JP2021119788A - 多重特異的結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】医薬組成物及びキットに用いられる、多重特異的結合タンパク質を提供する。【解決手段】ａ）第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及びｂ）第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖を含むタンパク質であって、前記の第一の重鎖及び第二の重鎖の特定の位置のアミノ酸が特定のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、該タンパク質である。【選択図】なし

Description

発明の技術分野
本発明は、一般的に、多重特異的結合タンパク質に関する。本発明はまた、このようなタンパク質の作製法、及びこのようなタンパク質の使用法に関する。このようなタンパク質を含む医薬組成物及びキットも開示されている。

発明の背景
単独療法としてのモノクローナル抗体は、癌及び免疫学的疾患をはじめとする様々な疾患の処置において使用されかなりの成功を収めてきた。それらの標的に対するそれらの特異的結合能により医学の発展がもたらされた。しかしながら、いくつかの療法においては、１つを超える標的の調節が有益である場合があり、そして１つを超えるタンパク質に又は標的タンパク質上の様々なエピトープに結合する生物学的分子が、モノクローナル抗体と比較してさらなる利点を与える場合がある。

１つを超える標的に結合する生物学的構造についての多くの設計が提案されてきたが、多重特異的な生物学的分子の開発は難題であり得る。二重特異的分子を作製する最も一般的な方法は、ポリペプチドリンカーによる抗体断片の遺伝子的融合である。ＩｇＧが対称性であることから、二重特異的抗体ドメイン融合物は二価の性質である。しかしながら、特定の場合においては、二価であることにより、望ましくないアゴニスト活性がもたらされる。ロイシンジッパーなどの多量体化ドメインは、２つの結合特異性を単一の分子へとするために使用されてきた。リンカーは二重特異的分子の工学操作において利点を有するが、それらはまた、治療状況において問題を引き起こす場合がある。実際に、これらの外来ペプチドは、リンカー自体又はタンパク質とリンカーの間の接合部に対する免疫応答を誘発する可能性がある。このような構造はまた、インビボでの低下した安定性を有し得、及び／又は発現するのが困難な場合があり、これにより同質性に欠けるか又は部分的アミノ酸鎖が生成される可能性がある。

２本の異なる重鎖のヘテロ二量体を作製するために他の戦略が設計されている。しかしながら、これらの戦略は、それぞれの重鎖のかなりの量の望ましくないホモ二量体の形成によって、及び軽鎖の誤対合形成によって妨害される。多重特異的構造についてのさらなる困難はまた、機能の低下、例えば標的に対する親和性の低下である。

したがって、要約すると、二重特異的な生物学的分子の設計及び開発は多くの難題が課されており、そして適切な薬理学的特性を有しかつ効果的に製造され得る多重特異的結合タンパク質の必要性がある。したがって、本発明の１つの目的は、好ましい生物物理学的及び／又は薬理学的特性を有する、多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、高いレベルの同質性及び／又は完全性で産生され得る多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、例えば哺乳動物細胞において効果的に産生され得る多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、その結合部分の機能性を維持する多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、結合部分の選択において柔軟性を可能とする多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、望ましくない免疫応答を回避する多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、安定性などの好ましい開発可能な特性を有する多重特異的結合タンパク質を提供することである。

本発明のさらなる目的は、上記に示された目的のいずれかの組合せを含む。

発明の要約
本発明は上記の需要に取り組み、そして２つの異なるエピトープに対して特異的である少なくとも２つの結合単位を含むタンパク質を提供する。１つの態様では、本発明は、第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖を含む。１つの態様では、第一の重鎖及び前記の第二の重鎖は各々、一方の重鎖のホモ二量体の形成を減少させる１つ以上のアミノ酸変化を含む。１つの態様では、このようなアミノ酸変化は、第一の重鎖の３６６位のチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ、ＥＵ番号付け（Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85）］及び第二の重鎖の４０７位のトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ、ＥＵ番号付け］である。１つの態様では、このようなアミノ酸変化は、第一の重鎖の３６６位のトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、及び第二の重鎖の３６６位のセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位のアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位のバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］である。１つの態様では、重鎖は、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する重鎖である。１つの態様では、第一の重鎖は、３６６位のトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］に加えて３５４位のシステイン（Ｃ）［Ｓ３５４Ｃ］を含み、そして第二の重鎖は、３６６位のセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位のアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位のバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］に加えて３４９位のシステイン（Ｃ）［Ｙ３４９Ｃ］を含む。１つの態様では、重鎖は、ＩｇＧ_４の重鎖に由来する重鎖である。２本の重鎖へのこれらのアミノ酸変化の包含は、２本の重鎖のヘテロ二量体化を促進し、そしてホモ二量体の形成を最小限とする。これらのアミノ酸変化はまた、インシリコでの評価に基づいた低い免疫原性を有する（De Groot et al. Trends Immunol. 2007 Nov;28(11):482）。

１つの態様では、本発明のタンパク質における第一の重鎖又は第二の重鎖はさらに、ブドウ球菌プロテインＡへの重鎖の結合を減少させる１つ以上のアミノ酸変化を含む。１つの態様では、このようなアミノ酸変化は、一方の重鎖の４３５位のアルギニン［Ｈ４３５Ｒ、ＥＵ番号付け］及び４３６位のフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ、ＥＵ番号付け］である。これらの２つの突然変異はＣＨ３ドメインに位置し、そしてプロテインＡへの結合を減少させるために一方の重鎖に取り込まれる。これらの２つの変化は重鎖のホモ二量体及びタンパク質精製中の他の不純物の除去を促進する。１つの態様では、本発明のタンパク質において、４３５位のアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位のフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］が重鎖に含まれ、この重鎖はまた４０７位にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］も含む。１つの態様では、本発明のタンパク質において、４３５位のアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位のフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］が重鎖に含まれ、この重鎖はまた、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］も含む。

さらなる態様では、第一及び第二の重鎖は、本発明のタンパク質において１つ以上のジスルフィド橋を通してヘテロ二量体を形成する。

さらなる態様では、本発明のタンパク質において、結合単位の１つにおける重鎖及び軽鎖はリンカーを通して共有結合している。１つの態様では、２つの結合単位における重鎖及び軽鎖はそれぞれリンカーを通して共有結合している。これが、タンパク質の発現及び精製中の軽鎖の誤対合形成を防ぎ、そして結合単位の機能性及び／又は結合親和性を損なくことなく、本発明のタンパク質における様々な軽鎖の使用を可能とする。

１つの態様では、本発明のタンパク質に使用されるリンカーは、２６〜４２アミノ酸、例えば３０〜４０アミノ酸を含む。さらなる態様では、本発明のタンパク質に使用されるリンカーは、３４〜４０アミノ酸、例えば３６〜３９アミノ酸、例えば３８アミノ酸を含む。

したがって、１つの態様では、本発明は、第一のアミノ酸鎖及び第二のアミノ酸鎖を含み、第一の鎖は、リンカー（それ自体が第一の重鎖と共有結合している）に共有結合した第一の軽鎖を含み、そして第二の鎖は、リンカー（それ自体が第二の重鎖と共有結合している）に共有結合した第二の軽鎖を含むタンパク質を提供する。

１つの態様では、第一の鎖は、そのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。１つの態様では、第二の鎖は、そのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。１つの態様では、第一及び第二の鎖の両方が、それらのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。

得られたタンパク質は完全なＦｃを有し、これはＩｇＧより僅かに大きく、そして２つの独立した結合部位を有し、例えばそれぞれ１つの標的タンパク質に対するもの又は標的タンパク質上のエピトープに対するものである。この形式は、発現及び精製後の異質性を大きく減少させ、そして結合部分の機能的特性を維持する。これはまた、例えば哺乳動物細胞内で良好に発現する、同種タンパク質の発現を可能とする。本発明のタンパク質は許容可能な免疫原性プロファイルを有し、そしてインビトロ及びインビボで満足できる安定性を有する。

本発明はさらに、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列及びＤＮＡ分子を開示する。本発明はさらに、このような核酸配列及びＤＮＡ分子を含むベクター、例えば発現ベクター、及びこのようなベクターを含む細胞を開示する。本発明はさらに、本発明のタンパク質の産生法、及びこのようなタンパク質の使用法、例えば治療法を開示する。

本発明のタンパク質は、例えば本明細書に記載のような疾患又は障害を治療又は予防する方法に有用である。治療又は予防される疾患又は障害は、結合単位の特異性、すなわち本発明のタンパク質における結合単位によって認識される標的タンパク質（群）に依存するだろう。したがって、本発明はまた、本発明のタンパク質を患者に投与する工程を含む、疾患又は障害の処置法を提供する。本発明はまた、例えば哺乳動物、特にヒトにおける疾患又は障害を治療又は予防するための、医薬に使用するための本発明のタンパク質を提供する。

したがって、１つの実施態様では、本発明は、
ａ）第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
ｂ）第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
を含み、
第一の重鎖は３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第二の重鎖は４０７位にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、そして第一又は第二の重鎖はさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含むタンパク質を提供する。

１つの実施態様では、本発明は、
ａ）第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
ｂ）第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
を含み、
前記の第一の重鎖は３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記の第二の重鎖は３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、そして前記の第一又は前記の第二の重鎖はさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含むタンパク質を提供する。

１つの実施態様では、重鎖は、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する。１つの実施態様では、重鎖はＩｇＧ_１の重鎖に由来する。１つの実施態様では、重鎖はＩｇＧ_４の重鎖に由来する。

１つの実施態様では、第二の重鎖はさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む。

１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖はさらにＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む。

１つの実施態様では、第一の重鎖は配列番号１、４、３６又は３７のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第二の重鎖は配列番号３、５、３８又は３９のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第一の重鎖は配列番号１又は４のアミノ酸配列を含み、そして第二の重鎖は配列番号３又は５のアミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、第一の重鎖は配列番号３６のアミノ酸配列を含み、及び／又は第二の重鎖は配列番号３８のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第一の重鎖は配列番号３７のアミノ酸配列を含み、及び／又は第二の重鎖は配列番号３９のアミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖は各々さらに重鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、第一又は第二の軽鎖は配列番号２又は３５のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第一の軽鎖及び第二の軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第一の軽鎖及び第二の軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列を含む。１つの実施態様では、第一及び第二の軽鎖は各々さらに軽鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、配列番号２のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、配列番号３のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖は各々さらに重鎖可変領域を含み、そして第一及び第二の軽鎖は各々さらに軽鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、本発明のタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、配列番号２のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖は各々さらに重鎖可変領域を含み、そして第一及び第二の軽鎖は各々さらに軽鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、本発明のタンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、配列番号２のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、配列番号３８のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖は各々さらに重鎖可変領域を含み、そして第一及び第二の軽鎖は各々さらに軽鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、本発明のタンパク質は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、配列番号２のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。１つの実施態様では、第一及び第二の重鎖は各々さらに重鎖可変領域を含み、そして第一及び第二の軽鎖は各々さらに軽鎖可変領域を含む。

１つの実施態様では、第一及び／又は第二の軽鎖は、配列番号２のアミノ酸配列の代わりに、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、第一の重鎖及び第一の軽鎖は、第一のリンカーを通して共有結合している。１つの実施態様では、第二の重鎖及び第二の軽鎖は第二のリンカーを通して共有結合している。１つの実施態様では、第一の重鎖及び第一の軽鎖は第一のリンカーを通して共有結合し、そして第二の重鎖及び第二の軽鎖は第二のリンカーを通して共有結合している。

１つの実施態様では、第一及び／又は第二のリンカーは２６〜４２アミノ酸を含む。１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーは３０〜４０アミノ酸を含む。１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーは３４〜４０アミノ酸を含む。１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーは３６〜３９アミノ酸を含む。１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーは３８アミノ酸を含む。

１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーはグリシン及びセリンアミノ酸を含む。１つの実施態様では、第一及び／又は前記の第二のリンカーは配列番号６から配列番号１４又は配列番号４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、第一及び前記の第二のリンカーは同じ長さを有する。１つの実施態様では、第一のリンカー及び前記の第二のリンカーは同一である。１つの実施態様では、第一及び前記の第二のリンカーは配列番号６から配列番号１４又は配列番号４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、第一のリンカーは第一の重鎖のＮ末端に及び第一の軽鎖のＣ末端に共有結合し、そして第二のリンカーは第二の重鎖のＮ末端に及び第二の軽鎖のＣ末端に共有結合している。

１つの実施態様では、第一及び第二のエピトープは同じ標的タンパク質上にある。１つの実施態様では、第一及び第二のエピトープは異なる標的タンパク質上にある。

１つの実施態様では、本発明のタンパク質はさらに、第三のエピトープに対して特異的な第三の結合単位を含む。１つの実施態様では、第三の結合単位は第一又は第二の重鎖のＣ末端に共有結合している。１つの実施態様では、第三の結合単位は第一又は第二の軽鎖のＮ末端に共有結合している。１つの実施態様では、本発明のタンパク質はさらに、第四のエピトープに対して特異的な第四の結合単位を含む。１つの実施態様では、第四の結合単位は第一又は第二の重鎖のＣ末端に共有結合している。１つの実施態様では、第四の結合単位は第一又は第二の軽鎖のＮ末端に共有結合している。１つの実施態様では、第三及び／又は第四の結合単位はｓｃＦｖである。

１つの実施態様では、本発明はさらに、上記のようなタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

１つの実施態様では、本発明はさらに、上記のような軽鎖又は重鎖をコードしている配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

１つの実施態様では、本発明はさらに、上記のようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

１つの実施態様では、本発明はさらに、上記のような１つ以上の単離されたポリヌクレオチド（群）又は上記のような１つ以上のベクター（群）を含む宿主細胞を提供する。

１つの実施態様では、本発明はさらに、上記のような宿主細胞を得る工程、及び該宿主細胞を培養する工程を含む、タンパク質の産生法を提供する。１つの実施態様では、該方法はさらに、該タンパク質を回収及び精製する工程を含む。

代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体の図解。図１に示された二重特異的抗体は、第一の重鎖の３６６位のチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］への及び第二の重鎖の４０７位のトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］へのアミノ酸変化を含む。本発明の代替的な二重特異的抗体は、第一の重鎖の３６６位のトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］への及び第二の重鎖の３６６位のセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位のアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び４０７位のバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］へのアミノ酸変化を含む。 分析超遠心分離によるオリゴマー化状態の評価。それぞれ配列番号２３／２４及び配列番号２５／２６の重鎖及び軽鎖の対と、両方の鎖に配列番号７のリンカーとを含む、図１に示されているような代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体は２工程の精製後に９９％超の単量体であることが判明した。５．６４〜６．７８Ｓでのピークは単量体を示す。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：それぞれ配列番号２３／２４及び配列番号２７／２８の重鎖及び軽鎖の対と、両方の鎖に配列番号７のリンカーとを含む、図１に示されているような代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（４〜１２％の勾配のゲル）によって評価された。推定されるインタクトな二重特異的抗体の分子量は約１５０ｋＤａであるが、還元条件下の同じ試料（ＤＴＴ ５０mM）は、ヒンジ領域のジスルフィド結合の減少により約７５ｋＤａである。僅かな分子量の差のために（Ａ鎖：７４，２８５Ｄａ及びＢ鎖：７４，４３０Ｄａ）、２本の鎖はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて識別できない（還元条件下）。 それぞれ配列番号２７／２８及び配列番号２９／３０の重鎖及び軽鎖の対と、両方の鎖に配列番号７のリンカーとを含む、図１に示されているような代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体のオリゴマー化状態は、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ランニング緩衝液５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２００mMアルギニン、０．０５％アジ化ナトリウム、ＴＳＫ３０００）によって評価された。２工程の精製の試料は高度に同質であった（９９％を超える単量体）。 図５Ａ及び５Ｂ：ＳＰＲ結合アッセイは、それぞれ配列番号２３／２４及び配列番号２７／２８の重鎖及び軽鎖の対と、両方の鎖に配列番号７のリンカーとを含む、図１に示されているような代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体が、標的抗原に対する結合親和性を保持していることを示す（ヒトＴＮＦα、図５Ａ）。対照として、親ＩｇＧ（アダリムマブ）の１つも、ヒトＴＮＦαへの結合について評価した。ＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体についての結合速度、解離速度、並びに平衡解離速度定数（Ｋ_Ｄ）値は、親ＩｇＧと同等である（図５Ｂ）。軽鎖と重鎖の間のリンカーの存在は、標的抗原との結合に干渉しないようである。 カニクイザルＰＫ試験を、雄ナイーブチャイニーズカニクイザルを使用して実施した。配列番号２３／２４及び配列番号２５／２６の重鎖と軽鎖の対を含む代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体、及びＹＴＥ突然変異を有する対応するＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体（それぞれ配列番号３１／２４及び配列番号３２／２６の重鎖と軽鎖の対、及び４本の鎖内の配列番号７のリンカーを含む）を、０．６mg/kg（静脈内ボーラス、１回量）で投与した。血清試料採取は、投薬から３週間後に実施された。 図７Ａ〜Ｂ：ＥＬＩＳＡに基づいた方法において試験されたＦｃドメイン上のＨ４３５Ｙ／Ｒ４３６Ｆ突然変異の非存在下又は存在下におけるプロテインＡへの結合。それぞれＹ４０７Ｔ突然変異も含む、アーム上にＨ４３５Ｙ／Ｒ４３６Ｆ突然変異を有する、配列番号２３／２４及び配列番号２５／２６の重鎖と軽鎖の対、及び両鎖に配列番号７のリンカーを含む代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体（ＡＢ）は、対照ＩｇＧ１と類似した結合プロファイルを示す。Ｆｃの一方のアーム上のＨ４３５Ｙ／Ｒ４３６Ｆ突然変異により、プロテインＡに対するホモ二量体変異体の１つ（ＡＡ）のより弱い結合がもたらされ、一方、Ｆｃの両方のアーム上のＨ４３５Ｙ／Ｒ４３６Ｆ突然変異により、プロテインＡに対するホモ二量体変異体（ＢＢ）の結合の有意な減少がもたらされた。 リンカーの長さ及び組成の試験。ＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体における軽鎖と重鎖を接続するポリペプチドリンカーを、長さ（２２アミノ酸から４２アミノ酸）及び組成を変更するように工学操作した。タンパク質の質は、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって評価された。

詳細な説明
本発明は、多重特異的結合タンパク質を提供する。本発明の多重特異的結合タンパク質は、標的タンパク質に対する結合単位が取り込まれた構造を提供する。例示的な本発明の多重特異的結合タンパク質の一般的構造を図１に示すが（この場合、例示的な二重特異的結合タンパク質）、多重特異的結合タンパク質もまた本発明に包含される。本発明の多重特異的結合タンパク質はまた本明細書において「ＺｗｅｉＭａｂ」、「ＺｗｅｉＭａｂ抗体」又は「抗体」と称される。ＺｗｅｉＭａｂのいくつかの実施態様は二重特異的であり、そして本明細書においていくつかの場合には「ＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体」又は「二重特異的抗体」と称される。ＺｗｅｉＭａｂのいくつかの実施態様は多重特異的であり、そして本明細書においていくつかの場合には「ＺｗｅｉＭａｂ多重特異的抗体」又は「多重特異的抗体」と称される。

一般的に、本発明の多重特異的結合タンパク質は、２つの異なるエピトープに対して特異的である少なくとも２つの結合単位を含む。別の態様では、本発明のタンパク質内の結合特異性の数は、タンパク質へのさらに他の結合単位の添加によって増加し、したがって、例えば本明細書に記載のように、三重特異的結合タンパク質又は四重特異的結合タンパク質がもたらされる。

１つの態様では、本発明のタンパク質は、第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖を含む。

一般的に、本発明に記載のタンパク質内の重鎖は、以下に記載されているようなアミノ酸変化を含む抗体の重鎖に由来する。このような重鎖は典型的には、アミノ末端において可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、次いで３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）、並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２との間のヒンジ領域を含む。一般的には、本発明に記載のタンパク質内の軽鎖は、抗体の軽鎖に由来する。このような軽鎖は典型的には、２つのドメイン、すなわちアミノ末端可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及びカルボキシ末端定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。一般的には、Ｖ_ＬドメインはＶ_Ｈドメインと非共有結合的に会合し、一方、Ｃ_Ｌドメインは一般的にジスルフィド結合を介してＣ_Ｈ１ドメインに共有結合している。一般的に、第一の重鎖と第二の重鎖は、本発明のタンパク質内で１つ以上のジスルフィド橋を通してヘテロ二量体を形成している。本発明の文脈において、重鎖は例えば、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する。例えば、本発明の重鎖は、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖であり、そして可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、次いで３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）、並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２との間のヒンジ領域を含む。定常領域及び重鎖の例は配列番号１、３〜５、及び３６〜３９に示されている。本発明の文脈において、軽鎖は、例えば、カッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖である。１つの態様では、このような軽鎖は２つのドメイン、すなわちアミノ末端可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及びカルボキシ末端定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。κ軽鎖の定常領域の例は配列番号２に示されている。λ軽鎖の定常領域の例は配列番号３５に示されている。

本発明のタンパク質のアミノ酸鎖内のアミノ酸の番号付けは本明細書において、特記しない限り、ＥＵ番号付け体系に従う（Edelman, Cunningham et al. 1969）。このことは、本明細書に示されたアミノ酸の番号は、特記しない限り、ＥＵ番号付け体系に従って、対応するサブタイプ（例えばＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４）の重鎖内の位置に対応することを意味する。

１つの態様では、本発明のタンパク質における第一の重鎖及び前記の第二の重鎖は各々、重鎖のホモ二量体の形成を減少させる１つ以上のアミノ酸変化を含む。これらの変化を通して、一方の重鎖の界面に由来する１つ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換することによって、一方の重鎖内に「突出」が生じる。より大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置換することによって、他方の重鎖の界面上に同一又は類似のサイズの補完的な「空洞」が作られる。このことが、ホモ二量体、特に「突出」を有する重鎖のホモ二量体などの他の所望ではない最終産物よりヘテロ二量体の収率を向上させる機序を提供する（例えば、Ridgway et al. Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21参照）。１つの態様では、このようなアミノ酸変化は第一の重鎖の３６６位のチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］及び第二の重鎖の４０７位のトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］である。代替的な態様では、第一の重鎖は、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］を含み、そして第二の重鎖は３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。代替的な態様では、第一の重鎖は３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、そして第二の重鎖は３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。１つの態様では、このような重鎖はＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する重鎖である。

１つの態様では、第一の重鎖は、３６６位のトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］に加えて３５４位にシステイン（Ｃ）［Ｓ３５４Ｃ］を含み、そして第二の重鎖は、３６６位のセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位のアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び４０７位のバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］に加えて３４９位にシステイン（Ｃ）［Ｙ３４９Ｃ］を含む。１つの態様では、このような重鎖は、ＩｇＧ_４の重鎖に由来する重鎖である。

上記のアミノ酸変化、例えば重鎖の３６６位のアミノ酸変化［Ｔ３６６Ｙ］及び第二の重鎖の４０７位のアミノ酸変化［Ｙ４０７Ｔ］は、低い免疫原性という追加の利点を有する。

さらなる態様では、本発明のタンパク質における第一の重鎖又は第二の重鎖はさらに、プロテインＡに対する重鎖の結合を減少させる１つ以上のアミノ酸変化を含む。１つの態様では、このようなアミノ酸変化は、一方の重鎖の４３５位のアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位のフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］である。両方の変化が、ヒトＩｇＧ３の配列に由来する（ＩｇＧはプロテインＡには結合しない）。これらの２つの突然変異はＣＨ３ドメインに位置し、そしてプロテインＡに対する結合を減少させるために一方の重鎖に取り込まれる（例えば、Jendeberg et al. J Immunol Methods, 1997. 201(1): p. 25-34参照）。これらの２つの変化は、タンパク質精製中のこれらの変化を含む重鎖のホモ二量体の除去を促進する（例えば図７Ａ〜Ｂを参照）。

１つの態様では、本発明のタンパク質において４０７位にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含む重鎖はさらに、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む。この場合、他方の重鎖は、３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含むが、４３５位及び４３６位に２つの変化を含まない。これは例えば図１に示される。あるいは、１つの態様では、本発明のタンパク質において、３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］ 及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む重鎖はさらに、４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む。この場合、他方の重鎖は、３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含むが、４３５位及び４３６位に２つの変化を含まない。したがって、上記のような「空洞」を生じるアミノ酸変化を含む重鎖はまた、プロテインＡへの結合を減少させるアミノ酸変化を含む。この重鎖を含むホモ二量体は、プロテインＡへの減少した結合を通して除去される。「突出」を含む、他方の重鎖のホモ二量体の生成は、「突出」の存在によって減少する。

さらなる態様では、本発明のタンパク質において、結合単位の１つにおける重鎖及び軽鎖は、リンカーを通して共有結合している。さらなる態様では、２つの結合単位における重鎖及び軽鎖は、それぞれ、リンカーを通して共有結合している。これは、タンパク質の発現及び精製中の軽鎖の誤対合形成を防ぎ、そして結合単位の機能性及び／又は結合親和性を損なうことなく、本発明のタンパク質における様々な軽鎖の使用を可能とする。

１つの態様では、第一のリンカーは、第一の重鎖のＮ末端に及び第一の軽鎖のＣ末端に共有結合し、そして第二のリンカーは、第二の重鎖のＮ末端に及び第二の軽鎖のＣ末端に共有結合している。１つの態様では、本発明のタンパク質において使用されるリンカーは、２６〜４２アミノ酸、例えば３０〜４０アミノ酸を含む。さらなる態様では、本発明のタンパク質において使用されるリンカーは、３４〜４０アミノ酸、例えば３６〜３９アミノ酸、例えば３８アミノ酸を含む。１つの態様では、第一及び前記の第二のリンカーは同じ長さを有する。１つの態様では、第一及び前記の第二のリンカーは異なる長さを有する。１つの態様では、第一及び前記の第二のリンカーは同一である。１つの態様では、第一及び前記の第二のリンカーは異なる配列組成を有する。本発明のタンパク質に使用されるリンカーの代表例は、本明細書の表２及び図８に示されている。

さらなる態様では、本発明のタンパク質のＦｃドメインはさらに、ＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、ＥＵ番号付け（Dall'Acqua, Kiener et al. 2006））を含んでいても含んでいなくてもよい。これらの突然変異は、ｐＨ６．０における新生児期ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性の選択的増強を通してＦｃドメインの薬物動態特性を向上させることが示された。

さらなる態様では、ＩｇＧ１に由来する本発明の重鎖はまた、「ＫＯ」突然変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を含む。さらなる態様では、ＩｇＧ４に由来する本発明の重鎖はまた、Ｐｒｏヒンジ突然変異（Ｓ２２８Ｐ）も含む。

したがって、１つの態様では、本発明は、第一のアミノ酸鎖及び第二のアミノ酸鎖を含み、第一の鎖は、リンカー（それ自体が第一の重鎖と共有結合している）に共有結合した第一の軽鎖を含み、そして第二の鎖は、リンカー（それ自体が第二の重鎖と共有結合している）に共有結合した第二の軽鎖を含むタンパク質を提供する。

１つの態様では、第一の鎖は、そのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。１つの態様では、第二の鎖は、そのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。１つの態様では、第一の鎖及び第二の鎖は両方共に、それらのＮ末端から始まって、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、リンカー、重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含む。

得られたタンパク質は完全なＦｃを有し、これはＩｇＧより僅かに大きく、そして２つの独立した結合部位を有し、それぞれ１つの標的タンパク質に対するもの又は標的タンパク質上のエピトープに対するものである。この形式は、発現及び精製後の異質性を大きく減少させ、そして結合部分の機能的特性を維持する。これはまた、例えば哺乳動物細胞内で良好に発現する、同種タンパク質の発現を可能とする。本発明のタンパク質は許容可能な免疫原性プロファイルを有し、そしてインビトロ及びインビボで満足できる安定性を有する。

本発明の多重特異的結合タンパク質は、２つ異なるエピトープに対して特異的である少なくとも２つの結合単位を含む。１つの態様では、２つのエピトープは、２つの異なる標的タンパク質のエピトープである。別の態様では、２つのエピトープは、同じ標的タンパク質のエピトープである。例えば、複合体内に存在する標的、あるいは捕捉及び／又はクラスター形成のための標的などの複数の標的タンパク質に対する結合は、結合タンパク質の治療特性を向上させ得る。あるいは、同じ標的タンパク質の１つを超えるエピトープへの結合は、標的タンパク質上のたった１つのエピトープにしか結合しない単一特異的タンパク質よりも大きな特異性を付与し得る。

エピトープは、最も一般的にはタンパク質、短いペプチド、又はその組合せである。ペプチド又はポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４から５アミノ酸であると考えられている。ペプチド又はポリペプチドエピトープは、例えば、少なくとも７アミノ酸又は例えば少なくとも９アミノ酸、又は例えば約１５〜約２０アミノ酸を含有している。結合単位はその３次元形の抗原性ペプチド又はポリペプチドを認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖上にさえない場合がある。エピトープは、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、水素／重水素交換質量分析（ＨＸＭＳ）、部位特異的突然変異誘発、アラニン走査型突然変異誘発、及びペプチドスクリーニング法などの当技術分野において公知である様々な技術によって決定され得る。

本発明に記載の結合単位によって認識される標的タンパク質の対は、同じ生化学的経路にあっても、又は異なる経路にあってもよい。

１つの態様では、本発明に記載の結合タンパク質の結合単位は、抗体に由来する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む。このような可変ドメインは、本明細書に記載のような最適化された可変ドメインであり得る。このような場合、各可変ドメインは、本明細書に記載のような３つのＣＤＲを含む。１つの態様では、本発明に記載の結合タンパク質又は該タンパク質の特定の部分は、一般的に、抗体に由来する。抗体又は免疫グロブリンの一般的構造は当業者には周知である。これらの分子は、２本の同一の軽鎖（Ｌ）と２本の同一の重鎖（Ｈ）から構成される典型的には約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、そして典型的には完全長抗体と称される。各軽鎖は、１本のジスルフィド結合によって重鎖に共有結合することによりヘテロ二量体を形成し、そしてヘテロ四量体分子は、ヘテロ二量体の２本の同一の重鎖の間のジスルフィド共有結合を通して形成されている。軽鎖及び重鎖は互いに１本のジスルフィド結合によって連結されているが、２本の重鎖間のジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）、次いで３つ又は４つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、及びＣ_Ｈ４）、並びにＣ_Ｈ１とＣ_Ｈ２の間のヒンジ領域を含む。各軽鎖は、２つのドメイン、すなわちアミノ末端可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）及びカルボキシ末端定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。Ｖ_ＬドメインはＶ_Ｈドメインと非共有結合的に会合し、一方、Ｃ_Ｌドメインは一般的にジスルフィド結合を介してＣ_Ｈ１ドメインに共有結合している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成していると考えられている（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663）。可変ドメインはまた本明細書において可変領域とも称される。

可変ドメイン内の特定のドメインが、様々な抗体間で異なり、すなわち「超可変的」である。これらの超可変ドメインは、その特異的な抗原決定基に対する各々の特定の抗体の結合及び特異性に直接関与している残基を含有している。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方における超可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として知られる３つのセグメントに集中している。ＣＤＲは、Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.の配列比較によって規定され、一方、ＨＶＬ（本明細書においてＣＤＲとも称される）は、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917に記載のような可変ドメインの３次元構造に従って構造的に規定される。これらの２つの方法では、ＣＤＲの同定は僅かに異なる。Kabatによって定義されているように、ＣＤＲ−Ｌ１は、軽鎖可変ドメイン内のおよそ２４〜３４残基に位置し、ＣＤＲ−Ｌ２はおよそ５０〜５６残基に位置し、ＣＤＲ−Ｌ３はおよそ８９〜９７残基に位置し；ＣＤＲ−Ｈ１は、重鎖可変ドメイン内のおよそ３１〜３５残基に位置し、ＣＤＲ−Ｈ２はおよそ５０〜６５残基に位置し、ＣＤＲ−Ｈ３はおよそ９５〜１０２残基に位置する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化するだろう。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。それ故、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、所与の抗体に特異的な独特かつ機能的な特性を規定する。

重鎖及び軽鎖の各々の中にある３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられ、このフレームワーク領域はより可変性が低い傾向がある配列を含有している。重鎖及び軽鎖の可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＦＲ及びＣＤＲは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順に整列している。ＦＲの主にβ−シートの立体配置により、各々の鎖内のＣＤＲが互いに及び他の鎖のＣＤＲと近接する。結果として生じたコンフォメーションは抗原結合部位に寄与するが（Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669を参照）、全てのＣＤＲ残基が必ずしも抗原との結合に直接関与しているわけではない。

ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは、抗原との結合に直接関与していないが、抗原との結合に寄与する、及び／又は、抗体エフェクター機能を媒介する。いくつかのＦＲ残基は少なくとも３つの方法で抗原との結合に対して有意な効果を及ぼすと考えられている：エピトープに非共有結合的に直接結合することによって、１つ以上のＣＤＲ残基と相互作用することによって、及び重鎖と軽鎖との間の界面に影響を及ぼすことによって。定常ドメインは、抗原との結合に直接関与していないが、様々なＩｇエフェクター機能を媒介し、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）における抗体の関与を媒介する。

脊椎動物の免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）という２つの明確に異なるクラスの中の１つに割り当てられる。これに対して、哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って、５つの主要なクラスの中の１つに割り当てられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。ＩｇＧ及びＩｇＡはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分類される、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ、及びμとそれぞれ呼ばれる。天然免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び３次元立体配置は周知である。

いくつかの実施態様では、本発明の結合タンパク質は、エフェクター機能を媒介する定常領域を含む。定常領域は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）応答を提供し得る。エフェクタードメイン（群）は、例えば、Ｉｇ分子のＦｃ領域であり得る。

抗体のエフェクタードメインは、任意の適切な脊椎動物種及びアイソタイプに由来し得る。異なる動物種に由来するアイソタイプは、エフェクター機能の媒介能が異なる。例えば、ヒト免疫グロブリンのＣＤＣ及びＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ媒介能は、一般的に、それぞれＩｇＭ＝ＩｇＧ_１＝ＩｇＧ_３＞ＩｇＧ_２＜ＩｇＧ_４及びＩｇＧ_１＝ＩｇＧ_３＞ＩｇＧ_２／ＩｇＭ／ＩｇＧ_４の順である。マウス免疫グロブリンは一般的にＣＤＣ及びＡＤＣＣ／ＡＤＣＰをそれぞれマウスＩｇＭ＝ＩｇＧ_３＞＞ＩｇＧ_２ｂ＞ＩｇＧ_２ａ＞＞ＩｇＧ_１及びＩｇＧ_２ｂ＞ＩｇＧ_２ａ＞ＩｇＧ_１＞＞ＩｇＧ_３の順で媒介する。別の例では、マウスＩｇＧ_２ａはＡＤＣＣを媒介するが、マウスＩｇＧ_２ａ及びＩｇＭは両方共にＣＤＣを媒介する。

「抗体」という用語は、１つ以上の所望の生物学的活性／活性群を示すモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及び抗体断片、例えば抗体の可変ドメイン及び他の部分を包含する。

「単量体」という用語は、均質な形態の抗体を指す。例えば、完全長の抗体では、単量体は、２本の同一な重鎖と２本の同一な軽鎖とを有する単量体の抗体を意味する。本発明の文脈では、単量体は、本明細書に記載のような２本の重鎖と２本の軽鎖を有する本発明のタンパク質を意味する。

「抗体断片」という用語は、可変領域又は機能的能力が保持されている完全長抗体の一部を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ−Ｆｃ断片が挙げられるがこれらに限定されない。

完全長の抗体を、パパイン又はペプシンなどの酵素で処理することにより、有用な抗体断片を作製することができる。パパインによる消化を使用することにより、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合性の抗体断片（各々は１つの抗原結合部位を有する）と残りの「Ｆｃ」断片を生成する。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣ_Ｈ１ドメインも含有している。ペプシンによる処理により、２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）_２断片が生じ、これは依然として抗原と架橋することができる。

Ｆａｂ’断片は、Ｃ_Ｈ１ドメインのＣ末端における抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、追加の残基の存在によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、ヒンジ領域内のシステイン残基によって連結されたＦａｂ’断片の対である。抗体断片の他の化学的結合も公知である。

「Ｆｖ」断片は、緊密に非共有結合的に会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる、完全な抗原認識結合部位を含有している。この立体配置では、各々の可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用して、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。要するに、６つのＣＤＲが、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。

「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとを含む一本鎖Ｆｖ変異体であり、ここでのドメインは、１本のポリペプチド鎖内に存在している。一本鎖Ｆｖは、抗原を認識し結合することができる。ｓｃＦｖポリペプチドはまた場合により、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に位置するポリペプチドリンカーを含有していてもよく、これによりｓｃＦｖと抗原との結合のために望ましい３次元構造の形成が促進される（例えば、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照）。

「最適化された抗体」又は「最適化された抗体断片」は、予め決定された抗原に結合することができ、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＦＲと非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンアミノ酸配列変異体、又はその断片を含む、特殊なタイプのキメラ抗体である。「インポート」配列と称されることの多いこの非ヒトアミノ酸配列は典型的には「インポート」抗体ドメイン、特に可変ドメインから採用される。一般的に、最適化抗体は、ヒト重鎖又は軽鎖の可変ドメインのＦＲ間に挿入された、非ヒト抗体の又は非ヒト抗体に由来する少なくともＣＤＲ又はＨＶＬを含む。特定のマウスＦＲ残基が、最適化された抗体の機能にとって重要であり得、それ故、特定のヒト生殖系列配列の重鎖及び軽鎖可変ドメイン残基は、対応するマウス配列の残基と同じになるように改変されることが理解されるだろう。このプロセス中に、望ましくないアミノ酸もまた、例えば脱アミド化、望ましくない荷電若しくは親油性、又は非特異的結合を回避するために、除去又は変更され得る。「最適化された抗体」、「最適化された抗体断片」又は「最適化された」は時に、「ヒト化抗体」、「ヒト化抗体断片」、若しくは「ヒト化」、又は「配列の最適化された」と称され得る。

重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の界面（「Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈ界面」）に影響を及ぼす免疫グロブリン残基は、２つの鎖の互いの近接性又は配向に影響を及ぼす残基である。鎖間相互作用に関与する可能性のある特定の残基としては、Ｖ_Ｌ残基３４、３６、３８、４４、４６、８７、８９、９１、９６及び９８、並びにＶ_Ｈ残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００、及び１０３が挙げられる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)に示される番号付けシステムを利用）。米国特許第６，４０７，２１３号はまた、Ｖ_Ｌ残基４３及び８５、並びにＶ_Ｈ残基４３及び６０などの残基も、この相互作用に関与している可能性があると考察している。これらの残基は、ヒトＩｇＧについてのみ示されているが、それらは種間で適用可能である。鎖間相互作用に関与することが合理的に考えて予想される重要な抗体残基が、共通配列の置換のために選択される。

「共通配列」及び「共通抗体」という用語は、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造の全ての免疫グロブリン、例えばヒト免疫グロブリン可変ドメインにおける各々の位置において最も高い頻度で存在するアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列を指す。共通配列は、特定の種の又は多くの種の免疫グロブリンに基づき得る。「共通」配列、構造、又は抗体は、特定の実施態様に記載されているような共通ヒト配列を包含すると理解され、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造の全てのヒト免疫グロブリンにおける各々の位置において最も高い頻度で存在するアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列を指す。したがって、共通配列は、１つ以上の公知の免疫グロブリンに存在するアミノ酸を各々の位置において有するアミノ酸配列を含有するが、任意の単一の免疫グロブリンの完全アミノ酸配列を正確に複製していなくてもよい。可変領域の共通配列は、どの天然に生成された抗体又は免疫グロブリン（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）及びその変異体からも得られない。重鎖及び軽鎖の共通配列のＦＲ、及びその変異体は、抗体の調製のための有用な配列を提供する。例えば、米国特許第６，０３７，４５４号及び第６，０５４，２９７号を参照されたい。

ヒト生殖系列配列は、ヒト個体群に天然に見られる。そうした生殖系列遺伝子の組合せは、抗体の多様性を生じる。抗体の軽鎖についての生殖系列抗体配列は、保存されたヒト生殖系列κ又はλｖ−遺伝子及びｊ−遺伝子に由来する。同様に、重鎖配列は、生殖系列ｖ−、ｄ−及びｊ−遺伝子に由来する（LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001）。

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されたものである。抗体の天然環境の混入成分は、抗体の診断用途又は治療用途に干渉する可能性のある材料であり、これは酵素、ホルモン、又は他のタンパク質性若しくは非タンパク質性溶質であり得る。１つの態様では、該抗体は、抗体の重量に対して少なくとも９５％超まで単離されて精製されるだろう。

単離された抗体としては、それが産生された組換え細胞内のインサイチュでの抗体が挙げられる。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分さえ存在しないであろうからである。しかしながら、通常、単離された抗体は、組換え細胞性材料が除去されるような少なくとも１回の精製工程によって調製されるだろう。

「抗体の性能」という用語は、抗体による抗原の認識又は抗体のインビボでの効力に寄与する因子を指す。抗体のアミノ酸配列の変化は、折り畳みなどの抗体の特性に影響を及ぼし得、抗原に抗体が結合する初期速度（ｋ_ａ）、抗原からの抗体の解離定数（ｋ_ｄ）、抗原に対する抗体の親和性定数（Ｋ_ｄ）、非特異的結合、抗体のコンフォメーション、タンパク質の安定性、及び抗体の半減期などの、物理的因子に影響を及ぼし得る。

本明細書において使用する「エピトープでタグ化された」という用語は、「エピトープタグ」に融合させた抗体を指す。「エピトープタグ」は、抗体産生のためのエピトープを提供するに十分な数のアミノ酸を有するポリペプチドであるが、それが、抗体の所望の活性に干渉しないように設計されている。エピトープタグは通常、十分に独特であるので、エピトープタグに対して生じた抗体は、実質的に他のエピトープと交差反応しない。適切なタグポリペプチドは一般的に、少なくとも６個のアミノ酸残基を含有し、通常、約８〜５０個のアミノ酸残基、又は約９〜３０個の残基を含有している。エピトープタグ及び該エピトープに結合する抗体の例としては、ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体である１２ＣＡ５（Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165）；ｃ−ｍｙｃタグ及びその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553）が挙げられる。特定の実施態様では、エピトープタグは、「サルベージ受容体に結合するエピトープ」である。本明細書において使用する「サルベージ受容体に結合するエピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清中半減期を延長させることに関与する、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４）のＦｃ領域のエピトープを指す。

いくつかの実施態様では、本発明の抗体を、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートさせ得る。これは、細胞の機能を阻害若しくは防止する及び／又は細胞の破壊を引き起こす任意の物質である。該用語は、放射性同位体（例えばＩ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、及びＲｅ^１８６）、化学療法剤、並びに毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、及びその断片を含むことを意図する。このような細胞傷害性薬剤を、標準的な手順を使用して本発明の抗体に結合させることができ、そして例えば、抗体を用いての療法に適応される患者を処置するために使用することができる。

「化学療法剤」は癌の処置に有用な化合物である。本発明の治療用抗体とコンジュゲートさせることのできる数多くの化学療法剤の例がある。

抗体はまた、プロドラッグにもコンジュゲートさせ得る。「プロドラッグ」は親薬物と比較して腫瘍細胞に対してあまり細胞傷害性ではない薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体形であり、そして酵素的に活性化され得るか又はより活性な形態に変換され得る。例えば、Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Pressを参照されたい。有用なプロドラッグとしては、より活性な細胞傷害性のない薬物へと変換され得る、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸の改変されたプロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、及び場合により置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されない。プロドラッグ形へと誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上記の化学療法剤が挙げられるがこれらに限定されない。

診断上並びに治療上のモニタリングのために、本発明の抗体をまた、標識に、すなわち標識のみに又は標識と追加の第二の薬剤（プロドラッグ、化学療法剤など）のいずれかにコンジュゲートさせてもよい。他の第二の薬剤から識別されるような標識は、検出可能な化合物又は組成物である物質を指し、それを、本発明の抗体に直接又は間接的にコンジュゲートさせ得る。標識はそれ自体検出可能であっても（例えば放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。標識された抗体を調製し、インビトロ及びインビボでの診断を含む様々な適用に使用することができる。

本発明の抗体は、インビボでのその送達に影響を及ぼすために、リポソーム調製物の一部として製剤化され得る。「リポソーム」は、様々なタイプの脂質、リン脂質、及び／又は界面活性剤から構成される小胞である。リポソームは、例えば場合により１つ以上の薬学的に活性な薬剤及び／又は標識と結合させるか又は組み合わせた、化合物又は製剤、例えば本明細書において開示された抗体の哺乳動物への送達に有用である。リポソームの成分は、生物膜の脂質の整列と同じように二重層形成で一般的に整列している。

本発明の特定の態様は、例えば本発明の抗体などの本発明の抗体の１つ以上のドメインをコードする単離された核酸に関する。「単離された」核酸分子は、天然源の抗体の核酸と通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然細胞に存在しているような核酸分子とは区別される。

本発明の様々な態様において、抗体の１つ以上のドメインは組換え形で発現されるだろう。このような組換え発現は、１つ以上の制御配列、すなわち、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要とされるポリヌクレオチド配列を使用し得る。原核細胞において使用するのに適した制御配列としては、例えば、プロモーター、オペレーター、及びリボソーム結合部位の配列が挙げられる。真核細胞の制御配列としては、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーが挙げられるがこれらに限定されない。これらの制御配列は、原核宿主細胞及び真核宿主細胞における抗体の発現及び産生のために使用され得る。

核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、核酸プレ配列又は分泌リーダーは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作動可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置しているならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的かつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、場合により近接している。連結は、好都合な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用していてもよい。

本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は同義語として使用され、全てのこのような名称はその子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、初代の対象細胞、及び継代数に関係なくそれから得られた培養物を含む。

処置の目的のための「哺乳動物」という用語は、ヒト、飼い慣らされた動物及び家畜、並びに動物園用、スポーツ用、又はペット用の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどをはじめとする哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

本明細書において使用する「障害」は、本明細書に記載された抗体を用いての処置から恩恵を受けるであろう任意の容態である。これは、慢性及び急性の障害又は疾患、例えば、問題となっている障害に哺乳動物を罹りやすくさせる病状を含む。本明細書において処置しようとする障害の非制限的な例としては、炎症障害、血管新生障害、自己免疫障害、及び免疫学的障害、呼吸器障害、中枢神経系の障害、眼障害、心血管障害、癌、血液悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、白血病、及びリンパ性腫瘍が挙げられる。

「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には未制御な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を指すか又はそれを説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられるがこれらに限定されない。

「静脈内注入」という用語は、約１５分間を超える時間をかけての、一般的には約３０〜９０分間かけての、動物又はヒト患者の静脈への薬剤の導入を指す。

「静脈内ボーラス」又は「静脈内プッシュ」という用語は、生体が約１５分間以内、一般的には５分間以内に薬物を受けるような、動物又はヒトの静脈への薬物の投与を指す。

「皮下投与」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚下への、好ましくは皮膚と下層組織との間のポケット内への、薬物貯蔵からの比較的緩徐で持続的な送達による、薬剤の導入を指す。皮膚をつまむか、又は皮膚を引き上げて下層組織から引き離すことにより、ポケットが作られ得る。

「皮下注入」という用語は、３０分以内、又は９０分以内を含むがそれに限定されない時間をかけての、動物又はヒト患者の皮膚下への、好ましくは皮膚と下層組織との間のポケット内への、薬物貯蔵からの比較的緩徐で持続的な送達による、薬物の導入を指す。場合により、注入は、動物又はヒト患者の皮膚下に埋め込まれた薬物送達ポンプの皮下埋め込みによって行なわれ得、ここでポンプは、予め決定された時間かけて、例えば３０分間、９０分間、又は処置計画の長さにおよぶ時間をかけて、予め決定された量の薬物を送達する。

「皮下ボーラス」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚下への薬物の投与を指し、ここでボーラス薬物送達は、約１５分以内であり；別の態様では、５分以内であり、さらに別の態様では、６０秒以内である。またさらなる別の態様では、投与は、皮膚と下層組織との間のポケット内であり、ここでポケットは、皮膚をつまむか又は皮膚を引き上げて下層組織から引き離すことによって作られ得る。

「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つ以上の症状を緩和又は寛解する活性物質の量を指すために使用される。別の態様では、治療有効量は、疾患の進行を緩徐化させる上で効果的であることが示された標的の血清中濃度を指す。効力は、処置しようとする容態に依存して、慣用的な方法で測定され得る。

本明細書において使用する「処置」及び「療法」などという用語は、１つ以上の症状の軽減又は緩和、疾患若しくは障害の後退、緩徐化、又は休止を含むがこれらに限定されない、あらゆる臨床的に望ましいか又は有益な効果をもたらす、疾患又は障害についての治療的措置並びに予防的又は抑制的措置を含むことを意味する。したがって、例えば、処置という用語は、疾患又は障害の症状の発症前又は発症後の薬剤の投与を含み、これにより、疾患又は障害の１つ以上の兆候が予防又は除去される。別の例として、この用語は、疾患の臨床徴候後に薬剤を投与することにより、疾患の症状と戦うことを含む。さらに、発症後及び臨床症状が発生した後の薬剤の投与は（ここで投与は、処置により疾患の寛解がもたらされるか否かに関係なく、疾患又は障害の臨床パラメーター、例えば組織損傷度、又は転移の量若しくは程度に影響を及ぼす）、本明細書において使用する「処置」又は「療法」を含む。さらに、単独での又は別の治療剤と組み合わせた本発明の組成物が、抗体組成物を使用しない場合の症状と比較して、処置される障害の少なくとも１つの症状を軽減又は寛解する限り、結果は、障害の全ての症状が軽減されるか否かに関係なく、根底にある障害の効果的な処置であると判断されるべきである。

「添付文書」という用語は、適応症、使用法、投与法、禁忌、及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告に関する情報を含有している、治療用製品の商業包装に慣例上含まれる説明書を指すために使用される。

本発明に記載の結合タンパク質の代表的な重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を表１に示す。本発明の結合タンパク質において、可変領域は、定常領域のＮ末端において定常領域に連結されている。本明細書に記載のようなＴ３６６Ｙ、Ｙ４０７Ｔ、Ｈ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ、及びＹＴＥ突然変異の残基は表１において太字で示されそして下線が付されている。Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの残基もまた表１において太字で示されそして下線が付されている。

配列番号１、３〜５、３６及び３８の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１に由来する。配列番号３６及び３８の重鎖はまた「ＫＯ」突然変異も含む（太字及び下線のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）。

配列番号３７及び３９の重鎖定常領域はＩｇＧ４に由来し、そしてＰｒｏヒンジ突然変異も含む（太字及び下線のＳ２２８Ｐ）。

配列番号２の軽鎖定常領域はκ鎖である。配列番号３５の軽鎖定常領域はλ鎖である（λ６サブタイプ）。

表２は、本発明の結合タンパク質に使用される代表的なリンカーを示す。

表３は、本発明の結合タンパク質に使用される代表的な軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を示す。

表４は、可変領域と定常領域の様々な組合せを有する本発明の結合タンパク質の代表的な軽鎖及び重鎖を示す。

表４はまた、本発明のタンパク質に含まれるアミノ酸鎖の代表例を示す。

配列番号４９〜５６において、下線の付されたアミノ酸配列は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり、そして太字のアミノ酸配列はリンカー配列である。重鎖における特定のアミノ酸は太字で示され、そして下線が付されている。

抗体の改変
抗体は改変を含み得る。例えば、癌の処置における抗体の効力を増強させるために、エフェクター機能に関して抗体を改変することが望ましい場合がある。１つのこのような改変は、Ｆｃ領域へのシステイン残基（群）の導入であり、これによりこの領域内での鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能及び／又は増加した補体媒介性細胞殺滅及び／又は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有し得る。例えば、Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; and Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565に記載のようなヘテロ二官能性架橋リンカーを使用して調製されてもよい。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を含有して、補体による溶解及び抗体のＡＤＣＣ能を増強させるように工学操作されてもよい。Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230を参照されたい。

ＡＤＣＣを支持する能力の向上した抗体は、それらのＦｃ領域のグリコシル化パターンを改変することによって作製された。これは、Ｃ_Ｈ２ドメイン内のアスパラギン残基Ｎ２９７での抗体のグリコシル化が、ＡＤＣＣに必要なＩｇＧとＦｃγ受容体の間の相互作用に関与しているために可能である。宿主細胞株は、改変されたグリコシル化、例えば増加した二分岐Ｎ−アセチルグルコサミン又は減少したフコースなどを有する抗体を発現するように工学操作されている。フコースの減少は、二分岐Ｎ−アセチルグルコサミンの存在を増加させるよりも、ＡＤＣＣ活性のより大きな増強を提供する。さらに、低フコース抗体によるＡＤＣＣの増強は、ＦｃγＲＩＩＩａＶ／Ｆ多形とは独立している。

抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列の改変は、ＡＤＣＣを増強させるためのグルコシル化工学操作の代替選択肢である。Ｆｃγ受容体に対するヒトＩｇＧ_１上の結合部位は、十分な突然変異分析によって決定された。これにより、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を増加させそしてインビトロでＡＤＣＣを増強させるＦｃ突然変異を有するＩｇＧ_１抗体が作製された。さらに、多くの様々に並べ替えられた結合特性を有する、例えば他のＦｃγＲ受容体への結合は未変化又は消失しているが特定のＦｃγＲ受容体への結合は改善された、Ｆｃ変異体が得られた。

別の態様は、細胞傷害性薬剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）にコンジュゲートさせた抗体又はその断片を含むイムノコンジュゲートを含む。

このようなイムノコンジュゲートの作製に有用な化学療法剤は、上記されている。有用なイムノコンジュゲートを形成するのに使用され得る酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン（crotin）、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセンなどが挙げられる。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲートした抗体の作製に利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、及び^１８６Ｒｅが挙げられる。

抗体と細胞傷害性薬剤又は化学療法剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチル塩酸塩）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス活性フッ化化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して公知の方法によって作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., 1987, Science 238:1098に記載のように調製され得る。Ｃ−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲートのための例示的なキレート剤である。コンジュゲートはまた、切断可能なリンカーを用いても形成され得る。

本明細書において開示された抗体はまたイムノリポソームとしても製剤化され得る。抗体を含有しているリポソームは、当技術分野において公知の方法、例えばEpstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載のような方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって作製され得る。リポソームは、規定の孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームを生成する。本明細書において開示された抗体のＦａｂ’断片を、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288に記載のようにリポソームにコンジュゲートさせ得る。化学療法剤（例えばドキソルビシン）が場合によりリポソーム内に含有される。例えばGabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484を参照されたい。

本明細書において記載及び開示された抗体はまた、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤）を活性な抗癌薬へと変換するプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることによって、ＡＤＥＰＴ（抗体誘導性の酵素プロドラッグ療法）に使用され得る。例えば、国際公開公報第８１／０１１４５号、国際公開公報第８８／０７３７８号、及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。ＡＤＥＰＴに有用なイムノコンジュゲートの酵素成分は、プロドラッグをより活性な細胞傷害性形態へと変換するように該プロドラッグに作用することのできる酵素である。ＡＤＥＰＴに有用な具体的な酵素としては、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物へと変換するためのアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物へと変換するためのアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルへと変換するためのシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物へと変換するための、プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチシリン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有しているプロドラッグを変換するためのＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物へと変換するための、糖鎖切断酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムを用いて誘導体化された薬物を遊離薬物へと変換するためのβ−ラクタマーゼ；及び、そのアミン窒素においてフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基をそれぞれ用いて誘導体化された薬物を遊離薬物へと変換するための、ペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、酵素活性を有する抗体（「触媒抗体」）を使用して、プロドラッグを遊離活性薬物へと変換することができる（例えば、Massey, 1987, Nature 328: 457-458を参照）。抗体−触媒抗体コンジュゲートは、腫瘍細胞個体群への触媒抗体の送達のための公知の方法によって、例えば、酵素を上記に考察された抗体／ヘテロ二官能性架橋試薬に共有結合させることによって調製され得る。あるいは、上記のような酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本明細書に開示された抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例えばNeuberger et al., 1984, Nature 312:604-608を参照）。

特定の実施態様では、例えば組織への浸透を増加させるために、インタクトな抗体ではなく、抗体断片を使用することが望ましくあり得る。その血清中半減期を延長するために、抗体断片を改変することが望ましくあり得る。これは、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを抗体断片に取り込むことによって達成され得る。１つの方法では、抗体断片の適切な領域を改変（例えば突然変異）させ得るか、又はエピトープをペプチドタグに取り込み得、次いでこれを抗体断片のいずれかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成によって融合させ得る。例えば、国際公開公報第９６／３２４７８号を参照されたい。

他の実施態様では、共有結合的な改変も含まれる。共有結合的な改変としては、システイニル残基、ヒスチジル残基、リジニル及びアミノ末端残基、アルギニル残基、チロシル残基、カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）、グルタミニル及びアスパラギニル残基、又はセリル若しくはトレオニル残基の改変が挙げられる。別のタイプの共有結合的な改変としては、抗体への化学的又は酵素的なグリコシドのカップリングが挙げられる。このような改変は、化学合成によって、又は、適用可能である場合、抗体の酵素的若しくは化学的切断によって行なわれ得る。抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖又はアミノ末端残基若しくはカルボキシル末端残基と反応することのできる有機誘導体化剤と反応させることによって、抗体の他のタイプの共有結合的な改変を分子に導入することができる。

抗体上に存在する任意の糖鎖部分の除去は、化学的に又は酵素的に実施され得る。化学的脱グルコシル化が、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131によって記載されている。抗体上の糖鎖部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350に記載のような様々なエンド−及びエキソ−グルコシダーゼの使用によって達成され得る。

別のタイプの有用な共有結合的改変は、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号及び米国特許第４，１７９，３３７号の１つ以上に示されているような様式で、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結させることを含む。

配列の最適化及びアミノ酸配列変異体
抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡに導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような変異体としては、例えば、本明細書における実施例の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はへの挿入、及び／又はの置換を含む。

欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが、最終構築物に到達するために行なわれるが、ただし最終構築物は所望の特徴を有する。アミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを変化させ得、例えばグリコシル化部位の数又は位置を変化させ得る。

突然変異誘発のための好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham and Wells (Science, 244:1081-1085 (1989))に記載のように「アラニン走査型突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、１つの残基又は１群の標的残基が同定され（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ）、そして中性又は負に荷電したアミノ酸（典型的にはアラニン）によって置換されることにより抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対して機能的な感受性を実証するそうしたアミノ酸の位置を、置換の部位に又は置換部位のためにさらなる又は他の変異を導入することによって精密にする。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異の性質それ自体は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の成績を分析するために、アラニン走査型突然変異誘発又は無作為突然変異誘発を、標的コドン又は標的領域に実施し、そして発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。

アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有しているポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合物、並びに、１アミノ酸残基又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端への挿入の例はエピトープタグに融合させた抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清中半減期を延長させる酵素又はポリペプチドの、抗体のＮ末端又はＣ末端への融合を含む。

別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発のために最も関心の高い部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変も考えられる。保存的置換が、表５の「好ましい置換」の表題の下に示されている。このような置換により生物学的活性が変化し、「例示的置換」と命名されるか又はアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載されているような、より実質的な変化も導入され得、そして産物がスクリーニングされ得る。

タンパク質化学では、抗体の生物学的活性は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックスコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の荷電又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するその効果が有意に異なる置換を選択することによって達成され得ることが一般的に認められている。天然残基は、一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを包含する。

抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与していないあらゆるシステイン残基を、一般的にはセリンを用いて置換することにより、分子の酸化的安定性を向上させ得るか、異常な架橋を防ぎ得るか、又は細胞傷害性化合物若しくは細胞分裂阻害性化合物への確立されたコンジュゲーション点を提供し得る。逆に、システイン結合（群）を抗体に加えることにより、その安定性を向上させてもよい（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。

１つのタイプの置換変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般的には、さらなる開発のために選択される得られた変異体（群）は、それらが作製された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有するだろう。このような置換変異体を作製するための慣用的な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟である。簡潔に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７個の部位）を突然変異させることにより、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成する。このようにして作製された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、線維状ファージ粒子から一価の形式で提示される。次いで、ファージディスプレイされた変異体を、その生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査型突然変異誘発を実施して、抗原との結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はさらに、抗体と標的タンパク質との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書において精巧に作り上げられた技術による置換のための候補である。一旦このような変異体が作製されれば、一連の変異体を本明細書に記載のようなスクリーニングにかけ、そして１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。

抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元来のグリコシル化パターンを改変させる。「改変すること」によって、抗体に見られる１つ以上の糖鎖部分を欠失させること、及び／又は抗体に存在しない１つ以上のグルコシル化部位を付加することを意味する。

いくつかの実施態様では、グリコシル化部位を付加するために本発明の抗体を改変することが望ましくあり得る。抗体のグルコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド内のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性あるグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースという糖の１つの、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。したがって、所与のタンパク質、例えば抗体をグリコシル化するために、１つ以上の上記のトリペプチド配列を含有するようにタンパク質のアミノ酸配列を工学操作する（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。改変はまた、元来の抗体の配列への１つ以上のセリン又はトレオニン残基の付加又はそれによる置換によってなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。

抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野において公知である様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）、又は以前に調製された変異体形若しくは非変異体形の抗体のオリゴヌクレオチドにより媒介される（又は部位特異的な）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が挙げられるがこれらに限定されない。

ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び組換え法
他の実施態様は、抗体をコードしている配列を含む単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、並びに、抗体の産生のための組換え技術を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、完全長のモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ディアボディ、鎖状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異的抗体をはじめとする、任意の所望の形態の抗体をコードすることができる。

抗体又はその断片又はその鎖をコードしている配列を含むポリヌクレオチド（群）を、当技術分野において公知であるような１つ以上の調節配列又は制御配列に融合させることができ、またこれを当技術分野において公知であるような適切な発現ベクター又は宿主細胞に含有させることができる。重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードしている各ポリヌクレオチド分子を、独立して、ヒト定常ドメインなどの定常ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列に融合させることができ、これによりインタクトな抗体の産生が可能となる。あるいは、ポリヌクレオチド又はその一部を互いに融合させることができ、これにより、一本鎖抗体の産生のための鋳型がもたらされる。

組換え産生のために、抗体をコードしているポリヌクレオチドを、クローニング用（ＤＮＡの増幅）又は発現用の複製可能なベクターに挿入する。組換え抗体を発現させるための多くの適切なベクターが入手可能である。ベクター成分は一般的に、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター、及び転写終結配列。

抗体はまた融合ポリペプチドとして産生されてもよく、ここでは該抗体は、シグナル配列などの異種ポリペプチド、又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのアミノ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドと融合している。選択された異種シグナル配列は典型的には、宿主細胞によって認識されプロセシング（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断）されるものである。抗体シグナル配列を認識しプロセシングしない原核宿主細胞では、シグナル配列を、原核生物のシグナル配列によって置換してもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーなどであり得る。酵母での分泌のために、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼα因子（サッカロマイセス（Saccharomyces）及びクルイベロマイセス（Kluyveromyces）α因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼ、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）・グルコアミラーゼ、又は国際公開公報第９０／１３６４６号に記載のシグナルから得られたリーダー配列で置換してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳動物シグナル配列、並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを使用してもよい。このような前駆領域についてのＤＮＡを、抗体をコードしているＤＮＡにリーディングフレーム内でライゲートする。

発現ベクター及びクローニングベクターは、１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能とする核酸配列を含有している。一般的には、クローニングベクター内におけるこの配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能とするものであり、これは複製起点又は自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母、及びウイルスについてのこのような配列は周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌にとって適切であり、２−νプラスミド起点は酵母に適切であり、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、及びＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（ＳＶ４０起点が典型的には使用され得る。なぜなら、それは初期プロモーターを含有しているからである）。

発現ベクター及びクローニングベクターは、発現の同定を容易にする選択マーカーをコードする遺伝子を含有していてもよい。典型的な選択マーカー遺伝子は、抗生物質又は他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンをコードするか、又は代替的には補完的な栄養要求性欠乏症であるか、又は他の代替選択肢では、複合培地に存在しない特定の栄養分を供給し、例えば桿菌のためのＤ−アラニンラセミ化酵素をコードしている遺伝子である。

選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裡に形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、よって選択計画を生き延びる。このような優性選択の例は、薬物のネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。哺乳動物細胞のための一般的な選択マーカーは、抗体をコードしている核酸を取り入れる能力のある細胞の同定を可能とするもの、例えばＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ（例えば霊長類のメタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞をまず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性の欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えばＤＧ４４）である。

あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードしているＤＮＡ配列を用いて形質転換された又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）を、選択マーカーのための選択物質、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８を含有している培地中での細胞増殖によって選択することができる。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。

組換え産生を、宿主細胞としての酵母細胞において行なう場合、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するＴＲＰ１遺伝子（Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39）を、選択マーカーとして使用することができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠失している酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する（Jones, 1977, Genetics 85:12）。よって、酵母宿主細胞ゲノム内のｔｒｐ１病変の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって、形質転換を検出するために有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２ｐ欠損酵母株、例えばＡＴＣＣ２０，６２２及び３８，６２６は、ＬＥＵ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。

さらに、１．６μmの環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターを、クリベロマイセス（Kluyveromyces）酵母の形質転換のために使用することができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模産生のための発現系がＫ．ラクティス（K. lactis）において報告された（Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135）。クリベロマイセスの工業生産株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている（Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975）。

発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識されかつ抗体又はそのポリペプチド鎖をコードしている核酸分子に作動可能に連結されている、プロモーターを含有している。原核生物宿主と共に使用するのに適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターも適している。細菌系に使用するためのプロモーターはまた、抗体をコードしているＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有しているだろう。

多くの真核生物プロモーター配列が公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこではＮはどのようなヌクレオチドでもよい。大半の真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルである可能性があるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの全ての配列は、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。

酵母宿主と共に使用するのに適したプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。

誘導性プロモーターは、増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する。これらは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した誘導酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素についての酵母プロモーター領域を含む。酵母における発現に使用するのに適したベクター及びプロモーターはさらに、欧州特許第７３，６５７号に記載されている。酵母エンハンサーはまた、有利には酵母プロモーターと共に使用される。

哺乳動物宿主細胞内のベクターからの抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２型）、ウシパピローマウイルス、サル肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、又は熱ショックプロモーターから制御される。ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。

ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは簡便には、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限酵素断片として得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは簡便には、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素断片として得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下にあるマウス細胞内のヒトｐ−インターフェロンｃＤＮＡの発現を開示している、Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモーターとして使用してもよい。

組換え発現ベクターに使用され得る別の有用な配列は、高等な真核生物による抗体をコードしているＤＮＡの転写を増加させるために使用される、エンハンサー配列である。哺乳動物遺伝子（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）に由来する多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー配列の記載についてYaniv, 1982, Nature 297:17-18を参照されたい。エンハンサーは、抗体をコードする配列の５’位又は３’位でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターに対して５’の部位に位置する。

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターはまた、転写終結のために必要とされる及びｍＲＮＡの安定化のために必要とされる配列も含有していてもよい。このような配列は、一般的に、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合により３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分内にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有している。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開公報第９４／１１０２６号及びそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。いくつかの実施態様では、抗体は、ＣＨＥＦ系を使用して発現させ得る（例えば、米国特許第５，８８８，８０９号を参照されたい；その開示は参照により本明細書に組み入れられる）。

本明細書においてベクター内のＤＮＡをクローニング又は発現させるのに適した宿主細胞は、上記の原核細胞、酵母細胞、又はより高等な真核細胞である。この目的のために適した原核細胞としては、真正細菌、例えばグラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌類、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター菌、エルウィニア菌、クレブシエラ菌、プロテウス菌、サルモネラ菌、例えばサルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア菌、例えばセラチア・マルセセンス（Serratia marcescans）、及び赤痢菌、並びに、桿菌、例えば枯草菌及びバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）（例えば１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０号に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス菌、例えば緑膿菌、及びストレプトマイセス菌が挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）などの他の株も適している。これらの例は、制限するものではなくむしろ例である。

原核生物の他に、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードしているベクターに適したクローニング用宿主又は発現用宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又は一般的なパン酵母が、より下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、多くの他の属、種、及び株が一般的に入手可能であり、かつ本明細書において有用であり、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）；クリベロマイセス（Kluyveromyces）宿主、例えばＫ．ラクティス（K. lactis）、Ｋ．フラジリス（K. fragilis）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（K. bulgaricus）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミ（K. wickeramii）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（K. waltii）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（K. drosophilarum）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（K. thermotolerans）、及びＫ．マルキシアヌス（K. marxianus）；ヤロウィア属（yarrowia）（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（Pichia pastors）（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア（Trichoderma reesia）（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Neurospora crassa）；シュワンニオマイセス（Schwanniomyces）、例えばシュワンニオマイセス・オシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）；及び糸状菌、例えばニュースポラ（Neurospora）、アオカビ類（Penicillium）、トリポクラディウム（Tolypocladium）、及びアスペルギルス（Aspergillus）宿主、例えばＡ．ニデュランス（A. nidulans）及びクロコウジカビ（A. niger）である。

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞、例えば数多くのバキュロウイルス株及び変異株、並びにヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びボムビークス・モリー（Bombyx mori）（カイコ）などの宿主からの対応する許容される昆虫宿主細胞が挙げられる。例えばアウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＮＰＶのＬ−１変異体及びボムビークス・モリー（Bombyx mori）ＮＰＶのＢｍ−５株などの、トランスフェクション用の様々なウイルス株が公共的に入手可能であり、このようなウイルスを、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用し得る。

綿、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養液もまた宿主として使用することができる。

別の態様では、抗体の発現は、脊椎動物細胞内で行なわれる。培養液（組織培養液）中の脊椎動物細胞の増殖は慣用的な手順となっており、技術は広く利用可能である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞）、（Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ１（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例えばＤＧ４４）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）、ＴＲ１細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞腫株（ＨｅｐＧ２）である。

宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現ベクター又はクローニングベクターを用いて形質転換し、そして、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅させるために適宜改変された慣用的な栄養培地中で培養する。

本明細書に記載の抗体を産生するために使用された宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。市販の培地、例えばＨａｍのＦ１０（Sigma-Aldrich Co.、セントルイス、ミズーリ州）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Sigma-Aldrich Co.）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma-Aldrich Co.）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma-Aldrich Co.）が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、米国特許第５，１２２，４６９号、国際公開公報第９０／１０３４３０号、及び国際公開公報第８７／００１９５号の１つ以上に記載された培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として使用し得る。これらの培地のいずれかに、必要であれば、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、及びブドウ糖又は等価なエネルギー源を補充し得る。他の補助物質も、当業者には公知であろう適切な濃度で含まれていてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内の細胞膜周辺腔で産生されても、又は培地中に直接分泌されてもよい。抗体が細胞内で産生される場合、第一工程として細胞を破壊してタンパク質を放出させ得る。宿主細胞又は溶解した断片のいずれかの粒子状破片物を、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって除去することができる。Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を記載している。

簡潔に言えば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍する。細胞破片物を、遠心分離によって除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、このような発現系からの上清を、一般的にまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン又はミリポアペリコン限外ろ過装置を使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を、前記の工程のいずれかに含めることにより、タンパク質の分解を抑制することができ、そして抗生物質を含めることにより外来性の混入物の増殖を防ぐことができる。様々な方法を使用して、宿主細胞から抗体を単離することができる。

細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーが典型的な精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適切性は、抗体に存在するあらゆる免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づいた抗体を精製することができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13参照）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（例えば、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575参照）。アフィニティリガンドが付着するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。力学的に安定なマトリックス、例えば制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成され得るより迅速な流速及びより短い処理時間を可能とする。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノールによる沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂上でのヘパリンセファロース（商標）クロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカッシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈降法もまた、回収しようとする抗体に依存して利用可能である。

任意の予備精製工程（群）の後に、関心対象の抗体と混入物とを含む混合物を、典型的には低塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）で行なわれる、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用した、低いｐＨでの疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ得る。

本発明の抗体又は抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド配列（群）によって示されるヌクレオチド配列の全部又は一部（例えば可変領域をコードする部分）に、本明細書に定義されているような、低い、中程度、及び高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば２０、２５、３０又は５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分は、ポリペプチド（例えば重鎖又は軽鎖の可変領域）をコードしている核酸又はその相補体の一部又は全部の配列に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。本明細書に記載のタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、又は診断用プローブとして使用され得る。

２つの配列間の同一率又は類似率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変された、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を用いて実施されることにより、関心対象のタンパク質をコードしている核酸に対して相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施されることにより、関心対象のタンパク質に対して相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップを入れたアラインメントを得るために、ギャップありのＢＬＡＳＴをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠位関係を検出する反復探索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップありのＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターを使用することができる。配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非制限的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと取り込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長さペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。配列分析のための追加のアルゴリズムは当技術分野において公知であり、そしてTorellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載のようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載のＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐは、探索の感度及び速度を設定する制御選択肢である。ｋｔｕｐ＝２である場合、比較される２つの配列内の類似した領域は、アラインさせた残基の対を見ることによって判明する；ｋｔｕｐ＝１である場合、１つのアラインさせたアミノ酸を調べる。ｋｔｕｐはタンパク質配列については２若しくは１に設定され得るか、又はＤＮＡ配列では１〜６に設定され得る。ｋｔｕｐが明記されない場合、デフォールトはタンパク質については２であり、ＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載のように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して実施され得る。

非治療的使用
本明細書に記載の抗体は、アフィニティ精製剤として有用である。このプロセスでは、抗体を固相上に、例えばプロテインＡ樹脂上に、当技術分野において周知である方法を使用して固定する。固定された抗体を、精製しようとする含有している試料と接触させ、その後、支持体を適切な溶媒で洗浄し、これにより固定された抗体に結合している標的タンパク質以外の試料中の全ての材料は実質的に除去されるであろう。最後に、支持体を、抗体から標的タンパク質を遊離するであろう別の適切な溶媒で洗浄する。

いくつかの実施態様では、例えば診断目的のために、抗体を検出可能な部分で標識することが有利であろう。数多くの検出可能な標識が利用可能であり、これには、放射性同位体、蛍光標識、酵素基質標識などが含まれる。標識は、様々な公知の技術を使用して抗体と間接的にコンジュゲートさせ得る。例えば、抗体をビオチンとコンジュゲートさせ得、そして上記の３つの広いカテゴリーの中のいずれかの標識をアビジンとコンジュゲートさせ得るか、又は逆でもよい。

ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって、標識はこのような間接的な様式で抗体とコンジュゲートすることができる。あるいは、標識と抗体の間接的なコンジュゲーションを達成するために、抗体を小さなハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ得、そして上記の様々なタイプの標識の１つを、抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、標識と抗体の間接的なコンジュゲーションが達成され得る。

例示的な放射性同位体標識としては、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉが挙げられる。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubsに記載の技術を使用して、放射性同位体を用いて標識され得る。放射能は、例えばシンチレーション計測によって測定され得る。

例示的な蛍光標識としては、希土類キレート（ユーロピウムキレート）由来の標識が挙げられるか、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドが入手可能である。蛍光標識は、例えばCurrent Protocols in Immunologyに開示の技術などの公知の技術を介して抗体にコンジュゲートさせ得る。蛍光はフルオロメーターを使用して定量され得る。

当技術分野において公知である様々な十分に特徴付けられている酵素−基質標識が存在する（例えば、概説については米国特許第４，２７５，１４９号を参照されたい）。酵素は一般的に、様々な技術を使用して測定され得る発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、変化は、分光光度的に測定され得る基質の色の変化であり得る。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量するための技術は上記されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、次いで、例えばケミルミノメーターを使用して測定され得る光を放出し得るか、又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与し得る。

酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素をコンジュゲートするための技術は、例えば、O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166に記載されている。

酵素−基質の組合せの例としては、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての水素ペルオキシダーゼ（ここで、水素ペルオキシダーゼは、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）などの色素前駆体を酸化する）；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェート；及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの発色基質、又は４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの蛍光発生基質が挙げられる。

数多くの他の酵素−基質の組合せが当業者には入手可能である。これらの一般的な概説については、米国特許第４，２７５，１４９号及び米国特許第４，３１８，９８０号を参照されたい。

別の実施態様では、該抗体は標識せずに使用され、そして該抗体と結合する標識された抗体を用いて検出される。

本明細書に記載の抗体は、任意の公知のアッセイ法、例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイにおいて使用され得る。例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)を参照されたい。

診断キット
抗体は、診断キット、すなわち診断アッセイを実施するための説明書と予め決定された量の試薬との梱包された組合せにおいて使用され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、検出可能な発色団又はフルオロフォアを与える基質前駆体などの酵素によって必要とされる基質及び補因子を含み得る。さらに、他の添加剤、例えば安定化剤、緩衝液（例えば遮断緩衝液又は溶解緩衝液）などが含まれ得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する溶液中の試薬濃度を提供するために、幅広く変更され得る。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を与えるであろう、賦形剤を含む、乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供され得る。

治療用途
別の実施態様では、本明細書において開示された抗体は、１つ以上の標的タンパク質の発現に関連した様々な障害の処置に有用である。障害を処置するための方法は、治療有効量の抗体をそれを必要とする被験者に投与する工程を含む。

抗体又は薬剤は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、眼内、経皮、局所、口腔内吸入、及び鼻腔内、並びに局所的な免疫抑制処置を所望の場合には病巣内投与（灌流するか、又はさもなくば移植前に移植片を抗体と接触させることを含む）をはじめとする任意の適切な手段によって投与される。抗体又は薬剤は、例えば、注入として又はボーラスとして投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、又は皮下投与を含む。さらに、抗体は適切には、特に漸減している投与量の抗体を用いてのパルス注入によって投与される。１つの態様では、投薬は、一部には投与が短時間であるか又は慢性であるかに依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によって行なわれる。

疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投与量は、上記に定義されているような処置しようとする疾患の種類、疾患の重度及び経緯、該抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床履歴、並びに該抗体に対する応答、並びに担当医師の慎重さなどの様々な要因に依存するだろう。該抗体は、一度に又は一連の処置をかけて患者に適切に投与される。

疾患の種類及び重度に依存して、約１μg/kg〜２０mg/kg（例えば、０．１〜１５mg/kg）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるか又は連続的な注入によるものであれ、患者への投与のための候補初回投与量である。典型的な１日投与量は、上記の要因に依存して、約１μg/kg〜１００mg/kg又はそれ以上の範囲であり得る。数日間又はそれ以上におよぶ反復投与の場合、容態に依存して、疾患の症状の望ましい抑制が起こるまで処置は持続される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

「抑制」という用語は、「寛解」及び「軽減」と同じ内容で本明細書において使用され、疾患の１つ以上の特徴の減少を意味する。

前記抗体組成物は、良い医療行為にかなっている様式で製剤化され、秤量され、投与されるだろう。この文脈において考えられる因子としては、処置される具体的な障害、処置される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床容態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与計画、及び医療従事者には公知である他の因子が挙げられる。投与しようとする抗体の「治療有効量」はこのような配慮によって左右され、そしてこれは、有害な活性に関連した障害を予防、寛解、又は治療するために必要とされる最小量である。

前記抗体は、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている薬剤の１つ以上と共に製剤化される必要はないが、場合によりそれと共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記に考察された他の因子に依存する。これらは一般的に、本明細書で以前に使用されたのと同じ投与量及び投与経路で、又は今までに使用された投与量のおよそ１〜９９％で使用される。

医薬組成物及びその投与
抗体を含む組成物を、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、又は癌を有する又は有するリスクがある被験者に投与することができる。本発明はさらに、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、又は癌の予防若しくは治療用の医薬品の製造における抗体の使用を提供する。本明細書において使用する「被験者」という用語は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト及び非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、げっ歯類、並びにイヌを意味する。本明細書に記載の方法を使用した処置に特に意図される被験者としては、ヒトが挙げられる。抗体又は薬剤を、単独で又は他の組成物と組み合わせてのいずれかで、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、又は癌の予防若しくは治療において投与することができる。抗体又は薬剤と組み合わせて投与され得るこのような組成物は、メトトレキサート（ＭＴＸ）及び免疫調節剤、例えば抗体又は小分子を含む。

様々な送達システムが知られており、これを使用して抗体を投与することができる。導入法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、眼内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、例えば、注入、ボーラス、又は注射によって投与されてもよく、そして、他の生物学的に活性な薬剤、例えば化学療法剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身性であっても局所性であってもよい。好ましい実施態様では、投与は、皮下注射による。このような注射用の製剤は、隔週毎に１回投与され得る例えば薬剤充填済み注射器に調製され得る。

具体的な実施態様では、抗体は、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、又は埋込剤を用いて投与され、該埋込剤は、多孔性材料、非多孔性材料、又はゲル性材料（サイラスティック膜などの膜を含む）、又は繊維である。典型的には、該組成物を投与する場合に、抗体又は薬剤が吸収しない材料が使用される。

他の実施態様では、抗体又は薬剤は、徐放性システムで送達される。１つの実施態様では、ポンプが使用され得る（例えばLanger, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照）。別の実施態様では、ポリマー材料が使用され得る。（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105参照）。他の徐放性システムも、例えば上記のLangerにおいて考察されている。

抗体を、治療有効量の結合剤と１つ以上の薬学的に適合性の成分とを含む医薬組成物として投与することができる。

典型的な実施態様では、医薬組成物は、ヒトへの静脈内投与又は皮下投与に適合した医薬組成物として、慣用的な手順に従って製剤化される。典型的には、注射による投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、該医薬はまた、可溶化剤及び局所麻酔剤、例えばリグノカインを含むことにより、注射部位における疼痛を和らげることができる。一般的には、成分は、別々に又は単位投与剤形内に一緒に混合されてのいずれかで、例えば凍結乾燥粉末又は水分非含有の濃縮物として、活性物質の量を示したアンプル又はサッシェなどの密閉容器で供給される。該医薬を注入によって投与しようとする場合、それを、無菌の医薬等級の水又は食塩水を含有している注入瓶を用いて施薬することができる。該医薬を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水又は食塩水のアンプルを提供し得る。

さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形の抗体を含有している容器と、（ｂ）注射用の薬学的に許容される希釈剤（例えば滅菌水）を含有している第二の容器とを含む、医薬キットとして提供され得る。薬学的に許容される希釈剤は、凍結乾燥させた抗体の復元又は希釈のために使用され得る。このような容器（群）に場合により付随されるのは、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって定められた形式の通知であり得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の当局による承認を反映する。

免疫学的障害又は癌の治療又は予防に効果的である抗体の量は、標準的な臨床的技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイを場合により使用して、最適な投与量範囲を同定することを助け得る。製剤に使用される正確な投与量はまた、投与経路及び免疫学的障害又は癌の段階に依存し、施術者の判断及び各患者の環境に応じて決断されるべきである。有効投与量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから導かれた用量反応曲線から推定され得る。

一般的には、患者に投与される抗体の投与量は、典型的には、約０．１mg/kg〜約１００mg/kg（被験者の体重）である。被験者に投与される投与量は、約０．１mg/kg〜約５０mg/kg、約１mg/kg〜約３０mg/kg、約１mg/kg〜約２０mg/kg、約１mg/kg〜約１５mg/kg、又は約１mg/kg〜約１０mg/kg（被験者の体重）である。

例示的な投与量としては、１ng/kg〜１００mg/kgが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、投与量は約０．５mg/kg、約１mg/kg、約２mg/kg、約３mg/kg、約４mg/kg、約５mg/kg、約６mg/kg、約７mg/kg、約８mg/kg、約９mg/kg、約１０mg/kg、約１１mg/kg、約１２mg/kg、約１３mg/kg、約１４mg/kg、約１５mg/kg、又は約１６mg/kgである。投与量は、例えば、１日１回、１週間に１回（週１回）、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、２週間に１回、又は１か月に１回、２か月毎に１回、又は３か月毎に１回投与され得る。具体的な実施態様では、投与量は、約０．５mg/kg/週、約１mg/kg/週、約２mg/kg/週、約３mg/kg/週、約４mg/kg/週、約５mg/kg/週、約６mg/kg/週、約７mg/kg/週、約８mg/kg/週、約９mg/kg/週、約１０mg/kg/週、約１１mg/kg/週、約１２mg/kg/週、約１３mg/kg/週、約１４mg/kg/週、約１５mg/kg/週、又は約１６mg/kg/週である。いくつかの実施態様では、投与量は、約１mg/kg/週から約１５mg/kg/週の範囲である。

いくつかの実施態様では、抗体を含む医薬組成物はさらに、結合剤とコンジュゲートした又はコンジュゲートしていないのいずれかである治療剤を含むことができる。抗体は、炎症疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝障害、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えば炎症に関連した中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、又は癌の治療若しくは予防のための１つ以上の治療剤と組み合わせて共投与されてもよい。

このような併用療法の投与は、疾患パラメーター（例えば症状の重度、症状の数、又は再発頻度）に対して相加効果又は相乗効果を及ぼすことができる。

併用投与のための治療計画に関して、具体的な実施態様では、抗体は、治療剤と併用して投与される。別の具体的な実施態様では、治療剤は、抗体薬剤の投与の少なくとも１時間及び最大数か月間前若しくは後に、例えば、抗体の投与の少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日間、１週間、１か月間、又は３カ月間前若しくは後に投与される。

製品
別の態様では、上記の障害の処置に有用な材料を含有している製品が含まれる。製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、容態を処置するのに効果的な組成物を保持し、そして無菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静注バッグ又はバイアルであり得る。組成物中の活性薬剤は、抗体である。容器上の又は容器に付随したラベルは、該組成物が選択された容態の処置に使用されることを示す。製品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液などを含む第二の容器を含み得る。それはさらに、商業的見地及び使用者の見地から望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を含む添付文書を含み得る。

本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、この実施例は本発明の範囲を制限するものではない。

実施例
実施例１：タンパク質の発現及び精製
可変領域をコードしている核酸配列を、標準的なＰＣＲ制限酵素に基づいたクローニング技術を使用して、ＩｇＧ１発現カセットの定常領域を含有している特別注文の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。多重特異的抗体を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株における一過性トランスフェクションによって発現させた。抗体を最初に、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって精製した（Brown, Bottomley et al. 1998）。カラムを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）を用いて平衡化し、そして２mL/分の流速で発酵上清をローディングした。ローディング後、カラムをＰＢＳ（４カラム体積）を用いて洗浄し、その後、３０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。Akta Explorer（ＧＥヘルスケア社）で２８０nmの吸光度によってモニタリングされたタンパク質ピークを含有している画分を共にプールし、そして１％の３M 酢酸ナトリウム（ｐＨ９．０）の添加によってｐＨ５．０まで中和した。プロテインＡにより精製された抗体の平均回収率は９０％超であった。研磨工程として、抗体を分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を使用して精製した。

実施例２：分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣを、５０mMリン酸塩、２００mMアルギニン、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ６．５緩衝液中のＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム（直径７．８mm、長さ３０cm、５μm）を使用して実施した。流速を１mL/分に維持し、そしてローディングされた試料容量は５０μLであった。溶出ピークを、単量体の比率を計算するために製造され提供されたソフトウェアを使用して積分した（曲線下面積）。これらの実験からの結果を図４及び図８に示す。

実施例３：分析超遠心分離を介した同質性の特徴付け（ＡＵＣ）
全ての実験は、ベックマンＸＬ１分析超遠心機（ベックマンコールター社、フラートン、ＣＡ州）で実施された。全ての沈降速度実験は、４０，０００rpm及び２０℃で実施された。実験は、２０mMクエン酸塩及び１１５mM ＮａＣｌを含有しているｐＨ６．０の緩衝液中で実施された。データを２８０nmで回収し、そしてＳｅｄＦｉｔバージョン１２．１ｃの連続ｃ（Ｓ）モデルを使用して分析した。これらの実験からの結果を図２に示す。

実施例４：示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
多重特異的抗体の熱的安定性は、キャピラリーＶＰ−ＤＳＣマイクロカロリメーター（マイクロキャル社、ノーサンプトン、ＭＡ州）によって特徴付けられた。タンパク質の濃度は、０．４５０mLのセル容量で１℃/分の走査速度で測定したところ約１．４mg/mLであった。温度走査は２５〜１２０℃で実施された。緩衝液基準走査を、タンパク質走査から差し引き、そしてタンパク質の濃度を熱力学的分析の前に正規化した。データはＯｒｉｇｉｎ７．０（オリジンラボ社、ノーサンプトン、ＭＡ州）でプロットされ、そしてその後の熱力学的分析は、遷移前及び遷移後の基線の修正されたデータで実施された。ＤＳＣ曲線を、２状態ではないモデルを使用してフィットさせることにより、熱量測定エンタルピー、ファントホッフエンタルピー、及び見かけの遷移温度（Ｔ_ｍ）を得た。

表６は、それぞれの二重特異的抗体についての示差走査熱量測定による熱的安定性の評価を示す。最も低い遷移温度（Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン）は６７．６℃であった。Ｆａｂ及びＣＨ３ドメインの遷移温度は約８０℃である。新生児期ＦｃＲｎ媒介性突然変異（ＹＴＥ）の組み込みにより、約４．６℃だけＦｃ領域の不安定化が起こった。この実験において二重特異的抗体に使用された可変領域は、表３に示されているような、セルトリズマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、又はイキセキズマブの可変領域である。

実施例５：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（バイオラッド社、ハーキュリーズ、ＣＡ州）を使用して、二重特異的抗体に結合している標的タンパク質の動態及び親和性を測定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧγＦｃ特異的（ＧＡＨＡ）（インビトロジェン社、グランドアイランド、ＮＹ州）を、製造業者の説明書に従って、８０００ＲＵから１００００ＲＵまでの表面密度で、アミンカップリングキット（バイオラッド社、ハーキュリーズ、ＣＡ州）を使用して６つの水平なチャンネルに沿って、ＧＬＭチップのデキストランマトリックス（バイオラッド社、ハーキュリーズ、ＣＡ州）に固定した。二重特異的抗体を、約２００ＲＵの表面密度で５つの垂直チャネルに沿ってＧＡＨＡ表面に捕捉した。最後の垂直チャンネルを、かさの変動を除去するためのカラム基準として使用した。各抗体と標的タンパク質の結合動態は、５つの希釈率（１０、５．０、２．５、１．２５、０．６２５、及び０nM）の標的タンパク質の２回の注射のグローバルフィッティングによって決定された。２回の５つの濃度の標的タンパク質の回収された結合センサーグラムは、不活性なチャンネル／スポット間基準及び抽出緩衝液基準を使用して二重基準とした。基準にしたセンサーグラムを１：１のラングミュア結合モデルにフィットさせ、結合速度（ｋ_ａ）、解離速度（ｋ_ｄ）、及び解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。これらの実験からの結果を図５に示す。

実施例６：血清の干渉
１×動態緩衝液及びヒト血清（シグマ社、セントルイス、ＭＯ州）中の各抗体とそれらの（ビオチニル化）標的タンパク質の相互作用はそれぞれ、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーチップ（フォルテバイオ社）の具備されたＯｃｔｅｔＱＫ（フォルテバイオ社）機器で実施された。ビオチニル化標的タンパク質を用いて捕捉されたセンサーをヒト血清中に浸漬し、抗体と標的タンパク質との望ましい相互作用をモニタリングする前に、血清中の結合についての基線を確立した。様々な結合時点（６０秒間、１２０秒間、及び２４０秒間）における１×動態緩衝液及びヒト血清中の結合センサーグラムの応答を比較して、抗体がヒト血清中のオフターゲット分子に結合したかどうかを決定した。

表７では、血清干渉結合アッセイは、血清成分による標的抗原との結合に対する干渉がないことを示す。代表的なＺｗｅｉＭａｂ二重特異的抗体を、その親ＩｇＧと共に、ＰＢＳ緩衝液及び９０％ヒト血清中の標的抗原の結合を用いて評価した。結合応答の１．３倍の変動が観察された（水性緩衝液と比較して血清の屈折率の増加を伴う）。類似の変動が親ＩｇＧでも観察された。この実験で二重特異的抗体に使用された可変領域は、表３に示されているように、セルトリズマブ及び／又はアダリムマブの可変領域である。

実施例７：プロテインＡ結合評価のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づいた方法
ＥＬＩＳＡに基づいた方法を使用して、多重特異的抗体の変異体がプロテインＡに結合する能力を評価した。ビオチニル化プロテインＡをストレプトアビジンＥＬＩＳＡプレート上に捕捉し、そしてそれをＰＢＳＴ緩衝液中１％ミルクと共にインキュベートして、非特異的結合を最小限とした。続いて、２つのホモ二量体変異体（ＡＡ及びＢＢ）をヘテロ二量体多重特異的抗体（ＡＢ）及び対照ＩｇＧと共に、室温で１時間インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて３回洗浄し、そして結合を、ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗κ抗体を使用して検出した。これらの実験からの結果を図７ｂを示す。

実施例８：カニクイザル薬物動態分析
多重特異的抗体の皮下薬物動態を、カニクイザルにおいて評価した。試験はＩＡＣＵＣによって許可され、そして米国農務省の動物福祉法（９ＣＦＲパート１、２及び３）を遵守した。抗体を皮下注射によって中央肩甲骨間領域に投与した。多重特異的抗体の血清中濃度を、検証された抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。簡潔に言えば、ビオチニル化標的タンパク質をストレプトアビジンでコーティングされたヌンクマキシソープ（アフィメトリクス社、イーバイオサイエンス社、サンディエゴ、ＣＡ州）に固定した。次いで、９６ウェルプレートを洗浄し、次いでＰＢＳ及び２％ＢＳＡ（ｗ/ｖ）を用いて遮断した。次いで、マトリックス基準標準物質試料（品質管理）及び試験試料を、５％サル血清の最終濃度に希釈し、そして遮断されたプレートに移した。プレートを、０．０５μg/mlの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（サザンバイオテック社）の添加前に洗浄した。プレートを再度洗浄し、ＢｉｏＦｘ（サーモディクス社、エデンプレーリー、ＭＮ州）ＴＭＢＷ基質を加えた。プレートを、ＴＭＢ基質のためのＢｉｏＦｘ液体停止溶液（０．２M Ｈ_２ＳＯ_４）の添加前に室温で約５分間展開させ、次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（モレキュラーデバイス社、サニーベール、ＣＡ州）Ｍ５プレートリーダーを使用して４５０nMの吸光度で解読した。濃度は、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア（モレキュラーデバイス社、サニーベール、ＣＡ州）を使用して両対数曲線フィットに４５０ ＯＤシグナル強度に対して標準的な曲線濃度をプロットすることによって得られた。ノンコンパートメント薬物動態分析はＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（ｖ．５．３、ファーサイト社、マウンテンビュー、ＣＡ州、米国）を用いて実施された。最後の定量可能な時点までの血清中濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ０−ｔ）を、線形トラペゾイダル法を使用して計算し、そして終末相半減期（ｔ_１/２）を推定するために個々の曲線の終末相部分の対数線形回帰を使用して時間∞（ＡＵＣ_∞）に外挿した。消失速度定数（Ｋ_ｅｌ）は、１日目から７日目までの検査によって同定された、終末相を使用して対数変換された濃度データの最小二乗回帰によって決定され、そして終末相半減期はｌｎ２/ｋ_ｅｌと等しかった。これらの実験からの結果を図６に示す。

表８は、代表的な二重特異的抗体の薬物動態プロファイルを示す。この実験において二重特異的抗体に使用された可変領域は、表３に示されるように、セルトリズマブ及びアダリムマブの可変領域である。

実施例９：免疫原性評価
二重特異的抗体配列を、ＥｐｉＶａｘ Ｅｐｉｍａｔｒｉｘのインシリコでの免疫原性予測プログラムからの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）調整スコアを使用して可能性ある免疫原性について分析した。

表９は、代表的な二重特的抗体についての免疫原性プロファイルを示す。

実施例１０：分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）
ａ）ＤＮＡ構築法及び細胞培養
ＤＮＡ構築物を、伝統的なクローニング法を使用して構築した。ＤＮＡセグメントは、外部の供給業者（ＩＤＴＤＮＡ）で合成されるか、又は事前に社内で構築された構築物のＰＣＲから合成されるかのいずれかであった。セグメントをＳＯＥ（スプライスオーバーラップ伸長）ＰＣＲを使用して構築し、そして制限酵素で消化されたベクターに内部融合（クロンテック社、製造番号６３９６３８）するか又はライゲートした。使用される標準的なベクターは、ＣＨＯ−Ｅ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞におけるエピソーム複製のためのＣＭＶプロモーター、ＡＭＰ遺伝子選択マーカー、及びＯｒｉＰ遺伝子を有するｐＴＴ５（カナダ国立研究機関）であった。ベクターを、ＩｇＧ１ＫＯベクターについてはＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ（ニューイングランドバイオラボ社）を用いて又はＩｇＧ４ＰｒｏベクターについてはＥｃｏＲＩ/ＡｐａＩ（ニューイングランドバイオラボ社）を用いてのいずれかで制限酵素により消化した。ＤＮＡ挿入断片を有するベクターをＳｔｅｌｌａｒ細胞（クロンテック社）に形質転換し、そして振盪しながら３７℃で一晩培養した。プラスミド精製ミニプレップ（キアゲン社、製造番号２７１７３）を完了させ、そして陽性試料は、外部供給業者（ユーロフィンジェノミクス社）でのサンガーシークエンスによって決定された。次いで、配列の確認された挿入断片を有する培養液を、ギガプレッププラスミド精製（キアゲン社、製造番号１２９９１）又は自動マキシプレップ（ベンチプロ２１００プラスミド精製システム、サーモフィッシャー社）を介してスケールアップした。次いで、ＤＮＡをＣＨＯ−Ｅ細胞のトランスフェクションに使用した。

ＣＨＯ−３Ｅ７（ＣＨＯ−Ｅ）細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、及び１４０rpmの振盪速度で、８mMグルタマックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の補充されたフリースタイルＣＨＯ（ＦＳ−ＣＨＯ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地からなる増殖培地中で活発に分裂している状態で維持した。ＣＨＯ−Ｅ細胞を、２mMグルタミンの補充されたＦＳ−ＣＨＯ（トランスフェクション培養培地）中で２×１０^６個の細胞/mLでトランスフェクトした。３５mLのＣＨＯ−Ｅの一過性トランスフェクションのために、第一のアミノ酸鎖をコードしているＤＮＡ含有配列 ３５μgと、第二のアミノ酸鎖をコードしているＤＮＡ含有配列 １７．５μgを、５０mLのＴＰＰ ＴｕｂｅＳｐｉｎバイオリアクター中のＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ ３．５mL中に希釈した。２６．２５μLのＭｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ Ｐｒｏトランスフェクション試薬を、希釈されたＤＮＡ混合物に加え、そして混合物を穏やかに回旋させた。回旋後（インキュベーションは１分間より短い）、調製されたＣＨＯ−Ｅ細胞をＤＮＡ複合体化混合物に加えた。ＴｕｂｅＳｐｉｎバイオリアクターを３７℃、５％ＣＯ_２、２００rpmでインキュベートした。トランスフェクションの４〜２４時間後、ギブコ抗凝集剤 ３５０μL、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ ３５０μL、及びＣＨＯ ＣＤエフィシェントフィードＢ ５．２５mLを、トランスフェクトされた細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後、温度を３２℃に変動させた。トランスフェクトされた培養液を１０日後、又は一旦培養液が６０％未満の生存率となった場合に収集した。トランスフェクション体は、４７００rpm、４℃で２０分間遠心分離することによって収集された。バイオマス（清澄化された上清）をデカントし、そして０．２μmのフィルターを通して滅菌ろ過し、そして細胞ペレットを廃棄した。バイオマスを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ/Ｐａｌｌ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６機器によって力価のために試料採取した。

ｂ）精製及び分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）
ＣＨＯ−Ｅ培養上清 ３０mlを、プロテインＡ樹脂（ＰｈｙＮｅｘｕｓ、カタログ番号ＰＴＲ９１−４０−０７）４０μlを含有している「ＰｒｏＰｌｕｓＰｈｙＴｉｐ」アフィニティカラムにローディングした。流速は０．２５ml/分であった。ＰｈｙＴｉｐｓを、緩衝液Ａ（ＤＰＢＳ）１．３ml、緩衝液Ｂ（ＤＰＢＳと１M ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）１．３ml、及び緩衝液Ａ １．３mlを用いて０．５ml/分で順次洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、緩衝液Ｃ（３０mM ＮａＯＡｃ、ｐＨ３．５）０．３mlを３回用いて溶出した。ｐＨは、各溶出液について１％の緩衝液Ｄ（３．０M ＮａＯＡｃ、ｐＨ約９）を用いてｐＨ約５の６０mM ＮａＯＡｃの最終緩衝液となるように調整された。

タンパク質濃度を測定した後、試料（約１０μg）を分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）カラムに流して、より高い及びより低い分子量種から単量体タンパク質画分を分離した。ウォーターズＢＥＨ２００カラム（内径４．６mm×長さ１５cm、１．８μm）を０．５ml/分の流速でウォーターズＵＨＰＬＣシステムで使用した。移動相緩衝液は５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、２００mMアルギニン、０．０５％アジ化ナトリウムであった。ＨＭＷ、単量体及びＬＭＷの比率をＢＥＨ２００プロセシング法によって自動計算した。

本発明の６つのタンパク質についての単量体の比率を表１０に示す。これらのタンパク質では、第一の鎖は、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ又はレブリキズマブの可変領域を含み、そして第二の鎖は、ＣＤ３３の可変領域を含む。重鎖定常領域はＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４に由来する。

試験された本発明のタンパク質におけるアミノ酸鎖の対もまた表１０に示す。

Claims (38)

1. ａ）第一のエピトープに対して特異的な第一の結合単位を形成している第一の重鎖と第一の軽鎖、及び
   ｂ）第二のエピトープに対して特異的な第二の結合単位を形成している第二の重鎖と第二の軽鎖
   を含むタンパク質であって、
   前記の第一の重鎖は３６６位にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記の第二の重鎖は４０７位にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、そして前記の第一又は前記の第二の重鎖はさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含むか、又は前記の第一の重鎖は３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記の第二の重鎖は３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、そして前記の第一又は第二の重鎖はさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む、該タンパク質。
2. 前記の第二の重鎖がさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む、請求項１記載のタンパク質。
3. 前記の第一及び第二の重鎖がさらにＹＴＥ突然変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む、請求項１又は２記載のタンパク質。
4. 前記の第一の重鎖が３６６位にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記の第二の重鎖が３６６位にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、３６８位にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び４０７位にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、前記の第二の重鎖がさらに４３５位にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び４３６位にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含み、前記の重鎖がＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
5. 前記の第一の重鎖が、配列番号１、４、３６又は３７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
6. 前記の第二の重鎖が、配列番号３、５、３８又は３９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
7. 前記の第一の重鎖が配列番号１又は４のアミノ酸配列を含み、そして前記の第二の重鎖が配列番号３又は５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
8. 前記の第一の重鎖が配列番号３６のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記の第二の重鎖が配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
9. 前記の第一の重鎖が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記の第二の重鎖が配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
10. 前記の第一又は第二の軽鎖が配列番号２又は３５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
11. 前記の第一の重鎖及び前記の第一の軽鎖が第一のリンカーを通して共有結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
12. 前記の第二の重鎖及び前記の第二の軽鎖が第二のリンカーを通して共有結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
13. 前記の第一の重鎖及び前記の第一の軽鎖が第一のリンカーを通して共有結合し、そして前記の第二の重鎖及び前記の第二の軽鎖が第二のリンカーを通して共有結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
14. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが２６〜４２アミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
15. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが３０〜４０アミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
16. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが３４〜４０アミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
17. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが３６〜３９アミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
18. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが３８アミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
19. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーがグリシン及びセリンアミノ酸を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
20. 前記の第一及び／又は前記の第二のリンカーが配列番号６から配列番号１４又は配列番号４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
21. 前記の第一及び前記の第二のリンカーが同じ長さを有する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
22. 前記の第一及び前記の第二のリンカーが同一である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
23. 前記の第一のリンカーが前記の第一の重鎖のＮ末端に及び前記の第一の軽鎖のＣ末端に共有結合し、そして前記の第二のリンカーが前記の第二の重鎖のＮ末端に及び前記の第二の軽鎖のＣ末端に共有結合している、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
24. 前記の第一及び前記の第二のエピトープが同じ標的タンパク質上にある、請求項１記載のタンパク質。
25. 前記の第一及び前記の第二のエピトープが異なる標的タンパク質上にある、請求項１記載のタンパク質。
26. 第三のエピトープに対して特異的な第三の結合単位をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
27. 前記の第三の結合単位が、前記の第一又は第二の重鎖のＣ末端に共有結合している、請求項２６記載のタンパク質。
28. 前記の第三の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の軽鎖のＮ末端に共有結合している、請求項２６記載のタンパク質。
29. 第四のエピトープに対して特異的な第四の結合単位をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のタンパク質。
30. 前記の第四の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の重鎖のＣ末端に共有結合している、請求項２９記載のタンパク質。
31. 前記の第四の結合単位が、前記の第一又は前記の第二の軽鎖のＮ末端に共有結合している、請求項２９記載のタンパク質。
32. 前記の第三及び／又は前記の第四の結合単位がｓｃＦｖである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のタンパク質。
33. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
34. 請求項１〜３２のいずれか一項に記載の軽鎖又は重鎖をコードしている配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
35. 請求項３４記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
36. 請求項３４記載の１つ以上のポリヌクレオチド又は請求項３５記載の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞。
37. ａ）請求項３６記載の宿主細胞を得る工程；及び
    ｂ）宿主細胞を培養する工程
    を含むタンパク質の産生法。
38. 前記タンパク質を回収及び精製する工程をさらに含む、請求項３７記載の方法。

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