BRPI0612293A2 - conjugados antigênicos e usos dos mesmos - Google Patents

conjugados antigênicos e usos dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BRPI0612293A2
BRPI0612293A2 BRPI0612293-0A BRPI0612293A BRPI0612293A2 BR PI0612293 A2 BRPI0612293 A2 BR PI0612293A2 BR PI0612293 A BRPI0612293 A BR PI0612293A BR PI0612293 A2 BRPI0612293 A2 BR PI0612293A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
wing
val
thr
seq
gly
Prior art date
Application number
BRPI0612293-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Bachmann
Andrea Jegerlehner
Philippe Saudan
Yu Zou
Nicole Schmitz
Adrian Huber
Stephen Martin
Heather Hinton
Alain Tissot
Original Assignee
Cytos Biotechnology Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytos Biotechnology Ag filed Critical Cytos Biotechnology Ag
Publication of BRPI0612293A2 publication Critical patent/BRPI0612293A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18123—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

CONJUGADOS ANTIGENICOS E USOS DOS MESMOS. A presente invenção é no campo da medicina, saúde pública, imunologia, biologia molecular e virologia. A invenção proporciona composição compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) encadeada a no mínimo um antígeno da invenção, em que o referido antígeno da invenção é CCR5 da invenção, gastrina da invenção, CXCR4 da invenção, CETP da invenção ou 05a da invenção. A invenção também proporciona um processo para produzir a composição. As composições desta invenção são úteis na produção de vacinas, em particular, para o tratamento de doenças nas quais o antígeno da invenção media ou contribui para a condição, particularmente para o tratamento da AIDS, de cânceres gastrointestinais, de doenças cardíacas coronárias ou doenças inflamatórias. Além disso, as composições da invenção induzem reações imunes eficientes, em particular reações de anticorpos. Além disso, as composições da invenção são particularmente úteis para induzir de modo eficaz reações imunes auto-específicas dentro do contexto indicado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGADOSANTIGÊNICOS E USOS DOS MESMOS".
Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo da medicina, saúdepública, imunologia, biologia molecular e virologia. A invenção proporcionaua composição compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) en-cadeada a no mínimo um antígeno da invenção, em que o referido antígenoda invenção é CCR5 da invenção, gastrina da invenção, CXCR4 da inven-ção, CETP da invenção ou C5a da invenção.
A invenção também proporciona um processo para produzir acomposição. As composições desta invenção são úteis na produção de va-cinas, em particular, para o tratamento de doenças nas quais o antígeno dainvenção media ou contribui para a condição, particularmente para o trata-mento de AIDS, cânceres gastrointestinais, doenças cardíacas coronarianasou doenças inflamatórias. Além disso, as composições da invenção induzemreações imunes eficientes, em particular reações de anticorpos. Além disso,as composições da invenção são particularmente úteis para induzir de modoeficiente reações imunes auto-específicas dentro do contexto indicado.
Técnica Relacionada
Antecedentes
Cepas de HIV R5 usam as moléculas da superfície celular CD4e CCR5 para fixação e ingresso em macrófagos e células CD4+ T. CCR5 éum receptor 7-transmembrana com uma seqüência N-terminal e três alçasexpostas ao espaço extracelular, as quais são denominadas subseqüente-mente PNt, ECL-1, ÈCL-2, e ÉCL-3, respectivamente. Os Iigantes de CCR5naturais, RANTES, MIP-loc, ΜΙΡ-1β e análogos dos mesmos são capazes debloquear a interação vírus-co-receptor e adicionalmente causam a internali-zação de CCR5 (Lederman et aí., 2004, Science 306, p485). Auto-anticorposCCR5 específicos foram encontrados em 12,5% das mulheres que foramexpostas repeticamente ao HIV mas permaneceram não infectadas (Lopalcoet al., 2000, J. Immunology 164, 3426). Foi demonstrado que estes anticorposaglutinam a primeira alça extracelular (ECL-1) de CCR5 e podem inibir infec-ção por HIV R5-trópica de células mononucleares do sangue (PBMC). A alo-imunização em mulheres levou a anticorpos CCR5 específicos que foramcapazes de inibir infecção por R5-HIV in vitro (Wang et al., 2002, Clin. Exp.Immunol. 129, 493).
Anticorpos a-CCR5 monoclonais são capazes de prevenir infecçãopor HIV in vitro (Olson et al., 1999, J. Virol. 73, 4145; Wu e LaRosa et al.,1997, J. Exp. Med. 186, 1373). A aglutinação de anticorpos a um peptídeocíclico correspondente à pequena alça extracelular ECL-2A (Arg168-Cys178)suprimiu infecção por HIV-1 R5 (Misumi et al., 2001, J. Virol. 75, 11614). An-ticorpos produzidos por imunização de macacos com peptídeos CCR5 linea-res (a partir da seqüência N-terminal, a ECL-1, ou a ECL-2) têm efeito inibi-tório viral in vitro (Lehner et al., 2001, J. Immunology 166, 7446). O domínioN-terminal de CCR5 foi apresentado sobre partículas semelhantes a papil-loma vírus e macaco imunizado (Chackerian et al., 2004, J. Virol. 78, 4037).
O receptor de quimocina CXCR4, também conhecido comoLESTR ou fusina, pertence à família de receptores acoplados à proteína Gde sete domínios transmembrana (Federsppiel et. al. (1993), Genomics16:707). CXCR4 é expressado sobre a superfície celular da maioria das po-pulações de leucócitos, inclusive todas as células B e monócitos, a maiorparte dos subgrupos de linfócitos T, células endoteliais e células epiteliais(Murdoch, (2000) Immunol. Rev. 177:175). O único Iigante conhecido paraCXCR4 é SDF-1 (Pelchen-Mattews, et. al. (1999) Immunol. Rev. 168:33).
CXCR4 foi posteriormente identificado como um co-receptor pa-ra HIV (Feng et al (1996) Science 272:872). Por conseguinte, cepas de HIVque necessitam de CXCR4 para ingressar nas células são categorizadascomo cepa X4 e este ingresso pode ser bloqueado por SDF-1 foi demons-trado que bloqueiam o ingresso de HIV-1 (Oberlin et al (1996), Nature382:833; Bleul1 et al (1996) Nature 382:829.
Vários antagonistas do peptídeo CXCR4 foram identificados e foidemonstrado que inibem o ingresso e a infecção de cepas de X4 HIV-1 (Mu-rakami et al (1997) J Exp Med 186:1389;Arakaki et al (1999). J Virol73:1779;Doranz et al (2001) AIDS Res Hum Retroviruses 17:475; Doranz, etal (1997) J Exp Med 186:1395; Schols, D. (2004), Curr Top Med Chem4:883. Além disso, foi mostrado que o pequeno composto químico AMD3100o qual é um potente e seletivo inibidor de replicação de HIV-1 e HIV-2 é es-pecífico para CXCR4 (De Clercq (2003) Nat Rev Drug Discov 2:581). Alémdisso foi mostrado que anticorpos monoclonais anti-CXCR4 tendo por alvodiferentes domínios extracelulares de CXCR4 inibem infecção por HIV-1(Endres et al (1996) Cell 87:745; Brelot et al (1997), J Virol 71:4744; Misumiet al (2003), J Biol Chem 278:32335; Xiao et al (2000), Exp Mol Pathol68:139).
Gastrina (G17) é um grupo de hormônios peptídicos intestinaisclássicos com quantidade muito menor no cólon e pâncreas (Koh, Regula-tory Peptides. 93, 37-44 (2000)). Gastrina é processada a partir de seu pre-cursor progastrina (G34). Tanto gastrina quanto progastrina existem em umaforma glicina-estendida de C-terminal e em uma forma de fenilalanina ami-dada de C-terminal. (Steel. IDrugs. 5, 689-695 (2002)).
Gastrina é de conhecimento geral por sua capacidade para es-timular a secreção de ácido gástrico (Pharmacol Ther. 98, 109-127 (2003)).O hormônio relacionado colecistocinina (CCK), o qual tem a amida tetrapep-tídica C-terminal como gastrina, é sintetizado no duodeno e é responsávelpela secreção de enzimas pancreáticas. Enquanto G17 amidado aglutina aoCCK-2 receptor, CCK aglutina tanto ao CCK-1 receptor quanto a CCK-2 re-ceptores (Steel. IDrugs. 5, 689-695 (2002)). O receptor para a gastrina glici-na-estendida permanece incerto. Dados recentes sugerem que a gastrinapode promover o desenvolvimento de cânceres do trato gastrointestinal(Watson. Aliment Pharmacol Ther. 14, 1231-1247 (2000); Watson. AlimentPharmacol Ther. 14, 1231-1247 (2000)).
A ativação do sistema do complemento induz uma série de efei-tos biológicos potentes, muitos dos quais são mediados pela anafilatoxinaC5a. O quinto componente do complemento (C5) é clivado pela C5 conver-tase em dois fragmentos, C5a e C5b.
C5a, uma glicoproteína de 74 aminoácidos, de feixe de 4 hélices(Femandez e Hugli1 J. Biol. Chem. 253, 6955-6964, 1978), é responsável porgerar uma série de efeitos diversos sobre sistemas celulares, especialmenteneutrófilos, células endoteliais e macrófagos induzindo inflamação local paracombate microorganismos infectantes (Ward P., Nat.Rev. Immunol. 4:133,2004). No entanto, em prova do que digo, a produção excessiva de C5a emsepticemia leva a graves defeitos funcionais nos neutrófilos (Czermak et al.,Nat. Med. 5:788, 1999; Huber-Lang et al., J. Immunol. 166:1193, 2001).
A elevada ativação de C5a também foi implicada em uma sériede doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, tais como artrite reumatói-de (Jose P. Ann Rheum. Dis. 49:747, 1990), psoríase (Takematsu H., Arch.Dermatol. 129:74,1993), síndrome da angústica respiratória do adulto (LangloisP., Heart Lung 18:71, 1989), lesão por reperfusão (Homeister, J. Annu. Rev.Pharmacol. Toxicol. 34:17, 1994), nefrite por lúpus e penfigóide bolhoso.
Anticorpos, os quais aglutinam a C5 e bloqueiam a clivagem edeste modo reduzem a produção de C5a e C5b, foram sugeridos para uso notratamento de condições como, por exemplo, glomerulonefrite (W09529697),asma (W004022096), artrite induzida por colágeno (Wang et al, Proc. Natl.Acad. Sci., 92:8955, 1995) e artrite soro transferida (Ji et al, Immunity,16:157, 2002). Anticorpos, especificamente aglutinando a C5a, têm sido su-geridos para uso no tratamento da síndrome da angústia respiratória do a-dulto (ARDS) (W08605692) e ativação do complemento intravascular preju-dicial (EP245993). O uso de um anticorpo monoclonal, o qual é reativo à al-ça extracelular de C5aR e deste modo presumivelmente reduz ou inibe aaglutinação de C5a com C5aR, também foi proposto no tratamento de dis-túrbios imunopatológicos (W02003062278).
A proteína transferência de ester colesterílico (CETP) é uma gli-coproteína plasmática a qual media a troca de éster de colesterol (CE) e tri-glicerídeos (TG) entre partículas de lipoproteínas de alta densidade (HDL) epartículas ricas em apo B tais como partículas de lipoproteínas de densidademuito baixa (VLDL) ou partículas de lipoproteínas de baixa densidade (LDL).CETP também transfere fosfolipídeos (PL). O cDNA de CETP humano codi-fica uma proteína de 476 aminoácidos.HDL é considerado antiaterogênico, uma vez que foi observadauma correlação inversa entre o nível de colesterol HDL e doença cardíacacoronariana (CHD) (Barter P.J. e Rye K.-A. (1996) Atherosclerosis 121:1-12).
A publicação de Patente Internacional N- WO 96/39168 descre-ve um método para aumentar HDL-c estimulando uma reação imune queinibe a atividade de CETP. Imunização contra antígenos CETP também foidescrita na publicação de Patente U.S. N2 US2003/0026808. PolipeptídeosCETP foram fundidos a "MAPs", e emulsificados em adjuvante Completo deFreund (CFA) para imunização de coelhos. A fusão de um peptídeo CETP aantígeno do núcleo da Hepatite B (HBcAg) também foi descrita na publica-ção de Patente U.S. N2 US2003/0026808, mas não foi reportada imunogeni-cidade do constructo.
Sumário da Invenção
Agora, surpreendentemente, foi descoberto que as composiçõese vacinas da invenção, respectivamente, compreendendo no mínimo umdomínio extracelular CCR5 ou no mínimo um fragmento de domínio extrace-Iular CCR5, são capazes de induzir reações imunes, em particular reaçõesde anticorpos, levando a alto título de anticorpos contra CCR5. Além disso,foi descoberto surpreendentemente que composições e vacinas da inven-ção, respectivamente, compreendendo no mínimo um domínio extracelularCCR5 ou no mínimo um fragmento de domínio extracelular CCR5, são ca-pazes de induzir reações imunes, em particular reações de anticorpos, comefeito protetor e/ou terapêutico contra a infecção por HIV. Isto indica que asreações imunes, em particular os anticorpos gerados pelas composições evacinas da invenção, respectivamente, são, portanto, capazes de reconhe-cer especificamente CCR5 in vivo, e interferindo com sua função como co-receptor de HIV.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporcionauma composição a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus(VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antí-geno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mí-nimo um antígeno é um domínio extracelular CCR5 ou um fragmento de do-mínio extracelular CCR5 ou qualquer combinação dos mesmos, e em que(a) e (b) são ligados através do referido no mínimo um primeiro e o referidono mínimo um segundo sítio de fixação, preferencialmente para formar umasérie de antígenos ordenada e repetitiva. Em uma modalidade preferencialda invenção, a partícula semelhante a vírus adequada para uso na presenteinvenção compreende proteína recombinante, preferencialmente proteína derevestimento recombinante, mutantes ou fragmentos das mesmas, de umvírus, preferencialmente de um bacteriófago de RNA.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona uma composição compreendendo: (a) uma partícula semelhante a ví-rus (VLP) de um bacteriófago de RNA com no mínimo dois primeiros sítiosde fixação; e (b) no mínimo um domínio extracelular CCR5 PNt com no mí-nimo dois segundos sítios de fixação; em que o referido domínio extracelularCCR5 PNt compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: (i) umdomínio Nta ou um fragmento de domínio Nta, e (ii) um domínio Ntb com-preendendo aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:56) oufragmento de domínio Ntb compreendendo aminoácidos 23 a 27 de SEQ IDNO:27, em que o C-término do referido domínio Nta ou o referido fragmentode domínio Nta é fundido, preferencialmente diretamente, ao referido N-término do referido domínio Ntb ou o referido fragmento de domínio Ntb, eem que o primeiro ou o segundo dos referidos no mínimo dois segundos sí-tios de fixação compreende ou é um grupo sulfidrila, preferencialmente umgrupo sulfidrila de um resíduo cisteína, e em que o primeiro dos referidos nomínimo dois segundos sítios de fixação está localizado a montante do N-término dos referidos aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27; e em que osegundo dos referidos no mínimo dois segundos sítios de fixação está locali-zado a jusante do término de C dos referidos aminoácidos 23 a 27 de SEQID NO:27, preferencialmente a jusante do término de C do referido domínioextracelular CCR5 PNt; e em que a referida VLP do referido bacteriófago deRNA e o referido domínio extracelular CCR5 PNt são ligados por no mínimouma ligação covalente não peptídica.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um métodopara prevenir e/ou tratar infecção por HIV1 em que o método compreendeadministrar a composição da invenção ou a composição de vacina da inven-ção, respectivamente, a um ser humano, em que o antígeno da invenção éum CCR5 da invenção.
Agora, surpreendentemente, descobriu-se que as composições evacinas da invenção, respectivamente, compreendendo no mínimo um domínioextracelular CXCR4 ou no mínimo um fragmento de domínio extracelularCXCR4, são capazes de induzir fortes reações imunes, em particular fortesreações de anticorpos, levando a alto título de anticorpos contra CXCR4.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporcionauma composição a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus(VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antí-geno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mí-nimo um antígeno é um domínio extracelular CXCR4 ou um fragmento dedomínio extracelular CXCR4 ou qualquer combinação dos mesmos, e emque (a) e (b) são ligados através do referido no mínimo um primeiro e o refe-rido no mínimo um segundo sítio de fixação, preferencialmente para formaruma série de antígenos ordenada e repetitiva. Em uma modalidade prefe-rencial da invenção, a partícula semelhante a vírus adequada para uso napresente invenção compreende proteína recombinante, preferencialmenteproteína de revestimento recombinante, mutantes ou fragmentos das mes-mas, de um vírus, preferencialmente de um bacteriófago de RNA.
Agora, surpreendentemente, descobriu-se que as composiçõese vacinas da invenção, respectivamente, compreendendo no mínimo um pro-teína CETP ou no mínimo um fragmento de CETP, são capazes de induzirfortes reações imunes, em particular fortes reações de anticorpos, levando aalto título de anticorpos contra CETP.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporcionauma composição a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus(VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antí-geno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mí-nimo um antígeno é uma proteína CETP ou um fragmento de CETP e emque (a) e (b) são ligados através do referido no mínimo um primeiro e o refe-rido no mínimo um segundo sítio de fixação, preferencialmente para formaruma série de antígenos ordenada e repetitiva. Em uma modalidade prefe-rencial da invenção, a partícula semelhante a vírus adequada para uso napresente invenção compreende proteína recombinante, preferencialmenteproteína de revestimento recombinante, mutantes ou fragmentos das mes-mas, de um vírus, preferencialmente de um bacteriófago de RNA.
Agora, surpreendentemente, descobriu-se que as composiçõese vacinas da invenção, respectivamente, compreendendo no mínimo umaproteína C5a ou no mínimo um fragmento C5a, são capazes de induzir fortesreações imunes, em particular fortes reações de anticorpos, levando a altotítulo de anticorpos contra C5a. Além disso, nós, surpreendentemente, des-cobriu-se que composições e vacinas da invenção, respectivamente, com-preendendo no mínimo uma proteína C5a ou no mínimo um fragmento C5a,são capazes de induzir fortes reações imunes, em particular fortes reaçõesde anticorpos, com efeito protetor e/ou terapêutico contra doenças inflamató-rias primárias e/ou crônicas, nas quais C5a tem um importante papel, talcomo artrite. Isto indica que as reações imunes, em particular os anticorposgerados pelas composições e vacinas da invenção, respectivamente, são,portanto, capazes de reconhecer especificamente C5a in vivo, e interferircom sua função.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporcionauma composição a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus(VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antí-geno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mí-nimo um antígeno é uma proteína C5a ou um fragmento C5a e em que (a) e(b) são ligados através do referido no mínimo um primeiro e o referido nomínimo um segundo sítio de fixação, preferencialmente para formar umasérie de antígenos ordenada e repetitiva. Em uma modalidade preferencialda invenção, a partícula semelhante a vírus adequada para uso na presenteinvenção compreende proteína recombinante, preferencialmente proteína derevestimento recombinante, mutantes ou fragmentos das mesmas, de umvírus, preferencialmente de um bacteriófago de RNA.
A presente invenção é vantajosa em relação à técnica anteriorempregando anticorpos monoclonais contra C5a para tratar doenças. Osdefeitos da terapia de anticorpos monoclonais incluem a necessidade deinjeções repetidas de grandes quantidades de anticorpo (Kaplan, Curr OpinInvest. Drugs. 2002; 3:1017-23). Altas doses de anticorpos podem levar aefeitos colaterais tais como doença de infusão. Também podem ser produzi-dos anti-anticorpos em pacientes em uma reação alotípica, mesmo se foremusados anticorpos humanos ou humanizados, levando a uma redução doefeito terapêutico ou potencialmente também causando efeitos colaterais.
Além disso, a despesa associada com o alto custo de produção de anticorpomonoclonal humanizado e com a necessidade de visita hospitalar freqüentetorna este tratamento com anticorpos indisponível para muitos pacientes quenecessitem.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um métodopara prevenir e/ou tratar doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, emque o método compreende administrar a composição da invenção ou a com-posição de vacina da invenção, respectivamente, a um animal ou um serhumano, em que o antígeno da invenção é um C5a da invenção. Doençasinflamatórias primárias e/ou crônicas, nas quais C5a media ou contribui paraa condição, incluem mas não estão limitadas a artrite reumatóide, lúpus eri-tematoso sistêmico, asma e penfigóide bulhoso.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composi-ção a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus (VLP) com nomínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antígeno com nomínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mínimo um antí-geno é Bradicinina da invenção, e em que (a) e (b) são ligados através doreferido no mínimo um primeiro e o referido no mínimo um segundo sítio defixação, preferencialmente para formar uma série de antígenos ordenada erepetitiva. Em uma modalidade preferencial da invenção, a partícula seme-lhante a vírus adequada para uso na presente invenção compreende proteí-na recombinante, preferencialmente proteína de revestimento recombinante,mutantes ou fragmentos das mesmas, de um vírus, preferencialmente de umbacteriófago de RNA.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composi-ção a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus (VLP) com nomínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antígeno com nomínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mínimo um antí-geno é des-Arg-Bradicinina da invenção, e em que (a) e (b) são ligados atra-vés do referido no mínimo um primeiro e o referido no mínimo um segundosítio de fixação, preferencialmente para formar uma série de antígenos orde-nada e repetitiva. Em uma modalidade preferencial da invenção, a partículasemelhante a vírus adequada para uso na presente invenção compreendeproteína recombinante, preferencialmente proteína de revestimento recom-binante, mutantes ou fragmentos das mesmas, de um vírus, preferencial-mente de um bacteriófago de RNA.
Agora, surpreendentemente, descobriu-se que as composiçõese vacinas da invenção, respectivamente, compreendendo no mínimo umagastrina G17, no mínimo um fragmento de gastrina G17, progastrina G34, ouno mínimo um fragmento de progastrina G34, são capazes de induzir fortesreações imunes, em particular fortes reações de anticorpos, levando a altotítulo de anticorpos contra gastrina ou progastrina.
Portanto, no primeiro aspecto, a presente invenção proporcionauma composição a qual compreende (a) uma partícula semelhante a vírus(VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) no mínimo um antí-geno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que o referido no mí-nimo um antígeno é uma gastrina G17, um fragmento de gastrina G17, umaprogastrina G34, ou um fragmento de progastrina G34 e em que (a) e (b)são ligados através do referido no mínimo um primeiro e o referido no míni-mo um segundo sítio de fixação, preferencialmente para formar uma série deantígenos ordenada e repetitiva. Em uma modalidade preferencial da inven-ção, a partícula semelhante a vírus adequada para uso na presente inven-ção compreende proteína recombinante, preferencialmente proteína de re-vestimento recombinante, mutantes ou fragmentos das mesmas, de um ví-rus, preferencialmente de um bacteriófago de RNA.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma com-posição de vacina, em que a referida composição de vacina compreende nomínimo um antígeno da invenção. Além disso, a presente invenção propor-ciona um método para administrar a composição de vacina a um ser humanoou um animal, preferencialmente um mamífero. A composição de vacina dainvenção é capaz de induzir forte reação imune, em particular reação de an-ticorpos, sem a presença de no mínimo um adjuvante. Portanto, em umamodalidade preferencial, a composição de vacina é destituída de um adju-vante. A evitação do uso de adjuvante pode reduzir uma possível ocorrênciade reações de células T inflamatórias indesejadas.
Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona umacomposição farmacêutica compreendendo a composição da invenção e umveículo farmaceuticamente aceitável.
Em novamente um aspecto adicional, a presente invenção pro-porciona um método para produzir a composição da invenção compreen-dendo (a) proporcionar uma VLP com no mínimo um primeiro sítio de fixa-ção; (b) proporcionar no mínimo um antígeno da invenção com no mínimoum segundo sítio de fixação; e (c) combinar a referida VLP e o referido nomínimo um antígeno da invenção para produzir a referida composição, emque o referido no mínimo um antígeno e a referida VLP são ligados atravésdo referido no mínimo um primeiro e o referido no mínimo um segundo sítiode fixações.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1A mostra os resultados de ELISA de lâminas revesti-das com ou nG17amida ou CCK8 e incubadas com soros de camundongodiluídos serialmente (14 dias depois da imunização). A figura 1B mostra osresultados de ELISA de inibição, nos quais o soro foi pré-incubado comnG17 amida ou CCK8 diluídos serialmente antes de adicionados às lâminasrevestidas.
A figura 2 mostra a soma do escore clínico médio de todos osmembros depois da injeção final de colágeno/CFA (FIG 2A) oui depois dainjeção final de coquetel de anticorpos monoclonais anticolágeno (FIG.2B)de camundongos imunizados com ou Q3-mC5acys ou QB VLP. O eixo χ re-presenta os dias depois de injeção de colágeno e o eixo y representa a so-ma média do escore clínico de todas as pernas.
A figura 3 mostra percentagem de camundongos imunizados comou QB-mC5acys ou Q3 VLP com leituras de proteinúria de mais de 300 pg/ml.
Descrição Detalhada da Invenção
A menos que definido de modo diverso, todos os termos técni-cos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm os mes-mos significados como entendido comumente por um versado na técnica àesta invenção pertence.
Antígeno: conforme usado aqui, neste requerimento de patente,o termo "antígeno" se refere a uma molécula capaz de ser ligada por um an-ticorpo ou um receptor de células T (TCR) caso apresentado por moléculasMHC. O termo "antígeno", conforme usado aqui, neste requerimento de pa-tente, também engloba epitopos de células T. Um antígeno é adicionalmentecapaz de ser reconhecido pelo sistema imune e/ou ser capaz de induzir umareação imune humoral e/ou reação imune celular levando à ativação de Iin-fócitos B e/ou T. No entanto, isto pode requerer que, no mínimo em algunscasos, o antígeno contenha ou esteja ligado a um epitopo de células Th eseja administrado em adjuvante. Um antígeno pode ter um ou mais epitopos(epitopo B e Τ). A reação específica referida acima pretende indicar que oantígeno preferencialmente reagirá, tipicamente em uma maneira altamenteseletiva, com seu anticorpo correspondente ou TCR e não com a multitudede outros anticorpos ou TCRs os quais podem ser provocados por outrosantígenos. Antígenos conforme usado aqui, neste requerimento de patente,também podem ser misturas de vários antígenos individuais.
Sítio antigênico: o termo "sítio antigênico" e o termo "epitopo an-tigênico", os quais são usados aqui, neste requerimento de patente, de modointercambiável, se referem a porções contínuas ou descontínuas de um poli-peptídeo, as quais podem ser ligadas imunoespecificamente por um anticor-po ou por um receptor de células T dentro do contexto de uma moléculaMHC. Aglutinação imunoespecífica exclui aglutinação não específica, masnão exclui necessariamente reatividade cruzada. Sítio antigênico tipicamentecompreende 5 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial a qual éúnica para o sítio antigênico.
Antígeno da invenção: o termo "antígeno da invenção", conformeusado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um antígeno selecio-nado entre o grupo consistindo em: a) CCR5 da invenção; b) CXCR4 da in-venção; c) CETP da invenção; d) C5a da invenção; e) gastrina da invenção,f) Bradicinina da invenção; e g) des-Arg-Bradicinina da invenção.
CCR5 da invenção: o termo "CCR5 da invenção" conforme usa-do aqui, neste requerimento de patente, se refere a no mínimo um domínioextracelular CCR5, no mínimo um fragmento de domínio extracelular CCR5conforme definido aqui, neste requerimento de patente, oü qualquer combi-nação dos mesmos.
Domínio extracelular CCR5: o termo "domínio extracelular C-CR5" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobarqualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, oualternativamente ou preferencialmente consistindo em, qualquer um dosquatro domínios extracelulares de CCR5 humano de SEQ ID NO:24 ou osortólogos correspondentes de quaisquer outros animais, preferencialmentemamíferos. Além disso, o termo "domínio extracelular CCR5" conforme usa-do aqui, neste requerimento de patente, também deve englobar qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vamente ou preferencialmente consistindo em, qualquer variante natural ouproduzida por engenharia genética tendo mais de 70%, preferencialmentemais de 80%, ainda mais preferencialmente mais de 90%, novamente maispreferencialmente mais de 95%, e ainda mais preferencialmente mais de97% de identidade de seqüência de aminoácidos com o domínio extracelularCCR5 conforme definido acima. O termo "domínio extracelular CCR5" con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobar além dissomodificações pós-translacionais incluindo, mas não limitadas a glicosilações,acetilações, fosforilações do domínio extracelular CCR5 conforme definidoacima. Preferencialmente o domínio extracelular CCR5, conforme definidoaqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo 200, aindamais preferencialmente no máximo 100 aminoácidos de extensão. Tipica-mente e preferencialmente, o domínio extracelular CCR5 é capaz de induzirin vivo a produção de anticorpo aglutinando especificamente a CCR5.
Fragmento de domínio extracelular CCR5: o termo "fragmentode domínio extracelular CCR5" conforme usado aqui, neste requerimento depatente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreendendo, consistindoessencialmente em, ou alternativamente ou preferencialmente consistindoem, no mínimo 4, 5, preferencialmente no mínimo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17,18, 19, 20, 25, ou 30 aminoácidos contíguos de um domínio extracelularCCR5 conforme definido aqui, neste requerimento de patente, bem comoqualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmente mais de 80%,mais preferencialmente mais de 90% e ainda mais preferencialmente maisde 95% de identidade de seqüência de aminoácidos com essa. Preferenci-almente, o termo "fragmento de domínio extracelular CCR5" conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente oupreferencialmente consistindo em, no mínimo 6 aminoácidos contíguos deum domínio extracelular CCR5 conforme definido aqui, neste requerimentode patente, bem como qualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferenci-almente mais de 80%, preferencialmente mais de 90% e ainda mais prefe-rencialmente mais de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos alémdisso. Preferencialmente o fragmento de domínio extracelular CCR5, con-forme definido aqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo50, ainda mais preferencialmente no máximo 30 aminoácidos de extensão.Tipicamente e preferencialmente, um fragmento de domínio extracelularCCR5 é capaz de induzir a produção de anticorpo in vivo, o qual especifica-mente aglutina a CCR5.
Combinação de domínio extracelular CCR5 e/ou fragmento de
domínio extracelular CCR5: o termo "combinação de domínio extracelularCCR5 e/ou fragmento de domínio extracelular CCR5" deve englobar qual-quer entidade compreendendo ou alternativamente consistindo em qualquercombinação de domínio extracelular CCR5 e/ou fragmento de domínio ex-tracelular CCR5 conforme definido acima. Preferencialmente o domínio ex-tracelular CCR5 e/ou fragmento de domínio extracelular CCR5 são combi-nados por fusão em um polipeptídeo. Portanto, o termo "combinação de do-mínio extracelular CCR5 e/ou fragmento de domínio extracelular CCR5" adi-cionalmente compreende aminoácidos adicionais como espaçador, em que oreferido espaçador é geralmente não mais longo do que 10, preferencial-mente não mais longo do que 6 aminoácidos e em que o referido espaçadorestá entre dois domínios extracelulares CCR5 e/ou fragmentos de domíniosextracelulares CCR5.
CXCR4 da invenção: o termo "CXCR4 da invenção" conformeusado aqui, neste requerimento de patente, se refere a no mínimo um domí-nio extracelular CXCR4, no mínimo um fragmento de domínio extracelularCXCR4 conforme definido aqui, neste requerimento de patente, ou qualquercombinação dos mesmos.
Domínio extracelular CXCR4: o termo "domínio extracelular CXCR4"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobar qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vãmente ou preferencialmente consistindo em, qualquer um dos quatro do-mínios extracelulares de CXCR4 humano de SEQ ID NO:28 ou os ortólogoscorrespondentes de quaisquer outros animais, preferencialmente mamíferos.
Além disso, o termo "domínio extracelular CXCR4" conforme usado aqui,neste requerimento de patente, também deve englobar qualquer polipeptí-deo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamenteou preferencialmente consistindo em, qualquer variante natural ou produzidapor engenharia genética tendo mais de 70%, preferencialmente mais de80%, ainda mais preferencialmente mais de 90%, novamente mais preferen-cialmente mais de 95%, e ainda mais preferencialmente mais de 97% deidentidade de seqüência de aminoácidos com o domínio extracelular CXCR4conforme definido acima. O termo "domínio extracelular CXCR4" conformeusado aqui, neste requerimento de patente, deve englobar além disso modi-ficações pós-translacionais incluindo, mas não limitadas a glicosilações, ace-tilações, fosforilações do domínio extracelular CXCR4 conforme definido a-cima. Preferencialmente o domínio extracelular CXCR4, conforme definidoaqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo 200, aindamais preferencialmente de no máximo 100 aminoácidos de extensão. Tipi-camente e preferencialmente, o domínio extracelular CXCR4 é capaz de in-duzir in vivo a produção de anticorpo aglutinando especificamente a CXCR4.
Fragmento de domínio extracelular CXCR4: o termo "fragmentode domínio extracelular CXCR4" conforme usado aqui, neste requerimentode patente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreendendo, consistin-do essencialmente em, ou alternativamente ou preferencialmente consistin-do em, no mínimo 4, 5, preferencialmente no mínimo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,17, 18, 19, 20, 25, ou 30 aminoácidos contíguos de um domínio extracelularCXCR4 conforme definido aqui, neste requerimento de patente, bem comoqualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmente mais de 80%,mais preferencialmente mais de 90% e ainda mais preferencialmente maisde 95% de identidade de seqüência de aminoácidos além disso. Preferenci-almente, o termo "domínio extracelular CXCR4" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreen-dendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou preferenci-almente consistindo em, no mínimo 6 aminoácidos contíguos de um domínioextracelular CXCR4 conforme definido aqui, neste requerimento de patente,bem como qualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmentemais de 80%, preferencialmente mais de 90% e ainda mais preferencialmen-te mais de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos além disso. Pre-ferencialmente o fragmento de domínio extracelular CXCR4, conforme defi-nido aqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo 50, aindamais preferencialmente de no máximo 30 aminoácidos de extensão. Tipica-mente e preferencialmente, um fragmento de domínio extracelular CXCR4 écapaz de induzir a produção de anticorpo in vivo, o qual especificamenteaglutina a CXCR4.
Combinação de CXCR4 domínio extracelular e/ou fragmento dedomínio extracelular CXCR4: o termo "Combinação de CXCR4 domínio ex-tracelular e/ou fragmento de domínio extracelular CXCR4" engloba qualquerentidade compreendendo ou alternativamente consistindo em qualquer com-binação de CXCR4 domínio extracelular e/ou fragmento de domínio extrace-Iular CXCR4 conforme definido acima. Preferencialmente CXCR4 domínioextracelular e/ou fragmento de domínio extracelular CXCR4 são combinadospor fusão em um polipeptídeo. Portanto, o termo "combinação de CXCR4domínio extracelular e/ou fragmento de domínio extracelular CXCR4" adicio-nalmente compreende aminoácidos adicionais como espaçador, em que oreferido espaçador é geralmente não mais longo do que 10, preferencial-mente não mais longo do que 6 aminoácidos e em que o referido espaçadorestá entre dois domínios extracelulares CXCR4 e/ou fragmentos de domí-nios extracelulares CXCR4.
C5a da invenção: o termo "C5a da invenção" conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, se refere a no mínimo uma proteínaC5a ou no mínimo um fragmento C5a conforme definido aqui, neste reque-rimento de patente, ou qualquer combinação dos mesmos.
Proteína C5a: o termo "proteína C5a" conforme usado aqui, nes-te requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreen-dendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou preferenci-almente consistindo em, o C5a humano de SEQ ID NO:45 ou os ortólogoscorrespondentes de quaisquer outros animais, preferencialmente mamíferos.
Além disso, o termo "proteína C5a" conforme usado aqui, neste requerimen-to de patente, também deve englobar qualquer polipeptídeo compreenden-do, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou preferencialmen-te consistindo em, qualquer variante natural ou produzida por engenhariagenética tendo mais de 70%, preferencialmente mais de 80%, ainda maispreferencialmente mais de 90%, novamente mais preferencialmente mais de95%, e ainda mais preferencialmente mais de 97% de identidade de se-qüência de aminoácidos com o C5a humano de SEQ ID NO:45 ou os ortólo-gos correspondentes de quaisquer outros animais. O termo "proteína C5a"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobar alémdisso modificações pós-translacionais incluindo mas não limitadas a glicosi-lações, acetilações, fosforilações da proteína C5a conforme definido acima.Preferencialmente a proteína C5a, conforme definido aqui, neste requeri-mento de patente, consiste em no máximo 200, ainda mais preferencialmen-te de no máximo 100 aminoácidos de extensão. Tipicamente e preferencial-mente, proteína C5a é capaz de induzir in vivo a produção de anticorpo aglu-tinando especificamente a C5a.
Fragmento C5a : o termo "fragmento C5a" conforme usado aqui,neste requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo com-preendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou prefe-rencialmente consistindo em, no mínimo 4, 5, preferencialmente no mínimo6,7,8,9,10,11,12,17,18,19, 20, 25 ou 30 aminoácidos contíguos de umaproteína C5a conforme definido aqui, neste requerimento de patente, bemcomo qualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmente mais de80%, mais preferencialmente mais de 90% e ainda mais preferencialmentemais de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos além disso. Prefe-rencialmente, o termo "fragmento C5a" conforme usado aqui, neste requeri-mento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreendendo,consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou preferencialmenteconsistindo em, no mínimo 6 aminoácidos contíguos de uma proteína C5aconforme definido aqui, neste requerimento de patente, bem como qualquerpolipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmente mais de 80%, preferen-cialmente mais de 90% e ainda mais preferencialmente mais de 95% de i-dentidade de seqüência de aminoácidos além disso. Preferencialmente ofragmento C5a, conforme definido aqui, neste requerimento de patente, con-siste em no máximo 50, ainda mais preferencialmente de no máximo 30 a-minoácidos de extensão. Tipicamente e preferencialmente, um fragmentoC5a é capaz de induzir a produção de anticorpo in vivo, o qual especifica-mente aglutina a C5a.
CETP da invenção: o termo "CETP da invenção" conforme usa-do aqui, neste requerimento de patente, se refere a no mínimo um proteínaCETP ou no mínimo um fragmento de CETP conforme definido aqui, nesterequerimento de patente, ou qualquer combinação dos mesmos.
Proteína CETP: o termo "proteína CETP" conforme usado aqui,neste requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo com-preendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou prefe-rencialmente consistindo em, o CETP humano de SEQ ID NO:31 ou os ortó-Iogos correspondentes de quaisquer outros animais, preferencialmente ma-míferos. Além disso, o termo "proteína CETP" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, também deve englobar qualquer polipeptídeocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente oupreferencialmente consistindo em, qualquer variante natural ou produzidapor engenharia genética tendo mais de 70%, preferencialmente mais de80%, ainda mais preferencialmente mais de 90%, novamente mais preferen-cialmente mais de 95%, e ainda mais preferencialmente mais de 97% deidentidade de seqüência de aminoácidos com o CETP humano de SEQ IDNO:31 ou os ortólogos correspondentes de quaisquer outros animais. O ter-mo "proteína CETP" conforme usado aqui, neste requerimento de patente,deve englobar além disso modificações pós-translacionais incluindo mas nãolimitadas a glicosilações, acetilações, fosforilações da proteína CETP con-forme definido acima. Preferencialmente a proteína CETP, conforme definidoaqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo 500 aminoáci-dos de extensão. Tipicamente e preferencialmente, proteína CETP é capazde induzir in vivo a produção de anticorpo aglutinando especificamente aCETP.
Fragmento CETP: o termo "fragmento CETP" conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente oupreferencialmente consistindo em, no mínimo 4, 5, preferencialmente no mí-nimo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 aminoácidos contíguosde um proteína CETP conforme definido aqui, neste requerimento de paten-te, bem como qualquer polipeptídeo tendo mais de 65%, preferencialmentemais de 80%, mais preferencialmente mais de 90% e ainda mais preferenci-almente mais de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos além dis-so. Preferencialmente, o termo "fragmento CETP" conforme usado aqui, nes-te requerimento de patente, deve englobar qualquer polipeptídeo compreen-dendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente ou preferenci-almente consistindo em, no mínimo 6 aminoácidos contíguos de um proteínaCETP conforme definido aqui, neste requerimento de patente, bem comoqualquer polipeptídeo tendo mais de 80%, preferencialmente mais de 90% eainda mais preferencialmente mais de 95% de identidade de seqüência deaminoácidos além disso. Preferencialmente o fragmento CETP, conformedefinido aqui, neste requerimento de patente, consiste em no máximo 50,ainda mais preferencialmente de no máximo 30 aminoácidos de extensão.Tipicamente e preferencialmente, um fragmento de CETP é capaz de induzira produção de anticorpo in vivo, o qual especificamente aglutina a CETP.
Gastrina da invenção: o termo "gastrina da invenção" conformeusado aqui, neste requerimento de patente, se refere a no mínimo um gas-trina G17, no mínimo um fragmento de gastrina G17, no mínimo um progas-trina G34 ou no mínimo um fragmento de progastrina G34 conforme definidoaqui, neste requerimento de patente, ou qualquer combinação dos mesmos.
Gastrina G17: o termo "gastrina G17" deve englobar qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vãmente consistindo na gastrina humana 1-17 como de SEQ ID NO:34, SEQID NO: 36, gastrina 1-17 de SEQ ID NO:34 com a fenilalanina amidada C-terminal ou os ortólogos correspondentes de quaisquer outros animais, pre-ferencialmente mamíferos. O termo "gastrina G17" deve englobar adicional-mente qualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmenteem, ou alternativamente consistindo na gastrina humana 1-17 como de SEQID NO:34, SEQ ID NO: 36, gastrina 1-17 de SEQ ID NO:34 com a fenilalani-na amidada C-terminal ou os ortólogos correspondentes de quaisquer outrosanimais, nos quais no máximo três, preferencialmente no máximo dois, maispreferencialmente um aminoácido foi eliminado, adicionado ou substituído.
Preferencialmente a substituição é substituição de aminoácido conservativa.A extensão da gastrina G17 é preferencialmente não mais longa do que 50,mais preferencialmente não mais longa do que 30 aminoácidos. Tipicamentee preferencialmente, uma gastrina G17 é capaz de induzir a produção deanticorpo in vivo, o qual especificamente aglutina a gastrina.
Fragmento de gastrina G17: o termo "fragmento de gastrinaG17" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobarqualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, oualternativamente consistindo em no mínimo 4, 5, preferencialmente no míni-mo 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos contíguos a gastrina G17. O termo "frag-mento de gastrina G17" deve englobar adicionalmente qualquer polipeptídeocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente con-sistindo no fragmento de gastrina G17 conforme definido acima, no qual nomínimo um aminoácido, preferencialmente no máximo 3, ainda mais prefe-rencialmente no máximo 2, ainda mais preferencialmente um aminoácido foieliminado, adicionado ou substituído por outro aminoácido. Preferencialmen-te a substituição é substituição de aminoácido conservativa. A extensão deum fragmento de gastrina G17 é preferencialmente não mais longa do que30, mais preferencialmente não mais longa do que 20 aminoácidos. Tipica-mente e preferencialmente, um fragmento de gastrina G17 é capaz de indu-zir a produção de anticorpo in vivo, o qual especificamente aglutina a gastrina.
Progastrina G34: o termo "progastrina G34" engloba qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vamente consistindo na gastrina humana 1-34 como de SEQ ID NO:35, SEQID NO: 37, gastrina 1-34 com a fenilalanina amidada C-terminal ou os ortólo-gos correspondentes de quaisquer outros animais, preferencialmente mamí-feros. O termo "progastrina G34" deve englobar adicionalmente qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vamente consistindo na gastrina humana 1-34 como de SEQ ID NO:35, SEQID NO: 37, gastrina 1-34 com a fenilalanina amidada C-terminal ou os ortólo-gos correspondentes de quaisquer outros animais, na qual no máximo cinco,preferencialmente no máximo quatro, mais preferencialmente no máximotrês, preferencialmente no máximo dois, mais preferencialmente um aminoá-cido foi eliminado, adicionado ou substituído. Preferencialmente a substitui-ção é substituição conservativa. A extensão da progastrina G34 é preferen-cialmente não mais longa do que 60, mais preferencialmente não mais longado que 40 aminoácidos. Tipicamente e preferencialmente, uma progastrinaG34 é capaz de induzir a produção de anticorpo in vivo, o qual especifica-mente aglutina a progastrina.
Fragmento de progastrina G34: o termo "fragmento de progastri-na G34" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englo-bar qualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em,ou alternativamente consistindo em no mínimo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou14 aminoácidos de progastrina G34. O termo "fragmento de progastrinaG34" deve englobar adicionalmente qualquer polipeptídeo compreendendo,consistindo essencialmente em, ou alternativamente consistindo em frag-mento de progastrina G34 conforme definido acima, no qual no mínimo umaminoácido, preferencialmente no máximo 3, ainda mais preferencialmenteno máximo 2, ainda mais preferencialmente um aminoácido foi eliminado,adicionado ou substituído por outro aminoácido. Preferencialmente a substi-tuição é substituição de aminoácido conservativa. A extensão de um frag-mento de progastrina G34 é não mais longa do que 40, mais preferencial-mente não mais longa do que 20 aminoácidos. Tipicamente e preferencial-mente, um fragmento de gastrina G34 é capaz de induzir a produção de an-ticorpo in vivo, o qual especificamente aglutina a progastrina.
Bradicinina da invenção: o termo "Bradicinina da invenção" con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, deve englobar qualquerpolipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternati-vãmente consistindo na Bradicinina humana como SEQ ID NO:22 ou os ortó-Iogos correspondentes de quaisquer outros animais, preferencialmente ma-míferos. O termo "Bradicinina da invenção" conforme usado aqui, neste re-querimento de patente, deve englobar adicionalmente qualquer polipeptídeocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou alternativamente con-sistindo na Bradicinina humana como SEQ ID NO:22 ou os ortólogos corres-pondentes de quaisquer outros animais, na qual no máximo dois, preferenci-almente um aminoácido foi eliminado, adicionado ou substituído por outroaminoácido. Preferencialmente a substituição é substituição de aminoácidoconservativa. A extensão da Bradicinina da invenção é preferencialmentenão mais longa do que 30, mais preferencialmente não mais longa do que 20aminoácidos. Tipicamente e preferencialmente, uma Bradicinina da invençãoé capaz de induzir a produção de anticorpo in vivo, o qual especificamenteaglutina a Bradicinina.
Des-Arg-Bradicinina da invenção: o termo "des-Arg-Bradicininada invenção" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, englobaqualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, oualternativamente consistindo na des-Arg-Bradicinina humana como SEQ IDNO:23 ou os ortólogos correspondentes de quaisquer outros animais, prefe-rencialmente mamíferos. O termo "des-Arg-Bradicinina da invenção" confor-me usado aqui, neste requerimento de patente, adicionalmente englobaqualquer polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, oualternativamente consistindo na des-Arg-Bradicinina humana como SEQ IDNO:23 ou os ortólogos correspondentes de qualquer outro animal, na qualno máximo dois, preferencialmente um aminoácido foi eliminado, adicionadoou substituído por outro aminoácido. Preferencialmente a substituição ésubstituição de aminoácido conservativa. A extensão da des-Arg-Bradicininada invenção é preferencialmente não mais longa do que 30, mais preferenci-almente não mais longa do que 20 aminoácidos. Tipicamente e preferenci-almente, uma Bradicinina da invenção é capaz de induzir a produção de an-ticorpo in vivo, o qual especificamente aglutina a des-Arg-Bradicinina.
Associada: o termo "associada" (ou seu substantivo associação)conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a todos osmodos possíveis, preferencialmente interações químicas, pelas quais duasmoléculas são unidas juntas. Interações químicas incluem interações cova-Ientes e não covalentes. Exemplos típicos para interações não covalentessão interações iônicas, interações hidrofóbicas ou aglutinações de hidrogê-nio, ao passo que interações covalentes são baseadas, a título de exemplo,em ligações covalentes tais como aglutinações éster, éter, fosfoéster, amida,peptídeo, carbono-fósforo, aglutinações carbono-enxofre tais como aglutina-ções tioéter, ou imida.
Sítio de Fixação, Primeiro: conforme usado aqui, neste requeri-mento de patente, a expressão "primeiro sítio de fixação" se refere a um e-Iemento o qual está ocorrendo naturalmente com a VLP ou qual é adiciona-do artificialmente à VLP1 e ao qual o segundo sítio de fixação pode ser liga-do. O primeiro sítio de fixação pode ser uma proteína, um polipeptídeo, umaminoácido, um peptídeo, um açúcar, um polinucleotídeo, um polímero natu-ral ou sintético, um metabólito ou composto secundário (biotina, fluoresceí-na, retinol, digoxigenina, íons metálicos, fenilmetilsulfonilfluoreto), ou umgrupo quimicamente reativo tal como um grupo amino, um grupo carboxila,um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila, um grupo guanidinila, grupo histidini-la, ou uma combinação dos mesmos. Uma modalidade preferencial de umgrupo quimicamente reativo sendo o primeiro sítio de fixação é o grupo ami-no de um aminoácido tal como lisina. O primeiro sítio de fixação está Iocali-zado, tipicamente sobre a superfície, e preferencialmente sobre a superfícieexterna da VLP. Múltiplos primeiros sítios de fixação estão presentes sobre asuperfície, preferencialmente sobre a superfície externa da partícula seme-lhante a vírus, tipicamente em uma configuração repetitiva. Em uma modali-dade preferencial o primeiro sítio de fixação está associado com a VLP, a-través de no mínimo uma ligação covalente, preferencialmente através de nomínimo uma aglutinação peptídica. Em uma modalidade preferencial adicio-nal o primeiro sítio de fixação ocorre naturalmente com a VLP. Alternativa-mente, em outra modalidade preferencial o primeiro sítio de fixação é adicio-nado artificialmente à VLP.
Sítio de Fixação, Segundo: conforme usado aqui, neste requeri-mento de patente, a expressão "segundo sítio de fixação" se refere a umelemento o qual está ocorrendo naturalmente com ou qual é adicionado arti-ficialmente ao antígeno da invenção e ao qual o primeiro sítio de fixação po-de ser ligado. O segundo sítio de fixação de antígeno da invenção pode seruma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um aminoácido, um açúcar, umpolinucleotídeo, um polímero natural ou sintético, um metabólito ou compos-to secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, íons metálicos,fenilmetilsulfonilfluoreto), ou um grupo quimicamente reativo tal como umgrupo amino, um grupo carboxila, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila, umgrupo guanidinila, grupo histidinila, ou uma combinação dos mesmos. Umamodalidade preferencial de um grupo quimicamente reativo sendo o segun-do sítio de fixação é o grupo sulfidrila, preferencialmente de um aminoácidocisteína. O termo "antígeno da invenção com no mínimo um segundo sítio defixação", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere aum constructo compreendendo o antígeno da invenção e no mínimo um se-gundo sítio de fixação. Em uma modalidade preferencial, o segundo sítio defixação ocorre naturalmente dentro do antígeno da invenção. Em outra mo-dalidade preferencial, o segundo sítio de fixação é adicionado artificialmenteao antígeno da invenção. Em uma modalidade preferencial o segundo sítiode fixação é associado com o antígeno da invenção através de no mínimouma ligação covalente, preferencialmente através de no mínimo uma agluti-nação peptídica. Em uma modalidade preferencial, antígeno da invençãocom no mínimo um segundo sítio de fixação adicionalmente compreende umligador, preferencialmente o referido Iigador compreende no mínimo um se-gundo sítio de fixação, preferencialmente o referido ligador é fundido ao an-tígeno da invenção por uma aglutinação peptídica.
Proteína de revestimento: o termo "proteína de revestimento" e otermo usado de modo intercambiável "proteína do capsídeo" dentro desterequerimento, se refere a uma proteína viral, a qual é capaz de ser incorpo-rada em um capsídeo viral ou uma VLP. Tipicamente e preferencialmente otermo "proteína de revestimento" se refere à proteína de revestimento codifi-cada pelo genoma de um vírus, preferencialmente um bacteriófago de RNAou pelo genoma de uma variante de um vírus, preferencialmente de um bac-teriófago de RNA. Mais preferencialmente e a título de exemplo, o termo"proteína de revestimento de AP205" se refere a SEQ ID NO: 14 ou a se-qüência de aminoácidos, em que a primeira metionina é clivada de SEQ IDNO: 14. Mais preferencialmente e a título de exemplo, o termo "proteína derevestimento de Οβ" se refere a SEQ ID NO:1 ("Qp CP") e SEQ ID NO:2(A1), com ou sem a metiona no N-término. O capsídeo do bacteriófago Οβ écomposto essencialmente do Οβ CP, com um menor teor da proteína A1.
Ligado: o termo "ligado" (ou seu substantivo: ligação) conformeusado aqui, neste requerimento de patente, se refere a todos os modos pos-síveis, preferencialmente interações químicas, por meio dos quais o no mí-nimo um primeiro sítio de fixação e no mínimo um segundo sítio de fixaçãosão unidos juntos. Interações químicas incluem interações covalentes e nãocovalentes. Exemplos típicos para interações não covalentes são interaçõestônicas, interações hidrofóbicas ou aglutinações de hidrogênio, ao passo queinterações covalentes se baseiam, a título de exemplo, em ligações covalentestais como aglutinações éster, éter, fosfoéster, amida, peptídeo, carbono-fós-foro, aglutinações carbono-enxofre tais como aglutinações tioéter, ou imida.
Em algumas modalidades preferenciais o primeiro sítio de fixação e o se-gundo sítio de fixação são ligados através de no mínimo uma ligação cova-lente, preferencialmente através de no mínimo uma aglutinação não peptídi-ca, e ainda mais preferencialmente através de exclusivamente uma ou maisaglutinações não peptídicas. O termo "ligado" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, no entanto, não somente englobará uma aglutina-ção direta de no mínimo um primeiro sítio de fixação e no mínimo um segun-do sítio de fixação, mas também, alternativamente e preferencialmente, umaaglutinação indireta de no mínimo um primeiro sítio de fixação e no mínimoum segundo sítio de fixação através de uma ou mais moléculas intermediá-rias, e por meio deste tipicamente e preferencialmente usando no mínimoum, preferencialmente um, reticulador hetero-bifuncional.
Ligador: um "ligador", conforme usado aqui, neste requerimentode patente, ou associa o segundo sítio de fixação com antígeno da invençãoou já compreende, essencialmente consiste em, ou consiste no segundosítio de fixação. Preferencialmente, um "ligador", conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, já compreende o segundo sítio de fixação, tipica-mente e preferencialmente - mas não necessariamente - como um resíduoaminoácido, preferencialmente como um resíduo cisteína. Um "ligador" con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, também é denominado"aminoácido ligador", em particular quando um ligador de acordo com a in-venção contém no mínimo um resíduo aminoácido. Portanto, os termos "li-gador" e "aminoácido ligador" são usados de modo intercambiável aqui, nes-te requerimento de patente. No entanto, isto não implica que um ligador se-melhante consiste exclusivamente em resíduos aminoácidos, mesmo se umligador consistindo em resíduos aminoácidos for uma modalidade preferen-cial da presente invenção. Os resíduos aminoácidos do ligador, preferenci-almente, são compostos de aminoácidos que ocorrem naturalmente ou ami-noácidos não naturais conhecidos na técnica, alI-L ou alI-D ou misturas dosmesmos. Modalidades preferenciais adicionais de um ligador de acordo comesta invenção são moléculas compreendendo um grupo sulfidrila ou um re-síduo cisteína e as moléculas referidas, portanto, também são englobadasdentro desta invenção. Ligadores adicionais úteis para a presente invençãosão moléculas compreendendo uma C1-C6 alquila-, uma cicloalquila tal co-mo uma porção ciclopentila ou ciclohexila, uma cicloalquenila, arila ou hete-roarila. Além disso, Iigadores compreendendo preferencialmente uma porçãoC1-C6 alquila, cicloalquila (C5, C6), arila ou heteroarila e um ou mais amino-ácidos adicionais também podem ser usados como Iigadores para a presen-te invenção e serão englobados dentro do âmbito da invenção. A associaçãodo ligador com o antígeno da invenção é preferencialmente por meio de nomínimo uma ligação covalente, mais preferencialmente por meio de no mí-nimo uma aglutinação peptídica. No caso de um segundo sítio de fixaçãonão ocorrendo naturalmente com o antígeno da invenção, o ligador é asso-ciado a no mínimo um segundo sítio de fixação, por exemplo, uma cisteína,preferencialmente, por meio de no mínimo uma ligação covalente, mais pre-ferencialmente por meio de no mínimo uma aglutinação peptídica.
Série de antígenos ordenados e repetitivos: conforme usado a-qui, neste requerimento de patente, o termo "série de antígenos ordenados erepetitivos" se refere de modo geral a um padrão de repetição de antígenoou, caracterizado por uma ordem de uniformidade tipicamente e preferenci-almente elevada na disposição espacial dos antígenos com respeito a partí-cula semelhante a vírus, respectivamente. Em uma modalidade da invenção,o padrão de repetição pode ser um padrão geométrico. Algumas modalida-des da invenção, tais como VLP de fatos de RNA1 são exemplos típicos epreferenciais de séries de antígenos ordenados e repetitivos adequadas asquais, além disso, possuem ordens paracristalinas estritamente repetitivasde antígenos, preferencialmente com espaçamentos de 1 a 30 nanômetros,preferencialmente 2 a 15 nanômetros, ainda mais preferencialmente 2 a 10nanômetros, de novo ainda mais preferencialmente 2 a 8 nanômetros, e adi-cionalmente mais preferencialmente 1,6 a 7 nanômetros.
Embalada: o termo "embalada" conforme usado aqui, neste re-querimento de patente, se refere ao estado de uma macromolécula polianiô-nica em relação à VLP. O termo "embalada" conforme usado aqui, neste re-querimento de patente, inclui aglutinação que pode ser covalente, por exem-plo, acoplando quimicamente, ou não covalente, por exemplo, interaçõesiônicas, interações hidrofóbicas, aglutinações de hidrogênio, e etc. O termotambém inclui o encerramento, ou encerramento parcial, de uma macromo-lécula polianiônica. Portanto, a macromolécula polianiônica pode ser encer-rada pela VLP sem a existência de uma aglutinação real, em particular deuma ligação covalente. Em modalidades preferenciais, a no mínimo umamacromolécula polianiônica é embalada dentro da VLP, ainda mais prefe-rencialmente em uma maneira não covalente.
Polipeptídeo: o termo "polipeptídeo" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, se refere a uma molécula composta de monôme-ros (aminoácidos) ligados linearmente por aglutinações amida (também co-nhecidas como aglutinações peptídicas). Indica uma cadeia molecular deaminoácidos e não se refere a uma extensão específica do produto. Portan-to, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos e proteínas são inclu-ídos dentro da definição de polipeptídeo. Modificações pós-translacionais dopolipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações, e seme-lhantes também são englobados.
VLP recombinante: o termo "VLP recombinante", conforme usa-do aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma VLP que é obtidapor um processo o qual compreende no mínimo uma etapa de tecnologia deDNA recombinante. O termo "VLP produzida de modo recombinante", con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma VLP queé obtida por um processo o qual compreende no mínimo uma etapa de tec-nologia de DNA recombinante. Portanto, os termos "VLP recombinante" e"VLP produzida de modo recombinante" são usados de modo intercambiávelaqui, neste requerimento de patente, e devem ter o significado idêntico.
Partícula de vírus: o termo "partícula de vírus" conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, se refere à forma morfológica de umvírus. Em alguns tipos de vírus compreende um genoma circundado por umcapsídeo de proteína; outros têm estruturas adicionais (por exemplo, enve-lopes, caudas, e etc.).
Partícula semelhante a vírus (VLP), conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, se refere a uma partícula não replicativa ou nãoinfecciosa, preferencialmente uma partícula viral não replicativa e não infec-ciosa, ou se refere a uma estrutura não replicativa ou não infecciosa, prefe-rencialmente uma estrutura não replicativa e não infecciosa se assemelhan-do a uma partícula viral, preferencialmente um capsídeo de um vírus. O ter-mo "não replicativa", conforme usado aqui, neste requerimento de patente,se refere a ser incapaz de replicar o genoma compreendido pela VLP. Otermo "não infecciosa", conforme usado aqui, neste requerimento de patente,se refere a ser incapaz de penetrar na célula hospedeira. Preferencialmenteuma partícula semelhante a vírus de acordo com a invenção é não replicati-va e/ou não infecciosa uma vez que carece de todo ou parte do genoma viralou função do genoma. Em uma modalidade, uma partícula semelhante avírus é uma partícula viral, na qual o genoma viral foi inativado fisicamenteou quimicamente. Tipicamente e mais preferencialmente uma partícula se-melhante a vírus carece de todos ou parte dos componentes replicativos einfecciosos do genoma viral. Uma partícula semelhante a vírus de acordocom a invenção pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma. Umamodalidade típica e preferencial de uma partícula semelhante a vírus de a-cordo com a presente invenção é um capsídeo viral tal como o capsídeo viraldo vírus correspondente, bacteriófago, preferencialmente fago de RNA. Ostermos "capsídeo viral" ou "capsídeo", se referem a uma montagem macro-molecular composta de subunidades de proteína viral. Tipicamente, há 60,120, 180, 240, 300, 360 e mais de 360 subunidades de proteína viral. Tipi-camente e preferencialmente, as interações destas subunidades levam àformação de capsídeo viral ou estrutura semelhante a capsídeo viral comuma organização repetitiva inerente, em que a referida estrutura, tipicamen-te, é esférica ou tubular.
Uma característica comum de partícula viral e partícula seme-lhante a vírus é sua disposição altamente ordenada e repetitiva de suas su-bunidades.
Partícula semelhante a vírus de um bacteriófago de RIMA: con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "partícula seme-lhante a vírus de um bacteriófago de RNA" se refere a uma partícula seme-lhante a vírus compreendendo, ou preferencialmente consistindo essencial-mente em ou consistindo em proteínas de revestimento, mutantes ou frag-mentos das mesmas, de um bacteriófago de RNA. Além disso, partícula se-melhante a vírus de um bacteriófago de RNA se assemelha à estrutura deum bacteriófago de RNA, sendo não replicativa e/ou não infecciosa, e care-cendo de no mínimo o gene ou genes codificando para o mecanismo de re-plicação do bacteriófago de RNA, e tipicamente também carecendo do geneou genes codificando a proteína ou proteínas responsáveis por fixação virala ou ingresso no hospedeiro. Esta definição, no entanto, também deve en-globar partículas semelhantes a vírus de bacteriófagos de RNA, nas quais ogene ou genes mencionados acima ainda estão presentes mas inativos, e,portanto, também levando a partículas semelhantes a vírus não replicativase/ou não infecciosas de um bacteriófago de RNA. Dentro desta presentedescrição o termo "subunidade" e "monômero" são usados de modo inter-cambiável e equivalente dentro deste contexto.
Um, uma, ou algum: quando os termos "um", "uma", ou "algum"são usados nesta descrição, significam "no mínimo um" ou "um ou mais" amenos que indicado de modo diverso.
Dentro deste requerimento, anticorpos são definidos como sen-do especificamente aglutinandos se eles se aglutinam ao antígeno com umaafinidade de aglutinação (Ka) de 10® M1 ou mais, preferencialmente 107 M"1ou mais, mais preferencialmente 108 M1 ou mais, e ainda mais preferenci-almente 109 M1 ou mais. A afinidade de um anticorpo pode ser prontamentedeterminada por um versado na técnica (por exemplo, por análise de Scat-chard.)
A identidade da seqüência de aminoácidos de polipeptídeos po-de ser determinada convencionalmente usando programas de computadorconhecidos tais como o programa Bestfit. Ao usar Bestfit ou qualquer outroprograma de alinhamento de seqüência, preferencialmente usando Bestfit,para determinar se uma seqüência em particular é, por exemplo, 95% idênti-ca a uma seqüência de aminoácidos de referência, os parâmetros são de-terminados de tal modo que a percentagem de identidade seja calculada portoda a extensão da seqüência de aminoácidos de referência e que sejampermitidos hiatos na homologia de até 5% do número total de resíduos ami-noácidos na seqüência de referência. Este método mencionado acima nadeterminação da percentagem de identidade entre polipeptídeos é aplicávela todas as proteínas, polipeptídeos ou um fragmento dos mesmos descritosnesta invenção.
Substituições de aminoácidos conservativas, conforme entendi-do por um versado na técnica, incluem substituições isostéricas, substitui-ções onde a natureza carregada, polar, aromática, alifática ou hidrofóbica doaminoácido é mantida. Substituições de aminoácidos conservativas típicassão substituições entre aminoácidos dentro de um dos grupos seguintes:Gly, Ala; Vai, lie, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Cys; Lys, Arg; e Phe eTyr.
Esta invenção proporciona composições e métodos para reforçarreações imunes contra antígeno da invenção em um animal ou em um serhumano. A composição da invenção compreende: (a) uma partícula seme-lhante a vírus (VLP) com no mínimo um primeiro sítio de fixação; e (b) nomínimo um antígeno com no mínimo um segundo sítio de fixação, em que nomínimo um antígeno é um antígeno da invenção e em que (a) e (b) são liga-dos através do no mínimo um primeiro e no mínimo um segundo sítio de fi-xação. Preferencialmente, o antígeno da invenção é ligado à VLP1 de modoa formar uma série de antígeno-VLP ordenada e repetitiva. Em modalidadespreferenciais da invenção, no mínimo 20, preferencialmente no mínimo 30,mais preferencialmente no mínimo 60, novamente mais preferencialmenteno mínimo 120 e adicionalmente mais preferencialmente no mínimo 180 an-tígenos da invenção são ligados à VLP.
Qualquer vírus conhecido na técnica tendo uma estrutura orde-nada e repetitiva pode ser selecionado como uma VLP da invenção. Vírus deDNA ou RNA ilustrativos, cuja proteína de revestimento ou do capsídeo podeser usada para a preparação de VLPs foram descritos na publicação de pa-tente internacional N2 WO 2004/009124 na página 25, linha 10-21, na página26, linha 11-28, e na página 28, linha 4 na página 31, linha 4. Estas descri-ções são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio dereferência.
Vírus ou partícula semelhante a vírus pode ser produzido e puri-ficado a partir de cultura celular infectada por vírus. O vírus ou partícula se-melhante a vírus resultantes para fins de vacina precisam ser destituídos devirulência. Além de engenharia genética, podem ser empregados métodosfísicos ou químicos para inativar a função do genoma viral, tais como irradia-ção UV, tratamento com formaldeído.
Em uma modalidade preferencial, a VLP é uma VLP recombi-nante. Quase todos os vírus comumente conhecidos foram seqüenciados eestão prontamente disponíveis para o público. O gene codificando a proteínade revestimento pode ser facilmente identificado por um técnico versado. Apreparação de VLPs por expressão recombinante da proteína de revesti-mento em um hospedeiro está dentro do conhecimento comum de um técni-co versado.
Em uma modalidade preferencial, a partícula semelhante a víruscompreende, ou alternativamente consiste em, proteínas recombinantes,mutantes ou fragmentos das mesmas, de um vírus selecionado entre o gru-po consistindo em: a) fagos de RNA; b) bacteriófagos; c) vírus da Hepatite B,preferencialmente sua proteína do capsídeo (Ulrich, et al., Virus Res.50:141-182 (1998)) ou sua proteína superficial (publicação de patente Inter-nacional N2 WO 92/11291); d) measles virus (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) Sindbis vírus; f) rotavírus (Patente U.S. N2 5.071.651 e Pa-tente U.S. N2 5.374.426); g) vírus da febre aftosa, Twomey, et al., Vaccine13:1603 1610, (1995)); h) Norwalk vírus (Jiang, X., et al., Science 250:15801583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); i) Al-phavirus; j) retrovírus, preferencialmente sua proteína GAG (publicação depatente Internacional N2 96/30523); k) retrotransposon Ty1 preferencialmentea proteína p1; I) Papiloma vírus humano (publicação de patente InternacionalN2 98/15631); m) Polyoma vírus; n) vírus do mosaico do Tabaco; e o) FlockHouse Vírus.
Em uma modalidade preferencial, a VLP compreende, ou consis-te em, mais de uma seqüência de aminoácidos, preferencialmente duas se-qüências de aminoácidos, das proteínas recombinantes, mutantes ou frag-mentos das mesmas. VLP compreendendo ou consistindo em mais de umaseqüência de aminoácidos é referida, neste requerimento, como VLP mosaico.
O termo "fragmento de uma proteína recombinante" ou o termo"fragmento de uma proteína de revestimento", conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, é definido como um polipeptídeo, o qual tem nomínimo 70%, preferencialmente no mínimo 80%, mais preferencialmente nomínimo 90%, ainda mais preferencialmente no mínimo 95% da extensão daproteína recombinante selvagem, ou proteína de revestimento, respectiva-mente e o qual preferencialmente retém a capacidade de formar VLP. Prefe-rencialmente o fragmento é obtido por no mínimo um eliminação interna, nomínimo uma truncação ou no mínimo uma combinação das mesmas. O ter-mo "fragmento de uma proteína recombinante" ou "fragmento de uma proteí-na de revestimento" adicionalmente englobarão polipeptídeo, o qual tenhano mínimo 80%, preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%de identidade de seqüência de aminoácidos com o "fragmento de uma prote-ína recombinante" ou "fragmento de uma proteína de revestimento", respec-tivamente, conforme definido acima e o qual é preferencialmente capaz dereunir em uma partícula semelhante a vírus.
O termo "proteína recombinante mutante" ou o termo "mutantede uma proteína recombinante" conforme usado de modo intercambiávelnesta invenção, ou o termo "proteína de revestimento mutante" ou o termo"mutante de uma proteína de revestimento", conforme usado de modo inter-cambiável nesta invenção, se refere a um polipeptídeo tendo uma seqüênciade aminoácidos derivada da proteína recombinante selvagem, ou proteínade revestimento, respectivamente, em que a seqüência de aminoácidos é nomínimo 80%, preferencialmente no mínimo 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99%idêntica à seqüência selvagem e preferencialmente retém a capacidade dereunir em uma VLP.
Em uma modalidade preferencial, a partícula semelhante a vírusda invenção é de vírus da Hepatite Β. A preparação de partículas semelhan-tes a vírus da Hepatite B foi descrita, entre outros, na publicação de patenteinternacional N2 WO 00/32227, na publicação de patente internacional N2WO 01/85208 e na publicação de patente internacional N2 WO 01/056905.
Todos os três documentos são explicitamente incorporados aqui, a este re-querimento de patente, por meio de referência. Outras variantes de HBcAgadequadas para uso na prática da presente invenção foram descritas nàspáginas 34-39 da publicação de patente internacional N2 WO 01/056905.
Em algumas modalidades preferenciais-adicionais da invenção,um resíduo Iisina é introduzido no polipeptídeo HBcAg, para mediar a ligaçãodo antígeno da invenção à VLP de HBcAg. Em modalidades preferenciais,VLPs e composições da invenção são preparadas usando um HBcAg com-preendendo, ou alternativamente consistindo nos, aminoácidos 1-144, ou 1-149, 1-185 de SEQ ID N0:20, que é modificado de modo que os aminoáci-dos nas posições 79 e 80 são substituídos com um peptídeo tendo a se-qüência de aminoácidos Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. Esta modificação muda a SEQN0:20 para a SEQ ID NO:21. Em modalidades preferenciais adicionais,Mduos cisteína nas posições 48 e 110 de SEQ ID NO:21, ou seusas correspondentes, preferencialmente 1-144 ou 1-149, são muta-na. A invenção inclui adicionalmente composições compreen-dendo mutantes de proteínas do núcleo da Hepatite B tendo alterações deaminoácidos correspondentes mencionadas acima. A invenção inclui adicio-nalmente composições e vacinas, respectivamente, compreendendo polipep-tídeos HBcAg os quais compreendem, ou alternativamente consistem em,seqüências de aminoácidos as quais são no mínimo 80%, 85%, 90%, 95%,97% ou 99% idênticas à SEQ ID NO:21.
Em uma modalidade preferencial, a partícula semelhante a vírusé de um Vírus do Mosqueado Clorótico do Feijão-de-corda, um Vírus do Mo-saico do Feijão-de-corda ou um Vírus do Mosaico da Alfalfa. Métodos paraproduzir VLP destes vírus foram descritos na Patente U.S. N- 2005/0260758e na publicação de patente internacional N2 W005067478.
Em modalidades preferenciais da invenção, a partícula seme-lhante a vírus é de um bacteriófago de RNA. Preferencialmente, o bacterió-fago de RNA é selecionado entre o grupo consistindo em a) bacteriófago Οβ;b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófagoSP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacte-riófago NL95; k) bacteriófago f2; I) bacteriófago PP7 e m) bacteriófagoAP205.
Em uma modalidade preferencial da invenção, a composiçãocompreende proteína de revestimento, mutantes ou fragmentos das mes-mas, de bacteriófagos de RNA, em que a proteína de revestimento tem se-qüência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindo em: (a) SEQID NO: 1, referindo a Οβ CP; (b) uma mistura de SEQ ID NO:1 e SEQ IDNO:2 (referindo à proteína Οβ A1); (c) SEQ ID NO:3; (d) SEQ ID NO:4; (e)SEQ ID NO:5; (f) SEQ ID NO:6, (g) uma mistura de SEQ ID NO:6 e SEQ IDNO:7; (h) SEQ ID NO:8; (i) SEQ ID NO:9; (j) SEQ ID N0:10; (k) SEQ IDNO:11; (I) SEQ ID NO:12; (m) SEQ ID NO:13; e (n) SEQ ID NO:14. Geral-mente a proteína de revestimento mencionada acima é capaz de reunir emVLP com ou sem a presença da metionina de N-terminal.
Em uma modalidade preferencial da invenção, a VLP é uma VLPem mosaico compreendendo ou alternativamente consistindo em mais deuma seqüência de aminoácidos, preferencialmente duas seqüências de ami-noácidos, de proteínas de revestimento, mutantes ou fragmentos das mes-mas, de um fago de RNA.
Em uma modalidade muito preferencial, a VLP compreende oualternativamente consiste em duas diferentes proteínas de revestimento deum fago de RNA, as referidas duas proteínas de revestimento têm uma se-qüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2, ou de SEQ IDNO:6 e SEQ ID NO:7.
Em modalidades preferenciais da presente invenção, a partículasemelhante a vírus da invenção compreende, ou alternativamente consisteessencialmente em, ou alternativamente consiste em proteínas de revesti-mento recombinantes, mutantes ou fragmentos das mesmas, do bacteriófa-go de RNA Οβ, fr, AP205 ou GA.
Em uma modalidade preferencial, a VLP da invenção é uma VLPde fago de RNA Οβ. Partículas semelhantes a vírus preferenciais adicionaisde fatos de RNA, em particular de Οβ e fr de acordo com esta invenção sãodescritas na publicação de patente internacional N2 WO 02/056905, cujadescrição é deste modo incorporada por meio de referência em sua totalida-de. Em particular o exemplo 18 da publicação de patente internacional N2WO 02/056905 proporcionou descrição detalhada da preparação de partícu-Ias VLP de Οβ.
Em outra modalidade preferencial, a VLP da invenção é umaVLP de fago de RNA AP205. Formas mutantes de agrupamentos-competentes de VLPs de AP205, inclusive proteína de revestimento AP205com a substituição de prolina no aminoácido 5 para treonina, asparigina noaminoácido 14 para ácido aspártico, também podem ser usadas na práticada invenção e leva a outras modalidades preferenciais da invenção. A publi-cação de patente internacional N2 WO 2004/007538 descreve, em particularno Exemplo 1 e no Exemplo 2, como obter VLP compreendendo proteínasde revestimento de AP205, e por meio deste em particular a expressão e apurificação além disso. A publicação de patente internacional N2 WO2004/007538 é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meiode referência.Em uma modalidade preferencial, a VLP da invenção compreen-de ou consiste em uma proteína de revestimento mutante de um vírus, prefe-rencialmente um fago de RNA1 em que a proteína de revestimento mutantefoi modificada por remoção de no mínimo um resíduo Iisina por meio desubstituição e/ou por meio de eliminação. Em outra modalidade preferencial,a VLP da invenção compreende ou consiste em uma proteína de revesti-mento mutante de um vírus, preferencialmente um fago de RNA, em que aproteína de revestimento mutante foi modificada por adição de no mínimoum resíduo Iisina por meio de substituição e/ou por meio de inserção. Emuma modalidade muito preferencial, a proteína de revestimento mutante é dofago de RNA Οβ, em que no mínimo um, ou alternativamente no mínimodois, resíduos Iisina foram removidos por meio de substituição ou por meiode eliminação. Em uma modalidade alternativa muito preferencial, a proteínade revestimento mutante é do fago de RNA Οβ, em que no mínimo um, oualternativamente no mínimo dois, resíduos Iisina foram adicionados por meiode substituição ou por meio de inserção. Em uma modalidade preferencialadicional, a proteína de revestimento mutante do fago de RNA Οβ tem umaseqüência de aminoácidos selecionada entre qualquer um de SEQ IDNO: 15-19.
Em uma modalidade preferencial, as composições e vacinas dainvenção têm uma densidade antigênica sendo a partir de 0,5, preferencial-mente a partir de 1,0, preferencialmente a partir de 1,2, preferencialmente apartir de 1,6, preferencialmente a partir de 1,9, preferencialmente a partir de2,2 até 4,0. O termo "densidade antigênica", conforme usado aqui, neste re-querimento de patente, se refere ao número médio de antígeno da invençãoo qual é ligado por subunidade, preferencialmente por proteína de revesti-mento, da VLP, e por meio deste preferencialmente da VLP de um fago deRNA. Portanto, este valor é calculado como uma média de todas as subuni-dades ou monômeros da VLP, preferencialmente da VLP do fago de RNA,na composição ou nas vacinas da invenção.
Também foi mostrado que Proteínas de revestimento de fago deRNA adicionais auto-agrupam na expressão em um hospedeiro bacteriano(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Do-kl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). Emparticular foram descritas as propriedades biológicas e bioquímicas de GA(Ni, CZ., et al., Protein Sei. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol.271:759-773(1997)) e de fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993),Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994)). Foi determinada a estruturacristalina de vários bacteriófagos de RNA (Golmohammadi, R. et al., Structu-re 4:543-554 (1996)). Usando semelhante informação, podem ser identifica-dos resíduos expostos superficialmente e, portanto, proteínas de revestimen-to de fagos de RNA podem ser modificadas de tal modo que um ou maisresíduos aminoácidos reativos podem ser inseridos por modo de inserção ousubstituição. Outra vantagem das VLPs derivadas de fagos de RNA em suaprodução de alta expressão em bactérias que possibilitam produção degrandes quantidades de material em custo custeável.
Em uma modalidade preferencial, o antígeno da invenção é umdomínio extracelular CCR5, um fragmento de domínio extracelular CCR5 ouqualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferencial da in-venção, no mínimo um antígeno é um fragmento de domínio extracelularCCR5. Em uma modalidade preferencial, o fragmento de domínio extracelu-lar CCR5 compreende, consiste essencialmente em ou consiste em umfragmento de domínio extracelular CCR5 ECL2, preferencialmente ECL2A.ECL2A, conforme entendido de modo geral na técnica, se inicia preferenci-almente a partir do primeiro aminoácido do N-término do ECL2 e para prefe-rencialmente na treonina, a qual está logo antes da cisteína na seqüência deECL2 humana. Em uma modalidade preferencial adicional, o fragmento dedomínio extracelular CCR5 compreende, consiste essencialmente em oualternativamente consiste em SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade prefe-rencial, o fragmento de domínio extracelular CCR5 compreende, consisteessencialmente em ou consiste em um ECL2A ciclizado. Em uma modalida-de preferencial adicional, o fragmento de domínio extracelular CCR5 com-preende, consiste essencialmente em, ou alternativamente consiste em SEQID NO:25 ciclizada. Em uma modalidade preferencial adicional, o fragmentode domínio extracelular CCR5 compreende, consiste essencialmente em oualternativamente consiste em SEQ ID NO:26 ciclizada ou SEQ ID NO:52, emque o peptídeo é ciclizado pelo resíduo C e G em ambas as extremidades.
SEQ ID NO:25 ciclizada, conforme usado aqui, neste requerimento de paten-te, se refere a uma seqüência de aminoácidos compreendendo, consistindoessencialmente de ou consistindo em SEQ ID N2 25, em que o primeiro resí-duo aminoácido e o último resíduo aminoácido da referida seqüência de a-minoácidos interagem um com o outro por no mínimo uma ligação química,preferencialmente por no mínimo uma ligação covalente. Preferencialmenteo primeiro resíduo aminoácido e o último resíduo aminoácido da referida se-qüência de aminoácidos interagem um com o outro por todas as ligaçõescovalentes. Preferencialmente o primeiro resíduo aminoácido e o último re-síduo aminoácido da referida seqüência de aminoácidos interagem um como outro por uma aglutinação peptídica, levando a um peptídeo circular.
Em uma modalidade preferencial da invenção, no mínimo umantígeno é um domínio extracelular CCR5 PNt. Em uma modalidade prefe-rencial adicional, o domínio extracelular CCR5 PNt compreende, consisteessencialmente em ou alternativamente consiste em SEQ ID NO:27. Emuma modalidade preferencial adicional, o domínio extracelular CCR5 PNtcompreende, ou consiste em SEQ ID NO:27 com Iigador adicional, preferen-cialmente cisteína, fundido a ou o C- ou o N- término de SEQ ID NO:27, pre-ferencialmente fundido ao C-término de SEQ ID NO:27. Em ainda modalida-de preferencial adicional, o domínio extracelular CCR5 PNt compreende,consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO:27 com Iigador adi-cional, preferencialmente cisteína, fundido a ou o C- ou o N- término de SEQID NO:27, preferencialmente fundido ao C-término de SEQ ID NO:27, emque a cisteína que ocorre naturalmente dentro de SEQ ID NO:27 foi substitu-ído por outro aminoácido, preferencialmente por serina. Isto é para assegu-rar uma apresentação antigênica uniforme e definida.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona uma composição compreendendo: (a) uma partícula semelhante a ví-rus (VLP) de um bacteriófago de RNA com no mínimo dois primeiros sítiosde fixação; e (b) no mínimo um domínio extracelular CCR5 PNt com no mí-nimo dois segundos sítios de fixação; em que o referido domínio extracelularCCR5 PNt compreende, consiste essencialmente em ou consiste em: (i) umdomínio Nta ou um fragmento de domínio Nta, e (ii) um domínio Ntb com-preendendo aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:56) oufragmento de domínio Ntb compreendendo aminoácidos 23 a 27 de SEQ IDNO:27, em que o C-término do referido domínio Nta ou o referido fragmentode domínio Nta é fundido, preferencialmente diretamente, ao referido N-término do referido domínio Ntb ou o referido fragmento de domínio Ntb, eem que o primeiro ou o segundo dos referidos no mínimo dois segundos sí-tios de fixação compreende ou é um grupo sulfidrila, preferencialmente umgrupo sulfidrila de um resíduo cisteína, e em que o primeiro dos referidos nomínimo dois segundos sítios de fixação está localizado a montante do N-término dos referidos aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27; e em que osegundo dos referidos no mínimo dois segundos sítios de fixação está locali-zado a jusante do término de C dos referidos aminoácidos 23 a 27 de SEQID NO:27, preferencialmente a jusante do término de C do referido domínioextracelular CCR5 PNt; e em que a referida VLP do referido bacteriófago deRNA e o referido domínio extracelular CCR5 PNt são ligados por no mínimouma ligação covalente não peptídica.
Domínio Nta: o termo "domínio Nta" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, se refere ao domínio Nta nativo tendo a seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO:57 ou a seqüência correspondente de C-CR5s ortólogos de quaisquer outros animais, preferencialmente de primatas(inclusive anthropoidea e prosimii), mais preferencialmente de anthropoidea.
Além disso, o termo "domínio Nta", conforme usado aqui, neste requerimentode patente, se refere a um domínio Nta modificado, no qual três, preferenci-almente dois, mais preferencialmente um aminoácido do domínio Nta nativo,conforme definido aqui, neste requerimento de patente, foi modificado poreliminação, inserção e/ou substituição, preferencialmente substituição con-servativa, com a condição de que os anticorpos provocados pelas composi-ções da invenção compreendendo o referido domínio Nta modificado agluti-nam especificamente a CCR5 humano.
Fragmento de domínio Nta : o termo "fragmento de domínio Nta "conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a qualquerpolipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em nomínimo 8, preferencialmente no mínimo 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 se-qüências de aminoácidos consecutivas do domínio Nta conforme definidoaqui, neste requerimento de patente, com a condição de que os anticorposprovocados pelas composições da invenção compreendendo o referidofragmento de domínio Nta aglutinam especificamente a CCR5 humano.
Domínio Ntb: o termo "domínio Ntb" conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, se refere ao domínio Ntb nativo tendo a seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO:58 ou a seqüência correspondente de C-CR5s ortólogos de quaisquer outros animais, preferencialmente de primatas(inclusive anthropoidea e prosimii), mais preferencialmente de anthropoidea.Além disso, o termo "domínio Ntb", conforme usado aqui, neste requerimentode patente, se refere a um domínio Ntb modificado, no qual dois, preferenci-almente um aminoácido do domínio Ntb nativo, conforme definido aqui, nes-te requerimento de patente, foi modificado por eliminação, inserção e/ousubstituição, preferencialmente por substituição conservativa, com a condi-ção de que os anticorpos provocados pelas composições da invenção com-preendendo o referido domínio Ntb modificado aglutinam especificamente aCCR5 humano.
Fragmento de domínio Ntb: o termo "fragmento de domínio Ntb"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a qualquerpolipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em nomínimo 6, preferencialmente no mínimo 7, 8, 9, 10 seqüências de aminoáci-dos consecutivas do domínio Ntb conforme definido aqui, neste requerimen-to de patente, com a condição de que os anticorpos provocados pelas com-posições da invenção compreendendo o referido fragmento de domínio Ntbaglutinam especificamente a CCR5 humano. Preferencialmente o referidofragmento de domínio Ntb compreende, consiste essencialmente em, ouconsiste em seqüência de aminoácidos CQKINVK (SEQ ID NO:59), maispreferencialmente CQKINVKQ (SEQ ID N0:60). Além disso, o referido frag-mento de domínio Ntb compreende, consiste essencialmente em, ou consis-te em seqüência de aminoácidos CQKINVK, mais preferencialmente CQ-KINVKQ1 na qual um aminoácido de CQKINVK ou CQKINVKQ foi modificadopor eliminação, inserção e/ou substituição, preferencialmente substituiçãoconservativa, com a condição de que os anticorpos provocados pelas com-posições da invenção compreendendo o referido fragmento de domínio Ntbaglutinam especificamente a CCR5 humano.
Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular CCR5PNt com no mínimo dois segundos sítios de fixação não compreende umgrupo sulfidrila adicional de cisteína, preferencialmente um grupo sulfidrilaadicional, além dos referidos dois grupos sulfidrila, preferencialmente doisgrupos sulfidrila dos referidos resíduos cisteína, compreendidos pelos ousendo o referido primeiro e o referido segundo dos referidos no mínimo doissegundos sítios de fixação.
Em uma modalidade preferencial, o primeiro dos referidos nomínimo dois segundos sítios de fixação não está localizado a montante doN-término do domínio Nta ou o fragmento de domínio Nta. Isto é para asse-gurar o livre acesso do N-término do domínio Nta ou o fragmento de domínioNta ao sistema imune do hospedeiro uma vez que a configuração natural deCCR5 tem um N-término livremente móvel. Preferencialmente o primeiro dosreferidos no mínimo dois segundos sítios de fixação está localizado a jusantedo C-término do domínio Nta ou o fragmento de domínio Nta.
Em uma modalidade preferencial, o primeiro dos referidos nomínimo dois segundos sítios de fixação é o resíduo cisteína que ocorre natu-ralmente dentro do referido domínio extracelular CCR5 PNt. Em uma moda-lidade preferencial, o primeiro dos referidos no mínimo dois segundos sítiosde fixação corresponde ao grupo sulfidrila do resíduo cisteína de SEQ IDNO:27.
Em uma modalidade alternativa, o primeiro dos referidos no mí-nimo dois segundos sítios de fixação está localizado uma, duas ou três posi-ções de aminoácidos a montante, ou uma ou duas posições de aminoácido ajusante da referida cisteína que ocorre naturalmente, em que preferencial-mente o referido primeiro dos referidos no mínimo dois segundos sítios defixação foi gerado por inserção ou por substituição do resíduo aminoácidoque ocorre naturalmente nesta posição em cisteína; e em que preferencial-mente a referida cisteína que ocorre naturalmente dentro do domínio PNt foieliminado ou substituído, preferencialmente por uma serina ou uma substitu-ição alanina.
Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular CCR5PNt compreende, consiste essencialmente em, ou preferencialmente consis-te na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:27. Em uma modalidadepreferencial, o domínio extracelular CCR5 PNt compreende, consiste essen-cialmente em, ou preferencialmente consiste na seqüência de aminoácidosderivado de SEQ ID NO:27, na qual três, preferencialmente dois, preferenci-almente um aminoácido de SEQ ID NO:27 foi modificado por inserção, elimi-nação e/ou substituição, preferencialmente substituição conservativa, com acondição de que os anticorpos provocados pelas composições da invençãocompreendendo a referida seqüência de aminoácidos derivada de SEQ IDNO:27 aglutinam especificamente a CCR5 humano.
Em uma modalidade preferencial, a composição adicionalmentecompreende um ligador, em que o referido Iigador é fundido ao C-término doreferido domínio extracelular CCR5 PNt, e em que o referido ligador com-preende ou é o segundo dos referidos no mínimo dois segundos sítios defixação. O ligador pode ser de extensão variada de modo que a flexibilidadedo domínio Ntb ou fragmento de domínio Ntb pode ser ajustada para ligaçãomais eficiente a diferentes VLPs ou para melhor simular a configuração natu-ral do domínio Ntb nativo.
Em uma modalidade preferencial, o ligador é selecionado entre ogrupo consistindo em: (a) GGC; (b) GGC-CONH2; (c) GC; (d) GC-CONH2;(e) C; e (f) C-CONH2. Em uma modalidade preferencial adicional, o ligador éuma cisteína ou uma cisteína amidada. Em uma modalidade preferencial, odomínio extracelular CCR5 PNt com no mínimo dois segundos sítios de fixa-ção compreende, consiste essencialmente em, ou preferencialmente consis-te na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:44.
Em uma modalidade preferencial, o primeiro e o segundo dosreferidos no mínimo dois segundos sítios de fixação associam com os nomínimo dois primeiros sítios de fixação através de no mínimo duas ligaçõescovalentes não peptídicas. Em uma modalidade preferencial adicional, so-mente o primeiro e o segundo dos referidos no mínimo dois segundos sítiosde fixação associam com os no mínimo dois primeiros sítios de fixação atra-vés de no mínimo duas ligações covalentes não peptídicas, tipicamente epreferencialmente.levando a uma estrutura "semelhante a ponte" do domínioNtb ou fragmento de domínio Ntb. Sem ser limitado pela teoria proposta, a -credita-se que esta estrutura semelhante a ponte mimetize a configuraçãonatural do domínio Ntb nativo, cujo N-término é empregado em uma ligaçãodissulfeto com outra cisteína na alça ECL3, e cujo C-término é ancorado àmembrana celular.
Em uma modalidade preferencial, os no mínimo dois primeirossítios de fixação compreendem funcionalidade reativa idêntica. Preferenci-almente cada um dos no mínimo dois primeiros sítios de fixação compreen-de um grupo amino. Mais preferencialmente cada um dos no mínimo doisprimeiros sítios de fixação compreende um grupo amino de um resíduo Iisina.
Em uma modalidade preferencial, a composição adicionalmentecompreende no mínimo duas moléculas hetero-bifuncionais, em que as refe-ridas no mínimo duas moléculas hetero-bifuncionais ligam os referidos nomínimo dois primeiros sítios de fixação e os referidos no mínimo dois segun-dos sítios de fixação, em que preferencialmente cada uma das no mínimoduas moléculas hetero-bifuncionais é SMPH.
Em uma modalidade preferencial, a partícula semelhante a vírusde bacteriófago de RNA é Οβ, AP205, fr ou GA. Em uma modalidade prefe-rencial, a partícula semelhante a vírus de bacteriófago de RNA é Οβ No mí-nimo quatro resíduos Iisina são expostos sobre a superfície da VLP de prote-ína de revestimento de Οβ. Esta densidade da Iisina assegura que um dosno mínimo dois segundos sítios de fixação rapidamente encontra e encadeiao primeiro sítio de fixação depois do outro sítio de fixação dos no mínimodois segundos sítios de fixação encadeou um primeiro sítio de fixação por nomínimo uma ligação covalente não peptídica. Similarmente VLPs de outrosbacteriófagos de RNA também são adequados para esta invenção.
Em um aspecto, esta invenção proporciona um método paraproduzir uma composição compreendendo as etapas de: (a) proporcionandouma partícula semelhante a vírus de um bacteriófago de RNA com no míni-mo dois primeiros sítios de fixação; em que a referida partícula semelhante avírus (VLP) de um bacteriófago de RNA compreende ou consiste em proteí-nas de revestimento, mutantes ou fragmentos das mesmas, do referido bac-teriófago de RNA; em que preferencialmente cada um dos referidos no mí-nimo dois primeiros sítios de fixação compreende ou é um grupo amino, pre-ferencialmente um grupo amino de um resíduo lisina; (b) proporcionando nomínimo um domínio extracelular CCR5 PNt com no mínimo dois segundossítios de fixação; em que o referido domínio extracelular CCR5 PNt compre-ende, consiste essencialmente em ou consiste em: (i) um domínio Nta ou umfragmento de domínio Nta, e (ii) um domínio Ntb compreendendo aminoáci-dos 23 a 27 de SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:56) ou fragmento de domínio Ntbcompreendendo aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27, em que o C-término do referido domínio Nta ou o referido fragmento de domínio Nta éfundido, preferencialmente diretamente, ao referido N-término do referidodomínio Ntb ou o referido fragmento de domínio Ntb1 e em que o primeiro ouo segundo dos referidos no mínimo dois segundos sítios de fixação compre-ende ou é um grupo sulfidrila, preferencialmente um grupo sulfidrila de umresíduo cisteína, e em que o primeiro dos referidos no mínimo dois segundossítios de fixação está localizado a montante do N-término dos referidos ami-noácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27; e em que o segundo dos referidos nomínimo dois segundos sítios de fixação está localizado a jusante do términode C dos referidos aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27, preferencialmen-te a jusante do término de C do referido domínio extracelular CCR5 PNt; (c)encadeando a VLP do referido bacteriófago de RNA e o domínio extracelularCCR5 PNt por no mínimo uma ligação covalente não peptídica.
Em uma modalidade preferencial, a proporção molecular do do-mínio extracelular CCR5 PNt para a proteína de revestimento da VLP de umbacteriófago de RNA é de 8:1 a 0.5:1, preferencialmente de 4:1, a 1:1, maispreferencialmente de 4:1 a 2:1, ainda mais preferencialmente 2:1.
Em uma modalidade preferencial, a etapa (a) adicionalmentecompreende adicionar à referida partícula semelhante a vírus (VLP) do bac-teriófago de RNA um Iigador heterobiofunctional, em que preferencialmenteo referido Iigador heterobiofunctional é SMPH. Preferencialmente a propor-ção molecular de SMPH para proteína de revestimento da VLP do bacterió-fago de RNA é de 40:1 a 2:1, preferencialmente de 20:1 a 4:1, mais prefe-rencialmente 10:1.
Em uma modalidade preferencial, o encadeamento da referidaVLP do bacteriófago de RNA e o referido sítio do domínio extracelular CCR5PNt é realizado em uma solução com força iônica de não mais de 150 mM,preferencialmente não mais de 100 mM, preferencialmente não mais de 75,mais preferencialmente não mais de 50 mM.
Em uma modalidade preferencial, a partícula semelhante a vírusdo bacteriófago de RNA é Οβ, AP205, fr ou GA, preferencialmente Qj3
Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular CCR5PNt compreende, consiste essencialmente em, ou preferencialmente consis-te na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:27. Em uma modalidadepreferencial, o domínio extracelular CCR5 PNt compreende, consiste essen-cialmente em, ou preferencialmente consiste na seqüência de aminoácidosderivada de SEQ ID NO:27, na qual três, preferencialmente dois, preferenci-almente um aminoácido de SEQ ID NO:27 foi modificado por inserção, elimi-nação e/ou substituição, preferencialmente substituição conservativa com acondição de que os anticorpos provocados pelas composições da invençãocompreendendo a referida seqüência de aminoácidos derivada de SEQ IDNO:27 aglutinam especificamente a CCR5 humano.
Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular CCR5PNt com no mínimo dois segundos sítios de fixação compreende, consisteessencialmente em, ou preferencialmente consiste na seqüência de aminoá-cidos de SEQ ID NO:44.
Em um aspecto, a invenção proporciona uma composição obte-nível ou preferencialmente obtida de acordo com o método da invenção.
Em uma modalidade preferencial, o antígeno da invenção é umdomínio extracelular CXCR4, um fragmento de domínio extracelular CXCR4 ouqualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, o domí-nio extracelular CXCR4 é o domínio extracelular de N-terminal CXCR4. Emuma modalidade preferencial, o domínio extracelular de N-terminal CXCR4 éacoplado através de seu C-término à partícula semelhante a vírus.
Em uma modalidade preferencial, o domínio extracelular de N-ter-minal CXCR4 compreende, consiste essencialmente em ou consiste emSEQ ID N0:30 ou uma seqüência de aminoácidos derivada de SEQ IDN0:30, na qual três, preferencialmente dois, preferencialmente um aminoá-cido de SEQ ID N0:30 foi modificado por inserção, eliminação e/ou substitu-ição, preferencialmente substituição conservativa com a condição de queanticorpos provocados pelas composições da invenção compreendendo areferida seqüência de aminoácidos derivada de SEQ ID N0:30 aglutinamespecificamente a CXCR4 humano. Em uma modalidade preferencial adi-cional, o domínio extracelular de N-terminal CXCR4 compreendendo, consis-tindo essencialmente de ou consistindo em SEQ ID N0:30 é acoplado atra-vés de seu C-término à partícula semelhante a vírus.
Em uma modalidade preferencial, o fragmento de domínio extra-celular CXCR4 é fragmento de domínio extracelular CXCR4 ECL2. Em umamodalidade preferencial adicional, o fragmento de domínio extracelular CX-CR4 ECL2 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQID NO:29 ou uma seqüência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:29, naqual dois, preferencialmente um aminoácido de SEQ ID NO:29 foi modifica-do por inserção, eliminação e/ou substituição, preferencialmente substituiçãoconservativa, com a condição de que anticorpos provocados pelas composi-ções da invenção compreendendo a referida seqüência de aminoácidos de-rivada de SEQ ID NO:29 aglutinam especificamente a CXCR4 humana. Emuma modalidade preferencial, o fragmento de domínio extracelular CXCR4ECL2 compreende, consiste essencialmente em ou consiste essencialmenteem, ou consiste em revestimento, isto é, SEQ ID NO:29 não ciclizada ou areferida seqüência de aminoácidos derivada de SEQ ID NO:29. Em umamodalidade preferencial adicional, o referido revestimento SEQ ID NO:29 éacoplado à partícula semelhante a vírus, ou através de seu N-término ouC-término, preferencialmente através de seu C-término.
Em uma modalidade preferencial, o fragmento de domínio extra-celular CXCR4 compreende ou consiste em fragmento de domínio extracelu-lar CXCR4 ECL2 ciclizado. Em uma modalidade preferencial adicional, ofragmento de domínio extracelular CXCR4 compreende, consiste essencial-mente em ou alternativamente consiste em SEQ ID NO:29 ciclizada ou umaseqüência de aminoácidos ciclizada derivada de SEQ ID NO:29. SEQ IDNO:29 ciclizada, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, serefere a uma seqüência de aminoácidos compreendendo ou consistindo emSEQ ID N2 29, em que o primeiro resíduo aminoácido e o último resíduo a-minoácido da referida seqüência de aminoácidos interagem um com o outropor, no mínimo, uma aglutinação química, preferencialmente por, no mínimo,uma ligação covalente. Preferencialmente o primeiro resíduo aminoácido e oúltimo resíduo aminoácido da referida seqüência de aminoácidos interagemum com o outro por todas as ligações covalentes. Preferencialmente o pri-meiro resíduo aminoácido e o último resíduo aminoácido da referida seqüên-cia de aminoácidos interagem um com o outro por uma aglutinação peptídi-ca, levando a um peptídeo circular. Em uma modalidade preferencial adicio-nal, o fragmento de domínio extracelular CXCR4 ECL2 compreende ou con-siste em SEQ ID NO:49 ciclizada ou SEQ ID NO:53, em que o peptídeo éciclizado pelo resíduo C e G em ambas as extremidades.
Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno é gas-trina da invenção. Em uma modalidade, no mínimo um antígeno é gastrinaG17. Em uma modalidade preferencial, a gastrina G17 compreende, consis-te essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO:34. Em uma modalidadepreferencial adicional, a gastrina G17 compreende, consiste essencialmenteem, ou consiste em SEQ ID NO:36. Em uma modalidade preferencial adicio-nal alternativa, a gastrina G17 compreende, consiste essencialmente em oupreferencialmente consiste em SEQ ID NO:34 com o último aminoácido Fsendo amidado.
Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno é pro-gastrina G34. Em uma modalidade preferencial, a progastrina G34 compre-ende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO:35. Em umamodalidade preferencial adicional, a progastrina G34 compreende ou consis-te em SEQ ID NO:37. Em uma modalidade preferencial adicional alternativa,a progastrina G34 compreende, consiste essencialmente em ou consiste emSEQ ID NO:35 com o último aminoácido F sendo amidado.
Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno com-preende, consiste essencialmente em ou consiste em fragmento de gastrinaG17 1-9 (SEQ ID NO:33), preferencialmente com uma seqüência encadea-dora fundida a seu C-término, mais preferencialmente com uma seqüênciaencadeadora SSPPPPC fundida ao C-término (SEQ ID NO:39).
Em uma modalidade muito preferencial, a gastrina da invençãofundida com um Iigador compreende, consiste essencialmente em ou consis-te em SEQ ID NO:38.
Em uma modalidade preferencial, a gastrina da invenção com nomínimo um segundo sítio de fixação compreende, consiste essencialmenteem, ou alternativamente consiste em uma seqüência de aminoácidos sele-cionada entre o grupo consistindo em: SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; SEQID N0:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42; e SEQ ID NO:43.
Deve-se observar que E na posição uma da seqüência EGP-WLEEEE como parte da seqüência de gastrina deve ser E, pyro E ou Q.Quando aminoácido adicional é fundido ao N-término de EGPWLEEEE, E naposição um da seqüência EGPWLEEEE pode ser E ou preferencialmente Q.
Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno dainvenção é um fragmento de CETP. Em uma modalidade preferencial adi-cional, o fragmento de CETP compreende, consiste essencialmente em, ouconsiste em um polipeptídeo tendo seqüência de aminoácidos como SEQ IDNO:32 ou um polipeptídeo derivado de SEQ ID NO:32, no qual dois, prefe-rencialmente um aminoácido de SEQ ID NO:32 foi modificado por inserção,eliminação e/ou substituição, preferencialmente substituição conservativacom a condição de que anticorpos provocados pelas composições da inven-ção compreendendo o referido polipeptídeo derivado de SEQ ID NO:32 aglu-tinam especificamente a CETP, preferencialmente CETP humano.
Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno é umaproteína C5a. Em uma modalidade preferencial, a proteína C5a compreen-de, consiste essencialmente em ou consiste em um polipeptídeo tendo se-qüência de aminoácidos como SEQ ID NO:45 ou um polipeptídeo derivadode SEQ ID NO:45, no qual cinco, quatro, preferencialmente três, preferenci-almente dois, preferencialmente um aminoácido de SEQ ID NO:45 foi modi-ficado por inserção, eliminação e/ou substituição, preferencialmente substitu-ição conservativa com a condição de que anticorpos provocados pelas com-posições da invenção compreendendo o referido polipeptídeo derivado deSEQ ID NO:45 aglutinam especificamente a C5a, preferencialmente C5ahumano. Em uma modalidade preferencial, no mínimo um antígeno é umfragmento C5a. Em uma modalidade preferencial adicional, o fragmento C5acompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeotendo seqüência de aminoácidos como SEQ ID NO:46 ou um polipeptídeoderivado de SEQ ID NO:46, no qual dois, preferencialmente um aminoácidode SEQ ID NO:46 foi modificado por inserção, eliminação e/ou substituição,preferencialmente substituição conservativa com a condição de que anticor-pos provocados pelas composições da invenção compreendendo o referidopolipeptídeo derivado de SEQ ID NO:46 aglutinam especificamente a C5a,preferencialmente C5a humano.
Em uma modalidade preferencial, o antígeno da invenção é umaBradicinina da invenção. Bradicinina (BK, KRPPGFSPFR, SEQ ID N0:50) éum importante peptídeo vasodilatador e tem um papel importante na regula-ção local da pressão sangüínea, do fluxo sangüíneo e da permeabilidadevascular (Margolius H.S, et ai, Hypertension, 1995). Bradicinina exerce seusefeitos através do B2-receptor.des-Arg9-BK (KRPPGFSPF, SEQ ID N0:51) tem funções sobre-postas e distintas da Bradicinina. Evidência sugere que a des-Arg9-BK é ra-pidamente produzida depois de lesão tecxidual e modula a maior parte doseventos observados durante processos inflamatórios inclusive vasodilatata-ção, aumento da permeabilidade vascular, extravasamento plasmático, mi-gração celular, dor e hiperalgesia (Calixto J.B. etal., Pain 2000). A des-Arg9-BK exerce seus efeitos através do B1-receptor
Foi reportado que a BK e a Des-Arg9-BK têm um pepel em vá-rias doenças inflamatórias (Cruwys S.C. et ai, Br J Pharmacol, 1994; Cas-sim B. et ai., Immunopharmacology 1997). Evidência experimental sugereque tanto a Bradicinina quanto a des-Arg9-BK têm um papel durante o de-senvolvimento da asma (Christiansen S.C. etal., Am. Rev. Dis. 1992;BarnesP.J. etal., Thorax, 1992)] FullerR.W.etai, Am. Rev. Respir. Dis., 1987).
Em uma modalidade preferencial adicional, a Bradicinina da in-venção adicionalmente compreende um Iigador fundido ao N-término daBradicinina da invenção, preferencialmente a seqüência encadeadora é umacisteína. Em uma modalidade preferencial adicional, a Bradicinina da inven-ção adicionalmente compreende um Iigador fundido ao C-terminal da Bradi-cinina da invenção, preferencialmente a seqüência encadeadora é uma cis-teína. Em uma modalidade preferencial adicional, a Bradicinina da invençãocompreende ou consiste em SEQ ID N0:50.
Em uma modalidade preferencial, o antígeno da invenção é umades-Arg-Bradicinina da invenção. Em uma modalidade preferencial adicional,a composição da invenção adicionalmente compreende um Iigador fundidoao N-término da des-Arg-Bradicinina da invenção, preferencialmente a se-qüência encadeadora é uma cisteína. Em uma modalidade preferencial adi-cional, a composição da invenção adicionalmente compreende um Iigadorfundido ao C-terminal da des-Arg-Bradicinina da invenção, preferencialmentea seqüência encadeadora é uma cisteína. Em uma modalidade preferencialadicional, a des-Arg-Bradicinina da invenção compreende ou consiste emSEQ ID NO:51.
Em ainda outra modalidade preferencial, no mínimo um antígenocompreende ou alternativamente consiste em no mínimo um sítio antigênicodo antígeno da invenção.
É sabido que a posse de imunogenicidade não requer geralmen-te toda a extensão de uma proteína e geralmente uma proteína contém maisde um epitopo antigênico, isto é, sítio antigênico. Um fragmento ou um pep-tídeo curto pode ser suficiente para conter no mínimo um sítio antigênico quepode ser ligado imunoespecificamente por um anticorpo ou por um receptorde células T dentro do contexto de uma molécula MHC. Sítio ou sítios anti-gênicos podem ser determinados por uma série de técnicas conhecidas demodo geral das pessoas versadas na técnica. Métodos para determinar umou mais sítios antigênicos de uma proteína é de conhecimento de uma pes-soa versada na técnica. A publicação de patente internacional N2W02005/108425 elaborou alguns destes métodos do parágrafo [0099] ao[0103] e estas descrições específicas são incorporadas aqui, a este requeri-mento de patente, por meio de referência. Deve-se observar que estes mé-todos são aplicáveis de modo geral á outros antígenos polipeptídicos, e por-tanto não restritos a IL-23 p19 conforme descrito na publicação de patenteinternacional N2 W02005/108425.
Em uma modalidade preferencial da invenção, a VLP com nomínimo um primeiro sítio de fixação é encadeada ao antígeno da invençãocom no mínimo um segundo sítio de fixação através de no mínimo uma aglu-tinação peptídica. Gene codificando antígeno da invenção, preferencialmen-te antígeno da invenção não mais longo do que 75 aminoácidos, preferenci-almente não mais longo do que 50 aminoácidos, ainda mais preferencial-mente menos de 30 aminoácidos, é ligado in-frame, quer internamente oupreferencialmente ao N- ou ao C-término ao gene codificando a proteína derevestimento da VLP. Fusão também pode ser realizada inserindo seqüên-cias do antígeno da invenção em um mutante de uma proteína de revesti-mento onde parte da proteína de revestimento seqüência foi eliminada, quesão posteriormente referidas como mutantes de truncação. Mutantes detruncação podem ter N- ou C-terminal, ou eliminações internas de parte daseqüência da proteína de revestimento. Por exemplo, para o HBcAg especí-fico VLP1 os aminoácidos 79-80 são substituídos com um epitopo estranho.A proteína de fusão preferencialmente reterá a capacidade de reunir em umaVLP na expressão que pode ser examinada por eletromicroscopia.
Resíduos aminoácidos flanqueantes podem ser adicionados pa-ra aumentar a distância entre a proteína de revestimento e epitopo estranho.Resíduos glicina e serina são particularmente aminoácidos favorecidos aserem usados nas seqüências flanqueantes. Uma seqüência flanqueantesemelhante confere flexibilidade adicional, a qual pode diminuir o efeito de-sestabilizante potencial de fundir uma seqüência estranha na seqüência deuma subunidade da VLP e diminuir a interferência com o conjunto pela pre-sença do epitopo estranho.
Em uma modalidade preferencial, a VLP modificada é uma VLPem mosaico, em que preferencialmente a referida VLP em mosaico compre-ende ou alternativamente consiste em no mínimo uma proteína de fusão eno mínimo uma proteína de revestimento viral.
Em outras modalidades, no mínimo um antígeno da invenção,preferencialmente o antígeno da invenção consistindo em menos de 50 ami-noácidos pode ser fundido a uma série de outra proteína de revestimentoviral, a título de exemplos, ao C-término de uma forma truncada da proteínaA1 de Qp (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996)), ou sendoinserida entre a posição 72 e 73 da extensão CP. Por exemplo, Kozlovska etal., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) descrevem fusões de proteína ΟβΑ1 ondeo epitopo é fundido no C-término da extensão QpCP truncada na posição 19.Como outro exemplo, o antígeno da invenção pode ser inserido entre o ami-noácido 2 e 3 do fr CP (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). Alémdisso, o antígeno da invenção pode ser fundido à β-hairpina protuberante deN-terminal da proteína de revestimento do fago de RNA MS-2 (publicação depatente internacional N2 WO 92/13081). Alternativamente, o antígeno da in-venção pode ser fundido a uma proteína do capsídeo de papiloma vírus, pre-ferencialmente à proteína do capsídeo maior L1 de papiloma vírus bovinotipo 1 (BPV-1) (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 96:2373-2378 (1999), publicação de patente internacional N2 WO 00/23955). A subs-tituição dos aminoácidos 130-136 de BPV-1 L1 eom um antígeno da inven-ção também é uma modalidade da invenção. Modalidades adicionais de fu-são do antígeno da invenção a proteína de revestimento, mutantes ou fra-gementos da mesma, a uma proteína de revestimento de um vírus foramdescritas na publicação de patente internacional N2 WO 2004/009124 napágina 62 linha 20 na página 68 linha 17 e são incorporadas aqui, a esterequerimento de patente, por meio de referência.
Em outra modalidade preferencial, no mínimo um antígeno dainvenção, preferencialmente o antígeno da invenção composto de menos de70 aminoácidos, preferencialmente com menos de 50 aminoácidos é fundidoa ou o N- ou o C-término de uma proteína de revestimento, mutantes oufragmentos das mesmas, do fago de RNA AP205. Em uma modalidade pre-ferencial adicional, a proteína de fusão adicionalmente compreende um es-paçador, em que o referido espaçador é fundido à proteína de revestimento,fragmentos ou mutantes da mesma, de AP205 e o antígeno da invenção.
Preferencialmente o referido espaçador composto de menos de 30, prefe-rencialmente menos de 20, ainda mais preferencialmente menos de 10, ain-da mais preferencialmente menos de 5 aminoácidos.
Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a com-posição compreende ou alternativamente consiste essencialmente em umapartícula semelhante a vírus com no mínimo um primeiro sítio de fixação li-gado a no mínimo um antígeno da invenção com no mínimo um segundosítio de fixação através de no mínimo uma ligação covalente, preferencial-mente a ligação covalente é uma aglutinação não peptídica. Preferencial-mente o primeiro sítio de fixação não compreende ou não é grupo sulfidrilade cisteína. Adicionalmente e preferencialmente o primeiro sítio de fixaçãonão compreende ou não é grupo sulfidrila. Em uma modalidade preferencialda presente invenção, o primeiro sítio de fixação compreende, ou preferen-cialmente é, um grupo amino, preferencialmente o grupo amino de um resí-duo lisina. Em outra modalidade preferencial da presente invenção, o se-gundo sítio de fixação compreende, ou preferencialmente é, um grupo sulfi-drila, preferencialmente um grupo sulfidrila de uma cisteína.Em uma modalidade muito preferencial da invenção, no mínimoum primeiro sítio de fixação compreende, ou preferencialmente é, um grupoamino, preferencialmente um grupo amino de um resíduo Iisina e no mínimoum segundo sítio de fixação compreende, ou preferencialmente é, um gruposulfidrila, preferencialmente um grupo sulfidrila de um resíduo cisteína.
Em uma modalidade preferencial da invenção, o antígeno dainvenção é ligado à VLP por meio de reticulação química, tipicamente e pre-ferencialmente usando um reticulador hetero-bifuncional. Em modalidadespreferenciais, o reticulador hetero-bifuncional contém um grupo funcional oqual pode reagir com os primeiros sítios de fixação preferenciais, preferenci-almente com o grupo amino, mais preferencialmente com os grupos aminode um ou mais resíduos Iisina da VLP, e um grupo funcional adicional o qualpode reagir com o segundo sítio de fixação preferencial, isto é, um gruposulfidrila, preferencialmente de um ou mais resíduos cisteína inerentes de,ou adicionados artificialmente ao antígeno da invenção, e opcionalmentetambém tornados disponíveis para reação por redução. Vários reticuladoreshetero-bifuncionais são conhecidos na técnica. Estes incluem os reticulado-res preferenciais SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sul-fo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros reticuladores dispo-níveis, por exemplo na Pierce Chemical Company, e tendo um grupo funcio-nal reativo contra grupos amino e um grupo funcional reativo contra grupossulfidrila. Os reticuladores mencionados acima todos levam à formação deuma aglutinação amida depois de reação com o grupo amino e uma agluti-nação tioéter com os grupos sulfidrila. Outra classe de reticuladores ade-quados na prática da invenção é caracterizada pela introdução de uma liga-ção dissulfeto entre o antígeno da invenção e a VLP no acoplamento. Reti-culadores preferenciais pertencentes a esta classe incluem, por exemplo,SPDP e SuIfo-LC-SPDP (Pierce).
Em uma modalidade preferencial, a composição da invençãoadicionalmente compreende um ligador. A produção de um segundo sítio defixação sobre o antígeno da invenção é obtida pela associação de um liga-dor, preferencialmente contendo no mínimo um aminoácido adequado comosegundo sítio de fixação de acordo com as descrições desta invenção. Por-tanto, em uma modalidade preferencial da presente invenção, um Iigador éassociado ao antígeno da invenção por meio de no mínimo uma ligação co-valente, preferencialmente, por no mínimo uma, tipicamente uma aglutinaçãopeptídica. Preferencialmente, o Iigador compreende, ou alternativamenteconsiste em, o segundo sítio de fixação. Em uma modalidade preferencialadicional, o Iigador compreende um grupo sulfidrila, preferencialmente de umresíduo cisteína. Em outra modalidade preferencial, o aminoácido Iigador éum resíduo cisteína.
A seleção de Iigadores foi descrita na publicação do requerimen-to de patente internacional N2 W02005/108425A1, páginas 32-33, a qual éincorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
A aglutinação do antígeno da invenção à VLP usando um reticu-Iador hetero-bifuncional de acordo com os métodos preferenciais descritosacima, possibilita o acoplamento do antígeno da invenção à VLP em um mo-do orientado. Outros métodos para ligar o antígeno da invenção à VLP inclu-em métodos em que o antígeno da invenção é reticulado à VLP, usando acarbodiimida EDC, e NHS. O antígeno da invenção também pode ser primei-ro tiolado através de reação, por exemplo com SATA, SATP ou iminotiolano.
O antígeno da invenção, depois de desproteção caso necessário, pode serentão acoplado à VLP como se segue. Depois de separação do excesso dereagente de tiolação, o antígeno da invenção é reagido com a VLP, previa-mente ativada com um reticulador hetero-bifuncional compreendendo umaporção reativa com cisteína, e portanto apresentando no mínimo um ou vá-rios grupos funcionais reativos com resíduos cisteína, aos quais o antígenotiolado da invenção pode reagir, tal como descrito acima. Opcionalmente,pequenas quantidades de um agente redutor são incluídas na mistura dareação. Em métodos adicionais, o antígeno da invenção é fixada à VLP, u-sando um reticulador homo-bifuncional tal como glutaraldeído, DSG,BM[PE0]4, BS3, (Pierce) ou outros reticuladores homo-bifuncionais conhe-cidos com grupos funcionais reativos com grupos amina ou grupos carboxilada VLP.Em outras modalidades da presente invenção, a composiçãocompreende ou alternativamente consiste essencialmente em uma partículasemelhante a vírus encadeada ao antígeno da invenção através de intera-ções químicas, em que no mínimo uma destas interações não é uma ligaçãocovalente. As interações referidas incluem mas não Iimitadsa a interaçãoantígeno-anticorpo, interação receptor-ligante. Aglutinação da VLP ao antí-geno da invenção pode ser realziada por biotinilação da VLP e expressandoo antígeno da invenção como uma proteína de fusão de estreptavidina.
Em uma modalidade preferencial da invenção, a VLP da inven-ção é produzida de modo recombinante por um hospedeiro e em que a refe-rida VLP é essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmenteácidos nucléicos do hospedeiro. Em uma modalidade preferencial adicional,a composição adicionalmente compreende no mínimo uma macromoléculapolianiônica ligada a, preferencialmente embalada ou encerrada, na VLP.Em uma modalidade ainda adicionalmente preferencial, a macromoléculapolianiônica é ácido poliglutâmico e/ou ácido poliaspártico.
Essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmenteácidos nucléicos do hospedeiro: o termo "essencialmente livre de RNA dohospedeiro, preferencialmente ácidos nucléicos do hospedeiro" conformeusado aqui, neste requerimento de patente, se refere à quantidade de RNAdo hospedeiro, preferencialmente ácidos nucléicos do hospedeiro, compre-endidos pela VLP, cuja quantidade tipicamente e preferencialmente é menosde 30 μg, preferencialmente menos de 20 μg, mais preferencialmente menosde 10 μg, ainda mais preferencialmente menos de 8 μg, ainda mais prefe-rencialmente menos de 6 μg, ainda mais preferencialmente menos de 4 μg,ainda mais preferencialmente menos de 2 μg, por mg da VLP. Hospedeiro,conforme usado dentro do contexto mencionado acima, se refere ao hospe-deiro no qual a VLP é produzida de modo recombinante. Métodos conven-cionais para determinar a quantidade de RNA, preferencialmente ácidos nu-cléicos, são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. O métodotípico e preferencial para determinar a quantidade de RNA, preferencialmen-te ácidos nucléicos, de acordo com a presente invenção é descrito no E-xemplo 17 da publicação do requerimento de patente Internacional N-W02006/037787A2 arquivado em 5 de outubro de 2005 pela mesma reque-rente. Condições idênticas, similares ou análogas são usadas, tipicamente epreferencialmente, para a determinação da quantidade de RNA, preferenci-almente ácidos nucléicos, para composições da invenção compreendendoVLPs diferentes de Οβ. As modificações das condições eventualmente ne-cessárias estão dentro do conhecimento de uma pessoa versada na técnica.
O valor numérico das quantidades determinadas devem ser entendidos tipi-camente e preferencialmente como compreendendo valores tendo um des-vio de ± 10%, preferencialmente tendo um desvio de ± 5%, do valor numéri-co indicado.
Macromolécula polianiônica: o termo "macromolécula polianiôni-ca", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a umamolécula de elevada massa molecular relativa a qual compreende gruposrepetitivos de carga negativa, cuja estrutura essencialmente compreende amúltipla repetição de unidades derivadas, realmente ou conceitualmente, demoléculas de baixa massa molecular relativa. Uma macromolécula polianiô-nica deve ter um peso molecular de no mínimo 2000 Dálton, mais preferen-cialmente de no mínimo 3000 Dálton e ainda mais preferencialmente de nomínimo 5000 Dálton. O termo "macromolécula polianiônica" conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, tipicamente e preferencialmente se re-fere a uma molécula que não é capaz de ativar receptores TLK (toll-like).
Portanto, o termo "macromolécula polianiônica" tipicamente e preferencial-mente exclui Iigantes de receptores Toll-like, e ainda mais preferencialmenteadicionalmente exclui substâncias imunoestimulatórias tais como Iigantes dereceptores Toll-like, ácidos nucléicos imunoestimulatórios, e lipopolissacarí-deos (LPS). Mais preferencialmente o termo "macromolécula polianiônica"conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma molé-cula que não é capaz de induzir a produção de citocinas. Ainda mais prefe-rencialmente o termo "macromolécula polianiônica" exclui substâncias imu-noestimulatórias. O termo "substância imunoestimulatória", conforme usadoaqui, neste requerimento de patente, se refere a uma molécula que é capazde induzir e/ou reforçar reação imune especificamente contra o antígenocompreendido na presente invenção.
RNA do hospedeiro, preferencialmente ácidos nucléicos do hos-pedeiro: o termo "RNA do hospedeiro, preferencialmente ácidos nucléicos dohospedeiro" ou o termo "RNA do hospedeiro, preferencialmente ácidos nu-cléicos do hospedeiro, com estrutura secundária", conforme usado aqui, nes-te requerimento de patente, se refere ao RNA, preferencialmente aos ácidosnucléicos, que são originariamente sintetizados pelo hospedeiro. O RNA,preferencialmente ácidos nucléicos, no entanto, podem sofrer alteraçõesquímicas e/ou físicas durante o procedimento de reduzir ou eliminar a quan-tidade de RNA, preferencialmente ácidos nucléicos, tipicamente e preferen-cialmente por meio dos métodos da invenção, por exemplo, o tamanho doRNA, preferencialmente ácidos nucléicos, pode ser encurtado ou a estruturasecundária do mesmo pode ser alterada. No entanto, tal KNA resultante ouácidos nucléicos são ainda considerados como RNA do hospedeiro, ou áci-dos nucléicos do hospedeiro.
Métodos para determinar a quantidade de RNA e reduzir a quan-tidade de RNA compreendida pela VLP foram descritos na publicação dorequerimento de patente internacional N2 W02006/037787A2 arquivada pelamesma requerente em 5 de outubro de 2005 e portanto todo o requerimento,em particular os exemplos 4, 5 e 17, são incorporados aqui, a este requeri-mento de patente, por meio de referência. A redução ou eliminação da quan-tidade de RNA do hospedeiro, preferencialmente ácido nucléico hospedeiro,minimiza ou reduz reações de células T indesejadas, tais como reação decélulas T inflamatórias e reação de células T citotóxicas, e outros efeitos co-laterais indesejados, tais como febre, ao mesmo tempo que mantendo fortereação de anticorpos especificamente contra o antígeno.
Em um aspecto, a invenção proporciona uma composição devacina compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo nacomposição da invenção. Em uma modalidade preferencial, o antígeno dainvenção ligado à VLP na composição de vacina pode ser de origem animal,preferencialmente mamífero ou ser humano. Em modalidades preferenciais,o antígeno da invenção é de origem humana, bovina, de cão, gato, camun-songo, rato, porco ou cavalo.
Em uma modalidade preferencial, a composição de vacina adi-cionalmente compreende no mínimo um adjuvante. A administração do nomínimo um adjuvante pode ocorrer antes de, contemporaneamente a ou de-pois da administração da composição da invenção. O termo "adjuvante" con-forme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a estimuladoresnão específicos da reação imune ou substâncias que possibilitam a produ-ção de um depósito no hospedeiro o qual quando combinado com a vacina ecomposição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção pode pro-porcionar uma reação imune ainda mais reforçada.
Em outra modalidade preferencial, a composição de vacina édestituída de adjuvante. Uma características vantajosa da presente invençãoé a alta imunogenicidade da composição, mesmo na ausência de adjuvan-tes. A ausência de um adjuvante, além disso, minimiza a ocorrência de rea-ções de células T inflamatórias indesejadas representando uma preocupa-ção de segurança na vacinação contra auto antígenos. Portanto, a adminis-tração da vacina da invenção a um paciente preferencialmente ocorrerá semadministrar no mínimo um adjuvante ao mesmo paciente antes de, contem-poraneamente ou depois da administração da vacina. VLP tem sido descritade modo geral como um adjuvante. No entanto, o termo "adjuvante", confor-me usado dentro do contexto deste requerimento, se refere a um adjuvantenão sendo a VLP usada para as composições da invenção, de preferênciaem adição à referida VLP.
A invenção descreve adicionalmente um método para imuniza-ção compreendendo administrar a vacina da presente invenção a um animalou um ser humano. O animal é preferencialmente um mamífero, tal comogato, carneiro, porco, cavalo, bovino, cão, rato, camundongo e particular-mente um ser humano. A vacina pode ser administrada a um animal ou umser humano por vários métodos conhecidos na técnica, mas normalmenteserão administrados por injeção, infusão, inalação, administração oral, ououtros métodos físicos adequados. Os conjugados alternativamente podemser administrados por via intramuscular, por via intravenosa, por via trans-mucosa, por via transdérmica, por via intranasal, por via intraperitoneal oupor via subcutânea. Componentes de conjugados para administração inclu-em soluções e suspensões estéreis aquosas (por exemplo, salina fisiológica)ou não aquosas. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol,polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite de oliva, e ésteres orgâni-cos injetáveis tais como etil oleato. Veículos ou pensos oclusivos podem serusados para aumentar a permeabilidade da pele e reforçar a absorção deantígeno.
Diz-se que as vacinas da invenção são são "farmacologicamenteaceitáveis" se sua administração pode ser tolerada por um indivíduo recep-tor. Além disso, as vacinas da invenção serão administradas em uma "quan-tidade terapeuticamente eficaz" (isto é, uma quantidade que produz um efei-to fisiológico desejado). A natureza ou tipo de reação imune não é um fatorIimitante desta descoberta. Sem a intenção de limitar a presente invençãopela seguinte explicação relativa ao mecanismo, a vacina da invenção podeinduzir anticorpos os quais aglutinam a CCR5, CXCR4, gastrina, progastrina,CETP, C5a, Bradicinina ou des-Arg-Bradicinina e portanto reduzir sua con-centração e/ou interferir com sua função fisiológica ou patológica.
Em um aspecto, a invenção proporciona uma composição far-macêutica compreendendo, consiste essencialmente em, ou consistindo nacomposição conforme ensinado na presente invenção e um veículo farma-ceuticamente aceitável. Quando a vacina da invenção é administrada a umindivíduo, pode estar em uma forma a qual contém sais, tampões, adjuvan-tes, ou outras substâncias as quais são desejáveis para aumentar a eficáciado conjugado. Exemplos de materiais adequados para uso na preparação decomposições farmacêuticas são proporcionados em numerosas fontes inclu-sive Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack PublishingCo., (1990)).
A invenção ensina um processo para produzir a composição dainvenção compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma VLP com nomínimo um primeiro sítio de fixação; (b) proporcionar um antígeno da inven-ção com no mínimo um segundo sítio de fixação, e (c) combinar a referidaVLP e o referido antígeno da invenção para produzir uma composição, emque o referido antígeno da invenção e a referida VLP são ligados através doprimeiro e do segundo sítios de fixação. Em uma modalidade preferencial, aprovisão do no mínimo um antígeno da invenção, com no mínimo um segun-do sítio de fixação é por meio de expressão, preferencialmente por meio deexpressão em um sistema bacteriano, preferencialmente em E. coli. Geral-mente etiqueta, tal como etiqueta His, etiqueta Myc é adicionada para facili-tar o processo de purificação. Em outra abordagem particularmente no mí-nimo um antígeno da invenção com não mais de 50 aminoácidos pode sersintetizado quimicamente.
Em uma modalidade preferencial adicional, a etapa de propor-cionar uma VLP com no mínimo um primeiro sítio de fixação compreendeetapas adicionais: (a) desagrupar a referida partícula semelhante a vírus pa-ra as referidas proteínas de revestimento, mutantes ou fragmentos dasmesmas, do referido bacteriófago de RNA; (b) purificar as referidas proteínasde revestimento, mutantes ou fragmentos das mesmas; (c) reagrupar as re-feridas proteínas de revestimento purificadas, mutantes ou fragmentos dasmesmas, do referido bacteriófago de RNA a uma partícula semelhante a ví-rus, em que a referida partícula semelhante a vírus é essencialmente livre deRNA do hospedeiro, preferencialmente ácidos nucléicos do hospedeiro. Emuma modalidade ainda adicionalmente preferencial, o reagrupamento dasreferidas proteínas de revestimento purificadas é realizado na presença deno mínimo uma macromolécula polianiônica.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar infecção por HIV, em que o méto-do compreende administrar a composição da invenção ou a composição devacina da invenção, respectivamente, a um ser humano, em que o antígenoda invenção é um CCR5 da invenção.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar infecção por HIV, em que o méto-do compreende administrar a composição da invenção ou a composição devacina da invenção, respectivamente, a um ser humano, em que o antígenoda invenção é um CXCR4 da invenção.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar aterosclerose, em que o métodocompreende administrar a composição da invenção ou a composição de va-cina da invenção, respectivamente, a um animal ou um ser humano, em queo antígeno da invenção é um CETP da invenção. Aterosclerose é uma doen-ça arterial que inclui mas não está limitada a doença cardíaca coronariana,doença da artéria coronária, doença da artéria carótida e doença cerebro-vascular.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar doenças inflamatórias primáriase/ou crônicas, em que o método compreende administrar a composição dainvenção ou a composição de vacina da invenção, respectivamente, a umanimal ou um ser humano, em que o antígeno da invenção é um C5a da in-venção, Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nas quais C5a mediaou contribui para a condição, incluem mas não estão limitadas a artrite reu-matóide, lúpus eritematoso sistêmico, asma e penfigóide bolhoso.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar doenças inflamatórias primáriase/ou crônicas, em que o método compreende administrar a composição dainvenção ou a composição de vacina da invenção, respectivamente, a umanimal ou um ser humano, em que o antígeno da invenção é uma Bradicini-na da invenção. Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nas quaisBradicinina media ou contribui para a condição, incluem mas não estão limi-tadas a artrite e asma.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar doenças inflamatórias primáriase/ou crônicas, em que o método compreende administrar a composição dainvenção ou a composição de vacina da invenção, respectivamente, a umanimal ou um ser humano, em que o antígeno da invenção é uma des-Arg-Bradicinina da invenção. Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nasquais des-Arg-Bradicinina media ou contribui para a condição, incluem masnão estão limitadas a artrite e asma.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona um método para prevenir e/ou tratar câncer, em particular cânceres dotrato gastrointestinal, em que o método compreende administrar a composi-ção da invenção ou a composição de vacina da invenção, respectivamente,a um animal ou um ser humano, em que o antígeno da invenção é uma gas-trina da invenção. Cânceres do trato gastrointestinal incluem mas não estãolimitadas a carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer retal e câncer pan-creático.
Em outro aspecto, a invenção proporciona a composição da in-venção para uso como um medicamento, em que o antígeno da invenção éCCR5 da invenção, CXCR4 da invenção, gastrina da invenção, CETP dainvenção, C5a da invenção, Bradicinina da invenção ou des-Arg-Bradicininada invenção, respectivamente.
Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona o usoda composição para a fabricação de um medicamento para prevenção e/outratamento de infecção por HIV em ser humano, em que a referida composi-ção compreende no mínimo um CCR5 da invenção.
Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona o usoda composição para a fabricação de um medicamento para prevenção e/outratamento de infecção por HIV em ser humano, em que a referida composi-ção compreende no mínimo um CXCR4 da invenção.
Em uma modalidade preferencial, a invenção proporciona o usoda composição para a fabricação de um medicamento para prevenção e/outratamento de aterosclerose, em que a referida composição compreende nomínimo um CETP da invenção. Aterosclerose é uma doença arterial que in-clui mas não está limitada a doença cardíaca coronariana, doença da artériacoronária, doença da artéria carótida e doença cerebrovascular.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona o uso da composição para a fabricação de um medicamento para pre-venção e/ou tratamento de doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas,em que a referida composição compreendendo no mínimo um C5a da inven-ção. Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nas quais C5a media oucontribui para a condição, incluem mas não estão limitadas a artrite reuma-tóide, lúpus eritematoso sistêmico, asma e penfigóide bolhoso.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona o uso da composição para a fabricação de um medicamento para pre-venção e/ou tratamento doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, emque a referida composição compreendendo no mínimo uma Bradicinina dainvenção. Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nas quais Bradici-nina media ou contribui para a condição, incluem mas não estão limitadas aartrite e asma.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona o uso da composição para a fabricação de um medicamento para pre-venção e/ou tratamento doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, emque a referida composição compreendendo no mínimo uma des-Arg-Bradicinina da invenção. Doenças inflamatórias primárias e/ou crônicas, nasquais des-Arg-Bradicinina media ou contribui para a condição, incluem masnão estão limitadas a artrite e asma.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção propor-ciona o uso da composição para a fabricação de um medicamento para pre-venção e/ou tratamento de câncer, em particular cânceres do trato gastroin-testinal, em que a referida composição compreendendo no mínimo uma gas-trina da invenção. Cânceres do trato gastrointestinal incluem mas não estãolimitados a carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer retal e câncer pan-creático.
Exemplos
Exemplo 1
Acoplamento de peptídeos CCR5 PNt ou ECL2A a Qí3 VLP
2 g/l Οβ VLPs (143 μΜ of Οβ proteína de revestimento) foramderivados com 1,43 mM de SMPH (Pierce) por 30 minutos a 25°C e em se-guida dialisados contra 20 mM de Hepes pH8, 150 mM de NaCI. 0,286 mMde peptídeo PNt-CC (SEQ ID NO:44, de 3 mM estoque em DMSO) com acisteína amidada de C-término e 1 g/l de partículas Οβ derivadas foram in-cubadas por duas horas a 25°C.
Como segundo método, 2 g/l de Οβ VLPs foram derivados com1,43 mM de SMPH por 30 minutos a 25°C e em seguida dialisados contra 20mM de fosfato pH 7.4. 0,143 mM de peptídeo PNt-CC (SEQ ID NO:44, de 50mM de estoque em DMSO) com a cisteína amidada de C-término e 1 g/l departículas Οβ derivadas foram incubadas por duas horas a 25°C. O produtodo acoplamento foi dialisado contra 20 mM de Fosfato pH 7.4.
2 g/l de Οβ foram derivados com 1,43 mM de SMPH por 30 mi-nutos a 25°C e em seguida dialisados contra 20 mM de Hepes pH 7.4, 150mM de NaCI. 0,286 mM de peptídeo PNt-SC (SEQ ID NO:54, de 5 mM deestoque em DMSO) com a cisteína amidada de C-término e 1 g/l de partícu-las Οβ derivadas foram incubadas por duas horas a 25°C. O produto do a-coplamento foi dialisado contra 20 mM de Hepes pH 7.4, 150 mM de NaCI.
2 g/l de Οβ foram derivados com 1,43 mM de SMPH for 30 minu-tos a 25°C e em seguida dialisados contra 20 mM de Hepes pH 7.4, 150 mMde NaCI. 0,143 mM de peptídeo PNt-CN (SEQ ID NO:55, de 5 mM de esto-que em DMSO) com a cisteína amidada de C-término e 1 g/l de partículasΟβ derivadas foram incubadas por duas horas a 25°C. O produto do aco-plamento foi dialisado contra 20 mM de Hepes pH 7.4, 150 mM de NaCI.
2 g/l de Οβ foram derivados com 1,43 mM de SMPH por 30 mi-nutos a 25°C e em seguida dialisados contra 20 mM de fosfato pH 7.5. 1 g/lde partículas Οβ derivadas foram dissolvidas em 20 % de acetonitrilo e0,286 mM de ECL2A cíclico (SEQ ID NO:26, de uma solução estoque a 5mM em DMSO) foram adicionados e incubados por duas horas a 25°C em20 mM de fosfato pH 7.5, 150 mM de NaCI. O produto do acoplamento foidialisado contra 20 mM de fosfato pH 7.5.
Exemplo 2
Imunização
Camundongos C57BL/6 foram inicializados com 50 pg de Οβ-PNtCC, Οβ-PNtCN, Οβ-PNtSC ou Οβ-ΕΟ_2Α (obtido do EXEMPLO 1) nodia 0, (por via subcutânea, em 0,2 ml de fosfato a 20 mM pH 7.5) e compa-rados com camundongos Balb/C inicializado com 50 yg de QB somente. De-pois de reforço com as mesmas vacinas no dia 14, os títulos de anticorpospeptídicos α-QB e a-CCR5 foram checados por ELISA no dia 14 e dia 21(Tabela 1).
Tabela 1
<table>table see original document page 68</column></row><table>
Alternativamente, coelhos New Zealand White foram inicializadocom 100 pg de Qp-PNtCC (obtido do EXEMPLO 1, segundo método) no dia0, (intradérmico em 10 pontos sobre o dorso do coelho) com partes iguais(v/v) de adjuvante completo de Freund. Os três reforços seguintes (100 pgde Οβ-PNtCC nos dias 14, 28, 56) foram realizados com partes iguais (v/v)de adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpos peptídicos a-QBe a-CCR5 foram checados por ELISA no dia 37 e dia 56, e foi visto que es-tavam sempre acima de 12Ό00.
Exemplo 3
Purificação de IgG policlonal de camundongo ou coelho
Soros reunidos de cinco camundongos imunizados Οβ-PNtCC,Οβ-PNtCN, Οβ-PNtSC ou Qp-ECL2A, respectivamente, (ou dois coelhos)(obtidos do EXEMPLO 4) foram centrifugados por cinco minutos a 14Ό00rpm. O sobrenadante foi carregado sobre uma coluna de 3,3 ml de proteínaG pré-lavada sepharose (Amersham). A coluna foi em seguida lavada comPBS e elutriada com 100 mM de glicina pH 2.8. Frações de 1 ml foram cole-tadas em tubos providos previamente com 112 μΙ de Tris a 1 M pH8. Fra-ções de pico absorvendo a 280 nm foram reunidas.
Exemplo 4
Purificação por afinidade de IgG policlonal de coelho
1 mg de Οβ ou Οβ-PNtCC foi imobilizado sobre uma coluna Se-pharose ativada com N-hidroxissuccinimida, de acordo com as instruçõesdos fabricantes (GE Healthcare Europe). 5 mg de IgG de coelho (do EXEM-PLO 3) foi carregado em PBS sobre uma coluna de afinidade Οβ com umíndice de fluxo de 0,5 ml/min. A fração de fluxo de escoamento foi coletadapara purificação PNtCC específica adicional. IgG Οβ específica foi elutriadada coluna de Οβ com 100 mM de glicina pH 2.6 e neutralizada com 120 mMde Tris pH 8. IgG PNtCC específica na fração de fluxo de escoamento foi5 posteriormente purificada sobre uma coluna de Οβ-PNtCC. IgG elutriadas eneutralizadas foram lavadas 4 vezes com PBS usando um dispositivo defiltro centrífugo (Amicon Ultra-4, 10Ό00 MWCO).
Exemplo 5
Tintura FACS de CCR5 celular com IqG policlonal de camundonqo
CEM.NKR-CCR5 é uma variante expressando CCR5 da linhagemcelular CEM.NKR1 uma linhagem humana que expressa naturalmente CD4(Trkola et al., J. Virol., 1999, pag. 8966). Células CEM.NKR-CCR5 foramcultivadas em meio de cultura RPMI 1640 (com 10% de FCS, glutamina, eantibióticos). Células foram peletizadas e ressuspendidas em salina tampo-nada com fosfato (PBS) contendo 1% de soro de feto de vitelo (FCS) e modoa obter 2,3x106 células/ml. Uma diluição a [1:250] de IgG humana (MiltenyiBiotec) foi adicionada como um agente de bloqueio e incubada por 20 minu-tos. As células foram lavadas uma vez em 1% de FCS/PBS e 0,1 ml (2,3x105células/ cavidade) foram laminadas e incubadas com anticorpos policlonaisCCR5 purificados do EXEMPLO 3 (60 mg/l; elutriados da coluna de proteínaG; diluições com 1% de FCS/PBS). Depois de 30 minutos a 4°C, as célulasforam lavadas uma vez em 1% de FCS/PBS e coradas por 20 minutos a 4°Ccom 15 mg/l de FITC-goat-a-mouse-lgG (Jackson) em 1% de FCS/PBS. De-pois de duas lavagens em 1% de FCS/PBS, 5Ό00 - 10Ό00 células coradasforam analisadas por citometria de fluxo. A média geométrica de cada tinturafoi determinada usando o programa de citometria de fluxo "cell quest".
A tabela 2 mostra que anticorpos PNtCC ou ECL2A específicosaglutinam especificamente a moléculas CCR5 expressadas sobre a superfí-cie celular de CEM.NKR, ao passo que os anticorpos PNtSC1 e PNtCN es-pecíficos bem como os anticorpos Οβ específicos não aglutinam a moléculasCCR5 expressadas sobre a superfície celular.Tabela 2
<table>table see original document page 70</column></row><table>
Exemplo 6
Ensaio de Neutralização de HIV
Em resumo, camadas leucocitárías obtidas de 3 doadores desangue saudáveis foram exauridas de células T CD8+ usando coquetel Ro-sette Sep (StemCeII Technologies lnc) e PBMC foram isolados por centrifu-gação Ficoll-Hypaque (Amersham-Pharmacia Biotech). As células foram a-justadas para 4x106/ml em meio de cultura (RPMI 1640, 10% de FCS, 100U/ml de IL-2, glutamina e antibióticos), divididas em três partes e estimula-das com ou 5 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA), 0,5 pg/ml de PHA ou 1 mg/lde MAb OKT3 anti-CD3. Depois de 72 horas, células de todas as três esti-mulações foram combinadas e usadas como fonte de células T CD4+ esti-muldas para experimentos de infecção e neutralização viral.
Ensaio de neutralização do HIV foi realizado essencialmenteconforme descrito previamente (Trkola et al., J. Virol., 1999, pag. 8966). Osvírus R5 (cepas CCR5 co-receptor específicas ), JR-FL e SF162, foram des-critas previamente (O1Brien et al., Nature 1990, 348, page 69; e Shioda et al.,Nature 1991, 349, pg. 167). Em resumo, as células foram incubadas comdiluições seriais de IgG de coelho policlonal purificada (25 μg/ml - 25 ng/ml,obtidas do EXEMPLO 5 ou do EXEMPLO 6) ou controle positivo Rantes ini-bidor de HIV em lâminas de cultura de 96 cavidades por 1 hora a 37°C.
Os inóculos de HIV-1 foram ajustados para conterem aproxima-damente 1.000 a 4.000 TCID5o/ml em meio de teste (TCID50: 50% de doseinfecciosa de cultura de tecido, Trkola et al., J. Virol., 1999, pg. 8966). Inócu-lo viral (100 TCID50; 50% de dose infecciosa de cultura de tecido) foi adicio-nado e as lâminas foram cultivadas por 7 dias. O volume total da infecção foide 200 μΙ. Em seguida, o meio do sobrenadante foi testado para a produçãode antígeno HIV-1 p24 usando um imunoensaio, conforme descrito previa-mente (Moore et al., 1990. Science 250, pag. 1139).
A tabela-3 mostra que os anticorpos purificados neutralizam demodo eficaz HIV até 70 % em uma baixa concentração de anticorpos (porexemplo, 0,56 μg/ml).
Tabela 3:
Concentrações de anticorpos inibidoras de HIV
<table>table see original document page 71</column></row><table>
Ensaio de neutralização de HIV com células CEM 5.25
Atividade de neutralização de amostras séricas de imunoglobuli-na de camundongo purificadas contra o isolado viral JR-FL foi avaliada sobrecélulas CEM 5.25.EGFP.Iuc.M7 (Nathaniel Landau) usando vírus repórterIuciferase pseudotyped de envelope JR-FL conforme descrito (Montefiori,D.C. (2004). Evaluating neutralizing antibodies against HIV, SIV and SHIV inIuciferase repórter gene assays. Current Protocols in Immunology, John Wi-Iey & Sons, 12.11.1-12.11.15. e Wei, X., et al, Nature 422:307-12). CélulasCEM 5.25,EGFP.Iuc.M7 foram incubadas com diluições seriais de anticorposde camundongo (obtidos do EXEMPLO 3) por 1 hora a 37°C. Inóculo viral(150 TCID50) e polibreno (concentração final 10 pg/ml) foi em seguida adi-cionado. O volume total da infecção foi 200 μΙ. A concentração de Ig cau-sando 50% de redução (NT5o) na produção de gene repórter Iuciferase de-pois de 72 horas foi determinada por análise de regressão.
A tabela 4 mostra que IgG total PNtCC específica inibiu infecçãopor HIV em baixa concentração, ao passo que IgG PNtCN específica nãoinibiu infecção por HIV em qualquer concentração medida.Tabela 4:
<table>table see original document page 72</column></row><table>
Exemplo 7
Digestão in-qel e análise LC/MS de QB-PNtCC
Amostras de Οβ-PNtCC, Qp-PNtSC e Οβ derivado (obtido do EXEM-PLO 1) foram carregadas sobre um gel SDS-PAGE redutor. Bandas de gelcorrespondentes ao monômero Οβ por peptídeo e dímero Οβ por peptídeo(ou monômero Οβ e dímero Οβ no caso de Οβ derivado) foram cortadas empequenos pedaços e lavadas duas vezes com 100 μl de NH4HCO3 a 100 mM,50% de acetonitrilo, e lavadas uma vez com 50 μl de acetonitrilo. Todos ostrês sobrenadantes foram descartados. Em seguida, 10 μl de protease Glu-C(0,01 ng/μl em 10 mM de Tris, pH 8.2) e 10 μl de tampão (10 mM de Tris, pH8.2) foram adicionados e incubados a 37° C de um dia para o outro. O so-brenadante foi armazenado e pedaçois de gel foram extraídos duas vezescom 100 μl de ácido trifluoroacético a 0,1%, 50% de acetonitrilo. Todos ostrês sobrenadantes foram combinados e secados. As amostras foram dissol-vidas em 15 μl de ácido fórmico a 0,1%. 6 μl foi injetado sobre a coluna deHPLC e massas dos peptídeos foram determinadas por LC/MS.
Exemplo 8
Síntese química de fragmentos CXCR4 (aa1-39) e (aa176-185) e acopla-mento a 03 VLP
Fragmento de CXCR4 1-39 (SEQ ID N0:30) com uma seqüênciaencadeadora CGG ou GGC fundida ou ao N- ou ao C-término do fragmentoCXCR4 1-39, CXCR4 fragment 176-185 (SEQ ID N0:29) com um IigadorCGG ou GGC fundido ou ao N- ou ao C-término ou o fragmento CXCR4176-185 (SEQ ID NO:29) o qual foi ciclizado conectando um C o qual foi adi-cionado ao N-término com um G o qual foi adicionado ao C-término foramsintetizados quimicamente de acordo com procedimentos de rotina (PeterHenklein, Charité).
Uma solução de 3 ml (1,0 mg/ml) Οβ VLP em 20 mM de Hepes1pH 7.2 foi reagida por 30 minutos com 85 μΙ de SMPH (50 mM em DMSO,Pierce) at 25°C. Os dialisados, Οβ VLP derivada, foram subseqüentementeusados para acoplar peptídeos CXCR4-CGG-1-39, CXCR4-1-39-GGC, CX-CR4-CGG-176-185, CXCR4-176-185-GGC ou CXCR4-C-176-185-G. Emresumo, 1 ml de Οβ VLP derivada em uma concentração de 1 mg/ml foi rea-gido com 70 μΙ de uma solução a 5 mM de peptídeo por 2 horas a 25°C em20 mM de Hepes, pH 7.2.
A eficiência da aglutinação foi estimada como sendo entre 0,24 - 0,5fragmentos CXCR4 por monômero Οβ.
Exemplo 9
Imunização de camundonqos com fragmentos CXCR4
Camundongos adultos fêmeas C57BL76 (3 por grupo) foram va-cinados com fragmentos Οβ-ΟΧΟΡ4 (obtidos no EXEMPLO 8), usando ΟβVLP como um controle. 100 pg de vacina dialisada de cada amostra foramdiluídos em PBS para um volume de 200 μΙ e injetados por via subcutânea(100 μΙ sobre dois lados ventrais) nos dias 0 e 14. As vacinas foram adminis-tradas sem ou com adjuvante (Allhydrogel, 1 mg/injeção). Os camundongosforam sangrados retro-orbitalmente no dia 14, 21, 28 e reações de anticor-pos peptídeo-específicos foram determinadas por ELISA revestindo peptí-deos CXCR4 acoplados a RNase em uma concentração de 10 μg/ml emtampão de revestimento (0,1 M de NaHC03, pH 9.6), de um dia para o outroa 4°C. CXCR4 foi acoplado a RNase rapidamente como o seguinte: 5 mg/mlde RNase foi derivado em 0,2 mM de SPDP (SIGMA) por 1 hora em tempe-ratura ambiente. Solução de RNase derivada foi em seguida purificada sobreuma coluna PD10 (Amersham). 10 mM de EDTA e 1 mM de peptídeo foramadicionados à solução de RNase derivada e a reação foi incubada por 1 hora.Tabela 5
<table>table see original document page 74</column></row><table>
São mostrados títulos ELISA de peptídeos específicos médiosem soros de três camundongos por grupo.
Exemplo 10
Detecção de anticorpos CXCR4-específicos por tintura superficial das linha-gens de células T humanas Jurkat e CEM.NKR-CCR5
Células Jurkat ou células CEM.NKR-CCR5 foram cultivadas emmeio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS1 glutamina, eantibióticos. As células foram colhidas, lavadas e ressuspendidas em salinatamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de soro de feto de vitelo (FCS).Para prevenir aglutinação mediada por Fc-receptor, as células foram primei-ro incubadas por 30 minutos com rat-a-mouse-CD16/CD32 (BD Pharmin-gen) em PBS/1% de FCS por a 4 0C. Depois de lavagem as células (1 χ 105)foram incubadas com soro de camundongo diluído serialmente (obtido doEXEMPLO 10) por 30 minutos a 4 °C. As células foram lavadas comPBS/1% de FCS e incubadas com FITC-oc-mouse-lgG (BD Pharmingen) por30 minutos a 4 °C, as células foram em seguida analisadsa com uma FACSCalibur e a aglutinação específica dos anticorpos foi quantificada usando oprograma CeIIQuest (BD Biosciences). Os resultados estão resumidos naTABELA abaixo.Tabela 6:
<table>table see original document page 75</column></row><table>
* Soro de d21 depois da primeira imunização em uma diluição de 1:200 foiusado para a coloração das células.
Exemplo 11
Ensaio de Neutralização da cepa R4 HIV-1
Em resumo, camadas leucocitárias obtidos de 3 doadores desangue saudáveis são primeiro exauridas de células T GD8+ usando coque-tel Rosette Sep (StemCeII Technologies Inc., BIOCOBA AG) e células mo-nonucleares do sangue periférico são coletadas por centrifugação Ficoll-Hypaque (Amersham-Pharmacia Biotech). Células purificadas são em se-guida ajustadas para 4x106/ml em meio de cultura (RPMI 1640, 10% deFCS, 100 U/ml de IL-2, glutamina e antibióticos), divididas em três amostrase estimuladas com ou 5 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA), 0,5 pg/ml de PHAou 1 mg/l de MAb OKT3 anti-CD3. Depois de 72 horas, as células são com-binadas e usadas como células T CD4+ estimuladas para experimentos deinfecção e neutralização viral.
Para testar o potencial de neutralização, as células são primeiroincubadas com diluições seriais de IgG de camundongo policlonal purificada(conforme descrito acima) ou anticorpo controle 12G5 (25 μg/ml - 25 ng/ml;Pharmingen) em lâminas de cultura de 96 cavidades por 1 hora a 37°C.
As cepas X4 NL4-3 e 2044 foram descritas previamente (Trkolaet al (1998), J. Virol. 72:396; Trkoly et al (1998), J. Virol 72-1876). Em segui-da inóculo viral (100 TCID5o; 50% de dose infecciosa de cultura de tecido;Trkola et al., J. Virol., 1999, page 8966) são adicionados e as células sãocultivadas por outros 4 a 14 dias. O volume total da infecção é 200 μΙ. No dia6 pós infecção, os sobrenadantes são testados para a quantidade de produ-ção de antígeno HIV-1 p24 usando um imunoensaio, conforme descrito pre-viamente (Moore et al., 1990. Science 250, page 1139).
Exemplo 12
Acoplamento de fragmento CETP a QB VLP
O CETP peptídico CETP1, tendo a seqüência de terminal carbó-xi variando do aminoácido 461-476 (SEQ ID NO:32) de CETP humana efundido em seu N-término com o tripeptídeo CGG para acoplamento a VLPsfoi sintetizado por química de fase sólida em GmbH de microcoleções porEMC. O peptídeo foi amidado em seu C-término.
Uma solução de 750 μΙ (4,0 mg/ml) de Οβ VLP em 20 mM deHepes, 150 mM de NaCI pH 7.4 foi reagida por 30 minutos com um excessode 10 vezes de SMPH (21,4 μΙ de um estoque a 100 mM em DMSO, Pierce)a 25°C. 1,5 ml de Οβ VLP derivada em uma concentração de 2 mg/ml foireagido com 21 μΙ de uma solução a 50 mM de peptídeo CETP por 2 horas a15°C em 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCI, pH 7.4.
Exemplo 13
Imunização de camundonqos com QB- CETP1 e ELISA
Camundongos fêmeas Balb/c (n=3) foram vacinados comCETP1 acoplado a Οβ VLP. 50 pg de vacina dialiusada foram diluídos emPBS para um volume de 200 μl e injetados por via subcutânea (100 μl sobredois lados ventrais) no dia 0, 14, 50 e 73. A vacina foi administrada sem ad-juvante. Títulos de anticorpos foram determinados nos soros dos camundon-gos sangrados retro-orbitalmente no dia 0, 70 e 80.
CETP1 foi acoplado a AP205 VLP (20 mM de Hepes, 150 mMde NaCI pH 7.4) para revestimento para lâminas de ELISA. Em resumo, 1 mlde 1 mg/ml de AP205 VLP foi derivado com 7,1 μl de um estoque a 50 mMde SMPH (Pierce) (em DMSO) por 30 minutos em temperatura ambiente.Solução AP205 derivada (1 ml) foi reagida com 7,1 μl de um estoque a 50mM de CETP1 (em DMSO), e incubada por 2 horas a 15°C. CETP1 tambémfoi acoplado a BSA para revestimento para lâminas de ELISA.
Lâminas de ELISA foram revestidas com peptídeo CETP aco-plado a AP205 VLP ou BSA em uma concentração de 5 μςΛηΙ em tampão derevestimento (0,1 M de NaHC03, pH 9.6), de um dia para o outro a 4°C.
Tabela 7 Título de anticorpos IgG específicos anti-CETP1 médio(expressado como a recíproca da diluição sérica dando aglutinação meia-máxima no ensaio ELISA) em camundongos imunizados no dia 0, 14, 50 e73 com QpC ETP1.
Tabela 7
<table>table see original document page 77</column></row><table>
Exemplo 14
Clonagem, expressão e purificação de CETP1 fundido ao C-término deAP205 VLP
Clonagem
O fragmento de DNA codificando para o peptídeo CETP1 (SEQID NO:32) é criado anelando dois oligonucleotídeos complementares codifi-cando a seqüência peptídica de CETP1 e contendo os sítios de restrilçãoKpn2l e Mph1103l, respectivamente. O fragmento obtido é digerido comKpn2l e Mph1103l e clonado nos mesmos sítios de restrilção no vetorpAP405-61 (conforme descrito no EXEMPLO 1 da publicação de patenteinternacional Ns W02006/032674) sob o controle de promotor de triptofanooperon de E.coli.
A proteína AP205-II-CETP1 codificada pelo plasmídeo resultanteé: proteína de revestimento AP205 - GTAGGGSG - FGFPEHLLVDFLQSLS.
AP205-II-CETP1 é expressada e purificada essencialmente con-forme descrito na publicação de patente internacional Ns W004/007538.Exemplo 15
Teste de vacinas CETP no modelo de aterosclerose de coelho alimentadocom colesterol
Coelhos New Zealand White (n = 12 por grupo) são vacinadospor via subcutânea com 200 pg de vacina VLP-CETP ou VLP no dia 0, e re-forçados na semana 3, 6, 9, 12, 15, 19, 23 e 27. Os coelhos são colocadosem uma dieta de alto teor de colesterol (0,25%) na semana 16 e mantidosnesta dieta por outras 16 semanas. Amostras plasmáticas de coelhos emjejum são coletadas em intervalo regular para medições do título de anticor-pos, lipoproteína, colesterol e atividade de CETP. Os animais são sacrifica-dos na semana 32 e a aorta é removida para análise da lesão por ateroscle-rose. As aortas são coradas com óleo vermelho O depois de preparação daAorta "e/7 face", e a percentagem da aorta coberta por lesões é calculadapara cada animal.
Exemplo 16
Acoplamento de Bradicinina e des-Arg9-Bradicinina a Q3 VLP e Imunizaçãode camundonqos
Bradicinina (BK) (SEQ ID NO:22) e des-Arg9- Bradicinina (SEQID NO:23) com uma Cys fundida ao N- término de ambas as seqüências ouBradicinina (BK) com uma Cys fundida ao C-término foram sintetizadas qui-micamente de acordo com procedimentos de rotina. Os peptídeos foram a-coplados a Οβ VLP.
Camundongos adultos fêmeas C57BL/6 (10 por grupo) foramvacinados com ou 50 pg de Οβ-ΒΚ ou Οβ^βε-Α^Θ-ΒΚ acoplado a Οβ porvia subcutânea (100 μΙ sobre dois lados ventrais) nos dias 0, 14 e 28. A va-cina foi administrada sem adjuvante. Os camundongos foram sangrados re-tro-orbitalmente no dia 0, 14, 21 e 30 e anticorpos específicos para BK oudes-BK são medidos por ELISA seguindo protocolo padrão.
Primeiro, BK ou des-Arg9-BK foi acoplado a RNase (SIGMA).Em seguida lâminas de ELISA foram revestidas com peptídeos Bradicininaacoplados a RNase em uma concentração de 10 μg/ml em tampão de reves-timento (0,1 M de NaHC03, pH 9.6), de um dia para o outro a 4°C.Tabela 8 Título de anticorpos IgG específicos anti-BK e anti-des-Arg9-BK médios (expressado como um fator de diluição) em camundon-gos imunizados no dia 0 e 14 com QpBK ou C^-des-Arg9-BK respectivamente.
<table>table see original document page 79</column></row><table>
Exemplo 17
Eficácia de vacinação contra QB-BK, QB-des-Arg9-BK para o tratamento deartrite induzida por colágeno
10 camundongos machos DBA/1 por grupo foram imunizadospor via intradérmica três vezes (dias 0, 14 e 28) com 50 μg de Οβ-ΒΚ, Οβ-des-Arg9-BK ou Οβ somente. Em seguida os camundongos foram injetadosduas vezes por via intradérmica (dias 34 e 55) com 200 μg de colágeno bo-vino tipo Il misturado com adjuvante completo de Freund.
Depois da segunda injeção de colágeno/CFA os camundongossão examinados em uma base regular e um escore clínico variando de 0 a 3é atribuído a cada membro de acordo com o grau de vermelhidão e intumes-cimento observado. Três semanas depois da segunda injeção de coláge-no/CFA o escore clínico médio por membro é determinado nos três gruposexperimentais.
Exemplo 18
Eficácia da vacinação contra Οβ-ΒΚ e QB-des-Arg9-BK para o tratamento deinflamação alérgica das vias aéreas (AAI)
Um modelo de asma experimental de inflamação alérgica dasvias aéreas é usado para avaliar os efeitos de vacinação contra Bradicinina(BK) e des-Arg9-Bradicinina (des-Arg9-BK) sobre reações imunes mediadaspor Th2 caracterizadas por: influxo de eosinófilos no pulmões, produção decitocinas (IL-4, IL-5, IL-13), anticorpo IgE e produção de muco e bronco hi-per-responsividade (BHR). Camundongos Balb/c (5 por grupo) são imuniza-dos com ou Ωβ-ΒΚ ou Qp-des-Arg9-BK conforme descrito no EXEMPLO 16ou injetados com Qp somente. 35 dias depois da primeira imunização, oscamundongos são injetados por via intraperitoneal com 50 μg de ovalbumina(OVA) na presença ou ausência de adjuvante (Alhydrogel). 10 dias depois(isto é, no dia 45) todos os camundongos são diariamente testados por viaintranasal com 50 μg de OVA em PBS em 4 dias consecutivos. 24 horas de-pois do último teste da bronco hiper-responsividade é determinado com umflegtismógrafo corporal total. Em seguida os camundongos são sacrificadosem momentos específicos para analisar a inflamação pulmonar e reaçõesimunes mediadas por Th2. Lavagens pulmonares são realziadas comPBS/1% de BSA. As células contidas na lavagem bronco alveolar (BAL) sãocontadas em um contador Coulter Counter (lnstrumenten Gesellschaft AG) ediferenciadas com tintura Maigrünwald-Giemsa conforme descrito previa-mente (Trifilieff A, et al. Clin Exp Allergy. 2001 Jun; 31 (6):934-42).
Exemplo 19
Acoplamento de gastrina ou fragmentos de aastrina a QB VLP
Os seguintes peptídeos de gastrina foram sintetizados de acordocom procedimentos de rotina.
G17(1-9)C2: pEGPWLEEEESSPPPPC (SEQ ID NO:39)
c1 G17: pEGPWLEEEEEAYGWMDFGGC (SEQ ID N0:40)
nG17amida: CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2 (SEQ ID NO:41)
nG17-G: CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFG (SEQ ID N0:40)
nG34amida: CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2(SEQ ID NO:38)
nG34-G: CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG(SEQ ID NO:43)
A Οβ VLP derivada dialisada foi subseqüentemente usada paraacoplar c1G17. Em resumo, 1 ml de Οβ VLP derivadas (em uma concentra-ção de 2 mg/ml) foi reagido com 167 μΙ de uma solução a 10 mM de peptí-deo em DMSO e 100 μΙ de acetonitrilo por 2 horas a 15°C. O produto aco-plado foi denominado Qp-c1G17. A eficiência do acoplamento [isto é, mol deΟβ-gastrina / mol de monômero QP(total)] foi estimada, por análise densito-métrica do SDS-PAGE corado com Coomassie blue, como estando entre 2,4fragmentos de c1G17 por monômero Οβ.
A Οβ VLP derivada dialisada foi subseqüentemente usada paraacoplar nG17amida, nG17-G, nG34amida ou nG34-G. Em resumo, 84 μΙ deQp VLP derivada (em uma concentração de 2 mg/ml) foi reagida com 12 μΙde uma solução a 10 mM de peptídeo e 4 μΙ de H2O por 2 horas a 15°. Osprodutos acoplados foram denominados Qp-nG17amida, Qp-nG17-G, Οβ-nG34amida e Qp-nG34-G respectivamente.
Exemplo 20
Acoplamento de G17(1-9)C2 (SEQ ID NO:39) a Toxóide Diftérico (DT) e QB
O protocolo usado para acoplamento de G17(1-9)C2 a DT foisimilar ao EXEMPLO 1 da Patente U.S. N2 5.866.128. Em resumo, DT (ListBiological Laboratories) foi ativado dissolvendo 1 mg de DT em 100 μΙ detampão de fosfato de sódio a 0,2 M, pH 6.6. Separadamente, 2 mg de SMPHfoi dissolvido em 80 μΙ de DMSO. 12 μΙ de SMPH foi adicionado em 100 μΙde DT. Depois de 2 horas de incubação em temperatura ambiente, a misturafoi dialisada duas vezes por 2 horas contra 2 L de tampão de citrato de sódioa 0,1 Μ, pH 6.0. O produto acoplado foi denominado DT-G17(1-9)C2.
A Οβ VLP derivada dialisada foi subseqüentemente usada paraacoplar o G17(1-9)C2. Em resumo, 84 μΙ de Οβ VLP derivada foi reagidacom 6 μΙ de uma solução a 10 mM de peptídeo em DMSO e 6 μΙ de H2O por2 horas a 18°C. O produto acoplado foi denominado 0β-617(1-9)02.
Exemplo 21
Imunização de camundonqos com QB-c1G17, QB-nG17amida. QB-nG17-G.QB-nG34amida. QB-nG34-G, QB-G17(1-9)C2 e DT-G17(1-9)C2
Camundongos fêmeas adultos C57BL/6 foram vacinados com ouΟβ-ο1617 (5 camundongos por grupo), Οβ-ηβ^π^, Qp-nG17-G, Οβ-η634amida e Οβ-ηβ34-6 (3 camundongos por grupo). 50 μg de Οβ-ο1Θ17 ou 25μg de Οβ-ηΘ173ΐτ^3, 0β-η617-0, Οβ-ηΘ343ητ^3 e Οβ-ηΘ34-Θ (obtidosno EXEMPLO 24) foram diluídos em PBS para um volume de 200 μΙ e inje-tados por via subcutânea (100 μΙ sobre dois lados ventrais) nos dias 0 e 14.As vacinas foram administradas sem adjuvante. Como um controle, um gru-po de camundongos foi injetado com 50 μg de Qp. Camundongos imunizadocom Qp-Cl G17 foram sangrados retro-orbitalmente no dia 0, 14, 21, 28, 42,69, e 101 e camundongos os quais foram imunizados com Qp-nG17amida,Qp-nG17-G, Qp-nG34amida e Qp-nG34-G foram sangrados retro-orbitalmenteno dia 0, 14, 21, 28, 42, 56, e 77.
Camundongos fêmeas adultos C57/BL6 foram imunizados comQP-G17(1-9)C2 com 1 mg de alume por camundongo ou sem alume e DT-G17(1-9)C2 (5 camundongos por grupo) com 1 mg de alume por camundon-go. 50 pg de Qp-Gl7(1 -9)C2 e DT-G17(1-9)C2 foram diluídos em PBS paraum volume de 200 μΙ e injetados por via subcutânea (100 μΙ sobre dois ladosventrais) nos dias 0 e 14. Os camundongos foram sangrados retro-orbital-mente no dia 0 e dia 14. Os títulos de anticorpos específicos contra estesfragmentos de gastrina foram medidos por ELISA revestindo lâminas deELISA (MAXIsorp de 96 cavidades, NUNC immuno plate) foram revestidascom c1G17 acoplado a RNase ou nG17amida, nG17-G, nG34smide, nG34-Gem uma concentração de 10 μg/ml em tampão de revestimento (0,1 M deNaHC03, pH 9.6), de um dia para o outro a 4°C.
Tabela 9 Título de anticorpos IgG anti-c1G17-, nG17amida,nG17-G, nG34amida ou nG34-G-específicos médio (expressado como um fatorde diluição) em camundongos imunizados no dia 0, e 14 com Qp-c1G17,Qp-nG17amida, Qp-nG17-G, Qp-nG34amida e Qp-nG34-G, respectivamen-te. Isto demonstra claramente que um conjugado de gastrina-VLP é capazde induzir um alto título de anticorpos contra fragmentos de gastrina.
Tabela 9
<table>table see original document page 82</column></row><table>A tabela 10 mostra os títulos médios de anticorpos G17(1-9)C2-es-pecíficos. Os títulos ELISA são expressos como diluições séricas as quaislevam a OD meio máximo no ensaio ELISA. Em camundongos imunizadoscom Qp-G17(0-9)C2 com ou sem Alume ou DT-G17(1-9)C2, títulos médiosde aproximadamente 1: 4242, 1: 5 838 e 1: 788 respectivamente, foram atin-gidos no dia 14. O título de OD meio máximo foi menos de 100, o quql foiconsiderado como estando abaixo do corte do ensaio. Isto demonstra clara-mente que Qp-G17(1-9)C2 é capaz de induzir reação de anticorpos maisfácil e maior do que DT-G17(1 -9)C2.
Tabela 10
<table>table see original document page 83</column></row><table>
Exemplo 22
Checando a reatividade cruzada de soros os quais foram produzidos contrac1G17 a CCK8
Lâminas de ELISA foram revestidas com c1G17 ou CCK8 (SIG-MA) em uma concentração de 0,2 mg/ml em tampão de revestimento (0,1 Mde NaHC03, pH 9.6), de um dia para o outro a 4°C. Enquanto o título de E-LISA de lâmina revestida com c1G17 foi 1250, não foi observada clara reati-vidade para CCK (FIG. 1A).
A atividade cruzada também foi checada em uma ELISA de ini-bição. Lâminas de ELISA foram revestidas com c1G17 ou CCK8 (SIGMA)em uma concentração de 0,2 mg/ml em tampão de revestimento (0,1 M deNaHC03, pH 9.6), de um dia para o outro a 4°C. Soros camundongos (14dias depois da imunização) produzidos contra QP-c1G17 (obtido do EXEM-PLO 21) foram incubadas com ou nG17amida ou CCK8 diluído serialmente a37QC por 2 horas sobre um bloco de aquecimento com agitação a 600 rpm.
Em seguida estes soros foram adicionados à lâmina do ensaio ELISA e in-cubadas em temperatura ambiente por 2 horas. Enquanto pré-incubação denG17amida inibiu o reconhecimento dos soros para a nG17amida revestida,não foi observada nenhuma atividade de inibição de CCK. Estes dois expe-rimentos mostrou que anticorpos produzidos com Qp-c1G17 não tiveramreação cruzada com CCK8 (FIG 1B).
Exemplo 23
Acoplamento de C5a e fragmento de C5a a QB
A seqüência de aminoácidos C5a murina contendo um Iigadorde N-terminal CGSGG (SEQ ID NO:47, denominado nas partes que se se-guem mC5acys) foi sintetizada quimicamente pela Dictagene SA. Os 19 ami-noácidos de C-terminal da seqüência C5a murina foram sintetizados quimi-camente (EMC Microcollections) com um Iigador CGG adicional no N-término(SEQ ID NO:48, denominado nas partes que se seguem mC5acys59"77).
Uma solução de 143 μΜ de Qp VLP em 20 mM de HEPES, 150mM de NaCI, pH 7.2 foi reagida com um excesso molar de 2 vezes (286 μΜ)de (SMPH, Pierce) por 30 minutos a 25°C com agitação. Depois de diálise,uma quantidade equimolar de mC5acys foi adicionada a uma solução a 36μΜ de Qp VLPs derivadas com SMPH. O volume da reação foi 100 μΙ e asreações foram incubadas por 2 horas a 15°C com agitação.
Uma solução de 200 μΜ de Qp VLP em 20 mM de HEPES, 150mM de NaCI, pH 7.2 foi reagida com um excesso molar de 5 vezes (1 mM)de SMPH (Pierce) por 30 minutos a 25°C com agitação. Depois de diálise,um excesso molar de 5 vezes de mC5acys59"77 foi adicionado a uma soluçãoa 107 μΜ de Qp VLP derivada com SMPH. A reação foi incubada por 2 ho-ras a 15°C com agitação.
Exemplo 24
Imunização de camundongos com vacina QP-mC5acvs e detecção de anti-corpos mC5acvs-específicos
Camundongos foram imunizados por via subcutânea com 50 μgde vacina Qp-mC5acys preparada conforme descrito no EXEMPLO 23 nosdias 0 e 14 e conforme necessário. Os camundongos foram sangrados retro-orbitalmente ou através da veia da cauda no dia 14 e dia 21 e em momentossubseqüentes. O soro foi preservados destes sangramentos e analisado porELISA C5a-específico. Os camundongos receberam 50 μg de Qp-VLP oureceberam PBS somente como controles negativos. O título de anticorposIgG anti-mC5acys foi determinado por ELISA por revestimento com 1 pg/mlde mC5acys de um dia para o outro em 0,1 M de tampão de carbonato (pH 9.6).
A tabela 11 mostra resultados representativos deste ensaio comsoros de camundongos ou imunizados 24 dias previamente com Qp-mC5acys,com Οβ VLP somente ou deixados sem tratamento. Camundongos que re-ceberam a vacina Qp-mC5acys apresentaram consistentemente uma reaçãode anticorpos IgG contra mC5acys revestidos sobre lâmina.
Tabela 11
<table>table see original document page 85</column></row><table>
Os camundongos são imunizados por via subcutânea com 50 pgde Qp-mC5acys59'77 substancialmente o mesmo conforme descrito acima.
Exemplo 25
Imunização com vacina de Qp-mC5acvs neutralizou os efeitos in vivo demC5acvs sistêmico
A atividade biológica de mC5acys foi determinada in vivo em umensaio de neutropenia medindo a queda aparente nos números de granulóci-tos do sangue depois de administração intravenosa de pequenas quantida-des de mC5acys.
Camundongos fêmeas C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de idade)foram anestesiados e injetados com 100 μΙ de solução através da veia lateralda cauda. Os camundongos receberam ou PBS1 mC5acys em PBS ou cap-sídeo de Οβ em PBS. Depois de três minutos os camundongos foram san-grados através da via retro-orbital e 100 μΙ de sangue total foi transferidopara 2 ml de PBS contendo a heparina anti-coagulante (Roche). As célulasforam peletizadas por centrifugação a 450 xg por 10 minutos em temperaturaambiente. Depois de aspirar o sobrenadante, o pélete celular foi ressuspen-dido em 2 ml de solução de Tris Cloreto de Amônio (TAC) (17 mM de Tris1126 mM de NH4CI1 pH 7.2) por 5 minutos em temperatura ambiente para Ii-sar as 'hemácias. As células remanescentes foram peletizadas por centrifu-gação e o tratamento com TAC foi repetido. As células remanescentes foramre-peletizadas por centrifugação e ressuspendidas em 50 μΙ de tampão delavagem de citometria de fluxo (PBS de Dulbecco contendo 2 % (v/v) de sorofetal bovino e 0,1 % de NaN3). As células foram passadas através de umcitômetro de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickenson) e a fração de granulóci-tos foi determinada por canal de dispersão luminosa frontal e lateral.
Um experimento representativo demonstrando que mCaõcysinduz neutropenia é dado na TABELA 6. Neste caso 1 nmol de mC5acysinduz neutropenia estatisticamente importante comparado com camundon-gos tratados com PBS e camundongos que receberam 1 pg de proteína docapsídeo Οβ, mostrando que o mC5acy sintetizado tinha atividade biológica.
Camundongos C57BLy6 foram imunizados por via subcutâneasobre o flanco com 50 pg de QB-mC5acys diluído em PBS de Dulbecco.Camundongos controle receberam QB somente ou foram não tratados. Asimunizações foram realizadas no dia 0 e dia 14 do experimento. No dia 22depois da primeira imunização 50 pmol de mC5acys foi injetado por via in-travenosa através da vria lateral da cauda para induzir neutropenia sistêmi-ca. Em camundongos imunizados com QB VLP somente ou em camundon-gos não tratados há uma queda na percentagem de granulócitos no sangue3 minutos depois da injeção de 50 pmol de mC5acys. Em camundongos va-cinados com QB-mC5acys esta redução na percentagem de granulócitos nosangue é evitada. Portanto anticorpos anti-mC5a produzidos em camundon-gos por imunização com QB-mC5acys são capazes de neutralizar a reaçãode neutropenia sistêmica induzida pela administração de mC5acys intrave-noso (TABELA 12).<table>table see original document page 87</column></row><table>Exemplo 26
Imunização com Qp-mC5acvs VLP alivia doença em um modelo de artriteinduzida por colágeno em camundongos
Camundongos machos DBA/1 JCrl de 6 semanas de idade(Charles River, Alemanha) foram imunizados por via subcutânea sobre osflancos com ou 50 pg de QB-mC5acys (n = 8) ou 50 pg de QB VLP (n = 8),ambos diluídos em PBS de Dulbecco. Duas imunizações de reforço adicio-nais de ou 30 pg de QB-mC5a ou 30 pg de QB VLP também foram adminis-tradas por via subcutânea, nos dias 15 e 24 depois da imunização inicial. Oscamundongos foram imunizados por via intradèrmica na base da cauda duasvezes nos dias 35 e 57 depois da imunização inicial com 100 pg de colágenobovino tipo Il (MD Biosciences) emulsificado usando seringas de vidro comouma proporção a 1:1 em Adjuvante Completo de Freund (CFA). CFA foi pre-parado a partir de Adjuvante Incompleto de Freund (Difco Laboratories) con-tendo 5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis morto termicamente cepaH37RA (Difco Laboratories). Os camundongos foram em seguida monitoradospara a indução e gravidade da artrite induzida por colágeno por medições diá-rias da espessura das juntas do membro anterior e posterior e pela estimativadiária de escores clínicos das juntas. A espessura das juntas foi medida usandocalibradores de tensão constante. Escores clínicos foram atribuídos com basena escala seguinte: Escore 0 - nenhum intumescimento, junta normal; Escore 1- branda vermelhidão e/ou intumescimento dos dedos / patas; Escore 2 - Ver-melhidão e intumescimento, envolvendo toda a pata / junta; Escore 3 - Graveintumescimento, deformação das patas / juntas com anquilose. As observa-ções experimentais foram continuadas até o dia 15 depois da injeção final decolágeno / CFA (dia 72 depois das imunizações iniciais.)
A tabela 13 mostra o aumento médio na espessura das juntasatravés de todos os membros depois da injeção final de colágeno/CFA. Oaumento médio na espessura das juntas é menor na maioria dos dias para ogrupo vacinado com QB-mC5acys comparado com o controle QB, com estadiferença tendo um valor de ρ < 0,1 (pelo teste t de student bicaudado) nosdias 5, 7 e 10 deois das injções finais de colágeno/CFA.<table>table see original document page 89</column></row><table>A figura 2a mostra a soma do escore clínico médio através detodos os membros depois da injeção final de colágeno / CFA. A soma doescore clínico médio é consistentemente menos no graupo vacinado comQB-mC5acys comparado com o controle QB VLP1 com esta diferença tendo umvalor de ρ < 0,1 (pelo teste t de student bicaudado) nos dias 6, 8 12 e 14 e umvalor de ρ < 0,05 (pelo teste t de student bicaudado) nos dias 7, 9 e 10 depoisda injeção final de colágeno / CFA. Este resultado implica que a vacinação comQB-mC5acys reduz a gravidade da artrite induzida por colágeno em camun-dongos quando comparados com animais vacinados com veículo QB.
Exemplo 27
Imunização com Qp-mC5acvs VLP alivia doença em um modelo de artrite indu-zida por coquetel de anticorpos monoclonais anticoláqeno em camundongos
Camundongos balb/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (CharlesRiver) foram imunizados por via subcutânea sobre os flancos com ou 50 pg deQB-mC5acys (n = 5) ou 50 pg de QB VLP (n = 5), todos diluídos em PBS deDulbecco. Duas imunizações de reforço adicionais de ou 50 pg de QB-mC5a ou50 pg de QB VLP também foram administradas por via subcutânea, nos dias 21e 35 depois da imunização inicial. Os camundongos foram imunizados por viaintravenosa no dia 41 depois da imunização inicial com 200 μΙ de coquetel deanticorpos monoclonais anticolágeno (MDBiosciences) seguida por injeção in-traperitoneal de 100 ul de solução de LPS (MDBiosciences) 1 dia depois. Oscamundongos foram em seguida monitorados para a indução e gravidade deartrite induzida por anticorpos monoclonais anticolágeno substancialmente amesma conforme descrito no EXEMPLO 26. Observações experimentais fo-ram continuadas até o dia 14 depois da injeção de coquetel de anticorposmonoclonais anticolágeno (dia 55 depois das imunizações iniciais).
A figura 2b mostra a soma do escore clínico médio através detodos os membros depois da injeção de coquetel de anticorpos monoclonaisanticolágeno. A soma do escore clínico médio é consistentemente menor nogrupo vacinado com QB-mC5acys comparado com o controle de QB VLP,com esta diferença tendo um valor de ρ < 0,1 (pelo teste t de student bicau-dado) nos dias 3, 4, 7, 8, 9,10,11 e 13 e um valor de ρ < 0,05 (pelo teste t destudent bicaudado) nos dias 12 e 14 depois da injeção final de colágeno /CFA. Este resultado implica que vacinação com QB-mC5acys reduz a gravi-dade de artrite induzida por anticorpos monoclonais anticolágeno em ca-mundongos quando comparados com animais vacinados com veículo QB.
Exemplo 28
Imunização com QB-mC5acvs VLP e os New Zealand Black/New ZealandWhite F1 através do modelo de lúpus eritematoso sistêmico
Camundongos NZB/NZW F1 desenvolvem espontaneamenteuma doença autoimune com similaridades surpreendentes ao lúpus eritema-toso sistêmico humano (Andrews et. al. J. Exp. Med., 148: 1198, 1978). Ca-mundongos fêmeas NZB/NZW F1 de 16 semanas de idade (Charles River)foram imunizados por via subcutânea sobre os flancos com ou 50 pg de QB-mC5acys (n = 20) ou 50 pg de QB VLP (n = 20), todas diluídas em PBS deDulbecco. Duas imunizações de reforço adicionais de ou 50 pg de QB-mC5aou 50 pg de QR VLP também foram administradas por via subcutânea, nosdias 14 e 28 depois da imunização inicial. Um reforço adicional de ou 50 pgde QB-mC5a ou 50 pg de QB VLP em alume foi administrado no dia 58. Aquantidade de proteína excretada na urina (proteinúria) foi medida sema-nalmente a partir de 16 (dia 0) até 29 semanas de idade (dia 91) por análisecolorimétrica usando dipsticks (Roche). A proteinúria é posteriormente medi-da semanalmente até 52 semanas de idade e os títulos de anticorpos sãomantidos altos por reforço adicional conforme necessário.
A figura 3 mostra a percentagem de camundongos cuja leiturade proteinúria atingiu 300 mg/dL. Estes dados mostram que 30% dos ca-mundongos no grupo tratado com Qp teve leituras de proteinúria de mais de300 pg/ml por volta da idade de 29 semanas. EM comparação somente umcamundongo no grupo tratado com QpC5acys teve uma leitura acima de 300pg/ml nesta idade. Este camundongo em particular teve baixos títulos de anti-corpos C5acys conforme determinado por ELISA. Este resultado implica quevacinação com QB-mC5acys reduz a incidência ou retarda o início de protei-núria no modelo de lúpus eritematoso sistêmico New Zealand black/NewZealand white F1 comparado com animais vacinados com controle QB.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Cytos Biotechnology AGBachmann, Martin FTissot, Alain FSchmitz, Nicole FMartin, Stepnen FHuber, Adrian FZou, Yu
Jegerlehner, AndréaSaudan, PhilippeHinton, Heatner
<120> CONJUGADOS ANTIGÊNICOS E USOS DOS MESMOS
<130> Pl052PCÒ0
<150> 60/690,094
<151> 2005-06-14
<160> 60
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<2i3> Bacteriófago Q-beta
<400> 1
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Tnr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu115
Leu Ala Ser Pro Leu120
^eu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu125Asn Pro Ala Tyr130
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> Bacteriófago Q-beta
<400> 2
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15
Lys Gln Thr Leu Val Leu As.n Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Alc180 185 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn lie. Glu Arq Phe Ile Tyr Leu260 265 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300
Ala ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325
<210> 3
<211> 129
<212> PRT
<213> Bacteriófago R17
<400> 3
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 - 5 10 15
Asn Val Thr VaI Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Tnr Cys Ser Val35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60
Pro Lys Vai Ala Thr Gln Thr Val GIy Gly Val C-Iu Leu Pro Val Ala65 70 75 80
Aia Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 SO 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Glv Ile115 120 125
Tyr
<210> 4<211> 130<212> PRT
<213> Bacte riófago fr
<400> 4
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly C-Iy Thr1 5 10 15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lvs Val Tnr Cys Ser35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125
Ile Tyr130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> Bacíeriófago GA
<400> 5
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly10 15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Va]50 55 60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala65 90 95
Ala Tnr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Glv Leu Phe100 105 110
l,ys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125
Tyr Ala130
<210> 6
<211> 132
<212> PRT
<213> Bacteriófago SP
<400> 6
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Tnr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly15 10 15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arq Asp Ala Cys65 70 .75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser PheThr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130
<210> 7
<211> 329
< 212 > PRT
<213> Bacteriófago SP
<400> 7
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp15 10 15
Gln Thr Leu Thr Leu Tnr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser GIu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
50 55 60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr65 70
Pro Ser Val Thr -Arg Ser Ala Phe85
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg100
Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp75 80
Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr90 95
Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala105 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn115 120 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp130 135 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp VaI Pro VaI Val Pro Asp Val Lys Pro Pro145 ' 150 155 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cvs Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly165 170 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg180 185 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp210 215 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp225 230 235 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly245 250 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile i.ys Tyr Leu260 265 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser325
<210> 8<211> 130
<212> PRT
<213> Bacteriófago MS2
<400> 8
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Pne Val Leu Val Asp Asn C-Iy Gly Thr1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30
rp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln AIa Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lvs Val Glu50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lvs Ala Met Gln Gly Leu100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125
Ile Tyr130
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> Bacteriófago M11
<400> 9
Met Ala.Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 .15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Glv Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr130
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<2ΐ3> Bacteriófago ΜΧ1
<400> 10
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lvs Asn Gly1 5 10 15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 . 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lvs Arg35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 ■ 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr130
<210>; 11<2I1> 330<212> PRT
<213> Bacteriófago NL95
<400> 11
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly1 5 10 15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 4 0 4 5Vai Thr Val Ser VaI Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Aia Cys Tnr Lys Asp Ala Cys65 70 75 SO
Asp Pro Ser VaI Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95
Phr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr GIu Leu
100 105 110
AIa Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 - 125
Asn Pro Ala. Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro14 5 150 * 155 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cvs Tyr Arg Arg Gly165 170 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Giy Tyr Val Asp Leu Asp225 230 235 240
Aia Ser Val Met Gln Ser Asp Giu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tvr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330
<210> 12
<211> 129
<212> PRT
<213> Bacte rióíago f2
<4 00> 12
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly 'vai Ala Glu Trp20 25 30
:ie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 4 0 .45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val GIy Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125
Tyr
<210> 13
<211> 128
<212> PRT<213>
Bacteriófago PP7
<4 00> 13
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Ara Thr LeuIO 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85' 90 95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 . 105 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125
<210> 14
<211> 131
<212> PRT
<213> Bacteriófago AP205
<4 00> 14
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60
Cys Ala Asp Ala Cys Vai65 70
Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg75 80~
Tnr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125
Thr Thr Ala130
<210> 15
<2Ι1> 132
<212> PRT<213>
Seqüência Artificial
<220><223>
Bacteriófago Qbeta 240 mutante
<4 00> 15
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys15 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gl.y Val Asn Pro Thr Asn GIy Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser GIn Ala Gly AIa Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 AO 45
Tnr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130
<210> 16
<211> 132
<212> PRT
<2ΐ3> Seqüência Artificial
<220><223> Bacteriófago Q-beta 243 mutante
<400> 16
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Glv Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Va35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130
<210> 17<211> 132<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Bacteriófago Qbeta 250 mutante<400> 17
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly
10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Vai Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Αεη Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Tnr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130
<210> 18
<211> 132
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Bacteriófago Qbeta 251 mutante
<400> 18
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg15 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Glv Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Pns85 90 ~ 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp GIn Leu106
115
120
125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210> IS
<211> 132
<212> PRT<213>
Seqüência Artificial
<220>
<223> Bacteriófago Qbeta 259 mutante
<400> 19
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15
Gln Thr Leu.Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Prc- Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45
Fhr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu C-Iu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130
<210> 20<211> 185<212> PRT<213> Vírus da hepatite B<400> 20Met Asp Ile Asp Pro Tyr
Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cy£35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185
<210> 21<211> 188<212> PRT<213>
Vírus da hepatite B
<400> 21
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Vsl Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln L100
eu Trp Phe His
105
[le Sei
Cys Leu Thr110
Phe Gly Arg115
Glu Thr Val Lei.
Glu Tyr120
Val Ser Phe125
51y Val Trp
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr-Val Val Arg Arg Arq Asp Arg Gly Arg Ser145 150 155 160
Pro Arg Arg Ara Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Músculo Mus
<400> 22
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg1 5
<2i0> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Músculo Mus
<400> 23
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 24
<211> 352
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 24
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu20 25 30
Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn35 40 45
Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met50 55 60Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala ile Ser Asp Leu Pne Phe Leu65 70 75 80
Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala Kis Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe85 90 95
Gly Asn Thr Met Cvs Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe IIe Gly Phe100 105 110
Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu115 120 125
Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe130 135 140
Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp VaI Val Ala Val Pne Ala Ser145 150 155 160
Leu Pro Gly Ile Ile Phe Tnr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr165 170 175
Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn180 185 190
Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu195 200 205
Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys210 215 220
Arg Asn GluiLys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile225 230 235 240Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu245 250 255
Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser260 265 270
Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr275 280 285
His Cys Cys Ile Asn Prc- Ile Ile Tyr Ala Phe
290 295 300
Arg Asn305
310
LV£
His Ile AIa Lys Arg Phe
315
320
:ys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln GIu Ala Pro Glu Arg Ala Ser325 330 335
Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu340 345 350
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> CCR5 ECL2A
<400> 25
Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr
1 5<210> 26<211> . 12<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> CCR5 ECL2A ClClíCa<400> 26
Cys Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Gly1 5 IO
<210> 27
<211> 31
<212> PRT<213>
Seqüência Artificiai
<220>
<223> CCR5 PNt<400> 27
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln lie. Ala Ala Arg20 25 30
<210> 28
<211> 352
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 G0> 26
Met Glu Giy Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 10 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cvs Phe Arg Glu Glu20 25 30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile35 "40 45
Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly50 55 60
Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu65 7θ" 75 80
Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val85 90 95
Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val100 105 110
His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala115 120 125
Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys VaI Val Tyr Val Gly Val145 150 155 160
Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn165 170 175
Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr i.le Cys Asp Arg Phe Tyr Pro AsnAsp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu195 200 205
Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser210 215 220
Lys Leu Ser His Ser Lys Glv His Gln Lvs Arg Lys Ala Leu Lys Thr225 230 235 210
Thr Val lie. Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr245 250 255
ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe2 60
Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val275 280
Ala Leu Ala Phe Phe His Cvs Cys290 295
Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln265 270
His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu285
Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe300
Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val305 310 315 320
Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly325 330 335
His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser340 345 350
<210> 29
< 211> 10
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> CXCR4 176-185
<40G> 29
Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile
1 5 * 10
<210> 30
<2I1> 39
<212> PRT
<2l3> Seqüência Artificial
<220><223> CXCR4 1-39<400> 30
Met Giu Gly Ile Ser Ile Tyr Tnr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met1 5 IO 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu20~ 25 30
Asn Als Asn Phe Asn Lys Ile35
<210> 31
<211> 476
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Cys Ser Lys Gly Thr Ser His Glu Ala Gly Ile Val Cys Arg Ile Thr1 .5 10 15
Lys Pro Ala Leu Leu Val Leu Asn His Glu Thr Ala Lys Val Ile Gln20 25 30
Thr Ala Phe Gln Arg Ala Ser Tyr Pro Asp Ile Thr Gly Glu Lys Ala35 40 45
Met Met Leu Leu Gly Gln Val Lys Tyr Gly Leu His Asn Ile Gln Ile50 55 60
Ser His Leu Ser Ile Ala Ser Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ala Lys65 70 75 80
Ser Ile Asp Val Ser Ile Gln Asn Val Ser Val Val Phe Lys Gly Thi85 90 95
Leu Lys Tyr Gly Tyr Thr Thr Ala Trp Trp Leu Gly Ile Asp Gln Ser100 105 11Ò
Ile Asp Phe Glu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Leu Gln Ile Asn Thr Gln115 120 125
Leu Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Pro Asp Cys Tyr130 135 ■ * 140
Leu Ser Phe His Lys Leu Leu Leu His Leu Gln Gly Glu Arg Glu Pro145 150 155 160Gly Trp Ile Lys Gln Leu Phe Thr Asn Phe Ile Ser Phe Thr Leu Lys165 170 175
Leu Val Leu Lys GIy Gln Ile Cys Lys Glu ile Asn Val Ile Ser Asn180 185 190
Ile Met Ala Asp Phe Val Gln Thr Arg Ala Ala Ser Ile Leu Ser Asp195 200 205
Gly Asp Ile Gly Val Asp Ile Ser Leu Thr Gly Asp Pro Val210 215 220
Thr
Ala Ser Tyr Leu Glu Ser His His Lys Gly His Phe225 230 235
Ile Tyr Lys Asn240
Val Ser Glu Asp Leu Pro Leu Pro Thr Phe Ser Pro Thr Leu Leu Gly245 250 255
Asd Se
Arg Met Leu Tyr Phe Trp Pne Ser Glu Arg VaI Phe His Ser
260
26f
27C
Leu Ala Lys Val Ala Phe Gln Asp Giy Arg Leu Met Leu Ser Leu Met275 280 285
Ly Asp Glu Phe Lys Ala Val Leu Glu Thr Trp Gly Phe Asn Thr Asn290 295 300
Gln Glu Iie Phe Gln Glu Val Val Gly Gly Phe Pro Ser Gln Ala Gln305 310 . 315 320
Val Thr Val His Cys Leu Lys Met Pro Lys Ile Ser Cys Gln Asn Lys325 330 335
Gly Val Val Val Asn Ser Ser Val Met Val Lys Phe Leu Phe Pro Arg340 345 350
Pro Asp Gln Gln His Ser Vsl Ala Tyr Thr Phe Glu Glu Asp Ile Val355 360 365
Thr Thr Val Gln Aia Ser Tyr Ser Lys Lys Lys Leu Phe Leu Ser Leu370 375 380
Leu Asp Phe Gln Ile Thr Pro Lys Thr Val Ser Asn Leu Thr Glu Ser385 390 395 400
Ser Ser Glu Ser Ile Gln Ser Phe Leu Gln Ser Met Ile Thr Ala ValGly Ile Pro Glu Val Met Ser Arg Leu Glu Val Val Phe Thr Ala Leu420 425 430
Met Asn Ser Lys Gly Val Ser Leu Phe Asp Ile Ile Asn Pro Glu IIe435 440 445
Ile Thr Arg Asp GIv Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe GIy Phe Pro450 455 460
GIu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Glri Ser Leuà (=. 4 7Q & 15
<210> 32<211> 16<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> CETP 461-476<400> 32
Phe Gly Phe Pro Glu His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser15 10 15
<210> 33<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> gastrina 1-9<400> 33
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu GXu Glu1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu GIu Ala Tyr Gly Trp Met Asp15 10 15
Phe
<210> 35<211> 34
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 35
Glu Leu GIy Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys1 5 10 15
Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30
Asd Phe
<210> 36<211> 18<212> PRT<213> Homo<300> 36
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu AIa Tyr Gly Trp Met Asp1 5 10 15
Phe Gly
<210> 37<211> 35<212> PRT<213> Homo<400> 37
Glu Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val Ala Asp Pro Ser Lys
15 10 15
Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met20 25 30
Asp Phe Gly35
<210> 38<211> 21<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> CGGgastrina 1-17G<400> 38
Cys Gly Gly Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr GIyTrp Met Asp Phe Gly
20
<210> 39<211> 16<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Gastrina 1-9 C2<400> 39
Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu G
Iu Ser Ser Prc- Pro Pro rro Cys10 15
<210> 40<211> 20<212> PRT<213> Seqüência Artificial< 2 2 0 > <223> Gastrina 1-17GGC<400> 40Glu Gl y Pro Trp Leu Glu Glu
5
Phe Gly Gly Cys20
Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp10 15
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Gastrina CGG-17 amida
<400>
Cys Gly Gly Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly
1 5 " 10 15
Trp Met Asp Phe20
<210> 42
<211> 37
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Gastrina cGGi-34.amida< 4OO > 42
Cys Gly Gly Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro Kis Leu Val Ala Asp1 5 10 15
Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30
Gly Trp Met Asp Phe
<210> 4 3<2il> 33<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> Gastrina i-34g<400> 43Cys GI y GIy Gln Leu Gly
10 15
Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr20 25 30
Gly Trp Met Asp Phe Gly35
<210> 44
<211> 32
<212> PRT<213>
Seqüência Artificial
<220>
<223> CCR5 PNt Cys
<220>
<221> misc_feature
<222> (32) .. (32)
<223> Cyséamidada
<400> 44
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15
Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln lie AIa Ala Arg Cys20 25 30
<210>
45<21i> 74<212> PRT<213> Homo<400> 45Thr Le u Gln1 Val Va 1 Lys
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile35 4 0 4 5
jys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Aia Ser Gln Leu Arg Ala Asn50 55 60
Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg65 70
<210> 46<211> 20<212> prt
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> humano C5a 55-74<400> 46
Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met1 5 10 15
Gln Leu Gly Arg20
<210> 47<211> 82<212> -PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> camundongo cgsgg C5a
<400> 47
Cys Gly Ser Gly Glv Asn Leu His Leu Leu Arg Gln Lys Ile Glu Glu1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser Val Pro Lys Lys Cys Cys Tyr Asp2.0 25 30Gly Ala Arg Val Asn Phe Tyr Glu Tnr Cys Glu Glu Arg Val Ala Arg35 40 45
Val Thr Ile Gly Pro Leu Cvs Ile Arg Ala Phe Asn Glu Cys Cys Thr50 55 60
Ile Ala Asn Lys Ile Arg Lys Glu Ser Pro His Lys Pro Val Gln Leu65 7 0 75 80
51y Arg
<210> 48 <211 > 22 <212> PRT <2I3> Seqüência Artificial <220> <223> camundongo cggc5a59-77 <400> 48 Cys Gl y Gly Thr Ile Ala Asn Lys1 '5Pro Va 1 Gln Leu Gly Arg 20<210> 4 9 <211> 12 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
15
<223> CÍCliCO CXCR4 176-185<400> 49
Cys Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile C-Iy15 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg15 10
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens<4 0Q> 51
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe1 5
<210> 52<211> 12<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> CiCÜZadO ECL2A< 4 O O > 52Gly Arg Ser Gln Lys Glu 1 <210> 53<211> 12<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220> <223> CiCÜZadO ECL2<400> 53
Gly Asn Val Ser Gl1J Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys1 5 10
<210> 54
<211> 32
<212> PRT<213>
Seqüência Artificial
<220>
<223> CCR5 PNt domain with C20 to Serine and C fused at the C terrainus<4 00> 54
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15
Ser Glu Pro Ser Gln Lys Ile Asn VaI Lys Gln Ile Ala Ala Arg Cys20 25 30
<210> 55
<2il> 32
<2i2> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> ccr5 PNt CN (cisteína no N-término)
<400> 55Cys Met Asp Tyr Gln Val Ser Ssr Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr1 5 10 15
Thr Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg20 25 30
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> amino acia 23-27 of CCR5 PNt
<400> 56
Ile Asn Val Lys GIn1 5
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> domínio Nta de CCR5 PNt
<400> 57
Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15
Ser Glu Pro
5812PRT
Seqüência Artificial
<220>
<223> domínio Nfb de CCR5 PNt
<400> 58
Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<2i3> Seqüência Artificial
<220>
<223> Ponte de domínio CCR5 NTb
<400> 59
<210><211><212><213>Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys1 5
<210> 60
< 211 > 8
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Ponte de domínio CCR 5 NTb
<4 00> 60

Claims (25)

1. Composição compreendendo:(a) uma partícula semelhante a vírus (VLP) com no mínimo umprimeiro sítio de fixação; e(b) no mínimo um antígeno com no mínimo um segundo sítiode fixação, em que o referido no mínimo um antígeno é um antígeno da in-venção selecionado entre o grupo consistindo em:a) CCR5 da invenção;b) C5a da invenção;c) CXCR4 da invenção;d) Gastrina da invenção; ee) CETP da invenção;e em que (a) e (b) são ligados através do referido no mínimo um primeiro e oreferido no mínimo um segundo sítio de fixação.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo:(a) uma partícula semelhante a vírus de um bacteriófago de RNAcom no mínimo dois primeiros sítios de fixação; e(b) no mínimo um domínio extracelular CCR5 PNt com no míni-mo dois segundos sítios de fixação; em que o referido domínio extracelularCCR5 PNt compreende:(i) um domínio Nta ou um fragmento de domínio Nta, e(ii) um domínio Ntb compreendendo os aminoácidos 23 a-27 de SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:56) ou fragmento de domínio Ntb compre-endendo os aminoácidos 23 a 27 de SEQ ID NO:27, eem que o primeiro ou o segundo dos referidos no mínimo doissegundos sítios de fixação compreende um grupo sulfidrila, eem que o primeiro dos referidos no mínimo dois segundos sítiosde fixação está localizado a montante do N-término dos referidos aminoáci-dos 23 a 27 de SEQ ID NO:27; eem que o segundo dos referidos no mínimo dois segundos sítiosde fixação está localizado a jusante do término de C do referido domínio ex-tracelular CCR5 PNt; eem que a referida VLP do referido bacteriófago de RNA e o refe-rido domínio extracelular CCR5 PNt são ligados por no mínimo uma ligaçãocovalente não peptídica.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o refe-rido domínio extracelular CCR5 PNt com no mínimo dois segundos sítios defixação não compreende um grupo sulfidrila adicional além dos dois grupossulfidrila referidos compreendidos pelos referido primeiro e referido segundodos referidos no mínimo dois segundos sítios de fixação.
4. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que oprimeiro dos referidos no mínimo dois segundos sítios de fixação correspon-de ao grupo sulfidrila do resíduo cisteína de SEQ ID NO:27.
5. Composição de a cordo com qualquer uma das reivindicações-2 a 4, em que o referido domínio extracelular CCR5 PNt compreende a se-qüência de aminoácidos de SEQ ID NO:27.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-2 a 5, adicionalmente compreendendo um ligador, em que o referido Iigadoré fundido ao C-término do referido domínio extracelular CCR5 PNt1 e em queo referido ligador compreende o referido segundo dos referidos no mínimodois segundos sítios de fixação, em que preferencialmente o referido ligadoré uma cisteína ou uma cisteína amidada.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-2 a 6, em que o referido primeiro e o referido segundo dos referidos no mí-nimo dois segundos sítios de fixação associam com os referidos no mínimodois primeiros sítios de fixação através de no mínimo duas ligações covalen-tes não peptídicas.
8. Composição de qualquer uma das reivindicações 2 a 7, emque o referido bacteriófago de RNA é Οβ ou AP205.
9. Composição de qualquer uma das reivindicações 2 a 8, emque cada um dos referidos no mínimo dois primeiros sítios de fixação com-preende um grupo amino.
10. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o re-ferido CCR5 da invenção é um domínio extracelular CCR5, preferencialmen-te o referido domínio extracelular CCR5 é domínio extracelular CCR5 PNt,adicionalmente preferencialmente o referido domínio PNt compreende a se-qüência de aminoácidos como de SEQ ID NO:27.
11. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o re-ferido CCR5 da invenção é um fragmento de domínio extracelular CCR5,preferencialmente o referido fragmento de domínio extracelular CCR5 éfragmento de domínio extracelular CCR5 ECL2A, adicionalmente preferenci-almente o referido fragmento de domínio extracelular CCR5 ECL2 compre-ende uma seqüência de aminoácidos selecionada entre o grupo consistindoem:(a) SEQ ID NO:25; e(b) SEQ ID NO:26.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida gastrina da invenção compreende, consiste essencialmente em, oualternativamente consiste em uma seqüência de aminoácidos selecionadaentre o grupo consistindo em:a) SEQ ID NO:33b) SEQ ID NO:34;c) SEQ ID NO:35;d) SEQ ID NO:36;e) SEQ ID NO:37;
13. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a re-ferida C5a da invenção é uma proteína C5a, preferencialmente a referidaproteína C5a compreende, consiste essencialmente em, ou alternativamenteconsiste em uma seqüência de aminoácidos selecionada entre um grupoconsistindo em:(a) SEQ ID NO:45; e(b) um polipeptídeo derivado de SEQ ID NO:45, no qual três,preferencialmente dois, preferencialmente um aminoácido de SEQ ID NO:45foi modificado por inserção, eliminação e/ou substituição.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou qualqueruma das reivindicações 10 a 13, em que a referida VLP é de um bacteriófa-go de RNA.
15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que oreferido bacteriófago de RNA é Qp1 fr, GA ou AP205.
16. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou qualqueruma das reivindicações 10 a 15, em que a referida VLP com primeiro sítio defixação é encadeada ao referido antígeno da invenção com segundo sítio defixação via no mínimo uma ligação covalente, em que preferencialmente areferida ligação covalente é uma aglutinação peptídica, em que a referidaVLP é de um bacteriófago de RNA AP205.
17. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou qualqueruma das reivindicações 10 a 15, em que o referido primeiro sítio de fixação éligado ao referido segundo sítio de fixação via no mínimo uma ligação cova-lente, em que preferencialmente a referida ligação covalente é uma aglutina-ção não peptídica.
18. Composição de qualquer uma das reivindicações preceden-tes, em que o referido primeiro sítio de fixação compreende, preferencial-mente um grupo amino de uma lisina.
19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções precedentes, em que o referido segundo sítio de fixação compreendeum grupo sulfidrila, preferencialmente um grupo sulfidrila de uma cisteína.
20. Vacina compreendendo a composição de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 19, em que preferencialmente a referidavacina é destituída de um adjuvante.
21. Composição farmacêutica compreendendo:(a) a composição como definida em uma das reivindicações 1a 19 ou a vacina como definido na reivindicação 20; e(b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
22. Método para produzir a composição da reivindicação 1 ouqualquer uma das reivindicações 10 a 19, ou a vacina da reivindicação 20,compreendendo:(a) proporcionar uma VLP com no mínimo um primeiro sítio defixação;(b) proporcionar no mínimo um antígeno da invenção com nomínimo um segundo sítio de fixação; e(c) ligar a referida VLP e o referido no mínimo um antígeno dainvenção para produzir a referida composição, em que o referido no mínimoum antígeno da invenção e a referida VLP são ligados através do referido nomínimo um primeiro e o referido no mínimo um segundo sítio de fixação.
23. Uso da composição como definida nas reivindicações 2 a 11,para a fabricação de um medicamentoo para o tratamento da AIDS.
24. Uso da composição como definida na reivindicação 12, paraa fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer gastrointestinal.
25. Uso da composição como definida na reivindicação 13 paraa fabricação de um medicamento para o tratamento de artrite.
BRPI0612293-0A 2005-06-14 2006-06-14 conjugados antigênicos e usos dos mesmos BRPI0612293A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69009405P 2005-06-14 2005-06-14
US60/690,094 2005-06-14
PCT/EP2006/063198 WO2006134125A1 (en) 2005-06-14 2006-06-14 Antigen conjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0612293A2 true BRPI0612293A2 (pt) 2010-11-03

Family

ID=36869919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0612293-0A BRPI0612293A2 (pt) 2005-06-14 2006-06-14 conjugados antigênicos e usos dos mesmos

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20100111995A1 (pt)
EP (1) EP1896068A1 (pt)
JP (1) JP2008543810A (pt)
KR (1) KR20080015854A (pt)
CN (1) CN101193654A (pt)
AU (1) AU2006259057A1 (pt)
BR (1) BRPI0612293A2 (pt)
CA (1) CA2612069A1 (pt)
IL (1) IL187479A0 (pt)
MX (1) MX2007015781A (pt)
RU (1) RU2007147938A (pt)
WO (1) WO2006134125A1 (pt)
ZA (1) ZA200710488B (pt)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008074895A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Cytos Biotechnology Ag Circular ccr5 peptide conjugates and uses thereof
EP2468295A1 (en) 2010-12-21 2012-06-27 Affiris AG Vaccines based on peptides of the complement protein C5a
SG11201405162YA (en) * 2012-03-28 2014-09-26 Sanofi Sa Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands
EP2666785A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-27 Affiris AG Complement component C5a-based vaccine
WO2016112921A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 University Of Copenhagen Virus-like particle with efficient epitope display
ES2854726T3 (es) 2015-10-30 2021-09-22 The Univ Of Copenhagen Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos
MX2019015769A (es) 2017-06-23 2020-08-03 Verimmune Inc Partículas tipo virus quiméricas y usos de estas como redireccionadores de respuestas inmunitarias específicos para el antígeno.
KR20210110321A (ko) * 2018-12-27 2021-09-07 버이뮨 아이엔씨. 접합된 바이러스-유사 입자 및 항-종양 면역 재유도제로서의 이의 용도
WO2021062037A1 (en) * 2019-09-24 2021-04-01 Auburn University Phage-peptide constructs for stimulation of an anti-cancer immune response against cd47

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1015584A1 (en) * 1997-09-19 2000-07-05 Monsanto Company Dna vaccination against cholesterol ester transfer protein in the treatment of atherosclerosis
TWI229679B (en) * 1998-06-20 2005-03-21 United Biomedical Inc Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens
EP1123114B1 (en) * 1998-10-21 2005-12-28 THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Virus-like particles for the induction of autoantibodies
US7005503B2 (en) * 2002-02-08 2006-02-28 Genetastix Corporation Human monoclonal antibody against coreceptors for human immunodeficiency virus
MX342385B (es) * 2001-08-17 2016-09-27 Genentech Inc Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a c5 y c5a sin evitar la formación de c5b.
DK1443960T3 (da) * 2001-11-07 2009-03-23 Cytos Biotechnology Ag Antigen-arrays der betegner IL-5, IL-13 eller eotaxin til behandling af allergiske eosinofile sygdomme
CN102061288A (zh) * 2002-07-17 2011-05-18 希托斯生物技术股份公司 使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列
AU2004224762B2 (en) * 2003-03-26 2009-12-24 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
US7320795B2 (en) * 2003-07-30 2008-01-22 Vaccine Research Institute Of San Diego Rodent hepatitis B virus core proteins as vaccine platforms and methods of use thereof
EP1791870A1 (en) * 2004-09-21 2007-06-06 Cytos Biotechnology AG Virus-like particles comprising a fusion protein of the coat protein of ap205 and an antigenic polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008543810A (ja) 2008-12-04
IL187479A0 (en) 2008-02-09
EP1896068A1 (en) 2008-03-12
ZA200710488B (en) 2009-04-29
WO2006134125A1 (en) 2006-12-21
RU2007147938A (ru) 2009-07-20
US20100111995A1 (en) 2010-05-06
CA2612069A1 (en) 2006-12-21
WO2006134125A9 (en) 2007-05-10
KR20080015854A (ko) 2008-02-20
CN101193654A (zh) 2008-06-04
AU2006259057A1 (en) 2006-12-21
MX2007015781A (es) 2008-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7572451B2 (en) Gastric inhibitory polypeptide (GIP) antigen arrays and uses thereof
CA2599218C (en) Cat allergen conjugates and uses thereof
US20080292652A1 (en) Virus-Like Particles Comprising a Fusion Protein of the Coat Protein of Ap205 and an Antigenic Polypeptide
BRPI0612293A2 (pt) conjugados antigênicos e usos dos mesmos
US20090123414A1 (en) Il-15 Antigen Arrays And Uses Thereof
JP2008501658A (ja) 非ヒトｔｎｆ−ペプチドの担体コンジュゲートの医学上の使用
JP2006504653A (ja) グレリン−担体複合体
JP2009510025A (ja) インターロイキン−１コンジュゲート及びその使用
US20090123471A1 (en) T-Cadherin antigen arrays and uses thereof
MX2007004854A (en) Gastric inhibitory polypeptide (gip) antigen arrays and uses thereof
MXPA06008170A (en) Ghrelin-carrier conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: NAO APRESENTADA A GUIA DE CUMPRIMENTO DE EXIGENCIA. REFERENTE A 6A ANUIDADE.