CN102639566B - 用于抗血管生成治疗的双特异性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性结合分子，特别是免疫球蛋白单一可变域，例如VHH及域抗体，其在一个分子中包含VEGF结合组分及Dll4结合组分。本发明涉及含有所述双特异性结合分子的药物组合物，及其在治疗与VEGF和Dll4介导的血管生成作用相关的疾病的用途。本发明涉及编码所述双特异性结合分子的核酸、宿主细胞及其制备方法。

Description

用于抗血管生成治疗的双特异性结合分子
技术领域
本发明涉及人类治疗的领域，尤其是癌症治疗的领域，以及适于该治疗中的药物和组合物。
现有技术
如US 2008/0014196中所概述，血管生成涉及于大量疾病(包括实体瘤及转移)的发病机制中。
在肿瘤生长的情况下，血管生成对于自增生转变为瘤形成以及对于为肿瘤生长及转移提供营养似乎是至关重要的(Folkman等人,Nature 339-58(1989))，这使肿瘤细胞相比于正常细胞获得生长优势。因此，抗血管生成治疗已成为若干类型肿瘤的重要治疗选择。
最重要的促血管生成因子之一为血管内皮生长因子(VEGF-A，以下称为“VEGF”)，其属于包括胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及VEGF-E的基因家族，并且以由替代性拼接单一基因的mRNA产生的若干同工型形式存在，VEGF165为生物学上最相关的同工型。因此，大多数依赖抗血管生成的抗癌治疗已集中于阻断VEGF路径(Ferrara等人,Nat Rev DrugDiscov.2004年5月；3(5):391-400)。
近来，Dll4(或Delta样4或delta样配体4)已鉴定为癌症治疗的有希望的靶点。Dll4为Notch配体的Delta家族成员。Notch信号传导在许多癌症中，例如在T细胞急性淋巴母细胞白血病中及在实体肿瘤中调控异常(Sharma等人,2007,Cell Cycle 6(8):927-30；Shih等人,Cancer Res.2007年3月1日；67(5):1879-82)。
Dll4的细胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2(DSL)域、及一串八个表皮生长因子(EGF)样重复构成。一般而言，认为EGF域包含氨基酸残基218-251(EGF-1；域1)、252-282(EGF-2；域2)、284-322(EGF-3；域3)、324-360(EGF-4；域4)及362-400(EGF-5；域5)，同时DSL域在hDll4的约氨基酸残基173-217处，并且N-末端域在约氨基酸残基27-172处(WO 2008/076379)。
已报导Dll4由血管内皮高度选择性表达，特别是在动脉内皮中高度选择性表达(Shutter等人,(2000)Genes Develop.14:1313-1318)。近来在小鼠中的研究已显示，Dll4由VEGF诱导且为限制血管萌芽及分枝的负反馈调节子。与此作用一致，缺失或抑制Dll4会导致血管生成过度(Scehnet等人,Blood.2007年6月1日；109(11):4753-60)。这种不受限制的血管生成由于非生产性(non-productive)血管的形成而反常地减缓肿瘤生长，即使在对抗VEGF治疗具有抗性的肿瘤中也是如此(Thurston等人,Nat Rev Cancer.2007年5月；7(5):327-31；WO 2007/070671；Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122))。除对肿瘤血管生成的作用外，抑制Dll4还显示降低临床前肿瘤模型中癌干细胞的频率(Hoey等人,Cell Stem Cell.2009年8月7日；5(2):168-77)。
已公开的处于临床(前)研发中的若干靶向Dll4的生物化合物有：REGN-421(=SAR153192；Regeneron，Sanofi-Aventis；WO 2008076379)及OPM-21M18(OncoMed)(Hoey等人,Cell Stem Cell.2009年8月7日；5(2):168-77)，两者均为完全人Dll4抗体；YW152F(Genentech)，一种人化Dll4抗体(Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7)；Dll4-Fc(Regeneron，Sanofi-Aventis)，一种由Dll4细胞外区域及人IgG1的Fc区域构成的重组融合蛋白(Noguera-Troise等人,Nature.2006年12月21日；444(7122))。
已显示在多个肿瘤类型的异种移植模型中及在抗VEGF抗性肿瘤模型中，相比于单独的抗VEGF，VEGF与Dll4的组合抑制会提供优越的抗肿瘤活性(Noguera-Troise等人，Nature.2006年12月21日；444(7122):1032-7；Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7；US2008175847)。
单克隆抗体(MAb)及融合蛋白鉴于其治疗应用具有若干缺点：为了防止其降解，其必须储存在接近冰点的温度。此外，因为其在消化道中快速消化，所以其不适于口服给药。MAb用于癌症治疗的另一主要限制为转运不良，这导致浓度较低以及不能靶向于肿瘤中的所有细胞。
此外，基于靶向VEGF及Dll4两者的现有技术的治疗代表了涉及两种单独的抑制剂(即VEGF结合分子和独立的Dll4结合分子)的组合治疗。然而，这些治疗具有以下缺点：两种独立药物的研发及生产涉及高成本和大量资源，两种药物可能具有不同药代动力学性质，以及给予两种药物对患者造成不便。
鉴于以上所述，本发明的一个目标在于提供用于人类抗肿瘤治疗的改良分子。
本发明基于将一个或多个VEGF结合分子与一个或多个Dll4结合分子合并在单一治疗剂中的概念。
因此，本发明涉及包含一个或多个Dll4结合分子与一个或多个VEGF结合分子的双特异性结合分子。
在下文中，除非另有说明，则术语“结合分子”(或“抗原结合分子”)是指Dll4结合分子(特别是免疫球蛋白单一可变域)或VEGF结合分子(特别是免疫球蛋白单一可变域)或两者。术语“双特异性结合分子”是指包含至少一个Dll4结合分子(或“结合组分”)和至少一个VEGF结合分子(或结合组分)的分子。双特异性结合分子在结合Dll4或VEGF的分子部分中，即分别在其“Dll4结合组分”(或抗Dll4组分)或“VEGF结合组分”(或抗VEGF组分)中，可含有一个以上Dll4结合分子和/或一个以上VEGF结合分子，即在双特异性结合分子含有双互补位(biparatopic，如下文所定义)Dll4结合分子和/或双互补位VEGF结合分子的情况下。
本发明的双特异性结合分子适于用作预防、治疗、减轻和/或诊断可通过抑制Dll4而调节的疾病或病症(例如癌症)的组合物中的药理学活性剂。
本发明的另一目标在于提供预防、治疗、减轻和/或诊断这些疾病、病症或症状的方法，其涉及使用和/或给予这些药物及组合物。
特别地，本发明的一个目标在于提供所述药理学活性剂、组合物和/或方法，其相比于当前使用的和/或本领域中已知的药物、组合物和/或方法可提供某些优势。
尤其相比于如上所述的常规抗体或其片段，这些优势包括治疗性质和/或药理学性质得到改良和/或其他(例如)对于制造目的而言有利的性质。
更具体地，本发明的一个目标在于提供新分子，且具体为结合哺乳动物且尤其人Dll4及人VEGF的分子，其中所述分子适用于如本文所述的治疗及诊断目的。
发明内容
根据第一方面，提供双特异性结合分子，其于单一分子中包含Dll4结合组分及VEGF结合组分。
更具体地，本发明的双特异性结合分子基本上包含：(i)特异性结合Dll4的至少一个表位的Dll4结合组分和(ii)特异性结合VEGF的至少一个表位的VEGF结合组分，其中所述组分以同时结合Dll4及VEGF的方式或一次仅结合Dll4或VEGF的方式彼此连接。
根据本发明的优选方面，所述两种组分包含一个或多个可彼此独立地为VHH或域抗体的免疫球蛋白单一可变域、和/或如本文所定义的任一其他种类的免疫球蛋白单一可变域，例如VL域，条件是这些免疫球蛋白单一可变域各自与抗原(Dll4或VEGF)结合。
根据优选的实施方案，免疫球蛋白单一可变域具有相同类型，特别地，所有免疫球蛋白单一可变域均为VHH或域抗体。
根据特别优选的实施方案，所有免疫球蛋白单一可变域均为VHH，优选为人化(或如本文定义的“序列最优化”)VHH。因此，本发明涉及包含(任选地人化或序列最优化的)抗Dll4 VHH和(任选地人化或序列最优化的)抗VEGFVHH的双特异性结合分子。
然而，本领域技术人员会了解，本文的教导可以类似方式应用于包括其他抗Dll4或抗VEGF免疫球蛋白单一可变域(例如域抗体)的双特异性结合分子。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及一种产品或组合物，其含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子和任选的这些组合物的一种或多种其他组分。
本发明还涉及制备或产生本文所述的双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的方法。
本发明还涉及本文所述双特异性结合分子、核酸、宿主细胞、产品及组合物的应用及用途，以及预防和/或治疗可通过抑制Dll4而调节的疾病及病症的方法。
本发明的这些及其他方面、实施方案、优势及应用将由下文进一步描述而变得明确。
定义
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(第2版),第1-3卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford University Press,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower MedicalPublishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层(sandwich)组成。
如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”中断。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域正是因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他免疫球蛋白可变域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，与抗原的各别表位发生结合通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域，而是通过共同结合各别抗原的表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链及重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VHVL对。
“VHH域”，亦称为VHH、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，已最初描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G，Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid oflight chains”；Nature 363,446-448(1993))。已经选择术语“VHH域”以将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”或“VL域”)进行区分。VHH域特异性结合表位而没有无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及“Nanobody”及“Nanobody域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且无需第二免疫球蛋白可变域的存在即可特异性结合表位)，且其由例如WO 2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmark residue)”与VH域区分。
如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH域所应用的免疫球蛋白单一可变域(例如VHH)的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,公开案第91号)。根据该编号法，
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而应注意，如本领域中对于VH域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
对VH域的氨基酸残基进行编号且还可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。
VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
免疫球蛋白单一可变域(例如VHH及域抗体)具有大量使其极有利于在治疗中用作功能性抗原结合分子的独特结构特征及功能性质。特别地，且不对其进行限制，VHH域(其已本质上经“设计”为在不与轻链可变域配对情况下功能性地结合抗原)可充当单一、相对较小、功能性的抗原结合结构单元。
由于其独特性质，如本文定义的免疫球蛋白单一可变域，例如VHHs或VHs(或VLs)，无论是单独存在还是作为较大多肽(例如双互补位分子或双特异性结合分子)的一部分，均提供许多显著优点：
·仅需要单一域以高亲和性及高选择性地结合抗原，因而无需存在两个各别的域，也无需确保这两个域以正确的空间构象及构型存在(即通过使用特别设计的连接子，如scFv的连接子)；
·免疫球蛋白单一可变域可从单一核酸分子表达且不需要任何翻译后修饰(如糖基化)；
·免疫球蛋白单一可变域可轻易经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步论述)；
·免疫球蛋白单一可变域对其靶点具有高特异性及亲和性，具有低遗传毒性，可通过输注或注射以外的替代途径给予；
·免疫球蛋白单一可变域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或变性条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备情况下制备、储存或运输；
·免疫球蛋白单一可变域无论是以小规模还是以生产规模制备均较为容易且相对廉价。例如，免疫球蛋白单一可变域及含有免疫球蛋白单一可变域的多肽可使用微生物发酵(例如下文进一步公开)产生，不需要像常规抗体那样使用哺乳动物表达系统；
·相比于常规4链抗体及其抗原结合片段，免疫球蛋白单一可变域是相当小的(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此显示穿透入组织(包括但不限于实体瘤及其他致密组织)的穿透性(更)高，且可以以高于这些常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给予；
·VHH具有特定的所谓“空腔结合性质”(尤其是由于相比于4链抗体的VH域，其CDR3环更为延伸)，因此其也能够进入常规4链抗体及其抗原结合片段不能进入的靶点及表位；
·VHH具有高度可溶及极其稳定且不具有凝集趋势的特别优势(正如由Ward等人,Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠源性抗原结合域的情况一样)。
本发明的双特异性结合分子的组分中含有的免疫球蛋白单一可变域，在获得所述免疫球蛋白单一可变域的具体生物来源或具体制备方法的方面不受限制。例如，获得VHH可包括以下步骤：
(1)分离天然存在的重链抗体的VHH域；或筛选包含重链抗体或VHH的文库且从中分离VHH；
(2)表达编码具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
(3)任选在亲和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH“人化”(或序列最优化)，或表达编码所述人化VHH的核酸；
(4)使动物物种(特别是哺乳动物物种，例如人)的天然存在抗体的免疫球蛋白单一可变重域“骆驼化”(如下所述)，或表达编码所述骆驼化域的核酸分子；
(5)使VH“骆驼化”，或表达编码这类骆驼化VH的核酸分子；
(6)使用以合成方式或半合成方式制备蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技术；
(7)使用核酸合成技术制备编码VHH域的核酸分子，随后表达由此获得的核酸；
(8)使重链抗体或VHH经受亲和力成熟、诱变(例如随机诱变或定点诱变)和/或任何其他技术以增加VHH的亲和性和/或特异性；和/或
(9)组合或选择上述步骤。
适于进行上述步骤的方法及技术在本领域中是已知的且将为本领域技术人员所了解。
根据一个具体实施方案，存在于本发明的双特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域为氨基酸序列基本上对应于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH，但其已经人化(序列最优化，任选在亲和力成熟之后)，即通过以人的常规4链抗体可变重域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换该天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可使用本领域中已知的方法进行，所述方法可由本领域技术人员以常规方式使用。
序列最优化的VHH可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一个甚至更具体的实施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或之此高度同源的人框架区序列。因此，人化方案可包含单独或组合使用生殖系VH基因(例如DP 47、DP 29及DP 51)的相应框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)残基来置换任何VHH残基。本发明的免疫球蛋白单一可变域的适合的框架区(FR)可选自那些例如WO 2006/004678中公开的FR，且具体地包括所谓“KERE”及“GLEW”类型。在约位置44至47处具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白单一可变域及其分别的人化对应物是特别优选的。
例如，属于103P，R,S组和/或GLEW组(如下文所定义)的VHH的人化取代为108Q至108L。使免疫球蛋白单一可变域人化的方法在本领域中是已知的。
在治疗应用方面具有改良的性质(例如增强的亲和性或减少的免疫原性)的结合免疫球蛋白单一可变域，可通过本领域中已知的技术而从单个的结合分子获得，所述技术例如亲和力成熟(例如从合成、随机或天然存在免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、人化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装、及本领域技术人员公知的用于工程改造免疫球蛋白序列的类似技术；或任何上述者的任何适合组合，也称为如本文所述的“序列最优化”。例如参考标准手册以及其他公开及实例。
适当时，可通过使另一结合分子亲和力成熟来获得亲和性增加的结合分子，所述另一结合分子表示就亲和力成熟分子而言的“亲本”结合分子。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于例如WO2006/040153及WO 2006/122786中。亦如其中所详述，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人化”(本文中亦称为“序列最优化”，除人化外，“序列最优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一甚至更具体实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。
域抗体，亦称为“Dab”及“dAb”(术语“域抗体(Domain Antibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已公开于例如以下文献中：Ward,E.S.,等人:“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulinvariable domains secreted from Escherichia coli”；Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domain antibodies:proteins for therapy”；TRENDS inBiotechnology 21(11):484-490(2003)；及WO 2003/002609。
域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
如同VHH的域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。
可互换使用的术语“表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。
可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、本发明的免疫球蛋白单一可变域、或一般而言结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为关于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。在上下文中，VEGF或Dll4结合分子也可分别称为“VEGF中和”分子或“Dll4中和”分子。
一般而言，术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白单一可变域)分子可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合分子的亲和性和/或亲抗原性(avidity)确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和性，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和性也可表示为亲和性常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以以本身已知方式测定亲和性。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。抗原结合分子识别表位的部分称为互补位。
除非另有说明，否则术语“Dll4结合分子”或“VEGF结合分子”包括如本文定义的抗Dll4或抗VEGF抗体、抗Dll4抗体或抗VEGF抗体片段、“抗Dll4抗体样分子”或“抗VEGF抗体样分子”、及与上述任一者的缀合物。抗体包括但不限于单克隆抗体及嵌合单克隆抗体。术语“抗体”涵盖通过于宿主细胞中重组表达产生的完全免疫球蛋白(如单克隆抗体)、以及抗体片段或“抗体样分子”，包括单链抗体及线型抗体，例如描述于WO 02/056910中的所谓的“SMIP”(“小模块免疫药物”)；抗体样分子包括如本文定义的免疫球蛋白单一可变域。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。
“VEGF结合分子”或“Dll4结合分子”分别是指以下两者：单价靶结合分子(即与各别靶点的一个表位结合的分子)，以及二价或多价结合分子(即结合一个以上表位的结合分子，例如如下文定义的“双互补位”分子)。含有一个以上VEGF(或Dll4)结合免疫球蛋白单一可变域的VEGF(或Dll4)结合分子亦称为“形式化(formatted)”结合分子，其在靶结合组分内除免疫球蛋白单一可变域外也可包含连接子和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或连接聚合物(如PEG)。
如本文所用的术语“双互补位VEGF (或Dll4)结合分子”或“双互补位免疫球蛋白单一可变域”将是指包含如本文定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的结合分子，其中两个分子结合各别抗原的两个非重叠表位。双互补位结合分子由对于表位具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变域构成。识别表位的抗原结合分子(例如抗体或本发明的免疫球蛋白单一可变域)的部分称为互补位。
即使是次优选的形式化结合分子，也可包含识别相同或重叠表位或其各别抗原的两个相同免疫球蛋白单一可变域或两个不同免疫球蛋白单一可变域。在此情况下，就VEGF而言，所述两个免疫球蛋白单一可变域可与形成VEGF二聚体的两个单体中的相同或重叠表位结合。
通常，本发明的结合分子将以如例如于Biacore或Kinexa分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且甚至更优选10E-11至10E-13的解离常数(KD)，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(KA)结合。任何大于10E-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD结合所要结合的抗原(即分别为VEGF或Dll4)。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwichcompetition assay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。
氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO 98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
例如相比于其天然生物来源和/或获得该多肽或核酸分子的反应介质或培养基，在其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中其通常与之相关的其他组分分离时，多肽或核酸分子视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一蛋白/多肽、另一核酸、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，多肽或核酸分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的多肽或核酸分子优选基本上为均质的。
两个VEGF结合分子序列之间的“序列一致度”指示序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO 08/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表达保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
对VH域的氨基酸残基进行编号并且也可以类似方式应用于VHH域的替代方法在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。
“亲和力成熟”的结合分子，特别是VHH或域抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对其靶点的亲和性相比于其各自的亲本结合分子有所增加。亲和力成熟的结合分子可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783或Barbas,等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.MoI.Biol.226(3):889896；KS Johnson及RE Hawkins,“Affinity maturation of antibodies using phagedisplay”，Oxford University Press 1996。
对于本发明，除非另有说明，则“SEQ ID NO:x的氨基酸序列”包括：
a)与各别SEQ ID NO:x中所显示的序列100%一致的氨基酸序列；
b)与各别SEQ ID NO:x中所示序列具有至少80%氨基酸一致度的氨基酸序列；
c)与各别SEQ ID NO:x中所示序列具有3个、2个或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
术语“癌症”及“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长/增殖为特征的生理症状。可用本发明的双特异性结合分子治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。如US 2008/0014196中表明用Dll4拮抗剂治疗的这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头颈癌。血管生成的调控异常可导致许多可由本发明组合物及方法治疗的病症。这些病症包括非肿瘤性症状及肿瘤性症状两者。肿瘤性病症包括但不限于上述病症。非肿瘤性病症包括但不限于如US 2008/0014196中所述用Dll4拮抗剂治疗的不欲或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣斑块、类肉瘤病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性及其他增生性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成(cornealneovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜红变(rubeosis))、眼新血管病(ocularneovascular disease))、血管再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(arteriovenous malformations，AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(包括格雷夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他组织移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、恶性肺积液(malignant pulmonaryeffusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤(closed head injury)/外伤相关)、滑液炎症、RA中的血管翳形成(pannus formation)、骨化性肌炎(myositisossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation)、骨关节炎(OA)、难治愈的腹水症、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第3间隔体液疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征(compartment syndrome)、灼伤、肠病)、子宫纤维瘤、早产、例如IBD(克罗恩氏病(Crohn's disease)及溃疡性结肠炎)的慢性炎症、肾同种异体移植排斥、发炎性肠病、肾病综合征、不欲或异常的组织大量生长(非癌)、血友病性关节(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、头发生长抑制、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生(pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子痫前症(preeclampsia)、腹水症、心包积液(pericardial effusion)(例如与心包炎(pericarditis)相关的心包积液)、及胸膜积液(pleural effusion)。
实施方案
在第一方面中，本发明涉及包含Dll4结合组分及VEGF结合组分的双特异性结合分子。
根据优选的实施方案，该Dll4结合组分及该VEGF结合组分分别包含至少一个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域及至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域。
在优选方面中，该Dll4结合组分及该VEGF结合组分各自分别包含至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域及至少一个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域，其中所述各个免疫球蛋白单一可变域具有四个框架区及三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区，其中
a)所述至少一个Dll4结合免疫球蛋白单一可变域的CDR3具有选自以下的氨基酸序列：
i)如SEQ ID NO:1中所示的Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Xaa Pro TyrXaa Tyr Asp Xaa，其中
位置8处的Xaa为Arg、Ala或Glu；
位置11处的Xaa为Leu或Glu；及
位置14处的Xaa为Tyr或His；及
ii)如SEQ ID NO:2中所示的Asp Arg Tyr Ile TrpAlaArg Gln Gly Glu TyrTrp Gly Ala Tyr Xaa Asp Tyr，其中Xaa为Gln、Ala或Tyr；且其中
b)所述至少一个VEGF结合免疫球蛋白单一可变域的CDR3具有如SEQID NO:3中所示的氨基酸序列Ser Arg Ala Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Arg Leu AlaAsp Thr Tyr Xaa Tyr，其中Xaa为Asp或Glu，
其中该VEGF结合免疫球蛋白单一可变域能够以≥60%的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2的相互作用。
根据优选的实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为VHH。
在优选的实施方案中，本发明的双特异性结合分子含有已通过任选在亲本免疫球蛋白单一可变域的亲和力成熟之后进行序列最优化获得的免疫球蛋白单一可变域，特别是VHH。
例如，所述双特异性结合分子中含有的Dll4结合分子已从具有表5及SEQ ID NO:4-20中所示氨基酸序列的亲本Dll4结合分子(其为VHH)获得。
Dll4结合组分中含有的优选免疫球蛋白单一可变域源自具有显示于SEQID NO:10中的氨基酸序列的VHH。
在某些实施方案中，所述优选的Dll4结合免疫球蛋白单一可变域通过对源自序列显示于SEQ ID NO:10中的VHH的亲和力成熟的VHH进行序列最优化而获得，其中所述亲和力成熟VHH具有显示于SEQ ID NO:21-27及表16中的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，该亲和力成熟的VHH具有选自显示于SEQID NO:22中的序列的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，VHH已通过对氨基酸序列显示于SEQ ID NO:22中的VHH进行序列最优化而获得。优选的序列最优化的VHH具有选自显示于SEQ ID NO:34及35及表23中的序列的氨基酸序列。
Dll4结合组分中含有的另一组优选的免疫球蛋白单一可变域源自具有显示于SEQ ID NO:12中的氨基酸序列的VHH。
在某些实施方案中，所述优选Dll4结合免疫球蛋白单一可变域已通过对源自序列显示于SEQ ID NO:12中的VHH的亲和力成熟的VHH进行序列最优化而获得，其中所述亲和力成熟的VHH具有显示于SEQ ID NO:28-33及表17中的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，该亲和力成熟的VHH具有选自显示于SEQID NO:30、32及33中的序列的氨基酸序列。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述VHH已通过对氨基酸序列显示于SEQ ID NO:32中的VHH进行序列最优化而获得。序列最优化的VHH的实例为具有显示于SEQ ID NO:36-39及表24中的序列的VHH，且特别优选为具有显示于表25中的SEQ ID NO:40及41的序列的VHH。
能够以≥60%的抑制率阻断人重组VEGF165与人重组VEGFR-2的相互作用的VEGF结合免疫球蛋白单一可变域的实例为显示于SEQ ID NO:42-44及表32中的VHH。
优选地，VEGF结合组分中含有的VEGF结合免疫球蛋白单一可变域已通过对氨基酸序列显示于SEQ ID NO:43中的VHH进行序列最优化而获得。优选的VHH具有如SEQ ID NO:54-62中所示的序列，特别优选的受体阻断VHH具有显示于SEQ ID NO:63及64及表59中的序列。
在另一实施方案中，本发明涉及双特异性结合分子，其中Dll4结合组分和/或VEGF结合组分包含两个或多个呈免疫球蛋白单一可变域形式的结合分子，其在各别抗原上的不同非重叠表位处分别结合抗原Dll4或VEGF。本发明的双特异性结合分子中含有的这些结合分子包含针对分别存在于Dll4或VEGF中的至少两个非重叠表位的免疫球蛋白单一可变域，其中所述单个的免疫球蛋白单一可变域以能够同时结合其各别表位的方式彼此连接。
因此，本发明的双特异性结合分子中含有的抗Dll4和/或抗VEGF组分可分别包括两个(或多个)抗Dll4(或抗VEGF)免疫球蛋白单一可变域，其中所述免疫球蛋白单一可变域为针对Dll4(或VEGF)靶点内的不同表位。因此，所述双特异性结合分子中的两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原特异性且因此具有不同的CDR序列。
因为两个免疫球蛋白单一可变域将包括两个不同的互补位，所以这些二价结合分子也分别称为“双互补位单域抗体构建体(construct)”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由单域抗体组成)或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由或基本上由VHH组成)。
在本发明的双特异性结合分子中，结合分子之一或两者可为二价；例如所述VEGF结合组分可为双互补位且Dll4结合组分可为一个免疫球蛋白单一可变域，或所述VEGF结合组分可为一个免疫球蛋白单一可变域且Dll4结合组分可为双互补位。
在本发明的双特异性结合分子中，VEGF结合组分优选含有二价VEGF结合免疫球蛋白单一可变域，例如双互补位VHH。
所述VEGF结合免疫球蛋白单一可变域可为两个或多个VEGF结合VHH，其为
a.能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间相互作用的相同VHH或
b.结合VEGF的非重叠表位的不同VHH，其中至少一个VHH能够以≥60%的抑制率阻断重组人VEGF与重组人VEGFR-2之间的相互作用，且其中至少一个VHH能够以≤60%的抑制率阻断该相互作用。
能够以≤60%的抑制率阻断该相互作用的VHH(“非受体阻断”VHH)的实例列于SEQ ID NO:45-47及表33中；这类优选的VHH具有显示于SEQ IDNO:45中的序列。适合作为用于人治疗的双特异性结合分子中的组分的这类VHH为具有SEQ ID NO:45中所示序列的、特别是具有SEQ ID NO:65及66及表61中所示序列的VHH的序列最优化变异体，二价VEGF结合VHH中的特别优选的结合配偶体具有显示于SEQ ID NO:67(表63)中的序列。
二价抗VEGF VHH构建体例示于SEQ ID NO:48-53及表45中；用于人治疗的双特异性结合分子含有这些VHH的各别序列最优化的变异体。双特异性结合分子例示于SEQ ID NO:68-73(亦参见表66及图39)及SEQ IDNO:74-80(亦参见表68及图40)中；所示实例含有作为构建块(blocks)的亲本VHH及亲和力成熟VHH；用于人治疗的双特异性结合分子含有这些VHH的各别序列最优化变异体(如SEQ ID NO:81-89及图48中所例示)。
优选的本发明的双特异性结合分子包含
a)序列选自SEQ ID NO:35或41中的序列的VHH作为Dll4结合组分，及
b)以下作为VEGF结合组分
i)具有显示于SEQ ID NO:64中的序列的VHH或
ii)包含序列显示于SEQ ID NO:64中的VHH及序列显示于SEQ IDNO:67中的VHH的双互补位VHH。
根据优选的实施方案，VEGF结合组分位于N-末端。
在以EVQ起始的本发明的双特异性结合分子中，VHH的N-末端E可被D置换(这经常是序列最优化的结果)或可缺失(就大肠杆菌(E.coli)中的表达而言)。这通常仅适用于位于N-末端的VHH。N-末端E缺失的双特异性结合分子的实例为图48中给出化合物A1、A2及A3(SEQ ID NO:81-83)。
根据优选的实施方案，存在于所述双特异性结合分子中的结合分子(Dll4结合组分内的Dll4结合分子，或VEGF结合组分内的VEGF结合分子，或两种相邻的Dll4及VEGF结合组分)可彼此直接连接(即不使用连接子)或通过连接子连接。连接子优选为连接肽，且将经过选择以使所述两个不同结合分子与靶点的各非重叠表位结合，所述靶点可在同一个靶分子内或在两个不同的分子内。
在双互补位结合分子的情况下，Dll4或VEGF结合组分内的连接子的选择将尤其取决于表位，且特别是取决于免疫球蛋白单一可变域所结合靶点上的表位之间的距离，并且本领域技术人员基于本文公开的内容，任选在一些有限程度的常规实验之后将了解此选择。
两个结合分子(两个VHH或域抗体，或VHH和一个域抗体)或两个结合组分可分别通过另一VHH或域抗体而彼此连接(在这些结合分子中，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合连接子连接至所述另一免疫球蛋白单一可变域)。所述另一VHH或域抗体可例如为提供增加的半衰期的VHH或域抗体。例如，后一VHH或域抗体可为能够结合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)转铁蛋白(transferrin)的VHH或域抗体。
或者，结合各别靶点的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可(直接或通过适合连接子)串联连接，且所述另一VHH或域抗体(其可提供增加的半衰期)可直接或通过连接子连接至这些两个或两个以上上述免疫球蛋白序列之
本文中也公开了与本发明的具体多肽相关、并且例如但不限于包含一定氨基酸序列的合适的连接子，所述氨基酸序列长度优选为9个或9个以上氨基酸、更优选为至少17个氨基酸，例如约20至40个氨基酸。然而，上限并不关键，该上限是由于与例如这些多肽的生物医药生产的便利性的相关的原因而选择的。
连接序列可为天然存在序列或非天然存在序列。若用于治疗目的，则在给予本发明的双特异性结合分子的受试者中所述连接子优选为非免疫原性的。
一组适用连接序列为如WO 96/34103及WO 94/04678中所述源自重链抗体铰链区的连接子。
其他实例为聚丙氨酸连接序列，例如Ala-Ala-Ala。连接序列的其他优选实例为不同长度的Gly/Ser连接子，例如(glyx sery)z连接子，包括(gly4 ser)3、(gly4 ser)4、(gly4 ser)、(gly3 ser)、gly3和(gly3 ser2)3。
连接子的一些非限制性实例显示于图40及48中，例如以下连接子：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS;SEQ IDNO:90);
GGGGSGGGS(9GS;SEQ ID NO:91);
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(40GS;SEQ ID NO:92).
若双特异性结合分子通过聚合物例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分的连接进行修饰，则连接序列优选包括允许连接区域中的此修饰(例如聚乙二醇化)的氨基酸残基，例如半胱氨酸或赖氨酸。
适用于聚乙二醇化的连接子的实例为：
GGGGCGGGS(“GS9,C5”,SEQ ID NO:93);
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25,C5,SEQ ID NO:94)
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG  ("GS27,C14",SEQ  IDNO:95),
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS("GS35,C 15",SEQ ID NO:96)，和
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35,C5”,SEQ ID NO:97)。
此外，连接子也可为例如于WO 04/081026中所示的聚(乙二醇)部分。
在另一实施方案中，免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一个或两个连接子)，例如另一多肽来彼此连接，该另一多肽在一个优选但非限制性实施方案中可为如上所述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可为基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性质的生物效应或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。例如但不限于，该部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。
根据一个优选的实施方案，尤其在欲使用或用作治疗剂时，本发明的双特异性结合分子包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”定义为(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50%所花费的时间。
更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合至免疫球蛋白单一可变域且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。
在另一实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(brinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。
根据一个特别优选的实施方案，该部分为白蛋白结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白结合VHH域。
若欲在人中使用，则该白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人化白蛋白结合VHH域。
结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO 2006/122786中。特别地，适用的白蛋白结合VHH为ALB 1及其人化对应物ALB 8(WO 2009/095489)。然而，也可使用在以上专利公开案中提及的其他白蛋白结合VHH域。
具体适用的白蛋白结合VHH域为由显示于SEQ ID NO:98中的氨基酸序列组成或含有该氨基酸序列的ALB8。
根据本发明的另一实施方案，优选呈VHH形式的两个免疫球蛋白单一可变域可融合至例如公开于WO 01/79271及WO 03/59934中的血清白蛋白分子。如例如于WO01/79271中所述，融合蛋白可通过以下常规重组技术获得：将编码血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至编码VEGF结合分子的DNA，将所得构建体插入适于在所选宿主细胞(例如酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或细菌细胞)中表达的质粒中，接着用融合的核苷酸序列转染该宿主细胞，并使之在合适条件下生长。适用于HSA的序列显示于SEQ IDNO:99中。
根据另一实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO 04/060965。
用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOF Corporation,Japan购得，所述试剂例如SunbrightEA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如SunbrightME-100MA、SunbrightME-200MA及SunbrightME-400MA。
优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人,Protein Engineering 16,761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。
优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa至80kDa范围内。
关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何双特异性结合分子，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对其靶点的亲和性(例如通过本领域中所述的适合分析所测定，不使该亲和性降低50%以上、且更优选不使之降低10%以上)；和/或(5)不影响本发明的双特异性结合分子的任何其他所需性质。适合的PEG群组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售，例如可从NektarTherapeutics,USA或NOF Corporation,Japan购得，所述试剂例如SunbrightEA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如SunbrightME-100MA、SunbrightME-200MA及SunbrightME-400MA。
根据本发明的一个尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有40kDa或60kDa分子量的线性PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQ ID NO:93中所示的GS9连接肽的位置5处、在如SEQ ID NO:95中所示的GS27连接肽的位置14处、或在如SEQ ID NO:96中所示的GS35连接肽的位置15处、或在如SEQ IDNO:97中所示的35GS连接肽的位置5处的Cys残基处连接至所述多肽。
如以下化学式中所示，本发明的双特异性结合分子可经如上提及的PEG试剂之一(例如“SunbrightME-400MA”)来聚乙二醇化：
含有连接子和/或半衰期延长官能团的双特异性结合分子显示于SEQ IDNO:81及图48中。
根据另一实施方案，所述免疫球蛋白单一可变域为如本文所定义的域抗体。
存在于本发明的双特异性结合分子中的免疫球蛋白单一可变域的序列也可具有对应于天然存在VH域已经“骆驼化”的氨基酸序列，即通过以一个或多个存在于重链抗体VHH域中相应位置处的氨基酸残基置换常规4链抗体的天然存在可变重链氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。这可以本领域技术人员所了解的本身已知的方式进行，且另外参考WO 94/04678。所述骆驼化可优先发生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置处及所谓骆驼科印记残基处(也例如参见WO94/04678)。这些“人化”及“骆驼化”技术及与此相符的优选框架区序列的详述也可参见WO 2006/040153的第46页及第98页及WO2006/122786的第107页。
所述结合分子分别对Dll4或VEGF具有特异性，因为其包含分别与Dll4分子内或VEGF分子内的一个或多个表位特异性结合的一个或多个免疫球蛋白单一可变域。
结合分子对其抗原Dll4或VEGF的特异性结合可以以本身已知的任何适合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夹心式竞争分析)及本领域中本身已知的其不同变化形式来测定。
关于分别抗原Dll4或VEGF，免疫球蛋白单一可变域在物种方面分别不受限制。因此，若欲用于人中的治疗目的，则免疫球蛋白单一可变域优选分别结合人Dll4或人VEGF。然而，分别结合另一哺乳动物物种的Dll4或VEGF的免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽也在本发明的范围内。与一个物种形式的Dll4或VEGF结合的免疫球蛋白单一可变域，可与一个或多个其他物种的各别抗原发生交叉反应。例如，结合人抗原的免疫球蛋白单一可变域可表现出与一个或多个其他灵长类物种的各别抗原和/或与用于疾病动物模型(且特别是用于可通过抑制Dll4而调节的疾病及病症的动物模型)中的一个或多个动物物种(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、猪、犬)(例如本文提及的物种及动物模型)的抗原的交叉反应性。表现所述交叉反应性的本发明的免疫球蛋白单一可变域，在研究和/或药物研发中是有利的，因为其允许在公认的疾病模型(例如猴(特别是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中对本发明的免疫球蛋白单一可变域进行测试。
此外，所述结合分子不限于其所针对的抗原的特定域或抗原决定子或不由其所针对的抗原的特定域或抗原决定子限定。优选地，鉴于与除人以外的物种(其欲在治疗性Dll4/VEGF拮抗剂的研发期间将其用作动物模型)的一种或多种抗原分子的交叉反应性，结合分子识别与人抗原具有高一致度的各别抗原的区域中的表位。例如，鉴于使用小鼠模型，本发明的双特异性结合分子中含有的抗Dll4免疫球蛋白单一可变域识别完全或部分位于Dll4的EGF-2域内的表位，该EGF-2域在人与小鼠之间显示较高的一致度。
因此，根据一个优选的实施方案，本发明的双特异性结合分子包含Dll4结合分子，其为选自与完全或部分地包含于EGF-2域内的表位结合的免疫球蛋白单一可变域，该EGF-2域对应于SEQ ID NO:101的氨基酸残基252-282。
若本发明的双特异性结合分子含有包含多于一个免疫球蛋白单一可变域的双互补位Dll4结合分子，则至少一个免疫球蛋白单一可变域组分与上文所定义的EGF-2域内的表位结合。VEGF结合组分优选结合VEGF同工型VEGF165和/或VEGF121。
优选地，作为本发明的双特异性结合分子的组分的免疫球蛋白单一可变域以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM(如如实例5.7中所述地通过表面等离子共振分析所测定)的亲和性分别结合Dll4或VEGF。
优选地，如竞争ELISA分析(如实例5.1.中所述)中所测得，本发明的双特异性结合分子中含有的免疫球蛋白单一可变域具有的IC50值在10-6至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内，更优选在10-8至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内、且甚至更优选在10-9至10-10摩尔/升或10-10摩尔/升以下的范围内。
根据本发明的一非限制性但优选的实施方案，本发明的双特异性结合分子中含有的Dll4或VEGF结合免疫球蛋白单一可变域分别以10-5至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且优选10-7至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下、且更优选10-8至10-12摩尔/升(M)或10-12摩尔/升以下的解离常数(KD)，和/或以至少107M-1、优选至少108M-1、更优选至少109M-1，例如至少1012M-1的缔合常数(KA)；且特别是以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD分别结合Dll4或VEGF。可测定本发明的免疫球蛋白单一可变域针对Dll4的KD及KA值。
在另一方面中，本发明涉及编码本发明的双特异性结合分子的核酸分子。这些核酸分子在本文中也称为“本发明的核酸”且也可呈如本文定义的遗传构建体形式。本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已特定适于在预定宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子用途(codon usage)的DNA)。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸呈如上定义的基本上分离的形式。
本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供Dll4结合分子体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合调控组件(例如启动子、增强子、终止子等)。这些组件及其鉴于特测序列在特定宿主中的表达的选择为本领域技术人员的常识。对本发明Dll4结合分子的表达有用或必需的调控组件及其他组件的具体实例，例如启动子、增强子、终止子、整合因子(integration factor)、选择标记物、前导序列、报告基因(reporter gene)等公开于例如WO 2006/040153的第131至133页。
本发明的核酸可基于关于本文给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的双特异性结合分子和/或含有本发明的核酸的宿主细胞。根据一个特别优选的实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞；其他适用细胞为酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。适合真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞。适合酵母细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本发明还提供制造本发明的双特异性结合分子的方法，这些方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本发明的双特异性结合分子的条件下培养包含能够编码双特异性结合分子的核酸的宿主细胞；及
-从培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；及
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的双特异性结合分子。
对于工业规模生产而言，优选的宿主有机体包括适于大规模表达、生产及发酵，且特别是适于大规模医药表达、生产及发酵的大肠杆菌菌株、巴斯德毕赤酵母菌株及酿酒酵母菌株。
具体表达系统的选择部分取决于某些翻译后修饰的要求，更特别是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本发明的双特异性结合分子的产生，必需使用能够使所表达蛋白糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员将了解所获得的糖基化样式(即所连接残基的种类、数目及位置)将取决于用于表达的细胞或细胞株。
本发明的双特异性结合分子可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞溶质中、在胞间质(periplasma)中或在包涵体(inclusion body)中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
在另一方面中，本发明涉及氨基酸序列选自分别显示于SEQ ID NO:1至166、SEQ ID NO:333至353、或SEQ ID NO:375至395中的氨基酸序列的肽，及编码该肽的核酸分子。
这些肽对应于源自本发明的VHH的CDR3。这些肽，特别是编码这些肽的核酸分子，适用于CDR移植以置换免疫球蛋白链中的CDR3，或适用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制剂、DNA结合蛋白、细胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、双硫桥式肽(disulfde-bridged peptide)、脂质运载蛋白(lipocalin)或抗运载蛋白(anticalin)中，从而赋予此支架靶结合性质。CDR移植方法在本领域中是公知的且已广泛使用，例如用于使抗体人化(此通常包含将啮齿动物抗体的CDR移植在人抗体的Fv框架上)。
为了获得含有本发明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根据如例如由Daugherty等人,1991,Nucleic Acids Research,第19卷,9,2471-2476所述的分子生物学标准方法，例如通过基因合成、通过寡核苷酸退火或借助于重叠PCR片段来获得编码此分子的DNA。将VHH CDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人,2004,Protein Science,13,1882-1891公开。
本发明还涉及一种产物或组合物，其含有或包含至少一种本发明的双特异性结合分子及任选的这些组合物的本身已知的一种或多种其他组分，即视组合物的预定用途而定。
对于医药用途而言，本发明的双特异性结合分子或含有本发明的双特异性结合分子的多肽可调配成医药制剂或组合物，其包含至少一种本发明的双特异性结合分子及至少一种医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂和/或佐剂及任选的一种或多种其他医药活性多肽和/或化合物。借助于非限制性实例，这类调配物可呈适于口服给药、肠胃外给药(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、局部给药或通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂等给药的形式。根据给药方式，合适的给药形式可为固体、半固体或液体，且其制备方法及载剂将为本领域技术人员所了解且进一步在本文中公开。
因此，在另一方面中，本发明涉及一种药物组合物，其含有至少一种双特异性结合分子，特别是一种本发明的免疫球蛋白单一可变域或含有该免疫球蛋白单一可变域的多肽，及至少一种适合的载剂、稀释剂或赋形剂(即适于医药用途)及任选一种或多种其他活性物质。
本发明的双特异性结合分子可以以本身已知的任何适合方式调配及给予：特别是对于免疫球蛋白单一可变域，例如参考WO 04/041862、WO04/041863、WO 04/041865、WO04/041867及WO 08/020079，以及标准手册，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)；Remington,the Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或the Handbook of TherapeuticAntibodies(S.Dubel编),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
例如，本发明的免疫球蛋白单一可变域可以以用于常规抗体及抗体片段(包括ScFv片段及双特异抗体)及其他医药活性蛋白的本身已知的任何方式调配及给予。这些调配物及制备这些调配物的方法将为本领域技术人员所了解，且例如包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、腔内、动脉内或鞘内给药)或局部(即经皮或皮内)给药的制剂。
用于肠胃外给药的制剂可例如为适于输注或注射的灭菌溶液、混悬液、分散液或乳液。适用于这些制剂的载剂或稀释剂，例如包括(但不限于)灭菌水及医药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；含水油(water oil)；甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及矿物油、动物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其适合的混合物。通常将优选水性溶液或混悬液。
因此，本发明的双特异性结合分子可组合医药学上可接受的载体(例如惰性稀释剂或可吸收食用载剂)而全身给予(例如口服给予)。对于口服治疗性给药而言，可将本发明的双特异性结合分子与一种或多种赋形剂组合且以可摄取片剂、口腔锭、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这些组合物及制剂应含有至少0.1%的本发明的双特异性结合分子。其在组合物及制剂中的百分比当然可变化且宜介于既定单位剂型重量的约2%与约60%之间。本发明的双特异性结合分子在用于这些治疗的组合物中的量为获得有效剂量浓度的量。
所述片剂、丸剂、胶囊剂等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂及甜味剂或矫味剂，例如在WO08/020079的第143-144页上所提及的。当单位剂型为胶囊剂时，其除以上类型的物质外也可含有液体载剂，例如植物油或聚乙二醇。可存在各种其他物质作为包衣或者用以修饰固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可由明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有本发明的双特异性结合分子、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、色素及矫味剂(例如樱桃或橙香料)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何物质均应为医药学上可接受且在所用量下基本上无毒。此外，本发明的双特异性结合分子可并入持续释放制剂及装置中。
用于口服给药的制剂及调配物也可具有将使本发明构建体抵抗胃环境且进入肠中的肠溶包衣。更一般地，用于口服给药的制剂及调配物可经适当调配以递送进入胃肠道的任何所需部分中。此外，可使用适合的栓剂以递送进入胃肠道中。
如WO 08/020079第144及145页上所进一步公开，本发明的双特异性结合分子也可通过输注或注射而经静脉内或腹膜内给予。
对于本发明的双特异性结合分子的局部给药而言，如WO08/020079第145页上所进一步公开，一般需要将其与皮肤可接受的载剂(其可为固体或液体)组合而以组合物或调配物形式给予皮肤。
一般而言，本发明的双特异性结合分子在液体组合物(例如洗剂)中的浓度将为约0.1-25重量%、优选约0.5-10重量%。在半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度将为约0.1-5重量%、优选约0.5-2.5重量%。
本发明的双特异性结合分子的治疗中需要的量不仅依所选特定双特异性结合分子，而且也依给药途径、所治疗症状特性及患者年龄及症状而变化且将最终由当值医师或临床医师酌情决定。此外，本发明的双特异性结合分子的剂量视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。
所需剂量宜呈现为单次剂量或以适当间隔给予的分次剂量，例如呈每天两次、三次、四次或四次以上的亚剂量形式。所述亚剂量自身可经进一步划分，例如分成大量单个的松散间隔的给药；例如来自吹入器(insufflator)的多次吸入或通过对眼中多次滴眼。
给药方案可包括长期每天治疗。“长期”是指持续时间至少两周且优选数周、数月或数年。该剂量范围的必要修改可由一般技术人员仅使用本文教导的常规实验来确定。参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.第4版),Mack Publishing Co.,Easton,PA。若发生任何并发症，则该剂量也可由单个的医师来调整。
根据另一实施方案，本发明涉及双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域或含有其的多肽)的用途，其用于治疗目的，例如
-尤其在人中用于预防、治疗和/或减轻与Dll4对血管生成的介导效应相关或可通过用Dll4结合分子调节Notch信号传导路径来预防、治疗或减轻的病症、疾病或症状，
-在一治疗需要此治疗的患者的方法中，该方法包含给予有需要的个体医药活性量的至少一种本发明的双特异性结合分子(例如免疫球蛋白单一可变域)或含有所述的本发明的双特异性结合分子的药物组合物；
-用于制备预防、治疗或减轻与Dll4对血管生成的介导效应相关的病症、疾病或症状的药物；
-作为用于以上目的药物组合物或药物中的活性成分。
根据一个具体的方面，该病症、疾病或症状为如本文定义的癌症或癌性疾病。
根据另一方面，疾病为与Dll4对血管生成的介导效应相关或可通过用Dll4结合分子调节Notch信号传导路径来治疗或减轻的眼病。
视欲治疗的癌性疾病而定，本发明的双特异性结合分子可单独或组合一种或多种特别是选自以下的其他治疗剂加以使用：
化学治疗剂(如DNA损伤剂)，或抑制癌细胞中血管生成、信号转导路径或有丝分裂检查点(mitotic checkpoint)的治疗活性化合物。
其他治疗剂可任选作为同一医药制剂的组分与双特异性结合分子的给药同时给予、或在该双特异性结合分子的给药之前或之后给予。
在某些实施方案中，所述其他治疗剂可为(不限于，且在包括各别配位体的受体的情况下)一种或多种选自以下物质的抑制剂：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR。
其他治疗剂的其他实例为CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90的抑制剂；刺猬拮抗剂(hedgehog antagonist)；JAK/STAT、Mek、mTor、NFκB、蛋白酶体、Rho的抑制剂；wnt信号传导的抑制剂或遍在蛋白化(ubiquitination)路径的抑制剂或Notch信号传导路径的另一抑制剂。
Aurora抑制剂的实例为(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。
PLK抑制剂的一个实例为GSK-461364。
raf抑制剂的实例为BAY-73-4506(也为VEGFR抑制剂)、PLX 4032、RAF-265(此外也为VEGFR抑制剂)、索拉非尼(sorafenib)(此外也为VEGFR抑制剂)及XL 281。
KSP抑制剂的实例为伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。
src和/或bcr-abl抑制剂的实例为达沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228(也为IGF-1R抑制剂)、尼洛替尼(nilotinib)(也为PDGFR及cKit抑制剂)、伊马替尼(imatinib)(也为cKit抑制剂)及NS-187。
PDK1抑制剂的一个实例为BX-517。
Rho抑制剂的一个实例为BA-210。
PI3激酶抑制剂的实例为PX-866、BEZ-235(也为mTor抑制剂)、XL 418(也为Akt抑制剂)、XL-147及XL 765(也为mTor抑制剂)。
cMet或HGF的抑制剂的实例为XL-184(也为VEGFR、cKit、Flt3的抑制剂)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也为VEGFR的抑制剂)、MGCD-265(也为VEGFR、Ron、Tie2的抑制剂)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。
c-Myc抑制剂的一个实例为CX-3543。
Flt3抑制剂的实例为AC-220(也为cKit及PDGFR的抑制剂)、KW 2449、来他替尼(lestaurtinib)(也为VEGFR、PDGFR、PKC的抑制剂)、TG-101348(也为JAK2的抑制剂)、XL-999(也为cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR的抑制剂)、舒尼替尼(sunitinib)(也为PDGFR、VEGFR及cKit的抑制剂)及坦度替尼(tandutinib)(也为PDGFR及cKit的抑制剂)。
HSP90抑制剂的实例为坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。
JAK/STAT抑制剂的实例为CYT-997(其也与微管蛋白相互作用)、TG101348(也为Flt3的抑制剂)及XL-019。
Mek抑制剂的实例为ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。
mTor抑制剂的实例为西罗莫司脂化物(temsirolimus)、AP-23573(其也作为VEGF抑制剂)、依维莫司(everolimus)(此外也为VEGF抑制剂)、XL-765(也为PI3激酶抑制剂)及BEZ-235(也为PI3激酶抑制剂)。
Akt抑制剂的实例为哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立滨(triciribine)。
cKit抑制剂的实例为AB-1010、OSI-930(也作为VEGFR抑制剂)、AC-220(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、坦度替尼(也为Flt3及PDGFR的抑制剂)、阿西替尼(也为VEGFR及PDGFR的抑制剂)、XL-999(也为Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR的抑制剂)、舒尼替尼(也为Flt3、PDGFR、VEGFR的抑制剂)、及XL-820(也作为VEGFR及PDGFR抑制剂)、伊马替尼(也为bcr-abl抑制剂)、尼洛替尼(也为bcr-abl及PDGFR的抑制剂)。
刺猬拮抗剂的实例为IPI-609及CUR-61414。
CDK抑制剂的实例为塞来昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。
蛋白酶体抑制剂的实例为硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(也为NFκB的抑制剂)。
NFκB路径抑制剂的一个实例为NPI-0052。
遍在蛋白化路径抑制剂的一个实例为HBX-41108。
在优选的实施方案中，所述其他治疗剂为抗血管生成剂。
抗血管生成剂的实例为FGFR、PDGFR及VEGFR或各别配位体的抑制剂(例如VEGF抑制剂，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide)，这些药物选自(但不限于)贝伐单抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(也为CDK的抑制剂)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD (免疫调节药物)、沙立度胺衍生物CC-4047、来那度胺(lenalidomide)、ENMD 0995、IMC-D11、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(也为cKit及Flt3的抑制剂)、1B3、CP 868596、IMC3G3、R-1530(也为Flt3的抑制剂)、舒尼替尼(也为cKit及Flt3的抑制剂)、阿西替尼(也为cKit的抑制剂)、来他替尼(也为Flt3及PKC的抑制剂)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也为Flt3及cKit的抑制剂)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(也为Raf的抑制剂)、RAF-265(也为Raf的抑制剂)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(也为EGFR及Her2的抑制剂)、BAY-57-9352(也为Raf的抑制剂)、BAY-73-4506(也为Raf的抑制剂)、XL 880(也为cMet的抑制剂)、XL-647(也为EGFR及EphB4的抑制剂)、XL 820(也为cKit的抑制剂)及尼洛替尼(也为cKit及brc-abl的抑制剂)。
其他治疗剂也可选自EGFR抑制剂，其可为小分子EGFR抑制剂或抗EGFR抗体。抗EGFR抗体的实例(但不限于)为西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制剂的一个实例为吉非替尼(gefitinib)。EGFR调节剂的另一实例为EGF融合毒素。
尤其适用于与本发明的双特异性结合分子组合的EGFR及Her2抑制剂为拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、凡德他尼(也为VEGFR的抑制剂)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(也为VEGFR的抑制剂)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。
宜在治疗中与本发明的双特异性结合分子组合的其他药物为替坦托西莫单抗(tositumumab tiuxetan)及替坦伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(两种放射性标记的抗CD20抗体)、阿仑单抗(alemtuzumab)(一种抗CD52抗体)、地诺单抗(denosumab)(一种破骨细胞分化因子配位体抑制剂)、加利昔单抗(galiximab)(一种CD80拮抗剂)、奥法木单抗(ofatumumab)(一种CD20抑制剂)、扎木单抗(zanolimumab)(一种CD4拮抗剂)、SGN40(一种CD40配位体受体调节剂)、利妥昔单抗(rituximab)(一种CD20抑制剂)或马帕木单抗(mapatumumab)(一种TRAIL-1受体激动剂)。
可与本发明的双特异性结合分子组合使用的其他化学治疗药物选自但不限于激素、激素类似物及抗激素药(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷诺昔芬(raloxifene)、氟维司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、奥曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美坦(formestane))；LHRH激动剂及拮抗剂(例如乙酸性瑞林(goserelin acetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))；抗代谢物(例如抗叶酸物(如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed))、嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、地西他滨(decitabine)、奈拉滨(nelarabine)、及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(例如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素(anthracycline)(如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及伊达比星(idarubicin))、丝裂霉素-C(mitomycin-C)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、链佐星(streptozocin))；铂衍生物(例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、洛铂(lobaplatin)、沙铂(satraplatin))；烷化剂(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、羟基脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亚硝基脲(nitrosourea)(例如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类(vinca alkaloids)，如长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)及长春新碱(vincristine)；及紫杉烷类(taxanes)，如紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)及其调配物、拉诺他赛(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)；及埃博霉素(epothilone)，如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹隆(patupilone)、ZK-EPO)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及杂项化学治疗药物，例如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干扰素P、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、及卟菲尔钠(porfimer)、贝沙罗汀(bexarotene)、塞来考昔(celecoxib)。
可根据感兴趣的具体疾病或病症而使用本身已知的任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或动物模型或其任何组合来测试本发明的双特异性结合分子或含有所述分子的多肽以及包含本发明的双特异性结合分子的组合物的效能。适合的分析及动物模型将为本领域技术人员所了解且例如包括本文所述且用于以下实例中的分析，例如增殖分析。
附图说明
图1：人、恒河猴及短尾猴DLL4的氨基酸序列比对。
图2：人及小鼠DLL4缺失突变体(上标中为氨基酸域边界)。
图3：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。
图4：纯化的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图5：纯化的VHH  阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用(FMAT)。
图6：纯化的VHH阻断DLL4介导的Notch1裂解(报告基因)。
图7：纯化的VHH对重组人及小鼠DLL4的结合(ELISA)。
图8：纯化的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。
图9：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。
图10：亲和力成熟的VHH阻断hDLL4/hNotch1-Fc相互作用(ELISA)。
图11：亲和力成熟的VHH  阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch 1-Fc相互作用(FMAT)。
图12：纯化的VHH对人/小鼠DLL4的结合(ELISA)。
图13：纯化的亲和力成熟的VHH对重组人DLL1及人Jagged-1的结合(ELISA)。
图14：纯化的VHH对人/小鼠/短尾猴DLL4的结合(FACS)。
图15：VHH对Dll4介导的HUVEC增殖抑制效应的评估。
图16：DLL4介导的报道基因分析中的亲和力成熟的VHH。
图17：
A)VHH DLLBII129B05与人VH3/JH生殖系序列的序列比对。
B)VHH DLLBII136C07与人VH3/JH5生殖系序列的序列比对。
图18：
A)阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHOmDLL4/hNotch1-Fc相互作用的DLLBII129B05的纯化的序列最优化的VHH变异体(FMAT)。
B)阻断CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc相互作用的DLLBII136C07的纯化的序列最优化的VHH变异体(FMAT)。
图19：阻断DLL4介导的Notch1裂解的纯化的序列最优化的VHH(报告分析)。
图20：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)。
图21：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)。
图22：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图23：纯化的单价VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图24：单价VHH对重组人及小鼠VEGF(ELISA)的结合。
图25：单价VHH对人VEGF121的结合。
图26：纯化的VHH不结合VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF。
图27：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)。
图28：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)。
图29：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图30：格式化的VHH阻断hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图31：格式化的VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图32：格式化的VHH对小鼠及人VEGF的结合。
图33：格式化的VHH不结合VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF。
图34：格式化的VHH对VEGF121的结合。
图35：VHH VEGFBII23B04与人VH3/JH生殖系共同序列的序列比对。
图36：VEGFBII23B4的VHH变异体阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图37：VEGFBII23B4的序列最优化的克隆阻断hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)。
图38：VHH VEGFBII5B5与人VH3/JH生殖系共同序列的序列比对。
图39：循环1双特异性VEGF-DLL4VHH的形式。
图40：循环2双特异性VEGF-DLL4VHH的形式。
图41：VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环1)。
图42：VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环1)。
图43：CHO-hDLL4/hNotch1-Fc FMAT分析(在25μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环1)。
图44：VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环2)。
图45：VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环2)。
图46：CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc FMAT分析(在25μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环2)。
图47：DLL4介导的报告分析(在175μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环2)。
图48：序列最优化的双特异性VEGF-DLL4 VHH的形式。
图49：VEGF/VEGFR2 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环3)。
图50：VEGF/VEGFR1 AlphaScreen分析(在5μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环3)。
图51：CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc FMAT分析(在25μM HSA存在或不存在下)中的双特异性VHH(循环3)。
图52：所选VHH在人结肠癌的小鼠模型(SW620模型)中的效能：
A：SW620肿瘤生长动力学；
B：第21天研究结束时的绝对肿瘤体积；
C：体重随时间的变化。
材料及方法
a)过度表达人、小鼠及短尾猴Dll4的CHO及HEK293细胞株的产生
使用按照相应序列的5'及3'UTR设计的寡核苷酸分别从人成人正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)和小鼠心脏组织cDNA文库(分离自C57/Bl6株)扩增编码人(SEQ ID NO:101；NM_019074.2)和小鼠Dll4(NM_019454.3)的cDNA。将扩增子克隆至哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
使用根据亲缘关系接近的物种恒河猴的Dll4编码序列(猕猴(Macacamulatta)Dll4，SEQ ID NO:102；XM_001099250.1)的5'及3'UTR设计的引物，从短尾猴正常组织心脏cDNA文库(BioChain,Hayward,CA,USA)扩增短尾猴Dll4cDNA(参见图1)。将最终扩增子克隆于哺乳动物表达载体pCDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。显示短尾猴Dll4的氨基酸序列与恒河猴100%一致且与人99%一致(参见图1；与人序列的差异用粗体加下划线标示)。
为了产生过度表达人Dll4、小鼠Dll4或短尾猴Dll4的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，分别用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4、pcDNA3.1(+)-neo-mDll4或pcDNA3.1(+)-neo-cDll4对亲本CHO细胞进行电穿孔。过度表达人Dll4和小鼠Dll4的人胚肾(HEK293)细胞是通过分别使用pCDNA3.1(+)-neo-hDll4质粒或pCDNA3.1(+)-neo-mDll4质粒的Fugene(Roche)于HEK293亲本细胞株中进行脂质介导的转染而产生的。对于所有条件，转染子均通过添加1mg/mL遗传霉素(geneticin)(Invitrogen,Carlsbad CA,USA)来选择。
b)单克隆抗Dll4 IgG及Fab片段的产生
在US 2008/0014196(Genentech)中，公开了人/小鼠交叉反应性Dll4 mAb，其由Ridgway等人(2006)使用以显示大量异种移植模型中VEGF mAb和Dll4mAb对肿瘤生长的累加效应。将该抗Dll4 mAb及其相应的Fab纯化，以在生物化学/细胞分析及异种移植模型中针对噬菌体选择期间的特异性洗脱来评估该抗体(片段)性质。将所公开的Dll4 mAb的可变重链及轻链序列克隆入hIgG2aκ框架中，在HEK293细胞中短暂表达，且使用蛋白A色谱法自上清液纯化。纯化的Dll4 mAb在ELISA及FACS(使用CHO-mDll4及CHO-hDll4细胞)中显示对人Dll4和小鼠Dll4的结合，在Biacore中显示对两种生长因子直系同源物(orthologue)的低于纳摩尔的亲和性。
通过基于回译(back-translation)及使用Leto's基因最佳化软件(www.entechelon.com)针对大肠杆菌中的表达的密码子最佳化的基因组装来构建相应的Dll4Fab片段。设计用于组装可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)及重链(CH1)的恒定域1的寡核苷酸引物，并进行组装PCR。分别使用限制位点SfiI、AscI及限制位点KpnI、NotI，将编码VL+CL及VH+CH1的cDNA区段克隆入源自pUC119的载体中，该载体含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列。在Fab编码序列的框架内，表达载体编码C-末端HA及His6标签。Fab片段在大肠杆菌中表达为标记His6的蛋白，且随后通过固定化金属亲和性色谱法(IMAC)及尺寸排阻色谱法(SEC)从培养基纯化。描述了可变重链及可变轻链的相关氨基酸序列(分别为US 2008/0014196的SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)；完全重链及轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:419及420中。
c)用于表位定位的Dll4突变体的产生
为了鉴别包含可由抗Dll4VHH识别的表位的Dll4的细胞外域(ECD)，产生Dll4ECD的渐进缺失突变体。使用标准重组DNA技术，产生包含CMV启动子的哺乳动物表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，该启动子位于编码融合至聚His标签的Dll4ECD的一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上游(参见图2；上标为氨基酸域边界)。这些重组蛋白使用Freestyle 293表达系统(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)(可从其中收集条件培养基)在经短暂转染的HEK293细胞中表达，并通过IMAC纯化。只有缺乏EGF2样域的Dll4突变体才显示对上述人化人/小鼠交叉反应性抗Dll4 mAb(通过捕获型抗人IgG涂布的Biacore传感器芯片来固定)的减弱结合。已知该IgG在该Dll4域中具有特异性结合表位(专利申请案Genentech，US 2008/0014196A1)。
d)Dll4报告基因检测质粒的产生
基本上如Struhl及Adachi,Cell.1998年5月15；93(4):649-60所述，基于γ分泌酶介导的Notch1裂解以及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的核转位来开发报告基因检测(reporter assay)。将Gal4/VP16编码序列插入NICD编码序列中。有效杂交转录活化因子GAL4-VP16插入Notch1跨膜域的羧基末端，该因子由融合至单纯疱疹病毒转录活化域VP16的酵母GAL4DNA结合片段组成。γ分泌酶将该构建体裂解，导致Gal4/VP16 NICD融合蛋白的释放，其将该蛋白转位至核，在核中该融合蛋白将结合至(并以转录方式激活)含有强力GAL4-UAS启动子序列的共转染的荧光素酶报告基因质粒(Struhl,G.及Adachi,A.,Cell,第93卷,649-660,1998)。将人Notch1-Gal4/VP16表达框(expression cassette)克隆于pcDNA3.1(+)-neo(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。将pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]载体(Promega,Madison,WI,USA)用作荧光素酶报告基因质粒。
e)VEGF109的产生及功能性测试
将编码人血管内皮生长因子同工型VEGF165的受体结合域的cDNA(GenBank：AAM03108.1；AA残基27-135)克隆入pET28a载体(Novagen,Madison,WI)中，并在大肠杆菌(BL21 Star DE3)中过度表达为标记His的不溶性蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。离心收集细胞，并通过声波处理细胞片状沉淀物使细胞溶解。通过离心分离包涵体。在使用1%Triton X 100(Sigma-Aldrich)的洗涤步骤之后，使用7.5M盐酸胍来溶解蛋白，并使用尿素浓度从6M递减至0M的缓冲液通过连续多轮过夜透析将其再折叠。通过使用MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences)柱的离子交换色谱，随后以Superdex75 10/300 GL柱(Amersheim BioSciences)进行凝胶过滤来纯化所述再折叠的蛋白。蛋白纯度及均质性由SDSPAGE及蛋白印迹分析法(Westen blot)予以确认。此外，通过ELISA监测对VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗的结合活性。为此，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将1μg/mL重组人VEGF109固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。将VEGFR1、VEGFR2或贝伐单抗的系列稀释液添加至涂布VEGF109的培养板中，并使用碱性磷酸酶(AP)接合的Fc特异性羊抗人IgG(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA,USA)且接着使用底物PNPP(对硝基苯基磷酸)(Sigma-Aldrich)存在下的酶促反应来检测结合。VEGF109可结合VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗，表明产生的VEGF109具有活性。
f)VEGF165的KLH缀合及KLH缀合的VEGF165的功能性测试
根据制造商说明书，使用含有海水养殖钥孔血蓝蛋白(mariculturekeyhole limpet hemocyanin，mcKLH)的Imject免疫原EDC试剂盒(Pierce,Rockford,IL,USA)，将重组人VEGF165(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)接合至mcKLH。通过SDS-PAGE确认多肽对mcKLH的有效接合。用ELISA检验接合蛋白的功能：在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将2μg/mL KLH接合的VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。添加VEGFR1或VEGFR2的系列稀释液且使用辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合的Fc特异性羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA,USA)，接着使用底物TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测结合。KLH缀合的蛋白仍与VEGFR1、VEGFR2及贝伐单抗相互作用，从而证实仍然可影响VEGF165上的相关表位。
实施例1
使用来自不同物种的Dll4免疫来诱导美洲驼(llama)中的体液免疫反应
1.1.免疫化
在经兽医学学院的伦理委员会(the Ethical Committee of the faculty ofVeterinary Medicine，University Ghent,Belgium)批准之后，通过6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,US)使4只美洲驼(命名为第208、209、230、231号)免疫化。用Stimune(Cedi Diagnostics BV，Lelystad,The Netherlands)调配Dll4抗原。根据标准方案，通过4次交替皮下注射如上所述产生的过度表达人Dll4的CHO细胞及过度表达小鼠Dll4的CHO细胞来使另外三只美洲驼(命名为第127b、260、261号)免疫化。将细胞再混悬于DPBS中且在注射之前保存在冰上。此外，根据标准方案，通过4次交替肌内注射(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人Dll4及小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,US)来使另外三只美洲驼(命名为第282、283、284号)免疫化。第0天含有人Dll4的首次注射液是用弗氏完全佐剂(Complete Freund′s Adjuvant，Difco,Detroit，MI,USA)调配的，而随后含有人及小鼠Dll4的注射液是用弗氏不完全佐剂(Incomplete Freund′s Adjuvant，Difco,Detroit,MI,USA)调配的。
1.2.美洲驼中诱导的免疫反应的评估
为了通过ELISA评估动物中对抗人Dll4的免疫反应的诱导，在第0天(免疫前)、第21天及第43天(收集外周血液淋巴细胞[PBL]的时间)从美洲驼208、209、230和231收集血清；在第0天及第51天从美洲驼127b、260和261收集血清；且在第0天、第28天及第50天从美洲驼282、283和284收集血清。简言之，2μg/mL重组人Dll4或小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗美洲驼免疫球蛋白(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX,USA)，接着使用底物TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下的酶促反应来检测经特异性结合的免疫球蛋白，从而显示诱导对抗Dll4的显著抗体依赖性免疫反应。抗体反应是由表达常规抗体的B细胞谱系及表达仅有重链的抗体的B细胞谱系来发动，因为经特异性结合的免疫球蛋白可用特异性识别常规美洲驼IgG1抗体或仅有重链的美洲驼IgG2或IgG3抗体的抗体来检测(表2-A)。在所有注射小鼠Dll4的美洲驼中，抗体反应由表达常规抗体及仅有重链的抗体的、特异性针对小鼠Dll4的B细胞发动。另外，经细胞免疫的动物的血清效价是通过对过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞进行FACS分析来确认的(表2-B)。各美洲驼的Dll4血清效价反应见于表2中。
表2：抗体介导的对抗DLL4的特异性血清反应
A)ELISA(重组蛋白，涂布于固相上)
n/d：未测定
B)FACS(HEK293细胞上的天然表达的蛋白)
n/d：未测定
实施例2
仅有重链的抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备
在末次免疫原注射之后，从免疫化的美洲驼收集作为产生重链抗体的B细胞的来源的免疫组织。通常，收集每只动物在末次抗原注射后4天及8天收集的两个150ml血液样品，以及在末次抗原注射之后4天收集的一个淋巴结活组织检查。根据制造商说明书(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。如WO 05/044858中所述，从PBMC及淋巴结活组织检查提取总RNA，其用作扩增编码VHH的DNA区段的RT-PCR的起始物质。对于各免疫化的美洲驼，通过汇集从该动物收集的所有免疫组织分离的总RNA来构建文库。简言之，经PCR扩增的VHH谱系通过特定限制位点克隆入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。该载体源自pUC119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白编码序列、氨苄西林或羧苄西林抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列(pAX050)。载体编码与VHH编码序列同框的C-末端c-myc标签及His6标签。根据标准方案制备噬菌体，且在过滤灭菌后储存在4℃以供进一步使用。
实施例3
通过噬菌体展示进行Dll4特异性VHH的选择
将从所有美洲驼获得且克隆为噬菌体文库的VHH谱系用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括：i)Dll4蛋白形式(人Dll4(Met1-Pro524)及小鼠Dll4(Met1-Pro525)的C末端标记His的重组表达细胞外域(R&DSystems,Minneapolis,MN,USA)、或存在于过度表达Dll4的CHO或HEK293细胞上的全长人Dll4及小鼠Dll4)，ii)抗原呈递方法(直接涂布Dll4的培养板或通过生物素标签涂布Dll4的中性链亲和素(Neutravidin)培养板；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链亲和素涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度和iv)不同洗脱方法(通过胰蛋白酶的非特异性方法或通过同源受体Notch1/Fc嵌合体或抗Dll4 IgG/Fab的特异性方法)。所有选择均在Maxisorp 96孔培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。
如下进行选择：如上所述以多个浓度呈现用于固相及溶液相选择形式的Dll4抗原制备物。在与噬菌体文库一起培养2h、随后充分洗涤之后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合噬菌体30分钟。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则施用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF立刻中和蛋白酶活性。平行进行无抗原选择作为对照。将显示超过背景值(无抗原对照)的富集的噬菌体输出(phage output)用于感染大肠杆菌。经感染的大肠杆菌细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2%)上用于分析单个的VHH克隆。为了筛选特异性结合物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL 96深孔培养板中培养。通过在葡萄糖存在下添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方案制备周质(periplasmic)提取物(体积约80μL)。
实施例4
Dll4-Notch1 AlphaScreen和FMAT竞争分析中周质提取物的筛选
在人Dll4/人Notch1 AlphaScreen分析中筛选周质提取物以评估被表达的VHH的阻断能力。使用生物素(Sigma,St Louis,MO,USA)及生物素氨基己酸3-硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sigma,St Louis,MO,USA)对人Dll4进行生物素化。根据制造商说明书(Perkin Elmer,Waltham,MA,US)，使用偶合至受体微珠的抗Fc VHH来捕获Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。
为了评估VHH的中和能力，使周质提取物的系列稀释液与生物素化的人Dll4一起预培养。将受体微珠及链亲和素(streptavidin)供体微珠添加至该混合物中并进一步在室温培养1小时。通过使用680nm的激发波长及520nm的发射波长在Envision多标记培养板读取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上读取培养板来测量荧光。荧光信号减少表明生物素化的人Dll4对人Notch1/Fc受体的结合是由表达于周质提取物中的VHH阻断的。
或者，在人Notch1/Fc FMAT(荧光微容量分析技术)竞争分析中使用CHO-hDll4及CHO-mDll4细胞。用Alexa-647(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)随机标记重组的人Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。简言之，将5μL周质物质连同7,500个分别过度表达CHOhDll4或CHO-mDll4的细胞一起添加至100pM或175pM经标记的人Notch1/Fc中，且在培养2小时后进行读数。为了设定无竞争基线，用人Notch1/Fc~Alexa647至少30次重复测定细胞且由该基线计算抑制百分比。所有计算均基于FL1总信号，该信号包含每孔荧光的平均值乘以每孔计数数目。
从该筛选来选择抑制性VHH且测序。序列分析探明了属于40个不同B细胞系的166个独特的VHH。各B细胞系发现的变异体的总数见于表3中。周质筛选数据的概述在表4中给出。经选择用于进一步表征的独特的VHH的氨基酸序列显示于序列表(SEQ ID NO:4-20)及表5(指示了CDR和框架区)中。
表3：用于鉴别DLL4特异性VHH B细胞系的选择参数B细胞系VHH ID变异体
表4：含有表达的抗DLL4 VHH的周质提取物的筛选
(a)若鉴别了B细胞系内的多个独特变异体，则在括号内以斜体字给出细胞系成员的解离速率范围(最大值-最小值)或解离速率。
(b)异质拟合：测出的快速及缓慢解离速率。
实施例5
纯化的抗Dll4 VHH的表征
对选自实施例4中所述筛选的抑制性抗Dll4 VHH进行进一步纯化且加以表征。所选VHH在大肠杆菌TG1中表达为标记c-myc、His6的蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。这些提取物用作起始物质且通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到95%的纯度。
5.1.ELISA中阻断Dll4的VHH的评估
在人Dll4-人Notch1/Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简言之，将1μg/mL人Notch1/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使15nM固定浓度的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在被涂布的Notch1受体上再培养1小时。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(图3)。如上所述对人Dll4进行生物素化。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表6中。
表6：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  6B11   1.5
  55D12   12.3
  56A09   4.9
  56C04   33.9
  56H08   6.9
  57C11   17.3
  62C11   72.0
  96C03   38.4
  101G08   9.5
  104G01   1.1
  115A05   9.1
  抗DLL4 Fab   0.7
5.2.AlphaScreen中阻断Dll4的VHH的评估
简言之，在链亲和素涂布的供体微珠(20μg/mL)上捕获1nM生物素化的人Dll4，而在抗人Fc VHH涂布的受体微珠(20μg/mL)上捕获0.4nM的受体人Notch1(呈Fc融合蛋白形式)。两种负载微珠均与一定稀释度范围的竞争VHH一起培养(图4)。阻断人Dll4-人Notch1/Fc相互作用的VHH的IC50值见于表7中。
表7：hDLL4/hNotch1竞争AlphaScreen中VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  5B11   0.7
  6B11   0.3
  7A02   0.4
  7B05   1.1
  8A09   0.4
  8C11   0.7(a)
  19F04   0.05(a)
  55D12   2.3
  56A09   1.2
  56C04   5.4
  56H08   1.6
  57C11   2.2
  62C11   24.1
  115A05   5.0
  抗DLL4Fab   0.3
(a)部分抑制剂
5.3.抗Dll4VHH对人Notch1/Fc与在CHO细胞上表达的人或小鼠Dll4的结合的抑制
在如实施例4中概述的人及小鼠Dll4-人Notch1/Fc竞争性FMAT分析(图5)中来评估VHH的阻断能力。阻断人Notch1/Fc与在CHO细胞上表达的人或小鼠Dll4的相互作用的VHH的IC50值见于表8中。
表8：阻断人Notch1/Fc与表达在CHO细胞上的人或小鼠DLL4的相互作用的纯化的VHH的(平均)IC50值(nM)(FMAT)
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  6B11   8.9   -
  8A09   5.5   -
  19F04   33.0   -
  55D12   39.1   41.0
  56A09   10.6   15.0
  56C04   28.7   49.6
  56H08   22.0   33.7
  57C11   53.9   49.5
  62C11   172.2   106.3
  96C03   160.8   28.8
  101G08   24.6   92.1
  104G01   2.5   -
  115A05   22.0   43.0
  抗DLL4 Fab   5.4   2.3
5.4.报告基因检测中阻断Dll4的VHH的评估
为了评估所选VHH的效能，建立基于Notch1的γ分泌酶介导的裂解及Dll4刺激后Notch1细胞内域(NICD)的释放的报告基因检测。将Notch1-GAL4/VP16构建体与pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]报告质粒一起共转染于HEK细胞中，使融合蛋白短暂表达。通过与HEK293-hDll4稳定细胞株共培养来刺激这些经短暂转染细胞24小时。转染后48小时进行读数。VHH在开始共培养之前与HEK293-hDll4细胞一起预培养1小时且包括在共培养期间内(图6)。阻断Notch1的Dll4介导的裂解且随后阻断其NICD转位至受体细胞核的VHH的IC50值见于表9中。
表9：DLL4/Notch1报告基因测试中纯化的VHH的(平均)IC50值(nM)
  VHH ID   IC50
  56A09   540
  62C11   4663
  96C03   5156
  101G08   2760
  104G01   964
  115A05   1740
  抗DLL4 Fab   133
5.5.表位重新分级(epitope binning)
在例如基准抗体经结合时为了确定VHH是否可同时结合Dll4，通过Biacore T100仪器上的表面等离子共振(SPR)进行表位重新分级实验。抗-Dll4Fab片段以不可逆方式固定在CM5传感器芯片的参考及活性流量槽上。对于各样品(循环)，将人Dll4注射在活性及参考流量槽上且由抗Dll4Fab以可逆方式捕获。通过注射在固定表面上评估另外的VHH结合。所有VHH及抗Dll4Fab均以100nM注射，表面接触时间为120秒，且流速为10微升/分钟。使用10mM甘氨酸(pH 1.5)使表面再生。用Biacore T100评估软件来评估经处理的曲线。表10-A 表示所分析VHH及对照的依序注射/再生的途径。显示VHH DLLBII56A09(SEQ ID NO:15)、DLLBII96C03(SEQ ID NO:19)、DLLBII101G08(SEQ ID NO:10)及DLLBII115A05(SEQ ID NO:112)不另外地与由Dll4Fab捕获到的人Dll4结合。Dll4Fab的注射也未能另外地结合人Dll4，表明所有表位均已饱和。因此，可断定这些VHH识别了与用于结合人Dll4的Dll4Fab重叠的表位。人所独有的VHH DLLBII6B11(SEQ ID NO:5)及DLLBII104G01(SEQ ID NO:11)显示对捕获Dll4Fab的人Dll4的额外结合，表明对人Dll4具有特异性的这些VHH识别了与人/小鼠交叉反应性VHH不同的表位。
表10-A：抗DLL4VHH的表位重新分级，同时以DLL4Fab进行结合
  注射步骤   结合/再生   [样品]   结合水平(RU)
  1   hDLL4   100nM   1727
  2   DLL4Fab   100nM   无结合
  3   59A9   100nM   无结合
  4   6B11   100nM   405
  5   甘氨酸pH1.5   10mM   90
  6   hDLL4   100nM   1349
  7   104G1   100nM   276
  8   甘氨酸pH1.5   10mM   87
  9   hDLL4   100nM   1336
  10   甘氨酸pH1.5   10mM   70
  11   hDLL4   100nM   1333
  12   96C3   100nM   无结合
  13   101G8   100nM   无结合
  14   115A05   100nM   无结合
  15   甘氨酸pH1.5   10mM   70
5.6.使用Dll4缺失突变体的表位定位
在Biacore中评估VHH对这些Dll4突变体的结合。简言之，将VHHDLLBII101G08(SEQ ID NO:10)及DLLBII115A5SEQ ID NO:12)涂布于CM4传感器芯片上且横跨芯片注射200nM的各缺失突变体。对结合进行定性评估。未观测到DLLBII56A09(SEQ ID NO:15)、DLLBII101G08(SEQ ID NO:10)及DLLBII115A05(SEQ ID NO:12)分别对缺乏EGF样2域的人及小鼠Dll4突变体hDll4.1及mDll4.8的结合(表10-B)。使用hDll4/Dll4IgG竞争性ELISA的间接证据已指出了该观测结果。简言之，将1μg/mL Dll4IgG涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。使固定浓度6nM的生物素化的人Dll4与VHH的系列稀释液一起预培养1小时，此后将该混合物在经涂布的IgG上再培养1小时。使用辣根过氧化酶缀合的extravidin(Sigma,St.Louis,MO,USA)检测生物素化的人Dll4的残余结合(数据未显示)。如上所述对人Dll4进行生物素化。从专利文献得知单克隆抗Dll4IgG(Genentech,US2008/0014196A1)与Dll4的EGF样2域内的表位相结合。
表10-B：抗DLL4VHH的表位定位-结合DLL4缺失突变体
5.7.测定hDll4-VHH相互作用的亲和性
测定Dll4-VHH相互作用的亲和性的动力学分析通过Biacore T100仪器上的表面等离子共振(SPR)来进行。使用EDC及NHS通过胺偶合将重组人Dll4固定在CM5芯片上或在SA芯片(链亲和素表面)上捕获生物素化的人Dll4。将纯化的VHH或Fab片段在不同浓度(介于10与300nM之间)下注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离20分钟。在样品注射之间，用10mM甘氨酸(pH 1.5)及100mM HCl使表面再生。将HBS-N(Hepes缓冲液，pH 7.4)用作操作缓冲液。若有可能，则通过将1∶1相互作用模型(朗缪尔(Langmuir)结合)拟合在结合曲线上来评估数据。亲和性常数KD由所得缔合及解离速率常数(ka)及(kd)来计算。抗Dll4VHH的亲和性见于表11中。
表11：纯化的VHH对重组人DLL4的亲和性KD(nM)
(a)导致非1:1拟合的异质结合曲线
5.8.与直系同源物(mDll4，cDll4)和家族成员(hJagged-1，hDLL1)结合
为了测定对小鼠Dll4的交叉反应性，进行结合ELISA。简言之，重组小鼠Dll4(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP缀合物(Sigma,St Louis,MO,USA)来检测结合(图7)。测量对人Dll4的结合作为参考。EC50值总结于表12中。
表12：重组人DLL4及小鼠DLL4结合ELISA中VHH的EC50(nM)值
  rhDLL4   rmDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)
  5B11   1.8   -
  6B11   1.4   -
  7A02   1.4   -
  7B05   7.2   -
  8A09   0.9   -
  8C11   1.1   -
  17F10   0.9   -
  19F04   0.9   0.8
  55D12   13.1   30.0
  56A09   3.6   6.3
  56C04   44.3   244.0
  56H08   4.1   8.7
  57C11   7.9   83.4
  62C11   137.0   13.1
  96C03   86.5   8.7
  101G08   8.9   53.9
  104G01   8.4   -
  115A05   5.0   33.4
  抗DLL4 Fab   3.0   3.0
为了确定VHH的短尾猴交叉反应性，进行FACS结合实验。将表达短尾猴Dll4的HEK293细胞(短暂或稳定转染)用于VHH的滴定结合实验。在冰上培养30分钟后，洗涤所有样品且通过施用抗c-myc~Alexa647(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA,USA)来进行检测。过度表达人及小鼠Dll4的HEK293细胞作为参考。在FACS阵列(FACS Array)上测定平均MCF值且用于计算EC50值(参见图9)。
通过固相结合分析(ELISA)评估对同源配位体人DLL1和人Jagged-1结合的缺失。简言之，人DLL1(Alexis,San Diego,CA,USA)和人Jagged-1(Alexis,San Diego,CA,USA)在4℃以1μg/mL于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以系列稀释液形式施用VHH，并使用小鼠抗myc(Roche)和抗小鼠AP缀合物(Sigma,St.Louis,MO,USA)来检测结合。所有抗Dll4VHH均视为对这些同源配位体无交叉反应性(图8)。
5.9.抗Dll4 VHH阻断Dll4介导的HUVEC增殖的评估
在如Ridgway等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7所述的增殖分析(以经修饰的形式)中评估所选VHH的效能。简言之，96孔组织培养板使用涂布缓冲液(PBS，0.1%BSA)中的纯化的Dll4-His(RnD Systems；C-末端标记His的人Dll4，氨基酸27-524，0.75毫升/孔，10ng/ml)涂布。用PBS洗涤各孔，随后一式四份每孔接种4000个HUVEC细胞。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量细胞增殖。图15中所示的结果说明DLL4 VHHDLLBII101G08、DLLBII104G01、DLLBII115A05、DLLBII56A09和DLL4 Fab以剂量依赖性方式抑制对HUVEC增殖的DLL4依赖性效应，IC50值总结于表13中。所测试的VHH在10μM下完全抑制DLL4依赖性效应。
表13：DLL4增殖分析中获得的IC50值
  VHH/Fab   Fab   56A9   104G1   101G8   115A5
  IC50(nM)(实验1)   4.9   11.0   103   401   10002
  IC50(nM)(实验2)   5.6   6.8   32   112   N.D.
  n   2   2   2   2   1
实施例6
所选抗Dll4 VHH的亲和力成熟
使VHH DLLBII101G08和DLLBII115A05经受两个循环的亲和力成熟。
在第一循环中，使用易错PCR方法在框架(FW)和互补决定区(CDR)两者中随机引入氨基酸取代。用两轮基于PCR的方法(从Stratagene,La Jolla,CA,USA获得的Genemorph II随机诱变试剂盒)来进行诱变，该方法使用1ngDLLBII101G08或DLLBII115A05cDNA模板，随后使用0.1ng的第1轮产物进行第二次易错PCR。在精制步骤之后，将PCR产物通过独特限制位点插入经设计以便于噬菌体展示VHH文库的载体中。使用浓度递减的生物素化重组人DLL4(biot-rhDLL4)和胰蛋白酶洗脱来进行连续多轮的溶液中选择(in-solution selection)。也在第三轮中使用冷rhDLL4(至少比biot-rhDLL4过量100倍)进行亲和性驱动选择(affinity-driven selection)。关于鼠类DLL4的选择不包括在内，因为交叉反应性(的保留)是在筛选水平上加以评估的。使用源自pUC119的表达载体产生呈重组蛋白形式的单个的突变体，该表达载体含有LacZ启动子、氨苄西林抗性基因、多克隆位点及ompA前导序列(pAX50)。大肠杆菌TG1细胞经表达载体文库转化且涂布于琼脂培养板(LB+Amp+2%葡萄糖)上。从琼脂培养板挑取单一群落且在1mL 96深孔培养板中培养。通过添加IPTG(1mM)来诱导VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)且在ProteOn(BioRad,Hercules,CA,USA)解离速率分析中针对与重组人及小鼠Dll4的结合加以筛选。简言之，GLC ProteOn传感器芯片在“配位体通道”L2及L4(L1/L3作为参考通道)上由重组人Dll4涂布，而“配位体通道”L3及L6由小鼠Dll4涂布。将亲和力成熟克隆的周质提取物稀释10倍且横跨“分析物通道”A1-A6加以注射。计算存在于培养板中的野生型克隆的平均解离速率且作为计算解离速率增加的参考。
在第二循环中，通过同时将第一循环中鉴别的敏感位置随机化来产生组合文库。为此，使用在随机化位置处经简并的寡核苷酸(NNS)，通过重叠PCR来合成全长DLLBII101G8或DLLBII115A05cDNA且进行补救PCR。如上(实施例2)所述，使用特定限制位点将随机化的VHH基因插入噬菌体展示载体(pAX50)中。如先前所述制备单个的VHH克隆的周质提取物。
ProteOn解离速率分析中针对与重组人Dll4的结合进行的筛选鉴别出了解离速率增加多达38倍的克隆(DLLBII101G08)及多达11倍的克隆(DLLBII115A05)(表15)。
表15：DLLBII101G08和DLLBII115A05亲和力成熟克隆的解离速率筛选
在C-末端c-myc标签及(His)6标签的框架内，将DLLBII101G08和DLLBII115A05变异体中的最佳变异体克隆入表达载体pAX100中。重组小鼠Dll4的解离速率也得以增加。VHH是以标记His6的蛋白形式在大肠杆菌中产生，且通过IMAC及SEC来纯化。所选用于进一步表征的VHH序列分别见于表16(DLLBII101G08)和表17(DLLBII115A05)中。
实施例7
亲和力成熟的纯化的抗Dll4VHH的表征
如上(实施例5)所述，对VHH DLLBII101G08和DLLBII115A05的亲和力成熟的变异体进行表达与纯化。在以下中对VHH进行表征：hDll4-hNotch1竞争ELISA(实施例5.1；表17；图10)、CHO-hDll4/hNotch1-Fc和CHO-mDll4/hNotch1-Fc竞争FMAT(实施例5.3；表18；图11)、hDLL1和hJAG1-结合ELISA及hDll4/mDll4/短尾猴Dll4FACS(实施例5.8；表19；图13及14，表20)、在Biacore中测定对hDLL4及mDLL4的结合亲和性(实施例5.7；表19，图12)及DLL4介导的报告基因测试(实施例5.4；表21；图16)。
表征数据总结于表22中。总之，亲和力成熟的VHH显示亲和性及效能的明确增加，同时维持其对mDll4及短尾猴Dll4的结合且未观测到对hDLL1或hJAG1的结合。
表17：hDLL4/hNotch1-Fc竞争ELISA中亲和力成熟的VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  101G08   10.0
  129A03   1.8
  129B05   0.9
  129D08   1.2
  129E11   1.3
  129H07   1.0
  130B03   1.5
  130F06   1.3
  抗DLL4Fab   1.5
  VHH ID   IC50(nM)
  115A05   7.5
  133A05   2.1
  133A09   1.5
  133G05   2.0
  134D10   1.3
  136C07   1.4
  015   0.9
  抗DLL4 Fab   1.2
表18：阻断人Notch1/Fc与在CHO细胞上表达的人或小鼠DLL4的相互作用的亲和力成熟的纯化的VHH的IC50值(nM)(FMAT)
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  101G08(wt)   69.3   140.5
  129B05   7.4   14.4
  129D08   7.8   11.0
  129E11   8.1   12.3
  DLL4Fab   5.5   3.0
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  115A05(wt)   106.7   348.9
  133A09   6.6   18.6
  133G05   5.9   12.0
  136C07   8.0   31.2
  015   5.7   21.2
  DLL4 Fab   3.4   1.6
表19：亲和力成熟的纯化的VHH对重组人DLL4及小鼠DLL4的亲和性KD(nM)
表20：结合CHO-hDLL4、CHO-mDLL4及CHO-cDLL4的亲和力成熟的VHH的EC50(nM)值(FACS)
  hDLL4   mDLL4   cDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)   EC50(nM)
  101G08(wt)   17.5   11.2
  129B05   9.7   3.9   3.9
  129D08   9.6   3.7   3.8
  129E11   1.4   4.1   4.2
  抗DLL4 Fab   5.6   2.1   2.5
  hDLL4   mDLL4   cDLL4
  VHH ID   EC50(nM)   EC50(nM)   EC50(nM)
  115A05(wt)   11.3   13.8
  133A09   7.2   1.7   2.3
  133G05   8.5   2.8   2.7
  136C07   10.9   8.3   3.5
  015   14.8   7.0   5.1
  抗DLL4 Fab   5.6   2.1   2.5
表21：DLL4介导的报告基因测试中亲和力成熟的VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)
  101G08(wt)   1940
  129B05   60
  129D08   77
  129E11   98
  DLL4 Fab   16
  VHH ID   IC50(nM)
  115A05(wt)   1340
  133A09   87
  133G05   104
  133H05   25
  133H07   35
  134D10   18
  136C07   226
  015   18
  DLL4 Fab   16
实施例8
VHH DLLBII129B05和DLLBII136C07的序列最优化
将DLLBII129B05(图17-A)和DLLBII136C07(图17-B)的氨基酸序列与人生殖系VH3/JH共同序列进行比对。根据Kabat对残基编号，根据AbM定义(Oxford Molecular的AbM抗体模型化软件)CDR以灰色显示。
用下划线表示待突变成其人对应物的残基。
比对显示DLLBII129B05相对于参考生殖系序列含有4个框架突变。选择位置14、64、83及108处的非人残基经其人生殖系对应物取代。构建且产生一组在这些位置上具有不同人残基组合的2个DLLBII129B05变异体(DLLBII017和DLLBII018)(实施例6；AA序列列于表23中)。
对于DLLBII136C07，VHH相对于参考生殖系序列含有4个框架突变。选择位置39、40、83及108处的非人残基经其人生殖系对应物取代。产生一组在这些位置处具有不同人残基组合的4个DLLBII136C07变异体(DLLBII019、DLLBII020、DLLBII021、DLLBII022)(实施例6；AA序列列于表24中)。同时，通过引入N52S突变来移除位置N52-S52a处的潜在Asn脱酰胺位点(CDR2区域，参见图17-B加框的残基)。在第二循环中，将人化成果的可耐受突变与N52S取代相组合，从而产生序列最优化变异体DLLBII036。在CDR1中构建包括F29I突变的另一序列最优化变异体(DLLBII039)，该突变表明在DLL4介导的报告分析中增加DLLBII136C07效能(表21；图16)。DLLBII136C07的两个序列最优化变异体的序列列于表25中。
所有这些变异体均以纯化蛋白形式在以下中进行表征：CHO-hDLL4/hNotch1-Fc和CHO-mDLL4/hNotch1-Fc竞争性FMAT分析(实施例5.3；表26；图18)、DLL4介导的报告基因测试(实施例5.4；表27；图19)、DLL4HUVEC增殖分析(实施例5.9；表28)及测定亲和性的Biacore(实施例5.7；表29)。另外，在热位移分析(thermal shift assay)中测定各克隆的熔解温度(Tm)，该分析基于荧光信号在并入宝石橙(Sypro Orange)(Invitrogen)后的增加(Ericsson等人,Anal.Biochem.357(2006),第289-298页)。所有变异体在与亲本DLLBII129B05进行比较时均展示类似Tm值。表30总结了这些克隆在pH为7时的Tm值。
表23：亲本DLLBII129B05的单价序列最优化的抗DLL4VHH的序列ID及AA序列(FR：框架；CDR：互补决定区)
表24：亲本DLLBII136C07的单价序列最优化的抗DLL4VHH的序列ID及AA序列(第1循环)(FR：框架；CDR：互补决定区)
表25：亲本DLLBII136C07的单价序列最优化的抗DLL4VHH的序列ID及AA序列(第2循环)(FR：框架；CDR：互补决定区)
表26：CHO-hDLL4及CHO-mDLL4竞争FMAT中序列最优化
  hDLL4   mDLL4
  VHH ID   IC50(nM)   IC50(nM)
  129B05   8.2   15.9
  017   12.1   n/d
  018   11.0   15.4
  DLL4 Fab   5.8   4.3
n/d：未测定
n/d：未测定
表27：DLL4介导的报告基因测试中序列最优化的VHH的IC50(nM)值
n/d：未测定
表28：DLL4介导的HUVEC增殖分析中序列最优化的VHH的IC50(nM)值
  VHH ID   IC50(nM)   抑制(%)
  129B05   3.7   100
  018   5.3   100
  DLL4 Fab   4.7   100
  VHH ID   IC50(nM)   抑制(%)
  136C07   14.5   100
  036   7.6   100
  039   14.4   100
  DLL4 Fab   4.7   100
表29：序列最优化的VHH的亲和性(Biacore)(对于参考，DLL4Fab具有1.5nM的亲和性)
  VHH ID   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KD(nM)
  129B05   3.4E+05   7.9E-05   0.2
  017   3.7E+05   8.0E-05   0.2
  018   4.5E+05   9.4E-05   0.2
  VHH ID   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KD(nM)
  136C07   5.5E+05   5.2E-04   1.0
  019   5.7E+05   7.4E-04   1.3
  020   3.4E+05   9.3E-03   27
  021   5.6E+05   5.7E-04   1.0
  022   4.7E+05   2.2E-02   46
  036   6.6E+05   5.5E-04   0.8
  039   4.5E+05   8.1E-04   1.8
表30：pH为7时序列最优化的VHH的Tm值(℃)
  VHH ID   Tm(C)
  129B05   67.3
  017   68.1
  018   71.0
  VHH ID   Tm(C)
  136C07   68.1
  019   69.0
  020   69.0
  021   69.0
  022   70.3
  036   71.4
  039   69.4
实施例9
不同VEGF形式的免疫诱导美洲驼中的体液免疫反应
9.1 免疫化
在兽医学学院的伦理委员会(University Ghent,Belgium)批准之后，根据标准方案以6次肌内注射(以每周一次的间隔，每次给药100或50μg)重组人VEGF109来使4只美洲驼(命名为第264、265、266、267号)免疫化。第0天的首次注射液是用弗氏完全佐剂(Difco,Detroit,MI,USA)调配的，而随后注射液是用弗氏不完全佐剂(Difco,Detroit,MI,USA)调配的。此外，根据以下方案使四只美洲驼(命名为第234、235、280及281号)免疫化：5次肌内注射KLH缀合的人VEGH165(以两周一次的间隔，每次给药100或50μg)，随后4次肌内注射人VEGF109(首次给药100μg，2周后以每周一次的间隔给药3次，每次给药50μg)。
9.2 美洲驼中VEGF诱导的免疫反应的评估
为了监测VEGF特异性血清效价，建立ELISA分析，其中将2μg/mL重组人VEGF165或VEGF109在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加血清稀释液之后，使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗美洲驼免疫球蛋白(Bethyl LaboratoriesInc.,Montgomery,TX,USA)，随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测所结合的总IgG。对于美洲驼264、265、266及267，进行另一ELISA，评估对抗VEGF165及VEGF109的同型特异性反应。依次使用特异性识别常规美洲驼IgG1及仅有重链的美洲驼IgG2及IgG3的小鼠mAb[Daley等人(2005).Clin.Diagn.Lab.Imm.12:380-386]、兔抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测同型特异性反应。使用TMB作为显色底物来开发ELISA且在450nm下测量吸光度。各美洲驼的血清效价见于表31中。
表31：对抗VEGF165及VEGF109的抗体介导的特异性血清反应。ELISA(经重组蛋白涂布的固相)
n/d：未测定
实施例10
通过噬菌体展示进行VEGF特异性VHH的选择
仅有重链的抗体片段谱系的克隆及噬菌体的制备如实施例2中所述来进行。VHH噬菌体文库用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括i)VEGF蛋白形式(rhVEGF165、rhVEGF109或rmVEGF164)，ii)抗原呈递方法(固相：直接涂布或通过生物素标签涂布于中性链亲和素涂布的培养板上；溶液相：在溶液中培养，随后在中性链亲和素的涂布培养板上捕获)，iii)抗原浓度及iv)洗脱方法(胰蛋白酶洗脱或使用VEGFR2的竞争性洗脱)。所有选择均在Maxisorp 96孔培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中进行。
如下进行选择：在室温将噬菌体文库与可变浓度的VEGF抗原(在溶液中或固定于固体支撑物上)一起培养。在培养2小时且充分洗涤之后，将结合的噬菌体洗脱。若胰蛋白酶用于噬菌体洗脱，则通过添加0.8mM蛋白酶抑制剂AEBSF即刻中和蛋白酶活性。将显示超过背景值的富集的噬菌体输出用于感染大肠杆菌。将感染大肠杆菌的细胞用于制备下一轮选择的噬菌体(噬菌体补救)或接种于琼脂培养板(LB+amp+葡萄糖2%)上用于分析单个的VHH克隆。为了筛选特异性结合物的选择输出，从琼脂培养板挑取单一群落且使其在1mL 96深孔培养板中生长。通过添加IPTG(终浓度为0.1-1mM)来诱导受LacZ控制的VHH表达。根据标准方法制备周质提取物(体积约80μL)。
实施例11
VEGF结合(非受体阻断)及VEGF阻断(受体阻断)VHH的鉴定
通过ELISA测试周质提取物对人VEGF165的结合。简言之，在4℃于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将2μg/mL重组人VEGF165固定过夜。用酪蛋白溶液(1%)阻断各孔。在添加通常稀释10倍的周质提取物之后，使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)来检测VHH结合。将显示ELISA信号高于背景值3倍以上的克隆视为VEGF结合VHH。
此外，在人VEGF165/人VEGFR2AlphaScreen分析中筛选周质提取物以评估VHH的阻断能力。使用磺基-NHS-LC生物素(Pierce,Rockford,IL，USA)对人VEGF165进行生物素化。根据制造商说明书(Perkin Elmer,Waltham,MA,US)，使用偶合至受体微珠的抗人Fc VHH来捕获人VEGFR2/Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。为了评估VHH的中和能力，用含有0.03%吐温20(Tween 20，Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液将周质提取物稀释25倍且在室温(RT)下与0.4nM生物素化的人VEGF165一起预培养15分钟。将受体微珠(10μg/ml)及0.4nM VEGFR2huFc添加至该混合物中且在室温于黑暗中再培养1小时。随后添加供体微珠(10μg/ml)，接着在室温于黑暗中培养1小时。通过使用680nm的激发波长及介于520nm与620nm之间的发射波长在Envision多标记培养板读取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上读取培养板来测量荧光。将含有无关VHH的周质提取物用作阴性对照。含有能够使荧光信号相对于阴性对照信号减少60%以上的抗VEGF165VHH的周质提取物鉴别为击中物(hit)。AlphaScreen中鉴别出的所有击中物均在竞争ELISA中加以确认。为此，将1μg/mL人VEGFR2嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在固定浓度(4nM)的生物素化的人VEGF165的存在下，在含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma-Aldrich)的PBS缓冲液中培养稀释5倍的周质提取物。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)来检测这些VHH/bio-VEGF165复合物对人VEGFR2嵌合体涂布的培养板的结合。选择用于进一步表征的抑制性(受体阻断)VHH及VEGF结合(非受体阻断)VHH的VHH序列ID及相应AA序列分别列于表32及表33中。
表32：选择用于进一步表征的单价受体阻断抗VEGF VHH的序列ID及AA序列(FR：框架；CDR：互补决定区)
表33：选择用于进一步表征的单价非受体阻断抗VEGF VHH的序列ID和AA序列(FR：框架；CDR：互补决定区)
在Biacore(Biacore T100仪器，GE Healthcare)上分析受体阻断VHH的解离速率。将HBS-EP+缓冲液用作操作缓冲液且在25℃进行实验。重组人VEGF165通过胺偶联(使用EDC及NHS)以不可逆方式被捕获在CM5传感器芯片上直至+/-1500RU的目标程度。在固定之后，注射10分钟1M乙醇胺(pH8.5)来使表面失活。参考表面分别用EDC/NHS及乙醇胺来活化及失活。VHH的周质提取物在操作缓冲液中稀释10倍以45μl/分钟注射2分钟且使其解离10或15分钟。
在不同样品之间，用再生缓冲液使表面再生。通过减去关于参考通道的曲线及空白操作缓冲液注射而对数据进行双重参考处理。通过在Biacore T100评估软件v2.0.1中拟合两阶段衰减模型(two phase decay model)来评估经处理曲线的解离阶段。快速kd、缓慢kd及快速%的值列于表34中。
表34：用Biacore测定受体阻断VHH的解离速率
  VHH ID   kd(快速)   kd(缓慢)   快速%   结合水平(RU)
  VEGFBII23B04   8.80E-03   4.00E-05   12   768
  VEGFBII24C04   1.30E-02   3.40E-05   17   456
  VEGFBII23A06   1.70E-02   3.70E-05   13   547
实施例12
纯化的抗Dll4 VEGF VHH的表征
选择以下三个抑制性抗VEGF VHH以纯化蛋白形式来进一步表征：VEGFBII23B04、VEGFBII24C04和VEGFBII23A06。这些VHH在大肠杆菌TG1中表达为c-myc、标记His6的蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。这些提取物用作起始物质通过IMAC及尺寸排阻色谱法(SEC)纯化VHH。最终VHH制备物经SDS-PAGE评估显示了95%的纯度。
12.1 在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估
在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断ELISA中评估VHH的阻断能力。简言之，将1μg/mL VEGFR2-Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在4nM生物素化的VEGF165存在下培养含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR2的残余结合。贝伐单抗(Avastin)及雷珠单抗(Ranibizumab，Lucentis)作为对照一起进行处理。图20中显示剂量抑制曲线，表35中总结了相应的IC50值和抑制%。
表35：单价VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争ELISA中的IC50(nM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII23B04   2.1   100
  VEGFBII23A06   3.0   100
  VEGFBII24C04   2.5   100
  雷珠单抗   1.6   100
  贝伐单抗   1.7   100
12.2 在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中对阻断人VEGF165/VEGFR2的VHH的评估
也在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断ELISA中评估VHH。简言之，将2μg/mL VEGFR1-Fc嵌合体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)涂布于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在0.5nM生物素化的VEGF165存在下培养含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围1mM-64pM)。使用辣根过氧化酶(HRP)缀合的extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)及TMB作为底物来检测bio-VEGF165对VEGFR1的残余结合。将贝伐单抗、雷珠单抗及无关VHH(2E6)作为对照一起进行处理。图21中显示剂量抑制曲线，表36中总结了相应的IC50值和抑制%。
表36：单价VHH在hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争ELISA中的IC50(nM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII23B04   0.5   64
  VEGFBII23A06   0.9   55
  VEGFBII24C04   0.8   71
  雷珠单抗   1.2   91
  贝伐单抗   1.5   96
12.3 在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH
也在人VEGF165/人VEGFR2-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：200nM-0.7pM)添加至4pM bio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR2-Fc(0.4nM)及抗Fc VHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图22中显示剂量-反应曲线。表37中概述阻断人VEGF165与人VEGFR2-Fc相互作用的VHH的IC50值。
表37：VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争AlphaScreen中的IC50(pM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(pM)   %抑制
  VEGFBII23B04   160   100
  VEGFBII23A06   250   100
  VEGFBII24C04   250   100
  雷珠单抗   860   100
12.4 在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估抗VEGF165VHH
亦在人VEGF165/人VEGFR1-Fc阻断AlphaScreen中评估VHH的阻断能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：500nM-1.8pM)添加至0.4nM bio-VEGF165中且培养15分钟。随后添加VEGFR1-Fc(1nM)及抗Fc VHH涂布的受体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在黑暗中培养1小时后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图23中显示剂量-反应曲线。表38中总结了阻断人VEGF165与人VEGFR1-Fc相互作用的VHH的IC50值和抑制%。
表38：VHH在hVEGF165/hVEGFR1-Fc竞争AlphaScreen中的IC50(nM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII23B04   0.9   41
  VEGFBII23A06   0.4   46
  VEGFBII24C04   0.2   53
  雷珠单抗   3.3   79
12.5 人VEGF165-VHH相互作用的亲和性的测定
在Biacore T100仪器上通过SPR分析VHH VEGFBII23B4与hVEGF165的结合动力学。通过胺偶合(使用EDC及NHS)将重组人VEGF165直接固定在CM5芯片上。在介于10与360nM之间的不同浓度下分析VHH。样品注射2分钟且使其在45μl/分钟的流速下解离多达20分钟。在样品注射之间，用100mM HCl使芯片表面再生。HBS-EP+(Hepes缓冲液(pH 7.4)+EDTA)用作操作缓冲液。通过Biacore T100评估软件v2.0.1使用两态反应模型(TwoState Reaction model)拟合结合曲线。计算出的抗VEGF VHH的亲和性列于表39中。
表39：纯化的VHH对重组人VEGF165的亲和性KD(nM)
(a)导致非1∶1拟合的异质结合曲线，通过Biacore T100评估软件v2.0.1使用两态反应模型来拟合曲线
12.6 对小鼠VEGF164的结合
使用结合ELISA来确定对小鼠VEGF164的交叉反应性。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将重组小鼠VEGF164(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中之一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图24)。包括作为阳性对照的小鼠VEGF164反应性mAb。还测量对人VEGF165的结合作为参考。EC50值总结于表40中。
表40：VHH在重组人VEGF165及小鼠164结合ELISA中的EC50(pM)值
 rhVEGF165   rmVEGF164
  VHH ID  EC50(pM)   EC50(pM)
  VEGFBII23B04  297   NB
  VEGFBII24C04  453   NB
  VEGFBII23A06  531   NB
NB：无结合
12.7 对VEGF121的结合
通过固相结合ELISA评估对重组人VEGF121的结合。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将重组人VEGF121(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以于含有0.1%酪蛋白及0.05%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中之一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP缀合物(DAKO)、随后在底物TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下进行酶促反应来检测结合(图25)。将VEGFR2的系列稀释液作为阳性对照一起进行处理。EC50值总结于表41中。
表41：单价VHH在重组人VEGF121结合ELISA中的EC50(pM)值
  VHH ID   EC50(pM)
  VEGFBII23B04   510
  VEGFBII24C04   792
  VEGFBII23A06   928
12.8 对VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合
通过固相结合ELISA评估对VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF的结合。简言之，在4℃在1μg/mL下于96孔MaxiSorp培养板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中将VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)涂布过夜。用酪蛋白溶液(1%的PBS溶液)阻断各孔。以一系列稀释液(浓度范围：500nM-32pM)的形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠AP缀合物(Sigma,St Louis,MO,USA)来检测结合。将适当受体的系列稀释液作为阳性对照一起进行操作，且用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG(Fc特异性抗体)(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.,WestGrove,PA,USA)、随后在底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(Pierce,Rockford,IL，USA)存在下进行酶促反应来检测。图26中显示VHH及对照的剂量-反应曲线。结果显示未检测到所选VHH对VEGFB、VEGFC、VEGFD或PlGF的结合。
12.9 表位重新分级
进行基于Biacore的表位重新分级实验，以研究哪些VEGF结合物可结合与VEGFBII23B04类似或重叠的表位。为此，将VEGFBII23B04固定在CM5传感器芯片上。对于各样品，人VEGF165通过芯片表面且由VEGFBII23B4以可逆方式捕获。接着在240秒的表面接触时间并以10微升/分钟的流速注射纯化的VHH(100nM)或周质提取物(稀释10倍)。在不同样品之间，用再生缓冲液(100mM HCl)使芯片表面再生。用Biacore T100评估软件来评估经处理的曲线。VHH可划分为两组：对捕获VEGFBII23B04的VEGF165产生额外结合的第1组，以及不能同时与捕获VEGFBII23B04结合的VEGF165的第2组(所选的VHH 24C04、23A06及23B04在该组中)。
用相同的分析设置评估VEGFR1、VEGFR2、雷珠单抗及贝伐单抗是否能够与VEGFBII23B04同时结合人VEGF-165。表42显示对捕获VEGFBII23B04的VEGF165的额外结合反应。仅有VEGFR2是不能与捕获VEGFBII23B04的VEGF165结合的，从而强调了VEGFBII23B04对VEGF-VEGFR2相互作用的阻断能力。此外，这些数据显示VEGFBII23B04表位与贝伐单抗及雷珠单抗的表位并不对应。
表42：VEGFBII23B04的表位结合-基准抑制剂或同源受体对捕获VEGFBII23B04的VEGF 165的结合
  注射步骤   结合   样品   结合水平(RU)
  1   VEGF165   100nM   1727
  2   VEGFBII23B04   100nM   -
  3   雷珠单抗   100nM   763
  4   贝伐单抗   100nM   1349
  5   VEGFR1   100nM   1011
  6   VEGFR2   100nM   -
12.10 HUVEC增殖分析中抗VEGF VHH的表征
在增殖分析中评估所选VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿(supplement-starved)，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量增殖速率。显示于表43中的HUVEC增殖分析结果说明VEGFBII23B04及贝伐单抗抑制VEGF诱导的HUVEC增殖超过90%，其IC50<1nM。
表43：VEGF HUVEC增殖分析中单价VEGFBII23B04、VEGFBII23A06及VEGFBII24C04的IC50(nM)值和抑制%
12.11 HUVEC Erk磷酸化分析中抗VEGF VHH的表征
在HUVEC Erk磷酸化分析中评估所选VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞过夜经受血清饥饿(serum-starved)，接着用10ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。用PBS中的4%甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1及pERK2，M8159,Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161,Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化程度。如表44中所示，VEGFBII23B4及贝伐单抗以IC50<1nM抑制VEGF诱导的Erk磷酸化至少90%。
表44：VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中单价VEGFBII23B04的IC50(nM)值和抑制%
实施例13
多价抗VEGF阻断的VHH的产生
VHH VEGFBII23B04以基因改造方式融合至VEGFBII23B04中以产生同源二聚VHH或融合至不同VEGF结合VHH中以产生异源二聚(二价)VHH。为了产生二价VHH，一组10个独特的VEGF结合VHH通过长度为9或40的Gly-Ser柔性连接子以两种不同的定向连接至VEGFBII23B04。同源二聚VEGFBII23B04(VEGFBII010)及40个异源二聚二价VHH在大肠杆菌TG1中表达为标记c-myc、His6的蛋白。通过添加1mM IPTG来诱导表达且使其在37℃继续4小时。在旋转细胞培养物之后，通过冻融片状沉淀物来制备周质提取物。将这些提取物用作起始物质且通过IMAC及脱盐来纯化VHH，经SDS-PAGE评估得到90%的纯度。同源二聚及所选二价VEGF结合VHH的AA序列显示于SEQ ID NO:48-53及表45中。
表45：所选二价抗VEGF VHH的序列ID、VHH ID及AA序列
分别如实施例12.3及12.4中所述在VEGFR2和VEGFR1阻断AlphaScreen分析中测试40个二价VHH的嵌板。基于抑制的效能及最大抑制水平选择了5个最佳的二价VHH(VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及VEGFBII025-参见表45)以用于进一步表征。所选5个二价VHH在竞争性VEGFR2及VEGFR1 AlphaScreen中的筛选结果的概述显示于表46中。
表46：5个所选双特异性二价VHH在VEGF/VEGFR1和VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen分析中的效力及效能
实施例14
格式化的抗VEGF VHH的表征
分别如实施例12.1、12.2、12.3及12.4中所述在VEGFR2及VEGFR1阻断ELISA(分别参见图27及图28、表47及表48)及AlphaScreen分析(图29及30、表49及50)中并排比较VHH VEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、VEGFBII024和VEGFBII025。
表47：形式化VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争ELISA中的IC50(pM)值和抑制%
表48：形式化VHH在VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争ELISA中的IC50(pM)值和抑制%
表49：形式化VHH在hVEGF165/hVEGFR2-Fc竞争AlphaScreen中的IC50(pM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(pM)   %抑制
  VEGFBII010   16   100
  VEGFBII021   7   100
  VEGFBII022   7   100
  VEGFBII023   46   100
  VEGFBII024   50   100
  VEGFBII025   51   100
  雷珠单抗   600   100
表50：形式化VHH在VEGF165/hVEGFR1-Fc竞争AlphaScreen中的IC50(pM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(pM)   %抑制
  VEGFBII010   21   70
  VEGFBII021   12   100
  VEGFBII022   9   98
  VEGFBII023   48   87
  VEGFBII024   69   98
  VEGFBII025   71   82
  雷珠单抗   1300   87
此外，还测试了格式化的VHH阻断mVEGF164/mVEGFR2-huFc相互作用的能力。简言之，将于含有0.03%吐温20(Sigma)的PBS缓冲液中的纯化的VHH的系列稀释液(浓度范围：4μM-14.5pM)添加至0.1nM生物素化mVEGF164中且培养15分钟。随后，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1nM)及抗huFc VHH涂布的受体微珠(20μg/ml)，培养该混合物1小时。最后，添加链亲和素供体微珠(20μg/ml)且在培养1小时之后在Envision微定量盘读取器上测量荧光。图31中显示剂量-反应曲线。表51中总结了阻断小鼠VEGF164/VEGFR2-huFC相互作用的VHH的IC50值。
表51：格式化的抗VEGF VHH在mVEGF164/mVEGFR2-hFc竞争AlphaScreen中的IC50(pM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII022   108   100
  VEGFBII024   -   -
  mVEGF164   0.05   100
  雷珠单抗   -   -
也在ELISA中测试格式化的VHH与以下结合的能力：mVEGF164及rhVEGF165(实施例12.6；图32；表52)、VEGF121(实施例12.7；图34；表53)，以及VEGF家族成员VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(实施例12.8；图33)。如实施例12.5中所述分析人VEGF165的结合动力学。KD值列于表54中。
表52：格式化的VHH在重组人VEGF165及小鼠VEGF164结合ELISA中的EC50(pM)值
 rhVEGF165   rmVEGF164
  VHH ID  EC50(pM)   EC50(pM)
  VEGFBII010  428   -
  VEGFBII021  334   502
  VEGFBII022  224   464
  VEGFBII023  221   -
  VEGFBII024  320   -
  VEGFBII025  668   -
表53：格式化的VHH在重组人VEGF121结合ELISA中的EC50(pM)值
 rhVEGF121
  VHH ID  EC50(pM)
  VEGFBII010  920
  VEGFBII022  540
  VEGFBII024  325
  VEGFBII025  475
表54：格式化的纯化的VHH对重组人VEGF165的亲和性KD(nM)
  VHH ID   ka1(1/Ms)   kd1(1/s)   ka2(1/s)   kd2(1/s)   KD(nM)(a)
  VEGFBII010(b)   4.5E+05   1.7E-02   2.9E-02   1.3E-04   0.16
  VEGFBII021(b)   1.2E+06   1.1E-02   2.3E-02   1.9E-04   0.07
  VEGFBII022(b)   1.2E+06   9.1E-03   1.4E-02   2.6E-04   0.14
  VEGFBII023(b)   3.0E+05   1.8E-02   2.4E-02   2.7E-04   0.69
  VEGFBII024(b)   3.0E+05   1.3E-02   2.6E-02   2.8E-04   0.47
  VEGFBII025(b)   3.3E+05   1.7E-02   1.8E-02   3.7E-04   1.1
(a)KD=kd1/ka1*(kd2/(kd2+ka2))
(b)通过Biacore T100评估软件v2.0.1使用两态反应模型来拟合曲线
也在VEGF介导的HUVEC增殖及Erk磷酸化分析中测试VHHVEGFBII010、VEGFBII022、VEGFBII024和VEGFBII025。
在增殖分析中评估所选形式化VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量增殖速率。显示于表55中的结果说明形式化VHH及贝伐单抗抑制VEGF诱导的HUVEC增殖超过90%，其IC50<1nM。
表55：形式化VHH在VEGF HUVEC增殖分析中的IC50(nM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII010   0.22   95
  VEGFBII021   0.40   98
  VEGFBII022   0.34   100
  VEGFBII023   0.52   98
  VEGFBII024   0.38   96
  VEGFBII025   0.41   104
  贝伐单抗   0.21   92
也在HUVEC Erk磷酸化分析中评估所选形式化VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞过夜经受血清饥饿，接着用10ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。用PBS中的4%甲醛固定细胞且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1及2,M8159,Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161,Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化程度。如表56中所示，形式化VHH及贝伐单抗抑制VEGF诱导的Erk磷酸化超过90%，其IC50<1nM。
表56：格式化的VHH在VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中的IC50(nM)值和抑制%
实施例15
序列最优化
15.1 VEGFBII23B04的序列最优化
将VEGFBII23B04的氨基酸序列与人生殖系序列VH3-23(DP-47)及JH5进行比对，参见图35 SEQ ID NO:100。比对显示VEGFBII23B04相对于参考生殖系序列含有19个框架突变。选择位置14、16、23、24、41、71、82、83及108处的非人残基经其人生殖系对应物取代。产生一组在这些位置上具有不同组合的人残基的8个VEGFBII23B04变异体(AA序列列于表57中)。构建通过引入S60A突变来移除位置D59S60处的潜在异构化位点(CDR2区域，参见图35，指示为粗斜体残基)的另一变异体。
这些变异体以纯化蛋白形式在VEGF165/VEGFR2 AlphaScreen中进行表征(实施例12.3，图36)。在热位移分析中测定各克隆的熔解温度(Tm)，该分析基于荧光信号在并入宝石橙(Invitrogen)后的增加(Ericsson等人,Anal.Biochem.357(2006),第289-298页)。所有变异体显示与VEGFBII23B04相当的IC50及与亲本VEGFBII23B04相比类似或较高的Tm值。表58概述所测试9个克隆的IC50值、抑制%及pH为7时的Tm值。
表58：VEGFBII23B04的序列最优化的变异体的IC50(pM)值、抑制%及熔解温度(在pH为7时)
  VHH ID   IC50(pM)   %抑制   PH为7时的Tm(C)
  VEGFBII23B04(wt)   169   100   63
  VEGFBII111D05   209   100   68
  VEGFBII111G06   366   100   71
  VEGFBII112D11   221   100   70
  VEGFBII113A08   253   100   69
  VEGFBII113E03   290   100   68
  VEGFBII114C09   215   100   71
  VEGFBII114D02   199   100   74
  VEGFBII114D03   227   100   64
  VEGFBII118E10   189   100   62
在第二循环中，将人化成果(VEGFBII111G06)的可耐受突变与避免所选位点处的潜在翻译后修饰的突变(D16G、S60A取代及E1D突变)相组合，从而产生源自VEGFBII23B04的序列最优化克隆：VEGFBII0037。预期得到含有除I82M突变外与VEGFBII0037相同的所有取代的一个额外的序列最优化变异体(VEGFBII038)，因为此突变可能与效能的微小降低相关。两个序列最优化克隆的序列列于表59中。在VEGF165/VEGFR2阻断AlphaScreen(实施例13.3，图37)中对VEGFBII0037及VEGFBII0038进行表征，在如上所述的热位移分析中测定熔解温度且在Biacore(实施例13.5)中测定结合VEGF165的亲和性。2个序列最优化VHH的特征的概述于表60中。
表59：VHH VEGFBII23B04的序列最优化变异体的AA序列
表60：序列最优化的克隆VEGFBII037及VEGFBII038的IC50(pM)值、抑制%、熔解温度(在pH为7时)及亲和性(pM)
15.2 VEGFBII5B05的序列最优化
将VEGFBII5B05的氨基酸序列与人生殖系序列VH3-23/JH5进行比对；参见图38及SEQ ID NO:100。比对显示VEGFBII5B05相对于参考生殖系序列含有15个框架突变。选择位置23、60、83、105、108处的非人残基经其人生殖系对应物取代，同时选择位置44处的组氨酸由谷氨酰胺取代。构建具有6个所述突变的一个人化变异体(AA序列列于表61中)。
表61：VHH VEGFBII5B05的序列最优化变异体的AA序列(FR：框架；CDR：互补决定区)
通过引入M30I突变来移除位置M30处的潜在氧化位点(CDR1区域，参见图38，指示为粗斜体残基)，从而构建另一变异体。使用ProteOn测试两个变异体结合hVEGF165的能力。简言之，用人VEGF165涂布GLC ProteOn传感器芯片。将该变异体的周质提取物稀释10倍且横跨涂布有人VEGF165的芯片加以注射。计算解离速率且与亲本VEGFBII5B05的解离速率相比较。2个变异体的解离速率与亲本VEGFBII5B05的解离速率在相同范围内，表明所有突变均可耐受(表62)。
表62：序列最优化的变异体VEGFBII5B05的解离速率
  VHH ID   结合水平(RU)   kd(1/s)
  VEGFBII5B05   242   6.15E-02
  VEGFBII119G11   234   7.75E-02
  VEGFBII120E10   257   4.68E-02
在第二循环中，将人化成果的突变与M30I取代相组合，从而产生VEGFBII5B05的序列最优化克隆，命名为VEGFBII032。序列列于表63中。通过Biacore测定VEGFBII032的亲和性(参见实施例12.5)且在如上所述的热位移分析中测定熔解温度。序列最优化的VHH VEGFBII032的特征的概述于表64中。
表63：序列最优化的克隆VEGFBII032的AA序列(FR：框架；CDR：互补决定区)
表64：序列最优化克隆VEGFBII032的熔解温度(在pH为7时)及亲和性(nM)
在增殖分析中评估序列最优化克隆VEGFBII037及VEGFBII038的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量增殖速率。表65中显示的结果说明亲本VHH VEGFBII23B04的活性(效能及抑制度)保留于序列最优化克隆VEGFBII038中。
表65：序列最优化克隆VEGFBII037和VEGFBII038在VEGF HUVEC增殖分析中的IC50(nM)值和抑制%
  VHH ID   IC50(nM)   %抑制
  VEGFBII23B04   0.68   92
  VEGFBII037   1.54   78
  VEGFBII038   0.60   92
  贝伐单抗   0.29   94
实施例16
使用聚乙二醇化或抗血清白蛋白结合物作为半衰期延长部分的靶向VEGF及DLL4的双特异性VHH的构建及表征
在第一循环中，VEGFBII23B04及DLLBII101G08用作产生双特异性VHH VEGFDLLBII001-006的构建块。应用两种半衰期延长方法：i)聚乙二醇化或ii)与血清白蛋白结合VHH的遗传融合。构建块通过长度为9的Gly-Ser、长度为35的Gly-Ser或长度为35的Gly-Ser(Cys在位置15处)柔性连接子连接。所有6个双特异性VHH的形式及序列的概述见于表66-A(连接序列用下划线表示)、SEQ ID NO:68-73及图39中。
表66-A：靶向VEGF及DLL4的双特异性VHH的序列
为了探究抗VEGF相比于单价构建块VEGFBII23B04的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(实施例12.3；图41)及VEGF/VEGFR1-Fc(实施例12.4；图42)竞争AlphaScreen中分析所有6个VHH。这2个竞争分析也在将所述VHH与5μM人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表66-B中。
表66-B：VEGF/VEGFR1及VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen中的IC50值(nM)及抑制%(VHH形式的描述参见图39)
n/d：未测定
为了探究抗DLL4相比于单价构建块DLLBII101G08的阻断性质，在CHO-hDLL4/hNotch1-Fc竞争性FMAT分析(实施例4；图43)中测试所有6个VHH。该分析也在将所述VHH与25μM人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表67中。
表67：CHO-hDLL4竞争FMAT中的IC50值(nM)。VHH形式的描述参见图39
n/d：未测定
在第二循环中，构建7个靶向VEGF及DLL4的双特异性VHH(VEGFDLLBII010、VEGFDLLBII011、VEGFDLLBII012、VEGFDLLBII013、VEGFDLLBII014、VEGFDLLBII015、VEGFDLLBII016)。在这些构建体中，包括DLLBII101G08亲和力成熟VHH DLLBII129B05或DLLBII115A05亲和力成熟的VHH DLLBII136C07。另外，在2个构建体中包括包含VEGFBII23B04及VEGFBII5B05的二价抗VEGF VHH。应用两种半衰期延长方法：i)聚乙二醇化或ii)与血清白蛋白结合VHH的遗传融合。构建块通过长度为9的Gly-Ser、长度为35的Gly-Ser或长度为35的Gly-Ser(Cys在位置15处)柔性连接子连接。所有7个双特异性VHH的形式及序列的概述见于表68-A(连接序列用下划线表示)、SEQ ID NO:74-80及图40中。
为了探究抗VEGF相比于单价构建块VEGFBII23B04的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(实施例12.3；图44)及VEGF/VEGFR1-Fc(实施例12.4；图45)竞争AlphaScreen中表征所有7个VHH。这2个竞争分析也在将所述VHH与5μM人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表68-B中。
表68-A：靶向VEGF及DLL4的双特异性VHH的序列
表68-B：VEGF/VEGFR1及VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen中的IC50值(nM)及抑制%(VHH形式的描述参见图40；连接序列用下划线表示)SEQ IDNO:74-80
n/d：未测定
为了研究抗DLL4相比于单价亲和力成熟的构建块DLLBII129B05及DLLBII136C07的阻断性质，在CHOhDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc竞争性FMAT分析(实施例4；图46)及DLL4介导的报告基因测试(实施例12.5；图47)中评估所有7个VHH。这些分析也在将VHH与25μM(FMAT分析)或175μM(报告分析)人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表69中。
表69：CHO-hDLL4/CHO-mDLL4竞争FMAT及DLL4介导的报告基因测试中的IC50值(nM)(VHH形式的描述参见图40)。(*，无完全剂量反应曲线)
最后，在第三循环中，构建双特异性VHH A1、A2、A3及HSA1-6。以下构建块用于产生这些构建体：VEGFBII038(VEGFBII23B04的序列最优化变异体)、VEGFBII032(VEGFBII5B05的序列最优化变异体)、DLLBII018(DLLBII129B05的序列最优化变异体)及DLLBII039(DLLBII136C7的序列最优化变异体)。应用三个半衰期延长方法：i)聚乙二醇化，ii)与血清白蛋白结合VHH的遗传融合及iii)与人血清白蛋白遗传融合。构建块通过长度为9的Gly-Ser、长度为35的Gly-Ser或长度为35的Gly-Ser(Cys在位置15处)柔性连接子连接。所有3个双特异性VHH的形式及序列的概述见于表70-A、SEQID NO:81-89及图48中。
为了研究抗VEGF相比于单价序列最优化构建块VEGFBII038或双互补位序列最优化构建块VEGFBII022的阻断性质，在VEGF/VEGFR2-Fc(实施例12.3；图49)及VEGF/VEGFR1-Fc(实施例12.4；图50)竞争AlphaScreen中表征所有7个VHH。这2个竞争分析也在将所述VHH与5μM人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表70-B中。
表70-A：靶向VEGF及DLL4的双特异性VHH的序列
表70-B：VEGF/VEGFR1及VEGF/VEGFR2竞争AlphaScreen中的IC50值(nM)和抑制%(VHH形式的描述参见图48)。所有分子均在VEGF/VEGFR2AlphaScreen分析中显示100%抑制。
n/d：未测定
图例：
为了探究抗DLL4相比于单价序列最优化的构建块DLLBII018及DLLBII039的阻断性质，在CHO-hDLL4/hNotch1-Fc及CHO-mDLL4/hNotch1-Fc竞争性FMAT分析(实施例4；图51)中评估所有7个VHH。这些分析也在将所述VHH与25μM(FMAT分析)人血清白蛋白一起预培养之后进行。IC50值的概述显示于表71中。
表71：CHO-hDLL4/CHO-mDLL4竞争FMAT及DLL4介导的报告分析中的IC50值(nM)(形式的描述参见表70-A、图48及SEQ ID NO:81-89)。
n/d：未测定
图例
在VEGF增殖分析中评估双特异性VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞(Technoclone)过夜经受补充物饥饿，接着每孔4000个细胞一式四份接种于96孔组织培养板中。用33ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激细胞。如所指示，该分析在将VHH与520nM人血清白蛋白一起预培养之后进行。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量增殖速率。显示于表72中的结果说明双特异性VHH及贝伐单抗以IC50<1nM抑制VEGF诱导的HUVEC增殖超过90%。
表72：VEGF HUVEC增殖分析中双特异性VHH的IC50(nM)值和抑制%
图例
n/d：未测定
在VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中评估双特异性VHH的效能。简言之，使初级HUVEC细胞过夜经受血清饥饿，接着用10ng/mL VEGF在不存在或存在VHH下刺激5分钟。如所指示，该分析在将VHH与250nM人血清白蛋白一起预培养之后进行。用PBS中的4%甲醛固定细胞，且使用磷酸ERK特异性抗体(抗磷酸MAP激酶pERK1及2,M8159,Sigma)及多株兔抗小鼠免疫球蛋白-HRP缀合物(PO161,Dako)通过ELISA来测量ERK磷酸化水平。如表73中所示，双特异性VHH及贝伐单抗抑制VEGF诱导的Erk磷酸化超过90%，其IC50<1nM。
表73：双特异性VHH在VEGF HUVEC Erk磷酸化分析中的IC50(nM)值和抑制%
n/d：未测定
图例
在如Ridgwthey等人,Nature.2006年12月21日；444(7122):1083-7所述的Dll4HUVEC增殖分析中评估双特异性VHH的效能(以修饰的形式)。简言之，在涂布缓冲液(PBS，0.1%BSA)中，用纯化的Dll4-HiS(RnD Systems；C-末端标记His的人Dll4，氨基酸27-524，0.75毫升/孔，10ng/ml)涂布96孔组织培养板。用PBS洗涤各孔，随后一式四份每孔接种4000个HUVEC细胞。如所指示，该分析在将VHH与50μM人血清白蛋白一起预培养之后进行。在第4天通过引入[3H]-胸苷来测量细胞增殖。双特异性VHH及DLL4Fab的IC50值总结于表74中。
表74：双特异性VHH在Dll4介导的HUVEC增殖分析中的IC50(nM)值及抑制
图例
实施例17：
所选结合分子在人结肠癌的小鼠模型中的效能
在裸小鼠人结肠癌(细胞株SW620)的小鼠模型中评估三个所选VHHVEGFDLLBII010、VEGFDLLBII013和VEGFDLLBII015的效能。
从ATCC(CCL-227)得到SW620细胞。在37℃及0%CO2下于T175组织培养烧瓶中培养细胞。所用培养基为莱伯维兹氏L-15培养基(Leibovitz's L-15Medium，Gibco目录号11415)及10%胎牛血清(JRH目录号12103-1000ml)。培养物在分流比为1:10或1:20的分会合性(subconfluency)下进行分流。小鼠为7周龄无胸腺雌性BomTac:NMRI-Foxn1nu，购自Taconic,Denmark。为了产生皮下肿瘤，SW620细胞经胰蛋白酶化、洗涤、以每毫升5×107个细胞再混悬于PBS+5%FCS中。接着将含有5×106个细胞的100μl细胞混悬液皮下注射至小鼠右侧胁腹(每只小鼠一个部位)。当肿瘤良好地产生且已达到47至93mm3的体积时(注射细胞后10天)，将小鼠随机分配于治疗组与载体对照组之间。
用PBS稀释VHH。
剂量经计算分别为7.5mg/kg、2.5mg/kg及15mg/kg的Avastin(贝伐单抗)等效剂量(表75)。所有剂量均根据第0天所有小鼠的平均体重(27.7g)来计算，且以每只小鼠100μl的体积来给予。每天或每隔一天腹膜内给予VHH。第1天为治疗的第一天，第21天为治疗的最后一天。
每周三次(星期一、星期三及星期五)用测径器测量肿瘤直径。各肿瘤体积(以mm3计)系根据式“肿瘤体积=长度*直径2*π/6”来计算。为了监测治疗的副作用，每天检查小鼠的异常且每周三次(星期一、星期三及星期五)测定体重。在对照肿瘤达到平均约1000mm3的尺寸时处死动物。
在第21天实验结束时对肿瘤体积及体重的参数进行统计学评估。对于肿瘤体积，使用绝对值，且对于体重，使用相对于第1天初始体重的变化百分比。由于观测偏差，应用非参数方法。
出于描述性考虑，计算观测结果中位数、最小值及最大值的数量。为快速概述可能的治疗效果，将各治疗组的肿瘤体积的中位数T与参考对照组的中位数C相比较。
●相对肿瘤体积(T/C)
T / C = 100 * T d C d
●从第1天至第d天的肿瘤生长抑制(TGI)
TGI = 100 * ( C d - C 1 ) - ( T d - T 1 ) ( C d - C 1 )
其中
C1、T1=在第1天实验开始时对照组及治疗组中的中位肿瘤体积，
Cd、Td=在第d天实验结束时对照组及治疗组中的中位肿瘤体积。
将单侧递减威尔卡逊(Wilcoxon)试验用于比较三个VHH的剂量组与对照组的效果（肿瘤体积降低）以及不良事件（增重降低）。
调整肿瘤体积(效能参数)的p值以用于根据邦弗朗尼-荷姆(Bonferroni-Holm)进行多重比较，而保持体重(可耐受性参数)的p值不被调整，以便不致忽略可能的不良事件。
显著性水平固定在α=5%。将小于0.05的(经调整)p值视为治疗组之间具有差异；只要0.05≤p值<0.10，则差异视为指示性差异。
使用软件包SAS 9.2版(SAS Institute Inc.,Cary NC,USA)及Proc StatXacT(Cytel Software Corporation,Cambridge MA,USA)来制定统计学评估。
如图52、表75及76中所示，VEGFDLLBII013、VEGFDLLBII010及VEGFDLLBII015在SW620结肠癌模型中显示显著效能且耐受良好。
图52A显示SW620肿瘤生长动力学：具有SW620肿瘤的小鼠每天(空心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)或VEGFDLLBII015(VHH 3)或每隔一天(实心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)或VEGFDLLBII010(VHH 2)处理。将中位肿瘤体积随时间绘图。第1天为实验第一天，第21天为实验最后一天。图上方的三角指示处理天数。
图52B显示第21天研究结束时的绝对肿瘤体积：具有SW620肿瘤的小鼠每天(空心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)或VEGFDLLBII015(VHH 3)或每隔一天(实心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)或VEGFDLLBII010(VHH 2)处理。对第21天单个的绝对肿瘤体积绘图。每个符号表示一个单个的肿瘤。水平线表示中位肿瘤体积。
图52C显示体重随时间的变化；具有SW620肿瘤的小鼠每天(空心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)、VEGFDLLBII010(VHH 2)或VEGFDLLBII015(VHH 3)或每隔一天(实心符号)经VEGFDLLBII013(VHH 1)或VEGFDLLBII010(VHH 2)处理。第1天为治疗的第一天，第21天为治疗的最后一天。图上方的三角指示处理天数。
表75：肿瘤体积：治疗组相对于对照组(第21天结果)
表76：体重：治疗组相对于对照组(第21天结果)
实施例18
小鼠中格式化的VHH的药代动力学
为了测定所选VHH在小鼠中的药代动力学，将0.1mL的33nmol/kg的单次剂量腹膜内给予每组6只动物(BomTac:NMRI-Foxn1nu雌性小鼠(6-7周龄))。在不同时间点(每个时间点3只小鼠)通过在异氟烷麻醉下眼眶后取血获得约50μl血液。在30分钟之后离心样品并将所得20μL血清储存在-20℃直至分析。通过夹心式ELISA测量VHH浓度。
在+4℃，每孔用100μl在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释至0.5μg/ml的人VEGF(R&D Systems 293-VE/CF)涂布微量滴定盘(Medisorp Nunc)，过夜。在用300μl去离子水洗涤之后，通过添加200μl阻断缓冲液(PBS/0.5%牛血清白蛋白/0.05%吐温20)来阻断残余结合位点0.5小时。
在另一洗涤步骤之后，将每孔100μl于血清稀释培养基(SDM，阻断缓冲液+2%小鼠血清池(mouse serum pool)，PAA Labor GmbH)中的标准物或样品的稀释液添加至ELISA培养板中且在室温在培养板振荡器上培养1小时。为产生标准曲线，用血清稀释培养基将VHH稀释成100ng/mL(VEGFDLLBII013)或10ng/mL(VEGFDLLBII010及VEGFDLLBII015)，且一式两份以于SDM中的8个两倍稀释液添加至ELISA培养板中。小鼠血清样品经阻断缓冲液稀释最少50倍且进一步用SDM进行稀释。亦以8个两倍稀释液一式两份将血清样品添加至ELISA培养板中。
再次洗涤培养板，且每孔添加100μl于阻断缓冲液中稀释至0.2μg/mL的人Dll4-HIS(R&D Systems 1506-D4/CF)且如前所述在振荡器上培养1小时以检测所结合的VHH。在再次洗涤培养板之后，每孔添加100μl于阻断缓冲液中稀释5000倍的抗-6×聚组氨酸-HRPO(R&D SystemsMAB050H)且如前所述培养培养板1小时。在每次用300μl去离子水最终洗涤3次之后，通过每孔添加100μl TMB染色溶液(Bender MedSystems BMS406.1000)且在室温在振荡器上培养约10分钟之后通过每孔添加100μl 1M磷酸终止显色来检测所结合的VHH。使用微量滴定盘分光光度计(ThermoMax,Molecular Devices)及ELISA软件SoftMaxPro(Molecular Devices)对单个的孔的光学密度进行定量。样品结果源自使用四参数对数曲线拟合法拟合的标准曲线。
表77：
VHH的血清半衰期经测定分别为15小时(VEGFDLLBII013)、17小时(VEGFDLLBII010)及24小时(VEGFDLLBII015)。(半衰期是用WinNonLin V6将平均血浆浓度曲线的最后3个数据点拟合成指数斜率来测定的)。

Claims (7)

1.一种双特异性结合分子，其包含Dll4结合组分及VEGF结合组分，其中所述双特异性结合分子由以下序列组成：SEQ ID NO:82。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1的双特异性结合分子。
3.一种表达载体，其包含权利要求2的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求3的表达载体。
5.一种药物组合物，其含有至少一种权利要求1的双特异性结合分子作为活性成分。
6.权利要求5的药物组合物，其用于治疗与VEGF介导的血管生成作用相关的疾病。
7.权利要求5的药物组合物，其用于治疗癌症疾病。
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