KR20220066035A - 폴리펩타이드 - Google Patents

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KR20220066035A
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마이크 웨스트
케빈 로버츠
팀 칼톤
루아나 마조레
매리온 쿠빗
루르데스 두아르테
마틴 시몬스
키이스 레이
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소리소 파마슈티컬스 인크.
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Abstract

특히, IL-7R(IL-7R)에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이들 폴리펩타이드를 포함하는 작제물 및 약학 조성물이 제공된다.

Description

폴리펩타이드
본 발명은 IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 이들 폴리펩타이드를 포함하는 작제물 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 이러한 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법, 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 cDNA 및 벡터, 이러한 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포 및 이러한 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
위장관의 자가면역 질환
위장관의 자가면역 질환은 크론병(Crohn's Disease; CD)과 같은 염증성 장 질환, 및 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis; EoE)과 다른 자가면역 질환을 포함한다. 크론 증후군(Crohn syndrome) 및 국한성 장염(regional enteritis)으로도 알려져 있는 크론병은 매우 다양한 증상을 유발한다. 이는 주로 복통, 설사, 구토 및/또는 체중 감소를 유발하지만, 또한 위장관(gastrointestinal tract; GIT) 바깥쪽의 합병증, 예컨대, 빈혈, 피부 발진, 관절염, 눈 염증, 피로, 및 집중력 부족을 유발할 수도 있다(Baumgart et al 2012). 크론병은 현재, 종래 요법으로는 제어하기가 어려운 치유할 수 없는 평생의 위장 질환이다. EoE는, 식도 기능 장애를 유발하는 식도에 국한되지만 치료하지 않고 방치하면 섬유증으로 이어지는 심각한 병리학적 호산구 침윤으로 정의되는 만성 질환이다. 식도 섬유증 및 식도 협착증은 EoE의 알려진 합병증이다.
항체-기반 치료제는 이의 표적에 대한 특이성은 높고, 고유의 독성은 낮기 때문에, IBD 및 EoE와 같은 자가면역 질환에 효과적인 치료법으로서 상당한 잠재능을 가지고 있다. 3종의 항-TNF-알파 항체 인플릭시맙(상표명 레미케이드(Remicade)), 아달리무맙(상표명 휴미라(Humira)) 및 세르톨리주맙(또는 '세르톨리주맙 페골', 둘 모두 상표명 심지아(Cimzia))이 크론병 치료용으로 임상적으로 사용되고 있지만; 이들 항체는 이의 고유한 불안정성 및 소화계에 의한 단백질 분해성 분해, 장관의 병상 부위에 존재하는 염증성 프로테아제, 및 장내 미생물군에 대한 감수성에 기인하여, 일반적으로는 경구용 치료제로서 투여하기에는 부적합한 것으로 간주되고 있다. 그러므로, 상기 작용제들은 피하 시린지 또는 니들을 정확하고 안전하게 사용하기 위하여 전문가 훈련을 필요로 하는 정맥내 주입 또는 피하 주사에 의해 투여되어야 한다. 상기 작용제들은 또한 멸균 장비, 치료학적 폴리펩타이드의 액체 제형, 상기 폴리펩타이드의 멸균 및 안정적인 형태로의 바이알 패킹, 및 니들 유입에 적합한 대상체의 부위를 필요로 한다. 대상체는 보편적으로 주사를 맞기 전 심리적 스트레스 및 주사를 맞는 동안에는 통증을 경험하게 된다. 이러한 전신 항-TNF-알파 항체를 이용한 장기간의 치료로는 중증 감염 및 암의 위험 위험이 증가하게 된다. 높은 생산 비용과 함께, 이들 인자들로 인해, 현재 중증도가 더 중증의 질환이 있는 환자에게 상기 작용제들을 사용하는 것은 제한되고 있다.
수개의 소분자 항-염증성 및 면역억제성 약물이 또한 현재 크론병용으로 임상 개발 중에 있다(Danese 2012, Shealy et al 2010 및 Vetter & Neurath 2017). 비록 이들 약물이 경구적으로 투여되기는 하지만, 다수는 투여 이후에 전신으로 흡수될 것이며, 따라서, 위장관 병변에 대한 작용과는 관련이 없는 전신 면역억제성 작용을 가질 수 있다. 추가로, 소분자는 항체의 특이성이 부족하기 때문에, 유의한 표적외 부작용의 위험이 여전히 높다.
전신 노출 감소에 기인한 안전성의 유의한 개선과 함께 조합된, 위장관의 자가면역 질환과 관련된 표적에 대하여 높은 특이성을 가지되, 노출 및 활성은 장관으로 제한되는, 경구용 치료제를 전달할 수 있는 능력이 주사용 항체와 유사한 효능을 제공할 수 있다.
인터루킨-7(IL-7) 및 인터루킨-7 수용체(IL-7R)
인터루킨-7(IL-7)은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 및 IL-21을 포함하는 시토카인의 패밀리의 일원이다. IL-7은 림프 기관, 장, 피부 및 간에서 비-조혈 간질 및 상피 세포에 의해 구성적으로 생산되며, 흉선에서 T-림프구의 발달과 말초 T 세포의 생존 및 항상성 조절에 필수적이다(Fry and Mackall, 2002; Fry and Mackall 2005). 장 점막에서 IL-7은 또한 병원성 미생물 공격에 대한 면역 반응의 초기 프라이밍에 중요한 선천성 림프구 세포의 표현형으로 및 기능적으로 별개의 집단, 뿐만 아니라 림프 조직 기관형성을 촉진하는 능력을 갖는 CD4+ 림프 조직 유도제(LTi) 세포 및 일부 수지상 세포 집단을 조절한다(Goldberg et al 2015; Peters et al 2015). 또한, IL-7은 나이브 및 기억 T 세포의 증식을 유도하고, 이펙터 T 세포 반응, 우선적으로 T 헬퍼 1(Th1) 및 Th17 반응을 향상시킨다(Dooms, 2013). T 세포에 대한 IL-7의 기능적 효과는 IL-7을 자가면역 및 염증뿐만 아니라 보호 면역의 중요한 증강제로 만든다.
상이한 표적 세포에 대한 IL-7의 효과는 IL-7R, IL-7Rα 서브유닛을 포함하는 이종이량체 복합체(CD127) 및 공통 시토카인 수용체 감마 쇄(γc)(CD132)를 통해 매개된다. 전장 인간 IL-7Rα는 219-잔기 세포외 도메인, 25-잔기 막관통 도메인, 및 195-잔기 세포내 도메인으로 이루어진다. IL-7 유도성 활성화는 IL-7Rα와의 초기 IL-7 상호작용을 수반하여 복합체를 형성하고, 이는 후속적으로 γc를 모집하여 활성화된 수용체 신호전달 복합체를 형성하는 것으로 사료된다. IL-7에 의한 두 수용체 서브유닛의 연관성은 JAK/Stat, PI3/Akt, 및 SRC 신호전달 캐스케이드를 통해 세포내 인산화 이벤트를 활성화시킨다(Walsh, 2012).
IL-7Rα는 세포-막-결합된 형태뿐만 아니라 가용성 형태(sIL-7Rα)로도 이용 가능하다. sIL-7R은 막-결합된 수용체의 절단(shedding)에 의해 생성되고, 또한 대체 스플라이싱(또는 IL-7Rα 엑손 6)에 의해 생산되어 막관통 도메인이 결여된 단백질로 이어지고; 인간 혈장에 존재하는 sIL-7Rα는 주로 대체 스플라이싱으로부터 유래된다(Rose et al 2009). IL-7Rα 유전자의 네 개의 공통 일배체형이 확인되었다(Teutsch et al 2003). 2개의 일배체형은 변경된 발현 및 가용성 형태의 수용체 생산 및 다발성 경화증 및 1형 당뇨병을 포함하는 자가면역 질환에 대한 감수성과 관련이 있다(Hafler et al 2007).
인간 T 세포 발달 및 항상성에서 IL-7/IL-7Rα가 수행하는 역할 이외에, 전임상 연구에 따라 상이한 자가면역 및 염증성 질환의 동물 모델에서 IL-7/IL-7Rα 경로의 관련성이 입증되었다. 이들 연구는 질환 병리와 관련된 추가적인 IL-7-의존적 기전을 확인하고, IL-7/IL-7Rα 상호작용을 관련된 자가면역 및 만성 염증성 병태를 갖는 환자의 치료를 위한 가능한 표적으로 강조하였다.
전임상 연구에 따라, IL-7Rα 차단 항체의 단기 전신 투여가 자가면역 질환 및 위장 염증의 모델에서 효과적인 치료를 제공한다는 것이 입증되었다. IBD 모델에서 IL-7R-길항제 치료에 따른 효능에 대한 일차 기전은 중간 내지 높은 수준의 IL-7Rα(CD127)를 발현하는 대장균성 T 세포(IL-7R+ 이펙터/기억 T 세포)의 국소 고갈 또는 기능적 억제를 수반하는 것으로 보이고, 간질 및 상피 세포에 의한 IL-7의 생산 증가로 인해 염증이 있는 장에서 활성화될 수 있다. 건강한 점막에서, 매우 낮은 수준의 IL-7R을 발현하는 장-상주 FOXP3+CD25+ 조절 T 세포(Treg 세포)는 공생 박테리아에 대한 조절 장애 CD4+ T 반응을 억제할 것으로 예상된다. 그러나, 문헌[Heninger et al 2012]에 의해, IL-7-풍부 환경에서 통상적인 T 세포의 증식을 억제하는 FOXP3+CD25+ Treg의 능력이 폐지된다는 것이 제안되었다. 따라서, 위장 질환에서, IL-7/IL-7R 신호전달의 차단은 이펙터 T 세포의 활성화를 억제하고 또한 조절 T 세포의 억제 기능을 회복함으로써 T 세포 매개 염증을 조절하는 데 도움이 될 수 있다. 뮤린 IBD 모델 및 생체외 인간 조직 연구로부터의 증거는 또한 선천적 림프구 세포(ILC)를 포함하는 선천적 면역 세포의 IL-7/IL-7Rα-의존적 활성화가 위장 염증성 질환에 관여하는 과정에 기여한다는 것을 시사한다.
흉선 기질 림포포이에틴(TSLP) 및 IL-7R
TSLP는 피부, 폐, 장 및 안구 조직의 상피 세포에 의해 생산되는 시토카인으로서, 신체의 점막 표면에서 염증 과정의 조절에 관여하는 것으로 보인다. TSLP는 수지상 세포(DC) 및 선천성 림프구 세포(ILC)를 자극하여 Th2 시토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 분비를 유도하고 Th2-형 염증의 발병을 촉진한다. TSLP는 이제 아토피성 피부염, 비염을 비롯한 일부 알레르기 장애의 발병에 근원이 되고, 또한 호산구성 식도염(EoE) 및 궤양성 대장염(UC)을 비롯한 장 질환을 촉진하는 것으로 사료된다. 역설적으로, TSLP는 또한 위장관에서 면역 항상성 및 점막 보호의 유지에 중요한 것으로 보고되었다. 최근, TSLP가 2개의 상이한 동형으로 발현될 수 있다는 발견은 이러한 시토카인의 명백하게 대조되는 활성에 대한 생물학적 설명을 제공하였다(Fornasa et al 2015; Tsilingiri et al 2017). 분자 연구에 따라, TSLP 유전자는 2개의 상이한 프로모터 영역에 의해 조절되는 2개의 코딩 RNA를 발생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 전사체 중 하나는 159aa의 TSLP(L-TSLP)의 긴 동형을 인코딩하고(UNIPROT 항목 Q969D9, 서열번호 62), 두 번째 전사체는 L-TSLP의 C-말단 63aa를 포함하는 짧은 형태의 TSLP(S-TSLP)를 인코딩한다(UNIPROT 항목 Q969D9-2, 서열번호 63). L-TSLP는 TSLP-특이적 수용체 쇄(TSLPR) 및 IL-7Rα 쇄를 포함하는 수용체 복합체를 통해 표적 세포에서 작용한다. 최근, 구조적 연구에 따라, TSLP-수용체 복합체의 IL-7Rα 쇄와 IL-7 및 L-TSLP의 상호작용은 공통 IL-7Rα 결합 부위를 수반하는 것으로 밝혀졌다(Verstraete et al 2017).
S-TSLP는 TSLPR에 결합하지 않으며, 이는 이러한 수용체에 대한 L-TSLP의 결합을 억제할 수 없다. 저자가 아는 한, S-TSLP에 대한 특이적 수용체는 지금까지 확인된 바 없다.
중요하게는, S-TSLP가 건강한 피부에 의해 그리고 건강한 장 점막 조직에서 상피 및 고유층 세포에 의해 우선적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. S-TSLP는 항-염증 활성을 갖고; 시험관내에서 S-TSLP는 단핵구 유래 DC에 의한 친-염증성 시토카인의 생산을 억제하고 CD103+ DC의 관용성 표현형에 대한 컨디셔닝에 기여한다. 따라서, 장 상피에 의해 생산된 S-TSLP는 수지상 세포 및 림프구를 포함하는 기저 면역 세포에 영향을 미칠 수 있고, 건강에서 관용성 및 조절 반응을 촉진할 수 있는 것으로 보인다. S-TSLP는 또한 강력한 항미생물(세균 및 진균) 활성을 나타내며, 이는 점막 상피의 미생물 침입에 대항하는 보호에 중요할 수 있다(Bjerkan et al 2016). 건강한 조직에서 S-TSLP 발현은 구성적이지만, 비타민 D3 및 PPARγ 효능제에 의해 상향조절될 수 있거나 친-염증성인 병원성 세균에 의해 하향조절될 수 있다. L-TSLP는 건강한 조직에는 존재하지 않지만, 친-염증성 자극에 대한 반응으로 발현되며, DC 및 Th2 세포의 이펙터 기능을 활성화함으로써 Th2 시토카인 관련 염증을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다. L-TSLP-활성화된 DC에 노출된 네이티브 CD4+ T 세포는 Th2 림프구로의 증식 및 분화를 겪는다. L-TSLP는 또한 호염기구, ILC(ILC2) 및 호산구의 활성화를 통해 Th2 선천적 면역 반응을 자극할 수 있다.
최근 연구에 따라, TSLP 동형 둘 모두의 발현 패턴은 염증성 장 질환 및 호산구성 식도염(EoE)을 비롯한 장 질환에서 정상 상태로부터 급격하게 변하는 것으로 밝혀졌다. 문헌[Rimoldi et al 2005]에는 TSLP(문헌[Fornasa et al 2015]의 결과에 따라 구체적으로 이러한 경우 S-TSLP일 수 있음)가 건강한 결장 조직으로부터 단리된 일차 상피 세포에 의해 구성적으로 발현된 것으로 보고되어 있다. 그러나, TSLP 발현은 CD가 있는 9명 중 6명의 환자의 상피 세포에서 검출되지 않는 것으로 밝혀졌다. CD 상피 세포가 질환이 있는 점막에서 S-TSLP를 생산하지 못하는 것은 정상적으로 비-염증성 환경을 생성함으로써 장의 항상성을 유지하는 것을 돕는 기전의 실패를 초래할 것이다. 이러한 기전의 결함은 원치 않는 Th1 염증 반응을 유도하여 CD의 발병에 기여할 수 있다. 크론병에서 우세한 고유판 Th1 세포와 대조적으로, 궤양성 대장염이 있는 환자의 고유층 T 세포는 Th2형 시토카인 IL-5 및 IL-13을 생산하는 것으로 밝혀졌고, 이들 세포는 단지 저수준의 IL-4 생산을 나타내어, 이들은 고전적인 Th2 세포의 모든 특징을 나타내지 않는다는 것을 시사하였다. 기능적으로, IL-13은 섬유증을 촉진하고, 장 상피 세포에서 변경된 치밀 이음 기능 및 이의 아폽토시스를 유발함으로써 점막 궤양을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 최근, 문헌[Fornasa et al 2015]에서, L-TSLP 특이적 항체로 검출된 TSLP 발현은 건강한 결장 점막에서 검출된 수준과 비교하여 궤양성 대장염이 있는 환자로부터의 장 조직에서 유의하게 상향조절되는 것으로 보고되었다. TSLP-활성화된 수지상 세포(DC)는 나이브 CD4+ T 세포를 유도하여 IL-5, IL-13 및 TNF-생산 염증성 Th2 세포로 분화될 수 있으므로(Liu 2006), 상피 세포-수지상 세포 계면에서 작용하는 이러한 상류 시토카인의 억제는 궤양성 대장염이 있는 환자에서 점막 염증 치료에 효과적인 전략이라는 것을 입증할 수 있다.
역학 데이터는 EoE의 발병에서 아토피 기전과 유전적 요인의 관여를 뒷받침한다. 중요하게는, 전장 게놈 연관성 연구(genome wide association study)의 결과에 따라, TSLP 및 이의 수용체 TSLPR은 EoE의 발병에서 후보 유전자로서 확인되었다(Cianferoni and Spergel, 2015). TSLP 발현은 EoE 환자의 식도 생검 표본에서 증가되고, 면역-조직화학적 염색에 의해 층화된 편평 상피 세포로 국부화되었다(Noti et al 2013). L-TSLP는 시토카인(CCL-26/에오탁신-3, IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13 포함) 및 염증 및 조직 재형성에 기여하는 Th2 세포, 호염기구, 호산구 및 비만 세포로부터의 친-섬유증 인자의 생산을 강력하게 촉진하므로 질환 병리의 주요 상류 동인인 것으로 보인다.
EoE에서, TSLP는 염증 캐스케이드가 시작될 때 바로 상류 상피 '마스터-스위치(master-switch)'로 기능하는 것으로 여겨지며, 결과적으로 이러한 시토카인의 길항작용은 염증 캐스케이드가 이전의 표적화된 항-시토카인 요법보다 더 상류에서 중단되도록 할 수 있다. 이 개념에 대한 뒷받침은 중증 천식이 있는 환자에서 최초의 TSLP 길항제 mAb인 테제펠루맙(AMG 157)에 대한 최근 시험의 긍정적인 결과에 의해 제공되었다(Corren et al 2017).
상기에 비추어 볼 때, IBD 및 EoE와 같은 염증 및/또는 자가면역 질환에 대한 보다 효과적인 요법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다는 것이 인지될 것이다. 특히 경구적으로 투여할 수 있는 경우의, IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 작용제가 이러한 요법으로 제시될 수 있고, 이에 따라 매우 바람직할 것이다.
WO2013056984, WO2015189302, WO2011094259 및 WO2011104687에는 IL-7R에 대항하여 유도된 항체가 개시되어 있다.
발명의 개요
본 발명자들은 IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 생산하였다. 이들 폴리펩타이드는 IL-7Rα에 결합한다. 이들 폴리펩타이드는 특히 놀랍게 높은 역가로 유리하다. 이들은 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα와 교차-반응할 수 있고, 소장 및 대장의 프로테아제에 대한 노출에 안정하게 유지된다. 일 실시양태에서, 이들 폴리펩타이드는 조작(engineering)에 의해 더욱 향상된다. 이러한 더욱 향상된 폴리펩타이드는 인간화된 서열을 포함하지만 그럼에도 불구하고 실질적으로 상기 이점들을 유지한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 Biacore 연구에서 고친화도로 IL-7R을 결합하고, ELISA에서 IL-7과 IL-7-관련 시토카인 L-TSLP 둘 모두와의 IL-7R 상호작용의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 기능적인 세포-기반 검정에서, 본 발명의 특정 폴리펩타이드는 임상적 항-IL-7R mAb829(문헌[Ellis et al 2019]에 개시된 항-IL-7Rα 단클론성 항체인 "GSK2618960"으로도 알려짐)와 유사한 역가를 갖는 둘 모두의 시토카인의 생물학적 작용(IL-7-유도 Stat5 인산화; L-TSLP-유도 TARC 생산)을 억제한다.
인 실리코 모델링은 본 발명의 특정 폴리펩타이드의 이중 길항작용 활성이 둘 모두의 시토카인에 대한 공유 결합 부위를 또한 구성하는 IL-7R의 에피토프에 대한 폴리펩타이드의 결합에 기인한다는 것을 시사하였다. 특이성 연구에서, 본 발명의 특정 폴리펩타이드는 다른 인간 IL-7R-패밀리 또는 다른 시토카인 수용체를 향하여 결합 활성을 나타내지 않았다. 종간 특이성 검정에서, 본 발명의 특정 폴리펩타이드는 마우스 IL-7R에 결합하지 않았지만, 유사한 역가로 시노몰구스 원숭이 및 인간 IL-7R을 결합하였고; 결과적으로, 시노몰구스 원숭이는 전임상 개발 연구에 적합한 종일 수 있다.
염증이 있는 궤양성 대장염 점막 조직의 생체외 배양에서, 본 발명의 예시된 폴리펩타이드는 신호전달 단백질의 인산화 및 친-염증성 및 면역-조절성 경로와 관련이 있는 시토카인 및 케모카인의 생산을 억제하였다. 결과는 이러한 폴리펩타이드에 의한 점막 IL-7R+ve T 세포의 길항작용이 질환 환경과 밀접하게 관련된 모델에서 적어도 임상적 항-IL-7R mAb829만큼 효과적으로 염증 과정을 억제할 수 있다는 것을 입증하여, 본 발명의 폴리펩타이드가 특히 궤양성 대장염이 있는 환자에서 효과적일 수 있다는 신뢰성을 제공하였다. 정상 마우스에서 본 발명의 특정 폴리펩타이드의 생체내 경구 투여는 전체 GI 계통을 통과하는 동안 고수준의 결장 내강 노출(마이크로몰)을 나타내어 소화에 대한 내성을 입증하였다.
따라서, 이들 폴리펩타이드는 특히 경구적으로 투여될 때 자가면역 및 또는 염증성 질환, 예컨대, 염증성 장 질환(예를 들어, 크론병 또는 궤양성 대장염) 또는 호산구성 식도염의 예방 또는 치료에 특히 유용성을 갖는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 폴리펩타이드를 포함하는 작제물 및 약학 조성물을 제공한다. 또한, 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 이러한 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법, 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 cDNA 및 벡터, 이러한 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 숙주 세포 및 이러한 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.
상기 용어 '및/또는'과 관련된 의심을 피하기 위해, 'IL-7R에 대한 IL-7 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드'는 IL-7R에 대한 IL-7 및 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 포괄한다. 유사하게는, 'IL-7R에 대한 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드'는 IL-7R에 대한 IL-7 및 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드를 포괄한다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 적어도 일부 실시양태에서, IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 종래 기술의 물질에 비해 하기 이점들 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(i) IL-7Rα에 대한 친화도 증가;
(ii) IL-7Rα에 대한 특이성 증가;
(iii) IL-7R에 대한 IL-7 또는 L-TSLP 결합에 대한 중화 능력 증가;
(iv) IL-7R에 대한 IL-7과 L-TSLP 둘 모두의 결합 억제;
(v) 상이한 종, 예컨대, 인간 및 시노몰구스 원숭이로부터의 IL-7Rα와의 교차-반응성 증가;
(vi) 예를 들어, 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간에게 투여되었을 때, 면역원성 감소;
(vii) 프로테아제의 존재 하에서의, 예를 들어, (a) 소장 및/또는 대장에서 발견되는 프로테아제 및/또는 IBD 염증성 프로테아제, 예를 들어, 트립신, 키모트립신, MMP3, MMP12, 다른 MMP 및 카텝신의 존재 하에서의, 및/또는 (b) 소장 및/또는 대장에서 발견되는 미생물 세포의 용해에 의해 활발히 분비 및/또는 방출되는, 장관 공생 미생물군 및/또는 병원성 박테리아로부터의 프로테아제의 존재 하에서의 안정성 증가;
(viii) 생산 동안 프로테아제 분해에 대한 안정성(예를 들어, 효모 프로테아제에 대한 내성) 증가;
(ix) 경구 투여에 대한 적합성 증가;
(x) 경구 투여 후 장관 및 점막 고유층으로의 국소 전달에 대한 적합성 증가;
(xi) 경구 투여 후 식도로의 국소 전달에 대한 적합성 증가;
(xii) 이종성 숙주, 예컨대, 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 또는 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속 또는 피치아(Pichia) 속에 속하는 효모, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현에 대한 적합성 증가;
(xiii) 제약에서의 사용을 위한 적합성, 및 제약에서의 사용을 위한 개선된 특성;
(xiv) 기능성 식품에서의 사용을 위한 적합성, 및 기능성 식품에서의 사용을 위한 개선된 특성;
(xv) 조직 침투, 예컨대, 점막하 고유층에 접근하기 위한 염증이 생긴 결장 점막 상피 및 점막하 조직의 침투 개선;
(xvi) 다중특이적 포맷으로 포맷화하는 데 있어서의 적합성 증가;
(xvii) 신규한 에피토프에 대한 결합.
상기 이점 (i) 내지 (xvii)은 잠재적으로는 1가 포맷으로 또는 다가 포맷, 예컨대, 비헤드(bihead) 포맷(예를 들어, 동종비헤드(homobihead) 또는 이종비헤드(heterobihead) 포맷)의 본 발명의 폴리펩타이드에 의해 실현될 수 있다.
IL-7R의 IL-7Rα 서브유닛에 특이적으로 결합하는 본 발명의 폴리펩타이드로 인해, 상기 요점에서(및 설명 전반에 걸쳐) "IL-7R"의 언급은 또한 적절하게 "IL-7Rα"로 대체될 수 있다.
도면의 설명
도 1은 인간 림프구에서 IL-7 유도성 pSTAT-5의 억제이다.
도 2는 인간 단핵구에서 TSLP 유도성 TARC 분비의 억제이다.
도 3은 IL-7Rα에 결합된 V7R-2E9의 모델 구조이다.
도 4는 인간 림프구에서 IL-7 유도성 pSTAT5의 A62U, A59U 및 mAb829 억제이다.
도 5는 종 IL-7Rα와 ID-A40U의 교차-반응성이다.
도 6은 인간 및 시노몰구스 IL-7Rα와 ID-A59U 및 ID-A62U의 교차-반응성이다.
도 7은 인간 IL-7Rα에 대한 ID-A40U의 특이성이다.
도 8은 소화기 기질에서 V7R-2E9, ID-A24U 및 ID-A40U의 생존율 백분율이다.
도 9는 인간 배설물 상청액에서 ID-A62U 및 ID-A41U의 안정성 백분율이다.
도 10은 에타너셉트, mAb829 및 A40U-F/H의 MMP에 의한 소화이다.
도 11은 비희석 배설물 상청액에서의 예상 농도이다(ID-A24U vs ID-A40U vs ID-38F).
도 12는 GIT 비희석 상청액에서의 예상 농도이다(ID-A24U vs ID-A40U vs ID-38F).
도 13은 비희석 배설물 상청액에서의 예상 농도이다(ID-A40U vs ID-38F).
도 14는 GIT 비희석 상청액에서의 예상 농도이다(ID-A40U vs ID-38F).
도 15 내지 도 18은 인간 IBD 조직 단백질 인산화 프로파일이다.
도 19는 총 인산화 수준이다.
서열의 설명
서열번호 1 - ID-A62U CDR1의 폴리펩타이드 서열
서열번호 2 - ID-A62U CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 3 - ID-A62U CDR3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 4 - ID-A62U FR1의 폴리펩타이드 서열
서열번호 5 - ID-A62U FR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 6 - ID-A62U FR3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 7 - ID-A62U FR4의 폴리펩타이드 서열
서열번호 8 - ID-A62U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 9 - V7R-2B6의 폴리펩타이드 서열
서열번호 10 - V7R-2E5의 폴리펩타이드 서열
서열번호 11 - V7R-2E9의 폴리펩타이드 서열
서열번호 12 - V7R-2F6의 폴리펩타이드 서열
서열번호 13 - V7R-3B5의 폴리펩타이드 서열
서열번호 14 - V7R-4F6의 폴리펩타이드 서열
서열번호 15 - V7R-6C12의 폴리펩타이드 서열
서열번호 16 - ID-A2U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 17 - ID-A3U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 18 - ID-A4U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 19 - ID-A5U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 20 - ID-A6U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 21 - ID-A7U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 22 - ID-A8U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 23 - ID-A9U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 24 - ID-A10U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 25 - ID-A11U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 26 - ID-A12U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 27 - ID-A13U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 28 - ID-A14U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 29 - ID-A15U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 30 - ID-A16U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 31 - ID-A17U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 32 - ID-A18U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 33 - ID-A19U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 34 - ID-A20U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 35 - ID-A21U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 36 - ID-A23U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 37 - ID-A24U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 38 - ID-A25U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 39 - ID-A26U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 40 - ID-A27U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 41 - ID-A28U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 42 - ID-A29U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 43 - ID-A30U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 44 - ID-A31U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 45 - ID-A32U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 46 - ID-A33U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 47 - ID-A34U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 48 - ID-A35U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 49 - ID-A36U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 50 - ID-A37U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 51 - ID-A38U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 52 - ID-A39U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 53 - ID-A40U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 54 - ID-A43U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 55 - ID-A50U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 56 - ID-A52U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 57 - ID-A53U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 58 - ID-A54U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 59 - ID-A55U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 60 - ID-A57U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 61 - ID-A59U의 폴리펩타이드 서열
서열번호 62 - L-TSLP의 폴리펩타이드 서열
서열번호 63 - S-TSLP의 폴리펩타이드 서열
서열번호 64 - 전장 인간 공통 γ-쇄 수용체의 폴리펩타이드 서열
서열번호 65 - 전장 인간-IL-7Rα의 폴리펩타이드 서열
서열번호 66 - 전장 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα의 폴리펩타이드 서열
서열번호 67 - 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα 세포외 도메인의 폴리펩타이드 서열
서열번호 68 - 인간-IL-7Rα 세포외 도메인의 폴리펩타이드 서열
서열번호 69 - ID-A59U를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열
서열번호 70 - ID-A62U를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열
서열번호 71 - V7R-2B6 CDR1의 폴리펩타이드 서열
서열번호 72 - V7R-2E9 CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 73 - V7R-2F6 CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 74 - V7R-4F6 CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 75 - V7R-2B6 CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 76 - ID-A14U CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 77 - V7R-6C12 CDR3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 78 - V7R-2B6 CDR3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 79 - 적합하게는 ID-A62U FR2(서열번호 5)의 잔기 9 내지 14를 차지하는 폴리펩타이드 서열
서열번호 80 - 적합하게는 ID-A62U FR2(서열번호 5)의 잔기 9 내지 14를 차지하지 않는 폴리펩타이드 서열
서열번호 81 - SpeI 부위를 함유하는 3' 프라이머의 폴리뉴클레오타이드 서열
서열번호 82 - 서열번호 1의 잔기 1에서 선택적인 보존적 치환을 갖는 CDR1의 폴리펩타이드 서열
서열번호 83 - 서열번호 2의 잔기 2, 3, 7, 12 및 16에서 선택적인 보존적 치환을 갖는 CDR2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 84 - 서열번호 3의 잔기 3 및 9에서 선택적인 보존적 치환을 갖는 CDR3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 85 - 프로테아제-불안정성 링커 화학식 1의 폴리펩타이드 서열
서열번호 86 - 프로테아제-불안정성 링커 화학식 2의 폴리펩타이드 서열
서열번호 87 - 프로테아제-불안정성 링커 화학식 1 및 2의 바람직한 변이체의 폴리펩타이드 서열
서열번호 88 - 비-프로테아제-불안정성 링커 화학식 3의 폴리펩타이드 서열
서열번호 89 - 바람직한 비-프로테아제-불안정성 링커의 폴리펩타이드 서열
발명의 상세한 설명
VH 및 VHH와 같은 면역글로불린쇄 가변 도메인(ICVD)을 포함하는 항체 및 항체 단편과 같은 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 쇄에서 함께 결합된 다수의 아미노산 잔기로 이루어진 유기 중합체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 '단백질' 및 '펩타이드'와 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩타이드는 이들이, 친화도(적합하게는, 본원에서 추가로 기재된 바와 같이, Kd 값, Ka 값, kon-속도 및/또는 koff-속도로서 표시됨)로 표적 상의 에피토프에 결합할 수 있는, 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트렛치를 함유할 때에 결합 폴리펩타이드라고 한다.
결합 폴리펩타이드는 DARPin(Binz et al. 2003), Affimer™(Johnson et al 2012), Fynomer™(Grabulovski et al 2007), Centyrin(Goldberg et al 2016), Affitin(예를 들어, Nanofitin®, Krehenbrink et al 2008), 사이클릭 펩타이드, 항체 및 항체 단편과 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 결합 폴리펩타이드는 또한 Affibody(Nygren 2008), Affilin(Ebersbach et al. 2007), Alphabody(Desmet et al 2014), Anticalin(Skerra et al 2008), Avimer(Silverman et al 2005), Kunitz 도메인 펩타이드(Nixon and Wood 2006), Monobody(Koide and Koide 2007), nanoCLAMP(Suderman et al 2017), Adnectin(Lipovsek 2011) 및 바이사이클릭 펩타이드와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
종래의 항체 또는 면역글로불린(Ig)은 4개의 폴리펩타이드 쇄: 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 단백질이다. 각 쇄는 불변 영역 및 가변 영역으로 분할된다. 중쇄 가변 도메인은 본원에서 VHC로 약칭되고, 경쇄(L) 가변 도메인은 본원에서 VLC로 약칭된다. 이들 도메인, 이와 관련된 도메인 및 이로부터 유래된 도메인은 본원에서 면역글로불린쇄 가변 도메인으로 지칭된다. VHC 및 VLC 도메인은, "프레임워크 영역"("FR")으로 명명되는, 보다 보존된 영역으로 산재된, "상보성 결정 영역"("CDR")으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 프레임워크 및 상보성 결정 영역은 정확하게 정의되어 있다(Kabat et al 1991). 통상의 항체에서, 각각의 VHC 및 VLC는 다음 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 2개의 중쇄 면역글로불린쇄 및 2개의 경쇄 면역글로불린쇄의 통상의 항체 사량체는, 예를 들어, 디설파이드 결합 및 결합된 중쇄 유사성에 의해 상호-연결된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린쇄로 형성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인이다. 항체의 불변 영역은 전형적으로, 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 상보성 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다. 용어 항체는 타입 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(뿐만 아니라 이의 서브타입)의 면역글로불린을 포함하고, 여기서 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 타입일 수 있다. 2개의 동일한 중쇄(H) 및 2개의 동일한 경쇄(L) 폴리펩타이드로부터 조립된 면역글로불린-감마(IgG) 항체의 전체 구조는 충분히 확립되어 있고 포유동물에서 고도로 보존되어 있다(Padlan 1994).
종래의 항체 구조에 대한 예외는 낙타과의 혈청에서 발견된다. 종래의 항체에 추가하여, 이들 혈청은 특별한 IgG 항체를 보유한다. 중쇄 항체(HCAb)로서 공지된 이들 IgG 항체는 L 쇄 폴리펩타이드가 없고 제1 불변 도메인(CH1)이 결여된다. 이의 N-말단 영역에서, 호모이량체 단백질의 H 쇄는, 이의 동족 항원과 회합하도록 작용하는, VHH로서 지칭되는 전용 면역글로불린쇄 가변 도메인을 함유한다(Muyldermans 2013, Hamers-Casterman et al 1993, Muyldermans et al 1994).
본원에 사용된 바와 같은 항원-결합 단편(또는 "항체 단편" 또는 "면역글로불린 단편")은 IL-7Rα에 특이적으로 결합하는 항체의 부분(예를 들어, 하나 이상의 면역글로불린쇄가 전장은 아니지만 IL-7Rα에 특이적으로 결합하는 분자)을 지칭한다. 용어 항원-결합 단편 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 하기를 포함한다:
(i) Fab 단편(VLC, VHC, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편);
(ii) F(ab')2 단편(힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편);
(iii) Fd 단편(VHC 및 CH1 도메인으로 이루어짐);
(iv) Fv 단편(항체의 단일 암(arm)의 VLC 및 VHC 도메인으로 이루어짐);
(v) scFv 단편(VLC 및 VHC 영역이 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여, 결합된 VLC 및 VHC 도메인으로 이루어짐);
(vi) VH(VHC 도메인으로 이루어진 면역글로불린쇄 가변 도메인(Ward et al 1989);
(vii) VL(VLC 도메인으로 이루어진 면역글로불린쇄 가변 도메인);
(viii) V-NAR(연골어강 IgNAR로부터 VHC 도메인으로 이루어진 면역글로불린쇄 가변 도메인(Roux et al 1998 및 Griffiths et al 2013);
(ix) VHH.
VHH 또는 VH 중 아미노산 잔기의 총 개수는 약 110개 내지 130개일 수 있고, 적합하게는 115개 내지 120개이고, 가장 적합하게는 118개이다.
본 발명의 면역글로불린쇄 가변 도메인은, 예를 들어, 핵산 합성을 위한 기법을 사용하여 면역글로불린쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 제조한 후, 상기와 같이 수득된 핵산을 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 구체적인 실시양태에 따라, 본 발명의 면역글로불린쇄 가변 도메인은, 예컨대, 자연적으로 발생된 항체의 VH 또는 VHH 도메인과 같은 자연적으로 발생된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 정확하게 동일한(즉, 그와 100%의 서열 동일성을 공유하는) 아미노산 서열을 가지는 것은 아니다.
본원에서 제공하는 예는 IL-7Rα에 결합하는 면역글로불린쇄 가변 도메인 그 자체에 관한 것이다. 그러나, 본원에 개시된 본 발명의 원리는 IL-7Rα 결합 폴리펩타이드, 예컨대, 항체 및 항체 단편에 동등하게 적용가능하다. 예를 들어, 본원에 개시된 항-IL-7Rα 면역글로불린쇄 가변 도메인은 폴리펩타이드, 예컨대, 전장의 항체 내로 도입될 수 있다. 상기 접근법은, 이량체 작제물로서 발현된, (힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는) 인간 Fc 영역과의 융합물로서 조작된 항-HIV VHH를 제공하는 문헌[McCoy et al 2014]에 의해 입증된다.
비인간 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역 중의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 인간 면역글로불린쇄 가변 도메인으로부터의 상응하는 잔기로 치환하는 것이 인간화이다. 가변 도메인의 인간화가 인간에서의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역글로불린쇄 가변 도메인을 포함한다. 더욱 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인으로 이루어진다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편이다. 더욱 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체 단편이다. 적합하게는, 항체 단편은 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VHH, VH 또는 VL이다. 적합하게는, 항체 단편은 VHH, VH, VL, V-NAR, scFv, Fab 단편, 또는 F(ab')2 단편이다. 적합하게는, 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이다. 더욱 적합하게는, 항체 단편은 VHH 또는 VH이고, 가장 적합하게는 VHH이다.
특이성, 친화도, 결합활성 및 교차-반응성
특이성이란, 특정 항원-결합 폴리펩타이드의 결합 대상이 될 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기의 개수를 지칭한다. 항원-결합 폴리펩타이드의 특이성은 특정 항원을 독특한 분자 엔티티로서 인식하고, 그를 또 다른 것과 구별할 수 있는 항원-결합 폴리펩타이드의 능력이다.
결합 폴리펩타이드로부터 표적의 해리에 대한 평형 상수(Kd)로 표현되는 친화도는 결합 폴리펩타이드 상의 결합 부위와 표적 사이의 결합 강도의 척도이며: Kd 값이 작을수록, 결합 폴리펩타이드와 표적 사이의 결합 강도는 더 강하다(대안적으로, 친화도는 또한 1/Kd인 친화도 상수(Ka)로 표시될 수 있다). 친화도는 관심의 대상이 되는 특정 항원에 의존하여 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 적합하게는, 친화도는 동적으로 전환 가능한 생체표면(예를 들어, "switchSENSE®", 문헌[Knezevic et al 2012] 참조)을 사용하거나 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
결합활성은 항원-결합 폴리펩타이드와 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 항원 결정기와, 항원-결합 폴리펩타이드 상의 이의 항원-결합 부위 사이의 친화도, 및 항원-결합 폴리펩타이드 상에 존재하는 관련 결합 부위의 개수, 둘 모두에 관한 것이다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-7 M 이하, 더욱 적합하게는 10-8 M 이하, 더욱 적합하게는 10-9 M 이하 및 더욱 적합하게는 10-10 M 이하의 평형 해리 상수(Kd)로 IL-7Rα에 결합한다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 동일한 검정으로 mAb829 보다 낮은 평형 해리 상수로 IL-7Rα에 결합한다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 5.67 × 10-10 M 이하, 더욱 적합하게는 5.67 × 10-10 M 미만의 평형 해리 상수로 IL-7Rα에 결합한다. mAb829는 "GSK2618960", 문헌[Ellis et al 2019]에 개시된 항-IL-7Rα 단클론성 항체로도 알려져 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 친화도는 직접적으로 Biacore(또는 등가물) 센서 플레이트 상에서 코팅에 의해, 또는 Fc에 대한 융합 및 항-인간 IgG Fc로의 포획에 의해 확립되고, 여기서 폴리펩타이드는 플레이트 상에서 유동되어 결합을 검출한다. 적합하게는, Biacore T200 플레이트는 25℃에서 30 ul/min으로 HBS-EP+(GE Healthcare) 러닝 완충액에서 사용된다.
항-IL-7Rα 폴리펩타이드, IL-7Rα 결합 폴리펩타이드, IL-7Rα와 상호작용하는 폴리펩타이드, 또는 IL-7Rα에 대항하는 폴리펩타이드는 모두 IL-7Rα에 결합하는 효과적인 폴리펩타이드이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα에서 선형 또는 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 IL-7Rα에 결합할 것이다. 더욱 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 개코원숭이 IL-7Rα, 마모셋 IL-7Rα, 시노몰구스 IL-7Rα 및 레수스 IL-7Rα로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 영장류와 인간 둘 모두의 IL-7Rα에 결합할 것이다. 가장 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 및 시노몰구스 IL-7Rα, 둘 모두에 결합한다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 IL-7R을 결합하는 인간 IL-7 및/또는 인간 L-TSLP를 중화시킬 것이다. 더욱 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 개코원숭이 IL-7R, 마모셋 IL-7R, 시노몰구스 IL-7R 및 레수스 IL-7R로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 영장류와 인간 둘 모두의 IL-7R을 결합하는 인간 IL-7 및/또는 인간 L-TSLP 결합을 중화시킬 것이다. 가장 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 IL-7R을 결합하는 인간 IL-7 및 인간 L-TSLP를 중화시킬 것이다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα(예를 들어, 인간-IL-7Rα, 서열번호 65 및/또는 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα, 서열번호 66)에 또는 γ-쇄 수용체(예를 들어, 인간 공통 γ-쇄 수용체, 서열번호 64)에 결합한다. 더욱 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα, 가장 적합하게는, 인간 IL-7Rα에 결합한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα의 세포외 영역(서열번호 67 및 68, 각각 시노몰구스 및 인간 IL-7Rα의 세포외 영역), 즉, 막관통 헬릭스 및 세포질 도메인이 결여된 IL-7Rα의 폴리펩타이드 서열에 결합한다.
적합하게는, IL-7Rα는 서열번호 65 또는 서열번호 66을 포함하는 폴리펩타이드이고, 더욱 적합하게는, IL-7Rα는 서열번호 65 또는 서열번호 66으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 더욱 적합하게는, IL-7Rα은 서열번호 65를 포함하는 폴리펩타이드이고, 더욱 적합하게는, IL-7Rα은 서열번호 65로 이루어진 폴리펩타이드이다. 성숙한 전장 인간 IL-7Rα의 폴리펩타이드 서열이 또한 UniProt 항목 P16871 하에 입수 가능하다.
인간으로부터의 IL-7Rα 및 또 다른 종으로부터의 IL-7Rα과, 예컨대, 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα과 반응("교차-반응")할 수 있는 폴리펩타이드는 전임상 연구가 동물 모델에서 보다 용이하게 수행될 수 있게 하기 때문에 유리하다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7 및/또는 L-TSLP의 수용체 결합 부위(들)에 있고/거나, 이의 일부를 형성하는 IL-7Rα 상의 에피토프에 대한 것이며, 이로써, 상기 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα에 대한 결합 시, IL-7 및/또는 L-TSLP 신호 전달을 억제 또는 감소시킬 수 있다.
발명의 폴리펩타이드는 IL-7Rα 상의 하나 이상의 에피토프(들)에 결합한다. 본 발명의 한 측면에서, V7R-2E5, V7R-2E9, V7R-2F6, V7R-6C12, V7R-2B6, V7R-3B5 또는 V7R-4F6과 동일한, IL-7Rα 상의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드가 제공된다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 단리된다. "단리된" 폴리펩타이드는 이의 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연적으로 발생된 본 발명의 폴리펩타이드가 자연계에서 공존 물질 중 일부 또는 그 모두로부터 분리되었다면, 이는 단리된 것이다.
역가, 억제 및 중화
역가는 주어진 강도의 효과를 일으키는 데 필요한 양과 관련하여 표현되는 치료제의 활성 척도이다. 저농도에서 더 작은 반응을 일으키는 더 낮은 역가의 작용제와 비교하였을 때, 고도로 강력한 작용제는 저농도에서 더 큰 반응을 일으킨다. 역가는 친화도 및 효능의 함수이다. 효능이란, 표적 리간드에 대한 결합 시 생물학적 반응을 일으킬 수 있는 치료제의 능력 및 상기 반응의 정량적 크기를 지칭한다. 반수 최대 유효 농도(EC50)라는 용어는 지정된 노출 시간 후, 기준선과 최대 사이의 중간의 반응을 일으키는 치료제 농도를 지칭한다. 치료제는 억제 또는 자극을 유발할 수 있다. 이는 일반적으로 역가의 척도로 사용되며, 본원에서도 사용된다.
본 발명의 목적을 위한 중화 폴리펩타이드는 ELISA에 의해 측정되는 바와 같이, IL-7 및/또는 L-TSLP에 대한 IL-7R의 결합을 억제하는, IL-7Rα에 결합하는 폴리펩타이드이다. 이러한 맥락에서 억제의 수준을 결정하기에 적합한 특정 ELISA 방법은 하기에서 실시예 3에 상세히 기재되어 있다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 2.00 nM 이하, 예컨대, 1.50 nM 이하, 예컨대, 1.00 nM 이하, 예컨대, 0.90 nM 이하, 예컨대, 0.80 nM 이하, 예컨대, 0.70 nM 이하, 예컨대, 0.65 nM 이하, 예컨대, 0.60 nM 이하, 예컨대, 0.55 nM 이하, 예컨대, 0.50 nM 이하, 예컨대, 0.45 nM 이하, 예컨대, 0.4 nM 이하, 예컨대, 0.35 nM 이하, 예컨대, 0.30 nM 이하의 E50으로 IL-7에 대한 IL-7R 결합을 중화시킨다.
적합하게는, EC50은 하기 실시예 3에 상세히 기재된 IL-7/IL-7R 중화 ELISA를 사용하여 확립된다.
폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열
밀접한 관련이 있는 두 폴리펩타이드 서열을 비교하기 위해, 폴리펩타이드 서열에 대한 표준 설정 환경(BLASTP)을 이용하여 NCBI BLAST v2.0을 사용함으로써 제1 폴리펩타이드 서열과 제2 폴리펩타이드 서열 사이의 "서열 동일성 %"을 산출할 수 있다. 밀접한 관련이 있는 두 폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위해, 뉴클레오타이드 서열에 대한 표준 설정 환경(BLASTN)을 이용하여 NCBI BLAST v2.0을 사용함으로써 제1 뉴클레오타이드 서열과 제2 뉴클레오타이드 서열 사이의 "서열 동일성 %"를 산출할 수 있다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 데폴트로서 11개 단어 길이(W) 및 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 데폴트로서 3의 단어 길이, 및 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 점수 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조) 50의 정렬(B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 또한 두 서열간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 척도 중 하나는 최소 확률 총합(P(N))인데, 이는 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열간의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산을 참조 핵산과 비교했을 때의 최소 확률 총합이 약 0.2 미만, 더욱 적합하게는 약 0.01 미만, 및 가장 적합하게는 약 0.001 미만이면, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 이의 전체 길이에 걸쳐 100%의 서열 동일성을 공유한다면, 이는 다른 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 같거나, 또는 동일하다고 한다. 서열 잔기는 좌측에서 우측으로, 즉, 폴리펩타이드의 경우, N-말단에서 C-말단으로; 폴리뉴클레오타이드의 경우, 5' 말단에서 3' 말단으로 넘버링된다.
서열 사이의 "차이"는 제1 서열과 비교하였을 때 제2 서열 위치의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 두 폴리펩타이드 서열은 1개, 2개 이상의 상기와 같은 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 다르게는 제1 서열과 동일한 (100%의 서열 동일성) 제2 서열의 삽입, 결실, 또는 치환은 서열 동일성 %를 감소시킨다. 예를 들어, 동일한 서열의 길이가 9개의 아미노산 잔기 길이인 경우, 제2 서열에서 하나의 치환은 88.9%의 서열 동일성을 가지게 된다. 동일한 서열의 길이가 17개의 아미노산 잔기 길이인 경우, 제2 서열에서 2개의 치환은 88.2%의 서열 동일성을 가지게 된다. 동일한 서열의 길이가 7개의 아미노산 잔기 길이인 경우, 제2 서열에서 3개의 치환은 57.1%의 서열 동일성을 가지게 된다. 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열의 길이가 9개의 아미노산 잔기 길이이고, 6개의 동일한 잔기를 공유하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 66% 초과의 동일성을 공유한다(제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 66.7%의 동일성을 공유한다). 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열이 17개의 아미노산 잔기 길이이고, 16개의 동일한 잔기를 공유하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 94% 초과의 동일성을 공유한다(제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 94.1%의 동일성을 공유한다). 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열이 7개의 아미노산 잔기 길이이고, 3개의 동일한 잔기를 공유하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 42% 초과의 동일성을 공유한다(제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 42.9%의 동일성을 공유한다).
대안적으로, 제1 참조 폴리펩타이드 서열을 제2 비교 폴리펩타이드 서열과 비교하기 위해, 제2 서열을 제조하기 위해 제1 서열에 대하여 이루어진 부가, 치환 및/또는 결실의 개수를 확인할 수 있다. 부가는 제1 폴리펩타이드의 서열 내로 하나의 아미노산 잔기를 부가하는 것(제1 폴리펩타이드의 어느 한 말단에서의 부가 포함)이다. 치환은 제1 폴리펩타이드의 서열 중의 하나의 아미노산 잔기를 다른 한 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 결실은 제1 폴리펩타이드의 서열로부터 하나의 아미노산 잔기를 결실시키는 것(제1 폴리펩타이드의 어느 한 말단에서의 결실 포함)이다.
제1 참조 폴리뉴클레오타이드 서열을 제2 비교 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하기 위해, 제2 서열을 제조하기 위해 제1 서열에 대하여 이루어진 부가, 치환 및/또는 결실의 개수를 확인할 수 있다. 부가는 제1 폴리뉴클레오타이드의 서열 내로 하나의 뉴클레오타이드 잔기를 부가하는 것(제1 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단에서의 부가 포함)이다. 치환은 제1 폴리뉴클레오타이드의 서열 중의 하나의 뉴클레오타이드 잔기를 다른 한 뉴클레오타이드 잔기로 치환하는 것이다. 결실은 제1 폴리뉴클레오타이드의 서열로부터 하나의 뉴클레오타이드 잔기를 결실시키는 것(제1 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단에서의 결실 포함)이다.
"보존적" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 화학 구조를 가지는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고, 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 영향을 미치지 않을 것으로 예상되는 아미노산 치환이다. 그러한 보존적 치환은 적합하게는 하기 군 내의 한 아미노산이 같은 군 내의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 치환이다:
Figure pct00001
적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 비극성 아미노산이다. 더욱 적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 V, I, L, M, F, W 또는 C로부터 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 폴리펩타이드 서열의 넘버링 및 CDR 및 FR의 정의는 카바트(Kabat) 체계에 따라 정의된 바와 같다(Kabat et al 1991). 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열 사이의 "상응하는" 아미노산 잔기는 카바트 체계에 따라 같은 위치에서 제2 서열 중의 아미노산 잔기와 공유하는 제1 서열 중의 아미노산 잔기인 반면, 제2 서열 중의 아미노산 잔기는 제1의 것과 동일성이 다를 수 있다. 적합하게는, 프레임워크 및 CDR이 카바트 정의에 따라 같은 길이라면, 상응하는 잔기는 같은 개수(및 문자)를 공유할 것이다. 정렬은 수동으로, 또는 예를 들어, 표준 설정 환경을 이용하여 서열 정렬을 위한 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, NCBI BLAST v2.0(BLASTP 또는 BLASTN)을 사용함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드인 ID-A62U의 폴리펩타이드 서열은 하기에서 카바트 포맷으로 제공된다:
Figure pct00002
본 발명의 추가 폴리펩타이드인 ID-A59U의 폴리펩타이드 서열은 하기에서 카바트 포맷으로 제공된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명의 추가 폴리펩타이드인 V7R-2E9의 폴리펩타이드 서열은 하기에서 카바트 포맷으로 제공된다:
Figure pct00005
N-말단에서 C-말단으로의 잔기 넘버링은 맨 아래 행에 제공된다. 카바트 넘버링은 'H' 접두사를 포함하고, 두 번째 행에 제공된다. CDR1, CDR2 및 CDR3는 각각 'CDR-H1', 'CDR-H2' 및 'CDR-H3'로 표기된다.
본 발명의 추가 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 서열(실시예 2 및 3 하에 논의됨)은 하기에서 정렬된다(V7R-6C12는 하기에서 IL-7R-6C12로 지칭됨을 주지한다):
Figure pct00006
적합하게는, 본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 단리된 것이다. "단리된" 폴리뉴클레오타이드는 이의 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오타이드가 자연계에서 공존 물질 중 일부 또는 그 모두로부터 분리되었다면, 이는 단리된 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 그가 예를 들어, 이의 천연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝되었거나, 또는 그가 cDNA 내에 포함되었다면, 이는 단리된 것으로 간주된다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 69 또는 70, 가장 적합하게는, 서열번호 70과 70% 이상의, 예컨대, 80% 이상의, 예컨대, 90% 이상의, 예컨대, 95% 이상의, 예컨대, 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 가장 적합하게는, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 69 또는 70, 가장 적합하게는, 서열번호 70을 포함하거나 이로 이루어진다(가장 적합하게는 이로 이루어진다). 추가 측면에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 cDNA가 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 인코딩된 면역글로불린쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 인코딩하는, 서열번호 69 또는 70의 일부 중 어느 하나와 70% 이상의, 예컨대, 80% 이상의, 예컨대, 90% 이상의, 예컨대, 95% 이상의, 예컨대, 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드 서열은 네이티브 서열과 관련하여 적어도 하나의 변경을 함유한다. 적합하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 네이티브 서열과 관련하여 적어도 하나의 변경을 함유한다. 적합하게는, 장관에 존재하는 프로테아제(예를 들어, 트립신 및 키모트립신)에 대한 폴리펩타이드 또는 인코딩된 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키기 위해 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 변경이 이루어진다.
본 발명의 폴리펩타이드의 CDR 및 프레임워크의 가능한 특징이 이하에서 기술된다.
CDR1
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR1은 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR1은 서열번호 1과 비교하여 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR1은 서열번호 1과 비교하여 2개 이하, 더욱 적합하게는, 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR1은 서열번호 1과 비교하여 2개 이하, 더욱 적합하게는, 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 1에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 CDR1의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다.
적합하게는, CDR1의 잔기는 하기 동일성을 갖는다(서열번호 82):
Figure pct00007
적합하게는, CDR1은 서열번호 1 또는 서열번호 71을 포함하거나 이로 이루어진다. 더욱 적합하게는, CDR1은 서열번호 1을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
CDR2
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR2는 서열번호 2와 65% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR2는 서열번호 2와 비교하여 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR2는 적합하게는 서열번호 2와 비교하여 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR2는 적합하게는 서열번호 2와 비교하여 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 2에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 CDR2의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다.
적합하게는, CDR2의 잔기는 하기 동일성을 갖는다(서열번호 83):
Figure pct00008
적합하게는, 서열번호 2의 잔기 번호 16에 상응하는 CDR2의 잔기는 Q 또는 K, 가장 적합하게는 K이다. 적합하게는, CDR2는 서열번호 2, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 또는 서열번호 76을 포함하거나 이로 이루어진다. 더욱 적합하게는, CDR2은 서열번호 2를 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
CDR3
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3은 서열번호 3과 60% 이상, 70% 이상 또는 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3은 서열번호 3과 비교하여 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3은 서열번호 3과 비교하여 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3은 서열번호 3과 비교하여 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 임의의 치환은 서열번호 3에서 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적인 것이다.
적합하게는, 서열번호 3에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 CDR3의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다.
적합하게는, CDR3의 잔기는 하기 동일성을 갖는다(서열번호 84):
Figure pct00009
적합하게는, CDR3의 서열은 서열번호 3, 서열번호 77 또는 서열번호 78을 포함하거나 이로 이루어진다. 더욱 적합하게는, CDR3은 서열번호 3을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
특정 CDR
일부 특히 적합한 CDR 서열은 하기 표에 나타나 있다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR1은 하기 열거된 CDR1 서열 중 하나이다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR2는 하기 열거된 CDR2 서열 중 하나이다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 CDR3은 하기 열거된 CDR3 서열 중 하나이다. 적합하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 하기 열거된 CDR 서열 중 2개, 또는 더욱 적합하게는 3개의 조합을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 특정 CDR이 하기에 제공된다. '예'는 해당 서열에 대한 CDR 및 상응하는 서열 식별자 번호를 포함하는 예시적인 ICVD를 나타낸다.
Figure pct00010
FR1
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR1은 서열번호 4와 5%, 12%, 18%, 26%, 32%, 38%, 46%, 52%, 58%, 62%, 66%, 68%, 72%, 75%, 78%, 82%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR1은 서열번호 4와 비교하여 28개 이하, 더욱 적합하게는 26개 이하, 더욱 적합하게는 24개 이하, 더욱 적합하게는 22개 이하, 더욱 적합하게는 20개 이하, 더욱 적합하게는 18개 이하, 더욱 적합하게는 16개 이하, 더욱 적합하게는 14개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게, 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR1은 적합하게는 서열번호 4와 비교하여 28개 이하, 더욱 적합하게는 26개 이하, 더욱 적합하게는 24개 이하, 더욱 적합하게는 22개 이하, 더욱 적합하게는 20개 이하, 더욱 적합하게는 18개 이하, 더욱 적합하게는 16개 이하, 더욱 적합하게는 14개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR1은 적합하게는 서열번호 4와 비교하여 28개 이하, 더욱 적합하게는 26개 이하, 더욱 적합하게는 24개 이하, 더욱 적합하게는 22개 이하, 더욱 적합하게는 20개 이하, 더욱 적합하게는 18개 이하, 더욱 적합하게는 16개 이하, 더욱 적합하게는 14개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 4에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 FR1의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다. 적합하게는, 서열번호 4의 잔기 번호 1에 상응하는 FR1의 잔기는 D 또는 E, 가장 적합하게는 D이다. 적합하게는, 서열번호 4의 잔기 번호 1 내지 5에 상응하는 FR1의 잔기는 DVQLV이다. 적합하게는, FR1은 서열번호 4를 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 서열번호 4의 잔기 번호 24에 상응하는 FR1의 잔기는 S이다.
FR2
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR2는 서열번호 5와 10%, 15%, 25%, 30%, 40%, 45%, 55%, 60%, 70%, 75%, 85%, 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR2는 서열번호 5와 비교하여 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR2는 적합하게는 서열번호 5와 비교하여 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR2는 적합하게는 서열번호 5와 비교하여 13개 이하, 더욱 적합하게는 12개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 5에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 FR2의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 10에 상응하는 FR2의 잔기는 R 또는 L이고, 가장 적합하게는 L이다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 8 내지 11에 상응하는 FR2의 잔기는 KEXE이고, 여기서 X는 R 또는 L이고, 가장 적합하게는 L이다. 대안적으로, 서열번호 5의 잔기 번호 9 내지 12에 상응하는 FR2의 잔기는 GLEW이다. 적합하게는, FR2는 서열번호 5를 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 2에 상응하는 FR2의 잔기는 F이고, 더욱 적합하게는 또한 서열번호 5의 잔기 번호 14에 상응하는 FR2의 잔기는 A이다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 9 내지 14에 상응하는 FR2의 잔기는 ELEFLA(서열번호 79)이다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 9 내지 14에 상응하는 FR2의 잔기는 GLEWVS(서열번호 80)가 아니다. 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 9에 상응하는 FR2의 잔기는 G가 아니다. 더욱 적합하게는, 서열번호 5의 잔기 번호 9에 상응하는 FR2의 잔기는 E이다.
FR3
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR3는 서열번호 6과 8%, 15%, 20%, 26%, 32%, 40%, 45%, 52%, 58%, 65%, 70%, 76%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR3은 서열번호 6과 비교하여 29개 이하, 더욱 적합하게는 27개 이하, 더욱 적합하게는 25개 이하, 더욱 적합하게는 23개 이하, 더욱 적합하게는 21개 이하, 더욱 적합하게는 19개 이하, 더욱 적합하게는 17개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR3은 적합하게는 서열번호 6과 비교하여 29개 이하, 더욱 적합하게는 27개 이하, 더욱 적합하게는 25개 이하, 더욱 적합하게는 23개 이하, 더욱 적합하게는 21개 이하, 더욱 적합하게는 19개 이하, 더욱 적합하게는 17개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR3은 적합하게는 서열번호 6과 비교하여 29개 이하, 더욱 적합하게는 27개 이하, 더욱 적합하게는 25개 이하, 더욱 적합하게는 23개 이하, 더욱 적합하게는 21개 이하, 더욱 적합하게는 19개 이하, 더욱 적합하게는 17개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 13개 이하, 더욱 적합하게는 11개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 6에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 FR3의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다. 적합하게는, FR3은 서열번호 6을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 서열번호 6의 잔기 번호 18, 19 및 20에 상응하는 FR3의 잔기는 NSL이다. 적합하게는, 서열번호 6의 잔기 번호 21에 상응하는 FR3의 잔기는 R이다. 적합하게는, 서열번호 6의 잔기 번호 22에 상응하는 FR3의 잔기는 A이다.
FR4
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR4는 서열번호 7과 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 FR4는 서열번호 7과 비교하여 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR4는 적합하게는 서열번호 7과 비교하여 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FR4는 적합하게는 서열번호 7과 비교하여 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 서열번호 7에서 이의 상응하는 잔기와 상이한 FR4의 임의의 잔기는 이의 상응하는 잔기와 관련하여 보존적 치환이다. FR4는 적합하게는 서열번호 7을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다
전체 폴리펩타이드
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 8과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 8과 비교하여 20개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 부가(들)를 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드는 적합하게는 서열번호 8과 비교하여 20개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드는 적합하게는 서열번호 8과 비교하여 20개 이하, 더욱 적합하게는 15개 이하, 더욱 적합하게는 10개 이하, 더욱 적합하게는 9개 이하, 더욱 적합하게는 8개 이하, 더욱 적합하게는 7개 이하, 더욱 적합하게는 6개 이하, 더욱 적합하게는 5개 이하, 더욱 적합하게는 4개 이하, 더욱 적합하게는 3개 이하, 더욱 적합하게는 2개 이하, 더욱 적합하게는 1개 이하의 결실(들)가지는 서열을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는, 폴리펩타이드의 N-말단은 D이다. 폴리펩타이드는 적합하게는 서열번호 8을 포함하거나, 더욱 적합하게는 이로 이루어진다.
프레임워크 실시양태
본 발명의 한 측면에서, 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하는 폴리펩타이드로서, 각 프레임워크 영역이 ID-A62U(즉, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7)의 상응하는 프레임워크 영역의 변이체인, 폴리펩타이드가 제공된다. 적합하게는, 각 변이체 프레임워크 영역은 ID-A62U에서 이의 상응하는 프레임워크 영역과 적어도 50%, 더욱 적합하게는 적어도 60%, 더욱 적합하게는 적어도 70%, 더욱 적합하게는 적어도 80% 또는 더욱 적합하게는 적어도 90% 동일성을 공유한다. 더욱 적합하게는, 변이체 프레임워크 영역은 ID-A62U의 상응하는 프레임워크 영역을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진다. 적합하게는, 4개의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편이다. 적합하게는, 항체 단편은 VHH, VH, VL, V-NAR, scFv, Fab 단편, 또는 F(ab')2 단편이다. 더욱 적합하게는, 항체 단편은 VHH 또는 VH이고, 가장 적합하게는 VHH이다.
에피토프
실시예 5는 본 발명의 폴리펩타이드, V7R-2E9에 대하여 수행된 에피토프 모델링 작업을 상세히 기술한 것이다. 이러한 작업은 IL-7Rα의 다음 잔기에 V7R-2E9가 결합한다는 것을 지시하였다. 계면에 특히 중요한 영역이 파묻힌 잔기가 굵게 강조된다. 잔기 넘버링은 서열번호 65에 해당한다.
Figure pct00011
따라서, 본 발명의 한 측면에서, Glu27, Ser31, Leu57, Val58, Glu59, Lys77, Lys78, Phe79, Leu80, Leu81, Ile82, Thr104, Lys137, Lys138, Tyr139, Lys141, His191, Tyr192 및 Phe193로 이루어진 목록으로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 IL-7Rα(서열번호 65) 상의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드가 제공된다. 적합하게는, 폴리펩타이드는 이러한 목록으로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 8개, 더욱 적합하게는 적어도 15개, 더욱 적합하게는 적어도 모든 잔기를 포함하는 IL-7Rα 상의 에피토프에 결합한다.
IL-7Rα의 특정 잔기는 V7R-2E9와의 계면에 특히 중요한 영역이 파묻혀 있다는 것이 주지될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에서, Ser31, Val58, Phe79, Leu80, Leu81, Ile82, Lys138, Tyr139 및 Phe193으로 이루어진 목록으로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 IL-7Rα(서열번호 65) 상의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드가 제공된다. 적합하게는, 폴리펩타이드는 IL-7Rα의 적어도 Val58, Leu80 및 Lys138, 더욱 적합하게는, IL-7Rα의 Val58, Leu80, Lys138, Ile82 및 Tyr139, 더욱 적합하게는 IL-7Rα의 Val58, Leu80, Lys138, Ile82, Tyr139, Leu81 및 Phe79를 포함하는 IL-7Rα 상의 에피토프에 결합한다. 적합하게는, 폴리펩타이드는 Ser31, Val58, Phe79, Leu80, Leu81, Ile82, Lys138, Tyr139 및 Phe193로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 5개, 더욱 적합하게는 적어도 7개, 더욱 적합하게는 모든 잔기를 포함하는 IL-7Rα 상의 에피토프에 결합한다.
적합하게는, 이러한 문맥에서 '에피토프에 결합한다"는 적어도 관련 잔기에 관하여 상기 표에서 언급된 BSA를 갖는, 폴리펩타이드 결합 시, 에피토프를 구성하는 IL-7Rα의 관련 잔기로서 정의될 수 있다.
링커 및 다량체
본 발명에 따른 작제물은 다중 폴리펩타이드를 포함하고, 그러므로, 적합하게는 다가일 수 있다. 상기 작제물은 적어도 2개의 동일한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 2개의 동일한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드로 이루어진 작제물은 "동종비헤드"이다. 본 발명의 한 측면에서, 2개 이상의 동일한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 작제물이 제공된다.
대안적으로, 작제물은 상이하지만, 이 둘 모두는 여전히 본 발명에 따른 폴리펩타이드인 것인 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다("이종비헤드").
대안적으로, 상기 작제물은 (a) 적어도 하나의, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 (b) 본 발명의 폴리펩타이드가 아닌, 적어도 하나의 폴리펩타이드, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다(이는 또한 "이종비헤드"). (b)의 적어도 하나의 폴리펩타이드는 (예를 들어, (a)의 것과 상이한 에피토프를 통해) IL-7R을 결합할 수 있거나, 또는 대안적으로, IL-7R과 다른 표적에 결합할 수 있다. 적합하게는, 상이한 폴리펩타이드 (b)는 예를 들어: 인터루킨(예컨대, IL-1, IL-1ra, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 및 IL-18), 인터루킨 수용체(예컨대, IL-6R), 전사 인자(예컨대, NF-κB), 시토카인(예컨대, TNF-알파, IFN-감마 TGF-베타), 막관통 단백질(예컨대, gp130 및 CD3), 표면 당단백질(예컨대, CD4, CD20, CD40), 가용성 단백질(예컨대, CD40L), 인테그린(예컨대, a4b7 및 AlphaEbeta7), 부착 분자(예컨대, MAdCAM), 케모카인(예컨대, IP10 및 CCL20), 케모카인 수용체(예컨대, CCR2 및 CCR9), 억제성 단백질(예컨대, SMAD7), 키나제(예컨대, JAK3), G-단백질 커플링된 수용체(예컨대, 스핑고신-1-P 수용체), 다른 염증성 매개인자 또는 인간 병리학적 프로세스에 관여하는 면역학적으로 관련된 리간드에 결합한다. 따라서, 상이한 폴리펩타이드 (b)는 예를 들어, IL-6R, IL-6, IL-12, IL-1-베타, IL-17A, TNF-알파 또는 CD3; 또는 다른 염증성 매개인자 또는 인간 병리학적 프로세스에 관여하는 면역학적으로 관련된 리간드에 결합한다.
작제물은 다가 및/또는 다중특이적일 수 있다. 다가 작제물(예컨대, 2가 작제물)은 2개 이상의 결합 폴리펩타이드를 포함하며, 그러므로, 하나 이상의 항원에 대한 결합이 이루어질 수 있는 2개 이상의 부위가 존재한다. 다가 작제물의 한 예는 동종비헤드 또는 이종비헤드일 수 있다. 다중특이적 작제물(예컨대, 이중특이적 작제물)은, (a) 2개 이상의 상이한 항원에 대한 부착이 이루어질 수 있거나, 또는 (b) 동일한 항원 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 부착이 이루어질 수 있는 2개 이상의 부위가 존재하는 2개 이상의 상이한 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 다중특이적 작제물의 한 예는 이종비헤드일 수 있다. 다중특이적 작제물은 다가이다.
적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 항체 단편이다. 더욱 적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 VHH, VH, VL, V-NAR, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 더욱 적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 VH 또는 VHH, 가장 적합하게는 VHH이다.
적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 ICVD(예컨대, VHH, VH, VL), V-NAR, scFv, Fab 단편, 또는 F(ab')2 단편으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 더욱 적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 ICVD이고, 더욱 적합하게는, 작제물 내에 포함된 폴리펩타이드는 VH 또는 VHH, 가장 적합하게는 VHH이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서로 직접(즉, 링커를 사용하지 않고), 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 적합하게는, 링커는 프로테아제-불안정성 또는 비-프로테아제-불안정성 링커이다. 링커는 적합하게는 폴리펩타이드이고, 폴리펩타이드가 이의 에피토프에 결합할 수 있도록 선택될 것이다. 치료학적 목적으로 사용되는 경우, 링커는 적합하게는 폴리펩타이드를 투여받는 대상체에서 비-면역원성이다. 적합하게는, 폴리펩타이드는 모두 비-프로테아제-불안정성 링커에 의해 연결된다. 적합하게는, 프로테아제-불안정성 링커는 포맷 [-(GaS)x-BJB'-(GaS)y-]z이며, 상기 식에서, J는 리신 또는 아르기닌이고, B는 R, H, N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, W, P, M, C, F, K 또는 I로부터 선택되는 0개 내지 5개의 아미노산 잔기이고, B'는 R, H, N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, W, M, C, F, K 또는 I로부터 선택되는 0개 내지 5개의 아미노산 잔기이고, a는 1 내지 10이고, x는 1 내지 10이고; y는 1 내지 10이고, z는 1 내지 10이다(서열번호 85). 적합하게는, a는 4이다. 가장 적합하게는, a는 4이고, J는 리신이고, B는 0이고, x는 1이고, y는 1이고, z는 1이다. 대안적으로, 프로테아제-불안정성 링커는 포맷 -(G4S)x-K-(G4S)y-(상기 식에서, x 및 y는 각각 독립적으로 1 내지 5(서열번호 86)), 더욱 적합하게는 -(G4S)2-K-(G4S)2-(서열번호 87)이다.
적합하게는, 비-프로테아제-불안정성 링커는 포맷 (G4S)x(서열번호 88)이다. 더욱 적합하게는, x는 1 내지 10이고, 더욱 적합하게는 x는 4 내지 8이고, 더욱 적합하게는 x는 4, 6 또는 8이다. 가장 적합하게는, x는 6(서열번호 89)이다.
벡터 및 숙주
본원에서 사용되는 바와 같은, "벡터"라는 용어는 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형으로는 "플라스미드"가 있으며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 바이러스 벡터가 있으며, 여기서, 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 및 효모 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그가 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단하게, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드 형태이다. 플라스미드는 벡터 중 가장 일반적으로 사용되는 형태인 바, 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스), 및 또한 박테리오파지 및 파지미드 시스템을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드 서열 또는 다가 및/또는 다중특이적 작제물을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라, 상기 세포의 자손도 지칭하는 것으로 의도된다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 cDNA를 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 추가 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 발현할 수 있는, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 적합하게는, 숙주 세포는 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이, 아스페르길루스 속, 사카로마이세스 속, 클루이베로마이세스 속, 한세눌라 속 또는 피치아 속에 속하는 효모, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시아에 또는 피치아 파스토리스이다.
자가면역 질환 및/또는 염증성 질환
자가면역 질환은 면역계가 정상적인 신체 조직에 불리하게 반응할 때 발병한다. 자가면역 장애는 신체 조직을 손상시키고/거나, 비정상적인 기관 성장을 일으키고/거나, 기관 기능을 변화시킬 수 있다. 상기 장애는 오직 한 기관 또는 조직 유형에만 영향을 줄 수 있거나, 또는 다중 기관 및 조직에 영향을 줄 수 있다. 일반적으로 자가면역 장애에 의해 영향을 받는 기관 및 조직으로는 혈액 성분, 예컨대, 적혈구, 혈관, 결합 조직, 내분비선, 예컨대, 갑상선 또는 췌장, 근육, 관절 및 피부를 포함한다. 염증성 질환은 염증을 특징으로 하는 질환이다. 다수의 염증성 질환은 자가면역 질환이고, 그 반대의 경우도 그러하다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 의약으로서 사용하기 위한 것이고, 더욱 적합하게는 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는(적합하게는, 경구적으로 전달되었을 때) 이상적으로는 IL-7 및/또는 L-TSLP가 병리의 적어도 한 비율에 기여하는 염증성 질환을 치료할 것이고, 폴리펩타이드는 IL-7 및/또는 L-TSLP가 생물학적으로 활성인 조직에 접근할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 수용체(IL-7R)에 결합한다. 따라서, 이는 또한 질환에 관여할 수 있는 IL-7R의 아직 발견되지 않은 시토카인 또는 기타 결합 파트너를 파괴할 수 있다.
IL-7 및 L-TSLP의 IL-7R 결합의 억제
TSLP의 다른 동형이 차등적으로 발현되고 다른 신호전달 경로를 통해 작용한다는 증거는 이러한 시토카인의 짧은 동형의 생리학적으로 유익한 효과보다 L-TSLP의 질환 관련 활성을 선택적으로 표적화하는 것이 가능할 수 있다는 것을 시사하였다. 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7R에 대한 IL-7의 결합을 억제한다. IL-7Rα와 V7R-2E9 분자의 상호작용과 TSLP:TSLPR:IL-7R 복합체(Verstraete et al 2017)의 최근 발표된 구조에 대한 인실리코 모델링으로부터의 정보는 V7R-2E9 및 다른 본 발명의 폴리펩타이드가 IL-7Rα에 대한 IL-7과 L-TSLP 둘 모두의 결합을 억제할 것을 강력하게 시사하였다. IL-7(IL-7-유도성 STAT5 인산화)과 L-TSLP(TSLP-유도성 TARC 분비) 둘 모두의 수용체-결합 및 세포-기반 생물학적 활성을 강하게 차단하는 V7R-2E9의 능력이 이제 확인되었다. V7R-2E9는 TSLP보다는 IL-7Rα에 결합하기 때문에, V7R-2E9 및 관련 ICVD가 L-TSLP의 친-염증성 활성만을 차단할 것이고 S-TSLP의 중요한 점막 항상성 기능이 영향을 받지 않을 것으로 예상된다.
염증성 장 질환(IBD)
아동 및 성인, 둘 모두에서 이환되는 것인 만성 염증성 장 질환 크론병 및 궤양성 대장염은 GIT의 자가면역 및 염증성 질환의 예이다(Hendrickson et al 2002). 궤양성 대장염은 염증성 반응 및 형태학적 변화가 결장으로 국한된 상태로 유지되는 병태인 것으로 정의된다. 직장은 환자 중 95%에 연루되어 있다. 염증은 대개 점막으로 제한되고, 결장 길이를 따라 궤양 형성, 부종, 및 출혈과 함께 다양한 중증도의 연속된 병발로 이루어진다(Hendrickson et al 2002). 궤양성 대장염은 보통, 배변 통과 동안에 가장 심각한 경련성 하복부 복통과 함께, 대변에 섞인 혈액 및 점액이 존재하는 소견을 나타낸다. 임상적으로, 혈액 및 점액이 있는 설사의 존재를 통해 궤양성 대장염은, 혈액이 존재하지 않는 과민성 장 증후군과 구별된다. 궤양성 대장염과 달리, 크론병으로 나타나는 것은 보통 감지하기가 어렵고, 이로 인해 후반에 진단을 받게 된다. 인자, 예컨대, 병발 위치, 정도, 및 중증도가 위장 증상의 정도를 결정짓는다. 회결장 병발을 앓는 환자는 보통 우하복 4분부 압통 및 간헐성 염증성 덩어리와 함께 식후 복통을 앓는다. 위 십이지장 크론병과 관련된 증상으로는 조기 포만감, 구역, 구토, 심와부 통증, 또는 연하곤란을 포함한다. 항문 꼬리, 항문 심부 열창, 및 누공과 함께 항문 주변 질환이 일반적이다(Hendrickson et al 2002).
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 GI(위장) 관의 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용되고, 여기서 IL-7 및/또는 L-TSLP가 이러한 질환의 병리에 기여한다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 장 증후군, II형 당뇨병, 사구체신염, 자가면역 간염, 호그렌 증후군, 셀리악 병 및 약물- 또는 방사선-유도된 점막염(더욱 적합하게는 크론병 또는 궤양성 대장염, 가장 적합하게는 궤양성 대장염)으로 이루어진 목록으로부터 선택된 GI 관의 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
호산구성 식도염(EoE)
호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis; EoE)(철자가 또한 호산구성 식도염(eosinophilic oesophagitis)이고, 알레르기성 식도염으로도 알려짐)은 백혈구의 일종인 호산구를 포함하는 식도의 알레르기성 염증 상태이다. 증상으로는 연하 곤란, 식편 압입, 구토, 및 속쓰림이 있다.
적합하게는 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 호산구성 식도염의 치료에 사용하기 위한 것이다. 더욱 적합하게는 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 호산구성 식도염의 치료에 사용하기 위한 것이고, 경구적으로 투여된다.
기타 자가면역/염증성 질환
예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드의 경구 투여를 통해 치료될 수 있는 GIT의 기타 질환은, 예를 들어, 염증성 질환 점막염(적합하게는 약물- 및 방사선 유도성-점막염), 천식, 특발성 폐 섬유증, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 니트레토 증후군, 식품 알레르기, 알레르기성 설사, 호산구성 위장염, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(ABPA), 알레르기성 진균 부비동염, 암, COPD, 켈로이드, 만성 비부비동염(CRS), 비강 폴립증, 만성 호산구성 폐렴, 호산구성 기관지염, 셀리악병 및 처그-스트라우스 증후군을 포함한다.
점막염에서 병변은 입에서 항문까지 어디에서나 발생할 수 있으며, 입 및 식도 병변의 경우 가변 도메인을 함유하는 구강 세정제 또는 크림 제제가 사용될 수 있다. 항문 및 직장 병변의 경우, 가변 도메인을 함유하는 좌약, 크림 또는 폼제가 국소 적용에 적합할 것이다. 면역글로불린쇄 가변 도메인은 염증 부위에서의 혈류 내로의 흡수를 통해 또는 림프성 제거, 및 이어서, 혈류 내로의 유입을 통해 점막 고유층 또는 다른 염증성 부위로부터 제거될 것이다. 이로써, 도메인은 혈류를 통해 간에 도달하게 될 것이며, 신장에서의 사구체 여과를 통해 제거될 것이다. 그러므로, 도메인이 질환, 예컨대, 자가면역 간염, II형 당뇨병 및 사구체신염에서 치료학적으로 작용하게 된다는 것은 충분히 이론적으로 설명이 된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 적합하게는 피부로 및/또는 피부를 통한 국소 전달에 의해, 적합하게는 크림, 나노입자, 연고 또는 하이드로겔의 형태로 아토피성 피부염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
적합하게는, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 IL-7 및/또는 L-TSLP가 관찰되는 일부 비율의 병상에 원인이 되는 기타 자가면역/염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다.
치료학적 용도 및 전달
본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 치료적 유효량은 대상체에게 단일 또는 다회 용량으로 투여되었을 때, 대상체에서 유의한 정도로 IL-7 및/또는 L-TSLP가 IL-7R를 결합하는 것을 억제하는 데 효과적인 양이다. 치료적 유효량은 인자, 예컨대, 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 임의의 독성 또는 해로운 영향을 치료학상 유익한 효과가 능가하는 양이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 대상체에게 투여하는 데 적합한 약학 조성물 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 약학적으로 허용되는 염 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적합하게는 경구, 근육내, 피하 또는 정맥내 전달용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액체 액제(예를 들어, 주사액 및 주입액), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 분제, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 고체 투여 형태가 바람직하다. 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 부형제와 함께 도입될 수 있고, 섭취할 수 있는 정제, 협측용 정제, 트로키, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제, 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 호산구성 식도염의 치료를 위해, 로젠지 형태의 전달이 특히 바람직하다. 아토피성 피부염의 치료를 위해, 크림 형태의 전달이 특히 바람직하다.
전형적으로, 약학 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충처리된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올 등뿐만 아니라, 이의 조합 중 하나 이상의 것을 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 보관 수명 또는 유효성을 증진시키는 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, 또는 완충제를 최소량으로 추가로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 점착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 향미제, 착색제, 윤활제, 흡착제, 보존제, 감미제, 동결 건조 부형제(동결건조보호제 포함) 또는 압착 보조제를 포함할 수 있다.
EoE 및 UC가 있는 환자에서, 염증이 있는 장 점막 상피 장벽이 손상되어 결과적으로 경구적으로 투여된 본 발명의 폴리펩타이드가 아래에 있는 점막 조직으로 침투되는 것이 촉진되어, 잠재적으로 염증 부위의 표적 세포에서 IL-7와 L-TSLP 둘 모두의 활성의 억제가 야기되는 것으로 사료된다. 경구적으로 투여하는 본 발명의 폴리펩타이드는 IL-7 및 L-TSLP 활성의 전신 억제를 제한하여 주사에 의해 제공되는 종래의 IL-7 및 TSLP 항체와 관련된 일반적인 면역억제의 위험을 감소시킬 것이다. 단기간의 항-IL-7R 항체 치료는, 예컨대, 동물 모델에서 이루어지는 이러한 치료는, 병원성 T 세포의 고갈로 인해 장기간의 임상 효과(관해)를 제공할 가능성이 있다. 그러나, 기존 IL-7Rα-차단 항체를 환자에게 반복적으로 전신 투여하면 흉선 T 세포 발달이 억제되고 말초에서 T 세포가 고갈되어 상당한 전신 면역억제를 초래할 가능성이 있다. 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염) 및 EoE는 대부분 위장관에 국부화되고; 결과적으로, 염증이 있는 장 점막에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 경구 투여는 제한된 전신 노출로 국부화된 효과를 달성함으로써 질병에 의해 영향을 받지 않은 조직에서 면역억제의 위험을 감소시키는 잠재력을 제공한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 적합하게는 경구적으로 투여된다. 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 협측강, 인두 및 식도(더욱 적합하게는, 식도)로 경구적으로 전달될 수 있거나(예컨대, EoE의 치료를 위해), 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장 및/또는 항문관으로 경구적으로 전달될 수 있다(예컨대, IBD의 치료를 위해).
경구 전달의 경우, 중요한 문제는 충분한 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물이, 이를 필요로 하는 장관 영역에 확실히 도달하도록 하는 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물이, 이를 필요로 하는 장관 영역에 도달하는 것을 막는 인자로는 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물을 분해할 수 있는 소화 분비물 중의 프로테아제의 존재를 포함한다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 폴리펩타이드 또는 작제물 그 자체의 고유한 특성에 의해 상기 프로테아제 중 하나 이상의 것의 존재 하에서도 실질적으로 안정적이다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 약학 조성물 내로 도입되기 이전에 동결건조된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 장용 코팅제와 함께 제공될 수 있다. 장용 코팅제는 위의 낮은 pH로부터 폴리펩타이드를 보호하는 데 도움을 주는, 경구용 의약 상에 도포된 중합체 장벽이다. 장용 코팅제용으로 사용되는 물질로는 지방산, 왁스, 셸락, 플라스틱, 및 식물 섬유를 포함한다. 적합한 장용 코팅제 성분으로는 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트(히프로멜로스 아세테이트 숙시네이트), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 알긴산 나트륨 및 스테아르산을 포함한다. 적합한 장용 코팅제로는 pH-의존성 방출 중합체를 포함한다. 이들은 위에서 발견되는 고도로 산성인 pH에서는 불용성이지만, 산성이 더 낮은 pH에서는 빠르게 용해되는 중합체이다. 따라서, 적합하게는, 장용 코팅제는 산성 위액(pH ~3)에서는 용해되지 않지만, 소장(pH 6 초과) 중에 또는 결장(pH 7.0 초과) 중에 존재하는 더 높은 pH 환경에서는 용해될 것이다. pH-의존성 방출 중합체는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물이 소장에 투여량이 도달하는 대략적인 시점에 방출되도록 선택된다.
IBD의 치료를 위해 경구적으로 투여되는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드는 적합하게는 장용성 코팅제로 제공된다. EoE의 치료를 위해 경구적으로 투여되는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드는 적합하게는 압축된 트로키 형태로 제공된다.
본 발명의 폴리펩타이드, 작제물 또는 약학 조성물은 국소적으로 피부에 전달될 수 있다. 상기 약학 조성물은 적합하게는 크림제, 연고제, 로션제, 겔제, 폼제, 경피용 패치, 분제, 페이스트제 또는 틴크제의 형태일 수 있고, 적합하게는 비타민 D3 유사체(예를 들어, 칼시포트리올 및 막사칼시톨), 스테로이드(예를 들어, 플루티카손 프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트 및 클로베타솔 프로피오네이트), 레티노이드(예를 들어, 타자로텐), 콜타르 및 디트라놀을 포함할 수 있다. 국소용 의약은 대개 서로 조합되어(예를 들어, 비타민 D3 및 스테로이드), 또는 추가 작용제, 예컨대, 실리실산과 함께 사용된다.
본 발명의 폴리펩타이드, 작제물 또는 약학 조성물은 이를 수성 또는 비수성 용매, 예컨대, 식물성 오일 또는 다른 유사 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜 중에; 및 원하는 경우, 통상의 첨가제, 예컨대, 가용제, 등장제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 함께 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에 대하여 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌 및 시트르산을 비롯한 항산화제; 보존제(예컨대, 에탄올, 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 또는 이의 조합); 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린 및 이의 조합; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 젤라틴 또는 혈청 알부민; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 트레할로스, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프럭토스, 소르보스, 라피노스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴라민산; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트, POE 에테르, 폴록사머, 트리톤-X, 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
모든 전달 방식을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 조성물의 pH를 안정화시키기 위해 5-50g/l, 또는 더욱 적합하게는 15-40g/l 또는 더욱 적합하게는 25-30 g/l인 농도로 완충제 중에서 제형화될 수 있다. 적합한 완충제 성분의 예로는 생리학적 염, 예컨대, 시트르산 나트륨 및/또는 시트르산을 포함한다. 적합하게는, 완충제는 100-200, 더욱 적합하게는, 125-175 mM 생리학적 염, 예컨대, 염화나트륨을 함유한다. 적합하게는, 완충제는 조성물의 pH, 또는 환자의 생리학적 pH에 가까운 pKa를 가지는 것으로 선택된다.
약학 조성물 중의 예시적인 폴리펩타이드 또는 작제물 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 또는 약 150 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 범위일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 작제물 또는 약학 조성물의 수성 제형은 pH-완충처리된 용액 중에서, 예를 들어, 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 대안적으로 약 5.5 범위의 pH에서 제조될 수 있다. 적합한 완충제의 예로는 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 다른 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어, 완충제, 및 제형의 원하는 장성에 의존하여 약 1 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM일 수 있다.
약학 조성물의 장성은 장성 개질제를 포함함으로써 변경될 수 있다. 상기 장성 개질제는 하전된 또는 비하전된 화학물질 종일 수 있다. 전형적인 비하전된 장성 개질제로는 당 또는 당 알콜 또는 다른 폴리올, 바람직하게, 트레할로스, 수크로스, 만닛톨, 글리세롤, 1,2-프로판디올, 라피노스, 소르비톨 또는 락티톨(특히, 트레할로스, 만닛톨, 글리세롤 또는 1,2-프로판디올)을 포함한다. 전형적인 하전된 장성 개질제로는 염, 예컨대, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 이온과 클로라이드, 술페이트, 카르보네이트, 술파이트, 니트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 아세테이트 또는 말레에이트 이온과의 조합(특히, 염화나트륨 또는 황산나트륨); 또는 아미노산, 예컨대, 아르기닌 또는 히스티딘을 포함한다. 적합하게는, 수성 제형은 비록 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수도 있지만, 등장성이다. "등장성"이라는 용어는 용액이 이의 비교 대상이 되는 일부 다른 용액, 예컨대, 생리학적 염 용액 또는 혈청과 동일한 장성을 가진다는 것을 나타낸다. 장성 작용제는 약 5 mM 내지 약 350 mM인 양으로, 예컨대, 1 mM 내지 500 nM인 양으로 사용될 수 있다. 적합하게는, 적어도 하나의 등장성 작용제가 조성물에 포함된다.
계면활성제는 또한 제형화된 폴리펩타이드 또는 작제물의 응집을 감소시키고/거나, 제형 중 미립자의 형성을 최소화하고/거나, 흡착을 감소시키기 위해 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르(트윈), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(트리톤-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머, 플루로닉), 및 소듐 도데실 술페이트(SDS)를 포함한다. 적합한 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르의 예로는 폴리소르베이트 20, 및 폴리소르베이트 80이 있다. 계면활성제의 예시적인 농도는 약 0.001% w/v 내지 약 10% w/v의 범위일 수 있다.
동결건조 프로세스 동안 탈안정화 조건으로부터 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 보호하기 위해 동결건조보호제 또한 첨가될 수 있다. 예를 들어, 공지된 동결건조보호제로는 당(글루코스, 수크로스, 만노스 및 트레할로스 포함); 폴리올(만닛톨, 소르비톨 및 글리세롤 포함); 및 아미노산(알라닌, 글리신 및 글루탐산 포함)을 포함한다. 동결건조보호제는 약 10 mM 내지 500 mM의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 약학 조성물 또는 작제물의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 치료학적 효과를 발휘하는 투여량이다. 필요한 투여량 범위는 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 정확한 성질, 투여 경로, 제형의 성질, 환자의 연령, 환자의 병태의 성질, 정도 또는 중증도, 존재하는 경우, 사용 금지 사항, 및 주치의의 판단에 의존한다. 최적화를 위한 표준 실험상의 통상적 방법을 사용하여 상기 투여량 수준의 변동은 조정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 약학 조성물 또는 작제물의 적합한 1일 투여량은 50 ng-50 mg/kg(체중), 예컨대, 50 ug-40 mg/kg(체중), 예컨대, 5-30 mg/kg(체중) 범위이다. 단위 투여량은 100 mg 미만으로부터 달라질 수 있지만, 전형적으로는 1회 투약당 250-2,000 mg인 범위가 될 것이며, 이는 매일 또는 더욱 빈번하게, 예를 들어, 1일 2회, 3회 또는 4회, 또는 덜 빈번하게, 예를 들어, 2주마다, 또는 주당 1회, 2주일당 1회, 또는 월 1회로 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 자가면역 질환 치료용 의약 제조에서의 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 용도가 제공된다. 본 발명의 추가 측면에서, 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 사람에게 치료적 유효량의, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 자가면역 및/또는 염증성 질환 치료용 의약 제조에서의 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 용도가 제공된다. 본 발명의 추가 측면에서, 자가면역 및/또는 염증성 질환 치료를 필요로 하는 사람에게 치료적 유효량의, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물을 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 및/또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
'치료'라는 단어는 예방적인 것뿐만 아니라, 치료학적 치료를 포함하는 것으로 의도된다. 질환 치료는 또한 이의 악화를 치료하는 것을 포함하고, 이는 또한 질환 증상의 재발을 막기 위해 질환 증상으로부터 차도가 있도록 환자를 치료하는 것을 포함한다.
조합 요법
본 발명의 약학 조성물은 또한 하나 이상의 활성제(예를 들어, 본원에 언급된 질환 치료용으로 적합한 활성제)를 포함할 수 있다. 자가면역 질환 치료에서 일반적으로 사용되는 확립된 다른 요법에 대한 부가물로서, 또는 그와 함께 자가면역 질환 치료를 위한 치료 방법에서 본 발명의 약학 조성물을 사용하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다.
IBD(예컨대, 크론병 또는 궤양성 대장염) 치료를 위해, 가능한 조합은, 예를 들어, 5-아미노살리실산, 또는 이의 프로드럭(예컨대, 술파살라진, 올살라진 또는 비살라지드); 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 또는 부데소니드); 면역억제제(예를 들어, 시클로스포린, 타크로리무스, 메토트렉세이트, 아자티오프린 또는 6-메르캅토퓨린); 항-TNF-알파 항체(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 또는 골리무맙); 항-IL12/IL23 항체(예를 들어, 우스테키누맙); 항-IL6R 항체 또는 소분자 IL12/IL23 억제제(예를 들어, 아필리모드); 항-알파-4-베타-7 항체(예를 들어, 베돌리주맙); MAdCAM-1 차단제(예를 들어, PF-00547659); 세포 부착 분자 알파-4-인테그린에 대한 항체(예를 들어, 나탈리주맙); IL2 수용체 알파 서브유닛에 대한 항체(예를 들어, 다클리주맙 또는 바실릭시맙); JAK3 억제제(예를 들어, 토파시티닙 또는 R348); Syk 억제제 및 이의 전구약물(예를 들어, 포스타마티닙 및 R-406); 포스포디에스테라제-4 억제제(예를 들어, 테토밀라스트); HMPL-004; 프로바이오틱스; 데르살라진; 세마피모드/CPSI-2364; 및 단백질 키나제 C 억제제(예를 들어, AEB-071)를 포함하는 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제와의 조합을 포함한다. 가장 적합한 조합 작용제는 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 또는 골리무맙이다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 추가의 활성제, 예를 들어, 상술된 하나 이상의 활성제와 함께 조합된 본 발명의 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물은 상기 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성제와 순차적으로, 동시에 또는 별개로 투여된다.
유사하게, 본 발명의 또 다른 측면은
(A) 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물; 및
(B) 하나 이상의 다른 활성제를 포함하는 조합 생성물로서,
여기서, 성분 (A) 및 (B)가 각각 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합되어 제형화되는 것인 조합 생성물을 제공한다. 본 발명의 본 측면에서, 조합 생성물은 단일(조합) 제형 또는 부품들의 키트일수 있다. 따라서, 본 발명의 본 측면은 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합하여, 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물 및 또 다른 치료제를 포함하는 조합 제형을 포함한다.
본 발명은 또한 성분:
(i) 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합된 본 발명의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물; 및
(ii) 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합된 하나 이상의 다른 활성제를 포함하는 제형을 포함하고, 성분 (i) 및 (ii)는 각각 서로 함께 투여되는 데 적합한 형태로 제공되는 것인, 부품들의 키트도 포함한다.
따라서, 부품들의 키트의 성분 (i)은 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합되는 상기 성분(A)이다. 유사하게, 성분 (ii)는 약학적으로 허용되는 애주번트, 희석제 또는 담체와 함께 혼합되는 상기 성분(B)이다. 하나 이상의 다른 활성제(즉, 상기 성분 (B))는, 예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대, IBD (예를 들어, 크론병 및/또는 궤양성 대장염) 치료와 관련하여 상기 언급된 작용제들 중 임의의 것일 수 있다. 성분 (B)가 1개 초과의 추가 활성제일 경우, 이들 추가 활성제는 서로 제형화될 수 있거나, 또는 성분 (A)로 제형화될 수 있거나, 또는 별개로 제형화될 수 있다. 일 실시양태에서, 성분 (B)는 다른 한 치료제이다. 또 다른 실시양태에서, 성분 (B)는 2개의 다른 치료제이다. 본 발명의 본 측면의 조합 생성물(조합된 제형 또는 부품들의 키트)은 자가면역 질환(예컨대, 본원에서 언급된 자가면역 질환)의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다.
안정성
일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 경구적으로 전달된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 적합하게는 경구적으로 전달될 때 중화 능력 및/또는 역가를 상당히 보유한다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 경구적으로 전달되었을 때, 및 장관에 대한 노출 후(예를 들어, 소장 및/또는 대장의 프로테아제 및/또는 IBD 염증성 프로테아제에 대한 노출 후)에도 실질적으로는 중화 능력 및/또는 역가를 유지한다. 상기 프로테아제로는 엔테로펩티다제, 트립신, 키모트립신, 및 과민성 장 질환 염증성 프로테아제(예컨대, MMP3, MMP12 및 카텝신)를 포함한다. 소장 및/또는 대장의, 또는 소장 및/또는 대장에서 생산되는 프로테아제로는 장내 공생 미생물군 및/또는 병원성 박테리아로부터 공급되는 프로테아제, 예를 들어, 프로테아제가 세포 막에 부착되어 있는 프로테아제인 것인 프로테아제, 배출된 프로테아제 및 세포 용해 시 방출된 프로테아제를 포함한다. 가장 적합하게는, 프로테아제는 트립신 및 키모트립신이다.
적합하게는, 장관은 개, 돼지, 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 마우스의 장관이다. 더욱 적합하게는, 장관은 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 마우스, 가장 적합하게는, 인간의 장관이다. 소장은 적합하게는 십이지장, 공장 및 회장으로 이루어진다. 대장은 적합하게는 맹장, 결장, 직장 및 항문관으로 이루어진다. 위장관과 달리, 장관은 오직 소장 및 대장으로만 이루어진다. 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 장관의 프로테아제, 가장 적합하게는 인간 장관의 프로테아제에 대하여 실질적으로 내성이다.
구강, 인두 및 식도에서의 안정성
위장관에서 구강, 인두 및 식도는 위 전에 있다. 적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 경구적으로 전달될 때 구강, 인두 및 식도에 대한 노출 후(예를 들어, 구강, 인두 및 식도의 프로테아제에 대한 노출 후) 중화 능력 및/또는 역가를 실질적으로 유지한다. 구강, 인두 및 식도의 프로테아제는 공생 미생물 및/또는 병원성 세균으로부터 유래된 프로테아제를 포함하고, 예를 들어, 여기서 프로테아제는 세포막-부착 프로테아제, 배설된 프로테아제 및 세포 용해 시 방출되는 프로테아제이다.
적합하게는, 구강, 인두 및 식도는 개, 돼지, 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 마우스의 것이다. 더욱 적합하게는 구강, 인두 및 식도는 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 마우스, 가장 적합하게는 인간의 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 실질적으로 소장 및/또는 대장에 존재하는 프로테아제 및/또는 IBD 염증성 프로테아제에 대한 노출 후에도 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 원래의 중화 능력의 적합하게는 10% 이상, 더욱 적합하게는 20% 이상, 더욱 적합하게는 30% 이상, 더욱 적합하게는 40% 이상, 더욱 적합하게는 50% 이상, 더욱 적합하게는 60% 이상, 더욱 적합하게는 70% 이상, 더욱 적합하게는 80% 이상, 더욱 적합하게는 90% 이상, 더욱 적합하게는 95% 이상, 또는 가장 적합하게는 100%가 유지될 때, 중화 능력을 유지한다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은 실질적으로, 예를 들어, 37℃에서 최대 적어도 2시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 3시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 4시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 5시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 5.5시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 6시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 6.5시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 7시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 7.5시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 10시간, 더욱 적합하게는 최대 적어도 13시간, 또는 더욱 적합하게는 최대 적어도 16시간 동안 소장 및/또는 대장에 존재하는 프로테아제 및/또는 IBD 염증성 프로테아제에 대한 노출 후에도, 중화 능력을 유지한다.
장관, 더욱 적합하게는 소장 또는 대장 조건, 더욱 적합하게는 인간 대변 추출물에 대한 노출의 적어도 2시간, 더욱 적합하게는 적어도 3시간, 더욱 적합하게는 적어도 4시간, 더욱 적합하게는 적어도 5시간, 더욱 적합하게는 적어도 6시간, 더욱 적합하게는 적어도 7시간, 더욱 적합하게는 적어도 9시간, 더욱 적합하게는 적어도 11시간, 더욱 적합하게는 적어도 13시간, 또는 더욱 적합하게는 16시간 후에도, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 중화 능력의 적합하게는 10% 이상, 더욱 적합하게는 20% 이상, 더욱 적합하게는 30% 이상, 더욱 적합하게는 40% 이상, 더욱 적합하게는 50% 이상, 더욱 적합하게는 60% 이상, 더욱 적합하게는 70% 이상, 더욱 적합하게는 80% 이상, 더욱 적합하게는 90% 이상, 또는 더욱 적합하게는 95% 이상이 유지된다.
마우스 소장 상청액에 대한 노출의 적합하게는 적어도 1시간, 더욱 적합하게는 적어도 2 시간, 더욱 적합하게는 적어도 3 시간, 더욱 적합하게는 적어도 4 시간, 더욱 적합하게는 적어도 5시간 또는 더욱 적합하게는 적어도 6시간 후에, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 중화 능력의 적합하게는 10% 이상, 더욱 적합하게는 20% 이상, 더욱 적합하게는 30% 이상, 더욱 적합하게는 40% 이상, 더욱 적합하게는 50% 이상, 더욱 적합하게는 60% 이상, 더욱 적합하게는 70% 이상, 더욱 적합하게는 80% 이상, 더욱 적합하게는 90% 이상, 적합하게는 95% 이상이 유지된다.
투여 후 적어도 2 시간, 더욱 적합하게는 적어도 3 시간, 더욱 적합하게는 적어도 4 시간, 더욱 적합하게는 적어도 5 시간, 더욱 적합하게는 적어도 6 시간, 더욱 적합하게는 적어도 7 시간, 더욱 적합하게는 적어도 9 시간, 더욱 적합하게는 적어도 11 시간, 더욱 적합하게는 적어도 13 시간, 또는 더욱 적합하게는 적어도 16 시간 후 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 투여된 용량의 적합하게는 10% 이상, 더욱 적합하게는 20% 이상, 더욱 적합하게는 30% 이상, 더욱 적합하게는 40% 이상, 더욱 적합하게는 50% 이상, 더욱 적합하게는 60% 이상, 더욱 적합하게는 70% 이상이 IL-7 및/또는 L-TSLP에 대한 중화 능력을 유지하고, 마우스, 시노몰구스 원숭이 및/또는 인간의 대변(적합하게는, 배설된 대변 또는 장관으로부터 제거된 대변)에 그대로 남아 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물은, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물의 투여된 양의 적합하게는 10% 이상, 더욱 적합하게는 20% 이상, 더욱 적합하게는 30% 이상, 더욱 적합하게는 40% 이상, 더욱 적합하게는 50% 이상, 더욱 적합하게는 60% 이상, 더욱 적합하게는 70% 이상, 더욱 적합하게는 80% 이상, 더욱 적합하게는 90% 이상, 더욱 적합하게는 95% 이상, 더욱 적합하게는 99% 이상, 가장 적합하게는 100%가 소장 및/또는 대장에 존재하는 프로테아제 및/또는 IBD 염증성 프로테아제에 노출된 후에도 무손상 상태 그대로 남아 있을 때, 실질적으로 무손상 상태 그대로 남아 있는 것이다.
'안정성' 및 '생존율', 예컨대, '% 안정성' 및 '% 생존율'은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "중화 능력을 실질적으로 보유한다" 및 "실질적으로 내성이 있는"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 인간 대변 상청액 소화물에서 이들의 안정성에 기초하여 하기와 같이 열거된 ICVD 중 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진 폴리펩타이드가 제공된다:
V7R-2E9, ID-A59U, ID-A2U, ID-A9U, ID-A10U, ID-A11U, ID-A12U, ID-A14U, ID-A15U, ID-A16U, ID-A17U, ID-A18A, ID-A19U, ID-A20U, ID-A21U, ID-A24U, ID-A43U, ID-A25U, ID-A30U, ID-A31U, ID-A50U, ID-A33U, ID-A52U, ID-A34U, ID-A53U, ID-A35U, ID-A54U, ID-A36U, ID-A55U, ID-A37U, ID-A38U, ID-A57U, ID-A39U, ID-A40U, V7R-2F6, V7R-6C12, V7R-2B6, V7R-3B5, V7R-4F6, V7R-2E5, ID-A3U, ID-A4U, ID-A5U, ID-A6U, ID-A7U, ID-A8U, ID-A13U, ID-A23U, ID-A26U, ID-A27U, ID-A28U, ID-A29U 및 ID-A32U.
또한, 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하는 폴리펩타이드로서, CDR1이 임의의 상기 ICVD의 CDR1 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR2가 임의의 상기 ICVD의 CDR2 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR3가 임의의 상기 ICVD의 CDR3 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지는, 폴리펩타이드가 제공된다. 가장 적합하게는, 폴리펩타이드는 상기 하나의 단일 ICVD로부터 3개 모두의 CDR을 포함한다.
인간 대변 상청액 소화물에서의 이들의 안정성에 기초하여, 더욱 적합하게는 하기와 같이 열거된 ICVD 중 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진 폴리펩타이드가 제공된다:
V7R-2E9, ID-A59U, ID-A2U, ID-A9U, ID-A10U, ID-A11U, ID-A12U, ID-A14U, ID-A15U, ID-A16U, ID-A17U, ID-A18A, ID-A19U, ID-A20U, ID-A21U, ID-A24U, ID-A43U, ID-A25U, ID-A30U, ID-A31U, ID-A50U, ID-A33U, ID-A52U, ID-A34U, ID-A53U, ID-A35U, ID-A54U, ID-A36U, ID-A55U, ID-A37U, ID-A38U, ID-A57U, ID-A39U, ID-A40U, V7R-2F6, V7R-6C12, V7R-2B6, V7R-3B5, V7R-4F6 및 V7R-2E5.
또한, 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하는 폴리펩타이드로서, CDR1이 임의의 상기 ICVD의 CDR1 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR2가 임의의 상기 ICVD의 CDR2 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR3가 임의의 상기 ICVD의 CDR3 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지는, 폴리펩타이드가 제공된다. 가장 적합하게는, 폴리펩타이드는 상기 하나의 단일 ICVD로부터 3개 모두의 CDR을 포함한다.
인간 대변 상청액 소화물에서의 이들의 안정성에 기초하여, 더욱 적합하게는 하기와 같이 열거된 ICVD 중 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어진 폴리펩타이드가 제공된다:
V7R-2E9, ID-A59U, ID-A2U, ID-A9U, ID-A10U, ID-A11U, ID-A12U, ID-A14U, ID-A15U, ID-A16U, ID-A17U, ID-A18A, ID-A19U, ID-A20U, ID-A21U, ID-A24U, ID-A43U, ID-A25U, ID-A30U, ID-A31U, ID-A50U, ID-A33U, ID-A52U, ID-A34U, ID-A53U, ID-A35U, ID-A54U, ID-A36U, ID-A55U, ID-A37U, ID-A38U, ID-A57U, ID-A39U, ID-A40U.
또한, 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하는 폴리펩타이드로서, CDR1이 임의의 상기 ICVD의 CDR1 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR2가 임의의 상기 ICVD의 CDR2 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지고, CDR3가 임의의 상기 ICVD의 CDR3 서열을 포함하거나 더욱 적합하게는 이로 이루어지는, 폴리펩타이드가 제공된다. 가장 적합하게는, 폴리펩타이드는 상기 하나의 단일 ICVD로부터 3개 모두의 CDR을 포함한다.
제조 방법
본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook 2012 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 개시된 기법을 사용하여 수득되고, 조작될 수 있다.
단클론성 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체-생산 B 세포를, 조직 배양물 중에서 성장할 수 있는 이의 능력 및 항체 쇄 합성 부재에 대하여 선별된 골수종(B 세포 암) 세포와 융합시킴으로써 제조될 수 있다(K
Figure pct00012
hler and Milstein 1975 및 Nelson et al 2000).
결정된 항원에 대한 단클론성 항체는, 예를 들어,
a) 하이브리도마를 형성하기 위해, 앞서 결정된 항원으로 면역화된 동물의 말초 혈액으로부터 수득된 림프구를 불멸 세포 및 바람직하게는 골수종 세포로 무한증식시키고,
b) 형성된 무한증식된 세포(하이브리도마)를 배양하고, 원하는 특이성을 가지는 항체를 생산하는 세포를 회수함으로써 수득될 수 있다.
대안적으로, 하이브리도마 세포 사용이 요구되는 것은 아니다. 따라서, 단클론성 항체는
a) (적합하게는, 앞서 결정된 항원으로 면역화된) 동물의 림프구, 특히, 말초 혈액 림프구로부터 수득된 DNA 또는 cDNA 서열을 벡터로, 특히, 파지로, 및 더욱 특히, 사상성 박테리오파지로 클로닝하는 단계,
b) 원핵 세포를 항체 생산을 허용하는 조건 하에서 상기 벡터로 형질전환시키는 단계,
c) 이에 대하여 항원-친화성 선별을 수행하여 항체를 선별하는 단계,
d) 원하는 특이성을 가지는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
낙타과를 면역화하고, 혈중 순환 B 세포의 VHH 레퍼토리를 클로닝하고(Chomezynnski and Sacchi 1987), 파지, 효모, 또는 리보솜 디스플레이를 이용하여 면역(Arbabi-Ghahroudi et al 1997) 및 비면역(Tanha et al 2002) 라이브러리로부터 항원-특이적 VHH를 단리시키는 방법은 공지되어 있다(WO92/01047, Nguyen et al 2001 및 Harmsen et al 2007).
항체의 항원-결합 단편, 예컨대, scFv 및 Fv 단편을 단리시키고, 이. 콜라이에서 발현시킬 수 있다(Miethe et al 2013, Skerra et al 1988 및 Ward et al 1989).
폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대하여 침묵이지만, 특정 숙주에서의 번역에 바람직한 코돈을 제공하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 또는 cDNA로 돌연변이화시킬 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이 및 에스. 세레비시아에에서의 핵산 번역에 바람직한 코돈은 공지되어 있다.
폴리펩타이드의 돌연변이는, 예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실은, 예를 들어, 오류-유발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발, 어셈블리 PCR, PCR 돌연변이유발, 생체내 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 순환 앙상블 돌연변이유발, 지수적 앙상블 돌연변이유발, 부위-특이적 돌연변이유발((Ling et al 1997), 유전자 리어셈블리, 유전자 부위 포화 돌연변이유발(GSSM), 합성 라이게이션 리어셈블리(SLR) 또는 상기 방법의 조합을 비롯한, 다수의 방법에 의해 도입될 수 있다. 핵산에 대한 변형, 부가 또는 결실 또한 재조합, 순환 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발, 우라실-함유 주형 돌연변이유발, 갭이 있는 이중 돌연변이유발, 점 미스매치 수복 돌연변이유발, 수복-결핍 숙주 균주 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 방사성 돌연변이유발, 결실 돌연변이유발, 제한-선별 돌연변이유발, 제한-정제 돌연변이유발, 앙상블 돌연변이유발, 키메라 핵산 다량체 생성, 또는 이의 조합을 포함하는 다수의 방법에 의해 도입될 수 있다.
특히, 인공 유전자 합성이 사용될 수 있다(Nambiar et al 1984, Sakamar and Khorana 1988, Wells et al 1985 및 Grundstrom et al 1985). 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는, 예를 들어, 고체상 DNA 합성에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 전체 유전자는 전구체 주형 DNA를 필요로 하지 않으면서, 새로 합성될 수 있다. 원하는 올리고뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 빌딩 블록을 생성물 서열에 필요한 순서로 성장 올리고뉴클레오타이드 쇄에 순차적으로 커플링시킨다. 쇄 어셈블리 완료 시, 생성물을 고체상으로부터 용액으로 유리시키고, 탈보호화하고, 수집한다. 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리시켜 고순도의 원하는 올리고뉴클레오타이드를 수득할 수 있다(Verma and Eckstein 1998).
면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VH 및 VHH의 발현은 적합한 발현 벡터, 예컨대, 원핵 세포, 예컨대, 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이를 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, WO94/04678(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함되고, 하기에서 추가로 상세하게 설명된다)에 개시된 프로토콜에 따라). 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VH 및 VHH의 발현은 또한 진핵 세포, 예를 들어, 곤충 세포, CHO 세포, 베로(Vero) 세포 또는 적합하게는 효모 세포, 예컨대, 아스페르길루스 속, 사카로마이세스 속, 클루이베로마이세스 속, 한세눌라 속 또는 피치아 속에 속하는 효모를 사용하여 달성될 수 있다. 적합하게는, 에스. 세레비시아에가 사용된다(예를 들어, WO94/025591 (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함되고, 하기에서 추가로 상세하게 설명된다)에 개시된 프로토콜에 따라).
구체적으로, VHH는 이. 콜라이 세포를 사용하여 WO94/04678에 개시된 방법에 따라
a) 임의적으로 His-태그를 포함하는 (예를 들어, 낙타과의 림프구로부터 수득되거나, 또는 합성적으로 제조된) VHH에 대해 코딩하는 DNA 또는 cDNA 서열을 블루스크립트(Bluescript) 벡터(애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies))에 클로닝하는 단계,
b) XhoI 부위를 함유하는, VHH에 대하여 특이적인 5' 프라이머, 및
서열 TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG(서열번호 81)를 가지는 SpeI 부위를 포함하는 3' 프라이머를 사용하는 증폭 이후에 클로닝된 단편을 회수하는 단계,
c) 벡터를 XhoI 및 SpeI 제한 효소로 소화시킨 후, 상에서 회수된 단편을 면역 PBS 벡터(Huse et al 1989)에 클로닝시키는 단계,
d) 형질감염에 의해 숙주 세포, 특히, 이. 콜라이를 단계 c의 재조합 면역 PBS 벡터로 형질전환시키는 단계,
e) 예를 들어, 친화성 정제에 의해, 예컨대, VHH가 His-태그를 포함하는 경우, 단백질 A, 양이온 교환, 또는 니켈-친화성 수지를 이용하는 칼럼 상의 크로마토그래피에 의해 VHH 코딩 서열의 발현 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VH 및 VHH는
a) 결정된 특이적 항원-결합 부위를 가지는 VHH에 대하여 코딩하는 DNA 또는 cDNA 서열을 수득하는 단계,
b) 개시 코돈 및 HindIII 부위를 함유하는 5' 프라이머, 및 XhoI 부위를 가지는 종결 코돈을 함유하는 3' 프라이머를 사용하여, 수득된 DNA 또는 cDNA를 증폭시키는 단계,
c) 증폭된 DNA 또는 cDNA를 플라스미드 pMM984의 HindIII(2650번 위치) 및 XhoI(4067번 위치) 부위로 재조합하는 단계(Merchlinsky et al 1983),
d) 허용 세포 특히, NB-E 세포(Faisst et al 1995)를 재조합 플라스미드로 형질감염시키는 단계,
e) 수득된 생성물을 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능하다.
추가로, 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VHH 또는 VH는 문헌[Frenken et al 2000] 및 WO99/23221(그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 개시된 방법에 따라 이. 콜라이 또는 에스. 세레비시아에를 사용하여 하기와 같이 제조될 수 있다:
면역화된 라마로부터 혈액 샘플을 채취하고, 피콜(Ficoll)(수용액 중에서 쉽게 용해되는 중성, 고분지형, 고질량, 친수성 다당류 - 파마시아(Pharmacia)) 불연속 구배 원심분리를 통해 림프구 집단을 강화시키고, 산 구아니디니움 티오시아네이트 추출에 의해 전체 RNA를 단리시키고(Chomezynnski and Sacchi 1987), 제1 가닥 cDNA 합성(예를 들어, cDNA 키트, 예컨대, RPN 1266(애머샴(Amersham))을 사용하여)을 수행한 후, WO99/23221의 22쪽 및 23쪽에 상세하게 설명된 특이적 프라이머를 사용하여 VHH 및 VH 단편, 및 짧은 또는 긴 힌지 영역의 일부를 인코딩하는 DNA 단편을 증폭시킨다. PstI 및 HindIII 또는 BstEII를 이용하여 PCR 단편을 소화시켰을 때, 길이가 약 300 bp 내지 450 bp인 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제시키고, 각각 이. 콜라이 파지미드 벡터 pUR4536 또는 에피솜 에스. 세레비시아에 발현 벡터 pUR4548에 라이게이션시킨다. pUR4536은 pHEN으로부터 유도된 것이고(Hoogenboom et al 1991), 라마 VHH 및 VH 유전자의 클로닝을 허용하는 독특한 제한 부위 및 lacIq 유전자를 함유한다. pUR4548은 pSY1으로부터 유도된 것이다(Harmsen et al 1993). 상기 플라스미드로부터 leu2 유전자 중의 BstEII 부위를 PCR을 통해 제거하고, VH/VHH 유전자 단편의 클로닝을 촉진시키기 위해 SUC2 신호 서열과 종결인자 사이의 클로닝 부위를 대체한다. VH/VHH는 검출을 위해 C-말단에 c-myc 태그를 가진다. 1% 글루코스 및 100 mg L-1의 암피실린으로 보충된 150 ml의 2TY 배지를 함유하는 96 웰 마이크로타이터 플레이트로 개별 이. 콜라이 JM109 콜로니를 옮긴다. 밤새도록 성장시킨 후(37℃), 100 mg L-1의 암피실린 및 0.1 mM IPTG를 함유하는 2TY 배지 중에서 플레이트를 이중으로 복제한다. 추가로 또 밤새도록 인큐베이션시키고, 임의적으로 냉동 및 해동시킨 후, 세포를 원심분리하고, 펠릿화하고, 상청액을 ELISA에서 사용할 수 있다. 개별 에스. 세레비시아에 콜로니를 (필수 아미노산 및 염기로 보충된, 0.7% 효모 질소 염기, 2% 글루코스를 포함하는) 선별 최소 배지를 함유하는 시험관으로 옮기고, 30℃에서 48 h 동안 성장시킨다. 이어서, 배양물을 YPGal 배지(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤 및 5% 갈락토스를 포함하는) 중에서 10배 희석시킨다. 24 h 및 48 h 성장 후, 세포를 펠릿화하고, 배양물 상청액을 ELISA로 분석할 수 있다. 임의적으로 600 nm에서의 흡광도(OD600)를 측정한다.
추가로, 하기와 같은 절차를 사용하여 에스. 세레비시아에를 이용함으로써 면역글로불린쇄 가변 도메인, 예컨대, VH/VHH를 제조할 수 있다:
VH/VHH를 인코딩하는 자연적으로 발생된 DNA 서열을 단리시키거나, 또는 5'-UTR, 신호 서열, 종결 코돈을 포함하고, SacI 및 HindIII 부위가 측접된, VH/VHH를 인코딩하는 합성적으로 제조된 DNA 서열을 수득한다(상기 합성 서열은 상기 개략적으로 설명된 바와 같이 제조될 수 있거나, 또는 상업적 공급업체, 예컨대, 진아트(Geneart) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))로부터 주문할 수 있다.
하기와 같이, VH/VHH 유전자를 다중 카피 통합(MCI) 벡터 pUR8569 또는 pUR8542로 전달하기 위해 제한 부위를 사용한다. 37℃에서 밤새도록 25 ul의 VHH DNA(진아트 플라스미드 또는 MCI 벡터), 1 ul의 SacI, 1 ul의 HindIII, 3 ul의 이중 소화에 적합한 완충제, 예컨대, NEB 완충제 1(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))을 이용하여 임의적으로, SacI 및 HindIII가 있는 MCI 벡터 및 셔틀 벡터, 카세트 또는 다른 합성 유전자 작제물 내에 함유되어 있는, VHH를 인코딩하는 DNA 서열을 절단한다. 25 ul의 소화된, VHH를 인코딩하는 DNA 및 25 ul의 소화된 MCI 벡터를 1.5% 아가로스 겔 상에서 1×TAE 완충제와 함께 전개시킨 후, 예를 들어, QIA퀵 겔 엑스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 겔 추출을 수행한다. 소화된 MCI 벡터 및 소화된, VH/VHH를 인코딩하는 DNA의 라이게이션을 하기와 같이 설정한다: 100 ng의 벡터, 30 ng의 VHH 유전자, 1.5 ul의 10× 리가제 완충제, 1 ul의 T4 DNA 리가제, 및 ddH2O. 이어서, 16℃에서 밤새도록 라이게이션을 수행한다.
이어서, 이. 콜라이 세포를 형질전환시킨다. 화학 적격 XL-1 블루 세포의 경우, 200 ul의 열 적격 XL-1 블루 세포를 해동시키고, 약 30분 동안 얼음 상에서 5 ul 라이게이션 믹스를 첨가한 후, 42℃에서 90초 동안 열 충격을 가한다. 이어서, 2% 글루코스로 보충된 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 저염 배지 800 ul를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 세포를 회수한다. 루리아-베르타니 아가 및 암피실린(100 ug/ml) 플레이트 상에 세포를 플레이팅하고, 37℃에서 밤새도록 유지시킨다. 전기 적격 TG1 이. 콜라이 세포의 경우, 전기천공 큐베트를 이용한다. 전기천공 큐베트에서: 약 15분 동안 얼음 상에서 50 ul의 전기 적격 TG1 세포 및 1 ul의 라이게이션 믹스를 해동시킨다. 홀더에 큐베트를 놓고, 펄싱한다. 500 ul의 2TY 배지를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 세포를 회수한다. 암피실린(100 ug/ml) 및 2% 글루코스를 함유하는 루리아-베르타니 아가 플레이트 상에 100 ul의 세포를 플레이팅한다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 유지시킨다.
상기 상세하게 설명된 바와 같이, VH/VHH 유전자를 이. 콜라이로 클로닝한 후, 에스. 세레비시아에를 선형화된 MCI 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환을 수행하기 이전에, 일부 단계를 수행한다: (i) DNA는 소화에 의해 환형에서 선형으로 변경되어야 하거나, 그렇지 않으면, DNA는 효모 게놈 내로 통합될 수 없고, (ii) 소화된 DNA는 에탄올 침전에 의해 불순물 제거가 이루어져야 한다. 또한, 형질전환 프로세스 동안, 효모 세포는 반투과성으로 제조되고, 이로써, DNA가 막을 통과할 수 있다.
효모 형질전환을 위한 준비: 하기와 같이, VH/VHH 유전자를 발현하는 선별된 이. 콜라이 콜로니로부터 제조된 미디 프렙의 HpaI 소화를 수행한다. 20 ng의 미디-프렙, 5 ul의 HpaI, 10 ul의 적절한 완충제, 예컨대, NEB4 완충제(바이오랩스(BioLabs)), 및 ddH2O를 함유하는 100 ul 용액을 제조한다.
DNA를 실온에서 밤새도록 HpaI로 절단한다. 이어서, 에탄올 침전을 수행한다(그리고, 5 ul의 샘플을 HpaI 소화로부터 별개로 처리한다). 300 ul의 에탄올 100%를 95 ul의 HpaI 소화된 미디 프렙에 첨가하고, 와동시키고, 5분 동안 전속력으로 회전시킨다. 펠릿이 존재할 경우, 주의를 기울여 경사 분리하고, 100 ul의 에탄올 70%를 첨가한 후, 다시 5분 동안 전속력으로 회전시킨다. 샘플을 다시 경사 분리하고, 펠릿이 건조될 때까지 50-60℃에서 유지시킨다. 펠릿을 50 ul의 ddH2O 중에 재현탁시킨다. 5 ul의 HpaI 소화된 샘플 이외에도, 5 ul를 겔 상에서 전개시킨다.
효모 형질전환: YNBglu 플레이트를 준비한다. 10 g의 아가 + 425 ml의 물(멸균), 25 ml의 여과된 20× YNB(25 ml의 멸균 H2O 중 3.35g의 YNB(효모 질소 염기)) 및 50 ml의 멸균 20% 글루코스를 사용하고, 이를 페트리 디쉬에 붓는다. 마스터플레이트로부터 1개의 효모 콜로니를 채취하고, 30℃에서 밤새도록 3 ml의 YPD(효모 추출물 펩톤 덱스트로스) 중에서 성장시킨다. 다음날, 약 600 ml의 YPD를 제조하고, 이를 사용하여 3개의 플라스크를 275 ml, 225 ml 및 100 ml의 YPD로 충전시킨다. 27.5 ul의 효모 YPD 배양물을 제1 플라스크에 첨가하고, 온화하게 혼합한다. 제1 플라스크로부터 75 ml를 채취하고, 이를 제2 플라스크에 넣고, 온화하게 혼합한다. 제2 플라스크로부터 100 ml를 채취하고, 이를 제3 플라스크에 넣고, 온화하게 혼합한다. OD660가 1 내지 2에 도달할 때까지 성장시킨다. 상기 OD에 도달한 플라스크를 4개의 팔콘(Falcon) 튜브에 각각 ± 45 ml씩으로 나눈다. 2분 동안 4,200 rpm으로 회전시킨다. 상청액을 경사 분리한다. (튜브 개수를 4개에서 2개로 감소시키면서) 2개의 팔콘 튜브 중의 펠릿을 45 ml의 H2O로 용해시킨다. 2분 동안 4,200 rpm으로 회전시킨다. 펠릿을 45 ml의 H2O에 용해시킨다(2개의 튜브에서 1개로). 2분 동안 4,200 rpm으로 회전시킨다. 펠릿을 5 ml의 아세트산 리튬(LiAc)(100 mM) 중에 온화하게 용해시키고, 몇 초 동안 회전시킨다. 일부 LiAc는 주의를 기울여 경사 분리하되, 튜브 중 LiAc의 절반 이상은 그대로 유지시킨다. 세포를 와동시키고, 캐리어 DNA를 5분 동안 비등시키고, 빙수에서 빠르게 냉각시킨다. 240 ul의 PEG, 50 ul의 세포, 36 u의 LiAc(1 M), 25 ul의 캐리어 DNA, 45 ul의 에탄올 침전된 VH/VHH를 함유하는 15 ml 튜브에 첨가한다. 각 단계 후에는 온화하게 혼합한다(동일하되, 단, 오직 에탄올 침전된 VH/VHH만을 포함하지 않는 블랭크 샘플을 처리한다). 30℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 튜브를 3-4회에 걸쳐 온화하게 도립시킨 후, 42℃에서 20-25분 동안 열 충격을 가한다. 단시간 동안 최대 6,000 rpm으로 회전시킨다. 상청액을 온화하게 제거하고, 250 ul의 ddH2O를 첨가하고, 혼합한다. 플레이트가 건조될 때까지 YNBglu 플레이트 상에 그들 모두를 스트리킹하고, 30℃에서 4일 내지 5일 동안 성장시킨다. 마지막으로, 플레이트를 동일한 6개 파트로 나누어 YNBglu 플레이트를 준비하고, 파트 1부터 6으로 넘버링하고, 가장 큰 콜로니를 접종하고, 번호 1번으로 스트리킹한다. 다른 콜로니에 대해서도 큰 것부터 작은 것까지 1에서 6으로 반복 수행한다. 콜로니가 생성될 때까지 30℃에서 3일 내지 4일 동안 크게 성장시킨다. 탄소원으로서 글루코스를 사용하여 VH/VHH 클론을 성장시키고, 0.5% 갈락토스를 첨가하여 갈락토스-7-프로모터를 작동시킴으로써 VH/VHH 발현을 유도한다. 3 mL 소규모 배양을 수행하여 콜로니를 시험하고, VH 또는 VHH를 가장 잘 발현하는 것을 선별한다. 이어서, 상기 콜로니를 정제에 사용한다.
정제: 강한 음이온 수지(예컨대, 캅토 S(Capto S))를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 VH/VHH를 정제한다. 1일째, VH/VHH를 발현하는, 선별된 효모 콜로니를 5 ml의 YPD 배지(YP 배지 + 2% 글루코스) 중에 접종하고, 30℃에서 밤새도록 25 mL 실링된 멸균 튜브 중에서 세포를 성장시킨다(180 rpm으로 진탕시키면서). 2일째, 5 ml의 밤새도록 배양된 배양물을 50 mL의 새로 제조된 YS 배지 + 2% 글루코스 + 0.5% 갈락토스 중에서 희석시키고, 30℃에서 이틀 동안 밤새도록 250 ml 통기 배플형 플라스크에서 세포를 성장시킨다(180 rpm으로 진탕시키면서). 4일째, 20min 동안 4,200 rpm으로 원심분리기에서 세포를 원심분리시킨다. 강한 음이온 수지를 이용한 양이온 교환 정제 단계: 리간드를 함유하는 상청액의 pH를 3.5로 조정한다. 50 mL의 ddH2O를 이용하여 50 mL의 상청액당 0.75 ml의 수지(+/- 0.5mL의 슬러리)를 세척한 후, 결합 완충제로 3회에 걸쳐 세척한다. 세척된 수지를 상청액에 첨가하고, 현탁액을 진탕기 상에서 4℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨다. 2분 동안 500 g로 원심분리하여 수지 결합된 VH/VHH를 펠릿화하고, 이를 세척 완충제로 세척한다. 상청액을 경사 분리하고, 10 mL의 결합 완충제로 수지를 재현탁시킨다. 필터를 PD-10 칼럼에 놓고, 칼럼에 수지를 붓고, 잠시 동안 수지를 가라앉힌 후, 수지 위에 필터를 첨가한다. 결합 완충제 모두가 속으로 퍼질 때까지 기다린다. 6 × 0.5 ml의 용출 완충제를 이용하여 VH/VHH를 용출시킨다. 에펜도르프 튜브 중에 용출 분획을 수집한다. 나노드롭(Nanodrop)을 이용하여 6개의 용출된 분획의 단백질 농도를 측정한다. VHH를 함유하는 분획을 풀링하고, 상기 용액을 3,500 Da 컷오프 투석 막으로 옮겨 놓는다. 정제된 단백질 용액을 4℃에서 밤새도록 3 L PBS에 대하여 투석한다. 5일째, 정제된 단백질 용액을 4℃에서 추가로 2시간 동안 2 L의 새 PBS에 대하여 투석한다. 마지막으로, BCA에 의해 최종 농도를 산출한다.
비록 VH/VHH와 관련하여 논의되기는 하였지만, 상술된 기법은, 필요하다면, scFv, Fab, Fv 및 다른 항체 단편에 대해서도 또한 사용될 수 있다.
다중 항원-결합 단편(적합하게는, VH/VHH)은 문헌[Blattler et al 1985]에 기술된 바와 같이 아미노산 잔기를 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 화학적 가교 결합에 의해 융합될 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 단편은 DNA 수준으로 유전적으로 융합될 수 있고, 즉, 하나 이상의 항원-결합 단편을 포함하는 완전한 폴리펩타이드 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 작제물로 형성될 수 있다. 유전적 경로를 통해 다중 항원-결합 단편을 연결시키는 한 방법은 항원-결합 단편 코딩 서열을 직접 또는 펩타이드 링커를 통해 연결함으로써 이루어진다. 예를 들어, 제1 항원-결합 단편의 카르복시 말단 단부는 다음 항원-결합 단편의 아미노 말단 단부에 연결될 수 있다. 이러한 연결 모드는 트리-, 테트라- 등의 기능성 작제물의 구축을 위해 연장되어 항원-결합 단편을 연결할 수 있다. 다가(예컨대, 2가) VHH 폴리펩타이드 작제물을 제조하는 방법은 WO 96/34103(상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.
적합하게는, 본 발명의 폴리펩타이드(특히, 본 발명의 VHH)는 WO02/48382에 개시된 방법에 따라, 탄소원 중 50-100wt%는 에탄올인, 탄소원을 포함하는 배지 상에서의 진균 성장을 포함하는, 진균, 예컨대, 효모(예를 들어, 에스. 세레비시아에)에서 제조될 수 있다. 에스. 세레비시아에에서의 VHH 단편의 대규모 제조는 문헌[Thomassen et al 2002]에 기재되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 제조하는 방법으로서,
i) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 벡터, 예컨대, 플라스미드로 클로닝하는 단계,
ii) 본 발명의 폴리펩타이드 또는 작제물을 제조할 수 있는 세포, 예컨대, 박테리아 세포 또는 효모 세포를 폴리펩타이드 또는 작제물이 제조될 수 있도록 허용하는 조건 하에서 상기 벡터로 형질전환시키는 단계,
iii) 예컨대, 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드 또는 작제물을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 실시양태를 기술하는 조항들은 하기와 같다:
조항
1. IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는, 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 IL-7R에 대한 IL-7 결합을 억제할 수 있는, 폴리펩타이드.
3. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 IL-7R에 대한 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는, 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 IL-7R에 대한 IL-7 결합 및 IL-7R에 대한 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는, 폴리펩타이드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 IL-7Rα에 결합하는, 폴리펩타이드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하고, CDR1이 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR2가 서열번호 2와 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR3가 서열번호 3과 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
7. 제6항에 있어서, CDR1이 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR2가 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR3가 서열번호 3과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
8. 제7항에 있어서, CDR1이 서열번호 1 또는 서열번호 71을 포함하고; CDR2가 서열번호 2, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 또는 서열번호 76을 포함하고; CDR3가 서열번호 3, 서열번호 77 또는 서열번호 78을 포함하는, 폴리펩타이드.
9. 제8항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 8을 포함하는, 폴리펩타이드.
10 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 항체 또는 항체 단편인, 폴리펩타이드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 2 nM 이하의 EC50으로 IL-7R에 대한 IL-7 결합을 중화시키는, 폴리펩타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 인간 장관의 프로테아제에 실질적으로 내성인, 폴리펩타이드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
14. 제13항에 있어서, 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 폴리펩타이드가 경구 투여에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드.
본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
실시예
실시예 1: 면역화 및 파지 라이브러리 구축
2 마리의 라마를 각각 가용성 인간 재조합 IL-7Rα로 면역시켰다. 면역화 동안 상이한 시점에 두 라마 모두로부터 혈액을 수집하고, IL-7Rα에 대한 면역 반응의 생성을 모니터링하기 위해 IL-7Rα 결합 및 중화에 대하여 시험하였다. 분석은 단지 한 마리의 라마만이 우수한 항-IL-7Rα 항체 역가를 생성하였고, 반면에 다른 라마는 IL-7Rα 면역화에 반응할 수 없었다는 것을 보여 주었다. 면역화의 종료 시 반응성 라마로부터 수집된 백혈구로부터 단리된 RNA를 사용하여 12개의 개별 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하였다.
실시예 2: 인간 IL-7Rα-결합 활성을 가지는 파지에 대한 라이브러리 선별
라이브러리 선별 전략은 IL-7R에 대한 IL-7 결합을 방해하는 ICVD를 포함하여, IL-7Rα 서브유닛의 세포외 도메인에 존재하는 에피토프에 결합하는 ICVD를 단리하기 위해 개발되었다. IL-7Rα 결합 특징 및 높은 결합 친화도 및 장 프로테아제에 대한 내성을 포함하는 다른 바람직한 특성을 갖는 ICVD를 나타내는 파지의 선택적 농축을 위해 여러 방법을 이용하였다. 상이한 라이브러리 선별로부터의 용출액에 존재하는 파지를 사용하여 이. 콜라이를 감염시키고, 개별 콜로니를 마스터-플레이트로 고르고 증식시켜 클론 배양물을 생성하였다. 선별된 단클론성 ICVD를 함유하는 주변세포질 상청액을 1차 평가 연구에 사용하여 필요한 특성을 갖는 것들을 확인하였다.
스크리닝된 원래의 8개 마스터-플레이트로 고른 총 630개의 라이브러리-선별된 클론으로부터, 7개의 1차 클론의 최종 세트를 이. 콜라이에서의 생산 및 보다 상세한 평가 연구를 위해 정제된 ICVD 친화도에 대하여 선별하였다.
상기 단리된 7개의 1차 클론(V7R-2E5, V7R-2E9, V7R-2F6, V7R-6C12, V7R-2B6, V7R-3B5, 및 V7R-4F6)의 DNA 서열을 이. 콜라이에서의 생산을 위해 벡터 pMEK222(따라서, C-말단 FLAG 및 6xHis 태그 도입)에 재클로닝하고, 이어서 보다 상세한 평가 연구를 위해 친화도 정제를 수행하였다. FLAG 및 His 태그를 제외한 이들 ICVD의 폴리펩타이드 서열은 "폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열"이라는 표제의 섹션에서 상기 제공된 정렬에 나타나 있다. 임상 항-IL-7R 항체 mAb829(중쇄 및 경쇄를 함유하는 150 kDa 항체, 문헌[Ellis et al 2019]에 개시된 바와 같이 "GSK2618960"로도 알려짐)를 생산하고, 하기 다수의 실시예에서 비교예로서 사용하였다.
하기 실시예의 주요 목적은 IL-7R에 대한 IL-7 결합을 억제하는 능력과 소장 프로테아제에 의한 불활성화에 대한 어느 정도의 고유 내성을 갖는 ICVD 클론을 확인하는 것이었다.
실시예 3: 1차 클론의 역가 및 프로테아제 내성
역가
IL-7/IL-7R 중화 ELISA를 사용하여 7개의 1차 클론의 역가를 평가하였다.
C-말단 FLAG-6xHis 태그의 첨가 및 이. 콜라이에서의 발현을 위해 1차 클론을 파지미드로부터 pMEK222 플라스미드로 서브클로닝하였다. 이들 ICVD를 이. 콜라이 TG1으로부터 발현시키고, 6xHis 태그를 통해 정제시켰다.
클론의 7-점 희석 시리즈를 300nM에서 시작하여 3.2 희석 배수를 사용함으로써 1% BSA(2× 검정 농도에서)에서 제조하였다. mAb829 비교예 항체를 10nM 내지 0.088nM(2× 검정 농도)의 농도 범위로 ELISA에서 양성 대조군으로 사용하였다. 각각의 클론 희석에 대해 삼중에 충분한 부피를 제조한 반면, mAb829에 대해 2개의 삼중(2개 플레이트)에 충분한 부피를 제조하였다. 85 μL(또는 170 μL)의 각 ICVD(또는 mAb829) 희석액을 85 μL(또는 170 μL)의 10ng/mL IL-7(2× 검정 농도)과 혼합하였다. 85 μL의 IL-7을 각 플레이트에서 IL-7(1×) 완전 결합 신호를 갖도록 85 μL의 블록 완충제와 혼합하였다. 블록 완충제 단독을 또한 블랭크로서 각 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 비오틴화된 항-hIL-7, 및 이어서 엑스트라비딘-HRP를 사용하여 결합된 IL-7을 측정하였다. TMB 반응을 30 분 후에 중단시켰다.
곡선을 핏팅하고 EC50을 생성하기 위해 ELISA 신호 블랭크 보정 A450 데이터 및 '로그(억제제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)'를 사용하여 그래프드 프리즘(Graphpad prism)에서 EC50 값을 생성하였다. 이들 값은 하기 표 1에 나타나 있다. 모든 ICVD는 hIL-7R에 대한 hIL-7의 결합을 억제하는 데 있어서 비교예 mAb829만큼 효과적인 것으로 나타났으며, 이들 대부분은 mAb829보다 약간 더 강력하였다.
프로테아제 내성
7개의 정제된 ICVD를 마우스 소장 상청액("마우스 SI") 및 풀링된 인간 대변 샘플로부터 제조된 상청액("HFP")의 존재 하에 인큐베이션하였다.
모든 ICVD의 스톡 희석액을 250 μg/mL(30 μL 최종 부피)에서 1% BSA를 함유하는 1× PBS에서 제조하였다. 이어서, 60 μL의 최종 부피로 PCR 스트립에서 각 ICVD에 대해 소화 혼합 반응을 제조하였고, ICVD는 최종 농도가 최종 농도가 20 μg/mL였다(250 μg/mL에서 55.2 μL의 소화 기질 + 4.8 μL의 ICVD). 4.8 μL의 1× PBS를 대신에 비-ICVD 대조군에 사용하였다. 후속적으로, 25 μL의 각 소화 반응을 (i) 저온 정지 완충제(이들은 T = 0 시점으로 사용됨)를 함유하는 새로운 PCR 튜브로 옮기고, -80℃에서 냉동시키고; (ii) 새로운 빈 PCR 튜브에 넣고, 37℃에서 소화를 위해 PCR 열순환기에 인큐베이션하였다(소화된 및 비-ICVD 대조군 샘플). 마우스 SI에서 소화된 샘플을 2h 후에 열순환기에서 꺼내고, HFP에서 소화된 샘플을 4h 후 꺼냈다. 25 μL의 저온 정지 완충제로 샘플을 즉시 정지시키고, 분석될 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.
소화된 샘플을 1.8(소화된 샘플의 경우) 또는 2.1(비-소화된 샘플의 경우) 희석 배수를 이용하여 1:100의 최종 시작 희석에서 후속적인 6회의 연속 희석으로 상기 '역가' 하에 상세히 기술된 ELISA에서 시험하고, 각 플레이트에서 삼중 웰로 검정하였다. 비소화된 샘플(0h)은 이론적으로 이들 샘플에서 프로테아제 분해가 일어나지 않을 것이기 때문에(이들은 얼음에서 처리되고 정지 완충제가 소화 매트릭스의 첨가 직후 첨가되므로) 표준 곡선으로 간주된다.
'소화된' 샘플에서 소화가 발생하면 곡선이 왼쪽으로 이동할 것으로 예상된다(T = 0h와 비교). 이동이 클수록 ICVD가 더 불안정해진다. "% 생존율"은 소화 후 유지되는 활성 수준을 나타낸다.
모든 클론은 둘 모두의 매트릭스에서 단백질 분해에 대한 높은 수준의 내성을 보였고, V7R-2E9는 최대 4시간 동안 인간 대변 풀 소화에 대한 완전한 내성을 나타내어 가장 큰 프로테아제-내성 ICVD로 확인되었다.
이들 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1
Figure pct00013
이들 본 발명의 폴리펩타이드 모두는 소화 매트릭스에서 놀랍게 높은 역가 및 생존율을 입증하였다. 이들 ICVD는 분명하게 관련되어 있지만, 이들 폴리펩타이드의 CDR 및 프레임워크는 다수의 잔기가 서로 상이하다는 것이 주지될 수 있다(상기의 "폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열" 하에 제공된 정렬 참조).
실시예 4: V7R-2E9 및 비교예 mAb829에서 수행된 추가 역가 검정
IL-7/IL-7R 중화 ELISA
실시예 3 하에 상술된 IL-7/IL-7R 중화 ELISA를 V7R-2E9 및 임상 항-IL-7R 비교예 항체, mAb829에 대하여 다시 수행하였다. 결과는 하기 표 2에 주어져 있다.
TSLP/TSLPR/IL-7R ELISA
IL-7Rα에 결합하는 L-TSLP/TSLP-R 복합체를 중화시키는 V7R-2E9의 능력을 시험하였다. 96-웰 플레이트를 0.25 μg/mL의 재조합 인간 IL-7Rα-His6-Fc + 5 μg/mL의 BSA로 코팅한 후, 차단하였다. V7R-2E9를 연속 희석하고, 재조합 인간 L-TSLP(15 ng/mL의 최종 농도) 및 인간 TSLP-R(20 ng/mL의 최종 농도)과 1:1:1 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 IL-7Rα 코팅된 플레이트에 첨가하기 전에 결합하도록 30분 동안 인큐베이션하였다. 2 시간 인큐베이션 후, 결합된 L-TSLP를 50 μL/웰 0.3 μg/mL의 비오티닐화된 토끼 항-hTSLP 항체 및 이어서 50 μL/웰 1/2000의 엑스트라비딘-HRP으로 검출하고, ICVD에 의해 IL-7Rα에 대한 L-TSLP/TSLP-R 복합체 결합의 중화 수준을 그래프패드 프리즘을 이용하여 결정하였다. 결과는 하기 표 2에 주어져 있다.
hPBMC에서의 IL-7 유도성 pSTAT5
IL-7Rα에 대한 IL-7 결합을 억제하고 STAT5 인산화를 저해하는 V7R-2E9의 능력을 인간 림프구에서 시험관내로 시험하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 IL-7R 신호전달을 통한 세포내 STAT5 인산화의 자극에 의해 외인성 IL-7에 반응하지만, 이러한 반응은 IL-7/IL-7R 결합을 방지하는 IL-7Rα-특이적 ICVD에 의해 부정될 수 있다.
림프구 풍부 집단을 인간 연막으부터 단리하고, 액체 질소 중 90% FBS 10% DMSO에 저장하였다. 완전 RPMI-1640에서 회수를 위해 세포를 해동하고 정치시켰다. 회수 후, 세포를 100 μl의 2.5×105 개 세포/웰로 둥근-바닥 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, FBS가 없는 완전 RPMI에서 1h 동안 기아 상태로 두었다. 기아상태 후, 요망되는 ICVD 농도를 각 웰(50 μL/웰)에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15min 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 50 μL/웰의 IL-7을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃ 5% CO2에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. 얼음 위에서 플레이트를 신속하게 냉각시킴으로써 반응을 정지시킨 후 원심분리 및 상청액 제거를 수행하였다. 이어서 세포를 고정, 투과화 및 pSTAT5 세포내 염색으로 처리하였다. 세포를 100 μL/웰의 Cytofix/Cytoperm 용액(BD Bioscience #554722)과 얼음 위에서 20min 동안 인큐베이션하고, 150 μl/웰의 1× Perm/Wash 완충제(BD Bioscience #554723)로 2회 세척하고, 200 μL/웰의 Perm 완충제 III(BD Bioscience #558050)와 30min 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 150 μL/웰의 1× PBS 2% BSA(FACS 완충제)로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 25 μL/웰의 pSTAT5 항체([47/Stat5(pY694)](A488)(BD Bioscience #612598)) 또는 이소타입 대조군 마우스 IgG1([B11/6](FITC)(Abcam #ab91356))로 1h 동안 실온에서 염색하였다. 150 μL/웰의 FACS 완충제를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 1 회 세척/원심분리 단계 후, 세포를 최종적으로 200 μL/웰의 FACS 완충제로 재현탁시키고, CytoFlex 유세포 분석기(Beckman Coulter)에서 데이터를 획득하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
인간 단핵구에서의 TSLP-유도성 TARC 분비
V7R-2E9를 또한 상세히 기술된 인간 단핵구 세포 검정에서 IL-7R 중화 활성을 확인하기 위해 시험하였다. 인간 단핵구는 세포 표면 IL-7R과의 TSLP/TSLP-R 결합의 결과로서 TSLP로의 자극 후 배양 배지에서 TARC 분비 반응을 나타낸다. IL-7R에 대한 TSLP/TSLP-R 결합을 억제하고 TARC 분비를 저해하는 항-IL-7Rα ICVD의 능력을 인간 단핵구에서 시험관내로 시험하였다.
단핵구를 인간 연막으로부터 단리하고, 완전 RPMI에 1×105 개 세포를 함유하는 100 μl/웰의 평저형 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 단핵구 순도를 증가시키기 위해, 플레이팅된 세포를 37℃ 5% CO2에서 2h 동안 정치시킨 다음, 비-부착성 세포를 각 웰에서 배지를 흡인한 다음 따뜻한 cRPMI로 조심스럽게 2회 세척함으로써 제거하였다. 세포를 37℃ 5% CO2(완전 RPMI로 희석, 100 μL/웰의 최종 부피)에서 TSLP의 존재 하에 요망되는 농도의 ICVD와 함께 24h 동안 인큐베이션하였다. 24h 인큐베이션 후, 75 μL의 상청액/웰을 수집하고, 분비된 TARC의 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.
항-IL-7Rα 작용제에 의한 인간 TSLP의 중화 수준을 시험하였다. 96-웰 플레이트를 50 μL/웰 항 인간 TARC 항체로 코팅한 다음 차단하였다. 인간 TARC 표준물을 검정 희석액에서 연속 희석한 다음, 50 μL/웰의 회수된 배양 상청액과 함께 50 μL/웰의 표준물을 항-TARC 코팅 플레이트에 첨가하였다. 결합된 인간 TARC를 비오틴화된 항-인간 TARC 다클론성 항체 및 이후 아비딘-HRP로 검출하였다. 작용제에 의한 인간 TSLP의 중화 수준을 결정하였다. 결과는 하기 표 2에 나타나 있다.
표 2
Figure pct00014
요약하면, V7R-2E9는 ELISA와 세포 검정 둘 모두에서 비교예 임상 항-IL-7R 항체 mAb829와 유사한 역가로 IL-7R에 대한 IL-7 및 L-TSLP 결합을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 5: 에피토프 모델링
V7R-2E9에 대한 모델 구조 및 에피토프를 인실리코로 확립하였다. 이 모델은 주형으로서 단백질 데이터 뱅크(PDB) '4ybq' 파일을 사용하여 개발되었다. 4ybq는 랫트 GLUT5 촉진된 글루코스 수송체 구성원 5에 결합된 FV의 중쇄이다. 4ybq 주형은 특히 CDR3 루프 길이 및 예상되는 입체형태의 관점에서 V7R-2E9와 유사하다. PDB 항목 '3di3'은 IL-7Rα에 결합된 IL-7의 고분해능 구조이다. IL-7은 예측된 V7R-2E9 구조로 도킹하기 위한 표적 수용체를 제공하기 위해 이러한 구조로부터 간단히 삭제되었다.
사용되는 HEX 8.0 도킹 방법이 각 도메인의 표면에 국부화된 방식으로 작동함에 따라, 다수의 표적 영역을 IL-7Rα 구조에 걸쳐 선택하고 병렬로 실행하였다. V7R-2E9에 대한 최상의 솔루션은 46개 솔루션의 클러스터를 대표하는 것으로, 에너지 최소화 후 -894(DARS 힘의 장)의 매우 높은 에너지 점수를 가졌고, '범프(bump)'(허용되지 않을 정도로 가까운 원자 위치)가 없었다. 도 3은 IL-7Rα 표적에 도킹된 V7R-2E9의 위치에 대한 리본 개략도를 보여주는 것이다. V7R-2E9는 N- 및 C-말단 도메인 사이의 계면에 위치한다.
표 3은 V7R-2E9를 접촉하는 IL-7Rα의 에피토프 잔기를 나열한 것이다. 계면에 특히 중요한 영역이 파묻힌 잔기는 굵게 강조되어 있다(서열번호 65 참조).
표 3
Figure pct00015
실시예 6: 면역원성을 감소시키기 위한 최적화
V7R-2E9의 아미노산 서열을 인간 VH3 생식계열 항체 서열로 정렬하고, 잠재적인 인간화 변화를 확인하였다. 프레임워크 2의 말단/CDR2의 시작부에서 18개의 단일 돌연변이 및 2개의 변화 조합의 선택을 V7R-2E9 모 ICVD 서열, 및 이. 콜라이로부터 생성된 돌연변이체로 도입하였다. 먼저 ICVD를 IL-7/IL-7R 중화 ELISA에서 역가에 대하여 시험하였다. 클론은 V7R-2E9와 유사하거나 더 큰 IL-7R 중화 활성을 나타냈는데, 이는 모 ICVD로 도입된 어떠한 돌연변이도 항원 결합에 해로운 영향을 미치지 않았다는 것을 지시한다. 이후 모든 클론을 인간 대변 상청액 물질에서 16시간 동안 소화시켜 이들의 상대 생존율을 측정하였다(표 4).
표 4
Figure pct00016
IL-7/IL-7Rα-His6-Fc ELISA에서 높은 역가를 보유하고 인간 대변 풀에 대해 유사한 내성을 유지한 돌연변이를 이후 조합하여 19개의 인간화 ICVD를 생성하였다(표 5).
표 5
Figure pct00017
이들 19개의 인간화 ICVD 중에서, 표 6은 인간 대변과 마우스 소장 프로테아제 둘 모두에 대한 역가 및 내성을 유지한 가장 유리한 인간화 ICVD를 요약한 것이다.
표 6
Figure pct00018
특히 주목할 만한 ICVD는 E1D(고리형 N-말단 글루타메이트를 갖는 생성물을 생성할 가능성을 피하기 위한 효모 발현용) 및 인간화 돌연변이 R45L, Q65K, K87R 및 S88A를 포함하는 ID-A62U였다. 특히 주목할 만한 또 다른 ICVD는 E1D, Q65K, K87R 및 S88A를 포함하는 ID-A59U였다. ID-A59U는 5.1의 pI 및 12.966 kDa의 분자량을 가졌다(pI 및 분자량은 CLC 서열 뷰어를 사용하여 계산됨).
실시예 7: 인간화된 V7R-2E9 변이체에 대해 수행된 역가 검정
ID-A40U의 억제 역가 및 효능(최대 억제)(이. 콜라이에서 생산됨)을 인간 PBMC에서 IL-7/IL-7R 중화 ELISA 및 IL-7 유도성 STAT5 인산화 검정에서 시험관내로 확인하였다. 곡선을 핏팅하고 EC50을 생성하기 위해 ELISA 신호 블랭크 보정 A450 데이터 및 '로그(억제제) 대 반응 -- 가변 기울기(4개의 매개변수)'를 사용하여 그래프드 프리즘에서 EC50 값을 생성하였다.
결과는 표 7a에 비교예와 함께 나타나 있다.
표 7a
Figure pct00019
별도의 실험에서, 이들 동일한 검정을 비교예들과 함께 ID-A62U(에스. 세레비시아에에서 생산됨)에 대하여 수행하였다. 결과는 표 7b 및 도 4에 나타나 있다.
표 7b
Figure pct00020
IL-7Rα에 대한 L-TSLP/TSLP-R 복합체 결합을 중화시키는 ID-A62U의 능력을 mAb829와 함께 실시예 4 하에 상술된 방식으로 시험하였다. 결과는 하기 표 7c에 나타나 있다. (플레이트에서 고수준의 배경을 극복하기 위해) 시험된 항체의 최고 농도로 정규화된 그래프화 전에 데이터 세트에 대해 감법을 수행하였다.
표 7c
Figure pct00021
요약하면, ID-A62U 및 ID-A40U는 비교예 임상 항-IL-7R 항체 mAb829에 필적 가능하거나 이보다 큰 역가를 갖는 것으로 입증되었다.
실시예 8: ICVD - IL-7R 결합 친화도의 Biacore 추정
ID-A40U의 결합 동역학을 Biacore 연구에서 mAb829 임상 항체에 대하여 비교하였다. IL-7Rα-His6-Fc를 Biacore 센서 플레이트에 직접 코팅하거나(mAb829 분석용) 항-인간 IgG Fc에 의해 포획하고(ICVD 분석용), ICVD/Ab를 플레이트 위로 흘려보내 결합을 검출하였다. ID-A40U는 7.8×10-11 M의 친화도(KD)을 가졌고, mAb829는 5.67×10-10 M의 약간 더 낮은 친화도(KD)를 가졌다. 결과는 ID-A40U가 항원에 대한 강한 결합을 나타낸다는 것을 지시한다.
실시예 9: 독성 종으로부터 IL-7Rα와의 교차-반응성
독성학적 종으로부터 IL-7Rα에 결합하는 ID-A40U, ID-A59U 및 ID-A62U의 교차-반응성을 조사하였다.
96-웰 플레이트를 0.5 μg/mL의 재조합 인간 IL-7Rα His6-Fc + 5 μg/mL의 BSA로 코팅한 후 차단하였다. 0.5nM의 ICVD를 1% BSA에 연속 희석된 선택된 시험 화합물과 1:1 혼합한 후, 30 분 동안 인큐베이션하여 IL-7Rα 코팅 플레이트에 첨가하기 전에 결합되게 하였다. 2 시간 인큐베이션 후, 결합된 ICVD를 50 uL/웰의 1/20000 항-FLAG-HRP 염소 항체(GeneTex, GTX21238)로 검출하고, 시험 화합물에 의해 결합하는 ICVD-IL-7Rα의 중화 수준을 결정하였다.
이러한 검정에서 뮤린 IL-7Rα는 ICVD/IL-7Rα 결합을 방해하지 않은 것으로 밝혀졌는데, 이는 마우스 또는 랫트가 독성 연구에 적합하지 않은 종일 것임을 지시한다. 그러나, 시노몰구스 원숭이 IL-7Rα는 인간 IL-7Rα에 대한 이들 ICVD 결합을 방해하여(도 5 및 도 6), 시노몰구스 원숭이를 이들 ICVD 및 관련 ICVD에 적합한 독성 종으로 만들었다.
실시예 10: 비-표적 시토카인에 대한 특이성
실질적으로 실시예 9 하에 상술된 방식으로 인간 IL-7Rα와 관련된 단백질에 대한 선택성에 대하여 ID-A40U를 시험하였다. 인간 IL-12Rβ1 및 인간 IL-12Rβ2는 IL-7Rα와 각각 29% 및 30%의 서열 동일성으로, NCBI BLASTp 툴을 사용하여 확인된 IL-7Rα와 가장 밀접하게 관련된 인간 단백질인 것으로 밝혀졌다. 경쟁 IL-7R 결합 ELISA 검정에서, hIL-12Rβ1 및 IL-7R 패밀리(IL-2R, IL-21R, 및 IL-9R) 내 선택된 수용체 또는 비관련 수용체(TNFR-2 및 IL-6R)를 플레이트 상에 고정된 인간 IL-7Rα에 대한 ID-A40U의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 인간 IL-12Rβ1, IL-2R, IL-21R, IL-9R, TNFR-2, 또는 IL-6R 어느 것도 IL-7Rα에 대한 ID-A40U 결합을 방해하지 않았지만, 증가량의 인간 IL-7Rα의 첨가는 용량-의존적 곡선을 생성하였다(도 7). 이는 표적 외 분자에 대한 ID-A40U ICVD의 결합이 인간에서 매우 드물다는 것을 지시하였다.
실시예 11: 위장 추출물에 대한 내성
장 상청액에서의 생체외 인큐베이션은 시노몰구스 원숭이 및 인간의 장관에서 ICVD의 안정성을 예측할 수 있다. 주요 소장 프로테아제, 트립신 및 키모트립신의 활성은 포유류 종에 걸쳐 보존되는 반면, 대장에 존재하는 프로테아제는 숙주 종-특이적 장내 미생물상에 의해 생성될 가능성이 있다. 이들 두 환경을 반영하는 시험 매트릭스를 생성하기 위해, 풀링된 마우스 소장 상청액 및 풀링된 대변 상청액을 준비하였다. 이들 두 매트릭스 모두는 선별되지 않은 비조작된 ICVD에 대해 매우 소화력이 있었다.
ICVD ID-38F는 이들 매트릭스에서 높은 안정성을 가지며(WO2016/156465 참조), 이러한 특성은 ID-38F에 대하여 장을 통한 이동 동안 높은 안정성으로 예측되었다는 것이 이전에 밝혀진 바 있다.
V7R-2E9, ID-A24U 및 ID-A40U를 뮤린과 인간 공급원 둘 모두로부터의 위장 추출물에서 이들의 생존에 대하여 시험하였다. ICVD를 마우스 소장 상청액과 함께 37℃에서 6 시간 동안, 그리고 인간 대변 상청액과 함께 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 생존율을 IL-7/IL-7R 중화 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 작제물은 시험된 모든 소화 매트릭스에서 우수한 생존을 나타냈다(도 8, 여기서 "SI" = 마우스 소장액 및 "HF" = 인간 대변 상청액). ID-A40U는 효모-생산 ID-A59U와 동일한 기능적 돌연변이를 함유하였다.
별도의 실험에서, ID-A62U를 ID-A41U(불안정한 비교예 ICVD)와 함께 동일한 인간 대변 상청액 검정에서 생존율에 대하여 시험하였다. ID-A62U는 ID-A41U의 경우 약 40%의 생존율에 비해 약 100%의 생존율을 나타냈다(도 9).
이들은 연장된 인큐베이션 기간을 수반하는 엄격한 시험이었다. 따라서, 임의의 이들 ICVD는 위장 환경에서 매우 잘 생존할 것으로 예상된다.
실시예 12: 위장 매트릭스 메탈로프로테아제에 대한 내성
활성화된 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 수준은 대장 질환 환자의 염증이 있는 점막에서 증가된다. 이들 MMP는 네이티브 인간 IgG 및 인간 IgG 스캐폴드를 함유하는 치료제를 소화할 수 있다(Biancheri et al 2015). 항-TNFα 요법 에타너셉트의 경우, 이러한 소화는 TNFα 중화 역가의 유의한 감소를 야기한다. ID-A40U가 MMP에 대해 내성이라는 것을 확인하기 위해, 인간 MMP3, MMP12 또는 TCNB 완충제의 존재 하에 37℃에서 22 시간 동안 인큐베이션한 후 웨스턴 블롯팅에 의해 mAb829 및 Enbrel과 함께 ID-A40U를 검출하였다. Enbrel 및 mAb829를 감마-쇄에 특이적인 퍼옥시다제-접합 항-인간 IgG에 의해 검출하였다. ID-A40U 및 TCNB 완충제-단독 대조군을 pAb 1219 일차 토끼 α-ICVD 및 2차 HRP-접합 pAb 돼지α토끼로 검출하였다.
인큐베이션 후, ID-A40U는, 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하는 경우, 예상되는 전장 ICVD에 상응하는 분자량을 갖는 밴드를 보여주어(소화 동안 절단된 Flag-His6 태그가 결여됨), MMP에 의해 소화되지 않았다(도 10). 그러나, 동일한 인큐베이션 시간 후, MMP3 및 MMP12는 전장 에타너셉트 및 mAb829를 더 작은 단편으로 소화시켰다. MMP 인큐베이션 후 ID-A40U는 IL7/IL-7R 기능성 ELISA를 사용하여 측정하는 경우 IL-7R을 중화시키는 데 완전히 강력한 것으로 나타났다. 도 10에서 'F/H'는 FLAG/His 태그의 존재를 의미한다.
실시예 13: 마우스 위장관에서의 이동 및 생존
상술된 시험관내 연구의 결과는 최적화된 V7R-2E9-유도체가 마우스 소장 내용물로부터 제조된 상청액 추출물에 존재하는 프로테아제에 의한 불활성화에 내성이었다는 것을 보여주었다. 마우스의 위장계를 통과하는 동안 ID-A24U 및 ID-A40U의 안정성을 조사하기 위해 후속 연구를 수행하였다.
ID-A24U와 ID-A40U 둘 모두를 유액과 바이카보네이트 혼합물에서 ID-38F(항-TNFα ICVD, WO2016/156465 참조)와 함께 제형화하여 저 pH에서의 변성 및 위에서 펩신에 의한 소화에 대항하여 보호하였다. 마우스에 경구 위관영양에 의해 ICVD를 투여한 후, 투여 후 6 시간에 위, 소장, 맹장 및 결장에서 ICVD의 농도를 결정하였다. 또한, 시 간격으로 수집된 대변 펠렛의 ICVD 농도를 측정하였다.
ID-A24U 및 ID-A40U를 모든 마우스로부터 투여 후 4h 내지 6h 사이에 수집된 대변에서 측정하고, ID-A40U는 2 마리의 마우스로부터 3h 시점에서도 측정하였다(도 11). 대신, ID-A24U는 처음 3시간 동안 마우스 6(M6)으로부터 수집된 대변에서 측정하였는데, 이는 이러한 마우스에서의 이동이 다른 마우스에 비해 특히 빨랐다는 것을 지시하였다.
이들 결과는 ID-A24U와 ID-A40U 둘 모두가 마우스 GI 관을 통한 이동에 생존할 수 있다는 것을 시사한다. 전반적으로, ID-A24U 및 ID-A40U의 이동 시간은 각 그룹(M6 및 M12) 내에서 1 마리의 마우스를 제외하고는 매우 유사해 보였다. 도태 시점(6h)에 대부분의 ID-A24U 및 ID-A40U는 모든 마우스의 맹장(CAE) 및 결장(COL)에 존재했으며, 위(STO) 및 소장(SI)에서 여전히 상당히 다량이 측정되었다. 슬러리 제조에 사용된 희석 배수를 고려하여 계산된 농도에 기초할 때, 도태 시점에 ID-A24U 및 ID-A40U의 예상 농도는 대변에서 각각 22.7 μM 내지 140 μM 및 12 μM 내지 22.5 μM였다(도 11). 맹장과 결장에서 ID-A24U의 예상 농도는 각각 2.9 μM 내지 8 μM 및 9.7 μM 내지 16.5 μM이었다. 맹장과 결장에서 ID-A40U의 예상 농도는 각각 0.9 μM 내지 1.2 μM 및 0.8 μM 내지 6.2 μM이었다(도 12).
본 연구에서 대조군으로 사용된 ID-38F는 이전에 관찰된 바와 같이 모든 대변 및 하부 GIT 샘플에서 고수준으로 측정되었다. 6h 시점에 ID-38F의 예상 농도는 맹장에서 0.04 μM 내지 2.1 μM, 결장에서 0.33 μM 내지 5.1 μM, 및 대변에서 4.9 μM 내지 48 μM으로 6마리 마우스에서 다양했다. 반복 실험을 ID-A40U 및 ID-38F에서 수행하였다. 유사한 결과가 얻어졌다(도 13 및 도 14).
전반적으로, 이들 결과는 ID-A24U 및 ID-A40U가 고농도의 활성 ICVD를 맹장 및 결장에 전달하는 마우스를 통해 이동 시 ID-38F와 유사하게 잘 생존한다는 것을 지시한다. 이는 시험관내에서 앞서 관찰된 이들 장 구획에서 각 ICVD의 상대적 안정성을 반영하는 것으로 짐작된다. ID-A24U 및 ID-A40U는 마우스 소장에서 안정한 것으로 나타났다. 따라서, 이들 및 관련 ICVD는 인간 GI 관에서 높은 안정성을 가질 것으로 예상된다.
실시예 14: 인간 IBD 조직 연구
염증성 장 질환 조직 환경을 재현하는 인간 생체외 모델에서 V7R-2E9의 활성을 조사하기 위한 연구를 수행하였다. V7R-2E9 및 대조군(ID-2A, 항 씨. 디피실리 독소 ICVD; mAb829, 및 IgG1k(비-IL-7R 결합 정제된 인간 IgG1k 이소타입 대조군 재조합 항체)를 활동성 궤양성 대장염이 있는 4 명의 환자로부터 채취한 조직을 사용하여 염증성 시토카인의 생산 및 조직 인단백질 수준에 대한 이들의 영향에 대하여 생체외 배양으로 시험하였다.
Pathscan 인단백질 어레이에서 조직 용해물의 분석(도 15 내지 도 18)은 4 명의 UC 환자 중 3명으로부터의 생검에서 V7R-2E9 처리가 상응하는 ID-2A-처리 생검과 비교할 때, 어레이에서 검출된 39개 단백질의 상당 비율의 인산화를 억제하였다는 것을 보여주었다. mAb829는 또한 동일한 3 명의 UC 환자로부터의 생검에서 단백질 인산화 수준을 억제하였고, 수득된 억제 패턴은 V7R-2E9로 달성된 것들과 유사한 것으로 보였다. 각 생검에 대한 총 인산화 강도 값을 어레이 상의 모든 39개의 인 단백질의 강도로부터 계산하였다. 도 19에 제시된 결과는 V7R-2E9 및 mAb829가 3 명의 반응성 UC 환자로부터의 생검에서 총 인산화 수준을 억제했지만, 환자 UC2700으로부터의 생검에서 총 인산화에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다. 이 환자는 이의 의약의 일부로서 아자티오프린(T 세포 억제제)을 투여받는 동안 활동성 질환을 가졌고, 따라서 T 세포 유도 요법에 대한 내성은 IL-7R-매개된 T 세포 활성화를 표적화한 항체(V7R-2E9 및 mAb829)에 대한 반응의 결여에 있어서 가능한 설명이 될 것이다.
환자 UC2698, UC2701 및 UC2703 생검으로부터의 배양 배지의 분석은 V7R-2E9 처리가 또한 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα를 포함하는 여러 시토카인의 생산을 억제했지만, 항-염증성 시토카인 IL-10의 생산에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다(데이터 미도시). 인단백질 분석의 결과와 일치하여, V7R-2E9는 환자 UC2700의 생검 배양에서 친-염증성 시토카인의 생산을 억제하지 않았다.
결론적으로, V7R-2E9에 의한 UC 생검 조직에서 IL-7R의 길항작용은 친-염증성 및 면역-조절성 경로와 관련이 있는 시토카인 및 케모카인의 생산 및 신호전달 단백질의 인산화를 억제하였다. 결과는 V7R-2E9(및 mAb829)에 의한 점막 IL-7R+ve T 세포의 길항작용이 질환 환경과 밀접하게 관련이 있는 모델에서 염증 과정을 억제할 수 있다는 것을 입증해 주었다.
실시예 15: 발효 배양에서 효모 생산성
ID-A59U를 발현하는 에스. 세레비시아에를 5 리터 에탄올-공급 발효물에 접종하였다. 발효 종료(EoF) 브로스 상청액을 SDS-PAGE 및 IL-7/IL-7Rα-His6-Fc 기능성 ELISA에 의해 ID-A59U 농도에 대하여 분석하였다. SDS-PAGE는 ≤ 2g/L의 고수율을 지시하였고, 기능성 ELISA는 ID-A59U가 EoF에서 완전히 활성이고 최종 수율이 적어도 1.5g/L이라는 것을 확인시켜 주었다. ID-A62U를 발현하는 에스. 세레비시아에를 50 mL 진탕 플라스크 발현 시스템에 접종하였다. 고수율의 ICVD가 얻어졌다.
상기 실시예들로부터의 결론
IL-7Rα에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합의 억제를 포함하여, IL-7Rα 활성의 중화를 측정하는 세포 검정 시스템에서 높은 역가로 유리한 폴리펩타이드가 확인되었다. 이들 폴리펩타이드는 또한 일부 경우에 소장 및/또는 인간 대변 상청액에서 높은 안정성으로 유리하다. 에스. 세레비시아에에서 효과적으로 생산되는 능력 및 장 프로테아제에 대한 내성을 또한 보유하면서 비변형 V7R-2E9에 비해 역가를 실질적으로 보유하거나 역가의 증가로 유리한 하나의 특정 폴리펩타이드, V7R-2E9의 인간화 유도체가 생산되었다. E1D 효모 생산 돌연변이를 포함하여 V7R-2E9에 대한 돌연변이(R45L, Q65K, K87R, S88A)의 가장 유리한 조합은 ID-A62U에 의해 구현된다.
기타
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참고 문헌
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Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> VHSQUARED LIMITED <120> Polypeptides <130> VHS-P2585PCT <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Ser Asp Ala Met Gly 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr 1 5 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Glu 20 25 30 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 9 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<400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Gly Ser Asp 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Thr Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ser Ser Ile Ser Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser 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225 230 235 240 Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu 245 250 255 Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys 260 265 270 Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile 275 280 285 His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu 290 295 300 Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu 305 310 315 320 Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile 325 330 335 Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly 340 345 350 Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu 355 360 365 Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu 370 375 380 Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser 385 390 395 400 Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro 405 410 415 Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met 420 425 430 Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 435 <210> 66 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 66 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln 20 25 30 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Ser 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Gly Lys Ser Leu 85 90 95 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro 100 105 110 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val 115 120 125 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met 130 135 140 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Met His 145 150 155 160 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Asn Leu Gln 165 170 175 Pro Glu Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr 180 185 190 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Ile Asn Asn Ser Pro Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Leu Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala 225 230 235 240 Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu 245 250 255 Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys 260 265 270 Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile 275 280 285 His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu 290 295 300 Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Lys Lys Gln Arg Leu 305 310 315 320 Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Ser Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile 325 330 335 Thr Pro Glu Ser Phe Glu Arg Asp Ser Ser Leu Arg Cys Leu Ala Gly 340 345 350 Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu 355 360 365 Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu 370 375 380 Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser 385 390 395 400 Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro 405 410 415 Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met 420 425 430 Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 435 <210> 67 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 67 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln 20 25 30 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Ser 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Gly Lys Ser Leu 85 90 95 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro 100 105 110 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val 115 120 125 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met 130 135 140 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Met His 145 150 155 160 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Asn Leu Gln 165 170 175 Pro Glu Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr 180 185 190 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Ile Asn Asn Ser Pro Gly Glu Met Asp Pro 210 215 220 <210> 68 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 68 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln 20 25 30 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu 85 90 95 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro 100 105 110 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val 115 120 125 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met 130 135 140 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His 145 150 155 160 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln 165 170 175 Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr 180 185 190 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp 210 215 <210> 69 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 69 gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaag ccggtggttc tttgagattg 60 tcttgtgaat cttctatctc caccttctca tctgatgcta tgggttggtt tagacaagct 120 ccaggtaaag aaagagaatt tttggctgct attggttgga gtggtgctgt tactcattat 180 tccgattctg ttaaaggtcg tttcaccatt tctagagata acgctaagaa caccgtctac 240 ttgcaaatga actctttgag agctgaagat accggtagat attactgcgc tgaagattac 300 gatactgatg tttggcaata ttggggtcaa ggtactcaag ttactgtctc ctcat 355 <210> 70 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 70 gatgttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaag ccggtggttc tttgagattg 60 tcttgtgaat cttctatctc caccttctca tctgatgcta tgggttggtt tagacaagct 120 ccaggtaaag aattggaatt tttggctgct attggttgga gtggtgctgt tactcattat 180 tccgattctg ttaaaggtcg tttcaccatt tctagagata acgctaagaa caccgtctac 240 ttgcaaatga actctttgag agctgaagat accggtagat attactgcgc tgaagattac 300 gatactgatg tttggcaata ttggggtcaa ggtactcaag ttactgtctc ctcat 355 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 71 Asp Asp Ala Met Gly 1 5 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 72 Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 Ala Ile Gly Trp Ser Gly Thr Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 Ala Thr Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Val Thr His Tyr Ser Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 77 Asp Tyr Val Thr Asp Val Trp Gln Tyr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 78 Asp Tyr Asp Thr Asp Val Trp Gln His 1 5 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 79 Glu Leu Glu Phe Leu Ala 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 80 Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 <210> 81 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 tcttaactag tgaggagacg gtgacctg 28 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser or Asp <400> 82 Xaa Asp Ala Met Gly 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Ile or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Gly or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gln or Lys <400> 83 Ala Xaa Xaa Trp Ser Gly Xaa Val Thr His Tyr Xaa Asp Ser Val Xaa 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Asp or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is Tyr or His <400> 84 Asp Tyr Xaa Thr Asp Val Trp Gln Xaa 1 5 <210> 85 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> Said residues may be present 1 to 10 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(25) <223> Said residues may be present 1 to 10 times <220> <221> VARIANT <222> (2)..(10) <223> None, some, or all of said Gly residues may be present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is 0 to 5 amino acid residues selected from Arg, His, Asp, Gln, Ser, Thr, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu, Trp, Pro, Met, Cys, Phe, Lys or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is 0 to 5 amino acid residues selected from Arg, His, Asp, Gln, Ser, Thr, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu, Trp, Pro, Met, Cys, Phe, Lys or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(25) <223> Said residues may be present 1 to 10 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(24) <223> None, some, or all of said Gly residues may be present <400> 85 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Xaa Xaa Xaa Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(5) <223> Said residues may be present 1 to 5 times <220> <221> VARIANT <222> (7)..(11) <223> Said residues may be present 1 to 5 times <400> 86 Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 87 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 87 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(5) <223> Said residues may be present 1 to 10 times <400> 88 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 89 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 89 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30

Claims (32)

  1. IL-7R에 대한 IL-7 및/또는 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드로서, 폴리펩타이드가 IL-7Rα에 결합하는 면역글로불린쇄 가변 도메인을 포함하고, 면역글로불린쇄 가변 도메인이 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-CDR3) 및 4개의 프레임워크 영역(FR1-FR4)을 포함하고, CDR1이 서열번호 1과 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR2가 서열번호 2와 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하고, CDR3가 서열번호 3과 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, IL-7R에 대한 IL-7 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, IL-7R에 대한 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL-7R에 대한 IL-7 결합 및 IL-7R에 대한 L-TSLP 결합을 억제할 수 있는 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CDR1이 서열번호 1과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR2가 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR3가 서열번호 3과 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, CDR1이 서열번호 82를 포함하거나 이로 이루어지고, CDR2가 서열번호 83을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR3가 서열번호 84를 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, CDR1이 서열번호 1 또는 서열번호 71을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR2가 서열번호 2, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 또는 서열번호 76을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR3가 서열번호 3, 서열번호 77 또는 서열번호 78을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, CDR1이 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지고, CDR2가 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지고, CDR3가 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 8과 50% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 55% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 60% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 65% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 75% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 85% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 96% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 97% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 98% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 예컨대, 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 8을 포함하는 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 8로 이루어지는 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Glu27, Ser31, Leu57, Val58, Glu59, Lys77, Lys78, Phe79, Leu80, Leu81, Ile82, Thr104, Lys137, Lys138, Tyr139, Lys141, His191, Tyr192 및 Phe193으로 이루어진 목록으로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 하나의 잔기를 포함하는 IL-7Rα 상의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드.
  13. IL-7Rα 상의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드로서, 에피토프가 Glu27, Ser31, Leu57, Val58, Glu59, Lys77, Lys78, Phe79, Leu80, Leu81, Ile82, Thr104, Lys137, Lys138, Tyr139, Lys141, His191, Tyr192 및 Phe193으로 이루어진 목록으로부터 선택된 IL-7Rα의 적어도 하나의 잔기를 포함하는, 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편인 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린쇄 가변 도메인이 VHH, VH 또는 VL인, 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 면역글로불린쇄 가변 도메인이 VHH 또는 VH인, 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 상이한 폴리펩타이드를 포함하는 작제물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 2.00 nM 이하, 예컨대, 1.50 nM 이하, 예컨대, 1.00 nM 이하, 예컨대, 0.90 nM 이하, 예컨대, 0.80 nM 이하, 예컨대, 0.70 nM 이하, 예컨대, 0.65 nM 이하, 예컨대, 0.60 nM 이하, 예컨대, 0.55 nM 이하, 예컨대, 0.50 nM 이하, 예컨대, 0.45 nM 이하, 예컨대, 0.4 nM 이하, 예컨대, 0.35 nM 이하, 예컨대, 0.30 nM 이하의 EC50으로 IL-7에 대한 IL-7R 결합을 중화시키는, 폴리펩타이드 또는 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 10-7 M 이하, 예컨대, 적합하게는 10-8 M 이하, 예컨대, 10-9 M 이하, 예컨대, 10-10 M 이하의 평형 해리 상수(Kd)로 IL-7Rα에 결합하는, 폴리펩타이드 또는 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 트립신 및 키모트립신에 실질적으로 내성인, 폴리펩타이드 또는 작제물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 작제물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 추가 활성제를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물.
  24. 제23항에 있어서, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물이 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물.
  25. 자가면역 및/또는 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 사람에게 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  26. 자가면역 및/또는 염증성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물의 용도.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 및/또는 염증성 질환이 크론병 또는 궤양성 대장염인, 폴리펩타이드, 약학 조성물, 작제물, 방법 또는 용도.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 및/또는 염증성 질환이 아토피성 피부염인, 폴리펩타이드, 약학 조성물, 작제물, 방법 또는 용도.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드, 약학 조성물 또는 작제물이 경구 투여에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드, 약학 조성물, 작제물, 방법 또는 용도.
  30. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 약학 조성물 또는 작제물이 국소 투여에 사용하기 위한 것인, 폴리펩타이드, 약학 조성물, 작제물, 방법 또는 용도.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  32. 제31항에 있어서, 서열번호 70을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
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