JP2016507520A - 安定化されたb型肝炎コアポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
は、クリックケミストリー共役のあいだ安定ではなく、そして機能性分子との共役後に解離し得る。2つの欠損型HBc単量体(16.7kDa)が、二量体間のC61−C61ジスルフィド結合を介して二量体(33.5kDa)を形成する。その後、120個の二量体が疎水性相互作用により1個のVLPへと自己集合化する。二量体間のコンタクトが弱いため、機能性分子のVLP表面上への共役がVLP二量体間の相互作用を妨げる可能性があり、これは結果としてVLPを不安定化する。第2の問題は、負電荷を有する分子はVLPsに不充分にしか共役しないことである。生理学的pHにおいて、HBc VLPの表面は、負に帯電されている。同じ電荷は反発し合うため、負電荷を有する分子は、HBc VLPに近接することができず、このため、クリックケミストリー共役が、効果的に進み得ない。
本発明は、上述の特定の方法、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されず、それ自体変更されてもよいことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することは意図していないこともまた理解されるべきである。
分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の導入によって四次構造が安定化されるHBcポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、例えば配列番号:1または配列番号:2で参照されるHBc配列であって、少なくとも1対のアミノ酸がシステインと置換されている配列、2対、3対等の置換を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、[D29C、R127C];[T109C、V120C];[Y132C、N136C];[Y132C、A137C];[R133C、N136C];[R133C、A137C];[P134C、P135C];[P134C、N136C];[P134C、A137C];および[P135C、N136C]から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、D29C、R127C;P134CおよびN136C;またはD29C、R127C、P134CおよびN136Cである。対象となるアミノ酸配列としては、実施例に記載される配列、例えば配列番号:3〜配列番号:52などが挙げられる。
・{D29C、R127C};{P134C、N136C};または{D29C、R127C、P134CおよびN136C};
・M66S
・N75AHA、T74AHA、L76AHA、Q77AHA、D78AHA、Q79AHAまたはA80AHA
・{I57V、L60S、G63R、D64E、L65V、M66T、T67D、L68F、A69G、T70D、T74N、L76M、E77Q、P79Q、S81A、S87N, T91A、V93I、F97I};または{T74N、L76M、E77Q、P79Q、S81A}。
・{D29C、R127C、P134CおよびN136C};
・M66S
・D78AHA
・{I57V、L60S、G63R、D64E、L65V、M66T、T67D、L68F、A69G、T70D、T74N、L76M、E77Q、P79Q、S81A、S87N、T91A、V93I、F97I}。
HBcから成るVLPを含むHBcポリペプチド、および、1つまたはそれ以上の共役部位を含む単量体、二量体またはVLPsは、薬学的に許容され得る賦形剤中で提供されてもよく、および様々な処方とされてもよい。当該技術分野において公知であるように、薬学的に許容され得る賦形剤は、薬理学的に効果のある物質の投与を容易にする相対的に不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状もしくは粘稠性を付与でき、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させるための塩、カプセル化剤、バッファーならびに皮膚浸透促進剤などが挙げられる。非経口薬および経口的薬デリバリーのための賦形剤および処方は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing(1995)に記載されている。
実施例1
B型肝炎コア(HBc)ウイルス様粒子(VLPs)の安定化および改変
材料および方法
プラスミド構築。149位のアミノ酸においてトランケートされたC末端を有する、サブタイプadyw(Pasekら、1979)のヒトB型肝炎コア(HBc)カプシド単量体をコードする配列が、大腸菌tRNA濃度に対して最適化され、そしてDNAworks(v3.0)を用いて設計されたオリゴヌクレオチドから合成された。ベクターpET24a−HBc149が、最適化されたHBcタンパク質遺伝子をNdeIおよびXhoI制限酵素部位でpET−24a(+)ベクター(Novagen、San Diego、CA)中に連結することにより(T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、Ipswich、MA)作製された。メチオニンアナログを組み入れるために、2つの突然変異(M66SおよびL76M)が導入された。pET24a−HBc149−M66S−L76MがDH5a細胞中に形質転換され、そしてプラスミドが、無細胞タンパク質合成(CFPS)中での使用のために、Qiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen、Valencia、CA)を用いて精製された。全ての突然変異体は、QuikChange(登録商標) PCR(Stratagen、La Jolla、CA)を用いて構築された。
共有結合性ジスルフィド結合を導入することによるHBc VLPの安定化。この研究において、V149においてトランケートされたHBcカプシドタンパク質が使用された。トランケートされたHBcタンパク質は、T=4 正二十面体対称性で配置された240個のサブユニットから成るVLPsへと自己集合化する。T=4 正二十面体カプシドは、図1に示されるように、12個の正五角形の面と、30個の正六角形の面とを有する。各々の五量体は、5個の六量体によって囲まれている。HBc二量体の5倍ユニット(five-fold unit)およびHBc二量体の6倍ユニット(six-fold unit)は、図2に示されるように、1個の五量体と1個の六量体とをそれぞれ含む。5倍ユニットおよび6倍ユニットは、1個の二量体を共有し、および架橋結合されてVLPを形成する。
生理的pHにおいて、HBc VLPの表面は負に帯電されている。HBc VLPの表面は、その表面から突き出す120個の二量体スパイクで占められている。これらのスパイクは、立体化学的に利用可能性の高い明白な結合部位であるが、4個の負に帯電されたアミノ酸(E77×2、D78×2)で終止されている。VLP表面上の負電荷は、スパイクチップ上のこれら4個の負に帯電したアミノ酸由来である。同じ電荷は反発し合うため、負電荷を有する分子は、HBc VLPに近接することができず、このため、クリックケミストリー共役が効果的に進み得ない。表面の負電荷の除去は、タンパク質の溶解性を顕著に低下させ、そしてHBcタンパク質は、VLPsへ良好に自己集合化出来なかった。以下の例は、この問題に対処する。
プラスミド構築。149位のアミノ酸においてトランケートされたC末端を有する、サブタイプadyw(Pasekら、1979)のヒトB型肝炎コア(HBc)カプシド単量体をエンコードする配列が、大腸菌tRNA濃度に対して最適化され、そしてDNAworks(v3.0)を用いて設計されたオリゴヌクレオチドから合成された。ベクターpET24a−HBc149が、最適化されたHBcタンパク質遺伝子をNdeIおよびXhoI制限酵素部位でpET−24a(+)ベクター(Novagen、San Diego、CA)中に連結することにより(T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、Ipswich、MA)作製された。メチオニンアナログを組み入れるために、2つの突然変異(M66SおよびL76M)が導入された。pET24a−HBc149−M66S−L76MがDH5a細胞中に形質転換され、そしてプラスミドが、無細胞タンパク質合成(CFPS)中での使用のために、Qiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen、Valencia、CA))を用いて精製された。全ての突然変異体は、QuikChange(登録商標) PCR(Stratagen、La Jolla、CA)を用いて構築された。
Claims (26)
- ネイティブHBcポリペプチドの少なくとも2つのアミノ酸がシステイン残基によって置換されており、HBcがウイルス様粒子(VLP)へと集合化される場合に分子間ジスルフィド結合を形成することができるHBcポリペプチド。、
- 前記ネイティブHBcポリペプチドが、配列番号:1または配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含む請求項1記載のシステイン置換されたHBcポリペプチド。
- アミノ酸の置換が、[D29C、R127C]、[T109C、V120C]、[Y132C、N136C]、[Y132C、A137C]、[R133C、N136C]、[R133C、A137C]、[P134C、P135C]、[P134C、N136C]、[P134C、A137C]および[P135C、N136C]から選択される請求項2記載のシステイン置換されたHBcポリペプチド。
- 前記アミノ酸の置換が、[D29C、R127C]、[P134C、N136C]、または[D29C、R127C、P134C、N136C]である請求項3記載のシステイン置換されたHBcポリペプチド。
- 配列番号:1の番号付けに対応して、73〜81位の残基におけるスパイク領域のアミノ酸が、負電荷を減少させるために置換されているHBcポリペプチド。
- 57〜81位の残基における疎水性ポケットのアミノ酸が置換されている請求項5記載のHBcポリペプチド。
- 記置換アミノ酸が天然に存在するウイルス遺伝子型由来である請求項5または6記載のHBcポリペプチド。
- アミノ酸置換が、[I57V、L60S、G63R、D64E、L65V、M66T、T67D、L68F、A69G、T70D、T74N、L76M、E77Q、P79Q、S81A、S87N、T91A、V93I、F97I]または[T74N、L76M、E77Q、P79Q、S81A]のうちの1つである請求項7記載のポリペプチド。
- [D29C、R127C]、[T109C、V120C]、[Y132C、N136C]、[Y132C、A137C]、[R133C、N136C]、[R133C、A137C]、[P134C、P135C]、[P134C、N136C]、[P134C、A137C]および[P135C、N136C]から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換の対をさらに含む請求項5〜8のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- [D29C、R127C]、[P134C、N136C]および[D29C、R127C、P134C、N136C]から選択されるアミノ酸置換をさらに含む請求項5〜8のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- M66Sのアミノ酸置換をさらに含む請求項1〜10のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが単量体である請求項1〜11のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが二量体である請求項1〜11のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、VLPへと集合化される請求項1〜11のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、少なくとも1個の非天然型アミノ酸をさらに含む請求項1〜11のいずれか1項に記載のHBcポリペプチド。
- 前記非天然型アミノ酸が、クリックケミストリー反応のための反応基を提供する請求項15記載のHBcポリペプチド。
- 前記非天然型アミノ酸が、アジドホモアラニン、p−アセチル−L−フェニルアラニンまたはp−アジド−L−フェニルアラニンである請求項16記載のHBcポリペプチド。
- 非天然型アミノ酸に共役された一またはそれ以上の追加の部位をさらに含む請求項16記載のHBcポリペプチド。
- 配列番号:3〜31、34〜52のいずれか1つのアミノ酸配列を含むHBcポリペプチド。
- 配列番号:39、配列番号:42または配列番号:52のアミノ酸配列を含む請求項19記載のHBcポリペプチド。
- 請求項1〜20のいずれか1項に記載のポリプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項21記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項22記載のベクターまたは請求項21記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞タンパク質合成反応混合物。
- プロモーターに作動可能に連結された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、細胞または無細胞タンパク質合成反応混合物に導入する工程、および
前記タンパク質を合成するために充分な期間、インキュベートする工程
を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造する方法。 - 前記ポリペプチドが、還元条件下でVLPへと集合化される請求項24記載の方法。
- VLPへ追加のポリペプチドを共役させるさらなる反応の前に、前記VLPがジスルフィド結合を生成させるために酸化される請求項25記載の方法。
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