JP5004154B2 - 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体 - Google Patents
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20)上記17)または18)記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記1)から15)のいずれかに記載の組換え抗体または抗体フラグメントを生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とする組換え抗体の製造方法。
VH:(配列番号11)
VH−CDR1:Asp Tyr Tyr Met Ser (配列番号26)
VH−CDR2:Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly (配列番号27)
VH−CDR3:Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr (配列番号28)
VL:(配列番号13)
VL−CDR1:Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala (配列番号29)
VL−CDR2:Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser (配列番号30)
VL−CDR3:His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr (配列番号31)
VH:(配列番号15)
VH−CDR1:Gly Tyr Tyr Met His (配列番号38)
VH−CDR2:Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly (配列番号39)
VH−CDR3:Pro Pro Thr Thr Val Val Ala Thr Asp Trp Tyr Phe Asp Val (配列番号40)
VL:(配列番号17)
VL−CDR1:Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala (配列番号41)
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VL−CDR3:His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr (配列番号43)
VH:(配列番号19)
VH−CDR1:Ser Tyr Gly Val His (配列番号50)
VH−CDR2:Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser (配列番号51)
VH−CDR3:Lys Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr (配列番号52)
VL:(配列番号21)
VL−CDR1:Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His (配列番号53)
VL−CDR2:Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser (配列番号54)
VL−CDR3:Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr (配列番号55)
VH:(配列番号23)
VH−CDR1:Ser Phe Gly Met His (配列番号62)
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VH−CDR3:Lys Gly Phe Gly Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Ala Met Asp Tyr (配列番号64)
VL:(配列番号25)
VL−CDR1:Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala (配列番号65)
VL−CDR2:Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser (配列番号66)
VL−CDR3:Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr Thr (配列番号67)
1種類のモノクローナル抗体より、個々の中和活性は低くとも異なるエピトープを認識する複数のモノクローナル抗体を混合したときの方が、毒素の中和能が高いという報告(Nowakowski Aら、Proc Natl Acad Sci USA., 99, 11346(2002))がある。このような知見から、複数の中和抗体を混合した製剤を想定した場合、問題になるのは開発や製造のコストである。1つの細胞が1つの抗体を産生し、それらを混合する場合、前述のコストはその抗体数に比例して増大する。本願発明は、それらの課題に対する一つの解決策を示している。
また本願発明は、抗体機能分子として前述の二重特異性抗体だけを示すものではなく、二重特異性抗体の類似物として、例えば、ヒンジ領域のCys残基による自発的な2量体化、両親媒性ペプチドの導入によるFabの2量体化や、2つの1本鎖抗体(scFv)をペプチドリンカーで結合させるscFvの2量体化(BiscFv)、特異性の異なる2つの抗体におけるお互いのドメインを入れ替えて、非共有結合的に2量体化(diabody)なども、本願発明のV領域を用いることにより作製することが可能である。
現在治療用毒素として使用されているC. botulinum type A 62A株より精製したA型神経毒素をB型神経毒素で行われた方法に準拠して(Infect. Immun. 18: 761-766, 1977)、ホルマリンで不活化したトキソイドを免疫抗原に用いた。上記のトキソイドとFreund’s Complete Adjuvant(Difco)を等量混合しBALB/cマウス1匹当たり毒素蛋白量で0.25mgを腹腔内に接種した。初回免疫後、4及び8週目にFreund’s Incomplete Adjuvant(Difco)を用いて同量を追加免疫した。10日後、部分採血を行い、ELISAにより抗原結合抗体価を測定した。ELISAには、A型神経毒素(0.5μg/well)をコートしたプレート(FALCON, Flexible Plate)を用い、ブロッキングには0.2%BSA、2次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG(H+L)(1:5000,BioRad)、基質はオルソフェニレンジアミン(Nacalai Tesque)を使用した。反応は基質反応以外全て37℃2時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。トキソイド免疫後の血中のボツリヌスA型神経毒素に対するELISA抗体価は3回の免疫でマウス5匹中4匹が100,000倍以上に上昇していた。ELISA抗体価が500,000倍以上のマウスにおいて順次、A型神経毒素(10μg/マウス;106LD50/マウス)を腹腔内に投与した。3〜4日後に脾細胞を調製し、ポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞(P3U1)と細胞融合を行った。脾細胞とP3U1を10:3の割合で混合し、50% PEG4000(MERCK) /10% DMSO(SIGMA)を用いて細胞融合を行った。DMEM (DIFCO)/15% FCS (GIBCO)/HAT (SIGMA)を用いて細胞を選択した。
得られたハイブリドーマの培養上清中のELISA抗体価を測定し、限界希釈法により中和活性のある抗体を産生しているハイブリドーマのクローニングを2〜3回行った結果、抗体陽性ハイブリドーマが37クローン得られた。
これら37クローンについて産生する抗体の毒素中和活性を調べた。中和活性は、ボツリヌス神経毒素(200ipLD50/ml)とハイブリドーマ培養上清を等量混合し、室温で30分反応させた後、マウスの腹腔内へ0.5ml接種し、毒素を培地のみと混合したサンプルをコントロールとし、コントロールが死亡した時点における、試験群の臨床症状(麻痺の程度)により判定した。その結果、13クローンについて、コントロールと比較して延命あるいは症状の緩和が観察された。このうち6クローンについては症状の緩和が著しく、特に4クローン(2-4,2-5,9-4,B1)については6時間まで毒素の中毒症状を示さず、さらに3クローン(2-4,2-5,9-4)については毒素を完全中和した(表1)。
マウスモノクローナル抗体のV領域遺伝子は、RT-PCR法によって単離した。2-4,2-5,9-4,B1の4種の各ハイブリドーマよりQuickPrep micro mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience)を用いてmRNAを抽出し、Superscript II 逆転写酵素(Invitrogen)によるcDNA合成を行った。これをテンプレートとし、プライマーとしてKozak配列及び必要なスプライシングシグナル、酵素サイト(HindIII、BamHI)を持ったオリゴマーをVH、VL領域遺伝子用にそれぞれのV領域及びJ領域のサブグループ毎に作製し(配列番号1〜9)、Advantage HF-2 PCR Kit(BD Bioscience)を用いて当該キットのプロトコールに従ってPCR反応を行った。その結果、VH、VL領域それぞれにPCR増幅バンドが複数検出された。その中からサイズ的に既知のVH、VL領域のcDNA遺伝子と一致しているバンドを選び、TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、ABI PRISM310 Genetic Analyzer(PEバイオシステムズ)を用いてその核酸塩基配列の決定を行った。これらの複数のバンドから、開始コドンからJ領域までV領域内で正しいオープンリーディングフレームを取る遺伝子を選んだ結果、それぞれのハイブリドーマ毎に一対のVH、VL領域遺伝子の組み合わせが得られた。その核酸塩基及びアミノ酸配列を配列番号10〜25にそれぞれ示す。また、各VH領域及びVL領域のアミノ酸配列について相同性を比較したところ、VH領域間では相同性は認められなかったが、VL領域については2-4と2-5において121番目のアミノ酸1個のみ違い(2-4:R/2-5:Y)がみられたが、それ以外のVL領域間では相同性はなかった。
このようにして得たVH、VL領域遺伝子をHindIIIとBamHI(TAKARA)で消化し、それぞれを、発現ベクターであるCAG-γ1、CAG-1κ(J. Immnol., 167, 3266, 2001)の同サイトに組み込み、キメラ抗体発現ベクターを構築した。CAG-γ1は、ヒト抗体C領域γ1鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子(neor)を持ち、CAG-κはヒト抗体C領域κ鎖の遺伝子及び選択マーカーとしてのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(dhfr)を持っている。構築したキメラ抗体発現プラスミドを用い以下に述べる方法にてCHO DG44(Urlaub Gら, Somatic cell. Mol. Genet., 12, 555 (1986)、以下CHO)細胞を形質転換した。形質転換の前日にCHO細胞を6 well プレートに1-0.5×105cells/2ml/wellの細胞密度で10%ウシ胎児血清(FCS、GIBCO-BRL社製)を含むYMM培地(インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含MEMアルファ培地)を用い播種した。37℃、5%CO2培養装置で一夜培養の後、リポソーム系形質転換試薬、TransIT-LT1(宝)あるいはリポフェクトアミン2000(インビトロジェン)を用いて、あらかじめキメラ抗体H鎖及びL鎖遺伝子発現プラスミドを等量混合し、PvuIで消化・線状化しておいたものを導入DNAとして、それぞれのプロトコールに従いトランスフェクションを行った。37℃、5%CO2培養装置で一夜培養した後、選択培地、10%透析FCS(d-FCS:GIBCO-BRL社製)、0.5 mg/ml Geneticin(G418:GIBCO-BRL社製)、300nM メトトレキサート(MTX:和光純薬工業製)を含むYMM培地に培地交換した。3〜4日毎に培地を交換しながら37℃、5%CO2培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。得られた形質転換細胞の培養上清中に含まれるキメラ抗体の濃度は、ヤギ由来抗ヒトIgG Fc抗体(CAPPEL)とプロテインA-HRP(ZYMED社)を用いたサンドイッチELISA法により測定した。この際、市販のヒトIgG1抗体(Biogenesis)の希釈系列を作製し、それを標準試料とした。このELISA法により得られた形質転換細胞の中から抗体産生量の高い細胞をスクリーニングし、次いで限界希釈法によるクローニングを行って。最終的に得られた9-4、B1、2-4、2-5由来の4種のキメラ抗体産生細胞は各々AC94、ACB1、AC24、AC25と名付けた。
得られたキメラ抗体の神経毒素に対する結合活性をA型神経毒素(0.5μg/well)をコートしたプレート(FALCON, Flexible Plate)を用いて測定した。ブロッキングには0.2%BSA、2次抗体にはペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG(H+L)(1:5000,BioRad)、基質はオルソフェニレンジアミン(Nacalai Tesque)を使用した。反応は基質反応以外全て37℃2時間で行った。基質の発色反応は37℃30分で行った。これらの細胞の培養上清中の抗ボツリヌス神経毒素キメラモノクローナル抗体(抗体濃度は20〜100μg/ml)はELISAによって期待通りに毒素と結合することが示された(図2A〜C)。
抗A型神経毒素中和キメラ抗体のうち、AC25、AC94のそれぞれとAC24とH鎖L鎖遺伝子の交換発現実験を行った。それぞれの組合せH鎖L鎖遺伝子発現ベクターを、CHO-DG44細胞に導入し、新たに4種のキメラ抗体産生細胞(AC2425、AC2524、AC2494、AC9424)を得た。これらの細胞の培養上清中のキメラ抗体(抗体濃度14.9〜40.5μg/ml)の毒素結合能をELISAによって調べたところ、図5に示すように、いずれの抗体も毒素と結合することが示された。特に、AC9424は強い結合活性を示した。また、各培養上清中の毒素中和活性を調べたところ、表2に示すようにAC2425、AC2524は強い中和活性を示し、AC2494、AC9424はコントロールと比較して延命あるいは症状の緩和が観察された。以上のようにAC24とAC25抗体のH鎖L鎖交換を行ったところ、そのいずれの場合も毒素結合能と中和活性を保持していた。
Claims (9)
- マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体であって、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とし、かつボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有し、当該組換え抗体の可変領域重鎖(VH)及び可変領域軽鎖(VL)のアミノ酸配列の一部が可変領域内の相補性決定領域(CDR)を含み、当該VHのCDR1〜3と当該VLのCDR1〜3との組み合わせ並びに当該組換え抗体のVHのアミノ酸配列及びVLのアミノ酸配列の組み合わせが、それぞれ配列番号26〜28及び配列番号29〜31並びに配列番号11及び13、配列番号38〜40及び配列番号41〜43並びに配列番号15及び17、配列番号50〜52及び配列番号53〜55並びに配列番号19及び21、もしくは配列番号62〜64及び配列番号65〜67並びに配列番号23及び25から選択される、組換えヒト化抗ボツリヌス神経毒素抗体またはその抗原結合フラグメント。
- マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体であって、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とし、かつボツリヌス神経毒素に対する中和活性を有し、当該組換え抗体のVH及びVLのアミノ酸配列の一部が可変領域内の相補性決定領域(CDR)を含み、当該VHのCDR1〜3と当該VLのCDR1〜3との組み合わせ並びに当該組換え抗体のVHのアミノ酸配列及びVLのアミノ酸配列の組み合わせが、配列番号26〜28及び配列番号41〜43並びに配列番号11及び17、もしくは配列番号38〜40及び配列番号29〜31並びに配列番号15及び13から選択される、組換えヒト化抗ボツリヌス神経毒素二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 当該抗原結合フラグメントが抗体機能分子であり、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体またはジスルフィド安定化抗体であることを特徴とする、請求項1または2に記載の組換え抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の組換え抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNA。
- 請求項4に記載のDNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項4に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項5に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項1〜3のいずれかに記載の組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを生成蓄積させ、該培養物から該抗体を採取することを特徴とする組換え抗体の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の組換え抗体またはその抗原結合フラグメントが、放射性同位元素、蛋白質または低分子の薬剤と化学的または遺伝子工学的に結合させることを特徴とする融合抗体。
- 請求項1〜3及び8のいずれかに記載の組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する、ボツリヌス感染症またはボツリヌス神経毒素中毒症の治療薬。
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