JP5432727B2 - A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 - Google Patents
A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5432727B2 JP5432727B2 JP2009551427A JP2009551427A JP5432727B2 JP 5432727 B2 JP5432727 B2 JP 5432727B2 JP 2009551427 A JP2009551427 A JP 2009551427A JP 2009551427 A JP2009551427 A JP 2009551427A JP 5432727 B2 JP5432727 B2 JP 5432727B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- antibody
- complementarity determining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims description 103
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 title claims description 91
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims description 69
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 55
- 241000486679 Antitype Species 0.000 title claims description 49
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 355
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 184
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 180
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 72
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 56
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 55
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 45
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 33
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 33
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 20
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 17
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 17
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 16
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 description 13
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 229940049154 botulinum antitoxin Drugs 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 5
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 5
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 201000011422 infant botulism Diseases 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 3
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 201000011423 wound botulism Diseases 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- QYETVTFBDRINOR-PHGYPNQBSA-N (2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 QYETVTFBDRINOR-PHGYPNQBSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 1,3-diethoxypropan-2-ol Chemical compound CCOCC(O)COCC WIHIUTUAHOZVLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012452 Xenomouse strains Methods 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000002320 anti-botulinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940070874 babybig Drugs 0.000 description 1
- 239000003131 biological toxin Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- -1 external preparation Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007900 neurotoxin activity Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940000673 orphan drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002859 orphan drug Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 206010040400 serum sickness Diseases 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Description
食中毒の原因毒素は国により多少異なるがA型、B型およびE型による症例が報告されている。また乳児ボツリヌス症の大半はA型、B型であるが、C.butiricumによるE型毒素、によるF型毒素の報告もある。
一方、米国では特にバイオテロの脅威に備える意味からも毒素中和の研究開発が行われ、ボツリヌス毒素ペンタマーを免疫した人のBリンパ球からファージ抗体ライブラリーを作製し、その中から所望の完全ヒト中和抗体を選択する方法が試みられた。しかし、A型毒素に対して、単独で十分な中和活性を発揮する抗体クローンの取得には成功していない。そのため、ファージディスプレイスクリーニングの結果得られた1種のヒト抗体に、XENOマウス由来のクローン1種、さらにマウスの免疫により得たマウス抗体をヒト化したものを混合する(オリゴクローナル化)ことによって中和活性を強化せざるを得ず、所期の目的、即ち完全ヒト中和抗体による毒素の中和、を達成するには至っていなかった(特許文献2、3、非特許文献4、5、6)。
続いて、これらの抗体を3種又は4種組み合わせた場合の中和活性を、国際的な基準(日本薬局法 医薬品各条に掲げる生物学的製剤医薬品に記載の「乾燥ボツリヌスウマ抗毒素(乾燥ボツリヌス抗毒素)」の項 3.2.7 「力価試験」に準ずる)に従って比較・評価した。その結果、高い中和活性を与える抗体クローンの組合せとして、3種の抗体クローンの組合せが見出された。また、さらに1種の抗体クローンを組合せれば中和活性が向上することが示された。
以上のように本発明者らは、A型ボツリヌス毒素に対する高い中和活性をもたらす抗体クローンを複数取得することに成功するとともに、当該抗体に認識される4つのエピトープと中和活性の関係を明らかにした。本発明は主としてこれらの成果に基づくものであり、以下の通りである。
[1]配列番号4のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号36のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号44のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号48のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープ、又は配列番号52のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号56のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
を含むA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[2]第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(1)〜(3)からなる群より選択されるいずれかの抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(4)又は(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(6)〜(8)からなる群より選択されるいずれかの抗体である、[1]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物:
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(2)配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(3)配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(4)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(5)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号37のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号38のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号39のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号42のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号43のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号45のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号46のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号47のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(7)配列番号49のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号50のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号51のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号53のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号54のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号55のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(8)配列番号57のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号58のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号59のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号61のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号62のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号63のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体。
[3]第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(1)〜(3)からなる群より選択されるいずれかの抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(4)又は(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(6)の抗体であり、
第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として前記(7)又は(8)の抗体を更に含む、[2]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[4]第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(1)の抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(6)の抗体である、[2]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[5]第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として前記(7)の抗体を更に含む、[4]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[6]第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(1)の抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が前記(7)の抗体である、[2]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[7]第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として前記(4)の抗体を更に含む、[6]に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[8]前記(1)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号4のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号8のアミノ酸配列を有し、
前記(2)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号12のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号16のアミノ酸配列を有し、
前記(3)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号20のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号24のアミノ酸配列を有し、
前記(4)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号28のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有し、
前記(5)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号36のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号40のアミノ酸配列を有し、
前記(6)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号44のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号48のアミノ酸配列を有し、
前記(7)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号52のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号56のアミノ酸配列を有し、
前記(8)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号60のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号64のアミノ酸配列を有する、
[2]〜[7]のいずれか一項に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
[9][2]に規定された(1)〜(8)のいずれかの抗体からなる、単離されたヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体。
[10]前記(1)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号4のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号8のアミノ酸配列を有し、
前記(2)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号12のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号16のアミノ酸配列を有し、
前記(3)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号20のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号24のアミノ酸配列を有し、
前記(4)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号28のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有し、
前記(5)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号36のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号40のアミノ酸配列を有し、
前記(6)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号44のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号48のアミノ酸配列を有し、
前記(7)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号52のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号56のアミノ酸配列を有し、
前記(8)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号60のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号64のアミノ酸配列を有する、[9]に記載の単離されたヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体。
[11][10]に記載の抗体の重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子。
[12][11]に記載の核酸分子を保持するベクター。
[13][12]に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[14][13]に記載の形質転換体を培養し、ヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体を産生させる工程と、
培養上清を回収し、該培養上清からヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体を精製する工程と、
を含む、ヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体の製造方法。
説明の便宜上、本明細書に使用される用語の一部についてその定義をまとめて以下に示す。
本明細書において用語「〜を含む」又は「〜を含んでなる」は、「〜からなる」の意味をも含む表現として使用される。したがって例えば、「複数の要素(部材)を含んで構成される物(又は方法)」と記載した場合には、それが意味するものとして「当該複数の要素(部材)から構成される物(又は方法)」も当然に考慮される。
「単離された抗体」には、天然であって且つ何ら外的操作(人為的操作)が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。尚、単離された抗体は、典型的には、他の種類の抗体が混在していない状態、即ち単独で(同種の抗体の集合として)存在している。
「相補性決定領域(CDR)」については、Kabatら(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition US Department of Health and Human Services(1987))を参照)の定義に従う。
「A型ボツリヌス毒素中和組成物」とは、複数種の抗体を有効成分として含有し、A型ボツリヌス毒素に対して中和活性を示す薬学的混合物をいう。
本発明における「抗毒素力価」は、特に言及しない限り、国際単位で表現される。「抗毒素力価」は、日本薬局法 医薬品各条に掲げる生物学的製剤医薬品に記載の「乾燥ボツリヌスウマ抗毒素(乾燥ボツリヌス抗毒素)」の項 3.2.7 「力価試験」に準じて決定される。
重鎖(H鎖)、軽鎖(L鎖)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、相補性決定領域(CDR)、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、相補性決定領域3(CDR3)、重鎖相補性決定領域1(VH CDR1)、重鎖相補性決定領域2(VH CDR2)、重鎖相補性決定領域3(VH CDR3)軽鎖相補性決定領域1(VL CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(VL CDR2)、軽鎖相補性決定領域3(VL CDR3)
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(2)配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(3)配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(4)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(5)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号37のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号38のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号39のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(6)配列番号41のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号42のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号43のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号45のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号46のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号47のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(7)配列番号49のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号50のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号51のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号53のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号54のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号55のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
(8)配列番号57のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号58のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号59のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号61のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号62のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号63のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体
VH CDR1:配列番号1
VH CDR2:配列番号2
VH CDR3:配列番号3
VH:配列番号4
VL CDR1:配列番号5
VL CDR2:配列番号6
VL CDR3:配列番号7
VL:配列番号8
VH CDR1:配列番号9
VH CDR2:配列番号10
VH CDR3:配列番号11
VH:配列番号12
VL CDR1:配列番号13
VL CDR2:配列番号14
VL CDR3:配列番号15
VL:配列番号16
VH CDR1:配列番号17
VH CDR2:配列番号18
VH CDR3:配列番号19
VH:配列番号20
VL CDR1:配列番号21
VL CDR2:配列番号22
VL CDR3:配列番号23
VL:配列番号24
VH CDR1:配列番号25
VH CDR2:配列番号26
VH CDR3:配列番号27
VH:配列番号28
VL CDR1:配列番号29
VL CDR2:配列番号30
VL CDR3:配列番号31
VL:配列番号32
VH CDR1:配列番号33
VH CDR2:配列番号34
VH CDR3:配列番号35
VH:配列番号36
VL CDR1:配列番号37
VL CDR2:配列番号38
VL CDR3:配列番号39
VL:配列番号40
VH CDR1:配列番号41
VH CDR2:配列番号42
VH CDR3:配列番号43
VH:配列番号44
VL CDR1:配列番号45
VL CDR2:配列番号46
VL CDR3:配列番号47
VL:配列番号48
VH CDR1:配列番号49
VH CDR2:配列番号50
VH CDR3:配列番号51
VH:配列番号52
VL CDR1:配列番号53
VL CDR2:配列番号54
VL CDR3:配列番号55
VL:配列番号56
VH CDR1:配列番号57
VH CDR2:配列番号58
VH CDR3:配列番号59
VH:配列番号60
VL CDR1:配列番号61
VL CDR2:配列番号62
VL CDR3:配列番号63
VL:配列番号64
Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、又はdsFv抗体などの抗体断片として各抗体を調製することもできる。Fabは、IgG抗体をシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約5万の断片である。所望のIgG抗体があれば、これをパパイン消化することによりFabを得ることができる。また、H鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
第1抗体:(1)の抗体
第2抗体:(5)の抗体
第3抗体:(6)の抗体
第1抗体:(1)の抗体
第2抗体:(5)の抗体
第3抗体:(7)の抗体
第1抗体:(1)〜(3)からなる群より選択されるいずれかの抗体
第2抗体:(4)又は(5)の抗体
第3抗体:(6)の抗体
第4抗体:(7)又は(8)の抗体
(BT-015)
VH:配列番号65
VL:配列番号66
VH:配列番号67
VL:配列番号68
VH:配列番号69
VL:配列番号70
VH:配列番号71
VL:配列番号72
VH:配列番号73
VL:配列番号74
VH:配列番号75
VL:配列番号76
VH:配列番号77
VL:配列番号78
VH:配列番号79
VL:配列番号80
改変されるアミノ酸の数は、好ましくはFR全体の15%以下であり、更に好ましくはFR全体の10%以下であり、更に更に好ましくはFR全体の5%以下であり、最も好ましくはFR全体の1%以下である。
発現ベクターに含まれるプロモーターとしてはSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンプロモーターなどが利用される。
監訳、ラボマニュアル動物細胞の遺伝子工学、宝酒造(1994)を参照)が利用できる。
製剤化する場合の剤型も特に限定されないが、注射剤、外用剤又は座剤など、即効性のある製剤処方が好ましい。
また、各抗体のクラスや形態などは任意である。従って、異なるクラスの抗体が混在した状態や、異なる形態の抗体が混在した状態で本発明の組成物が構成されていてもよい。
本発明の組成物中の抗体濃度は、最終的な投与形態と投与スケジュールを鑑みた上で逆算的に決定することが好ましい。
1−1.ボツリヌストキソイドのヒトボランティアへの接種
各A,B,E及びF型菌を培養し、得られた毒素を精製して得た毒素を材料として、トキソイドの調製を行った。特にA型は現在治療用毒素として使用されているクロストリジウム・ボツリヌス97株(C. botulinum 97)または62A株(C. botulinum 62A)より産生された神経毒素を、B型神経毒素で行われた方法(Infect. Immun. 18 : 761-766, 1977)に準じて精製した。精製した各型毒素はホルマリンで不活化してアルミニウムアジュバントと混合し沈降ABEF型多価混合トキソイドとした。この多価トキソイドを基礎免疫として3-4週間隔で3回、さらに約12ヶ月後に1回を0.5mLを皮下に注射した。さらに、10年後、20年後に追加注射し、さらに以下の成分採血に際して約3週間前にも同量を注射した。
ABEF型ボツリヌストキソイドを接種したヒトから、成分採血により3リットルの血液に相当する単核球成分血を分取(約50ml)した。PBSで2倍希釈して血球を回収後、10ml/チューブで分注したFicoll Paque PLUS(GEヘルスケアバイオサイエンス)上に重層し、400g、RT、30分の条件で遠心処理して単核球分画のみを再精製し、1.8x109細胞を分画した。0.9x109細胞を用いてtotal RNAの抽出(RNA Extraction Kit:アマシャム)を行い、1.89mgを回収した。ランダムプライマーを用いてcDNAを調製後(Super Script II:インビトロジェン)、抗体のH鎖(VH)に特異的なプライマー群(下記参照)と抗体のL鎖(VLCL:カッパ鎖、ラムダ鎖)に特異的なプライマー群(下記参照)を用いて目的の抗体遺伝子を増幅した。H鎖はpscFvCA-E8VHdベクターへ(SfiI-XhoIを利用)、L鎖はファージミドベクター(pFCAH9-E8d:再表01/062907参照、SfiI-AscIを利用)に組み込み、H鎖ライブラリー、カッパ鎖ライブラリー及びラムダ鎖ライブラリーを得た。ライブラリーサイズはH鎖ライブラリーが7.05x109、カッパ鎖ライブラリーが5.87x108、ラムダ鎖ライブラリーが5.05x108であった。
ヒト抗体重鎖遺伝子の取得用5'末端側プライマー(VH1〜VH7)と3’末端側プライマー(human JHプライマー4種(697〜700)を等量混合したもの)
各VH familyの増幅に使用したプライマー
ヒトVHプライマー(SfiI siteを下線で示す)
628 hVH1a(配列番号81):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
629 hVH2a(配列番号82):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG
630 hVH3a(配列番号83):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
631 hVH4a(配列番号84):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
632 hVH5a(配列番号85):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC
633 hVH6a(配列番号86):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG
629-2 hVH2a-2(配列番号87):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC
631-2 hVH4a-2(配列番号88):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG
632-2 hVH5a-2(配列番号89):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
712 hVH7(配列番号90):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT
ヒトJHプライマー(BstPI, XhoI siteを下線で示す)
697 hJH1-2(配列番号91):GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC
698 hJH3(配列番号92):GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC
699 hJH4-5(配列番号93):GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC
700 hJH6(配列番号94):GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC
軽鎖遺伝子の取得用VLの5'側にアリールするプライマー(κ1〜κ6、λ1〜λ6)とCκ、Cλの3’側にアリールするプライマー(hCKASCプライマーまたはhCLASCプライマー)
L鎖(VLCL:カッパ鎖、ラムダ鎖)
5’-プライマーκ1〜κ6
hVK1a(配列番号95):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
hVK2a(配列番号96):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC
hVK3a(配列番号97):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC
hVK4a(配列番号98):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
hVK5a(配列番号99):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
hVK6a(配列番号100):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC
5’-プライマーλ1〜λ6
hVL1(配列番号101):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC
hVL2(配列番号102):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC
hVL3a(配列番号103):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
hVL3b(配列番号104):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC
hVL4(配列番号105):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CACGTTATACTGACTCAACCGCC
hVL5(配列番号106):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCC
hVL6(配列番号107):GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA
3’-プライマー hCKASC(配列番号108):TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG
3’-プライマーHCLASC(配列番号109):TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC
2−1.スクリーニング実験1
(1)特異的クローンの選択・回収
中和抗体を取得するには、神経毒の活性を有するニューロトキシン部位に結合する抗体をスクリーニングすることが理想となる。しかし献血ボランティアには毒素全長で作製したトキソイドを免疫しており、無毒成分タンパク質に結合する抗体(ここでは不要な抗体)も体内で産生されている。また、神経毒の活性を有するニューロトキシンの入手も制限されている。そこで、最初に無毒成分タンパク質とヒト抗体ライブラリーを反応させて不要な抗体を無毒成分タンパク質に吸収させた後、反応上清を回収し、続いてボツリヌストキソイドと無毒成分タンパク質に吸収されなかったヒト抗体ライブラリー反応させるというスクリーニング戦略を採用した。
これをOD 0.5の大腸菌DH12S 20mlに1時間感染させ、60mlのSBGA培地(SB培地(MOPS 10g、Tryptone 30g及びYeast Extract 20gを溶解し、3N NaOHでpH 7へ調整した後、最終溶液量を1リットルとしたもの)に最終濃度として125μg/ml ampicillin sulfateと0.5% glucoseを添加したもの)に添加して37℃、2時間培養後、500mlのSBA培地に添加して更に37℃、2時間培養した。続いて、ヘルパーファージKO7を1x1012当量添加し、37℃にて2時間培養した後、カナマイシンを終濃度50μg/mlになるよう添加し、30℃、18時間培養した。これを8000rpmにて10分間遠心処理して上清を回収し、それに110mlのPEG液(20% polyetyleneglycol 6000, 2.5M NaCl)を混ぜてよくかきまぜた後、8500rpm、15分間の遠心処理を行い、ファージを沈殿させた。これを2.5mlのPBSに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。このようにして1stスクリーニングのファージ(1stファージ)を得た。
2ndスクリーニングは、1stファージ400μlを使用すること及びPBSの洗浄回数を20回にすること以外、1stスクリーニングと同じ条件で実施した。3rdスクリーニングは、2ndファージ400μlを使用する以外、2ndスクリーニングと同じ条件で実施した。3rdスクリーニングの後、46クローンをピックアップした。
スクリーニングによって得られた大腸菌を希釈し、ampicillin(100μg/ml)を添加した普通寒天培地に蒔いた。得られたコロニーをピックアップ(上記(1)の46クローンに相当)して2xYTGA培地にて30℃通夜培養後、PI-50(倉敷紡績株式会社)にてDNAを抽出し、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
スクリーニングによって得られた大腸菌を希釈し、ampicillin(100μg/ml)を添加した普通寒天培地に蒔いた。得られたコロニーをピックアップ(上記(1)の46クローンに相当)して2xYTGA培地にて30℃通夜培養後、20μlを2mlの0.05% Glucose 2xYTA(2xYT, 100μg/ml ampicillin sulfate,0.05% Glucose)に接種した。30℃、3時間培養後、1M IPTGを20μl添加し、さらに20時間培養した。次に、マイクロ遠心機にて15000rpm、5分間遠心処理し、上清を回収した。上清中には各抗体クローンのcp3融合型タンパク質が含まれる。この上清を用いてトキソイドや無毒成分とのELISAを行った。
ボツリヌストキソイド及び無毒成分タンパク質を用いたELISAで抗体の結合能を判定した。ボツリヌストキソイドにのみ反応する抗体が単離目的の抗体(即ち中和抗体)となる。
まず、マイクロカップ(Nunc社、Maxisorp)にPBSで10μg/mlの濃度に調製したボツリヌストキソイド及び無毒成分タンパク質を各々100μlずつ分注し、4℃通夜反応させて固相化した。溶液を除去後、1% BSA/PBSを200μlずつ分注して37℃、1時間でブロッキングした。(3)で得た上清(抗体のcp3融合型タンパク質を含む)を100μlずつ分注し、37℃にて1時間反応させた。溶液を除去した後、PBSで洗浄し、PBSで2.5μg/mlに希釈したウサギ抗cp3抗体(MBL)を37℃にて1時間反応させた。溶液を除去した後、PBSで洗浄し、PBSで10000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(MBL)を37℃にて1時間反応させた。溶液を除去した後、PBSで洗浄し、100μlのOPD液を室温にて5分反応させた。2N硫酸にて反応を停止し、SPECTRAmax 340PC(Molecular Devices)にて492nmの吸光度を測定した。
以上のようにして、(1)で回収した46クローンの結合能を調べた結果、40クローン(アミノ酸配列が相違するものとして22種類)がボツリヌストキソイドに対して反応性を示した。また、ボツリヌス毒素の無毒成分タンパク質に対しては19種類が反応した。
一方、上記ボツリヌストキソイドを抗原としたスクリーニングで得られた抗体のうち、ボツリヌス毒素の無毒成分タンパク質に対しては反応性を示さないが、ボツリヌストキソイドには反応する抗体は3種類であった(図2)。尚、無毒成分タンパク質に対するABS<0.2を判定基準とした。矢印で示したBT-015、37、39、44のうち、BT-037と無毒成分タンパク質と反応するBT-014はアミノ酸配列が同一であった)。これらのファージミドDNAを制限酵素SalIにて消化後、自己再結合させてProteinA融合型抗体(Fab-pp型抗体)に変換し、それを用いてDH12Sを形質転換した。形質転換後、25mlの2xYTGAにて30℃通夜培養した。この培養液20mlを2リットルの2xYTAに混ぜて3時間培養した後、2mlの1M IPTGを加え30℃で20時間培養した。培養液を4℃、8000rpm、10分間の遠心処理に供し、上清を回収した。回収した上清に1122gの硫酸アンモニウムをゆっくり加えて室温にて1時間かき混ぜた後、4℃、8500rpm、30分間の遠心処理に供した。沈渣を100mlのComplete(Roche社製)入りPBSに懸濁した。続いてPBSに対して4℃で通夜透析後、4℃、10000rpm、10分間の遠心処理に供した。上清を回収し、それを3mlのIgGセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス)を充填したカラムに添加し、室温にてカラム内を自然滴下で通過させた。300mlのPBSでカラムを洗浄した後、6mlの0.2Mグリシン(pH3)、3mlの0.2Mグリシン(pH2.5)、10mlの0.2Mグリシン(pH3)で溶出した。溶出液を各々2M TrisにてpHを7.0に調整した後、透析濃縮用チューブ(Millipore 社製、Amicon Ultra-15、4℃、5530rpm回転)に入れ、PBSに対して透析し、濃縮した。その後SDS-PAGEを行い、タンパク濃度を算出した。
単離・調製したFab-pp型抗体を毒素と混合して皮下投与した後、マウスの麻痺等の症状を観察するという、半定量的な試験法によって各抗体の中和能を評価した。方法は参考文献(M. Takahashi et al., International Journal of Food Microbiology, 11, 271-278, 1990. Jpn. J. Med. Sci. Biol., 43. 163-170, 1990)に準じた。比較対照として、A型ボツリヌス毒素抗毒素日本標準品(10単位/ml)を10倍希釈してストック溶液とした抗毒素原液(1単位/ml)を、更にPBSで3倍ずつ6段階希釈したものを調製した(以下「標準希釈」という)。一方、(5)で得た抗体溶液をPBSで5倍希釈して抗体原液とし、更に5倍ずつ4段階希釈したものを検体(以下「検体希釈液」という)とした。
また、ボツリヌス神経毒素(3.8×105LD50/ml)を400倍希釈してストック溶液(950LD50/ml)とし、更に500倍希釈して試験毒素(1.9LD50/ml)を作製した。試験毒素0.25mlと、各標準希釈及び検体希釈液0.25mlを正確に採り、よく混合して室温で1時間反応させた後、1群2匹のマウスの皮下へ0.2mlずつ接種し、3日間観察した。試験群のマウスの臨床症状(完全緩解、麻痺の程度)により、検体の力価を判定した。その結果、BT-015が中和能を示した(図3)。
スクリーニング実験1で取得した抗体のうち、ネガティブと判断された(無毒素部位にも反応する抗体)19クローンの抗体タンパク質を混合したものを以下の方法で調製した。
まず、当該19クローンのDNAを混合し、制限酵素SalIにて消化後、自己再結合させてFab-pp型抗体に変換し、それを用いてDH12Sを形質転換した。形質転換後、100mlの2xYTGAにて30℃通夜培養した。この培養液40mlを4リットルの2xYTAに混ぜて3時間培養した後、4mlの1M IPTGを加えて30℃で20時間培養した。培養液を4℃、8000rpm、10分間の遠心処理に供し、上清を回収した。回収した上清に2244gの硫酸アンモニウムをゆっくり加えて室温にて1時間かき混ぜた後、4℃、8500rpm、30分間の遠心処理に供した。沈渣を200mlのComplete(Roche社製)入りPBSに懸濁した。続いて、PBSに対して4℃で通夜透析後、4℃、10000rpm、10分間の遠心処理に供した。上清を回収し、それを3mlのIgGセファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス)を充填したカラムに添加し、室温にてカラム内を自然滴下で通過させた。500mlのPBSでカラムを洗浄した後、6mlの0.2Mグリシン(pH3)、3mlの0.2Mグリシン(pH2.5)、10mlの0.2Mグリシン(pH3)で溶出した。溶出液を各々2M TrisにてpHを7.0に調整した後、透析濃縮用チューブ(Millipore 社製、Amicon Ultra-15、4℃、5530rpm回転)に入れ、PBSに対して透析し、濃縮した。その後SDS-PAGEを行い、タンパク濃度を算出した。
スクリーニング実験1の3rdスクリーニングでネガティブと判断したクローンの数が多いことから、この段階で既に偏りが生じ、中和抗体の存在比率が低くなっていると考えた。そこで、スクリーニングの途中段階である2ndスクリーニング後のファージ抗体(2ndファージ)を用いてスクリーニング(3rd-2)を実施した。まずマイクロカップ(Nunc社製、Maxisorp)6well分にPBSで10μg/mlの濃度に調製したボツリヌストキソイドを100μlずつ分注し、4℃通夜反応させて固相化した。溶液を除去後、1% BSA/PBSを200μlずつ分注して37℃、1時間でブロッキングした。ブロッキング溶液除去後、2−2.で調製した抗体ミックスタンパク質を30μg/wellで分注して37℃、1時間反応させて抗原をマスクした。抗体タンパク質溶液を除去後、2ndファージ3.6x1013当量と2−2.で調製した抗体ミックスタンパク質180μgを混合した後、マイクロカップに分注して、37℃、2時間反応させた。以後の操作は上記スクリーニング実験1と同様とした。
これら各抗体クローンから抗体タンパク質を調製し、毒素の中和試験を実施した。その結果、二つのクローン(BT-058、BT-047)が中和活性を示したが、それらのH鎖のアミノ酸配列は、スクリーニング実験1で取得したクローンBT-015のそれとほぼ同一であった(図6)。従って、これら3クローンのエピトープは同じであると予想される。
ネガティブと判断した抗体をスクリーニング系に共存させることでトキソイド特異的な抗体クローンが効率的に取得されるように改善されたものの、スクリーニング実験1で取得した抗体クローンBT-015と同一又は類似の抗体クローンしか取得できなかった。そこで、新規抗体クローンを取得するため、ネガティブと判断した抗体クローン19種の抗体タンパク質に加えて抗体クローンBT-015の抗体タンパク質も共存させることで、これらの抗体クローンのエピトープをマスクするという戦略をとることにした(4th-2スクリーニング)。
まず、マイクロカップ6well分にPBSで10μg/mlの濃度に調製したボツリヌストキソイドを100μlずつ分注し、4℃通夜反応させて固相化した。溶液を除去後、1% BSA/PBSを200μlずつ分注して37℃、1時間でブロッキングした。ブロッキング溶液除去後、2−2.で調製した抗体ミックスタンパク質と抗体クローンBT-015から調製した抗体タンパク質を分注し(各々30μg/well)、て37℃、1時間反応させて抗原をマスクした。抗体タンパク質溶液を除去後、スクリーニング実験3で得たファージ(3rd-2ファージ)7.2x1012当量と2−2.で調製した抗体ミックスタンパク質180μg及び抗体クローンBT-015から調製した抗体タンパク質180μgを混合した後、マイクロカップに分注して37℃、2時間反応させた。以後の操作は上記スクリーニング実験1と同様とした。
ボツリヌス神経毒素を400倍希釈してストック溶液(950LD50/ml)とし、更に10倍希釈して試験毒素(95LD50/ml)を作製した。試験毒素0.25mlと、各標準希釈及び検体0.25mlを正確に採り、よく混合して室温で1時間反応させた後、1群2匹のマウスの皮下へ0.2mlずつ接種し、4日間観察した。試験群のマウスの臨床症状(完全緩解、麻痺の程度)により、検体の力価を判定した。その結果、抗体クローンBT-175が中和能を示した(図8)。
クロストリジウム・ボツリヌス62A株より、文献INFECTION AND IMMUNITY, Vol. 12, No. 6 Dec. 1975, p. 1262-1270に従い、精製したボツリヌス毒素より無毒成分タンパク質を除去して調製したニューロトキシン(毒素の活性中心150kDa)を精製した。これを抗原としたスクリーニングを実施し、抗体クローンBT-015、BT-175とは異なるエピトープを認識する中和抗体の取得を試みた。
まず、マイクロカップ6well分にPBSで10μg/mlの濃度に調製したボツリヌスニューロトキシンを100μlずつ分注し、4℃通夜反応させて固相化した。溶液を除去後、1% BSA/PBSを200μlずつ分注して37℃、1時間でブロッキングした。ブロッキング溶液除去後、ヒト抗体ライブラリー1.0×1013を分注(130μl/well)して、37℃、2時間反応させた。以後の操作は上記スクリーニング実験1と同一とした(4thスクリーニングまで実施した。4thスクリーニングでは3rdファージ400μlを使用した)。
4thスクリーニングを実施後、188クローンをピックアップし、それらの結合能をELISAで確認した結果、トキソイド特異的に反応するクローンは6種類であった(図10、11)。その中には、これまでに取得した2種類の抗体クローン(BT-015、BT-0175)と同一又は類似のクローンが数多く含まれていた(BT-015については6クローン、BT-175については5クローン)。
ニューロトキシンを抗原としたスクリーニング(2−5.)でも数多く取得された抗体クローン(BT-015又はBT-175と同一又は類似のクローン)を排除することを目的として更にスクリーニング実験を実施した。
まず、マイクロカップ8well分にPBSで10μg/mlの濃度に調製したニューロトキシンを100μlずつ分注し、4℃通夜反応させて固相化した。溶液を除去後、1% BSA/PBSを200μlずつ分注して37℃、1時間でブロッキングした。ブロッキング溶液除去後、抗体クローンBT-015及びBT-175から調製した抗体タンパク質を分注し(各々30μg/well)、37℃、1時間反応させて抗原をマスクした。抗体タンパク質溶液を除去後、スクリーニング実験5の3rdスクリーニングで得られたファージ(3rdファージ)2.0x1013と抗体クローンBT-015及びBT-175から調製した抗体タンパク質(各180μg)を混合した後、マイクロカップに分注して、37℃、2時間反応させた。188クローンをピックアップし、それらの結合能をELISAで確認したところ、ニューロトキシン特異的に反応する新規クローンは24種類であった(図12、13)。尚、以上のスクリーニング過程を図15に示す。
ニューロトキシンを抗原としたスクリーニング(スクリーニング実験5及び6)で取得された30種類の抗体クローンからFab-pp型抗体を調製した。各Fab-pp型抗体について、毒素と混合して皮下投与してマウスの生死・麻痺等の症状を観察するという、試験法によって中和能を判断した。試験法は参考文献(生物学的製剤基準 厚生労働省 日本薬局方)に準じ、検体の力価は日本標準品に対する相対価として求めた。A型ボツリヌス抗毒素日本標準品(10単位/ml)を10倍希釈してストック溶液とした抗毒素原液(1単位/ml)をPBSで希釈して0.1単位/mlとしたものと更に2倍ずつ5段階希釈したものを調製した(以下「標準希釈」という)。検体には調製した原液をそのまま使用した。
また、ボツリヌス神経毒素を400倍希釈してストック溶液(950LD50/ml)とし、更に10倍希釈して試験毒素(95LD50/ml)を作製した。試験毒素0.25mlと、各標準希釈及び検体0.25mlを正確に採り、よく混合して室温で1時間反応させた後、1群2匹のマウスの皮下へ0.2mlずつ接種し、40日間観察した。試験群のマウスの臨床症状(完全緩解、麻痺の程度)により、検体の力価を判定した。その結果、4種類の抗体クローン(NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)が中和能を示した(図14)。
以上のスクリーニング(スクリーニング実験1〜6)で取得された抗体の配列情報を以下に示す。尚、図16では、これらの抗体(但し、BT-015の類似クローンであるBT-047及びBT-058を除く)のアミノ酸配列を比較するとともに、Germlineとの相同性を示した。
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号1
VH CDR2:配列番号2
VH CDR3:配列番号3
VH:配列番号4
VL CDR1:配列番号5
VL CDR2:配列番号6
VL CDR3:配列番号7
VL:配列番号8
(塩基配列)
VH:配列番号65
VL:配列番号66
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号9
VH CDR2:配列番号10
VH CDR3:配列番号11
VH:配列番号12
VL CDR1:配列番号13
VL CDR2:配列番号14
VL CDR3:配列番号15
VL:配列番号16
(塩基配列)
VH:配列番号67
VL:配列番号68
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号17
VH CDR2:配列番号18
VH CDR3:配列番号19
VH:配列番号20
VL CDR1:配列番号21
VL CDR2:配列番号22
VL CDR3:配列番号23
VL:配列番号24
(塩基配列)
VH:配列番号69
VL:配列番号70
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号25
VH CDR2:配列番号26
VH CDR3:配列番号27
VH:配列番号28
VL CDR1:配列番号29
VL CDR2:配列番号30
VL CDR3:配列番号31
VL:配列番号32
(塩基配列)
VH:配列番号71
VL:配列番号72
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号33
VH CDR2:配列番号34
VH CDR3:配列番号35
VH:配列番号36
VL CDR1:配列番号37
VL CDR2:配列番号38
VL CDR3:配列番号39
VL:配列番号40
(塩基配列)
VH:配列番号73
VL:配列番号74
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号41
VH CDR2:配列番号42
VH CDR3:配列番号43
VH:配列番号44
VL CDR1:配列番号45
VL CDR2:配列番号46
VL CDR3:配列番号47
VL:配列番号48
(塩基配列)
VH:配列番号75
VL:配列番号76
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号49
VH CDR2:配列番号50
VH CDR3:配列番号51
VH:配列番号52
VL CDR1:配列番号53
VL CDR2:配列番号54
VL CDR3:配列番号55
VL:配列番号56
(塩基配列)
VH:配列番号77
VL:配列番号78
(アミノ酸配列)
VH CDR1:配列番号57
VH CDR2:配列番号58
VH CDR3:配列番号59
VH:配列番号60
VL CDR1:配列番号61
VL CDR2:配列番号62
VL CDR3:配列番号63
VL:配列番号64
(塩基配列)
VH:配列番号79
VL:配列番号80
4−1.IgG抗体の調製
Fab-pp型抗体に中和活性が観察された抗体クローン(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)からIgG抗体を調製した。まず、各抗体クローンについて、VHをコードする遺伝子断片をヒトγ1鎖定常領域DNAとライゲートした後、発現ベクター「BCMGS Neoベクター」(烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」,村松正実および岡山博人編,実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック,羊土社,pp.297-299(1991)に組み込み、定常領域を伴ったH鎖ベクターを作製した。同様に、各抗体クローンのL鎖全長遺伝子をベクターに組み込み、L鎖発現抗体発現ベクターとした。
抗体発現ベクターをチャイニーズハムスター細胞株CHO-K1にリポフェクチン法を用いてトランスフェクトし、37℃で所定時間培養した後、96穴プレートに移植し高発現の細胞を選択した。選択した各細胞を無血清培地(CHO-S-SFM II:Invitrogen 社製、1% (v/v) Penicillin - Streptomycin Solution:Sigma-Aldrich 社製、700 µg/ml G418:Sigma-Aldrich 社製)を使用し、大量培養フラスコ(Becton
Dickinson 社製
CELLine 1000 Flask)で2週間培養した。培養上清を回収し、Protein G結合アフィニティカラムへ供した。カラムをPBSで洗浄後、グリシン塩酸緩衝液(pH 2.7)で溶出し、トリス塩酸緩衝液(pH8.9)で中和した。続いて、溶出液を透析濃縮用チューブ(Millipore 社製、Amicon Ultra-15)に入れ、PBSに対して透析して濃縮した。このようにして得られたIgG型抗体を以降の実験に用いた。
解析には、Biacore3000バイオセンサー装置を利用した。まず、ニューロトキシン88ORUをセンサーチップ(CM5)に固相化後、Fab-PP型或いはIgG型抗体を順次濃度を変えて(1.9nM〜1μM)インジェクション(40μl、2分間)した。解析結果を図17(BT-015のFab-PP型抗体)、図18(BT-015のIgG型抗体)、図19(BT-175のFab-PP型抗体)、図20(BT-175のIgG型抗体)、図21(NT-221のFab-PP型抗体)、図22(NT-320のFab-PP型抗体)に示す。解析の結果、何れも強い結合力を有する抗体であった。
A型ボツリヌス毒素に対して中和活性を示した6種類の抗体クローン(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)のFab-PP型抗体を調製し、それを用いてBiacoreにる競合実験を行った。ニューロトキシン800RUをセンサーチップ(CM5)に固相化後、以下の濃度で抗体を順次インジェクションし、競合の有無を測定した。インジェクションは40μl(2分間)ずつ流した。すべての解析実験は、HBS-EP流速20μl/min HBS-EP(Biacore)中、25℃にて行った。再生は100mM Glycine-HCl(pH2.0)を20μl(流速60μl/min、20秒間)で行った。
各抗体クローンから調製したIgG型抗体を用い、生物学的製剤基準に則して中和試験を行った。
まず、ボツリヌスA型国内標準品を希釈し、0.25ml中に0.050単位を中心に試験精度を考慮した適当な間隔濃度単位を含む5段階希釈(以下「標準希釈」という)を作製した。また、IgG型抗体を希釈し、同様の希釈(以下「被検希釈」という)を作製した。更に、A型試験毒素を希釈し、0.25ml中に1試験毒素量を含む液(以下「毒素希釈」という)を作製した。各標準希釈及び被検希釈のそれぞれと各毒素希釈との等量ずつを正確に採り、よく混ぜて1時間放置した。23〜29日齢のマウス4匹を1群として、各混合液につき1群ずつを用い、1匹当たり混合液0.5mlを腹腔内に注射して3日間観察し、標準品に対する相対値を計算した。
比較対照はA型ボツリヌス抗毒素日本標準品(10単位/ml)とし、PBSで希釈して0.50単位/mlを中心に試験精度を考慮した適当な間隔濃度単位を含む5段階希釈(以下「標準希釈」という。表4)を作製した。またそれぞれの抗毒素に対応するボツリヌス神経毒素を希釈して試験毒素(214ipLD50/ml)を作製した。試験毒素0.63mlと、各標準希釈及び検体希釈液0.63mlを正確に採り、よく混合して室温で1時間反応させた後、1群2匹のマウスの腹腔内へ0.5mlずつ接種し、40日間観察した。検体の力価は日本標準品に対する相対価として求めた。
尚、現行の治療用乾燥ボツリヌスウマ抗毒素(A, B, E, F 4種混合)にはA型毒素抗体が10000単位/vial含まれており、4種類の抗体で代替する場合は各抗体を約210mgずつ混合することで同等の活性が得られることになる。
6種類の中和抗体(BT-015, BT-175, NT-221、NT-320, NT-523, NT-539)のエピトープをより詳細に解析し、またその亜型であるA2型のニューロトキシン(CHIBA-H)に対する反応性も同時に確認するため、以下に示す各抗原を用いてELISAを実施した。
・A型毒素 62A ニューロトキシン(NT)(BoNT/A1)
・ニューロトキシン重鎖(H chain)
・ニューロトキシン軽鎖(L chain)
・A2亜型毒素 ニューロトキシン CHIBA-H(BoNT/A2)
・BT-015, BT-175, NT-221:1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml
・NT-320, NT-523, NT-539:10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml
・NT-320はH chainを認識しているためNT-320のエピトープはH chain上に存在している。
・NT-523はH chain、L chain両方に反応した。
・その他4種類はH chain、L chainのいずれとも反応しなかった。
・BT-015, BT-175, NT-539はBoNT/A1、BoNT/A2に対して同程度の反応性を有している。
・NT-221, NT-320, NT-523はBoNT/A2に対する反応性がBoNT/A1に比較して低下している。
続いて、ニューロトキシン(NT)及び重鎖C末端側の神経細胞結合ドメイン(Hc、大腸菌リコンビナントタンパク質)に対してイムノブロッティングによるエピトープ解析を行った。アクリルアミドの濃度が10%のゲルを用いてSDS-PAGEを行い(ニューロトキシン:1.5μg/lane、Hc:0.5μg/lane)、メンブレンに転写・ブロッキング後、2種類の濃度(50μg/ml(実線のレーン)、5μg/ml(破線のレーン)に希釈し、6種類のIgG型中和抗体を各々200ulずつ反応させた。PBSで洗浄し、PBSで20000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ヒトIgG抗体を反応させた。PBSで洗浄し、発色基質にDABを用いて検出した(図30)。
・NT-523はHcドメインの一次構造を認識した。
・その他の抗体はバンドが検出されなかったことから、毒素の高次構造を認識する抗体であると考えられる。
更に3種類の抗原(ニューロトキシン、重鎖、軽鎖)を用いて、免疫沈降によるエピトープ解析を行った。プロテインGセファロース 100μlにIgG型中和抗体を5μgずつ反応させ、6種類の抗体ビーズを作製した。抗体ビーズに抗原(ニューロトキシン:0.6μg/100μl、H chain:0.4μg/100μl、L chain:0.4μg/100μl)を4℃で通夜反応させた。洗浄後、アクリルアミドの濃度が10%のゲルを用いてSDS-PAGEを行い、メンブレンに転写・ブロッキング後、アフィニティー精製したウサギ抗A型ボツリヌスニューロトキシン抗体(1000倍希釈)を反応させた。PBSで洗浄した後、PBSで2000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(BIO-RAD)を37℃にて反応させた。PBSで洗浄した後、発色基質にDABを用いて検出した(図31)。
・BT-015, NT-523, NT-539はH chainを認識(実線の丸)している。
・BT-175はL chainを認識している可能性が高い(破線の丸)。
・NT-221, NT-320はH chainとL chainのどちらを認識しているか判定不能である。
一方、本発明は、毒素中和試験の国際基準に適合したA型ボツリヌス毒素中和組成物を提供するものである。従って、備蓄体制が整っていない途上国における中毒症、特に突発的に大発生した中毒症、バイオテロなどに対して国際的に使用可能な治療・予防手段として本発明は極めて有用である。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (5)
- 配列番号4のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号36のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号44のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号48のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープ、又は配列番号52のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号56のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
を含むA型ボツリヌス毒素中和組成物であって、
第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(1)の抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(6)の抗体であり、
第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として、以下の(7)又は(8)の抗体を更に含む、A型ボツリヌス毒素中和組成物:
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(2)配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(3)配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(4)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(5)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号37のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号38のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号39のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号42のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号43のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号45のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号46のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号47のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(7)配列番号49のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号50のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号51のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号53のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号54のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号55のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(8)配列番号57のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号58のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号59のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号61のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号62のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号63のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体。 - 配列番号4のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号36のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号44のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号48のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープ、又は配列番号52のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号56のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
を含むA型ボツリヌス毒素中和組成物であって、
第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(1)の抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(6)の抗体である、A型ボツリヌス毒素中和組成物:
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(2)配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(3)配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(4)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(5)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号37のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号38のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号39のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号42のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号43のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号45のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号46のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号47のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(7)配列番号49のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号50のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号51のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号53のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号54のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号55のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(8)配列番号57のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号58のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号59のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号61のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号62のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号63のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体。 - 第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として前記(7)の抗体を更に含む、請求項2に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
- 配列番号4のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号36のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
配列番号44のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号48のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープ、又は配列番号52のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号56のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する抗体のエピトープを認識する第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体と、
を含むA型ボツリヌス毒素中和組成物であって、
第1のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(1)の抗体であり、
第2のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(5)の抗体であり、
第3のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体が、以下の(7)の抗体であり、
第4のヒト抗A型ボツリヌス毒素抗体として以下の(4)の抗体を更に含む、A型ボツリヌス毒素中和組成物:
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号2のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号3のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号5のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号6のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(2)配列番号9のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号10のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号11のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号13のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号14のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(3)配列番号17のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号18のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号21のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号23のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(4)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号29のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号30のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号31のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(5)配列番号33のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号34のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号35のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号37のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号38のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号39のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(6)配列番号41のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号42のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号43のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号45のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号46のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号47のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(7)配列番号49のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号50のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号51のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号53のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号54のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号55のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体;
(8)配列番号57のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域1、配列番号58のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域2、配列番号59のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域3、配列番号61のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域1、配列番号62のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域2、及び配列番号63のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域3を有する抗体。 - 前記(1)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号4のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号8のアミノ酸配列を有し、
前記(2)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号12のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号16のアミノ酸配列を有し、
前記(3)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号20のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号24のアミノ酸配列を有し、
前記(4)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号28のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有し、
前記(5)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号36のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号40のアミノ酸配列を有し、
前記(6)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号44のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号48のアミノ酸配列を有し、
前記(7)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号52のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号56のアミノ酸配列を有し、
前記(8)の抗体は、重鎖可変領域が配列番号60のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号64のアミノ酸配列を有する、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のA型ボツリヌス毒素中和組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009551427A JP5432727B2 (ja) | 2008-01-29 | 2009-01-23 | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008017152 | 2008-01-29 | ||
JP2008017152 | 2008-01-29 | ||
PCT/JP2009/000250 WO2009096162A1 (ja) | 2008-01-29 | 2009-01-23 | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 |
JP2009551427A JP5432727B2 (ja) | 2008-01-29 | 2009-01-23 | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009096162A1 JPWO2009096162A1 (ja) | 2011-05-26 |
JP5432727B2 true JP5432727B2 (ja) | 2014-03-05 |
Family
ID=40912519
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009551427A Active JP5432727B2 (ja) | 2008-01-29 | 2009-01-23 | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8540987B2 (ja) |
EP (1) | EP2246426A4 (ja) |
JP (1) | JP5432727B2 (ja) |
CN (1) | CN101965403B (ja) |
WO (1) | WO2009096162A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7563874B2 (en) | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
EP2246426A4 (en) * | 2008-01-29 | 2011-08-10 | Inst Antibodies Co Ltd | COMPOSITION FOR NEUTRALIZING BOTULINUM TOXIN TYPE A AND ANTI-TOXIN BOTULINUM HUMAN ANTIBODY TYPE A |
US20110033431A1 (en) * | 2008-03-31 | 2011-02-10 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Type a2 botulinum toxin preparation |
US11505599B2 (en) | 2016-01-14 | 2022-11-22 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | T cell receptor-like antibodies specific for Foxp3-derived peptides |
US11021533B2 (en) | 2016-11-02 | 2021-06-01 | Vanderbilt University | Human Zika virus antibodies and methods of use therefor |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007094754A2 (en) * | 2005-01-27 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of Califordnia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1196733A (zh) | 1995-06-30 | 1998-10-21 | 持田制药株式会社 | 抗Fas配体抗体和利用抗Fas配体抗体的测定方法 |
US20020155114A1 (en) * | 1998-08-31 | 2002-10-24 | James D. Marks | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US7563874B2 (en) * | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
DE19925739A1 (de) * | 1999-06-07 | 2000-12-21 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Therapeutikum mit einem Botulinum-Neurotoxin |
AU2001234125A1 (en) | 2000-02-22 | 2001-09-03 | Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. | Antibody library |
JP2006503547A (ja) * | 2002-02-11 | 2006-02-02 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 生物兵器防衛のための免疫療法 |
US20040258699A1 (en) * | 2002-02-11 | 2004-12-23 | Bowdish Katherine S. | Immunotherapeutics for biodefense |
WO2005016232A2 (en) | 2002-08-01 | 2005-02-24 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US20050042775A1 (en) * | 2003-08-21 | 2005-02-24 | Nicholas Pomato | Botulinum antitoxin compositions and methods |
JP5004154B2 (ja) | 2005-04-06 | 2012-08-22 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え抗ボツリヌス神経毒素抗体 |
US20100222555A1 (en) * | 2005-06-17 | 2010-09-02 | Thomas Jefferson University | Monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxin |
JP4979690B2 (ja) * | 2006-04-28 | 2012-07-18 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 神経毒素の定量方法 |
EP2134749B1 (en) * | 2007-03-22 | 2013-11-06 | The Regents of the University of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
BRPI0809435A2 (pt) * | 2007-03-27 | 2014-09-09 | Sea Lane Biotechnologies Llc | Constructos e bibliotecas que compreendem sequências de cadeia leve substituida de anticorpos |
EP2246426A4 (en) * | 2008-01-29 | 2011-08-10 | Inst Antibodies Co Ltd | COMPOSITION FOR NEUTRALIZING BOTULINUM TOXIN TYPE A AND ANTI-TOXIN BOTULINUM HUMAN ANTIBODY TYPE A |
KR101604515B1 (ko) * | 2008-03-14 | 2016-03-17 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 a 활성 검정 |
NZ588029A (en) * | 2008-03-14 | 2012-12-21 | Allergan Inc | Immuno-based botulinum toxin serotype a activity assays |
WO2010014854A2 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | The Regents Of The University Of California | Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US8673890B2 (en) * | 2009-10-29 | 2014-03-18 | Janssen Pharmaceutica Nv | 2,3-dihydro-1H-isoindol-1-imine derivatives useful as thrombin PAR-1 receptor antagonist |
-
2009
- 2009-01-23 EP EP09706257A patent/EP2246426A4/en not_active Withdrawn
- 2009-01-23 US US12/864,018 patent/US8540987B2/en active Active
- 2009-01-23 WO PCT/JP2009/000250 patent/WO2009096162A1/ja active Application Filing
- 2009-01-23 CN CN2009801071001A patent/CN101965403B/zh active Active
- 2009-01-23 JP JP2009551427A patent/JP5432727B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007094754A2 (en) * | 2005-01-27 | 2007-08-23 | The Regents Of The University Of Califordnia | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6009006798; 高橋元秀: 抗毒素製剤の効率的製造方法の開発に関する研究 , 2006, p.21-23 * |
JPN6009006801; 高橋元秀: 抗毒素製剤の効率的製造方法の開発に関する研究 , 2005, p.1-7 * |
JPN6009006803; 高橋元秀: 抗毒素製剤の効率的製造方法の開発に関する研究 , 2005, p.23-26 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8540987B2 (en) | 2013-09-24 |
US20110014211A1 (en) | 2011-01-20 |
WO2009096162A1 (ja) | 2009-08-06 |
EP2246426A1 (en) | 2010-11-03 |
CN101965403B (zh) | 2013-07-03 |
EP2246426A4 (en) | 2011-08-10 |
JPWO2009096162A1 (ja) | 2011-05-26 |
CN101965403A (zh) | 2011-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9771415B2 (en) | Influenza virus antibody compositions | |
CN105968200A (zh) | 抗人pd-l1人源化单克隆抗体及其应用 | |
JP2011087586A (ja) | 抗体ライブラリー | |
TW201843170A (zh) | 人類化之抗-因子d抗體及其用途 | |
CN104520317A (zh) | 针对高度保守靶标的包含来自骆驼科之序列的抗体 | |
CN108473559A (zh) | 特异性结合脂多糖的抗体分子-药物共轭物及其应用 | |
CA2687681A1 (en) | Antigen-binding proteins targeting s. aureus orf0657n | |
JP5432727B2 (ja) | A型ボツリヌス毒素中和組成物及びヒト抗a型ボツリヌス毒素抗体 | |
CN110317267B (zh) | 针对狂犬病病毒的双特异性抗体及其用途 | |
US7101551B2 (en) | Remedies for hepatitis C | |
CN106084058B (zh) | 抗人pcsk9单克隆抗体 | |
TW202140547A (zh) | 抗angptl3抗體及其應用 | |
CN107531797A (zh) | 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
CN108148136A (zh) | 抗vegf抗体 | |
CN110343181B (zh) | 针对凝血因子ix(fix)的单域抗体 | |
US20230220053A1 (en) | ANTI-SARS-CoV-2 ANTIBODIES AND USES THEREOF | |
EP2319867A1 (en) | Human monoclonal nicotine specific antibodies | |
US20220289843A1 (en) | Anti-cd19 antibodies and uses thereof | |
CN108883151A (zh) | 抗瓜氨酸化hla多肽抗体以及其用途 | |
CN113651884A (zh) | 人源化抗SARS-CoV-2单克隆抗体及其应用 | |
RU2793967C1 (ru) | Однодоменное антитело ламы Н5 и его производное H5-Fc, специфически связывающие RBD-домен S-белка вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей активностью | |
US20230086530A1 (en) | Human cd47-targeting single-domain antibody and use thereof | |
EP4190811A1 (en) | Humanized antibody specific to bacillus anthracis protective antigen and preparation method thereof | |
CN107043423A (zh) | 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
US9845350B2 (en) | Monoclonal antibodies that react with the capsule of bacillus anthracis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111109 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130724 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130829 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131025 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131118 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131206 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5432727 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |