ES2854726T3

ES2854726T3 - Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos

Info

Publication number: ES2854726T3
Application number: ES16801955T
Authority: ES
Inventors: Adam Frederik Sander Bertelsen; Ali Salanti; Thor Theander; Susan Thrane; Janitzek Christoph Mikkel; Agerbæk Mette Ørskov; Nielsen Morten Agertoug
Original assignee: Kobenhavns Universitet
Current assignee: Kobenhavns Universitet
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2021-09-22
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: US11129882B2; US20190022206A1; EP3368068B1; WO2017071713A1; DK3368068T3; EP3368068A1; US20200171138A9

Abstract

Una vacuna para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad donde la vacuna comprende: i. una proteína L1 del papilomavirus (PV) que contiene un sitio aceptor de biotina, y ii. una molécula de biotina conjugada enzimáticamente a dicho sitio aceptor de biotina, y iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente, donde la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 [bucle DE, genotipo 16 de HPV] y SEQ ID NO: 2 [bucle HI, genotipo 16 de HPV], donde el antígeno y la proteína PV L1 están unidos mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman una partícula similar a un virus que muestra dicho antígeno y donde el sitio aceptor de biotina comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36.

Description

DESCRIPCIÓN

Partícula similar a virus con presentación eficiente de epítopos

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a una tecnología y un procedimiento para fabricar una vacuna basada en partícula similar a un virus con una presentación efectiva de epítopos y capaz de inducir una respuesta inmune protectora fuerte y a largo plazo. La presente divulgación resuelve el desafío clave de obtener una partícula similar a un virus que presenta un antígeno más grande en la superficie de la partícula a alta densidad, al tiempo que está regularmente espaciado y con una orientación constante; tres factores críticos para obtener una activación óptima del sistema inmunológico.

Antecedentes

Las vacunas han jugado, y aún juegan, un papel importante en la reducción del impacto de las enfermedades infecciosas en la salud global. La primera generación de vacunas se basó en patógenos atenuados o inactivados. Estas vacunas basadas en patógenos completos han demostrado ser extremadamente efectivas y, en algunos casos, (por ejemplo, la viruela) han conducido a la erradicación completa del patógeno diana. Sin embargo, existen serias preocupaciones asociadas con el uso de patógenos completos para la inmunización, ya que se ha observado que inducen efectos secundarios graves con cierta frecuencia en las poblaciones, lo que subraya la necesidad de desarrollar vacunas más seguras (Plotkin SA y col. 2005). Junto con los avances recientes en la tecnología del ADN recombinante y la ingeniería genética, la investigación de vacunas modernas se ha esforzado en identificar dianas antigénicas críticas de anticuerpos neutralizantes con el objetivo de desarrollar las llamadas 'vacunas de subunidades' compuestas únicamente por componentes antigénicos purificados y bien definidos (Murray K. y col. 1988). La inmunogenicidad de las vacunas de subunidades basadas en proteínas solubles es, lamentablemente, baja en comparación con las vacunas completas basadas en patógenos. Por tanto, para inducir una respuesta de anticuerpos de alto título, a menudo es necesario utilizar altas dosis de antígeno, administraciones de refuerzo y coadministración de adyuvantes y, aun así, estas vacunas de subunidades generalmente no son capaces de inducir una inmunidad protectora a largo plazo. De hecho, esto se ejemplifica por las muchas fallas de vacunas observadas con proteínas solubles durante los últimos años y apuntan a un hecho importante: que el tamaño y el ensamblaje espacial del componente del antígeno de la vacuna es crítico para la activación adecuada del sistema inmunológico, lo que demuestra la importancia de respuestas inmunes cualitativas más allá de las cuantitativas.

Partículas Similares a Virus (PSV), que son altamente inmunogénicas y seguras, representan un avance importante en el desarrollo de vacunas de subunidades, combinando muchas de las ventajas de las vacunas basadas en patógenos completos y de las vacunas de subunidades recombinantes. Las PSV están compuestas por una o varias proteínas virales expresadas de manera recombinante que se ensamblan espontáneamente en estructuras macromoleculares de partículas que imitan la morfología de la cubierta del virus nativo, pero que carecen de material genético infeccioso. La naturaleza particulada y el tamaño de las PSV (22-150 nm) parecen ser óptimos para una captación eficiente por parte de las células presentadoras de antígenos profesionales, particularmente las células dendríticas (CD), así como para la entrada en los vasos linfáticos (Bachmann, MF, Jennings, GT.2010). Además, las estructuras de superficie que presentan un antígeno a alta densidad, aunque están espaciadas regularmente y con una orientación constante, son características de los antígenos de superficie microbianos para los que el sistema inmunológico de los mamíferos ha evolucionado para responder vigorosamente. A nivel molecular, la presentación de un epítopo a alta densidad, mientras que está regularmente espaciado y con una orientación constante permite una reticulación eficiente de los receptores de células B (Bachmann, MF y Zinkernagel, RM. 1997) que conduce a respuestas fuertes de células B, incluso en ausencia de ayuda de las células T (Bachmann, m F y col., 1993; Chackerian y col., 1999; Kouskoff, V. y col., 2000) y los datos acumulados de varios estudios indican que las células B, de hecho, discriminan patrones de antígenos a través del grado de reticulación superficial de Ig y usan la repetitividad de antígenos como un discriminador propio/no propio.

Ha sido durante mucho tiempo un objetivo atractivo explotar las PSV como una plataforma de potenciación de la inmunogenicidad para inducir respuestas inmunes contra antígenos heterólogos usándolos como andamios moleculares para la presentación de antígenos. Tradicionalmente, esto se ha logrado mediante la incorporación de epítopos antigénicos en PSV mediante fusión genética (PSV quiméricas) o mediante la conjugación de antígenos con PSV preensambladas. La estrategia con PSV quiméricas es hasta la fecha el procedimiento más común para mostrar epítopos heterólogos en PSV (Pumpens, P y Grens, E. 2001; Bachmann, MF y Jennings, GT, 2004a; Chackerian, 2007; Grgacic, EVL. y Anderson, DA 2006). Sin embargo, esta estrategia está severamente limitada tanto por el tamaño como por la naturaleza de los epítopos que pueden insertarse en las PSV, especialmente en sus regiones inmunodominantes, y en general no ha sido posible insertar péptidos de más de 20 aminoácidos sin perturbar el frágil procedimiento de auto-ensamblaje de las PSV. Además, esta estrategia requiere que ya se hayan identificado epítopos críticos en el antígeno diana y que estos puedan presentarse en una región inmunodominante en la superficie de PSV mientras se mantiene su conformación nativa. Por lo tanto, a pesar de una comprensión cada vez mayor de la estructura/procedimiento de ensamblaje de PSV, la generación de PSV quiméricas sigue siendo un procedimiento de prueba y error y sigue siendo imposible predecir si los péptidos individuales serán compatibles con el ensamblaje de PSV o si las inserciones serán inmunogénicas. Finalmente, debido al pequeño tamaño de las secuencias de péptidos insertadas, la respuesta de anticuerpos inducida será esencialmente monoclonal, lo que en algunos casos establecerá un límite a la potencia de protección.

Por otro lado, la conjugación química, por ejemplo, a través de la biotinilación química de residuos de lisina expuestos, permite la unión de diversos tipos de antígenos diana (incluidas las dianas no proteicas) a las PSV y esta estrategia generalmente no está restringida por el tamaño del antígeno (Raja KS. y col. 2003 y otros). Sin embargo, con esta estrategia es muy desafiante, si no imposible, controlar la orientación y la cantidad/estequiometría total del antígeno acoplado, lo que afecta tanto la densidad como la regularidad de los epítopos mostrados y, por lo tanto, limita potencialmente la respuesta inmune. Además de esto, los procedimientos de acoplamiento químico rara vez son compatibles con la producción de vacunas a gran escala. Como resultado, las tecnologías actuales no son suficientes para asegurar la presentación de antígenos de PSV a alta densidad, mientras están espaciados regularmente y con una orientación constante, que son tres factores críticos para obtener una activación fuerte y duradera del sistema inmunológico.

Sun Wenchao y col. (Non-covalent ligand conjugation to biotinylated DNA nanoparticles using TAT peptide genetically fused to monovalent streptavidin, Journal of Drug Targeting, vol. 400A, p. 241-245, 1997) describe un vector que comprende un polinucleótido que codifica el antígeno TAT del VIH. fusionado con estreptavidina.

Staszczak y col. (An in vitro method for selective detection of free monomeric ubiquitin by using a C-terminally biotinylated form of ubiquitin, International Journal of Biochemistry and Cell Biology, vol. 39, no. 2, p. 319-326, 2006) describe un vector que comprende un polinucleótido que codifica una biotina ligasa capaz de biotinilar un sitio aceptor de biotina.

EP 1637166 describe una PSV que presenta un antígeno a través del sistema estreptavidina-biotina donde un sitio aceptor de biotina se encuentra en el papilomavirus L1.

WO 2015/004158 describe la unión de un antígeno a rotavirus a través del sistema estreptavidina-biotina usando el péptido aceptor de biotina AviTag.

En resumen:

□ La inducción de una respuesta inmune fuerte y duradera a los patógenos, así como a los antígenos asociados a enfermedades, es muy difícil de obtener con las vacunas de subunidades.

□ La presentación de antígenos de partículas similares a virus (PSV) ha demostrado ser muy efectiva para inducir respuestas inmunes a largo plazo altamente funcionales.

□ El acoplamiento de un antígeno a la superficie de una PSV, para asegurar una presentación de alta densidad de epítopos espaciados regularmente, representa un desafío biotecnológico importante.

□ Específicamente, el principal desafío de las actuales plataformas de administración de PSV es presentar un antígeno en la superficie de la PSV, a alta densidad y con una orientación constante para permitir un espaciado regular, de alta densidad, de los epítopos presentados, lo cual es importante para inducir una inmunidad protectora a largo plazo. Resumen

La presente divulgación resuelve los desafíos de obtener una PSV que presente antígenos de superficie espaciados densa y regularmente con una orientación constante, capaz de presentar epítopos de manera eficiente e inducir inmunidad protectora a largo plazo en un sujeto. El concepto general de la presente divulgación se ilustra en la figura 1. Los presentes inventores han identificado regiones de PSV del papilomavirus (PV) donde los inventores pueden insertar un sitio aceptor de biotina, sin comprometer el autoensamblaje de la partícula. Además, los inventores han logrado configurar un sistema para producir antígenos fusionados a una estreptavidina monovalente, lo que asegura el control de la orientación del antígeno acoplado. La biotinilación enzimática de las PSV del papilomavirus humano (VPH) facilita el enlace con el antígeno/estreptavidina monovalente y asegura el control de la cantidad/estequiometría general, así como la presentación de antígenos de una manera ordenada densamente y repetitiva con una orientación constante que es importante para producir una presentación eficiente de epítopos y, en consecuencia, una potente respuesta inmune. El andamio de presentación de antígenos descrito es único ya que por primera vez permite el acoplamiento de prácticamente cualquier antígeno a alta densidad en una superficie de PSV, presentando así matrices ordenadas de los antígenos particulares que se mantienen todos en la misma orientación, resolviendo así tres problemas clave de montar una respuesta inmune eficiente. El sistema puede usarse tanto para alcanzar a autoantígenos (es decir, tolerancia a la ruptura) como para alcanzar eficazmente a organismos infecciosos.

Los problemas descritos anteriormente se resuelven mediante los aspectos y realizaciones de la presente divulgación caracterizados en las reivindicaciones. Como se ilustra en la figura 1, un aspecto principal de la presente divulgación se refiere a una vacuna para uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad donde la vacuna comprende:

i. una proteína L1 del papilomavirus (PV) que contiene un sitio aceptor de biotina, y

ii. una molécula de biotina conjugada enzimáticamente a dicho sitio aceptor de biotina, y

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde el antígeno y la proteína PV L1 están unidos mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman una partícula similar a un virus que presenta dicho antígeno.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica

i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y

iii. un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente como se ilustra en la figura 1.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una célula huésped que expresa al menos un polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende dicha vacuna.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende dicha vacuna, donde el procedimiento comprende las etapas de

i. obtener un primer polipéptido; una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y

ii. obtener un segundo polipéptido; una biotina ligasa, capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y iii. obtener un tercer polipéptido; un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente, y

iv. someter el primer polipéptido a condiciones que permitan la formación de partículas similares a virus, y v. permitir la biotinilación enzimática del sitio aceptor de biotina de dichas partículas similares a virus usando dicho segundo polipéptido, y

vi. obtener una vacuna mediante la unión del tercer polipéptido y dichas partículas similares a virus mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de dichas partículas similares a virus, y

vii. generar una composición que comprende dicha vacuna,

obteniendo así una composición farmacéutica.

Aún un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de administración de dicha vacuna para tratar y/o impedir una condición clínica en un sujeto que lo necesita, que comprende las etapas de:

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna, y/o

ii. administrar dicha composición a un sujeto al menos una vez para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad.

En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un kit de piezas que comprende i. una composición que comprende una vacuna, y

ii. un instrumento médico u otro medio para administrar la vacuna, y

iii. instrucciones sobre cómo utilizar el kit de piezas.

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna, y

Descripción de los Dibujos

Figura 1. Representación esquemática de los componentes de la vacuna de PSV VAR2CSA y el sistema de ensamblaje.

a. Estructura de la proteína de la cápside principal de HPV16 L1. La secuencia aceptora de biotina (AviTag™) se insertó con éxito en los bucles DE y HI que sobresalen y en la espiral H4-pJ (recuadros azules) de1HPV16 L1. Los recuadros grises representan regiones (bucles y espirales) de la proteína L1 donde no se pudo insertar AviTag™ (bucle FG) o no se ha investigado. El antígeno VAR2CSA abarca los dominios extracelulares ID1-ID2a (ID1 -Interdominio 1, DBL2X - Unión Duffy como 2X e ID2a - Interdominio 2a) del VAR2CSA de longitud completa fusionado en el extremo N-terminal a una estreptavidina monovalente (mSA) descrita anteriormente (Lim y col., 2011). b. Procedimiento de producción de pSv de HPV16 Avi-L1 que muestran antígenos de mSA-VAR2 orientados constantemente de manera repetitiva a alta densidad. El VPH16 Avi-L1 y el antígeno de la vacuna mSA se expresan por separado. Las Avi-PSV de HPV16 se biotinilan in vitro (el triángulo representa BirA ligasa) y finalmente se mezclan con el antígeno soluble de la vacuna mSA. En teoría, se espera que la PSV de HPV16 Avi-L1 se una a un antígeno mSA-VAR2CSA por Avi-L1.

Figura 2: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus HPV AviTag-L1. Las imágenes TEM muestran PSV no agregadas (intervalo de tamaño: 28-60 nm) ensambladas a partir de construcciones de HPV16 L1-Avi biotiniladas (SEQ ID NO. 1-3), respectivamente. Barra de escala = 200 nm.

Figura 3: Eficacia de acoplamiento PSV/mSA-antígeno. La figura muestra geles de SDS-PAGE (condiciones reducidas) con cantidades relativas de antígenos de mSA acoplados (mSA-ID1ID2a-HIS SEQ ID NO. 21; mSA-IL-5 (C63T/C105T) SEQ ID NO. 19; HIS-GMZ2T: ggsmSA SEQ ID NO. 25; mSA-Her2-ECD|23-686 SEQ ID NO. 18) y proteína AviTag-L1 (SEQ ID NO. 2). Hay un estimado de 0,8-1,0 mSA-antígeno por proteína AviTag-L1 en las fracciones que contienen PSV.

Figura 4: Microscopía electrónica de transmisión de partículas similares al virus HPV AviTag-L1 acopladas con diferentes antígenos mSA (mSA-ID1ID2a-HIS SEQ ID NO. 21; mSA-IL-5 (C63T/C105T) SEQ ID NO. 19; HIS -GMZ2T: ggsmSA SEQ ID NO. 25; mSA-Her2-ECD | 23-686 SEQ ID NO. 18) y proteína AviTag-L1 (SEQ ID NO.

2). Las imágenes de TEM muestran PSV no agregadas ensambladas a partir de construcciones de L1-Avi de HPV16 biotiniladas (SEQ ID NO. 2), respectivamente. El tamaño medio aparente de las PSV acopladas al antígeno mSA parece (~5-10 nm) más grande que las PSV no acopladas correspondientes. Barra de escala = 200 nm. Figura 5. Verificación del autoensamblaje y posterior biotinilación in vitro de PSV de Avi-L1 de HPV16 a. La purificación de las PSV (HI) de PSV de HPV16 Avi-L1 se realizó mediante ultracentrifugación (UC) en un gradiente de densidad de iodixanol (Optiprep™) (27 %/33 %/39 %). Análisis de SDS-PAGE reducidos posteriores mostraron la presencia de una banda de proteína de 56 kDa (tamaño teórico de Avi-L1) en las fracciones de UC de alta densidad [4-6] que contienen material particulado. b. Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) del material que representa la fracción 4 de UC después de la purificación de UC. Para verificar la integridad de las PSV quiméricas de HPV16 Avi-L1 (HI), se colocó una alícuota de partículas diluidas en rejillas recubiertas de carbón, se tiñó negativamente con ácido fosfotúngstico al 2 % (pH = 7,0) y se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando un CM 100 BioTWIN a un aumento de x 36.000 (A), barra de escala de 80 nm. c. Análisis por Western blot de la fracción 4 después de la purificación por UC. Western blot demuestra la presencia de HPV16 Avi-L1 (56 kDa) detectada por Camvir-1 (carril uno) y biotinilación exitosa de HPV16 Avi-L1 usando Strep-HRP para detectar biotina (carril dos).

Figura 6. PSV de HPV16 Avi-L1 acoplada a mSA-ID1-ID2a analizada por ultracentrifugación seguida de SDS-PAGE, Western blot y análisis TEM a Después del acoplamiento del antígeno mSA-ID1-ID2a a la PSV de HPV16 Avi -L1, el exceso de antígeno se eliminó mediante UC sobre un gradiente de Optiprep™ (27 %/33 %/39 %). El análisis de SDS-PAGE reductor mostró la presencia de dos bandas de proteínas correspondientes al tamaño de HPV16 Avi-L1 (56kDa) y mSA-VAR2CSA (85kDa), respectivamente, en las fracciones de alta densidad [4-6] después de la purificación por UC. El exceso de mSA-VAR2CSA no unido estaba presente en las fracciones de UC superiores [12-14] que contienen proteínas solubles. B Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de material de la fracción 4 de UC que contiene PSV de Avi-L1 de HPV16 acopladas con mSA-VAR2CSA. Se colocó una alícuota de partículas diluidas sobre rejillas recubiertas de carbón, se tiñó negativamente con ácido fosfotúngstico al 2 % (pH = 7,0) y se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) usando un CM 100 BioTWIN a un aumento x 36.000 (A). Barra de escala negra 200 nm, barra de escala blanca de sección mejorada 40 nm. C Análisis por Western blot de la fracción 4 después de la purificación por UC de una mezcla de HPV16 Avi-L1 y mSA-VAR2CSA. Western blot confirma la presencia de HPV16 Avi-L1 y mSA-VAR2CSA detectados por Camvir-1 y a-PENTA HIS-tag, respectivamente.

Figura 7. Otras PSV PV con AviTag™ insertadas en bucle de DE.

La PSV HPV16 L1 se utilizó como plataforma de PSV para prueba de concepto en este estudio. Sin embargo, el AviTag™ también se puede insertar en el bucle de DE de la proteína de la cápside principal de otros papilomavirus mientras se conserva la capacidad de autoensamblarse en PSV, como se demuestra en esta figura. A Alineación de secuencia múltiple de HPV16 L1, HPV118 L1 y la proteína de la cápside principal del papilomavirus europeo Elk (Alces alces) (Pa PVE). B La purificación de las pSv de HPV118 Avi-L1 y PAPVE Avi-L1 se realizó mediante UC sobre un gradiente de densidad de Optiprep™ (27 %/33 %/39). El subsiguiente análisis de SDS-PAGE reducido de fracciones de UC de alta densidad [3-5] muestra la presencia de una banda de proteína de 56 kDa correspondiente a la proteína Avi-L1 de longitud completa. Estas fracciones también contienen una banda de proteína intensa de aproximadamente 43 kDa, que puede representar un producto Avi-L1 truncado.

Figura 8. Reactividad de sueros de ratones vacunados por ELISA.

Se inmunizaron ratones C57BL/6 tres veces con intervalos de tres semanas. Se recolectaron muestras de suero dos semanas después de cada inmunización. Se midió la inmunoglobulina específica de VAR2CSA total en una dilución en serie de antisueros de ratón mediante ELISA utilizando VAR2CSA recombinante como antígeno de captura en fase sólida. Se utilizaron anticuerpos Ig anti-ratón conjugados con HRP para la detección midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm. La reactividad sérica de ratones individuales vacunados con PSV de Avi-L1 (HI) de HPV16 acoplado a mSA-VAR2CSA (azul) o mSA-VAR2CSA desacoplado (rojo) se muestran después de la primera (a), segunda (b) y tercera (c) inmunización donde cada línea muestra la reactividad de un animal. Las curvas verdes representan sueros de ratones vacunados con VAR2CSA desnudo soluble y es un pool de sueros obtenidos después de la 2a y la 3a hemorragia.

Figura 9. Presentación de VAR2CSA en PSV en L1-AviTag de HPV16 evaluadas mediante ensayo de inhibición de parásitos.

La respuesta funcional del anticuerpo se evaluó midiendo la capacidad de los antisueros de ratón para inhibir la unión entre VAR2CSA nativa expresada en eritrocitos parasitados y CSA en un ensayo de unión estático.Los glóbulos rojos infectados con P. falciparum (genotipo FCR3), que expresan la VAR2CSA nativa, se incubaron primero con antisuero de ratón (serie de dilución de 4 veces, a partir de 1:50) y a continuación se dejaron incubar en placas recubiertas con decorina durante 90 min. Los IE no unidos se eliminaron por lavado y los IE restantes se cuantificaron. La unión normalizada del parásito después de la incubación con antisueros combinados de ratones (n = 5) vacunados con PSV de Avi-L1 de HPV16 acoplado a mSA-VAR2CSA (azul) o mSA-VAR2CSA soluble (rojo) se muestran después de la primera (a), la segunda ( b) y tercera (c) inmunización. Los cúmulos verdes en la Figura 6c representan anti-sueros de ratones vacunados VAR2CSA desnudo soluble y es un pool de sueros de 2a y 3a hemorragia.

Figura 10. Experimento de control en el que se mezclaron PSV no biotiniladas con mSA-VAR2CSA. SDS PAGE muestra que la ultracentrifugación separó eficazmente la mSA-VAR2CSA soluble de las PSV no biotiniladas.

Figura 11. Inmunotolerancia a un auto-antígeno asociado al cáncer "Survivina". a. Todos los ratones inmunizados con survivina-PSV (mSA-Survivina acoplada a HPV Avi-L1 (HI-LOOP)) (n = 3) indujeron respuestas de anticuerpos de alta titulación contra el autoantígeno mSA-survivina, mientras que la vacuna de control negativo no fue capaz de romper la tolerancia inmune en los ratones inmunizados (sin sero-conversión). b. Los mismos antisueros en ELISA usando mSA-survivina como antígeno capturador de fase sólida, lo que demuestra que los ratones de control negativo produjeron anticuerpos contra la parte mSA "extraña".

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención. La presente divulgación resuelve el desafío de conjugar proteínas más grandes (por ejemplo, antígenos de longitud completa) a alta densidad y en una orientación consistente sobre la superficie de una ^pS^v, obteniendo así PSV que presentan matrices densamente y repetitivas de epítopos heterólogos. La solución de la presente divulgación representa una estrategia novedosa para hacer una plataforma versátil de administración de vacunas basada en PSV capaz de mostrar eficazmente epítopos antigénicos y de inducir inmunidad protectora a largo plazo.

Un aspecto general de la presente divulgación se ilustra en la figura 1b.

Definiciones

El término "PV" se refiere al papilomavirus.

El término "proteína L1" se refiere a la proteína L1 de la cápside principal del papilomavirus, que tiene la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en partículas similares a virus (PSV). Las proteínas L1 de la presente divulgación presentan antígenos.

El término "Partícula Similar a Virus" o "PSV" se refiere a una o varias proteínas virales expresadas recombinantemente que se ensamblan espontáneamente en estructuras particuladas macromoleculares que imitan la morfología de una cubierta del virus, pero que carecen de material genético infeccioso.

El término "autoensamblaje" se refiere a un procedimiento en el que un sistema de componentes preexistentes, bajo condiciones específicas, adopta una estructura más organizada a través de interacciones entre los propios componentes. En el presente contexto, el autoensamblaje se refiere a la capacidad intrínseca de L1, la principal proteína de la cápside del papilomavirus, de autoensamblarse en partículas similares a virus en ausencia de L2 u otras proteínas del papilomavirus, cuando se somete a condiciones específicas. El procedimiento de autoensamblaje puede ser sensible y frágil y puede estar influenciado por factores tales como, entre otros, la elección del huésped de expresión, la elección de las condiciones de expresión y las condiciones para la maduración de las partículas similares a virus.

El término "orientación consistente", como se usa en esta invención, se refiere a la orientación de las construcciones de estreptavidina/antígeno monoméricas de la presente divulgación y su orientación espacial a la proteína de la cápside principal del papilomavirus (PV L1) de la presente divulgación. Cuando se une un antígeno fusionado a una estreptavidina monomérica a una PSV de proteína PVL1 que comprende un sitio aceptor de biotina con una molécula de biotina conjugada enzimáticamente con el sitio aceptor de biotina, la estreptavidina monomérica solo se puede unir a una única proteína PV L1, creando así una presentación uniforme y/o consistente de dicho antígeno con una orientación consistente. En contraste, un homo-tetrámero de estreptavidina puede reticular varias proteínas PV L1 en la superficie de una PSV, creando así una orientación irregular y no consistente de dicho antígeno. Además, es muy difícil usar una estreptavidina homo-tetrámero como molécula puente, por ejemplo, para conjugar antígenos biotinilados en PSV biotiniladas, ya que los múltiples sitios de unión de biotina permitirán la reticulación y agregación de las PSV biotiniladas.

El término "regularmente espaciado" como se usa en esta invención, se refiere a antígenos de la presente divulgación que forman un patrón en la superficie de una PSV. Dicho patrón puede ser un patrón de antígenos simétrico, en forma de círculo y/o en forma de ramo.

El término "tratamiento" se refiere a la remediación de un problema de salud. El tratamiento también puede ser preventivo y/o profiláctico o reducir el riesgo de aparición de una enfermedad y/o infección. El tratamiento también puede ser curativo o mejorar una enfermedad y/o infección.

El término "profilaxis" se refiere a la reducción del riesgo de aparición de una enfermedad y/o infección. La profilaxis también puede referirse a la prevención de la aparición de una enfermedad y/o infección.

El término "bucle" se refiere a una estructura secundaria de un polipéptido donde la cadena polipeptídica invierte su dirección general y también puede denominarse un giro.

El término "cóctel de vacunas" se refiere a una mezcla de antígenos administrados juntos. Un cóctel de vacunas se puede administrar como una dosis única o como varias dosis administradas durante un período de tiempo. Los intervalos de tiempo pueden ser, entre otros, la administración dentro del mismo año, mes, semana, día, hora y/o minuto. La covacunación y el cóctel de vacunas se pueden usar indistintamente.

El término "autoantígenos" se refiere a antígenos endógenos que se han generado dentro de células previamente normales como resultado del metabolismo celular normal, o debido a una infección bacteriana viral o intracelular. El término "sitio aceptor de biotina" se refiere a una secuencia de péptidos capaz de unirse a una molécula de biotina. Sitio aceptor de biotina y AviTag se usan indistintamente en esta invención.

El término "variante de secuencia" se refiere a un polipéptido y/o secuencia de polinucleótidos con al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con dicha secuencia de polipéptido y/o polinucleótido.

Vacuna a base de PSV

La expresión de proteínas estructurales virales, como las proteínas Envoltura o Cápside, puede resultar en el autoensamblaje de partículas similares a virus (PSV). Las PSV se parecen a los virus, pero no son infecciosas ya que no contienen ningún material genético viral. A los efectos de la inmunización activa, las PSV han demostrado ser altamente inmunogénicas y proporcionan una alternativa más segura a los virus atenuados, ya que carecen de material genético. Además, las PSV son una herramienta útil para el desarrollo de vacunas y se pueden usar como andamios moleculares para la presentación eficiente de epítopos de antígenos. Esto se ha logrado mediante la inserción genética o mediante estrategias de conjugación química. Sin embargo, generalmente no ha sido posible incorporar péptidos de más de 20 aminoácidos sin interrumpir el procedimiento de autoensamblaje de las PSV quiméricas. Al mismo tiempo, las tecnologías actuales que utilizan la conjugación química no son suficientes para permitir la presentación de PSV de proteínas más grandes a alta densidad y con una orientación consistente para asegurar una presentación ordenada y de alta densidad de epítopos de antígenos repetitivos, que son factores críticos para obtener respuestas inmunes fuertes y de larga duración.

Los presentes inventores han resuelto estos problemas mediante una estrategia novedosa para unir antígenos a una PSV de PV L1 utilizando un sitio aceptor de biotina, una molécula de biotina y una etiqueta de estreptavidina monovalente sin alterar el autoensamblaje de la PSV. Por tanto, en un aspecto principal de la presente divulgación, como se ilustra en la figura 1b, la presente divulgación se refiere a una vacuna para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad donde la vacuna comprende:

i. una proteína L1 del virus del papiloma (PV) que contiene un sitio aceptor de biotina, y

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

En una realización de la presente divulgación, la proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina es capaz de formar una partícula similar a un virus.

Los inventores de la presente descripción han demostrado la formación de PSV usando células de insecto, tales como High Five de células Sf9 incubadas a 28°C.La maduración in vitro puede ocurrir durante 18 a 24 horas a 30°C - 37°C. También pueden funcionar otras condiciones y huéspedes de expresión (como Pichia Pastoris).

En una realización de la presente divulgación, el antígeno es capaz de provocar una reacción inmune en un animal, como un mamífero, como una vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, llama, ratón, rata, mono, lo más preferiblemente como un ser humano; o un pájaro como un pollo, o un pez como un salmón.

Ha sido durante mucho tiempo un objetivo atractivo explotar las PSV como una plataforma de potenciación de la inmunogenicidad para inducir respuestas inmunes contra antígenos heterólogos usándolos como andamios moleculares para la presentación de antígenos. Por tanto, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un andamio de presentación de antígenos, que comprende una partícula similar a un virus ensamblada que comprende:

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde el antígeno y la proteína PV L1 están unidos mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman un andamio de presentación de antígeno.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producir una matriz de antígenos repetitiva, ordenada y no de origen natural que comprende

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde el antígeno y la proteína PV L1 están unidos mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman una matriz de antígenos repetitiva, ordenada y no natural.

Enfermedades e indicaciones médicas.

La presente divulgación es una estrategia novedosa, genérica y fácil de usar para conjugar varios antígenos a una PSV. Dependiendo del antígeno, las vacunas basadas en PSV de la presente divulgación se pueden usar para la profilaxis y/o el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Las enfermedades para las que se puede usar la presente divulgación como profilaxis y/o tratamiento incluyen, pero no se limitan a, cánceres, enfermedades cardiovasculares, enfermedades alérgicas y/o enfermedades infecciosas.

En una realización de la presente divulgación, un antígeno que está asociado con al menos una enfermedad cancerosa se une a la proteína PV L1 a través de la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna de PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer y/o cánceres con los que está asociado el antígeno.

En una realización de la presente divulgación, un antígeno que está asociado con al menos una enfermedad cardiovascular se une a la proteína PV L1 mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna de PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad cardiovascular y/o enfermedades cardiovasculares con las que está asociado el antígeno.

En una realización de la presente divulgación, un antígeno que está asociado con al menos una enfermedad alérgica se une a la proteína PV L1 a través de la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna de PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad alérgica y/o enfermedades alérgicas con las que está asociado el antígeno.

En una realización de la presente divulgación, un antígeno que está asociado con al menos una enfermedad infecciosa se une a la proteína PV L1 mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína Pv L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna de PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad infecciosa y/o enfermedades infecciosas con las que está asociado el antígeno.

Una lista no exhaustiva de antígenos que pueden ser usados por la presente divulgación se describe en la tabla 1 y la tabla 2. Además, la tabla 1 muestra ejemplos de enfermedades específicas con las que los antígenos están asociados así como ejemplos de grupos de pacientes que pueden necesitar profilaxis y/o tratamiento usando las vacunas de antígeno-PSV de la presente divulgación.

Tabla 1 Lista no exhaustiva de antígenos o partes de los mismos que podrían usarse en el tratamiento de enfermedades/indicaciones médicas específicas en varios grupos de pacientes.

Los antígenos descritos también pueden ser relevantes para el uso en otros grupos de pacientes y/o contra otras enfermedades específicas o relacionadas. En una realización de la presente divulgación, se pueden combinar al menos dos, como tres, cuatro y/o cinco antígenos.

Tabla 2: Lista no exhaustiva de enfermedades/indicaciones médicas y antígeno/organismos diana de la resente vacuna de PSV.

La vacuna de la presente divulgación también puede usarse contra otras enfermedades y/o usar otros antígenos. En una realización de la presente divulgación, la indicación médica se selecciona de entre el grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad cardiovascular, una alergia y/o una enfermedad infecciosa. En una realización particular de la presente divulgación, la indicación médica es una alergia. En una realización particular de la presente divulgación, la indicación médica es una enfermedad cardiovascular. En una realización más preferida de la presente divulgación, la indicación médica es un cáncer.

En otra realización de la presente divulgación, el antígeno es un polipéptido, péptido y/o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una respuesta fisiológica anormal tal como una enfermedad cardiovascular y/o una reacción/enfermedad alérgica. En una realización particular de la presente divulgación, la respuesta fisiológica anormal es un cáncer.

En una realización adicional de la presente divulgación, el antígeno es una proteína, péptido y/o un fragmento antigénico asociado con una indicación médica descrita en la presente divulgación.

Cáncer y antígenos asociados

En 2012, más de 14 millones de adultos fueron diagnosticados con cáncer y hubo más de 8 millones de muertes por cáncer en todo el mundo. En consecuencia, existe la necesidad de tratamientos eficaces contra el cáncer.

Una característica de las células cancerosas son los niveles anormales de expresión de genes y proteínas. Un ejemplo de un gen asociado al cáncer es el HER2, que se sobreexpresa en el 20 % de todos los cánceres de mama y está asociado con un mayor potencial metastásico y una escasa supervivencia del paciente. Aunque las células cancerosas expresan antígenos asociados al cáncer de una manera que las distingue inmunológicamente de las células normales, la mayoría de los antígenos asociados al cáncer son sólo débilmente inmunogénicos porque la mayoría de los antígenos asociados al cáncer son proteínas "propias" que generalmente son toleradas por el huésped. La presente divulgación ha resuelto este problema mediante una vacuna basada en antígeno-PSV efectiva que es capaz de activar el sistema inmunológico para reaccionar contra, por ejemplo, antígenos asociados al cáncer y superar la tolerancia inmunológica a dichos antígenos. Los diferentes cánceres se caracterizan por tener diferentes antígenos asociados al cáncer. Se considera que la Survivina se sobreexpresa en la mayoría de las células cancerosas y también podría usarse en la presente descripción. Por lo tanto, la presente divulgación puede usarse en el tratamiento/profilaxis de la mayoría de los tipos de cánceres que sobreexpresan un antígeno asociado a un tumor.

El antígeno está unido a la proteína PV L1 de la presente divulgación mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1 (véase la figura 1b para el concepto general de la presente divulgación). Por tanto, la presente divulgación proporciona una vacuna basada en antígeno-PSV efectiva que es capaz de activar el sistema inmunológico para reaccionar contra, por ejemplo, antígenos asociados al cáncer y superar la tolerancia inmunológica a tales antígenos. En una realización, la vacuna de PSV de la presente divulgación puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer con el que está asociado el antígeno.

Una realización de la presente divulgación comprende un antígeno asociado al cáncer unido a la proteína PV L1 mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna de PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer con el que está asociado el antígeno. En otra realización de la presente divulgación, la presente divulgación se usa en el tratamiento/profilaxis de cualquier tipo de cáncer que sobreexpresa un antígeno. El tipo de cáncer contra el que se puede usar la divulgación se determina mediante la elección del antígeno.

Se sabe que los oncovirus pueden causar cáncer. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la vacuna comprende un antígeno asociado a oncovirus unido a la proteína PV L1 mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1. En una realización adicional de la presente divulgación, la presente vacuna se puede usar para la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer con el que está asociado el antígeno.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno es una proteína o péptido o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con un cáncer seleccionado de entre el grupo que comprende cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, Cáncer de vejiga, cáncer óseo, tumores cerebrales/del sistema nervioso central en adultos, tumores cerebrales/del sistema nervioso central en niños, cáncer de mama, cáncer de mama en hombres, cáncer en adolescentes, cáncer en niños, cáncer en adultos jóvenes, cáncer de primario desconocido, enfermedad de Castleman, Cáncer cervical , Cáncer de colon/recto, Cáncer del endometrio, Cáncer de esófago, Familia de tumores de Ewing, Cáncer ocular, Cáncer de la vesícula biliar, Tumores carcinoides gastrointestinales, Tumor del estroma gastrointestinal, Enfermedad trofoblástica gestacional, Enfermedad de Hodgkin, Sarcoma de Kaposi, Cáncer renal, Cáncer laríngeo e hipofaríngeo, Leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia en niños, cáncer del hígado, Cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumor carcinoide del pulmón, linfoma, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal y de los senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, Linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin en niños, cáncer de la orofaringe y de la cavidad oral, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer del páncreas, cáncer del pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de tejido blando en adultos, sarcoma, cáncer de piel, cáncer de piel de células basales y escamosas, cáncer de piel melanoma, cáncer de piel de células de Merkel, cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer del timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de la vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.

En una realización preferida de la invención, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de ovario y carcinoma seroso uterino.

La unión de Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina o un fragmento antigénico del mismo con la PSV forma una vacuna basada en PSV que es capaz de activar el sistema inmunológico para que reaccione contra, por ejemplo, células con alta expresión de Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina y superar la tolerancia inmunológica. En una realización de la presente divulgación, la vacuna de PSV Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad cancerosa descrita en esta invención y/u otras enfermedades cancerosas. Usando un razonamiento similar, se pueden usar otras vacunas basadas en antígeno-PSV asociadas a enfermedades cancerosas contra cualquier enfermedad cancerosa.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno es Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina o un fragmento antigénico del mismo, donde el antígeno está asociado y dirigido contra al menos uno de los presentes tipos de cánceres divulgados en esta invención.

En una realización más preferida de la invención, la presente divulgación se refiere a una vacuna para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de uno de los cánceres divulgados en esta invención donde la vacuna comprende: i. una proteína L1 del papilomavirus (PV) que contiene un sitio aceptor de biotina, y

iii. un antígeno asociado al cáncer como Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina o un fragmento antigénico de Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde el antígeno y la proteína PV L1 se unen mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman una partícula similar a un virus que presenta dicho antígeno.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente se selecciona de entre el grupo que comprende SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y/o SEQ ID NO: 47 y/o una variante de secuencia de los mismos.

Enfermedades cardiovasculares y antígenos asociados

Se estima que 17,3 millones de personas murieron de enfermedades cardiovasculares en 2008, lo que representa el 30 % de todas las muertes mundiales. Abordar los factores de riesgo como el consumo de tabaco, las dietas malsanas y la obesidad, la inactividad física, la hipertensión arterial, la diabetes y los lípidos elevados son importantes para la prevención de enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, la necesidad de medidas farmacéuticas preventivas es cada vez más importante. La presente divulgación puede usarse en el tratamiento/profilaxis de la mayoría de los tipos de enfermedades cardiovasculares. El tipo de enfermedad cardiovascular contra la que se puede utilizar la divulgación se decide mediante la elección del antígeno.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno es una proteína o péptido o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una enfermedad seleccionada de entre el grupo que comprende un trastorno lipídico tal como hiperlipidemia, tipo I, hiperlipidemia tipo II, tipo III, tipo IV o tipo V, hipertrigliceridemia secundaria, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, xantomatosis, deficiencia de colesterol acetiltransferasa, afección ateriosclerótica (p. ej., aterosclerosis), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardiovascular y enfermedad de Alzheimer.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno es una proteína o péptido o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una enfermedad cardiovascular. En una realización adicional de la presente divulgación, la enfermedad cardiovascular se selecciona de entre el grupo que consiste en dislipidemia, aterosclerosis e hipercolesterolemia. Un ejemplo de polipéptido asociado con una enfermedad cardiovascular es PCSK9 que actúa en la homeostasis del colesterol. El bloqueo de PCSK9 tiene importancia médica y puede reducir los niveles de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) en plasma y/o suero. La reducción de LDL-C reduce el riesgo de, por ejemplo, ataques cardíacos.

La unión del antígeno PCSK9 a la PSV forma una vacuna basada en PCSK9-PSV que es capaz de activar el sistema inmunológico para reaccionar contra, por ejemplo, células con alta expresión de PCSK9 y superar la tolerancia inmunológica a PCSK9, lo que reduce los niveles de LDL-C y el riesgo de ataques cardíacos. En una realización de la presente divulgación, la vacuna PCSK9-PSV puede usarse para la profilaxis y/o el tratamiento de la enfermedad cardiovascular y/u otras enfermedades cardiovasculares descritas en esta invención. Usando un razonamiento similar, se pueden usar otras vacunas basadas en antígeno-PSV asociadas a enfermedades cardiovasculares contra cualquier enfermedad cardiovascular.

En una realización preferida de la presente divulgación, el antígeno comprende PCSK9 o un fragmento antigénico de la misma, donde el antígeno está asociado y dirigido contra al menos una de las enfermedades cardiovasculares y/u otras enfermedades cardiovasculares descritas en esta invención.

En una realización más preferida de la invención, la presente divulgación se refiere a una vacuna para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de al menos una de las enfermedades cardiovasculares descritas en esta invención donde la vacuna comprende:

iii. un antígeno asociado a una enfermedad cardiovascular tal como PCSK9 o un fragmento antigénico del mismo fusionado con una estreptavidina monovalente,

En una realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende la SEQ ID NO: 20 y/o una variante de secuencia de la misma.

Asma o enfermedades alérgicas y antígenos asociados.

La prevalencia de las enfermedades alérgicas en todo el mundo está aumentando drásticamente tanto en los países desarrollados como en los países en desarrollo. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud, cientos de millones de sujetos en el mundo padecen rinitis alérgica y se estima que 300 millones padecen de asma que afecta notablemente la calidad de vida de estas personas e impacta negativamente en el bienestar socioeconómico de la sociedad.

Se ha demostrado que la interleucina 5 (IL-5) juega un papel fundamental en la inflamación eosinofílica en varios tipos de alergias, incluido el asma eosinofílica grave. Los eosinófilos están regulados en cuanto a su reclutamiento, activación, crecimiento, diferenciación y supervivencia por la IL-5 que, en consecuencia, ha identificado a esta citoquina como una diana principal para las intervenciones terapéuticas. La unión de un antígeno de IL-5 o un fragmento del mismo a la PSV de la presente divulgación forma una vacuna basada en IL-5-PSV que es capaz de activar el sistema inmunológico para que reaccione contra IL-5. Por consiguiente, una vacuna basada en IL-5-PSV descrita en la presente divulgación puede usarse en el tratamiento/profilaxis del asma eosinofílica o alergia. En la presente divulgación pueden usarse otros antígenos asociados a alergias (por ejemplo, IgE) usando un razonamiento similar. El tipo de asma o enfermedad alérgica contra la que se puede utilizar la divulgación se decide mediante la elección del antígeno. En una realización de la presente divulgación, el antígeno es una proteína o péptido o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una o más enfermedades de asma o alergia descritas en esta invención. En una realización preferida de la presente divulgación, el asma o alergia se selecciona de entre el grupo que consiste en asma eosinofílica, alergia, poliposis nasal, dermatitis atópica, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico y síndrome de Churg-Strauss.

En una realización preferida de la presente divulgación, el antígeno comprende IL-5 o un fragmento antigénico de la misma, donde el antígeno está asociado y dirigido contra al menos una de las enfermedades de asma o alergia descritas en esta invención y/u otras enfermedades alérgicas o de asma.

En una realización más preferida de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una vacuna para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una de las enfermedades de asma o alergia descritas en esta invención donde la vacuna comprende:

iii. un antígeno asociado a alergias como IL-5 o un fragmento antigénico del mismo fusionado con una estreptavidina monovalente,

En una realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende la SEQ ID NO: 19 y/o una variante de secuencia de la misma.

Enfermedades infecciosas y antígenos asociados.

La tuberculosis y la malaria son dos enfermedades infecciosas importantes. En 2012, se estima que se produjeron 207 millones de casos de malaria que provocaron más de 500.000 muertes. También en 2012, se estima que 8,6 millones de personas desarrollaron tuberculosis y 1,3 millones murieron a causa de la enfermedad. Los procedimientos actuales de tratamiento son insuficientes y algunos han resultado en resistencia a los fármacos. En consecuencia, existe la necesidad de fármacos nuevos y eficaces para el tratamiento/profilaxis de la tuberculosis y la malaria. La unión de un antígeno asociado a malaria o tuberculosis o un fragmento del mismo a la PSV de la presente divulgación forma una vacuna basada en PSV que es capaz de activar el sistema inmunológico para reaccionar contra, por ejemplo, malaria o tuberculosis. Usando una línea de razonamiento similar, la presente descripción puede usarse en el tratamiento/profilaxis de la mayoría de las enfermedades infecciosas. El tipo de enfermedad infecciosa contra la que se puede utilizar la divulgación se decide mediante la elección del antígeno.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a la estreptavidina monovalente de la presente divulgación es una proteína o péptido o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una enfermedad infecciosa tal como tuberculosis y/o malaria.

En una realización adicional de la presente descripción un antígeno de Plasmodium falciparum se fusiona a la estreptavidina monovalente de la presente descripción para su uso en el tratamiento/profilaxis de la malaria.

En una realización adicional de la presente descripción un antígeno de Mycobacterium tuberculosis se fusiona a la estreptavidina monovalente de la presente descripción para su uso en el tratamiento/profilaxis de la tuberculosis. En una realización adicional de la presente divulgación, el antígeno se selecciona de entre el grupo que consiste en Ag85A de Mycobacterium tuberculosis, PfRH5 de Plasmodium falciparum, VAR2CSA (dominio, ID1-ID2a) de Plasmodium falciparum, dominio CIDR1a, de PfEMP1 de Plasmodium falciparum, GLURP de Plasmodium falciparum, MSP3 de Plasmodium falciparum, Pfs25 de Plasmodium falciparum, CSP de Plasmodium falciparum y PfSEA-1 de Plasmodium falciparum o un fragmento antigénico de los antígenos descritos. En otra realización de la presente divulgación, el antígeno comprende una construcción de fusión entre MSP3 y GLURP (GMZ2) de Plasmodium falciparum.

En otra realización de la presente divulgación, el antígeno comprende una proteína, o un fragmento antigénico de la misma, del organismo patógeno que causa la enfermedad infecciosa.

En una realización más preferida de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una vacuna para su uso en la profilaxis y/o tratamiento de una de las enfermedades infecciosas descritas en esta invención donde la vacuna comprende:

iii. un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa como Ag85A de Mycobacterium tuberculosis, PfRH5 de Plasmodium falciparum, VAR2CSA (dominio, ID1-ID2a) de Plasmodium falciparum, dominio CIDR1a, de PfEMP1 de Plasmodium falciparum, GLURP de Plasmodium falciparum, MSP3 de Plasmodium falciparum Pfs25 de Plasmodium falciparum, CSP de Plasmodium falciparum y/o PfSEA-1 de Plasmodium falciparum o un fragmento antigénico de los mismos fusionado con una estreptavidina monovalente,

En una realización preferida de la presente divulgación, el antígeno es VAR2CSA y la vacuna es para uso en la profilaxis y/o el tratamiento de la malaria placentaria.

En otra realización preferida de la presente divulgación, el antígeno sobrevive y la vacuna es para uso en la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer.

En una realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID N°: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28 y/o una variante de secuencia de la misma. En una realización preferida de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende la SEQ ID NO: 21. En una realización más preferida de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende la SEQ ID NO: 24. En una realización más preferida de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende la SEQ ID NO: 28.

Inducción de una respuesta inmune en un sujeto

La vacunación activa (inmunización), mediante la administración de pequeñas dosis de un antígeno a un sujeto, es una forma de activar el sistema inmunológico de un sujeto para desarrollar inmunidad adaptativa al antígeno. Esto permite que el cuerpo de un sujeto reaccione rápida y eficientemente a exposiciones futuras.

Un aspecto de la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna de la presente divulgación y/o

ii. administrar dicha composición a un sujeto al menos una vez para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad,

induciendo así una respuesta inmune en el sujeto.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inmunizar a un sujeto que lo necesita, dicho procedimiento comprende las etapas de:

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna de la presente divulgación, y/o

inmunizando así al sujeto que lo necesite.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para obtener una respuesta inmune fuerte y duradera en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i. obtener una composición que comprende una vacuna de la presente divulgación, y/o

ii. administrar la vacuna para tratar y/o impedir una condición clínica en un sujeto que lo necesite,

donde la vacuna obtiene una respuesta inmune fuerte y duradera en el sujeto.

En una realización de la presente divulgación, el procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, inmunizar a un sujeto que lo necesita y/u obtener una respuesta inmune fuerte y duradera comprende además al menos una vacuna de refuerzo y/o un segundo ingrediente activo.

Origen de la proteína PV L1

Un elemento importante de la presente vacuna basada en PSV es la principal proteína L1 de la cápside del papilomavirus (PV), que tiene la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en partículas similares a virus (PSV). El uso de proteínas L1 de papilomavirus en la presente divulgación se ilustra en la figura 1 b. Se sabe que varios cientos de especies de papilomavirus, tradicionalmente denominados "tipos", infectan a la mayoría de los mamíferos, así como a aves, serpientes y tortugas. En principio, la proteína de la cápside principal L1 de la mayoría de los papilomavirus, capaz de formar una PSV, puede usarse para llevar a cabo la presente divulgación.

En una realización de la presente divulgación, la proteína PV L1 es de un mamífero tal como, pero no limitado a: género Alces, Homo sapiens, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, llama, ratón , rata, mono y pollo.

En una realización más preferida de la presente divulgación, la proteína PV L1 es del genotipo 16 y/o 118 de PV humano. En aún una realización particular de la presente divulgación, la proteína PV L1 es de Alces alces.

Sitio aceptor de biotina y su posición en la proteína PV L1

El sitio aceptor de biotina de la presente divulgación comprende una secuencia de 15 aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos. Es extremadamente difícil, si no imposible, predecir las consecuencias de las modificaciones de las proteínas formadoras de PSV, como las proteínas PV L1. Tales modificaciones a menudo conducen a la interrupción del delicado y sensible procedimiento de autoensamblaje de las PSV. La modificación exitosa del procedimiento de formación de PSV depende al menos de tres factores 1) la secuencia de aminoácidos del sitio aceptor de biotina, 2) el sitio de inserción, y 3) la eliminación/deleción de residuos de aminoácidos para dejar espacio para el sitio aceptor de biotina. Los inventores han demostrado varias modificaciones exitosas de los bucles PV L1 sin interrumpir el delicado procedimiento de autoensamblaje.

En una realización de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina se fusiona en un bucle de la proteína PV L1. En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una vacuna para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad donde la vacuna comprende:

i. una proteína L1 del papilomavirus (PV) que contiene un sitio aceptor de biotina en un bucle de la proteína PV L1, y

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

En otra realización de la presente divulgación, el bucle se selecciona de entre el grupo que consiste en el bucle DE y el bucle HI de la proteína PV L1. La proteína PV L1 comienza con un residuo de metionina que se escinde después de la traducción. Por tanto, hay dos formas de numerar los residuos de aminoácidos de la proteína PV L1: o el residuo de metionina es el primero, o el residuo de metionina no se cuenta y el siguiente residuo de serina es el primero. Las posiciones dadas en la presente divulgación se numeran usando la primera numeración, es decir, donde se cuenta la metionina.

En una realización de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina se inserta en el bucle HI de la proteína L1 del genotipo 16 de PV humano en la posición 351/352 (SEQ ID NO: 2). En otra realización, el sitio aceptor de biotina se inserta en el bucle H4 de la proteína L1 del genotipo 16 de PV humano en la posición 431/432 (s Eq ID NO: 1). En una realización de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina se inserta en el bucle HI de la proteína L1 del genotipo 118 de PV humano en la posición 360/365 donde se eliminan los residuos 361-364 (AGKI) (S^eQ ID NO: 6 ). En una realización más preferida de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina se inserta en el bucle DE de la proteína L1 del genotipo 16 de PV humano en la posición 134/139 donde se eliminan los residuos 135-137 (YAAN) (SEQ ID NO: 3).

En una realización de la presente divulgación, la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 o una variante de secuencia biológicamente activa que tenga al menos 95 %, tal como 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 % , tal como 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las proteínas PV L1 descritas en esta invención que contienen las secuencias del sitio aceptor de biotina. Por "activo biológico" se entiende la capacidad de formar una partícula similar a un virus.

En una realización de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina de la presente divulgación comprende la secuencia de aminoácidos GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO 36).

Biotinilación enzimática

En general, existen dos estrategias para la biotinilación de proteínas; biotinilación química y biotinilación enzimática. La biotinilación química, como la biotinilación de residuos de lisina expuestos, permite la unión a PSV de diversos tipos de antígenos diana (incluidas las dianas no proteicas) y esta estrategia generalmente no está restringida por el tamaño del antígeno (Raja KS. y col., 2003 ). Sin embargo, con esta estrategia es muy difícil controlar la cantidad/estequiometría general, así como la orientación del antígeno acoplado. Por último, los procedimientos de acoplamiento químico rara vez son compatibles con la producción de vacunas a gran escala. El principal desafío de las plataformas actuales de PSV es presentar el antígeno en la superficie de la PSV, a alta densidad, en un orden regularmente espaciado con una orientación constante para una exhibición de epítopo eficiente que sea capaz de inducir inmunidad protectora a largo plazo.

Con el fin de resolver estos desafíos, las PSV de la presente divulgación se preparan mediante biotinilación enzimática. La biotinilación enzimática asegura que solo una única molécula de biotina se conjuga con cada L1 en la PSV, controlando así la relación/estequiometría general y la ubicación de las proteínas PSV y las moléculas de biotina. Este control permitirá la presentación de un antígeno a alta densidad, es decir, en teoría, un antígeno por proteína L1, mientras está espaciado regularmente y con orientación constante en la superficie de las PSV de la presente divulgación.

Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la molécula de biotina se conjuga enzimáticamente con el sitio aceptor de biotina. En otra realización de la presente divulgación, la molécula de biotina se conjuga enzimáticamente con el sitio aceptor de biotina mediante una biotina ligasa de un procariota, tal como de una bacteria, tal como de E. coli.La biotina ligasa es, en una realización preferida de la invención, de la presente divulgación, BirA de E. coli.

Antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente

La estreptavidina de Streptomyces avidinii forma homo-tetrámeros de estreptavidina y une hasta cuatro moléculas de biotina. La estreptavidina monovalente de la presente divulgación forma monómeros y se une a una única molécula de biotina. Por tanto, cuando se une el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente a la PSV de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente asegura una presentación uniforme de dichos antígenos. El uso de estreptavidina monovalente asegura además el control de la cantidad/estequiometría general, así como la orientación del antígeno acoplado. Este control permitirá la presentación de un antígeno a alta densidad, mientras se espacia regularmente y con una orientación constante en la superficie de una PSV, resolviendo así tres factores críticos principales para obtener la activación del sistema inmunológico. Por el contrario, un homo-tetrámero de estreptavidina puede reticular varias proteínas PV L1 en la superficie de una PSV, creando así una presentación irregular de dicho antígeno, lo que puede obstaculizar la respuesta inmune de un antígeno. Por tanto, un aspecto de la presente divulgación es usar estreptavidina monovalente fusionada al antígeno para unir el antígeno a la proteína PV L1 mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1.

En una realización de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente utilizada por la presente divulgación comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

En otra realización de la presente divulgación, cada antígeno se presenta en la continuación inmediata de cada proteína PV L1 en una orientación constante.

En otra realización de la presente divulgación, la proporción de proteína PV L1:molécula de biotina:antígeno es 1:1:1. Cambiar la posición donde la etiqueta de estreptavidina monomérica se fusiona con el antígeno permitirá cambiar la orientación del antígeno. Esto se puede realizar para permitir la mejor presentación posible de los epítopos más inmunogénicos del antígeno. La mejor orientación posible puede ser diferente de un antígeno a otro.

En otra realización de la presente divulgación, el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende además una etiqueta. Dichas etiquetas se pueden usar para técnicas de purificación conocidas por los expertos. La etiqueta se puede seleccionar de entre el grupo que comprende etiqueta de polihistidina, etiqueta de calcodulina, etiqueta de poliglutamato, etiqueta E, etiqueta FLAG, etiqueta HA, etiqueta Myc, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta Strep, etiqueta Strep-II, etiqueta TC, etiqueta V5, etiqueta VSV y etiqueta Xpress. Se pueden usar otras etiquetas peptídicas o no peptídicas en su lugar o en combinación con las etiquetas peptídicas mencionadas anteriormente. En una realización particular de la presente divulgación, la etiqueta es una etiqueta de polihistidina, tal como una etiqueta 4xHis, 5xHis, 6xHis, 7xHis, 8xHis, 9xHis o 10xHis.

En una realización de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente se fusiona con el antígeno en cualquier posición. En otra realización de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente se fusiona con el antígeno en el extremo N, extremo C y/o se fusiona con el antígeno en la secuencia codificante del antígeno. Una persona experta sabrá cómo fusionar el antígeno y la estreptavidina monovalente, sin introducir codones de terminación o causar cambio de marco o cualquier otra mutación.

En otra realización de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente fusionada al antígeno comprende i. una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, o

ii. una variante de secuencia de dicha secuencia polipeptídica, donde la variante de secuencia tiene al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como , 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con las secuencias de entre el grupo que comprende SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

En una realización preferida de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente fusionada al antígeno comprende

i. una secuencia polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 19, y/o

ii. una variante de secuencia de dicha secuencia polipeptídica, donde la variante de secuencia tiene al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 19. En una realización más preferida de la presente divulgación, la estreptavidina monovalente fusionada al antígeno comprende

i. una secuencia polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 18, y/o

ii. una variante de secuencia de dicha secuencia polipeptídica, donde la variante de secuencia tiene al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18.

Vector y secuencias de polinucleótidos/polipéptidos

En la clonación molecular, un vector es una molécula de ADN que se utiliza como vehículo para transportar artificialmente material genético extraño a una célula, donde se puede replicar y/o expresar. Los cuatro tipos principales de vectores son plásmidos, vectores virales, cósmidos y cromosomas artificiales. El vector en sí mismo es generalmente una secuencia de ADN que consiste en un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como "columna vertebral" del vector. El propósito de un vector que transfiere información genética a otra célula es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula diana. Los vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión de transgenes en células diana y generalmente tienen una secuencia promotora que dirige la expresión del transgén.

La expresión/producción heteróloga de la vacuna de la presente divulgación comprende 3 componentes peptídicos 1) una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina 2) una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y 3) un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, cada uno de los componentes peptídicos está codificado por una secuencia polinucleotídica y cada una de las secuencias polinucleotídicas puede expresarse en uno, dos o tres plásmidos diferentes.

Para permitir la expresión/producción heteróloga de la vacuna, un aspecto de la presente divulgación es un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica

i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y/o

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente.

En otra realización de la presente divulgación, el vector comprende al menos dos, tales como al menos tres polinucleótidos de los siguientes polipéptidos:

i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y/o

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente.

En una realización adicional de la presente divulgación, la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina está codificada por una secuencia de polinucleótidos que comprende:

i. una secuencia de polinucleótidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 14, SEQ ID 15, SEQ ID 16, SEQ ID 17, y/o

ii. una variante de secuencia de dicha secuencia polinucleotídica, donde la variante de secuencia tiene al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como , 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con dicha SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 14, SEQ ID 15, SEQ ID 16, SEQ ID 17 y/o

iii. una variante de secuencia de dicho polinucleótido, donde se modifica el uso del codón.

En una realización preferida de la presente divulgación, la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina está codificada por una secuencia de polinucleótidos que comprende:

i. una secuencia de polinucleótidos seleccionada de entre el grupo que comprende, SEQ ID 12, y/o SEQ ID 13, y/o ii. una variante de secuencia de dicha secuencia polinucleotídica, donde la variante de secuencia tiene al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % de identidad de secuencia con dicha SEQ ID 12 y/o SEQ ID 13, y/o

En una realización adicional de la presente divulgación, el antígeno fusionado a la estreptavidina monovalente tiene una secuencia de polinucleótidos que comprende:

i. una secuencia de polinucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID 29, SEQ ID 30, SEQ ID 31, SEQ ID 32, SEQ ID 33, SEQ ID 34, SEQ ID 35, y/o

En una realización de la presente divulgación, el sitio aceptor de biotina comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 39.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a secuencias de polinucleótidos que codifican

i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y/o

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente.

En una realización preferida de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a secuencias de polinucleótidos que codifican

i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina que comprende la SEQ ID NO: 2, y/o

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina que comprende la SEQ ID 38, y/o

iii. un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente que comprende la SEQ ID NO: 19.

En una realización más preferida de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a secuencias de polinucleótidos que codifican

iii. un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente que comprende la SEQ ID NO: 20.

iii. un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente que comprende la SEQ ID NO: 18.

Célula huésped

La divulgación se refiere además a una célula huésped que comprende un polinucleótido y/o un vector. El polinucleótido puede tener una secuencia con codones optimizados. Los procedimientos de optimización de codones son conocidos en la técnica y permiten una expresión optimizada en un organismo o célula huésped heteróloga. En una realización de la presente divulgación, la célula huésped puede seleccionarse de entre el grupo que comprende células de bacterias, levaduras, hongos, plantas, mamíferos y/o insectos.

Procedimientos para expresar un primer polipéptido: una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina y/o un segundo polipéptido; una biotina ligasa, capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o un tercer polipéptido: se conocen en la técnica un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente en una célula huésped. El primer, segundo o tercer polipéptido puede expresarse heterólogamente a partir de las correspondientes secuencias de polinucleótidos clonadas en el genoma de la célula huésped o pueden estar comprendidas dentro de un vector. Por ejemplo, un primer y/o segundo y/o tercer polinucleótido que codifica el primer y/o segundo y/o tercer polipéptido se clona en el genoma, y un primer y/o segundo y/o tercer polinucleótido que codifica el primero y/o el segundo y/o tercer polipéptido está comprendido dentro de un vector transformado o transfectado en la célula huésped. Alternativamente, el primer y/o segundo y/o tercer polinucleótido está comprendido dentro de un primer vector y el primer y/o segundo y/o tercer polinucleótido está comprendido dentro de un segundo vector y el primero y/o segundo y/o tercero está compuesto dentro de un tercer vector.

La expresión del primer, segundo y tercer polipéptido en la célula huésped puede ocurrir de manera transitoria. Cuando el polinucleótido que codifica uno de los polipéptidos se clona en el genoma, también se puede clonar un promotor inducible para controlar la expresión de los polipéptidos. Tales promotores inducibles son conocidos en la técnica. Alternativamente, los genes que codifican para los supresores del silenciamiento génico también pueden clonarse en el genoma o en un vector transfectado dentro de la célula huésped.

En una realización particular de la presente divulgación, la célula huésped puede seleccionarse de entre el grupo que comprende Escherichia coli, Spodoptera frugiperda (sf9), Trichoplusia ni (BTI-TN-5B1-4), Pichia Pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Drosophila Schneider 2 (S2), Lactococcus lactis, ovario de hámster chino (CHO), riñón embrionario humano 293, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN y Solanum tuberosum cv. Solara. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la célula huésped es Escherichia coli.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Spodoptera frugiperda.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Pichia Pastoris.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Hansenula polymorpha.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Drosophila Schneider 2.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Lactococcus lactis.En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es ovario de hámster chino (CHO). En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es riñón embrionario humano 293. En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Trichoplusia ni (BTI-TN-5B1-4). En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Nicotiana tabacum cv. Samsun NN. En otra realización de la presente divulgación, la célula huésped es Solanum tuberosum cv. Solara. En otro aspecto de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a una célula huésped que expresa al menos un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos divulgados por la presente divulgación.

En una realización de la presente descripción, la célula huésped expresa:

i. un primer polipéptido; una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y/o

ii. un segundo polipéptido; una biotina ligasa, capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o

iii. un tercer polipéptido; un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde la célula se selecciona de entre el grupo que comprende células de bacterias, levaduras, hongos, plantas, mamíferos y/o insectos.

En una realización adicional de la presente divulgación, la célula huésped expresa

i. un primer polipéptido que tiene una secuencia de al menos el 70 %, tal como el 75 %, tal como el 80 %, tal como el 85 %, tal como el 90 %, tal como el 95 %, tal como el 96 %, tal como el 97 %, tal como el 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % idéntico a SEQ ID NO: 3 [bucle DE, HPV genotipo 16], SEQ ID NO: 2 [bucle HI, HPV genotipo 16], SEQ ID NO: 6 [bucle HI, HPV118]; y/o

ii. un segundo polipéptido que tiene una secuencia de al menos el 70 %, tal como el 75 %, tal como el 80 %, tal como el 85 %, tal como el 90 %, tal como el 95 %, tal como el 96 %, tal como el 97 %, tal como el 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % idéntico a SEQ ID NO: 38, y/o

iii. un tercer polipéptido que tiene una secuencia de al menos el 70 %, tal como el 75 %, tal como el 80 %, tal como el 85 %, tal como el 90 %, tal como el 95 %, tal como el 96 %, tal como el 97 %, tal como el 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % idéntico a SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, donde la célula se selecciona de entre el grupo que comprende células de bacterias, levaduras, hongos, plantas, mamíferos y/o insectos.

En una realización preferida de la presente divulgación, la célula huésped expresa:

i. un primer polipéptido; una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina que comprende SEQ ID NO: 2, y/o

ii. un segundo polipéptido; una biotina ligasa, capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina que comprende SEQ ID NO: 38, y/o

iii. un tercer polipéptido; un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente que comprende la SEQ ID NO: 18,

Los inventores de la presente divulgación han demostrado la formación de PSV utilizando células de insectos, tales como High Five (Trichoplusia ni) de células Sf9 incubadas a 28°C. También pueden funcionar otras condiciones y huéspedes de expresión.

En una realización particular de la presente divulgación, células de Trichoplusia ni se utilizan como célula huésped para la expresión de cualquiera de los polinucleótidos y/o polipéptidos divulgados. En otra realización de la presente divulgación, células de Trichoplusia ni se usan para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de al menos 70 %, tal como 75 %, tal como 80 %, tal como 85 %, tal como 90 %, tal como 95 %, tal como 96 %, tal como, 97 %, tal como 98 %, tal como 99 %, tal como 99,5 %, tal como 100 % idéntico a cualquiera de los polipéptidos descritos en esta invención.

Composición que comprende la vacuna

La vacuna de la presente divulgación se va a utilizar en la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad. Por tanto, un aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición que comprende la vacuna de la presente divulgación. Dichas composiciones pueden comprender además, por ejemplo, un adyuvante, un tampón y/o sales o una combinación de los mismos.

Un adyuvante es un agente farmacológico y/o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes. Pueden añadirse adyuvantes a una vacuna para modificar la respuesta inmune reforzándola de modo que proporcione una mayor cantidad de anticuerpos y/o una protección más duradera, minimizando así la cantidad de material extraño inyectado. También se pueden usar adyuvantes para mejorar la eficacia de una vacuna ayudando a subvertir la respuesta inmune a tipos de células particulares del sistema inmune, por ejemplo, activando las células T en lugar de las células B secretoras de anticuerpos, dependiendo del tipo de vacuna.

Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la composición comprende al menos un adyuvante. En una realización de la presente divulgación, el adyuvante está basado en aluminio. Los adyuvantes de aluminio pueden ser fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, sulfato de hidroxifosfato de aluminio amorfo y/o una combinación de los mismos. También se pueden incluir otros adyuvantes.

En otra realización de la presente divulgación, la composición descrita anteriormente comprende al menos un tampón. En una realización de la presente divulgación, el tampón está basado en PBS y/o histidina. En otra realización de la presente divulgación, el tampón tiene un pH entre pH 6 - pH 7,5. En una realización de la presente divulgación, el tampón es isotónico, por ejemplo, tiene 0,6 % - 1,8 % de NaCl.

Un emulsionante (también conocido como "emulgente") es una sustancia que estabiliza una emulsión aumentando su estabilidad cinética. Una clase de emulsionantes se conoce como "agentes tensioactivos" o tensioactivos. Los polisorbatos son una clase de emulsionantes que se utilizan en algunos productos farmacéuticos y en la preparación de alimentos. Marcas comunes de polisorbatos incluyen Alkest, Canarcel y Tween. Algunos ejemplos de polisorbatos son polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80. En una realización de la presente divulgación, la composición de la presente divulgación comprende un emulsionante tal como uno de los polisorbatos descritos anteriormente. En una realización particular de la presente divulgación, la composición comprende 0,001-0,02 % de polisorbato 80. En la presente descripción también se pueden usar otros polisorbatos o emulsionantes.

Una composición farmacéutica que comprende la vacuna

La vacuna de la presente divulgación está destinada a utilizarse en la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona además una formulación farmacéutica, que comprende la vacuna de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma. Las formulaciones farmacéuticas pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2005, Lippincott, Williams & Wilkins.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, obleas, supositorios, y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser uno o más excipientes que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes humectantes, agentes desintegradores de comprimidos o un material encapsulante.

También se incluyen preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, colorantes, saborizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares. 3

Los compuestos de la presente divulgación pueden formularse para administración parenteral y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes multidosis, opcionalmente con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo, soluciones en polietilenglicol acuoso. Ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos aceitosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables, y pueden contener agentes como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y / o dispersantes. Preferiblemente, la formulación comprenderá aproximadamente de 0,5 % a 75 % en peso del ingrediente o ingredientes activos y el resto consistirá en excipientes farmacéuticos adecuados como se describe en esta invención.

La vacuna de la divulgación puede administrarse al mismo tiempo, simultáneamente o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, especialmente y preferiblemente en forma de una composición farmacéutica de la misma, ya sea por vía oral, rectal o parenteral (incluida la subcutánea), en una cantidad efectiva.

Por tanto, un aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una vacuna. Tal composición farmacéutica puede comprender un adyuvante, un tampón y/o sales o una combinación de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, la composición farmacéutica comprende además una composición que comprende una vacuna como se describe en la presente divulgación.

Un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende una vacuna.

La presente divulgación se refiere además a un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende una vacuna. En un aspecto de la presente divulgación, la vacuna basada en PSV de la presente divulgación se puede fabricar al menos mediante las siguientes etapas:

i. obtener un primer polipéptido que comprende: una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, y/o ii. obtener un segundo polipéptido: una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y/o iii. obtener un tercer polipéptido: un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente, y

iv. someter el primer polipéptido a condiciones que permitan la formación de partículas similares a virus, y/o v. permitir la biotinilación enzimática del sitio aceptor de biotina de dichas partículas similares a virus usando dicho segundo polipéptido, y/o

vi. obtener una vacuna mediante la unión del tercer polipéptido y dichas partículas similares a virus mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de dichas partículas similares a virus, y/o

vii. generar una composición que comprende dicha vacuna.

obteniendo así una composición farmacéutica.

En la fabricación de la composición farmacéutica se pueden incluir otras etapas, por ejemplo a) aislamiento/purificación de la PSV para producir un producto de alta pureza/calidad. Esto se logrará utilizando diferentes técnicas para la purificación de proteínas. Para este propósito, se llevarán a cabo varias etapas de separación utilizando las diferencias en, por ejemplo, tamaño de proteína, propiedades físico-químicas, afinidad de unión o actividad biológica b) formulación agregando estabilizadores para prolongar la vida útil o conservantes para permitir que los viales multidosis sean utilizados de forma segura según sea necesario c) todos los componentes que constituyen la vacuna final se combinan y mezclan uniformemente, por ejemplo, en un solo vial o jeringa d) la vacuna se coloca en un recipiente receptor (por ejemplo, un vial o una jeringa) y se sella con tapones estériles.

Todos los procedimientos descritos anteriormente deberán cumplir con los estándares definidos para las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) que involucrarán varios controles de calidad y una adecuada infraestructura y separación de actividades para evitar la contaminación cruzada. Finalmente, la vacuna puede etiquetarse y distribuirse en todo el mundo.

Procedimiento de administración de una vacuna.

Vías de administración

Tratamiento sistémico. Las principales vías de administración son la oral y la parenteral con el fin de introducir el agente en el torrente sanguíneo para finalmente apuntar a los sitios de acción deseada. Las formas de dosificación apropiadas para dicha administración se pueden preparar mediante técnicas convencionales.

Administración por vía oral. La administración por vía oral es normalmente para la administración de fármacos por vía enteral, donde el agente se administra a través de la mucosa enteral.

Administración parenteral. La administración parenteral es cualquier vía de administración que no sea la vía oral/enteral, mediante la cual el medicamento evita la degradación de primer paso en el hígado. Por consiguiente, la administración parenteral incluye cualquier inyección e infusión, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua, tal como administración intravenosa, administración intramuscular o administración subcutánea. Además, la administración parenteral incluye inhalaciones y administración tópica.

Por consiguiente, el agente puede administrarse tópicamente para atravesar cualquier membrana mucosa de un animal al que se le va a administrar la sustancia biológicamente activa, p.ej., en la nariz, la vagina, los ojos, la boca, el tracto genital, los pulmones, el tracto gastrointestinal o el recto, preferiblemente la mucosa de la nariz o la boca y, en consecuencia, la administración parenteral también puede incluir la administración bucal, sublingual, nasal, rectal, vaginal e intraperitoneal, así como la administración pulmonar y bronquial por inhalación o instalación. Además, el agente puede administrarse por vía tópica para penetrar en la piel.

Generalmente se prefieren las formas subcutánea e intramuscular de administración parenteral.

Tratamiento local. El agente según la divulgación se puede usar como tratamiento local, es decir. introducirse directamente en el o los sitios de acción como se describirá a continuación.

Por tanto, puede aplicarse un agente a la piel o la mucosa directamente, o el agente puede inyectarse en el tejido enfermo o en una arteria terminal que conduzca directamente al tejido enfermo.

Por tanto, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de administración de una vacuna para tratar y/o impedir una afección clínica en un sujeto que lo necesita, que comprende las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna según la presente divulgación, y/o ii. administrar dicha composición a un sujeto al menos una vez para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad.

Una realización preferida de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de administración de una vacuna para tratar y/o prevenir el cáncer, como se describe en esta invención, en un sujeto que lo necesita, que comprende las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna como se describe en esta invención, y/o ii. administrar dicha composición a un sujeto por vía intramuscular y/o intravenosa al menos una vez para la profilaxis y/o el tratamiento de un cáncer.

Una realización preferida de la presente divulgación se refiere a un procedimiento de administración de una vacuna para tratar y/o prevenir una enfermedad cardiovascular, como se describe en esta invención, en un sujeto que lo necesita, que comprende las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna como se describe en esta invención, y/o ii. administrar dicha composición a un sujeto por vía intramuscular y/o intravenosa al menos una vez para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad cardiovascular.

En otra realización de la presente divulgación, la vacuna se administra mediante cualquier tipo de inyecciones o infusiones seleccionadas de entre el grupo de inyección en bolo, infusión continua, administración intravenosa, administración intramuscular, administración subcutánea, inhalación o administración tópica o una combinación de las mismas. En una realización particular de la presente divulgación, la vacuna se administra mediante administración intramuscular y/o administración intravenosa.

En medicina, una dosis de refuerzo es una administración adicional de una vacuna después de una dosis anterior. Después de la inmunización inicial, una inyección de refuerzo o una dosis de refuerzo es una reexposición a la célula antigénica inmunizante. Está destinada a aumentar la inmunidad contra ese antígeno de nuevo a niveles protectores después de que se haya demostrado que ha disminuido o después de un período específico. En una realización de la presente divulgación, la vacuna se administra cualquier número de veces de una, dos, tres, cuatro veces o más. En una realización adicional de la presente divulgación, la vacuna se potencia mediante la administración en una forma y/o parte del cuerpo diferente de la administración anterior. En otra realización de la presente divulgación, la vacuna se administra en el área que es más probable que sea el receptáculo de una determinada enfermedad o infección cuya vacuna pretende prevenir/reducir su riesgo.

En otra realización de la presente divulgación, el receptor de la vacuna (el sujeto) de la presente divulgación es un animal, por ejemplo un mamífero, tal como un Homo sapiens, vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra, llama, ratón, rata, mono y/o pollo. En una realización particular de la presente divulgación, el sujeto es un Homo sapiens.

La administración de más de una vacuna es conocida en la técnica y se refiere a este concepto como covacunación o para dar un cóctel de vacunas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la vacuna se coadministra con cualquier otra vacuna. En otra realización de la presente divulgación, la vacuna forma parte de un cóctel de vacunas.

Un kit de partes

En otro aspecto de la presente divulgación se hace referencia a un kit de piezas que comprende

i. una composición que comprende una vacuna de la presente divulgación, y/o

ii. un instrumento médico u otro medio para administrar la vacuna, y/o

iii. instrucciones sobre cómo utilizar el kit de piezas.

En una realización de la presente divulgación, el kit de partes comprende un segundo ingrediente activo o componente de vacuna para uso terapéutico en el tratamiento o prevención de una o más de las enfermedades descritas en la presente divulgación.

En una realización de la presente divulgación, la vacuna de la divulgación se administra por separado, secuencial o simultáneamente con al menos otro ingrediente activo farmacéutico y/o componente de vacuna.

Dosis y regímenes de dosificación

Los requisitos de dosificación variarán con la composición de fármaco particular empleada, la vía de administración y el sujeto particular que se esté tratando. Un experto en la técnica también reconocerá que la cantidad y el espaciamiento óptimos de las dosis individuales de un compuesto estarán determinados por la naturaleza y extensión de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el lugar de administración, y el paciente particular en tratamiento, y que dichos valores óptimos pueden determinarse mediante técnicas convencionales. Un experto en la técnica también apreciará que el curso óptimo de tratamiento, es decir, el número de dosis de un compuesto administradas por día durante un número definido de días, puede determinarse usando pruebas de determinación del curso de tratamiento convencional.

El régimen de dosificación oral diario será preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 80 mg / kg de peso corporal total. El régimen de dosificación parenteral diario de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 80 mg / kg de peso corporal total. El régimen de dosificación tópico diario será preferiblemente de 0,1 mg a 150 mg, administrados de una a cuatro, preferiblemente dos o tres veces al día. El régimen de dosificación por inhalación diaria será preferiblemente de aproximadamente 0,01 mg / kg a aproximadamente 1 mg / kg por día.

El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un compuesto, solo o en combinación con otros agentes, calculado en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la presente divulgación dependen del compuesto o compuestos particulares empleados y del efecto a lograr, así como de la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el huésped. La dosis administrada debe ser una "cantidad efectiva" o una cantidad necesaria para lograr un "nivel efectivo" en el paciente individual. Cuando el "nivel efectivo" se usa como el punto final preferido para la dosificación, la dosis real y el programa pueden variar, dependiendo de las diferencias interindividuales en farmacocinética, distribución de fármacos edad, sexo, tamaño, salud y metabolismo. El "nivel efectivo" puede definirse, por ejemplo, como el nivel en sangre o tejido deseado en el paciente que corresponde a una concentración de uno o más compuestos según la divulgación.

Ejemplos

La modificación de PSV sin interrumpir el delicado y sensible procedimiento de autoensamblaje es un desafío. Los inventores han mostrado a continuación varios ejemplos de introducción exitosa de un sitio aceptor de biotina en varios bucles de PSV sin interrumpir el procedimiento de autoensamblaje. Además, los inventores han mostrado biotinilación enzimática del sitio aceptor de biotina, así como acoplaron varias proteínas de fusión antígeno/estreptavidina monovalente a las PSV. Se han iniciado las pruebas inmunológicas de las vacunas de PSV. Los ejemplos siguientes no limitan el alcance de la divulgación.

Ejemplo 1 - Diseño de proteínas quiméricas de cubierta HPV16 Avi-L1

Las secuencias del gen quimérico VPH16 Avi-L1 se construyeron mediante la inserción de la secuencia aceptora de biotina (AviTag™), GLNDIFEAQKIEWHE, en la DE-(posiciones aa 134-139) , FG-(posiciones aa 279-286), Hl-(posiciones aa 351-352) o espiral H4-pJ (posiciones aa 431-432) después de haber eliminado cualquier aminoácido intermedio (número de acceso de HPV16 L1 DQ155283.1). Las secuencias de genes se modificaron adicionalmente para contener un sitio de restricción EcoRV seguido de una secuencia promotora de polihedrina en el extremo N y un codón de parada seguido de un sitio de restricción Notl en el extremo C. Las secuencias de genes sintéticos fueron finalmente optimizadas por codones para la expresión recombinante en células de Trichoplusia ni y sintetizadas por Geneart (Life Technologies).

Ejemplo 2 - Expresión y purificación de PSV de Avi-L1-PSV de HPV16 quiméricas

Los fragmentos del gen HPV16 Avi-L1 se clonaron en los sitios EcoRV/Notl del vector pAcGP67A (BD Biosciences) eliminando la secuencia señal de secreción gp67. Para generar partículas de virus recombinantes, se cotransfectó ADN viral BakPak linealizado (BD Biosciences) con pAcGP67A/Avi-L1 en células de insecto Sf9 utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 10 (Invitrogen, 11668-019) y se incubó a 28°C durante 3-5 dias. Se recogió el Baculovirus recombinante del sobrenadante y se usó para generar una reserva de virus de alta titulación, que se usó para la infección de células de insectos High-Five. Las células High-Five infectadas se incubaron durante 48 horas a 28°C con agitación.La maduración y purificación in vitro de las PSV deHPV16 Avi-L1 se realizaron como se describió anteriormente (Buck y col., 2005, Buck y col., 2007). En resumen, se recolectaron los lisados celulares y se dejaron madurar las VLP en tampón de maduración. (0,5 % Triton-X-100, 0,1 % Benzonase®Nuclease (Sigma-Aldrich), 25 mM (NH4)2SO4 y 4mM MgCb) durante 18h a 37°C. Las PSV maduras se purificaron posteriormente mediante ultracentrifugación a través de un gradiente escalonado de Optiprep™ (27 %/33 %/39 %) como se describió anteriormente (22). Las VLP se dializaron en PBS (0,02 % de PS80) y se incubaron durante 30 min a 30°C con biotina y biotina ligasa (BirA) de acuerdo con las instrucciones de Avidity (Aurora, CO). El exceso de biotina se eliminó mediante diálisis en PBS (NaCl 0,32 M, PS80 al 0,02 %) y se determinó la concentración de proteína usando análisis BCA. Las fracciones de ultracentrifugación recolectadas se analizaron con geles de proteína NuPAGE® Bis-Tris (Life Technologies) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE-Healthcare, RPN203E) para la detección de L1 o biotina con CamVir-1 (AbD Serotec, Bio-Rad, 7135- 2804) o estreptavidina - HRP (Life Technologies, 43-4323), respectivamente. El análisis densitométrico de geles de SDS-PAGE se realizó usando ImageJ.

Ejemplo 3: Diseño de genes y expresión recombinante de antígenos de vacunas que se unen a biotina Se fusionaron genéticamente antígenos de vacuna heterólogos con un enlazador GGS en su extremo C o N a una estreptavidina monovalente (mSA) ((US8586708 B2) previamente descrita (refs)/patentada (SEQ ID NO: 37), introduciendo así la capacidad de unión de biotina a las proteínas de fusión mSA-antígeno expresadas. Genes de fusión de antígeno-mSA expresados en E.. coli se diseñaron con una etiqueta 6xHistidina y sitios de restricción NcoI/BamHI para subclonar en el vector pET-15b. Los genes de fusión mSA-antígeno expresados en células S2, células 293 de riñón embrionario humano (HEK293) o en células de insectos infectadas con baculovirus se diseñaron con sitios flanqueantes EcoRI/BamHI (extremo N) y Notl (extremo C) y una etiqueta 6xHistidina y se subclonaron en el vector pHP34s, pcDNA™ 4/HisMax o pAcGP67A (BD Biosciences), respectivamente.

Ejemplo 4 - Caracterización de partículas

Microscopía electrónica - Tinción negativa

Se adsorbió una alícuota de PSV diluida en rejillas recubiertas de carbón de mica de malla 200 y se tiñó negativamente con ácido fosfotúngstico al 2 % (pH = 7,0). La muestra se examinó con un microscopio electrónico CM 100 BioTWIN (Phillips, Amsterdam) a un voltaje de aceleración de 80 kV. Los registros fotográficos se realizaron con una cámara Olympus Veleta. Los tamaños de partículas se estimaron utilizando ImageJ. En la figura 2 se muestran imágenes representativas.

Ejemplo 5 - Medición del tamaño de partículas mediante dispersión dinámica de luz (DLS)

El diámetro hidrodinámico (denominado tamaño) de las PSV se midió usando un analizador de partículas, DynaPro NanoStar (tecnología WYATT), equipado con un láser de 658 nm. Muestras de PSV se diluyeron a 0,2 mg / ml con PBS (NaCl 0,32 M, PS80 al 0,02 %) y se cargaron 70 pl de cada muestra de PSV en una cubeta desechable de bajo volumen y se montaron en la cámara DLS. Después de 1 min de equilibrado, se obtuvo la distribución de tamaño mediante medición de DLS a 25°C. Cada muestra se midió 2 veces con 20 corridas en cada medición. Los tamaños medios de partículas más predominantes en la población se calcularon a partir de las mediciones y se registraron junto con el % de polidispersidad ( % Pd).

Ejemplo 6: Determinación del grado de biotinilación de AviTag-PSV

El grado de biotinilación de AviTag-PSV se estima mediante la comparación con cantidades conocidas de proteína de unión a maltosa AviTag de extremo C completamente biotinilada (proteína MBP-AviTag) usando una configuración ELISA. En resumen, la proteína MBP-AviTag estándar y las AviTag-PSV se adsorben en los pocillos de una placa maxisorb de 96 pocillos (Nunc 456537) en cantidades de proteínas conocidas (incrementos de 1 - 45 ng, 5 ng). La biotina extraña se elimina lavando con tampón TBST (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %) y la placa se bloquea añadiendo 300 pl de solución de bloqueo (PBS más 40 pg / ml BSA) a cada pocillo. La solución de peroxidasa estreptavidina-rábano picante se añade luego a cada pocillo y se incuba con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, la biotina asociada con el sitio aceptor de biotina es detectada por su interacción con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina monitoreando la absorción a 490 nm después de agregar la solución de desarrollo (3 tabletas de OPD disueltas en 12 ml de agua-d con 10 pl de H2O2).

Ejemplo 7 - Verificación del acoplamiento mSA-antígeno en (sitio aceptor de biotina)-PSV:

Las cantidades totales de antígeno acoplado a las PSV se estimaron comparando las cantidades relativas de antígeno/proteína HPV L1 en un gel de SDS-PAGE reducido (Figura 3). El material para este análisis se preparó mezclando en primer lugar PSV biotiniladas con una cantidad en exceso del antígeno-mSA y luego separando los complejos antígeno-mSA/PSV del exceso de antígeno-mSA mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad. Las PSV también se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión para evaluar su integridad después del acoplamiento de diferentes antígenos mSA (Figura 4). Específicamente, se colocó una alícuota de partículas diluidas (después del acoplamiento de mSA y eliminación del exceso de antígeno de mSA) en rejillas recubiertas de carbón de mica de malla 200, teñidas negativamente con ácido fosfotúngstico al 2 % (pH = 7,0) y se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando un CM 100 BioTWIN.

Ejemplo 8 - Acoplamiento de Antígenos a PSV

Los inventores han probado parcialmente el acoplamiento de 7 PSV diferentes con 12 proteínas de fusión antígeno/estreptavidina monovalente diferentes. Los resultados se han obtenido como se describe anteriormente y se resumen en la tabla 3.

Tabla 3: Acoplamiento de VLP1-7 y antígeno/mSA A1-A11. Las secuencias de las construcciones se encuentran en la tabla 5.

Ejemplo 9 - Expresión y purificación de VAR2CSA y mSA-VAR2CSA

La secuencia del gen quimérico mSA-VAR2CSA se diseñó con un pequeño enlazador Gly-Gly-Ser que separa la estreptavidina monomérica (mSA) [GenBank: 4JNJ_A] de los dominios ID1-ID2a de VAR2CSA [cepa FCR3 , GenBank: GU249598] (extremo amino). Tanto los fragmentos de genes VAR2CSA como mSA-VAR2CSA se modificaron adicionalmente para contener una etiqueta de 6xhistidina de extremo C y sitios de restricción BamHI y Notl flanqueantes usados para subclonación en el vector Baculovirus pAcGP67A (Bd Biosciences). Se cotransfectó ADN de Baculovirus Bakpak6 linealizado (BD Biosciences) con pAcGP67A-VAR2CSA o pAcGP67A-mSA-VAR2CSA en células de insecto Sf9 para la generación de partículas de virus recombinantes. La proteína recombinante etiquetada con histidina se purificó en columnas de sefarosa Ni²⁺del sobrenadante de células de insectos High-Five infectadas con Baculovirus usando un sistema de purificación ÁKTAxpress (GE-Healthcare).

Ejemplo 10 - Conjugación y purificación de mSA-VAR2CSA a PSV de L1-Avi

Para la producción de la vacuna de PSV-VAR2CSA, se mezclaron PSV Avi-L1 de HPV16 biotiniladas con un exceso molar de 3x de mSA-VAR2CSA y la muestra se incubó a 4°C durante 18-24 horas con suave agitación. mSA-VAR2CSA no unido se eliminó mediante ultracentrifugación sobre un gradiente escalonado de Optiprep™ (27 %, 33 %, 39 %) como se describió anteriormente (Buck y col., 2004).

La vacuna VLP-VAR2CSA se dializó en PBS (NaCl 0,32 M, PS80 al 0,02 %) y la concentración relativa de mSA-VAR2CSA unida a VLP se estimó mediante SDS-PAGE utilizando un intervalo de dilución estándar de BSA. Las fracciones posteriores a la ultracentrifugación se analizaron mediante SDS-PAGE o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE-Healthcare RPN203E) para la detección de L1 o mSA-VAR2CSA (a través de una etiqueta 6xhistidina) con CamVir-1 (AbD Serotec, Bio-Rad, 7135-2804 ) o Penta^His HRP (QIAGEN, 34460) respectivamente.

Ejemplo 11 - Respuesta de anticuerpos anti-VAR2CSA medida por ELISA

VAR2CSA recombinante (1 mg/ml en PBS) se revistió sobre placas Nunc MaxiSorp durante la noche a 4°C. Las placas se incubaron con tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) para inhibir la unión no específica a la placa. Las placas se lavaron tres veces entre diferentes etapas. Las muestras de suero se diluyeron en tampón de bloqueo (1:100), se añadieron a los pocillos en diluciones triples y se incubaron durante 1 hora a TA. Se diluyó Ig anti-ratón de conejo policlonal conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (P260 DAKO, Dinamarca) 1:3000 en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora. Finalmente, se desarrollaron reacciones de color durante 7 min añadiendo sustrato de o-fenilendiamina. La reacción enzimática de HRP se detuvo añadiendo H²SO⁴2,5 M y se midió la densidad óptica a 490 nm utilizando un lector de placas ELISA (VersaMax Molecular Devices).

Ejemplo 12 - Cultivo de parásitos

Los parásitos se mantuvieron en cultivo como se describió (23). Brevemente, se cultivaron parásitos en 5 % de hematocrito de sangre humana (grupo 0+) en RPMI 1640 (Sigma) suplementado con 0,125 |jg / ml de Albumax II (Invitrogen) y 2 % de suero humano normal. El aire atmosférico se intercambió con una mezcla de 1 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono en nitrógeno, después de lo cual se realizó la incubación a 37°C en condiciones estáticas con cambio ad hoc de medio de cultivo. El aislado de FCR3 se seleccionó para unirse a CSA mediante cribado en células BeWo como se describe (Haase y col., 2006). Los aislados de parásitos resultaron negativos para micoplasma (Lonza) y se genotiparon regularmente utilizando cebadores GLURP y MSP-2 anidados en una sola etapa de PCR, como se describe (Snounou y col., 1999).

Ejemplo 13 - Ensayos de inhibición de unión

El ADN del parásito se marcó con tritio mediante la incorporación durante la noche de hipoxantina titulada. Se revistió una placa de 96 pocillos (Falcon) con 2 jg/ml de Decorin (Sigma-Aldrich) durante la noche y se bloqueó con albúmina de suero bovino al 2 % (Sigma) como se describe (Nielsen y col., 2009). Los IE de etapa tardía etiquetados con tritio se purificaron con MACS y se añadieron a la placa de 96 pocillos en una concentración de 200.000 células por pocillo. Se añadieron titulaciones de suero en un volumen total de 100 j l en pocillos por triplicado. Después de la incubación durante 90 min a 37°C, un robot pipeteador (Beckman-Coulter) lavó los IE no unidos. Los IE restantes se recolectaron en una placa de filtro (Perkin-Elmer). Después de la adición de fluido de centelleo (Perkin-Elmer), se determinaron los recuentos por minuto (CPM) que registraban el número de IE no inhibidos mediante recuento de centelleo líquido en un Topcount NXT (Perkin-Elmer). Los datos se ajustaron al porcentaje de unión dividiendo el resultado de la prueba con el valor medio de los pocillos con IE incubados sin suero.

Ejemplo 14 - Generación de PSV de VPH Avi-L1 biotiniladas

La secuencia del sitio aceptor de biotina (AviTag™) se insertó genéticamente como se describe anteriormente en cuatro posiciones diferentes en la secuencia de HPV16 L1, que se basa en la estructura cristalina de la cápside de la proteina HPV16 L1, corresponden a los bucles expuestos a la superficie en la estructura de PSV ensambladas. Las construcciones quiméricas de Avi-L1 se expresaron en células High-Five y se dejaron ensamblar en PSV (Fig. 1 b). La formación de PSV se confirmó realizando ultracentrifugación en gradiente de densidad seguida de análisis SDS-PAGE. Este análisis indicó que tres de las proteínas recombinantes, Avi-L1 (HI), Avi-L1 (DE) y Avi-L1 (espira1H4-pJ) formaron PSV ya que la mayoría de las proteínas expresadas estaban presentes en fracciones de alta densidad/peso molecular 4-6 después de la ultracentrifugación (Fig. 5a). La proteína Avi-L1 (FG) se encontró exclusivamente en las fracciones de baja densidad que contienen proteína soluble no particulada, lo que indica que la inserción de AviTag™, en este caso, impidió el ensamblaje de PSV.

La identidad de las proteínas Avi-L1 en las fracciones de alta densidad se confirmó mediante análisis de Western blot usando un anticuerpo monoclonal anti-HPV16 L1 (figura 5c). El ensamblaje de PSV de las construcciones Avi-L1 se verificó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) como se describió anteriormente, que muestra una población heterogénea de PSV de diferentes tamaños (28-60 nm) (Fig.5b), que representan diferentes simetrías de ensamblaje icosaédrico de las cuales aproximadamente el 30 % tenía el tamaño/apariencia de las PSV de HPV16 L1 nativas. Las partículas se biotinilaron posteriormente (Fig. 5c) y se analizaron mediante TEM.

Ejemplo 15 - Construcción del antígeno VAR2CSA presentado

La secuencia de polipéptido VAR2CSA truncada más corta que es capaz de unirse a CSA cubre la región ID1-ID2a de la proteína de longitud completa (Fig. 1a). Esta construcción (denominada en esta invención VAR2CSA) se fusionó genéticamente en el extremo amino a estreptavidina monomérica (mSA) que puede unirse a biotina con alta afinidad. Para evitar la agregación de PSV, utilizamos una forma monomérica de estreptavidina que es ventajosa para la estreptavidina nativa ya que esta última contiene cuatro sitios de unión a biotina. La construcción quimérica expresó altos niveles de proteína soluble y retuvo una estructura capaz de unirse a CSA (datos no mostrados). Posteriormente, se mezcló mSA-VAR2CSA purificada con PSV biotiniladas (1:3 HPV L1/antígeno), y se examinó mediante ultracentrifugación seguida de SDS-PAGE y análisis de Western blot. Las fracciones de ultracentrifugación de alta densidad [4-5] contenían tanto la proteína mSA-VAR2CSA como la proteína Avi-L1, que se estimó mediante análisis densitométrico que estaba presente en una relación molar de 0,6:1. El exceso de mSA-VAR2CSA estaba presente en las fracciones de baja densidad [12-14] (Fig. 6 a&c). La co-localización de Avi-L1 y mSA-VAR2CSA, indicó que el antígeno mSA-VAR2CSA estaba unido a la superficie de las PSV de Avi-L1 a alta densidad y que estos grandes complejos de proteínas se habían separado del exceso de mSA-VAR2CSA soluble ( Fig. 6a). Para confirmar que la co-localización de las PSV de mSA-VAR2CSA y Avi-L1 fue causada por la interacción específica entre mSA y biotina, se repitió el procedimiento usando PSV no biotiniladas. Este experimento de control mostró que la ultracentrifugación separaba eficazmente la mSA-VAR2CSA soluble de las PSV no biotiniladas (Fig. 10).

Las PSV acopladas a antígeno se examinaron más a fondo mediante TEM, mostrando partículas de un tamaño comparativamente mayor (~70 nm) que las PSV no acopladas (-30-60 nm) (Fig. 6b). Esta observación se examinó más a fondo mediante análisis de dispersión dinámica de luz (DLS), que confirmó que la mezcla de mSA-VAR2CSA con VLP de Avi-L1 biotiniladas dio como resultado partículas considerablemente más grandes con un diámetro medio de ~70 nm (12,9 % de Pd) en comparación con Avi desnudo -L1 VLPs (<60 nm, 23,9 % Pd). Es importante destacar que este análisis también confirmó que no se formaron complejos tan grandes después de mezclar PSV no biotiniladas con mSA-VAR2CSA, lo que demuestra que mSA-VAR2CSA está, de hecho, unido a la superficie de las PSV de Avi-L1 mediante la interacción de afinidad específica entre mSA y biotina.

Juntos, estos resultados indican que la vacuna mSA-VAR2CSA PSV producida consiste en PSV de HPV16 Avi-L1 no agregadas que muestran matrices densas y repetitivas del antígeno mSA-VAR2CSA presentado en una orientación constante, como ilustrado esquemáticamente en la Figura 1b.

Ejemplo 16 - Inserción de AviTag™ en otras proteínas de cubierta que forman PSV de papiloma

El genotipo HPV16 L1, utilizado como plataforma PSV en este estudio, constituye uno de los tipos de HPV oncogénicos más prevalentes. Este genotipo está incluido en todas las vacunas contra el VPH autorizadas, que se administran a millones de mujeres jóvenes cada año. Por tanto, la inmunogenicidad de esta plataforma de PSV podría verse obstaculizada por la inmunidad preexistente hacia la proteína de la cápside principal de HPV L1. Por lo tanto, examinamos si la inserción de la secuencia AviTag™ era compatible con la formación de PSV en otros genotipos de HPV así como en PV no humanos. La secuencia AviTag™ se insertó en la proteína de la cápside principal L1 del alce europeo PV, así como en el genotipo 118 del VPH en una posición correspondiente al sitio de fusión en el VPH16 Avi-L1 (DE) (Fig. 7a). Las dos secuencias de proteínas se expresaron y purificaron como se describió previamente. Para ambas construcciones, se encontró una banda L1 del tamaño de proteína esperado (56 kDa) en las fracciones de ultracentrifugación de alta densidad, aunque la mayoría de la proteína presente en estas fracciones era de un tamaño molecular más bajo, posiblemente representando un truncamiento de L1 (Fig. 7b).

Estos datos indican que la inserción de la secuencia AviTag™ en otros tipos de PV es una estrategia factible para evitar el problema potencial de la inmunidad preexistente.

Ejemplo 17 - Inmunización de ratones

Se inmunizaron ratones hembra C57BL/6 (Taconic, Dinamarca) mediante inyección intramuscular con 5 |jg de mSA-VAR2CSA acoplada a PSV, mSA-VAR2CSA soluble o VAR2CSA desnuda soluble el día 0 sin adyuvante. Se administraron dos inyecciones de potenciador con 2,5 jg de los respectivos antígenos los días 21 y 42. Se recogió suero inmunológico los días 14, 35 y 56.

A continuación, se ensayó la inmunogenicidad de la vacuna mSA-VAR2CSA PSV. Se usó ELISA para medir los niveles de inmunoglobulina (Ig) totales contra VAR2CSA en sueros obtenidos de ratones inmunizados con mSA-VAR2CSA PSV, mSA-VAR2CSA soluble o VAR2CSA desnuda soluble (Fig. 8). Después de tres inmunizaciones, los niveles de Ig específica de VAR2CSA eran más altos en sueros de ratones inmunizados con la vacuna mSA-VAR2CSA Avi-L1 PSV que en sueros de ratones inmunizados con VAR2CSA desnudo soluble (Fig. 8c). Después de la 1a y 2a inmunizaciones, los sueros de ratones inmunizados con mSA-VAR2CSA Avi-L1 VLP tenían títulaciones de punto final de Ig significativamente más altas en comparación con los sueros de ratones inmunizados con la vacuna soluble mSA-VAR2CSA (P = 0,014 y P = 0,018, respectivamente). Sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa después de la 3a inmunización (P = 0,058) (Tabla 4) donde ambas vacunas parecen haber alcanzado un nivel similar.

Tabla 4. Títulaciones de puntro final de suero (mediana {percentiles 25 y 75 }) obtenidos con los diferentes inmunó enos

Ejemplo 18 - Funcionalidad de los anticuerpos anti-VAR2 inducidos por la vacuna mSA-VAR2CSA PSV Se examinó la capacidad de los antisueros para bloquear la unión entre VAR2CSA nativa expresada en la superficie de eritrocitos infectados por parásitos y CSA inmovilizada. Después de la primera inmunización, ninguna de las tres vacunas (mSA-VAR2CSA PSV, mSA-VAR2CSA soluble o VAR2CSA desnuda soluble) había inducido niveles eficaces de anticuerpos inhibidores de la unión funcional, lo que condujo a la unión completa de los parásitos (Fig. 9a). Sin embargo, después de la segunda ronda de inmunizaciones, el suero diluido 1:50 de ratones inmunizados con mSA-VAR2CSA PSV inhibió la unión entre IE y CSA en aproximadamente un 70 %. En comparación, la vacuna soluble mSA-VAR2CSA solo inhibió aproximadamente un 20 %, mientras que no se observó inhibición para la vacuna soluble VAR2CSA desnuda (Fig. 9b). Después de tres inmunizaciones, el suero diluido 1:200 de ratones inmunizados con la vacuna mSA-VAR2CSA PSV mostró aproximadamente un 90 % de inhibición de la unión, mientras que los sueros de ratones inmunizados con la vacuna soluble mSA-VAR2CSA inhibieron la unión del parásito en aproximadamente un 60 %. Por el contrario, la vacuna VAR2CSA desnuda soluble no logró inducir ningún anticuerpo inhibidor de la unión (Fig. 9c).

Estos datos muestran que la vacuna mSA-VAR2CSA PSV muestra una mayor capacidad para inhibir la unión entre IE y CSA.

Ejemplo 19 - Medición de la avidez de los anticuerpos:

Los valores de avidez de los anticuerpos séricos (Ab) se determinaron midiendo la resistencia de los complejos Ab diana a urea 8 M mediante ELISA. Los sueros analizados se obtuvieron después de la 2a inmunización. Las títulaciones de anticuerpos de sueros de ratones individuales se normalizaron en primer lugar mediante dilución. Después de la incubación del suero, se trataron pocillos por triplicado con PBS o urea 8 M durante 5 minutos. Posteriormente, se lavaron los pocillos con PBS y se realizó el ELISA como se describió anteriormente. El valor de la avidez se calculó como la relación del valor medio de DO de los pocillos tratados con urea a los pocillos de control con PBS multiplicado por 100. Una prueba no paramétrica de dos muestras rango-suma de Wilcoxon (Mann-Whitney) mostró que los sueros de ratones inmunizados con la vacuna VAR2CSA AviL1 VLP tenían valores de avidez significativamente más altos en comparación con los ratones inmunizados con mSA-VAR2CSA soluble (valor de P: 0,0275).

Análisis estadístico:

Prueba ran o-suma de Wilcoxon de dos muestras Mann-Whitne

Ho: reducall(grupo==1) = reducall(grupo==2)

z = 2,205

Prob > |z| = 0,0275

Ejemplo 20 - Survivina

Queríamos examinar si nuestra plataforma de presentación de antígenos de partículas similares a virus (PSV) era capaz de superar la tolerancia inmune a un antígeno propio asociado al cáncer "Survivina". Esto se probó acoplando proteínas de fusión de estreptavidina monovalente (mSA) -survivina a la superficie de las PSV de Avi-L1 (bucle HI) de VPH biotiniladas. Se inmunizaron tres ratones con esta vacuna de survivina basada en PSV. Se inmunizaron ratones de control negativo (n = 2) con la misma cantidad (5 |jg) de mSA-Survivina, pero se mezclaron con PSV de Avi-L1 (bucle HI) no biotiniladas. Ambas vacunas se formularon utilizando adyuvante ALUM. Los ratones se inmunizaron tres veces a intervalos de tres semanas y se obtuvieron sueros dos semanas después de cada inmunización.

Los antisueros obtenidos se probaron en ELISA usando survivina desnuda (sin mSA) como antígeno de captura en fase sólida. De esta manera, pudimos probar directamente qué efecto tenía la presentación de PSV sobre la capacidad de los ratones para inducir inmunidad humoral contra el autoantígeno.

Los resultados muestran claramente que todos los ratones inmunizados con survivina-PSV (mSA-Survivina acoplada a HPV Avi-L1 (BUCLE HI)) (n = 3) indujeron respuestas de anticuerpos de alta titulación contra el autoantígeno mSAsurvivina, mientras que la vacuna de control negativo no fue capaz de romper la inmunotolerancia en los ratones inmunizados (sin seroconversión) (Fig. 11a). Por tanto, la capacidad para romper la inmunotolerancia depende únicamente de la presentación de similaridad a un virus y no es el resultado de, por ejemplo, fusionar el autoantígeno con mSA.

Al probar los mismos antisueros en ELISA usando mSA-survivina como antígeno de captura en fase sólida, pudimos ver que los ratones de control negativo producían anticuerpos contra la parte mSA 'extraña' (Fig. 11b ).

Este experimento muestra que después de tres inmunizaciones, los ratones 1-3 (inmunizados con Survivina mostrada en PSV) fueron capaces de romper la autotolerancia, mientras que los ratones 4 y 5 no pueden generar una respuesta contra la survivina soluble.

Ejemplo 20 - Prueba de plataforma PSV:avi para inducir inmunidad humoral contra autoantígenos.

Para demostrar la capacidad de la plataforma PSV: Avi para romper la tolerancia inmune a los autoantígenos, asociados tanto con enfermedad cardiovascular (PCSK9), alergia (IL-5) y cáncer (Her2), fusionaremos genéticamente los autoantígenos con el mSA monovalente y los acoplaremos en PSV biotiniladas (sitio aceptor de biotina), como se describió anteriormente. En algunos casos (IL-5) usaremos al principio los homólogos de genes de ratón para la inmunización de ratones. Específicamente, nuestro procedimiento de trabajo será en primer lugar acoplar HER2 (mSA: Her2-ECD | 23-686 |) y PCSK9 (PCSK9 | 31-692 |: mSA-HIS) al (sitio aceptor de biotina) -PSV, inmunizar, y medir la seroconversión de los animales de entre el grupo a) ratones inmunizados con PSV conjugadas y b) ratones inmunizados con el antígeno soluble no acoplado. La titulación de Ig e IgG específica de antígeno se estimará en una serie de diluciones de 2 veces de los sueros. Una seroconversión positiva se define como las mediciones de la DO de ELISA por encima de 2 x la desviación estándar de un animal inmunizado simulado. La conversión en suero y la inducción de anticuerpos específicos contra HER2 se confirman adicionalmente mediante Western blot usando sueros y lisados celulares de diferentes líneas celulares cancerosas (por ejemplo, melanoma, cáncer de próstata, mama y pulmón).

Ejemplo 21 - Prueba de plataforma PSV:avi para inducir anticuerpos inhibidores del cáncer.

Estamos estableciendo modelos animales para estudiar el efecto de inmunizar animales con antígenos tumorales sobre el crecimiento de un tumor subcutáneo establecido. Se inyectan 100.000 células tumorales que expresan HER2 y / o Survivina en el flanco izquierdo. Esto se está haciendo tanto en animales vacunados como en animales inmunizados de forma simulada, para estudiar el efecto profiláctico de la vacuna. El crecimiento del tumor se monitorea midiendo el tamaño del tumor en crecimiento, así como mediante el escaneo del animal cuando se utilizan líneas celulares transfectadas con luciferasa. En otra configuración, estamos estudiando el efecto terapéutico de la vacuna inmunizando animales con tumores establecidos y monitoreando la regresión/progresión del tumor mediante mediciones de tamaño y/o escaneos fluorescentes.

Ejemplo 22 - Prueba de plataforma PSV:avi para inducir anticuerpos anti-PCSK9 capaces de reducir los niveles de colesterol en plasma/suero.

El objetivo de hacer una vacuna basada en PSV basada en el antígeno PCSK9 es inducir una respuesta humoral capaz de reducir el colesterol en sangre. Por lo tanto, para probar la plataforma PSV:avi medimos los niveles de colesterol en muestras de plasma y suero obtenidas de ratones inmunizados con PSV-PCSK9 y los comparamos con los niveles medidos en ratones inmunizados con el antígeno PCSK9 no acoplado, como se describió anteriormente. Los niveles de colesterol en muestras de plasma y suero se miden usando un kit de ensayo de colesterol E WAKO (n° de cat. 439-17501) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añaden diluciones de estándar de colesterol o muestras de suero/plasma de prueba (volumen de 4|jl) a los pocillos de una placa de 96 pocillos y se añaden 196|jl de reactivo de colesterol preparado. La placa se incuba durante 5 minutos a 37°C y la absorbancia del color desarrollado se lee a 600 nm en 30 minutos.

Secuencias

Tabla 5: R m n l n i iv l n l r n iv l i n

>SEQ ID NO: 1 [Bucle H4, genotipo 16 de VPH] Proteína L1Av¡1

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNN

KILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV

GISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKG

SPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICK

YPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLA

SSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRSTNMS

LCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWN

FGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHGLNDIFEAQKIEWHETPPAPKEDPLKKYTF

WEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRK

LELSGR

> SEQ ID NO: 2 [Bucle Hl, genotipo 16 de VPH] Proteína L1Av¡2

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNN

KILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV

GISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKG

SPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICK

YPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGXXWIYXXQ

XLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRST

NMSLCAAISTSGLNDIFEAQKIEWHEETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTA

DVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKK

YTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRK

KRKLELSGR

> SEQ ID NO: 3 [Bucle DE, genotipo 16 de VPH] Proteína L1Av¡3

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNN KILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV GISGHPLLNKLDDTENASAGLNDIFEAQKIEWHEAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCK PPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSE VPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIK GSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTW DTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHS MNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVN LKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKLEL

> SEQ ID NO: 4 [Bucle FG genotipo 16 de VPH]) Proteína L1av¡4

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNN KILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV GISGHPLLNKLDDTENASAAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCT NVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQAN KSEVPLDICTSICKYPDYI KMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGLNDIFEAQKIEWH EASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTN MSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILED WNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSAD LDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKLELSGRF

> SEQ ID NO: 5 gi|9627108|ref|NP_041332.1 |Proteína L1 de cápside principal [Papilomavirus humano tipo 16]

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNN KILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGV GISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKG SPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVHTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICK YPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGTVGENVPDDLYIKGSGSTANLA SSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRSTNMS LCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWN FGLQPPPGGTLEDTYRFVTQAIACQKHTPPAPKEDDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLD QFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL

> SEQ ID NO: 6 Proteína L1Av¡2 (bucleHI, genotipo 118 de VPH)

MAVWQAASGKVYLPPSTPVARVQSTDEYVERTNIYYHAFTDRLLTVGHPYFNIFNND GNKLEVPKVSGNQHRVFRLRLPDPNRFALADMSVYNPDKERLVWAITGLEIGRGQPL GVGTSGHPLFNKFNDTENGNKYTNTSTDDRQNISFDPKQLQMFIIGCTPCIGEHWDR APACVEDEQLGRCPPIELVNTFIQDDDMADIGYGNLNFKALQQNRSDVSLDIVDEICKY PDFLKMQNDVYGDACFFYARREQCYARRFFVRGGKPGDDIPAEQIDAGKLKNEFYIP AAGGQAQGQLGNSMYFPTVSGSLVSSDAQLFNRPFWLQRAQGHNNGILWGNQLFV TVLDNTRNTNFSIAVYSEGLNDIFEAQKIEWHEQDIANYDSSKSREYQRHVEEYEVSMI LQLCKIPLKPEVLAHINAMNPAILEDWQLGFIPTPDNPIHDTYRYIDSLATRCPDKVPAK EKEDPYGKYVFWNVDLSERLSLDLDQYPLGRKFLFQAGLRQKSVNGSVTRTVSRGA KRKRKSGR

> SEQ ID NO: 7 Proteína L1avi3 (bucleDE, genotipo 118 de VPH)

MAVWQAASGKVYLPPSTPVARVQSTDEYVERTNIYYHAFTDRLLTVGHPYFNIFNND GNKLEVPKVSGNQHRVFRLRLPDPNRFALADMSVYNPDKERLVWAITGLEIGRGQPL GVGTSGHPLFNKFNDTENGNGLNDIFEAQKIEWHETSTDDRQNISFDPKQLQMFIIGC TPCIGEHWDRAPACVEDEQLGRCPPIELVNTFIQDDDMADIGYGNLNFKALQQNRSD VSLDIVDEICKYPDFLKMQNDVYGDACFFYARREQCYARRFFVRGGKPGDDIPAEQID AGKLKNEFYIPAAGGQAQGQLGNSMYFPTVSGSLVSSDAQLFNRPFWLQRAQGHNN GILWGNQLFVTVLDNTRNTNFSIAVYSEQDIANYDSSKSREYQRHVEEYEVSMILQLC KIPLKPEVLAHINAMNPAILEDWQLGFIPTPDNPIHDTYRYIDSLATRCPDKVPAKEKED PYGKYVFWNVDLSERLSLDLDQYPLGRKFLFQAGLRQKSVNGSVTRTVSRGAKRKR KSGRF

> SEQ ID NO: 8 gi|256807737|gb|ACV30153| Proteína L1 [Virus del papiloma humano tipo 18^]

MAVWQAASGKVYLPPSTPVARVQSTDEYVERTNIYYHAFTDRLLTVGHPYFNIFNND GNKLEVPKVSGNQHRVFRLRLPDPNRFALADMSVYNPDKERLVWAITGLEIGRGQPL GVGTSGHPLFNKFNDTENGNKYTNTSTDDRQNISFDPKQLQMFIIGCTPCIGEHWDR APACVEDEQLGRCPPIELVNTFIQDDDMADIGYGNLNFKALQQNRSDVSLDIVDEICKY PDFLKMQNDVYGDACFFYARREQCYARRFFVRGGKPGDDIPAEQIDAGKLKNEFYIP AAGGQAQGQLGNSMYFPTVSGSLVSSDAQLFNRPFWLQRAQGHNNGILWGNQLFV TVLDNTRNTNFSIAVYSEAGKIQDIANYDSSKSREYQRHVEEYEVSMILQLCKIPLKPE VLAHINAMNPAILEDWQLGFIPTPDNPIHDTYRYIDSLATRCPDKVPAKEKEDPYGKYV FWNVDLSERLSLDLDQYPLGRKFLFQAGLRQKSVNGSVTRTVSRGAKRKRK > SEQ ID NO: 9 Proteína Avi3 Europaeisk elg virus del papiloma (bucle DE)

MAFWQPSQRLYLPPTPVTKVLCSEQYIRRKDVFYHGETERMLTVGHPYYEIKQSGSG KTIPKVSPNQYRVFRILLPDPNQFALPDKAMYDPSKERLVWAVVGVQVSRGQPLGGS VSGHSYQNTLIDAENVSGLNDIFEAQKIEWHEQGTDDRKQGGMDVKQQQILLLGCTP AIGEYWTTARPCVTDRPETGSCPPIELKNKPIEDGDMMDIGFGAANFKELNATKSDLP LDIAKDICLYPDYLKMTEEAAGNSMFFFARKEQVYVRHIWSRGGTDKEMPPEAYFLKP KGGDQTQKMPSILFGVPSGSLVSTDGQLFNRPYWLFRAQGMNNGICWLNQLFVTVG DNTRGTTLTITVPTSGSPLTEYDTSKFNVFQRHVEEYKLAFVFQLCSVTLSPETVSHLQ GLMPSILEHWDINMQPPTSSILEDTYRYLESPATKCADNVTPMGPEDPYAGLKFWEV NLKERLSLDLDQFPLGRRFLAQQGLGCSTRKRVAPVPKVTEKRIVRKRRKGN

> SEQ ID NO: 10 sp|P11326|VL1_PAPVE Proteína L1 de cápside principal OS=European elk virus del papiloma GN=L1 PE=3 SV=Proteína 1

MAFWQPSQRLYLPPTPVTKVLCSEQYIRRKDVFYHGETERMLTVGHPYYEIKQSGSG KTIPKVSPNQYRVFRILLPDPNQFALPDKAMYDPSKERLVWAVVGVQVSRGQPLGGS VSGHSYQNTLIDAENVSKKVNAQGTDDRKQGGMDVKQQQILLLGCTPAIGEYWTTAR PCVTDRPETGSCPPIELKNKPIEDGDMMDIGFGAANFKELNATKSDLPLDIAKDICLYP DYLKMTEEAAGNSMFFFARKEQVYVRHIWSRGGTDKEMPPEAYFLKPKGGDQTQKM PSILFGVPSGSLVSTDGQLFNRPYWLFRAQGMNNGICWLNQLFVTVGDNTRGTTLTIT VPTSGSPLTEYDTSKFNVFQRHVEEYKLAFVFQLCSVTLSPETVSHLQGLMPSILEHW DINMQPPTSSILEDTYRYLESPATKCADNVTPMGPEDPYAGLKFWEVNLKERLSLDLD QFPLGRRFLAQQGLGCSTRKRVAPVPKVTEKRIVRKRRKGN

> SEQ ID NO: 11 [Bucle H4, genotipo 16 de VPH]L1Avi1] ADN

G AT AT C AT G G AG AT AATT AAAAT G AT AAC C AT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT C GT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT C AT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGTCTCTGTGGCTGCCCTCTGAA GCCACCGTCTACCTGCCCCCCGTCCCTGTCTCTAAGGTCGTCAGCACCGACGAAT ACGTCGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGAACCTCTAGGCTGCTGGCCG TC G G AC AC CCCTACTTCCC C AT C AAG AAG C C C AAC AAC AAC AAG AT CCTGGTCCC CAAGGT GT CCGGACT GCAGT ACAGGGT GTT CAGGAT CCACCT CCCCGACCCCAA C AAGTT C G G ATT C C C C G AC AC CT CTTT CT AC AAC C C C G AC AC C C AG AG G CTC GTC TGGGCCTGCGTCGGAGTCGAAGTCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCGGAAT CTCTGGACACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAAAACGCCTCTGCCTA C G C C G C C AAC GCCGGTGTC G AC AAC AG G G AAT G C AT CTCTATG G ACT AC AAG C A GACCCAGCTGTGCCTGATCGGATGCAAGCCCCCCATCGGAGAACACTGGGGAAA GGGATCTCCCTGCACCAACGTCGCCGTCAACCCCGGCGACTGCCCCCCTCTGGA ACT G AT C AAC AC C GT C AT C C AG G AC G G C G AC AT G GTC G AC AC C G G ATT C G G AG C CAT GGACTT CACCACCCT GCAGGCCAACAAGT CT GAAGT CCCCCTGGACAT CTGC ACCT CT AT CT GCAAGT ACCCCGACT ACAT CAAGAT GGT GT CT GAACCCTACGGCG ACT CT CT GTT CTT CT ACCT GAGGCGCGAACAGAT GTT CGT CAGGCACCT GTT CAA CCGCGCCGGTGCCGTCGGAGAAAACGTCCCCGACGACCTGTACATCAAGGGATC TGGATCTACCGCCAACCTGGCCTCTTCTAACTACTTCCCTACCCCTTCTGGATCTA TGGTCACCTCTGACGCCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCC AG G G AC AC AAC AAC G G AAT CTGCTGGG G AAAC C AG CTGTTC GT C AC CGTCGTCG ACACCACCAGGT CT ACCAACAT GTCCCT GTGCGCCGCCAT CTCT ACCT CT GAAAC CACCTACAAGAACACCAACTTCAAAGAATACCTGCGCCACGGCGAAGAATACGAC CTGCAGTT CAT CTT CCAGCT GTG CAAGAT CACCCT GACCGCCGACGT CAT GACCT ACAT CCACTCTATGAACTCTAC CAT CTTG G AG G ACT G G AACTT C G G ACT G C AG C C CCCTCCCGGTGGAACCCTCGAGGACACCTACCGCTTCGTCACCAGCCAGGCTAT C G C CTG C C AG AAG C AC G G ACT G AAC G AC AT CTTCGAAGCC C AAAAG AT C G AAT G GCACGAAACCCCCCCT GCCCCCAAAGAGGACCCCCT GAAGAAGT ACACCTT CT G GGAAGTCAACCTGAAAGAAAAGTTCTCTGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGA CGCAAGTTCCTGCTGCAAGCCGGACTGAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGA AAGAGGAAGGCCACCCCCACCACCTCTTCTACCTCTACCACCGCCAAGAGGAAG AAGCGCAAGCTGGAACTGTAAAGCGGCCGC

> SEQ ID NO: 12 L1avi2 (bucle Hl, HPV16) ADN

G AT AT CAT G G AG AT AATT AAAAT G AT AAC CAT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT CGT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT CAT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGTCTCTGTGGCTGCCCTCTGAA GCCACCGTCTACCTGCCCCCCGTCCCTGTCTCTAAGGTCGTCAGCACCGACGAAT ACGTCGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGAACCTCTAGGCTGCTGGCCG TC G G AC AC CCCTACTTCCC CAT C AAG AAG C C C AAC AAC AAC AAG AT CCTGGTCCC CAAGGT GTCCGGACTGCAGTACAGGGTGTTCAG G AT C C AC CTCCCCGACCC CAA C AAGTT C G G ATT C C C C G AC AC CT CTTT CT AC AAC C C C G AC AC C C AG AG G CTC GTC TGGGCCTGCGTCGGAGTCGAAGTCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCGGAAT CTCTGGACACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAAAACGCCTCTGCCTA C G C C G C C AAC GCCGGTGTC G AC AAC AG G G AAT G C AT CTCTATG G ACT AC AAG C A GACCCAGCTGTGCCTGATCGGATGCAAGCCCCCCATCGGAGAACACTGGGGAAA GGGATCTCCCTGCACCAACGTCGCCGTCAACCCCGGCGACTGCCCCCCTCTGGA ACT G AT C AAC AC C GT C AT C C AG G AC G G C G AC AT G GTC G AC AC C G G ATT C G G AG C CAT GGACTT CAC CACCCTGCAGGCCAACAAGT CT GAAGT CCCCCTGGACAT CTGC ACCT CT AT CT GCAAGT ACCCCGACT ACAT CAAGAT GGT GT CT GAACCCTACGGCG ACTCTCTGTTCTTCTACCT G AG G C G C G AAC AG AT GTTC GT C AG G CAC CTCTT CAA CAGGGCCGGTGCCGTCGGAGAAAACGTCCCCGACGACCTGTACATCAAGGGATC TGGATCTACCGCCAACCTGGCCTCTTCTAACTACTTCCCTACCCCTTCTGGATCTA TGGTCACCTCTGACGCCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCC AG G G AC AC AAC AAC G G AAT CTGCTGGG G AAAC C AG CTGTT C GT CAC CGTCGTCG ACACCACCAGGT CT ACCAACAT GT CCCT GTGCGCCGCCAT CT CT ACCT CTGGACT G AAC G AC AT CTT C G AG G C C C AAAAG AT C G AAT G G C AC G AG G AAAC C AC CT AC AAG AAC AC C AACTT C AAAG AAT ACCT G C G C CAC G G C G AAG AAT AC G AC CTG C AGTT C A TCTTC C AG CTGTG CAAGAT CAC C CT G AC CG C C G AC GT CAT G AC CT ACAT C C ACT C T AT G AACT CTAC CAT CTTG G AG G ATT G G AACTT C G G ACTG C AG CCCCCTCCCGGT G G AAC C CTC G AG G AC AC CTACCGCTTCGT CAC C AG C C AG GCTATCGCCTGC C AG AAG C AC AC CCCCCCTGCCCC C AAAG AG G AC C C C CT G AAG AAGT AC AC CTTCTG G GAAGT CAACCT GAAAGAAAAGTT CT CTGCCGACCT GGACCAGTT CCCCCT GGGAC G C AAGTT C CTG CTG C AAG CC G G ACT G AAG G C C AAG C C C AAGTT CAC C CTG G G AA AG AG G AAG G C CAC C C C CAC CAC CTCTTCTAC CTCTACCACCGC C AAG AG G AAG A AGCGCAAGCTGGAACTGTAAAGCGGCCGC

> SEQ ID NO: 13 L1avi3 (bucle DE, HPV16)

G AT AT CAT G G AG AT AATT AAAAT G ATAAC CAT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT C GT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT CAT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGTCTCTGTGGCTGCCCTCTGAA GCCACCGTCTACCTGCCCCCCGTCCCTGTCTCTAAGGTCGTCAGCACCGACGAAT ACGTCGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGAACCTCTAGGCTGCTGGCCG TC G G AC AC CCCTACTTCCC CAT C AAG AAG C C C AAC AAC AAC AAG AT CCTGGTCCC C AAG GT GTC C G G ACT G C AGT AC AG G GTGTT C AG G AT C CAC CTCCCCGACCC CAA C AAGTT C G G ATT C C C C G AC AC CT CTTT CT AC AAC C C C G AC AC C C AG AG G CTC GTC TGGGCCTGCGTCGGAGTCGAAGTCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCGGAAT CTCTGGACACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAAAACGCCTCTGCCGG ACT G AAC G AC AT CTTC G AG G C C C AAAAG AT C G AAT G G C AC GAGGCCGGTGTCGA C AAC AG G G AAT G C AT CTCTATG G ACT AC AAG C AG AC C C AG CTGTGCCT G AT C G G A TGCAAGCCCCCCATCGGAGAACACTGGGGAAAGGGATCTCCCTGCACCAACGTC GCCGTCAACCCCGGCGACTGCCCCCCTCTGGAACTGATCAACACCGTCATCCAG G AC G G C G AC AT G GTC G AC AC C G G ATT C G G AG C C AT G G ACTT C AC C AC C CTG C AG GCCAACAAGT CT GAAGT CCCCCTGGACAT CTGCACCT CT AT CT GCAAGT ACCCCG ACT ACAT CAAG AT G GTGTCT GAACC CT ACG G CGACT CT CT GTT CTT CT ACCT G AG GCGCGAACAGATGTTCGTCAGGCACCTCTTCAACAGGGCCGGTGCCGTCGGAGA AAACGT CCCCGACGACCT GT ACAT CAAGGGAT CTGGAT CT ACCGCCAACCT GGCC T CTT CT AACT ACTT CCCT ACCCCTT CT GGAT CT ATGGT CACCT CT GACGCCCAGAT CTT C AAC AAG CCCTACTGGCTG C AG AG G G C C C AG G G AC AC AAC AAC G G AAT CTG CTG G G G AAAC C AG CTGTTC GT C AC C GTC GTC G AC AC C AC C AG GTCTAC C AAC AT G TCCCT GTGCGCCGCCAT CT CT ACCT CT G AAACC ACCT ACAAG AACACCAACTT CA AAG AAT ACCTGCGC C AC G G C G AAG AAT AC G AC CTG C AGTT C AT CTTC C AG CTGTG C AAG AT C AC C CT G AC CGCCGACGT C AT G AC CT ACAT C C ACTCTAT G AACT CTAC C ATCTTGGAGGATTGGAACTTCGGACTGCAGCCCCCTCCCGGTGGAACCCTCGAG GACACCTACCGCTTCGTCACCAGCCAGGCTATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCC CCTGCCCCCAAAGAGGACCCCCT GAAGAAGT ACACCTT CTGGGAAGT CAACCT GA AAGAAAAGTT CT CTGCCGACCT GGACCAGTT CCCCCTGGGACGCAAGTT CCTGCT G CAAG CCGGACTGAAGGC CAAG C C C AAGTT C AC C CTG G G AAAG AG G AAG G C C AC CCCCACCACCTCTTCTACCTCTACCACCGCCAAGAGGAAGAAGCGCAAGCTGGAA CTGTAAAGCGGCCGC

> SEQ ID NO: 14 L1avi4 (bucle FG, HPV16)

G AT AT C AT G G AG AT AATT AAAAT G AT AAC C AT CTC G C AAAT AAATAAGT ATTTTACT GTTTT C GT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT C AT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGTCTCTGTGGCTGCCCTCTGAA GCCACCGTCTACCTGCCCCCCGTCCCTGTCTCTAAGGTCGTCAGCACCGACGAAT ACGTCGCCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGAACCTCTAGGCTGCTGGCCG TCGGACACCCCTACTTCCC C AT CAAG AAG C C C AAC AAC AAC AAG AT CCTGGTCCC C AAG GT GTCCGGACTGCAGTACAGGGTGTTCAG G AT C C AC CTCCCCGACCC CAA C AAGTT C G G ATT C C C C G AC AC CT CTTT CT AC AAC C C C G AC AC C C AG AG G CTC GTC TGGGCCTGCGTCGGAGTCGAAGTCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCGGAAT CTCTGGACACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAAAACGCCTCTGCCTA C G C C G C C AAC GCCGGTGTC G AC AAC AG G G AAT G C AT CTCTATGGACT AC AAG C A GACCCAGCTGTGCCTGATCGGATGCAAGCCCCCCATCGGAGAACACTGGGGAAA GGGATCTCCCTGCACCAACGTCGCCGTCAACCCCGGCGACTGCCCCCCTCTGGA ACT G AT C AAC AC C GT C AT C C AG G AC G G C G AC AT G GTC G AC AC C G G ATT C G G AG C C AT G G ACTT C AC C AC CCTGCAGGC C AAC AAGT CT G AAGT C C C C CTG G AC AT CTG C ACCT CT AT CT GCAAGT ACCCCGACT ACAT CAAGAT GGT GT CT GAACCCTACGGCG ACTCTCTGTTCTTCTACCTGAGGCGCGAACAGATGTTCGTCAGGCACCTCTTCAA C AG G G C C G GTG C C GTC G G AG AAAAC GTC C C C G AC G AC CTGTAC ATC AAG G G ACT G AAC G AC AT CTTCGAGGCC C AAAAG AT C G AAT G G C AC G AG GCCTCTTCT AACT AC TTCCCT ACCCCTT CT GGAT CT ATGGT CACCT CT GACGCCCAGAT CTT CAACAAGCC CTACTGGCTG C AG AG G G C C C AG G G AC ACAAC AAC G G AAT CTGCTGGG G AAAC C A GCT GTT CGT CACCGT CGT CGACACCACCAGGT CT ACCAACAT GTCCCTGTGCGCC G C C AT CTCTACCTCT G AAAC C AC CT AC AAG AAC AC C AACTT C AAAG AAT AC CTG C G CCACGGCG AAG AAT ACG ACCTGCAGTT CAT CTT CC AGCT GT GC AAGAT CACCCT G

GGAACTTCGGACTGCAGCCCCCTCCCGGTGGAACCCTCGAGGACACCTACCGCT TCGTCACCAGCCAGGCTATCGCCTGCCAGAAGCACACCCCCCCTGCCCCCAAAG AGGACCCCCT GAAGAAGT ACACCTT CT G GGAAGT CAACCT GAAAGAAAAGTT CT C TGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGACGCAAGTTCCTGCTGCAAGCCGGACT GAAGGCCAAGCCCAAGTTCACCCTGGGAAAGAGGAAGGCCACCCCCACCACCTC TTCTACCTCTACCACCGCCAAGAGGAAGAAGCGCAAGCTGGAACTGTAAAGCGG CCGC

> SEQ ID NO: 15 L1avi2 (bucle Hl, HPV118)

G AT AT CAT G G AG AT AATT AAAAT G ATAAC CAT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT CGT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT CAT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGGCCGTCTGGCAGGCCGCCTC TGGAAAGGTCTACCTGCCCCCCTCTACCCCCGTCGCCAGGGTCCAGTCTACCGA C G AAT AC GTC G AAAG G AC C AAC AT CTACTAC C AC G C CTT C AC C G AC AG G CTG CTG ACCGTCGGACACCCCTACTT C AAC AT CTT C AAC AAC G AC G G AAAC AAG CTC G AAG TCCCCAAGGTGTCCGGAAACCAGCACAGGGTGTTCAGGCTGAGGCTGCCCGACC CCAACCGCTTCGCCCT GGCCGACAT GT CT GT CT ACAACCCCGACAAAGAAAGGCT CGTCTGGGCCATCACCGGACTGGAAATCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCG G AAC CTCTG G AC AC C C C CTGTT C AAC AAGTT C AAC G AC AC C G AAAAC G G C AAC AA GT AC AC C AAC AC CTC C AC C G AC G AC AG G C AG AAC AT CT CTTT C G AC C C C AAG C AG CTGCAGATGTTCATCATCGGATGCACCCCCTGCATCGGAGAACACTGGGACAGG GCCCCTGCCTGCGTCGAGGACGAACAGCTGGGAAGGTGCCCCCCCATCGAACTG GTCAACACCTTCATCCAGGACGACGACATGGCCGACATCGGATACGGAAACCTGA ACTTCAAGGCCCTGCAGCAGAACCGCTCTGACGTGTCCCTGGACATCGTCGACG AAATCTGCAAGTACCCCGACTTCCTGAAGATGCAGAACGACGTCTACGGCGACGC CTGCTTCTTCTACGCTAGGCGCGAACAGTGCTACGCCAGGCGCTTCTTCGTCCGC GGAGGAAAGCCCGGCGACGACATCCCCGCCGAACAGATCGACGCCGGAAAGCT GAAGAACGAATTCTACATCCCTGCCGCCGGTGGACAGGCCCAGGGACAGCTCGG AAACT CT AT GT ACTT CCCCACCGT CAGCGGAT CT CT CGT CAGCT CT GACGCCCAG CTGTT C AAC AG GCCCTTCTGGCTG C AG C G C G CT C AG G G AC AC AAC AAC G G AAT C CTGTG G G G AAAC CAGTTGTTCGTCACCGTCCTG G AC AAC AC C C G C AAC AC C AACT T CT CT AT CGCCGT CT ACT CT GAGGGACT GAACGACAT CTT CGAAGCCCAAAAGAT CGAATGGCACGAGCAG GACATTGCCAACT ACGACT CTT CT AAGT CT AGGGAAT AC CAGCGCCACGT CGAAGAGTACGAAGT CT CT AT GAT CCTGCAGCT GTGCAAGAT CC CCCTGAAGCCCGAAGTCCTGGCCCACATCAACGCCATGAACCCCGCCATCTTGG AGGACT GGCAGCTGGGATT CAT CCCCACCCCCGACAACCCCATCCACGACACCT ACCGCTACATCGACTCCCTGGCCACCAGGTGCCCTGACAAGGTCCCCGCCAAAG AAAAAGAGGACCCCT ACGGCAAAT ACGT GTT CTGGAACGT CGACCT GT CT GAAAG GCTGTCTCTGGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGACGCAAGTTCCTGTTCCAAGC CGGACTGAGGCAGAAGTCTGTCAACGGATCTGTCACCAGGACCGTCAGCAGGGG AGCCAAGAGGAAGCGCAAGTAAAGCGGCCGC

> SEQ ID NO: 16 L1avi3 (bucle DE, HPV118)

GAT AT CAT G G AG AT AATT AAAAT GAT AAC CAT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT CGT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT CAT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGGCCGTCTGGCAGGCCGCCTC TGGAAAGGTCTACCTGCCCCCCTCTACCCCCGTCGCCAGGGTCCAGTCTACCGA C G AAT AC GTC GAAAG G AC C AAC AT CTACTAC C AC G C CTT C AC C G AC AG G CTG CTG AC C GTC G G AC AC C C CT ACTT C AAC AT CTT C AAC AAC G AC G G AAAC AAG CTC G AAG T CCCCAAGGT GT CCGGAAACCAGCACAGGGT GTT CAGGCT GAGGCTGCCCGACC CCAACCGCTTCGCCCT GGCCGACAT GT CT GT CT ACAACCCCGACAAAGAAAGGCT CGTCTGGGCCATCACCGGACTGGAAATCGGAAGGGGACAGCCCCTGGGAGTCG G AAC CTCTG G AC AC C C C CTGTT C AAC AAGTT C AAC G AC AC C G AAAAC G G C AAC G G ACT G AAC G AC AT CTTC G AAG C C C AAAAG AT C G AAT G G C AC G AG AC CTC C AC C G AC G AC AG G C AG AAC AT CT CTTT C G AC C C C AAG C AG CTG C AG AT GTT CAT CAT C G G AT GCACCCCCTGCATCGGAGAACACTGGGACAGGGCCCCTGCCTGCGTCGAGGAC GAACAGCTGGGAAGGTGCCCCCCCATCGAACTGGTCAACACCTTCATCCAGGAC G AC G AC AT G G C C G AC AT C G G AT AC G G AAAC CT G AACTT C AAG G C C CTG C AG C AG AACCGCT CT GACGT GTCCCT GGACAT CGT CGAC GAAAT CTGCAAGT ACCCCGACT TC CT G AAG AT G C AG AAC G AC GT CT AC G G C G AC GCCTGCTTCTTCT AC GCTAGGCG CGAACAGTGCTACGCCAGGCGCTTCTTCGTCCGCGGAGGAAAGCCCGGCGACGA C AT C C C C G C C G AAC AG AT C G AC G C C G G AAAG CT G AAG AAC G AATT CT AC AT C C CT GCCGCCGGTGGACAGGCCCAGGGACAGCTCGGAAACTCTATGTACTTCCCCACC GTCAGCGGATCTCTCGTCAGCTCTGACGCCCAGCTGTTCAACAGGCCCTTCTGGC T G C AG C G C G CT C AG G G AC AC AAC AAC G G AAT CCTGTGGG G AAAC C AGTT GTTC G T CACCGT CCT GGACAACACCCGCAACACCAACTT CT CT AT CGCCGT CT ACT CT GA GGCCGGAAAGATCCAGGACATTGCCAACTACGACTCTTCTAAGTCTAGGGAATAC CAGCG CCACGT CGAAGAGTACGAAGT CT CT AT GAT CCTGCAGCT GTGCAAGAT CC CCCTGAAGCCCGAAGTCCTGGCCCACATCAACGCCATGAACCCCGCCATCTTGG AGGACT GGCAGCTGGGATT CAT CCCCACCCCCGACAACCCCATCCACGACACCT ACCGCTACATCGACTCCCTGGCCACCAGGTGCCCTGACAAGGTCCCCGCCAAAG AAAAAGAGGACCCCT ACGGCAAAT ACGT GTT CTGGAACGT CGACCT GT CT GAAAG GCTGTCTCTGGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGACGCAAGTTCCTGTTCCAAGC CGGACTGAGGCAGAAGTCTGTCAACGGATCTGTCACCAGGACCGTCAGCAGGGG AGCCAAGAGGAAGCGCAAGTAAAGCGGCCGC

> SEQ ID NO: 17 PAPVE-L1avi3

GAT AT CAT G G AG AT AATT AAAAT GAT AAC CAT CTC G C AAAT AAAT AAGT ATTTT ACT GTTTT CGT AAC AGTTTT GT AAT AAAAAAAC CTAT AAAT ATT C C G G ATT ATT CAT AC C GTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCTACTAGTATGGCCTTCTGGCAGCCCTCTCAG CGTCTGTACCTGCCCCCCACCCCCGTCACCAAGGTCCTGTGCTCTGAACAGTACA T C AG G C G C AAG G AC GTGTTCTAC C AC G G C G AAAC C GAAAG G ATG CT G AC C GTC G G AC AC CCCTACTAC GAAAT C AAG C AGT CTG GAT CTG G AAAG AC CAT C C C C AAG GT GTC C C C C AAC C AGT AC AG GGTGTTCAGGATCCTGCTGCCCGACCCTAACCAGTTC GCCCTGCCCGACAAGGCTATGTACGACCCCTCTAAGGAAAGGCTCGTCTGGGCC GTCGTCGGAGTCCAGGTGTCCCGTGGACAGCCTCTGGGAGGATCTGTCTCTGGA CACT CTT ACCAGAACACCCT GAT CGACGCCGAAAACGT GT CCGGACT GAACGACA TCTTC G AAG C C C AAAAG AT C G AAT G G C AC G AAC AG G G AAC C G AC G AC C G C AAG C AGGGTGGAATGGACGTCAAGCAGCAGCAGATCCTGCTCCTGGGATGCACCCCCG CCATCGGAGAATACTGGACCACCGCCAGGCCCTGCGTCACCGACAGGCCCGAAA CCGGATCTTGCCCCCCCATCGAACTGAAGAACAAGCCCATCGAGGACGGCGACA TG ATG G AC AT C G G ATT C G G AG C C G C C AACTT C AAG G AACT G AAC G C C AC C AAGT C T GACCT GCCCCT GGACAT CGCCAAGGACAT CTGCCT GT ACCCCGACT ACCT GAAG ATGACCGAAGAAGCCGCCGGAAACTCTATGTTCTTCTTCGCCCGCAAGGAACAGG TCTACGTCCGCCACATCTGGTCCCGCGGAGGAACCGACAAGGAAATGCCCCCCG AAGCCTACTTCCTGAAGCCCAAGGGTGGCGACCAGACCCAGAAGATGCCCTCTAT CCTGTTCGGAGTCCCCTCTGGATCTCTCGTCAGCACCGACGGACAGCTGTTCAAC AGGCCCTACTGGCTGTTCAGGGCCCAGGGAATGAACAACGGAATCTGCTGGCTG AACCAGCTGTTCGTCACCGTCGGAGACAACACCAGGGGAACCACCCTGACCATC ACCGTCCCCACCT CTGGATCCCCCCT GACCGAAT ACGACACCT CCAAGTT CAACG TGTTCCAGAGGCACGTCGAAGAGTACAAGCTGGCCTTCGTGTTCCAGCTGTGCTC TGTCACCCTGTCTCCCGAAACCGTCAGCCACCTCCAGGGACTGATGCCTTCCATC CTG G AAC ACT G G G AC AT C AAC AT G C AG C C C C C C AC CT CTTCTATCCTC G AG G AC A CCTACCGCTACCTGGAATCTCCTGCCACCAAGTGCGCCGACAACGTCACCCCCAT GGGACCCGAGGACCCCTACGCCGGACTGAAGTTCTGGGAAGTCAACCTGAAGGA ACGCCTGTCCCTGGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGAAGGCGCTTCCTGGCCCA GCAGGGACTGGGATGCTCTACCCGCAAGAGGGTCGCCCCCGTCCCTAAGGTCAC CGAAAAGAGGATCGTCCGCAAGAGGCGCAAGGGAAACTAAAGCGGCCGCTAA

> SEQ ID NO: 18 A1 >mSA- Her2-ECD|23-686

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQWQGNLELTYLPTNASLS FLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVT GASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRS RACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAG CTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACP YNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAV TSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAW PDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHL CFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCV NCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQC VACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDK GCPAEQRASPLTSIISAVVGILLWVLGWFGILIKRRQQKIRKYTHHHHHH

> SEQ ID NO: 19 A2 >mSA-IL-5(C63T/C105T)

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQLTTEEIFQGIGTL ESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKTGEERRRVNQFLDYLQEFLGVMNTEWII ES*SGRK

> SEQ ID NO: 20 A3 >PCSK9|31-692|:mSA:HIS

QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVWLKEETH LSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEED SSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTD FENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKG TVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGN FRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDC STCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQ RVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSF SRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEAS MGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASC CHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCW RSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGGSAEAGITGTWYNQHGSTFT VTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRT EWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVKHHHHHH

> SEQ ID NO: 21 A4 >mSA-ID1 ID2a-HIS

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSNYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVG QAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCC CQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSG TSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFD TKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWD NEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAM KHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEVWENFCEQRQAKVKDV ITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQI YKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTP SSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLWVNVPSPLG NTPYRYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNG VDVKPTTVRSNSSKLDHHHHHH

> SEQ ID NO: 22 A5 >mSA-RO-HIS

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSTSENRNKRIGGPKLRGNVTSNIKFPSDNKGKIIRGSNDKLNKNSEDVLEQS EKSLVSENVPSGLDIDDIPKESIFIQEDQEGQTHSELNPETSEHSKDLNNNGSKNESSD IISENNKSNKVQNHFESLSDLELLENSSQDNLDKDTISTEPFPNQKHKDLQQDLNDEPL EPFPTQIHKDYKEKNLINEEDSEPFPRQKHKKVDNHNEEKNVFHENGSANGNQGSLK LKSFDEHLKDEKIENEPLVHENLSIPNDPIEQILNQPEQETNIQEQLYNEKQNVEEKQN SQIPSLDLKEPTNEDILPNHNPLENIKQSESEINHVQDHALPKENIIDKLDNQKEHIDQS QHNINVLQENNINNHQLEPQEKPNIESFEPKNIDSEIILPENVETEEIIDDVPSPKHSNHE TFEEETSESEHEEAVSEKNAHETVEHEETVSQESNPEKADNDGNVSQNSNNELNEN EFVESEKSEHEARSKAKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEENMLSHLYVSSKDKENI SKENDDVLDEKEEEAEETEEEELEEKNEEETESEISEDEEEEEEEEEKEEENDKKKEQ EKEQSNENNDQKKDMEAQNLISKNQNNNEKNVKEAAESIMKTLAGLIKGNNQIDSTLK DLVEELSKYFKNHRSHHHHHH

> SEQ ID NO: 23 A6 >HIS-RO-mSA

GSTSENRNKRIGGPKLRGNVTSNIKFPSDNKGKIIRGSNDKLNKNSEDVLEQSEKSLV SENVPSGLDIDDIPKESIFIQEDQEGQTHSELNPETSEHSKDLNNNGSKNESSDIISEN NKSNKVQNHFESLSDLELLENSSQDNLDKDTISTEPFPNQKHKDLQQDLNDEPLEPFP TQIHKDYKEKNLINEEDSEPFPRQKHKKVDNHNEEKNVFHENGSANGNQGSLKLKSF DEHLKDEKIENEPLVHENLSIPNDPIEQILNQPEQETNIQEQLYNEKQNVEEKQNSQIP SLDLKEPTNEDILPNHNPLENIKQSESEINHVQDHALPKENIIDKLDNQKEHIDQSQHNI NVLQENNINNHQLEPQEKPNIESFEPKNIDSEIILPENVETEEIIDDVPSPKHSNHETFEE ETSESEHEEAVSEKNAHETVEHEETVSQESNPEKADNDGNVSQNSNNELNENEFVE SEKSEHEAGGSGAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNS PYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGG SGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO:24 A7 >HIS-GMZ2ggsmSA

GSTSENRNKRIGGPKLRGNVTSNIKFPSDNKGKIIRGSNDKLNKNSEDVLEQSEKSLV SENVPSGLDIDDIPKESIFIQEDQEGQTHSELNPETSEHSKDLNNNGSKNESSDIISEN NKSNKVQNHFESLSDLELLENSSQDNLDKDTISTEPFPNQKHKDLQQDLNDEPLEPFP TQIHKDYKEKNLINEEDSEPFPRQKHKKVDNHNEEKNVFHENGSANGNQGSLKLKSF DEHLKDEKIENEPLVHENLSIPNDPIEQILNQPEQETNIQEQLYNEKQNVEEKQNSQIP SLDLKEPTNEDILPNHNPLENIKQSESEINHVQDHALPKENIIDKLDNQKEHIDQSQHNI NVLQENNINNHQLEPQEKPNIESFEPKNIDSEIILPENVETEEIIDDVPSPKHSNHETFEE ETSESEHEEAVSEKNAHETVEHEETVSQESNPEKADNDGNVSQNSNNELNENEFVE SEKSEHEARSKAKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEENMLSHLYVSSKDKENISKEN DDVLDEKEEEAEETEEEELEEKNEEETESEISEDEEEEEEEEEKEEENDKKKEQEKEQ SNENNDQKKDMEAQNLISKNQNNNEKNVKEAAESIMKTLAGLIKGNNQIDSTLKDLVE ELSKYFKNHGGSGAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQN SPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEG GSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO:25 A8 >HIS-GMZ2T:ggsmSA GSTSENRNKRIGGPKLRGNVTSNIKFPSDNKGKIIRGSNDKLNKNSEDVLEQSEKSLV SENVPSGLDIDDIPKESIFIQEDQEGQTHSELNPETSEHSKDLNNNGSKNESSDIISEN NKSNKVQNHFESLSDLELLENSSQDNLDKDTISTEPFPNQKHKDLQQDLNDEPLEPFP TQIHKDYKEKNLINEEDSEPFPRQKHKKVDNHNEEKNVFHENGSANGNQGSLKLKSF DEHLKDEKIENEPLVHENLSIPNDPIEQILNQPEQETNIQEQLYNEKQNVEEKQNSQIP SLDLKEPTNEDILPNHNPLENIKQSESEINHVQDHALPKENIIDKLDNQKEHIDQSQHNI NVLQENNINNHQLEPQEKPNIESFEPKNIDSEIILPENVETEEIIDDVPSPKHSNHETFEE ETSESEHEEAVSEKNAHETVEHEETVSQESNPEKADNDGNVSQNSNNELNENEFVE SEKSEHEARSKTKEYAEKAKNAYEKAKNAYQKANQAVLKAKEASSYDYILGWEFGGG VPEHKKEENMLSHLYVSSKDKENISKENDDVLDEKEEEAEETEEEELEGGSGAEAGIT GTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVE WNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO:26 A9 >mSA-PfRH5-HIS

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSLSFENAIKKTKNQENNLTLLPIKSTEEEKDDIKNGKDIKKEIDNDKENIKTNN AKDHSTYIKSYLNTNVNDGLKYLFIPSHNSFIKKYSVFNQINDGMLLNEKNDVKNNEDY KNVDYKNVNFLQYHFKELSNYNIANSIDILQEKEGHLDFVIIPHYTFLDYYKHLSYNSIYH KYSTYGKYIAVDAFIKKINETYDKVKSKCNDIKNDLIATIKKLEHPYDINNKNDDSYRYDI SEEIDDKSEETDDETEEVEDSIQDTDSNHTPSNKKKNDLMNRTFKKMMDEYNTKKKK LIKCIKNHENDFNKICMDMKNYGTNLFEQLSCYNNNFCNTNGIRFHYDEYIHKLILSVKS KNLNKDLSDMTNILQQSELLLTNLNKKMGSYIYIDTIKFIHKEMKHIFNRIEYHTKIINDKT KIIQDKIKLNIWRTFQKDELLKRILDMSNEYSLFITSDHLRQMLYNTFYSKEKHLNNIFHH LIYVLQMKFNDVPIKMEYFQTYKKNKPLTQHHHHHH

> SEQ ID NO:27 A10 >mSA-Pfs25-HIS

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF TKVKGGSNKLYSLFLFLFIQLSIKYNNAKVTVDTVCKRGFLIQMSGHLECKCENDLVLV NEETCEEKVLKCDEKTVNKPCGDFSKCIKIDGNPVSYACKCNLGYDMVNNVCIPNEC KNVTCGNGKCILDTSNPVKTGVCSCNIGKVPNVQDQNKCSKDGETKCSLKCLKENET CKAVDGIYKCDCKDGFIIDNESSICTAFSAYNILNLSIMFILFSVCFFIM

> SEQ ID NO:28 A11 >HIS-PfCSP(aa92-397)-mSA

KLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNAN PNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNA NPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPN ANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEP SDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICK MEKCSSVFNWNSSIGLIMVLSFLFLNGGSAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLT GQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGG AEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO:29 A3 >PCSK9|31-692|:mSA:HIS ADN

TTTCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT G G C ATT ATG C C C AGT AC AT G AC CTT AT G GG ACTTT CCTACTTGG C AGT AC AT CT AC GT ATT AGT C AT C G CT ATT AC C AT G GTG ATG C G GTTTT G G C AGT AC AT C AAT G G G C GTG G AT AG C G GTTT G ACT C AC G G G G ATTT C C AAGT CTC C AC C C C ATT G AC GT CAA TG G G AGTTT GTTTT G G C AC C AAAAT C AAC G G G ACTTT C CAAAAT GT C GTAAC AACT CCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAA G C AG AG CT CTCTGGCTAACT AG AG AAC C C ACT GCTTACTGGCTTATC G AAATT AAT AC G ACT C ACTATAG G G AG AC C C AAG CTGGCTAGC GTTT AAACTT AAG CTTAG C G C AGAGGCTTGGGGCAGCCGAGCGGCAGCCAGGCCCCGGCCCGGGCCTCGGTTCC AGAAGGGAGAGGAGCCCGCCAAGGCGCGCAAGAGAGCGGGCTGCCTCGCAGTC CGAGCCGGAGAGGGAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGACGGCCTCCGAAACC ATGCAGGAAGATGAGGACGGCGACTACGAGGAACTGGTGCTGGCCCTGCGGAG CGAAGAGGATGGACTGGCCGAGGCCCCTGAGCACGGCACCACCGCCACCTTCC ACAGATGCGCCAAGGACCCTTGGCGGCTGCCCGGCACATACGTGGTGGTGCTGA AAGAGGAAACCCACCTGAGCCAGAGCGAGCGGACCGCCAGAAGGCTGCAGGCC CAGGCCGCCAGAAGAGGCTACCTGACCAAGATCCTGCACGTGTTCCACGGCCTG CTGCCCGGCTTCCTGGTGAAAATGAGCGGCGACCTGCTGGAACTGGCCCTGAAG CTGCCCCACGTGGACTACATCGAAGAGGACAGCAGCGTGTTCGCCCAGAGCATC CCCTGGAACCTGGAACGGATCACCCCCCCCAGATACCGGGCCGACGAGTACCAG CCTCCTGACGGCGGCAGCCTGGTGGAAGTGTACCTGCTGGACACCAGCATCCAG AGCGACCACCGCGAGAT CGAGGGCAGAGT GAT GGT GACAGACTT CGAGAACGT G CCCGAAGAGGACGGCACCCGGTTCCACAGACAGGCCAGCAAGTGCGACAGCCA CGGCACACATCTGGCCGGCGTGGTGTCTGGCAGAGATGCCGGCGTGGCCAAGG GCGCCAGCATGAGAAGCCTGCGGGTGCTGAACTGCCAGGGCAAGGGCACCGTG TCCGGCACCCTGATCGGCCTGGAATTCATCCGGAAGTCCCAGCTGGTGCAGCCC GTGGGCCCTCTGGTGGTGCTGCTGCCTCTGGCTGGCGGCTACAGCAGAGTGCTG AACGCCGCCTGCCAGAGACTGGCCAGAGCTGGCGTGGTGCTGGTGACAGCCGC CGGAAACTTCCGGGACGACGCCTGCCTGTACAGCCCCGCCTCTGCCCCCGAAGT GATCACCGTGGGCGCCACCAACGCCCAGGACCAGCCTGTGACACTGGGCACCCT GGGCACAAACTTCGGCAGATGCGTGGACCTGTTCGCCCCTGGCGAGGACATCAT CGGCGCCAGCAGCGACTGCAGCACCTGTTTCGTGTCCCAGAGCGGCACCAGCCA GGCCGCTGCCCATGTGGCCGGAATCGCCGCCATGATGCTGAGCGCCGAGCCTG AGCTGACCCTGGCCGAGCTGCGGCAGCGGCTGATCCACTTCTCCGCCAAGGACG T GAT CAACGAGGCCTGGTTCCCCGAGGACCAGAGAGT GCT GACCCCCAACCT GG TGGCCGCCCTGCCTCCTTCTACACACGGCGCTGGCTGGCAGCTGTTCTGCAGGA CAGTGTGGTCCGCCCACAGCGGCCCCACCAGAATGGCCACAGCCGTGGCCAGAT GCGCCCCTGATGAG G AACT GCT G AG CTG C AG C AG CTTCTC C AG AAG C G G C AAG C GGAGAGGCGAGCGGATGGAAGCCCAGGGCGGCAAGCTCGTGTGCAGAGCCCAC AATGCCTTCGGCGGCGAGGGCGTGTACGCCATTGCCAGATGCTGCCTGCTGCCT C AG G C C AACT G C AG C GTG C AC AC AG C C C CTC C AG C C G AG G C C AG C AT G G G C AC C AG AGT G C ACT G C C AC C AG C AG G G C C ACGT GCT G AC C G G CTGT AG C AG C C ACT G GGAGGTGGAAGATCTGGGCACCCACAAGCCCCCCGTGCTGAGGCCCAGAGGCC AG C CT AAT CAGTGCGTGGGC C AC AG AG AG G C CTC C AT CC AC G C C AG CTGTTG C C ACGCCCCTGGCCTGGAATGCAAAGTGAAAGAGCACGGCATCCCTGCCCCCCAGG AACAGGTCACAGTGGCCTGCGAGGAAGGCTGGACCCTGACAGGCTGTTCCGCCC TGCCAGGCACCTCTCACGTGCTGGGCGCCTACGCCGTGGACAATACCTGCGTCG TGCGCAGCCGGGACGTGTCCACAACCGGCTCTACAAGCGAGGGCGCCGTGACC GCCGTGGCCATCTGCTGCAGAAGCAGACACCTGGCCCAGGCCTCCCAGGAACTG CAGGGCGGATCTGCCGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGGTACAATCAGCACGG C AG C AC CTTC AC C GT G AC CG CT GGCGCCGACGG C AAC CT G AC C G G C C AGT AC G A GAACAGAGCCCAGGGCACCGGCTGCCAGAACAGCCCTTACACCCTGACCGGCAG

CTGCCACAGCCGGACCGAGTGGCGGGGACAGTATCAGGGCGGAGCCGAGGCCC GGATCAACACCCAGTGGAACCTGACCTACGAGGGCGGCTCTGGCCCTGCCACAG AG C AG G G AC AG G AC AC CTT C AC C AAAGT G AAG C AC C ACC AC C AT C AC C ACT AAG C GGCCGCTTTT

> SEQ ID NO:30 A4 >mSA-ID1 ID2a-HIS ADN

C C AT GGGCGGTG C AG AAG C AG GT ATT AC C G G C AC CTG G TAT AAT C AG C AT G GTA G C AC CTTT AC C GTTAC C G C AG G C G C AG AT G GT AAT CT G AC AG GT C AGT AT G AAAA TCGTGCACAGGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTAT AATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTGAATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTC ATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAA TACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGCGGTCCGGCAACCGAACAGGG TCAGGATACCTTTACCAAAGTTAAAGGTGGCAGCAACTATATCAAAGGCGATCCGT ATTTT G C AG AGT AT G C AAC C AAACT G AG CTTT ATT CT G AAT C C G AGT G ATG C AAAT AAT CCGAGCGGT GAAACCGCAAAT CACAAT GAT GAAGCCT GT AATT GT AACGAAA G C G GT ATT AG C AG C GTTG GT C AG G C AC AG AC C AG C G GT C C G AG C AG C AAT AAAA C CTGT ATT AC C C AT AG C AG C ATT AAAAC C AAT AAAAAG AAAG AAT G C AAAG AT GTG AAACTGGGCGTGCGCGAAAATGATAAAGATCTGAAAATTTGCGTGATCGAGGATA CCAGC CT GAGCGGT GTT GAT AATT GTT GTT GT CAGGAT CTGCTGGGT ATT CT GCA AG AAAATT G C AG C G AT AAT AAAC GT G GTAG C AG C AG C AAT GATAGCTGC GAT AAC AAAAAT C AG GAT G AAT G C C AG AAAAAACT G G AAAAAGTTTTT G C C AG C CT G AC G AA TG GTT AC AAAT G C GAT AAAT GT AAAAG C G G C AC C AG C C G C AG C AAAAAG AAAT G G ATTT G G AAAAAAAG C AG C G G C AAT G AAG AAG GT CTG C AAG AG G AAT AT G C AAAT A CCATTGGTCTGCCTCCGCGTACCCAGAGCCTGTATCTGGGTAATCTGCCGAAACT GGAAAAT GT GT GT GAAGAT GT GAAAGAT AT CAATTTT GAT ACC AAAG AAAAATTT CT GGCAG GCT GCCT GATT GT GAGCTTT CAT GAAGGT AAAAACCT GAAAAAACGCT AT C C G C AG AAT AAAAAC AG C GGT AAC AAAG AAAAT CTGTG C AAAG C ACT G G AAT ACA G CTTT G C AG ATT ATG G C GAT CT GATT AAAG G C AC C AG C ATTT G G G AT AAC G AGT AT ACCAAAGAT CTGGAACT GAAT CT GCAGAACAATTT CGGT AAACT GTT CGGCAAAT A T AT C AAAAAAAAC AAT AC C G C AG AG C AG GAT AC C AG CTATAG C AG C CTG GAT G AA CTG C GT G AAAGTT G GTG G AAT AC C AAC AAAAAAT AC ATTT G G AC C G C C AT G AAAC ATGGTGCCGAAATGAATATTACCACCTGTAATGCAGATGGTAGCGTTACCGGTAG C G GTAG C AG CTGTG ATG AT ATT C C G AC C ATT G ATCT G ATT C C G C AGT ATCTG C GTT TTCTG C AAG AAT G G GTT G AAAACTTTT GT G AAC AG C GTC AG G C G AAAGT G AAAG A TGTT ATT AC CAATT G C AAAAG CTG C AAAG AAAG C G G C AAT AAAT G C AAAAC C G AGT G C AAAAC C AAAT G C AAAG AC G AGT G C G AG AAAT AC AAAAAATT C ATT G AAG C AT GT GGTACAGCCGGTGGTGGTATTGGCACCGCAGGTAGCCCGTGGTCAAAACGTTGG G AT C AG AT CTAT AAAC G CT AC AG C AAAC AC AT C G AAG AT G C C AAAC GT AAT C GT AA AG C AG G C ACC AAAAATT GTG G C AC C AG C AG C AC C AC C AAT G C AG C AG C AAG C AC CGAT G AAAAC AAAT GT GTT CAGAGCGAT AT CGAT AGCTT CTT CAAACAT CT GATT G AT ATT G GTCT G AC C AC C C C G AG C AG CT ATCTG AG C AAT GTTCTG G ATG AT AAC ATT TG C G GTG C AG AT AAAG C AC C GTG G AC C AC CTATAC C AC AT AT AC C AC C AC AG AAA AAT G C AAC AAAG AG C G C G AT AAAAG C AAAAG C C AG AG C AG C G AT ACCCTGGTTGT T GTT AAT GTTCCGAGT CCGCTGGGT AAT ACCCCGTAT CGTT AT AAGT ATGCCTGCC AGT GT AAAATCCCGACCAAT G AAG AAAC CT GT GAT GAT CGCAAAGAAT ACAT GAAT CAGTGGTCATGTGGTAGCGCACGTACCATGAAACGTGGCTATAAAAACGATAATT AT G AACT GTG C AAAT AT AAC G G C GTG GAT GTT AAAC C G AC C AC CGTTCGTAG CAA TAG C AG C AAACT G GAT C AT C AT C AT C AC C AT C ATT AAG GAT C C

> SEQ ID N0:31 A5 >mSA-RO-HIS ADN

C C AT GGGCGGTG C AG AAG C AG GT ATT AC C G G C AC CTG G TAT AAT C AG C AT G GTA G C AC CTTT AC C GTTAC C G C AG G C G C AG AT G GT AAT CT G AC AG GT C AGT AT G AAAA TCGTGCACAGGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTAT AATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTGAATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTC ATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAA TACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGCGGTCCGGCAACCGAACAGGG T CAGGAT ACCTTT ACC AAAGTT AAAG GTG GCAGCAC AAGT GAGAAT AGAAAT AAAC GAATCGGGGGTCCTAAATTAAGGGGTAATGTTACAAGTAATATAAAGTTCCCATCA GAT AACAAAGGT AAAATT AT AAGAG GTT C GAAT GAT AAACTT AAT AAAAACT CT G AA GAT GTTTT AGAACAAAGCGAAAAAT CGCTT GTTT CAGAAAAT GTT CCT AGTGGATT AGAT AT AGAT GAT ATCCCT AAAGAAT CT ATTTTT ATT CAAGAAGAT CAAGAAGGT CA AACT C ATT CT G AATT AAAT CCT G AAAC AT CAG AAC AT AGTAAAG ATTT AAAT AAT AA T G GTT CAAAAAAT GAAT CT AGT GAT ATT ATTT CAGAAAAT AAT AAAT CAAAT AAAGT ACAAAAT CATTTT GAAT CATT AT CAGATTT AGAATT ACTT G AAAATT CCT CACAAGAT AATTT AGACAAAGAT ACAATTT CAACAGAACCTTTT CCT AAT CAAAAACAT AAAGAC TT ACAACAAGATTT AAAT GAT GAACCTTT AGAACCCTTT CCT ACACAAAT ACAT AAA GATT AT AAAGAAAAAAATTT AAT AAAT GAAGAAGATT CAGAACCATTT CCCAGACAA AAG C AT AAAAAG GT AG AC AAT C AT AAT G AAG AAAAAAAC GT ATTT C AT G AAAAT G G TT CT G CAAAT GGT AAT C AAGG AAGTTT G AAACTT AAAT C ATT CG AT GAAC ATTT AAA AGAT GAAAAAAT AG AAAAT GAACCACTT GTT CAT GAAAATTT AT CCAT ACCAAAT GA T C C AAT AG AAC AAAT ATT AAAT C AAC CT GAAC AAG AAAC AAAT AT C C AG G AAC AATT GTAT AAT G AAAAACAAAAT GTT G AAG AAAAACAAAATT CT CAAAT ACCTTCGTT AG A TTT AAAAG AAC C AAC AAAT GAAGAT ATTTT ACCAAAT CAT AAT CCATT AG AAAAT AT AAAACAAAGT GAAT CAGAAAT AAAT CAT GTACAAGAT CAT GCGCT ACCAAAAGAGA AT AT AAT AGAC AAACTT GAT AAT CAAAAAGAACACAT CGAT CAAT CACAACAT AAT A T AAAT GT ATT AC AAG AAAAT AAC AT AAAC AAT C AC C AATT AG AAC CT C AAG AG AAAC CT AAT ATT GAAT C GTTT GAAC CT AAAAAT AT AG ATT C AG AAATT ATT CTTC CT G AAA AT GTT G AAACAGAAG AAAT AAT AGAT GAT GTGCCTT CCCCT AAACATT CT AACC AT G AAAC ATTT G AAG AAG AAAC AAGT GAAT CT G AAC AT G AAG AAG C C GTATCT G AAAA AAAT GCCCACGAAACT GT CGAACAT GAAGAAACT GT GT CT CAAGAAAGCAAT CCT G AAAAAG CTG AT AAT G ATG G AAAT GTATCT C AAAAC AG C AAC AAC G AATT AAAT G A AAAT G AATT C GTT GAAT C G G AAAAAAG C G AG CAT G AAG C AAG AT C C AAAG C AAAA G AAG CTT CT AG TT AT GATT AT ATTTT AG GTT G G G AATTT G G AG G AG G C GTTC CAGA ACACAAAAAAGAAG AAAAT AT GTT AT CACATTT AT AT GTTT CTT CAAAG GAT AAG GA AAAT ATATCT AAG G AAAAT G ATG ATGT ATT AGAT G AG AAG G AAG AAG AG G C AG AAG AAACAGAAG AAG AAG AACTT G AAG AAAAAAAT GAAG AAG AAACAG AAT CAGAAAT A AGT GAAGAT GAAGAAGAAGAAG AAGAAGAAGAAGAAAAGGAAGAAGAAAAT GACA AAAAAAAAGAAC AAGAAAAAG AACAAAGT AAT G AAAAT AAT GAT CAAAAAAAAG AT A T G GAAG CACAG AATTT AATTT CT AAAAAC C AG AAT AAT AAT G AG AAAAAC GT AAAA GAAG CTG CT G AAAG CAT CAT G AAAACTTT AG CT G GTTT AAT C AAG G G AAAT AAT C A AAT AG ATT CTAC CTT AAAAG ATTT AGT AG AAG AATT AT C CAAAT ATTTT AAAAAT CAT AGAT CT CAT CACCAT CAT CACCATT AGggatccttt

> SEQ ID NO:32 A6 >HIS-RO-mSA ADN

G GAT C C AC AAGT G AG AAT AG AAAT AAAC GAAT CGGGGGTCCT AAATT AAG G G GTA AT GTT AC AAGT AAT AT AAAGTT C C CAT C AG AT AAC AAAG GT AAAATT AT AAG AG GTT CGAAT GAT AAACTT AAT AAAAACT CT GAAGAT GTTTT AG AAC AAAG CG AAAAAT CG CTT GTTT CAGAAAAT GTT CCT AGT G GATT AGAT AT AGAT GAT ATCCCT AAAG AAT CT ATTTTT ATT CAAGAAGAT CAAGAAGGT CAAACT CATT CT GAATT AAAT CCT G AAAC A T CAGAACAT AGT AAAG ATTT AAAT AAT AAT G GTT CAAAAAAT G AAT CT AGT G AT ATT ATTT CAG AAAAT AAT AAAT C AAAT AAAGT AC AAAAT CATTTT G AAT CATT AT CAG ATT T AGAATT ACTT GAAAATT CCT CACAAGAT AATTT AGACAAAGAT ACAATTT CAACAG AAC CTTTT C CT AAT C AAAAAC AT AAAG ACTT AC AAC AAG ATTT AAAT G AT G AAC CTT T AG AAC C CTTT CCT AC AC AAAT AC AT AAAG ATT AT AAAG AAAAAAATTT AAT AAAT G AAG AAG ATT CAG AAC C ATTT C C C AG AC AAAAG C AT AAAAAG GT AG AC AAT C AT AAT G AAG AAAAAAACGT ATTT CAT G AAAAT G GTTCT GC AAAT G GT AAT CAAG GAAGTTT GAAACTT AAAT CATT CGAT GAACATTT AAAAGAT GAAAAAAT AGAAAAT GAACCACT TGTT CAT G AAAATTT AT C CAT AC C AAAT G ATC C AAT AG AAC AAAT ATT AAAT C AAC C T G AACAAG AAACAAAT AT CCAG GAACAATT GTAT AAT G AAAAACAAAAT GTT G AAG AAAAAC AAAATT CT CAAAT ACCTT CGTT AGATTT AAAAG AAC C AAC AAAT GAAGAT A TTTT ACCAAAT CAT AAT C CATT AGAAAAT AT AAAAC AAAGT G AAT CAG AAAT AAAT C AT GT ACAAGAT CATGCGCT ACCAAAAGAGAAT AT AAT AGACAAACTT GAT AAT CAA AAAGAACACAT CGAT CAAT C ACAACAT AAT AT AAAT GT ATT ACAAG AAAAT AACAT A AAC AAT C AC C AATT AG AAC CT C AAG AG AAAC CT AAT ATT G AAT C GTTT G AAC CT AAA AAT AT AGATT CAGAAATT ATT CTT CCT GAAAAT GTT GAAACAGAAGAAAT AAT AGAT GAT GTGCCTTCCCCT AAACATT CT AACCAT GAAACATTT G AAGAAGAAACAAGT GA ATCT G AAC AT G AAG AAG C C GTATCT G AAAAAAAT G C C C AC G AAACT GTC G AAC AT G AAG AAACT GTGTCT CAAG AAAG CAAT CCT GAAAAAG CT GAT AAT GAT GG AAAT GT ATCT C AAAAC AG C AAC AAC G AATT AAAT GAAAAT G AATT CGTT G AAT C G G AAAAAA GCGAGCATGAAGCAGGTGGTAGCGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGCACCTGGT AT AAT CAG CAT G GTAG C AC CTTT ACCGTTACCG CAG G C G C AG AT G GT AAT CT G AC AG GT C AGT AT GAAAAT C GTG C AC AG G G C AC C G GTTGT CAG AAT AG C C C GTAT AC C CTGACCGGTCGTTATAATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTGAATGGAATAATA GCACCGAAAATTGTCATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTG CAGAAGCCCGTATTAATACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGTGGTCC GGCAACCGAACAGGGTCAGGATACCTTTACCAAAGTGAAATAAcatatg

> SEQ ID NO:33 A7 >HIS-GMZ2ggsmSA3

G GAT C C AC AAGT G AG AAT AG AAAT AAAC G AAT CGGGGGTCCT AAATT AAG G G GTA AT GTT ACAAGT AAT AT AAAGTT CCCAT CAGAT AACAAAG GT AAAATT AT AAGAG GTT C G AAT GAT AAACTT AAT AAAAACT CT GAAGAT GTTTT AG AAC AAAG C G AAAAAT C G CTT GTTT CAGAAAAT GTT CCT AGT G GATT AGAT AT AGAT GAT ATCCCT AAAG AAT CT ATTTTT ATT CAAGAAGAT CAAGAAGGT CAAACT CATT CT GAATT AAAT CCT GAAACA T CAGAACAT AGT AAAG ATTT AAAT AAT AAT G GTT CAAAAAAT G AAT CT AGT GAT ATT ATTT CAG AAAAT AAT AAAT C AAAT AAAGT AC AAAAT C ATTTT G AAT CATT AT CAG ATT T AGAATT ACTT GAAAATT CCT CACAAGAT AATTT AGACAAAG AT ACAATTT CAACAG AAC CTTTT C CT AAT C AAAAAC AT AAAG ACTT AC AAC AAG ATTT AAAT G AT G AAC CTT T AGAACCCTTT CCT ACACAAAT ACAT AAAGATT AT AAAGAAAAAAATTT AAT AAAT G AAG AAG ATT CAG AAC C ATTT C C C AG AC AAAAG C AT AAAAAG GT AG AC AAT C AT AAT G AAG AAAAAAACGT ATTT CAT G AAAAT G GTT CT GCAAAT G GT AAT CAAG GAAGTTT GAAACTT AAAT CATT CGAT GAACATTT AAAAGAT GAAAAAAT AGAAAAT GAACCACT T GTT CAT GAAAATTT AT CCAT ACCAAAT GAT CCAAT AGAACAAAT ATT AAAT CAACC T G AAC AAG AAAC AAAT AT CCAGGAACAATT GTAT AAT G AAAAAC AAAAT GTT GAAG AAAAAC AAAATT CT C AAAT AC CTTC GTT AG ATTT AAAAG AAC C AAC AAAT G AAG AT A TTTT ACCAAAT CAT AAT C CATT AGAAAAT AT AAAAC AAAGT G AAT CAG AAAT AAAT C AT GT ACAAGAT CATGCGCT ACC AAAAG AG AAT AT AAT AGACAAACTT GAT AAT CAA AAAG AAC ACAT CGAT CAAT CACAACAT AAT AT AAAT GT ATT AC AAG AAAAT AACAT A AACAAT CACCAATTAGAACCT CAAGAGAAACCTAATATT GAAT CGTTT GAACCTAAA AAT AT AGATT CAGAAATT ATT CTT CCT GAAAAT GTT GAAACAGAAGAAAT AAT AGAT GATGTGCCTTCCCCT AAAC ATT CT AAC CAT G AAAC ATTT GAAG AAG AAAC AAGT G A ATCT G AAC AT GAAG AAG C C GTATCT G AAAAAAAT G C C C AC G AAACT GTC G AAC AT GAAGAAACT GT GT CT CAAGAAAGCAAT CCT GAAAAAGCT GAT AAT GAT GGAAAT GT ATCT C AAAAC AG C AAC AAC G AATT AAAT GAAAAT G AATT C GTT GAAT C G G AAAAAA G C G AG CAT GAAG C AAG AT C C AAAG C AAAAG AAG CTTCTAGTTAT G ATT AT ATTTT A G GTTG G G AATTT G G AG G AG G C GTTC CAG AAC ACAAAAAAG AAG AAAAT AT GTT AT CACATTT AT AT GTTT CTT CAAAG GAT AAG GAAAAT AT AT CT AAG GAAAAT GAT GAT G T ATT AGAT G AG AAG GAAG AAG AG G CAG AAG AAAC AG AAG AAG AAG AACTT GAAG A AAAAAAT GAAG AAG AAACAG AAT CAG AAAT AAGT GAAG AT GAAG AAG AAG AAG AA GAAG AAG AAG AAAAG GAAG AAG AAAAT GACAAAAAAAAAGAACAAGAAAAAGAAC AAAGT AAT GAAAAT AAT GAT C AAAAAAAAG AT AT G GAAG CACAG AATTT AATTT CTA AAAAC CAG AAT AAT AAT GAG AAAAAC GT AAAAG AAG CTG CT G AAAG CAT CAT G AAA ACTTT AG CTG GTTT AAT CAAG G G AAAT AAT C AAAT AGATT CT AC CTT AAAAG ATTT A GT AG AAG AATT AT C C AAAT ATTTT AAAAAT CAT GGTGGTAGCGGTG CAG AAG C AG G TATTACCGGCACCTGGTATAATCAGCATGGTAGCACCTTTACCGTTACCGCAGGC GCAGATGGTAATCTGACAGGTCAGTATGAAAATCGTGCACAGGGCACCGGTTGTC AGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACCAAACTGGAATGGCG TGTTGAATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTCATAGCCGTACCGAATGGCGTGGT CAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGTGGAATCTGACCTATG

AAGGTGGTAGTGGTCCGGCAACCGAACAGGGTCAGGATACCTTTACCAAAGTGAA ATAAcatatg

> SEQ ID NO:34 A8 >HIS-GMZ2T:ggsmSA ADN

G G AT C C AC AAGT G AG AAT AG AAAT AAAC G AAT CGGGGGTCCT AAATT AAG G G GTA AT GTT AC AAGT AAT AT AAAGTT C C C AT C AG AT AAC AAAG G T AAAATT AT AAG AG GTT C G AAT G AT AAACTT AAT AAAAACT CT G AAG AT GTTTT AG AAC AAAG C G AAAAAT C G CTT GTTT CAG AAAAT GTTCCT AGT GG ATT AG AT AT AG AT G AT ATCC CT AAAG AAT CT ATTTTT ATT CAAGAAGAT CAAGAAGGT CAAACT CATT CT GAATT AAAT CCT G AAAC A T CAGAACAT AGT AAAG ATTT AAAT AAT AAT G GTT CAAAAAAT G AAT CT AGT G AT ATT ATTT CAG AAAAT AAT AAAT C AAAT AAAGT AC AAAAT CATTTT G AAT CATT AT CAG ATT T AGAATT ACTT G AAAATT CCT CACAAGAT AATTT AGACAAAGAT ACAATTT CAACAG AAC CTTTT CCT AAT C AAAAAC AT AAAG ACTT AC AAC AAG ATTT AAAT G AT G AAC CTT T AG AAC C CTTT CCT AC AC AAAT AC AT AAAG ATT AT AAAG AAAAAAATTT AAT AAAT G AAG AAG ATT CAG AAC C ATTT C C C AG AC AAAAG C AT AAAAAG GT AG AC AAT C AT AAT G AAG AAAAAAACGT ATTT CAT G AAAAT G GTT CT GCAAAT G GT AAT CAAG GAAGTTT GAAACTT AAAT CATT CGAT GAACATTT AAAAGAT GAAAAAAT AGAAAAT GAACCACT TGTT CAT G AAAATTT AT C CAT AC C AAAT G ATC C AAT AG AAC AAAT ATT AAAT C AAC C T G AACAAG AAACAAAT AT CCAG GAACAATT GTAT AAT G AAAAACAAAAT GTT G AAG AAAAAC AAAATT CT C AAAT AC CTTC GTT AG ATTT AAAAG AAC C AAC AAAT G AAG AT A TTTT ACCAAAT CAT AAT C CATT AGAAAAT AT AAAAC AAAGT G AAT CAG AAAT AAAT C ATGT AC AAG AT CAT G C G CTAC C AAAAG AG AAT AT AAT AGAC AAACTT G AT AAT CAA AAAG AAC ACAT CGAT C AAT C AC AAC AT AAT AT AAAT GT ATT AC AAG AAAAT AAC AT A AAC AAT C AC C AATT AG AAC CT C AAG AG AAAC CT AAT ATT G AAT C GTTT G AAC CT AAA AAT AT AGATT CAGAAATT ATT CTT CCT GAAAAT GTT GAAACAGAAGAAAT AAT AGAT G AT GT G CCTT C CC CT AAACATT CT AACCAT GAAACATTT G AAG AAG AAACAAGT G A ATCT G AAC AT G AAG AAG C C GTATCT G AAAAAAAT G C C C AC G AAACT GTC G AAC AT G AAG AAACT GTGTCT CAAG AAAG CAAT CCT GAAAAAG CT G AT AAT G AT GG AAAT GT AT CT C AAAAC AG C AAC AAC GAATT AAAT GAAAAT GAATTCGTT GAAT CGGAAAAAA G C G AG CAT G AAG C AAG AT C C AAAAC AAAAG AAT ATG CT GAAAAAG CAAAAAAT G C TT AT G AAAAG G CAAAAAAT G CTTAT C AAAAAG C AAAC CAAG CT GTTTT AAAAG CAA AAG AAG CTTCTAGTTAT G ATT AT ATTTT AG GTT G G G AATTT G G AG G AG G C G TTC C A GAACACAAAAAAG AAG AAAAT AT GTT AT CACATTT AT AT GTTT CTT CAAAG G AT AAG GAAAAT ATATCT AAG GAAAAT G ATG ATGT ATT AGAT G AG AAG G AAG AAG AG G CAGA AGAAACAGAAGAAGAAGAACTT GAAGGTGGT AGCGGTGCAGAAG CAGGT ATT ACC G G C AC CTG GTAT AAT CAG CAT G GT AG C AC CTTT AC C GTTAC C G CAG G C G C AG AT G GT AAT CT G AC AG GTC AGTAT GAAAAT C G TG C AC AG GGCACCGGTTGT CAG AAT AG CCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTGAA TGGAATAATAGCACCGAAAATTGTCATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTATC AGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGTGG TAGTGGTCCGGCAACCGAACAGGGTCAGGATACCTTTACCAAAGTGAAATAAcatat 9

> SEQ ID NO:35 A9 >mSA-PfRH5-HIS ADN

gaattcGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGCACCTGGTATAATCAGCATGGTAGCACC

TTT ACCGTTACCGCAGGCG C AG AT G GT AAT CT G AC AG GT C AGT AT G AAAAT C GTG

CACAGGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGG

C AC C AAACT G G AAT G G C GTGTT G AAT G G AAT AAT AG C AC C G AAAATT GT C AT AG C

CGTACCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCC

AGTGGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGCGGTCCGGCAACCGAACAGGGTCAGG

ATACCTTTACCAAAGTTAAAGGTGGCAGCCTGTCCTTCGAGAACGCCATCAAGAA

GACCAAGAACCAGGAAAACAACCT G ACCCT GCTGCCCAT CAAGT CCACCGAGGA

AG AG AAG G AC G AC AT C AAG AAC G G C AAG G AT AT C AAG AAG G AAAT C G AC AAC G A

C AAG G AAAAC AT C AAG AC C AAC AAC G C C AAG G AC C ACTC C AC CTAC AT CAAGT CT

T ACCT GAACACCAACGT GAACGACG GCCT G AAGT ACCT GTT CAT CCCAT CCCACA

AC AG CTT C AT C AAG AAGT ACTC C GTTTT C AAC C AG AT C AAC G AC G G C AT G CTG CT

GAACGAGAAGAACGACGT GAAGAACAACGAGGACT ACAAGAACGT CGACT ACAA

GAACGT GAACTTCCT GCAGT ACCACTT CAAGGAACT GT CCAACT ACAACAT CGCC

AACT CCAT CG ACAT CCTGCAAGAAAAGGAAGGCCACCTGGACTT CGT GAT CAT CC

C C C ACT AC ACTTT CTTG G ACT ACT AC AAG C AC CTGT C CT AC AAC AG CAT CT AC C AC

AAGT ACAGCACCT ACGG CAAGT ACAT CGCT GTGGACGCTTT CAT CAAGAAGAT CA

ACGAGACTT ACGACAAAGT GAAGT CCAAGT GT AACGAT AT CAAGAACGACCT GAT

C G C C AC CAT C AAG AAG CT CG AG C AC C C CT AC G AC AT C AAC AAC AAG AAC G AC G AC

AGCTACCGCTACGACATCTCCGAAGAGATCGACGACAAGTCCGAGGAAACCGAC

GACGAGACT GAGGAAGT CGAGGACT CCAT CCAGGACACCGACT CCAACCACACC

CCCT CCAACAAGAAGAAGAACGAT CT GAT GAACCGCACCTT CAAGAAGAT GATGG

ACGAGTACAACACTAAGAAGAAGAAGCT GAT CAAGTGCAT CAAGAACCACGAGAA

CGACTT CAACAAGAT CTGCAT GGACAT GAAGAACT ACGGCACCAACCT GTT CGAG

CAGCTGTCCTGCTACAACAACAACTTCTGCAACACTAACGGCATCCGCTTCCACTA

CGAT GAGT ACAT CCACAAGCT GAT CCTGTCCGT CAAGAGCAAGAACCT GAACAAG

GACCTGAGCGACATGACCAACATCCTCCAGCAGTCCGAGCTGCTGCTGACCAACT

T GAACAAG AAG AT GGGCTCCT ACAT CT ACAT C G AC ACT AT C AAGTT CAT C C AC AAG

G AAAT G AAG C AC AT CTT C AAC C G CAT C GAGT AC C AC AC C AAG AT CAT C AAC GAT AA

G ACT AAG AT C ATC C AAG AC AAG AT C AAG CT G AAC AT CTG G C G C ACTTT C C AAAAG

CCT CCGACCACCT GAGGCAGATGCT GT ACAACACCTT CT ACT CCAAGGAAAAGCA

C CT C AAC AAC AT CTTC C AC C AC CT GAT CTACGTGCTG C AG AT G AAGTT C AAC G AC

GTC C C CAT C AAG AT G G AAT ACTT C C AG ACCT AC AAG AAG AAC AAG C C C CT G AC C C

AG CAT CAT C AC C AC C AC C AC

> SEQ ID NO: 36 (sitio aceptor de biotina)

GLNDIFEAQKIEWHE

> SEQ ID NO: 37 estreptavidina monovalente

AEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKL

EWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTF

TKVK

> SEQ ID NO: 38 BirA OS=Escherichia coli (cepa-K12) GN=birA PE=1 SV=1

MKDNTVPLKLIALLANGEFHSGEQLGETLGMSRAAINKHIQTLRDWGVDVFTVPGKGY

SLPEPIQLLNAKQILGQLDGGSVAVLPVIDSTNQYLLDRIGELKSGDACIAEYQQAGRG

RRGRKWFSPFGANLYLSMFWRLEQGPAAAIGLSLVIGIVMAEVLRKLGADKVRVKWP

NDLYLQDRKLAGILVELTGKTGDAAQIVIGAGINMAMRRVEESWNQGWITLQEAGINL

DRNTLAAMLIRELRAALELFEQEGLAPYLSRWEKLDNFINRPVKLIIGDKEIFGISRGIDK

QGALLLEQDGIIKPWMGGEISLRSAEK

> SEQ ID NO: 39 Secuencia de ADN del sitio de unión de biotina

GGTCTGAACGACATCTTCGAGGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA

> SEQ ID NO: 40 >Survivina:mSA (Homo Sapiens)

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQC

FFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAK

ETNNKKKEFEETAKKVRRAlEQLAAMDggsGAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNL

TGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQG

GAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO: 41 >Survivina:mSA (Homo Sapiens)

MAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGT

KLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQD

TFTKVKggsGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTEN

EPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRER

AKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD

> SEQ ID NO: 42 >Survivina(F101A/L102A):mSA (Homo Sapiens)

MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQC

FFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEAAKLDRERAKNKIAK

ETNNKKKEFEETAKKVRRAlEQLAAMDggsGAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNL

TGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQG

GAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO: 43 > Survivina:mSA(F101A/L102A) (Homo Sapiens)

MAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGT

KLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGGD

TFTKVKggsGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTEN

EPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEAAKLDRE

RAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD

> SEQ ID NO: 44 > Survivina:mSA(F101A/L102A) (Mus musculus) MAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGT KLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQD TFTKVKGGSGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIHCPTEN EPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEAAKLDRQ RAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAASGRF

> SEQ ID NO: 45 >Surv¡vina(F101A/L102A):mSA (Mus musculus) GAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF CFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEAAKLDRQRAKMKIAKE TNNKQKEFEETAKTTRQSlEQLAAggsAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQY ENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEA RINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO: 46 > Survivina :mSA (Mus musculus) MAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGT KLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQD TFTKVKGGSGAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIHCPTEN EPDLAQCFFCFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDRQ RAKNKIAKETNNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAASGRF

> SEQ ID NO: 47 >Surv¡vina :mSA(Mus musculus) GAPALPQIWQLYLKNYRIATFKNWPFLEDCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFF CFKELEGWEPDDNPIEEHRKHSPGCAFLTVKKQMEELTVSEFLKLDRQRAKNKIAKET NNKQKEFEETAKTTRQSIEQLAAGGSAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQY ENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEA RINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVK

> SEQ ID NO: 48 > Survivina :mSA(F101 A/L102A) (Mus musculus) ADN

AT GG C AGAAG C AG GT ATT ACCG GCAC CTG GTAT AAT C AG C ATG GT AGCAC CTTT A CCGTTACCGCAGGCGCAGATGGTAATCTGACAGGTCAGTATGAAAATCGTGCACA GGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACC AAACTGGAATGGCGTGTTGAATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTCATAGCCGTA CCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGT GGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGCGGTCCGGCAACCGAACAGGGTCAGGATA CCTTTACCAAAGTTAAAGGTGGCAGCGGTGCACCGGCACTGCCGCAGATTTGGC AGCTGTATCTGAAAAACTATCGTATCGCCACCTTTAAAAACTGGCCGTTTCTGGAA GATTGTGCATGTACACCGGAACGTATGGCAGAAGCAGGTTTTATTCATTGTCCGA CCG AAAAT G AACCGG AT CTGGCACAGT GTTTTTTTT GCTTT AAAGAACT G G AAGGT TGGG AGCC GGAT GAT AATCCG ATT GAAGAAC AT CGT AAACAT AGT CCGG GTTGTG CATTTCTGACCGTGAAAAAACAAATGGAAGAACTGACCGTTAGCGAGGCAGCAAA ACT GGAT CGT CAGCGT GCCAAAAACAAAATTGCAAAAGAAAC C AAT AACAAACAGA AAGAATTCGAAGAAACCGCCAAAACCACCCGTCAGAGCATTGAACAGCTGGCAGC

Aagcggccgcttt

> SEQ ID NO: 49 >Survivina(F101A/L102A):mSA (Mus musculus)ADN

G GTG C AC C G G C ACT G C C G C AG ATTT GGCAGCTGTATCT G AAAAACT ATC GTATC G C C AC CTTT AAAAACT G G C C GTTT CTG G AAG ATT GTG C AT GT AC AC CGGAACGTAT G G C AG AAG C AG GTTTT ATT C ATT GTCCGACC G AAAAT G AAC CGGATCTGG C AC AG T GTTTTTTTT G CTTT AAAG AACT G G AAG GTTG G G AG C C G G AT G AT AAT C C G ATT G A AG AAC AT C GT AAAC AT AGTCCGGGTTGTG C ATTT CT G ACC GT G AAAAAAC AAAT G G AAGAACTGACCGTTAGCGAGGCAGCAAAACTGGATCGTCAGCGTGCCAAAAACAA AATT G C AAAAG AAAC C AAT AAC AAAC AG AAAG AATT C G AAG AAAC C G C C AAAAC C A C C C GT C AG AG C ATT G AAC AG CTG G C AG C AG GTG G C AG C G C AG AAG C AG GT ATT A CCGGCACCTGGTATAATCAGCATGGTAGCACCTTTACCGTTACCGCAGGCGCAGA TG GT AAT CT G AC AG GT C AGT AT G AAAAT C GTG C AC AG G G C AC C G GTTGT C AG AAT AGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTG AATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTCATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTA TCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGT GGTAGCGGTCCGG C AAC CGAACAGGGT C AG G ATAC CTTT AC C AAAGTT AAA

> SEQ ID NO: 50 > Survivina :mSA (Mus musculus) ADN ATGGCAGAAGCAGGTATTACCGGCACCTGGTATAATCAGCATGGTAGCACCTTTA CCGTT ACCGCAGGCGCAGATGGT AAT CT GACAGGT CAGT AT GAAAAT CGT GCACA GGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACC AAACT G G AAT G G C GTGTT G AAT G G AAT AAT AG C AC C G AAAATT GTCATAGCCGTA CCGAATGGCGTGGTCAGTATCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGT GGAATCTGACCTATGAAGGTGGTAGCGGTCCGGCAACCGAACAGGGTCAGGATA C CTTT AC C AAAGTT AAAG GTG G C AG C G GTG C AC C G G C ACT G C C G C AG ATTT G G C AGCT GT AT CT GAAAAACT AT CGT AT CGCCACCTTT AAAAACT GGCCGTTT CTGGAA G ATT GTG C AT GT AC AC C G G AAC GT ATG G C AG AAG C AG GTTTT ATT C ATT GTC C G A C C GAAAAT G AAC CGGATCTGG C AC AGT GTTTTTTTT G CTTT AAAG AACT G G AAG GT TGGGAGCCGGAT GAT AAT CCGATT G AAGAACAT CGT AAACAT AGT CCGGGTT GT G CATTT CT GACCGT GAAAAAACAAATGGAAGAACT GACCGTT AG CGAGTTT CT GAAA CTG GAT CGT C AG C GTG C CAAAAAC AAAATT G C AAAAG AAAC C AAT AAC AAAC AGAA AGAATTCGAAGAAACCGCCAAAACCACCCGTCAGAGCATTGAACAGCTGGCAGCA

agcggccgcttt

> SEQ ID NO: 51 >Survivina :mSA(Mus musculus) ADN GGTGCACCGGCACTGCCG C AG ATTT GGCAGCTGTATCT GAAAAACT ATC GTATC G C C AC CTTT AAAAACT G G C C GTTT CTG G AAG ATT GTG C AT GT AC AC CGGAACGTAT G G C AG AAG C AG GTTTT ATT C ATT GTCCGACC GAAAAT G AAC CGGATCTGG C AC AG T GTTTTTTTT G CTTT AAAG AACT GGAAGGTTGG G AG C C G G AT GAT AAT C C G ATT G A AG AAC AT CGT AAACAT AGTCCGGGTTGTG CATTT CTG ACC GT G AAAAAAC AAAT G G

AAG AACT G AC C GTTAG C G AGTTT CT G AAACT G G AT C GT C AG C GTG C C AAAAAC AA

AATT G C AAAAG AAAC C AAT AAC AAAC AG AAAG AATT C G AAG AAAC C G C C AAAAC C A

C C C GT C AG AG C ATT G AAC AG CTG G C AG C AG GT G G C AG C G C AG AAG C AG GT ATT A

CCGGCACCTGGTATAATCAGCATGGTAGCACCTTTACCGTTACCGCAGGCGCAGA

AGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTATAATGGCACCAAACTGGAATGGCGTGTTG

AATGGAATAATAGCACCGAAAATTGTCATAGCCGTACCGAATGGCGTGGTCAGTA

TCAGGGTGGTGCAGAAGCCCGTATTAATACCCAGTGGAATCTGACCTATGAAGGT

GGTAGCGGTCCGG C AAC C G AAC AG G GT C AG G ATAC CTTT AC C AAAGTT AAA

> SEQ ID NO: 52 >mSA:CIDR1a-HIS

GAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTK

LEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDT

FTKVKGGSKITSFDEFFDFWVRKLLIDTIKWETELTYCINNTDVTDCNKCNKNCVCFDK

WVKQKEDEWTNIMKLFTNKHDIPKKYYLNINDLFDSFFFQVIYKFNEGEAKWNELKEN

LKKQIASSKANNGTKDSEAAIKVLFNHIKEIATICKDNNTN

> SEQ ID NO: 53 > mSA:CIDR1a-HIS ADN

GC AG AAGC AGGT ATT AC CGGC AC CTGGT A T AA T C AGC AT GGT AGC AC CTTT

ACC GTT ACCGC AGGC GC AG AT GGT AATCTG AC AGGT C AGT AT G A A AA T C GT

GCACAGGGCACCGGTTGTCAGAATAGCCCGTATACCCTGACCGGTCGTTAT

AAT GGC ACC AAAC T GGAAT GGCGT GTT GAATGGAAT AA T AGC ACCGAAAAT

T GT C A T AGCCGT ACCG A AT GGC GT GGT C AGT AT C AGGGT GGT GC AG AAGC C

CGT ATTAAT ACCC AGT GGAAT CT GACCT AT GAAGGT GGTAGCGGTCCGGC A

ACCGAACAGGGTCAGGATACCTTTACCAAAGTTAAAGGTGGCAGCAAAATAAC

GT C ATTT G AT G AATTTTTT G ATTTTT GGGTT AG AAAATT ATT AAT AG ACACT AT AAAGTGGG AAACCG AA

CTT ACGT ATT GT AT A AAT AAT ACT G ATGT C ACG G ATT GT AAT AA AT GT AAC AAA AATT GCGTAT GTTTT G

ACAAATGGGTTAAACAAAAAGAAGACGAATGGACAAATATAATGAAACTATTCACAAACAAACACGAT

AT ACCG AAAAAAT ATT AT CTT AAT ATT AAT G AT CTTTTT G AT AG I I I I I I I I I CC A AGTT AT AT AT AAGTTT

AACGAAGGAGAAGCAAAATGGAATGAACTTAAAGAAAATTTAAAAAAGCAAATTGCGTCTTCCAAAGC

A AAT A ACG G AAC C A AAG ATT C AG A AG CT G C A AT AAAAGT GTT GTTT AAT C AC AT A AAAG A AATT G CAA

C A AT AT G C A AAG AT AAT AAT AC AA AC

Bibliografía

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad donde la vacuna comprende:

iii. un antígeno fusionado con una estreptavidina monovalente,

donde la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 [bucle DE, genotipo 16 de HPV] y SEQ ID NO: 2 [bucle HI, genotipo 16 de HPV],

donde el antígeno y la proteína PV L1 están unidos mediante la interacción entre la estreptavidina monovalente y la molécula de biotina conjugada enzimáticamente al sitio aceptor de biotina de la proteína PV L1, y donde i - iii forman una partícula similar a un virus que muestra dicho antígeno y donde el sitio aceptor de biotina comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36.

2. La vacuna para el uso según la reivindicación anterior, donde la molécula de biotina se conjuga enzimáticamente con el sitio aceptor de biotina mediante una biotina ligasa.

3. La vacuna para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la enfermedad es cáncer, una enfermedad cardiovascular, un asma o una enfermedad alérgica y/o una enfermedad infecciosa, un trastorno lipídico, un asma o una enfermedad alérgica, o una enfermedad infecciosa.

4. La vacuna para el uso según la reivindicación 3, donde el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de ovario y/o carcinoma seroso uterino, el trastorno lipídico se selecciona de entre el grupo que consiste en hiperlipidemia, hiperlipidemia tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV o tipo V, hipertrigliceridemia secundaria, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, xantomatosis, deficiencia de colesterol acetiltransferasa, una afección ateriosclerótica (p. ej., aterosclerosis), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Alzheimer y una enfermedad cardiovascular tal como se selecciona de entre el grupo que consiste en dislipidemia, aterosclerosis e hipercolesterolemia, el asma o enfermedad alérgica se selecciona de entre el grupo que comprende asma eosinofílica, alergia, poliposis nasal, dermatitis atópica, esofagitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico y síndrome de Churg-Strauss, o la enfermedad infecciosa se selecciona de entre el grupo que consiste en malaria y tubérculosis.

5. La vacuna para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde varias proteínas PV L1 que contienen un sitio aceptor de biotina pueden formar una partícula similar a un virus.

6. La vacuna para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el antígeno es un polipéptido, péptido y/o un fragmento antigénico de un polipéptido asociado con una respuesta fisiológica anormal tal como una enfermedad autoinmune, una reacción alérgica y/o un cáncer, donde preferiblemente dicho antígeno es una proteína, péptido y/o un fragmento antigénico que se selecciona de entre el grupo que comprende polipéptidos específicos del cáncer, polipéptidos asociados con enfermedades cardiovasculares, polipéptidos asociados con asma, polipéptidos asociados con poliposis nasal, polipéptidos asociados con dermatitis atópica , polipéptidos asociados con esofagitis eosinofílica, polipéptidos asociados con síndrome hipereosinofílico, polipéptidos asociados con síndrome de Churg-Strauss y/o polipéptidos asociados con organismos patógenos, tales como un antígeno seleccionado de entre el grupo que comprende Her2/Neu (ERBB2) y/o Survivina o un fragmento antigénico del mismo, PCSK9 o un fragmento antigénico del mismo, IL-5 o un fragmento antigénico del mismo, o donde el antígeno se selecciona de entre el grupo que comprende Ag85A de Mycobacterium tuberculosis, PfRH5 de Plasmodium falciparum, VAR2CSA (dominio, ID1-ID2a) de Plasmodium falciparum, dominio CIDR1a, de PfEMP1 de Plasmodium falciparum, GLURP de Plasmodium falciparum, MSP3 de Plasmodium falciparum, Pfs25 de Plasmodium falciparum, CSP de Plasmodium falciparum y/o PfSEA-1 de Plasmodium falciparum y un fragmento antigénico del mismo, o donde el antígeno comprende una construcción de fusión entre MSP3 y GLURP (GMZ2) de Plasmodium falciparum.

7. La vacuna para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada antígeno se presenta en la continuación inmediata de cada proteína PV L1 en una orientación constante, y/o donde el antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente comprende además una etiqueta de polihistidina, y/o donde la estreptavidina monovalente comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 37, y/o donde la estreptavidina monovalente se fusiona al antígeno en una posición seleccionada de entre el grupo que comprende el extremo N, el extremo C y/o insertado en marco en la secuencia codificante del antígeno, y/o

donde la estreptavidina monovalente fusionada al antígeno comprende

i. una secuencia polipeptídica seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

8. Un vector que comprende al menos uno, como al menos dos, como al menos tres polinucleótidos que codifican i. una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y

ii. una biotina ligasa capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y

iii. un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sitio aceptor de biotina comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 39,

donde la proteína PV L1 que contiene el sitio aceptor de biotina tiene preferiblemente una secuencia de polinucleótidos que comprende

i. una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que comprende SEQ ID 11, SEQ ID 12, SEQ ID 13, SEQ ID 14, SEQ ID 15, SEQ ID 16, SEQ ID 17.

9. Composición que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el procedimiento comprende las etapas de

i. obtener un primer polipéptido; una proteína PV L1 que contiene un sitio aceptor de biotina, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 [bucle DE, HPV genotipo 16] y SEQ ID NO: 2 [bucle HI, HPV genotipo 16], donde el sitio aceptor de biotina comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36, y

ii. obtener un segundo polipéptido; una biotina ligasa, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, capaz de biotinilar el sitio aceptor de biotina, y

iii. obtener un tercer polipéptido; un antígeno fusionado a una estreptavidina monovalente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y

vii. generar una composición que comprende dicha vacuna,

obteniendo así una composición farmacéutica.

11. La vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una condición clínica en un sujeto que lo necesita.

12. La vacuna para el uso según la reivindicación 11, donde la vacuna se potencia mediante la administración en una forma o parte del cuerpo diferente de la administración anterior, y/o donde la vacuna se administra en el área con mayor probabilidad de ser el receptáculo de una enfermedad dada.

13. La vacuna para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, donde la vacuna se administra en combinación con otra vacuna.

14. Un kit de partes que comprende

i. una composición que comprende una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y

ii. un instrumento médico u otro medio para administrar la vacuna, y

iii. instrucciones sobre cómo utilizar el kit de partes, y

iv. opcionalmente un segundo ingrediente activo.

15. Una composición que comprende al menos una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de

i. obtener una composición que comprende al menos una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o

ii. administrar dicha composición a un sujeto al menos una vez,

induciendo así una respuesta inmune en el sujeto.