KR101025143B1 - 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가수분해상으로 안정화된 말레이미드-작용성화된 수용성 중합체 및 이러한 중합체 및 이들의 전구체들의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
가수분해, 말레이미드, 수용성 중합체

Description

가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체 {HYDROLYTICALLY STABLE MALEIMIDE-TERMINATED POLYMERS}
본 발명은 특정 말레이미드-종결 수용성 중합체 및 이러한 중합체의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기에 관한 것이다: (i) 하나 이상의 말단 말레이미드기를 가진 가수분해로 안정화된 중합체, (ii) 본원에 기술된 바와 같은 말레이미드-종결 수용성 중합체 시약을 또다른 물질, 예컨대 활성제 또는 표면 등에 부착하여 형성된 접합체(conjugate), (iii) 상기 중합성 시약의 합성 방법, (iv) 상기 중합성 시약들을 포함한 조성물, 등.
최근 바이오기술의 진보로 인해, 치료 단백질 및 기타 생체분자, 예를 들어, 항체 및 항체 절편을 이제 대규모로 제조할 수 있게 되어 상기 생체분자를 더욱 넓게 사용할 수 있게 되었다. 공교롭게도, 잠재적 치료 생체분자의 임상 유용성은 종종 이의 빠른 단백질 분해성 (proteolytic) 분해, 저생체이용율, 제조, 저장 또는 투여상 불안정성 또는 이의 면역원성에 의해 방해받는다. 치료상 사용을 위한 단백질 및 기타 생체분자의 투여에 대한 지속적인 관심 때문에, 상기 결점을 극복하기 위한 다양한 접근법이 연구되어 왔다.
많이 연구된 하나의 접근법으로는 단백질 및 폴리에틸렌 글리콜 또는 "PEG" 등의 수용성 중합체에 공유 결합된 기타 잠재적 치료 분자를 변형시키는 것이다 [Abuchowski, A., 등, J. Biol. Chem. 252 (11), 3579 (1977); Davis, S.,등., Clin. Exp Immunol., 46, 649-652 (1981)]. PEG-개질된 단백질(PEG 접합체 또는 페길화 단백질로도 언급)의 생물학적 특성은, 많은 경우에, 이의 비페길화 대응물의 것보다 상당히 향상된 것을 보여주었다[Herman, 등, Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209 (1994)]. 폴리에틸렌 글리콜-개질된 단백질은 단백질 분해성 분해에 대한 증가된 내성 때문에, 체내에서 순환 시간이 더 길고 또한 증가된 내열성을 가진 것으로 나타났다[Abuchowski, A., 등, J.Biol. Chem., 252, 3582-3586 (1977)]. 생체효능의 유사한 증가는 기타 생체 분자, 예를 들어, 항체 및 항체 절편에 의해 관찰된다[Chapman, A., Adv. Drug Del. Rev. 54, 531-545 (2002)].
전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜의 약물 또는 기타 표면에의 부착은 활성 PEG 유도체 즉, 생체분자의 친핵 센터와 반응하기에 적합한 하나 이상의 활성화된 말단(예를 들어, 리신, 시스테인 및 단백질의 유사 잔기) 을 가진 PEG를 이용하여 수행한다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 활성화된 PEG 와 단백질 아미노기, 예컨대, 단백질의 리신 측쇄에 존재하는 것 등과의 반응에 기초한 방법이다. 단백질의 아미노기와 반응에 적합한 활성화된 말단기를 가진 폴리에틸렌 글리콜은 PEG-알데히드[Harris, J. M., Herati, R. S., Polym Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem), 32 (1), 154-155 (1991)], 혼합 무수물, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카르보닐이미다졸리드, 및 클로로시아누레이트를 포함한다[Herman, S., 등, Macromol. Chem. Phys. 195,203-209 (1994)]. 비록 많은 단백질이 PEG 변형 동 안에 활성이 유지되는 것으로 나타났고, 일부 경우에, 단백질 아미노기를 통한 중합체 부착은, 예컨대, 특이 리신 잔기의 유도체화 반응이 상기 단백질을 불활성화시킬 때, 바람직하지 않을 수 있다[Suzuki, T., 등, Biochimica et Biophysica Acta 788, 248-255 (1984)]. 더군다나, 대부분의 단백질이 수개의 사용가능한/이용할 수 있는 아미노기를 가지고 있기 때문에, 상기 형성된 중합체 접합체는 전형적으로 모노-페길화, 디-페길화, 트리-페길화 화학종 등이고, 이것을 특성화하고 분리하는 것은 어렵고 또한 시간-소비일 수 있다. 추가로, 상기 혼합물은 종종 재생산 제조되지 않으며, 이는 규정 승인 및 이후의 상업화를 위한 대규모 생산시에 문제를 야기할 수 있다.
상기 문제점을 피하는 한가지 방법은 아민 이외의 작용기를 목표로 하는 위치-선택성 중합체 시약을 사용하는 것이다. 한가지 특히 매력적인 표적은 단백질 상의 아미노산, 즉 시스테인에 존재하는 티올기이다. 시스테인은 전형적으로 단백질 내에 리신보다 적은 양으로 존재하여, 이들 티올-함유 아미노산에 대한 접합시에 단백질의 불활성화 가능성을 감소시킨다. 더욱이, 시스테인 위치로의 접합은 종종 단일 화학종 중합체-접합체의 형성으로 이끄는, 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다.
티올-선택적 반응성 말단기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 유도체로는, 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드, 티올 및 디술피드가 있으며, 말레이미드가 가장 잘 쓰인다. 상기 유도체는 모두 단백질의 시스테인 측쇄로의 커플링을 위해 사용된다[Zalipsky, S. Bioconjug. Chem. 6,150-165 (1995); Greenwald, R. B. 등 Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17,101-161 (2000); Herman, S., 등, Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209 (1994)]. 그러나, 상기 시약들 중 다수가 이의 합성과 정제의 어려움 때문에 넓게 이용되고 있지 않다.
상기 논의한 바와 같이, 종결 말레이미드기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 유도체들은 술프히드릴-선택적 시약의 가장 잘 쓰이는 유형 중 하나이고, 수많은 원천(source)으로부터 상용된다. 넓게 인식 또는 인지되지는 않았지만, 본 출원인은 많은 PEG-말레이미드가 공교롭게도 저장 및 약물 후보물질로의 접합시 가수분해적으로 불안정하다는 것을 인식하였다. 더욱 특히, 접합 전후 모두 상기 말레이미드 고리에서 상당한 가수분해 정도가 관찰되었다. 상기 불안정성은 약물-접합체 조성물 내에서 다종의 약물 접합체를 형성시킬 수 있다. 상기 다양한 약물 접합체 화학종은 유사한 생물학적 활성을 가지는 것 같지만 이의 약물 동력학적 특성은 다를 수 있으며, 상기 조성물을 환자 투여용으로는 바람직하지 않게 한다. 또한, 상기 약물 접합체의 개환 및 폐환 형태의 분리는 극도로 어려울 수 있다. 더욱이, 이러한 가수분해로 인한 불안정성은 약물 뱃치 (batch) 의 불일치를 초래할 수 있다. 따라서, 본 출원인은, 당업계에서 생물학적 활성 분자로의, 바람직하게 위치-선택적 방식으로의, 커플링에 유용한, 저장 및 커플링시 안정한 새로운 활성화 PEG 의 개발에 대한 지속적인 요구가 있음을 인식하였다. 본 발명은 상기 요구를 만족시킨다.
발명의 개요
본 발명은 유일한 일군의 가수분해상 안정화된 말레이미드-종결 중합체들을 제공하며, 이때 상기 중합체들은 중합체 단편과 말레이미드기 사이에 개재된 특정 연결자를 포함한다.
본 발명은 말레이미드-종결 중합체의 말레이미드 고리에 인접한 포화 아크릴성, 환형 (cyclic) 또는 지환족 (alicyclic) 탄화수소 연결자를 편입시킬 경우 이의 불안정성이 실질적으로 감소된다는 발견에 기초한 것이다. 본원에서는 가수분해상 안정화된 말레이미드 고리를 가진 중합체, 이들의 중합체 전구체, 상기 가수분해상 안정화된 말레이미드-종결 중합체의 접합체 및 이러한 중합체 및 이들의 접합체의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
일반적으로, 본 발명은 하기 구조를 가지는 수용성 중합체에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure 112005035674947-pct00001
상기 일반화된 구조에서, POLY 는 수용성 중합체 단편이고, L 은 인접 말레이미드 고리에 대하여 가수분해상 안정성을 부여하는 연결이다. 전형적으로 상기 연결자는 상기 말레이미드 고리에 인접한 포화 비환형 (acyclic), 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬을 포함하고, 탄소수가 총 약 3 내지 약 20 개이고, 임의적으로는 다른 비-간섭 원자 또는 작용기를 포함한다.
좀 더 구체적으로, 한가지 양상에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 수용성 중합체에 관한 것이다:
[화학식 II]
Figure 112005035674947-pct00002
구조 II 에서, POLY 는 수용성 중합체 단편이고, b 는 0 또는 1 이고, X 는 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한 가수분해상으로 안정한 연결자이다. 바람직하게는, 상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다. 한가지 구현예에서, POLY 는 상기 아미드 카르보닐 탄소에 직접, 임의적으로는 개재 산소([O]b) 를 통해, 공유 결합되어 카르바메이트기를 형성한다. 한가지 대안적인 구현예에서, POLY 는 상기 아미드 카르보닐 탄소에, 개재 스페이서 (spacer), 예를 들어, 메틸렌을 경유하여, 임의적으로는 개재 산소, b = 1 인 경우 ([O]), 를 경유하여, 연결된다.
한가지 구현예에서, X 는 탄소수가 총 약 3 내지 약 20 개인 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬이다. 좀 더 구체적으로, X 는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 으로 이루어진 군에서 선택되는 총 탄소 원자 수를 가질 수 있다. 연결자 X 내의 총 탄소 원자 수에 대한 바람직한 범위는 약 3 내지 약 20 개, 또는 약 4 내지 약 12 개, 또는 약 4 내지 약 10 개, 또는 약 5 내지 약 8 개이다.
화학식 II 에서 연결자 X 는 다수의 구조적 특징 중 임의의 것을 가질 수 있다. 한가지 구현예에서, X 는 선형 포화 비환형 탄화수소 사슬이다. 또 다른 구현예에서, X 는 분지형 포화 비환형 탄화수소 사슬이고, 상기 사슬 내의 임의의 하나 이상의 탄소 위치에서 1 개 또는 심지어 2 개의 치환기를 포함할 수 있다. 예를 들어, X 는 상기 말레이미딜기에 대한 α 탄소에서, 또는 상기 말레이미딜기에 대한 β 탄소에서, 또는 상기 말레이미딜기에 대한 γ 탄소에서 분지된 것일 수 있다. 탄소수가 19 이하인 탄화수소 사슬에 있어서, 위치 1 내지 19 중 임의의 하나 (이때 위치 1 은 상기 말레이미드 고리에 근접한 것임) 는 분지된 것일 수 있다. 예를 들어, C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14-C15-C16-C17-C18-C19- 로 표시되는 탄소수 2 내지 19 의 예시적인 포화 탄화수소 사슬에 있어서, C1, C2, C3, C4, C5, C6 ,C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18 또는 C19 탄소 중 임의의 하나 이상은, 상기 사슬 중의 총 탄소수에 따라, 분지형일 수 있다. 바람직하게는, 임의의 주어진 포화 탄화수소 사슬 또는 지환족 연결자에서, 4 개 이하의 탄소 원자가 분지형이고, 분지 위치의 총 개수는 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 이다. 상기 "분지" 지점들이 함께 포화 고리 또는 고리 시스템 (예컨대, 2환식, 3환식 등) 을 형성하는 구현예가 하기에서 개별적으로 논의된다.
본 발명의 상이한 구현예들에 따른 대표적인 중합체가 하기에 제시된다.
[화학식 III]
Figure 112005035674947-pct00003
예를 들어, 구조 III 에서, y 는 1 내지 약 20 의 정수이고; R1 및 R2 는 각각 발생 위치에서 각각 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다.
바람직하게는, 상기 구조 III 에서, R1 및 R2 는 각 발생 위치에서 각각 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 및 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다. Y 는 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 으로 이루어진 군에서 선택된다. 구조 III 의 특정 구현예에서, R1 및 R2 는 모두 수소이다.
구조 III 의 다양한 구현예들로서 하기가 있다.
[화학식 III-A]
Figure 112005035674947-pct00004
예시적인 구조 III-A, Cα 상의 R1 또는 R2 중 하나 이상이 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고, y 는 1 이상이고, 상기 기술한 특정 수치들 중 임의의 것을 가질 수 있다.
구조 III-A 의 특정 구현예들로서는 하기의 것들이 있다: (i) Cα 상의 R1 또는 R2 각각이 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 것, 및/또는
(ii) 모든 다른 비-Cα R1 및 R2 변수들이 수소인 것, 및/또는
(iii) Cα 상의 R1 또는 R2 중 하나 이상이 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬인 것, 및/또는
(iv) Cα 상의 R2 가 수소인 것, 및/또는
(v) Cα 상의 R1 이 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실 및 메틸렌시클로헥실로 이루어진 군에서 선택되는 것.
본 발명의 이 양상의 또 다른 특정 구현예는 하기 구조 III-B 로 제시된다.
[화학식 III-B]
Figure 112005035674947-pct00005
[식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 알킬 또는 시클로알킬이다]. 대안적으로는, R1 은 알킬 또는 시클로알킬이고, R2 는 수소이다. 구조 III-B 의 추가적인 구현예는 (i) R1 및 R2 가 각각 독립적으로 메틸 또는 에틸 중 하나이고/이거나, R1 및 R2 가 동일한 것들이다.
구조 III 의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 한 중합체는 하기 구조를 가진다:
[화학식 III-C]
Figure 112005035674947-pct00006
[식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되나, 둘 다 수소는 아니고, y 는 2 이상이다]. 이 구조의 특정 구현예들로는, (i) R1 및 R2 가 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬인 것, 및/또는 (ii) R1 및 R2 가 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실 및 시클로헥실로 이루어진 군에서 선택되고/되거나, R2 가 수소인 것들이 있다.
구조 III 의 또 다른 구현예에서,
[화학식 III-D]
Figure 112005035674947-pct00007
Cγ 에 부착된 R1 및 R2 중 하나 이상이 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구현예들로는 하기의 것들이 있다: (i) Cγ 에 부착된 R1 및 R2 중 하나 이상이 알킬 또는 시클로알킬이고, 다른 모든 R1 및 R2 변수들은 수소인 것, 및/또는 (ii) Cα 또는 Cβ 에 부착된 R1 변수들 중 하나가 알킬 또는 시클로알킬이고, 다른 모든 R1 및 R2 변수들은 수소인 것.
앞서 기술한 바와 같이, X 는 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬일 수 있는데, 다시 말해, 상기 연결자 X 는 하나 이상의 환형 탄화수소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에서는 또한 하기 구조를 가지는 중합체들이 제시된다:
[화학식 IV]
Figure 112005035674947-pct00008
상기 구조에서, CYCa 는 "a"개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고; p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이다. R1 및 R2 는 각 발생 위치에서 각각 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다.
본 발명에 따른 CYCa 는 단환식, 2환식, 3환식 구조 등을 포괄한다.
상기 구조 IV 의 다양한 구현예들로는 하기의 것들이 있다: (i) p 및 q 가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택되는 것, 및/또는
(ii) R1 이 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼이고, R2 는, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼인 것, 및/또는
(iii) a 가 5, 6, 7, 8 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 것, 및/또는
(iv) a 가 6 이고, CYCa 가 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-치환된 시클로헥실 고리인 것, 및/또는
(v) p 및 q 가 각각 독립적으로 0 내지 4 인 것, 및/또는
(vi) R1 및 R2 가 각 발생 위치에서 수소인 것.
시클로알킬렌기 및 거기에 2 개의 치환기가 있는 연결자에 있어서, 상기 치환기는 시스 (cis) 또는 트랜스 (trans) 일 수 있다.
구조 IV 의 특정 구현예들로는 하기가 있다:
[화학식 IV-A]
Figure 112005035674947-pct00009
[식 중, q 및 p 는 상기 기술된 바와 같다]. 한가지 특정 구현예에서, q 및 p 의 범위는 각각 독립적으로 0 내지 6 이다. 또 다른 구현예에서, q 의 범위는 0 내지 6 이고, p 는 0 이다.
본 발명에 따른 시클로알킬렌 고리를 가진 또 다른 예시적인 중합체 구조는 하기이다:
[화학식 IV-B]
Figure 112005035674947-pct00010
[식 중, q 및 p 는 상기 정의된 바와 같고, 좀 더 바람직하게는, 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이다].
본 발명의 중합체로는, 단일 작용성, 2 작용성 및 다중-작용성 구조들이 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 중합체는 일반적으로 하기 구조로 기술될 수 있다:
[화학식 V]
Figure 112005035674947-pct00011
[식 중, X 및 b 는 앞서 정의된 바와 같고, b' 은 0 또는 1 이고, X' 은 인접 포화 탄소 원자의 수가 3 이상인 가수분해상으로 안정한 연결자이다]. 상기 구현예에서, b 및 b' 은 동일 또는 상이할 수 있다. 한가지 특정 구현예에서, 상기 중합체 시약은 동종(homo)-2 작용성, 다시 말해, 양 반응성 말단기들이 동일하다. 이 경우, b 는 b' 과 같고, X 는 X' 과 같다.
바람직하게는, 본원에 제시된 중합체 말레이미드 중 임의의 것에서 상기 수용성 중합체 단편은 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린) 또는 폴리(옥시에틸화 폴리올) 이다. 한 바람직한 구현예에서, 상기 중합체 단편은 폴리(알킬렌 옥시드), 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) 이다.
한가지 구현예에 따르면, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 단편은 하기 구조를 포함한다: Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2- (식 중, n 의 범위는 약 10 내지 약 4000 이고, Z 는 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴 및 플루오레신 (fluorescein) 으로 이루어진 군에서 선택되는 작용기를 포함한 부분이다). 이 구현예에서, Z 는 반응성 작용기 또는 말단-봉쇄기 (end-capping group) 를 포함한다.
또한 좀 더 구체적인 구현예에서, POLY 는 말단에서 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐옥시, 치환된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환된 알키닐옥시, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시 또는 인지질 등의 말단-봉쇄 부분으로 봉쇄될 수 있다. 바람직한 말단-봉쇄기로는, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시가 있다.
일반적으로, POLY 는 하기 범위 중 하나에 속하는 공칭평균분자량을 가진다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤, 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 약 2,000 달톤 내지 약 30,000 달톤. POLY 의 바람직한 분자량으로는, 250 달톤, 500 달톤, 750 달톤, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa 및 50 kDa, 또는 심지어 그 이상이 있다.
상기 중합체 단편은 임의 수의 형태를 가질 수 있는데, 예컨대 선형, 분지형 또는 갈래진 형 (forked) 일 수 있다.
본 발명의 중합체는 멀티-아암(multi-arm) 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 예시적인 멀티-아암 중합체는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 VI]
Figure 112005035674947-pct00012
상기 도시한 구조에서, d 는 3 내지 약 100 의 정수이고, R 은 3 개 이상의 히드록실기, 아미노기 또는 이들의 조합을 가진 중심 코어 분자의 잔기이다. 바람직하게는, d 는 3 내지 약 12 의 정수이다.
대안적인 멀티-아암 구현예에서, 상기 중합체는 하기 구조에 해당한다:
[화학식 VII]
Figure 112005035674947-pct00013
이 구조에서, PEG 는 -(CH2CH20)nCH2CH2- 이고,
M 은 하기이고:
Figure 112005035674947-pct00014
m 은 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택된다.
또 다른 양상으로, 본원에서는, 상기 기술된 중합체에서 상기 말레이미드기가 아미노기, 바람직하게는 일차 아미노인 -NH2 로 대체된 것을 제외하고는 상기 기술된 특징 및 예시적인 구조를 가진 중합체가 제시된다. 이러한 중합체들은 예컨대, 활성제에 대한 접합용의, 활성화된 중합체 시약으로서 뿐 아니라, 본 발명의 안정화된 말레이미드 중합체에 대한 전구체로서도 유용하다.
예를 들어, 본 발명은 하기 구조에 따른 수용성 중합체를 포괄한다:
[화학식 VIII]
Figure 112005035674947-pct00015
[식 중, 상기 변수 X 및 b 는 일반적으로 및 특정 구현예들에서 이미 기술된 바와 같다]. 바람직하게는, 상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 하기 구조를 가지는 수용성 중합체를 제공한다:
[화학식 XIII]
Figure 112005035674947-pct00016
[식 중, POLY 는 수용성 중합체 단편이고, X 는 총 탄소수가 약 3 내지 약 20 인 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 가수분해상으로 안정한 연결자이다]. 바람직하게는, 상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다.
본 발명의 이 양상에 따른 중합체는, 다양한 구현예들에서, X 가 일반적인 및 본원에 기술된 특정 환형 및 지환족 탄화수소 구조에 해당하는 것들이다.
구조 XIII 의 한가지 특정 구현예에서, 상기 연결자 X 는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 XIII-A]
Figure 112005035674947-pct00017
[식 중, CYCa 는 "a" 개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고; p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이다]. 구조 XIII-A 에서, R1 및 R2 각각은, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다. CYCa 가 2 개의 치환기만을 가진 경우, 상기 치환기들은 시스 또는 트랜스일 수 있다.
구조 XIII-A 의 또 다른 구현예에서, p 및 q 는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택된다.
구조 XIII-A 의 또 다른 구현예에서, R1 은, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬, 저급 시클로알킬 및 저급 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고, R2 는, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬, 저급 시클로알킬, 및 저급 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다.
구조 XIII-A 의 또 다른 구현예에서, a 는 5, 6, 7, 8 및 9 로 이루어진 군에서 선택된다.
구조 XIII-A 의 한 바람직한 구현예에서, a 는 6 이고, CYCa 는 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-치환된 시클로헥실 고리이다. 추가적인 구현예로서, p 및 q 가 각각 독립적으로 0 내지 4 의 범위인 것, 및/또는 R1 및 R2 가 각 발생 위치에서 수소인 것이 있다.
특히, 구조 XIII 의 특정 구현예들로서 하기가 있다:
[화학식 XIII-B]
Figure 112005035674947-pct00018
[화학식 XIII-C]
Figure 112005035674947-pct00019
[식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이다].
구조 XIII 의 또 다른 구현예에서, CYCa 는 2환식 또는 3환식이다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 본원에 기술된 중합체 중 임의의 하나 이상을 사용하여 제조되는 히드로겔 (hydrogel) 을 포함한다.
또 다른 양상으로, 가수분해상으로 안정한 말레이미드-종결 중합체의 형성 방법이 제공된다. 상기 방법은, (a) POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2 (X) 를 형성시키기에 효과적인 조건 하에서, 하기 구조, POLY-[O]b-C(O)-LG (IX) 를 가진 중합체를 하기 구조, NH2-X-NH2 (XII) 를 가진 디아민과 반응시키는 단계, 및 이어서 (b) POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH2 (X) 를 POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL (II) 로 변환시키는 단계를 포함한다.
변수들인 POLY, b 및 X 는 일반적으로 및 특정하게 이미 기술된 바와 같고, LG 는 이탈기이고, MAL 는 말레이미드이다. 바람직하게는, 상기 결과적인 생성물인, POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL 은 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다.
상기 방법은 본원에 기술된 중합체-종결 말레이미드 중 임의의 것을 제조하는데 사용될 수 있다.
바람직한 이탈기로는, 할로겐화물, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸, 파라-니트로페놀레이트가 있다.
상기 방법에 대한 한가지 구현예에서, 상기 NH2-X- NH2 시약 중의 상기 아미노기 중 하나는 보호된 형태이다. 이 경우, 상기 방법은 일반적으로 상기 반응 단계 후에, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 에서 아미노기를 탈보호화하는 단계를 포함할 것이다.
상기 반응시키는 단계는 전형적으로 유기 용매 중에서 수행된다. 전형적인 용매로는, 아세토니트릴, 염소화 탄화수소, 방향족 탄화수소, 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸포름아미드 (DMF) 및 디메틸술폭시드가 있다.
상기 방법의 또 다른 구현예에서, 상기 반응시키는 단계를 질소 또는 아르곤 등의 불활성 대기 하에서 수행한다.
상기 반응시키는 단계를 수행함에 있어서 온도 범위는 약 0 내지 100 ℃ 이다.
추가적인 구현예에서, 상기 반응시키는 단계는 염기의 존재하에서 수행된다. 예시적인 염기로는, 트리에틸 아민 및 기타 유사한 3차 아민류, 피리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘 및 탄산나트륨 등의 무기 염기류가 있다.
한 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 변환시키는 단계 전에 단계 (a) 로부터의 생성물을, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 변환시키는 단계는, 반응 혼합물 중에서 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 형성시키기에 적당한 조건하에서, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를, N-메톡시카르보닐말레이미드, 엑소-7-옥사[2.2.1]비시클로헵탄-2,3-디카르복실산 무수물, 및 말레산 무수물로 이루어진 군에서 선택되는 시약과 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 시약이 N-메톡시카르보닐말레이미드인 구현예에서, 상기 변환시키는 단계는 바람직하게는 물 또는 물 및 아세톤 또는 아세토니트릴 등의 수 혼화성 용매의 수성 혼합물 중에서 수행된다.
상기 시약이 말레산 무수물인 방법의 한 구현예에서, 상기 변환시키는 단계는, 중간체로서의 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-NH-C(O)CH=CHCOOH (XI) 를 형성시키기에 효과적인 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를 말레산 무수물과 반응시키는 단계, 이어서 물의 제거에 의한 고리화를 촉진시키는데 효과적인 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH-C(O)CH=CHCOOH 를 가열하여 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL 을 형성시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 상기 방법은 상기 반응 혼합물로부터 생성물인 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 회수하는단계를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 회수된 생성물은 순도가 약 80 % 를 초과하며, 원하는 생성물 이외의 중합성 불순물이 없다.
상기 방법을 수행함에 있어서 예시적인 디아민으로는 하기가 있다:
[화학식 XII-A]
Figure 112005035674947-pct00020
및
[화학식 XII-B]
Figure 112005035674947-pct00021
[식 중, 상기 변수들은 일반적으로 및 특정하게 상기 기술된 것들을 모두 포괄한다].
또 다른 양상으로, 본원에서는, 본 발명의 가수분해상으로 안정한 말레이미드-종결 중합체를 제조하는 대안적인 방법이 제시된다. 상기 방법은, POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL (II) 를 형성시키기에 효과적인 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-LG (IX) 를 H2N-X-MAL (XIV) 와 반응시키는 단계를 포함하고, 이때 변수들인 POLY, b, X, LG 및 MAL 은, 예시의 목적으로 사용된 대상 구현예에 관계없이, 일반적으로 및 특정하게 이미 기술된 바와 같다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 생물학상의 활성제와 본원에 기술된 가수분해상으로 안정한 말레이미드-또는 아미노-종결 중합체 중 임의의 것과의 반응으로 형성되는 접합체를 제공한다.
좀 더 구체적으로, 본 발명의 이 양상의 한가지 구현예로는 하기 구조를 포함한 접합체가 있다:
[화학식 XV]
Figure 112005035674947-pct00022
[식 중, 변수들인 POLY, b 및 X 는, 상기 주제 예시 구현예와 무관하게 일반적으로든 특정하게든 이미 정의된 바와 같고, "POLY-[O]b-C(O)-NH-X-" 는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여하고, "-S-생물학상의 활성제" 는 티올 (-SH) 기를 포함한 생물학상의 활성제를 나타낸다.
한가지 구현예에서, 상기 접합체를 포함한 조성물이 제공된다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 접합체 조성물은 단일 중합체 접합체 화학종을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조를 포함한 접합체에 관한 것이다:
[화학식 XVI]
Figure 112005035674947-pct00023
[식 중, POLY, b 및 X 는 일반적으로든 특정하게든 이미 정의된 바와 같고, "POLY-[O]b-C(O)-NH-X-" 는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여하며, "-NH-생물학상의 활성제" 는 아미노기를 포함한 생물학상의 활성제를 나타낸다.
또 다른 관련 양상으로, 본 발명은 중합체 접합체의 형성 방법을 제공하고, 이때 상기 방법은, 하기 구조를 가진 중합체 접합체의 형성을 촉진시키기에 효과적인 조건하에서 반응성 티올기인 "HS-생물학상의 활성제"를 포함한 생물학상의 활성제를 본 발명의 가수분해상으로 고리 안정한 말레이미드 종결 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다:
Figure 112005035674947-pct00024
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징들은 하기 도면 및 상세한 설명과 함께 읽을 때 좀 더 충분히 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B 는 가수분해상으로 안정한 환형 (2환식 및 3환식 포함) 연결자를 포함한 본발명의 예시적인 중합체 말레이미드의 구조를 제시하고,
도 2 는 본 발명의 특정 안정화된 중합체 말레이미드를 제조하는데 유용한 예시적인 디아민의 구조를 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정 중합체, 합성 기술, 활성제 등에 제한되지 않으며 매우 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어법은 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어법은 하기 기술된 정의들에 따라 사용될 것이다.
정의
본원에 사용된 바 하기 용어들은 지시된 의미를 갖는다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태 "a," "an," 및 "the" 는, 내용이 명백히 다르게 기술되지 않는 한 복수의 관련 대상체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)" 은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드) 를 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 따라 사용되는 PEG 는 예컨대, 합성 변형 동안, 말단 산소(들)의 치환 여부에 따라 하기 두 구조 "-(CH2CH20)n-" 또는 "-(CH2CH20)n-1-CH2CH2-" 중 하나를 포함한다. 변수 (n) 은 3 내지 3000 이고, 말단기 및 전체 PEG 의 구조는 다양할 수 있다. PEG 가 추가로 연결자 부분 (하기에 보다 상세히 기재됨) 을 포함하는 경우, 상기 연결자를 포함하는 원자는 PEG 단편에 공유결합되는 경우 (i) 산소-산소 결합 (-O-O-, 퍼옥시드 연결) 또는 (ii) 질소-산소 결합 (N-O, O-N) 의 형성을 야기하지 않는다. "PEG" 는 과반수, 다시 말해, 50% 초과의 -CH2CH20- 서브유닛 (subunit) 을 함유하는 중합체를 의미한다. 본원에 사용되는 PEG 는 다양한 분자량, 구조 또는 기하학적 구조 (예컨대, 분지형, 선형, 갈래형 PEG, 덴드리머성(dentritic) 등) 를 포함하며, 이는 하기에 보다 상세히 기재된다.
"PEG 디올" 은 또한 알파-, 오메가-디히드록시폴리(에틸렌 글리콜)로도 공지되어 있으며, HO-PEG-OH 로서의 간단한 형태로 나타낼 수 있고, 이때 PEG 는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 중합체 또는 "수용성 중합체 단편"의 맥락에서 "수용성" 은 실온에서 수용성인 임의의 단편 또는 중합체이다. 일반적으로, 수용성 중합체 또는 단편은, 여과 후 동일한 용액에 의해 전달되는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 빛을 전달할 것이다. 중량을 기준으로, 수용성 중합체 또는 이의 단편은 바람직하게는 물에 약 35 중량% 이상 용해될 것이며, 보다 바람직하게는 물에 약 50 중량% 용해될 것이며, 더욱 더 바람직하게는 물에 약 70 중량% 이상 용해될 것이며, 훨씬 더 바람직하게는 물에 약 85 중량% 용해될 것이다. 그러나, 수용성 중합체 또는 단편이 물에 약 95 중량% 이상 용해되거나 물에 완전히 용해되는 것이 가장 바람직하다.
"말단-봉쇄" 또는 "말단-봉쇄된" 은 PEG 등의 중합체의 말단에 존재하는 불활성 또는 비-반응성 기이다. 말단-봉쇄기는 전형적인 합성 반응 조건하에서 화학적 변형이 쉽게 일어나지 않는 기이다. 일반적으로, 말단-봉쇄기는 알콕시기, -OR 이고, 식중 R은 탄소수 1 내지 20 인 유기 라디칼이고, 바람직하게는 저급 알킬 (예컨대, 메틸, 에틸) 또는 벤질이다. "R" 은 포화 또는 불포화일 수 있고, 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 및 상기 중 임의의 것의 치환된 형태를 포함한다. 예를 들어, 말단 봉쇄된 PEG 는 전형적으로 하기 구조 "RO-(CH2CH20)n-"을 포함하고, 이때 R 은 상기 정의된 바와 같다. 대안적으로, 말단-봉쇄기는 또한 유리하게는 검출가능 표지 (label) 를 포함할 수도 있다. 중합체가 검출가능 표지를 포함하는 말단-봉쇄기를 가질 경우, 중합체 및/또는 상기 중합체가 커플링되는 잔기 (예컨대, 활성제) 의 양 또는 위치는 적합한 검출기를 사용하여 결정될 수 있다. 적합한 표지로는, 형광물질, 화학발광제 (chemiluminescer), 효소 표지화에 사용되는 잔기, 비색제 (예컨대, 염료), 금속 이온, 방사성 잔기 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 말단-봉쇄기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 상기 중합체가 인지질 등의 말단-봉쇄기를 가지는 경우, 독특한 특성들 (예컨대 유사한 말단-봉쇄된 중합체와 함께 체계화된 구조를 형성하는 능력) 이 상기 중합체에 부과된다. 예시적인 인지질로는 포스파티딜콜린으로 지칭되는 인지질의 부류에서 선택되는 것들이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 구체적인 인지질로는, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린 및 레시틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 중합체에 대해 "비자연적으로 발생하는" 이란, 그 전체가 자연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나, 본 발명의 비자연적으로 발생하는 중합체는, 전체 중합체 구조가 자연에서 발견되지 않는 한, 자연적으로 발생하는 하나 이상의 서브유닛 또는 서브유닛의 단편들을 포함할 수 있다.
PEG 와 같은, 본 발명의 수용성 중합체의 맥락에서, "분자량" 은 중합체의 공칭평균분자량을 말하며, 일반적으로는 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography), 광 산란 기술, 또는 1,2,4-트리클로로벤젠에서의 고유 속도 결정에 의해 결정된다. 본 발명의 중합체는 일반적으로 다분산성 (polydisperse) 이고, 바람직하게는 약 1.20 미만의 낮은 다분산도 값을 갖는다.
용어 "반응성" 또는 "활성화된" 은 통상적인 유기 합성 조건하에서 용이하게 또는 실제적인 속도로 반응하는 작용기를 말한다. 이는, 반응하지 않거나 반응하기 위해서 강한 촉매 또는 매우 비실용적인 반응 조건이 요구되는 기 (즉, "비반응성" 또는 "불활성" 기) 와는 대조적이다.
반응 혼합물 중의 한 분자에 존재하는 작용기에 대하여 "용이하지 않은 반응성" 또는 "불활성" 이란, 상기 작용기가 상기 반응 혼합물에서 원하는 반응을 생산하기에 충분한 조건하에서 크게 손상되지 않고 남아있는 것을 가리킨다.
"보호기"는 특정 반응 조건 하에서 분자 내 특정 화학 반응성 작용기의 반응을 예방하거나 차단하는 잔기이다. 보호기는 보호되는 화학 반응기의 유형 뿐만 아니라 사용되는 반응 조건 및 임의로 분자 내의 추가 반응기 또는 보호기의 존재에 따라 달라질 것이다. 보호될 수 있는 작용기로서, 예를 들어, 카르복실산기, 아미노기, 히드록실기, 티올기, 카르보닐기 등이 있다. 카르복실산의 대표적인 보호기로서는, 에스테르류 (예컨대 p-메톡시벤질 에스테르), 아미드류 및 히드라지드류; 아미노기에 있어서는, 카르바메이트류 (예컨대 tert-부톡시카르보닐) 및 아미드류; 히드록실기에 있어서는, 에테르류 및 에스테르류; 티올기에 있어서는, 티오에테르류 및 티오에스테르류; 카르보닐기에 있어서는, 아세탈류 및 케탈류; 등이 있다. 이러한 보호기는 당업계의 숙련된 자들에게 충분히 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [T.W. Greene 및 G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999], 및 그에 인용된 참조문헌들에 기술되어 있다.
"보호된 형태"의 작용기는 보호기를 가진 작용기를 지칭한다. 본원에 사용된 바, "작용기" 라는 용어 또는 이의 임의의 동의어는 이의 보호된 형태들을 포괄하는 것으로 의도되었다.
"연결자" 라는 용어는, 상호연결 잔기들, 예컨대 중합체 단편 및 말레이미드를 연결하는데 임의적으로 사용되는 원자 또는 원자 집합을 지칭한다. 본 발명의 연결자는 일반적으로 가수분해상으로 안정하다.
"생리학적으로 분해가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 비교적 약한 결합이다. 결합이 물 속에서 가수분해되는 경향은 두 개의 중심 원자를 연결시키는 연결기의 일반적인 유형 뿐만 아니라 이러한 중심 원자에 부착되는 치환기에 따라 달라질 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정하거나 약한 연결기로는, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드, 티오에스테르, 티올에스테르 및 카르보네이트가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
"효소적으로 분해가능한 연결기" 는 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 연결을 의미한다.
"가수분해상으로 안정한" 연결 또는 연결자는, 본 발명의 목적상 및 특히 본 발명의 중합체들과 관련하여, 정상 생리학적 조건하에서 가수분해상으로 안정한 원자 또는 원자 집합을 지칭한다. 다시 말해, 가수분해상으로 안정한 연결은 생리학적 조건 하에서 연장된 시간에 걸쳐 뚜렷한 정도로 가수분해를 겪지 않는다. 가수분해적으로 안정한 연결기의 예로는, 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 쇄 중의), 에테르, 아미드, 우레탄, 아민 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서에서 확인될 수 있다.
"가수분해상 안정화된 말레이미드 고리"는, 본 발명의 한 중합체와 관련하여, 연결자가 없는 중합체 말레이미드 대응물의 개환(ring opening)-안정성과 비교할 때, 상기 말레이미드 고리의 가수분해에 저항하는 것이다. 예를 들어, 어떤 대상 수용성 말레이미드가 구조 CH30-(CH2CH20)5K-CH2CH2-C(O)-NH-CH2-1,3-C6H10-CH2-MAL 를 가지고, 이때 연결자가 -C(O)-NH-CH2-1,3-C6H10-CH2- 일 때, 비교의 기초를 형성하는 이에 대응하는 연결자없는 형태는 CH30-(CH2CH20)5K-CH2CH2-MAL 이다. 전형적으로, 이러한 가수분해 평가는 실온의 인산 완충액 중에서 pH 7.5 에서 수행되고, 상기 말레이미드 고리의 UV 흡광도를 관찰함으로써 측정된다. 따라서, 본 발명의 중합체 시약 중에 함유된 가수분해상 안정화된 말레이미드 고리는 가수분해 안정성의 정도가 그의 연결자없는 대응물보다 향상된 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 가수분해상 안정화된 말레이미드 고리는 상기 기술한 조건 하에서의 가수분해 반감기가 약 16 시간 이상인, 좀 더 바람직하게는 약 20 시간 이상인 안정화된 중합체 말레이미드를 생성시킨다.
중합체의 기하학 또는 전체 구조와 관련한 "분지형" 은 2 개 이상의 중합체 "아암 (arm)" 을 갖는 중합체를 말한다. 분지형 중합체는 2 개의 중합체 아암, 3 개의 중합체 아암, 4 개의 중합체 아암, 6 개의 중합체 아암, 8 개의 중합체 아암 또는 그 이상을 가질 수 있다. 고도로 분지형인 중합체의 한 특정 유형은, 본 발명의 목적을 위해 분지형 중합체의 구조와 구별되는 구조를 갖는 것으로 고려되는 덴드리머성 중합체 또는 덴드리머 (dendrimer) 이다.
"분지점(branch point)"은 중합체가 분리되거나 또는 선형 구조로부터 분지되어 하나 이상의 부가적인 중합체 아암을 형성하는 하나 이상의 원자를 포함한 분기 지점을 지칭한다.
"덴드리머"는 모든 결합이, 규칙적인 분지 패턴 및 각각 분지점을 제공하는 반복 단위를 갖는 중심 초점 또는 코어로부터 방사상으로 방출되는 구형의, 크기 일분산성 (size monodisperse) 중합체이다. 덴드리머는 이를 다른 유형의 중합체와 구별되게 하는 코어 캡슐화와 같은 덴드리머성 상태 특성을 나타낸다.
"실질적으로" 또는 "필수적으로" 라는 것은 거의 전적으로 또는 완전히, 예를 들어 어떤 주어진 양의 95 % 이상인 것을 의미한다.
"알킬" 또는 "알킬렌"기 (분자 내의 이의 위치 및 상기 기가 수소 이외의 원자들에 부착하는 지점의 수에 따름) 는, 일반적으로는 그 길이가 1 내지 20 개의 원자 범위인 탄화수소 사슬 또는 잔기를 말한다. 상기 탄화수소 사슬은 반드시 그렇지는 않지만 그렇게 지시되지 않는 한 바람직하게는 포화이고, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있지만, 일반적으로는 직쇄가 바람직하다. 예시적 알킬기로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸, 헥실, 헵틸 등이 포함된다.
"저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌" 은 탄소수 1 내지 6 의 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 알킬렌기를 말하며, 이는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸로 예시될 수 있다.
"시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌" (분자 내의 이의 위치 및 상기 기가 수소 이외의 원자들에 부착하는 지점의 수에 따름) 은 바람직하게는 탄소수 3 내지 약 12, 보다 바람직하게는 3 내지 약 8 인, 브릿지된 (bridged), 융합된 또는 스피로 환형 화합물 등의 다환족을 포함하는, 포화 또는 불포화 환형 탄화수소 사슬을 말한다.
"저급 시클로알킬" 또는 "저급 시클로알킬렌" 은 탄소수가 1 내지 6 인 시클로알킬기를 지칭한다.
"지환족"은 탄소 원자들의 고리를 포함하는 임의의 지방족 화합물을 지칭한다. 지환족기는 하나 이상의 알킬 또는 알킬렌으로 치환된 상기 정의된 바의 "시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌"기를 포함하는 기이다.
"비간섭 치환기 (non-interfering substituents)" 는, 분자 내에 존재하는 경우, 일반적으로 분자 내에 함유된 다른 작용기와 비반응성인 기이다.
예를 들어, "치환된 알킬" 에서와 같은 용어 "치환된" 은 하나 이상의 비간섭 치환기, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 C3-C8 시클로알킬, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸 등; 할로, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환된 페닐 등으로 치환된 잔기 (예컨대, 알킬기) 를 말한다.
"알콕시" 는 R 이 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-C20 알킬 (예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 벤질 등), 바람직하게는 C1-C7 알킬인 -O-R 기를 말한다.
본원에서 사용되는 바, "알케닐" 은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는, 길이가 1 내지 15 원자 범위인 분지 또는 비분지 탄화수소기, 예컨대 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "알키닐" 은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는, 길이가 2 내지 15 개의 원자인 분지 또는 비분지 탄화수소기, 예컨대 에티닐, n-프로피닐, 이소프로피닐, n-부티닐, 이소부티닐, 옥티닐, 데시닐 등을 지칭한다.
"아릴" 은 각각 5 또는 6 개의 코어 (core) 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합된 것일 수 있는 다중 아릴 고리 또는 비페닐에서와 같이 비융합된 것일 수 있는 다중 고리를 포함한다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리와 함께 융합 또는 비융합된 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "아릴" 에는 헤테로아릴이 포함된다.
"헤테로아릴" 은 1 내지 4 개의 헤테로원자, 바람직하게는 N, 0 또는 S, 또는 이들의 조합을 포함하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 함께 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 은 불포화 또는 방향족 특성이 있거나 없고 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 갖는 하나 이상의 5-12 개의 원자, 바람직하게는 5-7 개의 원자의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자에는 황, 산소, 및 질소가 포함된다.
"치환된 헤테로아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비간섭기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환된 헤테로사이클" 은 비간섭 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
"친전자체" 는, 이온성일 수 있고, 친전자 중심, 즉 전자 추적 (electron seeking) 성이고 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자 집단에 관한 것이다.
"친핵체" 는, 이온성일 수 있고, 친핵 중심, 즉 친전자 중심을 추적하거나 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자 집단에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바의 "활성제" 는 생체내 또는 시험관내에서 입증될 수 있는 어떠한 약리학적 (종종, 이로운) 효과를 제공하는 임의의 제제, 약물, 화합물, 물질의 조성물 또는 혼합물을 포함한다. 이는 식품, 식품보조제, 영양제, 영양기능식품, 약물, 백신, 항체, 비타민, 및 다른 이로운 제제 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 또한 환자에서 국소적 또는 전신적 효과를 생성하는 임의의 생리학적 또는 약리학적 활성 물질을 추가로 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고 환자에 실질적인 독성학적 부작용을 야기하지 않는 부형제를 말한다.
"약리학적 유효량", "생리학적 유효량", 및 "치료적 유효량" 은 본원에서 교환가능하게 혈류 또는 표적 조직 내에서 목적한 수준의 활성제 및/또는 접합체를 제공하는 데 필요한 약학 제제에 존재하는 PEG-활성제 접합체의 양을 의미하는 데 사용된다. 정확한 양은 다수의 인자, 예컨대 특정 활성제, 약학 제제의 성분 및 물리적 특성, 의도된 환자 집단, 환자 고려사항 등에 따라 달라질 것이며, 본원에 제공되고 관련 문헌에서 입수가능한 정보에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 중합체의 맥락에서 "다작용성" 은 그 안에 함유된 3 개 이상의 작용기를 갖는 중합체 골격을 의미하며, 상기 작용기는 동일하거나 상이할 수 있고, 전형적으로는 중합체 말단에 존재한다. 본 발명의 다작용성 중합체는 일반적으로 약 3-100 개의 작용기, 3-50 개의 작용기, 또는 3-25 개의 작용기, 또는 3-15 개의 작용기, 또는 3 내지 10 개의 작용기를 함유할 것이며, 중합체 골격 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 작용기를 포함할 것이다.
"이작용성" 중합체는 그 안에 함유된 두 개의 작용기를 갖는 중합체를 의미한다. 상기 작용기가 동일할 경우, 상기 중합체는 상동이작용성 (homodifunctional) 으로 언급된다. 상기 작용기가 상이한 경우, 상기 중합체는 이종이작용성 (heterodifunctional) 으로 언급된다.
본원에 기재된 염기성 또는 산성 반응물에는 중성의, 하전된, 및 이들의 임의 대응 염 형태가 포함된다.
"폴리올레핀계 알콜"은 올레핀 중합체 골격, 예컨대 폴리에틸렌을 포함하고, 상기 중합체 골격에 다중 부속성 히드록실기가 부착되어 있는 중합체를 지칭한다. 예시적인 폴리올레핀계 알콜은 폴리비닐 알콜이다.
본원에서 사용된 바, "비-펩티드성"이라는 것은 펩티드 연결이 실질적으로 없는 중합체 골격을 지칭한다. 그러나, 상기 중합체는, 반복 단량체 서브유닛을 따라 일정한 간격으로 있는 소수의 펩티드 연결, 예컨대, 예를 들어, 약 50 개 단량체 단위당 약 1 개 이하의 펩티드 연결을 포함할 수 있다.
용어 "환자" 는 반드시는 아니지만 전형적으로 중합체-활성제 접합체 형태인, 본 발명의 중합체 투여로 예방 또는 치료될 수 있는 상태를 겪거나 겪기 쉬운 생명체를 나타내며, 인간 및 동물이 모두 포함된다.
"임의" 또는 "임의로" 는 이후 기재되는 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하여, 상기 기재에는 그 상황이 일어나는 상황 및 일어나지 않는 상황이 포함된다.
"잔기"라는 것은 하나 이상의 분자와의 반응 후 남아있는 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 중합체 접합체에서 생물학상으로 활성인 분자 잔기는 중합체 골격으로의 공유 결합 후 남아있는 생물학상으로 활성인 분자 부분이다.
"접합체"라는 용어는 분자, 예컨대 생물학상으로 활성인 분자 또는 임의의 반응성 표면의 반응성 중합체 분자, 바람직하게는 반응성 폴리(에틸렌 글리콜)로의 공유적 부착의 결과로서 형성된 실재를 지칭하는 것으로 의도되었다.
"전자유인기"라는 용어는 공명현상 (mesomeric) 기작 (즉, π 결합을 통해 국부적 전자밀도를 추가하거나 제거하는) 또는 유도 기작 (즉, σ 결합을 따라 전자밀도를 유인하여 결합을 극성화하는 전기적으로 음성인 부분) 중 하나를 통해 분자의 다른 영역으로부터 전자밀도를 자신쪽으로 가져오는 화학적 부분을 지칭한다.
"입체 장애"라는 용어는 두 화학적 원자단 간의 공간적, 물리적 방해를 지칭한다.
안정화된 중합체 말레이미드-일반적 특징
본 발명은 그의 말레이미드 고리들이 이들의 연결자 없는 말레이미드 대응물과 비교할 때 가수분해상으로 안정한 수용성 및 비-펩티드성 중합체를 제공한다. 일반적으로, 상기 가수분해 저항성의 특징, 즉 상기 말레이미드 고리에 관해서는, 이는 상기 중합체 단편과 상기 말레이미드 사이의 연결자의 도입으로 부여된다. 전형적으로, 상기 연결자는 상기 말레이미드의 질소 원자에 공유적으로 부착된, 바로 인접한 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬을 포함한다. 알킬렌기, 시클로알킬기 또는 이들의 조합을 치환 또는 비치환된 형태로 포함할 수 있는 상기 탄화수소 사슬의 구조 및 크기는, i) 연결자 또는 상기 중합체 단편에서 상기 말레이미드와 임의의 전자유인기 간에 충분한 거리를 제공하여 상기 말레이미드 고리로의 전자 방출을 가능하게 하는 것, 및/또는 ii) 상기 가수분해적 방법에 대하여 입체장애를 제공하는 것으로써 상기 말레이미드의 개환을 지연시키도록 설계된다. 이러한 방식으로, 본원에 기술된 연결자는 가수분해 및 이로 인한 개환에 대항하여 상기 말레이미드 고리를 안정화시킨다. 따라서, 본 발명의 말레이미드-종결 중합체는, 예컨대 합성, 분리 및 저장시에 좀 더 우수한 안정성을 나타내며, 상당량의 개환 접합체를 생산하지 않으면서 보다 넓은 범위의 값의 pH 에 걸쳐 생물학상 활성 분자들에 접합될 수 있다. 본원에서 제시되는 가수분해 데이터는 이 점을 나타낸다. 대표적인 안정화된 중합체 말레이미드들의 합성이 실시예 I, II, III, IV, V, IX, X, XI 및 XII 에 기술되어 있다. 이에서 알 수 있듯이, 선형 비환형, 분지형 비환형 및 지환족 연결자들은 모두 인접 말레이미드 고리의 안정성을 강화시키는데 효과적이다. 상기 중합체 시약 및 이에 대응하는 접합체 모두에 대한 이 특성을 예증하는 가수분해 데이터가 실시예 VII, VIII 및 XIII 에 제시되어 있다.
하기에서 더욱 상세히 기술되는 연결자들로는, 또한 하나 이상의 가수분해상으로 안정하고 비-반응성인 비-탄화수소 원자 또는 원자들의 집합, 예컨대 히드록실, 황, 산소 등을 들 수 있다.
본 발명의 말레이미드-작용화된 중합체는 바람직하게는 넓은 범위의 pH, 예컨대 약 5 내지 약 10 에 걸쳐 가수분해상으로 안정하다. 특히, 가장 바람직하게는, 본 발명의 반응성 중합체 말레이미드는 생물학상 활성 분자 상의, 예컨대 단백질 상의 티올 또는 아미노기에 대한 접합에 적당한 pH 들에서 가수분해상으로 안정하다. 예를 들어, 본 발명의 중합체들은 바람직하게는, 약 7 내지 약 10 의 pH 범위, 좀 더 바람직하게는 약 7 내지 약 8.5 의 pH 범위에서 가수분해-유도된 말레이미드 개환에 대하여 저항성 있다(즉, 접합되지 않은 경우 말레임산 (maleimic acid) 을 형성하거나 또는 접합된 경우 숙신아미드산 (succinamidic acid) 을 형성하는 경향이 없다). 본원에 정의된 바와 같이, 가수분해상으로 안정한 말레이미드는 25 ℃ 및 pH 7.5 의 수성 매질 (예컨대, 인산 완충액) 에서의 상기 말레이미드의 반감기가 약 16 시간 이상, 좀 더 바람직하게는 약 20 시간 이상, 가장 바람직하게는 약 28 시간 이상인 것이다.
중합체 말레이미드의 반감기는, HPLC 를 사용하여 시간에 따른 상기 말레이미드-종결 중합체의 농도를 측정하거나 또는 상기 말레이미드 고리의 UV 흡광도를 관찰함으로써 결정할 수 있다.
상기 말레이미드기에 인접한 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 연결자는 바람직하게는 사슬 길이가 탄소 원자 3 개 이상이고, 인접 탄소 원자가 3 개 이상이다. 좀 더 바람직하게는, 상기 연결자는 탄소수가 약 4 개 이상이고, 가장 바람직하게는 약 5 또는 6 개 이상이다. 상기 사슬 길이는 상기 말레이미드의 질소 원자를 상기 중합체 단편에 연결시키는 가장 짧은 원자 사슬을 형성하는 탄소 원자의 수로 측정된다. 전형적으로, 상기 연결자 내에서 사슬 치환기를 포함한 총 탄소수의 범위는 4 내지 약 20 개, 바람직하게는 4 내지 약 12 개, 좀 더 바람직하게는 4 내지 약 10 개 및 가장 바람직하게는 5 내지 약 8 개이다. 본 발명은 총 탄소수가, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 인 연결자를 포함한다.
상기 중합체 말레이미드의 통상적인 구조상 특징
일반적으로 말해서, 본 발명의 반응성 중합체는 가수분해상으로 안정한 연결자를 경유하여 말레이미드 고리에 연결된 수용성 중합체 단편을 가진다. 가수분해상으로 안정한 연결자는 이가 공유적으로 직접 부착된 상기 말레이미드 고리에 가수분해 안정성을 부여하기에 효과적이다. 좀 더 구체적으로, 본원에서 일반적으로 POLY 로 지칭하는 상기 중합체 단편은 개재 -O-, -C(O)-NH- 또는 O-C(O)-NH- 기를 경유하여 상기 가수분해상으로 안정한 연결자, X 에 공유적으로 부착된다. X 는 전형적으로 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한다. 바람직하게는, 필수적인 것은 아니나, 생성된 중합체 말레이미드는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다.
또한, 본원에서는, 상기 말레이미드 고리가 아미노기, 바람직하게는 일차 아미노기로 치환된 것을 제외하고는, 상기 안정화된 중합체 말레이미드에 대하여 기술된 일반화된 및 특정 예시적인 구조상 특징 모두를 가진 중합체가 제공된다. 따라서, 본원에서 말레이미드-종결 중합체 시약에 대한 모든 구조 및 설명은 상기 기술된 바와 같은 이들의 아미노-종결 대응물로까지 확장되어야 한다.
상기 연결자, X 는 전형적으로 탄소수가 약 1 내지 약 20 이다. 일반적으로, X 는 탄소 및 수소 원자만을 가진 탄화수소 사슬이나, 특정 구현예들에서, X 는 부가적인 비-반응성 원자들 또는 작용기, 예컨대 히드록실기, 에테르, 티오에테르, 또는 기타 비-반응성기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기 또는 원자들은 상기 말레이미드 고리로부터 먼 거리에 위치한다. 좀 더 바람직하게는, 이러한 비-반응성 원자 또는 기들은 상기 말레이미드 질소로부터 4 개 탄소 이상의 거리에 위치한다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 X 에 포함된 부가적 비-반응성 원자 또는 기들은 상기 말레이미드 질소로부터 4 개 탄소 이상, 5 개 탄소 이상 또는 6 개 탄소 이상 또는 그보다 멀리 위치한다. 상기 기들은 그 비환형 대응물들에서보다는 시클로알킬 또는 지환족 X 내에 존재할 가능성이 더 큰데, 이는 단순히 이들이 시중에서 구매가능한 많은 출발물질에 존재하기 때문이다.
본 발명의 중합체 말레이미드는 일반적으로 하기 화학식으로 특징화된다:
[화학식 I]
Figure 112005035674947-pct00025
[식 중, b 는 0 또는 1 이다]. 구조 I 에서, 상기 카르보닐 및 -NH 기가 모두 없을 경우(즉, 각 아랫첨자가 0 일 경우), b 는 1 이다. 상기 연결자 X 의 특징은 하기 부분에서 좀 더 상세히 설명 및 예시된다.
연결자 부분
앞서 언급한 바와 같이, 상기 연결자, X 는 상기 말레이미드 고리의 질소 원자에 인접한 포화 비환형 또는 환형 또는 지환족 탄화수소 부분을 포함한다. X 의 크기 및 구조는 상기 말레이미드 고리의 가수분해 안정성을 향상시키도록 설계되는데, 일반적으로 상기 분자 내에 존재하는 상기 말레이미드 고리 및 전자유인기 간의 거리를 증가시키거나 또는 상기 말레이미드 가수분해 반응에 입체 장애를 제공함으로써이다. 전형적으로, X 는 총 약 3 내지 약 20 개의 탄소 원자를 포함한다. 좀 더 구체적으로, X 는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 으로 이루어진 군에서 선택된 총 탄소수를 가질 수 있다. 연결자 X 내의 총 탄소수의 바람직한 범위는 약 3 내지 약 20, 또는 약 4 내지 약 12, 또는 약 4 내지 약 10, 또는 약 5 내지 약 8 이다.
예시적인 탄화수소 연결로는, 인접 탄소 원자의 수가 3 개 이상인 직쇄 포화 비환형 탄화수소, 예컨대 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌 및 헥사메틸렌 등이 있다. 다시 말해, 가장 간단한 형태로, X 는 -(CH2)y 와 같고, 이때 y 의 범위는 3 내지 약 20 이다. 다시 말해, Y 는 하기 값 중 임의의 것을 가질 수 있다: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20. 대안적으로는, X 는 상기 사슬 내 탄소 위치들 중 임의의 하나 이상에서 분지된 것일 수 있는데, 즉, 1 개 또는 심지어 2 개의 치환기를 포함할 수 있다. 다시 말해, X 는 상기 말레이미딜기에 대한 α 탄소에서, 또는 상기 말레이미딜기에 대한 β 탄소에서, 또는 상기 말레이미딜기에 대한 γ 탄소에서 분지될 수 있다. 탄소수가 19 이하인 탄화수소 사슬에 있어서, 위치 1 내지 19 (이때 위치 1 은 상기 말레이미드 고리에 가장 가까운 것임) 중 임의의 하나가 분지될 수 있다. 예를 들어, C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14-C15-C16-C17-C18-C19- 로 표시되는 탄소수 2 내지 19 의 예시적인 포화 탄화수소 사슬에 있어서, C1, C2, C3, C4, C5, C6 ,C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18 또는 C19 탄소 중 임의의 하나 이상은, 상기 사슬 중의 총 탄소수에 따라, 분지될 수 있는데, 다시 말해, 1 개 또는 심지에 2 개의 치환기를 가질 수 있다. 전형적으로, 분지화기 (branching group) 는 알킬기, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌 시클로알킬 또는 치환된 시클로알킬이다. 특히 바람직한 시클로알킬은 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 등, 및 시클로알킬 고리를 상기 분지화 탄소에 연결하는 하나 이상의 메틸렌기 (예컨대, 메틸렌, 디메틸렌,트리메틸렌, 테트라메틸렌, 등) 를 가진 상기 시클로알킬 중 임의의 것이다. 바람직하게는, 임의의 주어진 포화 탄화수소 사슬 또는 지환족 연결자에서, 4 개 이하의 탄소 원자가 분지되고, 분지화 위치의 총 개수는 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 이다. "분지" 지점들이 함께 포화 고리 또는 고리 시스템 (예컨대, 2환식, 3환식, 등) 을 형성하는 구현예들이 하기에서 개별적으로 논의된다. 가장 바람직하게는, X 가 분지된 경우, 분지화 탄소는 단일하게 분지되는데, 즉, 2 개의 분지화 치환기보다는 1 개의 치환기를 가진다.
예를 들어, 상기 연결은 하기 구조 -(CR1R2)y- 를 가질 수 있고, 이때 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬이고, 및 y 는 약 1 내지 약 20 의, 바람직하게는 약 3 내지 약 20 의, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 약 12 의 정수이다. X 가 분지된 경우, 바람직하게는 상기 분지화는, 상기 말레이미드 고리 가수분해 반응에 대하여 최대의 입체 장애를 제공하기 위하여, C1, C1, C3 또는 C4 중 하나 이상, 다시 말해, 상기 말레이미드 고리에 가장 가까운 탄소 원자 위치에서이다. (상기 연결자, X 내에서의 탄소 원자 위치를 논의할 경우, C1 은 상기 말레이미드 질소 등에 인접한 탄소 원자를 지칭한다). X 가 분지된 경우, 상기 분지화기 (예컨대, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬) 는 전형적으로 8 개 이하의 탄소 원자를 포함한다. 상기 분지화기가 알킬 또는 시클로알킬일 경우, 바람직하게는 상기 알킬기는 저급 알킬 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실 및 시클로헥실이다.
상기 논의한 바와 같이, 상기 연결자 X 자체는 환형 또는 지환족일 수 있다. 구체적으로, X 는 하기 형태를 소유할 수 있다:
[화학식 IV]
Figure 112005035674947-pct00026
[식 중, CYCa 는 "a" 개의 고리 탄소를 가진 시클로알킬렌기이고, 이때 상기 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고; p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, 및 p + q + a ≤ 20 이고, R1 은, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고, R2 는, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다]. 한 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 는 각 발생 위치에서, 모두 수소이다. 바람직하게는, p 및 q 는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이다. 더욱 더 바람직하게는, p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 6 또는 0 내지 4 의 범위이다. 바람직하게는, CYCa 로 표시되는 시클로알킬 고리는 5 내지 약 12 개의 고리 탄소 원자, 더욱 더 바람직하게는 약 6 내지 약 10 개의 고리 탄소 원자를 포함한다. 대표적인 시클로알킬기로는, C3-C8 시클로알킬렌, 예컨대 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌 및 시클로헵틸렌 및 시클로옥틸렌이 있다. CYCa 는 하나 이상의 알킬기, 바람직하게는 저급 알킬기로 임의 치환될 수 있고, 이는 상기 고리 내의 임의 위치에서일 수 있다. CYCa 가 2 개의 치환기, 즉, 상기 구조 IV 에 보여지는 바와 같은 (CR1R2)p 및 (CR1R2)q 로만 치환된 경우, 상기 치환기는 유사하게 상기 고리 중의 임의의 하나 이상의 탄소 상에 위치할 수 있다. 예를 들어, 시클로페닐렌에 있어서, 상기 치환기는 1,1-, 1,2- 또는 1,3-위치에서 일 수 있다. 시클로헥실렌 고리에 있어서, 상기 치환기는 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-위치에서 일 수 있다. 특히 바람직한 구현예는 R1 및 R2 가 모든 경우에 수소인 것, 및 p 및 q 가 각각 독립적으로 0, 1, 2 및 3 에서 선택되는 것이다. 예시적인 연결자로서, 1,2-(CH2)0,1,2,3-C6H4-(CH2)0,1,2,3, 및 1,3-(CH2)0,1,2,3-C6H4-(CH2)0,1,2,3 및 1,4-(CH2)0,1,2,3-C6H4-(CH2)0,1,2,3- 이 있다. CYCa 가 2 개의 치환기만 소유한 경우, 상기 치환기는 시스 또는 트랜스 중 하나일 수 있다. CYCa 가 2 개 이상의 치환기를 포함한 경우, 상기 치환기는 서로에 대하여 임의의 상대적 배향에 있을 수 있다.
CYCa 는 또한 2환식 고리를 포괄한다. CYCa 에 해당하는 예시적인 2환식 고리로는, 예컨대 비시클로[1.1.1]펜탄, 비시클로[2.2.1]헥산, 비시클로[2.2.1]헵탄, 비사이클[2.2.2]옥탄, 비시클로[3.1.0]헥산, 비시클로[3.1.1]헵탄, 비시클로[3.2.1]옥탄, 비시클로[3.3.1]노난, 비시클로[3.3.2]데칸, 비시클로[3.3.3]운데칸 등이 있다. CYC 는 또한 3환식 고리 시스템을 포괄하며, 예컨대 아다만탄이다. 이들 2- 및 3환식 시스템의 일부가 하기에 나와 있다:
Figure 112005035674947-pct00027
이들 고리들은 상기 고리 시스템 내의 임의의 이용가능한 위치 내의 -[C(R1)(R2)]p 및 -[C(R1)(R2)]q 에 해당하는 알킬렌 또는 치환된 알킬렌기를 가질 수 있다. 나아가, 상기 2환식 또는 3환식 고리는 또한 -[C(R1)(R2)]p 및 -[C(R1)(R2)]q 외에 추가적인 치환기들을 소유할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 치환기들은 저급 알킬, 히드록실, 술프히드릴 또는 할로겐화물이다. 2- 및 3환식 고리 시스템을 가진 대표적인 중합체 말레이미드가 도 1A 및 1B 에 제시되어 있다.
구조 I 에서 상기 연결, L 은 상기 기술한 바와 같이 상기 중합체 단편에 인접하고 X 에 상호연결되는 비-탄화수소 부분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 중합체 단편에 인접한 예시적인 비-탄화수소 부분으로는, -0-, -O-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -CH2-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, NH-C(O)-NH-, -NH- 및 - S- 가 있고, 이들은 바람직하게는 가수분해상으로 안정하다. 특히 바람직한 비-탄화수소 부분으로는, -O-, -O-C(O)-NH-, -C(O)-NH- 가 있다. 보다 덜 바람직한 구현예에서, 상기 아미드 또는 카르바메이트 작용기 중의 질소 아미드는 상기 보여지는 수소 대신, 예컨대, 메틸 또는 에틸 또는 이와 유사한 기를 가진 3차 질소이다.
본 발명에 따른 탄화수소 사슬을 포함한 예시적인 연결이 하기 표 1 에 나와 있다.

말레이미드-종결 중합체에 대한 예시적인 연결자
Figure 112005035674947-pct00028
L 2 = -NH-Q-
표기 Q
L2-TEME 테트라메틸렌, -(CH2)4-
L2-HEXA 헥사메틸렌, -(CH2)6-
L2-EPEN
Figure 112005035674947-pct00029
L 3 = -O-Z
표기 Z
L3-ET 에틸렌, -(CH2)2-
L3-TME 트리메틸렌, -(CH2)3-
L3-TEME 테트라메틸렌, -(CH2)4-
L3-PENT 펜타메틸렌, -(CH2)5-
L3-HEXA 헥사메틸렌, -(CH2)6-
Figure 112005035674947-pct00030
Figure 112005035674947-pct00031
표 1 에 있는 연결들 중 다수가 상기 말레이미드 고리의 가수분해를 지연시키는데 효과적이나, 일부는 다른 것들보다 더욱 효과적이다. 표 1 에 있는 수 개의 연결들은 물이 상기 말레이미드 고리 질소를 공격하는데 대한 입체 장애를 제공하여, 상기 말레이미드가 가수분해에 대해 저항성 있게 한다. 이들 연결자들로는, L4-TMPA, L4-CMEN, L5-TMPE, L1-TEPE, L2-EPEN, L4-ETPA 및 L4-HEDA 를 포함하는 것들이 있다. 용이하게 이용가능한 대응 대칭 3 차 디아민에 기초한 L4-TMPA 및 L5-TMPE, 및 자연 발생적인 p-멘탄의 시중에서 구매가능한 디아민 유도체에 기초한 L4-CMEN 를 포함하는 연결자들은, 입체 장애 및 상기 고리와 전자유인기 사이에 적절한 간격을 제공함으로써 상기 말레이미드 고리의 가수분해 속도를 감소시키는 예시적인 연결이다. 표 4 에 제시된 가수분해 데이터로부터 알 수 있듯이, 시클로헥실렌 고리를 함유하는 연결자가 특히 바람직하다. 상기 가수분해 데이터로부터 알 수 있듯이, 상기 1,3-디메틸렌-시클로헥실렌 연결자는 생성되는 PEG-말레이미드에 가수분해에 대한 특별한 안정성을 부여한다. 사실상, 이의 가수분해 반감기는 이의 연결자 없는 말레이미드 대응물의 반감기보다 8 배 더 길다. 상기 1,4-디메틸렌-시클로헥실렌 연결자는 또한 가수분해 반감기가 이의 연결자 없는 말레이미드 대응물의 반감기보다 2.5 배 이상 더 긴 안정한 말레이미드 중합체를 생성한다.
중합체 단편
상기 예시적인 구조들에 나와 있듯이, 본 발명의 말레이미드 종결 중합체는 수용성 중합체 단편을 포함한다. 대표적인 POLY 들로는, 폴리(알킬렌 글리콜) 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다(당류), 폴리(α-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠 (polyphosphazene), 폴리옥사졸린 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 이 있다. POLY 는 상기 중 임의의 것의 동종중합체, 교대 공중합체, 불규칙 공중합체, 블록 공중합체, 교대 3중합체, 불규칙 3중합체 또는 블록 3중합체일 수 있다. 상기 수용성 중합체 단편은 바람직하게는, 필수적인 것은 아니나, 폴리(에틸렌 글리콜) "PEG" 또는 이의 유도체이다.
상기 중합체 단편은 다수의 상이한 기하학 중 임의의 것일 수 있는데, 예를 들어, POLY 는 선형, 분지형 또는 갈래진 형일 수 있다. 가장 전형적으로, POLY 는 선형이거나 또는, 예를 들어, 2 개의 중합체 아암을 가진 분지형이다. 본원에서 논의의 많은 부분이 예시적인 POLY 로서의 PEG 에 초점이 맞춰지고 있으나, 본원에 제시된 상기 논의 및 구조들은 상기 기술된 수용성 중합체 단편 중 임의의 것을 포괄하는 것으로 용이하게 확대될 수 있다.
하나 이상의 반응성 말단을 가진 임의의 수용성 중합체를 사용하여 본 발명에 따른 중합체 말레이미드를 제조할 수 있으며, 본 발명은 이 점에 있어서 제한되지 않는다. 단 1 개의 반응성 말단을 가진 수용성 중합체를 사용할 수 있으나, 본원에 개시된 바와 같이 안정화된 중합체 말레이미드로의 변환에 적합한 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 , 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개 또는 그 이상의 반응성 말단을 포함하는 중합체를 사용할 수 있다. 이롭게는, 상기 물-중합체 단편 상의 히드록실 또는 기타 반응성 부분의 수가 증가함에 따라, 연결된 말레이미도기를 도입용으로 이용가능한 위치의 수도 증가한다. 상기 수용성 중합체 단편에 결합된 히드록실 및/또는 반응성 부분들의 수의 상한의 비제한적인 예로서, 약 1 내지 약 500 개, 1 내지 약 100 개, 약 1 내지 약 80 개, 약 1 내지 약 40 개, 약 1 내지 약 20 개 및 약 1 내지 약 10 개가 있다.
이제 상기 바람직한 POLY 로 돌아가서, PEG 는, 말단-봉쇄된 PEG, 갈래진 PEG, 분지형 PEG, 부속형 PEG, 및 보다 덜 바람직하게는, 하기에서 보다 충분히 기술될, 단량체 서브유닛들을 분리시키는 하나 이상의 분해가능한 연결을 포함한 PEG 를 포함하여, 이의 선형, 분지형 또는 멀티-아암 형태 중 임의의 것에 있는 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포괄한다.
PEG 중합체 단편은 하기를 포함한다: -(CH2CH20)n-CH2CH2- (식 중 (n) 은 전형적으로 약 3 내지 약 4,000, 또는 약 3 내지 약 3,000, 또는 좀 더 바람직하게는 약 20 내지 약 1,000 의 범위이다).
POLY 는 또한 말단-봉쇄된 것일 수 있는데, 예를 들어, PEG 는 불활성 말단-봉쇄기로 말단이 봉쇄된 말단-봉쇄 PEG 일 수 있다. 바람직한 말단-봉쇄된 PEG 는 말단-봉쇄 부분으로서 예컨대 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐옥시, 치환된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환된 알키닐옥시, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시를 가지는 것들이다. 바람직한 말단-봉쇄기들은 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시이다. 상기 말단-봉쇄기는 또한 이롭게는 인지질을 포함할 수 있으나, 상기 중합체는 또한 지질을 결여할 수 있다. 예시적인 인지질로는, 포스파티딜콜린, 예컨대 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린 및 레시틴이 있다.
이제 중합체 단편인 POLY 를 포함한 구조들 중 임의의 것을 참조하면, POLY 는 하기에 상응하거나 또는 하기를 포함할 수 있다: "Z-(CH2CH20)n" 또는 "Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-" (식 중, n 의 범위는 약 3 내지 약 4000 또는 약 10 내지 약 4000 이고, Z 는 반응성기 또는 말단-봉쇄기일 수 있는 작용기이거나 상기 작용기를 포함한다). Z 의 예로서, 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 아세탈, 알데히드 수화물, 케톤, 케탈, 케톤 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴 및 플루오레신이 있으며, 응용가능한 경우 이들의 활성화된 및 보호된 형태를 포함한다. 바람직한 것은 작용기, 예컨대 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 비닐술폰, 말레이미드, N-숙신이미딜 카르보네이트, 히드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데히드, 오르토피리딜-디술피드 및 아크릴롤이다.
이들 및 다른 작용기들인 Z 는 하기 참조문헌들에 기술되어 있으며, 이들은 모두 참조로서 본원에 포함된다: N-숙신이미딜 카르보네이트 (참조: 예컨대, 미국특허 제 5,281,698 호, 제 5,468,478 호), 아민 (참조: 예컨대, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), 히드라지드 (참조: 예컨대, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (참조: 예컨대, Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997; 또한 미국특허 제 5,672,662 호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트 (참조: 예컨대, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) 및 Joppich et al., Makromol. Chem. 180: 1381 (1979), 숙신이미딜 에스테르 (참조: 예컨대, 미국특허 제 4,670,417 호), 벤조트리아졸 카르보네이트 (참조: 예컨대, 미국특허 제 5,650,234 호), 글리시딜 에테르 (참조: 예컨대, Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), 옥시카르보닐이미다졸 (참조: 예컨대, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-니트로페닐 카르보네이트 (참조: 예컨대, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); 및 Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), 알데히드 (참조: 예컨대, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), 미국특허 제 5,824,784 호, 미국특허 제 5,252,714 호), 말레이미드 (참조: 예컨대, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), 및 Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), 오르토피리딜-디술피드 (참조: 예컨대, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314 (1993)), 아크릴롤 (참조: 예컨대, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), 비닐술폰 (참조: 예컨대, 미국특허 제 5,900,461 호).
또한, 상기 직전에 보여진 POLY 구조는 선형 중합체 단편을 나타낼 수 있고, 또는 분지형 또는 갈래진 형태의 중합체 단편 중 일부를 포함할 수 있다. 상기 중합체 단편이 분지형인 경우에, 상기 직전의 POLY 구조는, 예를 들어, 전체 POLY 구조 중 일부를 형성하는 상기 중합체 아암에 해당한다. 대안적으로는, POLY 는 갈래진 형태의 구조인 경우, 상기 POLY 구조는, 예를 들어, 상기 분지점 전에 상기 중합체 단편의 선형 부분에 해당한다.
POLY 는 또한 아암이 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 그 이상인 분지형 PEG 분자에 해당한다. 본 발명의 중합체 말레이미드를 제조하는데 사용되는 분지형 중합체는 임의 지점에서 2 내지 300 정도의 반응성 말단을 가질 수 있다. 바람직한 것은, 중합체 아암이 2 개 또는 3 개인 분지형 중합체 단편이다. 미국특허 제 5,932,462 호에 기술된 바와 같은 분지형 폴리는 하기 구조에 해당한다:
Figure 112005035674947-pct00032
이 표시에서, R" 은 비반응성 부분, 예컨대 수소, 메틸 또는 PEG 이고, P 및 Q 는 비반응성 연결이다. 한 바람직한 구현예에서, 상기 분지형 PEG 중합체 단편은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2 치환된 리신이다.
상기 특정 분지된 배열에서, 상기 분지형 중합체 단편은, 본원에 기술된 바와 같이 상기 반응성 말레이미드기의 위치화를 위한 "C" 분지점으로부터 연결자를 경우하여 연장되는 단일한 반응성 부위를 포함한다. 본 발명에서 사용된 것 등의 분지형 PEG 는 전형적으로 PEG 아암이 4 개 미만, 좀 더 바람직하게는 PEG 아암이 2 개 또는 3 개일 것이다. 이러한 분지형 PEG 는 그 선형 PEG 대응물보다 더 크고 더 조밀한 중합체 구름과 결합된 단일 반응성 부위를 가지는 것의 이점을 제공한다.
분지형 PEG 말레이미드의 한가지 특정 유형은 하기 구조에 해당한다: (MeO-PEG-)iG-[O]b-C(O)-NH-X-MAL (식 중, MAL 은 말레이미드를 나타내고, i 는 2 또는 3 이고, G 는 리신 또는 기타 적당한 아미노산 잔기이다).
본 발명의 한 예시적인 분지형 중합체 말레이미드는 하기 보여지는 구조를 가지며, 이때 X 는 본원에 기술된 가수분해상으로 안정한 연결자들 중 임의의 것이다.
[화학식 XVII]
Figure 112005035674947-pct00033
상기 XVIII 로 구현되는 구조상 특징을 가지는 본 발명의 중합체의 합성이 실시예 1 에 제시되어 있다. 본 발명의 중합체 말레이미드를 제조하는데 사용되는 분지형 PEG 는, 좀 더 일반적으로는 화학식 R(PEG)n (식 중, R 은 2 개 이상의 PEG 아암이 연장되는 중심 또는 코어 분자이다) 으로 표시되는 것들을 포함한다. 변수 n 은 PEG 아암의 개수를 표시하고, 이때 상기 중합체 아암 각각은 독립적으로 말단-봉쇄된 것일 수 있고 또는 대안적으로는, 그의 말단에서 반응성 작용기, 예컨대 말레이미드 또는 기타 반응성 작용기를 가진다. 본 발명의 이러한 멀티-아암화 구현예들에서, 각 PEG 아암은 전형적으로 그의 말단에서 말레이미드기를 가진다. 분지형 PEG 예컨대 일반적으로 상기 화학식 R(PEG)d 로 표시되는 것들은 중합체 아암이 2 개 내지 약 300 개이다(즉, n 의 범위는 2 내지 약 300 임). 이들 등의 분지형 PEG 는 바람직하게는 중합체 아암이 2 내지 약 25 개, 좀 더 바람직하게는 2 내지 약 20 개, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 약 15 개 또는 그 미만이다. 가장 바람직한 것은, 아암이 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개인 멀티-아암화 중합체이다.
상기 기술한 바와 같은 분지형 PEG 에서 바람직한 코어 분자는 폴리올이다. 이러한 폴리올로는, 에틸렌 글리콜, 알칸 디올, 알킬 글리콜, 알킬이덴 알킬 디올, 알킬 시클로알칸 디올, 1,5-디칼린디올, 4,8-비스(히드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬이덴 디올, 디히드록시알칸, 트리히드록시알칸 등을 포함하는, 탄소수가 1 내지 10 이고 히드록실기의 수가 1 내지 10 인 지방족 폴리올이 있다. 직쇄 또는 폐환 당류 및 당알콜류, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨, 케브라키톨, 트레이톨, 아라비톨, 에리트리톨, 아도니톨, 둘시톨, 파코오스 (facose), 리보오스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스 (lyxose), 람노스, 갈락토스, 글루코스, 프럭토스, 소르보스, 만노스, 피라노스, 알트로스, 탈로스, 타기토스 (tagitose), 피라노시드, 슈크로스, 락토오스, 말토스 등을 포함하는, 시클로지방족 폴리올 또한 이용가능하다. 부가적인 지방족 폴리올로는, 글리세랄데히드, 글루코스, 리보오스, 만노스, 갈락토스 및 관련 입체 이성질체들의 유도체들이 있다. 기타 사용될 수 있는 코어 폴리올로는, 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린 및 기타 탄수화물 예컨대 전분 및 아밀로오스가 있다. 바람직한 폴리올로는, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨 및 트리메틸올프로판이 있다.
상기 기술된 유형의 대표적인 멀티-아암 중합체 구조는 하기이다:
[화학식 VI]
Figure 112005035674947-pct00034
[식 중, d 는 3 내지 약 100 의 정수이고, R 은 3 개 이상의 히드록실기, 아미노기 또는 이들의 조합물을 가진 중심 코어 분자의 잔기이다].
본 발명의 중합체 말레이미드를 제조하는데 사용하기 위한 멀티-아암화 PEG로는, Nektar 사 (Huntsville, Alabama) 로부터 구매가능한 멀티-아암 PEG 가 있다. 한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 멀티-아암화 중합체 말레이미드는 하기에 해당하며, 이때 상기 분자의 연결된 말레이미드 부분의 특정물이 본원의 다른 곳에서 제시된다.
[화학식 VII]
Figure 112005035674947-pct00035
[식 중, PEG 는 -(CH2CH20)nCH2CH2- 이고, M 은 하기이고:
Figure 112005035674947-pct00036
m 은 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택된다].
대안적으로는, 상기 중합체 말레이미드는 전체적으로 갈래진 형태의 구조를 소유할 수 있다. 갈래진 형태의 PEG 의 한 예는 하기 구조에 해당한다:
[화학식 XVIII]
Figure 112005035674947-pct00037
[식 중, PEG 는 본원에 기술된 PEG 의 형태 중 임의의 것이고, A 는 연결기, 바람직하게는 가수분해상으로 안정한 연결, 예컨대 산소, 황 또는 -C(O)-NH- 이고, F 및 F' 는 임의로 존재하는 가수분해상으로 안정한 스페이서기이고, 가수분해상으로 안정한 연결자, X 및 말레이미드 (MAL) 부분에 해당하는 기타 변수들은 상기 정의된 바와 같다]. 가능한 X 값에 대한 일반적인 및 특정적 설명 모두 상기 구현예인 구조 XVIII 에 적용가능하다. A, F 및 F' 에 해당하는 예시적인 연결자 및 스페이서기는 국제출원번호 PCT/US99/05333 에 기술되어 있고, 이들은 본 발명에서 사용되는 이 유형의 중합체 단편을 형성하는데 유용하다. F 및 F' 은 동일 또는 상이할 수 있는 스페이서기이다. 상기 중 한가지 특정 구현예에서, PEG 는 mPEG 이고, A 는 -C(O)-NH- 에 해당하고, F 및 F' 는 모두 메틸렌 또는 -CH2- 이다. 이 유형의 중합체 단편은 활성제가 2 개인 반응에 유용한데, 이 때 상기 두 활성제는 F 및 F' 의 선택에 따라 규정된 또는 미리 결정된 거리 만큼 떨어져 위치한다.
갈래진 형태의 중합체 단편을 가지는 본 발명의 중합체 시약의 또 다른 변형은 하기에 해당한다:
[화학식 XIX]
Figure 112005035674947-pct00038
[식 중, 상기 변수들은 상기 기술된 바와 같다]. 바람직하게는, 이 구현예에서 X 는 총 탄소수가 3 내지 약 20 인 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬이다.
상기 화학식에서 "PEG" 에 해당하는 예시적인 분지형 PEG 는 mPEG 2치환된 리신이고, 이때 "PEG" 는 하기에 해당한다:
Figure 112005035674947-pct00039
대안적으로는, 본 발명의 중합체 말레이미드를 제조하는데 사용되는 PEG 중합체 단편은 그 말단에서 보다는 오히려 PEG 사슬의 길이 방향을 따라 부속형 반응성기를 가져서 상기 PEG 사슬에 하나 이상의 부속형 말레이미드기가 연결자 X 에 의해 부착된 안정화된 중합체 말레이미드를 산출하는 PEG 분자일 수 있다.
또한, 보다 덜 바람직한 구현예에서, 상기 중합체 단편 자체는 가수분해되기 쉬운 하나 이상의 약한 또는 분해가능한 연결을 소유할 수 있다. 상기 중합체 단편에 존재할 수 있는 예시적인 분해가능한 연결로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 카르보네이트, 이민, 포스페이트 에스테르 및 히드라존이 있다.
일반적으로, 상기 수용성 중합체 단편, POLY 의 공칭 평균 분자량은 다양할 것이다. POLY 의 공칭 평균 분자량은 전형적으로 하기 범위 중 하나 이상에 속한다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 500 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 약 2,000 달톤 내지 약 25,000 달톤; 약 5,000 달톤 내지 약 20,000 달톤. 수용성 중합체 단편 POLY 에 대한 예시적인 공칭 평균 분자량으로는, 약 1,000 달톤, 약 5,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤 및 약 40,000 달톤을 들 수 있다. 저분자량의 POLY 는 약 250, 500, 750, 1000, 2000 또는 5000 달톤의 분자량을 가진다.
중합체 아민
본 발명은, 이에 대하여 기술된 말레이미드 고리를 아미노기, 바람직하게는 -NH2 로 치환한 것을 제외하고는, 상기 기술한 임의의 및 모든 구조의 아민 대응물로 확장된다.
좀 더 구체적으로, 본 발명은 하기 구조를 가지는 수용성 중합체로 확장된다:
[화학식 VIII]
Figure 112005035674947-pct00040
[식 중, POLY, b 및 X 는 상기 기술된 바와 같다].
대표적인 중합체 아민으로는, 하기 보여지는 일반화된 구조를 가진 것들이 있다:
[화학식 VIII-C]
Figure 112005035674947-pct00041
[식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이고, 상기 시클로헥실렌 고리 상의 치환기들은 시스 또는 트랜스 중 하나이다].
[화학식 VIII-D]
Figure 112005035674947-pct00042
[식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이고, 상기 시클로헥실렌 고리 상의 치환기들은 시스 또는 트랜스 중 하나이다].
일반적으로 VIII 로 표시되는 아민-종결 중합체는 하기에서 좀 더 상세히 기술되는 다수의 용도를 가진다. 예를 들어, 이들은 본 발명의 말레이미드-종결 중합체로 변환될 수 있고, 또는 대안적으로는, 추가적인 변형없이 활성제 또는 표면들에의 공유 부착에, 또는 히드로겔 형성에 사용할 수 있다.
가수분해 안정성 및 제조 방법
상기 기술된 바와 같이, 본원에 제시된 상기 중합체 말레이미드는, 상기 중합체 시약 자체 (실시예 VII 및 XIII) 및 이들의 대응 접합체 (실시예 VIII) 모두에 대하여 증명된 바와 같이, 가수분해에 대하여 저항성 있다. 본 발명의 한 중합체 말레이미드는, 동일 조건하에서 측정시, 그의 연결자 없는 중합체 말레이미드 대응물의 반감기보다 더 긴 가수분해 반감기를 가진다. 다시 말해, 본 발명의 연결자화 중합체 말레이미드는 그의 대응 연결자 없는 형태의 가수분해 속도보다 더 느린 가수분해 속도를 가지며, 이는 상기 말레이미드 고리가 필수적으로 동일한 조건하에서 손상되지 않고 남아있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 실시예 7 및 14, 표 2 및 4 에 있는 가수분해 데이터를 볼 때, 상기 대표적인 연결자 각각은 그의 연결자 없는 말레이미드 ("3-ET") 보다 더 연장된 가수분해 반감기를 가진다.
본 발명의 중합체 말레이미드는 하기를 포함하는 다수의 대안적인 경로에 의 해 제조될 수 있다. 한가지 접근법에서, 본 발명의 말레이미드-종결 중합체는 중합체 단편에 부착된 작용기 (즉, 활성화된 중합체 단편) 를 2 작용성 연결자에 부착된 작용기와 반응시킴으로써 제조한다. 상기 중합체 단편을 2 작용성 연결자 시약과 반응시킴으로써 상기 연결자와 상기 중합체 단편과의 가수분해상으로 안정한 연결을 통해 공유 부착이 생성된다. 상기 2 작용성 연결자 시약 상의 잔류 작용기는 말레이미드 또는 말레이미드로 쉽게 변환될 수 있는 작용기 중 하나이다.
예를 들어, 상기 연결자 시약은 A-L-B 구조를 가질 수 있는데, 이때 A 는 제 1 작용기이고 이는 상기 중합체 단편 상의 제 2 작용기와 반응하여 가수분해상으로 안정한 연결인 L 을 형성하여 POLY-L-B 를 형성하고, 이때 B 는 말레이미드 또는 말레이미드로 쉽게 변환될 수 있는 작용기 (예컨대, 메톡시카르보닐말레이미드와의 반응으로 말레이미드로 변환될 수 있는 아민) 이다. 상기 접근법에서, A 는 다수의 작용기 중 임의의 것일 수 있으며, 예컨대 할로, 히드록실, 활성 에스테르 예컨대 N-숙신이미딜 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드 및 에폭시드일 수 있다. 연결자 시약의 특정 예로서는, 1,4-디브로모부탄, 1,5-디브로모펜탄, 1,6-디브로모헥산, N-숙신이미딜(ε-말레이미도헥사노에이트), N-숙신이미딜(ε-말레이미도펜타노에이트), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르, N-(γ-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 에스테르, 4,7,10-트리옥사-1,3-트리데칸디아민, 4-(말레이미도메틸)-1-시클로헥산카르복실산-NHS 에스테르, 테트라메틸렌디아민, 펜타메틸렌디아민, 헥사메틸렌디아민, 2,5-디아미노-2,5-디메틸헥산, 1,3-시클로헥실비스(메틸아민) 및 1,4-시클로헥실비스(메틸아민)이 있다. 이러한 연결자 시약은 시중에서, 예를 들어 Pierce Chemical Company 로부터, 구매가능하고, 또는 당업계에 공지된 방법론을 사용하여 시중에서 구매가능한 출발물질로부터 제조될 수 있다.
이 접근법은 하기 방법 1 로서 좀 더 구체적으로 보여지는데, 이는 상기 중합체 단편을 상기 연결자, X 에 연결하는 아미드 또는 우레탄 결합을 포함한 중합체 말레이미드 형성에 관한 것이다.
방법 1
Figure 112005035674947-pct00043
상기와 유사한 방법인 고안된 방법 2 에서, 반응성 중합체 출발물질인 POLY-[O]b-C(O)-LG, 를 디아민 시약인 H2N-X-NH2 와 반응시켜 대응 중합체 아민 중간체인 POLY-[0]b-C(0)-HN-X-NH 를 형성한다. 이 중간체를 그 후 대응 안정화된 말레이미드-종결 중합체로 변환시킨다. 이 방법은 본원에 기술된 바와 같은 안정화된 중합체 말레이미드를 형성시키기에 적당한 많은 디아민 시약들이 시중에서 구매가능하다는 점에서 유리하다. 나아가, 중합체-아민 중간체는 이들의 말레이미드 대응물보다, 예컨대 컬럼 크로마토그래피에 의하여, 정제하기가 더욱 용이할 수 있어서, 기타 바람직하지 않은 중합체-유도 부산물, 예컨대 PEG-디올 및 PEG-디올 유래 불순물을 상당히 결여한 중합체 말레이미드 생성물을 제공한다. 방법 2 는 하기에 나와 있다.
방법 2.
일반화된 반응식.
단계 a.
Figure 112005035674947-pct00044
단계 b.
Figure 112005035674947-pct00045
방법 1 및 2 에서, LG 는 이탈기를 나타내고, 기타 변수들은 앞서 기술된 바와 같다. 상기 반응성 중합체 출발물질, POLY-[O]b-C(O)-LG 는, 예를 들어, 아실 할로겐화물, 할로포르메이트, 무수물 또는 활성 에스테르이다. 상기 방법들에 유용한 이탈기로는, 할로겐화물 (예컨대, 클로로, 브로모 및 요오도), N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸 및 파라-니트로페놀레이트가 있다. 아미드 또는 우레탄 결합을 형성시키는 커플링 반응은 일반적으로 건조 유기 용매, 바람직하게는 질소 또는 아르곤 등의 불활성 대기 하에서 수행된다. 적당한 용매로는, 아세토니트릴, 염소화 탄화수소 예컨대 클로로포름 및 디클로로메탄, 방향족 탄화수소 예컨대 벤젠, 톨루엔 및 크실렌, 및 아세톤 및 테트라히드로푸란 등의 용매가 있다. 상기 반응은, 이용되는 용매의 유형 및 특정 시약들 자체의 반응도에 따라, 전형적으로 약 0 내지 100 ℃ 의 온도범위에서 수행된다. 상기 커플링은 일반적으로 염기의 존재하에서 수행된다. 염기로서는, 트리알킬아민 예컨대 트리에틸 아민, 피리딘, 4-(디메틸아미노) 피리딘, 및 무기 염기 예컨대 탄산나트륨이 있다.
방법 2 에서 H2N-X-NH2 에 해당하는 대표적인 2환식 및 3환식 디아민 반응물이 도 2 에 제시되어 있다. 방법 2 에서, 어떤 경우에서는, 예를 들어, 통상적인 아미노-보호기 예컨대 t-BOC 또는 FMOC 를 사용하여, H2N-X-NH2 의 아미노기 중 하나를 보호하는 것이 필요할 수 있다. 그 후 전형적으로는 POLY-[O]b-C(O)-HN-X-NH 에서 보호기를 추가적인 정제 또는 변형 전에 제거한다. 예를 들어, 실시예 10 및 11 참조. 상기 중간체 중합체 아민의 정제를 수행하는 경우에는, 다수의 정제 방법 중 임의의 것을 사용할 수 있는데, 예컨대 예컨대 침전법 또는 크로마토그래피법이 있고, 그러나 상기 중간체 중합체 아민 상의 아미노기의 존재 때문에 이온 교환 크로마토그래피가 바람직하다.
방법 2 에서 상기 접근법을 계속함에 있어서, 상기 중간체 중합체 아민을 그 후 대응 말레이미드로 변환시킨다. 일반적으로, 이 변환은, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 형성시키기에 적당한 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를 시약, 예컨대 N-메톡시카르보닐말레이미드, 엑소-7-옥사[2.2.1] 비시클로헵탄-2,3-디카르복실산 무수물 또는 말레산 무수물과 반응시킴으로써 수행된다.
바람직한 시약은 N-메톡시카르보닐말레이미드이고, 이 경우, 상기 말레이미드로의 변환은 물 또는 물 및 아세토니트릴 또는 아세톤 등의 수 혼화성 용매의 수성 혼합물에서 수행된다. 상기 변환 반응은 일반적으로 약 0 내지 80 ℃ 의 온도 범위 및 약 6.5 내지 9 의 pH 범위에서 수행된다.
상기 시약이 말레산 무수물일 경우, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를, 중간체로서의 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-NH-C(O)CH=CHCOOH (XI) 를 생성시키기에 효과적인 조건하에서 말레산 무수물과 반응시킨다. 이 중간체를 그 후 물의 제거로 고리화를 촉진시키기에 효과적인 조건하에서 가열하여 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL 을 형성한다. 상기 말레이미드 고리를 형성시키는 고리화 반응의 효율은 전형적으로 약 15 내지 약 80 % 범위이다.
일반적으로, 생성물인 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 상기 반응 혼합물로부터 회수하며, 임의적으로는 추가로 정제한다. 상기 생성물을 방법 2 로 형성시키는 경우, 상기 아민-전구체에 대하여 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피로 정제를 수행할 경우, 중합체-유래 불순물을 제거하기 위한, 추가의 정제는 불필요하다. 바람직하게는, 상기 회수된 생성물, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 은 중합체 순도가 약 80 % 를 초과한다.
실시예 1 및 5 는 말단 말레이미드기를 포함한 연결자를 사용하여 본 발명의 반응성 중합체를 형성시키는 방법을 예시한다. 실시예 1 에서, 반응성 아미노기를 포함하도록 변형된 중합체 단편을 활성화된 에스테르 및 말레이미드기를 포함한 2 작용성 연결자와 반응시킨다. 유사한 접근법을 실시예 5 에서 이용하여 연결자를 포함한 시클로헥실렌을 가진 중합체 말레이미드를 제조한다. 실시예 2, 3, 및 4 는 이후 대응 말레이미드로 변환되는 중합체 아민 중간체의 형성을 보여준다.
실시예 9, 10, 11 및 12 는 상기 방법 2 에 의한 시클로알킬렌-함유 연결자의 합성을 증명하는데, 여기에서 반응성 중합체 출발물질인 POLY-[O]b-C(O)-LG 를 디아민 시약과 반응시켜 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를 형성시키고, 그 후 이를 대응 말레이미드-종결 생성물로 변환시킨다.
중합체 말레이미드 시약의 저장
바람직하게는, 본 발명의 중합체 말레이미드, 뿐만 아니라 이들의 아미노 대응물을, 불활성 대기, 예컨대 아르곤 하 또는 질소 하에서 저장한다. 상기 분자의 말레이미드 부분이 물과 반응할 가능성 때문에 (예컨대, 수분에 노출되어 대응 개환 형태를 형성), 본 발명의 중합체 말레이미드에 있어서 수분에의 노출을 최소화하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 바람직한 저장 조건은 약 -15 ℃ 이하의 온도 및 건조 아르곤 또는 또 다른 건조 불활성 기체하이다. 저온 조건하에서의 저장이 바람직한데, 이는 바람직하지 않은 부반응, 예컨대 말레이미드 개환, 의 속도가 보다 저온에서는 느리기 때문이다. 상기 중합체 생성물의 중합체 단편이 PEG 인 경우, 상기 PEG 부분은 산소와 느리게 반응하여 상기 분자의 PEG 부분을 따라 과산화물을 형성할 수 있다. 과산화물의 형성은 궁극적으로 사슬 절단을 야기하고, 따라서 본원에 제시된 PEG 시약들의 다분산성을 증가시킬 수 있다. 상기의 관점에서, 본 발명의 PEG 말레이미드 및 관련 중합체를 어두운 곳에 저장하는 것이 또한 바람직하다.
생물학상의 활성 접합체
커플링 화학, 분리, 저장
접합체
본 발명은 또한 본원에 기술된 안정화된 중합체 말레이미드 또는 이들의 대응 중합체 아민 대응물 중 임의의 것의 반응으로 생성되는 접합체를 포괄한다. 특히, 본원에 기술된 중합체 말레이미드는 반응에 이용가능한 하나 이상의 티올 또는 아미노기를 가진 활성제 또는 표면에의 접합에 유용하고, 한편 본원에 기술된 중합체 아민은 반응에 이용가능한 하나 이상의 카르복실기를 가진 활성제 또는 표면에의 접합에 유용하다.
예를 들어, 본 발명의 접합체는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112005035674947-pct00046
[식 중, "-S-활성제" 는 티올 (-SH) 기를 포함한 활성제, 바람직하게는 생물학상의 활성제를 나타내고, 기타 변수들은 앞서 기술한 바와 같다]. 상기 활성제가 1 개의 반응성 티올기만을 포함한 생물학상의 활성제 또는 소형 분자인 경우, 전형적으로 단백질에 포함되어 있고 접합에 있어서 접근이 용이한 술프히드릴기의 수가 비교적 적기 때문에, 생성되는 조성물은 이롭게도 단일 중합체 접합체 화학종만을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 또는 소형 분자 또는 기타 활성제를 공지된 위치에서 티올기를 가지도록 설계하며, 이는 마찬가지로 단일 중합체 접합체 화학종만을 포함하는 조성물이 생성되도록 할 것이다.
대안적으로는, 본 발명의 접합체는 하기 구조를 가진다:
Figure 112008083794070-pct00047
삭제
구조 XV 에서, "-NH-활성제" 는 아미노기를 포함한 활성제 또는 표면, 바람직하게는 생물학상의 활성제를 나타내며, 기타 변수들은 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 중합체 아민은, 직접 사용할 경우, 하기 유형의 접합체를 제공하는데 사용될 수 있다:
Figure 112005035674947-pct00048
본원에 제시된 중합체 접합체, 특히 본 발명의 안정화된 중합체 말레이미드에서 유래한 것들은 마찬가지로 말레이미드 개환에 대하여 향상된 가수분해 안정성의 특징을 가진다. 이 특징은 실시예 VIII 에서 증명된다. 상기 모델 화합물, 2-메르캅토에탄올, 및 예시적인 단백질 모두를 사용한 예시적인 접합체의 합성이 실시예 6, 14, 15, 16 및 17 에 기술되어 있다.
접합 방법
적당한 접합 조건은 중합성 시약과 활성제 사이의 접합을 달성하기에 충분한 시간, 온도, pH, 시약 농도, 용매 등의 조건들이다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 다른 것들 중 특정 조건들은 활성제, 원하는 접합 유형, 반응 혼합물 중 다른 물질의 존재 등에 좌우된다. 임의의 특정 경우에 접합을 구현하기에 충분한 조건은, 당업계의 통상의 기술을 가진 자가 본원에 개시된 것 및 관련 문헌을 읽음으로써, 및/또는 일상적인 실험을 통해 결정할 수 있다.
예시적인 접합 조건으로는, 약 6 내지 약 10 의 pH, 예를 들어, 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 의 pH 에서 접합 반응을 수행하는 것이 있다. 상기 반응을 약 5 분 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 약 48 시간, 좀 더 바람직하게는 약 4 시간 내지 약 24 시간 또는 그 이하로 진행되도록 한다. 접합 반응에 있어서의 온도는 전형적으로, 필수적인 것은 아니나, 약 0 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위이고; 접합은 종종 실온에서 또는 그 이하에서 수행된다. 접합 반응은 종종 완충제 예컨대 인산 또는 아세트산 완충액 또는 유사 계에서 수행된다.
시약 농도에 관해서, 과량의 중합성 시약을 전형적으로 상기 활성제와 결합시킨다. 그러나, 일부 경우, 활성제의 양에 대하여 화학양론적 양의 상기 중합성 시약 상의 반응성기의 수를 가지는 것이 바람직하다. 활성제에 대한 중합성 시약의 예시적인 비로서는, 몰비가 약 1:1 (중합성 시약:활성제), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 또는 10:1 인 것들이 있다. 상기 접합 반응을 실질적으로 더 이상의 접합이 일어나지 않을 때까지 진행하도록 하는데, 이는 일반적으로 시간에 따른 반응의 경과를 모니터링하여 결정할 수 있다.
상기 반응의 진행 경과는 다양한 시점에서 상기 반응 혼합물로부터의 분취량을 회수하고 상기 반응 혼합물을 SDS-PAGE 또는 MALI-TOP 질량 분석법 또는 임의의 기타 적당한 분석 방법을 이용하여 모니터링할 수 있다. 형성된 접합체의 양 또는 남아있는 비접합 중합체의 양에 있어서 플래토우 (plateau) 에 도달하면, 반응이 완결된 것으로 가정한다.
전형적으로, 상기 접합 반응은 수분 내지 수 시간 사이 (예컨대, 5 분 내지 24 시간 또는 그 이상) 에 일어난다. 필수적인 것은 아니나, 상기 결과적인 생성물 혼합물을, 바람직하게는 정제하여 과량의 시약, 비접합 반응물 (예컨대, 활성제), 원치않는 다중-접합 화학종 및 유리 또는 비반응 중합체를 분리시킨다. 생성된 접합체를 그 후, 예컨대 MALDI, 모세관 전기영동법 (capillary electrophoresis), 겔 전기영동법 및/또는 크로마토그래피 등의 분석 방법을 사용하여 추가로 특징화할 수 있다.
좀 더 바람직하게는, 본 발명의 중합체 말레이미드를 전형적으로, 약 6 내지 9 범위 (예컨대, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5 또는 9), 좀 더 바람직하게는 약 7 내지 9, 더욱 더 바람직하게는 약 7 내지 8 범위의 pH 에서 술프히드릴-함유 활성제에 접합시킨다. 일반적으로, 약간의 과량의 몰의 중합체 말레이미드를 이용하는데, 예를 들어, 1.5 내지 15-배 과량의 몰, 바람직하게는 2-배 내지 10 배 과량의 몰을 이용한다. 반응 시간은 일반적으로 실온에서 약 15 분 내지 수 시간의 범위, 예컨대, 8 또는 그 이상의 시간이다. 입체 장애된 술프히드릴기에 있어서, 필요한 반응 시간은 상당히 더 길 수 있다. 본 발명의 안정화된 말레이미드는 티올-선택적이고, 티올-선택적 접합은 바람직하게는 약 7 의 pH 에서 수행된다.
아미노기를 이용한 반응은 보다 높은 pH 에서 진행되나, 상대적으로 느리다. 단백질 PEG화 반응 조건은 단백질, 원하는 PEG화 정도 및 특정 중합체 말레이미드 시약에 따라 다양하다.
예시적인 반응식
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분리
임의로, 본 발명의 PEG 말레이미드 또는 PEG 아민을 생물학적 활성제와 반응시켜서 제조된 접합체를 정제하여, 상이한 PEG화 화학종을 수득/단리하였다. 다르게는, 그리고 저분자량의, 예컨대 분자량이 약 20 킬로달톤 미만, 바람직하게는 약 10 킬로달톤 이하인 PEG 에 있어서는 더욱 바람직하게, 생성 혼합물을 정제하여, 적용가능한 경우, 단백질 분자당 대략 일정 수의 PEG 분포 상태를 수득할 수 있다. 예를 들어, 생성 혼합물을 정제하여 단백질당 평균 약 1 내지 5 개의 PEG, 통상적으로는 단백질당 평균 약 3 개의 PEG를 수득할 수 있다. 최종 접합체 반응 혼합물의 정제 방법은 몇 가지 요소에 의존한다 - 사용된 중합체의 분자량, 특정 단백질, 바람직한 투약 방법, 및 각 접합체(들) 화학종의 잔여 활성 및 생체내 특성.
필요에 따라, 상이한 분자량의 PEG 접합체를 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 단리할 수 있다. 상기 접근법은 분자량이 상이한 PEG 접합체를 분리하는 데 사용될 수 있으나, 이는 단백질내에 상이한 PEG화 부위를 갖는 위치 이성질체를 분리하는 데는 일반적으로 효과가 없다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피법을 이용하여 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 혼합물 각각을 서로 분리할 수 있지만, 회수된 각 PEG-머 조성물은 단백질내의 상이한 반응성 아미노기(예컨대, 리신 잔기)에 부착된 PEG를 함유할 수 있다.
상기 유형의 분리 작업을 수행하기에 적합한 겔 여과 칼럼에는 Amersham Biosciences 에서 입수가능한 SuperdexTM 및 SephadexTM 이 포함된다. 특정 칼럼의 선택은 목적하는 분획 범위에 따라 다르다. 용리는 일반적으로 비-아민계 완충액, 예컨대 포스페이트, 아세테이트 등을 이용하여 수행된다. 수집된 분획을, 몇 가지 상이한 방법, 예를 들어 (i) 단백질 함량에 대한 280 nm 에서의 OD, (ii) BSA 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 테스트(Sims G. E. C., 등, Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980), 또는 다르게는, (iv) SDS PAGE 겔을 건 후, 요오드화바륨을 염색하는 방법을 이용하여 분석할 수 있다.
위치 이성질체의 분리는, RP-HPLC C18 칼럼(Amersham Biosciences 또는 Vydac)을 이용한 역상 크로마토그래피 또는 이온 교환 칼럼, 예컨대 Amersham Biosciences에서 입수가능한 SepharoseTM 이온 교환 칼럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된다. 동일 분자량의 PEG-생체분자 이성질체(위치 이성질체)를 분리하는 데 둘 중 어느 접근법을 사용해도 무방하다.
접합에 의해 생성된 PEG-접합체, 및 임의의 부가적 분리 단계에의 사용 목적에 따라, 접합체 혼합물을 농축, 멸균 여과, 및 약 -20 ℃ 내지 약 -80 ℃ 에서 저장할 수 있다. 다르게는, 상기 접합체를 잔여 완충액의 존재 또는 부재하에서 동결건조하고 동결건조된 분말로 저장할 수 있다. 일부의 경우, 소디움 아세테이트와 같은 접합용 완충액을, 동결건조 도중 쉽게 제거될 수 있는 휘발성 완충액, 예컨대 암모늄 카보네이트 또는 암모늄 아세테이트으로 교환하여, 동결건조된 단백질 접합체 분말 제형에 잔여 완충액이 남아있지 않도록 하는 것이 바람직하다. 다르게는, 특수 제조된 완충액을 이용하여 완충액 교환 단계를 수행하여, 동결건조된 접합체가 특수 제조된 완충액으로 재구성되고, 궁극적으로는 포유류에 투여하기에 적합한 형태가 되도록 한다.
표적 분자 및 표면
본 발명의 안정화 중합체 말레이미드(아민)은, 필름, 화학적 분리 및 정제 표면, 고체 지지체, 금, 티타늄, 탄탈륨, 니오븀, 알루미늄, 스틸 및 그들의 산화물과 같은 금속/금속 산화물 표면, 규소 산화물, 거대분자, 및 작은 분자를 포함하는 다수의 실재물에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체는 생화학적 센서, 생전자성 스위치 및 문에 사용될 수 있다. 본 발명의 중합체 말레이미드(아민)은 친화력 분할을 위한 고분자-리간드 접합체를 제조하기 위하여, 가교 또는 비-가교된 하이드로겔의 제조를 위하여, 및 생물반응기를 위한 고분자-코펙터 첨가물을 제조하기 위하여, 중합체-코팅된 표면 및 중합체 그라프트(graft) 제조를 위한 펩티드 합성용 담체로 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 중합체에의 커플링에 사용되는 생물학적인 활성제는 하기 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 적합한 작용제는 예를 들어, 최면제 및 진정제, 심리적 활성 부여제, 안정제, 호흡기 약물, 진경제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 마취제, 항-염증제, 항불안제 (불안 완화제), 식욕 억제제, 항편두통제, 근육 수축제, 항-감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 제토제, 항간질제, 기관지확장제, 시토킨, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심장혈관제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 피임제, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항남성호르몬제, 항기생충제, 항응집제, 종양제, 항종양제, 저혈당제, 영양제 및 보충제를 포함하는 호르몬제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 대조제로부터 선택될 수 있다.
더 구체적으로, 활성제는 작은 분자 (바람직하게는 불용성 작은 분자), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 스테로이드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지방, 전해질 등을 포함하는 많은 구조적 분류 중 하나에 해당될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 중합체 말레이미드에 커플링하기 위한 활성제는 천연 아미노기 또는 술프히드릴(sulfydryl)기를 소유하거나, 또는 선택적으로 본 발명의 중합체 말레이미드에 커플링하기에 적합한 하나 이상의 반응성 아미노기 또는 술프히드릴기를 포함하도록 개질되어 있다.
본 발명의 중합체에 공유 결합하기에 적합한 활성제의 특정 예로는 아스파리지나아제, 암독소비르 (amdoxovir (DAPD)), 앤티드, 비케플레민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 작용제 (예를 들어, 약 10-40 아미노산 길이로부터이고 WO 96/40749에 설명된 것처럼 특이한 코어 서열을 포함하는 펩티드), 도나아제 알파, 에리스로포에시스 자극 단백질 (NESP), 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, 본 윌레브랜드 인자 (von Willebrand factor)와 같은 응집 인자, 세레데이즈, 세레자임, 알파-글루코시데이즈, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 디펜신, 베타 디펜신, 엑스딘-4 (exedin-4), 그레눌로사이트 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로티나아제 억제제, 엘카토닌, 그레눌로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 본 몰포제닉 단백질-2, 본 몰포제닉 단백질-6, OP-1과 같은 본 몰포제닉 단백질, 산성 피브로블라스트 성장 인자, 염기성 피브로블라스트 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론과 같은 인터페론, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체와 같은 인터루킨 및 인터루킨 수용체, 락토페린 및 락토페린 단편, 루테나이징 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 특허번호 5,922,675에 언급된 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥테레오타이드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인플루엔자 백신, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 알테플라아제, 유로키나아제, 레테플라아제, 스트렙토키나아제, 파미테플라아제, 라노테플라아제 및 테네테플라아제와 같은 플라스미노젠 활성제, 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테거린, 혈소판-유래된 성장 인자, 조직 성장 인자, 변형 성장 인자-1, 혈관 내피 성장 인자, 루케미아 저해 인자, 루케미아 성장 인자 (KGF), 아교 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 모노사이트 화학유인물질 단백질-1, 내피 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 (매우 늦은 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기세포융합바이러스 항체, 낭 섬유증 막 조절제 (CFTR) 유전자, 디옥시레보뉴클리에이즈 (Dnase), 살균/침투 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 모노클로날 항체는 이타네르셉트 (etanercept) (IgG1의 Fc 부분에 결합된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체 융합 단백질), 아브식시마브(abciximab), 아페리모마브(afelimomab), 바시릭시마브(basiliximab), 다클리쥬마브(daclizumab), 인플릭시마브(infliximab), 이브리튜모마브 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan), 미투모마브(mitumomab), 무로모나브-CD3 (muromonab-CD3), 요오드 131 토시투모마브 접합체, 올리주마브 리툭시마브, 및 트라스투주마브(헤르셉틴)를 포함한다.
본 발명의 중합체에 공유 결합하기에 적합한 부가적인 작용제는 아미포스틴 (amifostine), 아미오다론 (amiodarone), 아미노카프로익 산 (aminocaproic acid), 아미노히프레이트 소디움 (aminohippurate sodium), 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 아미노이불리닉 산 (aminolevulinic acid), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 암사크린 (amsacrine), 아나그레라이드 (anagrelide), 아나스트로졸 (anastrozole), 아스파라지나제 (asparaginase), 안트라시클린 (anthracyclines), 벡사로텐 (bexarotene), 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 부세레린 (buserelin), 부설판 (busulfan), 카베르고린 (cabergoline), 카페시타빈 (capecitabine), 카보플라틴 (carboplatin), 카무스틴 (carmustine), 클로람부신 (chlorambucin), 실라스타틴 소디움 (cilastatin sodium), 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 클로드로네이트 (clodronate), 시클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 시프로테론 (cyproterone), 시타라빈 (cytarabine), 캠토테신(camptothecins), 13-시스 레티놀릭 산, 모든 트랜스 레티놀릭 산; 다카르바진 (dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 디퍼록사민(deferoxamine), 덱사메타손(dexamethasone), 디클로페낙 (diclofenac), 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 이피루비신 (epirubicin), 에스트라뮤스틴 (estramustine), 에토포사이드 (etoposide), 엑세메스탄 (exemestane), 펙소페나딘 (fexofenadine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루드로코티손 (fludrocortisone), 플루오로우라실, 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 플루타미드 (flutamide), 겜시타빈 (gemcitabine), 에피네프린, L-도파, 하이드록시유레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드 (ifosfamide), 이마티니브(imatinib), 이리노테칸 (irinotecan), 이트라코나졸 (itraconazole), 고세레린 (goserelin), 레트로졸 (letrozole), 루코보린 (leucovorin), 레바미졸 (levamisole), 리시노프릴 (lisinopril), 로보티록신 소디움 (lovothyroxine sodium), 로무스틴 (lomustine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 멜파란 (melphalan), 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 메타라미놀 비타트레이트 (metaraminol bitartrate), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토클로프라미드 (metoclopramide), 멕실레틴 (mexiletine), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 날로손 (naloxone), 니코틴, 니루타미드 (nilutamide), 옥트레오티드 (octreotide), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 펜토스타틴 (pentostatin), 필카마이신 (pilcamycin), 폴피머 (porfimer), 프레드니손 (prednisone), 프로카르바진 (procarbazine), 프로클로페라진 (prochlorperazine), 온단세트론, 랄티트렉스트 (raltitrexed), 시로리머스 (sirolimus), 스트렙토조신 (streptozocin), 타크로리머스 (tacrolimus), 타목시펜 (tamoxifen), 테모조로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토스테론 (testosterone), 테트라하이드로케나비놀 (tetrahydrocannabinol), 탈리도미드 (thalidomide), 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레티노인 (tretinoin), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데스틴 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 도라세트론 (dolasetron), 그라니세트론 (granisetron); 포르모테롤 (formoterol), 플루티카손 (fluticasone), 루프로리드 (leuprolide), 미다졸람 (midazolam), 알프라졸람 (alprazolam), 암포테리신 B (amphotericin B), 포도피로톡신 (podophylotoxins), 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존 (aroyl hydrazones), 수마트립탄 (sumatriptan); 에리트로마이신 (erythromycin), 오레안도마이신 (oleandomycin), 트로리안도마이신 (troleandomycin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 다베르신 (davercin), 아지트로마이신 (azithromycin), 플루리트로마이신 (flurithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin), 조사마이신 (josamycin), 스피로마이신 (spiromycin), 미데카마이신 (midecamycin), 루코마이신 (leucomycin), 미오카마이신 (miocamycin), 로키타마이신 (rokitamycin), 안다지트로마이신 (andazithromycin) 및 스위놀라이드 A (swinolide A)와 같은 마크로라이드; 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 트로바플록사신 (trovafloxacin), 아라트로플록사신 (alatrofloxacin), 목시플록시신 (moxifloxicin), 노르플록사신 (norfloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 그레파플록사신 (grepafloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 스파플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 페플록사신 (pefloxacin), 아미플록사신 (amifloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 투수플록사신 (tosufloxacin), 프루리플록사신 (prulifloxacin), 이르록사신 (irloxacin), 파쥬플록사신 (pazufloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 및 시타플록사신 (sitafloxacin)과 같은 플루오로퀴놀론; 젠타미신 (gentamicin), 네틸미신 (netilmicin), 파라메신 (paramecin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌 (teicoplanin), 람포라닌 (rampolanin), 미데플라닌 (mideplanin), 코리스틴 (colistin), 다프토마이신 (daptomycin), 그라마시딘 (gramicidin), 콜리스티메테이트 (colistimethate)와 같은 아미노글리코시드; 폴리믹신 B (polymixin B), 카프레오마이신 (capreomycin), 바시트라신 (bacitracin), 페넴 (penems)과 같은 폴리믹신; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실린-감수성 작용제를 포함하는 페니실린; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실린-저항성 작용제; 암피실린, 아목시실린 및 헤타실린, 실린 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제; 카베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항슈도모날 페니실린; 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프트부텐 (ceftbuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리옥손 (ceftriaxone), 세팔로틴, 세파피린, 세파렉신, 세프라드린, 세폭시틴 (cefoxitin), 세파만돌 (cefamandole), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로리딘 (cephaloridine), 세파클로 (cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세팔로글리신 (cephaloglycin), 세프록심 (cefuroxime), 세포라나이드 (ceforanide), 세포탁심 (cefotaxime), 세파트리진 (cefatrizine), 세파세트릴 (cephacetrile), 세페파임 (cefepime), 세픽심 (cefixime), 세포니시드 (cefonicid), 세포페라존 (cefoperazone), 세포테탄 (cefotetan), 세프메타졸 (cefmetazole), 세프타지딤 (ceftazidime)과 같은 세팔로스포린, 로라카베프 (loracarbef), 및 목사락탐 (moxalactam), 아즈트레오남 (aztreonam)과 같은 모노박탐 (monobactams); 및 카르바페넴 (carbapenems), 예컨대 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem), 펜트아미디네세티오네이트 (pentamidineisetionate), 알부테롤 설페이트(albuterol sulfate), 리도카인 (lidocaine), 메타프로테레놀 설페이트 (metaproterenol sulfate), 베클로메타손 디프레피오네이트 (beclomethasone diprepionate), 트리암시놀론 아세트아미드, 부데소나이드 아세토나이드, 플루티카손 (fluticasone), 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔라이드 (flunisolide), 크로몰린 소디움 (cromolyn sodium), 및 에르고타민 타르트레이트 (ergotamine tartrate); 팍리탁셀 (paclitaxel)과 같은 탁센 (taxanes); SN-38, 및 티르포스틴 (tyrphostines)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 중합체 말레이미드에의 커플링을 위한 바람직한 펩티드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 콘센서스 IFN, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, IL-2, 레미케이드(인플릭시마브), 리툭산(리툭시마브), 엔브렐(에타네르셉트), 신나기스(팔리비주마브), 레오프로(압식시마브), 헤르셉틴(트라스투지마브), tPA, 세리자임(이미글루세라아제), B형 간염 백신, rDNAse, 알파-1 프로티나아제 억제제, GCSF, GMCSF, hGH, 인슐린, FSH 및 PTH 를 포함한다.
상기 예시적인 생물학적 활성제는 가능한 유사체, 작용제, 길항제, 억제제, 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것을 의미한다. 펩티드 및 단백질에 관하여서는, 본 발명은 그의 생물학적 활성 단편 뿐만 아니라 합성, 재조합, 천연, 글리코실화된, 및 비-글리코실화된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 생물학적 활성 단백질은, 생성된 변형 단백질이 부모(천연)단백질의 활성을 일정 정도 이상 함유하는 한, 치환(예컨대, 시스테인), 소실 등이 된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변형체를 포함하는 것으로 의도된다.
약학적 조성물
본 발명은 약학적 첨가제와 결합된 본 발명의 접합체를 포함하는 약학적 제제를 또한 포함한다. 일반적으로, 접합체 자체는 고체 형태 (예를 들면, 침전물)인데, 이것은 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적당한 약학적 첨가제와 결합될 수 있다.
예시적인 첨가제는 탄수화물, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
당, 알디톨, 알도닉 산 (aldonic acid), 에스테르화된 당과 같은 유도된 당, 및/또는 당 고분자와 같은 탄수화물은 첨가제로서 존재할 수 있다. 특정한 탄수화물 첨가제는 예를 들어, 프락토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스 등과 같은 모노사카라이드; 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 디사카라이드; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 스타치 등과 같은 폴리사카라이드; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락시톨, 자일리톨, 솔비톨 (글루시톨), 피라노실 솔비톨, 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다.
첨가제는 시트르산, 소디움 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소디움 설페이트, 포타슘 니트레이트, 소디움 포스페이트 모노베이직, 소디움 포스페이트 디베이직 및 이들의 혼합물과 같은 무기염 또는 완충제를 또한 포함할 수 있다.
제제는 미생물의 성장을 방해하거나 예방하기 위해서 항미생물제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 제한되지 않는 예는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티머졸 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항산화제가 제제에 또한 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 막기 위하여 사용되는데, 이에 따라 제제의 접합체 또는 다른 성분들의 오염을 막는다. 본 발명에서 사용되는 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시안니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 히포포스포러스 산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소디움 비설피트, 소디움 포름알데히드 설폭실레이트, 소디움 메타비설피트 및 이들의 혼합물을 포함한다.
계면활성제가 첨가제로서 포함될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리사카라이드, 예를 들어 "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 플루로닉스, 예를 들어 F68 및 F88 (둘다 BASF, 마운트 올리브, 뉴 저지로부터 입수가능함); 솔비탄 에스테르; 지질, 예를 들어 인지질, 예를 들어 레시틴 및 다른 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게 리포솜 타입이 아니지만), 지방산 및 지방성 에스테르; 스테로이드, 예를 들어 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 아연 및 다른 적합한 양이온.
산 또는 염기가 제제에 첨가제로서 포함될 수 있다. 사용 가능한 제한적이지 않은 산은 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 젖산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함한다. 적합한 염기의 예로는 소디움 히드록시드, 소디움 아세테이트, 암모늄 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소디움 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소디움 시트레이트, 소디움 포르메이트, 소디움 설페이트, 포타슘 설페이트, 포타슘 푸머레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 염기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
약학적 제제는 모든 유형의 제제를 포함하고, 특히 예를 들어, 서스펜젼 및 용액 뿐만 아니라 물을 타서 사용할 수 있는 파우더와 같이 주사용으로 적합한 것들을 포함한다. 조성물 내의 접합체 (즉, 본 발명의 활성제 및 고분자 사이에서 형성된 접합체)의 함량은 많은 요소들에 따라 다양할 수 있으나, 상기 조성물이 단위 용량 컨테이너 (예를 들어, 바이알)에 저장되었을 때 치료적으로 유효량이 되도록 하는 것이 바람직하다. 게다가, 약학적 제제는 시린지에 수용될 수 있다. 치료적인 유효량은 어떤 함량이 임상적으로 바람직한 종말점을 나타내는지를 결정하기 위하여 접합체의 함량을 증가시킨 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물에서 각 첨가제의 함량은 첨가제의 활성 및 조성물의 특정 필요에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 각 개별 첨가제의 최적 함량은 통상적인 실험, 즉 첨가제의 다양한 함량 (낮은 함량부터 높은 함량까지)을 포함하는 조성물의 제조, 안정성 및 다른 변수들의 시험, 및 중요한 부작용 없이 최적 성능이 얻어지는 범위를 결정을 통해서 결정된다.
그러나, 일반적으로 조성물에서 첨가제는 약 1 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 약 98 중량%, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 95 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량% 미만으로 존재한다.
다른 첨가제와 함께 상기 약학적 첨가제들은 ["레밍톤: 약학의 과학 & 실습", 19 판, 윌리암스 & 윌리암스, (1995)], ["외과의사의 데스크 참고자료", 52 판, 의학 경제학, 몽발르, NJ (1998)], 및 [크리브, A. H., 약학적 첨가제의 안내서, 3 판, 미국 약학회, 워싱톤, D.C., 2000.]에 설명되어 있다.
본 발명의 약학적 제제는 전형적으로, 비록 반드시는 아니지만, 주사를 통해서 투여되고, 따라서 투여 전에 일반적으로 즉시 액체 용액 또는 서스펜젼으로 된다. 약학적 제제는 시럽, 크림, 연고, 정, 파우더 등과 같은 다른 형태 또한 가능하다. 폐, 직장, 경피, 점막, 경구, 경막, 피하, 동맥 속 등과 같은 다른 투여 모드 또한 포함된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 접합체는 정맥 주사 또는 덜 바람직하게 근육내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 주사되어 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 제제 유형은 즉시 주사 용액, 사용 전에 용매와의 혼합을 위한 건조 파우더, 즉시 주사가능한 서스펜젼, 사용 전에 담체와 혼합하기 위한 건조 불용성 조성물, 및 에멀션 및 투여 전에 희석을 위한 액체 농축물 등을 포함한다.
투여 방법
본 발명은 본 발명의 접합체를 접합체 치료에 반응하는 상태로 고통받는 환자에게 투여하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 주사를 통하여 접합체 (바람직하게 약학적 제제의 부분으로 제공되는)의 치료적인 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 특정 접합체의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 어떤 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 특정 접합체가 효과적으로 치료할 수 있는 조건을 인식할 것이다. 투여되는 실제 함량은 치료되는 상태의 심각성, 건강 케어 전문가의 판단, 및 투여되는 접합체 뿐만 아니라 환자의 나이, 중량 및 일반적인 상태에 따라 다양할 수 있다. 치료적인 유효량은 본 발명 분야의 당업자 및/또는 적당한 참고문헌 및 논문에 공지되어 있다. 일반적으로, 치료적인 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일, 및 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일이다.
어떤 주어진 접합체 (또한, 바람직하게 약학적 제제의 부분으로 제공되는)의 단위 용량은 임상의의 판단에 따른 다양한 복용 계획, 환자의 필요량 등에 따라 투여될 수 있다. 특정 복용 계획은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려져 있고, 통상적인 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 복용 계획은 하루에 5 번, 하루에 4 번, 하루에 3 번, 하루에 2 번, 하루에 1 번, 한주에 3 번, 한주에 2 번, 한주에 1 번, 한달에 2 번, 한달에 1 번, 및 이들의 혼합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일단, 임상적인 종말점에 이르면, 조성물의 복용은 중지된다.
본 발명의 접합체 투여의 장점은 개별 수용성 고분자 부분이 쪼개질 수 있다는 것이다. 상기 결과는 고분자 크기 때문에 체내로부터의 제거가 잠재적으로 문제가 될 때 유용하다. 바람직하게, 각 수용성 고분자 부분의 쪼개짐은 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-포함하는 결합과 같은, 생리학적으로 쪼개질 수 있는 및/또는 효소학적으로 분해될 수 있는 결합의 사용을 통하여 촉진된다. 이런 방식으로, 접합체의 제거 (개별 수용성 고분자 부분의 쪼개짐을 통한)는 바람직한 제거 특성을 제공하는 고분자 분자 크기 및 유형 관능기를 선택함으로써 조절될 수 있다. 당업자는 쪼개질 수 있는 관능기 뿐만 아니라 고분자의 적절한 분자 크기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 통상적인 실험 방법을 이용하여, 먼저 다른 고분자 중량 및 쪼개질 수 있는 관능기를 가진 다양한 고분자 유도체를 제조하고, 그리고 나서, 상기 고분자 유도체들을 환자에게 투여하고 주기적인 혈액 및/또는 소변 시료를 채취하여 제거 프로필 (예를 들어, 주기적인 혈액 또는 소변 샘플링)을 얻음으로써 적절한 분자 크기 및 쪼개질 수 있는 관능기를 결정할 수 있다. 일단 각 시험 접합체에 대한 일련의 제거 프로필이 얻어지면, 적합한 접합체가 확인될 수 있다.
본원에서 참조된 모든 논문, 서적, 특허, 특허 공개물 및 기타 간행물은 그 전문이 참조로서 포함된다.
실시예
본 발명은 이의 바람직한 특정한 구현예와 함께 기술되었으나, 상술 내용 및 후술하는 실시예들은 발명을 예시하고자 하는 것이고, 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님이 이해되어져야 한다. 본 발명의 범위의 다른 면, 장점 및 변형은 본 발명의 당분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
약어
DCM: 디클로로메탄
NMR: 핵 자기 공명
DI: 탈이온화
r.t. 실온
anh. 무수 (anhydrous)
Da: 달톤
GPC 겔 투과 크로마토그래피
물질 및 방법
첨부된 실시예에서 언급된 모든 화학 시약은 다른 언급이 없는 한 상업적으로 입수하였다.
첨부된 실시예에서 언급된 모든 PEG 시약은 Nektar 사 (Huntsville, AL) 로부터 입수가능하다. 모든 1HNMR 데이터는 브루커 (Bruker) 에 의해 제조된 300 또는 400 MHz NMR 분광계로부터 얻어졌다.
실시예 1
분지형 PEG2-아미도펜타메틸렌-말레이미드 (40 kDa) (Ll-AMPE)
합성 개관:
Figure 112005035674947-pct00050
A. 분지형 PEG2 (40K) 아민
메틸렌 클로라이드 중의 분지형 PEG2(40,000)-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (20g, 0.00050 몰) (Nektar, Huntsville Alabama) 용액 (250 ㎖) 에, 에틸렌디아민 (0.68 ㎖, 0.01017 몰) 을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 하룻밤 교반하였다. 다음으로 용매증발시켜 건조하였다. 조생성물을 소량의 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 습한 생성물을 감압하에서 건조시켰다. 수율 17.2 g.
NMR (d6-DMSO): 2.65 ppm(t,-CH 2 -NH2), 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격).
B. 분지형 PEG2-아미도펜타메틸렌-말레이미드-40 kDa
메틸렌 클로라이드 중의 N-숙신이미딜 (ε-말레이미도헥사노에이트) (0.1 g, 0.000324 몰, Pierce Chemical Company) 용액 (10 ㎖) 에, 3 분간에 걸쳐 메틸렌 클로라이드 중의 단계 A 로부터의 분지형 PEG2 (40K) 아민 (12.2 g, 0.000305 몰) 용액 (20 ㎖) 을 첨가하였다. 이어서, 0.045 ㎖ 의 트리에틸아민 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 하룻밤 교반하였다. 상기 용매를 그 후 증류하고, 잔류 조생성물을 30 ㎖ 의 메틸렌 클로라이드에 용해시킨 후, 450 ㎖ 의 이소프로필 알콜을 실온에서 첨가하여 침전시켰다. 수율은 11.5 g 이었다.
양성자 NMR 분석결과, 하기에서 주요 신호가 나타났고: 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 7.01 ppm (s, CH=CH, 말레이미드), 이는 올바른 생성물을 가리킨다. NMR 에 기초할 때, 치환은 대략 89 % 로 평가되었다. GPC 분석 결과, 상기 주 생성물이 98.3 % 원하는 화합물이고, 1.7% 가 2량체인 것으로 나타났다. 상기 생성물은 또한 요구되는 자외선 흡광도를 가졌다.
실시예 2
mPEG (5,000 Da)-부틸말레이미드 (L3-TEME)
합성 개관:
Figure 112005035674947-pct00051
A. mPEG(5,000 Da)-부틸아민
톨루엔 중의 mPEG-5,000 Da (2.0g, 0.0004 몰) (NOF Corporation) 용액 (30 ㎖) 을 15 ㎖ 톨루엔을 증류 제거함으로써 공비적으로 건조시켰다. tert-부탄올 중의 포타슘 tert-부톡시드 (2.0 ㎖, 0.002 몰) 1.O M 용액 및 1,4-디브로모부탄 (0.43g, 0.002 몰) 을 첨가하고, 상기 혼합물을 아르곤 대기하 75 ℃ 에서 하룻밤 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 용매룰 감압하에서 증류 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (3 ㎖) 에 용해시키고, 이소프로필 알콜 (50 ㎖) 을 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과하고 감압하에서 건조시켰다. 다음으로, 이를 농축 암모니아 (20 ㎖) 에 용해시키고, 생성된 용액을 실온에서 20 시간 교반하였다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 감압하에서 증류 제거하여 1.5 g 의 M-PEG (5,000)-부틸아민을 수득하였다.
NMR(D20): 1.53 ppm (m,-CH 2 -CH2-CH 2 -NH2) 2.75 ppm (t,-CH 2 -NH2), 3.27 ppm (s,-OCH3), 3.53 ppm (s, PEG 골격).
B. mPEG(5000 Da)-부틸말레이미드
단계 A 로부터의 mPEG (5,000)-부틸아민(1.O g, 0.0002 몰) 을 포화 수성 NaHCO3 (5 ㎖) 에 용해시키고, 상기 혼합물을 ℃ 로 냉각시켰다. 격렬히 교반하면서 N-메톡시카르보닐말레이미드 (0.25 g) 를 첨가하였다. 15 분간 교반한 후, 물 (8 ㎖) 을 첨가하고, 상기 혼합물을 65 분간 더 교반하였다. NaCl (0.5g) 을 첨가하고, 10% 인산으로 pH 를 3.0 으로 조절하였다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 MgS04 로 건조시키고 용매를 감압하에서 증류 제거하여 0.9 g 의 백색, 고체 생성물을 수득하였다.
NMR (d6-DMSO): 1.48 ppm (bm,-CH 2 -CH 2 -CH2-Mal), 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 7.00 ppm (s,-CH=CH-).
상기 생성물은 그 PEG 부분 상의 말레이미딜기에 대하여 82% 의 치환율을 가졌다.
실시예 3
mPEG(5000 DA)-헥실말레이미드(L3-HEXA)
Figure 112005035674947-pct00052
이 합성은, 이용된 디브로모-시약이 2 개의 추가적인 메틸렌을 가진 것, 즉, Br-(CH2)6-Br 인 것을 제외하고는 필수적으로 상기 실시예 2 에 기술된 것과 등가이다.
A. mPEG (20,000 Da)-헥실아민
톨루엔 중의 mPEG-5,000 Da (2.0g, 0.0004 몰) (NOF Corporation) 용액 (30 ㎖) 를 15 ㎖ 톨루엔을 증류 제거하여 공비적으로 건조시켰다. tert-부탄올 중의 포타슘 tert-부톡시드 1.0 M 용액 (2.0 ㎖, 0.002 몰) 및 1,6-디브로모헥산 (0.49 g, 0.002 몰) 을 첨가하고, 상기 혼합물을 아르곤 대기하 80 ℃ 에서 하룻밤 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 용매를 감압하에서 증류 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (3 ㎖) 에 용해시키고, 이소프로필 알콜 (50 ㎖) 을 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과 제거하고, 감압하에서 건조시켰다. 다음으로 이를 농축 암모니아 (20 ㎖) 에 용해시킨 후, 생성된 용액을 실온에서 20 시간 교반하였다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고, 용매를 감압하에서 증류 제거하여 1.6 g 의 M-PEG (5,000)-헥실아민을 수득하였다.
NMR(D20): 1.28 ppm (m,-CH 2 -CH 2 -CH2-CH2-NH2), 1.47 ppm (m,-CH 2 -CH 2 -CH2-CH 2 -CH2-NH2), 2.71 ppm (t,-CH 2 -NH2), 3.27 ppm (s,-OCH3), 3.53 ppm (s, PEG 골격).
B. mPEG (5000 Da)-헥실말레이미드
단계 A 로부터의 mPEG (5,000 Da)-헥실아민 (1.0 g, 0.0002 몰) 을 포화 수성 NaHCO3 (5 ㎖) 에 용해시키고, 혼합물을 ℃ 로 냉각시켰다. 격렬히 교반하면 서 N-메톡시카르보닐말레이미드 (0.25 g) 을 첨가하였다. 15 분간 교반한 후, 물 (8 ㎖) 을 첨가하고, 상기 혼합물을 65 분간 더 교반하였다. NaCl (0.5g) 을 첨가하고, 10 % 인산으로 pH 를 3.0 으로 조절하였다. 상기 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 추출물을 무수 MgS04 로 건조시키고, 용매를 감압하에서 증류 제거하여 0.9 g 의 백색, 고체 생성물을 수득하였다.
NMR(d6-DMSO): 1.24 ppm (bm,-CH 2 -CH 2 -CH2-CH2-Mal), 1.45 ppm (bm,-CH 2 -CH2-CH2-CH 2 -CH2-Mal), 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 7.01 ppm (s,-CH=CH-).
상기 생성물은 상기 PEG 부분 상의 말레이미딜기에 대하여 80 % 의 치환율을 가졌다.
실시예 4
mPEG (5KDa)-프로필말레이미드 (L3-TME)
합성 개관:
Figure 112005035674947-pct00053
A. mPEG (5K Da)-프로필아민
무수 아세토니트릴 중의 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 (4.2 g) 용액 (100 ㎖) 에, 무수 아세토니트릴 (60 ㎖) 중의 mPEG-벤조트리아졸릴카르보네이트 (5 g) (Shearwater Corp.) 를 20 분 동안 첨가하고, 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 하룻밤 교반하였다. 다음으로 상기 용매를 증류 제거하였다. 상기 생성물을 100 ㎖ 의 DI H20 에 용해시켰다. NaCl (5g) 을 첨가하고, 10% H3P04 를 이용하여 pH 를 3.0 으로 조절하였다. 생성물을 CH2Cl2 로 추출하였다. 상기 추출물을 50 ㎖ 2% KOH 용액으로 세척한 후, 이를 건조시키고(MgS04), 상기 용매를 증류 제거하였다. 다음으로 생성물을 10 ㎖ CH2Cl2 에 용해시키고, 0-5 ℃ 에서 200 ㎖ 이소프로필 알콜로 역침전하였다. 건조 후 수율 4.2g.
NMR: 목적 생성물, 치환율 85.0 %, GPC (완충제, 25 ℃) 치환율 97.02 %.
B. mPEG (5K Da)-PA-말레이미드
단계 A 로부터의 mPEG (5K Da)-프로필아민 (20 ㎖ 탈이온수 중 4.0 g, pH 8.93) 을 얼음조에서 0-5 ℃ 으로 냉각시키고, N-메톡시카르보닐말레이미드 (3.5 ㎖ 의 무수 아세토니트릴 중 0.5 g) 용액을 첨가하고 혼합물을 0-5 ℃ 에서 15 분간 교반하였다. 상기 얼음조를 제거하고 DI H20 (16 ㎖) 를 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 45 분간 교반하였다. NaCl (2g) 을 첨가하고, 10% H3P04 를 이용하여 혼합물의 pH 를 3.0 으로 조절하였다. 생성물을 CH2Cl2 로 추출하였다. 상기 추출물을 MgS04 로 건조시킨 후, 용매를 증류 제거하였다. 조생성물을 CH2Cl2 (10 ㎖) 에 용해시킨 후, 0-5 ℃ 에서 이소프로필 알콜 (200 ㎖) 로 침전시켰다. 수율 3.7 g.
NMR: 목적 생성물의 합성을 확인함; 치환율 83.5%.
실시예 5
mPEG (5K Da)-아미도시클로헥실메틸-말레이미드 (L1-MCH)
합성 개관:
Figure 112005035674947-pct00054
CH2Cl2 중의 4-(말레이미도메틸)-1-시클로헥산카르복실산, NHS 에스테르 (0.100 g) (Pierce Chemical Company) 용액 (10 ㎖) 에, CH2Cl2 중의 mPEG (5K Da)-아민 (1.5 g) (Shearwater Corp.) 용액 (20 ㎖) 을 첨가하였다. TEA (0.042 ㎖) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용매를 증류 제거하였다. 조생성물 2 ㎖ CH2Cl2 에 용해시키고, 0-5 ℃ 에서 이소프로필 알콜 (60 ㎖) 로 침전시켰다. 수율 1.35 g.
NMR: 원하는 화합물, 치환율 79.7%. GPC (질산 완충제, 25 ℃): 이량체: 3.98 % ; 주 화합물: 96.02 %.
실시예 6
접합체 OF mPEG (5K Da)-프로필말레이미드 (L3-TME)
본 발명의 반응성 중합체와 티올기를 가진 분자와의 반응을 예시하기 위하여, 인산 완충액 중의 실시예 4 로부터의 MPEG-PA-MAL (1.0 g) 에, 25 ㎕ 의 2-메 르캅토에탄올을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 하룻밤 교반하였다. 생성물을 CH2Cl2 로 추출하였다(3 x 20 ㎖). 상기 추출물을 건조시키고(MgS04), 용매를 증류 제거하였다. 조생성물 2 ㎖ CH2Cl2 중에 용해시키고, 0-5 ℃ 에서 40 ㎖ 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 수율 0.78g
NMR: 목적 생성물 형성을 NMR 로 확인함; 치환율: 64.9 %
실시예 7
반응성 중합체들의 가수분해 속도 연구
HPLC 분석을 사용하여, 수 개의 예시적인 말레이미드-종결 mPEG 중합체들(평균 분자량 5000 Da) 의 말레이미드 고리의 가수분해성 분해의 속도를 조사하였다.
상기 말레이미드와 PEG 중합체 단편 사이의 하기 연결을 평가하였다: 아미도에틸렌 (L1-AMDE), 아미도펜타메틸렌 (L1-AMPE), 아미도시클로헥실메틸 (L1-MCH), 옥시부틸 (L3-TEME), 옥시헥실(L3-HEXA), 옥시에틸 (L3-ET) 및 옥시프로필 (L3-TME). 완전한 구조는 참조의 용이성을 위해 하기에 제시하였다.
Figure 112005035674947-pct00055
297 nm 에서의 UV 흡광도로 측정한 바, 50 mM 인산 완충액(pH ~ 7.5) 중 mPEG (5 k-Da) 말레이미드 (5 ㎎/㎖) 의 가수분해 속도
중합체 구조 (표 1) 반감기 (시간) 상대적 가수분해 속도
mPEG-AMDE-MAL L1-AMDE 8.8 3.66
mPEG-AMPE-MAL L1-AMPE 19.4 1.66
mPEG-MCH-MAL L1-MCH 16.3 1.98
mPEG-TEME-MAL L3-TEME 19.6 1.65
mPEG-HEXA-MAL L3-HEXA 32.3 1.00
mPEG-ET-MAL L3-ET 8.1 4.01
mPEG-TME-MAL L3-TME 11.5 2.82
상기 표 2 의 데이터로 알 수 있듯이, 이들 예시적인 중합성 말레이미드들의 각각의 말레암산을 형성하는 가수분해 속도는 상기 말레이미드 고리에 인접한 탄화수소 부분의 구조에서의 변화에 따라 다양하다. 세번째 컬럼에서의 데이터는 상기 헥사메틸렌-말레이미드 중합체에 대한 가수분해 속도를 증명한다. 보여지는 바와 같이, 조사된 중합체들에 있어서, L3-HEXA 중합체가 가장 안정하였는데, 다시 말해, 이것이 가장 느린 가수분해 속도를 가졌고, 따라서, 가장 긴 반감기를 가졌다. 상기 데이터는 상기 중합체 및 상기 말레이미드를 분리하는 탄화수소 사슬의 길이의 증가는 상기 말레이미드-종결 중합체 자체의 반감기를 증가시키는 것을 보여준다.
실시예 8
중합체 접합체들에 대한 가수분해 속도 연구
대표적인 단백질 및 소형 분자 모델 접합체들의 가수분해 속도를 조사하여 상기 중합체-종결 말레이미드 자체와 이들의 접합체들의 개환 경향들 사이의 관계를 고찰하였다.
단백질 등의 거대 생체분자 성분들은 접합된 분자들의 보통의 액체 크로마토그래피 컬럼 상에의 체류에 극적인 효과를 가지기 때문에, 일반적으로 상기 중합체 자체들에 대하여 보다 말레이미드 접합체의 동역학을 측정하는 것이 좀 더 어렵다. 이 분석에서, 상기 말레암산의 열린 산 (acid) 형태는 비개환 또는 폐환 형태와 특별히 분리가능하지 않았다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC-SE) 및 분석적 단백질 전기영동법 (SDS-PAGE) 에 기초한 조합적 분석을 이용하여 중합성 말레이미드 단백질 접합체, 뿐만 아니라 모델 비-단백질 화합물을 사용하여 제조된 접합체들의 개환 특성을 성공적으로 평가하였다.
이 연구에서, 일반적으로 하기로 표시되는 2 개의 PEG-구형 단백질 접합체들을 연구하여 이들의 개환 특성을 조사하였다.
Figure 112005035674947-pct00056
상기 상단의 구조는 Glob 단백질 2 의 PEG-말레이미드 접합체이고, 이때 Glob 단백질 2 는 분자량이 대략 48 kDa 인 단백질이다. Glob 단백질을 2 PEG 프로피온산에서 유래한 PEG 말레이미드, MW 30 kDa, 에 접합시켰는데, 이는 상기 중합체의 프로피온산 유래 부분과 상기 말레이미드 말단 사이에 개재된 중간-길이의 연결자를 포함하였다. 상기 상단 구조에서 연결자는 -C(O)-NH(CH2)2-NH-C(O)-CH2CH2- 이다.
상기 하단 구조는 Glob 단백질 1 의 PEG-말레이미드 접합체이고, 이때 상기 단백질은 분자량이 약 11 kDa 이다. 상기 접합체는 분자량이 약 20 kDa 인 연결자 없는 말레이미드 (mPEG-ET-MAL) 를 사용하여 제조되었다. 대응 PEG 말레이미드 구조는 L3-ET 이고, 실시예 7 에서 논의되었다.
상기 하단 구조 (Glob 단백질 2) 는 pH 8.5 및 실온에서 24 시간 후에 완전히 개환되어, 상기 중합체 및 상기 말레이미드 고리를 분리시키는 안정화시키는 연결자를 결여하고 있는 이 유형의 말레이미딜 종결 중합체가 불안정함을 나타낸다. 그러나, 상기 연결자 없는 형태와 비교하여, 상기 상단 구조에 있는 연결자 (Glob 단백질 1) 는 상기 개환을 지연시키는데, 이는 상기 상단 접합체 내의 고리 구조가 pH 9 에서 50 ℃ 에서 17 시간 동안 가열시 17 시간까지 완전히 개환하지 않기 때문이다.
유사하게, 모델 화합물인 2-메르캅토에탄올에 접합된 본 발명의 안정화된 중합체 말레이미드의 가수분해 속도를 결정하여 상기 접합체의 개환 경향을 평가하였다. 이 연구로, 본 안정화된 중합체 말레이미드가 Glob 단백질 1 및 Glob 단백질 2 의 접합체를 형성하는데 사용된 것들보다 더 우수한 것으로 나타났다. 즉, 유리 형태 및 접합 형태 모두에서, 본 발명의 중합체 말레이미드는 연결자 없는 PEG 말레이미드 및, 예를 들어 Glob 단백질 2 에 부착되어 보여진 상기 PEG-말레이미드와 비교할 때, 보다 우수한 안정성 및 개환 저항성을 보였다.
8-TRI, 8-PEN 및 8-MCH (하기 표 3 에 제시된 구조) 의 접합체들에 대한 가수분해 속도 연구를, 비접합 말레이미드에 대하여 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 2 개의 상이한 pH 값에서 취한 데이터로부터 나타난 반감기를 계산하였다. 상기 비접합 말레이미드와 마찬가지로, 상기 데이터는 pH 가 낮아짐에 따라 반응 속도가 느려지고 개환이 증가됨을 보여준다. 상기 숙신이미드 고리에 인접한 가장 짧은 탄화수소 사슬과의 연결 (즉, 8-TRI) 은 연구된 다른 접합체들과 비교해 개환이 가장 빨랐다. 상기 데이터는 보다 긴/보다 거대한 탄화수소 사슬이 가수분해로 유도된 개환에 대하여 보다 우수한 저항성을 제공한다는 것을 보여준다.
mPEG (5 k-Da) 말레이미드 접합체들의 가수분해 반감기
Figure 112005035674947-pct00057
연결자, D 실험적으로 결정된 반감기
pH 9.06 pH 8.11
8-TRI; D = 트리메틸렌 31.4 시간 17. 6 일
8-PEN; D = 펜타메틸렌 -- 28.5 일
8-MCH; D =
Figure 112005035674947-pct00058
 43.3 시간 --
실시예 9
1-(N-말레이미도메틸)-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물)
단계 1.
Figure 112005035674947-pct00059
9A. 1-아미노메틸-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물): 아세토니트릴 (200 ㎖) 중의 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온산의 N-히드록시숙시미딜 에스테르, MW 5,000 (20.0 g, 4.0 mmol, Nektar Therapeutics) 을 트리에틸아민 (20 ㎖) 을 함유한 아세토니트릴 중의 1,4-시클로헥산 (비스메틸아민) (11.34 g, 79.7 mmol) 용액 (200 ㎖) 에 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3 일간 교반하였다. 상기 용매를 진공 상태에서 제거하여 백색 고체를 수득하였다. 상기 고체를 에테르 (100 ㎖) 로 교반하고, 여과로 수집하고 건조하여 20.23 g 의 조 생성물을 수득하였다. 이 조 혼합물을 CH2Cl2 (30 ㎖) 중에 넣고, IPA (500 ㎖)/에테르 (250 ㎖) 로 침전시켰다. 상기 고체를 여과하여 수집하고, 진공하에서 건조시켰다 (16.3 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.76(1H, d, NHC=O), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격), 2.98 및 2.88 (2H, t, CH 2-NH-C=O), 2.43 및 2.36 (2H, d, CH 2-NH2), 2.30 (2H, CH2C=O), 1.78-1.68(1H, m, 고리 CH), 1.45-1.21 (6H, m, 고리 메틸렌 양성자), 0.90-0.73(1H, m, 고리 CH).
단계 2.
Figure 112005035674947-pct00060
9.B. 1-(N-말레이미도메틸)-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물) :
NaHCO3 (포화된 것, 19 ㎖) 중의 1-아미노메틸-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산 용액 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물) (3.68g, 0.74 mmol) 을 얼음/염/물 조에서 냉각시켰다. 여기에, N-메톡시카르보닐말레이미드 (116 mg, 0.82 mmol) 를 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음조에서 15 분간 교반하고, H20 (29 ㎖) 을 첨가하였다. 얼음조에서 1 시간동안 교반한 후, 상기 조에서 반응 혼합물을 제거하고 실온에서 3 시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 염수 (30 ㎖) 로 희석하였다. 10 % 인산으로 pH 를 3 으로 조절하고, CH2Cl2 로 추출하였다(3 x 50 ㎖). 수합된 유기 추출물을 건조시키고(Na2S04), 진공 상태에서 농축하였다. 잔류물을 CH2Cl2 (10 ㎖) 에 넣고, IPA (60mL)/에테르 (100 ㎖) 로 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집하고 진공 상태에서 하룻밤 건조시켰다(3.14 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.79 (1H, d, NHC=O), 7.01 (2H, s, CH=CH), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격), 2.32 (2H, CH2C=O), 1.78-1.45 (2H, m, 고리 메틸렌), 1.45-1.21 (5H, m, 고리 메틸렌 양성자 및 CH), 0.90-0.73(1H, m, 고리 양성자).
실시예 10
트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)-N-시클로헥실말레이미드의 합성.
단계 1.
Figure 112005035674947-pct00061
10.A. 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥실-t-BOC 아민의 제조: 아세토니트릴 (200 ㎖) 중의 트랜스-4-아미노메틸시클로헥실-t-BOC-아민 (1.0 g, 4.67 mmol, Albany Molecular) 및 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온산의 N-히드록시숙시미딜 에스테르, MW 5,000 (22.9 g, 4.20 mmol, Nektar Therapeutics) 용액에, 아르곤 하에서 트리에틸아민 (1.2 ㎖, 8.6 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 아르곤 대기하에서 실온에서 24 시간동안 교반하였다. NMR 결과 상기 SPA 기로부터 임의의 잔류 양성자가 나타나지 않았다. 상기 용매를 진공 상태에서 제거하여 백색 잔류물을 수득하고, 이를 CH2Cl2 (60 ㎖) 에 넣고, IPA (500 ㎖)/ 에테르(1 ℓ) 로 침전시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 생성물을 백색 고체로 수득하였다(22.2 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.80 (1H, s, CH-NH), 6.70 (1H, d, CH-NH), 3.55 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격), 3.28 (3H, s, CH3), 3.15 (1H, br s, CH), 2.90 (2H, t, CH-CH 2-NH), 2.33 (3 H, t, CH2-C=O), 1.74-1.65 (4 H, M, 고리 양성자), 1.37 (9 H, s, C(CH3)3), 1.25 (1H, br s, CH), 1.14-0.83 (4 H, m, 고리 양성자).
단계 2.
Figure 112005035674947-pct00062
10.B. 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥실아민, 트리플루오로아세테이트의 제조. 무수 CH2Cl2 (5.0 ㎖) 중의 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥실-t-BOC 아민 (1.20 g, 0.24 mmol) 용액에, 트리플루오로아세트산 (2.5 ㎖, 32.5 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 25 ℃ 에서 18 시간동안 교반하였다. 상기 용매를 진공 상태에서 제거하여 오일성 잔류물을 수득하고, 이를 진공하에서 하룻밤 건조시켰다. 잔류물을 무수 에테르 (20 ㎖) 와 함께 교반하였다. 생성물을 여과로 수집한 후, 건조하였다(0.99 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 8.13 (1H, br s, NH), 7.80 (3 H, d, NH3), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격 및 CH), 3.24 (3 H, s, CH3), 2.97 (1 H, br s, CH), 2.27 (2H, t, CH2C=O), 1.95-1.35 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.34-1.25 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.40-1.25 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.25-1.13 (2H, m, 시클로헥산 양성자).
단계 3.
Figure 112005035674947-pct00063
10.B. 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)-N-시클로헥실말레이미드의 제조. 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥실아민, 트리플루오로아세테이트 (3.0 g, 0.60 mmol) 를 NaHCO3 (수성, 포화, 16 ㎖) 에 넣고, 얼음/염 조에서 2 ℃ 로 냉각하였다. 여기에, N-메톡시카르보닐 말레이미드 (100 mg, 0.70 mmol) 를 첨가하였다. 2 ℃ 에서 15 분간 교반한 후, 상기 반응 혼합물에 H20 (24 ㎖) 를 첨가하고, 4 시간동안 교반을 계속하였다. 염수 (50 ㎖) 를 첨가하고, 10% 인산을 사용하여 pH 를 3 으로 조절하였다. 이 혼합물을 CH2Cl2 로 추출하였다(3 x 50 ㎖). 수합된 유기 추출물을 건조시키고(Na2S04), 진공 상태에서 농축한 후, 진공하에서 건조시켰다. 1H NMR 결과, 상기 생성물이 불완전한 고리 폐쇄로부터 약 50% 말레이미드/50% 개환된 물질인 것으로 나타났다.
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.80 (1H, d, NH), 6.96 (2 H, s, 말레이미드 CH=CH), 3.51 (474, br s, PEG 골격 및 CH), 3.24 (3H, s,CH3), 2.89 (2H, t, CH2), 2.30 (2H, t, CH2C=O), 1.85-1.73 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.73-1.63 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.32 (1H, br s, CH), 1.15-1.05 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.00-0.85 (2H, m, 시클로헥산 양성자).
실시예 11
트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌글리콜)프로피온아미도)-N-시클로헥실말레이미드의 합성.
단계 1.
Figure 112005035674947-pct00064
]
11.A. 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)시클로헥실-t-BOC 아민의 제조: 아세토니트릴 (200 ㎖) 중의 모노-t-BOC- 트랜스-1,4-디아미노시클로헥산 (1.0 g, 4.38 mmol, Albany Molecular) 및 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온산의 N-히드록시숙시미딜 에스테르, MW 5,000 (21.5 g, 4.30 mmol, Nektar Therapeutics) 용액에, 아르곤 하에서 트리에틸아민 (1.2 ㎖, 8.6 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 아르곤 대기하에서 실온에서 24 시간동안 교반하였다. 1H NMR 결과, N-히드록시숙신이미딜 에스테르기로부터 임의의 잔류 양성자도 남아있지 않은 것으로 나타났다. 용매를 진공 상태에서 제거하여 백색 잔류물을 수득하고 이를 에테르 (50 ㎖) 와 함께 30 분간 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 진공 하에서 건조시켜 생성물을 백색 고체로 수득하였다 (1.95 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.70 (1H, d, CH-NH), 6.69 (1H, d, CH-NH), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격 및 CH), 3.24 (3 H, s, CH3), 3.15 (1H, br s, CH), 2.26 (3 H, t, CH2-C=O), 1.74 (4 H, br d, 고리 양성자), 1.37 (9 H, s, C(CH3)3), 1.17-1.07 (4 H, m, 고리 양성자).
단계 2.
Figure 112005035674947-pct00065
11.B. 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)시클로헥실아민,트리플루오로아세테이트. 무수 CH2Cl2 (55 ㎖) 중의 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)시클로헥실-t-BOC 아민 (12.0 g, 2.4 mmol) 용액에 트리플루오로아세트산 (25 ㎖, 325 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 25 ℃ 에서 18 시간동안 교반하였다. 용매를 진공 상태에서 제거하여 오일성 잔류물을 수득하고 이를 진공하에서 하룻밤 건조시켰다. 잔류물을 CH2Cl2 (30 ㎖) 에 넣고, IPA (750 ㎖)/에테르 (500 ㎖) 로 침전시켰다. 생성물을 여과로 수집한 후, 건조시켜 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (10.2 g).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 8.13(1H, br s, NH), 7.80 (3 H, d, NH3), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격 및 CH), 3.24 (3 H, s, CH3), 2.97 (1 H, br s, CH), 2.27 (2H, t, CH2C=O), 1.95-1.35 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.34-1.25 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.40-1.25 (2H, m, 시클로헥산 양성자), 1.25-1.13 (2H, m, 시클로헥산 양성자).
단계 3.
Figure 112005035674947-pct00066
11.C. 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)-N-시클로헥실말레이미드의 제조. 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)시클로헥실아민, 트리플루오로아세테이트 (3.0 g, 0.60 mmol) 를 NaHCO3 (수성, 포화, 16 ㎖) 에 넣고, 얼음/염 조에서 2 ℃ 로 냉각시켰다. 여기에, N-메톡시카르보닐 말레이미드 (100 mg, 0.70 mmol) 를 첨가하였다. 2 ℃ 에서 15 분간 교반한 후, H20 (24 ㎖) 를 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 5 시간동안 교반을 계속하였다. 염수 (20 ㎖) 를 첨가한 후, 10% 인산을 사용하여 pH 를 3 으로 조절하였다. 이 혼합물을 CH2Cl2 로 추출하였다(3 x 50 ㎖). 수합된 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 진공 상태에서 농축하고, 진공 하에서 건조시켜 생성물을 백색 고체로서 수득하였다(2.75g). 1H NMR 결과 생성물이 불완전 고리 폐쇄로부터의 26 % 말레이미드/74% 개환 물질인 것으로 나타났다.
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.77(1H, d, NH), 6.96 (2 H, s, 말레이미드 CH=CH), 3.51 (br s, O-CH2CH2-, PEG 골격), 3.24 (3H, s, CH3), 2.28 (2H, t, CH2C=O), 2.06-1.92 (1H, m, 시클로헥산 양성자), 1.88-1.73 (3H, m, 시클로헥산 양성자), 1.59-1.65(1H, m, 시클로헥산 양성자), 1.28-1.13 (3H, m, 시클로헥산 양성자).
실시예 12
1-N-말레이미도메틸-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 합성 (시스 및 트랜스 이성질체들의 혼합물)
단계 1.
Figure 112005035674947-pct00067
12.A. 1-아미노메틸-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물): 아세토니트릴 (100 ㎖) 중의 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온산의 N-히드록시숙시미딜 에스테르, MW 5,000 (10.0 g, 2.0 mmol, Nektar Therapeutics) 을 트리에틸아민 (10 ㎖) 을 함유한 아세토니트릴 (100 ㎖) 중의 1,3-시클로헥산(비스메틸아민) (6.0 ㎖, 39.9 mmol, Albany Molecular) 용액에 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3 일간 교반하였다. 불용성 고체를 여과하고, 여과액을 진공 상태에서 농축하여 백색 고체를 수득하였다. 조 혼합물을 CH2Cl2 (50 ㎖) 에 넣고, IPA (375 ㎖)/에테르 (300 ㎖) 로 침전시켰다. 고체를 여과하여 백색 고체를 수득하고, 이를 진공 하에서 건조시켰다 (9.5 g). 1H NMR 결과, 일부 1,3-시클로헥산 (비스메틸아민) 가 잔류한 것으로 나타났고, 상기 고체를 CH2Cl2 에 용해시키고, Amberlyst 15 (15 g) 를 통해 세척하여 이를 제거하였다. 용매를 제거하여 1-메틸아미노-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산 (8.62 g) 을 수득하였다.
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.78 (1H, d, NHC=O), 3.51 (br s, PEG 골격), 3.24 (3H, s, OCH3), 2.95 및 2.89 (2H, m, CH2-NH-C=O), 2.49 및 2.37 (2H, d, CH 2 - NH2), 2.30 (2H, CH2C=O), 1.75-1.65 (4H, m, 고리 양성자), 1.63-1.21 (2H, m, 고리 양성자), 1.21-1.03 (2H, m, 고리 양성자), 0.80-0.70 (1H, m, 고리 양성자), 0.50-0.30 (1H, m, 고리 양성자).
단계 2.
Figure 112005035674947-pct00068
12.B. 1-N-말레이미도메틸-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물): NaHCO3 (포화, 20 ㎖) 중의 1-아미노메틸-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물) (4.0 g, 0.8 mmol) 용액을 얼음/염/물 조에서 냉각시켰다. 여기에, N-메톡시카르보닐말레이미드 (126 mg, 0.89 mmol) 를 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음조에서 15 분간 교반하고, H20 (32 ㎖) 를 첨가하였다. 얼음조에서 1 시간동안 교반한 후, 상기 조로부터 반응 혼합물을 제거하고, 실온에서 3 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 염수 (30 ㎖) 로 희석하였다. 10 % 인산으로 pH 를 3 으로 조절하고, CH2Cl2 로 추출하였다(3 x 50mL). 수합된 유기 추출물을 건조시키고(Na2S04) 진공 상태에서 농축시켰다. 잔류물을 진공 하에서 건조시켜 생성물을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.79 (1H, d, NHC=O), 7.01 (2H, s, CH=CH), 3.51 (br s, PEG 골격 및 CHCH 2), 3.24 (3H, s, OCH3) 3.10-2.63 (2H, m, CHCH 2), 2.31 (2H, dd CH2C=O), 1.65-1.1.10 (8H, m, 고리 양성자), 0.83-0.48 (2H, m, 고리 양성자).
실시예 13
대표적인 중합체 말레이미드들의 가수분해 속도 연구
실시예 7 에 기술된 바와 같은 몇몇 대표적인 안정화된 PEG-말레이미드들에 대한 가수분해 연구를 수행하였다. 특정 PEG-말레이미드들 및 이들의 대응되는 반감기들이 이하의 표 4 에 제공된다.
선택된 mPEG 말레이미드들의 안정성
구조 반감기 (시간)
Figure 112005035674947-pct00069
실시예 14
안정화된 mPEG-말레이미드, 1-(N-말레이미도메틸)-4-(메톡시폴리(에틸렌글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의, 모델 화합물인 2-메르캅토에탄올에의 접합
Figure 112005035674947-pct00070
1-(3-(2-히드록시에탄메르캅토)-N-숙신이미딜메틸)-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물)
CH3CN (10 ㎖) 중의 1-(N-말레이미도메틸)-4-(메톡시폴리 (에틸렌 글리콜) 프로피온아미도메틸)시클로헥산 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물) (500 mg, 0.1 mmol) 용액에 2-메르캅토에탄올 (15 ㎕, 0.21 mmol) 를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 1H NMR 결과, 잔여 말레이미드 출발물질이 있는 것으로 나타났다. 추가의 2-메르캅토에탄올 (15 ㎕, 0.21 mmol) 을 첨가하고 추가적인 24 동안 혼합물을 교반하였다. 1H NMR 결과, 잔여 말레이미드가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 용매를 진공 상태에서 제거하고 건조시켰다. 고체를 CH2Cl2 (2 ㎖) 에 용해시키고, IPA (50 ㎖) 으로 침전시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 건조시켜 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (403 mg).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.66 (1H, br s, NH), 4.83 (1H, t, OH), 4.01 (1H, dd, CH-S), 3.51 (br s, PEG 골격), 3.05-2.61 (4H, m, 2 x CHCH 2), 2.30 (2H, t, CH2C=O), 1.75-0.75 (10H, m, 고리 양성자).
실시예 15
안정화된 mPEG-말레이미드, 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)-N-시클로헥실말레이미드의, 모델 화합물인 2-메르캅토에탄올로의 접합
Figure 112005035674947-pct00071
트랜스 -1-(3-(2-히드록시에탄메르캅토)-N-숙신이미딜)-4-(메톡시폴리 (에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조: CH3CN (10 ㎖) 중의 트랜스-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)-N-시클로헥실말레이미드 (400 mg, 0.0. 08 mmol) 용액에 2-메르캅토에탄올 (15 ㎕, 0.21 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18 시간동안 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고 건조시켰다. 잔여물을 에테르와 함께 교반하고 (2 x 20 ㎖), 고체를 여과에 의해 수집하여 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (310 mg).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.81 (1H, br s, NH), 4.87 (1H, t, OH), 3.85 (1H, dd, CH-SEtOH), 3.51 (br s, PEG 골격, CH 및 SCH2CH 2OH), 3.24 (3H, s, CH3), 2.90 (2H, br s, CH2NH), 2.79 (2H, t,SCH 2CH2), 2.30 (2H, t,CH2C=O), 2.08-1.55 (5H, m, 고리 양성자), 1.25-0.94 (4H, m, 고리 양성자).
실시예 16
안정화된 mPEG-말레이미드, 트랜스 -4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)-N-시클로헥실말레이미드의, 모델 화합물인 2-메르캅토에탄올로의 접합
Figure 112005035674947-pct00072
트랜스 -1-(3-(2-히드록시에탄메르캅토)-N-숙신이미딜)-4-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)시클로헥산의 제조: CH3CN (10 ㎖) 중의 트랜스-4- (메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도)-N-시클로헥실말레이미드 (400 mg, 0.0.08 mmol) 용액에 2-메르캅토에탄올 (15 ㎕, 0.21 mmol) 을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18 시간동안 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고 건조시켜 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (240 mg).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.75 (1H, br s, NH), 4.83 (1H, t, OH), 4.01 (1H, dd, CH-S), 3.51 (br s, PEG 골격 및 2 X CH), 2.75 (2H, m, S-CH2), 2.33 (2H, t, CH2C=O), 2.02-1.65 (4H, m, 고리 양성자), 1.55-0.95 (4H, m, 고리 양성자).
실시예 17
안정화된 mPEG-말레이미드, 1-N-말레이미도메틸-3-(메톡시폴리 (에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸) 시클로헥산의, 모델 화합물, 2-메르캅토에탄올로의 접합
Figure 112005035674947-pct00073
1-(3-(2-히드록시에탄메르캅토)-N-숙신이미딜메틸)-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도메틸)시클로헥산의 제조 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물): CH3CN (10 ㎖) 중의 1-N-말레이미도메틸-3-(메톡시폴리(에틸렌 글리콜)프로피온아미도 시클로헥산 (시스 및 트랜스 이성질체의 혼합물) (450 mg, 0.0. 09 mmol) 용액에, 2-메르캅토에탄올 (15 ㎕, 0.21 mmol) 를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18 시간동안 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고 건조하였다. 잔여물을 에테르 (20 ㎖) 와 함께 교반하고, 고체를 여과에 의해 수집하여 생성물을 백색 고체로서 수득하였다 (230 mg).
1H NMR (dmso-d 6 ) δ 7.81 (1H, br s, NH), 4.89 (1H, t, OH), 4.03 (1H, dd, CH-S), 3.51 (PEG 골격 및 S-CH 2CH 2), 3.24 (3H, s, CH3), 3.05-2.60 (4H, m, 2 x CHCH 2), 2.30 (2H, t, CH 2C=O), 1.80-1.05 (8H, m, 고리 양성자), 0.80-0.51 (2H, m, 고리 양성자).
상기 상세한 설명에 제시된 교시들의 잇점을 가진 본 발명의 많은 변형 및 다른 구현예들이, 본 발명이 속하는 당업계의 숙련된 자에게 떠오를 것이다. 따라서, 본 발명이 기술된 특정 구현예들에 제한되지 않고, 변형 및 다른 구현예들이 첨부된 청구항의 영역에 속하는 것으로 의도된 것으로 이해되어야 한다. 특정 용어가 본원에 사용되지만, 이들은 단지 포괄적이고 설명적인 의미에서 사용된 것이며 제한을 위한 것은 아니다.

Claims (130)

  1. 하기 구조를 가지는 수용성 중합체:
    [화학식 II]
    Figure 112005035674947-pct00074
    (식 중,
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다).
  2. 제 1 항에 있어서, X 가 탄소수가 총 3 내지 20 개인 포화 비환형 (acyclic), 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체.
  3. 제 2 항에 있어서, X 가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 으로 이루어진 군에서 선택되는 총 탄소 원자 수를 가지는 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체.
  4. 제 3 항에 있어서, X 가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 총 탄소 원자 수를 가지는 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체: 3 내지 20 개, 4 내지 12 개, 4 내지 10 개 및 5 내지 8 개.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, X 가 선형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 중합체.
  6. 제 5 항에 있어서, X 가 분지형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 중합체.
  7. 제 6 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 α 탄소에서 분지된 중합체.
  8. 제 6 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 β 탄소에서 분지된 중합체.
  9. 제 6 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 γ 탄소에서 분지된 중합체.
  10. 제 5 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III]
    Figure 112010065119849-pct00075
    (식 중,
    y 는 1 내지 20 의 정수이고;
    R1 은 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고;
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  11. 제 10 항에 있어서, R1 및 R2 가 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 및 저급 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼인 중합체.
  12. 제 10 항에 있어서, R1 및 R2 가 모두 수소이고, Y 는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 으로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  13. 제 10 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III-A]
    Figure 112005035674947-pct00076
    (식 중, Cα 상의 R1 또는 R2 중 하나 이상이 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되고, y 는 1 이상이다).
  14. 제 13 항에 있어서, Cα 상의 R1 또는 R2 각각이 독립적으로 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  15. 제 13 항에 있어서, 모든 다른 비-Cα R1 및 R2 변수들이 수소인 중합체.
  16. 제 13 항에 있어서, Cα 상의 R1 또는 R2 중 하나 이상이 저급 알킬 또는 저 급 시클로알킬인 중합체.
  17. 제 13 항에 있어서, Cα 상의 R2 가 수소인 중합체.
  18. 제 17 항에 있어서, Cα 상의 R1 이 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실 및 시클로헥실로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  19. 제 13 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III-B]
    Figure 112005035674947-pct00077
    (식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 알킬 또는 시클로알킬이다).
  20. 제 13 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III-B]
    Figure 112005035674947-pct00078
    (식 중, R1 은 알킬 또는 시클로알킬이고, R2 는 수소이다).
  21. 제 19 항에 있어서, R1 및 R2 가 각각 독립적으로 메틸 또는 에틸 중 하나인 중합체.
  22. 제 19 항에 있어서, R1 및 R2 가 동일한 중합체.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 중합체가 가수분해상으로 안정화된 말레이미드 고리를 가지는 중합체.
  24. 제 8 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III-C]
    Figure 112005035674947-pct00079
    (식 중, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되나, 둘 다 수소는 아니고,
    y 는 2 이상이다).
  25. 제 24 항에 있어서, R1 및 R2 가 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬인 중합체.
  26. 제 25 항에 있어서, R1 및 R2 가 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 시클로펜틸, 헥실 및 시클로헥실로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  27. 제 24 항에 있어서, R2 가 수소인 중합체.
  28. 제 10 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 III-D]
    Figure 112005035674947-pct00080
    (식 중, Cγ 에 부착된 R1 및 R2 중 하나 이상이 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택된다).
  29. 제 28 항에 있어서, Cγ 에 부착된 R1 및 R2 중 하나 이상이 알킬 또는 시클로알킬이고, 다른 모든 R1 및 R2 변수들은 수소인 중합체.
  30. 제 28 항에 있어서, Cα 또는 Cβ 에 부착된 R1 변수들 중 하나가 알킬 또는 시클로알킬이고, 다른 모든 R1 및 R2 변수들은 수소인 중합체.
  31. 제 2 항에 있어서, X 가 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체.
  32. 제 31 항에 있어서, X 가 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 IV]
    Figure 112008083794070-pct00081
    (식 중,
    CYCa 는 "a"개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고;
    p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이고,
    R1 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고,
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  33. 제 32 항에 있어서, p 및 q 가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  34. 제 32 항에 있어서, R1 이 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼이고, R2 는, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼인 중합체.
  35. 제 32 항에 있어서, a 가 5, 6, 7, 8 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  36. 제 35 항에 있어서, a 가 6 이고, CYCa 가 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-치환된 시클로헥실 고리인 중합체.
  37. 제 32 항에 있어서, p 및 q 가 각각 독립적으로 0 내지 4 인 중합체.
  38. 제 36 항에 있어서, 상기 치환된 시클로헥실 고리 상의 치환기가 시스 (cis) 인 중합체.
  39. 제 36 항에 있어서, 상기 치환된 시클로헥실 고리 상의 치환기가 트랜스 (trans) 인 중합체.
  40. 제 32 항에 있어서, R1 및 R2 가 모든 발생 위치에서 수소인 중합체.
  41. 제 34 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 IV-A]
    Figure 112005035674947-pct00082
    (식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이다).
  42. 제 41 항에 있어서, q 의 범위는 0 내지 6 이고, p 는 0 인 중합체.
  43. 제 34 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    Figure 112005035674947-pct00083
    (식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이고, 상기 시클로헥실렌 고리 상의 치환기들은 시스 또는 트랜스이다).
  44. 제 32 항에 있어서, CYCa 가 2환식 또는 3환식인 중합체.
  45. 제 44 항에 있어서, CYCa 가 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    Figure 112005035674947-pct00084
    상기 고리 치환기는 상기 2환식 또는 3환식 고리 상의 임의의 이용가능한 위치에 위치하는 중합체.
  46. 제 1 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 V]
    Figure 112005035674947-pct00085
    (식 중, X 및 b 는 앞서 정의된 바와 같고,
    b' 은 0 또는 1 이고,
    X' 은 인접 포화 탄소 원자의 수가 3 이상인 가수분해상으로 안정한 연결자이다).
  47. 제 1 항에 있어서, POLY 가 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린) 및 폴리(옥시에틸화 폴리올)로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  48. 제 47 항에 있어서, POLY 가 폴리(알킬렌 옥시드)인 중합체.
  49. 제 48 항에 있어서, POLY 가 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)이 말단에서 말단-봉쇄 부분으로 봉쇄된 중합체.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 말단-봉쇄 부분이 독립적으로 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐옥시, 치환된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환된 알키닐옥시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 말단-봉쇄 부분이 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  53. 제 49 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 이 100 달톤 내지 100,000 달톤의 공칭평균분자량 (nominal average molecular mass) 을 가지는 중합체.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 이 1,000 달톤 내지 50,000 달톤의 공칭평균분자량을 가지는 중합체.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 이 2,000 달톤 내지 30,000 달톤의 공칭평균분자량을 가지는 중합체.
  56. 제 46 항에 있어서, 상기 POLY 가 선형이고, 상기 중합체가 동종 2 작용성 (homobifunctional) 인 중합체.
  57. 제 49 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 이 선형, 분지형 및 갈래진 형 (forked) 으로 이루어진군에서 선택되는 구조를 가지는 중합체.
  58. 제 26 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜) 이 하기 구조를 포함하는 중합체:
    Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
    (식 중, n 은 10 내지 4000 이고, Z 는 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 알데히드 수화물, 아세탈, 케톤, 케톤 수화물, 케탈, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴 및 플루오레신 (fluorescein) 으로 이루어진 군에서 선택되는 부분을 포함한다).
  59. 제 1 항에 있어서, 하기 구조에 해당하는 중합체:
    [화학식 VI]
    Figure 112010065119849-pct00086
    (식 중:
    d 는 3 내지 100 의 정수이고,
    R 은 3 개 이상의 히드록실기, 아미노기 또는 이들의 조합물을 가진 중심 코어 분자의 잔기이다).
  60. 제 59 항에 있어서, d 가 3 내지 12 의 정수인 중합체.
  61. 제 1 항에 있어서, POLY 가 멀티-아암(multi-arm) 중합체 단편이고, 상기 중합체가 하기 구조에 해당하는 중합체:
    [화학식 VII]
    Figure 112005035674947-pct00087
    (식 중
    PEG 는 -(CH2CH20)nCH2CH2- 이고,
    M 은 하기이고:
    Figure 112005035674947-pct00088
    ,
    m 은 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택된다).
  62. 하기 구조를 가진 수용성 중합체:
    [화학식 VIII]
    Figure 112010065119849-pct00089
    (식 중,
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 인접 포화 탄소 원자수가 3 이상인 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다).
  63. 제 62 항에 있어서, X 가 총 탄소수가 3 내지 20 인 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체.
  64. 제 62 항에 있어서, X 가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 으로 이루어진 군에서 선택되는 총 탄소 원자 수를 가지는 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체.
  65. 제 64 항에 있어서, X 가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 총 탄소 원자 수를 가지는 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 중합체: 3 내지 20 개, 4 내지 12 개, 4 내지 10 개 및 5 내지 8 개.
  66. 제 63 항에 있어서, X 가 선형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 중합체.
  67. 제 63 항에 있어서, X 가 분지형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 중합체.
  68. 제 67 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 α 탄소에서 분지된 중합체.
  69. 제 67 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 β 탄소에서 분지된 중합체.
  70. 제 67 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 γ 탄소에서 분지된 중합체.
  71. 제 63 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 VIII-A]
    Figure 112010065119849-pct00090
    (식 중,
    y 는 1 내지 20 의 정수이고;
    R1 은 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고;
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  72. 제 62 항에 있어서, X 가 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 부분인 중합체.
  73. 제 72 항에 있어서, X 가 하기 구조를 가진 중합체:
    [화학식 VIII-B]
    Figure 112005035674947-pct00091
    (식 중,
    CYCa 는 "a"개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고;
    p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이고,
    R1 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고,
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  74. 제 73 항에 있어서, p 및 q 가 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  75. 제 73 항에 있어서, R1 이 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼이고, R2 는, 각 발생 위치에서, 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬 또는 저급 시클로알킬 중 하나인 유기 라디칼인 중합체.
  76. 제 73 항에 있어서, a 가 5, 6, 7, 8 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  77. 제 76 항에 있어서, a 가 6 이고, CYCa 가 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-치환된 시클로헥실렌 고리인 중합체.
  78. 제 77 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 VIII-C]
    Figure 112005035674947-pct00092
    (식 중, p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이고, 상기 시클로헥실렌 고리 상의 치환기는 시스 또는 트랜스 중 하나이다).
  79. 제 77 항에 있어서, 하기 구조를 가지는 중합체:
    [화학식 VIII-D]
    Figure 112005035674947-pct00093
    (식 중, p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이고, 상기 시클로헥실렌 고리 상의 치환기는 시스 또는 트랜스 중 하나이다).
  80. 제 73 항에 있어서, CYCa 가 2환식 또는 3환식인 중합체.
  81. 하기 단계를 포함하는 말레이미드-종결 중합체의 형성 방법:
    a) POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 (X) 를 형성시키기에 효과적인 조건하에서, POLY-[O]b-C(O)-LG (IX) 를 NH2-X-NH2 (XII) 와 반응시키는 단계, 및
    b) POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 (X) 를 POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL (II) 로 변환시키는 단계
    (이때:
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한 가수분해상으로 안정한 연 결자이고,
    LG 는 이탈기이고,
    MAL 은 말레이미드이고,
    상기 말레이미드 종결 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다).
  82. 제 81 항에 있어서, 상기 LG 는 할로겐화물, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸, 파라-니트로페놀레이트로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  83. 제 81 항에 있어서, 상기 NH2-X- NH2 시약 중의 아미노기 중 하나가 보호된 형태인 방법.
  84. 제 81 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계가, 아세토니트릴, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 아세톤, 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸포름아미드 (DMF) 및 디메틸술폭시드로 이루어진 군에서 선택되는 유기 용매 중에서 수행되는 방법.
  85. 제 81 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계가 불활성 대기 하에서 수행되는 방법.
  86. 제 81 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계가 0 내지 100 ℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  87. 제 81 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계가 트리에틸 아민, 피리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘 및 탄산나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 염기의 존재하에서 수행되는 방법.
  88. 제 83 항에 있어서, 상기 반응시키는 단계 후에 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 중의 아미노기를 탈보호화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  89. 제 81 항에 있어서, 단계 a) 로부터의 생성물을 상기 변환시키는 단계 전에 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 상기 정제하는 단계가 상기 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 것을 포함하는 방법.
  91. 제 89 항에 있어서, 상기 정제하는 단계가 상기 생성물을 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 포함하는 방법.
  92. 제 81 항에 있어서, 상기 변환시키는 단계가, 반응 혼합물 중에서 POLY- [O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 형성시키기에 적당한 조건하에서, POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를, N-메톡시카르보닐말레이미드, 엑소-7-옥사[2.2.1]비시클로헵탄-2,3-디카르복실산 무수물 및 말레산 무수물로 이루어진 군에서 선택되는 시약과 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  93. 제 92 항에 있어서, 상기 시약이 N-메톡시카르보닐말레이미드이고, 상기 변환시키는 단계가 물 또는 물 및 수 혼화성 용매의 수성 혼합물 중에서 수행되는 방법.
  94. 제 92 항에 있어서, 상기 시약이 말레산 무수물이고, 상기 변환시키는 단계가, 중간체로서의 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-NH-C(O)CH=CHCOOH (XI) 를 형성시키기에 효과적인 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-NH2 를 말레산 무수물과 반응시키는 단계를 포함하고, 상기 방법이 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    물의 제거에 의한 고리화를 촉진시키는데 효과적인 조건하에서 POLY-[O]b-C(O)-N2H-X-NH-C(O)CH=CHCOOH 를 가열하여 POLY-[O]b-C(O)-NH-X-MAL 을 형성시키는 단계.
  95. 제 92 항에 있어서, 상기 반응 혼합물로부터 상기 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 를 회수하는단계를 추가로 포함하는 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 상기 회수된 POLY-[O]b-C(O)-H2N-X-MAL 이 80 % 를 초과하는 순도를 가지는 방법.
  97. 제 81 항에 있어서, X 가 탄소수가 총 3 내지 20 개인 포화 비환형, 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 방법.
  98. 제 81 항에 있어서, X 가 선형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 방법.
  99. 제 81 항에 있어서, X 가 분지형 포화 비환형 탄화수소 사슬인 방법.
  100. 제 99 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 α 탄소에서 분지된 것인 방법.
  101. 제 99 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 β 탄소에서 분지된 것인 방법.
  102. 제 99 항에 있어서, X 가 말레이미딜기에 대한 γ 탄소에서 분지된 것인 방 법.
  103. 제 81 항에 있어서, 상기 NH2-X-NH2 가 하기 구조에 해당하는 방법:
    [화학식 XII-A]
    Figure 112010065119849-pct00094
    (식 중,
    y 는 1 내지 20 의 정수이고;
    R1 은 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고;
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  104. 제 81 항에 있어서, 상기 NH2-X-NH2 가 하기 구조에 해당하고:
    [화학식 XII-B]
    Figure 112005035674947-pct00095
    CYCa 는 "a"개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고;
    p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이고,
    R1 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고,
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼인 방법.
  105. 생물학상의 활성제와 제 1 항의 중합체와의 반응으로 형성되는 접합체.
  106. 하기 구조를 포함한 접합체:
    [화학식 XV]
    Figure 112005035674947-pct00096
    (식 중,
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    "POLY-[O]b-C(O)-NH-X-" 는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여하고,
    "-S-생물학상의 활성제" 는 티올 (-SH) 기를 포함한 생물학상의 활성제를 나타낸다).
  107. 제 106 항의 접합체를 포함한 조성물로서, 단일 중합체 접합체 화학종을 포함한 조성물.
  108. 하기 구조를 포함한 접합체:
    Figure 112005035674947-pct00097
    (식 중,
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 3 개 이상의 인접 포화 탄소 원자를 포함한 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    "POLY-[O]b-C(O)-NH-X-" 는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여하고,
    "-NH-생물학상의 활성제" 는 아미노기를 포함한 생물학상의 활성제를 나타낸다).
  109. 중합체 접합체의 형성 방법으로서, 하기 구조를 가진 중합체 접합체의 형성을 촉진시키기에 효과적인 조건하에서, 반응성 티올기인 "HS-생물학상의 활성제"를 포함한 생물학상의 활성제를 제 1 항의 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    Figure 112005035674947-pct00098
  110. 제 109 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계가 6.0 내지 8.0 범위의 pH 에서 수행되는 방법.
  111. 제 110 항에 있어서, 상기 중합체 접합체가 반응 혼합물 중에서 생성되고, 상기 방법이, 상기 접촉시키는 단계 후에 상기 중합체 접합체를 상기 반응 혼합물로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  112. 제 1 항의 수용성 중합체를 사용하여 형성되는 히드로겔(hydrogel).
  113. 제 59 항의 수용성 중합체를 사용하여 형성되는 히드로겔.
  114. 제 61 항의 수용성 중합체를 사용하여 형성되는 히드로겔.
  115. 하기 구조를 가진 수용성 중합체:
    [화학식 XIII]
    Figure 112010065119849-pct00099
    (식 중,
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    X 는 총 탄소수가 3 내지 20 인 포화 환형 또는 지환족 탄화수소 사슬인 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    상기 중합체는 방향족기 및 에스테르 연결을 결여한다).
  116. 제 115 항에 있어서, X 가 하기 구조인 중합체:
    [화학식 XIII-A]
    Figure 112005035674947-pct00100
    (식 중, CYCa 는 "a"개의 고리 탄소를 가지는 시클로알킬렌기이고, 이때 "a" 값의 범위는 3 내지 12 이고;
    p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20 이고, p + q + a ≤ 20 이고,
    R1 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고,
    R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이다).
  117. 제 116 항에 있어서, p 및 q 는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  118. 제 116 항에 있어서, R1 이 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬, 저급 시클로알킬 및 저급 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼이고, R2 는 각 발생 위치에서 독립적으로 수소 또는, 저급 알킬, 저급 시클로알킬 및 저급 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 유기 라디칼인 중합체.
  119. 제 116 항에 있어서, a 가 5, 6, 7, 8 및 9 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체.
  120. 제 116 항에 있어서, CYCa 상의 치환기가 시스인 중합체.
  121. 제 116 항에 있어서, CYCa 상의 치환기가 트랜스인 중합체.
  122. 제 119 항에 있어서, a 가 6 이고, CYCa 가 1,1-, 1,2-, 1,3- 또는 1,4-치환된 시클로헥실 고리인 중합체.
  123. 제 116 항에 있어서, p 및 q 가 각각 독립적으로 0 내지 4 의 범위인 중합체.
  124. 제 116 항에 있어서, R1 및 R2 가 각 발생 위치에서 수소인 중합체.
  125. 제 116 항에 있어서, 하기 구조를 가진 중합체:
    [화학식 XIII-B]
    Figure 112005035674947-pct00101
    (식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이다).
  126. 제 116 항에 있어서, q 가 0 내지 6 의 범위이고, p 가 0 인 중합체.
  127. 제 116 항에 있어서, 하기 구조를 가진 중합체:
    [화학식 XIII-C]
    Figure 112005035674947-pct00102
    (식 중, q 및 p 는 각각 독립적으로 0 내지 6 의 범위이다).
  128. 제 116 항에 있어서, CYCa 가 2환식 또는 3환식인 중합체.
  129. 제 116 항에 있어서, CYCa 가 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    Figure 112005035674947-pct00103
    상기 고리 치환기는 상기 2환식 또는 3환식 고리 상의 임의의 이용가능한 위치에 위치하는 중합체.
  130. 하기 단계를 포함하는 말레이미드-종결 중합체의 형성 방법:
    a) POLY-[O]b-C(O)-HN-X-MAL 을 형성시키기에 효과적인 조건 하에서, POLY-[O]b-C(O)-LG 를 H2N-X-MAL 과 반응시키는 단계로서,
    이때:
    POLY 는 수용성 중합체 단편이고,
    b 는 0 또는 1 이고,
    X 는 인접 포화 탄소 원자수가 3 이상인 가수분해상으로 안정한 연결자이고,
    -LG 는 이탈기이고,
    MAL 은 말레이미드이고,
    상기 말레이미드 종결 중합체가 방향족기 및 에스테르 연결을 결여하는 단계.
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