CN104321344B

CN104321344B - Ang2结合分子

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Publication number: CN104321344B
Application number: CN201380026471.3A
Authority: CN
Inventors: E·博格斯; A·格施温德; R·G·奥特; M-A·拜斯; J·波科诺; P·默切尔斯; E·德普拉; F·史蒂夫内特
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: CA2865464C; PH12014502179A1; RS58732B1; EP2831111B1; EA201401065A1; HUE044263T2; US20230203146A1; CY1122007T1; NZ628584A; SI2831111T1; BR112014023415A2; JP2015516805A; MX2014011171A; JP5970734B2; US20130259859A1; DK2831111T3; PT2831111T; IN2014DN06904A; ES2729165T3; CL2014002393A1

Abstract

Ang2结合分子，优选Ang2结合免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体，包含它们的药物组合物，及其在治疗与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病中的用途。编码Ang2结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

Description

ANG2结合分子

发明领域

本发明涉及人的治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合物。

发明背景

如US 2008/0014196、WO 2008101985和US 2011/0027286中所述，血管生成是借以形成新血管的生物学过程，且涉及包括实体瘤和转移以及眼病在内的多种疾病的发病机制。当肿瘤达到约1mm³的临界大小时，它们变得依赖于血管生成以保持氧气和营养物的血液供应以便进一步生长。抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。

一种最为重要的促血管生成因子是促血管生成素2(Ang2)，Tie2受体(Tie2)的一种配体，其通过使其他的血管生成因子(如VEGF)能够发挥功能来调控血管重构。在本领域中，Ang2还被称为Tie2配体(美国专利号5,643,755，Yancopoulos等人.2000，Nature 407：242-248)。

Ang2主要由内皮细胞表达，由缺氧和其他血管生成因子强烈诱导，并已证明其调节肿瘤血管的可塑性，使血管能够应答VEGF和FGF2(Augustin等人，Nat Rev Mol CellBiol.2009年3月；10(3):165-77)。与该作用相一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成减少(Falcón等人，Am J Pathol.2009年11月；175(5):2159-70)。已经报道患有结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑素瘤的患者具有升高的Ang2血清浓度(Goede等人，Br JCancer.2010年10月26日；103(9):1407-14)(Park等人，Chest.2007年7月；132(1):200-6)(Helfrich等人，Clin Cancer Res.2009年2月15日；15(4):1384-92)。在CRC癌症中，Ang2血清水平与抗VEGF治疗的治疗应答相关。

Ang-Tie系统由2个受体(Tie1和Tie2)和3个配体(Ang1、Ang2和Ang4)组成(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009年3月；10(3):165-77)。Tie2、Ang1和Ang2是这个家族中得到最好研究的成员，Tie1是一个孤儿受体而Ang4对血管重构的作用仍然需要明确。Ang2和Ang1在Tie2的结合和活化中介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化导致内皮细胞活化、周细胞解离、血管渗漏和诱导血管萌芽。与Ang2相反，Ang1信号传导通过募集周细胞维持血管完整性，从而保持内皮细胞静止。

促血管生成素2(Ang2)是一种分泌的、66kDa的Tie2受体酪氨酸激酶的配体(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009年3月；10(3):165-77)。Ang2由N-末端卷曲螺旋域和C-末端的纤维蛋白原样域组成，后者是与Tie2相互作用需要的。Ang2主要由内皮细胞表达并由缺氧和其他血管生成因子(包括VEGF)强烈诱导。Tie2存在于内皮细胞、造血干细胞和肿瘤细胞上。已经证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF和FGF2。

在体外已经表明Ang2在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中充当温和的有丝分裂原、趋化吸引剂(chemoattractant)和管形成的诱导物。Ang2诱导成纤维细胞中异位表达的Tie2的酪氨酸磷酸化，并促进下游信号传导事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。已经描述了Ang2在Ang1诱导的内皮细胞应答中的拮抗作用。

已经表明Ang2缺乏导致了小鼠中严重的淋巴模式(lymphatic patterning)缺陷。虽然Ang2丧失不是胚胎血管发育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在视网膜和肾脏中具有持久性血管缺陷。结合在血管生成部位(例如卵巢)的Ang2表达的动态模式，这些结果表明Ang2通过使其他的血管生成因子(如VEGF)能够发挥功能而调控血管重构。

Ang2-Tie2系统在血管生成开关和肿瘤血管生成后期阶段中发挥至关重要的作用。在肿瘤相关的内皮中Ang2的表达强烈上调。当肿瘤植入Ang2缺陷小鼠，特别是在肿瘤生长的早期阶段植入时，观察到了肿瘤生长减少。使用Ang2单克隆抗体治疗性阻断Ang2已经在各种肿瘤异种移植模型中显示出广泛的疗效。

如上述美国2008/0014196中所概述，血管生成牵涉于包括实体瘤及转移的多种疾病的发病机制中。

在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为新生肿瘤及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人，Nature 339-58(1989))，这使得肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗集中于阻断VEGF途径(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004年5月；3(5):391-400)。

结合Ang2和Ang1的抗体及其它肽抑制剂在例如美国专利号6,166,185；7,521,053；7,205,275；和美国专利申请号2006/0018909和2006/0246071中被提及。此外，美国2011/0027286公开了不拮抗相关分子Ang1的特异性单克隆Ang2抗体。

然而，现有技术的单克隆抗体(MAb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点：为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以其不适于口服给药。MAb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度低且不能靶向于肿瘤中的所有细胞。

本发明的一个目的在于提供新的改良的Ang2结合分子，即阻断Ang2与Tie2结合却不阻断Ang1与Tie2结合的纳米抗体。

更具体地，本发明的目的在于提供新的Ang2结合分子，且具体是结合哺乳动物Ang2而不结合哺乳动物Ang1的Ang2结合分子，且特别是结合人Ang2而不结合人Ang1的Ang2i结核分子，其中此类分子或多肽适用于如本文所述的治疗和诊断目的。本发明的另一目的是提供特异性结合Ang2而不结合Ang1的免疫球蛋白单一可变域。

此类Ang2结合分子或Ang2拮抗剂可用作预防、治疗、缓解和/或诊断与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病或状况的组合物中的药理学活性剂。

此类疾病的实例是癌症或癌性疾病，例如乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌和胰腺癌，眼病例如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变，和/或慢性肾病例如糖尿病肾病、肾后性肾衰、肾前性氮质血症和内在肾功能衰竭。

本发明的另一个目的在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或病状的方法，其涉及使用和/或给予这些Ang2结合分子及包含这些Ang2结合分子的组合物。具体地，本发明的一个目的在于提供这种药理学活性的Ang2结合分子、组合物和/或方法，其相比于当前使用的和/或本领域中已知的药剂、组合物和/或方法体现出优势。这些优势包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利的性质例如对于制造目的而言有利的性质，尤其是与如上所述的常规抗体或其片段相比。

发明概述

根据第一方面，本发明提供了一种包含免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有选自SEQ ID NO:168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有选自SEQ ID No:171至173中所示氨基酸序列的氨基酸序列且CDR3具有选自SEQ ID NO:174至177中所示氨基酸序列的氨基酸。

本发明还涉及由所述免疫球蛋白单一可变域组成的Ang2结合分子。

此外，本发明涉及具有选自由SEQ ID No:167、166、129和138组成的组的序列的Ang2结合分子。

根据另一方面，本发明提供了编码所述Ang2结合分子的核酸以及包含所述核酸的表达载体。

本发明还涉及携带携带一种或多种包含所述核酸的表达载体的宿主细胞。

本发明还涉及产生或生成根据本发明的Ang2结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用一种或多种包含所述核酸分子的所述载体转染宿主细胞，

(b)培养所述宿主细胞，以及

(c)回收并纯化所述Ang2结合分子。

本发明的另一方面涉及包含作为活性成分的一种或多种所述Ang2结合分子以及至少生理学上可接受的载体的药物组合物。

本发明还涉及本文所述的Ang2结合分子、核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用及用途，以及涉及用于预防和/或治疗与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病(优选癌症、癌性疾病和眼病)的方法。

本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明确。

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义对于本领域技术人员而言是清楚的。参考例如标准手册，如Sambrook等人，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower Medical Publishing，London，New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以以本身已知的方式进行，该方式对于本领域技术人员而言是清楚的。还可参考例如标准手册、上述一般背景现有技术及其中引用的其他参考文献。

除非规定为来自非人类物种(例如“小鼠Ang2”等)，否则术语“促血管生成素2”或“Ang2”是指人Ang2或其生物活性片段(例如可在体外或体内诱导血管生成的Ang2蛋白的片段)，即，是指登录号为NM 001147.2的人Ang2(变体1)、具有登录号NM_001118887.1的人Ang2(变体2)或者具有登录号NM_001118888.1的人Ang2(变体3)，和/或它们的生物活性片段。Ang2非人类物种，例如小鼠Ang2和猴Ang2的氨基酸序列分别可从蛋白序列数据库的登录号:NM_007426.3(SEQ ID NO:(SEQ ID 188)和AB172643.1(SEQ ID NO:187)下获得。

除非规定为来自非人类物种(例如“小鼠Ang2”等)，否则术语“促血管生成素1”或“Ang1”是指人Ang1或其生物活性片段(例如可在体外或体内诱导血管生成的Ang1蛋白的片段)，即，是指登录号为NM_001146.3的人Ang1或其生物活性片段。

除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是用于指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(分别包括但不限于抗原结合域或片段，如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)，一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。

如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的各种功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。

如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7条反平行β链的2层夹层(sandwich)组成。

如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区被本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的来自骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。

鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域与抗原的各别表位发生结合，而是通过共同结合各别抗原表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VH-VL对发生结合。

“VHH域”，也称为VHH、V_HH域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C，AtarhouchT，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363，446-448(1993))。已选择术语“VHH域”从而将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“V_H域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“V_L域”或“VL域”)进行区分。VHH域可特异性结合表位而无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型、鲁棒且高效的抗原识别单元。

在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、V_HH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及“”及“域”(“Nanobody”为比利时根特Ablynx N.V.公司的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且特异性结合表位无需存在第二免疫球蛋白可变域)，且其通过例如WO 2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmark residue)”区别于VH域。

如例如Riechmann及Muyldermans，J.Immunol.Methods 231，25-38(1999)的图2中所示，适用于骆驼科的VHH域，根据Kabat等人给出的V_H域的通用编号法(“Sequence ofproteins of immunological interest”，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，公开案第91号)来编号免疫球蛋白单一可变域(如VHH)的氨基酸残基。

根据该编号法，

-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，

-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，

-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，

-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，

-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，

-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且

-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。

然而应注意，如本领域中对于V_H域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号法所指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号法的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。

对V_H域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。

VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110-120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。

免疫球蛋白单一可变域，例如根据本发明优选实施方案的VHH及域抗体具有大量使其高度有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其已本质上经“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。

由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH(或VL)，无论是单独存在还是作为较大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点：

●仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个单独的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的接头，如scFv的接头)；

●免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；

●免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述的)；

●免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低固有毒性，并且可通过输注或注射以外的替代途径给予；

●免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用制冷设备情况下制备、储存或运输；

●免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵(例如下文进一步描述的)产生，不需要像例如常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；

●相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相对较小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示(更)高的组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)穿透性，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；

●VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(cavity-binding properties)(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其CDR3环更为伸展)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位；

●VHH具有高度可溶性和极其稳定且没有聚集趋势的特别优势(如同由Ward等人，Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠源抗原结合域)。

本发明的免疫球蛋白单一可变域，其获得的具体生物来源或具体制备方法不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：

(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；

(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；

(3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人源化”(如本文所述的)，或表达编码这类人源化VHH的核酸；

(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码这类骆驼化域的核酸分子；

(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；

(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；

(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；

(8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和力和/或特异性；和/或

(9)组合或选择上述步骤。

适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。举例而言，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已经在WO 2006/040153和WO2006/122786中描述。

根据具体实施方案，本发明的或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经“人源化”或“序列优化”(任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。

人源化的VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个进一步更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51的人框架区序列或其部分，或与其高度同源，任选与JH序列(例如JH5)组合。因此，人源化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP 47、DP 29及DP 51)的相应框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如WO2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。实例为在约位置44-47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应物。人源化VHH域可包含一个或多个完全的人框架区序列。

例如，属于103P,R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH的人源化取代是将108Q取代成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。

在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的结合免疫球蛋白单一可变域，可通过如下本领域中已知的技术而从各别的结合分子获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的术语“序列优化”。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。

适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和力增加的结合分子，就亲和力成熟分子而言所述另一结合分子表示“亲本”结合分子。

获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如WO 2006/040153及WO2006/122786中。如其中所详述的，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基来“人源化”(本文中也称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一进一步更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51的人框架区序列，或其部分，任选与JH序列(例如JH5)组合。

“域抗体“，也称为“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(Domain Antibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已描述于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domainssecreted from Escherichia coli”；Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domain antibodies:proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003)；及WO 2003/002609。

域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。

域抗体如VHH的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。

此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。用于这种CDR移植的适合支架及技术在本领域中是已知的。

可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。

可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域、或一般而言抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为对于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，Ang2结合分子也可称为“Ang2中和分子”。

一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。抗原结合分子的特异性可基于其亲和力和/或亲抗原性(avidity)来测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子(如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有免疫球蛋白单一可变域的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者均有关：表位与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。

抗原结合分子(如本发明抗体或免疫球蛋白单一可变域)识别表位的部分称为“互补位”。

除非另有说明，否则术语“Ang2结合分子”包括抗Ang2抗体、抗Ang2抗体片段、“抗Ang2抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及Ang2结合抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，如例如描述于WO02/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)。抗Ang2抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。

“Ang2结合分子”是指单价靶结合分子(即与Ang2的一个表位结合的分子)以及含有一个以上Ang2结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子，亦称为“形式化(formatted)”Ang2结合分子。所述形式化Ang2结合分子除Ang2结合免疫球蛋白单一可变域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或附接的聚合物(如PEG)。

即使是次优选的，形式化Ang2结合分子也可包含识别相同或重叠表位的两个相同的Ang2结合免疫球蛋白单一可变域或两个不同的免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成Ang2二聚体的两个单体中每一单体的相同或重叠表位结合。包括竞争性ELISA分析的实验数据揭示当与单一Ang2结合分子的个体构件比较时，形式化Ang2二聚体的效力显著改善(数据未示出)。

通常，本发明的Ang2结合分子将以(如于Biacore或KinExA分析中测量的)10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且进一步更优选10E-11至10E-13的解离常数(K_D)结合，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，如至少10E11ME-1的缔合常数(K_A)结合。任何大于10E-4M的K_D值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的K_D结合所要结合的抗原(即Ang2)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwich competition assay)及本领域中本身已知的其不同变化形式。

氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或单字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在该参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：

Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。

例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当多肽或核酸分子已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分分离时，其被视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上分离的”。经适合的技术(例如适合的色谱技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为同质的。

术语“N端”(又称氨基端、NH₂端、N-末端或胺端)是指由具有游离氨基(-NH₂)的氨基酸终止的蛋白/多肽(即Ang2结合分子)的起点。肽序列的书写惯例是将N端放在左边并从N端至C端进行书写。当所述蛋白翻译自信使RNA时，其从N端至C端创建。

两个Ang2结合分子序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO 2008/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表示保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。

对V_H域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。

“亲和力成熟”的Ang2结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对Ang2的亲和力相比于其各自的亲本Ang2结合分子有所增加。本发明亲和力成熟的Ang2结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology 10:779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91:3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169:147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155:1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinitymaturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。

对于本发明，除非另有说明，则“SEQ ID NO:x的氨基酸序列”包括：与各自SEQ IDNO:x中所显示的序列100％相同的氨基酸序列；

a)与各自SEQ ID NO:x中所示序列具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；

b)与各自SEQ ID NO:x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理状况。可用本发明的Ang2结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。这些癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非肿瘤性症状及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。

非肿瘤性病症包括但不限于不希望的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增生性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(corneal neovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocular neovascular disease))、血管再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(arteriovenous malformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primary pulmonaryhypertension)、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closed head injury)/外伤相关)、滑液炎症、RA中的血管翳形成(pannusformation)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥大性骨形成(hypertropic boneformation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovariandisease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rd spacing of fluiddisease)(胰腺炎、间隔综合征(compartment syndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn's disease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不希望的或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenic granulomaretrolental fibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascularadhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardial effusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleural effusion)。

术语"眼病”是指增生性视网膜病变，包括早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管形成、角膜移植新生血管形成、角膜移植排斥反应、视网膜/脉络膜新生血管形成。

术语“慢性肾病”是指糖尿病肾病、肾后性肾衰竭、肾前性氮质血症和内在肾功能衰竭。

发明详述

在第一方面中，本发明涉及包含免疫球蛋白单一可变域的Ang2结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1具有选自SEQID NO:168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有选自SEQ ID No:171至173中所示氨基酸序列的氨基酸序列且CDR3具有选自SEQ ID NO:174至177中所示氨基酸序列的氨基酸。

CDR1具有选自以下的序列：

SEQ ID NO:168DYAIG

SEQ ID NO:169DYALG

SEQ ID NO:170YYAIG

CDR2具有选自以下的序列：

SEQ ID NO:171AIRSSGGSTYYADSVKG

SEQ ID NO:172CIRCSGGSTYYADSVKG

SEQ ID NO:173CISSSGGITYYADSVKG

CDR3具有选自以下的序列：

SEQ ID NO:174VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA

SEQ ID NO:175VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA

SEQ ID NO:176SIVPRSKLEPYEYDA

SEQ ID NO:177DSGGYIDYDCSGLGYDY

根据优选实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中

(a)CDR1具有SEQ ID NO:168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO:171中所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO:174中所示的氨基酸序列，或者其中

(b)CDR1具有SEQ ID NO:168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO:171中所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO:175中所示的氨基酸序列，或者其中

(c)CDR1具有SEQ ID NO:169中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO:172中所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO:176中所示的氨基酸序列，或者其中

(d)CDR1具有SEQ ID NO:170中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO:173中所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO:177中所示的氨基酸序列。

根据另一优选实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH或域抗体。

根据又更优选的实施方案，所述Ang2结合分子包含免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。

根据具体实施方案，所述VHH由具有选自由SEQ ID No:167、166、129和138组成的组的序列的免疫球蛋白单一可变域组成。

在另一方面中，本发明涉及由所述免疫球蛋白单一可变域组成的Ang2结合分子。

根据本发明的Ang2结合物序列可在其N端被修饰(即缺失或置换第一氨基酸)而不显著降低其结合活性。此修饰增强在细菌宿主(例如但不限于大肠杆菌)中胞内/胞质表达期间的N端甲硫氨酸的翻译间/后切割。

在一个方面中，由免疫球蛋白单一可变域组成的所述VHH在N端具有修饰或置换，其中所述修饰是缺失第一氨基酸且所述置换是由另一氨基酸替代所述第一氨基酸。

在一个优选实施方案中，N端的所述第一氨基酸是缬氨酸(V)或天冬氨酸(D)，被例如丙氨酸(A)所替代。

在治疗应用方面具有改良性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的Ang2结合组分，可通过如下技术而从本发明的各别Ang2结合组分获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装，及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。

优选地，具有增强的亲和力的本发明的Ang2结合组分是通过另一Ang2结合组分的亲和力成熟来获得的，就亲和力成熟分子而言所述另一Ang2结合组分代表“亲本”Ang2结合组分。

因此，在另一项优选实施方案中，本发明的Ang2结合分子是通过使上述亲本免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟获得的免疫球蛋白单一可变域。

在另一项优选实施方案中，本发明涉及通过使VHH的亲和力成熟获得的免疫球蛋白单一可变域。

在一项优选实施方案中，本发明涉及免疫球蛋白单一可变域，其用于人源化具有SEQ ID NO:1、17和80中所示氨基酸序列的VHH。

在另一优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO:127、132和146中所示氨基酸序列的VHH人源化而获得的免疫球蛋白单一可变域。

本发明也涉及Ang2结合分子，其通过上述定义的VHH的亲和力成熟和/或序列优化而获得，例如涉及通过使具有SEQ ID NO:167、166、129和138所示氨基酸序列的VHH序列优化获得的VHH。

在另一项更优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO:167所示氨基酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。

在进一步更优选的实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO:166所示氨基酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。

在另一项优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。

在又一优选实施方案中，本发明涉及通过使具有SEQ ID NO:138中所示氨基酸序列的VHH亲和力成熟而获得的免疫球蛋白单一可变域。

在另一实施方案中，本发明或存在于本发明多肽中的代表性种类的Ang2结合免疫球蛋白单一可变域具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基替代常规4链抗体的天然存在的可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且可另外参考WO 1994/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓的骆驼科印记残基处(也参见例如WO 1994/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO 2006/040153的第46页和第98页及WO 2006/122786的第107页。

本发明的Ang2结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域和/或含有其的多肽)对Ang2具有特异性，因为其包含与Ang2分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。

Ang2结合组分对其抗原Ang2的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA和ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。

关于抗原Ang2，本发明的Ang2结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)在物种方面不受限制。因此，若欲用于人的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽优选结合至人Ang2。然而，结合至另一哺乳动物物种的Ang2的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种的Ang2形式结合的本发明的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的Ang2发生交叉反应。例如，结合人Ang2的本发明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的Ang2和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病及病症的动物模型)(例如本文提及的物种及动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是食蟹猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)的Ang2的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物开发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是食蟹猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。

而且，本发明的Ang2结合组分不限于其所针对的Ang2的特定域或Ang2的抗原决定簇或不由其所针对的Ang2的特定域或Ang2的抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种(欲在治疗性Ang2拮抗剂的开发期间将该物种用作动物模型)的一种或多种Ang2分子的交叉反应性，Ang2结合组分识别与人Ang2具有高同一性的感兴趣的Ang2区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于FLD-域内的表位，所述FLD-域发表在Kim H-Z，Jung K，Kim HM，Cheng Y和Koh GY(2009)中。一种经设计的促血管生成素2变体，五聚体COMP-Ang2，强烈活化Tie2受体并刺激血管生成。Biochim Biophys Acta 1793，772-780。

因此，根据一项优选实施方案，本发明涉及Ang2结合组分，具体涉及免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域选自与完全或部分地包含于FLD域(SEQ ID NO:188-190)内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域。

优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM(如通过表面等离子共振分析所测定)的亲和力结合Ang2。

优选地，如竞争ELISA分析中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC₅₀值在10^-6至10^-10摩尔/升或10^-10摩尔/升以下的范围内，更优选在10^-8至10^-10摩尔/升或10^-10摩尔/升以下的范围内、且进一步更优选在10^-9至10^-10摩尔/升或10^-10摩尔/升以下的范围内。

根据本发明的一个非限制性但优选的实施方案，本发明的Ang2结合免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽以10^-5至10^-12摩尔/升(M)或10^-12摩尔/升以下、且优选10^-7至10^-12摩尔/升(M)或10^-12摩尔/升以下、且更优选10^-8至10^-12摩尔/升(M)或10^-12摩尔/升以下的解离常数(K_D)，和/或以至少10⁷M^-1、优选至少10⁸M^-1、更优选至少10⁹M^-1，例如至少10¹²M^-1的缔合常数(K_A)；且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的K_D结合Ang2。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对Ang2的K_D及K_A值。

根据另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。

存在于本发明的单特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且可另外参考WO 94/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也参见例如WO94/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO 2006/040153的第46页和第98页及WO 2006/122786的第107页。

所述结合组分对Ang2具有特异性，因为在一项优选实施方案中其包含与Ang2分子内的一个或多个表位特异性结合的一个免疫球蛋白单一可变域。

结合组分对其抗原Ang2的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA和ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。

关于抗原Ang2，免疫球蛋白单一可变域在物种方面不受限制。因此，若欲用于人中的治疗目的，则免疫球蛋白单一可变域优选结合人Ang2。然而，结合另一哺乳动物物种的Ang2的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种形式的Ang2结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反应。例如，结合人抗原的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的各别抗原和/或与用于疾病动物模型(例如猴(特别是食蟹猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(且特别是用于可通过抑制Ang2而调节的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如本文提及的物种及动物模型)的抗原的交叉反应性。表现这种交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是食蟹猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。

而且，所述结合组分不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇或不由其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种(其欲在治疗性Ang2拮抗剂的研发期间将其用作动物模型)的一种或多种抗原分子的交叉反应性，结合组分识别与人抗原具有高度同一性的各别抗原的区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的单特异性结合分子中含有的抗Ang2免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于Ang2的EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示高同一性。

因此，根据一项优选实施方案，本发明的单特异性结合分子包含Ang2结合分子，其为选自与完全或部分地包含于FLD域内的表位结合的由SEQ ID NO:167、166、129和139所构成的组的免疫球蛋白单一可变域。

本发明还涉及编码本发明的所述Ang2结合分子的核酸。

在一项优选实施方案中，当本发明的Ang2结合分子表达于大肠杆菌中时，其由选自以下的核苷酸序列编码：

SEQ ID NO:178

GAGGTACAGCTGGTCGAGTCAGGTGGCGGATTAGTGCAGCCTGGGGGTTCTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCATCAGGCTTCACACTGGATGACTACGCCATCGGCTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGCGAAGGTGTTTCAGCAATCCGTTCAAGCGGTGGTTCAACATATTACGCCGACTCTGTTAAAGGACGCTTCACCATTAGCTCCGACAATAGTAAAAATACAGTCTACTTACAAATGAACAGTTTACGCCCAGAAGATACTGCGGTATACTATTGCGCTGCCGTGCCTGCTGGTCGCTTACGCTTTGGCGAGCAATGGTATCCTCTGTACGAGTACGACGCCTGGGGACAGGGTACGCTGGTAACGGTTTCAAGC

SEQ ID NO:179

GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTCGTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTGCAAATGAACTCATTACGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAGGTCGTCTGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCAAGGTACACTGGTTACAGTGAGTAGC

SEQ ID NO:180

GAAGTGCAGTTAGTCGAAAGTGGCGGAGGCCTGGTACAACCTGGTGGCAGTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCTTCAGGTTTTACATTCGACGACTACGCCCTGGGGTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGTGAGGGCGTTTCATGCATTCGTTGTTCAGGTGGTTCAACCTATTATGCCGATAGTGTAAAAGGTCGGTTCACCATTAGTAGCGACAATAGCAAGAATACAGTCTATCTGCAAATGAACTCTTTACGTCCTGAAGATACTGCGGTGTACTACTGCGCTGCATCAATCGTTCCTCGTTCAAAACTTGAACCTTACGAGTACGACGCCTGGGGTCAGGGTACGTTAGTAACGGTGTCAAGC

以及

SEQ ID NO:181

GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGTTTAGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGCCAGCGGTTTTGCACTGGATTATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCTGTATTAGCAGCAGCGGTGGTATTACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCTCTCGTGATAATAGTAAAAACACGGTTTACCTGCAGATGAACTCATTAAGACCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGTGCAACCGATAGCGGTGGCTATATTGATTATGATTGTAGCGGTCTGGGCTACGATTATTGGGGACAAGGTACGCTGGTGACAGTTAGCAGC

本发明涉及编码本发明的单特异性结合分子的核酸分子。这些核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子用途(codon usage)的DNA)。根据本发明的一项实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。

本发明的另外方面涉及包含编码本发明所述的Ang2结合分子的核酸分子的表达载体。

在优选实施方案中，本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。

载体可尤其为表达载体，即可提供单特异性结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的调控组件，例如启动子、增强子、终止子等。这些组件及其鉴于特定序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明双特异性结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integration factor)、选择标记物、前导序列、报告基因等公开于例如WO 2006/040153的第131-133页。

此类载体表达或可表达本发明的一种或多种单特异性结合分子；和/或含有本发明的核酸。

本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。

在另一方面中，本发明涉及携带包含编码根据本发明的Ang2结合分子的核酸分子的一种或多种表达载体的宿主细胞。

根据一项特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲霉属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。

适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLa cell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

本发明还提供制造本发明的单特异性结合分子的方法，这些方法通常包含以下步骤：

-在允许表达本发明的单特异性结合分子的条件下培养包含能够编码单特异性结合分子的核酸的宿主细胞；及

-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；

-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的单特异性结合分子。

优选实施方案呈现了用于生产具有序列SEQ ID NO:167、166、129和138的Ang2结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用一种或多种所述载体转染宿主细胞，

(b)培养所述宿主细胞，以及

(c)回收并纯化所述Ang2结合分子。

对于工业规模生产而言，优选的宿主生物体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模医药表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。

具体表达系统的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的单特异性结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。

本发明的单特异性结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusion body)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。

用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。

这些肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。这些肽，特别是编码这些肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、双硫桥式肽(disulfide-bridged peptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人源化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv框架上)。

为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人，1991，Nucleic Acids Research，第19卷，9，2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHH CDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人，2004，ProteinScience，13，1882-1891公开。

本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的单特异性结合分子及任选的这些组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。

在另一方面中，本发明涉及本发明单特异性结合分子作为药物的用途。

在又另一方面中，本发明涉及本发明单特异性结合分子用于治疗癌症、癌性疾病或眼病的方法中的用途。

对于药物用途而言，本发明的单特异性结合分子或含有本发明的单特异性结合分子的多肽可调配成药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的单特异性结合分子及至少一种生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类调配物可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴剂、植入物、栓剂等给药的形式。这些合适的给药形式(取决于给药方式，可为固体、半固体或液体)及用于其制备的方法及载体将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。

因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种单特异性结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有该免疫球蛋白单一可变域的多肽，及至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂(即适于药物用途)及任选一种或多种其他活性物质。

本发明的单特异性结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO 2004/041862、WO 2004/041863、WO 2004/041865、WO 2004/041867及WO 2008/020079，以及标准手册，例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，USA(1990)；Remington，the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel编)，Wiley，Weinheim，2007(参见例如第252-255页)。

例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他药物活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。这些调配物及制备这些调配物的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。

用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于这些制剂的载剂或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及医药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；含水油(water oil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。

因此，本发明的单特异性结合分子可组合药学上可接受的媒介物(例如惰性稀释剂或可吸收食用载体)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的双特异性结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔片、含片、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这些组合物及制剂应含有至少0.1％的本发明的Ang2结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2％与约60％之间。本发明的双特异性结合分子在用于这些治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。

所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO 08/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的双特异性结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的双特异性结合分子可并入持续释放制剂及装置中。

用于口服给药的制剂及调配物也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及调配物可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。

如WO 2008/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的单特异性结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。

对于本发明的单特异性结合分子的局部给药而言，如WO 2008/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载体(其可为固体或液体)组合而以组合物或调配物形式给予皮肤。

一般而言，本发明的单特异性结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量％、优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量％、优选约0.5-2.5重量％。

本发明的单特异性结合分子用于治疗中所需要的量不仅依所选特定单特异性结合分子变化，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的单特异性结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。

给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由本领域的一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin，E.W.第4版)，MackPublishing Co.，Easton，PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。

根据另一实施方案，本发明涉及本发明的单特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)的用途，其用于治疗目的，例如

-用于预防、治疗和/或减轻与Ang2介导的和/或Ang2相关的对血管生成的作用有关或可通过用本发明的单特异性结合分子调节Notch信号传导途径和/或Tie2信号传导途径来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，尤其在人中；

-在治疗需要此治疗的患者的方法中，该方法包含给予有需要的个体药物活性量的至少一种本发明的单特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述本发明的单特异性结合分子的药物组合物；

-用于制备用于预防、治疗或减轻与Ang2相关的和/或Ang2介导的对血管生成的作用相关的病症、疾病或症状的药物；

-作为用于以上目的药物组合物或药物中的活性成分。

根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。

在一项优选实施方案中，本发明涉及所述药物组合物用于治疗癌症和癌性疾病，例如乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌和胰腺癌。

根据另一方面，所述疾病为与Ang2相关的和/或Ang2介导的对血管生成作用相关或可通过用单特异性结合分子调节Notch信号转导途径和/或Tie2信号转导途径来治疗或减轻的眼病。

在另一优选实施方案中，本发明涉及所述药物组合物用于治疗眼病，例如年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。

在又另一优选实施方案中，本发明涉及所述药物组合物用于治疗慢性肾病。

视欲治疗的癌症/癌性疾病、眼病和/或慢性肾病而定，本发明的单特异性结合分子可单独或组合一种或多种其他治疗剂加以使用。

在优选实施方案中，本发明涉及药物组合物，包含作为活性成分的一种或多种所述Ang-2结合分子，还包含一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂如癌细胞中的DNA损伤剂和/或抗有丝分裂药物(例如紫杉醇)或者抑制血管生成的治疗活性化合物(抗血管生成药物例如抗VEGF/VEGF受体抑制剂，例如安维汀、nitedanib或舒尼替尼)、或者信号传导途径抑制剂例如mTOR抑制剂(例如替西罗莫司)或者激素治疗剂(例如他莫昔芬)。

其他治疗剂可与单特异性结合分子的给药同时给予(任选作为同一药物制剂的组分)、或在该单特异性结合分子的给药之前或之后给予。

在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为(而不限于)(在受体的情况下，包括各自配体)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGF、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。

其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehog antagonist)；JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号转导的抑制剂或泛素化(ubiquitination)途径的抑制剂或Notch信号转导途径的另一抑制剂。

Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。

PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。

VEGF抑制剂的实例为安维汀(avastin)(Roche)、阿柏西普(aflibercept)(Regeneron)。

raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX 4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL 281。

KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。

src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。

PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。

Rho抑制剂的一个实例为BA-210。

PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL 418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL 765(也为mTor抑制剂)。

cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。

c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。

Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW 2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。

HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。

JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG 101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。

Mek抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。

mTor抑制剂的实例为替西罗莫司(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。

Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。

cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。

刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。

CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。

蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。

NFκB途径抑制剂的一个实例为NPI-0052。

泛素化途径抑制剂的一个实例为HBX-41108。

在优选实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。

抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各自配体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐珠单抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide)，这些药物选自(但不限于)贝伐珠单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP 868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、维罗非尼(也称为PLX4032、RG7204或RO5185426，商品名zelboraf)一种B-Raf酶抑制剂，克唑替尼(称为ALK(间变性淋巴瘤激酶)和ROS1(c-ros致癌基因1，受体酪氨酸激酶)抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL 820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)及nitedanib。

其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。

尤其适用于与本发明的双特异性结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。

宜在治疗中与本发明的单特异性结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumab tiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)或马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)或OMP-21M18(Dll4抑制剂)。

可与本发明的双特异性结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类(vinca alkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其调配物、拉洛他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。

本发明的双特异性结合分子的特别优选的组合搭配是VEGF拮抗剂，如贝伐珠单抗(bevacizumab())、nitedanib、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)。

根据本发明的另一实施方案，提供一种通过如下步骤诊断疾病的方法

a)使样品与如上文定义的本发明的结合分子接触，及

b)检测所述结合分子对所述样品的结合，及

c)将步骤(b)中检测到的结合与标准物进行比较，其中相对于该样品的结合差异可诊断出与VEGF和/或Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病或病症。

对于此用途及其它用途，例如通过引入作为特异性结合对(例如生物素-(链菌素)抗生物素蛋白结合对)的一部分的官能团来进一步修饰本发明的单特异性结合分子可能是有用的。此类官能团可用于将本发明的结合分子与结合至该结合对另一半的另一蛋白、多肽或化合物进行连接，即通过形成结合对而连接。例如，本发明的单特异性结合分子可缀合至生物素并连接至与抗生物素蛋白或链亲和素缀合的另一蛋白、多肽、化合物或载体。例如，本发明的这些经缀合的单特异性结合分子可用作例如可检测信号产生剂缀合至抗生物素蛋白或链亲和素的诊断系统中的报告子(reporter)。

取决于感兴趣的具体疾病或病症，可使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的单特异性结合分子或多肽以及包含本发明的单特异性结合分子或多肽的组合物的效能。适合的分析及动物模型是本领域技术人员所了解的且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。

本发明的单特异性结合分子经受了涉及亲和力成熟、人源化以及移除潜在翻译后修饰位点的广泛序列优化过程以确保在人类中的低潜在免疫原性以及改善的生物物理学稳定性。出乎意料地，数据显示本发明的单特异性结合分子具有优于现有技术中那些结合分子的性质。此类性质包括与Ang1中和相比对Ang2中和的高选择性，如例如从图9至10、13至14、16至19数据可知；高效地完全抑制Ang2-Tie2相互作用，如例如从图6、9、13、16、18和20以及表12至13、16至17、20至22的ELISA数据，以及如例如表7中所示的VHH在AlphaScreen分析中的IC₅₀(nM)值(实施例7)；以及表8、14、18和23中纯化的VHH对重组人Ang2、猴Ang2、小鼠Ang2的亲和力KD(nM)可知。

这表明对于与Ang2介导的血管生成作用相关的疾病及病症(例如癌症、癌性疾病、眼病和/或慢性肾病)，本发明的单特异性结合分子为具有治疗功效的有希望的候选者。

附图简述：

图1至4、6至7、9至10、12至14和16至20中的轴注释：X轴代表OD 450(nm)且Y轴代表log竞争剂(M)。

图1(图1-1A至1-2C):纯化的VHH阻断hAng2-hTie2相互作用(ELISA)。

图2(图2-1A至2-2C):纯化的VHH阻断mAng2-mTie2相互作用(ELISA)。

图3(图3A至3B):纯化的VHH阻断cAng2-cTie2相互作用(ELISA)。

图4(图4A至4I):纯化的VHH阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图5:VHH 28D10亲和力成熟变体的序列比对。将所述氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat编号残基，根据AbM定义以粗体显示CDR。下划线示出被取代的残基。

图6(图6A至6C):纯化的VHH 28D10亲和力成熟变体阻断hAng2-hTie2相互作用(ELISA)。

图7(图7A至7C):纯化的VHH 28D10亲和力成熟变体阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图8(图8A至8B):VHH 1D01与hVH3-JH共有序列(A)和VHH 1D01序列优化变体(B)的序列比对。将所述氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat编号残基，根据AbM定义以粗体显示CDR。下划线示出突变为其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。

图9(图9-1A至9-3B):纯化的VHH 1D01序列优化变体阻断hAng2-hTie2(10-1)、mAng2-mTie2(10-2)和cAng2-cTie2(11-3)相互作用(ELISA)。

图10:纯化的VHH 1D01序列优化变体阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图11(图11A至11C):VHH 37F02与hVH3-JH共有序列(A)，VHH 37F02循环1(B)和循环2(C)序列优化变体的序列比对。将所述氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat编号残基，根据AbM定义以粗体显示CDR。下划线示出突变为其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。

图12(图12-1至12-3):纯化的VHH 37F02循环1序列优化变体阻断hAng2-hTie2(14-1)、mAng2-mTie2(14-2)和cAng2-cTie2(14-3)相互作用(ELISA)。

图13(图13-1A至13-3):纯化的VHH 37F02循环2序列优化变体阻断hAng2-hTie2(15-1)、mAng2-mTie2(15-2)和cAng2-cTie2(15-3)相互作用(ELISA)。

图14:纯化的VHH 37F02循环2序列优化变体阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图15(图15A至15D):VHH 28D10与hVH3-JH共有序列(A)，VHH 28D10循环1序列优化变体(B)，循环2变体(C)和循环3变体(D)序列优化变体的序列比对。将所述氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat编号残基，根据AbM定义以粗体显示CDR。下划线示出突变为其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。

图16(图16-1A至16-3C):纯化的VHH 28D10循环1序列优化变体阻断hAng2-hTie2(18-1)、mAng2-mTie2(18-2)和cAng2-cTie2(18-3)相互作用(ELISA)。

图17(图17A至17B):纯化的VHH 28D10循环1序列优化变体阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图18(图18-1A至18-3):纯化的VHH 28D10序列优化C₅₀X–S₅₃X变体阻断hAng2-hTie2(20-1)、mAng2-mTie2(20-2)和cAng2-cTie2(20-3)相互作用(ELISA)。

图19:纯化的VHH 28D10序列优化C₅₀X–S₅₃X变体阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。

图20(图20-1A至20-3C):纯化的VHH 28D10循环2序列优化变体阻断hAng2-hTie2(22-1)、mAng2-mTie2(22-2)和cAng2-cTie2(22-3)相互作用(ELISA)。

实施例

材料和方法

a)过表达人或小鼠Tie2受体的HEK293H稳定细胞株的产生

在pcDNA3.1-neo表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中克隆编码人Tie2(NM_000459.3；SEQ ID NO:182)、小鼠Tie2(NM_013690.2；SEQ ID NO:183)和猴Tie2(SEQID NO:184)的cDNA。为建立过表达人Tie2或小鼠Tie2的人胚肾(HEK)细胞，分别使用具有pcDNA3.1-neo-hTie2或pcDNA3.1-neo-mTie2的Fugene(Roche)对HEK293亲本细胞进行脂质介导的转染。对于所有条件，均通过添加1mg/mL遗传霉素(geneticin)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在转染2日后选择转染子。对于人、小鼠和猴Tie2，使用FACSAria细胞分选仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)，通过分别结合PE标记的抗人Tie2(R&DSystems，Minneapolis，MN，US)、PE标记的抗小鼠Tie2(eBioscience，San Diego，CA，USA)以及2步山羊抗人Tie2(R&D Systems，Minneapolis，MN，US)然后是PE标记的驴抗山羊(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)的单细胞排序克隆选择最终高表达的克隆。

b)过表达小鼠或猴Ang2的HEK293T细胞株的产生以及重组小鼠和猴Ang2条件培养基的产生

在pSecTag2B表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中克隆编码N-端FLAG-标记的小鼠Ang2(NM_007426.3；SEQ ID NO:185)和猴Ang2(AB172643.1；SEQ ID NO:186)的cDNA。瞬时过表达小鼠Ang2或猴Ang2的人胚肾(HEK)细胞分别是在HEK293T亲本细胞株中，通过pSecTag2B-mAng2或pSecTag2B-cAng2的脂质介导的转染(Fugene；Roche)而产生的。在1.5升CF10袋中进行生产并在转染5日后收集1.5L条件培养基(CM)。

c)HEK293-F细胞中重组猴Tie2/Fc嵌合体的产生

使用适当限制性位点将编码Tie-2胞外域的cDNA亚克隆进入表达质粒pSecTag2b以产生Fc-融合蛋白。如制造商所述使用Megaprep(Qiagen)质粒制备物、Optimem-Medium(Invitrogen)、293-fectin(Invitrogen)以1x10⁶活细胞/mL的初始细胞密度连同1μg质粒DNA/10⁶细胞进行转染进入HEK293-F细胞(Invitrogen)。在振荡烧瓶中37℃培育转染细胞7天。通过4000g下离心10min并过滤通过无菌滤器(0.45μm膜)收获条件培养基(CM)。

通过以5ml/min将CM装载至采用DPBS平衡的5ml MabSelect SuRe蛋白A柱上使用亲和色谱纯化Fc-融合蛋白。DPBS清洗步骤后，使用pH 3.0的10mM柠檬酸钠缓冲液洗脱结合的Fc-蛋白，随后通过加入1M Tris/HCl pH 8.0中和至pH 7.0。采用Millipore AmiconUltra(10kDa分子量截留)离心浓缩机浓缩纯化蛋白并将缓冲液置换为DPBS。采用标准分析方法(采用Experion Pro 260试剂盒-BioRad电泳；质谱)证实蛋白的存在。通过尺寸排阻色谱进一步分析所述蛋白并测定内毒素含量(Endosafe PTS试剂盒–Charles River)。

d)HEK293-F细胞中重组人、猴、小鼠和大鼠Ang2-FLD的产生

如对于Tie2-Fc-融合蛋白所述进行分子克隆和细胞培养。为纯化His-标记蛋白，以5ml/min将所述CM加样至采用DPBS平衡的2ml Ni²⁺螯合琼脂糖快速流动柱(His-Trap-GEHealthcare Life Sciences)上。加样后在存在4％洗脱缓冲液(DPBS+0.5％咪唑)以防止非特异性结合的情况下用DPBS洗柱。采用含有0.5％咪唑的DPBS从柱洗脱Ang2-FLD-蛋白。随后进行超滤步骤用于浓缩和缓冲液置换(10kDa分子量截留)。如对于Tie2-Fc所述保留一份蛋白用于分析表征。

实施例1

使用重组人Ang2免疫来诱导美洲驼(llama)中的体液免疫反应

1.1.免疫化

在经兽医学学院的伦理委员会(the Ethical Committee of the faculty ofVeterinary Medicine，University Ghent,Belgium)批准之后，通过4次肌内注射(第0天:50μg，第14天:20μg，第28天:17.5μg以及第42天:17.5μg剂量)重组人Ang2(R&D Systems，Minneapolis，MN，US)来免疫4只美洲驼(命名为第406、408、454、455号)。第0天抗原用弗氏完全佐剂(Complete Freund's Adjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配用于初次注射，而抗原用弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配用于加强注射。

1.2.美洲驼中诱导免疫反应的评估

为了通过ELISA评估动物中对抗人Ang2的免疫反应的诱导，在第0天(免疫前)、第35天及第46天(收集外周血液淋巴细胞[PBL]的时间)收集血清。简而言之，1μg/mL重组人Ang2(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(PBS+1％酪蛋白)阻断各孔。在添加系列血清稀释液之后，使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的羊抗美洲驼免疫球蛋白(Bethyl LaboratoriesInc.,Montgomery,TX,USA)且接着使用在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测特异性结合的免疫球蛋白，显示诱导了对抗人Ang2的显著抗体依赖性免疫反应。抗体反应是由表达常规抗体的B细胞谱系及表达仅有重链的抗体的B细胞谱系来发动，因为经结合的免疫球蛋白可用特异性识别常规美洲驼IgG1抗体或仅有重链的美洲驼IgG2或IgG3抗体的抗体来检测。在所有注射人Ang2的美洲驼中，抗体反应由表达常规抗体及仅有重链的抗体的、特异性针对人Ang2的B细胞发动。各美洲驼的Ang2血清效价反应见于表1中。

表1:抗体介导的对抗重组人Ang2的特异性血清反应

图例:(*)

低(或+/-):1,000≥HSD_S/N≥2<1,500

适中(或+):1,500≥HSD_S/N≥2<13,500

良好(或++):13,500≥HSD_S/N≥2<365,000

优异(或+++):HSD_S/N≥2≥365,000

(*)HSD，最高血清稀释；S/N≥2，信噪比≥2

实施例2

仅有重链的抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备

在末次免疫原注射之后，从免疫化美洲驼收集免疫组织作为产生仅有重链的抗体的B细胞的来源。通常，每只动物在末次抗原注射后4天及10天收集两个150mL血液样品，及在末次抗原注射之后4天收集一个淋巴结活检。根据制造商说明书(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。如WO 05/044858实施例3(第46页)中所述，从PBMC及淋巴结(未从第406号动物提取)活检提取总RNA，其用作扩增编码VHH的DNA区段的RT-PCR的起始物质。对于各免疫化美洲驼，通过汇集从该动物收集的所有免疫组织分离的总RNA来构筑文库。简而言之，经PCR扩增的VHH谱系通过特异性限制位点克隆入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。该载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄西林或羧苄西林抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列。载体编码与VHH编码序列同框的C-末端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，且在过滤灭菌后储存在4℃以供进一步使用。

实施例3

通过噬菌体展示进行Ang2特异性VHH的选择

将从所有美洲驼获得且克隆为噬菌体文库的VHH谱系用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括：i)Ang2蛋白形式：生物素化C末端His标记的全长重组人Ang2(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)以及C末端His标记的全长小鼠Ang2(产自GeneArt，现为Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，ii)Ang2呈现方法：直接涂布小鼠Ang2的培养板或通过在具有生物素化人Ang2的溶液中培养，随后在中性链亲和素(Neutravidin)涂布的培养板上捕获，以及iii)抗原浓度。所有选择均在96孔Maxisorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。

如下进行多轮选择：如上所述以多个浓度(生物素化人Ang2:50，5，0.5，0.05及0.005nM；小鼠Ang2:10，1，0.1及0.01μg/mL)呈现用于固相及溶液相选择形式的Ang2制备物。在与噬菌体文库一起培养2h、随后充分洗涤之后，用胰蛋白酶(1mg/mL)室温下洗脱结合噬菌体15-30分钟。然后立即通过施用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF中和胰蛋白酶活性。平行进行w/o抗原选择作为背景对照。将显示超过背景值的富集的噬菌体输出(phage output)用于感染大肠杆菌。经感染的大肠杆菌细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于LB琼脂培养板(氨苄西林+葡萄糖^2％)上用于分析单个的VHH克隆。为了筛选特异性结合物或阻断物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL 96深孔培养板中培养。通过在葡萄糖不存在的条件下添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ调控的VHH表达。根据标准方案(如在例如本文引用的WO 2006/040153中所公开)制备周质(periplasmic)提取物(体积约80μL)。简而言之，4,500rpm下离心培养物15分钟。将沉淀(pellet)冰冻过夜或在-20℃冰冻1小时。然后，室温下解冻所述沉淀40分钟，再悬于15ml peri缓冲液(50mMNaHPO₄，300mM NaCl)中并振摇1小时。通过在14000rpm下离心20分钟分离周质部分。

实施例4

Ang2-Tie2和Ang1-Tie2ELISA以及AlphaScreen竞争分析中周质提取物的筛选

在人Ang2-人Tie2AlphaScreen竞争分析中筛选含有经表达的VHH的周质提取物以评估其阻断能力。简而言之，使用生物素的N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(Thermo FisherScientific，Rockford，IL，USA)将人Tie2/Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)生物素化。使用涂布抗FLAG M2抗体(Sigma，St Louis，MO，USA)的受体珠(Perkin Elmer，Waltham，MA，US)来捕获FLAG标记的人Ang2(Alexis Biochemicals，San Diego，CA，USA)。为了评估VHH抑制人Ang2结合其受体人Tie2的能力，使含有经表达的VHH的周质提取物的1:25稀释液与0.1nM FLAG标记的人Ang2一起培养。将受体珠及0.3nM生物素化人Tie2/Fc嵌合体添加至该混合物中并进一步在室温培养2小时。最后，加入链霉亲和素缀合的供体珠(Perkin Elmer，Waltham，MA，US)并在室温下额外培养2小时。分析缓冲液是PBS+0.03％吐温-20+0.1％BSA。通过使用680nm的激发波长及520nm的发射波长在Envision多标记培养板读取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上测量荧光。荧光信号减少表明人Ang2对人Tie2的结合是由表达于周质提取物中的VHH阻断的。在基于竞争分析的验证性ELISA中筛选至少50％阻断人Ang2-人Tie2相互作用的VHH。此外，还在竞争ELISA中评估了结合小鼠Ang2的交叉反应性以及相较于人Ang1的选择性。简而言之，4℃下以2μg/mL将人或小鼠Tie2/Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)过夜固定在96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中。用1％酪蛋白溶液阻断各孔。根据分析类型使用以下Ang种类培养含有经表达的VHH的周质提取物的1:5稀释液：0.02nM FLAG标记的人Ang2，一种含有FLAG标记的小鼠Ang2或0.02nM FLAG标记的人Ang1的HEK293条件培养基(Alexis Biochemicals，San Diego，CA，USA)的1:3,000稀释液。将此混合物加至所述Tie2/Fc涂布孔并在室温培养2小时。使用HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma，St Louis，MO，USA)检测Ang的残余结合。

在第二筛选循环中，在1:300稀释下筛选具有选择输出的含有经表达VHH的周质提取物，其中所述选择输出产生高差异性的小鼠Ang2交叉反应性阻断VHH。选择抑制人Ang2结合人Tie2，小鼠Ang2结合小鼠Tie2且显示未抑制人Ang1结合人Tie2的VHH。序列分析显示了属于38个不同B细胞系的86个独特的VHH。各B细胞系发现的独特序列变体的总数、代表性VHH以及使用的选择条件示于表2中。基于AlphaScreen和ELISA的筛选数据概述在表3中给出。全部独特的VHH的氨基酸序列显示于序列表(SEQ ID NO:1至86)及表4中。

表2:用于鉴别Ang2特异性VHH B细胞系的选择参数

表3:含有表达的抗Ang2 VHH的周质提取物的筛选^(a)

^(a)若鉴别了B细胞系内的多个独特VHH变体，则给出抑制％范围(最小值-最大值)

表4:筛选期间鉴别的独特抗Ang2 VHH的氨基酸序列

实施例5

纯化的抗Ang2 VHH的表征

将选自实施例4中所述筛选的一部分抑制性抗Ang2 VHH进一步纯化且加以表征。所选VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc、His6标记的蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融丸状物来制备周质提取物。这些提取物用作起始物质且通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到95％的纯度。

5.1.ELISA中阻断hAng2的VHH的评估

在人Ang2-人Tie2阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简而言之，将2μg/mL Tie2/Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。将0.02nM固定浓度的FLAG标记的人Ang2(Alexis Biochemicals，San Diego，CA，USA)添加至经纯化的VHH的系列稀释液(在PBS+0.1％酪蛋白+0.05％吐温-20中稀释)中，并在涂布的人Tie2受体上培养2小时。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗FLAG M2(Sigma，St.Louis，MO，USA)检测人Ang2的残余结合(图1)。参照分子是Ab536的Fab片段(US2009/0191212)(图1-1)或者肽体AMG386的肽部分(WO2004/092215中SEQ ID NO:25)(图1-2)。使用不相关的VHH作为阴性对照。VHH阻断人Ang2-人Tie2相互作用的IC₅₀值分别见于表5-1和表5-2中。

表5-1:纯化的VHH阻断hAng2/hTie2相互作用的IC₅₀(nM)值(竞争ELISA；VHH:n＝2-3；Fab Ab536:n＝6)

表5-2:纯化的VHH阻断hAng2-hTie2相互作用的IC₅₀(nM)值(竞争ELISA；VHH:n＝1-3；AMG386肽:n＝3)

5.2.阻断ELISA中对小鼠和猴Ang2交叉反应性的评估

为确定VHH是否抑制小鼠Ang2与小鼠Tie2结合以及猴Ang2与猴Tie2结合，进行了竞争ELISA。简而言之，在4℃将2μg/mL重组小鼠Tie2-Fc或猴Tie2-Fc涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中过夜。用1％酪蛋白溶液阻断经涂布的各孔。室温下将FLAG标记的小鼠Ang2(来自瞬时HEK转染的条件培养基的1:3,000稀释液)或者FLAG标记的猴Ang2(来自瞬时HEK转染的条件培养基的1:800稀释液)以及纯化VHH的系列稀释液(在PBS+0.1％酪蛋白+0.05％吐温-20中稀释)在经涂布Tie2-Fc受体上培养2小时以实现结合平衡。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗FLAG M2 mAb(Sigma，St.Louis，MO，USA)检测FLAG-mAng2或FLAG-cAng2的残余结合。参照分子是Ab536的Fab片段(小鼠：图2-1)或者肽体AMG386的肽部分(小鼠:图2-2；猴:图3)。使用不相关的VHH作为阴性对照。VHH阻断小鼠Ang2-小鼠Tie2相互作用的IC₅₀值见于表6-1中。VHH阻断小鼠和猴Ang2分别结合小鼠和猴Tie2的IC₅₀值示于表6-2中。

表6-1:纯化的VHH阻断mAng2与mTie2相互作用的IC₅₀(nM)值(竞争ELISA；VHH:n＝2-3；Fab Ab536:n＝5)

表6-2:纯化的VHH阻断mAng2和cAng2分别与mTie2和cTie2的相互作用的IC₅₀(nM)值(竞争ELISA；VHH:n＝1-3；AMG386肽:n＝3；n.d.，未测)

5.3.ELISA中人Ang2阻断VHH对人Ang1的选择性的评估

为确定抗Ang2阻断VHH是否对人Ang1结合人Tie2具有选择性，进行了竞争ELISA。简而言之，在4℃将2μg/mL重组人Tie2-Fc(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中过夜。用1％酪蛋白溶液阻断经涂布的各孔。在室温将固定浓度(0.02nM)的FLAG标记的重组人Ang1(Alexis Biochemicals，San Diego，CA，USA)和VHH的系列稀释液(在PBS+0.1％酪蛋白+0.05％吐温-20中稀释)在经涂布的受体Tie2-Fc上培养2小时以实现结合平衡。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗FLAG M2 mAb检测FLAG-hAng1的残余结合。参照分子是AMG386肽体的肽部分(图4)。使用不相关的VHH作为阴性对照。VHH阻断人Ang1-人Tie2相互作用的指示性IC₅₀值示于表7中。

表7:纯化的VHH阻断人Ang1与人Tie2相互作用的IC₅₀(nM)值(竞争ELISA；VHH:n＝2-3；AMG386肽:n＝3)

5.4.测定人、小鼠、猴Ang2-VHH相互作用的亲和力

使用表面等离子共振(SPR)分析(Biacore T100)测定VHH结合人、小鼠和猴Ang2的亲和力。简而言之，通过胺偶联将VHH和基准化合物固定在CM5芯片上。使用多循环动力学方法：注射不同浓度的人、小鼠和猴Ang2-FLD(0.4-1-2.6-6.4-16-40-100nM)。使Ang2-FLD种类缔合2分钟并在45μl/分钟的流速下解离20分钟。在注射间隙，用10秒25mM NaOH脉冲及60秒稳定期使表面再生。通过拟合1:1相互作用模型(朗缪尔(Langmuir)结合)来评估缔合/解离数据。亲和力常数K_D由所得缔合及解离速率常数k_a及k_d来计算并示于表8中。

表8:纯化的VHH对人、小鼠和猴Ang2的亲和力K_D(nM)

实施例6

所选VHH的亲和力成熟

使VHH 28D10变体(带有C₅₀S/S₅₃N和Q₁₀₈L取代的00027–实施例7.3)经受亲和力成熟。

在第一循环中，使用易错PCR方法在框架(FW)及互补决定区(CDR)两者中随机引入氨基酸取代。用两轮基于PCR的方法(使用Genemorph II随机诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA，USA))来进行诱变，该方法使用1ngVHH 00027cDNA模板，随后使用0.1ng的第1轮产物进行第二次易错PCR。在精制步骤之后，将PCR产物通过独特限制位点插入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。使用递减浓度的生物素化重组人Ang2(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)及胰蛋白酶洗脱液来进行连续多轮的溶液中选择(in-solutionselection)。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)且在ProteOn(BioRad,Hercules,CA,USA)解离速率分析中筛选与重组人Ang2-FLD的结合。简而言之，GLC ProteOn传感器芯片在“配体通道”L3、L4、L5及L6(L1/L2作为参照通道)上涂布有重组人Ang2-FLD。将亲和力成熟克隆的周质提取物以1:10稀释且横跨“分析物通道”A1-A6加以注射。计算以与亲和力成熟VHH相同方式制备及测试的参照VHH 00027的平均解离速率且作为计算解离速率改善的参照。最高的25种亲和力成熟变体示于表9中。对VHH测序(表10-A)以鉴定对改善解离速率有益的氨基酸突变(表10-B)。

表9:VHH 00027亲和力成熟变体的解离速率和倍数改善

构建含有Kabat 27、29、100b和100i位上突变组合的初始12种VHH变体(表11；图5)。这4处突变的不同组合移接在含有附加D₅₄G取代(实施例6.3)的序列优化VHH 00042骨架(图17-B)上。将所述氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat编号残基，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)以灰色显示CDR。在具有C-末端c-myc标签及(His)6标签的框架内，将构建体克隆入表达载体pAX100中。在大肠杆菌中产生VHH变体并通过IMAC和SEC纯化。序列呈现在表11中。在hAng2/hTie2(实施例5.1；结果示于图6和表12中)和hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3；结果示于图7和表12中)中分析所有这些VHH。此外，在热转移分析中测定了各变体在pH7下的熔点(T_m)，所述热转移分析基于引入宝石橙(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)后荧光信号的温度依赖性改变(Ericsson等人，Anal.Biochem.357(2006),pp289-298)(表12)。

表10-A:亲和力成熟的抗Ang2 VHH的氨基酸序列

表10-B:单一突变或其组合产生解离速率的改善

表11:亲和力成熟的抗Ang2 VHH的氨基酸序列

表12:VHH 00027亲和力成熟变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(pM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

从效力、T_m和序列角度，采用VHH 00908进入组合的亲和力成熟和序列优化的第二循环(实施例7.3)。

实施例7

所选VHH 1D01、28D10和37F02的序列优化

7.1 VHH 1D01

将抗Ang2 VHH 1D01的氨基酸序列(参见图8-A)与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat对残基编号，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)将CDR显示为灰色。下划线示出突变为其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。所述比对显示相对于所述参照生殖系序列1D01含有6个框架突变。选择14、41、71、74、83和108位的非人残基以供用它们的人生殖系对应残基取代。构建并产生在这些位点携带不同人残基组合的一组7种1D01变体(图8-B)(实施例5)。平行地，在这7种变体的3种中通过引入D₅₄G取代移除D₅₄G₅₅位的潜在Asp异构化位点，并在这7种变体的1种中通过E₁D取代移除E₁位的潜在焦Glu形成位点(AA序列在表15中列出)。

这些变体在人(图9-1)、小鼠(图9-2)和猴(图9-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)、hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3；图10)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。数据概述可见于表13中。此外，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)计算了与人生殖系的％FR同一性。VHH00921对人、猴、小鼠和大鼠Ang2的亲和力示于表14(实施例5.4)中。

表13:VHH 1D01序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(nM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

n.d.，未测

表14:纯化VHH 00921对重组人、猴、小鼠和大鼠Ang2的亲和力K_D

表15:抗Ang2 VHH 1D01序列优化变体的氨基酸序列

7.2 VHH 37F02

将抗Ang2 VHH 37F02的氨基酸序列(参见图12-A)与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat对残基编号，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)将CDR显示为灰色。下划线示出突变至其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。所述比对显示相对于所述参照生殖系序列37F02含有4个框架突变。选择60、74、83和108位的非人残基用它们的人生殖系对应残基取代。平行地，通过引入D₅₄G取代移除D₅₄G₅₅位的潜在Asp异构化位点。构建并产生在这些位点携带不同人残基组合的一组三种循环137F02变体(图12-B)(实施例5；AA序列在表21-1中列出)。

这些变体在人(图12-1)、小鼠(图12-2)和猴(图12-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。数据概述可见于表16中。此外，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)计算了与人生殖系的％FR同一性。

表16:VHH 37F02循环1序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(pM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

使用NNK文库法敲除CDR3中的两个潜在翻译后修饰位点：i)100e位上的氧化敏感性Met以及ii)D₉₅S₉₆位上的Asp异构化位点。由于D₅₄G是耐受的(VHH 00046和00920；表16和表17)，未使用NNK法敲除此潜在Asp异构化位点。

最后，在hAng2/hTie2竞争AlphaScreen分析(实施例2)中筛选含有在D₉₅、S₉₆和M_100e位取代为所有其它氨基酸的VHH克隆的3个NNK文库。简而言之，在3种不同稀释下(粗略对应于亲本VHH 37F02的EC₂₀、EC₅₀和EC₈₀)筛选含有经表达的VHH的周质提取物并与亲本37F02比较不同稀释点下的抑制％变化。基于筛选结果以及表17中所示数据，构建了8种额外的携带不同D₉₅S₉₆和M_100e敲除组合的循环2VHH变体(基于VHH 00920骨架)(图11-C；AA序列在表19-2中列出)。

所有这些变体在人(图13-1)、小鼠(图12-2)和猴(图12-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)、hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3；图14)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。数据概述可见于表17中。此外，计算与人生殖系的％FR同一性。VHH 00928对人、小鼠、猴和大鼠Ang2的亲和力示于表18中。

表17:VHH 37F02循环2序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(pM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

n.d.，未测

表18:纯化VHH 00928对重组人、猴、小鼠和大鼠Ang2的亲和力K_D

表19-1

表19-2

7.3 VHH 28D10

将抗Ang2 VHH 28D10的氨基酸序列(参见图15-A)与人生殖系VH3/JH共有序列比对。根据Kabat对残基编号，根据AbM定义(Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件)将CDR显示为灰色。下划线示出突变为其人对应残基的残基。框示要处理的潜在翻译后修饰位点。所述比对显示相对于所述参照生殖系序列28D10含有5个框架突变。选择14、71、74、83和108位的非人残基替换为它们的人生殖系对应残基。平行地，通过引入D₅₄G取代移除D₅₄G₅₅位的潜在Asp异构化位点。通过用Ala、Thr或Ser取代移除50位的游离半胱氨酸。最后，构建并产生在这些位点携带不同人残基组合的一组11种循环128D10变体(参见图15-B；AA序列在表24-1中列出)。

这些变体在人(图16-1)、小鼠(图16-2)和猴(图16-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)、hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3；图17)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。数据概述可见于表20中。此外，计算与人生殖系的％FR同一性。

表20:VHH 28D10循环1序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(nM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

n.d.，未测

创建一套附加变体(循环2)以探究A₂₄V位上的亲和力成熟取代并进一步探究C₅₀X–S₅₃X变体(表21；图15-C；AA序列在表23-4-2中列出)。这些变体在人(图18-1)、小鼠(图18-2)和猴(图18-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)、hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3；图19)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。

表21:VHH 28D10循环2序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(nM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

n.d.，未测

平行地，使用NNK文库法敲除CDR2中的两个翻译后修饰位点：D_52aS₅₃和D₅₄G₅₅位上的两个连续Asp异构化位点。由于D₅₄G是耐受的(实施例6；表20)，未使用NNK法敲除此潜在Asp异构化位点。最后，在hAng2/hTie2竞争AlphaScreen分析(实施例2)中筛选含有在D_52a和S₅₃位取代为所有其它氨基酸的VHH克隆的2个NNK文库。简而言之，在3种不同稀释下(粗略对应于参照00902的EC₂₀、EC₅₀和EC₈₀)筛选含有经表达的VHH的周质提取物并与参照00902比较不同稀释点下的抑制％变化。基于筛选结果以及表21中所示数据，构建了7种额外的VHH循环3变体(基于00908骨架)(参见图15-D)。最终目的是构建与VHH 28D10相比保留或显示增加的效力、增加的热稳定性并且敲除了相关PTM位点的VHH变体(AA序列在表24-3中列出)。这些变体在人(图20-1)、小鼠(图20-2)和猴(图20-3)Ang2/Tie2竞争ELISA(实施例5.1；实施例5.2)、hAng1/hTie2竞争ELISA(实施例5.3)中被表征为纯化蛋白。此外，在热转移分析中测定了各变体的熔点(T_m)(实施例6)。数据概述可见于表22中。此外，计算与人生殖系的％FR同一性。将最优化序列变化最终应用至非亲和力成熟变体VHH 00956(图15-D)。VHH 00919、00938和00956对人、小鼠、猴和大鼠Ang2的亲和力示于表23中。

表22:VHH 28D10循环3序列优化变体的T_m、在人、小鼠和猴Ang2竞争ELISA中的IC₅₀(pM)以及hAng1/hAng2 IC₅₀比的概述

n.d.未测

表23:纯化的VHH 00919、00938和00956对重组人、猴、小鼠和大鼠Ang2的亲和力K_D

表24-1

表24-2

表24-3

Claims

1.一种Ang2结合分子，其包含免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中

CDR1由SEQ ID NO:168中所示的氨基酸序列组成，CDR2由SEQ ID NO:171中所示的氨基酸序列组成且CDR3由SEQ ID NO:175中所示的氨基酸序列组成，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。

2.根据权利要求1的所述Ang2结合分子，其中所述VHH由具有SEQ ID No:166的序列的免疫球蛋白单一可变域组成。

3.根据权利要求1至2中任一项的所述Ang2结合分子，其中所述VHH或免疫球蛋白单一可变域在其N端具有修饰或置换，其中所述修饰是缺失第一氨基酸且所述置换是由另一氨基酸替代所述第一氨基酸。

4.编码根据权利要求1至3中任一项的所述Ang2结合分子的核酸分子。

5.包含根据权利要求4的所述核酸分子的表达载体。

6.携带根据权利要求5的一种或多种表达载体的宿主细胞。

7.产生根据权利要求1至3中任一项的所述Ang2结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用根据权利要求5的一种或多种所述表达载体转染宿主细胞，

(b)培养所述宿主细胞，以及

(c)回收并纯化所述Ang2结合分子。

8.一种药物组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求1至3中任一项的一种或多种所述Ang2结合分子，和至少一种生理学上可接受的载体。

9.根据权利要求8的所述药物组合物，还包含一种或多种其它治疗剂。

10.根据权利要求8至9中任一项的所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与Ang2介导的对血管生成的作用相关的疾病。

11.根据权利要求10的所述用途，其中所述药物用于治疗癌症。

12.根据权利要求10的用途，其中所述药物用于治疗眼病。

13.根据权利要求12的用途，其中所述眼病为年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变。

14.根据权利要求10的用途，其中所述药物用于治疗慢性肾病。