MXPA03009566A - Metodos y composicion para la produccion de pares trna-aminoaciltrna sintetasa ortogonales. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporciona composiciones y metodos para generar componentes de maquinaria biosintetica de proteinas incluyendo tRNAs ortogonales, aminoacil-tRNA sintetasas ortogonales y pares ortogonales de tRNAs/sintetasas. Tambien se proporcionan metodos para identificar pares ortogonales. Estos componentes pueden emplearse para incorporar amino acidos no naturales en proteinas in-vivo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE PARES DE t NA-AMINOACIL-tRNA SINTETASA ORTOGONAL REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Seta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/285,030, presentada en Abril 19, 2001, y la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 60/355,514, presentada en Febrero 6, 2002, la especificación de la cual se incorpora aquí totalmente.

DECLARACIÓN EN CUANTO A LOS DERECHOS A INVENCIONES REALIZADAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AUSPICIADOS FEDERALMENTE

[0002] La invención se realizó con el soporte del Gobierno de los E.U.A. bajo Otorgamiento No. 6502573 de la Oficina de Investigación Naval (Office of Naval Research) y la Concesión No. GM62159 de los Institutos Nacionales (National Institutes) . El gobierno de .los E.U.A. tiene ciertos derechos en esta invención. CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0003] La invención se refiere al campo de bioquímica de traducción. En particular, la invención se refiere a métodos para producir tRNAs ortogonales, sintetasas mutadas aminoacil-trNA ortogonales y pares de los mismos. La invención también proporciona métodos para identificar pares ortogonales, que se utilizan para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas in vivo, y composiciones relacionadas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] Las proteínas llevan a cabo virtualmente todos los procesos complejos de la vida, desde fotosíntesis a transducción de señal e inmuno respuesta. Para comprender y controlar estas actividades intrincadas, se requiere una mejorar compresión de la relación entre la estructura y función de las proteínas .

[0005] A diferencia de la síntesis de pequeñas moléculas orgánicas, en donde casi cualquier cambio estructural puede realizarse para influenciar propiedades funcionales de un compuesto, la síntesis de proteínas se limita a cambios codificados por los veinte aminoácidos naturales. El código genético de todo organismo conocido, desde las bacterias a los humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Estos aminoácidos pueden modificarse a través de la modificación post-traducción de proteínas, por ejemplo glicosilación, fosforilación u oxidación, o en instancias más raras, por la modificación enzimática de tRNAs supresores aminoacilados, por ejemplo, en el caso de la selenocisteína . Sin embargo, los polipéptidos, que se sintetizan de sólo estos 20 - bloques de construcción simples, transportan (llevan a cabo) todos los procesos complejos de la vida.

[0006] Tanto la mutagénesis dirigida de sitio como la aleatoria, en donde los aminoácidos específicos en una proteína pueden ser reemplazados con cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos comunes, se han vuelto importantes herramientas para comprender la relación entre la estructura y la función de las proteínas . Estas metodologías han hecho posible la generación de proteínas con propiedades mejoradas, incluyendo estabilidad, actividad catalítica y especificidad de enlace. Sin embargo, los cambios en proteínas se limitan a los 20 aminoácidos comunes, la mayoría de los cuales tienen grupos funcionales simples. Ver Knowles, J. R. "Tinkering wifc enzymes : what are we learning?" (Trabajando experimentalmente con enzimas: qué estamos aprendiendo?) Science (Ciencia) , 236:1252-1258 (1987) ; y Zoller, M. J., Smith, M. Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA f agmente cloned into M13 vectors (Mutagénesis dirigida por oligonucleótido de fragmentos de ADN clonados en vectores M13) , ethods Enzymol . , 100: 4S8-500 (1983) . Al expander el código genético para incluir aminoácidos adicionales con novedosas propiedades biológicas, químicas o físicas, las propiedades de las proteínas, por ejemplo el tamaño, la acidez, la nucleofilicidad, los enlaces de hidrogeno, las propiedades hidrofóbicas , etc., pueden modificarse en comparación con una proteína compuesta de sólo aminoácidos a partir de los 20 aminoácidos comunes, por ejemplo como en una proteína de origen natural.

[0007] Varias estrategias se han empleado para introducir aminoácidos no naturales en proteínas. Los primeros experimentos involucraron la obtención en derivados de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr, por ejemplo la conversión de lisina a Ne~acetil-lisina . La síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales, pero la síntesis de péptidos en fase sólida rutinaria generalmente se limita a pequeños péptidos o proteínas con menos de 100 residuos. Con el reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química nativa de fragmentos péptidos, es posible hacer proteínas más grandes, pero estos métodos no se ajustan fácilmente en escala. Ver por ejemplo, P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem. , 69: 923 (2000) . Un método general biosintético in vivo, en donde un supresor tRNA químicamente acilado con el aminoácido no natural deseado se agrega a un extracto in vivo capaz de soportar biosíntesis de proteína, ha sido utilizado para incorporar específicamente en sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente de cualquier tamaño. Ver, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Ange . Chem. Int . Ed. Engl . , 1995,34: 621 (1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins" (Un método general para incoporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas), Science (Ciencia) 244: 182-188 (1989); y J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, "Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide" (Incorporación específica de sitio biosintética de un aminoácido no natural en un polipéptido) , J. Am. Chem. Soc. 111: 8013-8014 (1989) . Un amplio rango de grupos funcionales se ha introducido en las proteínas para estudios de estabilidad de proteínas, plegado de proteínas, mecanismos de enzima y transducción de señal . Aunque estos estudios demuestran que la maquinaria biosintética de proteínas tolera una amplia variedad de cadenas laterales de aminoácido, el método es técnicamente exigente y son bajos los rendimientos de proteínas mutantes.

[0008] Hace más de 50 años, se encontró que muchos análogos de aminoácidos naturales inhiben el crecimiento de bacterias. El análisis de las proteínas producidas en la presencia de estos análogos de aminoácido reveló que habían sido substituidos por sus contrapartes naturales en diversas proporciones. Ver, por ejemplo, M. H. Richmond, Bacteriol . Rev. , 26: 398 (1962) . Esto ocurre debido a que la aminoacil-tR A sintetasa, la enzima responsable por la conexión del aminoácido correcto a su tRNA connato, no puede distinguir rigurosamente el análogo del aminoácido natural correspondiente. Por ejemplo, la norleucina se carga por metionil-tRNA sintetasa, y la p-fluorofenilalanina se carga por la fenilalanina-tRNA sintetasa. Ver, D. B. Cowie, G. N. Cohén, E. T. Bolton y H. de Robichon-Szulmajster, Biochim. Biophys . Acta, 1959, 34:39 (1959); y, R. Munier y G. N. Cohén, Biochim. Biophys. Acta, 1959,31:378 (1959).

[0009] Un método in ¦ vivo, denominado incorporación con presión selectiva, posteriormente se desarrolló para explotar la promiscuidad de sintetasas de tipo silvestre. Ver, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J . , 13:41 (1999). Una cepa auxotrófica, en donde se desactiva la ruta metabólica relevante que suministra a la célula con un aminoácido natural particular, se desarrolla en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras que se reprime la transcripción del gen objetivo. Al inicio de una fase estacionaria de crecimiento, el aminoácido natural se agota y se reemplaza con el aminoácido análogo no natural . La inducción de expresión de la proteína recombinante resulta en la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, se han incorporado o, m y p-fluorofenilalaninas en proteínas, y exhiben dos hombros característicos en el espectro UV, que pueden identificarse fácilmente; ver, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29 (2000) ; la trifluorometionina se ha empleado para reemplazar la metionina en bacteriófago lambda lisozima para estudiar su interacción con ligandos citooligosacáridos por 19F NMR, ver, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry (Bioquímica) , 36: 3404 (1997); y se ha insertado trifluoroleucina en lugar de leucina, resultando en estabilidad química y térmica incrementada de una proteina-cierre de leucina (leucine-zipper) . Ver, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, . A. Petka, T. Makajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl - , 40: 1494 (2001). Aún más, se incorporan selenometionina y telurometionina en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos-X. Ver, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J. , 9: 1665 (1990); J. 0. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, CTat . Struc . Biol . , 1: 283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann y R. Huber, Eur . J. Biochem. , 230: 788 (1995); y N. Budisa, W. arnbrock, S.

Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol., 270: 616 (1997). También se han insertado eficientemente análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino, permitiendo modificación adicional de proteínas por medios químicos. Ver, por ejemplo, J. C. M. vanHest y D. A. Tirrell, FEBS Lett . , 428: 68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc . , 122: 1282 (2000); y, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487 (2000) .

[0010] El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos aminoácidos no naturales por (medio de) aminoacil-tRNA sintetasas que, en general, requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de protelna . Por lo tanto, el rango de funcionalidad química accesible mediante esta ruta es limitado. Por ejemplo, aunque se puede incorporar tiaprolina cuantitativamente en proteínas, oxaprolina y selenoprolina no. Ver, N. Budisa, C. Minks, F. J. Medrano, J. Lutz, R. Huber y L. Moroder, Proc . Nati . Acad. Sci. U.S. A., 95: 455 (1998) . Una forma de expandir el alcance de este método es relajar la especificidad del substrato de aminoacil-tRNA sintetasas, que se ha logrado en una cantidad limitada de casos. Por ejemplo, se encontró que el reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-tRNA sintetasa de Escherichia coli (PheRS) incrementa el tamaño de la cavidad de enlace de substrato, y resulta en la acilación de tRNAPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Ver, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry (Bioquímica) , 33: 7107 (1994) . Una cepa de Escherichia coli que aloja este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina . Ver, por ejemplo, M. Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett . , 364: 272 (1995); y N.

Sharma, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell, FBBS Lett . , 467: 37 (2000). Similarmente , una mutación punto Phel30Ser cerca del sitio de enlace aminoácido de tirosil-tRNA sintetasa de Escherichia coli se mostró que permite incorporar azatirosina más eficientemente que tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. I ama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Solí y S. Nishimura, J. Biol . Chem. , 275: 40324 (2000).

[0011] La fidelidad de aminoacilación se mantiene tanto a nivel de discriminación de substrato como de revisión de intermediarios y productos no-connato (no afin) . Por lo tanto, una estrategia alterna para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas in vivo es modificar sintetasas que tienen mecanismos de revisión. Estas sintetasas no pueden discriminar y, por lo tanto, activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales connatos . Este error se corrige en un sitio separado, que desacila el aminoácido mal cargado del tRNA para mantener la fidelidad de la traducción de proteína. Si se desactiva la actividad de revisión de la sintetasa, los análogos estructurales que se desactivan pueden escapar a la función de edición e incorporarse. Este enfoque se ha demostrado recientemente con la valil-tR A sintetasa (ValRS) . Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science, 292: 501 (2001). ValRS puede aminoacilar mal tRNAVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no connato subsecuen emente se hidrolizan por del dominio de edición. Después de mutagénesis aleatoria del cromosoma Escherichia coli, una cepa de Escherichia coli mutante se seleccionó que tenga una mutación en el sitio de edición de ValRS. Este ValRS defectuoso de edición carga incorrectamente tRNAVal con Cys. Debido a que Abu semeja estéricamente Cys (grupo -SH de Cys se reemplaza con -CH3 en Abu) , el ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando esta cepa Escherichia coli mutante se desarrolla en la presencia de Abu. El análisis espectrométrico de masas muestra que aproximadamente 24% de valinas se reemplazan por Abu en cada posición valina en la proteína nativa.

[0012] Al menos una mayor limitación de los métodos descritos anteriormente es que se reemplazan todos los sitios correspondientes a un aminoácido natural particular a través de la proteína. La extensión de incorporación del aminoácido natural y no natural también puede variar -sólo en casos raros puede lograrse substitución cuantitativa ya que es difícil agotar completamente el aminoácido natural connato dentro de la célula. Otra limitación es que estas estrategias hacen difícil estudiar la proteína mutante en células vivas, debido a que la incorporación de múltiples sitios de análogos a menudo resulta en toxicidad. Finalmente, este método es aplicable en general sólo para análogos estructurales cercanos de los aminoácidos comunes, de nuevo debido a que las subs ituciones deben tolerarse en todos los sitios en el genoma.

[0013] La síntesis en fase sólida y métodos semisintéticos también ha permitido la síntesis de una cantidad de pequeñas proteínas que contienen aminoácidos novedosos. Por ejemplo, ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Crick, F. J. C, Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. "General nature of the genetic code for proteins" (Naturaleza general de código genético para proteínas) . Nature, 192 1227-1232 (1961) ; Hofmann, K. , Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment (Estudios en polipéptidos. XXXVI. El efecto de reemplazos pirazol-imidazol en la potencia de activación de S-proteína de un fragmento S-péptido) , J. Am. Chem. , 5914-5919 (1966); Kaiser, E. T. "Synthetic approaches to hiologically active peptides and proteins including enzymes" (Aproximaciones sintéticas a péptidos biológicamente activos y proteínas incluyendo enzimas) , Acc. Chem. Res., 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, . , Kaiser, E. T. Peptlde segment couplíng catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin" (Acoplamento péptido catalizado por la enzima semisintética tiosubtiUsina) , J. Am. Chem. Soc . , 109: 3808-3810 (1987); Schnolzer, M. , Kent, S. B. H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease {Construyendo proteínas al ensamblar en cola de milano péptidos sintéticos no protegidos: HIV proteasa sometida a ingeniería en estructura principal) , Science, 256 (5054): 221-225 (1992); Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and proteins (Péptidos y proteínas semisintéticos) , CRC Crit Rev Biochem. , 11(3): 255-301 (1981) ; Offord, R. E. Protein engineering by chemical means? (¿Ingeniería de proteínas por medios químicos?) Protein Eng . 1(3), 151-157 (1987); y, Jackson, D. Y., Burnier, J. , Quan, C, Stanley, M. , Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Sínthesis of Ribonuclease A wi h Unnatural Catalytic Residues" (Una ligasa péptida diseñada para síntesis total de ribonucleasa A con residuos catalíticos no naturales) , Science, 266 (5138) : 243-247 (1994) .

[0014] Se ha empleado una modificación química para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cof ctores, etiquetas de espín y oligonucleótidos en proteínas in vivo. Ver, por ejemplo, Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease {Generación de una deoxiribonucleasa de hebra sencilla específica de secuencia híbrida) , Science, 283 (4832) :1401-1403 (1987); Kaiser, E . T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity (La modificación química de especificidad enzimática) , Rev. Biochem. , 54: 565-595 (1985); Kaiser, E. T. , Lawrence, D. S. Chemical mutation of enyzme active sites (Mutación química de sitios activos de enzima) , Science, 226(4674): 505-511 (1984); Neet, K. E . , Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, (Propiedades de tiol-subtiUsina) , J Biol . Chem. , 243 (24) : 6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin {Una nueva enzima que contiene un sitio activo formado sintéticamente . Tiol-subtilisina) . J. Am. Chem. Soc, 88: 3153-3154 (1966); y Pollack, S. J. , Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody co bining sites (Introducción de nucleofilos y sondas espectroscópicas en sitios de combinación de anticuerpo) , Science, 242 (4881) : 1038-1040 (1988) .

[0015] En forma alterna, los métodos biosintéticos que emplean aminoacíl-tRHAs químicamente modificados, se han empleado para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods (Nuevos métodos de fotoetiquetado y entrelazamiento), Annu. Rev. Biochem. , 62: 483-514 (1993); y, Krieg, U. C, alter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition partióle (Fotoentrelazamiento de la secuencia de señal de preprolactina naciente del polipéptido de 54-kilodaltons de la partícula de reconocimiento de señal), Proc. Nati . Acad. Sci., 83(22): 8604-8608 (1986) .

[0016] Previamente se ha mostrado que los aminoácidos no naturales pueden ser incorporados específicamente en sitio en proteínas in vitro por la adición de tRNAs supresores químicamente aminoacilados en reacciones de síntesis de proteina programadas con un gen que contiene una mutación no sentida de ámbar deseada. Utilizando estos enfoques, se puede substituir un número de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, por ejemplo, fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando cepas auxotróficas para un aminoácido particular. Ver, por rejemplo, Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P. G. A general method for slte-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins {Un método general para incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas), Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, y colaboradores, Science 268: 439-42 (1995); Bain, J. D., Glabe, C. G. , Dix, T. A., Chamberlin, A. R. , Diala, E. S. "Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid ínto a polypeptide" {Incorporación biosíntética específica de sitio de un aminoácido no natural en un polipéptido) , J . Am. Chem. Soc . , 111: 8013-8014 (1989); N. Budisa y colaboradores, FASEB J. 13: 41-51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill , S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins {Método biosintético para introducir aminoácidos no naturales específicamente en sitio en proteínas) , Methods in Enz . , 301-336 (1992); y, Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code (Mutagénesis dirigida de sitio con un código genético expandido) , Annu. Rev. Biophys. Biomol . Struct . 24, 435-62 (1995) .

[0017] Por ejemplo, un tR A supresor fue preparado para que reconociera el codón de parada UAG y se aminoaciló químicamente con un aminoácido no natural. Se utilizó la mutagénesis dirigida de sitio convencional para introducir el codón de parada TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver, por ejemplo, Sayers, J. R., Schmidt, W. Eckstein, F. "5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis" (51 , 3' Exonucleasa en mutagénesis dirigida por oligonucleótido basado en fosforotioato) , Mucleic Acids Res . , 16(3): 791-802 (1988). Cuando fueron combinados el tRNA supresor acilado y el gen mutante en un sistema de transcripción/traducción in vi tro, el aminoácido no natural se incorporó en respuesta al codón UAG que dio una proteína que tenía el aminoácido en la posición especificada. Los experimentos utilizando [3H] -Phe y los experimentos con alfa-hidroxi ácidos demostraron que sólo el aminoácido deseado es incorporado en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no es incorporado en cualquier otro sitio en la proteína. Ver, por ejemplo, Woren, y colaboradores, supra; y Ellraan, J. A., Mendel, D. , Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, (Incorporación específica de sitio de estructuras de cadena principal novedosos en proteínas) , Science, 197-200 (1992) .

[0018] En general, estos enfoques in vitro son limitados por las dificultades para lograr incorporación específica de sitio de los aminoácidos, por el requerimento de que los aminoácidos sean derivados simples de los veinte aminoácidos comunes o problemas inherentes en la síntesis de grandes proteínas o fragmentos péptidos.

[0019] También se han utilizado las técnicas de microinyección para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas. Ver, por ejemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. . Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y, H . A. Lester, Science, 268: 439 (1995); y, D. A. Dougherty, Curr . Opin . Chem. Biol . , 4: 645 (2000) . Un oocito Xenopus se coinyectó con dos especies RNA hechas in vitro: un mRNA que codifica la proteína objetivo con un codón de parada UAG en la posición aminoácido de interés y un tRNA supresor ámbar aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria de traducción del oocito luego insertó el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios de función-estructura in vivo de proteínas de membrana integral, que en general no son susceptibles a sistemas de expresión in vitro. Los ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido fluorescente en receptor taquicinina neurocinina-2 para medir distancias por transferencia de energía de resonancia por fluorescencia, ver, por ejemplo G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. nowles, H. Vogel y A. Chollet, J. Biol. Chem., 271: 19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos expuestos en superficies en canales de ión, ver, por ejemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol . , 4: 739 (1997); el uso de análogos tirosina en jaula para supervisar cambios de conformación en un canal de ión en tiempo real, ver por ejemplo J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron, 20: 619 (1998); y el uso de alfa-hidroxi aminoácidos para cambiar estructuras principales de canal de ión, para sondear sus mecanismos de compuerta, ver, por ejemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Cell, 96: 89 (1999); y, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Sc ultz y J. Yang, Nat . Neurosci . , 4: 239 (2001).

[0020] Sin embargo, hay limitaciones en el método de microinyección, por ejemplo el tRNA supresor tiene que aminoacilarse químicamente con el aminoácido no natural in vitro, y el tRNA acilado se consume como un reactivo estequiométrico durante traducción y no puede ser regenerado. Esta limitación resulta en deficiente eficiencia de supresión y bajos rendimientos de protelna, requiriendo técnica altamente sensibles para ensayar la proteína mutante, tales como mediciones electrofisiológicas . Aún más, este método sólo es aplicable a células que pueden ser microinyectadas .

[0021] La capacidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo ofrece las ventajas de alto rendimientos de proteínas imitantes, facilidad técnica, el potencial por estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamiento terapéuticos. La capacidad para incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidad.es, hidrofobicidades , ? otras propiedades en proteínas, puede expandir enormemente nuestra capacidad para manipular racional y sistemáticamente las estructuras de proteínas, tanto para sondear la función de proteínas como crear nuevas proteínas u organismos con propiedades novedosas. Sin embargo, el proceso es difícil, debido a la naturaleza compleja de las interacciones tR A-sintetasa que se requieren para lograr un alto grado de fidelidad en traducción de proteína. Por lo tanto, se necesitan mejoras en el proceso para suministrar métodos más eficientes y efectivos para alterar la maquinaria biosintética de la célula. La presente invención atiende estas y otras necesidades, como será aparente ante una revisión de la siguiente descripción. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

[0022] La presente invención proporciona composiciones de componentes empleados en la maquinaria biosintética de proteína, que incluye pares ortogonales tRNA-aminoacilo-tK A sintetasa y los componentes individuales de los pares . También se suministran métodos para generar y seleccionar tR As ortogonales, sintetasas ortogonales aminoacil-tR A, y sus pares, que pueden emplear un aminoácido no natural . Las composiciones de la invención incluyen novedosos pares ortogonales tRNA-aminoacil-tRNA sintetasa, por ejemplo pares mutR ATyr-m tTyrRS, pares mutRNALeu-mutLeuRS, pares mutRNAThr-mutThrRS , pares mutRNAGlu-mutGluRS, y semejantes. Los pares ortogonales novedosos pueden utilizarse para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido, in vivo. Otras modalidades de la invención incluyen seleccionar pares ortogonales .

[0023] Las composiciones de la presente invención incluyen una aminoacil-tRNA sintetasa (O-RS) ortogonal, en donde O-RS preferencialmente aminoacila un tRNA ortogonal (0-tRNA) con un aminoácido no natural, opcionalmente in vivo. En una modalidad, la O-RS comprende un ácido nucleico que consiste de una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4-34 (Ver Tabla 5) y su secuencia de polinucléotido complement rio. En otra modalidad, la 0-RS tiene mejoradas propiedades enzimaticas, por ejemplo, la m, es superior o inferior, la kcat es superior o inferior, el valor de kcat/Rm es superior o inferior o semejante, para el aminoácido no natural en comparación con un aminoácido de origen natural, por ejemplo, uno de los veinte aminoácidos conocidos .

[0024] Los aminoácidos no naturales de la presente invención abarcan una variedad de substancias. Por ejemplo, opcionalmente incluyen (pero nó están limitados a) moléculas tales como una O-metil-L-tyrosina, una L-3- (2-naf il) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alyl-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-0-acetyl-GlcNAcbeta-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-ácido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, unafosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina. Adicionalmente , otros ejemplos incluyen opcionalmente (pero no están limitados a) un análogo no natural de un aminoácido tirosina; un análogo no natural de un aminoácido glutamina; un análogo no natural de un aminoácido fenilalanina; un análogo no natural de un aminoácido serina; un análogo no natural de un aminoácido treonina; un aminoácidos substituido con alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, hidroxilamina, ceto, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un entrelazador fotoactivable; un aminoácido etiquetado por espín; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un grupo funcional novedoso; un aminoácido que interactúa en forma covalente o no covalente con otra molécula; un aminoácido de enlace a metal; un aminoácido que contiene metal, un aminoácido radioactivo; un aminoácido fotoenj aulado; un aminoácido fotoisomerizable ; un aminoácido que contiene biotiona o análogo de biotina; un aminoácido modificado con carbohidrato o glicosilado; un aminoácido que contiene ceto; un aminoácido que comprende polietilen glicol; un aminoácido que comprende polieter; un aminoácido substituido con átomo pesado; un amino fotoescindible o escindible químicamente; un aminoácido con una cadena lateral alargada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido substituido con azúcar, por ejemplo una serina substituida con azúcar o semejante; un aminoácido que contiene azúcar enlazado en con carbón; un aminoácido redox-activo; un ácido que contiene alfa-hidroxi ; un aminoácido que contiene amino tio ácido; un aminoácido alfa, alfa -disubstituido; un beta-aminoácido; y un aminoácido cíclico diferente a prolina .

[0025] La presente invención también incluye un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de polinucleótido de codificación que se elige de: una secuencia de polinucleótido de codificación seleccionada de SEQ ID NO: 4-34 (ver, Tabla 5 para secuencias) ; una secuencia de polinucleótido de codificación que codifica un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 35-6G una secuencia de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones altamente estrictas substancialmente sobre toda la longitud de estas secuencias polinucleótido; y secuencias complementarias de cualquiera de estas secuencias. Adic onalmente, el polipéptido opcionalmente codifica una aminoacil tRNA sintetasa ortogonal y/o una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 35 a SEQ ID NO: 66.

[0026] La presente invención también incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de : una secuencia de polinucleótido seleccionada de SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO : 3 (o su secuencia polinucleótido complementaria) y una secuencia de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones altamente estrictas substancialmente sobre toda la longitud de estas secuencias de polinucleótido . Estos ácidos nucleicos también incluyen en donde la secuencia de polinucleótido comprende un tRNA ortogonal y/o en donde la secuencia de polinucleótido forma un par complementario con una amino acil-tRNA sintetasa ortogonal (que opcionalmente se elige de aquellas cuyas secuencia se enlista en SEQ ID NO: 35 a SEQ ID NO: 66.

[0027] Composiciones de un tRNA (O-tRNA) ortogonal también se incluyen, en donde O- RNA reconoce un codón selector y en donde O-tRNA de preferencia es aminoacilando con un aminoácido no natural por una amino acil-tRNA sintetasa ortogonal. En una modalidad, el O-tRNA comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1-3 (ver, Tabla 5) y la secuencia de polinucleótido complementaria del mismo.

[0028] Codones selectores de la presente invención expanden el marco de codón genético de la maquinaria biosintética de proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye por ejemplo un codón de tres bases único (compuesto de bases naturales o no naturales) , un codón no-sentido (tal como un codón de parada, por ejemplo un codón ámbar, o un codón ópalo) , un codón no natural , un codón raro, un condón que comprende cuando menos cuatro bases, un codón que comprende al menos cinco bases, un codón que comprende al menos seis bases o semejantes .

[0029] En una modalidad, el O-tRNA (que opcionalmente comprendido con composiciones) puede incluir una amino acidil-tRNA sintetasa ortogonal (O-RS) , por ejemplo, en donde O-tR A y O-RS son complementarios, por ejemplo un par O-tR A/O-RS. En una modalidad, un par comprende por ejemplo un par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como un par mutR ATyr-SS12TyrRS, un par mutRNALeu-mutLeuRS , un par mntRNAThr-mutThrRS, un par mutR AGlu-mutGluRS o semejantes. En otra modalidad, el par es diferente a mutRNAGln-mutGlnRS derivado de Escherichia coli, un mutRNAAsp-mutAspRS derivado de levadura o un mutRNAPheCUA-mutfenilalaninaRS de levadura, en donde estos pares no poseen las propiedades de los pares de la presente invención.

[0030] O-tRNA y O-RS pueden derivarse por mutación de un tRNA y RS de origen natural de una variedad de organismos. En una modalidad, O-tRNA y O-RS se derivan de al menos un organismo, en donde el organismo es un organismo procariótico, por ejemplo Methanococcus ja.nna.schii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulcfidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophílus, o semejantes. Opcionalmente, el organismo es un organismo eucariótico, por ejemplo plantas (por ejemplo plantas complejas tales como monocotiledóneas o dicotiledóneas) , algas, hongos (por ejemplo levadura, etc.), animales (por ejemplo mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), insectos, protistas, o semejantes. Opcionalmente, el O-tRNA se deriva por mutación de un tRNA de origen natural de un primer organismo y O-RS se deriva por mutación de una RS de origen natural de un segundo organismo. En una modalidad, los O-tRNA y O-RS pueden derivarse de un tRNA mutado y RS mutada.

[0031] Los O-tRNA y O-RS también opcionalmente pueden aislarse de una variedad de organismos. En una modalidad, los 0-tRNA y O-RS se aislan de al menos un organismo, en donde el organismo es un organismo procariótico, por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobactetirium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pemix, T. thermophílus, o semejantes. Opcionalmente, el organismo es un organismo eucariótico, por ejemplo plantas (por ejemplo plantas complejas tales como monocotiledóneas, o dicotiledóneas) , algas, hongos (por ejemplo levadura, etc) , animales (por ejemplo mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), insectos, protistas, o semejantes. Opcionalmente, el O-tRNA se aisla de un tRNA de origen natural de un primer organismo y O-RS se aisla de una RS de origen natural de un segundo organismo. En una modalidad, los O-tRNA y O-RS pueden aislarse de una o más bibliotecas (que opcionalmente comprenden uno más O-tRNA y/o O-RS de uno o más organismos, incluyendo aquellos que comprenden procariotas y/o eucariotas) .

[0032] En otro aspecto, las composiciones de la presente invención pueden estar en una célula. Opcionalmente, las composiciones de la presente invención pueden estar en un sistema de traducción in vitro.

[0033] Métodos para generar componentes de la maquinaria biosintética de proteína, tales como O-RSs, O-tRNAs, y pares O-tRNA/O-RS ortogonales que pueden emplearse para incorporar un aminoácido no natural, se proporcionan en la presente invención. Métodos para seleccionar un par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un organismo, también se proporcionan. Los aminoácidos no naturales y codones selectores empleados en los métodos se describen anteriormente y a continuación.

[0034] Métodos para producir cuando menos una aminoacil tRNA sintetasa ortogonal recombinante (0-RS) comprende : (a) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente imitante) derivado de al menos un aminoacil -tRNA sintetasa (RS) de un primer organismo, por ejemplo un oganismo procariotico tales como Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophícum, Halohacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A. penix, T. thermophilus, o semejantes; (b) seleccionar (y/o tamizado) la biblioteca de RSs (RSs opcionalmente mutante) para miembros que aminoacilan un tRNA ortogonal (O-tRNA) en la presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) ; y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) el conjunto para RSs activas (por ejemplo mutante RSs) que de preferencia aminoacilan el 0-tRNA en la ausencia del aminoácido no natural, de esta manera proporcionando la O-RS cuando menos recombinante; en donde la 0-RS es recombinante cuando menos de preferencia aminoacila 0-tRNA con el aminoácido no natural . 0-RSs recombinantes producidos por los métodos también se incluyen en la presente invención.

[0035] En una modalidad, el RS es una RS inactivo. El RS inactivo puede generarse al mutar una RS activo, por ejemplo, el RS inactivo puede generarse al mutar cuando menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2 , al menos aproximadamente 3 , al menos aproximadamente 4 , al menos aproximadamente 5 , al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, por ejemplo alanina .

[0036] Bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando diversas técnicas de mutagénesis conocidas en la especialidad. Por ejemplo, los RSs mutantes pueden generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones recombinantes generadoras de diversidad, construcciones quiméricas y por otros métodos descritos aquí o conocidos en la especialidad .

[0037] En una modalidad, el seleccionar (y/o clasificar) la biblioteca de RSs (opcionalmente mutante RSs) para miembros que son activos, por ejemplo que aminoacilan un tR A ortogonal (O-tRNA) en la presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, incluye: introducir un marcador de tamizado o de selección positivo, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos, o semejantes y la biblioteca de RSs (opcionalmente imitante) en una pluralidad de células, en donde los marcadores de tamizado y/o selección positivos comprenden al menos un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, ocre u ópalo; desarrollando la pluralidad de células en la presencia de un agente de selección; identificando las células que sobreviven (o muestran una respuesta especifica) en la presencia de un agente de tamizado y/o selección al suprimir el codón selector como mínimo en el marcador de tamizado o selección positivo, de esta manera proporcionando un sub-conjunto de células selectas positivamente que contienen el conjunto de RSs activas (opcionalmente imitantes) . Opcionalmente, puede variarse la concentración de agentes de tamizado y/o selección.

[0038] En un aspecto, el marcador de selección positivo es un gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positivo es un gen beta-lactamasa y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen beta-lactamasa . En otro aspecto el marcador de tamizado positivo comprende un marcador de tamizado luminiscente o fluorescente o un marcador de tamizado basado en afinidad (por ejemplo un marcador de superficie celular) .

[0039] En una modalidad, el clasificado seleccionado negativamente el conjunto de RSs activo (opcionalmente mutantes) que de preferencia aminoacilan el 0-tRNA en la ausencia del aminoácido no natural incluyen: introducir un marcador de tamizado o selección negativo con el conjunto de RSs activo (opcionalmente mutantes) de la tamizado o selección positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de tamizado o selección negativo comprende al menos un codón selector (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo un gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de tamizado especifica en un primer medio suplementado con el aminoácido no natural y un agente de selección o tamizado, pero fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio no suplementado con el aminoácido no natural y el agente de selección o tamizado, de esta manera proporcionando células supervivientes o células clasificadas con 0-RS recombinante como mínimo. Por ejemplo, un protocolo de identificación CAT opcionalmente actúa como una selección positiva y/o tamizado negativa para determinar recombinantes O-RS apropiado. Por ejemplo, un conjunto de ciónos se replica opcionalmente en placas de crecimiento que contienen CAT (que comprenden al menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos no naturales . Colonias que se desarrollan exclusivamente en las placas que contienen aminoácidos no naturales de esta manera se considera que contienen una O-RS recombinante . En un aspecto, la concentración de un agente de selección (y/o tamizado) se varía. En algunos aspectos, el primer y segundo organismos son diferentes. De esta manera, el primer y/o segundo organismos opcionalmente comprenden: un procariota, un eucariota, un mamífero, un Escherichia col!, un hongo, una levadura, un arquebacterio, un eubacterio, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras modalidades, el marcador de tamizado comprende un marcador de tamizado fluorescente o luminiscente o un marcador de tamizado basado en afinidad.

[0040] En otra modalidad, la tamizado o selección (por ejemplo selección negativa) del conjunto para RSs activo (opcionalmente mutante) incluye: aislar el conjunto de RSs mutante activo de la etapa de selección positiva (b) ; introducir un marcador de tamizado o selección negativo, en donde el marcador de tamizado o selección negativo comprende al menos un codón selector (por ejemplo un gen marcador tóxico, por ejemplo un gen de ribonucleasa barnasa, que comprende al menos un codón selé'ctor) , y un conjunto de RSs activo (opcionalmente mutante) en una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de tamizado o tamizado especifica en un primer medio no suplementado con el aminoácido no natural, pero fallan en sobrevivir o mostrar una respuesta de tamizado específica en un segundo medio suplementado con el aminoácido no natural, de esta manera proporcionando células supervivientes o clasificadas, con al menos un O-RS recombinante, en donde la O-RS recombinante como mínimo es específico para el aminoácido no natural. En un aspecto, el codón selector como mínimo comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Estas modalidades opcionalmente pueden incluir en donde el codón selector como mínimo comprende dos o más codones selectores, y en donde el primer y segundo organismos son diferentes (por ejemplo cada organismo es, opcionalmente, por ejemplo un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichía coli, un hongo, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc.) . También, algunos aspectos incluyen en donde marcadores de selección negativo comprenden un gen ribonucleasa barnasa (que comprende cuando menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de tamizado opcionalmente comprende un marcador de tamizado luminescente o fluorescente o un marcador de tamizado basado en afinidad. En las presentes modalidades, las clasificaciones y/o selecciones opcionalmente incluyen variación de lo estricto de tamizado y/o selección.

[0041] En una modalidad, los métodos para producir al menos una amino-acil-tR A sintetasa ortogonal recombinante (O-RS) además pueden comprender: (d) aislar la O-RS recombinante como mínimo; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutada) derivada de O-RS recombinante como mínimo; y (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtenga una O-RS mutada, que comprende una habilidad para aminoacilar preferencialmente el 0-tRNA. Opcionalmente, se repiten las etapas (d) - (f) , por ejemplo, al menos alrededor de dos veces. En un aspecto, el segundo juego de O-RS mutada derivado de al menos una O-RS recombinante puede generarse por mutagénesis, por ejemplo mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o combinación de los mismos.

[0042] Lo estricto de las etapas de selección/tamizado, por ejemplo la etapa de tamizado/selección positiva (b) , la etapa de tamizado/selección negativa; (c) o tanto las etapas de tamizado/selección positiva y negativa (b) y (c) , en los métodos anteriormente descritos, opcionalmente incluye variar lo estricto de la selección/tamizado . En otra modalidad, la etapa de tamizado/selección positiva (b) , la etapa de tamizado/selección negativa (c) o tanto las etapas de tamizado/selección positiva, negativa (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, en donde el reportero se detecta por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS = fluorescence-activated cell sorting) o en donde el reportero se detecta por luminescencia . Opcionalmente, el reportero se exhibe en una superficie celular, en un exhibidor fago o semejante y selecciona con base en afinidad o actividad catalítica que involucra el aminoácido no natural o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se exhibe en una superficie celular, en exhibidor fago o semejantes.

[0043] Los métodos incorporados aquí opcionalmente comprenden en donde el aminoácido no natural se elige de por ejemplo: una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, un ?-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcbeta-serina, una L-Dopa, un fenilalanina fluorada, un isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil -L-fenilalanin . Un O-RS recombinante producido por los métodos aguí presentes también se incluyen en la presente invencion.

[0044] Métodos para producir un tRNA ortogonal recombinante (0-tRNA) incluyen: (a) generar una biblioteca de tRNAs mutantes derivados de al menos un tRNA, por ejemplo un tRNA supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar (por ejemplo selección negativa) o clasificar la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutante) que se aminoacilan por una amino acil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS, del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) ; y (c) seleccionar o clasificar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducido RS (O-RS) , de esta manera proporcionando cuando menos un 0-tRNA recombinante; en donde el O-tRNA recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no se reconoce eficie emente por la RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila por la O-RS. En algunas modalidades el tRNA como mínimo es un tR A supresor y/o comprende un codón de tres bases de bases naturales y/o no naturales, o es un codón no sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende al menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ocre, o un codón de parada ópalo. En una modalidad, el O-tRNA recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, O-tRNA opcionalmente es importado en un primer organismo de un segundo organismo sin necesidad por modificación. En diversas modalidades, el primer y segundo organismos ya son iguales o diferentes y se eligen opcionalmente de, por ejemplo, procariotas (por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, etc.), eucariotas, mamíferos, hongo, levaduras, archaebacteria, eubacteria, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el tRNA recombinante opcionalmente se aminoacilan por un aminoácido no natural, en donde el aminoácido no natural se biosintetiza in vivo ya sea en forma natural o a través de manipulación genética. El aminoácido no natural se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primer o segundo organismos .

[0045] En un aspecto, el seleccionar (por ejemplo seleccionar negativamente) o clasificar la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutante) que se aminoacilan por una aminoacil-tRNA sintetasa (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende al menos uno de codones selectores (o un gen que lleva a la producción de un agente tóxico o estático o un gen esencial para el organismo, en donde el gen marcador comprende cuando menos un codón selector) y la biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutante) en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes, en donde las células supervivientes contienen el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) que comprende al menos un tRNAs ortogonal o tRNA no funcional. Por ejemplo, células supervivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular de proporción por comparación.

[0046] En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores . En otra modalidad de los métodos, el gen marcador tóxico es un gen ribonucleasa barnasa, en donde el gen ribonucleasa barnasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar.

[0047] En una modalidad, el seleccionar o claisificar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida (O-RS) puede incluir: introducir un gen marcador de tamizado o selección positivo, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a droga (por ejemplo, gen beta-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones selectores, tal como al menos un codón de parada ámbar) o un gen esencial para el organismo, o un gen que lleva a desintoxicación de un agente tóxico, junto con la O-RS, y el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) en una pluralidad de células del segundo organismo; e identificar células supervivientes o clasificadas que se desarrollan en la presencia de un agente de selección o tamizado, por ejemplo un antibiótico, de esta manera proporcionando un conjunto de células que poseen el tRNA recombinante como mínimo, en donde el tRNA recombinante como mínimo se aminoacilan por la O-RS e inserta un aminoácido en el producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a los codones selectores como mínimo. En otra modalidad, la concentración del agente de tamizado y/o selección se varia. 0-tRNAs recombinante producidos por los métodos de la presente invención también se incluyen.

[0048] Métodos para generar pares O-tRNA/O-RS específicos se proporcionan. Métodos incluyen: (a) generar una biblioteca de tRNAs mutante derivada de al menos un tRNA de un primer organismo; (b) seleccionar negativamente o claisificar la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutante) que se aminoacilan por una amino acil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) ; (c) seleccionar o clasificar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutante) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida (O-RS) , de esta manera proporcionando al menos un 0-tRNA recombinante. El 0-tRNA recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no es reconocido con eficiencia por el RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila por la O-RS. El método también incluye (d) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutante) derivado de al menos un aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un tercer organismo; (c) seleccionar o clasificar la biblioteca de RSs mutante para miembros que aminoacilan preferencialmente el O-tRNA recombinante como mínimo en la presencia de un aminoácido no natural y aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activas (opcionalmente rautantes) ; y, (f) seleccionar o clasificar negativamente el conjunto por RSs activas (opcionalmente mutantes) que de preferencia aminoacilan en O-tRNA recombinante como mínimo en la ausencia de aminoácido no natural, de esta manera proporcionando el par específico O-tRNA/0-RS como mínimo, en donde el par 0-tRNA/O-RS específico, como mínimo comprende al menos un O-RS recombinantes que es específico para el aminoácido no natural y el O-tRNA recombinante como mínimo. Pares 0-tRNA/O-RS específicos producidos por los métodos se incluyen. Por ejemplo, el par 0-tRNA/O-RS específicos pueden incluir, por ejemplo un par mutRNATyr-mutTyrRS , tal como un par mutRNATyr-SS12TyrRS, un par mutRNALcu-mutLeuRS , un par mutR-NAThr-mutThrRS, un par mutRNAGlu-mutGluRS o semejantes. Adicionalmente, estos métodos incluyen en donde el primero y tercer organismos son los mismos tanto ejemplo (e.g. Methanococcus jannaschii) .

[0049] También se incluyen en la presente invención los métodos para seleccionar un par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un tR A y un aminoacil tRNA sintetasa (RS) aislado o derivado de un primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tRNA en un conjunto de células duplicadas de un segundo organismo; y seleccionar células sobrevivientes en el primer conjunto que falla en sobrevivir el conjunto de células duplicadas o que clasificar en las células que muestran una respuesta de tamizado específica que falla en dar esta respuesta en el conjunto de células duplicadas, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicadas se desarrollan en la presencia de un agente de selección o tamizado, en donde las células supervivientes o seleccionadas comprenden el par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal para utilizar un sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, comparar y seleccionar o tamizar incluye un ensayo de complementación in vivo. La concentración del agente de selección o tamizado puede variarse.

[0050] Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primer y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procariótico, por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherlchia coli, A. fidgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o semejantes. En forma alterna, los organismos opcionalmente comprenden un organismo eucariótico, por ejemplo plantas (por ejemplo plantas complejas tales como monocotiledóneas , o dicotiledóneas), algas, protistas, hongos (por ejemplo, levadura, etc) , animales (e.g. , mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o semejantes. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pemix, T. Thermophilus, o semejantes. En forma alterna, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, por ejemplo una levadura, una célula animal, una célula de planta, un hongo, una célula de mamífero o semejantes. En diversas modalidades los primeros y segundos organismos son diferentes .

[0051] Los diversos métodos (anteriores) de la invención opcionalmente comprenden seleccionar o tamizar una o más selecciones o tamizados positivos o negativos, por ejemplo un cambio en ' permeabilidad de aminoácido, un cambio en eficiencia de traducción y un cambio en fidelidad de traducción. Adicionalmente, uno o más cambios se basa opcionalmente en una mutación en uno o mas genes en un organismo, en donde un par tKA-tRNA sintetasa ortogonal se utilizan para producir esta proteína. La selección y/o tamizado aquí opcionalmente comprende al menos son empleados 2 codones selectores con uno o más genes de selección o con uno o más genes de tamizado. Estos codones selectores múltiples están opcionalmente dentro del mismo gen o dentro de diferentes genes de tamizado/selección. Adicionalmente, los codones selectores múltiples opcionales son codones selectores opcionalmente diferentes o comprenden el mismo tipo de codones selectores .

[0052] Los equipos son una característica adicional de la invención. Por ejemplo, los equipos pueden incluir uno o más sistemas de traducción como se anotó anteriormente (por ejemplo una célula) , uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo con material de empaque apropiado, recipientes para contener los componentes del equipo, materiales instructivos para practicar los métodos presentes y/o semejantes. Similarmente, productos de los sistemas de traducción (por ejemplo, proteínas tales como análogos EPO comprenden aminoácidos no naturales) pueden proporcionarse en forma de equipo, por ejemplo con recipientes para contener los componentes del equipo, material instructivo para practicar los métodos presentes y/o semejantes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0053] La Figura 1 ilustra esquemáticamente incorporación específico del sitio de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo. Una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal aminoacila un tRNA con un aminoácido no natural. El tRNA ortogonal acilado inserta el aminoácido no natural en la posición especificada por un codón selector, por ejemplo un codón único, que se introduce en el gen que codifica una proteína de interés.

[0054] La Figura 2, Panel A y Panel B, ilustran esquemáticamente ejemplos de métodos de selección para sintetasas activas que aminoacilan con aminoácidos no naturales . Panel A ilustra en tamizado/selección general para aminoacil-tRNA sintetasas con especificidades de aminoácidos no naturales. En la selección positiva, se identifican sintetasas activas ya sea con especificidades de aminoácidos naturales o no naturales; en la selección negativa, se eliminan sintetasas con especificidades de aminoácidos naturales . Sólo pueden sobrevivir sintetasas que se cargan en tRNA ortogonal con el aminoácido no natural, tanto selecciones/tamizado. El Panel B ilustra esquemáticamente una modalidad de la selección/tamizado para sintetasas que de preferencia aminoacilan un O-tR A con un aminoácido no natural. Por ejemplo, vectores de expresión que contienen un tRNA supresor ortogonal y un miembro de una biblioteca de RS mutado con un marcador de selección positivo, por ejemplo beta-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, son introducidos en un organismo y desarrollados en la presencia de un agente selector, por ejemplo ampicilina. La expresión del marcador de selección positivo permite que la célula sobreviva en el agente de selección. Los supervivientes codifican sintetasas capaces de cargar cualquier aminoácido natural o no natural (aa) en el 0-tRNA. Las sintetasas activas se transforman en una segunda cepa en el vector de expresión, y un vector de expresión con un marcador de selección negativo, por ejemplo, un gen tóxico, tal como una barnasa, que cuando se expresa extermina las células, con uno o más codones selectores, por ejemplo, TAG. Las células se desarrollan sin el aminoácido no natural . Si la sintetasa proporcionada aminoacila O-tRNA con un aminoácido natural, el marcador de selección negativo se expresa y la célula muere. Si la sintetasa aminoacila preferencialmente O-tRNA, no se expresa marcador de selección negativo, debido a que no hay aminoácido no natural y la célula vive . Esto permite al menos una sintetasa ortogonal que aminoacila de preferencia el O-tRNA con el codón no natural deseado.

[0055] La Figura 3 ilustra mutaciones especificas de sitio para generar bibliotecas dirigidas para análogo de tirosina.

[0056] La Figura 4 ilustra un secuencia de consenso para selección de pentafluorofenilalanina para generar bibliotecas directas para estos análogos.

[0057] La Figura 5 ilustra esquemáticamente el transplante de un dominio, por ejemplo el dominio CPI, de un organismo, por ejemplo Escherichia coli, a la sintetasa de otro organismo, por ejemplo Methanococcus jannaschii TyrRS .

[0058] La Figura 6 ilustra esquemáticamente la construcción de sintetasas Methanococcus jannaschii/Escherichia coli quiméricas.

[0059] La Figura 7 ilustra esquemáticamente la generación de una biblioteca de sintetasas quiméricas, por ejemplo, Methanococcus jannaschii/Escherichia coli.

[0060] La Figura 8 ilustra esquemáticamente un ejemplo para selección de tR As supresores que son deficientes substratos para sintetasas endógenos, por ejemplo una sintetasa de Escherichia coli, y que se cargan eficientemente a una sintetasa cognato de interés . Vectores de expresión que contienen un miembro de una biblioteca tRNA mutada y otro vector con un marcador de selección negativo, por ejemplo un gen tóxico, tal como una barnasa, con uno o más codones selectores, se introducen en una célula de un organismo . Supervivientes de la selección negativa codifican tRNAs mutados que ya son ortogonales al organismo o no f ncionales . Los vectores de los supervivientes se aislan y transforman en otras células junto con un marcador de selección positiva, por ejemplo gen beta-lactamasa, con un codón selector. Las células se desarrollan en la presencia de un agente de selección, por ejemplo ampicilina, y una RS de un organismo de la misma fuente, por ejemplo, Methanococcus jannaschii , como tRNA. Los supervivientes de esta selección codifican tRNA mutantes que es ortogonal a las sintetasas de la célula, como por ejemplo sintetasas de Escherichia coli y aminoacilan por RS de la misma fuente que tRNA.

[0061] La Figura 9, Panel A y B, ilustran esquemáticamente una biblioteca tRNA anticodón-bucle mutada, Panel A, y una biblioteca de todo bucle mutada, Panel B, de Methanococcus jannaschii tRNATyrCuA-Nucleóticos mutados aleatoriamente (N) están sombreados en negro .

[0062] La Figura 10 ilustra esquemáticamente ejemplos de estructuras que forman pares por fuerza diferentes a enlaces de hidrógeno (PICS:PICS, 3MN : 3MN, 7AI:7AI, Dipic:Py).

[0063] La Figura 11 es una gráfica de resultados de un método de selección negativa para tRNAs supresor, que muestra el por ciento de células supervivientes que contienen una de tres construcciones, para una cantidad determinada de tiempo con base en la supresión de dos codones ámbar en el gen barnasa introducido por un vector, por ejemplo pSCB2 plásmido. Este plásmido codifica el gen barnasa que contiene dos codones ámbar. Se llevan a cabo selecciones en GMML medio líquido y 20 mM de arabinosa se utiliza para inducir expresión de barnasa. Estas construcciones se indican por lo siguiente: (1) un círculo que presenta un plasmido de control sin tRNA supresor; (2) un triángulo que presenta un tRNA supresor en el plásmido, pAC-YYGl; y (3) un cuadrado que presenta un tRNA supresor en el plásmido pAC-JY.

[0064] La Figura 12 exhibe histogramas de crecimiento, ilustrando selección positiva con base en la supresión de un codón ámbar en el gen beta-lactamasa . Un vector que codifica un tRNA supresor, por ejemplo un plásmido pAC, se cotransforma con un vector que codifica una sintetasa, por ejemplo pBLAM-JYRS, en un organismo, por ejemplo células de DH10B de Escherichia coli . El crecimiento de células que alojan sintetasas y diferentes plásmidos pAC en el medio 2X YT líquido con diversas concentraciones de ampicilina, por ejemplo 0, 100 y 500 ^g/ml, se ilustra en al Panel A, en donde pAC es un plásmido de control sin RNA supresor, en donde pAC-YYGl es un plásmido con tRNA supresor, y en donde pAC-JY es un plásmido con tRNA supresor. Panel B muestra selección positiva ' de las mismas construcciones utilizando placas de agar 2X YT con 500 ng/ml de ampicilina. Estas construcciones se indican por lo siguiente: (1) un círculo que presenta un plásmido de control sin supresor tR A; (2) un triángulo que presenta un tRNA supresor en el plásmido, pAC-Y-YCTI; y (3) un cuadrado que presenta un tRNA supresor en el plásmido pAC-JY.

[0065] La Figura 13 ilustra secuencias de DNA de tRNAs supresores mutantes seleccionados de bibliotecas anticodón-bucle y todo bucle . JY representa tR ACUATyrCUA de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre .

[0066] La Figura 14 ilustra esquemáticamente una vista en estéreo del sitio activo de TyrRS. Residuos de TyrRS de B. stearothermophilus se ilustra en la Figura. Residuos correspondientes de TyrRS Methanococcus jannaschii son Tyr32 (Tyr34) , Glu107 (Asn123) , Asp158 (Asp17S) , lie159 (Phe177) , y Leu162 (Leu180) con residuos de TyrRS B. stearothermophilus en paréntesis.

[0067] La Figura 15 ilustra esquemáticamente una vista del sitio activo de TyrRS. Residuos de TyrRS B. stearothermophilus se ilustra en la Figura. Residuos correspondientes de TyrRS Methanococcus janizaschii son Tyr32 (Tyr34), Asp158 (Asp176) , lie153 (Phe177) , Leu162 (Leu180) y Ala167 (Gln189) con residuos de TyrRS B. stearothernzophilus TyrRS en paréntesis .

[0068] La Figura 16, Panel A y Panel B ilustran esquemáticamente un ejemplo de métodos de selección y tamizado basados en FACS empleados para generar un componente de la presente invención, por ejemplo sintetasa ortogonal. Un Panel A ilustra esquemáticamente vectores, por ejemplo plásmidos para expresión de biblioteca sintetasa ortogonal y O-tRNA (plásmido de biblioteca) para el sistema reportero de polimerasa/GFP T7RNA (plásmido reportero) , con uno o más codones selectores, por ejemplo TAG. El Panel B ilustra esquemá icamente el esquema de tamizado negativo/ selección positivo, en donde las células se desarrollan en la presencia y ausencia de aminoácido no natural, la presencia y ausencia de un agente de selección y tamizado por células de fluorescencias y no-fluorescentes en el proceso de tamizado, en donde "+" y circuios vacíos corresponden a las células fluorescentes y no fluorescentes , respectivamente .

[0069] La Figura 17, Panel A, Panel B, Panel C y Panel D ilustran un sistema reportero de fluorescencia amplificable . Panel A ilustra esquemáticamente vectores que pueden emplearse en el tamizado, por ejemplo plásmidos, tales como pREP, en donde transcripción de T7 RNA polimerasa se controla por el promotor ara; expresión de proteína depende en su supresión de codones ámbar en sitios variantes en el gen, expresión reportero, por ejemplo expresión GFPuv se controla por T7 RNA polimerasa. El vector reportero, por ejemplo plásmido pREP, es compatible para utilizar con un vector para expresar el par sintetasa/t A ortogonal, por ejemplo un plásmido ColEl . El Panel B ilustra composiciones y mejora su fluorescencia de construcciones de gen T7 RNA polimerasa con pREP (1-12) . El miembro de construcción se indica a la izquierda de cada uno. Mejoras de fluorescencia, indicadas a la derecha de cada construcción, se calculan como la proporción corregida por concentración celular de fluorescencia, como se mide fluorimétricamente, de células que contienen pREP(l-12) y pQ o pQD. La posición de las mutaciones ámbar dentro de un gen se indica. El Panel C ilustra análisis citometrico de células que contienen pREP (10) y ya sea pQD (superior) o pQ (fondo) . El Panel D ilustra análisis fluorimétricos de células que contienen pREP (10) y expresan diversos tR As supresores de Escherichia coli. "Ninguno" indica que las células no contienen tRNA supresor .

[0070] La Figura 18 ilustra esquemáticamente selección basada en fago para incorporación de aminoácidos no naturales en un epítope de superficie. Por ejemplo, Escherichia coli que transporta la biblioteca sintetasa mutante se infectan por fago por un codón de parada en un gen que codifica una proteína de superficie. El fago que contiene una sintetasa activa exhibe el aminoácido no natural en la superficie de fago y se elige con anticuerpos monoclonales inmovilizados.

[0071] La Figura 19 ilustra esquemáticamente un ejemplo de una molécula, por e emplo análogo e aminoalquil adenilato inmovilizado del intermediario aminoacil adenilato, empleado para tamizar sintetasas exhibidas, por ejemplo, sintetasas exhibidas de fago, con especificidad de aminoácido no natural .

[0072] La Figura 20 es una gráfica que ilustra resistencia a ampicilina de diversos pares ortogonales y una variedad de organismos. La Figura ilustra un ejemplo de encontrar un par ortogonal que utiliza construcciones reporteras, cada que contiene un gen reportero, por ejemplo, un gen beta-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, y un tRNA supresor (con un anticodón selector) , en donde el tR A supresor puede ser de una variedad de organismos, por ejemplo A. fulgidus, Halobacterlvm NRC-1, P. furiosus, P. horikoshii, y Methanococcus jannaschii . Las construcciones reporteras y sintetasas clonadas de diferentes organismos, por ejemplo, M. thermoautotrophicum, Methanococcus jannaschii, P. horíkoshíí, A. pernix, A. fulgidus, Halobacteríum NRC-1, y Escherichia coli se transforman en una célula. Las células se desarrollan en diversas concentraciones de un agente selector, por ejemplo ampicilina. Células que poseen un par tRNA/RS ortogonal se eligen, por ejemplo, utilizando un ensayo de complementación in vivo. Como se ilustra, dos sistemas mostraron niveles de supresión significantes superiores a los observados con sintetasa de Escherichia coli . Estos son M. thermoautotrophicum y Methanococcus jannaschii .

[0073] La Figura 21, el Panel A y el Panel B, ilustran tRNAs supresores ámbar mutados de Halobacteríum NRC-1, que se generan al mutar, por ejemplo, aleatorizar, el bucle de anticodón de leucil tRNA y seleccionar (Panel B) supresión más eficiente de un codón selector, por ejemplo un codón ámbar en uno varios genes reporteros, por ejemplo utilizando una combinación de etapas de selección, tal como selección basada en beta-lactamasa y selección basada en barnasa. El Panel B ilustra valores IC50 en /ig/ml de ampicilina de sistema de supresión ámbar beta-lactamasa con tres construcciones de tRNA mutantes, mutante ámbar original, bucle anticodón optimizado y tallo aceptor optimizado, sólo o con una RS, por ejemplo MtLRS. El anticodón optimizado y el tallo aceptor optimizado dieron los valores más altos en la etapa de selección de beta-lactamasa.

[0074] La Figura 22 ilustra un supresor LRNA para un codón base . El supresor tR A ilustrado en esta Figura se aisló de una biblioteca derivada del TTG tRNA de H lobacterium NRC-1, en donde el bucle anticodón se aleatorizó con 8 nucleótidos y sometió a selección de ampicilina con una construcción reportera que contiene un gen beta-lactamasa con un codón AGGA en el sitio A184.

[0075] La Figura 23 Paneles A-D, ilustra la actividad de la variante sintetasa dominantes por cada experimento de evolución exitoso. La Figura 23A es una fotografía que ilustra iluminación ultravioleta de longitud de onda larga de células que contienen pREP/YC-JYCUA y la variante sintetasa indicada, desarrollada ya sea en la presencia (+) o ausencia (-) del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23B ilustra análisis fluorimétricos de células que contienen pREP/YC--TYCUA y la variante sintetasa indicada, desarrollada ya sea en la presencia (izquierda) o ausencia (derecha) del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23C es una tabla que ilustra un análisis Cm IC50 de células que contienen pREP/YC-JYCUA y la variante sintetasa indicada, que se desarrolla ya sea en la presencia o ausencia del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23D ilustra análisis de expresión de proteína de células que contienen pBAD/JYAMB-4TAG y la variante sintetasa indicada, desarrollada ya sea en la presencia (+) o ausencia (-) del aminoácido no natural correspondiente.

[0076] La Figura 24, ilustra comparaciones de actividad de variantes OAY-RS derivadas utilizando un tamizado basado en FACS- (OAY-RS (1, 3 , 5) ) o selección basada en barnasa negativo (OAY-RS (B) ) . Las células que contienen pREP/YC-JYCUA y la variante sintetasa indicada, se desarrollaron ya sea en la presencia (bloque sólido, izquierda) o ausencia (bloque sólido, derecha) del aminoácido no natural correspondiente y analizaron fluorimétricamente . La mejora de fluorescencia (barra, posterior) se calcula como la proporción corregida por concentración celular de fluorescencia de células desarrolladas en la presencia contra la ausencia de aminoácido no natural .

[0077] La Figura 25, Paneles A-B, ilustran componentes del sistema plásmido reportero de múltiples propósitos para dirigir la evolución de M. jannaschii TyrRS. La Figura 25A ilustra el plásmido pREP/YC-JYCUA.

El Plásmido pREP/YC-JYCUA es compatible para uso con el plásmido pBK y variantes. La Figura 25B ilustra estructuras de aminoácidos no naturales empleados como objetivos para la evolución de . jannaschii TYfRS .

[0078] La Figura 26 ilustra la estrategia para la evolución de una aminoacil-tRNA sintetasa utilizando el plásmido pREP/YC-JYCUA. Las células fluorescentes y no-fluorescentes se ilustran en blanco y negro, respectivemente .

[0079] La Figura 27 ilustra una treonil-tR A sintetasa de Thermus thermophilus.

[0080] La Figura 28 ilustra la generación de un tRNA ortogonal para una treonil-tRNA/RS ortogonal de T. thermophilus.

[0081] La Figura 29 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares como se utilizan en la presente invención .

[0082] La Figura 30 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares como se utiliza en la presente invención.

[0083] La Figura 31 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares como se utiliza en la presente invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0084] Introducción

[0085] Las proteínas están en los cruces de virtualmente de todo proceso biológico, desde la fotosíntesis y transducción de señal a visión y la respuesta inmune. Las funciones complejas resultan en un polímero basado en poliamida que consiste de veinte bloques de construcción relativamente simples dispuestos en una secuencia primaria definida.

[0086] La presente invención incluye métodos y composición para utilizar en la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales directamente en proteínas ±n vivo. De manera importante, el aminoácido no natural se agrega al repertorio genético, en vez de substituirlo por uno de los 20 aminoácidos comunes. La presente invención proporciona métodos para generar, métodos para identificar y composiciones que comprenden los componentes empleados por la maquinaria biosintética para incorporar un aminoácido no natural en una proteína. La presente invención, por ejemplo (i) permite la inserción selectiva de sitio de uno o más aminoácidos no naturales en cualquier posición deseada de cualquier proteína, (ii) es aplicable tanto a células procarióticas como eucarióticas, (iii) Permite estudios in vivo de proteínas mutantes además de la generación de grandes cantidades de proteínas mutantes purificadas, y (iv) es adaptable para incorporar cualquiera de una gran variedad de aminoácidos no naturales, en proteínas in vivo. De esta manera, en una secuencia de polipéptido específico, es posible una cantidad de diferentes inserciones selectivas de sitio de aminoácidos no naturales . Estas inserciones son opcionalmente todas del mismo tipo (por ejemplo múltiples ejemplos de un tipo de aminoácido no natural insertado en múltiples puntos en un polipéptido) u opcionalmente son de tipos diversos (por ejemplo, tipos de aminoácido no natural diferentes se insertan en múltiples puntos en un polipéptido) .

[0087] DEFINICIONES

[0088] Antes de describir la presente invención en detalle, habrá de entenderse que esta invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por supuesto variar. También habrá de entenderse que la terminología aquí empleada es para propósitos de describir modalidades particulares solamente, y no se pretenden limitantes. Como se emplea en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una" y "el" , "la" incluyen las referencias plurales a menos de que de otra forma lo dicte claramente el contenido. De esta manera, por ejemplo, referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de estas moléculas, y semejantes.

[0089] A menos que se defina de otra forma, todos los términos científicos y técnicos se entiende que tienen el mismo significado como se utilizan comúnmente en la técnica a la cual se refiere. Al propósito de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos .

[0090] Como se emplea aquí, proteínas y/o secuencias de proteína son "homologas" cuando se deriva, en forma natural o artificial de una secuencia de proteína o proteína ancestral común. Similarmente, ácidos nucleicos y/o secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se derivan, en forma natural o artificial, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Por ejemplo, cualquier ácido nucleico de origen natural puede modificarse por cualquier métodos de mutagénesis disponible para incluir uno o más codones selectores. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturales . El proceso de mutación puede por supuesto, adicionalmente alterar uno o más codones estándar, de esta manera cambiando uno o más aminoácidos estándar en la proteína mutante resultante por igual . La homología en general se infiere a partir de similaridad de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o sus secuencias) . El porcentaje preciso de similaridad entre secuencias que es útil para establecer homología varía con el ácido nucleico y proteína de interés, pero tampoco como 25% de similaridad de secuencia se emplea rutinariamen e para establecer homología. Superiores niveles de similaridad de secuencia, por ejemplo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más también pueden emplearse para establecer homología. Aquí se describen métodos para determinar porcentajes de similaridad de secuencia (por ejemplo BLASTP y BLASTN utilizando parámetros predefinidos) y, en general, están disponibles.

[0091] El término "aminoacila preferencialmente" se refiere a una eficiencia, como por ejemplo aproximadamente 70% eficiente, aproximadamente 75% eficiente, aproximadamente 85% eficiente, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99% o más eficiente, en las cuales una 0-RS aminoacila un O-tRNA con un aminoácido no natural en comparación con un material de partida tRNA de origen natural empleado para generar el O-tRNA. El aminoácido no natural luego se incorpora en una cadena polipéptido creciente con alta fidelidad, por ejemplo a más de aproximadamente 75% de eficiencia para un codón selector determinado, a más de aproximadamente 80% de eficiencia para un codón selector determinado, a más de aproximadamente 90% de eficiencia para un codón selector determinado, mayor a aproximadamente 95% de eficiencia para un codón selector determinado o mayor de aproximadamente 99% de eficiencia para un codón selector determinado.

[0092] El término "codón selector" se refiere a codones reconocidos por O-tRNA en el proceso de traducción no reconocido por un tRNA endógeno. El bucle anticodón O-tRNA reconoce el codón selector en el O-tRNA e incorpora su aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no natural, en este sitio en el polipéptido. Codones selectores pueden incluir por ejemplo codones no sentido, tales como codones de parada, por ejemplo codones ámbar, ocre y ópalo; cuatro o más codones base; codones derivados de pares de base natural o no naturales y semejantes. Para un sistema determinado, un codón selector también puede incluir uno de los tres codones base naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza los tres codones base naturales, por ejemplo, un sistema que carece de un tRNA que reconoce los tres codones base naturales o un sistema en donde el codón de tres bases naturales es un codón raro.

[0093] Como se emplea aquí, el término "ortogonal" se refiere a una molécula (por ejemplo un tRNA ortogonal) (O-tRNA) y/o un aminoacil tRNA sintetasa ortogonal (O-RS) ) que se utiliza con eficiencia reducida por un sistema de interés (por ejemplo un sistema de traducción, por ejemplo una célula) . Ortogonal se refiere a la incapacidad o eficiencia reducida, por ejemplo menos de 20% eficiente, menos de 10% eficiente, menos de 5% eficiente o, por ejemplo, menos de 1% eficiente, de un tRNA ortogonal y/o RS ortogonal para funcionar en el sistema de traducción de interés. Por ejemplo, un tRNA ortogonal en un sistema de traducción de interés se aminoacilan cualquier RS endógeno de un sistema de traducción de interés con eficiencia reducida o incluso cero, cuando se comparan con aminoacilación de un tRNA endógeno por la RS endógena. En otro ejemplo, una RS ortogonal aminoacilan cualquier tRNA endógeno en el sistema de traducción de interés con eficiencia reducida o incluso cero, en comparación con aminoacilación del tRNA endógeno por una RS endógeno. "Mejora en ortogonalidad" se refiere a ortogonalidad mejorada en comparación con un material de partida o un tRNA o RS de origen natural .

[0094] El término "complementario" se refiere a componentes de un par ortogonal, 0-tRNA y 0-RS que pueden funcionar en conjunto, por ejemplo, de O- S aminoacila O-tR A.

[0095] El término "derivado de" se refiere a un componente que se aisla de un organismo o aisla y modifica o genera, por ejemplo sintetiza químicamente utilizando información del componente del organismo.

[0096] El término "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido de origen natural en una cadena polipéptido creciente (proteína) . Por ejemplo, los componentes pueden incluir ribosomas, tRNAs, sintetasas, mRNA y semejantes. Los componentes de la presente invención pueden agregarse a un sistema de traducción, in vivo o in vitro.

[0097] El término "RS inactivo" se refiere a una sintetasa que se ha mutado de manera tal que no puede aminoacilar más su tRNA connato con un amino ácido.

[0098] El término "agente de selección" se refiere a un agente que cuando está presente permite una selección de ciertos componentes de una población, por ejemplo un antibiótico, longitud de onda de luz, un anticuerpo, un nutriente o semejantes. El agente de selección puede variarse, por ejemplo tal como concentración, intensidad, etc.

[0099] El término "marcador de selección positivo" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo expresa, activa o semejante, resulta en identificación de un organismo con el marcador de selección positivo de aquellos cuyo marcador de selección positivo.

[0100] El término "marcador de selección negativo" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo expresado o activado o semejante, permite identificación de un organismo que no posee la propiedad deseada (por ejemplo, en comparación con un organismo que posee la propiedad deseada) .

[0101] El término "reportero" se refiere a un componente que puede emplearse para seleccionar componentes descritos en la presente invención. Por ejemplo, un reportero puede incluir una proteína fluorescente verde, una proteína fil luciferasa, o genes tales como beta-gal/lacZ (beta-galactosidasa) , Adh (alcohol dehidrogenasa) o semejantes.

[0102] El término "no eficientemente reconocido" se refiere a una eficiencia, por ejemplo menor a aproximadamente 10%, menor a aproximadamente 5%, o mejor a aproximadamente 1%, en la cual RS de un organismi aminoacilan O-tR A.

[0103] El término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucaria tales como animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas, hongos (por ejemplo, levaduras, etc.), flagelados, microsporidia, protistas, etc. Adicionalmente , el término "procariota" se refiere a organismos no-eucarióticos que pertenecen a la Eubacteria (por ejemplo, Escherichia coli, Thermus thermophilus, etc.) y Archaea (por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y Halobacterium especies NRC-1, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, etc) . de dominios filogenéticos .

[0104] Un "tRNA supresor" es un tRNA que altera la lectura de un RNA mensajero (mRNA) en un sistema de traducción determinado. Un tRNA supresor puede leer a través por ejemplo de un codón de parada, un codón de cuatro bases, o un codón raro.

[0105] DISCUSIÓN

[0106] La presente invención se refiere a métodos y composiciones para nuevos componentes de maquinaria de traducción biosintética que permite la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo. Específicamente, se proporcionan composiciones que comprenden y métodos para generar tRNAs ortogonales y RS ortogonales y pares tRNAs ortogonales/RS ortogonales. Estos componentes, cuando se introducen en una célula huésped, pueden emplearse en el sistema de traducción de una célula para incorporar un aminoácido no natural in vivo en un polipéptido (proteina) de interés. Por ejemplo, esto puede proporcionar mutagénesis de aminoácido no natural específica de sitio; u opcionalmente, el mutagénesis de aminoácido no natural aleatorio. El tRNA ortogonal suministra el aminoácido no natural en respuesta a un codón selector y la sintetasa ortogonal de preferencialmente aminoacila un tRNA ortogonal con el aminoácido no natural . La 0-RS no aminoacila eficientemente el tRNA ortogonal con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes . También se proporcionan métodos para producir e identificar pares ortogonales .

[0107] La incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. Un codón selector, por ejemplo un codón único, se introduce en un gen de interés . El gen se transcribe en mRMA y la traducción convencional empieza en el ribosoma. Las sintetasas endógenas aminoacilan tRNAs endógenos con aminoácidos naturales (aa) en la presencia de ATP. Un tRNA ortogonal se aminoacila enzimáticamente por una sintetasa ortogonal con un aminoácido no natural en la presencia de ATP. Cuando el ribosoma encuentra un codón selector, un tRNA ortogonal, que se modifica para contener un anticodón selector, por ejemplo un anticodón único, es capaz de decodificar la mutación como un aminoácido no natural y la traducción procede al producto de longitud íntegra con el aminoácido no natural incorporado .

[0108] Aminoacil tRNA sintetasa, Ortogonal O-RS

[0109] A fin de incorporar específicamente un aminoácido no natural in vivo, la especificidad del substrato de la sintetasa se altera de manera tal que sólo el aminoácido no natural deseado, pero no cualquiera de los 20 aminoácido comunes se cargan al tRNA. Si la sintetasa ortogonal es promiscua, resultará en proteínas mutantes con una mezcla de aminoácidos naturales y no naturales en la posición objetivo. Por ejemplo, en un intento para incorporar específicamente en sitio p-F-Phe, un par de tRNAPheCUA/fenilalanil-tRNA sintetasa supresor ámbar de levadura, se utiliza en una cepa de Escherichia coli auxotrópica Phe resistente a p-F-Phe. Ver por ejemplo, R. Furter, Protein Sci . , 7:419 (1998). Debido a que PheRS de levadura no tiene alta especificidad de substrato para p-F-Phe, el sitio de mutagénesis se traduce con 64-75% p-F-Phe y el resto como Phe y Lys aún en el exceso de p-F-Phe agregado al medio de crecimiento. Además, las posiciones de codón Phe, se encontró 7% de p-F-Phe, indicando que el PheRS de Escherichia coli endógeno incorpora p-F-Phe además de Phe. Debido a su infidelidad de traducción, este enfoque en general no es aplicable a otros aminoácidos no naturales. Se espera que fuera difícil la modificación de la especificidad del substrato de una sintetasa debido, a la alta fidelidad intrxnsica de las sintetasas naturales, y al hecho de que no se requieren aminoácidos no naturales para cualquier función celular. La presente invención resuelve este problema y proporciona composición de, y métodos para, generar sintetasas que tienen especificidad de substrato modificada, tal como aminoácido no natural. Utilizando los componentes de la presente invención, la eficiencia de incorporación de un aminoácido no natural es, por ejemplo, mayor a aproximadamente 75%, mayor a aproximadamente 85%, mayor a aproximadamente 95%, mayor a aproximadamente 99% o más.

[0110] Las composiciones de la presente invención incluyen una amino acil-tRNA sintetasa ortogonal (0-RS) , en donde 0-RS de preferencia aminoacilan un tRNA ortogonal (0-tR A) con un aminoácido no natural, opcionalmente in vivo. En una modalidad, la 0-RS comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4-34 (ver, Tabla 5) y su secuencia polinucleótido complementaria. En otra modalidad, la 0-RS tiene propiedades enzimáticas mejoradas, por ejemplo la es menor, la kcat es superior, el valor de kCat/km es superior o semejante, para el aminoácido no natural en comparación con un aminoácido de origen natural, por ejemplo uno de los 20 aminoácido conocidos. Las secuencias de moléculas 0-tRNA y 0-RS ejemplares pueden encontrarse en el Ejemplo 10.

[0111] Métodos para producir un O-RS se basan en generar un conjunto de sintetasas mutantes del bastidor o de la estructura de una sintetasa de tipo silvestre, y luego seleccionar RSs mutadas con base en su especificidad por un aminoácido no natural respecto a los veinte comunes. Para aislar esta sintetasa, los métodos de selección de la presente invención son: (i) sensibles, en cuanto a la actividad de las sintetasas deseadas desde las vueltas iniciales pueden ser bajas y la población pequeña; (ii) "operable", ya que es conveniente el variar lo estricto de la selección a diferentes vueltas de selección; y (iíi) general, de manera tal que puede emplearse para aminoácidos no naturales diferentes.

[0112] La presente invención proporciona métodos para generar un aminoacil tRNA sintetasa ortogonal al mutar la sintetasa, por ejemplo en el sitio activo en la sintetasa, en el sitio de mecanismo de edición en la sintetasa, en diferentes sitios al combinar diferentes dominios de sintetasas, o semejantes y aplicar un proceso de selección. La Figura 2, Panel A ilustra esquemáticamente una estrategia de tamizado/selección in vivo, que se basa en la combinación de una selección positiva seguido por una selección negativa. En la selección positiva, la supresión del codón selector introducido en una o varias posiciones no esenciales de un marcador positivo, permite que células sobrevivan bajo presión de selección positiva. En la presencia tanto de aminoácidos naturales como no naturales, los supervivientes de esta manera codifican sintetasas activas cargando el tRNA supresor ortogonal ya sea con un aminoácido natural o no natural . En la selección negativa, la supresión de un cod n selector introducido en una o varias posiciones no esenciales de un marcador negativo retira sintetasas con especificidades de aminoácidos naturales . Supervivientes de la selección negativa y positiva codifican sintetasas que aminoacilan (cargan) el tRNA supresor ortogonal con aminoácidos no naturales solamente . Estas sintetasas luego pueden someterse a mayor mutagenesis, por ejemplo DNA mezclado u otros métodos de mutagénesis recursiva. Por supuesto, en otras modalidades, la invención opcionalmente puede utilizar diferentes órdenes de etapas para identificar (por ejemplo O-RS, O-tRNA, pares, etc.), e.t., tamizado/selección negativa seguido por tamizado/ selección positiva o viceversa o cualquiera de estas combinaciones .

[0113] Por ejemplo, ver, Figura 2, Panel B. En Figura 2, Panel B, un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, se coloca en un gen reportero, por ejemplo un gen de resistencia a antibiótico, tal como beta-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo, TAG. Este se coloca en un vector de expresión con miembros de la biblioteca RS mutada. Este vector de expresión junto con un vector de expresión con un tRNA ortogonal, por ejemplo un tRNA supresor ortogonal, se introducen en una célula, que se desarrolla en la presencia de un agente de selección, por ejemplo medio antibiótico, tal como ampicilina. Sólo si la sintetasa es capaz de aminoacilar (cargar) el tRNA supresor con algún aminoácido, el codón selector se decodifica permitiendo supervivencia de la célula en medio antibiótico.

[0114] Aplicar esta selección en la presencia del aminoácido natural, los genes sintetasa que codifican sintetasas; que tienen alguna habilidad para aminoacilar se eligen separando de aquellas sintetasas que no tienen actividad. El conjunto resultante de sintetasas puede cargar cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural o el aminoácido no natural . Para seleccionar adicionalmente aquéllas sintetasas que cargan exclusivamente el aminoácido no natural, se aplica una segunda selección, por ejemplo una selección negativa. En este caso, un vector de expresión que contiene un marcador de selección negativo, y un O-tRNA se utiliza, junto con un vector de expresión que contiene un miembro de la biblioteca RS mutada. Este marcador de selección negativo contiene al menos un codón selector, por ejemplo TAG. Estos vectores de expresión se introducen en otra célula y se desarrollan sin aminoácidos no naturales, y opcionalmente un agente de selección, por ejemplo tetraciclina . En la selección negativa, aquellas sintetasas con especificidades para aminoácidos naturales cargan el tRNA ortogonal, resultando en supresión de un codón selector en el marcador negativo y muerte celular. Ya que no se agrega aminoácido no natural , sobreviven las sintetasas con especificidades por el aminoácido no natural. Por ejemplo, un codón selector, por ejemplo un codón de parada, se introduce en el gen reportero, por ejemplo un gen que codifica una proteína tóxica, tal como barnasa. Si la sintetasa es capaz de cargar el tRNA supresor en la ausencia del aminoácido no natural, la célula se exterminará al traducir el producto de gen tóxico. Los supervivientes que pasan tanto tamizados/selección codifican sintetasas cargando específicamente el tRNA ortogonal con un aminoácido no natural .

[0115] En una modalidad, los métodos para producir cuando menos una amino acil-tRNA sintetasa ortogonal (0-RS) incluyen: (a) generar una biblioteca de RSs mutante derivado de al menos una aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un primer organismo; (b) seleccionar la biblioteca de RSs mutante para miembros que aminoacilan un tR A ortogonal (O-tR A) en la presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs mutante activo; y, (c) seleccionar negativamente el conjunto para RSs mutantes activos que preferencialmente aminoacilan el 0-tR A en al ausencia del aminoácido no natural, de esta manera proporcionando la O-RS recombinante como mínimo; en donde la O-RS recombinante como mínimo de preferencia aminoacilan el 0-tRMA con el aminoácido no natural. Opcionalmente, se introducen más mutaciones por mutagénesis, por ejemplo mutagénesis aleatoria, recombinación o semejantes, en los genes de sintetasa selectos para generar una biblioteca de sintetasa de segunda generación, que se utiliza para adicionales vueltas de selección hasta que se evolucione una sintetasa mutante con actividad deseada. La 0-RSs recombinante producido por los métodos se incluyen en la presente invención. Como se explica a continuación, pares tRNA/sintetasa ortogonales de la invención también se generan opcionalmente al importar de un primer organismo en un segundo organismo.

[0116] En una modalidad, el RS es una RS inactivo. El RS inactivo puede generarse al mutar una RS activo. Por ejemplo, el RS inactivo puede generarse al mutar al menos aproximadamente 5 aminoácidos a diferentes aminoácidos, por ejemplo alanina.

[0117] La biblioteca de RSs imitantes pueden generarse utilizando varias técnicas de mutagénesis conocidas en la especialidad. Por ejemplo, RSs mutantes pueden generarse por mutaciones especificas de sitio, mutaciones de punto elatorio, recombinante homólogo in vit.ro, construcciones quiméricas o semejantes. En una modalidad, se introducen mutaciones en el sitio de edición de la sintetasa para dificultar el mecanismo de edición y/o alterar especificidad de substrato. Ver, por ejemplo, Figura 3 y Figura 4. La Figura 3 ilustra mutaciones especificas de sitio para generar bibliotecas dirigidas para análogos de tirosina. La Figura 4 ilustra una secuencia de consenso para selección de pentafluoro-fenilalanina para generar bibliotecas dirigidas para estos análogos . Bibliotecas de RSs mutantes también incluyen bibliotecas de sintetasa quiméricas, por ejemplo, bibliotecas de sintetasas de Methanococcus jannaschii/Escherichia coli quimérica. El dominio de una sintetasa puede agregarse o intercambiarse con un dominio de otra sintetasa. La Figura 5 ilustra esquemáticamente el transplante de un dominio, por ejemplo el dominio CPI, de un organismo por ejemplo Escherichia coli, a la sintetasa de otro organismo, por ejemplo TyrRS Methanococcus jannaschii. CPI puede transplantarse de TyrRS Escherichia coli a TyrRS de H. sapiens. Ver, por ejemplo Wakasugi, K. , y colaboradores, EMBO J. 17:297-305 (1998) . La Figura 6 ilustra esquemáticamente la construcción de sintetasas de Methanococcus jannaschii/Escherichia coli quiméricas y la Figura 7 ilustra esquemáticamente la generación de una biblioteca de sintetasas quiméricas, por ejemplo sintetasas de Methanococcus j nnaschii/Escherichia coli. Ver, por ejemplo, Sieber, y colaboradores Nature Biotechnology, 19:4,56-460 (2001). La biblioteca quimérica se tamiza por una variedad de propiedades, por ejemplo por miembros que se expresan y en cuadro, para miembros que carecen de actividad con una sintetasa deseada y/o para miembros que muestran actividad con una sintetasa deseada.

[0118] En una modalidad, la etapa de selección positiva incluye: introducir un marcador de selección positivo, por ejemplo un gen de resistencia antibiótico, o semejante, y la biblioteca de RSs mutante en una pluralidad de células, en donde el marcador de selección positivo comprende al menos un codón selector, por ejemplo un codón ámbar; desarrollar la pluralidad de células en la presencia de un agente de selecció ; seleccionar células que sobreviven en la presencia de un agente de selección al suprimir el codón selector como mínimo en el marcador de selección positivo, de esta manera proporcionando un conjunto de células selectas positivamente que contienen el conjunto de RSs mutante activo. Opcionalmente, la concentración de agente de selección puede variarse.

[0119] En una modalidad, la selección negativa incluye: introducir un marcador de selección negativo con el conjunto de RSs mutantes activos, de la selección positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de selección negativo es un gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo un gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , que comprende cuando menos un codón selector; y seleccionar células que sobreviven en un primer medio suplementado con el aminoácido no natural y un agente de selección, pero fallan en sobrevivir un segundo medio no suplementado con el aminoácido no natural y el agente de selección, de esta manera proporcionando células supervivientes con la O-RS recombinante como mínimo. Opcionalmente, la concentración del agente de selección se varía.

[0120] El 1er y 2do medios descritos anteriormente pueden incluir, por ejemplo, un método de placa de réplica directa. Por ejemplo, después de pasar la selección positiva, se desarrollan células en la presencia ya sea de ampicilina o cloranfenicol y la ausencia del aminoácido no natural . Aquéllas células que no sobreviven se aislan de una placa de réplica suplementada con el aminoácido no natural . Se requiere que no haya transformación en una segunda cepa de selección negativa, y el fenotipo se conozca. Comparado con otros marcadores de selección potenciales, una selección positiva con base en resistencia a antibiótico ofrece la capacidad para ajusfar lo estricto de la selección al variar la concentración del antibiótico, y para comparar la eficiencia de supresión al supervisar las células de concentración antibiótica más alta que puedan sobrevivir. Además, el proceso de crecimiento también es un procedimiento de enriquecimiento. Esto puede conducir a una rápida acumulación del fenotipo deseado .

[0121] En otra modalidad, la selección negativa del conjunto para RSs mutante activo incluye: aislar el conjunto de RSs mutante activo de la etapa de selección positiva (b) ; introducir una marcador de selección negativo, en donde el marcador de selección negativo es un gen marcador tóxico, por ejemplo un gen ribonucleasa barnasa, que comprende cuando menos un codón selector, y el conjunto de RSs mutante activo en una pluralidad de células de un segundo organismo; y seleccionar células que sobreviven en un primer medio no suplementado con el aminoácido no natural, pero fallan en sobrevivir en un segundo medio suplementado con el aminoácido no natural, de esta manera proporcionando células supervivientes con la O-RS recombinante como mínimo, en donde O-RS recombinante como mínimo es específico para el aminoácido no natural. Opcionalmente, el marcador de selección negativo comprende dos o más codones selectores .

[0122] En un aspecto, la selección positiva se basa en supresión de un codón selector en un marcador de selección positivo, por ejemplo un gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que comprende un codón selector, por ejemplo un codón de parada ámbar, en el gen CAT, de manera tal que puede aplicarse cloranfenicol como la presión de selección positiva. Además, el gen CAT puede emplearse tanto como un marcador positivo como un marcador negativo como se describe aquí en la presencia y ausencia de aminoácido no natural. Opcionalmente, el gen CAT comprende un codon selector se utiliza para la selección positiva y un marcador de selección negativo, por ejemplo, un marcador tóxico, tal como un gen barnasa que comprende al menos uno o más codones selectores, se emplea para la selección negativa.

[0123] En otro aspecto, la selección positiva se basa en supresión de un codón selector en posición no esencial en el gen beta-lactamasa, haciendo a las células resistentes a ampicilina; y se emplea una selección negativa utilizando la ribonucleasa barnasa como el marcador negativo. En contraste a beta-lactamasa, que se secreta en el periplasma, CAT se localiza en el citoplasma; aún más, la ampicilina es bacteriocida, mientras que el cloranfenicol es bacterioestático .

[0124] La O-RS recombinante además puede mutarse y seleccionarse. En una modalidad, los métodos para producir al menos una aminoacil tR A sintetasa ortogonal recombinante (0-RS) además pueden comprender: (d) aislar la O-RS recombinante como mínimo; (e) generar un segundo conjunto de O-RS mutado derivado día O-RS recombinante como mínimo; y (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtiene un O-RS mutado que comprende una capacidad por aminoacilanr preferencialmente el O-tRNA. Opcionalmente, se repiten las (d) - (f) , por ejemplo, al menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el Segundo juego de O-RS mutado puede generarse por mutagénesis, por ejemplo mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de los mismas .

[0125] Lo estricto de las etapas de selección, por ejemplo la etapa de selección positiva (b) , la etapa de selección negativa (c) o ambas etapas de selección positiva y negativa (b) y (c) , en los métodos anteriormente descritos, incluyen opcionalmente variar lo estricto de la selección. Por ejemplo, debido a que la barnasa es una proteína extremadamente tóxica, lo estricto de la selección negativa puede controlarse al introducir diferentes números de codones selectores en el gen barnasa. En un aspecto de la presente invención, lo estricto se varía, debido a que la actividad deseada puede ser baja durante las primeras vueltas. De esta manera, se aplican criterios de selección menos estrictos en las primeras vueltas y criterios más estrictos se aplican en vueltas posteriores de selección.

[0126] Otros tipos de selecciones pueden emplearse en la presente invención por ejemplo par O-RS, 0-tRNA, y par O-tRNA/O-iíS. Por ejemplo, la etapa de selección positiva (b) , la etapa de selección negativa (c) o ambas etapas de selección positiva y negativa (b) y (c) pueden incluir utilizando un reportero, en donde el reportero se detecta por identificación de célula activada por fluorescencia (FACS = fluorescence-activated cell sorting) . Por ejemplo, puede realizarse una selección positiva primero con un marcador de selección positivo, por ejemplo gen cloranfenicol acetxltransferasa (CAT) , en donde el gen CAT comprende un codón selector, por e emplo un codón de parada ámbar, en el gen CAT, que es seguido por un tamizado de selección negativa, que se basa en la incapacidad de suprimir codón(es) selector (es) , por ejemplo dos o más en las posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo gen T7 RNA polimerasa. En una modalidad, el marcador de selección positivo y el marcador de selección negativo pueden encontrarse en el mismo vector, por ejemplo plásmido. Expresión del marcador negativo elige la expresión del reportero, por ejemplo proteína fluorescente verde (GFP = green fluorescent protein) . Lo estricto de la selección y tamizado puede variarse, por ejemplo la intensidad de la necesidad de luz a la fluorescencia del reportero puede variarse. En otra modalidad, una selección positiva puede realizarse con un reportero como marcador de selección positivo, que se tamiza por FACs, seguido por un tamizado de selección negativa, que se basa en la incapacidad por suprimir codón(s) selector (s), por ejemplo dos o más en las posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo un gen barnasa.

[0127] Opcionalmente, el reportero se exhibe en una superficie celular, por ejemplo en un exhibidor de fago o semejante. La exhibición de superficie celular, por ejemplo el sistema de exhibición de superficie-célula basada en OmpA, se basa en la expresión de un epítope particular, por ejemplo un péptido poliovirus C3 fusionado a una porina de membrana exterior OmpA, en la superficie de la célula de Escherichia coli. El epítope se exhibe en la superficie celular sólo cuando un codón selector en el mensaje de proteína se suprime durante traducción. El péptido exhibido luego contiene el aminoácido reconocido por una de las aminoacil-tRNA sintetasas mutantes en la biblioteca, y la célula que contiene el gen sintetasa correspondiente puede aislarse con anticuerpos desarrollados contra péptidos que contienen aminoácidos no naturales específicos . El sistema de exhibición de superficie-celular basada en OmpA se desarrolló y optimizó por Georgiou y colaboradores, como una alternativa a exhibición de fago. Ver, Francisco, J. A., Campbell, R. , Iverson, B. L. & Georgoiu, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing afimctional antibody fragment on the external surface (Producción y el tamizado de células activadas por fluorescencia de Escherichia coli que expresa un f agmento de anticuerpo functional en la superficie externa) . Proc . Nati. Acad. Sel. U S A 90:10444-8 (1993).

[0128] Otras modalidades de la presente invención incluyen el llevar a cabo uno o más de las etapas de selección in vivo. El componente selecto, por ejemplo sintetasa y/o tRNA, pueden luego introducirse en una célula para utilizar en la incorporación in vivo de un aminoácido no natural .

[0129] tRNA Ortogonal

[0130] Composiciones de un tRNA ortogonal (0-tRNA) también es una característica de la invención, por ejemplo donde el 0-tRNA reconoce un codón selector y el 0-tRNA se aminoacila de preferencia con un aminoácido no natural por una aminoacil tRNA sintetasa ortogonal . En una modalidad, el 0-tRNA comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4-34 (ver, Tabla 5) y subsecuente de polinucléotido complentario.

[0131] Aquí se proporcionan los métodos para producir un tRNA ortogonal recombinante (0-tR A) . Por ejemplo, para mejorar la ortogonalidad de un tRNA mientras que conserva su afinidad hacia una RS deseado, los métodos incluyen una combinación de selecciones negativa y positiva con una biblioteca tRNA de supresor mutante en la ausencia y presencia de la sintetasa connato, respectivamente. Ver, Figura 8. En la selección negativa, se introduce un codón(s) selector (s) se introducen en un gen marcador, por ejemplo un gen tóxico, tal como barnasa, en una posición no esencial. Cuando un miembro de la biblioteca tRNA mutante, por ejemplo derivado de Methanococcus jannaschii , se aminoacila por el hospedero endógeno, por ejemplo sintetasas de Escherichia coli (es decir no es ortogonal al hospedero o huésped, por ejemplo sintetasas de Escherichia coli) , el codón selector, por ejemplo un codón ámbar, se suprime y el producto de gen tóxico producido lleva a muerte celular. Células que alojan tRNAs ortogonales o tRNAs no funcionales sobreviven. Los sobrevivientes luego se someten a selección positiva en donde un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, se coloca en un gen marcador positivo, por ejemplo un gen de resistencia a droga, tal como un gen beta-lactamasa .

Estas células- también contienen un vector de expresión con una RS connato. Estas células se desarrollan en la presencia de un agente de selección, por ejemplo ampicilina. tRAs luego se eligen por su habilidad por aminoacilarse por la sintetasa connato coexpresada y para insertar un aminoácido en respuesta a este codón selector. Células que alojan tRNAs no funcionales, o tRNAs que no pueden reconocerse por la sintetasa de interés, son sensibles al antibiótico. Por lo tanto, tRNAs que: (i) no son substratos para un hospedero endógeno, por ejemplo Escherichia col!, sintetasas; (ii) pueden ser aminoaciladas por la sintetasa de interés; y (iii) son funcionales en supervivencia de traducción de ambas selecciones .

[0132] Los métodos para producir un O-tRNA recombinante incluyen: (a) generar una biblioteca de tRNAs mutantes derivados de al menos un tRNA, por ejemplo un tRNA supresor, de un primer organismo; (b) selecciona negativamente la biblioteca para tRNAs mutantes que son aminoacilados por una aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs mutantes; y (c) seleccionar el conjunto de tRNAs mutantes de miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida (O-RS) , de esta manera proporcionando al menos un O-tRNA recombinante; en donde el O-tRNA recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce eficientemente por el RS del segundo organismo ? de preferencia se aminoacila por la O-RS . En una modalidad, el O-tRNA recombinante posee una mejora de ortogonalidad.

[0133] Se construyen bibliotecas de tR A mutante . Ver, por ejemplo, Figura 9. Las mutaciones pueden introducirse en una o varias posiciones especificas, por ejemplo en una o varias posiciones no conservativas, o en una posición conservativa, en una o varias posiciones aleatorizadas o una combinación tanto de un bucle deseado de un tRNA, por ejemplo un bucle anticodón, (brazo D, bucle V, brazo TphiC) o una combinación de bucles o todos los bucles. Bibliotecas quiméricas de tRNA también se incluyen en la presente invención. Habrá de notarse que bibliotecas de tRNA sintetasas de diversos organismos (por ejemplo microorganismos tales como eubacteria o arquebacteria) tales como bibliotecas que comprenden diversidad natural (tales como bibliotecas que comprenden diversidad natural (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 6,238,884 otorgada a Short y colaboradores, y las referencias de ahí, la patente de los E.U.A. No. 5,756,316 otorgada a Schallenberger y colaboradores; la patente de los E.U.A. No. 5,783,431 otorgada a Petersen y colaboradores; la patente de los E.U.A. No. 5,824,485 otorgada a Thompson y colaboradores; y la patente de los E.U.A. No. 5,959,572 otorgada a Short y colaboradores) , se construyen opcionalmente y tamizan para pares ortogonales.

[0134] En una modalidad, el seleccionar en forma negativa la biblioteca para tRNAs mutantes que son aminoacilados por una aminoacil-tRNA sintetasa (etapa (b) anterior) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el gen marcador tóxico comprende cuando menos uno de codones selectores y la biblioteca de tRNAs mutantes en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes, en donde las células supervivientes contienen el conjunto de tRNAs mutantes que comprenden al menos un tRNA ortogonal o tRNA no funcional. Por ejemplo, el gen marcador tóxico es opcionalmente un gen ribonucleasa barnasa, en donde el gen ribonucleasa barnasa comprende al menos un codón ámbar. De manera opcional, el gen ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar. Las células supervivientes pueden seleccionarse por ejemplo al utilizar un ensayo de densidad celular con proporción de comparación .

[0135] En una modalidad, el seleccionar el conjunto de tRNAs mutantes para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (0-RS) introducido, pueden incluir: introducir un gen marcador de selección positivo, en donde el gen marcador de selección positivo comprende un gen de resistencia a droga, por ejemplo un gen beta-lactamasa, que comprende cuando menos uno de los codones selectores, por ejemplo un gen beta-lactamasa que comprende al menos un codón de parada ámbar, la O-RS y el conjunto de tRNAs mutantes en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes ' desarrolladas en la presencia de un agente de selección, por ejemplo un antibiótico, de esta manera proporcionando un conjunto de células que poseen el tRNA recombinante como mínimo, en donde el tRNA recombinante se aminoacila por la O-RS e inserta un aminoácido en un producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a los codones selectores como mínimo. En otra modalidad, la concentración del agente de selección se varía. En la presente invención se incluyen 0-tRNAs recombinantes producidos por los métodos .

[0136] Como se describió anteriormente para generar O-RS, lo estricto de las etapas de selección puede variarse. Además, otros procedimientos de selección/tamizado, que se describen aquí, tales como FACs, exhibición de fago y célula también pueden emplearse .

[0137] Codones Selectores

[0138] Los Codones selectores de la presente invención se expanden el marco de códigos genéticos de la maquinaria biosintética de proteína. Por ejemplo, un codón selector incluye por ejemplo un codón de tres bases único, un codón no sentido, tal como un codón de parada, por ejemplo un codón ámbar o un codón ópalo, un codón no natural, un codón de base cuatro (o más) o semejantes. Un número de codones selectores puede introducirse en un gen deseado, por ejemplo uno o más, dos o más, más de tres, etc. Adicionalmente, se apreciará que múltiples aminoácidos no naturales diferentes (o similares o idénticos) de esta manera pueden incorporarse en forma precisa en aminoácidos (es decir a través del uso de múltiples codones selectores) .

[0139] Los 64 codones genéticos codifican 20 aminoácidos y 3 codones de parada. Debido a que sólo un codón de parada se requiere para terminación de traducción, los otros dos pueden en principio emplearse para codificar aminoácidos no proteinogénicos . El codón de parada ámbar, UAG, se ha empleado exitosamente en sistemas biosintéticos in vitro y oocitos Xenopus para dirigir la incorporación de aminoácidos no naturales. Entre los 3 codones de parada, UAG es el codón de parada menos empleado en Escherichia coli . Algunas cepas de Escherichia coli contienen tRNAs supresores naturales, que reconocen UAG e insertan un aminoácido natural en respuesta a UAG. Además, estos tRNAs supresores ámbar se han empleado ampliamente en mutagénesis de proteína convencional . Diferentes especies preferencialmente utilizan diferentes codones por sus aminoácidos naturales, · estos se utilizan opcionalmente de manera preferencial para diseñar/seleccionar los presentes codones selectores .

[0140] Aunque aquí se discute con referencia a aminoácidos no naturales, se apreciará que una estrategia similar puede emplearse para incorporar un aminoácido natural en respuesta a un codón selector particular. Esto es, una sintetasa puede modificarse para cargar un aminoácido natural en un tRNA ortogonal que reconoce un codón selector en una forma similar a la carga de un aminoácido no natural como se describe completamente .

[0141] En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de aminoácidos no naturales in vivo. Por ejemplo, se genera un 0-tR A que reconoce el codón de parada, por ejemplo UAG, y se aminoacila por un 0-RS con un aminoácido no natural deseado. Este 0-tR A no se reconoce por las aminoacil-tRNA sintetasas de origen natural . La mutagénesis dirigida de sitio convencional puede emplearse para introducir el codón de parada, por ejemplo, TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver por ejemplo, Sayers, J. R. , Schmidt, W. Eckstein, F. 51, 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagénesis (5' ,3' Exonucleasa en mutagénesis dirigida por oligonucleótido de base fósforotioato) . Nucleic Acids Res, 791-802 (1988) . Cuando la 0-RS, 0-tRNA y el gen mutante se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar una proteína que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada.

[0142] La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede realizarse sin perturbación significante del hospedero, por ejemplo Escherichia coli . Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el O-tRNA, por ejemplo el tRNA supresor ámbar, y el factor de liberación 1 {RSl) (que liga al codón UAG e inicia liberación del péptido de crecimiento del ribosoma) , la eficiencia de supresión puede modularse, por ejemplo ya sea al incrementar el nivel de expresión de O-tRNA, por ejemplo el tRNA supresor o utilizar una cepa deficiente RSl. Adicionalmente , la eficiencia de supresión y absorción de aminoácido no natural al llevar a cabo mutagénesis aleatoria en un organismo o en una porción de un genoma de organismo y realizar selección adecuada utilizando, por ejemplo, uno de los sistemas reporteros aguí descritos .

[0143] Aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando la concentración de arginina en una reacción de, síntesis de proteína in vivo se reduce, el codón de arginina raro, AGG, ha demostrado que es eficiente para inserción de Ala por un tRNA sintético acilado con una alanina. Ver por ejemplo, C. H. a, W. Kudlicki, 0. W. Odom, G. Kramer y B. Hardesty, Biochemistry (Bioquímica) 32:7939 (1993). En este caso, el tRNA sintético compite con el tRNAArg de origen natural, que existe como una especie menor en Escherichia coli. Algunos organismos no utilizan todos los codones tripletes . Un codón no asignado AGA en Micrococcus luteus se ha utilizado para inserción de aminoácidos en un extracto de traducción/transcripción in vitro. Ver por ejemplo, A. K. Kowal y J. S. Oliver, Nucí. Acid. Res., 25; 4585 (1997) . Componentes de la presente invención pueden generare para utilizar estos codones raros in vivo.

[0144] Codones selectores también comprenden cuatro o más codones base, tales como cuatro, cinco, seis o más . Ej emplos de cuatro codones base incluyen por ejemplo, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y semejantes. Ejemplos de cinco codones base incluyen por ejemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y semejantes. Por ejemplo, en la presencia de O-tR As mutados, por ejemplo un tRHAs supresor de cambio de marco de lectura especial, con bucles anticodón, por ejemplo con al menos bucles anticodón de 8-10 nt, los cuatro o más codones base se leen como un solo aminoácido. En otras modalidades, los bucles anticodón pueden decodificar, por ejemplo al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de seis bases o más. Ya que hay 256 posibles codones de cuatro bases, pueden codificarse múltiples aminoácidos no naturales en la misma célula utilizando el codón de cuatro o más bases.

Ver también, J. Christopher Anderson y colaboradores, Exploring the Limits of Codon and Anticodón Size (Explorando los Límites del Tamaño de Codón y Anticodón) , Chemistri and Biology (Química y Biología) , Vol . 9, 237-244 (2002) ; Thomas J. Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli (Expansión del Código Genético: Selección de Supresores Eficientes de Codones de Cuatro Base e Identificación de Codones de Cuatro Base "mezcladas" con un Enfoque de Biblioteca en Escherichia Coli), J. Mol. Biol . 307: 755-769 (2001).

[0145] Los métodos de la presente invención incluyen utilizar codones extendidos con base en supresión de cambio de marco de lectura. Codones de cuatro o más base pueden insertar, por ejemplo uno o múltiples aminoácidos no saturados en la misma proteína. Por ejemplo, codones de cuatro base se han empleado para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas utilizandos métodos biosintéticos in vivo. Ver por ejemplo, C. H. Ma, W. Kudlicki, 0. . Odom, G. Kramer y B. Hardesty, Biochemistry (Bioquímica) , 1993, 32,7939 (1993); y, T. Hohsaka, D. Kajihara, Y. Ashizuka, H. Murakami and M. Sisido, J. Am. Chem. Soc, 121:34 (1999).

CGGG y AGGU se emplearon para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavilina in vitro con dos tRNAs supresores de cambio de marco de lectura típicamente acilados. Ver, por ejemplo T. Hohsaka, Y. Ashizuka, R Sasald, H. Murakami y A Sisido, J. Am. Chem. Soc. 121:12194 (1999). En un estudio in vivo, Moore y colaboradores examinaron la capacidad de derivados de tRNALeu con anticodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G, o C) , y encontraron que el cuadruplete UAGA puede decodificarse por tRNALeu con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con poca descodificación en el cuadro 0 o -1. Ver, B. Moore, B. C. Persson, C. C. Nelson, R. P. Gesteland y J. F. Atkins, J. Mol. Biol . , 298:195 (2000). En una modalidad, codones extendidos con base en codones ragos o codones no sentidos pueden emplearse en la presente invención, que pueden reducir lectura de mil y supresión de cambio de marco de lectura en sitios no deseados .

[0146] También puede emplearse un sistema de derivación de traducción para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido diseñado. En un sistema de derivación de traducción, una gran secuencia se inserta en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una guia para inducir el ribosoma a saltar sobre la secuencia y reanudar la traducción corriente abajo la inserción.

[0147] En forma alterna, o en combinación con otros métodos descritos anteriormente para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido, puede emplearse un sistema de transición y traducción. Este sistema involucra un molécula denominada tmRNA presente en Escherichia coli. Esta molécula de RNA se relaciona estructuralmente con una alanil tRNA y se aminoacila por la alanil sintetasa. La diferencia entre mRNA y tRNA es que el bucle anticodón se reemplaza con una gran secuencia especial . Esta secuencia permite que el ribosoma reanude la traducción en secuencias que se han estancado utilizando un cuadro de lectura abierto codificado dentro del tmRNA como plantilla. En la presente invención, un tmRMA ortogonal puede generarse que se aminoacila preferencialmente con una sintetasa ortogonal y carga con un aminoácido no natural . Al transcribir un gen por el sistema, el ribosoma tallo en un sitio especifico; el aminoácido no natural se introduce en este sitio y la traducción se reanuda utilizando la secuencia codificada dentro del tmRNA ortogonal .

[0148] Los codones selectores también incluyen opcionalmente pares base no naturales . Estos pares base no naturales se expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par base extra incrementa el número de codones triplefce de 64 en 125. Propiedades de terceros pares base incluyen estables y selectivos, incorporación enzimática eficiente en DNA con alta fidelidad por un polimerasa, y la extensión de cebador continuo eficiente después de síntesis del par base no natural naciente . La descripción de pares base no naturales que pueden adaptarse para métodos y composiciones incluyen por ejemplo, Hirao, y colaboradores, "An amino acid no naturall base pair for incorporating amino acid analogues into protein" (Un par base no natural de incorporar análogos de aminoácido en proteína) , Nature Biotechnology, 20:177-182 (2002). Otras publicaciones se enlistan a continuación.

[0149] Para uso in vivo, el nucleócido no natural es permeable a membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no se destruye por enzimas celulares. Los esfuerzos previos por Benner y otros aprovecharon patrones de enlace de hidrógeno que son diferentes de aquellos en pares Watson-Crick genómicos, el ejemplo más notable del cual es el par iso-C: iso-G. Ver por ejemplo, C. Switzer, S. E. oroney y S. A. Benner, J . Am . Chem . Soc . , 111:8322 (1989); y, J. A. Piccirilli, T. rauch, S. E. Moroney y S. A. Benner, Nature , 1990, 343:33 (1990); y E. T. Kool, Curr. Qpin. Chem. Biol . , 4:602 (2000). Estas bases en general mil en cierto grado con las bases naturales y no pueden replicarse enzimáticamente . Kool y colaboradores, demostraron que interacciones de empaque hidrofóbico entre bases pueden reemplazar uniones de hidrógeno para desplazar la formación de par base. Ver, E. T. Kool, Curr. Qpin. Chem. Biol., 4:602 (2000); y K. M. Guckian y E. T. Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Enal . , 36, 2825 (1998) . En un esfuerzo por desarrollar un par base no natural que satisface todos los anteriores requerimientos, Schultz, Romesberg y colaboradores, han sintetizado sistemáticamente y estudiado una serie de bases hidrofóbicas no naturales. El auto-par PICS:PICS que se ilustra en la Figura 10, se encuentra que es más estable que los pares base naturales, y puede incorporarse eficientemente en DNA por el fragmento pleno de DMA polimerasa I Escherichia coli (KF) . Ver por ejemplo, D. L. McMinn, A. K. Ogawa, Y. Q. Wu, I Q. Liu, P. G. Schultz y F. E. Romesberg. J. Am. Chem. Soc.. 121-11586 (1999) ; y, ?. . Osawa, Y. Q. Wu, D. L. McMinn, J. Q. Liu, P. G. Schultz y F. E. Romesberg, I Ana. Chem. Soc . , 122:3274 (2000) . Un auto-par 3 W.-3N4N puede sintetizarse por KF con eficiencia y selectividad suficiente para función biológica. Ver por ejemplo, A. K. Oga a, Y. Q. Wu, M. Berger, P. G. Schultz y R E. Romesberg, J. Am. Chem. Soc . , 122:8803 (2000). Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para mayor replicación. Una DNA polimerasa mutante se ha desarrollado recientemente que puede utilizarse para replicar el auto par PICS . Además, un auto-par 7AI puede replicarse utilizando una combinación de KP y pol de esta polimerasa. Ver por ejemplo, E. J. L. Tae, Y. Q. Wu, G. Xia, P. G. Schultz y R E. Romesberg, J. Am. Chem. Soc, 123:7439 (2001). Un par metalobase novedoso, Dipic:Py, también se ha desarrollaron que forma un par estable al ligar Cu (II) . Ver, E. Megge.RS, P. L. Holland, W. B. Tolman, R E. Romesberg y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc, 122:10714 (2000) . Debido a que codones extendidos y codones no naturales son intrínsicamente ortogonales a codones naturales, los métodos de la presente invención pueden aprovechar esta propiedad para generar tRNAs ortogonales para ellos.

[0150] tRNA ortogonal y pares aminoacil-tRNA sintetasa ortogonales

[0151] Un par ortogonal está compuesto por un O-tRNA, por ejemplo un tRNA supresor, un tRNA de cambio de marco de lectura o semejantes y un O-RS: Como se describió anteriormente, el O-tRNA no se acila por sintetasas endógenas y es capaz de decodificar un codón selector. La O-RS reconoce el O-tRNA, por ejemplo con un bucle anticodón extendido, y de preferencia aminoacila el O-tRNA con un aminoácido no natural. En la presente invención se incluyen métodos para generar pares ortogonales junto con composiciones de pares ortogonales. El desarrollo de múltiples pares t-RNA/sintetasa ortogonales puede permitir la incorporación simultánea de múltiples aminoácidos no naturales utilizando diferentes codones en el mismo polipéptido/proteína.

[0152] En la presente invención, métodos y composiciones relacionadas, se refieren a la generación de pares ortogonales (O-tRNA/O-RS) que pueden incorporar un aminoácido no natural en una proteína, in vivo. Por ejemplo, composiciones de O-tRNAs de la presente invención pueden comprender una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal (O-RS) . En una modalidad, O-tRNA y O-RS pueden ser complementarios, por ejemplo un par O-tRNA/0-RS ortogonal. Ejemplos de pares incluyen un par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como un par mutRNATyr-SS12TyrRS , un par mutRNALeu-mutLeuRS , un par mutR AThr-mutT rRS, un par mutRNAGlu-mutGluRS o semejantes. En una modalidad, un par ortogonal de la presente invención comprende las propiedades deseadas del par tRNA-aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal y es diferente a mutR AGln-mutGlnRS derivado de Escherichia coli, un mutRNAAsp-mutAspRS derivado de levadura o un mutR APheCUA-mutphcnlalaninaRS de levadura, en donde estos pares no poseen las propiedades de los pares de la presente invención.

[0153] 0-tR A y 0-RS pueden derivarse por mutación de un tR A y/o RS de origen natural de una variedad de organismos, que se describen bajo fuentes y hospederos. En una modalidad, 0-tRNA y 0-RS se derivan de al menos un organismo. En otra modalidad, 0-tRNA se deriva por mutación de un tRNA de origen natural mutado o de origen natural, de un primer organismo y la O-RS se deriva por mutación de una RS de origen natural o de origen natural mutado de un segundo organismo.

[0154] En la presente invención también se proporcionan los métodos para generar pares O-tRNA/O-RS específicos . Estos métodos resuelven los problemas discutidos a continuación para las otras estrategias que se intentaron para generar pares tR A/RS ortogonales. Específicamente, métodos de la presente invención incluyen: (a) generar una biblioteca de tRAs mutantes derivados de al menos un tRNA de un primer organismo; (b) seleccionar negativamente la biblioteca de los tRNAs mutantes que se aminoacilan por aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs mutantes; (c) seleccionar un conjunto de tRNAs mutantes para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducido (O-RS) , de esta manera proporcionando al menos un 0-tRNA recombinante . El O-tRNA recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no es reconocido eficientemente por el RS del segundo organismo y se aminoacila preferencialmente por la O-RS. El método también incluye : (d) generar una biblioteca de RSs mutantes derivados de al menos una aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar la biblioteca de RSs mutantes para miembros que preferencialmente aminoacilan al menos el 0-tRNA recombinante en la presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs mutantes activos; y, (f) seleccionar en forma negativa el conjunto para RSs mutantes activos que aminoacilan preferencialmente en O-tRNA recombinante como mínimo en la ausencia del aminoácido no natural, de esta manera proporcionando el par O-tRNA/O-RS específico como mínimo, en donde el par O-tRNA/O-RS específico como mínimo comprende al menos un O-RS recombinante que es específico para el aminoácido no natural y el O-tRNA recombinante como mínimo. También se incluyen pares producidos por los métodos de la presente invención.

[0155] Previamente, se intentó la generación de un par tRNA/sintetasa ortogonal a partir de un par tRNA/sintetasa de Escherichia col!. El método involucra eliminar la afinidad de tRNA hacia su sintetasa connato al mutar nucleótidos en la intersfase tRNA-sintetasa, mientras que conserva su ortogonalidad a otras sintetasas y su capacidad para funcionar en traducción. Utilizando la sintetasas de tipo silvestre connato como plantilla de partida, una sintetasa mutante luego se desarrolla o se desprende que reconoce en forma única el tRNA ortogonal de ingeniería. Con base en un análisis de la estructura cristalina de rayos-X de glutaminil-tRNA sintetasa (GlnRS) de Escherichia coli complejada con tRNAGln2, tres sitios ("perilla") en tRNAGln2 se identificaron que hacen contactos específicos con GlnRS. Ver por ejemplo, D. R. Liu, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Chem. Biol . , 4:S85 (1997) ; y, D. R. liu, T. J. Magliery, . Pastmak y P. G. Schultz, Proc. Nati. Acad, Sci . U S A, 94:10092 (1997). Estos sitios se mutaron en el tRNA, y los tR As supresores mutantes que contienen todas las combinaciones posibles de perilla 1, 2, y 3 se generaron y probaron individualmente por una aminoacilación in vitro con GlnRS y supresión in vi tro de mutantes ámbar de corismato mutasa. Un tRNA mutante (O-tRNA) que contiene todas las tres mutaciones perilla, se muestra que es ortogonal a todas las sintetasas de Escherichia coli endógenas y competencia en traducción. A continuación, múltiples vueltas de DNA mezclado junto con mutagénesis dirigida por oligonucleótido se emplearon para generar bibliotecas de GlnRS mutantes . Estas enzimas mutantes se seleccionaron por su capacidad para acilar el O-tRNA in vivo utilizando las cepas de Escherichia coli BT235. Sólo si un GlnRS mutante carga el O-tRNA con glutamina puede suprimirse el codón ámbar genómico en lacZ, permitiendo que células BT235 se desarrollen en medio mínimo de lactosa. Varias sintetasas mutantes que sobreviven cada vuelta de selección se purificaron y ensayaron in vitro. La proporción de acilación tRNAGln de tipo silvestre ( t = wild-type) a acilación O-tRNA por sintetasa mutante disminuye significativamente ante múltiples vueltas de selección. Sin embargo, no se han desprendido GlnRS ' s de Escherichia coli rautantes que carguen el O-tRNA más eficientemente que tRNAGln2 Escherichia coli de tipo silvestre. El mejor mutante desprendido después de varias vueltas de mezclado de DNA y selección acila O-tRNA sólo en un noveno de la velocidad de wt tRNAGln. Sin embargo, estos experimentos fallaron en producir un candidato de sintetasa con las propiedades deseadas, por ejemplo una sintetasa que no acila cualquier wt tRNA, ya que la mala acilación de un wt tRNA con un aminoácido no natural puede resultar en un fenotipo letal. Adem s, las mutaciones dentro del tRNA interactúan en formas complicadas, no aditivas con respecto tanto a aminoacilación como traducción. Ver, D. R. Liu, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Chem. Biol . , 14:685 (1997). De esta manera, típicamente se emplean métodos alternos para proporcionar un par funcional con las propiedades deseadas .

[0156] Una segunda estrategia para generar un par tRNA/sintetasa ortogonal involucra importar un par tRNA/sintetasa de otro organismo en Escherichia coli. Las propiedades del candidato sintetasa heterólogo incluyen, por ejemplo que no carga cualquier tRNA de Escherichia coli, y las propiedades del candidato tRNA heterologo incluyen, por ejemplo que no se acila por cualquier sintetasa de Escherichia coli. Además, el tRNA supresor derivado de tRNA heterologo es ortogonal a todas las sintetasas de Escherichia coli. Schimmel y colaboradores, reportaron que GlnRS Escherichia coli (EcGlnRS) no acila tRNAGln Saccharomyces cerevisiae (EcGlnRS carece un dominio de enlace RNA N-terminal que posee GlnRS de Saccharomyces cerevisiae (ScGlnRS) ) . Ver, E. F. Whelihan y P. Schimmel, EMBO J . , 16:2968 (1997) . El supresor tRNAGln ámbar de Saccharomyces cerevisiae (SctRNAGlnCUA) luego se analiza para determinar si también no es un substrato para EcGJnRS . Ensayos de aminoacilación in vi tro mostraron que este es el caso; y estudios de supresión in vitro mostraron que SctRNAGlnCUA es competente para traducción. Ver por ejemplo, D. R. Liu y P. G. Schultz, Proc . Nati. Acad. Sci. U S A, 96:4780 (1999). Además se mostró que ScGlnRS no acila cualquier tRNA de Escherichia coli, sólo el SctRNAGlnCUA in vivo. El grado al cual ScGlnRS es capaz de aminoacilar SctRNAGlnCUA en Escherichia coli también se evaluó utilizando un ensayo de complementación in vivo. Una mutación no sentido ámbar se introduce en un sitio permisivo en el gen beta-lactamasa . La supresión de la mutación por el tRNA supresor ámbar habrá de producir beta-lactamasa de longitud íntegra y conferir resistencia a ampicilina a la célula. Cuando sólo se expresa SctRNAGlnCUA, células exhiben una ICS0 de 20 µ /p?-! de ampicilina, indicando virtualmente sin acilación por sintetasas de Escherichia coli endógenas; cuando SctRNAGlnCUA se coexpresa con ScGlnRS, células adquieren un IC50 de aproximadamente 500 //g/mL de ampicilina, demostrando que ScGlnRS acila SctRNAGlnCUA eficientemente en Escherichia coli. Ver, D. R. Liu y P. G. Schultz, Proc. Nati. Acad. Sci . U S A. 96:4780 (1999). El Saccharomyces cerevisiae tRNAGInCUA/GlnRS es ortogonal a Escherichia coli.

[0157] Esta estrategia posteriormente se aplicó a un sistema tRNAAsp/AspRS . Saccharomyces cerevisiae tRNAAsp se conoce que es ortogonal a sintetasas de Escherichia coli. Ver por ejemplo, B. P. Doctor y J. A. Mudd, J. Biol. Chem. , 238:3677 (1963); y Y. Kwok y J. T. Wong, Can. J. Biochem. , 58:213 (1980). Se demostró que un tRNA supresor ámbar derivado de ahí (SctRNAAspCUA) también es ortogonal en Escherichia coli utilizando el ensayo de beta-lactamasa in vivo descrito anteriormente. Sin embargo, el anticodón de tRNAAsp es un elemento de reconocimiento crítico de AspRS, ver por ejemplo, R. Giege, C. Florentz, D. Kern, J. Gangloff, G. Eriani y D.

Moras, Biochimie , 78:605 (1996), y mutación del anticodón a CUA resulta en una pérdida de afinidad del supresor para AspRS. Un mutante AspRS E93K Escherichia coli se ha mostrado que reconoce el supresor tRNAAspCUA ámbar de Escherichia coli de aproximadamen e una orden de magnitud mejor que wt AspRS. Ver, por ejemplo F. Martin, 'Thesis ' (Tesis) , Universite Louis Pasteur, Strasbourg, Francia, 1995. Se especuló que la introducción de la mutación relacionada en AspRS Saccharomyces cerevisiae (E188K) puede restaurar su afinidad para SctRNAAspCUA. Se determinó que el AspRS de Saccharomyces cerevisiae (E188K) mutante no acila tR As Escherichia coli, pero carga SctRNAAspCUA con eficiencia moderada como se ilustra por experimentos de aminoacilación in vi tro. Ver por ejemplo, U Pastmak, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Helv. Chim. Acta, 83:2277 (2000) . Aunque SctRNAAspCUA/ ScAspRS (E188K) posee actividad débil, puede servir como otro par ortogonal en Escherichia coli.

[0158] Un enfoque similar involucra el uso de una sintetasa heterologa como la sintetasa ortogonal pero un tRNA iniciador mutante del mismo organismo o un organismo relacionado como el tRNA ortogonal . RajBhandary y colaboradores encontraron que un mutante ámbar de tRNAfMet iniciador humano se acila por GlnRS de Escherichia coli y actúa como un supresor ámbar en células de levadura sólo cuando se coexpresa EcGlnRS. Ver, A. K. Kowal , C. Kohrer y U. L. RajBhandary, Proc . Nati. Acad. Sci . U S A, 98:2268 (2001) . Este par de esta manera presenta un par ortogonal para uso en levaduras . También, un mutante ámbar tRNAfMet iniciador de Escherichia coli se encontró que es inactivo hacia cualesquiera sintetasas de Escherichia coli. Una levadura mutante TyrRS se selecciona que carga este tRNA mutante, resultando en un par ortogonal en Escherichia coli. Ver, A. K. Kowal, y colaboradores, (2001), arriba.

[0159] Los pares tRNATyr/ yrRS procarióticos y eucarióticos tienen diferencias significantes: los elementos de identidad de tRNATyr procariotico incluyen un brazo variable largo en contraste con el brazo corto de tRNATyr eucariótico. Además, tRNATyr eucariótico contiene un elemento de reconocimiento positivo CLG72 mientras que tRNATyr procariotico no tiene ese par base consenso. Estudios in vi tro también han mostrado que tRNTATyr de Saecharomyees cerevisiae y H. sapiens no puede aminoacilarse por sintetasas bacterianas, ni su TyrRS aminoacila tRNA bacteriano. Ver por ejemplo, K. Wakasugi, C. L. Quinn, N. Tao y P. Schimmel, EMBO J . , 17:297 (1998); y, T. A. Kleeman, D. Wei, K. L. Simpson y E. A. First, J. Biol. Chem. , 272:14420 (1997). Pero, a pesar de todas estas características promisorias para ortogonalidad, ensayos de complementación de beta-lactamasa in vivo, mostraron que el supresor ámbar tRNATyrCUA derivado tanto de Saccharomyces cerevisiae como H. sapiens no son ortogonales en Escherichia coli. Ver por ejemplo, L . Wang, T. J. Magliery, D. R. Liu y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc . , 122:5010 (2000). La susceptibilidad del tRNA supresor a acilación por sintetasas de Escherichia coli; se debe al cambio de un sólo nucleótido en el anticodón (G34 a C34) .

[0160] Utilizando los métodos de la presente invención, los pares y componentes de pares deseados anteriores se desarrollan para generar pares tRNA/sintetasa ortogonales que poseen características deseadas, por ejemplo que pueden aminoacilar preferencialmente un O-tRNA con un aminoácido no natural.

[0161] Organismos, Fuentes y Hospedero

[0162] El par tRNA-RS ortogonal, por ejemplo derivado de al menos un primer organismo o al menos dos organismos, que pueden ser iguales o diferentes, puede emplearse en una variedad de organismos, por ejemplo un segundo organismo. El primero y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, el primer organismo es un organismo procariótico, por ejemplo Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, A horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o semejantes. En forma alterna, el primer organismo es un organismo eucariótico, por ejemplo plantas (por ejemplo plantas complejas tales como monocotiledóneas, o dicotiledóneas) , algas, protistas, hongos (por ejemplo levadura, etc.), animales (por ejemplo mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o semejantes. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, Metanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium; Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o semejante. En forma alterna, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, por ejemplo plantas, hongos, animales o semejantes.

[0163] Como se describió anteriormente, los componentes individuales de un par pueden derivarse del mismo organismo o diferentes organismos. Por ejemplo, tRNA puede derivarse de un organismo procariótico, por ejemplo una arquibacteria, tal como Methanococcus jannaschii ? Halobacterium NRC-1 o una eubacteria, tal como Escherichia coli, mientras que la sintetasa puede derivarse del mismo u otro organismo procariótico, tal como Methanococcus jannaschii, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, Halobacterium, Escherichia coli o semejantes. Fuentes eucarióticas también pueden emplearse, por ejemplo plantas (por ejemplo, plantas complejas tales como monocotiledoneas, o dicotiledóneas) , algas, protistas, hongos (por ejemplo levadura, etc.), animales (por ejemplo mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o semejantes.

[0164] Métodos para seleccionar un par sintetasa tRNA-tRNA ortogonal, para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo también se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un tR A y una aminoacil tRNA sintetasa (RS) aislada o derivada de un primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tRNA en un conjunto de células duplicadas del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes en el primer conjunto que fallan en sobrevivir en el conjunto de células duplicadas, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicadas se desarrollan en la presencia de un agente de selección, y en donde las células supervivientes comprenden el par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal para utilizar en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, comparar y seleccionar incluye un ensayo . de complementación in vivo. En otra modalidad, la concentración del agente de selección se varia.

[0165] Por ejemplo, un par tR A/sintetasa puede seleccionarse con base en si los elementos de identidad, que son sitios de reconocimiento del tRNA para la sintetasa, se encuentran. Por ejemplo, un par tRNA/sintetasa se elige cuando los elementos de identidad están fuera del anticodón, por ejemplo el par tRNATyr/TyrRS de la arqueobacteria Methanococcus jannaschii . Esta TyrRS carece de la mayoría del enlace de dominio no conservado para un bucle anticodón de su tRNATyr, pero puede discriminar tRNA con C1:G72 de aquél con G1:C72. Además, la Methanococcus jannaschii TyrRS (Mj'TyrRS) aminoacila Saccharomyces cerevisiae pero no la tRNA cruda de Escherichia coli. Ver por ejemplo, B. A. Steer y P. Schimmel, J. Biol . Chem. , 274:35601 (1999) . Utilizando un ensayo de complementación in vivo con un vector de expresión que contiene un gen reportero, por ejemplo gen beta-lactamasa, con al menos un codón selector, célula que expresan tRNATyrCUA de Methanococcus jannaschii {MjtRNATyrCUA) también sobreviven a un ICS0 de 55 µg/mL de ampicilina células que coexpresan MjtRNATyrCUA con su TyrRS sobreviven a un ICS0 de 1220 ^g/mL de ampicilina. Aunque MjtRNATyrCUA es menos ortogonal en Escherichia coli que SctRNAGlnCUA (IC50 20 /¿g/mL) , el Mj TyrRS tiene alta actividad de aminoacilación hacia su tRNA supresor ámbar connato. Ver por ejemplo, L. ang, T. J. Magliery, D. R. Liu y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc, 122:5010 (2000). Como resultado, Methanococcus jannaschii /TyrRS se identifica como un par ortogonal en Escherichia coli y puede seleccionarse para utilizar en un sistema de traducción in vivo.

[0166] Amino Acidos No Naturales

[0167] Una amplia variedad de aminoácidos no naturales puede emplearse en los métodos de la invención. El aminoácido no natural puede seleccionarse con base en características deseadas del aminoácido no natural, por ejemplo función de aminoácido no natural, tal como modificar propiedades biológicas de proteínas tales como toxicidad, biodistribución, o vida media, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas , propiedades químicas y/o fotoquímicas, propiedades catalíticas, capacidad por reaccionar con otras moléculas (ya sea en forma covalente o no covalente) o semejantes.

[0168] Como se emplea un "aminoácido no natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado o análogo de aminoácido diferente a selenocisteína y los siguientes veinte alfa-aminoácidos genéticamente codificados: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, valina. La estructura genérica de alfa-amino se ilustra en la Fórmula I: Un aminoácido no natural típicamente es cualquier estructura que tiene la Fórmula I, en donde el grupo R es cualquier substituyente diferente a aquél empleado en los veinte aminoácidos naturales . Ver por ejemplo cualquier texto de bioquímica tal como Biochemistry (Bioquímica) por L. Stryer, 3era Edición 1988, Freeman and Company, New York, para estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Hay que notar que, los aminoácidos no naturales de la presente invención pueden ser compuestos de origen natural diferentes a los veinte alfa aminoácidos anteriores . Debido que los aminoácidos no naturales de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales en cadena lateral solamente, los aminoácidos no naturales de enlaces amida con otros aminoácidos, por ejemplo naturales o no naturales, en la misma forma en la que se forman en proteínas de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturales tienen grupos de cadenas laterales que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la Fórmula I opcionalmente comprende un grupo -alquilo, -arilo, -acilo, -ceto, -azido, -hidroxilo, -hidrazina, -ciano, -halo, -hidrazida, -alquinilo, -alquinilo, -éter, -tiol, -seleno, -sulfonilo, -borato, -boronato, -fosfo, -fosfono, -fosfina, -heterocíclico, -enona, -imina, -aldehido, -áster, -tioácido, -hidroxilamina, -amino, o semejantes o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos no naturales de interés incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos que comprenden un entrelazador fotoactivable, aminoácidos etiquetados con espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de enlace de metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos radioactivos, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interactúan en forma covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden a biotina o un análogo de biotina, amino ácidos glicosilados tales como cerina substituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidratos, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilen glicol o poliéter, aminoácidos substituidos con átomos pesados, aminoácidos químicamente escindibles y/o fotoescindibles, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, por ejemplo poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, por ejemplo mayores a aproximadamente 5 o mayor que aproximadamente 10 átomos de carbono, aminoácidos que contienen azúcar enlazada al carbono, aminoácidos activos-redox, aminoácidos que contienen amino tioácidos y aminoácidos que comprenden uno o más porciones tóxicas .

[0169] Además de los aminoácidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, aminoácidos no naturales también comprenden opcionalmente estructuras principales modificadas, por ejemplo como se ilustra por las estructuras de las Fórmulas II y III: en donde Z típicamente comprende OH, N¾, SH, H-R1, o S-R 1 ; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, típicamente comprenden S u O, y R y R ' , que son opcionalmente iguales o diferentes, se eligen típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, aminoácidos no naturales de la invención opcionalmente comprenden substituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III. Aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, pero no están limitados a, alfa-hidroxi ácidos, alfa-tioácidos, alfa-aminotiocarboxilatos, por ejemplo con cadenas laterales que corresponden a veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, substituciones en el alfa-carbono opcionalmente incluyen aminoácidos L, D, o alfa-alfa-disubstituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico y semejantes. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina de 3, 4, 6, 7, 8, y 9 miembros de anillo, beta y gamma aminoácidos tales como ácido beta-alanina y ácido gamma-amino butírico substituido.

[0170] Por ejemplo, muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina, y semejantes. Análogos de tirosina incluyen tirosinas para— substituidas, tirosinas orto-substituidas, y tirosinas meta-substituidas, en donde la tirosina substituida comprende un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada de C6-C2o/ un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, o semejantes. Además, anillos arilo de substitución múltiple, también se contemplan. Análogos glutamina de la invención incluyen, pero no están limitados a, alfa-hidroxi derivados, derivados gamma-substituidos , derivados cíclicos, y derivados de glutamina substituidos con amida. Análogos de fenilalanina ejemplares incluyen pero no están limitados a fenilalaninas meta-substituidas , en donde el substituyente comprende un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo acetilo o semejantes. Ejemplos específicos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no están limitados a, O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4 -alil -L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAc beta-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina, y semejantes. Las estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales no limitantes, se proporcionan en las figuras, por ejemplo Figuras 29, 30, y 31.

[0171] Típicamente, los aminoácidos no naturales de la invención se eligen o diseñan para proporcionar características adicionales no disponibles en los veinte aminoácidos naturales. Por ejemplo, se diseñan o eligen opcionalmente aminoácidos no naturales para modificar las propiedades biológicas de un péptido, por ejemplo en el cual se incorporan. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, por ejemplo térmica, hidrolítica, oxidativa, resistencia a degradación enzimática, y semejantes, facilidad de purificación y procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas , propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, vida media, capacidad para reaccionar con otras moléculas, por ejemplo de manera covalente o no covalente y semejantes.

[0172] Adicionales detalles respecto a aminoácidos no naturales, se describen en la solicitud correspondiente, "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids" (Incorporación In vivo de Aminoácidos No Naturales", expediente del Agente No. 54-00012 OPC/US, presentada en Abril 19, 2002, que se incorpora aquí por referencia.

[0173] Uso de pares tRNA y 0-RS y O-tRNA/0-RS mutantes

[0174] Las composiciones de la presente invención y composiciones elaboradas por los métodos de la presente invención opcionalmente están en una célula. Los pares O-tRNA/O-RS o componentes individuales de la presente invención luego pueden emplearse en una maquinaria de traducción de un sistema hospedero, que resulta en un aminoácido no natural incorporado en una proteína. La solicitud de patente correspondiente "Jn vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids" (Incorporación In vivo de Aminoácidos No Naturales) , expediente del agente No. 54-00012OPC/US por Schultz, y colaboradores, describe este proceso y se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, cuando un par 0-tRNA/O-RS se introduce en un hospedero, por ejemplo Escherichia coli, el par lleva a la incorporación in vivo de un aminoácido no natural, por ejemplo un aminoácido sintético tal como O-metil-L-tirosina, que puede agregarse exógenamente al medio de crecimiento en una proteína, por ejemplo dihidrafolato reductasa o una proteína terapéutica tal como EPO, en respuesta a un codón selector, por ejemplo un codón sin sentido ámbar. Opcionalmente, las composiciones de la presente invención pueden estar en un sistema de traducción in vitro o en sistema o sistemas in vivo.

[0175] Variantes de secuencia de polipeptido y ácido nucléico

[0176] Como se describió anteriormente y a continuación, la invención proporciona secuencias de polinucleótido de ácido nucleico y secuencias de amino ácido polipeptido, por ejemplo 0-tRNAs y 0-RSs, y por ejemplo composiciones y métodos que comprenden dichas secuencias. Ejemplos de esas secuencias, por ejemplo 0-tRNAs y O-RSs, se describen aquí. Sin embargo, una persona con destreza en la especialidad, apreciará que la invención no se limita a las secuencias aquí descritas. Una persona con destreza apreciará que la presente invención también proporciona muchas secuencias relacionadas y no relacionadas con las funciones aquí descritas, por ejemplo codificar un O-tRNA o un O-RS.

[0177] Una persona con destreza, también apreciará que muchas variantes de las secuencias descritas, se incluyen en la invención. Por ejemplo, variaciones conservadoras de las secuencias descritas que producen una secuencia funcionalmente idéntica, se incluyen en la invención. Variantes de las secuencias de ácido nucleico polinucleótido, en donde las variantes hibridizan cuando menos a una secuencia descrita, se consideran incluidas en la invención. Sub-secuencias únicas de las secuencias aquí descritas, como se determina por ejemplo por técnicas de comparación de secuencia estándar, también se incluyen en la invención.

[0178] Variaciones Conservadoras

[0179] Debido a la degeneración del código genético, "substituciones silenciosas" (es decir substituciones en una secuencia de ácido nucleico que no resultan en una alteración en un polipeptido codificado) son una característica implicada de toda secuencia de ácido nucleico, que codifica un amino ácido. Similarmente, "substituciones de amino ácido conservadoras" en uno o unos cuantos amino ácidos en una secuencia de amino ácidos se substituyen con diferentes amino ácidos con propiedades altamente similares, también se identifican fácilmente como altamente similares a una construcción descrita. Estas variaciones conservadoras de cada secuencia descrita son una característica de la presente invención.

[0180] "Variaciones conservadoras" de una secuencia de ácido nucleico particular, se refieren a aquéllos ácidos nucleicos que codifican secuencias de amino ácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de amino ácido, a secuencias esencialmente idénticas, ver Tabla 1 a continuación. Una persona con destreza reconocerá que substituciones individuales, eliminaciones o adiciones que alteran, agregan o eliminan un solo amino ácido o un pequeño porcentaje de amino ácidos (típicamente inferior a 5%, más típicamente inferior a 4%, 2% o 1%) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas conservadoramente" , en donde las alteraciones resultan en la eliminación de un amino ácido, adición de un amino ácido, o substitución de un amino ácido con un amino ácido químicamente similar. De esta manera, "variaciones conservadoras" de una secuencia de polipéptidos citada en la presente invención, incluyen substituciones de un pequeño porcentaje, típicamente menos de 5%, más típicamente inferior a 2% o 1%, de los amino ácidos de la secuencia de polipéptido, con un amino ácido selecto conservadoramente del mismo grupo de substitución conservadora. Finalmente, la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservadora del ácido nucleico básico.

Tabla 1 - Grupos de Substitución Conservadora

[0182] Hibridización de Ácido Nucleico

[0183] Hibridización comparativa puede utilizarse para identificar ácidos nucleicos de la invención, incluyendo variaciones conservadoras de ácidos nucleicos de la invención, y este método de hibridización comparativa, es un método preferido para distinguir ácidos nucleicos de la invención. Además, ácidos nucleicos objetivos que hibridizan a los ácidos nucleicos representados por SEQ ID NO: 1-3 o SEQ ID MO:4-34 (ver, Tabla 5) con condiciones de severidad alta, ultra-alta y ultra-ultra alta, son una característica de la invención. Ejemplos de estos ácidos nucleicos incluyen aquéllos con una o unas cuantas substituciones de ácido nucleico conservador en comparación con una secuencia de ácido nucleico determinada.

[0184] Un ácido nucleico de prueba se dice que hibridiza específicamente a un ácido nucleico sonda cuando hibridiza al menos ½ al igual que la sonda en cuanto el objetivo complementario perfectamente apareado, es decir con una proporción de señal a interferencia de al menos ¾ tan alta como hibridización de la sonda al objetivo bajo condiciones en donde la sonda perfectamente apareada liga al objetivo complementario perfectamente apareado con una proporción de señal a interferencia que es al menos aproximadamente 5x-10x tan alta como la observada para hibridización a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no apareados.

[0185] Ácidos nucleicos "hibridizan" cuando se asocian típicamente en solución. Ácidos nucleicos hibridizan debido a una variedad de fuerzas físico químicas bien caracterizadas tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de solvente, apilamiento de base y semejantes. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Lahoratory Technicpj.es in Biochemistry and Molecular Biology- -Hibridization with Ácid nucleic Acid Probes part I chapter 2, "Overview of principies of hibridization and the strategy of acid nucleic acid probe assays" (Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular— Hibridización con Sondas de Ácido Nucleico parte I capítulo 2, "Información general de principios de hibridización y la estrategia de ensayos de sonda de ácido nucleico) , (Elsevier, New York) , así como con Ausubel, arriba. Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra, (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 RZL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Harnes y Higgins 2) proporciona detalles de la síntesis, etiquetado, detección y cuantificación de DNA y RNA, incluyendo oligonucleótidos .

[0186] Un ejemplo de condiciones de hibridización severas para hibridizar ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro, en una técnica Southern o northern es 50% de formalina con 1 mg de heparina a 42°C, con la hibridización que se lleva a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado severas es un lavado SSC 0.2x a 65°C por 15 minutos (Ver, Sambrook, arriba para una descripción de amortiguador SSC) . ? menudo, el lavado de alta severidad es precedido por una lavado de baja severidad para retirar la señal sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de baja severidad es SSC 2x a 40°C por 15 minutos. En general, una proporción de señal a interferencia de 5x (o superior) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridización particular, indica detección de una hibridización especifica.

[0187] "Severas Condiciones de lavado de hibridización" en el contexto de experimentos de hibridización de ácido nucleico tales como hibridizaciones Southern y northern, son dependientes de secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guia extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993), arriba y en Hames y Higgins, 1 y 2. Severas condiciones de lavado e hibridización pueden determinarse fácilmente en forma empírica para cualquier ácido nucleico de prueba. Por ejemplo, para determinar condiciones de lavado e hibridizacion altamente severas, las condiciones de hibridizacion y lavado se incrementan gradualmente (por ejemplo al incrementar la temperatura, disminuir la concentración de sal, incrementar concentración de detergente y/o incrementar la concentración de solventes orgánicos tales como formalina, en la hibridizacion o lavado) , hasta que un conjunto selecto de criterios se satisface. Por ejemplo, las condiciones de hibridizacion y lavado se incrementan gradualmente hasta que una sonda liga a un objetivo complementario perfectamente apareado con una proporción de señal a interferencia que es al menos 5x tan alta como la observada para hibridizacion de la sonda a un objetivo no acoplado .

[0188] Condiciones "muy severas" se eligen iguales al punto de fusión térmico (Tm) para una sonda particular. La Tm es la temperatura (bajo definidos concentración iónica y pH) , en la cual 50% de la secuencia de prueba se hibridiza a una sonda perfectamente acoplada. Para los propósitos de la presente invención, en general condiciones de hibridizacion y lavado "altamente severas", se eligen de aproximadamen e 15°C menor a Tm para la secuencia específica a definidas concentración iónica y pH.

[0189] Condiciones de hibridización y lavado "ultra altas severas", son aquéllas en donde la severidad de las condiciones de hibridización y lavado se incrementa, hasta que la proporción de señal a interferencia para ligar las sondas al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente apareado es al menos lOx tan alto como el observado para la hibridización a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no apareados. Un ácido nucleico objetivo que hibridiza a una sonda bajo estas condiciones, con una proporción de señal a interferencia de al menos ¾ el ácido nucleico objetivo complementario perfectamente acoplado, se dice que liga a la sonda bajo condiciones de severidad ultra-alta.

[0190] Similármente, incluso niveles superiores de severidad pueden determinarse, al incrementar gradualmente las condiciones de hibridización y/o lavado del ensayo de hibridización relevante. Por ejemplo, aquéllas en las que la severidad de condiciones de hibridización y lavado se incrementa hasta que la proporción de señal a interferencia para ligar la sonda al ácido nucleico objetivo complementario perfectamente apareado es al menos 10X, 20X, 50X, 100X, o 500X o más tan alto como lo observado para la hibridización a cualquiera de los ácidos nucleicos objetivo no apareados. Un ácido nucleico objetivo que hibridiza a una sonda bajo estas condiciones, con una proporción de señal a interferencia de al menos ½ la del ácido nucleico objetivo complementario perfectamente apareado, se dice que liga a la sonda bajo condiciones de severidad ultra-ultra-altas .

[0191] Ácidos nucleicos que no hibridizan entre si bajo condiciones severas, todavía son substancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son substancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo cuando una copia de un ácido nucleico se crea utilizando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético .

[0192] Subsecuencias únicas

[0193] En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia única en un ácido nucleico seleccionado de las secuencias de 0-tRNAs y 0-RSs aquí descritas, por ejemplo SEQ ID NO: 1-3 o SEQ ID NOA-34 {ver, Tabla 5) . La sub-secuencia única, es única en comparación con un ácido nucleico que corresponde a cualquier secuencia de ácido nucleico 0-tRNA o O-RS previamente conocida, por ejemplo como se encuentra en Genbank. Puede realizarse alineamiento utilizando por ejemplo, BLAST ajustado a los parámetros predefinidos. Cualquier sub-secuencia única es útil, por ejemplo como una sonda para identificar los ácidos nucleicos de la invención.

[0194] Similármente, la invención incluye un polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de las secuencias de 0-RSs aquí descritas, por ejemplo SEQ ID NO:35-66 (ver, Tabla 5) . Aquí, la subsecuencia única, es única en comparación con un polipéptido que corresponde a cualquiera de las secuencias de polipéptido conocidas.

[0195] La invención también proporciona ácidos nucleicos objetivo que hibridizan bajo condiciones estrictas a un oligonucleotido de codificación único que codifica una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de las secuencias de 0-RSs en donde- la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido que corresponde a cualquiera de los polipeptidos de control . Secuencias únicas se determinan como se anotó anteriormente .

[0196] Comparación, identidad y homología de secuencia

[0197] Los términos "idéntico" o "identidad" en por ciento, en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o ácido nucleico, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de amino ácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencia descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles a personas con destreza) o por inspección visual .

[0198] La frase "substancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo DNAs que codifican un O-tRNA o O-RS, o la secuencia de amino ácido de un O-RS) , se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 60%, de preferencia 80%, más preferiblemente 90-95% de identidad de residuo amino ácido o nucleótido, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, como se mide utilizando un algoritmo de comparación de secuencia o mediante inspección visual. Estas secuencias "substancialmente idénticas" típicamente se consideran "homologas " , sin referencia a lo ancestros actuales. De preferencia, "identidad substancial" existe sobre una región de las secuencias que es al menos aproximadamente 50 residuos de longitud, más preferiblemente sobre una región de cuando menos aproximadamente 100 residuos, y más preferiblemente las secuencias son substancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 residuos, o sobre toda la longitud de las dos secuencias a comparar.

[0199] Para determinación de homología y comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia a la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo DE comparación de secuencia, secuencias de prueba y referencia se alimentan en una computadora, se designan coordenadas de sub-secuencia, de ser necesario y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula la identidad de secuencia en por ciento para la o las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa designados .

[0200] Alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede conducirse por ejemplo por el algoritmo de homología local de Smith & Waterminan, Ad . Ap l . Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Meedleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443 (1970) , por la búsqueda de método de similaridad de Pearson & Lipman, Proc. Mad. Acad. Sci . USA 85:2444 (1988) , por implementaciones computarázadas de estos algoritmos (GAP, BESTFTT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (Paquete de Soporte Lógico de Genética de Wisconsin, Grupo de Computación de Genética) 575 Science Dr. , Madison, WI) , o por inspección visual (ver en general, Ausubel y colaboradores, arriba) .

[0201] Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia, es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) . El soporte lógico para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (National Center for Biotechnology Information) (www. nebi . nlm. nih. gov/) . Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencias de alta calificación (HSPs = high scoring sequence pairs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, que ya corresponden o satisfacen alguna calificación umbral de valor positivo T, cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos . T se refiere como el umbral de calificación de palabra vecinal (Altschul y colaboradores, arrija) . Estos aciertos de palabra vecinal inicial, actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar más largos HSPs que los contienen. Los aciertos de palabra luego se extienden en ambas direcciones sobre cada secuencia hasta donde pueda incrementarse la calificación de alineamiento acumulativo. Calificaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (calificación de recompensa para un par de residuos correspondientes; siempre > 0) y N (calificación de penalidad, para residuos no acoplados; siempre < 0) . Para secuencias de amino ácidos, una matriz de calificación se utiliza para calcular la calificación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando : la calificación de alineamiento acumulativo cae por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la calificación acumulativa pasa a cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo con calificación negativa; o el fin de cualquier secuencia se alcanza . Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) utiliza como valores predefinidos, una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras . Para secuencias de amino ácidos, el programa BLASTP utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 3 , una expectativa (E) de 10, y una matriz de calificación BLOSUM62 (ver, Henikoff & Henikoff (1989) Proc . Nad. Acad. Sci. USA 89:10915).

[0202] Además de calcular la identidad de secuencia en por ciento, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (ver por ejemplo Karlin & Altschul. Proc . Nad. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similaridad que se proporciona por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría por azar un apareamiento entre dos secuencias de nucleótido o amino ácido. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera - similar a una secuencia de referencias y la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia, es inferior a aproximadamente 0.1, más preferible inferior a aproximadamente 0.01, y aun más preferible inferior a aproximadamente 0.001.

[0203] Definición de Polipeptidos por Inmunoreactividad

[0204] Debido a que los polipéptidos de la invención proporcionan una variedad de nuevas secuencias de polipéptido (por ejemplo que comprenden amino ácidos no naturales en el caso de proteínas sintetizadas en los sistemas de traducción presentes, o por ejemplo en el caso de sintetasas novedosas presentes, novedosas secuencias de amino ácidos estándar) , los polipéptidos también proporcionan nuevas características estructurales que pueden reconocerse, por ejemplo en ensayos inmunológicos . La generación de antisueros, que específicamente ligan los polipéptidos de la invención, así como los polipéptidos que se ligan por estos antisueros, es una característica de la invención.

[0205] Por ejemplo, la invención incluye proteínas sintetasa que ligan específicamente con o que son específicamente i minore ctivas con un anticuerpo o antisuero generado contra un inmunógeno que comprenden una secuencia de amino ácidos seleccionada de uno o más SEQ ID NO: 35-66 (ver, Tabla 5) . Para eliminar reactividad cruzada con otros homólogos, el anticuerpo o antisuero se substrae con sintetasas disponibles, tales como Methanococcus jannaschii tirosil sintetasa (M. jannaschii) de tipo silvestre (TyrRS) , por ejemplo los polipéptidos de "control". Cuando la Methanococcus jannaschii tirosil sintetasa ( . jannaschii) de tipo silvestre (TyrRS) corresponde a un ácido nucleico, un polipéptido codificado por el ácido nucleico se genera y utiliza para propósitos de substracción de anticuerpo/antisuero .

[0206] En un formato típico, el inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que se desarrolla contra uno o más polipéptidos que comprenden una o más de las secuencias que corresponden a uno o más de SEQ ID NO: 35-66 (ver, Tabla 5) o una subsecuencia substancial del mismo (es decir al menos aproximadamente 30% de la secuencia de longitud íntegra proporcionada) . El conjunto de inmunógenos de polipéptido potenciales derivados de SEQ ID NO:35-66 (ver, Tabla 5) se refieren colectivamente a continuación como los "polipéptidos inmunogénicos" . Los antisueros resultantes se eligen opcionalmente que tengan reactividad cruzada baja contra los homólogos de sintetasa de control y cualquier reactividad cruzada se retira, por ejemplo por inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos de sintetasa de control, antes de uso del antisuero policlonal en el inmunoensayo .

[0207] Para producir antisuero para utilizar en un inmunoensayo, uno o más de los polipéptidos inmunogénicos se produce y purifica como se describe aqui. Por ejemplo, proteína recombinante puede producirse en una célula recombinante . Una cepa de ratones endogámicos (utilizada en este ensayo debido a que los resultados son más reproducibles debido a la identidad genética virtual de los ratones) se inmuniza con la o las proteínas inmunogénicas, en combinación con un adyuvante estándar, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón estándar (ver por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual (Anticuerpos, Un Manual de Laboratorio) , Cold Spring Harbor Publications , Mew York, para una descripción estándar de generación de anticuerpos, formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar inmunoreactividad específica. Referencias y discusiones adicionales de anticuerpos también se encuentran aqui y pueden aplicarse para definir polipeptidos por inmunoreactividad) . En forma alterna, uno o más polipeptidos sintéticos o recombinantes derivados de las secuencias aqui descritas, se conjugan con una proteína portadora y utilizan como un inmunógeno .

[0208] Sueros policlonales se recolectan y circulan contra el polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo de fase sólida con una o más de las proteínas inmunogénicas inmovilizadas en un soporte sólido. Antisueros policlonales con un título de 10s o mayor se eligen, recolectan y substraen con los polipeptidos de sintetasa de control, para producir antisueros policlonales titulados, recolectados y substraídos.

[0209] Los antisueros policlonales titulados recolectados y substraídos, se prueban para reactividad cruzada contra los homólogos de control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan condiciones de enlace discriminatorias para los antisueros policlonales titulados substraídos, que resultan aproximadamente en cuando menos una proporción de señal a interferencia de al menos aproximadamente 5-10 veces superior para ligar los antisueros policlonales titulados con la sintetasa inmunogénica en comparación a ligar con los homólogos de la sintetasa de control . Esto es, la severidad de la reacción de enlace, se ajusta por la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leche deshidratada sin grasa, y/o al ajusfar condiciones de sal, temperatura y/o semejantes. Estas condiciones de enlace se emplean en ensayos subsecuentes para determinar si un polipéptido de prueba (un polipéptido comparado con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos de control) se liga específicamente por los antisueros policlonales substraídos recolectados . En particular, polipéptidos de prueba que muestran al menos una proporción de señal a interferencia de 2-5x superior a los homólogos de sintetasa de control, bajo condiciones de enlace discriminatorias, y al menos una proporción de señal de interferencia aproximadamente ½, en comparación con el o los polipéptido inmunogénicos, comparte una similaridad estructural substancial con el polipéptido inmunogénico en comparación con sintetasas conocidas y por lo tanto es un polipéptido de la invención.

[0210] En otro ejemplo, inmunoensayos en el formato de enlace competitivo se utilizan para detección de un polipéptido de prueba. Por ejemplo, como se anotó, se retiran anticuerpos de reacción cruzadas de la mezcla de antisueros recolectada por inmunoabsorbción con los polipeptidos de control. El o los polipéptidos inmunogénicos luego se inmovilizan en un soporte sólido que se expone a los antisueros recolectados substraídos . Proteínas de prueba se agregan al ensayo para competir por enlace con los antisueros substraídos recolectados. La capacidad de la o las proteínas de prueba para competir el enlace con los antisueros substraídos recolectados, en comparación con la o las proteínas inmovilizadas, se compara con la capacidad de el o los polipéptidos inmunogénicos agregados al ensayo para competir por enlace (los polipéptidos inmunogénicos compiten efectivamente con los polipéptidos inmunogénicos inmovilizados, para enlazar con los antisueros recolectados) . El por ciento de reactividad cruzada para las proteínas de prueba se calcula, utilizando cálculos estándar .

[0211] En un ensayo paralelo, la capacidad de las proteínas de control para competir por enlace con el antisuero substraído recolectado, se determina opcionalmente en comparación con la capacidad de el o los polipéptidos inmunogénicos para competir por enlace al antisuero. De nuevo, el por ciento de reactividad cruzada para los polipéptidos de control se calcula, utilizando cálculos estándar. Cuando el por ciento de reactividad cruzada es al menos 5-10x tan elevado para los polipéptidos de prueba en comparación con los polipéptidos de control y o el enlace de los polipéptidos de prueba está aproximadamente en el rango del enlace de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos se prueba ligan específicamente a los antisueros substraídos recolectados.

[0212] En general, los antisueros inmunoabsorbidos y recolectados pueden utilizarse en un inmunoensayo de enlace competitivo como se describe aquí, para comparar cualquier polipéptido de prueba con el o los polipéptidos inmunogénicos y/o de control. A fin de hacer esta comparación, los polipéptidos inmunogénicos, de prueba y de control, cada uno se ensayan en un amplio rango de concentraciones y la cantidad de cada polipeptido requerida para inhibir 50% del enlace de los antisueros substraídos por ejemplo a una proteína de control de prueba o inmunogénica inmovilizada, se determina utilizando técnicas estándar. Si la cantidad del polipeptido de prueba requerido para ligar en el ensayo competitivo es menos que el doble de la cantidad del polipéptido inmunogénico que se requiere, entonces se dice que el polipéptido de prueba liga específicamente a un anticuerpo generado por la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 5-lOx tan alta como para el polipéptido de control.

[0213] Como una determinación adicional de especificidad, el antisuero recolectado se inmunosorbe completamente de manera opcional con el o los polipéptidos inmunogénicos (en vez de los polipéptidos de control) hasta que es detectable poco o ningún enlace del antisuero recolectado substraído con polipéptido inmunogénico resultante, con el o los polipéptidos inmunogénicos empleados en la inmunosorción . Este suero totalmente inmunosorbido luego se ensaya por reactividad con el polipéptido de prueba. Si se observa poca o ninguna reactividad (es decir no más de 2x la proporción de señal a interferencia observada para ligar el antisuero totalmente inmunosorbido al polipéptido inmunogénico) , entonces el polipéptido de prueba se liga específicamente por el antisuero producido por la proteína inmunogénica .

[0214] Técnicas Generales

[0215] Textos generales que describen técnicas biológicas moleculares, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y semejantes, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Guía a Técnicas de Clonación Molecular, Métodos en Enzimología) volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) ; Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación Molecular - Un Manual de Laboratorio) (3era Edición), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , F. M. Ausubel Y colaboradores, eds . , Current Protocols (Protocolos Actuales) , una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado a través de 2002) ( "Ausubel" ) ) · Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes, relacionados por ejemplo a la generación de tRNA ortogonal, sintetasas ortogonales y sus pares.

[0216] Diversos tipos de mutagénesis se emplean en la presente invención, por ejemplo para producir sintetasas novedosas de tR As . Incluyen pero no están limitados a mutagénesis punto aleatoria dirigida por sitio, recombinación homologa (transposición de secuencias de DNA) , mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de DNA modificada con fosforotioato, mutagénesis utilizando DNA dúplex con espacios o semejantes. Métodos convenientes adicionales incluyen reparación de apareado incorrecto punto, mutagénesis utilizando cepas hospederas deficientes de reparación, selección-restricción y purificación-restricción, mutagénesis de eliminación, mutagénesis por síntesis de gen total, reparación de ruptura de doble hebra y semejantes. la mutagénesis, por ejemplo involucra construcciones quiméricas, también se incluye en la presente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede guiarse por información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural alterada o mutada, por ejemplo secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura de cristal o semejantes.

[0217] Los anteriores textos y ejemplos aguí encontrados describen estos procedimientos así como las siguientes publicaciones y referencias citadas ahí: Sieber, y colaboradores, Nature Biotechnology (Biotecnología de Naturaleza), 19:456-460 (2001); Ling y colaboradores, Approaches to DNA mutagenesis : an overview (Enfogues a mutagénesis de DNA: Una información general) , Anal Biothem. 254(2): 157-178 (1997); Dale y colaboradores, Oligonucleotide-directed rando mutagenesis using the phosphorothioate method (Mutagénesis aleatoria dirigida por oligonucleótido utilizando el método fósforotioato) , Methods Mol . Biol . 57:369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res . 23, 3067-8 (1995); W. P. C. 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Acids Res . , 16: 6987-6999 (1988) ; Kramer y colaboradores, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations (Reacciones in vitro enzimáticas mejoradas en el enfoque de DNA dúplex con espacios a construcciones dirigidas por oligonucleótido de mutaciones) , Nucí . Acids Res . 16: 7207 (1988) ; Sakamar y horana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) (Síntesis total y expresión de un gen para la a-subunidad de proteína que liga nucleótido guanina de segmento exterior de varilla bovina), Nucí . Acids Res . 14: 6361-6372 (1988) Sayers y colaboradores, Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis (Exonucleasas Y-T en mutagénes dirigida por oligonucleótido basada en fosforotioato) , Nucí . 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[0218] Oligdnucleótidos , por ejemplo para utilizar en mutagénesis de la presente invención, por ejemplo al rautar bibliotecas de sintetasas, o alterar tRNAs, se sintetizan químicamente en forma típica de acuerdo con el método de fósfororamidita triéster en fase sólida descrita por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts . 22 (20) :1859-1862 , (1981), por ejemplo utilizando un sintetizador automatizado como se describe por Needham-VanDevanter y colaboradores, Nucleic Acids Res . , 12 :6159 6168 (1984) . [0219 ] Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede ser a la medida o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como Midland Certified Reagent The any (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros.

[0220] La presente invención también se refiere a células hospederas y organismos para la incorporación in vivo de un amino ácido no natural mediante los pares NA/RS ortogonales. Células hospederas en general son modificadas por ingeniería genética (por ejemplo transformadas, transducidas o transfectadas) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo en la forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos , por métodos estándar incluyendo electroporación (From y colaboradores, Proc . Nati. Acad, Sci. USA 82, 5824 (1985), infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad por pequeñas partículas, con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o en la superficie (Klein y colaboradores, Nature 327, 70-73 (1987) ) . Berger, Sambrook, y Ausubel proporcionan una variedad de métodos de transformación apropiados .

[0221] Las células hospederas de ingeniería pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para actividades tales como, por ejemplo etapas de tamizado, promotores de activación, o transformantes de selección. Estas células pueden opcionalmente cultivarse en organismos transgénicos .

[0222] Otras referencias útiles, por ejemplo para aislamiento y cultivo celular (por ejemplo para subsecuente aislamiento de ácido nucleico) , incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, Manual of Basic Technique (Cultivo de Células de Animales, Un Manual de Técnica Básica) Tercera Edición, Wiley-Liss, New York y las referencias ahí citadas; Payne y colaboradores (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems (Células de Plantas y Cultivo de Tejido en Sistemas Líquidos) John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture (Células de Planta, Tejido y Cultivo de Órgano) ,-Fundamental Methods Springer Lab Manual (Métodos Fundamentales Manual de Laboratorio Springer) , Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (El Manual de Medios Microbiologicos) (1993) CRC Press, Boca Ratón, Fl.

[0223] Están disponibles varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos objetivo en células bacterianas, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la presente invención. Estos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el DNA, electroporación, bombardeo de proyectiles e infección con vectores virales, etc. Pueden utilizarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de DNA de esta invención. Las bacterias se desarrollan a fase log y los plásmidos dentro de la bacteria pueden aislarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad (ver, por ejemplo Sambrook) . Además, una plétora de equipos está comercialmente disponible para la purificación de plásmidos de bacterias, (ver, por ejemplo EasyPrepTm, FlexiPrep11111, ambos de Pharmacia Biotech; StrataCleanTm, de Stratagene; y QlAPrep™ de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados luego se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, utilizados para transfectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción y promotores útiles para regular la expresión de ácido nucleido objetivo particular. Los vectores opcionalmente comprenden casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten replicación de cásete en eucariotas, o procariotas o ambos (por ejemplo vectores lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistemas procarióticos como eucarióticos . Vectores son adecuados para replicación e integración en procariotas, eucariotas, o de preferencia ambos. Ver Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, y colaboradores, Mature 328:731 (1987); Schneider, B., y colaboradores, Protein Bur. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos arriba) . Un catálogo de Bacterias y Bacteriófagos útiles para clonar, se proporciona, por e emplo por ATCC, por ejemplo The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriographage (El Catálogo de ATCC de Bacterias y Bacteriografos) (1992) Ghema y colaboradores (eds.) publicado por ATCC. Procedimentos básicos adicionales para secuenciar, clonar y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes, también se encuentran en Watson y colaboradores, (1992) Recombinant DNA Second Edition (DNA Recombinante, Segunda Edición) Scientific American Books, Y. EJEMPLOS

[0224] Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada.

[0225] Ejemplo 1- Mejora de Ortogonalidad de un Methanococcus jannaschii tRNA

[0226] Debido a la naturaleza compleja de interacciones tRNA-sintetasa que se requieren para lograr un alto grado de fidelidad en traducción de proteínas, el diseño racional de pares tRNA-sintetasa ortogonales es difícil. Este ejemplo describe métodos que explotan el deficiente reconocimiento cruzado de algunos pares tRNA-sintetasa entre especies, acoplado con subsecuente desprendimiento in vivo de tRNAs con ortogonalidad mejorada. Ver, también, L. Wang y P. G. Schultz, Chem. Biol . , 8:883 (2001). Específicamente, una biblioteca de tRNAs supresores ámbar derivados de Methanococcus jannaschii tRNATyr, se generó. tRNATyrCUAs que son substratos para aminoacil-tRNA sintetasas de Escherichia coli endógenas, se eliminaron del conjunto por selección negativa con base en supresión de mutaciones no sentido ámbar en el gen barnasa (barnase) . Los restantes tRNATyrCUAs luego se seleccionaron por su capacidad por suprimir codones no sentido ámbar en el gen beta-lactamasa en la presencia de Methanococcus jannaschii tirosil-tRNA sintetasa connato (TyrRS) . Cuatro tRNAs supresores mutantes se seleccionaron que son más deficientes substratos para Escherichia coli sintetasas que Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA, pero aún pueden' cambiarse eficientemente por Methanococcus jannaschii TyrRS. El supresor mutante tRNATyrCUA junto con Methanococcus jannaschii TyrRS proporciona un par tRNA-sintetasa ortogonal, útil para la incorporación in vivo de amino ácidos no naturales en proteínas .

[0227] El Methanococcus jannaschii tRNATyr, una arguibacteria, tiene diferentes elementos de identidad de aquéllos de Escherichia coli tRNATyr. En particular, el Escherichia coli tRNATyr tiene un par G1C72 en tallo aceptor mientras que el Methanococcus jannaschii tRNATyr tiene un par C1G72. Un tRNA supresor ámbar derivado de Methanococcus jannaschii tRNATyr se mostró que no se aminoacila eficientemente por las sintetasas de Escherichia coli, pero funciona eficientemente en traducción de proteína en Escherichia coli. Ver, por ejemplo, L. Wang, T.J. Magliery, D. R. Liu, P. G. Schultz, "A new funtional suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA sintetasa pair for the in vivo incorporation of unnatural antino acids into proteins" (Un nuevo par tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa supresor funcional para la incorporación in vivo de amino ácidos no naturales en proteínas) , Am. Chem. Soc . 122:5010-5011 (2000). Además, el Methanococcus jannaschii TyrRS, que solo tiene un dominio de enlace-bucle-anticodón minimalista no aminoacila tRNAs de Escherichia coli, pero aún aminoacila eficientemente su propio tRNATyrCUA supresor. Ver, por ejemplo B. A. Steer, P. Schimmel, "Major anticodcn-binding región missingfrom an archaebacterial tRNA sintetase" (Mayor región de enlace anticodón que carece de una tRNA sintetasa arquibacteriana) , J. Biol . Chem. 274 (1999) 35601-35606; y Wang y colaboradores , (2000) , arriba.

[0228] Para probar la ortogonalidad de este tRNA supresor en Esch.erich.ia coli, un codón ámbar se introduce en un sitio permisivo (Alai84) en el gen beta-lactamasa. Ver por ejemplo, D. R. Liu, P. G. Schultz, "Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code" (Avance hacia la evolución de un organismo con un código genético expandido) , Proc . Nati . Acad. Sci. USA 96:4780-4785 (1999) . Estos tRNAs que pueden cargarse por Escherichia coli sintetasas, suprimir.án el codón ámbar y permitirán que las células vivan en la presencia de ampicilina. Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA suprime el codón ámbar en el gen beta-lactamasa con un valor IC50 de 56 µg/ml de ampicilina. Ver Wang y colaboradores, (2000) , arriba. En contraste, el tRNAGlnCUA ortogonal derivado de Saccharomyces cervisiae tRNAGln2 tiene un IC50 de 21 µg/ml de ampicilina, cuando se prueba en el mismo ensayo. Ver Liu & Schultz, (1999), arriba. El, IC50 para Escherichia coli en la ausencia de cualquier tRNA supresor es 10 µg/ml de ampicilina. Este resultado muestra que Methanococcus j nnaschii tRNATyrCUA es un mejor substrato para las sintetasas de Escherichia coli que tRNAGInCUA. Consecuentemente, si el Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA se utiliza in vivo para suministrar amino ácidos no naturales en proteínas en Escherichia coli, también puede cargarse mal con amino ácidos naturales por Escherichia coli sintetasas, lo que lleva a incorporación de amino ácidos heterogéneos .

[0229] La mejora de la ortogonalidad de Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA, se logró por la introducción de "determinantes de reconocimiento negativo" para evitar reconocimiento por Escherichia coli sintetasas endógena. Estas mutaciones no deberán interferir fuertemente con la interacción de tR A con su Methanococcus jannaschii TyrRS connato o el ribosoma. Ya que Methanococcus jannaschii TyrRS carece de la mayoría del dominio de enlace anticodón, ver por ejemplo B. A. Steer, P. Schimmel, nMajor anticodon-binding región missing from an archaebacterial tRNA sintetase" (Mayor región de enlace anticodón que carece de una tRNA sintetasa arquibacteriana) , J. Biol . Chem. 274:35601-35606 (1999) , mutaciones introducidas en el bucle anticodón del tRNA, se espera que tenga un efecto mínimo en reconocimiento de TyrRS . Una biblioteca de bucle anticodón con cuatro nucleótidos aleatorizados, se construyó . Ver Figura 9. Dada las diversas combinaciones y ubicaciones de elementos de identidad para diversos Escherichia coli tRNAs, mutaciones en posiciones adicionales pueden incrementar a probabilidad de encontrar un tR A mutante con las propiedades deseadas. De esta manera, una segunda biblioteca que mutaciones en posiciones no conservadoras en todos los bucles tRNA (biblioteca de todo bucle) también fue construida. Ver Figura 9. Nucleótidos conservados no se aleatorizaron para mantener las interacciones terciarias que estabilizan la estructura en forma "L" del tRNA. Ver, por ejemplo G. Dirheimer, G. eith, P. Dumas, E. Westhof, "Primary, secondary, and tertiary structures of tRNAs" (Estructuras primaria, secundaria y terciaria de tRNAs), en: D. Solí, U. L. RajBhandary (eds.), tRNA Structure, Biosynthesis, and Function (Estructura Biosintésis y Función de tRNA) , ASM Press, Washington, DC, 1995, pp. 93-126; y, R. Giegé, M. Sissler, C. Florentz, "Universal rules mid idiosyncratic features in tRNA identity" (Reglas universales y características idiosincrasias en identidad de tRNA) , Nucleic Acids Res . 26:5017-5035 (1998) . Nucleótidos tallo o madre tampoco se mutaron ya que la substitución de un nucleótido tal requiere una mutación compensatoria. Los 11 nucleótidos (C16, C17, U17a, U20, C32, G37, A38, U45, U47, A59, y U60) fueron aleatorizados . Ver, Figura 9. El tamaño teórico de esta biblioteca es aproximadamente 4.19x10s, y una biblioteca con un tamaño de aproximadamente 1.93xl09 unidades formadoras de colonia, se construye para asegurar cobertura completa de una biblioteca mutante.

[0230] Los métodos emplearon una cepa de Escherichia coli, por ejemplo DH10B, que se obtiene de Gibco/BRL. Plásmidos de expresión tRNA supresores se derivaron de un plásmido, por ejemplo pAC123. Ver, por ejemplo D. R. Liu, T. J. Magliery, A Pastmak, P. G. Schultz, "Engineering a tRNA and aminoacyl-tRNA síntetase for the site-specific incorporation of unnatural amino acids ínto proteins ín vivo" (Ingeniería de un tRNA y aminoacil-tRNA sintetasa para la incorporación específica de sitio de. amino ácidos no naturales en proteínas in vivo), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:10091-10097 (1997) . Plásmidos para selecciones negativas se derivaron de plásmidos, por ejemplo pBATS, pYsupA38B2 y pYsupA38B3 como se describe a continuación. Ver, por ejemplo K. Gabriel, .R. cClain, "A set of plasmids constitutively producing different RNA levéis in Escherichia coli" (Un conjunto de plásmidos que producen en forma constitutiva diferentes niveles de RNA en Escherichia coli), . Mol . Biol . 290 (1999) 385-389; y, Liu & Shultz, (1999) , arriba .

[0231] Para seleccionar un miembro de la biblioteca tR A de Methanococcus jannaschii con ortogonalidad mejorada, una combinación de selecciones negativas y positivas en la ausencia y presencia de sintetasa connato, se empleó. Ver Figura 8. En la selección negativa, codones selectores, por ejemplo ámbar sin sentido, se introducen en un gen marcador negativo, por ejemplo un gen tóxico, por ejemplo en una posición no esencial. Cuando un miembro de la biblioteca tRNA mutada, por ejemplo supresor, se aminoacila por sintetasas endógenas (por ejemplo Escherichia coli) (es decir no es ortogonal a las sintetasas de Escherichia coli) , el codón selector se suprime y el producto de gen tóxico producido lleva a muerte celular. Solo células que alojan tRNAs ortogonales o tRAs no funcionales pueden sobrevivir. Todos los supervivientes luego se someten a selección positiva en donde un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, se coloca en un marcador de selección positiva, por ejemplo un gen de resistencia a droga por ejemplo en una posición no esencial. tRNAs luego se eligen por su habilidad para aminoacilarse por la sintetasa connato coexpresada e insertar un amino ácido en respuesta a este codón ámbar. Células que alojan tRNAs no funcionales o tRNAs que no pueden ser reconocidos por la sintetasa de interés, serán sensibles a antibióticos. Por lo tanto, solo tRNAs que (1) no son substratos para sintetasas de Escherichia coli endógenas ; (2) pueden aminoacilarse por la sintetasa de interés; (3) que son funcionales en traducción, sobrevivirán ambas selecciones.

[0232] Una selección negativa se elige que aprovecha las toxicidad de barnasa cuando se produce en Escherichia coli en la ausencia de su inhibitor natural barstar. Ver, por ejemplo, R.W. Hartley, Barnase & barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease (Barnasa y barstar. Expresión de su inhibidor clonado permite expresión de una ribonucleasa clonada), J. Mol. Biol . 202:913-915 (1988) . Codones ámbar se introdujeron en posiciones no esenciales en el gen barnasa con base en análisis de la estructura tri-dimensional de barnasa. Ver, por ejemplo Liu y Schultz, (1999) , arriba. Debido a la autotoxicidad extrema de barnasa, un origen pSClOl de bajo número de copias se coloca en el plásmido que expresa barnasa. Además, diferentes números de codones ámbar se prueban para modular la severidad de la selección. El plásmido pSCB2 se utiliza para expresar un mutante barnasa con dos codones de parada ámbar en Gln2 y Asp44; el plásmido pSC133 contiene un codón de parada ámbar adicional en Gly65.

[0233] Para selección negativa, un fragmento PCR que contiene el gen beta-lactamasa y el origen pSClOl, se genera a partir de pBATS utilizando los siguientes oligonucleótidos : LW115, 5'- ATGCATGCTGCATTAATGAATCGG CCAACG-3 ' ; L 116,5'- TCCCCGCGGAGGTGGCACTTTTCGGGG-31. DMA que codifica barnasa que contiene dos codones ámbar (residuos Gln2 y Asp44) o tres (residuos Gln2 , Asp44 y Gly65) , se obtuvieron de pYsupA38B2 y pYsupA38B3, respectivamente por digestión con Sacll y Sphl . La ligación de los fragmentos anteriores produce los plásmidos pSCB2 y pSCB3. La expresión de barnasa fue bajo inducción de arabinosa. Genes que codifican diferentes tRNAs supresores para expresión in vivo, se construyeron a partir de dos oligonucleótidos sintéticos superpuestos (Operon, Alameda, CA, USA) por extensión Klenow e insertaron entre los sitios EcoRl y PstI de pAC123 para generar pAC-YYGl y pAC-JTY, respectivamente, colocando transcripción bajo control del promotor Ipp y el terminador rmC. pAC-Crn es el plásmido de control sin ningún tR A. Para optimizar las condiciones de selección negativa, células DH10B competentes que alojan pSCB2 o pSCB3 se transformaron por electroporación con pAC-Cm, pAC-YYGl, y pAC-JY, separadamente. Colonias sencillas se recolectaron y desarrollaron en 2xYT con cloranfenicol (Cm, 34 µg/ml) y ampicilina (Amp, 100 /ug/ml) . Cultivos celulares desarrollados durante la noche, se lavaron dos veces con medio mínimo que contiene glicerol al 1% y 0.3 mM de leucina (GMML) , y resuspendieron en GMML con Cm y Amp a un OD600 de 0.1. Después de recuperar a 30°C por 10 minutos en un cultivo (conjunto 1) se agregan 20 mM de arabinosa para inducir la expresión de barnasa; no se agregó arabinosa al segundo cultivo (conjunto 2) . A diferentes puntos en tiempo, una pequeña cantidad de cultivo celular se diluyó y revistió en agar 2xYT con Cm y Amp, para medir densidad celular. Para selecciones negativas de las bibliotecas tR A supresoras, los plásmidos pAC que contienen la biblioteca, se transformaron en células DH10B que alojan pSCB2. Las células se neutralizaron por adición de medio SOC y recuperaron a 30°C por 1 hora, luego se lavaron con amortiguador fosfato y GMML y cultivaron en 1 1 de GMML. Después de recuperar a 30°C por 30 minutos, Cm, Amp, y arabinosa 20 mM, se agregaron. Después de 36 horas, se nodulizaron las células y plásmidos pAC se aislaron y purificaron por electroforésis en gel de agarosa.

[0234] Para optimizar las condiciones de selección, dos tR As supresores se emplearon que se conoce son de icientemente reconocidos por las sintetasas de Escherichia coli. Un supresor mutante tRNATyr derivado de Saccharomyces cervisiae (sc-tRNATyrCUA, expresado en pAC-YYGI) suprime el codón ámbar (Alal84TAG) en el gen beta-lactamasa, produciendo un valor IC50 de 12 9/p?1 de ampicilina para células de Escherichia coli; y el supresor tRNATyr derivado de Methanococcus jannaschii (mj -tRNATyrCUA, expresado en pAC-JY) produce un ICS0 de 56 µ9/?t?1 de ampicilina para células hospederas. Ver, por ejemplo Wang y colaboradores, (2000) , arriba. Para comparación, el supresor tRNAGlnCUA derivado de Saccharomyces cervisiae tRNAGln2 tiene una IC50 de 21 µg/ml de ampicilina cuando se prueba en el mismo ensayo, y se ha demostrado que es ortogonal a Escherichia coli sintetasas in vitro e in vivo. Ver, por ejemplo Liu & Schultz, (1999) , arriba. Por lo tanto, una selección negativa que elimina células que expresan mj -tRNATyrCUA, pero permite el crecimiento de células que expresan sc-tRNATyrCUA, elimina tRNAs supresores no-ortogonales . Se desarrollaron células en medio mínimo líquido que contiene 1% de glicerol y leucina 0.3 mM (GMML) con antibióticos apropiados para mantener plásmido pSCB2 y el plásmido pAC. Se agregó arabinosa a un juego de células (conjunto 1) para inducir la expresión de la barnasa, mientras que en el conjunto 2 no se agregó arabinosa. La fracción de células que sobreviven la selección, se determinó por la proporción de densidades celulares en el conjunto 1 respecto al conjunto 2. Ver Figura 11: células que alojan el plásmido de control pAC-Cm (sin tRNA supresor) y el plásmido pACYYGI, sobrevivieron, mientras que células que alojan el plásmido pAC-JY substancialmente murieron. Cuando el plásmido pSCB3 se empleó, células que alojan el plásmido pAC-JY empezaron a crecer en 24 horas. Por lo tanto, la selección negativa se llevó a cabo utilizando pSCB2, que codifica el gen barnasa que contiene dos codones ámbar bajo las condiciones anteriores para la selección de biblioteca.

[0235] Para selección positiva, un plásmido, por ejemplo pBLAM-JYRS, se construye al insertar el gen Methanococcus jannaschii TyrRS de pDSA50 entre los sitios Ndel y PstI de PBLAM-YQRS utilizando los oligonucleótidos LW104 , 5 ¦ -GGAATTCCATrAGGACGAATf GAAATG-3 ' ; y LW105 , 51 -AAACTGCAGTTATAATCTCTTTCTAATTGGCTC-3 ' . Ver, por ejemplo Steer, y colaboradores, (1999) , arriba; y Liu y Schultz, (1999) , arriba. Para optimizar las condiciones de selección positiva, células DHIOB competentes que alojan pBLAM-JYRS, se transformaron con pAC-Cm, pAC-YYGl, y PAC-JY, separadamente. Colonias sencillas se recogieron y desarrollaron en 2xYT con Cm y tetraciclina (Tet, 40 ?mi) . En selecciones liquidas, cultivos celulares durante la noche se diluyeron en 2xYT con Cm y Tet a un OD600 de partida de 0.1. Diversas concentraciones de Amp se agregaron y se supervisó el crecimiento celular por OD600. En selecciones de placa, aproximadamente 103 a 105 células se revistieron en dos juegos de placas de agar 2xYT que contienen Cm y Tet, un juego de las cuales contiene 500 µg/ml de Amp. Para selecciones que involucran la biblioteca tRNA mutante, pl smidos pAC aislados de las células de la selección negativa, se transformaron en células DH10B competentes que alojan pBLAM-JYRS . Se recuperaron células a 37°C por 45 minutos, y aproximadamente 105 células se revistieron en cada placa de agar 2xYT que contiene Cm, Tet y 500 ED/ml de Amp. Después de 24 horas, se recolectaron colonias y volvieron a crecer en 6 mi de 2xYT que contiene Cm, Tet y 200 //g/ml de Amp. DNA se aisló y el plásmido pAC se purificó por electrofor sis en gel de agarosa.

[0236] La selección positiva se basa en supresión de un codón de parada ámbar introducido en la posición Alal84 en el gen beta-lactamasa TEM-1. El plásmido pBLAM-JYRS codifica el gen para la tirosil-tR A sintetasa de Methanococcus jannaschii y una betalactamasa con una mutación ámbar en Alal84. Plásmidos pAC que se aislaron de células que sobreviven la selección negativa se co-transformaron con pBLAM-JYRS en células DH10B de Escherichia coli. Células que alojan tRNAs no funcionales o tRNAs que son deficientes substratos para la Methanococcus jannaschii sintetasa mueren; aquéllos con tRNAs que pueden cargarse por la sintetasa, sobreviven. Para probar la factibilidad de la selección positiva, se probaron dos tRNAs supresores modelo en la presencia de Methanococcus jannaschii TyrRS . El sc-tRNATyrCUA tiene un par base G1:C72 y no se carga eficientemente por Methanococcus jannaschii TyrRS. Cuando se co-expresaron en células con el mutante betalactamasa ámbar Alal84, las células sobrevivieron a una IC50 de 18 /xg/ml de ampicilina. En contraste, células que contienen Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA y TyrRS connato sobreviven a un IC50 de 1220 ^g/ml de ampicilina. Ver, por ejemplo Wang, y colaboradores, (2000) , arriba. El modelo de selección positiva primero se intentó en medio líquido 2xYT. El crecimiento de células que alojan pBLAM-JYRS y diferentes plásmidos pAC en medio líquido 2xYT con diversas concentraciones de ampicilina se ilustra en la Figura 12, Panel A. Células transformadas con mj -tR ATyrCUA crecieron a una velocidad más rápida y a superiores concentraciones de ampicilina. Si las células se desarrollaron por más de 24 horas, las células transformadas con cualquiera de pAC-Cm o pAC-YYGl también crecieron a saturación. Por lo tanto, la selección positiva se llevó a cabo en placas con densidades celulares iniciales entre 103 y 105 por placa. Ver Figura 12, Panel B. La proporción de supervivencia (número de colonias en placas con ampicilina respecto a placas sin ampicilina) no cambió significativamente con densidades celulares iniciales diferentes, y fue estable sobre el tiempo de crecimiento. La selección positiva en placas de ampicilina resultó en crecimiento preferencial de células con mj -tRNATyrCUA expresado. Por lo tanto, para la selección de biblioteca, la selección positiva se llevó a cabo en placas en lugar de en medio liquido.

[0237] La biblioteca de tRNAs mutantes se generó al utilizar las secuencias de los dos oligonucleótidos translapantes, empleados para construir la biblioteca bucle-anticodón son (la secuencia tRNA resaltada) : L I25, 5 ' -GGAATTC-3 ' ; LW126, 51 -AAAACTGCAG-3 ' (donde N es equimolar de A, C, T o G) . Las secuencias de oligonucleótidos para la biblioteca de toda asa son: LW145, 5 ' -GGAATrC-3 ' y LW146, 51 -AAAACTGCAG-31. Estos genes se insertaron en pAC123 en forma similar a como se describió anteriormente par dar las bibliotecas tRNA.

[0238] Las selecciones negativa y positiva se llevaron a cabo en tándem como se describió anteriormente tanto en las bibliotecas asa-anticodón como toda-asa. Los tRNAs supresores selectos se aislaron y retransformaron en DH10B de Escherichia coli que aloja pBLAM para probar la ortogonalidad de tRNA a sintetasas de Escherichia coli . Los tRNAs luego se retransformaron en pBLAM-JYRS que alojan Escherichia coli para probar que tan eficientemente el tRNA se cargó por TyrRS de Methanococcus jannaschii . El secuenciado de los ciónos que resultan de una vuelta de selección negativa y positiva de la biblioteca asa-anticodón reveló que se aislaron tres tRNAs independientes. Ver Figura 13. Cuando se cotransforman con pBLAM, todos tuvieron valores IC50 inferiores que el tRNATyrCUA de Methanococcus jannaschii , indicando que son más pobres substratos para las sintetasas de Escherichia coli.

[0239] El mutante AA2 también tuvo muy alta afinidad para Methanococcus jannaschii TyrRS. Aunque este tRNA mutante puede mantenerse en forma estable en Escherichia coli, frenó la velocidad de crecimiento de células por razones desconocidas . Este efecto probablemente llevó a la emergencia de los imitantes ??3 y ??4, que ambos tuvieron una mutación fuera de la región de aleatorización. Células que alojan AA3 o AA4 crecieron en forma normal . Sin embargo ??3 y ??4 fueron substratos relativamente pobres para Methanococcus jannaschii TyrRS .

[0240] Cuatro tRNAs independientes se seleccionaron de dos vueltas de selecciones negativas y positivas, utilizando la biblioteca toda-asa. Ver Figura 13. Todos fueron más pobres substratos para la sintetasa de Escherichia coli que Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA, sin embargo aún se cargaron eficientemente por Methanococcus jannaschii TyrRS como se ilustra por el ensayo de beta-lactamasa in vivo. Ver Tabla 2. El valor IC50 para células que se expresan en el mejor mutante, J17, fue 12 µg/ml de ampicilina, que es incluso menor que aquél de células con el tRNAGlnCUA ortogonal derivado de Saccharomyces cerevisiae expresado (21 /¿g/ml de ampicilina) . Cuando J17 se coexpresó con Methanococcus jannaschii TyrRS, las células sobrevivieron a un valor IC50 de 436 /g/ml de ampicilina, proporcionando una ventana de selección (proporción de valor IC50 con TyrRS a valor IC50 sin TyrRS) de 35-veces. Además, la expresión de todos estos tRNAs imitantes no afecta el crecimiento de células de Escherichia coli.

[0241] Tabla 2. Ensayo de beta-lactamasa in vivo de tRNAs supresores selectos tRNA supresor IC50 (//g/ml de ampicilina) Coexpresado con pBLAM Coexpresado con pBLAMJYRS mj-tRNATyrCUA 56 ' 1220 No tRNATyrCUA 10 10 TRNAs mutantes seleccionados de biblioteca asa-anticodón AA2 22 1420 AA3 10 110 AA4 12 135 tRNAs mutantes seleccionados de biblioteca toda-asa tRNAs mutantes que sobreviven ambas selecciones J15 30 845 J17 12 436 J18 20 632 J22 14 459 tRNAs mutantes que sobreviven selección negativa solamente Nll 11 16 NI2 9 18 NI3 ' 10 12 NI6 9 9 El plásmido pBLAM se utiliza para expresar el gen beta-lactama con un codón ámbar en Alal84; el plásmido pBLAM-TYRS expresó el mutante ámbar y Methanococcus jannaschii TyrRS . tRNAs supresores se codificaron en plásmido pAC y cotransformaron con pBLAM o pBLAMJYRS en el ensayo.

[0242] Para confirmar las propiedades de los tRNAs supresores selectos, se probaron en otro ensayo in vivo, con base en la supresión de un codón ámbar en el gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . En contraste con beta-lactamasa, que se secreta en el periplasma, CAT se localiza en el citoplasma. Aún más, ampicilina es bactericida mientras que el cloranfenicol es bacterioestático . Como se ilustra en la Tabla 3 siguiente, los tRNAs supresores selectos también fueron ortogonales en el ensayo CAT, indicando su conveniencia para selecciones TAT. [0243 ] Tabla 3. Ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa in vivo de tR As supresores selectos tRNA Supresor IC50 {µ /ta1 de cloranfenicol) pYC solo pYC+pBK-JYRS mj -tRNATyrCUA 27 308 No tRNATyrCUA 3 3 J15 11 297 J17 4 240 . J18 6 284 J22 5 271 plásmidos pYC codificaron el gen cloranfenicol acetiltransferasa con un codón ámbar en Aspll2 y diferentes tRNAs supresores en lista en la columna izquierda de la tabla. pBK S se empleó para expresar Methanococcus jannaschii TyrRS.

[0244] El ensayo de complementación in vivo que se basa en supresión de un codón ámbar en el gen beta-lactamasa, se llevó a cabo como se describe. Ver, por ejemplo Liu & Schultz, (1999) , arriba; y Wang, y colaboradores, (2000) , arriba. En el ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , un codón ámbar se substituye por Aspll2 en el gen CAT de pACYC184 para dar pAC Dll'2TAG. Ver, por ejemplo M. Pastmak, T.J. Magliery, P. G. Schultz, "A new orthogonal suppressor tRNA/aminoacyl- tRNA sintetase pair for evolving an organism with an expanded genetic code" (Un Nuevo par tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa supresor ortogonal para evolución de un organismo con un código genético expandido), Hely. Chim. Acta 83:2277-2286 (2000) . Los genes que codifican los tR As supresores bajo el control del promotor Ipp y el terminador rrnC se cortaron de plásmidos pAC con Ncol y Aval, e insertaron en pACMD] 12TAG pre-digerido para dar los plásmidos pYC-JY, pYC-Jl5, pYC-Jl7, pYC-J18, y pYC-J22, respectivamente. El plásmido pBK-JYRS, un derivado de pBR322, se empleó para expresar el Methanococcus j nnaschii TyrRS, bajo el control de el promotor y terminador GlnRS de Escherichia coli. La supervivencia de las células DH10B de Escherichia coli transformadas con el plásmido pYC solo o cotransformadas con pYC y pBK-JYRS se tituló contra un amplio rango de concentraciones de cloranfenicol agregado al medio de crecimiento, y valores C50 se interpolaron de las curvas .

[0245] Para comparación, cuatro colonias se recolectaron aleatoriamente que pasaron la selección negativa solamente, y probaron los tRNAs utilizando el ensayo de complementación in vivo. Todos ellos tuvieron muy bajos valores IC50 cuando se transformaron con pBLAM, indicando que la selección negativa trabajó bien. Ver Tabla 2. Los valores IC50 fueron también bajos cuando se cotransformaron con pBLAMJYRS, revelando que la selección positiva funciona para eliminar tRNAs que no pueden cargarse por los Methanococcus jannaschii TyrRS .

[0246] Análisis de las secuencias de DISTA de los tRNAs selectos produce un patrón característico de substituciones de nucleótido. Ver Figura 13. tRNAs que pasaron ambas selecciones negativa y positiva, todos tuvieron C32 y T60 sin cambio, mientras que G37 se mutó en A, y TI7a se mutó a cualquiera de A o G. Algunos cambios semi-conservados incluyen mutación de A38 a cualquiera de C o A; mutación de T45 a cualquiera de T o A; mutación de T47 a cualquiera de G o T. Otras mutaciones no tuvieron patrón común obvio. Veinte (20) tRNAs que pasaron la selección negativa solamente también fueron secuenciados , cuatro de los cuales se ilustra en la Figura 13 , y se encontró que todos carecen al menos una de las mutaciones comunes citadas anteriormente.

[0247] Los nucleótidos preferidos en los tRNAs supresores mutantes selectos, pueden desempeñar los siguientes papeles: (i) pueden funcionar como determinantes negativos para reconocimiento por las sintetasas de Escherichia coli; (ii) pueden ser elementos de identidad para aminoacilación por Methanococcus jannaschii TyrRS; o (iii) también pueden optimizar la interacción de tRNA con maquinaria de traducción de Escherichia coli, para incrementar la eficiencia de supresión del tR A. Vale la pena notar que la mutación G37A encuentra en tRNAs seleccionados tanto de la biblioteca asa-anticodón como toda-asa. Esta mutación es consisten con estudios previos que muestran que adenina en la posición 37 mejora la eficiencia de supresión ámbar. Ver, por ejemplo M. Yarus, "Translational efficiency of transfer RNA's: Use of an expanded anticodón" (Eficiencia de traducción de RNA de transferencia: Uso de un anticodón expandido) , Science 218:646-652 (1982); D. Bradley, J.V. Park, L. Solí, " tRNA2Gln Su+2 mutants that increase a ber codon suppression" (tRNA2Gln Su+2 imitantes gue incrementan supresión ámbar), J. Bacteriol . 145:704-712 (198 1); y L. G. Kleina, 1. asson, J. Normanly, I Abelson, J.H. Miller, "Construction of Escherichia coli amber codon suppressor tRNA genes. II. Synthesis of additional tRNA genes and íniprovement of suppressor efficiency" (Construcción de genes tRNA supresores ámbar de Escherichia coli. II. Síntesis de genes tRNA adicionales y mejora de eficiencia de supresión) , . Mol . Biol . 213:705-717 (1990). Fechter y colaboradores, recientemente reportaron que el conjunto de identidad completa para Methanococcus jannaschii tRNATyr es seis nucleótidos (C1G72, A73 , y anticodón G34U35A36) . Ver P.

Fechter, 1. Rudinger-Thirion, M. Tukalo, R. Giegé, "Major tyrosine identity determinants in Methanococcus jannaschii and Saccharomyces cerevisiae tRNATyr are conserved but expressed differently" (Mayores determinantes de identidad de tirosina en Saccharomyces cerevisiae y Methanococcus jannaschii tRNATyr se conservan pero expresan de manera diferente), Eur. J. Biochem. 268:761-767 (2001). La presencia de C32 y T60 en todos los supresores mutantes selectos, por lo tanto no se requiere para reconocimiento por Methanococcus jannaschii TyrRS . Todos los Escherichia coli tRNA tienen T en la posición 60 excepto cuatro tRNAs que tienen C. Ver, M. Sprinzl, C. Horn, M. Brown, A. Loudovitch, S. Steinberg, " Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes" (Compilación de secuencias de tRNA y secuencias de genes tRNA), Nucleic Acids Res. 26:148-153 (1998) . Con base en la estructura cristalina de tR APhe de levadura, el nucleótido 60 no interactúa con otros nucleótidos. Ver J. L. Sussman, S. R. Holbrook, R. W. Warrant, G. M. Church, S.H. Kim, "Crystal structure of yeast phenylalanine transfer RNA. L Crystallographic refinement" (Estructura cristalina de RNA de transferencia de fenilalanina en levadura. I. Refinamiento cristalográfico), J. Mol. Biol . 123:607-630 (1978) . De esta manera, T60 puede mantener la forma de asa TC para interacción productiva con la maquinaria de traducción de Escherichia coli. El cambio de la estructura de asa TC puede afectar la fidelidad de traducción, ya que la inserción de un nucleótido entre T60 y el C61 conservado permite que una glicina tRNA cambie o desplace el cuadro de lectura. Ver, D. J. O'Mahony, B.H. Hims, S . Tbompsoii , E.J. Murgola, JR Atkins, "Glycine tRNA mutants with normal anticodon loop size cause 1 f ameshifting" (Matantes glicina tRNA con tamaño de asa de anticodon normal provocan 1 cambio de marco de lectura), Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86:7979-7983 (1989) . El papel de C32 no es obvio - posición 32 en Escherichia coli tRNAs incluye T, C, y A, y dos Escherichia coli tRNATyrs tienen C32. Para la posición 17a, solo tRNAThr tiene A en esta posición.

[0248] Todos los tRNAs supresores selectos son más pobres substratos para sintetasas de Escherichia coli respecto al Methanococcus jannaschii tRNATyrCUA, resultando en menos carga errónea cuando se introducen en Escherichia coli. Estos tRNAs también pueden mantenerse en forma estable en Escherichia coli, sin efectos adversos en el crecimiento de células hospederas . Aún más, aún pueden cargarse eficientemente por Methanococcus jannaschii TyrRS . Todas estas propiedades hacen al tRNA supresor mutante junto con el Methanococcus jannaschii TyrRS un par tRNA-sintetasa ortogonal robusto para la incorporación selectiva de amino ácidos no naturales en proteínas, in vivo. El tRNA supresor mutante J17 y un TyrRS mutante de ingeniería, se han empleado para suministrar O-metil-L-tirosina en respuesta a un codón TAG con una fidelidad que rivaliza con la de los 20 amino ácidos comunes. Ver, L. Wang, A. Brock, B. Herbefich, P. G. Schultz, "Expanding the genetic code of Escherichia coli" (Expandiendo el código genético de Escherichia coli), Science 292:498-500 (2001).

[0249] Ejemplo 2- Mutar TyrRS de manera tal que carga el mutRNA Tyr/CUA con un amino ácido no natural, 0-metil-L-tirosina

[0250] Un par de transferencia único R A (tRNA) -aminoacil tRNA sintetasa, se ha generado que expande el número de amino ácidos genéticamente codificado en Escherichia coli. Cuando se introduce en Escherichia coli, este par lleva a la incorporación in vivo del amino ácido sintético O-metil-L-tirosina, agregado en forma exógena al medio de crecimiento, en proteína, en respuesta a un codón sin sentido ámbar. La fidelidad de traducción es mayor que 99%, como se determina por análisis de dihidrofolato reductasa que contiene el amino ácido no natural. Este enfoque proporciona un método general para incrementar el repertorio genético de células vivas, para incluir una variedad de amino ácidos con novedosas estructuras, propiedades químicas y físicas no encontradas en los veinte amino ácidos comunes .

[0251] Un par tRNA/sintetasa ortogonal en Escherichia coli, puede generarse al importar un par de un organismo diferente, si es ineficiente aminoacilación de especies cruzadas o a través de especies, y opcionalmente el codón anti-asa no es un determinante clave de reconocimiento de sintetasa. Un par candidato tal es el par tirosil tRNA/sintetasa de Methanococcus jannaschii (Methanococcus jannaschii) , una arquibacteria cuyos elementos de identidad tRNATyr difieren de aquéllos de Escherichia coli tRNATyr (en particular, el primer par base del tallo aceptor es GC en Escherichia coli y CG en Methanococcus jannaschii) , y cuya tirosil sintetasa (TyrRS) tiene solo un dominio de enlace de asa anticodón minimalista. Ver por ejemplo, B. A. Steer, & P. Schimmel, J. Biol . Chem. 274:35601-6 (1999). Además, el Methanococcus jannaschii TyrRS no tiene un mecanismo de edición, ver por ejemplo, Jakubowski & Goldman, Microbiol. Rev. 56:412 (1992), y por lo tanto no deberá revisar (proofread) un amino ácido no natural ligado al . tRNA. El Methanococcus jannaschii TyrRS aminoacila eficientemente un tRNA supresor ámbar derivado de su tRNATyr connato, ver por ejemplo, ang, y colaboradores, (2000 J. Am. Chem. Soc . arriba, pero no aminoacila Escherichia coli tRNAs, ver por ejemplo, Steer & Schimmel, (1999), arri-ha. Aún más, el Methanococcus jannaschii tRNATyrCuA/ es un deficiente substrato para las sintetasas de Escherichia coli pero funciona eficientemente en traducción de proteína en Escherichia coli. Ver, por ejemplo, Wang, y colaboradorres, (2000 J. Am. Chem. Soc . , arriba.

[0252] Para reducir adicionalmente reconocimiento del tRNA ortogonal , Methanococcus jannaschii tR ATyrcuAí por Escherichia coli sintetasas, once nucleótidos del tRNA que no interactúan directamente con el Methanococcus jannaschii TyrRS (C16, C17, U17a, U20, C32, G37, A38, U45, U47, A59 y U60) se mutaron aleatoriamente para generar una biblioteca de tRNA supresor. Esta biblioteca tRNA se pasó a través de selección negativa (por ejemplo supresión de mutaciones ámbar en un gen reportero tóxico, por ejemplo gen barnasaj , que retira tRNAs que se aminoacilan por sintetasas de Escherichia coli, y luego una selección positiva para tRNAs que se aminoacila eficientemente por Methanococcus jannaschii TyrRS (por rejemplo supresión de mutaciones ámbar en un gen reportero, por ejemplo gen beta-lactamasa) .

[0253] La naturaleza ortogonal de los tRNAs supresores resultantes se probó por un ensayo de complementación in vivo, que se basa en supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (por ejemplo Alal84) de un gen reportero en un vector, por ejemplo el gen beta-lactamasa TEM-1 transportado en el plásmido pBLAM. La aminoacilación de un tR A supresor transformado por cualquier sintetasa de Escherichia coli endógena, resulta en crecimiento celular en la presencia de ampicilina. Escherichia coli transformada con Methanococcus jannaschii tR ATyrCuA y la construcción de reportero, pBLAM, sobreviven a 55 /g/mL de ampicilina. Cuando el mejor tRNA supresor mutante (mtRNAYrCuA) selecto de la biblioteca se expresó, las células sobrevivieron a solo 12 /g/mL de ampicilina; se obtienen valores similares en la ausencia de cualquier tRNA supresor. El tRNA supresor mutante contiene las siguientes substituciones de nucleótido: C17A, U17aG, U20C, G37A, y U47G. Cuando la Methanococcus jannaschii TyrRS se coexpresa con mtRNATyrCrow las células sobreviven a 440 /g/mL de ampicilina. Hay que notar que mtRNATyrCuA es un más pobre substrato para las sintetasas endógenas que el Methanococcus jannaschii mtRNATyrCuA pero aún se aminoacila eficientemente por la Methanococcus jannaschii TyrRS .

[0254] Para alterar la especificidad de amino ácido de la TyrRS ortogonal de manera tal que cargar el mtRNATyrcuA con un amino ácido no natural deseado, se genera y tamiza o supervisa una biblioteca de TyrRS mutantes . Con base en la estructura cristalina del TyrRS homólogo de Bacillus stearothermophilus, ver por ejemplo, P. Brick, T. N. Bhat, D. M. Blow, J. Mol. Biol ¦ , 208:83 (1988) , cinco residuos (Tyr32, Glu107, Asp158, lie159 y Lúe162) en el sitio activo de Methanococcus ja.nna.schii TyrRS que están dentro de 6.5 angstroms de la posición para del anillo arilo de tirosina ligado, se mutaron. Ver, Figura 14. Estos resultados todos se mutaron inicialmente a alanina, y la Ala5 TyrRS inactiva resultante se empleó como una plantilla para mutagenesis aleatoria de reacción de cadena polimerasa (PCR polymerase chain reaction) con oligonucleótidos adulterados . ·

[0255] Por ejemplo, el gen TyrRS se expresó bajo el control del promotor y terminador Escherichia coli GlnRS en plasmido pBK-JYRS, un plásmido derivado de pBR322 con resistencia a canamicina. Los residuos Tyr32, Glu107, Asp158, lie159 y Leu162 se substituyeron con Ala mediante mutagenesis dirigida por sitio para proporcionar el plásmido pBK-JYA5. Ocho (8) oligonucleótidos con N K (N=A + T + G + C y K= G + T, y M= C ÷ A), por ejemplo oligonucleótidos LW157 5 ' -GGAATTCCATATGGACGAATTTGAAATG-3 ' , LW164 51 - GTATTTTACCACTTGGTTCAAAACCTAT NAGCAGATTTTTCATCTTTTTTTCATC TTTTTTTAAAAC-31 , LWI59 5 ' -TAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATAC-3 ' , LW165 51 -CATTCAGTGTATAATCCTTATCAAGCTGGAAMNNACTTCCATAAACAT ATTTTGCCTTTAAC-31 , ' LW161 5'- TCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATG-3 ' , LW167 51 - CATCCCTCCAACTGCAACATCAACGCCMNNATAATC TGGATAGATAAC-31 , LW163 5 ' -GCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATG-3 ' , y LW105 51 -AAACTGCAGTTATAATCTCTTTCTAATTGGCTC-3 ' (Operon, CA) en los sitios de mutación, se emplearon para amplificación PCR del mutante Ala5 TyrRS (pBK-JYA5) y ligaron de regreso en el pBK-JYA5 digerido con Ndel-PstI, para lograr la biblioteca TyrRS. Los vectores ligados se transformaron en células competentes DH10B Escherichia coli para dar una biblioteca de 1.6 X 169 unidades formadoras de colonia (cfu) . Los genes TyrRS de 40 colonias recolectadas aleatoriamente fueron secuenciados para confirmar que no hubo sesgo de base en las posiciones N K aleatorizadas y ninguna otra mutación inesperada. La biblioteca se amplificó por maxiprep, y DNA superhelicoidal se empleó para transformar la cepa de selección pYC-J17.

[0256] Una selección positiva luego se aplicó a la biblioteca de TyrRS ortogonal mutado, que se basa en supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (por ejemplo Aspll2) en el gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . Ver, por ejemplo, M. Pastmak, T.J. Magliery, P. G. Schultz, Hely. Chim. Acta, 83:2277 (2000) . Células transformadas con la biblioteca TyrRS mutante y el gen mtRNATyrCuA, se desarrollaron en medio que contiene el amino ácido no natural y seleccionaron por su supervivencia en la presencia de diversas concentraciones de cloranfenicol . Si un TyrRS mutante carga el mtRNATyrCUA ortogonal con cualquier amino ácido, ya sea natural o no natural, la célula produce CAT y sobrevive. Las células supervivientes luego se desarrollaron en la presencia de cloranfenicol y en la ausencia del amino ácido no natural. Aquellas células que no sobreviven, por ejemplo que codifican TyrRSs mutantes que cargan el mtRNATyrCuA ortogonal con un amino ácido no natural, se aislaron de una placa de réplica suplementada con el amino ácido no natural . Los genes TyrRS mutantes se aislaron de estas células, recombinaron in vitro por entremezclado de DNA, y transformaron de nuevo en Eschierichia coli para adicionales vueltas de selección con concentraciones incrementadas de cloranfenicol .

[0257] Un análogo de tirosina con el grupo para hidroxilo substituido con el grupo metoxi, se empleó en la selección. Opcionalmente , otros análogos de tirosina también pueden emplearse en la selección, por ejemplo análogos de tirosina con diferentes grupos funcionales en la posición para del anillo arilo (acetilo, amino, carboxilo, isopropilo, metilo, O-metilo y nitro, etc.). Por ejemplo, el gen que codifica mtKNATyrCuA se expresa en células DH10B de Escherichia coli bajo el control del promotor lpp y el terminador rmC en el plasmido pYC-J17, un derivado pACYC184 que también codifica el mutante Aspi12 TAG CAT. DNA superhelicoidal que codifica la biblioteca TyrRS se transformó en células competentes DH10B de Escherichia coli que contienen pYC-J17 para dar por resultado una biblioteca con tamaño mayor a 3 X 109 cfu, asegurando cobertura completa de la biblioteca original. Células luego se revistieron en placas de medio mínimo que contienen 1% de glicerol y leucina 0.3 mM (GMML) con 17 ^g/mL de tetraciclina (Tet) , 25 g/mL de canamicina (Kan) , 50 µg/mL de cloranfenicol (Cm) , y amino ácido no natural 1 mM. Después de incubación a 37°C por 44 horas, colonias en placas suministradas con O-metil-L-tirosina se recolectaron, se aislaron plásmidos y retransformaron en células competentes DH10B de Escherichia coli que contienen pYC-J17, y las células transformadas se seleccionan positivamente en 50 g/mL de Cm. Colonias (96) se recogieron individualmente de la placa, diluyeron en 100 µ]_? de medio GMM líquido, y rayaron sobre dos juegos de placas Kan/Tet GMML con diversas concentración de Cm. No se agregó O-metil-L-tirosina al juego de placa 1 y la concentración de Cm se varió de 10 - 25 ^g/mL; el juego de placa 2 contiene O-metil-L-tirosina ImM y 50 /g/mL de Cm. Réplicas de colonias que no crecen en 15 g/mL de Cm en el juego de placa 1 se recogieron del juego de placa 2. Plásmidos que contienen el gen TyrRS se purificaron y recombinaron in vitro por mezclado de DNA utilizando el protocolo de Stemmer excepto por Mn2+ 10 mM en lugar de Mg2+ en la reacción de fragmentación. Ver, W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y I. A. Lorimer, 1. Pastan, Nucleic Agids Res . 23, 3067-8 (1995). La biblioteca luego se volvió a ligar en el vector pBK-JYA5 predigerido para dar por resultado una biblioteca TyrRS de segunda generación con un tamaño típico de 8 X 108 a 3 X 109 cfu, treinta miembros selectos aleatoriamente de la biblioteca se secuenciaron. La velocidad mutagénica introducida por mezclado de DNA fue 0.35%. Esta biblioteca se transformó en la cepa de selección para la siguiente vuelta de selección seguida por mezclado. La concentración de Cm en la selección positiva y en el juego de placa 2 se eleva a 80 ^g/mL para la segunda vuelta y 120 /ig/mL para la tercer vuelta; la concentración de Cm en el juego de placa 1 estuvo sin cambio. Después de tres vueltas de mezclado de DNA, las colonias empezaron a desarrollarse en 20 - 25 ¿g/mL de Cm en el juego de placa' 1, indicando que los mutantes TyrRS están aceptando amino ácidos naturales como substratos. Por lo tanto, el mejor clon selecto después de dos vueltas de mezclado de DNA fue caracterizado en detalle.

[0258] Dos vueltas de selección y mezclado de DNA se llevaron a cabo y un clon se desarrolló cuya supervivencia en cloranfenicol dependió de la adición de O-metil-L-tirosina 1 mM al medio de crecimiento. En la ausencia de O-metil-L-tirosina, células que alojan en TyrRS mutante, no fueron viables en las placas de medio mínimo que contienen 1% de glicerol, leucina 0.3 mM (GMML) y 15 µ /mL de cloranfenicol . Las células fueron capaces de desarrollarse en placas GMML con 125 /¿g/mL de cloranfenicol en la presencia de O-metil-L-tirosina 1 mM. Resultados similares se obtienen en GMML líquido. Como un control, células con mtRNATyrCuA y Ala5 TyrRS inactivo no sobreviven a la concentración más baja de cloranfenicol empleado, ya sea en la presencia o ausencia de O-metil-L-tirosina 1 mM. Ver Figura 14. La adición de O-metil-L-tirosina 1 mM misma no afecta significativamente la velocidad de crecimiento de Escherichia coli .

[0259] El análisis de la secuencia de TyrRS mutante que carga el mtRNATyrcuA con O-metil-L-tirosina reveló las siguientes mutaciones: Tyr32->Gln32, Asp158->Ala158, Glu107->Thr107, y Leu162->Pro162. Ver Figura 14. Con base en la estructura cristalina de rayos-X del B. stearothermophílus TyrRS homólogo, la pérdida de la red de enlace de hidrógeno entre Tyr32, Asp158 y substrato tirosina puede desfavorecer el enlace de tirosina a la TyrRS mutante. En su lugar, la mutación de Asp176 (que corresponde a Asp158 en Methanococcus jannaschii) de B. stearothermophílus TyrRS produce enzima inactiva. Ver, por ejemplo G.D.P. Gray, H.W. Duck orth, A. R. Fernst, FEBS Lett . 318:167 (1993) . Al mismo tiempo, las mutaciones Asp158->Ala158 y Leu162->Pro162 crean una bolsa hidrofóbica que permite al grupo metilo de O-metil-L-tirosina extenderse más en la cavidad de enlace-substrato. Otros residuos catalíticos importantes en el sitio activo, que ligan a la ribosa o el grupo fosfato de adenilato, estuvieron sin cambio después de dos pasos o vueltas de mezclado de DNA.

[0260] Cinética de formación de adenilato de O-metil-L-tirosina y tirosina con adenosina trifosfato (ATP) catalizado por el TyrRS mutante, se analizaron in vi tro utilizando un ensayo e intercambio de pirofosfato a 37°C. Por ejemplo, el gen TyrRS mutante con seis histidinas en su extremo C, se clonó en el plásmido pQE-60 (Qiagen, CA) para generar el plásmido pQE-mJY S. Se purificó proteína por cromatografía de afinidad de metal inmovilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen, CA) . Intercambio de pirofosfato (PPi) se llevó a cabo a 37°C en una mezcla de reacción que contiene TrisHCl 100 mM (pH7.5), KF 10 mM, MgC12 5mM, ATP 2mM, NaPPi 2mM, 0.1 mg/mL de albúmina de suero bovino, aproximadamente 0.01 Ci/µL de [32P]NaPPi, y diversas concentraciones de tirosina u O-metil-L-tirosina . Las reacciones se iniciaron con la adición del mutante purificado TyrRS, y se tomaron periódicamente alícuotas y neutralizaron con NaPPi 0.2 M, ácido perclórico 7%, y carbón activado al 2%. El carbón se filtró y lavó con NaPPi 10 mM (pH2) , luego midió por conteo de destelleo para determinar los niveles 32P en ATP adsorbido en carbón. Valores de kcat y ¾i calcularon por ajuste directo de la ecuación Michaelis-Menten, utilizando análisis de regresión no lineal.

[0261] La constante de Michaelis (¾) para tirosina (5833 +/- 902 DM) es aproximadamente 13 -veces superior que para O-metil-L-tirosina (443 +/- 93 DM) , y la constante de velocidad catalítica (kcat) para tirosina (1.8 +/- 0.2 X 10"3 s"1) es ocho veces menos que para O-metil-L-tirosina (14 +/- 1 X 10~3 s"1) . De esta manera, el valor de kcat/km del TyrRS mutante para O-metil-L-tirosina es aproximadamente 100-veces superior que para tirosina. La concentración fisiológica de tirosina en Escherichia coli es aproximadamente 80 DM, que es muy inferior al valor Km (5833 DM) del TyrRS mutante para tirosina. Supuestamente, la concentración de O-metil-L-tirosina en células es comparable o mayor que (443 ?M) .

[0262] Este ejemplo muestra que es posible aumentar la maquinaria biosintética de proteina de Escherichia coli, para acomodar adicionales amino ácidos genéticamente codificados. La capacidad de introducir' amino ácidos novedosos en proteínas directamente en células vivas proporcionará nuevas herramientas para estudios de función celular y de proteína y puede llevar a generación de proteínas con propiedades mejoradas en comparación con proteínas de origen natural . Los métodos aquí descritos pueden aplicarse a otros amino ácidos con novedosas propiedades espectroscópicas, químicas, estructurales o semejantes. Ribosoma de Escherichia coli se ha mostrado que es capaz de incorporar amino ácidos con un amplio conjunto de cadenas laterales en proteínas utilizando síntesis de proteínas in vitro. Ver, por ejemplo C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, Science 244, 182-8 (1989) .

Pares tRNA/sintetasa ortogonal adicionales, ver por ejemplo, D. R. Liu, P. G. Schultz, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 96, 4780-5 (1999); y, A. K. Ko al, C. Ko rer, U.L., RajBhandary, Proc. Nati. Acad. Sci, U.S.A., 98:2268 (2001) , al igual que cuatro codones base, ver por ejemplo, T. J. Magliery, J. C. Anderson, P. G. Schultz, J. Mol. Biol . 307:755 (2001); y, B. Moore, B. C. Persson, C. C. Nelson, R. F. Gesteland, J. F. Atkins, J. Mol .

Biol . , 298:195 (2000), y otros codones selectores aquí descritos, pueden adicionalmente expander el número y alcance de amino ácidos que pueden ser incorporados . Pares ortogonales para células eucarióticas también pueden ser generados por los métodos aquí expuestos.

[0263] Ver también la solicitud de patente correspondiente "In vivo incorporation of unnatural amino acid" (Incorporación de amino ácidos no naturales In vivo) expediente de agente número 54-000120PC/US que aquí se incorpora por referencia. Esta solicitud describe un ejemplo de la generación de un mutante O-metil-L-tirosina de dihidrofolato reductasa (DHFR) utilizando el sistema anteriormente descrito.

[0264] Ejemplo 3- utar TyrRS de manera tal que carga el mutRNA Tyr/CUA con un amino ácido no natural, L-3- (2-Naftil) alanina

[0265] Este ejemplo proporciona otro par ortogonal que puede emplearse para incorporar un segundo amino ácido no natural, L-3- (2-Naftil) alanina en proteínas en un organismo, por ejemplo Escherichia coll. Un ejemplo de los métodos empleados para generar el par ortogonal que incorpora el amino ácido no natural en proteínas, se describe a continuación. Más detalles que describen la incorporación del amino ácido no natural en una proteína, pueden encontrarse en la solicitud de patente correspondiente "In vivo incorporation of unnatural amino acid" expediente de agente 54-000120PC/US incorporada aquí por referencia.

[0266] Un codón de parada ámbar y su supresor tRNA ámbar ortogonal correspondiente, tRNtyrCUA, se seleccionaron para codificar un amino ácido no natural. Como se describió anteriormente, y ver Wang & Schultz, Chem. Biol. 8:883-890 (2001) . La Methanococc s jannaschii tirosil-tR A sintetasa (TyrRS) ) , se empleó como el punto de partida para la generación de una sintetasa ortogonal con especificidad de amino ácido no natural. Esta TyrRS no aminoacila ninguna Escherichia coli tR As endógeno, ver por ejemplo, Steer & Schimmel, J.Biol. Chem., 274:35601-35606 (1999), pero aminoacila el mu tRNATyrcuAf con tirosina. Ver por ejemplo, Wang, Magliery, IAu, Schultz, J. Am. Chem. Soc, 122:5010-5011 (2000) . L-3- (2-naftil) -alanina se seleccionó para este estudio ya que representa una perturbación estructural significante de la tirosina y puede tener novedosas propiedades de empaque. Para cambiar la especificidad de amino ácido del TyrRS de manera tal que . carga mu tRNATYrCUA/ con L-3 - (2-naftil) -alanina y no. cualesquiera 20 amino ácidos comunes, se generó y tamizó una biblioteca de mutantes Methanococcus jannaschii TyrRS. En base al análisis de una estructura de cristal de la TyrRS homologa de Bacillus stearothermophilus, ver, Brick, Bhat, Blow, J. Mol. Biol . 208:83-98 (1989), cinco residuos (Tyr32, Asp158, lie159 , Leu162, y Ala157) en el ¦ sitio activo de Methanococcus jannaschii TyrRS que están dentro de 7 angstroms de la posición para del anillo arilo de tirosina, se mutaron. Ver Figura 15. No se seleccionaron sintetasas específicas para L-3- (2- naftil) alanina de la biblioteca TyrRS mutante reportada por Wang, Brock, Herberich, Schultz, Science 292:498-500 (2001) . Para reducir la contaminación de sintetasa tipo silvestre en la siguiente selección, estos residuos (excepto Ala167) primero todos se mutaron a alanina. El gen Alas TyrRS inactivo resultante se emplea como una plantilla para mutagénesis aleatoria con reacción de cadena polimerasa (PCR) con oligonucleótidos que contienen mutaciones aleatorias en los sitios correspondientes .

[0267] La biblioteca TyrRS mutante se pasó primero a través de una selección positiva con base en supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (Asp112) en el gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . Células transformadas con la biblioteca TyrRS mutante y el gen mu tRNATyrCuA se desarrollaron en medio mínimo que contiene L-3- (2-naftil) -alanina 1 MM y 80 //g/mL de cloranfenicol . Las células pueden sobrevivir solo si una TyrRS mutante aminoacila mu tRNA^cua. con cualquiera de los amino ácidos naturales o L-3- (2-naftil) -alanina. Las células supervivientes luego se desarrollaron en la presencia de cloranfenicol y la ausencia del amino ácido no natural . Aquéllas células que no sobreviven deben codificaron un TyrRS mutante que carga mu tRKTA^cua con L-3- (2-naftil) -alanina, y se recolectaron de una placa de réplica suministrada con el amino ácido no natural. Después de tres vueltas de selección positiva seguidas por un tamizado negativo, cuatro TyrRS se caracterizaron utilizando un ensayo in vivo con base en la supresión del codón Asp112TAG en el gen CAT.

[0268] Tabla 4 Ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa in vivo de TyrRS mutante TyrRS mutante IC50 (^g/mL de cloranfenicol) No L-3- (2-naftil) -Ala' **¿Add L-3- (2-naftil) -Ala no TyrRS 4 4 wt TyrRS 240 240 Después de selección 51-TyrRS 30 120 52-TyrRS 30 120 S3-TyrRS 25 110 S4-TyrRS 35 100 Después de DNA mezclado SS12 -TyrRS 9 150 aUn plásmido pYC-J17 se emplea para expresar el gen mu tR ATyrCuA y el gen cloranfenicol acetiltransferasa con un codón de parada ámbar en Aspll2. Un plásmido pBK se emplea para expresar TyrRS, y se cotransformó con pYC-J17 en DH10B de Escherichia coli . Supervivencia de células en placas GMML se tituló en la presencia de diferentes concentraciones de cloranfenicol .

[0269] En la ausencia de L-3- (2-naftil) -alanina, células que expresan TyrRS selecto y mu tRNATYrCUA sobrevivieron en 25 a 35 /zg/mL de cloranfenicol en placas de medio mínimo que contienen 1% de glicerol y leucina 0.3 mM (placa GMML); en la presencia de L-3 (2-naftil) -alaniña, células sobreviven en 100 a 120 ^g/raL de cloranfenicol en placas de GMML. Comparado con el valor ICso en la ausencia de cualquier TyrRS (4 //g/mL de cloranfenicol) , estos resultados indican que los TyrRS selectos aceptan L-3- (2-naftil) alanina, pero también aún cargan amino ácidos naturales en cierto grado. Ver Tabla 4 anterior.

[0270] Para reducir adicionalmente la actividad de la TyrRS mutante hacia amino ácidos naturales, una vuelta de DNA mezclado se lleva a cabo utilizando los cuatro genes mutantes anteriores como plantillas. La biblioteca TyrRS mutante resultante se pasa a través de dos vueltas adicionales de selecciones positivas y tamizados negativos. Una TyrRS mutante (SS12-TyrRS) se desarrolló, cuya actividad para amino ácidos naturales se redujo enormemente (IC50 = 9 ^g/mL de cloranfenicol) mientras que su actividad hacia L-3- (2-naftil) -alanina se mejoró (IC50=150 µg/mL de cloranfenicol) . Ver Tabla 4.

[0271] El SS12 -TyrRS desarrollado tuvo las siguientes mutaciones: Tyr32->Leu32, Asp158->pro158, Ile159->Ala159, Leu162->Glnle2, y Ala167->Val167. Ver Figura 15. Con base en la estructura cristalina de B . stearothermophilus TyrRS homólogo, las mutaciones de Tyr32->Leu32, y Asp ->pro pueden resultar en la pérdida de enlace de hidrógeno entre Tyr32, Asp158, y el substrato nativo tirosina, de esta manera desfavoreciendo el enlace de tirosina a SS12-TyrRS. La mayoría de los residuos se mutan en amino ácidos con cadenas laterales hidrofóbicas, que se espera favorezcan el enlace de L-3- (2-naftil) -alanina. La estructura cristalina de Methanococcus jannaschii TyrRS de tipo silvestre y SS12-TyrRS desarrollado puede determinarse por métodos disponibles.

[0272] El par mu tRNATyrCUA/SS12 -TyrRS fue capaz de insertar selectivamente L-3 - (2 -naftil ) -alanina en proteínas en respuesta al codón ámbar con fidelidad que rivaliza con la de los amino ácidos naturales, con base en crecimiento celular, expresión de proteína y ejemplos de espectrometría de masa descritos aquí y en la solicitud correspondiente "In vivo incorporation of unnatural amino acids" expediente del agente Número 54-000120PC/US. Ver también, Wang, Brock, y Schultz, "Adding L-3- (2-Naphthyl) alanina to tow genetic code of E. coli" (Agregar L-3- (2-naftil) lanina al código genético de E.coli) , J . Am . Chem Soc . , (2002) 124 (9) : 1836-7. Este resultado, que involucra un amino ácido estructuralmente distinto de tirosina, confirma que los métodos aquí descritos son generalizables a una variedad de amino ácidos no naturales .

[0273] Ejemplo 4. Mutar TyrRS de manera tal que pueda cargar mutRNA Tyr/CUA y clasificar la TyrRS mutada con las propiedades deseadas por otros métodos, por ejemplo FACs y exhibición de fago y selección

[0274] Pares ortogonales también pueden seleccionarse al utilzar genes ' reporteros y proteínas como se describió anteriormente junto con tamizado FACS in vivo, detección anticuerpo, exhibición de fago in vitro y selección o semejantes. Ver, Wang & Schultz, "Exp nding the genetic code" (Expansión del código genético) , Chem. Commun. , 1:1-11 (2002) .

[0275] Por ejemplo, una tamizado celular activada por fluorescencia general (FACS = fluorescence activated cell sorting) se ha desarrollado por ejemplo con proteina fluorescente verde (GFP = green fluorescent protein) como el reportero, para clasificar para síntesis. Ver Figura 16, Panel A, y Panel B Actividad de sintetasa se reporta al suprimir el codón selector, por ejemplo un codón de parada ámbar (TAG) dentro de T7 RNA polimerasa, que dirige la expresión de GFP. Ver por ejemplo Figura 26, para otro ejemplo de métodos de selección/tamizado de la invención. Solo cuando los codones ámbar se suprimen, las células pueden producir T7 RNA polimerasa funcional y expresar GFP, haciendo a las células fluorescentes. En tamizado positivo, células fluorescentes se recolectan que codifican sintetasas activas que cargan el tRNA ortogonal ya sea con amino ácidos naturales o no naturales. Las células selectas luego se diluyen y desarrollan en la ausencia del amino ácido no natural, y luego clasifican por FACS para células sin fluorescencia, por ejemplo que expresan sintetasas con especificidades para amino ácidos no naturales solamente. Figura 17, Panel A, Panel B, Panel C y Panel D ilustran supresión de un codón selector, por ejemplo un codón ámbar, utilizando glutamina sintetasa. Al ajustar el umbral de colección de la intensidad de fluorescencia, tanto la severidad de un tamizado positivo como negativo puede controlarse convenientemente.

[0276] Una selección positiva directa específica para un amino ácido no natural particular, también se ha desarrollado, que explota la alta afinidad de un anticuerpo monoclonal para un amino ácido no natural exhibido en una superficie de fago. Ver Figura 18. Ver, . Pastmak y P. G. Schultz, Bioorg. Med. Chem. , 9:2373 (2001). Por ejemplo, un péptido C3 con una mutación ámbar se fusiona al extremo N de la proteína pIII de revestimiento de fago VSCM13, tal que la producción de fago requiera supresión del codón de parada ámbar. Células que alojan un fagomidio que expresa un tRNA supresor ortogonal y una biblioteca de sintetasa se infectan con el fago C3TAG. Una sintetasa activa resulta en supresión de C3TAG y exhibe su amino ácido connato en la superficie de fago. El conjunto o recolectado de fago luego se incuba con anticuerpos monoclonales inmovilizados, dirigidos contra el amino ácido no natural para aislar solo aquellos fagos que transportan la sintetasa específica para el amino ácido no natural . En una selección simulada, fago que exhibe Asp se enriquece más de 300-veces de un recolectado de fago que exhibe Asn utilizando anticuerpos desarrollados contra el epitope que contiene Asp.

[0277] Varios métodos de tamizado in vitro también pueden emplearse. En un método tal, una biblioteca de sintetasas mutantes se exhibe en el fago, y las partículas de fago se seleccionan contra análogos de aminoalquil adenilato inmovilizados del intermediario aminoacil adenilato. Ver Figura 19. Por ejemplo Methanococcus jannaschii TyrRS se fusiona a la proteína de revestimiento pIII del fago M13. Este fago se enriqueció 1000 veces sobre un fago de control que exhibe un anticuerpo no relacionado después de selección contra el análogo aminoalquil adenilato de tirosil adenilato. Dado que solo 0.1 a 1% de la población de fago TyrRS de partida exhibe la proteína TyrRS, el factor de enriquecimiento actual puede ser tan alto como 10s a 106.

[0278] Ejemplo 5- Generar un par leucil-tRNA sintetasa arqueal

[0279] Una leucil-tRNA sintetasa de una arqueobacteria, Me anobacterium thermoautotrophicum, se identificó que puede aminoacilar ámbar y cambiar marco de lectura de tRNA supresores derivados de leucil tRNAs arquéales, pero no aminoacila cualesquiera tRNAs nativos a Escherichia coli . Utilizando una estrategia de selección descrita en la presente invención, se identificaron substratos tRNA altamente activos que se cargan selectivamente por la sintetasa. Bibliotecas imitantes de sintetasas pueden generarse y seleccionarse por que son capaces de cargar selectivamente amino ácidos no naturales .

[0280] Genes reporteros beta-lactamasa se construyeron con codones ámbar y tRNAs supresores derivados de cinco diferentes leucil tRNAs arquéales, para los cuales el anticodón se reemplazó con un anticodón CUA para producir tRNAs supresores ámbar. Siete diferentes leucil tRNA sintetasas se clonaron y se cotransforinaron con construcciones reporteras. Tres sintetasas dieron superiores niveles de supervivencia en ampicilina, en la presencia de sintetasa que controla la carencia de sintetasa, y estos sistemas se examinaron más. Ver, Figura 20.

[0281] La siguiente etapa involucra la determinación de una sintetasa que carga el tRNA supresor sin interactuar con tRNA huésped. Los dos sistemas selectos, Methanobacterium ther oautotrophicum y Methanococcus jannaschii se expresaron y se realizó aminoacilación in vitro en tRNA purificado de Halobacterium como un control positivo, y para tRNA total de Escherichia coli. Se encontró que la sintetasa de Methanococcus jannaschii fue capaz de cargar ef ctivamente tRNA de Escherichia coli, pero la sintetasa de Methanobacterium thermoautotrophicum fue especifica para tRNA Halobacterium.

[0282] Adicionales mejoras se realizaron para incrementar la eficiencia del sistema de supresión. El sitio A37 del bucle o asa anticodón fue un G37 en las leucil tRNA sintetasas. Esta mutación se ha mostrado que es un determinante negativo contra aminoacilación por sintetasas no connato en diversas células eucarióticas y Halobacterium, y también un determinante positivo para aminoacilación en levadura, pero no en Halobacterium. A37 también se mostró que es un requerimiento clave para eficiente supresión. El bucle anticodón se mutagenizó aleatoriamente y seleccionó para supresión más eficiente. Mutar G37 en A, resultó en un supresor más eficiente que puede suprimir concentraciones 20 veces superiores de ampicilina en comparación con la versión no mutada. Ver, Figura 21.

[0283] Para mejorar el tRNA de manera tal que no se carga preferencialmente por otras sintetasas en Escherichia coli, el tallo aceptor de tRNA se mutagenizó aleatoriamente. Una selección positiva/negativa se utilizó para identificar tRNAs que no pueden cargarse en la ausencia de RS de Methanobacterium thermoautotrophicum .

[0284] Entre los tRNAs mutados selectos observados, todos conservaron la base discriminadora, A73, que se ha mostrado en todos los sistemas previos como un determinante positivo crítico para leucil aminoacilación. También se conservó un par base C3:G70 entre todos los aciertos que han mejorado la ortogonalidad. El tRNA mutante mejor observado dió aproximadamente un decremento de 3 -veces en aminoacilación sin sintetasa y actualmente un incremento en supresión en la presencia de RS Methanobacterium thermoautotrophicum.

[0285] También se hicieron variantes que pudieran suprimir cuatro codones base en lugar por ejemplo de tres codones base. Cuatro codones base ofrecen la posibilidad de decodificar las cuatro bases de código genético a la vez, para lo cual pueden codificarse 256 cosas en vez de 3 a la vez, en donde solo 64 amino ácidos pueden ser codificados. La dificultad al utilizar cuatro codones base es que requieren expansión del bucle anticodón para tRNA, una perturbación que la mayoría de los sistemas no son capaces de aceptar. Sin embargo, un supresor AGGA de primer generación para el sistema leucilo se identificó. Este se generó por mutagénesis aleatoria del bucle anticodón con 8 bases y realizar selección con un sistema reportero AGGA-P-lactamasa. Vez-Figura 22.

[0286] El mecanismo de edición de la sintetasa también se mutó para eliminar la función de edición. El sistema leucilo, como otras varias sintetasas tiene (al menos) dos sitios activos. Un sitio realiza activación del amino ácido con ATP, para formar un aminoacil adenilato ligado a enzima en complejo con la sintetasa, y luego transferir el amino ácido en el extremo 3' de tRNA. Un segundo sitio, sin embargo es capaz de hidrolizar el amino ácido del tRNA si no es leucina. El sistema leucina se conoce que realiza esta función de edición post -transferencia para metionina e isoleucina y opcionalmente hace esto por igual a amino ácidos no naturales .

[0287] Inicialmente, se eliminó el dominio de edición. El dominio de edición se reemplaza con una biblioteca de 6 amino ácidos aleatorios en tándem. Una selección positiva se utiliza, que se basa en supresión de un codón de parada en beta-lactamasa . Muchas sintetasas funcionales se obtuvieron, pero al intentar purificar las sintetasas ningún material en ningún caso pudo ser detectado, y todas estas sintetasas exhibieron un fenotipo sensible a temperatura, sugiriendo que la eliminación del dominio de edición resultó en una proteina menos estable.

[0288] A continuación, se realizaron mutaciones punto en el dominio de edición. El núcleo catalítico del dominio de edición está bien conservado a través de especies y aún para diferentes amino ácidos, al menos para la familia de amino ácidos de cadena ramificada. Varios de estos sitios conservados previamente se han mutado, por ejemplo una mutación T->P, y se encontró que desprenden funciones de edición. Se construyeron mutantes de efchanojacterium thermoa.utotroph.icum RS que fueron similares a varios mutantes conocidos, y también una biblioteca NNK de 20 miembros derivada de T214 se elaboró. Se expresaron proteínas y examinaron in vitro para aminoacilación con leucina y metionina. Ninguna de las mutaciones previamente identificadas fue transferible a nuestro sistema, pero una mutación conveniente se identifico de la biblioteca T214. Dos mutantes se identificaron que fueron capaces de cargar con leucina, T214S y 7214Q. De estas mutaciones, solo 7214Q fue capaz de cargar metionina. El mutante T214S aparentemente retiene la capacidad para evitar metionina mientras que el mutante Gln ha perdido esta función.

[0289] Luego se diseñó una biblioteca con base en la estructura cristalina que se ha resuelto para la Thermus thermophilus leucil sintetasa. La cadena lateral leucina del inhibidor adenosina análogo leucina aminoalquil adenilato- se ligó en el sitio activo. Seis sitios que circundan la cavidad que liga cadena lateral leucina se reemplazaron con amino ácidos aleatorizados , para crear una más grande biblioteca. Las sintetasas de esta biblioteca luego pueden ser tamizadas, por ejemplo al realizar selección de doble tamiz positivo/negativo para identificar sintetasas capaces de cargar amino ácidos no naturales, selectivamente.

[0290] Ejemplo 6- Identificación de tRNAs que suprimen eficientemente cuatro codones base

[0291] Un enfoque combinatorio se utiliza para identificar tRNAs mutados que suprimen eficientemente cuatro codones base. Ver, T. J. Magliery, J. C. Anderson y P. G. Schultz, J. Mol. Biol . , 307:755 (2001) . Una biblioteca de reportero se construye, en donde un codón serina en el gen beta-lactamasa se reemplaza por cuatro nucleótidos aleatorios. Un tRNA mutado, por ejemplo tRNA supresor, biblioteca de supresor luego se genera que consiste de derivados de Escherichia coli con el asa anticodón (7 nt) reemplazados con ocho o nueve nucleótidos aleatorios. Cuando estas dos bibliotecas se cruzan, un tRNA supresor de cambio de marco de lectura apropiado que decodifica la secuencia de cuatro bases como un solo codón resulta en traducción de beta-lactamasa de longitud íntegra, haciendo a las células resistentes a ampicilina. La supervivencia a superiores concentraciones de ampicilina indica que el tRNA correspondiente tiene superior eficiencia de supresión para el codón de cuatro bases. Utilizando esta selección, cuatro codones cuádruples AGGA, CUAG, UAGA, y CCCU y sus tRNAs supresores connato se identifica que decodifican solo el codón de cuatro bases canónico con eficiencias cercana a la de los supresores de triple codón naturales . Novedosos supresores de codón de cinco y seis bases también se han seleccionado utilizando esta estrategia. Ver, Anderson, Magliery, Schultz, "Exploring the Limits of Codon and Anticodón Slze" (Explorando los Límite de Tamaño de Codón y Anticodón), Chemistry & Biology (Química y Biología) , 9:237-244 (2002). Estos codones extendidos, algunos de los cuales son nuevamente identificados, pueden ser útiles para la incorporación de múltiples amino ácidos no naturales in vitro y para mutagénesis de proteina in vivo.

[0292] Ejemplo 7- Generación de tRNA-sintetasa ortogonal para p-aminofenilalanina

[0293] Para generar un par sintetasa ortogonal para p-aminofenilalanina (pAF) , el par Methanococcus jannaschii tirosil-tRNA sintetasa (TyrRS) y el tRNA supresor ámbar tirosina mutante (TyrCUA mutRNA) se emplea como punto de partida. Ver, Wang, L . , Magliery, T. J. , Liu, D. R. & Schultz, P. G. "A new functional suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA sintetase pair for the in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins" (Un nuevo par tRNA/aminoacil/tRNA sintetasa supresor funcional para la incorporación in vivo de amino ácidos no naturales en proteínas) , J. Am. Chem. Soc . 122:5010-5011 (2000) ; y Wang, L. & Schultz, P. G. Chem. and Biol . 8:883 (2001) . La sintetasa específica pAF (pAFRS) se generó al modificar la especificidad de amino ácido de Methanococcus jannaschii TyrRS para aceptar pAF y no cualquiera de los veinte amino ácidos comunes . Una combinación de selecciones positivas y tamizados negativos se emplea para identificar la enzima pAFRS de una biblioteca de variantes TyrRS 12 que contienen amino ácidos aleatorios en cinco posiciones (Try32, Glu107, Asp158, lie159, y Leu162) . Ver, Wang, L., Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G. "Expanding the genetic code of Escherichia coli (Expansión del código genético de Escherichia coli). Science (Ciencia) 292:498-500 (2001) . Un solo plásmido reportero se utiliza tanto para selección como tamizado. Por ejemplo, el plásmido reportero es pREP (2 ) /YC-JYCUA, que contiene los genes CAT, T7 RNA polimerasa, GFP, y TyrCUA mutRNA, y un marcador seleccionable para resistencia a Tet . El gen CAT contiene una substitución de codón TAG en la posición D112. El gen T7 RNA polimerasa contiene grupos péptido y líder N-terminal de 7 amino ácidos y substituciones TAG en MI y Q107.

[0294] La selección positiva se basa en supresión de un codón TAG en una posición permisiva dentro del gen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) por otro pAF o un amino ácido endógeno. Ver por ejemplo, ang y colaboradores (2001) , arriba; y Pastrnak, M. , Magliery, T. J. & Schultz, P. G. "A new orthogonal suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA sintetase pair for evolving an organism with an expanded genetic code" (Un nuevo par tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa supresor ortogonal para desarrollar un organismo con un código genético expandido) . Helvética Chemica Acta 83:2277 (2000) . Células que contienen la biblioteca TyrRS y el plásmido reportero, se desarrollaron en cultivo líquido que contiene pAF y seleccionaron para supervivencia en la presencia de .cloranfenicol (Cm) . Por ejemplo, para la selección positiva, se desarrollaron células en medio mínimo GMML que contiene 35 g/ml de Kn, 25 µg/ml de Tet, 75 µ9/t?1 de Cm y pAF lmM (Sigma) .

[0295] El tamizado negativo se basa en la incapacidad de suprimir en la ausencia de pAF, dos codones de parada TAG en posiciones permisivas dentro del gen T7 RNA polimerasa. La expresión de T7 NA polimerasa de longitud íntegra, dirige la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) . Células de la selección positiva se desarrollaron en la ausencia de pAF y Cm, y luego tamizaron utilizando tamizado de células activada por fluorescencia (FACS) para carencia de fluorescencia. Por ejemplo, para tamizado negativo, se desarrollaron células en medio GMML que contiene 35 µg/ml de Kn, 25 /g/ml de Tet y 0.002% de arabinosa. FACS se lleva a cabo utilizando un clasificador celular BDIS FACVantage TSO con un láser de iones Coherent Enterprise II. La longitud de onda de excitación fue 351 nm y se detectó emisión utilizando un filtro de paso de banda de 575/25 nm. Las células recolectadas se diluyeron en cuando menos 10 volúmenes de LB, que contienen Tet y Kn, y desarrollan a saturación.

[0296] El pAFRS deseado se identifica siguiendo dos vueltas de selección positiva en medio líquido, una vuelta de tamizado negativo, otra vuelta de selección positiva en medio líquido y una vuelta de selección positiva en placas . La enzima pAFRS contiene cinco mutaciones respecto al TyrRS de tipo silvestre (Y32T, E107T, D158P, I159L, y L162A) . En la ausencia de pAF, el IC50 de células que expresan pAFRS selectas y plásmido reportero fue 10 g/ml, Cm en placas de medio mínimo GMML. ICS0 fue 120 g/ml de Cm con pAF 1 mM. De esta manera, pAF está suprimiendo selectivamente el codón UAG. (02971 Ejemplo 8- Evolución de una aminoacil-tRNA sintetasa utilizando tamizado celular activada por fluorescencia.

[0298] Un sistema de tamizado basado en FACs se utiliza para evolución rápida de tres variantes de sintetasa altamente selectivas que aceptan análogos de tirosina que contienen -amino, -isopropilo o -alilo. El sistema incluye un plásmido reportero de múltiples propósitos utilizado para aplicación tanto de presión selectiva positiva como negativa y para la evaluación fácil y cuantitativa de actividad de sintetasa. Un marcador de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) permitió selección positiva por actividad de la M. jannaschii tirosil-tRNA sintetasa (TyrRS) . Un sistema reportero T7 polimerasa/GFP, permitió evaluación de actividad de sintetasa dentro de células desarrolladas tanto en la presencia como ausencia de un amino ácido no natural. Tamizado celular activada por fluorescencia (FACS) se utiliza para tamizar contra variantes de sintetasa que aceptan amino ácidos naturales, mientras que análisis visuales y fluorimétricos fueron para evaluar actividad de sintetasa cuantitativamente y cualitativamente, en forma respectiva.

[0299] Diseño de un sistema reportero de fluorescencia ampliflicable . Esfuerzos por desarrollar un sistema de tamizado versátil para la evaluación de actividad de sintetasa en células vivas inicialmente surgieron de un deseo por un mayor grado de control sobre la presión selectiva aplicada a poblaciones de variantes de sintetasa, especialmente presión selectiva negativa. Ya que el sistema se iba a emplear para evaluar las actividades de grandes cantidades de variantes de sintetasa, se buscó un reportero que fuera susceptible a tamizado de alto rendimiento. Además, se deseaba un reportero que permitiera una evaluación fácil cualitativa y cuantitativa de actividad de sintetasa. Para satisfacer estos requerimientos, se diseñó un tamizado con base en fluorescencia. El sistema se basó en la producción dependiente de sintetasa de GFPuv, una variante de la proteína fluorescente verde que se ha optimizado para expresión en E. coli (ver, Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. & Stermmer, W. P., Nature Biotechnol . 1996, 14, 315-319) . Este fluoróforo es susceptible a utilizar en FACS y fluorimetría, así como inspección visual en placas y en cultivo liquido. El sistema se diseñó de manera tal que la supresión dependiente de sintetasa del selector, por ejemplo codones sin sentido ámbar, resultaría en la producción de una señal de fluorescencia. A fin de llevar al máximo la sensibilidad del reportero, se hizo amplificable por colocación de los codones ámbar dentro del gen para T7 RNA polimerasa, que se diseñó para dirigir la expresión del gen reportero GFPuv en analogía a otros sistemas reporteros intracelulares amplificables (ver, Lorinez, M. , Roederer, M. , Diwu, Z., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Cytometry, 1996, 24,321-329; y Zlokarnik, G. , Negulescu, P. A. , napp, T. E., Mere, L., Burres, N. , Feng, L., Wiftney, M. , Roemer, K. & Tsien, R. Y., Science, 1998, 279, 84-88) . El gen T7 RNA polimerasa se colocó bajo el control del promotor arabinosa, a fin de permitir fácil optimización de la producción de transcripción RNA para T7 RNA polimerasa que contiene codón ámbar.

[0300] Optimización del sistema reportero T7 RNA polimerasa/GPPuv. Un plásmido reportero de copia de medio, pREP, se diseño para expresar variantes T7 RNA polimerasa que contienen ámbar bajo el control del promotor arabinosa y el gen GFPuv bajo el control del promotor T7 (Figura 17a) . Una serie de doce variantes T7 RNA polimerasa, diseñada para optimizar mejora de fluorescencia dependiente de sintetasa (Figura 17b) , se insertaron en pREP para crear el plásmido pREP(I-12). Todas las variantes contienen una secuencia líder N-terminal de siete amino ácidos (MTMITVH) y 1-3 codones de parada ámbar (TAG) . Las variantes 1-3 contienen uno, dos y tres codones de parada ámbar, respectivamente, substituidos por la original metionxna en la posición uno (MI) , justo corriente abajo de la secuencia lider. Las variantes 4-9 contienen un codón ámbar substituido por DIO, R96, Q107, A159, Q169, o Q232, respectivamente que se pronosticó ubicado en regiones bucle de la estructura (ver, Jeruzalmi, D. & Steitz, . A., EMBO J. , 1998, 17,4101-4113) . Las variantes 10-12 contienen codones de parada ámbar substituido en las posiciones MI y cualquiera de Q107, A159, o Q232, respectivamente. Construcciones de plásmido se evaluaron por fluorimetria y citometría de flujo de células vivas por mejora de fluorescencia utilizando un plásmido compatible que contiene la glutaminil-tRNA sintetasa ortogonal y S. cerevisiae glutamina tRNACUA. Plásmidos pREP(l-12) se encontró que proporcionan niveles variantes de mejoras de fluorescencia dependiente de sintetasa con la mejor construcción pREP(10) que exhibe fluorescencia 220-veces mayor por fluorimetria (Figura 17c) y aproximadamente 400-veces mayor de fluorescencia mediana por citometria (Figura 17d) en células que contienen la sintetasa de tipo silvestre contra un mutante inactivo. La substitución de una variedad de grupos funcionales en posiciones correspondientes a los codones ámbar dentro de pREP(10) demuestra que la posición 107 dentro de T7 R A polimerasa es altamente permisiva.

[0301] Construcción de un plásmido reportero de múltiples propósitos. A fin de construir un plásmido de múltiples propósitos para utilizarse tanto para selección como tamizado de variantes de M. jannaschii TyrRS, el plásmido pREP(10) se combinó con el plásmido pYC-J17 (ver, Wang, L, Brock, A., Herbarich, D. & Schultz, P. G. , Science, 2001, 292,498-500) para obtener pREP/YC-JYCUA (Figura 25a) . El plásmido pREPIYC-JYCUA se ensayó para funcionar con un plásmido compatible que expresa una variante de M. jannaschii TyrRS (pBK-mJ-YRS ; ang, L, Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) selectivo para incorporar O-Metil-Tirosina (C Y) . Células que contienen pREPIYCJYCUA y pBK-mJYRS, desarrolladas en la presencia de CMY, exhiben un valor IC50 del cloranfenicol (Cm) de 120 Dg/Dl, idéntico al obtenido utilizando el plásmido pYC-J17, y una mejora de fluorescencia de 330-veces para células desarrolladas en la presencia contra la ausencia de OMY, como se mide por fluorimetria .

[0302] Evolución de la especificidad del substrato de M. jannaschii tirosil-tRNA sintetasa. Los resultados han mostrado que la cavidad de enlace de cadena lateral amino ácido de M. janna.sch.ii TyrRS puede evolucionar para alojar selectivamente grupos químicos diferentes a la cadena lateral fenol de tirosina (ver, Wang, L, Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G. , Scince, 2001, 292,498-500; Wang, L. , Brock, A. & Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc . 2002, 124, 1836-1837) . Buscamos explorar más la generalidad de acomodo de amino ácidos no naturales por M. jannaschii TyrRS al poner a prueba la enzima para aceptar cuatro nuevas funcionalidades: p-Isopropil-Fenilalanina (plF) , p-Amino-Fenilalanina (pAF) , p-Carboxil-Fenilalaniña (pCF) , o O-Alil -Tirosina (OAT) (Figura 25b) . Una biblioteca de variantes de M. jannaschii TyrRS que contienen aleatorizaciones entre las posiciones Y32, E107, D158, 1159, y L162 (Wang, L, Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G. , Scince, 2001,292,498 500) , residuos que se consideran forman la cavidad de enlace para la posición para del anillo tirosilo, se introdujeron en células que contienen el plásmido pREP/YC-JYCUA. Estas células abarcan una diversidad de bibliotecas de 109, se emplearon para iniciar cuatro experimentos de evolución, para identificar variantes de sintetasa selectivas para pIF, pAF, pCF, o OAT (Figura 25b) . Dos ciclos de selección positiva se llevaron a cabo al permitir que los cultivos celulares crecieran a saturación en la presencia de Cm y uno de los cuatro araino ácidos no naturales . Alícuotas celulares se retiraron después del Segundo ciclo de selección positiva y emplearon para inocular un nuevo cultivo que no contiene amino ácido agregado o Cm, y el cultivo de nuevo se dejó que creciera a saturación. En este punto, es probable que células que fluorescen contengan variantes de sintetasa que pueden aceptar uno de los 20 amino ácidos naturales. Aproximadamente 108 células de cada línea se sometieron a tamizado negativo utilizando FACS a fin de eliminar variantes de sintetasa que aceptan amino ácidos naturales . Las células no fluorescentes se recolectaron y amplificaron a través del crecimiento a saturación. Estas células amplificadas se utilizaron para inocular un nuevo cultivo para un ciclo final de selección positiva en cultivo líquido que contiene amino ácido no natural y Cm. Después de crecimiento a saturación, cada población de células se revistió en medio que contiene 0, 30, 60 o 100 /¿g/mL de Cm y ya sea 0 o 1 mM de amino ácido no natural apropiado.

[0303] Identificación y caracterización de variantes de sintetasa de evolución. Placas Cm suplementadas con pIF, pAF, y OAT producen 10- 100 -veces números mayores de colonias fluorescentes que placas que no contienen amino ácido agregado. En contraste, placas para la población pCF producen el mismo número de colonias fluorescentes con o sin adición de pCF . Las diez colonias fluorescentes más grandes se recolectaron para cada una de las poblaciones de pIF, pAF, y OAT, a partir de placas que contienen amino ácido no natural y desarrollan a saturación en medio líquido con o sin amino ácido no natural agregado . Una evaluación cualitativa de producción de fluorescencia se realiza visualmente con el uso de una lámpara ultravioleta de larga longitud de onda manual (Figura 23a) .

[0304] Variantes de sintetasa que corresponden a ciónos, que producen diferencias significantes en fluorescencia, fueron secuenciadas . Todos los diez ciónos de las poblaciones pIF y pAF tuviero secuencias idénticas, mientras que tres ciónos diferentes se identificaron de la población OAT. Cambios de amino ácido ocurrieron dentro de los cinco sitios aleatorizados en todos los ciónos, excepto por dos substituciones adicionales dentro la variante pIF-tRNA sintetasa (pIF-RS) . Las actividades de los diferentes ciónos se evaluaron cuantitativamente. Se midió fluorescencia fluorimétricamente para células desarrolladas en cultivo liquido, en la presencia o ausencia de amino ácido no natural (Figura 23b) . Los IC50 de Cm se determinaron al revestir las células en concentraciones variantes de Cm en la presencia o ausencia de amino ácido no natural (Figura 23c) .

[0305] Un gen de mioglobina que contiene un codón ámbar en la cuarta posición, se emplea para evaluar la producción de proteína que contiene amino ácido no natural. El gen fue expresado en células utilizando la variante pIF-RS, pAF-RS, o OMY-RS, respectivamente ya sea en la presencia o ausencia de plF, pAF, o OAT (Figura 23d) . Rendimientos de proteína fueron comparables para todas las tres variantes, en el rango de 1-2 miligramos de proteína por litro de cultivo celular que contiene amino ácido no natural. En contraste, producción de proteína fue virtualmente indetectable en cultivos desarrollados en la ausencia de amino ácido no natural . Se analizaron proteínas por espectrometría de masa con electrorocío, dando masas de 18457.40 ± 0.81 (18457.28 esperado) para la proteína que contiene pIF y 18430.30 + 0.27 (18430.21 esperado) para la proteína que contiene pAF. Mediciones de actividad obtenidas utilizando ICS0 Cm, fluorimetria y análisis de expresión de proteína se correlacionan bien, sin embargo la actividad de pIF-RS parece ser algo sub-estimada por fluorimetria. En comparación con otros ensayos, la medición de fluorometría desproporcionalmente baja para la variante pIF-RS sugiere que T7 RNA polimerasa puede desestabilizar parcialmente ante incorporación del análogo pIF, a pesar de la permisividad aparente de las posiciones ámbar dentro del reportero (ver, Figura 17c) .

[0306] Utilidad del sistema reportero de múltiples propósitos. El sistema reportero aquí descrito permite el uso de un solo plásmido de múltiples propósitos tanto para selección positiva como tamizado negativo, obviando la necesidad de transportar plásmidos entre vueltas alternas de selección positiva y negativa. Un total de solo tres vueltas de selección positiva y una vuelta de tamizado negativo se requirió para permitir la identificación de variantes de sintetasa que aceptan selectivamente amino ácidos no naturales deseados . Estas características permiten que experimentos de evolución se han llevado a cabo en una cuestión de días . El sistema de tamizado puede utilizarse para identificar fácilmente variantes de sintetasa activa utilizando placas de agar que contienen amino ácido no natural y ensayar individualmente la especificidad de amino ácido de las variantes .

[0307] Como se describió anteriormente, el sistema T7 RNA polimerasa/GFP puede utilizarse para comparar cuantitativamente las actividades de variantes de sintetasa. La disponibilidad de tres ciónos OAT-RS aquí descritos y un clon OAT-RS diferente derivado independientemente de la misma biblioteca utilizando una selección positiva/negativa con base en CAT y barnasa, permite la posibilidad de comparar los dos sistemas de evolución diferentes en términos de la variante sintetasa que resulta de cada uno. Este análisis revela que los tres ciónos derivados de selección positiva y tamizado negativo exhiben niveles ligeramente menores de fluorescencia en la presencia de OAT, pero aproximadamente 10-veces menor de niveles de fondo en la ausencia del amino ácido no natural. La mejora de fluorescencia para células desarrolladas en la presencia contra la ausencia del amino ácido no natural de esta manera es aproximadamente 6-veces superior para células que "expresan OAT-RS (1) de selección y tamizado que para células que expresan el clon OAT-RS derivado de selección positiva/negativa utilizando barnasa. Aunque no es claro si este ejemplo es representativo, estos datos sugieren que el sistema T7 K A polimerasa/GPP puede permitir más severidad para seleccionar contra variantes de sintetasa que promiscuos hacia substratos de amino ácido naturales. Sin embargo, la mejora de fluorescencia para células desarrolladas en la presencia contra la ausencia de un amino ácido no natural, se espera que representa un límite inferior para la fidelidad de la incorporación de amino ácido no natural , como competencia de amino ácidos no naturales por estar ligados por una variante de sintetasa de evolución reducirla el ligado de amino ácidos naturales. Aún más, aunque es claramente deseable alta fidelidad, es probable que hay una compensación entre fidelidad y actividad de sintetasa total, que puede depender de la aplicación deseada. [03081 Generalidad de evolución de aminoacil tRNA sintetasa. Previos resultados y aquéllos presentados aquí demuestran que la cavidad de enlace de cadena lateral amino ácido de M. jaimaschii TyrRS es bastante maleable. La enzima puede evolucionarse para acomodar una variedad de f ncionalidades en sitio de la cadena lateral fenol de tirosina y puede hacerlo con alta selectividad. En esta aplicación, se demostró que la enzima puede evolucionarse para acomodar una funcionalidad amina, isopropilo o alil éter en la posición para del anillo tirosina, en lugar de hidroxilo. No fue posible identificar una variante de enzima que pueda aceptar el amino ácido no natural pCF. Un segundo intento por evolucionar una sintetasa para aceptar el amino ácido pCF, tampoco tuvo éxito. Utilizando análisis LC/MS, pCF no puede detectarse ante toluenización de células E. coli desarrolladas en la presencia de amino ácido no natural, sugiriendo que pCF no se transporta en células o que se metaboliza al entrar.

[0309] De los tres experimentos de evolución exitosos aquí descritos, solo la evolución de OAT-RS resulta en la identificación de más de un clon activo. La evolución OAT-RS también fue el experimento que produce la variante sintetasa más activa. Estos resultados sugieren que algunas especificidades de amino ácido pueden ser más fáciles de seleccionar que otras . Esto puede realizarse en parte por la dificultad relativa de reconocer selectivamente diferentes amino ácidos no naturales en el contexto de los 20 amino ácidos naturales. Puede ser por ejemplo, que pAF, debido a sus similaridades estructurales y electrónicas con tirosina, es más difícil de reconocer selectivamente que OAT. Esto explicará porque un número mayor de ciónos OAT-RS se identificaron que los ciónos pAF-RS y porque el clon pAF-RS es menos activo que el mejor clon OAT-RS.

[0310] Construcción de Plásmido. El plásmido pREP (Figura 17a) se construye por inserción de un fragmento PCR de superposición BamHl/ApaLI que contiene el gen T7 RNA polimerasa corriente arriba de una región de terminación de transcripción rrnB, seguido por un fragmento PCR de superposición ApaLI/Ahdl que contiene el gen araC y una región promotora ara del plásmido pBAD/Myc-His A (Invitrogen para control de transcripción del gen T7 RNA polimerasa) y el gen GFPuv (Clontech; corriente arriba de la región T7 terminadora y corriente abajo del promotor T7) entre los sitios Ahdl/BairiH.1 del plásmido pACYC177 (New England Biolabs) . Los plásmidos pREP(l-12) se construyeron por reemplazo de un fragmento Hpal/ApaLI de T7 RNA polimerasa con fragmentos PCR superpuestos que contienen mutaciones ámbar en las posiciones descritas. El plásmido pREP/YC-JTYCÜA se construyó por ligación de un fragmento Afel/SacII a partir de pREP(10) y un fragmento Earl (romo) /SacII de pYC-Jl7 ( ang, L, Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G . , Science, 2001, 292,498-500). La construcción deseada se identificó siguiendo transformación en células que contiene tamizado de plásmido pQ por fluorescencia.

[0311] El plásmido pQ se construyó por triple ligación de un fragmento PCR de superposición Aatll/Sall que contiene el ScQRS corriente abajo de la región promotora Lac y corriente arriba de la región de terminación E. coli QRS, un fragmento PCR de superposición Salí/Aval que contiene el S. cerevisiae tR A(CUA)Gl corriente abajo de la región promotora lpp y corriente arriba de una región terminadora rrnC, y el fragmento Aval/AatlI de pBR322 (New England Biolabs) . El plásmido pQD se construyó por reemplazo de un fragmento pQ entre BarnHI y BglII con un fragmento BamHl/Bg/lI del mutante ScQRS (D291A) .

[0312] El plásmido pBAD/JYAMB-4TAG se construyó por inserción de un fragmento PCR del mutante S ámbar de mioglobina, que contiene una etiqueta 6His C-terminal en el plásmido pBAD/YC-JYCUA, un híbrido de plásmido pYC-117 (Wang, L, Brock, A., Herbench, B. & Schultz, P. G. , Scince, 2001, 292, 498-500) y pBAD/Myc-His A (Invitrogen) que contiene el gen para Jíj'YtRNAcuA/ Y el promotor pBAD y clonar regiones para expresión heteróloga de un gen insertado .

[0313] Análisis fluorimétricos y citométricos . Colonias sencillas que contienen plásmidos deseados se emplearon para inocular cultivos de 2-mL de GMML que contienen los antibióticos apropiados, Arabinosa 0.002%, y un amino ácido no natural apropiado, si se desea. Se desarrollaron cultivos a saturación y células (200 DL) se nodulizaron y resuspendieron en 1 mL de salino amortiguado con fosfato (PBS = phosphate-buffered saline) . Las concentraciones celulares se analizaron por absorbancia a 600 nm y niveles de fluorescencia se midieron a 505 nm con excitación a 396 nm, utilizando un fluorimetro FluoroMax-2. Células suspendidas en PBS se analizaron citométricamente . Para evaluar la permisividad de las posiciones ámbar dentro del gen T7 polimerasa de pREP(10), el plásmido reportero se transformó en un panel de cepas supresoras que subsecuentemente se analizaron fluorimétricamente .

[0314] Evolución de variantes de aminoacil-tRNA sintetasa. Variantes M. jannachii TyrRS aleatorizadas en las posiciones Y32, E107, D158,1159, y L162 ( ang, L, Brock, A., Herberich, B. & Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) se transformaron en células DH10B E. coli (Life Technologies) que contienen pREP/YC-JYCUA para generar una biblioteca con una diversidad de aproximadamente 109. Se permitió que transformantes se recuperaran en medio SOC por 60 minutos a 37°C, y se desarrollaron a saturación en medio LB. Para empezar una selección de posición inicial, 2 mL de cultivo de biblioteca, nodulizados y resuspendidos en medio GMML, se emplean para inocular 500 mL de GMML que contiene 25 ^g/mL de Tetraciclina (Tet) , 35 µg/mL de Canamicina (Kn.) , y pIF lmM, pAF, pCF, o OAY. Después de incubación por 3 horas a 37°C, Cm se agregó a una concentración final de 75 /xg/mL y se desarrollaron células a saturación (aproximadamente 48 horas} . Para la segunda selección positiva, un cultivo de 100-mL de GMML que contiene Tet, n, 75 g/mL de Cm, y pIF lmM, pAF, pCF, o OAY, se inoculó con células de la selección positiva inicial (500 µ?.) y desarrolló a saturación a 37°C (aproximadamente 24-36 horas) . En preparación para el tamizado negativo, un cultivo de 25-mL de GMML que contiene Tet, Kn, y 0.02% de arabinosa (Ara) se inocula con células de la segunda selección positiva (100 µ?., noduliza y resuspende en GMML) y desarrolla a saturación a 37°C (aproximadamente 24 horas) . Células inducidas Ara desarrolladas en la ausencia de amino ácidos no naturales (1 mL) se nodulizaron y resuspendieron en 3 mL de salino amortiguado con fosfato (PBS) . Se clasificaron células por falta de expresión de GFPuv utilizando un clasificador celular BDIS FACVantage TSO con un láser de ión Coherente Enterprise II con excitación a 351 nra y emisiones detectadas utilizando un filtro de paso de banda de 575/25 nm. Las células recolectadas se diluyeron en al menos 10 volúmenes de LB, que contienen Tet y Kn y desarrollaron a saturación. Para empezar la tercer vuelta de selección positiva, 100 DL de células del tamizado negativo se nodulizaron, resuspendieron en GMML, y utilizaron para inocular 25 mL de GMML que contiene Tet, n, y pIF 1 mM, pAF, pCF, o OAY. Después de incubación por 3 horas a 37°C, Cm se agrega a una concentración final de 75 µg/mL y células se desarrollaron a saturación (aproximadamente 24 horas) . Siguiendo la tercer selección positiva, se revistieron células en GMML/agar que contiene Tet, Kn, 0.002% Ara, 0, 75 o 100 ig/mL de Cm, y 0 o 1 mMpIF, pAF, pCF, o OAY, y desarrollaron por 48 horas a 37°C.

[0315] Expresión y caracterización de proteínas que contienen amino ácido no natural. Células DHIOB co-transformadas con pBAD/JYAMB-4TAG y el plásmido pBK apropiado, se emplearon para inocular cultivo iniciador GMML 100-mL que contiene Kn y Tet, que se desarrolló a saturación. Un cultivo de 500-mL que contiene Kn, Tet, 0.002% Ara. 5 DM FeCl3, y el amino ácido no natural deseado (o ninguno) , se inoculó con 50 mL del cultivo iniciador y desarrolló a saturación (aproximadamente 18 horas) . Los cultivos se nodulizaron, sonicaron y la proteína mioglobina aislada de acuerdo con el protocolo del equipo de purificación His-tag QiaExpressionist (Qiagen) . Se analizaron proteínas electroforéticamente en un gel SDS poliacrilamida con gradiente 12-20% y por espectrometría de masas con electrorocío.

[0316] Ejemplo 9- Par tRNA/Treonil-tRNA Sintetasa Ortogonal .

[0317] Este ejemplo ilustra la generación de un par tRNA/Treonil-tRNA sintetasa ortogonal. La Figura 27 ilustra una treonil-tRNA sintetasa de Ther us ther ophilus . Esta sintetasa tiene dos dominios de edición N-terminal, un dominio catalítico y un dominio de enlace anticodón C-terminal (659 amino ácidos) . Para generar la sintetasa ortogonal con base en T. thermophilus sintetasa, el o los dominios de edición, NI o NI y N2 se eliminaron de la sintetasa para generar una T. Thermophilus ThrRS N-truncada (475 amino ácidos) . Esta sintetasa tiene la misma actividad catalítica pero carece de la actividad de revisión (proofreading) . La sintetasa N-truncada se monitoreó por actividad. La sintetasa N-truncada no aminoacila Escherichia coli tRNA.

[0318] Debido a que T. thermophilus tRNATbr se encuentra es un substrato para Escherichia coli Treonil-tRNA sintetasa, T. thermophilus tRNAThr se mutó a fin de generar un par ortogonal. La Figura 28 ilustra las mutaciones hechas en tRNA. Específicamente, C2G71 se mutó en A2U71. Experimentos de carga in vitro demuestran que este mutante no es un substrato para la E. coli Threonyl-tRNA sintetasa, pero es un buen substrato para T. thermophilus Threonyl-tRNA sintetasa. Otro mutante también se construyó, que incluye las siguientes mutaciones: C2G71->A2U71 y G34G35U36->C34G35U36 a fin de generar un tRNA supresor ámbar. Otro tRNAs mutantes con asas anticodón modificadas además de C2G71->A2U71 también se generaron para suprimir codones de tres y cuatro bases tales como TGA, ACCA, ACAA, AGGA, CCCT, TAGA, y CTAG. Todas estas tRNAs no fueron tan buenos substratos como la tRNAThr tipo silvestre (con A2U71) pero pueden mejorarse al mutar el sitio de enlace anticodón del T. Thermophilus Threonyl-tRNA sintetasa.

[0319] Ejemplo 10- Secuencias de O-tRNAs y O-RSs Ejemplares

[0320] 0-tRNAs ejemplares comprenden un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-3 y/o su secuencia polinucleotido complementaria. Ver, Tabla 5, Apéndice 1. Similarmente , el ejemplo O-RS incluye polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de: un polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 35-66 y un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende, una secuencia de polinucleotido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: -34 y su secuencia polinucleotido complementario.

[0321] Se entiende que los ejemplos y modalidades aguí descritas, son para propósitos ilustrativos solamente y que variaciones, modificaciones o cambios a la luz de la misma, se les sugerirán a personas a personas con destreza en la técnica y habrán de incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes aquí citadas aquí se incorporan por referencia totalmente para todos los propósitos.'

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal (O-RS) , en donde la 0-RS preferenc almente aminoacila un tR A ortogonal (0-tRNA) con un amino ácido no natural . 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la O-RS comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4-34 y su secuencia de polinucleótido complementaria . 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la O-RS aminoacila O-tRNA con el amino ácido no natural in vivo. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amino ácido no natural se elige del grupo que consiste de: una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcbeta-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina . 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amino ácido no natural se elige del grupo que consiste de: un análogo no natural de un amino ácido de tirosina; un análogo no natural de un amino ácido de glutamina; un análogo no natural de amino ácido de fenilalanina; un análogo no natural de un amino ácido de serina; un análogo no natural de un amino ácido de treonina; un amino ácido substituido con alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioacido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, hidroxilamina, ceto, o amino o cualquier combinación de los mismos; un amino ácido con un entrelazador fotoactivable; un amino ácido etiquetado con espín; un amino ácido fluorescente; un amino ácido con un grupo funcional novedoso; un amino ácido que interactúa de manera covalente o no covalente con otra molécula; un amino ácido de enlace de metal; un amino ácido que contiene metal; un amino ácido radioactivo; un amino ácido fotoenj aulado, un amino ácido fotoisomerizable ; un amino ácido que contiene biotina o análogo de biotina; un amino ácido modificado con carbohidrato o glicosilado; un amino ácido que contiene ceto; un amino ácido que comprende polietilen glicol; un amino ácido que comprende poliéter; un amino ácido substituido con átomo pesado; un amino ácido fotoescindible o químicamente escindxble; un amino ácido con una cadena lateral alargada; un amino ácido que contienen un grupo tóxico; un amino ácido substituido con azúcar; una serina substituida con azúcar; un amino ácido que contiene azúcar enlazada a carbono; un amino redox-activo; un amino ácido alfa-hidroxi ; un amino ácido que contiene amino tio ácido; un amino ácidoalfa, alfa-disubstituido; un beta-amino; y un amino ácido cíclico diferente a prolina. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la O-RS tiene una o más propiedades enzimáticas mejoradas, seleccionado de los grupos que consisten de: Km y cat, para el amino ácido no natural en comparación a un amino ácido natural . 7. Un polipeptido que comprende una secuencia de amino ácido codificado por una secuencia de polinucleótido de codificación, la secuencia de polinucleotido de codificación se elige del grupo que consiste de: a) una secuencia de polinucleótido de codificación seleccionada de SEQ ID NOA-34; b) una secuencia de polinucleótido de codificación que codifica un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 35-66; c) una secuencia de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones altamente severas sobre substancialmente toda la longitud de una secuencia de polinucleótido de (a) o (b) ; y d) una secuencia complementaria de (a) , (b) , o (c) . 8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polipéptido codificado codifica una aminoacil tRNA sintetasa ortogonal . 9. Un polipéptido que comprende una secuencia de amino ácidos seleccionada de SEQ ED NO:35-66. 10. Un ácido nucleico que comprende: una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de polinucleótido seleccionada de SEQ ID NO: l a SEQ ID N0:3, o una secuencia de polinucleótido complementaria de los mismos; y b) una secuencia de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones altamente severas, substancialmente sobre toda la longitud de la secuencia de polinucleótido (a) . 11. El ácido nucleico ácido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido comprende un tRNA ortogonal . 12. El ácido nucleico ácido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido forma un par complementario con una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal. 13. El ácido nucleico ácido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de polipéptido de la aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal se elige del grupo que consiste de SEQ ID: 35 a SEQ ID.NO:66. 1 . La composición que comprende un tRNA ortogonal (O-tRNA) , en donde el O-tRNA reconoce un codón selector y en donde O-tRNA de preferencia se aminoacila con un amino ácido no natural por una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal . 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque OARNA comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-3 y una secuencia de polinucleótido complementaria de la misma. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el codón selector comprende un codón de tres bases único, un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, o al menos un codón de cuatro bases . 17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque además comprende la aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal, (O-RS) . 18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque 0-tRNA y O-RS son complementarias . 19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición comprende un par mutRNATyr-mutTyrRS . 20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende un par mutR ATyr-SS12TyrRS . 21. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición de comprende un par mutR ALeu-mutLeuRS . 22. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición comprende un par mutRNAThr-mutThrRS . 23. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición comprende un par mutRNAGlu-mutGluRS . 24. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque O-tRNA y O-RS se derivan por mutación de un tRNA de origen natural y una RS de un organismo como mínimo, en donde el organismo como mínimo es un organismo procariótico. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el organismo como mínimo se elige del grupo que consiste de: Methanococcus jannaschíi , Methanobacterium thermoautotrophicum, y Halobactenum. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque O-tRNA y O-RS se derivan por mutación de un tRNA de origen natural y RS de un organismo como mínimo, en donde el organismo como mínimo es un organismo eucariótico. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el organismo como 252 mínimo se elige del grupo que consiste de levaduras, mamíferos, hongos, insectos, plantas y protistas. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque O-tRNA se deriva por mutación de un t A de origen natural de un primer organismo y O-RS se deriva por mutación de una RS de origen natural de un segundo organismo. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque O-tRNA y O-RS se aislan de un organismo como mínimo, en donde el organismo como mínimo es un organismo procariotico. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el organismo como mínimo se elige del grupo que consiste de Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, y Halobacterium. 31. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque O-tRNA y O-RS se aislan de un organismo como mínimo, en donde el organismo como mínimo es un organismo eucariótico. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el organismo como mínimo se elige del grupo que consiste de: levaduras, mamíferos, hongos, insectos, plantas y protistas. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque O-tRNA se aisla de un primer organismo y O-RS se aisla de un segundo organismo . 34. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o más de 0-tR A y 0-RS se aislan de una o más bibliotecas, una o más bibliotecas comprenden un O-tRNA o un 0-RS de uno o más organismos . 35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque uno o más organismos comprenden un procariota o un eucariota. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición está en una célula. 37. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición de comprende un sistema de traducción in vitro. 38. Un método para producir al menos una aminoacil-tR A sintetasa ortogonal recombinante (0-RS) , el método se caracteriza porque comprende: (a) generar una biblioteca de RSs derivada de al menos una aminoacil-tR A sintetasa (RS) de un primer organismo; ' (b) seleccionar o tamizar la biblioteca de RSs por miembros que aminoacilan una tR A ortogonal (O-tRNA) en la presencia de un amino ácido no natural de un amino ácido natural, de esta manera proporcionando un recolectado o conjunto de RSs activas; y (c) seleccionar o tamizar el conjunto por RSs activas que aminoacilan preferencialmente el O-tRNA en la ausencia del amino ácido no natural, de esta manera proporcionando la O-RS recombinante como mínimo; en donde la O-RS recombinante como mínimo preferencialmente aminoacila la O-tRNA con el amino ácido no natural . 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el primer organismo es un organismo procariotico. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el primer organismo se elige del grupo que consiste de: Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophícum y Halobacterium. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la RS como mínimo es una RS inactiva. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la RS inactiva se genera al mutar una RS activa. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la RS inactiva comprende al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2 , al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4 , aproximadamente 5 , al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más amino ácidos mutados en amino ácidos de alanina. 44. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la biblioteca de RSs comprende una biblioteca de RS mutante. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la etapa (a) comprende mutación aleatoria. 46. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (b) comprende : introducir un marcador de tamizado o selección positiva y la biblioteca de RSs en una pluralidad de células, en donde el marcador de tamizado o selección positiva comprende cuando menos un codón selector; desarrollar la pluralidad de células en la presencia de un agente de tamizado o selección; identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de tamizado específica en la presencia de un agente de selección o tamizado, al suprimir el codón selector como mínimo en el marcador de tamizado o selección positiva, de esta manera proporcionando un sub-conjunto de células tamizadas o selectas de manera positiva que contienen el recolectado de RSs activas . 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque se varía la concentración y el agente de selección o tamizado. 48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el codón selector como mínimo comprende un codón ámbar, un codón ocre, o un un codón de parada ópalo. 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el marcador de selección positiva es un gen cloranfenicol acetil transferasa (CAT) y en donde el codón selector como mínimo es un codón de parada ámbar en el gen CAT. 50. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el marcador de selección positiva es un gen beta-lactamasa y en donde el codón selector como mínimo es un codón de parada ámbar en el gen beta-lactamasa. 51. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porgue el marcador de tamizado positivo comprende un marcador de tamizado luminiscente o fluorescente. 52. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el marcador de tamizado positivo comprende un marcador de tamizado basado en afinidad. 53. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (c) comprende: introducir un marcador de tamizado o selección negativo con el recolectado de Ss activas de la etapa (b) en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el gen marcador de tamizado o selección negativa comprende al menos un codón selector; identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de tamizado específica en un primer medio suplementado con el amino ácido no natural y un agente de tamizado o selección, pero fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta de tamizado específica en un segundo medio no suplementado con el amíno ácido no natural y el agente de selección o tamizado, de esta manera proporcionando células supervivientes o tamizadas con al menos una O-RS recombinante . 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la concentración del agente de selección o tamizado se varia. 55. El método de conformidad con la reivindicación 53 , caracterizado porque el primero y segundo organismos son diferentes. 56. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el primero y segundo organismos comprenden un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto o un protista. 57. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el marcador de selección negativo comprende un gen cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) que comprende al menos un codón selector. 58. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porgue el marcador de tamizado comprende un marcador de tamizado luminescente o fluorescente . 59. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el marcador de tamizado comprende un marcador de tamizado basado en afinidad . 60. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (c) comprende: aislar el recolectado de RSs activas de la etapa (b) ; introducir un marcador de tamizado o selección negativa, en donde el gen marcador de tamizado o selección negativa comprende al menos un codón selector, y el recolectado o conjunto de RSs activas en una pluralidad de células de un segundo organismo; identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de tamizado específica en un primer medio no suplementado con el amino ácido no natural, pero fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta de tamizado específica en un segundo medio suplementado con el amino ácido no natural, de esta manera proporcionando células supervivientes o tamizadas con 0-RS recombinante como mínimo, en donde la 0- S recombinante como mínimo es específica para el amino ácido no natural . 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el codón selector como mínimo comprende dos o más codones selectores. 62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el primer y segundo organismos son diferentes . . 63. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el primer y segundo organismos comprenden un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia coli, un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto o un protista. 64. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el marcador de selección negativa comprende un gen ribonucleasa barnasa que comprende cuando menos un codón selector. 65. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el marcador de tamizado comprende un marcador de tamizado luminescente o fluorescente . 66. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el marcador de tamizado comprende un marcador de tamizado basado en afinidad . 67. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (b) , (c) o ambas etapas (b) y (c) , comprenden variar una severidad de selección o tamizado. 68. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende: (d) aislar la 0-RS recombinante como mínimo; (e) generar un Segundo juego de 0-RS derivadas de la O-RS recombinante como mínimo, en donde el segundo juego de 0-RS comprende un juego de 0-RS imitadas; y (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtiene una 0-RS mutada que comprende una capacidad para aminoacilar preferencialmente O-tRNA. 69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque además comprende repetir las etapas (d) - (f) al menos aproximadamente dos veces . 70. El método de conformidad con la reivindicación 38??, caracterizado porque la etapa (e) comprende mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o cualquier combinación de las mismas . 71. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (b) , (c) o ambas etapas (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, en donde el reportero se detecta por tamizado celular activada por fluorescencia (FACS) o en donde el reportero se detecta por luminescencia . 72.. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa (b) , (c) o ambas etapas (b) y (c) comprenden utilizar ' un reportero, en donde el reportero se exhibe en una superficie celular o en un exhibidor fago. 73. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el amino ácido no natural se elige del grupo que consiste: una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAc beta-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina . 7 . La O-RS recombinante como mínimo producida por el método de la reivindicación 38. 75. Un método para producir una tRNA ortogonal recombinante (O-tRMA) , el método se caracteriza porque comprende: (a) generar una biblioteca de tRNAs derivada de al menos un tRNA de un primer organismo; (b) seleccionar o tamizar la biblioteca por tRNAs que se aminoacilan por una aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un recolectado de tRNAs; y (c) seleccionar o tamizar el recolectado de tRNAs por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida (O-RS) , de esta manera proporcionando cuando menos un O-tRNA recombinante; en donde el O-tRNA recombinante reconoce cuando menos un codón selector y no se reconoce eficientemente por el RS del segundo organismo y se aminoacila preferencialmente por la O-RS. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el tRNA como mínimo es un tRNA supresor. 77. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el codón selector comprende un codón de tres bases único, de bases naturales o no naturales, un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural o al menos un codón de cuatro bases . 78. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el codón selector comprende un codón ámbar, un codón ocre o un codón de parada ópalo . 79. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el 0-tRNA recombinante como mínimo posee una mejora de ortogonalidad. 80. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el primer organismo es un organismo procariotico. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el organismo procariotico se elige del grupo que consiste de : 265 Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, y Halobacterium. 82. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el primero y segundo organismos comprenden un procariota, un eucariota, un mamífero, una Escherichia colí, un hongo, una levadura, una arquibacteria, una eubacteria, una planta, un insecto o un protista. 83. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el primero y segundo organismos son diferentes. 84. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el tR A recombinante se aminoacila por un amino ácido no natural, en donde el amino ácido no natural se biosintetiza in vivo ya sea en forma natural o a través de manipulación genética . 85. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el amino ácido no natural se agrega a un medio de crecimiento de uno o más de primero o segundo organismos. 8S. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la etapa (b) comprende : introducir un gen marcador tóxico o un gen que lleva a la producción de un agente tóxico o estático o un gen esencial al organismo, en donde el gen marcador comprende el codón selector como mínimo y la biblioteca de tRNAs mu antes . en una pluralidad de células del segundo organismo; y, seleccionar células supervivientes, en donde las células supervivientes contienen el recolectado de tRNAs que comprende al menos un tRNA ortogonal o un tRNA no funcional . 87. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la selección de células supervivientes comprende un ensayo de densidad celular para proporción de comparación. 88. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el codón selector comprende dos o más codones selectores . 89. El método de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el gen marcador es un gen ribonucleasa barnasa, en donde el gen ribonucleasa barnasa comprende cuando menos un codón ámbar. 90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el gen ribonucleasa barnasa comprende dos o más codones ámbar. 91. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la etapa (c) comprende: introducir un gen marcador de tamizado o selección positiva, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a droga o un gen esencial para el organismo, o un gen que conduce a desintoxicación de un agente tóxico, que comprende al menos uno de los codones selectores, las 0-RS, y el recolectado de tRNAs en una pluralidad de células del segundo organismo; e identificar células supervivientes o tamizadas en la presencia de un agente de tamizado o selección, de esta manera proporcionando un recolectado de células que poseen el tRNA recombinante como mínimo, en donde el tRNA recombinante como mínimo se aminoacila por la 0-RS e inserta un amino ácido en un producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a los codones selectores como mínimo . 92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el agente de selección es un antibiótico. 93. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque la concentración del agente de selección o tamizado se varía. 94. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porgue el gen de resistencia a droga es un gen beta-lactamasa . 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el gen beta-lactamasa comprende al menos un codón de parada ámbar. 96. El 0-tRNA recombinante como mínimo, producido por el método de la reivindicación 75. 97. El método para producir al menos un par 0-tRA/O-RS específico, el método se caracteriza porque comprende: (a) generar una biblioteca de tR As derivados de al menos un tRA de un primer organismo; (b) seleccionar o tamizar en forma negativa la biblioteca de tRNAs que se aminoacilan por la aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un recolectado de tRNAs; (c) seleccionar o tamizar el recolectado de tRNAs por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal introducida (O-RS) , de esta manera proporcionando al menos un 0-tRNA recombinante; en donde 0-tRNA recombinante como mínimo reconoce un codón selector y no se reconoce eficientemente por el RS de un segundo organismo y se aminoacila preferencialmente por la O-RS (d) generar una biblioteca de RSs derivadas de al menos una aminoacil-tRA sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar o tamizar la biblioteca de RSs por miembros que aminoacilan preferencialmente 0-tRNA recombinante como mínimo en la presencia de un amino ácido no natural de µ? amino ácido natural , de esta manera proporcionando un recolectado de RSs activas; y (f) tamizar o seleccionar negativamente el recolectado para RSs activas que de preferencia aminoacilan el 0-tRNA recombinante como mínimo en la ausencia del amino ácido no natural, de esta manera proporcionando el par 0-tRNA/O-RS específico como mínimo, en donde el par 0-tRNA/0-RS específico como mínimo comprende cuando menos una 0-RS recombinante que es específica para el amino ácido no natural y el 0-tRNA recombinante como mínimo. 98. El par 0-tRNA/O-RS específico producido por el método de la reivindicación 97. 99. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque al menos un par 0-tRNA/O-RS específico es un par mutRNATyr-mutTyrRS. 100. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el primer y tercero organismos son el mismo. 101. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el primer organismo y el tercer organismo son Methanococcus ja.nna.schii . 102. Método para identificar un par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal, para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo, el método se caracteriza porque comprende: introducir un gen marcador, un tRNA y una aminoacil-tR A sintetasa (RS) aislada o derivada de un primer organismo en un primer juego de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el tRNA en un conjunto de células duplicados del segundo organismo; y seleccionar o tamizar células supervivientes o células que muestran una respuesta de tamizado específica en el primer conjunto que fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta en el conjunto de células duplicado, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicado se desarrollan en la presencia de un agente de selección o tamizado, en donde las células supervivientes o tamizadas comprenden el par tR A-tRNA sintetasa ortogonal, para utilizar en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. 103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la comparación y selección o tamizado comprenden un ensayo de complementación in vivo. 104. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la concentración del agente de selección o tamizado se varía. 105. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el primer organismo es un organismo procariotico. 106. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el segundo organismo es un organismo procariotico. 107. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el primer y segundo organismos son diferentes. 108. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el primer organismo se elige del grupo que consiste de Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, y Halobacteriu . 109. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el segundo organismo es Escherichia coli . 110. El método de conformidad con las reivindicaciones 38, 75, 97, o 102, caracterizado porque la selección o tamizado comprende uno o más de selección o tamizado positivos o negativos seleccionados de los grupos que consisten de un cambio en permeabilidad de amino ácido, un cambio en eficiencia de traducción y un cambio de fidelidad de traducción, en donde el uno o más cambios se basan en una mutación en uno o más genes en un organismo, en donde un par tRNA-tRNA sintetasa ortogonal se utiliza para producir proteína. 111. El método de conformidad con la reivindicación 38, 75, 97 o 102, caracterizado porque la selección o tamizado comprende seleccionar o tamizar al menos 2 codones selectores dentro de uno más genes de selección o dentro de uno o más genes de tamizado. 112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque los 2 codones selectores como mínimo están en el mismo gen de selección o el mismo gen de tamizado. 113. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque los 2 codones selectores como mínimo están en diferentes genes de tamizado o selección. 114. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque los 2 codones selectores como mínimo comprenden diferentes codones selectores . 115. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque los 2 codones selectores como mínimo comprenden los mismos codones selectores .