KR20130028055A

KR20130028055A - Ｃｄ１２７ 결합 단백질

Info

Publication number: KR20130028055A
Application number: KR1020127022553A
Authority: KR
Inventors: 이안 커비; 알렉산더 에이치. 테일러; 토마스 매튜 웨브; 유 쉬에
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2010-01-28
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2013-03-18
Also published as: CA2787070A1; EP2528947A2; US8940303B2; US20120282254A1; WO2011094259A3; JP5850860B2; CN102812046B; NZ601271A; IL220899A; SG182590A1; PE20170687A1; US9150653B2; UA104663C2; CN102812046A; IL220899A0; TW201136607A; JP2013517799A; EP2528947A4; ZA201205624B; EA201290589A1

Abstract

인간 IL-7 수용체(CD127)에 결합하는 항원 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 전형적으로 항체이며, 인간의 질병 또는 질환, 특히 다발성 경화증 같은 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

Description

ＣＤ１２７ 결합 단백질 {ＣＤ１２７ＢＩＮＤＩＮＧＰＲＯＴＥＩＮＳ}

본 발명은 인간의 IL-7 수용체(CD127)의 α-사슬에 특이적으로 결합하는 항원 결합성 단백질, 특히 면역글로불린에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 단백질이 관련된 질환 또는 질병을 치료하는 방법, 상기 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

다발성 경화증(MS)은 중추 신경계에 영향을 주는 만성 염증 및 수초 제거성 질환이다. MS에서, 침투능력이 있는 염증성 면역 세포가 회돌기교세포의 파괴에 관련되어 있다고 추정하고 있는데, 여기서 회돌기교세포는 수초라고 알려진 지방층을 생성 및 유지시키는데 필요한 세포이다. MS는 수초를 얇게 하거나 완전히 제거한다. 수초가 사라지면, 신경세포는 신경세포의 전기 신호를 더 이상 효과적으로 전달할 수 없어서 다양한 신경계의 기능장애를 유발한다.

MS가 있는 피검자는 신경 섬유의 수초를 따라 염증성 병소의 형성에 관여하는 자가활성이 있는 T 세포를 생산한다. MS가 활성화된 환자의 뇌척수액은 활성화된 T 세포를 보유하는데, 이 세포들은 뇌 조직을 침투하여 특유의 염증 병소를 유발하여, 수초를 파괴한다. MS증상 및 병의 과정은 개인마다 다르지만, 질병의 세 가지 주요한 형태가 있다 - 재발성의 정체성(진행이 억제된) MS, 2차 진행형MS, 및 주요 진행형 MS. MS의 초기 단계에서는, 염증성 공격이 급성으로 강화된 질환 활성의 짧은 간격을 통해 발생한다. 이러한 사건들 이후에는 회복 및 정체 시기가 이어진다. 정체 시기 동안에는, 신경계 병소의 국지적인 팽창이 나타나고, 면역 세포들은 점점 활성이 감소되거나 비활성화되며, 수초-생성 세포들은 축색돌기에 수초를 재형성한다. 신경 신호는 개선되고, 염증에 의한 장애는 점점 완화되어 완전히 사라진다. 질환의 이러한 양상은 재발성의 정체성 다발성경화증(RRMS)이라고 부른다. 모든 병소들은 완전히 치료되지 않는다. 일부는 “만성” 병소로 남는데, 이 만성 병소들은 보통 면역 세포가 부족한 탈수초화된 중심 영역을 가지고 있다. 시간이 지나면, 염증이 주로 병소들의 가장자리에서 지속된다 할지라도 그러한 병소들의 중심에 있는 세포들은 대부분 죽는다. 뇌는 일부 신경세포의 손실에 잘 적응할 수 있고, 영구적인 장애는 오랜 시간 동안 발생하지 않을 것이다. 하지만, MS환자의 50% 이상은 결국 2차 진행형 MS(SPMS)라 불리는 진행형 악화 단계에 진입한다. 이 단계에서는, 질환이 더 이상 질환-완화 약제에 대하여 잘 반응하지 않고 환자의 장애들은 점점 악화되어 간다. MS의 자연스런 과정의 초기로부터의 신경세포 파괴는 SPMS의 진행형 장애가 최종적으로 뇌의 보정 기능을 압도하는 축적된 뇌세포 손실의 결과가 될 수도 있다는 점을 시사한다. 주요 진행형 MS는 재발이 없지만 수년 간의 기간 동안에 물리적 기능 및 인식 기능의 점진적인 손실이 생기는 형태의 다발성 경화증이다. 재발성의-정체성 다발성 경화증(RRMS) 환자를 치료하는 목적은 그 질환의 진행형 양상의 개시를 예방하거나 늦출 뿐만 아니라 재발의 빈도 및 정도를 감소(그리하여 악화를 예방)하는 것이다. 이와 같은 목표를 달성하기 위하여, 특히 과거에는, 면역 조절 또는 면역 억제 약제를 사용해 왔으나, 이와 같은 약제들은 제한된 효능 및 심각한 독성 때문에 광범위하게 사용할 수 없다는 것으로 나타났다. 예를 들어, 광범위하게 임의적으로 조절한 시험들은 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b 및 글라티라머 아세테이트를 이용하여 성공적으로 수행하였다.

면역계의 조절 네트워크의 변형된 자가면역 T 세포 반응 및 기능장애는 두 종류 모두 MS 및 류마티스성 관절염(Kuchroo et al., (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:101-123; Sospedra and Martin (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 683-747; Toh and Miossec (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19:284-288) 같은 인간의 자가면역 병리에서 중요한 역할을 한다.

MS의 병인학 및 발병에 대하여 알려진 바가 없다 할지라도, MS는 일반적으로 T_H1 및 T_H17 세포처럼 발병 가능성이 있는 자가 반응성이 있는 T 세포가 중요한 역할을 수행할 것으로 추측하는 자가면역 질환으로 판단하고 있다. 이러한 주효 T 세포들은 질병 과정 중에 생체 내 환경에서 활성화되고 중주신경계 염증의 원인이 된다는 증거가 있다. 또한 이러한 T 세포들이 질병의 활성화 시기 동안에 뇌척수염 및 MS의 병소들에게 수초를 발현하는 세포의 파괴를 매개한다는 증거도 있다. 다른 한편으로는, 발병성 T_H1 및 T_H17 세포들을 지속적으로 확인하는 조절성 T 세포들(T_reg)이 MS환자에서는 결핍되어 있고, 이후로 면역계를 전-염증 상태로 유도하게 된다.

별개의 세 그룹이 최근에 MS가 있거나 없는 모든 17,947 공여체에서 유전체적 단일염기 다형성(SNP) 검색 결과를 발표하였다. 334, 923개 SNP를 검색한 후, 그 그룹들은 인간 IL-7 수용체 알파 사슬(IL-7Rα)에서 동의어가 아닌 암호화 SNP MS 민감성 사이의 매우 중요한 연관성(전체 P=2.9x10^-7)을 찾아 내었다. 이 SNP는 CD127(또한 IL-7Rα라고 알려진)의 엑손6에서 T가 C로 변화하는 것에 상응한다. 이러한 변화는 RNA 스플라이싱 동안에 엑손6를 건너뛰는 가능성을 크게 향상시켜서, 결과적으로 CD127는 수용성 형태가 된다. 더욱이, MS 환자의 뇌척수액(CSFs)에서 CD127 및 IL-7 RNA의 발현은 다른 뇌신경 질환 환자의 CSF에 비해 매우 높다.

IL-7 및 IL-7 수용체 (IL-7R)은 T 세포 및 B 세포 발달과 주로 흉선 환경에서의 항상성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 실제로, 흉선의 기질 세포들, 태아의 흉선 및 골수는 IL-7을 생산하는 장소이다. IL-7 수용체는 2 가지 소단위체인 CD127과 IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 및 IL-21의 수용체들이 공유하는 공통 사슬(감마 사슬 또는 γc)로 구성되어 있다.

CD127은 또한 IL-7 수용체 알파(IL-7Rα 및 p90 IL-7R로써 알려져 있다. 인간 CD127(Swiss Prot 접속 번호 P16871)은 전체 459 아미노산(20개 아미노산은 신호 서열)이다. 인간 CD127은 219개 아미노산의 세포 외 영역, 25개 아미노산의 막투과성 영역 및 195개 아미노산의 세포 내 영역으로 구성되어 있다. 본문에서 사용한 것처럼(예컨대, 항체 에피토프의 상세한 설명에 대하여) CD127 내의 잔기들에 대한 번호는 신호 서열 잔기들을 포함하는 전장 단백질을 근거로 한다. CD127은 네 가지 동종체로 존재할 수 있는데, 하나의 동종체인 H20(Swiss Prot 접속 번호 P16871-1)은 하기의 아미노산 서열(신호 서열 포함)과 같다:

MTILGTTFGM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE

DPDVNTTNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCKK

IDLTTIVKPE APFDLSVIYR EGANDFVVTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH

VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP

ILLTISILSF FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP

ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVVVTPES

FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS

LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (서열번호 1)

CD127은 또한 흉선 기질에서 유래한 림포포이에틴(TSLP)의 수용체에서 찾을 수 있다. TSLP 수용체는 CD127과 사이토카인 수용체-유사 인자2(CRLF2)의 이종이량체이다.

IL-7R에 대한 IL-7의 결합은 Stat5의 인산화 및 활성화를 이끄는 야누스 키나아제 1,3의 활성화를 포함하는 다양한 신호 전달 경로들을 활성화시킨다. Stat5 활성화가 항-세포사멸 단백질 Bcl-2의 유발 및 항-세포사멸 단백질 Bax의 미토콘드리아 진입에 필요하기 때문에 이러한 경로는 흉선에서 발달하는 T 세포 전구체들의 생존에 중요하다. IL-7R이 매개하는 또 다른 경로는 결과적으로 항-세포사멸 단백질 Bad의 인산화 및 이의 세포질 내에 멈추게 하는 PI3 키나아제의 활성화이다. T 세포의 생존 및 항상성 및 주변부의 IL-7의 원천에 대한 IL-7 조절 기작은 완전하게 이해되지 않은 상태이다. 더욱이, 자가면역 질환에서 병원성 T 세포의 분화와 기능에 있어서 IL-7의 잠재적 역할은 연구가 부실하고 많이 알려지지 않았다. IL-7이 자가면역 질환의 발병에 기여할 수도 있다고 시사하는 보고들도 매우 드물다.

최근에는, Liu 와 그 동료들(Liu et al, (2010) Nature Medicine 16:191-197)이 T_H17의 생존 및 팽창에서 IL-7의 역할을 상세히 설명하였다. MS 및 다른 자가면역 질환들의 치료에 대한 쥐의 항-CD127 항체들(항-CD127 항체 1A11 및 6A3 포함)과 이 항체들의 역할은 PCT 출원 번호 PCT/US2009/053136에 상세히 설명하였다.

앞으로는 인간 CD127에 결합하고/결합하거나 인간 CD127의 생물학적 효과를 저해하는 단일클론 항체들을 분리하고 개발하는 것이 바람직하다. 그러한 항체들은 MS 및 다른 염증성 질환, 자가면역 질환 및 특히 발병성의 T_H17가 관련되어 있는 질환들의 치료에 약리적으로 유용할 것이다.

본 발명은 CD127에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질들을 제공하였다. 항원 결합 단백질들은 치료 방법, 특히 발병성의 T_H17 세포가 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 항원 결합 단백질들은 CD127에 결합할 수 있고 CD127의 생물학적 기능을 저해, 예컨대 중화시킬 수도 있다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 항체들과 같은 항원 결합 단백질들을 제공하는데, 이러한 항체들은 하기의 상보성 결정 영역(complementarity determining regions, CDR) 또는 이의 변이체들의 하나에서 여섯 가지로 구성되어 있다:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2

(iii) 서열번호 4 또는 서열번호 132에서 137 중 한 가지로 표시되는 CDRH3

(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1

(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2

(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체들과 같은 항원 결합 단백질들을 제공하는데, 이러한 항체들은 하기의 상보성 결정 영역 또는 이의 변이체들의 하나에서 여섯 가지로 구성되어 있다:

(i) 서열번호 39로 표시되는 CDRH1

(ii) 서열번호 40로 표시되는 CDRH2

(iii) 서열번호 41로 표시되는 CDRH3

(iv) 서열번호 42로 표시되는 CDRL1

(v) 서열번호 43으로 표시되는 CDRL2

(vi) 서열번호 44로 표시되는 CDRL3

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 항체이고, 다른 대안으로써 키메라, 인간적응된 항체 또는 인간의 항체이다. 항체는 수용체 항체 골격 내에 하나 또는 그 이상의 CDR(공여체 항체로부터 서열번호 2~7 또는 서열번호 39~44의 CDR)를 포함할 수 있다. 수용체 항체 골격은 인간의 항체일 수 있다.

하나의 측면에서, 본 발명은 하기의 상보성 결정 영역의 하나 또는 그 이상으로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간적응된 항체를 제공하였다:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2

(iii) 서열번호 4 또는 서열번호 132에서 137까지 중 어느 한 가지로 표시되는 CDRH3

항체는 또한 중쇄 가변 영역(kabat 에 따른 번호화)의 66번 위치에 Lys 잔기, 69번 위치에 Phe, Met, Ile, Leu 또는 Val 잔기, 71번 위치에 Val, Arg, Ala 또는 Leu 잔기 중 적어도 한 가지를 포함하고 있다.

하나의 실시예에서, 인간적응된 항체는 69번 위치에 Leu을 포함하고 있다. 하나의 실시예에서, 인간적응된 항체는 71번 위치에 Val을 포함하고 있다. 하나의 실시예에서, 인간적응된 항체는 69번 위치에 Leu 및 71번 위치에 Val을 포함하고 있다. 하나의 실시예에서, 인간적응된 항체는 66번 위치에 Lys, 69번 위치에 Leu 및 71번 위치에 Val을 포함하고 있다. 상기 언급한 점 변이들을 제외하고, 중쇄 가변 영역은 인간의 생식계열 가변 영역의 골격 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시예에서, 중쇄 가변 영역은 IGHV1_2 인간 골격(서열번호 116)에서 유래한 것이다.

그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 상보성 결정 영역의 하나 또는 그 이상으로 구성된 항체를 제공하였다:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2

(iii) 서열번호4 또는 서열번호 132에서 서열번호 137 중의 한 가지로 표시되는 CDRH3

V_H 골격에서, V_H 골격은 인간 생식계열 V_H 골격에서 유래하였고, 중쇄 가변 영역(kabat 에 따른 번호화)의 66번 위치에 Lys 잔기, 69번 위치에 Phe, Met, Ile, Leu 또는 Val 잔기 및 71번 위치에 Val, Arg, Ala 또는 Leu 잔기 중 적어도 한 가지로 구성되어 있다. 하나의 실시예에서, 인간의 V_H 골격은 IGHV1_2 인간 골격(서열번호 116)이다.

본 발명의 항체는 CDRH1(서열번호 2)와 CDRH3(서열번호4); CDRH2(서열번호3)와 CDRH3(서열번호4); CDRH1(서열번호2)와 CDRH2(서열번호3); 또는 CDRH1(서열번호2), CDRH2(서열번호3)와 CDRH3(서열번호4)로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 그 항체는 서열번호 10-17(1A11.H0 V_H 에서 1A11.H7 V_H) 중의 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 이러한 실시예들 중 어느 하나에서, 서열번호 4의 CDRH3는 서열번호 132에서 서열번호 137까지 중 어느 하나로 표시되는 CDRH3으로 치환할 수 있다. 그 대신에, 서열번호 13의 중쇄 가변 영역은 N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI 및 F100bV (Kabat)에서 선택한 하나 또는 그 이상의 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 121, 123, 125, 127 또는 131의 아미노산 서열을 가지고 있다. 하나의 실시예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 16의 경쇄 가변 영역과 한 쌍을 이루고 있다. 또한 본 발명은 하기의 상보성 결정 영역들로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하였다:

(i) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1

(ii) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2

(iii) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3

상기 항체는 또한 경쇄 가변 영역(Kabat에 따른 번호화)의 45번 위치에 Lys 잔기, 46번 위치에 Pro 잔기, 47번 위치에 Trp 잔기, 58번 위치에 Val 잔기, 60번 위치에 Val 잔기, 70번 위치에 Ser 잔기 및 71번 위치에 Tyr 또는 Phe 잔기 중 적어도 한 가지를 포함한다.

하나의 실시예에서, 항체는 46번 위치에 Pro 잔기를 포함한다. 하나의 실시예에서, 항체는 71번 위치에 Tyr 잔기를 포함한다. 하나의 실시예에서, 항체는 46번 위치에 Pro 잔기 및 71번 위치에 Tyr 잔기를 포함한다.

항체는 CDRL1 (서열번호5)와 CDRL3 (서열번호7); CDRL2 (서열번호6)와 CDRL3 (서열번호7); CDRL1 (서열번호5)와 CDRL2 (서열번호6); 또는 CDRL1 (서열번호5), CDRL2 (서열번호6)과 CDRL3 (서열번호7)로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 서열번호 18에서 27(1A11.L0 Vκ부터 1A11.L9 Vκ) 중의 어느 한 가지의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 항체는 서열번호 22(1A11.L4 V_κ)의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 상보성 결정 영역의 둘 또는 세 가지로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하였다:

(i) 서열번호 2에 제시한 CDRH1

(ii) 서열번호 3에 제시한 CDRH2

(iii) 서열번호 4 또는 서열번호 132에서 137 중 어느 하나로 표시되는 CDRH3

여기서, 항체는 또한 경쇄 가변 영역(Kabat에 따른 번호화)의 66번 위치에 Lys 잔기, 69번 위치에 Leu 또는 Val 잔기, 71번 위치에 Val, Arg, Ala 또는 Leu 잔기 중 적어도 한 가지와 하기 상보성 결정 영역들의 둘 또는 세 가지로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(i) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1

(ii) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2

(iii) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3

여기서, 항체는 또한 경쇄 가변 영역(Kabat에 따른 번호화)의 45 번 위치에 Lys 잔기, 46 번 위치에 Pro 잔기, 47 번 위치에 Trp 잔기, 58 번 위치에 Val 잔기, 60 번 위치에 Val 잔기, 70번 위치에 Ser 잔기 및 71번 위치에 Tyr 또는 Phe 잔기 중 적어도 하나를 포함한다.

항체는 하나의 중쇄 CDR 및 하나의 경쇄 CDR로부터 언급한 6가지 CDR들(예컨대, 모든 3가지 중쇄 및 3가지 경쇄 CDR들)을 포함하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 모든 조합을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 항체는 하기 상보성 결정 영역들로 구성된 중쇄 가변 영역:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2

(iii) 서열번호 4 또는 서열번호 133에서 서열번호 138까지의 어느 하나로 표시되는 CDRH3과 하기 상보성 결정 영역으로 구성된 경쇄 가변 영역:

(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1

(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2

(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3

을 포함한다. 상기에서, 항체는 또한 중쇄 가변 영역의 69 번 위치에 Leu 잔기와 경쇄 가변 영역의 46 번 위치에 Pro 잔기를 포함한다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13(1A11.H3 V_H)의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열 또는 서열번호 121, 123, 125, 127, 129 또는 131 중 어느 한 가지로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열 또는 서열번호 22(1A11.L4 V_κ) 의 아미노산 서열과 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 114의 아미노산 서열 또는 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열 또는 서열번호 118의 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다.

특정 실시예에서, 중쇄 영역은 N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI 및 F100bV (Kabat)로부터 선택한 하나 또는 그 이상의 치환을 포함한다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 115의 아미노산 서열 또는 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함한다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 114 또는 118 또는 서열번호 114 또는 118의 아미노산 서열에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열 또는 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열로 구성된 중쇄를 포함한다. 특정 실시예는 서열번호 118의 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 115의 경쇄 아미노산 서열로 구성된 항원 결합 단백질을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1 또는 이의 CDR 변이체,

(ii) 서열번호3으로 표시되는 CDRH2 또는 이의 CDR 변이체,

(iii) 서열번호 4로 표시되는 CDRH3 또는 이의 CDR 변이체, 또는 서열번호 132에서 서열번호 137 중 어느 한 가지로 표시되는 CDRH3,

(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1 또는 이의 CDR 변이체,

(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2 또는 이의 CDR 변이체,

(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3 또는 이의 CDR 변이체:

중의 하나 또는 그 이상을 포함하는,

또한 하기 잔기들 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 골격을 포함하는

(a) 2 번 위치에서 Val, Ile, 또는 Gly

(b) 4 번 위치에서 Leu 또는 Val

(c) 20 번 위치에서 Leu, Ile, Met 또는 Val

(d) 22 번 위치에서 Cys

(e) 24번 위치에서 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser

(f) 26 번 위치에서 Gly

(g) 47 번 위치에서 Trp 또는 Tyr

(h) 48 번 위치에서 Ile, Met, Val 또는 Leu

(i) 69 번 위치에서 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val

(j) 71 번 위치에서 Arg, Val, Ala 또는 Leu

(k) 78 번 위치에서 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe

(l) 80 번 위치에서 Leu 또는 Met

(m) 90 번 위치에서 Tyr 또는 Phe

(n) 92 번 위치에서 Cys

(o) 94 번 위치에서 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asp,

및 / 또는 하기 잔기들 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 골격:

(p) 2 번 위치에서 Ile

(q) 4 번 위치에서 Leu

(r) 23 번 위치에서 Cys

(s) 35 번 위치에서 Trp

(t) 36 번 위치에서 Tyr

(u) 71 번 위치에서 Tyr 또는 Phe

(v) 88 번 위치에서 Cys

(w) 98 번 위치에서 Phe

을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하였다. 여기서, 항원 결합 단백질은 CD127에 결합할 수 있다.

항원 결합 단백질은 하나의 CDR부터 상기의 6가지 CDR(서열번호 2에서 7)을 포함하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 상기의 모든 6가지 CDR(서열번호 2에서 7)을 포함한다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 상기에서 설명한 중쇄 골격 영역 및 경쇄 골격 영역 모두를 포함한다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 항체, 다른 대안으로써 인간적응된 또는 인간 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.

본 발명의 이런 측면의 하나 또는 그 이상의 CDR 변이체들은:

(a) 여기서, CDRH1(서열번호2)의 변이체:

i. 32 번 위치의 Tyr 잔기는 Ile, His, Phe, Thr, Asp, Cys, Glu 또는 Asp으로 치환되고;

ii. 33 번 위치의 Thr 잔기는 Tyr, Ala, Trp, Gly, Leu 또는 Val으로 치환되며,

iii. 34 번 위치의 Met 잔기는 Ile, Val 또는 Trp; 및/또는

iv. 35 번 위치의 Asp 잔기는 His, Glu, Gln, Ser, Tyr 또는 Thr으로 치환된다;

(b) 여기서, CDRH2의 변이체(서열번호3):

i. 50 번 위치의 Leu 잔기는 Arg, Glu, Trp, Tyr, Gly, Gln, Val, Asp, Lys 또는 Ala으로 치환되고;

ii. 51 번 위치의 Ile 잔기는 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asp으로 치환되며;

iii. 52 번 위치의 Asp 잔기는 Asp, Leu, Ser 또는 Tyr으로 치환되며;

iv. 53 번 위치의 Tyr 잔기는 Ala, Gly, Ser, Lys, Thr 또는 Asp으로 치환되며;

v. 54 번 위치의 Asp은 Ser, Thr, Lys, Asp 또는 Gly으로 치환되며;

vi. 56 번 위치의 Val은 Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Ser 또는 Ala으로 치환되며; 및/또는

vii. 58번 위치의 Ser은 Lys, Asp, Thr, Arg, Gly, Phe 또는 Tyr으로 치환되며;

(c) CDRH3의 변이체 (서열번호4), 여기서 번 위치 102의 Val은 Tyr, His, Ile, Ser, Asp 또는 Gly으로 치환된다;

(d) 여기서, CDRL1의 변이체 (서열번호5):

i. 29 번 위치의 Ser은 Val으로 치환되고; 및/또는

ii. 33 번 위치의 Met은 Leu으로 치환되며; 및/또는

(e) 하기 치환들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 CDRL3 (서열번호7) 의 변이:

i. 89 번 위치의 Gln은 Leu으로 치환되며;

ii. 90 번 위치의 Glu은 Gln으로 치환되며;

iii. 91 번 위치의 Trp은 Tyr으로 치환되며; 및/ 또는

iv. 93 번 위치의 Tyr은 Ser 또는 Arg으로 치환된다.

:를 포함할 수도 있다.

항원 결합 단백질은 서열번호 10-17(1A11.H0 V_H 에서 1A11.H7 V_H까지)의 어느 한 가지의 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 121, 123, 125, 127, 129 또는 131 중의 어느 한 가지의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13(1A11.H3 V_H)의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항원 결합 단백질은 서열번호 18-27(1A11.L0 Vκ 에서 1A11.L9 Vκ까지)중 어느 한 가지의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 22(1A11.L4 Vκ)의 경쇄 가변 영역을 포함한다.

특정 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13(1A11.H3 V_H)의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22(1A11.L4 V_L)의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 114 또는 서열번호 118, 특히 서열번호 118의 중쇄 및 서열번호 115의 경쇄를 포함한다. 중쇄는 또한 하기의 치환들 중 어느 한 가지를 포함할 수 있다: N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI 및 F100bV (Kabat).

또 다른 실시예에서, 항원 결합 단백질은 CDRH3 내에 하나 또는 그 이상의 점 변이를 포함하고 있으며, 이 때 항원 결합 단백질은 상기 변이가 없는 항원 결합 단백질보다 IL-7R에 대하여 더 큰 결합 친밀성를 가지고 있다. 예를 들어, 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 132부터 137로 표시되는 CDRH3를 포함하고 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 121, 123, 125, 127, 129 또는 131로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하고 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

(a) 서열번호 11

(b) 서열번호 12

(c) 서열번호 13

(d) 서열번호 14

(e) 서열번호 15

(f) 서열번호 16

(g) 서열번호 17

(h) 서열번호 121

(i) 서열번호 123

(j) 서열번호 125

(k) 서열번호 127

(l) 서열번호 129

(m) 서열번호 131

로 표시되는 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호 11부터 17 중 한 가지와 70% 또는 그 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는데, 이 때 항원 결합 단백질은 CD127에 대하여 결합할 수 있다.

하나의 실시예에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 11 내지 서열번호 17 중 한 가지와 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지고 있다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 도메인 또는 서열번호 13에 대하여 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 115 또는 서열번호 118에 대하여 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 중쇄를 가지고 있다.

하나의 실시예에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인은 서열번호 11에서 17, 121, 123,125, 127, 129, 131 중 한 가지의 변이체이며, 여기서 변이의 크기는

i. 2 번 위치에서 Val, Ile 또는 Gly

ii. 4 번 위치에서 Leu 또는 Val

iii. 20 번 위치에서 Ile, Met 또는 Val

iv. 24 번 위치에서 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser

v. 47 번 위치에서 Trp 또는 Tyr

vi. 48 번 위치에서 Ile, Met, Val 또는 Leu

vii. 69 번 위치에서 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val

viii. 71 번 위치에서 Arg, Val, Ala 또는 Leu

ix. 78 번 위치에서 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe

x. 80 번 위치에서 Leu 또는 Met

xi. 90 번 위치에서 Tyr 또는 Phe 및

xii. 94 번 위치에서 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asp

중의 하나 또는 그 이상으로 구성되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

(a) 서열번호 19

(b) 서열번호 20

(c) 서열번호 21

(d) 서열번호 22

(e) 서열번호 23

(f) 서열번호 24

(g) 서열번호 25

(h) 서열번호 26

(i) 서열번호 27

에서 제시하는 경쇄 가변 도메인 또는 서열번호 19에서 27 중 한 가지와 70% 또는 그 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하는데, 여기서 항원 결합 단백질은 CD127에 대하여 결합할 수 있다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 22로 표시되는 경쇄 가변 도메인 또는 서열번호 22에 대하여 70% 또는 그 이상의 동일성을 가진 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있다.

하나의 실시예에서, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 19내지 27 사이의 어느 한 가지에 대히여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지고 있다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 115에 대하여 70% 또는 그 이상, 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 경쇄를 포함하고 있다.

본 발명은 상세히 설명한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 모든 쌍에 대하여 고려하고 있다. 그러므로, 하나의 실시예에서, 본 발명은 또한 하기의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 조합 중 어느 한 가지를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하고 있다: 서열번호 11의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중의 어느 한 가지와 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 12의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27의 어느 한 가지에 대하여 75 % 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 13 의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중의 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중의 어느 한 가지에 대하여 75 % 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 14의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중의 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 15의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 16의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 17의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중의 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 121의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75 % 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 99 % 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 123의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 125의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 127의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 서열번호 129의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 %또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 또는 서열번호 131의 중쇄 가변 도메인(또는, 이에 대하여 75% 또는 그 이상의, 80% 또는 그 이상의, 85% 또는 그 이상의, 90% 또는 그 이상의, 98% 또는 그 이상의, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열).

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13에 제시한 서열에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열로 구성된 중쇄 가변 도메인과 서열번호 22에 제시한 서열에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열로 구성된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 도메인과 서열번호 22로 표시되는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 상보성 결정 영역(CDR)들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하였다:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1또는 이의 CDR 변이체

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2또는 이의 CDR 변이체

(iii) 서열번호 4로 표시되는CDRH3 또는 이의 CDR 변이체, 또는 서열번호 132에서 서열번호 137로 표시되는 CDRH3

(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1 또는 이의 CDR 변이체

(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2 또는 이의 CDR 변이체

(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3 또는 이의 CDR 변이체

여기서, 상기 언급한 CDR 중 적어도 한 가지는 CDR 변이체이고 상기 언급한 항원 결합 단백질은 CD127에 결합할 수 있다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 서열번호 6로 표시되는 CDRL2 또는 이의 변이체를 포함하고 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 서열번호 4로 표시되는 CDRH3 또는 이의 CDR 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서의 CDR 변이체는 하기의 CDR 변이체들을 포함할 수 있다:

(f) 여기서, CDRH1의 변이체 (서열번호 2):

i. 32 번 위치의 Tyr 잔기는 Ile, His, Phe, Thr, Asp, Cys, Glu 또는 Asp으로 치환하였다.;

ii. 33 번 위치의 Thr 잔기는 Tyr, Ala, Trp, Gly, Leu 또는 Val으로 치환하였다,

iii. 34 번 위치의 Met 잔기는 Ile, Val 또는 Trp으로 치환하였고/거나;

iv. 35 번 위치의 Asp 잔기는 His, Glu, Gln, Ser, Tyr 또는 Thr으로 치환하였다;

(g) 여기서, CDRH2 의 변이체 (서열번호 3):

i. 50번 위치의 Leu 잔기는 Arg, Glu, Trp, Tyr, Gly, Gln, Val, Asp, Lys 또는 Ala으로 치환하였다;

ii. 51 번 위치의 Ile 잔기는 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asp으로 치환하였다;

iii. 52 번 위치의 Asp 잔기는 Asp, Leu, Ser 또는 Tyr으로 치환하였다;

iv. 53 번 위치의 Tyr 잔기는 Ala, Gly, Ser, Lys, Thr 또는 Asp으로 치환하였다;

v. 54 번 위치의 Asp은 Ser, Thr, Lys, Asp 또는 Gly으로 치환하였다;

vi. 56 번 위치의 Val은 Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Ser 또는 Ala으로 치환하였고/거나

vii. 58 번 위치의 Ser은 Lys, Asp, Thr, Arg, Gly, Phe 또는 Tyr으로 치환하였다;

(h) CDRH3의 변이체(서열번호 4), 여기서 102 번 위치의 Val은 Tyr, His, Ile, Ser, Asp 또는 Gly으로 치환하였다;

(i) 여기서, CDRL1의 변이체(서열번호 5):

i. 29 번 위치의 Ser은 Val으로 치환하였고/치환하였거나;

ii. 33 번 위치의 Met은 Leu으로 치환하였고/치환하였거나;

(j) 하기 치환들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 CDRL3의 변이체 (서열번호 7):

i. 89번 위치의 Gln을 Leu으로 치환하였다;

ii. 90번 위치의 Glu을 Gln으로 치환하였다;

iii. 91번 위치의 Trp을 Tyr으로 치환하였고/치환하였거나;

iv. 93번 위치의 Tyr을 Ser 또는 Arg을 치환하였다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하였다:

하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인:

(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1 또는 이의 CDR 변이체

(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2 또는 이의 CDR 변이체

(iii) 서열번호 4로 표시되는 CDRH3 또는 이의 CDR 변이체, 또는서열번호 132부터 서열번호 137의 모든 서열로 표시되는 CDRH3

중쇄 가변 도메인 골격에서, 그 골격은 하기의 적어도 한 가지를 포함한다:

(a) 2 번 위치의 Val, Ile 또는 Gly

(b) 4 번 위치의 Leu 또는 Val

(c) 20 번 위치의 Leu, Ile, Met 또는 Val

(d) 22 번 위치의 Cys

(e) 24 번 위치의 Thr, Ala, Val, Gly 또는 Ser

(f) 26 번 위치의 Gly

(g) 47 번 위치의 Trp 또는 Tyr

(h) 48 번 위치의 Ile, Met, Val 또는 Leu

(i) 69 번 위치의 Ile, Leu, Phe, Met 또는 Val

(j) 71 번 위치의 Arg, Val, Ala 또는 Leu

(k) 78 번 위치의 Ala, Leu, Val, Tyr 또는 Phe

(l) 80 번 위치의 Leu 또는 Met

(m) 90 번 위치의 Tyr 또는 Phe

(n) 92 번 위치의 Cys

(o) 94 번 위치의 Arg, Lys, Gly, Ser, His 또는 Asp;

및 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인:

(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1 또는 이의 CDR 변이체

(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2 또는 이의 CDR 변이체

(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3 또는 이의 CDR 변이체

경쇄 가변 도메인 골격에서, 이는 하기의 적어도 한 가지를 포함한다:

(a) 2 번 위치의 Ile

(b) 4 번 위치의 Leu

(c) 23 번 위치의 Cys

(d) 35 번 위치의 Trp

(e) 36번 위치의 Tyr

(f) 71번 위치의 Tyr 또는 Phe

(g) 88번 위치의 Cys

(h) 98번 위치의 Phe;

여기서, 항원 결합 단백질은 CD127에 결합할 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에서의 CDR 변이체는 하기의 CDR 변이체들을 포함할 수 있다:

(a) CDRH1 변이체에서, CDRH1 변이체 (서열번호 2)

i. 32번 위치의 Tyr 잔기는 Ile, His, Phe, Thr, Asp, Cys, Glu 또는 Asp으로 치환하였다;

ii. 33 번 위치의 Thr 잔기는 Tyr, Ala, Trp, Gly, Leu 또는 Val으로 치환하였다

iii. 34번 위치의 Met 잔기는 Ile, Val 또는 Trp으로 치환하였고/거나;

iv. 35번 위치의 Asp 잔기는 His, Glu, Gln, Ser, Tyr 또는 Thr으로 치환하였다;

(b) CDRH2 변이체에서, CDRH2 변이체 (서열번호3)

i. 50번 위치의 Leu은 Arg, Glu, Trp, Tyr, Gly, Gln, Val, Asp, Lys 또는 Ala으로 치환하였다;

ii. 51번 위치의 Ile은 Leu, Val, Thr, Ser 또는 Asp으로 치환하였다;

iii. 51번 위치의 Asp 잔기는 Asp, Leu, Ser 또는 Tyr으로 치환하였다;

iv. 53번 위치의 Tyr 잔기는 Ala, Gly, Ser, Lys, Thr 또는 Asp으로 치환하였다;

v. 54번 위치의 Asp은 Ser, Thr, Lys, Asp 또는 Gly으로 치환하였다;

vi. 56번 위치의 Val은 Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Ser 또는 Ala으로 치환하였고/거나;

vii. 58번 위치의 Ser은 Lys, Asp, Thr, Arg, Gly, Phe 또는 Tyr으로 치환하였다;

(c) CDRH3 변이체 (서열번호 4), CDRH3 변이체 에서 102번 위치의 Val은 Tyr, His, Ile, Ser, Asp 또는 Gly으로 치환하였다;

(d) CDRL1 변이체에서, CDRL1 변이체 (서열번호 5)

i. 29번 위치의 Ser은 Val으로 치환하였고/거나;

ii. 33번 위치의 Met은 Leu으로 치환하였고/거나;

(e) 하기 치환들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는CDRL3 변이체 (서열번호 7):

i. 89번 위치의 Gln은 Leu으로 치환하였다;

ii. 90번 위치의 Glu은 Gln으로 치환하였다;

iii. 91번 위치의 Trp은 Tyr으로 치환하였고/거나;

iv. 93번 위치의 Tyr은 Ser 또는 Arg으로 치환하였다.

하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 항체, 다른 대안으로써는 인간적응된 항체 또는 인간의 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 CDR의 하나, 둘 또는 세 가지를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하였다:

(i) 서열번호 39에 제시한 CDRH1

(ii) 서열번호 40에 제시한 CDRH2

(iii) 서열번호 41에 제시한 CDRH3

이 항체는 또한 중쇄 가변 영역(Kabat에 따른 번호화)의 24번 위치의 Val, 27번 위치의 Tyr, 28번 위치의 Ser, 29번 위치의 Ile, 30번 위치의 Thr, 48번 위치의 Met, 49번 위치의 Gly, 67번 위치의 Ile, 68번 위치의 Ser, 71번 위치의 Arg, 73번 위치의 Thr 및 78번 위치의 Phe:의 적어도 한 가지를 포함한다.

하나의 실시예에서, 항체는 27번 위치의 Tyr, 30번 위치의 Thr, 48번 위치의 Met, 67번 위치의 Ile 및 71번 위치의 Arg 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 가지 모두를 포함한다. 그 항체는 CDRH1(서열번호 39)와 CDRH3(서열번호41); CDRH2(서열번호 4)와 CDRH3(서열번호 41); CDRH1(서열번호 39)와 CDRH2(서열번호 40); 또는 CDRH1(서열번호 39), CDRH2(서열번호40) 및 CDRH3(서열번호 41)을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 그 항체는 서열번호 48에서 56(6A3IGHV4_61.H1 V_H to 6A3IGHV4_61.H9)중 어느 하나인 중쇄 가변 영역 또는 서열번호 58에서 68(6A3IGHV3-33.H1 V_H to 6A3 IGHV3-33.H11)중 어느 하나인 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 CDR의 1, 2 또는 3 가지를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하였다:

(iv) 서열번호 42에 제시한 CDRL1

(v) 서열번호 43에 제시한 CDRL2

(vi) 서열번호 44에 제시한 CDRL3

상기 항체는 또한 하기 사항을 더 포함한다:

(a) 경쇄 가변 영역의 45번 위치의 Gln 잔기 및 70번 위치의 Lys 잔기 중 한 가지 또는 두 가지 모두, 또는

(b) 4 번 위치의 Leu, 31번 위치의 Tyr, 70번 위치의 Met, 85번 위치의 Thr, 94번 위치의 Tyr, 100번 위치의 Gly 및 104 번 위치의 Val 중 하나 또는 그 이상(Kabat에 따른 번호화).

하나의 실시예에서, 항체는 45번 위치의 Gln 잔기와 70번 위치의 Lys 잔기를 모두 포함한다. 또 다른 실시예에서, 항체는 4번 위치의 Leu, 31번 위치의 Tyr, 70번 위치의 Met, 85번 위치의 Thr, 94번 위치의 Tyr, 100번 위치의 Gly 및 104번 위치의 Val 각각을 포함한다.

상기 항체는 CDRL1(서열번호 42)와 CDRL3(서열번호44); CDRL2(서열번호 43)와 CDRL3(서열번호44); 또는 CDRL1(서열번호 42)와 CDRL2(서열번호 43); 또는 CDRL1(서열번호 42), CDRL2(서열번호43)과 CDRL3(서열번호44)로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체는 서열번호 70에서 72까지 및 서열번호 138 (6A3.L1 Vκ, 6A3.L2 Vκ, 6A3.L3 Vκ및 6A3.L27 Vκ)의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기 CDR의 하나, 둘, 또는 세 가지로 구성되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공하였다:

(iv) 서열번호 39에 제시한 CDRH1

(v) 서열번호 40에 제시한 CDRH2

(vi) 서열번호 41에 제시한 CDRH3

상기 항체는 또한 중쇄 가변 영역의 24 번 위치의 Val, 27번 위치의 Tyr, 28번 위치의 Ser, 29번 위치의 Ile, 30번 위치의 Thr, 48번 위치의 Met, 49번 위치의 Gly, 67번 위치의 Ile, 68번 위치의 Ser, 71번 위치의 Arg, 73번 위치의 Thr 및 78번 위치의 Phe 중의 적어도 한 가지 및 하기 CDR의 하나, 둘 또는 세 가지로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함한다:

(i) 서열번호 42에 제시한CDRL1

(ii) 서열번호 43에 제시한 CDRL2

(iii) 서열번호 44에 제시한 CDRL3

상기 항체는 또한:

(a) 경쇄 가변 영역의 45번 위치의 Gln 잔기 및 70번 위치의 Lys 잔기의 하나 또는 두 가지 전부; 또는

(b) 4번 위치의 Leu, 31번 위치의 Tyr, 70번 위치의 Met, 85번 위치의 Thr, 94번 위치의 Tyr, 100번 위치의 Gly 및 104 번 위치의 Val 중 하나 또는 그 이상을 포함한다(Kabat에 따른 번호화).

상기 항체는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 모든 조합을 포함할 수 있는데, 상기 6가지 CDR에 대한 하나의 중쇄 CDR 및 하나의 경쇄 CDR을 포함한다.

하나의 실시예에서, 항체는 하기 CDR로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다:

(i) 서열번호 39에 제시한 CDRH1

(ii) 서열번호 40에 제시한 CDRH2

(iii) 서열번호 41에 제시한 CDRH3

(iv) 서열번호 42에 제시한 CDRL1

(v) 서열번호 43에 제시한 CDRL2

(vi) 서열번호 44에 제시한 CDRL3

상기 항체는 또한

(a) 중쇄 가변 영역의 24번 위치의 Val, 27번 위치의 Tyr, 28번 위치의 Ser, 29번 위치의 Ile, 30번 위치의 Thr, 48번 위치의 Met, 49번 위치의 Gly, 67번 위치의 Ile, 68번 위치의 Ser, 71번 위치의 Arg, 73번 위치의 Thr 및 78번 위치의 Phe: 및/또는

(b)

a. 경쇄 가변 영역의 45 번 위치의 Gln 잔기 및 70번 위치의 Lys 잔기 중 적어도 한가지, 또는

b. 4번 위치의 Leu, 31번 위치의 Tyr, 70번 위치의 Met, 85번 위치의 Thr, 94번 위치의 Tyr, 100번 위치의 Gly 및 104번 위치의 Val(Kabat에 따른 번호화) 중 하나 또는 그 이상

의 적어도 한 가지를 포함한다.

본 발명은 상세히 설명한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들의 모든 쌍을 고려한다. 그러므로, 하나의 실시예에서, 본 발명은 또한 하기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 조합들의 어느 한 가지를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하였다:

서열번호 47의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 139에 대하여 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 48의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98 % 또는 그 이상, 또는 99 % 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 49의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 50의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 하나의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 51의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대하여 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 52의 중쇄 가변 도메인 (또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 53의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75 % 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98 % 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 54의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 55의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 56의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 57의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 58의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 59의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 60의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 61의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 62의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 63의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 64의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 65의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 66의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열);

서열번호 67의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열); 및

서열번호 68의 중쇄 가변 도메인(또는 이에 대해서 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90 % 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열)과 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지의 경쇄 가변 도메인(또는 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 138 중 어느 한 가지에 대해서 75% 또는 그 이상, 80 % 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 또는, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가진 서열).

특별한 실시예에서, 서열번호 53, 54, 54 또는 56에 제시한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 138에 제시한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공하였다.

항원 결합 단백질은 항체, 특히, 인간적응된 항체 또는 인간의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수도 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 28의 가변 중쇄 도메인과 서열번호 29의 가변 경쇄 도메인 또는 서열번호 73의 가변 중쇄 도메인과 서열번호 74의 가변 중쇄 도메인을 포함하는 키메라 항체를 제공하였다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 TSLP 신호전달을 저해하지 않을 수도 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 TSLP 신호전달을 저해하지 않았다.

본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하였다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 서열번호 30부터 38, 서열번호 75부터 113, 서열번호 119부터 120, 및 서열번호 122, 124, 128 및 130의 핵산분자들을 제공하였다. 본 발명은 또한 본문에서 설명한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 본문에서 설명한 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하였다. 발현 벡터는 서열번호 30내지 38, 서열번호 75내지 113, 서열번호 119내지 120 및 서열번호 122, 124, 126, 128 및 130 중 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 발현 벡터는 앞서 설명한 것처럼 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하였다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 앞서 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하였다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 앞서 설명한 숙주세포에 의해 발현되는 항체를 제공하였다.

또한 본 발명은 상기에서 언급한 대로의 방법이 세포를 배양하는 단계와 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 항원 결합 단백질의 생산에 대한 방법을 제공하였다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 서열을 포함하는 숙주 세포에 의해 발현되는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단백질을 제공하였다.

본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용할 수 있는 운반체 또는 부형제을 제공하였다.

본 발명은 또한 자가면역 또는 염증성 질환으로 고통받는 대상을 치료하는 방법을 제공하였고, 이 방법은 그 대상에게 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하였다.

본 발명은 또한 발병성의 T_H17 세포들이 관련된 질병으로 고통받는 대상을 치료하는 방법을 제공하였고, 이 방법은 그 대상에게 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하였다.

본 발명은 또한 IL-17 과다발현과 연관된 질병으로 고통받는 대상을 치료하는 방법을 제공하였고, 이 방법은 그 대상에게 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하였다.

특히, 자가면역 또는 염증성 질환, 발병성의 T_H17 세포들이 관련된 질환 또는 IL17의 과다발현과 연관된 질환은 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스(SLE), 류마티스성 관절염, 바체트 병 또는 천식일 수도 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 본 발명의 항원 결합 단백질은 다발성 경화증을 치료하는 방법으로 유용할 것이다. 본 발명의 항원 결합 단백질의 투여에 의해 치료할 수 있는 다른 질병들은 본문에서 상세히 설명하였다.

본 발명은 또한 자가면역 또는 염증성 질환, 발병성 T_H17 세포가 관련된 질병, 또는 IL17의 과발현과 연관된 질병으로 고통받는 대상을 치료하는 방법에 대해 본문에서 설명한 항원 결합 단백질을 제공하였다.

본 발명은 자가면역 또는 염증성 질환으로 고통받는 대상의 치료에 사용하는 약제의 제조시에 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 이용을 제공하고; 상기 질환은 발병성 T_H17 세포가 관련된 질환이거나; IL-17의 과발현에 연관된 질환이다.

본 발명의 다른 측면들과 실시예들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 hIL-7R를 발현하는 HEK293 세포주에 대한 항-IL7R 단일클론항체 1A11 H3L4의 보체 의존성 세포 독성을 보여주는 것이다.
도 2는 말초혈액 단핵구(PBMC)가 있는 경우에, hIL-7R를 발현하는 HEK293 세포주에 대한 인간적응된 항--IL7R 단일클론항체 1A11 H3L4 및 Fc 기능손상된 항- IL7R 단일클론항체(1A11 H3L4Fc)의 항체 의존성 세포가 매개하는 세포독성을 보여주는 것이다.
도 3A와 3B는 서로 다른 두 공여체들이 제공한 인간 PBMC에서 IL-7이 유도하는 STAT5 인산화의 1A11 H3L4에 의한 저해를 보여주는 것이다.
도 4A부터 4D는 (서로 다른 4개 공여체들의) 1A11 H3L4에 의해 분화된 인간 Th17 세포에서 IL-7이 유도하는 IL-17 생산 저해를 보여주는 것이다.
도 5A부터 5E는 1A11 H3L4 가 TSLP의 TARC(흉선과 활성-조절 케모카인) 유도에 영향을 주지 않는다는 점을 보여주는 것이다.

IL-7/IL7R 신호 전달은 마우스와 인간 두 체계에서 수임된 T_H17의 생존과 팽창에 매우 필요하지만, T_H17 분화에서 IL-7/IL7R 신호 전달의 역할은 IL-6의 역할(Liu et al, (2010) Nature Medicine 16:191-197)과 비교하면 필수적이지 않다. 놀랍게도, IL-7R 길항작용에 의해 면역계에 대한 생체 내 효과는 뇌척수염, 다발성 경화증에 대한 동물 모델, T_H17 세포에 대한 영향에서는 매우 선택적이고, 보다 적게는, 기억 표현형의 대부분인 T_H1 세포와 여분의 T_reg세포에 대하여 선택적이다. 이러한 선택성은 뇌척수염에서 IL-7R 길항작용에 의한 발병성 T_H17 세포 및 T_reg세포의 비율의 재조정에 중요한 역할을 하는 것처럼 보이고 치료 효능의 원인이 된다.

T_H17 세포의 생존 및 팽창에서 IL-7/IL7R 신호 전달의 역할은 MS 같은 인간의 자가면역 질환들에서 IL-7R 길항작용의 치료 효능을 지지한다. IL-7R 길항작용에 대한 IL-7의 중화작용은 독특한 치료의 장점을 갖는 것처럼 보인다. 한편으로는, 치료가 T_reg 및 비조절성 면역 세포들로부터 발병성 T_H1 세포와 T_H17 세포를 구분하는 선택성을 부여한다. 다른 한편으로는, IL-7R 길항작용에 대한 추가적인 치료 장점들이 T_H17 분화와는 대조적으로 분화된 T_H17의 생존 및 팽창에 대한 IL-7R 길항작용의 선택 효과를 포함한다. 수임된 T_H17와 T_H17 분화의 생체 내 보존에 대한 표적화는 치료 내용에서 좀 더 효과적이라는 것을 인식할 수 있다. 그러므로, IL-7 수용체가 매개하는 신호전달의 저해는 자가면역 또는염증성 질환의 치료에 대한 확실한 치료적 간섭을 제공한다.

IL-7R 신호전달이란 용어는, 본문에서 사용한 것처럼, IR-7R가 이의 리간드인 IL-7와 결합했을 때 IL-7R 수용체 복합체에 의해 유발되는 생물학적 효과를 의미한다. 그러므로 IL-7R이 매개하는 신호전달은 IL-7에 의해 유도되는 STAT-5 인산화, IL7이 유도하는 T_H17 세포의 팽창 및 IL-7이 유도하는 T_H17 세포의 생존 중에서 하나 또는 그 이상 또는 전부를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.

쥐의 항체인 1A11과 6A3은 특허 출원 번호 PCT/US2009/053136 (WO2010/017468)에서 상세히 설명하였다. 이러한 항체들은 인간 IL-7 수용체인 CD127(서열번호 1)의 알파 사슬에 특이적으로 결합한다. 이러한 항체들의 가변 도메인들은 서열번호 8과 9(각각 V_H와 V_κ1A11) 및 서열번호 45와 46(각각 V_H와V_κ6A3)에서 상세히 설명하였다.

본 발명은 1A11 또는 6A3 및 이의 변이체들의 상보성 결정 영역들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 항원 결합 단백질들을 제공한다. 항원 결합 단백질들은 IL-7R과 결합할 수도 있고 IL-7R 신호전달을 중화시킬 수도 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명은 하나의 인간 수용체 항체의 쥐의 항체들 1A11 또는 6A3(공여체 항체)로부터의 CDR 중 한 가지부터 6가지 모두를 포함하는 인간적응된 항체들을 제공한다.

본문에서 사용한 용어 "항원결합단백질"은 항체들, 항체 단편들 및 CD127에 결합할 수 있는 도메인들과 같은 다른 단백질 구조체들을 의미한다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다.

용어 "항체"는 본문에서처럼 면역글로불린-유사 도메인 같은 분자들을 의미하는 넓은 의미로 사용하였고 단일클론, 재조합, 다중클론성, 키메라, 인간적응된, 이중특이적 및 이질성접합체 항체들; 단일 가변 도메인, 도메인 항체, 항원 결합 단편들, 면역학적으로 효과적인 단편들, 단일 사슬 Fv, 이량체화, mdabs^TM 및 기타(또 다른 "항체" 형태들의 요약에 대해서는 Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136를 참조);를 포함한다.

문구 “단일 가변 도메인”은 다른 가변 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 항원결정기와 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 가변 도메인(예를 들어, V_H, V_HH, V_L)를 의미한다.

"도메인 항체" 또는 "dAb"는 항원과 결합할 수 있는 “단일 가변 도메인”과 같다고 고려할 수 있다. 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수도 있고, 설치류(예를 들어, WO 00/29004에서 개시한 것처럼), 수염 상어 및 카멜리드 V_HH dAbs 같은 다른 종들로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함할 수도 있다. 카멜리드 V_HH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종들로부터 유래한 면역 글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드들인데, 상기 종들은 자연스럽게 경쇄가 결핍된 중쇄 항체들을 생산한다. 이러한 V_HH도메인들은 “도메인 항체들”로 간주한다. 본문에서 사용한 것처럼 V_H는 카멜리드 V_HH도메인들을 포함한다. 본문에서 사용한 것처럼 용어 “도메인”은 단백질의 나머지 부분에 관계 없이 3차 구조를 갖는 접힌 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인들은 단백질들의 별개의 기능적 특성들의 주요 원인이고, 많은 경우에 추가, 제거되거나 단백질 및/또는 도메인의 남은 부분의 기능 손실 없이 다른 단백질로 운반될 수도 있다. “단일 가변 도메인”은 항체 가변 도메인의 특성을 가진 서열들을 포함하는 접힌 폴리펩티드 도메인이다. 그러므로, 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인들 및 변형된 가변 도메인들을 포함하고, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 고리들은 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열로 교체되거나 또는 적어도 결합 활성 및 전장 도메인의 특이성을 보유한 가변 도메인들의 접힌 단편들뿐만 아니라 절단되거나 N-말단 확장 또는 C-말단 확장을 포함하는 항체 가변 도메인으로 교체되었다. 도메인은 다른 가변 영역 또는 도메인에 관계 없이 항원 또는 항원결정기에 결합할 수 있다.

항원 결합 단편은 도메인 같은 비-항체 단백질 지지체들 상의 하나 또는 그 이상의 CDR의 배열 방법에 의해 제공할 수 있다. 비-항체 단백질 지지체 또는 도메인은 본래의 리간드와는 다른 리간드에 대한 결합을 수득하기 위한, 예를 들어: CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A(친화체, SpA)의 Z-도메인 같은 단백질 A 유래 분자들, A-도메인(아비머/Maxibody); GroEI 및 GroES 같은 열 충격 단백질; 트랜스페린(trans-body); 안키린 반복 단백질(DARPin); 펩타이드 앱타머; C-형태 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 g-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(affilins) ; PDX 도메인들; 인간 단백질 분해효소 저해제들의 전갈 toxinkunitz 형태 도메인들; 및 섬유결합소(어드넥틴):로부터 선택된 지지체의 유도체인 도메인은 단백질 공학의 대상이고, 이들은 본래의 리간드와는 다른 리간드에 대한 결합을 얻기 위한 결합을 수득하기 위한 단백질 공학의 대상이다.

CTLA-4(세포 독성 T 림프구-관련 항원 4)는 주로 CD4+ T 세포에 발현되는 CD28-군 수용체이다. 이의 세포 외 도메인은 가변 도메인과 유사한 면역글로불린 접힘을 가지고 있다. 항체들의 CDR에 상응하는 고리들은 다른 결합 특성들을 부여하는 이종의 서열로 치환할 수 있다. 다른 결합 특성들을 갖도록 조작한 CTLA-4 분자들은 또한 에비바디로 알려졌다. 좀 더 상세한 사항들은 [Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]를 참조한다.

리포칼린은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질 같은 작은 소수성 분자들을 운반하는 세포 외 단백질들의 군이다. 리포칼린은 다른 목표 항원들에 결합하도록 조작할 수 있는 정규 구조의 열린 말단에 번 위치한 다수의 고리로 형성된 단단한 β-sheet 2차 구조를 가지고 있다. 안티칼린은 160~180개의 아미노산 크기이고 리포칼린으로부터 유래한 것이다. 좀 더 자세한 사항들은 [Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1와 US20070224633]를 참조한다.

친화체들은 항원에 결합하도록 조작할 수 있는 Staphylococcus aureus 의 단백질 A로부터 유래한 지지체이다. 도메인은 대략 58개 아미노산의 3개-나선형 다발로 구성되어 있다. 라이브러리들은 표면 잔기들의 임의 추출에 의해 제작하였다. 좀 더 상세한 사항은 [Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 [EP1641818A1]를 참조한다.

아비머들은 A-도메인 지지체 군으로부터 유래한 단백질들이다. 약 35개 아미노산의 선천성 도메인들은 정의된 이황화 결합 구조를 수용한다. 다양성은 A-도메인들 군에 의해 나타나는 천연 변이들의 순서바뀜(shuffling)에 의해 만들어진다. 좀 더 자세한 사항은 [Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) 와 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]를 참조한다.

트랜스페린은 단량체의 혈청 운반 당 단백질이다. 트랜스페린들은 허용된 표면 고리 내에 하나 또는 그 이상의 CDR 같은 펩타이드 서열들을 삽입함으로써 다른 표적 항원들에 결합하도록 가공할 수 있다. 가공한 트랜스페린 지지체들의 예는 Trans-body를 포함한다. 좀 더 자세한 사항은 [J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]를 참조한다.

계획적인 안키린 반복 단백질들(DARPins)는 세포 골격에 대한 내장된 막 단백질들의 부착을 매개하는 단백질 군인 안키린으로부터 유래한 것이다. 하나의 단일 안키린 반복은 2개의 α-나선과 β-턴으로 구성된 33 잔기 모티프이다. 안키린 반복 단백질들은 각각 반복 구조의 첫번째 a-helix 와 a b-turn내의 잔기들을 임의추출하거나 하나 또는 그 이상의 CDR 같은 펩타이드 서열의 삽입에 의해 다른 표적 항원들에 결합하도록 가공할 수 있다. 이들의 결합 경계면은 모듈(친화성 성숙의 방법)의 수를 증가시킴으로써 증가할 수 있다. 좀 더 자세한 사항은 [J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 [US20040132028A1]를 참조한다.

섬유결합소는 항원에 결합하도록 가공할 수 있는 지지체이다. 어드넥틴은 인간 섬유결합소 형태 III(FN3)의 15개 반복 단위의 10번째 도메인의 천연 아미모산 서열의 기본 골격으로 구성되어 있다. 좀 더 자세항 사항은 [Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], [US20080139791], [WO2005056764] 및 [US6818418B1]를 참조한다.

펩타이드 앱타머들은 변함없는 지지체 단백질, 활성 부위에 삽입된 제한적인 가변 펩타이드 고리를 포함하는 전형적인 티오레독신(TrxA)로 구성된 조합적 인식 분자들이다. 좀 더 자세한 사항은 [Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]를 참조한다.

미소체들은 3~4 Cys 가교를 포함하는 길이가 25~50 아미노산인 천연 발생하는 미세 단백질들로부터 유래한다; 미세단백질들의 예는 카라타B1, 코노톡신 및 크노틴을 포함한다. 미세단백질들은 미세단백질의 전체 접힘에 영향을 주지 않으면서 25개 아미노산을 포함하도록 가공할 수 있는 루프를 가지고 있다. 가공한 크노틴 도메인의 좀 더 자세한 사항은 [WO2008098796]를 참조한다.

다른 결합 도메인들은 다른 표적 항원 결합 특성들을 가공하기 위한 지지체로 사용하는 단백질들을 포함하고, [Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel)]의 7장 및 Protein Science 15:14-27 (2006)에서 검토한 인간 g-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(어플린), 인간 단백질 분해효소 저해제들의 kunitx 형태 도메인들, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ 도메인들, 전갈 독소, C-형태 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함한다. 본 발명의 결합 도메인들은 이러한 대체적인 단백질 도메인들 중 어느 한 가지 및 그 도메인으로 이식하는 본 발명의 CDR의 모든 조합들로부터 제조할 수 있다.

항원 결합 단편 또는 면역학적으로 효과적인 단편은 부분적으로 중쇄 또는 경쇄 가변 서열들을 포함할 수 있다. 단편들은 길이가 적어도 5,6,8 또는 10개인 아미노산이다. 다른 대안으로써, 단편들은 길이가 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 75 또는 적어도 100 개인 아미노산이다.

항원 결합 단백질에 관련한 본 명세서에서 전반적으로 사용한 것처럼 용어 "특이적으로 결합"은 항원 결합 단백질이 다른 (예를 들어, 관련 없는) 단백질과의 결합 없이 또는 중요하지 않은 결합과 동시에 CD127과 결합한다는 의미한다-즉 본문에서 언급한 항원 결합 단백질 및 항체들은 CD127에 특이적으로 결합할 수 있다. 하지만 이 용어는 항원 결합 단백질들이 또한 다른 종들, 예를 들어 쥐의 CD127, 게잡이 원숭이(마카카 파스시쿨라리스) 또는 마모셋의 CD127과 교차결합할 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질은 게잡이 원숭이와 마모셋 CD127 모두와 결합한다. 본문에서 언급한 항원 결합 단백질들은 다른 종들로부터의 CD127에 결합하는 것보다 인간 CD127에 대하여 적어도 2, 5, 10, 50, 100 또는 1000 배가 큰 친화도를 가지고 결합할 수 있다.

항원 결합 단백질-CD127 상호작용의 결합 친화도 또는 평형 해리 상수(K_D)는 100 nM 또는 이보다 작거나, 10 nM 또는 이보다 작거나, 2 nM 또는 이보다 작거나, 또는 1 nM 또는 이보다 작을 수 있다. 다른 대안으로써 K_D 는 5 와 10 Nm 사이; 또는 1 과 2 nM 사이에 있을 수 있다. K_D 는1 pM내지 500 pM 사이; 또는 500 pM 과 1 nM 사이에 있을 수 있다. 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 결합 속도 상수(k_a)와 해리 속도 상수(k_d) (K_D = k_d/k_a)에 의해 결정된다. 결합 친화도는 BIAcore^TM에 의해, 예를 들어, 주요 아민 결합에 의한 CM5 칩으로 연결한 CD127를 이용한 항원 포착 및 이러한 표면에서의 항체 표착에 의해 측정할 수 있다. 실시예 4에서 설명한 The BIAcore^TM 방법은 결합 친화도 측정에 사용할 수 있다. 다른 대안으로써, 결합 친화도는 FORTEbio에 의해 측정할 수 있는데, 예를 들어 주요 아민 결합에 의한 CM5 바늘 위로 연결된 CD127을 이용한 항원 포착 및 이러한 표면 위의 항체 포착에 의해서 측정할 수 있다.

k_d 는 1x10^-3 s^-1 또는 이보다 낮을 수 있고, 1x10^-4 s^-1 이거나 또는 이보다 낮을 수 있고, 또는 1x10^-5 s^-1 이거나 또는 이보다 낮을 수 있다. k_d 는 1x10^-5 s^-1 과 1x10^-4 s^-1사이 또는 1x10^-4 s^-1 와 1x10^-3 s^- ¹사이일 수 있다. 느린 k_d 는 항원 결합 단백질-리간드 복찹체의 느린 분리를 야기시켜서 리간드의 중화를 향상시킨다.

당 업자들에게 용어 "유래된"은 재료에 대한 물리적 기원의 의미에서 원천으로 정의할 뿐만 아니라 참고 원천으로부터 기원하지 않은 재료에 구조적으로 동일한 재료로 정의하는 것을 의미한다는 점이 명백할 것이다. 그러므로 "공여체 항체에서 보이는 잔기들"은 필수적으로 공여체 항체로부터 정제할 필요가 없다.

분리는 항원 결합 단백질 같은 분자를 자연 그대로 찾을 수 있는 환경으로부터 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 분자는 자연 상태에 정상적으로 공존하는 물질들로부터 분리 정제할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 항원 결합 단백질을 포함하는 배양 배지에 대해 더 높게 정제할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질들 및 항체들은 분리된 항원 단백질들 및 항체들일 수 있다.

"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역들과 결합한 공여체 항체로부터 유래한 자연 발생하는 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 포함하는 가공 항체 형태를 의미한다.

"인간적응된 항체"는 비-인간 공여체 면역글로불린으로부터의, 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래한 분자의 잔여 면역글로불린-유래한 일부분으로부터의 파생한 하나 또는 그 이상의 CDR를 갖춘 가공 항체 형태를 의미힌다. 부가적으로, 골격 지지 잔기들은 결합 친화도를 보존하도록 변형할 수 있다(참조, 예를 들어 [Queen et al. Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991))]. 적절한 인간 수용체 항체는 공여체 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들에 대한 유사성에 의한 통상적인 데이터베이스, 예를 들어 KABAT 데이터베이스, 로스알라모스 데이터베이스, 및 S스위스 프로테인 데이터베이스로부터 선택한 한 가지일 수 있다. 공여체 항체의 골격 영역(아미노산 기반)에 대한 유사성에 의해 특성화된 인간 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 가변 골격 영역을 제공하는 것에 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 골격 영역들을 제공하는 적절한 수용체 항체는 유사한 방법으로 선택할 수 있다. 수용체 항체 중쇄 및 경쇄는 같은 수용체 항체로부터 기원해야 할 필요가 없다는 점에 주의해야 한다. 선행 기술은 이러한 인간적응된 항체들을 생산하는 다양한 방법을 상세히 설명하고 있으며, 예를 들어 [EP-A-0239400] 및 [EP-A-054951]을 참조한다.

용어 "공여체 항체"는 항체의 가변 영역, 하나 또는 그 이상의 CDR, 또는 다른 기능적 단편들 또는 첫 번째 면역 글로불린 파트너에 대한 이의 유사체들에 기여하는 항체를 의미한다. 그러므로 공여체는 변형된 면역글로불린 암호화 영역 및 그 결과로써 발현된 항원 특이성 및 공여체 항체의 특징적인 중화 활성을 갖춘 항체를 제공한다.

용어 "수용체 항체"는 공여체 항체와는 이질적이며, 수용체 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 골격 영역들을 암호화하는 아미노산 서열들의 모든 부분(또는 어느 일부분) 및/또는, 첫 번째 면역글로불린 파트너에 대한 수용체 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역들에 기여하는 항체를 의미한다.

용어들 "V_H"와 "V_L"은 항원 결합 단백질 각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 대한 의미로 본문에서 사용하였다. Vκ또한 가변 경쇄 도메인을 의미하는 것으로 사용하였다.

"CDR"는 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열들로써 정의하였다. CDR는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 극변 영역들이다. 면역글로불린의 가변 부위에는 3개의 중쇄 및 3 개의 경쇄 CDR(또는 CDR 영역들)이 있다. 그러므로, "CDR"는 모든 3 가지 중쇄 CDR, 모든 3 가지 경쇄 CDR, 모든 중쇄 및 경쇄 CDR, 또는 적어도 2 개의 CDR를 의미하는 것으로 본문에서 사용하였다.

본 명세서를 통해, 가변 도메인 서열들 및 전장 항체 서열들 내의 아미노산 잔기들은 다른 방식으로 특정된 바가 없으면 Kabat 번호화 조항에 따라 번호화하였다. 유사하게도, 실시예들에서 사용한 용어 "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"는 Kabat 번호화 조항을 따르고 있다. 좀 더 상세한 정보를 대해서는, [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]를 참조한다.

가변 도메인 서열들과 전장 항체 서열들의 아미노산 잔기들에 대하여 또 다른 번호화 조항들이 있다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다. 또한 [Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883]으로 표시되는 예처럼 CDR 서열들에 대한 또 다른 번호화 조항들이 있다. 항체의 구조와 단백질 접힘은 다른 잔기들을 CDR 서열의 일부로 판단하고 숙련된 이들에 의해 이러한 방식으로 이해될 수 있다는 것을 의미한다. 그러므로, 용어 "상응 CDR"은 예를 들어 표 1로 표시되는 것처럼, 하나의 번호화 조항을 이용한 CDR 서열을 의미하는 것으로 본문에서 사용하였다.

숙련된 이들에게 유용한 CDR 서열에 대한 다른 번호화 조항들은 "AbM(University of Bath) 및 "콘택트"(University College London) 방법들을 포함한다. Kabat, Chothia, AbM 및 콘택트 방법들 중의 적어도 2 가지를 사용할 때 최소의 겹치는 영역은 "최소 결합 단위"를 제공할 때 결정할 수 있다. 최소 결합 단위는 CDR의 하위-일부분이 될 수 있다.

하기의 표 1은 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대한 각각의 번호화 조항을 사용하는 한 가지 정의를 나타낸다. Kabat 번호화 방식은 가변 도메인 아미노산 서열을 번호화하는 표 1에서 사용하였다. CDR 정의들 중 일부는 각각의 사용한 발표에 따라 다를 수 있다는 점을 주의해야 한다.

	Kabat CDR	Chothia CDR	AbM CDR	콘택트 CDR	최소결합단위
H1	31-35/35A/35B	26-32/33/34	26-35/35A/35B	30-35/35A/35B	31-32
H2	50-65	52-56	50-58	47-58	52-56
H3	95-102	95-102	95-102	93-101	95-101
L1	24-34	24-34	24-34	30-36	30-34
L2	50-56	50-56	50-56	46-55	50-55
L3	89-97	89-97	89-97	89-96	89-96

본문에서 사용한 것처럼, 용어 "항원 결합 번 위치"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 단백질의 번 위치를 의미한다. 이는 단일 도메인(예를 들어, 항원결정기-결합 도메인), 또는 단일-사슬 Fv(ScFv) 도메인일 수 있거나 표준 항체에서 볼 수 있는 것처럼 짝을 이룬 V_H/V_L 도메인일 수도 있다.

본문에서 사용한 것처럼 용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질의 특별한 결합 도메인과 접촉할 수 있는 항원의 일부분을 의미한다. 에피토프는 직선형일 수 있고, 항원으로부터의 필수적인 직선형 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 대안으로써, 에피토프는 배좌형태이거나 불연속적일 수도 있다. 예를 들어, 배좌형태의 에피토프는 구조적 제한이 있는 구성요소들을 필요로 하는 아미노산 잔기들을 포함한다. 불연속적인 에피토프는 다른 서열들, 예를 들어, 항원의 주요 서열 내의 연속적인 서열이 아닌 서열에 의해 구분되는 아미노산 잔기들을 포함한다. 항원의 3차 및 4차 구조의 상황에서, 불연속적인 에피토프의 잔기들은 충분히 가까워서 항원 결합 단백질에 의해 서로 결합할 수 있다.

뉴클레오티드 및 아미노산 서열들에 대하여, 용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 2가지 핵산 또는 2가지 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도 및 만약 필요하다면 최적화된 일직선 배열 및 적절한 삽입 또는 결실과 비교했을 때를 의미한다.

두 서열들 간의 백분율 동일성은 틈들의 숫자 및 각 틈의 길이를 고려한 서열들이 공유하는 동일한 번 위치들의 숫자의 함수(예를 들어, % 동일성=동일한 번 위치들의 숫자/전체 번 위치들의 숫자 * 100)이고, 이는 두 서열들 사이의 최적 일직선 배열을 위해 도입할 필요가 있다. 서열들의 비교 및 두 서열들 사이의 백분율 동일성의 결정은 하기에서 상세히 설명하는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.

두 뉴클레오티드 서열들 간의 백분율 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여, NWS gapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 틈 무게 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 무게를 사용하여 결정할 수 있다. 또한 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 간의 백분율 동일성은 PAM120 무게 잔기 표, 12의 틈 길이 페널티 및 4의 틈 페널티를 이용하여 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 병합시킨 E.Meyers 및 W.Miller의 알고리즘[Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]을 이용하여 결정할 수 있다. 부가적으로, 두 아미노산 서열들 간의 백분율 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중의 한 가지와 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 틈 무게 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길기 무게를 이용하여 GCG 소프트웨어 패키지에 GAP 프로그램으로 병합시킨 Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.

하나의 방법에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 본문에서 설명한 것처럼 참고 폴리뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있는데(예를 들어 서열번호 30에서 39, 서열번호 76~105를 참조), 이는 100% 동일하거나, 참고 서열과 비교했을 때 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 것처럼 뉴클레오티드 변화의 특정 정수만큼 포함할 수도 있다. 이러한 변화들은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결식, 치환, 전치 및 전환 포함, 또는 삽입 중에서 선택하였고, 여기서 언급한 변화들은 참고 뉴클레오티드 서열의 5'말단 번 위치 또는 3'말단 번 위치 또는 두 말단 번 위치 사이의 모든 번 위치에서 발생할 수 있고, 참고 서열의 뉴클레오티드들 사이의 각각에 배치되거나 참고 서열 내의 하나 또는 그 이상의 연속된 그룹들에서 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변화들의 수는 본문에서 설명한 것처럼 참고 폴리뉴클레오티드 서열 내 모든 뉴클레오티드의 수를 곱함으로써(예를 들어 서열번호 30~39, 서열번호 76~105를 참조), 예상 백분율 동일성(100으로 나눈)의 숫자로 나타낸 백분율 및 본문에서 설명한 것처럼 참고 폴리뉴클레오티드 서열 내의 모든 뉴클레오티드 숫자로부터 이러한 생성물을 뺌으로써, 또는 n_n ≤x_n - (x_n ㆍy),여기서 n_n은 뉴클레오티드 변화의 수, x_n은 본문에서 설명한 것처럼 참고 폴리뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오티드 수(예를 들어 서열번호 30~39, 서열번호 76~105 참조), 및 y는 50%에 대하여 0.50, 60%에 대하여 0.60, 70%에 대하여 0.70, 75%에 대하여 0.75, 80%에 대하여 0.80, 85%에 대하여 0.85, 90%에 대하여 0.90, 95%에 대하여 0.95, 98%에 대하여 0.98, 99%에 대하여 0.99 또는 100%에 대하여 1.00, ㆍ는 곱셈 연산에 대한 기호이며 x_n의 모든 비-정수 생성물과 y는 x_n으로부터 y를 빼기 전에 끝자리수를 잘라낸 가장 가까운 정수로써 결정한다.

유사하게도, 폴리펩티드 서열은 본문에서 설명한 것처럼(예를 들어 서열번호 1~29, 서열번호 40~75 참조) 100% 동일한 폴리펩티드 참고 서열에 대해 동일할 수 있거나, 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 동일한 것처럼 % 동일성은 100%보다 적은 참고 서열과 비교한 것과 같이 아미노산 변화들의 특정 정수까지 포함할 수 있다.

이러한 변화들은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환, 보존적 및 비-보존적 치환을 포함, 또는 삽입으로 구성된 그룹으로부터 선택하고, 여기서 언급한 변화들은 참고 폴리펩티드 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 번 위치, 또는 양 말단 번 위치 사이의 한 가지 번 위치에서도 발생할 수 있고, 참고 서열의 아미노산 사이의 각각에 배치될 수도 있거나, 참고 서열 내의 하나 또는 그 이상의 연속 그룹 내에서 발생할 수도 있다. 주어진 % 동일성에 대한 아미노산 변화들의 수는 본문에서 설명한(예를 들어 서열번호 1~29, 서열번호 40~75 참조) 폴리펩티드 참고 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열 내의 모든 아미노산 수를 곱함으로써, 예상하는 퍼센트 동일성(100으로 나눈)의 숫자로 나타낸 백분율에 의해서, 본문에서 설명한 것처럼(예를 들어 서열번호 1~29, 서열번호 40~75 참조) 폴리펩티드 참고 서열 내의 언급한 모든 아미노산 숫자로부터 상기 생성물을 뺌으로써, 또는 n_a _≤x_a - (x_a ㆍy), 여기서 n_a는 아미노산 변화의 숫자, x_a는 본문에서 설명한 것처럼(예를 들어 서열번호 1~29, 서열번호 40~75 참조) 참고 폴리펩티드 서열 내 모든 아미노산 숫자이고, y는 50%에 대하여 0.50, 60%에 대하여 0.60, 70%에 대하여 0.70, 75%에 대하여 0.75, 80%에 대하여 0.80, 85%에 대하여 0.85, 90%에 대하여 0.90, 95%에 대하여 0.95, 98%에 대하여 0.98, 99%에 대하여 0.99, 또는 100%에 대하여 1.00이며,ㆍ는 곱셉 연산에 대한 기호이고, 여기서 x_a 의 모든 비-정수 생성물 및 y는 x_n으로부터 y를 빼기 전에 끝자리수를 잘라낸 가장 가까운 정수로써 결정된다.

% 동일성은 전장 서열 또는 이의 단편들 사이의 교차; 및 삽입 또는 결실이 있거나 없는 조건에 의해 결정된다.

용어 "펩타이드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 각각 두 가지 또는 그 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 의미한다. 펩타이드는 단량체 또는 다량체일 수 있다.

당 업계에서는 특정 아미노산 치환을 "보존적"으로 판단하여 인식하고 있다. 아미노산은 공통적인 측쇄의 특성 및 하기 표 2에서 알 수 있듯이, 항원 결합 단백질의 결합 친화도의 전부 또는 대부분을 보존적 치환으로 판단하는 그룹들 내의 치환들에 기초하여 여러 그룹으로 나눌 수 있다:

측쇄	구성원
소수성	met, ala, val, leu, ile
중화 친수성	cyc, ser, thr
산성	asp, glu
염기성	asn, gln, his, lys, arg
사슬 방향에 영향을 주는 잔기들	gly, pro
고리형	trp, t y r phe

본 발명은 CD127에 결합하고 서열번호 4의 CDRH3; 및 CDRH3의 변이체, 또는 서열번호 132에서 서열번호 137의 CDRH3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 특이적으로 CD127에 결합할 수 있고 또한 IL-7R 활성을 중화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 서열번호 3의 CDRH2; 또는 CDRH2의 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 특이적으로 CD127에 결합할 수 있고 또한 IL-7R 활성을 중화시킬 수 있다.

항원 결합 단백질은 또한 상기에서 설명한 CDRH3 또는 CDRH2 서열들, 하나 또는 그 이상의 CDR, : CDRH1 (서열번호 2), CDRH2 (서열번호 3), CDRH3 (서열번호 4, 또는 서열번호 132에서 서열번호 137 사이의 어느 한 가지), CDRL1 (서열번호 5), CDRL2 (서열번호 6), 및 CDRL3 (서열번호 7); 또는 상기 CDR의 변이체:로부터 선택한 어느 한 조합을 추가적으로 포함할 수 있다.

예를 들어, 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 4) 및 CDRH1(서열번호 2), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 4) 및 CDRH2(서열번호 3), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 2) 및 CDRH2(서열번호 3), 및 CDRH3(서열번호 4), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 5) 및 CDRL2(서열번호 6), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL2(서열번호 6) 및 CDRL3(서열번호 7) 및 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 5), CDRL2(서열번호 6) 및 CDRL3(서열번호 7), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 4) 및 CDRL3(서열번호 7), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 4), CDRH2(서열번호 3) 및 CDRL2(서열번호 6) 및 CDRL3(서열번호 7), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 2), CDRH2(서열번호 3), CDRH3(서열번호 4), CDRL1(서열번호 5), CDRL2(서열번호 6) 및 CDRL3(서열번호 7)을 포함할 수 있다. 다른 대안으로써, 변이체 CDR이 존재할 수 있고, 또는 서열번호 4의 CDRH3는 서열번호 132~137의 CDR 중 어느 한 가지로 대체할 수 있다.

본 발명은 CD127에 결합하고 서열번호 41의 CDRH3; 또는 CDRH3의 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 또한 IL-7R 활성을 중화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 서열번호 40의 CDRH2; 또는 CDRH2의 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 또한 IL-7R 활성을 중화시킬 수 있다.

항원 결합 단백질은 또한 상기에서 설명한 CDRH3 또는 CDRH2 서열들에 부가하여, 하나 또는 그 이상의 CDR, 또는: CDRH1 (서열번호 39), CDRH2 (서열번호 40), CDRH3 (서열번호 41), CDRL1 (서열번호 42), CDRL2 (서열번호 43), 및 CDRL3 (서열번호 44); 또는 언급한 CDR의 변이체로부터 선택한 어느 한 조합의 모든 CDR를 포함할 수 있다.

예를 들어, 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 41) 및 CDRH1(서열번호 40), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 41) 및 CDRH2(서열번호 40), 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 39), CDRH2(서열번호 40), 및 CDRH3(서열번호 41), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 42) 및 CDRL2(서열번호 43), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL2(서열번호 43) 및 CDRL3(서열번호 44), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRL1(서열번호 42), CDRL2(서열번호 43) 및 CDRL3(서열번호 44), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 41) 및 CDRL3(서열번호 44), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 41), CDRH2(서열번호 40) 및 CDRL3(서열번호 44), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 CDRH3(서열번호 44), CDRH2(서열번호 40), CDRL2(서열번호 43) 및 CDRL3(서열번호 44), 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 CDRH1(서열번호 39), CDRH2(서열번호 40), CDRH3(서열번호 41), CDRL1(서열번호 42), CDRL2(서열번호 43) 및 CDRL3(서열번호 44)를 포함할 수 있다. 선태적으로 CDR 변이체들이 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 인간 수용체 골격 내에 서열번호 8의 가변 도메인 서열의 상응하는 CDRH3또는 이의 CDRH3 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 CD127 활성을 중화시킬 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간, 키메라 또는 인간적응된 항체일 수 있다.

항원 결합 단백질은 또한 서열번호 8 및/또는 서열번호 9의 가변 도메인 서열로부터 선택한 대응 CDR 또는 이의 CDR 변이체의 하나 또는 그 이상, 또는 전부를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 특이적으로 결합하고 인간 수용체 골격 내에 서열번호 45의 가변 도메인 서열의 대응하는 CDRH3 또는 이의 CDRH3 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 CD127 활성을 중화시킬 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간, 키메라 또는 인간적응된 항체일 수 있다.

항원 결합 단백질은 또한 서열번호 45 및/ 또는 서열번호 46의 가변 도메인 서열로부터 선택한 대응하는 CDR 또는 이의 CDR 변이체의 하나 또는 그 이상, 또는 전부를 포함할 수 있다.

예를 들어, 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 CRDH1, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 CDRH2, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3; 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL1 및 CDRL2, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL2 및 CDRL3, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3 및 CDRL3, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, CDRH2 및 CDRL3, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH3, CDRH2, CDRL2 및 CDRL3, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 상응하는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

상응하는 CDR는 Kabat(1987), Chothia(1989), AbM에 대한 참고 문헌 또는 접촉 방법에 의해 정의할 수 있다. 각각의 방법들에 대한 한 가지 정의는 표 1에서 확인할 수 있고 상응하는 CDR을 결정하는 참고 중쇄 가변 도메인(서열번호 8 또는 서열번호 45) 및 참고 경쇄 가변 도메인(서열번호 9 또는 서열번호 46)에 적용할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고, 서열번호 8의 Kabat 잔기 95~101 구성된 결합 단위 H3, 또는 H3 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 인간, 인간적응된 또는 키메라 항체 같은 항원 결합 단백질일 수도 있다.

항원 결합 단백질은 또한 서열번호 8의 Kabat 잔기 31~32번째를 포함하는 H1, 서열번호 8의 Kabat 잔기 52~56번째을 포함하는 H2, 서열번호 9의 Kabat 잔기 30~34를 포함하는 L1, 서열번호 9의 Kabat 잔기 50~55를 포함하는 L2 및 서열번호 9의 Kabat 잔기 89~96을 포함하는 L3; 또는 변이체 결합 유닛 중에서 선택하는 하나 또는 그 이상 또는 모든 결합 단위들을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 서열번호 45의 Kabat 잔기 95~101로 구성된 결합 단위 H3, 또는 변이체 H3를 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 인간, 인간적응된 또는 키메라 항체 같은 항원 결합 단백질일 수 있다.

항원 결합 단백질은 또한 서열번호 45의 Kabat 잔기 31~32로 구성된 H1, 서열번호 46의 Kabat 잔기 52~56으로 구성된 H2, 서열번호 46의 Kabat 잔기 30~34로 구성된 L1, 서열번호 46의 Kabat 잔기 50~55로 구성된 L2 및 서열번호 46의 Kabat 잔기 89~96으로 구성된 L3; 또는 변이체 결합 단위로부터 선택한 하나 또는 그 이상 또는 모든 결합 단위들을 포함할 수 있다.

예를 들어, 항원 결합 단백질은 결합 단위 H3 및 결합 단위 H1, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 H3 및 결합 단위 H2, 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합 단위 H1, 결합 단위 H2, 및 결합 단위 H3; 또는 이의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 결합단위 L1 및 결합단위 L2, 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합단위 L2 및 결합단위 L3, 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합단위 L1, 결합단위 L2, 및 결합단위 L3; 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 결합단위 H3 및 결합단위 L3, 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합단위 H3, 결합단위 H2, 및 결합단위 L3; 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 결합단위 H3, 결합단위 H2, 결합단위 L2, 및 결합단위 L3; 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질은 결합단위 H1, 결합단위 H2, 결합단위 H3, 결합단위 L1, 결합단위 L2, 및 결합단위 L3; 또는 이들의 변이체들을 포함할 수 있다.

CDR 변이체 또는 결합단위 변이체는 적어도 하나의 아미노산이 변형된 아미노산 서열을 포함하는데, 상기의 변형은아미노산 서열의 화학적 또는 부분 변형일 수 있고(예를 들어 적어도 10 아미노산 이상), 이러한 변형은 변이체가 변형되지 않은 서열의 생물학적 특성들을 유지하도록 허용한다. 예를 들어, 변이체는 CD127에 결합하는 기능적 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적 변형은 여러 개의 아미노산에 대한 하나의 결실 또는 치환에 의해, 또는 여러 개의 아미노산에 대한 하나의 첨가 또는 삽입에 의해 형성될 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 어느 하나의 조합 내에, 아미노산 서열 내에 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다. CDR 변이체 또는 결합단위 변이체는 어느 하나의 조합 내에, 아미노산 서열 내에 1, 2, 또는 3 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 잔기들의 치환들은 보존적 치환일 수 있는데, 예를 들어, 하나의 선택적인 소수성 아미노산에 대한 하나의 소수성 아미노산을 치환하는 것이다. 예를 들어 Leu은 Val, 또는 Ile으로 치환할 수 있다.

CDR L1, L2, L3, H1, H2 및 H3는 구조적으로 제한된 수의 주요 사슬 형태(정규 구조) 중 한 가지를 보이는 경향이 있다. CDR의 특별한 정규 구조 등급은 CDR의 길이 및 고리 패킹 2 가지에 의해 정의되고, CDR 및 골격 영역들(구조적으로 결정하는 잔기들 또는 SDRs)의 주요 번 위치에 있는 잔기들에 의해 결정된다. Martin과 Thornton [1996; J Mol Biol 263:800-815]은 “핵심 잔기” 정규 구조 견본들을 정하는 자동화된 방법을 만들어 내었다. 클러스터 분석은 일련의 CDR에 대한 정규 구조 등급들을 정하는데 사용하였고, 그런 후에 정규 구조 견본들은 매립된 소수성, 수소-결합 잔기들, 및 보존된 Gly과 Pro을 분석함으로써 확인되었다. 항체 서열들의 CDR은 서열을 핵심 잔기 견본들과 비교하고 동일성 또는 유사성 매트리스(matrice)를 이용하여 점수를 매김으로써 정규구조 등급을 정할 수 있다.

1A11 H3L4 항체(서열번호 13(1A11.H3 V_H) 또는 서열번호 22(1A11.L4 V_κ)의 정규구조 등급을 기초로 하여, 기능적 항체 결합은 이후의 CDR 치환들이 있으면 유지된다고 예측할 수 있고, 여기서 Kabat 번호 이전의 아미노산은 본래의 아미노산 서열이고 Kabat 번호 말단에 있는 아미노산 서열은 치환된 아미노산이다:

CDRH1 정규구조들:

Y32I, Y32H, Y32F, Y32T, Y32N, Y32C, Y32E, Y32D

T33Y, T33A, T33W, T33G, T33L, T33V

M34I, M34V, M34W

N35E, N35H, N35Q, N35S, N35Y, N35T

CDRH2 정규구조들:

L50R, L50E, L50W, L50Y, L50G, L50Q, L50V, L50N, L50K, N50A

I51L, I51V, I51T, I51S, I51N

N52D, N52L, N52S, N52Y

Y53A, Y53G, Y53S, Y53K, Y53T, Y53N

N54S, N54T, N54K, N54D, N54G

V56Y, V56R, V56E, V56D, V56G, V56S, V56A

S58K, S58N, S58T, S58D, S58R, S58G, S58F, S58Y

CDRH3 정규구조들:

V102Y, V102H, V102I, V102S, V102D, V102G

CDRL1 정규구조들:

S29V

M33L

CDRL3 정규구조들:

Q89L

E90Q

W91Y

Y93S, Y93R

따라서, 항원 결합 단백질은 CDR 번 위치 내에 상기의 치환들 중 어느 한 가지를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다. CDR 변이체마다, 상응하는 CDR마다, 결합 단위마다, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역마다, 중쇄 또는 경쇄마다, 및 항원 결합 단백질마다 다양한 치환들이 있을 수 있으며, 그러므로 치환의 어느 한 가지 조합은 본 발명의 항원 결합 단백질 내에 있을 수도 있는데, 이는 CDR의 정규 구조가 보존된다는 것을 의미한다.

의심을 회피하기 위해, 상기에서-설명한 치환들은 기능적인 항-CD127 항체를 계속 보존하는 한 수행할 수 있는 가능한 CDR 치환들을 제한하는 것으로 이해할 수는 없다.

CDR, 상응하는 CDR, 변이체 CDR, 결합 단위들 또는 언급한 변이체 결합 단위들을 포함하는 항원 결합 단백질은 EC50으로 설명한 것처럼 10배 이내의, 도는 1A11c(키메라, V_H-서열번호28, V_κ-서열번호29) 또는 6A3c(키메라, V_H-서열번호74, V_κ-서열번호75)에 의해 설명한 잠재력의 5배 이내의 CD127에 대한 결합의 잠재력을 보여주고 있다. CD127에 대한 결합의 잠재력은, 결합 친화도(예를 들어, BIAcore에 의해), 또는 EC50(예를 들어, ELISA 분석법에 의해) 같은 다양한 방법들에 의해 설명할 수 있다.

상기에서 논의한 대로, CDR의 특별한 정규구조 등급은 CDR 길이 또는 고리 패킹에 의해 정하며, CDR과 골격 영역들 내의 핵심 번 위치에 있는 잔기들에 의해 결정된다. 그러므로 서열번호 2~6, 변이체 CDR, 상응하는 CDR, 결합 단위들 또는 이들의 변이체들에 부가하여, 치환은 기능적 항체를 보존하면서 정규구조 등급에 기초하여 본 발명의 항원 결합 단백질의 골격 잔기들 내에서 만들 수 있다. 이러한 것들은 다음을 포함한다(Kabat 번호화 사용):

중쇄: 2 번 위치에서 V,I 또는 G; 4 번 위치에서 L 또는 V; 20 번 위치에서 L,I,M 또는 V; 22 번 위치에서 C; 24 번 위치에서 T,A,V,G 또는 S; 26 번 위치에서 G; 29 번 위치에서 I,F,L 또는 S; 36 번 위치에서 W; 47 번 위치에서 W 또는 Y; 48 번 위치에서 I,M,V 또는 L; 69 번 위치에서 I,L,F,M 또는 V; 71번 위치에서 V,A,R 또는 L; 78 번 위치에서 A,L,V,Y 또는 F; 80 번 위치에서 L 또는 M; 90 번 위치에서 Y 또는 F; 92 번 위치에서 C; 및/ 또는 94 번 위치에서 R,K,G,S,H 또는 N; 및/또는

경쇄: 2 번 위치에서 I, L 또는 V; 3 번 위치에서 V,Q,L 또는 E; 4 번 위치에서 M 또는 L; 23 번 위치에서 C; 35 번 위치에서 W; 36 번 위치에서 Y,L 또는 F; 46 번 위치에서 S,L,R 또는 V; 49 번 위치에서 Y,H,F 또는 K; 71 번 위치에서 Y 또는 F; 88 번 위치에서 C; 및/또는 98 번 위치에서 F.

상기에서 설명한 골격 번 위치의 어느 하나, 어느 하나의 조합, 또는 모든 번 위치들은 본 발명의 항원 결합 단백질 내에 있을 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 영역마다, 중쇄 또는 경쇄 마다, 및 항원 결합 단백질마다 다양한 변이체 골격 정규구조 번 위치들이 있을 수 있으며, 그러므로 어느 하나의 조합이 본 발명의 항원 결합 단백질 내에 있을 수도 있고, 이는 골격의 정규 구조가 보존된다는 것을 의미한다.

예를 들어, 경쇄 가변 골격은 2 번 위치에 V, 4 번 위치에 L, 20 번 위치에 V, 22 번 위치에 C, 24 번 위치에 A, 26 번 위치에 G, 29 번 위치에 F, 36 번 위치에 W, 47 번 위치에 W, 48 번 위치에 M, 69 번 위치에 L, 71 번 위치에 R, 78 번 위치에 A, 80 번 위치에 M, 90번 위치에 Y, 92 번 위치에 C 및 94 번 위치에 R를 포함할 수 있고, 예를 들어, 경쇄 가변 골격은 2번 위치에 I, 4 번 위치에 L, 23 번 위치에 C, 35 번 위치에 W, 36 번 위치에 Y, 71 번 위치에 F, 88 번 위치에 C, 90 번 위치에 E, 및 93 번 위치에 Y를 포함할 수 있다.

CDR, 상응하는 CDR, 변이체 CDR 또는 본문에서 설명한 결합 단위들 중 하나 또는 그 이상은 인간 골격의 컨텍스트, 예를 들어 인간적응된 항체 또는 키메라 가변 도메인 내에 있을 수도 있다.

인간적응된 중쇄 가변 도메인은 서열번호 2~4, 또는 서열번호 39~41; 이들의 변이체 CDR; 상응하는 CDR; 결합 단위들; 또는 이들의 변이체들, 서열번호 116의 인간 수용체 가변 도메인 서열에 대한 골격 영역들과 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상 또는 100%의 동일성을 가진 수용체 항체 골격 내에; 열거한 CDR를 포함할 수 있다.

인간적응된 경쇄 가변 도메인은 서열번호 5~7, 또는 서열번호 42~44; 이들의 변이체 CDR; 상응하는 CDR; 결합 단위들; 또는 이들의 변이체들, 서열번호 117의 인간 수용체 가변 도메인 서열에 대한 골격 영역들과 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상 또는 100%의 동일성을 가진 수용체 항체 골격 내에; 열거한 CDR를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 또는 131중 어느 하나로부터 선택한 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 27 중 어느 하나로부터 선택한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 가변 영여들 중 어느 하나는 경쇄 가변 영역들 중 어느 하나와 조합할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 CD127을 중화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 결합하고 서열번호 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69 중 어느 한 가지로부터 선택한 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 서열번호 70, 71, 72, 73 또는 138 중의 어느 하나로부터 선택한 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 중쇄 가변 영역들 중 어느 한 가지는 경쇄 가변 영역들 중 어느 한 가지와 조합할 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 CD127을 중화시킬 수 있다.

항체 중쇄 가변 영역은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 또는 131; 또는 서열번호 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69 중의 어느 한 가지에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98 % 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상, 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27; 또는 서열번호 70, 71, 72, 73 또는 138 중의 어느 한 가지에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98 % 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상, 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 121, 123, 125, 127, 129 또는 131의 변이체들의 퍼센트 동일성은 서열의 전장을 통해 결정할 수 있다.

항체 중쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 또는 131 중 어느 한 가지의 변이체일 수 있다.

항체 경쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 중 어느 한 가지의 변이체일 수 있다;

예를 들어, 상기에서 설명한 정규구조 CDR 및 정규구조 골격 잔기 치환들은 적어도 75% 동일하거나 30 아미노산 치환들까지 포함하는 변이체 서열로써 중쇄 또는 경쇄 가변 영역들 내에 존재할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 항체 중쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 서열번호 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 또는 69 중 어느 한 가지의 변이체일 수 있다. 항체 경쇄 가변 영역은 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는 서열번호 70, 71, 72 또는 73 중 어느 하나의 변이체일 수도 있다.

예를 들어, 상기에서 설명한 정규구조 CDR 및 정규구조 골격 잔기 치환은 또한 적어도 75% 동일하거나 30 아미노산 치환까지 포함하는 변이 서열들로써 변이체 중쇄 또는 경쇄 내에 존재할 수 있다.

본 발명의 중쇄 가변 영역들 중 어느 한 가지는 적절한 인간 불변 영역과 조합할 수 있다. 본 발명의 경쇄 가변 영역들 중 어느 한 가지는 적절한 불변 영역과 조합할 수 있다.

본 발명은 또한 CD127에 특이적으로 결합하고 하기의 어느 한 가지의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 조합: 1A11.H3.L4 (서열번호13 및 서열번호22)을 포함하는 항원 결합 단백질 또는 서열번호 13에 대하여 적어도 75% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 22에 대하여 적어도 75% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질은 또한 CD127을 중화시킬 수도 있다.

상기에서 설명한 항원 결합 단백질들은, 예를 들어 화학적 변화 및/또는 삽입, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 결실 또는 치환에 의한 서열의 부분적 변화를 갖는 변이체 또는 상기에서 설명한 서열들 중 어느 한 가지에 대해 75% 또는 그 이상, 80% 또는 그 이상, 85% 또는 그 이상, 90% 또는 그 이상, 95% 또는 그 이상, 98% 또는 그 이상, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 변이체들은, EC50 또는 BIAcore에 의해 설명한 것처럼, 1A11 또는 6A3에 의해 설명한 잠재력의 10배 이내 또는 5배 이내의 CD127에 대한 결합의 잠재력을 보여줄 수 있다. CD127에 대한 결합의 잠재력은, ELISA 분석법에 의해 수행한 EC50, 또는 BIAcore에 의해 수행한 결합 친화도에 의해 설명할 수 있다.

본 발명자들은 또한 CDRH3 내의 특정 번 위치들은 결합 친화도의 감소(예를 들어, 더 강한 결합)를 야기하도록 치환될 수 있다는 것을 실험적으로 결정하였다. 이러한 CDRH3 유사체들은 표 4에서 제시하였다. 번 위치 N98 및 F100b(Kabat 번호화)에서의 치환들은 친화도 증가에서 특별히 효과적인 것처럼 보인다. 특별한 치환은 N98D, N98E, F100bE, F100bI 및 F100Bv를 포함한다. 이러한 치환들을 표시하는 CDRH3 서열들은 각각 서열번호 132, 133, 134, 135, 136 및 137이다.

본 발명은 이러한 치환들의 본문에서 설명한 항체들 중 어느 한 가지로의 병합을 고려한다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 100번 위치의 W(Trp) 잔기를 가지고 있다.

항원 결합 단편의 작용 기능-예를 들어, ADCC 또는 CDC, 또는 반감기, 기타 사항을 변형시키는 것이 바람직할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 Fc 장애일 수 있다. Fc 장애를 달성하는 하나의 방법은 중쇄 불변 영역의 235 및 237(EU index 번호화) 번 위치에 Ala 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 다른 대안으로써, 항원 결합 단백질은 Fc 장애이거나 235 및 237 번 위치에 Ala 치환을 포함하지 않을 수도 있다.

항원 결합 단백질은 인간의 생체 내 조건에서, 또는 쥐의 동물 모델에서 적어도 6시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 7일, 또는 적어도 9일의 반감기를 가질 수 있다.

항원 결합 단백질은 랫, 마우스, 영장류(예를 들어, 시노몰거스, 올드 월드 멍키 또는 유인원) 또는 인간으로부터 유래할 수 있다. 항원 결합 단백질은 인간, 인간적응된 또는 키메라 항체일 수 있다. 항원 결합 단백질은 불변 영역을 포함할 수 있고, 이는 어느 하나의 동종형 또는 하위등급일 수 있다. 불변 영역은 IgG 동종형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 이들의 변이체들일 수도 있다. 항원 결합 단백질 불변 영역은 IgG1일 수도 있다.

항체의 Fc 효능 부분에 대한 돌연변이 변화는 항체 순환을 조정하는 FcRn과 항체 사이의 상호작용의 친화도의 변화에 사용할 수 있다. 항체의 반감기는 생체 내에서 연장할 수 있다. 최대의 투여량 및 최대의 투여 빈도가 좀 더 긴 시간에 대한 생체 내 IC₅₀의 유지 결과로써 얻을 수 있기 때문에, 이러한 점은 환자군에 대하여 이로울 수 있다. CD127을 발현하는 모든 세포들을 죽이는 것이 바람직하지 않기 때문에 항체의 Fc 작용 기능은 완전하게 또는 부분적으로 제거할 수 있다. 이러한 제거는 안전 외형의 증가를 야기시킬 수 있다.

불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질은 감소된 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효능 기능성을 가질 수 있다. 불변 도메인은 IgG2 또는 IgG4 동종형 또는 변이된 IgG1 불변 도메인의 자연 발생된 장애 불변 영역을 포함할 수 있다. 적절한 변형들에 대한 실시예들은 EP0307434에서 상세히 설명하였다. Fc 장애를 달성하는 하나의 방법은 중쇄 불변 영역의 235 및 237 번 위치(EU index 번호화)의 Ala 잔기들의 치환을 포함한다.

항원 결합 단백질은 항체가 향상된 효능 기능/ADCC 또는/및 보체 활성화를 갖도록 변이된 불변 도메인으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있다. 적절한 변이들에 대한 실시예들은 Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276:6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103:4005-4010 및 US6737056, WO2004063351 및 WO2004029207에서 상세히 설명하였다.

항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질이 향상된 효능 기능/ADCC 및/또는 보체 활성화를 갖도록 변형된 당화 형태를 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 변형된 당화 형태를 갖는 항원 결합 단백질을 생산하는 적절한 방법론들의 실시예들은 WO2003/011878, WO2006/014679 및 EP1229125에서 상세히 설명하였다.

항원 결합 단백질이 결합하는 CD127 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드일 수 있고, 세포 외 도메인(ECD), 다른 대안으로써 Fc 도메인 같은 다른 단백질과의 융합을 포함할 수 있거나, 전장 CD127 단백질을 포함할 수 있다. CD127은 용액 내 있을 수 있거나 고체 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, CD127은 자성 비드 같은 비즈에 부착될 수 있다. CD127은 바이오틴 잔기와 결합할 수 있다. CD127에 접합된 바이오틴 분자는 바이오틴스트렙타비딘을 고체 표면에 결합시킴으로써 고체 표면에 CD127을 고정시키는데 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 본문에서 설명한 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 (a)하나 또는 그 이상의 CDRH, 중쇄 가변 서열, 또는 전장 중쇄 서열; 및 (b)하나 또는 그 이상의 CDRL, 경쇄 가변 서열, 또는 같은 핵산 분자에 (i)및 (ii)를 갖는 전장 경쇄 서열을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 대안으로써, 본문에서 설명한 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 (a)하나 또는 그 이상의 CDRH, 중쇄 가변 서열, 또는 전장 중쇄 서열; 또는 (b)하나 또는 그 이상의 CDRL, 별개의 핵산 분자들 위에 (a) 및 (b)를 갖는 경쇄 가변 서열 또는 전장 경쇄 서열을 암호화하는 서열들을 포함할 수 있다.

중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 30~36을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 10~113을 포함할 수 있다.

중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 75~96을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 97~100을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본문에서 설명한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한 본문에서 설명한 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.

본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 적절한 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 본문에서 설명한 항원 결합 단백질을 생산하는 방법은 본문에서 설명한 숙주 세포 배양하는 단계를 포함할 수 있고 항원 결합 단백질을 회복시킬 수도 있다. 재조합 형질전환된, 형질주입된 또는 형질 도입된 숙주 세포는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 발현 카세트는 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 대안으로써, 재조합 형질전환된, 형질주입된, 또는 형질도입된 숙주세포는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하며, 여기서 첫 번째 발현 카세트는 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 두 번째 카세트를 포함한다. 안전하게 형질전환된 숙주세포는 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 발현카세트로 구성된 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어 그러한 숙주 세포들은 경쇄를 암호화하는 첫 번째 벡터와 중쇄를 암호화하는 두 번째 벡터를 포함할 수 있다.

숙주 세포는 진핵세포일 수 있으며, 예를 들어 포유동물 세포일 수 있다. 그러한 세포주들의 실시예들은 CHO 또는 NS0를 포함한다. 숙주 세포는 비-인간 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어 혈청이 없는 배양 배지 같은 배양 배지에서 배양할 수 있다. 항원 결합 단백질은 숙주 세포에 의해 배양 배지로 분비될 수 있다. 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질을 포함하는 상기 배양 비지에 대하여 적어도 95% 또는 그 이상(예를 들어 98% 또는 그 이상)까지 정제할 수 있다.

항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용하는 운반체를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 본 발명에 의해 제공될 수 있다. 사용 설명서와 함께 약제학적 조성물을 포함하는 성분키트 또한 제공되었다. 편의상, 성분키트는 사용 설명서와 함께 미리 결정된 양의 제재를 포함할 수 있다.

항체 구조들

비손상 항체들

대부분 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열에 근처하여 카파 및 람다라고 불리는 두 가지 형태 중 하나로 지정할 수 있다. 항체 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 의해, 인간 항체들은 다섯 가지의 다른 등급들, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 지정할 수 있다. IgG와 IgA는 또한 하위 등급인 IgG1, IgG2, IgG3와 IgG4; 및 IgA1 와 IgA2로 세분될 수 있다. 종들의 변이체들은 적어도 IgG2a, IgG2b를 포함하는 마우스와 랫과 함께 존재한다.

가변 영역의 좀 더 보존된 부분들은 골격 영역(FR)이라고 부른다. 손상되지 않은 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각 3개의 CDR 의해 연결된 4 개의 FR을 포함한다. 각 사슬 내의 CDR는 FR 영역들에 의해 매우 근접하여 뭉쳐 있고 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여하는 다른 사슬로부터의 CDR과 같이 존재한다.

불변 영역들은 항원에 대한 항체의 결합에 직적접으로 관련되어 있지 않지만 항체 의존성 세포 독성(ADCC)의 참여, Fcg 에 대한 결합을 통한 식균작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)을 통한 반감기/제거 속도 및 보체 캐스케이드의 C1q 성분에 의한 보체 의존성 세포 독성 같은 다양한 작용 기능을 보여준다.

인간 IgG2 불변 영역은 전형적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력 또는 항체-의존성 세포 독성을 매개하는 능력이 근본적으로 결핍되어 있다고 알려져 있다. IgG4 불변 영역은 전형적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력이 결핍되어 있고 항체-의존성 세포 독성을 매우 약하게 매개한다고 알려져 있다. 이러한 작용 기능들이 근본적으로 결핍된 항체들은 '비-용해성' 항체라고 명명할 수 있다. 본 발명에 따라, 항체가 근본적인 작용 기능이 없는 정도까지 임의적으로 항체의 작용 기능을 감소시키는 것이 바람직할 수도 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 비-용해성이다. 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 근본적으로 작용 기능이 없다. 항체는 세포독성 일부분 또는 방사선활성 일부분 같은 작용 기능을 변형시킬 의도의 분자 같은 다른 분자에 연결시키거나 연결시키지 않을 수 있다. 하나의 실시예에서, 항체는 방사선 표지 분자 또는 세포 독성 분자 같은 다른 분자에 연결하지 않는다. 이러한 실시예에서, 항체는 직접적인 세포-사멸 효과에 의하기보다는 자연적인 생물학적 상호작용을 억제함으로써 항체의 기능적 효과를 발휘한다.

인간 항체들

인간 항체들은 당업자들에게 알려진 다양한 방법들에 의해 생산할 수 있다. 인간 항체들은 인간 골수종 또는 마우스-인간 이질적 골수종 세포 주들을 이용한 융합세포 방법에 의해 제조할 수 있다(참조, Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)). 또 다른 방법들은 인간 가변 영역 목록(참조, Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23))들을 이용하는 파지 라이브러리 또는 형질전환 마우스의 사용 두 가지를 모두 포함한다.

형질 전환 마우스의 여러 가지 품종들은 형질전환 마우스 면역글로불린의 유전자좌가 인간의 면역글로불린 유전자 조각들로 치환할 수 있다는 점(참조, Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156))에서 현재 이용가능하다. 항원 검색 시에 이러한 마우스들은 관심 있는 항체들을 선택할 수 있는 인간 항체들의 목록을 생산할 수 있다.

파지 디스플레이기술은 인간 항체 결합 단백질(및 이의 단편들)의 생산에 사용할 수 있다 (참조, McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 and Griffiths et al. (1994) EMBO 13: 3245-3260).

친화도 성숙의 기술(Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783)은 주요 인간 항체의 친화도가 자연 발생적인 변이체를 포함하는 H 및 L 사슬 가변 영역들의 순차적인 교체 및 향상된 결합 친화도에 근거하여 선택함으로써 결합 친화도를 향상시키는데 사용할 수 있다. "에피토프 각인" 같은 이러한 기술의 변이체들 또한 현재 사용할 수 있다 (참조, WO 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266).

키메라 및 인간적응된 항체들

키메라 항체들은 전형적으로 재조합 DNA 방법들을 이용하여 생산할 수 있다. 항체들을 암호화하는 DNA(예를 들어, cDNA)는 통상적인 순서들(예를 들어, 항체의 H 및 L 사슬들을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용)을 이용하여 분리하여 서열 분석한다. 융합 세포주 세포들은 이러한 DNA의 전형적인 기원의 역할을 한다. 한번 분리시키면, DNA는 항체의 합성을 수득하기 위해 다르게 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균, COS 세포, CHO 세포 및 골수종 세포들 같은 숙주 세포들로 형질 주입하는 발현 벡터에 배치된다. DNA는 대응하는 비-인간(예를 들어, 쥐의) H 및 L 불변 영역들에 대하여 인간 L 및 H 사슬에 대한 암호화 서열을 치환함으로써 변형시킬 수 있다(참조, Morrison (1984) PNAS 81: 6851).

면역원성의 큰 감소는 비-인간(예를 들어, 쥐의) 항체의 CDR을 인간적응된 항체를 생산할 수 있는 인간 골격("수용체 골격") 및 불변 영역으로 단지 이식함으로써 달성할 수 있다 (참조, Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536)). 하지만, CDR 이식 그 자체로는 항원 결합 특성들의 완전히 보존시킬 수 없고 중요한 항원-결합 친화도가 회복된다면 수용체 항체의 일부 골격 잔기들(때때로 "역변이"라고 명명하는)은 인간 적응된 분자 내에 보존될 필요가 있다는 점이 수시로 발견된다(참조, Queen et al. (1989) PNAS 86: 10,029-10,033: Co et al. (1991) Nature 351: 501-502)). 이러한 경우에, 비-인간 수용체 항체에 대해 가장 큰 서열 유사성을 보여주는 인간 가변 영역들은 인간의 골격(FR)을 제공하기 위해 데이터베이스로부터 선택한다. 인간 FRs의 선택은 인간 보존적 항체들 또는 각각의 인간 항체들로부터 제조할 수 있다. 필요하다면, 수용체 항체들로부터의 핵심 잔기들은 CDR 형태들을 보존하기 위해 인간 수용체 골격으로 치환시킬 수 있다. 항체의 컴퓨터 모델화는 아마도 이러한 구조적으로 중요한 잔기들을 확인하는데 도움을 주도록 사용할 것이다(참조, WO 99/48523).

다른 대안으로써, 인간적응화는 아마도 "베니어링" 과정에 의해 달성할 것이다. 독특한 인간 및 쥐의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들의 통계적 분석은 노출된 잔기들의 정확한 패턴들이 인간 및 쥐의 항체들에서 다르다는 것을 밝혔고, 대부분 각각의 표면 번 위치들은 소수의 다른 잔기들에 대한 강한 선호도를 가지고 있다(참조, Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498; and Pedersen et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 959-973)). 그러므로 인간 항체들에서 흔히 볼 수 있는 잔기들과는 다른 항체의 골격 영역들에 노출된 잔기들을 교환함으로써 비-인간 Fv의 면역원성을 감소시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성은 표면 접근성과 관련될 수도 있기 때문에, 표면 잔기들의 교환은 마우스 가변 영역을 인간 면역 체계에 대해 "보이지 않게" 만들기에 충분할 수 있다(참조, Mark et al. (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134)). 단지 항체의 표면이 변하고 지지 잔기들은 영향을 받지 않기 때문에 이러한 인간적응의 과정을 "베니어링"이라고 한다. 또 다른 선택적인 접근들은 WO04/006955에 제시된 것과 박테리아 발현 체계를 이용하여 서열상 인간의 생식 계열에 가까운 항체를 생산하는 Humaneering^TM (Kalobios)의 순서를 포함한다(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California).

이중 특이적 항원 결합 단백질

이중 특이적 항원 결합 단백질은 적어도 두 가지 다른 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항원 결합 단백질이다. 이러한 항원 결합 단백질을 만드는 방법들은 당 업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이적 항원 결합 단백질의 재조합 생산은 2가지 면역 글로불린 H사슬-L 사슬 쌍의 동시-발현을 기초로 하는데, 여기서 2가지 H 사슬은 다른 결합 특이성을 갖는다(참조, Millstein et al. (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829; and Traunecker et al. (1991) EMBO 10: 3655-3659). H와 L 사슬의 무작위 분류 때문에, 10가지 다른 항체 구조들의 잠재적 혼합물을 생산하였고, 이 중에서 한 가지 구조만이 바람직한 결합 특이성을 갖는다. 하나의 선택적인 접근은 가변 도메인들과 경첩 영역의 적어도 일부와 CH2 및 CH3 영역으로 구성된 중쇄 불변 영역에 대한 바람직한 결합 특이성을 융합하는 것을 포함한다. 중쇄 결합에 필요한 부분을 포함하는 CH1 영역은 적어도 융합들 중 한 가지에 존재할 수 있다. 이러한 융합들 및 바람직한 L 사슬을 암호화하는 DNA는 개별적인 발현 벡터에 삽입하였고 적절한 숙주 생물체에 동시-형질주입하였다. 두 가지 또는 세 가지 사슬에 대한 암호화 서열들을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다. 하나의 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 팔에 첫번째 결합 특이성을 가진 H 사슬과 다른 팔에 두 번째 결합 특이성(참조 WO 94/04690)을 제공하는 H-L 사슬 쌍으로 구성되어 있다. 또한 Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121: 210.를 참조한다.

항원 결합 단편들

불변 영역이 결핍된 단편들은 전형적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 또는 항체-의존성 세포 독성을 매개하는 능력이 부족하다. 전통적으로 이러한 단편들은 예를 들어 papain 분해 (참조, [WO 94/29348])같은 비손상 항체의 단백질 분해효소의 분해에 의해 생산하지만 재조합 형질전환된 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산할 수도 있다. ScFv의 생산에 대해서는, [Bird et al. (1988) Science 242: 423-426]를 참조한다. 부가적으로, 항원 결합 단편들은 하기에서 설명하는 다양한 가공 기술들을 사용하여 생산할 수 있다.

Fv 단편들은 Fab 단편들보다 두 사슬 간에 더 낮은 상호작용 에너지를 갖는 것처럼 보인다. V_H 및 V_L 도메인들의 결합을 안정화시키기 위해, V_H 및 V_L 도메인들은 펩타이드[Bird et al. (1988) Science 242: 423-426] 및 [Huston et al. (1988) PNAS 85(16): 5879-5883], 이황화 가교([Glockshuber et al. (1990) Biochemistry 29: 1362-1367] 및 “놉 인 홀" 변이[Zhu et al. (1997) Protein Sci., 6: 781-788])로 연결시켰다. ScFv 단편들은 당 업자들에게 잘 알려진 방법들을 이용해 생산할 수 있다(참조, [Whitlow et al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105] 및 [Huston et al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217]). ScFv는 대장균 같은 원핵세포 또는 진핵 세포에서 생산할 수 있다. ScFv의 한 가지 단점은 생산물의 1가 결합인데, 이는 다원자가의 결합 및 짧은 반감기 때문에 향상된 결합성을 베재시킨다. 이러한 문제점들을 극복하려는 시험들은 화학 결합(Adams et al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034; and McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8: 301-314) 또는 짝이 없는 C-말단 Cys 잔기를 포함하는 ScFv의 자발적인 번 위치-특이적 이량체화(참조, Kipriyanov et al. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204)에 의해 추가적인 C-말단 Cys을 포함하는 ScFv로부터 생산한 2가 (ScFv')₂를 포함한다. 다른 대안으로써, ScFv는 펩타이드 링커를 3 에서 12번째 잔기까지 줄여서 “이량항체”를 형성함으로써 강제적으로 다량체를 형성할 수 있다(참조, Holliger et al. (1993) PNAS 90: 6444-6448). 링커를 더 감소시키면 ScFv 삼량체(“삼량항체”, 참조 Kortt et al. (1997) Protein Eng 10: 423-433) 및 사량체(“사량항체”, 참조 see Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168)가 될 수 있다. 2가 ScFv 분자의 제조 또한 “미니항체”를 형성하기 위한 단백질 이량화 모티프와의 유전적 융합에 의해 달성할 수 있다[참조, Pack et al. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584] 및 "미니바디"[see Hu et al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061)]. ScFv-Sc-Fv 연쇄 ((ScFv)₂)는 또한 2 개의 ScFv 단위체를 세 번째 펩타이드 링커에 의해 연결함으로써 생산할 수 있다[참조, Kurucz et al. (1995) J. Immol. 154: 4576-4582]. 이중특이적 이량항체는 한 항체로부터의 V_H 도메인이 또 다른 항체의 V_L 도메인에 대해 짧은 링커에 의해 연결되도록 구성된 두 가지 단일 사슬 융합 생산물의 비공유 결합을 통해 생산할 수 있다[참조, Kipriyanov et al. (1998) Int. J. Can 77: 763-772]. 이러한 이중특이적 이량항체의 안정성은 앞서 설명한 대로 이황화 가교 또는 "knob in hole"변이의 도입, 또는 두 개의 혼성 ScFv 단편들이 펩타이드 링커를 통해 연결되는 곳에 단일 사슬 이량항체를 형성함으로써 향상될 수 있다[참조, Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods 226:179-188]. 4가의 이중특이적 분자들은 예를 들어 ScFv 단편들을 IgG 분자의 CH3 도메인에 융합시키거나 경첩 영역을 통해 Fab 단편에 융합시킴으로써 이용할 수 있다[참조, Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163]. 다른 대안으로써, 4가의 이중특이적 분자들은 이중특이적 단일 사슬 이량항체들의 융합에 의해 창조할 수 있다. 더 작은 4가의 이중특이적 분자들은 또한 나선-고리-나선 모티프(DiBi 미니항체, 참조, [Muller et al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49])를 포함하는 링커를 이용하여 또는 분자내 짝 형성을 억제한느 방향으로 4가지 항체 가변 도메인을 포함하는 단일 사슬 분자(연쇄 이량항체, 참조 [Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56)]를 이용하여 두 가지 각각의 ScFv-ScFv 연쇄를 이량체화함으로써 형성할 수 있다. 이중특이적 F(ab')₂ 단편들은 Fab' 단편들의 화학적 결합에 의해 또는 Leu 지퍼를 통한 이질적이량체화에 의해 창조할 수 있다(참조, [Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 217-225]; 및 [Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553)]). 또한 분리된 V_H and V_L 도메인 (Domantis plc)도 이용할 수 있다(참조, [US 6,248,516]; [US 6,291,158]; 및 [US 6,172,197]).

이질성 접합체 항체

이질성 접합체 항체들은 어느 한 가지의 유용한 교차-연결 방법을 이용한 2 개의 공유결합된 항체들로 구성되어 있다(참조, 실시예, US 4,676,980).

다른 변형들

본 발명의 항원 결합 단백질은 항체의 작용 기능들을 향상시키거나 변화시키기 위해 다른 변형들을 포함할 수 있다. 본문에서 사용한 용어 "작용 기능"은 항체 의존성 세포가 매개하는 세포 독성 활성(ADCC), 보체=의존성 세포독성 활성(CDC)가 매개하는 반응들, Fc가 매개하는 식균작용 및 FcRn 수용체에 의한 항체 재순환 중 하나 또는 그 이상을 언급하는 것을 의미한다. IgG 항체에 대하여, ADCC와 ADCP를 포함하는 작용 기능성들은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 있는 일련의 Fcγ수용체들 간의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서는, Fcγ수용체들은 FcγI (CD64), FcγII (CD32) 및 FcγIII (CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질 간의 상호작용 및 Fc/ Fcγ복합체의 형성은 세포 독성, 면역 세포 활성화, 식균작용 및 염증성 사이토카인의 분비를 포함하는 다양한 효과들을 유발한다.

항원 결합 단백질과 다양한 Fc 수용체들(FcR) 간의 상호작용은 항원 결합 단백질의 작용 기능을 매개할 것으로 믿고 있다. 중요한 생물학적 효과들은 작용 기능성, 특히 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 보체의 고정(보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 및 항원 결합 단백질의 반감기/제거의 결과일 수 있다. 일반적으로, 작용 기능을 매개하는 능력은 항원 결합 단백질의 항원에 대한 결합을 필요로 하고 모든 항원 결합 단백질들이 모든 작용 기능을 매개하지는 않는다.

작용 기능은 예를 들어 ADCC 작용 기능을 측정하기 위한 자연 살상 세포에 대한 FcγIII의 결합에 의해 또는 단핵세포/대식세포에 대한 FcγI의 결합에 의한 것을 포함하는 다양한 방법들을 통해 측정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연살상세포 분석법에서 작용 기능에 대하여 측정할 수 있다. 이러한 분석법의 실시예들은 [Shields et al, 2001], [The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604]; [Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131]; [Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 확인할 수 있다.

CDC 기능을 결정하는 분석법들의 실시예들은 [1995 J Imm Meth 184:29-38]에 설명한 것을 포함한다.

인간 불변 영역들의 일부 동종형, 특히 IgG4 및 IgG2 동종형들은 근본적으로 a) 전통적인 경로에 의한 보체의 활성과; 및 b) 항체-의존성 세포 독성의 기능이 결핍되어 있다. 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형들은 원하는 작용 특성에 따라 수행할 수 있다. 특이한 변이들을 포함하는 IgG1 불변 영역들은 각각 Fc 수용체들에 대한 결합을 감소시키고 그리하여 ADCC와 CDC를 감소시킨다고 알려져 있다(참조, [Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564]; [Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662]; [Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040]; [Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84]; [Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324]; [Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168]).

항체의 Fc 영역에 대한 다양한 변형들은 원하는 특성에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 다른 용해성 항체를 비-용해성 항체로 만드는 Fc 영역의 특이적인 변이들은 EP 0629 240 및 EP 0307 434에 상세히 설명하였고, 한 가지 변이는 항체 반감기를 증가시키기 위해 재생 수용체 결합 에피토프를 항체로 병합시킬 수 있다(참조, US 5,739,277). 인간 Fcg 수용체들은 FcgR (I), FcgRIIa, FcgRIIb, FcgRIIIa 및 태아의 FcRn를 포함한다. 일반 세트의 IgG1 잔기들이 모든 FcgRs에 대한 결합에 관여하지만, FcgRII 와 FcgRIII는 이러한 일반 세트 외부에 있는 별도의 번 위치들을 사용한다는 것을 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem 276: 6591-6604]에서 설명하였다. 일련의 IgG1 잔기들은 Ala을 변형되면 Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239으로 모든 FcgRs에 대한 결합이 감소한다. 모든 FcgRs는 IgG CH2 도메인 내에 있고 CH1과 CH2를 연결하는 경첩 근처에서 모여 있다. FcgRI은 결합을 위해 일반 세트의 IgG1 잔기들만을 사용하지만, FcgRII 와 FcgRIII는 일반 세트에 부가하여 별도의 잔기들과 상호작용을 한다. 일부 잔기들의 변형은 단지 FcgRII (예를 들어, Arg-292) 또는 FcgRIII (예를 들어, Glu-293)에 대한 결합을 감소시킨다. 일부 변이체들은 FcgRII 또는 FcgRIII 에 대한 향상된 결합을 보여주지만 다른 수용체에 대한 결합(예를 들어, Ser-267Ala는 FcgRII에 대한 결합을 향상시키지만 FcgRIII에 대한 결합에는 영향을 주지 않는다)에는 영향을 주지 않는다. FcgRIIIa에 대하여, 최고의 결합 IgG1 변이체들은 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서의 Ala 치환들을 조합하였다. 신생아 FcRn 수용체는 항체 제거 및 조직간 통과세포외배출에 관련되어 있다고 믿고 있다(참조, [Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57] 및 [Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766)]). 인간 FcRn과 직접적으로 상호작용하게 된 인간 IgG1 잔기들은 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 이 구획 내에서 설명한 번 위치들 중 어느 한 가지의 치환들은 항체의 혈청 반감기를 증가시키고/증가시키거나 작용 특징을 변형시킬 수 있다.

다른 변형들은 항체들의 당화 변이체들을 포함한다. 항체의 불변 영역 내 보존적 번 위치들에서의 항체들의 당화는 항체 기능, 특히 상기에서 설명한 작용 기능에 대하여 굉장한 효과를 가진다고 알려져 있다(참조, [Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318]). 하나 또는 그 이상의 탄수화물 부분들이 첨가, 치환, 결실 또는 변형된 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들의 당화 변이체들을 고려하였다. Asp-X-Ser 또는 Asp-X-Thr 모티프의 도입은 탄수화물 부분의 효소적 부착에 대한 잠재적인 번 위치를 창조하였고 그리하여 항체의 당화를 조절하는데 사용할 수 있다. [Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876]에서, TNFR-IgG 면역접합체의 말단 살리실산화는 베타-1,4-갈락코실전이효소 및/또는 알파,2,3,살리실산 전이효소를 이용하여 재갈락토실화 및/또는 재살리실산화의 과정을 통해 증가하였다. 말단 살리실산화를 증가시키는 것은 면역 글로불린의 반감기를 증가시킨다고 믿고 있다. 대부분 당단백질 형태인 항체들은 전형적으로 당 형태의 혼합물로써 생산된다. 이 혼합물은 항체들이 진핵세포, 특히 포유동물 세포들에서 생산될 때 특별히 명백하다. 다양한 방법들이 확정된 당 형태를 제조하도록 개발되어 왔다(참조, [Zhang et al. (2004) Science 303: 371]: [Sears et al. (2001) Science 291: 2344]; [Wacker et al. (2002) Science 298: 1790]; [Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579]; [Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727]). 본문에서 설명한 항체들(예를 들어 IgG 이종형태인 IgG1)은 정해진 수(예를 들어 7개 또는 그 미만, 예를 들어 5개 또는 그 미만, 둘 또는 단일 같은)의 당 형태를 포함할 수 있다.

항체들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 같은 비-단백질성 중합체에 결합시키거나 결합시키지 않을 수도 있다. PEG로의 단백질 결합은 단백질의 항원성 및 면역원성을 감소시킬 뿐만 아니라 반감기를 증가시키는데 필요한 완성된 기술이다. 다른 분자량과 형태(선형 또는 가지형)를 가진 페그화의 사용은 Fab' 단편들뿐만 아니라 비손상 항체를 이용하여 연구해 오고 있다(참조, [Koumenis et al. (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95]).

생산 방법들

항원 결합 단백질들은 염소(참조, [Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157)]), 닭(참조, [Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55]), 마우스(참조, [Pollock et al.]) 또는 식물체(참조, [Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204]; [Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606]; [Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54]; [Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590]) 같은 형질 전환 생물체들에서 생산할 수 있다.

항원 결합 단백질들은 또한 화학합성에 의해 생산할 수도 있다. 하지만, 항원 결합 단백질들은 전형적으로 당 업자들에게 잘 알려진 재조합 세포 배양 기술을 이용하여 생산하였다. 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 분리하여 이후에 클로닝(증폭) 또는 발현에 사용하는 플라스미드 같은 복제가능한 벡터에 삽입하였다. 하나의 발현 시스템은 글루타메이트 합성효소 시스템(Lonza Biologics 에 의해 판매되는 것 같은)이고, 여기서 특별히 숙주 세포가 CHO 또는 NS0이다. 항원 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 즉시 분리하여 통상적인 순서(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 탐침들)들을 이용하여 서열 분석하였다. 사용할 수 있는 벡터들은 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 플라스미드를 전형적으로 이용하는 미니크로모좀들을 포함한다. 일반적으로 이러한 벡터들은 또한 신호 서열, 복제 개시점, 하나 또는 그 이상의 표지 유전자들, 증강 인자, 발현을 촉진시키기 위해 항원 결합 단백질 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결시킨 프로모터 및 전사 종료 서열들을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터들에 삽입할 수 있고 같은 숙주 세포로 동시에 또는 순차적으로 도입(예를 들어 형질전환, 형질주입, 전기천공 또는 형질도입에 의해) 할 수 있고, 원한다면 상기의 도입 이전에 두 중쇄 및 경쇄를 같은 벡터에 삽입시킬 수도 있다. 코돈 최적화는 숙주 세포에 의해 생산되는 모든 양의 단백질이 야생형 서열을 형질 주입했을 때 양과 비교했을 때 코돈 최적화된 유전자를 형질 주입했을 때의 양이 더 크게 하려는 목적으로 사용할 수 있다. 여러 가지 방법들이 출판되었다([Nakamura et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215]; [W098/34640]; [W097/11086]). 유전자 코드의 잉여성 때문에, 본문에서 발표한 폴리뉴클레오티드(특별히 주어진 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈)에 대한 대안적인 폴리뉴클레오티드는 또한 본문에서 설명한 항원 결합 단백질들을 암호화할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질의 코돈 사용은 전사체 및/또는 생산 효율(예를 들어, [Hoekema et al Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24])을 증가시키도록 하는 숙주 세포의 코돈 성향을 수용하도록 변형할 수 있다. 코돈의 선택은 발현에 사용하는 숙주세포와의 적절한 적합성에 근거할 수 있다.

신호 서열들

항원 결합 단백질들은 성숙한 단백질의 N-말단에 특이한 절단 번 위치를 가진 이질적인 신호 서열을 포함하는 융합 단백질로써 생산할 수 있다. 이 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되어야 한다. 원핵 숙주 세포에 대하여, 신호 서열은 예를 들어, 염기성 탈인산화효소, 페니실린 분해효소 또는 열 안정성 장독소 II 리더일 수도 있다. 효모 분비에 대하여 신호 서열들은 예를 들어 효모 전화효소 리더, a 요소 리더 또는 산 탈인산화효소 리더일 수도 있다(참조, WO90/13646). 포유동물 세포 시스템에서, 헤르페스 심플렉스 gD 신호 및 본래의 면역글로불린 신호 서열 같은 바이러스 분비 리더들이 적합할 수도 있다. 전형적으로 신호 서열은 항원 결합 단백질을 암호화하는 DNA에 대한 해독틀 내로 연결하였다.

복제 개시점

복제 개시점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대한 pBR322, 대부분 효모에 대한 2m 플라스미드 및 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 대부분의 포유동물 세포를 위한 VSV 또는 BPV 같은 다양한 바이러스 개시점을 통해 당 업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 복제 개시점 요소는 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않지만 SV40는 초기 프로모터를 포함하고 있으므로 사용할 수 있다.

선발 표지

전형적인 선발 유전자는 a) 항생제 또는 다른 독소들 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이드 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나 b) 영양요구성 결핍증을 보충 또는 복합 배지에서 이용할 수 없는 영양소를 공급하거나 c) 상기 두 가지의 조합한 단백질들을 암호화한다. 선별 계획은 숙주 세포의 억제된 성장을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질을 암호화하는 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환된 세포들은, 동시에-전달된 선별 표지자에 의해 부여된 약제 내성 같은 특성에 의해 생존하게 된다. 하나의 실시예는 형질전환체를 메토트렉세이트와 같이 배양하는 DHFR 선별 표지자이다. 세포는 관심 있는 외부 유전자의 복제수를 증폭시키기 위해 메토트렉세이트의 양이 점점 증가하는 곳에서 배양할 수 있다. CHO 세포들은 DHFR 선별에 특별히 유용한 세포주이다. 또 다른 실시예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템이다(Lonza Biologics). 효모에서 사용할 수 있는 선별 유전자의 실시예는 trp1 유전자이다(참조, [Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38]).

프로모터

항원 결합 단백질들을 발현하는 적절한 프로모터들은 항원 결합 단백질을 암호화하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결하였다. 원핵세포 숙주에 대한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 염기성 탈인산화효소, Trp 및 Tac 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 효모 세포에서의 발현에 적합한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 인산화효소 또는 다른 당분해 효소들 예를 들어, 엔올라아제, 글리세르알데히드 3 인산 탈수소화효소, 헥소키나아제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포프룩토키나아제, 글루코스 6 인산 이성화효소, 3-포스포글리세르산 무타제 및 글루코키나제를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 알코올 탈수소효소2, 이소시토크롬C, 산 탈인산화효소, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토오스/갈락토오스 사용에 필요한 효소들을 포함한다.

포유동물 세포 시스템에서 발현에 필요한 프로모터들은 폴리오마, 계두 및 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스2), 소유두종바이러스, 조류육종바이러스, 사이토메갈로바이러스(특히 즉시 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스육종바이러스(RSV) 프로모터 및 초기 또는 늦은 유인원 바이러스 40 같은 바이러스 프로모터들을 포함한다. 물론 프로모터의 선택은 발현에 사용하는 숙주세포와의 적절한 적합성에 기초하는 것이다. 첫번째 플라스미드는 RSV 및/또는 SV40 및/또는 CMV 프로모터, 경쇄 가변 영역(V_L)을 암호화하는 DNA, 네오마이신 및 앰피실린 저항성 선별 표지자들과 같이하는 kC 영역 및 RSV 또는 SV40 프로모터로 구성된 2차 플라스미드, 중쇄 가변 영역(V_H)을 암호화하는 DNA, g1 불변 영역을 암호화하는 DNA, DHFR 및 앰피실린 저항성 표지자들을 포함할 수 있다.

증강 인자

예를 들어 고등 진핵생물에서의 발현에 대해 적절하다면, 벡터의 프로모터 요소에 기능적으로 연결한 증강 인자는 사용할 수 있다. 포유동물 증강 서열들은 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 태아단백질 및 인슐린을 포함한다. 또 다른 대안으로써, 당업자는 SV40 증강제(100~270 bp), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강제, 폴리마 증강제, 배큘로바이러스의 증강제 또는 쥐의 IgG2a 유전자좌(참조 WO04/009823) 같은 진핵세포 바이러스로부터의 증강 인자를 사용할 수 있다. 증강제는 벡터에서 프로모터보다 상향 부분에 번 위치할 수 있다. 또 다른 대안으로써, 증강제는 다른 곳에 번 위치할 수 있는데, 예를 들어 번역되지 않는 영역 또는 폴리아데닐레이션 신호의 하향 부분에 번 위치할 수 있다. 증강제의 선택과 번 위치선택은 발현에 사용하는 숙주 세포와의 적절한 적합성에 기반을 둘 수 있다.

폴리아데닐레이션 /종료

진핵세포 시스템에서, 폴리아데닐레이션 신호들은 항원 결합 단백질을 암호화하는 DNA/폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결되었다. 이러한 신호들은 전형적으로 개방형 해독틀의 3'에 번 위치한다. 포유동물 시스템에서, 비-제한 실시예들은 성장 호르몬들, 연장 인자-1 알파 및 바이러스(예를 들어 SV40) 유전자 또는 레트로바이러스의 긴말단 반복순서로부터 유래한 신호들을 포함한다. 효모 시스템에서 폴리아데닐레이션/종료 신호의 비-제한 실시예들은 포스포글리세린산 키나아제(PGK)와 알코올탈수소화효소1(ADH) 유전자로부터 유래한 신호들을 포함한다. 원핵세포 시스템에서는 폴리아데닐레이션 신호들은 전형적으로 필요하지 않으며 대신 더 짧고 좀 더 명확한 종료 서열들을 사용하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐레이션/종료 서열들의 선택은 발현을 위해 사용하는 숙주 세포를 이용한 적절한 적합성에 기반을 둘 수 있다.

다른 방법들/향상된 수율을 위한 요소들

상기의 내용에 부가하여, 수율을 향상시키는데 사용하는 다른 특징들은 염색질 개조 인자들, 인트론들 및 숙주-세포 특이적인 코돈 변형을 포함한다.

숙주세포들

클로닝 또는 항원 결합 단백질을 암호화하는 벡터들에 대한 적절한 숙주 세포들은 진핵세포, 효모 또는 고등한 진핵세포들이다. 적절한 원핵 세포들은 진정세균, 예를 들어 장내세균, 예를 들어 대장균(예를 들어 ATCC31, 446; 31,537;27, 325)인 에스케리키아속 같은 엔테로박테리아속, 엔테로박터, 어웨니아, 클렙시엘라 프로테우스, 살모넬라 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움, 세라티아속 예를 들어 세라티아 마르세스캔스 및 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포르미스(참조 DD 266 710)같은 바실러스 뿐만 아니라 쉐겔라 속균, 슈도모나스 애루지노사 같은 슈도모나스균 및 스트렙토마이시스를 포함한다. 효모 숙주세포들 중에서는, 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 클루베라마이세스(예를 들어, [ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500]), 야로위아[EP402, 226], 피키아 파스토리스 [EP 183 070] 및 [Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192] 또한 참조), 칸디다, 트리코데르마 레에시아 [EP 244 234], 페니실린, 아스파길러스 니둘란스 및 아스파길러스 니거 같은 톨리포클라디움 및 아스퍼질러스 숙주들 또한 고려하고 있다.

고등한 진핵 숙주 세포들은 COS-1(ATCC 번호 CRL1650), COS-7(ATCC CRL 1632), BHK570(ATCC 번호:CRL 10314), 293(ATCC 번호 CRL 1573), 중국 햄스터 난소세포 CHO(예를 들어 CHO-K1, ATCC 번호: CCL61, DG44 같은 DHFR-CHO 세포주 (참조 Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556), 특히 현탁 배양에 적합한 CHO 세포주들, 마우스 세르토리 세포들, 원숭이 신장 세포들, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개의 신장 세포들(ATCC CCL34), 인간 폐 세포들(ATCC CCL 75), HepG2 및 골수종 또는 림프종 세포들 예를 들어 NS0(참조 US 5,807,715), Sp2/0, Y0 같은 포유동물 세포들을 포함한다.

이러한 숙주 세포들은 또한 좀 더 가공하거나 항원 결합 단백질의 질, 기능 및/또는 수율을 변형하기 위해 적응시킬 수도 있다. 비-제한적인 실시예들은 특별한 변형(예를 들어, 당화) 효소들 및 단백질 접힘 샤페론의 발현을 포함한다.

세포 배양 방법들

항원 결합 단백질들을 암호화하는 벡터들로 형질전환한 숙주 세포들은 당 업자들에게 알려진 어느 하나의 방법에 의해 배양할 수 있다. 숙주 세포들은 스피너 플라스크, 회전병 또는 중공 섬유 시스템에서 배양할 수 있지만 더 큰 대량 생산을 위해서는 교반 탱크 배양기를 현탁 배양을 위해 특별히 사용한다. 교반 탱크는 예를 들어 스파저, 배플 또는 저전단 임펠러를 사용하여 에어레이션에 적응시켰다. 기포탑 및 공기부양식 반응기에 대하여, 공기 또는 산소 기포를 이용한 직접적인 에어레이션을 사용할 수도 있다. 숙주 세포들이 혈청 없는 배양 배지에서 배양하는 장소에는, 에어레이션 공정의 결과로서 세포 피해를 방지하는데 도움을 주는 플루로닉 F-68 같은 세포 보호 제재를 배지에 보충한다. 숙주 세포 특성에 따라, 마이크로캐리어는 부착 의존형 세포주들에 대한 성장 기질로 사용하거나 세포들을 관류배양(전형적인 형태)에 적응시킨다. 숙주 세포, 특히 무척추 숙주 세포들의 배양은 유가식, 반복적인 배치 처리 [Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109], 확장한 배치 공정 또는 관류 배양 같은 다양한 운영 모드를 이용할 수 있다. 재조합으로 형질전환된 포유동물 숙주 세포들은 우아혈청(FCS) 같은 혈청 함유 배지엣 배양할 지라도, 예를 들어, 이러한 숙주세포들은 [Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163]에 명시된 것 같은 합성 무혈청 배지, 또는 재조합 글루코스 같은 에너지원 및 재조합 인슐린 같은 합성 성장 인자들을 필요시에 보충한 ProCHO-CDM 또는 UltraCHO^TM (Cambrex NJ, USA) 같은 상용화되어 사용할 수 있는 배지에서 배양한다. 숙주세포의 무혈청배양은 숙주 세포들이 무혈청 조건에서 적응하는 것을 필요로 한다. 하나의 적응 방법은 배지를 포함하는 혈청에서 이러한 숙주 세포들을 배양하고 반복적으로 배양 배지의 80%를 무혈청 배지로 교환해서 숙주 세포들이 무혈청 조건에 적응시키는 것이다[Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers].

배지로 분비되는 항원 결합 단백질은 회수하여 사용 의도에 적합한 정제 수준을 제공하는 다양한 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들어 인간 환자의 치료에 대한 항원 결합 단백질의 사용은 전형적으로 적어도 95 % 순도, 좀 더 전형적으로는 98% 또는 99% 또는 그 이상의 순도(조배양배지와 비교하여)를 필요로 한다. 배양 배지로부터의 세포 잔해들은 전형적으로 원심 분리에 이어 예를 들어어 정밀여과, 초정밀여과 및/또는 심층 여과를 이용한 정화단계를 이용하여 제거한다. 투석 및 젤 전기영동, 수산화아파타이트(HA), 친화크로마토그래피(선택적으로 폴리His 같은 친화도 표지 시스템을 포함하는) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC, see US 5, 429,746) 같은 다양한 다른 기술들을 이용할 수 있다. 다양한 정화 단계들을 거친 항체들은 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 포획할 수 있다. 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 황산 암모늄 침전 같은 추가적인 크로마토그래피 단계들은 뒤이어 시행할 수 있다. 다양한 바이러스 제거 단계들은 또한 이용한다(예를 들어, DV-20 여과를 이용하는 나노여과). 이러한 다양한 단계들 이후에, 적어도 75mg/ml 또는 그 이상, 또는 100mg/ml 또는 그 이상의 항원 결합 단백질을 포함하는 정제(예를 들어 단일클론성) 제조법을 제공하였다. 이러한 제조법은 항원 결합 단백질의 응집 형태들이 충분히 제거한다.

박테리아 시스템은 항원 결합 단백질의 발현에 사용할 수 있다. 이러한 단편들은 세포 내에서 주변세포질 내에 번 위치할 수 있거나 세포 외로 분비될 수 있다. 비수용성 단백질은 당 업계에 알려진 방법에 따라 추출하여 다시 접혀서 활성 단백질을 형성할 수 있다([Sanchez et al. (1999) J. Biotechnol. 72: 13-20] 및 [Cupit et al. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277]).

약제학적 조성물

용어 질병, 질환 및 상태는 교환하여 사용할 수 있다. 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 정제 제조법은 본문에서 설명한 인간 질병의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 병합할 수 있다. 약제학적 조성물은 IL-7이 질병에 기여하거나 IL-7R 매개성 신호전달의 저해/중화가 효과가 있는 질병의 치료에 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 치료적 효과량을 포함한다.

약제학적 제조법은 약제학적으로 허용하는 운반체와 조합한 항원 결합 단백질을 포함한다. 항원 결합 단백질은 단독 투여하거나, 또는 약제학적 조성물의 일부로써 투여할 수 있다.

전형적으로 이러한 조성물은 허용할 수 있는 약제학적 관습에 의해 알려지고 명명된 약제학적으로 허용된 운반체를 포함한다[Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co]. 이러한 운반체의 예는 염분, 링거액 또는 덱스트로오스액, 선택적으로 5~8 내의 pH로 완충시킨 적절한 완충액 같은 멸균된 운반체를 포함한다.

약제학적 조성물은 주사 또는 연속적인 주입(예를 들어, 정맥내, 복강내의, 피내의, 피하의, 근육내 또는 문맥내)에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물들은 눈에 보이는 입자상 물질이 적절히 없는 상태이다. 약제학적 조성물은 1mg에서 10g 사이의 항원 결합 단백질, 예를 들어 5mg에서 1g 사이의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 대안으로써, 조성물은 5mg에서 500mg 사이, 예를 들어 5mg에서 50mg 사이의 항원 결합 단백질을 포함할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물들을 제조하는 방법은 당 업자들에게 잘 알려져 있다. 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 1mg에서 10g 사이의 항원 결합 단백질을 선택적으로는 사용 설명서와 같이 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 당 업자들에게 잘 알려지거나 명백한 방법에 따라 투여하기 전에 재구성을 위해 동결건조할 수 있다. 항체가 IgG1 동종형을 가지고 있다면, 구연산염(예를 들어, 구연산 나트륨) 또는 EDTA 또는 His 같은 구리의 킬레이터를, 구리가 매개하는 이러한 동종형 항체의 분해 정도를 감소시키기 위해 약제학적 조성물에 첨가할 수 있다(참조, EP0612251). 약제학적 조성물은 또한 Arg 염기 같은 가용화제, 폴리소베이트 80같은 계면활성제/항-응집 제재 및 유리병 공간 부분 산소를 대체하는 질소 같은 비활성 기체를 포함할 수 있다.

항원 결합 단백질을 투여에 대한 효과적인 투여량 및 치료 제도는 일반적으로 경험에 의해 결정하며 환자의 나이, 체중 및 건강 상태 같은 요소와 질병 또는 치료해야 할 질환에 의해 결정되기도 한다. 적절한 투여량을 선택하는 지침은 예를 들어, [Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 확인할 수 있다.

피검자에 투여하는 항원 결합 단백질의 투여량은 일반적으로 피검자 체중의 1 ㎍/kg 에서 150 mg/kg 사이, 0.1 mg/kg 에서 100 mg/kg 사이, 0.5 mg/kg 에서 50 mg/kg 사이, 1 에서 25 mg/kg 또는 1 에서 10 mg/kg 사이에 있다. 예를 들어, 투여량은 10 mg/kg, 30 mg/kg, 또는 60 mg/kg일 수 있다. 항원 결합 단백질은 예를 들어 피하, 정맥내, 또는 근육내 같은 비경구로 투여할 수 있다.

원한다면, 치료용 조성물의 효과적인 일일 투여량은 적절한 간격으로, 선택적으로는 단위 투여량 형태로 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 그 이상의 개별적인 하위 투여량으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 투여량은 피하에 투여 날짜에 다수의 하위 투여량 형태로 14일 또는 28일마다 한 번씩 투여할 수 있다.

1회 투여량의 투여는 2에서 12시간 또는 2에서 6시간 같은 전형적으로는 15분에서 24시간의 기간 동안에 정맥 내 주입에 의해 수행할 수 있다. 이러한 투여는 독성 부작용을 감소시킬 수 있다.

1회 투여량의 투여는 예를 들어, 하루에 3회, 하루에 1회, 2일마다 1회, 일주일에 1회, 1 개월에 1회, 매 3개월마다 1회, 매 6개월마다 1회, 또는 매 12개월 마다 1회처럼 필요할 때마다 1회 또는 그 이상의 횟수로 반복할 수 있다. 항원 결합 단백질은 예를 들어 6개월 기간 동안 1주에 한 번 또는 그 이상처럼 유지 요법에 의해 투여할 수 있다. 항원 결합 단백질은 예를 들어, 3에서 6개월간 투여, 그 후에 3에서 6개월간 투여중지, 이후 항원 결합 단백질을 다시 3에서 6개월간 투여하는 과정을 반복하는 간헐적인 치료법에 의해 투여할 수 있다.

투여량은 생물학적 표본의 IL-17의 양을 측정함으로써 결정하거나 조정할 수 있다. 다른 투여량 결정 또는 조정 방법들을 이용할 수 있고, 약리학의 생물학적 마커("바이오마커"), 근육양 및/또는 기능의 측정, 안정성, 순응성 및 치료 반응성을 포함하며 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 단백질은 피검자의 IL-7 매개성 신호전달 활성을 하향 조절하는데 효과적인 양 및 기간 동안에 투여할 수 있다.

항원 결합 단백질은 피검자에게 특별한 번 위치로의 치료를 표적화하는 방법으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 예를 들어 골격근 같은 근육에 국부적으로 주입할 수 있다.

항원 결합 단백질은 하나 또는 그 이상의 다른 치료적으로 활성이 있는 제재들, 예를 들어: 인터페론 베타(IFNγ1a 또는 IFNγ1b) 같은 면역 조절제 및 글라티라머 아세테이크, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클라드리빈, 사이클로스포린, 미토산트론, 정맥내 면역 글로불린(IVIg) 같은 다른 면역 치료법들, 혈장 교환 및 설파살아진과 조합하여 사용할 수 있다. 추가적인 치료제는 내과 의사가 처방한 방법(투여량, 시기, 기작)대로 투여할 수 있다. 하나의 실시예에서, 추가적인 치료제재는 동시에 또는 순차적으로 또는 본 발명의 항원 결합 단백질과는 별도로 투여할 수 있다. 하나의 실시예에서, 추가적인 치료제제 및 항원 결합 단백질은 환자 겹침에 대한 약리적 효과; 달리 말하면 동시에 환자에 대한 생물학적 효과를 발휘하는 방식으로 투여하였다.

항원 결합 단백질을 다른 약제학적 활성 제재와 조합하여 사용하면, 각각의 성분들은 함께 또는 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에, 구분하여 또는 조합된 약제학적 조성으로, 어느 한 가지의 적절한 경로에 의해 투여할 수 있다. 만약 구분하거나 순차적으로 투여한다면, 항원 결합 단백질 및 치료적 활성 제재(들)는 순서에 따라 투여할 수 있다.

상기에 언급한 조합들은 상기에서 정의한 조합들을 선택적으로는 약제학적으로 허용하는 운반체 또는 와 같이 포함하는 단일 약학 조성의 형태로써 사용하도록 제시할 수 있다.

같은 조성으로 조합한다면, 성분들은 안정해야 하고 성분들 서로 간에 적합해야 하고, 조성의 다른 성분과 적합해야하고 투여에 맞게 제조할 수 있어야 한다는 점을 인식할 것이다. 개별적으로 제조했을 때, 성분들은 어느 한 가지의 편리한 공식, 예를 들어 당 업계의 항원 결합 단백질에 대해 알려진 방식으로 제공할 수 있다.

같은 질병에 대하여 활성을 가진 2차 치료제재와 조합하면, 각 성분의 투여량은 항원 결합 단백질만을 단독으로 사용했을 때와는 달라질 수 있다. 적절한 투여량은 당 업자들이 즉시 인식할 것이다.

항원 결합 단백질 및 치료적 활성 제재(들)은 달리 표현해서 상승작용에 의해 효과를 발휘할 수 있고, 항원 결합 단백질과 치료적 활성 제재(들)를 조합해서 투여하는 것은 질병, 질환, 또는 본문에서 설명한 상태에 대하여 각각의 독자적인 효과의 총합보다 더 큰 효과를 가질 수 있다.

약제학적 조성물은 항원 결합 단백질과 다른 약제들, 선택적으로는 사용에 필요한 설명서를 첨부한 구성품 키트를 포함할 수 있다. 편의상, 키트는 사용 설명서와 함께 선결된 양의 제재를 포함할 수 있다.

용어 "개인", "피검자" 및 "환자"는 본문에서 교체하여 사용하였다. 피검자는 전형적으로 인간이다. 피검자는 또한 마우스 랫 또는 영장류(예를 들어, 마모셋 또는 원숭이) 같은 포유동물일 수도 있다. 피검자는 인간이 아닌 동물일 수 있다. 항원 결합 단백질은 또한 수의 용도를 가질 수도 있다. 치료해야 할 피검자는 가축 예를 들어, 암소 또는 황소, 양, 돼지, 소, 염소 또는 말이 될 수 있고 또는 개나 고양이 같은 가축일 수도 있다. 동물은 모든 연령대의 또는 성숙하고 다 자란 동물일 수도 있다.

치료는 치료적이고, 예방적 또는 예방학적일 수 있다. 피검자는 이러한 치료가 필요한 개체일 수도 있다. 치료를 필요로 하는 피검자들은 이미 특정한 의학적 질병으로부터 고통받는 개체부터 미래에 질병이 발생할 수 있는 개체들까지 포함할 수 있다.

그러므로, 본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 예방적 또는 예방학적 치료에 사용할 수 있다. 이러한 경우에, 본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 질병의 하나 또는 그 이상의 특성 또는 증상의 개시를 예방하거나 늦추려고 개체에 투여하였다. 개체는 무증상일 수도 있다. 개체는 질병에 대한 유전적 성향을 가질 수도 있다. 항원 결합 단백질의 예방학적으로 효과적인 양은 이러한 개체에 투여하였다. 예방학적으로 효과적인 양은 본문에서 설명한 질환의 하나 또는 그 이상의 특성 또는 증상의 개시을 억제하거나 늦추는 양이다.

본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 또한 치료 방법에 사용할 수 있다. 용어 "치료"는 질병의 적어도 한 가지 특징 또는 증상의 완화, 감소, 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 본문에서 설명한 질환의 하나 또는 그 이상의 특징 또는 증상을 완화하거나 감소시키는데 이용할 수 있다.

본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 치료, 예방 또는 예방학적 치료에 효과적인 양으로 사용하였다. 본문에서 설명한 항원 결합 단백질의 치료적으로 효과적인 양은 질병의 하나 또는 그 이상의 특징 또는 증상을 완화하거나 감소시키는데 효과적인 양이다. 본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 또한 본문에서 설명한 질병의 치료, 예방 또는 치유하는데 이용할 수 있다.

본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 일반적으로 개체의 건강에 유용한 효과를 보이는데, 예를 들어 개체의 예상 수명을 증가시킬 수 있다.

본문에서 설명한 항원 결합 단백질은 생존성 치료학적 치료를 구성하는 완벽한 치유, 또는 모든 증상의 제거 또는 질병의 표시에 영향을 줄 필요가 없다. 적절한 영역에서 인식하는 것처럼, 치료학 제재로써 사용한 약제들은 특정 질병 상태의 심각성을 완화시킬 수 있지만, 유용한 치료학 제재로써 인식하는 질병의 모든 표시를 폐기할 필요는 없다. 유사하게도, 예방학적으로 투여하는 치료는 생존성 예방 제재를 구성하기 위해 일본의 개시를 예방함에 있어서 완전히 효과적일 필요는 없다. 질병에 대한 효과를 단순히 감소시키는 것(예를 들어, 질병의 증상 수 또는 심각성을 감소시키는 것에 의한, 또는 또 다른 치료의 유효성을 증가시키는 것에 의한, 또는 또 다른 유용한 효과를 생성하는 것에 의한), 또는 피검자에서 질병이 발생할 또는 악화될 가능성을 감소하는 것(예를 들어 질병의 개시를 늦추는 것에 의한)은 충분하다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 다발성 경화증 및 다른 자가면역 또는 염증성 질병들, 특히 발병성의 T_H17 세포가 관련된 질병들의 치료에 사용할 수 있다. 이러한 질병들은 높은 수준의 IL-17 발현과 관련되어 있다. IL-17의 증가된 양은 MS 환자[Matusevicius, D. et al.; Mult. Scler. 5, 101-104; 1999]의 혈청 및 CSF와 류마티스성 관절염 환자로부터 수득한 윤활액에 알려져 있다. 또한 IL-17은 건선에 관련[Homey et al.; J. Immunol. 164(12):6621-32; 2000]되어 있지만, 반면 Hamzaoui et al는 바체트병에서 높은 수준의 IL-17[Scand. J. Rhuematol.; 31:4, 205-210; 2002]을 발표하였다. 증가한 IL-17의 양은 또한 전신 홍반성 루프스(SLE)에서 관찰되었다[Wong et al . Lupus 9(8):589-93; 2000].

IL-7이 매개하는 신호전달의 저해는 또한 천식처럼 증가된 IL-17이 관련되어 있던 염증성(비-자가면역) 질병들의 치료에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 염증성 및/또는 자가면역 질병들은; 건선 및 아토피성 피부염; 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환(IBD); 크론 병; 궤양성 대장염; 수술용 조직 재관류 손상, 심근 경색 같은 심근 허혈성 상태, 심장 마비, 심장 수술 후의 재관류 및 경피경관혈관성형 후의 수축, 뇌졸중, 및 복부 대동맥류를 포함하는 허혈성 재관류 질환; 뇌졸중에 버금가는 뇌 부종; 두개 외상; 혈액량 감소성 쇼크; 질식; 성인 호흡 장애 증후군; 급성 폐 손상; 바체트 병; 피부근염; 다발성근염; 다발성 경화증(MS); 피부염; 수막염; 뇌염 바이러스; 포도막염; 골관절염; 루프스 신염; 류마티스성 관절염(RA) 같은 자가면역 질병, 스요르겐 증후군, 혈관염; 백혈구의 혈관외 유출을 포함하는 질환들; 중추신경계(CNS) 염증성 질환들; 패혈증 또는 외상에 버금가는 다양한 기관 손상; 알코올성 간염; 박테리아성 폐렴; 사구체신염을 포함하는 항원-항체 복합체가 매개하는 질환들; 패혈증; 유육종증; 조직-기관 이식에 대한 면역발병원성 반응; 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, chronic 기관지염, 기관지확장증, 미만성범세기관지염, 과민성 폐렴, 특발성 폐 섬유증(IPF)를 포함하는 폐의 염증들 및 낭포성 섬유종; 건선 관절염; 시신경 척수염; 기앵-바레 증후군(GBS); 만성 폐쇄성 폐질환; 제 1형 당뇨병 및 기타 질환을 포함하는 염증성 피부 질병들을 포함한다.

특히, 본 발명의 길항제들은 모든 형태들이 시신경 척수염을 포함하는 다발성 경화증의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 길항제를 이용한 치료는 활성 염증성 질환 상황, 예를 들어 다발성 경화증의 임상적으로 분리한 증후군 또는 재발성 유형들의 치료에 이용하는 상황에서 투여하면 가장 효과적일 것으로 예측하고 있다. 질병의 이러한 단계들은 가돌리늄 향상과 같은 기준의 영상화 또는 좀 더 민감한 기술들, 및/또는 활성 질환의 아직 밝혀지지 않은 바이오마커들에 의해 임상적으로 정의할 수 있다. 특히, 본 발명의 길항제들은 환자들이 진입하거나 재발하는 상태라면 RRMS(정맥내, 피하로, 경구로, 또는 근육내 전달에 의해)를 치료하는데 사용할 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 길항제들은 재발성 개시점에 또는 재발성 개시로부터 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 2일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 또는 10 일에 환자에 투여하였다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 CD127에 결합할 수 있다. 하나의 실시예에서 본 발명의 항원 결합 단백질들은 IL-7 수용체의 생물학적 효과를 중화시킬 수 있다. 하나의 실시예에서, 항원 결합 단백질들은 IL-7 수용체가 매개하는 T_H17 팽창, 및 IL-7 수용체가 매개하는 T_H17 생존 중 적어도 한 가지를 중화시킬 수 있다.

용어 저해하다, 중화하다 및 중화시키다는 본문에서 같은 뜻으로 사용하였다. 어느 용어도 전체적인 중화를 제안하려는 의도로 사용하지 않았다; 부분적인 중화-생물학적 효과의 감소에 상응하지만 완전한 폐기는 아닌 상태- 또한 고려하였다.

IL-7수용체가 매개하는 T_H17 팽창 및/또는 생존은 T_H17 세포 계산의 증가 또는 유지에 의해, 또는 다른 CD4+ T 세포의 수에 비교하여 T_H17 세포수의 비율의 증가에 의해, 또는 좀 더 특이적으로 T_H17:T_H1 세포들의 비율, T_H17: T_reg세포들의 비율, (T_H17와 T_H1의 세포합):T_reg세포의 비율, 및/또는 T_H17:(T_H1와 T_reg의 합)의 비율이 증가함에 의해 세포 수준에서 관찰할 수 있다.

분자 수준에서는, T_H17 팽창 및/또는 생존은 CD4+ T 세포 군(또는 T_H17 세포군에 의한)에 의한 IL-17 생산의 증가에 의해 관찰할 수 있다. 그러므로, 하나의 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CD4+ T 세포 군에 의해 IL-17 생산을 감소시킨다. IL-7 수용체가 매개하는 T_H17 팽창 및/또는 생존은 또한 CD4+ T 세포군에 의한(또는 T_H17 세포군에 의한) IFN-γ 생산의 증가에 의해 관찰할 수 있다. 그러므로, 하나의 실시예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CD4+ T 세포군에 의한 IFN-γ 생산을 중화시킨다(감소시킨다). 분자 수준에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 IL-7이 매개하는 STAT-5 인산화를 저해할 수도 있다. 모범적인 분석법은 PCT 출원번호 PCT/US2009/053136 (WO2010/017468)에 상세히 설명하였다.

모범적인 pSTAT-5 분석법에서, PBMCs는 시험 제재가 있는 조건 및 없는 조건에서 IL-17에 의해 자극을 받았다. 차후에 세포는 예를 들어 pSTAT-5에 대한 염색(예를 들어, Alexa Fluor 647 마우스 항-Stat5 (pY694, BD [#612599] 처럼 표지한 항-pSTAT-5 항체를 이용함) 후에 형광 활성 세포 분류를 실시함에 의해 pSTAT-5의 양에 대하여 정량적으로 측정하였다. 인산화된 STAT-5의 양은 또한 ELISA에 의해 결정할 수 있다. 인산화된 STAT-5의 양을 감소시키는 이러한 제재들은 자가면역 질환에 대한 잠재적인 치료학적 후보들일 수도 있다.

길항제는 길항제 부재시의 STAT-5 양과 비교했을 때, 또는 음성 대조군과 비교했을 때, 또는 제재를 처리하지 않은 세포와 비교했을 때, 적어도 20%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 로써 인산화된 STAT-5의 양을 감소시킬 수도 있다. 길항제는 50㎍/ml, 25㎍/ml 또는 그 미만의, 10㎍/ml 또는 그 미만의, 5㎍/ml 또는 그 미만의, 또는 2㎍/ml 또는 그 미만의 IC₅₀를 가질 수도 있다. 하나의 실시예에서, 길항제는 1㎍/ml 보다 낮거나 동등한, 또는 0.75㎍/ml 보다 낮거나 이와 동등한, 0.5㎍/ml 보다 낮거나 이와 동등한, 0.25㎍/ml 보다 낮거나 이와 동등한, 또는 0.1㎍/ml 보다 낮거나 이와 동등한 IC₅₀를 가질 수도 있다. 하나의 실시예에서,

본 발명의 길항제는 특별히 T_H17 세포의 확장에 대한 저해에 효과적이다. T_H17 세포의 팽창은 T_H17 팽창 분석법에서 결정할 수 있는데, 이 분석법은 순수한 T 세포군을 시험 제재의 존재 및 부재 시에 팽창하도록 자극한 후에 세포를 자극하여IL-17을 생산하게 하고 시험 제재의 존재 및 부재 시의 세포에 의해 생산되는 IL-17의 양을 측정하는 것을 포함한다.

모범적인 분석법에서, 인간 CD4+ T 세포는 IL-1, IL-6, 및 IL-23가 있을 때 T 세포 수용체 활성화에 의해 자극을 받아서 T_H17로 분화된다. 5일간의 분화 후에, CCR6+ 세포는 풍부한 T_H17 군을 생산하도록 선별된다. 선별 후에, 이러한 T_H17 군은 인간 IL-7에 의해 활성화되어서 상층액의 IL-17및 IFN-γ증가가 이루어진다. IL-7과 CD127 사이의 상호작용을 억제하는 본 발명의 항원 결합 단편 같은 시험 제재의 기능은 배양 기간 중에 이러한 상호작용의 길항제가 있으면 IL-17 감소와 IFN-γ생산을 야기하는 T_H17 세포의 팽창을 저해하는 것으로 결정될 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 음성 대조군에 비해 상기와 같은 분석법에서 IL-17분비를 20% 또는 그 이상 저해할 수도 있다. 좀 더 전형적으로는, 항원 결합 단백질은 대조군에 비해 IL-17 분비의 50%, 75%, 85%, 90%, 또는 그 이상을 저해할 수 있다. 일부 실시예들에서, 항원 결합 단편은 분석법 내에서 50㎍/ml보다 적거나 동등한 IC₅₀ 를 보여준다. 다른 실시예들에서, IC₅₀는 20㎍/ml, 10㎍/ml 또는 5㎍/ml보다 적거나 동등할 수도 있다.

그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 본 발명의 항원 결합 단백질을 환자에서 T_H17 세포 수를 감소시키기에 충분할 정도의 양을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-7 수용체가 매개하는 STAT-5 인산화를 감소시키기에 충분할 정도의 항원 결합 단백질 양을 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 피검자의 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에 대해 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 환자에서 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서의 환자는 재발성의 늦춰진 다발성 경화증으로 고통받고 있는 환자이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에 대해 본 발명의 항원 결합 단백질을 T_H1세포에 대한 T_H17세포의 비율을 감소시키기에 충분한 양으로 피검자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 피검자의 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에 대하여 (Foxp3+) T_reg세포에 대한 T_H세포의 비율을 감소시키기에 효과적인 양으로 본 발명의 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 인간 피검자의 자가면역 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

진단 방법의 사용

본문에서 설명한 항원 결합 단백질들은 진단을 목적으로 생체 외 조건 또는 생체 내 조건의 생물학적 표본에서 CD127을 검출하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 항-CD127 항원 결합 단백질은 배양된 세포에서, 조직에서 또는 혈청에서 CD127을 검출하는데 사용할 수 있다. 조직은 우선적으로 인간 또는 동물 몸체로부터 분리할 수 있다(생체 검사 표본을 위해). ELISA, 웨스턴 블롯, 면역조직염색법 또는 면역침강법을 포함하는 통상적인 면역 분석법을 사용할 수 있다.

항원 결합 단백질들은 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질, 탐지할 수 있는 표지, 및 키트의 사용 설명을 포함하는 진단 키트 내에 제공할 수 있다. 편의상, 키트는 사용 설명서에 미리 결정된 양의 제재를 포함할 수 있다.

유전자 치료

본문에서 설명한 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자들은 필요에 따라 피검자에게 투여할 수 있다. 핵산 분자는 적절한 지지체 또는 도메인, 가변 도메인, 또는 전장 항체 내에서 CDR을 발현할 수 있다. 핵산 분자는 인간 또는 동물 세포에서 발현을 허용하는 벡터 내로 포함될 수 있다. 핵산 분자 또는 벡터는 약제학적으로 허용하는 부형제 및/또는 상기에서 논의한 치료학적 활성 제재들의 투여를 위해 제조할 수 있다.

실시예

1.0 1A11의 인간적응화

1.1 융합세포 가변 영역들의 1A11 클로닝

전체 RNA는 1A11 융합세포의 세포 펠릿으로부터 수득하였고 가변 영역들의 cDNA을 만들기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 각 융합세포의 중쇄 및 경쇄에 대하여 증폭시킨 가변 영역들을 pCR2.1 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 각 융합세포의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들에 대한 서열을 수득하였다. 서열 분석은 하기(상보성 결정 영역은 강조하였음)와 같은 펩타이드 서열을 예측하였다:

A) 1A11 VH

EVQLQQSGPELLKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGVTSYNQKFKGKATLTVAKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS

B) 1A11 VL

EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKPWIYEISKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSM뇌척수염DAAIYYCQEWNYPYTFGGGTKLEIK

항체의 재조합 키메라 형태는 인간 IgG1Fc와 카파 불변 영역에 대한 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 각각 융합하여 제조하였다

1.2 1A11 중쇄 인간적응화 계획

인간 V 유전자 생식계열 데이터베이스를 BLAST 분석한 후에, 마우스 1A11 가변 중쇄 서열과 (CDR를 포함하여) 64% 동일성을 갖는 인간 생식계열 IGHV1_2는 인간적응화를 위한 바람직한 수용체 골격으로 선택하였다. 생식계열 V 영역은 적절한 FR4와 인실리코로 조합하였는데, 이번 경우에는 서열 유사성에 근거하여 JH6 미니유전자(Kabat Vol.II)와 조합하였다. WGQG 모티프보다 앞선 JH6 미니유전자 잔기 중 첫 번째 6개 잔기들은 공여체 항체로부터 들어오는 CDR로 교체된 CDR3 영역 내에 번 위치한다. 8개의 인간적응된 중쇄 변이체들은 서열 비교와 항체 기능에 대한 가능한 영향을 근거로 제조하였다. H0 구조체는 1A11(Kabat 정의를 사용)로부터의 마우스 CDR은 상기에서 선택한 인간 수용체 골격으로 직선 이식한 형태이다. H3를 통한 구조체 H1은 H0를 기초로 하고; 각각은 각각의 구조체에서와는 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함하며; 각각 71, 66, 및 69 번 위치. H7 구조체를 통한 H4는 상기 역 변이들 중 2가지, 3가지, 4 가지 또는 5 가지를 포함한다.

1.3 IGHV1 -2 골격을 위한 1A11 중쇄 인간적응화 원리

1 11 21 CDR1 39 48

VH1A11 EVQLQQSGPE LLKPGASMKI SCKASGYSFT GYTM..N WVK QSHGKNLEWI

IGVH1-2 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYM..H WVR QAPGQGLEWM

1A11H0 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H2 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H3 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H4 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM .. N WVR QAPGQGLEWM

1A11H5 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H6 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

1A11H7 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYTM..N WVR QAPGQGLEWM

49 CDR2 66 76 83 92

VH1A11 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KATLTVAKSS STAYMELLSL TSEDSAVYYC

IGVH1-2 G WINPN..SG GTNYAQKFQG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H0 G LINPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H1 G LINPY..NG VTSYNQKFKG RVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H2 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H3 G LINPY..NG VTSYNQKFKG RVTLTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H4 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KVTMTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H5 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H6 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVDKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

1A11H7 G LINPY..NG VTSYNQKFKG KVTLTVAKSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC

93 CDR3 104

VH1A11 AR GDGNY... ...WYFDV WG AGTTVTVSS

JH6 -- WG QGTTVTVSS

1A11H0 AR GDGNY... ...WYFDV WG QGTTVTVSS

1.4 1A11 경쇄 인간적응화 계획

인간 V 유전자 생식계열 데이터베이스를 BLAST 분석한 후, 마우스 1A11 가변 경쇄 서열과 53% 동일성(CDR 포함)을 갖는 인간 생식계열 IGKV3_11는 인간적응화를 위한 바람직한 수용체 골격으로 선택하였다. 생식계열 V 영역은 적절한 FR4와 인실리코로 조합하였는데, 이번 경우에는 서열 유사성을 기초로 한 카파 4 미니유전자(Kabat Vol.II)와 조합하였다. JK-4 미니유전자 잔기들 중 첫 번째 3 잔기들은 공여체 항체로부터 들어오는 CDR로 교체된 CDR3 영역 내에 번 위치한다. 10가지의 인간적응된 경쇄 변이체들은 서열 비교와 항체 기능에 대한 가능한 영향을 근거로 제조하였다. L0 구조체는 1A11(Kabat 정의를 이용함)로부터의 마우스 CDR를 상기에서 선택한 인간 수용체 골격으로 스트레이트 그래프트한 형태이다. L1, L2, L4 구조체들은 L0를 기반으로 하고, 각각은 각 구조체에서 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함하고; 각각 47번, 71번 및 46번 위치를 포함한다. L3 구조체는 상기의 47번, 71번 위치의 역변이를 모두 포함한다. L5 구조체는 상기 47번, 71번 및 46번 위치의 역변이 3 가지를 포함한다. L9를 통한 L6 구조체는 L5를 기초로 하고, 각각은 각 구조체에서와는 다른 1, 2, 3 및 4 가지의 추가적인 골격 변이들을 포함하며; 각각 58번, 45번, 70번 및 60번 위치를 포함한다.

1.5 IGKV3 -11 골격을 위한 1A11 경쇄 인간적응화 원리

1 CDR1 44

Vk1A11 EIVLTQSPAI TAASLGQKVT ITC SASS... ....SVTYMH WYQQKSGTSP

Vk3-11 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQ... ...SVSSYLA WYQQKPGQAP

1A11L0 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SASS... ....SVTYMH WYQQKPGQAP

1A11L1-L9 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC SASS... ....SVTYMH WYQQKPGQAP

45 CDR2 CDR3 94

Vk1A11 KPWIY EISKL AS GVPVRFSG SGSGTSYSLT ISSM뇌척수염DAA IYYC QEWNY

Vk3-11 RLLIY DASNR AT GIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC

1A11L0 RLLIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L1 RLWIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L2 RLLIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L3 RLWIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L4 RPLIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDFTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L5 RPWIY EISKL AS GIPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L6 RPWIY EISKL AS GVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L7 KPWIY EISKL AS GVPARFSG SGSGTDYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L8 KPWIY EISKL AS GVPARFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

1A11L9 KPWIY EISKL AS GVPVRFSG SGSGTSYTLT ISSLEPEDFA VYYC QEWNY

95

Vk Vk1A11 . PYT FGGGT KLEIK

1A11L0 . PYT FGGGT KVEIK

hJk1 ----Q-- -V---

hJk2 Y---Q-- -----

hJk3 F---P-- -VD--

hJk4 L---G-- -V---

hJk5 I---Q-- R----

2.0 6A3의 인간적응화

2.1 6A3 중쇄 인간적응화 계획

인간 V 유전자 생식계열 데이터베이스를 BLAST 분석한 후, 마우스 6A3 가변 중쇄 서열과 71% 동일성(CDR 포함)을 갖는 인간 생식계열 IGHV4_61과 51% 동일성(기존에 IGKV1_39와 같이 발현이 잘 되는 것으로 알려진) 인간 생식계열 IGHV3_33은 인간적응화를 위한 바람직한 수용체 골격으로 선택하였다. 생식계열 V 영역은 적절한 FR4와 인실리코로 조합하였는데, 이번 경우에는 서열 유사성을 기초로 한 JH6 미니유전자(Kabat Vol.II)와 조합하였다. WGWG 모티프에 앞선 번 위치의 JH6 미니유전자 잔기들 중 첫 번째 2개 잔기들은 공여체 항체로부터 들어오는 CDR로 교체된 CDR3 영역 내에 번 위치한다. 골격 IGHV4_61을 포함하는 10 개의 인간적응된 중쇄 변이체들과 골격 IGHV3_33을 포함하는 12개의 인간적응된 중쇄 변이체들은 서열 비교와 항체 기능에 대한 가능한 영향을 근거로 제조하였다. H0 구조체는 6A3(Kabat 정의를 이용함)로부터의 마우스 CDR를 상기에서 선택한 인간 수용체 골격으로 직선 이식한 형태이다. 골격 IGHV4_61을 포함하는 H1부터 H5 구조체들은 H0를 기반으로 하는데, 각 구조체에서는 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함한다. H6부터 H9 구조체들은 상기 역 변이들의 2, 3, 4, 또는 5가지를 포함한다. 골격 IGHV3_33을 포함하는 H1부터 H11 구조체들은 H0를 기반으로 하는데, 각각은 각 구조체에서와는 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함하고; 각각 27번, 30번, 28번, 29번, 67번, 73번, 78번, 49번, 68번, 24번 및 48번 위치를 포함한다.

2.2 골격 IGHV4_61에 대한 6A3 중쇄 인간적응화 원리

1 11 21 CDR1 39 48

VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT TDYAW . N WIR QFPGNKLEWM

IGHV4_61 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGGYYWS WIR QPPGKGLEWI

6A3-H0 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H1 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H2 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H3 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVT TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H4 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H5 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS TDYAW . N WIR QPPGKGLEWM

6A3-H6 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVS TDYAW . N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H7 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H8 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW.N WIR QPPGKGLEWI

6A3-H9 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGYSVT TDYAW.N WIR QPPGKGLEWM

49 CDR2 66 76 83 92

VH6A3 G YIFY...SG STTYTPSLKS RISITRDTSK NQFFLQLNSV TTEDTATYYC

IGHV4_61 G YIYY...SG STNYNPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H0 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H1 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H2 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H3 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H4 G YIFY...SG STTYTPSLKS RITISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H5 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H6 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H7 G YIFY...SG STTYTPSLKS RVTISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H8 G YIFY...SG STTYTPSLKS RITISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

6A3-H9 G YIFY...SG STTYTPSLKS RITISRDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC

93 CDR3 104

VH6A3 AR GGYDVNYF.... ...DY W GQGTTLTVSS

IGHV4_61 AR

6A3 H0-H9 AR GGYDVNYF.... ...DY W GQGTTVTVSS

골격 4

93 CDR3 104

VH6A3 AG GLAGTL.........DY W GQGTTLTVSS

IGHV4_61 AR

hJH1 FQH- ----LV----

hJH2 FDL- -R--LV----

hJH3 FDV- ----MV----

hJH4 --- - ----LV----

hJH5 FDS- ----LV----

hJH6 MDV- -----V----

6A3H0-9 AG GLAGTL.........DY W GQGTTVTVSS

2.3 골격 IGHV3_33을 위한 6A3 중쇄 인간적응화 원리

1 11 21 CDR1 39 48

VH6A3 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT TDYAW.N WIR QFPGNKLEWM

IGHV3_33 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMH ..WVR QAPGKGLEWV

6A3-H0 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H1 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGYTFS TDYAW . N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H2 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFT TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H3 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFSFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H4 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTIS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H5 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H6 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H7 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H8 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H9 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H10 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAVSGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWV

6A3-H11 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS TDYAW.N WVR QAPGKGLEWM

49 CDR2 66 76 83 92

VH6A3 G YIFY...SG STTYTPSLKS RISITRDTSK NQFFLQLNSV TTEDTATYYC

IGHV3_33 A VIWY...DGSNKYYADSVKG RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H0 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H1 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H2 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H3 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H4 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H5 A YIFY...SG STTYTPSLKS RITISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H6 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDTSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H7 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTFYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H8 G YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H9 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFSISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H10 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

6A3-H11 A YIFY...SG STTYTPSLKS RFTISRDNSK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC

93 CDR3 104

VH6A3 AR GGYDVNYF.... ...DY W GQGTTLTVSS

IGHV3_33 AR

6A3 H0-H9 AR GGYDVNYF.... ...DY W GQGTTVTVSS

골격 4

93 CDR3 104

VH6A3 AG GLAGTL.........DY W GQGTTLTVSS

IGHV3_33 AR

hJH1 FQH- ----LV----

hJH2 FDL- -R--LV----

hJH3 FDV- ----MV----

hJH4 --- - ----LV----

hJH5 FDS- ----LV----

hJH6 MDV- -----V----

6A3H0-11 AG GLAGTL.........DY W GQGTTVTVSS

2.4 6A3 경쇄 인간적응화 계획

인간 V 유전자 생식계열 데이터베이스를 BLAST 분석한 후, 마우스 6A3 가변 경쇄 서열과 72% 동일성(CDR 포함)을 갖는 인간 생식계열 IGKV1_39는 인간적응화를 위한 바람직한 수용체 골격으로 선택하였다. 생식계열 V 영역은 적절한 FR4와 인실리코로 조합하였는데, 이번 경우에는 서열 유사성을 기초로 한 J영역 카파2 미니유전자(Kabat Vol.II)와 조합하였다. JK-2 미니유전자 잔기들 중 첫 번째 2 잔기들은 CDR3 영역 내에 번 위치하며 마우스 6A3 경쇄 CDR3의 마지막 2 잔기들과 동일하다. 5가지 인간적응된 경쇄 변이체들은 서열 비교와 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기반으로 제조하였다. L0 구조체는 6A3(Kabat 정의를 사용함)로부터의 마우스 CDR를 상기에서 선택한 인간 수용체 골격으로 직선 이식한 형태이다. L1, L2 구조체들은 L0를 기반으로 하는데, 각각은 각각의 구조체에서와는 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함한다; 각각 45, 70 번 위치. L3 구조체는 상기의 역 변이들 2 가지를 모두 포함한다.

6A3 골격 IGKV1_39를 위한 경쇄 인간적응화 원리

1 CDR1 44

Vk 6A3 DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKSP

IGKV1_39 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKAP

6A3 L0 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKAP

6A3 L1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKAP

6A3 L2 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKAP

6A3 L3 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQ... ...TIGAWLA WYQQKPGKAP

45 CDR2 CDR3 94

Vk 6A3 QLLIY AATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFSFK ISSLQAEDFV SYYCQQFFST

IGKV1_39 KLLIY AATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCQQFFST

6A3 L0 KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST

6A3 L1 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST

6A3 L2 KLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST

6A3 L3 QLLIYAATRL ADGVPSRFSG SGSGTKFTLT ISSLQPEDFA VYYCQQFFST

95

Vk 6A3 P..WT FGGGT KLEIKR

6A3 L0-L3 P..WTFGQGT KLEIKR

골격 4

hJk2 FGQGT KLEIKR

5가지 인간적응된 경쇄 변이체들을 서열 비교와 항체 기능에 대한 가능한 영향을 기반으로 제조하였다. L0 구조체는 6A3(Kabat 정의를 이용함)으로부터 마우스 CDR를 상기에서 선택한 인간 수용체 골격으로 직선 이식한 형태이다. L1, L2 구조체들은 L0를 기반으로 하며, 각각은 각각 구조체에서와는 다른 하나의 추가적인 골격 변이를 포함하고: 각각 45번, 70번 위치를 포함한다. L3 구조체는 상기의 역 변이들 2 가지를 모두 포함하고; L27 구조체는 T4L, A31Y, D70M, V85T, T94Y, Q100G, L104V (서열번호 138)을 포함하는 더 많은 변이들을 포함한다.

6A3 가변 경쇄 인간 적응된 변이체들

인간적응된 VL	주형	역변이들(Kabat#)
L0	IGKV1-39 + JK-2미니유전자로 6A3VLCDR의 직선 이식	None
L1	L0	K45Q
L2	L0	D70K
L3	L1	K45Q, D70K
L27	L0	T4L, A31Y, D70M, V85T, T94Y, Q100G, L104V

2.5 Fc 장애 가변 중쇄의 제조

2가지의 아미노산 치환, L237A 및 G239A는 1A11 H3 구조체를 만드는데 사용하였다. 이러한 변형들은 분자가 면역 효과 세포들 또는 보체를 덜 동원하도록 한다. 그 결과인 VH 구조체를 1A11 H3-Fc로 확인하였고, 서열번호 118(서열번호 119의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된)에 보여준 서열을 가지고 있다. 1A11 H3-Fc와 1A11.L4 경쇄(1A11 H3L4Fc)를 포함하는 항체는 하기의 실시예 4에서 설명한 대로 차후에 분석하였다.

2.6 1A11 H3L4 의 친화도 성숙

2.6.1 재조합 항- IL7R 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 제조

다수의 인간적응된 항-IL7R 단일클론 항체 1A11 H3L4의 변이체들이 생산되었다. 이러한 모든 변이체들은 서열번호 114(H3)로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 115(L4)로 표시되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 CDRH3 영역에서 오직 한 가지 아미노산 치환만이 다르다.

pLEFD 포유동물 발현 벡터 내의 1A11 H3L4의 인간적응된 CDRH3 변이체들은 번 위치-지향성 돌연변이를 이용하여 제조하였다.

2.6.2 HEK 293 6E 세포에서의 소규모 항체 발현

1A11 H3L4 및 CDRH3 변이체들의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 pLEFN 및 pLEFD 플라스미드들은 각각 293펙틴 (Invitrogen, 12347019)를 이용하여 96-웰 규모 (500㎕ 발현 부피)에서 HEK 293 6E 세포로 일시적인 공동-형질주입하였다. 상등액들을 1500rpm에서 10분간 원심분리하여 회수하였다. 그 후에 항체를 포함하는 상등액들은 0.45㎛ 여과판을 이용하여 여과하였다. 항체들은 조직 배양 상등액으로부터 직접적으로 평가하였다.

2.6.3 항- IL7R 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 프로테온 분석

CDRH3 항체 변이체들(실시예 2.6.2에 설명한 것처럼, HEK293 6E 세포의 소규모 항체 발현에서 유래하여 조직 배양 상등액으로부터 직접적으로 평가함)의 결합 친화도를 측정하는 초기 탐색은 ProteOn XPR36 (Biorad)에서 수행하였다. 방법은 다음과 같다: 단백질 A를 1차 아민 결합을 이용하여 GLC 칩위에 고정시킨 후, CDRH3 변이 항체들은 GLC 칩 표면에서 포획하였고 이중 참조 결합 곡선에 사용하는 0nM 주입(예를 들어, 완충액 단독)과 함께 256, 64, 16, 4, 1nM 에서 IL7R를 통과하였다. 포획 표면을 재생하기 위해50mM 수산화나트륨을 사용하였고, 또 다른 포획 주기와 분석물 주입을 준비하는 결합된 CDRH3 변이 항체들을 제거하였다. 자료는 장치에 대하여 고유한 분석 소프트웨어를 사용하는 1:1 모델에 맞추었다. 변이 항체들에 대한 결합 분석은 조직 배양 상등액으로부터 직접적으로 수행하였다.

탐색은 모체 분자(1A11 H3L4)보다 더 나은 동적 특성을 가지는 것으로 보이는 여러 개의 항체들을 확인하였다. 이러한 분석으로부터 수득한 자료는 4.2.3에 나타내었고, N98 및 F100b 잔기에서의 여러 가지 CDRH3 변이들이 IL7R에 대한 결합 친화도를 향상시키는 것처럼 보인다는 것을 나타내었다. 이러한 자료 세트로부터, 차후의 분석을 위해 6개 분자들을 선택하였다(실시예 2.6.4.).

2.6.4 HEK 293 6E세포에서의 대규모 항체 발현

자료는 N98 및 F100b 잔기들에서의 여러 가지 CDRH3 변이들이 IL7R에 대한 결합 친화도를 향상시키는 것처럼(4.2.3의 자료) 보인다는 점을 강조하였다. 그러므로, 정제된 항체는 이러한 6가지 CDRH3 변이체들을 위해 생산하였다. 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 구조체들은 최적의 대규모 HEK 293 6E 발현을 위해 pLEFD 및 pLEFN플라스미드로부터 pTT 벡터로 서브-클로닝하였다. 플라스미드들은 293펙틴 (Invitrogen, 12347019)를 이용하여 50-100ml 의 HEK 293 6E(표 7에 요약한 플라스미드의 상세 내역들)로 공동-형질주입하였다. 24시간 후에 트립톤 배지를 세포 배양에 첨가하였고 이후 72시간 후에 세포들을 회수하였다. 그 후에 항체는 고정화된 단백질 A 컬럼을 이용하여 친화도 정제하였고 280nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다.

3.0 인간적응된 벡터의 제조

인간적응된 가변 영역들의 DNA 서열들은 LETO 1.0 소프트웨어(Entelechon GmbH)를 이용한 최적화된 서열이고 겹치는 올리고뉴클레오티드와 PCR 증폭의 제조에 의해 새로이 합성되었다. 프라이머들은 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 절단 부위와 분비를 위한 인간 면역글로불린 신호 서열들을 포함하였다. 인간적응된 가변 중쇄 영역은 Age1/Kas1을 이용하여 인간 감마1 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 동시에, 인간적응된 가변 경쇄 영역은 HindIII 및 BsiWI를 이용하여 인간 카파 불변 영역을 포함하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다.

4.0 인간적응된 항체들의 특성화

4.1 1A11 및 6A3구조체들의 결합 속도론의 측정: BIAcore ^TM 3000

인간 CD127 ECD에 대한 항-CD127 항체의 결합 속도론은 BIAcore 3000 기기(GE Healthcare)를 이용하여 측정하였다. 인간적응된 6A3 또는 1A11 구조체들은 공급된 결합 완충액을 이용하여 미리 고정시킨 BIAcore(GE Healthcare cat# BR-1008-39) 항-인간 IgG(Fc 특이적) 단일클론 항체인 CM5 바이오센터 칩에서 포획하였다. 다양한 농도 (512, 256, 128, 64, 32, 16nM)의 인간 CD127 ECD은 30ul/min의 유속으로 240초간 주입하였다.

1) 관심 있는 단일클론항체의 포획

2) 포획된 단일클론항체에 대한 분석물의 결합

3) 분석물(완충액)의 해리

4) BIAcore 최적화된 완충액을 이용한 재생. 공유결합한 항-H 항체를 제외한 나머지 모든 것을 제거. BIAcore Kinetic 작동 주기들: 완충액, 512, 256, 128, 64, 32, 16nM IL7R ECD; 이중 기준에 사용하는 완충액 주기

항체 표면은 3M MgCl₂을 이용하여 재생하였다. 속도론은 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 1:1 Langmuir 모델에 대한 자료의 전반적인 맞춤에 의해 측정하였다. 결과들은 실시예 4.2.1(1A11) 및 4.2.2(6A3)에 나타내었다.

4.1.1 선택된 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 결합 속도론의 측정

BIAcore^TM 분석은 정제된 CDRH3 변이 항체들(실시예 2.6.4에서 설명한 것처럼, HEK293 6E 세포에서 더 큰 규모의 항체 발현으로부터 유래한)의 결합 친화도를 측정하기 위해 사용하였다.

4.1.1.1 방법 1: BIAcore ^TM T100

항-인간 IgG(GE Healthcare/BIAcore^TM BR-1008-39)는 ~1300 수준의 공명 단위(RU's)와 연결한 1차 아민에 의해 CM3 칩 위에 고정시켰고, 그 후에 CDRH3 항체들은 그 위에서 포획하였고, 모든 항체들은 유사한 수준(44-56 RU's)으로 포획하였고 이중 기준 결합 곡선에 사용한 0nM 주입(예를 들어, 완충액 단독)과 함께 256, 64, 16, 4, 1nM 에서 IL-7R을 통과시켰고, 이 표면에서의 재생은 3M MgCl₂를 이용하여 달성하였다. 결합 자료는 BIAcore^TM T100 분석 소프트웨어에 고유한 1:1 모델에 맞추었다. 이 시험은 작동 완충액으로써 HBS-EP를 이용하여 수행하였고 BIAcore^TM T100상의 25^oC에서 수행하였다. 결과는 4.2.4에 나타내었다.

4.1.1.2: Method 2: BIAcore ^TM 3000

항-인간 IgG(GE Healthcare/BIAcore^TM BR-1008-39)는 ~5400 수준의 공명 단위(RU's)와 연결한 1차 아민에 의해 CM5 칩 위에 고정시켰고, 그 후에 CDRH3 항체들은 그 표면에서 포획하였고, 모든 항체들은 유사한 수준(175-205 RU's)으로 포획하였고 이중 기준 결합 곡선에 사용한 0nM 주입(예를 들어, 완충액 단독)과 함께 64, 16, 4, 1nM에서 IL-7R을 통과시켰고, 이 표면에서의 재생은 3M MgCl₂를 이용하여 달성하였다. 결합 자료는 BIAcore^TM 3000 분석 소프트웨어에 고유한 1:1 모델에 맞추었다. 이 시험은 작동 완충액으로써 HBS-EP를 이용하여 수행하였고, BIAcore^TM 3000상의 25^oC에서 수행하였다. 결과는 4.2.5에 나타내었다.

4.1.2 시노몰거스및 마모셋에서 1A11 H3L4 의 종 교차-반응성의 측정

시노몰거스 및 마모셋 CD127 ECD에 대한 1A11H3L4의 결합 속도론은 Biacore 3000을 이용하여 측정하였다. 1A11 H3L4는 미리 고정된 BIAcore(GE Healthcare cat# BR-1008-39) 항-인간 IgG(Fc 특이적) 단일클론 항체인 CM5 바이오센서 칩에서 포획하였다. 항체 표면은 3M MgCl₂을 이용하여 재생하였다. 속도론은 BIAevaluation 소프트웨어를 이용하여 1:1 Langmuir 모델에 대한 자료의 전반적인 맞춤에 의해 측정하였다. 결과는 4.3에 나타내었다.

4.1.3 IL7 수용체 저해 분석법

BIAcore^TM 분석은 IL7과 IL7R 사이의 상호작용을 저해할 수 있는 정제된 CDRH3 변이 항체(실시예 2.6.4에서 설명한 것처럼, HEK293 6E 세포의 대규모 항체발현으로부터 유래한)를 설명하기 위해 사용하였다.

IL7 (R&D Systems)는 1차 아민 결합에 의해 CM5 칩에 고정시키고; 중화 분석법을 위한 안정적인 표면을 제공하기 위해 표면은 pH3.0, 10mM Gly을 이용하여 조절하였다. 64nM의 IL7R은 시험1에서는 256nM, 128nM, 64nM, 16nM, 8nM, 4nM, 2nM 및 1nM의 농도의 시험항체를 이용하고, 시험2에서는 256nM, 128nM, 64nM, 16nM, 8nM, 4nM, 2nM, 1nM, 0.5nM 및 0.25nM의 농도의 시험 항체를 이용하여 배양하였다. 그 후에 표본들은 IL7/CM5 칩 위를 통과하기 전에 상온에서 3시간 동안 배양하였고, 이후의 상호작용을 위한 표면을 재생하기 위해 pH3.0, 10mM Gly을 사용하였다. IC₅₀ 값은 로보시지를 이용하여 계산하였고, 여기서 결합 신호는 0nM 항체를 포함하는 64nM에서의 IL7R를 이용하여 얻은 대략적인 최대 신호에 근거하여 백분율 값으로 전환되었다. 결과는 4.7에 나타내었다.

4.2 결합 속도론 결과

4.2.1 1A11

1A11 구조체들에 대한 결합 속도론

표본	ka (1M/s)	kd (1/s)	KD (M)
1A11 키메라	9.26e4	2.98e-4	3.22e-9
1A11 H0L0	결합 없음	-	-
1A11 H1L1	결합 없음	-	-
1A11 H6L6	결합 없음	-	-
1A11 H7L5	발현 없음	-	-
1A11 H3L4	1.77e5	4.64e-4	2.62e-9
1A11 H3L5	2.94e4	6.07e-3	2.07e-7
1A11 H3L9	4.32e4	1.84e-3	4.25e-8
1A11 H3L6	1.82e4	2.82e-3	1.55e-7
1A11 H4L4	결합 없음	-	-
1A11 H6L4	결합 없음	-	-
1A11 H7L4	결합 없음	-	-
바이오틴-표지된 1A11 H3L4	1.69e5	4.52e-4	2.67e-9
1A11 H3L4Fc	1.8e5	6.62e-4	3.68e-9

4.2.2 6A3

6A3 구조체들의 결합 속도론

표본	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
H4-61_6L27	1.6e4	2.99e-4	19
H4-61_7L27	3.77e4	1.04e-3	28
H4-61_8L27	2.43e4	3.7e-4	15
H4-61_9L27	6.99e4	1.22e-3	18

4.2.3 BIAcore ^TM 분석에 의한 1A11 H3L4 의 다양한 항- IL7R 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 선택

[표 6]

항-IL-7R 1A11 H3L4 CDRH3변이체들의 프로테온 분석 (KD, in nM)

제조 및 발현시킨 선택된 CDRH3 변이체 단일클론항체들

항체 ID	대체 이름	Batch No.	분자설명	DNA 서열번호	단백질 서열번호
BPC4398	1A11 H3L4 N98D (CDRH3 변이체)	HEK1023	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 N98D	120	121
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC4399	1A11 H3L4 N98E (CDRH3 변이체)	HEK1024	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 N98E	122	123
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC4400	1A11 H3L4 F100bE (CDRH3 변이체)	HEK1025	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 F100bE	124	125
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC4401	1A11 H3L4 F100bH (CDRH3 변이체)	HEK1026	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 F100bH	126	127
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC4402	1A11 H3L4 F100bI (CDRH3 변이체)	HEK1027	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 F100bI	128	129
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC4403	1A11 H3L4 F100bV (CDRH3 변이체)	HEK1028	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3 F100bV	130	131
			경쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VL4	108	22
BPC1142	1A11 H3L4	HEK1029	중쇄: 항-인간 IL7R 1A11 VH3	13	32
			경쇄: 항-인간 IL7R	108	22

4.2.4 선택된 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 BIAcore ^TM T100 분석

표 8은 4.1.1.1 연구에서 수득한 자료를 보여주는데, 이는 모든 CDRH3 변이들이 BPC4398(항-IL7R 1A11 H3L4 N98D)처럼 보이는 최고의 구조체를 포함하는 모체분자들보다 더 나은 친화도를 가지는 것처럼 보인다는 것을 나타낸다.

선택된 1A11 H3L4 CDRH3 변이체들의 친화도 분석

분자식별자/수	분자설명	ka (M/s)	Kd (1/s)	KD (nM )
BPC1142 (GRITS37988) 복제물1	항-IL7R 1A11 H3L4	1.08E+06	7.06E-05	0.065
BPC1142 (GRITS37988) 복제물2	항-IL7R 1A11 H3L4	1.12E+06	5.86E-05	0.052
BPC4398	항-IL7R 1A11 H3L4 N98D (CDRH3 변이체)	1.71E+06	3.70E-05	0.022
BPC4399	항-IL7R 1A11 H3L4 N98E (CDRH3 변이체)	1.45E+06	4.08E-05	0.028
BPC4400	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bE (CDRH3 변이체)	9.24E+05	2.68E-05	0.029
BPC4401	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bH (CDRH3 변이체)	9.10E+05	3.06E-05	0.034
BPC4402	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bI (CDRH3 변이체)	8.26E+05	3.32E-05	0.040
BPC4403	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bW (CDRH3 변이체)	8.47E+05	3.30E-05	0.039
BPC1142 (HEK 1029)	항-IL7R 1A11 H3L4	1.16E+06	6.48E-05	0.056
모체분자 (BPC1142-항-IL7R 1A11 H3L4는 CHO 발현된 재료(GRITS37988) 및 HEK 발현된 재료 (H EK 1029)를 이 용한 실험 내에서 반복적으로 운용하였다. 모체 분자에 대한 다른 발현 시스템에서의 친화도들 사이에는 유의한 차이가 나타나지 않았다.

4.2.5 선택된 1A11 H3L4 CDH R3 변이체들의 BIAcore ^TM 3000 분석

표 9는 4.1. 1.2 연구로부터 수득한 자료를 보여주고 BPC4398 (1A11 H3L4 N98D) 및 BPC4399 (1A11 H3L4 N98E)처럼 보이는 최고의 구조물들을 포함한 모체 분자들보다 더 나은 친화도를 가진 것처럼 보이는 모든 CDRH3 변이를 보여준다.

CDRH3 변이체들의 친화도

분자 식별자 / 수	분자 설명	ka (M/s)	kd( 1/s)	KD (nM )
BPC1142(GRITS37988) 복제물 1	항-IL7R 1A11 H3L4	3.60E+05	2.70E-04	0.751
BPC1142(GRITS37988) 복제물 2	항-IL7R 1A11 H3L4	3.62E+05	2.36E-04	0.651
BPC4398	항-IL7R 1A11 H3L4 N98D (CDRH3 변이체)	5.44E+05	2.09E-04	0.385
BPC4399	항-IL7R 1A11 H3L4 N98E (CDRH3 변이체)	5.97E+05	2.33E-04	0.39
BPC4400	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bE (CDRH3 변이체)	3.51E+05	1.91E-04	0.546
BPC4401	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bH (CDRH3 변이체)	3.37E+05	1.96E-04	0.582
BPC4402	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bI (CDRH3 변이체)	3.00E+05	2.00E-04	0.668
BPC4403	항-IL7R 1A11 H3L4 F100bV (CDRH3 변이체)	2.98E+05	1.89E-04	0.636
BPC1142 (HEK1029)	항-IL7R 1A11 H3L4	3.49E+05	2.29E-04	0.656
모체 분자 (BPC1142-항-IL7R 1A11 H3L4)는 CHO 발현된 재료 (GRITS37988) 및 HEK 발현된 재료(HEK1029)를 이용한 실험에서 반복적으로 운용하였다, 모 체 분자에 대한 다른 발현 시스템에서의 친화도들 사이에는 유의한 차이가 나타나지 않았다.

차이점은 두 방법들 사이에서 계산된 전반적인 친화도들 사이에서 보여주었다. 이는 IL7R이 동종이량체라는 사실에 기인하는 것 같고 그러므로 결합성의 크기와 항원 및 항체들 간의 교차 연결은 2 가지 분석법에서 사용한 다른 포획 표면들에 의해 고정된 IL7R의 다른 밀도에 따라 증가하거나 감소할 수 있다. 2 가지 운용 간에서 보여지는 다른 친화도에도 불구하고 2개 실험들의 순위는 BPC4398 (1A11 H3L4 N98D)이 모체 분자인 1A11 H3L4보다 향상된 친화도를 가지고 있음을 보여 준다.

4.3 종들의 교차-반응성

1A11 H3L4 (야생형)은 Biacore 시스템에 의한 비교가능한 수준에서 검사한 마모셋 및 시노몰구스 IL-7R과 교차반응하는 것으로 관찰되었다(표 10).

1A11 H3L4와 인간 IL7R, 마우스 IL7R및 시노몰구스 IL7R의 비교

표본	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
인간 IL7R를 포함하는 1A11 H3L4	1.77 e5	4.64e-4	2.62e-9
시노몰구스 IL7R를 포함하는 1A11 H3L4	2.58e4	2.34e-4	9.06e-9
마모셋 IL7R를 포함하는 1A11 H3L4	4.93e4	2.99e-4	6.05e-9

4.4 X-선 결정학에 의한 에피토프 결합

1A11 H3L4 Fab을 이용하여, 인실리코 모델링과 연계한 X-ray 결정학은 단일클론항체들에 대한 경계면의 관찰 된 기능성 중화에 대한 기계론적인 통찰력 제공을 돕고 항체 성숙에 대한 합리적인 선택을 하기 위한 예측에 사용하였다. 1A11H3L4 Fab/인간 IL7 수용체 복합체의 고해상도(2.08A) 구조를 설정하였다. 인간 IL7R 수용체 세포외 도메인 및 1A11H3L4는 CHO lec 세포에서 발현되었고 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 1A11H3L4의 Fab 단편은 파파인 절단에 의해 제작하였다. Fab1A11H3L4/I L7R ECD 복합체는 Fab1A11H3L4와 IL7 수용체 ECD를 1:1.2 비율로 혼합하여 제작하였다. 단백질은 농축하였고, 방울 혼합 증기 평형법을 이용하여 결정화시켰다. X-선 회절 자료는 Argonne 국립 연구소의 개량 광자원에서 수집하였다. 회절 자료는 색인하였고 HKL2000 소프트웨어를 이용하여 확대하였다. 구조는 X-PLOR 프로그램에 서의 분자 교체에 의해 밝혀 내었다. 초기의 분자 교체 용액은 CNX 내 여러 번의 분자 동력학 개선 및 Wincoot 프로그램을 이용한 재건립의 대상이다.

고해상도 2.08A 결정 구조에 근거하여, 1A11H3L4가 IL-7R 세포외 고리의 4에서 IL7 수용체에 결합하고, 그리하여 IL7-리간드 결합을 억제한다는 것을 예측하였다:

고리 2: 55Gly 56Ala 57Leu 58Val 59Glu 60Val 61Lys

고리 3: 80Leu 81Leu 82Ile 83Gly 84Lys 100Lys

고리 4: 138Lys 139Tyr 142Val

고리 5: 192Tyr 193Phe

이러한 발견은 1A11과 6A3 사이에서 관찰한 hIL7에 대한 결합에서 관찰한 경쟁과 일관되는 것이다.

4.5 작용 기능의 분석

4.5.1 1A1 1 H3L4 은 보체 - 매개성 세포독성이 없다

6가지 각각의 실험들 전부는 1A11 H3L4 (야생형)은 측정가능한 보체-매개성 세포독성이 없음을 보여 주었다. 이러한 실험들은 표적으로써 사용한 hIL-7r BacMam를 형질도입시킨 HEK 293 MSR II 세포주를 이용하여 수행하였다. 이러한 세포들은 T175 배양 플라스크 내 37℃, 5% CO₂에서 21시간까지 형질도입(moi 75)시켰다. 그 후에, 부착성 세포들은 TrypLE를 이용해 플라스크로부터 분리하고, 96 웰-플레이트에 1x10⁵ 세포/50ul/웰 비율로 플레이팅 하기 전에 여러 번 세척하였다. 항체 25㎍를 37℃, 5% CO₂에서 30분 동안 첨가하였다. 이렇게 배양한 후에, 토끼 보체 20㎍를 플레이트에 첨가하고 그 후에 2시간 동안 배양기로 돌려 보냈다. 세포 생존력의 측정은 다중 파이펫을 이용하여 CellTiter-Glo100㎕를 각각의 웰에 첨가하고 약하게 섞음으로써 수행하였다. 그 후에 Victor V 플레이트 리더(살아있는 세포는 증가된 신호를 보유한다)에서 발광 신호에 대하여 플레이트를 읽었다. 이러한 실험들의 한 가지에 대한 하나의 실시예는 도 1에 나타내었다.

상기 실험에서 사용한 양성 대조군 항체(Grits 32092)는 hIL-7Ra를 발현하는 같은 표적 세포에서 공동-발현시킨 HER3에 대한 세포-표면 수용체에 대하여 특이적이다. 이러한 대조군 항체는 1A11 H3L4 (10 mg/ml)로써 같은 농도로 사용하였고, 토끼 보체(Calbiochem and Invitrogen)의 같은 두 가지 근원들과 조합하였다. 이러한 결과들은 분석법에서 사용했던 표적 세포 및 보체 두 가지 모두가 보체 의존성 세포독성을 유발할 수 있다는 것을 보여 주었다.

4.5.2 1A11 H3L4Fc 는 항체 의존성-세포 매개성 세포 독성(ADCC)를 감소시킨다

여러 개의 인간 공여체로부터 정제된 말초혈 단핵구 세포들은 ADCC 분석법에서 작용 세포로 분류되었다. 이러한 실험들은 표적세포로써 hIL-7r BacMam를 형질도입한 HEK 293 MSR II 세포주를 이용하여 수행하였다. 이러한 세포들은 T175 배양 플라스크 내 37℃, 5% CO₂에서 21시간까지 형질도입(moi75)하였다. 그 후에 이러한 부착성 세포들은 Tryple을 이용하여 플라스크로부터 분리하였고 유로피움과 같이 “로딩”하기 전에 여러 번 세척하였다. 이러한 로딩된 세포는 37℃, 5% CO ₂에서 30분간 항-IL-7R 항체를 포함하는 96-웰 플레이트(2x10⁴ 세포/25ul/웰)와 조합하였다. 배양 후에, 작용 세포들은 200, 100, 50 및 25:1 (100㎕/웰) 비율로 첨가하였고 2 시간 동안 37℃, 5% CO₂로 돌려보냈다. 이러한 배양 후에, 상등액 25㎕를 취하여 100㎕/웰의 Delfia 상승 용액를 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 후에 플레이트는 상온의 플레이트 혼합기에서 5분간 배양하였고 그 후에 Victor V 플레이트 리더에서 발광 값을 읽었다. 용균된 세포에 의해 주위 상등액으로 분비된 유로피움(세포독성)은 형광 단위로써 측정하였다.

이러한 분석법들은 자신의 Fc 수용체들을 통해 인간 작용 세포에 결합하고 IL-7 수용체 양성 표적 세포를 죽이는 "야생형" 1A11 H3L 4의 능력과 Fc-장애 분자 1A11 H3L4Fc의 능력을 비교하였다. 이러한 실험들로부터의 전반적인 결과들은 Fc- 장애 1A11 H3L4Fc는 "야생형" 1A11 H3L4보다 항체 의존성 세포-매개성 세포독성을 개시함에 있어서의 잠재력 이 적어도 2 배 이상 낮다는 것을 보여 주었다. 이러한 결과들은 또한 일곱 개 공여체 중 여섯 개에서, 장애 항체가 일정 수준의 ADCC 활성(하나의 공여체는 야생형 및 장애 1A11H3L4와의 활성을 거의 나타내지 않았다 )을 유발할 수 있다는 것을 보여 주었다. 결과는 도 2에 나타내었다.

4.5.3 Fc 수용체 결합

1A11 H3L4와 1A11 H3L4Fc는 다양한 Fc 작용 수용체들(Fc Gamma I, IIa and IIIa) 및 다양한 종들의 FcRn에 대해 결합하는 이들의 능력을 측정하였고 대조군 야생형 및 Fc 장애 항체들과 비교하였다. 이 연구는 Prote On XPR36 표면 플라스몬 공명 장치(Biorad)에서 수행하였다. 검사 할 항체들은 1차 아민 결합에 의해 GLM 바 이오센서 칩에 연결시켰다. 다양한 Fcγ수용체들은 작동 완충액으로써 HBS-EP (pH7.4)를 이용하여 2048nM, 5 12nM, 128nM, 32nM 및 8nM에서 분석물로써 사용하였다. FcRn 수용체 결합에 대하여, 인간, 개, 마우스 및 랫의 RcRn을 2048nM, 512nM, 128nM, 32nM 및 8nM에서 pH6.0 및 pH7.4에서 수행한 시험과 함께 분석물로써 사용하였다. 모든 결합 센소그램들은 0nM 주입(예를 들어, 완충액 단독)을 이용하여 이중으로 조회하였다. 자료들은 ProteOn 분석 소프트웨어에 고유한 평형 모델에 맞추었다.

표 11은 이번 연구에서 측정한 다양한 Fc 수용체들에 대한 항체 결합에 관해서 제작한 친화도들을 보여주고, 1A11 H3L4와 1A11 H3L4Fc가 이들의 대조군 항체 대응체들에 대하여 비슷한 방식으로 작용한다는 것을 보여준다. 장애 Fc 항체들(1A11 H3L4Fc)은 결합 없음 또는 Fcγ 수용체들에 대한 매우 감소된 결합을 보여주고, 그렇기 때문에 정확한 분석을 수행할 수 없다. FcRn 결합에 대한 자료는 Fc 장애 및 Fc 야생형이 시험한 모든 종들에 대해 유사한 친화도를 갖는다는 것을 보여주었고, 표에서의 자료는 pH6.0 분석법에 대한 것이며, 결합이 없거나 예상한 대로 pH7.4에서 매우 감소하였다.

다양한 Fc 수용체들에 대한 항체 결합에 관해서 제작한 친화도

구조체들	Fcγ2a (Arg)	Fcγ2a (His)	Fcγ3a (Phe)	Fcγ (Val)	Fcγ1	인간 FcRn	개 FcRn	마우스 FcRn	랫 FcRn
대조군항체 (Fc야생형)	1290	1500	1840	442	14.9	95	156	160	112
대조군항체 (Fc장애)	매우 감소된 결합	결합 없음	결합 없음	결합 없음	매우 감소된 결합	154	195	171	118
1A11 H3L4	1250	1040	990	319	21.4	183	210	192	145
1A11 H3L4 Fc	14매우 감소된 결합	결합 없음	결합 없음	결합 없음	매우 감소된 결합	158	248	207	163

6 생체 외 조건의 효능 분석법

4.6.1 1A11 및 1A11 H3L4 에 의한 IL -7 유발성 STAT5 인산화의 저해

IL-7Rγ에 대한 기능적 항체의 탐색을 위해서, IL-7으로 자극하기 전에 융합세포 배양 배지, 양성 대조군 항체 또는 시험 상등액 표본들을 PBMC 세포와 같이 30분 동안 배양하였다. 미처리된 세포들은 배경 신호로써 분석되었지만, IL-7처리된 세포들은 음성 대조군으로 설정되었다. 대조군 또는 시험 표본들과 30분 배양한 후에, 세포들은 37℃에서 15분간 IL-7으로 자극하였다. 그 후에 세포들은 37℃에서 10분간 1.6% 파라포름알데히드/PBS를 이용하여 고정시켰고, 100% 메탄올에서 20 ~30분 동안 투과성을 유발하였다. 그 후에 세포는 염색 완충액(1% BSA in PBS)에서 두 번 세척하였고 Alexa-647로 표지한 항-p-Stat5 항체(BD Biosciences Inc #612599)를 이용하여 1시간 동안 염색하였다. 표본들은 BD LSR II FACS 장비에서 분석하였다.

모체성 1A11 단일클론 항체는 IC₅₀가 0.088 ug/ml인 인간 PBMC에서 IL-7에 의한 STAT5 인산화를 억제하였다(자료는 나타내지 않음). 1A11 H3L4는 2 가지 인간 IL-7 농도들(0.1 ng/ml and 1 ng/ml)에서 두 공여체로부터의 PBMC를 이용하여 같은 분석법으로 검사하였다. 1A11 H3L4는 1A11과 비교했을 때 매우 유사한 IC50(평균=0.087 ug/ml)를 보여주는데 이는 인간 적응화 과정이 IL-7이 유발하는 pSTAT5를 저해하는 항체의 능력에 영향을 주지 않는다는 것을 암시한다(도 3A 및 3B).

4.6.2 1A11 H3L4 에 의한 IL -7 유발성 IL -17 생산의 저해

Th17 팽창을 억제하는 능력을 시험하기 위해 1A11 H3L4는 하기의 프로토콜에 따라 검사하였다. CD4+ 세포들은 설명서(#130-091-155, Miltenyi)에 따라 분리하였다. 대략적으로 100 ml내 1x10⁶/ml 의 CD4+ 세포들을 2배 농도인 Th17 분화 배지(2μg/ml 항-CD28 + 10μg/ml 항-IFN-γ + 10μg/ml 항-IL-4 + 12.5ng/ml IL-1ß + 20ng/ml IL-23 + 50ng/ml IL-6) 의 같은 부피로 혼합하였고, 37℃인 5% CO₂ 에서 5일간 배양하였다. Th17 배지에서 다양한 사이토카인 및 성장인자들의 처리는 CD4+세포를 우선적으로 Th17 세포로 분화시켰다. 5일에 분화된 배양 세포들로부터의 CCR6+ 세포들은 BD FACS SORP Aria II을 이용하여 분류하였다. 그 후에 CCR6+ 세포들은 IL-17 생산 분석을 위해 2 x10⁶/ml로 맞추었다.

IL-17 및 IFN-γ양을 측정하기 위해, 100㎕의 CCR6+ 세포들을 시험 항체와 함께 37℃에서 전-배양시키고 나서, 100㎕의 10ng/ml IL-7와 혼합하였다. 세포들은 5% CO₂로 보충된 37℃에서 24~40시간 동안 배양하였다. 100 ml의 배양 상등액 내 IFN-γ및 IL-17 양은 24시간 및 40시간에서 각각 플로우사이토믹스 (Bende r MedSystems)에 의해 측정하였다.

1A11 H3L4는 전체 4가지 인간 CD4+ 세포 표본들(도 4A-D)에서 Th17 팽창 분석법으로 검사하였다. 인간적응된 항체는 두 표본들에서 IL-17 생산에 대한 유의한 저해를 입증하였고 다른 두 표본에서는 저해 동향성을 보여 주었다. 이 분석법에서 공여체-공여체 변화가 정해졌기 때문에, 우리는 1A11 H3L4는 IL-7이 매개하는 Th17 세포 팽창을 억제할 수 있다고 결론 지었다.

4.6.3 TSLP 신호전달에 대한 효과

IL-7Rγ하부단위는 IL-7R과 TSLP 수용체 복합체(TSLPR) 모두에 의해 공유되고 있다. TSLP 신호전달에 대한 1A11 H3L4의 효과는 인간 혈액 단핵세포구에 의한 TARC 생산을 TSLP가 유도한다는 점을 기초로 하는 생체 외 조건 분석법에서 검사하였다. 상업용 항 IL-7Rγ항체인 R34.34는 TARC에 대한 TSLP의 유발성을 억제하기 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 Fc-장애 인간적응된 IgG1(HuIgG1; GRITS39633) 또한 음성 대조군으로 사용하였다. 5가지 공여체로부터의 단핵백혈구들은 1ng/ml로 사용하는 TSLP, 투여량 0.001-30㎍/ml으로 사용하는 HulgG1 및 0.4, 2, 및 10 ㎍/ml에서 사용하는 R34.34와 같이 사용하였다. 또한 세포 생존은 세포 계수에 의해 측정하였다.

1A11 H3L4는 도 5A 내지 도 5E에 나타난 것처럼 TARC에 대한 TSLP의 유발성에 영향을 주지 않지만, 같은 5가지 공여체에 대하여 R34.34는 TARC 생산을 상당히 저해시킨다. 인간적응된 음성 대조군 항체는 TARC 생산에 아무런 효과가 없다. 이러한 결과 세트는 1A11 H3L4가 인간 단핵백혈구에서 TSLP 신호전달을 중화시키지 않는다는 점을 보여 준다. 그러므로 1A 11 H3L4는 IL-7R을 통한 IL-7 신호전달의 중화에 특이적이고 TSLPR을 통한 TSLP 신호전달에는 영향을 주지 않는다고 예측되었다.

4.7 IL7 수용체 저해 분석법

표 12A는 시험 1에서 수득한 IC₅₀ 값을 보여주고, 모든 구조체들은 모 1A11 H3L4 분자에 대해 수득한 최고의 값보다 더 나은 IC₅₀ 값을 가지고 있으며 최고의 2가지 분자들은 BPC4401 (Ant i-IL7R 1A11 H3L4 F100bH) 과 BPC4398 (1A11 VH3 N98D L4)라는 것을 보여준다. 표 12B는 시험2에서 수득한 IC₅₀ 값을 보여주고, 또한 두 구조체들 BPC4401 (Anti-IL7R 1A11 H3L4 F100bH)과 BPC4398 (1A 11 VH3 N98D L4)가 모 1A11 H3L4 분자에 대하여 수득한 최고의 값보다 더 나은 IC₅₀ 값을 가지고 있음을 보여준다. 시험 1과 시험 2는 별개의 IL7R/CM5 표면에서 수행하였다.

[표 12a]

IC50수용체 저해 분석법(시험1)

[표 12b]

IC50수용체 저해 분석법(시험2)

4. 8 IL -7R 다형체 결합 분석법

IL-7R는 두 가지 다형체 형태, 변이체 1: Thr66-Ile128, 변이체 2: Ile66-Thr128로써 존재한다. 두 가지 다형체 형태에 대한 1A11H3L4의 결합을 검사하였다 . 항-인간 IgG(GE Healthcare/BIAcore^TM BR-1008-39)는 9000개까지의 공명단위 양까지 1차 아민 결합에 의해 CM5칩에 고정시켰고, 그 후에 이 표면 위에서 1A11H3L4를 포획하였고, IL7R은 이중 참조 결합 곡선에 사용하는 0nM 주입(예를 들어, 완충액 단독)과 함께256, 64, 16, 4, 1nM 에서 IL7R는 통과하였고, 이 표면의 재생은 3M 염화마그네슘를 이용하여 달성하였다. 결합 자료는 BIAcore^TM 3000 분석 소프트웨어에 고유한 1:1 모델에 맞추었다. 이 시험은 작동 완충액으로써 HBS-EP를 사용하여 수행하였고 BIAcore^TM 3000상의 25℃에서 수행하였다. 표 13은 수득한 자료를 보여주고 있고 1A11 H3L4는 두 다형체의 변이체에 대한 같거나 유사한 결합 친화도를 가진다는 것을 보여주었다(예를 들어, 1A11 H3L4는 두 가지 다형체에 결합한다).

IL-7R 다형체 결합

hIL7R 변이체1를 포함하는 1A11H3L4: Thr66-Ile128	Kon (Ka ) 1.52e5	Koff (Kd)4.15e-4	KD 2.73e-9
hIL7R 변이체2를 포함하는 1A11H3L4: ILE66-Thr128	Kon (Ka) 1.46e5	Koff (Kd) 4.56e-4	KD 3.1e-9

이 명세서 내에서 본 발명은 실시예들을 참고로 하여, 명확하고 간결한 명세서를 작성하는 방식으로 설명하였다. 실시예들은 본 발명으로부터의 개시함이 없어도 다양하게 조합될 수 있거나 구분될 수 있다는 점을 의미하였고 인식해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited <120> CD127 Binding Proteins <130> PB64061 <140> 61/299010 <141> 2010-01-28 <150> unknown <151> 2011-01-26 <160> 138 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 455 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> human CD127 <400> 1 Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp 20 25 30 Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Gln Leu Glu Val Asn Gly 35 40 45 Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr 50 55 60 Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys 65 70 75 80 Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys 85 90 95 Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys 100 105 110 Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu 115 120 125 Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe 130 135 140 Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val 145 150 155 160 Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp 165 170 175 Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys 180 185 190 Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp 195 200 205 His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe 210 215 220 Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu 225 230 235 240 Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Leu Val Ile Leu Ala 245 250 255 Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu 260 265 270 Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys 275 280 285 Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile 290 295 300 His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu 305 310 315 320 Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu 325 330 335 Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Val 340 345 350 Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly 355 360 365 Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu 370 375 380 Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu 385 390 395 400 Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser 405 410 415 Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro 420 425 430 Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met 435 440 445 Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 450 455 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR H1 <400> 2 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR H2 <400> 3 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR H3 <400> 4 Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR L1 <400> 5 Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR L2 <400> 6 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 CDR L3 <400> 7 Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 VH <400> 8 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 1A11 Vk <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H0 VH <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H1 VH <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H2 VH <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H3 VH <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H4 VH <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H5 VH <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H6 VH <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H7 VH <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L0 Vk <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L1 Vk <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L2 Vk <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L3 Vk <400> 21 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L4 Vk <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L5 Vk <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L6 Vk <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L7 Vk <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L8 Vk <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L9 Vk <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11c VH <400> 28 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11c Vk <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H1 VH <400> 30 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccatg accgtggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 31 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H2 VH <400> 31 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccatg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H3 VH <400> 32 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 33 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H4 VH <400> 33 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccatg accgtggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H5 VH <400> 34 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccctg accgtggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H6 VH <400> 35 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccctg accgtggata agagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 36 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 1A11.H7 VH <400> 36 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggtgaccctg accgtggcca agagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 37 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding 1A11c VH <400> 37 gaggtgcagc tgcagcagag cggccccgaa ctgctgaagc ccggcgctag catgaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc ggctacacca tgaactgggt caagcagtcc 120 cacggcaaga acctggagtg gatcggcctg atcaacccct acaacggcgt gacctcctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctc acagtggcca aaagcagcag caccgcctac 240 atggaactgc tgagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actattgcgc caggggcgac 300 ggcaattact ggtacttcga cgtgtggggc gccggaacca ccgtgaccgt gtctagc 357 <210> 38 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding 1A11c Vk <400> 38 gagatcgtgc tgacccagag ccccgcaatt accgccgcca gcctgggcca gaaggtgacc 60 atcacctgca gcgcaagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagagcggc 120 accagcccca agccctggat ctacgagatc tccaagctcg cctctggagt ccctgtgagg 180 ttcagcggca gcggcagcgg cactagctac tcactgacca tcagcagcat ggaggccgaa 240 gacgccgcca tctattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaactggaga tcaag 315 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR H1 <400> 39 Thr Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR H2 <400> 40 Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR H3 <400> 41 Gly Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR L1 <400> 42 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR L2 <400> 43 Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 CDR L3 <400> 44 Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 VH <400> 45 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3 Vk <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H0 VH <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H1 VH <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H2 VH <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H3 VH <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H4 VH <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H5 VH <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H6 VH <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H7 VH <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H8 VH <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV4_61.H9 VH <400> 56 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Val Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H0 VH <400> 57 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H1 VH <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H2 VH <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H3 VH <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H4 VH <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H5 VH <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H6 VH <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H7 VH <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H8 VH <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H9 VH <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.IGHV3-33.H10 VH <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr 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Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.L0 Vk <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.L1 Vk <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.L2 Vk <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6A3.L3 Vk <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3c VH <400> 73 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Gly Tyr Asp Val Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> 6A3c Vk <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Ala Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H0 VH <400> 75 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 76 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H1 VH <400> 76 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 77 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H2 VH <400> 77 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcta ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 78 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H3 VH <400> 78 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgacc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 79 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H4 VH <400> 79 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag gatcaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 80 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H5 VH <400> 80 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatgggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 81 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H6 VH <400> 81 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcta ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 82 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H7 VH <400> 82 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcta ctccgtgacc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 83 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H8 VH <400> 83 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcgg ctccgtgagc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag ggtgaccatc agcgtcgaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 84 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV4_61.H9 VH <400> 84 caggtgcagc tgcaggagag cggacccggc ctggtgaaac ccagcgagac cctgagcctg 60 acctgcacag tgagcggcta ctccgtgacc accgactacg cttggaactg gatcaggcag 120 cctcccggca agggcctgga gtggatcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tcaagtccag gatcaccatc agcagggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgat accgccgtgt actactgcgc caggggaggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca cctatactgt gagcagc 357 <210> 85 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H0 VH <400> 85 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 86 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H1 VH <400> 86 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggata caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 87 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H2 VH <400> 87 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcacc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 88 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H3 VH <400> 88 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt cagcttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 89 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H4 VH <400> 89 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccatcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 90 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H5 VH <400> 90 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gatcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 91 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H6 VH <400> 91 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca ccagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 92 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H7 VH <400> 92 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccttctac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 93 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H8 VH <400> 93 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcggc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 94 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H9 VH <400> 94 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcagcatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 95 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H10 VH <400> 95 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg tgagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtgggtcgcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 96 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.IGHV3_33.H11 VH <400> 96 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctc 60 tcttgcgccg ccagcggatt caccttcagc accgactacg cctggaattg ggtgaggcag 120 gcccccggga agggcctgga gtggatggcc tacatcttct acagcggcag caccacctac 180 acccccagcc tgaagagcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt attactgcgc tagggggggc 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 97 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L0 Vk <400> 97 gacatccaga tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaaactgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 98 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L1 Vk <400> 98 gacatccaga tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc cccagctgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gcagcggaag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 99 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L2 Vk <400> 99 gacatccaga tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaaactgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gcagcggaag cggcaccaag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 100 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3.L3 Vk <400> 100 gacatccaga tgacccagag ccccagctcc ctgagcgcca gcgtgggcga tagggtgacc 60 atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc cccagctgct gatctacgcc gcaactaggc tcgccgacgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gcagcggaag cggcaccaag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggg 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 101 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3c VH <400> 101 gacgtccagc tgcaggagag cggccccggg ctggtgaagc cctctcagag cctgagcctg 60 acctgcaccg tgaccggcta cagcatcacc accgactacg cctggaactg gatcaggcag 120 ttccccggca acaagctgga gtggatgggc tacatcttct acagcggcag caccacctat 180 acccccagcc tcaagagcag gatcagcatc accagggaca cctccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagctga acagcgtgac cacagaggac accgccacct actactgcgc caggggcgga 300 tacgacgtga actacttcga ctactggggc cagggcacca ctctgaccgt gagcagc 357 <210> 102 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence encoding 6A3c Vk <400> 102 gacatccaga tgacccagag ccccgccagc cagagcgcct ctctgggcga gagcgtgaca 60 atcacctgcc tggccagcca gaccattggc gcttggctgg cctggtacca gcagaagccc 120 ggcaagagcc cccagctgct gatctacgcc gccactaggc tggccgacgg cgtgcccagc 180 aggtttagcg gcagcggcag cggcaccaag ttcagcttca agatcagcag cctgcaggcc 240 gaggacttcg tgtcctacta ctgccagcag ttcttcagca ccccctggac cttcggcggc 300 ggaaccaaac tcgagatcaa g 321 <210> 103 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.H0 <400> 103 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaaag cctccggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt caggcaggct 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccatg accagggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcaggctgag gagcgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 gggaactact ggtacttcga cgtatggggc cagggaacaa ccgtgaccgt gagcagc 357 <210> 104 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L0 <400> 104 gagatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagggccacc 60 ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccggc 120 caggcccctc gcctgctgat ctacgagatc tctaagctgg ccagcggcat tcccgctagg 180 ttcagcggca gcggctcagg caccgacttc accctcacca tcagcagcct ggagcccgaa 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct ataccttcgg cggcgggacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 105 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L1 <400> 105 gagatcgtgc tgactcagag ccccgccacc ctgagcctga gccccggcga aagggccaca 60 ctgagctgca gcgctagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccta ggctgtggat ctacgagatc agcaagctgg ccagcggcat tcccgccagg 180 ttctcaggca gcggaagcgg caccgacttc accctcacca tcagctctct ggagcccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct ataccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 106 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L2 <400> 106 gagatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctca gccctggcga gagggccact 60 ctgagctgct ctgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccgga 120 caggccccca ggctgctgat ctacgagatc agcaagctgg cctctggcat tcccgccagg 180 ttcagcggct caggcagcgg caccgactac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactatccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 107 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L3 <400> 107 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccaca ctgtcactgt ctcccggcga aagggccacc 60 ctgagctgca gcgcctctag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggctccca ggctgtggat ctacgagatc agcaagctgg ccagcggcat ccctgccagg 180 ttcagcggca gcggcagcgg caccgactat accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcgggacc 300 aaagtggaga tcaag 315 <210> 108 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L4 <400> 108 gaaattgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctgt caccaggcga gagggcaact 60 ctgagctgca gcgccagctc tagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccgga 120 caggcccccc ggcccctgat ctacgagatc tccaagctgg ccagcggcat ccccgccagg 180 tttagcggca gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 240 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 109 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L5 <400> 109 gaaatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctga gccccggaga gagggccact 60 ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccaa ggccctggat ctacgagatt agcaagctgg cctccggcat ccctgccagg 180 ttcagcggct caggcagcgg caccgactat accctcacca tcagcagcct ggagcccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 110 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L6 <400> 110 gagatcgtgc tgacccagtc acccgcaaca ctgagcctga gcccaggaga gagggccacc 60 ctgagctgca gcgcctctag ctccgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccca gaccctggat ctacgagatc agcaagctcg ccagcggcgt ccccgccagg 180 ttcagcggaa gcggcagcgg gaccgactac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 111 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L7 <400> 111 gaaattgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctgt caccaggcga gagggcaact 60 ctgagctgca gcgccagctc tagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaaacccgga 120 caggccccca agccctggat ctacgagatc tccaagctgg ccagcggcgt gcccgccagg 180 tttagcggca gcggcagcgg caccgactac accctgacca tcagcagcct cgagcccgag 240 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 112 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L8 <400> 112 gaaatcgtgc tgacccagag ccccgcaacc ctgagcctga gccccggaga gagggccact 60 ctgagctgca gcgccagcag cagcgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccaa agccctggat ctacgagatt agcaagctgg cctccggcgt ccctgccagg 180 ttcagcggct caggcagcgg cacctcctat accctcacca tcagcagcct ggagcccgag 240 gacttcgccg tctactactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 113 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding 1A11.L9 <400> 113 gagatcgtgc tgacccagtc acccgcaaca ctgagcctga gcccaggaga gagggccacc 60 ctgagctgca gcgcctctag ctccgtgacc tacatgcact ggtaccagca gaagcccggc 120 caggccccca agccctggat ctacgagatc agcaagctcg ccagcggcgt ccccgtcagg 180 ttcagcggaa gcggcagcgg gaccagctac accctgacca tcagcagcct ggaacccgag 240 gacttcgccg tgtattactg ccaggagtgg aactacccct acaccttcgg cggcggcacc 300 aaggtggaga tcaag 315 <210> 114 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.H3FL (Full length) <400> 114 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tyr Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 115 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11.L4FL (Full length) <400> 115 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 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Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 <210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Human immunoglobulin kappa light chain IGKV3-11 V gene (leader plus V region)sequence <400> 117 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 85 90 95 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 100 105 110 Pro <210> 118 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11_H3-Fc (FULL LENGTH) <400> 118 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 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accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 840 acctgtgtgg tggtggatgt gagccacgag gaccctgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 960 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtac 1020 aagtgtaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccctatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1080 aagggccagc ccagagagcc ccaggtgtac accctgcccc ctagcagaga tgagctgacc 1140 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260 agcgatggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag 1320 ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacccagaag 1380 agcctgagcc tgtcccctgg caagtga 1407 <210> 120 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 N98D <400> 120 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcgactact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 121 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11 VH3 N98D <400> 121 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 122 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 N98E <400> 122 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcgagtact ggtacttcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 123 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11 VH3 N98E <400> 123 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Glu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 124 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding 1A11 VH3 F100bE <400> 124 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacgagga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 125 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11 VH3 F100bE <400> 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Glu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 126 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding VH3 F100bH <400> 126 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtaccacga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 127 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A11 VH3 F100bH <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr His Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 128 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding VH3 F100bI <400> 128 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacatcga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 129 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3 F100bI <400> 129 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid encoding VH3 F100bV <400> 130 caggtgcagc tggtgcagag cggagccgag gtgaagaaac ccggagccag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacacca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gactcgagtg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgt gaccagctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggtgaccctg accagggata ccagcatcag caccgcttac 240 atggaactga gcaggctgag gtccgacgac accgccgtgt attactgcgc caggggcgac 300 ggcaactact ggtacgtgga tgtgtggggc cagggcacca ccgtcacagt gagcagc 357 <210> 131 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3 F100bV <400> 131 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Asp Gly Asn Tyr Trp Tyr Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3 N98D CDRH3 <400> 132 Gly Asp Gly Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3 N98E CDRH3 <400> 133 Gly Asp Gly Glu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 134 <211> 10 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80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Phe Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

하기 상보성 결정 영역들의 하나, 둘 또는 세 개를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간적응된 항체로써,
(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1
(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CD RH2
(iii) 서열번호 4로 표시되는 CDRH3 또는 서열번호 132~137 중 어느 하나로 표시되는 CDRH3
여기서, 중쇄 가변 영역(Kabat에 따른 번호화)의 66번 위치에서 Lys 잔기, 69번 위치에서 Leu 잔기, 또는 71번 위치에서 Val 중 적어도 한 개를 포함하는 항체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 중쇄 가변 영역의 69번 위치에서 Leu 잔기를 포함하는 항체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 2로 표시되는 CDRH1, 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2, 및 서열번호 4로 표시되는 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체.
제1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 2로 표시되는 CDRH1, 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2, 및 서열번호 132, 133, 134, 135, 136 또는 137로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 가지는 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 121, 123, 125, 127, 129 또는 131로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체.
제 5항에 있어서,
상기 항체는 서열 번호 13(1A11.H3 V_H)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 114 또는 서열번호 118의 중쇄를 포함하는 항체.
제 5항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 121 또는 서열번호 123의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
하기의 상보성 결정 구역 중 하나, 둘 또는 세 개를 포함하는 항체:
(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1
(iv) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2
(v) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3
제 9항에 있어서,
경쇄 가변 영역은 가변 영역 경쇄의 45번 위치의 Lys 잔기, 46번 위치의 Pro 잔기, 47번 위치의 Trp 잔기, 58번 위치의 Val 잔기, 60번 위치의 Val 잔기, 70번 위치의 Ser 잔기 및 71번 위치의 Tyr 잔기(Kabat에 따른 번호화)로 구성된 그룹으로부터 선택한 적어도 하나의 잔기를 포함하는 항체.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 하기의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 도메인:
(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1
(ii) 서열번호 3으로 표시되는 CDRH2
(iii) 서열번호 4에서 제시 한 CDRH3, 또는 서열번호 132~137 중 어느 한 개 서열로 표시되는 CDRH3
및 하기의 상보성 결정 영역 을 포함하는 경쇄 가변 도메인:
(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1
(v) 서열번호 6에서 제 시한CDRL2
(vi) 서열번호 7로 표시되는CDRL3
을 포함하고 중쇄 가변 영역의 69번 위치의 Leu 잔기 및 경쇄 가변 영역의 46번 위치의 Pro 잔기를 포함하는 항체.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 22의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 115의 경쇄를 포함하는 항체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
하기의 상보성 결정 영역을 포함하는 항원 결합 단백질:
(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1 또는 이의 CDR 변이체
(ii) 서열번호 3으로 표시되는CDRH2 또는 이의 CDR 변이체
(iii) 서열번호 4로 표시되는CDRH3 또는 이의 CDR 변이체, 또는 서열번호 132~137 중 어느 하나의 서열로 표시되는 CDRH3
(iv) 서열번호 5로 표시되는CDRL1 또는 이의 CDR 변이체
(v) 서열번호 6로 표시되는CDRL2또는 이의 CDR 변이체
(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3 또는 이의 CDR 변이체
본 항에 있어서, 상기 CDR 중 적어도 한 개는 CDR 변이체이거나 CDRH3는 서열번호 132~137로 표시되는 서열을 포함하며, 상기 항원 결합 단백질은 CD127에 결합할 수 있는 항원 결합 단백질.
제 15항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 하기의 상보성 결정 영역을 포함하는 항원 결합 단백질:
(i) 서열번호 2로 표시되는 CDRH1
(ii) 서열 번호 3으로 표시되는 CDRH2
(iii) 서열번호 132~137 중 어느 한 서열에서 제시한 CDRH3
(iv) 서열번호 5로 표시되는 CDRL1
(v) 서열번호 6로 표시되는 CDRL2
(vi) 서열번호 7로 표시되는 CDRL3
제 15항 또는 제 16항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 서열번호 22의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
제 15항, 제 16항, 또는 제 17항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 중쇄에 하나 또는 그 이상의 치환체를 포함하고, 상기 치환체는 N98D, N98E, F100bE, F100bH, F100bI 및 F100bV로 구성된 그룹에서 선택한 치환이며, 서열번호 13의 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제 15항, 제 16항, 또는 제 17항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 서열번호 121, 123, 125, 127, 129 및 131로 구성된 그룹에서 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질.
제 20항에 있어서,
상기 항원 결합 단백질은 서열번호 114 또는 서열번호 118로 표시되는 중쇄 및 서열번호 115로 표시되는 경쇄를 포함하는, 항원 결합 단백질.
제 1항내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
제 22항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 23항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제 24항의 숙주세포에 의해 발현되는 항체 또는 항원 결합 단백질.
항원 결합 단백질을 생산하는 배지에서 제 24항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이로부터 항원 결합 단백질을 분리 또는 정제하는 단계를 포함하는 항원 결합 단백질의 생산 방법.
제 26항에 있어서,
숙주세포로부터 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현, 및 상기 세포로부터의 항체 분비에 적당한 조건에서 상기의 배양 단계를 수행하는 항원 결합 단백질의 생산 방법.
제 1항내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 전달체 또는 부형체를 포함하는 약제학적 조성물.
제 1항부터 제 20항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 또는 염증 질환으로 고통받는 피검자를 치료하는 방법.
제 29항에 있어서,
자가 면역 또는 염증성 질환은 다발성 경화증인 자가면역 또는 염증 질환에 대한 치료 방법.