CN103562222B - 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子，其优选为免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体的形式，公开了包含它们的药物组合物，及其在治疗与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病中的用途。而且，还描述了编码双特异性结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

Description

结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子
发明领域
本发明涉及人的治疗，特别是癌症治疗的领域以及适用于该治疗中的药物及组合物。
发明背景
当肿瘤达到约1mm3的临界大小时，它们变得依赖于血管生成以维持氧气和营养的血液供应以便进一步生长。抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗集中于通过中和VEGF(Avastin，安维汀)或其受体(索坦(Sutent)和索拉非尼(Sorafinib))阻断VEGF通路(Ferrara等人，NatRevDrugDiscov.2004年5月；3(5)：391-400)。近来在小鼠中的研究已显示，促血管生成素2(Ang2，Tie2受体的一种配体)通过使其他的血管生成因子(例如VEGF)发挥功能来控制血管重构。Ang2主要由内皮细胞表达，由缺氧和其他血管生成因子强烈诱导，并已证明其调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF和FGF2(Augustin等人，NatRevMolCellBiol.2009年3月；10(3)：165-77.)。与该作用相一致，Ang2的缺失或抑制导致血管生成减少(Gale等人，DevCell.2002年9月；3(3)：302-4.)(Falcón等人，AmJPathol.2009年11月；175(5)：2159-70.)。已经报道结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和黑素瘤患者具有升高的Ang2血清浓度(Goede等人，BrJCancer.2010年10月26日；103(9)：1407-14)(Park等人，Chest.2007年7月；132(1)：200-6.)(Helfrich等人，ClinCancerRes.2009年2月15日；15(4)：1384-92.)。在CRC癌症中，Ang2血清水平与抗VEGF治疗的治疗应答相关。
Ang-Tie系统由2个受体(Tie1和Tie2)和3个配体(Ang1、Ang2和Ang4)组成(Augustin等人，NatRevMolCellBiol.2009年3月；10(3)：165-77.)。Tie2、Ang1和Ang2是这个家族中研究最好的成员，Tie1是一个孤儿受体而Ang4对血管重构的作用仍然需要加以界定。Ang2和Ang1对于Tie2的结合和活化介导相反的功能。Ang2介导的Tie2活化导致内皮细胞活化、周细胞解离、血管渗漏和诱导血管萌芽。与Ang2相反，Ang1信号转导通过募集周细胞维持血管完整，从而保持血管内皮细胞静止。
血管生成素2(Ang2)是Tie2受体酪氨酸激酶的一种分泌的、66kDa的配体(Augustin等人，NatRevMolCellBio1.2009年3月；10(3)：165-77.)。Ang2由N-末端卷曲螺旋域和C-末端的纤维蛋白原样域组成，后者是与Tie2相互作用需要的。Ang2主要由内皮细胞表达并由缺氧和其他血管生成因子(包括VEGF)强烈诱导。Tie2在内皮细胞、造血干细胞和肿瘤细胞上发现。已经证明Ang2-Tie2调节肿瘤血管的可塑性，使血管应答VEGF和FGF2。
在体外已经表明Ang2在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中充当温和的有丝分裂原、趋化因子和管形成诱导物。Ang2诱导成纤维细胞中异位表达的Tie2的酪氨酸磷酸化，并促进下游信号事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。已经描述了Ang2在Ang1诱导的内皮细胞应答中的拮抗作用。
已经表明Ang2缺乏导致了小鼠中严重的淋巴模式(lymphaticpatterning)缺陷。虽然Ang2损耗不是胚胎血管发育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在视网膜和肾脏中具有持久性血管缺陷。结合在血管生成部位(例如卵巢)的Ang2表达的动态模式，这些结果表明Ang2通过使其他的血管生成因子(例如VEGF)发挥功能而控制血管重构。
Ang2-Tie2系统在血管生成开关和肿瘤血管生成后期阶段中发挥至关重要的作用。在肿瘤相关的内皮中Ang2的表达强烈上调。当肿瘤植入Ang2缺陷小鼠，特别是在肿瘤生长的早期阶段植入时，已经观察到肿瘤生长降低。使用Ang2单克隆抗体治疗性阻断Ang2已经在各种肿瘤异种移植模型中显示出广泛的疗效。已经描述了Ang2单克隆抗体与VEGFR2抑制剂(单克隆抗体及小分子量抑制剂)的累加效应。
如US2008/0014196和WO2008/101985中所述，血管生成牵涉于包括实体瘤和转移瘤，以及眼部疾病的许多病症的发病机制中。一种最重要的促血管生成因子是血管内皮生长因子(VEGF)，也称为VEGF-A或血管通透因子(VPF)。VEGF属于包括以下基因的基因家族：胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和VEGF-F。单个人VEGF基因的mRNA选择性剪接产生至少6种同工型(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206)，其中VEGF165是丰度最高的同工型。
已经确定两种VEGF酪氨酸激酶受体(VEGFR)与VEGF相互作用，即VEGFR-1(也称为FLT-1)和VEGFR-2(也称为KDR或者FLK-1)。VEGFR-1具有最高的VEGF亲和力，而VEGFR-2则具有稍低的VEGF亲和力。Ferrara(EndocrineRev.2004，25：581-611)提供了VEGF的详细说明，在Hoeben等人，Pharmacol.Rev.2004，56：549-580中可以发现VEGF与其受体的相互作用以及其在正常和病理过程中的功能。
已经报道VEGF是正常及异常血管生成的一个关键的调节子(Ferrara和Davis-Smyth，EndocrineRev.1997，18：4-25；FerraraJ.MoLMed.1999，77：527-543)。与促进血管形成过程的其他生长因子相比，VEGF的独特之处在于对血管系统内的内皮细胞的高特异性。
大多数人类肿瘤过表达VEGFmRNA。在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人，1989，Nature339-58)，这使肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。这些治疗集中于阻断VEGF通路(Ferrara等人，NatRevDrugDiscov.2004年5月；3(5)：391-400)。
VEGF也涉及眼部疾病。眼液中VEGF浓度与糖尿病及其他缺血相关的视网膜病变患者中存在活跃的血管增生高度相关。此外，最近的研究已经证明在患者的脉络膜新生血管膜中VEGF的定位受年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响。在各种炎性病症中也观察到VEGF的上调。VEGF牵涉于类风湿性关节炎(一种血管生成在其中发挥重要作用的炎性疾病)的发病机制中。
VEGF及其在血管生成和不同过程中作用的阐明为治疗性干预提供了一个潜在的新靶点。阻断或阻碍VEGF受体酪氨酸激酶活化的小分子抑制了VEGF的功能，从而干扰VEGF受体信号转导通路(Schlaeppi和Wood，1999，CancerMetastasisRev.，18：473-481)。含有细菌或植物毒素的细胞毒性缀合物可以抑制VEGF对肿瘤血管生成的刺激作用。例如VEGF-DT385毒素缀合物(白喉毒素域融合或化学缀合到VEGF165)可有效地抑制肿瘤的体内生长。抑制肿瘤生长也可以通过由逆转录病毒递送Flk-1突变体或可溶性VEGF受体而实现。
已经开发出来VEGF中和抗体，如A4.6.1和MV833，以阻断VEGF与其受体的结合并已显示出临床前的抗肿瘤活性(Kim等人，Nature1993，362：841-844；FolkmanNat.Med.1995，1：27-31；Presta等人，CancerRes.1997，57：4593-4599；Kanai等人，Int.J.Cancer1998，77：933-936；Ferrara和AlitaloNat.Med.1999，5：1359-1364；320，340。治疗性抗VEGF方法试验的综述，参见Campochiaro和Hackett(Oncogene2003，22：6537-6548)。
大多数临床经验是应用A4.6.1，也称为贝伐珠单抗(bevacizumab)(；Genentech，SanFrancisco，CA)获得的。
WO2008/101985描述了结合VEGF的来自骆驼科动物的免疫球蛋白单一可变域(如本文所定义的VHH或“”)，以及它们在治疗以过度和/或病理性血管生成或新生血管形成为特征的病状及疾病中的用途。
本发明的一个目标在于提供用于人治疗的新的抗血管生成的结合分子。
本发明的另一个目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或症状的方法，其涉及使用和/或给予这些结合分子及含有这些结合分子的组合物。特别地，本发明的一个目标在于提供这样的药理学活性结合分子、组合物和/或方法，其相比于本领域中当前使用的和/或已知的药物、组合物和/或方法可提供优势。这些优势包括改良的治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利的性质(例如用于制造目的)，尤其与如上所述的常规抗体或其片段相比。
发明内容
根据第一方面，本发明提供了双特异性结合分子，优选双特异性免疫球蛋白，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体，其在单个分子中包含至少一种VEGF结合组分和至少一种Ang2结合组分。优选地，所述双特异性结合分子还包含血清白蛋白结合组分。
更具体地，本发明的双特异性结合分子基本上包含(i)特异性结合至少一个Ang2表位的Ang2结合组分，及(ii)至少特异性结合VEGF表位的VEGF结合组分，其中所述组分彼此连接的方式使得它们同时结合Ang2和VEGF，或者它们每次结合Ang2或VEGF两者之一。
根据本发明优选的方面，所述两种组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，所述可变域可彼此独立地为VHH或域抗体，和/或任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如如本文所定义的VL域，前提是这些免疫球蛋白单一可变域中的每一个分别结合抗原，即Ang2或VEGF。
根据一项优选实施方案，免疫球蛋白单一可变域是相同类型的，特别地，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH或域抗体。
根据一个特别优选的实施方案，所有免疫球蛋白单一可变域是VHH，优选人源化的(或如本文所定义的“序列最优化”的)VHH。因此，本发明涉及双特异性结合分子，其包含一个(任选地人源化的或序列最优化的)抗Ang2VHH和(任选地人源化的或序列最优化的)抗VEGFVHH。
然而，本领域技术人员将清楚本文的教导可以类似地应用于包含其他抗Ang2或抗VEGF的免疫球蛋白单一可变域(例如域抗体)的双特异性结合分子。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子的产品或组合物以及任选地含有或包含一种或多种其它组分的这样的组合物。
本发明还涉及制备或产生本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的方法。
本发明还涉及本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗可以通过抑制Ang2调节的疾病及病症的方法。
已经发现，与对Ang1或Ang4的结合效能相比，根据本发明的双特异性结合分子的Ang2结合组分以高至少5,000倍，优选高10,000倍的效能结合并拮抗Ang2。这将在很大程度上避免Ang1介导的信号转导活化的阻断，所述Ang1介导的信号转导活化的阻断会抵消预期的抗血管生成作用。
已进一步发现，与对VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PlGF的亲和力相比，根据本发明的双特异性结合分子的VEGF结合组分以高至少1,000倍，优选高至少5,000倍，更优选高至少10,000倍的亲和力结合VEGF-A。由于高度优先地结合VEGF-A，调节淋巴血管生成的VEGFR3信号转导不受干扰。
在一项优选实施方案中，本发明的双特异性结合分子以连接的VHH域提供。这样的分子显著地小于常规抗体，因此与常规抗体相比，具有更深地穿透肿瘤的能力。通过本文公开的特异性序列在去除糖基化位点后，进一步突出了该益处。
另外，由于双特异性的特性(VEGF和Ang2结合组分存在于一个分子中)，两种功能性(functionality)的肿瘤穿透必然相等，这将确保在穿透肿瘤的整个深度内提供VEGF和Ang2联合拮抗的有益效果。相比于针对这些靶点的单独拮抗剂的联合，这是一个优势，因为单独拮抗剂的穿透深度总在一定程度上有所不同。
本发明优选的双特异性结合分子的另一优势是由于血清白蛋白结合组分(例如本文所述的血清白蛋白结合分子)而增加血清半衰期等。
本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得清楚。
定义
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人，“MolecularCloning：ALaboratoryManual”(第2版)，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；Lewin，“GenesIV”，OxfordUniversityPress，NewYork，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，GowerMedicalPublishing，London，NewYork(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。还参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
术语“双特异性结合分子”是指包含至少一个Ang2结合分子(或“Ang2结合组分”)和至少一个VEGF结合分子(或“VEGF结合组分”)的分子。双特异性结合分子可含有多于一个Ang2结合分子和/或多于一个VEGF结合分子，即双特异性结合分子在结合Ang2或VEGF的分子部分，即在其“Ang2结合组分”(或抗Ang2组分)或“VEGF结合组分”(或抗VEGF组分)中，分别含有一个双互补位(定义见下文)Ang2结合分子和/或一个双互补位VEGF结合分子。然而在本文中术语“双特异性”并不解释为从双特异性结合分子中排除对VEGF和Ang2以外的分子具有结合特异性的其他结合组分。这样的其他结合组分的非限制性实例是结合血清白蛋白的结合组分。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在术语“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”等中的)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。
如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7条反平行β链的2层夹层(sandwich)组成。免疫球蛋白域包含可变域，即一个或多个免疫球蛋白可变域。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区被本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开来。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。在本发明的内容中，优选免疫球蛋白单一可变域样VHH和域抗体。
如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他可变的免疫球蛋白域配对的情况下特异性结合抗原表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的来自骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域与抗原的各别表位发生结合，而是通过共同结合各别抗原表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VH-VL对进行结合。
“VHH域”，也称为VHH、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC，AtarhouchT，MuyldermansS，RobinsonG，HamersC，SongaEB，BendahmanN，HamersR.：“Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains”；Nature363，446-448(1993))。已选择术语“VHH域”将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”或“VL域”)进行区分。VHH域可在无其他抗原结合域的情况下特异性结合表位(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及“”及“域”(“Nanobody”为比利时根特的AblynxN.V.公司的商标)可互换使用，且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，并且特异性结合表位而无需存在另一免疫球蛋白可变域)，且其由例如WO2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmarkresidue)”与VH域区分。
如例如Riechmann及Muyldermans，J.Immunol.Methods231，25-38(1999)的图2中所示，适用于骆驼科的VHH域，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”，USPublicHealthServices，NIHBethesda，MD，公开案第91号)来编号免疫球蛋白单一可变域(如VHH)的氨基酸残基。根据该编号法，
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而应注意，如本领域中对于VH域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号法所指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号法的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号法所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
对VH域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110-120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意更小及更长序列也可适于本文所述的目的。
免疫球蛋白单一可变域，例如根据本发明优选实施方案的VHH及域抗体具有大量使其高度有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其本质上被“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。
由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHH或VH(或VL)，无论是单独存在还是作为更大多肽(例如双互补位分子)的一部分，均提供许多显著优点：
·仅需要单一域以高亲和力及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的接头，如scFv的接头)；
·免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；
·免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；
·免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和力，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；
·免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；
·免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域可使用微生物发酵(例如下文进一步描述的)产生，且不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；
·相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相对较小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示(更)高的组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)穿透性，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；
·VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(cavity-bindingproperties)(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其CDR3环更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位；
·VHH具有高度可溶性和极其稳定且具有不趋于聚集的特别优势(如同由Ward等人，Nature341：544-546(1989)所述的小鼠源抗原结合域)。
本发明的免疫球蛋白单一可变域，其获得的具体生物来源或具体制备方法不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：
(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；
(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
(3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人源化”(如本文所述的)，或表达编码这类人源化VHH的核酸；
(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码这类骆驼化域的核酸分子；
(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；
(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；
(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；
(8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和力和/或特异性；和/或
(9)组合或选择上述步骤。
适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。举例而言，获得结合特异性抗原或表位的VHH域的方法已经在WO2006/040153和WO2006/122786中描述。
根据具体实施方案，本发明的或存在于本发明的多肽中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已经“人源化”或“序列最优化”(任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。
人源化的VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个进一步更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或与其高度同源，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。因此，人源化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP47、DP29及DP51)的相应框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如WO2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。实例为在约位置44-47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人源化对应物。人源化VHH域可包含一个或多个完全的人框架区序列。
例如，属于103P，R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH的人源化人源化置换是将108Q置换成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。
在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的结合免疫球蛋白单一可变域，可通过如下本领域中已知的技术而从各别的结合分子获得：亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的术语“序列最优化”。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。
适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和力增加的结合分子，就亲和力成熟分子而言所述另一结合分子表示“亲本”结合分子。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如WO2006/040153及WO2006/122786中。如其中所详述的，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基经“人源化”(本文中也称为“序列最优化”，除人源化外，“序列最优化”可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一进一步更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。
域抗体，也称为“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(DomainAntibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已描述于例如以下文献中：Ward，E.S.，等人：“BindingactivitiesofarepertoireofsingleimmunoglobulinvariabledomainssecretedfromEscherichiacoli”；Nature341：544-546(1989)；Holt，L.J.等人：“Domainantibodies：proteinsfortherapy”；TRENDSinBiotechnology21(11)：484-490(2003)；及WO2003/002609。
域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
域抗体如VHH的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。用于这种CDR移植的适合支架及技术在本领域中是已知的。
可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。
可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和力”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域、或一般而言抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为对于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，VEGF结合组分也可称为“VEGF中和组分”。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。抗原结合分子的特异性可基于其亲和力和/或亲抗原性(avidity)来测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以本身已知方式测定亲和力。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有免疫球蛋白单一可变域的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者均有关：表位与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。
除非另有说明，否则术语“VEGF结合分子”或“Ang2结合分子”包括如本文定义的抗VEGF或抗Ang2抗体、抗VEGF抗体或抗Ang2抗体片段、“抗VEGF抗体样分子”或“抗Ang2抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如描述于WO2002/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)；抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
“Ang2结合分子”或“VEGF结合分子”分别是指以下两者：单价靶结合分子(即与各自靶点的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子，例如如下文定义的“双互补位”分子)。含有一个以上Ang2(或VEGF)结合免疫球蛋白单一可变域的Ang2(或VEGF)结合分子亦称为“形式化(formatted)”结合分子，其在靶结合组分内除免疫球蛋白单一可变域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或连接聚合物(如PEG)。
如本文所用的术语“双互补位Ang2(或VEGF)结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的结合分子，其中所述两个分子结合各自抗原的两个非重叠表位。双互补位结合分子由对于表位具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。抗原结合分子(例如抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)识别表位的部分称为互补位。
即使是次优选的形式化结合分子，也包含识别相同或重叠表位或其各自抗原的两个相同的免疫球蛋白单一可变域或两个不同的免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，就VEGF而言，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成VEGF二聚体的两个单体中每一单体的相同或重叠表位结合。
通常，本发明的结合分子将以如例如于Biacore或Kinexa分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且进一步更优选10E-11至10E-13的解离常数(KD)结合，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(KA)结合。任何大于10E-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合所要结合的抗原(即VEGF或VEGF)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchardanalysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwichcompetitionassay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或单字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在该参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或置换。在置换的情况下，所述置换将优选为保守氨基酸置换，所述保守氨基酸置换是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物学性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸置换在本领域中是公知的，例如根据WO1998/49185，其中保守氨基酸置换优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所置换：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸置换如下：Ala被Gly或Ser置换；Arg被Lys置换；Asn被Gln或His置换；Asp被Glu置换；Cys被Ser置换；Gln被Asn置换；Glu被Asp置换；Gly被Ala或Pro置换；His被Asn或Gln置换；Ile被Leu或Val置换；Leu被Ile或Val置换；Lys被Arg、Gln或Glu置换；Met被Leu、Tyr或Ile置换；Phe被Met、Leu或Tyr置换；Ser被Thr置换；Thr被Ser置换；Trp被Tyr置换；Tyr被Trp或Phe置换；Val被Ile或Leu置换。
例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，当多肽或核酸分子已与至少一种在该来源或介质(培养基)中通常与之相关的其他组分分离时，其被视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合的色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为同质的。
两个VEGF结合分子序列之间或两个Ang2结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO2008/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同氨基酸或表示保守氨基酸置换的氨基酸的百分比。
对VH域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号法。
“亲和力成熟”的VEGF结合分子或Ang2结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对VEGF或Ang2的亲和力相比于其各自的亲本VEGF结合分子或Ang2结合分子有所增加。本发明亲和力成熟的VEGF结合分子或Ang2结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene169：147-155；Yelton等人，1995，Immuno1.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KSJohnson及REHawkins，“Affinitymaturationofantibodiesusingphagedisplay”，OxfordUniversityPress1996。
对于本发明，除非另有说明，则“SEQIDNO：x的氨基酸序列”包括与各自SEQIDNO：x中所显示的序列100％一致的氨基酸序列；
a)与各自SEQIDNO：x中所示序列具有至少80％氨基酸一致度的氨基酸序列；
b)与各自SEQIDNO：x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的双特异性结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。US2008/0014196中建议用VEGF拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非赘生性症状及赘生性症状两者。赘生性病症包括但不限于上述病症。
非赘生性病症包括但不限于如US2008/0014196中所述用VEGF拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增殖性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolentalfibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocularneovasculardisease))、血管再狭窄(vascularrestenosis)、动静脉畸形(arteriovenousmalformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave′sdisease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primarypulmonaryhypertension)、恶性肺积液(malignantpulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closedheadinjury)/外伤相关)、滑液炎症、类风湿性关节炎中的血管翳形成(pannusformationinRA)、骨化性肌炎(myositisossificans)、肥大性骨形成(hypertropicboneformation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycysticovariandisease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rdspacingoffluiddisease)(胰腺炎、间隔综合征(compartmentsyndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn′sdisease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilicjoint)、肥厚性瘢痕(hypertrophicscar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Webersyndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenicgranulomaretrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascularadhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardialeffusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleuraleffusion)。
发明详述
在第一方面中，本发明涉及包含至少一个Ang2结合组分和至少一个VEGF结合组分的双特异性结合分子。
在一项优选实施方案中，本发明涉及包含至少一个VEGF结合组分和至少一个Ang2结合组分的双特异性结合分子，其还包含至少一个其他结合组分，优选血清白蛋白结合组分(血清白蛋白结合分子)。
在一项优选实施方案中，本发明的结合分子的血清白蛋白结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO：257、260、263、266、269、272或275所示氨基酸序列的氨基酸序列。
更优选地，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域包含：
a.CDR3，其具有选自SEQIDNO：257、260、263、266、269、272或275所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
b.CDR1，其具有选自SEQIDNO：255、258、261、264、267、270或273所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列；
c.CDR2，其具有选自SEQIDNO：256、259、262、265、268、271或274所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列。
在一项更优选实施方案中，所述血清白蛋白结合组分的一个或多个免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQIDNO：98或254所示的氨基酸序列。
根据一项优选实施方案，所述Ang2结合组分和所述VEGF结合组分分别包含至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域。
在一个优选方面中，所述Ang2结合组分和所述VEGF结合组分各分别包含至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域和至少一个Ang2结合免疫球蛋白单一可变域，其中每一个所述免疫球蛋白单一可变域具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区。
因此，包含于本发明的双特异性结合分子中的抗Ang2和/或抗VEGF组分可包含两个或多个分别为抗Ang2或抗VEGF的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域针对Ang2(或VEGF)靶点内的不同表位。因此，双特异性结合分子中的两个免疫球蛋白单一可变域具有不同的抗原特异性，且因此具有不同CDR序列。
因为两个免疫球蛋白单一可变域包含两个不同互补位，也分别将这样的二价结合分子命名为“双互补位单域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)，或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
在本发明的双特异性结合分子中，一个或两个结合分子可以为二价；例如VEGF结合组分可为双互补位而Ang2结合组分可为免疫球蛋白单一可变域，或者VEGF结合组分可为免疫球蛋白单一可变域而Ang2结合组分可为双互补位。
在本发明的双特异性结合分子中，优选包含二价VEGF结合免疫球蛋白单一可变域的VEGF结合组分，例如双互补位VHH。
这种VEGF结合免疫球蛋白单可变域可以是两个或多个VEGF-结合VHH，其为
a.能够以≥60％的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同的VHH，或
b.结合VEGF非重叠表位的不同的VHH，其中至少一个VHH能够以≥60％的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用，并且其中至少一个VHH能够以≤60％的抑制率阻断所述相互作用。
VEGF结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列SerArgAlaTyrXaaSerXaaArgLeuArgLeuXaaXaaThrTyrXaaTyr，其中
位置5的Xaa为Gly或Ala；
位置7的Xaa为Ser或Gly；
位置12的Xaa为Gly，Ala或Pro；
位置13的Xaa为Asp或Gly；
位置16的Xaa为Asp或Glu；且
其中所述VEGF结合组分能够以≥60％的抑制率阻断重组人VEGF165与重组人VEGFR-2之间相互作用。
根据一项优选实施方案，位置5的Xaa为Gly，位置7的Xaa为Ser，位置12的Xaa为Ala，和位置13的Xaa为Asp。
特别地，所述CDR3具有选自下述的序列：
SEQIDNO：2SRAYGSSRLRLGDTYDY，
SEQIDNO：3SRAYGSSRLRLADTYDY；
SEQIDNO：4SRAYGSSRLRLADTYEY；
SEQIDNO：5SRAYGSGRLRLADTYDY；
SEQIDNO：6SRAYASSRLRLADTYDY；
SEQIDNO：7SRAYGSSRLRLPDTYDY；
SEQIDNO：8SRAYGSSRLRLPGTYDY。
根据某些实施方案，VEGF结合组分包含一个或多个免疫球蛋白单一可变域，每个免疫球蛋白单一可变域包含：
a.CDR3，其具有选自SEQIDNO：2-8所示的第一组序列的氨基酸序列；
b.CDR1及CDR2，其具有如表3所示的包含于选自SEQIDNO：9-46所示的第二组氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述第二组序列包含根据a)所选择的各别CDR3。
根据一项优选实施方案，免疫球蛋白单一可变域为VHH。
根据特定的实施方案，所述VHH具有选自如SEQIDNO：9-46所示序列的氨基酸序列。
根据另一特定的实施方案，所述VHH具有选自SEQIDNO：15、SEQIDNO：18和SEQIDNO：25的氨基酸序列。
本发明也涉及通过使上面定义的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VEGF结合组分，例如涉及通过使具有如SEQIDNO：18所示氨基酸序列的VHH序列最优化而获得的VHH。实例为具有选自如SEQIDNO：47-57所示序列的氨基酸序列的VHH。
根据某些实施方案，本发明的VEGF结合域可以是形式化的，如本文所定义，如可以是双互补位或包含两个相同的免疫球蛋白单一可变域。这样的VEGF结合组分可以包含两个或多个VHH，其为
a.能够以≥60％的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同的VHH，或
b.结合VEGF非重叠表位的不同的VHH，其中至少一个VHH能够以≥60％的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用，并且其中至少一个VHH能够以≤60％的抑制率阻断所述相互作用。
以≥60％或≤60抑制百分比率阻断所述相互作用，该百分比分别是指通过如实施例中使用的光激化学发光免疫分析(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay竞争性ELISA、或基于等离子体共振(SPR)的分析测定的抑制率。
在下文中，根据a)的VHH的能力也称为“受体阻断”，而根据b)的VHH的能力也称为“非受体阻断”。
优选地，所述受体阻断VHH具有≥80％的抑制率，更优选抑制率≥90％，最优选地VHH为完全受体阻断剂，即具有100％的抑制率。
VEGF结合组分可包含两个或多个选自具有如SEQIDNO：9-46所示的氨基酸序列的相同的VHHa)或通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。VHH可以选自具有如SEQIDNO：18或SEQIDNO：47-57所示氨基酸序列的VHH。
根据优选实施方案，形式化的VEGF结合组分包含两个VHH，每个具有如SEQIDNO：57所示的氨基酸序列。
在包含两个不同VHH的形式化的VEGF结合组分中
a)所述具有≥60抑制百分比率的一个或多个VHH选自
i.具有选自如SEQIDNO：9-46所示氨基酸序列的氨基酸序列的VHH，或
ii.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH，并且其中
b)所述具有≤60抑制百分比率的一个或多个VHH选自
i.SEQIDNO：58-124，或
ii.通过使这样的VHH亲和力成熟和/或序列最优化而获得的VHH。
根据优选实施方案，两个VHH包含于具有如SEQIDNO：128-168所示氨基酸序列中，其由表15所示的连接序列分隔开来。
在优选的VEGF结合组分中，VHHa)i.具有如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，且VHHb)i.具有如SEQIDNO：64所示的氨基酸序列。
在其他优选的VEGF结合组分中，根据a)ii.的VHH选自具有如SEQIDNO：47-57所示的氨基酸序列的VHH，且根据b)ii.的VHH选自具有如SEQIDNO：125-127所示的氨基酸序列的VHH。
包含两个VHH的双互补位VEGF结合组分是特别优选的，所述两个VHH中一个具有如SEQIDNO：57所示的氨基酸序列和一个具有如SEQIDNO：127所示的氨基酸序列。
Ang2结合组分至少包含具有四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区的可变域，其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
在第二方面中，该Ang2结合组分是分离的免疫球蛋白单一可变域或包含一个或多个所述免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域由四个框架区和三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区组成，且其中所述CDR3具有选自如SEQIDNO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一方面中，该Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域包含：
a.CDR3，其具有选自SEQIDNO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253(也见表49)所示的第一组氨基酸序列的氨基酸序列；
b.CDR1，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO：224、227、230、233、236、239、242、245、248或251(也见表49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列；
c.CDR2，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所示的作为部分序列包含于选自SEQIDNO：225、228、231、234、237、240、243、246、249或252(也见表49)所示的第二组氨基酸序列的序列中的氨基酸序列。
优选地，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域为VHH，优选具有选自如SEQIDNO：214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示氨基酸序列的氨基酸序列。
在另一优选实施方案中，Ang2结合组分的免疫球蛋白单一可变域是通过使本文所述的免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟或人源化而获得。
类似地，本发明也涉及Ang2结合VHH，其通过使本文所述的Ang2结合组分的VHH的亲和力成熟或人源化而获得。
因此本发明也涉及具有选自SEQIDNO：214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示氨基酸序列的氨基酸序列的Ang2结合VHH。
举例而言，适于亲和力成熟的亲本Ang2结合组分为上述具有SEQIDNO：214、215、216、217、218或219所示氨基酸序列的VHH。
因此，本发明也涉及Ang2结合分子，其通过上述定义的VHH的亲和力成熟和/或序列最优化而获得，例如涉及通过使具有SEQIDNO：217、218、219、220、221、222或223所示氨基酸序列的VHH的序列最优化而获得的VHH。用于产生后者VHH的“源”氨基酸序列示于SEQIDNO：214、215或216。这些氨基酸序列也是可应用于本发明的结合分子的适合的Ang2结合组分。
如本文所述，本发明的结合分子优选包含至少一个血清白蛋白结合组分。因此，特别优选的结合分子具有至少一个VEGF结合组分，至少一个Ang2结合组分和至少一个血清白蛋白结合组分。该三个结合组分的顺序可以是任何可能的顺序，例如表36-B、38-B、40、41-B、42、43、45-B、46-A或47-A、或图20、23、27或30所示的顺序，例如，VEGF、Ang2或血清白蛋白结合组分可以是N-末端或C-末端。值得注意的是，前述的表及图的图例中提及的“1D01”(SEQIDNO：214)、“11B07”、“00027”(SEQIDNo：216)、“00908”、“7G08”(SEQIDNo：215)、“00919”、“00921”(SEQIDNO：220)、“00928”(SEQIDNo：221)、“00932”、“00933”、“00934”、“00935”、“00936”、“00937”、“00938”(SEQIDNo：222)，或“00956”(SEQIDNo：223)代表Ang2结合组分，而“00038”代表VEGF结合组分且“ALB11”代表血清白蛋白结合组分。它们中任何一个都不解释为特定的序列，而是当用于本发明的结合分子可能的构造(set-up)时通常代表Ang2、VEGF和血清白蛋白结合组分。
然而，优选血清白蛋白结合组分在VEGF结合组分和Ang2结合组分之间(或反之)，而且特别优选至少一个VEGF结合组分是N-末端，后接至少一个血清白蛋白结合组分，再接至少一个Ang2结合组分在C-末端。已显示这种安排是特别有效的。
因此，在一个优选的方面，本发明涉及结合分子，其包含至少一个VEGF结合组分，至少一个Ang2结合组分和至少一个具有选自SEQIDNO：180-213所示的氨基酸序列的氨基酸序列的血清白蛋白结合组分。
在本文中使用时，“至少一个”结合组分(VEGF、Ang2或血清白蛋白)的情形包括：本发明的结合分子可包含一个、两个、三个、四个或五个VEGF结合组分、Ang2结合组分和/或血清白蛋白结合组分(即实体/单元)，其优选由如本文所述的免疫球蛋白单一可变域所表示。
在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和力或降低的免疫原性)的VEGF和/或Ang2结合组分，可通过本领域中已知的技术而从本发明单个的VEGF或Ang2结合组分获得，所述技术例如亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述技术的任何适合组合，也称为如本文所述的“序列最优化”。例如参考标准手册以及其他描述及实施例。
适当时，可通过使另一VEGF或Ang2结合组分亲和力成熟来获得亲和力增加的本发明的VEGF或Ang2结合组分，就亲和力成熟分子而言所述另一结合组分表示“亲本”VEGF结合组分。
在以EVQ起始的本发明的VEGF或Ang2VHH中，N-末端E可以由D置换(通常是序列最优化的结果)或可以缺失(如在大肠杆菌中VHH的表达)。对于形式化的VEGF结合组分，这通常仅适用于位于N-末端的VHH。
对于属于103P，R，S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VEGFVHH域，一种优选但非限制性的人源化置换是将108Q置换成108L。使免疫球蛋白单一可变域人源化的方法在本领域中是已知的。
根据另一实施方案，免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。
在另一实施方案中，本发明的代表性种类的VEGF和/或Ang2结合免疫球蛋白单一可变域VEGF具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在的可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO1994/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓的骆驼科印记残基处(也参见例如WO1994/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。
本发明的VEGF结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)对VEGF具有特异性，因为其包含与VEGF分子内的一个或多个表位分别特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。对于本发明的Ang2结合组分同样如此。
VEGF结合组分对其抗原VEGF的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。当与其抗原结合时，对于Ang2结合组分同样如此。
关于抗原VEGF，本发明的VEGF结合组分(例如免疫球蛋白单一可变域)在物种方面不受限制。因此，若欲用于人的治疗目的，则本发明的免疫球蛋白单一可变域优选结合至人VEGF。然而，结合至另一哺乳动物物种的VEGF的免疫球蛋白单一可变域也在本发明的范围内。与一个物种的VEGF结合的本发明的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个与人VEGF相比具有不同序列的其他物种的VEGF发生交叉反应。例如，结合人VEGF的本发明的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的VEGF和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于与VEGF介导的血管生成作用相关的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的VEGF的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物开发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。
优选地，对于与除人以外的物种(欲在治疗性VEGF拮抗剂的开发期间将该物种用作动物模型)的一种或多种VEGF分子的交叉反应性，VEGF结合组分识别目标VEGF区域中与人VEGF具有高一致度的表位。
本发明的免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于VEGF区域的表位，该VEGF区域与结合其受体、特别是结合VEGFR2(已经表明其活化是肿瘤新生血管形成的原因)相关。根据优选方面，本发明免疫球蛋白单一可变域至少部分地、优选基本上和最优选完全地阻断VEGF受体活化，特别是VEGFR2活化。
如上文所述，可以通过如实施例中描述的光激化学发光免疫分析(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)、竞争性ELISA、或基于等离子体共振(SPR)的分析来测定VEGF结合组分阻断VEGF及其受体(特别是VEGFR2)之间相互作用的能力。
优选地，本发明的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM(如实施例5.7中所述的通过表面等离子共振分析所测定)的亲和力结合VEGF。对于本发明的结合血管生成素的免疫球蛋白单一可变域同样如此。
优选地，如竞争性ELISA分析(如实施例5.1.中所述)中所测得，本发明的免疫球蛋白单一可变域具有的IC50值在10-6至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内，更优选在10-8至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内、且进一步更优选在10-9至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内。
根据本发明的一非限制性但优选的实施方案，本发明的VEGF结合免疫球蛋白单一可变域以10-5至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且优选10-7至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且更优选10-8至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下的解离常数(KD)，和/或以至少107M-1、优选至少108M-1、更优选至少109M-1，例如至少1012M-1的缔合常数(KA)；且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对VEGF的KD及KA值。对于本发明的Ang2结合免疫球蛋白单一可变域同样如此。
包含两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域的双互补位VEGF结合组分基本上由以下组成或包含以下：(i)特异性结合VEGF的第一表位的第一免疫球蛋白单一可变域及(ii)特异性结合VEGF的第二表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中VEGF的该第一表位及VEGF的该第二表位不为同一表位。换言之，本发明的该多肽包含以下或基本上由以下组成：两个或两个以上针对存在于VEGF中的至少两个非重叠表位的免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域以能够同时结合VEGF的方式彼此连接。在此意义中，本发明的多肽也可视为“二价”或“多价”免疫球蛋白构建体(construct)，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为该多肽含有至少两个VEGF结合位点。(这样的构建体也称为“形式化的”VEGF结合分子，例如“形式化的”VHH)。对于双互补位Ang2结合组分同样如此，除必要的变通之外。
本发明的该VEGF或Ang2结合组分分别包括(至少)两个抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，其中(该)两个免疫球蛋白单一可变域优选分别针对VEGF分子或血管生成素分子内的非重叠表位。因此，这两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同CDR序列。为此，由于所述两个免疫球蛋白单一可变域包括两个不同互补位，本发明的这些多肽在本文中也分别称为“双互补位多肽”、或“双互补位域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由域抗体组成)或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
如果本发明的多肽是如本文定义的双互补位分子，所述免疫球蛋白单一可变域的组分中的至少一个结合表位从而使得重组人VEGF与重组人VEGFR2之间的相互作用以≥80％的抑制率被阻断。如本发明的实验中所示，某些形式化的分子包含两个均以≥80％的抑制率阻断VEGFR2受体的VHH。本发明的某些VHH以100抑制百分比率阻断VEGFR2，即它们是完全阻断剂。
在这两种情况下，其他序列和部分可以存在于本发明的VEGF结合组分中，例如在N-末端、C-末端或位于两个免疫球蛋白单一可变域之间，例如连接序列和提供效应子功能的序列，如本文更详细述及的。
根据另一个但较不优选的实施方案，本发明的VEGF结合组分可包括多于两个抗VEGF免疫球蛋白单一可变域，即三个、四个或甚至四个以上抗VEGFVHH。在此情况下，至少两个所述抗VEGF免疫球蛋白单一可变域针对VEGF分子内的非重叠表位，其中任何另一免疫球蛋白单一可变域可结合存在于VEGF分子中的这两个非重叠表位的任一个和/或其他表位。
根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为VHH或域抗体，和/或如本文定义的任何其它种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，条件是这些免疫球蛋白单一可变域将分别结合抗原(即VEGF或血管生成素)。
本发明主要对于VEGF结合组分提供结合组分的详细描述。然而，本文对于VEGF结合组分所概述的全部特征和选项同样应用于Ang2结合组分，除必要的变通之外。
根据优选实施方案，存在于双特异性结合分子中的结合分子(Ang2结合组分中的Ang2结合分子或VEGF结合组分中的VEGF结合分子或两个相邻的Ang2结合组分和VEGF结合组分)可彼此直接连接(即不使用接头)或通过接头连接。接头优选为连接肽且将经选择以允许两个不同的结合分子与靶点的每个非重叠表位结合，无论位于一个相同靶点分子中，或位于两个不同分子中。
对于双互补位结合分子，Ang2结合组分或VEGF结合组分内接头的选择将尤其取决于表位，且具体地取决于免疫球蛋白单一可变域所结合靶点上的表位之间的距离，且本领域技术人员基于本文公开的内容，任选在某些有限程度的常规实验之后将了解此选择。
两个结合分子(两个VHH或两个域抗体，或一个VHH和一个域抗体)或两个结合组分可分别通过另一VHH或域抗体而彼此连接(在这些结合分子中，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合接头连接至所述另一免疫球蛋白单一可变域)。所述另一VHH或域抗体可例如为提供增加的半衰期的VHH或域抗体。例如，后者的VHH或域抗体可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白(transferrin)的VHH或域抗体。
或者，结合各自靶点的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可(直接或通过适合接头)串联连接，且所述另一VHH或域抗体(其可提供增加的半衰期)可直接或通过接头连接至上述两个或两个以上免疫球蛋白序列之一。
本文中也描述了与本发明的具体多肽相关、并且例如但不限于包含一定氨基酸序列的合适的接头，所述氨基酸序列长度优选为9个或9个以上氨基酸、更优选为至少17个氨基酸，例如约20-40个氨基酸。然而，上限并不关键，该上限是由于与例如这些多肽的生物医药生产的便利性的相关的原因而选择的。
连接序列可为天然存在序列或非天然存在序列。若用于治疗目的，则在给予受试者的本发明的双特异性结合分子中所述接头优选为非免疫原性的。
一组适用的连接序列为如WO1996/34103及WO1994/04678中所述源自重链抗体铰链区的接头。
其他实例为聚丙氨酸连接序列，例如Ala-Ala-Ala。
连接序列的其他优选实例为不同长度的Gly/Ser接头，例如(glyxsery)z接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。
包含于本发明的双特异性结合分子中的接头的一些非限制性实例显示于表15(SEQIDNO128-168)中，例如以下接头：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS；SEQIDNO：169)；
GGGGSGGGS(9GS；SEQIDNO：170)；
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS；SEQIDNO：171).
若本发明形式化的双特异性结合分子通过聚合物例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分的连接进行修饰，则连接序列优选包括允许连接区域中的此修饰(例如聚乙二醇化)的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸。
适用于聚乙二醇化的接头的实例为：
GGGGCGGGS(“GS9，C5”，SEQIDNO：172)；
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25，C5”，SEQIDNO：173)
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(“GS27，C14”，SEQIDNO：174)，
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35，C15”，SEQIDNO：175)，和
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35，C5”，SEQIDNO：176)。
此外，接头也可为例如于WO2004/081026中所示的聚(乙二醇)部分。
在另一实施方案中，免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个接头)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一项优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。
根据一项优选实施方案，尤其在欲使用或用作治疗剂时，本发明的双特异性结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50％所花费的时间。
更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合至免疫球蛋白单一可变域且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。
在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(fibrinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。根据一项特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。
若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人源化白蛋白结合VHH域。
结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO2006/122786中。具体地，适用的白蛋白结合VHH为ALB1及其人源化对应物ALB8(WO2009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开中提及的其他白蛋白结合VHH域。
具体适用的白蛋白结合VHH域为由SEQIDNO：98或254所示的氨基酸序列组成的或含有该氨基酸序列的ALB8。
根据本发明的另一实施方案，优选呈VHH形式的两个免疫球蛋白单一可变域可融合至血清白蛋白分子，如例如WO2001/79271及WO2003/59934中所述。如例如WO2001/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得：将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码双特异性结合分子的DNA，将所得构建体插入适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适条件下生长。适用的HSA的序列如SEQIDNO：99中所示。
根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman，Nat.Biotechnol.，54，531-545(2002)；Veronese及Harris，Adv.DrugDeliv.Rev.54，453-456(2003)；Harris及Chess，Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO2004/060965。
用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics，USA或NOFCorporation，Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。
优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人，ProteinEngineering16，761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。
优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa-80kDa范围内。
关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双特异性结合分子，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对其靶点的亲和力(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和力降低50％以上、且更优选不使之降低10％以上)；和/或(5)不影响本发明的双特异性结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG群组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售，例如可从NektarTherapeutics，USA或NOFCorporation，Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。
根据本发明的一项尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有分子量为40kDa或60kDa的线型PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQIDNO：93中所示的GS9连接肽的5位处、在如SEQIDNO：95中所示的GS27连接肽的14位处、或在如SEQIDNO：96中所示的GS35连接肽的15位处、或在如SEQIDNO：97中所示的35GS连接肽的5位处的Cys残基处连接至所述多肽。
如以下化学式中所示，本发明的双特异性结合分子可经如上提及的PEG试剂之一(例如“ME-400MA”)来聚乙二醇化：
含有接头和/或半衰期延长官能团的双特异性结合分子显示于SEQIDNO：81及图48中。
根据另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。
存在于本发明的双特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域的序列也可具有对应于已经“骆驼化”的天然存在VH域的氨基酸序列的序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO1994/04678。这种骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也参见例如WO1994/04678)。这些“人源化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。
所述结合组分分别对Ang2或VEGF具有特异性，因为在一项优选实施方案中其包含分别与Ang2分子内或VEGF分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。
结合组分对其抗原Ang2或VEGF的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。
关于抗原Ang2或VEGF，免疫球蛋白单一可变域在物种方面分别不受限制。因此，若欲用于人中的治疗目的，则免疫球蛋白单一可变域优选分别结合人Ang2或人VEGF。然而，分别结合另一哺乳动物物种的Ang2或VEGF的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种形式的Ang2或VEGF结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反应。例如，结合人抗原的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的各别抗原和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于可通过抑制Ang2而调节的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的抗原的交叉反应性。表现这种交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。
此外，所述结合组分不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇或不由其所针对的抗原的特定域或抗原决定簇限定。优选地，对于与除人以外的物种(其欲在治疗性Ang2/VEGF拮抗剂的研发期间将其用作动物模型)的一种或多种抗原分子的交叉反应性，结合组分识别与人抗原具有高一致度的各别抗原的区域中的表位。举例而言，对于使用小鼠模型，本发明的双特异性结合分子中含有的抗Ang2免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于Ang2的FLD域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示较高的一致度。
优选地，VEGF结合组分结合VEGF同工型VEGF165和/或VEGF121。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸分子。这些核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子用途(codonusage)的DNA)。根据本发明的一项实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。
本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供双特异性结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的调控组件(例如启动子、增强子、终止子等)。这些组件及其鉴于特测序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明双特异性结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integrationfactor)、选择标记物、前导序列、报告基因等公开于例如WO2006/040153的第131-133页。
本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的双特异性结合分子和/或含有本发明的核酸的宿主细胞。根据一项特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本发明还提供制造本发明的双特异性结合分子的方法，这些方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本发明的双特异性结合分子的条件下培养包含能够编码双特异性结合分子的核酸的宿主细胞；及
-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；及
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的双特异性结合分子。
对于工业规模生产而言，优选的宿主有机体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模医药表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。
具体表达系统的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的双特异性结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。
本发明的双特异性结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusionbody)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
在另一方面中，本发明涉及具有包含于抗VEGF-VHH的CDR3的氨基酸序列的肽及编码该肽的核酸分子，其中所述氨基酸序列分别选自SEQIDNO：9-57或SEQIDNO：58-127所示的序列。
这些肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。这些肽，特别是编码这些肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、双硫桥式肽(disulfide-bridgedpeptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人源化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv框架上)。
为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人，1991，NucleicAcidsResearch，第19卷，9，2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHHCDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人，2004，ProteinScience，13，1882-1891公开。
本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子及任选的这些组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。
对于药物用途而言，本发明的双特异性结合分子可调配成药物制剂或组合物，其包含至少一种本发明的双特异性结合分子及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他药物活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类调配物可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴剂、植入物、栓剂等给药的形式。合适的给药形式(取决于给药方式，可为固体、半固体或液体)及用于其制备的方法及载体将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。
因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种双特异性结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域，及至少一种适合的载体、稀释剂或赋形剂(即适于药物用途)及任选一种或多种其他活性物质。
本发明的双特异性结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO2004/041862、WO2004/041863、WO2004/041865、WO2004/041867及WO2008/020079，以及标准手册，例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版，MackPublishingCompany,USA(1990)；Remington，theScienceandPracticeofPharmacy,第21版，LippincottWilliamsandWilkins(2005)；或theHandbookofTherapeuticAntibodies(S.Dubel编)，Wiley,Weinheim，2007(参见例如第252-255页)。
例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他药物活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。这些调配物及制备这些调配物的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。
用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于这些制剂的载体或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及医药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′ssolution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank′ssolution)；含水油(wateroil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。
因此，本发明的双特异性结合分子可组合药学上可接受的媒介物(例如惰性稀释剂或可吸收食用载体)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的双特异性结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔片、含片、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这些组合物及制剂应含有至少0.1％的本发明的结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2％与约60％之间。本发明的双特异性结合分子在用于这些治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。
所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO2008/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的双特异性结合分子可并入持续释放制剂及装置中。
用于口服给药的制剂及调配物也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及调配物可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。
如WO2008/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的双特异性结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。
对于本发明的双特异性结合分子的局部给药而言，如WO2008/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载体(其可为固体或液体)组合而以组合物或调配物形式给予皮肤。
一般而言，本发明的双特异性结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量％、优选约0.5-10重量％。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量％、优选约0.5-2.5重量％。
本发明的双特异性结合分子的治疗中需要的量不仅依所选特定结合分子变化，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。
所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。
给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由本领域的一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington′sPharmaceuticalSciences(Martin，E.W.第4版)，MackPublishingCo.，Easton，PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。
根据另一实施方案，本发明涉及双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)用于治疗目的的用途，例如
-尤其在人中用于预防、治疗和/或减轻与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用有关或可通过用本发明的双特异性结合分子调节Notch信号转导通路和/或Tie2信号转导通路来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，
-用于需要此治疗的患者的治疗方法中，该方法包括给予有此需要的个体药物活性量的至少一种本发明的双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述本发明的双特异性结合分子的药物组合物；
-用于制备预防、治疗或减轻与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用相关的病症、疾病或症状的药物；
-作为用于以上目的的药物组合物或药物中的活性成分。
根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。
根据另一方面，该疾病为与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用相关或可通过用双特异性结合分子调节Notch信号转导通路来治疗或减轻的眼病。
视欲治疗的癌性疾病而定，本发明的双特异性结合分子可单独或组合一种或多种特别是选自以下的其他治疗剂加以使用：化学治疗剂(如DNA损伤剂)，或抑制癌细胞中血管生成、信号转导通路或有丝分裂检查点(mitoticcheckpoint)的治疗活性化合物。
其他治疗剂可任选作为同一药物制剂的组分与双特异性结合分子的给药同时给予、或在该结合分子的给药之前或之后给予。
在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为，而不限于(且在受体的情况下，包括各自的配体)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。
其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcrabl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehogantagonist)；JAK/STAT、MEK、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号转导的抑制剂或泛素化(ubiquitination)通路的抑制剂或Notch信号转导通路的另一抑制剂。
Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。
PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。
raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL281。
KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。
src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。
PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。
Rho抑制剂的一个实例为BA-210。
PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL765(也为mTor抑制剂)。
cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。
c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。
Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。
HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF2024。
JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。
MEK抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL518。
mTor抑制剂的实例为替西罗莫司(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。
Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。
cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。
刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。
CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG024322。
蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。
NFκB通路抑制剂的一个实例为NPI-0052。
泛素化通路抑制剂的一个实例为HBX-41108。
在优选实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。
抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各自配体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐珠单抗贝伐珠单抗(bevacizumab))、EGFL7抑制剂，例如抗EGFL7MAb，血管生成素1/2抑制剂如AMG386及沙立度胺(thalidomide)，这些药物选自(但不限于)贝伐珠单抗贝伐珠单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(1enalidomide)、ENMD0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenibtosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)。
其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。
尤其适用于与本发明的双特异性结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。
宜在治疗中与本发明的双特异性结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumabtiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)或马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)、REGN421(SAR153192)或OMP-21M18(D114抑制剂)。
可与本发明的双特异性结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproteroneacetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelinacetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelinacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类(vincaalkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其调配物、拉洛他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。
取决于感兴趣的具体疾病或病症，可使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的双特异性结合分子或多肽以及包含本发明的双特异性结合分子的组合物的效能。适合的分析及动物模型将为本领域技术人员所了解且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。
本发明实验中获得的数据证实本发明的双特异性结合分子具有优于现有技术的结合分子的性质。这种性质为完全抑制VEGF165-VEGFR2相互作用和低IC50，如可以例如从图1和表5的ELISA数据，以及图3、17、18和表7所示的AlphaScreen分析的VHH的IC50值(nM)，及表9、10和图5中的纯化的VHH对重组人VEGF和小鼠VEGF的亲和力KD(nM)了解。另外，如表13中所示，本发明的VEGF结合剂具有较高的效价，例如在次纳摩尔范围内，在HUVEC增殖分析中。这表明对于与VEGF介导的血管生成作用相关的疾病及病症(例如癌症)，本发明的双特异性结合分子为具有治疗功效的有希望的候选者。
根据本发明的另一实施方案，提供一种诊断疾病的方法：
a)使样品与如上文定义的本发明的结合分子接触，及
b)检测该结合分子对该样品的结合，及
c)将步骤(b)中检测到的结合与标准物进行比较，其中通过相对于该样品结合的差异可诊断出与VEGF和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病或病症。
对于此用途及其它用途，例如通过引入作为特异性结合对(例如生物素-(链菌素)抗生物素蛋白结合对)的一部分的官能团来进一步修饰本发明的双特异性结合分子可为有用的。此类官能团可用于将本发明的结合分子与结合至该结合对另一半的另一蛋白、多肽或化合物进行连接，即通过形成结合对而连接。例如，本发明的双特异性结合分子可接合至生物素并连接至与抗生物素蛋白或链亲和素接合的另一蛋白、多肽、化合物或载体。例如，本发明的这些经接合的双特异性结合分子可用作例如可检测信号产生剂接合至抗生物素蛋白或链亲和素的诊断系统中的报告基因。
附图说明
图1：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)。
图2：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)。
图3：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图4：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图5：单价VHH对重组人和小鼠VEGF的结合(ELISA)。
图6：单价VHH对人VEGF121的结合。
图7：纯化的VHH未结合VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF。
图8：形式化VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)。
图9：形式化VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)。
图10：形式化VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图11：形式化VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图12：形式化VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图13：形式化VHH结合小鼠和人VEGF。
图14：形式化VHH未结合VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF。
图15：形式化VHH对VEGF121的结合。
图16：VHHVEGFBII23B04与人VH3/JH生殖系共有序列的序列比对。
图17：VEGFBII23B04的VHH变异体阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图18：VEGFBII23B04的序列最优化的克隆阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图19：VHHVEGFBII5B05与人VH3/JH生殖系共有序列的序列比对。
图20：双价Ang2VHH的说明。
图21：纯化的双价Ang2VHH阻断hAng2-hTie2(25-1)、mAng2-mTie2(25-2)和cAng2-cTie2(25-3)相互作用(ELISA)。
图22：纯化的双价Ang2VHH阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。
图23：三价VEGFxAng2双特异性VHH的说明。
图24：纯化的三价VEGFxAng2Nanobody阻断hVEGF-hVEGFR2相互作用(AlphaScreen)。
图25：纯化的三价VEGFxAng2VHH阻断hAng2-hTie2相互作用(ELISA)。
图26：三价和四价VEGFxAng2双特异性VHH的说明。
图27：纯化的三价和四价VEGFxAng2VHH阻断hVEGF-hVEGFR2(31-1)和hVEGF-hVEGFR1(31-2)相互作用(AlphaScreen)。
图28：纯化的三价和四价VEGFxAng2VHH阻断hAng2-hTie2(32-1)、mAng2-mTie2(32-2)和cAng2-cTie2(32-3)相互作用(ELISA)。
图29：纯化的三价和四价VEGFxAng2VHH阻断hAng2介导的HUVEC存活。
图30：序列最优化的和亲和性VEGFxAng2双特异性VHH的说明。
图31：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH阻断hVEGF-hVEGFR2(35-1)和hVEGF-hVEGFR1(35-2)相互作用(AlphaScreen)。
图32：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH结合人VEGF165(36-1)和hVEGF121(36-2)(ELISA)。
图33：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH结合(A)小鼠和(B)大鼠VEGF164(ELISA)。
图34：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH结合(A)人VEGF-B、(B)人VEGF-C、(C)人VEGF-D和(D)人PlGF(ELISA)。
图35：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH阻断hAng2-hTie2(39-1)、mAng2-mTie2(39-2)和cAng2-cTie2(39-3)相互作用(ELISA)。
图36：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH阻断hAng1-hTie2相互作用(ELISA)。
图37：纯化的VEGFANGBII00022-25-28VEGFxAng2VHH阻断hAng2介导的HUVEC存活。
材料和方法
a)VEGF109的产生及功能性测试
将编码人血管内皮生长因子同工型VEGF165的受体结合域的cDNA(GenBank：AAM03108.1；AA残基27-135)克隆入pET28a载体(Novagen，Madison，WI)中，并在大肠杆菌(BL21StarDE3)中过度表达为His标记的不溶性蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。离心收集细胞，并通过超声法处理细胞沉淀物使细胞溶解。通过离心分离包涵体。在使用1％TritonX100(Sigma-Aldrich)的洗涤步骤之后，使用7.5M盐酸胍来溶解蛋白，并使用尿素浓度从6M递减至0M的缓冲液通过连续多轮过夜透析将其复性。通过使用MonoQ5/50GL(AmershamBioSciences)柱的离子交换色谱，随后以Superdex7510/300GL柱(AmersheimBioSciences)进行凝胶过滤来纯化所述复性的蛋白。蛋白纯度及均质性由SDS-PAGE及蛋白印迹分析法(Westenblot)予以确认。此外，通过ELISA监测对VEGFR1、VEGFR2及贝伐珠单抗的结合活性。为此，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中将1μg/mL重组人VEGF109固定过夜。用酪蛋白溶液(1％)阻断各孔。将VEGFR1、VEGFR2或贝伐珠单抗的系列稀释液添加至涂布VEGF109的培养板中，并使用碱性磷酸酶(AP)缀合的Fc特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.，WestGrove，PA，USA)和随后在底物PNPP(对硝基苯基磷酸酯)(Sigma-Aldrich)存在下的酶促反应来检测结合。VEGF109可结合VEGFR1、VEGFR2及贝伐珠单抗，表明产生的VEGF109具有活性。
b)VEGF165的KLH缀合及KLH缀合的VEGF165的功能性测试
根据制造商说明书，使用含有海水养殖钥孔血蓝蛋白(mariculturekeyholelimpethemocyanin，mcKLH)的Imject免疫原EDC试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)，将重组人VEGF165(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)缀合至mcKLH。通过SDS-PAGE确认多肽对mcKLH的有效接合。用ELISA检验接合蛋白的功能：在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中将2μg/mLKLH接合的VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1％)阻断各孔。添加VEGFR1或VEGFR2的系列稀释液且使用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)缀合的Fc特异性山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.，WestGrove，PA，USA)，以及随后在底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)存在下的酶促反应来检测结合。KLH缀合的蛋白仍可与VEGFR1、VEGFR2及贝伐珠单抗相互作用，从而证实VEGF165上的相关表位仍然可被结合。
实施例1
不同VEGF形式的免疫诱导美洲驼中的体液免疫反应
1.1免疫化
在兽医学学院的伦理委员会(UniversityGhent，Belgium)批准之后，根据标准方案以6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人VEGF109来使4只美洲驼(命名为第264、265、266、267号)免疫化。第0天的首次注射液是用弗氏完全佐剂(Difco，Detroit，MI，USA)调配的，而随后注射液是用弗氏不完全佐剂(Difco，Detroit，MI，USA)调配的。此外，根据以下方案使四只美洲驼(命名为第234、235、280及281号)免疫化：5次肌内注射KLH缀合的人VEGH165(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)，随后4次肌内注射人VEGF109(首次给药100μg，2周后以每周一次的间隔给药3次，每次给药50μg)。
1.2美洲驼中VEGF诱导的免疫反应的评估
为了监测VEGF特异性血清效价，建立ELISA分析，其中将2μg/mL重组人VEGF165或VEGF109在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1％)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗美洲驼免疫球蛋白(BethylLaboratoriesInc.，Montgomery,TX，USA)，随后在底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)存在下进行酶促反应来检测所结合的总IgG。对于美洲驼264、265、266及267，进行另一ELISA，评估针对VEGF165及VEGF109的同型特异性反应。依次使用特异性识别常规美洲驼IgG1及仅有重链的美洲驼IgG2及IgG3的小鼠mAb[Daley等人(2005).Clin.Diagn.Lab.Imm.12：380-386]，以及随后的兔抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测同型特异性反应。使用TMB作为显色底物来建立ELISA且在450nm下测量吸光度。各美洲驼的血清效价见于表1中。
表1：针对VEGF165及VEGF109的抗体介导的特异性血清反应ELISA(固相涂布重组蛋白)
n/d：未测定
实施例2
只有重链的抗体片段库的克隆及噬茵体制备
在最后一次的免疫原注射之后，从免疫的美洲驼中收集免疫组织作为产生重链抗体的B细胞的来源。通常，每只动物收集两个150ml的血液样本(在最后一次抗原注射后的第4和第8天收集)和一个淋巴结活检(在最后一次抗原注射后的第4天收集)。从血液样品中，根据制造商的说明(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA)使用聚蔗糖-泛影葡胺制备外周血单核细胞(PBMC)。从外周血单核细胞及淋巴结活检提取总RNA，这是用作RT-PCR的起始原料以扩增VHH编码DNA片段，如WO2005/044858中所述。对于每只免疫的美洲驼，通过汇集分离自所有收集到的该动物的免疫组织的总RNA构建一个库。总之，通过特定的限制性位点将PCR扩增的VHH库克隆到经设计以促进VHH库噬菌体展示的载体中。载体来自于pUC119并包含LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因、多克隆位点、以及杂合gIII-pelB前导序列(pAX050)。在VHH编码序列框内，该载体编码一个C-末端c-myc标签和一个His6标签。根据标准方法制备噬菌体并在滤器除菌后储存于4℃以供进一步使用。
实施例3
通过噬茵体展示进行VEGF特异性VHH的选择
VHH噬菌体文库用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括i)VEGF蛋白形式(rhVEGF165、rhVEGF109或rmVEGF164)，ii)抗原呈递方法(固相：直接涂布或通过生物素标签涂布于中性链亲和素涂布的培养板上；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链亲和素的涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度及iv)洗脱方法(胰蛋白酶洗脱或使用VEGFR2的竞争性洗脱)。所有选择均在Maxisorp96孔培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中进行。
如下进行选择：在室温将噬菌体文库与不同浓度的VEGF抗原(在溶液中或固定于固体支撑物上)一起培养。在培养2小时且充分洗涤之后，将结合的噬菌体洗脱。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则通过添加0.8mM蛋白酶抑制剂AEBSF即刻中和蛋白酶活性。将显示超过背景值的富集的噬菌体输出用于感染大肠杆菌。将感染大肠杆菌的细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2％)上用于分析单个的VHH克隆。为了筛选特异性结合剂的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且使其在1mL96深孔培养板中生长。通过添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)。
实施例4
VEGF结合及VEGF受体阻断性VHH的鉴定
通过ELISA测试周质提取物对人VEGF165的结合。简而言之，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中将2μg/mL重组人VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1％)阻断各孔。在添加通常稀释10倍的周质提取物之后，使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测VHH结合。将显示ELISA信号高于背景值3倍以上的克隆视为VEGF结合VHH。
此外，在人VEGF165/人VEGFR2AlphaScreen分析(光激化学发光免疫分析，AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)中筛选周质提取物以评估VHH的阻断能力。使用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL,USA)将人VEGF165生物素化。根据制造商说明书(PerkinElmer，Waltham，MA，US)，使用偶合至受体微珠的抗人FcVHH来捕获人VEGFR2/Fc嵌合体(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)。为了评估VHH的中和能力，用含有0.03％吐温20(Tween20，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液将周质提取物稀释25倍且在室温(RT)下与0.4nM生物素化的人VEGF165一起预培养15分钟。将受体微珠(10μg/ml)及0.4nMVEGFR2huFc添加至该混合物中且在室温于黑暗中再培养1小时。随后添加供体微珠(10μg/ml)，接着在室温于黑暗中培养1小时。通过使用680nm的激发波长及介于520nm与620nm之间的发射波长在Envision多标记培养板读取器(PerkinElmer,Waltham，MA，USA)上读取培养板来测量荧光。将含有无关VHH的周质提取物用作阴性对照。含有能够使荧光信号相对于阴性对照信号减少60％以上的抗VEGF165VHH的周质提取物鉴别为击中物(hit)。AlphaScreen中鉴别出的所有击中物均在竞争性ELISA中加以确认。为此，将1μg/mL人VEGFR2嵌合体(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中。在固定浓度(4nM)的生物素化的人VEGF165的存在下，在含有0.1％酪蛋白及0.05％吐温20(Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液中培养稀释5倍的周质提取物。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma，StLouis，MO，USA)来检测这些VHH/bio-VEGF165复合物对人VEGFR2嵌合体涂布的培养板的结合。VEGF结合(非受体阻断)VHH及抑制性(受体阻断)VHH的VHH序列ID及相应AA序列分别列于表2及表3中。
在Biacore(BiacoreT100仪器，GEHealthcare)上分析抑制性VHH的解离速率。将HBS-EP+缓冲液用作操作缓冲液且在25℃进行实验。重组人VEGF165通过胺偶联(使用EDC及NHS)以不可逆方式被捕获在CM5传感器芯片上直至+/-1500RU的目标水平。在固定之后，注射10分钟1M乙醇胺(pH8.5)来使表面失活。参考表面分别用EDC/NHS及乙醇胺来活化及失活。VHH的周质提取物在操作缓冲液中稀释10倍以45μl/分钟注射2分钟且使其解离10或15分钟。在不同样品之间，用再生缓冲液使表面再生。通过减去关于参考通道的曲线及空白操作缓冲液注射而对数据进行双重参考处理。通过在BiacoreT100评估软件v2.0.1中拟合两相衰减模型(twophasedecaymodel)来评估经处理的曲线(processedcurve)。快速kd、缓慢kd及快速％的值列于表4中。
表4：用Biacore测定抗VEGF受体阻断性VHH的解离速率
n/d：未测定
实施例5
纯化的抗VEGFVHH的表征
选择以下三个抑制性抗VEGFVHH以纯化蛋白形式来进一步表征：VEGFBII23B04、VEGFBII24C4和VEGFBII23A6。这些VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc、His6标记的蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。使用这些提取物作为起始物质通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH。最终VHH制备物经SDS-PAGE评估显示95％的纯度。
5.1在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估
在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简而言之，将1μg/mLVEGFR2-Fc嵌合体(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中。在4nM生物素化的VEGF165存在下培养纯化的VHH在含有0.1％酪蛋白及0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma，StLouis，MO，USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR2的残余结合。贝伐珠单抗及雷珠单抗(雷珠单抗，)作为对照一起进行处理。图1中显示剂量抑制曲线，表5中概述了相应的IC50值和抑制百分比。
表5：单价VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争性ELISA中的IC50值(nM)和抑制百分比
VHH ID IC50(nM) ％抑制
VEGFBII23B04 2.1 100
VEGFBII23A06 3.0 100
VEGFBII24C04 2.5 100
雷珠单抗 1.6 100
贝伐珠单抗 1.7 100
5.2在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估
也在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中评估VHH。简而言之，将2μg/mLVEGFR1-Fc嵌合体(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中。在0.5nM生物素化的VEGF165存在下培养纯化的VHH在含有0.1％酪蛋白及0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma，StLouis，MO，USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR1的残余结合。将贝伐珠单抗、雷珠单抗及无关的VHH(2E6)作为对照一起进行处理。图2中显示剂量抑制曲线，表6中概述了相应的IC50值和抑制百分比。
表6：单价VHH在hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争性ELISA中的IC50值(nM)和抑制百分比
VHH ID IC50(nM) ％抑制
VEGFBII23B04 0.5 64
VEGFBII23A06 0.9 55
VEGFBII24C04 0.8 71
雷珠单抗 1.2 91
贝伐珠单抗 1.5 96
5.3在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH
也在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简而言之，将纯化的VHH在含有0.03％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：200nM-0.7pM)添加至4pMbio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR2-Fc(0.4nM)及抗FcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后，在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图3中显示剂量-反应曲线。表7中概述VHH阻断人VEGF165与人VEGFR2-Fc相互作用的IC50值。
表7：VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争AlphaScreen中的IC50值(pM)和抑制百分比
VHH ID IC50(pM) ％抑制
VEGFBII23B04 160 100
VEGFBII23A06 250 100
VEGFBII24C04 250 100
雷珠单抗 860 100
5.4在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH
也在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简而言之，将纯化的VHH在含有0.03％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：500nM-1.8pM)添加至0.4nMbio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR1-Fc(1nM)及抗FcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图4中显示剂量-反应曲线。表8中概述了VHH阻断人VEGF165与人VEGFR1-Fc相互作用的IC50值和抑制百分比。
表8：VHH在hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争AlphaScreen中的IC50值(nM)
VHH ID IC50(nM) ％抑制
VEGFBII23B04 0.9 41
VEGFBII23A06 0.4 46
VEGFBII24C04 0.2 53
雷珠单抗 3.3 79
5.5人VEGF165-VHH相互作用的亲和力的测定
在BiacoreT100仪器上通过SPR分析VHHVEGFBII23B04与hVEGF165的结合动力学。通过胺偶合(使用EDC及NHS)将重组人VEGF165直接固定在CM5芯片上。在介于10与360nM之间的不同浓度下分析VHH。样品注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离多达20分钟。在样品注射间隔，用100mMHCl使芯片表面再生。将HBS-EP+(Hepes缓冲液(pH7.4)+EDTA)用作操作缓冲液。通过BiacoreT100评估软件v2.0.1使用两态反应模型(TwoStateReactionmodel)拟合结合曲线。计算出的抗VEGFVHH的亲和力列于表9中。
表9：纯化的VHH对重组人VEGF165的亲和力KD(nM)
(a)导致非1：1拟合的异质结合曲线，通过BiacoreT100评估软件v2.0.1使用两态反应模型来拟合曲线
5.6对小鼠VEGF164的结合
使用结合ELISA来测定对小鼠VEGF164的交叉反应性。简而言之，在4℃将1μg/mL重组小鼠VEGF164(R&DSystems，Minneapolis，MS，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中过夜。用酪蛋白溶液(1％的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1％酪蛋白及0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图5)。包括小鼠VEGF164反应性mAb作为阳性对照。还测量对人VEGF165的结合作为参考。EC50值概述于表10中。
表10：VHH在重组人VEGF165及小鼠VEGF164结合ELISA中的EC50值(pM)
rhVEGF165 rmVEGF164
VHH ID EC50(pM) EC50(pM)
VEGFBII23B04 297 NB
VEGFBII24C04 453 NB
VEGFBII23A06 531 NB
NB：无结合
5.7对VEGF121的结合
通过固相结合ELISA评估对重组人VEGF121的结合。简而言之，在4℃将1μg/mL重组人VEGF121(R&DSystems，Minneapolis，MS，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中过夜。用酪蛋白溶液(1％的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1％酪蛋白及0.05％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图6)。将VEGFR2的系列稀释液作为阳性对照一起进行处理。EC50值概述于表11中。
表11：单价VHH在重组人VEGF121结合ELISA中的EC50值(pM)
VHH ID EC50(pM)
VEGFBII23B04 510
VEGFBII24C04 792
VEGFBII23A06 928
5.8对VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合
通过固相结合ELISA评估对VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合。简而言之，在4℃将1μg/mLVEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(R&DSystems，Minneapolis，MS，USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc，Wiesbaden，Germany)中过夜。用酪蛋白溶液(1％的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP缀合物(Sigma，StLouis，MO，USA)来检测结合。将适当受体的系列稀释液作为阳性对照一起进行操作，且用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性抗体)(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.，WestGrove，PA，USA)、随后在底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(Pierce，Rockford，IL，USA)存在下进行酶促反应来检测。图7中显示VHH及对照的剂量-反应曲线。结果显示未检测到所选VHH对VEGFB、VEGFC、VEGFD或PlGF的结合。
5.9表位重新分级(epitopebinning)
进行基于Biacore的表位重新分级实验，以研究哪些VEGF结合物可结合与VEGFBII23B04类似或重叠的表位。为此，将VEGFBII23B04固定在CM5传感器芯片上。对于各样品，人VEGF165通过芯片表面且由VEGFBII23B04以可逆方式捕获。接着在240秒的表面接触时间并以10微升/分钟的流速注射纯化的VHH(100nM)或周质提取物(稀释10倍)。在不同样品之间，用再生缓冲液(100mMHCl)使芯片表面再生。用BiacoreT100评估软件来评估经处理的曲线。VHH可划分为两组：对VEGFBII23B04捕获的VEGF165产生额外结合的第1组，以及不能同时与VEGFBII23B04捕获的VEGF165结合的第2组。表12-A概述了测试的VHH的结合表位。
用相同的分析设置评估VEGFR1、VEGFR2、雷珠单抗及贝伐珠单抗是否能够同时结合人VEGF-165与VEGFBII23B04。表12-B显示对VEGFBII23B04捕获的VEGF165的额外结合反应。仅有VEGFR2是不能与VEGFBII23B04捕获的VEGF165结合的，从而强调了VEGFBII23B04对VEGF-VEGFR2相互作用的阻断能力。此外，这些数据显示VEGFBII23B04表位与贝伐珠单抗及雷珠单抗的表位并不相同。
表12-A：抗VEGFVHH的表位重新分级-对VEGFBII23B04的同时结合
*表示相同或重叠表位
表12-B：VEGFBII23B04的表位重新分级-基准抑制剂或捕获VEGFBII23B04的VEGF165上的同源受体的结合
注射步骤 结合 [样品] 结合水平(RU)
1 VEGF165 100nM 1727
2 VEGFBII23B04 100nM -
3 雷珠单抗 100nM 763
4 贝伐珠单抗 100nM 1349
5 VEGFR1 100nM 1011
6 VEGFR2 100nM -
5.10HUVEC增殖分析中抗VEGFVHH的表征
在增殖分析中评估所选VHH的效能。简而言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿(supplement-starved)，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过[3H]-胸苷掺入来测量增殖速率。HUVEC增殖分析结果显示于表13中。
表13：VEGFHUVEC增殖分析中单价VEGFBII23B04、VEGFBII23A06及VEGFBII24C04的IC50值(nM)和抑制百分比
5.11HUVECErk磷酸化分析中抗VEGFVHH的表征
在HUVECErk磷酸化分析中评估所选VHH的效能。简而言之，使初级HUVEC细胞过夜经受血清饥饿(serum-starved)，接着用10ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。用PBS中的4％甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1&2，M8159，Sigma)及多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161，Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化程度。如表14中所示，VEGFBII23B04及贝伐珠单抗抑制VEGF诱导的Erk磷酸化至少90％，其IC50<1nM。
表14：VEGFHUVECErk磷酸化分析中单价VEGFBII23B04的IC50值(nM)和抑制百分比
实施例6
多价抗VEGF阻断性VHH的产生
VHHVEGFBII23B04基因融合至VEGFBII23B04中以产生同源二聚VHH(AA序列参见表15)或融合至不同VEGF结合VHH中以产生异源二聚VHH。为了产生异源二聚VHH，一组10个独特的VEGF结合VHH通过长度为9或40的Gly-Ser柔性接头以两种不同的定向连接至VEGFBII23B04(AA序列参见表15)。同源二聚VEGFBII23B04(VEGFBII010)及40个异源二聚二价VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc、His6标记的蛋白。通过添加1mMIPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。将这些提取物用作起始物质且通过IMAC及脱盐来纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到90％的纯度。
分别如实施例5.3及5.4中所述在VEGFR2和VEGFR1阻断AlphaScreen分析中测试一组40个二价VHH的嵌板。基于抑制的效能及最大抑制水平选择了5个最佳的二价VHH(VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及VEGFBII025)以用于进一步表征。所选5个二价VHH在竞争性VEGFR2及VEGFR1AlphaScreen中的筛选结果的概述显示于表16中。
表16：5个最佳的二价VHH在VEGF/VEGFR1和VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen分析中的效能及效果
实施例7
形式化的抗VEGFVHH的表征
分别如实施例5.1、5.2、5.3及5.4中所述在VEGFR2及VEGFR1阻断ELISA(分别参见图8及图9、表17及表18)及AlphaScreen分析(图10及11、表19及20)中并排比较VHHVEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、VEGFBII024和VEGFBII025。
表17：形式化VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争性ELISA中的IC50值(pM)和抑制百分比
表18：形式化VHH在VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争性ELISA中的IC50值(pM)和抑制百分比
表19：形式化VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争性AlphaScreen中的IC50值(pM)和抑制百分比
VHH ID IC50(pM) ％抑制
VEGFBII010 16 100
VEGFBII021 7 100
VEGFBII022 7 100
VEGFBII023 46 100
VEGFBII024 50 100
VEGFBII025 51 100
雷珠单抗 600 100
表20：形式化VHH在VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争性AlphaScreen中的IC50值(pM)和抑制百分比
VHH ID IC50(pM) ％抑制
VEGFBII010 21 70
VEGFBII021 12 100
VEGFBII022 9 98
VEGFBII023 48 87
VEGFBII024 69 98
VEGFBII025 71 82
雷珠单抗 1300 87
此外，还测试了形式化VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-huFc相互作用的能力。简而言之，将纯化的VHH在含有0.03％吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的系列稀释液(浓度范围：4μM-14.5pM)添加至0.1nM生物素化mVEGF164中且培养15分钟。随后，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1nM)及抗huFcVHH涂布的受体微珠(20μg/ml)，培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在培养1小时之后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图12中显示剂量-反应曲线。表21中概述了VHH阻断小鼠VEGF164/VEGFR2-hFC相互作用的IC50值。
表21：形式化的VHH在mVEGF164/mVEGFR2-hFc竞争性AlphaScreen中的IC50值(pM)和抑制百分比
VHH ID IC50(nM) ％抑制
VEGFBII022 108 100
VEGFBII024 - -
mVEGF164 0.05 100
雷珠单抗 - -
也在ELISA中测试形式化的VHH与以下结合的能力：mVEGF164及人VEGF165(实施例5.6；图13；表22)、VEGF121(实施例5.7；图15；表23)，以及VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(实施例5.8；图14)。如实施例5.5中所述分析人VEGF165的结合动力学。KD值列于表24中。
表22：形式化的VHH在重组人VEGF165及小鼠VEGF164结合ELISA中的EC50值(pM)
rhVEGF165 rmVEGF164
VHH ID EC50(pM) EC50(pM)
VEGFBII010 428 -
VEGFBII021 334 502
VEGFBII022 224 464
VEGFBII023 221 -
VEGFBII024 320 -
VEGFBII025 668 -
表23：形式化VHH在重组人VEGF121结合ELISA中的EC50值(pM)
rhVEGF121
VHH ID EC50(pM)
VEGFBII010 920
VEGFBII022 540
VEGFBII024 325
VEGFBII025 475
表24：形式化的纯化VHH对重组人VEGF165的亲和力KD(nM)
VHH ID ka1(1/Ms) kd1(1/s) ka2(1/s) kd2(1/s) KD(nM)(a)
VEGFBII010(b) 4.5E+05 1.7E-02 2.9E-02 1.3E-04 0.16
VEGFBII021(b) 1.2E+06 1.1E-02 2.3E-02 1.9E-04 0.07
VEGFBII022(b) 1.2E+06 9.1E-03 1.4E-02 2.6E-04 0.14
VEGFBII023(b) 3.0E+05 1.8E-02 2.4E-02 2.7E-04 0.69
VEGFBII024(b) 3.0E+05 1.3E-02 2.6E-02 2.8E-04 0.47
VEGFBII025(b) 3.3E+05 1.7E-02 1.8E-02 3.7E-04 1.1
(a)KD=kd1/ka1*(kd2/(kd2+ka2))
(b)通过BiacoreT100评估软件v2.0.1使用两态反应模型来拟合曲线
也在VEGF介导的HUVEC增殖及Erk磷酸化分析中测试VHHVEGFBII010、VEGFBII022、VEGFBII024和VEGFBII025。
在增殖分析中评估所选形式化VHH的效能。简而言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过[3H]-胸苷掺入来测量增殖速率。显示于表25中的结果说明形式化VHH及贝伐珠单抗抑制VEGF诱导的HUVEC增殖超过90%，其IC50<1nM。
表25：形式化VHH在VEGFHUVEC增殖分析中的IC50值(nM)和抑制百分比
VHH ID IC50(nM) ％抑制
VEGFBII010 0.22 95
VEGFBII021 0.40 98
VEGFBII022 0.34 100
VEGFBII023 0.52 98
VEGFBII024 0.38 96
VEGFBII025 0.41 104
贝伐珠单抗 0.21 92
在HUVECErk磷酸化分析中评估所选形式化VHH的效能。简而言之，使初级HUVEC细胞过夜经受血清饥饿，接着用10ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激该细胞5分钟。用PBS中的4％甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1&2，M8159，Sigma)及多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161，Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化水平。如表26中所示，形式化VHH及贝伐珠单抗抑制VEGF诱导的Erk磷酸化超过90％，其IC50<1nM。
表26：形式化的VHH在VEGFHUVECErk磷酸化分析中的IC50值(nM)和抑制百分比
实施例8
序列最优化
8.1VEGFBII23B04的序列最优化
将VEGFBII23B04的氨基酸序列与人生殖系序列VH3-23/JH5进行比对，参见图16(SEQIDNO：179)。
比对显示VEGFBII23B04相对于参考生殖系序列含有19个框架突变。选择位置14、16、23、24、41、71、82、83及108处的非人残基经其人生殖系对应残基置换。产生一组在这些位置上具有不同组合的人残基的8个VEGFBII23B04变异体(AA序列列于表27中)。构建另一变异体，在该变异体中通过引入S60A突变来移除位置D59S60处的潜在异构化位点(CDR2区域，参见图16，表示为粗斜体残基)。
这些变异体以纯化蛋白形式在VEGF165/VEGFR2AlphaScreen中进行表征(实施例5.3，图17)。在热位移分析中测定各克隆的熔解温度(Tm)，该分析基于荧光信号在并入宝石橙(SyproOrange，Invitrogen)后的增加(Ericsson等人，Anal.Biochem.357(2006)，第289-298页)。所有变异体显示与VEGFBII23B04相当的IC50及与亲本VEGFBII23B04类似或较高的Tm值。表28概述所测试9个克隆的IC50值及pH为7时的Tm值。
表28：VEGFBII23B04的序列最优化的变异体的IC50值(pM)、抑制百分比及熔解温度(在pH为7时)
VHH ID IC50(pM) ％抑制 PH为7时的Tm(℃)
VEGFBII23B04(野生型) 169 100 63
VEGFBII111D05 209 100 68
VEGFBII111G06 366 100 71
VEGFBII112D11 221 100 70
VEGFBII113A08 253 100 69
VEGFBII113E03 290 100 68
VEGFBII114C09 215 100 71
VEGFBII114D02 199 100 74
VEGFBII114D03 227 100 64
VEGFBII118E10 189 100 62
在第二循环中，将来自人源化成果(humanizationeffort)(VEGFBII111G06)的可耐受突变与避免在所选位点处的潜在翻译后修饰中避免突变(D16G、S60A置换及E1D突变)相结合，从而产生源自VEGFBII23B04的序列最优化克隆：VEGFBII0037。预期得到含有除I82M突变外与VEGFBII0037相同的置换的一个额外的序列最优化变异体(VEGFBII038)，因为此突变可能与效能的微小降低相关。两个序列最优化克隆的序列列于表29中。在VEGF165/VEGFR2阻断AlphaScreen(实施例5.3，图18)中对VEGFBII0037及VEGFBII0038进行表征，在如上所述的热位移分析中测定熔解温度且在Biacore(实施例5.5)中测定结合VEGF165的亲和力。2个序列最优化VHH的特征的概述于表30中。
表29：VHHVEGFBII23B04的序列最优化变异体的AA序列
表30：序列最优化的克隆VEGFBII037及VEGFBII038的IC50值(pM)、抑制百分比、熔解温度(在pH为7时)及亲和力(pM)
8.2VEGFBII5B05的序列最优化
将VEGFBII5B05的氨基酸序列与人生殖系序列VH3-23/JH5进行比对，参见图19(SEQIDNO：179)。比对显示VEGFBII5B05相对于参考生殖系序列含有15个框架突变。选择位置23、60、83、105、108处的非人残基经其人生殖系对应残基置换，同时选择位置44处的组氨酸经谷氨酰胺置换。构建具有6个所述突变的一个人源化变异体(AA序列列于表31中)。
表31：VHHVEGFBII5B05的序列最优化变异体的AA序列
(FR：框架区；CDR：互补决定区)
构建另一变异体，在该变异体中通过引入M30I突变来移除位置M30处的潜在氧化位点(CDR1区域，参见图19，表示为粗斜体残基)。使用ProteOn测试两种变异体结合hVEGF165的能力。简而言之，用人VEGF165涂布GLCProteOn传感器芯片。将该变异体的周质提取物稀释10倍且横跨涂布有人VEGF165的芯片加以注射。计算解离速率且与亲本VEGFBII5B05的解离速率相比较。从2种变异体的解离速率与从亲本VEGFBII5B05的解离速率在相同范围内，表明所有突变均可耐受(表32)。
表32：序列最优化的变异体VEGFBII5B05的解离速率
VHH ID 结合水平(RU) kd(1/s)
VEGFBII5B05 242 6.15E-02
VEGFBII119G11 234 7.75E-02
VEGFBII120E10 257 4.68E-02
在第二循环中，将人源化成果(humanizationeffort)的突变与M30I置换相组合，从而产生VEGFBII5B05的序列最优化克隆，命名为VEGFBII032。序列列于表33中。通过Biacore测定VEGFBII032的亲和力(参见实施例5.5)且在如上所述的热位移分析中测定熔解温度。序列最优化的VHHVEGFBII032的特征概述于表34中。
表33：序列最优化的克隆VEGFBII032的AA序列
(FR：框架区；CDR：互补决定区)
表34：序列最优化克隆VEGFBII032的熔解温度(在pH为7时)及亲和力(nM)
在增殖分析中评估序列最优化克隆VEGFBII037及VEGFBII038的效能。简而言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mLVEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过[3H]-胸苷掺入来测量增殖速率。表35中显示的结果说明序列最优化克隆VEGFBII038保留了亲本VHHVEGFBII23B04的活性(效能及抑制度)。
表35：序列最优化克隆VEGFBII037和VEGFBII038在VEGFHUVEC增殖分析中的IC50值(nM)和抑制百分比
实施例9
靶向Ang2的二价VHH的构建、产生和表征
1D01(SEQIDNo：214)、11B07、00908和00027(SEQIDNo：216)VHH分别基因融合至1D01(SEQIDNO：214)、11B07、00908和00027(SEQIDNo：216)中以产生同源二聚VHH。二价VHH通过9-GlySer或40-GlySer柔性接头连接。将形式化VHH的编码DNA序列克隆到表达载体pAX172中。VHH在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达为c-末端myc-His6标记的蛋白。简而言之，从在30℃(250rpm)孵育过周末的单克隆时期开始BGCM培养。培养基换为BMCM后，培养物在30℃(250rpm)孵育直到晚上并随后用100％甲醇诱导。第二天额外诱导培养物3次(早上、中午、晚上)。第二天培养物在4℃(1，500xg)离心20分钟。通过固定化金属亲和色谱(IMAC)，然后脱盐(DS)和最后凝胶过滤(GF)以去除任何内毒素/杂质，来纯化存在于上清中的His6-标记的VHH。所有二价VHH的形式和序列的概述描述于图20和表36-A(接头序列以下划线表示)以及SEQIDNo180-185中。表达水平显示于表36-B中。
为了探究抗-Ang2相比于单价构件的阻断性质，在人Ang2/hTie2(图21-1)、小鼠Ang2/mTie2(图21-2)、短尾猴Ang2/cTie2(图21-3)和人Ang1/hTie2(图22)竞争性ELISA中分析了二价VHH。IC50值的概述显示于表37中。
表36-A
表36-B
表37：在人Ang2/人Tie2、小鼠Ang2/小鼠Tie2、短尾猴Ang2/短尾猴Tie2和hAng1/hTie2竞争性ELISA中的IC50值(pM)
n.d.，未测定
实施例10
使用抗血清白蛋白作为半衰期延长形式来构建、产生和表征靶向VEGF和Ang2的三价双特异性VHH
使用抗-VEGFVHHVEGFBII00038(US2011/0172398A1)和抗-Ang2VHH00027(SEQIDNO：216)作为构件以产生双特异性VHHVEGFANGBII00001-00004。使用血清白蛋白结合VHH的遗传融合体作为半衰期延长方法。通过3Ala或9Gly-Ser柔性接头连接构件。按实施例9中的描述生产和纯化VHH。所有4个双特异性VHH的形式和序列描述于图23和表37-A(接头序列以下划线表示)、SEQIDNo186-189。表达水平显示于表38-B中。
表38-A
表38-B
为了探究抗-VEGF相比于单价构件VEGFBII00038的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(图22)竞争性AlphaScreen中分析了所有4个双特异性VHH。与专利US2011/0172398A1描述的实施例12.3相比，对分析进行了略微调整。以0.05nM加入人VEGF165和VEGFR2-Fc。用25μM人血清白蛋白预孵育VHH后也进行该竞争性分析。IC50值及抑制百分比的概述显示于表39中。
表39：在人VEGF165/人VEGFR2竞争性AlphaScreen中的IC50值(nM)
为了探究抗-Ang2相比于单价构件00027(SEQIDNO：216)的阻断性质，在人Ang2/hTie2-Fc(图25)竞争性ELISA中分析了所有4个双特异性VHH。用0.5μM人血清白蛋白孵育VHH后也进行该分析。IC50值的概述如表40所示。
表40：在人Ang2/人Tie2竞争性ELISA中的IC50值(pM)
n.d.，未测定
实施例11
使用抗血清白蛋白结合作为半衰期延长形式来构建、产生和表征靶向VEGF和Ang2的三价和四价双特异性VHH
构建了10个靶向VEGF和Ang2的双特异性VHH(VEGFANGBII00005-00015)。这些构建体中包括单价和二价1D01(SEQIDNO：214)、单价和二价7G08(SEQIDNO：215)和二价00027(SEQIDNO：216)抗Ang2构件。使用血清白蛋白结合VHH的遗传融合体作为半衰期延长方法。通过9Gly-Ser柔性接头连接构件。按实施例8中的描述生产和纯化VHH。所有10个双特异性VHH的形式和序列描述于图26和表41-A(接头序列以下划线表示)、SEQIDNo190-199。表达水平显示于表41-B中。
表41-A
表41-B
为了探究抗-VEGF相比于单价构件VEGFBII00038的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(实施例10；图27-1)和VEGF/VEGFR1(图27-2)竞争性AlphaScreen中分析了所有10个双特异性VHH。与专利US2011/0172398A1描述的实施例12.4相比，对VEGFR1分析进行了略微调整。以0.05nM加入人VEGF165和VEGFR1-Fc。用25μM人血清白蛋白预孵育VHH后也进行该竞争性分析。IC50值的概述显示于表42中。
表42：在人VEGF165/人VEGFR2和人VEGF165/VEGFR1竞争性AlphaScreen中的IC50值(nM)
n.d.，未测定
为了探究抗-Ang2相比于各自单价构件7G08(SEQIDNO：215)、1D01(SEQIDNO：214)和00027(SEQIDNO：216)的阻断性质，在人Ang2/hTie2-Fc(参见实施例5.1；图28-1)、小鼠Ang2/mTie2-Fc(参见实施例5.2；图28-2)和短尾猴Ang2/cTie2-Fc(参见实施例5.2；图28-3)竞争性ELISA中分析了所有10个双特异性VHH。用0.5μM人血清白蛋白孵育VHH后也进行人的分析。另外，进行了hAng2介导的HUVEC存活分析(参见实施例5.5；图29)。IC50值和抑制百分比的概述显示于表43中。
测定了对人血清白蛋白的亲和力并显示于表44。简而言之，人血清白蛋白(Sigma，StLouis，MO，USA)通过胺偶合固定在CM5芯片上。使用多循环动力学方法：注射递增浓度的VHH(2-8-31-125-500nM)并允许缔合2分钟并以100μl/min的流速解离10分钟。在VHH注射间隔，用10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)以10s脉冲和60秒稳定期再生表面。通过拟合1：1相互作用模型(Langmuir结合)或异质配体模型评估缔合/解离数据。从所得的缔合及解离率常数ka和kd计算亲和力常数KD(表44)。
实施例12
使用抗血清白蛋白结合作为半衰期延长形式来构建、产生和表征序列最优化和亲和力成熟的靶向VEGF和Ang2的双特异性VHH
构建了14个靶向VEGF和Ang2的双特异性VHH(VEGFANGBII00015-00028)。这些构建体中包括二价00921(序列最优化的1D01变异体)(SEQIDNO：220)、单价VHH00908-00932-00933-00934-00935-00936-00937-00938(序列最优化/亲和力成熟的28D10变异体)(SEQIDNO：222)、二价00956(SEQIDNO：223)(序列最优化的28D10变异体)和单价00928(SEQIDNO：221)(序列最优化的37F02变异体)抗Ang2构件。使用血清白蛋白结合VHH的遗传融合体作为半衰期延长方法。通过9Gly-Ser柔性接头连接构件。所有14个双特异性VHH的形式和序列描述于图30和表45-A(接头序列以下划线表示)以及SEQIDNo200-213中。
表达水平显示于表45-B中。
表45-A
表45-B
为了探究抗-VEGF相比于单价构件VEGFBII00038的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(实施例10；图31-1)和VEGF/VEGFR1(实施例11；图31-2)竞争性AlphaScreen中分析了双特异性VHH。用25μM人血清白蛋白预孵育VHH后也进行该竞争性分析。IC50值的概述显示于表46-A中。
表46-A：在人VEGF165/人VEGFR2和人VEGF165/人VEGFR1竞争性AlphaScreen中的IC50值(nM)
n.d.，未测定
使用BiacoreT100仪上的SPR分析VEGF上得双特异性VHH的结合动力学(参见专利US2011/0172398A1描述的实施例12.5)。使用单价NanobodyVEGFBII00038作为参考(表46-B)。
表46-B：hVEGF165Biacore分析中动力学参数概览
在结合ELISA中测定VHH结合人VEGF121同工型的能力。先后使用生物素化的抗-VHH1A4及extravidin-HRP检测了VHH稀释系列对1μg/mL直接包被的人VEGF121(R&D)(人VEGF165作为参考)的结合。1A4是抗-VHHVHH(由AblynxNV内部生产)。条带标记Avastin作为阳性对照并用HRP缀合的抗人Fc抗体检测。无关的VHH作为阴性对照。对于VEGF165和VEGF121的代表性结合反应曲线显示于图46中，对应的EC50值概述于表46-C中。
表46-C：hVEGF165和hVEGF121结合ELISA中EC50值概览
hVEGF165 hVEGF121
EC50(M) EC50(M)
VEGFANGBII00022 1.4E-09 2.3E-09
VEGFANGBII00025 1.5E-09 2.5E-09
VEGFANGBII00028 1.2E-09 2.1E-09
在结合ELISA中评估了对大鼠和小鼠VEGF164的结合。先后使用生物素化的抗-VHH1A4及extravidin-HRP检测了VHH对1μg/mL直接涂布的小鼠或大鼠VEGF164(R&D)的结合。作为阳性对照，使用HRP缀合的抗人Fc抗体滴定并检测了小鼠/大鼠交叉反应单克隆抗体B20-4.1(Genentech)。无关的VHH作为阴性对照。结果显示于图33中。所有3个双特异性VHH均不与小鼠和大鼠VEGF交叉反应。
通过结合ELISA评估了对人VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF的结合。先后使用生物素化的抗-VHH1A4及extravidin-HRP检测了VHH对1μg/mL直接涂布的VEGF-B(R&D)、VEGF-C(R&D)、VEGF-D(R&D)和PlGF(R&D)的结合。使用适当受体(hVEGFR1-Fc对应hVEGF-B和hPlGF，hVEGFR2-Fc对应hVEGF-C，抗-hVEGF-DmAb(R&D)对应hVEGF-D)的系列稀释液单独作为阳性对照。无关的VHH作为阴性对照。结果显示于图34中。所有3个双特异性VHH均不结合VEGF家族成员。
为了探究抗-Ang2相比于各自单价构件00921(SEQIDNO：220)和00938(SEQIDNO：222)的阻断性质，在人Ang2/hTie2-Fc(参见实施例5.1；图35-1)、小鼠Ang2/mTie2-Fc(参见实施例5.2；图35-2)和短尾猴Ang2/cTie2-Fc(参见实施例5.2；图35-3)竞争性ELISA中分析了所有3个双特异性VHH。用0.5μM人血清白蛋白孵育VHH后也进行人的分析。另外，在hAng1/hTie2竞争性ELISA(参见实施例5.3；图36)和Ang2介导的HUVEC存活分析(参见实施例5.5；图37)中测试了双特异性VHH。IC50值和抑制百分比的概述显示于表47-A中。
测定了VEGFANGBII00022-25-28对人、小鼠、短尾猴和大鼠Ang2的亲和力(参见实施例5.4)并显示于表47-B。
表47-B：纯化的VHH对重组人、短尾猴、小鼠和大鼠Ang2的亲和性KD
测定了VEGFANGBII00022-25-28对人、小鼠和短尾猴血清白蛋白的亲和力(实施例11)并显示于表48。从所得的缔合及解离率常数ka和kd计算亲和性常数KD。
表48：使用(A)1：1相互作用模型或(B)异质配体模型测得纯化VHH对重组人、小鼠和短尾猴血清白蛋白的亲和力KD(nM)
*描述了相互作用的70％或更多

Claims (13)

1.一种双特异性结合分子，其包含
-VEGF结合性免疫球蛋白单一可变域，
-血清白蛋白结合性免疫球蛋白单一可变域，
-Ang2结合性免疫球蛋白单一可变域，
其中所述VEGF结合性免疫球蛋白单一可变域具有以下CDR序列：
CDR1：SYSMG
CDR2：AISKGGYKYDAVSLEG
CDR3：SRAYGSSRLRLADTYEY，
其中所述血清白蛋白结合性免疫球蛋白单一可变域具有以下CDR序列：
CDR1：SFGMS(SEQIDNO:255)
CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(SEQIDNO:256)
CDR3：GGSLSR(SEQIDNO:257)，
其中所述Ang2结合性免疫球蛋白单一可变域具有以下CDR序列：
CDR1：DYAIG(SEQIDNO:248)
CDR2：AIRSSGGSTYYADSVKG(SEQIDNO:249)
CDR3：VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA(SEQIDNO:250)。
2.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH域。
3.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其中
所述VEGF结合性VHH域为VEGFBII00038，其为SEQIDNO:57，
所述血清白蛋白结合性VHH域为Alb11VHH域，其为SEQIDNO:254，
所述Ang2结合性VHH域为ANGBII00938域，其为SEQIDNO:222。
4.双特异性结合分子VEGFANGBII00022，其为SEQIDNO:207。
5.一种核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项的双特异性结合分子。
6.一种载体，其含有权利要求5的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其含有权利要求6的载体。
8.药物组合物，其含有至少一种权利要求1-4中任一项的双特异性结合分子作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗与VEGF介导的和/或Ang2介导的血管生成作用相关的疾病。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
11.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其用于治疗眼病。
12.制备权利要求1-4中任一项的双特异性结合分子的方法，其包括以下步骤：
-在允许表达所述双特异性结合分子的条件下培养权利要求7的宿主细胞；及
-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的所述双特异性结合分子。
13.权利要求12的方法，其还包括以下步骤：
-进一步纯化或修饰或调配所述双特异性结合分子。
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