KR20190028771A - Cd3 및 cd123에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체-유사 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD3 및 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물과, 암을 치료하기 위한 상기 제약 조성물 및 항체-유사 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체-유사 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

CD3 및 CD123에 특이적으로 결합하는 이중특이성 항체-유사 결합 단백질
본 발명은 CD3 및 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물과, 암을 치료하기 위한 상기 제약 조성물 및 항체-유사 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 항체-유사 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
제1 세대의 이중특이성 항체가 20여년 전에 개발되었다. 그때부터, 수많은 임상 연구에서 암세포 표면 항원을 표적화하도록 조작된 이중특이성 항체를 시험하여 왔다. 이러한 항암 융합 단백질의 군은 면역학적 이펙터 세포를 표적화된 암세포의 근처에 국소화시켜, 항암 활성을 달성하는 둘 이상의 기능성 도메인을 함유한다.
이중특이성 항체 기법이 개발됨에 따라, 2개의 항체 단쇄 가변 영역(scFv)만(Fc 아미노산 세그먼트는 포함되지 않음)을 유연성 링커를 사용하여 연결함으로써 이중특이성 T-세포 관여항체(bispecific T-cell engager; BiTE)로 명명된 상이한 융합 단백질의 군을 생성하였으며, 하나의 scFv는 표적화된 세포에 결합하며, 다른 하나는 T 세포 표면 상의 CD3에 결합한다. CD19xCD3 이중특이적 결합 활성을 갖는 하나의 BiTE, 블리나투모맙(blinatumomab)은 II상 임상 시험에서 B-계통 급성 림프모구성 미세 잔존 질환(minimal residual disease)을 갖는 환자에 대하여 유망한 결과를 보였다.
CD123(인터류킨-3 수용체 알파 사슬 IL-3Rα)은 다양한 혈액 신생물에서 과발현되는 종양 항원이다. 대다수의 AML 모세포(blast)는 표면 CD123을 발현하며, 이러한 발현은 AML의 하위유형에 따라 달라지지 않는다. 진단시에 AML에서의 더 높은 CD123의 발현은 더욱 불량한 예후와 연관된 것으로 보고되었다. CD123이 백혈병 줄기 세포(LSC) 상에서 발현됨이 보고되었다. 휴지 상태이며, DNA 손상 화학요법에 대하여 상대적으로 저항성인 것으로 밝혀진 이들 백혈병 줄기 세포(LSC)로부터 AML이 발생함을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 이에 따라, 조혈 줄기 세포(HSC)에 비하여 LSC 상에서의 증가된 CD123 발현은 AML-LSC의 치료적 표적화를 위한 기회를 제시한다.
CD123에 대하여 유도된 단클론 항체(MAb) 7G3은 백혈병 세포주 및 일차 세포 둘 다의 IL-3 매개된 증식 및 활성화를 저해하는 것으로 이전에 밝혀졌다(미국 특허 제6,177,078호). 그러나, CD123의 표적화가 AML-LSC를 기능적으로 손상시킬 수 있는지는 여전히 불확실하였다.
CD123xCD3 항체-유사 결합 단백질의 이용은 본원에서 본 발명자들이 나타낸 바와 같이 종양 세포 사멸을 초래한다.
CD123xCD3 이중특이적 결합 활성을 갖는 이중특이성 항체-유사 결합 단백질을 생성하는 발상은 이미 제안되어 있으며, 국제 특허 출원 제WO2013/173820호에 기술되어 있다.
더욱이, 마크로제닉스(MacroGenics)로부터의 CD123 x CD3 이중 친화성 재-표적화(Dual Affinity Re-Targeting; DART) 이중특이성 항체 기반 분자가 2014년도에 I상 임상 시험에 들어갔다.
그러나, 본 발명자들이 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 마크로제닉스로부터의 CD123xCD3 이중 친화성 재-표적화(DART) 이중특이성 항체 기반 분자는 표적 세포의 부재 하에서 CD4+ 발현 T-세포의 82% 및 CD8+ 발현 T-세포의 83%의 활성화를 갖는다. T-세포의 부적절한 활성화는 심각한 부작용, 예컨대 사이토카인 방출 증후군을 초래할 수 있다. 사이토카인 방출 증후군은 활성화된 T 세포에 의해 사이토카인이 방출되어, 중증 감염에서 발견되는 것과 유사한, 저혈압, 발열 및 경직을 특징으로 하는 유형의 전신 염증 반응을 생성하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 항-CD3 항체 OKT3에 대하여 사이토카인 방출 증후군으로 인한 사망이 보고되었다.
항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질이 국제 특허 출원 제PCT/EP2016/051386호에 개시되어 있는데, 상기 국제 특허 출원은 본 특허 출원의 우선 출원일에 아직 공개되지 않았다(유럽 특허 조약에 따른 54조 3항). 따라서, 이중특이성 항체 기법에서의 이러한 발전에도 불구하고, 추가의 암 치료제, 특히 직접적으로 또는 간접적으로 암세포를 효율적으로 표적화하여 사멸시키는 것에 대한 필요성이 여전히 남아 있다. 게다가, 원하는 생물학적 활성, 양호한 대사적, 약동학적 및 안전 프로파일 등을 갖고, 산업적 실시와 양립가능한 대규모 제조를 할 수 있는 새로운 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질을 개발할 필요성이 있다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명자들은 RF 돌연변이 및 놉-인투-홀(Knob-into-hole) 돌연변이와 같은 돌연변이를 포함하고 이에 의해 발현 동안의 상기 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 응집을 감소시킨 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 몇몇 돌연변이체의 개발에 성공하였다. 응집체의 양의 감소에 의해, 발현 및 정제 동안 본 항체-유사 결합 단백질의 증가된 양의 이종이량체가 성취되고 이에 따라 정제 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 수율이 증가될 수 있다.
이와 같이 본 발명은 발현 및/또는 정제 동안 응집 감소를 초래하는 돌연변이를 포함하는 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 상기 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질은 CD123 발현 표적 세포, 예컨대 THP-1 세포의 부재 하에서는 낮은 T-세포 활성화 능력을 갖지만, CD123 발현 표적 세포, 예컨대 THP-1 세포의 존재 하에서는 높은 T-세포 활성화 능력을 갖는다.
항-CD3 항체
"CD3"은 다분자 T-세포 수용체 복합체의 부분으로서 T-세포 상에서 발현되며, 적어도 3가지의 상이한 사슬 CD3ε, CD3δ 및 CD3γ로 이루어진 항원을 나타낸다. CD3δ 및 CD3γ는 인간 CD3ε에 대하여 낮은 서열 동일성 및/또는 유사성을 갖는다(유사성 및 동일성은 20% 미만이다). CD3ε 및 CDR3δ는 함께 복합체, 소위 "CD3ε/δ-복합체"를 형성할 수 있다. 또한, CD3ε은 CDR3γ와 복합체, 소위 "CD3ε/γ-복합체"를 형성한다. 예를 들어, 고정화된 항-CD3-항체에 의한 T-세포 상에서의 CD3의 클러스터링은 T-세포 수용체의 관여와 유사하지만 이의 전형적인 클론 특이성과 독립적인 T-세포 활성화를 초래한다. "CD3ε"은 3가지 도메인, 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다.
대부분의 종래 기술의 항-CD3-항체는 CD3ε-사슬을 인식한다. 이러한 종래 기술의 항-CD3-항체 중 하나로는 OKT3이 있다. 종래 기술은 예를 들어, 항체 분자 OKT3을 사용함으로써 항체 분자를 사용하는 T 세포 활성화 이벤트(event)를 예시하였다. 항-CD3 항체 및 이의 변이체는 종래 기술에서 개시되었다(미국 특허 제4,361,549호; 미국 특허 제4,361,549호; 미국 특허 제5,885,573호; 미국 특허 제5,929,212호; 및 국제 공개 제98/52975호 또는 미국 특허 제5,955,358호). OKT3은 추가로 임상 이식에서 동종이식편 거부를 치료하기 위한 효력 있는 면역억제제로서 사용되어 왔다(문헌[Thistlethwaite 1984, Transplantation 38, 695-701]; 문헌[Woodle 1991, Transplantation 51, 1207-1212]; 문헌[Choi 2001, Eur. J. Immunol. 31(1), 94-106]).
이러한 치료법의 주요 단점은 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응 및 T 세포와 FcγR-함유 세포 사이의 교차-결합으로 인한 사이토카인 방출에서 나타나는 T 세포 활성화이다. 다음의 몇몇 공보에는 이들 부작용을 감소시키기 위한 OKT3의 인간화와 같은 변경이 기술되어 있다: 미국 특허 제5,929,212호; 미국 특허 제5,885,573호 등. 반면, OKT3 또는 기타 항-CD3-항체는 T 세포의 활성화 및 증식을 자극하기 위한 면역강화제로 사용될 수 있다(미국 특허 제6,406,696호(Bluestone); 미국 특허 제6,143,297호(Bluestone); 미국 특허 제6,113,901호(Bluestone); 문헌[Yannelly 1990, J. Immunol. Meth. 1 , 91-100]). 또한, 항-CD3-항체는 T 세포 증식을 유도하기 위하여 항-CD28-항체와 조합되어 사용되는 에이전트(agent)로서 기술되어 있다(미국 특허 제6,352,694호). OKT3은 추가로 그것만으로 또는 이중특이성 항체의 성분으로서 세포독성 T 세포를 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포에 표적화하기 위하여 사용되어 왔다(문헌[Nitta 1990, Lancet 335, 368-376]; 문헌[Sanna 1995, Bio/Technology 13, 1221-1224]; 국제 공개 제99/54440호).
지금까지 T-세포를 모집하기 위한 에이전트로서 항체를 사용하는 접근법은 몇몇 발견에 의해 방해되었다. 첫째, T-세포에 대하여 높은 결합 친화성을 갖는 천연 또는 조작된 항체는 종종 그들이 결합하는 T-세포를 활성화시키지 않는다. 둘째, T-세포에 대하여 낮은 결합 친화성을 갖는 천연 또는 조작된 항체는 또한, 종종 T-세포 매개된 세포 용해를 촉발시키는 그들의 능력에 관하여 비효율적이다.
신호 펩티드를 포함하는 전장 인간 CD3ε 단백질의 기준 서열은 Uniprot 데이터베이스로부터 등록 번호 P07766으로 이용가능하며, 본원에 서열 번호 1로 포함되어 있다.
신호 펩티드를 포함하는 전장 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) CD3ε 단백질의 기준 서열은 Uniprot 데이터베이스로부터 등록 번호 Q95LI5(2014년 12월 12일자로 이용가능한 바와 같음)로 이용가능하며, 본원에 서열 번호 2로 포함되어 있다.
게놈 DNA로부터 본 발명자들에 의해 클로닝된 성숙 인간 CD3ε His-태그 Fc-융합 단백질의 서열은 서열 번호 3으로 개시되어 있다. 상기 성숙 인간 CD3ε His-태그 Fc-융합 단백질은 전장 인간 CD3ε 단백질의 아미노산 23 내지 126을 포함하며, 이에 따라, 인간 CD3ε의 세포외 도메인을 포함한다.
게놈 DNA로부터 본 발명자들에 의해 클로닝된 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD3ε Fc-융합 단백질의 서열은 서열 번호 4로 개시되어 있다. 상기 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD3ε Fc-융합 단백질은 전장 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 단백질의 아미노산 23 내지 117을 포함하며, 이에 따라, 야생형 서열의 아미노산 위치 57과 비교하여 아미노산 위치 35에서 하나의 알라닌에서 발린으로의 교환을 함유하는 인간 또는 마카카 파시쿨라리스 CD3ε의 세포외 도메인을 포함한다.
인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3ε의 도메인 구성은 다음과 같다(Uniprot P07766 서열(인간) 및 Uniprot Q95LI5 서열(마카카 파시쿨라리스)을 기반으로 함):
Figure pct00001
따라서, 인간 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 1의 위치 23　~　126의 아미노산으로 이루어지고, 마카카 파시쿨라리스 CD3ε의 세포외 도메인은 서열 번호 2의 위치 22　~　117의 아미노산으로 이루어진다.
인간화 항-CD3 항체 "hz20G6"(이의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열이 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 사용됨)은 다음을 포함한다:
- 서열
Figure pct00002
(서열 번호 9, 볼드체로 나타낸 CDR을 포함함)로 이루어진 중쇄 가변 도메인(서열 번호 5의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 6의 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 7의 서열의 CDR3-H를 포함함), 및
- 서열
Figure pct00003
(서열 번호 10, 볼드체로 나타낸 CDR을 포함함)로 이루어진 경쇄 가변 도메인(서열 번호 11의 서열의 CDR1-H, 서열 'KVS'의 CDR2-H, 및 서열 번호 8의 서열의 CDR3-H를 포함함).
본 발명의 맥락에서 사용되는 인간화 항-CD3 항체 "hz20G6"은 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3 단백질 둘 다에 대하여 높은 친화성을 나타내지만, 표적 세포의 부재 하에서는 낮은 T-세포 활성화를 갖는다.
특히, 항-CD3 항체 "hz20G6"은 인간 CD3의 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3 둘 다의 세포외 도메인에 결합한다. 더욱 구체적으로, 항체는 CD3ε에 결합한다. 더욱 구체적으로, 항-CD3 항체는 CD3ε의 인간 및 마카카 파시쿨라리스 세포외 도메인에 결합한다. 항-CD3 항체는 단리된 형태로 발현되든지, 가용성 세포외 도메인으로 존재하든지, 예를 들어, T-세포에 존재하는 바와 같이 전장 막-고정 CD3ε으로 존재하든지에 개의치 않고, 복합체, 예컨대 CD3ε/δ 복합체의 형태로 존재하는 경우 또는 단일 단백질로 존재하는 경우에 CD3ε에 결합한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 항-CD3 항체 "hz20G6"은 표면 인간 CD3 단백질 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3 단백질 둘 다에, 특히 CD3ε에 특이적이다. 특히, 본 항체는 상기 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3γ 및/또는 CD3δ 단백질(들)의 세포외 도메인에 결합하지 않거나, 이와 유의하게 교차-반응하지 않는다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 항-CD3 항체 "hz20G6"은 인간화 버전의 항-CD3 항체 "20G6"이다. 항-CD3 항체 "20G6"은 인간 CD3ε/δ 복합체에 대하여 ka가 3,5*104 (1/Ms)이고, kd가 2,7 *10-4 (1/s)이어서 KD가 7,7*10-9 (M)이 되고, 마카카 파시쿨라리스 CD3ε/δ 복합체에 대하여 ka가 2,7*104 (1/Ms)이고, kd가 2,2 *10-4 (1/s)이어서 KD가 8,2*10-9 (M)이 되는데, 이들 둘 다는 비아코어(Biacore)에 의해 측정되는 바와 같다(데이터는 예시되어 있지 않음). 이와 같이 항-CD3 항체 "20G6"은 인간 CD3에 대한 친화도에 대한 마카카 파시쿨라리스 CD3에 대한 친화도의 비(KD(마카카 파시쿨라리스)/ KD(인간))가 1이다. 따라서, 항-CD3 항체 "20G6" 및 이로부터 유래된 항체-유사 결합 단백질은 원숭이에서 수행되는 독성 연구에 사용될 수 있으며, 원숭이에서 관찰되는 독성 프로파일은 인간에서의 잠재적인 유해 효과를 예상하기에 적절하다.
따라서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 사용되는 항-CD3 항체 "20G6"은 인간 CD3 또는 마카카 파시쿨라리스 CD3, 또는 이들 둘 다에 대한 친화도(KD)가 ≤ 10 nM이다.
항-CD123 항체
" CD123"(Cluster of Differentiation 123)은 "인터류킨 3 수용체, 알파(IL3RA)" 또는 "IL3R", "IL3RX", "IL3RY", "IL3RAY", "hIL-3Ra"로도 공지되어 있으며, 이종이량체형 사이토카인 수용체의 인터류킨 3 특이적 서브유닛을 나타낸다. 기능성 인터류킨 3 수용체는 특이적인 알파 사슬(IL-3A; CD123), 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터류킨 5(IL-5)에 대한 수용체와 공유되는 IL-3 수용체 베타 사슬(β0; CD 131)을 포함하는 이종이량체이다. CD123은 IL-3 결합에 연루된 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 약 50개 아미노산의 짧은 세포질 테일을 함유하는 약 43 kDa의 추정 분자량을 갖는 제I형 내재성 막관통 단백질이다. 상기 세포외 도메인은 다음의 두 영역으로 구성된다: 서열이 GM-CSF 및 IL-5 수용체 알파-사슬의 동등한 영역에 대하여 유사성을 나타내는 약 100개 아미노산의 N-말단 영역; 및 4개의 보존된 시스테인 잔기 및 이러한 사이토카인 수용체 패밀리의 다른 구성원에 공통적인 WSXWS 모티프를 함유하는 막관통 도메인에 근접한 영역. IL-3 결합 도메인은 2개의 Ig-유사 폴딩 도메인으로 구성된 약 200개 아미노산 잔기의 사이토카인 수용체 모티프(CRM)를 포함한다. CD123의 세포외 도메인은 고도로 글리코실화되며, N-글리코실화는 리간드 결합 및 수용체 신호전달 둘 다에 필요하다. 상기 단백질 패밀리는 다음의 3가지 구성원이 모인 것이다: IL3RA (CD123A), CSF2RA 및 IL5RA. 상기 3가지 구성원 사이에서 전체 구조는 잘 보존되어 있지만, 서열 상동성은 매우 낮다. 현재까지, CD123의 300개 아미노산 길이의 하나의 아이소폼이 발견되었지만, Getentry 데이터베이스에스 등록 번호 ACM24116.1로 접근가능한 RNA 수준에서만 발견되었다.
신호 펩티드를 포함하는 전장 인간 CD123 단백질의 기준 서열은 NCBI 데이터베이스로부터 등록 번호 NP_002174.1로, 그리고 Uniprot 등록 번호 P26951로 이용가능하며, 본원에 서열 번호 12로 개시되어 있다(2014년 12월 14일자로 이용가능한 바와 같음).
신호 펩티드를 포함하는 전장 마카카 파시쿨라리스 CD123 단백질의 기준 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 등록 번호 EHH61867.1로, 그리고 Uniprot 등록 번호 G8F3K3으로 이용가능하며, 본원에 서열 번호 13으로 개시되어 있다(2014년 12월 14일자로 이용가능한 바와 같음).
본 발명자들에 의해 게놈 DNA로부터 클로닝된 성숙 인간 CD123 His-II 태그 Fc-융합 단백질의 서열은 서열 번호 14로 개시되어 있다. 상기 성숙 인간 CD123 Fc-융합 단백질은 전장 인간 CD123 단백질의 아미노산 19 내지 305를 포함하며, 이에 따라, 인간 CD123의 세포외 도메인을 포함한다.
본 발명자들에 의해 cDNA로부터 클로닝된 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD123 His-II 태그 Fc-융합 단백질의 서열은 서열 번호 15로 개시되어 있다. 상기 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD123 Fc-융합 단백질은 전장 마카카 파시쿨라리스 CD123 단백질의 아미노산 19 내지 305를 포함하며, 이에 따라, 마카카 파시쿨라리스 CD123의 세포외 도메인을 포함한다.
인간 및 마카카 파시쿨라리스 Cd123의 도메인 구성은 다음과 같다(NCBI 데이터베이스에서 등록 번호 NP_002174.1 (서열 번호 12)로 접근가능한 인간 CD123 서열을 기반으로 하며 Uniprot 데이터베이스에서 등록 번호 G8F3K3 (서열 번호 13)으로 접근가능한 마카카 파시쿨라리스 CD123 서열을 기반으로 함):
Figure pct00004
따라서, 인간 CD123의 세포외 도메인은 서열 번호 12의 위치 19 내지 305의 아미노산으로 이루어진다.
CD123(인터류킨-3 수용체 알파 사슬 IL-3Rα)은 다양한 혈액 신생물에서 과발현되는 종양 항원이다. 대다수의 AML 모세포는 표면 CD123을 발현하며, 이러한 발현은 AML의 하위유형에 따라 달라지지 않는다. 진단시에 AML에서의 더 높은 CD123의 발현은 더욱 불량한 예후와 연관된 것으로 보고되었다. CD123 발현은 척수형성이상증, 전신 비만세포증, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN), ALL 및 모상 세포 백혈병을 포함하는 다른 혈액 악성종양에서 보고되었다.
CD123은 AML 백혈병 줄기 세포 상에서 발현되고, 증가하고 있는 증거는 AML이 이러한 LSC로부터 발생함을 시사하는데, 상기 LSC는 휴지 상태이며, DNA 손상 화학요법에 대하여 상대적으로 저항성인 것으로 밝혀졌다. LSC의 지속성은 초기의 관해 후의 재발을 뒷받침하며, 이에 따라, LSC의 제거가 치유를 위한 요건 및 중요한 치료적 목적으로 여겨질 수 있는 것으로 가정된다.
CD123에 대하여 유도된 단클론 항체(MAb) 7G3은 백혈병 세포주 및 일차 세포 둘 다의 IL-3 매개된 증식 및 활성화를 저해하는 것으로 이전에 밝혀졌다(미국 특허 제6,177,078호). 특히, 미국 특허 제6,177,078호에는 항-IL-3수용체 알파 사슬(IL-3Rα, CD123) 단클론 항체 7G3, 및 IL-3Rα의 N-말단 도메인, 특히 아미노산 잔기 19 내지 49에 결합하는 7G3의 능력이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,733,743호에는 세포를 세포사를 야기하기에 효과적인 양의, 항체 및 세포독성제(화학요법제, 독소 또는 알파-방출 방사성동위원소로부터 선택됨)의 조성물과 접촉시키고, 그에 의해, 조성물이 CD123에 선택적으로 결합되게 하는 단계에 의한, CD123을 발현하지만, CD131을 유의하게 발현하는 것은 아닌 혈액암 전구 세포의 손상 방법이 개시되어 있다. 그러나, CD123의 표적화가 AML-LSC를 기능적으로 손상시킬 수 있는지는 여전히 불확실하였다.
인간화 항-CD123 항체 "hz7G3"(이의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열이 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 사용됨)은 다음을 포함한다:
- 서열
Figure pct00005
(서열 번호 52, 볼드체로 나타낸 CDR을 포함함)로 이루어진 중쇄 가변 도메인(서열 번호 50의 서열의 CDR1-H, 서열 번호 53의 서열의 CDR2-H, 및 서열 번호 51의 서열의 CDR3-H를 포함함), 및
- 서열
Figure pct00006
(서열 번호 54, 볼드체로 나타낸 CDR을 포함함)로 이루어진 경쇄 가변 도메인(서열 번호 48의 서열의 CDR1-L, 서열 'WAS'의 CDR2-L, 및 서열 번호 49의 서열의 CDR3-L을 포함함).
인간화 항-CD123 항체 "hz7G3"은 잠재적인 탈아미드화의 존재를 회피하기 위하여 서열 번호 52의 위치 55에서의 N의 S로의 돌연변이를 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 항체에서의 탈아미드화 부위의 존재는 항체 샘플들의 이질성을 야기하는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 바람직하게는 회피된다.
정의
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "및/또는"은 문법적인 접속사로서, 그것이 연결하는 사례 중 하나 이상이 발생할 수 있음을 포괄하는 것으로 해석되는 접속사이다. 예를 들어, 표현 "이러한 천연 서열 단백질은 표준 재조합 및/또는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다"는 천연 서열 단백질이 표준 재조합 및 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 천연 서열 단백질이 표준 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 천연 서열 단백질이 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있음을 나타낸다.
더욱이, 본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "포함하는"은 구체적으로 언급된 모든 특징뿐만 아니라, 선택적, 추가적, 불특정 특징을 포괄하는 것으로 해석될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"의 사용은 구체적으로 언급된 특징 이외의 특징이 존재하지 않는(즉, "~로 이루어진") 실시 형태를 또한 개시한다. 더욱이, 단수형("a" 또는 "an")은 복수형을 배제하지 않는다. 특정한 방안들이 상호간에 다른 종속항에서 나열된다는 단순한 사실은 이러한 방안들의 조합이 유리해지도록 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
"면역글로불린"으로도 지칭되는 "항체"는 2개의 중쇄가 디술피드 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄가 디술피드 결합에 의해 경쇄에 연결된 천연 또는 통상의 항체일 수 있다. 2가지 유형의 경쇄, 람다(l)와 카파(k)가 존재한다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 다음의 5가지의 주요 중쇄 클래스(또는 아이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 사슬은 특유한 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 2개의 도메인 또는 영역, 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 하나의 가변 도메인(VH)과 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, CH로 총칭됨)을 포함한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 항원에 대한 결합 인식 및 특이성을 결정한다. 경쇄(VL) 및 중쇄(CH)의 불변 영역 도메인은 항체 사슬의 회합, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)에의 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N 말단 부분이고, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 가변 부분으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 조합 부위와 항원 결정기 사이의 구조적 상보성에 있다. 항체 조합 부위는 주로 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)으로부터의 것인 잔기로 구성된다. 가끔, 비초가변 영역 또는 프레임워크 영역(framework region; FR)으로부터의 잔기가 전체 도메인 구조에 영향을 주고 그에 따라 조합 부위에 영향을 준다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 각각은 CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L, 및 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로 각각 표기되는 3개의 CDR을 갖는다. 따라서 통상적인 항체의 항원-결합 부위는 6개의 CDR을 포함하며, 이는 각각의 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 항체 또는 면역글로불린은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE이다.
" 프레임워크 영역"(FR)은 CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열, 즉, 단일 종에서 상이한 면역글로불린들 중에서 상대적으로 보존된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 각각은 각각 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 및 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로 표기되는 4개의 FR을 갖는다. 따라서, 경쇄 가변 도메인은 이에 따라 (FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)로 표기될 수 있으며, 중쇄 가변 도메인은 이에 따라 (FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)로 표기될 수 있다.
당업자는 CDR의 아미노산 서열을 알고 있으므로, 프레임워크 영역 FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L 및/또는 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H를 용이하게 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 프레임워크 영역"은 천연 발생 인간 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 이상, 특히, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%) 프레임워크 영역이다.
본 발명의 맥락에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서의 CDR/FR의 정의는 IMGT 정의를 기초로 하여 결정된다(문헌[Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77]; www.imgt.org).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 통상적인 항체 및 이의 단편뿐만 아니라, 단일 도메인 항체 및 이의 단편, 특히, 단일 도메인 항체의 가변 중쇄 및 키메라, 인간화, 이중특이성 또는 다중특이성 항체도 나타낸다.
용어 "인간화 항체"는 전적으로 또는 부분적으로 비-인간 기원이며, 인간에서 면역 반응을 회피하거나 최소화하기 위해 특히 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역에서 특정 아미노산을 대체하도록 변형된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 불변 도메인은 대부분 인간 CH 및 CL 도메인이다.
항체 서열의 인간화를 위한 다수의 방법이 본 기술 분야에 알려져 있으며; 예를 들어, 문헌[Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633]에 의한 개관을 참조한다. 통상적으로 사용되는 하나의 방법은 CDR 그래프팅, 또는 항체 재성형이며, 이는 공여자 항체, 일반적으로 마우스 항체의 CDR 서열을 상이한 특이성의 인간 항체의 프레임워크 스캐폴드 내로 그래프팅하는 것을 수반한다. CDR 그래프팅은 CDR이 그래프트된 비-인간 항체의 결합 특이성 및 친화성을 감소시킬 수 있고, 따라서 생물학적 활성을 감소시킬 수 있으므로, 모 항체의 결합 특이성 및 친화성을 유지하기 위하여 CDR 그래프트된 항체의 선택된 위치에 역돌연변이를 도입할 수 있다. 가능한 역돌연변이를 위한 위치의 확인은 문헌 및 항체 데이터베이스에서 입수가능한 정보를 사용하여 수행될 수 있다. 역돌연변이를 위한 후보인 아미노산 잔기들은 전형적으로 항체 분자의 표면에 위치한 것들이지만, 묻힌 잔기들 또는 낮은 정도의 표면 노출을 갖는 잔기들은 보통은 변경되지 않을 것이다. CDR 그래프팅 및 역돌연변이에 대한 대안적인 인간화 기술은 표면치환(resurfacing)으로, 비-인간 기원의 비-표면 노출 잔기는 보유하는 반면 표면 잔기는 인간 잔기로 변경하는 것이다. 또 다른 대안적인 기술은 "유도 선택(guided selection)"으로 알려져 있으며(문헌[Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899]), 예를 들어, 쥐과 또는 래트 항체로부터, 모 항체의 에피토프 및 결합 특징이 보존된 완전 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 인간화 방법으로는 소위 4D 인간화가 있다. 4D 인간화 프로토콜은 미국 특허 출원 제20110027266 A1호(국제 공개 제2009032661A1호)에 기술되어 있으며, 래트 항체 가변 경(VL) 및 중(VH) 도메인을 인간화하기 위한 하기의 4D 인간화의 적용에 예시되어 있다. 일 예에서, 주형으로서 PDB 구조(문헌[Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242])를 사용하여 전형적으로 MOE 소프트웨어(v.2011.10 - 캐나다 퀘벡 소재의 케미컬 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group))로 래트 항체 상동성 모델을 행하였으며, 이후에 MOE에서 구현되는 표준 절차를 사용하여 에너지를 최소화시켰다. 그 다음, 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 래트 항체의 최소화된 3D 상동성 모델(MOE 소프트웨어로 행함)에서 수행하고, 예를 들어, MOE 내에서 이용가능하며, LGCR/SDI에 의해 설계되는 7가지 대표적인 경쇄(vk1, vk2, vk3, vk4, v람다1, v람다2, v람다3) 및 7가지 대표적인 중쇄(vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)로부터 유래되는 49개의 인간 모델과 비교하였다. 예를 들어, 최적의 CDR 외측의 서열 동일성 및 소수성, 정전기 요소 둘 다를 갖는 사슬 커플(Vkx-Vhx)의 하나의 모델을 "4D 인간화"를 위하여 선택하였다. 래트 항체 가변 도메인과 선택된 모델 사이의 쌍별 연관을 위하여, 전형적으로 상응하는 상동성 모델의 알파 탄소의 최적의 3D 중첩에 기초하여 서열들을 정렬하였다. 그 다음, 원치 않는 모티프를 고려하고 돌연변이시켰다. 마지막으로, 생성된 인간화 서열을 예를 들어, IEDB 데이터베이스(http://www.immuneepitope.org; 지역에서 접근가능한 버전 2012/01/30)에 대하여 서열 유사성에 대하여 블라스트하여, 서열들 중 어느 것도 열거된 임의의 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 함유하지 않음을 보장하였다.
키메라 항체에 있어서, 인간화는 전형적으로 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 변형을 수반한다.
CDR의 일부인 아미노산 잔기는 전형적으로 인간화와 관련하여 변경되지 않을 것이지만, 특정한 경우에, 개별 CDR 아미노산 잔기를 변경하여, 예를 들어, 글리코실화 부위, 탈아미드화 부위 또는 원하지 않는 시스테인 잔기를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. N-결합 글리코실화는 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr에서 아스파라긴 잔기에 올리고당 사슬를 부착하여 발생하는 것으로, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-글리코실화 부위의 제거는 Asn 또는 Ser/Thr 잔기를 특히 보존적 치환에 의해 상이한 잔기로 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화는 pH 및 표면 노출과 같은 요인에 따라 발생할 수 있다. 아스파라긴 잔기는, 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때, 및 보다 적게는 Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열에 존재할 때 탈아미드화에 특히 민감하다. 따라서, 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly이 CDR 서열에 존재할 때, 전형적으로, 연루된 잔기들 중 하나의 제거를 위한 보존적 치환에 의한 그 부위의 제거가 바람직할 수 있다. 또한, 연루된 잔기들 중 하나를 제거하기 위한 CDR 서열에서의 치환도 본 발명에 포함시키고자 한다.
(통상적인) 항체의 "단편"은 온전한 항체의 일부분, 특히 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, 디아바디, 항체 단편으로부터 형성된 이중특이성 및 다중특이성 항체를 포함한다. 또한, 통상적인 항체의 단편은 중쇄 항체 또는 VHH와 같은 단일 도메인 항체일 수 있다.
용어 "Fab"는 약 50,000의 분자량 및 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 나타내며, 여기서, IgG를 프로테아제, 파파인으로 처리함으로써 수득되는 단편 중에 H 사슬의 N 말단 측의 대략 절반 및 전체 L 사슬은 디술피드 결합을 통해 함께 결합된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같이, 용어 "F c 도메인"은 상기에 정의된 바와 같은 천연 Fc 및 Fc의 변이체 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자에서와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 분해되든지, 다른 수단에 의해 생성되든지 간에, 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 F c "는 단량체 형태든지, 다량체 형태든지 간에, 항체의 분해에 의해 생성되거나 다른 수단에 의해 생성되는 항원-비-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 지칭하고, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 천연 Fc의 원래의 면역글로불린 공급원은 특히 인간 기원이고, 면역글로불린 중 임의의 것일 수 있지만, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. 천연 Fc 분자는 공유적(즉, 디술피드 결합) 및 비-공유적 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 이루어진다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 클래스(예를 들어, IgG, IgA 및 IgE) 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4개의 범위이다. 천연 Fc의 한 예로는 IgG의 파파인 분해에 의해 생성되는 디술피드-결합된 이량체가 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 변이체"는 천연 Fc로부터 변형되지만 구제 수용체(salvage receptor)인 FcRn(신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 지칭한다. 예시적인 Fc 변이체, 및 이것과 구제 수용체의 상호작용이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 천연 Fc는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 요구되지 않는 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되어 있거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함하고, 이는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 불상용성(incompatibility), (3) 선택된 숙주 세포에서의 발현시의 N-말단 이종성(heterogeneity), (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 구제 수용체 이외의 Fc 수용체에의 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 영향을 주거나 이들에 연루된다.
용어 "이중특이성 항체" 또는 "BsAb"는 전형적으로 단일 분자 내에서 두 항체의 항원-결합 부위를 조합시킨 항체를 나타낸다. 따라서, BsAb는 상이한 두 항원에 동시에 결합할 수 있다. 예를 들어 유럽 특허 제2 050 764 A1호에 기술된 바와 같이, 원하는 세트의 결합 특성 및 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 설계, 변형 및 생성하기 위하여 증가하는 빈도로 유전 공학이 이용되어 왔다.
본원에서 용어 "항체-유사 결합 단백질"은, 이중특이성 항체와 같이 상이한 두 항원에 동시에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 결합 단백질을 지칭한다. 그러나, 본원에서 정의된 바와 같이, 통상적인 항체와는 달리, 항체-유사 결합 단백질은 6개 초과의 CDR을 포함한다. 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 본원에서 하기에 정의된 바와 같이 CODV 형식으로 존재하며, 본원에서 하기에 "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질" 섹션에서 추가로 정의된 바와 같다.
본 발명의 맥락에서 "CODV 형식"은 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체의 교차 이중 가변(CODV) 구성을 지칭한다. CODV 형식은 폴딩의 보유 및 궁극적인 결합 친화성을 갖는 가변 도메인들의 상호교환 가능성을 가능하게 한다.
CODV 형식은 국제 공개 제2012/135345호 및 문헌[Steinmetz et al. (MAbs. 2016 Jul; 8(5):867-78])에 이전에 개시되어 있었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 교차 이중 가변 영역 면역글로불린으로 폴딩되기에 충분한 이동성을 경쇄 및 중쇄의 도메인에 제공하도록 면역글로불린 도메인들 사이에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 0개의 아미노산으로 이루어지며, 이는 링커가 부재함을 의미한다. 링커는 서열 수준에서 각각 가변 도메인들 사이 또는 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 전환부(transition)에 삽입된다. 면역글로불린 도메인의 대략적인 크기가 잘 이해되어 있기 때문에, 도메인 사이의 전환부가 확인될 수 있다. 도메인 전환부의 정확한 위치는, 실험 데이터에 의해 입증되는 바와 같이 또는 2차 구조 예측 또는 모델링 기술에 의해 추정될 수 있는 바와 같이, 베타-시트(sheet) 또는 알파-나선과 같은 2차 구조의 요소를 형성하지 않는 펩티드 스트레치(stretch)의 위치화에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 기술된 링커는 링커 L1, L2, L3, L4 및 L5이다. L1은 N-말단 VD1 도메인과 VD2 도메인 사이에 위치하며; L2는 VD2와 C-말단 CL 도메인 사이에 위치한다. 링커 L3 및 L4는 항체 유사-단백질의 화학식 III에 따라 정의된 바와 같은 폴리펩티드 상에 위치한다. 더욱 정확하게, L3은 N-말단 VD3과 VD4 도메인 사이에 위치하며, L4는 VD4와 C-말단 CH1-Fc 도메인 사이에 위치한다. L5는 CL과 N-말단 Fc2 사이에 위치한다. 링커 L1, L2, L3, L4 및 L5는 독립적이지만, 일부 실시 형태에서, 그들은 동일한 서열 및/또는 길이를 갖는다. 링커 L1, L2, L3, L4 및 L5는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 본원에서 상기에 정의된 바와 같다. 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 변이체에서 나타날 수 있는 대안적인 링커는 섹션 "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 변이체"에 추가로 기술되어 있다.
" RF 돌연변이"는 일반적으로 Fc 도메인의 CH3 도메인에서의 아미노산 HY의 RF로의 돌연변이, 예컨대 CH3 도메인에서의 돌연변이 H435R 및 Y436F(문헌[Jendeberg, L. et al. (1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34)]에 기술된 바와 같음)를 지칭하며, 이것이 단백질 A에의 결합을 없애기 때문에 정제 목적에 유리한 것으로 기술되어 있다.
본 발명의 맥락에서, RF 돌연변이는 예를 들어 서열 번호 67, 68, 71 또는 70의 위치 X6 및 X7을 지칭하며, 여기서, RF 돌연변이는 X6이 아미노산 R이고 X7이 아미노산 F일 때 존재한다. 일 예에서, RF 돌연변이는 서열 번호 69의 Fc 스텀프(Fc3)(항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF의 Fc3)에서의 위치 215~216에서의 아미노산 HY의 RF에 의한 치환 또는 서열 번호 79의 서열의 Fc 영역(항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF의 Fc 영역)에서의 위치 220~221에서의 HY의 RF로의 돌연변이를 지칭하며, 이는 하기에 본원에서 섹션"항체-유사 결합 단백질"에서 추가로 기술된 바와 같다.
" 놉-인투-홀" 또는 "놉-인투-홀" 기술로도 칭해지는 것은 이종다량체 형성을 촉진하도록 둘 다가 CH3-CH3 경계면에 있는 돌연변이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(홀) 및 S354C 및 T366W(놉)을 지칭하며, 이는 특히 미국 특허 제5731168호 및 미국 특허 제8216805호에 개시되어 있는데, 상기 미국 특허들은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 맥락에서, 예를 들어 "놉" 돌연변이는 예를 들어 서열 번호 66 또는 62의 위치 X2 및 X3을 지칭하며, 여기서, 놉 돌연변이는 X2가 C이고 X3이 W일 때 존재한다. 일 예에서, 놉 돌연변이는 서열 번호 66의 Fc(항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1a "hz20G6xhz7G3" 및 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF의 Fc)에서의 치환 S139C 및 T151W를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 "홀" 돌연변이는 예를 들어 서열 번호 75의 위치 X1, X3, X4 및 X5를 지칭하며, 여기서, "홀" 돌연변이는 X1이 C이고, X3이 S이고, X4가 A이고 X5가 V일 때 존재한다. 일 예에서, 홀 돌연변이는 서열 번호 75의 Fc(항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole 및 CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 Fc)에서의 치환 Y134C, T151S, L153A, Y192V를 지칭한다.
"LALA 돌연변이"는 Fc 이펙터 기능을 없애는 이중 돌연번이 L234A 및 L235A를 지칭한다. Fc 이중 돌연변이 L234A 및 L235A는 FcγR 또는 C1q에 결합하지 않으며, IgG1 하위클래스의 Fc 도메인의 ADCC 및 CDC 기능 둘 다는 없어진다(문헌[Hezareh, M. et al.,J Virol. 2001 Dec; 75(24): 12161-12168]).
그러나, 본 발명의 맥락에서, 이중 돌연변이 L234A 및 L235A가 언급될 때, 상응하는 위치는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 도메인들에서 상이할 수 있다. 그러나, 당업자라면 Fc 도메인(들)(즉, 화학식 III에서의 Fc, 화학식 IV에서의 Fc2 및/또는 Fc3)에서의 상응하는 위치를 용이하게 확인할 수 있다. 일 예에서, 이중 돌연변이 L234A 및 L235A는 서열 번호 60의 서열의 Fc의 이중 돌연변이 L19A 및 L20A에 상응하거나, 또는 환언하면, 서열 번호 59의 CODV-Fab-TL1-RF의 화학식 IV의 폴리펩티드에서의 돌연변이 L359A 및 L358A에 상응한다.
폴리펩티드(즉, 본 발명의 항체) 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 "정제된" 및 "단리된"은, 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 지시된 분자가 존재함을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된"은 특히 중량을 기준으로 적어도 75%, 85%, 95% 또는 98%의 동일한 유형의 생물학적 거대분자가 존재함을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 대상 폴리펩티드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭하지만; 상기 분자는 조성물의 기본 특징에 유해하게 영향을 미치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 항체 또는 항체-유사 결합 단백질이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 상기 용어는 추가로 상기 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위하여 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 항체에 의해 또는 항체-유사 결합 단백질에 의해 인식되는 각 표적 항원과 관련하여, 항체-유사 결합 단백질은 표적 항원을 인식하는 온전한 항체와 경쟁할 수 있다.
"친화도"는 이론적으로, 전체 항체와 항원 사이의 평형 회합으로 정의된다. 친화도는 예를 들어, 반치 최대 유효 농도(EC50) 또는 평형 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다.
"EC 50 "으로도 지칭되는 "반치 최대 유효 농도"는 기준선과 특정 노출 시간 후의 최대치 사이의 중간의 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독물의 농도를 지칭한다. EC50과 친화도는 반비례 관계이며, EC50 값이 더 낮을수록 항체의 친화도는 더 높다.
"K D "는 항체와 이의 항원 간의 평형 해리 상수, koff/kon의 비이다. KD 및 친화도는 반비례 관계이다. KD 값은 항체의 농도와 관련되며, KD 값이 더 낮을수록 항체의 친화성은 더 높다. 친화성은 다양한 공지된 방법, 예컨대 표면 플라스몬 공명을 사용한 회합 및 해리 속도의 측정 또는 면역화학적 분석법(ELISA, 유세포 분석법)에서의 EC50의 측정에 의해 실험적으로 평가될 수 있다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 액체 샘플 또는 습윤 샘플 중 물질, 통상 항원의 존재를 검출하기 위해 고체상 효소 면역분석법을 사용하는 생화학 분석법이다. 샘플로부터의 항원은 표면에 부착된다. 그 다음, 추가의 특이적인 항체가 표면 위에 적용되고, 따라서 항체는 항원에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 효소에 연결되며, 마지막 단계에서, 효소의 기질을 함유하는 물질을 첨가한다. 이후의 반응은, 기질에서 검출가능한 신호, 가장 흔하게는 색상 변화를 생성한다. 유세포 분석법은 각각의 세포의 특정한 광 산란 및 형광 특징 또는 특정한 형광 표지를 기반으로 하여 단일 세포 수준에서 생물학적 세포의 불균질 혼합물을 분석하는 방법을 제공한다. 이들 분석법에서, EC50은 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법)에 의해 항원의 정의된 농도에 대하여 또는 유세포 분석법에 의해 항원을 발현하는 세포에 대하여, 기준값과 일부 특정 노출 시간 이후의 최대값 사이의 중간의 반응을 유도하는 항체의 농도이다. 표면 플라스몬 공명은 무라벨 방법이며, 여기서, 센서 표면 상에 고정화된 "리간드" 분자에의 가용성 상("피분석물") 중 분자의 결합을 직접 측정한다. 센서 장치에서, 리간드의 결합을 표면 플라스몬으로 칭해지는 광학 현상에 의해 모니터링한다. 특히, "피분석물" 분자가 "리간드" 분자로부터 해리되는 경우, SPR 신호(공명 단위, RU로 표현)의 감소가 관찰된다. 회합 속도('온 속도(on rate)', k a) 및 해리 속도('오프 속도(off rate)', k d)를 결합 및 해리 동안 수득되는 신호로부터 수득하고, 평형 해리 상수('결합 상수', K D)를 그로부터 계산할 수 있다. 공명 단위(RU)로 제공되는 신호는 피분석물에 존재하는 리간드의 크기에 따라 달라지지만, 실험 조건이 동일한 경우에, 즉, 리간드가 동일한 조건에서 동일한 분자인 경우, 수득되는 RU는 친화성을 나타낼 수 있으며, 여기서, 수득되는 RU 단위의 신호가 더 클수록, 결합성이 더 크다.
항원 1(Ag1)에 결합하는 단클론 항체는, EC50이 두 항원 모두에 대해 유사한 범위 내에 있는 경우, 항원 2(Ag2)에 대해 "교차-반응성"이다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단클론 항체는, Ag2의 친화도 대 Ag1의 친화도의 비가 10(특히, 5, 2, 1 또는 0.5) 이하인 경우, Ag2에 대해 교차-반응성이며, 이때 친화도는 두 항원 모두에 대해 동일한 방법으로 측정된다.
Ag1에 결합하는 단클론 항체는, 상기 두 항원에 대한 친화도가 매우 상이한 경우 Ag2에 대해 "유의하게 교차-반응성인 것이 아니다". Ag2에 대한 친화도는 결합 반응이 너무 낮은 경우 측정가능하지 않을 수 있다. 본 출원에서, Ag1에 결합하는 단클론 항체는, 동일한 실험 환경 및 동일한 항체 농도에서 Ag2에의 단클론 항체의 결합 반응이 Ag1에의 동일한 단클론 항체의 결합 반응의 5% 미만인 경우, Ag2에 대해 유의하게 교차-반응성인 것이 아니다. 실제로, 사용된 항체 농도는 Ag1에 의해 얻어지는 포화 평탄역에 도달하는 데 필요한 농도 또는 EC50일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "특이성"은 항체가 결합하는 표적 펩티드 서열("에피토프")을 밀접하게 관련된, 매우 상동성인 펩티드 서열과 구별하는 항체의 능력을 나타낸다.
단클론 항체가 Ag2에 대해 유의하게 교차-반응성이 아닌 경우, 단클론 항체는 Ag1에 "특이적으로 결합한다".
본원에서 용어 "T-세포의 활성화" 또는 "T-세포 활성화"는 세포독성 과립 융합, 일시적 사이토카인 방출 및 증식을 수반하는 CD3 신호전달의 촉발을 지칭한다. 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 CD3ε을 표적으로 하며, 표적 세포의 존재 하에 T-세포를 활성화시키며; 이러한 활성은 "T-세포 관여 효과"로도 지칭된다. T-세포 관여 효과는 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
당업자에게 알려져 있는 바와 같이, T-세포의 활성화는 표면 마커, 예를 들어, CD69 및 CD25의 발현을 유도한다. 이에 따라, CD4+/CD25+, CD4+/CD69+, CD8+/CD25+ 또는 CD8+/CD69+ T 세포의 발현의 검출 및 측정에 의해 T-세포의 활성화를 측정할 수 있다. T-세포 활성화의 측정 방법은 당업자에게 알려져 있다.
T-세포 활성화의 측정 방법은 실시예 섹션(실시예 2.9)에 추가로 개시되어 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, T-세포 활성화를 총 세포수의 % 단위의 CD69 발현 세포의 백분율, 또는 총 세포수의 % 단위의 CD4 및 CD69 발현 세포의 백분율, 또는 총 세포수의 % 단위의 CD8 및 CD69 발현 세포의 백분율로서 측정한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 "낮은 T-세포 활성화"는 20% 미만, 18% 미만, 16% 미만, 14% 미만, 12% 미만, 10% 미만의 T-세포 활성화를 지칭한다.
본원에서 "표적 세포"는 제2 항원을 발현하는 세포를 지칭하며, 일 예에서, 본원의 표적 세포는 CD123 발현 세포, 예컨대 THP-1 세포를 지칭한다.
본원에서 "높은 T-세포 활성화"는 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 62% 초과, 64% 초과, 66% 초과, 68% 초과, 70% 초과의 T-세포 활성화를 지칭한다. 본원에서 "세포독성"은 세포에 대하여 독성을 갖는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질과 같은 화합물의 특질을 지칭한다. 세포독성은 상이한 작용 메커니즘에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라, 세포-매개 세포독성, 아폽토시스, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)으로 나뉠 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 세포-매개 면역 방어 메커니즘을 지칭하며, 그에 의해, 면역계의 이펙터 세포는 막-표면 항원에 본 발명의 특이적 항체 또는 항체-유사 결합 단백질이 결합된 표적 세포를 활발하게 용해시킨다.
본 발명의 맥락에서 "보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체계 단백질의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다.
"세포-매개 세포독성"은 이펙터 림프구, 예컨대 세포독성 T 림프구 또는 자연 살해 세포에 의한 표적 세포의 세포용해를 지칭하며, 이에 따라, T-세포-매개 세포독성 및 NK-세포 세포독성으로 구별될 수 있다.
"도메인"은 일반적으로 서열 상동성에 기초하여 정의되며, 특정한 구조적 또는 기능적 엔티티와 종종 관련된 단백질의 임의의 영역일 수 있다.
"재조합" 분자는 재조합적 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 것이다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하거나 이에 상응하는 DNA 서열을 의미하며, 예를 들어, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는, 프로모터 서열과 같은 조절 DNA 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 구조 유전자가 아닌 일부 유전자는 DNA로부터 RNA로 전사될 수 있지만, 아미노산 서열로 번역되지는 않는다. 다른 유전자는 구조 유전자의 조절자로서, 또는 DNA 전사의 조절자로서 기능할 수 있다. 특히, 용어 유전자는 단백질을 코딩하는 게놈 서열, 즉, 조절자, 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 서열을 위해 의도된 것일 수 있다.
"기준 서열과 적어도 85% 동일한" 서열은 이의 전장에서 기준 서열의 전장과 85% 이상, 특히 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열이다.
본 출원의 맥락에서, "동일성 백분율"은 전체 쌍별 정렬을 사용하여 계산된다(즉, 2개의 서열은 그들의 전체 길이에 걸쳐 비교된다). 둘 이상의 서열의 동일성의 비교 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 2개의 서열들의 전체 길이를 고려할 때 이들 서열의 (갭을 포함한) 최적 정렬을 찾기 위해 니들맨-분쉬(Needleman-Wunsch) 전체 정렬 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453])을 사용하는 ≪니들(needle)≫ 프로그램이 사용될 수 있다. 니들 프로그램은 예를 들어, ebi.ac.uk ebi.ac.uk World Wide Web 사이트에서 입수가능하다. 본 발명에 따른 두 폴리펩티드 사이의 동일성 백분율은, "갭 오픈(Gap Open)" 파라미터가 10.0이며, "갭 익스텐드(Gap Extend)" 파라미터가 0.5이고, Blosum62 매트릭스를 이용하는 EMBOSS: 니들 (글로벌) 프로그램을 사용하여 계산된다.
기준 서열과 "적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한" 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 기준 서열에 비하여 돌연변이, 예컨대 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 치환의 경우에, 기준 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 기준 서열과 다른 종으로부터 유래된 상동성 서열에 상응할 수 있다.
"아미노산 치환"은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 바람직하게는, 치환은 보존적 치환이며, 여기서, 하나의 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 치환은 바람직하게는 하기 표에 나타낸 바와 같은 보존적 치환에 상응한다.
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용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시켜 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하도록 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있게 하는 비히클을 의미한다.
용어 "형질전환"은 "외래"(즉, 외인성) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포로 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생성하도록 하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 제공받고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환되었다".
용어 "발현 시스템"은 숙주 세포 및 양립가능한 벡터(적합한 조건 하에서)로서, 예를 들어, 벡터가 지니고 있는 외래 DNA에 의해 코딩되고 숙주 세포로 도입된 단백질의 발현을 위한 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약 조성물" 또는 "치료용 조성물"은 환자에게 적당하게 투여되는 경우, 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
"제약상" 또는 "제약상 허용가능한"은 적절할 경우, 포유동물, 특히 인간에 투여될 때, 유해 반응, 알러지 반응 또는 기타 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다. "제약상 허용가능한 담체" 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형화 보조제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 설치류, 고양이과, 개과 및 영장류를 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 대상체는 인간이다.
용어 "대상체" 또는 "개체"는 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 박쥐; 흰담비; 토끼; 고양이과(고양이); 개과(개); 영장류(원숭이), 말과(말); 남성, 여성 및 아동을 포함하는 인간이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 (즉, 주어진 질환을 갖는 대상체에서의) 치료적 사용을 지칭하며, 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행의 저해를 의미한다. 따라서, 치료는 질환의 완전한 치유를 초래하는 치료를 지칭할 뿐만 아니라 질환의 진행을 늦추고/늦추거나 대상체의 생존을 연장시키는 치료를 지칭하기도 한다.
"예방하는"은 예방적 사용(즉, 주어진 질환이 발병하기 쉬운 대상체에 대한 예방적 사용)을 의미한다.
"치료를 필요로 하는"이라는 용어는 이미 그 장애에 걸린 대상체와, 그 장애를 예방해야 하는 대상체를 지칭한다.
항체-유사 결합 단백질 또는 이의 제약 조성물의 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 이익/위험 비로, 상기 암 질환을 치료하기에 충분한 항체-유사 결합 단백질의 양을 의미한다. 그러나 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물의 총 일일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 이용된 특정 폴리펩티드의 활성; 이용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 이용된 특정 폴리펩티드의 배출 속도; 치료 지속기간; 이용된 특정 폴리펩티드와 조합하여 또는 동시에 이용된 약물; 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 내에서 잘 알려져 있다.
"재발"은 완전 관해 후의 AML의 재발생으로 정의된다.
"완전 관해" 또는 "CR"은 다음과 같이 정의된다: 호중구에 대한 정상 값(1.0*109/L 초과), 10 g/dL의 헤모글로빈 수준 및 혈소판 수(100*109/L 초과) 및 적혈구 수혈로부터의 독립성; 5% 미만의 모세포, 모세포의 클러스터 또는 콜렉션(collection)의 부재, 및 골수 검사에서의 아우어 로드(Auer rod)의 부재; 및 정상적인 혈액 세포의 성숙(형태; 척수조영상) 및 골수외 백혈병의 부재.
"백혈병 줄기 세포(LSC)"는 정상 줄기 세포와 연관된 특징, 즉, 자가 재생성 및 다계통 발생 능력을 보유하는 암세포이다. 이러한 세포는 별개의 집단으로서 혈액암, 예컨대 AML에서 지속되는 것으로 제안된다. AML 환자에 존재하는 LCS는 소위 "AML-LCS"이다.
"급성 골수성 백혈병(AML)"은 이종성 미분화 골수성 모세포의 증식 증가로서 임상적으로 나타나는 클론성 장애이다. 백혈병 계층은 특유한 자가 재생능을 가지며 백혈병 전구세포로 분화될 수 있는 LSC의 소 집단(AML-LCS)에 의해 유지된다. 이들 전구세포는 진단 및 재발시에(궁극적으로 사망을 초래함) 환자에서 용이하게 검출가능한 다수의 백혈병 모세포를 생성한다. AML-LSC는 빠르게 분열하는 클론원성 전구세포와는 대조적으로 통상적으로 휴지 세포로 보고되어 있다. 이러한 AML-LSC의 특성은 증식 중인 세포를 표적으로 하는 통상적인 화학치료제를 덜 효과적으로 만들며, 이것은 높은 비율의 AML 환자가 완전한 관해에 진입하지만, 거의 변함없이 재발하며, 성인의 30% 미만이 4년 넘게 생존한다는 현재의 경험을 가능성 있게 설명한다. 게다가, 미세 잔존 질환 발생과 불량한 생존성은 AML 환자의 진단시의 높은 LSC 빈도에 기인하였다. 그 결과, AML(및 유사하게는 다른 상기 언급된 혈액암 병태)의 장기적 관리가 반드시 필요하여, LSC를 특이적으로 제거하도록 새로운 치료법이 개발되어야 한다. CD123의 과발현은 정상 조혈 세포에 비하여 AML 모세포 및 CD34+/CD38 AML- LSC 상에서 보고되었다.
항-CD3/항-CD123항체-유사 결합 단백질
단순함을 위하여, 본 출원 전반에 걸쳐, "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질" 또는 "본 발명의 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질"은 "항체-유사 결합 단백질" 또는 "본 발명의 항체-유사 결합 단백질"로 지칭될 수 있다.
이러한 항체-유사 결합 단백질은 CODV 설계를 갖는다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 본원에 참고로 포함되는 국제 공개 제2012/135345호에 이전에 기술된 바와 같이 CODV 형식으로 존재한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 국제 공개 제2012/135345호에 이전에 기술된 바와 같이 CODV 형식으로 존재하며, 여기서, 경쇄는 추가 Fc 도메인에 의해 연장된다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 그러한 항체-유사 결합 단백질로는 CODV-Fab-TL1 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질이 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 국제 공개 제2012/135345호에 이전에 기술된 바와 같이 CODV 형식으로 존재하며, 여기서, 추가 Fc 도메인이 있다. 중쇄는 Fc 도메인을 포함하지만 경쇄는 그렇지 않다. 본 발명의 그러한 항체-유사 결합 단백질로는 CODV-Fab-OL1 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질이 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것으로서, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VD1-L1-VD2-L2-CL
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고,
a) 화학식 I의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함하는 서열 번호 55의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 55의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어지며;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
일 실시 형태에서, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며 X7은 Y임)로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않고/않거나,
본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이고 X7은 Y이거나 X6은 R이고 X7은 F임)로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않는다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않고/않거나,
본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 61 또는 서열 번호 65의 아미노산 서열로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않는다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함하지 않는다:
a) 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 및/또는
b) 서열 번호 55의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 I의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 61의 아미노산 서열, 및 서열 번호 63의 폴리펩티드 Fc 스텀프(Fc3)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드; 및/또는
c) 서열 번호 55의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 I의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 65의 아미노산 서열, 및 서열 번호 64의 폴리펩티드 Fc 스텀프(Fc3)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드.
항체-유사 결합 단백질은, 폴리펩티드 [I]이 각각 인간화 항-CD123 항체 "7G3" ("hz7G3"으로도 칭해짐) 및 인간화 항-CD3 항체 "20G6" ("hz20G6"으로도 칭해짐)의 경쇄의 가변 도메인인 VD1 및 VD2를 포함하고, 폴리펩티드 [III]이 각각 인간화 항-CD3 항체 "20G6" ("hz20G6으로도 칭해짐) 및 인간화 항-CD123 항체 "7G3" ("hz7G3"으로도 칭해짐)의 중쇄의 가면 도메인인 VD3 및 VD4를 포함하기 때문에, 소위 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질이다.
더 구체적으로, 항체-유사 결합 단백질은, 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 폴리펩티드가 인간화 항-CD123 항체 "7G3"("hz7G3"으로도 칭해짐)의 경쇄 가변 도메인인 서열 번호 54의 서열의 VD1, 및 인간화 항-CD3 항체 "20G6"의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열(VL1c)인 서열 번호 10의 서열의 VD2를 포함하고, 화학식 III으로 표시되는 구조를 갖는 폴리펩티드 사슬이 인간화 항-CD3 항체 "20G6"의 중쇄 가변 도메인 변이체 VH1d인 서열 번호 9의 서열의 VD3 및 인간화 항-CD123 항체 "7G3"("hz7G3"으로도 칭해짐)의 변이형 중쇄 가변 도메인인 서열 번호 52의 서열의 VD4를 포함하기 때문에, 소위 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질이다.
상기에 정의된 바와 같이, 화학식 III으로 표시되는 구조를 갖는 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하며, 여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F이다.
당업자라면,
- X1이 Y이며, X2가 S이며, X3이 T이며, X4가 L이며, X5가 Y이며, X6이 H이며, X7이 Y인 서열 번호 68의 Fc 서열은 소위 서열 번호 60의 야생형 Fc 서열이고,
- X1이 Y이며, X2가 S이며, X3이 T이며, X4가 L이며, X5가 Y이며, X6이 R이며, X7이 F인 서열 번호 68의 Fc 서열은 RF 돌연변이를 포함하는 Fc 서열이고,
- X1이 C이며, X2가 S이며, X3이 S이며, X4가 A이며, X5가 V이며, X6이 H이며, X7이 Y인 서열 번호 68의 Fc 서열은 "정의"라는 섹션에서 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 홀 돌연변이를 포함하는 Fc 서열로서 서열 번호 75의 Fc 도메인으로 이어지고,
- X1이 C이며, X2가 S이며, X3이 S이며, X4가 A이며, X5가 V이며, X6이 R이며, X7이 F인 서열 번호 68의 Fc 서열은 본원에서 상기에 이미 정의된 바와 같은 RF 돌연변이 및 홀 돌연변이를 포함하는 Fc 서열로서 서열 번호 79의 Fc 도메인으로 이어지고,
- X1이 Y이며, X2가 C이며, X3이 W이며, X4가 L이며, X5가 Y이며, X6이 H이며, X7이 Y인 서열 번호 68의 Fc 서열은 "정의"라는 섹션에서 본원에서 상기에 이미 정의된 바와 같은 놉 돌연변이를 포함하는 Fc 서열로서 서열 번호 66의 Fc 도메인으로 이어지고,
- X1이 Y이며, X2가 C이며, X3이 W이며, X4가 L이며, X5가 Y이며, X6이 R이며, X7이 F인 서열 번호 68의 Fc 서열은 "정의"라는 섹션에서 본원에서 상기에 이미 정의된 바와 같은 놉 돌연변이 및 RF 돌연변이를 포함하는 Fc 서열로서 서열 번호 62의 Fc 도메인으로 이어짐을 이해할 것이다.
Fc 도메인들, 즉, 서열 번호 68의 Fc 및 FC 및 Fc2 도메인(서열 번호 70)(서열 번호 70의 Fc2 도메인은 본원에서 하기에 소개됨) 중 임의의 것에서의 일반 정의(이에 따르면, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임)는 X1이 Y 또는 C이며, X2가 S 또는 C이며, X3이 T, S 또는 W이며, X4가 A 또는 L이며, X5가 V 또는 Y이며, X6이 H 또는 R이며, X7이 Y 또는 F인 모든 실시 형태에서 다음에 따른 정의로 대체될 수 있음이 추가로 이해될 것이다:
- X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이거나(야생형에 상응함), 또는
- X1은 C이며, X2는 S이며, X3은 S이며, X4는 A이며, X5는 V이거나("홀" 돌연변이에 상응함), 또는
- X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며("놉" 돌연변이에 상응함),
- X6은 H이며, X7은 Y이거나(야생형에 상응함), 또는
- X6은 R이며, X7은 F이다("RF" 돌연변이에 상응함).
따라서, 추가 예시를 위하여, 일 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것으로서, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VD1-L1-VD2-L2-CL
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고,
a) 화학식 I의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함하는 서열 번호 55의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 55의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어지며;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서,
X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이거나, 또는
X1은 C이며, X2는 S이며, X3은 S이며, X4는 A이며, X5는 V이거나, 또는
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며,
X6은 H이며, X7 은 Y이거나, 또는
X6은 R이며, X7은 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
추가 실시 형태에서, 제2 Fc 도메인(Fc2로 칭해짐)이 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab의 화학식 I의 폴리펩티드에 부가된다.
따라서, 일 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리펩티드는 Fc 도메인(Fc2)을 추가로 포함한다. 상기 실시 형태에서, 링커 L5는 화학식 I의 폴리펩티드 사슬의 CL 및 Fc2 도메인 사이에 존재하여, 화학식 IV의 폴리펩티드 사슬을 생성한다.
특정한 일 실시 형태에서, 화학식 I의 폴리펩티드는 서열 번호 70의 Fc2 도메인을 추가로 포함하며, 여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F이다.
따라서, 본 발명은 추가로 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고,
a) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 화학식 I로 표시되는 폴리펩티드 사슬에 대하여 상기에 정의된 바와 같은 VD1, L1, VD2, L2 및 CL 및 0개의 아미노산으로 이루어진 L5 및 서열 번호 70의 서열의 Fc2를 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임), 또는
서열 번호 71의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 화학식 IV로 표시되는 상기 폴리펩티드 사슬에서 서열 번호 71에서 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 서열 번호 67에서 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 IV의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
화학식 III 및 IV로 표시되는 폴리펩티드 사슬이 그들의 각각의 Fc2 및 Fc 영역을 통하여 이량체화하는 이러한 CODV 형식은 본원에서 CODV-Fab-TL로 지칭된다.
관련 실시 형태에서, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은
a) 화학식 IV의 폴리펩티드가 화학식 I로 표시되는 폴리펩티드 사슬에 대하여 상기에 정의된 바와 같은 VD1, L1, VD2, L2 및 CL 및 0개의 아미노산으로 이루어진 L5 및 서열 번호 70의 서열의 Fc2를 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 R이며, X7은 F임)로 이루어지고,
b) 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y임)로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않는다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질은
a) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고,
b) 화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 항체-유사 결합 단백질을 포함하지 않는다.
추가의 관련 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것으로서, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고,
a) 화학식 IV의 상기 폴리펩티드는
(i)
· 서열 번호 54의 서열의 VD1,
· 서열 번호 56의 서열의 L1,
· 서열 번호 10의 서열의 VD2,
· 서열 번호 56의 서열의 L2,
· 서열 번호 18의 서열의 CL,
· 0개의 아미노산으로 이루어진 L5, 및
· 서열 번호 70의 서열로 이루어진 Fc2를 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열
· (여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
· X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
· X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 R이며, X7은 F임),
또는
(ii) 서열 번호 71의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서,
· 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 71에서 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 a)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며;
b) 화학식 III의 상기 폴리펩티드는
(i)
· 서열 번호 9의 서열의 VD3,
· 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 및
· 서열 번호 52의 서열의 VD4,
· 0개의 아미노산으로 이루어진 L4,
· 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및
· 서열 번호 68의 서열로 이루어진 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임),
또는
(ii) 서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서,
· 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 67의 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 b)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며,
화학식 IV의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
추가의 관련 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고, 여기서,
a) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 70의 서열의 Fc2 및 0개의 아미노산으로 이루어진 L5 및 상기에 정의된 바와 같은 VD1, L1, VD2, L2 및 CL을 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열
(여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 R이며, X7은 F임), 또는
서열 번호 71의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 서열 번호 71에서 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 서열 번호 67의 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 IV의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
하나의 Fc 도메인이 야생형 서열이거나 놉 돌연변이를 지닐 때 다른 하나의 Fc 도메인은 야생형이거나 홀 돌연변이를 지닌다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
따라서, 하나의 추가의 관련 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) 서열 번호 70의 서열의 Fc2 및 0개의 아미노산으로 이루어진 L5 및 상기에 정의된 바와 같은 VD1, L1, VD2, L2 및 CL을 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드
(여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 R이며, X7은 F임), 및
b) 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드(여기서,
X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이거나, 또는
X1은 C이며, X2는 S이며, X3은 S이며, X4는 A이며, X5는 V이며,
X6은 H이며, X7 은 Y이거나, 또는
X6은 R이며, X7은 F임).
따라서, 하나의 특정한 실시 형태에서, 본 발명은 추가로 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2
로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 갖고, 여기서,
a) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 70의 서열의 Fc2 및 0개의 아미노산으로 이루어진 L5 및 화학식 I로 표시되는 폴리펩티드 사슬에 대하여 상기에 정의된 바와 같은 VD1, L1, VD2, L2 및 CL을 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는 X6은 R이며, X7은 F임), 또는
서열 번호 71의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 화학식 IV로 표시되는 상기 폴리펩티드 사슬에서 서열 번호 70에서 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서,
X1은 C이며, X2는 S이며, X3은 S이며, X4는 A이며, X5는 V이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는 X6은 R이며, X7은 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 서열 번호 67에서 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 IV의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 81의 서열 또는 서열 번호 81의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 60의 서열 또는 서열 번호 60의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
b) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 73의 서열 또는 서열 번호 73의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 서열 또는 서열 번호 75의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
c) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 서열 또는 서열 번호 77의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 서열 또는 서열 번호 75의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
d) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 서열 또는 서열 번호 77의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 79의 서열 또는 서열 번호 79의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것.
따라서, 하나의 추가 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 73의 서열 또는 서열 번호 73의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 서열 또는 서열 번호 75의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
ii) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 서열 또는 서열 번호 77의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 79의 서열 또는 서열 번호 79의 서열과 적어도 85% 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 것.
추가 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 다음의 항체-유사 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 81의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 60의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
b) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 73의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
c) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
d) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 79의 Fc 도메인을 포함하는 것.
추가 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 다음의 항체-유사 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 73의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 Fc 도메인을 포함하는 것, 또는
ii) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 79의 Fc 도메인을 포함하는 것.
추가 실시 형태에서, 항체-유사 결합 분자는 다음을 포함한다:
a) 서열 번호 80의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 80의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 80의 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 59의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 59의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 59의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드; 또는
b) 서열 번호 72의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 72의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 72의 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 74의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 74의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 74의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드; 또는
c) 서열 번호 76의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 76의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 76에서 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 74의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 74의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 74의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드; 또는
d) 서열 번호 76의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 76의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 76에서 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 78의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 78의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 78의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드.
추가 실시 형태에서, 항체-유사 결합 분자는 다음을 포함한다:
i) 서열 번호 72의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 72의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 72의 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 74의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 74의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 74의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드; 또는
ii) 서열 번호 76의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 76의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 76에서 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 78의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 78의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 78의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드.
추가 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 서열 번호 80의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드,
ii) 서열 번호 72의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드,
iii) 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 및
iv) 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드.
추가 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
a) 서열 번호 72의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드,
b) 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
서열 번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드.
일 실시 형태에서, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 화학식 I로 표시되는 구조를 갖는 하나의 폴리펩티드 사슬 및 화학식 III으로 표시되는 구조를 갖는 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체-유사 결합 단백질은 Fc 도메인(Fc3으로 칭해짐)을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 추가로 포함한다.
화학식 III으로 표시되는 구조를 갖는 제2 폴리펩티드는 제1 Fc 도메인을 포함하기 때문에 상기 FC3 도메인은 제2 Fc 도메인으로 지칭될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 다음 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서,
제1 폴리펩티드는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VD1-L1-VD2-L2-CL
로 표시되는 구조를 갖고, 제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 가지며; 제3 폴리펩티드 Fc3은 면역글로불린의 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
a) 화학식 I의 상기 폴리펩티드는
(i) 서열 번호 55의 아미노산 서열(이는
· 서열 번호 54의 서열의 VD1,
· 서열 번호 56의 서열의 L1,
· 서열 번호 10의 서열의 VD2,
· 서열 번호 56의 서열의 L2,
· 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함함),
또는
(ii) 서열 번호 55의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서,
· 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어지며;
b) 화학식 III의 상기 폴리펩티드는
(i) 서열 번호 67의 아미노산 서열(이는
· 서열 번호 9의 서열의 VD3,
· 0개의 아미노산으로 이루어진 L3,
· 서열 번호 52의 서열의 VD4,
· 0개의 아미노산으로 이루어진 L4,
· 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및
· 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하며, 여기서, X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는 X6은 R이며, X7은 F임),
또는
(ii) 서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서,
· 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
· 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 b)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며,
여기서,
- 화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
- 화학식 III의 폴리펩티드는 이의 Fc 도메인을 통하여 제3 폴리펩티드에 의해 이종이량체화된다.
- 상기 제3 폴리펩티드 Fc3은 서열 번호 69의 서열 또는 서열 번호 69의 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어지며, 여기서, 서열 번호 69의 아미노산 위치 129, 146, 148, 187, 215, 216은 비변경된다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 다음 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서,
제1 폴리펩티드는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VD1-L1-VD2-L2-CL
로 표시되는 구조를 갖고, 제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
으로 표시되는 구조를 가지며; 제3 폴리펩티드 Fc3("Fc 스텀프"로도 칭해짐)은 면역글로불린의 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
a) 화학식 I의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함하는 서열 번호 55의 아미노산 서열, 또는
서열 번호 55의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어지며;
b) 화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산으로 이루어진 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4, 0개의 아미노산으로 이루어진 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서,
X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는 X6은 R이며, X7은 F임), 또는
서열 번호 67의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며, 상기 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기에 정의된 바와 같음)로 이루어지고;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
화학식 III의 폴리펩티드는 이의 Fc 도메인을 통하여 제3 폴리펩티드에 의해 이종이량체화된다.
따라서, 상기 실시 형태에서, 소위 "Fc 스텀프"(Fc3)는 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 영역에 의해 이종이량체화된다. 이러한 CODV 형식은 본원에서 CODV-Fab-OL로 지칭된다. 이러한 구축물은 CODV-Fab가 응집체를 형성하는 것을 막는다.
따라서, 특정한 일 실시 형태에서, 상기에 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질의 Fc3 도메인은 서열 번호 69의 서열로 이루어진다.
관련 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 서열 번호 55의 서열, 또는
서열 번호 55의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어진 화학식 I의 폴리펩티드; 및
서열 번호 66의 서열, 또는
서열 번호 78의 서열과 적어도 85% 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 78의 아미노산 위치 473, 492, 531, 539, 560, 478, 490은 비변경됨)의 Fc 도메인을 포함하는 화학식 III의 폴리펩티드; 및
- 서열 번호 69의 서열 또는 서열 번호 69의 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어진 Fc 스텀프(Fc3)(여기서, 서열 번호 69의 아미노산 위치 129, 146, 148, 187, 215, 216은 비변경됨).
추가의 관련 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 서열 번호 55의 서열로 이루어진 화학식 I의 하나의 폴리펩티드,
- 서열 번호 65의 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 69의 서열 또는 서열 번호 69의 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어진 Fc 스텀프(Fc3)(여기서, 서열 번호 69의 아미노산 위치 129, 146, 148, 187, 215, 216은 비변경됨).
추가의 관련 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 서열 번호 55의 서열로 이루어진 화학식 I의 하나의 폴리펩티드,
- 서열 번호 65의 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 및
- 서열 번호 69의 서열 또는 서열 번호 69의 서열과 적어도 85% 동일한 서열로 이루어진 Fc 스텀프(Fc3).
일부 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질이 2개의 Fc 도메인을 포함할 경우(즉, CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질(Fc 및 Fc2), 및 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질(Fc 및 Fc3), 상기 2개의 Fc 도메인은 동일한 면역글로불린 아이소타입 또는 아이소타입 하위클래스의 것이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, CODV-Fab-TL1의 Fc 및 Fc2 둘 다, 또는 CODV-Fab-OL1의 Fc 및 Fc3 둘 다는 IgG1 하위클래스, 또는 IgG2 하위클래스, 또는 IgG3 하위클래스, 또는 IgG4 하위클래스의 것이다.
CODV-Fab-TL1 "hz20G6x7G3"항체-유사 결합 단백질에서, Fc 서열 및 Fc2 서열은 IgG1 백본 유래의 것이다. 상기 CODV-Fab-TL1 변이체는 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드 및 화학식 III의 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 본원에 기술된 바와 같은 모든 항체-유사 결합 단백질은 이펙터 기능을 갖지 않는다. 이것은 항체-유사 결합 단백질이 IgG1 하위클래스의 하나 이상의 Fc 도메인(들)(즉, 화학식 III에서 Fc, 화학식 IV에서 Fc2 및/또는 Fc3)을 함유하는 경우에, IgG1 백본의 상기 하나 이상의 Fc 도메인(들)이 Fc 이펙터 기능을 없애는 이중 돌연변이 L234A 및 L235A(소위 "LALA 돌연변이")를 함유함을 의미한다.
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체-유사 단백질의 모든 Fc 도메인은 이중 돌연변이 L234A 및 L235A를 함유하며, 따라서 상기 돌연변이는 본 발명의 항체-유사 단백질과 관련하여 추가로 언급되지도 않고 본 발명의 항체-유사 단백질의 서열에서 추가로 표시되지도 않는다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역은 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 RF 및/또는 "놉-인투-홀" 돌연변이를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 화학식 I 또는 화학식 IV의 폴리펩티드의 VD1 및 VD2는 둘 모두 경쇄의 가변 도메인 또는 중쇄의 가변 도메인 중 어느 하나이며, 폴리펩티드 [III]의 VD3 및 VD4는 둘 모두 중쇄의 또는 경쇄의 가변 도메인이다. 이러한 상호교환 가능성은 "교체 가능성(swapability)"으로도 지칭되며, 이에 따라, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 교차 이중 가변(CODV) 구성을 결정한다. 상기 정의에 따르면, VD1 및 VD4는 제1 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인이며, VD2 및 VD3은 제2 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인이며, 이에 따라, VD1 및 VD4, 및 VD2 및 VD3은 동족 도메인으로 여겨질 것이다.
따라서, 용어 "교차"는 화학식 I 또는 화학식 IV의 폴리펩티드의 VD1 또는 VD2의 교체된 정렬(화학식 III의 폴리펩티드의 이의 동족 가변 도메인 VD4 또는 VD3과 관련하여)을 지칭한다. 특정한 일 실시 형태에서, VD1 및 VD2는 경쇄 가변 도메인이며, VD3 및 VD4는 중쇄 가변 도메인이다.
본 발명의 맥락에서, 몇몇 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질, 소위 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질, 특히 다음이 생성되었다:
CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole,
CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF,
CODV-Fab-TL1,
CODV-Fab-TL1-Knobxhole,
GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF.
특정한 일 실시 형태에서, 본 발명은 CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질인 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF 및 CODV-Fab-TL1-Knobxhole, 더 구체적으로 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF에 관한 것이다. 이 항체-유사 결합 단백질 전부는 놉-인투-홀 돌연변이를 포함하며, 여기서, 놉 돌연변이는 경쇄(즉, 폴리펩티드 IV의 경쇄)의 Fc 영역 내에 위치하며, 홀 돌연변이는 중쇄에, 즉, 폴리펩티드 III에 위치한다. 상기 항체-유사 결합 단백질은 RF 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 상기에 언급된 바와 같이, 놉-인투-홀 돌연변이는 항체-유사 결합 단백질의 이종이량체의 양을 증가시킨다.
소위 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00008
(서열 번호 72, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL, 0개의 아미노산을 포함하는 L5, 및 서열 번호 73의 서열의 Fc2(밑줄이 그어져 있음)를 포함함)
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00009
(서열 번호 74)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 75의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함).
상기 항체-유사 결합 단백질은 CODV-Fab-TL 형식으로 존재하며, 즉, 그것은 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드 및 화학식 III의 하나의 폴리펩티드를 함유하거나, 이로 이루어진다.
서열 번호 58의 서열의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 서열은 아미노산 위치 116 및 117에서 RF 돌연변이를 포함한다(상기에서 볼드체).
더욱이, 그의 Fc 및 Fc2 서열은 "놉-인투-홀" 기술에 따라 조작되었으며, Fc2 도메인은 이전에 놉 돌연변이로 기술된 서열 번호 73에서의 S134C 및 T146W 돌연변이(볼드체로 표시된 바와 같음)를 추가로 포함하며, Fc는 이전에 홀 돌연변이로 기술된 서열 번호 75에서의 Y134C, T151S, L153A, Y192V를 추가로 포함한다.
소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00010
(서열 번호 76, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL, 0개의 아미노산을 포함하는 L5, 및 서열 번호 77의 서열의 Fc2(밑줄이 그어져 있음)를 포함함); 및
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00011
(서열 번호 78)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 79의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함).
화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 서열은 그의 서열 번호 77의 서열에서 S134C 및 T146W 돌연변이를 포함한다. 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 서열은 돌연변이 Y134C, T151S, L153A, Y192V(홀 돌연변이) 및 RF 돌연변이(그의 서열 번호 79의 서열에서)를 포함한다.
소위 CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00012
(서열 번호 80, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL, 0개의 아미노산을 포함하는 L5, 및 서열 번호 81의 서열의 Fc2(밑줄이 그어져 있음)를 포함함); 및
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00013
(서열 번호 59)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 60의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함).
소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00014
(서열 번호 76, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL, 0개의 아미노산을 포함하는 L5, 및 서열 번호 77의 서열의 Fc2(밑줄이 그어져 있음)를 포함함); 및
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00015
(서열 번호 74)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 75의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함).
화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 서열은 그의 서열 번호 77의 서열에서 S134C 및 T146W 돌연변이를 포함한다. 폴리펩티드 III의 Fc 도메인은 서열 번호 75에서 홀 돌연변이 Y134C, T151S, L153A, Y192V를 포함한다.
CODV-Fab-OL1a와 비교하여 GS를 포함하지 않는 새롭게 개발된 분자 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(woGS)는 Fc 스텀프(Fc3)의 N-말단에 위치하는 아미노산 "GS"를 포함하지 않는다.
GS를 포함하지 않는 단백질 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(woGS)는 정제가 용이하고, 단백질 A 정제 후 많은 양의 이종이량체를 갖는다(즉, 88%의 이종이량체가 도 4에서 보였음).
GS를 포함하지 않는 소위 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 I의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00016
(서열 번호 55)(이는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 및 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함함);
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00017
(서열 번호 65)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체이고 밑줄이 그어져 있음), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 66의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함);
- 소위 GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질이 다음 아미노산 서열의 Fc 스텀프(Fc3)를 추가로 포함하는 것:
Figure pct00018
(서열 번호 69)(이는 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 영역에 의해 이종이량체화됨).
서열 번호 66의 서열의 Fc는 위치 220~221에서 HY 잔기(상기에서 볼드체)를 포함하고, 놉 돌연변이 S139C 및 T151W를 포함한다(한편, 서열 번호 69의 서열의 Fc 스텀프는 위치 217~218에서 RF 잔기(상기에서 볼드체)를 포함하고, 홀 돌연변이 Y131C, T148S, L150A 및 Y189V를 포함한다).
항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질, 소위 "hz20G6Xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질:
CODV-Fab-TL1-RF,
CODV-Fab-OL1 및
CODV-Fab-OL1a
가 국제 특허 출원 제PCT/EP2016/051386호에 개시되어 있는데, 상기 국제 특허 출원은 본 특허 출원의 우선 출원일에 아직 공개되지 않았다(유럽 특허 조약에 따른 54조 3항).
소위 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 국제 특허 출원 제PCT/EP2016/051386호(이는 본 특허 출원의 우선 출원일에 아직 공개되지 않았음(유럽 특허 조약에 따른 54조 3항))에 CODV-Fab-TL1이라는 명칭으로 이전에 개시되었으며, 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00019
(서열 번호 57, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 서열 번호 18의 서열의 CL, 0개의 아미노산을 포함하는 L5, 및 서열 번호 58의 서열의 Fc2(밑줄이 그어져 있음)를 포함함); 및
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00020
(서열 번호 59)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 60의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함).
상기 항체-유사 결합 단백질은 CODV-Fab-TL 형식으로 존재하며, 즉, 그것은 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드 및 화학식 III의 하나의 폴리펩티드를 함유하거나, 이로 이루어진다. 서열 번호 58의 서열의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 서열은 추가로, Fc 영역의 위치 116 및 117에 존재했을 HY 잔기 대신 이들 위치에서 RF 잔기(상기에서 볼드체)를 포함하도록 설계되었다. HY > RF 돌연변이(즉, 문헌[Jendeberg, L. et al. 1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34)]에 기술된 바와 같이 CH3 도메인에서 H435R 및 Y436F)는 단백질 A에의 결합성을 없애기 때문에 정제 목적에 유리하다.
소위 CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 국제 특허 출원 제PCT/EP2016/051386호(이는 본 특허 출원의 우선 출원일에 아직 공개되지 않았음(유럽 특허 조약에 따른 54조 3항))에 이전에 개시되었으며, 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 I의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00021
(서열 번호 55, 링커는 볼드체로 표시되어 있고 밑줄이 그어져 있음)(이는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 및 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함함); 및
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00022
(서열 번호 61)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체이고 밑줄이 그어져 있음), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 62의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함);
소위 CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음 아미노산 서열의 Fc 스텀프(Fc3)를 추가로 포함함:
Figure pct00023
(서열 번호 63)(이는 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 영역에 의해 이종이량체화됨).
상기 항체-유사 결합 단백질은 CODV-Fab-OL 형식으로 존재하며, 즉, 그것은 화학식 I의 하나의 폴리펩티드, 화학식 III의 하나의 폴리펩티드 및 하나의 Fc 스텀프를 함유하거나 이로 이루어진다. 그의 Fc 및 Fc3 서열은 "놉-인투-홀" 기술에 따라 조작되었으며, Fc 도메인은 이전에 놉 돌연변이로 기술된 서열 번호 62에서의 S139C 및 T151W 돌연변이(볼드체로 표시된 바와 같음)를 추가로 포함하며, Fc3은 이전에 홀 돌연변이로 기술된 서열 번호 63에서의 Y131C, T148S, L150A 및 Y189V를 추가로 포함한다. 서열 번호 62의 서열의 Fc 서열은 추가로, 위치 220~221에서 RF 돌연변이(상기에서 볼드체)를 포함하도록 설계되었다.
소위 CODV-Fab-OL1a "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 국제 특허 출원 제PCT/EP2016/051386호(이는 본 특허 출원의 우선 출원일에 아직 공개되지 않았음(유럽 특허 조약에 따른 제54조(3)))에 이전에 개시되었으며, 다음을 포함한다:
- 다음 아미노산 서열의 화학식 I의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00024
(서열 번호 55)(이는 서열 번호 54의 서열의 VD1, 서열 번호 56의 서열의 L1, 서열 번호 10의 서열의 VD2, 서열 번호 56의 서열의 L2, 및 서열 번호 310의 서열의 CL을 포함함);
- 다음 아미노산 서열의 화학식 III의 하나의 폴리펩티드:
Figure pct00025
(서열 번호 65)(서열 번호 9의 서열의 VD3, 0개의 아미노산인 L3, 서열 번호 52의 서열의 VD4(이탤릭체이고 밑줄이 그어져 있음), 0개의 아미노산인 L4, 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및 서열 번호 66의 서열의 Fc(밑줄이 그어져 있음)를 포함함);
- 소위 CODV-Fab-OL1a "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질은 다음 아미노산 서열의 Fc 스텀프(Fc3)를 추가로 포함함:
Figure pct00026
(서열 번호 64)(이는 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 영역에 의해 이종이량체화됨).
서열 번호 66의 서열의 Fc는 위치 220~221에서 HY 잔기(상기에서 볼드체)를 포함하고, 놉 돌연변이 S139C 및 T151W를 포함한다(한편, 서열 번호 64의 서열의 Fc 스텀프는 위치 217~218에서 RF 잔기(상기에서 볼드체)를 포함하고, 홀 돌연변이 Y131C, T148S, L150A 및 Y189V를 포함한다).
본 발명자는 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-RF의 몇몇 대안적인 분자, 예컨대 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1 및 CODV-Fab-TL1-Knobxhole을 개발하였다. 더욱이, 본 발명자는 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1 및 CODV-Fab-OL1a에 대한 대안으로서 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF를 개발하였다.
이러한 CODV-Fab-TL1 변이체는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 이종이량체의 정제의 단순화, 응집의 감소 및 이에 따른 수율의 증가를 위하여 놉-인투 홀 돌연변이 및/또는 RF 돌연변이를 포함한다. 단백질 A 정제 후 수득되는 항체-유사 결합 단백질은 예를 들어 CODV-Fab-TL1-RF의 경우 52%의 이종이량체, CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole의 경우 72 내지 85%의 이종이량체, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF의 경우 55%의 이종이량체 및 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF의 경우 88%의 이종이량체를 포함한다. 더욱이, 항체-유사 결합 단백질들의 융점들은 56~57℃에서 매우 유사한 것으로 밝혀졌다(실시예 2.7.1).
본원에서 상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 CD3 및 Cd123에 결합한다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD3에 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 추가로 마카카 파시쿨라리스 Cd3에 결합한다. 특히, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD3 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3 둘 다의 세포외 도메인에 결합한다. 더욱 구체적으로, 항체는 CD3ε에 결합한다. 더욱 구체적으로, 항체-유사 결합 단백질은 인간 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스의 CD3ε의 세포외 도메인에 결합한다. 항체-유사 결합 단백질은 단리된 형태로 발현되든지, 가용성 세포외 도메인으로 존재하든지, 예를 들어, T-세포에 존재하는 바와 같이 전장 막-고정 CD3ε으로 존재하든지에 개의치 않고, 복합체, 예컨대 CD3ε/δ 복합체의 형태로 존재하는 경우 또는 단일 단백질로 존재하는 경우에 CD3ε에 결합한다. 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 표면 인간 CD3 단백질 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3 단백질 둘 모두, 특히 CD3ε에 특이적이다.
본 발명에 따른 항체-유사 결합은 인간 CD3에 대한 친화도에 대한 마카카 파시쿨라리스 CD3에 대한 친화도의 비(KD(마카카 파시쿨라리스)/KD(인간))가 10 이하, 특히, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 1 이하 또는 0.5 이하이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 원숭이에서 수행되는 독성 연구에 사용될 수 있으며, 원숭이에서 관찰되는 독성 프로파일은 인간에서의 잠재적인 유해 효과를 예상하기에 적절하다.
더욱이, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD3 또는 마카카 파시쿨라리스 CD3 또는 이들 둘 다에 대한 친화도(KD)가 50 nM 이하, 40 nM 이하 또는 30 nM 이하, 예를 들어, 20 nM 이하, 예를 들어, 0.1 nM 내지 30 nM, 특히 0.4 nM 내지 25 nM 또는 10 nM 내지 25 nM의 친화도이다.
본 발명의 추가 양태에서, 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD123에 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 추가로 마카카 파시쿨라리스 CD123에 결합한다. 특히, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD123 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD123 둘 다의 세포외 도메인에 결합한다. 더욱 구체적으로, 항체-유사 결합 단백질은 CD123의 원위 모이어티, 예를 들어, 서열 번호 12의 아미노산 서열의 인간 CD123의 위치 19 내지 49에서 시작하는 아미노산에 결합한다. 항체-유사 결합 단백질은 단리된 형태로 발현되든지, 가용성 세포외 도메인으로 존재하든지, 또는 CD123 발현 세포, 예컨대 AML 세포 또는 CD123 트랜스펙션된 세포에 존재하는 바와 같이 전장 막-고정 CD123으로 존재하든지에 개의치 않고, CD123에 결합한다. 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 그들의 표면 상에서 인간 또는 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD123 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어, CD123 발현 암세포에 특이적이다.
따라서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 인간 CD123 또는 마카카 파시쿨라리스 CD123 또는 이들 둘 다에 대한 친화도(KD)가 20 nM 이하, 15 nM 이하 또는 10 nM 이하, 예를 들어, 5 nM 이하, 예를 들어, 0.01 nM 내지 5 nM, 특히 0.01 nM 내지 2 nM, 더 구체적으로 0.05 nM 내지 2 nM의 친화도이다.
일 실시 형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 Cd123의 기능을 저해할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 50 내지 70℃, 바람직하게는, 50 내지 65℃, 더 바람직하게는, 55 내지 60℃의 열변성 온도를 갖는다. 열변성 온도를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 시차 주사 형광 측정법(DSF)을 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 상기 실험에 사용되는 실험 조건, 예컨대 사용되는 완충제, 단백질의 농도는 결과에 강한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일 예에서, 50 내지 70℃, 바람직하게는, 50 내지 65℃, 더 바람직하게는, 55 내지 60℃의 변성 온도는, 실시예(실시예 2.7.1)에 예시된 바와 같이, 예를 들어, 백색 세미-스커트(semi-skirt) 96웰 플레이트(BIORAD)에서 전형적으로 D-PBS 중 사이프로-오렌지(SYPRO-Orange) 염색제 (인비트로겐(Invitrogen), DMSO 중 5000x 스톡)의 4x 농축액을 포함하는, 예를 들어 0.2 μg/μl의 최종 농도까지 전형적으로 D-PBS 완충제(인비트로겐)에서 희석시킨 항체-유사 결합 단백질과 관련 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 표적 세포의 부재 하에서 20% 미만, 18% 미만, 16% 미만, 14% 미만, 12% 미만, 10% 미만보다 더 낮은 T-세포 활성화를 갖는다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 표적 세포의 존재 하에서 55% 초과, 60% 초과, 62% 초과, 64% 초과, 66% 초과, 68% 초과, 70% 초과보다 더 높은 T-세포 활성화를 갖는다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 T-세포 관여 효과를 갖는다. 이러한 T-세포 관여 효과는 CD123 발현 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 표적 세포는 CD123 발현 세포, 예컨대 CD123 발현 암세포, 예를 들어 THP-1 또는 TF-1이다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질은 일차 T-세포에 관여되어 표적 세포를 용해시킬 수 있으며(시험관 내에서), 여기서, (EC50)은 40 pM 이하, 35 pM 이하, 20 pM 이하, 10 pM 이하, 5 pM 이하, 예를 들어 2 pM 이하이다.
일 실시 형태에서, 본원에서 세포독성은 세포-매개 세포독성, 예를 들어, T-세포-매개 세포독성을 지칭한다.
더욱이, 일 실시 형태에서, 세포-매개 세포독성은 T-세포에 의한 세포-매개 세포독성을 지칭한다.
따라서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 T-세포에 의해 매개되는 CD123 발현 표적 세포에서의 세포-매개 세포독성을 유도한다.
세포독성의 측정 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 다음의 이용을 포함한다: 51-크롬(Cr) 방출 분석법, 프로피디움 요오다이드, 7-AAD 및 당업자에게 알려져 있는 다른 착색제를 포함하는 표적 세포의 살아있는/죽은 세포 염색, 유세포 분석법 또는 ELISA에 의한 그랜자임 및 퍼포린을 포함하는 T 세포에 의해 방출되는 용해 분자의 검출, 세포의 세포독성 및 세포용해에 대한 바이오마커로서 손상된 세포로부터 배지 내로 방출되는 락테이트 데히드로게나아제(LDH)의 검출, CD107a의 세포 표면 동원의 검출, 아폽토시스 표적 세포의 아넥신(Annexin) V(칼슘-의존성 인지질-결합 단백질) 염색 및 예를 들어, 활성화 카스파아제-3(CASP3)의 검출. 더욱이, 당업자는 선택되는 테스트에 기초하여, 그리고 실험 환경에 기초하여, 상이한 세포독성 메커니즘들을 구별할 수 있다.
일 예에서, 예를 들어 세포-매개 세포독성은 예를 들어 실시예 1.8에 기술된 바와 같이 표적 세포를 표지하기 위하여 CFSE를 사용하고, 죽은 세포를 표지하기 위하여 7-AAD를 사용하여 측정될 수 있다.
항-CD3/항-CD123항체-유사 결합 단백질의 변이체
본원에 개시된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질의 변이체가 고려되며, 이는 본원에서 상기에 정의된 항체-유사 결합 단백질의 정의에서 구현된 바와 같이 "기준 서열과 적어도 85% 동일한"이라는 표현을 사용하여 명백하게 언급된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 기준 서열은 화학식 I, III 또는 IV의 폴리펩티드이며, "기준 서열과 적어도 85% 동일한"을 갖는 변이체는 항체 "hz20G6" 및 "hz7G3"의 CDR, 및 RF 돌연변이, 놉 돌연변이 및 홀 돌연변이에 상응하는 아미노산 위치(상이한 Fc 영역들에서)가 변경되지 않는 방식으로 정의된다.
그에 따라 기준 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환이 프레임워크 영역(FR), CL 및 CH1 및 Fc 영역 내의 루프 영역 L1, L2, L3, L4 및 선택적으로 L5 내에 도입될 수 있음이 당업자에 의해 또한 이해될 것이다. 프레임워크 영역(FR)은 상기에서 "정의" 섹션에서 정의된 바와 같으며, CDR들 사이에 개재된 아미노산 서열을 지칭한다. CDR이 정의되어 있기 때문에 당업자라면 프레임워크 영역을 용이하게 위치화할 수 있다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 CH 도메인은 인간 면역 글로불린 중쇄에 속하는 임의의 CH 영역일 수 있지만, IgG 클래스의 것들이 적합하고, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은, IgG 클래스에 속하는 하위클래스 중 어느 하나가 또한 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 CL은 인간 면역글로불린 경쇄에 속하는 임의의 영역일 수 있고, 카파 클래스 또는 람다 클래스의 것들이 이용될 수 있다.
이와 같이, 본원에서 상기에 정의된 바와 같은 CH 또는 CL 영역은 또 다른 하위클래스의 면역글로불린으로부터의 CH 또는 CL 도메인으로 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본원에 정의된 바와 같은 변이체를 생성하기 위한 추가의 지침에 있어서, 일부 예가 링커 영역 L1, L2, L3, L4 및 L5에 대하여 주어진다.
일 예에서, L3의 길이는 L1의 길이의 적어도 2배이다. 추가 예에서, L4의 길이는 L2의 길이의 적어도 2배이다. 일부 예에서, L1의 길이는 L3의 길이의 적어도 2배이다. 다른 예에서, L2의 길이는 L4의 길이의 적어도 2배이다.
일 예에서, 링커 L1, L2, L3 및 L4는 0 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 일 실시 형태에서, L5는 0 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
일부 예에서, L1은 길이가 3 내지 12개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 3 내지 14개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1 내지 8개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 1 내지 3개의 아미노산 잔기이다. 다른 예에서, L1은 길이가 5 내지 10개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 5 내지 8개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1 내지 5개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 1 내지 2개의 아미노산 잔기이다. 추가 예에서, L1은 길이가 7개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 5개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 2개의 아미노산 잔기이다.
일부 예에서, L1은 길이가 1 내지 3개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 1 내지 4개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 2 내지 15개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 2 내지 15개의 아미노산 잔기이다. 다른 예에서, L1은 길이가 1 내지 2개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 1 내지 2개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 4 내지 12개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 2 내지 12개의 아미노산 잔기이다. 바람직한 예에서, L1은 길이가 1개의 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 2개의 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 7개의 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 5개의 아미노산 잔기이다.
일부 예에서, L1, L3, 또는 L4는 0일 수 있다. 그러나, L3 또는 L4가 0인 항체-유사 결합 단백질에서, 가변 영역과 불변 영역 사이 또는 다른 사슬 상의 이중 가변 도메인들 사이의 상응하는 전환부 링커는 0일 수 없다. 일부 실시 형태에서, L1은 0이고, L3은 2개 이상의 아미노산 잔기이거나, L3은 0이고, L1은 1개 이상의 아미노산 잔기이거나, L4는 0이고, L2는 3개 이상의 아미노산 잔기이다.
일부 예에서, L2, L3 및 L4로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커 중 적어도 하나는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 변이체에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 단일 글리신, 트레오닌 또는 세린 잔기; 디펩티드, 예컨대 디글리신 펩티드, 히스티딘-트레오닌 펩티드 또는 글리신-세린 디펩티드; 3개의 글리신을 갖는 트리펩티드, 트리펩티드 Thr-His-Thr, 트리펩티드 Gly-Gly-Ser; 4개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 5개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 6개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 7개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 8개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드를 포함한다. 아미노산 잔기들의 다른 조합, 예컨대 펩티드 Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 27), 펩티드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 20), 펩티드 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 28), 펩티드 Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 29), 펩티드 Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 30), 펩티드 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 31), 및 펩티드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 21)이 사용될 수 있다. 다른 적합한 링커는 단일 Ser, 및 Val 잔기; 디펩티드 Arg-Thr, Gin-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, and Ser-Leu; Lys-Thr-His-Thr (서열 번호 32); Lys-Thr-His-Thr-Ser (서열 번호 33); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (서열 번호 34); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (서열 번호 35); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (서열 번호 36); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (서열 번호 37); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (서열 번호 38); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (서열 번호 39); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (서열 번호 40); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (서열 번호 41); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (서열 번호 42); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (서열 번호 43); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (서열 번호 44); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (서열 번호 45); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (서열 번호 46); Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (서열 번호 47); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (서열 번호 22), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (서열 번호 23), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (서열 번호 24); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (서열 번호 25), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (서열 번호 26), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (서열 번호 16), Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (서열 번호 17), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (서열 번호 351), 및 Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (서열 번호 56)을 포함한다. 상기 열거된 예는 본 발명의 범주를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 무작위로 선택된 아미노산을 포함하는 링커가 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에서 적합한 것으로 나타났다.
링커에서의 아미노산 잔기의 아이덴티티(identity) 및 서열은 링커에서 달성할 필요가 있는 이차 구조 요소의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 글리신, 세린 및 알라닌은 최대 유연성을 갖는 링커에 있어서 최적이다. 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린의 일부 조합은, 더욱 경성(rigid)이고 연장된 링커가 필요한 경우에 유용하다. 원하는 특성에 따라 필요할 경우 더 큰 펩티드 링커가 구축되도록 임의의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기와 조합되어 링커로 간주될 수 있다.
일 예에서, 링커 L1은 서열 Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (서열 번호 16)의 것이며, 링커 L2는 서열 Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (서열 번호 17)의 것이며, 링커 L3은 서열 'S'의 것이며, 링커 L4는 서열 'Rt'의 것이다.
추가 예에서, 링커 L1, L2, L3, 및 L4의 서열은 트레오닌; 디펩티드, 예컨대 히스티딘-트레오닌 펩티드; 트리펩티드 Thr-His-Thr, Lys-Thr-His-Thr (서열 번호 32); Lys-Thr-His-Thr-Ser (서열 번호 33); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (서열 번호 34); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (서열 번호 35); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (서열 번호 36); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (서열 번호 37); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (서열 번호 38); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (서열 번호 39); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (서열 번호 40); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (서열 번호 41); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (서열 번호 42); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (서열 번호 43); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (서열 번호 44); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (서열 번호 45); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (서열 번호 46) 및 Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (서열 번호 47)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 링커 L5의 서열은 단일 세린 잔기, 디펩티드, 예컨대 글리신-세린 디펩티드; 트리펩티드 Gly-Gly-Ser, 펩티드 Gly-Gly-Gly- Ser (서열 번호 27), 펩티드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 20), 펩티드 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 28), 펩티드 Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 29), 펩티드 Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 30), 펩티드 Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 31),펩티드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 21), 및 펩티드 Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (서열 번호 56)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"기준 서열과 적어도 85% 동일한" 서열을 생성하기 위하여 항체-유사 결합 단백질에 적용될 수 있는 추가의 변형이 본원에서 하기에 "본 발명의 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 변형" 섹션에 기술되어 있다.
본 발명의 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 변형
본원에 기술된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질의 아미노산 서열 변경(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체-유사 결합 단백질의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 비-인간 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 단순히 그래프팅함으로써 인간화 항체가 생성될 때, 항원 결합 활성은 비-인간 동물로부터 유래된 원래의 항체의 항원 결합 활성에 비하여 감소될 수 있음이 알려져 있다. 비-인간 항체의 VH 및 VL의 몇몇의 아미노산 잔기는, CDR에서 뿐만 아니라 FR에서도, 직접적으로 또는 간접적으로 항원 결합 활성과 연관될 수 있다고 여겨진다. 따라서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR로부터 유래된 상이한 아미노산 잔기로 이들 아미노산 잔기를 치환하면 결합 활성이 감소될 것이다. 상기 문제를 해결하기 위하여, 비-인간 CDR로 그래프팅된 인간 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서 항체의 결합과 직접적으로 연관된 아미노산 잔기, 또는 CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하는 아미노산 잔기, 또는 항체의 3차원 구조를 유지하고 항원에의 결합과 직접적으로 연관된 아미노산 잔기를 확인하려는 시도가 이루어져야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 확인된 아미노산을 비-인간 동물로부터 유래된 원래의 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다. 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 인간화 항체 "20G6"의 가변 영역 및 인간화 항체 "7G3"의 가변 영역을 포함하며, 이에 따라, 본원에서 언급된 고려사항이 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 동일하게 적용된다.
변경 및 변화가 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 구조 및 이를 코딩하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있으며, 이는 여전히, 바람직한 특징을 갖는 기능성 항체-유사 결합 단백질 또는 폴리펩티드로 이어질 수 있다.
폴리펩티드의 아미노 서열의 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 일반적으로, 상호적인 생물학적 기능을 단백질에게 부여하는 데 있어서의 아미노산의 소수친수 지수의 중요성을 본 기술 분야에서 알고 있다. 아미노산의 상대적인 소수친수 특징은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 결과적으로, 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 정함이 인정된다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징을 바탕으로 하여 소수친수 지수가 할당되었으며, 이들은 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
본 발명의 추가의 목적은 또한 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩티드의 기능-보존적 변이체를 포함한다.
예를 들어, 특정 아미노산은 주목할 만한 활성의 손실 없이 단백질 구조에 있어서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호적 능력 및 성질은 이의 생물학적 기능적 활성을 정하므로, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열 내에서, 그리고 물론 이를 코딩하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 서열, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 상응하는 DNA 서열에서, 그들의 생물학적 활성의 주목할 만한 손실 없이 다양한 변화들이 이루어질 수 있다고 생각된다.
특정 아미노산이 유사한 소수친수 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 여전히 초래할 수 있다는, 즉, 생물학적 기능상 동등한 단백질을 여전히 수득할 수 있다는 것이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에서, 항원에의 결합의 유의한 손실 없이 치환될 수 있는 모든 아미노산을 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 접근법과 같은 잘 확립된 기술을 이용하는 것이 가능하다. 그러한 잔기는, 항원 결합 또는 항체의 구조 유지에 연루되지 않기 때문에 중성인 것으로 간주될 수 있다. 이들 중성 위치 중 하나 이상은 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 주요 특징을 변화시키지 않고 알라닌 또는 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
따라서, 상기에 약술된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 전술한 다양한 특징을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 이펙터 기능과 관련하여 변경시켜, 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 향상시키거나 감소시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있는데, 이는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질과 관련하여 본원에서 Fc-변이체로도 지칭된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써 이 영역에서 사슬간 디술피드 결합이 형성되게 할 수 있다. 이에 따라 생성된 동종이량체형 항체는 향상된 또는 감소된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 살해 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다(문헌[Caron PC. et al. 1992]; 및 문헌[Shopes B. 1992]).
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 또 다른 유형의 아미노산 변경은, 즉, 항체-유사 결합 단백질에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나 항체-유사 결합 단백질에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가함으로써, 항체-유사 결합 단백질의 원래의 글리코실화 패턴을 바꾸는 데 유용할 수 있다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임) 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 항체-유사 결합 단백질에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 이의 결실은 아미노산 서열이 위에 기술된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록(N-결합 글리코실화 부위) 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다.
또 다른 유형의 변형은 가상에서(in silico) 또는 실험적으로, 잠재적으로 항체-유사 결합 단백질 제제의 이질성 또는 분해 생성물로 이어지는 것으로 확인된 서열의 제거를 수반한다. 예로서, pH 및 표면 노출과 같은 요인에 따라 아스파라긴 및 글루타민 잔기의 탈아미드화가 일어날 수 있다. 아스파라긴 잔기는, 주로 서열 Asn-Gly에 존재할 때, 및 보다 적게는 Asn-Ala과 같은 다른 디펩티드 서열에 존재할 때 탈아미드화에 특히 민감하다. 따라서, 그러한 탈아미드화 부위, 특히 Asn-Gly이 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 존재할 때, 전형적으로, 연루된 잔기들 중 하나의 제거를 위한 보존적 치환에 의한 그 부위의 제거가 바람직할 수 있다. 연루된 잔기 중 하나 이상을 제거하기 위한 서열에서의 그러한 치환도 본 발명에 포함시키고자 한다.
또 다른 유형의 공유적 변형은 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 항체-유사 결합 단백질에 커플링시키는 것을 수반한다. 이러한 절차는 N- 또는 O-결합 글리코실화를 위하여 글리코실화 능력이 있는 숙주 세포에서 항체-유사 결합 단백질을 생산할 것을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것들과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것들과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 국제 공개 제87/05330호에 기술되어 있다.
항체-유사 결합 단백질 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 항체-유사 결합 단백질을 트리플루오로메탄술폰산 화합물 또는 동등한 화합물에 노출시킬 것을 요구한다. 이러한 처리는 항체를 온전하게 두면서, 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 당 또는 모든 당의 절단으로 이어진다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Sojahr H. et al. (1987)] 및 문헌[Edge, AS. et al. (1981)]에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 이용하여 달성될 수 있으며, 이는 문헌[Thotakura, NR. et al. (1987)]에 기술된 바와 같다.
항체-유사 결합 단백질의 공유적 변경의 또 다른 유형은 항체를 다양한 비 단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 미국 특허 제4,640, 835호; 미국 특허 제4,496, 689호; 미국 특허 제4,301, 144호; 미국 특허 제4,670, 417호; 미국 특허 제4,791, 192호 또는 미국 특허 제4,179,337호에 기재된 방식으로 연결하는 것을 포함한다.
핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
본 발명의 추가적인 목적은 상기에 정의된 항체-유사 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자로서, 이는 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
그러한 벡터는 대상체로의 투여시 상기 폴리펩티드의 발현을 야기하거나 지시하기 위한 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포를 위한 발현 벡터에 이용되는 프로모터 및 인핸서의 예는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(문헌[Mizukami T. et al. 1987]), 몰로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(문헌[Kuwana Y et al. 1987]), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터(문헌[Mason JO et al. 1985]) 및 인핸서(문헌[Gillies SD et al. 1983]) 등을 포함한다.
인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자가 삽입되고 발현될 수 있는 한 임의의 동물 세포용 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 pAGE107(문헌[Miyaji H et al. 1990]), pAGE103(문헌[Mizukami T et al. 1987]), pHSG274(문헌[Brady G et al. 1984]), pKCR(문헌[O'Hare K et al. 1981]), pSG1 베타 d2-4-(문헌[Miyaji H et al. 1990]) 등을 포함한다. 플라스미드의 다른 예는 복제 원점을 포함하는 복제 플라스미드 또는 예를 들어, pUC, pcDNA, pBR 등과 같은 통합형 플라스미드(integrative plasmid)를 포함한다.
바이러스 벡터의 다른 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 바이러스는 본 기술 분야에 공지된 기술에 의해, 예컨대 패키징 세포를 트랜스펙션시킴으로써 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 이용한 일시적인 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등을 포함한다. 상기 복제-결함 재조합 바이러스를 생성시키기 위한 상세한 프로토콜은, 예를 들어, 국제 공개 제95/14785호, 국제 공개 제96/22378호, 미국 특허 제5,882,877호, 미국 특허 제6,013,516호, 미국 특허 제4,861,719호, 미국 특허 제5,278,056호 및 국제 공개 제94/19478호에서 발견될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 트랜스펙션되거나, 감염되거나 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 항체를 생성하는 데 이용될 수 있다.
일반적인 발현 시스템은 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포와 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포와 배큘로바이러스(Baculovirus) 벡터 및 포유동물 숙주 세포와 벡터를 포함한다. 숙주 세포의 다른 예는 제한 없이, (박테리아와 같은) 원핵 세포 및 (효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등과 같은) 진핵 세포를 포함한다. 구체적인 예는 이. 콜라이, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)뿐만 아니라, (예를 들어, 림프모세포, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등으로부터 생성된) 일차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물도 포함한다. 또한, 예는 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자(이하 "DHFR 유전자"로 지칭됨) 결함 CHO 세포(문헌[Urlaub G et al; 1980]), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"로 지칭됨) 등을 포함한다. YB2/0 세포가 바람직한데, 이는 이러한 세포에서 발현되는 경우 키메라 또는 인간화 항체의 ADCC 활성이 향상되기 때문이다.
특히, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 발현을 위해, 발현 벡터는 항체 중쇄를 코딩하는 유전자 및 항체 경쇄를 코딩하는 유전자가 개별 벡터 상에 존재하는 유형 또는 두 유전자 모두가 동일한 벡터 상에 존재하는 유형(탠덤형) 중 어느 하나일 수 있다. 항체-유사 결합 단백질 발현 벡터의 구축의 용이성, 동물 세포 내로의 도입의 용이성 및 동물 세포에서 항체 H 및 L 사슬의 발현 수준 사이의 균형과 관련하여, 탠덤형의 인간화 항체 발현 벡터가 바람직하다(문헌[Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3;167(1-2):271-8]). 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터의 예는 pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호), pEE18 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 상기에 기술된 재조합 핵산 또는 벡터를 시험관 내에서 또는 생체 외에서 적격(competent) 세포 내로 도입하는 것, (ii) 수득된 재조합 숙주 세포를 시험관 내에서 또는 생체 외에서 배양하는 것, (iii) 선택적으로, 상기 항체를 발현하고/하거나 분비하는 세포를 선발하는 것으로 이루어진 단계를 포함한다.
이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 적어도 하나의 항체-유사 결합 단백질의 생산에 이용될 수 있다.
본 발명의 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질의 생성 방법
본 발명의 일 실시 형태는 본원에서 상기에 "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질" 섹션에서 정의된 바와 같은 항체-유사 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 제한 없이, 단독의 또는 조합된 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기술과 같은, 본 기술 분야에 공지된 임의의 기술에 의해 생산될 수 있다.
당업자는 원하는 서열의 아미노산 서열을 알고 있으므로, 폴리펩티드의 생성을 위한 표준 기술에 의해 상기 항체 또는 면역글로불린 사슬을 용이하게 생성할 수 있다. 예를 들어, 그들을 잘 알려져 있는 고체상 방법을 사용하여, 특히 구매가능한 펩티드 합성 장치(예컨대 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)에 의해 제조된 펩티드 합성 장치)를 사용하여, 그리고 제조업자의 지시에 따라 합성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체, 면역글로불린 사슬 및 항체-유사 결합 단백질은 본 기술 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 이들 단편은 원하는 (폴리)펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 내로 혼입시키고, 이러한 벡터를 원하는 폴리펩티드를 발현할 적합한 진핵 또는 원핵 숙주 내로 도입한 후 DNA 발현 산물로서 수득될 수 있는데, 상기 단편은 잘 알려진 기술을 이용하여 이후에 숙주로부터 단리될 수 있다.
특히, 본 발명은 추가로 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하고; (ii) 상기 항체-유사 결합 단백질 또는 상응하는 폴리펩티드를 발현시키고; (iii) 발현된 항체-유사 결합 단백질 또는 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어진 단계를 포함한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해, 배양 배지로부터 적절하게 분리된다.
일 실시 형태에서, 본원의 발현된 항체-유사 결합 단백질 또는 폴리펩티드의 회수는 단백질 A 크로마토그래피, 카파 선발 크로마토그래피, 및/또는 크기 배제 크로마토그래피, 바람직하게는 단백질 A 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피, 더 바람직하게는 단백질 A 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 것을 지칭한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 생성 방법은 통상적인 재조합 DNA를 수반하며, 유전자 트렌스펙션 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다(문헌[Morrison SL. et al. (1984)] 및 미국 특허 제5,202,238호; 및 미국 특허 제5,204,244호 참조).
통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술을 기반으로 한 인간화 항체의 생성 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Riechmann L. et al. 1988]; 문헌[Neuberger MS. et al. 1985] 참조) 항체-유사 결합 단백질의 생성에 쉽게 유사하게 전해질 수 있다.
일 예에서, 본원에서 하기의 섹션 2.5에 개시된 바와 같이, 전형적으로, 예를 들어 F17 무혈청 현탁 배지(인비트로겐)에서 성장하는 프리스타일(FreeStyle) HEK293 세포가 동일한 비의 경쇄 및 중쇄 플라스미드로 트랜스펙션되었으며, 여기서, CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질의 항체 정보는 전형적으로 하나의 경쇄와 하나의 중쇄에 코딩된 반면, CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질, 예컨대 GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF의 경우, 하나의 경쇄와 두 개의 중쇄 플라스미드가 예를 들어, 제조업자에 의해 개시된 바와 같이 폴리에틸렌이민 트렌스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션되었다.
전형적으로 세포를 8% CO2를 이용하여, 110 rpm에서 Kuhner ISF1-X 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 예를 들어 7일의 배양 후에, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 전형적으로 10%(Vol/Vol) 1 M Tris HCl(pH 8.0)을 첨가하고, 상청액을 예를 들어 0.2 μM 보틀 탑 필터(bottle top filter)를 통해 여과하여, 입자를 제거하였다. CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질 및 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질은 전형적으로 단백질 A 컬럼(하이트랩(HiTrap) 단백질 A HP 컬럼, 지이 라이프 사이언시즈(GE Life Sciences))에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 예를 들어, 0,1M Citrat, pH 3.0을 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨 후, CODV-Fab 구축물은 전형적으로 예를 들어, 전형적으로 PBS(집코(Gibco) 14190-136)에서 조제된 HiPrep 26/10 탈염 컬럼을 이용하여 탈염되었다.
응집체로부터 단량체를 분리하기 위하여, 두 구축물, CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질 및 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질을 위한, 전형적으로 예를 들어, PBS (집코 14190-136)에서의 고분리능 분획화 단계가 전형적으로 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 26/60 320ml 컬럼(지이 헬스케어(GE Healthcare) 카탈로그 번호 29-9893-36])을 이용하여 수행되었다. 단량체 분획을 풀링하고, 비바스핀(Vivaspin) 20 원심분리 컬럼(VS2002 사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim biotech))을 사용하여 예를 들어 1 mg/ml까지 농축시키고, 전형적으로 0.22 ㎛ 막(밀렉스(Millex)® 시린지 필터 SLGV033RS)을 사용하여 여과하였다.
제약 조성물
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 제약상 허용가능한 부형제 및 선택적으로, 생분해성 중합체와 같은 지효성 매트릭스와 조합되어 치료용 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체-유사 결합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물에 관한 것이다.
이러한 치료용 조성물 또는 제약 조성물은 투여 방식에서의 적합성에 대하여 선택되는 제약상 또는 생리학적으로 허용가능한 제형화제와의 혼합물 형태의, 치료적 유효량의 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 약물 콘쥬게이트를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 제약상 허용가능한 담체는 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 물, 아미노산, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물에 당, 폴리알코올 또는 염화나트륨과 같은 등장성 에이전트를 포함하는 것이 바람직할 것이며, 제형은 트립타민과 같은 항산화제 및 트윈(Tween) 20과 같은 안정화제도 함유할 수 있다.
제약 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 투여계획은 당연히, 치료되는 병태, 병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다.
본 발명의 제약 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
특히, 제약 조성물은 주사될 수 있는 제형용으로 제약상 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 살균, 식염액(모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 그러한 염의 혼합물) 또는 경우에 따라 살균된 물 또는 생리학적 식염수의 첨가시에 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다.
투여에 이용되는 용량은 다양한 파라미터의 함수로, 그리고 특히, 이용되는 투여 방식의 함수, 관련된 병리학의 함수, 또는 대안적으로 원하는 치료 지속기간의 함수로 조정될 수 있다.
제약 조성물을 제조하기 위하여, 본 발명의 유효량의 항체 또는 면역콘쥬게이트가 제약상 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 제약 형태는 살균 수성 용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 살균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 모든 경우에 이 형태는 살균되어야 하며, 쉽게 주사될 수 있는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물에서, 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
본 발명의 항체-유사 결합은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 제약상 허용가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성되고, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성됨)을 포함한다. 또한, 유리 카르복실기에 의해 형성되는 염은 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 글리신, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
또한, 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등의 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 초래될 수 있다. 많은 경우에 등장성 에이전트, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 에이전트, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 이용함으로써 초래될 수 있다.
살균 주사가능 용액은 필요에 따라, 위에 열거된 다양한 기타 성분과 함께, 적절한 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입한 후, 여과 살균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 위에서 언급된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 혼입시켜 제조된다. 살균 주사가능 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술로, 이는 활성 성분의 분말에 더하여, 임의의 추가적인 원하는 성분(이전에 살균 여과된 이의 용액으로부터)을 생성한다.
직접적인 주사를 위한 더욱 농축된, 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되는데, 여기서 용매로서 DMSO를 사용하는 것이 구상되어, 극도로 빠른 침투를 초래하여 작은 종양 영역에 고농도의 활성제를 전달한다.
제형화시에, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 상기에 기술된 주사가능한 용액 유형과 같이 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 이용될 수 있다.
수성 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 예를 들어, 상기 용액은 필요할 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되도록 하여야 한다. 이들 특정 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 살균 수성 매질은 본 발명의 개시내용을 고려하면 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량은 등장성의 NaCl 용액 1 ml에 용해되거나, 피하 주입액 1000 ml에 첨가되거나, 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 치료할 대상체의 상태에 따라 투여량의 약간의 변이가 반드시 발생할 것이다. 투여 책임자는 어떠한 경우에도 개별 대상체를 위한 적절한 용량을 결정할 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 용량당 약 0.01 내지 100 밀리그램 등을 포함하도록 치료용 혼합물 내에서 제형화된다.
정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여용으로 제형화된 항체-유사 결합 단백질에 더하여, 기타 제약상 허용가능한 형태는 예를 들어 경구 투여용 정제 또는 기타 고체; 지속 방출형 캡슐; 및 현재 이용되는 임의의 기타 형태를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 리포좀 및/또는 나노입자의 이용이 숙주 세포 내로의 폴리펩티드, 예컨대 항-CD3 항체, 항-CD123 항체 또는 항체-유사 결합 단백질의 도입을 위해 고려된다. 리포좀 및/또는 나노입자의 형성 및 이용은 당업자에게 공지되어 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위하여, 이러한 (약 0.1 ㎛ 크기의) 초미세입자가 일반적으로 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계된다. 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에 이용하기 위하여 고려되며, 그러한 입자는 용이하게 제조될 수 있다.
리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되며, 자발적으로 다중막 동심상 이중층 소포(다중막 소포(MLV)로도 지칭됨)를 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 직경을 갖는다. MLV의 초음파 처리는 코어에 수성 용액을 함유하는, 200 내지 500 Å 범위의 직경을 갖는 작은 단일막 소포(SUV)의 형성으로 이어진다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 달려 있다.
일단 제약 조성물이 제형화되었으면, 그것은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 살균 바이알에 보관될 수 있다. 그러한 제형은 즉시 사용가능한 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태 (예를 들어, 동결건조됨)로 보관될 수 있다.
치료적 방법 및 용도
본 발명자들은 CD123 양성 종양 세포주 모델에 대한 본 발명의 몇몇 이중특이성 화합물, 예컨대 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1 및 hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1 T-세포 매개 세포독성을 생체 내에서 보여주었다. 추가로, 본 발명자들은 본 발명의 몇몇 이중특이성 화합물에 있어서, 표적 세포의 존재 하에 T-세포를 활성화시켜, 종양 세포의 세포독성을 초래하는 능력을 입증하였다. 본 발명자들은 추가로 표적 세포의 부재 하에서의 T-세포 활성화의 부재 하에서의 T-세포의 낮은 활성화를 입증하였다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 항체-유사 결합 단백질 또는 "제약 조성물" 섹션에서 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 제약 조성물을 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체-유사 결합 단백질 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 항체-유사 결합 단백질 또는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, "대상체"는 인간을 지칭한다.
일 실시 형태에서, "질환" 또는 "장애"는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 사용한 치료로 이익을 얻을 임의의 병태이다. 일 실시 형태에서, 이것은 대상체가 당해 장애에 취약하게 하는 병리학적 상태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 장애는 암을 지칭한다.
추가의 실시 형태에서, 암은 혈액암, 특히 CD123 발현과 연관된 혈액암과 관련된다.
일 실시 형태에서, 암세포에 의한 CD123의 발현은 예를 들어 항-CD123 항체를 사용함으로써 용이하게 분석된다. 항-CD123 항체를 이용하여 CD123 발현 암을 확인하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
"CD123 발현과 연관된 혈액암"은 백혈병(예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 모상 세포 백혈병 및 골수이형성증후군) 및 림프종(예컨대 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 소세포 및 대세포 소포성 림프종)을 포함하는 악성 림프증식성 병태, 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 전신 비만세포증을 포함한다.
'정의' 섹션에서 상기에 기술된 바와 같이, LSC는 CD123을 발현한다.
따라서, 관련 실시 형태에서, 암은 백혈병 줄기 세포와 연관된 혈액암을 지칭한다.
본 발명에 따라 치료될 백혈병 줄기 세포(LSC)와 연관된 혈액암 병태는 백혈병(예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병 및 골수이형성증후군) 및 림프종(예컨대 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 소세포 및 대세포 소포성 림프종)을 포함하는 악성 림프증식성 병태를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 혈액암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다.
일 실시 형태에서, 대상체는 AML을 앓고 있는 것으로 진단되었다.
추가의 실시 형태에서, 대상체는 이미 화학요법으로 완전 관해까지 치료를 받았지만 재발되었다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 단독으로 또는 임의의 적합한 성장 저해제와 조합되어 사용된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 이용한 치료의 효능은 생체 내에서, 예를 들어, 마우스 암 모델에서, 그리고 예를 들어 처리군과 대조군 사이의 종양 부피의 변화를 측정함으로써 용이하게 분석된다.
키트
마지막으로, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 키트도 제공한다.
일 실시 형태에서, 키트는 다음을 포함한다:
a) 본원에서 상기 "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질"섹션에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 본 발명의 항체-유사 결합 단백질,
b) 선택적으로 패키징 물질, 및
c) 선택적으로, 상기 항체-유사 결합 단백질이 암 치료에 효과적이거나 암 치료를 위한 사용을 위한 것임을 나타내는, 상기 패키징 물질 내에 포함된 라벨 또는 패키징 삽지.
관련 실시 형태에서, 적어도 하나의 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 단일 및/또는 다중-챔버형 사전충전 시린지(예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지(lyosyringe)) 내에 함유된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 단회-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트를 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 키트의 a)에서 언급된 적어도 하나의 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 제1 용기에 함유된 건조된 본 발명의 항체-유사 결합 단백질이다. 다음으로 키트는 추가로 수성 제형을 가진 제2 용기를 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 키트는 다음을 포함한다:
a) 본원에서 상기 "항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질" 섹션에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 건조된 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 제1 용기,
b) 수성 제형을 포함하는 제2 용기,
c) 선택적으로 패키징 물질, 및
d) 선택적으로, 상기 항체-유사 결합 단백질이 암 치료에 효과적이거나 암 치료를 위한 사용을 위한 것임을 나타내는, 상기 패키징 물질 내에 포함된 라벨 또는 패키징 삽지.
수성 제형은 전형적으로 본원에서 상기 "제약 조성물" 섹션에서 정의된 바와 같은 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 수성 용액이다.
관련 실시 형태에서, "제1 용기" 및 "제2" 용기는 다중챔버형 사전충전 시린지(예를 들어, 리오시린지)의 챔버를 지칭한다.
본 발명은 이제 하기의 도면 및 실시예를 참고하여 더욱 상세하게 기술될 것이다. 본원에 열거된 모든 문헌 및 특허 문서는 본원에 참고로 포함된다. 본 발명이 전술한 설명에 상세히 예시되고 기술되었지만, 실시예는 제한적인 것이 아닌, 예증적이거나 예시적인 것으로 여겨질 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 Uniprot 데이터베이스로부터 등록 번호 P07766으로 이용가능한 신호 펩티드를 포함하는 전장 인간 CD3ε 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 2는 Uniprot 데이터베이스로부터 등록 번호 Q95LI5로 이용가능한 신호 펩티드를 포함하는 전장 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 3은 전장 야생형 인간 CD3ε 단백질의 아미노산 23 내지 126을 포함하는 성숙 인간 CD3ε His-태그 Fc-융합물의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 4는 야생형 서열의 아미노산 위치 57과 비교하여 아미노산 위치 35에서 하나의 Ala에서 Val으로의 교환을 함유하는 전장 야생형 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 단백질(서열 번호 2)의 아미노산 23 내지 117을 포함하는 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD3ε Fc-융합물의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 5, 6 및 7은 소위 "hz20G6" 항체의 CDR1-H, CDR2-H 및 CDR3-H의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 8은 소위 "hz20G6" 항체의 CDR3-L의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 9는 인간화 "20G6" 항-CD3 항체의 VH 변이체 VH1d의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 10은 인간화 "20G6" 항-CD3 항체의 VL 변이체 Vl1c의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 11은 서열 번호 10의 인간화 "20G6" 항-CD3 항체의 Vl1c 변이체의 CDR1-L의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 12는 NCBI 데이터베이스로부터 NP_002174.1로, 그리고 Uniprot 데이터베이스로부터 P26951로 이용가능한 신호 펩티드를 포함하는 전장 인간 CD123 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 13은 GenBank 데이터베이스로부터 EHH61867.1로, 그리고 Uniprot 데이터베이스로부터 G8F3K3으로 이용가능한 신호 펩티드를 포함하는 전장 마카카 파시쿨라리스 CD123 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 14는 전장 인간 CD123 단백질(서열 번호 12)의 아미노산 22 내지 305를 포함하는 성숙 인간 CD123 His-II 태그 Fc-융합물의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 15는 전장 마카카 파시쿨라리스 CD123 단백질(서열 번호 13)의 아미노산 22 내지 305를 포함하는 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD123 His-II 태그 Fc-융합물의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 16은 소위 CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 링커 L1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 17은 소위 CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 링커 L2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 18은 소위 CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 CL의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 19는 소위 CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 CH1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 20은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 21은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 22는 링커 서열의 아미노산 서열(Thr-Val-Ala-Ala-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 23은 링커 서열의 아미노산 서열(Gln-Pro-Lys-Ala-Ala)을 나타낸다.
서열 번호 24는 링커 서열의 아미노산 서열(Gln-Arg-Ile-Glu-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 25는 링커 서열의 아미노산 서열(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 26은 링커 서열의 아미노산 서열(Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 27은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 28은 링커 서열의 아미노산 서열(Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 29는 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 30은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 31은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 32는 링커 서열의 아미노산 서열(Lys-Thr-His-Thr)을 나타낸다.
서열 번호 33은 링커 서열의 아미노산 서열(Lys-Thr-His-Thr-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 34는 링커 서열의 아미노산 서열(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 35는 링커 서열의 아미노산 서열(Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 36은 링커 서열의 아미노산 서열(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 37은 링커 서열의 아미노산 서열(Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 38은 링커 서열의 아미노산 서열(Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 39는 링커 서열의 아미노산 서열(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser)을 나타낸다.
서열 번호 40은 링커 서열의 아미노산 서열(Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 41은 링커 서열의 아미노산 서열(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro)을 나타낸다.
서열 번호 42는 링커 서열의 아미노산 서열(Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 43은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 44는 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 45는 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 46은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 47은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 48 및 49는 소위 "hz7G3" 항체의 CDR1-L 및 CDR3-L의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 50 및 51은 서열 번호 52의 소위 인간화 "7G3" 항체의 CDR1-H 및 CDR3-H의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 52는 소위 인간화 "7G3" 항체의 중쇄 가변 도메인의 추가의 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 53은 서열 번호 52의 소위 인간화 "7G3" 항체 중 하나의 CDR2-H의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 54는 소위 인간화 "7G3" 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 55는 소위 CODV-Fab-OL1 및CODV-Fab-OL1a 및 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(GS를 포함하지 않음)(woGS) "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 I의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 56은 링커 서열의 아미노산 서열(Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly)을 나타낸다.
서열 번호 57은 소위 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 58은 소위 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 Fc2 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 59는 소위 CODV-Fab-TL1-RF 및 CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 60은 소위 CODV-Fab-TL1-RF 및 CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3"의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 61은 소위 CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 62는 소위 CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 Fc 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 63은 소위 CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 Fc 스텀프(Fc3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 64는 소위 CODV-Fab-OL1a "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 Fc 스텀프(Fc3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 65는 소위 CODV-Fab-OL1a 및 GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 66은 소위 CODV-Fab-OL1a 및 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RFwoGS "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 67은 본 발명의 소위 항체-유사 결합 단백질(즉, CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole, CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(GS를 포함하지 않음; woGS))의 화학식 III의 폴리펩티드의 일반적인 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 68은 본 발명의 소위 항체-유사 결합 단백질(즉, CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole, GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(woGS)의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 도메인의 일반적인 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 69는 소위 GS를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF(woGS) "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 Fc 스텀프(Fc3)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 70은 소위 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2)의 일반적인 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 71은 소위 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 IV의 폴리펩티드의 일반적인 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 72는 소위 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 73은 소위 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 74는 소위 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole 및 CODV-Fab-TL1-Knob-xhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 75는 소위 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole 및 CODV-Fab-TL1-Knob-xhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 76은 소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF 및 CODV-Fab-TL1-Knob-xhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 77은 소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF 및 CODV-Fab-TL1-Knobxhole "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 78은 소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 79는 소위 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 80은 소위 CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 81은 소위 CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" 항체-유사 결합 단백질의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc2 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 82는 국제 공개 제2015026892호에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 83은 국제 공개 제2015026892호에 나타낸 바와 같은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 84는 Strep 태그의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 85는 His 태그의 아미노산 서열을 나타낸다.
도면
도 1: A) CODV-Fab-TL1-RF의 개략도 B) SDS-겔 C) SEC 프로파일(178,17mL에서의 피크는 이종이량체 분획을 나타냄. 단백질 A 후 수율 = 12 mg/L, 52%의 이종이량체).
도 2: A) CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole의 개략도 B) SDS-겔 C) SEC 프로파일(177,90mL에서의 피크는 이종이량체 분획을 나타냄. 단백질 A 후 수율 = 20 mg/L, 85%의 이종이량체).
도 3: A) CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF의 개략도 B) SDS-겔 C) SEC 프로파일(180,54mL에서의 피크는 이종이량체 분획을 나타냄. 단백질 A 후 수율 = 9 mg/L, 55%의 이종이량체).
도 4: CODV-Fab-OL1- Knobxhole-RF_woGS (GS를 포함하지 않음)의 개략도 B) SDS-겔 C) SEC 프로파일(peak at 180,59mL에서의 피크는 이종이량체 분획을 나타냄. 단백질 A 후 수율 = 5 mg/L, 88%의 이종이량체).
도 5: 본 발명의 항체 결합 단백질의 안정성을 보여주는 그래프. 가속화 스트레스 조건(2주, 40℃) 후 응집 성향을 SEC에 의해 평가하였다. 이와 비교하여, -80℃ 또는 4℃에서 보관된 상기 단백질들의 SEC 프로파일.
A) CODV-Fab-TL1-RF
B) CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole
C) CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF
D) CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF wo GS
도 6 및 도 8: 인간 T 세포의 존재 하에서 완전 인간 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량에서 전신에서 Molm13 종양 성장을 저해한다.
도 7 및 도 9: 인간 T 세포의 존재 하에서 완전 인간 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량에서 장골에서의 종양 퇴행과 연관된다.
도 10: CODV-Fab-TL 및 CODV-Fab-OL(LALA 돌연변이(IgG1 백본의 Fc가 사용되는 경우) 및 놉-인투-홀 돌연변이를 추가로 보여줌)의 구조의 도식적 표현.
도 11: 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-RF, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2) 및 이들의 일반적인 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호 70의 서열 정렬. 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-RF는 PCT/EP2016/051386에 개시되어 있다. CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2)은 "놉" 돌연변이의 존재에 의해 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-RF의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2)과 구별되며, CODV-Fab-TL1의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2)은 RF 돌연변이의 부재가 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-RF의 화학식 IV의 폴리펩티드의 Fc 도메인(Fc2)과 다름을 이 정렬로부터 알 수 있다.
도 12: 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-RF, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 도메인 및 이들의 일반적인 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호 68의 서열 정렬. CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1-Knobxhole의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc 도메인은 "홀" 돌연변이의 존재에 의해 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-TL1-RF와 구별됨을 이 정렬로부터 알 수 있다.
도 13: 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1, CODV-Fab-OL1a, CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF woGS의 화학식 III의 폴리펩티드의Fc 도메인의 서열 정렬.
도 14: 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1, CODV-Fab-OL1a, CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RFwoGS의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc3 도메인의 서열 정렬. 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1 및 CODV-Fab-OL1a는 PCT/EP2016/051386에 개시되어 있다. CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF woGS의 화학식 III의 폴리펩티드의 Fc3 도메인은 아미노산 GS의 부재에 의해 항체-유사 결합 단백질 CODV-Fab-OL1 및 CODV-Fab-OL1a와 구별됨을 이 정렬로부터 알 수 있다.
도 15: 인간 T 세포의 존재 하에서 완전 인간 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량에서 전신에서 Molm13 종양 성장을 저해한다.
도 16: 인간 T 세포의 존재 하에서 완전 인간 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량에서 장골에서의 종양 퇴행과 연관된다.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들 항-CD3/항-CD123 항체-유사 결합 단백질은 발현 및 정제 동안 단순화된 정제 및 감소된 응집을 초래하고 따라서 CD123 발현 표적 세포, 예컨대 THP-1 세포의 부재 하에서 낮은 T-세포 활성화를 갖지만 CD123 발현 표적 세포, 예컨대 THP-1 세포의 존재 하에서는 T-세포의 높은 활성화를 갖는 한편 증가된 양의 이종이량체를 초래하는 돌연변이를 포함한다.
실시예
실시예 1: hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1-RF, hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1 및 DART
1.1 CD123xCD3 CODV 또는 DART의 T-세포 활성화 효과
안전성 판독물로서 T 세포의 활성화 상태에 대한 항체-유사 결합 단백질의 효과를 2.9에 기술된 바와 같이 일차 인간 T 세포의 표면 상의 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현의 유세포 분석법 기반의 검출에 의해 분석하였다. 비교에는 DART 형식(본원에 "MGD006"으로 지칭)의 단쇄 CD123 x CD3 이중특이성 디아바디가 포함되며, 이는 디술피드 결합에 의해 서로 공유 결합된 서열 번호 82의 서열(이는 국제 공개 제2015026892호에 나타낸 바와 같은 서열 번호 1임)의 제1 폴리펩티드 사슬 및 서열 번호 83의 서열(이는 국제 공개 제2015026892호에 나타낸 바와 같은 서열 번호 3임)의 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것으로 국제 공개 제2015026892호에 기술되어 있다. CODV를 단독의 단리된 T 세포와 함께 인큐베이션시키는 경우, 후기 활성화 마커 CD25의 발현의 유의한 증가가 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포의 표면 상에서 검출될 수 없었다(데이터는 예시되어 있지 않음). 이와 동일하게, 둘 다의 T-세포 하위세트에서 초기 활성화 마커 CD69의 발현 수준의 농도 의존적 증가가 존재하지 않았다(표 1). 따라서, 구축물은 활성이 아닌 것으로 평가되었다(NA). 이와 대조적으로, THP-1 표적 세포를 첨가하는 경우, 두 마커 모두의 발현 수준의 거대한 증가가 측정가능하였다(CD25 데이터는 예시되어 있지 않으며, CD69 데이터는 표 2에 있음).
[표 1]
Figure pct00027
표 1에 나타낸 결과는 단쇄 항체(DART)가 테스트되는 조건 하에서 표적 세포의 부재 하에서 유의하게 더 많은 T-세포 활성화를 야기하는 것을 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00028
Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3", CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" 및 단쇄 DART MGD006의 세포독성 효과를 평가하였다. 각각의 이중특이성 구축물의 CD3ε/δ-복합체 및 CD123에 대한 친화성을 비아코어에 의해 측정하였다. 더욱이, 세포독성 분석은 2.8에 기술된 바와 같이 수행하였다(표 3).
[표 3]
Figure pct00029
표적 세포의 존재(원함) 또는 부재(원치 않음) 하에 T-세포 활성화를 촉발시키는 분자의 잠재력을 평가하기 위하여, 새로운 분석법을 구현하였다. NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(프로메가(Promega) #CS176401)를 384웰 플레이트에서 2 g/L (11 mM)의 글루코스, GlutaMAX, 25 mM HEPES를 포함하는 RPMI 1640에서 37℃ 및 5% CO2에서 1:3의 이펙터:표적 비로, THP-1 표적 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 5시간 후에, 인큐베이션을 중단시키고, 루미네선스 마이크로 플레이트 판독기(Luminescence Micro Plate Reader)에서 바이오-글로(Bio-Glo) 루시퍼라아제 분석 시스템, 프로메가 #G7940을 사용하여 발광을 측정하였다.
[표 4]
Figure pct00030
표 4에 나타낸 결과는 모든 항체-유사 결합 단백질이 표적 세포의 존재 하에, nM 미만의 EC50 값으로, 리포터 세포 활성화를 유도하는 것을 나타낸다. T-세포 관여 접근법에 있어서, T-세포 활성화를 표적 세포의 존재에 제한해야 한다. 이것은 표적 세포의 부재 하에서 유의한 발광 신호가 존재하지 않기 때문에 CODV 분자에 대해서 관찰된다. 이와는 대조적으로, 단쇄 DART 분자는 표적 세포의 부재 하에 더 높은 리포터 세포주 활성화를 유도한다. 이들 결과는 일차 T-세포로 수득되는 결과와 일치한다.
1.2 CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1-RF 및 CD123xCD3 이중특이성 DART의 생체 내에서의 항-종양 활성
재료 및 방법
전혈로부터의 인간 PBMC 및 T 세포 단리
PBMC를 피콜(Ficoll) 구배 원심분리를 사용하여 건강한 인간 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 전혈을 살균 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 1:1로 희석하였다. 그 다음, 2배 부피의 35 mL의 희석된 혈액을 15 mL의 피콜-파크(Ficoll-Paque)의 존재 하에 2개의 50 mL 팔콘 튜브(Falcon Tube) 내에 넣었다. 튜브를 중단 없이 실온에서 200 g에서 40분 동안 원심분리하였다. 2개의 버피 코트(buffy coat) 층을 회수하고, 45 mL의 살균 PBS가 있는 6개의 50 mL 팔콘 튜브에 넣고, 실온에서 100 g에서 10분 동안 중단 없이 3회 원심분리하였다(각 원심분리 사이에 상청액을 버리고, 45 mL의 PBS를 첨가하였다). 마지막 원심분리 후에, 2개의 펠렛을 50 mL 팔콘 튜브 내의 PBS로 완성된 50 mL의 최종 부피에 함께 넣었다. 총 생존가능 PBMC 개수를 비셀(Vicell) 계수에 의해 정의하였다. 그 다음, 펠렛을 밀테니이 바이오테크(Myltenyi Biotech)(130-091-221)로부터의 오토맥스(Automacs) 런닝 완충제에서 회수하고, T 세포를 제조업자의 지시에 따라 밀테니이 바이오테크(130-091-156)로부터의 음성 선발 KIT 및 오토맥스를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 정제된 T 세포를 회수하고, 2.5 x10E+6개의 세포/mL의 농도로 Xvivo-15 5%HIS + 페니실린-스트렙토마이신1X 배지 중에 넣어 배양하였다.
인간 T 세포 증폭
인간 풍부화 T 세포 집단을 활성화시키고, 밀테니이 바이오테크로부터의 T 세포 활성화/확장 키트(130-091-441)를 사용하여 14일 동안 시험관 내에서 확장시켰다.
생체 내 투여를 위한 인간 T 세포 제제
세포 및 세포 배양 배지를 400 g에서 10분 원심분리하였다. 펠렛을 살균 PBS 중에 2x10E+7개의 세포/mL의 농도로 회수하였다. 증폭된 T 세포로부터의 활성화 비드의 제거를 제조업자의 지시에 따라, 밀테니이 바이오테크로부터의 MACsiMAG 분리기(130-092-168)를 사용하여 수행하였다. 풍부화된 T 세포 집단을 비셀 계수에 의해 계수하고, 50 mL 팔콘 튜브 내의 25 mL의 살균 PBS 중에 회수하였다. 실온에서 400 g에서 10분 동안 원심분리하는 단계 후에, 세포 펠렛을 적당한 부피의 살균 PBS 중에 회수하여, 5x10E+7개의 세포/mL의 최종 농도를 수득하였다.
종양 모델
CD123을 발현하는 Molm-13 인간 급성 골수성 백혈병 세포를 라이프니츠(Leibniz)-연구소 DSMZ(German collection of microorganisms and cell cultures)로부터 획득하였다(독일 소재의 DSMZ 브라운슈바이크(Braunshweig)). 세포를 RPMI1640 글루타맥스 배지(우태아 혈청 20%를 사용하여 완성) 중에서 배양하여(37℃, 5% CO2, 95% 습도) 성장시켰다. Molm-13 세포를 비-복제성 렌티바이러스가 지닌 루시퍼라아제 벡터(SV40-PGL4-Puro(즉, 루시퍼라아제 2 및 퓨로마이신 저항성 카세트 서열에 연결된 시미안 바이러스(Simian Virus) 40 프로모터로 이루어진 루시퍼라아제 벡터))로 감염시켰다.
Molm13-luc+ 종양 세포를 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ NSG 마우스에 정맥내(IV) 주사하였다(동물당 200 ㎕의 PBS 중 10E+6개의 세포의 현탁액).24시간 후에, 10E+7개의 인간 T-세포를 0.2 mL의 살균 PBS의 부피로 상기 마우스에 복강내(IP) 투여하였다.
종양 이식 후 제3일에 기준선 생물발광 영상화를 리빙 이미지(Living Image) 3.2 획득 소프트웨어(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨-엘머(PerkinElmer))를 갖춘 IVIS100 이미저(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨-엘머)를 사용하여 수행하였다. 영상화 15분 전에 PBS 중 비틀 루시페린(Beetle luciferin) 칼륨 염(배치 316019, 프랑스 리옹 소재의 프로메가(Promega)) 120 ㎎/kg 용액을 동물에 복강내 주사하였다. 마우스를 영상화 5분 전에 케타민®/자일라진®(120 ㎎/kg; 6 ㎎/kg IM, 5 ml/kg)로 마취시켰다.
정맥내 경로(IV)에 의한 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 및 CD123xCD3 이중특이성 DART 경쟁자 (단쇄 항체 DART 형식 MGD006 또는 "DART-툴(tool)"로 본원에서 칭해지는 밀접한 유사체) 또는 PBS 처리는 표 5에 약술된 바와 같이, 이미 뼈에서 검출가능한 확립된 종양 상에의 종양 이식 후 제4일에 시작하였다.
[표 5]
Figure pct00031
데이터 수집 및 효능 기준
동물 체중을 제3일부터 분석의 마지막까지 모니터링하여, 치료법의 영향을 추적하였다. 연속 3일 동안 20% 체중 손실 또는 15% 체중 손실, 또는 10% 이상의 약물 관련 사망을 야기하는 투여량을 과도 독성 투여량으로 간주하였다. 동물 체중은 종양 중량을 포함하였다.
종양 부하 후에 비-침습적 생물발광 영상화(BLI)를 행하였다. 종양 이식 후 제3일, 처리를 시작하기 24시간 전에 기준선 BLI를 수행하였다. 전신 생물발광 신호를 기반으로 하여 동물들을 상이한 군에 배정하였다. 종양 성장을 종양 이식 후 제7일, 제10일 및 제14일에 BLI 신호 측정에 의해 전신 및 뒷다리의 장골에서 추적하였다. 장골 신호를 구획화에 의해 측정하였으며, 이는 거의 국소-영역 신호(예를 들어, 늦은 시점에 연조직 내의 잔존 신호)에 의해 영향을 받을 수 있었다. 처리군을 Molm13-luc+ 산재성 종양 및 인간 T 세포를 지니는 대조 동물과 비교하였다.
일차 효능 종점은 처리군과 대조군 간의 기준선으로부터의 종양 신호 변화의 비(dT/dC), 부분 종양 퇴행(PR)의 수 및 완전 종양 퇴행(CR)의 수였다.
시간에 따른 생물발광 신호 곡선(광자/초로 표현)에 기초한 종양 성장을 각 처리군의 각 동물에 대하여 모니터링하고, 전신 및 골 분할 신호 둘 다에 대하여 중간값 곡선 ± MAD로 표시하였다. 제1 처리일(스테이징일(staging day))에서의 종양 신호를 특정 관찰일의 종양 신호로부터 제하여, 종양 생물발광 신호의 변화를 각 대조(C) 또는 처리(T) 동물에 대하여 매일 계산한다. 중간값 T는 처리군에 대하여 계산되며, 중간값 C는 대조군에 대하여 계산된다.
그 다음, T/C 비를 계산하고, 백분율로 표현한다:
dT/dC =[(중간값 T 관찰일 - 중간값 T 제3일)/(중간값 C 관찰일 - 중간값 C 제3일)]x100
실험의 마지막(제14일)에 dT/dC가 42% 미만인 경우, 용량을 치료적으로 활성인 것으로 간주하고, dT/dC가 10% 미만인 경우 매우 활성인 것으로 간주한다.
종양 퇴행 퍼센트는 제1 처리일에서의 그의 신호와 비교한 특정 관찰일에서의 처리군에서의 종양 신호 감소의 %로서 정의된다. 특정 시점 및 각 동물에 있어서, 퇴행%는 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00032
루시페린 반응속도 및 가능한 IP 주사 누락(IP miss-injection)으로 인한 신호 가변성의 위험을 고려해볼 때, 적어도 연속 2회의 시점에서 관찰되는 경우에만 동물에 대한 신호 퇴행을 진정한 종양 퇴행으로 고려한다.
부분 퇴행(PR): 종양 신호가 연속 2회의 시점 동안 처리의 시작시의 신호 미만으로 감소되고, 하나는 기준선 신호의 50% 초과로 유지된다면, 퇴행은 부분적인 것으로 정의된다.
완전 퇴행(CR): 종양 신호가 연속 2회의 시점 동안 처리의 시작시의 신호보다 50%보다 더 크게 감소된다면, 퇴행은 완전한 것으로 정의된다.
통계학적 분석
IV 경로 화합물 평가
각 처리군의 개별 생물발광 신호를 날에 따라 반복 측정 이원 분산 분석 후에 다중도 쌍별 비교를 위한 본페로니-홀름(Bonferroni-Holm) 조정을 사용하여 다른 군과 비교하였다: p>0.05: NS, 0.05 > p > 0.01: *, p<0.01: **. 통계적 분석을 전신 생물발광 신호 및 장골 생물발광 신호 둘 모두에 대하여 수행한다.
결과
CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3"IV
인간 T 세포의 존재 하에 완전 인간 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량(1.3, 0.13 및 0.013 nmol/Kg Q3d)에서 전신에서 각각 20%, 14% 및 38%의 dT/dC로 Molm13 종양 성장을 저해하였으며(도 6 및 도 8), 장골에서 모든 테스트된 용량에서 각각 4/7 CR, 6/8 CR 및 2/6 CR로 종양 퇴행과 연관된다(도 7 및 도 9).
완전 인간 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 최대 반응을 0.13 nmol/kg Q3d에서, 전신 및 골 내에서 수득하였다. 이 용량에서, 활성은 DART 1.3 nmol/kg IV Qd (장골에서 1/7CR 및 1/7PR에서 전신 dT/dC: 29%)와 통계적으로 상이하지 않았다. 데이터를 최종 조직병리학적 분석에 의해 확인하였다(예시되어 있지 않음).
전신과 장골 사이에 관찰되는 차이는 정맥내 주사 후 수질외 종양 산재에 연속되는 복부 지방 및 난소 내의 잔존 종양 성장과 관련된다.
1.3 CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1 및 CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab의 생체내 항-종양 활성
재료 및 방법
인간 T 세포 단리 및 증폭은 단락 1.2에 개시되었다.
종양 모델
종양 모델은 단락 1.2에서 개시된 바와 같다. 정맥내 경로(IV)에 의한 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" 및 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 또는 PBS 처리는 표 6에 약술된 바와 같이, 이미 뼈에서 검출가능한 확립된 종양 상에의 종양 이식 후 제4일에 시작하였다.
통계학적 분석
IV 경로 화합물 평가는 단락 1.2에 기술된 바와 같다.
[표 6]
Figure pct00033
결과
CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3"IV
인간 T 세포의 존재 하에 완전 인간 CODV-Fab-TL1- Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량(1.3, 0.13 및 0.013 nmol/Kg Q3d)에서 전신에서 각각 7%, 5% 및 15%의 T/C로 Molm13 종양 성장을 저해하였으며, 장골에서 모든 테스트된 용량에서 각각 5/7 CR, 6/8 CR 및 4/6 CR로 종양 퇴행과 연관된다(도 15 및 도 16).
완전 인간 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 최대 반응을 0.13 nmol/kg Q3d에서, 전신 및 골 내에서 수득하였다.
CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3"IV
인간 T 세포의 존재 하에 완전 인간 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" IV Q3d는 모든 테스트된 용량(1.3, 0.13 및 0.013 nmol/Kg Q3d)에서 전신에서 각각 12%, 6% 및 4%의 T/C로 Molm13 종양 성장을 저해하였으며, 장골에서 모든 테스트된 용량에서 각각 8/8 CR, 5/7 CR 및 7/7 CR로 종양 퇴행과 연관된다(도 15 및 도 16).
모든 테스트된 용량에서, CD123xCD3 이중특이성 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" 활성은 CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3"과 통계적으로 상이하지 않았다. 데이터를 최종 조직병리학적 분석에 의해 확인하였다.
전신과 장골 사이에 관찰되는 차이는 정맥내 주사 후 수질외 종양 산재에 연속되는 복부 지방 및 난소 내의 잔존 종양 성장과 관련된다.
실시예 2: hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-TL1, hz20G6xhz7G3 CODV-Fab-OL1의 변이체
2.1 hCD3ε/δ-hFc 융합 발현 플라스미드(CD3ed-Fc)의 구축
cDNA 함유 플라스미드를 주형으로 사용하여, 선택적인 탠덤 정제를 위하여 8x His 또는 Strep-II 태그를 추가적으로 지니는 인간 면역글로불린 IgG의 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역과 리딩 프레임 내에서, 본원에 하기에 상세히 기술된 바와 같이 인간 및 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 및 CDδ 융합 단백질을 생성하였다.
인간 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 신호 서열을 포함하는 인간 CD3ε 및 인간 CDδ 서브유닛 세포외 도메인을 증폭시켰다. 생성된, 증폭되고, 절단되고, 정제된 PCR 산물을 라이게이션 PCR에 의해 조합하고, NheI 및 HindIII 부위를 사용하여 InFusion 방법에 의해 포유동물 발현 벡터 pXL 내로 라이게이션시켰다. 각각의 서브유닛을 하나의 플라스미드 상에 클로닝하였다. 생성된 성숙 인간 CD3ε His-태그 Fc-융합 단백질의 서열은 본원에 서열 번호 3으로 개시되어 있다. 서열 번호 3의 아미노산 1 내지 104는 야생형 전장 인간 Cd3ε(본원에서 서열 번호 1로 개시되며, Uniprot 데이터베이스에서 등록 번호 P07766으로 이용가능함) 단백질의 아미노산 23 내지 126 및 이에 따라 인간 CD3ε의 세포외 도메인에 상응한다.
시노몰구스 원숭이 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 신호 서열을 포함하는 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 및 CD3δ 세포외 도메인을 증폭시켰다. 생성된, 증폭되고, 절단되고, 정제된 PCR 산물을 라이게이션 PCR에 의해 조합하고, NheI 및 HindIII을 사용하여 InFusion 방법에 의해 포유동물 발현 벡터 pXL 내로 라이게이션시켰다. 각각의 서브유닛을 하나의 플라스미드 상에 클로닝하였다. 생성된 성숙 마카카 파시쿨라리스 CD3ε Fc-융합 단백질에 대한 서열은 서열 번호 4로 개시되어 있다. 서열 번호 3의 아미노산 1 내지 95는 전장 마카카 파시쿨라리스 CD3ε 단백질의 아미노산 23 내지 117에 상응하며 따라서 야생형 전장 마카카 파시쿨라리스 CD3ε(본원에서 서열 번호 2로 개시되며, Uniprot 데이터베이스에서 등록 번호 Q95LI5로 이용가능함)의 세포외 도메인을 포함한다. 클로닝된 융합 단백질은 야생형 서열의 아미노산 위치 57에 비하여 아미노산 위치 35에서 하나의 알라닌에서 발린으로의 교환을 추가로 함유한다.
2.2 인간 및 시노 CD3ε/δ-Fc의 발현 및 정제
F17 무혈청 현탁 배양(라이프(Life))에서 성장 중인 프리스타일(freestyle) HEK293 세포를 발현 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. CD3ε 및 CD3δ 세포외 도메인(ECD) 서브유닛을 나타내는 두 플라스미드 모두의 공동-트랜스펙션을 셀펙틴(Cellfectin) 트랜스펙션 시약(라이프)을 사용하여 수행하였다. 세포를 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 배양 상청액을 원심분리에 의해 수확하고, 여과(0.22 ㎛)에 의해 청징시켰다.
정제를 위하여, Fc-융합 단백질 변이체를 단백질 A 매트릭스(GE) 상에 포획하고, pH 변화에 의해 용출시켰다. 슈퍼덱스(Superdex) 200(GE)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 단백질의 폴리싱(polishing) 및 최종 한외여과 농축 단계 후에, 단백질을 추가의 분석에 사용하였다.
인간 이종이량체를 단백질 A 상의 포획 후에 His-Trap 컬럼(GE)상에 추가적으로 적용하고, 탈염시켰다. 용출된 단백질을 스트렙타비딘 컬럼(GE)에 적용하였으며, d-데스티오비오틴으로 용출시킨 후에, 슈퍼덱스 200(GE)을 사용한 SEC에 의하여 최종 폴리싱시켰다. 이러한 전략을 사용하여, 동종이량체로부터 이종이량체를 단리하였다.
2.3 CD123(IL3RA) -hFc 융합물 발현 플라스미드(CD123-Fc-His)의 구축
주형으로서 cDNA 함유 플라스미드를 이용하여, 부가적으로 헥사히스티딘 태그를 보유하는 인간 면역글로불린 IgG의 중쇄 불변 영역, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인과 리딩 프레임으로 인간 CD123 융합 단백질을 생성하였다.
인간 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 신호 서열을 포함하는 인간 CD123(IL3RA) 세포외 도메인을 증폭시켰다. 생성된, 증폭되고, 절단되고, 정제된 PCR 산물을 라이게이션 PCR에 의해 조합하고, NheI 및 HindIII 부위를 사용하여 InFusion 방법에 의해 포유동물 발현 벡터 pXL 내로 라이게이션시켰다. 생성된 성숙 인간 CD123 His-II 태그 Fc-융합 단백질의 서열은 서열 번호 14로 개시되어 있다. 아미노산 1 내지 284는 전장 야생형 인간 CD123 단백질(본원에서 서열 번호 12로 개시되며, NCBI 데이터베이스에서 등록 번호 NP_002174.1로 이용가능함)의 아미노산 22 내지 305 및 이에 따라 인간 Cd123의 세포외 도메인에 상응한다.
2.4 인간 CD123-Fc-His의 발현 및 정제
F17 무혈청 현탁 배양(라이프)에서 성장 중인 프리스타일 HEK293 세포를 발현 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션을 셀펙틴 트랜스펙션 시약(라이프)을 사용하여 수행하였다. 세포를 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 재조합 단백질을 함유하는 배양 상청액을 원심분리에 의해 수확하고, 여과(0.22 ㎛)에 의해 청징시켰다.
정제를 위하여, Fc-융합 단백질 변이체를 단백질 A 매트릭스(GE) 상에 포획하고, pH 변화에 의해 용출시켰다. 슈퍼덱스 200(GE)을 사용한 PBS에서의 SEC에 의한 단백질의 폴리싱 및 최종 한외여과 농축 단계 후에, 단백질을 추가의 분석에 사용하였다.
섹션 2.1 내지 2.4에 개시된 것과 같은 본 발명의 폴리펩티드 각각은 His-태그 또는 Strep 태그와 같은 태그를 포함할 수 있으며, 이와 같이 태그는 예를 들어 정제를 더욱 용이하게 할 수 있다. 태그는 예를 들어, His Tag (HHHHHH, 또한 서열 번호 85) 또는 Strep-II 태그(WSHPQFEK, 또한 서열 번호 84)에 상응할 수 있으며, 이들 두 태그는 서로 대체될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 태그가 없다. 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드의 비-태깅 형태 및 태깅 형태 둘 다는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 　일 실시 형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 펩티드 및/또는 프로-펩티드를 포함하며, 이는 본 폴리펩티드의 분비를 더 용이하게 및/또는 더 효율적으로 만든다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 성숙 폴리펩티드, 즉, 신호 펩티드 및 프로-펩티드가 없는 폴리펩티드에 상응한다. 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드의 성숙 형태 및 전장 형태 둘 다는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
2.5 CODV 항체-유사 결합 단백질의 발현 및 정제
단클론 항체 "hz20G6" 및 "hz7G3"의 서열을 이용하는 이중특이성 CD3xCD123 CODV 항체 유사 결합 단백질을 발현시키고 정제하였다.
F17 무혈청 현탁 배지(인비트로겐)에서 성장 중인 프리스타일 HEK293 세포를 동일한 비의 경쇄 및 중쇄 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질에 있어서, 항체 정보가 하나의 경쇄와 하나의 중쇄에 코딩된 반면(도 1~도 3), Gs를 포함하지 않는 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF 와 같은 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질(도 4)의 경우 하나의 경쇄와 두 개의 중쇄 플라스미드를 제조업자가 설명한 바와 같이 폴리에틸렌이민 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션시켰다. 세포를 8% CO2를 이용하여, 110 rpm에서 Kuhner ISF1-X 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 7일의 배양 후에 10%(Vol/Vol) 1 M Tris HCl(pH 8.0)을 첨가하고, 상청액을 0.2 μM 보틀 탑 필터를 통해 여과하여, 입자를 제거하였다. 모든 CODV 분자, CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질 및 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질을 단백질 A
컬럼(하이트랩 단백질 A HP 컬럼, 지이 라이프 사이언시즈)에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 0.1 M 시트레이트, pH 3.0을 사용한 컬럼으로부터의 용출 후에, CODV 구축물을 PBS(집코 14190-136) 중에 제형화된 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼을 사용하여 탈염시켰다.
응집체로부터 단량체를 분리하기 위하여, 두 구축물, CODV-Fab-TL1 항체-유사 결합 단백질 및 CODV-Fab-OL1 항체-유사 결합 단백질을 위한 PBS (집코 14190-136)에서의 고분리능 분획화 단계가 하이로드 수퍼덱스 200 26/60 320ml 컬럼(지이 헬스케어 카탈로그 번호29-9893-36])을 이용하여 수행되었다. 단량체 분획을 풀링하고, 비바스핀 20 원심분리 컬럼(VS2002 사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim biotech))을 사용하여 1 ㎎/㎖까지 농축시키고, 0.22 ㎛ 막(밀렉스® 시린지 필터 SLGV033RS)을 사용하여 여과하였다.
단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도의 측정에 의해 결정하였다. 각 배치를 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하여, 각 서브유닛 및 단량체의 순도 및 분자량을 결정하였다.
정량적 LAL 분석을 찰스 리버(Charles river)로부터의 엔도세이프(Endosafe)-PTS 시스템을 이용하여 수행하여 내독소 무함유 샘플을 보장하였다.
[표 6]
Figure pct00034
CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole의 발현은 CODV-Fab-TL1-RF에 비하여 더 높은 수율과 더 많은 양의 올바른 이종이량체 분획을 생성하였다. 놀랍게도, RF 돌연변이의 포지셔닝의 변화는 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF에 대해 관찰된 바와 같이 이러한 긍정적 효과를 역전시켰다. CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RFwoGS 구성은 이종이량체 분획의 양에 긍정적으로 영향을 준 반면 수율에는 영향이 없었다(표 6).
2.6 SPR을 이용한 인간 CD3ε/δ 및 인간 CD123에의 CD3xCD123 CODV 항체-유사 결합 단백질의 친화성의 평가
분석 완충제로서 HBS-EP(지이 헬스케어)를 이용하여 비아코어 3000 또는 비아코어 T200 기기(지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 인간 CD3ε/δ 및 인간 CD123에의 CODV 항체-유사 결합 단백질의 결합 친화성을 측정하였다. CD3ε/δ-Fc 또는 CD123-Fc-His 융합 단백질의 포획은 His 포획 키트(지이 헬스케어)를 이용하여 달성하였다. 포획 항체를 아민 커플링 키트(BR-100-50, 지이 헬스케어)를 사용하여 대략 12,000 RU까지 CM5 칩(지이 헬스케어)에 커플링시켰다. CD3εδ-Fc 또는 CD123-Fc-His 융합 단백질을 10 μl/분으로 포획하여 30 RU의 Rmax 값을 생성하였다. CODV 항체-유사 결합 단백질에서의 결합 반응 속도( binding kinetics)를 30 μl/분에서 측정하였다. 분석 완충제 중 3 nM로부터 200 nM까지의 CODV 항체-유사 결합 단백질의 2배 희석을 이용하였다. 모든 Fab 농도를 이중 참조를 위하여 이중 완충제 블랭크와 함께 이중으로 진행하였다. 포획 표면의 재생은 30 μl/분으로 10 mM 글리신(pH1.5)의 1분 주사에 의해 수행하였다. 데이터 분석을 위하여, BIAevaluation 소프트웨어(지이 헬스케어)를 이용하였다. 매스 트랜스퍼(mass transfer)를 이용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 모델을 사용하여 데이터를 전체적으로 피팅시켰다.
[표 7]
Figure pct00035
CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF", CODV-FabOL1-Knobxhole-RF wo GS로 불리는 상이한 CD3xCD123 CODV에 대해 수득한 huCD3εδ 및 huCD123에 대한 결합 반응 속도는 모든 테스트한 구축물에 있어서 유사하다.
2.7 CD3xCD123 CODV 항체-유사 결합 단백질의 안정성 평가
2.7.1 시차 주사 형광측정법(DSF)에 의해 측정된 열안정성
융점 Tm을 시차 주사 형광 측정법(DSF)를 이용하여 결정하였다. 샘플을 백색 세미-스커트 96웰 플레이트(바이오라드)에서 D-PBS 중 사이프로-오렌지 염색제(인비트로겐, DMSO 중 5000x 스톡)의 4x 농축액을 포함하는 0.2 μg/μl의 최종 농도까지 D-PBS 완충제(인비트로겐)에서 희석시켰다. 모든 측정은 MyiQ2 실시간 PCR 기기(바이오라드)를 이용하여 이중으로 이루어졌다. 용융 곡선의 네거티브 일차 도함수 곡선(Negative first derivative curves)(-d(RFU)/dT)을 iQ5 소프트웨어 v2.1(바이오라드)에서 생성시켰다. 그 후, 데이터를 Tm 결정 및 데이터의 그래픽 디스플레이를 Excel로 엑스포트하였다. 모든 테스트된 CODV 구축물의 융점(표 8)은 56~57℃에서 매우 유사한 것으로 밝혀졌다.
[표 8]
Figure pct00036
2.7.2 가속화 온도 스트레스에서의 안정성
가속화 온도 스트레스 하에서의 CODV 구축물의 안정성을 평가하기 위하여, 단백질을 2주 동안 40℃에서 0.5 mL 세이프-락(Safe-lock) 튜브(에펜도르프 바이오푸르(Eppendorf BIOPUR))에서 D-PBS 완충제에서 1 mg/ml로 인큐베이션하였다. 대조 샘플을 동일한 기간 동안 -80℃ 및 4℃에서 유지하였다. 스트레스 처리 후, 샘플을 바이오시큐리티(BioSECcurity) HPLC 시스템(PSS 폴리머(Polymer))을 이용한 분석적 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 응집체 함량에 대해 분석하였다. 크로마토그래피는 0.25 ml/분으로 런닝 완충제로서 250 mM NaCl, 100 mM 인산나트륨(pH 6.7)을 이용하여 TSKgel SW-Type 가드 컬럼(4 μm, 4,6x35 mm, 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))을 갖춘 TSKgel SuperSW3000 컬럼(4 μm, 4,6x300 mm, 토소 바이오사이언스)에서 5 μl 단백질 용액을 이용하여 이루어졌다. 데이터를 WinGPC 소프트웨어(PSS 폴리머)를 이용하여 분석하였다. 가속화 온도 스트레스 후 분석된 모든 CODV 구축물은 대조 샘플에 비하여 응집체 함량의 증가를 나타냈다(도 5). 스트레스 후 응집된 함량은 CODV-Fab-TL1-RF(PB05126)에 대해 6%, CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole에 대해 4.1%, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF에 대해 6.6% 및 CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF wo GS에 대해 3.4%였다.
2.8 CODV CD123 x CD3에 의해 매개되는 THP-1 세포에 대한 세포독성 효과
CODV CD123 x CD3의 T-세포 관여 효과를 유세포 분석법 기반의 세포독성 분석에 의해 분석하였다.
이펙터 세포는 건강한 공여자의 전혈로부터 단리된 일차 T 세포였다. THP-1 세포를 CD123 발현 표적 세포로서 사용하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜 밀도 원심분리에 의해 EDTA로 처리된 건강한 공여자의 200 mL의 말초 혈액으로부터 단리하였다. 15 ml의 히스토파크(Histopaque)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 50 ml 류코셉-튜브(Leucosep-Tube)(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one))에 사전-로딩하였다. 혈액을 autoMACS 헹굼 완충제 + 1% BSA(밀테니이 바이오테크)로 희석하고, 총 10개의 준비된 튜브의 막에 로딩하였다. 튜브를 1000 xg에서 10분 동안 중단 없이 원심분리하였다. PBMC를 수집하고, autoMACS 헹굼 완충제 + 1% BSA로 3회 세척하였다. 마지막으로, PBMC를 제조업자의 지시에 따라 Pan T 세포 단리 키트(밀테니이 바이오테크)를 사용하여 autoMACSpro 기술에 의한 T 림프구의 단리를 위하여 autoMACS 런닝 완충제(밀테니이 바이오테크) 중에 재현탁화시켰다. 분리된 T 세포의 순도를 인간 7-색 면역표현형분석 키트(밀테니이 바이오테크)를 사용하여 MACSQuant 유세포 분석법에 의해 분석하였다.
표적 세포(즉, THP-1 세포주)를 1 ml RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS(인비트로겐) 중 1 μM CFSE를 사용하여 37℃에서 15분 동안 염색하였다. 2.5E4개의 표적 세포를 96웰 U자형 바닥 현탁 배양 플레이트(그레이너 바이오-원)에 웰당 50 ㎕의 배지 중에 접종하였다.
단리된 일차 인간 T 림프구를 RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS 중에 재현탁시키고, 웰당 50 ㎕ 중에 표시된 이펙터-대-표적 비로 표적 세포에 첨가하였다(일반적으로 E:T=10:1).
이중특이성 항체-유사 결합 단백질을 1 ml RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS (인비트로겐) 또는 PBS에서 연속하여 1:3으로 희석하고 각 5 μl를 최대 3000 ng/ml의 최종 최대 농도로 세포에 첨가하였다. 분석물을 5% CO2에서 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션시켰다.
죽은 표적 세포를 검출하기 위하여, 모든 세포를 7-AAD로 염색하였다. 따라서, FBS가 있는 염색 완충제(비디 파민젠(BD Pharmingen)) 중에 희석된 5 ㎍/ml의 7-AAD를 각 웰에 첨가하고, 암소에서 4℃에서 30분까지 인큐베이션시켰다. 세포를 각각 MACSQuant(밀테니이 바이오테크) 또는 LSRII 또는 Verse(둘 다 BD) 유세포 측정기를 사용하여 측정하였다. 추가의 데이터 분석을 FlowJo 소프트웨어(트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc.))를 사용하여 수행하였다. 판독물은 CFSE 및 7-AAD 이중 양성 세포의 백분율이었다. 곡선을 XLfit(알고리즘(Algorithm) 205)에 의해 계산하였다.
표 9에 예시된 바와 같이, 이중특이성 항체-유사 결합 단백질은 시험관 내에서 일차 T 세포에 관여하여 THP-1 표적 세포를 용해시킬 수 있었다. 죽은 표적 세포의 항체 농도 의존적 증가가 20시간의 공동-인큐베이션 후에 검출될 수 있었다. 본원에 나타낸 항체-유사 결합 단백질에 있어서, 0.8 내지 1.2 pM의 범위의 EC50 값이 계산되었다.
[표 9]
Figure pct00037
CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF 또는 CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole에서의 백본 돌연변이의 도입은 CODV-Fab-TL1-RF에 비하여 이들 분자에 대한 기능적 파라미터를 변경하지 않으며, 이는 이들 CODV 변형이 T-세포 관여에서의 활성의 상실을 야기하지 않음을 나타내는 것이다.
2.9 표적 세포의 존재(활성 판독물) 및 부재(안전성 판독물)에서 T-세포 활성화에 대한 CD123xCD3 CODV 항체-유사 결합 단백질의 효과
활성 또는 안전성 판독물로서 T 세포의 활성화 상태에 대한 이중특이성 항체-유사 결합 단백질의 효과를 표적 세포의 존재(조건 2.8 참고) 또는 부재 하에서 일차 인간 T 세포의 표면 상의 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현의 유세포 분석법 기반 검출에 의해 분석하였다. 단리된 일차 인간 T 림프구를 RPMI + GlutaMAX I(집코) + 10% FCS(인비트로겐) 중에 재현탁시키고, 2.5E5개의 세포를 96웰 U자형 바닥 현탁 배양 플레이트(그레이너 바이오-원)에 웰당 50 ㎕ 중에 접종하였다.
어느 하나의 T 세포만을 테스트하고, 웰을 50 ㎕ RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS로 채우거나, 표적 세포(즉, THP-1 세포주)를 50 ㎕ RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS 중에 웰당 2.5E4개의 세포로 첨가하였다.
이중특이성 항체-유사 결합 단백질을 RPMI + GlutaMAX I + 10% FCS 또는 PBS에서 연속으로 1:3 또는 1:10으로 희석하고 각 5 ㎕를 최대 30 0000 ng/ml의 최종 최대 농도로 세포에 첨가하였다. 분석물을 5% CO2에서 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 시간 후에, 세포를 스핀다운시키고, 하기의 표지된 항체를 사용하여 웰당 FBS가 있는 염색 완충제(비디 파민젠) 100 ㎕에서 4℃에서 15분 동안 염색시켰다: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7
플루오레센스 마이너스 원(fluorescence minus one; FMO) 대조군으로서, CD25를 하나의 튜브에서 그의 아이소타입(아이소타입 APC-IG1k)으로 대체하고, CD69를 제2 튜브에서 그의 아이소타입(아이소타입 PE-Cy7-IG1k)으로 대체한 것을 제외하고는 상기에 기술된 바와 같이 활성화 T 세포를 염색하였다.
염색 후에 세포를 2회 세척하고, FBS가 있는 염색 완충제 150 ㎕ 중에 재현탁시키고, LSRII(BD) 유세포 측정기를 사용하여 10000개의 세포를 측정하였다. 추가의 데이터 분석을 FlowJo 소프트웨어(트리 스타, 인크.)를 사용하여 수행하였다. 판독물은 CD4양성CD25양성, CD4양성CD69양성, CD8양성CD25양성 및 CD8양성CD69양성 T 세포의 백분율이었다. 게이트를 FMO 대조군에 따라 설정하였다.
표 10은 표적 세포의 존재 하에서의 T-세포 활성화 결과(활성 판독)를 보여준다. 표적 세포의 발현에 대한 EC50 값은 세포독성 분석에서 관찰된 EC50 값과 매우 유사하다. CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole 또는 CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF에서의 백본 돌연변이의 도입은 CODV-Fab-TL1-RF에 비하여 이 분자에 대한 기능적 파라미터를 변경시키지 않으며, 이는 이들 CODV-Fab 변형이 표적 접근과 양립가능함을 나타내는 것이다.
[표 10]
Figure pct00038
표 10 및 표 11은 CD4+(표 11) 및 CD8+(표 12) T-세포에 대하여 이중특이성인 것의 고농도(100 nM, EC50보다 5log 더 큼)에서의 표적 세포의 부재(안전성 판독) 및 존재(활성 판독) 하에서의 T-세포 활성화 결과(CD69 발현을 기반으로 함)를 보여준다. 표적 세포의 부재 하에서 단지 적은 퍼센트의 T-세포만이 CD69 양성이 되며, 이때 분자들 사이에 또는 CD4+ T-세포와 CD8+ T-세포 사이에 큰 차이가 없다. 또한 표 10에 나타낸 바와 같이, 모든 CODV는 표적 세포의 존재 하에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 활성화를 유도한다. 따라서, CODV-분자에서의 백본 돌연변이의 도입은 표적 세포의 부재 하에서 T-세포 활성화와 관련하여 원치 않는 효과를 유도하지 않는다.
[표 11]
Figure pct00039
[표 12]
Figure pct00040
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> BISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO CD3 AND CD123 <130> FR2016/016 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 135 140 Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 165 170 175 Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 180 185 190 Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(104) <223> extracellular domain of human CD3 epsilon <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(340) <223> His-tagged FC-Fusion <400> 3 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly 20 25 30 Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu 35 40 45 Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu 50 55 60 Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly 65 70 75 80 Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val 85 90 95 Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 100 105 110 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 145 150 155 160 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 195 200 205 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 225 230 235 240 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 245 250 255 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 260 265 270 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 275 280 285 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 290 295 300 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 305 310 315 320 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly His His His His 325 330 335 His His His His 340 <210> 4 <211> 333 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> Domain <222> (1)..(95) <223> extracellular domain of Macaca fascicularis CD3epsilon protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (96)..(333) <223> Fc fusion <400> 4 Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val 1 5 10 15 Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu Gly 20 25 30 Ser Glu Val Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser Gly 35 40 45 Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly Tyr 50 55 60 Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His His 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Gly 85 90 95 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 100 105 110 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 130 135 140 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 145 150 155 160 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 165 170 175 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 245 250 255 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 260 265 270 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 275 280 285 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 290 295 300 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 305 310 315 320 Ser Pro Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 325 330 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-H of the so-called "hz20G6" anti-CD3 antibody <400> 5 Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-H of the so-called "hz20G6" anti-CD3 antibody <400> 6 Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-H of the so-called "hz20G6" anti-CD3antibody <400> 7 Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-L of the so-called "hz20G6" anti-CD3 antibodies <400> 8 Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1d of humanized "20G6" anti-CD3 antibody <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL1c of humanized "20G6" anti-CD3 antibody. <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-L of the VL1c variant of the humanized "20G6" anti-CD3 antibody. <400> 11 Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu 1 5 10 15 Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met 20 25 30 Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr 35 40 45 Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn 50 55 60 Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe 85 90 95 Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 100 105 110 Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn 130 135 140 Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly 145 150 155 160 Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly 165 170 175 Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly 180 185 190 Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu 195 200 205 Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met 210 215 220 His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp 245 250 255 Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile 260 265 270 Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro 275 280 285 Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp 290 295 300 Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys 305 310 315 320 Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro 325 330 335 Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp 340 345 350 Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu 355 360 365 Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr 370 375 <210> 13 <211> 378 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 13 Met Thr Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Thr Pro Cys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Thr Lys Glu Asp Pro Asn Ala Pro Ile Arg Asn Leu Arg Met 20 25 30 Lys Glu Lys Ala Gln Gln Leu Met Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr 35 40 45 Asp Val Glu Cys Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Ser Met Pro Ala Met Asn 50 55 60 Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Val Arg Val Ala Ser Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe 85 90 95 Pro Glu Asn Ser Gly Thr Pro Arg Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 100 105 110 Trp Val His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Val Val Gly Pro 115 120 125 Ala Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Asn Pro Asn 130 135 140 Ser His Glu Gln Tyr Arg Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Arg Gly 145 150 155 160 Thr Gln Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly 165 170 175 Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Val Ser 180 185 190 Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Phe Phe Ser Gln Ile Glu Arg Leu 195 200 205 Thr Pro Pro Asn Met Thr Gly Glu Cys Asn Glu Thr His Ser Phe Met 210 215 220 His Trp Lys Met Lys Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Arg Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Arg Thr Glu Gln Val Arg Asp 245 250 255 Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile 260 265 270 Arg Ala Arg Glu Thr Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro 275 280 285 Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Ser Ser Arg Ala Trp 290 295 300 Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Leu Cys 305 310 315 320 Val Phe Leu Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro 325 330 335 Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Thr Phe Gln Gln Asp 340 345 350 Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu 355 360 365 Val Ser Glu Val Gln Val Val Glu Lys Thr 370 375 <210> 14 <211> 519 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(284) <223> extracellular domain of human CD123 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (285)..(519) <223> His tagged Fc-Fusion <220> <221> MISC_FEATURE <222> (514)..(519) <223> His Tag <400> 14 Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met Lys Ala 1 5 10 15 Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Ile 20 25 30 Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn Asn Ser 35 40 45 Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn Tyr Thr 50 55 60 Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe Pro Glu 65 70 75 80 Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys Trp Ile 85 90 95 His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro Gly Ala 100 105 110 Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn Arg Arg 115 120 125 Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly Thr Arg 130 135 140 Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly Ile Pro 165 170 175 Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu Thr Pro 180 185 190 Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met His Trp 195 200 205 Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu Gln Ile 210 215 220 Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp Arg Thr 225 230 235 240 Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile Arg Ala 245 250 255 Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro Gln Arg 260 265 270 Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp Arg Asp 275 280 285 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 290 295 300 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 325 330 335 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 340 345 350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 355 360 365 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 385 390 395 400 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 450 455 460 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 500 505 510 Gly His His His His His His 515 <210> 15 <211> 525 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(284) <223> extracellular domain of Macaca fascicularis CD123 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (285)..(525) <223> His tagged Fc-fusion <220> <221> MISC_FEATURE <222> (520)..(525) <223> His tag <400> 15 Thr Lys Glu Asp Pro Asn Ala Pro Ile Arg Asn Leu Arg Met Lys Glu 1 5 10 15 Lys Ala Gln Gln Leu Met Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Val 20 25 30 Glu Cys Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Ser Met Pro Ala Met Asn Asn Ser 35 40 45 Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn Tyr Thr 50 55 60 Val Arg Val Ala Ser Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe Pro Glu 65 70 75 80 Asn Thr Gly Thr Pro Arg Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys Trp Val 85 90 95 His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Val Val Gly Pro Ala Ala 100 105 110 Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Asn Pro Asn Ser His 115 120 125 Glu Gln Tyr Arg Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Arg Gly Thr Gln 130 135 140 Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ala Arg Leu Ser Arg Gly Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Val Ser Ile Pro 165 170 175 Cys Thr Asp Lys Phe Val Phe Phe Ser Gln Ile Glu Arg Leu Thr Pro 180 185 190 Pro Asn Met Thr Gly Glu Cys Asn Glu Thr His Ser Phe Met His Trp 195 200 205 Lys Met Lys Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu Arg Ile 210 215 220 Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Arg Thr Glu Gln Val Arg Asp Thr Thr 225 230 235 240 Ser Phe Gln Leu Pro Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile Arg Ala 245 250 255 Arg Glu Thr Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro Gln Arg 260 265 270 Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Ser Ser Arg Ala Trp Arg Gly 275 280 285 Ser Gly Gly Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 290 295 300 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 305 310 315 320 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 325 330 335 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 340 345 350 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 355 360 365 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 370 375 380 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 385 390 395 400 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 405 410 415 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 420 425 430 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 435 440 445 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 450 455 460 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 465 470 475 480 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 485 490 495 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 500 505 510 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly His His His His His His 515 520 525 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 of the so-called CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" antibody-like binding proteins <400> 16 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 of the so-called CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" antibody-like binding proteins <400> 17 Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL of the so-called CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" antibody-like binding proteins <400> 18 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 of the so-called CODV-Fab "hz20G6xhz7G3" antibody-like binding proteins <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 22 Thr Val Ala Ala Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 23 Gln Pro Lys Ala Ala 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 24 Gln Arg Ile Glu Gly 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 26 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 27 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> shows the amino acid sequence of a linker sequence <400> 28 Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 29 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 31 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 32 Lys Thr His Thr 1 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 33 Lys Thr His Thr Ser 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 34 Asp Lys Thr His Thr Ser 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 35 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 36 Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 37 Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 38 Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 39 Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 40 Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 41 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 42 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gly 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 43 Gly Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gly 1 5 10 15 <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 44 Gly Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gly <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 45 Gly Gly Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 Gly Gly <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 46 Gly Gly Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 Gly Gly Gly <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a linker sequence <400> 47 Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly 20 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-L of the so-called "hz7G3" antibody. <400> 48 Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-L of the so-called "hz7G3" antibody. <400> 49 Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1-H of the so-called humanized "7G3" antibody <400> 50 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3-H of the so-called humanized "7G3" antibody. <400> 51 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH variant of the so-called humanized "7G3" antibody. <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Ser Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2-H of one of the so-called humanized "7G3" antibody. <400> 53 Ile Ile Pro Ser Ser Gly Ala Thr 1 5 <210> 54 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL variant of the so-called humanized "7G3" antibody. <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 55 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide I of the so-called CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" and CODV-Fab-OL1a "hz20G6xhz7G3" <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile 165 170 175 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 56 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 57 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide according to formula [IV] of the so-called CODV-Fab-TL1-RF "hz20G6xhz7G3" <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile 165 170 175 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 370 375 380 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 385 390 395 400 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 405 410 415 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 420 425 430 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 435 440 445 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 450 455 460 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 465 470 475 480 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 485 490 495 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 500 505 510 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 515 520 525 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 530 535 540 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 545 550 555 560 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 565 570 575 Pro Gly <210> 58 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc2 of the so-called CODV-Fc-TL1 "hz7G3xhz20G6" antibody-like binding protein <400> 58 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 59 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide according to formula [III] of the so-called CODV-Fab-TL1-RF and CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln 145 150 155 160 Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Ile Pro Ser Ser 165 170 175 Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys 195 200 205 Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 245 250 255 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 260 265 270 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 275 280 285 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 290 295 300 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 305 310 315 320 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 325 330 335 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 465 470 475 480 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 530 535 540 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 545 550 555 560 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 <210> 60 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the Fc region of the polypeptide of formula [III] of the so-called CODV-Fab-TL1-RF and CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3". <400> 60 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 61 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide according to formula [III] of the so-called CODV-Fab-OL1 "hz20G6xhz7G3" <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln 145 150 155 160 Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Ile Pro Ser Ser 165 170 175 Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys 195 200 205 Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 245 250 255 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 260 265 270 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 275 280 285 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 290 295 300 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 305 310 315 320 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 325 330 335 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 67 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> generalized amino acid sequence of the polypeptide according to formula [III] of CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole, CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF without GS (woGS). <220> <221> MISC_FEATURE <222> (473)..(473) <223> X1 is Y or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (478)..(478) <223> X2 is S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (490)..(490) <223> X3 is T, S or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (492)..(492) <223> X4 is A or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (531)..(531) <223> X5 is V or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (559)..(559) <223> X6 is H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (560)..(560) <223> X7 is Y or F <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val 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Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 325 330 335 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Xaa Thr Leu Pro Pro Xaa Arg Asp 465 470 475 480 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Xaa Ser Lys Leu 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Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 69 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc stump (Fc3) of the so-called CODV-Fab-OL1-Knobxhole-RF without GS (woGS) "hz20G6xhz7G3" <400> 69 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 70 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> generalized amino acid sequence of the Fc domain (Fc2) of polypeptide of formula [IV] of CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(129) <223> X1 is Y or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (134)..(134) <223> X2 is S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146) <223> X3 is T, S or W, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (148)..(148) <223> X4 is A or L, <220> <221> MISC_FEATURE <222> (187)..(187) <223> X5 is V or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (215)..(215) <223> X6 is H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (216)..(216) <223> X7 is Y or F, or <400> 70 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Xaa Thr Leu Pro Pro Xaa Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Xaa Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Xaa Xaa Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 71 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> generalized amino acid sequence of polypeptide of formula [IV] of the so-called antibody-like binding proteins CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole, CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF, CODV-Fab-TL1, CODV-Fab-TL1-Knobxhole <220> <221> MISC_FEATURE <222> (481)..(481) <223> X1 is Y or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (486)..(486) <223> X2 is S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (498)..(498) <223> X3 is T, S or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (500)..(500) <223> X4 is A or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (539)..(539) <223> X5 is V or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (567)..(567) <223> X6 is H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (568)..(568) <223> X7 is Y or F <400> 71 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile 165 170 175 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 370 375 380 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 385 390 395 400 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 405 410 415 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 420 425 430 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 435 440 445 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 450 455 460 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 465 470 475 480 Xaa Thr Leu Pro Pro Xaa Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 485 490 495 Leu Xaa Cys Xaa Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 500 505 510 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 515 520 525 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Xaa Ser Lys Leu Thr Val 530 535 540 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 545 550 555 560 His Glu Ala Leu His Asn Xaa Xaa Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 565 570 575 Pro Gly <210> 72 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide of formula [IV] of the so-called ODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole "hz20G6xhz7G3" <400> 72 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile 165 170 175 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 370 375 380 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 385 390 395 400 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 405 410 415 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 420 425 430 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 435 440 445 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 450 455 460 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 465 470 475 480 Tyr Thr Leu Pro 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Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 74 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the amino acid sequence of the polypeptide of formula [III] of the so-called ODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole and CODV-Fab-TL1-Knob-xhole "hz20G6xhz7G3" <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln 145 150 155 160 Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Ile Pro Ser Ser 165 170 175 Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys 195 200 205 Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 245 250 255 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 260 265 270 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 275 280 285 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 290 295 300 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 305 310 315 320 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 325 330 335 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 465 470 475 480 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 530 535 540 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 545 550 555 560 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 <210> 75 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Fc of the polypeptide of formula [III] of the so-called CODV-Fab-TL1-Knob-RFxhole and CODV-Fab-TL1-Knob-xhole "hz20G6xhz7G3" <400> 75 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 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<213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide of formula [IV] of the so-called CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF and CODV-Fab-TL1-Knob-x hole "hz20G6xhz7G3" <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu 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370 375 380 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 385 390 395 400 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 405 410 415 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 420 425 430 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 435 440 445 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 450 455 460 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 465 470 475 480 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 485 490 495 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 500 505 510 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 515 520 525 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 530 535 540 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 545 550 555 560 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 565 570 575 Pro Gly <210> 77 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the Fc2 domain of the polypeptide of formula [IV] of the so-called CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF and CODV-Fab-TL1-Knobxhole "hz20G6xhz7G3" <400> 77 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 78 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide of formula [III] of the so-called CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" <400> 78 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln 145 150 155 160 Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Ile Pro Ser Ser 165 170 175 Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser 180 185 190 Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys 195 200 205 Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 245 250 255 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 260 265 270 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 275 280 285 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 290 295 300 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 305 310 315 320 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 325 330 335 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 465 470 475 480 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 530 535 540 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 545 550 555 560 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 <210> 79 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Fc of the polypeptide of formula [III] of the so-called CODV-Fab-TL1-Knobxhole-RF "hz20G6xhz7G3" <400> 79 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 80 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the polypeptide of formula [IV] of the so-called CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr 115 120 125 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Ala Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Ser Leu Ile 165 170 175 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Thr Gln Tyr Pro Phe 210 215 220 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 370 375 380 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 385 390 395 400 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 405 410 415 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 420 425 430 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 435 440 445 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 450 455 460 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 465 470 475 480 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 485 490 495 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 500 505 510 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 515 520 525 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 530 535 540 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 545 550 555 560 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 565 570 575 Pro Gly <210> 81 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of the Fc2 domain of the polypeptide of formula [IV] of the so-called CODV-Fab-TL1 "hz20G6xhz7G3" <400> 81 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 82 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> first polypeptide chain amino acid sequence of the single chain CD123 x CD3 bi-specific diabody in DART format <400> 82 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr 165 170 175 Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp 210 215 220 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 225 230 235 240 Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 83 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> second polypeptide chain amino acid sequence of the single chain CD123 x CD3 bi-specific diabody in DART format <400> 83 Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 165 170 175 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 210 215 220 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala 245 250 255 Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys 260 265 270 Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 275 280 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-II tag <400> 84 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His Tag <400> 85 His His His His His His 1 5

Claims (15)

  1. 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질로서, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
    [화학식 IV]
    VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2
    로 표시되는 구조를 가지며, 하나의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
    [화학식 III]
    VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
    으로 표시되는 구조를 갖고, 여기서,
    a) 화학식 IV의 상기 폴리펩티드는
    (i)
    · 서열 번호 54의 서열의 VD1,
    · 서열 번호 56의 서열의 L1,
    · 서열 번호 10의 서열의 VD2,
    · 서열 번호 56의 서열의 L2,
    · 서열 번호 18의 서열의 CL,
    · 0개의 아미노산으로 이루어진 L5, 및
    · 서열 번호 70의 서열로 이루어진 Fc2를 포함하는 서열 번호 71의 아미노산 서열
    · (여기서, X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
    · X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는
    · X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 R이며, X7은 F임),
    또는
    (iii) 서열 번호 71의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서,
    · 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 71에서 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 a)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며;
    b) 화학식 III의 상기 폴리펩티드는
    (i)
    · 서열 번호 9의 서열의 VD3,
    · 0개의 아미노산으로 이루어진 L3,
    · 서열 번호 52의 서열의 VD4,
    · 0개의 아미노산으로 이루어진 L4,
    · 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및
    · 서열 번호 68의 서열로 이루어진 Fc를 포함하는 서열 번호 67의 아미노산 서열(여기서, X1은 Y 또는 C이며, X2는 S 또는 C이며, X3은 T, S 또는 W이며, X4는 A 또는 L이며, X5는 V 또는 Y이며, X6은 H 또는 R이며, X7은 Y 또는 F임),
    또는
    (iii) 서열 번호 67의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서,
    · 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 67의 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 b)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며,
    화학식 IV의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 III의 폴리펩티드는 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하며, 여기서,
    X1은 Y이며, X2는 S이며, X3은 T이며, X4는 L이며, X5는 Y이거나, 또는
    X1은 C이며, X2는 S이며, X3은 S이며, X4는 A이며, X5는 V이며,
    X6은 H이며, X7 은 Y이거나, 또는
    X6은 R이며, X7은 F인 항체-유사 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 81의 서열 또는 서열 번호 81의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
    화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 60의 서열 또는 서열 번호 60의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하거나, 또는
    b) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 73의 서열 또는 서열 번호 73의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
    화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 서열 또는 서열 번호 75의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하거나, 또는
    c) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 서열 또는 서열 번호 77의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
    화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 75의 서열 또는 서열 번호 75의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하거나, 또는
    d) 화학식 IV의 폴리펩티드가 서열 번호 77의 서열 또는 서열 번호 77의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인(Fc2)을 포함하며,
    화학식 III의 폴리펩티드가 서열 번호 79의 서열 또는 서열 번호 79의 서열과 85% 이상 동일한 서열의 Fc 도메인을 포함하는 항체-유사 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는
    서열 번호 80의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 80의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 80의 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어지며;
    화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 59의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 59의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 59의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어지거나; 또는
    b) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 72의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 72의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 72의 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어지며;
    화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 74의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 74의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 74의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어지거나; 또는
    c) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 76의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 76의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 76에서 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어지며;
    화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 74의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 74의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 74의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어지거나; 또는
    d) 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 76의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 76의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 76에서 아미노산 위치 481, 486, 498, 500, 539, 567, 568은 비변경됨)로 이루어지며;
    화학식 III의 하나의 폴리펩티드는 서열 번호 78의 아미노산 서열, 또는
    서열 번호 78의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서, 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR, 및 서열 번호 78의 아미노산 위치 473, 492, 531, 559, 560, 478, 490은 비변경됨)로 이루어진 항체-유사 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열 번호 80의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
    서열 번호 59의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드,
    ii) 서열 번호 72의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드,
    iii) 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 또는
    vi) 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 IV의 하나의 폴리펩티드; 및
    서열 번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드를 포함하는 항체-유사 결합 단백질.
  6. 2개의 항원-결합 부위를 형성하는 다음 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는, 인간 CD3ε 및 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항체-유사 결합 단백질:
    제1 폴리펩티드는 하기 화학식 I:
    [화학식 I]
    VD1-L1-VD2-L2-CL
    로 표시되는 구조를 갖고, 제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
    [화학식 III]
    VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc
    으로 표시되는 구조를 가지며; 제3 폴리펩티드 Fc3은 면역글로불린의 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인임
    (여기서,
    c) 화학식 I의 상기 폴리펩티드는
    (iii) 서열 번호 55의 아미노산 서열(이는
    · 서열 번호 54의 서열의 VD1,
    · 서열 번호 56의 서열의 L1,
    · 서열 번호 10의 서열의 VD2,
    · 서열 번호 56의 서열의 L2,
    · 서열 번호 18의 서열의 CL을 포함함),
    또는
    (iv) 서열 번호 55의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서,
    · 서열 번호 54의 서열의 VD1의 서열 번호 48, 'WAS' 및 서열 번호 49의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 10의 서열의 VD2의 서열 번호 11, 'KVS' 및 서열 번호 8의 서열의 3개의 CDR은 비변경됨)로 이루어지며;
    d) 화학식 III의 상기 폴리펩티드는
    (iii) 서열 번호 67의 아미노산 서열(이는
    · 서열 번호 9의 서열의 VD3,
    · 0개의 아미노산으로 이루어진 L3,
    · 서열 번호 52의 서열의 VD4,
    · 0개의 아미노산으로 이루어진 L4,
    · 서열 번호 19의 서열의 CH1, 및
    · 서열 번호 68의 서열의 Fc를 포함하며, 여기서, X1은 Y이며, X2는 C이며, X3은 W이며, X4는 L이며, X5는 Y이며, X6은 H이며, X7은 Y이거나, 또는 X6은 R이며, X7은 F임),
    또는
    (iv) 서열 번호 67의 서열과 85% 이상 동일한 서열(여기서,
    · 서열 번호 52의 서열의 VD4의 서열 번호 50, 서열 번호 53 및 서열 번호 51의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 서열 번호 9의 서열의 VD3의 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7의 서열의 3개의 CDR은 비변경되며,
    · 아미노산 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 상기 b)(i)에서 정의된 바와 같음)로 이루어지며,
    - 화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 III의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
    - 화학식 III의 폴리펩티드는 이의 Fc 도메인을 통하여 제3 폴리펩티드에 의해 이종이량체화되고,
    - 상기 제3 폴리펩티드 Fc3은 서열 번호 69의 서열 또는 서열 번호 69의 서열과 85% 이상 동일한 서열로 이루어지며, 여기서, 서열 번호 69의 아미노산 위치 129, 146, 148, 187, 215, 216은 비변경됨).
  7. 제6항에 있어서,
    - 서열 번호 55의 서열로 이루어진 화학식 I의 하나의 폴리펩티드,
    - 서열 번호 65의 서열로 이루어진 화학식 III의 하나의 폴리펩티드, 및
    - 서열 번호 69의 서열로 이루어진 Fc3을 포함하는 항체-유사 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체-유사 결합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  9. 의약으로 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체-유사 결합 단백질 또는 제8항에 따른 제약 조성물.
  10. 암 치료용으로 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체-유사 결합 단백질 또는 제8항에 따른 제약 조성물.
  11. 암이 혈액암인, 제9항에 따른 용도를 위한 항체-유사 결합 단백질 또는 제약 조성물.
  12. 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체-유사 결합 단백질 또는 제8항에 따른 제약 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체-유사 결합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  14. 제13항에 따른 핵산에 의해 형질전환된 숙주 세포.
  15. 다음을 포함하는 키트:
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 정의된 바와 같은 하나 이상의 항체-유사 결합 단백질,
    b) 선택적으로 패키징 물질, 및
    c) 선택적으로, 상기 항체-유사 결합 단백질이 암 치료에 효과적이거나 암 치료를 위한 사용을 위한 것임을 나타내는, 상기 패키징 물질 내에 포함된 라벨 또는 패키징 삽지.
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