JP2017071627A

JP2017071627A - 凝集が低減された免疫グロブリン

Info

Publication number: JP2017071627A
Application number: JP2016232369A
Authority: JP
Inventors: チェナムセティーナレッシュ; Chennamsetty Naresh; ヘルクバーナード; Helk Bernhard; ケイサーヴェイセル; Kayser Veysel; トラウトバーナート; Trout Bernhardt; ヴォイノフヴラジミール; Voynov Vladimir
Original assignee: Novartis AG; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Novartis AG; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-04-13
Also published as: ES2669591T3; CN102625813A; EP3385870A1; CA2727937A1; US9676841B2; KR20110059588A; AU2009259901A1; US20120003211A1; AU2009259901B2; JP6146949B2; JP2012502622A; US20140348820A1; TR201807049T4; KR101784231B1; WO2009155513A2; BRPI0915419A2; RU2532226C2; WO2009155513A3; DK2310412T3; LT2310412T

Abstract

【課題】凝集が低減された免疫グロブリンの提供。
【解決手段】本開示は、低下した凝集を有する免疫グロブリンおよび組成物、コンピュータツールを用いてそのような免疫グロブリンを生成するための方法および特に疾患の治療および予防においてそのような免疫グロブリンを使用するための方法に関する。一局面において、本発明は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変および／または単離免疫グロブリンが提供される。
【選択図】なし

Description

本開示は、凝集が低減された、改良された免疫グロブリンに関する。

タンパク質安定性の理解およびコントロールは、生物学者、化学者、および技術者にとって切望される試みであった。アミノ酸置換および疾患の間の第１の関係（非特許文献１）は、健康および疾患における、タンパク質安定性に対する新しく本質的な展望を提供した。タンパク質に基づく医薬品、特に免疫グロブリンに基づく医薬品の最近の莫大な増加は、新しい障害を生み出した。治療用タンパク質は、非常に高濃度で数か月の間、液体中で保存される。非単量体種のパーセントが、時と共に増加する。凝集体が形成されると、産物の効能が減少するだけではなく、投与に際しての免疫応答などのような副作用が生じ得る。産物の貯蔵寿命のためのタンパク質医薬品の安定性を確実にすることは、避けられない。

様々な疾患の治癒におけるそれらの潜在能力のために、抗体は、現在最も急速に成長しているクラスのヒト治療薬を構成する（非特許文献２）。２００１年以来、それらの市場は、３５％の平均年間成長率で成長しており、これは、バイオテクノロジー薬剤のすべてのカテゴリーの中で最も高い率である（非特許文献３）。

治療用免疫グロブリンは、疾患治療に必要なように、高濃度で水溶液中に調製および保存される。しかしながら、これらの免疫グロブリンは、これらの条件下で熱力学的に不安定となり、凝集により分解する。凝集は、ひいては、抗体活性の減少に至り、薬剤を無効性にし、さらに、免疫応答を生成し得る。したがって、凝集する傾向が少ない治療用免疫グロブリンを生成するための緊急の必要性がある。

免疫グロブリン凝集を予防するための多数の既存のアプローチは、タンパク質製剤における添加剤の使用を利用する。これは、免疫グロブリンそれ自体が分子シミュレーションから予測される凝集しやすい領域に基づいて改変される、本明細書において記載される直接的なアプローチとは異なる。抗体安定化において一般に使用される添加剤は、アルギニン、グアニジン、またはイミダゾールなどのような窒素含有塩基の塩である（特許文献１）。安定化のための他の適した添加剤は、ポリエーテル（特許文献２）、グリセリン、アルブミン、および硫酸デキストラン（特許文献３）、洗浄剤およびポリソルベートに基づく界面活性剤などのような界面活性剤（公開ＤＥ２６５２６３６および公開ＧＢ２１７５９０６（英国特許出願ＧＢ８５１４３４９））、ＧｒｏＥＬなどのようなシャペロン（Ｍｅｎｄｏｚａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．１９９１年、（１０号）５３５〜５４０頁）、クエン酸バッファー（ＷＯ９３２２３３５）、またはキレート剤（ＷＯ９１１５５０９）である。これらの添加剤は、溶液中である程度までタンパク質を安定化することができるが、それらは、添加剤除去のためのさらなる処理工程の必要性などのようなある種の不利益を被る。

最適化された免疫グロブリン変異体は、Ｆｃ受容体の結合などのような他の特徴を改良するために生成された。例として、米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１（Ｌａｚａｒら）において記載されるように、２１６の抗体変異体の１属（ｇｅｎｕｓ）が、生成され（Ｌ２３４およびＬ２３５突然変異種を含む）、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合に際しての効果について試験された。しかしながら、Ｌａｚａｒらは、凝集に対するそれらの傾向について抗体変異体のいずれについても試験しなかった。

欧州特許出願公開第００２５２７５号明細書欧州特許出願公開第００１８６０９号明細書米国特許第４，８０８，７０５号明細書

Ｉｎｇｒａｍ．Ｎａｔｕｒｅ．（１９５７年）１８０巻（４５８１号）：３２６〜８頁Ｃａｒｔｅｒ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２００６年）６巻（５号），３４３頁Ｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．ＢｉｏＴｅｃｈ．（２００７年）２５巻（１０号）１０９７頁

したがって、添加剤の使用を伴わないで直接安定化される、抗体治療薬などのような改良された免疫グロブリン組成物に対する必要性がある。

この必要性を満たす、低下した凝集および／または増強された安定性を示す改良された免疫グロブリンが本明細書において記載される。

したがって、一態様は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（Ｓｐａｔｉａｌ−Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）（５Å半径の球（ｒａｄｉｕｓｓｐｈｅｒｅ））を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変および／または単離免疫グロブリンを含み、ここで、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中のＫａｂａｔの残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）に対応する残基にない。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある残基に第２の凝集低下突然変異を有し、第２の凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケール（ＢｌａｃｋＭｏｕｌｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｓｃａｌｅ）を使用して、計算される。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

他の態様は、凝集モチーフ１：１７４（Ｃ_Ｈ１）、１７５（Ｃ_Ｈ１）、および１８１（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２６（ヒンジ）、２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、２２９（ヒンジ）、２３０（ヒンジ）、２３１（ヒンジ）、および２３２（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５２（Ｃ_Ｈ２）および２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０８（Ｃ_Ｈ２）および３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２８（Ｃ_Ｈ２）、３２９（Ｃ_Ｈ２）、３３０（Ｃ_Ｈ２）、および３３１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）、３９６（Ｃ_Ｈ３）、３９７（Ｃ_Ｈ３）、３９８（Ｃ_Ｈ３）、および４０４（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）および１１１（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５３（Ｃ_Ｌ）および１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを含み、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔ残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、凝集モチーフ１：１７５（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、および２３０（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２９（Ｃ_Ｈ２）および３３０（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）および３９８（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２３４（ヒンジ）、２３５（ヒンジ）、２５３（Ｃ_Ｈ２）、または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２５３（Ｃ_Ｈ２）または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある疎水性残基に第２の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して、計算される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

別の態様は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、先の態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの免疫グロブリンから構成することができる改変免疫グロブリン製剤を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

なお別の態様は、先の改変免疫グロブリンの態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの免疫グロブリンをコードする単離または組換えポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター中にある。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結される。他の態様は、先の実施形態のいずれかのベクターを有する宿主細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる免疫グロブリンを発現することができる。

他の態様は、低下した凝集傾向を有する免疫グロブリンを産生するための方法であって、先の態様の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび免疫グロブリンが発現する条件下に培養培地を置くステップを含む方法を含む。特定の実施形態では、方法は、発現された免疫グロブリンを単離するためのさらなるステップを含む。

他の態様は、高度に濃縮された医薬製剤中の免疫グロブリンの凝集傾向を低下させるための方法を含み、この方法は、凝集する傾向がある免疫グロブリンを提供するステップ、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基を、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基と置換するステップ、および改変免疫グロブリンの高度に濃縮された液体製剤を生成するステップを含み、改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌであり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である。

他の態様は、高度に濃縮された液体製剤を含む医薬の調製における、先の改変免疫グロブリンの態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの使用を含み、改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、医薬の使用は、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症性疾患、神経系疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、脈管炎、しゅさ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；廃用性骨減少（ｄｉｓｕｓｅｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）；栄養失調、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成（ｍｏｎｏｏｓｔｏｔｉｃｆｉｂｒｏｕｓｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、歯根膜再構築（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌（ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃｂｏｎｅｃａｎｃｅｒ）、乳癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｍａｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ））、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含む、リンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む、成熟Ｔ細胞および成熟ＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患などのような骨髄新生物、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽腔癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症（ｓｃｈｌｅｒａｄｅｒｍａ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのような血液悪性疾患、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療用である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬の使用は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬中の免疫グロブリンは、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

他の態様は、非凝集性医薬品活性成分としての、先の改変免疫グロブリンの態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの使用を含む。

他の態様は、先の態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの免疫グロブリンならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度にある。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

他の態様は、２３５（ヒンジ）、２４１（Ｃ_Ｈ２）、２４３（Ｃ_Ｈ２）、２８２（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを含み、残基２３５が選択される場合、それはグルタメートまたはセリンに突然変異させられ、残基２８２が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、残基３０９が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔ残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のセリンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、セリンへの残基２４３の第２の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のチロシンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、チロシンへの残基２４３の第２の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２８２のリジンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、第２また第３の凝集低下突然変異であって、第２の凝集低下突然変異は、残基２３５のリジンへの突然変異であり、第３の凝集低下突然変異は、残基３０９のリジンへの突然変異である、第２また第３の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、疎水性残基に第２の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、第２の凝集低下突然変異は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある第３の凝集低下突然変異を有し、第３の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、セリン、グルタメート、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して、計算される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

他の態様は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、先の態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの免疫グロブリンから構成することができる改変免疫グロブリン製剤を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

他の態様は、低下した凝集傾向を有する免疫グロブリンを産生するための方法を含み、この方法は、先の態様の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび免疫グロブリンが発現する条件下に培養培地を置くステップを含む。特定の実施形態では、方法は、発現された免疫グロブリンを単離するためのさらなるステップを含む。

他の態様は、高度に濃縮された液体製剤を含む医薬の調製における、先の改変免疫グロブリンの態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの使用を含み、改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、医薬の使用は、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症性疾患、神経系疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、脈管炎、しゅさ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；廃用性骨減少；栄養失調、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成、多骨性線維性骨異形成、歯根膜再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含む、リンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む、成熟Ｔ細胞および成熟ＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患などのような骨髄新生物、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽腔癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのような血液悪性疾患、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療用である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬の使用は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬中の免疫グロブリンは、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、医薬は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

他の態様は、先の態様ならびに先の実施形態の任意のおよびすべての組合せのいずれかの免疫グロブリンならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない。

本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンであって、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある、前記免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含み、前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して前記残基の前記空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換であり、低下した前記凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である、改変または単離免疫グロブリン。
（項目２）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない、項目１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３）
（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある残基に第２の凝集低下突然変異をさらに含み、前記第２の凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して前記残基の前記空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換である、項目１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目４）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている、項目３に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目５）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある、項目３に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目６）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である、項目１〜５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７）
前記凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目１〜５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８）
前記凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目１〜５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目９）
前記凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である、項目１〜５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１０）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目１〜９のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１１）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む、項目１〜９のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１２）
ヒトＣ_Ｈ１ドメインを含む、項目１〜１１のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１３）
ヒトＣ_Ｈ２ドメインを含む、項目１〜１２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１４）
ヒトＣ_Ｈ３ドメインを含む、項目１〜１３のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１５）
ヒトＣ_Ｌドメインを含む、項目１〜１４のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１６）
前記免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性をさらに含み、前記標的抗原に対する前記結合親和性は、前記標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである、項目１〜１５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１７）
前記濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目１〜１６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目１８）
低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンであって、凝集モチーフ１：１７４（Ｃ_Ｈ１）、１７５（Ｃ_Ｈ１）、および１８１（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２６（ヒンジ）、２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、２２９（ヒンジ）、２３０（ヒンジ）、２３１（ヒンジ）、および２３２（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５２（Ｃ_Ｈ２）および２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０８（Ｃ_Ｈ２）および３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２８（Ｃ_Ｈ２）、３２９（Ｃ_Ｈ２）、３３０（Ｃ_Ｈ２）、および３３１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）、３９６（Ｃ_Ｈ３）、３９７（Ｃ_Ｈ３）、３９８（Ｃ_Ｈ３）、および４０４（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）および１１１（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５３（Ｃ_Ｌ）および１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含み、前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した前記凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である、改変または単離免疫グロブリン。
（項目１９）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、（ｉ）凝集モチーフ１：１７５（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、および２３０（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２９（Ｃ_Ｈ２）および３３０（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）および３９８（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される、項目１８に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２０）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない、項目１８または項目１９に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２１）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、２３４（ヒンジ）、２３５（ヒンジ）、２５３（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される、項目１８に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２２）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、２５３（Ｃ_Ｈ２）または３０９（Ｃ_Ｈ２）である、項目１８に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２３）
（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある疎水性残基に第２の凝集低下突然変異をさらに含み、前記第２の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である、項目１８〜２２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２４）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている、項目２３に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２５）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある、項目２３に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２６）
少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される、項目１８〜２２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２７）
前記凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目１８〜２６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２８）
前記凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目１８〜２６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目２９）
前記凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である、項目１８〜２６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３０）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目１８〜２９のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３１）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む、項目１８〜２９のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３２）
ヒトＣ_Ｈ１ドメインを含む、項目１８〜３１のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３３）
ヒトＣ_Ｈ２ドメインを含む、項目１８〜３２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３４）
ヒトＣ_Ｈ３ドメインを含む、項目１８〜３３のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３５）
ヒトＣ_Ｌドメインを含む、項目１８〜３４のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３６）
前記免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性をさらに含み、前記標的抗原に対する前記結合親和性は、前記標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである、項目１８〜３５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３７）
前記濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目１８〜３６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目３８）
項目１〜３７のいずれかに記載の免疫グロブリンを含む改変免疫グロブリン製剤であって、前記免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、改変免疫グロブリン製剤。
（項目３９）
前記免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある、項目３８に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４０）
前記改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である、項目３８または項目３９に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４１）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目３８〜４０のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４２）
前記免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目３８〜４１のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４３）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目４２に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４４）
前記免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目３８〜４３のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４５）
前記免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目３８〜４３のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目４６）
項目１〜３７のいずれかに記載の免疫グロブリンをコードする単離または組換えポリヌクレオチド。
（項目４７）
項目４６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目４８）
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した誘導性プロモーターをさらに含む項目４７に記載のベクター。
（項目４９）
項目４７または項目４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目５０）
低下した凝集傾向を有する免疫グロブリンを産生するための方法であって、（ａ）項目４９に記載の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップ、および
（ｂ）前記免疫グロブリンが発現する条件下に前記培養培地を置くステップを含む方法。
（項目５１）
（ｃ）前記免疫グロブリンを単離するステップをさらに含む項目５０に記載の方法。
（項目５２）
高度に濃縮された医薬製剤中の免疫グロブリンの凝集傾向を低下させるための方法であって、
（ａ）凝集する傾向がある免疫グロブリンを提供するステップ、
（ｂ）（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある、前記免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基を、前記空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基と置換するステップ、および
（ｉｉｉ）前記改変免疫グロブリンの高度に濃縮された液体製剤を生成するステップを含み、
前記改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌであり、
低下した前記凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である方法。
（項目５３）
高度に濃縮された液体製剤を含む医薬の調製における項目１〜３７のいずれかに記載の改変免疫グロブリンの使用であって、前記改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、使用。
（項目５４）
前記医薬は、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症性疾患、神経系疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療用である、項目５３に記載の使用。
（項目５５）
前記医薬は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、脈管炎、しゅさ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；廃用性骨減少；栄養失調、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成、多骨性線維性骨異形成、歯根膜再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含む、リンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む、成熟Ｔ細胞および成熟ＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患などのような骨髄新生物、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽腔癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのような血液悪性疾患、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患の治療用である、項目５３に記載の使用。
（項目５６）
前記医薬は、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療用である、項目５３に記載の使用。
（項目５７）
前記医薬は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目５３〜５６のいずれかに記載の使用。
（項目５８）
前記医薬中の前記免疫グロブリンは、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目５３〜５７のいずれかに記載の使用。
（項目５９）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目５８に記載の使用。
（項目６０）
前記医薬は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目５３〜５９のいずれかに記載の使用。
（項目６１）
前記医薬は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目５３〜５９のいずれかに記載の使用。
（項目６２）
非凝集性医薬品活性成分としての、項目１〜３７のいずれかに記載の改変免疫グロブリンの使用。
（項目６３）
項目１〜３７のいずれかに記載の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目６４）
前記免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目６３に記載の医薬組成物。
（項目６５）
前記免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある、項目６３または項目６４に記載の医薬組成物。
（項目６６）
前記改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である、項目６３〜６５のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目６７）
前記免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目６３〜６６のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目６８）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目６７に記載の医薬組成物。
（項目６９）
前記免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目６３〜６８のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目７０）
前記免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目６３〜６９のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目７１）
２３５（ヒンジ）、２４１（Ｃ_Ｈ２）、２４３（Ｃ_Ｈ２）、２８２（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンであって、残基２３５が選択される場合、それはグルタミン酸またはセリンに突然変異させられ、残基２８２が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、残基３０９が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した前記凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である、改変または単離免疫グロブリン。
（項目７２）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のセリンへの突然変異であり、残基２４３のセリンへの第２の凝集低下突然変異をさらに含む、項目７１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７３）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のチロシンへの突然変異であり、残基２４３のチロシンへの第２の凝集低下突然変異をさらに含む、項目７１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７４）
前記少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２８２のリジンへの突然変異であり、第２および第３の凝集低下突然変異をさらに含み、前記第２の凝集低下突然変異は、残基２３５のリジンへの突然変異であり、前記第３の凝集低下突然変異は、残基３０９のリジンへの突然変異である、項目７１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７５）
疎水性残基に第２の凝集低下突然変異をさらに含み、前記第２の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である、項目７１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７６）
前記第２の凝集低下突然変異は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある残基にある、項目７５に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７７）
（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある疎水性残基に第３の凝集低下突然変異をさらに含み、前記第３の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である、項目７５または項目７６に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７８）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている、項目７５〜７７のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目７９）
前記凝集低下突然変異および前記第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある、項目７５〜７７のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８０）
少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される、項目７１に記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８１）
前記凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目７１または７５〜８０のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８２）
前記凝集低下突然変異は、リジン、セリン、グルタミン酸、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である、項目７１または７５〜８０のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８３）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される、項目７１〜８２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８４）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む、項目７１〜８２のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８５）
ヒトＣ_Ｈ１ドメインを含む、項目７１〜８４のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８６）
ヒトＣ_Ｈ２ドメインを含む、項目７１〜８５のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８７）
ヒトＣ_Ｈ３ドメインを含む、項目７１〜８６のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８８）
ヒトＣ_Ｌドメインを含む、項目７１〜８７のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目８９）
前記免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性をさらに含み、前記標的抗原に対する前記結合親和性は、前記標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである、項目７１〜８８のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目９０）
前記濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目７１〜８９のいずれかに記載の改変または単離免疫グロブリン。
（項目９１）
項目７１〜９０のいずれかに記載の免疫グロブリンを含む改変免疫グロブリン製剤であって、前記免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、改変免疫グロブリン製剤。
（項目９２）
前記免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある、項目９１に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９３）
前記改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である、項目９１または項目９２に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９４）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目９１〜９３のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９５）
前記免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目９１〜９４のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９６）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目９５に記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９７）
前記免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目９１〜９６のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９８）
前記免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目９１〜９６のいずれかに記載の改変免疫グロブリン製剤。
（項目９９）
項目７１〜９０のいずれかに記載の免疫グロブリンをコードする単離または組換えポリヌクレオチド。
（項目１００）
項目９９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目１０１）
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結した誘導性プロモーターをさらに含む項目１００に記載のベクター。
（項目１０２）
項目１００または項目１０１に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１０３）
低下した凝集傾向を有する免疫グロブリンを産生するための方法であって、
（ａ）項目１０２に記載の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップおよび
（ｂ）前記免疫グロブリンが発現する条件下に前記培養培地を置くステップを含む方法。
（項目１０４）
（ｃ）前記免疫グロブリンを単離するステップをさらに含む項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
高度に濃縮された液体製剤を含む医薬の調製における項目７１〜９０のいずれかに記載の改変免疫グロブリンの使用であって、前記改変免疫グロブリン濃度は、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、使用。
（項目１０６）
前記医薬は、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症性疾患、神経系疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療用である、項目１０５に記載の使用。
（項目１０７）
前記医薬は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、脈管炎、しゅさ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；廃用性骨減少；栄養失調、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成、多骨性線維性骨異形成、歯根膜再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含む、リンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む、成熟Ｔ細胞および成熟ＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患などのような骨髄新生物、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽腔癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのような血液悪性疾患、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患の治療用である、項目１０５に記載の使用。
（項目１０８）
前記医薬は、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療用である、項目１０５に記載の使用。
（項目１０９）
前記医薬は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目１０５〜１０８のいずれかに記載の使用。
（項目１１０）
前記医薬中の前記免疫グロブリンは、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目１０５〜１０９のいずれかに記載の使用。
（項目１１１）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目１１０に記載の使用。
（項目１１２）
前記医薬は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目１０５〜１１１のいずれかに記載の使用。
（項目１１３）
前記医薬は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目１０５〜１１１のいずれかに記載の使用。
（項目１１４）
非凝集性医薬品活性成分としての、項目７１〜９０のいずれかに記載の改変免疫グロブリンの使用。
（項目１１５）
項目７１〜９０のいずれかに記載の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目１１６）
前記免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、項目１１５に記載の医薬組成物。
（項目１１７）
前記免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが同じ条件下で濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度を超える濃度にある、項目１１５または項目１１６に記載の医薬組成物。
（項目１１８）
前記改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントは、非凝集単量体である、項目１１５〜１１７のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１１９）
前記免疫グロブリン製剤は、同じ条件下で、非突然変異免疫グロブリンと比較して、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す、項目１１５〜１１８のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１２０）
前記凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される、項目１１９に記載の医薬組成物。
（項目１２１）
前記免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させるいかなる添加剤も実質的に含まない、項目１１５〜１２０のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目１２２）
前記免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリド、およびポリオールを実質的に含まない、項目１１５〜１２１のいずれかに記載の医薬組成物。
本発明のさらなる態様および実施形態は、本明細書の全体にわたって見出され得る。

本開示は、凝集が低減された改良型免疫グロブリン、特にヒト抗体に関する。特定の実施形態では、本開示の免疫グロブリンを、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域内の特異的疎水性残基で改変する。本開示は、改変型免疫グロブリン、このような免疫グロブリン、このような免疫グロブリンを含む免疫複合体および多価または多重特異性分子、ならびに本開示の免疫グロブリン、免疫複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を作製する方法を提供する。

定義
本明細書で言及する用語「抗体」は、完全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互結合した少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌで構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的である領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に、さらに分割することができる。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列した３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含めた、宿主組織または因子の結合を仲介することができる。

本明細書で使用する用語抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）は、抗原および重鎖または軽鎖の定常領域の少なくとも一部分と特異的に結合する能力を保持する、抗体の完全長または１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることは示されている。用語抗体の「抗原結合部分」の中に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄ断片、および抗体の単鎖アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片がある。

さらに、Ｆｖ断片の２ドメイン、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域が対になり一価分子を形成する一本のタンパク質鎖としてそれらを作製することができる合成リンカーによって、組換え法を使用して結合させることが可能である（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５巻：５８７９〜５８８３頁参照）。このような単鎖抗体も、用語抗体の「抗原結合領域」の中に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者に公知である従来の技法を使用して得られ、断片は完全抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングする。

本明細書で使用する「単離」抗体または免疫グロブリンは、このような抗体または免疫グロブリンが本来見られる他の成分を実質的に含まない抗体または免疫グロブリンを指す。さらに、単離抗体または免疫グロブリンは、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。

本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単結合特異性および親和性を典型的に示す。

本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域は、例えば、ヒト生殖系列配列、または突然変異型のヒト生殖系列配列などのヒト配列、またはＫｎａｐｐｉｋら、（２０００年、ＪＭｏｌＢｉｏｌ２９６巻、５７〜８６頁）中に記載されたのと同様のヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体にも由来する。

本開示のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異またはｉｎ
ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体は含まないものとする。

本明細書で使用する用語「ヒトドメイン」は、ヒト起源の配列、例えばヒト生殖系列配列、または突然変異型のヒト生殖系列配列、またはＫｎａｐｐｉｋら、（２０００年、Ｊ
ＭｏｌＢｉｏｌ２９６巻、５７〜８６頁）中に記載されたのと同様のヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体由来の免疫グロブリン定常領域ドメインを含むものとする。

本明細書で使用する用語「組換えヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体である動物（例えば、マウス）から単離した抗体またはそこから調製したハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離した抗体、組換え、組合せヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子、配列の全体または一部分と他のＤＮＡ配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体に、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックである動物を使用するとき、ｉｎｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を施すことができ、したがって、組換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来し関連する一方で、ｉｎｖｉｖｏでヒト抗体生殖系列レパートリー内に本来存在し得ない配列である。

「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、またはその一部分が、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラスの、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな性質を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤などと結合するように、変更、置換または交換されている、または（ｂ）可変領域、またはその一部分が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換されている、抗体分子である。例えば、マウス抗体は、本明細書に開示する改変を含むヒト免疫グロブリン由来の定常領域で、その定常領域を置換することによって改変することができる。ヒト定常領域との置換のため、キメラ抗体は、原型マウス抗体または本明細書に開示する改変を含まないキメラ抗体と比較して、ヒトにおける低い抗原性および全体的に低い凝集性を有しながら、その特異性を保持することができる。

「ヒト化」抗体は、ヒト中での免疫原性は低いながら非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持すること、および抗体の残り部分とそれらのヒト相当物（すなわち、定常領域および可変領域のフレームワーク部分）を置換することによって得ることができる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁、１９８４年；ＭｏｒｒｉｓｏｎａｎｄＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４巻：６５〜９２頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁、１９８８年；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、２８巻：４８９〜４９８頁、１９９１年；およびＰａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、３１巻：１６９〜２１７頁、１９９４年を参照。ヒト操作技術の他の例には、米国特許第５，７６６，８８６号中に開示されたＸｏｍａ技術があるが、これだけには限られない。

本明細書で使用する用語「Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ」は、非ヒト抗体を操作したヒト抗体に転換するための方法を指す（例えば、ＫａｌｏＢｉｏｓのＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）技術を参照）。

本明細書で使用する「アイソタイプ」は、本明細書に開示する凝集傾向モチーフを有する（したがって、凝集を減らす本明細書に開示する改変の影響を受けやすい）重鎖定常領域遺伝子によって与えられる、任意の抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２などのＩｇＧ）を指す。

本明細書で使用する用語「親和性」は、１つの抗原部位での抗体と抗原の間の相互作用の強度を指す。それぞれの抗原部位内では、抗体「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力によって、多数の部位で抗原と相互作用する。相互作用が多いほど、親和性は強い。本明細書に開示する改変は、本明細書に開示する免疫グロブリンまたは抗体の親和性を低下させないことが好ましく、あるいは親和性を、３０パーセント未満、２０パーセント未満、１０パーセント未満、または５パーセント未満低下させる。本明細書で使用するように、本明細書に開示する改変が親和性を低下するかどうか決定するとき、改変を有する免疫グロブリンまたは抗体と、改変を欠くが何らかの無関係な突然変異を含む同じ免疫グロブリンの間で比較を行う。例えば、本明細書に開示するＬ２３４Ｋ突然変異を有するヒト化抗体は、野生型Ｌ２３４以外正確な同じ配列を有するヒト化抗体と比較され得る。

本明細書で使用する用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。

用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。

本明細書で使用する用語「最適化」は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般に真核細胞、例えばＰｉｃｈｉａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知である開始ヌクレオチド配列によって本来コードされていた、完全または可能な限り多くのアミノ酸配列を保持するように操作する。他の真核細胞中でのこれらの配列の最適化発現も本明細書において想定する。最適化ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は最適化とも呼ぶ。

用語「エピトープ」は、抗体と特異的に結合することができるタンパク質抗原決定基を意味する。エピトープはアミノ酸または糖側鎖などの化学的活性がある表面分子群から通常なり、特異的三次元構造特性、および特異的電荷特性を通常有する。コンフォメーションエピトープと非コンフォメーションエピトープは、後者ではなく前者との結合が変性溶媒の存在下で消失する点で区別する。

用語「保存的改変変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用する。個々の核酸配列に関して、保存的改変変異体は、同一またはほぼ同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、ほぼ同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、いずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるそれぞれの位置で、コードされるポリペプチドを変えずに、コドンを記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、保存的改変変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書のそれぞれの核酸配列は、それぞれの考えられる核酸のサイレント変異も記載する。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外）を改変して、機能的に同一の分子を生成することができることを理解しているであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれの記載した配列中に内在する。

ポリペプチド配列に関して、「保存的改変変異体」は、あるアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個別の置換、欠失、または付加を含む。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的置換表は当技術分野で周知である。このような保存的改変変異体は、さらに本開示の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子であり、これらは除外しない。以下の８群は互いに保存的置換されるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照）。

用語「同一」または％「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況で、同一である２つ以上の配列または部分列を指す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定して、比較ウィンドウ、または指定領域にわたって最大の一致に関して比較および調整したとき、２つの配列が同一である（すなわち、指定領域にわたって、または指定しないときは配列全体にわたって、６０％の同一性、場合によっては６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）指定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合、２つの配列は「実質的に同一である」。場合によっては、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）長である領域にわたって存在する。

配列比較用に、典型的には１つの配列が、それと試験配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列をコンピュータに入れ、必要な場合、部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または別のパラメータを指定することができる。したがって配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列％同一性を計算する。２つの配列を同一性に関して比較するとき、それらの配列が連続している必要はないが、いかなるギャップも、それには全体の％同一性を低減するであろうペナルティーが伴う。ｂｌａｓｔｎに関して、デフォルトパラメータはギャップオープニングペナルティー＝５およびギャップエクステンションペナルティー＝２である。ｂｌａｓｔｐに関して、デフォルトパラメータはギャップオープニングペナルティー＝１１およびギャップエクステンションペナルティー＝１である。

本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常約１００〜約１５０だけには限られないが、これらを含めた数の連続する位置のいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、２つの配列を最適に整列させた後、その中で配列を同数の隣接位置の参照配列と比較することができる。比較用配列のアラインメント法は当技術分野で周知である。比較用配列の最適アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０年の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４、１９８８年の類似性検索法によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ中、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の実行によって、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕｅｄ．、２００３年）を参照）によって実施することができる。

％配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９７７年およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年中に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同ワード長と整列させたとき一定の正値の閾値スコアＴと一致するかまたは満たすかのいずれかである、クエリー配列中の短ワード長Ｗを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、検索を開始して、これらを含有するより長いＨＳＰを見出すためのシードとして働く。これらのワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一致する残基対に対する報酬スコア；常に０を超える）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列に関しては、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するとき、１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの累積により累積スコアがゼロ以下になるとき、またはいずれかの配列の末端に到達するとき停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸが、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に対して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９巻：１０９１５頁、１９８９年を参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：５８７３〜５７８７頁、１９９３年を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。

前述の配列同一性の％以外、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である別の指標は、以下に記載するように、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性である。したがってポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第二のポリペプチドと典型的には実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、以下に記載するように、２つの分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーを使用してその配列を増幅することができることである。

用語「作動可能に連結した」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは転写制御配列と転写される配列の機能的関係を指す。例えば、それが適切な宿主細胞または他の発現系中のコード配列の転写を刺激または調節する場合、プロモーターまたはエンハンサー配列はコード配列と作動可能に連結している。一般に、転写される配列と作動可能に連結したプロモーター転写制御配列は、その転写される配列と物理的に隣接している、すなわちそれらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写制御配列は、それらがその転写を促進するコード配列と物理的に隣接している、または非常に接近して位置する必要はない。

用語「ベクター」は、それが連結する別のポリヌクレオチドに輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すものとする。１タイプのベクターは「プラスミド」であり、これはその中に追加的ＤＮＡセグメントを連結させることが可能である環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスゲノムに追加的ＤＮＡセグメントを連結させることが可能であるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞中への導入によって宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形であることが多い。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は交互に使用することができる。プラスミドは、最も一般的に使用される形のベクターであるからである。しかしながら本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、このような他の形の発現ベクターを含むものとする。

用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、その中に組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことを目的とすることは理解されるはずである。突然変異または環境的影響のいずれかのため、いくつかの改変が続く世代で起こる可能性があるので、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

用語「標的抗原」は、それに対する親免疫グロブリンが惹起されるか、または他の方法によって（例えば、ファージディスプレイによって）生成されている抗原を指す。

用語「非突然変異免疫グロブリン」は、少なくとも１つの凝集低下突然変異を含まない免疫グロブリンを指す。本明細書で使用するように、非突然変異免疫グロブリンは、凝集低下突然変異有りまたは無しでの免疫グロブリンの凝集傾向または結合親和性の比較の目的で、仮想構築体であってよい。例えば、ヒト化突然変異および凝集低下突然変異を含むマウス抗体は、非突然変異免疫グロブリンではない。非突然変異免疫グロブリンは、ヒト化突然変異を含むが凝集低下突然変異を含まない抗体で有り得る。突然変異が凝集低下を含めた２つ以上の目的を果たすと考えられる場合、非突然変異免疫グロブリンはこのような突然変異を含まない。

用語「凝集モチーフ」は、以下のプロセスに基づいて一緒に分類した一組の残基を指す。最初に、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基を同定する。次いで、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有するそれぞれの残基の５Å以内のすべての残基を同定する。したがってモチーフは、０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基、および０．１５を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有する残基の５Å以内の、０．０を超えるＳＡＰ（５Å半径）を有するすべての残基である。共通した少なくとも１つの残基を有する任意のこのようなモチーフを、共通した残基を有する残りのモチーフが存在しなくなるまで、さらに大きなモチーフに繰り返し統合する。これらの残りのモチーフまたは残基組が凝集モチーフを構成する。以下の表２は、ＩｇＧ定常ドメインに関する凝集モチーフを述べる。

したがって、本発明の目的は、凝集モチーフ１：１７４（Ｃ_Ｈ１）、１７５（Ｃ_Ｈ１）、および１８１（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２６（ヒンジ）、２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、２２９（ヒンジ）、２３０（ヒンジ）、２３１（ヒンジ）、および２３２（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５２（Ｃ_Ｈ２）、および２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０８（Ｃ_Ｈ２）および３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２８（Ｃ_Ｈ２）、３２９（Ｃ_Ｈ２）、３３０（Ｃ_Ｈ２）、および３３１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）、３９６（Ｃ_Ｈ３）、３９７（Ｃ_Ｈ３）、３９８（Ｃ_Ｈ３）、および４０４（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）および１１１（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５３（Ｃ_Ｌ）および１５４（Ｃ_Ｌ）；および凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）由来の残基からなる群から選択される残基において少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低い凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを提供することであり、その少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号がＩｇＧ１配列とのアラインメントに基づいたＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔの残基番号である、。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、凝集モチーフ１：１７５（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、および２３０（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２９（Ｃ_Ｈ２）および３３０（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）および３９８（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５４（Ｃ_Ｌ）；および凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）由来の残基からなる群から選択される。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２３４（ヒンジ）、２３５（ヒンジ）、２５３（Ｃ_Ｈ２）、または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は２５３（Ｃ_Ｈ２）または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する、疎水性残基に第二の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は異なる凝集モチーフ中に存在する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、それぞれの凝集低下突然変異が異なる凝集モチーフから選択される少なくとも１４の凝集低下突然変異を有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄの疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

したがって、本発明のさらなる目的は、２３５（ヒンジ）、２４１（Ｃ_Ｈ２）、２４３（Ｃ_Ｈ２）、２８２（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される残基において少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低い凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを提供することであり、残基２３５を選択した場合それはグルタメートまたはセリンに突然変異し、残基２８２を選択した場合それはリジンに突然変異し、残基３０９を選択した場合それはリジンに突然変異し、ここで、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号がＩｇＧ１配列とのアラインメントに基づいたＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔの残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はセリンへの残基２４１の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンはセリンへの残基２４３の第二の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はチロシンへの残基２４１の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンはチロシンへの残基２４３の第二の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はリジンへの残基２８２の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは第二および第三の凝集低下突然変異をさらに含み、第二の凝集低下突然変異はリジンへの残基２３５の突然変異であり、第三の凝集低下突然変異はリジンへの残基３０９の突然変異である。特定の実施形態では、免疫グロブリンは疎水性残基に第二の凝集低下突然変異を有し、かつ少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、第二の凝集低下突然変異は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する第三の凝集低下突然変異を有し、この第三の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は異なる凝集モチーフ中に存在する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、それぞれの凝集低下突然変異が異なる凝集モチーフから選択される少なくとも１４の凝集低下突然変異を有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、セリン、グルタメートおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄの疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

免疫グロブリン残基を本明細書の番号によって言及する場合、その残基番号は、対象とする免疫グロブリン配列をヒトＩｇＧ１免疫グロブリンと整列したときの、ＩｇＧ１分子中の対応する残基のＫａｂａｔ番号を指す。参照によって、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４定常ドメインを整列する：

空間的凝集傾向
本明細書の本発明は、タンパク質表面上の凝集しやすい領域を同定するため、およびタンパク質の凝集を予防または低減するための方法に関する。本発明を適用して、低い凝集傾向を有する免疫グロブリンを作製することができる、すなわち、この免疫グロブリンは、濃縮溶液中において高次凝集マルチマーではなく主にモノマー形態で維持される。本明細書の方法は、タンパク質の凝集傾向を低減するために改変することができるタンパク質領域を同定するための、計算法の能力の進歩を示す。特に、これらの方法は、タンパク質表面を特徴付けるために当技術分野で公知であるＳＡＡ（溶媒接触可能面積）の計算に、少なくとも一部分は基づく。ＳＡＡは、溶媒と接触した各アミノ酸またはタンパク質構造の表面積を与える。それがタンパク質表面、すなわちタンパク質構造モデルの表面を転がるときの、プローブ球体の中心位置を計算することによって、ＳＡＡは典型的に計算することができる。プローブ球体は、水分子のそれと同じ半径、Ｒ＝１．４Åを有する。以下に記載するＳＡＡを計算する別の方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載する方法と適合性がある。ＳＡＡはタンパク質表面を特徴付けるのに非常に有用であるが、以下の欠点のため、それが、おそらく凝集傾向があるタンパク質表面上の疎水性パッチを特徴付けるのに適しているとは見出されていない。

１．ＳＡＡは疎水性領域と親水性領域を区別しない
２．ＳＡＡは残基の疎水性に正比例しない（例えば、ＭＥＴはＬＥＵより広い表面積を有するが疎水性は低い）
３．ＳＡＡは、数個の疎水性残基が近接し、したがって特定領域の疎水性を高めることができたかどうか示さない。これらの残基は一次配列中、またはそれらが一次配列中で離れている場合でさえ三次構造中のいずれかで近接している可能性がある。どちらにしても、それらは抗体表面上の特定パッチの疎水性を高め得る。

本明細書に記載する１つの尺度、有効−ＳＡＡは、以下の式に従い、露出したアミノ酸画分の疎水性を計算することによって生成する：

有効−ＳＡＡのさらなる実施形態は、一次タンパク質配列中で隣接した少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個など）のアミノ酸残基にわたって有効−ＳＡＡを合計することをさらに含む。有効−ＳＡＡは基本ＳＡＡに優る改善を示すが、それにもかかわらず、それはフォールディングしたタンパク質の構造、およびタンパク質配列中で隣接していないアミノ酸が、フォールディングしたタンパク質の二次、三次、または四次構造中で互いに接近している可能性があるという事実を完全に説明する能力を欠く。このようなタンパク質のフォールディングは、一次構造単独には出現せず、またはフォールディングしたタンパク質の構造をより正確に分析することによってのみ検出することができる凝集しやすい領域を形成する可能性がある。

本発明は、タンパク質表面上の特定パッチまたは領域の有効な疎水性を強調する、空間的凝集傾向と呼ぶ、新たな、より進歩した尺度を提供する。空間的凝集傾向は、タンパク質構造モデルの原子上または近辺の規定された空間領域に関して計算する。

この文脈において、「規定された空間領域」は、タンパク質構造上または近辺の局所物理的構造および／または化学的環境を得るために選択した三次元の空間または体積である。特に好ましい実施形態では、空間的凝集傾向を、タンパク質中の原子（例えば、タンパク質構造モデル中の原子）に中心があり半径Ｒを有する球状領域に関して計算する。空間的凝集傾向は、化学結合に中心がある、または構造モデル近辺の空間中に位置する、半径Ｒを有する球状領域に関して計算することもできる。したがって、別の実施形態では、原子近辺に中心がある、例えば特定原子または化学結合の中心から１〜１０Å、１〜５Å、または１〜２Åの間に存在する空間中の地点に中心がある規定された空間領域に関して、ＳＡＰを計算することができる。

特定の実施形態では、選択する半径Ｒは１Åと５０Åの間である。特定の実施形態では、選択する半径は少なくとも１Å、少なくとも３Å、少なくとも４Å、少なくとも５Å、少なくとも６Å、少なくとも７Å、少なくとも８Å、少なくとも９Å、少なくとも１０Å、少なくとも１１Å、少なくとも１２Å、少なくとも１５Å、少なくとも２０Å、少なくとも２５Å、または少なくとも３０Åである。特定の実施形態では、選択する半径は５Åと１５Åの間、５Åと１２Åの間、または５Åと１０Åの間である。具体的な実施形態では、選択する半径は５Åまたは１０Åである。

他の実施形態では、空間的凝集傾向を計算する領域は球状ではない。考えられる領域の形状は、立方体、円柱、円錐形、楕円、回転楕円体（ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌｓｐｈｅｒｏｉｄ）、角錐形、半球、またはそれを使用して空間の一部を囲うことができる任意の他の形状をさらに含むことができる。かかる実施形態では、半径以外の尺度、例えば形状の中心から表面または頂点までの距離を使用して、領域の大きさを選択することができる。

特定の実施形態では、ＳＡＰを使用して、タンパク質、特に抗体または免疫グロブリン中の残基を選択することができ、これを置換し、したがってタンパク質の安定性を増大することができる。以前の試験では、ｉｎｖｉｔｒｏでタンパク質を安定化するための２つの主な手法は、（１）タンパク質の配列自体を操作すること、および（２）液体製剤中に添加剤を含めることであった。両方の手法が調べられており、有意な結果が得られている。第一の手法は、ｉｎｓｉｌｉｃｏまたは実験によるランダム変異体の広範囲のライブラリーのスクリーニングに頼るものである。第二の手法では、安定化添加剤に関するハイスループットスクリーニング、および添加剤の合理的設計が、治療用タンパク質の最適製剤の同定を可能にする。

本発明は、コンピュータにより既存の凝集ホットスポットを同定すること、および実験によりこれらの部位に置換を有する変異体を分析することによって、安定性増大のプロセスを簡素化すると予想される。

したがって、一般論として、タンパク質中の特定の原子に関する空間的凝集傾向を計算するための方法は、（ａ）タンパク質を表す構造モデル中の１つまたは複数の原子を同定するステップであって、１つまたは複数の原子が、特定の原子に中心があるまたはその近辺の規定された空間領域内に存在する、ステップ、（ｂ）規定された空間領域中の１つまたは複数の原子のそれぞれに関して、それらの原子の溶媒接触可能面積（ＳＡＡ）と完全に露出した同一残基中の原子のＳＡＡの比を計算するステップ、（ｃ）それぞれの比と１つまたは複数の原子の原子疎水性をかけ合わせるステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）の積を合計するステップであって、その合計が特定の原子に関するＳＡＰである、ステップを含む。

関連する実施形態では、（ａ）タンパク質を表す構造モデル中の１つまたは複数のアミノ酸残基を同定するステップであって、１つまたは複数のアミノ酸残基が、特定の原子に中心があるまたはその近辺の規定された空間領域内に少なくとも１つの原子を有する、ステップ、（ｂ）同定した１つまたは複数のアミノ酸残基のそれぞれに関して、アミノ酸中の原子の溶媒接触可能面積（ＳＡＡ）と完全に露出した同一残基中の原子のＳＡＡの比を計算するステップ、（ｃ）それぞれの比とアミノ酸疎水性スケールによって測定した１つまたは複数のアミノ酸残基の疎水性をかけ合わせるステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）の積を合計するステップであって、その合計が特定の原子に関するＳＡＰである、ステップを含む、異なる方法に従いＳＡＰを計算することができる。好ましい実施形態では、分子動力学シミュレーションにおいて構造モデルを溶媒と相互作用させることによって、ステップ（ａ）の前に構造モデルを処理する。規定された空間領域内に少なくとも１つの原子を有するとしてアミノ酸を同定するとき、その少なくとも１つの原子は排他的にアミノ酸側鎖中の原子であることが必要とされ得る。あるいはそれは、主鎖原子であることが必要とされる原子で有り得る。

他の実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）の前に分子動力学シミュレーションを場合によっては実施するステップ、およびステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返すステップであって、毎回さらなる分子動力学シミュレーションを複数回のステップで実施し、それによってステップ（ｄ）中と同様に多数の合計を生成するステップ、および合計の平均を計算するステップであって、計算した平均が特定の原子に関するＳＡＰである、ステップをさらに含むことができる。

当業者は、分子動力学シミュレーションで計算した値の平均を利用する本発明の実施形態は、よりコンピュータ集約型であろうことを理解しているはずである。かかる実施形態は、いくつかの場合、空間的凝集傾向のさらに正確なまたは高解像度マップも与え得る。しかしながら、本明細書で論じる実験は、分子動力学による平均化を利用しないとき、方法は一層高度に正確であることを示している。好ましい一実施形態では、空間的凝集傾向値は、データベース、例えばタンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）中のすべてのタンパク質構造に関して計算することができ、それによってすべての公知のタンパク質構造上の疎水性残基およびパッチを迅速に同定することができる。この方法は多数組のタンパク質の迅速なスクリーニングを可能にして、潜在的な凝集しやすい領域および／またはタンパク質相互作用部位を同定する。

好ましい適用例では、空間的凝集傾向は以下の式によって記載する：
ＳＡＰ_原子＝Σ_{シミュレーション平均}（Σ_{原子のＲ内の原子}（（ＳＡＡ−Ｒ／ＳＡＡ−ｆｅ）×原子−ｈｂ）
上式で：
１）ＳＡＡ−Ｒは、それぞれのシミュレーションスナップショットで計算した半径Ｒ内の側鎖原子のＳＡＡである。ＳＡＡは、それがタンパク質表面を転がるときのプローブ球体の中心位置を計算することによって、シミュレーションモデルにおいて計算することが好ましい。プローブ球体は、水分子のそれと同じ半径、Ｒ＝１．４Ａを有する。当業者は、ＳＡＡを計算する他の方法が、ＳＡＰを計算するための本明細書に記載した方法と適合性がある可能性があることを理解しているはずである。例えば、ＳＡＡはアミノ酸側鎖原子のみで計算することができる。ＳＡＡは、アミノ酸主鎖原子（すなわち、ペプチド骨格の原子および付随した水素）のみでも計算することができる。あるいはＳＡＡは、付随した水素を除いたアミノ酸主鎖原子のみで計算することができる：
２）ＳＡＡ−ｆｅは、トリペプチド「Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａ」の完全に伸長したコンフォメーション中の中央残基の側鎖のＳＡＡを計算することによって好ましい実施形態中で得た、完全に露出した残基（例えばアミノ酸「Ｘ」）の側鎖のＳＡＡである：かつ
３）原子−ｈｂは、ＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄ（ＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１年、１９３巻、７２〜８２頁）の疎水性スケールを使用して前に記載したように得る、原子の疎水性である。グリシンがゼロの疎水性を有するように尺度を正規化する。したがって、疎水性スケールでグリシンより疎水性が高いアミノ酸は正であり、グリシンより疎水性が低いアミノ酸は負である。

「完全に露出した」残基は、トリペプチドＡｌａ−Ｘ−Ａｌａの完全に伸長したコンフォメーション中の残基Ｘである。当業者は、このような残基ＸにおけるＳＡＡの計算が利用可能な最大の溶媒接触可能面積をもたらすように、この配置を設計することを理解しているはずである。したがって、結果を完全に妨害または変更せずに、計算中でアラニン以外の他の残基を使用することができると企図される。

前に記載したように、本発明の方法は、前と同じ式を使用するＸ線構造を含めた、任意のタンパク質構造モデルに適用することができる。

同様に、Ｘ線構造が利用可能ではない場合、同じ空間的凝集傾向パラメータを、ホモロジーモデリングによって作製した構造に適用することができ、前と同じ式を使用してＳＡＰパラメータを計算することができる。

特定の実施形態では、タンパク質構造モデル中のすべての原子に関して空間的凝集傾向を計算する。いくつかの実施形態では、原子の空間的凝集傾向値をそれぞれ個別のタンパク質残基で、または小群の残基で平均化することができる。

ＳＡＰ方法論の使用
１つの態様では、本発明は、タンパク質における疎水性アミノ酸残基、領域またはパッチを同定するために上記のように使用することができる。特異的な閾値に維持する必要なしに、空間的凝集傾向＞０を有する原子またはアミノ酸残基は、疎水性であるか、凝集しやすい領域にあると考えられる。タンパク質のタイプ、特定の構造およびそれが存在する溶媒によって、例えば、−０．１、−０．１５、−０．２などより大きい空間的凝集傾向を有する原子または残基を選ぶことにより、わずかにゼロより小さいカットオフを使用して、原子または残基を同定することが望ましい場合がある。あるいは、最も高い疎水性原子、残基またはパッチを選ぶために、例えば、０、０．０５、０．１、０．１５、０．２などのより厳密なカットオフを採用することが望ましい場合もある。さらに、アルゴリズムが、パッチの中央の残基により高い数を与えるとき、カットオフを満たす残基の３Ａ、４Ａ、５Ａ、７．５Ａまたは１０Ａ内の残基を、凝集を低下させる、より低い疎水性残基に突然変異させるために選択することもできる。別の実施形態では、配列的に（すなわち、タンパク質配列に沿って）、または好ましい実施形態では空間的に（すなわち、３次元構造において）隣接する原子または残基より大きい空間的凝集傾向を有する原子または残基を、単に選択することが有利である場合もある。疎水性パッチ中の原子または残基を選択するための１つの好ましい方法は、例えば、それらが由来したタンパク質構造のモデル上へのカラーコーディングまたは数値コーディングを使用して、計算した空間的凝集傾向値をマップすることであり、したがってタンパク質表面にわたって空間的凝集傾向の違いが可視化され、故に疎水性パッチまたは残基の容易な選択が可能になる。特に好ましい実施形態では、空間的凝集傾向の計算は、半径に関して選んだ２つの値、１つは例えば５Ａなどのより高解像度、および１つは例えば１０Ａなどのより低解像度を使用して、別々に行う。かかる実施形態では、より大きいまたはより広範な疎水性パッチを、より低解像度のマップによるタンパク質構造上に見ることができる。対象の疎水性パッチが、低解像度のマップ上に選択されると、これらのパッチを、より高解像度のマップにおいて、より詳細に見ることができ、いくつかの実施形態では、当業者が、より容易に、またはより正確に、突然変異または改変する残基を選ぶことが可能になる。例えば、より高解像度のマップにおいて疎水性パッチを見たとき、最高のＳＡＰスコアを有する、または最も高い疎水性である残基（例えば、ＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１年、１９３巻、７２〜８２頁のスケールによる、パッチ中の最も高い疎水性残基）の突然変異を選択することが望ましい可能性がある。

具体的な実施形態において、タンパク質上の凝集しやすい領域を同定する方法は、（ａ）タンパク質中の原子に関して本明細書で記載されている任意の方法に従って計算したとき、構造モデルのＳＡＰについてにマップするステップ、および（ｂ）ＳＡＰ＞０を有する複数の原子を有するタンパク質内で領域を同定するステップを含み、凝集しやすい領域が、前記複数の原子を含むアミノ酸を含む。かかる実施形態では、タンパク質中の全原子または一部の原子に関して、ＳＡＰを計算することができる。対象の特定の残基または残基群に関してのみＳＡＰを計算できることが企画される。

同様の実施形態では、原子のＳＡＰスコア（またはアミノ酸残基にわたり平均化したときのＳＡＰスコア）をプロットすることが有益となり得る。タンパク質の原子または残基に沿ったＳＡＰスコアを示すかかるプロットにより、ピークの容易な同定が可能になり、交換する候補を示すことができる。特定の好ましい実施形態では、タンパク質中の原子または残基に沿ったＳＡＰスコアをグラフ中にプロットし、グラフ中のピークに関して曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する。かかる実施形態では、より大きいＡＵＣを有するピークは、より大きいまたはより高い疎水性の凝集しやすい領域を表す。特定の実施形態では、ピーク、またはより好ましくは大きいＡＵＣを有するピーク中に存在すると同定される１つまたは複数の残基の交換を選択することが望ましいであろう。

特定の実施形態では、本発明は、凝集傾向の低下を示す免疫グロブリン変異体をつくるために使用することができ、これは、変異体の凝集傾向が低下するように、本明細書に記載の任意の方法によって同定された、免疫グロブリン中の凝集しやすい領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を、交換される残基より高い親水性であるアミノ酸残基と交換することによるものである。本明細書で使用するとき、アミノ酸残基を「より高い」または「より低い」親水性または疎水性と言及するとき、これは、当技術分野で公知の疎水性（親水性）の尺度、例えばＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄの疎水性スケールによって別のアミノ酸と比較したときに、より高いまたはより低い疎水性であることを意味すると、当業者に理解されよう。

同様の実施形態では、本発明は、各免疫グロブリン変異体において免疫グロブリン中の凝集しやすい領域内の少なくとも１つの残基を交換することにより、複数の免疫グロブリン変異体を産生すること、および（ｂ）凝集傾向の低下を示す（ａ）で調製された免疫グロブリン変異体を選択することによって、凝集傾向の低下を示す免疫グロブリン変異体をつくるために使用することができ、ここでは、凝集しやすい領域が、本明細書に記載の任意の方法によって計算されたＳＡＰスコアを使用して同定され、１つもしくは異なる残基、または残基の異なる組合せが、各変異体において交換され、少なくとも１つの残基が、より強い親水性である残基と交換されている。

さらに、凝集しやすい領域におけるアミノ酸残基は、交換よりむしろ欠失させる場合もある。複数のアミノ酸残基が交換に選択されるいくつかの免疫グロブリンでは、交換され得る残基もあれば、欠失される残基もある。

さらなる実施形態では、上記の方法によって（例えば、残基が選択される上記の空間的凝集傾向カットオフを使用することによって）、複数の凝集しやすい領域または残基を、最初の免疫グロブリンにおいて同定することができる。続いて、様々な異なるアミノ酸置換を表す複数の免疫グロブリン変異体をつくり出すように、前記最初の免疫グロブリンにおいて、１つまたは複数の選択されたアミノ酸残基（または選択されたパッチに入る１つもしくは複数の残基）を、より強い親水性のアミノ酸残基と交換することによって、複数の免疫グロブリン変異体を産生することができる。次いで、この集団をスクリーニングし、凝集傾向の低下を有する１つまたは複数の免疫グロブリン変異体を選択することができる。当業者は、複数の凝集しやすい領域が同定される場合があり、１つまたは複数の置換および／または欠失が、１つまたは複数の凝集しやすい領域でつくられ得ることを理解するであろう。アミノ酸の相対的な疎水性は、上記のＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄの疎水性スケールによって決定することができる。具体的な実施形態では、交換するアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、ＡｌａまたはＧｌｙを含む、またはこれらからなる群から選択される。関連する実施形態では、免疫グロブリンに置換することになるより高い親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＡｒｇを含む、またはこれらからなる群から選ぶであろう。

したがって、本発明の目的は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基で、少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、凝集傾向の低下を有する改変および／または単離免疫グロブリンを提供することであり、前記少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非突然変異の免疫グロブリンと比較したときに、残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低下させるアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が、濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づく、ＩｇＧ１中のＫａｂａｔ残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）に対応する残基にはない。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å内にある残基に、第２凝集低下突然変異を有し、前記第２凝集低下突然変異が、非突然変異免疫グロブリンと比較したときに、残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低下させるアミノ酸残基での置換である。第２凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より低い疎水性であるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、グルタミンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性が、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセントまたは少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

免疫グロブリン変異体は、部位特異的突然変異誘発および他の組換えＤＮＡ技術を含む、当技術分野で公知の任意の方法によってつくることができ、例えば、米国特許第５２８４７６０号、５５５６７４７号、５７８９１６６号、６８７８５３１号、５９３２４１９号および６３９１５４８号を参照されたい。

特定の実施形態では、本発明は、変異体の凝集傾向が低下するように、本明細書に記載の任意の方法によって同定された、免疫グロブリン中の凝集しやすい領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を、交換される残基より高い親水性の天然アミノ酸残基、改変アミノ酸残基、珍しいアミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、またはアミノ酸類似体もしくは誘導体と交換することによって、凝集傾向の低下を示す免疫グロブリン変異体をつくるために使用することができる。

非天然アミノ酸の合成は、当業者に公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００３−００８２５７５号にさらに記載されている。一般的に、非天然、改変、または珍しいアミノ酸をタンパク質に合成または組み込むための、当技術分野で公知の任意の方法には、これに限定されないが、出版物ＬｉａｏＪ．、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．、２００７年１〜２月、２３巻（１号）、２８〜３１頁；ＲａｊｅｓｈおよびＩｑｂａｌ．、ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００６年８月、７巻（４号）、２４７〜５９頁；Ｃａｒｄｉｌｌｏら、ＭｉｎｉＲｅｖＭｅｄＣｈｅｍ．、２００６年３月、６巻（３号）、２９３〜３０４頁；Ｗａｎｇら、ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｐｈｙｓＢｉｏｍｏｌＳｔｒｕｃｔ．、２００６年、３５巻、２２５〜４９頁、Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、ＧｌｙｃｏｃｏｎｊＪ．、２００５年３月、２２巻（３号）、８３〜９３頁に記載または言及されている方法が挙げられ、これらを採用することができる。さらなる実施例として、本明細書に記載の方法によって示されるように、ＡｍｂｒｘＲｅＣＯＤＥ（商標）技術を採用して、非天然アミノ酸または珍しいアミノ酸をタンパク質に発展および組み込むことができる。

本発明による免疫グロブリン変異体は、例えば、加速安定性試験によって決定されるような、強化または改良された安定性を示すことができる。典型的な加速安定性試験には、これに限定されないが、貯蔵温度の上昇を特徴とする試験が挙げられる。野生型または最初のタンパク質と比較したときの、免疫グロブリン変異体に関して観察される凝集体形成の減少は、安定性の増加を示す。免疫グロブリン変異体の安定性は、野生型または最初の免疫グロブリンと比較したときの、変異体の融解温度転移の変化を測定することによって試験することもできる。かかる実施形態では、安定性の増加は、変異体の融解温度転移の上昇として明確であろう。タンパク質凝集を測定するための追加の方法は、米国特許出願第１０／１７６，８０９号に記載されている。

したがって、本発明の目的は、段落［００６１］、［００６２］または［００９１］、ならびにそれらの実施形態の任意およびすべての組合せにおいて議論されるような、改変免疫グロブリンをコードする、単離または組換えポリヌクレオチドを提供することである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター中に存在する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結する。別の態様は、前述のいずれかの実施形態のベクターを有する宿主細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチドによってコードされる免疫グロブリンを発現することができる。

したがって、本発明の目的は、先の段落の宿主細胞を含む培養培地を提供するステップ、および免疫グロブリンが発現する条件下に培養培地を置くステップを含む、凝集傾向が低下した免疫グロブリンを産生する方法を提供することである。特定の実施形態では、方法には、発現された免疫グロブリンを単離する追加のステップが含まれる。

本発明の別の態様では、計算した空間的凝集傾向は、タンパク質構造の表面上のタンパク質−タンパク質相互作用部位を同定するために使用することができる。タンパク質相互作用部位は、しばしば疎水性残基または疎水性パッチを含むことが、当技術分野で公知である。本明細書に記載の方法が、疎水性パッチを同定することによって結合部位の位置を決めるのに有用になることが期待される。かかる疎水性パッチは、次いで、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−リガンド認識部位に関する候補になるであろう。

いくつかの実施形態では、本発明はさらに、本発明の方法に従ってＳＡＰを決定するためのコンピュータコードに関する。他の実施形態では、本発明は、本発明の方法を行うために決められたコンピュータ、スーパーコンピュータまたはコンピュータのクラスターに関する。さらなる別の態様では、本発明は、タンパク質上の凝集しやすい領域を決定するための、ウェブベース、サーバベースまたはインターネットベースのサービスを提供し、前記サービスが、ユーザ（例えば、インターネットにわたる）からタンパク質（例えば、タンパク質構造モデル）についてのデータを受容するステップ、またはサービスプロバイダがタンパク質の静的構造を作成、回収、また受容できるように、データベースからかかるデータを回収するステップを含み、任意選択として、タンパク質の動的構造を提供するためのタンパク質の動的分子モデリングのステップ、作成されるような静的または動的構造に基づくタンパク質の原子または残基に関するＳＡＰを決定するステップ、および例えば、前記ＳＡＰデータによりマップした構造モデルとして、サービスプロバイダによってＳＡＰデータをユーザに返すステップを含む。いくつかの実施形態では、ユーザは人である。他の実施形態では、ユーザはコンピュータシステムまたは自動化したコンピュータアルゴリズムである。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＡＰ計算システムを証明し、これには、インターネットを通してユーザ端末にＳＡＰを計算するためのウェブサービスを提供するウェブサーバと、計算方法、アミノ酸疎水性などの一般的な情報を蓄積するためのデータベースと、データベース中の情報およびインターネットを通してユーザによって提供または伝達された情報に基づくＳＡＰ計算を行うための計算サーバが含まれる。

いくつかの実施形態では、ウェブサーバおよび計算サーバは、同じコンピュータシステムである。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、スーパーコンピュータ、クラスターコンピュータ、または単一のワークステーションもしくはサーバである。関連する実施形態では、ＳＡＰ計算システムのウェブサーバには、さらに、全体の作動を制御するためのコントローラ、インターネットに接続するためのネットワーク接続ユニット、およびインターネットを通して接続されたユーザ端末にＳＡＰを計算するためのウェブサービスを提供するウェブサービスユニットが含まれる。

さらに、本発明の実施形態は、コンピュータ実行型の様々な作動、例えば、構造モデルのためのＳＡＰの計算、ＳＡＡの計算、有効ＳＡＡの計算、構造モデルの操作、分子の動的シミュレーションの実行、関連データの組織化および蓄積、または本明細書に記載の他の作動の実行を行うためのプログラムコードを含む、コンピュータ可読媒体を有するコンピュータ蓄積プロダクトにさらに関連する。コンピュータ可読媒体とは、データを蓄積でき、その後コンピュータシステムによってそれを読むことができる任意のデータ蓄積装置である。コンピュータ可読媒体の例には、これに限定されないが、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、フラッシュドライブ、光ディスク（例えば、ＣＤ、ＤＶＤ、ＨＤ−ＤＶＤ，Ｂｌｕ−Ｒａｙディスクなど）、および特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能論理回路（ＰＬＤ）などの特別に構成されたハードウェア装置が挙げられる。コンピュータ可読コードが、分散方式で蓄積および実行されるように、コンピュータ可読媒体は、結合コンピュータシステムのネットワークにわたる搬送波中に具体化されたデータシグナルとして、分散させることもできる。上記のハードウェアおよびソフトウェアエレメントが、標準的な設計および構成であることを、当業者は理解するであろう。上記の実施形態に関連する、コンピュータ、インターネット、サーバおよびサービスは、さらに、ＳＡＡおよび有効ＳＡＡならびにＳＡＰに適用することができる。

免疫グロブリンおよび免疫グロブリン変異体を含む医薬組成物
別の態様では、本発明は、例えば、本発明の方法によって産生される１つまたは複数の免疫グロブリン変異体を含み、薬学的に許容される担体と共に処方される、医薬組成物などの組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法には、少なくとも１つの他の抗癌剤と組み合わせた本発明の免疫グロブリンを挙げることができる。

本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」には、生理的適合性のある任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与の経路によって、活性化合物、すなわち本発明の免疫グロブリンまたはその変異体は、酸の作用、および化合物を不活性化し得る他の自然条件から化合物を保護するために物質中にコートすることができる。

本発明の医薬組成物には、１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含めることができる。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、所望されないどんな毒性影響も与えない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ、Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。かかる塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸、ならびに脂肪族のモノおよびジカルボン酸、フェニル置換したアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。

本発明の医薬組成物には、薬学的に許容される抗酸化剤を含めることもできる。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。

本発明の医薬組成物中に採用できる、適した水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適した混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用によって、分散物の場合の必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含めることもできる。微生物の存在の防止は、滅菌手順ならびに様々な抗生物質および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどの封入の両方によって、確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な医薬品形態の吸収の遅延は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の封入によって引き起こすことができる。

薬学的に許容される担体には、無菌水溶液または分散物、および注射可能な無菌溶液または分散剤を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。薬学的な活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物中でのそれらの使用が、企画されている。追加の活性化合物を、組成物中に組み込むこともできる。

典型的な製剤には、本発明の少なくとも１つの免疫グロブリン変異体を含み、本明細書に開示の方法に加えて、免疫グロブリンの凝集を防ぐまたは減少させるために使用できる、より低濃度の安定化（または脱凝集）剤を含めることができる。したがって、凝集を防ぐために使用される従来の方法を、本発明の方法によって産生される免疫グロブリン変異体を含む医薬組成物の開発に採用することができる。例えば、様々な安定化または脱凝集化合物を、本発明の医薬組成物の意図する使用およびそれらの生物学的毒性によって、医薬組成物中に含めることができる。かかる安定化化合物には、例えば、シクロデキストリンおよびその誘導体（米国特許第５７３０９６９号）、アルキルグリコシド組成物（米国特許出願第１１／４７４，０４９号）、シャペロン分子の使用（例えば、ＬＥＡ（Ｇｏｙａｌら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．、２００５年、３８８巻（Ｐｔ１）：１５１〜７頁；米国特許第５６８８６５１号の方法）、ベタイン化合物（Ｘｉａｏ、Ｂｕｒｎ、Ｔｏｌｂｅｒｔ、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．、２００８年Ｍａｙ２３）、界面活性剤（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗｅｉら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．、２００７年、３３８巻（１〜２号）：１２５〜１３２頁））および米国特許第５６９６０９０号、５６８８６５１号および６４２０１２２号に記載の方法を含めることができる。

さらに、タンパク質、そして特に抗体は、異なる種類の賦形剤の組合せを使用して製剤中で安定化され、この賦形剤は、例えば（１）ジサッカリド（ｄｉｓａｃｃａｒｉｄｅ）（例えば、ショ糖、トレハロース）またはポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール）は、優先的な排除によって安定化剤として働き、凍結乾燥の間、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として働くこともでき、（２）界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）は、液体／氷、液体／物質表面、および／または液体／空気の界面のような界面でのタンパク質相互作用を最小化させることによって働き、（３）緩衝液（例えば、リン酸−、クエン酸−、ヒスチジン）は、製剤ｐＨの制御および維持に役立つ。したがって、かかるジサッカリドポリオール、界面活性剤および緩衝液は、本発明の方法に加えて、免疫グロブリンをさらに安定化させ、それらの凝集を防ぐために使用することができる。

治療用組成物は、一般的に、製造および貯蔵の条件下で、無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソームまたは高い薬物濃度に適する他の秩序だった構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、例えばマンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含めることが望ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を遅らせる剤を組成物中に含めることによって引き起こすことができる。

注射可能な無菌溶液は、適切な溶媒中の必要な量の活性化合物と、必要とする上述で列挙された成分の１つまたは組合せとを組み込み、続いて滅菌微量濾過をすることによって調製することができる。一般的に、分散物は、基本的な分散媒および上述で列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、これにより、事前に無菌濾過したそれらの溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

担体物質と組み合わせて単回剤形を産生できる活性成分の量は、治療する対象および特定の投与様式によって変化するであろう。担体物質と組み合わせて単回剤形を産生できる活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす組成物の量であろう。一般的に、１００パーセントの中で、この量は、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約１パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。

したがって、本発明の目的は、段落［００６１］、［００６２］または［００９１］で議論されるような改変免疫グロブリン、および少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度でのそれらの実施形態の任意およびすべての組合せで構成できる改変免疫グロブリン製剤を提供することである。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが、同じ条件下の濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度より高い濃度にある。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセントまたは少なくとも９９パーセントが、非凝集性単量体である。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、製剤には、薬学的に許容される賦形剤が含まれる。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下の非突然変異免疫グロブリンと比較したとき、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセントまたは少なくとも５０パーセント低い凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させる任意の添加剤を実質的に含まない。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリドおよびポリオールを実質的に含まない。

したがって、本発明の目的は、非凝集性医薬活性成分としての段落［００６１］、［００６２］または［００９１］で議論されるような改変免疫グロブリン、ならびにそれらの実施形態の任意およびすべての組合せの使用を提供することである。

したがって、本発明の目的は、段落［００６１］、［００６２］または［００９１］で議論されるような改変免疫グロブリン、それらの実施形態の任意およびすべての組合せ、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供することである。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、非突然変異免疫グロブリンが、同じ条件下の濃縮液体溶液中でそれ自体と凝集する濃度より高い濃度にある。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、改変免疫グロブリンの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセントまたは少なくとも９９パーセントは、非凝集性単量体である。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、同じ条件下の非突然変異免疫グロブリンと比較したとき、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセントまたは少なくとも５０パーセント低い凝集体を示す。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、免疫グロブリンの凝集を低下させる任意の添加剤を実質的に含まない。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリン製剤は、遊離ヒスチジン、サッカリドおよびポリオールを実質的に含まない。

投与計画は、所望の最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整する。例えば、１回のボーラスで投与でき、数回に分けた用量を経時的に投与することもでき、または治療状況の緊急性が示されるとき、用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与の容易さおよび投薬の一様性のために、投薬単位形態において非経口の組成物を処方することは、特に有利である。本明細書で使用するとき、投薬単位形態とは、治療する対象への単回の投薬に適する、物理的に別々のユニットをいい、各ユニットには、必要な医薬担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された、活性化合物の所定の量が含まれる。本発明の投薬単位形態に関する仕様は、（ａ）活性化合物および達成すべき特定の治療効果の特有の特徴、および（ｂ）個体における治療の感受性のために、かかる活性化合物を混合する当技術分野の固有の制限によって指定され、そして直接的に依存する。

免疫グロブリンの投与のために、投与量は、宿主の体重当たり、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇであり、より一般的には０．０１から５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってよい。典型的な治療計画は、１週間につき１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１カ月に１回、３カ月毎に１回または３から６カ月毎に１回の投与を必要とする。本発明の免疫グロブリンのための好ましい投与計画には、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられ、抗体が、次の投与スケジュール：（ｉ）４週間毎に６回の投薬、次いで３カ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回の後、３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重のうち１つを用いて与えられる。

あるいは、本発明の免疫グロブリンは、持続的な放出性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与頻度はより少ない。投与量および頻度は、患者に投与した物質の半減期によって変化する。一般的に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が予防的か治療的かによって変えることができる。予防的な適用では、比較的少ない投与量を、長期間にわたり比較的低頻度の間隔で投与する。幾人かの患者は、彼らの残りの人生の間、治療を受け続ける。治療的な適用では、疾患の進行が遅くなるまたは止まるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的多い投与量が、時々必要とされる。その後、患者は、予防的な計画で投与され得る。

本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物および投与様式に関して所望の治療応答を達成するのに効果的な量の活性成分が得られるように、変えることができる。選択される投与量レベルは、採用する本発明の特定の組成物またはエステル、塩もしくはそのアミドの活性、投与の経路、投与の時間、採用する特定の化合物の排泄速度、治療の期間、採用する特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、体重、状態、全体的の健康、および治療する患者の以前の病歴、ならびに医学分野で周知の類似の要因を含む、様々な薬物動態の要因に依存する。

本発明の免疫グロブリンの「治療上効果的な投薬」により、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない時期の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防がもたらされる。例えば、腫瘍の治療のために、「治療上効果的な投薬」により、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖が、治療していない対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害される。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の阻害能を試験することによって評価でき、かかる阻害は、当業者に公知のアッセイによってｉｎｖｉｔｒｏで評価される。治療上効果的な量の治療用化合物により、腫瘍の大きさを減少させるか、他の方法で対象の症状を改善することができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択する特定の組成物または投与経路のような要因に基づき、かかる量を決定することができよう。

本発明の組成物は、当技術分野で公知の１つまたは複数の様々な方法を用いて、１つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果によって変えるであろう。本発明の結合部分のための好ましい投与経路には、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口の投与経路が挙げられる。本明細書で使用するとき、「非経口投与」という表現は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、これに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。

あるいは、本発明の免疫グロブリンは、局所、表皮または粘膜の投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下にまたは局所的に投与することができる。

活性化合物は、移植物、経皮パッチおよびマイクロカプセル化による送達系が挙げられる、制御された放出製剤などの、急速な放出に対して化合物を保護するであろう担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許を取得されているか、または一般的に当業者に公知である。例えば、ＳｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。

治療用組成物は、当技術分野で公知の医療機器により投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、５，３８３，８５１号、５，３１２，３３５号、５，０６４，４１３号、４，９４１，８８０号、４，７９０，８２４号または４，５９６，５５６号に開示された機器などの、針なしの皮下注射器を用いて投与することができる。本発明に有用な周知の移植物およびモジュールの例には、制御された速度で医薬を分注するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚から医薬を投与するための治療用機器を開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、持続的な薬物送達のための流速可変型移植注入器具を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、複数のチャンバー区画を有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。

したがって、本発明の目的は、高度に濃縮した医薬製剤中の免疫グロブリンの凝集傾向を低下させるための方法を提供することであって、この方法は、凝集しやすい免疫グロブリンを提供するステップ、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å内にある免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基と、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低下させるアミノ酸残基とを置換するステップ、および高度に濃縮した改変免疫グロブリンの液体製剤を産生するステップを含み、前記改変免疫グロブリン濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌであり、前記低下した凝集傾向が、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である。

したがって、本発明の目的は、高度に濃縮した液体製剤を含む医薬の調製における、段落［００６１］、［００６２］または［００９１］で議論されるような改変免疫グロブリン、およびそれらの実施形態の任意およびすべての組合せの使用を提供することであって、前記改変免疫グロブリンの濃度が、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである。特定の実施形態では、医薬の使用は、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、炎症性疾患、神経系疾患、ならびに癌を含む腫瘍疾患および新生物疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、脈管炎、しゅさ、ざ瘡、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞、ならびに骨髄間質；骨量減少；パジェット病、骨巨細胞腫；乳癌；廃用性骨減少；栄養失調、歯周疾患、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷、急性化膿性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成、多骨性線維性骨異形成、歯根膜再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、乳癌、肺癌、腎癌、および直腸癌；骨転移、骨痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎、ならびに他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウイルス感染症、血液新生物、および新生物様の状態、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁層リンパ腫、ヘアリーセル白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含む、リンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫、および大顆粒リンパ球性白血病を含む、成熟Ｔ細胞および成熟ＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球増加症、成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患などのような骨髄新生物、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣腫、および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽腔癌、基底細胞癌、膵癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮癌、膣癌、もしくは子宮頸癌、卵巣癌、原発性肝癌、または子宮内膜癌、ならびに血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、同種異系島移植片拒絶、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのような血液悪性疾患、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷、または脱髄疾患の治療用である。特定の実施形態では、医薬の使用は、尋常性乾癬、潰瘍性大腸炎、非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌、若年性特発性関節炎、黄斑変性、呼吸器合胞体ウイルス、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、治療誘発性の骨量減少、骨転移、多発性骨髄腫、アルツハイマー病、緑内障、および多発性硬化症の治療用である。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、医薬の使用には、さらに、薬学的に許容される賦形剤が含まれる。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、医薬中の免疫グロブリンは、同じ条件下の非突然変異免疫グロブリンと比較したとき、２４時間の加速凝集の後に、少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも１５パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも２５パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも３５パーセント、少なくとも４０パーセントまたは少なくとも５０パーセント少ない凝集体を示す。特定の実施形態では、凝集は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、医薬は、免疫グロブリンの凝集を低下させる任意の添加物を実質的に含まない。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、医薬は、遊離ヒスチジン、サッカリドおよびポリオールを実質的に含まない。

凝集しやすい領域を予測する、および凝集メカニズムを研究するための分子シミュレーション技法には、本発明に採用できる詳細な原子モデルではなく、大部分は、比較的単純なシミュレーションモデル（ＭａａｎｄＮｕｓｓｉｎｏｖ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００６年、１０巻、４４５〜４５２頁；Ｃｅｌｌｍｅｒら、ＴＲＥＮＤＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７年、２５巻（６号）、２５４頁）を採用した。採用した最も詳細でないシミュレーションモデルは、格子モデルであり、これは、タンパク質凝集の多くの研究に使用されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．ＭｏＬＢｉｏｌ．１９９９年、２８６巻，５９３〜６０６頁；ＤｉｍａおよびＴｈｉｒｕｍａｌａｉ、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００２年、１１巻、１０３６〜１０４９頁；Ｌｅｏｎｈａｒｄら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００４年、１３巻、３５８〜３６９頁；ＰａｔｒｏおよびＰｒｚｙｂｙｃｉｅｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９４年、６６巻、１２７４〜１２８９頁；ＰａｔｒｏおよびＰｒｚｙｂｙｃｉｅｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９６年、７０巻、２８８８−２９０２頁；Ｂｒｏｇｌｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８年、９５巻、１２９３０〜１２９３３頁；Ｉｓｔｒａｉｌら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９年、６巻、１４３〜１６２頁；Ｇｉｕｇｌｉａｒｅｌｌｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０００年、１１３巻、５０７２〜５０７７頁；Ｂｒａｔｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００１年、１１４巻、５６１〜５６９頁；ＢｒａｔｋｏおよびＢｌａｎｃｈ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００３年、１１８巻、５１８５〜５１９４頁；ＣｏｍｂｅおよびＦｒｅｎｋｅｌ、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００３年、１１８巻、９０１５〜９０２２頁；ＴｏｍａおよびＴｏｍａ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０００年、１巻、２３２〜２３８頁；Ｇｕｐｔａら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．１９９８年、７巻、２６４２〜２６５２頁；およびＮｇｕｙｅｎおよびＨａｌｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００２年、８０巻、８２３〜８３４頁）。ここで各残基は、３次元格子上の単一部位を占めるビーズとして表される。その単純さのため、格子モデルは、計算の要求がより少なく、長時間スケールでの大きなシステムをシミュレートするために使用した。これらの格子モデルは、タンパク質凝集の根底にある基礎物理学への洞察を与えるが、２次および３次構造を正確には表さず、水素結合などの異なる原子レベルの相互作用を十分に説明することはできない。

格子モデルと比較してより詳細なモデルは、中間の解像度モデルであり、通常、数個の原子を単一ビーズに組み合わせ、骨格の結合角および異性化状態を維持するために仮性結合を時々導入する（ＳｍｉｔｈおよびＨａｌｌ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１年、３１２巻、１８７〜２０２頁；ＳｍｉｔｈおよびＨａｌｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．２００１年、４４巻、３４４〜３６０頁；ＳｍｉｔｈおよびＨａｌｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．２００１年、４４巻、３７６〜３９１頁；Ｎｇｕｙｅｎら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００４年、１３巻、２９０９〜２９２４頁；ＮｇｕｙｅｎおよびＨａｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００４年、１０１巻（４６号）、１６１８０〜１６１８５頁；ＮｇｕｙｅｎおよびＨａｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００６年、１２８巻、１８９０〜１９０１頁；Ｊａｎｇら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２００４年、８６巻、３１〜４９頁；Ｊａｎｇら、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００４年、１３巻、４０〜５３頁）。このモデルを、無秩序な状態から開始する、１２および９６個の間のポリアラニンペプチド（それぞれ１６残基）を含む系から、線維形成をシミュレートするために首尾よく使用した（ＮｇｕｙｅｎおよびＨａｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００４年、１０１巻（４６号）、１６１８０〜１６１８５頁；ＮｇｕｙｅｎおよびＨａｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００６年、１２８巻、１８９０〜１９０１頁）。Ｄｏｋｈｏｌｙａｎおよび共同研究者らは、８つのモデルＳｒｃＳＨ３ドメインタンパク質によって（Ｄｉｎｇら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００２年、３２４巻、８５１〜８５７頁）、または２８個のモデルＡβ（１〜４０）ペプチド（Ｐｅｎｇら、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｅ：Ｓｔａｔ．Ｐｈ．Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｔｏｐ．２００４年、６９巻、４１９０８〜４１９１４頁）によって、原線維βシート構造の形成を研究するために、かかるモデルを適用した。

より単純なモデルとは違い、原子モデルは、水素結合などのすべての原子の詳細を含み、したがって、格子または中間の解像度モデルより正確である。かかる原子モデルは、明示的な（ｅｘｐｌｉｃｉｔ）溶媒または暗黙の（ｉｍｐｌｉｃｉｔ）溶媒のいずれかを用いて使用し、溶媒は、連続体として処理した。明示的なモデルは、暗黙のモデルより正確であるが、計算もより要求される。暗黙の溶媒を用いるかかる原子モデルを、酵母タンパク質Ｓｕｐ３５の一部であるヘプタペプチドＧＮＮＱＱＮＹ（配列番号：１７）の凝集の初期段階を研究するために使用した（Ｇｓｐｏｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３年、１００巻、５１５４〜５１５９頁）。同様のモデルを、逆平行βシートへのＡｂ１６〜２２アミロイドペプチド（ＫＬＶＦＦＡＥ（配列番号：１８））の凝集に使用した（ＫｌｉｍｏｖおよびＴｈｉｒｕｍａｌａｉ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２００３年、１１巻、２９５〜３０７頁）。Ｄｏｋｈｏｌｙａｎおよび共同研究者ら（Ｋｈａｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００５年、６１巻、６１７〜６３２頁）は、酵素Ｃｕ，Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）の配列に沿った秩序的な凝集傾向を調査するために、明示的な原子モデルを使用した。彼らは、ＳＯＤ１配列を、オーバーラップするヘプタペプチドに分解し、単量体、二量体および四量体セグメントの多数の明示的な水分子動的シミュレーション（それぞれ０．５ｎｓ）を行った。これにより、彼らは、ＳＯＤ１配列におけるアミロイド形成領域が、β鎖４および７の２つの末端、ならびに２つのクロスオーバーループであることを同定した。

同様の分子動的シミュレーションプロトコールを、アミロイド形成ポリペプチドの秩序的なβ凝集に関する構造情報を得るために開発した（Ｃｅｃｃｈｉｎｉら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６年、３５７巻、１３０６〜１３２１頁）。手順は、オーバーラップするセグメントへのポリペプチド鎖の分解、および各セグメントの少数のコピーの平衡分子動的（ＭＤ）シミュレーションに基づく。アルツハイマーのＡβ（１〜４２）ペプチドの配列に沿ったβ凝集傾向が、非常に不均一であることが見出され、セグメントＶ_１２ＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥ_２２（配列番号：１９）で最大、および４つのターン様ジペプチドで最小であった。この技法を用いて、酵母プリオンＵｒｅ２ｐのＮ末端ドメインの二重点突然変異の凝集傾向における予測した変化を、チオフラビンＴ結合アッセイを使用してｉｎ
ｖｉｔｒｏで検証した。ポリペプチド鎖をオーバーラップするセグメントに分解するかかる手順は、抗体などの系に関して、それらの巨大さから、非常に困難であろう。さらに、明示的な溶媒中の単一の完全抗体の原子シミュレーションは、抗体の巨大さから、非常に計算を要求される。したがって、本文献では、完全抗体の原子シミュレーションではないと思われる。

しかし、抗体の小さい部分の原子シミュレーションはあり、大部分はＦａｂ断片に関してであった（Ｎｏｏｎら、ＰＮＡＳ．２００２年、９９巻、６４６６頁；ＳｉｎｈａおよびＳｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ、ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．２００５年、４３巻、２５３頁）。本明細書に開示の研究では、明示的な溶媒を用いる完全抗体分子の原子シミュレーションを行った。これらのシミュレーションに基づき、抗体上の凝集しやすい領域を、本明細書に記載の「空間的凝集傾向」パラメータを使用して同定した。これらの凝集しやすい領域を、次いで、強化した安定性を有する抗体を設計するように突然変異させた。本明細書に記載の実施例には、特に、本発明の非限定的な実施形態を言及する。

（実施例１）分子動的シミュレーション法
分子動的シミュレーションを、全原子モデルを使用して、完全抗体に関して行った。完全抗体に関するシミュレーションの最初の構造を、個々のＦａｂおよびＦｃ断片のＸ線構造から得た。概念実証（ＰＯＣ）のＦａｂ断片のＸ線構造を、ＩｇＧ１抗体１ＨＺＨから得たＦｃのＸ線構造上にモデリングするために選択した（Ｓａｐｈｉｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年、２９３巻、１１５５頁）。完全抗体に関するＸ線構造が公知であり、Ｆｃ構造が、すべてのＩｇＧ１クラスの抗体で同じため、１ＨＺＨを選んだ。次いで、１ＨＺＨ構造をモデルテンプレートとして使用し、ＦａｂおよびＦｃ断片を整列させることによってＰＯＣ完全抗体の構造を得た。正しい距離および方向で断片を整列させるために、ＲＭＳＤ（平均二乗偏差）を、断片および完全抗体テンプレート（１ＨＺＨ）の共通のＣＹＳ残基間で最小にした。各抗体のサブドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２など）が、ジスルフィド結合を含み、よって、ＣＹＳ残基が全体の抗体構造にわたって広範に分布するため、ＣＹＳ残基を選んだ。結果として得られる完全抗体構造を、次いで、３０ｎｓ間、明示的な原子シミュレーションの実行に使用した。Ｇ０グリコシル化パターンをシミュレーションに使用した。なぜなら、これが、抗体において観察される最も共通のグリコシル化パターンであるからである。

ＣＨＡＲＭＭシミュレーションパッケージ（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１９８３年、４巻、１８７頁）を、セットアップおよび解析に使用し、ＮＡＭＤパッケージ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５年、２６巻、１７８１頁）をシミュレーションの実行に使用した。ＣＨＡＲＭＭ全原子力場（ａｔｏｍｉｓｔｉｃｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ）（ＭａｃＫｅｒｅｌｌら、Ｊ．ＰｈｙｓＣｈｅｍ．Ｂ．１９９８年、１０２巻、３５８６頁）は、タンパク質に使用し、ＴＩＰ３Ｐ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９８３年、７９巻、９２６頁）は、水についての溶媒モデルに使用した。シミュレーションは、ＮＰＴアンサンブルにおいて２９８Ｋおよび１気圧で行った。Ｆｃ断片のグリコシル化に関連する糖基に関するパラメータは、ＣＳＦＦ力場（Ｋｕｔｔｅｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、２３巻、１２３６頁）に続くＣＨＡＲＭＭ力場と一致するように導く。ｐＨ−７でのヒスチジン残基のプロトン化状態を、電気陰性基の空間的近接に基づいて選んだ。完全抗体を斜方晶ボックス（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃｂｏｘ）において溶媒和した。なぜなら、これが、必要な水分子の数を最小にし、よって計算時間を最小にするからである。周期的境界条件（ｐｅｒｉｏｄｉｃｂｏｕｎｄａｒｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を、すべて３方向において使用した。８Åの水の溶媒和シェルを、斜方晶ボックスの各方向において使用した。結果として得られた全体の系サイズは、２０２１３０原子であった。全体の系の電荷を中和するために十分なイオンを添加した。電荷の中性は、系における静電気相互作用の寄与を計算するために採用されるＥｗａｌｄ合計法によって必要とされる。

抗体を溶媒和した後、タンパク質周囲で水の緩和を可能にするために、タンパク質を固定することによって、エネルギーを最初にＳＤ（最急降下（ｓｔｅｅｐｅｓｔｄｅｓｃｅｎｔ））により最小にした。次いで、拘束を除去し、構造をＳＤおよびＡＢＮＲ（ＡｄｏｐｔｅｄＢａｓｉｓＮｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ）でさらに最小にした。次いで系を、１ｆｓの時間ステップを用いて０．５ｐｓ毎に５℃上昇させて室温までゆっくり加熱した。シミュレーションから対象の特性を計算する前に、次いで系をＩｎｓに対して平衡にした。さらなる統計解析のために、シミュレーションの間、０．１ｐｓ毎にコンフォメーションを保存した。

（実施例２）空間的凝集傾向（ＳＡＰ）の計算
ＳＡＡの欠点を克服するために、上記のような「空間的凝集傾向」と呼ばれる新しいパラメータを規定した。

この実施例では、実施例１で記載の抗体におけるあらゆる原子で中央に位置する半径Ｒの球状領域に関して、「空間的凝集傾向」を計算した。したがって、パッチの２つの異なる半径（Ｒ＝５Å、１０Å）に対する抗体のＦｃ断片に関して３０ｎｓのシミュレーションの平均を用いて、空間的凝集傾向値を評価した（当業者は、利用可能な計算資源および結果の所望の解像度にしたがって、シミュレーションのための様々な時間ステップが選択可能であることを理解するであろう）。両方の場合において、値の大部分が負であり、ほとんどの露出領域が親水性を示すことに注記のこと。露出したタンパク質表面のほとんどが、通常、親水性であるため、これは予想通りであった。露出した高い疎水性を示す、空間的凝集傾向が正であるピークを有する少数の領域があることも観察された。パッチのより小さい半径（５Å）からより大きい半径（１０Å）にすることにより、いくつかのピークが消失し、一方、いくつかの他のピークが強化される。これらの領域において、小さい疎水性パッチ（半径５Å未満）が、親水性パッチによって囲まれるため、いくつかのピークは消失し、したがって、平均して１０Åを超えることにより、この領域に関する疎水性の効果的な低下が導かれる。一方、いくつかの他の領域では、Ｒ＝１０Åでの空間的凝集傾向は、疎水性パッチが同様の疎水性パッチを囲むため、強化される。

上記で、空間的凝集傾向は、３０ｎｓのシミュレーション実行の間の平均として計算した。シミュレーションを用いて計算した結果を、次いで、分子シミュレーションなしのＸ線構造のみの空間的凝集傾向と比較した。空間的凝集傾向（Ｘ線）を、したがってＲ＝５ÅおよびＲ＝１０Åに関して計算した。空間的凝集傾向（Ｘ線）は、シミュレーションの平均した値のものと同様であり、同じ位置にピークを有したが、ピークの振幅は異なった。差は、パッチのより大きな半径Ｒ＝１０Åでより大きくなった。これはおそらく、大きなパッチサイズで見たとき、差が相加的であるためであろう。動的シミュレーションの実行において残基の変化する表面の露出により、これらの差は生じる。それにもかかわらず、この比較により、特にパッチの小さい半径Ｒに関して、空間的凝集傾向の優れた最初の推定を、そのＸ線構造から取得できることが示される。

Ｒ＝５ÅおよびＲ＝１０Åに関するシミュレーションから得た空間的凝集傾向値を、抗体構造上にマップした。両場合において、抗体表面を、空間的凝集傾向の値によって色付けした。空間的凝集傾向の計算において使用される両半径（５Åおよび１０Å）で、表面の大部分が親水性であることが観察された。タンパク質表面のほとんどが、通常、親水性であるため、これも予想通りである。しかし、少数の疎水性領域が目立った。疎水性および親水性領域間の対比は、ＳＡＰの計算において使用したパッチのより大きい半径Ｒ＝１０Åでより顕著である。同定した疎水性領域のいくらかは、他のタンパク質と相互作用することが公知である抗体の領域との優れた相関を有する。ヒンジ領域における残基２３４および２３５の周囲の１つのパッチは、Ｆｃ受容体が相互作用する部位である。残基２３５の周囲の第２パッチは、プロテインＡおよびプロテインＧが相互作用するＦｃ断片中の領域に相当する。顕著な疎水性パッチを、抗体が抗原と結合する領域に相当するＦａｂ断片の末端で観察した。Ｒ＝５Åおよび１０Åのそれぞれに関する空間的凝集傾向のプロットでは、相互作用領域とピークとの同じ相関を観察することができた。タンパク質相互作用部位を、タンパク質複合体、すなわちＰＤＢ登録１Ｔ８９、１ＦＣ２および１ＦＣＣ（Ｒａｄａｅｖ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年、２７６巻（１９号）１６４６９頁；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒら、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺＰｈｙｓｉｏｌＣｈｅｍ．１９７８年、３５９巻、９７５〜９８５頁；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８１年、２０巻、２３６１〜２３７０頁；Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１９９５年、３巻、２６５頁）のＸ線構造から得た。疎水性相互作用は、空間的凝集傾向が正であるピークと非常によく相関し、親水性相互作用は、空間的凝集傾向が負であるピークとよく相関する。したがって、空間的凝集傾向パラメータは、タンパク質の結合部位を予測するためにも使用することができる。低い空間的凝集傾向（すなわち、ゼロ近くの正または負のいずれか）を有する残基も相互作用する稀な例外では、実際には、側鎖の代わりに、骨格の主鎖自体の原子と相互作用することが観察された。

上記で議論した、他のタンパク質との相互作用が既に示された疎水性パッチとは別に、抗体表面上の追加の疎水性パッチ（領域４から６）を同定した。Ｆｃの底部の領域５は、顕著に疎水性であるが、いくらか内部に埋まっており、その境界上に親水性領域がある。同様に、領域４および６は、疎水性であり、溶媒にさらされるが、それらは抗体の内側に向いている。抗体の顕著なコンフォメーション的変化またはアンフォールディングのために、領域４および６が露出すると、これらはさらに他のタンパク質との相互作用に潜在的に関与できた。より大きいパッチ半径（Ｒ＝１０Å）と比較してコントラストはより小さいが、すべての疎水性パッチ（領域１から６）を、より小さいパッチ半径（Ｒ＝５Å）でも観察できた。

Ｘ線構造のみに基づく空間的凝集傾向（Ｘ線）値も、シミュレーションの平均値と比較するために、抗体表面上にマップした。シミュレーションにより、またはＸ線構造のみを使用して計算した空間的凝集傾向の比較により、同定された疎水性領域がかなり類似していることが示された。当然、プロテインＡ相互作用パッチの強度などのいくらかの違いはある。それにもかかわらず、この比較により、Ｘ線構造のみに基づく空間的凝集傾向（Ｘ線）は、表面上の疎水性パッチの分布に関するよい説明を得るために使用可能であることが実証される。完全抗体の原子シミュレーションが、計算を要求するため、このことは重要である。Ｘ線構造モデルを欠くタンパク質のために、同じ空間的凝集傾向パラメータを、ホモロジーモデリングまたは非経験的な（ａｂ−ｉｎｉｔｉｏ）構造予測により産出された構造に適用することができる。ホモロジー構造が、Ｘ線構造に非常に類似することが観察され、その空間的凝集傾向値もＸ線構造に類似する。

このように、空間的凝集傾向により、抗体の表面上の疎水性パッチが同定される。これらのパッチは、天然で露出するか、抗体の動的な変動または部分的なアンフォールディングのためにさらされ得た。これらの疎水性パッチのいくらかも、他のタンパク質と相互作用する領域とよく相関する。空間的凝集傾向により予測されたこれらの疎水性パッチが、凝集にも関連するかどうかを試験するために、疎水性残基を親水性残基に変化させる、これらの特定領域における突然変異を行った。結果として得られる抗体は、より低下した凝集挙動および改善された安定性を示した。凝集しやすい残基の同定とは別に、ＳＡＰ法は、他のタンパク質と結合しやすい抗体の領域を正確に同定することが観察された。したがって、この方法は、凝集しやすい領域または他のタンパク質との結合領域を同定するために全タンパク質に広範に適用することができた。

（実施例３）安定性操作のための抗体部位の選択
高い空間的凝集傾向を有する（したがって、本発明者らによって同定された凝集しやすいモチーフの中央にある）と同定された残基を、表１に記載する。モチーフの中央に存在すれば、これらの残基および５Å（または計算に１０Åウィンドウが用いられるときは１０Å）内のそれらの残基を、凝集を低下させる、および／または安定性を増加させる、より低い疎水性残基に改変することができる。残基は、ヒトＩｇＧ１抗体（カッパー軽鎖を有する）に関して同定し、異なるＩｇＧクラスにおいて相当する残基は、表１に示す。

表１は、モチーフが、数個の違いを有する異なるＩｇＧ間にほぼ保存されていることを示す。しかし、この違いのほとんどは、疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸のものである。したがって、モチーフの疎水性は、これらの違いがあってもインタクトなままであり、したがって、同じ位置の疎水性残基を有する他のクラスも、凝集しやすいモチーフである。凝集しやすいモチーフではないこれの数個の例外（Ａ３３０Ｓ、Ｖ１１０ＫおよびＬ２０１の欠失）がある。これらの例外は別として、ここで同定されたモチーフは、すべてのＩｇＧクラスの抗体に関して、露出された疎水性およびより高いＳＡＰ値を同様に有する。

表２は、凝集しやすいモチーフに組織化した疎水性残基を示す。

（実施例４）安定性操作のための抗体部位の選択
それらのＳＡＰによって同定した凝集しやすいモチーフが、凝集および／または不安定性に関与することを実証するために、同定された領域で突然変異を起こし、疎水性残基を親水性残基に変えた。ここで、選択された残基を、すべてリジンに変えた。一般的に、一般のモチーフを形成するアミノ酸を、ＢｌａｃｋａｎｄＭｏｕｌｄスケールにおいてより親水性であるアミノ酸によって、特に、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＡｒｇによって交換することができる。選択された領域は、Ａ１（Ｌ２３５Ｋ）、Ａ２（Ｉ２５３Ｋ）、Ａ３（Ｌ３０９Ｋ）、Ａ４（Ｌ３０９Ｋ、Ｌ２３５Ｋ）およびＡ５（Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３５Ｋ）であった。結果として得られる突然変異体抗体は、実施例６に記載のような、より低下した凝集挙動および改善された安定性を示した。

（実施例５）抗体変異体の発現および精製
上記の実施例４に議論される選択された残基を突然変異させ、結果として得られる抗体変異体を発現させ、精製した。一過性トランスフェクションからの高い発現に対して最適化した、所有権のあるベクター（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）からｇＷＩＺベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）に遺伝子をサブクローニングすることによって、ヒトＩｇＧ１抗体Ａの軽鎖または重鎖遺伝子を保有するベクターを得た。部位特異的突然変異誘発のためのストラタジーンプロトコールにしたがって、抗体変異体を産生した。全構築物を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｍｇスケールでのプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡＭａｘｉＰｒｅｐカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による細菌培養液から精製した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の増殖および一過性トランスフェクションのために、製造者のプロトコールにしたがった。簡潔には、培養液１Ｌのトランスフェクションのために、総ＤＮＡ１ｍｇ（ＨＣおよびＬＣベクターそれぞれ０．５ｍｇ）を、１５分間、ＯｐｔｉＰｒｏ溶液２０ｍｌでインキュベートし、同じ時間で、２ｍｇのトランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）１ｍｇ／ｍｌで）を、１５分間、ＯｐｔｉＰｒｏ溶液２０ｍｌでインキュベートした。ＰＥＩ溶液を、次いで、回旋によって混合したＤＮＡ溶液に添加し、もう１５分間インキュベートした。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物２０ｍｌのアリコートを、１．０×１０^６細胞／ｍｌで、細胞培養液５００ｍｌに添加した。トランスフェクトした細胞を、３７℃で７〜９日間、ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。

ＦＰＬＣＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、抗体の野生型および変異体を、プロテインＡカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の組織培養液の上澄みから精製した。抗体を、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５によりカラムから溶出し、１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０により、ｐＨ６．６〜７．０に平衡化した。この溶出液を、Ｑセファロースカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通過させ、負に荷電した不純物を除去した。ｐＨ７．０以下では、抗体は、正に荷電し、フロースルー中に残り、一方、負に荷電した不純物は、Ｑセファロースカラムの正に荷電したマトリックスと結合する。精製した抗体を有する溶液を、３０ＫＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＶＷＲ）を使用し、そして２０ｍＭＨｉｓ緩衝液、ｐＨ６．５で緩衝液交換し、最終濃度１５０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。

品質管理として、精製および濃縮した試料のアリコートを、非還元および還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。試料につき４μｇのタンパク質のアリコートを、ＤＴＴを含まないまたは含む変性緩衝液中でインキュベートし、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）上で分離した。また、変異体Ａ１を、円二色性によって野生型と比較し、このスペクトルは、基本的に同一であり、２つのタンパク質が、同じ程度の二次構造を本質的に有することが示された。

（実施例６）抗体変異体の生物物理学的特性付け
抗体変異体の安定性を、３つの異なる解析方法を用いて解析した。

濁度アッセイ
濁度アッセイを、４時間まで６５℃で行った。抗体Ａおよび変異体は、２０ｍＭＨｉｓ、ｐＨ６．５中で、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度であり、濁度評価のために、１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５中で、１０ｍｇ／ｍｌに１５倍希釈した。定性的観察に加えて、試料を１ｍｇ／ｍｌにさらに希釈し、表３に示すように３２０ｎｍでの吸光度を記録した後、濁度を定量化した。

分子ふるい−高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
第２のおよび好ましいアッセイとして、加速凝集実験において、経時的な単量体の減少を決定するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用した。抗体Ａの野生型および変異体を、２４時間まで５８℃で、１５０ｍｇ／ｍｌで、サーマルサイクラ−（ＢｉｏＲａｄ）中でインキュベートした。各時点に関して、２μｌのアリコートの試料を、１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５中で、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに１５倍希釈した。０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で、１５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５の移動相を用いて、２２℃で維持したＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上でＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、単量体を非単量体種から分離した。単量体のパーセントを、２８０ｎｍで検出される全ピークの総面積で割った単量体ピークの面積として計算した。

示差走査マイクロカロリメトリー（ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＭｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）
第３に、抗体Ａの野生型および変異体の熱力学的安定性を、示差走査マイクロカロリメトリー（ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ）によって比較した。ＭＡｂは、オーバーラップがないとき、Ｆａｂ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３の３つの融解転移（ｍｅｌｔｉｎｇｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を有する特徴的なＤＳＣサーモグラムを有する（Ｉｏｎｅｓｃｕら、ＪＰｈａｒｍＳｃｉ、９７巻、１４１４頁、２００８年；Ｍｉｍｕｒａら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２７６巻、４５５３９頁、２００１年）。ここで使用される実験条件では、抗体ＡのＦａｂは、７７℃で融解転移を有する。Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３の融解温度は、それぞれ７３℃および８３℃である。したがって、抗体Ａでは、Ｃ_Ｈ２は、最も低い融解温度を有する抗体ドメインである。

抗体Ａの野生型および変異体Ａ１〜Ａ５を、ｐＨ６．５のＨｉｓ緩衝液２０ｍＭ中で２ｍｇ／ｍｌの濃度で、１分につき１．０度の加熱速度で、解析した。参照データの減算、タンパク質濃度およびＤＳＣセル体積に対する正規化、および立方ベースライン（ｃｕｂｉｃｂａｓｅｌｉｎｅ）の内挿によって、試料データを解析した。ＭｉｃｒｏｃａｌＯｒｉｇｉｎ５．０ソフトウェアを使用して、非２状態フィッティング（ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅｆｉｔ）によって、ピークをデコンボルートした。サーモグラムの比較により、野生型と比較して、１から３度の、変異体のＣ_Ｈ２融解転移の増加が示され、二重変異体Ａ４およびＡ５に関して最も明白な違いを有した（以下の表４）。

（実施例７）まとめ
抗体Ａの野生型および変異体の濁度、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＤＳＣ実験から得た結果を、表５にまとめた。

それぞれ３つの単一突然変異体Ａ１、Ａ２およびＡ３は、それぞれ３つの解析方法によって、改善された安定性を示した。濁度アッセイでは、６５℃で２時間、ストレスを与えた抗体Ａｗｔ試料の希釈により、溶液の濁りが生じ、一方、全変異体に関する溶液は、透明のままであった。５８℃で２４時間、ストレスを与えた試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果により、単量体が、野生型に関して９１％から、変異体に関して９３〜９５％まで、増加することが示された。最初の単量体集団が９９％のとき、変異体における非単量体種は、野生型と比較して半分まで減少した。ＤＳＣ解析により、Ｃ_Ｈ２（抗体Ａにおいて最も低い融解転移を有するドメイン）に関する融解転移の上昇が、野生型についての７３℃から、変異体についての７５〜７６℃までであることが示された。

変異体Ａ４およびＡ５に関する濁度結果およびＤＳＣサーモグラムによって証明したように、変異体Ａ１において追加の高ＳＡＰの残基を置換することにより、安定性がさらに改善された。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果により、変異体Ａ４（２４時間のストレス後、単量体９６％）についてのみ、変異体Ａ１を超える改善が示されたが、変異体Ａ５（変異体Ａ１と同様に、２４時間のストレス後、単量体９３％）について改善はなかった。

確認の目的として、抗体のＣＤＲ領域中の残基の変異を追加することにより、同様の突然変異を、第２抗体において起こした。試験した突然変異の１つを除くすべては、安定性が改善され、および／または凝集が低下した。ＣＤＲ領域中の１つの残基での突然変異は、予想したように行わなかったが、このことは、フォールディングにおける欠陥のための可能性があったため、この変異体がよく発現しなかったことが理由かもしれず、したがって、加速凝集解析の前でさえも、野生型よりも大きな凝集程度を有した。したがって、フレームワークおよび保存領域において試験した全突然変異は、予測した結果をもたらし、これによって、ＳＡＰアルゴリズムを頑強であることを証明したが、正しくフォールドできない変異という、可能性のある唯一の例外はある。しかし、突然変異が、すべて、表面の露出した残基にあり、より高い親水性残基との置換を含むことを考慮すると、かかるフォールディングの問題は、稀であると予想される。

（実施例８）追加の抗体変異体の安定性解析
追加の変異体を設計し、第１および第２抗体における改善された安全性に関して解析した。突然変異のための部位は、ＳＡＰ予測を基にした。各変異体における突然変異を表６にリストする。

ＳＥＣ−ＨＰＣＬを、加速凝集実験において経時的な単量体の減少の決定に使用した。第１抗体に関して、野生型および変異体抗体を、１５０ｍｇ／ｍｌで、５８℃で、２４時間まで、サーマルサイクラ−（ＢｉｏＲａｄ）中でインキュベートした。第２抗体に関して、野生型および変異体抗体を、６０ｍｇ／ｍｌで、５２℃で、３６時間まで、サーマルサイクラ−（ＢｉｏＲａｄ）中でインキュベートした。各時点に関して、２μｌのアリコートの試料を、１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５中で、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまで１５倍希釈した。０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で、１５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５の移動相を用いて、２２℃で維持したＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上でＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、単量体を非単量体種から分離した。単量体のパーセントを、２８０ｎｍで検出される全ピークの総面積で割った単量体ピークの面積として計算した。

変異体Ａ６は、１２時間のとき、野生型についての９５．５％から９６％の単量体の増加、および２４時間のとき、野生型についての９１％から９２％の単量体の増加を示した。変異体Ａ７は、１２時間のとき、野生型についての９６．５％から９７．５％の単量体の増加、および２４時間のとき、野生型についての９１％から９４％の単量体の増加を示した。変異体Ａ８は、１２時間のとき、野生型についての９６．５％から９８．５％の単量体の増加、および２４時間のとき、野生型についての９１％から９７％の単量体の増加を示した。変異体Ｂ６は、１２時間のとき、単量体のパーセントの有意差を示さず、２４時間のとき、野生型についての９７．５％から９８％の単量体の増加、および３６時間のとき、野生型についての９６％から９７％の単量体の増加を示した。

（実施例９）ＳＡＰおよび安定性におけるタンパク質−炭水化物相互作用の役割
この実施例では、本発明者等は、ＳＡＰ値に対する抗体のグリコシル化の効果を決定した。グリコシル化を含むまたは含まない両方の完全抗体に関して、ＳＡＰをＲ＝５Åで決定した。グリコシル化を含む抗体に関するＳＡＰを、Ｇ０グリコシル化を含む完全抗体の３０ｎｓ分子動的シミュレーションから決定した。グリコシル化を含まない抗体のためのＳＡＰを、同じシミュレーションにより決定したが、そこでは、本発明者等は、ＳＡＰ解析の間、グリコシル化を除去した。高いＳＡＰ領域は、最も凝集しやすい領域であった。グリコシル化の除去により、グリコシル化により覆われる領域において、特に残基Ｆ２４１およびＦ２４３に関して、ＳＡＰが顕著に増加することが観察された。したがって、グリコシル化の除去または置き換えにより、凝集しやすい領域の顕著な増加が引き起こされる。これらの領域は、直接的に、凝集を引き起こすことができ、またはアンフォールディングのための自由エネルギーの障壁を低下させることができ、グリコシル化の形態と比較して、より低い安定性の非グリコシル化の形態をつくり得た。

タンパク質−炭水化物相互作用の役割を、実験的にさらに調査するために、２つの抗体突然変異体、すなわちＦ２４１ＳＦ２４３Ｓ（変異体ＦＳ）およびＦ２４１ＹＦ２４３Ｙ（変異体ＦＹ）を産生した。変異体ＦＳは、より小さい非芳香族側鎖を有する極性セリン残基で交換した炭水化物部分と相互作用することが公知であるフェニルアラニン残基を有する（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８１年、２０巻、２３６１〜７０頁；Ｋｒａｐｐら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ、２００３年、３２５巻、９７９〜８９頁）。変異体ＦＹでは、同じフェニルアラニン残基は、より高度な糖界面傾向を有すると示唆された、Ｔｙｒ残基によって交換される（Ｔａｒｏｎｉら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ、２０００年、１３巻、８９〜９８頁）。同時に、例えばＶａｌ２６４の他の疎水性残基は、この領域において非改変のままである。野生型および変異体ＦＹは、それらの炭水化物のシアリル化がたとえあったとしても、非常に少ないが、変異体ＦＳ分子の５０％近くが、少なくとも１つのシアル酸残基を有する。

野生型および変異体ＦＳおよびＦＹの安定性を、加速凝集試験において、および示差走査マイクロカロリメトリー（ＤＳＣ）によって比較した。１５０ｍｇ／ｍｌでの試料を、５８℃で３６時間まで凝集を誘発し、単量体レベルを、分子ふるい高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって分離し、定量化した。野生型の単量体レベルは、０、１２、２４および３６時間の時点で、１００から９６、９１および８７％に徐々に減少した。比較として、変異体ＦＹは、より早い時点で、１〜３％単量体レベルが減少したが、３６時間のときに８８％残存し、これは、野生型の統計的誤差内である。変異体ＦＳは、この温度で顕著により低い安定性であり、単量体が、１２時間のときに９９％から３９％に、２４時間のときに２０％に減少することが示された。３６時間での試料は、多くの目に見える凝集体が存在したため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣでの試行は行わなかった。

ＤＳＣの結果も、変異体および野生型の間で異なった。Ｃ_Ｈ２ドメインの融解温度（Ｔｍ）は、野生型についての７３℃から、変異体ＦＳについての５９℃まで低下した。１℃を超えない、変異体ＦＳにおけるわずかな違いを、ＦａｂおよびＣ_Ｈ３の融解転移でも観察した。変異体ＦＹのＣ_Ｈ２融解転移ショルダーが、野生型のものとオーバーラップするが、ソフトウェアの適合により、Ｃ_Ｈ２のＴｍが７１℃に低下することが示され、他の２つのＴｍは変化しないままである。

変異体ＦＳと野生型とを比較するために、および観察された安定性の低下をよりよく理解するために、多くの追加実験を行った。変異体ＦＳは、野生型と同じβシートリッチな構造を保持した。変異体は、還元性および非変性のゲル電気泳動において野生型と比較して、異なる移動度パターンを有する。プロテアーゼ処理実験も、変異体ＦＳおよび野生型のタンパク質表面露出を比較するために行った。Ｇｌｕ−Ｃによる抗体の消化は、変異体ＦＳが、野生型より効率的（より多くの小さな断片）であり、その効率は、いくつかの違いは存続したが、変異体および野生型の脱グリコシル化の対応物において大部分は同等化した。その上、変異体ＦＳは、完全ＦｃＲｎおよび部分的ＦｃγＲＩａ結合機能を保持するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合を失った。

したがって、一態様は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（Ｓｐａｔｉａｌ−Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−Ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）（５Å半径の球（ｒａｄｉｕｓｓｐｈｅｒｅ））を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変および／または単離免疫グロブリンを含み、ここで、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中のＫａｂａｔの残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）に対応する残基にない。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å以内にある残基に第２の凝集低下突然変異を有し、第２の凝集低下突然変異は、非突然変異免疫グロブリンと比較して残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低くするアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケール（ＢｌａｃｋＭｏｕｌｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙｓｃａｌｅ）を使用して、計算される。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

他の態様は、凝集モチーフ１：１７４（Ｃ_Ｈ１）、１７５（Ｃ_Ｈ１）、および１８１（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２６（ヒンジ）、２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、２２９（ヒンジ）、２３０（ヒンジ）、２３１（ヒンジ）、および２３２（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５２（Ｃ_Ｈ２）および２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０８（Ｃ_Ｈ２）および３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２８（Ｃ_Ｈ２）、３２９（Ｃ_Ｈ２）、３３０（Ｃ_Ｈ２）、および３３１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）、３９６（Ｃ_Ｈ３）、３９７（Ｃ_Ｈ３）、３９８（Ｃ_Ｈ３）、および４０４（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）および１１１（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５３（Ｃ_Ｌ）および１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを含み、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔ残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、凝集モチーフ１：１７５（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、および２３０（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２９（Ｃ_Ｈ２）および３３０（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）および３９８（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５４（Ｃ_Ｌ）；ならびに凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）に由来する残基からなる群から選択される。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２３４（ヒンジ）、２３５（ヒンジ）、２５３（Ｃ_Ｈ２）、または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２５３（Ｃ_Ｈ２）または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある疎水性残基に第２の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して、計算される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

他の態様は、２３５（ヒンジ）、２４１（Ｃ_Ｈ２）、２４３（Ｃ_Ｈ２）、２８２（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される残基に少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低下した凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを含み、残基２３５が選択される場合、それはグルタミン酸またはセリンに突然変異させられ、残基２８２が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、残基３０９が選択される場合、それはリジンに突然変異させられ、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換であり、低下した凝集傾向は、濃縮液体溶液中の免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づくＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔ残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のセリンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、セリンへの残基２４３の第２の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２４１のチロシンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、チロシンへの残基２４３の第２の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、残基２８２のリジンへの突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは、第２また第３の凝集低下突然変異であって、第２の凝集低下突然変異は、残基２３５のリジンへの突然変異であり、第３の凝集低下突然変異は、残基３０９のリジンへの突然変異である、第２また第３の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、免疫グロブリンは、疎水性残基に第２の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、第２の凝集低下突然変異は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内にある第３の凝集低下突然変異を有し、第３の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基よりも疎水性ではないアミノ酸残基での置換である。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２の凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、少なくとも１４の凝集低下突然変異を含み、それぞれの凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフから選択される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、セリン、グルタミン酸、およびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０と等しいように正規化されたＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して、計算される。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせられてもよい特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせられてもよい特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

したがって、本発明の目的は、凝集モチーフ１：１７４（Ｃ_Ｈ１）、１７５（Ｃ_Ｈ１）、および１８１（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２６（ヒンジ）、２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、２２９（ヒンジ）、２３０（ヒンジ）、２３１（ヒンジ）、および２３２（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５２（Ｃ_Ｈ２）、および２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０８（Ｃ_Ｈ２）および３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２８（Ｃ_Ｈ２）、３２９（Ｃ_Ｈ２）、３３０（Ｃ_Ｈ２）、および３３１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）、３９６（Ｃ_Ｈ３）、３９７（Ｃ_Ｈ３）、３９８（Ｃ_Ｈ３）、および４０４（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）および１１１（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５３（Ｃ_Ｌ）および１５４（Ｃ_Ｌ）；および凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）由来の残基からなる群から選択される残基において少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低い凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを提供することであり、その少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号がＩｇＧ１配列とのアラインメントに基づいたＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔの残基番号である、。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異残基は、凝集モチーフ１：１７５（Ｃ_Ｈ１）；凝集モチーフ２：２２７（ヒンジ）、２２８（ヒンジ）、および２３０（ヒンジ）；凝集モチーフ３：２３４（ヒンジ）および２３５（ヒンジ）；凝集モチーフ４：２５３（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ５：２８２（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ６：２９１（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ７：２９６（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ８：３０９（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ９：３２９（Ｃ_Ｈ２）および３３０（Ｃ_Ｈ２）；凝集モチーフ１０：３９５（Ｃ_Ｈ３）および３９８（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１１：４４３（Ｃ_Ｈ３）；凝集モチーフ１２：１１０（Ｃ_Ｌ）；凝集モチーフ１３：１５４（Ｃ_Ｌ）；および凝集モチーフ１４：２０１（Ｃ_Ｌ）由来の残基からなる群から選択される。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）ではない。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は、２３４（ヒンジ）、２３５（ヒンジ）、２５３（Ｃ_Ｈ２）、または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異残基は２５３（Ｃ_Ｈ２）または３０９（Ｃ_Ｈ２）である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する、疎水性残基に第二の凝集低下突然変異を有し、少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は異なる凝集モチーフ中に存在する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、それぞれの凝集低下突然変異が異なる凝集モチーフから選択される少なくとも１４の凝集低下突然変異を有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄの疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

したがって、本発明のさらなる目的は、２３５（ヒンジ）、２４１（Ｃ_Ｈ２）、２４３（Ｃ_Ｈ２）、２８２（Ｃ_Ｈ２）、および３０９（Ｃ_Ｈ２）からなる群から選択される残基において少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、低い凝集傾向を有する改変または単離免疫グロブリンを提供することであり、残基２３５を選択した場合それはグルタミン酸またはセリンに突然変異し、残基２８２を選択した場合それはリジンに突然変異し、残基３０９を選択した場合それはリジンに突然変異し、ここで、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集であり、残基番号がＩｇＧ１配列とのアラインメントに基づいたＩｇＧ１中の対応するＫａｂａｔの残基番号である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はセリンへの残基２４１の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンはセリンへの残基２４３の第二の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はチロシンへの残基２４１の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンはチロシンへの残基２４３の第二の凝集低下突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異はリジンへの残基２８２の突然変異であり、改変または単離免疫グロブリンは第二および第三の凝集低下突然変異をさらに含み、第二の凝集低下突然変異はリジンへの残基２３５の突然変異であり、第三の凝集低下突然変異はリジンへの残基３０９の突然変異である。特定の実施形態では、免疫グロブリンは疎水性残基に第二の凝集低下突然変異を有し、かつ少なくとも１つの凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、第二の凝集低下突然変異は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有するか、または（ｉｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向を有する残基の５Å以内に存在する第三の凝集低下突然変異を有し、この第三の凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より疎水性が低いアミノ酸残基での置換である。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第二の凝集低下突然変異を有する先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異と第二の凝集低下突然変異は異なる凝集モチーフ中に存在する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、それぞれの凝集低下突然変異が異なる凝集モチーフから選択される少なくとも１４の凝集低下突然変異を有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、チロシン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、セリン、グルタミン酸およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）を、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄの疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１を含む。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態のいずれかと組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性は、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセント、または少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

したがって、本発明の目的は、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å内にある、免疫グロブリンの保存ドメイン中の残基で、少なくとも１つの凝集低下突然変異を含む、凝集傾向の低下を有する改変および／または単離免疫グロブリンを提供することであり、前記少なくとも１つの凝集低下突然変異が、非突然変異の免疫グロブリンと比較したときに、残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低下させるアミノ酸残基での置換であり、低下する凝集傾向が、濃縮液体溶液中での免疫グロブリン分子間の凝集である。特定の実施形態では、少なくとも１つの凝集低下突然変異は、ＩｇＧ１配列とのアライメントに基づく、ＩｇＧ１中のＫａｂａｔ残基２３４（ヒンジ）または２３５（ヒンジ）に対応する残基にはない。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、（ｉ）少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有するか、または（ｉｉ）０．０を超える空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有し、かつ少なくとも０．１５の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を有する残基の５Å内にある残基に、第２凝集低下突然変異を有し、前記第２凝集低下突然変異が、非突然変異免疫グロブリンと比較したときに、残基の空間的凝集傾向（５Å半径の球）を低下させるアミノ酸残基での置換である。第２凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２凝集低下突然変異は、少なくとも５Å、少なくとも１０Å、少なくとも１５Å、または少なくとも２０Å離れている。第２凝集低下突然変異を有する先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異および第２凝集低下突然変異は、異なる凝集モチーフ中にある。任意の先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、非改変免疫グロブリン中の残基より低い疎水性であるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸残基での置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、凝集低下突然変異は、リジン残基との置換である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、空間的凝集傾向（５Å半径の球）は、グリシンが０に等しいように正規化したＢｌａｃｋＭｏｕｌｄ疎水性スケールを使用して計算する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１である。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ１ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ２ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｈ３ドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＣ_Ｌドメインを有する。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標的抗原に対する結合親和性を有し、標的抗原に対する結合親和性が、標的抗原に対する非突然変異免疫グロブリンの結合親和性の少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも１００パーセントまたは少なくとも１０５パーセントである。先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、濃縮液体溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

Claims

凝集が低減された免疫グロブリンなど。