JP2010518839A - 血管内皮増殖因子に指向性を有するアミノ酸配列、及び過度の及び／もしくは病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患を治療するためにこれを含むポリペプチド - Google Patents

血管内皮増殖因子に指向性を有するアミノ酸配列、及び過度の及び／もしくは病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患を治療するためにこれを含むポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に指向性を有するアミノ酸配列、並びに１つ又は複数のこのようなアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれらから成る化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに関する。過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患の治療のような予防目的、治療目的又は診断目的に、アミノ酸配列、化合物及び構築物を使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、（本明細書で規定のように）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に指向性を有するアミノ酸配列、並びに１つ又は複数のこのようなアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれらから成る化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに関する（それぞれ本明細書中で、「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、及び「本発明のポリペプチド」とも称される）。
本発明は、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書中で「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド核酸」とも称される）、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドを調製する方法、このようなアミノ酸配列又はポリペプチドを発現するか、又は発現することが可能な宿主細胞、このようなアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物、並びに特に本発明で言及する予防目的、治療目的又は診断目的のような予防目的、治療目的又は診断目的のためのこのようなアミノ酸配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。
本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
血管形成は、血管内皮細胞が増殖、プルーニング（prune）及び再組織化して、既存の血管網から新たな血管を形成する、重要な細胞事象である。血管供給の進展は、正常及び病理学的な増殖プロセスに必須である（非特許文献１）。酸素及び栄養素の送達、並びに異化産物の除去は、多細胞生物で起こる成長プロセスの大部分で律速工程を示す。成人では血管形成は、「血管形成平衡」、即ち血管成長のための刺激シグナルと阻害シグナルとの間の生理学的平衡によって強く制御される。通常の状況では、創傷治癒、組織再生時に、また女性の生殖器系では、排卵、生理及び胎盤形成時に新規の血管形成が起こる。血管形成は、腫瘍成長、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症及び乾癬等の幾つかの病理プロセスにおける重要な要因でもある。
血管形成の注目すべき生理学的及び病理学的な重要性に関して、多くの研究によって、このプロセスを調節することが可能な要因が解明されている。血管形成プロセスは、血管形成促進分子と抗血管形成分子との平衡によって調節され、様々な疾患、特に癌で狂わせられる（非特許文献２）。血管形成の表現型への切り替えは、血管形成刺激因子と血管形成阻害因子との平衡の局所的な変化によっている。
最も重要な血管形成促進因子の１つは、ＶＥＧＦ−Ａとも呼ばれる血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又は血管透過性因子（ＶＰＦ）である。ＶＥＧＦは、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）（非特許文献３、非特許文献４）、ＶＥＧＦ−Ｂ（非特許文献５）、ＶＥＧＦ−Ｃ（非特許文献６、非特許文献７）、ＶＥＧＦ−Ｄ（非特許文献８、非特許文献９）、ＶＥＧＦ−Ｅ（非特許文献１０）及びＶＥＧＦ−Ｆ（非特許文献１０）を含む遺伝子ファミリーに属する。ヒトＶＥＧＦは、単一遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる少なくとも６つのアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、及びＶＥＧＦ２０６）として存在する（非特許文献１１）。最も豊富なアイソフォームであるＶＥＧＦ１６５は、分子量が４５０００ダルトンである塩基性のヘパリン結合する二量体糖タンパク質である。
ＶＥＧＦ、ｆｍｓ様チロシンキナーゼＦｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１又はＦｌｔ−１）及び胎児肝臓キナーゼとも称されるキナーゼドメイン領域（ＶＥＧＦＲ−２、ＫＤＲ又はＦｌｋ−１）と相互作用する２つのＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）が同定されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦに対して最も高い親和性を有し、Ｋｄが１０ｐＭ〜２０ｐＭであり（非特許文献１６）、ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦに対して幾らか低い親和性を有し、Ｋｄが７５ｐＭ〜１２５ｐＭである（非特許文献１４、非特許文献１７、非特許文献１８）。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦとその受容体との相互作用、及び正常及び病理学的なプロセスにおけるＶＥＧＦの機能のさらなる詳細な説明を非特許文献１０及び非特許文献１９で見出すことができる。
ＶＥＧＦは、正常な血管形成及び異常な血管形成の両方の極めて重要な調節因子として報告されている（非特許文献２０、非特許文献２１）。血管形成プロセスに寄与する他の成長因子に比べて、ＶＥＧＦは、血管系内の内皮細胞に対する特異性が高いという点が独特である。ＶＥＧＦは、胚の脈管形成及び血管形成に必須である（非特許文献２２、非特許文献２３）。さらに、ＶＥＧＦは、女性の生殖器官における循環血管増殖、並びに骨成長及び軟骨形成に必要である（非特許文献２４、非特許文献２５）。
血管形成及び脈管形成における血管形成因子であるだけでなく、多面的成長因子としてＶＥＧＦは、内皮細胞生存、血管浸透性及び血管拡張、単球走化及びカルシウム流入のような他の生理学的なプロセスにおける複合的な生物学的効果を示す（非特許文献２０）。さらに、近年の研究によって、網膜色素上皮細胞、膵管細胞及びシュワン細胞等の幾つかの非内皮細胞型に対するＶＥＧＦの細胞分裂効果が報告されている（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）。
ＶＥＧＦは、病的な血管形成を伴う症状又は疾患の進行にも関与する。試験ヒト腫瘍の大部分でＶＥＧＦのｍＲＮＡが過剰発現する（非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３）。
眼液におけるＶＥＧＦ濃度は、糖尿病及び他の虚血関連網膜症の患者における増殖中の血管の存在に強く相関する（非特許文献３４）。
さらに、近年の研究によって、ＡＭＤに罹患した患者における脈絡膜新生血管膜中のＶＥＧＦの局在化が実証されている（非特許文献３５）。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高齢者集団における重大な視力喪失の主な原因である。滲出型のＡＭＤは、脈絡膜血管新生及び網膜色素上皮細胞分離を特徴とする。
様々な炎症性障害においてもＶＥＧＦ上方調節が観察されている（非特許文献３６）。ＶＥＧＦは、ＲＡの発病、血管形成が重要な役割を果たす炎症性障害に関与している（非特許文献３７、非特許文献３８）。ＶＥＧＦは、微小血管透過性及び血管形成の増大を特徴とする症状である、創傷治癒並びに乾癬における表皮角化細胞で強く発現する（非特許文献３９）。脳浮腫の進行においてもＶＥＧＦ上方調節が観察されている。拡散した少量のＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現が成体のラット脳で観察されている（非特許文献４０）。
ＶＥＧＦ、並びに血管形成及び異化プロセスにおけるその役割の解明が、治療的介入の潜在的に新しい標的を提供している。ＶＥＧＦ機能は、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼの活性化を遮断又は阻止する小分子によって阻害されており（非特許文献４１）、その結果、ＶＥＧＦシグナル変換経路を妨げる。細菌毒素又は植物毒素を含有する腫瘍細胞特異的細胞毒性複合体は、腫瘍血管形成に対するＶＥＧＦの促進効果を阻害することができる。例えばＶＥＧＦ１６５−ＤＴ３８５複合体（ＶＥＧＦ１６５と融合又は化学的に共役したジフテリア毒素ドメイン）が、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を効率的に阻害する（非特許文献４２）。また、レトロウイルス送達したＦｌｋ−１突然変異体（非特許文献４３）及び可溶性ＶＥＧＦ受容体（非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７、非特許文献４８）で、腫瘍成長阻害が実証された。
Ａ４．６．１及びＭＶ８３３等のＶＥＧＦ中和抗体が、ＶＥＧＦとその受容体とが結合するのを遮断し、且つ前臨床抗腫瘍活性を示すものとして開発されている（非特許文献４９、非特許文献５０、非特許文献５１、非特許文献５２、非特許文献５３）。抗ＶＥＧＦ抗体処理は一般的に、ヌードマウス又は重度の複合免疫不全症のマウスで皮下に移植した、急成長する血管形成依存型のヒト腫瘍異種移植片を小さい血管形成した微小コロニーに変換させる。
臨床試験における抗ＶＥＧＦアプローチの総説に関しては、非特許文献５４を参照されたい。
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Genentech, San Francisco, CA）とも呼ばれるＡ４．６．１で、最も臨床経験が得られている（非特許文献５５、非特許文献５６）。化学療法と併用したアバスチンは、ＦＤＡ認可されているか、又は多くの癌兆候に対して臨床試験中である。しかしながら、この製品の組合せは、副作用（出血、動脈血栓塞栓症、高血圧、胃腸管（ＧＩ）穿孔、創傷治癒問題、タンパク尿及び鬱血性心不全）が問題であり、これは主に抗ＶＥＧＦ活性が、腫瘍の部位に制限されないが、長期間にわたって血液循環中で持続するためである。これによって、末梢内皮細胞の生理学的活性から病態生理学的活性への移行が引き起こされる。
またＡＭＤ患者に組換えヒト化抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ（ｒｈｕＦａｂ ＶＥＧＦ、ラニビズマブ又はルセンチス（商標））を使用するという抗ＶＥＧＦ戦略がＦＤＡ認可されている（非特許文献５７、非特許文献５８）。ｒｈｕＦａｂ ＶＥＧＦは、ＡＭＤの霊長類モデルにおいて血管形成及び血管漏出を低減することが見出されている（非特許文献５９）。ＶＥＧＦ阻害因子の眼への局所送達によって、全身投与よりも副作用が小さくなる。硝子体内注射によって、高い眼球内濃度を達成することができる。しかしながら、眼内炎、硝子体出血及び網膜剥離の危険性から、糖尿病性網膜症等の慢性疾患を治療するために繰り返し注射することは理想的ではない。
ナノボディ（本明細書中でさらに規定）は、従来の４鎖抗体よりも強力で、且つ安定性があり、これによって（１）剤形を小さくし、投与頻度を少なくすることで、副作用を小さくし、また（２）安定性を向上させることで、静脈内経路の他に経口経路又は皮下経路及び徐放製剤を含む投与経路が広範に選択される。例えば、安定な抗ＶＥＧＦナノボディを有する徐放製剤は、ＡＭＤの治療に有益であり、繰り返し注射する必要と、これに関連する副作用とを避けることができる。また、ナノボディのサイズが小さく、且つ半減期が短いことが、これらをＡＭＤの治療に特異的に適合させている。サイズが小さいことによって、眼により深くナノボディを浸透させ、脈絡膜血管に達することが容易になる。
サイズが小さいために、ナノボディには、膜を通過することができると共に、他のより大きいポリペプチド及びタンパク質に接近できない生理学的なコンパートメント、組織及び器官に浸透することができる能力がある。サイズが小さいナノボディは、半減期がより小さく、且つ４８時間を超えて留まる場合、腎臓及び膀胱に迅速に蓄積する。またこのことが、ナノボディを、腎細胞癌及び膀胱癌の治療に理想的に適合させている。例えば抗ＶＥＧＦナノボディの全身投与の際に、循環血液中の抗ＶＥＧＦ活性は低く、副作用の危険性が低減するが、腫瘍部位で高い抗ＶＥＧＦ活性、及び腎臓癌又は膀胱癌の効果的治療が得られる。
またサイズが小さいために、ナノボディは、ＶＥＧＦ上の特異的なエピトープ（例えばＶＥＧＦＲ−２結合部位等）と選択的に結合することができるが、他のエピトープ（例えばＶＥＧＦＲ−１結合部位等）を（立体的に）遮断しない。このことによって、或る特定の生物学的プロセスが選択的に阻害され得るが、他の生物学的プロセスは阻害されず、副作用の危険性は低減する。ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦＲ−１ではなくＶＥＧＦＲ−２との結合を遮断するモノクローナル抗体（２Ｃ３）によって、新たに形成した未成熟血管の内皮細胞のアポトーシスが引き起こされることを実際に示しており、このことは、ＶＥＧＦに依存的であり、傍内皮（periendothelial）細胞がより永続的な付着形態を容易にするまで、仮の細胞外マトリクスとの細胞付着を維持するが、成熟血管の完全性は、この抗血管形成療法に影響されない（非特許文献６０）。
またナノボディのサイズが小さいことが、ナノボディを二重特異性又は多重特異性のポリペプチドの調製に理想的に適合させている。例えば、二重特異性の抗ＶＥＧＦ／抗ＶＥＧＦＲナノボディ又は二重特異性の抗ＶＥＧＦ／抗腫瘍ナノボディは、腫瘍側を特異的に標的とするが、循環血液中の抗ＶＥＧＦ活性は、副作用の危険性を低減しつつも低いままである。ＶＥＧＦ上の２つの異なるエピトープ（例えばＶＥＧＦＲ−１結合部位及びＶＥＧＦＲ−２結合部位）との二重特異性のナノボディの結合は、それらの有効性がより高いために有益であり得る。
Folkman and Klagsbrun Science 1987, 235: 442-447 Carmeliet and Jain Nature 2000, 407: 249-257 Maglione et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1991, 88: 9267-9271 Maglione et al. Oncogene 1993, 8: 925-931 Olofsson et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1996, 93: 2576-2581 Joukov et al. EMBO J. 1996, 15: 1751-1758 Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1996, 93: 1988-1992 Orlandini et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1996, 93: 11675-11680 Achen et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA1998, 95: 548-553 Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-580 Ferrara and Davis-Smyth Endocr. Rev. 1997, 18: 1-22 Shibuya et al. Oncogene 1990, 5: 519-24 Matthews et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88: 9026-30 Terman et al. Oncogene 1991, 6: 1677-83 Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, 187: 1579-86 de Vries et al., Science 1992, 255: 989-91 Millauer et al. Cell 1993, 72: 835-46 Quinn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 7533-7 Ferrara（Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611） Ferrara and Davis-Smyth Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25 Ferrara J. Mol. Med. 1999, 77: 527-543 Carmeliet et al. Nature 1996, 380: 435-439 Ferrara et al. Nature 1996, 380: 439-442 Ferrara et al. Nature Med. 1998, 4: 336-340 Gerber et al. Nature Med. 1999, 5:623-628 Guerrin et al. J. Cell Physiol. 1995, 164: 385-394 Oberg-Welsh et al. Mol. Cell. Endocrinol. 1997, 126: 125-132 Sondell et al. J. Neurosci. 1999, 19:5731-5740 Berkman et al. J Clin Invest 1993, 91: 153-159 Brown et al. Cancer Res. 1993, 53: 4727- 4735 Brown et al. Human Pathol. 1995, 26: 86-91 Dvorak et al. Am J. Pathol. 1995, 146: 1029-1039 Mattern et al. Brit. J. Cancer. 1996, 73: 931-934 Aiello et al. N. Engl. J. Med. 1994, 331: 1480-1487 Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 1996, 37: 855-868 Dvorak J. Clin. Oncol. 2002, 20: 4368-4380 Koch et al. J. Immunol. 1994, 152: 4149-4156 Fava et al. J. Exp. Med. 1994, 180: 341-346 Detmar et al. J. Invest. Dermatol. 1995,105: 44-50 Monacci et al. Am. J. Physiol. 1993, 264: C995-C1002 Schlaeppi and Wood Cancer Metastasis Rev. 1999, 18: 473-481 Olson et al. Int. J. Cancer 1997, 73: 865-870 Millauer et al. Nature 1994, 367: 576-579 Kong et al. Hum. Gene Ther. 1998, 9: 823-833 Goldman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 8795-8800 Gerber et al. Cancer Res. 2000, 60: 6253-6258 Kuo et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2001, 98: 4605-4610 Holash et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99: 11393-11398 Kim et al. Nature 1993, 362: 841-844 Folkman Nat. Med. 1995, 1: 27-31 Presta et al. Cancer Res. 1997, 57: 4593-4599 Kanai et al. Int. J. Cancer 1998, 77: 933-936 Ferrara and Alitalo Nat. Med. 1999, 5: 1359-1364; 320, 340 Campochiaro and Hackett（Oncogene 2003, 22:6537-6548） Bunn In: Proceedings of the Annual Meeting of the American Societyof Clinical Oncology 2001, May 12-15, San Francisco, Vol. 20, pp 395-406,American Society of Clinical Oncology, Chestnut Hill, MA Margolin et al. J. Clin. Oncol. 2001, 19: 851-856 Chen et al. J. Mol. Biol. 1999, 293:865-881 Ferrara et al. Retina 2006, 26: 859-870 Krzystolik et al. Arch. Ophthalmol. 2002,120: 338-346 Brekken et al. Cancer Res. 2000, 60:5117-5124
本発明のポリペプチド及び組成物は一般的に、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの結合を調節、特に阻害及び／又は阻止するのに、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲで媒介されるシグナル伝達の調節、特に阻害及び／又は阻止するのに、ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲが関与する生物学的経路を調節するのに、及び／又はこのようなシグナル伝達又はこれらの経路に関連し、生物学的機構、反応及び作用を調節するのに使用することができる。
このようなものとして、本発明のポリペプチド及び組成物は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の予防及び治療（本明細書中に規定）に使用することができる。一般的に、「過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患」はそれぞれ、（特に薬学的に活性な量の）本発明のポリペプチド又は組成物のいずれか、及び／又はＶＥＧＦ、又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路若しくは機構に対して活性な（特に薬学的に活性な量の）既知の活性成分を、それを必要とする（即ち疾患若しくは障害、又は少なくとも１つのこれらの症状を有するか、及び／又は疾患若しくは障害を誘引又は発症する危険性がある）被験者に好適に投与することによって予防及び／又は治療することができる疾患及び障害として規定することができる。過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とするこのような症状又は疾患の例は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、例えば以下の疾患及び障害が挙げられる：様々な新生物症状、例えばこれらに限定されないが、腫瘍、特に固形悪性腫瘍（非特許文献１０）、乳癌（Yoshiji et al. Cancer Res. 1996, 56: 2013-2016、Brown et al. Hum. Pathol. 1998, 26: 86-91、Linderholmet al. Cancer Res. 2000, 61: 2256-2260、Fox et al.Lancet Oncol. 2001, 2: 278-289、Gasparini Crit. Rev.Oncol. Hematol. 2001, 37: 97-114）、非小細胞肺癌等の肺癌（Giatromanolakiet al. J. Pathol. 1996, 179: 80-88、Volm et al.Anticancer Res. 1997, 17: 99-103、Volm et al. Int. J.Cancer 1997, 64-68、非特許文献５４、Fox et al. Lancet Oncol.2001, 2: 278-289）、胃癌（非特許文献３０、Suzuki et al. Cancer Res.1996, 56: 3004-3009、Maeda et al. Cancer 1996, 77:858-863、Ellis et al. Eur. J. Cancer 1998, 34: 337-340、Uchida et al. Br. J. Cancer 1998, 77: 1704-1709、Fox et al. Lancet Oncol. 2001, 2: 278-289）、食道癌、結腸直腸癌（Papamicheal Anticancer Res. 2001, 21 : 4349-4353）、肝臓癌、卵巣癌（Olson et al. Cancer Res. 1994, 54: 276-280、Sowteret al. Lab. Invest. 1997, 77: 607-614、Yamamoto et al.Br. J. Cancer 1997, 76: 1221-1227）、卵胞膜細胞腫、男化腫瘍、子宮頸癌、子宮内膜癌（Guidi et al. Cancer 1996, 78: 454-460）、子宮内膜増殖症、子宮内膜症（McLaren et al. J. Clin. Invest. 1996, 98: 482-489、Shifren et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996, 81: 3112-3118、Hull et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88: 2889-2899、Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-579）、線維肉腫、絨毛癌、頭頸部癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ（Kaposils）肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫（非特許文献２９、Wizigmann et al. Cancer Res. 1995, 155: 1358-1364）、膵臓癌、網膜芽腫、星状細胞腫、膠芽細胞腫（Shweiki et al. Nature 1992, 359: 843-845、Plateet al. Nature 1992, 359: 845-848、Phillips et al. Int.J. Oncol. 1993, 2: 913-919）、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、腎腫瘍（Brown et al. Am. J. Pathol. 1993, 143: 1255-1262、Nicol et al. J. Urol. 1997, 157: 1482-1486、Tomisawaet al. Eur. J. Cancer 1999, 35: 133-137）、膀胱腫瘍（Brown etal. Am. J. Pathol. 1993, 143: 1255-1262）、甲状腺癌（Son etal. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 82: 3741-3747、Kleinet al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001, 86:656-658）、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌（Joseph et al. Clin. Cancer Res. 1997, 3: 2507-2511、Balbay et al. Clin. Cancer Res. 1999, 5: 783-789）、母斑症（phakomatoses）に関連する異常血管増殖、メーグス症候群、Ｔ細胞リンパ腫等の血液悪性疾患（Gerber and Ferrara J. Mol. Med. 2003, 81: 20-31）、急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病、組織球性リンパ腫、前骨髄球性白血病等；様々な非新生物疾患及び症状、例えばこれらに限定されないが、関節リウマチ（非特許文献３７、非特許文献６０、Walsh, Rheumatology（Oxford）1999, 38: 103-112、Ballara et al. Int. J.Exp. Pathol. 1999, 80: 235-250、Ikeda et al. J. Pathol.2000, 191: 426-433、de Brandt et al. Arthritis Rheum.2000, 43: 2056-63、Lee et al. Clin. Exp. Rheumatol.2001, 19: 321-324、Ballara et al. Arthritis Rheum. 2001,44: 2055-2064）、変形性関節症（osteoarthritis）（Walsh, Rheumatology（Oxford）1999, 38: 103-112）、乾癬（Bhusan et al. 1999）、アテローム性動脈硬化症、糖尿病及び他の網膜症（非特許文献３４、Malecazeet al. Arch. Ophthalmol. 1994, 112: 1476-1482、Duh and Aiello Diabetes 1999, 48: 1899-1906、Chakrabarti et al.Diabetes Metab. Res. Rev. 2000, 16: 393-407、Ozaki et al. Am. J. Pathol.2000, 156: 697-707）、後水晶体繊維増殖症、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（非特許文献３５、非特許文献５７、非特許文献５９）、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜及び他の組織の移植、同種移植片拒絶反応（Reinders et al. J. Clin. Invest. 2003, 112: 1655-1665）、様々な炎症性疾患（非特許文献３６）、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症（Maynard et al. J. Clin. Invest. 2003, 111 : 649-658、Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-579）、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）（McClure et al. Lancet 1994, 344: 235-269、Leeet al. Fertil. Steril. 1997, 68: 305-311、Levin et al.J. Clin. Invest. 1998, 102: 1978-1985、Artini et al.Fertil. Steril. 1998, 70: 560-565、非特許文献２４）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）（Agrawal et al. Hum. Reprod. 1998, 13: 651-655）、腹水症、心外膜液（心膜炎関連のもの等）、及び胸水；浮腫（Kovacs et al. Stroke 1996, 27: 1865-1872、Hayashiet al. Stroke 1997, 28: 2039-2044、Lennmyr et al. J.Neuropathol Exp. Neurol. 1998, 57: 874-882）、例えば、これらに限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）浮腫、脳浮腫、脊髄若しくは脊椎管の浮腫、又は頭蓋内圧上昇による他の症状（局所脊髄の損傷等）、血管原性浮腫及び細胞毒性浮腫、急性高血圧、髄膜炎、脳炎、膿瘍、新生物疾患（上記のようなもの）（特に固形腫瘍）、外傷（頭部損傷等）、出血、ウイルス感染、脳マラリア、脳梗塞、放射線照射、多発性硬化症、後心停止、出生時仮死、グルタミン酸毒性、脳症、低酸素症、虚血及び腎臓透析を含むが、これらに限定されない多種多様の病理学的症状若しくは刺激に起因するか、又はこれらに付随する浮腫。
例えば、ＶＥＧＦアゴニストは、心臓血管虚血（Hoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-579）；重症虚血肢等の末梢血管疾患（Baumgartner et al. Circulation 1998, 97: 1114-1123）、閉塞性血栓動脈炎（Isner et al. J. Vasc. Surg. 1998, 28: 964-973）、虚血性血管閉塞（Mack et al. J. Vasc. Surg. 1998, 27: 699-709）、末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）及び血管再生虚血性心臓組織に使用することができる。
特に、本発明のポリペプチド及び組成物は、ＶＥＧＦで媒介する過度の及び／又は不要なシグナル伝達、又はＶＥＧＦが関与する経路（複数可）によって引き起こされる過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患の予防及び治療に使用することができる。また過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とするこのような症状又は疾患の例は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかである。
したがってこれに限定されないが、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは例えば、ＶＥＧＦ媒介シグナル伝達を調節することができる活性成分（例えば上記の従来技術で言及されるもの）で現在予防又は治療されている全ての疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができる。本発明のポリペプチドは、このような活性成分による治療が現在展開中であるか、提案されているか、又は将来提案若しくは展開予定である全て疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができることも予想される。また、本明細書でさらに記載される有利な特性から、本発明のポリペプチドは、これらの既知の活性成分が現在使用中か又は提案若しくは展開予定であるもの以外の疾患及び障害の予防及び治療に使用してもよいこと、及び／又は本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の疾患及び障害を治療する新規の方法及びレジメンを提供し得ることが予想される。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの他の用途及び使用は、本明細書のさらなる開示から当業者にとって明らかになる。
概して、本発明の目的は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患、並びに本明細書で言及されるさらなる疾患及び障害の診断、予防及び／又は治療に使用することができる、薬学的に活性な作用物質、及びこれを含む組成物を提供すること、並びにこのような作用物質及び組成物の投与及び／又は使用を伴う、このような疾患及び障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供することである。
具体的には本発明の目的は、現在当該技術分野で使用されている、及び／又は既知の作用物質、組成物及び／又は方法に比べて或る特定の利点を有するような薬理学的に活性のある作用物質、組成物及び／又は方法を提供することである。これらの利点は、以下のさらなる記載から明らかになる。
より具体的には本発明の目的は、過度の及び／又は病的な血管形成及び／又は血管新生を特徴とする症状及び疾患並びに本明細書で言及されるさらなる疾患及び障害の診断、予防及び／又は治療に、薬理学的に活性のある作用物質、及びこれを含む組成物として使用することができる治療タンパク質を提供すること、並びにこのような治療タンパク質及び組成物の投与及び／又は使用を伴うような疾患及び障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供することである。
したがって本発明の特定の目的は、（本明細書に規定の）ＶＥＧＦ、具体的には温血動物由来のＶＥＧＦ、より具体的には哺乳動物由来のＶＥＧＦ、特にヒトＶＥＧＦに指向性があるアミノ酸配列を提供すること、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質及びポリペプチドを提供することである。
具体的には本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて予防的用途、治療的用途及び／又は診断的用途に好適であるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
より具体的には本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて１つ又は複数のＶＥＧＦに関連する、及び／又はＶＥＧＦで媒介される疾患、障害又は症状（本明細書中で言及される疾患、障害及び症状等）の予防、治療、緩和及び／又は診断に使用することができるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することである。
本発明の特定の目的は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて１つ又は複数のＶＥＧＦに関連する、及び／又はＶＥＧＦで媒介される疾患、障害又は症状（本明細書中で言及される疾患、障害及び症状等）の予防及び／又は治療のための薬学的組成物又は獣医学的組成物の調製に使用することができるようなアミノ酸配列及びタンパク質及び／又はポリペプチドを提供することでもある。
本発明において概して、これらの目的は、本明細書に記載のアミノ酸配列、タンパク質、ポリペプチド及び組成物の使用によって達成される。
概して本発明は、（本明細書に規定のように）ＶＥＧＦに指向性を有する、及び／又は（本明細書に規定のように）ＶＥＧＦと特異的に結合することができる、アミノ酸配列、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む、化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
より具体的には本発明は、本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができるアミノ酸配列、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む、化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
特に、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＶＥＧＦと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等のｋｏｎ速度でＶＥＧＦと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等のｋｏｆｆ速度でＶＥＧＦと結合するようなものであるのが好ましい。
好ましくは、本発明の一価のアミノ酸配列（又は本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチド）が、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性でＶＥＧＦと結合するようなものであるのが好ましい。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドとＶＥＧＦとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
ＶＥＧＦとの結合のために、本発明のアミノ酸配列は通常、そのアミノ酸配列内に１つ又は複数のアミノ酸残基或いは１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチ（即ちそれぞれの「ストレッチ」が、（即ちアミノ酸配列の一次構造又は三次構造で）互いに隣接しているか、又は互いに密接している２つ以上のアミノ酸残基を含む）を含有し、それを介して本発明のアミノ酸配列はＶＥＧＦと結合することができ、このようにしてアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、ＶＥＧＦと結合する「部位」（本明細書で「抗原結合部位」とも表される）を形成する。
本発明で与えられるアミノ酸配列は、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるか、又は（本明細書で規定のように）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド（１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列を含むか、又は本質的にこれから成り、任意でさらに１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含んでもよい（全て任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結される））の一部を形成するのが好ましい。例えば、これに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、全て本明細書に記載される、それぞれ本発明の一価、多価、又は多重特異性のポリペプチドを提供するように、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用してもよい（任意で（即ちＶＥＧＦ以外の１つ又は複数の他の標的に対する）結合単位としての役割を果たし得る１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含有してもよい）。このようなタンパク質又はポリペプチドは、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態でもあり得る。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチド自体が、本質的にジスルフィド架橋を介して他のアミノ酸配列又はアミノ酸鎖と連結しない（が、１つ又は複数の分子内ジスルフィド架橋を含有しても又は含有しなくてもよい。例えば本明細書中に記載のナノボディは、ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２との間にジスルフィド架橋を含有し得ることもあることが知られている）単一のアミノ酸鎖から成るのが好ましい。しかしながら、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、互いに及び／又は他のアミノ酸配列と（例えばジスルフィド架橋を介して）連結し、また本発明に有用であり得るペプチド構築物（例えばＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＳｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」及び他の多重特異性の構築物、例えばHolliger and Hudson, Nat. Biotechnol. 2005 Sep; 23（9）: 1126-36による総説を参照されたい）を提供し得ることに留意されたい。
概して、本発明のアミノ酸配列（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、（例えば本明細書に記載の治療目的及び／又は診断目的のための）被験者への投与を目的とする場合、当該被験者において自然発生しないか、又は当該被験者において自然発生する場合は、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態であるのが好ましい。
薬学的用途の場合、本発明のアミノ酸配列（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）はヒトＶＥＧＦに指向性を有するのが好ましく、一方で獣医学目的の場合は、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは治療する種由来のＶＥＧＦに指向性を有するか、又は治療する種由来のＶＥＧＦと少なくとも交差反応性であるのが好ましいことも、当業者にとって明らかである。
さらに、本発明のアミノ酸配列は、任意でＶＥＧＦとの結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有し得る。
発症する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又はそれ自体が既知の動物モデル、又はそれらの任意の組合せを使用して、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチド、並びにこれを含む組成物の有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは、当業者にとって明らかであり、例えばＥＬＩＳＡ；固相受容体結合及び遮断アッセイ、アルファスクリーンアッセイ（Perkin Elmer, MN, US）；ビアコア（BIAcore ABCorporation, Uppsala, Sweden）；例えばWinkles et al.（Proc. Natl. Acad. Sci USA 1987, 84: 7124-7128）、Miao et al.（2006, Biochem. Biophys. Res.Commun. 345: 438-445）、Jo et al.（Am. J. Pathol. 2006, 168: 2036-2053）及びWu etal.（Clin. Cancer Res. 2006, 12: 6573-6584）に記載のような細胞増殖アッセイ；例えば国際公開第９４／１０２０２号パンフレット、国際公開第００／３７５０２号パンフレット及びMiao et al.（2006, Biochem. Biophys. Res.Commun. 345: 438-445）に記載のようなＶＥＧＦ誘導走化性アッセイ；例えばトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ及びHasan et al.（Angiogenesis 2004, 7: 1-16）に記載の他の血管形成アッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ血管形成アッセイ；例えば国際公開第９４／１０２０２号パンフレット、国際公開第００／３７５０２号パンフレット、非特許文献５１及びWu et al.（Clin. Cancer Res. 2006, 12:6573-6584）に記載のような異種移植片マウスモデル；例えばDuh and Aiello（Diabetes 1999, 48: 1899-1906）に記載のような虚血性マウス網膜モデル；例えばAiello et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995,92: 10457-10461）に記載のような虚血性網膜症の動物モデル；例えばKrzystolik etal.（Arch. Ophthalmol. 2002, 120: 338-346）に記載のようなＡＭＤの霊長類モデル；虚血性虹彩新生血管の霊長類モデル；例えばJoussen et al.（Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2003, 44: 117-123）及びJo et al.（Am.J. Pathol. 2006, 168: 2036-2053）に記載のような角膜血管新生モデル；例えばMoriet al.（Am. J. Pathol. 2001, 159: 313-320）及びJo et al.（Am. J. Pathol. 2006, 168:2036-2053）に記載のような脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデル；例えば国際公開第００／３７５０２号パンフレットに記載のような脳浮腫モデル、並びに以下の実験部で使用したアッセイ及び動物モデル、並びに本明細書で言及した従来技術が含まれる。
ビアコアにおいて、ナノボディＶＥＧＦ１６５結合に関するＫＤは、例えば１ｐＭ〜１００ｎＭ、好ましくは１ｐＭ〜１０ｎＭ、より好ましくは１ｐＭ〜１ｎＭ、例えば１ｐＭ〜１００ｐＭであるのが好ましい。
アルファスクリーンアッセイ（実施例の項で記載）において、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ相互作用を阻害する際のナノボディに関するＩＣ５０は、例えば１ｐＭ〜１００ｎＭ、好ましくは１ｐＭ〜１０ｎＭ、より好ましくは１ｐＭ〜１ｎＭ、例えば１ｐＭ〜１００ｐＭであるのが好ましい。
ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイ（実施例の項で記載）において、ＶＥＧＦ刺激増殖を阻害する際のナノボディに関するＩＣ５０は、例えば０．１ｐＭ〜１０ｎＭ、好ましくは０．１ｐＭ〜１ｎＭ、より好ましくは０．１ｐＭ〜２００ｐＭ、例えば０．１ｐＭ〜２０ｐＭであるのが好ましい。
また本発明によれば、第１の種の温血動物由来のＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の温血動物由来のＶＥＧＦと交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。例えば、ヒトＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の霊長類（例えば、これらに限定されないが、マカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macacamulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus））由来のＶＥＧＦ、疾患のために動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）及び特にＶＥＧＦに関連がある疾患及び障害のために動物モデルで使用されることが多い、１種又は複数種の動物（例えば本明細書で言及される種及び動物モデル）由来のＶＥＧＦと交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。この態様では、このような疾患モデルでヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列及びポリペプチドを試験することが可能であるので、存在する場合、このような交差反応性は薬剤開発の観点から都合がいいことが当業者にとって明らかである。
より一般的には、複数種の哺乳動物由来のＶＥＧＦと交差反応性である本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが複数種にわたって使用することが可能であるので、このアミノ酸配列及びポリペプチドは通常、獣医学用途に使用するのに有利である。したがって、或る種の動物由来のＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列及びポリペプチド（例えばヒトＶＥＧＦに対するアミノ酸配列及びポリペプチド）は、アミノ酸配列及び／又はポリペプチドの使用によって、治療する種において所望の効果が提供されれば、別の種の動物の治療に使用することができることも本発明の範囲内に包含される。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａだけでなく、ＶＥＧＦファミリーの他の成員と結合することができる。好ましくは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦファミリーの他の成員と相互作用することなく、ＶＥＧＦ−Ａと結合する。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦ（即ちＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９及び／又はＶＥＧＦ２０６）の少なくとも１つのアイソフォームと結合する。好ましい態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦの少なくとも２つのアイソフォーム、少なくとも３つのアイソフォーム、少なくとも４つのアイソフォーム、少なくとも５つのアイソフォーム、好ましくは全てのアイソフォームと結合する。別の好ましい態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦの１つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５又はＶＥＧＦ１６５等）、２つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１４５、又はＶＥＧＦ１４５及びＶＥＧＦ１６５、又はＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５等）、３つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５及びＶＥＧＦ１６５、又はＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６、又はＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８３等）、４つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８３、又はＶＥＧＦ１１０、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５及びＶＥＧＦ１６５等）、５つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３及びＶＥＧＦ１８６、又はＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３及びＶＥＧＦ２０６等）又は６つのアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９及び／又はＶＥＧＦ２０６等）と結合し得る。本発明の一態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは例えば、全ての可溶性アイソフォームと結合することができるが、ヘパリン結合アイソフォームとは相互作用しないか、又は本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、全てのヘパリン結合アイソフォームと結合することができるが、可溶性アイソフォームと相互作用しない。
また本発明はその最も広範な意味で、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが指向性を有するＶＥＧＦの特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）に特に限定されないか、又はこれによって規定されない。例えば、アミノ酸配列及びポリペプチドは、「相互作用部位」（本明細書中で規定）に指向性を有しても、又は有しなくてもよい。しかしながら一般的に好ましくはは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合部位に指向性を有するか（Keyt el al. J. Biol. Chem, 1996, 274: 5638-5646）、又はそうでなければ例えばＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの接近の立体障害によってＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦの結合を妨げることが可能であることが好ましいことが推測される。したがって、好ましいが、非限定的な一態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１に対する結合部位、及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対する結合部位に指向性を有し、本明細書中にさらに規定されるようなものである。好ましいが、非限定的な一態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位を構成する少なくとも１つのアミノ酸と相互作用する。
本発明の一態様において、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する。本発明の別の態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する。本発明のさらに別の態様では、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する。
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する本発明のアミノ酸配列を２つ以上含有し得る。一般的には、このようなポリペプチドは、本発明の単一のアミノ酸配列に比べて、増大した結合活性（avidity：親和力）でＶＥＧＦと結合する。このようなポリペプチドは例えば、ＶＥＧＦ（相互作用部位であっても、又はなくてもよい）の同じ抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）に指向性を有する本発明のアミノ酸配列を２つ含み得るか、又はＶＥＧＦ（相互作用部位であっても、又はなくてもよい）の第１の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）に指向性を有する本発明の少なくとも１つの「第１の」アミノ酸配列と、第１のアミノ酸配列とは異なるＶＥＧＦ（これも相互作用部位であっても、又はなくてもよい）の第２の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）に指向性を有する本発明の少なくとも１つの「第２の」アミノ酸配列とを含み得る。好ましくは、本発明のこのような「二重パラトピック（biparatopic）」ポリペプチドでは、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列が、相互作用部位（本明細書中に規定）に指向性を有するが、本発明はその最も広範な意味ではこれに限定されない。
また、標的が結合対部分（例えば、受容体−リガンド結合対）である場合、アミノ酸配列及びポリペプチドは、標的と結合する同族結合パートナー（例えば適用可能な場合、リガンド、受容体又は他の結合パートナー）と競合するようなもの、及び／又は結合パートナーと標的との結合を（完全に又は部分的に）中和するようなものであり得る。
また適用可能な場合、本発明のアミノ酸配列は、ＶＥＧＦの２つ以上の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造と結合することができることは、本発明の範囲内である。このような場合、本発明のアミノ酸配列及び／又はポリペプチドが結合する、ＶＥＧＦの抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、又はサブユニットは、本質的に同じであり得るか（例えば、ＶＥＧＦが反復構造モチーフを含有するか、又は二量体／多量体形態で生じる場合）、又は異なり得る（後者の場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、同じであり得るか、若しくは異なり得る親和性及び／又は特異性で、ＶＥＧＦのこのような異なる抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、又はサブユニットと結合し得る）。
また例えば、ＶＥＧＦが活性化立体構造及び不活性化立体構造で存在する場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、これらの立体構造のいずれか１つと、又はこれらの立体構造の両方と（即ち同じであり得るか、若しくは異なり得る親和性及び／又は特異性で）結合し得る。また例えば、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、（これも同じであり得るか、若しくは異なり得る親和性及び／又は特異性で）付属リガンドと（又は細胞外マトリクスにおける細胞表面ヘパリン含有プロテオグリカン等の細胞外マトリクスと）結合するＶＥＧＦの立体構造と結合し得るか、又は（可溶性の立体構造等の）付属リガンドと結合しないＶＥＧＦの立体構造と結合し得るか、又はこのような立体構造の両方と結合し得る。
また本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは一般的に、ＶＥＧＦの天然又は合成の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片全て、又は本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドがＶＥＧＦ（例えば野生型ＶＥＧＦ）で結合する抗原決定基（複数可）又はエピトープ（複数可）と本質的に同じである、１つ又は複数の抗原決定基又はエピトープを含有する、ＶＥＧＦの少なくともこれらの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片と結合することが予想される。また、このような場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列が（野生型）ＶＥＧＦと結合する親和性及び特異性と同じか、又は異なる（即ちこれより高いか、又は低い）親和性及び／又は特異性で、このような類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片と結合し得る。本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、ＶＥＧＦの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、一部及び断片によっては結合するものもあれば、結合しないものもあることも本発明の範囲内に含まれる。
ＶＥＧＦが単量体形態で、及び１つ又は複数の多量体形態（二量体形態等）で存在する場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、単量体形態のＶＥＧＦのみと結合するか、多量体形態のＶＥＧＦのみと結合するか、又は単量体形態及び多量体形態の両方のＶＥＧＦと結合することは本発明の範囲内である。ここでも同様に、このような場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列が多量体形態のＶＥＧＦと結合する親和性及び特異性と同じ又は異なる（即ちこれより高いか、又は低い）、親和性及び／又は特異性で単量体形態のＶＥＧＦと結合し得る。
またＶＥＧＦが他のタンパク質又はポリペプチドと結び付き、（例えば複数のサブユニットと）タンパク質複合体を形成することができる場合、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが、非結合状態のＶＥＧＦと、結合状態のＶＥＧＦと、又はその両方と結合することは本発明の範囲内である。これらの場合全て、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドが単量体で非結合状態のＶＥＧＦと結合する親和性及び特異性と同じ又は異なる可能性がある（即ちこれより高いか、より低い）親和性及び／又は特異性で、このような多量体又は結合タンパク質複合体と結合し得る。
また当業者にとって明らかなように、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドは、対応する単量体アミノ酸配列（複数可）より高い結合活性でＶＥＧＦと結合し得る。例えば、これに限定されないが、異なるＶＥＧＦのエピトープに指向性を有するアミノ酸配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体のそれぞれよりも高い結合活性で結合する可能性があり（通常は結合する）、またＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドは、より高い結合活性で多量体（二量体等）のＶＥＧＦと結合する可能性がある（通常は結合する）。本発明の一態様では、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、それぞれが異なるＶＥＧＦ受容体結合部位、即ちＶＥＧＦＲ−１に対する結合部位、及びＶＥＧＦＲ−２に対する結合部位に指向性を有するアミノ酸配列を２つ含有する。
概して当業者にとって明らかなように、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、少なくとも生物学的及び／又は治療的観点から最も関連があるこれらの形態のＶＥＧＦ（単量体、多量体及び結合形態を含む）と結合する。
本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を使用すること、及び／又は本明細書で想定される使用に好適である限り、１つ又は複数のこのような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は通常、ＶＥＧＦとの結合に機能的な抗原結合部位（の少なくとも一部）を含有し、より好ましくはＶＥＧＦと特異的に結合することができ、さらにより好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができる。このような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドの幾つかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになる。また本発明のさらなる断片又はポリペプチドは、本明細書に記載の１つ又は複数の（より小さい）部分又は断片を好適に混合することによって（即ち連結又は遺伝子融合によって）提供し得る。
本明細書でさらに記載される、具体的であるが、本発明の１つの非限定的な態様において、このような類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体は、それら由来のアミノ酸配列に比べて（本明細書にさらに記載されるように）増大した血清半減期を有する。例えば、本発明のアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列の誘導体の半減期が増大するように、（化学的に又は別の方法で）半減期を延長する１つ又は複数の基又は部分（例えばＰＥＧ）と連結し得る。
具体的ではあるが、非限定的な１つの態様では、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含むアミノ酸配列であり得るか、又は好適な条件（例えば生理的条件）下で（即ちフォールディングによって）免疫グロブリンフォールドを形成することができるアミノ酸配列であり得る。特にHalaby et al., J. （1999） Protein Eng. 12, 563-71による概説を参照する。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように適切にフォールディングする場合、このようなアミノ酸配列は、ＶＥＧＦと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができ、より好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができる。また、このようなアミノ酸配列の一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるようなものであるのが好ましい。
具体的であるが、非限定的に、本発明のアミノ酸配列は、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片（したがって通常、本明細書でさらに記載されるように、少なくとも１つのＣＤＲを形成するアミノ酸残基の少なくとも幾つかを含有する）であり得る。
本発明のアミノ酸配列は、具体的に免疫グロブリン配列又はその好適な断片、より具体的には免疫グロブリン可変ドメイン配列又はその好適な断片（例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）若しくはその好適な断片）であり得る。本発明のアミノ酸配列が重鎖可変ドメイン配列である場合、従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列（例えば、これに限定されないが、ヒト抗体由来のＶＨ配列）又はいわゆる（本明細書に規定の）「重鎖抗体」由来のいわゆる（本明細書に規定の）ＶＨＨ配列であり得る。
しかし本発明が、本発明のアミノ酸配列（又はこれを発現するのに使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関しても、また本発明のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を生成又は入手する（或いは生成又は入手している）方法に関しても限定されないことに留意すべきである。したがって本発明のアミノ酸配列は、（任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であり得る。具体的ではあるが、本発明の非限定的な態様では、アミノ酸は（任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であり、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」免疫グロブリン配列（例えば部分又は完全ヒト化マウス又はウサギ免疫グロブリン配列、及び特に部分又は完全ヒト化ＶＨＨ配列又はナノボディ）、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列、並びに親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の結合（combining）、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する（engineering）同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られる免疫グロブリン配列が含まれる。例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる記載及び従来技術を参照する。
同様に、本発明のヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド配列、又は合成若しくは半合成の配列であってもよく、例えばＰＣＲによって好適な天然鋳型から単離される配列（例えば細胞から単離されるＤＮＡ又はＲＮＡ）、ライブラリ（特に発現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、（それ自体が既知の任意の好適な技法（例えばミスマッチＰＣＲ）を使用して）天然ヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、又はそれ自体が既知のＤＮＡ合成のための技法を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
本発明のアミノ酸配列は特に、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（本明細書に規定のように、ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、或いはそれらのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の概要に関しては、上記で言及された従来技術、及び欧州特許第０３６８６８４号明細書を参照する。用語「ｄＡｂ」に関しては、例えばWard et al.（Nature 1989 Oct 12; 341 （6242）: 544-6）、Holtet al.（Trends Biotechnol.,2003, 21（11）:484-490）、例えば国際公開第０６／０３０２２０号パンフレット、国際公開第０６／００３３８８号パンフレット、及びDomantis Ltd.の他の公開特許出願を参照する。哺乳動物起源ではないため、本発明に関してあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、或る特定種のサメ由来である可能性があることにも留意すべきである（例えばいわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号パンフレットを参照されたい）。
特に本発明のアミノ酸配列は、（本明細書で規定の）ナノボディ（登録商標）又はその好適な断片（備考：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（Nanobodies）（登録商標）及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N. V.の登録商標である）。ＶＥＧＦに指向性を有するこのようなナノボディは、「本発明のナノボディ」とも称される。
ナノボディの概要に関しては、以下のさらなる記載、及び本明細書で言及される従来技術を参照する。しかしこれに関して、本明細書及び従来技術は主に、いわゆる「ＶＨ３クラス」のナノボディ（即ちＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のＶＨ３クラスのヒト生殖細胞系列との高度な配列相同性を有するナノボディ）を説明し、このナノボディは本発明の好ましい態様を形成することに留意すべきである。しかし概して、本発明は広義で、ＶＥＧＦに指向性を有する任意種のナノボディをカバーし、例えばAblynx N. V.によって２００６年４月１４日に出願された表題"DP-78-likeNanobodies"の米国仮特許出願第６０／７９２，２７９号明細書に記載されるように、例えばいわゆる「ＶＨ４クラス」に属するナノボディ（即ちＤＰ−７８等のＶＨ４クラスのヒト生殖細胞系列細胞に対して高度な配列相同性を有するナノボディ）もカバーすることに留意すべきである（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００３２５９号明細書も参照されたい）。
概して、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、（また本明細書にさらに記載される）１つ又は複数のフレームワーク配列において（本明細書に記載される）１つ又は複数の「特徴的な（Hallmark：ホールマーク）残基」の存在を特徴とし得る。
したがって概して、ナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を表し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を表し、１つ又は複数の特徴的な残基は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有するアミノ酸配列として定義することができる。
特にナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（式中、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を表し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を表し、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有するアミノ酸配列であり得る。
より具体的に、ナノボディは、（一般）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有するアミノ酸配列であり得る；ここで
ｉ）好ましくは、カバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数は、以下の表Ａ−３で言及した特徴的な（Hallmark：ハルマーク）残基から選択され、
ｉｉ）上記アミノ酸配列は、配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列番号１〜配列番号２２の配列においてＸで示す）は無視する。
これらのナノボディにおいて、ＣＤＲ配列は概して、本明細書中にさらに規定されるようなものである。
したがって、本発明は、ＶＥＧＦと（本明細書中で規定のように）結合することができるか、及び／又はＶＥＧＦに指向性を有するこのようなナノボディ、この好適な断片、及びこのようなナノボディ及び／又は好適な断片を１つ又は複数含むか、又は本質的にこれらから成るポリペプチドにも関する。
配列番号４８６〜配列番号５７５は、ＶＥＧＦに対して惹起している多くのＶＨＨ配列のアミノ酸配列を与える。
特に、本発明は幾つかの特定の態様において、
（本明細書中に規定のように）ＶＥＧＦに指向性を有し、且つ配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば９０％又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（これらのアミノ酸配列はさらに、同族リガンドと、ＶＥＧＦとの結合を中和するようなもの、及び／又はＶＥＧＦと結合する同族リガンドと競合するようなもの、及び／又はＶＥＧＦ上の（本明細書中に規定の）相互作用部位（リガンド結合部位等）に指向性を有するようなものであり得る）、
（本明細書中に規定のように）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つとＶＥＧＦとの結合を交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）する、及び／又はＶＥＧＦと結合する配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと競合するアミノ酸配列（またこれらのアミノ酸配列はさらに、同族リガンドと、ＶＥＧＦとの結合を中和するようなもの、及び／又はＶＥＧＦと結合する同族リガンドと競合するようなもの、及び／又はＶＥＧＦ上の（本明細書中に規定の）相互作用部位（リガンド結合部位等）に指向性を有するようなものであり得る）；
このアミノ酸配列は本明細書中にさらに記載し得る（例えばナノボディであり得る）；並びに（本明細書中でさらに記載し、且つ例えば本明細書中に記載の二重特異性及び／又は二重パラトピックのポリペプチドであり得る）このようなアミノ酸配列を１つ又は複数含む本発明のポリペプチド、並びにこのようなアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。このようなアミノ酸配列及びポリペプチドは、全く天然リガンドを含まない。
したがって、幾つかの特に好ましい本発明のナノボディは、（本明細書にさらに規定のように）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はこれに指向性を有するナノボディであり、
ｉ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する（またこれに関して、表Ａ−１を参照し、これは配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディのフレームワーク１配列（配列番号１２６〜配列番号１７０）、フレームワーク２配列（配列番号２１６〜配列番号２６０）、フレームワーク３配列（配列番号３０６〜配列番号３５０）及びフレームワーク４配列（配列番号３９６〜配列番号４４０）を列挙する）（フレームワーク１配列の１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基に関しては、以下で為されるコメントも参照する。したがって、アミノ酸同一性の程度を決定するためにこれらのアミノ酸残基は無視するのが好ましい）、
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリング（Kabat numbering）に従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、以下の表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される
これらのナノボディにおいて、概してＣＤＲ配列は、本明細書にさらに規定されるようなものである。
またこのようなナノボディは、任意で好適な方法で任意の好適な供給源から誘導されてもよく、例えば（好適なラクダ種由来の）天然ＶＨＨ配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であってもよく、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」ナノボディ、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、並びに本明細書にさらに記載されるように、親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の結合、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られるナノボディが含まれる。また、ナノボディがＶＨＨ配列を含む場合、当該ナノボディは、１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、本明細書でさらに記載されるように好適にヒト化し得る。同様に、ナノボディが合成又は半合成の配列（例えば部分ヒト化配列）を含む場合、当該ナノボディは、ここでもまた１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、ここでもまた本明細書で記載されるように任意でさらに好適にヒト化し得る。
特にヒト化ナノボディは、概してこれまでの段落でナノボディに関して規定されたようなものであるが、この中に（本明細書に規定の）ヒト化置換である、及び／又はヒト化置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（特にフレームワーク残基の少なくとも１つに）存在する。本明細書中の開示に基づいて当業者にとって、幾つかの好ましいが、非限定的なヒト化置換（及びその任意の組合せ）は明らかである。付加的に又は代替的に、天然ＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）の１つ又は複数を上記ＶＨＨ配列に（それ自体が既知の任意の方法で、本明細書にさらに記載のように）導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列を、親和性、標的、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性に関して試験することができる。このように、試行錯誤による限定によって、本明細書中の開示に基づき当業者によって、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を決定することができる。また上記に基づいて、ナノボディ（のフレームワーク領域）を部分ヒト化又は完全ヒト化してもよい。
幾つかの特に好ましい本発明のヒト化ナノボディは、配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディのヒト化変異体である。
したがって、幾つかの他の好ましい本発明のナノボディは、（本明細書にさらに規定のように）ＶＥＧＦと結合することができるナノボディであり、
ｉ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の１つのヒト化変異体であり、及び／又は
ｉｉ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する、且つ
ｉ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数が、以下の表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される。
本発明の別の特定の態様によれば、本発明は、ＶＥＧＦとの結合に特に適する多くのアミノ酸残基のストレッチ（即ち低分子ペプチド）を提供する。これらのアミノ酸残基のストレッチは、特に本発明のアミノ酸配列の抗原結合部位の（一部）を形成するように、本発明のアミノ酸配列に存在し得る、及び／又は組み込まれ得る。初めに、これらのアミノ酸残基のストレッチを重鎖抗体のＣＤＲ配列、又はＶＥＧＦに指向性を有するＶＨＨ配列として生成された（又は本明細書でさらに記載されるように、このようなＣＤＲ配列に基づき得る、及び／又はこれに由来し得る）ので、これらのアミノ酸残基のストレッチは概して、本明細書で「ＣＤＲ配列」（即ちそれぞれＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列）とも称される。しかし、本発明が広義で、これらのアミノ酸残基のストレッチによる本発明のアミノ酸配列とＶＥＧＦとの結合が可能である限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが本発明のアミノ酸配列中に有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意すべきである。したがって概して、本発明は広義で、全アミノ酸配列が、ＶＥＧＦと結合することができる結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するように、ＶＥＧＦと結合することができ、本明細書に記載の１つ又は複数のＣＤＲ配列及び特に２つ以上のこのようなＣＤＲ配列の好適な組合せを含み、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を介して互いに好適に連結する、任意のアミノ酸配列を含む。しかし、本発明のアミノ酸配列における１つだけのこのようなＣＤＲ配列の存在は、それ自体で既にＶＥＧＦと結合することができる本発明のアミノ酸配列を提供するのに十分であり得ることにも留意すべきである。例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号パンフレットに記載される、いわゆる「促進断片（Expedite fragments）」を参照する。
したがって別の具体的ではあるが、非限定的な態様において、本発明のアミノ酸配列は、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の好適な組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であり得る。特に、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列（又はそれらの任意の好適な組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む）を含むアミノ酸配列であり得る。
概して本発明のこの態様において、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチ（当該アミノ酸残基のストレッチは、本明細書に記載のＣＤＲ配列の少なくとも１つの配列に対応するアミノ酸配列を有する）を含む任意のアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含んでも、又は含んでいなくてもよい。例えば、これに限定されないが、このようなアミノ酸配列は、少なくとも１つのこのようなＣＤＲ配列を含むが、（完全）免疫グロブリンフォールドを形成するのに十分な大きさではない好適な免疫グロブリン配列の断片であり得る（例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号パンフレットに記載される、「促進断片」を参照する）。代替的に、このようなアミノ酸配列は、このようなＣＤＲ配列に対応する（即ちその抗原結合部位の一部として）少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含む、好適な「タンパク質足場」であり得る。アミノ酸配列を提示するのに好適な足場が当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、（本明細書に既に記載の免疫グロブリン配列以外の）免疫グロブリンに基づく若しくはこれに由来する結合足場、プロテインＡドメイン由来のタンパク質足場（例えばアフィボディ（Affibodies）（商標））、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計アンキリン反復、アビマー（avimers）及びＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech2005, Vol 23:1257）、並びにＤＮＡ又はＲＮＡに基づく結合部分（ＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含むが、これに限定されない）（Ulrich et al., Comb Chem HighThroughput Screen 2006 9（8）:619-32）が含まれる。
また、１つ又は複数のこれらのＣＤＲ配列を含む、任意の本発明のアミノ酸配列は、ＶＥＧＦと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができるようなものであるのが好ましい。
より具体的には、本発明のこの態様のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、（ｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、（ｉｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、或いは（ｉｉｉ）第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択される場合、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列又は本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、本明細書に記載のＣＤＲ２配列、及び本明細書に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される、少なくとも２つのアミノ酸配列を含む）を含む任意のアミノ酸配列であり得る。
さらにより具体的には、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つの抗原結合部位（当該抗原結合部位は、第１のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ１配列から選択され、第２のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ２配列から選択され、第３のアミノ酸配列が、本明細書に記載のＣＤＲ３配列から選択されるように、本明細書に記載のＣＤＲ１配列、本明細書に記載のＣＤＲ２配列、及び本明細書に記載のＣＤＲ３配列から成る群から選択される、少なくとも３つのアミノ酸配列を含む）を含むアミノ酸配列であり得る。ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の好ましい組合せは、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。当業者にとって明らかなように、このようなアミノ酸配列は、（本明細書にさらに記載のように）免疫グロブリン配列であるのが好ましいが、例えばまた上記ＣＤＲ配列を提示するのに好適な足場を含む、任意の他のアミノ酸配列であってもよい。
したがって具体的ではあるが、非限定的な１つの態様において、本発明は、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列であって、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、又は
任意の好適なこれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含む、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するａ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列は、対応するａ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ａ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
同様に本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するｄ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列は、対応するｄ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｄ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
また同様に本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列を含有する場合、
ｉ）（本明細書に規定のように）このようなｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列における任意のアミノ酸置換は好ましく、対応するｇ）によるアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列は、対応するｇ）によるアミノ酸配列に比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｇ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
概して上述の段落は、それぞれ１つ又は複数のｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列を含む、任意の本発明のアミノ酸配列にも適用することが理解されるべきである。
この特定の態様において、アミノ酸配列は、
ｉ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、又は
任意の好適なそれらの組合せから成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含むのが好ましい。
また好ましくはこのようなアミノ酸配列において、上記のアミノ酸残基のストレッチの少なくとも１つが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
より具体的ではあるが、さらに非限定的な態様において、本発明は、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列であって、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがａ）、ｂ）又はｃ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
この特定の態様において、アミノ酸配列は、
ｉ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、及び
ｉｉｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含むのが好ましく、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号２６１〜配列番号３０５又は配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号１７１〜配列番号２１５又は配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチが配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号１７１〜配列番号２１５又は配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の１つに対応する。
またこのようなアミノ酸配列において、少なくとも２つのアミノ酸残基のストレッチが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
さらにより具体的であるが、非限定的な態様において、本発明は、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列であって、３つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、アミノ酸残基の第１のストレッチが、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
アミノ酸残基の第２のストレッチが、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
アミノ酸残基の第３のストレッチが、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列に関する。
好ましくはこの特定の態様において、アミノ酸残基の第１のストレッチは、配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列から成る群から選択され、アミノ酸残基の第２のストレッチは、配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つアミノ酸残基の第３のストレッチは、配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列から成る群から選択される。
また好ましくはこのようなアミノ酸配列において、少なくとも３つのアミノ酸残基のストレッチが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する。
このようなアミノ酸配列のストレッチの好ましい組合せは、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
好ましくはこのようなアミノ酸配列において、ＣＤＲ配列が、配列番号４４１〜配列番号４８５の少なくとも１つのアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、９５％以上のアミノ酸同一性等、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する。例えば、（本明細書中に記載の方法で）上記アミノ酸配列と、１つ又は複数の配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列とのアミノ酸同一性の程度を求めることによって、このアミノ酸同一性の程度を決定することができ、ここではフレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。また、このような本発明のアミノ酸配列は、本明細書中でさらに記載するようなものであり得る。
またこのアミノ酸配列は、（本明細書に規定のように）ＶＥＧＦと特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができるようなものであるのが好ましい。
本発明のアミノ酸配列が、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る場合、本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択されるようなものであるのが好ましい。
特にこのような本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又はＣＤＲ２が配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又はＣＤＲ３が配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであり得る。
特に本発明のアミノ酸配列が、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る場合、本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択されるようなもの、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片であるのが好ましい。
特にこのような本発明のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１が配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つＣＤＲ２が配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列から成る群から選択され、且つＣＤＲ３が配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであり得る。
また、ＣＤＲ配列の好ましい組合せは、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
またこのアミノ酸配列は、（本明細書に規定のように）ＶＥＧＦと特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合することができるようなものであるのが好ましい。
好ましいが、非限定的な１つの態様において本発明は、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成るアミノ酸配列であって、アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、９５％以上のアミノ酸同一性等、又はさらに実質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、アミノ酸配列に関する。このアミノ酸同一性の程度は、上記アミノ酸残基と、配列番号４４１〜配列番号４８５の１つ又は複数の配列との間のアミノ酸同一性の程度を（本明細書に記載の方法で）求めることによって決定することができる（フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する）。このような本発明のアミノ酸配列は、本明細書にさらに記載されるようなものであり得る。
このような本発明のアミノ酸配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、又は（例えばヒト化又はラクダ化によって）免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されているフレームワーク配列（の好適な組合せ）であるのが好ましい。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されているフレームワーク配列であり得る。特に好ましい１つの態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（当該フレームワーク配列は任意で、部分又は完全ヒト化し得る）から誘導されているか、又は（本明細書に規定のように）ラクダ化した従来のＶＨ配列であるいずれかのフレームワーク配列である。
フレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であるようなものであるのが好ましい。また、好適なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
特に、本発明のアミノ酸配列に存在するフレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列がナノボディ（商標）になるように（本明細書に規定の）特徴的な残基の１つ又は複数を含有し得る。このようなフレームワーク配列（の好適な組合せ）の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
また概して、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書に記載のように、上記のいずれかの好適な断片（又は断片の組合せ）（例えば１つ又は複数のフレームワーク配列に好適に隣接した、及び／又はこれを介して連結した、１つ又は複数のＣＤＲ配列を含有する断片）を使用することも可能である（例えばこれらと同じ配列（order）で、ＣＤＲ配列及びフレームワーク配列は、断片が誘導された完全長の（full-sized：フルサイズの）免疫グロブリン配列で発生し得る。またこのような断片は、免疫グロブリンフォールドを含むか、若しくは形成することができるようなもの、又は代替的に免疫グロブリンフォールドを含まないか、若しくは形成することができないようなものであってもよい。
１つの特定の態様において、このような断片は、本明細書に記載の単一ＣＤＲ配列（特にＣＤＲ３配列）を含み、フレームワーク配列（の一部）（特に断片が誘導される免疫グロブリン配列において当該ＣＤＲ配列に隣接するフレームワーク配列（複数可）の一部）が両側に位置する。例えば、ＣＤＲ３配列は、ＦＲ３配列（の一部）の後にあり、ＦＲ４配列（の一部）の前にあり得る。このような断片はまた、ジスルフィド架橋、特にそれぞれＣＤＲ配列の前後にある２つのフレームワーク領域と連結するジスルフィド架橋を含有してもよい（このようなジスルフィド架橋を形成するために、当該フレームワーク領域で自然発生するシステイン残基を使用するか、又は代替的にシステイン残基を当該フレームワーク領域に合成的に付加若しくは導入してもよい）。これらの「促進断片」のさらなる説明に関しては、ここでもまた国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット、及び２００６年１２月５日に出願されたAblynx N. V.の”Peptides capable of binding toserum proteins”と題する米国仮出願（発明者：Revets, Hilde AdiPierrette; Kolkman, Joost Alexander;及びHoogenboom,Hendricus Renerus Jacobus Mattheus）（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８号明細書も参照されたい）を参照する。
別の態様において本発明は、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチド（それぞれ「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」とも称される）であって、１つ又は複数の本発明のアミノ酸（又はその好適な断片）を含むか、或いは本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチドに関する。本明細書中のさらなる開示から当業者にとって明らかになるように、このようなさらなる基、残基、部分、結合単位又はアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列（及び／又は存在する化合物又は構築物）に対するさらなる機能性を与えても、又は与えなくてもよく、本発明のアミノ酸配列の特性を変えても、又は変えなくてもよい。
例えば、このようなさらなる基、残基、部分又は結合単位は、化合物又は構築物が（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドになるように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列であり得る。好ましいが、非限定的な態様において、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディ（登録商標）から成る群から選択される。
代替的に、このような基、残基、部分又は結合単位は例えば、化学的な基、残基、部分（それ自体が生物学的に及び／又は薬理学的に有効であっても、又は有効でなくてもよい）を有し得る。例えば、これに限定されないが、このような基は、本明細書にさらに記載されるように、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供するように、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列と連結し得る。
本明細書に記載のように、１つ又は複数の誘導体を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物も本発明の範囲内である。好ましくは、当該１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位はアミノ酸配列である。
上記の化合物又は構築物において、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、及び１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位は、互いに直接、及び／又は１つ又は複数の好適なリンカー又はスペーサを介して連結してもよい。例えば、１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である場合、リンカーは、得られる化合物又は構築物が融合（タンパク質）又は融合（ポリペプチド）になるようにアミノ酸配列であってもよい。
概して本発明の化合物又はポリペプチドは、本発明の化合物又はポリペプチドを提供するように、任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列と、１つ又は複数のさらなる基、残基、部分又は結合単位とを好適に連結する工程を少なくとも１つ含む方法で調製することができる。本発明のポリペプチドは、概して少なくとも本発明のポリペプチドをコードする核酸を準備する工程と、好適な方法で当該核酸を発現する工程と、発現した本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む方法で調製することもできる。このような方法は、それ自体が既知の方法で行うことができ、例えば本明細書にさらに記載の方法及び技法に基づいて、当業者にとって明らかである。
本発明のアミノ酸配列から本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択、及び／又は調製する方法は、本明細書では当該本発明のアミノ酸配列を「フォーマットする（formatting）」とも称され、本発明の化合物又はポリペプチドの一部を構成する本発明のアミノ酸は、「フォーマットされた（formatted）」、或いは当該本発明の化合物又はポリペプチド「のフォーマット形態（inthe format of）」であるといわれる。本発明のアミノ酸配列をフォーマットすることができる方法の例及びこのようなフォーマットの例が、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、このようなフォーマットされたアミノ酸配列は、本発明のさらなる態様を形成する。
本発明の１つの特定の態様において、本発明の化合物、又は本発明のポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列に比べて増大した半減期を有し得る。このような化合物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えば半減期が増大するように（例えばペグ化によって）化学修飾された本発明のアミノ酸配列又はポリペプチド、血清タンパク質（例えば血清アルブミン、欧州特許第０３６８６８４号明細書、４頁を参照されたい）と結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のアミノ酸配列、又は本発明のアミノ酸配列の半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）と連結する少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドが含まれる。このような半減期が延長した部分又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその好適な断片）、或いは血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の結合単位と好適に連結するポリペプチド（例えばドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）等の血清タンパク質又はトランスフェリンと結合することができるナノボディ、さらなる記載及び本明細書で言及される参考文献を参照する）；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）又はその好適な一部若しくは断片と連結するポリペプチド；或いは１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の低分子タンパク質又はペプチドと好適に連結するポリペプチドが含まれる（例えば、これに限定されないが、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット、国際公開第０２／０７６４８９号パンフレット、及び２００６年１２月５日に出願されたAblynx N. V.の”Peptides capable of binding toserum proteins”と題する米国仮出願（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８号明細書も参照されたい）に記載のタンパク質及びペプチド）。
概して、半減期が増大した、本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、少なくとも１０倍等、又は２０倍を超えて大きい半減期を有するのが好ましい。例えば、半減期が増大した、本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、１２時間等を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する半減期を有し得る。
好ましいが、本発明の非限定的な態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、１２時間等を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する血清半減期を有する。
別の好ましいが、本発明の非限定的な態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチド（又はその好適な断片）をコードする核酸に関する。このような核酸は、本明細書で「本発明の核酸」とも称され、例えば本明細書でさらに記載されるように遺伝的構築物の形態であり得る。
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のポリペプチドを発現し（又は好適な環境下で発現することができ）、及び／又は本発明の核酸を含有する、宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、少なくとも１つの本発明のポリペプチド（又はその好適な断片）、及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸、及び任意で（即ち組成物の目的とする用途に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含有するか又は含む産物又は組成物に関する。このような産物又は組成物は例えば、（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（本明細書にも記載の）診断用途のための産物又は組成物であり得る。このような産物又は組成物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ又は細胞アッセイ）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば単一細胞又は多細胞生物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒト、例えば「挿入疾患及び障害（insert diseases and disorders）」の危険性があるか、又はそれを患うヒト）のいずれかでのＶＥＧＦの調節（のための方法又は組成物）における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ若しくはポリペプチド、又はこれを含む組成物の使用にも関する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ又は細胞アッセイ）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば単一細胞又は多細胞生物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒト、例えば過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の危険性があるか、又はそれを患うヒト）のいずれかでＶＥＧＦを調節する方法であって、少なくとも本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの少なくとも１つでＶＥＧＦを調節するのに適した方法及び量で、ＶＥＧＦを本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列、ナノボディ若しくはポリペプチド、又はこれを含む組成物に接触させる工程を含む、調節する方法にも関する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ又は細胞アッセイ）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば単一細胞又は多細胞生物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒト、例えば過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の危険性があるか、又はそれを患うヒト）のいずれかでＶＥＧＦを調節するための組成物（例えば、これに限定されないが、本明細書中にさらに記載の薬学的組成物又は製剤）の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの１つの使用にも関する。
本発明に関して、「調節すること（"modulating" or "to modulate"）」は概して、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば本明細書で言及されるもの）を用いて測定されるように、ＶＥＧＦの活性を低減若しくは阻害、又は代替的にＶＥＧＦの活性を増大させることのいずれかを意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば本明細書で言及されるもの）を用いて測定されるように、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下で同じアッセイでのＶＥＧＦの活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％等若しくは少なくとも２５％、少なくとも５０％等、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上ＶＥＧＦの活性を低減若しくは阻害、又は代替的にＶＥＧＦの活性を増大させることのいずれかを意味し得る。
また当業者にとって明らかなように、「調節すること」は、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下に比べて、１つ又は複数のその標的、リガンド又は基質に対するＶＥＧＦの親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又はＶＥＧＦが存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対するＶＥＧＦの感度を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）を伴い得る。当業者にとって明らかなように、任意の好適な方法で、及び／又は本明細書中に記載の、若しくは本明細書中で言及した従来技術におけるアッセイのようなそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを使用してさらにこれを求めてもよい。
「調節すること」は、ＶＥＧＦが関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、シグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、反応、機能、経路又は活性に関して変化させる（即ちそれぞれ、アゴニスト又はアンタゴニストとしての活性を与える）ことも意味し得る。さらに、当業者にとって明らかなように、任意の好適な方法で、及び／又は本明細書中に記載の、若しくは本明細書中で言及した従来技術におけるアッセイのようなそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ内（in assay））アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのこのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
例えば調節は、ＶＥＧＦとその基質又はリガンドの１つとの結合を低減又は阻害すること、及び／又はＶＥＧＦとの結合に対して、天然のリガンド、基質と競合することを伴い得る。ＶＥＧＦとその受容体との結合の阻害又は遮断によって、例えば本明細書中で記載の様々な癌、腫瘍及び癌腫、並びに関節リウマチ、ＡＭＤ、乾癬等の非新生物疾患（上記を参照されたい）における過度の血管形成及び／又は血管新生の作用が低減し得る。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける血管形成及び／又は血管新生に比べて、過度の血管形成及び／又は血管新生を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上低減する。
一態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害及び／又は遮断する。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける結合に比べて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上阻害する。
別の態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害及び／又は遮断する。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける結合に比べて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上阻害する。
別の態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害及び／又は遮断する。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける結合に比べて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上阻害する。
別の態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害及び／又は遮断する。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける結合に比べて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上阻害する。
さらに別の態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害及び／又は遮断する。好ましくは、同じであるが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが存在しない条件下での同じアッセイにおける結合に比べて、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及び／又はＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上阻害する。
調節は、（例えば半減期が増大した、本発明のアミノ酸又はポリペプチドで）ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化することを伴ってもよく、このことは、例えば末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）及び血管再生虚血性心臓組織等の虚血性症状の治療に関連し得る。
調節は、可逆であっても又は不可逆であってもよいが、薬学的目的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物を製造又は生成する方法に関する。このような方法の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
概してこれらの方法は、
ａ）アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するアミノ酸配列に関して、上記のアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するアミノ酸配列（複数可）を単離する工程とを含み得る。
このような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、任意の好適なアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、（本明細書に記載の）免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ（例えば免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリ）であり得る。
またこのような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメイン又はＶＨＨドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリであり得る。例えば、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体のセット、コレクション若しくはライブラリであり得るか、又はドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として機能することができるアミノ酸配列のセット、コレクション若しくはライブラリであり得る。
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物由来の免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法において、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（例えば酵母）上に提示してもよい。アミノ酸配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによる総説も参照する。
別の態様において、アミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列を発現する細胞のコレクション又はサンプルを準備する工程と、
ｂ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又はサンプルをスクリーニングする工程と、
ｃ）（ｉ）上記アミノ酸配列を単離する工程、又は（ｉｉ）当該アミノ酸配列をコードする核酸配列を上記細胞から単離し、その後当該アミノ酸配列を発現する、単離する工程のいずれかとを含む。
例えば、所望のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である場合、細胞のコレクション又はサンプルは例えば、Ｂ細胞のコレクション又はサンプルであり得る。また、この方法では、細胞のサンプルは、ＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物に由来し得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法は、当業者にとって明らかなように任意の好適な方法で行われ得る。例えば欧州特許第０５４２８１０号明細書、国際公開第０５／１９８２４号パンフレット、国際公開第０４／０５１２６８号パンフレット及び国際公開第０４／１０６３７７号パンフレットを参照する。工程ｂ）のスクリーニングは、ＦＡＣＳ等のフローサイトメトリ技法を使用して行うのが好ましい。これに関しては、例えばLieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)を参照する。
別の態様において、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に関して、上記の核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）上記核酸配列を単離し、その後当該アミノ酸配列を発現する、単離する工程とを含み得る。
このような方法では、アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、免疫グロブリン配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ、免疫グロブリン配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けている免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
またこのような方法では、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、重鎖可変ドメイン（例えばＶＨドメイン又はＶＨＨドメイン）又は軽鎖可変ドメインのセット、コレクション又はライブラリをコードし得る。例えば、核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体のセット、コレクション若しくはライブラリ、又はドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体として機能することができるアミノ酸配列のセット、コレクション若しくはライブラリをコードし得る。
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与した哺乳動物由来の核酸配列の免疫セット、コレクション又はライブラリであり得る。１つの特定の態様では、当該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインの免疫セット、コレクション又はライブラリをコードし得る。１つの特定の態様では、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、ＶＨＨ配列のセット、コレクション又はライブラリをコードし得る。
上記の方法において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（例えば酵母）上に提示してもよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによる総説も参照する。
本発明は、上記の方法、又は代替的に上記の方法の１つと、さらに少なくとも上記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する工程と、それ自体が既知の方法において、例えば好適な宿主細胞若しくは宿主生物における発現によって、又は化学合成によって当該アミノ酸配列を発現又は合成する工程とを含む方法によって得られるアミノ酸配列にも関する。
また上記の工程の後に、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は好適にヒト化（又は代替的にラクダ化）してもよく、及び／又はこのようにして得られたアミノ酸配列（複数可）は、本発明のポリペプチドを提供するために、（任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して）互いに或いは１つ又は複数の他のアミノ酸配列と連結してもよい。また、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、好適にヒト化（又は代替的にラクダ化）、及び好適に発現してもよく、及び／又は本発明のアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸配列は、（任意で１つ又は複数の好適なリンカーをコードするヌクレオチド配列を介して）互いに或いは他の好適なアミノ酸配列をコードする１つ又は複数の核酸配列と連結してもよく、その後このようにして得られたヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドを提供するために好適に発現してもよい。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、化合物、構成物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物の適用及び使用に、並びにＶＥＧＦに関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが、非限定的な適用及び使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明は、治療に使用する、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物にも関する。
詳細には、本発明は、それを必要とする被験者に、（薬学的に有効な量の）本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、構築物又はポリペプチドを投与することによって予防又は治療することができる疾患又は障害の治療に使用する、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物にも関する。
より詳細には、本発明は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の治療に使用する、アミノ酸配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物に関する。
また本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになり、本発明は、本発明のナノボディ及びこれを含む本発明のポリペプチド（これらは本発明の好ましい態様の幾つかを形成する）に関してより詳細に説明及び考察する。
本明細書中のさらなる記載から明らかになるように、一般的にナノボディは、「ｄＡｂ」又は同様の（単一）ドメイン抗体又は免疫グロブリン配列に比べて（本明細書で概説される）或る特定の利点があり、この利点は本発明のナノボディでも与えられる。しかし、以下の教示のより一般的な態様を、（直接又は同じように）他の本発明のアミノ酸配列に適用することもできることは、当業者にとって明らかである。
［発明の詳細な説明］
本発明の上記及び他の態様、実施の形態及び利点は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本明細書、実施例及び特許請求の範囲において：
ａ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は当該技術分野における通常の意味を有し、当業者にとって明らかである。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）, Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）、F. Ausubelet al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th.Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al., "Immunobiology"（6th Ed.）, Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone, New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
ｂ）特に他に指示がなければ、用語「免疫グロブリン配列」は、本明細書で重鎖抗体に言及するのに使用されるのか又は従来の４鎖抗体に言及するのに使用されるかに関係なく、全長抗体、その個々の鎖、及びその一部、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語で）本明細書で使用される用語「配列」は一般的に、文脈上さらなる限定的な解釈が要求される場合を除き、関連のアミノ酸配列と、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むと理解されるべきである。また、本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」は、該ヌクレオチド配列を有する核酸分子も包含し、そのため「ヌクレオチド配列」及び「核酸」は同等であると考えられ、本明細書中で区別なく使用されるものとする。
ｃ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施する。また例えば、例えば標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献並びに以下の総説、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin andWeiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J.Immunol. Methods,2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12,Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を記載している）を参照する。
ｄ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
ｅ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、第１のヌクレオチド配列に比べて、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異と考えられる。
代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、欧州特許第０９６７２８４号明細書、欧州特許第１０８５０８９号明細書、国際公開第００／５５３１８号パンフレット、国際公開第００／７８９７２号パンフレット、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット及び英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書に記載されている。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
ｆ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」と称される）のパーセントを算出することができ、第１のアミノ酸配列に比べて、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」と考えられる。
代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットから当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、関連の教示に基づいて国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献から選択することができる。
このような保存的な置換は、以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman,Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149,1978によって開発された構造形成可能性（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte& Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1、及びGoldmanet al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al., Natural StructuralBiology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
ｇ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言える。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差異」は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
ｉ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「含む」、又は別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から本質的に成る」というとき、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に組み込まれていることを意味するが、より一般的に概してこれは、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、（例えば本明細書に記載の任意の好適な方法によるものであり得る）実際にどのように初めに言及された配列を生成又は入手するかに関係なく、その配列内にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例によって、本発明のナノボディがＣＤＲ配列を含むというとき、これは、当該ＣＤＲ配列が、本発明のナノボディに組み込まれていることを意味するが、より一般的に概してこれは、本発明のナノボディが、どのように当該本発明のナノボディを生成又は入手するかに関係なく、その配列内に当該ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。後者のアミノ酸配列は、特異的な生物学的又は構造的な機能を有する場合、初めに言及されたアミノ酸配列において本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を有するのが好ましい（言い換えれば、初めに言及されたアミノ酸配列は、後者の配列が本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を果たすことができるようなものであるのが好ましい）ということにも留意すべきである。例えば、本発明のナノボディがそれぞれ、ＣＤＲ配列又はフレームワーク配列を含むというとき、ＣＤＲ配列及びフレームワークはそれぞれ、当該ナノボディでＣＤＲ配列又はフレームワーク配列として機能することができるのが好ましい。また、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むというとき、初めに言及されたヌクレオチド配列は、発現産物（例えばポリペプチド）で発現する場合、後者のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列が当該発現産物の一部を形成するようなもの（言い換えれば後者のヌクレオチド配列が、初めに言及されたより大きなヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内にあるようなもの）であるのが好ましい。
ｊ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常当該供給源又は媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分から単離されている場合、（例えばその天然の生物学的供給源及び／又はそれから得られる反応媒体又は培養媒体に比べて）「本質的な単離（形態）」であると見なされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離」すると考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して求められるように、本質的に相同であるのが好ましい。
ｋ）本明細書で使用される用語「ドメイン」は概して、アミノ酸配列の球状領域（例えば抗体鎖、特に重鎖抗体の球状領域）又は本質的にこのような球状領域から成るポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。用語「結合ドメイン」は（本明細書で規定されるように）抗原決定基に対して指向性を有するようなドメインを表す。
ｌ）用語「抗原決定基」は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）によって、及びより具体的には当該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、本明細書で区別なく使用することもできる。
ｍ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、当該抗原決定基、当該エピトープ、当該抗原又は当該タンパク質「に対する」、又は「に指向性を有する」と言われる。
ｎ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原結合基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位との間の結合力に関する評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の測定基準である。結合活性は、抗原結合分子上での抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性で所望の抗原と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性（ＫＤ＝１／ＫＡ）から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。
親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤ即ち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値で分子相互作用の強さを特定することを、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）と関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
有意（例えば特異的）と見なされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、ＫＤは低くなる。
ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。結合速度ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。結合速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用によって拡散律速結合速度定数に近づき得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサチップ上に固定され、もう１つの分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定分子上を通る）で測定することができる。例えば、既知のBIACOREの機器を使用してこれを実施することができる。
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artifact：人工産物）によって、示唆分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかである。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性に影響を与え得る。
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods, 77, 305-19,1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子の１つの吸着に関連すると考えられ得るアーチファクトが避けられる。
しかし、ＫＤの正確な測定値はかなりの労働集約型である可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定値が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして処理されるべきであることに留意すべきである。
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子に関して結合親和性を決定するのに都合がいいと判断することができることに留意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、且つＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするために、フルオロフォア若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、或いは他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持し、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化する。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃで測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆからＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
ｏ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は一般的に、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％まで低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドを温血動物（即ち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス）及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス））に好適に投与する工程と、血液サンプル又は他のサンプルを当該動物から採取する工程と、当該血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％に低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば、以下の実験部部分、及び標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbookfor Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis:A Practical Approach（1996））を参照する。"Pharmacokinetics", MGibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition（1982）も参照する。
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣのいずれか又は両方は増大しても或いは増大しなくてもよい。
ｐ）本発明に関して、「調節すること」は一般的に、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して測定するような標的又は抗原の活性の低減若しくは阻害のいずれか、又は代替的に活性の増大を意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（通常関与する標的又は抗原によって変わる）を用いて測定するように、同じであるが、本発明の構築物が存在しない条件下での同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上標的又は抗原の活性を低減又は阻害すること、代替的に（関連又は対象の）生物学的活性を増大することを意味し得る。
当業者にとって明らかなように、「調節すること」は、同じであるが、本発明の構築物が存在しない条件下に比べて、１つ又は複数のそのリガンド、結合パートナー、ホモマルチマー形態若しくはヘテロマルチマー形態で結び付くパートナー又は基質の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又は標的又は抗原が存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感度を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）を伴い得る。当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを用いてさらにこれを求めてもよい。
「調節すること」は、標的又は抗原が関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、シグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、反応、機能、経路又は活性に関して変化させる（即ち標的又は抗原及び所望の生物学的作用若しくは生理学的作用に応じて、それぞれ、アゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストとしての活性を与える）ことも意味し得る。ここでも同様に、当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ内）アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのこのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのこのような作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、同じであるが、本発明の構築物が存在しない条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
調節は例えば、標的又は抗原のアロステリック調節、及び／又は標的又は抗原とその基質又はリガンドの１つとの結合の低減又は阻害及び／又は標的又は抗原との結合に対する基質である天然リガンドとの競合も伴い得る。調節は、標的若しくは抗原、又はそれが関与する機構若しくは経路を活性化することも伴い得る。調節は、標的若しくは抗原のフォールディング若しくは立体構造に関して、又は標的若しくは抗原がフォールディングする能力、（例えばリガンドの結合の際に）その立体構造を変更する能力、他の（サブ）ユニットと結び付く能力、又は解離する能力に関して変化させることも伴い得る。調節は例えば、標的若しくは抗原が、他の化合物を移動させる能力、又は他の化合物（イオン等）に対するチャネルとして働く能力を変化させることも伴い得る。
調節は、可逆であっても又は不可逆であってもよいが、薬学的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
ｑ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、リガンド、受容体若しくは他の結合パートナーとの結合に関する部位、触媒部位、開裂部位、アロステリック相互作用に関する部位、標的又は抗原の多量体化（ホモマー化又はマルチマー化等）に関与する部位である、標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定部位、部分、ドメイン又はストレッチ、或いは標的又は抗原の生物学的作用又は機構に関与する標的又は抗原上のアミノ酸残基の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチのいずれかを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが、（本明細書中に規定のように）標的又は抗原（及び／又は標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的作用）を調節するように結合することができる、標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチのいずれかであり得る。
ｒ）アミノ酸配列又はポリペプチドは、該アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、及び最大１００００倍以上良好な親和性（上記のように、好適にＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度と表す）で第１の抗原と結合する場合、第２の標的又は抗原と比べて、第１の標的又は抗原「に特異的」であるといえる。例えば、第１の抗原は、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、及び好ましくは少なくとも１０００分の１、例えば１００００分の１以下のＫＤ値で標的又は抗原と結合し得る。好ましくは、アミノ酸配列又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原に比べて第１の標的又は抗原「に特異的」である場合、そのアミノ酸配列又はポリペプチドは、（本明細書中に規定のように）該第１の標的又は抗原に指向性を有するが、該第２の標的又は抗原に対しては指向性を有しない。
ｓ）用語「交差遮断（"cross-block", "cross-blocked" and"cross-blocking"）」は、本明細書中で区別なく使用し、アミノ酸配列又は他の結合剤（本発明のポリペプチド等）が、他の本発明のアミノ酸配列又は結合剤と所定の標的との結合を妨げる能力を意味する。本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が別のアミノ酸配列又は他の結合剤と該標的との結合を妨げることができる範囲、ひいては本発明に従って交差遮断するということができるか否かを、競合結合アッセイ（本明細書中で「交差遮断アッセイ」とも呼ばれる）を使用して求めることができる。１つの特に好ましい定量的な交差遮断アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の範囲を測定することができるビアコア機器を使用する。別の好適な定量的な交差遮断アッセイは、標的とのこれらの結合に関して、アミノ酸配列又は他の結合剤間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
概して以下に、アミノ酸配列又は他の結合剤が、本発明に従って交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否かを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列又は他の結合剤のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。ビアコア機器（例えばビアコア３０００）は、製造元の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイでは、標的でコーティングする表面を作製するのに、標準的なアミンカップリングケミストリを用いて、標的タンパク質をＣＭ５ビアコアチップと連結させる。典型的に２００個〜８００個の標的の共鳴単位をチップに連結させる（容易に測定可能なレベルの結合を与えるが、使用する試験試薬の濃度によって容易に飽和することができる量）。互いに交差遮断する能力を評価する、２つの試験アミノ酸配列（Ａ＊及びＢ＊と呼ばれる）又は他の結合剤を、好適なバッファー中で、１：１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を算出する場合、アミノ酸配列又は他の結合剤の分子量は、アミノ酸配列又は他の結合剤の全分子量を、このアミノ酸配列又は他の結合剤上の標的結合部位の数で除算したものであると見なす。試験混合物中の各アミノ酸配列又は他の結合剤の濃度は、ビアコアチップ上に捕捉された標的分子上のこのアミノ酸配列又は他の結合剤に対する結合部位を容易に飽和するのに十分高いものとする。混合物中のアミノ酸配列又は他の結合剤は、典型的に（結合部位ベースで）１．００マイクロモル〜１．５マイクロモルである（結合部位ベースの）モル濃度と同じである。Ａ＊及びＢ＊を単独で含有する分離溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、試験混合物と同じバッファー中で、且つ同じ濃度であるとする。試験混合物を標的コーディングビアコアチップに通し、結合総量を記録する。それから、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列又は他の結合剤を取り除くようにチップを処理する。典型的に、チップを３０ｍＭのＨＣｌで６０秒処理することによってこれを行う。その後、Ａ＊単独の溶液を標的コーディング表面に通し、結合量を記録する。さらに、チップを処理し、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列又は他の結合剤を全て取り除く。それから、Ｂ＊単独の溶液を標的コーディング表面に通し、結合量を記録する。次に、Ａ＊とＢ＊との混合物の理論最大結合を算出し、これは単独で標的表面を通した際の各アミノ酸配列又は他の結合剤の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論最大よりも小さい場合、２つのアミノ酸配列又は他の結合剤は互いに交差遮断している。このように概して、交差遮断する本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤は、アッセイ中、及び本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で、記録された結合が、組合せた２つのアミノ酸配列又は結合剤の最大理論結合（直前に規定）の８０％〜０．１％（例えば８０％〜４％）、具体的に最大理論結合の７５％〜０．１％（例えば７５％〜４％）、及びより具体的に最大理論結合の７０％〜０．１％（例えば７０％〜４％）であるように、上記のビアコア交差遮断アッセイで標的と結合するものである。上記のビアコアアッセイは、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差遮断するかどうかを求めるのに使用する主なアッセイである。稀に、特定のアミノ酸配列又は他の結合剤が、ＣＭ５ビアコアチップとアミンケミストリを介して連結した標的と結合しないことがある（通常、標的上の関連の結合部位がチップとの連結によって塞がれるか、又は破壊される場合にこれが起こる）。このような場合、標識型、例えばＮ末端Ｈｉｓ標識型の標的を用いて交差遮断を求めることができる。この特定のフォーマットで、抗Ｈｉｓアミノ酸配列をビアコアチップに連結させた後、Ｈｉｓ標識した標的をチップの表面上に通し、抗Ｈｉｓアミノ酸配列で捕捉する。各チップ再生サイクル後に、抗Ｈｉｓアミノ酸配列コーティング表面上に、新たなＨｉｓ標識した標的を充填し戻すことを除いて、本質的に上記のように、交差遮断解析を行う。Ｎ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用するとして与えられた例の他に、代替的にＣ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用することができる。
さらに、当該技術分野で既知の様々な他の標識及び標識結合タンパク質の組合せをこのような交差遮断解析に使用することができる（例えば、抗ＨＡ抗体によるＨＡ標識；抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ標識；ストレプトアビジンによるビオチン標識）。概して以下に、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は他の結合剤が、本明細書中に規定のように、交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否か求めるＥＬＩＳＡアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列（又は本発明のポリペプチド等の他の結合剤）のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。このアッセイの一般原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングした標的に指向性を有するアミノ鎖配列又は結合剤を有することである。過剰量の第２の、潜在的に交差遮断する抗標的アミノ酸又は他の結合剤を溶液中に添加する（即ちＥＬＩＳＡプレートと結合しない）。それから、限定量の標的をウェルに添加する。コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤と溶液中のアミノ酸配列又は他の結合剤とは、限定数の標的分子の結合に対して競合する。プレートを洗浄し、コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤と結合していない過剰な標的を取り除き、また第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤及び第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤と標的との間に形成される任意の複合体を取り除く。その後、標的を検出するのに適切な試薬を使用して、結合標的の量を測定する。コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤を交差遮断することができる溶液中のアミノ鎖配列又は結合剤によって、第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤の非存在下でコーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤と結合する標的分子の数に比べて、コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤と結合する標的分子の数を低減させることができる。アミノ酸配列又は他の結合剤を固定化させるように、第１のアミノ酸配列又は他の結合剤、例えばＡｂ−Ｘを選択する場合、第１のアミノ酸配列又は他の結合剤をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後、プレートを好適な遮断溶液で遮断し、その後添加する試薬の非特異的な結合を最小にする。Ａｂ−Ｙ標的結合部位の１つのウェル当たりのモルが、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中に使用したＡｂ−Ｘ標的結合部位の１つのウェル当たりのモルの少なくとも１０倍になるように、過剰量の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤、即ちＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。それから、添加した標的の１つのウェル当たりのモルが、各ウェルをコーティングするのに使用したＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルの少なくとも２５分の１になるように、標的を添加する。好適なインキュベート期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出する試薬を添加し、コーティングした抗標的アミノ酸配列又は他の結合剤（この場合、Ａｂ−Ｘ）と特異的に結合した標的の量を測定する。アッセイに関するバックグラウンドシグナルは、コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤（この場合、Ａｂ−Ｙ）、標的バッファーのみ（即ち標的を添加しない）及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。アッセイに関する陽性対照シグナルは、コーティングしたアミノ酸配列又は他の結合剤（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤バッファーのみ（即ち第２の溶液相のアミノ酸配列又は他の結合剤を添加しない）、標的及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍になるように、ＥＬＩＳＡアッセイを行い得る。どのアミノ酸配列をコーティングアミノ酸配列又は他の結合剤として使用し、どのアミノ酸配列を第２の（競合）アミノ酸配列又は他の結合剤として使用するかという選択に起因する任意のアーチファクト（artefects）（例えば有意に異なる、標的に対するＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙとの親和性）を避けるために、架橋遮断アッセイを２つのフォーマットで行い得る：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｙが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合であり、また２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｘが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１又はフォーマット２のいずれかで、溶液相の抗標的アミノ酸配列又は他の結合剤が、溶液相の抗標的アミノ酸配列又は他の結合剤の非存在下で得られた標的検出シグナル（即ち陽性対照ウェル）に比べて、標的検出シグナル（即ちコーティングしたアミノ酸配列で結合した標的の量）の６０％〜１００％、具体的に７０％〜１００％、及びより具体的に８０％〜１００％の低減を引き起こすことができる場合、交差遮断すると定義する。
ｔ）本明細書でさらに記載されるように、ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０、好ましくは１１２〜１１５の範囲内、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディの一部、断片、類似体又は誘導体（本明細書中に記載）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに特に限定されないことに留意すべきである。
ｕ）ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 （1-2）:185-195の論文（例えば本明細書の図２を参照されたい）においてラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Kabat et al. （"Sequence of proteins ofimmunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従うと、ナノボディのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（即ちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングが可能な数より多くのアミノ酸残基を含んでいてもよい）ことに留意すべきである。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）］。ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ由来のＶＨＨドメイン及びナノボディに適用することができる）は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883（1989））によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、特許請求の範囲及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
ｖ）図面、配列表及び実験部部分／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈すべきではない。
重鎖抗体及びその可変ドメインの概要に関しては、特に本明細書で言及される従来技術、Reviews in Molecular Biotechnology 74（2001）, 277-302におけるMuyldermansによる総説、及び一般的な背景技術として言及される以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７；Algonomics N.V.及びAblynx N. V.の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；カナダのNational Research Councilによる国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにAblynx N.V.による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、並びにAblynx N.V.によってさらに公開された特許出願を参照する。これらの出願で言及されるさらなる従来技術、特に国際出願の国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの４１頁〜４３頁で言及される参考リストも参照する（このリスト及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。
当該技術分野で使用される専門用語（上記の参考文献を参照されたい）に従って、天然重鎖抗体に存在する可変ドメインは、この可変ドメインを従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（以下「ＶＨドメイン」と表す）と、及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（以下、「ＶＬドメイン」と表す）と区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも表される。
上記で表された従来技術で言及されるように、ＶＨＨドメインは、単離ＶＨＨドメイン（並びにこれに基づくナノボディ、これは天然ＶＨＨドメインと、これらの構造的特徴及び機能的性質を共有する）及び機能的な抗原結合ドメイン又はタンパク質としての使用に非常に有利である、これを含有するタンパク質を作製する、多くの特有の構造的特徴及び機能的性質を有する。特に、これらに限定されないが、（軽鎖可変ドメインの非存在下で、及びこれとの相互作用が全くなく、自然に抗原と機能的に結合するように「設計」された）ＶＨＨドメイン及びナノボディは、単一で比較的低分子の機能的な抗原結合構造単位、ドメイン又はタンパク質としても機能することができる。このことは、ＶＨＨドメインを従来の４鎖抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと区別し、概してこれら自体は単一抗原結合タンパク質又はドメインとしての実際の適用に適しておらず、幾つかの形態又は機能的な抗原結合単位を与えるような別の形態で（例えばＦａｂ断片等の従来の抗体断片、ＶＬドメインと共有結合するＶＨドメインから成るＳｃＦｖ断片等で）組合せる必要がある。
これらの特有の性質のために、単一抗原結合タンパク質又は抗原結合ドメインとして（即ちより大きなタンパク質又はポリペプチド部分として）のＶＨＨドメイン及びナノボディの使用によって、従来のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又はその従来の抗体断片（例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片）の使用に対する多くの有意な利点が与えられる：
単一ドメインだけでは、高い親和性及び高い選択性で抗原と結合することが要求されるので、２つの分離ドメインを存在させる必要もなく、これらの２つのドメインが正しい空間配座及び構造で存在することを（即ち特別に設計されたリンカー（ｓｃＦｖ等）の使用によって）確認する必要もない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは単一遺伝子から発現することができ、翻訳後フォールディング又は修飾の必要はない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、（本明細書でさらに考察されるように）容易に多価及び多重特異性のフォーマットに容易に遺伝子組み換えすることができる。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、高溶解性であり、凝集しにくい（Ward et al., Nature, Vol. 341, 1989, p. 544で記載されるマウス由来の「ｄＡｂ’ｓ」等）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対する安定性が高い（例えば上記のEwert et alを参照されたい）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、製造で要求される規模であっても調製するのが容易であり、且つ比較的安価である。例えば、ＶＨＨドメイン、ナノボディ、及びこれを含有するタンパク質／ポリペプチドは、微生物発酵を使用して（例えば以下でさらに記載されるように）製造することができ、哺乳動物の発現系（例えば従来の抗体断片）を使用する必要がない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的低分子（約１５ｋＤａ、即ち従来のＩｇＧの１０分の１）であるため、このような従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片よりも高い組織（充実性腫瘍及び他の高密度組織を含むが、これらに限定されない）への浸透性を示す。
ＶＨＨドメイン及びナノボディは、（特に従来のＶＨドメインに比べてＣＤＲ３ループが伸長するため）いわゆるキャビティ結合性を示すことができ、したがって従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片には接近することができない標的及びエピトープに接近することもできる。例えば、ＶＨＨドメイン及びナノボディは酵素を阻害することができることが分かっている（例えば国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Lauwereys etal., EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20を参照されたい）。
特定の好ましい態様において、本発明は、ＶＥＧＦに対するナノボディ、及び詳細には温血動物由来のＶＥＧＦに対するナノボディ、及びより詳細には哺乳動物由来のＶＥＧＦに対するナノボディ、及び具体的にヒトＶＥＧＦに対するナノボディ、並びに少なくとも１つのこのようなナノボディを含むタンパク質及び／又はポリペプチドを提供する。
特に、本発明は、ＶＥＧＦに対する従来の抗体又はその断片に比べて、このような従来の抗体又は抗体断片（Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＳｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」及び他の多重特異性構築物（例えばHolliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23（9）: 1126-36による総説を参照されたい）等）に基づき得る構築物に比べて、及びまた従来の抗体の可変ドメインに由来し得るいわゆる「ｄＡｂ」又は同様の（単一）ドメイン抗体に比べて、改善した治療特性及び／又は予防特性、及び／又は他の有益な特性（例えば調製の簡便性の向上、及び／又は製品のコスト低減等）を有するＶＥＧＦに対するナノボディ、及びこれを含むタンパク質及び／又はポリペプチドを提供する。これらの改善した有益な特性は、本明細書中のさらなる記載から明らかになり、例えばこれらに限定されないが、
一価フォーマット、多価フォーマット（例えば二価フォーマット）のいずれか及び／又は多重特異性のフォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）でのＶＥＧＦに対する親和性及び／又は結合活性の増大、
多価フォーマット（例えば二価フォーマット）に合わせるのにより良好な適合性、
多価フォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）でのフォーマット化の良好な適合性、
「ヒト化」置換（本明細書中で規定）に対する適合性又は感受性の改善、
一価フォーマット、多価フォーマット（例えば二価フォーマット）のいずれか及び／又は多重特異性のフォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）での免疫原性の低下、
一価フォーマット、多価フォーマット（例えば二価フォーマット）のいずれか及び／又は多重特異性のフォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）での安定性の増大、
一価フォーマット、多価フォーマット（例えば二価フォーマット）のいずれか及び／又は多重特異性のフォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）でのＶＥＧＦに対する特異性の増大、
異なる種由来のＶＥＧＦとの交差反応性の低減又は所望の増大、及び／又は
一価フォーマット、多価フォーマット（例えば二価フォーマット）のいずれか及び／又は多重特異性のフォーマット（例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの１つ）での薬学的用途（予防的用途及び／又は治療的用途を含む）及び／又は診断的用途（画像化目的への使用を含むが、これに限定されない）に望ましい、１つ又は複数の特性の改善の１つ又は複数が含まれる。
概して本発明のアミノ酸配列に対して本明細書中に記載するように、本発明のナノボディは、（本明細書中に規定のように）本質的に単離形態であるか、又は（本明細書中に規定のように）本発明のタンパク質若しくはポリペプチドの一部を形成するのが好ましく、１つ又は複数の本発明のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成っていてもよく、任意で１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（任意で全て１つ又は複数の好適なリンカーを介して）をさらに含んでいてもよい。例えば、これらに限定されることなく、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用してもよく、全て本明細書中に記載の一価、多価又は多重特異性のポリペプチドをそれぞれ提供するように、任意で結合単位として（即ちＶＥＧＦ以外の１つ又は複数の標的に対して）有用であり得る１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含有し得る。特に、このようなタンパク質又はポリペプチドは、本明細書中にさらに記載の一価、多価又は多重特異性のナノボディ構築物をそれぞれ提供するように、任意で全て１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結した、１つ又は複数の本発明のナノボディと、任意で１つ又は複数の（他の）（即ちＶＥＧＦ以外の標的に指向性を有する）ナノボディとを含み得るか、又は本質的にこれからなり得る。このようなタンパク質又はポリペプチドは、（本明細書中に規定のように）本質的に単離形態であってもよい。
本発明のナノボディにおいて、ＶＥＧＦとの結合に関する結合部位は、ＣＤＲ配列によって形成されるのが好ましい。任意で、本発明のナノボディは、少なくとも１つのＶＥＧＦとの結合に関する結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合に関するさらなる結合部位を１つ又は複数含有してもよい。このような第２の結合部位を導入する方法及び位置に関しては、例えばKeck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011、欧州特許第０６４０１３０号明細書、国際公開第０６／０７２６０号パンフレットを参照する。
本発明のアミノ酸配列に関して本明細書中に概して記載するように、本発明のナノボディ（又はこれを含む本発明のポリペプチド）が、被験者への投与を目的とする場合（例えば本明細書中に記載の治療目的及び／又は診断目的）、本発明のナノボディは、ヒトＶＥＧＦに指向性を有するのが好ましいが、獣医学的目的では、治療する種由来のＶＥＧＦに指向性を有するのが好ましい。また、本発明のアミノ酸配列と同様に、本発明のナノボディは交差反応性（即ちヒトＶＥＧＦ及び本明細書中で言及した少なくとも１種の哺乳動物由来のＶＥＧＦのような２種以上の哺乳動物由来のＶＥＧＦに対する指向性）を有していても又は有しなくてもよい。
またここでも同様に、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書中に概して記載するように、本発明のナノボディは概して、ＶＥＧＦの抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）のいずれかに指向性を有し得る。しかしながら概して、本発明のナノボディ（及びこれを含むポリペプチド）は好ましくは、ＶＥＧＦＲ−１に対する結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対する結合部位に指向性を有することが推測される。本明細書中で既に記載のように、ナノボディのアミノ酸配列及び構造は、これらに限定されないが、４つのフレームワーク領域即ち「ＦＲ」（又は「ＦＷ」と呼ばれることもある）から構成されていると考えることができ、当該技術分野及び本明細書中でそれぞれ、「フレームワーク領域１」即ち「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」即ち「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」即ち「ＦＲ３」及び「フレームワーク領域４」即ち「ＦＲ４」と称され、このフレーム領域の間には、３つの相補性決定領域即ち「ＣＤＲ」が挿入され、これは当該技術分野でそれぞれ、「相補性決定領域１」即ち「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」即ち「ＣＤＲ２」及び「相補性決定領域３」即ち「ＣＤＲ３」と称される。本発明のナノボディに存在する、幾つかの好ましいフレームワーク配列及びＣＤＲ（及びそれらの組合せ）を本明細書中に記載している。他の好適なＣＤＲ配列は、本明細書中に記載の方法によって得ることができる。
本発明の非限定的であるが、好ましい態様によれば、本発明のナノボディ（に存在するＣＤＲ配列）は、
ナノボディが、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＶＥＧＦと結合し得るようなもの、及び／又は
ナノボディが、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等のｋｏｎ速度でＶＥＧＦと結合し得るようなもの、及び／又は
ナノボディが、１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等のｋｏｆｆ速度でＶＥＧＦと結合し得るようなものである。
好ましくは、本発明のナノボディ（に存在するＣＤＲ配列）は、本発明の一価ナノボディ（又は本発明のナノボディを１つだけ含有するポリペプチド）が、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと結合するようなものである。
例えば本明細書中で言及した、ＫＤ、ＫＡ、ｋｏｆｆ又はｋｏｎを測定する一般的技法、及び本明細書中に記載の特定のアッセイの幾つかを使用するそれ自体が既知の方法で、ＶＥＧＦに対する本発明のナノボディの親和性を求めることができる。
本発明のナノボディ（及びこれを含むポリペプチド）とＶＥＧＦとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
好ましいが、非限定的な態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る、ＶＥＧＦに対する（本明細書中に規定の）ナノボディであって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される（又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片）、ナノボディに関する。
特に、好ましいが、非限定的なこの態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る、ＶＥＧＦに対する（本明細書中に規定の）ナノボディであって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、から成る群から選択される（又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片）、ナノボディに関する。
概して本発明のアミノ酸配列に関して本明細書中に言及するように、本発明のナノボディが、１つ又は複数のｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲ１配列を含有する場合、
ｉ）このようなｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換は、対応するａ）によるＣＤＲに比べて保存的なアミノ酸置換（本明細書に規定）であるのが好ましく、及び／又は
ｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲは、対応するａ）によるＣＤＲに比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ａ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
同様に本発明のアミノ酸配列が、１つ又は複数のｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲ２配列を含有する場合、
ｉ）このようなｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換は、対応するｄ）によるＣＤＲに比べて保存的なアミノ酸置換（本明細書に規定）であるのが好ましく、及び／又は
ｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲは、対応するｄ）によるＣＤＲに比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｄ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
また同様に本発明のナノボディが、１つ又は複数のｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲ３配列を含有する場合、
ｉ）このようなｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換は、対応するｇ）によるＣＤＲに比べて保存的なアミノ酸置換（本明細書に規定）であるのが好ましく、及び／又は
ｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲは、対応するｇ）によるＣＤＲに比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によって、ｇ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
概して上述の３つの段落は、ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）又はｉ）によるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及び／又はＣＤＲ３配列をそれぞれ１つ又は複数含む、任意の本発明のナノボディにも適用することを理解されたい。
詳細には、本発明のナノボディの中でも上記で明示的に列挙したＣＤＲを１つ又は複数含むナノボディが好ましく、より詳細には、上記で明示的に列挙したＣＤＲを２つ以上含むナノボディが好ましく、最も詳細には、上記で明示的に列挙したＣＤＲを３つ含むナノボディが好ましい。
ＣＤＲ配列の幾つかの特に好ましいが、非限定的な組合せ、及びＣＤＲ配列とフレームワーク配列との好ましい組合せは以下の表Ａ−１で言及し、表Ａ−１は、多くの好ましい（が非限定的な）本発明のナノボディに存在するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列を挙げている。当業者にとって明らかなように、同じクローンで発生するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せ（即ち表Ａ−１で同じ列で言及するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列）が、通常好ましい（が、本発明はその最も広い意味でこれらに限定されず、表Ａ−１で言及するＣＤＲ配列の他の好適な組合せも含む）。また、同じクローンで発生するＣＤＲ配列とフレームワーク配列との組合せ（即ち表Ａ−１で同じ列で言及するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列）が、通常好ましい（が、本発明はその最も広い意味でこれらに限定されず、表Ａ−１で言及するＣＤＲ配列とフレームワーク配列との他の好適な組合せ、並びに例えば本明細書中にさらに記載のこのようなＣＤＲ配列と他の好適なフレームワーク配列との組合せも含む）。
また、表Ａ−１で言及するＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディにおいて、各ＣＤＲを、言及したＣＤＲと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるＣＤＲに置き換えることができ、ここで
ｉ）このようなＣＤＲにおける任意のアミノ酸置換は、対応する表Ａ−１で言及するＣＤＲ配列に比べて保存的なアミノ酸置換（本明細書に規定）であるのが好ましく、及び／又は
ｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、対応する表Ａ−１で言及するＣＤＲに比べてアミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しないのが好ましく、及び／又は
ｉｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法によって誘導する、特に対応する表Ａ−１で言及するＣＤＲ配列から開始するＣＤＲである。
しかしながら、当業者にとって明らかなように、表Ａ−１で言及するＣＤＲ配列（の組合せ）、及びＣＤＲ配列とフレームワーク配列（との組合せ）が概して好ましい。
このように、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群、又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の「配列同一性」（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれの群、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれから成る群から好適に選択される。
これに関して、「好適に選択される」とは、適用可能な場合、それぞれＣＤＲ１配列が、好適なＣＤＲ１配列（即ち本明細書中で規定）から選択され、ＣＤＲ２配列が、好適なＣＤＲ２配列（即ち本明細書中で規定）から選択され、ＣＤＲ３配列が、好適なＣＤＲ３配列（即ち本明細書中で規定）から選択されることを意味する。より詳細には、ＣＤＲ配列は、本発明のナノボディが、本明細書に規定されるようなものである、（本明細書にさらに記載されるように（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＶＥＧＦと結合するように選択されるのが好ましい。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくとも存在するＣＤＲ３配列は、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列から成る群、又は表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列の群、及び／又は表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ３配列から成る群から好適に選択される。
好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群、又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれから成る群、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれから成る群から好適に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくとも存在するＣＤＲ３配列は、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列から成る群、又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列の群から好適に選択され、存在するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列から成る群、又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれの群、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれから成る群から好適に選択される。
最も好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する３つ全てのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群、又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれの群、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれから成る群から好適に選択される。
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在する他の２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つ又は好ましくは両方が、それぞれ表Ａ−１で列挙する対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列から、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙する対応する配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ配列から成る群から好適に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくとも存在するＣＤＲ３配列は、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３から成る群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、ＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つ及び好ましくは両方は、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれの群、及び／又はそれぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれから成る群から好適に選択される。
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ａ−１で列挙する対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群、及び／又は表Ａ−１で列挙する対応する配列の少なくとも１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ配列から成る群から好適に選択される。
特に、本発明のナノボディにおいて、少なくともＣＤＲ３配列は、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列から成る群から好適に選択され、ＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列のいずれかは、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列から成る群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在する残りのＣＤＲ配列は、表Ａ−１で列挙する対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群、及び／又は表Ａ−１で列挙する対応するＣＤＲ配列と３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ配列から成る群から好適に選択される。
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在する３つ全てのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列から成る群から好適に選択される。
また概して、表Ａ−１で列挙するＣＤＲの組合せ（即ち表Ａ−１の同じ列で言及されるもの）が好ましい。したがって、概して、本発明のナノボディにおけるＣＤＲが、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ配列であるか、又は表Ａ−１で列挙するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群、及び／又は表Ａ−１で列挙するＣＤＲ配列と３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ配列から成る群から好適に選択される場合、他のＣＤＲの少なくとも１つ及び好ましくは両方が、表Ａ−１での同じ組合せに属する（即ち表Ａ−１で同じ列に言及される）ＣＤＲ配列から好適に選択されるか、又は同じ組合せに属するＣＤＲ配列（複数可）と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列の群、及び／又は同じ組合せに属するＣＤＲ配列（複数可）と３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異（複数可）を有するＣＤＲ配列から成る群から好適に選択されることが好ましい。上記段落で示した他の参考文献は、表Ａ−１で言及されるＣＤＲの組合せにも適用される。
このように、非限定的な例によって、例えば本発明のナノボディは、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、表Ａ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ２配列の１つと３つ、２つ若しくは１つだけのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列と、ＣＤＲ３配列とを含むことができる。
例えば、本発明の幾つかの好ましいナノボディは、（１）表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、表Ａ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ２配列の１つと３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列と、表Ａ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ３配列の１つと８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列と、又は（２）表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、ＣＤＲ２配列と、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列の１つと、又は（３）ＣＤＲ１配列と、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ２配列の１つと８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ２配列と、ＣＤＲ２配列と同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ３配列と３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３配列とを含み得る。
例えば、幾つかの特に好ましい本発明のナノボディは、（１）表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ２配列と３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ３配列と８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列と、（２）ＣＤＲ１配列と、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ２配列と、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列（ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は異なる組合せに属してもよい）とを含み得る。
例えば、幾つかのさらにより好ましい本発明のナノボディは、（１）表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ２配列の１つと、異なる組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ３配列と、又は（２）表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ２配列と３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列と、同じ又は異なる組合せに属する、表Ａ−１で列挙するＣＤＲ３配列と８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列とを含み得る。
例えば、特に好ましい本発明のナノボディは、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ１配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ２配列との８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ２配列と、同じ組合せに属する、表Ａ−１で言及されるＣＤＲ３配列とを含み得る。
最も好ましい本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列は、それぞれ表Ａ−１で列挙するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せの１つから好適に選択される。
別の好ましいが、非限定的な本発明の態様によれば、（ａ）ＣＤＲ１は、１個〜１２個のアミノ酸残基長、及び通常２個〜９個のアミノ酸残基（５個、６個又は７個のアミノ酸残基等）長を有する、及び／又は（ｂ）ＣＤＲ２は、１３個〜２４個のアミノ酸残基長、及び通常１５個〜２１個のアミノ酸残基（１６個及び１７個のアミノ酸残基等）長を有する、及び／又は（ｃ）ＣＤＲ３は、２個〜３５個のアミノ酸残基長、及び通常３個〜３０個のアミノ酸残基（６個〜２３個のアミノ酸残基等）長を有する。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明は、ＣＤＲ配列（本明細書中に規定）が、配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書中に規定）を有するナノボディに関する。
概して、上記ＣＤＲ配列を有するナノボディは、本明細書中でさらに記載するようなものとすることができ、また好ましくは、同様に本明細書中にさらに記載のフレームワーク配列を有し得る。したがって例えば、本明細書中で言及されるように、このようなナノボディは、（任意の好適な種由来の）天然ナノボディ、天然ＶＨＨ配列（即ち好適なラクダ科動物種由来）、又は部分ヒト化ナノボディ又はＶＨＨ配列、完全ヒト化ナノボディ又はＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列、並びに本明細書中で言及される技法で得られたナノボディを含むが、これらに限定されない、合成若しくは半合成のアミノ酸配列若しくはナノボディであり得る。
したがって、具体的であるが、非限定的な一態様において、本発明は、ヒト化ナノボディであって、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が本明細書中に規定され、該ヒト化ナノボディが、少なくとも１つのヒト化置換（本明細書中に規定）、及び特にそのフレームワーク配列の少なくとも１つにおける少なくとも１つのヒト化置換（本明細書中に規定）を含む、ヒト化ナノボディに関する。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明は、ＣＤＲ配列が、配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有するナノボディに関する。例えば、該ナノボディと配列番号４４１〜配列番号４８５の配列の１つ又は複数との（本明細書中に記載の方法での）アミノ酸同一性の程度を求めることによって、このアミノ酸同一性の程度を求めることができ、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。このようなナノボディは、本明細書中でさらに記載するようなものであり得る。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明は、配列番号４４１〜配列番号４８５から成る群、又は配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するナノボディに関する。
別の好ましいが、非限定的な本発明の態様は、対応する天然ＶＨＨ配列に比べて、少なくとも１つのヒト化置換（本明細書中に規定）、及び特にそのフレームワーク配列の少なくとも１つにおける少なくとも１つのヒト化置換（本明細書中に規定）を含む、配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディのヒト化変異体に関する。
本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る。本発明のポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号４８６〜配列番号６７７で与えられる。
「好ましい」（又は「より好ましい」、「さらにより好ましい」等）と本明細書中で言及されるナノボディが、本明細書中に記載のポリペプチドで使用するのにも好ましい（又はより好ましい、又はさらにより好ましい等）ことは、当業者にとって明らかである。このように概して、１つ又は複数の「好ましい」本発明のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドが好ましく、概して１つ又は複数の「より好ましい」本発明のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドがより好ましい。
概して、単一のナノボディ（本発明の単一のナノボディ等）を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質又はポリペプチドは、本明細書で「一価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上のナノボディ（少なくとも２つの本発明のナノボディ、又は少なくとも１つの本発明のナノボディ及び少なくとも１つの他のナノボディ等）を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質及びポリペプチドは、本明細書で「多価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多価構築物」と呼ばれ、これらは、対応する本発明の一価のナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このような多価構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
具体的であるが、非限定的な一態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも２つの本発明のナノボディ、例えば２つ又は３つの本発明のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る。本明細書中にさらに記載のように、このような多価構築物は、本発明の単一ナノボディを含むか、又はこれから成るタンパク質又はポリペプチドに比べて、ＶＥＧＦに対する結合活性が大きく改善する等、或る特定の利点を与えることができる。このような多価構築物は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、このような多価ナノボディ構築物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号４８６〜配列番号６７７の構築物である。
具体的であるが、非限定的な別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のナノボディと、少なくとも１つの他の結合単位（即ち別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに指向性を有する）とを含むか、又は本質的にこれから成り、これは好ましくはナノボディでもある。このようなタンパク質又はポリペプチドは、本明細書中で「多重特異性」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多重特異性構築物」とも称され、これらは、（好ましいが、非限定的な幾つかの多重特異性構築物の本明細書中のさらなる考察から明らかになるように）対応する本発明の一価ナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このような多重特異性構築物は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、このような多重特異性ナノボディ構築物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号５７６〜配列番号６７７の構築物である。
一態様において、本発明のポリペプチド、化合物又は構築物は、ＶＥＧＦに対する本発明のナノボディと、ＶＥＧＦＲ−１及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するナノボディとを含むか、又は本質的にこれから成る、多重特異性（例えば二重特異性）のポリペプチド、化合物又は構築物である。別の態様では、本発明のポリペプチド、化合物又は構築物は、ＶＥＧＦに対する本発明のナノボディと、腫瘍抗原に対するナノボディとを含むか、又は本質的にこれから成る、多重特異性（例えば二重特異性）のポリペプチド、化合物又は構築物である。
別の態様において、本発明のポリペプチド、化合物又は構築物は、ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位に対するナノボディと、ＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に対するナノボディとを含むか、又は本質的にこれから成る、多重パラトピック（二重パラトピック）のポリペプチド、化合物又は構築物である。
さらに別の具体的であるが、非限定的な態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のナノボディと、任意で１つ又は複数のさらなるナノボディと、本発明のナノボディに及び／又は得られた融合タンパク質に少なくとも１つの所望の特性を与える少なくとも１つの他のアミノ酸配列（タンパク質又はポリペプチド等）とを含むか、又は本質的にこれから成る。ここでも同様に、このような融合タンパク質は、対応する本発明の一価ナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このようなアミノ酸配列及びこのような融合構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
例えば２つ以上の上記の態様を組合せて、２つの本発明のナノボディと、１つの他のナノボディと、任意で１つ又は複数の他のアミノ酸配列とを含む三価の二重特異性構築物を提供することも可能である。このような構築物、及び本発明の背景内で特に好ましい幾つかの構築物のさらなる非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
上記の構築物において、１つ又は複数のナノボディ及び／又は他のアミノ酸配列は、互いに直接連結しても、及び／又は１つ又は複数のリンカー配列を介して互いに好適に連結してもよい。このようなリンカーの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
具体的な本発明の一態様において、本発明のナノボディ、又は少なくとも１つの本発明のナノボディを含む、本発明の化合物、構築物若しくはポリペプチドの半減期は、対応する本発明のアミノ酸配列に比べて増大し得る。このようなナノボディ、化合物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づき、当業者にとって明らかになり、例えば（例えばペグ化によって）半減期が増大するように化学修飾した本発明のナノボディ配列又はポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミン等）との結合に関する、少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のアミノ酸配列；又は本発明のナノボディの半減期を増大させる、少なくとも１つの部位（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）と連結する、少なくとも１つの本発明のナノボディを含む本発明のポリペプチドを含む。このような半減期が延びた部位又はアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づき、当業者にとって明らかになり、例えば１つ又は複数の本発明のナノボディが、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（血清アルブミン又はその好適な断片等）、又は血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の結合単位（例えば血清アルブミン等の血清タンパク質、ＩｇＧ等の血清免疫グロブリン、又はトランスフェリンと結合することができるナノボディ又は（単一）ドメイン抗体等）と好適に連結するポリペプチド；本発明のナノボディがＦｃ部（ヒトＦｃ等）又はその好適な部分若しくは断片と連結するポリペプチド；或いは１つ又は複数の本発明のナノボディが、血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の小さいタンパク質又はペプチドと好適に連結するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（例えば国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット、国際公開第０２／０７６４８９号パンフレット、及び２００６年１２月５日付で出願したAblynx N.V.の"Peptides capable ofbinding to serum proteins"と題したAblynx N.V.の米国仮特許出願（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ／２００７／０６３３４８号明細書も参照されたい）に記載のタンパク質及びペプチドであるが、これに限定されない）。
さらに、当業者にとって明らかなように、このようなナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、三重特異性又は（of）多重特異性ナノボディ構築物を提供するように、１つ又は複数のさらなる基、残基、部位、又は結合単位（例えば１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列、特に１つ又は複数のさらなるナノボディ（即ちＶＥＧＦに指向性を有しない））を含有し得る。
概して、半減期が増大した本発明のナノボディ（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、対応する本発明のアミノ酸配列自体の半減期の少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍を超える半減期を有する。例えば、半減期が増大した本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列自体に比べて、半減期が１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大し得る。
好ましいが、非限定的な本発明の態様において、このような本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
本発明の別の一態様では、本発明のポリペプチドは、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする、（任意で１つ又は複数の好適なリンカー配列を介して）１つ又は複数（例えば２つ及び好ましくは１つ）のアミノ酸配列に連結する、１つ又は複数（例えば２つ又は好ましくは１つ）の本発明のナノボディを含む。特に、得られた本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする上記１つ又は複数のアミノ酸配列は、１つ又は複数の（例えば２つ及び好ましくは１つ）ナノボディ、例えば、国際公開第０２／０５７４４５号パンフレットに記載のナノボディ（好ましい例は、ＦＣ４４（国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの配列番号１８９）及びＦＣ５（国際公開第０６／０４０１５４号パンフレットの配列番号１９０）である）であり得る。
特に、１つ又は複数の本発明のナノボディを含むポリペプチドは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＶＥＧＦと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等のｋｏｎ速度でＶＥＧＦと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等のｋｏｆｆ速度でＶＥＧＦと結合するようなものであるのが好ましい。
好ましくは、本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチドが、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性でＶＥＧＦと結合するようなものである。これに対して、本発明のナノボディを２つ以上含有するポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列を１つだけ含有するポリペプチドに比べて、増大した結合活性でＶＥＧＦと結合することができる。
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドとＶＥＧＦとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
本発明の好ましいこの態様による他のポリペプチドは例えば、配列番号４８６〜配列番号６７７のアミノ酸配列の１つ又は複数と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の「配列同一性」（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択され得る。該アミノ酸配列内に含まれるナノボディは、本明細書中にさらに規定されるようなものが好ましい。
本発明の別の態様は、本発明のアミノ酸配列（本発明のナノボディ等）をコードする核酸、又はこれを含む本発明のポリペプチドに関する。さらに、本発明の核酸に関して本明細書中に概して記載するように、このような核酸は、本明細書中に規定のように遺伝的構築物の形態であり得る。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列（ナノボディ等）及び／又はこれを含む本発明のポリペプチドを発現するか、又は発現することができる、及び／又は本発明の核酸を含有する宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列と、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸と、任意で（即ち組成物の使用目的に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分とを含有するか又は含む産物又は組成物に関する。このような産物又は組成物は例えば、（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（同様に本明細書に記載の）診断用途のための産物又は組成物であり得る。このような産物又は組成物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物を調製又は生成する方法に関する。このような方法の好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物及び組成物の適用及び使用、並びにＶＥＧＦに関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが、非限定的な適用及び使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
また本発明の他の態様、実施形態、利点及び用途は、本明細書中の以下のさらなる記載から明らかになる。
概して、広義で本明細書で使用される用語ナノボディは、特定の生物学的供給源又は特定の製造方法に限定されないことに留意すべきである。例えば、以下でより詳細に考察されるように、本発明のナノボディは概して、（１）天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離すること、（２）天然のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、（３）天然ＶＨＨドメインの（本明細書に記載の）「ヒト化」、又はこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種、特に哺乳動物種（例えばヒト）由来の天然ＶＨドメインの（本明細書に記載の）「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）Ward et al（上記）によって記載されるような「ドメイン抗体」若しくは「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（６）それ自体が既知である、タンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を調製するのに合成技法又は半合成技法を使用すること、（７）それ自体が既知である核酸合成技法を使用して、ナノボディをコードする核酸を調製した後、このようにして得られた核酸を発現すること、及び／又は（８）上記の１つ又は複数の任意の組合せによって得ることができることに留意すべきである。上記を実施するのに好適な方法及び技法は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えば本明細書でより詳細に記載される方法及び技法が含まれる。
１つの好ましいクラスのナノボディは、ＶＥＧＦに指向性を有する天然重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、このようなＶＨＨ配列は概して、（即ち免疫応答及び／又はＶＥＧＦに指向性を有する重鎖抗体を生じるように）ＶＥＧＦをラクダ種に好適に免疫付与すること、当該ラクダ由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、当該サンプルからＶＥＧＦに指向性を有するＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手することができる。このような技法は、当業者にとって明らかであり、及び／又は本明細書でさらに記載される。
代替的に、ＶＥＧＦに対するこのような天然ＶＨＨドメインは、例えばそれ自体が既知の１つ又は複数のスクリーニング技法を用いて、ＶＥＧＦ、又は少なくとも１つのその一部、断片、抗原決定基若しくはエピトープを使用して、このようなライブラリをスクリーニングすることによってラクダＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得ることができる。このようなライブラリ及び技法は例えば、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第０１／９０１９０号パンフレット、国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット及び国際公開第０３／０３５６９４号パンフレットに記載されている。
代替的に、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の改良型の合成ライブラリ又は半合成ライブラリ（例えばランダム突然変異法及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば国際公開第００／４３５０７号パンフレットに記載されているようなもの）等の技法によって、ナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ）を使用してもよい。
このように、別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに指向性を有するナノボディを生成する方法に関する。一態様では、該方法は少なくとも、
ａ）ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するナノボディ配列に関して、上記のナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有するアミノ酸配列（複数可）を単離する工程とを含む。
このような方法では、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリは、ナノボディ配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ、ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
この方法の好ましい態様では、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリは、ＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ種に由来している、ナノボディ配列の免疫セット、コレクション又はライブラリ、特にＶＨＨ配列の免疫セット、コレクション又はライブラリであり得る。特定の一態様では、該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法において、ナノボディ配列又はＶＨＨ配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（酵母等）上に提示してもよい。ナノボディ配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及びNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによる総説も参照されたい。
別の態様において、ナノボディ配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）免疫グロブリン配列を発現するラクダ種由来の細胞のコレクション又は試料を準備する工程と、
ｂ）（ｉ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞、（ｉｉ）重鎖抗体を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又は試料をスクリーニングする工程であって、ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対して親和性を有する重鎖抗体を発現する細胞を少なくとも１つ提供するように、本質的に単一のスクリーニング工程として、又は２つの別々のスクリーニング工程として任意の好適な順番で下位工程（ｉ）及び（ｉｉ）を実施することができる、スクリーニングする工程と、
ｃ）（ｉ）上記重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列を上記細胞から単離する工程、又は（ｉｉ）該重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列をコードする核酸配列を該細胞から単離し、その後該ＶＨＨドメインを発現する、単離する工程のいずれかとを含む。
この態様による方法において、細胞のコレクション又は試料は例えば、Ｂ細胞のコレクション又は試料であり得る。また、この方法では、細胞の試料は、ＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ科動物に由来し得る。特定の一態様では、該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法は、当業者にとって明らかなように任意の好適な方法で行われ得る。例えば欧州特許第０５４２８１０号明細書、国際公開第０５／１９８２４号パンフレット、国際公開第０４／０５１２６８号パンフレット及び国際公開第０４／１０６３７７号パンフレットを参照されたい。工程ｂ）のスクリーニングは、ＦＡＣＳ等のフローサイトメトリ法を使用して行うのが好ましい。これに関しては、例えばLieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820を参照されたい。特に、Ablynx N.V.による国際出願である国際公開第０６／０７９３７２号で記載のいわゆる「ナノクローン（商標）」法を参照されたい。
別の態様において、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列を生成する方法は、少なくとも
ａ）重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ＶＥＧＦと結合することができる、及び／又はＶＥＧＦに対する親和性を有する重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列に関して、上記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）上記核酸配列を単離し、その後それぞれ上記重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列を発現するか、又は上記ナノボディ配列を発現する、単離する工程とを含み得る。
このような方法では、重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、重鎖抗体又はＶＨＨ配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；及び／又は親和性成熟を受けているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
この方法の好ましい態様では、アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリは、ＶＥＧＦ、又はこれに基づき若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の一部、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ科動物由来の重鎖抗体又はＶＨＨ配列をコードする核酸配列の免疫セット、コレクション又はライブラリであり得る。特定の一態様では、該抗原決定基は、細胞外の一部、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
上記の方法において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微小組織（例えば酵母）上に提示してもよい。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及びNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによる総説も参照されたい。
当業者にとって明らかなように、本明細書中に記載の方法のスクリーニング工程を選択工程として実施することもできる。したがって、本記載で使用する用語「スクリーニング」は、選択、スクリーニング、又は選択法及び／又はスクリーニング法の任意の好適な組合せを含むことができる。また、配列のセット、コレクション又はライブラリを使用する場合、これは、１個、２個、３個又は約５個、１０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個以上の配列等の任意の好適な数の配列を含有し得る。
また、上記のアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリにおける配列の１つ又は複数又は全ては、コンピュータモデリング法又は生物静力学法又はデータマイニング法等の合理的又は半経験的なアプローチで入手又は規定され得る。
さらに、このようなセット、コレクション又はライブラリは、自然に多様化した配列（例えば免疫ライブラリ）の多様なセットに由来する複数の配列を含む（compromise）、（例えば、指定の点突然変異又はランダム化した位置で）互いの変異体である１つ、２つ以上の配列、又は任意の他の多様な配列源（例えばHoogenboom et al, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005及びBinz et al, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247に記載）を含み得る。配列のこのようなセット、コレクション又はライブラリは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞の表面上に提示し、これらの担体内でアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に連結することができる。このことが、このようなセット、コレクション又はライブラリを、所望の本発明のアミノ酸配列を単離する選択法に従わせる。より一般的には、配列が好適な宿主又は宿主細胞上に提示される場合、初めに該宿主又は宿主細胞から所望の配列をコードするヌクレオチド配列を単離した後、好適な宿主生物で該ヌクレオチド配列を好適に発現することによって所望の配列を得ることも可能である（慣習になっている）。
さらに、当業者にとって明らかなように、それ自体が既知の任意の好適な方法でこれを実施することができる。
ＶＥＧＦに指向性を有するＶＨＨ配列又はナノボディ配列を得るためのさらに別の技法は、（即ち免疫応答及び／又はＶＥＧＦに指向性を有する重鎖抗体を生じるように）重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物に好適に免疫付与すること、該ＶＨＨ配列又はナノボディ配列（をコードする核酸配列）を含有する当該トランスジェニック哺乳動物由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれからそれ自体が既知の任意の好適な技法（本明細書で記載の方法又はハイブリドーマ法等）を使用して、当該サンプルからＶＥＧＦに指向性を有するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えばこのために、国際公開第０２／０８５９４５号パンフレット、国際公開第０４／０４９７９４号パンフレット、国際公開第０６／００８５４８号パンフレット及びJanssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2006 Oct 10;103（41）:15130-5に記載されている重鎖抗体発現マウス、並びにさらなる方法及び技法を使用することができる。例えば、このような重鎖抗体発現マウスは、天然源由来の（単一）可変ドメイン（例えばヒト（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物（単一）可変ドメイン又はサメ（単一）可変ドメイン）及び例えば合成又は半合成の（単一）可変ドメイン等の任意の好適な（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
本発明は、上記方法、又は代替的に上記の方法の１つと、さらに少なくとも上記ＶＨＨ配列又はナノボディ配列のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を決定する工程と、好適な宿主細胞若しくは宿主生物における発現又は化学合成のようなそれ自体が既知の方法で該ＶＨＨ配列又はナノボディ配列を発現又は合成する工程とを含む方法によって得られるＶＨＨ配列又はナノボディ配列にも関する。
本明細書で言及されるように、特に好ましいクラスの本発明のナノボディは、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、即ち当該天然ＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、（例えば上記の）ヒトの従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ヒト化」したアミノ鎖配列を有するナノボディを含む。例えば本明細書中のさらなる記載及び本明細書で言及されたヒト化に関する従来技術に基づいて、当業者にとってあきらかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。また、このような本発明のヒト化ナノボディは、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意すべきである。
別の特に好ましいクラスの本発明のナノボディは、天然ＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、即ち従来の４鎖抗体由来の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ラクダ化」したアミノ鎖配列を有するナノボディを含む。例えば本明細書中のさらなる記載に基づいて、当業者にとってあきらかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。このような「ラクダ化」置換は、本明細書に規定のように、ＶＨ−ＶＬ界面（及び／又はいわゆるラクダ科の特徴的な残基）を形成し、及び／又はこれに存在するアミノ酸位置に挿入するのが好ましい（例えば国際公開第９４／０４６７８号パンフレット及びDavies and Riechmann（1994 and 1996）（上記）を参照されたい）。好ましくは、出発材料又はラクダ化ナノボディを生成若しくは設計するための出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列（例えばＶＨ３）である。しかし、このような本発明のラクダ化ナノボディは、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意すべきである。
例えばまた、本明細書にさらに記載されるように、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を準備した後、それ自体が既知の方法で、新規のヌクレオチド配列がそれぞれ、本発明の「ヒト化」又は「ラクダ化」ナノボディをコードするように、当該ヌクレオチド配列における１つ又は複数のコドンを変えることによって、「ヒト化」及び「ラクダ化」の両方を行うことができる。次にこの核酸は、所望の本発明のナノボディを提供するようにそれ自体が既知の方法で発現することができる。代替的に、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディのアミノ酸配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。また、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディをコードするヌクレオチド配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができ、その後所望の本発明のナノボディを提供するように、それ自体が既知の方法で、このようにして得られた核酸を発現することができる。
天然ＶＨ配列又は好ましくはＶＨＨ配列から、本発明のナノボディ及び／又はこれをコードする核酸を得るのに好適な他の方法及び技法は、当業者にとって明らかであり、例えば本発明のナノボディ、又はこれをコードするヌクレオチド配列若しくは核酸を提供するように好適な方法で、１つ又は複数の天然ＶＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、１つ又は複数の天然ＶＨＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、及び／又は１つ又は複数の合成又は半合成の配列を組み合わせることを含み得る（したがって適切に表すことができる）。ＶＨＨ配列又はナノボディのフレームワーク配列をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中の開示及び／又は本明細書中で言及したさらなる従来技術に基づき、当業者にとって明らかであり（及び／又は代替的に本明細書中に記載の方法を使用して得られたヌクレオチド配列から始めるＰＣＲによって入手され得る）、本発明のナノボディをコードする核酸を提供するように、（例えば重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリによって）所望のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と好適に組合せ得る。
本明細書中に言及されるように、ナノボディは特に、１つ又は複数のフレームワーク配列における１つ又は複数の「特徴的な残基」（本明細書中に記載）の存在を特徴とし得る。
したがって、好ましいが、本発明の１つの非限定的な態様によれば、ナノボディは概して、広義で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、（本明細書に規定の）荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましい）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な第１の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましく、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
特に、ナノボディは概して、広義で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲである）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な態様によれば、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
特に本発明によるＶＥＧＦに対するナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
特に、好ましいが、本発明の１つの非限定的な態様によれば、ナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義することができ、
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであるか、又は
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
したがって、別の好ましいが、本発明の非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであり、且つ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
２つの特に好ましいが、本発明の非限定的なナノボディ群は、上記のａ）、上記の（ａ−１）〜（ａ−４）、上記のｂ）、上記の（ｂ−１）〜（ｂ−４）、上記の（ｃ）、上記の（ｃ−１）〜（ｃ−４）によるものであり、
ｉ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｉｉ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又は記載されるようなＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、且つ
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱであり、且つ
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基が、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基がＦであるのが最も好ましい。カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基が、配列ＧＬＥＷを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基は、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦから成る群から選択され、Ｖであるのが最も好ましい。
したがって、決してこれらには限定されないが、上記で言及された位置に存在するアミノ酸残基に基づき、概して本発明のナノボディを以下の３つの群に分類することができる：
ｉ）「ＧＬＥＷ群」：カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＶを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。ＧＬＥＷ群は、以下の表Ａ−３で言及されるもののような幾つかのＧＬＥＷ様配列も含む。より一般的には、これに限定されないが、ＧＬＥＷ群に属するナノボディは、４４位にＧ、及び／又は４７位にＷを有し、４６位は通常Ｅであり、好ましくは４５位が荷電アミノ酸残基でもシステインでもないナノボディと定義することができる。
ｉｉ）「ＫＥＲＥ群」：カバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又は別のＫＥＲＥ様配列）、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＦ、及び４７位にＬ又はＦを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。より一般的には、これに限定されないが、ＫＥＲＥ群に属するナノボディは、４４位にＫ、Ｑ又はＲ（通常Ｋ）を有し、４５位が荷電アミノ酸残基又はシステインであり、４７位が本明細書でさらに規定されるようなものであるナノボディと定義することができる。
ｉｉｉ）「１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群」：１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有するナノボディ。これらのナノボディは、カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、又はカバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥのいずれかを有することができ（後者は、（ＫＥＲＥ群に関して規定のように）３７位のＦと、４７位のＬ又はＦと組合せるのが最も好ましい）、カバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有することができ、Ｑを有するのが好ましい。
また必要に応じて、ナノボディは、２つ以上のこれらの群に属し得る（即ちこれらの特徴を有し得る）。例えば、１つの特に好ましいナノボディ群は、４４位〜４７位にＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列、１０３位にＰ、Ｒ又はＳ（特にＲ）、及び１０８位にＱを有する（Ｌへとヒト化してもよい）。
より一般的には、上記に言及される定義が、天然（即ち非ヒト化）ＶＨＨ配列の形態のナノボディを説明し、またこれに適用すること、及びこれらのナノボディのヒト化変異体は、上記のもの以外のアミノ酸残基（即ち本明細書中に規定の１つ又は複数のヒト化置換）を含み得ることに留意されたい。例えばこれに限定されないが、ＧＬＥＷ群又は１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群の幾つかのヒト化ナノボディにおいて、１０８位のＱは、１０８Ｌにヒト化し得る。本明細書中に既に言及されたように、他のヒト化置換（及びその好適な組合せ）は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかになる。付加的に又は代替的に、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後（本明細書中にさらに記載のように、それ自体が既知の任意の方法で）このようにして求めた、１つ又は複数の潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）を該ＶＨＨ配列に導入することができ、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性に関して、得られたヒト化ＶＨＨ配列を試験することができる。このようにして、試行試験及び誤差の程度を限定することによって、本明細書中の開示に基づき当業者によって、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を求めることができる。また、上記に基づき、ナノボディ（のフレームワーク領域）を部分ヒト化又は完全ヒト化してもよい。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＧＬＥＷ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＫＥＲＥ群に属するナノボディであってもよく、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
また、より一般的には、上記で言及された１０８Ｑ、４３Ｅ／４４Ｒ及び１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ残基の他に、本発明のナノボディは、従来のＶＨドメインでＶＨ／ＶＬ界面（の一部）が形成される１つ又は複数の位置で、対応する天然ＶＨ配列における同じ位置（複数可）で自然発生するアミノ酸残基よりも強く荷電する、１つ又は複数のアミノ酸残基、特に（表Ａ−２で言及される）１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含有することができる。このような置換としては、これらに限定されないが、以下の表Ａ−３で言及されるＧＬＥＷ様配列、及び４４位〜４７位のＫＬＥＷと共に１０８位にＱを有するナノボディを得るために、いわゆる「ミクロボディ」に関して国際出願の国際公開第００／２９００４号パンフレットで説明される置換が挙げられる。これらの位置での他の可能性のある置換は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかである。
本発明のナノボディの一態様において、８３位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ及びＷから成る群から選択され、Ｌであるのが好ましい。
また、本発明のナノボディの一態様において、８３位のアミノ酸残基は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｔ及びＱから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｋ若しくはＥ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。一態様では、８４位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＶから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｐ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。
さらに本発明のナノボディの一態様において、１０４位のアミノ酸残基は、Ｇ及びＤから成る群から選択され、Ｇであるのが最も好ましい。
まとめると、ナノボディにおいて上記で言及される、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基は、本明細書で「特徴的な残基」とも称される。特徴的な残基及び最も密接に関連したヒトＶＨドメイン（ＶＨ３）の対応する位置のアミノ酸残基を表Ａ−３に要約する。
幾つかの特に好ましいが、非限定的な天然ＶＨＨドメインで生じるこれらの特徴的な残基の組合せを表Ａ−４で言及する。比較のために、ＤＰ−４７と呼ばれるヒトＶＨ３の対応するアミノ酸残基をイタリック体で示している。
ナノボディにおいて、特徴的な残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの（カバットナンバリングによる）対応する位置で自然発生する任意のアミノ酸残基であり得る。
このようなアミノ酸残基は当業者にとって明らかである。表Ａ−５〜表Ａ−８は、天然ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の（カバットナンバリングによる）それぞれの位置に存在し得る幾つかの非限定的な残基を表す。それぞれの位置に関しては、天然ＶＨＨドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生する（ナノボディにおける当該位置に最も好ましいアミノ酸残基である）アミノ酸残基を太字で示し、それぞれの位置に好ましい他のアミノ酸残基を下線処理する（備考：天然ＶＨＨドメインの２６位〜３０位で見られるアミノ酸残基の数字は、これらの位置の残基が既にＣＤＲ１部分を形成するというChothia（上記）によるナンバリングに基づく仮説を支持する）。
表Ａ−５〜表Ａ−８では、ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置に存在し得る非限定的な残基の幾つかも表している。また、それぞれの位置に関しては、天然ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生するアミノ酸残基を太字で示し、他の好ましいアミノ酸残基を下線処理する。
参考のみのために、表Ａ−５〜表Ａ−８は、１１１８ＶＨＨ配列の代表的なサンプルにおけるそれぞれのアミノ酸位置でＶＨＨエントロピー（「ＶＨＨ Ｅｎｔ．」）及びＶＨＨ変動（「ＶＨＨ Ｖａｒ．」）に関するデータ（David Lutje Hulsing and Prof. Theo Verrips of Utrecht Universityによって無償（kindly）提供されたデータ）も含有する。ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動の値は、解析する１１１８ＶＨＨ配列間のアミノ酸残基の変動及び保存度に対する評価基準を与え、低い値（即ち１未満、例えば０．５未満）は、アミノ酸残基が、ＶＨＨ配列間で強く保存される（即ちほとんど変動性がない）ことを示す。例えば、８位のＧ及び９位のＧはそれぞれ、０．１及び０のＶＨＨエントロピー値を有し、これは（解析する全ての１１１８配列において９位がＧである場合）これらの残基が強く保存され、ほとんど変動しないことを示す一方で、ＣＤＲ部分を形成する残基に関しては概して、１．５以上の値が見られる（データ図示せず）。（１）表Ａ−５〜表Ａ−８の２列目に列挙されるアミノ酸残基は、後の２列で言及されるＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性を決定するのに解析された１１１８ＶＨＨ配列よりも大きいサンプルに基づいており、（２）以下で表すデータは、２７位〜３０位のアミノ酸残基、並びにおそらく９３位及び９４位のアミノ酸残基でさえも既にＣＤＲ部分を形成しているという仮説を支持することに留意されたい（しかしながら、本発明は任意の特定の仮説又は説明に限定されず、上記のように、本明細書ではカバットによるナンバリングを使用する）。配列エントロピー、配列変動及びこれを決定する方法の一般的説明に関しては、Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52:544-552（2003）を参照されたい。
このように、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディは、（一般）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有するアミノ酸配列として規定することができ、ここで
ｉ）カバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択され、
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
特に、本発明のナノボディは、（一般）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有するアミノ酸配列である可能性があり、ここで
ｉ）カバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の（好ましくは）１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択され（ＶＨＨ配列が１つ又は複数の特徴的な残基を含有すること、並びに部分ヒト化ナノボディが通常及び好ましくは［依然として］１つ又は複数の特徴的な残基を含有すること［しかしながら、本発明に応じて好適であれば、１つ又は複数の他のアミノ酸残基ではなく、全ての特徴的な残基がヒト化した部分ヒト化ナノボディを提供することも本発明の範囲内である］、並びに本発明に応じて好適であれば、完全ヒト化ナノボディにおいて特徴的な残基の位置の全てのアミノ酸残基がヒトＶＨ３配列で発生するアミノ酸残基であることが理解される。本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかなように、このようなＶＨＨ配列、少なくとも１つの特徴的な残基を有するこのような部分ヒト化ナノボディ、特徴的な残基を有しないこのような部分ヒト化ナノボディ及びこのような完全ヒト化ナノボディは全て、本発明の態様を形成する）、
ｉｉ）上記アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を求めるために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列番号１〜配列番号２２の配列においてＸで示す）は無視する）、
ｉｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
特に、ＫＥＲＥ群の本発明のナノボディは、（一般）構造
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を有するアミノ酸配列である可能性があり、ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸（本明細書中に規定）又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基は好ましくはＥであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｉｉ）ＦＲ２は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｖ）ＦＲ３は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖ）ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
また、上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
フレームワーク１に関して、上記で概説のアミノ酸配列がヌクレオチド配列の発現によって生成する場合、該核酸を生成するのに使用されているプライマー（複数可）によって、始めの４つのアミノ酸配列（即ちカバットナンバリングによる１位〜４位のアミノ酸残基）を求め得ることが多いことは、当業者にとって明らかである。このように、アミノ酸同一性の程度を求めるために、始めの４つのアミノ酸残基を無視するのが好ましい。
また、フレームワーク１に関して、カバットナンバリングによる２７位〜３０位のアミノ酸が（ＣＤＲではなく）フレームワークの一部であると考えられる場合、１０００個を超えるＶＨＨ配列のデータベースの解析によって、２７位〜３０位のアミノ酸が、１位〜２６位のアミノ酸に対する変動性よりも非常に大きい変動性（ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性に関して表される、表Ａ−５〜表Ａ−８を参照されたい）を有することが見出されている。このため、アミノ酸同一性の程度を求めるために、２７位〜３０位のアミノ酸残基も無視するのが好ましい。
これを考慮して、ＫＥＲＥ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成されるアミノ酸配列であり得る；
ｉ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸（本明細書中に規定）又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基は好ましくはＥであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｉｉ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、ＫＥＲＥ群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
ＧＬＥＷ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成されるアミノ酸配列であり得る；
ｉ）好ましくは、ＧＬＥＷ群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｉｉ）ＦＲ２は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｖ）ＦＲ３は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖ）ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
さらにフレームワーク１に関して、アミノ酸同一性の程度を求めるために、１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基を無視するのが好ましいことは当業者にとって明らかである。
これを考慮して、ＧＬＥＷ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成されるアミノ酸配列であり得る；
ｉ）好ましくは、ＧＬＥＷ群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｉｉ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、ＧＬＥＷ群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
Ｐ、Ｒ、Ｓ １０３群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成されるアミノ酸配列であり得る；
ｉ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＷではなく、
ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ又はＳであり、より好ましくはＲであり、
ｉｉｉ）ＦＲ１は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｖ）ＦＲ２は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖ）ＦＲ３は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖｉ）ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｖｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
フレームワーク１に関して、アミノ酸同一性の程度を求めるために、１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基を無視するのが好ましいことは当業者にとって明らかである。
これを考慮して、Ｐ、Ｒ、Ｓ １０３群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成されるアミノ酸配列であり得る；
ｉ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＷではなく、
ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ又はＳであり、より好ましくはＲであり、
ｉｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
ｉｖ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、Ｐ、Ｒ、Ｓ １０３群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明は、配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する上記のナノボディに関する。例えば、該ナノボディと１つ又は複数の配列番号４４１〜配列番号４８５の配列との（本明細書中に記載の方法での）アミノ酸同一性の程度を求めることによって、このアミノ酸同一性の程度を求めることができ、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する。このようなナノボディは、本明細書中でさらに記載するようなものであり得る。
既に本明細書中で言及されたように、別の好ましいが、非限定的な本発明の態様は、配列番号４４１〜配列番号４８５から成る群、又は配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するナノボディに関する。
また、上記ナノボディにおいて、
ｉ）（本明細書に規定のように）（本明細書中に規定のヒト化置換ではなければ）あらゆるアミノ酸置換が好ましく、対応する配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列に比べて保存的なアミノ酸置換であり、及び／又は
ｉｉ）そのアミノ酸配列が好ましくはアミノ酸置換のみ、又はそうでなければ対応する配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列に比べて５つ以下、好ましくは３つ以下、より好ましくは１つだけ又は２つのアミノ酸の欠失又は挿入のいずれかを含有し、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲが、例えば対応する配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列のＣＤＲから始まり、親和性成熟によって誘導されるＣＤＲであり得る。
好ましくは、本発明のナノボディにおけるＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、本発明のナノボディ（及びこれを含む本発明のポリペプチド）が、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、より好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、より好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）ＶＥＧＦに結合する、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度でＶＥＧＦに結合する、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９秒）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日のほぼ非可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度でＶＥＧＦに結合するものである。
好ましくは、本発明のナノボディに存在するＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、本発明のナノボディが、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと結合するようなものである。
本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有することが条件である。より具体的には、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定）を有することが条件である。通常、ナノボディは、ＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つにおいて、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）において、天然のＶＨドメインとの少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
また、本発明のヒト化ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定）を有することが条件である。より具体的には、本発明の非限定的な一態様によれば、ヒト化ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定）を有することが条件である。通常、ヒト化ナノボディは、ＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つにおいて、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）において、天然のＶＨＨドメインとの少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
本明細書における開示より明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの天然又は合成の類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、ホモログ及びオーソログ（本明細書中で集合的に「類似体」と称される）、特に配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディの類似体の使用も本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施形態によれば、用語「本発明のナノボディ」は広義ではこのような類似体も包含する。
一般に、このような類似体では、本明細書で規定されるような本発明のナノボディと比較して、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。このような置換、挿入又は欠失はフレームワーク領域の１つ又は複数、及び／又はＣＤＲの１つ又は複数において起こってもよい。このような置換、挿入又は欠失がフレームワーク領域の１つ又は複数において起こる場合、特徴的な残基の１つ又は複数、及び／又はフレームワーク残基中の他の位置の１つ又は複数において起こってもよいが、特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は（それらが本明細書中で説明されるような適切なヒト化置換であっても）一般にあまり好適ではない。
非限定的な例によると、置換は例えば保存的置換（本明細書中で説明される）であってもよく、及び／又はアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置に自然発生する別のアミノ酸残基により置換されてもよいが（このような置換の幾つかの非限定的な例については表Ａ−５〜表Ａ−８を参照）、本発明は一般にそれに限定されない。したがって、本発明のナノボディの特性を改善するか、又は少なくとも本発明のナノボディの所望の特性又は所望の特性のバランス若しくは組合せを過度に損なわない（すなわち、ナノボディがもはやその使用目的に適さなくなる程度までの）任意の１つ又は複数の置換、欠失又は挿入、又はその任意の組合せは本発明の範囲内に含まれる。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能な置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切な置換、欠失又は挿入、又はその適切な組合せを決定及び選択することが可能である。
例えば、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾される１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去し、当業者の能力の範囲内となるように設計してもよい。代替的には、置換又は挿入を官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入する、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように設計してもよい。
上記の表Ａ−５〜表Ａ−８に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は広義ではそれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
類似体は好ましくは、本発明のナノボディに関して本明細書で規定されるような親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）をもってＶＥＧＦに結合することができるものである。
類似体は好ましくは、本明細書中で説明されるようなナノボディの有利な特性を保持するものでもある。
また、好適な一態様によれば、類似体は、配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディの１つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有し、及び／又は好ましくは多くても２０個、好ましくは多くても１０個、さらにより好ましくは多くても５個、例えば４個、３個、２個又はただ１個のアミノ酸差異（本明細書で規定される）を有する。
また、類似体のフレームワーク配列及びＣＤＲは好ましくは、本明細書で規定される好適な態様に従うものである。より一般には、本明細書中で説明されるように、類似体は（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ且つ４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有する。
本発明のナノボディの１つの好適な種類の類似体は、ヒト化された（すなわち、本発明の天然のナノボディの配列と比較して）ナノボディを含む。本明細書中で引用される背景技術で述べられたように、このようなヒト化は一般に、ヒトＶＨドメインでの同じ位置、例えばヒトＶＨ３ドメインに起こる、天然のＶＨＨの配列における１つ又は複数のアミノ酸残基のアミノ酸残基での置換を含む。可能なヒト化置換又はヒト化置換の組合せの例は、例えば本明細書中の表から、本明細書中で引用される背景技術で述べられた可能なヒト化置換から、及び／又はナノボディの配列と天然のヒトＶＨドメインの配列との比較から当業者に明らかである。
ヒト化置換は、得られるヒト化ナノボディが、本明細書で規定されるようなナノボディの有利な特性を依然として保持するように、より好ましくは類似体に関して前述の段落に説明されるようなものであるように選択されるべきである。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なヒト化置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切なヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
一般に、ヒト化の結果として、本発明のナノボディは、本明細書中で説明されるような本発明のナノボディの有利な特性を依然として保持すると同時に、より「ヒト様」となり得る。結果として、このようなヒト化ナノボディは幾つかの利点、例えば対応する天然のＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性を有し得る。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に限られた日常実験の後、一方ではヒト化置換によりもたらされる有利な特性、他方では天然のＶＨＨドメインの有利な特性の間の所望の又は適切なバランスを最適化又は達成するヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを選択することが可能である。
本発明のナノボディは任意のフレームワーク残基（複数可）、例えば１つ又は複数の特徴的な残基（本明細書で規定される）又は１つ又は複数の他のフレームワーク残基（すなわち、非特徴的な残基）又はそれらの任意の適切な組合せで適切にヒト化され得る。「Ｐ，Ｒ，Ｓ−１０３群」又は「ＫＥＲＥ群」のナノボディに関する１つの好適なヒト化置換は、Ｑ１０８からＬ１０８への置換である。「ＧＬＥＷクラス」のナノボディもまた、他の特徴的な残基の少なくとも１つがラクダ化（camelid／camelizing）置換（本明細書で規定される）を含有するという条件で、Ｑ１０８からＬ１０８への置換によりヒト化され得る。例えば、上述したように、１つの特に好適な種類のヒト化ナノボディは、ＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列を４４位〜４７位に、Ｐ、Ｒ又はＳ（特にＲ）を１０３位に、Ｌを１０８位に有する。
ヒト化及び他の類似体、並びにそれをコードする核酸配列は、それ自体が既知の任意の方法で準備することができる。例えば、類似体は、天然のＶＨＨドメインをコードする核酸を準備すること、（例えば部位特異的突然変異誘発法、又は適切なミスマッチプライマーを使用するＰＣＲによって）置換を受ける１つ又は複数のアミノ酸残基に対するコドンを、対応する所望のアミノ酸残基に対するコドンに変えること、得られる核酸／ヌクレオチド配列を適切な宿主又は発現システムにおいて発現させること、及び任意に、得られる類似体を（例えば本明細書中でさらに説明されるように）単離及び／又は精製して、本質的に単離された形の当該類似体を提供する、単離及び／又は精製することにより得ることができる。これは一般に、例えば本明細書中で引用されるハンドブック及び参考文献、本明細書中で引用される背景技術及び／又は本明細書中のさらなる記載から当業者に明らかな、それ自体が既知の方法及び技法を用いて実行することができる。代替的には、所望の類似体をコードする核酸は、それ自体が既知の方法で（例えば所定のアミノ酸配列を有する核酸配列を合成する自動装置を用いて）合成することができ、次に本明細書中で説明されるように発現させることができる。さらに別の技法は、各々が所望の類似体の一部をコードする１つ又は複数の天然及び／又は合成の核酸配列を組み合わせること、及び次に組み合わせた核酸配列を本明細書中で説明されるように発現させることを含み得る。また、類似体は、例えば本明細書中で述べたような、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いた関連アミノ酸配列の化学合成を利用して準備することができる。
この点において、本発明のナノボディの配列を提供するため及び／又は得られる配列にナノボディの有利な特性を付与するために、本発明のナノボディ（例えばその類似体）を、例えばヒトＶＨ３配列、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のヒトＶＨ配列（すなわち、アミノ酸配列又は対応するヌクレオチド配列）から設計及び／又は準備すること、すなわち、１つ又は複数のラクダ化置換を導入する（すなわち、当該ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸残基を、ＶＨＨドメインの対応する位置で生じるアミノ酸残基に変化させる）ことが可能であることも、当業者には明らかである。また、これは一般に、開始点としてヒトＶＨドメインに対するアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列を使用し、前の段落で言及される多様な方法及び技法を用いて実行することができる。
幾つかの好ましいが非限定的なラクダ化置換は、表Ａ−５〜表Ａ−８から導くことができる。特徴的な残基の１つ又は複数でのラクダ化置換は一般に、所望の特性に他のアミノ酸位置の１つ又は複数での置換よりも大きな影響を与えるが、その両方及び任意の適切な組合せが本発明の範囲内に含まれることも明らかである。例えば、既に少なくとも幾つかの所望の特性を付与している１つ又は複数のラクダ化置換を導入すること、及び次に当該特性をさらに改善するか、及び／又はさらなる有利な特性を付与するさらなるラクダ化置換を導入することが可能である。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なラクダ化置換を導入すること、及びナノボディの有利な特性が得られたか又は改善されたか否かを求める（すなわち、本来のＶＨドメインと比較する）ことを含み得る限られた日常実験の後、適切なラクダ化置換又は適切なラクダ化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
しかしながら、一般にこのようなラクダ化置換は好ましくは、得られるアミノ酸配列が少なくとも（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ且つ４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳ、並びに任意に１つ又は複数のさらなるラクダ化置換を含有するものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、本発明のナノボディ及び／又はその類似体（本明細書で規定される）、例えばヒト化類似体及び／又は好ましくは前述の段落に規定されるような類似体をもたらすものである。
本明細書における開示から同様に明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの部分又は断片、又は２つ以上の部分又は断片の組合せ、特に配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディの部分又は断片の使用もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の一態様によれば、用語「本発明のナノボディ」は広義ではこのような部分又は断片も包含する。
一般に、本発明のナノボディ（例えばその類似体）のこのような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディ（又はその類似体）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、１つ又は複数の連続内部アミノ酸残基、又はその任意の組合せが欠失しているか、及び／又は除去されたアミノ酸配列を有する。
部分又は断片は好ましくは、本明細書で規定されるような親和性（本発明のナノボディに関して本明細書中でさらに規定されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）をもってＶＥＧＦ、並びに少なくとも１つのこのようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに結合することができるものである。
任意の部分又は断片は好ましくは、対応する本発明の全長ナノボディのアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むものである。
また、任意の部分又は断片は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の少なくとも１つ又は少なくともその一部（特に少なくともＣＤＲ３又は少なくともその一部）を含むものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び少なくとも１つの他のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２）又は少なくともその一部を含むものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは同様に適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び残り２つのＣＤＲの少なくとも一部を含むものである。
別の特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、このような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディの少なくともＣＤＲ３、例えばＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む（すなわち、例えば国際出願の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット（Lasters et al.）に説明される）。
上記で既に述べたように、２つ以上のこのような部分又は断片（すなわち、同一又は別個の本発明のナノボディに由来する）を組み合わせる、すなわち、本発明のナノボディの類似体（本明細書で規定される）及び／又はさらなる部分又は断片（本明細書で規定される）を提供することも可能である。例えば、本発明のナノボディの１つ又は複数の部分又は断片を、ヒトＶＨドメインの１つ又は複数の部分又は断片と組み合わせることもまた可能である。
好適な一態様によれば、部分又は断片は、配列番号４４１〜配列番号４８５のナノボディの１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有する。
一部及び断片、並びにそれをコードする核酸配列は、任意のそれ自体が既知の方法で準備して任意に組み合わせることができる。例えば、このような部分又は断片は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸中に終止コドンを挿入すること、及び次に得られる核酸をそれ自体が既知の方法（例えば本明細書中で説明される）で発現させることで得ることができる。代替的には、このような部分又は断片をコードする核酸は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸を適切に制限すること、又はこのような核酸をそれ自体が既知の方法で合成することにより得ることができる。部分又は断片はまた、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いて準備してもよい。
本発明は広義では本発明のナノボディの誘導体も含む。このような誘導体は一般に、本発明のナノボディ及び／又は本発明のナノボディを形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾、特に化学的及び／又は生物学的（例えば酵素的）修飾により得ることができる。
このような修飾の例、並びにこのような形（すなわち、タンパク質骨格、又は好ましくは側鎖のいずれか）で修飾することができるナノボディ配列中のアミノ酸残基の例、このような修飾の導入のために使用することができる方法及び技法、並びにこのような修飾の潜在的使用及び利点は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能性を本発明のナノボディに付与する１つ又は複数の官能基、残基又は部分を本発明のナノボディ中又はナノボディ上に（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基の例は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、本発明のナノボディの半減期、溶解性及び／又は吸収性を増大する、本発明のナノボディの免疫原性及び／又は毒性を低減する、本発明のナノボディの任意の望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドに他の有益なな特性を付与するか、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドの不要な特性を減らす、又は上記の２つ以上の任意の組合せである１つ又は複数の官能基を（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基及びそれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、一般に、以上で引用される一般的背景技術で述べた全ての官能基及び技法、並びに医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（例えばＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体）の修飾に関するそれ自体が既知の官能基及び技法を含み得る；これに関しては例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton,PA （1980）を参照する。同様に当業者に明らかなように、このような官能基は、例えば本発明のナノボディに直接（例えば共有結合的に）結合するか、又は任意に適切なリンカー又はスペーサーを介して結合する。
半減期を増大するか、及び／又は医薬用タンパク質の免疫原性を低減するために最も広く使用される技法の１つは、適切な薬学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の結合を含む。一般に、任意の適切な形のペグ化、例えば当該技術分野で抗体及び抗体断片（例えば、限定されるものではないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ）に対して使用されるペグ化を使用することができる；例えばChapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 （2002）、Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 （2003）、Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov.,2, （2003）及び国際公開第０４／０６０９６５号パンフレットを参照する。タンパク質のペグ化に関する多様な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAより市販されている。
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化を使用する（例えばYang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 （2003）を参照）。例えば、そのために、本発明のナノボディにおいて自然発生するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよく、本発明のナノボディを、ＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入するように修飾してもよく、又はＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のナノボディのＮ末端及び／又はＣ末端と融合してもよい（全て、それ自体が当業者に既知であるタンパク質工学の技法を使用する）。
好ましくは、ＰＥＧは、本発明のナノボディ及びタンパク質に対して５０００を超える（例えば１００００を超える）且つ２０００００未満（例えば１０００００未満）の分子量、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量で使用する。
さらに、通常あまり好ましくない修飾は、一般的に翻訳時及び／又は翻訳後の修飾の一部として、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応
じてＮ結合型又はＯ結合型のグリコシル化を含む。
さらに別の修飾は、標識したナノボディの用途に応じて、１つ又は複数の検出可能な標識、又は他のシグナル生成基若しくはシグナル生成部分の導入を含んでいてもよい。それらを結合、使用及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者にとって明らかであり、例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド、及びフルオレサミン、並びに１５２Ｅｕ等の蛍光金属、又はランタニド種からの他の金属）、リン光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えば、ルミナール、イソルミナール、セロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、及びジオキセタン又はＧＦＰ、並びにその類似体）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート又は金属カチオン（例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ等の金属カチオン、又はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｓｉｔｕ診断及びイメージングに特に適す他の金属若しくは金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ）、並びに、発色団及び酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な標識は当業者にとって明らかであり、例としては、ＮＭＲ分光法又はＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が挙げられる。
本発明のこのような標識したナノボディ及びポリペプチドは、例えば、特異的標識の選択に応じて、（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等の既知のイムノアッセイを含む）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕアッセイに、並びにｉｎ ｖｉｖｏ診断及びイメージングの目的で使用され得る。
当業者にとって明らかであるように、別の修飾は、例えば、上記の金属又は金属カチオンの１つをキレート化するキレート官能基（chelating group）の導入を含んでいてもよい。例えば好適なキレート官能基としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン五酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基は、本発明のナノボディを別のタンパク質、ポリペプチド、又は結合対の残り半分と結合する化合物に連結させるのに（即ち、結合対の形成を介して）使用され得る。例えば、本発明のナノボディは、ビオチンと結合し、別のタンパク質、ポリペプチド、アビジン又はストレプトアビジンと結合する化合物又は担体に連結し得る。例えば、このような結合ナノボディは、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合する診断系のレポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば、本発明のナノボディを、医薬目的に好適な担体を含む担体に結合させるのにも使用することができる。非限定的な一例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 （2000）によって記載のリポソーム製剤である。このような結合対はまた、本発明のナノボディに治療に有効な作用物質を連結させるのに使用することができる。
用途によっては、特に、（例えば、癌の治療において）本発明のナノボディが指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を低減するか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディは、毒素又は毒素残基又は毒素部分にも連結し得る。本発明のナノボディに連結して、例えば細胞毒性化合物をもたらし得る毒素部分、化合物又は残基の例は当業者にとって明らかであり、例えば、上記の従来技術に及び／又は本明細書中のさらなる説明に見ることができる。一例はいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である（国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット）。
他の可能な化学修飾及び酵素修飾は当業者にとって明らかであろう。このような修飾を、（例えば、機能−活性関係を研究するために）調査目的で導入してもよい。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 （1997）を参照する。
好ましくは、この誘導体は、（（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的に本明細書中にさらに記載のＩＣ５０値として好適に測定及び／又は表される）本発明のナノボディに関して本明細書中に規定される親和性を有して、ＶＥＧＦと結合するような誘導体である。
上述のように、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のナノボディから本質的に成るか又はこれを含む、タンパク質又はポリペプチドに関する。「から本質的に成る」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかが、本発明のナノボディのアミノ酸配列と厳密に同じであるか、又は、１個〜２０個のアミノ酸残基、例えば、１個〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは１個〜６個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基）である限定数のアミノ酸残基をナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加させた本発明のナノボディのアミノ酸配列に対応することを意味する。
上記のアミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、さもなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、ナノボディにさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。例えば、このようなアミノ酸残基は、
例えば、異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるＮ末端Ｍｅｔ残基を含み得る。
合成の際に宿主細胞からのナノボディの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、発明は広義では、限定されるものではないが、このようなリーダー配列は、ナノボディのＮ末端に連結されるであろう。
ナノボディが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込み、及び／又はナノボディが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断する、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの非限定的な例は、国際公開第０３／０２６７００号パンフレット、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 （2001）、Temsamani and Vidal, Drug Discov.Today, 9, 1012 （004）及びRousselle,J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 （2001）に記載されている小さいペプチドベクター（「Ｐｅｐ−トランスベクター」）、並びにZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 （2003）によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的のためのＣ末端アミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸配列は、例えば、Cardinale et al., Methods, 34, 171 （2004）によって記載されている。細胞内標的の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のナノボディを含むいわゆる「細胞内抗体」の発現及び／又は使用を伴う。
「タグ」、例えば、例えば上記の配列又は残基を対象とする親和性技法を用いてナノボディの精製を可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、（例えば、化学的又は酵素学的な開裂によって）上記の配列又は残基を除去して、ナノボディ配列をもたらし得る（この目的のために、タグは任意で、開裂可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に連結されてもよく、又は開裂可能なモチーフを含有していてもよい）。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及び）ｍｙｃタグ（例えば国際公開第０６／１２２８２号パンフレットの配列番号３１を参照）であり、
官能基の結合のために官能化し及び／又は部位として機能することができる１つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端、又はそのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列に融合する本発明のナノボディを含み、この結果、本発明の当該ナノボディと１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質がもたらされる。このような融合は本明細書中で「ナノボディ融合」とも呼ばれる。
１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、任意の好適及び／又は所望のアミノ酸配列であり得る。さらなるアミノ酸配列は、ナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、さもなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、ナノボディにさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ又はポリペプチドに、１つ又は複数の所望の特性又は官能性を付与する。
例えば、さらなるアミノ酸配列はまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープ（本発明のナノボディが対象とする同様のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープ、又は異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかを対象とし得る第２の結合部位をもたらし得る。
このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであり、一般に、従来の抗体及びその断片に基づきペプチド融合に用いられる全てのアミノ酸配列を含み得る（ＳｃＦｖ抗体及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 （2005）による総説を参照する。
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のナノボディ自体に比べて、半減期、溶解性又は吸着を増大させる、免疫原性又は毒性を低減する、望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は他の有益な特性を本発明のポリペプチドに付与するか、及び／又は本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減らすアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号パンフレットを参照）又はハプテン分子（例えば、循環抗体として認識されるハプテン（例えば国際公開第９８／２２１４１号パンフレットを参照））である。
特に、血清アルブミン又はその断片に対する免疫グロブリンの連結断片（例えば、ＶＨドメイン）を使用して半減期を増大させることができることは、当該技術分野において記載されている。例えば、国際公開第００／２７４３５号パンフレット及び国際公開第０１／０７７１３７号パンフレットを参照する）。
本発明によれば、本発明のナノボディは好ましくは、血清アルブミン（又はその好適な断片）に直接連結するか、又は好適なリンカーを介して、特に好適なペプチドを介して連結することにより、本発明のポリペプチドを遺伝子融合（タンパク質）として発現することができる。具体的な一態様によれば、本発明のナノボディは、少なくとも血清アルブミンのドメインＩＩＩ又はその一部を含む、血清アルブミンの断片に連結し得る。例えば、"Albumin derived amino acid sequence, use thereof forincreasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic proteinsand entities, and constructs comprising the same"と題されたAblynx N.V.の米国仮特許出願第６０／７８８，２５６号明細書（２００６年３月３１日出願）を参照する（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００２８１７号明細書も参照されたい）。
代替的に、さらなるアミノ酸配列は、血清中の半減期を増大させるように、血清タンパク質（例えば、ＩｇＧ等のヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質等）に指向性を有する、第２の結合部位又は結合単位を付与する。このようなアミノ酸配列は例えば、下記のナノボディ、並びに、国際公開第９１／０１７４３号パンフレット、国際公開第０１／４５７４６号パンフレット及び国際公開第０２／０７６４８９号パンフレットに記載の小さいペプチド及び結合タンパク質、及び国際公開第０３／００２６０９号パンフレット及び国際公開第０４／００３０１９号パンフレットに記載のｄＡｂを含む。Harmsen et al., Vaccine, 23 （41）; 4926-42, 2005、並びに欧州特許第０，３６８，６８４号明細書、並びに、本明細書中に記載のAblynx N.V.による以下の米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書も参照されたい）、同第６０／８５０，７７４号明細書（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８４９号明細書も参照されたい）、同第６０／８５０，７７５号明細書（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書も参照されたい）、及び”Peptides capable of binding to serum proteins”と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願（２００６年１２月５日出願）（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８号明細書も参照されたい）にも言及されている。
このようなアミノ酸配列は特に、血清アルブミン（及びより詳細にはヒト血清アルブミン）及び／又はＩｇＧ（及びより詳細にはヒトＩｇＧ）に指向性を有し得る。例えば、このようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有するアミノ酸配列、及びＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照）、及び／又は血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、同様に国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照）；増大した半減期を有するか又は半減期を増大させ得るアミノ酸配列（例えば、"Serum albumin binding proteins with long half-lives"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書を参照（２００６年９月８日出願；（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書も参照されたい）も参照）；哺乳類の少なくとも１種及び特に霊長類の少なくとも１種（例えば、限定されるものではないが、マカク属のサル（例えば、及び特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲサル（Macaca mulatta））、並びにヒヒ（Papio ursinus））に由来の血清アルブミンと交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列（同様に米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書及び（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書も参照されたい）を参照する）；ｐＨ非依存的に血清アルブミンに結合し得るアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to serum proteins in a mannerthat is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, anduses thereof"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７４号明細書（２００６年１０月１１日出願）（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書も参照されたい）を参照）、及び／又は条件付き結合剤であるアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to a desired molecule in aconditional manner"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７５号明細書（２００６年１０月１１日出願（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書も参照されたい）も参照）を参照）であり得る。
別の態様によれば、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、従来の４本鎖抗体（及び、特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１つ又は複数の部分、断片、又はドメインを含み得る。例えば、本発明の通常好ましくないナノボディは、従来の（好ましくはヒト）ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメインの天然型類似体若しくは合成類似体に、任意でリンカー配列（Ward et al.によって記載されているｄＡｂ抗体等の他の（単一）ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）を介して再度、連結され得る。
また、少なくとも１つのナノボディは、任意でリンカー配列を介して、１つ又は複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインと連結してもよい。例えば、好適なＣＨ１ドメインと連結するナノボディは、例えば従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片に類似する抗体断片／構築物を生成するように（好適な軽鎖と共に）使用することができるが、従来のＶＨドメインの１つ、又は（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合）１つ若しくは両方を本発明のナノボディで置換した。また、２つのナノボディは、（任意でリンカーを介して）ＣＨ３ドメインと連結してｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した構築物をもたらすことができる。
本発明のポリペプチドの具体的な一態様によれば、１つ又は複数の本発明のナノボディは、１つ又は複数のエフェクタ機能を本発明のポリペプチドに付与し及び／又は１つ又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る、１つ又は複数の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として使用する／Ｆｃ部分を形成することができる２つ又は３つの定常ドメイン）と（任意で好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結する。例えば、この目的で、及びこれらに限定されるものではないが、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、重鎖抗体（本明細書中に記載）及びより好ましくは従来のヒト４本鎖抗体等に由来する抗体の１つ又は複数のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、及び／又は例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＥ、又はＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＭ等の別のヒトＩｇに由来するＦｃ領域（の一部）を形成してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットは、ラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ナノボディ）を含む重鎖抗体を記載しており、ここでは、ラクダＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインで置換されている。それによりナノボディと（ＣＨ１ドメインは含まないが）ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインとをそれぞれ含む２つの重鎖から成る免疫グロブリンをもたらされるが、その免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクタ機能を有し、如何なる軽鎖も存在することなく機能する。本発明のナノボディと好適に連結してエフェクタ機能を付与し得る他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、所望のエフェクタ機能（複数可）に基づき選択され得る。例えば、国際公開第０４／０５８８２０号パンフレット、国際公開第９９／４２０７７号パンフレット、国際公開第０２／０５６９１０号パンフレット、及び国際公開第０５／０１７１４８号パンフレット、上記のHolliger and Hudsonの概説、並びに”Constructscomprising single variable domains and an Fc portion derived from IgE”と題されたAblynx N. V.による非公開の米国仮出願（２００７年１２月４日出願）を参照する。本発明のナノボディとＦｃ部分とのカップリングによっても、対応する本発明のナノボディに比べて半減期の増大が生じる。用途によっては、如何なる生物学的に重要なエフェクタ機能も含まない半減期が増大したＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（即ち、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン）も好適であるか、又は一層好ましい。１つ又は複数のナノボディと、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した１つ又は複数の定常ドメインとを含む他の好適な構築物は当業者にとって明らかであり、例えば、任意でリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結する２つのナノボディを含み得る。一般に、半減期が増大した任意の融合タンパク質又は誘導体は好ましくは、５０ｋＤを超える分子量、即ち腎臓吸収のカットオフ値を有する。
別の具体的であるが、非限定的な一態様において、本発明のポリペプチドを形成するために、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、（即ち従来の４鎖抗体で自然発生する定常ドメインに比べて）二量体に自己会合する傾向が低減した（又は本質的にない）天然、合成又は半合成の定常ドメイン（又はその類似体、変異体、突然変異体、部分又は断片）と（任意で好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結し得る。このような単量体の（即ち自己会合していない）Ｆｃ鎖変異体又は断片は、当業者にとって明らかである。例えば、Helm et al.（J Biol Chem 1996 271 7494）は、本発明のポリペプチド鎖で使用することができる単量体Ｆｃε鎖変異体を説明している。
また、このような単量体Ｆｃ鎖変異体は、依然として（これらに由来するＦｃ部位に応じて）補体又は関連のＦｃ受容体（複数可）に結合することができるようなもの、及び／又は依然としてこれらに由来するＦｃ部位のエフェクター機能を幾らか又は全て（又は依然として使用目的に適した低減レベルで）有するようなものであるのが好ましい。代替的に、このような本発明のポリペプチド鎖では、単量体Ｆｃ鎖を使用して、ポリペプチド鎖の半減期を増大させることができ、この場合単量体Ｆｃ鎖はエフェクター機能を有しなくても、又は本質的に有しなくてもよい。
二価／多価、二重特異性／多重特異性又は二重パラトピック／多重パラトピックの本発明のポリペプチドは、２００７年１２月４日に出願した表題"immunoglobulin constructs"の未公開（non-prepublished）米国仮特許出願に記載される種類のポリペプチド構築物を提供するためにＦｃ部位と連結してもよい。
また、さらなるアミノ酸配列は、（例えば、本発明のポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレフォーム、プロフォーム又はプレプロフォームをもたらすように）合成の際に宿主細胞から本発明のナノボディ又はポリペプチドの分泌を導くシグナル配列又はリーダー配列を形成する。
また、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ又はポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導され、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込み、及び／又は本発明のナノボディ又はポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍等の腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断する配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の好適な例は当業者にとって明らかであり、例えば、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット、米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット、国際公開第９９／０７４１４号パンフレット；国際公開第０５／０１６９０号パンフレット；欧州特許第１，５１２，６９６号明細書；及び、Cattaneo, A. & Biocca, S. （1997） Intracellular Antibodies：Development andApplications. Landes and Springer-Verlag；及びKontermann,Methods 34, （2004）, 163-170、並びに本明細書中に記載のさらなる参照文献に記載されるような、上記の「Peptrans」のベクター、即ち、Cardinale et al.によって記載される配列、並びにいわゆる「細胞内抗体」である本発明のナノボディ及びポリペプチドを発現又は製造するのに使用することができる、それ自体が既知のアミノ酸配列及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
用途によっては、特に（例えば癌の治療において）本発明のナノボディが指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を抑えるか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディはまた、（細胞）毒性タンパク質又はポリペプチドと連結し得る。本発明のナノボディと連結して、例えば、本発明の細胞毒性をもたらし得るこのような毒性タンパク質及びポリペプチドの例は当業者にとって明らかであり、例えば、上記従来技術及び／又は本明細書中のさらなる開示に見出すことができる。一例は、国際公開第０３／０５５５２７号パンフレットに記載のいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である。
好ましいが非限定的な一態様によれば、上記１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、少なくとも１つのさらなるナノボディを含み、これにより、少なくとも２つ、例えば３つ、４つ、５つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドをもたらし、当該ナノボディは任意で、１つ又は複数のリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結される。少なくとも１つが本発明のナノボディである２つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で本発明の「多価」ポリペプチドとも呼ばれ、このようなポリペプチド中に存在するナノボディは、本明細書中で「多価フォーマット」であるとも称される。例えば、本発明の「二価」ポリペプチドは、任意でリンカー配列を介して連結される２つのナノボディを含み、本発明の「三価」ポリペプチドは、任意で２つのリンカー配列を介して連結される３つのナノボディを含む。例えば、ポリペプチド中に存在するナノボディの少なくとも１つ、及び最高でポリペプチド中に存在するナノボディの全てが、本発明のナノボディである。
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のナノボディは、同じであっても異なっていてもよく、同じ抗原又は抗原決定基（例えば、同じ部分（複数可）若しくはエピトープ（複数可）、又は異なる部分若しくはエピトープ）に指向性を有するものであってもよく、代替的に異なる抗原若しくは抗原決定基、又はそれらの任意の好適な組合せに指向性を有するものであってもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一のナノボディ、（ｂ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、及び第１のナノボディと異なる上記タンパク質若しくは抗原の同一抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、（ｃ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、及び上記タンパク質若しくは抗原の別の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、又は（ｄ）第１のタンパク質若しくは抗原に指向性を有する第１のナノボディ、及び第２のタンパク質若しくは抗原（即ち、上記第１の抗原と異なる）に指向性を有する第２のナノボディを含み得る。同様に、本発明の三価ポリペプチドは例えば、これらに限定されるものではないが、（ａ）３つの同一のナノボディ、（ｂ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ、及び同一抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する第３のナノボディ、（ｃ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ、（ｄ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ、上記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ、又は（ｅ）第１の抗原に指向性を有する第１のナノボディ、上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディ、及び上記第１の抗原及び上記第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディを含み得る。
本発明の好ましい態様において、本発明の二価ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する第１のナノボディと、ＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する第２のナノボディとを含む本発明のポリペプチド（本明細書中に規定）であり、該第１及び第２のナノボディが、（本明細書中に規定のように）任意でリンカー配列を介して連結してもよい。
少なくとも２つのナノボディを含有する本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのナノボディは第１の抗原に指向性を有する（即ち、ＶＥＧＦに対する）ものであり、少なくとも１つのナノボディは第２の抗原（即ち、ＶＥＧＦと異なる抗原）に指向性を有するものであり、本発明の「多重特異性」ポリペプチドとも呼ばれており、このようなポリペプチド中に存在するナノボディは、本明細書中で「多重特異性フォーマット」であるとも称される。このため例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ちＶＥＧＦ）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ及び第２の抗原（即ち、ＶＥＧＦと異なる抗原）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ち、ＶＥＧＦ）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ、第２の抗原（即ち、ＶＥＧＦと異なる抗原）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディ、及び第３の抗原（即ち、第１の抗原及び第２の抗原の両方と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディを含むポリペプチド等である。
したがって、別の形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディとを含み、当該第１のナノボディ及び当該第２のナノボディが任意でリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結され得る本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であるのに対し、その最も単純な形態の本発明の三重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディと、第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディとを含み、当該第１のナノボディ、第２のナノボディ及び第３のナノボディが、任意で１つ又は複数、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結され得る本発明の三価ポリペプチド（本明細書中に規定）である。
本発明の好ましい態様において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、ＶＥＧＦ受容体に指向性を有する第２のナノボディとを含む本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり、該第１及び第２のナノボディが、（本明細書中に規定のように）任意でリンカー配列を介して連結してもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、ＶＥＧＦＲ−１に指向性を有する第２のナノボディとを含む本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり、該第１及び第２のナノボディが、（本明細書中に規定のように）任意でリンカー配列を介して連結してもよい。また、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、ＶＥＧＦＲ−２に指向性を有する第２のナノボディとを含む本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり、該第１及び第２のナノボディが、（本明細書中に規定のように）任意でリンカー配列を介して連結してもよい。
本発明の別の好ましい態様において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＶＥＧＦに指向性を有する第１のナノボディと、腫瘍抗原に指向性を有する第２のナノボディとを含む本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり、該第１及び第２のナノボディが、（本明細書中に規定のように）任意でリンカー配列を介して連結してもよい。
二重特異性ポリペプチドを介した本発明のナノボディのこのような標的化が、該ナノボディの全身曝露を低くし、腫瘍部位での該ナノボディの存在濃度を高くして、これによって腫瘍療法の有効性を増大させ得る一方で、現行の療法で見られる副作用を低減する。
しかしながら、上述から明らかであるように、本発明は、本発明の多重特異性ポリペプチドが、ＶＥＧＦに対する少なくとも１つのナノボディと、ＶＥＧＦと異なる１つ又は複数の抗原に指向性を有する幾つかのナノボディとを含み得るという意味において、これらに限定されない。
さらに、本発明のポリペプチド中における種々のナノボディの特定の順序又は配置が、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質（ＶＥＧＦに関する、又は１つ若しくは複数の他の抗原に対する、親和性、特異性、又は結合活性が挙げられるが、これらに限定されない）に何らかの影響を及ぼし得る点は、本発明の範囲内に包含されるが、通常、上記順序又は配置は重要なものでなく、場合によっては本明細書中の開示に基づく限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば好適に選択することができるであろう。したがって、特定の本発明の多価又は多重特異性のポリペプチドについて述べられる場合、明示的に指示がない限り、これは関連するナノボディの任意の順序又は配置を包含するものであることに留意されたい。
最終的に、本発明のポリペプチドが、２つ以上のナノボディと、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（本明細書中に記述）とを含有することも、本発明の範囲内である。
１つ又は複数のＶＨＨドメインを含有する多価の多重特異性のポリペプチド、及びそれらの調製に関して、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001;Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 （2001）, 277-302、並びに、例えば国際公開第９６／３４１０３号パンフレット及び国際公開第９９／２３２２１号パンフレットにも述べられている。本発明の幾つかの特定の多重特異性及び／又は多価のポリペプチドの幾つかの他の例は、本明細書中で参照されるAblynx N.V.による出願に記述されている。
本発明の多重特異性ポリペプチドの好ましいが非限定的な一例は、少なくとも１つの本発明のナノボディと、半減期の増大をもたらす少なくとも１つのナノボディとを含む。このようなナノボディは例えば、血清タンパク質、、特にヒト血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ等の免疫グロブリン、又は国際公開第０４／００３０１９号パンフレットに列挙された血清タンパク質に指向性を有するナノボディであり得る。これらの内で、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）又はＩｇＧ（特にヒトＩｇＧ、例えば上記のMuyldermansによる総説に記載されているナノボディＶＨ−１を参照されたい）と結合することができるナノボディが特に好ましい（が、例えばマウス又は霊長類での実験に関しては、それぞれマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）又は該霊長類由来の血清アルブミンに対する、又はこれと交差反応性のナノボディを使用することができる。しかしながら、薬学的使用に関しては、通常ヒト血清アルブミン又はヒトＩｇＧに対するナノボディが好ましい）。半減期が増大し、本発明のポリペプチドで使用することができるナノボディには、上記で言及されたようなもの等の国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及びAblynx N. V.によるさらなる特許出願で記載する血清アルブミンに指向性を有するナノボディが含まれる。
例えば、本発明で使用する半減期が増大した、幾つかの好ましいナノボディには、血清アルブミンとＦｃＲｎとの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基と結合することができるナノボディ（例えば国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照されたい）；血清アルブミンのドメインＩＩＩ部分を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基と結合することができるナノボディ（例えば国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照されたい）；半減期が増大したか又は増大することができるナノボディ（例えば本明細書中に言及されるAblynx N.Vによる米国仮特許出願第６０／８４３３４９号明細書を参照されたい、また国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書を参照されたい）；少なくとも１種の哺乳動物、特に少なくとも１種の霊長類（例えば、限定されるものではないが、マカク属のサル（例えば、及び特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲサル（Macaca mulatta））、並びにヒヒ（Papio ursinus））由来の血清アルブミンと交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するナノボディ（例えばAblynx N.Vによる米国仮特許出願第６０／８４３３４９号明細書を参照されたい、また国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９４７５号明細書を参照されたい）；ｐＨ依存的に血清アルブミンと結合することができるナノボディ（例えば本明細書中で言及されるAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０７７４号を参照されたい、また国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８４９号明細書を参照されたい）及び／又は条件付き結合剤（conditional binders）であるナノボディ（例えばAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０７７５号を参照されたい、また国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書を参照されたい）が含まれる。
半減期が増大し、本発明のポリペプチドで使用することができる、幾つかの特に好ましいナノボディには、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット（表ＩＩ及び表ＩＩＩを参照されたい）に記載のナノボディＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０が含まれ、その中でもＡＬＢ−８（国際公開第０６／１２２７８７号パンフレットにおける配列番号６２）が特に好ましい。
少なくとも１つの本発明のナノボディ、及び少なくとも１つの半減期が増大したナノボディを含む本発明のポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号５７６〜配列番号６７７に挙げられる。
具体的であるが非限定的な本発明の態様によれば、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の本発明のナノボディ以外に、少なくとも１つのヒト血清アルブミンに対するナノボディを含有する。
概して、１つ又は複数の本発明のナノボディを含有する、半減期が増大した任意の本発明のポリペプチド、及び本発明のナノボディ又は半減期が増大したこのようなポリペプチドの任意の誘導体は好ましくは、対応する本発明のナノボディ自体の少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍を超える半減期を有する。例えば、このような誘導体又は半減期が増大したポリペプチドは、対応する本発明のナノボディ自体に比べて、半減期が１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大し得る。
好ましいが、非限定的な本発明の態様において、このような誘導体又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示し得る。例えばこのような誘導体又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
本発明の一態様によれば、ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてポリペプチドの半減期を増大させることができる１又は複数の分子と結合することができる。
本発明のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて安定化され、それらの半減期は、分解耐性及び／又はクリアランス耐性若しくは捕捉耐性のある分子への結合により増大する。通常、このような分子は、それ自体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて長い半減期を有する天然タンパク質である。
本発明の多重特異性ポリペプチドの別の好ましいが非限定的な例は、少なくとも１つの本発明のナノボディ、及び本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導し、及び／又は本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに侵入させるか若しくは入り込ませ、及び／又はナノボディを細胞膜、上皮細胞層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入させるか若しくはそれらを横断する、少なくとも１つのナノボディを含む。このようなナノボディの例としては、所望の器官、組織又は細胞（例えば、腫瘍細胞に関連する細胞表面マーカー）に特有の細胞表面タンパク質、マーカー又はエピトープ、並びに国際公開第０２／０５７４４５号パンフレット及び国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットに記載の単一ドメインの脳に誘導して抗体断片を標的とするナノボディが挙げられ、このうち、ＦＣ４４（国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの配列番号１８９）及びＦＣ５（国際公開第０６／０４０１５４号パンフレットの配列番号１９０）が好ましい例である。
本発明のポリペプチドにおいて、１つ又は複数のナノボディ、及び１つ又は複数のポリペプチドは、（例えば、国際公開第９９／２３２２１号パンフレットに記載のように）互いに直接連結していてもよく、及び／又は１つ又は複数の好適なスペーサー若しくはリンカー、又はこれらの任意の組合せを介して互いに連結していてもよい。
多価及び多重特異性のポリペプチドに使用するのに好適なスペーサー又はリンカーは当業者にとって明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結させる当該技術分野で使用する任意のリンカー又はスペーサーであってよい。好ましくは、上記リンカー又はスペーサーは、医薬用途で意図されるタンパク質又はポリペプチドを構築する上での使用に好適である。
幾つかの特に好ましいスペーサーとしては、抗体断片又は抗体ドメインを連結させるのに当該技術分野で使用されるスペーサー及びリンカーが挙げられる。これらは、上記で引用した包括的な背景技術に記載したリンカーと共に、例えば、ダイアボディ又はＳｃＦｖ断片を構築するのに当該技術分野で使用するリンカーを含む（しかし、この点で、ダイアボディ及びＳｃＦｖ断片では、使用するリンカー配列が、関連するＶＨドメイン及びＶＬドメインが一体となって、完全な抗原結合部位を形成することができるような長さ、柔軟性の程度、及び他の性質を有している必要があるが、それぞれのナノボディは単独で完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドに使用するリンカーの長さ又は柔軟性に関しては特に制限が存在しないことに留意されたい）。
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、具体的には１個〜５０個、好ましくは１個〜３０個、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。このようなアミノ酸配列の幾つかの好ましい例としては、（国際公開第９９／４２０７７号パンフレットに記載の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３）等の例えば、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、上記Ablynxによる出願に記載のＧＳ３０リンカー、ＧＳ１５リンカー、ＧＳ９リンカー及びＧＳ７リンカー（例えば国際公開第０６１０４０１５３号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットを参照）、並びに天然型重鎖抗体のヒンジ領域等のヒンジ類似領域、又は（国際公開第９４／０４６７８号パンフレットに記載のもの等の）同様の配列が挙げられる。
幾つかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡ等）、並びにＧＳ３０リンカー（国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号８５）及びＧＳ９リンカー（国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号８４）である。
他の好適なリンカーは一般に、有機化合物又はポリマー、特に医薬用途のタンパク質に使用するのに好適な有機化合物又はポリマーを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結させるのに使用されており、例えば、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレットを参照されたい。
使用するリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度及び／又は他の性質（重要ではないが、ＳｃＦｖ断片に使用されるリンカーにおいて一般的なもの）は、ＶＥＧＦ又は１つ又は複数の他の抗原に対する親和性、特異性又は結合活性を含むがこれらに限定されない、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質に何らかの影響を及ぼし得る点は、本発明の範囲内に包含される。本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができるであろう。
例えば、（多量体受容体又は他のタンパク質等の）多量体抗原に指向性を有するナノボディを含む本発明の多価のポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明のそれぞれのナノボディを、多量体のそれぞれのサブユニット上の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。同様に、同一の抗原上の２つ以上の異なる抗原決定基（例えば、抗原の異なるエピトープ、及び／又は多量体受容体、チャネル若しくはタンパク質の異なるサブユニット）に指向性を有するナノボディを含む本発明の多重特異性ポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、それぞれのナノボディを、目的の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。この場合にも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができるであろう。
使用するリンカー（複数可）が、本発明のポリペプチドに、１つ又は複数の他の望ましい性質又は機能を付与し、及び／又は（例えば本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記載の）誘導体の形成及び／又は官能基の結合のための１つ又は複数の部位をもたらすことも本発明の範囲内に包含される。例えば、１つ又は複数の荷電アミノ酸残基（上記の表Ａ−２を参照）を含有するリンカーは、優れた親水性をもたらすのに対し、低分子量のエピトープ又はタグを形成するか又はそれらを含有するリンカーは、検出、同定及び／又は精製の目的で使用することができる。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された通常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカーを決定することができるであろう。
最終的に、本発明のポリペプチドに２つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは同一であっても異なっていてもよい。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するのに適切なリンカーを決定することができるであろう。
通常、発現及び産生を容易にするため、本発明のポリペプチドは直鎖ポリペプチドである。しかしながら、本発明は、広義ではこれらに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つ以上のナノボディを含む場合、「星型」の構築物を得るために、各「アーム」がナノボディに結合する３つ以上の「アーム」を有するリンカーを使用することによってこれらを結合させることも可能である。通常あまり好ましくないが、環状の構築物を使用することも可能である。
また、本発明には、本発明のポリペプチドの誘導体が含まれ、これは本発明の、即ち本明細書中に記載のナノボディの誘導体に本質的に類似するものであり得る。
また、本発明には、本発明のポリペプチドから「本質的に成る」タンパク質又はポリペプチドが含まれる（「から本質的になる」という語句は、上記で示したものと本質的に同じ意味を有する）。
本発明の一態様によれば、本発明のポリペプチドは、本明細書中に規定したように、本質的に単離形態である。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸は、それ自体が既知であり、本明細書中のさらなる説明により当業者にとって明らかである方法で調製することができる。例えば、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の調製のためのそれ自体が既知の任意の方法で調製することができる。アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸を調製するための、好ましいが非限定的な幾つかの方法としては、本明細書中に記載の方法及び技法が挙げられる。
当業者にとって明らかであるように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポｉ）リペプチドの調製に特に有用な一方法は通常、
好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書中では「本発明の宿主」とも呼ぶ）において、又は本発明の上記アミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書中では「本発明の核酸」とも呼ぶ）に適切な別の発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
ｉｉ）このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含む。
特に、このような方法は、
ｉ）本発明の宿主が少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び／又は維持する工程と、場合によってはその後、
ｉｉ）このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含み得る。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態を取ることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態をとる。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合するコドンの使用によるＤＮＡ等）であってもよい。
本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書中に記載したように、本質的に単離形態である。
本発明の核酸は、例えば、プラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクターの形態をとり、その一部に存在し、及び／又はその一部であってもよく、また本質的に単離形態であってもよい。
本発明の核酸は、本明細書中に記載の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製されるか又は得ることができ、及び／又は好適な天然資源から単離することができる。類似体を得るためには、天然型ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列に、例えば、部位特異的な突然変異誘発を起こして、当該類似体をコードする本発明の核酸を得ることができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を好適な方法で連結することができる。
本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然型配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の結合（combining）、切断された遺伝子産物を発現させる変異の導入、（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を生成するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による変異の導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrook et al.及びAusubel et al.の文献等の標準的なハンドブック、及び以下の実施例を参照する。
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態をとり、その一部に存在し、及び／又はその一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、例えば、１つ又は複数の好適な制御要素（好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等）といった、１つ又は複数のそれ自体が既知の遺伝子構築物の要素に、場合によっては連結する少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、目的とする宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における単独での複製、保持及び／又は継代に好適な形態をとり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態をとることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現を提供し得るベクターであってもよい。
好ましいが非限定的な一態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ｉ）ｉｉ）と作用可能に結合している少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｉｉ）プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の、１つ又は複数の制御要素と、場合によってはさらに
ｉｉｉ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「制御要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における（本明細書中に詳述するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば、３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば、使用する構築物の種類、目的とする宿主細胞又は宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の制御配列、プロモーター、及びターミネーターを、ほぼ同様の方法で使用してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記制御要素、及び場合によっては上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、これにより、これらは通常互いに機能的な関係にあることが意図されている。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写及び／又は発現を、開始又は他の方法により制御／調節することができる場合（上記コーディング配列は、上記プロモーター「に制御されている」ものとして理解されたい）、コーディング配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同一の配向を有し、通常同一リーディングフレーム内にある。必ずしも必要ではないが、通常、それらは本質的に隣接している。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の制御要素及びさらなる要素は、目的とする宿主細胞又は宿主生物において意図される生物学的機能を付与することができるほどのものである。
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、目的とする宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」でなければならず、このため（例えば）、上記プロモーターは、（上記で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコーディング配列）の転写及び／又は発現を、開始、又は他の方法により制御／調節することができるものであると意図される。
特に好ましい幾つかのプロモーターとしては、本明細書中に述べた宿主細胞における発現のためのそれ自体が既知のプロモーター、特に、本明細書中に述べたもの及び／又は実施例において使用されるもの等の、細菌細胞における発現のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
選択マーカーは、（即ち、適切な選択条件下で）本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（首尾良く）起こった宿主細胞及び／又は宿主生物を、形質転換が（首尾良く）起こらなかった宿主細胞及び／又は宿主生物と区別できるようなものでなければならない。このようなマーカーの好ましいが非限定的な幾つかの例は、抗生物質（カナマイシン又はアンピシリン等）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、形質転換されていない細胞又は生物が生存する上で不可欠な、培地中の或る種の因子、化合物及び／又は（食品）成分がない状態で宿主細胞又は宿主生物を維持させる遺伝子である。
リーダー配列は、（目的とする宿主細胞又は宿主生物において）所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに配向させるような配列であるものでなければならない。また、リーダー配列は、上記細胞から発現生成物を分泌させてもよい。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物中で作用可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であってもよい。リーダー配列は、細菌細胞中で発現する必要はない。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知であるリーダー配列を、ほぼ同様の方法で使用することができる。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、（宿主細胞又は宿主生物中で）遺伝子構築物の発現（遺伝子又はヌクレオチド配列の存在）を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、例えば、細胞の特定の部分又はオルガネラ、及び／又は多細胞生物の特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、又は部分（複数可）に局在化させてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列とのタンパク質融合として発現されてもよい。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が挙げられる。
好適なプロモーター、ターミネーター、及びさらなる要素の好ましいが非限定的な幾つかの例としては、本明細書中に記載した宿主細胞における発現に使用することができるもの、及び具体的には本明細書中に論じ、及び／又は下記の実施例で用いられているもの等の細菌細胞における発現に好適であるものが挙げられる。ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物中に存在／使用し得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及びさらなる要素についての（さらなる）非限定的な幾つかの例については、上記Sambrook et al.、及びAusubel et al.文献等の概説ハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９６／２３８１０号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９５／２１１９１号パンフレット、国際公開第９７／１１０９４号パンフレット、国際公開第９７／４２３２０号パンフレット、国際公開第９８／０６７３７号パンフレット、国際公開第９８／２１３５５号パンフレット、米国特許第７，２０７，４１０号明細書、米国特許第５，６９３，４９２号明細書、及び欧州特許第１，０８５，０８９号明細書に示されたものを参照する。他の例は当業者にとって明らかであろう。上記の包括的な背景技術に関する参考文献及び本明細書中にさらに引用した参考文献も参照する。
本発明の遺伝子構築物は、通常、例えば、上記Sambrook et al.、及びAusubel et al. 文献等の概説ハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記さらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的な幾つかの例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に記載したものである。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現及び／又は産生させるための、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核、又は真核細胞若しくは細胞株、例えば：
大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の菌株、蛍光菌等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、及び、枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の菌株、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）等のブドウ球菌の菌株、及び乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌株が挙げられるがこれらに限定されない細菌株、
トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属、アカパンカビ等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）等のソルダリア属、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillusniger）又はショウユコウジカビ等のアスペルギルス属、又は別の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない真菌細胞
出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomycespombe）等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス又はピキア・メタノリカ等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowialipolytica）等のヤロウィア属由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
シロイチモンジヨトウＳＦ９及びＳｆ２１細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞／細胞株、又はシュナイダー細胞及びＫｃ細胞等のショウジョウバエに由来する細胞／細胞株等の昆虫に由来する細胞又は細胞株、
タバコ植物等の植物又は植物細胞、及び／又は
ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−２１細胞等）、及びＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞等）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳類に由来する細胞又は細胞株等の哺乳類細胞又は細胞株、及び、
抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）を発現及び産生することでそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した包括的な背景技術に関する文献及び、例えば、国際公開第９４／２９４５７号パンフレット、国際公開第９６／３４１０３号パンフレット、国際公開第９９／４２０７７号パンフレット、Frenken et al.（1998）（上記）、Riechmann及びMuyldermans （1999）（上記）、van der Linden （2000）（上記）、Thomassen et al.（2002）（上記）、Joosten et al.（2003）（上記）、Joosten et al.（2005）（上記）及び本明細書中にさらに引用した文献を参照する。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、予防及び／又は治療（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１つ又は複数の細胞、組織、又は器官に導入し、発現させることができる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えば、このように（例えば、リポソームを用いて）、又は好適な（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス等のレトロウイルスに由来する）遺伝子治療用ベクターに挿入後、任意の好適な方法を用いて細胞又は組織に導入することができる。当業者にとって明らかであるように、このような遺伝子治療は、本発明の核酸又は本発明の核酸をコードする好適な遺伝子治療用ベクターを、患者又は患者の特定の細胞又は特定の組織若しくは器官に投与することにより患者の体内において、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｓｉｔｕで行うことができ、又は好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物又は組織生検試料等の、治療対象となる患者より採取された）細胞は、本発明のヌクレオチド配列を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで治療した後、患者の体内に好適に（再）導入することができる。これらは全て、Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary AnnLiebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano,Nature F Medicine 2 （1996）,534-539、Schaper, Circ. Res. 79 （1996）, 911-919、Anderson,Science 256 （1992）, 808-813、Verma, Nature 389 （1994）, 239、Isner, Lancet 348 （1996）, 370-374、Muhlhauser,Circ. Res. 77 （1995）, 1077-1086、Onodera, Blood 91; （1998）, 30-36、Verma, Gene Ther. 5 （1998）, 692-699、Nabel,Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 （1997）, 289-292、Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 （1998）, 2243-51、Wang,Nature Medicine 2 （1996）, 714-716、国際公開第９４／２９４６９号パンフレット、国際公開第９７／００９５７号パンフレット、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、米国特許第５，５８９５４６６号明細書、又はSchaper, CurrentOpinion in Biotechnology 7 （1996）, 635-640に記載の当業者に既知の遺伝子治療用ベクター、技法、及びデリバリーシステムを用いて行うことができる。例えば、ＳｃＦｖ断片（Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 （2003））及びダイアボディ（Blanco et al., J. Immunol,171, 1070-1077 （2003））のｉｎ ｓｉｔｕ発現は当該技術分野に記述されている。
細胞中でのナノボディの発現のために、これらは、例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット、国際公開第９５／２２６１８号パンフレット、及び米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号パンフレット、Cattaneo, A.及びBiocca, S. （1997） Intracellular Antibodies: Developmentand Applications. Landes and Springer-Verlag、並びにKontermann,Methods 34, （2004）, 163-170に記載の、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、例えば、ウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの母乳等のトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳類に導入する一般的な技法については、例えば、米国特許第６，７４１，９５７号明細書、米国特許第６，３０４，４８９号明細書、及び米国特許第６，８４９，９９２号明細書を参照）、植物、又は葉、花、果実、種、根、塊茎を含むがこれらに限定されない植物の一部中（例えば、タバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）、又は、例えば、カイコガの蛹中で産生することもできる。
さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、細胞を含まない発現系で発現及び／又は産生してもよく、このような系の好適な例は当業者にとって明らかであろう。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、小麦麦芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はZubayの方法による大腸菌を用いた系での発現が挙げられる。
上記のように、ナノボディを使用する利点の１つは、それに基づくポリペプチドを、好適な細菌系における発現によって調製することができる点であり、及び好適な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節要素等は、例えば上述した参考文献によって当業者にとって明らかであろう。しかしながら、本発明は、広義では細菌系における発現に限定されないことに留意されたい。
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系を使用し、このような発現系も当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することもできる。
工業的スケールでの製造において、ナノボディ又はナノボディを含有するタンパク質治療剤の（工業的）製造のために好ましい異種宿主としては、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケール（即ち、ＧＭＰグレード）での医薬用途発現／産生／培養に適した大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。このような菌株の好適な例は、当業者にとって明らかであろう。このような菌株及び産生／発現系も、Biovitrum社（スウェーデン、ウプサラ）等の企業から入手可能である。
或いは、哺乳類細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／培養のために用いることができる。このような発現／産生系も、上記幾つかの企業から入手可能である。
特定の発現系の選択は、或る特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要条件に一部依存している。グリコシル化が望ましいか又は必要とされるナノボディを含有する組換えタンパク質の産生には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現用宿主の使用が必要である。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（即ち、種類、数、及び残基が結合する位置）が、発現に用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは、ヒト（即ち、本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）細胞若しくは細胞株、又は、本質的に及び／又は機能的にヒトのグリコシル化と同一であるか、又は少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与えることができる別の哺乳類の細胞株が用いられる。一般に、大腸菌等の原核宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等原核細胞を使用すると、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上記宿主細胞及び発現系の全てを、得ようとする所望のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
したがって、本発明の非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化される。本発明の別の非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはグリコシル化されない。
本発明の好ましいが非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細菌細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の株の細胞等の細菌細胞中で産生する。
本発明の別の好ましいが非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、酵母細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の種の細胞等の酵母細胞中で産生する。
本発明のさらに別の好ましいが非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、哺乳類細胞中、具体的にはヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で、さらに具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の細胞株等のヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で産生する。
宿主細胞中での発現が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの製造に用いられる場合、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生し、次いで宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製してもよく、又は細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で産生し、次いで培地から単離し、場合によってはさらに精製してもよい。真核宿主細胞を使用する場合、得られるナノボディ及びタンパク質のさらなる単離及び下流工程での処理が大幅に容易になるため、通常、細胞外で産生されることが好ましい。通常、大腸菌の菌株等の上記細菌細胞は、毒素及び血液毒等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌せず、大腸菌において分泌物を産生することは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を転移させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して、幾つかの利点がある。例えば、分泌産物のＮ末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一であってもよい。また、ペリプラズム中では、細胞質中よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中では、混入するタンパク質が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境をもたらすため、正しい位置にジスルフィド結合が形成される可能性があるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性の凝集物中に見られることが多い。これらの封入体は、細胞質中にもペリプラズム中にも存在させることができ、これらの封入体からの生理活性タンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを必要とする。治療効果を有するタンパク質を含む多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。代替的には、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のアミノ酸配列ナノボディ又はポリペプチドを分泌するように遺伝的に修飾された細菌の組換え菌株を用いることができる。
したがって、本発明の非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞内で産生され、宿主細胞から、特に細菌細胞又は細菌細胞中の封入体から単離したアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。本発明の別の非限定的な態様によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのプロモーターとしては、
大腸菌における発現のための：ｌａｃプロモーター（及び、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のこれらの誘導体）；アラビノースプロモーター；λファージの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター；ｔｒｐオペロンのプロモーター；ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）；Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７−ファージ遺伝子１０のプロモーター）；及び他のＴ−ファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、１つ又は複数の外来制御オペレーター配列を含む上記プロモーターの組換え変異体；
出芽酵母における発現のための：ＡＤＨ１（アルコール脱水素酵素１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃ異性化酵素１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター；ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコール脱水素酵素２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター；ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の外来プロモーター；
ピキア・パストリスにおける発現のための：ＡＯＸ１プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
哺乳類細胞における発現のための：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター；プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーターが挙げられる。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのベクターとしては、
哺乳類細胞における発現のためのベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系；
細菌細胞における発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
酵母又は別の真菌細胞における発現のためのベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）；
昆虫細胞における発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
植物又は植物細胞における発現のためのベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な菌株又はＴｉ-プラスミドベースのベクターが挙げられる。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で使用するための分泌配列としては、
大腸菌等の細菌細胞における使用のための：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモリシンＣ−末端分泌シグナル；
酵母における使用のための：α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
哺乳類細胞における使用のための：標的タンパク質が真核細胞由来である場合には、固有シグナル、マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド等が挙げられる。
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するのに好適な技法は、当業者にとって明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存することもある。同様に、上記ハンドブック及び特許出願を参照する。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によってうまく形質転換された宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択する工程を実行することができる。この工程は、例えば、本発明の遺伝子構築物に含まれる選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、又は、例えば、特異的抗体を使用する本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であってもよい。
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態を取ることができる）又は宿主生物（安定な変異体系列又は株の形態を取ることができる）は、本発明のさらなる態様をなす。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官において）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現し、又は（少なくとも）（例えば、好適な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含んでおり、それらは、例えば、細胞分裂又は有性若しくは無性生殖により得られるものであってよい。
本発明のアミノ酸配列を発現させ／その発現を得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが発現／産生されるような条件下で飼育、維持及び／又は培養され得る。好適な条件は当業者にとって明らかであり、通常、使用する宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する制御因子に依存する。この場合にも、本発明の遺伝子構築物に関する上記の段落に記載したハンドブック及び特許出願を参照する。
一般に、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌及び／又は好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、及び場合によっては好適な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターにより制御される場合）が含まれ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、連続的、一時的、又は適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、（まず）未成熟型（上記）で産生され、次いで、使用する宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよいことも、当業者にとって明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、この場合にも、使用する宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は当該宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動法、分別沈殿法、アフィニティ法（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いる）、及び／又は分取免疫法（単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いる）等の、それ自体が既知のタンパク質の単離技法及び／又は精製技法を用いて単離することができる。
通常、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含み、１つ又は複数のさらなる薬理活性ポリペプチド及び／又は化合物を場合によっては含む薬学的調製剤又は薬学的組成物として製剤化することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、全身投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、座剤等による投与のために適した形態を取ることができる。このような好適な投与形態は、投与の方法、及びその調製剤で用いるための方法及び担体に応じて、固体、半固体又は液体であってよく、当業者にとって明らかであり、本明細書にさらに記載する。
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、少なくとも１つの本発明のナノボディ又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び少なくとも１つの好適な（医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤を含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質を含有する薬学的組成物に関する。
一般に、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により製剤化及び投与することができ、これらについては、例えば、上記で引用した包括的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット及び国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., MackPublishing Company, USA （1990）、又はRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition,Lippincott Williams and Wilkins （2005）等の標準的なハンドブックを参照する。
例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（ＳｃＦｖ及びダイアボディ等）及び他の薬理活性タンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で製剤化及び投与することができる。このような製剤及びそれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に好適な調製剤が挙げられる。
非経口投与のための調製剤は、例えば、点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製剤に好適な担体又は希釈剤としては、例えば、限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は鉱物油、動物油、及び植物油、例えば、落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば、その全文が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
このように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は吸収可能な食用の担体等の薬学的に許容される溶媒と組み合わせて、例えば、経口的に全身投与することができる。それらを、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製剤は、少なくとも０．１％の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有していなければならない。組成物及び調製剤中のそれらの割合は、当然ながら変えることができ、所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であることが適切である。このような治療上有用な組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油、チェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体状の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存料としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、単位投薬形態の調製に使用される全ての物質は、薬学的に許容され、使用する量において実質的に無毒でなければならない。さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、徐放剤及び装置中に封入されていてもよい。
経口投与のための調製剤及び製剤にはまた、本発明の構築物が胃内環境に耐性を有し且つ腸内を通過することを可能にする腸溶コーティングが付与される。より包括的には、経口投与のための調製剤及び製剤は、消化管のいずれかの所望部分に送達するのに好適に製剤化され得る。また、消化管に送達するのに用いられ得る好適な坐薬を使用してもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの溶液、又はそれらの塩は、水中で調製することがき、任意で無毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製剤は、微生物の繁殖を防ぐための保存料を含有している。
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液剤又は分散液剤の即時調製に適合し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌水溶液剤又は分散液剤又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定でなければならない。液体の担体又は溶媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を妨害することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、砂糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液剤は、所望の量の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に混合させた後、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び滅菌濾過された溶液剤中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
局所投与のためには、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、一般に、それらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル又はグリコール又は水−アルコール／グリコール混合物が挙げられ、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、場合によっては非毒性の界面活性剤の作用により、有効な濃度で溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及び他の抗菌剤等のアジュバントを加えてもよい。得られる液体組成物は、ばんそうこう及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって塗布することができ、又はポンプ型又はエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は当該技術分野に既知であり、例えば、Jacquet et al.（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Smith et al.（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）及びWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照されたい。
好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは徐放製剤中で送達される。徐放製剤には、（これらに限定されないが）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれる。これらのマトリクスは、成形加工品形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルである。徐放マトリクスの例としては、ポリエステル、Langer et al.（J. Biomed. Mater. Res. 1981,15: 167）及びLanger（Chem. Tech.,1982, 12: 98-105）によって記載のポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）等のヒドロゲル、若しくはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Sidman et al. Biopolymers, 1983, 22: 547）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer et al.、上記）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとから構成される注射用ミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、デキストランヒドロキシエチルメタクリレートポリマー（Vlugt-Wensink et al., Biomacromolecules, 2006, 7: 2983）並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーによって１００日を越える分子の放出が可能になる一方で、或る特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。封入した本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、長時間体内に残留すると、３７℃で湿気に曝された結果として変性又は凝集する可能性があり、これによって生物学的活性及び免疫原性の起こり得る変化が失われる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの徐放組成物には、リポソームに入り込んだ本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドも含まれる。Epstein et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985,82: 3688）、Hwang et al.（Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1980, 77: 4030）、米国特許第４４８５０４５号明細書及び米国特許第４５４４５４５号明細書で記載のような当該技術分野で既知の方法によって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有するリポソームを調製する。通常、リポソームは、小さい（約２００オングストローム〜８００オングストローム）単層型であり、その脂質含量は、約３０ｍｏｌ％を超えるコレステロールであり、最適な治療のために選択する割合を調整する。循環時間を高めるリポソームは、米国特許第５０１３５５６号明細書に開示されている。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの有用な用量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は当該技術分野に既知であり、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
一般に、ローション等の液体組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
治療における使用に必要な本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの量は、選択される特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドだけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの用量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば、１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔での分割投与で示され得る。部分用量自体を、例えば、吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与等の、個別で、大まかな間隔の数多くの投与にさらに分割してもよい。
投与計画には、長期間の１日処置が含まれ得る。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、又は数年の期間を意味する。この用量範囲における必要な改変は、本明細書中で教示される通常の実験のみを使用して当業者によって決定され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences （Martin,E. W., ed. 4）, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。用量は、何らかの合併症が発症した場合には、個々の医師が調節することもできる。
別の態様において、本発明は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする少なくとも１つの症状又は疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする患者に、薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、予防及び／又は治療する方法に関する。
本発明の文脈において、用語「予防及び／又は治療」とは、疾患を予防及び／又は治療することを含むだけでなく、概して、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延又は退行させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状の発症を予防又は遅延させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状を低減及び／又は軽減すること、疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重傷度及び／又は期間を低減すること、及び／又は疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重症度のさらなる増大を予防すること、疾患によって生じるあらゆる生理学的損傷を予防、低減又は退行させること、及び概して治療すべき患者に有益なあらゆる薬理作用も含む。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明は、ＶＥＧＦに、その生物活性若しくは薬理活性に、及び／又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連がある少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、本発明は、ＶＥＧＦ、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することによって治療することができる少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、上記の薬学的に有効な量とは、ＶＥＧＦ、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路又はシグナル伝達を調節するのに十分な量とすることができ、且つ／又は、ＶＥＧＦ、その生物学的活性又は薬学的活性、及び／又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路又はシグナル伝達を調節するのに十分な、循環血液中で本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチドのレベルを与える量とすることができる。
本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、又は本発明のポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
より具体的には、本発明は、本明細書中に列挙される疾患及び障害から成る群から選択される少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫療法、及び特に受動免疫療法に関する方法であって、本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のある被験者に、薬学的に有効な量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
上記の方法において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて任意の好適な方法で投与することができる。したがって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、例えば、この場合にも使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて経口的、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋内、又は消化管を回避した投与の任意の他の経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所的に、座薬を用いて、吸入によって投与することができる。臨床医は、予防又は治療すべき疾患又は障害、及び臨床医に既知の他の因子に応じて、好適な投与経路、及びこのような投与に使用される好適な薬学的製剤又は薬学的組成物を選択することができるであろう。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、予防又は治療すべき疾患又は障害の予防及び／又は治療に好適な治療計画に従って投与される。臨床医は一般的に、予防又は治療すべき疾患又は障害、治療すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド、特定の投与経路、及び使用される薬学的製剤又は薬学的組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に既知の同様の因子に応じて、好適な治療計画を決定することができるであろう。
通常、治療計画には、１つ又は複数の薬学的に有効な量又は用量における１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド、又はこれらを含む１つ又は複数の組成物の投与が含まれるであろう。投与される具体的な量（複数可）又は用量はこの場合でも上記の因子に基づき臨床医によって決定することができる。
通常、本明細書中に記載した疾患及び障害の予防及び／又は治療に関して、また治療すべき特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの効力、特定の投与経路、及び使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは概して、１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．０１μｇ／ｋｇ（体重）／日、好ましくは、０．１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．１μｇ／ｋｇ（体重）／日、例えば、約１μｇ／ｋｇ（体重）／日、１０μｇ／ｋｇ（体重）／日、１００μｇ／ｋｇ（体重）／日又は１０００μｇ／ｋｇ（体重）／日の量で、連続して（例えば、点滴によって）、日々の単回用量として、又は１日の中の複数回の分割用量として投与されるであろう。臨床医は一般的に、本明細書中に記載の因子に応じて好適な日用量を決定することができるであろう。特定の場合には、例えば、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づきこれらの量から外れるように臨床医が選択することもあることが明らかであろう。一般的に、親和性／結合活性、有効性、体内分布、半減期及び当業者に既知の同様の因子の差異は考慮するものの、本質的に同様の経路を介して投与される、同様の標的に対する比較可能な従来の抗体又は抗体断片に関して通常投与される量から、投与量に関する指針は幾らか得ることができる。
通常上記の方法では、本発明の単一のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを使用するであろう。しかしながら、２つ以上の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを組み合わせて使用することも本発明の範囲内である。
本発明のナノボディ、アミノ酸配列及びポリペプチドは、１つ又は複数のさらなる薬学的に有効な化合物又は成分と組み合わせて、即ち、相乗効果をもたらすことも又はもたらさないこともある複合治療計画として使用することもできる。この場合でも、臨床医は、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づき、このようなさらなる化合物又は成分、並びに好適な複合治療計画を選択することができるであろう。
特に、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、本明細書中に記載の疾患及び障害の予防及び／又は治療に用いられるか又は用いることができる他の薬学的に有用な化合物又は成分と組み合わせて使用してもよく、その結果、相乗効果が得られることも又は得られないこともある。このような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法及び薬学的製剤又は薬学的組成物は臨床医にとって明らかであろう。
本発明の一実施形態において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、本明細書中に言及される様々な腫瘍、癌及び／又は癌腫等の新生物疾患を予防及び／又は治療するのに使用する、及び／又は使用することができる化学療法剤と併用する。抗癌活性を示す任意の化学療法剤は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドとの併用治療に使用することができる。好ましくは、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体及び関連の阻害剤、ビンカアルカノイド、エピポドピロ（epipodopyyllo）毒素、抗生剤、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アドレノコルチコステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、及びゴナドトロピン放出ホルモン類似体から成る群から選択される。より好ましくは、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル及びドキセタキセルから成る群から選択される。２つ以上の化学療法剤は、カクテル中に使用し、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの投与と組合せて投与することができる。１つの好ましい複合化学療法は、５−ＦＵと１つ又は複数の他の化学療法剤とを含むフルオロウラシルに基づくものである。好適な複合化学療法の投与レジメンは、当該技術分野で既知であり、例えばSaltz et al.（Proc. ASCO 1999, 18: 233a）及びDouillard et al.（Lances 2000, 355: 1041）に記載されている。
２つ以上の物質又は成分を複合治療計画の一環として使用する場合、それらは、同様の投与経路を介して又は種々の投与経路を介して、本質的に同じ時間で又は種々の時間で（例えば、本質的に同時に、連続して、又は交互に）投与することができる。物質又は成分を、同様の投与経路を介して同時に投与しようとする場合、当業者にとって明らかであるような、種々の薬学的製剤又は薬学的組成物、又は併せた薬学的製剤又は薬学的組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の有効な物質又は成分を複合治療計画の一環として使用しようとする場合、化合物又は成分を単独で使用する場合に用いられるものと同様の量で、また同様の計画に従って、物質又は成分の各々を投与してもよく、このような併用によって、相乗効果がもたらされることも又はもたらされないこともある。しかしながら、２つ以上の有効な物質又は成分の併用によって相乗効果がもたらされる場合には、所望の治療作用を達成すると共に、投与される物質又は成分の１つ、複数又は全ての量を低減することができる可能性がある。これは、例えば、所望の薬学的効果又は治療効果を依然として得ると共に、一般的な量で使用される場合の物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連するあらゆる望ましくない副作用を回避、制限又は低減するのに有用であり得る。
本発明に従って使用される治療計画の有効性は、臨床医にとって明らかであるように、関与する疾患又は障害についてそれ自体が既知の任意の方法で決定及び／又は追及され得る。臨床医はまた、必要に応じて及びケースバイケースに基づき、特定の治療計画を変更又は改変し、それにより、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限又は低減し、及び／又は一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限又は低減することとの適切な均衡を達成することができる。
通常、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果を維持する必要がある以上、治療計画は続けられる。また、これは臨床医が決定することができるものである。
別の態様において、本発明は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする少なくとも１つの症状又は疾患を予防及び／又は治療するため；及び／又は本明細書中に言及される１つ又は複数の治療方法に使用するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
より具体的には、本発明は、過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患を予防及び／又は治療するための、並びに特に本明細書中に列挙した疾患及び障害の１つ又は複数を予防及び治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
また、このような薬学的組成物では、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、本明細書中に記載したもの等の１つ又は複数の他の有効な成分と好適に組み合わせてもよい。
最終的に、本発明のナノボディ（本明細書中に規定）及び本発明のポリペプチドの使用がはるかに好ましいが、本明細書中の記載に基づき、当業者であれば、同様の方法で、ＶＥＧＦに対する他のアミノ酸配列及び（単一）ドメイン抗体、並びにこのような（単一）ドメイン抗体を含むポリペプチドを設計及び／又は生成することもできることは明らかであろう。
例えば、本発明のナノボディに関して上記で記載されるＣＤＲの１つ又は複数をヒトの足場又は非免疫グロブリンの足場を含むがこれらに限定されないこのような（単一）ドメイン抗体又は他のタンパク質「足場」上に「グラフト化」することが可能であり得ることは、当業者にとって明らかであろう。このようなＣＤＲグラフト化の好適な足場及び技法は当業者にとって明らかであり、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第７，１８０，３７０号明細書、国際公開第０１／２７１６０号パンフレット、欧州特許第０，６０５，５２２号明細書、欧州特許第０，４６０，１６７号明細書、米国特許第７，０５４，２９７号明細書、Nicaise et al., Protein Science （2004）, 13: 1882-1891、Ewert et al., Methods, 2004Oct; 34 （2）: 184-199、Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4（7）: 773-783、O'Brienand Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100、及びSkerra,J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187、及びSaerens et al.,J. Mol. Biol. 2005 Sep 23; 352（3）: 597-607、及び本明細書中に引用したさらなる参考文献を参照されたい。例えば、マウス又はラットのＣＤＲをヒトのフレームワーク及び足場上にグラフト化するそれ自体が既知の技法は、本発明のナノボディのＣＤＲの１つ又は複数と、１つ又は複数のヒトフレームワーク領域又は配列とを含むキメラタンパク質をもたらすのと同様に使用することができる。
本発明のナノボディが、上記の好ましいＣＤＲ配列以外の１つ又は複数のＣＤＲ配列を含有する場合、これらのＣＤＲ配列は、自体が既知の任意の方法で、例えば、（好ましい）ナノボディ、従来の抗体に由来の（及び特にヒト抗体に由来の）ＶＨドメイン、重鎖抗体、従来の４本鎖抗体（例えば、従来のヒト４本鎖抗体）、又はＶＥＧＦに指向性を有する他の免疫グロブリン配列から得ることができることにも留意されたい。ＶＥＧＦに指向性を有するこのような免疫グロブリン配列は、自体が既知の任意の方法で、当業者にとって明らかであるように、即ち、ＶＥＧＦによる免疫化によって、又はＶＥＧＦを有する免疫グロブリン配列の好適なライブラリをスクリーニングすることによって、又は任意の好適なそれらの組合せによって生成することができる。任意で、この後、ランダム又は部位特異的突然変異のような技法、及び／又はそれ自体が既知の親和性成熟のような他の技法を続けてもよい。このような免疫グロブリン配列を生成する好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば、Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 （2005）に概説されるスクリーニング法が挙げられる。特定の標的に対する免疫グロブリンを生成する他の技法としては、例えば、ナノクローン技術（例えば、公開済み米国特許出願第２００６−０２１１０８８号明細書に記載）、いわゆるＳＬＡＭ技術（例えば、欧州特許出願第０，５４２，８１０号明細書に記載）、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスの使用、又は既知のハイブリドーマ技法（例えば、Larrick et al., Biotechnology,Vol.7, 1989, p.934を参照）が挙げられる。全てのこれらの技法は、ＶＥＧＦに対する免疫グロブリンを生成するのに使用することができ、且つこのような免疫グロブリンのＣＤＲは、即ち上記で概説されるように、本発明のナノボディにおいて使用することができる。例えば、このようなＣＤＲの配列は、本明細書中に記載されるもの等のそれ自体が既知の技法を全て用いて、測定、合成及び／又は単離して、本発明のナノボディの配列（例えば、対応する従来のＣＤＲに取って代わるように）に挿入することができ、又は、本明細書中に記載の技法を同様に用いて、このようなＣＤＲ（又はこのようなＣＤＲをコードする核酸）を含有する本発明のナノボディを新たに合成することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、核酸、遺伝的構築物、並びに宿主及び宿主細胞のさらなる使用は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであろう。例えば、限定するものではないが、本発明のアミノ酸配列は、好適な担体又は固体支持体と連結することができ、組成物及び組成物を含む調製剤からＶＥＧＦを精製するそれ自体が既知の方法で使用することができる培地をもたらす。好適な検出可能な標識を含む本発明のアミノ酸配列の誘導体はまた、組成物又は調製剤中のＶＥＧＦの存在を（定性的に又は定量的に）測定するマーカーとして、又は（例えば、好適な細胞分取技法と組み合わせて）細胞又は組織の表面上のＶＥＧＦの存在を選択的に検出するマーカーとして使用することができる。
ここで、以下の非限定的な例及び図面を用いて本発明をさらに説明する。
実施例２に記載のＥＬＩＳＡにおいてＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−１の相互作用の遮断に関するペリプラズム抽出物のスクリーニングを示す図である。ウェルＨ１２は、発現しないナノボディを含有し、遮断％を算出するためにバックグラウンド試料として使用する。 実施例３に記載のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−２における精製一価抗ＶＥＧＦナノボディの中和能の評価を示す図である。 実施例３に記載のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−２における精製二価抗ＶＥＧＦナノボディの中和能の評価を示す図である。 実施例４に記載のＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイにおける精製二価抗ＶＥＧＦナノボディの中和能の評価を示す図である。 実施例６で記載のＶＥＧＦ１０９との結合に関する抗ＶＥＧＦナノボディペリプラズム抽出物のスクリーニングを示す図である。陰性対照（ナノボディのペリプラズム抽出物を添加しない）は、ウェルＧ６、Ｈ６、Ｇ１２及びＨ１２に存在する。 実施例８に記載のＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２における抗ＶＥＧＦナノボディのペリプラズム抽出物の中和能の評価を示す図である。陰性対照（ナノボディのペリプラズム抽出物を添加しない）は、ウェルＥ１２及びＦ１２に存在する。
実施例１：ＶＥＧＦ結合ナノボディの同定
免疫付与
Ｔｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ（Titermax USA, Norcross, GA, US）中に配合されたｈＶＥＧＦ１６５（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）を６回の筋肉内注射（１週間間隔で１００μｇ／回又は５０μｇ／回）で２匹のラマ（番号９９及び番号１０２）に標準的なプロトコルに従って免疫付与した。４週目で、血清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ｈＶＥＧＦ１６５に対する抗体価を規定した。要するに、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc Wiesbaden, Germany）をｈＶＥＧＦ１６５でコーティングした。遮断し、希釈血清試料を添加した後、ウサギ抗ラマ免疫グロブリン抗血清及び抗ウサギ免疫グロブリンアルカリホスファターゼ複合体を使用することによって、抗ｈＶＥＧＦ１６５ナノボディの存在を実証した。抗体価は、両方の動物で１６０００を超えた。
ライブラリ構築物
製造元の取扱説明書に従って、フィコール−ハイパークを使用して、血清試料から末梢血単球細胞を調製した。次に、これらの細胞から全ＲＮＡを抽出して、ナノボディコード化遺伝子断片を増幅するＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用した。これらの断片を、ＬａｃＺプロモータと、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード化配列と、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子と、マルチクローニング部位とｇｅｎ３リーダー配列とを含有していた、ｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターにクローン化した。ナノボディコード化配列を有するフレームでは、ベクターが、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃタグと（Ｈｉｓ）６タグとをコードしていた。標準的な方法に従って、ファージを調製し（例えば、当該技術分野及び本明細書中で言及される出願人によって出願された出願を参照されたい）、さらなる使用のために４℃で濾過滅菌後に保存した。
抽出（Selections）
番号９９及び番号１０２のラマから得られたファージライブラリを様々な抽出に使用した。
第１の抽出において、ｈＶＥＧＦ１２１（R&D Systems, Minneapolis, MN. US）を１μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌでＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上にコーティングした。ファージライブラリとのインキュベート及び広範な洗浄の後に、結合ファージをトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）又はグリシン（０．１Ｍ）で特異的に溶離した。
第２の抽出において、ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）をｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティング固相上に捕捉した。ファージライブラリとのインキュベート及び広範な洗浄の後に、結合ファージをアバスチン（登録商標）（Genentech, Roche）、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２で特異的に溶離した。
第３の抽出において、可溶性ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５をファージライブラリとインキュベートした。広範な洗浄後、ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５をｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティング固相上に捕捉した。結合ファージをアバスチン（登録商標）、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２で特異的に溶離した。
全ての抽出において、濃縮が観察された。各抽出から漏れたもの（output）を、ＬａｃＺプロモータと、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子と、マルチクローニング部位とｇｅｎ３リーダー配列とを含有していたｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターへのプールとして再クローン化した。ナノボディコード化配列を有するフレームにおいて、ベクターは、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃタグと（Ｈｉｓ）６タグとをコードしていた。コロニーを摘み取り、９６ディープウェルプレート（１ｍｌ容量）で成長させ、ナノボディ発現のためにＩＰＴＧを添加することによって誘導した。標準的な方法に従って、ペリプラズム抽出物（容量：約８０μｌ）を調製した（例えば、当該技術分野及び本明細書中で言及される出願人によって出願された出願を参照されたい）。得られたクローンの配列は表Ｂ−１に示す。
実施例２：ＶＥＧＦ遮断ナノボディに関するスクリーニング
ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のＥＬＩＳＡにおいて実施例１で得られたペリプラズム抽出物をスクリーニングして、発現ナノボディの遮断能を評価した。以下のように、ＥＬＩＳＡを実施した：１μｇ／ｍｌのＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（R&D Systems; Minneapolis, MN, US）キメラを４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄した後、室温で２時間ＰＢＳ／１％カゼイン３００μｌで遮断した。この後、ＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄した。１０倍希釈ペリプラズム抽出物を室温で１時間２ｎＭのｈＶＥＧＦ１６５でプレインキュベートした。プレインキュベート混合物をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄し、ビオチニル化抗ＶＥＧＦ（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）１００μｌを添加した。洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（DAKO, Glostrup, Denmark）１００μｌを添加した。洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Pierce, Rockford, IL, US）１００μｌを添加した。２ＭのＨ２ＳＯ４ １００μｌで反応を停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。
代替的に、ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５をペリプラズム抽出物とプレインキュベートし、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して、ＶＥＧＦ−受容体結合を検出した。
これらのＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のＥＬＩＳＡにおける抽出物のスクリーニングによって、５０％までＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２の相互作用を遮断することができるクローンが同定された（図１）。
実施例３：アルファスクリーンアッセイにおけるＶＥＧＦ遮断ナノボディの評価
それから、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のアルファスクリーンアッセイにおいて、精製ナノボディの遮断相互作用を評価した。製造元（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）の取扱説明書に従って、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２のＦｃキメラ（R&D systems, Minneapolis, MN, US）をアクセプタビーズと連結させた。ビオチン（Sigma, St Louis, MO, US）及びビオチンアミドへキサン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩（Sigma, St Louis, MO, US）を使用して、ｈＶＥＧＦ１６５をビオチニル化した。このビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５は、依然としてＥＬＩＳＡを使用したＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２結合に対して機能的であることが示された。
ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５（２．５ｎＭ）１０μｌをＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＲ１のアクセプタヘッド（１００μｇ／ｍｌ）５μｌに添加することによって、ＶＥＧＦとそれぞれの受容体との結合を求めた。室温、暗所で４５分間インキュベートした後、ストレプトアビジンドナービーズ（１００μｇ／ｍｌ）５μｌを添加した後、室温、暗所で１時間インキュベートした。ドナービーズを励起した際、アクセプタビーズによって放出された蛍光シグナルは、それぞれの受容体に結合したＶＥＧＦのレベルと相関していた。
抗ＶＥＧＦナノボディの中和能を求めた後、アルファスクリーンアッセイを行った。２μＭから始めてナノボディの希釈系列を調製し、室温で３０分間ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１６５でプレインキュベートした。この混合物に、ＶＥＧＦＲアクセプタビーズ及びストレプトアビジンドナービーズを添加し、これまでに記載のように実験を行った。ナノボディの濃度を増大させながら観察された蛍光シグナルの減少は、それぞれの受容体とのＶＥＧＦ結合の遮断を示していた。図２Ａは、抗ＶＥＧＦナノボディの濃度を増大させながら観察されたＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２相互作用の低減を示している。このことは、本発明のナノボディがＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２相互作用を妨げることを示している。
二価及び二重特異性の抗ＶＥＧＦナノボディが同様の効果を示すか否かを評価するために、二価及び二重特異性の構築物を、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６７８）リンカー及び／又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６７９）リンカー（表Ｂ−３、表Ｂ−４、表Ｂ−５及び表Ｂ−６）を使用して生成し、標準的な方法に従って発現及び精製した（例えば、当該技術分野及び本明細書中で言及される出願人によって出願された出願を参照されたい）。
ＶＥＧＦＲ２アルファスクリーンアッセイにおける１Ｈ１０−１Ｈ１０及び１Ｃ４−１Ｃ４の評価によって、これらの分子がＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２相互作用を妨げることもできることが示された（図２Ｂ）。
実施例４：抗ＶＥＧＦナノボディが、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ細胞増殖を遮断することができる
ＶＥＧＦは、内皮細胞増殖の既知の刺激因子であり、したがって内皮細胞の増殖を評価するアッセイにおいて、ＶＥＧＦアンタゴニストの中和能を求めることができる。
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）（Cambrex, Verviers, Belgium）を、３７℃でＥＢＭ２補充培地中で培養した。実験開始の２日前、１０％ ＦＣＳと、１０％ヒトＡＢ血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）とを含有するＲＰＭＩ １６４０／Ｍ１９９培地（１：１）を使用して、細胞を静止させた。５％ ＦＣＳと、１％ ＰＳとを含有するＭ１９９培地中、３７５０細胞数／ウェルの細胞密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種し、加湿チャンバ内で３７℃でインキュベートした。抗ＶＥＧＦナノボディをｈＶＥＧＦ１６５と１時間プレインキュベートした。播種の６時間後、ＶＥＧＦ＋ナノボディ混合物を細胞に添加し、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のｈＶＥＧＦ１６５が得られた。１日後及び４日後、さらにｈＶＥＧＦ１６５を添加した。４日目に、ＢｒｄＵを細胞に添加した。さらに細胞をもう１８時間インキュベートし、化学発光ＢｒｄＵ細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Roche, Mannheim, Germany）を使用して、ＢｒｄＵ組み込みを求めた。このアッセイで、二価抗ＶＥＧＦナノボディ（１Ｈ１０−１Ｈ１０）及び陰性対照ナノボディ（１２Ｂ２）のＬＰＳ低調製（１００Ｅｕ／ｍｇ未満）を調べた。１Ｈ１０−１Ｈ１０二価ナノボディに関してのみ、ＶＥＧＦ刺激増殖の阻害が観察され、抗ＶＥＧＦナノボディによるＶＥＧＦ中和活性が強く示唆された（図３）。
実施例５：ＶＥＧＦ結合ナノボディの同定
免疫付与
Ｓｔｉｍｕｎｅ（Cedi Diagnostics, the Netherlands）中に配合されたｈＶＥＧＦ１６５−ＫＬＨ（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）を５回の筋肉内注射（２週間間隔で１００μｇ／回又は５０μｇ／回）で２匹のラマ（番号１５０及び番号１５１）に標準的なプロトコルに従って免疫付与した。１ヵ月後、Ｓｔｉｍｕｎｅで配合された大腸菌発現ＶＥＧＦ１０９（ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤ、配列番号６８０）を４回筋肉内注射した（１週間間隔及び２週間間隔で１００μｇ／回又は５０μｇ／回）。
ライブラリ構築物
製造元の取扱説明書に従って、フィコール−ハイパークを使用して、血清試料から末梢血単球細胞を調製した。次に、これらの細胞から全ＲＮＡを抽出して、ナノボディコード化遺伝子断片を増幅するＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用した。これらの断片を、ＬａｃＺプロモータと、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード化配列と、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子と、マルチクローニング部位とｇｅｎ３リーダー配列とを含有していた、ｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターにクローン化した。ナノボディコード化配列を有するフレームでは、ベクターが、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃタグと（Ｈｉｓ）６タグとをコードしていた。標準的な方法に従って、ファージを調製し（例えば、当該技術分野及び本明細書中で言及される出願人によって出願された出願を参照されたい）、さらなる使用のために４℃で濾過滅菌後に保存した。
抽出
番号１５０及び番号１５１のラマから得られたファージライブラリを抽出に使用した。第１の抽出において、ｈＶＥＧＦ１６５（R&D Systems, Minneapolis, MN, US）を２μｇ／ｍｌ〜０．２μｇ／ｍｌでｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）上に捕捉した。ファージライブラリとのインキュベート及び広範な洗浄の後に、結合ファージをＴＥＡで特異的に溶離した。ファージを再利用し、次の抽出に使用した。
第２の抽出において、ビオチニル化ｈＶＥＧＦ１０９を２μｇ／ｍｌ〜０．２μｇ／ｍｌでｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート上に捕捉した。ファージライブラリとのインキュベート及び広範な洗浄の後に、結合ファージをトリエタノールアミン（ＴＥＡ）で特異的に溶離した。ファージを再利用、プレート培養し、個々のコロニーを摘み取り、ペリプラズム抽出物を生成した。
得られたクローンの配列を表Ｂ−２に示す。
実施例６：ＶＥＧＦ結合ナノボディに関するスクリーニング
ＶＥＧＦ１０９のＥＬＩＳＡにおいて実施例５で得られたペリプラズム抽出物をスクリーニングした。以下のように、ＥＬＩＳＡを実施した：１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＶＥＧＦ１０９をｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングプレートで３０分間捕捉した。プレートをＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄した。ペリプラズム抽出物を０．１％カゼイン／ＰＢＳ中で１０倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに添加して、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄した。洗浄後、２０００倍希釈の抗ｍｙｃ（Roche, Basel, Switzerland）を添加し、１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴ ３００μｌで５回洗浄した。洗浄後、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（DAKO, Glostrup, Denmark）を添加し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Pierce, Rockford, IL, US）を使用して、結合を検出した。２ＭのＨ２ＳＯ４ １００μｌで反応を停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。
このＶＥＧＦ１０９のＥＬＩＳＡにおける抽出物のスクリーニングによって、ＶＥＧＦ１０９と結合することができるクローンが同定された（図４）。
実施例７：ＳＰＲ解析におけるＶＥＧＦ結合ナノボディの解離速度の評価
ＶＥＧＦ１０９及びＶＥＧＦ１６５をＣＭ５チップ上にコーティングし、ビアコア３０００を使用して、実施例５で得られた抗ＶＥＧＦナノボディのペリプラズム抽出物の結合反応速度を評価した。BIAの評価ソフトウェアを使用して、結果の解析を行った。解離速度は、「適合反応速度分離（fitkinetics separate）ｋａ／ｋｄ」モデル、ラングミュア解離によって求められた。適合には、±１００秒の時間間隔を使用した。解離曲線は、１０−１ｌ／ｓ〜１０−４ｌ／ｓの範囲の解離速度を示していた（表Ｃ−１）。
結果は、ナノボディが、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１０９の両方と相互作用することを示している。
実施例８：抗ＶＥＧＦナノボディが、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２の相互作用を遮断することができる
ＶＥＧＦ１６５−ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦ１６５−ＶＥＧＦＲ２のＥＬＩＳＡで、抗ＶＥＧＦナノボディの中和能を評価した。
ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ及びＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（R&D Systems, US）を、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートで一晩固相コーティングした。次の日、ＰＢＳでプレートを洗浄し、ＰＢＳ／１％カゼインで遮断した。ナノボディのペリプラズム抽出物の５倍希釈液を、２ｎＭのビオチニル化ＶＥＧＦ１６５と１時間プレインキュベートした後、１０分間、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ２コーティングプレートに添加した。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Sigma, St. Louis, MO, US）及びＴＭＢ（Pierce,Rockford, IL, US）を使用して、ビオチニル化ＶＥＧＦ１６５と受容体との結合を検出し、その後Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。４５０ｎｍでのＯＤを測定し、得られた値は、ＶＥＧＦ結合と相関する。図５で示す結果によって、抗ＶＥＧＦナノボディのペリプラズム抽出物が、ビオチニル化ＶＥＧＦのみを含有する陰性対照に比べて、９０％までＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１、並びにＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ２の間の相互作用を遮断することができることが示されている（ウェルＥ１２及びＦ１２）。

Claims (202)

  1. ＶＥＧＦに指向性を有し、及び／又はＶＥＧＦと特異的に結合することができるアミノ酸配列。
  2. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する、及び／又はこれと特異的に結合することができる、請求項１に記載のアミノ酸配列。
  3. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  4. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  5. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  6. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  7. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
  8. 過度の血管形成及び／又は血管新生を低減する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  9. ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化する、請求項１に記載のアミノ酸配列。
  10. 本質的に単離形態である、請求項１又は９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  11. 被験者に投与するためのものであり、アミノ酸配列が該被験者内で自然発生するものではない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  12. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  13. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  14. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  15. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  16. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  17. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  18. ４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成る、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  19. 免疫グロブリン配列である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  20. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  21. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は例えば親和性成熟の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  22. 軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的に成る、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  23. 従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成るか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成る、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  24. ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から本質的に成る、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  25. ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  26. ｉ）配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  27. ｉ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  28. ヒト化ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  29. ＶＥＧＦとの結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  30. ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列であって、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、又は
    任意の好適なこれらの組合せ、から成る群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチを含む、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列。
  31. 前記アミノ酸残基のストレッチの少なくとも１つが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項３０に記載のアミノ酸配列。
  32. ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、このため、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがａ）、ｂ）又はｃ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応し、或いは（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｇ）、ｈ）又はｉ）によるアミノ酸配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）によるアミノ酸配列の１つに対応する、請求項３０又は３１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  33. 少なくとも２つのアミノ酸残基のストレッチが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項３２に記載のアミノ酸配列。
  34. ３つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含み、アミノ酸残基の第１のストレッチが、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
    アミノ酸残基の第２のストレッチが、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    アミノ酸残基の第３のストレッチが、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される、請求項３０又は３３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  35. 少なくとも３つのアミノ酸残基のストレッチが、ＶＥＧＦと結合するための抗原結合部位の一部を形成する、請求項３４に記載のアミノ酸配列。
  36. 前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（例えば９５％以上のアミノ酸同一性）、又はさらに１００％のアミノ酸同一性を本質的に有する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  37. 請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つとＶＥＧＦとの結合を交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）する、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列。
  38. 請求項３０〜３６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つによってＶＥＧＦと結合するのを交差遮断する、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列。
  39. 本質的に単離形態である、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  40. 被験者に投与するためのものであり、アミノ酸配列が該被験者内で自然発生するものではない、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  41. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  42. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  43. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  44. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  45. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  46. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  47. 免疫グロブリン配列である、請求項３０〜４６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  48. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項３０〜４７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  49. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は例えば親和性成熟の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項３０〜４８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  50. 軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的に成る、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  51. 従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成るか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成る、請求項３０〜５０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  52. ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から本質的に成る、請求項３０〜５１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  53. ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項３０〜５２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  54. ａ）配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項３０〜５３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  55. ａ）配列番号２６６〜配列番号２８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項３０〜５４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  56. ヒト化ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項３０〜５５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  57. 前記ＣＤＲ配列によって形成される結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項３０〜５６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  58. ４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成るアミノ酸配列であって、
    ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される、アミノ酸配列。
  59. ４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成るアミノ酸配列であって、
    ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される、アミノ酸配列。
  60. 前記アミノ酸配列のＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、又はさらに１００％のアミノ酸同一性を本質的に有する、請求項５８又は５９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  61. 請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つとＶＥＧＦとの結合を交差遮断する、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列。
  62. 請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列の少なくとも１つによってＶＥＧＦと結合するのを交差遮断する、ＶＥＧＦに指向性を有するアミノ酸配列。
  63. 本質的に単離形態である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  64. 被験者に投与するためのものであり、アミノ酸配列が該被験者内で自然発生するものではない、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  65. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  66. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  67. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  68. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項５８〜６７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  69. （任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  70. 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができる、請求項５８〜６９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  71. 免疫グロブリン配列である、請求項５８〜７０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  72. （任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、請求項５８〜７１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  73. ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は例えば親和性成熟の技法によって得られる免疫グロブリン配列である、請求項５８〜７２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  74. 軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的に成る、請求項５８〜７３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  75. 従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成るか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成る、請求項５８〜７４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  76. 本質的にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から成る、請求項５８〜７５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  77. ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項５８〜７６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  78. ａ）配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項５８〜７７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  79. ａ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項５８９〜７８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  80. ヒト化ナノボディ（登録商標）から本質的に成る、請求項５８９〜７９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  81. 前記ＣＤＲ配列によって形成される結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、請求項５８〜８０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
  82. ＶＥＧＦに指向性を有し、及び／又はＶＥＧＦと特異的に結合することができるナノボディ。
  83. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する、及び／又はこれと特異的に結合することができる、請求項８２に記載のナノボディ。
  84. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項８２又は８３に記載のナノボディ。
  85. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項８２又は８３に記載のナノボディ。
  86. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項８２又は８３に記載のナノボディ。
  87. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項８２又は８３に記載のナノボディ。
  88. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項８２又は８３に記載のナノボディ。
  89. 過度の血管形成及び／又は血管新生を低減する、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載のナノボディ。
  90. ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化する、請求項８２に記載のナノボディ。
  91. 本質的に単離形態である、請求項８２〜９０のいずれか一項に記載のナノボディ。
  92. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項８２又は９１に記載のナノボディ。
  93. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項８２〜９２のいずれか一項に記載のナノボディ。
  94. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項８２〜９３のいずれか一項に記載のナノボディ。
  95. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項８２〜９４のいずれか一項に記載のナノボディ。
  96. （任意の好適な種由来の）天然ナノボディ、又は合成若しくは半合成のナノボディである、請求項８２〜９５のいずれか一項に記載のナノボディ。
  97. ＶＨＨ配列、部分ヒト化ＶＨＨ配列、完全ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン又は例えば親和性成熟の技法によって得られたナノボディである、請求項８２〜９６のいずれか一項に記載のナノボディ。
  98. ａ）配列番号１〜配列番号２２のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、請求項８２〜９７のいずれか一項に記載のナノボディ。
  99. ａ）配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視することとし、且つ
    ｂ）好ましくはカバットナンバリングに従った、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の１つ又は複数のアミノ酸残基が、表Ａ−３で言及される特徴的な残基から選択される、請求項８２〜９８のいずれか一項に記載のナノボディ。
  100. ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び／又は
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される、請求項８２〜９９のいずれか一項に記載のナノボディ。
  101. ＣＤＲ１が、
    ａ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｃ）配列番号１７１〜配列番号２１５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ２が、
    ｄ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列、
    ｅ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｆ）配列番号２６１〜配列番号３０５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、且つ
    ＣＤＲ３が、
    ｇ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列、
    ｈ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
    ｉ）配列番号３５１〜配列番号３９５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列、
    から成る群から選択される、請求項８２〜１００のいずれか一項に記載のナノボディ。
  102. 前記ＣＤＲ配列が、少なくとも１つの配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列のＣＤＲ配列と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（例えば９５％以上のアミノ酸同一性）、又はさらに１００％のアミノ酸同一性を本質的に有する、請求項８２〜１０１のいずれか一項に記載のナノボディ。
  103. 部分ヒト化ナノボディである、請求項８２〜１０２のいずれか一項に記載のナノボディ。
  104. 完全ヒト化ナノボディである、請求項８２〜１０３のいずれか一項に記載のナノボディ。
  105. 配列番号３９９〜配列番号４７１から成る群から、又は配列番号４４１〜配列番号４８５のアミノ酸配列の少なくとも１つと８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書中に規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項８２〜１０４のいずれか一項に記載のナノボディ。
  106. 配列番号４１１〜配列番号４８５から成る群から選択される、請求項８２〜１０５のいずれか一項に記載のナノボディ。
  107. 請求項３０〜３６若しくは５８〜６０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載のナノボディの少なくとも１つとＶＥＧＦとの結合を交差遮断する、ＶＥＧＦに指向性を有するナノボディ。
  108. 請求項３０〜３６若しくは５８〜６０のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項１００〜１０６のいずれか一項に記載のナノボディの少なくとも１つによってＶＥＧＦと結合するのを交差遮断する、ＶＥＧＦに指向性を有するナノボディ。
  109. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列及び／又は１つ又は複数の請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  110. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１０９に記載の化合物又は構築物。
  111. 前記１つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１０９又は１１０に記載の化合物又は構築物。
  112. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  113. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１０９〜１１２のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  114. 前記１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が免疫グロブリン配列である、請求項１０９〜１１３のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  115. 前記１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１０９〜１１４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  116. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成り、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がナノボディである、化合物又は構築物。
  117. 多価構築物である、請求項１０９〜１１６のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  118. 多重特異性の構築物である、請求項１０９〜１１６のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  119. ＶＥＧＦに対するナノボディ並びにＶＥＧＦＲ−１及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するナノボディを含むか、又は本質的にこれらから成る、請求項１１８に記載の化合物又は構築物。
  120. ＶＥＧＦに対するナノボディ及び腫瘍抗原に対するナノボディを含むか、又は本質的にこれらから成る、請求項１１８に記載の化合物又は構築物。
  121. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位に対するナノボディ及びＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に対するナノボディを含むか、又は本質的にこれらから成る、請求項１１８に記載の化合物又は構築物。
  122. それぞれ対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて半減期が増大する、請求項１０９〜１２１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  123. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、それぞれ対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、請求項１２２に記載の化合物又は構築物。
  124. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質と結合することができる低分子タンパク質又はペプチドから成る群から選択される、請求項１２３に記載の化合物又は構築物。
  125. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片から成る群から選択される、請求項１２３に記載の化合物又は構築物。
  126. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができる結合単位から成る群から選択される、請求項１２３に記載の化合物又は構築物。
  127. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）若しくは血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディから成る群から選択される、請求項１２３に記載の化合物又は構築物。
  128. 半減期が増大した化合物又は構築物を提供する、前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディである、請求項１２３に記載の化合物又は構築物。
  129. それぞれ対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍を超えて大きい血清半減期を有する、請求項１２２〜１２８のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  130. それぞれ対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体に比べて、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する血清半減期を有する、請求項１２２〜１２９のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  131. 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上、例えば少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）のヒトにおける血清半減期を有する、請求項１２２〜１３０のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  132. １つの請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、及び／又は１つの請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る一価の構築物。
  133. 前記本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、請求項１３２に記載の一価の構築物。
  134. 請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディを含むか、又は本質的にこれから成る一価の構築物。
  135. 核酸又はヌクレオチド配列であって、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
  136. 遺伝的構築物の形態である、請求項１３５に記載の核酸又はヌクレオチド配列。
  137. 宿主又は宿主細胞であって、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項１３２〜１３６のいずれか一項に記載の一価の構築物を発現する、或いは好適な環境下で発現することができ、及び／又は請求項３５に記載の核酸又はヌクレオチド配列、又は請求項１３６に記載の遺伝的構築物を含む、宿主又は宿主細胞。
  138. 請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を製造する方法であって、少なくとも
    ａ）好適な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の好適な発現系において、請求項３５に記載の核酸又はヌクレオチド配列、又は請求項１３６に記載の遺伝的構築物を発現する工程と、任意でその後に
    ｂ）このようにして得られる、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を単離及び／又は精製する工程とを含む、方法。
  139. 請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を製造する方法であって、少なくとも
    ａ）請求項１３７に記載の宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、該宿主又は該宿主細胞を培養及び／又は維持する工程と、任意でその後に
    ｂ）このようにして得られる、請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を単離及び／又は精製する工程とを含む、方法。
  140. 組成物であって、少なくとも１つの請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１３５又は１３６に記載の核酸又はヌクレオチド配列を含む、組成物。
  141. 薬学的組成物である、請求項１４０に記載の組成物。
  142. 少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、且つ任意で１つ又は複数のさらなる薬学的に有効なポリペプチド及び／又は化合物を含む、薬学的組成物である、請求項１４１に記載の組成物。
  143. 過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の少なくとも１つを予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験者に、薬学的に有効な量の請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価構築物、又は請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つを投与することを含む、予防及び／又は治療する方法。
  144. ＶＥＧＦ、その生物学的又は薬理学的な活性、及び／又はＶＥＧＦが関与する生物学的経路又はシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする被験者に、薬学的に有効な量の請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価構築物、又は請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の組成物の少なくとも１つを投与することを含む、予防及び／又は治療する方法。
  145. それが必要な被験者に請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物を投与することによって予防及び／又は治療することができる、少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  146. 免疫療法に関する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の少なくとも１つの請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価の構築物、或いは請求項１４０〜１４２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、免疫療法に関する方法。
  147. 過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする少なくとも１つの症状又は疾患を予防及び／又は治療するため；及び／又は１つ又は複数の請求項１４３〜１４６のいずれか一項に記載の方法で使用するための薬学的組成物の製造における請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価構築物の使用。
  148. 過度の及び／又は病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状又は疾患の少なくとも１つを予防及び／又は治療するため；及び／又は１つ又は複数の請求項１４３〜１４６のいずれか一項に記載の方法で使用するための請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価構築物。
  149. 請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列又は請求項８２〜１０８に記載のナノボディの部分又は断片。
  150. ＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１４９に記載の部分又は断片。
  151. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する、及び／又はこれと特異的に結合することができる、請求項１５０に記載の部分又は断片。
  152. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１５０又は１５１に記載の部分又は断片。
  153. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１５０又は１５１に記載の部分又は断片。
  154. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１５０又は１５１に記載の部分又は断片。
  155. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１５０又は１５１に記載の部分又は断片。
  156. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１５０又は１５１に記載の部分又は断片。
  157. 過度の血管形成及び／又は血管新生を低減する、請求項１５０〜１５６のいずれか一項に記載の部分又は断片。
  158. ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化する、請求項１５０に記載の部分又は断片。
  159. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１４９〜１５８のいずれか一項に記載の部分又は断片。
  160. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１４９〜１５９のいずれか一項に記載の部分又は断片。
  161. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１４９〜１６０のいずれか一項に記載の部分又は断片。
  162. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１４９〜１６１のいずれか一項に記載の部分又は断片を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  163. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１６２に記載の化合物又は構築物。
  164. 前記１つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１６２又は１６３のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  165. 核酸又はヌクレオチド配列であって、請求項１４９〜１６１のいずれか一項に記載の部分又は断片、或いは請求項１６２〜１６４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
  166. 請求項１４９〜１６１のいずれか一項に記載の部分又は断片、請求項１６２〜１６４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項１６５に記載の核酸又はヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む、組成物。
  167. 請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディの誘導体。
  168. ＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１６７に記載の誘導体。
  169. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する、及び／又はこれと特異的に結合することができる、請求項１６８に記載の誘導体。
  170. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１６８又は１６９に記載の誘導体。
  171. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１６８又は１６９に記載の誘導体。
  172. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１６８又は１６９に記載の誘導体。
  173. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１６８又は１６９に記載の誘導体。
  174. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１６８又は１６９に記載の誘導体。
  175. 過度の血管形成及び／又は血管新生を低減する、請求項１６８〜１７４のいずれか一項に記載の誘導体。
  176. ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化する、請求項１６８に記載の誘導体。
  177. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１６７〜１７６のいずれか一項に記載の誘導体。
  178. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１６７〜１７７のいずれか一項に記載の誘導体。
  179. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１６７〜１７８のいずれか一項に記載の誘導体。
  180. 請求項１０９〜１３４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物の誘導体。
  181. ＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１８０に記載の誘導体。
  182. ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ上の結合部位及び／又はＶＥＧＦＲ−２に対するＶＥＧＦ上の結合部位に指向性を有する、及び／又はこれと特異的に結合することができる、請求項１８１に記載の誘導体。
  183. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１８１又は１８２に記載の誘導体。
  184. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害する、請求項１８１又は１８２に記載の誘導体。
  185. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１８１又は１８２に記載の誘導体。
  186. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合を阻害することなく、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１８１又は１８２に記載の誘導体。
  187. ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−１との結合及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２との結合を阻害する、請求項１８１又は１８２に記載の誘導体。
  188. 過度の血管形成及び／又は血管新生を低減する、請求項１８１〜１８７のいずれか一項に記載の誘導体。
  189. ＶＥＧＦ、又はそれに関与する機構若しくは経路を活性化する、請求項１８１に記載の誘導体。
  190. １０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１８０〜１８９のいずれか一項に記載の誘導体。
  191. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度（ｋｏｎ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１８０〜１９０のいずれか一項に記載の誘導体。
  192. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でＶＥＧＦと特異的に結合することができる、請求項１８０〜１９１のいずれか一項に記載の誘導体。
  193. それぞれ対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、又は請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体、又は請求項１０９〜１３４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍を超えて大きい血清半減期を有する、請求項１６７〜１９２のいずれか一項に記載の誘導体。
  194. 対応する請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列自体、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ自体、又は請求項１０９〜１３４のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物自体に比べて、血清半減期が、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらには２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大する、請求項１６７〜１９３のいずれか一項に記載の誘導体。
  195. 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上、例えば少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）のヒトにおける血清半減期を有する、請求項１６７〜１９７のいずれか一項に記載の誘導体。
  196. ペグ化誘導体である、請求項１６７〜１９５のいずれか一項に記載の誘導体。
  197. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１６７〜１９６のいずれか一項に記載の誘導体を含むか、又は本質的にこれから成り、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  198. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、請求項１９７に記載の化合物又は構築物。
  199. 存在する場合、前記１つ又は複数のリンカーが１つ又は複数のアミノ酸配列である、請求項１９７又は１９８に記載の化合物又は構築物。
  200. 請求項１６７〜１９６のいずれか一項に記載の誘導体、又は請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物をコードする核酸。
  201. 請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載の誘導体、請求項１６７〜１９６のいずれか一項に記載の化合物又は構築物、或いは請求項２００に記載の核酸又はヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、組成物。
  202. 請求項１〜８１のいずれか一項に記載のアミノ酸、請求項８２〜１０８のいずれか一項に記載のナノボディ、請求項１０９〜１３１、１６２〜１６４若しくは１９７〜１９９のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、請求項１３２〜１３４のいずれか一項に記載の一価構築物、請求項１４０〜１４２、１６６若しくは２０１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１４９〜１６１のいずれか一項に記載の部分若しくは断片、又は請求項１６７〜１９６のいずれか一項に記載の誘導体を少なくとも含む徐放製剤。
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