JP6130350B2 - ＴＮＦαに対する単一ドメイン抗体で免疫障害を処置する方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含むポリペプチドおよび関節リウマチなどの免疫障害を処置するためにＳＤＡＢ分子を使用する方法に関する。

発明の背景
ＴＮＦαに対するＳＤＡＢは、例えばＰＣＴ公報である国際公開公報第０４／０４１８６２号および国際公開公報第０６／１２２７８６号に記載されている。これらの抗ＴＮＦα ＳＤＡＢは、炎症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、多発性硬化症、アジソン病、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、１型糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、男性不妊症、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、および脈管炎などの、ＴＮＦαに関連するおよび／またはＴＮＦαによって仲介される疾患および障害の予防および／または治療のために使用することができる。

処置計画での抗ＴＮＦ療法の実施は、炎症状態を有する患者についての疾病負担および生活の質を改善したが、これらの治療法の多くは、医療専門家による定期的な、例えば毎週の、薬物注射を必要とする。頻繁な来院および注射は、保健医療システム、患者およびその介護者に著しい負担を与える。これらの来院を減らし、患者および介護者に自己投与の選択肢を与える結果として、著しい個人的および経済的利益が生じうる。あらゆる抗ＴＮＦ療法が処置回数の減少または自己注射の候補であるわけではなく、そのため、より長い間隔で（例えば１〜２ヶ月に１回）および／または自己注射として投与された場合に有効な新規抗ＴＮＦ療法の必要性がある。

抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）薬の投与を受ける患者は、細菌、ミコバクテリア、真菌、ウイルス、寄生虫、および他の日和見病原体による重症感染症（ＳＩ）のリスクがある。これらの感染症は、基礎疾患または処置として行われた投薬のいずれかに関係しうる。重症感染症（ＳＩ）は、入院もしくは死亡を招くか、または抗生物質などの投薬を必要とする。従って、薬物の効力を保つ一方で、重症感染症を最小限に抑える必要性がある。

発明の概要
本発明は、上述の必要性の一つまたは複数に対処する。抗ＴＮＦα ＳＤＡＢを含むポリペプチドの特定の投与計画で、関節リウマチを患うヒト対象を処置する結果として、その対象の病状に統計的に有意な改善が生じた。従って、いくつかの態様では、本発明は、免疫障害を処置する必要のあるヒトに二つの抗ＴＮＦα ＳＤＡＢおよび抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＳＤＡＢを含むポリペプチド３０〜２００mgを複数回投与することを含む、そのヒトにおけるその処置の方法を含み、ここで、その投与は、少なくとも約４週間の時間間隔である。モデル化から、用量を増加したとき、抗ＴＮＦα ＳＤＡＢを含むポリペプチドが長時間間隔にわたり臨床的に有意な有害作用の増大なしに有効であったことが示された。同時の抗ＴＮＦ阻害剤を用いた比較モデル化から、さらに、抗ＴＮＦα ＳＤＡＢを含むポリペプチドがＳＩ作用のリスクプロファイルに影響せずに好都合な効力を併せ持つことが明らかになった。従って、いくつかの態様では、本発明は、免疫障害を処置する必要のあるヒトに二つの抗ＴＮＦα ＳＤＡＢおよび抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＳＤＡＢを含むポリペプチド３０〜４００mgを複数回投与することを含む、そのヒトにおけるその処置の方法を含み、ここで、その投与は、約８週間または２ヶ月などの、少なくとも約４週間の時間間隔である。いくつかの態様では、本発明は、免疫障害を処置する必要のあるヒトに二つの抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ＳＤＡＢおよび抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＳＤＡＢを含むポリペプチド３０〜４００mgを複数回投与することによって、そのヒトでの免疫障害を処置することに使用するためのそのポリペプチドを含み、ここで、その投与は、少なくとも約４週間毎の間隔である。

いくつかの態様では、抗ＴＮＦα ＳＤＡＢは、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲ１は、
（ｉ）アミノ酸配列ＤＹＷＭＹ（配列番号２２）；
（ｉｉ）ＤＹＷＭＹ（配列番号２２）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＤＹＷＭＹ（配列番号２２）とアミノ酸１個だけの差異を有するアミノ酸配列
を含み；
（ｂ）ＣＤＲ２は、
（ｉ）アミノ酸配列ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）；
（ｉｉ）ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）と少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）とアミノ酸２もしくは１個の差異を有するアミノ酸配列
を含み；
（ｃ）ＣＤＲ３は、
（ｉ）アミノ酸配列ＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）；
（ｉｉ）ＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）とアミノ酸１個の差異を有するアミノ酸配列
を含む。

いくつかの態様では、抗ＨＳＡ ＳＤＡＢは、三つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲ１は、
（ｉ）アミノ酸配列ＳＦＧＭＳ（配列番号２５）；
（ｉｉ）ＳＦＧＭＳ（配列番号２５）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＳＦＧＭＳ（配列番号２５）とアミノ酸１個だけの差異を有するアミノ酸配列
を含み；
（ｂ）ＣＤＲ２は、
（ｉ）アミノ酸配列ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）；
（ｉｉ）ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）と少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）とアミノ酸２もしくは１個の差異を有するアミノ酸配列
を含み；
（ｃ）ＣＤＲ３は、
（ｉ）アミノ酸配列ＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）；
（ｉｉ）ＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）ＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）とアミノ酸１個の差異を有するアミノ酸配列
を含む。

特定の態様では、抗ＴＮＦα ＳＤＡＢの少なくとも一つは、配列番号２（ＴＮＦ３０）と少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、抗ＨＳＡ ＳＤＡＢは、配列番号５（ＡＬＢ８）と少なくとも８０％、９０％、９５％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号１（オゾラリズマブ（ozoralizumab））で示されるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＳＤＡＢの少なくとも一つはヒト化されている。

いくつかの態様では、二つの抗ＴＮＦα ＳＤＡＢおよび抗ＨＳＡ ＳＤＡＢのそれぞれは、リンカーを介して連結されている。リンカーは、配列番号６および配列番号７から成る群より選択されうるアミノ酸配列でありうる。

本発明の投与は、少なくとも約２週間、３週間、４週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、８週間、または２ヶ月の時間間隔でありうる。

本発明の用量は、ＳＤＡＢ分子１０、３０、８０、１００、１２０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２０、３５０、３７５または４００mgを含む場合があり、静脈内、皮下、経口、経皮、経鼻、または舌下投与することができる。

本発明のＳＤＡＢ分子は、薬学的に許容されうる製剤に製剤化することができる。いくつかの態様では、製剤は、
（ａ）濃度約１mg/ml〜２５０mg/ml、例えば約１０mg/ml〜２５０mg/mlなどのＳＤＡＢ分子；
（ｂ）濃度約５％〜約１０％の、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースより選択される凍結保護剤；
（ｃ）濃度約０．０１％〜０．６％の、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８より選択される界面活性剤；および
（ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５になるような、濃度約１０〜２０mMのヒスチジン緩衝液または濃度約２０mMのトリス緩衝液より選択される緩衝液
を含む。

いくつかの態様では、製剤は、１mg/ml、１０mg/ml、３０mg/ml、８０mg/ml、１００mg/ml、１６０mg/ml、１８０mg/ml、２００mg/mlの、または２５０mg/mlでさえあるポリペプチド、２０mMヒスチジン、１０％(w/v)スクロース、および０．０２％ポリソルベート８０をｐＨ６．０で含む。

いくつかの態様では、１mg/ml、１０mg/ml、３０mg/ml、８０mg/ml、１００mg/ml、１６０mg/ml、１８０mg/ml、２００mg/mlの、または２５０mg/mlでさえあるポリペプチド、２０mMヒスチジン、７．５％(w/v)スクロース、および０．０１％ポリソルベート８０をｐＨ６．０で含む。

本発明のＳＤＡＢ分子は、免疫障害を処置するために投与することができ、かつ／または本発明のポリペプチドは、免疫障害を処置するために使用することができ、ここで、免疫障害は：炎症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎および変形性関節症を含めた関節炎、ＣＯＰＤ、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎を含めた炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、Ｉ型糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、男性不妊症、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、汗腺膿瘍、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、ならびに脈管炎から成る群より選択される。

本発明のＳＤＡＢ分子で処置されるヒトは、メトトレキサートで同時処置されうる。

特定の一態様では、本発明は、関節リウマチの処置を必要とするヒトに配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド８０mgを４週間に約１回投与することを含む、そのヒトにおけるその処置の方法を考えており、ここで、そのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

さらなる特定の一態様では、本発明は、関節リウマチの処置を必要とするヒトに配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド１６０、２００、３２０または４００mgを４週間に約１回投与することを含む、そのヒトにおけるその処置の方法を考えており、ここで、場合によりそのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

別の特定の態様では、本発明は、関節リウマチの処置を必要とするヒトに配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド３２０または４００mgを８週間に約１回または１ヶ月に１回投与することを含む、そのヒトにおけるその処置の方法を考えており、ここで、場合によりそのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

さらなる一態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、関節リウマチの処置を必要とするヒトにポリペプチド８０mgを約４週間毎に投与することによる、そのヒトにおけるその処置に使用するためのポリペプチドに関し、ここで、そのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

さらなる一態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、関節リウマチの処置を必要とするヒトに配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド１６０、２００、３２０または４００mgを４週間に約１回投与することによる、そのヒトにおけるその処置に使用するためのポリペプチドに関し、ここで、場合によりそのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

別の特定の態様では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、関節リウマチの処置を必要とするヒトに配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド３２０または４００mgを８週間に約１回または１ヶ月に１回投与することによる、そのヒトにおけるその処置に使用するためのポリペプチドを考えており、ここで、場合によりそのヒトは、メトトレキサートで同時処置される。

さらなる一態様では、本発明は、免疫障害の処置を必要とするヒトにおけるその処置に使用するためのポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号１（オゾラリズマブ）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと競合する。
発明の説明

オゾラリズマブを投薬された６処置群のそれぞれにおいて、８および１６週間目に関節リウマチの処置基準ＡＣＲ−２０、５０、および７０を満たしている患者のパーセンテージを示す図である。４週間毎の投与計画では、１日目、４、８、および１２週間目にオゾラリズマブまたはプラセボのいずれかを対象に投薬した。８週間毎の計画では、１日目および８週間目に対象にオゾラリズマブを投薬し、４および１２週間目にプラセボを投薬した。 処置群による経時的なＡＣＲ２０反応率（ＬＯＣＦ）を示す図である。 処置群による経時的なＤＡＳ２８反応率（ＬＯＣＦ）を示す図である。 ＡＴＮ−１０３のプラセボ補正後の用量−ＡＣＲ２０反応中央値（９５％ＰＩ）を示す図である。破線は、表示した対照薬処置のシミュレーション後の反応中央値を示す。 ＡＴＮ−１０３のシミュレーション後のＤＡＳ反応中央値（９５％ＰＩ）を示す図である。破線は、表示した対照薬処置の反応中央値を示す。 ％ＡＣＲ２０および％ＳＩに関する薬物による有用性を示す図である。各楕円は、各薬物についてその適応投与計画でのシミュレーション後の反応の９５％ＰＩの範囲を示すものである。

定義
本発明をさらに容易に理解できるために、いくつかの用語を最初に定義する。追加的な定義は、詳細な説明の全体にわたって示す。

本明細書に使用される冠詞「a」および「an」は、その冠詞の一つまたは複数（例えば少なくとも一つ）の文法的対象を表す。

用語「または」は、文脈から特に明記されない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、その用語と互換的に使用される。

用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、本発明のＳＤＡＢ分子を包含する。

「約」および「およそ」は、一般に、測定値の性質または精度を考えた場合、測定された量について許容されうる誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。

「約」、「およそ」、「少なくとも」、または「最大で」などの修飾語が項目のリストに先行する場合、この用語は、リスト中の各項目を改変するよう意図されている。例えば、語句「少なくとも約１０％または２０％」は、「少なくとも約１０％または少なくとも約２０％」と解釈すべきである。

ヌクレオチド配列の文脈において、用語「実質的に同一」は、第２の核酸配列中のアライメントされたヌクレオチドと同一のヌクレオチドを十分数または最小数含有することにより、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードする第１の核酸配列、例えば、参照配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を表すために、本明細書において使用される。

同じく本発明に含まれるのは、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログ、または変異体、およびその任意の組み合わせである。本発明のタンパク質を表す場合の用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「アナログ」には、対応するネイティブなＳＤＡＢ分子の機能的特性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書のどこか他に論じられる特異的抗原結合フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメントおよび欠失フラグメントが含まれる。本発明のポリペプチドの変異体には、上記フラグメント、およびアミノ酸の置換、欠失、または挿入によりアミノ酸配列が変化したポリペプチドも含まれる。変異体は、天然であっても、または非天然であってもよい。非天然変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技法を用いて産生させることができる。変異ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含みうる。本発明のフラグメントの誘導体は、ネイティブなポリペプチドに見られない追加的な特徴を示すように変化されたポリペプチドである。例には、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドは、また、本明細書において「ポリペプチドアナログ」と呼ばれることがある。本明細書に使用されるポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された一つまたは複数の残基を有する主題ポリペプチドである。同様に「誘導体」として含まれるのは、２０種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体を一つまたは複数含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに置換することができ；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに置換することができ；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに置換することができ；ホモセリンをセリンの代わりに置換することができ；オルニチンをリシンの代わりに置換することができる。

用語「機能的変異体」は、天然配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有する、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドであって、天然配列の一つまたは複数の活性を有する能力があるポリペプチドを表す。

配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）の計算は、以下のように行われる。

二つのアミノ酸配列の、または二つの核酸配列の同一率を決定するには、最適な比較目的のために配列をアライメントする（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。典型的な一態様では、比較目的のためにアライメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。

次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列での位置が、第２の配列での対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているならば、それらの分子はその位置で同一である（本明細書に使用されるアミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい）。

二つの配列間の同一率は、それら二つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。

二つの配列の間の配列の比較および同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。一態様では、二つのアミノ酸配列の間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットのgcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み入れられた、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)に記載のアルゴリズムを使用して、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、ならびにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。なお別の態様では、二つのヌクレオチド配列の間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネットのgcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリックスならびにギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重み１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。一つの典型的なパラメーターセット（および他に特に規定がなければ使用すべきセット）は、ギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５を有するBlossum 62スコアリングマトリックスである。

二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一率は、ALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み入れられた、E. Meyers and W. Miller CABIO, 4:11-17(1989)に記載のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。

本明細書記載の核酸配列およびタンパク質配列は、公共データベースに対して検索を行って、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10(1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明において特徴とされる核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明において特徴とされるタンパク質（配列番号１）分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ付きアライメントを得るために、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-25 3402(1997)に記載されたようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。

用語「ＳＤＡＢ」は、国際公開公報第０４／０４１８６２号および国際公開公報第０６／１２２７８６号に記載されたような単一ドメイン抗原結合分子を表す。用語「ＳＤＡＢ 分子」は、一つまたは複数のＳＤＡＢを含むポリペプチドまたは他の分子を表す。用語「ＳＤＡＢ」および「ＳＤＡＢ分子」は、単一ドメイン抗原結合ユニット（例えばＴＮＦ３０もしくはＡＬＢ８）または多価単一ドメイン抗原結合ドメイン（例えばＴＮＦ５５、ＴＮＦ５６、もしくはオゾラリズマブ）を表すために互換的に使用することができる。

可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Kabatの定義、Chothiaの定義、KabatおよびChothiaを一本化した定義、ＡｂＭ定義、接触定義、ならびに／もしくはコンフォメーション定義または当技術分野で周知の任意のＣＤＲ決定法に従って同定される、超可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Kabatらによって本来定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.Cを参照されたい。ＣＤＲの位置は、Chothiaらによって本来記載された構造ループ構造として同定することもできる。例えば、Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883を参照されたい。ＣＤＲの同定に対する他のアプローチには、KabatとChothiaの折衷案であって、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（現在のAccelrys（登録商標））を使用して得られる「ＡｂＭ定義」、またはMacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745に示される、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」が挙げられる。本明細書においてＣＤＲの「コンフォメーション定義」と呼ばれる別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定することができる。例えば、Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166を参照されたい。なお他のＣＤＲ境界の定義は、上記アプローチの一つに厳密には従わない場合があるが、それでもなおKabatのＣＤＲの少なくとも一部と重複する。もっとも、特定の残基または残基の群またはＣＤＲ全体でさえ抗原結合に著しくは影響しないという予測または実験結果に照らして、それらＣＤＲが短縮または延長される場合がある。本明細書に使用されるＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含めた、当技術分野において公知の任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを表しうる。本明細書に使用される方法は、任意のこれらのアプローチに従って定義されるＣＤＲを利用しうる。一つよりも多いＣＤＲを含有する任意の所与の態様について、ＣＤＲは、Kabatの定義、Chothiaの定義、拡張（extended）定義、ＡｂＭ定義、接触定義、および／またはコンフォメーション定義のいずれかに従って定義することができる。

発明の詳細な説明
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子
単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子には、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの部分である分子が含まれる。例には、非限定的に、重鎖可変ドメイン、軽鎖を自然に欠如している結合分子、従来の４本鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来の足場以外の単一ドメイン足場が挙げられる。ＳＤＡＢ分子は、任意の技術、または任意の将来的単一ドメイン分子でありうる。ＳＤＡＢ分子は、非限定的に、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含めた任意の種由来でありうる。

本発明の一局面によると、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠如している重鎖として知られる天然の単一ドメイン抗原結合分子である。そのような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号およびHamers-Casterman et al. Nature 363:446-448 (1993)に開示されている。はっきりさせるために、軽鎖を自然に欠如している重鎖分子由来のこの可変ドメインは、それを４本鎖免疫グロブリンの従来型ＶＨと区別するためにＶＨＨと表現することができる。そのようなＶＨＨ分子は、Camelidae種から、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコから得ることができる。Camelidae以外の他の種は、軽鎖を自然に欠如している重鎖分子を産生する場合があり；そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。

ＳＤＡＢ分子は、下にさらに詳細に記載するように、リコンビナント化、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化（camelized）、脱免疫化（deimmunized）および／またはin vitro発生（例えばファージディスプレイによって選択）されうる。

用語「抗原結合」には、ターゲット抗原またはそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含むポリペプチド、例えば本明細書記載の単一ドメイン分子の部分が含まれることが意図される。タンパク質（またはタンパク質模倣体）に関連して、抗原結合部位は、典型的には、ターゲット抗原に結合する界面を形成する（アミノ酸またはアミノ酸模倣体少なくとも４個の）一つまたは複数のループを含む。典型的には、ポリペプチド、例えば単一ドメイン抗体分子の抗原結合部位は、少なくとも１個もしくは２個のＣＤＲ、またはより典型的には少なくとも３、４、５、もしくは６個のＣＤＲを含む。

用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、多くの場合に、当技術分野においてヒトまたは動物起源のＶＬまたはＶＨドメインに同一または実質的に同一であると理解される。ある種、例えば、サメおよびラマでは、免疫グロブリン可変ドメインが進化した結果、アミノ酸配列がヒトまたは哺乳動物のＶＬまたはＶＨと異なる場合があることを認識されたい。

しかし、これらのドメインは、なお抗原結合に主に関与している。用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、典型的には、少なくとも１個もしくは２個のＣＤＲ、またはより典型的には少なくとも３個のＣＤＲを含む。

「免疫グロブリン定常ドメイン」または「定常領域」は、ヒトまたは動物起源のＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインと同一または実質的に類似の免疫グロブリンドメインを含むことが意図される。例えば、William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, 209, 210-218 (1989)中のHasemann & Capra, Immunoglobulins: Structure and Functionを参照されたい。用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリン定常ドメインまたはこれらに実質的に類似の免疫グロブリンドメインのＦｃ部分を表す。

ある態様では、ＳＤＡＢ分子は、一価分子または多特異性分子（例えば二価、三価、もしくは四価分子）である。他の態様では、ＳＤＡＢ分子は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、または四重特異性分子である。分子が「単一特異性」または「多重特異性」、例えば「二重特異性」であるかどうかは、結合性ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を表す。多重特異性分子は、本明細書記載のターゲットポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、またはターゲットポリペプチドおよび異種ポリペプチドもしくは固体支持材料のような異種エピトープに特異的であってもよい。

本明細書に使用される用語「価数」は、ＳＤＡＢ分子中に存在する潜在的結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を表す。各結合ドメインは、特異的に一つのエピトープと結合する。ＳＤＡＢ分子が一つよりも多い結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、「二価単一特異性」と呼ばれる二つの結合ドメインを有する抗体については同一エピトープと特異的に結合しうるし、または「二価二重特異性」と呼ばれる二つの結合ドメインを有するＳＤＡＢ分子については異なるエピトープと特異的に結合しうる。ＳＤＡＢ分子は、また、二重特異性であって、かつ各特異性について二価でありうる（「二重特異性四価分子」と呼ばれる）。二重特異性二価分子、およびそれらを製造する方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および同第２００２／０１５５５３７号に記載されており、これらの全ての開示は、参照により本明細書に組み入れられる。二重特異性四価分子およびそれらを製造する方法は、例えば、国際公開公報第０２／０９６９４８号および国際公開公報第００／４４７８８号に記載されており、これら両者の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。多重特異性分子および多価分子のさらなる例は、国際公開公報第９３／１７７１５号；国際公開公報第９２／０８８０２号；国際公開公報第９１／００３６０号；国際公開公報第９２／０５７９３号；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；および同第５，６０１，８１９号；Tutt et al, J. Immunol. 147:60-69 (1991);ならびにKostelny et al., J.Immunol. 148: 1547-1553 (1992)に提供されている。

ある態様では、ＳＤＡＢ分子は、一つまたは複数のターゲット抗原に結合する、相補性可変ドメインまたは免疫グロブリン定常領域例えばＦｃ領域を欠如している一つまたは複数の単一ドメイン分子を含む１本鎖融合ポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドによって認識される例示的なターゲット抗原には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）が挙げられる。いくつかの態様では、抗原結合性単一ドメイン分子は、一つもしくは複数の血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））またはトランスフェリンより選択される血清タンパク質、例えばヒト血清タンパク質に結合する。

ＴＮＦα
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症などの炎症障害に関連することが当技術分野において公知である。ＴＮＦαおよびそのレセプター（ＣＤ１２０ａおよびＣＤ１２０ｂ）の両方が非常に詳細に研究されてきた。生物活性型のＴＮＦαは三量体である。抗ＴＮＦα抗体を使用してＴＮＦαの作用と拮抗するいくつかの戦略が開発されており、Remicade（登録商標）およびHumira（登録商標）のように現在市販されている。ＴＮＦα結合性単一ドメイン抗原結合分子の多数の例が、国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第０４／０４１８６５号、および国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示されており、それら全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

単一ドメイン抗原結合分子の追加的な例は、US2006/286066、US2008/0260757、国際公開公報第０６／００３３８８号、US2005/0271663、およびUS2006/0106203に開示されており、その全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。特定の態様では、本発明のＳＤＡＢ分子には、表１のアミノ酸配列を含むＳＤＡＢ、または表１の配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。代替的な態様では、本発明のＳＤＡＢ分子は、表１の配列とアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の差異を有するアミノ酸配列を含みうる。

他の態様では、ＴＮＦαおよび血清タンパク質、例えばＨＳＡに対する単一特異性、二重特異性、三重特異性および他の多重特異性単一ドメイン抗体が考えられている。多重特異性ＴＮＦαおよびＨＳＡ結合性ポリペプチドの多数の例が、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の多重特異性ポリペプチドは、表１のアミノ酸配列、または表１の配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。代替的な態様では、本発明の多重特異性ＳＤＡＢ分子は、表１の配列と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を含みうる。

具体的な態様では、ＴＮＦα結合性ＳＤＡＢ分子は、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示された一つまたは複数のＳＤＡＢを含む。例えば、ＴＮＦα結合性ＳＤＡＢ分子は、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示された一価、二価、または三価ＴＮＦα結合性ポリペプチドでありうる。

国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示された例示的なＴＮＦα結合性ＳＤＡＢには、非限定的に、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ３、およびそのヒト化型が挙げられる（例えばＴＮＦ２９、ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３１、ＴＮＦ３２、ＴＮＦ３３）。一価ＴＮＦα結合性ＳＤＡＢの追加的な例は、国際公開公報第２００６／１２２７８６号の表８に開示されている。例示的な二価ＴＮＦα結合性ＳＤＡＢ分子には、非限定的に、２個のＴＮＦ３０ ＳＤＡＢがペプチドリンカーを介して連結して単一の融合ポリペプチドを形成したものを含むＴＮＦ５５およびＴＮＦ５６が挙げられる（国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示されている）。二価ＴＮＦα結合性ＳＤＡＢ分子の追加的な例は、国際公開公報第０６／１２２７８６号の表１９にＴＮＦ４、ＴＮＦ５、ＴＮＦ６、ＴＮＦ７、ＴＮＦ８として開示されている）。

特定の態様では、抗ＴＮＦα ＳＤＡＢは、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、ここで：ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＤＹＷＭＹ（配列番号２２）；ＤＹＷＭＹ（配列番号２２）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＤＹＷＭＹ（配列番号２２）とアミノ酸１個だけの差異を有するアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）；ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）と少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２３）とアミノ酸２もしくは１個の差異を有するアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）；ＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＳＰＳＧＦＮ（配列番号２４）とアミノ酸１個の差異を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、ＨＳＡ結合性ＳＤＡＢは、表１のアミノ酸配列、または表１の配列と約８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。代替的な態様では、本発明の抗ＨＳＡ ＳＤＡＢは、表１の配列とアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の差異を有するアミノ酸配列を含みうる。

他の態様では、ＨＳＡ結合性ＳＤＡＢ分子は、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示された一つまたは複数のＳＤＡＢを含む。例えば、ＨＳＡ結合性ＳＤＡＢ分子は、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示された一価、二価、三価ＨＳＡ結合性ＳＤＡＢ分子でありうる。他の態様では、ＨＳＡ結合性ＳＤＡＢ分子は、ＨＳＡへの結合特異性の少なくとも一つを有する単一特異性または多重特異性分子でありうる。例示的なＨＳＡ結合性ＳＤＡＢには、非限定的に、国際公開公報第０６／１２２７８６号に開示されたＡＬＢ１およびそのヒト化型（例えば、ＡＬＢ６、ＡＬＢ７、ＡＬＢ８、ＡＬＢ９、ＡＬＢ１０）が挙げられる。

特定の態様では、抗ＨＳＡ ＳＤＡＢは、三つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含み、ここで、ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＳＦＧＭＳ（配列番号２５）；ＳＦＧＭＳ（配列番号２５）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＳＦＧＭＳ（配列番号２５）とアミノ酸１個だけの差異を有するアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）；ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）と少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）とアミノ酸２もしくは１個の差異を有するアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）；ＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）と少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列；またはＧＧＳＬＳＲ（配列番号２７）とアミノ酸１個の差異を有するアミノ酸配列を含む。

他の態様では、ＳＤＡＢ分子の二つ以上の単一ドメイン分子は、連結基と共にまたは連結基なしに、遺伝的融合体またはポリペプチド融合体として融合される。連結基は、当業者に明らかな任意の連結基でありうる。例えば、連結基は、１〜１００原子長の生体適合性ポリマーでありうる。一態様では、連結基は、ポリグリシン、ポリセリン、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリイソロイシン、もしくはポリアルギニン残基、またはその組み合わせを含むまたはそれから成る。例えば、ポリグリシンまたはポリセリンリンカーは、少なくとも５、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、３５および４０個のグリシンおよびセリン残基を含みうる。使用されうる例示的なリンカーには、ＧＩｙ−Ｓｅｒリピート、例えば、１、２、３、４、５、６、７回またはそれよりも多い繰り返しの（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号１９）リピートが挙げられる。いくつかの態様では、リンカーは、以下の配列を有する：（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ（配列番号２０）または（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２１）［式中、ｎは４、５、または６である］。いくつかの態様では、リンカーは、配列番号６（ＧＳ９）または配列番号７（ＧＳ３０）を含む。

例示的な一態様では、本発明のＳＤＡＢ分子は、ターゲット抗原、例えばＴＮＦαに結合する二つのＳＤＡＢドメイン（例えば、二つのラクダ科可変領域）と、血清タンパク質、例えばＨＳＡに結合する一つの単一ドメイン抗体分子（例えば、ラクダ科可変領域）との１本鎖ポリペプチド融合体から構成されうる。

本明細書において「オゾラリズマブ」と呼ばれるポリペプチドは、ヒト化三価二重特異性ＴＮＦα阻害性融合タンパク質である。この融合タンパク質は、ラクダ科動物由来であって、ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと高度の配列相同性および構造相同性を有する。そのポリペプチド１本鎖は、ＴＮＦαに対する結合ドメイン二つおよびＨＳＡに対する結合ドメイン一つから構成され、アミノ酸９個のＧ−Ｓリンカー二つがドメイン同士を結合している。オゾラリズマブの詳細な説明は、国際公開公報第０６／１２２７８６号（そこではＴＮＦ６０と呼ばれる）に提供されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

ＳＤＡＢ分子の調製
本発明のＳＤＡＢ分子は、リコンビナント化、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、および／またはin vitro産生（例えば、ファージディスプレイによって選択）される一つまたは複数の単一ドメイン分子（例えばＳＤＡＢ）から構成されうる。抗体およびＳＤＡＢ分子を発生させるための技法、ならびにそれらをリコンビナント改変するための技法は、当技術分野において公知であり、下に詳細に説明される。

抗体を得るために、当業者に公知の多数の方法が利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法によるハイブリドーマの発生により産生させることができる。次に、このように形成されたハイブリドーマは、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（BIACORE（商標））分析などの標準法を用いてスクリーニングされ、特定抗原と特異的に結合するＳＤＡＢを産生する一つまたは複数のハイブリドーマが同定される。任意の形態の特定抗原、例えばリコンビナント抗原、天然形態、その任意の変異体またはフラグメント、さらにはその抗原性ペプチドを免疫原として使用することができる。

抗体およびＳＤＡＢ分子を作製する方法の一例には、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Smith Science 228: 1315-1317(1985)；国際公開公報第９２／１８６１９号；国際公開公報第９１／１７２７１号；国際公開公報第９２／２０７９１号；国際公開公報第９２／１５６７９号；国際公開公報第９３／０１２８８号；国際公開公報第９２／０１０４７号；国際公開公報第９２／０９６９０号；および国際公開公報第９０／０２８０９号に記載されている。

ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定抗原は、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ハムスター、またはラットを免疫処置するために使用することができる。一態様では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生を欠損するマウス系統を操作して、ヒトＩｇローカスの大フラグメントを有するようにすることが可能である。ハイブリドーマ技法を用いて、所望の特異性を有する遺伝子から得られた抗原特異性モノクローナル抗体を産生させ、選択することができる。例えば、XENOMOUSE（商標）、Green et al Nature Genetics 7:13-21 (1994)、US20030070185、国際公開公報第９６／３４０９６、およびＰＣＴ出願PCT/US96/05928を参照されたい。

別の態様では、ＳＤＡＢ分子が非ヒト動物から得られ、次に改変、例えばヒト化、脱免疫化、および／またはキメラ化される。これらのＳＤＡＢ分子は、当技術分野において公知のリコンビナントＤＮＡ技法を用いて産生させることができる。キメラ抗体およびＳＤＡＢ分子を製造するための多様なアプローチが記載されている。例えばMorrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81:6851(1985); Takeda et al, Nature 314:452(1985)；米国特許第４，８１６，５６７号および同第４，８１６，３９７号；欧州特許公報EP171496および0173494；ならびに英国特許GB 2177096Bを参照されたい。ヒト化ＳＤＡＢ分子も、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を発現する能力はないトランスジェニックマウスを使用して産生させることができる。Winterは、本明細書記載のヒト化ＳＤＡＢ分子を調製するために使用することができる例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のＳＤＡＢ分子のＣＤＲ全部を非ヒトＣＤＲの少なくとも一部に置き換えることもでき、またはＣＤＲのいくつかだけを非ヒトＣＤＲに置き換えることもできる。予め決定された抗原へのＳＤＡＢ分子の結合に必要とされる数のＣＤＲを置き換えることだけが必要である。

ヒト化ＳＤＡＢ分子は、抗原結合に直接的には関与しない可変ドメインの配列を、ヒト可変ドメイン由来の同等配列に置き換えることによって発生させることができる。ヒト化抗体またはそのフラグメントを発生させるための例示的な方法は、Morrison Science 229:1202-1207(1985); Oi et al. BioTechniques 4:214(1986)；ならびに米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号；および同第６，４０７，２１３号によって提供される。

それらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリン可変ドメインの全てまたは部分をコードする核酸配列を単離し、操作し、発現させることを含む。そのような核酸は、上記のような、予め決定されたターゲットに対するＳＤＡＢ分子を産生するハイブリドーマから、および他の起源から得ることができる。次に、ヒト化ＳＤＡＢ分子をコードするリコンビナントＤＮＡを、適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。

ある態様では、ヒト化ＳＤＡＢ分子は、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖細胞系列の置換および／または復帰突然変異の導入によって最適化される。そのような変化された免疫グロブリン分子は、当技術分野において公知のいくつかの技法のいずれかによって製造することができ（例えばTeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 80:7308-7312(1983); Kozbor et al, Immunology Today 4:7279(1983); Olsson et al, Meth. Enzymol, 92:3-16(1982)）、国際公開公報第９２／０６１９３号またはEP 0239400の教示に従って製造してもよい。ＳＤＡＢ分子をヒト化するための技法は、国際公開公報第０６／１２２７８６号にも提供されている。

ＳＤＡＢ分子は、また、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失、すなわち国際公開公報第９８／５２９７６号および国際公開公報第００／３４３１７号に開示された方法による「脱免疫化」によって改変することができる。簡潔には、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを求めて、ＳＤＡＢ分子の重鎖可変ドメインを分析することができ；これらのペプチドは、潜在的Ｔ細胞エピトープ（国際公開公報第９８／５２９７６号および国際公開公報第００／３４３１７号に定義されている）に相当する。国際公開公報第９８／５２９７６号および国際公開公報第００／３４３１７号に記載されているように、潜在的Ｔ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレッディング」と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用することができ、追加的に、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフを求めて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８種の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合することから、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは単一アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換が行われる。

多くの場合、しかし排他的ではなく、ヒト生殖細胞系列抗体配列中の位置に共通のアミノ酸を使用することができる。例えば、ヒト生殖細胞系列配列は、Tomlinson et al., J. MoI. Biol. 227:776-798(1992); Cook et al., Immunol. Today 16(5):237-242(1995); Chothia et al., J. MoI. Biol. 227:799-817(1992);およびTomlinson et al., EMBO J. 14:4628-4638(1995)に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合ディレクトリーを提供する（Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UKによって編集）。これらの配列は、ヒト配列の起源として、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲのために使用することができる。ヒトフレームワークのコンセンサス領域も、例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されているように使用することができる。ＳＤＡＢ分子は、タンパク質を産生するように遺伝的に操作された生きたホスト細胞によって産生させることができる。タンパク質を産生するように細胞を遺伝的に操作する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)を参照されたい。そのような方法には、タンパク質をコードし、そのタンパク質の発現を可能にする核酸を、生きたホスト細胞中に導入することを含む。これらのホスト細胞は、培養で成長した細菌細胞、真菌細胞、または好ましくは動物細胞でありうる。細菌ホスト細胞には、非限定的に、Escherichia coli細胞が挙げられる。適切なE. coli株の例には：ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを切断できない任意のE. coli株が挙げられる。使用できる真菌ホスト細胞には、非限定的に、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastorisおよびAspergillus細胞が挙げられる。使用できる動物細胞系の少数の例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８である。新規動物細胞系は、当業者に周知の方法を用いて樹立できる（例えば、トランスフォーメーション、ウイルス感染、および／または選択により）。場合により、タンパク質は、ホスト細胞によって培地中に分泌させることができる。

改変ＳＤＡＢ分子
本発明の製剤は、フレームワーク領域の一つ中の少なくとも一つのアミノ酸位置で天然ドメイン、例えばＶＨドメインのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する少なくとも一つのＳＤＡＢ分子を含有しうる。ヒト化ＳＤＡＢ分子などの、本発明のいくつかのＳＤＡＢ分子のアミノ酸配列は、少なくとも一つのフレームワーク領域中の少なくとも一つのアミノ酸位置で天然ドメイン、例えば天然ＶＨＩ−Ｉドメインのアミノ酸配列と異なりうることを了解されたい。

本発明には、また、ＳＤＡＢ分子の誘導体の製剤が含まれる。そのような誘導体は、一般に、ＳＤＡＢ分子および／または本明細書開示のＳＤＡＢ分子を形成する一つもしくは複数のアミノ酸残基の改変によって、特に化学的および／または生物学的（例えば酵素的）改変によって得ることができる。そのような改変の例、さらにはそのような方法で（すなわちタンパク質主鎖上または好ましくは側鎖上のいずれかで）改変できるＳＤＡＢ分子配列内のアミノ酸残基の例、そのような改変を導入するために使用できる方法および技法、ならびにそのような改変の潜在的使用および利点は、当業者に明らかであろう。

例えば、そのような改変は、ＳＤＡＢ分子内またはＳＤＡＢ分子上の一つまたは複数の官能基、残基または部分の、特にＳＤＡＢ分子に一つまたは複数の所望の性質または官能性を付与する一つまたは複数の官能基、残基または部分の（例えば共有結合による、または任意の他の適切な方法での）導入を必要としうる。そのような官能基の例は、当業者に明らかであろう。

例えば、そのような改変は、ＳＤＡＢ分子の半減期、溶解性および／もしくは吸収を増加させる、ＳＤＡＢ分子の免疫原性および／もしくは毒性を減少させる、ＳＤＡＢ分子の任意の望ましくない副作用を除去もしくは軽減する、および／またはＳＤＡＢ分子に他の好都合な性質を付与および／もしくはＳＤＡＢ分子の望まれない性質を減少させる一つまたは複数の官能基の（例えば共有結合による、または任意の他の適切な方法での）導入；あるいは前記の二つ以上の任意の組み合わせを含みうる。そのような官能基の例およびそれらを導入する技法の例は、当業者に明らかであり、一般に、本明細書上記に引用された全般背景技術に指摘された全ての官能基および技法、ならびに薬学的タンパク質の改変のために、特に抗体または抗体フラグメント（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の改変のためにそれ自体公知の官能基および技法（その参照は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)になされる）を含みうる。そのような官能基は、例えば本発明のＳＤＡＢ分子に直接（例えば共有結合的に）、または場合によってはこれも当業者に明らかなように適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結してもよい。薬学的タンパク質の半減期を増加および／または免疫原性を減少させるために広く使用される一技法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの適切な薬理学的に許容されうるポリマーまたはその誘導体（メトキシポリエチレングリコールもしくはｍＰＥＧなど）の結合を含む。一般に、抗体および抗体フラグメント（非限定的に（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖを含む）のために当技術分野において使用されるＰＥＧ化などの、任意の適切な形式のＰＥＧ化を使用することができ；例えば、Chapman, Nat. Biotechnol., 54:531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)；および国際公開公報第０４／０６０９６５号が参照される。タンパク質のＰＥＧ化用の様々な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAから市販されている。

好ましくは、部位特異的ＰＥＧ化が、特にシステイン残基を介して使用される（例えばYang et al., Protein Engineering 16(10):761-770 (2003)参照）。例えば、このために、ＳＤＡＢ分子中に自然に存在するシステイン残基にＰＥＧを結合させてもよく、ＰＥＧの結合のための一つもしくは複数のシステイン残基を適切に導入するようにＳＤＡＢ分子を改変してもよく、またはＰＥＧの結合のための一つもしくは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のＳＤＡＢのＮおよび／もしくはＣ末端に融合させてもよい（これら全ては、当業者に本質的に公知のタンパク質工学の技法を用いる）。

好ましくは、ＳＤＡＢ分子について、５０００よりも大きい、例えば１０，０００よりも大きく２００，０００未満、例えば１００，０００未満；例えば２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧが使用される。

ＰＥＧ化に関して、全般に、本発明は、好ましくは該ＰＥＧ化が、（１）in vivo半減期を増加させる；（２）免疫原性を減少させる；（３）ＰＥＧ化のために本質的に公知の一つもしくは複数のさらなる有益な性質を提供する；（４）ＳＤＡＢ分子の親和性に本質的には影響しない（例えば、下記実施例に記載されたアッセイなどの適切なアッセイによって決定されるとき、該親和性を９０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく、１０％よりも大きく減少させない）；および／または（４）ＳＤＡＢ分子の他の所望の性質のどれにも影響しない方法で、一つまたは複数のアミノ酸位置でＰＥＧ化された任意のＳＤＡＢ分子も包含することに留意されたい。適切なＰＥＧ基およびそれらを特異的にまたは非特異的に結合させるための方法は、当業者に明らかであろう。

ＰＥＧ化ＳＤＡＢは、例えば、２０１１年７月１６日に出願された、参照により本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第６１／２６５，３０７号に開示されている。

いくつかの態様では、ＰＥＧ化ＳＤＡＢは、ＰＥＧポリマーに連結した改変ＳＤＡＢ分子を含み、ここで、ＰＥＧポリマー分子は、式（ａ）〜（ｈ）：

から成る群より選択される分岐ＰＥＧポリマー分子である。

いくつかの態様では、ＰＥＧ化ＳＤＡＢは：
（ｉ）一つまたは複数のターゲットに結合する一つまたは複数の単一抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）非ペプチド性リンカー；および
（ｉｉｉ）一つまたは複数のポリマー分子
を含み、ここで、非ペプチド性リンカーは、式（Ｉ）：

［式中、
Ｗ１およびＷ２は、それぞれ独立して、結合またはＮＲ１より選択され；
Ｙは、結合、Ｒａで０〜２回置換されたＣ１−４アルキレン、またはピロリジン−２，５−ジオンであり；
Ｘは、Ｏ、結合、または不在であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ３、Ｓまたは結合であり；
Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して水素またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ２は、不在または一つもしくは複数のポリマー部分であり；
Ｒａは、ヒドロキシル、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシより選択され；
ｍは、０または１であり；
ｎは、０、１、２または３であり；
ｐは、０、１、２、３または４である］
で示される部分である。

追加的な態様では、ＰＥＧ化ＳＤＡＢは、次式：

により表されるリンカーを介してＰＥＧに連結している。

特定の態様では、改変ＳＤＡＢ分子は、以下：

の構造を含む。

別の、通常はあまり好ましくない改変は、ＳＤＡＢ分子を発現させるために使用されるホスト細胞に応じて、通常は共翻訳修飾および／または翻訳後修飾の部分として、ＮまたはＯ−結合型グリコシル化を含む。

ＳＤＡＢを製造する方法
ＳＤＡＢ分子は、タンパク質を産生するように遺伝的に操作された、生きたホスト細胞によって産生することができる。タンパク質を産生するために細胞を遺伝的に操作する方法は、当技術分野において周知である。例えば Ausubel et al., eds. (1990)、Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)を参照されたい。そのような方法には、タンパク質をコードし、その発現を可能にする核酸を、生きたホスト細胞中に導入することを含む。これらのホスト細胞は、培養して成長した細菌細胞、真菌細胞、または動物細胞でありうる。細菌ホスト細胞には、非限定的にEscherichia coli細胞が挙げられる。適切なE. coli株の例には：ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、および外来ＤＮＡを切断できない任意のE. coli株が挙げられる。使用できる真菌ホストには、非限定的に、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastorisおよびAspergillus細胞が挙げられる。使用できる動物細胞系の少数の例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８である。新しい動物細胞系は、当業者に周知の方法を用いて樹立することができる（例えば、トランスフォーメーション、ウイルス感染、および／または選択によって）。場合によっては、タンパク質は、ホスト細胞によって培地中に分泌させることができる。

いくつかの態様では、ＳＤＡＢ分子は、細菌細胞、例えばE. coli細胞から産生させることができる。例えば、ＳＤＡＢがディスプレイ実体とバクテリオファージタンパク質（またはそのフラグメント）との間に抑制可能な終止コドンを含むファージディスプレイベクター中の配列によってコードされる場合、ベクターの核酸を、終止コドンを抑制できない細菌細胞に転移することができる。この場合、ＳＤＡＢは、遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合されず、ペリプラズムおよび／または培地中に分泌される。

ＳＤＡＢ分子は、また、真核細胞で産生させることができる。一態様では、ＳＤＡＢ分子は、Pichia（例えばPowers et al. J Immunol Methods 251:123-35 (2001)参照）、Hansenula、またはSaccharomycesなどの酵母細胞で発現される。

一態様では、ＳＤＡＢ分子は、哺乳動物細胞で産生される。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるための典型的な哺乳動物ホスト細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用された、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220(1980)に記載のｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞を含む。例えばKaufman and Sharp, Mol. Biol. 159:601-621 (1982)に記載）、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ならびにトランスジェニック動物由来、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、乳腺上皮細胞である。

ＳＤＡＢ分子をコードする核酸配列に加えて、リコンビナント発現ベクターは、ホスト細胞でのベクターの複製をレギュレーションする配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加的な配列を保持しうる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されたホスト細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号；および第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されたホスト細胞に、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。

ＳＤＡＢ分子のリコンビナント発現のための例示的な一システムでは、単一ドメイン抗体鎖をコードするリコンビナント発現ベクターが、リン酸カルシウム介在性トランスフェクションによってｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞に導入される。リコンビナント発現ベクター内で、抗体遺伝子は、（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントのようなＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどから得られる）エンハンサー／プロモーター調節エレメントに作動的に連結されて高レベルの遺伝子転写を推進する。リコンビナント発現ベクターは、また、ベクターをトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の選択を、メトトレキサート選択／増幅を用いて可能にするＤＨＦＲ遺伝子を保持する。選択されたトランスフォーマントホスト細胞を培養して、抗体鎖の発現を可能にすることができ、インタクトな単一ドメインが、培地から回収される。標準的な分子生物学的技法を用いて、リコンビナント発現ベクターを調製し、ホスト細胞にトランスフェクションし、トランスフォーマントについて選択し、ホスト細胞を培養し、培養液から抗体分子を回収することができる。例えば、いくつかのＳＤＡＢ分子をアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。

一態様では、ＳＤＡＢ分子は、国際公開公報第１０／０５６５５０号に記載されたように精製される。例示的な一態様では、ＳＤＡＢは、ＳＤＡＢと混入物（一つまたは複数）との混合物をプロテインＡベースの支持体および／またはイオン交換支持体と、ＳＤＡＢをその支持体に結合または吸着させる条件で接触させること；ＳＤＡＢが支持体に結合し続ける条件で、結合された支持体を洗浄することによって一つまたは複数の混入物を除去すること、ならびに吸着したＳＤＡＢ分子を溶離緩衝液で溶離することによってＳＤＡＢを支持体から選択的に溶離することによって、一つまたは複数の混入物から精製される。

ＳＤＡＢ分子は、また、トランスジェニック動物によって産生させることができる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺中に抗体を発現させる方法を記載している。乳汁特異的プロモーターならびに抗体分子および分泌用シグナル配列をコードする核酸を含む導入遺伝子が構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳汁は、その中に分泌された関心対象の単一ドメインを含む。抗体分子は、乳汁から精製することができ、またはいくつかの適用では直接使用することができる。

製剤
本発明のＳＤＡＢは、薬学的に許容されうる任意の製剤に製剤化することができる。製剤は、液体または乾燥している場合がある。製剤は、混合、乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、または薬学的組成物を製剤化するための任意の公知の方法により発生させることができる。

薬学的製剤は、溶液、マイクロエマルション、分散物、リポソーム、または高いタンパク質濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。無菌注射液は、本明細書記載の薬剤を必要量で、必要に応じて上に列挙された成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、本明細書記載の薬剤を、基本分散媒および下記に列挙される成分からの他の必要成分を含有する無菌ビヒクル中に混合することによって調製される。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。

注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含ませることによってもたらすことができる。

ＳＤＡＢ分子の製剤は、ＳＤＡＢ分子、凍結保護剤として作用できる化合物、および緩衝剤を含む。製剤のｐＨは、一般にｐＨ５．５〜７．０、好ましくは約ｐＨ６である。いくつかの態様では、製剤は液体として保存される。他の態様では、製剤は液体として調製され、次に例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥され、その後保存される。乾燥された製剤は、乾燥化合物、例えばエアロゾルもしくは粉末として使用することができ、または例えば水、緩衝液、もしくは他の適切な液体を用いてその本来の濃度もしくは別の濃度に再構成することができる。

ＳＤＡＢ分子の精製プロセスは、凍結した液体としての長期保存およびその後の凍結乾燥に適した製剤へのＳＤＡＢ分子の移行を許すように計画される（例えば、ヒスチジン／スクロース製剤を使用）。製剤は、特定濃度のタンパク質と共に凍結乾燥される。次に、凍結乾燥された製剤を、必要に応じて適切な希釈剤（例えば水）で再構成して、本来の製剤成分を所望の濃度に、一般に凍結乾燥前の濃度以上の濃度に再溶解することができる。

凍結乾燥製剤を再構成して、本来凍結乾燥された液体の体積に対する、凍結乾燥物に添加される水または希釈剤の量に応じて、本来（すなわち凍結乾燥前）の濃度と異なる濃度を有する製剤を生産することができる。適切な製剤は、抗体の完全性の一つまたは複数のパラメーターをアッセイすることによって同定することができる。

本発明のＳＤＡＢは、国際公開公報第１０／０７７４２２号に記載されるように製剤化することができる。本発明のＳＤＡＢは、以下の例示的なプロセスによって製剤化することができる：ＳＤＡＢ、凍結保護剤、界面活性剤、および緩衝剤の混合物を凍結乾燥すること；ならびに凍結乾燥された混合物を希釈剤中で再構成することによって製剤を調製すること。特定の態様では、本発明のＳＤＡＢは、以下のプロセスによって製剤化される：細胞培養でＳＤＡＢを発現させること；クロマトグラフィー精製ステップおよび／または限外濾過／ダイアフィルトレーションステップによりＳＤＡＢを精製すること；スクロースを濃度約５〜１０％で、ポリソルベート８０を濃度約０．０１〜０．０２％で、製剤のｐＨが約５〜７．５になるようなヒスチジン緩衝液を濃度約１０〜２０mMまたはトリス緩衝液を濃度約２０mMで含有する製剤中のＳＤＡＢ濃度を約１０〜２５０mg/mlに調整すること。

処置方法
ＴＮＦα関連障害、例えば炎症障害または自己免疫障害を治療または予防（例えばそれに関連する一つもしくは複数の症状を軽減もしくは改善）するために、ＳＤＡＢ分子を、単独で、または第２の薬剤、例えば第２の治療活性薬剤もしくは薬理学的活性薬剤と組み合わせて、対象（例えばヒト対象）に投与することができる。

二つの抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）ＳＤＡＢおよび抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ＳＤＡＢを含むポリペプチドなどの本発明のＳＤＡＢ分子は、単独でまたは本明細書記載の第２の薬剤と組み合わせて、免疫障害の治療または予防を必要とするヒトにその治療または予防のために使用することができる。

用語「処置」は、統計的に有意な程度または当業者に検出可能な程度のいずれかに、障害に関連する状態、症状、もしくはパラメーターを改善するために、または障害の進行を予防するために有効な量、方式、および／または様式で治療薬を投与することを表す。治療的使用の場合、処置は、対象での障害もしくは状態を改善、治癒、維持しうる、または障害もしくは状態の持続期間を短縮しうる。治療的使用では、対象は、症状の部分的または完全な顕在化を有しうる。典型的な場合には、処置は、対象の障害もしくは状態を、医師によって検出されうる程度まで改善するか、または障害もしくは状態の悪化を予防する。有効量、やり方、または様式は、対象に応じて変動することがあり、対象に合わせることができる。

本明細書に使用される用語「対象」および「患者」は、互換的に使用される。本明細書に使用される用語「（一つまたは複数の）対象」は、動物、例えば、非霊長類を含めた哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジーなどのサルおよびヒト）を表す。

処置されうる免疫障害の非限定的な例には、非限定的に、自己免疫障害、例えば関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ループス関連関節炎または強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、脈管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、糖尿病（Ｉ型）；例えば皮膚の炎症状態（例えば、乾癬）；急性炎症状態（例えば、内毒血症、セプシスおよび敗血症、毒素性ショック症候群および感染症）；移植片拒絶およびアレルギーが挙げられる。一態様では、ＴＮＦα関連障害は、関節炎性障害、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ（ＲＡ）（例えば、中等症〜重症関節リウマチ）、骨関節炎、乾癬性関節炎、もしくは強直性脊椎炎、多関節型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）の一つもしくは複数より選択される障害；または乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、および／もしくは多発性硬化症である。

ある態様では、ＳＤＡＢ分子（または製剤）は、第２の治療剤と組み合わせて投与される、または投与のために使用される。例えば、ＴＮＦ−ＳＤＡＢについて、第２の薬剤は抗ＴＮＦ抗体またはそのＴＮＦ結合性フラグメントの場合があり、ここで、第２のＴＮＦ抗体は、製剤のＴＮＦ結合性ＳＤＡＢ分子と異なるエピトープ特異性を有する。ＴＮＦ結合性ＳＤＡＢと共に製剤化できる薬剤の他の非限定的な例には、例えば、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒、および細胞分裂阻害剤が挙げられる。一態様では、追加的な薬剤は、非限定的に非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）；コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン、およびトリアムシノロンなど；ならびに疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、例えばメトトレキサート、ヒドロキシクロロキン（Plaquenil）およびスルファサラジン、レフルノミド（Arava（登録商標））などを含めた関節炎のための標準処置、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））、インフリキシマブ（Remicade（登録商標））（メトトレキサートを併用または併用せず）、およびアダリムマブ（Humira（登録商標））、抗ＣＤ２０抗体（例えばRituxan（登録商標））、可溶性インターロイキン−１レセプター、例えばアナキンラ（Kineret）など、金、ミノサイクリン(Minocin（登録商標））、ペニシラミン、ならびに細胞毒、例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロスポリンなどを含めた腫瘍壊死因子阻害剤である。そのような組み合わせ療法は、投与される治療剤のより低い用量を有利に利用することで、様々な単剤療法に関連する、起こりうる毒性または合併症を避けることができる。

追加的な薬剤がメトトレキサートである場合、メトトレキサートの用量は、１週間に約７．５〜約２５mgの範囲でありうる。

ＳＤＡＢ分子は、液体溶液（例えば、注射液および注入液）の形態で投与するまたは投与のために使用することができる。そのような組成物は、非経口様式（例えば、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射）、または吸入によって投与することができる。本明細書に使用される語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、それには、皮下または筋肉内投与、さらには静脈内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、表皮下、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が挙げられる。一態様では、本明細書記載の製剤は、皮下投与される。

本発明者らは、オゾラリズマブとＴＮＦαとの二重特異性相互作用部位が特に免疫障害の処置に有用であるという仮説を立てた。従って、本発明は、免疫障害の処置を必要とするヒトにおいてそれを処置する方法であって、配列番号１（オゾラリズマブ）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと競合するポリペプチドをそのヒトに投与することを含む方法に関する。

投与計画
オゾラリズマブは、投薬間隔が少なくとも４週間で皮下投与された場合、関節リウマチの処置に効力を示した。対照的に、Humira（登録商標）に推奨される投薬は、２週間毎の投与であり、Remicade（登録商標）は、静脈投与しなければならない。従って、本発明の投与計画は、最新技術に勝る利点を提供する。

本発明のＳＤＡＢ分子は、３０mgおよび８０mg用量で４週間毎の投与で疾患の処置に効力を示した。これらの効力の結果に基づくモデル化から、より高い用量（例えば１２０〜２００mgまたは２００〜４００mg）で、本発明のＳＤＡＢ分子が６もしくは８週間または２ヶ月毎に投与された場合に疾患の処置に有効であることが示された。この有利なプロファイルの結果は、注射負担の減少を招く。

加えて、モデル化から、オゾラリズマブ処置の重症感染症（ＳＩ）がエタネルセプトおよびインフリキシマブよりも低かったことも示された。特に、従来技術の抗ＴＮＦα阻害剤に比べて、本発明のＳＤＡＢ分子は、非常に好都合な利益（効力）危険（ＳＩ作用）率を示す。

従って、本発明のＳＤＡＢ分子は、３０〜２００mgの範囲の用量で４、６、または８週間毎に投与することができる。特に有効な用量は３０〜４００mgである。特定の態様では、用量は、ＳＤＡＢ分子約５、１０、１５、２０、２５、３０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２０、３５０、３７５または４００mgを含む。

１回量約３０〜２００mgまたは３０〜４００mgであっても、およそ毎日、隔日、１週間に２回、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間毎、または１もしくは２ヶ月毎に投与することができる。

特定の態様では、用量約３０、８０、１２０、１６０、２００、２４０、２８０、３２０、３６０または４００mgの、配列番号１（オゾラリズマブ）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、およそ４、６、もしくは８週間または２ヶ月毎にヒト対象に投与される。いくつかの態様では、対象は、関節リウマチを患う。

追加的な態様では、ＳＤＡＢ分子の用量は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５または４００mgである。

いくつかの態様では、用量は、約３．６、１０．８、３６、７２、１４４、または２８８mgである。

特定の態様では、ＳＤＡＢ分子はＰＥＧ化されており、用量は、約３．６、１０．８、３６、７２、１４４、または２８８mgである。

若年患者への投与のために、用量は、患者の体重に合わせるべきである。特定の態様では、用量は、約０．１、０．３８、１、２、３、３．５、４、４．５または５mg/kgである。

対象を、メトトレキサートで同時処置してもよい。いくつかの態様では、対象は、オゾラリズマブの初回投薬前に、メトトレキサートを少なくとも約６または１２週間投与されている場合がある。メトトレキサートは、任意の適切な経路によって投与することができ、用量は、１週間に約７．５〜２５mgの範囲でありうる。

効力を決定する方法
任意の特定のＳＤＡＢ分子の効力または投与計画は、当業者に利用可能な方法によって決定することができる。簡潔には、臨床試験時に、医療関係者が患者を観察することができ、病状は基準の任意の組み合わせによって判断される。患者の病状の改善は、多数の時点でこれらの基準に基づき決定され、処置の効力を評価するために患者集団に関してこれらの決定の組み合わせがプロットされる。

例示的な態様では、関節リウマチについての疾患進行は、表２に示される任意または全ての基準によって測定することができる。

実施例
実施例１
関節リウマチ（ＲＡ）患者でのシームレス第１／２相無作為化層別化二重盲検プラセボ対照試験をオゾラリズマブで行った。試験に対して無作為化された対象は合計２５４人であり、そのうち対象１人は処置せず、残りの対象２５３人を改変包括解析（modified intent-to-treat）（ｍＩＴＴ）集団および安全性の解析対象集団（safety population）に組み込んだ。各対象を、ＴＮＦ阻害剤（ＴＮＦｉ）未処置またはＴＮＦｉ事前使用に基づき層別化された一つだけの処置群に無作為に割り付けた。処置群は表３記載の合計６群であり、各群に患者４０〜４５人を無作為化した。

これら６群におけるベースライン特性は、一般に類似しており；群間でＤＡＳ２８にわずかであるが統計的に有意な差（ｐ＝０．０４８）が観察され、８０mg Ｑ４群でＤＡＳ２８の平均が最高（６．５９）であった。対象の年齢は、１８〜７９歳（平均５２．１歳）であり、大部分の対象（８０．２％）は、女性であった（ＲＡ患者での臨床試験に予想される通り）。疾患持続期間の全体平均は８．３年であり、対象の２８．９％はＴＮＦｉの事前処置を受けていた。

効力分析のための一次集団は、オゾラリズマブを少なくとも１回投与された全ての無作為化対象として定義されるｍＩＴＴ集団であった。全ての患者を、１週間に用量７．５〜２５mgのメトトレキサートで同時処置した。

各対象は、表示の時点で１回量レベルのオゾラリズマブまたはプラセボの皮下（ＳＣ）注射を受けた。

関心対象の一次比較は、プラセボに対する各ＡＴＮ−１０３処置群の比較である。

表４に、１６週間目の米国リウマチ学会２０（ＡＣＲ２０）反応率を示す。

層別化された（ＴＮＦｉ未処置またはＴＮＦｉ事前使用）Cochran-Mantel-Haenszel検定に基づきＰ値を得た。プラセボ調整後の差について層別化された（ＴＮＦｉ未処置またはＴＮＦｉ事前使用）信頼区間を計算するために、MehrotraおよびRailkarによって提唱された最小危険（ＭＲ）重みづけ法を使用する。ＡＣＲ２０反応が得られる前に、ＡＣＲ要素の任意の欠落データを推定するために最終評価スコア外挿（last observation carried forward）（ＬＯＣＦ）アプローチを使用した。

図１に、８週間目および１６週間目にＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、およびＡＣＲ７０基準を満たしている対象のパーセンテージを示す。投与計画のいくつかは、以下の終点においてプラセボよりも利点を有した：ＡＣＲ２０（図１および２）、ＡＣＲ５０（図１）、ＤＡＳ２８（図３）、ＡＣＲ−Ｎ、ＴＪＣ、ＳＪＣ、疼痛ＶＡＳ、ＨＡＱ−ＤＩ、ＣＲＰ、医師の包括的評価、患者の包括的評価、一般健康ＶＡＳ、およびＥＵＬＡＲ反応（データは示さず）。

簡潔には図１に示すように、８週目に１０mg Ｑ８について対象の３６．６％がＡＣＲ２０を満たし、対象の９．８％がＡＣＲ５０を満たし、対象の０％がＡＣＲ７０を満たし；１０mg Ｑ４について対象の４５．２％がＡＣＲ２０を満たし、対象の１１．９％がＡＣＲ５０を満たし、対象の７．１％がＡＣＲ７０を満たし；３０mg Ｑ４について対象の５０％がＡＣＲ２０を満たし、対象の３２．５％がＡＣＲ５０を満たし、対象の１５％がＡＣＲ７０を満たし；８０mg Ｑ８について対象の５４．８％がＡＣＲ２０を満たし、対象の２３．８％がＡＣＲ５０を満たし、対象の４．８％がＡＣＲ７０を満たし；８０mg Ｑ４について対象の６５．１％がＡＣＲ２０を満たし、対象の２５．６％がＡＣＲ５０を満たし、対象の２．３％がＡＣＲ７０を満たした。１６週目に、１０mg Ｑ８について対象の４８．８％がＡＣＲ２０を満たし、対象の２４．４％がＡＣＲ５０を満たし、対象の８．９％がＡＣＲ７０を満たし；１０mg Ｑ４について対象の５２．４％がＡＣＲ２０を満たし、対象の２１．４％がＡＣＲ５０を満たし、対象の４．８％がＡＣＲ７０を満たし；３０mg Ｑ４について対象の６０％がＡＣＲ２０を満たし、対象の３２．５％がＡＣＲ５０を満たし、対象の２０％がＡＣＲ７０を満たし；８０mg Ｑ８について対象の５９．５％がＡＣＲ２０を満たし、対象の３１％がＡＣＲ５０を満たし、対象の１９％がＡＣＲ７０を満たし；８０mg Ｑ４について対象の７２．１％がＡＣＲ２０を満たし、対象の３７．２％がＡＣＲ５０を満たし、対象の１１．６％がＡＣＲ７０を満たした。

図３に示すように、４週間目に、ＤＡＳ２８基準について観察されたベースライン（プラセボ）からの平均変化は、１０mg Ｑ４について１．３９％、１０mg Ｑ８について１．０５％、３０mg Ｑ４について１．６２％、８０mg Ｑ４について１．６３％、８０mg Ｑ８について１．６７％であった。８週間目に、ＤＡＳ２８基準について観察されたベースラインからの平均変化は、１０mg Ｑ４について１．５９％、１０mg Ｑ８について１．０１％、３０mg Ｑ４について１．７８％、８０mg Ｑ４について２．００％、８０mg Ｑ８について１．８５％であった。１２週間目に、ＤＡＳ２８基準について観察されたベースラインからの平均変化は、１０mg Ｑ４について１．６１％、１０mg Ｑ８について１．７２％、３０mg Ｑ４について２．３１％、８０mg Ｑ４について２．３０％、８０mg Ｑ８について２．２０％であった。１６週間目に、ＤＡＳ２８基準について観察されたベースラインからの平均変化は、１０mg Ｑ４について１．６０％、１０mg Ｑ８について１．７０％、３０mg Ｑ４について２．０９％、８０mg Ｑ４について２．４６％、８０mg Ｑ８について１．９３％であった。２０週間目に、ＤＡＳ２８基準について観察されたベースラインからの平均変化は、１０mg Ｑ４について１．０２％、１０mg Ｑ８について１．０３％、３０mg Ｑ４について１．６２％、８０mg Ｑ４について２．００％、８０mg Ｑ８について１．３６％であった。

全体的に、オゾラリズマブの安全性プロファイルは、他のＴＮＦ阻害剤（ＴＮＦｉ）の安全性プロファイルに匹敵するように見える。報告されたＳＡＥも他の抗ＴＮＦ剤の安全性プロファイルと一致した（データは示さず）。

実施例２：関節リウマチにおける市販の抗ＴＮＦ剤５種に比べたNanobody（登録商標）ＡＴＮ−１０３の比較有効性
２．１ 目的：
新規な腫瘍壊死因子阻害剤（ＴＮＦｉ）であるオゾラリズマブ（ＡＴＮ−１０３）は、ヒト血清アルブミン結合ドメインに連結した２個のヒトＴＮＦ結合ドメインを含有するヒト化三価二重特異性Nanobodyである。効力（ＡＣＲ２０／５０／７０、ＤＡＳ、ＨＡＱ）および安全性／忍容性（重症感染症率、％ＳＩ）に関して市販の腫瘍壊死因子α遮断（抗ＴＮＦα）薬５種に比べた様々な用量／投与計画のＡＴＮ−１０３の比較有効性を判断するために、および説明共変数の作用を評価するために、モデルに基づくメタ解析（ＭＢＭＡ）を行った。

２．２ 方法：
モデルに基づく効力および安全性の比較解析は、５種の対照薬（インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブ）にわたり、試験群（study-arm）レベルで要約された公開データおよび施設内第ＩＩａ相データを用いて行った。

特に、ＡＣＲ２０／５０／７０データセットは、合計６３群の臨床試験２０試験に参加している対象７，４７４人からのデータを含んでいた。ＤＡＳを、臨床試験８試験の２１群から観察した。重症感染症率のデータセットは、合計４６群の臨床試験１４試験に参加している対象６，２０９人からのデータを含んでいた。データセットは、薬物曝露の測定値（用量力価、投薬間隔）、ベースライン疾患重症度の共変数（圧痛関節および腫脹関節数、観察されたＤＡＳ、患者および医師の包括的評価、ＣＲＰ濃度、疾患期間）、臨床試験集団の特徴（抗ＴＮＦαを経験した対象のパーセントおよび地理的特徴（アジア人対非アジア人対象）を含んだ。

三つのＡＣＲ終点およびＤＡＳ終点は、それぞれ関節のＡＣＲ２０／５０／７０およびＤＡＳモデルを用いて記載した。

２．３ 結果
２．３．１ シミュレーション後の用量−ＡＣ２０／５０／７０反応
ＤＭＡＲＤの連続バックグラウンド投薬に補助的に２４週間処置した後の、ＡＴＮ−１０３および５種の対照薬の予想される用量反応関係を、最終ＡＣＲ２０／５０／７０モデルを用いて典型的な患者集団（プラセボ群でＴＮＦの経験あり、平均ベースライン腫脹関節数１９、ＡＣＲ２０反応率２１％）においてシミュレーションした。図４にその集団における２４週間目でのＡＣＲ２０反応について予測されるＡＴＮ−１０３の用量反応関係を他の抗ＴＮＦα薬に比べて示す。

このシミュレーションから、８０mg Ｑ４Ｗ ＡＴＮ−１０３処置がアダリムマブおよびゴリムマブに対する反応の９５％に匹敵する一方で、２００mg ＡＴＮ−１０３ Ｑ４Ｗはエタネルセプトに対する反応の９５％に類似する反応を生じると予測されることが示唆される。

２．３．２ シミュレーション後の用量−ＤＡＳ反応
継続中のＤＭＡＲＤバックグラウンド投薬に補助的に２４週間処置した後の、ＤＡＳ ％ＣｆＢについてのＡＴＮ−１０３および５種の対照薬の予想される用量反応関係をシミュレーションした。ＤＡＳプラセボ反応は、ＤＡＳについてのベースラインから−１６％の変化と想定されたが、これは、構造化されていない平均プラセボモデルパラメーターの推定値の平均を反映している（データは示さず）。

図５に、ＤＡＳ反応についてのＡＴＮ−１０３の予想される用量反応関係を他の抗ＴＮＦα薬に比べて示す。シミュレーションから、２００mg Ｑ４Ｗで、ＡＴＮ−１０３がＤＡＳ ％ＣｆＢに関してゴリムマブおよびセルトリズマブよりも優れていることが示される。

２．３．３ シミュレーション後の重症感染症率
シミュレーション後のプラセボ補正後％ＳＩから、ＡＴＮ−１０３の予想される感染率がアダリムマブおよびゴリムマブに匹敵する一方で、セルトリズマブ、エタネルセプト、およびインフリキシマブの方が高い重症感染症率を有しうることが示唆される（データは示さず）。

図６に、他の抗ＴＮＦα薬に比べたＡＴＮ−１０３の予想される効力（ＡＣＲ）および安全性（％ＳＩ）プロファイルの総合的な概要を提供する。特に、図６に、関連する投与計画でのシミュレーション後の抗ＴＮＦα薬の効力（ＡＣＲ２０）の９５％予測区間および付随するシミュレーション後の重症感染症率の９５％予測区間を示す。最適な効力／安全性有用性を左上の隅（高い効力、低い重症感染症率）方向に示し、それは、右下の隅に近づくほど減少する。楕円プロットは、抗ＴＮＦα薬の間で有用性がかなり重複していることを示す。

シミュレーション後の効力および安全性のこの表示から、２００mg ＡＴＮ−１０３ Ｑ４Ｗが他の抗ＴＮＦα薬に比べて良好な位置にありうることが示唆される。

２．３．４ ４００mg Ｑ８Ｗの投与計画
モデルから、反応は処置計画に依存せず、２００mg Ｑ４Ｗ投与計画または４００mg Ｑ８Ｗで類似の作用を得られることが示唆される。

２．４ 結論：
５種の抗ＴＮＦα薬に比べたＡＴＮ−１０３の効力（ＡＣＲ／ＤＡＳ）および安全性／忍容性（重症感染症率）についての比較有効性を、モデルに基づくメタ解析で評価した。他の抗ＴＮＦα薬に比べて、ＡＴＮ−１０３は、効力とＳＩ作用との好都合な組み合わせを示す。

モデルに基づくシミュレーションから、２００mg ＡＴＮ−１０３ Ｑ４Ｗまたは４００mg ＡＴＮ−１０３ Ｑ８Ｗはエタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブに効力が類似していることが示された。

Claims (11)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む薬学的製剤であって、該ポリペプチドの８０〜４００mg用量を少なくとも約４週間毎の間隔で複数回ヒトに投与することにより関節リウマチの処置を必要とするヒトにおける該処置に使用するための、薬学的製剤。
2. 投与が、少なくとも約６週間の時間間隔である、請求項１記載の薬学的製剤。
3. 投与が少なくとも約８週間の時間間隔である、請求項１または２記載の薬学的製剤。
4. 用量が、前記ポリペプチドの約８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、２７５、３００、３２０、３５０、３７５および４００mgから成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬学的製剤。
5. 皮下または静脈内に投与される、請求項１〜４のいずれか一項記載の薬学的製剤。
6. ヒトが、メトトレキサートで同時処置される、請求項１〜５のいずれか一項記載の薬学的製剤。
7. 薬学的に許容されうる製剤に製剤化される、請求項１〜６記載の薬学的製剤。
8. 製剤が、
   （ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、濃度約８０mg/ml〜２５０mg/mlのポリペプチド；
   （ｂ）濃度約５％〜約１０％の、スクロース、ソルビトール、またはトレハロースより選択される凍結保護剤；
   （ｃ）濃度約０．０１％〜０．６％の、ポリソルベート８０またはポロキサマー１８８より選択される界面活性剤；および
   （ｄ）製剤のｐＨが約５．０〜７．５であるような、濃度約１０〜２０mMのヒスチジン緩衝液または濃度約２０mMのトリス緩衝液より選択される緩衝液
   を含む、請求項７記載の薬学的製剤。
9. 製剤が、１００mg/mlの前記ポリペプチド、２０mMヒスチジン、７．５％(w/v)スクロース、および０．０１％ポリソルベート８０をｐＨ６．０で含む、請求項８記載の薬学的製剤。
10. 関節リウマチの処置を必要とするヒトにポリペプチド８０mgを約４週間毎に投与することによる、該ヒトおける該処置に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む薬学的製剤であって、該ヒトがメトトレキサートで同時処置される、薬学的製剤。
11. 関節リウマチの処置を必要とするヒトにポリペプチド８０mgを約８週間毎に投与することによる、該ヒトおける該処置に使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む薬学的製剤であって、該ヒトがメトトレキサートで同時処置される、薬学的製剤。

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