CN102625813A - 具有降低的聚集的免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有降低的聚集的免疫球蛋白和组合物，用计算工具产生这种免疫球蛋白的方法以及这种免疫球蛋白尤其在治疗和预防疾病中的使用方法。

Description

具有降低的聚集的免疫球蛋白
技术领域
本公开涉及具有降低的聚集的改良免疫球蛋白。
背景技术
了解和控制蛋白质稳定性已成为生物学家、化学家和工程师渴望的努力。氨基酸取代和疾病之间的第一个联系(Ingram.Nature.1957，180(4581)：326-8.)提供了健康和疾病中对蛋白质稳定性的新的和重要的看法。基于蛋白质的药物——尤其基于免疫球蛋白的药物——的近来巨大增长已产生了新的挑战。将治疗用蛋白质以非常高的浓度在液体中贮藏几个月。非单体种类的百分比随着时间增加。随着聚集体形成，不但产品的效力降低，而且副作用诸如对给药的免疫应答可能发生。保证蛋白质药物的稳定性对于产品的贮存期限是必要的。
由于抗体在各种疾病治愈中的潜能，抗体目前构成人类治疗学中增长最快速的种类(Carter.Nature Reviews Immunology.2006，6(5)，343)。自从2001年，抗体市场一直在以35％的平均年增长率——所有种类生物技术药物之中最高的速率——增长(S.Aggarwal.Nature.BioTech.2007，25(10)1097)。
如疾病治疗所需要的，治疗用免疫球蛋白以高浓度在水溶液中制备和贮藏。然而，这些免疫球蛋白在这些条件下在热力学上是不稳定的，并由于聚集而降解。这种聚集进而导致抗体活性的降低，使药物无效，甚至能产生免疫应答。因此，存在迫切的需要来产生较少倾向于聚集的治疗用免疫球蛋白。
许多现存的用于防止免疫球蛋白聚集的方法采用蛋白制剂中添加剂的使用。这与本文描述的直接方法不同，在该直接方法中免疫球蛋白本身基于从分子模拟预测的易聚集区域被修饰。在抗体稳定中通常使用的添加剂是含氮碱基的盐诸如精氨酸、胍或咪唑(EP0025275)的盐。用于稳定的其它合适的添加剂是聚醚(EPA0018609)、甘油、白蛋白和硫酸葡聚糖(美国专利号4808705)、去垢剂和表面活性剂诸如基于聚山梨酯的表面活性剂(公布文本DA2652636和公布文本GB2175906(英国专利申请号GB8514349))、蛋白伴侣诸如GroEL(Mendoza.Biotechnol.Tech.1991，(10)535-540)、柠檬酸盐缓冲剂(WO9322335)或螯合剂(WO9115509)。尽管这些添加剂在一定程度上使蛋白在溶液中变得稳定，但是它们遭受到某些缺点诸如用于添加剂去除的另外处理步骤的必要性。
已经产生了最佳免疫球蛋白变体以提高其它特性诸如Fc受体的结合。举例来说，产生了260种抗体变体的属(包括L234和L235突变种类)并测试其对FcγRIIIa和FcγRIIb的结合的影响，如美国专利公布号2004/0132101(Lazar et al.)中所公开。然而，Lazar et al.没有测试任何抗体变体的聚集倾向。
因此，需要改良免疫球蛋白组合物，诸如抗体治疗，其为直接稳定的，不需要添加剂的使用。
概述
本文描述的是显示降低的聚集和/或增加的稳定性的改良免疫球蛋白，其满足了该需要。
因此，一方面包括具有降低的聚集倾向的修饰和/或分离的免疫球蛋白，其包括在免疫球蛋白的保守区域中的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000021
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000022
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000023
半径球)的残基的
Figure BPA00001311304000024
之内，其中所述至少一个降低聚集的突变是用相比未突变的免疫球蛋白降低该残基的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000025
半径球)的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。在某些实施方式中，所述至少一个降低聚集的突变基于与IgG1序列的比对不在与IgG1中Kabat残基234(铰链)或235(铰链)对应的残基上。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白在这样的残基上具有第二降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000026
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000027
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000028
半径球)的残基的
Figure BPA00001311304000029
之内，其中所述第二降低聚集的突变是用氨基酸残基的取代，其是用相比未突变的免疫球蛋白降低该残基的空间聚集倾向(
Figure BPA000013113040000210
半径球)的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少至少
Figure BPA000013113040000212
至少
Figure BPA000013113040000213
或至少
Figure BPA000013113040000214
在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用赖氨酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(半径球)是利用经标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
另一方面包括具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在这样的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基选自来自聚集模体1：174(CH1)、175(CH1)和181(CH1)；聚集模体2：226(铰链)、227(铰链)、228(铰链)、229(铰链)、230(铰链)、231(铰链)和232(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：252(CH2)和253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：308(CH2)和309(CH2)；聚集模体9：328(CH2)、329(CH2)、330(CH2)和331(CH2)；聚集模体10：395(CH3)、396(CH3)、397(CH3)、398(CH3)和404(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)和111(CL)；聚集模体13：153(CL)和154(CL)；以及聚集模体14：201(CL)的残基，其中所述至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集；并且其中残基编号基于与IgG1序列的比对是IgG1中相应的Kabat残基编号。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变残基选自来自聚集模体1：175(CH1)；聚集模体2：227(铰链)、228(铰链)和230(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：309(CH2)；聚集模体9：329(CH2)和330(CH2)；聚集模体10：395(CH3)和398(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)；聚集模体13：154(CL)；和聚集模体14：201(CL)的残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变不是残基234(铰链)或235(铰链)。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变残基是234(铰链)、235(铰链)、253(CH2)或309(CH2)。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变残基是253(CH2)或309(CH2)。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，所述疏水性残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000031
之内，其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少至少
Figure BPA00001311304000042
至少
Figure BPA00001311304000043
或至少
Figure BPA00001311304000044
在可与任何一种具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有至少十四个降低聚集的突变，其中每个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用赖氨酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(半径球)是利用经标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
另一方面包括修饰的免疫球蛋白制剂，其可由浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的前述方面中任一个和前述实施方式的任一组合和所有组合的免疫球蛋白构成的。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，制剂包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
又一方面包括分离的或重组的多核苷酸，其编码前述修饰的免疫球蛋白方面的任何一个和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白。在某些实施方式中，多核苷酸在载体中。在某些实施方式中，载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，可诱导的启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实施方式中任何一种的载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸编码的免疫球蛋白。
另一方面包括产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主细胞的培养基和将培养基置于免疫球蛋白被表达的条件下。在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
另一方面包括降低高浓药物制剂中免疫球蛋白的聚集倾向的方法，所述方法包括提供易于聚集的免疫球蛋白；用降低空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000051
半径球)的氨基酸残基取代免疫球蛋白的保守结构域中的残基——其(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000052
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000053
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000054
之内；和产生修饰的免疫球蛋白的高浓液体制剂，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml，并且其中降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
另一方面包括前述修饰的免疫球蛋白方面的任一个和前述实施方式的任意和所有组合在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理、和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括周边T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病(schleraderma)、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物中的免疫球蛋白与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
另一方面包括前述修饰的免疫球蛋白方面的任一个和前述实施方式的任意和所有组合作为非聚集的药物活性成分的用途。
另一方面包括药物组合物，其包括前述方面中任一个和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
另一方面包括具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自235(铰链)、241(CH2)、243(CH2)、282(CH2)和309(CH2)的残基上的至少一个降低聚集的突变，其中如果残基235被选择，它被突变成谷氨酸或丝氨酸，如果残基282被选择，它被突变成赖氨酸，以及如果残基309被选择，它被突变成赖氨酸，并且其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集；并且其中残基编号基于与IgG1序列的比对是IgG1中相应的Kabat残基编号。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基241向丝氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括残基243向丝氨酸的第二降低聚集的突变。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基241向酪氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括残基243向酪氨酸的第二降低聚集的突变。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基282向赖氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括第二和第三降低聚集的突变，其中第二降低聚集的突变是残基235向赖氨酸的突变并且第三降低聚集的突变是残基309向赖氨酸的突变。在某些实施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，第二降低聚集的突变(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的之内。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有第三降低聚集的突变，其(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000072
之内，其中第三降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少至少
Figure BPA00001311304000074
至少
Figure BPA00001311304000075
或至少
Figure BPA00001311304000076
在可与任何一种具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有至少十四个降低聚集的突变，其中每个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000081
半径球)是利用经标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
另一方面包括修饰的免疫球蛋白制剂，其可由浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的前述方面中任一个和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白构成。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，制剂包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％较少的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
又一方面包括分离的或重组的多核苷酸，其编码前述修饰的免疫球蛋白方面的任一个和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白。在某些实施方式中，多核苷酸在载体中。在某些实施方式中，载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，可诱导的启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实施方式中任何一种的载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸编码的免疫球蛋白。
另一方面包括产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主细胞的培养基和将培养基置于免疫球蛋白被表达的条件下。在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
另一方面包括前述修饰的免疫球蛋白方面的任一个和前述实施方式的任意和所有组合在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞、和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理、和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括周边T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物中的免疫球蛋白与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％的聚集体。在某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
另一方面包括前述修饰的免疫球蛋白方面的任一个和前述实施方式的任意和所有组合作为非聚集的药物活性成分的用途。
另一方面包括药物组合物，其包括前述方面中任一个和前述实施方式的任意和所有组合的免疫球蛋白以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％少的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
贯穿说明书可发现本发明另外的方面和实施方式。
优选实施方式的详述
本公开涉及改良免疫球蛋白，尤其是人抗体，其具有降低的聚集。在某些实施方式中，本公开的免疫球蛋白在该免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区之内的特定疏水性残基上被修饰。本公开提供修饰的免疫球蛋白，制备这样的免疫球蛋白的方法，包含这样的免疫球蛋白的免疫连接物和多价或多特异性分子以及包含本公开的免疫球蛋白、免疫连接物或双特异性分子的药物组合物。
定义
本文所谈及的术语“抗体”包括整个抗体和其任何抗原结合片段(即，“结合抗原部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区能被进一步细分成称作互补决定区(CDR)的高度可变区，散布着称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下面的顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗原部分”)是指全长抗体或保留特异性结合抗原能力的抗体的一个或多个片段以及重链或轻链的恒定区的至少一部分。已经显示抗体结合抗原的功能可以通过全长抗体的片段执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包含的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括由铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段，由VH和CH1结构域组成；和Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成。
此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由分开的基因编码，但是它们可采用重组方法通过合成连接体进行连接，所述合成连接体能使它们形成单条蛋白链，其中VL和VH区域成对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird et al.，1988 Science 242：423-426；和Huston et al.，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段利用本领域技术人员已知的传统技术获得，并且抗体被筛选用于以与完整抗体相同的方式使用。
如本文所用，“分离的”抗体或免疫球蛋白是指基本上不含其它成分的抗体或免疫球蛋白，其中这样的抗体或免疫球蛋白是天然发现的。此外，分离的抗体或免疫球蛋白可基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体成分”是指单分子成分的抗体分子制备物。单克隆抗体成分一般显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”意欲包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区域来自人来源的序列。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也来自这样的人序列，例如，人种系序列、或突变形式的人种系序列或抗体，其包含从人框架序列分析导出的共有框架序列，如Knappik，et al.(2000.J Mol Biol 296，57-86)中所述的。
本公开的人抗体可包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”没有意欲包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物种类诸如小鼠的种系的CDR序列已经被接枝到人框架序列。
如本文所用，术语“人结构域”意欲包括来自人来源的序列的免疫球蛋白恒定区结构域，人来源的序列例如，人种系序列、或突变形式的人种系序列或抗体，其包含从人框架序列分析——如Knappik，et al.(2000.J Mol Biol 296，57-86)中所述的——导出的共有框架序列。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如，从对于人免疫球蛋白基因来说是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂种细胞分离的抗体，从转化以表达人抗体的宿主细胞例如从转染瘤分离的抗体，从重组组合人抗体文库分离的抗体，以及通过涉及将人免疫球蛋白基因——序列——的全部或一部分拼接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架和CDR区域来自人种系免疫球蛋白序列。在某些实施方式中，然而，这样的重组人抗体可经历体外诱变(或者，当使用对人Ig序列是转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其当来自人种系VH和VL序列或涉及人种系VH和VL序列时，可不天然存在于体内人抗体种系清单之内。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而抗原结合位点(可变区)被连接到不同或改变的种类的恒定区、效应功能和/或种类、或者授予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。例如，小鼠抗体可通过用包含本文公开的修饰的人免疫球蛋白的恒定区替代其恒定区而进行修饰。由于用人恒定区替代，嵌合抗体可保留其特异性同时相比原小鼠抗体或者没有本文公开的修饰的嵌合抗体整体具有降低的人中抗原性和降低的聚集。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时具有较少的人中免疫原性的抗体。这可例如通过保留非人CDR区域并用其人对应物替代抗体剩余部分(即恒定区以及可变区的框架部分)来实现。参见例如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Morrison and Oi，Adv.Immunol.，44：65-92，1988；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31：169-217，1994。人工程化技术的其它实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“人性化(Humaneering)”是指将非人抗体转化成工程化人抗体的方法(参见例如KaloBios的HumaneeringTM技术)。
如本文所用，“同种型”是指由具有本文公开的易聚集模体(并且因此顺从于本文公开的降低聚集的修饰)的重链恒定区基因提供的任何抗体种类(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG2)。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点抗体和抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在许多位点相互作用；相互作用越多，亲和力越强。本文公开的修饰优选地不降低本文公开的免疫球蛋白或抗体的亲和力或者亲和力被降低30％以下、20％以下、10％以下、或5％以下。如本文所用，当测定本文公开的修饰是否降低亲和力时，在具有该修饰的免疫球蛋白或抗体与缺乏该修饰但包括任何不相关突变的相同免疫球蛋白之间进行比较。举例来说，具有本文公开的L234K突变的人源化抗体将与具有除野生型L234之外完全相同序列的人源化抗体进行比较。
如本文所用，术语“对象(subject)”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行类等。
如本文所用，术语“优化的”意指核苷酸序列已经被改变以利用生产细胞或有机体中优选的密码子编码氨基酸序列，生产细胞一般地为真核细胞，例如毕赤酵母(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被工程改造以完全或尽可能多地保留由开始核苷酸序列原始编码的氨基酸序列，其也被称为“亲本”序列。本文也预期了这些序列在其它真核细胞中优化的表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为被优化的。
术语“表位(epitope)”意指能特异性结合抗体的蛋白质决定子。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面小组组成并且通常具有特异性的三维结构特性以及特异性的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于与前者而不是后者的结合在变性溶剂的存在下被丢失。
术语“保守修饰的变体(conservatively modified variant)”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些核酸，其编码同一或基本同一的氨基酸序列，或者其中核酸不将氨基酸序列编码成基本同一的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子规定的每个位置，密码子可被改变成所述的相应密码子中任何一个而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述该核酸的每个可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的各个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异在各个所述序列中是隐式的。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对于多肽序列的各个取代、缺失或添加，其导致氨基酸用化学上类似的氨基酸的取代。提供功能类似的氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。这种保守修饰的变体是除本公开的多态变体、种间同系物和等位基因之外的，并且没有排除本公开的多态变体、种间同系物和等位基因。下列八组包含互相为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、丝氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文，术语“同一的(identical)”或％“同一性(identity)”是指相同的两个或多个序列或子序列。如采用下列序列比较算法之一或者通过手工比对和视觉观察所测，当在比较窗或指定区上比较和比对为最大对应时，如果两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域，或者，当未指定时，在整个序列上，60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，两个序列是“基本同一的”。任选地，在长度为至少大约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或者更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上存在同一性。
对于序列比较，一般地一个序列作为参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果必要的话，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选的参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。当比较两个序列的同一性时，序列没有必要是邻接的，但是任何空位将随其携带一个将会降低整体百分数同一性的罚分。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5和空位延伸罚分＝2。对于blastp，默认参数是空位开放罚分＝11和空位延伸罚分＝1。
如本文所用，“比较窗(comparison window)”包括参考任意数目的邻接位置的区段，其包括但不限于20至600个，通常约50至约200个，更通常地约100至约150个邻接位置，其中可以将一个序列与相同数目的邻接位置的参考序列在两个序列最佳比对后进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过下列进行：Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法；Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法；Pearson and Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444，1988的搜索相似性方法；这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)；或者手工比对和视觉观察(参见，例如Brent et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(ringbou ed.，2003))。
适于测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其被分别描述在Altschul et al.，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977；和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。执行BLAST分析的软件可以通过National Center for Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中识别长度W的短字串识别高得分序列对(HSPs)，其当与数据库序列中相同长度的字串对齐时或者匹配或者满足一些正值阀分值T。T被称为相邻字串分值阀(Altschul et al.，同上)。这些初始相邻字串命中(hit)作为启动搜寻以寻找包含它们的更长HSPs的种子。字串命中沿着各个序列在两个方向延伸直到可以增加累积对齐分值。对于核苷酸序列，采用参数M(对于一对匹配残基，赏分值是＞0)和N(对于错配残基，罚分值总是＜0)计算累计分值。对于氨基酸序列，得分矩阵被用于计算累计分值。当下列情况时各方向上字串命中的延长停止：累积对齐分值从其获得的最大值下降量X；由于一个或多个负得分残基对齐累积，累计分值达到零或以下；或者达到任意序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用默认字长(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用默认字长3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)对齐(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。
BLAST算法也执行两序列之间相似性的统计学分析(参见，例如Karlin andAltschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。BLAST算法所提供的相似性的一种度量是最小加和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率表示。例如，如果测试核酸和参考核酸的比较中最小加和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01以及最优选地小于约0.001，核酸被认为与参考序列相似。
除了上面提到的序列同一性百分数，两个核酸或多肽基本同一的另一表示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽引起的抗体免疫学交叉反应，如下所述。因此，举例来说，在两肽区别仅在于保守取代的情况下，多肽与第二多肽一般基本上同一。两核酸序列基本同一的另一表示是两分子或它们的互补体在严格条件下相互杂交，如下所述。两核酸序列基本同一的又一表示是可用相同的引物扩增序列。
术语“可操作地连接”是指两个或多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。一般地，它是指转录调节序列和转录序列的功能关系。举例来说，启动子或增强子序列被可操作地连接到编码序列，如果它激励或调节编码序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中的转录的话。一般，被可操作地连接到转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理上是邻接的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要与它们增强其转录的编码序列物理邻接或位于其附近。
术语“载体”意欲指能够转运另一多核苷酸的多核苷酸分子，该另一多核苷酸与该多核苷酸分子连接。一种载体是“质粒”，其是指另外的DNA区段可被连接到其中的环状双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可被连接到病毒基因组。某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组，并且因此与宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能指导与它们可操作连接的基因表达。这样的载体在本文被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书中，当质粒是最常用的载体形式时，“质粒”和“载体”可交换使用。然而，本公开意欲包括这种其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其起到等同的功能。
术语“重组宿主细胞”(或者简单地，“宿主细胞”)是指重组表达载体被引入的细胞。应当理解，这样的术语意欲不仅指特定对象细胞而且指这种细胞的后代。因为某些修饰由于突变或环境影响可发生在后代，这种后代事实上可能与亲代细胞不相同，但仍被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“靶抗原”是指针对其引起或另外产生(例如通过噬菌体展示)亲代免疫球蛋白的抗原。
术语“未突变的免疫球蛋白”是指不包括至少一个降低聚集的突变的免疫球蛋白。如本文所用，未突变的免疫球蛋白可以是为了比较具有和不具有降低聚集的突变的免疫球蛋白的聚集倾向或结合亲合力的目的的假设构建物。举例来说，包含人源化突变以及降低聚集的突变的鼠科抗体不是未突变的免疫球蛋白。未突变的免疫球蛋白将是具有人源化突变但不具有降低聚集的突变的抗体。在突变意欲起到包括聚集降低在内的一个以上目的的情况下，未突变的免疫球蛋白不包括这样的突变。
术语“聚集模体(aggregation motif)”是指根据下列方法归类在一起的一组残基。首先，识别SAP(
Figure BPA00001311304000171
半径)大于0.15的残基。然后识别在SAP(
Figure BPA00001311304000172
半径)大于0.15的各个残基的
Figure BPA00001311304000173
之内的所有残基。那么模体是SAP(
Figure BPA00001311304000174
半径)大于0.15的残基以及SAP(
Figure BPA00001311304000175
半径)大于0.0在SAP(半径)大于0.15的残基的
Figure BPA00001311304000177
之内的所有残基。任何这种具有共同至少一个残基的模体被反复合并成较大的模体直到没有具有共同残基的剩余模体。这些剩余模体或者残基组构成聚集模体。下面表2列出IgG恒定结构域的聚集模体。
因此本发明的目的是提供具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在这样的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基选自来自聚集模体1：174(CH1)、175(CH1)和181(CH1)；聚集模体2：226(铰链)、227(铰链)、228(铰链)、229(铰链)、230(铰链)、231(铰链)和232(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：252(CH2)和253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：308(CH2)和309(CH2)；聚集模体9：328(CH2)、329(CH2)、330(CH2)和331(CH2)；聚集模体10：395(CH3)、396(CH3)、397(CH3)、398(CH3)和404(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)和111(CL)；聚集模体13：153(CL)和154(CL)；以及聚集模体14：201(CL)的残基，其中所述至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集；并且其中残基编号基于与IgG1序列的比对是IgG1中相应的Kabat残基编号。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变残基选自来自聚集模体1：175(CH1)；聚集模体2：227(铰链)、228(铰链)和230(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：309(CH2)；聚集模体9：329(CH2)和330(CH2)；聚集模体10：395(CH3)和398(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)；聚集模体13：154(CL)；和聚集模体14：201(CL)的残基。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变不是残基234(铰链)或235(铰链)。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变残基是234(铰链)、235(铰链)、253(CH2)或309(CH2)。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变残基是253(CH2)或309(CH2)。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，所述疏水性残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000178
之内，其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少
Figure BPA00001311304000181
至少
Figure BPA00001311304000182
至少
Figure BPA00001311304000183
或至少在可与任何一种具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有至少十四个降低聚集的突变，其中每个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用赖氨酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000185
半径球)是利用经标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
因此本发明进一步的目的是提供具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自下列的残基上的至少一个降低聚集的突变：235(铰链)、241(CH2)、243(CH2)、282(CH2)和309(CH2)，其中如果残基235被选择，它被突变成谷氨酸或丝氨酸，如果残基282被选择，它被突变成赖氨酸，以及如果残基309被选择，它被突变成赖氨酸，并且其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集；并且其中残基编号基于与IgG1序列的比对是IgG1中相应的Kabat残基编号。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基241向丝氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括残基243向丝氨酸的第二降低聚集的突变。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基241向酪氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括残基243向酪氨酸的第二降低聚集的突变。在某些实施方式中，至少一个降低聚集的突变是残基282向赖氨酸的突变，并且修饰或分离的免疫球蛋白进一步包括第二和第三降低聚集的突变，其中第二降低聚集的突变是残基235向赖氨酸的突变并且第三降低聚集的突变是残基309向赖氨酸的突变。在某些实施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，第二降低聚集的突变(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000191
之内。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有第三降低聚集的突变，其(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000192
之内，其中第三降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少
Figure BPA00001311304000193
至少
Figure BPA00001311304000194
至少
Figure BPA00001311304000195
或至少在可与任何一种具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有至少十四个降低聚集的突变，其中每个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的取代。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和组氨酸的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(半径球)是利用经标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
在免疫球蛋白残基以本文的编号被指代的情况下，残基编号是指当目标免疫球蛋白序列与人IgG1免疫球蛋白比对时IgG1分子中相应残基的Kabat编号。通过参考的方式，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定结构域被比对：
CH1结构域：
IgG1(SEQ ID NO：1)
IgG2(SEQ ID NO：2)
IgG4(SEQ ID NO：3)
IgG3(SEQ ID NO：4)
           ..A..    环     ....B....  环..C...  C′环..D.
      120       130       140       150      160       170
      |         |         |         |         |         |
IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
..  环    ...E.....环.    ...F... 环   ..G....接头
            180       190       200       210       220
             |         |         |         |         |
IgG1 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
IgG2 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC
IgG4 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
IgG3 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKTP
铰链：
IgG1(SEQ ID NO：5)
IgG2(SEQ ID NO：6)
IgG4(SEQ ID NO：7)
IgG3(SEQ ID NO：8)
   上                         中   下
                              230
                                |
IgG1 -DKTHT ----------------CPPCP APELLGG
IgG2 -VE--- ----------------CPPCP AP-PVAG
IgG4 -PP--- ----------------CPSCP APEFLGG
IgG3 LGTTHT CPRCPEPK********CPRCP APELLGG
CH2结构域：
IgG1(SEQ ID NO：9)
IgG2(SEQ ID NO：10)
IgG4(SEQ ID NO：11)
IgG3(SEQ ID NO：12)
      ..A..     环      ....B....    环 ..C..   C′环 ...D
      240      250         260      270       280       290
       |        |          |         |         |         |
IgG1 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
IgG2 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
IgG4 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
IgG3 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP
       ...环  ....E... .环.   ...F.....   环 ..G...接头C3
            300       310       320       330      340
             |         |         |         |        |
IgG1 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
IgG2 REEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPRE
IgG4 REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE
IgG3 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPRE
CH3结构域：
IgG1(SEQ ID NO：13)
IgG2(SEQ ID NO：14)
IgG4(SEQ ID NO：15)
IgG3(SEQ ID NO：16)
  ..A..    环    ....B....  环  ..C...  C′环..D....
   350       360       370       380       390      400
    |         |         |         |         |         |
IgG1
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
IgG2
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS
IgG4
PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
IgG3
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYKTTPPVLDS
       环 ....E...  .环.    ...F...环  ....G....
             410       420       430       440
              |         |         |         |
IgG1 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG2 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG4 DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
IgG3 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHFTQKSLSLSPGK
空间聚集倾向
本发明涉及识别蛋白质表面上的易聚集区域以及阻止或减少蛋白质聚集的方法。本发明可用于产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白，即，浓缩溶液中的免疫球蛋白保持基本上单体形式而不是较高有序聚集的多聚体。本文的方法显示了计算的方法识别蛋白质区域的能力中的进步，该蛋白质区域可被修饰以减少蛋白质聚集的倾向。特别地，这些方法至少部分基于SAA(溶剂可及面积)的计算，其用于表征蛋白质的表面是本领域已知的。SAA给出与溶剂接触的每个氨基酸或蛋白质结构的表面积。当探针球在蛋白质表面，即蛋白结构模型的表面上翻滚时，可典型地通过计算探针球体的中心轨迹计算SAA。探针球体具有与水分子相同的半径，
Figure BPA00001311304000221
下面描述的计算SAA的可选方法是本领域已知的并与本文描述的方法一致。尽管SAA对表征蛋白质的表面非常有用，但是由于下面的缺点，发现它不足以表征蛋白质表面上潜在的易聚集的疏水补丁(patch)，
1.SAA不区分疏水和亲水区域
2.SAA与残基的疏水性不成正比(例如，MET具有较LEU更多的表面面积，但是较不疏水)
3.SAA没有表明几个疏水残基是否是邻近的，并因此能增强某一区域的疏水性。这些残基在一级序列或三级结构——即使它们在一级序列上很远——可为邻近的。不管怎样，它们能增强抗体表面上某一补丁的疏水性。
通过根据下面的公式计算暴露的氨基酸部分的疏水性产生本文描述的一个度量，有效SAA：
Figure BPA00001311304000222
有效SAA的另外实施方式进一步包括合计在一级蛋白质序列中相邻的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个(例如，二个、三个、四个、五个、六个等)氨基酸残基的有效SAA。尽管有效SAA代表超过基本SAA的提高，但是它还是缺乏完全地说明折叠的蛋白质结构和说明在蛋白质序列中不相邻的氨基酸可以是在蛋白质折叠的二级、三级或四级结构中互相靠近的事实的能力。这样的蛋白质折叠可形成易聚集区域，其不单独出现在一级结构中，或只可通过更坚定地分析折叠的蛋白质结构而被检测。
本发明提供新的、更先进的称作空间聚集倾向的度量，其将突出蛋白质表面上的某一补丁或区域的有效疏水性。针对在蛋白结构模型的原子上或附近的限定的空间区域计算空间聚集倾向。
在该上下文中，“限定的空间区域”是选择的用以在蛋白质结构上或附近捕获局部物理结构和/或化学环境的三维空间或体积。在特别优选的实施方式中，针对集中在蛋白质中的原子(例如蛋白结构模型中的原子)上的具有半径R的球形区域计算空间聚集倾向。还可针对集中在化学键或定位在接近结构模型的空间中的具有半径R的球形区域计算空间聚集倾向。相应地，在另一实施方式中，可针对集中在原子附近，例如集中在空间上距特定原子或化学键的中心之间，更优选地
Figure BPA00001311304000232
之间，更优选地
Figure BPA00001311304000233
之间的点上的限定的空间区域计算SAP。
在某些实施方式中，选择的半径R在
Figure BPA00001311304000234
和
Figure BPA00001311304000235
之间。在特定的实施方式中，选择的半径是至少
Figure BPA00001311304000236
至少至少
Figure BPA00001311304000238
至少
Figure BPA00001311304000239
至少
Figure BPA000013113040002310
至少
Figure BPA000013113040002311
至少
Figure BPA000013113040002312
至少
Figure BPA000013113040002313
至少
Figure BPA000013113040002314
至少
Figure BPA000013113040002315
至少
Figure BPA000013113040002316
至少
Figure BPA000013113040002317
至少
Figure BPA000013113040002318
至少
Figure BPA000013113040002319
或至少
Figure BPA000013113040002320
在某些实施方式中，选择的半径在和
Figure BPA000013113040002322
之间，在
Figure BPA000013113040002323
和之间，或在
Figure BPA000013113040002325
和
Figure BPA000013113040002326
之间。在特定的实施方式中，选择的半径是
Figure BPA000013113040002327
或
Figure BPA000013113040002328
在其他的实施方式中，空间聚集倾向计算针对的区域不是球形的。该区域的可能的形状可进一步包括立方体、圆柱体、圆锥体、椭圆的球状体、锥体、半球或可用于封闭空间部分的任何其它形状。在这样的实施方式中，可使用除了半径外的测量，例如从形状的中心到面或顶点的距离选择区域的大小。
在某个实施方式中，可使用SAP选择蛋白质尤其抗体或免疫球蛋白中可被取代的残基，因此增加蛋白质的稳定性。在先前的研究中体外稳定蛋白质的两个主要方法已是：(1)改造蛋白质序列自身，和(2)包括液体制剂中的添加剂。已研究了这两个方法，并已获得了显著的结果。第一个方法已依赖经由电脑模拟(in silico)或以实验筛选随机变体的广泛文库。在第二个方法中，针对稳定添加剂的高通量的筛选以及添加剂的合理设计允许用于治疗用蛋白质的最佳制剂的鉴别。
本发明期望通过计算地识别存在的聚集热点和在实验上分析具有那些位点的取代的变体来使稳定性增强的过程有效率。
因此，一般地说，针对蛋白质中的特定原子计算空间聚集倾向的方法包括(a)识别代表该蛋白质的结构模型中的一个或多个原子，其中一个或多个原子位于集中于特定原子上或其附近的限定空间区域内；(b)针对限定空间区域中的一个或多个原子中的每一个，计算原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的SAA的比；(c)用一个或多个原子的原子疏水性乘以每个比；和(d)合计步骤(c)的乘积；借此该和是针对特定原子的SAP。
在相关的实施方式中，根据一种不同的方法可计算SAP，所述方法包括(a)识别代表蛋白质的结构模型中的一个或多个氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸残基具有集中于特定原子上或其附近的限定空间区域内的至少一个原子；(b)针对识别的一个或多个氨基酸残基中的每一个，计算氨基酸中原子的溶剂可及面积(SAA)与完全暴露的同一残基中原子的SAA的比；(c)用如通过氨基酸疏水性标度所测定的一个或多个氨基酸残基的疏水性乘以每个比；和(d)合计步骤(c)的乘积；借此该和是针对特定原子的SAP。在优选的实施方式中，在步骤(a)之前通过允许结构模型与分子动力学模拟中的溶剂相互作用处理结构模型。当氨基酸被识别为具有限定的空间区域内的至少一个原子时，可能需要至少一个原子是氨基酸侧链中专有的原子。可选地它可以是需要成为主链原子的原子。
在其它实施方式中，该方法可进一步包括任选地在步骤(a)之前进行分子动力学模拟和重复步骤(a)-(d)，每次在许多时间步骤进行进一步的分子动力学模拟，由此产生多个如步骤(d)中的和，和计算这些和的平均数；借此该计算的平均数是针对特定原子的SAP。
本领域的技术人员将理解使用分子动力学模拟计算的值的平均数的本发明实施方式将是计算上更强化的。这样的实施方式在某些情况下也将提供空间聚集倾向的更精确或高度分辨的图。然而，本文讨论的实验已显示当不使用分子动力学平均技术时，该方法仍然是高度准确的。在一种优选的实施方式中，可针对数据库例如蛋白质数据库(PDB)中的所有蛋白质结构计算空间聚集倾向值，由此很快识别所有已知蛋白质结构上的疏水残基和补丁。该方法允许大批蛋白质的快速筛选以识别潜在的易聚集区域和/或蛋白质相互作用位点。
在优选的应用中，空间聚集倾向被描述
通过下面的公式：
SAP原子＝∑模拟平均值(∑原子的R内的原子((SAA-R/SAA-fe)*原子-hb)
其中：
1)SAA-R是在每个模拟快照上计算的半径R内侧链原子的SAA。优选地通过计算当在蛋白质表面上翻滚时探针球体中心的轨迹而在模拟模型中计算SAA。探针球体具有与水分子相同的半径，
Figure BPA00001311304000241
本领域的技术人员将理解，计算SAA的其它方法将与这里描述的计算SAP的方法一致。例如，可只在氨基酸侧链原子上计算SAA。也可只在氨基酸主链原子(即肽主链的那些原子和结合的氢)上计算SAA。可选地，可只在氨基酸主链原子上计算SAA，排除结合的氢；
2)SAA-fe是在优选的实施方式中，通过计算完全伸展的三肽‘Ala-X-Ala’构象中中间残基的侧链SAA，获得的完全暴露的残基(说的是氨基酸‘X’)的侧链SAA；和
3)原子-hb是如上所述使用Black和Mould(Black and Mould，Anal.Biochem.1991，193，72-82)的疏水性标度获得的原子疏水性。该标度被标准化以使甘氨酸疏水性为零。因此，在疏水性标度上，疏水性比甘氨酸大的氨基酸为正并且疏水性比甘氨酸小的氨基酸为负。
“完全暴露的”残基是三肽Ala-X-Ala的完全伸展构象中的残基X。本领域的技术人员将理解该排列被设计，以至于在这样的残基X上的SAA的计算将产生可利用的最大溶剂可及面积。相应地，考虑可在计算中使用除丙氨酸外的其它残基而没有完全破坏或改变结果。
如上所述，可将本发明的方法应用于任何蛋白结构模型，其包括利用上述相同公式的X射线结构。
相似地，如果得不到X射线结构，可将相同的空间聚集倾向参数应用到通过同源建模产生的结构，并且SAP参数可利用上述相同公式计算。
在某些实施方式中，对蛋白结构模型中的所有原子计算空间聚集倾向。在一些实施方式中，可对每个单个蛋白质残基或小群体残基进行原子空间聚集倾向值平均化。
SAP方法的用途
一方面，本发明可如上面所描述的用于识别蛋白质中疏水的氨基酸残基、区域或补丁。没有想保持特定的阈值，认为具有空间聚集倾向＞0的原子或氨基酸残基是疏水的或位于易聚集区域中。根据蛋白质的类型、特定的结构和其存在的溶剂，可期望使用稍微低于零的截止值，例如通过选择具有大于-0.1、-0.15、-0.2等的空间聚集倾向的原子或残基，识别原子或残基。可选地，为了选择最强的疏水的原子、残基或补丁，可期望使用更严格的截止值，例如0、0.05、0.1、0.15、0.2等。此外，因为算法将更高的数给予补丁中心处的残基，因此满足截止值的残基的3A、4A、5A、7.5A或10A内的残基也可被选择用于突变成更小疏水性残基以降低聚集。在另一个实施方式中，只是选择具有大于连续地(即沿着蛋白质序列)或在优选实施方式中，空间上(即在三维结构中)附近的原子或残基的空间聚集倾向的原子或残基可以是有利的。选择疏水补丁中的原子或残基的一个优选的方法是将计算的空间聚集倾向值，例如使用彩色编码或数字编码，绘制到它们所来源的蛋白结构模型上，因此使跨过蛋白质表面的空间聚集倾向中的差别可视化，并因此允许疏水补丁或残基容易选择。在特别优选的实施方式中，使用选择的用于半径的两个值分开进行空间聚集倾向的计算，这两个值一个具有较高的分辨率，例如5A，一个具有较低的分辨率，例如10A。在这样的实施方式中，可在具有较低分辨率的图的蛋白质结构上看到较大或较宽的疏水补丁。一旦在低分辨率图上选择感兴趣的疏水补丁，可在较高分辨率的图中更详细地观察那些补丁，这可在一些实施方式中允许本领域的技术人员更容易地或更准确地选择残基以突变或修饰。例如，当在较高分辨率的图中观察疏水补丁时，可期望为突变选择具有最高SAP得分的残基或是最疏水的残基(例如根据Black和Mould，Anal.Biochem.1991，193，72-82的标度，补丁中最疏水的残基)。
在具体的实施方式中，识别蛋白上的易聚集区域的方法包括：(a)将如根据本文描述的方法中的任何一个所计算的针对蛋白质中原子的SAP绘制到结构模型上；和(b)识别具有SAP＞0的许多原子的蛋白质内的区域；其中易聚集区域包括，包含所述许多原子的氨基酸。在这样的实施方式中，可针对蛋白质中的所有原子或部分原子计算SAP。考虑一个人可只针对感兴趣的特定残基或许多组残基计算SAP。
在相似的实施方式中，绘制原子的SAP得分(或者在氨基酸残基上进行平均的SAP得分)可以是有教益的。这种显示沿着蛋白质的原子或残基的SAP得分的绘图允许峰容易识别，这可表明用于代替的候选物。在特别优选的实施方式中，将沿着蛋白质中的原子或残基的SAP得分绘制在曲线图中，针对图中的峰计算曲线下面积(AUC)。在这样的实施方式中，具有较大AUC的峰代表较大或较疏水的易聚集区域。在特定的实施方式中，将期望选择用于替代的一个或多个残基，该残基被识别为存在于峰中，或更优选地在具有大AUC的峰中。
在特定的实施方式中，本发明可用于制备显示减少的聚集倾向的免疫球蛋白变体，这是通过用较被替代的残基更亲水的氨基酸残基替代通过本文描述的方法中的任何一个识别的免疫球蛋白中易聚集区域内至少一个氨基酸残基，以至于减少了变体的聚集倾向。如本文所用，当氨基酸残基被称为“更”亲水或疏水或“更不”亲水或疏水时，熟练的技术人员应理解这表示根据本领域已知的疏水性(亲水性)的测量，例如Black和Mould的疏水性标度与另一个氨基酸相比更疏水或更不疏水。
在相似的实施方式中，本发明可用于制备显示减少的聚集倾向的免疫球蛋白变体，这是通过替代每个变体中免疫球蛋白中易聚集区域内至少一个氨基酸残基产生多个免疫球蛋白变体，其中使用根据本文描述的任何方法计算的SAP得分识别易聚集区域，其中在每个变体中替代一个或不同的残基或残基的不同组合，其中用更亲水的残基替代至少一个残基；和(b)选择如(a)中所制备的显示减少的聚集倾向的免疫球蛋白变体。
此外，可缺失而不是替代易聚集区域中的氨基酸残基。在多个氨基酸残基被选择用于替代的一些免疫球蛋白中，可替代一些残基，同时缺失其它的残基。
在另外的实施方式中，通过上面描述的方法(例如通过使用空间聚集倾向截止值——在其之上，残基被选择)可在最初的免疫球蛋白中识别多个易聚集区域或残基。随后，通过用更亲水的氨基酸残基替代所述最初的免疫球蛋白中一个或多个选择的氨基酸残基(或落进选择的补丁中的一个或多个残基)可产生许多免疫球蛋白变体，这样产生了代表许多种不同的氨基酸替代的许多免疫球蛋白变体。然后可筛选该群体以选择具有减少的聚集倾向的一个或多个免疫球蛋白变体。本领域的技术人员将理解可识别多个易聚集区域，可在一个或多个易聚集区域进行一个或多个替代和/或缺失。通过上面描述的Black和Mould的疏水性标度可测定氨基酸的相对疏水性。在特定的实施方式中，将被替代的氨基酸选自包括Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met、Pro、Cys、Ala或Gly的组或由其构成的组。在相关的实施方式中，将被替代进免疫球蛋白中的更亲水的氨基酸将选自包括Thr、Ser、Lys、Gln、Asn、His、Glu、Asp和Arg的组或由其构成的组。
因此本发明的目的是提供具有降低的聚集倾向的修饰和/或分离的免疫球蛋白，其包括在免疫球蛋白的保守区域中的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000271
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000273
半径球)的残基的
Figure BPA00001311304000274
之内，其中所述至少一个降低聚集的突变是用相比未突变的免疫球蛋白降低该残基的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000275
半径球)的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。在某些实施方式中，所述至少一个降低聚集的突变基于与IgG1序列的比对不在与IgG1中Kabat残基234(铰链)或235(铰链)对应的残基上。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白在这样的残基上具有第二降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000276
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000277
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000278
半径球)的残基的
Figure BPA00001311304000279
之内，其中所述第二降低聚集的突变是用氨基酸残基的取代，其是用相比未突变的免疫球蛋白降低该残基的空间聚集倾向(
Figure BPA000013113040002710
半径球)的氨基酸残基的取代。在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少至少至少
Figure BPA000013113040002713
或至少
Figure BPA000013113040002714
在可与具有第二降低聚集的突变的前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，降低聚集的突变是用赖氨酸残基的的取代。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，空间聚集倾向(半径球)是利用标准化以使甘氨酸等于0的Black Mould疏水性标度计算的。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白是IgG1。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH1结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH2结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CH3结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有人CL结构域。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白具有对靶抗原的结合亲合力并且对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
可通过本领域已知的任何方法制备免疫球蛋白变体，包括位点定向诱变和其它的重组DNA技术，例如参见本文通过引用并入的美国专利号5284760；5556747；5789166；6878531；5932419和6391548。
在特定的实施方式中，本发明可用于制备显示减少的聚集倾向的免疫球蛋白变体，这是通过用较被替代的残基更亲水的天然氨基酸残基、修饰的氨基酸残基、稀有的氨基酸残基、非天然氨基酸残基或氨基酸类似物或衍生物替代通过本文描述的方法中的任何一个识别的免疫球蛋白中易聚集区域内至少一个氨基酸残基，这样减少了变体的聚集倾向。
非天然氨基酸的合成是本领域技术人员已知的，并进一步在，例如美国专利公布号2003-0082575中被描述。一般而言，可使用将非天然的、修饰的或稀有的氨基酸合成或掺入进蛋白质的本领域已知的任何方法，包括但并不限于本文通过引用并入的出版物Liao J.Biotechnol Prog.2007 Jan-Feb；23(1)：28-31；Rajesh，andIqbal.Curr Pharm Biotechnol.2006 Aug；7(4)：247-59；Cardillo et al.Mini Rev MedChem.2006 Mar；6(3)：293-304；Wang et al.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2006；35：225-49；Chakraborty et al.，and Glycoconj J.2005 Mar；22(3)：83-93中描述或引用的那些方法。作为进一步的例子，可使用Ambrx ReCODETM技术来如本文描述的方法所示将非天然氨基酸或稀有氨基酸形成和掺入到蛋白质中。
根据本发明的免疫球蛋白变体能显示，例如，如通过加速的稳定性研究所测定的提高的或改进的稳定性。示例性的加速的稳定性研究包括但并不限于以增加的贮存温度为特征的研究。与野生型或最初的蛋白质相比，观察到的针对免疫球蛋白变体的聚集体形成的降低表明增加的稳定性。还可通过测量与野生型或最初的免疫球蛋白相比变体的熔解温度转换的变化测试免疫球蛋白变体的稳定性。在这样的实施方式中，当变体中的熔解温度转换增加时，增加的稳定性将是明显的。在美国专利申请号10/176,809中描述了测量蛋白质聚集的另外的方法。
因此本发明的目的是提供分离的或重组的多核苷酸，其编码如在段落[0059]、[0060]或[0089]以及他们的实施方式的任意和所有组合中所讨论的修饰免疫球蛋白。在某些实施方式中，多核苷酸在载体中。在某些实施方式中，载体是表达载体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，可诱导的启动子可操作地连接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述实施方式中任何一种的载体的宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞能表达通过多核苷酸编码的免疫球蛋白。
因此本发明的目的是提供产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述段落的宿主细胞的培养基和将该培养基置于免疫球蛋白被表达的条件下。在某些实施方式中，方法包括分离表达的免疫球蛋白的另外步骤。
在本发明的另一个方面，计算的空间聚集倾向可用于识别蛋白质结构表面上的蛋白质-蛋白质相互作用位点。蛋白质相互作用位点常常含有疏水残基或疏水补丁，这是本领域已知的。期望本文描述的方法在通过识别疏水补丁定位结合位点中将是有用的。这样的疏水补丁然后将是蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体识别位点的候选物。
在一些实施方式中，本发明进一步涉及用于根据本发明方法测定SAP的计算机编码。在其它的实施方式中，本发明涉及致力于执行本发明的方法的计算机、超级计算机或计算机集群。在另一个方面，本发明提供用于测定蛋白质上的易聚集区域的基于网络的、基于服务器的或基于互联网的服务，该服务包括接收来自用户(例如通过互联网)的关于蛋白质(例如蛋白结构模型)的数据或从数据库取回这样的数据，这样该服务供给者能产生、取回或存取蛋白质的静态结构，任选地包括蛋白质的分子动力学建模以提供蛋白质的动态结构，基于这样产生的静态或动态结构测定针对蛋白质的原子或残基的SAP，和将SAP数据，例如，作为服务供给者用所述SAP数据绘制的结构模型，返回给用户。在一些实施方式中，用户是人。在其它的实施方式中，用户是计算机系统或自动化的计算机算法。
在一些实施方式中，本发明提供SAP计算系统，包括：用于将用于计算SAP的网络服务通过互联网提供给用户终端的网络服务器；用于贮存关于计算方法、氨基酸疏水性等一般信息的数据库和用于基于数据库中的信息和用户通过互联网提供或传输的信息执行SAP计算的计算服务器。
在一些实施方式中，网络服务器和计算服务器是相同的计算机系统。在一些实施方式中，计算机系统是超级计算机、集群计算机或单个的工作站或服务器。在相关的实施方式中，SAP计算系统的网络服务器进一步包括用于控制全部操作的控制器、用于连接互联网的网络连接单元和用于将用于计算SAP的网络服务通过互联网提供给用户终端的网络服务器单元。
此外，本发明的实施方式进一步涉及具有计算机可读介质的计算机存储器产品，该产品含有用于执行各种计算机执行的操作的程序编码，所述计算机执行的操作例如计算针对结构模型的SAP、计算SAA、计算有效SAA、操纵结构模型、实现分子动力学模拟、组织和储存相关数据、或执行本文描述的其它操作。计算机可读介质是能储存数据的任何数据存储设备，该数据此后能被计算机系统读取。计算机可读介质的例子包括但并不限于硬盘、软盘、闪存驱动器、光盘(例如CD、DVD、HD-DVD、蓝光光盘等)和专门配置的硬件装置诸如特定用途集成电路(ASICs)或可编程逻辑器件(PLDs)。还能将计算机可读介质分布为包括在遍及偶联的计算机系统网络的载波中的数据信号，以便使计算机可读代码以分布的形式储存和执行。本领域的技术人员将理解上面描述的硬件和软件组件是具有标准设计和构造的。上面描述的计算机、互联网、服务器和服务相关的实施方式可进一步应用到SAA和有效SAA以及SAP。
包含免疫球蛋白和免疫球蛋白变体的药物组合物
在另一个方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的、通过本发明的方法产生的一种或多种免疫球蛋白变体。本发明的药物组合物还能在联合治疗中施用，例如与其它药剂结合。例如，联合治疗能包括与至少一种其它抗癌药剂结合的本发明的免疫球蛋白。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗的和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，可将活性化合物，即本发明的免疫球蛋白或其变体，包在材料中以保护化合物免受酸的作用和可使化合物失活的其它天然条件。
本发明的药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的期望生物学活性和不赋予任何不期望的毒理学作用的盐(参见，例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒的无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒的有机酸诸如脂肪族的一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族的磺酸等的那些盐。碱加成盐包括来自碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等，以及来自无毒的有机胺，诸如N，N′-二苄乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些盐。
本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶的抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油，诸如橄榄油，和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，通过包衣材料，诸如卵磷脂的使用，通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性剂的使用能维持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等确保阻止微生物的存在。还可期望将等渗剂，诸如糖、氯化钠等包括进组合物。此外，通过包含延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和明胶可带来可注射的药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌的水溶液或分散体和用于无菌可注射的溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。用于药学上有活性的物质的这样的介质和药剂的使用是本领域已知的。除了在任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容的情况下，考虑其在本发明的药物组合物中的使用。也能将补充的活性化合物掺入进组合物。
示例性的制剂包括至少一种本发明的免疫球蛋白变体和能包括较低浓度的稳定(或解聚)剂，除了本文公开的方法，其能用于阻止或减少免疫球蛋白的聚集。相应地，在含有通过本发明的方法产生的免疫球蛋白变体的药物组合物的开发中可使用用于阻止聚集的常规方法。例如，许多种稳定或解聚化合物可根据它们的预期的用途和它们的生物学毒性包括在本发明的药物组合物中。这样的稳定化合物可包括，例如环糊精及其衍生物(美国专利号5730969)、烷基葡糖苷组合物(美国专利申请号11/474,049)、蛋白伴侣分子的使用(例如LEA(Goyal et al.，BiochemJ.2005，388(Pt 1)：151-7；美国专利号5688651的方法)、甜菜碱化合物(Xiao，Burn，Tolbert，Bioconjug Chem.2008 May 23)、表面活性剂(例如Pluronic F127、PluronicF68、Tween 20(Wei et al.International Journal of Pharmaceutics.2007，338(1-2)：125-132))和美国专利号5696090、5688651和6420122中描述的方法。
此外，使用不同种类的赋形剂的组合在制剂中稳定蛋白质，特别是抗体，例如(1)二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通过优先的排除充当稳定剂并且还能在冻干期间充当冷冻保护剂，(2)表面活性剂(例如Polysorbat 80、Polysorbat 20)通过最小化界面象液体/冰、液体/材料表面和/或液体/气体界面上蛋白质的相互作用起作用，和(3)缓冲液(例如磷酸盐-、柠檬酸盐-、组氨酸)有助于控制和维持制剂pH。因此，除了本发明的方法外可以使用这样的二糖多元醇、表面活性剂和缓冲液以进一步稳定免疫球蛋白和防止它们的聚集。
治疗组合物典型地在制造和贮存条件下必须是无菌的和稳定的。能将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其它规则结构。载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过包衣诸如卵磷脂的使用、通过分散的情况下需要的粒度的维持和通过表面活性剂的使用能维持适当的流动性。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠将是优选的。通过将延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶包括在组合物中能带来可注射组合物的延长的吸收。
能通过将活性化合物以需要的量掺入到具有如所需要的、上面列举的一个成分或成分组合的适当溶剂，接下来通过灭菌微滤来制备无菌可注射的溶液。一般地，通过将活性化合物掺入进含有基本的分散介质和需要的来自上面列举的那些其它成分的无菌载体中制备分散体。在用于无菌可注射的溶液制备的无菌粉剂的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其生产活性成分加上任何另外期望的来自其先前无菌过滤的溶液的成分的粉末。
能与载体材料结合以产生单个剂量形式的活性成分的量将根据被治疗的受试者和施用的特定方式而变化。能与载体材料结合以产生单个剂量形式的活性成分的量将通常是产生疗效的组合物的量。一般地，100％中，这个量的范围将是约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的与药学上可接受的载体结合的活性成分。
因此本发明的目的是提供修饰的免疫球蛋白制剂，其可由浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的段落[0059]、[0060]或[0089]和它们的实施方式中任意和所有组合中讨论的修饰免疫球蛋白构成。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，制剂包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
因此本发明的目的是提供段落[0059]、[0060]或[0089]和它们的实施方式中任意和所有组合中讨论的修饰免疫球蛋白作为非聚集药物活性成分的用途。
因此本发明的目的是提供包括段落[0059]、[0060]或[0089]和它们的实施方式中任意和所有组合中讨论的修饰免疫球蛋白以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在可与前述实施方式组合的某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
调节剂量方案以提供最佳期望的反应(例如治疗反应)。例如，可施用单个大丸剂(bolus)，可随着时间施用几个分次剂量或可如治疗情形的紧急所指示的按比例地减少或增加剂量。配制以剂量单位形式的胃肠外组合物用于使施用容易和剂量均匀是尤其有利的。如本文所用的剂量单位形式指适合用作用于将被治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有计算的预定数量的活性化合物以与需要的药物载体联合地产生期望的疗效。针对本发明的剂量单位形式的说明受指示于并直接依赖于：(a)活性化合物的独特特性和将要达到的特定疗效，和(b)在复合这样的活性化合物进行治疗的领域中固有的、个体中灵敏度的限制。
对于免疫球蛋白的施用，剂量范围是每kg宿主体重约0.0001至100mg，更通常地0.01至5mg。例如剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一个月一次、每3个月一次或每3至6个月一次施用。用于本发明的免疫球蛋白的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中采用以下的给药方案之一给予抗体：(i)每四周，进行六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，接下来每三周1mg/kg体重。
可选地，本发明的免疫球蛋白作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率可根据患者中施用的物质的半衰期而变化。一般而言，人类抗体显示最长的半衰期，接下来是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。剂量和频率可根据治疗是否是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时期内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者连续接受治疗持续他们生命的剩余部分。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高的剂量直到疾病的进展被降低或终止，优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，可给患者施用预防性方案。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化以获得活性成分的量，该量对达到针对特定患者、组合物和施用方式的期望的治疗反应是有效的，对患者没有毒性。选择的剂量水平将依赖许多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、正在使用的特定化合物的排泄速度、治疗的持续时间、与使用的特定组合物结合使用的其它药物、化合物和/或材料、正被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状态和以前的病史和医学领域中众所周知的相似因素。
本发明的免疫球蛋白的“治疗上有效的剂量”优选地导致疾病症状严重性的降低、无疾病症状周期的频率和持续时间的增加、或由于疾病折磨的损害或残疾的阻止。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗上有效的剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，更优选地至少约80％。能在预示人类肿瘤中效能的动物模型系统中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。可选地，能通过熟练的实施者所知的试验检查化合物抑制例如体外抑制的能力来评价组合物的这种性质。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤大小或另外改善受试者中的症状。本领域的普通技术人员将能基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和特定的组合物或选择的施用途径这样的因素测定这样的量。
能使用本领域已知的许多种方法中的一个或多个通过一个或多个施用途径施用本发明的组合物。如熟练的技术人员所将理解的，施用的途径和/或方式将根据期望的结果而变化。用于本发明的结合部分的优选的施用途径包括静脉内的、肌肉内的、真皮内的、腹膜内的、皮下的、脊椎的或其它肠胃外的施用途径，例如通过注射或输注。短语“胃肠外施用”如本文所用指除了肠的和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括，没有限制，静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的和胸骨内的注射和输注。
可选地，能通过非胃肠外途径诸如局部的、表皮的或粘膜的施用途径施用本发明的免疫球蛋白，例如鼻内地、经口地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
能将活性化合物与载体一起制备，该载体将保护该化合物抵抗快速释放，诸如控制释放制剂，包括埋植剂、透皮贴片和微型胶囊递送系统。能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这样的制剂的制备的许多方法是取得专利权的或通常是本领域的技术人员已知的。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物能与本领域已知的医疗器材一起施用。例如，在优选的实施方式中，本发明的治疗组合物能与无针皮下注射装置，诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置一起施用。众所周知的埋植剂和在本发明中有用的模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以控制的速度分配药的可植入的微量输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确的输注速度递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续的药物递送的变速流可植入的输液器；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔小室的渗透性药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。
因此本发明的目的是提供降低高浓药物制剂中免疫球蛋白的聚集倾向的方法，所述方法包括提供易于聚集的免疫球蛋白；用降低空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000351
半径球)的氨基酸残基取代免疫球蛋白的保守结构域中的残基——其(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure BPA00001311304000353
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure BPA00001311304000354
之内；和产生修饰的免疫球蛋白的高浓液体制剂，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml，并且其中被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
因此本发明的目的是提供段落[0059]、[0060]或[0089]和它们的实施方式中任意和所有组合中讨论的修饰免疫球蛋白在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括周边T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。在某些实施方式中，该药物的用途是用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物的用途进一步包括药学上可接受的赋形剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物中的免疫球蛋白与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。在某些实施方式中，聚集通过SEC-HPLC进行测量。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。在可与任何一种前述实施方式组合的某些实施方式中，该药物基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
实施例
用于预测易聚集区域和研究聚集机制的分子模拟技术已主要使用相对简单的模拟模型(Ma and Nussinov.Curr.Opin.Chem.Biol.2006，10，445-452；Cellmer，etal.，TRENDS in Biotechnology 2007，25(6)，254)，其与可在本发明中使用的详细的原子论模型不同。使用的最不详细的模拟模型是点阵模型，其在为数众多的蛋白质聚集研究中使用(Harrison et al.J.MoL Biol.1999，286，593-606；Dima andThirumalai.Protein Sci.2002，11，1036-1049；Leonhard et al.Protein Sci.2004，13，358-369；Patro and Przybycien.Biophys.J.1994，66，1274-1289；Patro and Przybycien.Biophys.J.1996，70，2888-2902；Broglia et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12930-12933；Istrail et al.Comput.Biol.1999，6，143-162；Giugliarelli et al.Chem.Phys.2000，113，5072-5077；Bratko et al.J.Chem.Phys.2001，114，561-569；Bratkoand Blanch J.Chem.Phys.2003，118，5185-5194；Combe and Frenkel Chem.Phys.2003，118，9015-9022；Toma and Toma.Biomacromolecules 2000，1，232-238；Guptaet al.Protein Sci.1998，7，2642-2652；和Nguyen and Hall Biotechnol.Bioeng.2002，80，823-834)。这里每个残基被表示为在三维点阵中占据单一位点的珠子。由于其简单性，点阵模型是计算上要求较少的，并已用于模拟针对长期规模的大系统。尽管这些点阵模型提供蛋白聚集之下的基本物理学的洞察，但是它们未准确地表示二级和三级结构，并不能充分地解释不同原子论水平的相互作用诸如氢键合。
与点阵模型相比更详细的模型是中间分辨率模型，其中通常将几个原子结合进单个珠子中，有时引入假键以保持主链键角和异构化状态(Smith and Hall，Mol.Biol.2001，312，187-202；Smith and Hall.Proteins：Struct.，Funct.，Genet.2001，44，344-360；Smith and Hall.Proteins：Struct.，Funct.，Genet.2001，44，376-391；Nguyen，et al.，Protein Sci.2004，13，2909-2924；Nguyen and Hall，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2004，101(46)，16180-16185；Nguyen and Hall.J.Am.Chem.Soc.，2006，128，1890-1901；Jang，et al.，Biophys.J.2004，86，31-49；Jang，et al.，Protein Sci.2004，13，40-53)。该模型被成功地用于从任意的状态开始从含有12和96个之间的聚丙氨酸肽(每个16个残基)的系统模拟原纤维的形成(Nguyen and Hall，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2004，101(46)，16180-16185；Nguyen and Hall，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，1890-1901)。Dokholyan和同事应用这样的模型来通过八个模型Src SH3结构域蛋白(Ding，et al.，Mol.Biol.2002，324，851-857)或通过28个模型Aβ(1-40)肽(Peng，et al.，Phys.Rev.E：Stat.Ph.Interdiscip.Top.2004，69，41908-41914.)研究原纤维的β-折叠结构的形成。
与较简单的模型不同，原子论模型包括所有的原子论细节诸如氢键合，因此较点阵模型或中间分辨率模型更准确。这样的原子论模型已与显式溶剂或隐式溶剂一起使用，其中将溶剂处理为连续体。显式模型比隐式模型更准确但在计算上也要求更多。将这样的具有隐式溶剂的原子论模型用于七肽GNNQQNY(SEQ IDNO：17)聚集的早期阶段的研究，该肽是酵母蛋白Sup35的一部分(Gsponer，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100，5154-5159.)。将相似的模型用于Ab16-22淀粉状肽(KLVFFAE(SEQ ID NO：18))聚集成反向平行的β折叠(Klimov andThirumalai，Structure 2003，11，295-307)。Dokholyan和同事(Khare，et al.，Proteins.2005，61，617-632.)使用显式原子论模型来研究沿着酶Cu、Zn超氧化物歧化酶(SOD1)序列的规则聚集倾向。他们已将SOD1序列分解成重叠的七肽并进行了单体、二聚体和四聚体区段的大量显式水分子动力学模拟(每个0.5ns)。用这个他们识别了在SOD1序列中淀粉状蛋白生成的区域是：两个末端，β链4和7，和两个交叉环。
发展了相似的分子动力学模拟方案以获得关于淀粉状蛋白生成多肽的规则β聚集的结构信息(Cecchini et al.，J Mol Biol.2006，357，1306-1321.)。该方法是基于多肽链分解成重叠的区段和小拷贝数的每个区段的平衡分子动力学(MD)模拟。发现沿着阿尔茨海默尔的Aβ(1-42)肽序列的β-聚集倾向是高度异源的，其中最大值在区段V12HHQKLVFFAE22(SEQ ID NO：19)和最小值在四个转角样二肽。使用该技术，使用硫代黄素T结合试验体外检验酵母朊病毒Ure2p的N末端结构域的双点突变体的聚集倾向的预测改变。由于它们的巨大尺寸，将多肽链分解成重叠区段的这样的方法对系统诸如抗体将是非常具有挑战性的。由于抗体的巨大尺寸，甚至显式溶剂中的单个完全抗体的原子论模拟在计算上也要求多。因此，在文献中似乎没有完全抗体的原子论模拟。
然而，已有抗体的小部分的原子论模拟，大部分是针对Fab片段(Noon，et al.，PNAS.2002，99，6466；Sinha and Smith-Gill，Cell Biochemistry and Biophysics.2005，43，253)。在本文公开的工作中，用显式溶剂进行完全抗体分子的原子论模拟。基于这些模拟，使用本文描述的‘空间聚集倾向’参数识别抗体上的易聚集区域。然后将这些易聚集区域突变以设计具有增加的稳定性的抗体。本文描述的实施例参考本发明的非限制性实施方式。
实施例1：分子动力学模拟方法学
使用所有原子模型针对完全抗体进行分子动力学模拟。从单独的Fab和Fc片段的X射线结构获得用于针对完全抗体的模拟的最初结构。选择概念验证(proof-of-concept)(POC)Fab片段的X射线结构用于在从IgG1抗体1HZH获得的Fc的X射线结构上做模型(Saphire et al.，Science.2001，293，1155)。由于对于完全抗体，X射线结构是已知的，并且由于Fc结构对抗体的所有IgG1类是相同的，所以选择1HZH。然后通过使用1HZH结构作为模型模板校准Fab和Fc片段而获得完全POC抗体的结构。为了在正确的距离和方向校准片段，将片段的共同CYS残基和完全抗体模板(1HZH)之间的RMSD(均方根偏差)减到最小。选择CYS残基是因为每个抗体亚域(CH1、CH2等)含有二硫键，以及因此CYS残基广泛分布于整个抗体结构。然后将所得的完全抗体结构用于进行针对30ns的显式原子模拟。由于G0糖基化模型是在抗体中观察到的最普通的糖基化模型，所以将其用于模拟。
CHARMM模拟程序包(Brooks et al.J.Comput.Chem.，1983，4，187)用于建立和分析，NAMD程序包(Phillips et al.Journal of Computational Chemistry.2005，26，1781)用于进行模拟。CHARMM完全地原子论力场(MacKerell et al.J.PhysChem.B.1998，102，3586)用于针对水的蛋白质和TIP3P(Jorgensen et al.J.Chem.Phys.，1983，79，926)溶剂模型。在NPT系综中的298K和1atm进行模拟。取得针对参与Fc片段糖基化的糖基的参数，与CHARMM力场一致，接下来来自CSFF力场(Kuttel et al.J.Comput.Chem.，2002，23，1236)。基于电负性基团的空间接近度，选择在pH-7的组氨酸残基的质子化状态。将完全抗体在正交晶系盒中形成溶剂化物，由于这使需要的水分子数目减到最小，因此使计算时间减到最少。在所有3个方向使用周期边界条件。在正交晶系盒的每个方向使用
Figure BPA00001311304000381
的水溶剂化层。所得的总系统大小是202130个原子。加入足够的离子以中和系统的总电荷。用以计算系统中静电相互作用的贡献的Ewald求和技术需要电中性。
将抗体形成溶剂化之后，通过固定蛋白以允许水在蛋白质周围松弛，用SD(最速下降)使能量最初减到最小。然后去除限制，用SD和ABNR(牛顿-拉菲森法(Adopted Basis Newton-Raphson))将结构进一步减小。然后使用1fs的时间步骤每0.5ps 5℃的增加量将系统缓慢地加热到室温。然后在计算来自模拟的感兴趣的性质之前将该系统平衡1ns。模拟期间每0.1ps保存构型用于进一步的统计学分析。
实施例2：空间聚集倾向(SAP)的计算
为了克服SAA的缺点，将新的参数定义，称作如上面所描述的‘空间聚集倾向’。
在这个实施例中，为集中在实施例1描述的抗体中的每个原子上的具有半径R的球形区域计算‘空间聚集倾向’。因此用针对抗体的Fc片段的30ns模拟平均数对两个不同的补丁半径
Figure BPA00001311304000391
评价空间聚集倾向的值(本领域的技术人员将理解根据可用的计算资源和期望的结果分辨率可选择用于模拟的各个时间步骤)。在两种情况下，注意到多个数值是负的，表示最暴露的区域是亲水的。这如同所期望的，由于多数暴露的蛋白质表面通常是亲水的。还观察到有具有针对空间聚集倾向的正峰的几个区域，其表示高暴露的疏水性。从补丁的较低的半径
Figure BPA00001311304000392
进行到较高的半径
Figure BPA00001311304000393
除去一些峰，而提高了一些其它的峰。除去了一些峰因为在这些区域中亲水补丁包围着小的疏水补丁(具有小于
Figure BPA00001311304000394
的半径)；因此，将超过
Figure BPA00001311304000395
的平均化导致针对该区域的疏水性有效的降低。而在一些其它区域，由于包围相似的疏水补丁的疏水补丁，在
Figure BPA00001311304000396
的空间聚集倾向提高了。
在上面，在30ns模拟运行期间将空间聚集倾向计算为平均数。然后将使用模拟计算的结果与仅仅X射线结构空间聚集倾向比较，而没有分子模拟。空间聚集倾向(X射线)因此针对
Figure BPA00001311304000397
和
Figure BPA00001311304000398
计算。空间聚集倾向(X射线)与平均化的模拟值的空间聚集倾向相似，在相同的位置具有峰，但是在峰的大小上有差别。在补丁的较大半径，
Figure BPA00001311304000399
下，这些差别更高。这可能是因为当看大的补丁大小时，差别是累积的。由于动力学模拟运行中残基的不断改变的表面暴露，这些差别出现了。尽管如此，该比较显示从X射线结构本身能获得空间聚集倾向的好的最初评价，尤其是针对补丁R的低半径。
将来自模拟的针对
Figure BPA000013113040003910
和
Figure BPA000013113040003911
的空间聚集倾向值绘制到抗体结构上。在两种情况下，根据空间聚集倾向的值给抗体表面赋予颜色。在空间聚集倾向的计算中使用的两个半径(
Figure BPA000013113040003912
和)下观察到，表面主要是亲水的。这再次如所期望的，由于多数蛋白质表面通常是亲水的。然而，几个疏水性区域是令人注目的。疏水性和亲水性区域之间的对比在SAP的计算中使用的补丁的较高半径，
Figure BPA000013113040003914
下，更显著。某些识别的疏水性区域与已知与其它蛋白质相互作用的抗体的区域具有极好的相关性。铰链区中残基234和235周围的一个补丁是Fc-受体相互作用的地方。残基253周围的第二补丁与Fc片段中蛋白A和蛋白G相互作用的区域对应。在Fab片段末端观察到显著疏水的补丁对应于抗体结合抗原的区域。为
Figure BPA000013113040003915
和
Figure BPA000013113040003916
分别绘制空间聚集倾向的图，其中可观察到峰与相互作用区域的相同的相关性。从蛋白复合体，PDB条目1T89、1FC2和1FCC的X射线结构获得蛋白质相互作用位点(Radaev，J.Biol.Chem.2001，276(19)16469；Deisenhofer et al.Hoppe-Seyler′s Z Physiol Chem.1978.359，975-985；Deisenhofer，J.Biochemistry.1981，20，2361-2370；Sauer-Eriksson et al.Structure.1995，3，265)。疏水的相互作用与空间聚集倾向正峰相关联非常好，亲水的相互作用与空间聚集倾向负峰相关联好。因此，同样能将空间聚集倾向参数用于预测蛋白质的结合位点。在几乎没有的例外中，其中具有低的空间聚集倾向(即接近零，正的或负的)的残基也相互作用，观察到相互作用实际上是与主骨架链自身的原子，而不是与侧链。
除了已显示与上述其它蛋白质相互作用的疏水性补丁，还识别了抗体表面上另外的疏水性补丁(区域4至6)。在Fc底部的区域5是显著疏水的，但是它被稍微埋在内部，亲水区域在其边缘上。相似地，区域4和6是疏水的和溶剂暴露的，但是它们面对抗体的内部。如果由于抗体的显著的构象变化或解折叠，区域4和6被暴露的话，它们仍然能潜在地参与与其它蛋白质的相互作用。还能在较小的补丁半径
Figure BPA00001311304000401
下观察到所有的疏水补丁(区域1至6)，尽管与较高的补丁半径
Figure BPA00001311304000402
相比具有较小的差异。
也将基于仅仅X射线结构的空间聚集倾向(X射线)值绘制到抗体表面上以比较它们与模拟平均值。比较通过模拟或使用仅仅X射线结构计算的空间聚集倾向显示：识别的疏水性区域非常相似。当然存在一些差别，诸如蛋白A相互作用补丁的强度。尽管如此，这种比较显示基于仅仅X射线结构的空间聚集倾向(X射线)能用于获得表面上疏水补丁分布的良好描述。这是重要的，原因在于完全抗体的原子论模拟在计算上要求多。对于缺少X射线结构模型的蛋白，能将相同的空间聚集倾向参数应用于通过同源建模或从头开始的结构预测产生的结构。观察到同源结构与X射线结构非常相似，其空间聚集倾向值也与X射线结构相似。
因此空间聚集倾向识别抗体表面上的疏水补丁。这些补丁能固有地暴露或由于抗体的动态波动或局部的解折叠而暴露。这些疏水补丁中的一些也与同其它蛋白质相互作用的区域良好地相关联。为了检测通过空间聚集倾向预测的这些疏水补丁是否同样参与聚集，在这些具体区域中进行突变以将疏水的残基改变成亲水的残基。所得的抗体显示较少的聚集行为和提高的稳定性。除了识别易聚集残基，还观察到SAP方法正确地识别易于与其它蛋白质结合的抗体区域。因此，该方法能广阔地应用于所有蛋白质以识别易聚集区域或与其它蛋白质的结合区域。
实施例3：用于稳定性工程改造的抗体位点的选择
识别为具有高空间聚集倾向(并且因此在本发明人识别的易聚集模体的中心处)的残基显示在表1中。考虑到这些在模体的中心，这些残基以及那些在(或
Figure BPA00001311304000404
如果在计算中使用
Figure BPA00001311304000405
窗口的话)之内的残基可以被修饰成疏水性较低的残基，以降低聚集和/或增加稳定性。残基被识别为人IgG1抗体(具有κ轻链)，并且不同IgG种类中的相应残基被显示在表1中。
Figure BPA00001311304000411
表1显示模体在不同IgGs之间大部分是保守的，稍有差别。然而，大部分差别是从疏水性氨基酸至另一疏水性氨基酸。因此，模体的疏水性甚至在这些差别下也保持完好，因此在相同位置具有疏水性残基的其他种类也是易聚集模体。对于此有几个例外(A330S、V110K，和L201的缺失)，其不是易聚集模体。除了这些例外，这里识别的模体对于所有IgG种类的抗体具有类似暴露的疏水性和较高的SAP值。
表2显示组织成易聚集模体的疏水性残基。
表2：IgG1分子的恒定区的十四个模体
Figure BPA00001311304000421
Figure BPA00001311304000431
实施例4-用于稳定性工程改造的抗体位点的选择
为了证实由其SAP识别的易聚集模体涉及聚集和/或不稳定性，在识别的区域产生突变以将疏水性残基变成亲水性残基。这里所选的残基都被变成赖氨酸。一般地，形成一般模体的氨基酸可被Black和Mould标度中更亲水的氨基酸，尤其Thr、Ser、Lys、Gln、Asn、His、Glu、Asp和Arg取代。所选的区域如下：A1(L235K)、A2(I253K)、A3(L309K)、A4(L309K、L235K)和A5(L234K、L235K)。所得突变抗体显示较小的聚集行为和提高的稳定性，如实施例6中所述。
实施例5-抗体变体的表达和纯化
上面实施例4中讨论的所选残基被突变，并且所得抗体变体被表达和纯化。携带人IgG1抗体A的轻链或重链基因的载体通过将基因从专有载体(Novartis)亚克隆到gWIZ载体(Genlantis)获得，从瞬时转染(transient transfection)优化以获得高表达。按照位点定向诱变的Stratagene方案产生抗体变体。所有构建物通过DNA测序进行证实。mg规模的质粒DNA用DNA Maxi Prep柱(Invitrogen)从细菌培养基中进行纯化。按照厂商的方案进行FreeStyle HEK 293细胞(Invitrogen)的生长和瞬时转染。简单而言，对于1L培养物的转染，1mg总DNA(HC和LC载体各0.5mg)用20ml OptiPro溶液温育15分钟；同时2mg转染试剂聚乙烯亚胺(PEI(Polysciences)，1mg/ml)用20ml OptiPro溶液温育15分钟。然后将PEI溶液加入到DNA溶液，旋转混合，并且被温育另外15分钟。将20ml PEI/DNA混合物的等分试样以1.0×106细胞数/ml加入到500ml的细胞培养物中。转染的细胞于37℃下在CO2恒温箱中温育7-9天。
抗体野生型和变体利用FPLC AKTA Purifier系统(GE Healthcare)在蛋白A柱(GE Healthcare)上从组织培养物上清液中进行纯化。抗体利用50mM柠檬酸盐缓冲液pH 3.5从柱中洗脱，并且用1M Tris-HCl pH 9.0平衡至pH 6.6-7.0。该洗出液经过Q琼脂糖柱(GE Healthcare)以去除带负电的杂质。在pH 7.0及以下，抗体带正电并且保留在流通液中，而带负电的杂质结合到Q琼脂糖柱的带正电的基质。具有纯化的抗体的溶液用30K MWCO(Millipore，VWR)过滤器浓缩，并且缓冲液用20mM His缓冲液pH 6.5交换至最终浓度150mg/ml。
作为质量控制，通过SDS-PAGE在非还原和还原条件下分析被纯化并浓缩的样品的等分试样。每个样品4μg的蛋白质等分试样在具有和不具有DTT的变性缓冲液中进行温育，并且被在10％聚丙烯酰胺凝胶(Pierce)上解析。通过圆二色性比较了变体A1和野生型抗体，其中光谱实质相同，表明两蛋白质具有实质相同等级的二级结构。
实施例6-抗体变体的生物物理学表征
抗体变体的稳定性用三种不同的分析方法进行分析。
浊度试验
浊度试验在65℃下进行达4小时。抗体A和变体在20mM His，pH 6.5中浓度为150mg/ml，并且在15mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中稀释15倍至10mg/ml用于浊度评价。除了定性观察外，在进一步将样品稀释至1mg/ml并且记录如表3中所示的320nm下吸光度值后量化浊度。
表3：抗体A野生型和变体的浊度试验比较。150mg/ml的样品在65℃下温育达4小时。星号表示10mg/ml的溶液的状态，或者如果样品已经凝胶化，如下：*表示稀释后液体，混浊的；**表示稀释后凝胶，清澈的；以及***表示稀释后凝胶，混浊的。不带有星号的值是稀释后液体，清澈的。数值表示样品进一步稀释至1mg/ml后320nm下的吸光度。
  变体   0 HRS   1 HR   2 HRS   4 HRS
  WT   0.02   0.06   0.27*   ***
  A1   0.01   0.03   0.04   0.19*
  A2   0.01   0.04   0.07   **
  A3   0.01   0.03   0.05   **
  A4   0.01   0.04   0.04   0.13*
  A5   0.01   0.04   0.09   0.14*
尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)
作为第二优选的试验，SEC-HPLC被用于测定在加速聚集实验中单体随着时间的减少。抗体A野生型和变体于58℃下以150mg/ml在热循环器(BioRad)中温育达24小时。对于各时间点，2μl样品等分试样在15mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中稀释15倍至最终浓度10mg/ml。单体通过SEC-HPLC从非单体种类解析在TSKgel Super SW3000柱(TOSOH Bioscience)，其保持在22℃，流动相为150mM磷酸钾，pH 6.5，流速为0.2ml/min。单体百分数被计算为在280nm下检测的单体峰的面积除以所有峰的总面积。
差示扫描量热法
第三，抗体A野生型和变体的热力学稳定性通过差示扫描量热法(DSC，Microcal)进行比较。MAbs具有典型的DSC热图，具有三个熔解转变，如果不重叠：Fab、CH2和CH3(Ionescu et al.，J Pharm Sci，v.97，1414，2008；Mimura et al.，J BiolChem，v.276，45539，2001)。在这里所用的实验条件下，抗体A Fab在77℃下具有熔解转变。CH2和CH3熔解温度分别在73℃和83℃。因此，在抗体A中，CH2是具有最低熔解温度的抗体结构域。
抗体A野生型和变体A1-A5以浓度2mg/ml在20mM His pH 6.5缓冲液和加热速度1.0℃/min下进行分析。通过减去参考数据、标准化到蛋白浓度和DSC细胞体积，和立方基线的插入而分析样本数据。峰利用Microcal Origin 5.0软件通过非-2-态(non-2-state)拟合被解卷积。热图的比较表明变体中CH2熔解转变相比野生型增加了1至3℃，其中两个变体A4和A5差别最显著(下面表4)。
表4：Tm1是CH2结构域的熔化转变点。Tm2是Fab结构域的熔化转变点。Tm3是CH3结构域的熔化转变点。
Figure BPA00001311304000451
实施例7-总结
抗体A野生型和变体的浊度、SEC-HPLC和DSC实验的结果被总结在表5中。
表5：抗体A野生型和变体的总结结果。图例：+最不稳定；++如WT一样稳定；+++较稳定；++++最稳定。
Figure BPA00001311304000452
三种单个突变体A1、A2和A3中每一个通过三种分析方法中每一种显示提高的稳定性。在浊度试验中，抗体A wt野生型样品的稀释在65℃下应力2小时导致溶液发混，而所有变体的溶液保持清澈。样品的SEC-HPLC结果在58℃下应力24小时，显示单体从野生型91％增加至变体93-95％。当初始单体群为99％时，变体中非单体种类相比野生型相比下降了达一半。DSC分析表明CH2熔化转变(抗体A中具有最低熔解转变的结构域)从野生型的73℃增至变体的75-76℃。
替代变体A1中另外高SAP残基进一步提高了稳定性，如变体A4和A5的浊度结果和DSC热图所证明。SEC-HPLC结果显示仅仅变体A4相对于变体A1的提高(24小时应力后96％单体)，而不是变体A5(24小时应力后93％单体，像变体A1一样)。
经过证实，在第二抗体中产生类似的突变，其中在抗体的CDR区域中添加了残基的突变。所测试的突变中除了一个突变外都提高了稳定性和/或降低了聚集。CDR区域中一个残基上的突变没有如所预测得进行，然而，这可能是因为该变体没有良好地表达，其可能是由于折叠缺陷并且因此具有比野生型更大程度的聚集，甚至在加速聚集分析之前。因此，在框架和保守区域中测试的所有突变产生所预测的结果，因此证明SAP算法是强大的，唯一可能的例外是不能正确折叠的突变。然而，考虑到突变都是对于表面暴露的残基并且包括用更亲水性残基的取代，这种折叠问题期望是稀有的。
实施例8-另外抗体变体的稳定性分析
设计了另外的变体并且分析了其在第一和第二抗体中提高的稳定性。突变的位点基于SAP预测。各个变体中的突变被列在表6中。
表6：另外变体中突变位点的位置
Figure BPA00001311304000461
SEC-HPLC被用于测定在加速聚集实验中单体随时间的减少。对于第一抗体，野生型和变体抗体于58℃下以150mg/ml在热循环器(BioRad)中温育达24小时。对于第二抗体，野生型和变体抗体于52℃下以60mg/ml在热循环器(BioRad)中温育达36小时。对于各时间点，2μl样品等分试样在15mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5中稀释15倍至最终浓度10mg/ml。单体通过SEC-HPLC从非单体种类解析在TSKgel Super SW3000柱(TOSOH Bioscience)，其保持在22℃，流动相为150mM磷酸钾，pH 6.5，流速为0.2ml/min。单体百分数被计算为在280nm下检测的单体峰的面积除以所有峰的总面积。
变体A6显示在12小时从野生型的95.5％增加至96％单体并且在24小时从野生型的91％增加至92％单体。变体A7显示在12小时从野生型的96.5％增加至97.5％单体并且在24小时从野生型的91％增加至94％单体。变体A8显示在12小时从野生型的96.5％增加至98.5％单体并且在24小时从野生型的91％增加至97％单体。变体B6显示在12小时单体百分数没有明显差别，显示在24小时从野生型的97.5％增加至98％单体，并且在36小时从野生型的96％增加至97％单体。
实施例9-蛋白质-碳水化合物相互作用在SAP和稳定性方面的作用
在该实施例中我们测定了抗体的糖基化对SAP值的作用。在
Figure BPA00001311304000471
下测定具有和不具有糖基化的完整抗体的SAP。从具有G0-糖基化的完整抗体的30ns分子动力学模拟测定具有糖基化的抗体的SAP。不具有糖基化的抗体的SAP采用相同的模拟进行测定，但是其中我们在SAP分析中去除了糖基化。高SAP区域是最易聚集的区域。观察到糖基化的去除显著增加了被糖基化覆盖的区域中的SAP，尤其对于残基F241和F243。因此，糖基化的去除或取代导致易聚集区域的显著增加。这些区域可能直接引起聚集或者降低未折叠的自由能垒，使非糖基化形式相比糖基化形式更不稳定。
为了通过实验进一步研究蛋白质-碳水化合物相互作用的作用，产生了两种抗体突变，F241S F243S(变体FS)和F241Y F243Y(变体FY)。变体FS具有已知与碳水化合物部分相互作用的苯丙氨酸残基，其被具有较小非芳族侧链的极性丝氨酸残基取代(Deisenhofer，Biochem，1981，20，2361-70；Krapp et al.，J Mol Biol，2003，325，979-89)。在变体FY中，相同的苯丙氨酸残基被Tyr残基——其已经表明具有较高的糖界面倾向——取代(Taroni et al.，Protein Eng，2000，13，89-98)。同时，其他疏水性残基例如Val264在该区域保持未修饰。野生型和变体FY具有非常少的——如果有的话——其碳水化合物的唾液酸化作用，而变体FS分子的接近50％具有至少一个唾液酸残基。
在加速聚集实验中和通过差示扫描微量热法(DSC)比较野生型和变体FS和FY的稳定性。150mg/ml的样品被诱导成在58℃下聚集达36小时，并且单体水平被解析并且通过尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)量化。野生型单体水平对于0、12、24和36小时时间点逐渐从100降至96、91和87％。比较起来，变体FY在较早的时间点已将单体水平降低1-3％但在36小时保持在88％，其在野生型的统计学误差之内。变体FS在该温度下明显不稳定，显示在12小时单体从99％降至39％，以及在24小时降至20％。36小时样品由于不存在大量可见聚集体而没有在SEC-HPLC上运行。
DSC结果也区分变体和野生型。CH2结构域的熔解温度(Tm)从野生型的73℃降至变体FS的59℃。对于Fab和CH3的熔解转变也观察到变体FS中微小的差别，不大于1℃。尽管变体FY的CH2熔解转变肩部与野生型重叠，但是软件拟合显示CH2Tm降至71℃，而其他两个Tm′s保持不变。
进行了许多另外的实验以比较变体FS与野生型和更好地理解所观察到的稳定性下降。变体FS保持与野生型相同的富含β折叠的结构。变体相比起野生型在还原以及天然凝胶电泳上具有不同的迁移模式。还进行了蛋白酶处理实验以比较变体FS和野生型中的蛋白表面暴露。对于变体FS，用Glu-C消化抗体比野生型更有效(更小的片段)；在变体和野生型脱糖基化的对应物中效率在很大程度上相等，尽管有一些差别。此外，变体FS保持完全FcRn和部分FcγRIa结合功能但失去对FcγRII和FcγRIII受体的结合。
Figure ISB00000462159200011
Figure ISB00000462159200021
Figure ISB00000462159200031

Claims (122)

1.具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在所述免疫球蛋白的保守结构域中的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900011
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900012
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(半径球)的残基的
Figure FPA00001311303900014
之内，其中所述至少一个降低聚集的突变是用相比未突变的免疫球蛋白降低所述残基的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900015
半径球)的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
2.权利要求1的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变不是残基234(铰链)或235(铰链)。
3.权利要求1的修饰或分离的免疫球蛋白，其进一步包括在这样的残基上的第二降低聚集的突变，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900016
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900017
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900018
半径球)的残基的之内，其中所述第二降低聚集的突变是用相比未突变的免疫球蛋白降低所述残基的空间聚集倾向(
Figure FPA000013113039000110
半径球)的氨基酸残基的取代。
4.权利要求3的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少
Figure FPA000013113039000111
至少
Figure FPA000013113039000112
至少或至少
Figure FPA000013113039000114
5.权利要求3的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。
6.权利要求1-5中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。
7.权利要求1-5中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。
8.权利要求1-5中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的取代。
9.权利要求1-5中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用赖氨酸残基的取代。
10.权利要求1-9中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白选自包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的组。
11.权利要求1-9中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
12.权利要求1-11中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH1结构域。
13.权利要求1-12中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH2结构域。
14.权利要求1-13中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH3结构域。
15.权利要求1-14中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CL结构域。
16.权利要求1-15中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白进一步包括对靶抗原的结合亲合力，并且所述对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。
17.权利要求1-16中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。
18.具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在这样的残基上的至少一个降低聚集的突变，所述残基选自来自聚集模体1：174(CH1)、175(CH1)和181(CH1)；聚集模体2：226(铰链)、227(铰链)、228(铰链)、229(铰链)、230(铰链)、231(铰链)和232(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：252(CH2)和253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：308(CH2)和309(CH2)；聚集模体9：328(CH2)、329(CH2)、330(CH2)和331(CH2)；聚集模体10：395(CH3)、396(CH3)、397(CH3)、398(CH3)和404(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)和111(CL)；聚集模体13：153(CL)和154(CL)；以及聚集模体14：201(CL)的残基，其中所述至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代，并且被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
19.权利要求18的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变残基选自来自聚集模体1：175(CH1)；聚集模体2：227(铰链)、228(铰链)和230(铰链)；聚集模体3：234(铰链)和235(铰链)；聚集模体4：253(CH2)；聚集模体5：282(CH2)；聚集模体6：291(CH2)；聚集模体7：296(CH2)；聚集模体8：309(CH2)；聚集模体9：329(CH2)和330(CH2)；聚集模体10：395(CH3)和398(CH3)；聚集模体11：443(CH3)；聚集模体12：110(CL)；聚集模体13：154(CL)；和聚集模体14：201(CL)的残基。
20.权利要求18或权利要求19的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变不是残基234(铰链)或235(铰链)。
21.权利要求18的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变残基选自234(铰链)、235(铰链)、253(CH2)和309(CH2)。
22.权利要求18的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变残基是253(CH2)或309(CH2)。
23.权利要求18-22中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其进一步包括在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，所述疏水性残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的之内，其中所述第二降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。
24.权利要求23的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少
Figure FPA00001311303900032
至少
Figure FPA00001311303900033
至少
Figure FPA00001311303900034
或至少
25.权利要求23的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。
26.权利要求18-22中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括至少十四个降低聚集的突变，其中各个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。
27.权利要求18-26中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸残基的取代。
28.权利要求18-26中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸残基的取代。
29.权利要求18-26中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用赖氨酸残基的取代。
30.权利要求18-29中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白选自包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的组。
31.权利要求18-29中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
32.权利要求18-31中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH1结构域。
33.权利要求18-32中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH2结构域。
34.权利要求18-33中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH3结构域。
35.权利要求18-34中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CL结构域。
36.权利要求18-35中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白进一步包括对靶抗原的结合亲合力，并且所述对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。
37.权利要求18-36中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
38.修饰的免疫球蛋白制剂，其包括权利要求1-37中任一项的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
39.权利要求38的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。
40.权利要求38或权利要求39的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。
41.权利要求38-40中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。
42.权利要求38-41中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。
43.权利要求42的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
44.权利要求38-43中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
45.权利要求38-43中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
46.分离的或重组的多核苷酸，其编码权利要求1-37中任一项的免疫球蛋白。
47.载体，其包括权利要求46的多核苷酸。
48.权利要求47的载体，其进一步包括可操作连接到所述多核苷酸的诱导型启动子。
49.宿主细胞，其包括权利要求47或权利要求48的载体。
50.产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白的方法，其包括：
(a)提供培养基，其包括权利要求49的宿主细胞；和
(b)将所述培养基置于所述免疫球蛋白被表达的条件下。
51.权利要求50的方法，其进一步包括(c)分离所述免疫球蛋白。
52.降低高浓药物制剂中免疫球蛋白的聚集倾向的方法，所述方法包括：
(a)提供易于聚集的免疫球蛋白；
(b)用降低空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900061
半径球)的氨基酸残基取代免疫球蛋白的保守结构域中的残基——其(i)具有至少0.15的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900062
半径球)，或者(ii)具有大于0.0的空间聚集倾向(
Figure FPA00001311303900063
半径球)并且在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的之内；和
(iii)产生修饰的免疫球蛋白的高浓液体制剂，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml，
并且其中所述被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
53.权利要求1-37中任一项的修饰的免疫球蛋白在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
54.权利要求53的用途，其中所述药物用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。
55.权利要求53的用途，其中所述药物用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞、和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理、和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括周边T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。
56.权利要求53的用途，其中所述药物用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。
57.权利要求53-56中任一项的用途，其中所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
58.权利要求53-57中任一项的用途，其中所述药物中的所述免疫球蛋白与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。
59.权利要求58的用途，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
60.权利要求53-59中任一项的用途，其中所述药物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
61.权利要求53-59中任一项的用途，其中所述药物基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
62.权利要求1-37中任一项的修饰的免疫球蛋白作为非聚集药物活性成分的用途。
63.药物组合物，其包括权利要求1-37中任一项的免疫球蛋白和药学上可接受的赋形剂。
64.权利要求63的药物组合物，其中所述免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
65.权利要求63或权利要求64的药物组合物，其中所述免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。
66.权利要求63-65中任一项的药物组合物，其中所述修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。
67.权利要求63-66中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。
68.权利要求67的药物组合物，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
69.权利要求63-68中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
70.权利要求63-69中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
71.具有降低的聚集倾向的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括在选自235(铰链)、241(CH2)、243(CH2)、282(CH2)和309(CH2)的残基上的至少一个降低聚集的突变，其中如果残基235被选择，它被突变成谷氨酸或丝氨酸，如果残基282被选择，它被突变成赖氨酸，以及如果残基309被选择，它被突变成赖氨酸，并且其中至少一个降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代，并且所述被降低的聚集倾向是浓缩的液体溶液中免疫球蛋白分子之间的聚集。
72.权利要求71的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变是残基241向丝氨酸的突变，并且进一步包括残基243向丝氨酸的第二降低聚集的突变。
73.权利要求71的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变是残基241向酪氨酸的突变，并且进一步包括残基243向酪氨酸的第二降低聚集的突变。
74.权利要求71的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述至少一个降低聚集的突变是残基282向赖氨酸的突变，并且进一步包括第二和第三降低聚集的突变，其中所述第二降低聚集的突变是残基235向赖氨酸的突变，并且所述第三降低聚集的突变是残基309向赖氨酸的突变。
75.权利要求71的修饰或分离的免疫球蛋白，其进一步包括在疏水性残基上的第二降低聚集的突变，其中所述第二降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。
76.权利要求75的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述第二降低聚集的突变在这样的残基上，所述残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的
Figure FPA00001311303900091
之内。
77.权利要求75或权利要求76的修饰或分离的免疫球蛋白，其进一步包括在疏水性残基上的第三降低聚集的突变，所述疏水性残基(i)具有至少0.15的空间聚集倾向，或者(ii)在具有至少0.15的空间聚集倾向的残基的之内，其中所述第三降低聚集的突变是用疏水性比未修饰的免疫球蛋白中的残基小的氨基酸残基的取代。
78.权利要求75-77中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变相隔至少
Figure FPA00001311303900093
至少
Figure FPA00001311303900094
至少
Figure FPA00001311303900095
或至少
79.权利要求75-77中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变和第二降低聚集的突变在不同的聚集模体里。
80.权利要求71的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括至少十四个降低聚集的突变，其中各个降低聚集的突变选自不同的聚集模体。
81.权利要求71或75-80中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和丝氨酸的氨基酸残基的取代。
82.权利要求71或75-80中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述降低聚集的突变是用选自赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的取代。
83.权利要求71-82中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白选自包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的组。
84.权利要求71-82中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包括IgG1。
85.权利要求71-84中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH1结构域。
86.权利要求71-85中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH2结构域。
87.权利要求71-86中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CH3结构域。
88.权利要求71-87中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其包括人CL结构域。
89.权利要求71-88中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白进一步包括对靶抗原的结合亲合力，并且所述对靶抗原的结合亲合力是未突变的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。
90.权利要求71-89中任一项的修饰或分离的免疫球蛋白，其中所述浓缩的液体溶液浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。
91.修饰的免疫球蛋白制剂，其包括权利要求71-90中任一项的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
92.权利要求91的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。
93.权利要求91或权利要求92的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。
94.权利要求91-93中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。
95.权利要求91-93中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％的聚集体。
96.权利要求95的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
97.权利要求91-96中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
98.权利要求91-96中任一项的修饰的免疫球蛋白制剂，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
99.分离的或重组的多核苷酸，其编码权利要求71-90中任一项的免疫球蛋白。
100.载体，其包括权利要求99的多核苷酸。
101.权利要求100的载体，其进一步包括可操作连接到所述多核苷酸的诱导型启动子。
102.宿主细胞，其包括权利要求100或权利要求101的载体。
103.产生具有降低的聚集倾向的免疫球蛋白的方法，其包括：
(a)提供培养基，其包括权利要求102的宿主细胞；和
(b)将所述培养基置于所述免疫球蛋白被表达的条件下。
104.权利要求103的方法，其进一步包括(c)分离所述免疫球蛋白。
105.权利要求71-90中任一项的修饰的免疫球蛋白在包含高浓液体制剂的药物的制备中的用途，其中所述修饰的免疫球蛋白浓度为至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。
106.权利要求105的用途，其中所述药物用于治疗自身免疫疾病、免疫学疾病、传染病、炎性疾病、神经学疾病以及包括癌症在内的肿瘤学和瘤性疾病。
107.权利要求105的用途，其中所述药物用于治疗充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、红斑痤疮、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病症、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑液成纤维细胞、和骨髓基质；骨丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；乳腺癌；废用性骨量减少、营养不良、牙周病、高歇病、朗格罕细胞组织细胞增生症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库兴综合征、单骨纤维性骨发育不良、多骨纤维性骨发育不良、牙周重建和骨折；肉样瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨痛处理和体液恶性高钙血症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液学瘤形成和瘤样病症，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样霉菌病、套细胞淋巴瘤、巨滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病和淋巴浆细胞性白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，其包括B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、和T细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK细胞的肿瘤，其包括周边T细胞白血病、成人T细胞白血病/T细胞淋巴瘤和大粒状淋巴细胞白血病、朗格罕细胞组织细胞增生症、骨髓瘤形成诸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、没有分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中枢神经系统的肿瘤，例如，脑瘤(神经胶质瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、室管膜瘤和成视网膜细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、和血管系统的肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、骨质疏松症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎关节炎、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、脓毒病和败血症性休克、克罗恩病、牛皮癣、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、异源胰岛移植物排斥、血液学恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、与肿瘤相关的炎症、周围神经损伤或脱髓鞘病。
108.权利要求105的用途，其中所述药物用于治疗菌斑牛皮癣、溃疡性大肠炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、幼年特发性关节炎、黄斑变性、呼吸道合胞病毒、克罗恩病、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、治疗诱导的骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤、阿尔茨海默病、青光眼和多发性硬化症。
109.权利要求105-108中任一项的用途，其中所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。
110.权利要求105-109中任一项的用途，其中所述药物中的所述免疫球蛋白与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％的聚集体。
111.权利要求110的用途，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
112.权利要求105-111中任一项的用途，其中所述药物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
113.权利要求105-111中任一项的用途，其中所述药物基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
114.权利要求71-90中任一项的修饰的免疫球蛋白作为非聚集药物活性成分的用途。
115.药物组合物，其包括权利要求71-90中任一项的免疫球蛋白和药学上可接受的赋形剂。
116.权利要求115的药物组合物，其中所述免疫球蛋白浓度为至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml或至少150mg/ml。
117.权利要求115或权利要求116的药物组合物，其中所述免疫球蛋白浓度大于相同条件下未突变的免疫球蛋白在浓缩的液体溶液中与自身聚集时的浓度。
118.权利要求115-117中任一项的药物组合物，其中所述修饰的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的单体。
119.权利要求115-118中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂与相同条件下的未突变的免疫球蛋白相比在24小时加速聚集之后显示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集体。
120.权利要求119的药物组合物，其中所述聚集通过SEC-HPLC进行测量。
121.权利要求115-120中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加剂。
122.权利要求115-121中任一项的药物组合物，其中所述免疫球蛋白制剂基本上不含游离的组氨酸、糖类和多元醇。
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