KR20180021875A

KR20180021875A - 다중특이적 결합 단백질

Info

Publication number: KR20180021875A
Application number: KR1020187002753A
Authority: KR
Inventors: 라즈쿠마르 가네산; 산자야 싱; 압둘살람 샤반
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2018-03-05
Also published as: US20170002097A1; AU2016285858A1; JP2018519832A; IL256298A; EA201890177A1; CN107949570A; PH12017502277A1; CL2017003311A1; MX2017016842A; EP3317299A1; WO2017004149A1; CA2986066A1; JP2021119788A; BR112017025872A2

Abstract

본 발명은 일반적으로 다중특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 단백질의 제조 방법 및 이러한 단백질의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 개시된다.

Description

다중특이적 결합 단백질

단일치료요법으로서의 모노클로날 항체는 암 및 면역학적 질환을 포함하는 각종 질환의 치료를 위해 상당히 성공적으로 사용되었다. 이의 표적에 특이적으로 결합하는 이의 능력은 의학의 진보로 이어졌다. 그러나, 일부 치료요법에서는, 하나 이상의 표적의 조정이 유리할 수 있으며, 하나 이상의 표적 단백질 또는 표적 단백질상의 상이한 에피토프들에 결합하는 생물학적 분자는 모노클로날 항체와 비교하여 추가의 이득을 제공할 수 있다.

하나 이상의 표적에 결합하는 생물학적 구조에 대한 수많은 고안이 제안되었지만, 다중특이적 생물학적 분자의 개발은 도전해 볼 만한 과제일 수 있다. 가장 통상적인 이중특이적 분자의 생성 방법은 폴리펩타이드 링커에 의한 항체 단편의 유전적 융합이다. IgG의 대칭적 성질로 인해서, 항체 도메인 융합 이중특이성은 천연적으로 2가이다. 그러나, 특정 사례에서, 2가는 목적하지 않는 효능제 활성을 초래한다. 류신 지퍼와 같은 다량체화 도메인이 2가지 결합 특이성을 강제로 단일 분자로 만드는데 사용되었다. 링커는 이중특이적 분자의 조작에 있어 이점을 갖지만, 치료 환경에서 문제를 유발할 수도 있다. 실제로, 이러한 외래 펩타이드들은 링커 자체 또는 펩타이드와 링커 사이의 접합에 대한 면역반응을 야기할 수 있다. 이러한 구조는 또한 생체내에서 감소된 안정성을 가질 수 있고/있거나 발현되기 어려워서, 균질성의 부족 또는 부분적 아미노산 쇄의 생성을 초래할 수 있다.

2가지 상이한 중쇄의 이종이량체를 생성시키는 다른 전략들이 고안되었다. 그러나, 이러한 전략들은 중쇄 각각의 상당량의 목적하지 않는 동종이량체 형성 및 경쇄의 미스페어링(mispairing)에 의해 방해를 받는다. 다중특이적 구조의 추가의 문제점은 또한 기능성의 감소, 예를 들면 표적에 대한 친화성을 감소시키는 것이다.

따라서 요약하면, 이중특이적 생물학적 분자의 고안 및 개발은 수많은 과제를 안고 있고, 적절한 약리학적 특성을 갖고 효과적으로 제조될 수 있는 다중특이적 결합 단백질에 대한 필요성이 존재한다.

따라서, 본 발명의 한가지 목적은 바람직한 생물물리학적 및/또는 약리학적 특성을 갖는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 고수준의 균질성 및/또는 온전성(integrity)을 산출할 수 있는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은, 예를 들면 포유동물 세포에서, 효과적으로 생산될 수 있는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 이들의 결합 모이어티의 기능성을 유지하는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 결합 모이어티의 선택의 유연성을 가능케 하는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 목적하지 않는 면역반응을 피하는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 안정성과 같은 바람직한 개발가능성 특성을 갖는 다중특이적 결합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기 제시한 임의의 목적들의 조합을 포함한다.

발명의 요약

본 발명은 상기 필요성을 해소하고 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 적어도 2개의 결합 유닛을 포함하는 단백질을 제공한다. 한 양상에서, 본 발명은 제1 에피토프에 특이적인 제1 결합 유닛을 형성하는 제1 중쇄와 제1 경쇄 및 제2 에피토프에 특이적인 제2 결합 유닛을 형성하는 제2 중쇄와 제2 경쇄를 포함하는 단백질을 포함한다. 한 양상에서, 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄들 중 하나의 동종이량체의 형성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 한 양상에서, 이러한 아미노산 변화는 제1 중쇄의 위치 366의 타이로신(Y)[T366Y, EU 번호매김](Edelman et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85) 및 제2 중쇄의 위치 407의 트레오닌(T)[Y407T, EU 번호매김]이다. 한 양상에서, 이러한 아미노산 변화는 제1 중쇄의 위치 366의 트립토판(W)[T366W] 및 제2 중쇄의 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]이다. 한 양상에서, 중쇄는 IgG₁ 또는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된 중쇄이다. 한 양상에서, 제1 중쇄는 위치 366의 트립토판(W)[T366W] 이외에도 위치 354의 시스테인(C)[S354C]을 포함하고 제2 중쇄는 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V] 이외에도 위치 349의 시스테인(C)[Y349C]을 포함한다. 한 양상에서, 중쇄는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된 중쇄이다. 2개의 중쇄 내 이러한 아미노산 변화의 포함은 2개의 중쇄의 이종이량체화를 촉진시키고 동종이량체의 형성을 최소화한다. 이들 아미노산 변화는 또한 인 실리코(in silico) 평가에 근거할 때 낮은 면역원성을 갖는다(De Groot et al. Trends Immunol. 2007 Nov;28(11):482).

한 양상에서, 본 발명의 단백질 내의 제1 중쇄 또는 제2 중쇄는 스타필로코커스 단백질 A(staphylococcal Protein A)에의 중쇄 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 이러한 아미노산 변화는 중쇄들 중 하나의 위치 435의 아르기닌[H435R, EU 번호매김] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F, EU 번호매김]이다. 이러한 2가지 돌연변이는 CH3 도메인 내에 위치하며 중쇄들 중 하나에 혼입되어 단백질 A에의 결합을 감소시킨다. 이러한 2가지 변화는 단백질 정제 동안 중쇄의 동종이량체 및 기타 불순물의 제거를 촉진한다. 한 양상에서, 본 발명에서, 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]은 위치 407[Y407T]의 트레오닌(T)을 또한 포함하는 중쇄 내에 포함된다. 한 양상에서, 본 발명의 단백질에서, 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]은 위치 366[T366S]의 세린(S), 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 또한 포함하는 중쇄 내에 포함된다.

추가 양상에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 본 발명의 단백질에서 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통해 이종이량체를 형성한다.

추가 양상에서, 본 발명의 단백질에서, 결합 유닛들 중 하나 내의 중쇄 및 경쇄는 링커를 통해 공유 결합된다. 한 양상에서, 2개의 결합 유닛 내의 중쇄 및 경쇄는 각각 링커를 통해 공유 결합된다. 이는 단백질의 발현 및 정제 동안 경쇄의 미스페어링을 방지하고 결합 유닛들의 기능성 및/또는 결합 친화성을 손상시키지 않으면서 본 발명의 단백질에서 광범위한 경쇄들이 사용될 수 있게 한다.

한 양상에서, 본 발명의 단백질에서 사용되는 링커는 26 내지 42개의 아미노산, 예를 들면 30 내지 40개 아미노산을 포함한다. 추가 양상에서, 본 발명의 단백질에서 사용되는 링커는 34 내지 40개의 아미노산, 예를 들면, 36 내지 39개의 아미노산, 예를 들면, 38개의 아미노산을 포함한다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은, 제1 아미노산 쇄 및 제2 아미노산 쇄를 포함하는 단백질로서, 여기서 상기 제1 쇄가 그 자체가 제1 중쇄에 공유 결합되어 있는 링커에 공유 결합된 제1 경쇄를 포함하고, 상기 제2 쇄가 그 자체가 제2 중쇄에 공유 결합되어 있는 링커에 공유 결합된 제2 경쇄를 포함하는 단백질을 제공한다.

한 양상에서, 이의 N-말단부터 시작하여, 제1 쇄는 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이의 N-말단부터 시작하여, 제2 쇄는 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 양상에서, 제1 쇄 및 제2 쇄 둘 다는, 이들의 N-말단부터 시작하여, 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.

생성된 단백질은 IgG보다 약간 큰 전체 Fc를 보유하고, 예를 들면 각각 하나의 표적 단백질에 대한 결합 부위 또는 표적 단백질상의 에피토프에 대한 결합 부위의 2개의 독립적인 결합 부위를 갖는다. 이러한 포맷은 발현 및 정제 후에 이질성을 크게 감소시키고 결합 모이어티의 기능적 특성을 유지한다. 이는 또한, 예를 들면 포유동물 세포에서 잘 발현되는 균질한 단백질이 발현될 수 있도록 한다. 본 발명의 단백질은 허용되는 면역원성 프로파일을 갖고 만족스러운 시험관내 및 생체내 안정성을 갖는다.

본 발명은 추가로 본 발명의 단백질의 아미노산을 암호화하는 핵산 서열 및 DNA 분자를 개시한다. 본 발명은 추가로 이러한 핵산 서열 및 DNA 분자를 포함하는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 세포를 개시한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 단백질의 생산 방법 및 이러한 단백질의 사용 방법, 예를 들면, 치료학적 방법을 개시한다.

본 발명의 단백질은 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법에서 유용하다. 치료 또는 예방되는 질환 또는 장애는 본 발명의 단백질 내의 결합 유닛의 특이성, 즉 결합 유닛에 의해 인식되는 표적 단백질(들)에 의존할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 환자에게 투여함을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 예를 들면, 포유동물, 특히 인간에서의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 의약에서 사용하기 위한 본 발명의 단백질을 제공한다.

따라서, 한 실시형태에서, 본 발명은

a) 제1 에피토프에 특이적인 제1 결합 유닛을 형성하는 제1 중쇄와 제1 경쇄 및

b) 제2 에피토프에 특이적인 제2 결합 유닛을 형성하는 제2 중쇄와 제2 경쇄

를 포함하는 단백질로서, 여기서, 상기 제1 중쇄가 위치 366의 타이로신(Y)[T366Y]을 포함하고, 상기 제2 중쇄가 위치 407의 트레오닌(T)[Y407T]을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하는 단백질을 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은

를 포함하는 단백질로서, 여기서, 상기 제1 중쇄가 위치 366의 트립토판(W)[T366W]를 포함하고 상기 제2 중쇄가 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하는 단백질을 제공한다.

한 실시형태에서, 중쇄는 IgG₁ 또는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된다. 한 실시형태에서, 중쇄는 IgG₁의 중쇄로부터 유래된다. 한 실시형태에서, 중쇄는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된다.

한 실시형태에서, 제2 중쇄는 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 및 제2 중쇄는 YTE 돌연변이(M252Y/S254T/T256E)를 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 4, 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제2 중쇄는 서열번호 3, 5, 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄는 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 중쇄는 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 중쇄는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 제2 중쇄는 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 제2 중쇄는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 또는 제2 경쇄는 서열번호 2 또는 35의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 각각 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 3의 아미노산을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 각각 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각가 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 각각 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 각각 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, 제1 경쇄 및 제2 경쇄는 각각 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 경쇄 및/또는 제2 경쇄는 서열번호 2의 아미노산 서열 대신에 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 제1 링커를 통해 공유 결합된다. 한 실시형태에서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 제2 링커를 통해 공유 결합된다. 한 실시형태에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 제1 링커를 통해 공유 결합되고 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 제2 링커를 통해 공유 결합된다.

한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 26 내지 42개의 아미노산을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 30 내지 40개의 아미노산을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 34 내지 40개의 아미노산을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 36 내지 39개의 아미노산을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 38개의 아미노산을 포함한다.

한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 글리신 및 세린 아미노산을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및/또는 제2 링커는 서열번호 6 내지 서열번호 14 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 상기 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 길이를 갖는다. 한 실시형태에서, 상기 제1 링커 및 제2 링커는 동일하다. 한 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 링커는 서열번호 6 내지 서열번호 14 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

한 실시형태에서, 제1 링커는 제1 중쇄의 N-말단 및 제1 경쇄의 C-말단에 공유 결합되고, 제2 링커는 제2 중쇄의 N-말단 및 제2 경쇄의 C-말단에 공유 결합된다.

한 실시형태에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 표적 단백질상에 있다. 한 실시형태에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 표적 단백질상에 있다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 제3 에피토프에 특이적인 제3 결합 유닛을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제3 결합 유닛은 제1 중쇄 또는 제2 중쇄의 C-말단에 공유 결합된다. 한 실시형태에서, 제3 결합 유닛은 제1 경쇄 또는 제2 경쇄의 N-말단에 공유 결합된다.

한 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 제4 에피토프에 특이적인 제4 결합 유닛을 추가로 포함한다. 한 실시형태에서, 제4 결합 유닛은 제1 중쇄 또는 제2 중쇄의 C-말단에 공유 결합된다. 한 실시형태에서, 제4 결합 유닛은 제2 경쇄 또는 제2 경쇄의 N-말단에 공유 결합된다. 한 실시형태에서, 제3 및/또 제4 결합 유닛은 scFv이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 하나 이상의 단리된 폴리펩타이드(들) 또는 상기 기재한 바와 같은 하나 이상의 발현 벡터(들)을 추가로 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같은 숙주 세포를 수득하고 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 단백질의 생산 방법을 추가로 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 상기 단백질을 회수 및 정제함을 추가로 포함한다.

도 1: 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체의 개략도이다. 도 1에 나타낸 이중특이적 항체는 제1 중쇄의 위치 366에서 타이로신(Y)으로의 아미노산 변화[T366Y] 및 제2 중쇄의 위치 407에서 트레오닌(T)으로의 아미노산 변화[Y407T]를 포함한다. 본 발명의 대안적인 이중특이적 항체는 제1 중쇄의 위치 366에서 트립토판(W)으로의 아미노산 변화[T366W] 및 제2 중쇄의 위치 366에서 세린(S)으로의 아미노산 변화[T366S], 위치 368에서 알라닌(A)으로의 아미노산 변화[L368A] 및 위치 407에서 발린(V)으로의 아미노산 변화[Y407V]를 포함한다.
도 2: 분석용 초원심분리에 의한 올리고머화 상태의 평가. 각각 서열번호 23/24 및 서열번호 25/26의 중쇄와 경쇄 쌍 및 2개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 포함하는, 도 1에 도시된 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체는 2단계 정제 후에 >99% 단량체인 것으로 밝혀졌다. 5.64 내지 6.78 S에서의 피크는 단량체를 나타낸다.
도 3: SDS-PAGE: 각각 서열번호 23/24 및 서열번호 27/28의 중쇄와 경쇄 쌍, 및 2개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 포함하는, 도 1에 도시된 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체의 온전성을 SDS-PAGE 겔 전기영동(4 내지 12% 구배 겔)에 의해 평가하였다. 온전한 이중특이적 항체의 추정 분자량은 약 150 kDa이고, 반면에 환원 조건(DTT 50mM)하의 동일한 샘플은 힌지 영역 내의 디설파이드 결합의 환원으로 인해서 약 75 kDa이다. 작은 분자 질량 차이(쇄-A: 74,285 Da 및 쇄-B: 74,430 Da) 때문에, 2개의 쇄는 SDS-PAGE(환원 조건하)에서 구별하기 어렵다.
도 4: 각각 서열번호 27/28 및 서열번호 29/30의 중쇄와 경쇄 쌍 및 2개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 포함하는, 도 1에 도시된 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체의 올리고머화 상태를 분석용 크기-배제 크로마토그래피(전개 완충액(running buffer) 50mM 인산나트륨 pH 6.5, 200mM 아르기닌, 0.05% 아지드화나트륨, TSK3000)에 의해 평가하였다. 2단계 정제의 샘플은 고도로 균질성이었다(>99% 단량체).
도 5a 및 5b: SPR 결합 검정은, 각각 서열번호 23/24 및 서열번호 27/28의 중쇄와 경쇄 쌍 및 2개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 포함하는, 도 1에 도시된 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체가 표적 항원(인간 TNFα, 도 5a)에 대한 결합 친화성을 보유하고 있음을 보여준다. 대조군으로서, 모 IgG(아달리무맙) 중 하나를 또한 인간 TNFα에의 결합에 대해 평가하였다. ZweiMab 이중특이적 항체에 대한 연합속도(on-rate), 해리속도(off-rate)뿐만 아니라 평형 해리속도 상수(K _D) 값은 모 IgG와 유사하다(도 5b). 경쇄와 중쇄 사이의 링커의 존재는 표적 항원 결합을 간섭하지 않는 것으로 보인다.
도 6: 시노몰구스 원숭이 PK 연구를 수컷 나이브(naive) 차이니즈 시노몰구스 원숭이를 사용하여 수행하였다. 서열번호 23/24 및 서열번호 25/26의 중쇄와 경쇄 쌍을 포함하는 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체 및 YTE 돌연변이를 갖는 상응하는 ZweiMab 이중특이적 항체(각각 서열번호 31/24 및 서열번호 32/26의 중쇄와 경쇄 쌍을 포함) 및 4개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 0.6 mg/kg(IV 볼러스(bolus), 단일 투여)에서 투여하였다. 혈청 샘플링을 투여 후 3주 동안 수행하였다.
도 7a 내지 7b: ELISA-기반 방법에서 시험된 Fc 도메인상의 H435Y/R436F 돌연변이의 부재 또는 존재하에서의 단백질 A에의 결합. 각각 Y407T 돌연변이를 또한 포함하는 암(arm)에서의 H435Y/R436F 돌연변이를 갖는 서열번호 23/24 및 서열번호 25/26의 중쇄와 경쇄 쌍 및 2개 쇄 내의 서열번호 7의 링커를 포함하는 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체(AB)는 대조군 IgG1과 유사한 결합 프로파일을 보여준다. Fc의 1개 암에서의 H435Y/R436F 돌연변이는 동종이량체 변이체 중 하나(AA)에 대해 더 약한 단백질-A에의 결합을 초래하고, 반면에 Fc의 2개 암 모두에서의 H435Y/R436F 돌연변이는 동종이량체 변이체(BB)에 대해 단백질-A에의 결합의 현저한 손실을 초래하였다.
도 8: 링커 길이 및 조성의 연구. ZweiMab 이중특이적 항체에서 경쇄와 중쇄를 연결시키는 폴리펩타이드 링커는 길이(22개 aa 내지 42개 aa) 및 조성이 달라지도록 조작하였다. 단백질의 품질은 분석용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 평가하였다.

본 발명은 다중특이적 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 다중특이적 결합 단백질은 표적 단백질에 대한 결합 유닛이 혼입되어 있는 구조를 제공한다. 본 발명의 예시적인 다중특이적 결합 단백질의 일반적 구조가 도 1(이 경우에는 예시적인 이중특이적 결합 단백질)에 도시되어 있지만, 다중특이적 결합 단백질도 또한 본 발명에 포괄된다. 본 발명의 다중특이적 결합 단백질은 본원에서 "ZweiMab", "ZweiMab 항체" 또는 "항체"로서도 언급된다. ZweiMab의 일부 실시형태는 이중특이적이며 본원에서 일부 사례에서 "ZweiMab 이중특이적 항체" 또는 "이중특이적 항체"로서 언급된다. ZweiMab의 일부 실시형태는 다중특이적이며 본원에서 일부 사례에서 "ZweiMab 다중특이적 항체" 또는 "다중특이적 항체"로서 언급된다.

일반적으로, 본 발명의 다중특이적 결합 단백질은 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 적어도 2개의 결합 유닛을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명의 단백질에서 결합 특이성의 수는 추가의 결합 유닛을 본 단백질에 첨가함으로써 증가되어, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들면 삼중특이적 또는 사중특이적 결합 단백질이 생성된다.

한 양상에서, 본 발명의 단백질은 제1 에피토프에 특이적 제1 결합 유닛을 형성하는 제1 중쇄와 제1 경쇄 및 제2 에피토프에 특이적인 제2 결합 유닛을 형성하는 제2 중쇄와 제2 경쇄를 포함한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 단백질 내의 중쇄는 항체의 중쇄로부터 유래되며 하기 기재하는 바와 같은 아미노산 변화를 포함한다. 이러한 중쇄는 전형적으로 아미노산 말단에 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 이어서 3개의 불변 도메인(C_H1, C_H2 및 C_H3)뿐만 아니라 C_H1과 C_H2사이의 힌지 영역을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 단백질 내의 경쇄는 항체의 경쇄로부터 유래된다. 이러한 경쇄는 전형적으로 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(V_L) 및 카복시-말단 불변 도메인(C_L)을 포함한다. 일반적으로, V_L 도메인은 V_H 도메인과 비공유 연합하고, 반면에 C_L 도메인은 통상적으로 디설파이드 결합을 통해 C_H1 도메인에 공유 결합된다. 일반적으로, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 본 발명의 단백질에서 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통해 이종이량체를 형성한다. 본 발명의 범주에서, 중쇄는 예를 들면 IgG, 예를 들면, IgG₁,IgG₂또는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된다. 예를 들면, 본 발명의 중쇄는 IgG₁또는 IgG₄의 중쇄이고 가변 도메인(V_H)에 이어서 3개의 불변 도메인(C_H1, C_H2 및 C_H3)뿐만 아니라 C_H1과 C_H2사이의 힌지 영역을 포함한다. 중쇄의 불변 영역의 예는 서열번호 1, 3 내지 5 및 36 내지 39에 나타내져 있다. 본 발명의 범주에서, 경쇄는 예를 들면 카파(κ) 또는 람다(λ) 경쇄이다. 한 양상에서, 이러한 경쇄는 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(V_L) 및 카복시-말단 불변 도메인(C_L)을 포함한다. 카파 경쇄의 불변 영역의 예는 서열번호 2에 나타내져 있다. 람다 경쇄의 불변 영역의 예는 서열번호 35에 나타내져 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 쇄에서 아미노산의 번호매김은, 본원에서 달리 명시하지 않는 한, EU 번호매김 체계(Edelman, Cunningham et al. 1969)에 따른다. 이는 본원에 표기된 아미노산 번호가, 달리 명시하지 않는 한, EU 번호매김 체계에 따라서 상응하는 서브타입(예: IgG₁또는 IgG₄)의 중쇄 내의 위치에 상응함을 의미한다.

한 양상에서, 본 발명의 단백질 내의 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 각각 중쇄의 동종이량체의 형성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함한다. 이들 아미노산 변화를 통해서, 중쇄들 중 하나의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예: 타이로신 또는 트립토판)으로 대체됨으로써 "돌출부"(protrusion)가 중쇄들 중 하나에 생성된다. 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 측쇄(예: 알라닌 또는 트레오닌)로 대체됨으로써 다른 중쇄의 계면에 동일하거나 유사한 크기의 보충적 "공동"이 생성된다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체, 특히 "돌출부"를 갖는 중쇄의 동종이량체와 같은 원치않는 최종 생성물을 능가하도록 증가시키는 기전을 제공한다(예를 들면, 문헌[Ridgway et al. Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21] 참조). 한 양상에서, 이러한 아미노산 변화들은 제1 중쇄의 위치 366의 타이로신(Y)[T366Y] 및 제2 중쇄의 위치 407의 트레오닌(T)[Y407T]이다. 대안적 양상에서, 제1 중쇄는 위치 366의 세린(S)[T366S]을 포함하고 제2 중쇄는 위치 366의 트립토판(W)[T366W], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 포함한다. 대안적 양상에서, 제1 중쇄는 위치 366의 트립토판(W)[T366W]을 포함하고 제2 중쇄는 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 중쇄는 IgG₁ 또는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된 중쇄이다.

한 양상에서, 제1 중쇄는 위치 366의 트립토판(W)[T366W] 이외에도 위치 354의 시스테인(C)[S354C]을 포함하고 제2 중쇄는 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V] 이외에도 위치 349의 시스테인(C)[Y349C]을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 중쇄는 IgG₄의 중쇄로부터 유래된 중쇄이다.

상기 아미노산 변화, 예를 들면, 제1 중쇄의 위치 366의 아미노산 변화[T366Y] 및 제2 중쇄의 위치 407의 아미노산 변화[Y407T]는 낮은 면역원성이라는 추가의 이득이 있다.

추가 양상에서, 본 발명의 단백질 내의 제1 중쇄 또는 제2 중쇄는 단백질 A에의 중쇄의 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변화를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 이러한 아미노산 변화들은 중쇄들 중 하나의 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]이다. 두 변화 모두 인간 IgG3(IgG3은 단백질 A에 결합하지 않는다)의 서열로부터 유래된다. 이들 2가지 돌연변이는 CH3 도메인 내에 위치하며 중쇄들 중 하나에 혼입되어 단백질 A에의 결합을 감소시킨다(예를 들면, 문헌[Jendeberg et al. J Immunol Methods, 1997. 201(1): p. 25-34]을 참조). 이들 2가지 변화는 단백질 정제 동안 이들 변화를 포함하는 중쇄의 동종이량체의 제거를 촉진한다(예를 들면, 도 7a 내지 7b를 참조).

한 양상에서, 본 발명의 단백질에서, 위치 407의 트레오닌(T)[Y407T]을 포함하는 중쇄는 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함한다. 상기 경우에, 나머지 중쇄는 위치 366의 타이로신(Y)[T366Y]을 포함하지만, 위치 435 및 위치 436의 두 변화는 포함하지 않는다. 이는, 예를 들면, 도 1에 도시되어 있다. 대안으로, 한 양상에서, 본 발명의 단백질에서 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 포함하는 중쇄는 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]를 추가로 포함한다. 상기 경우에, 나머지 중쇄는 위치 366의 트립토판(W)[T366W]을 포함하지만, 위치 435 및 위치 436의 두 변화는 포함하지 않는다. 따라서, 상기 기재한 바와 같은 "공동"을 생성시키는 아미노산 변화를 포함하는 중쇄는 또한 단백질 A에의 결합을 감소시키는 아미노산 변화를 포함한다. 이러한 중쇄를 포함하는 동종이량체는 단백질 A에의 결합의 감소를 통해 제거된다. "돌출부"를 포함하는 나머지 중쇄의 동종이량체의 생산은 "돌출부"의 존재에 의해 감소된다.

추가 양상에서, 본 발명의 단백질에서, 결합 유닛들 중 하나의 중쇄 및 경쇄는 링커를 통해 공유 결합된다. 추가 양상에서, 2개의 결합 유닛의 중쇄 및 경쇄는 각각 링커를 통해 공유 결합된다. 이는 단백질의 발현 및 정제 동안 경쇄의 미스페어링을 방지하고 결합 유닛들의 기능성 및/또는 결합 친화성을 손상시키지 않으면서 본 발명의 단백질에서 광범위한 경쇄들이 사용될 수 있게 한다.

한 양상에서, 제1 링커는 제1 중쇄의 N-말단 및 제1 경쇄의 C-말단에 공유 결합되고 제2 링커는 제2 중쇄의 N-말단 및 제2 경쇄의 C-말단에 공유 결합된다. 한 양상에서, 본 발명의 단백질에서 사용되는 링커는 26 내지 42개의 아미노산, 예를 들면, 30 내지 40개의 아미노산을 포함한다. 추가 양상에서, 본 발명의 단백질에서 사용되는 링커는 34 내지 40개의 아미노산, 예를 들면, 36 내지 39개의 아미노산, 예를 들면, 38개의 아미노산을 포함한다. 한 양상에서, 상기 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 길이를 갖는다. 한 양상에서, 상기 제1 링커 및 제2 링커는 상이한 길이를 갖는다. 한 양상에서, 상기 제1 및 제2 링커는 동일하다. 한 양상에서, 상기 제1 및 제2 링커는 상이한 서열 조성을 갖는다. 본 발명의 단백질에서 사용되는 링커의 대표적 예는 본원의 표 2 및 도 8에 나타낸다.

추가 양상에서, 본 발명의 단백질의 Fc 도메인은 YTE 돌연변이(M252Y/S254T/T256E, EU 번호매김(Dall'Acqua, Kiener et al. 2006))를 추가로 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 돌연변이들은 pH 6.0에서 신생아 FcRn 수용체에 대한 결합 친화성의 우선적 증진을 통해서 Fc 도메인의 약동학적 특성을 개선시키는 것으로 나타났다.

추가 양상에서, IgG1의 중쇄로부터 유래된 본 발명의 중쇄는 또한 "KO" 돌연변이(L234A, L235A)를 포함한다. 추가 양상에서, IgG4의 중쇄로부터 유래된 본 발명의 중쇄는 또한 Pro 힌지 돌연변이(S228P)를 포함한다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은, 제1 아미노산 쇄 및 제2 아미노산 쇄를 포함하는 단백질로서, 여기서 상기 제1 쇄가 그 자체가 제1 중쇄에 공유 결합되어 있는 링커에 공유 결합된 제1 경쇄를 포함하고 상기 제2 쇄가 그 자체가 제2 중쇄에 공유 결합되어 있는 링커에 공유 결합된 제2 경쇄를 포함하는 단백질을 제공한다.

한 양상에서, 이의 N-말단부터 시작하여, 제1 쇄는 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이의 N-말단부터 시작하여, 제2 쇄는 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 양상에서, 제1 쇄 및 제2 쇄 둘 다는 이들의 N-말단부터 시작하여 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 링커, 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다.

생성된 단백질은 전체 Fc를 보유하고, 이는 IgG보다 약간 크고, 예를 들면 각각 하나의 표적 단백질에 대한 결합 부위 또는 표적 단백질상의 에피토프에 대한 결합 부위의 2개의 독립적인 결합 부위를 갖는다. 이러한 포맷은 발현 및 정제 후에 이질성을 크게 감소시키고 결합 모이어티의 기능적 특성을 유지한다. 이는 또한, 예를 들면, 포유동물 세포에서 잘 발현되는 균질한 단백질이 발현될 수 있게 한다. 본 발명의 단백질은 허용되는 면역원성 프로파일을 갖고 만족스러운 시험관내 및 생체내 안정성을 갖는다.

본 발명의 다중특이적 결합 단백질은 2개의 상이한 에피토프에 특이적인 적어도 2개의 결합 유닛을 포함한다. 한 양상에서, 상기 2개의 에피토프는 2개의 상이한 표적 단백질의 에피토프이다. 다른 양상에서, 2개의 에피토프는 동일한 표적 단백질의 에피토프이다. 예를 들면, 복합체 내에 존재하는 표적 또는 격리 및/또는 군집화가 요망되는 표적과 같은 다수의 표적 단백질에의 결합은 결합 단백질의 치료학적 특성을 증가시킬 수 있다. 대안으로, 동일한 표적 단백질의 하나 이상의 에피토프에의 결합은 표적 단백질상의 오직 하나의 에피토프에만 결합하는 단일특이적 단백질보다 더 큰 특이성을 부여할 수 있다.

에피토프는 가장 통상적으로 단백질, 짧은 펩타이드 또는 이들의 조합이다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산인 것으로 사료된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 예를 들면, 적어도 7개의 아미노산 또는 예를 들면, 적어도 9개의 아미노산 또는 예를 들면, 약 15 내지 약 20개의 아미노산을 함유한다. 결합 유닛은 이의 3차 형태로 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있으므로, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속적일 필요가 없으며, 일부 경우에, 심지어 동일한 펩타이드 쇄 상에 존재하지 않을 수 있다. 에피토프는 X-선 결정학, 핵자기공명, 수소/중수소 교환 질량 분광계(HXMS), 부위-특이적 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 펩타이드 스크리닝 방법과 같은 당해 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 유닛에 의해 인식되는 표적 단백질의 쌍들은 동일한 생화학적 경로 또는 상이한 경로에 있을 수 있다.

한 양상에서, 본 발명에 따른 결합 단백질의 결합 유닛은 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함한다. 이러한 가변 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 최적화된 가변 도메인일 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 가변 도메인은 본원에 기재한 바와 같은 3개의 CDR을 포함한다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 결합 단백질 또는 이 단백질의 특정 부분은 일반적으로 항체로부터 유래된다. 항체 또는 면역글로불린의 일반적 구조는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이들 분자는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진, 전형적으로 약 150,000달톤(dalton)의 이종사량체성 당단백질이고, 전형적으로 전장 항체로서 언급된다. 각각의 경쇄는 하나의 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 공유 결합되어 이종이량체를 형성하고, 이종사량체성 분자는 이종이량체들의 2개의 동일한 중쇄들 사이의 공유 디설파이드 결합을 통해 형성된다. 경쇄 및 중쇄가 하나의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합되지만, 2개의 중쇄들 사이의 디설파이드 결합의 수는 면역글로불린 이소타입에 의해 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노-말단에 가변 도메인(V_H)에 이어서 3개 또는 4개의 불변 도메인(C_H1, C_H2, C_H3 및 C_H4), 및 C_H1과 C_H2 사이에 힌지 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 아미노-말단 가변 도메인(V_L) 및 카복시-말단 불변 도메인(C_L)을 갖는다. V_L 도메인은 V_H 도메인과 비공유 연합하고, 반면에 C_L 도메인은 흔히 디설파이드 결합을 통해 C_H1 도메인에 공유 결합된다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 믿어진다(Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). 가변 도메인은 또한 본원에서 가변 영역으로서도 언급된다.

가변 도메인내 특정 도메인은 상이한 항체들 사이에서 상이한데, 즉, "초가변적(hypervariable)"이다. 이들 초가변적 도메인은 이의 특이적 항원 결정인자에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에 직접 관여하는 잔기를 함유한다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변성은 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변성 루프(HVL)로서 공지된 3개의 분절(segment)내에 집중되어 있다. CDR은 문헌[Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]에서 서열 비교에 의해 정의되어 있는 반면, HVL(또한 본원에서 CDR로 언급됨)은 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 기재된 바와 같이, 가변 도메인의 3차원 구조에 따라 구조적으로 정의되어 있다. 이들 2가지 방법은 CDR의 약간 상이한 동정을 초래한다. 카뱃(Kabat)에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인 내에서 CDR-L1은 약 24 내지 34번 잔기에 위치하며, CDR-L2는 약 50 내지 56번 잔기에 위치하고 CDR-L3은 약 89 내지 97번 잔기에 위치하며; 중쇄 가변 도메인에서 CDR-H1은 약 31 내지 35번 잔기에 위치하고, CDR-H2는 약 50 내지 65번 잔기에 위치하며 CDR-H3은 약 95 내지 102번 잔기에 위치한다. 특정한 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 의존하여 달라질 것이다. 당해 분야의 숙련가는, 어떤 잔기가 소정의 항체의 가변 영역 아미노산 서열 내에 특정한 CDR을 포함하는지를 일상적으로 측정할 수 있다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3는 소정의 항체에 대해 특이적인 독특하고 기능적인 특성들을 정의한다.

각각의 중쇄 및 경쇄 내의 3개의 CDR은 덜 가변적인 경향이 있는 서열을 함유하는 골격 영역(FR)에 의해 분리된다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지, FR 및 CDR은 다음 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. FR의 거대한 β-시트 입체배치는 쇄 각각내 CDR이 서로 간에 및 다른 쇄로부터의 CDR에 밀접하게 근접하도록 한다. 비록 모든 CDR 잔기가 항원 결합에 필수적으로 직접 관여하는 것은 아니나, 수득되는 입체구조는 항원 결합 부위에 기여한다(문헌[Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669] 참조).

FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 이펙터 기능을 매개한다. 일부 FR 잔기는 적어도 3가지 방식으로 항원 결합에서 유의적인 효과를 가지는 것으로 사료된다: 에피토프에의 직접적인 비공유 결합에 의한 방식, 하나 이상의 CDR 잔기와의 상호작용에 의한 방식, 및 중쇄와 경쇄 사이의 계면에 영향을 미치는 방식. 불변 도메인은 항원 결합에 직접 관여하지 않지만 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 상보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)에서의 항체의 관여와 같은 다양한 Ig 이펙터 기능을 매개한다.

척추동물 면역글로불린의 경쇄는, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 분명히 별개인 클래스들인 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정된다. 비교에 의해, 포유동물 면역글로불린의 중쇄는, 불변 도메인의 서열에 따라 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 중 하나로 지정된다. IgG 및 IgA는 소부류(이소타입), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 세분된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라고 불린다. 본래의 면역글로불린의 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 익히 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이펙터 기능을 매개하는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 상보체-의존성 세포독성(CDC) 반응을 제공할 수 있다. 이펙터 도메인(들)은 예를 들면, Ig 분자의 Fc 영역일 수 있다.

항체의 이펙터 도메인은 임의의 적합한 척추동물 종 및 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 상이한 동물 종으로부터의 이소타입은 이펙터 기능을 매개하는 능력에 있어서 상이하다. 예를 들면, CDC 및 ADCC/ADCP를 매개하는 인간 면역글로불린의 능력은 일반적으로 각각 IgM 스캐닝 IgG₁스캐닝 IgG₃>IgG₂>IgG₄ 및IgG₁스캐닝 IgG₃>IgG₂/IgM/IgG₄의 순서이다. 뮤린 면역글로불린은 CDC 및 ADCC/ADCP를 일반적으로 각각 뮤린 IgM 스캐닝 IgG₃>>IgG_2b>IgG_2a>>IgG₁ 및IgG_2b>IgG_2a>IgG₁>>IgG₃의 순서로 매개한다. 다른 예에서, 뮤린 IgG_2a는 ADCC를 매개하고, 반면에 뮤린 IgG_2a 및IgM 둘 다는 CDC를 매개한다.

용어 "항체"는 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 및 가변 도메인 및 하나 이상의 목적하는 생물학적 활성/활성들을 나타내는 항체의 다른 부분과 같은 항체 단편을 포괄한다.

용어 "단량체"는 항체의 동종 형태를 말한다. 예를 들면, 전장 항체의 경우, 단량체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 갖는 단량체성 항체를 의미한다. 본 발명의 범주에서, 단량체는 본원에 기재된 바와 같은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 갖는 본 발명의 단백질을 의미한다.

용어 "항체 단편"은 가변 영역 또는 기능적 능력이 유지되는 전장 항체의 일부분을 말한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

전장 항체를 파파인 또는 펩신과 같은 효소로 처리하여 유용한 항체 단편을 생성할 수 있다. 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일의 항원-결합 부위 및 잔류성 "Fc" 단편을 갖는 2개의 동일한 항원-결합 항체 단편을 생산하는데 사용된다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 C_H1 도메인을 함유한다. 펩신 처리로 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원과 교차-결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 수득한다.

'Fab' 단편은 C_H1 도메인의 C-말단에서 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 추가의 잔기의 존재에 의해 Fab 단편과는 상이하다. F(ab')₂ 항체 단편은 힌지 영역내 시스테인 잔기에 의해 연결된 Fab' 단편의 쌍이다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

"Fv" 단편은 단단한, 비공유 연합 내의 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진 온전한 항원-인식 및 결합 부위를 함유한다. 이러한 입체배치에서, 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면상의 항원-결합 부위를 정의한다. 총체적으로, 6개의 CDR이 항체에 대해 항원-결합 특이성을 부여한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv 변이체이며, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 단일쇄 Fv는 항원을 인식하여 결합할 수 있다. 또한, scFv 폴리펩타이드는 임의로 V_H 도메인과V_L 도메인 사이에 위치한 폴리펩타이드 링커를 함유함으로써 scFv에 의한 항원 결합에 대해 바람직한 3차원 구조의 형성을 촉진한다(예를 들면, 문헌[Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315] 참조).

"최적화된 항체" 또는 "최적화된 항체 단편"은 예정된 항원에 결합할 수 있고, 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 아미노산 서열 변이체, 또는 이의 단편을 포함하는 특정 유형의 키메라 항체이다. "임포트(import)" 서열로서 흔히 언급되는 이러한 비-인간 아미노산 서열은 전형적으로 "임포트" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취해진다. 일반적으로, 최적화된 항체는 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR들 사이에 삽입된, 비-인간 항체의 또는 비-인간 항체로부터 유래된 적어도 CDR 또는 HVL을 포함한다. 특정 마우스 FR 잔기들은 최적화된 항체의 기능에 중요할 수 있으므로 인간 생식선 서열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기들 중 몇몇은 상응하는 마우스 서열의 것과 동일하도록 변형됨이 이해될 것이다. 이러한 과정 동안, 목적하지 않는 아미노산이 또한 제거되거나 변화되어, 예를 들면, 탈아미드화, 바람직하지 않은 전하 또는 친유성 또는 비특이적 결합이 회피된다. "최적화된 항체", "최적화된 항체 단편" 또는 "최적화된"은 때때로 "인간화된 항체", "인간화된 항체 단편" 또는 "인간화된" 또는 "서열-최적화된"으로 언급될 수 있다.

중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 계면("V_L-V_H 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기는 서로에 대해 2개의 쇄의 근접성 또는 배향에 영향을 미치는 것들이다. 쇄간 상호작용에 관여할 수 있는 특정 잔기는 V_L 잔기 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, 및 98번 및 V_H 잔기 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, 및 103번[문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987))에 제시된 번호매김 체계를 이용]을 포함한다. 미국 특허 제6,407,213호는 또한, V_L 잔기 43 및 85, 및 V_H 잔기 43 및 60과 같은 잔기가 이러한 상호작용에 관여할 수 있음을 논의한다. 이들 잔기를 인간 IgG에 대해서만 나타내지만, 이들은 종 전반에 걸쳐 적용될 수 있다. 쇄간 상호작용에 관여하는 것으로 충분히 예상되는 중요한 항체 잔기는 컨센서스 서열내로의 치환을 위해 선택된다.

용어 "컨센서스 서열" 및 "컨센서스 항체"는 임의의 특정 부류, 이소타입 또는 서브유닛 구조, 예를 들면, 인간 면역글로불린 가변 도메인의 모든 면역글로불린내 각각의 위치에 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 말한다. 컨센서스 서열은 특정 종 또는 다수의 종의 면역글로불린에 기초할 수 있다. "컨센서스" 서열, 구조 또는 항체는 특정 실시형태에서 기재된 바와 같은 컨센서스 인간 서열을 포함하며, 임의의 특정 부류, 이소타입 또는 서브유닛 구조의 모든 인간 면역글로불린내 각각의 위치에 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 컨센서스 서열은 각각의 위치에 하나 이상의 공지된 면역글로불린 내에 존재하는 아미노산을 갖지만 임의의 단일 면역글로불린의 전체 아미노산 서열을 정확히 복제할 수 없는 아미노산 서열을 함유한다. 가변 영역 컨센서스 서열은 임의의 천연적으로 생산된 항체 또는 면역글로불린(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), 및 이의 변이체로부터 수득되지 않는다. 중쇄 및 경쇄 컨센서스 서열의 FR은 항체의 제조에 유용한 서열을 제공한다(예를 들면, 미국 특허 제6,037,454호 및 제6,054,297호를 참조).

인간 생식선 서열은 인간 집단에서 천연적으로 발견된다. 이들 생식선 유전자의 조합은 항체 다양성을 생성한다. 항체의 경쇄에 대한 생식선 항체 서열은 보존된 인간 생식선 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자로부터 유래한다. 유사하게, 중쇄 서열은 생식선 v-, d- 및 j-유전자로부터 유래한다(LeFranc, M-P, and LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book"Academic Press, 2001).

"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 단리되고/되거나 회수된 것이다. 항체의 천연 환경의 오염성 성분은 항체의 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있는 물질들이고, 이는 효소, 호르몬 또는 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질일 수 있다. 한 양상에서, 항체는 항체의 적어도 95중량% 초과의 단리물로 정제될 것이다.

단리된 항체는, 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로, 이것이 생산되는 재조합 세포내에서 동일계(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는, 재조합 세포 물질이 제거되는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

용어 "항체 수행능(antibody performance)"은 생체내에서 항원의 항체 인식 또는 항체의 효능에 기여하는 인자를 말한다. 항체의 아미노산 서열의 변화는 폴딩(folding)과 같은 항체 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 항원에 결합하는 항체의 초기 속도(k_a), 항원으로부터 항체의 해리 상수(k_d), 항원에 대한 항체의 친화성 상수(Kd), 비-특이적 결합, 항체의 입체구조, 단백질 안정성 및 항체의 반감기와 같은 물리적 인자에 영향을 미칠 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프 태그된"은 "에피토프 태그"에 융합된 항체를 말한다. "에피토프 태그"는 항체 생산을 위한 에피토프를 제공하기에 충분한 수의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드지만, 항체의 목적하는 활성을 간섭하지 않도록 고안된다. 에피토프 태그는 통상적으로 에피토프 태그에 대해 생성된 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차-반응하지 않을 정도로 충분히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기를 포함하고, 통상적으로 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 또는 약 9 내지 30개의 잔기를 포함한다. 에피토프 태그 및 에피토프에 결합하는 항체의 예에는 flu HA 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5(Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165); c-myc 태그 및 이에 결합하는 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(Paborsky et al., 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553)가 포함된다. 특정 실시형태들에서, 에피토프 태그는 "구제 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)"이다. 본원에서 사용되는 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자(예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 말한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 세포독성제에 접합될 수 있다. 이는 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 임의의 물질이다. 본 용어는 방사활성 동위원소(예를 들면, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, 및 Re¹⁸⁶), 화학치료제, 및 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 이의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 세포독성제는 표준 과정을 이용하여 본 발명의 항체에 커플링시킬 수 있으며, 예를 들면 항체를 사용한 치료요법이 처방된 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 본 발명의 치료학적 항체와 접합될 수 있는 화학치료제의 다수의 예가 존재한다.

항체는 또한 프로드럭과 접합될 수 있다. "프로드럭"은 모 약물과 비교하여 종양 세포에 대한 세포독성이 적고 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 형태로 전환될 수 있는, 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다(예를 들면, 문헌[Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press] 참조). 유용한 프로드럭은 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩타이드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 글리코실화된 프로드럭, β-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭, 및 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로사이토신 및 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재한 화학치료요법제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

진단학적 및 치료학적 모니터링 목적을 위해, 본 발명의 항체를 또한 표지, 표지 단독 또는 표지와 추가의 제2 제제(프로드럭, 화학치료제 등)에 접합시킬 수 있다. 표지는, 다른 제2 제제와 구별하여, 검출가능한 화합물 또는 조성물인 제제를 말하며 이는 본 발명의 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 표지 자체는 검출가능(예를 들면, 방사선동위원소 표지 또는 형광성 표지)하거나, 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다. 표지된 항체는 제조되어 시험관내 및 생체내 진단을 포함하는 다양한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는, 생체내에서 이의 전달에 영향을 미치기 위해 리포좀 제제의 부분으로서 제형화될 수 있다. "리포좀"은 각종 유형의 지질, 인지질, 및/또는 표면활성제로 구성된 작은 소포(vesicle)이다. 리포좀은 임의로 하나 이상의 약제학적으로 활성인 제제 및/또는 표지에 커플링되거나 이와 조합된, 본원에 기재된 항체와 같은 화합물 또는 제형을 포유동물로 전달하기에 유용하다. 리포좀 성분은 일반적으로 생물학적 막의 지질 정렬과 유사한 이중층 형성으로 정렬된다.

본 발명의 특정 양상은 본 발명의 항체, 예를 들면, 본 발명의 항체의 하나 이상의 도메인을 암호화하는 단리된 핵산에 관한 것이다. "단리된" 핵산 분자는, 항체 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 연합되는 적어도 하나의 오염성 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하므로 핵산 분자와는 구별된다.

본 발명의 다양한 양상에서, 항체의 하나 이상의 도메인은 재조합 형태로 발현될 것이다. 이러한 제조합체 발현은 하나 이상의 제어 서열, 즉, 특수 숙주 유기체내에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현을 위해 필수적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 원핵 세포에서 사용하기에 적합한 제어 서열은 예를 들면, 프로모터, 오퍼레이터(operator), 및 리보솜 결합 부위 서열을 포함한다. 진핵세포 조절 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 및 인핸서(enhancer)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 조절 서열은 원핵 및 진핵 숙주 세포내에서 항체의 발현 및 생산에 이용될 수 있다.

핵산 서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 핵산 전서열(presequence) 또는 분비 리더는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 암호화 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 번역이 촉진되도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은, 연결된 DNA 서열이 연속적이며, 분비성 리더의 경우에, 연속성이고 판독 프레임내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 임의로 연속적이다. 연결은 편리한 제한 부위에서 연결하여 달성할 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커를 사용할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 정의 모두는 이의 자손 세포를 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 주요 대상 세포 및 전이의 수와 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다.

치료 목적을 위한 용어 "포유동물"은 인간, 사육 동물 및 농장 동물, 및 동물원, 운동, 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "장애"는 본원에 기재된 항체를 이용한 치료로부터 유리할 수 있는 임의의 병태이다. 이는, 포유동물이 해당 장애에 취약한 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비제한적 예에는 염증, 혈관신생, 자가면역 및 면역학적 장애, 호흡기 장애, 중추신경계 장애, 안구 장애, 심혈관 장애, 암, 혈액학성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 백혈병 및 림프구 악성종양이 포함된다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 병태를 말하거나 이를 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "정맥내 주입"은 동물 또는 인간 환자의 정맥내에 대략 15분 이상, 일반적으로 대략 30 내지 90분의 기간에 걸친 제제의 도입을 말한다.

용어 "정맥내 볼러스(intravenous bolus)" 또는 "정맥내 푸쉬(intravenous push)"는 신체가 약물을 대략 15분 이하, 일반적으로 5분 이하 내에서 제공받도록 동물 또는 인간의 정맥내로 약물을 투여하는 것을 말한다.

용어 "피하 투여"는 약물 용기(receptacle)로부터의 비교적 느리고 지속적인 전달에 의한 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 아래에 위치한 조직 사이의 포켓(pocket)내에의 제제의 도입을 나타낸다. 아래에 위치한 조직으로부터 피부를 위로 그리고 멀리 핀칭(pinching) 또는 드로잉(drawing)하여 포켓을 생성시킬 수 있다.

용어 "피하 주입"은 30분 이하 또는 90분 이하를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기간 동안 약물 용기로부터 비교적 느리고 지속적인 전달에 의한 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게는 피부와 아래에 위치한 조직 사이의 포켓내에의 약물의 도입을 말한다. 임의로, 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 여기서 펌프는 예정된 양의 약물을 30분, 90분, 또는 치료 요법의 길이 전체의 기간과 같은 예정된 기간 동안 전달한다.

용어 "피하 볼러스"는 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물을 투여하는 것을 말하며, 여기서 볼러스 약물 전달은 대략 15분 미만이고; 다른 양상에서는 5분 미만이며, 또 다른 양상에서는 60초 미만이다. 또 다른 추가의 양상에서, 투여는 피부와 아래에 위치한 조직 사이의 포켓내에서 이루어지고, 여기서 포켓은 피부를 아래 위치한 조직으로부터 위로 그리고 멀리 핀칭 또는 드로잉함으로써 생성시킬 수 있다.

용어 "치료학적 유효량"은 치료되는 장애의 증상들 중 하나 이상을 경감시키거나 완화시키는 활성제의 양을 나타내기 위해 사용된다. 다른 양상에서, 치료학적 유효량은 예를 들면 질환 진행을 지연시키는데 효과적인 것으로 입증된 표적 혈청 농도를 말한다. 효능은 치료되는 상태에 따라 종래의 방법으로 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료요법" 등은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 완화 또는 경감, 질환 또는 장애의 진행의 회귀, 지연 또는 중지를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 임상적으로 바람직하거나 유리한 효과를 초래하는 질환 또는 장애에 대한 치료학적 및 예방학적, 또는 억제성 조치를 포함함을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 용어 치료는 질환 또는 장애의 증상의 발병 이전 또는 이후에 제제를 투여함으로써 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거함을 포함한다. 다른 예로서, 상기 용어는 질환의 임상적 징후 후 제제를 투여하여 질환의 증상에 대처함을 포함한다. 또한, 발병 후 및 임상 증상 후 제제의 투여는, 투여가 조직 손상의 정도 또는 전이의 양 또는 정도와 같이, 질환 또는 장애의 임상적 매개변수에 영향을 미치는 경우에 개발되어 왔으며, 치료가 질환의 완화를 초래하거나 초래하지 않는지 여부에 관계없이, 본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료요법"을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 병용되어, 항체 조성물의 부재하의 증상과 비교하여 치료되는 장애의 적어도 하나의 증상을 완화하거나 개선시키는 한, 그 결과는, 장애의 모든 증상들이 완화되거나 완화되지 않는지 여부에 관계없이 근본적인 장애의 효과적인 치료인 것으로 고려되어야 한다.

용어 "패키지 삽입물"은, 이러한 치료학적 생성물의 사용에 관한 표시, 용도, 투여, 금지사항 및/또는 주의사항에 대한 정보를 함유하는 치료학적 생성물의 시판 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 나타내기 위해 사용된다.

본 발명에 따른 단백질의 대표적인 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 표 1에 나타낸다. 본 발명의 결합 단백질에서, 가변 영역은 불변 영역의 N-말단에서 불변 영역에 결합된다. 본원에 기재된 바와 같은 잔기 T366Y, Y407T, H435R, Y436F 및 YTE-돌연변이는 표 1에서 볼드체와 밑줄로 나타내져 있다. 잔기 T366W, T366S, L368A 및 Y407V도 표 1에서 볼드체와 밑줄로 나타내져 있다.

서열번호 1, 3-5, 36 및 38 내의 중쇄 불변 영역은 IgG1로부터 유래된다. 서열번호 36 및 38 내의 중쇄는 "KO" 돌연변이(L234A, L235A, 볼드체와 밑줄로 표시됨)를 또한 포함한다.

서열번호 37 및 39 내의 중쇄 불변 영역은 IgG4로부터 유래되며 Pro 힌지 돌연변이(S228P, 볼드체와 밑줄로 표시됨)를 또한 포함한다.

서열번호 2 내의 경쇄 불변 영역은 카파 쇄이다. 서열번호 35 내의 경쇄 불변 영역은 람다 쇄(람다 6 서브타입)이다.

표 2는 본 발명의 결합 단백질에서 사용된 대표적인 링커들을 나타낸다.

표 3은 본 발명의 결합 단백질에서 사용된 대표적인 경쇄 가변 영역들 및 중쇄 가변 영역들을 나타낸다.

표 4는 본 발명의 결합 단백질의 가변 영역과 불변 영역의 상이한 조합들을 갖는 대표적인 경쇄들 및 중쇄들을 나타낸다. 표 4는 또한 본 발명의 단백질에 포함된 아미노산 쇄의 대표적 예를 나타낸다.

서열번호 49 내지 56에서, 밑줄로 표시된 아미노산 서열들은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이고, 볼드체로 표시된 아미노산 서열은 링커 서열이다. 중쇄 내의 특정 아미노산은 볼드체와 밑줄로 나타내져 있다.

항체 변형

항체는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이는 이펙터 기능과 관련하여 항체를 변형시켜, 암의 치료시 항체의 효능을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 한가지 이러한 변형은 시스테인 잔기(들)의 Fc 영역내로의 도입에 의해 당해 영역내에서 쇄간 이황화물 결합 형성을 허용하는 것이다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내부화 능력 및/또는 증가된 상보체-매개된 세포 사멸 및/또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 개선시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; 및 Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922] 참조). 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 문헌[Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565]에 기재된 바와 같이 이종이기능성 교차-결합제를 사용하여 또한 제조할 수 있다. 대안으로, 항체는 이중 Fc 영역을 함유하도록 조작함으로써 항체의 상보체 분해 및 ADCC 능력을 향상시킬 수 있다(문헌[Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230] 참조).

ADCC를 지지하는 능력이 개선된 항체는 이들의 Fc 영역의 글리코실화 패턴을 변형시켜 생성할 수 있다. 이는, CH2 도메인 내의 아스파라긴 잔기인 N297에서의 항체 글리코실화가, ADCC에 대한 전제조건인 IgG와 Fcγ 수용체 사이의 상호작용에 관여하기 때문에 가능하다. 숙주 세포주는, 이분성(bisecting) N-아세틸글루코사민이 증가되거나 푸코즈가 감소된 것과 같이 글리코실화가 변경된 항체를 발현하도록 조작되었다. 푸코즈 감소는, 이분성 N-아세틸글루코사민의 존재를 증가시키는 것보다 더 큰 ADCC 활성의 향상을 제공한다. 또한, 저 푸코즈 항체에 의한 ADCC의 향상은 FcγRIIIa V/F 다형성과는 독립적이다.

항체의 Fc 영역의 아미노산 서열을 변형시키는 것은 ADCC를 향상시키기 위한 글리코실화 조작에 대한 대안이다. Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG₁ 상의 결합 부위는 광범위한 돌연변이 분석에 의해 측정되었다. 이는, FcγRIIIa에 대한 결합 친화성을 증가시키고 시험관내 ADCC를 향상시키는 Fc 돌연변이를 갖는 IgG₁ 항체를 생성하였다. 추가로, Fc 변이체는, 결합 특성, 예를 들면, 다른 FcγR 수용체에의 결합이 변화되지 않거나 감소된 특정 FcγR 수용체에 대한 향상된 결합의 다수의 상이한 순열을 이용하여 수득되었다.

다른 양상은 화학치료제, 독소(예를 들면, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함한다.

이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기 기재되어 있다. 유용한 면역접합체를 형성하는데 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄[슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터], 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테센 등을 포함한다. 다양한 방사핵이 방사선접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y, 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

항체 및 세포독성제 또는 화학치료제의 접합체는 공지된 방법에 의해 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타렐데하이드), 비스-아지도 화합물[예를 들면, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체[예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., 1987, Science 238:1098]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사선뉴클레오타이드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. 접합체는 또한 절단가능한 링커를 사용하여 형성시킬 수 있다.

본원에 기재된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌[Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030] 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 예를 들면, 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀을 정의된 공극 크기의 여과기를 통해 압출하여 바람직한 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 본원에 기재된 항체의 Fab' 단편은 문헌[Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288]에 기재된 바와 같이 디설파이드 교환 반응을 통해 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학치료제(예를 들면, 독소루비신)는 임의로 리포좀내에 함유된다(예를 들면, 문헌[Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484] 참조).

본원에 기재되고 개시된 항체는 또한 ADEPT(항체-지시된 효소 프로드럭 치료요법) 과정에서 프로드럭(예를 들면, 펩티딜 화학치료제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소에 항체를 접합시킴으로써 사용될 수도 있다(예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 81/01145호, 제WO 88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조). ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 프로드럭을 이의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭에 작용할 수 있는 효소이다. ADEPT에 유용한 구체적인 효소는 포스페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 알칼린 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 아릴설파타제; 비-독성 5-플루오로사이토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키기 위한 사이토신 데아미나제; 펩타이드-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 세라티아 프로테아제, 테르몰라이신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제, 및 카텝신(예를 들면, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키기 위한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키기 위한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 카보하이드레이트-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키기 위한 β-락타마제; 및 이들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 펜아실 그룹으로 유도체화된 약물을 각각 유리 약물로 전환시키기 위한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안으로, 효소 활성을 갖는 항체("아브자임")를 사용하여 프로드럭을 유리 활성 약물(예를 들면, 문헌[Massey, 1987, Nature 328: 457-458] 참조)로 전환시킬 수 있다. 항체-아브자임 접합체는 예를 들면, 효소를 상기 논의한 항체/이종이기능성 가교결합 시약에 공유 결합시킴으로써 아브자임을 종양 세포 집단으로 전달하기 위한 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 대안으로, 상기 기재한 바와 같은 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부위에 연결된 본원에 기재된 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질을 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제할 수 있다(예를 들면, 문헌[Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608] 참조).

특정 실시형태에서, 온전한 항체보다는 항체 단편을 사용하여 조직 침투를 증가시키는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들면, 이의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들면, 구제 수용체 결합 에피토프를 항체 단편내로 혼입시킴에 의해 달성될 수 있다. 한 방법에서, 항체 단편의 적절한 영역은 변경시킬 수 있거나(예를 들면, 돌연변이), 에피토프를 펩타이드 태그내로 혼입시킨 후, 예를 들면 DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 말단 또는 중간에서 항체 단편에 융합시킬 수 있다(예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 96/32478호 참조).

다른 실시형태에서, 공유 변형이 또한 포함된다. 공유 변형은 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 타이로실 잔기, 카복실 측쇄 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀), 글루타밀 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴, 또는 트레오닐 잔기의 변형을 포함한다. 공유 변형의 다른 유형은 항체에 대한 화학적으로 또는 효소적으로 커플링된 글리코시드를 포함한다. 이러한 변형은 경우에 따라, 항체의 화학적 합성 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 달성될 수 있다. 항체의 공유 변형의 다른 유형은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 아미노- 또는 카복시-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시켜 분자내로 도입시킬 수 있다.

항체에 존재하는 어떠한 탄수화물 모이어티(moiety)의 제거도 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 기재되어 있다. 항체에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기재된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.

유용한 공유 변형의 또 다른 유형은, 항체를, 미국 특허 제4,640,835호, 미국 특허 제4,496,689호, 미국 특허 제4,301,144호, 미국 특허 제4,670,417호, 미국 특허 제4,791,192호 및 미국 특허 제4,179,337호 중 하나 이상에 제시된 방식으로 각종 비단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결시키는 것을 포함한다.

서열 최적화 및 아미노산 서열 변이체

항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 항체 DNA내로 도입시키거나, 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변이체는 예를 들면, 본원의 실시예의 항체의 아미노산 서열로부터의 결실 및/또는 상기 서열내로의 삽입 및/또는 상기 서열의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 어떠한 조합이라도 최종 작제물에 도달하도록 이루어지며, 단 최종 작제물은 바람직한 특징을 지닌다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 항체의 번역후 과정을 변경시킬 수 있다.

돌연변이유발을 위한 바람직한 위치에 있는 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 컨닝엄(Cunningham) 및 웰스(Wells)(Science, 244:1081-1085 (1989))에 의해 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 동정되고(예를 들면, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기) 및 중성 또는 음성적으로 하전된 아미노산(전형적으로 알라닌)으로 대체되어 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미친다. 이후에, 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입시킴으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 부위가 사전 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 특성이 사전 결정될 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해서, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고 발현된 항체 변이체를 바람직한 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열간 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합체를 포함한다.

다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 제거된 항체 분자내에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖고 이의 위치내에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환성 돌연변이유발을 위한 가장 흥미있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 5에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재되는 추가의 실질적인 변화가 도입되고 생성물이 스크리닝될 수 있다.

단백질 화학에서, 항체의 생물학적 특징은 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 입체구조로서, 치환 부위내 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서 항체의 효과가 유의적으로 상이한 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 천연 발생 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기초하여 하기 그룹으로 나뉜다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환함을 수반할 것이다.

항체의 적절한 구조를 유지하는데 포함되지 않는 임의의 시스테인 잔기도 또한 일반적으로 세린으로 치환하여 분자의 산성 안정성을 증진시키거나, 비정상적인 가교결합을 방지하거나, 세포독성 또는 세포정지 화합물에 대한 확립된 접합점을 제공할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항체에 첨가하여 이의 안정성(특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우)을 개선시킬 수 있다.

치환성 변이체의 유형은 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 수득된 변이체(들)은, 이들이 생성되는 모 항체에 대해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환성 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은 파아지 디스플레이를 사용하는 친화성 성숙이다. 간략하게 언급하면, 수개의 초가변 영역 부위(예를 들면, 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각각의 위치에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성할 수 있다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자내에서 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 섬유상 파아지 입자로부터 1가 융합체로 나타난다. 이어서, 파아지-디스플레이된 변이체는 이들의 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화성)을 위해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의적으로 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 착체의 결정 구조를 분석하여 항체와 표적 단백질 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본원에 열거한 기술들에 따른 치환을 위한 후보들이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝에 적용시키고 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 변이체의 다른 유형은 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. "변경"은 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 항체내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항체를 변형시켜 글리코실화 부위를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 부착을 말한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린 이외의 임의의 아미노산이다)는 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 이들 트리펩타이드 서열들 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토즈아민, 갈락토즈, 또는 크실로즈 중 하나의 부착을 말하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 소정의 단백질, 예를 들면, 항체를 글리코실화시키기 위해, 단백질의 아미노산 서열을, 상기 기재한 트리펩타이드 서열(N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 중 하나 이상을 함유하도록 조작한다. 변경은 또한 본래의 항체의 서열(O-연결된 글리코실화 부위에 대해)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 이에 의한 치환에 의해 이룰 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원(천연적으로 존재하는 아미노산 서열 변이체의 경우에)으로부터의 단리 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항체의 이전에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis)에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

폴리펩타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법

다른 실시형태는 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포, 및 항체 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들면, 전장 모노클로날 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적인 항체를 포함하는 항체의 임의의 목적하는 형태를 암호화할 수 있다.

항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)은 당해 분야에 공지된 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 제어 서열에 융합시킬 수 있으며 당해 분야에 공지된 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포내에 함유될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 각각은 온전한 항체의 생산을 가능하게 하는, 인간 불변 도메인과 같은, 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 독립적으로 융합시킬 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부는 함께 융합되어 단일쇄 항체의 생산을 위한 주형을 제공할 수 있다.

재조합 생산을 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 재조합 항체를 발현시키기 위한 다수의 적합한 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 시그날 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열.

항체는 또한 융합 폴리펩타이드로서 생산될 수 있으며, 여기서 항체는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 특이적인 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드 또는 시그날 서열과 같은 이종 폴리펩타이드와 융합된다. 선택된 이종 시그날 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된(즉, 시그날 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 항체 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그날 서열은 원핵세포 시그날 서열로 치환될 수 있다. 시그날 서열은 예를 들면, 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, 지단백질, 열-안정성 장내독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 본래의 시그날 서열은 예를 들면, 효모 인버타제 알파-인자(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 산성 포스파타제, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제, 또는 국제 특허 출원 공보 제WO90/13646호에 기재된 시그날로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD 시그날을 사용할 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 암호화하는 DNA에 리딩 프레임내에서 연결된다.

발현 및 클로닝 벡터는, 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포내에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있도록 하고, 복제 오리진 또는 자가 복제하는 서열을 포함하는 것이다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모, 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 오리진이 대부분의 그램 음성 세균, 2-υ에 적합하다. 플라스미드 오리진은 효모에 적합하고 다양한 바이러스 오리진(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)는 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 오리진 성분은 포유동물 발현 벡터의 경우 필요하지 않다(SV40 오리진은 초기 프로모터(early promoter)를 함유하므로 단지 전형적으로 사용될 수 있다).

발현 및 클로닝 벡터는 선택가능한 마커를 암호화하는 유전자를 함유함으로써 발현의 확인을 용이하게 할 수 있다. 전형적인 선택가능한 마커 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하거나, 또는 보체 영양요구성 결함이 있거나 또는 다른 대안으로 복합 배지에 존재하지 않는 특수 영양분, 예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급한다.

선택 계획의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선택 용법에서 생존한다. 이러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포용으로 통상적인 선택가능한 마커는 DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II(예를 들면, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등과 같은 항체를 암호화하는 핵산을 수용하는데 적격한 세포의 동정을 가능하도록 하는 마커이다. DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 우선 형질전환체 모두를 메토트렉세이트(Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 동정된다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(예를 들면, DG44)이다.

대안으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 다른 선택가능한 마커를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시-형질전환된 숙주 세포(특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선택가능한 마커에 대한 선택제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.

재조합 생산이 숙주 세포로서 효모 세포에서 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자(Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)를 선택가능한 마커로서 사용할 수 있다. TRP1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여하고 있는 효모의 돌연변이 균주, 예를 들면, ATCC 수탁번호 44076 또는 PEP4-1(Jones, 1977, Genetics 85:12)에 대한 선택 마커를 제공한다. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈내 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하의 성장에 의해 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, ATCC 수탁번호 20,622 및 38,626과 같은 Leu2p-결핍성 효모 균주는 LEU2 유전자를 지닌 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6㎛의 원형 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 재조합 소(calf) 키모신의 대량 생산을 위한 발현 시스템은 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되어 있다(참조: Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터가 또한 기재되어 있다(Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵세포 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토즈 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 세균 프로모터도 또한 적합하다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: S.D.) 서열을 함유할 것이다.

다수의 진핵세포 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵세포 유전자는, 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 업스트림에 위치한 AT가 풍부한 영역을 갖는다. 다수의 유전자의 전사 개시로부터 상류로 70 내지 80개 염기에서 발견된 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 첨가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이다. 이들 서열 모두는 진핵세포 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모팅 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터 또는 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제, 및 글루코키나제와 같은 다른 당분해 효소에 대한 프로모터를 포함한다.

유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는다. 이는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토즈 및 갈락토즈 이용에 관여하는 효소를 위한 효모 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제EP 73,657호에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는 예를 들면, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-쇼크 프로모터로부터 수득된 프로모터에 의해 제어되며, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.

SV40 바이러스의 초기(early) 및 후기(late) 프로모터는 SV40 바이러스 복제 오리진을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시형 초기 프로모터(immediate early promoter)는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하에 마우스 세포내에서 인간 p-인터페론 cDNA의 발현을 개시하는 문헌[Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]도 참조한다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스 장 말단 반복체(Rous sarcoma virus long terminal repeat)를 프로모터로서 사용할 수 있다.

재조합 발현 벡터에서 사용할 수 있는 다른 유용한 요소는 인핸서 서열이며, 이는 고등 진핵생물에 의해 항체를 암호화하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 사용된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자(예를 들면, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인, 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용된다. 예는 복제 오리진의 후측면(late side)에서의 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 오리진의 후측면의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 요소의 향상의 설명에 대해 문헌[Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]을 참조한다. 인핸서는 항체를 암호화하는 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱(splicing)될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

진핵세포 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다핵 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA를 안정화시키는데 필수적인 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 때때로 3'으로부터의, 번역되지 않은 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 암호화하는 mRNA의 번역되지 않은 부위내에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 분절을 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 국제 특허 출원 공보 제WO94/11026호 및 이에 개시된 발현 벡터를 참조한다. 일부 실시형태에서, 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현시킬 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,888,809호를 참조; 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다).

본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재한 원핵세포, 효모, 또는 고등 진핵세포이다. 당해 목적을 위한 적합한 원핵세포는 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 진정세균, 예를 들면, 에스케리키아, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)와 같은 엔테로박테리아세아에, 엔테로박터, 에르위니아, 크렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들면, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라, 및 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스(B. licheniformis)(예를 들면, 1989년 4월 12일자로 공개된 제DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41 P)와 같은 바실러스, 피, 아에루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스, 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 한가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)와 같은 다른 균주도 적합하다. 이들 예는 제한하는 것이 아니라 예시하는 것이다.

원핵세포 이외에도, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물이 항체를 암호화하는 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 예를 들면, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 윅케라미이(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus)와 같은 클루이베로마이세스 숙주; 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토르스(Pichia pastors)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리초데르마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크로싸(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈와니오마이세스; 및 예를 들면, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)과 같은 섬유상 진균, 및 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)와 같은 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주와 같은, 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 일반적으로 본원에서 이용가능하며 유용하다.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 예를 들면, 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체를 포함하는 식물 및 곤충 세포 및, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 각종 바이러스 균주, 예를 들면, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 널리 이용가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다.

다른 양상에서, 항체의 발현은 척추동물 세포내에서 수행된다. 배양물(조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상의 절차가 되었고, 이 기술은 널리 이용가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질감염된 원숭이 신장 CV1 세포주, 인간 배아 신장 세포주(현탁액 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포)(Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR1(CHO, 문헌[Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216]; 예를 들면, DG44), 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251]), 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 세포(Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이다.

숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기 기재한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 바람직한 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.

본원에 기재된 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 광범위한 배지에서 배양될 수 있다. 햄스(Ham's) F10[제조원: 시그마-알드리치 컴퍼니(Sigma-Aldrich Co.), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재], 최소 필수 배지[(MEM), 제조원: 시그마-알드리치 컴퍼니], RPMI-1640(제조원: 시그마-알드리치 컴퍼니), 및 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)[(DMEM), 제조원: 시그마-알드리치 컴퍼니]과 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255], 미국 특허 제4,767,704호, 미국 특허 제4,657,866호, 미국 특허 제4,927,762호, 미국 특허 제4,560,655호, 미국 특허 제5,122,469호, 국제 특허 출원 공보 제WO 90/103430호, 및 제WO 87/00195호 중 하나 이상에 기재된 배지 중 어느 것이라도 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것도 필수적으로 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액(예를 들면, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들면, 젠타마이신), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충할 수 있다. 다른 보충제는 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지될 수 있는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건이 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용된 것들이며, 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내적으로, 원형질막주위 공간내에서 생산될 수 있거나, 배지내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내적으로 생산되는 경우, 세포는 파괴되어 제1 단계로서 단백질을 방출할 수 있다. 숙주 세포 또는 분해된 단편인 미립자 잔해는 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 문헌(참조: Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167)은 이. 콜라이의 원형질막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 과정을 기재하고 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상층액은 일반적으로 시판되는 단백질 농도 여과기, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치(Millipore Pellicon ultrafiltration unit)를 사용하여 우선 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 이전의 단계들 중 어느 하나에 포함되어 단백질분해를 억제할 수 있으며 항생제가 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다. 각종 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 항체를 단리할 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들면, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피는 대표적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 어떠한 면역글로불린 Fc 도메인의 동형 및 종에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄를 기준으로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13]을 참조). 단백질 G는 모든 마우스 동형 및 인간 감마3용으로 추천된다(예를 들면, 문헌[Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575]을 참조). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로즈이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로즈로 달성될 수 있는 것보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 프로세싱 시간을 허용한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX^TM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제를 위해 유용하다. 또한, 이온 교환 컬럼상에서 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상에서 크로마토그래피, 헤파린상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들면, 폴리아스파르트산 컬럼)상에서의 SEPHAROSE^TM 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 기타 기술들이, 회수될 항체에 따라 이용가능하다.

임의의 예비 정제 단계(들)에 이어서, 목적한 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물을 pH 약 2.5 내지 4.5에서 용출 완충액을 사용하여 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시키고, 전형적으로 저염 농도(예를 들면, 약 0 내지 0.25M의 염)에서 수행할 수 있다.

또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 나타내어진 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부분(예를 들면, 가변 영역을 암호화하는 부위)에 대해 본원에 정의한 바와 같은, 저, 중간 및 고 엄격성 조건(stringency condition) 하에서 하이브리드화하는 핵산이 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은, 전형적으로 길이가 적어도 15(예를 들면, 20, 25, 30 또는 50)개 뉴클레오타이드이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 전부 또는 일부분(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 이의 상보체의 서열에 대해 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기재된 유형의 하이브리드화 핵산은, 예를 들면, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들면, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.

2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트 또는 유사성 퍼센트의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용된 수학적 알고리즘의 바람직한, 비제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램내로 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 워드길이(wordlength)=12를 사용하여 수행하여 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산과 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3을 사용하여 수행함으로써 목적한 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, 갭 BLAST를 문헌[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자들(Id.) 사이의 원거리 관계를 검출하는 반복된 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수(default parameter)를 사용할 수 있다. 서열 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한, 비제한적 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)내로 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위한 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티(penalty) 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘이 당해 분야에 공지되어 있으며 문헌[Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기재된 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup이 2인 경우, 비교되는 2개의 서열내 유사한 영역은 정렬된 잔기의 쌍을 관찰함으로써 발견되며; ktup이 1인 경우, 단일의 정렬된 아미노산이 조사된다. ktup은 단백질 서열의 경우 2 또는 1로 설정될 수 있으며, DNA 서열의 경우 1 내지 6으로 설정된다. ktup이 특정되지 않는 경우 디폴트는 단백질의 경우 2이고 DNA의 경우 6이다. 대안으로, 단백질 서열 정렬은 문헌[Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기재된 바와 같이, CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.

비-치료학적 용도

본원에 기재된 항체는 친화성 정제 제제로서 유용하다. 상기 공정에서, 항체는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 단백질 A 수지와 같은 고체에 고정시킨다. 고정된 항체를 정제될 것을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이어서 지지체를 고정된 항체에 결합된, 표적 단백질을 제외한 샘플 중의 실질적으로 모든 물질을 제거하는 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 지지체를 항체로부터 표적 단백질을 방출할 다른 적합한 용매로 세척한다.

일부 실시형태에서, 예를 들면 진단 목적을 위해 항체를 검출가능한 모이어티로 표지하는 것이 유리할 것이다. 방사선동위원소, 형광성 표지, 표소 기질 표지 등을 포함하는, 다수의 검출가능한 표지가 이용가능하다. 상기 표지는 각종 공지된 기술을 사용하여 항체와 간접적으로 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 항체는 바이오틴과 접합시킬 수 있으며 상기 언급한 표지의 3개의 광범위한 카테고리 중 어느 하나를 아비딘과 접합시킬 수 있거나 그 반대일 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안으로, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성하기 위해, 항체를 소형 합텐(예를 들면 디곡신)과 접합시킬 수 있으며 상기 언급한 표지의 상이한 유형 중 하나를 항-합텐 항체(예를 들면, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합을 달성할 수 있다.

예시적인 방사선동위원소 표지는 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I를 포함한다. 항체는 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs]에 기재된 기술을 사용하여 방사선동위원소로 표지할 수 있다. 방사활성은 예를 들면, 신틸레이션 계수(scintillation counting)로 측정할 수 있다.

예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트)로부터 유래된 표지를 포함할 수 있거나 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리싸민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드(Texas Red)가 이용가능하다. 형광 표지는 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Immunology]에 기재된 것들과 같은, 공지된 기술을 통해 항체에 접합시킬 수 있다. 형광성은 형광계를 사용하여 정량화할 수 있다.

다양한 널리 특징확인된 효소-기질 표지가 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 검토를 위해 미국 특허 제4,275,149호 참조). 효소는 일반적으로 각종 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들면, 변경은 분광광도법으로 측정할 수 있는 기질에서의 색 변화일 수 있다. 대안으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하는 기술은 상기에 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이어서, 예를 들면, 화학발광측정계를 사용하여 측정되거나 광을 방출할 수 있거나 에너지를 형광 수용체에 공여할 수 있다

효소 표지의 예는 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제와 같은 루시퍼라제(참조: 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들면, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이딕 옥시다제(예를 들면, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은 예를 들면 문헌[O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)와 기질로서 수소 퍼옥시다제[여기서, 수소 퍼옥시다제는 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)과 같은 염료 전구체를 산화시킨다]; 알칼린 포스파타제(AP)와 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal)와 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광원성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 같은 발색성 기질을 포함한다.

다수의 다른 효소-기질 조합이 당해 분야의 숙련가에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 미국 특허 제4,318,980호를 참조한다.

다른 실시형태에서, 항체를 표지하지 않고 사용하고 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출한다.

본원에 기재된 항체는 경쟁적 결합 검정, 직접 또는 간접 샌드위치 검정 및 면역침전 검정과 같은 어떠한 공지된 검정 방법에서도 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조).

진단 키트

항체는 진단 키트, 예를 들면, 예정된 양의 시약과 진단 검사를 수행하기 위한 지침서의 패키징된 조합으로 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 기질 및 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체와 같은 효소에 의해 요구되는 보조인자를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들면, 차단 완충액 또는 용해 완충액)과 같은 다른 첨가제 등이 포함될 수 있다. 각종 시약의 상대적 양은 검사의 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변할 수 있다. 시약은 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있다.

치료학적 용도

다른 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 하나 이상의 표적 단백질의 발현과 연관된 각종 장애의 치료에서 유용하다. 장애의 치료 방법은 치료학적 유효량의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다.

항체 또는 제제는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 안구내, 경피, 국소, 경구 흡입 및 비강내 및 경우에 따라, 국소 면역억제 치료를 위해 병변내 투여(이식 전에 이식편을 항체로 관류시키거나 이와 접촉시킴을 포함함)를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 항체 또는 제제는 예를 들면, 주입으로서 또는 볼러스(bolus)로서 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 관절내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는, 특히 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입(pulse infusion)에 의해 적합하게 투여된다. 한 양상에서, 투여는, 투여가 간단한지 또는 만성인지의 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 항체의 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상학적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당 주치의의 재량과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 항체는 환자에게 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다.

질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 15 mg/kg)의 항체는, 예를 들면, 1회 이상의 별도의 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 전형적인 1일 용량은상기 언급한 인자들에 따라, 약 1㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라, 치료는 질환 증상의 바람직한 억제가 일어날 때까지 지속된다. 그러나, 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 진행은 종래 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.

용어 "억제"는 질환의 하나 이상의 특징을 약화시킴을 의미하기 위해 "개선" 및 "완화"와 동일한 문맥으로 본원에서 사용된다.

항체 조성물은, 우수한 의료 행위와 일치하는 양식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 의료인에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 투여될 항체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려에 의해 조절될 것이며 유해 활성과 연관된 장애를 예방하거나, 완화시키거나, 치료하는데 필수적인 최소량이다.

항체는 해당 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만 임의로 이와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의한 다른 인자들에 의존한다. 이들은 일반적으로 앞서 사용된 바와 동일한 용량 및 투여 경로로 또는 이전에 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

약제학적 조성물 및 이의 투여

항체를 포함하는 조성물은 염증 질환, 자가면역질환, 호흡기 질환, 대사 장애 또는 중추신경계(CNS)의 질환, 예를 들면, 염증과 관련된 중추신경계(CNS)의 질환 또는 암에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 염증 질환, 자가면역질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 염증과 관련된 중추신경계(CNS)의 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 의약의 제조에서의 항체의 용도를 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간 및 영장류, 설치류 및 개와 같은 비-인간 포유동물을 의미한다. 본원에 기재된 방법을 사용한 치료용으로 특별히 의도된 대상체는 인간을 포함한다. 항체 또는 제제는 염증 질환, 자가면역질환, 호흡기 질환, 대사 장애, 중추신경계(CNS)의 질환, 예를 들면, 염증과 관련된 중추신경계(CNS)의 질환 또는 암의 예방 또는 치료시에 다른 조성물과 함께 또는 단독으로 투여될 수 있다. 항체 또는 다른 제제와 함께 투여될 수 있는 이러한 제제는 메토트렉세이트(MTX) 및 면역조절인자, 예를 들면, 항생제 또는 소분자를 포함한다.

각종 전달 시스템이 공지되어 있으며 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 안구내, 경막외 및 경구 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체는, 예를 들면, 주입, 볼러스 또는 주사에 의해 투여될 수 있으며, 화학치료제와 같은 다른 생물학적으로 활성인 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 투여는 피하 주사에 의한다. 이러한 주사용 제형은 예를 들면 격주당 1회 투여될 수 있는 예비충전된 주사기에서 제조될 수 있다.

구체적인 실시형태에서, 항체는 주사에 의해, 카테터(catheter)에 의해, 좌제에 의해 또는 이식에 의해 투여되며, 이식체는 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질이다. 전형적으로, 조성물을 투여할 경우, 항체 또는 제제가 흡수되지 않는 물질이 사용된다.

다른 실시형태에서, 항체 또는 제제는 조절된 방출 시스템으로 전달된다. 한 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 다른 실시형태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 조절된 방출 시스템이 예를 들면 상기 문헌[Langer]에 논의되어 있다.

항체는 치료학적 유효량의 결합제 및 하나 이상의 약제학적으로 혼용성인 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.

전형적인 실시형태에서, 약제학적 조성물은 인간에게 정맥내 또는 피하 투여를 위해 채택된 약제학적 조성물로서 일상적 절차에 따라서 제형화된다. 전형적으로, 주사에 의한 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중 액제이다. 경우에 따라, 약제는 또한 주사 부위에서 통증을 줄이는 리그노카인과 같은 국소 마취제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들면 앰플 또는 활성 성분의 양을 나타내는 사셰(sachette)와 같은 밀봉된 용기 내에 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 단위 투여형으로 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입병으로 조제될 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공되어 성분을 투여 전에 혼합할 수 있다.

추가로, 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 항체를 함유하는 용기 및 (b) 주사용의 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들면, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 희석제는 동결건조된 항체의 재구성 또는 희석을 위해 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 용기(들)과 관련하여, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 공고문일 수 있고, 상기 공고문은 인간 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매에 대한 상기 기관의 승인을 반영한다.

면역학적 장애 또는 암의 치료 또는 예방에서 효과적인 항체의 양은 표준 임상 기술에 의해 측정될 수 있다. 또한, 시험관내 검사는 임의로 최적의 용량 범위를 동정하는데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 면역학적 장애 또는 암의 단계에 의존할 것이며, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정될 수 있다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.

일반적으로, 환자에게 투여되는 항체의 용량은 전형적으로 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 대상체의 체중이다. 대상체에게 투여된 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 대상체의 체중이다.

예시적인 용량은 1 ng/kg 내지 100 mg/kg을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg 또는 약 16 mg/kg이다. 용량은 예를 들면, 매일, 주당 1회(매주), 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회, 격주로 또는 매달, 격달마다, 또는 3개월마다 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 용량은 약 0.5 mg/kg/주, 약 1 mg/kg/주, 약 2 mg/kg/주, 약 3 mg/kg/주, 약 4 mg/kg/주, 약 5 mg/kg/주, 약 6 mg/kg/주, 약 7 mg/kg/주, 약 8 mg/kg/주, 약 9 mg/kg/주, 약 10 mg/kg/주, 약 11 mg/kg/주, 약 12 mg/kg/주, 약 13 mg/kg/주, 약 14 mg/kg/주, 약 15 mg/kg/주 또는 약 16 mg/kg/주이다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 1 mg/kg/주 내지 약 15 mg/kg/주의 범위이다.

일부 실시형태에서, 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 결합제에 접합되거나 접합되지 않는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 염증 질환, 자가면역질환, 호흡기 질환, 대사 장애 또는 중추신경계(CNS)의 질환, 예를 들면, 염증과 관련된 중추신경계(CNS)의 질환 또는 암의 치료 또는 예방용의 하나 이상의 치료제와 함께 동시-투여될 수 있다.

이러한 병용 치료요법 실시는 질환 파라미터(예를 들면, 증상의 중증도, 증상의 수 또는 재발 빈도)에 부가효과 또는 상승효과를 미칠 수 있다.

병용 투여를 위한 치료학적 용법과 관련하여, 구체적인 실시형태에서, 항체는 치료제와 동시에 투여된다. 다른 구체적인 실시형태에서, 치료제는 항체 제제의 투여 전 또는 후에, 적어도 1시간 내지 수개월, 예를 들면, 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 또는 3개월까지 항체의 투여 전 또는 후에 투여된다.

제조 물품

다른 양상에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 제품이 포함된다. 제조 제품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가질 수 있다. 예를 들면, 용기는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알(vial)일 수 있다. 조성물 중 활성제는 항체이다. 용기 상의 또는 이와 연관된 표지는, 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 포스페이스 완충 염수, 링거액 및 덱스트로즈 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 시판 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 의도되지 않는 다음 실시예에 추가로 기재되어 있다.

실시예

실시예 1: 단백질 발현 및 정제

가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 표준 PCR 제한 효소 기반 클로닝 기술을 사용하여 IgG1 발현 카세트의 불변 영역을 함유하는 맞춤식 포유동물 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 다중특이적 항체를 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. 항체를 먼저 Mab Select SuRe 단백질 A 컬럼(GE healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이)(Brown, Bottomley et al. 1998)에 의해 정제하였다. 상기 컬럼을 포스페이트 완충 염수(PBS), pH 7.2로 평형화시키고 발효 상청액을 2 mL/분의 유속으로 로딩하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 PBS(4 CV)로 세척한 다음, 30 mM 나트륨 아세테이트, pH 3.5에서 용리시켰다. Akta Explorer(GE healthcare)에서 280 nm에서의 흡광도로 모니터링시 단백질 피크를 함유하는 분획들을 함께 풀링(pool)하고 1%의 3M 나트륨 아세테이트, pH 9.0를 첨가하여 pH 5.로 중화시켰다. 단백질 A 정제된 항체의 평균 회수율은 >90%이었다. 연마 단계로서, 항체를 Superdex 200 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다.

실시예 2: 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)

SEC-HPLC를 50 mM 포스페이트, 200 mM 아르기닌, 0.05% 아지드화나트륨, pH 6.5 완충액 중에서 TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8mm diameter, 30cm length, 5㎛)을 사용하여 수행하였다. 유속을 1mL/분에서 유지시켰고, 로딩된 샘플 용적은 50㎕였다. 제조업체가 제공한 소프트웨어를 사용하여 용출 피크들을 통합하여(곡선하 면적) 단량체%를 계산하였다. 본 실험들의 결과는 도 4 및 도 8에 도시한다.

실시예 3: 분석용 초원심분리(AUC)를 통한 균질성의 특징확인

모든 실험들은 Beckman XLI 분석용 초원심분리기(Beckman Coulter, Inc., 캘리포니아주 풀러턴)에서 실시하였다. 모든 침강속도 실험들은 40,000 rpm 및 20℃에서 실시하였다. 실험들은 20 mM 시트레이트 및 115 mM NaCl을 함유하는 pH 6.0 완충액 중에서 실시하였다. 데이터를 280 nm에서 수집하고 SedFit 버젼 12.1c에서 연속 c(S) 모델을 사용하여 분석하였다. 본 실험들의 결과는 도 2에 도시한다.

실시예 4: 시차 주사 열량측정법(DSC)

다중특이적 항체의 열 안정성을 모세관 VP-DSC 마이크로열량계(Microcal Inc. 매사추세츠주 노스햄프턴)에 의해 특징확인하였다. 1℃/분의 스캔속도와 0.450 mL의 셀 용적에서 측정한 단백질 농도는 약 1.4 mg/mL이었다. 온도 스캔은 25 내지 120℃에서 수행하였다. 완충액 참조 스캔을 단백질 스캔으로부터 공제하고, 단백질의 농도를 열역학 분석 전에 정규화하였다. 데이터를 Origin 7.0(OriginLab, 매사추세츠주 노스햄프턴)에서 플롯팅하고, 후속적인 열역학 분석을 전이 전 및 전이 후 기준선 보정된 데이터에 대해 수행하였다. DSC 곡선을 비-2상태 모델을 사용하여 핏팅(fitting)하여 열량측정 엔탈피, 반트 호프 엔탈피 및 겉보기 전이 온도(T_m)를 수득하였다.

표 6은 대표적인 이중특이적 항체에 대한 시차 주사 열량측정법에 의한 열 안정성 평가를 나타낸다. 최저 전이 온도(Fc 영역의 CH2 도메인)는 67.6℃이었다. Fab 및 CH3-도메인의 전이 온도는 약 80℃이었다. 신생아 FcRn 매개 돌연변이(YTE)의 혼입은 약 4.6℃까지 Fc 영역의 탈안정화를 초래하였다. 본 실험의 이중특이적 항체에서 사용된 가변 영역은 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 세르톨리주맙(Certolizumab), 아달리무맙(Adalimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab) 또는 익세키주맙(Ixekizumab)의 가변 영역이다.

실시예 5: 표면 플라스몬 공명(SPR)

ProteOn XPR36(Bio Rad, 캘리포니아주 허큘리스)를 사용하여 이중특이적 항체의 표적 단백질 결합의 반응속도 및 친화성을 측정하였다. 염소 항-인간 IgG 감마 Fc 특이적 항체(GAHA)(Invitrogen, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를, 8000 RU 내지 10000 RU의 표면 밀도에서 제조업자의 지침에 따라서 아민 커플링 키트(Bio Rad, 캘리포니아주 허큘리스)를 사용하여 6개의 수평 채널을 따라서 GLM 칩(Bio Rad, 캘리포니아주 허큘리스)의 덱스트란 매트릭스에 고정시켰다. 이중특이적 항체는 약 200 RU의 표면 밀도에서 5개의 수직 채널을 따라서 GAHA 표면에 포획되었다. 마지막 수직 채널을 컬럼 참조로서 사용하여 벌크 이동(bulk shift)을 제거하였다. 표적 단백질과 각 항체의 결합 반응속도를 5가지 희석율(10, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625 및 0 nM)에서의 표적 단백질의 중복 주사액의 전체적 핏팅에 의해 측정하였다. 중복물과 함께 5가지 농도에서 수집된 표적 단백질의 결합 센서그램(sensorgram)을 비활성 채널/스폿간(inter-spot) 참조 및 추출 완충액 참조를 사용하여 이중 참조하였다. 참조된 센서그램을 1:1 랑뮈르(Langmiur) 결합 모델에 핏팅시켜 연합 속도(k _a), 해리 속도(k _d) 및 해리 상수(K _D)를 측정하였다. 본 실험들의 결과는 도 5에 도시한다.

실시예 6: 혈청 간섭

각각 1×반응속도 완충액 및 인간 혈청(Sigma, 미주리주 세인트 루이스)에서의 각 항체들과 이들의 (바이오티닐화된) 표적 단백질의 상호작용을 스트렙타비딘(SA) 바이오센서 팁(ForteBio)이 장착된 Octet QK(ForteBio) 장비에서 수행하였다. 목적하는 항체와 표적 단백질의 상호작용을 모니터링하기 전에, 바이오티닐화된 표적 단백질로 점유된 센서를 인간 혈청에 침지시켜 혈청에서의 결합에 대한 기준선을 확립하였다. 상이한 연합 시점(60초, 120초 및 240초)에서 1×반응속도 완충액 및 인간 혈청에서의 결합 센서그램의 반응을 비교하여, 항체가 인간 혈청 중에서 표적-이탈(off-target) 분자에 결합하였는지 여부를 측정하였다.

표 7에서, 혈청 간섭 결합 검정은 혈청 성분에 의한 표적 항원 결합에 대한 간섭이 결여되었음을 보여준다. 대표적인 ZweiMab 이중특이적 항체와 함께 이의 모 IgG를 PBS 완충액 및 90% 인간 혈청에서의 표적 항원의 결합에 대해 평가하였다. (수성 완충액과 비교하여 혈청의 굴절률 증가에 수반하여) 결합 반응의 1.3배 이동이 관찰되었다. 모 IgG에 대해서 유사한 이동이 관찰되었다. 본 실험의 이중특이적 항체에서 사용된 가변 영역은 표 3에 나타낸 바와 같이 세르톨리주맙 및/또는 아달리무맙의 가변 영역이다.

실시예 7: 효소 결합 면역흡착 검정(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 기반한 단백질-A 결합의 평가 방법

단백질-A에 결합하는 다중특이적 항체의 변이체의 능력을 평가하기 위해 ELISA 기반 방법을 사용하였다. 바이오티닐화된 단백질-A를 스트렙타비딘-ELISA 플레이트상에서 포획하고, 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 이를 PBST 완충액 중의 1% 우유와 항온배양하였다. 이어서, 2가지 동종이량체 변이체(AA & BB)와 함께 이종이량체성 다중특이적 항체(AB) 및 대조군 IgG를 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 플레이트를 ELISA 완충액으로 3회 세척하고, 결합을 HRP에 접합된 항-카파 항체를 사용하여 검출하였다. 본 실험들의 결과는 도 7b에 도시한다.

실시예 8: 시노몰구스 원숭이 약동학적 분석

다중특이적 항체의 피하 약동학을 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 연구는 IACUC에 의해 승인되었으며 USDA 동물복지법(9CFR 부분 1, 2 및 3)에 따른다. 항체를 피하 주사에 의해 중간 견갑 영역에 투여하였다. 다중특이적 항체의 혈청 농도를 검증된 항원-포획 ELISA 검정을 사용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 바이오티닐화된 표적 단백질을 스트렙타비딘-코팅된 Nunc MaxiSorp(Affimetrix eBioscience, 캘리포니아주 샌 디에고)에 고정시켰다. 이어서, 96웰 플레이트를 PBS 및 2% BSA(w/v)으로 차단시켰다. 이어서, 매트릭스 참조 표준, 품질 대조군 및 시험 샘플을 5% 원숭이 혈청의 최종 농도로 희석시키고 상기 차단된 플레이트로 옮겼다. 염소 항-인간 IgG-HRP(Southern Biotech)를 0.05㎍/ml의 농도로 첨가하기 전에 플레이트를 세척하였다. 플레이트를 BioFx(SurModics, 미네소타주 에덴 프레리)로 다시 세척하고 TMBW 기질을 첨가하였다. TMB 기질(0.2M H₂SO₄)에 대한 BioFx 액체 정지 용액을 첨가하기 전에, 플레이트가 실온에서 약 5분 동안 발색되도록 한 다음, OD 450 nM에서 SpectraMax(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) M5 플레이트 리더를 사용하여 판독하였다. Softmax Pro 소프트웨어(Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여, 로그-로그 곡선 핏트에서 표준 곡선 농도 대 450 OD 시그널 강도를 플롯팅하여 농도를 도출하였다. 비구획적 약동학 분석(Non-compartmental pharmacokinetic analysis)을 WinNonlin(v. 5.3, Pharsight Corporation, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)에서 수행하였다. 마지막 정량화 가능한 시점(AUC0-t)까지의 혈청 농도-시간 곡선하 면적을 사다리꼴 방법(trapezoidal method)을 사용하여 계산하고 개개 곡선의 최종 부분의 로그-선형 회귀를 사용하여 시간 무한대(AUC_inf)에 외삽하여 최종 반감기(t_1/2)를 추정하였다. 소실속도 상수(k_el)를 1일째 내지 7일째에 조사로 확인된 최종 단계를 사용하여 로그-변환된 농도 데이터의 최소제곱 회귀에 의해 측정하였고, 최종 반감기는 ln2/ k_el와 동일하였다. 본 실험들의 결과는 도 6에 도시한다.

표 8은 대표적인 이중특이적 항체의 약동학적 프로파일을 나타낸다. 본 실험에서 이중특이적 항체에서 사용된 가변 영역은 표 3에 나타낸 바와 같이 세르톨리주맙 및/또는 아달리무맙의 가변 영역이다.

실시예 9: 면역원성 평가

이중특이적 항체 서열을 EpiVax Epimatrix 인 실리코 면역원성 예측 프로그램으로부터의 T-조절(Treg) 조정된 스코어를 사용하여 잠재적 면역원성에 대해 분석하였다.

표 9는 대표적인 이중특이적 항체의 면역원성 프로파일을 나타낸다.

실시예 10: 분석용 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)

a) DNA 작제 방법 및 세포 배양

DNA 작제물을 전통적 클로닝 방법을 사용하여 조립하였다. DNA 분절은 외부 업체(IDTDNA)에서 합성되거나 이미 구축된 당사의 작제물의 PCR로부터 합성되었다. 분절을 SOE(스플라이스-중복 연장(Splice-overlap extension)) PCR을 사용하여 조립하고 제한 효소 분해된 벡터로 내부-융합(Clontech, 카탈로그 번호 639638)시키거나 연결시켰다. 사용된 표준 벡터는 CMV 프로모터, AMP 유전자 선택 마커 및 CHO-E(차이니즈 햄스터 난소) 세포에서의 에피솜 복제를 위한 OriP 유전자를 갖는 pTT5(National Research Council Canada)이었다. IgG1KO 벡터에 대해서는 HindIII/NheI(New England Biolabs)를 이용하거나 IgG4Pro 벡터에 대해서는 EcoRI/ApaI(New England Biolabs)를 이용하여 벡터를 제한-효소 분해시켰다. DNA 삽입체를 갖는 벡터를 스텔라(Stellar) 세포(Clontech)로 형질전환시키고 37℃에서 진탕시키면서 밤새 배양하였다. 플라스미드 정제 미니프렙(miniprep)(Qiagen, 카탈로그 번호 27173)을 완료하였고, 양성 샘플을 외부 업체(Eurofins Genomics)에서 생어(Sanger)-서열분석에 의해 측정하였다. 서열-검증된 삽입체를 갖는 배양물을 기가프렙(gigaprep) 플라스미드 정제(Qiagen, 카탈로그 번호 12991)) 또는 자동화 맥시프렙(maxiprep)(BenchPro2100 Plasmid Purification System, Thermo-Fisher)을 통해 규모 확대하였다. 이어서, DNA를 CHO-E 세포의 형질감염을 위해 사용하였다.

CHO-3E7(CHO-E) 세포를 37℃, 5% CO₂ 및 140rpm 진탕 속도에서 8mM 글루타맥스(ThermoFisher Scientific)가 보충된 FreeStyle CHO(FS-CHO; ThermoFisher Scientific)로 제조된 성장 배지에서 활발하게 분열하는 상태로 유지시켰다.　 CHO-E 세포를 2mM 글루타민이 보충된 FS-CHO(형질전환 배양 배지)에서 2×10⁶개 세포/mL로 형질전환시켰다. 35mL CHO-E 일시적 형질전환을 위해, 제1 아미노산 쇄를 암호화하는 서열을 함유하는 35㎍의 DNA 및 제2 아미노산 쇄를 암호화하는 서열을 함유하는 17.5㎍ DNA를 50mL TPP TubeSpin 생물반응기 내에서 3.5 mL의 OptiPro SFM에 희석시켰다. 26.25㎕의 Mirus TransIT Pro 형질전환 시약을 희석된 DNA 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 온화하게 교반하였다. 교반 후, 1분 이하로 항온배양하면서 생성된 CHO-E 세포를 DNA 복합체화 혼합물에 첨가하였다. TubeSpin 생물반응기를 37℃, 5% CO₂, 200rpm에서 항온배양하였다.　 형질감염 4시간 내지 24시간 후, 350㎕ Gibco 항응집제, 350㎕ Pen/Strep 및 5.25mL CHO CD Efficient Feed B를 형질감염된 세포에 첨가하였다. 형질감염 24시간 후, 온도를 32℃로 전환시켰다. 10일 후 또는 배양물이 60% 미만으로 생존성이 되면, 형질감염된 배양물을 수거하였다. 형질감염체는 4700rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 수거하였다. 바이오매스(정화된 상청액)를 경사 분리하고 0.2㎛ 필터를 통해 멸균 여과시키고, 세포 펠렛을 폐기하였다. 역가를 위해 바이오매스를 ForteBio/Pall Octet Red 96 장비에 의해 샘플링하였다.

b) 정제 및 분석용 크기 배제 크로마토그래피(aSEC)

30 ml의 CHO-E 배양 상청액을 40㎕ 단백질 A 수지(PhyNexus, 카탈로그# PTR 91-40-07)를 함유하는 'ProPlus PhyTip' 친화성 컬럼에 로딩하였다. 유속은 0.25ml/분이었다. PhyTip를 0.5ml/분에서 1.3 ml 완충액 A(DPBS), 1.3ml 완충액 B(DPBS와 1M NaCl, pH6.5) 및 1.3 ml 완충액 A로 연속적으로 세척하였다. 이어서, 결합된 단백질을 3×0.3ml의 완충액 C(30 mM NaOAc, pH3.5)을 이용하여 용리시켰다. 각 용리제에 대한 pH를 1%의 완충액 D(3.0 M NaOAc, pH 약 9) 내지 60 mM NaOAc의 최종 완충액(pH 약 5)을 이용하여 조정하였다.

단백질 농도를 측정한 후, 고분자량 및 저분자량 종으로부터 단량체 단백질 분획을 분리하기 위해 샘플(약 10㎍)을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(aSEC) 컬럼에 전개시켰다. Waters BEH200 컬럼(4.6mm ID x 15cm L, 1.8 um)을 Waters UHPLC 시스템에서 0.5 ml/분의 유속으로 사용하였다. 이동상 완충액은 50 mM 인산나트륨 pH 6.8, 200 mM 아르기닌, 0.05% 아지드화나트륨이었다. HMW, 단량체 및 LMW의 백분율은 BEH200 처리 방법(BEH200 Processing Method)에 의해 자동적으로 계산되었다.

6가지의 본 발명의 단백질에 대한 단량체의 백분율은 표 10에 나타낸다. 이들 단백질에서, 제1 쇄는 EpCAM, FAP 또는 레브리키주맙의 가변 영역을 포함하고 제2 쇄는 가변 영역 CD33을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 IgG₁ 또는 IgG₄로부터 유래된다.

본 발명의 단백질 내의 아미노산 쇄의 쌍들도 또한 표 10에 표시되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH <120> MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS <130> 09-0642-WO-1 <150> 62/186,423 <151> 2015-06-30 <160> 56 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 5 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 35 <210> 11 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly 20 25 30 Gly Ser <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Glu Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Glu Gly Ser Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys 20 25 30 Gly Ser Thr Gly Gly Ser 35 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 14 Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Glu Gly Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Glu Gly Ser Lys Ser Glu Gly Lys Ser Thr Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Ser Lys Gly Ser Thr Gly Gly Ser 35 40 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 26 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 27 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 28 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 30 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 31 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr 245 250 255 Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 32 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg 245 250 255 Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 33 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr 245 250 255 Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 34 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr 245 250 255 Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 36 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 37 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 38 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 39 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 39 Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 1 5 10 15 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 35 40 45 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 65 70 75 80 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 85 90 95 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 100 105 110 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 130 135 140 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 145 150 155 160 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 165 170 175 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 180 185 190 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 195 200 205 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 210 215 220 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 225 230 235 240 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 245 250 255 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 260 265 270 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val 275 280 285 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 290 295 300 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 40 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 20 25 30 Thr Gly Gly Gly Gly Ser 35 <210> 41 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 41 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn 20 25 30 Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys 50 55 60 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 106 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 43 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Leu Thr Ala Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 45 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 46 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 47 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser 20 25 30 Ser Lys Asn Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Ala His Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu His Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 707 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 49 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu 225 230 235 240 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 260 265 270 Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 275 280 285 Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 290 295 300 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn 305 310 315 320 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 325 330 335 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val 340 345 350 Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp 355 360 365 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 370 375 380 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 405 410 415 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 420 425 430 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 435 440 445 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 450 455 460 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 465 470 475 480 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 485 490 495 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 500 505 510 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 515 520 525 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 530 535 540 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 545 550 555 560 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 565 570 575 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 580 585 590 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 595 600 605 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 610 615 620 Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 625 630 635 640 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 645 650 655 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 660 665 670 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 675 680 685 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 690 695 700 Ser Pro Gly 705 <210> 50 <211> 704 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 50 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu 225 230 235 240 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 260 265 270 Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 275 280 285 Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 290 295 300 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn 305 310 315 320 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 325 330 335 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val 340 345 350 Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp 355 360 365 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 370 375 380 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 385 390 395 400 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 405 410 415 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 420 425 430 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 435 440 445 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 450 455 460 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 465 470 475 480 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 485 490 495 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 500 505 510 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 515 520 525 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 530 535 540 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 545 550 555 560 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 565 570 575 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 580 585 590 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 595 600 605 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 610 615 620 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 625 630 635 640 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 645 650 655 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 660 665 670 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 675 680 685 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 690 695 700 <210> 51 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser 20 25 30 Ser Lys Asn Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Ala His Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu 225 230 235 240 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 260 265 270 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 275 280 285 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys 290 295 300 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Glu Leu His Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp 355 360 365 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 370 375 380 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 385 390 395 400 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 405 410 415 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 420 425 430 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 435 440 445 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 450 455 460 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 465 470 475 480 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 485 490 495 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 500 505 510 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 515 520 525 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 530 535 540 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 545 550 555 560 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 565 570 575 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 580 585 590 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 595 600 605 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 610 615 620 Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 625 630 635 640 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 645 650 655 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys 660 665 670 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 675 680 685 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu 690 695 700 Ser Leu Ser Pro Gly 705 <210> 52 <211> 706 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Thr Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser 20 25 30 Ser Lys Asn Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Leu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Ala His Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu 225 230 235 240 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 260 265 270 Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 275 280 285 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys 290 295 300 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp 305 310 315 320 Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr 325 330 335 Ala Tyr Leu Glu Leu His Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Trp Ser Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Phe Asp 355 360 365 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 370 375 380 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 385 390 395 400 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 405 410 415 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 420 425 430 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 435 440 445 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 450 455 460 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 465 470 475 480 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 485 490 495 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 500 505 510 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 515 520 525 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 530 535 540 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 545 550 555 560 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 565 570 575 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 580 585 590 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 595 600 605 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 610 615 620 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 625 630 635 640 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 645 650 655 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val 660 665 670 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 675 680 685 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 690 695 700 Leu Gly 705 <210> 53 <211> 697 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly 225 230 235 240 Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln 245 250 255 Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser 260 265 270 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn Gly Ile Asn Trp Leu 275 280 285 Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro 290 295 300 Arg Ser Thr Asn Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser 325 330 335 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Leu Thr 340 345 350 Ala Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 370 375 380 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 405 410 415 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 420 425 430 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 435 440 445 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 450 455 460 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 465 470 475 480 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 485 490 495 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 500 505 510 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 515 520 525 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 530 535 540 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 545 550 555 560 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 565 570 575 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 580 585 590 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 595 600 605 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 610 615 620 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 625 630 635 640 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 645 650 655 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 660 665 670 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 675 680 685 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 690 695 <210> 54 <211> 694 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 54 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly 225 230 235 240 Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln 245 250 255 Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser 260 265 270 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn Gly Ile Asn Trp Leu 275 280 285 Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro 290 295 300 Arg Ser Thr Asn Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser 325 330 335 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Leu Thr 340 345 350 Ala Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 370 375 380 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 405 410 415 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 420 425 430 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 435 440 445 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 450 455 460 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 465 470 475 480 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 485 490 495 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 500 505 510 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 515 520 525 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 530 535 540 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 545 550 555 560 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 565 570 575 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 580 585 590 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 595 600 605 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 610 615 620 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 625 630 635 640 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 645 650 655 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 660 665 670 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 675 680 685 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 690 <210> 55 <211> 703 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu 210 215 220 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys 225 230 235 240 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 260 265 270 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 275 280 285 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 290 295 300 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 305 310 315 320 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 325 330 335 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 370 375 380 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 385 390 395 400 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 405 410 415 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 420 425 430 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 435 440 445 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 450 455 460 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 465 470 475 480 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 485 490 495 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 500 505 510 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 515 520 525 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 530 535 540 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 545 550 555 560 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 565 570 575 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 580 585 590 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 595 600 605 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 610 615 620 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 625 630 635 640 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 645 650 655 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 660 665 670 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 675 680 685 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 690 695 700 <210> 56 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 56 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu 210 215 220 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys 225 230 235 240 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 260 265 270 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 275 280 285 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 290 295 300 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 305 310 315 320 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 325 330 335 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 370 375 380 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 385 390 395 400 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 405 410 415 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 420 425 430 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 435 440 445 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 450 455 460 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 465 470 475 480 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 485 490 495 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 500 505 510 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 515 520 525 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 530 535 540 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 545 550 555 560 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 565 570 575 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 580 585 590 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 595 600 605 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 610 615 620 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 625 630 635 640 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 645 650 655 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 660 665 670 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 675 680 685 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 690 695 700

Claims

a) 제1 에피토프에 특이적인 제1 결합 유닛을 형성하는 제1 중쇄와 제1 경쇄 및
b) 제2 에피토프에 특이적인 제2 결합 유닛을 형성하는 제2 중쇄와 제2 경쇄
를 포함하는 단백질로서,
여기서, 상기 제1 중쇄가 위치 366의 타이로신(Y)[T366Y]을 포함하고 상기 제2 중쇄가 위치 407의 트레오닌(T)[Y407T]을 포함하고 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하거나,
상기 제1 중쇄가 위치 366의 트립토판(W)[T366W]를 포함하고 상기 제2 중쇄가 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]를 포함하고 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서, 상기 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하는, 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 중쇄 및 제2 중쇄가 YTE 돌연변이 (M252Y/S254T/T256E)를 추가로 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄가 위치 366의 트립토판(W)[T366W]을 포함하고, 상기 제2 중쇄가 위치 366의 세린(S)[T366S], 위치 368의 알라닌(A)[L368A] 및 위치 407의 발린(V)[Y407V]을 포함하고, 상기 제2 중쇄가 위치 435의 아르기닌[H435R] 및 위치 436의 페닐알라닌[Y436F]을 추가로 포함하고, 상기 중쇄들이 IgG₁ 또는 IgG₄의 중쇄로부터 유래되는, 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄가 서열번호 1, 4, 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중쇄가 서열번호 3, 5, 38 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄가 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열을 포함하고 상기 제2 중쇄가 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄가 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 제2 중쇄가 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄가 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 제2 중쇄가 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 경쇄가 서열번호 2 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄 및 상기 제1 경쇄가 제1 링커를 통해 공유 결합되는, 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 중쇄 및 상기 제2 경쇄가 제2 링커를 통해 공유 결합되는, 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 중쇄 및 상기 제1 경쇄가 제1 링커를 통해 공유 결합되고, 상기 제2 중쇄 및 상기 제2 경쇄가 제2 링커를 통해 공유 결합되는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 26 내지 42개의 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 30 내지 40개의 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 34 내지 40개의 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 36 내지 39개의 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 38개의 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 글리신 및 세린 아미노산을 포함하는, 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및/또는 상기 제2 링커가 서열번호 6 내지 서열번호 14 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및 상기 제2 링커가 동일한 길이를 갖는, 단백질.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커 및 상기 제2 링커가 동일한, 단백질.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 상기 제1 중쇄의 N-말단 및 상기 제1 경쇄의 C-말단에 공유 결합되고, 상기 제2 링커가 상기 제2 중쇄의 N-말단 및 상기 제2 경쇄의 C-말단에 공유 결합되는, 단백질.
제1항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프가 동일한 표적 단백질상에 있는, 단백질.
제1항에 있어서, 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프가 상이한 표적 단백질상에 있는, 단백질.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 에피토프에 특이적인 제3 결합 유닛을 추가로 포함하는 단백질.
제26항에 있어서, 상기 제3 결합 유닛이 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄의 C-말단에 공유 결합되는, 단백질.
제26항에 있어서, 상기 제3 결합 유닛이 상기 제1 경쇄 또는 제2 경쇄의 N-말단에 공유 결합되는, 단백질.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 에피토프에 특이적인 제4 결합 유닛을 추가로 포함하는 단백질.
제29항에 있어서, 상기 제4 결합 유닛이 상기 제1 중쇄 또는 제2 중쇄의 C-말단에 공유 결합되는, 단백질.
제29항에 있어서, 상기 제4 결합 유닛이 상기 제1 경쇄 또는 제2 경쇄의 N-말단에 공유 결합되는, 단백질.
제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 결합 유닛 및/또는 제4 결합 유닛이 scFv인, 단백질.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
제34항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
제34항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 제35항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
a) 제36항에 따른 숙주 세포를 수득하는 단계; 및
b) 숙주 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 단백질의 생산 방법.
제37항에 있어서, 단백질을 회수하고 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.