CN100455598C

CN100455598C - 功能人源化抗人cd20抗体及其应用

Info

Publication number: CN100455598C
Application number: CNB200610160713XA
Authority: CN
Inventors: 杨蕾; 李正东; 黄佩芬
Original assignee: CHINA ANTIBODY PHARMACY Co Ltd
Current assignee: CHINA ANTIBODY PHARMACY Co Ltd
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2026-11-29
Also published as: CN1958615A

Abstract

本发明公开了一种功能人源化抗人CD20抗体及其应用。该功能人源化抗人CD20抗体，其特异于CD20，它由轻链和重链组成，所述轻链和重链分为恒定区和可变区；所述重链的恒定区为同种型人IgG₁的恒定区，和/或所述轻链的恒定区为同种型人Kappa的恒定区；所述重链的可变区的氨基酸序列是序列表中的序列2，所述轻链的可变区的氨基酸序列是序列表中的序列1。该功能人源化抗人CD20抗体具有较低的免疫原性，经实验证明具有跟其鼠源母抗体一样的特异性和亲和力。以本发明的功能人源化抗人CD20抗体及其衍生物为活性成分的药物可以在治疗患有CD20高度表达量的癌症或免疫系统疾病引起的疾病如风湿性关节炎，红斑狼疮等中得到广泛应用。

Description

功能人源化抗人CD20抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种功能人源化抗人CD20抗体及其应用。

背景技术

CD20抗原为人B-淋巴细胞特异性限制性抗原(Bcell lineage restricted antigen)，CD20分子量33kD，是由4个跨膜区和胞浆内的N-/C-端构成的非糖基化蛋白，CD20细胞密度约50,000～200,000。CD20功能不十分清楚，可能通过Ca²⁺的跨膜传导、酪氨酸激酶信号转导，调节转录因子螺旋-环-螺旋单元(helix-loop-helix)和亮氨酸拉链，促进DNA合成，调控B细胞的增殖和分化。CD20广泛表达于前B细胞和成熟B细胞、激活的B细胞，但在造血干细胞(stem cell)、T细胞、树突细胞(dendritic cells)，正常的浆细胞以及其他正常组织均无表达，而恶变的B细胞常有CD20过度表达。CD20不易于从细胞膜脱落，亦不会因与抗体结合发生细胞内化，在人体血液循环中亦无游离CD20抗原。CD20所具有的这些特性，使其成为恶性淋巴瘤和自身免疫性疾病的理想治疗靶点。

Rituximab嵌合裸抗体为历史上首个用于肿瘤治疗的单克隆抗体，FDA于1997年批准用于治疗非何杰金淋巴瘤，全球已有56个国家批准Rituximab的临床应用，超过30万病例接受治疗。Rituximab与CD20结合能引发淋巴瘤细胞溶解的免疫反应，可能的作用机制包括：抗体依赖细胞的细胞毒作用(ADCC)；补体依赖的细胞毒作用(CDC)；诱导凋亡；诱导细胞因子如IL-2及TNF的释放；作用于抗独特型网络；增加淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性(Coucxmum MS，Lopez AJ，White CA.et al.Treatment of patients with low Bcell lymphoma with the combination of chimeric anti CD20 monoclonal antibody andCHOP chemotherapy.Clin Oncol.1999；17：268-76)。Rituximab主要应用于治疗低、中度恶性NHL病例，单独应用有效率达70％，对侵袭性NHL病例，单独应用总的有效率较低，但也有明显的治疗反应。Rituximab亦可与细胞因子联合应用、与免疫毒素或放射性同位素相结合、与标准化疗及干细胞移植的多种联合治疗方案。

近年来，以CD20为靶向的B细胞清除疗法，在自身免疫性疾病的研究和应用非常引人注目，包括类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、以及干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)的临床实验相继取得重大突破。正在进行中的抗人CD20治疗风湿病临床试验还包括皮肌炎(DM)、多发性运动神经病(MMN)。也正是由于CD20靶向治疗在恶性淋巴瘤和多种自身免疫性疾病所显示出的治疗前景和商业价值，有更多的生物技术公司参与到新一代的抗CD20抗体的研发和竞争中。比如，由Genentch开发的另一个特异于CD20的人源化单抗——Ocrelizumab(PRO70769，rhuMAb 2H7)，目前进行治疗RA多中心临床II期试验；由Genmab公司开发的CD20全人化单抗-Ofatumumab(HuMax-CD20)，正在进行治疗NHL和RA临床II期试验(www.genmab.com)；由Wyeth和Trubion合作开发的针对CD20小分子免疫药物TRU-015(Small Modular Immuno-Pharmaceuticals，SMIP)，用于治疗NHL以及类风湿性关节炎；由Immunomedics公司开发的一种人源化抗CD20抗体——IMMU-106，用于治疗NHL；Seattle Genetics公司开发的CD20抗体与细胞毒性药物偶联物，细胞毒性物为长春花碱，鬼臼毒素，紫杉烷，浆果赤霉素的衍生物等。

自1975年Kohler和Milstein(Continuous Cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature.1975.256：495-497)创立了B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术以来，单克隆抗体在临床诊断，治疗和预防方面的应用价值和开发前景已获得普遍肯定。但是，真正令单克隆抗体的临床应用变成主流，也不过是最近几年的事。主要问题在于大部分的单克隆抗体都是来自小鼠的B细胞杂交瘤。这些鼠源的抗体不单会在人体内引发“抗小鼠抗体”免疫反应(Human-Anti-Mouse-Antibody(HAMA)response)，而且缺乏能引导人体自身免疫功能如补体为媒介的细胞免疫作用(Complement-Mediated Cell Cytotoxicity：CMC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxici ty：ADCC)等等。基因工程的出现，改变了抗体临床应用的疗效和可靠性。最初出现的基因改造抗体是“人-鼠嵌合抗体”，即将鼠源单抗轻，重链可变区基因VL和VH分别与人源抗体轻，重链恒定区基因CL和CH连接形成人-鼠嵌合轻链和重链基因，并在骨髓瘤细胞，昆虫细胞，中国仓鼠卵巢细胞，转基因植物，转基因动物等表达系统中获得表达。理论上，嵌合抗体带有约70％的人源结构，大大减低其免疫原性，可供重复使用，加上其引入的Fc段能引发人体自身免疫效能，可增加人体抗病，如癌症，细菌，病毒等的免疫能力。1997年，美国食物及药品管理局(Foodand Drug Administration：FDA)首次批准了治癌的嵌合抗体Rituxan，而且获得空前成功，为抗体工程药物在医药界的广泛应用奠定了历史性的一页。由于嵌合抗体仍带有约30％(VL和VH)的鼠源结构，重复使用仍有机会会慢慢引发所谓“抗嵌合抗体”免疫反应(Human-Anti-Chime ric-Antibody(HACA)response)。为此，80年代中期，Greg Winter(Cambridge University)首次引进了“互补决定区(Complementarity-DeterminingRegions(CDR))移植”，或“人源化抗体”的概念和技术，将抗体中的人源结构由嵌合抗体内小于70％增加至人源化后的大于90％。由于鼠源部分少于10％，人源化抗体的免疫原性理论上应比嵌合抗体少，更适合大量及重复使用。

人源化的技术比嵌合抗体的制造要复杂。首先，要找到一个适合的人源V段框架(Framework)作为人源化(或CDR移植)的模板。除特别说明外，这里所指的V段框架(或框架区带)是指取自单一的免疫球蛋白的FR1，FR2，FR3和FR4(根据Kabat分法)。最常用的人源化用轻链V段框架为REI，重链V段框架则为NEWM，EU，或KOL。直接移植鼠源的互补决定区(CDR)于人源的V段框架很多时会使人源化后的抗体失去原来的特异性(Specificity)和亲和力(Affinity)。在互补决定区移植的人源化技术中，有所谓供体和受体的分别。譬如，要被人源化的抗体(如鼠源抗体)因要提供CDR以作移植之用，是为供体抗体。被选作CDR移植用的人源框架区带模板抗体，则为受体抗体。为了维持人源化后的抗体原来的特异性和亲和力，除了CDR的移植外，往往要在人源的V段框架部分加插供体框架的氨基酸残基。不同的科研机构出版了一系列的准则，专利和文章等，以帮助决定寻找适合人源化用的V段框架区带，及选择对免疫亲和力有重要影响的鼠源框架氨基酸残基，以取代受体框架的相应残基(US 5,585,089；US5,693,762；US 5,693,761)。

一般而言，人源化免疫球蛋白是在一整个选定的人源V段框架区带插入至少一个非人源的免疫球蛋白CDR。当人源化的轻链和重链组合一起，最后的产品便是人源化抗体(Jones et al.，Nature，321：522-525，1986；Verhoven et al.，Science，239：1534-1536，1988)。

人源化最主要的目的是在保持原有的特异性和对抗原的亲和力的前提下，尽量减低其免疫原性。一个成功人源化的抗体应具备以下特性：

1.大大减少，最好能完全消除在人体的免疫原性，可供多次在人体重复使用。

2.保持原有的抗原的免疫活性，包括，特异性，和亲和力等(三倍以内)。

3.能引发人体的免疫效应如补体结合，以补体为媒介的细胞毒作用(CMC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等等。

如何选择适当的受体V段框架区带，及决定对免疫亲和力有重要影响的鼠源(供体)框架氨基酸残基，是一门颇为复杂的学问，包括经验，反复尝试，及须借助电脑模拟等的帮助才能完成。在已知的人源化方法里，选择适当的受体人源V段框架区带，是整段的取舍(即构成V段框架区带的FR1，FR2，FR3，FR4都取自同一V段)。此法缺乏弹性，重要的是，为保持原来的特异性和亲和力而在人源受体框架区带插入相应的鼠源供体框架氨基酸残基，很有可能会引入新的致免疫表位(Immunogenic Epitope)。所以这只能算是一个表面上，外观上的人源化抗体，在功能上却未能将免疫原性降至最低。

一般而言，引致球蛋白免疫原性来自两种致免疫表位(epitope)。所谓“T细胞致免疫表位”是短的肽链，这些肽链是当球蛋白在抗原提呈细胞(Antigen Presen ting Cell(APC))体内被分解时产生的，当这些肽链的序列结构吻合依附于主要组织相容性复合体MHC(Major Histocompatibity Complex)结合沟(Binding Groove)的条件时，便会被APC有效地递交往合适的T细胞，刺激T细胞的活性。若这些肽链依附于抗原提呈细胞(APC)表面的MHC II上，被刺激的T细胞会将讯息传递至B细胞，引发强烈的抗球蛋白的抗体反应。同样原理适用于嵌合抗体，或人源化抗体等的免疫球蛋白。详细地分析一般人源化抗体的V段结构，无可避免的均具有潜在免疫原性的鼠源CDR。这些CDR在结构与功能上将V段框架区带(Framework Region)分成四个次区带(Sub-regions)，分别为，FR1，FR2，FR3和FR4(Kabat et al.Sequences of proteins of immunological interest.Maryland：US Department of Health and Human Services，NIH，1991，USA)。由于T细胞致免疫表位是延续直线的短肽链，这些T细胞致免疫表位在每一个FR次区带的存在与否，相互之间并没有连带关系。无论这些FR次区带是来自同一个V段框架区带，或来自不同的V段框架区带，只要是人源的FR次区带，便不应引起新的或非人源的T细胞致免疫表位。而Queen的人源化方法(US5,585,089；US5,693,762；US5,693,761)为了尽量保持原有的特异性和亲和力，会在“一个选定的受体V段框架区带”引进供体框架的氨基酸残基，极有可能产生新的T细胞致免疫表位，继而引发抗人源化抗体(HAHA)的免疫反应，产生对抗由供体CDR所组成的“抗原结合位点”(Antigen-Binding Site)的抗体反应(抗独特性型抗体反应)(Anti-idiotypic response)。一般人源化的过程，在每个受体V段框架区带插入三到七个供体框架的氨基酸残基的情况非常普遍，增加了新的T细胞致免疫表位出现的可能性.

同样地，这些混杂在“受体框架区带”的供体残基，也能形成新的B细胞致免疫表位(Immunogenic B-cell Epitope)，被抗体反应所产生的抗体所确认。除少数例外，插入适当的供体框架氨基酸残基对维持原抗体的特异性和亲和力已被验证为人源化的必要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低免疫原性且能保持原来的特异性与亲和力的功能人源化抗人CD20抗体。

本发明所提供的功能人源化抗人CD20抗体，名称为SMO9，其特异于CD20，它由轻链和重链组成，所述轻链和重链分为恒定区和可变区，其中，所述重链的恒定区为同种型人IgG₁的恒定区，和/或所述轻链的恒定区为同种型人Kappa的恒定区；所述重链的可变区的氨基酸序列是序列表中的序列2，所述轻链的可变区的氨基酸序列是序列表中序列1。

序列表中的序列1由107个氨基酸残基组成，序列2由122个氨基酸残基组成。

所述功能人源化抗人CD20抗体轻链的氨基酸序列是序列表中的序列3；所述抗人CD20抗体重链的氨基酸序列是序列表中的序列4。

序列3中，自氨基端第1位至107位为可变区序列，自氨基端第108位至214位为轻链恒定区序列。

序列4中，自氨基端第1位至122位为可变区序列，自氨基端第123位至452位为重链恒定区序列。

上述功能人源化抗人CD20抗体的轻链和/或重链的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述功能人源化抗人CD20抗体轻链的编码基因序列，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列5的核苷酸序列；

2)编码序列表中序列3蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中序列5的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述抗人CD20抗体重链的编码基因序列，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列6的核苷酸序列；

2)编码序列表中序列4蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中序列6的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述抗人CD20抗体轻链的编码基因序列优选为序列表中的序列5；所述抗人CD20抗体重链的编码基因序列优选为序列表中的序列6。

序列表中序列5的编码序列是自5′端的第1-642脱氧核苷酸，序列6的编码序列是自5′端的第1-1356脱氧核苷酸。

含有抗人CD20抗体的重链编码基因和/或轻链编码基因的转基因细胞系、工程菌或表达载体也属于本发明的保护范围。

抗人CD20抗体SMO9的衍生物如SMO9片段(Fab，Fab’，F(ab’)₂，等)、单链抗体(scFv，diabodies)、双特异性抗体、抗体/抗体片段-因子(如，抗体/抗体片段-白细胞介素，抗体/抗体片段-干扰素，抗体/抗体片段-毒素)融合蛋白、抗体/抗体片段-化学偶联物(如，抗体/抗体片段-化学毒药，抗体/抗体片段-放射核素)等也属于本发明的保护范围。

所述化学毒药为阿霉素(doxorubicin)，irinotecan，顺式铂氨(cisplatin)，等；所述放射核素为I¹²⁵，I¹³¹，Y⁹⁰，In¹¹¹，Re¹⁸⁸等。

本发明采用“功能人源化”方法所制造的功能人源化抗人CD20抗体SMO9，是除CDR外，不含有任何鼠源的功能人源化免疫球蛋白。SMO9既消除了抗体的免疫原性，同时又保持了原来的特异性与亲和力，维持原有对抗原的亲和力在三倍以内，同时又降低引入新的T或B细胞致免疫表位的可能。本发明采用的“功能人源化”方法不但简单，多变化，极富弹性，而且通常不用复杂的电脑模拟分析去帮助决定受体V段框架及供体残基的选择。

本发明的另一个目的是提供一种治疗与CD20表达有关疾病的药物。

本发明所提供的治疗与CD20表达有关疾病的药物，它的活性成分是上述功能人源化抗体抗人CD20抗体或其衍生物。

所述与CD20表达有关的疾病可为NHL，类风湿关节炎，红斑狼疮或任何与B细胞免疫系统失调有关的疾病。

本发明的治疗与CD20表达有关疾病的药物可与抗人CD19抗体，抗人CD22抗体或其他抗B细胞抗体共同使用而发挥致协同效应。

本发明提供的药物为功能人源化抗体SMO9的裸抗体，也可以是功能人源化抗体SMO9的抗体偶联物，可以注射的方式用于人体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为100-400mg/m²(注射)，疗程为四至八星期，每星期用药一次。

由于功能人源化抗体SMO9的靶点为人CD20，跟Rituximab一样，也是人IgG1/kappa同种型，而且其鼠源母抗体已广泛地以免疫毒素的形式进行临床前及临床测试，证明了它只特异地与成熟B细胞或B癌细胞结合。以裸抗体，或与偶联物(如放射核素，毒素等)结合的方式应用于NHL患者身上，是安全有效的治疗方法。

功能人源化抗体SMO9除了可以用裸抗体的形式作为治疗NHL的药物，SMO9及其衍生物还可用于治疗不同的与CD20表达有关疾病(如，NHL，类风湿关节炎，红斑狼疮，及其它的自身免疫病等)。

本发明的发明人根据其鼠源母抗体可变区内的序列，用基因合成的方法，将功能人源化后的VL与VH的DNA序列连接到各自相应的人源轻链(CK)与重链(IgG₁)恒定区。带有功能人源化抗体SMO9的轻链(VK-CK)和重链(VH-CH₁-hinge-CH₂-CH₃)的载体通过电穿孔法(electroporation)转染到SP2/0骨髓瘤细胞(myeloma cell line)及表达后，分离出的功能人源化抗体有超过95％的氨基酸序列是人源的IgG₁/k同种型(isotype)；鼠源序列少于5％。类似的IgG₁/k同种型抗体，如利妥昔(rituximab)(IDEC/Genentech，CA，USA)，Reopro(Centocor，PA，USA)，Remicade(Centocor，PA，USA)，Simulect(Novartis，NJ，USA)等，均为嵌合抗体，虽带有30％鼠源序列，已被广泛应用，并证实了疗效及可接受的安全性或副作用。功能人源化抗体SMO9应比嵌合抗体或传统的人源化抗体(因需要插入鼠源供体框架氨基酸残基)的免疫原性更低，所以应更为安全有效。其中的IgG₁人源Fc段，亦会加强抗体引发的免疫疗效。纯化后的功能人源化抗体SMO9经实验证明具有跟其鼠源母抗体一样的特异性和亲和力。

带有人源恒定区的功能人源化抗体SMO9具有生物效应活性如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，或补体介导的细胞毒作用(CMC)等。

本发明所指的抗体可以单独用于以抗体为基础的治疗，也可以与其它治疗模式合用。例如，免疫球蛋白可用于被动免疫，清除不需要的细胞或抗原，如通过补充调节溶胞作用，所有这些都没有与许多前抗体有关的物质副免疫反应(如过敏性休克)。

功能人源化单克隆抗体SMO9可识别CD20抗原并与其作特异性之结合。功能人源化单克隆抗体SMO9与B细胞有特异性的结合，因而提供了一个对B细胞NHL，风湿性关节炎(RA)，红斑狼疮(SLE)等有医疗潜力的工具/手段。

附图说明

图1A为功能人源化抗体SMO9的VK的DNA序列

图1B为功能人源化抗体SMO9的VH的DNA序列

图2A为SMO9的VK阶段载体的物理图谱

图2B为SMO9的VH阶段载体的物理图谱

图3A为SMO9的轻链表达载体的物理图谱

图3B为SMO9的重链表达载体的物理图谱

图4为典型的3公升Celligen生物反应器生产数据图表

图5为表达并纯化后的抗体的SDS-PAGE分析

图6为功能人源化抗体SMO9的流式细胞术(flow cytometry)分析

图7为功能人源化抗体SMO9与鼠源抗体的竞争抑制流式细胞术分析

图8为功能人源化抗体SMO9对淋巴瘤细胞所诱发的细胞杀伤作用

图9A为SMO9的鼠源母抗体1F5的轻链可变区的DNA序列

图9B为SMO9的鼠源母抗体1F5的重链可变区的DNA序列

具体实施方式

下面以一个抗体单链的V段为例，说明本发明所采用的功能人源化方法：“功能人源化”一个鼠源，或来自其他动物的所谓“母抗体”，应先将母抗体的V段氨基酸序例依据Kabat(Kabat et al.Sequences of proteins of immunological interest.Maryland：US Department of Health and Human Services，NIH，1991，USA)的方法细分成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4等七个次区带。FR1，FR2，FR3及FR4组成一个结构上基本不变的框架，支撑着由CDR1，CDR2及CDR3等多变区序列所组成的三维(3-D)抗原结合位点。因母抗体(供体)的CDR1，CDR2及CDR3直接影响其特异性及亲和力，其氨基酸序列基本上不能改变。但框架的FR次区带，却可个别处理。做法是将每个母抗体FR的次区带，分别与人源抗体相应的FR次区带序列排列比较。人源抗体氨基酸的序列可在不同公开或私有的资料库找到(例如：Kabat Database；the National Biomedical ResearchFoundation Protein identification Resource).母抗体其中每一个V段里的框架区带，都可与来自单一，或多个不同人源抗体V段相应的FR次区带相互替代。尽可能的话，最好能找到与母抗体FR次区带氨基酸序列相似度最高(60％或以上)的相应人源FR次区带，取而代之。实验证明，与CDR最接近的FR次区带氨基酸残基很有可能会与抗原或由CDRs组成的三维抗原结合位点有直接或间接的接触，从而影响到抗体的特异性和亲和力(Amitet al.，Science，233：747-753，1986)。所以在这些FR次区带内的重要局部序列的相似度(通常是最接近CDR的三到五个氨基酸残基)比FR次区带的整体相似度更为重要。可以的话，最好选择在某些框架位置上，已知在三维结构内跟CDR’s或抗原结合位点很接近，或有直接交互接触的框架氨基酸残基，跟母框架在相应位置有着相同或保守性相似残基的人源FR次区带作重塑之用。这些框架残基的位置，可以透过电脑模拟(computermodeling)，晶体结构(crystal structure)，其他已出版了的文章，及经验等方法找到(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901，1987；Chothia et al.，Nature 342：877，1989，Tramontano et al.，J.Mol.Biol.215：175，1990，Levy et al.，Biochemistry28：7168，1989；Bruccoleri et al.，Nature 335：564，1988；Chothia et al.，Science233：755，1986)。

本发明所提供的功能人源化抗人CD20抗体SMO9，其特异于CD20，它由轻链和重链组成，所述轻链和重链分为恒定区和可变区，所述重链的恒定区为同种型人IgG₁的恒定区，和/或所述轻链的恒定区为同种型人Kappa的恒定区；所述重链和轻链的可变区从氨基末端至羧基末端为依次串联的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，所述重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列均来自于鼠源免疫球蛋白的相应CDR次区带，所述重链和轻链的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列均来自于人源免疫球蛋白的相应FR次区带；所述FR次区带为FR1、FR2、FR3和FR4，所述CDR次区带为CDR1、CDR2和CDR3。

所述重链和轻链的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可各来自于相同的或不同的人源免疫球蛋白，也可各来自相同的或不同的人源免疫球蛋白的人源免疫球蛋白亚群(subgroup)，如subgroup I，II，III等，还可各来源自相同或不同的人源免疫球蛋白同种型(isotype)，如轻链kappa和lamda。

为了保证本发明功能人源化抗人CD20抗体的亲和力，被选择用以取代母免疫球蛋白FR次区带的相应人FR次区带，应尽量跟母FR次区带的氨基酸残基序列接近。选择条件必须考虑：

a、FR次区带的氨基酸残基序列相似度(sequence homology)：相似度于60％以上为佳；

b、跟母抗体任何一个CDR次区带最接近的三个相应FR次区带氨基酸残基相似度：相似度于60％以上为佳；

c、跟已知或可能与CDR次区带或抗原结合位点接近，甚至有接触的FR次区带氨基酸残基：在相应的位置上，有着不少于60％相同的氨基酸残基为佳。

根据上述原则，SMO9轻链的可变区的FR具体如下：FR1为人源BJ19的FR1，FR2为人源MOT的FR2，FR3为人源WES的FR3，和FR4人源NIG-58的FR4

SMO9重链的可变区的FR具体如下：FR1为人源LS2’CL的FR1，FR2为人源NEWM的FR2，FR3为人源783C’CL的FR3，和FR4为人源4G12’CL的FR4。

众所周知，重链和轻链有着不同的恒定区域种型(重链如IgG，IgM，IgD，IgA等等，轻链如kappa及lambda)。一个特殊的同种型将具有特殊的效应子特征/功能(effectorfunctions)，该特征/功能可被选择用于不同的目的。人类恒定区域DNA序列可以按常规方法从多种人类细胞中提取，但选用可组培繁殖的B细胞较好(Kabat op.cit.andWP87/02671)。同理，用作功能人源化的母抗体CDR也可用类似方法从单克隆抗体中提取。这些抗体能够结合到预定的抗原上，如与癌细胞有关的抗原。一般来说，这些抗体都能从常用的哺乳动物身上用常规方法获得，如小鼠，大鼠，兔子或其他能够产生抗体的脊椎动物。适合提取不同的恒定区，框架段DNA，或其分泌物等的资源细胞，可从许多途径获取，如美国标准培养中心(the American Type Culture Collection)(“Catalogue of CellLines and Hybridomas”，sixth edition，1988，Rockville，MD，USA)。

含有编码功能人源化免疫球蛋白DNA序列的表达载体，可以游离基因(episomes)或完整地连接在宿主染色体DNA的形式，在宿主生物细胞内复制。免疫球蛋白链可操作地连接在一个含有启动子和增强子的表达调控序列上。表达载体可放入标记物基因，如四环素(tetracycline)，新霉素(neomycine)，β-内酰胺霉(beta-lactamase)等以便检测含有DNA载体成功转化的细胞(US Pat.No.4,704,362)。

细菌宿主适宜于DNA载体的繁殖，也适宜于并入的免疫球蛋白DNA的表达。例如，大肠杆菌是最常用的克隆本发明DNA序列的原核宿主。用于同样目的的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草芽孢杆菌)和其他肠道细菌(如沙门氏菌，Serratia)，以及许多假单孢杆菌属的种。在这些宿主中表达克隆序列需要宿主细胞与表达调控序列相亲和(如一个复制起始点)，而且功能启动子应包括在DNA载体上。众所周知的启动子系列实例包括，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，λ类噬菌体启动子系统等，但并不仅限于这些。这些启动子负责调控启动子系统功能基因序列下游的表达或转录，除了所有必须的基元外，还包括可选择的一个操作程序，核糖体结合序列，及其它一些转录起始和翻译必须的序列。

同样，其它的微生物如酵母也被用于表达。例如，酿酒酵母就是一个优选的宿主，它适宜于含有恰当表达调控因子的表达载体，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，一个复制起始点，终止序列，和其它一些期望的类似组分。

无脊椎动物起源的真核细胞也可以利用。如昆虫细胞、hi-5、SF9、SF21。含有方便克隆位点，启动子，终止序列等的适宜的表达载体对于在可商业化购买到的宿主细胞中高效表达是非常重要的(Invitrogen，San Diego，CA)。

应当优选的是用哺乳动物的组织培养细胞来表达和生产本发明的多肽(Winnack er，“From Genes to Clones，”VCH Publisher，NY，NY，1987)。最常用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary(CHO))细胞系，多种COS细胞系，HeLa细胞系，骨髓细胞系如SP2/0细胞系，NS0细胞系，YB2/0细胞系等，以及转化的B-细胞或杂交瘤细胞。这些细胞系能够在恰当的位点进行正确的糖基化，如在重链CH2功能区的297氨基酸位点，而且能够分泌全长的免疫球蛋白，这些对于本发明的免疫球蛋白是必须的。和其它宿主细胞的表达载体相似，一个真核细胞的表达载体应包括恰当的表达调控序列，其中包括启动子(如那些从免疫球蛋白基因获得的基因，金属硫蛋白基因，SV40，腺病毒，巨细胞病毒，牛乳头瘤病毒等)，增强子(常常具有一个前导序列来引导表达的多肽到高尔基体并输出)，DNA有意义片段(如重链和轻链上的编码和表达调控序列)，一个终止密码子，以及其他一些加工信息位点(如核糖体结合位点，RNA剪接位点，一个聚腺苷酸化序列，和转录终止序列)，以及一个选择标记物(如突变体Dhfr，谷氨酰胺合成酶(GS)，潮霉素，新霉素)(“Gene Amplifica tion in mammalian cells”，Marcel Dekker Inc.，NY，NY，1993)。

对于引导含有DNA有意义片段的载体进入宿主细胞，暂时的或稳定地并入宿主细胞基因组，已有建立了一个多血症方法和许多众所周知的方法。这些方法包括氯化钙转染法，磷酸钙处理法，电穿孔法，脂质转染法等(Maniatis et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1982)，但并不仅限于这些。恰当的表达载体是否并入宿主细胞将在选择压力下通过载体上的选择标记在第一批生长细胞上得以证实。检测分泌的蛋白质，如含有两对重链和轻链的整个抗体，或本发明的其他免疫球蛋白形式，则通过标准的程序如ELISA和蛋白质印迹法(Western)进行。表达蛋白质的纯化可根据完善标准的程序进行，包括硫酸氨沉淀法，亲和柱法，柱层析法，电泳法等(R.Scopes，“Protein Purification”，Springer-Verlag，NY，1982)。对于用药来说，90-95％物质均一纯度的免疫球蛋白较好，98-99％或更高物质均一纯度的免疫球蛋白更好。一旦纯化，部分达到或达到期望的均一度，多肽就可用于治疗(包括体外)或用于研发和生产分析过程，免疫荧光染色等(Immuno logical Methods Vols I and II，Lefkovits and Pernis，eds.，Academic Press，New York，NY，1979 and 1981)。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、设计功能人源化抗体SMO9的轻链可变区与重链可变区的氨基酸序列及DNA序列

1、克隆功能人源化抗体SMO9的鼠源母抗体1F5的轻链可变区与重链可变区的DNA序列

抗体1F5为一抗CD20的鼠源抗体(Nadler LM，Ritz J，Hardy R，et al.1981.Aunique cell surface antigen identifying lymphoid malignancies of B cell origin.J.Clin.Invest.67：134；Clark EA，Shu G，Ledbetter JA：Role of the Bp35 cell surfacepolypeptide in human B-cell activation.PNAS USA 82：1766，1985；Press OW，Howell-Clark J，Anderson S，Bernstein I：Retention of B-cell-specific monoclonalantibodies by human lymphoma cells.Blood 83：1390，1994)。

分泌鼠1F5抗体的杂交瘤可在美国American Type Culture Collection(ATCC)买到。利用Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen，San Diego，CA)，从3×10⁷杂交瘤细胞分离出PolyA⁺RNA，再用cDNA cycle kit(Invitrogen)提取cDNA。简单的说，1微克的polyA⁺RNA配合一个特异鼠免疫球蛋白重链IgG的CH1部分的引物CH1B(5’-ACA GTCACT GAG CTG G-3’)，或是一个特异鼠免疫球蛋白轻链Ck部分的引物Ck3BH1(5’-GCCGGA TCC TCA CTG GAT GGT GGG AAG ATG GAT ACA-3’)用逆转录酶(Reverse Transcriptase)将相关的轻重链第一链(first-stranded)cDNA提取出来，然后再用常规RACE加PCR的方法分别以polyG oligos+Ck3BH1或polyG oligos+CH1B将相关的轻重链双链(double-stranded)cDNA扩增提取出来。扩增后的VH和VK DNA片段按照常规方法被克隆到TA Cloning Vector(Invitrogen)载体内。克隆后的DNA片段用Sanger的方法去解码VK与VH的DNA序列，克隆后的1F5的轻链可变区(VK)与重链可变区(VH)的DNA序列如图9A和图9B所示，框架内的序列为CDR的DNA序列。

2、人源框架次区带以作1F5抗体轻链(VK)框架置换的选择

下面的序列是解码后的鼠源1F5的VK氨基酸序列，框框内的氨基酸为互补决定区(CDR)序列。

Q I V L S Q S P A I L S A S P G E K V T M T C

W Y Q Q K P G S S P K P W I Y

GV P A R F S G S G S G T S Y S L T I S R V E A E D A A T Y FC

F G A G T K L E L K R

按照Kabat区分法将序列细分为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4等七个次区带。每个FR次区带的选择，都会根据Kabat的资料库(Kabat et al.，op.cit)将鼠源VK的FR次区带序列与相应人源的FR次区带比较，如下面的序列所示，是鼠源1F5轻链VK段内的FR次区带序列跟相应但不同的人源FR次区带序列(斜体)的比较，框框内为决定互补区序列。

a.FR1：人源BJ19的FR1段跟鼠源FR1的次区带氨基酸序列相似度最高，虽然其最接近CDR1的第三个，第六个及第七个氨基酸跟相应的母氨基酸序列相异，但M与I(第三)，K与R(第六)，及E与D(第七)为保守性相似的氨基酸。符合可选择的框架要求，因此，BJ19的FR1会用来重塑鼠源1F5 FR1；

b.FR2：同理，人源MOT的FR2序列跟鼠源1F5的FR2序列最相似。重要的是，超过四个最接近CDR1的氨基酸是跟鼠源抗体相应部位的序列相同的。唯一不符合要求的是距离CDR2第三个氨基酸并不相同，也非保守性相似。由于W与V皆为不带电的氨基酸，MOT的FR2还是被用作重塑之用；

c.FR3：人源WES的FR3段选为重塑鼠源FR3之用。FR3次区带是众框架次区带中最长的一段。WES的FR3除了跟鼠源1F5轻链FR3序列相似度高外，其处于CDR2和CDR3两旁最少三个氨基酸的序列是相同的；

d.FR4：同理，人源NIG-58的FR4段选为重塑鼠源FR4之用。

下面的序列展示了根据以上所述的方法设计出的1F5功能人源化VK段的最后序列。它包含了人源BJ19的FR1，人源MOT的FR2，人源WES的FR3，和人源NIG-58的FR4，把原来鼠源1F5的VK段的相应FR次区带替换掉。这里面并没有插入任何鼠源的框架残基。框框内为互补决定区序列。粗体残基展示人源FR次区带与相应鼠源母FR次区带间不同的氨基酸。

2、人源框架次区带以作1F5抗体重链(VH)框架置换的选择：

下面的序列是鼠源1F5的VH氨基酸序列。框框内的氨基酸为决定互补区序列。

按照Kabat的方法细分为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。如下面的序列所示，是鼠源1F5重链VH段内的FR次区带序列跟相应但不同的人源FR次区带序列(斜体)的比较，框框内为决定互补区序列。每个FR次区带的选择，都会基于上述的原理，根据Kabat的资料库(Kabat et al.，op.cit)将鼠源VH的FR次区带序列与相应人源的FR次区带比较。

a.FR1：人源LS2’CL的FR1序列跟鼠源1F5之VH的FR1序列非常接近。它们最近CDR1的10个残基序列都是相同的。所以选择了LS2’CL的FR1作重塑之用；

b.FR2：同理，跟据FR2序列的相似度，及最接近CD1第三个氨基酸虽不同于K但为保守性相似的R，所以人NEWM的FR2会被用作重塑之用；

c.FR3：783C’CL及58’CL与鼠源1F5之VH的FR1序列最为接近。选择783C’CL的FR3作为重塑之用是由于其最接近CDR3七个氨基酸与鼠源序列完全相同。而与CDR2相邻的残基序列皆为相同或保守性相似的氨基酸，如K和R(第一)，A和V(第二)及L和I(第四)；

d.FR4：人4G12’CL的FR4段序列与鼠1F5的FR4段序列几乎完全相同，因此被选为重塑鼠源FR4之用。

下面的序列展示了根据以上所述的方法设计出的1F5功能人源化VH段的最后序列。它包含了人源LS2’CL的FR1，人源NEWM的FR2，人源783C’CL的FR3，和人源4G12’CL的FR4，把原来鼠源1F5之VH段的相应FR次区带替换掉。这里面并没有插入任何鼠源的框架残基。框框内为互补决定区序列。粗体残基展示人源FR次区带与相应鼠源母FR次区带间不同的氨基酸。

有两点值得注意。一是框架的配搭可源自不同的序列种类。如不同的亚群(subgroup)，例如重链的FR1与FR3为subgroupI，FR2为subgroupII，FR4为subgroupIII，或不同的亚类/同种型(subclass/isotype)，例如轻链中的lambda(FR2，FR4)和kappa(FR1，FR3)；二是用以重塑的人FR次区带为100％人源序列，并没有渗杂鼠源框架序列或残基。

3、功能人源化VK基因的合成：

功能人源化VK氨基酸序列按哺乳动物细胞常用的密码子被转化成如图1A所示的DNA序列。图1A中，与原来鼠源母抗体1F5不同的DNA序列以粗体表示，下划线示限制酶切点序列。整段的DNA序列被分为N端与C端两部分(N-terminal half and C-terminalhalf)。N端与C端两部分可通过BspEI限制切点连成完整的VK基因序列。

N端部分的合成如下：

化学合成的N端有义链寡核苷酸(N-terminal sense-strand oligonucleotide)含有129个碱基，编码第9至51的VK氨基酸[5’TCA AGT CTT TCT GCA TCT GTG GGG GAC AGAGTC ACA ATT ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT TTA AGT TTC ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAGCCA GGA CAG GCT CCC GTC CCC GTA ATT TAT GCC ACA TCC 3’]作为聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction：PCR)的模板。

用以PCR的5’引物[5’GAT ATT CAG CTG ACA CAG TCT CCA TCA AGT CTT TCT GCA TCTGTG 3’]和3’引物[5’GGA CTC CGG AAG CCA GGT TGG ATG TGG CAT AAA TTA CGG G 3’]寡核苷酸以N端有义链寡核苷酸为模板，用基本PCR方法扩增整段N端双链。

同理，整段C端双链用化学合成的C端有义链寡核苷酸(编码第61至100的VK氨基)[5’TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC GAG TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGT TTG CAGCCT GAA GAT TTC GCC ACT TAT TTC TGC CAT CAG TGG AGT AGT AAC CCG CTC ACG TTC GGTGCT GGG 3’]为模板，配合相应的5’引物[5’GGC TTC CGG AGT CCC TAG TCG CTT CAGTGG CAG TGG GTC TGG G 3’]和3’引物[5’CCG TTT GAT CAC CAG CTT GGT CCC AGC ACCGAA CGT GAG CGG 3’]，用基本的PCR方法扩增。

PCR扩增后的N端与C端双链通过BspEI限制切点连成SMO9的完整的VK基因序列(图1A)。

4、功能人源化VH基因的合成：

功能人源化VH氨基酸序列按哺乳动物细胞常用的密码子被转化成如图1B所示的DNA序列。图1B中，与原来鼠源母抗体1F5不同的DNA序列以粗体表示，下划线示限制酶切点序列。整段的DNA序列被分为N端与C端两部分(N-terminal half and C-terminalhalf).N端与C端两部分通过SpeI限制切点连成完整的VH基因序列。

N端部分的合成如下：

整段N端双链用化学合成的N端有义链寡核苷酸(N-terminal sense-strandoligonucleotide)含有114个碱基，编码第12至44的VH氨基酸[5’AAT AAG CCT GGGGCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACA TTT ACC AGT TACAAT ATG CAC TGG GTA CGG CAG CCT CCT GGA AGG GGC CTG GAA TGG ATT GGA3’]作为模板，配合相应的5’引物[5’GTG CAA CTG CAG GCT TCC GGG GCT GAGGTA AAT AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 3’]和3’引物[5’TGT AAC TAG TATCAC CAT TTC CTG GAT AAA TAG CTC CAA TCC ATT CCA GGC CCC T 3’]，用基本的PCR方法扩增。

同理，整段C端双链以化学合成的C端有义链寡核苷酸(编码第70至111的VH氨基)[5’ATC ACT GCA GAC AAA TCC ACT AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC AGCAGT CTG AGG TCT GAG GAC ACT GCG GTC TAT TAC TGT GCA AGA TCG CAC TACGGT AGT AAC TAC GTA GAC TAC TTT GAC TAC 3’]为模板，配合相应的5’引物[5’TGA TAC TAG TTA CAA TCA GAA ATT CAA GGG CAG GGT CAC AAT CAC TGCAGA CAA ATC CAC T 3’]和3’引物[5’GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCCCCA GTA GTC AAA GTA GTC TAC GTA 3’]，用基本的PCR方法扩增。

PCR扩增后的N端与C端双链通过SpeI限制切点连成SMO9的完整的VH基因序列(图1B)。

实施例2、功能人源化抗体SMO9的表达

1、VK与VH阶段载体(Staging Vector)的构建

要表达功能人源化抗体SMO9，SMO9编码的VK和VH段DNA必先插入到植有人类轻链和重链区域编码DNA的表达载体中。为此，先将VK或VH段DNA插入适当的阶段载体。合成后的阶段载体在VK或VH段DNA的上游接上一个IgG的表达启动子(Promoter)，及一段信号肽(Signal Peptide)序列。

VK阶段载体改良自M13VKPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS 86：3833-3837)。将M13VKPCR1中载有IgG表达启动子(Promoter)序列和一段信号肽(Signal Peptide)序列的BamHI/HindIII段克隆到pBR322(ΔPvuII)载体的BamHI和HindIII位点间。pBR322(ΔPvuII)原为一pBR322载体(Strategene，La Jolla，CA，USA)，用限制酶Acc1/Bal1把pBR322载体中唯一的PvuII酶切点删除后，便成pBR322(ΔPvuII)载体。含有M13VKPCR1中的BamH1/HindIII段的pBR322(ΔPvuII)为VK阶段载体(VKpSTAGE)，其结构示意图如图2A所示。功能人源化抗体SMO9的VK段连接到相应的表达启动子/信号肽序列上是通过以下步骤完成的：(1)以功能人源化抗体SMO9的VK DNA序列为模板(图1A)，以(5’-GA

ATC CAG CTG ACA CAG TCT CCA TCA-3′)及(5′-TTG ATG AGG ATC CAACTG AGG AAG CAA AGT TTA AAT TCT ACT CAC GTA GGA CCG TCA GCT TGG TCCCAG CAC CGA-3′)为引物，通过标准的PCR方法，引入了一个PvuII和一个BamHI限制酶切点，得到功能人源化抗体SMO9的VK基因PCR产物，(2)用PvuII/BamHI酶切步骤(1)的功能人源化抗体SMO9的VK基因的PCR产物，(3)将PvuII/BamHI酶切过的功能人源化抗体SMO9的VK基因的PCR产物克隆到VKpSTAGE相应的位置上，得到含有SMO9的VK基因的重组阶段载体VKpSTAGE-SMO9。经过Sanger的方法证明克隆到VKpSTAGE的功能人源化抗体SMO9的VK基因的PCR产物序列跟原来设计的一样，SMO9的VK基因的PCR产物序列如图1A所示，图中，粗体碱基表示与原来鼠源母抗体1F5不同的DNA序列，划线的碱基为酶切位点。表达后的功能人源化抗体SMO9的VK氨基酸序列与实施例1设计的功能人源化VK氨基酸序列完全相同，其氨基酸序列如序列表中的序列1。

VH阶段载体改良自M13VHPCR1(Orlandi et al.1989.PNAS 86：3833-3837)。将M13VHPCR1中载有IgG表达启动子(Promoter)序列和一段信号肽(Signal Peptide)序列的BamHI/HindIII段克隆到pBS载体(Stratagene)的BamHI和HindIII位点间内，得到VH阶段载体(VHpSTAGE)，其结构示意图如图2B所示。功能人源化抗体SMO9的VH段连接到相应的表达启动子/信号肽序列上是通过以下步骤完成的：(1)以功能人源化抗体SMO9的VH DNA序列为模板(图1B)，以(5’-CAG GTC CAA CTG CAG GCT TCC GGGGCT GAG-3′)及(5′-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA-3′)为引物，通过标准的PCR方法，引入了一个PstI和一个BstEII限制切点，(2)用PstI/BstEII酶切功能人源化抗体SMO9的VH基因的PCR产物，(3)将PstI/BstEII酶切过的功能人源化抗体SMO9的VH基因的PCR产物克隆到VHpSTAGE相应的位置上，得到含有SMO9的VH基因的重组阶段载体VHpSTAGE-SMO9。经过Sanger的方法证明克隆到VHpSTAGE的功能人源化抗体SMO9的VH基因的PCR产物序列跟原来设计的一样，SMO9的VH基因的PCR产物序列如图1B所示。为了迁就VH序列克隆到VHpSTAGE阶段载体，表达后的功能人源化抗体的VH段中的N-端及C-端的氨基酸序列与实施例1设计的VH段有些微差异，表达后的功能人源化抗体的VH段的氨基酸序列是序列2，其中，自序列2的氨基末端第5位变成Gln。

2、功能人源化抗体SMO9表达载体的构建

该构建功能人源化抗体SMO9表达载体的方法是将SMO9的轻链及重链可变区的DNA序列连接到各自相应的人源轻链与重链表达载体的恒定区，得到功能人源化抗体SMO9的轻链和重链表达载体。具体的说，它包括以下步骤：

(1)克隆SMO9的VK与VH的DNA序列；

(2)将克隆后的SMO9的VK与VH的DNA序列插入阶段载体；

(3)将阶段载体中的VK与VH的DNA序列分别插入各自相应的人源轻链(CK)与重链(IgG₁)表达载体的恒定定区，得到SMO9的轻链和重链表达载体。

功能人源化抗体SMO9的轻链表达载体pEkappa是一个约10kb的表达载体。它源自于载体pSVgpt(Mulligan & Berg 1981.PNAS 78：2072-2076)，包含了一个上游的IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VK段的HindIII/BamH1克隆位点，和连着内含子(intron)的人Kappa轻链恒定区的基因序列(genomic sequence)。在轻链恒定区基因序列的下游，放置了一个用SV40启动子表达的hygromycin选择标记(selection marker)。

pEkappa的构建方法如下：将pSVgpt的gpt选择标记替换为hygromycin选择标记，得到重组载体pSVhyg。在pSVhyg的EcoRI和HindIII识别位点间插入319bp的Ig增强子，得到重组载体pSVhyg-Ig。在pSVhyg-Ig的BamHI和SacI识别位点间插入199pb的kappa增强子，得到重组载体pSVhyg-Ig-kappa。在pSVhyg-Ig-kappa的限制性内切酶SacI和BamHI识别位点间插入1.2kb的连着内含子(intron)的人Kappa轻链恒定区片段，得到pEkappa。

其中，319bp的Ig增强子的核苷酸序列是自GenBank Accession Number：K01901的5′末端的第1至319脱氧核苷酸。

199pb的kappa增强子核苷酸序列是自GenBank Accession Number：K01325的5′末端的第1至199脱氧核苷酸。

1.2kb的连着内含子(intron)的人Kappa轻链恒定区片段的核苷酸序列是自GenBankAccession Number：J00241的5′末端的第1至1209位脱氧核苷酸。

从VKpSTAGE-SMO9用HindIII/BamH1限制性内切核酸酶把IgG启动子/信号肽/SMO9VK序列提取出来，再插入pEkappa的HindIII和BamHI识别位点间，便成为含有序列3的氨基酸残基序列的SMO9轻链编码基因(序列5)的轻链表达载体(pEkappa-SMO9)(如图3A)。

重链表达载体pEgamma1是一个约10kb的表达载体。它源自于载体pSVgpt(Mulligan&Berg 1981.PNAS 78：2072-2076)，包含了一个上游的IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VH段的HindIII/BamH1克隆位点，和连着内含子(intron)的人IgG1重链恒定区的基因序列(genomic sequence)。在重链恒定区基因序列的下游，插入了一个用SV40启动子表达的gpt选择标记(selection marker)。

pEgamma1的构建方法如下：在载体pSVgpt的EcoRI和HindIII识别位点间插入319bp的Ig增强子，得到重组载体pSVgpt-Ig。在pSVgpt-Ig的限制性内切酶BamHI和BglII识别位点间插入2kb的连着内含子(intron)的人IgG1重链恒定区片段，得到pEgamma1。

2kb的连着内含子(intron)的人IgG1重链恒定区片段的核苷酸序列是自GenBankAccession Number：J00228的5′末端的第1至2009位脱氧核苷酸。

从VHpSTAGE-SMO9用HindIII/BamHI限制性内切核酸酶把IgG启动子/信号肽/SMO9VH序列提取出来，再插入pEgamma1的HindIII和BamHI识别位点间，便成为含有序列4的氨基酸残基序列的SMO9重链编码基因(序列6)的表达载体(pEgamma1-SMO9)(如图3B)。

3、功能人源化抗体SMO9表达细胞的制备及其生产

10微克被BstXI限制性内切核酸酶线化(linearized)的pEkappa-SMO9，加上30微克被PvuI限制性内切核酸酶线化的pEgamma1-SMO9，用电穿孔法(electroporation)去转染5×10⁶个小鼠骨髓瘤SP2/0细胞。转染后的细胞，在正常培养液(Hybridoma-SFM；Invitrogen，San Diego，CA)中经过两天的复原期，便开始在培养液中加上0.5g/L的hygromycin(Calbiochem，San Diego，CA)。受转染而存活的细胞株于2-3星期后出现。存活的细胞株被分别培养，扩大后，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(以羊抗人F(ab)₂抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)包板；HRP-羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.)为二抗)检测培养液中的人免疫球蛋白的浓度。呈阳性结果而浓度最高的三株克隆细胞被扩增，储存。被选择的三株克隆细胞，分别作500毫升的分批培养(batch culture)，培养上清用Protein A层析柱将抗体提纯。

选择最高生产量，最稳定，生长速率最快的SMO9生产细胞株用作生物反应器的生产。采用New Brunswick Scientific的三升(3L)Celligen发酵罐。2×10⁹个的SMO9生产细胞接入发酵罐作为种子培养(seed culture)。发酵培养基为无血清培养基(Hybridoma-SFM；Invitrogen，San Diego，CA)，细胞保持在37℃和含氧量60％。严密检测细胞生长情况，如氧气消耗量，pH值，葡萄糖消耗量，抗体浓度等。当培养液里的葡萄糖含量低于1克/升，新鲜的培养液便以灌流的方式输入发酵罐，等量的旧培养液亦以灌流的方式同时输出。由于Celligen发酵罐是利用纤维小薄片(fiber disc)去锁住细胞，细胞不会随灌流输出的旧培养液大量流失。灌流率的快慢视培养液里的葡萄糖含量而定。目标是要保持培养液里的葡萄糖含量在1克/升。培养好的培养液以Protein A层析柱的方法提纯。图4表示一个标准发酵的抗体生产量(图4中纵坐标的单位是每日罐流出的抗体量，以毫克为单位)，结果表明发酵培养13天，抗体的产量最高为每天200mg。提纯后的抗体用还原SDS-PAGE电泳法质控，电泳结果如图5所示，图中，泳道1为重量标记，泳道2为人免疫球蛋白标准对照(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)，泳道3为SMO9试产第一批，泳道4为SMO9试产第二批，从图中可以看出，抗体的纯度很高。

实施例3、用流式细胞仪(flow cytometry)分析SMO9

为检测SMO9是否仍保持其特异性(specificity)和亲和力(affinity)，将纯化后的SMO9和鼠源母抗体1F5用流式细胞术分析，测试其与Raji人淋巴瘤细胞的特异结合能力。具体方法如下：人何杰金淋巴瘤Raji细胞(5×10⁵个)先与0.1ug、0.01ug或0.001ug的SMO9或1F5混于100ul含有1％FCS，0.01％叠氮钠(sodium azide)的PBS(PBS-FA)液内，置于4℃内三十分钟。处理过后的Raji细胞先用PBS洗三次，以清除没有附在Raji细胞多余的抗体。附在Raji细胞上的抗体则用二十倍稀释的含有FITC-缀合物的羊抗人IgG1Fc段(测量SMO9)或羊抗鼠IgG1 Fc段(测量1F5)抗体，用FACScan去量度，结果如图6所示，在不同稀释度中、SMO9和鼠源母抗体1F5与Raji人淋巴瘤细胞结合后所产生的荧光强度接近，鼠1F5与SMO9对Raji细胞都有相似的亲和力。说明功能人源化后不会影响抗体的特异性和亲和力。

实施例4、SMO9与鼠源母抗体亲和力的比较

本实施例用竞争性流式细胞术分析比较鼠源母抗体1F5与SMO9的亲和力。作法是用固定稀释度(1∶200)FITC-SMO9偶联物，跟不同浓度的竞争者抗体(鼠源母抗体1F5或SMO9试产第一批抗体)混合后，再与Raji细胞反应。然后，用荧光活化细胞分类扫描器(FACScan)分析在竞争抗体影响下，还有多少残留的FITC-SMO9抗体能与Raji细胞结合。结果如图7所示，表明鼠源母抗体1F5跟功能人源化抗体SMO9作为竞争抗体有相近的亲和力，功能人源化后的抗体SMO9特异性与亲和力并未因功能人源化而减弱。反之，功能人源化抗体SMO9的竞争力略高于鼠源母抗体，其分别甚为轻微，在正常实验误差之内。总的来说，功能人源化抗体的SMO9亲和力并不低于，或基本相同于鼠源母抗体。图7中，纵坐标是荧光度。

实施例5、SMO9在玻管实验诱发的细胞毒性

在黏附有不同浓度的SMO9的96-孔板(96-well plate)内，加入4×10⁵个Raji细胞培养，孵育4小时后用Trypan Blue色素评估坏死细胞与健康细胞的比率。结果如图8所示，表明功能人源化抗体SMO9能诱导细胞毒性，尤以抗体浓度5ug/ml，细胞的死亡率已可达百分之三十。

序列表

<160>6

<210>1

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Pro Val Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105

<210>2

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Ala Glu Val Asn Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>3

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Pro Val Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Gln Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>4

<211>452

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Gln Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Ala Glu Val Asn Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Lys His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn Lys Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210>5

<211>642

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gatattcagc tgacacagtc tccatcaagt ctttctgcat ctgtggggga cagagtcaca 60

attacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

caggctcccg tccccgtaat ttatgccaca tccaacctgg cttccggagt ccctagtcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gaccgagttc actctcacaa tcagcagttt gcagcctgaa 240

gatttcgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctga cggtcctacg tcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210>6

<211>1356

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

caggtgcaac tgcaggcttc cggggctgag gtaaataagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt acggcagcct 120

cctggaaggg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tactagttac 180

aatcagaaat tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccactag cacagcctac 240

atggagctca gcagtctgag gtctgaggac actgcggtct attactgtgc aagatcgcac 300

tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc aaggcaccac ggtcaccgtc 360

tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaa 1356

Claims

1、功能人源化抗人CD20抗体，其特异于CD20，它由轻链和重链组成，所述轻链和重链分为恒定区和可变区；所述重链的恒定区为同种型人IgG₁的恒定区，和/或所述轻链的恒定区为同种型人Kappa的恒定区；所述重链的可变区的氨基酸序列是序列表中的序列2，所述轻链的可变区的氨基酸序列是序列表中的序列1。

2、根据权利要求1所述的功能人源化抗人CD20抗体，其特征在于：所述抗人CD20抗体轻链的氨基酸序列是序列表中的序列3；所述抗人CD20抗体重链的氨基酸序列是序列表中的序列4。

3、权利要求1或2所述功能人源化抗人CD20抗体的衍生物，是所述功能人源化抗人CD20抗体的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物；所述功能人源化抗人CD20抗体的片段为Fab、Fab’或F(ab’)₂；所述抗体/抗体片段-因子融合蛋白为抗体/抗体片段-白细胞介素，抗体/抗体片段-干扰素或抗体/抗体片段-毒素融合蛋白；所述抗体/抗体片段-化学偶联物为抗体/抗体片段-化学毒药或抗体/抗体片段-放射核素。

4、根据权利要求3所述的衍生物，其特征在于：所述化学毒药为阿霉素，irinotecan或顺式铂氨；所述放射核素为I¹²⁵，I¹³¹，Y⁹⁰，In¹¹¹或Re¹⁸⁸。

5、一种治疗与CD20表达有关疾病的药物，它的活性成分是权利要求1或2所述功能人源化抗人CD20抗体或权利要求3至5中任一所述功能人源化抗人CD20抗体的衍生物。

6、根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述与CD20表达有关的疾病为NHL，类风湿关节炎，红斑狼疮或任何与B细胞免疫系统失调有关的疾病。

7、根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于：所述药物中还含有抗人CD19抗体和/或抗人CD22抗体。

8、权利要求1或2所述的功能人源化抗人CD20抗体的编码基因。

9、根据权利要求8所述的编码基因，其特征在于：所述功能人源化抗人CD20抗体轻链编码基因的碱基序列如序列表中序列5所述；所述功能人源化抗人CD20抗体重链编码基因的碱基序列如序列表中序列6所述。

10、含有权利要求8或9所述的功能人源化抗人CD20抗体的轻链和重链的编码基因的转基因细胞系。

11、含有权利要求8或9所述的功能人源化抗人CD20抗体的轻链和重链的编码基因的工程菌。

12、含有权利要求8或9所述的功能人源化抗人CD20抗体的轻链和重链的编码基因的表达载体。