CN112512581A - 针对cldn18.2和cd3的抗体构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体构建体，该抗体构建体包含结合紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)的结构域和结合CD3的另一个结构域。此外，本发明提供了编码该抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、以及用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供了用于产生本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医学用途、以及包含所述抗体构建体的试剂盒。

Description

针对CLDN18.2和CD3的抗体构建体
本发明涉及抗体构建体，该抗体构建体包含结合紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)的结构域和结合CD3的另一个结构域。此外，本发明提供了编码该抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、以及用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供了用于产生本发明的抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医学用途、以及包含所述抗体构建体的试剂盒。
背景技术
紧密连接蛋白(Claudin)是上皮紧密连接的关键结构和功能组分，其作用是调节细胞-细胞通透性、维持离子稳态、并且支持细胞粘附和极性。紧密连接蛋白是22-27kDa的四分子交联体(tetraspan)跨膜蛋白，其在细胞膜内或跨细胞膜进行多聚化以形成保护屏障。已经报道的24种紧密连接蛋白由于它们的组织定位特异性和由于它们与其他蛋白质的相互作用而不同。
紧密连接蛋白18(CLDN18)最初被鉴定为转录因子T/EBP/NKX2.1的靶基因。符合其与其他紧密连接蛋白家族成员的同源性，CLDN18被证实定位于小鼠和人的细胞紧密连接处。已显示CLDN18编码由可变剪接产生的两种同种型：在正常肺中特异性表达的CLDN18.1、和在胃粘膜的分化细胞中表达的CLDN18.2。
CLDN18.2是具有两个细胞外环的261个氨基酸的蛋白质，并且与CLDN18.1具有92％的序列同一性。与第二个细胞外环不同，CLDN18.2的第一个细胞外环与CLDN18.1具有八个氨基酸差异。CLDN18.2与其他家族成员的同源性更为有限，与CLDN1、CLDN6和CLDN7具有29％-34％的总体同一性。
CLDN18.2在几种肿瘤类型(包括胃癌、胰腺癌、食管癌、粘液性卵巢癌和非小细胞肺癌)中表达。CLDN18.2在胃癌中的表达包括浸润性前沿和转移部位，但是据报道CLDN18的绝对水平在这些环境中降低了。CLDN18.2在多种肿瘤类型中的表达(其中正常组织表达主要限于胃中的分化细胞)已经导致将CLDN18.2视为胃癌和其他适应症的治疗靶标。
胃癌和胃食管癌仍然是医疗需求未得到满足的适应症，全球每年报道至少140万新病例和110万例死亡(Lordick和Janjigian,Nat Rev Cancer[癌症自然评论]2016)。典型的一线治疗包括手术和组合化学疗法(包括铂和氟嘧啶化合物)。虽然这种方案可以潜在地提高生活质量并将中值存活期延长8-10个月，但是5年存活率仍然很低。
靶向疗法提供了替代性治疗策略。抗Her2单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)被批准用于与化学疗法组合的Her2阳性胃癌和胃食管癌的一线治疗(Bang等人,TheLancet[柳叶刀]2010)。抗VEGFR2抗体雷莫芦单抗(ramucirumab)被批准用于治疗在化学疗法之后已经进展的胃癌和胃食管癌(Fuchs等人,The Lancet[柳叶刀]2014)。虽然与单独化学疗法相比，这些靶向药剂进一步增加了存活期，但是它们的功效受到靶标表达的异质性和受到抗性机制的限制。
最近，免疫检查点疗法已经在选择环境中表现出活性：派姆单抗(pembrolizumab)在美国被批准用于治疗微卫星不稳定性高(MSI-H)肿瘤，包括胃癌(Le等人,Science[科学]2017)，并且用于治疗在两线或更多线的化学疗法之后已进展的不可切除的晚期或复发性胃癌(Fuchs等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]2017)。纳武单抗(nivolumab)在日本被批准用于治疗在化学疗法之后已进展的不可切除的晚期或复发性胃癌(Kang等人,TheLancet[柳叶刀],2017)。在这些研究中，在未选择人群中仅1％-2％的患者、和MSI-H(微卫星不稳定性高)人群(占总体胃和胃食管病例的9％)的60％表现出完全缓解。因此，仍然需要具有为更大的患者群体提供持久反应的潜力的新疗法。
相比胃癌或胃食管癌，已证明胰腺癌对可用疗法的反应甚至更低。全球每年报道了有来自胰腺癌的至少338,000例病例和331,000例死亡，其中中值存活期为6个月(Ilic和Ilic,World J Gastroenterol[世界胃肠病学杂志]2016)。仅有20％-30％的患者是手术切除的候选人。直到最近当组合化学疗法方案FOLFIRINOX(5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、伊立替康)、以及吉西他滨与白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)组合显示，与单独的吉西他滨治疗相比，总体存活期增加约2-5个月(Uccello等人,Curr Oncol[现代肿瘤学]2018)时，吉西他滨(gemcitabine)一直被考虑为一线疗法。其他化学疗法组合典型地被用于二线疗法。已经在晚期胰腺癌中评估了几种靶向疗法和免疫治疗剂，但成效有限。胰腺肿瘤的特征在于结缔组织形成和免疫抑制性免疫浸润，这导致缺乏反应。需要具有克服这种免疫抑制环境和延长存活期的潜力的新疗法。
包含与T细胞上的CD3结合的一个结构域和与在靶细胞上表达的蛋白质结合的一个结构域的双特异性抗体构建体直接将T细胞连接到靶细胞，以诱导T细胞重定向裂解。这种作用机制不同于化学疗法、靶向疗法和其他免疫疗法，因为它可以与任何CD3阳性T细胞一起工作，而不依赖共刺激激活信号(Klinger等人,Immunol Reviews[免疫学评论]2016)。CLDN18.2在胃癌、胃食管癌和胰腺癌的细胞表面上的表达提供了用CLDN18.2 x CD3抗体构建体靶向这些肿瘤类型的基础。此外，CLDN18.2 x CD3抗体构建体具有靶向表达CLDN18.2的另外的肿瘤类型(包括粘液性卵巢癌、结直肠癌和非小细胞肺癌)的潜力。
具体实施方式
因此，在一个方面，本发明提供了一种抗体构建体，该抗体构建体包含与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域和与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域。
还设想：
(1)本发明的抗体构建体的第一结构域与CLDN18.2的第一细胞外环(环1)结合；
(2)本发明的抗体构建体的第一结构域与如下抗体或抗体构建体一样结合相同的CLDN18.2表位，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区；
(3)本发明的抗体构建体与如下抗体或抗体构建体竞争结合，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区；
(4)本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:22中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:24中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:23中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
(5)本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:14中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体和/或在靶细胞表面上的具有氨基酸序列SEQID NO 15的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有选自下组的氨基酸序列中的一个或多个CLDN18.2突变体，该组由SEQ ID NO:11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些氨基酸序列组成，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:18中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
(6)本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56处的Glu(E)对于第一结构域的结合是必需的，并且在人CLDN18.2的位置42处的Ala(A)和/或位置45处的Asn(N)对于第一结构域的结合不是必需的；和/或
(7)本发明的抗体构建体的第一结构域结合CLDN18.2的表位，该表位包含如SEQID NO:266中所描述的氨基酸序列，但不包含如SEQ ID NO:265中所描述的氨基酸序列，并且任选地还不包含如SEQ ID NO:267中所描述的氨基酸序列。
有利地，靶向被本发明的抗体构建体识别的CLDN18.2的表位(还参见实例2)提供以下益处：
(1)CLDN18.2 x CD3抗体构建体的选择性优于CLDN18.1(参见实例6)，以及
(2)对CLDN18.2 x CD3抗体构建体的出乎意料的高细胞毒性效力(参见实例7.4)。
术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能是基于抗体，例如全长免疫球蛋白分子的结构和/或功能的分子。因此，抗体构建体免疫特异性地结合其靶标或抗原，和/或其包含抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或包含由其衍生的结构域。根据本发明的抗体构建体包含允许免疫特异性靶标结合的抗体最小结构要求。这种最小要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选地全部六个CDR的存在来定义。因此，抗体构建体的特征可能在于在一个或两个结合结构域中存在三个或六个CDR，并且技术人员知道那些CDR在结合结构域内位于哪里(以什么顺序)。
根据本发明的“抗体”的定义包括全长抗体，还包括通过生物技术或蛋白质工程方法或过程产生的骆驼抗体和其他免疫球蛋白。这些全长抗体可以是例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化(deimmunized)抗体、人源化抗体和人抗体，以及来自其他物种(如小鼠、仓鼠、兔、大鼠、山羊或非人灵长类动物)的抗体。
本发明的“抗体构建体”可以具有天然存在的全长免疫球蛋白结构。例如，它们可以包含(至少)两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链。然而，鉴于根据本发明的抗体构建体包含结合CLDN18.2的一个结构域和结合CD3的另一个结构域，它们不是天然存在的，并且它们在其功能方面与天然存在的产物明显不同。因此，本发明的抗体构建体是包含至少两个具有不同特异性的不同结合结构域的人工“杂合”分子。
本发明的“抗体构建体”还可以包含全长抗体的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、轻链(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重链、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”(由重链和轻链组成的“半抗体”)。根据本发明的抗体构建体还可以包含经修饰的抗体片段，也称为抗体变体或抗体衍生物。实例包括但不限于scFv、二-scFv或联(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab’s)、串联二-scFv、串联三-scFv、微型抗体(由如下结构例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3)、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2)、多抗体(如三抗体或四抗体)、以及单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体)(仅包含一个可变区，其可以是VHH、VH或VL，其独立于其他可变区或结构域而特异性地结合抗原或靶标)。根据本发明的抗体构建体的进一步可能形式是交叉体(cross bodies)、超长体(maxi bodies)、杂Fc构建体、单Fc构建体和scFc构建体。那些形式的实例将在本文下面进行描述。
此外，术语“抗体构建体”的定义包括通过不同的结合结构域特异性地结合两个、三个或更多个抗原结构的二价和多价(polyvalent/multivalent)构建体以及双特异性和多特异性(polyspecific/multispecific)构建体。抗体构建体可以具有比特异性更多的结合价，例如在其中两个结合结构域针对第一靶标(Cldn18.2)并且一个结合结构域针对第二靶标(CD3)或反之亦然的情况下，在这种情况下，构建体是三价的和双特异性的。通常，术语“双特异性”包括抗体构建体结合(至少)两种不同抗原(如Cldn18.2和CD3)的含义。
此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由两条、三条、四条或更多条多肽链组成的分子，这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚物)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚物)。上述鉴定的抗体及其片段、变体、衍生物和由其衍生的抗体构建体的实例尤其描述于Harlow和Lane,Antibodies:Alaboratory manual[抗体：实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1988)；Kontermann和Dübel,Antibody Engineering[抗体工程],Springer[斯普林格出版社],第2版2010；以及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用于免疫疗法的重组抗体],Cambridge University Press[剑桥大学出版社]2009。
术语“结合结构域”或“与……结合的结构域”与本发明相关地表征抗体构建体的结构域，其免疫特异性地与在靶标或抗原(此处：在第一结构域的情况下为CLDN18.2，以及在第二结构域的情况下为CD3)上的表位结合/相互作用/识别该表位。第一结构域(结合CLDN18.2)的结构和功能，以及还优选地第二结构域(结合CD3)的结构和/或功能是基于抗体(例如全长免疫球蛋白分子)的结构和/或功能。因此，“结合结构域”或“与……结合的结构域”可以包含允许免疫特异性靶标结合的抗体最小结构要求。第一结构域的这种最小结构要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选地全部六个CDR的存在来定义。设想第二结构域还包含允许免疫特异性靶标结合的这种抗体最小结构要求。更优选地，第二结构域还包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选地全部六个CDR。“与……结合的结构域”(或“结合结构域”)典型地可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，它不必须包含两者，但可以包含VH或VL中的仅一者。例如，Fd片段通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。
“与……结合的结构域”(或“结合结构域”)的形式的实例包括但不限于全长抗体、全长抗体的片段(如VH、VHH、VL)、(s)dAb、Fv、轻链(VL-CL)、Fd(VH-CH1)、重链、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”(“半抗体”))、抗体变体或衍生物(如scFv、二-scFv或联(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab’s)、串联二-scFv、串联三-scFv、“微型抗体”(选自形式如(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2、((scFv)2-CH3+CH3))、((scFv)2-CH3)或(scFv-CH3-scFv)2)、多抗体(如三抗体或四抗体)、以及单结构域抗体(如纳米抗体或单可变结构域抗体)(仅包含一个可变区，其可以是VHH、VH或VL)。“与……结合的结构域”(或“结合结构域”)的形式的进一步实例包括(1)包含VL、VH、CL和CH1的抗体片段或变体(如Fab)；(2)包含两个连接的Fab片段的抗体片段或变体(如F(ab')2)；(3)包含VH和CH1的抗体片段或变体(如Fd)；(4)包含VL和CL的抗体片段或变体(如轻链)；(5)包含VL和VH的抗体片段或变体(如Fv)；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；(6)包含重链和/或轻链的至少三个分离的CDR的抗体变体；以及(7)单链Fv(scFv)。根据本发明的抗体构建体或结合结构域的实施例的实例例如描述于以下中：WO00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO2015/048272。
对于本发明的抗体构建体，设想
a)该抗体构建体是单链多肽或单链抗体构建体，
b)该第一结构域处于scFv的形式，
c)该第二结构域处于scFv的形式，
d)该第一结构域和该第二结构域经由接头、优选肽接头、更优选甘氨酸/丝氨酸接头连接，和/或
e)该抗体构建体包含提供延长的血清半衰期的结构域，如基于Fc的结构域。
本发明的抗体构建体优选地是“体外产生的抗体构建体”和/或“重组抗体构建体”。在本发明的上下文中，术语“体外产生的”是指根据上述定义的抗体构建体，其中结合结构域或可变区的全部或部分(例如，至少一个CDR)在非免疫细胞选择中(例如，在体外噬菌体展示中、在蛋白质芯片上或在其中可以测试候选氨基酸序列结合抗原的能力的任何其他方法中)产生。因此，这个术语优选地排除仅由动物中免疫细胞中基因组重排产生的序列。设想抗体构建体的第一和/或第二结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可通过其获得的，而不是通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列移植到支架中产生或可通过其获得的。“重组抗体构建体”是使用(尤其)重组DNA技术或基因工程产生或生产的抗体构建体。
设想本发明的抗体构建体是单克隆的。如本文使用的，命名为“单克隆”(mAb)的抗体或抗体构建体获自基本上同质的抗体/抗体构建体的群体，即除了可以以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，在群体中包含的各个抗体/抗体构建体是相同的(具体地，关于它们的氨基酸序列)。与典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体/抗体构建体针对抗原内的单一表位具有高度特异性。除了它们的特异性之外，单克隆抗体还在它们通过杂交瘤培养物合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面是有优势的。修饰语“单克隆”指示获得自基本上均质的抗体群体的抗体/抗体构建体的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。
对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，有待使用的单克隆抗体可以通过Koehler等人,Nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的另外技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today[今日免疫学]4(1983),72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症治疗],Alan R.Liss公司(1985),77-96)。
然后可以使用标准方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORETM)分析筛选杂交瘤，以鉴定一种或多种产生与指定抗原免疫特异性结合的抗体的杂交瘤。任何形式的相关抗原均可以用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段以及其抗原肽。如在BIAcoreTM系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与靶抗原的表位结合的噬菌体抗体/抗体构建体的效率(Schier,Human AntibodiesHybridomas[人抗体杂交瘤]7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183(1995),7-13)。
另一种制备抗体构建体或结合结构域的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示例如描述于以下中：Ladner等人,美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science[科学]228:1315-1317；Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)以及Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581-597(1991)。
除了使用展示文库之外，还可以使用相关抗原来免疫非人动物，例如啮齿动物(诸如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生并选择衍生自具有所希望的特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如XenomouseTM；Green等人(1994)Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO 96/33735。
单克隆抗体也可以获得自非人动物，并且然后使用本领域中已知的重组DNA技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。经修饰的抗体构建体或结合结构域的实例包括非人抗体/抗体构建体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体构建体或结合结构域(参见，例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]254,889-896(1992)以及Lowman等人,Biochemistry[生物化学]30,10832-10837(1991))以及具有改变的效应子功能的抗体变体或突变体(参见，例如美国专利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010),上述引文；以及Little(2009),上述引文)。
在免疫学中，亲和力成熟是这样的过程：通过该过程，在免疫应答的过程中B细胞产生与抗原的亲和力增加的抗体。由于反复暴露于相同的抗原，宿主会产生依次更大亲和力的抗体。如天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原则。体外亲和力成熟已成功用于优化抗体、抗体片段、抗体变体、抗体构建体或结合结构域。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR在CDR内引入随机突变。此外，遗传多样性可以通过链改组来增加。使用展示方法(如噬菌体展示)进行两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围内的亲和力的抗体、抗体片段、抗体变体、抗体构建体或结合结构域。
本发明的抗体构建体或结合结构域的氨基酸取代变化的优选类型涉及取代亲本抗体结构(例如人源化或人抗体结构)的高变区内的一个或多个残基。一般来讲，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于产生它们的亲本抗体结构将具有改善的生物特性。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，将高变区的几个位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后如本文所披露那样筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定对抗原结合有显著贡献的候选高变区位点(修饰候选物)，还可以进行丙氨酸扫描诱变。可替代地或另外地，分析在抗原与抗体构建体或结合结构域之间的复合物的晶体结构以鉴定在结合结构域与其特异性抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文阐述的技术，此类接触残基和相邻残基是用于取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体、其抗原结合片段、抗体构建体或结合结构域用于进一步的开发。
本发明的抗体构建体和结合结构域具体地包括“嵌合”形式(其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)，以及此类抗体的片段或变体，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体构建体或结合结构域包括“灵长类化”抗体构建体，这些抗体构建体包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列、和人恒定区序列。已经描述了多种用于制备嵌合抗体或抗体构建体的方法。参见，例如Morrison等人,Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.[美国国家科学院院刊]81:6851,1985；Takeda等人,Nature[自然]314:452,1985；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Boss等人,美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人,EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗体、抗体构建体、抗体片段、抗体变体或结合结构域还可以通过使用例如在WO98/52976或WO 00/34317中所披露的方法将人T细胞表位特异性缺失(称为“去免疫”的方法)来进行修饰。简言之，可以针对与MHC II类结合的肽分析抗体、抗体构建体或结合结构域的重链和轻链可变区；这些肽代表潜在的T细胞表位(如例如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。为了检测潜在T细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且此外针对VH和VL序列中存在的基序，可以搜索人MHC II类结合肽的数据库，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHC II类DR同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过取代可变结构域或可变区中的少量氨基酸残基，或者优选地通过单个氨基酸取代来消除。典型地，进行保守取代。通常但不排他地，可以使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如披露于以下中：Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫学]第16卷(5):237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]14:14:4628-4638。V BASE目录(www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php)提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson,LA.等人汇编MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK[英国剑桥MRC蛋白质工程中心])。这些序列可以用作人序列的来源，例如用于框架区和CDR。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所述。
“人源化”抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域是基于主要人序列的免疫球蛋白，这些主要人序列含有一种或多种衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域是基于人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自高变区或CDR的残基被具有期望的特异性、亲和力、能力和/或生物活性的来自非人物种(如啮齿动物(例如小鼠、仓鼠、大鼠或兔))(供体抗体)的高变区或CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，如本文使用的“人源化”抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域也可以包含在受体抗体和供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域也可以包含免疫球蛋白恒定区(如Fc)的至少一部分，典型地人免疫球蛋白的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人Nature[自然],321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596(1992)。
人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域可以通过用人(Fv)可变区的等效序列替代不直接参与抗原结合的(Fv)可变区的序列来产生。用于产生此类分子的示例性方法由以下提供：Morrison(1985)Science[科学]229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques[生物技术]4:214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213。这些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白(Fv)可变区的核酸序列。此类核酸可以获得自如上所述的产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，以及其他来源。然后可以将编码人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体或结合结构域的重组DNA克隆到合适的表达载体中。
人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体和结合结构域还可以使用转基因动物(如表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠)来产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化分子的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人序列的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替代，或者仅一些CDR可以用非人CDR替代。仅需要替代用于将人源化分子与预定抗原结合所需的CDR数量。
可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体、其变体或片段、抗体构建体或结合结构域。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任何一种来制备(例如，Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],80:7308-7312,1983；Kozbor等人,Immunology Today[今日免疫学],4:7279,1983；Olsson等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],92:3-16,1982，以及EP 239 400)。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答已经导致该行业制备嵌合或其他人源化抗体/抗体构建体。然而，据预期，特别是在抗体或抗体构建体的长期或多剂量利用中，会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)应答。因此，期望提供抗体构建体，这些抗体构建体包含针对CLDN18.2的人结合结构域和/或针对CD3的人结合结构域，以便消除HAMA或HACA反应的问题和/或效应。
因此，根据一个实施例，抗体构建体、第一结合结构域和/或第二结合结构域是“人”的。术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”分别包括具有抗体衍生区域的抗体、抗体构建体和结合结构域，这些抗体衍生区域是如基本上对应于本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区或结构域，包括例如由Kabat等人(1991)(上述引文)描述的那些。本发明的人抗体构建体或结合结构域可以包括例如CDR中且特别是CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体构建体或结合结构域可以具有至少1个、2个、3个、4个、5个或更多个被不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换的位置。然而，如本文使用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义还涵盖仅包括非人工和/或遗传改变的人抗体序列(如可以通过使用技术或系统(如Xenomouse)衍生的那些)的完全人抗体、抗体构建体和结合结构域。
包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免了与具有非人(如啮齿动物(例如鼠类、大鼠、仓鼠或兔))可变区和/或恒定区的抗体构建体相关的一些问题。此类啮齿动物衍生的蛋白质的存在可以导致抗体或抗体构建体快速清除或可以导致患者产生针对抗体或抗体构建体的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体构建体，可以通过将人抗体功能引入啮齿动物中以便使啮齿动物产生完全人抗体来产生人源化或完全人抗体构建体。
在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座并将它们引入到小鼠种系中的能力为阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型提供了强有力的方法。此外，使用这种技术将小鼠基因座取代为其人等效物可以提供关于人基因产物在发育过程中的表达和调控、其与其他系统的通信以及其参与疾病诱导和进展的独特见解。
这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的根本机制以及其在B细胞发育中的作用的机会。此外，这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的产生提供理想来源-这是有助于实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或由其衍生的抗体构建体将小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和变应性应答最小化，并且由此增加施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗体构建体可以在治疗需要重复施用化合物的慢性和复发性人疾病(诸如炎症、自体免疫和癌症)中提供显著的优势。
实现这一目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，预期这种小鼠在不存在小鼠抗体的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠机构实现抗体多样化和选择以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，在这些小鼠品系中再生的人抗体组库应产生针对任何感兴趣的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所希望特异性的抗原特异性人mAb。结合第一种XenoMouse小鼠品系的产生证明了这个一般策略(参见Green等人Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21(1994))。用含有人重链基因座和κ轻链基因座的分别245kb和190kb大小的种系构型片段的酵母人工染色体(YAC)将XenoMouse品系工程化，这些种系构型片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人Ig的YAC与小鼠系统相容以重排和表达抗体，并且这些YAC能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多数量的V基因、额外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可以基本上再现作为对感染和免疫的人体液应答的特征的完整组库。Green等人的工作扩展到通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和k轻链基因座的种系构型YAC片段来引入大于约80％的人抗体组库。参见Mendez等人NatureGenetics[自然遗传学]15:146-156(1997)以及美国专利申请序列号08/759,620。
XenoMouse模型的产生进一步论述和描述于以下中：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620；和美国专利号6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。还参见Mendez等人NatureGenetics[自然遗传学]15:146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.[实验医学杂志]188:483-495(1998)、EP 0 463 151B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO00/76310和WO 03/47336。
在一个替代性方法中，包括真药物国际公司(GenPharm International,Inc.)的其他公司利用了“微基因座”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟外源性Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选地γ恒定区)形成为用于插入动物中的构建体。该方法描述于Surani等人的美国专利号5,545,807；以及每一个都属于Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458；Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010；Berns等人的美国专利号5,612,205；5,721,367；和5,789,215；和Choi和Dunn的美国专利号5,643,763；以及GenPharm International公司的美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741中。还参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)，Chen等人(1993)，Tuaillon等人(1993)，Choi等人(1993)，Lonberg等人(1994)，Taylor等人(1994)，以及Tuaillon等人(1995)，Fishwild等人(1996)。
Kirin也展示了从通过微细胞融合引入大段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在开发用于人抗体的潜在产生的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞(例如B和/或T细胞)重构SCID小鼠。然后将小鼠用抗原免疫并且可产生针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。
在一些实施例中，本发明的抗体构建体是“分离的”或“基本上纯的”抗体构建体。当用于描述本文披露的抗体构建体时，“分离的”或“基本上纯的”意指抗体构建体已从其产生环境的组分中鉴定、分离和/或回收。优选地，抗体构建体不与或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分缔合。其产生环境的污染组分，诸如由重组转染细胞产生的污染组分，是可能干扰抗体构建体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质化合物。应当理解，根据情况，分离的或基本上纯的抗体构建体可以构成给定样品中总蛋白质/多肽含量的以重量计从5％至99.9％。通过使用诱导型启动子或高表达启动子，可以以显著更高的浓度生产所期望的抗体构建体。该定义包括在本领域中已知的多种生物体和/或宿主细胞中产生抗体构建体。在某些实施例中，抗体构建体(1)通过使用旋杯式序列分析仪纯化至足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度，或(2)可以通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色纯化至均质。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体构建体。
根据一个实施例，整个抗体构建体和/或结合结构域呈一种或多种多肽的形式或处于蛋白质的形式。除了蛋白质部分以外，此类多肽或蛋白质可以包括非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂如戊二醛)。
肽是通过共价肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的短链。因此，肽被列为生物低聚物和聚合物的宽的化学类别。作为肽或多肽链的一部分的氨基酸被称为“残基”并且可以被连续编号。除环肽以外的所有肽在肽的一个末端具有N末端残基，并且在另一个末端具有C末端残基。寡肽仅由少数氨基酸(通常在两个至二十个之间)组成。多肽是更长的连续的且无分支的肽链。肽根据大小与蛋白质不同，并且作为任意基准可以理解为含有约50个或更少个氨基酸。蛋白质由通常以生物功能方式排列的一种或多种多肽组成。虽然应用于肽与多肽和蛋白质的实验室技术的各方面不同(例如，电泳的特性、色谱等)，但区分肽与多肽和蛋白质的大小边界不是绝对的。因此，在本发明的上下文中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，并且术语“多肽”通常是优选的。
多肽可以进一步形成多聚体如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物，这些多聚体由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，此类多聚体的相应高阶结构被称为同或异二聚体、同或异三聚体等。异多聚体的实例是抗体或免疫球蛋白分子，其天然存在形式由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”还是指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是经化学修饰的，如聚乙二醇化的。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文描述。
术语“(特异性地或免疫特异性地)结合”、“(特异性地或免疫特异性地)识别”、或“与……(特异性或免疫特异性地)反应”根据本发明意指抗体构建体或结合结构域与靶分子(抗原)(此处：分别为CLDN18.2和CD3)上的给定表位相互作用或(免疫)特异性地相互作用。对于特定靶标上的表位而不是替代物质(非靶分子)，这种相互作用或关联以更大的持续时间、以更大的亲和力、或以上述的一些组合更频繁地、更快速地发生。但是，由于不同物种中同源蛋白质之间的序列相似性，免疫特异性地结合其靶标(如人靶标)的抗体构建体或结合结构域可能与来自不同物种(如，来自非人灵长类动物)的同源靶分子交叉反应。因此，术语“特异性/免疫特异性结合”可以包括抗体构建体或结合结构域与多于一个物种中的表位或结构相关表位的结合。
在本发明的上下文中，术语“表位”是指由结合结构域识别/免疫特异性地识别的抗原的部分或区域。“表位”是抗原性的，并且因此术语表位有时也被称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。与表位结合的结合结构域部分被称为互补位(paratope)。认为特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此，作为它们的一级、二级和/或三级结构以及所述结构的潜在二次修饰的结果，结合得以实现。互补位与其抗原决定簇的特异性相互作用可以导致所述位点与抗原的简单结合。在一些情况下，特异性相互作用可以替代地或另外地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等。
基于蛋白质抗原的结构和与互补位的相互作用，蛋白质抗原的表位被分为两大类：构象表位和线性表位。构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续部分构成。这些表位基于抗原的三维表面特征和形状或三级结构(折叠)与互补位发生相互作用。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。相反，线性表位基于其一级结构与互补位发生相互作用。线性表位由来自抗原的连续氨基酸序列形成，并且典型地在独特序列中包括至少3个或至少4个、且更通常地至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸。
以下描述了用于CLDN18.2表位定位的方法：在人CLDN18.2蛋白的细胞外环内的预定义区域(连续氨基酸延伸)与CLDN18.2旁系同源物(如人CLDN6或人CLDN9，但也可以想到其他旁系同源物，只要结合结构域不与所使用的旁系同源物发生交叉反应即可)的相应区域交换/替换。这些人CLDN18.2/旁系同源嵌合体在宿主细胞(如CHO细胞)的表面上表达。可以经由FACS分析测试抗体或抗体构建体的结合。当抗体或抗体构建体与嵌合分子的结合完全消除时，或当观察到显著的结合减少时，可以得出结论，从这种嵌合分子中去除的人CLDN18.2区域与免疫特异性表位-互补位识别相关。与人(野生型)CLDN18.2的结合相比，所述结合降低优选地为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选地为至少60％、70％或80％，并且最优选地为90％、95％或甚至100％，由此，与人CLDN18.2的结合被设定为100％。可替代地，可以通过将一个或多个点突变引入CLDN18.2的序列(特别是细胞外环1或环2的序列)中来改进上述表位定位分析。这些点突变可以例如反映在CLDN18.2与其密切相关的旁系同源物CLDN18.1之间的差异。例如，突变可以选自下组，该组由以下组成：Q29M、N37D、A42S、N45Q、Q47E、E56Q、G65P和L69I。参见实例1和2。
确定靶抗原的特定残基对抗体构建体或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见，例如Morrison KL和Weiss GA.Curr Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2001年6月；5(3):302-7)，其中待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替代。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下，有时可以使用巨大的氨基酸(诸如缬氨酸或亮氨酸)。
在结合结构域与靶抗原的表位之间的相互作用意味着结合结构域对表位/靶抗原(此处：分别为CLDN18.2和CD3)表现出相当可观或显著的亲和力，并且通常对除靶抗原(此处：CLDN18.2/CD3)以外的蛋白质或抗原不表现出显著的亲和力-尽管上面论述过与例如来自其他物种的同源靶标的交叉反应。“显著的亲和力”包括以≤10-6M的亲和力(解离常数，KD)结合。优选地，当结合亲和力为≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、或甚至≤10-11M、或≤10-12M时，结合被认为是特异性的。例如通过比较所述结合结构域对其期望的靶蛋白质或抗原的亲和力与所述结合结构域对非靶蛋白质或抗原的亲和力(此处：分别为除CLDN18.2或CD3以外的蛋白质)，可以容易地测试结合结构域是否与靶标(免疫)特异性地反应或结合。优选地，本发明的抗体构建体不分别与除CLDN18.2或CD3以外的蛋白质或抗原显著结合(即，第一结构域不与除CLDN18.2以外的蛋白质结合，并且第二结构域不与除CD3以外的蛋白质结合)-除非针对另外的靶标的任何一个或多个另外的结合结构域被刻意引入本发明的抗体构建体中，在这种情况下，本发明还提供该结合结构域与其特异性靶标的结合。
设想第一结构域对CLDN18.2(例如人CLDN18.2)的亲和力为≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM或≤20nM。优选地在基于细胞的测定(如Scatchard测定)中测量这些值。参见实例4。确定亲和力的其他方法也是熟知的。进一步设想第二结构域对CD3(例如人CD3)的亲和力为≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM或≤10nM。优选地在表面等离子体共振测定(如Biacore测定)中测量这些值。参见实例3。
术语“不显著结合”意指当所述蛋白质或抗原在细胞表面上表达时，本发明的抗体构建体或结合结构域不与除CLDN18.2或CD3以外的蛋白质或抗原结合。因此，抗体构建体显示出≤30％、优选≤20％、更优选≤10％、特别优选≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％或≤1％的与除CLDN18.2或CD3以外的蛋白质或抗原(当所述蛋白质或抗原在细胞表面上表达时)的反应性，由此，分别与CLDN18.2或CD3的结合被设定为100％。“反应性”可以例如以亲和力值表达(参见上文)。
设想本发明的抗体构建体(并且更具体地，其第一结构域)不结合或不显著结合CLDN18.2旁系同源物、更具体地人CLDN18.2旁系同源物和/或猕猴/食蟹猴CLDN18.2旁系同源物。还设想抗体构建体不结合或不显著结合在靶细胞表面上的(人或猕猴/食蟹猴)CLDN18.2旁系同源物。CLDN18.2旁系同源物包括-但不限于-CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9。根据一个实施例，CLDN18.2的人旁系同源物具有如SEQ IDNO:2-10所描述的序列。参见实例6和图6。因此，设想本发明的抗体构建体的第一结构域不结合或不显著结合(在靶细胞的表面上的)CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的CLDN18.2。“靶细胞”可以是在其表面上表达CLDN18.2的任何原核或真核细胞；优选地，靶细胞是作为人体或动物体的一部分的细胞，如表达特定CLDN18.2的癌症或肿瘤细胞或CLDN18.2阳性赘生物的细胞。应当理解，在本发明的上下文中，术语“在表面上”意指抗体构建体的第一结构域特异性地结合在第一CLDN18.2细胞外环(CLDN18.2 ECL1)内、在第二CLDN18.2细胞外环(CLDN18.2ECL2)内包含的表位、或在两个环的组合内包含的表位。因此，设想本发明的抗体构建体的第一结构域结合CLDN18.2(优选地人CLDN18.2)的细胞外环。细胞外环可以是第一环或第二环。还设想两个环都有助于结合。在这种情况下，有可能一个环(如第一环)代表抗体构建体的主要结合配偶体，而另一个环(如第二环)例如作为稳定化配偶体有助于结合，但对于结合并非绝对必要的。因此，当CLDN18.2被天然表达的细胞或细胞系(如人胃癌细胞系SNU-601、SNU-620、或还有SNU-16、NUGC、NUG-C4、GSU或IM95)和/或被用CLDN18.2转化或(稳定地/瞬时地)转染的细胞或细胞系表达时，根据本发明的第一结构域可以与CLDN18.2结合。在一个实施例中，在基于细胞的结合测定如Scatchard测定中，当CLDN18.2被用作靶分子时，第一结构域与CLDN18.2结合(参见例如实例4)。此外，设想抗体构建体/其第一结构域与靶细胞表面上的人CLDN18.2结合。人CLDN18.2的优选氨基酸序列描述于SEQ ID NO:1中。
设想根据本发明的抗体构建体(并且更具体地，所述抗体构建体的第一结构域)结合CLDN18.2的第一细胞外环(ECL1，环1)。这并不一定排除第二细胞外环也促成互补位-表位相互作用位点，尽管程度较小。术语“CLDN18.2 ECL”(ECL＝细胞外环)是指CLDN18.2的那些部分，其基本上不含CLDN18.2的跨膜和细胞质结构域。应当理解，按照本领域常规使用的用于鉴定该疏水结构域类型的标准来鉴定针对本发明的CLDN18.2多肽所鉴定的跨膜结构域。跨膜结构域的确切边界可以改变，但最有可能的是在本文具体提及的结构域的任一末端改变不超过约5个氨基酸。在SEQ ID NO:2中显示出优选的人CLDN18.2 ECL1，并且在SEQID NO:3中显示出优选的人CLDN18.2 ECL2。
此外，本发明提供了：
·本发明的抗体构建体的第一结构域与如下抗体或抗体构建体一样结合相同的CLDN18.2表位，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区；
·本发明的抗体构建体与如下抗体或抗体构建体竞争结合，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区；
·本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:22中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:24中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:23中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
·本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:14中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体和/或在靶细胞表面上的具有氨基酸序列SEQID NO 15的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有选自下组的氨基酸序列中的一个或多个CLDN18.2突变体，该组由SEQ ID NO:11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些氨基酸序列组成，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:18中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
·本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56处的Glu(E)对于第一结构域的结合是必需的，并且在人CLDN18.2的位置42处的Ala(A)和/或位置45处的Asn(N)对于第一结构域的结合不是必需的；和/或
·本发明的抗体构建体的第一结构域结合CLDN18.2的表位，该表位包含如SEQ IDNO:266中所描述的氨基酸序列，但不包含如SEQ ID NO:265中所描述的氨基酸序列，并且任选地还不包含如SEQ ID NO:267中所描述的氨基酸序列。
在表位定位中还分析了其他抗CLDN18.2结合物(CL-3、CL-4)的CLDN18.2结合特异性(参见实例2)。发现这些CLDN18.2 x CD3抗体构建体具有不同的表位特异性，并且同时显示出，与本发明的抗体构建体相比具有显著较差的细胞毒性潜力。在实例7.4中，证明了尽管对CLDN18.2具有相似的亲和力，本发明的抗体构建体显示在2位数皮摩尔范围内的EC50值，而比较构建体显示在3位数至5位数皮摩尔范围内的EC50值。显示后一范围的细胞毒性活性的抗体构建体可能不够有效用于在指导患者的免疫系统(更具体地T细胞对癌细胞的细胞毒性活性)中的治疗用途。另一方面，根据本发明的抗体构建体以非常有利的表位-活性关系存在，因此支持有效的抗体构建体介导的细胞毒性活性。
抗体、抗体构建体或结合结构域是否与另一种给定抗体、抗体构建体或结合结构域一样结合在靶细胞表面上的相同的CLDN18.2表位，可以通过如本文所述的不同分析(例如，通过用嵌合或突变的CLDN18.2分子进行表位定位)来测量，如本文上面或在实例1和2中所述的。本文描述了确定表位的其他方法，如丙氨酸扫描。
可以在竞争性测定如竞争性ELISA中测量抗体或抗体构建体是否与另一种给定抗体或抗体构建体竞争与靶细胞表面上的抗原(如CLDN18.2)结合。也可以使用抗生物素蛋白偶联的微粒(珠粒)。与抗生物素蛋白涂覆的ELISA板类似，当与生物素化蛋白质反应时，这些珠粒中的每一个都可用作可在其上进行测定的底物。将抗原涂覆在珠粒上，并且然后用第一抗体预涂覆。添加第二抗体并且确定任何另外的结合。读数经由流式细胞术发生。优选地使用基于细胞的竞争测定，使用天然表达CLDN18.2的细胞或用CLDN18.2稳定地或瞬时地转化的细胞。在本发明的上下文中，术语“竞争结合”意指在至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的两种测试抗体之间发生竞争，如通过上文披露的任何一种测定(优选地基于细胞的测定)确定的。当然，相同的分析可以应用于其他靶标，如CD3。
竞争性抗体结合测定包括确定两种抗体/抗体构建体与细胞表面结合抗原的竞争性结合的测定。旨在检测两种抗体/抗体构建体A和B与细胞表面上的相同抗原的结合的常用方法可以包括以下步骤：
a)通过将细胞与抗体/抗体构建体A一起预孵育、随后次最大程度地添加标记的抗体/抗体构建体B来阻断细胞表面抗原，并检测与在不存在A的情况下的结合相比B的结合；
b)在次最大量的标记的抗体/抗体构建体B的存在下滴定(即添加不同量的)抗体/抗体构建体A，并检测对B的结合的影响；或
c)共滴定A和B，其中两种抗体/抗体构建体以最大浓度一起孵育，并检测总结合是否等于或超过单独的A或B的结合，即不受添加的顺序或抗体/抗体构建体的相对量影响的方法。
当两种抗体/抗体构建体A和B竞争细胞表面结合的抗原时，抗体将经常在不依赖于添加抗体的顺序的阻断测定中彼此竞争。换句话说，如果在任一方向上进行测定，则竞争得以检测。然而，情况并非总是如此，并且在某些情况下，抗体添加的顺序或测定的方向可能对产生的信号具有影响。这可能是由于潜在竞争性抗体/抗体构建体的亲和力或亲合力的差异。如果添加的顺序对产生的信号具有显著影响，则推断如果在至少一个顺序中检测到竞争，则两种抗体/抗体构建体确实有竞争。
根据一个实施例，本发明的抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56处的Glu(E)对于第一结构域的结合是必需的，并且在人CLDN18.2的位置42处的Ala(A)和/或位置45处的Asn(N)对于第一结构域的结合不是必需的。在这个背景下，术语“对于结合是必需的”意指特定氨基酸(在位置56处的Glu)是抗体构建体与CLDN18.2的结合发生所必需的。如果在位置56处的氨基酸Glu被交换成例如Gln(→E56Q)，抗体构建体的结合被消除或显著降低(参见图4，命名为“P6”的列)。术语“对于结合不是必需的”意指特定氨基酸(在位置42处的Ala和/或在位置45处的Asn)不是抗体构建体与CLDN18.2的结合发生所必需的。如果在位置42处的氨基酸Ala和/或在位置45处的Asn被交换成例如在位置42处的Ser(→A42S)和/或在位置45处的Gln(→N45Q)，在抗体构建体的结合不被降低或不被显著降低(参见图4，命名为“P3”和“P4”的列)。
根据一个实施例，本发明的抗体构建体的第一结构域包含含有选自下组的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有选自下组的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，该组由以下组成：
a)如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；以及
b)如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，以及如SEQ ID NO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ IDNO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3。
在本发明的上下文中，术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域表现出其序列可变性并且参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力的那些部分(即“一个或多个可变区”)。通常，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的配对一起形成单个抗原结合位点。
可变性在整个抗体的可变区中并非均匀分布；它集中在重链可变区和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域称为“超变区”或“互补决定区”(CDR)。可变区的更保守的(即非超变)部分被称为“框架”(FR)区，并且为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的抗体重链和轻链的可变区各自包含主要采用β-折叠构型的四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)。与CDR一起，它们在可变重链或轻链内形成以下序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。每条链中的超变区通过框架区紧密靠近在一起，并通常与来自另一条链的超变区一起有助于抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,上述引文)。
术语“CDR”及其复数“CDR”是指其中三个构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特征并且三个构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特征的互补决定区。CDR包含大多数负责抗体(或抗体构建体或结合结构域)与抗原的特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定因素。
CDR边界和长度的准确定义受制于不同的分类和编号系统。因此，CDR可以通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“超变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以在相对于相邻框架区的长度和边界区域中不同。参见例如Kabat(基于跨物种序列变异性的方法)、Chothia(基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)、和/或MacCallum(Kabat等人,上述引文；Chothia等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917；以及MacCallum等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。表征抗原结合位点的还另一标准是由牛津大学分子公司(OxfbrdMolecular)的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如，Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]在：Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，海德尔堡)。就两种残基鉴定技术定义重叠区而非相同区而言，可以将它们组合以定义杂合CDR。然而，根据所谓的Kabat系统进行编号是优选的。
典型地，CDR形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此，在抗体之间的相应环可以具有非常相似的三维结构，尽管在环的大部分种具有高的氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志],1987,196:901；Chothia等人.,Nature[自然],1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外，所采用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内关键位置以及保守框架内(即，环外)的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在对特定的规范类别进行分配。
术语“规范结构”还可以包括关于抗体的线性序列的考虑因素，例如，如通过Kabat(Kabat等人,上述引文)编目的。Kabat编号方案(系统)是以一致方式对抗体可变区的氨基酸残基进行编号的广泛采用的标准，并且是本发明应用的优选方案，也如本文其他地方所提及。另外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号未完全反映的那些差异可以通过Chothia等人的编号系统来描述，并且/或者通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。因此，可以将给定抗体序列置于规范的类别中，该类别尤其允许鉴定适当的类别序列(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)。文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号和如由Chothia等人,上述引文所述的结构考虑因素以及其参与解释抗体结构的规范方面。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型在本领域中是熟知的。有关抗体结构的综述，参见Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Harlow等人编辑,1988。
轻链的CDR3以及特别是重链的CDR3可以构成轻链可变区和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体或抗体构建体/结合结构域中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。其中仅仅改变CDR3的体外选择方案可以用于改变抗体或抗体构建体/结合结构域的结合特性或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，CDR3典型地是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，CDR-H3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。
在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(L)链通过一个共价二硫键与重(H)链连接，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。通常将最靠近VH的重链恒定(CH)结构域命名为CH1。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体激活(补体依赖性细胞毒性，CDC)。抗体的Fc区是经典抗体的“尾部”区域，其与被称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由从抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3)衍生的两个相同的蛋白质片段构成。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)。Fc区还含有通过一个或多个二硫键和非共价相互作用保持在一起的所谓“铰链”区的部分。天然存在的IgG的Fc区具有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化是Fc受体介导的活性所必需的。
ADCC是细胞介导的免疫防御机制，由此免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，该靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合。ADCC需要免疫效应细胞，其通常已知是典型地与IgG抗体相互作用的天然杀伤(NK)细胞。然而，ADCC也可以由巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞介导。ADCC涉及通过表达Fc部分的抗体激活表达Fc受体的效应细胞。例如，NK细胞表面上最常见的Fc受体被称为CD16或FcγRIII。一旦Fc受体结合IgG的Fc区，NK细胞就释放导致靶细胞死亡的细胞毒性因子。同样，嗜酸性粒细胞的Fc受体(FceRI)将识别IgE。相比之下，在CDC中，由于经典途径补体激活，补体系统的分子“C1q”与抗体Fc区结合，并且这种结合触发补体级联，其导致在靶细胞表面形成膜攻击复合物(MAC)。在治疗性抗体或抗体构建体中，ADCC和CDC两者都可以通过Fc同种型工程、Fc基因突变或Fc糖基化谱修饰来调节。
组装和体细胞突变后的抗体基因的序列高度改变，并且估计这些改变的基因编码1010种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes[免疫球蛋白基因],第2版,Jonio等人编辑,Academic Press[学术出版社],San Diego,CA[加利福尼亚州圣地亚哥],1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白组库。术语“组库”是指完全或部分衍生自至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一种核苷酸序列。一种或多种序列可以通过重链的V、D和J区段以及轻链的V和J区段的体内重排来产生。可替代地，一种或多种序列可以响应于发生重排(例如体外刺激)而从细胞产生。可替代地，一种或多种序列的一部分或全部可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见例如美国专利5,565,332。组库可以仅包括一种序列或可以包括多种序列，包括遗传多样性集合中的序列。
设想抗体构建体在第一结构域内具有半胱氨酸夹具(cysteine clamp)。可以引入这种半胱氨酸夹具以改善构建体的稳定性。参见例如US 2016/0193295。
在本发明的一个实施例中，本发明的抗体构建体的第一结构域包含具有如SEQ IDNO:127或SEQ ID NO:139中所描述的氨基酸序列的VH区。在另外的实施例中，本发明的抗体构建体的第一结构域包含具有如SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:140中所描述的氨基酸序列的VL区。在另一个实施例中，本发明的抗体构建体的第一结构域包含VH区和VL区，该VH区和VL区具有如SEQ ID NO:127+128(VH+VL)或SEQ ID NO:139+140(VH+VL)中所描述的氨基酸序列。在又另外的实施例中，本发明的抗体构建体的第一结构域包含具有如SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:141中所描述的氨基酸序列的多肽。
如本文上面所述，本发明提供了如下实施例，其中抗体构建体处于选择下组的形式，该组由以下组成(scFv)2、scFv-单结构域mAb、任何上述形式的双抗体和寡聚物。术语“处于……形式”并不排除可以被进一步修饰的构建体(例如通过附接或融合到其他部分)，如本文所述。根据本发明的抗体构建体的一个实施例，第一结构域和/或第二结构域处于scFv的形式。在scFv中，VH区和VL区以VH-VL或VL-VH(从N末端至C末端)的顺序排列。设想第一和/或第二结合结构域的VH和VL区经由接头、优选肽接头连接。根据第一和/或第二结构域的一个实施例，VH区位于接头的N末端，并且VL区位于接头的C末端。换句话说，在第一和/或第二结构域的一个实施例中，scFv从N末端至C末端包含：VH-接头-VL。进一步设想，抗体构建体的第一结构域和第二结构域经由接头、优选肽接头连接。抗体构建体可以例如包含以第一结构域-接头-第二结构域的顺序(从N末端至C末端)的结构域。逆序(第二结构域-接头-第一结构域)也是可能的。
接头优选是肽接头，更优选是短肽接头。根据本发明，“肽接头”包含将抗体构建体的一个结构域的氨基酸序列与另一个(可变和/或结合)结构域(例如可变结构域或结合结构域)连接的氨基酸序列。这种肽接头的基本技术特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美国专利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区(诸如半衰期延长结构域)连接到本发明的抗体构建体。在SEQID NO:155-168中显示了有用的肽接头的实例。在本发明的上下文中，“短”接头具有在2个与50个之间的氨基酸，优选地在3个与35个之间、在4个与30个之间、在5个与25个之间、在6个与20个之间或在6个与17个之间的氨基酸。在一个结合结构域的两个可变区之间的接头可以具有与在两个结合结构域之间的接头不同的长度(例如可以更长)。例如，在一个结合结构域的两个可变区之间的接头可以具有在7个与15个之间(优选地在9个与13个之间)的氨基酸的长度，并且在两个结合结构域之间的接头可以具有在3个与10个(优选地在4个与8个之间)的氨基酸的长度。进一步设想，肽接头是甘氨酸/丝氨酸接头，如SEQ ID NO:156和158-168中所描述的那些。在甘氨酸/丝氨酸接头中的大多数氨基酸选自甘氨酸和丝氨酸。
在使用接头的情况下，该接头优选地具有足以确保第一结构域和第二结构域中的每一者均可以彼此独立地保留其差异结合特异性的长度和序列。对于连接抗体构建体中的至少两个结合结构域(或形成一个结合结构域的两个可变区)的肽接头，设想包含仅少数几个氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或更少)的那些肽接头。因此，12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4个、3个、2个或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的上下文中的“单个氨基酸”接头是Gly。肽接头的另一个实施例的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即Gly4Ser(SEQ ID NO:156))或其聚合物(即(Gly4Ser)x，其中x是1或更大(例如2或3)的整数)。在SEQ ID NO:155-163中描述了有用的接头。所述肽接头的特征在本领域中是已知的并且描述于例如Dall’Acqua等人(Biochem.[生物化学](1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫学](1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB[美国实验生物学联合会会志](1995)9(1),73-80)中。不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold SpringHarbor,New York[纽约冷泉港],2001)。
根据本发明的一个实施例，本发明的抗体构建体是“单链抗体构建体”。还设想第一结合结构域或第二结合结构域或两个结合结构域可以处于“单链Fv”(scFv)的形式。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但使用重组方法可以将这两个结构域通过人工接头接合，如上文所述，该人工接头使它们能够制成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见，例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且按照与全长抗体或IgG相同的方式评价片段的功能。因此，单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，通常用短接头肽连接。为了灵活性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性通常富含丝氨酸或还有苏氨酸，并且可以连接VH的N末端和VL的C末端，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链分子在本领域中是已知的并描述于以下中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.[免疫学杂志](1997),158,3965-3970；Mack,PNAS[美国国家科学院院刊],(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗],(1997),45,193-197；
Figure BDA0002918294490000311
Blood[血液],(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.[免疫学],(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],(1999),293,41-56。描述的用于产生单链抗体构建体的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010),上述引文，以及Little(2009),上述引文)可以适用于产生特异性识别一种或多种所选择的靶标的单链抗体构建体。
二价(bivalent)(也称为双价(divalent))或双特异性单链可变片段(具有形式(scFv)2的联-scFv或二-scFv)可以通过连接两个scFv分子(例如利用如上文所述的接头)来工程化。连接可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单一多肽链从而产生串联scFv来进行(参见，例如Kufer P.等人,(2004)Trends in Biotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子，这些接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。在这种情况下，结合结构域(与靶抗原CLDN18.2或CD3结合)的VH和VL不经由肽接头直接连接。因此，CD3结合结构域的VH可以例如经由肽接头与CLDN18.2结合结构域的VL融合，并且CLDN18.2结合结构域的VH经由这种肽接头与CD3结合结构域的VL融合。这种类型被称为双抗体(参见，例如Hollinger,Philipp等人,(1993年7月)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。
命名为“单结构域抗体”的抗体构建体包含一个(单体)抗体可变区，该抗体可变区能够独立于其他可变区选择性地结合特定抗原。第一单结构域抗体是从骆驼中发现的重链抗体工程化而来，并且这些被称为VHH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR)，可以从这些重链抗体中获得称为VNAR片段的单结构域抗体。替代性方法是将来自常见免疫球蛋白的二聚体可变区分裂成单体，因此获得VH或VL作为单结构域Ab。尽管对单结构域抗体的大多数研究目前都是基于重链可变区，但衍生自轻链的纳米抗体也显示出与靶表位特异性结合。单结构域抗体的实例是所谓的sdAb、纳米抗体或单一可变结构域抗体。因此，(单结构域mAb)2是由单独地选自下组的(至少)两个单结构域单克隆抗体构建体构成的单克隆抗体构建体，该组由以下组成：VH、VL、VHH和VNAR。接头优选地呈肽接头的形式。类似地，“scFv-单结构域mAb”是由至少一个如上所述的单结构域抗体和一个如上所述的scFv分子构成的单克隆抗体构建体。同样，接头优选地呈肽接头的形式。
还设想本发明的抗体构建体除了具有与靶分子CLDN18.2和CD3结合的功能外，还具有另外的功能。在这种形式中，通过CLDN18.2结合靶向靶细胞，通过CD3结合介导细胞毒性T细胞活性，并且提供另外的功能(如增强或延长血清半衰期的手段或结构域、通过募集效应细胞介导ADCC的完全功能或经修饰的Fc恒定结构域、标记(荧光等)、治疗剂如毒素或放射性核素等)，抗体构建体可以是三功能或多功能抗体构建体。
延长本发明的抗体构建体的血清半衰期的手段或结构域的实例包括与抗体构建体融合或以其他方式附接的肽、蛋白质或蛋白质的结构域。肽、蛋白质或蛋白质的结构域的组包括在人体中以优选药代动力学特征与其他蛋白质结合的肽，如血清白蛋白(参见WO2009/127691)。此类半衰期延长的肽的替代性概念包括与新生儿Fc受体(FcRn，参见WO2007/098420)结合的肽，其也可用于本发明的抗体构建体中。附接较大蛋白质结构域或完整蛋白质的概念包括人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其结构域的融合，以及免疫球蛋白恒定区(Fc结构域)及其变体的融合。Fc结构域的此类变体被称为基于Fc的结构域，并且可以例如被优化/修饰以便允许期望的二聚体或多聚体配对，以消除Fc受体结合(例如避免ADCC或CDC)或出于其他原因。在本领域中已知延长物质或分子在人体中的半衰期的另外的概念是那些分子(如本发明的抗体构建体)的聚乙二醇化。
在一个实施例中，例如出于延长构建体的血清半衰期的目的，根据本发明的抗体构建体与融合配偶体(如蛋白质、多肽或肽)连接(例如经由肽键)。这些融合配偶体可以选自人血清白蛋白(“HSA”或“HALB”)以及其序列变体、与HSA结合的肽、与FcRn结合的肽(“FcRn BP”)、或包含(抗体衍生的)Fc区的构建体。在SEQ ID NO:170-232中描述了这些融合配偶体的示例性序列。通常，融合配偶体可以直接(例如经由肽键)或通过肽接头如(GGGGS)n(其中“n”是2或更大的整数，例如2或3或4)与根据本发明的抗体构建体的N末端或C末端连接。在SEQ ID NO:155-163中描述了合适的肽接头。
因此，设想根据本发明的抗体构建体包含：
(a)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；以及
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·任选地His-标签，例如选自SEQ ID NO:169、269、270或271；
(b)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·任选地肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:170和176-205组成的组的氨基酸序列；以及
·任选地His-标签，例如选自SEQ ID NO:169、269、270或271；
(c)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX1PANG(SEQ ID NO:171)，其中X1是Y或H；以及
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·多肽，该多肽具有如SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:175中所描述的氨基酸序列；以及
·任选地His-标签，例如选自SEQ ID NO:169、269、270或271；
(d)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:106、SEQID NO:115、和SEQ ID NO:118组成的组的氨基酸序列；
·肽接头，该肽接头具有SEQ ID NO:162所描述的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:140组成的组的氨基酸序列，随后是在C末端处的丝氨酸残基；
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:206中所描述的氨基酸序列；以及
从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:139组成的组的氨基酸序列；
·肽接头，该肽接头具有SEQ ID NO:162所描述的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:107、SEQID NO:116、和SEQ ID NO:119组成的组的氨基酸序列；随后是在C末端处的丝氨酸残基；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:207中所描述的氨基酸序列；
(e)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:106、SEQID NO:115、和SEQ ID NO:118组成的组的氨基酸序列；
·肽接头，该肽接头具有SEQ ID NO:162所描述的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:140组成的组的氨基酸序列；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:208中所描述的氨基酸序列；以及
从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:139组成的组的氨基酸序列；
·肽接头，该肽接头具有SEQ ID NO:162所描述的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:107、SEQID NO:116、和SEQ ID NO:119组成的组的氨基酸序列，随后是在C末端处的丝氨酸残基；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:209中所描述的氨基酸序列；
(f)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:210中所描述的氨基酸序列；以及
多肽，该多肽具有SEQ ID NO:211中所描述的氨基酸序列；
(g)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:212中所描述的氨基酸序列；以及
从N末端开始按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:213中所描述的氨基酸序列；
(h)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:214中所描述的氨基酸序列；以及
从N末端开始按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:215中所描述的氨基酸序列；或
(i)从N末端至C末端按以下顺序构成的多肽：
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155-163组成的组的氨基酸序列；
·多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；以及
·多肽，该多肽具有SEQ ID NO:216中所描述的氨基酸序列。
根据另一个实施例，本发明的抗体构建体包含(除了第一和第二结构域以外)第三结构域，该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合。设想所述第三结构域按N末端至C末端的顺序包含：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。在SEQ ID NO:225-232中描述了可以用于所述第三结构域的氨基酸序列。所述多肽单体中的每一种可以具有选自由SEQ ID NO:217-224组成的组、或与那些序列至少90％相同的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的抗体构建体的第一和第二结构域经由肽接头与第三结构域融合，所述肽接头例如选自由SEQ ID NO:155、156、157、158、159、160、161、162或163组成的组。
根据本发明，“铰链”是IgG铰链区。该区域可以使用Kabat编号通过类比来鉴定，参见例如Kabat位置223-243。与上述一致，对于“铰链”的最低要求是与根据Kabat编号的D231至P243的IgG1序列延伸物对应的氨基酸残基。术语“CH2”和“CH3”是指免疫球蛋白重链恒定区2和3。这些区域也可以使用Kabat编号通过类比来鉴定，参见例如Kabat位置244-360(对于CH2)和Kabat位置361-478(对于CH3)。应当理解，在免疫球蛋白之间在其IgG1 Fc区、IgG2Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区和IgE Fc区方面存在一些变化(参见例如，Padlan,Molecular Immunology[分子免疫学],31(3),169-217(1993))。术语Fc区是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区、以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区。Fc区还可以包括这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc区可以包括J链。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3、以及在前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管免疫球蛋白的Fc区的边界可以改变，但是包含功能铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可以定义为例如分别对于IgG4包含残基D231(铰链结构域的残基)至P476(CH3结构域的C末端的残基)、或D231至L476，其中编号是根据Kabat。
因此，本发明的抗体构建体按N末端至C末端的顺序可以包含：
(a)第一结构域；
(b)肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:156、162和163组成的组的氨基酸序列；
(c)第二结构域；
(d)肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155、156、158、159、160、162和163的氨基酸序列；
(e)第三结构域(包含铰链、CH2和CH3结构域)的第一多肽单体；
(f)肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:165、166、167和168组成的组的氨基酸序列；以及
(g)第三结构域(包含铰链、CH2和CH3结构域)的第二多肽单体。
还设想本发明的抗体构建体按N末端至C末端的顺序包含：
·第一结构域，该第一结构域具有选自由SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:141组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ IDNO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:156、162和163组成的组的氨基酸序列；
·第二结构域，该第二结构域具有选自由SEQ ID NO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255组成的组的氨基酸序列；其中包含在那些序列中并且具有SEQ ID NO:163的肽接头可以被SEQ ID NO:155-162和164-168中的任何一者替代；
·肽接头，该肽接头具有选自由SEQ ID NO:155、156、158、159、160、162和163的氨基酸序列；以及
·第三结构域，该第三结构域具有选自由SEQ ID NO:225-232组成的组的氨基酸序列。
因此，在一个实施例中，本发明的抗体构建体包含如下多肽或由其组成，该多肽具有选自在SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144中所描述的那些氨基酸序列的组的氨基酸序列。
抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或与N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体构建体的若干种类型的共价修饰引入到分子中。用双功能剂衍生化可用于将本发明的抗体构建体交联到水不溶性支持基质或表面以用于多种方法中。谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。可替代地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。其他修饰包括对脯氨酸和赖氨酸的羟基化、对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化、对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],San Francisco[旧金山],1983,第79-86页)、对N末端胺的乙酰化和对任何C末端羧基基团的酰胺化。
包括在本发明范围内的抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知的，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，下文论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面论述特定的表达系统。多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中的任一者的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗体构建体添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来作出改变(用于O-连接的糖基化位点)。为了方便起见，抗体构建体的氨基酸序列可以通过DNA水平的变化来改变，特别是通过在预选碱基处突变编码多肽的DNA，以使得产生将翻译成所希望氨基酸的密码子。
增加抗体构建体上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷化学或酶促偶联至蛋白质。这些程序的有利之处在于它们不需要在具有用于N-和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联方式，一种或多种糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，诸如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论],第259-306页中。
存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分的去除可以化学或酶促方式完成。化学去糖基化要求将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]259:52以及Edge等人,1981,Anal.Biochem.[分析生物化学]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现，如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.[酶学方法]138:350所述的。可以通过使用化合物衣霉素预防潜在糖基化位点处的糖基化，如由Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:3105所述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文还考虑抗体构建体的其他修饰。例如，抗体构建体的另一种类型的共价修饰包括以在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式将抗体构建体与各种非蛋白质聚合物(包括多元醇)连接。此外，如本领域中已知的，可以在抗体构建体内的不同位置进行氨基酸取代，例如以有利于添加聚合物如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与抗体构建体偶联以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以用于进行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。一般来讲，标记属于多种类别，这取决于将检测它们的测定-以下实例包括但不限于：
a)同位素标记，这些同位素标记可以是放射性同位素或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性标记(例如，磁性颗粒)
c)氧化还原活性部分
d)光学染料(包括但不限于，生色团、磷光体和荧光团)，如荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、化学发光基团和荧光团，这些荧光团可以是“小分子”荧光剂或蛋白质荧光剂
e)酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)
f)生物素化基团
g)由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)
“荧光标记”意指可以经由其固有的荧光特性检测到的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、荧光黄、瀑布蓝J、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy5、Cy5.5、LC红705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红蛋白(PE)(俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))、FITC、罗丹明和德克萨斯红(伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(宾夕法尼亚州匹兹堡市的阿默舍姆生命科学公司(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA))。合适的光学染料(包括荧光团)描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探针手册]中。
合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于，绿色荧光蛋白，包括GFP的Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea种类(Chalfie等人,1994,Science[科学]263:802-805)、EGFP(Clontech实验室公司，
Figure BDA0002918294490000421
登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，量子生物技术公司(Quantum Biotechnologies,Inc.)，加拿大魁北克省蒙特利尔市迈松纳夫大道西1801号第8层(邮编：H3H 1J9)(1801de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9)；Stauber,1998,Biotechniques[生物技术]24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.[现代生物学]6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech实验室公司)、萤光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.[免疫学杂志]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2603-2607)和Renilla(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019、美国专利号5,292,658；5,418,155；5,683,888；5,741,668；5,777,079；5,804,387；5,874,304；5,876,995；5,925,558)。
亮氨酸拉链结构域是促进在其中发现它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中被鉴定(Landschulz等人,1988,Science[科学]240:1759)，并且自此以后已经在多种不同的蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链包括天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适合用于产生可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请WO 94/10308中，并且从肺表面活性蛋白D(SPD)衍生的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人,1994,FEBS Letters[欧洲生物化学会联盟通讯]344:191中。允许与其融合的异源蛋白质的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.[免疫学研讨文辑]6:267-78中。
本发明的抗体构建体还可以包含另外的结构域，这些结构域例如有助于分离分子或涉及分子的适应性药代动力学曲线。有助于分离抗体构建体的结构域可以选自肽基序或辅助性地引入的部分，这些部分可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签以及其变体(例如StrepII-标签)和His标签的肽基序。本文披露的所有抗体构建体(以鉴定的CDR为特征)可以包含His-标签结构域，该His-标签结构域通常被称为分子的氨基酸序列中的连续His残基的重复序列，例如五个His残基的重复序列(SEQ ID NO:269)或六个His残基的重复序列(六组氨酸，SEQ ID NO:169)。His-标签可以位于例如抗体构建体的N末端或C末端。在一个实施例中，六组氨酸标签(HHHHHH)经由肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C末端。
还设想本发明的抗体构建体包含如下多肽或由其组成，该多肽具有选自由SEQ IDNO:130和142中所描述的那些氨基酸序列组成的组的氨基酸序列并且在其N末端或其C末端与蛋白质纯化标签连接(优选地经由肽键(酰胺键))。蛋白质纯化标签在多肽的C末端的连接是优选的。设想蛋白质纯化标签是短肽。例如，短肽的长度可以是2个-30个氨基酸、4个-25个氨基酸、5个-20个氨基酸或6个-19个氨基酸。蛋白质纯化标签的实例包括但不限于AU1表位(例如，如SEQ ID NO:272中所描述)、AU5表位(例如，如SEQ ID NO:273中所描述)、T7-标签(例如，如SEQ ID NO:274中所描述)、V5-标签(例如，如SEQ ID NO:275中所描述)、B-标签(例如，如SEQ ID NO:276中所描述)、E2表位(例如，如SEQ ID NO:277中所描述)、FLAG表位/FLAG标签(例如，如SEQ ID NO:278中所描述)、Glu-Glu标签(例如，如SEQ ID NO:279或280中所描述)、HA标签、组氨酸亲和力标签(例如，如SEQ ID NO:281中所描述)、HSV表位(例如，如SEQ ID NO:282中所描述)、KT3表位(例如，如SEQ ID NO:283中所描述)、Myc表位(例如，如SEQ ID NO:284中所描述)、聚精氨酸标签(5个-6个Arg残基)、聚天冬氨酸标签(5个-16个Asp残基)、聚组氨酸标签(2个-10个His残基，通常6个His残基，参见例如，SEQ ID NO:169和269-271)、聚苯丙氨酸标签(通常11个Phe残基)、S1标签(例如，如SEQ ID NO:285中所描述)、S-标签(例如，如SEQ ID NO:286中所描述)、Strep-标签(例如，如SEQ ID NO:287或288中所描述)、通用标签(例如，如SEQ ID NO:289中所描述)、VSV-G(例如，如SEQ ID NO:290中所描述)、蛋白质C(例如，如SEQ ID NO:291中所描述)和蛋白质A。组氨酸标签是优选的，尤其是6x His标签(SEQ ID NO:169)。因此，进一步设想本发明的抗体构建体由如下多肽组成：该多肽具有选自由SEQ ID NO:130和142中所描述的那些氨基酸序列组成的组的氨基酸序列并且在其C末端经由肽键与6x His标签连接。本发明的抗体构建体的实施例具有如SEQ ID NO:131或SEQ ID NO:143中所描述的氨基酸序列。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一类淋巴细胞(其本身是一类白细胞)。有若干个T细胞亚组，每个亚组具有不同的功能。T细胞可以通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其他淋巴细胞(诸如B细胞和NK细胞)区分开。TCR负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原，并且由两种不同的蛋白质链构成。在95％的T细胞中，TCR由阿尔法(α)和贝塔(β)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、专门化衔接子分子和激活或释放的转录因子介导的生物化学事件而被激活。
本发明的抗体构建体包含与T细胞表面上的CD3结合的结构域。“CD3”(分化簇3)是由四条链构成的T细胞共受体。在哺乳动物中，CD3蛋白质复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(伊普西龙)链。这四条链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(截塔)链缔合以形成“T细胞受体复合物”并在T淋巴细胞中产生激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(伊普西龙)链是免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白，并且每一种都含有单一细胞外免疫球蛋白结构域。CD3分子的细胞内尾含有对于TCR的信号传导能力所必需的单一保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。CD3ε分子是一种多肽，该多肽在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码。
通过与T细胞上的CD3和与靶细胞上的靶蛋白结合的抗体构建体募集T细胞来将靶细胞重定向裂解通常涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够进行连续靶细胞溶解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见例如WO 2007/042261。
由CLDN18.2 x CD3抗体构建体介导的细胞毒性可以以各种方式测量。参见实例7。“半数最大有效浓度”(EC50)通常用作生物活性分子(如本发明的抗体构建体)的效力的量度。它可以按摩尔单位表示。在测量细胞毒性的当前情况下，EC50值是指在基线和最大值之间的中途诱导细胞毒性反应(靶细胞裂解)的抗体构建体的浓度。细胞毒性测定中的效应细胞可以例如是刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。与未刺激的PBMC相比，当将刺激的/富集的CD8+ T细胞用作效应细胞时，通常预期EC50值较低。如果靶细胞是猕猴起源或表达的或用猕猴CLDN18.2转染的，则效应细胞也应是猕猴起源的，如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应在细胞表面上表达CLDN18.2，如人或猕猴CLDN18.2。优选地，靶细胞应在细胞表面上至少表达CLDN18.2的一个或多个细胞外环，如CLDN18.2环1和/或环2。靶细胞可以是用CLDN18.2(例如人或猕猴CLDN18.2)稳定或瞬时转染的细胞系(如CHO)。可替代地，靶细胞可以是CLDN18.2阳性天然表达细胞系，如人胃癌细胞系SNU-601或SNU-620，或者也可以是SNU-16、NUGC、NUG-C4、GSU或IM95。通常，与具有较低靶标表达率的靶细胞相比，当使用在细胞表面上表达较高的CLDN18.2水平的靶细胞时，预期EC50值较低。
在细胞毒性测定中效应细胞与靶细胞(E:T)比率通常为约10:1，但也可以改变。可以在51-铬释放测定中(例如，孵育时间为约18小时)或在基于FACS的细胞毒性测定中(例如，孵育时间为约48小时)测量CLDN18.2 x CD3抗体构建体的细胞毒性活性。还设想了孵育时间(细胞毒性反应)的修饰。其他测量细胞毒性的方法是熟知的，并且包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定(包括生物发光测定)、磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆生成测定和ECIS技术。
根据一个实施例，在基于细胞的细胞毒性测定中测量由本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体介导的细胞毒性活性。它也可以在51-铬释放测定中进行测量。设想本发明的抗体构建体的EC50值为≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。
可以在不同的测定中和在不同条件下测量上述给定的EC50值。例如，当将人PBMC用作效应细胞并且将CLDN18.2转染细胞如CHO细胞用作靶细胞时，设想CLDN18.2 x CD3抗体构建体的EC50值为≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。当将人PBMC用作效应细胞时，并且当靶细胞是CLDN18.2阳性细胞系如SNU-601或SNU-620时，可以设想CLDN18.2 x CD3抗体构建体的EC50值为≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM。
根据一个实施例，本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体不诱导/介导不在其表面上表达CLDN18.2的细胞(CLDN18.2阴性细胞)如CHO细胞的裂解或基本上不诱导/介导裂解。术语“不诱导溶解”、“基本上不诱导溶解”、“不介导溶解”或“基本不介导溶解”意指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、特别优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的CLDN18.2阴性细胞的溶解，由此表达CLDN18.2的靶细胞(如用CLDN18.2转化或转染的细胞或天然表达细胞系如人胃癌细胞系SNU-601或SNU-620)的裂解被设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的抗体构建体。细胞裂解测量是常规技术。此外，本说明书教导了如何测量细胞溶解的具体说明。
单个的CLDN18.2 x CD3抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的细胞毒性活性的差异被称为“效力差距”。该效力差距可以例如计算为分子的单体与二聚体形式的EC50值之间的比率。在确定该差距的一种方法中，如下文所述(实例7.1和7.2)用纯化的抗体构建体单体和二聚体进行了18小时51-铬释放测定或48h基于FACS的细胞毒性测定。效应细胞是刺激的富集的人CD8+ T细胞或未刺激的人PBMC。靶细胞是hu CLDN18.2转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)的比率为10:1。本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体的效力差距优选为≤5、更优选≤4、甚至更优选≤3、甚至更优选≤2，并且最优选≤1。
本发明的抗体构建体的第一结构域和/或第二结构域优选地对于灵长类哺乳动物目的成员(如猕猴)具有跨物种特异性。跨物种特异性CD3结合结构域例如描述于WO 2008/119567中。根据一个实施例，除了与人CD3结合之外，第二结构域还将与灵长类动物的CD3结合，该灵长类动物包括(但不限于)新大陆灵长类动物(如普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus))、旧大陆灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿、猩猩和非人类人亚科(homininae)。设想与在T细胞表面上的人CD3结合的第二结构域还至少与猕猴CD3结合。优选的猕猴是食蟹猴(Macaca fascicularis)。还设想了猕猴(Macaca mulatta)(恒河猴)。本发明的一种抗体构建体包含与在靶细胞表面上的人CLDN18.2结合的第一结构域和与在T细胞表面上的人CD3和至少猕猴CD3结合的第二结构域。
在一个实施例中，根据本发明的抗体构建体对于结合猕猴CD3与人CD3的亲和力差距[KD ma CD3:KD hu CD3](如通过例如BiaCore或Scatchard分析确定的)为在0.01与100之间、优选地在0.1与10之间、更优选地在0.2与5之间、更优选地在0.3与4之间、甚至更优选地在0.5与3之间或在0.5与2.5之间，并且最优选地在0.5与1之间。参见实例3。
本发明的抗体构建体的第二结构域与CD3结合。更优选地，它与T细胞表面上的CD3结合。此外，设想第二结构域与人CD3结合，优选地与T细胞表面上的人CD3结合。还设想第二结构域与CD3ε结合。更优选地，它与人CD3ε结合，例如与T细胞表面上的人CD3ε结合。人CD3ε的细胞外结构域的优选氨基酸序列描述于SEQ ID NO:256中。
在本发明的一个实施例中，抗体构建体的第二结构域与人CD3ε(或T细胞表面上的人CD3ε)和与普通狨(Callithrix jacchus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε结合。还设想第二结构域与CD3ε的细胞外表位结合，优选地与人CD3ε的细胞外表位结合。还设想第二结构域与人和猕猴属(Macaca)CD3ε链的细胞外表位结合。CD3ε的一个优选表位包含在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内(参见SEQ ID NO:257)。甚至更具体地，表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨是属于狨猴科(Callitrichidae)的新大陆灵长类动物，而松鼠猴是属于悬猴科(Cebidae)的新大陆灵长类动物。具有此类特征的结合物在WO 2008/119567中有详细描述。
针对(人)CD3或特异性针对CD3ε的抗体或双特异性抗体构建体在本领域中是已知的，并且它们的CDR、VH和VL序列可以作为本发明的抗体构建体的第二结合结构域的基础。例如，Kung等人在1979年报道了OKT3(Ortho Kung T3)的开发，这是识别人T细胞上的CD3(特别是CD3的ε链)的第一个mAb。OKT3(muromonab)是可用于人类治疗的第一种鼠类起源的单克隆抗体。较新的抗CD3单克隆抗体包括奥昔珠单抗(otelixizumab)(TRX4)、替利珠单抗(teplizumab)(MGA031)、弗罗鲁单抗(foralumab)和维西珠单抗(visilizumab)，它们全部都靶向CD3的ε链。针对(癌症)靶标和CD3的双特异性抗体构建体也正在进行开发和(预)临床测试，并且它们的CD3结合结构域(CDR、VH、VL)可以用作本发明的抗体构建体的第二结合结构域的基础。实例包括但不限于博纳吐单抗(Blinatumomab)、索利托单抗(Solitomab)(MT110、AMG 110)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、Duvortuxizumab、厄妥索单抗(Ertumaxomab)、Mosunetuzumab、FBTA05(Bi20、TPBs05)、CEA-TCB(RG7802、RO6958688)、AFM11、和MGD006(S80880)。例如在US 7,994,289 B2、US 7,728,114 B2、US 7,381,803 B1、US 6,706,265 B1中披露了CD3结合结构域的其他实例。
对于本发明的抗体构建体，设想与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域包含VL区，该VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO:37中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:38中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:39中所描述的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO:82中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:83中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:84中所描述的CDR-L3；以及
(c)如SEQ ID NO:100中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:101中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:102中所描述的CDR-L3。
对于本发明的抗体构建体，还设想与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域包含VH区，该VH区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)如SEQ ID NO:31中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:32中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:33中所描述的CDR-H3；
(b)如SEQ ID NO:40中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:41中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:42中所描述的CDR-H3；
(c)如SEQ ID NO:49中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:50中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:51中所描述的CDR-H3；
(d)如SEQ ID NO:58中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:59中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:60中所描述的CDR-H3；
(e)如SEQ ID NO:67中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:68中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:69中所描述的CDR-H3；
(f)如SEQ ID NO:76中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:77中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:78中所描述的CDR-H3；
(g)如SEQ ID NO:85中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:86中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:87中所描述的CDR-H3；
(h)如SEQ ID NO:94中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:95中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:96中所描述的CDR-H3；
(i)如SEQ ID NO:103中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:104中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:105中所描述的CDR-H3；以及
(j)如SEQ ID NO:112中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:113中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:114中所描述的CDR-H3。
此外，对于本发明的抗体构建体，设想与CD3结合的第二结构域包含含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，以及含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区：
(a)如SEQ ID NO:28中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:29中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:30中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:31中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:32中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:33中所描述的CDR-H3；
(b)如SEQ ID NO:37中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:38中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:39中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:40中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:41中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:42中所描述的CDR-H3；
(c)如SEQ ID NO:46中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:47中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:48中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:49中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:50中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:51中所描述的CDR-H3；
(d)如SEQ ID NO:55中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:56中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:57中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:58中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:59中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:60中所描述的CDR-H3；
(e)如SEQ ID NO:64中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:65中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:66中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:67中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:68中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:69中所描述的CDR-H3；
(f)如SEQ ID NO:73中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:74中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:75中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:76中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:77中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:78中所描述的CDR-H3；
(g)如SEQ ID NO:82中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:83中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:84中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:85中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:86中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:87中所描述的CDR-H3；
(h)如SEQ ID NO:91中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:92中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:93中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:94中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:95中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:96中所描述的CDR-H3；
(i)如SEQ ID NO:100中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:101中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:102中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:103中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:104中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:105中所描述的CDR-H3；以及
(j)如SEQ ID NO:109中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:110中所描述的CDR-L2、如SEQ ID NO:111中所描述的CDR-L3、如SEQ ID NO:112中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:113中所描述的CDR-H2、和如SEQ ID NO:114中所描述的CDR-H3。
对于本发明的抗体构建体，设想与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域包含选自下组的VL区，该组由以下组成：如SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:233、SEQ ID NO:234和SEQ ID NO:235中的任一者中所描述的VL区。
还设想与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域包含选自下组的VH区，该组由以下组成：如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:70、SEQID NO:79、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ IDNO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244和SEQ ID NO:245中的任一者中所描述的VH区。
更优选地，本发明的抗体构建体的特征在于与T细胞表面上的CD3结合的包含选自下组的VL区和VH区的第二结构域，该组由以下组成：
(a)如SEQ ID NO:35或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:34或236中所描述的VH区；
(b)如SEQ ID NO:44或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:43或237中所描述的VH区；
(c)如SEQ ID NO:53或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:52或238中所描述的VH区；
(d)如SEQ ID NO:62或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:61或239中所描述的VH区；
(e)如SEQ ID NO:71或234中所描述的VL区和如SEQ ID NO:70或240中所描述的VH区；
(f)如SEQ ID NO:80或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:79或241中所描述的VH区；
(g)如SEQ ID NO:89或234中所描述的VL区和如SEQ ID NO:88或242中所描述的VH区；
(h)如SEQ ID NO:98或233中所描述的VL区和如SEQ ID NO:97或243中所描述的VH区；
(i)如SEQ ID NO:107或235中所描述的VL区和如SEQ ID NO:106或244中所描述的VH区；
(j)如SEQ ID NO:116或235中所描述的VL区和如SEQ ID NO:115或245中所描述的VH区；以及
(k)如SEQ ID NO:119中所描述的VL区和如SEQ ID NO:118中所描述的VH区。
上面描述的本发明的抗体构建体的优选实施例的特征在于与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域，该第二结构域包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ IDNO:36、45、54、63、72、81、90、99、108、117、120、246、247、248、249、250、251、252、253、254和255。
还考虑了本文所述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物特性。通过肽合成或通过将合适的核苷酸变化引入编码抗体构建体的核酸分子中来制备抗体构建体的氨基酸序列变体。所有下面描述的氨基酸序列修饰应产生保留了未经修饰的亲本分子的期望的生物活性(如结合CLDN18.2和CD3，诱导针对CLDN18.2阳性靶细胞的细胞毒性)的抗体构建体。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有其本领域公认的定义的氨基酸，诸如选自下组的氨基酸，该组由以下组成：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；以及缬氨酸(Val或V)，但可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。基本上存在由不同的侧链决定的四种不同类别的氨基酸：
(1)非极性和中性(不带电荷)：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val
(2)极性和中性(不带电荷)：Asn、Cys(仅略微极性)、Gln、Ser、Thr、Trp(仅略微极性)、Tyr
(3)酸性和极性(带负电荷)：Asp和Glu
(4)碱性和极性(带正电荷)：Arg、His、Lys
疏水性氨基酸可以根据它们是否具有脂肪族或芳香族侧链来分开。Phe和Trp(非常大的疏水性)、Tyr和His(较小疏水性)被分类为芳香族氨基酸。严格地说，脂肪族意味着侧链仅含有氢和碳原子。通过这种严格的定义，具有脂肪族侧链的氨基酸是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(也是正亮氨酸)、脯氨酸和缬氨酸。丙氨酸的侧链非常短，意味着它不是特别具有疏水性，并且脯氨酸具有不寻常的几何形状，使其在蛋白质中起特殊作用。通常方便地将甲硫氨酸考虑为与异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸在同一类别，尽管它还含有硫原子。统一的主题是这些氨基酸主要含有非反应性和柔性侧链。通常将氨基酸丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸分组在一起，原因是它们的大小全部都很小。Gly和Pro可能影响链取向。
氨基酸修饰包括，例如，抗体构建体的氨基酸序列内残基的缺失、残基的插入和/或残基的取代。进行缺失、插入和/或取代的任何组合以获得最终的抗体构建体，条件是最终的构建体拥有所期望的特征，例如，未经修饰的亲本分子的生物活性(如结合CLDN18.2和CD3，诱导针对CLDN18.2阳性靶细胞的细胞毒性)。氨基酸变化还可以改变抗体构建体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
例如，可以在每个CDR中插入、缺失和/或取代1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸(当然，取决于它们各自的长度)，而可以在每个FR中插入、缺失和/或取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或25个氨基酸。氨基酸序列插入还包括N末端和/或C末端氨基酸添加，其长度范围为例如从1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基至含有超过10个例如一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。本发明的抗体构建体的插入变体包括将增加或延长抗体构建体的血清半衰期的多肽融合至抗体构建体的N末端或C末端。还可以想到，这样的插入发生在抗体构建体内，例如在第一结构域与第二结构域之间。
对于氨基酸修饰(特别是对于氨基酸取代)最感兴趣的位点包括高变区，特别是重链和/或轻链的各个CDR，但是也考虑重链和/或轻链中的FR变化。取代可以是如本文所述的保守取代。优选地，可以在CDR中取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸，而可以在框架区(FR)中取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或25个氨基酸，这分别取决于CDR或FR的长度。例如，如果CDR序列包含6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个或3个被取代。类似地，如果CDR序列包含15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或6个被取代。
用于鉴定作为优选诱变位置的抗体构建体内的某些残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，并且描述于例如Cunningham B.C.和Wells J.A.(Science[科学].1989年6月2日；244(4908):1081-5)中。此处，鉴定抗体构建体内的残基或残基组(例如带电残基，如Arg、His、Lys、Asp和Glu)，并其将其用中性或非极性氨基酸(最优选地丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响各个氨基酸与靶蛋白表位的相互作用。丙氨酸扫描是用于确定特定残基对给定蛋白质的稳定性或功能的贡献的技术。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构偏好。在需要突变残基大小保守的情况下，有时可以使用巨大的氨基酸(如缬氨酸或亮氨酸)。该技术还可以用于确定特定残基的侧链是否在生物活性中起重要作用。丙氨酸扫描通常通过定点诱变或随机通过创建PCR文库来完成。此外，已经开发了基于理论丙氨酸取代来估计热力学参数的计算方法。数据可以通过IR、NMR波谱法、数学方法、生物测定等进行测试。
然后，通过在取代位点处或为取代位点引入另外的或其他变体来精确对取代展示功能敏感性的那些氨基酸位置(如例如通过丙氨酸扫描确定的)。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点或区域是预定的，但突变本身的性质无需预定。例如，为了分析或优化给定位点处突变的性能，可以在靶密码子或区处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且筛选所表达的抗体构建体变体以获得所希望活性的最优组合。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是熟知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。例如使用抗原(例如CLDN18.2或CD3)结合活性和/或细胞毒性活性的测定来进行突变体筛选。
一般来讲，如果在重链和/或轻链的一个或多个或所有CDR中氨基酸被取代，则设想当时获得的“经取代的”序列与“原始”或“亲本”CDR序列是至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％并且特别优选90％或95％相同的/同源的。这意味着原始序列与经取代的序列之间的同一性/同源性程度取决于CDR的长度。例如，总共具有5个氨基酸并且包含一个氨基酸取代的CDR与“原始”或“亲本”CDR序列是80％相同的，而总共具有10个氨基酸并且包含一个氨基酸取代的CDR与“原始”或“亲本”CDR序列是90％相同的。因此，本发明的抗体构建体的经取代的CDR可以与其原始序列具有不同的同一性程度，例如，CDRL1可以具有80％的同源性，而CDRL3可以具有90％的同源性。相同的考虑适用于框架区和整个VH和VL区。
“变体CDR”是与本发明的亲本CDR具有特定序列同源性、相似性或同一性的CDR，并且与亲本CDR共享生物学功能，包括但不限于至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR的特异性和/或活性。一般来讲，各个变体CDR之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为本文所描述的亲本序列的至少60％，并且更典型地具有至少65％或70％、优选至少75％或80％、更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、并且最优选95％、96％、97％、98％、99％、和几乎100％的渐增的同源性、相似性或同一性。这同样适用于“变体VH”和“变体VL”。根据一个实施例，“变体VH”和/或“变体VL”内的序列变化不延伸至CDR。因此，本发明涉及如本文所定义的抗体构建体，该抗体构建体包含与本文所定义的特定序列(“亲本”VH和VL)具有某些序列同源性(参见上文)的VH和VL序列，其中这些CDR序列与本文所定义的特定CDR序列(“亲本”CDR)是100％相同的。
优选的取代(或替代)是保守取代。然而，设想了任何取代(包括非保守取代或来自下表1中列出的“示例性取代”中的一个或多个)，只要抗体构建体保留其经由第一结构域与CLDN18.2结合并且经由第二结构域与CD3或CD3ε结合的能力，和/或只要其CDR、FR、VH和/或VL序列与原始或亲本序列具有至少60％或65％、更优选至少70％或75％、甚至更优选至少80％或85％、并且特别优选至少90％或95％的同一性程度即可。
保守替代(也称为保守突变或保守取代)是将给定氨基酸改变为具有相似的生物化学特性(例如电荷、疏水性、大小)的不同氨基酸的氨基酸取代。与非保守替代相比，蛋白质中的保守替代通常对蛋白质功能具有较小的影响。在表1中显示了保守取代。示例性保守取代显示为“示例性取代”。如果此类取代导致生物活性的变化，那么可以引入如本文中参考氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化，并筛选产物的期望特征。
表1：氨基酸取代(aa＝氨基酸)
Figure BDA0002918294490000561
Figure BDA0002918294490000571
本发明的抗体构建体的生物特性的实质性修饰是通过选择在保持以下的效应方面显著不同的取代来完成：(a)取代区域中的多肽骨架的结构，例如呈片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大部分。非保守取代通常需要将上面所定义的氨基酸类别之一(如极性、中性、酸性、碱性、脂肪族、芳香族、小……)的成员交换为另一种类别。任何不参与维持抗体构建体的适当构象的半胱氨酸残基通常可以被丝氨酸取代以改善抗体构建体的氧化稳定性。
氨基酸序列的序列同一性、同源性和/或相似性通过使用在本领域中已知的标准技术，优选地使用默认设置或通过检验来确定，这些标准技术包括但不限于Smith和Waterman(1981,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482)的局部序列同一性算法，Needleman和Wunsch(J Mol Biol.[分子生物学杂志]1970年3月；48(3):443-53)的序列同一性比对算法，Pearson和Lipman(Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]1988年4月；85(8):2444-8)的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊市科学大道575号遗传学计算机组(Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wis.))，由Devereux等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1984年1月11日；12(1Pt 1):387-95)描述的最佳拟合序列程序。设想了百分比同一性通过FastDB基于以下参数来计算：错配罚分为1；空位罚分为1；空位大小罚分为0.33；以及连接罚分为30。还参见“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis[序列比较和分析的当前方法]”,Macromolecule Sequencing and Synthesis[大分子测序与合成],SelectedMethods and Applications[所选择的方法与应用],第127-149页(1988),Alan R.Liss公司。
有用的算法的实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列中创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle(J Mol Evol.[分子进化杂志]1987；25(4):351-60)的渐进式比对方法的简单化；该方法类似于由Higgins和Sharp(Comput Appl Biosci.[计算机在生物科学中的应用]1989年4月；5(2):151-3)所描述的方法。有用的PILEUP参数包括默认空位权重为3.00、默认空位长度权重为0.10、和加权末端空位。
有用算法的另一个实例是BLAST算法，描述于以下中：Altschul等人(J Mol Biol.[分子生物学杂志]1990年10月5日；215(3):403-10)；Altschul等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1997年9月1日；25(17):3389-402)；以及Karlin和Altschul(Proc Natl AcadSci USA.[美国国家科学院院刊]1993年6月15日；90(12):5873-7)。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人(Methods Enzymol.[酶学方法]1996；266:460-80)获得的WU-Blast-2程序。WU-Blast-2使用多个搜索参数，其中大部分都设定为默认值。可调节的参数设定为以下值：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，单词阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和特定数据库的组成来确立，根据该特定数据库来搜索感兴趣的序列；然而，可以调整这些值以提高灵敏度。
另外的有用算法是空位BLAST，如由Altschul等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]1997年9月1日；25(17):3389-402)报道的。空位BLAST使用BLOSUM-62取代评分；阈值T参数设定为9；触发非空位扩展的双击方法，对k的空位长度收取10+k的成本；Xu设定为16，并且Xg设定为40(用于数据库搜索阶段)以及67(用于算法的输出阶段)。空位比对由对应于约22比特的评分触发。
与此一致，关于编码本文鉴定的抗体构建体的核酸序列的术语“核酸序列同一性/同源性/相似性的百分比(％)”被定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。比对两个序列并从而确定它们的同源性的一种方法使用WU-Blast2(设定为默认参数)的BLASTN模块，其中重叠跨度和重叠分数分别设定为1和0.125。一般来讲，编码各个变体CDR的核苷酸序列与本文所描述的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性是至少60％，并且更典型地具有至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的渐增的同源性、相似性或同一性。再次，这同样适用于编码“变体VH”和/或“变体VL”的核酸序列。
在一个实施例中，与根据本发明的抗体构建体的人种系或这些抗体构建体的第一和第二结构域(结合结构域)的人种系的同一性百分比是≥70％或≥75％、更优选≥80％或≥85％、甚至更优选≥90％、并且最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是降低治疗期间治疗性蛋白引发患者中针对药物的免疫应答的风险的重要特征。Hwang W.Y.和Foote J.(Methods.[方法]2005年5月；36(1):3-10)证明了药物抗体构建体的非人部分的减少导致治疗期间患者中诱导抗药物抗体的风险降低。通过比较无数临床评价的抗体药物和对应的免疫原性数据，显示以下趋势：抗体/抗体构建体的可变区的人源化使得蛋白质免疫原性(平均5.1％的患者)比携带未改变的非人可变区的抗体/抗体构建体(平均23.59％的患者)更低。因此，基于可变区和呈抗体构建体的形式的蛋白质治疗剂需要与人序列具有较高程度的同一性。出于确定种系同一性的目的，可以使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/)的氨基酸序列进行比对并且通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数计算氨基酸序列(以百分比计)。对于VH区段(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/)同样可以进行，只是由于VH CDR3的高度多样性和缺少现有人种系VH CDR3比对配偶体，可以将VH CDR3排除。然后可以使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。
在另外的实施例中，本发明的抗体构建体在标准研究规模条件下，例如在标准的两步纯化过程中表现出高的单体产率。设想根据本发明的抗体构建体的单体产率为≥0.25mg/L上清液(SN)、优选≥0.5mg/L SN、更优选≥1mg/L SN、甚至更优选≥2mg/L SN、并且最优选≥3mg/L SN。命名为“CL-1 x I2C-6His”的抗体构建体的产率显示为4.1mg/L上清液，并且命名为“CL-1 x I2C-scFc”的抗体构建体的产率显示为36.5mg/L上清液。
同样地，可以确定抗体构建体的二聚体抗体构建体同种型的产率，并由此确定单体百分比(即，单体:(单体+二聚体))。单体和二聚体抗体构建体的生产率和计算的单体百分比可以例如在对来自在滚瓶中标准化研究规模生产的培养物上清液的SEC纯化步骤中获得。根据一个实施例，本发明的抗体构建体的单体百分比为≥80％、更优选≥85％、甚至更优选≥90％、并且最优选≥95％。
根据一个实施例，本发明的抗体构建体的血浆稳定性(具有血浆的EC50与不具有血浆的EC50的比率)为≤5或≤4、更优选≤3.5或≤3、甚至更优选≤2.5或≤2、并且最优选≤1.5或≤1。可以通过例如以2-20μg/ml的浓度将纯化的构建体在人血浆中于37℃下孵育24至96小时来测试抗体构建体的血浆稳定性，随后在18h 51-铬释放或48h FACS细胞毒性测定(例如，如在实例7.1和7.2中所描述的测定)中进行EC50确定。细胞毒性测定中的效应细胞可以是刺激的富集的人CD8阳性T细胞(优选的)或未刺激的人PBMC。靶细胞可以例如是用人CLDN18.2转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)的比率可以是10:1。细胞毒性测定中抗体构建体的起始浓度可以是0.01-0.1μg/ml。用于此目的的人血浆库来源于由EDTA涂覆的注射器收集的健康供体的血液。通过离心去除细胞组分，并且收集上层血浆相并随后汇集。作为对照，在细胞毒性测定之前在适当的培养基如RPMI-1640中立即稀释未孵育的抗体构建体。将血浆稳定性计算为EC50(在血浆孵育之后)与EC50(对照/无孵育)的比率。
此外，设想本发明的抗体构建体的单体与二聚体转化较低。可以在不同条件下测量转化并且通过高性能尺寸排阻色谱进行分析。参见实例8。例如，抗体构建体的单体同种型的孵育可以在培养箱中在通用配制缓冲液中并且以例如100μg/ml或250μg/ml的浓度在37℃下进行7天，随后进行高性能SEC以确定已转化为二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。在这些条件下，设想本发明的抗体构建体显示出≤8％、优选≤6％、更优选≤5％、更优选≤4％、甚至更优选≤3％、甚至更优选≤2.5％、甚至更优选≤2％、甚至更优选≤1.5％、并且最优选≤1％或≤0.5％或甚至0％的二聚体百分比。
同样，设想本发明的抗体构建体在几次冷冻/解冻循环之后呈现非常低的二聚体转化。例如，将抗体构建体单体在例如通用配制缓冲液中调整至浓度为250μg/ml，并且进行三个冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min，之后在室温下解冻30min)，之后进行高性能SEC以确定已经转化成二聚体抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。设想，例如在三次冷冻/解冻循环之后，抗体构建体的二聚体百分比为≤8％、优选≤6％、更优选≤5％、更优选≤4％、甚至更优选≤3％、甚至更优选≤2.5％、甚至更优选≤2％、甚至更优选≤1.5％、并且最优选≤1％或≤0.5％或甚至0％。
根据一个实施例，本发明的抗体构建体显示出聚集温度≥45℃或≥46℃、更优选≥47℃或≥48℃、甚至更优选≥49℃或≥50℃、并且最优选≥51℃的有利热稳定性。热稳定性参数可以根据抗体聚集温度如下确定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到一次性比色杯中并置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，恒定获取测量的半径。使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算抗体的聚集温度。参见实例9。
可替代地，可以通过差示扫描量热法(DSC)确定温度熔融曲线以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验可以使用微凯尔有限公司(MicroCal LLC)VP-DSC装置进行。从20℃至90℃记录与仅含有配制缓冲液的样品相比含有抗体构建体的样品的能量摄取。例如在SEC运行缓冲液中将抗体构建体调整至终浓度为250μg/ml。为了记录对应的熔融曲线，逐步升高整个样品温度。在每个温度下记录样品和配制缓冲液参考物的能量吸收。将样品的能量吸收Cp(千卡/摩尔/℃)减去参考物的差针对对应的温度作图。熔融温度被定义为第一次最大能量吸收时的温度。
还设想本发明的抗体构建体具有≤0.2或≤0.15、优选≤0.10或≤0.08、更优选≤0.06或≤0.05、并且最优选≤0.04或≤0.03的浊度。可以通过在2.5mg/ml的抗体构建体浓度下的OD340和在5℃下孵育16h来测量浊度。参见实例10。
可以测量随着在不存在T细胞的情况下在靶细胞上的预孵育的变化，靶标x CD3抗体构建体的效力的变化。如果抗体构建体被内化，则预期其将经历溶酶体降解。因此，预期有效浓度随时间降低，并因此表观效力也应降低。已经观察到一些靶标的效果，对于它们这是已知的现象。设想本发明的抗体构建体不被靶细胞内化或不经历显著的靶细胞内化。可以测定内化率，例如如以下所述：将T细胞计数并在测定培养基中稀释至1x105个/ml的浓度。将靶标阳性靶细胞计数并例如以2500个细胞/孔(cpw)铺板。将抗体构建体例如以100nM的起始浓度以1:2连续稀释。将抗体构建体添加到培养测定板中，以允许在添加T细胞之前孵育0小时、1小时或2小时。然后将T细胞以25000cpw(E:T＝10:1)铺板，并将测定在37℃下孵育48小时。例如使用
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系统(25μl/孔)分析靶细胞存活。优选地，在抗体构建体与靶细胞(预)孵育2小时之后，内化率(例如，测量为细胞毒性的降低)为≤20％、更优选≤15％、甚至更优选≤10％、并且最优选≤5％。
此外，对于本发明的抗体构建体，设想脱落的或可溶性靶标不会显著损害其功效或生物活性。这可以例如在细胞毒性测定中测量，其中将可溶性靶标以渐增的浓度(例如，以0nM-0.3nM-0.7nM-1nM-3nM-7nM-12nM)添加到测定中。示例性E:T值为10:1。在可溶性靶标的存在下，测试的抗体构建体的EC50值不应显著增加。
在另外的实施例中，根据本发明的抗体构建体在酸性pH下是稳定的。抗体构建体在非生理pH(如pH 5.5)(运行例如阳离子交换色谱所需的pH)下的表现越耐受，从离子交换柱洗脱的抗体构建体相对于加载蛋白质总量的回收率越高。抗体构建体从pH 5.5的离子(例如阳离子)交换柱的回收率优选为≥30％、更优选≥40％、更优选≥50％、甚至更优选≥60％、甚至更优选≥70％、甚至更优选≥80％、并且最优选≥95％。百分比代表主峰的曲线下面积(＝AUC)。参见实例11。
此外，设想本发明的抗体构建体表现出治疗功效，其表现为抗肿瘤活性或肿瘤生长抑制。这可以例如在实例13或14中所披露的研究中进行评估。在一个实施例中，本发明的抗体构建体的肿瘤生长抑制T/C[％]为≤70、≤60、≤50、≤40、≤30、≤20、≤10、≤5、≤4、≤3或≤2。还设想修改或调整这些研究的某些参数(如注射的肿瘤细胞的数量、注射部位、移植的人T细胞的数量、待施用的抗体构建体的量和时间线)，同时仍然获得了有意义且可再现的结果。
本发明进一步提供了一种多核苷酸/核酸分子，该多核苷酸/核酸分子编码本发明的抗体构建体。核酸分子是由核苷酸构成的生物聚合物。多核苷酸是由共价键合在链中的13个或更多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸/核酸分子的实例。核苷酸是充当核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单位的有机分子。本发明的核酸分子或多核苷酸可以是双链的或单链的、线性的或环状的。设想核酸分子或多核苷酸被包含在载体中。此外，设想这样的载体被包含在宿主细胞中。所述宿主细胞例如在用本发明的载体或多核苷酸/核酸分子转化或转染后能够表达抗体构建体。为此目的，将多核苷酸或核酸分子可操作地连接至控制序列。
遗传密码是将遗传物质(核酸)内编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过以由mRNA指定的顺序连接氨基酸的核糖体、使用tRNA分子携带氨基酸并一次读出mRNA三个核苷酸来完成。该密码定义了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单一氨基酸。因为绝大多数基因都使用完全相同的密码进行编码，所以该特定密码通常称为规范或标准遗传密码。
密码子的简并性是遗传密码的冗余，表现为指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性。简并性发生是因为存在比可编码的氨基酸更多的密码子。编码一种氨基酸的密码子在它们的三个位置中的任何一个都可以不同；然而，这种差异通常是在第二或第三位置。例如，密码子GAA和GAG都指定谷氨酸并表现出冗余；但是，都没有指定任何其他氨基酸，并因此没有表现出歧义。不同生物体的遗传密码可能偏向于使用编码相同氨基酸的几个密码子之一而不是其他密码子-也就是说，将发现比偶然预期具有更大频率的一个。例如，亮氨酸由六种不同的密码子指定，其中一些很少被使用。可获得详细说明大多数生物体的基因组密码子使用频率的密码子使用表。重组基因技术通常通过实施称为密码子优化的技术来利用这种效应，其中将那些密码子用于设计被各自宿主细胞(如人仓鼠起源的细胞、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞)偏好的多核苷酸，例如以便增加蛋白质表达。因此，设想本披露的多核苷酸/核酸分子是密码子优化的。然而，可以使用编码所希望的氨基酸的任何密码子来设计编码本发明的抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。
根据一个实施例，编码本发明的抗体构建体的本发明的多核苷酸/核酸分子呈一个单一分子的形式或两个或更多个分开的分子的形式。如果本发明的抗体构建体是单链抗体构建体，则编码这种构建体的多核苷酸/核酸分子将最可能也呈一个单一分子的形式。然而，还设想抗体构建体的不同组分(如不同结构域，例如结合CLDN18.2的结构域、结合CD3的结构域、和/或另外的结构域如抗体恒定结构域)位于单独的多肽链上，在这种情况下，多核苷酸/核酸分子最可能呈两个或更多个分开的分子的形式。
这同样适用于包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。如果本发明的抗体构建体是单链抗体构建体，则一个载体可以在一个单一位置(作为一个单一开放阅读框，ORF)包含编码抗体构建体的多核苷酸。一个载体还可以在分开的位置(具有单独的ORF)包含两个或更多个多核苷酸/核酸分子，它们中的每一个编码本发明的抗体构建体的不同组分。设想包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体呈一个单一载体的形式或处于两个或更多个分开的载体的形式。在一个实施例中，并且出于在宿主细胞中表达抗体构建体的目的，本发明的宿主细胞应包含编码抗体构建体的多核苷酸/核酸分子或包含这种多核苷酸/核酸分子的载体全部，这意味着抗体构建体的所有组分-无论是编码为一个单一分子还是在单独的分子/位置编码-将在翻译之后组装并一起形成本发明的生物学活性的抗体构建体。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸/核酸分子的载体。载体是用作将(外来)遗传物质转移到细胞中的运载体的核酸分子，通常出于复制和/或表达的目的。术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒、粘粒和人造染色体。一些载体专门设计用于克隆(克隆载体)，其他载体设计用于蛋白质表达(表达载体)。所谓的转录载体主要用于扩增其插入物。通常在含有其在大肠杆菌中维持所需的元件的大肠杆菌载体上进行DNA操作。然而，载体也可以具有允许它们维持在另一种生物体如酵母、植物或哺乳动物细胞中的元件，并且这些载体被称为穿梭载体。将载体插入靶标或宿主细胞中通常被称为转化(对于细菌细胞)和转染(对于真核细胞)，而病毒载体的插入通常被称为转导。
一般来讲，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择性标志物。载体本身通常是包含插入物(转基因)和充当载体“骨架”的较大序列的核苷酸序列(通常为DNA序列)。虽然遗传密码决定了给定编码区的多肽序列，但其他基因组区域可能会影响这些多肽产生的时间和地点。因此，现代载体可以涵盖除转基因插入物和骨架之外的额外特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体尤其用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号、Kozak序列和增强子。
当核酸置处于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位成使得有助于翻译，则该核糖体结合侧可操作地连接至编码序列。一般来讲，“可操作地连接”意指所连接的核苷酸序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行接连接合来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入到靶细胞中的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。转染动物细胞典型地涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许摄取物质。转染可以使用生物粒子(如病毒转染，也称为病毒转导)、基于化学的方法(如使用磷酸钙、脂质转染、Fugene、阳离子聚合物、纳米粒子)或物理处理(如电穿孔、显微注射、基因枪、细胞挤压、磁转染、静水压力、穿刺转染(impalefection)、超声波、光学转染、热休克)进行。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中，以及向非动物真核细胞(包括植物细胞中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，该基因改变是因通过一个或多个细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传物质(核酸分子)而产生。转化可以通过人为手段来实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态，这可能作为对诸如饥饿等环境条件和细胞密度的时间限制反应而发生，并且也可以被人工诱导。
此外，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞用本发明的多核苷酸/核酸分子或用本发明的载体转化或转染。
如本文使用的，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源性核酸分子和/或编码本发明抗体构建体的多核苷酸的受体、和/或抗体构建体本身的受体的任何单个细胞或细胞培养物。通过转化、转染等方式将对应的物质引入细胞中(参见上文)。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为某些改变可能由于天然的、意外的或有意的突变或由于环境影响而在随后世代中发生，所以这种后代事实上可能不会与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或全部DNA补体中)，但仍包括在本文所用术语的范围内。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，并且还包括但不限于-细菌(如大肠杆菌)、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，诸如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如仓鼠、鼠类、大鼠、猕猴或人。
除了原核生物之外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是本发明的抗体构建体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株通常是可获得的并且可用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔提鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)；和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗体构建体的合适宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了来自诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，此类病毒可以用作本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等人,Nature[自然](1989)342:76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology[生物技术]10:790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J[植物杂志]8:745-750；以及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol[植物分子生物学]32:979-986。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且培养物(细胞培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(如COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如293细胞或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.[遗传病毒学杂志]36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(如BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(如CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(如TM4，Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980))；猴肾细胞(如CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(如VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(如HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(如MDCK，ATCCCCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(如BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(如W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(如Hep G2,1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(如MMT 060562,ATCC CCL-51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.[纽约科学院年刊](1982)383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(如Hep G2)。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于产生本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许表达本发明的抗体构建体的条件下培养本发明的宿主细胞并且从该培养中回收所产生的抗体构建体。
如本文使用的，术语“培养”是指细胞在合适的条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。使细胞在适当的温度和气体混合物下在细胞生长培养基中生长并维持。对于每种细胞类型，培养条件变化很大。典型的生长条件是约37℃的温度、约5％的CO2浓度和约95％的湿度。生长培养基的配方可以例如在pH值、碳源(如葡萄糖)浓度、生长因子的性质和浓度、以及其他营养素(如氨基酸或维生素)的存在方面变化。用于补充培养基的生长因子通常源自于动物血液的血清，如胎牛血清(FBS)、牛小牛血清(FCS)、马血清和猪血清。细胞可以在悬浮液中生长或作为贴壁培养物生长。还存在如下细胞系，这些细胞系已经被修饰以能够在悬浮培养物中存活，因此它们可以按比贴壁条件将允许的更高密度生长。
术语“表达”包括涉及产生本发明的抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、折叠、翻译后修饰、靶向特定亚细胞或细胞外位置、和分泌。术语“回收”是指旨在从细胞培养物中分离抗体构建体的一系列过程。“回收”或“纯化”过程可以分离细胞培养物的蛋白质和非蛋白质部分，并最终将所希望的抗体构建体与所有其他多肽和蛋白质分离。分离步骤通常利用蛋白质大小、物理化学特性、结合亲和力和生物活性的差异。制备型纯化旨在产生相对大量的纯化蛋白质供后续使用，而分析型纯化产生相对少量的蛋白质用于各种研究或分析目的。
当使用重组技术时，抗体构建体可以在周质空间中细胞内产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体构建体是在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或溶解片段的微粒状碎片。本发明的抗体构建体可以例如在诸如大肠杆菌等细菌中产生。在表达之后，将构建体从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离出来，并且可以例如经由亲和色谱和/或尺寸排阻进行纯化。最终纯化可以以与用于纯化在哺乳动物细胞中表达并分泌到培养基中的抗体构建体的方法类似的方式进行。Carter等人(Biotechnology(NY)[生物技术(NY)]1992年2月；10(2):163-7)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙中的抗体的程序。
在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器(例如，超滤单元自此类表达系统的上清液进行浓缩。
可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱回收或纯化从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体。根据待回收的抗体构建体，也可获得用于蛋白质纯化的其他技术，如离子交换柱上分级分离、混合模式离子交换、HIC、乙醇沉淀、尺寸排阻色谱、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素琼脂糖上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、免疫亲和(如蛋白质A/G/L)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、超速离心和硫酸铵沉淀。
蛋白酶抑制剂可以被包括在任何前述步骤中以便抑制蛋白水解，并且抗生素可以被包括来防止污染物的生长。
此外，本发明提供了一种药物组合物或配制品，该药物组合物或配制品包含本发明的抗体构建体或根据本发明的方法产生的抗体构建体。
如本文使用的，术语“药物组合物”涉及适合施用至患者、优选人患者的组合物。本发明的特别优选的药物组合物包含优选治疗有效量的一种或多种本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物进一步包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的合适配制品。组合物的可接受成分优选在所采用的剂量和浓度下是对接受者无毒性的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
这些组合物可以包含药学上可接受的载体。一般来讲，如本文使用的，“药学上可接受的载体”意指与药物施用、特别是肠胃外施用相容的任何和所有的水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)、水、悬浮液、乳液(诸如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣。此类介质和药剂在药物组合物中的使用在本领域中是熟知的，并且包含此类载剂的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
某些实施例提供了药物组合物，这些药物组合物包含本发明的抗体构建体和另外一种或多种赋形剂，诸如在本部分和本文其他地方说明性描述的那些赋形剂。赋形剂在本发明中可用于多种目的，诸如调整配制品的物理、化学或生物特性，诸如调整粘度和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制品和方法，以防止例如由于在制造、运输、存储、使用前制备、施用和其后过程中发生的压力而导致的降解和腐坏。赋形剂通常应以其最低有效浓度使用。
在某些实施例中，出于改变、保持或保存组合物的某些特征(如pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性)的目的，药物组合物可以含有配制物质(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书],第18版,1990,Mack Publishing Company[马克出版公司])。在此类实施例中，合适的配制物质可以包括但不限于：
·氨基酸
·抗微生物剂，如抗细菌剂和抗真菌剂
·抗氧化剂
·用于将组合物维持在生理pH或稍低的pH下(通常在约5至约8或9的pH范围内)的缓冲液、缓冲系统和缓冲剂
·非水性溶剂、植物油和可注射的有机酯
·水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质
·可生物降解聚合物，如聚酯
·增积剂
·螯合剂
·等渗剂和吸收延迟剂
·络合剂
·填充剂
·碳水化合物
·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载体，优选人起源的
·着色剂和调味剂
·含硫还原剂
·稀释剂
·乳化剂
·亲水性聚合物
·成盐抗衡离子
·防腐剂
·金属络合物
·溶剂和助溶剂
·糖和糖醇
·悬浮剂
·表面活性剂或润湿剂
·稳定性增强剂
·张力增强剂
·肠胃外递送运载体
·静脉内递送运载体
众所周知，例如，药物组合物的不同成分可以具有不同的效应，并且氨基酸可以充当缓冲液、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可以充当增积剂和/或张力增强剂；氯化钠可以充当递送运载体和/或张力增强剂；等等。
在本发明的上下文中，药物组合物可以包含：
(a)如本文所述的抗体构建体，
(b)至少一种缓冲剂，
(c)至少一种糖，以及
(d)至少一种表面活性剂；
其中该药物组合物的pH在3.5至6的范围内。
在上面所述的组合物中，第一结构域优选地具有在4至9.5的范围内的等电点(pI)；第二结构域具有在8至10(优选地8.5至9.0)的范围内的pI；并且抗体构建体任选地包含第三结构域，该第三结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合；
在上面所述的组合物中，进一步设想所述至少一种缓冲剂以5mM至200mM的浓度范围、更优选地以10mM至50mM的浓度范围存在。还设想所述至少一种糖选自下组，该组由以下组成：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链葡聚糖或线性非支链葡聚糖。还设想该二糖选自下组，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨糖醇及其组合。进一步设想该糖醇是山梨糖醇。还设想所述至少一种糖以1％至15％(m/V)的范围内的浓度存在，优选地以9％至12％(m/V)的浓度范围存在。进一步设想该抗体构建体以0.1mg/ml至8mg/ml、优选0.2-2.5mg/ml、更优选0.25-1.0mg/ml的浓度范围存在。
根据上面所述的组合物的一个实施例，所述至少一种表面活性剂选自下组，该组由以下组成：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯(polyoxyethylen)、PEG 3350、PEG 4000及其组合。进一步设想所述至少一种表面活性剂以在0.004％至0.5％(m/V)的范围内(优选地在0.001％至0.01％(m/V)的范围内)的浓度存在。设想该组合物的pH在4.0至5.0的范围内，优选地4.2。还设想该药物组合物具有150mOsm至500mOsm的摩尔渗透压浓度。进一步设想该药物组合物进一步包含选自下组的赋形剂，该组由以下组成：一种或多种多元醇和一种或多种氨基酸。在本发明的上下文中，设想所述一种或多种赋形剂以0.1％至15％(w/V)的浓度范围存在。
本发明还提供了药物组合物，其包含
(a)如本文所述的抗体构建体，优选在0.1mg/ml至8mg/ml、优选0.2mg/ml-2.5mg/ml、更优选0.25mg/ml-1.0mg/ml的浓度范围内；
(b)10mM谷氨酸盐或乙酸盐；
(c)9％(m/V)蔗糖或6％(m/V)蔗糖和6％(m/V)羟丙基-β-环糊精；
(d)0.01％(m/V)聚山梨醇酯80；
其中该液体药物组合物的pH为4.2。
设想除了本文定义的本发明的抗体构建体之外，本发明的组合物可以包含另外的生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。此类剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫应答的药物、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的剂诸如细胞因子。还设想将本发明的抗体构建体应用于共疗法中，即与另一种抗癌药物组合。
在这个背景下，设想本发明的药物组合物(其包含抗体构建体，该抗体构建体包含与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域和与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域，如本文上面更详细描述的)此外包含与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选地抗体或抗体构建体)。本发明还涉及根据本发明的抗体构建体(其包含抗体构建体，该抗体构建体包含与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域和与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域，如本文上面更详细描述的)和与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选抗体或抗体构建体)的组合。由于该组合的至少两种成分的性质，即它们的药物活性，该组合也可以被称为治疗性组合。在一些实施例中，该组合可以呈药物组合物或试剂盒的形式。根据一个实施例，该药物组合物或该组合包含本发明的抗体构建体和与PD-1结合的抗体或抗体构建体。例如在PCT/US 2019/013205中详细描述了可用于该目的的抗PD-1结合蛋白。
因此，在另外的方面，本发明涉及药物组合物或组合，该药物组合物或组合包含：
·抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域和与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域，如本文上面更详细描述的，以及
·抗体或抗体构建体，其与PD-1结合并且包含：
a)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:292中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:293中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:294中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:295中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:296中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:297中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:302中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:303中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:304中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:305中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:306中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:307中所描述的CDR-L3；
c)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:312中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:313中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:314中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:315中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:316中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:317中所描述的CDR-L3；
d)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:322中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:323中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:324中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:325中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:326中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:327中所描述的CDR-L3；
e)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:332中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:333中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:334中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:335中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:336中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:337中所描述的CDR-L3；
f)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:342中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:343中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:344中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:345中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:346中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:347中所描述的CDR-L3；
g)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:352中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:353中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:354中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:355中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:356中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:357中所描述的CDR-L3；或
h)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:362中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:363中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:364中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:365中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:366中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:367中所描述的CDR-L3。
在一个实施例中，上文所述的与PD-1结合的抗体或抗体构建体包含
a)如SEQ ID NO:298中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:299中所描述的VL区；
b)如SEQ ID NO:308中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:309中所描述的VL区；
c)如SEQ ID NO:318中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:319中所描述的VL区；
d)如SEQ ID NO:328中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:329中所描述的VL区；
e)如SEQ ID NO:338中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:339中所描述的VL区；
f)如SEQ ID NO:348中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:349中所描述的VL区；
g)如SEQ ID NO:358中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:359中所描述的VL区；或
h)如SEQ ID NO:368中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:369中所描述的VL区。
在一个实施例中，与PD-1结合的上述抗体或抗体构建体包含：
a)如SEQ ID NO:300中所描述的重链、和如SEQ ID NO:301中所描述的轻链；
b)如SEQ ID NO:310中所描述的重链、和如SEQ ID NO:311中所描述的轻链；
c)如SEQ ID NO:320中所描述的重链、和如SEQ ID NO:321中所描述的轻链；
d)如SEQ ID NO:330中所描述的重链、和如SEQ ID NO:331中所描述的轻链；
e)如SEQ ID NO:340中所描述的重链、和如SEQ ID NO:341中所描述的轻链；
f)如SEQ ID NO:350中所描述的重链、和如SEQ ID NO:351中所描述的轻链；
g)如SEQ ID NO:360中所描述的重链、和如SEQ ID NO:361中所描述的轻链；或
h)如SEQ ID NO:370中所描述的重链、和如SEQ ID NO:371中所描述的轻链。
在某些实施例中，最佳药物组合物将根据例如预期施用途径、递送形式和所希望的剂量来确定。参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上。在某些实施例中，此类组合物可以影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的运载体或载体可以是注射用水或生理盐水溶液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。在某些实施例中，包含本发明的抗体构建体的组合物可以通过将具有所希望纯度的选择成分与任选的配制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上)以冻干饼或水性溶液的形式混合来制备用于储存。此外，在某些实施例中，可以使用合适的赋形剂将本发明的抗体构建体配制成冻干物。
当考虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗组合物可以以无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式提供，该水性溶液包含在药学上可接受的媒介物中的本发明的所希望抗体构建体。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中将本发明的抗体构建体配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，制剂可以包括用可以提供产品的控制释放或持续释放的试剂配制所希望的分子，该产品可以经由积存注射递送，或者可以促进在循环中持久的持续时间。在某些实施例中，可植入药物递送装置可用于引入所希望的抗体构建体。
另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，包括涉及在持续或控制递送配制品中包括本发明的抗体构建体的配制品。用于配制各种持续或控制递送手段的技术对本领域技术人员而言是已知的。抗体构建体也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中、在胶体药物递送系统中或在粗乳液中。在Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书]，同上中披露了此类技术。
用于体内施用的药物组合物典型地作为无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或于溶液中储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌进入口的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一个方面包括包含本发明的抗体构建体的自缓冲配制品，这些自缓冲配制品可以用作药物组合物，如在国际专利申请WO 2006/138181中所述。关于可用于这方面的蛋白质稳定化和配制材料和方法，有多种出版物可用，如Arawaka T.等人,PharmRes.1991年3月；8(3):285-91；Kendrick等人,“Physical stabilization of proteins inaqueous solution”[蛋白质在水性溶液中的物理稳定化]在：Rational Design of StableProtein Formulations:Theory and Practice[稳定蛋白质配制品的合理设计：理论与实践],Carpenter和Manning编辑Pharmaceutical Biotechnology[药物生物技术].13:61-84(2002)，以及Randolph和Jones,Pharm Biotechnol.[药物生物技术]2002；13:159-75，尤其参见与用于自缓冲蛋白质配制品的赋形剂和方法有关的部分，特别是关于用于兽医和/或人类医学用途的蛋白质药物产品和方法。
根据本发明的某些实施例，可以使用盐例如以便调整组合物或配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的抗体构建体或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
离子物种对蛋白质的作用显著不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是Hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的”。不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施例，游离氨基酸可用于包含本发明的抗体构建体的配制品或组合物中，以作为增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及用于其他标准用途。可以将某些氨基酸用于稳定配制品中的蛋白质，其他氨基酸可用于冻干过程中以确保正确饼结构和活性成分的特性。可以将一些氨基酸用于抑制液体和冻干配制品中的蛋白质聚集，而其他氨基酸可用作抗氧化剂。
多元醇是亲液的，并且可用作液体和冻干配制品中的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程。多元醇还可用于调节配制品的张力并且用于防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块。在本发明的上下文中多元醇也可以用作冷冻保护剂。
包含本发明的抗体构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含表面活性剂。蛋白质可能易于吸附在表面上并且易于变性和在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处产生聚集。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且典型地因物理振荡(如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为一种特定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。
包含本发明的抗体构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。抗氧化赋形剂也可以用于防止蛋白质的氧化降解。设想用于根据本发明的治疗性蛋白质配制品的抗氧化剂可以是水溶性的并且在产品(包含抗体构建体的组合物)的整个保质期内保持其活性。抗氧化剂也可能破坏蛋白质，并且因此应该除了别的之外以一种方式选择，以消除或充分降低抗氧化剂破坏配制品中的抗体构建体或其他蛋白质的可能性。
包含本发明的抗体构建体的配制品或组合物的某些实施例可以包含一种或多种防腐剂。例如，当开发涉及从相同容器中提取超过一次的多剂量肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。尽管防腐剂与小分子肠胃外药物一起使用有很长的历史，但是开发包括防腐剂的蛋白质配制品可能具有挑战性。防腐剂通常对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而，当多剂量配制品是可能时，它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。一个良好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐配制品的开发已经导致更方便、多次使用的注射笔展示的商业化。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。
正如可以预期的那样，含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与抗体构建体接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下，应在整个产品保质期内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。一旦配制了药物组合物，可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干形式)储存。
本文定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来确定，如在以下实例、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗]20(2005),1-12)所述的。如本文使用的，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化NCI应答标准对本发明的药物组合物或配制品治疗的应答。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对于其预期用途的有效性，即组合物引起其所希望效应，即耗尽病理细胞(例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可以通过已建立的对应疾病实体的标准方法进行监测，这些方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选法、骨髓抽吸。另外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他建立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影、X射线、核磁共振断层摄影、正电子发射断层摄影扫描、淋巴结活组织检查/组织学和其他已建立的标准方法。
开发药物(诸如本发明的药物组合物)的另一主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容量、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药物剂的功效可以受到上文提及的每个参数的影响。
“半衰期”是将量减少到其初始值的一半所需的时间。医学科学是指物质或药物在人体内的半衰期。在医学背景下，半衰期可以是指物质/药物失去其活性(例如药理学、生理学或放射学活性)的一半所花费的时间。半衰期还可以描述药物或物质(例如，本发明的抗体构建体)在血浆/血清中的浓度达到其稳态值的一半所花费的时间(“血清半衰期”)。典型地，所施用的物质/药物的清除或去除是指通过诸如代谢、排泄等生物过程(还涉及肾脏和肝脏的功能)进行身体清洁。“首过代谢”是药物代谢、由此在药物到达循环之前使药物浓度降低的现象。它是吸收过程中药物损失的部分。因此，“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时(即在其首次通过肝脏期间)被代谢的倾向。“分布容量”(VD)意指药物在身体组织而非血浆中分布的程度，较高的VD表示较大的组织分布量。药物的保留可以发生在遍布身体的各个隔室，如细胞内和细胞外空间、组织和器官等。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(如白蛋白)相互作用并结合的倾向，从而导致药物生物活性的降低或丧失。
药代动力学参数还包括就所施用的给定量的药物而言的生物利用度、滞后时间(T滞后)、Tmax、吸收速率、和/或Cmax。“生物利用度”是指到达体循环(血液隔室)的所施用药物/物质剂量的分数。当静脉内施用药物时，其生物利用度被认为是100％。然而，当经由其他途径(如口服地)施用药物时，其生物利用度通常会降低。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。Cmax是药物在其施用之后(以及在施用第二剂量之前)达到的最大血浆浓度。Tmax是达到Cmax的时间。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。如上面所概述和例如在Schlereth等人(同上)中所示的，可以在非黑猩猩灵长类动物的临床前动物测试中确定表现出跨物种特异性的抗体构建体的药代动力学参数。
一个实施例提供了本发明的抗体构建体(或根据本发明的方法产生的抗体构建体)，用于在预防、治疗或缓解疾病(优选赘生物)中使用。另一个实施例提供了本发明的抗体构建体(或根据本发明的方法产生的抗体构建体)在制造用于预防、治疗或缓解疾病(优选赘生物)的药物中的用途。还设想提供用于预防、治疗或缓解疾病(优选赘生物)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用本发明的抗体构建体(或根据本发明的方法产生的抗体构建体)的步骤。术语“有需要的受试者”、“患者”或“需要治疗”的那些包括已经患有该疾病的那些，以及将要预防该疾病的那些。这些术语还包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
本发明的抗体构建体和本文描述的配制品/药物组合物可用于治疗、缓解和/或预防对其有需要的患者中的如本文所述的医学病症。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将抗体构建体/药物组合物施用或施用至患有如本文所述的疾病/障碍、具有这种疾病/障碍的症状或具有患这种疾病/障碍的倾向的患者或有需要的受试者的体内、分离组织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、缓解、改善或影响该疾病、该疾病症状或患该疾病的倾向。如本文使用的，术语“缓解”是指通过将根据本发明的抗体构建体施用至此类患者或有需要的受试者而对患者的疾病状态的任何改善。这样的改善可以被视为患者疾病的进展减缓或停止、和/或疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加、或由于疾病导致的损害或残疾的预防。如本文使用的，术语“预防”意指通过将根据本发明的抗体构建体的施用至对其有需要的受试者来避免如本文所指定的疾病的发生或复发。
术语“疾病”是指将受益于用本文所述的抗体构建体或药物组合物治疗的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所考虑疾病的病理学病状。该疾病优选地是赘生物、癌症或肿瘤。该疾病、赘生物、癌症或肿瘤优选地是CLDN18.2阳性的，即其特征在于CLDN18.2的表达或过表达。
“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，通常称之为“肿瘤”。在脑肿瘤中，不受控制的细胞分裂意指赘生物肿块的大小增加，并且在诸如颅内腔等密闭空间中这很快变得有问题，因为肿块侵入大脑空间将其推到一边，导致脑组织压缩和颅内压增高和脑实质的破坏。赘生物或肿瘤可以是良性的、潜在恶性的(癌前)、或恶性的(癌性)。恶性赘生物/肿瘤通常被称为癌症。它们通常侵入并破坏周围组织，并可能形成转移，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。“原发性肿瘤”是在肿瘤进展开始并继续产生癌性肿块的解剖部位处生长的肿瘤。例如，当在脑内形成异常细胞时，就会发生脑肿瘤。大多数癌症在其原发部位发展，但然后继续转移或扩散至身体的其他部分(例如组织和器官)。这些另外的肿瘤是“继发性肿瘤”。大多数癌症在它们的原发部位之后、甚至在它们已经扩散到身体的其他部分之后继续被调用。
淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。出于本发明的目的，它们也被术语“肿瘤”或“癌症”涵盖。出于本发明的目的，术语“赘生物”、“肿瘤”和“癌症”可以互换使用，并且它们既包含原发性肿瘤/癌症又包含继发性肿瘤/癌症(或“转移瘤”)、连同肿块形成赘生物(肿瘤)和淋巴赘生物(如淋巴瘤和白血病)以及MRD。
术语“微小残留病”(MRD)是指在癌症治疗之后，例如当患者处于缓解期(没有疾病症状或体征)时，留在患者体内的少量残留癌细胞存在的证据。通过常规手段通常不能检测到极少量的剩余癌细胞，因为用于评估或检测癌症的标准测试不够敏感以检测MRD。如今，对于MRD非常敏感的分子生物学测试是可用的，如流式细胞术、PCR和下一代测序。这些测试可以测量组织样品中最低水平的癌细胞，有时低至百万个正常细胞中的一个癌细胞。在本发明的上下文中，设想术语癌症的“预防”、“治疗”或“缓解”还涵盖“MRD的预防、治疗或缓解”，无论是否检测到MRD。
在本发明的一个实施例中，赘生物、癌症或肿瘤选自下组，该组包括但不限于胃肠癌、卵巢癌和肺癌(或由其组成)。根据本发明的一个实施例，胃肠癌选自下组，该组由以下组成：胃癌(gastric或stomach cancer)、食管癌、胃食管癌、胰腺癌和结直肠癌。根据本发明的另一个实施例，卵巢癌是粘液性卵巢癌。根据本发明的另外的实施例，肺癌是非小细胞肺癌。
本发明的抗体构建体通常将针对特定施用途径和方法、特定施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗、生物利用度和持久性范围等来设计。组合物的物质优选以对于施用位点可接受的浓度配制。因此可以根据本发明设计配制品和组合物以通过任何合适的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于局部途径、肠内途径和肠胃外途径。
如果药物组合物已被冻干，则在施用之前首先将冻干材料在适当液体中重构。可以将冻干材料在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。本发明的药物组合物和抗体构建体特别可用于肠胃外施用，例如静脉内递送，例如通过注射或输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医学设备的实例描述于美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。
本发明的组合物可以以合适的剂量施用至受试者，该剂量可以例如在剂量递增研究中确定。如上所述，表现出本文所述的种间特异性的本发明的抗体构建体还可以有利地用于非黑猩猩灵长类动物的临床前测试。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如在医学领域中熟知的，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、有待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。
“有效剂量”是足以实现或至少部分地实现所希望的效果的治疗剂的量。“治疗有效剂量”是足以治愈或至少部分地阻止患有疾病的患者的疾病及其并发症、体征和症状的量。对此用途有效的量或剂量将取决于待治疗的疾病(适应症)、递送的抗体构建体、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的应答、施用途径、患者的体型(体重、体表)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。可以根据主治医师的判断调整适当的剂量，以便获得最佳治疗效果。
治疗有效量的本发明的抗体构建体优选地导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病引起的损害或残疾。相对于未经治疗的患者，在表达CLDN18.2的肿瘤的治疗中，治疗有效量的本发明的抗体构建体优选地将肿瘤细胞生长抑制了至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。
在另外的实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗体构建体、根据本发明的方法产生的抗体构建体、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。在本发明的背景下，术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以实现某一目标的一组产品和/或器具，其可以作为单一单元销售。
设想本发明的试剂盒的另外的组分是与免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选地抗体或抗体构建体)。这些药剂在本文上面更详细地描述。根据一个实施例，该试剂盒包含本发明的抗体构建体和与PD-1结合的抗体或抗体构建体。例如在PCT/US 2019/013205中详细描述了可用于该目的的抗PD-1结合蛋白。在某些实施例中，该试剂盒允许组分的同时和/或依次施用。
试剂盒可以包括一个或多个具有任何适当形状、大小和材料(优选防水的，例如塑料或玻璃)的接受器(诸如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋)，该一个或多个接收器含有适于施用的剂量的本发明的抗体构建体或药物组合物(参见上文)。试剂盒可以另外含有使用说明(例如以小册子或说明手册的形式)、用于施用本发明的抗体构建体或药物组合物的装置(如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的抗体构建体的装置和/或用于稀释本发明的抗体构建体的装置。
本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的抗体构建体或药物组合物的第一接受器和包含水性配制品的第二接受器。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器的试剂盒。
本发明涉及以下项目：
项目1.一种抗体构建体，其包含与靶细胞表面上的CLDN18.2(优选地具有SEQ IDNO:1)结合的第一结构域和与T细胞表面上的CD3结合的第二结构域。
项目2.根据项目1所述的抗体构建体，其中该第一结构域与CLDN18.2的第一细胞外环(环1)结合，该环优选地具有SEQ ID NO:2。
项目3.根据项目1或2所述的抗体构建体，其包含
·与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域，以及
·与T细胞表面上的人CD3结合的第二结构域，其中
该第一结构域与如下抗体或抗体构建体一样结合相同的CLDN18.2表位，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区。
项目4.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该抗体构建体与包含如下结构域的抗体或抗体构建体竞争结合，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ IDNO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ IDNO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区。
项目5.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:22中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:24中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:23中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
项目6.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:14中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体和/或在靶细胞表面上的具有氨基酸序列SEQ ID NO 15的CLDN18.2突变体，并且任选地还结合在靶细胞表面上的具有选自下组的氨基酸序列中的一个或多个CLDN18.2突变体，该组由SEQ ID NO:11、12、13、16、17、19、20和21中所描述的那些氨基酸序列组成，但不结合在靶细胞表面上的具有如SEQ ID NO:18中所描述的氨基酸序列的CLDN18.2突变体；
项目7.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该抗体构建体的第一结构域结合在靶细胞表面上的人CLDN18.2，其中在人CLDN18.2的位置56处的Glu(E)对于该第一结构域的结合是必需的，并且在人CLDN18.2的位置42处的Ala(A)和/或位置45处的Asn(N)对于该第一结构域的结合不是必需的；和/或
项目8.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该抗体构建体的第一结构域结合CLDN18.2的表位，该表位包含如SEQ ID NO:266中所描述的氨基酸序列，但不包含如SEQ ID NO:265中所描述的氨基酸序列，并且任选地还不包含如SEQ ID NO:267中所描述的氨基酸序列。
项目9.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该第二结构域结合人CD3ε和普通狨或松鼠猴CD3ε。
项目10.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中
a)该抗体构建体、该第一结构域和/或该第二结构域是人的或人源化的，
b)该抗体构建体是单链抗体构建体，
c)该第一结构域处于scFv的形式，
d)该第二结构域处于scFv的形式，
e)该第一结构域和该第二结构域经由接头、优选肽接头、更优选甘氨酸/丝氨酸接头连接，和/或
f)该抗体构建体包含提供延长的血清半衰期的结构域，如基于Fc的结构域。
项目11.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域不结合或不显著结合CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
项目12根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中
a)该第一结构域对CLDN18.2(例如hu CLDN18.2)的亲和力为≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM或≤20nM，如优选地在基于细胞的测定如Scatchard测定中测量的；
b)该第二结构域对CD3(例如hu CD3，例如hu CD3ε)的亲和力为≤100nM、≤90nM、≤80nM、≤70nM、≤60nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM或≤10nM，如优选地在表面等离子体共振测定如Biacore测定中测量的；和/或
c)该抗体构建体的EC50值为≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤280pM、≤260pM、≤250pM、≤240pM、≤220pM、≤200pM、≤180pM、≤160pM、≤150pM、≤140pM、≤120pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤15pM、≤10pM或≤5pM，如优选地在用CLDN18.2阳性靶细胞(如SNU-601、SNU-620或CLDN18.2转染的CHO细胞)和刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞作为效应细胞进行的细胞毒性测定中测量的。
项目13.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含含有选自下组的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有选自下组的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，该组由以下组成：
a)如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；以及
b)如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，以及如SEQ ID NO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ IDNO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3。
项目14.根据前述项目中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:139中所描述的氨基酸序列的VH区。
项目15.根据前述项目中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:140中所描述的氨基酸序列的VL区。
项目16.根据前述项目中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含VH区和VL区，该VH区和VL区具有如SEQ ID NO:127+128或SEQ ID NO:139+140中所描述的氨基酸序列。
项目17.根据前述项目中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQ ID NO:129或SEQ ID NO:141中所描述的氨基酸序列的多肽。
项目18.根据前述项目中的一项所述的抗体构建体，其包含如下多肽或由其组成，该多肽具有选自在SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144中所描述的那些氨基酸序列的组的氨基酸序列。
项目19.一种多核苷酸，其编码如前述项目中任一项所定义的抗体构建体。
项目20.一种载体，其包含如项目19中所定义的多核苷酸。
项目21.一种宿主细胞，其用如项目19中所定义的多核苷酸或如项目20中所定义的载体转化或转染。
项目22.用于产生如项目1至18中任一项所定义的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许所述抗体构建体表达的条件下培养如项目21中所定义的宿主细胞并从培养物中回收所产生的抗体构建体。
项目23.一种药物组合物，其包含如项目1至18中任一项所定义的或根据项目22的方法产生的抗体构建体。
项目24.根据项目1至18中任一项所述的或根据项目22的方法产生的抗体构建体，用于在预防、治疗或缓解疾病、优选赘生物、更优选CLDN18.2阳性赘生物中使用。
项目25.根据项目24所述的抗体构建体，其中该疾病或赘生物选自下组，该组由以下组成：胃肠癌、卵巢癌和肺癌。
项目26.根据项目25所述的抗体构建体，其中该胃肠癌选自下组，该组由以下组成：胃癌、食管癌、胃食管癌、胰腺癌和结直肠癌。
项目27.一种试剂盒，其包含如项目1至18中任一项所定义的抗体构建体、根据项目22的方法产生的抗体构建体、如项目19中所定义的多核苷酸、如项目20中所定义的载体、和/或如项目21中所定义的宿主细胞。
项目28.如项目23所述的药物组合物或如项目27所述的试剂盒，该药物组合物或试剂盒进一步包含与该免疫检查点途径的蛋白质(如PD-1或CTLA-4)或与共刺激免疫检查点受体(如4-1BB)结合的药剂(优选地抗体或抗体构建体)。
项目29.如项目23或28所述的药物组合物或如项目27或28所述的试剂盒，用于治疗用途，优选地用于在预防、治疗或缓解疾病、优选赘生物、更优选CLDN18.2阳性赘生物中使用。
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附图说明
图1
人CLDN18.1和CLDN18.2氨基酸序列的比对。突出显示第一和第二细胞外结构域(＝细胞外环)，以及CLDN18.1与CLDN18.2之间不同的氨基酸位置。在细胞外环1内，CLDN18.2与CLDN18.1在8个位置处不同。还参见实例1。
图2
该图描绘了为实例2的表位定位分析产生的CLDN18.2构建体(嵌合体/点突变)。它还显示了人CLDN18.1环1与人CLDN18.2环1之间的序列比对，并突出显示了这两个分子不同的八个位置P1-P8。还参见实例1。
图3
表位定位分析的结果，参见实例2。该图显示了未转染的CHO细胞以及用huCLDN18.1、hu CLDN18.2、hu CLDN6和hu CLDN9转染的CHO细胞(左侧)的FACS分析。在右侧，该图显示了用三种不同的嵌合hu CLDN18.2构建体转染的CHO细胞的FACS分析：将整个环2(ECL2，E2)的氨基酸序列交换为来源于人CLDN9的序列，并且将区域E2A和E2B交换为人CLDN6的对应序列。以5μg/ml的浓度测试所有抗体/抗体构建体。
图4
表位定位分析的结果，参见实例2。该图显示了未转染的CHO细胞以及用huCLDN18.1、hu CLDN18.2、hu CLDN6和hu CLDN9转染的CHO细胞的FACS分析。此外，该图显示了用在指定位置P1-P8处具有一个、两个或三个点突变的十一种不同的hu CLDN18.2构建体转染的CHO细胞的FACS分析(有关进一步的细节，还参见实例1)，以及用四种不同的嵌合huCLDN18.2构建体转染的CHO细胞：将整个环2(ECL2，E2)的氨基酸序列交换为来源于人CLDN9的序列，并且将区域E1B、E1D和E1C交换为人CLDN6的对应序列(有关进一步的细节，还参见实例1)。以5μg/ml的浓度测试所有单特异性抗体，而以20μg/ml的浓度测试CD3 x CLDN18.2双特异性抗体构建体。
第1行：内部制造的α-hu CLDN-18.1
第2行：内部制造的α-hu CLDN-18.2
第3行：α-hu CLDN-6(R&D；MAB3656)
第4行：α-hu CLDN-9(ABIN1720917)
第5行：CL-1 x I2C-scFc
第6行：CL-2 x I2C-scFc
第7行：CL-4 x I2C-scFc
第8行：CL-3 x I2C-scFc
图5
实例5中描述的FACS测定的结果。
图6
实例6中描述的FACS测定的结果。
图7
实例7.4中描述的基于FACS的细胞毒性测定的结果。在测试的所有六种细胞系(五种天然表达细胞系和用hu CLDN18.2转染的CHO细胞)中，与结合不同的CLDN18.2表位的对照构建体(CL-3和CL-4)相比，本发明的抗体构建体(CL-1和CL-2)显示出显著更高的EC50值。
图8
CLDN18.2 x CD3抗体构建体的抗肿瘤活性(平均肿瘤体积与平均值的标准误差(SEM))。参见实例13。
图9
CLDN18.2 x CD3抗体构建体的抗肿瘤形成活性(平均肿瘤体积与平均值的标准误差(SEM))。参见实例14。
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应指出的是，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如，对“一种试剂”的提及包括此类不同试剂中的一种或多种，并且对“该方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指明，否则在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在由本发明所涵盖。
术语“和/或”在本文使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文使用的，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的±20％内、优选±15％内、更优选地±10％内、并且最优选地±5％内。它还包括具体值，例如，“约50”包括值“50”。
贯穿本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则字词“包含(comprise)”以及变型诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当被理解成隐含包括所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含(comprising)”可以用术语“含有”或“包括(including)”来取代，或者有时在本文中使用时用术语“具有”取代。
如本文使用的“由……组成”排除了在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文使用的，“基本上由……组成”并不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者都可以用另外两个术语中的任一者来替环。
应当理解，以上描述和以下实例提供了示例性的布置，但是本发明不限于本文描述的特定方法、技术、方案、材料、试剂、物质等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不打算限制仅由权利要求限定的本发明的范围。在独立权利要求中提供了本发明的各个方面。在从属权利要求中提供了本发明的一些可选特性。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均据此通过引用整体并入。本文没有任何内容应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些披露内容。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时，本说明书将替代任何此类材料。
将从以下实例中获得对本发明及其优点的更好理解，这些实例仅用于说明目的。这些实例不旨在并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实例1
产生表达CLDN18.2突变的CHO细胞
出于表位定位的目的，将CLDN18.2的E1(细胞外环1；ECL1，SEQ ID NO:2)分成四个亚结构域(E1A、E1B、E1C和E1D)，并且将E2(细胞外环2；ECL2，SEQ ID NO:3)分成两个亚结构域(E2A和E2B)。将人CLDN18.2(E1、E1A、E1B、E1C、E1D、E2、E2A和E2B)的各自表位区(环/结构域或亚结构域)的氨基酸序列交换为人CLDN6的对应序列，除了以下两个例外(参见图1和2)：E2被交换为来源于人CLDN9的序列；并且在具有突变的E1C的构建体(将CLDN18.2 E1C交换为对应的CLDN6区)中，CLDN18.2的E2也被交换为来源于人CLDN9的序列。后者用作检测CLDN18.2/CLDN6-嵌合体的表达的手段。经由FACS分析验证了CHO细胞中所有嵌合构建体的表达(参见下文)。由于没有E1和E1A嵌合构建体表达的证据，因此这些构建体不用于表位定位分析。因此，产生了以下构建体并将其用于表位定位：
CLDN18.2-E1B(CLDN6)→SEQ ID NO:22
CLDN18.2-E1C(CLDN6)-E2(CLDN9)→SEQ ID NO:23
CLDN18.2-E1D(CLDN6)→SEQ ID NO:24
CLDN18.2-E2(CLDN9)→SEQ ID NO:25
CLDN18.2-E2A(CLDN6)→SEQ ID NO:26
CLDN18.2-E2B(CLDN6)→SEQ ID NO:27
人CLDN18.2-ECL2和人CLDN18.1-ECL2的氨基酸序列相同，但在细胞外环1内，CLDN18.2和CLDN18.1在八个位置(29、37、42、45、47、56、65和69)上不同。因此，产生了另外的CLDN18.2突变体并在CHO细胞中表达，其中这八个CLDN18.2位置“P1”至“P8”单独地或按两个或三个位置一组被它们各自的CLDN18.1对应物交换。因此产生了以下构建体：
CLDN18.2-P1-CLDN18.1(Q29M突变)→SEQ ID NO:11
CLDN18.2-P2-CLDN18.1(N37D突变)→SEQ ID NO:12
CLDN18.2-P1/P2-CLDN18.1(Q29M/N37D突变)→SEQ ID NO:13
CLDN18.2-P3-CLDN18.1(A42S突变)→SEQ ID NO:14
CLDN18.2-P4-CLDN18.1(N45Q突变)→SEQ ID NO:15
CLDN18.2-P5-CLDN18.1(Q47E突变)→SEQ ID NO:16
CLDN18.2-P3/P4/P5-CLDN18.1(A42S/N45Q/Q47E突变)→SEQ ID NO:17
CLDN18.2-P6-CLDN18.1(E56Q突变)→SEQ ID NO:18
CLDN18.2-P7-CLDN18.1(G65P突变)→SEQ ID NO:19
CLDN18.2-P8-CLDN18.1(L69I突变)→SEQ ID NO:20
CLDN18.2-P7/P8-CLDN18.1(G65P/L69I突变)→SEQ ID NO:21
为了产生表达上述构建体的CHO细胞，以及产生作为对照的表达hu-CLDN18.2、hu-CLDN18.1、hu-CLDN6和hu-CLDN9(SEQ ID NO:1、4、9和10)的CHO细胞，将各自的编码序列克隆到命名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等人Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学免疫治疗]50(2001)141-150中)。所有克隆程序均按照标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning；A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold SpringHarbour Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbour,New York[纽约冷泉港](2001))。对于每种构建体，将相应的质粒转染到DHFR缺陷的CHO细胞中用于真核表达，如由Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.[酶学方法]185,537-566所述。
分别使用以5μg/ml浓度的针对CLDN18.2(内部制造的单克隆抗hu CLDN18.2抗体)、CLDN18.1(内部制造的单克隆抗hu CLDN18.1抗体)、CLDN6(R&D小鼠抗人CLDN6单克隆抗体MAB3656)和CLDN9(大鼠抗人CLDN9单克隆抗体ABIN1720917)的抗体，在FACS测定中验证上述构建体在CHO细胞上的表达。作为阴性对照，将细胞与代替第一抗体的同种型对照抗体(BD 553454/R&D MAB0041/R&D MAB0061)一起孵育。用第二抗小鼠/抗大鼠/抗人IgG Fc-γ-PE(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)115-116-071/112-116-071/109-116-098)检测结合的单克隆抗体。通过流式细胞术测量这些样品。
实例2
抗CLDN18.2抗体构建体的表位定位
将用实例1中所描述的构建体转染的CHO细胞用浓度为20μg/ml的纯化的CLDN18.2x CD3抗体构建体染色。用抗人IgG Fc-γ-PE(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch)；1:100)检测结合的抗体构建体。将所有抗体在PBS/2％FCS中稀释。作为阴性对照，将细胞与PBS/2％FCS一起孵育，随后与抗人IgG Fc-γ-PE一起孵育。通过流式细胞术测量这些样品。
表位定位分析的结果显示在图3和4中。当观察到表达某种CLDN18.2嵌合体或突变的细胞丧失FACS信号时，假定各自的CLDN18.2 x CD3抗体构建体结合表位(环/结构域/亚结构域)或结合在该CLDN18.2嵌合或突变分子中被交换的特定氨基酸。换句话说，该表位区域或氨基酸是结合被分析的CLDN18.2 x CD3抗体构建体所必需的。除了用于证明各自靶标的正确表达的对照抗体外，还在表位定位分析中特异性地测试了以下CLDN18.2 x CD3抗体构建体：
CL-1 x I2C-scFc(SEQ ID NO:132)
CL-2 x I2C-scFc(SEQ ID NO:144)
CL-3 x I2C-scFc(SEQ ID NO:149)
CL-4 x I2C-scFc(SEQ ID NO:154)
虽然CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc是根据本发明的抗体构建体，但是CL-3x I2C-scFc和CL-4 x I2C-scFc具有抗CLDN18.2 VH和VL区(分别被披露为WO 2014/075788的SEQ ID NO:8+15和SEQ ID NO:6+11)。
如图4所示，CL-3 x I2C-scFc抗体构建体明显需要位置P3(A42)、P4(N45)和P6(E56)来进行其与CLDN18.2的特异性结合。位置P4位于命名为E1B的亚结构域内，并且位置P6位于命名为E1C的亚结构域内。因此并且同样地，这些亚结构域与CLDN6对应序列的交换导致FACS信号丧失。观察到这三个位置对于CL-3 x I2C-scFc与CLDN18.2的结合是相关的，证实了先前公布的结果。以CL-4 x I2C-scFc命名的抗体构建体具有非常相似的结合模式(参见图4)。
相比之下，CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc两种抗体构建体明显需要位置P6(E56)来进行其与CLDN18.2的特异性结合。但是，其他位置(特别是P3和P4)的交换似乎对CL-1 x I2C-scFc或CL-2 x I2C-scFc与CLDN18.2的结合没有任何影响。与该观察结果一致，亚结构域E1C(位置P6位于其中)与CLDN6对应序列的交换-但不是E1B或E1D的交换-导致FACS信号丧失。因此，图4中所描绘的表位定位结果显示CL-1 x I2C-scFc和CL-2 x I2C-scFc结合CLDN18.2的ECL1内的相同表位，并且该表位不同于CL-3 x I2C-scFc和CL-4 xI2C-scFc的表位。
实例3
基于Biacore确定对人和食蟹猴CD3和FcRn的亲和力
使用重组人/猕猴CD3-ECD(ECD＝细胞外结构域)融合蛋白与鸡白蛋白进行Biacore分析实验，以确定本发明的抗体构建体的靶标结合。
详细地，根据制造商的手册，使用pH 4.5的乙酸盐缓冲液，用大约600-800RU的相应重组抗原固定CM5传感器芯片(GE医疗集团(GE Healthcare))。按以下浓度的稀释系列加载CLDN18.2 x CD3抗体构建体：在HBS-EP运行缓冲液(GE医疗集团)中稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.13nM。流速为30μl/min，持续3min，然后再次以30μl/ml的流速应用HBS-EP运行缓冲液8min至20min。使用10mM甘氨酸10mM NaCl pH 1.5溶液进行芯片的再生。使用BiaEval软件分析数据集。通常，进行两次独立实验。
根据本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体显示出对纳摩尔范围内的人CD3的高亲和力。使与猕猴CD3的结合平衡，也显示出在相似范围内的亲和力。在表2中显示了亲和力值以及计算的亲和力差距。
表2：如通过Biacore分析确定的CLDN18.2 x CD3抗体构建体对人和猕猴CD3的亲和力，以及计算的种间亲和力差距。在与第1行和第2行中的构建体不同的(单独的)测定中测量第3-5行中的构建体。
Figure BDA0002918294490000951
同样，对于命名为CL-1 x I2C-scFc、CL-2 x I2C-scFc、CL-3 x I2C-scFc和CL-4x I2C-scFc的构建体，经由Biacore测定证实了对人和食蟹猴FcRn的平衡结合。
实例4
对靶抗原阳性细胞上的人和猕猴CLDN18.2的亲和力的基于Scatchard的分析
通过Scatchard分析确定了CLDN18.2 x CD3抗体构建体对用人或猕猴CLDN18.2转染的CHO细胞的亲和力。对于该分析，使用单价检测系统进行饱和结合实验，以精确确定CLDN18.2 x CD3抗体构建体与相应细胞系的单价结合。
将重组表达人CLDN18.2的CHO细胞系的2x104个细胞各自与相应抗体构建体的50μl的起始于100-200nM的稀释系列(以1:2进行的十二个稀释液)一起孵育(直至达到饱和)，随后是在搅拌下在4℃下孵育16h和一个残余物洗涤步骤。然后，将细胞与30μl的AlexaFluorTM488-缀合的AffiniPureTMFab片段山羊抗人IgG(H+L)溶液一起孵育另一小时。在一个洗涤步骤之后，将细胞重悬于含有3.5％甲醛的150μl FACS缓冲液中，再孵育15min，离心，重悬于FACS缓冲液中并经由FACS软件进行分析。数据产生自两组独立的实验，每组使用一式三份。计算各自的一个位点特异性结合评价以外推最大结合(Bmax)。确定在半数最大结合处的抗体构建体的浓度，反映各自的KD。将一式三份测量的值绘制为双曲线和S形曲线，以展示从最小到最佳结合的适当浓度范围。
表3中描述的值源自于每个抗体构建体的两个独立实验。基于细胞的Scatchard分析证实，本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体对人CLDN18.2的亲和力为纳摩尔级的，并且由于人和猕猴细胞外结构域的序列同一性，呈现的食蟹猴/人种间亲和力差距为1。
表3：如在基于细胞的Scatchard分析中确定的CLDN18.2 x CD3抗体构建体对CLDN18.2的亲和力(KD)。在两个独立的实验中测量了抗体构建体，每个实验使用稀释系列。*人和食蟹猴CLDN18.2在细胞外结构域中共享相同的氨基酸序列。因此，按照定义亲和力差距等于“1”
Figure BDA0002918294490000961
在相同条件下进行的单独Scatchard测定中，在相同条件下测量CL-2 x I2C-scFc对于人CLDN18.2的基于细胞的亲和力为11.13±2.72。
实例5
确认与CLDN18.2和人/食蟹猴CD3表达细胞的结合
为了确认与人CLDN18.2和CD3以及与食蟹猴CD3的结合，通过流式细胞术使用以下细胞测试了本发明的抗体构建体：
·用人CLDN18.2转染的CHO细胞，
·表达CD3的人T细胞白血病细胞系HPB-all(德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，布伦瑞克(Braunschweig)，ACC483)，以及
·表达食蟹猴CD3的T细胞系LnPx 4119
对于流式细胞术，将各自细胞系的200,000个细胞在4℃下与浓度为5μg/ml的纯化抗体构建体一起孵育60min。在洗涤之后，用山羊抗人Fc-γ-PE(1:100)在4℃下检测具有Fc结构域的结合抗体构建体持续30min。用对CD3结合部分具有特异性的内部制造的小鼠抗体、随后用山羊抗小鼠Fc-γ-PE(1:100)在4℃下检测具有his标签的抗体构建体持续30min。通过流式细胞术测量样品。将未转染的CHO细胞用作阴性对照。
将结果显示于图5中。本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体将用人CLDN18.2转染的CHO细胞染色。抗体构建体还识别表达CD3的人和食蟹猴T细胞系。未转染的CHO细胞没有染色，并且CLDN18.2转染的CHO细胞没有被阴性对照抗EGFRvIII xI2C-scFc抗体构建体染色。
实例6
确认不存在与人CLDN18.2旁系同源物的结合
将人CLDN18.2旁系同源物CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和CLDN9稳定转染到CHO细胞中。如在本实例中使用的旁系同源物的序列描述于SEQ ID NO:4-10中。在FACS分析中使用对各个旁系同源物具有特异性的抗体证实了蛋白质表达：
CLDN1：大鼠抗人(5μg/ml最终)储液：100μg/ml R&D，MAB4618
CLDN2：内部制造的小鼠Ab(1:100-200)
CLDN3：小鼠抗人(5μg/ml最终)储液：500μg/ml R&D，MAB4620
CLDN4：小鼠抗人(5μg/ml最终)储液：500μg/ml R&D，MAB4219
CLDN6：小鼠抗人(5μg/ml最终)储液：500μg/ml R&D，MAB3656
CLDN9：大鼠抗人(5μg/ml最终)储液：2mg/ml，antibodies-online.com，ABIN1720917
CLDN18.1：内部制造的单克隆小鼠Ab(5μg/ml最终)
将转染的CHO细胞与浓度为5μg/ml的各自的抗体(参见上文)在4℃下孵育60min，随后与相应的PE缀合的抗体山羊抗小鼠IgG,Fc-γ片段PE缀合的(1:100)(杰克逊公司(Jackson)115-116-071)或山羊抗大鼠IgG,Fc-γ片段PE缀合的(1:100)(杰克逊公司(Jackson)112-116-071)在4℃下孵育30min。
如实例5中所描述的进行流式细胞术测定。将结果显示于图6中。分析证实，在该测定中测试的本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体不与人CLDN18.2旁系同源物交叉反应。
实例7
细胞毒性活性
在不同的体外细胞毒性测定中分析了本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体在针对表达CLDN18.2的靶细胞将效应T细胞重定向方面的效力：
·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量了CLDN18.2 x CD3抗体构建体在针对人CLDN18.2转染的CHO细胞将刺激的人CD8+效应T细胞重定向方面的效力。
·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量了CLDN18.2 x CD3抗体构建体在针对人CLDN18.2转染的CHO细胞将猕猴T细胞系重定向方面的效力。
·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量了CLDN18.2 x CD3抗体构建体在针对人CLDN18.2转染的CHO细胞(以及使用人CLDN18.1转染的CHO细胞的阴性对照)将在未刺激的人PBMC中的T细胞重定向方面的效力。
·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量了CLDN18.2 x CD3抗体构建体在针对CLDN18.2阳性人胃癌细胞系如SNU-601或SNU-620将在未刺激的人PBMC中的T细胞重定向方面的效力。
实例7.1
用刺激的人T细胞进行的铬释放测定
如下获得富集CD8+ T细胞的刺激的T细胞：将皮氏培养皿(直径145mm)用终浓度为1μg/ml的可商购的抗CD3特异性抗体(OKT3，强生公司(Orthoclone))在37℃下包被1小时。通过用PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白质。将3-5x107个人PBMC添加到在含有稳定的谷氨酰胺/10％FCS/20U/ml IL-2的120ml RPMI 1640中预包被的皮氏培养皿中并刺激2天。在第三天，将细胞收集并用RPMI 1640洗涤一次。将IL-2添加至终浓度为20U/ml，并将细胞在与上述相同的细胞培养基中再次培养一天。根据制造商的方案，使用Dynal-Beads通过耗尽CD4+ T细胞和CD56+ NK细胞来富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
将人CLDN18.2转染的CHO靶细胞用PBS洗涤两次，并在具有50％FCS的100μl RPMI终体积中用11.1MBq 51Cr在37℃下标记60分钟。随后，用5ml RPMI将标记的靶细胞洗涤3次，并且然后用于细胞毒性测定中。在96孔板中在200μl补充RPMI的总体积中按10:1的E:T比进行该测定。使用起始浓度为0.01-1μg/ml的纯化抗体构建体及其三倍稀释液。该测定的孵育时间为18小时。细胞毒性被确定为在上清液中释放的铬相对于最大裂解(添加Triton-X)和自发裂解(没有效应细胞)的差异的相对值。所有测量均以一式四份进行。在γ计数器中进行上清液中铬活性的测量。使用适当的软件对结果进行分析。将通过分析程序从S形剂量响应曲线计算的EC50值用于比较细胞毒性活性。
实例7.2
用未刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。在采血当天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏PBS进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。在100x g下离心PBMC后，经由上清液除去血小板。剩余的淋巴细胞主要包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC在含有10％FCS的RPMI培养基中于37℃/5％CO2下保持培养。
CD14+和CD56+细胞的耗尽
为了耗尽CD14+细胞，使用人CD14 MicroBeads(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec)，MACS，#130-050-201)。为了耗尽NK细胞，使用人CD56 MicroBeads(美天旎生物技术有限公司，MACS，#130-050-401)。对PBMC计数并将其在室温下以300x g离心10min。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液(80μl/107个细胞；PBS、0.5％(v/v)FBS、2mM EDTA)中。添加CD14 MicroBeads和CD56 MicroBeads(20μl/107个细胞)并在4℃-8℃下孵育15min。用MACS分离缓冲液(1-2ml/107个细胞)洗涤细胞。在离心(参见上文)之后，弃去上清液并将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μl/108个细胞)中。然后使用LS柱(美天旎生物技术有限公司，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将没有CD14+/CD56+细胞的PBMC在培养箱中在RPMI完全培养基(即补充有10％FBS、1x非必需氨基酸、10mMHepes缓冲液、1mM丙酮酸钠和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI1640)中在37℃下培养直至需要时。
靶细胞标记
为了在流式细胞术测定中分析细胞裂解，将荧光膜染料DiOC18(DiO)(分子探针公司(Molecular Probes))用于标记靶细胞(如人CLDN18.2转染的CHO细胞)并将它们与效应细胞区分开。简言之，将细胞收获，用PBS洗涤一次，并在含有2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μl/106个细胞)的PBS中调节至106个细胞/ml。在37℃下孵育3min之后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次，并将细胞数目调节至1.25x105个细胞/ml。使用0.5％(v/v)等渗EosinG溶液确定细胞的活力。
基于流式细胞术的分析
设计该测定以在CLDN18.2 x CD3抗体构建体的连续稀释液的存在下定量靶细胞(如人CLDN18.2转染的CHO细胞)的裂解。将等体积的DiO标记的靶细胞和效应细胞(即，没有CD14+细胞的PBMC)混合，得到10:1的E:T细胞比。将160μl该悬浮液转移到96孔板的每个孔中。添加40μl待分析的CLDN18.2 x CD3抗体构建体系列稀释液(以及可能的话，识别无关靶抗原的阴性对照抗体构建体如基于抗CD3(I2C)的双特异性抗体构建体)或RPMI完全培养基作为另外的阴性对照。抗体构建体介导的细胞毒性反应在7％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将细胞转移到新的96孔板中，并且通过添加终浓度为1μg/ml的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是通常被排除在活细胞之外的膜不可透过染料，然而死细胞则通过荧光发射将其吸收并变得可鉴定。
在FACSCanto II仪器上通过流式细胞术测量样品，并通过FACSDiva软件(均来自BD公司(Becton Dickinson))进行分析。将靶细胞鉴定为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞被分类为活的靶细胞。细胞毒性的百分比根据下式计算：
Figure BDA0002918294490001011
n＝事件数
使用Prism软件(图板软件公司(GraphPad Software Inc.))，将细胞毒性的百分比相对于相应的抗体构建体浓度绘图。使用四个参数逻辑回归模型来分析剂量反应曲线，用于评价具有固定坡面的S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
实例7.3
针对靶细胞将未刺激的人PBMC重定向的效力
在基于FACS的48h细胞毒性测定中，使用未刺激的人PBMC(CD14阴性/CD56阴性)作为效应细胞和使用以下作为靶细胞按10:1的E:T比分析CLDN18.2 x CD3抗体构建体的细胞毒性活性：
(1)用人CLDN18.2转染的CHO细胞，
(2)用人CLDN18.1转染的CHO细胞，以及
(3)天然表达细胞系SNU-601和SNU-620。
如上文实例7.2中所描述的进行该测定。将细胞毒性测定的结果显示在表4中。
表4：如用未刺激的人PBMC作为效应细胞在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量的CLDN18.2 x CD3抗体构建体的EC50值[pM]。靶细胞：(1)用hu CLDN18.2转染的CHO细胞；(2)用hu CLDN18.1转染的CHO细胞；(3)SNU-601；(4)SNU-620。
Figure BDA0002918294490001021
该测定证明，本发明的抗体构建体对用CLDN18.2旁系同源物CLDN18.1转染的CHO细胞没有表现出显著的不希望的细胞毒性活性(以灰色突出显示的行)。在命名为“CL-1 xI2C-6His”的构建体的情况下，CLDN18.2-CHO的EC50值与CLDN18.1-CHO的EC50值之间的因子几乎为4.000。此外，在命名为“CL-1 x I2C-scFc”的构建体的情况下，CLDN18.2-CHO的EC50值与CLDN18.1-CHO的EC50值之间的因子几乎为20.000。
通常，与具有较低靶标表达率的靶细胞相比，当使用在细胞表面上表达较高的CLDN18.2水平的靶细胞时，预期EC50值较低。因此，通常观察到，并且在本测定中证明，与使用天然表达物相比，用CLDN18.2转染的CHO细胞的使用倾向于导致较低的EC50值。
实例7.4
针对天然表达靶细胞将人PBMC重定向的效力
将本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体的细胞毒性活性与结合CLDN18.2靶标(CL-3和CL-4，参见实例2)内的不同表位的其他CLDN18.2 x CD3抗体构建体进行比较。将稳定表达内源水平的CLDN18.2的癌症细胞系(GSU、NUGC、IM95、SNU620、SNU601)和CLDN18.2阴性对照细胞系AGS用萤光素酶(Luc)稳定标记。此外，稳定转染CHO细胞以过表达CLDN18.2。将两个人T细胞供体用作效应细胞的来源。细胞毒性测定的E:T比为10:1。抗体构建体的1:3系列滴定开始于30nM的浓度。将测定在37℃下孵育48h。对于Luc标记的细胞，通过萤光素酶测定系统ONE-GloTM(普洛麦格公司(Promega))进行细胞毒性读数，并且对于CLDN18.2转染的CHO细胞，通过发光细胞活力测定CellTiter-GloTM(普洛麦格公司)进行细胞毒性读数。
除了抗CLDN18.2 VH和VL区的序列外，抗体构建体CL-3和CL-4与在本实例的细胞毒性测定中分析的本发明的抗体构建体相同。在，两种抗体构建体CL-3和CL-4的VH和VL区分别被披露为WO 2014/075788中的SEQ ID NO:8+15和SEQ ID NO:6+11。还参见如本文所披露的SEQ ID NO:145+146和SEQ ID NO:150+151。
将结果显示在下表5和图7中。不考虑靶细胞，显示本发明的抗体构建体(此处：CL-1、CL-2)具有比结合不同CLDN18.2表位的抗体构建体(CL-3、CL-4)显著更高的细胞毒性效力。虽然本发明的抗体构建体显示在2位数皮摩尔范围内的EC50值，但比较构建体显示在三位数至5位数皮摩尔范围内的EC50值。没有一种构建体显示出对靶标阴性细胞系的任何活性(数据未显示)。
表5：如在48小时细胞毒性测定中测量的，CLDN18.2 x CD3抗体构建体的EC50值[pM]。
Figure BDA0002918294490001031
为了排除这些观察结果是由于与对照构建体(此处：CL-3)相比，本发明的抗体构建体(此处：CL-1、CL-2)具有显著更高的亲和力，使用用hu Cldn18.2转染的CHO细胞进行基于细胞的亲和力测定。表明，三种测试构建体CL-1、CL-2和CL-3的亲和力处于非常相似的范围内。这意味着对于本发明的抗体构建体所展示的有利的表位/活性关系不是由于对照构建体仅具有较低的亲和力并因此表现出较低的细胞毒性活性。相反，效力似乎是因为由本发明的抗体构建体识别的CLDN18.2内的特定表位。
实例7.5
针对表达CLDN18.2的CHO细胞将猕猴T细胞重定向的效力
在48h基于FACS的细胞毒性测定中使用用人CLDN18.2转染的CHO细胞作为靶细胞和猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等人Blood[血液]95:3256-61(2000))作为效应细胞来源按10:1的E:T比分析CLDN18.2 x CD3抗体构建体的细胞毒性活性。注意，人和食蟹猴CLDN18.2在细胞外结构域中共享相同的氨基酸序列。如上文实例7.2中所描述的进行转染的CHO细胞的靶细胞标记和基于流式细胞术的细胞毒性活性分析。
将结果显示在表6中。通过根据本发明的CLDN18.2 x CD3抗体构建体诱导来自细胞系4119LnPx的猕猴T细胞，以有效杀死CLDN18.2转染的CHO细胞。在该测定中，抗体构建体有效地呈现1位数至2位数皮摩尔EC50值，证实它们在猕猴系统中非常有活性。
表6：如在48小时基于FACS的细胞毒性测定中使用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞和用人CLDN18.2转染的CHO细胞作为靶细胞测量的CLDN18.2 x CD3抗体构建体的EC50值[pM]。
CLDN18.2 x CD3抗体构建体 EC50[pM]
CL-1 x I2C-scFc 38
CL-1 x I2C-6His 7.2
实例8
在(i)三次冷冻/解冻循环和(ii)在37℃下孵育7天之后单体向二聚体的转化
使CLDN18.2 x CD3单体抗体构建体经受不同的胁迫条件，随后进行高性能SEC，以确定已转化为二聚体抗体构建体的初始单体抗体构建体的百分比。
(i)用通用配制缓冲液将25μg单体抗体构建体调节至250μg/ml的浓度，并且然后在-80℃下冷冻30min，随后在室温下解冻30min。在三次冷冻/解冻循环之后，通过HP-SEC确定二聚体含量。
(ii)用通用配制缓冲液将25μg单体抗体构建体调节至250μg/ml的浓度，随后在37℃下孵育7天。通过HP-SEC确定二聚体含量。
将基于高性能(HP)二氧化硅的尺寸排阻液相色谱(SEC)柱连接到配备有自动进样器的FPLC。柱平衡和运行缓冲液由调节至pH 6.6的100mM KH2PO4-200mM Na2SO4组成。将抗体构建体溶液(25μg蛋白质)应用于平衡的柱上，并且在7MPa的最大压力下以0.75ml/min的流速进行洗脱。在280、254和210nm光学吸光度下监测整个运行。通过软件运行评价表中记录的210nm信号的峰积分进行分析。通过将二聚体峰的面积除以单体加二聚体峰的总面积来计算二聚体含量。
将结果显示在下表7中。分析的CLDN18.2 x CD3抗体构建体在三次冷冻/解冻循环之后呈现0.0％的二聚体百分比，并且在37℃下孵育7天之后呈现≤2％的二聚体百分比。
表7：如通过高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)确定的单体与二聚体CLDN18.2 x CD3抗体构建体的百分比。
Figure BDA0002918294490001051
实例9
热稳定性
如下确定抗体聚集温度：将浓度为250μg/ml的40μl抗体构建体溶液转移到一次性比色杯中并置于动态光散射装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，恒定获取测量的半径。通过随DLS装置递送的软件包使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算抗体构建体的聚集温度。
显示抗体构建体CL-1 x I2C-scFc具有≥51℃(更具体地51.7℃)的有益聚集温度。在单独的测定中，显示命名为CL-1 x I2C-6His的分子的聚集温度具有≥45℃(更具体地49.7℃)的值。
实例10
在单体抗体构建体浓度为2.5mg/ml下的浊度
将浓度为250μg/ml的1ml纯化抗体构建体溶液通过自旋浓缩单元(spinconcentration unit)浓缩至2500μg/ml。在5℃下储存16h之后，溶液的浊度通过针对通用配制缓冲液的OD340 nm光学吸收测量来确定。
抗体构建体CL-1 x I2C-scFc显示具有≤0.021的非常有利的浊度，而CL-1 xI2C-6His显示具有≤0.029的非常有利的浊度。在三次冷冻/解冻循环之后的类似浊度测量导致CL-1 x I2C-scFc的浊度为0.021。
实例11
通过高分辨率阳离子交换色谱分析蛋白质同质性
通过高分辨率阳离子交换色谱(CIEX)分析本发明的抗体构建体的蛋白质同质性。
在一个测定中，用50ml结合缓冲液A(20mM磷酸二氢钠、30mM NaCl、0.01％辛酸钠，pH 5.5)稀释50μg抗体构建体单体，并将40ml该溶液应用于连接到FPLC设备的1ml BioProSP-F柱(YMC公司，德国)。在样品结合之后，用另外的结合缓冲液进行洗涤步骤。对于蛋白质洗脱，在10个柱体积内应用使用缓冲液B(20mM磷酸二氢钠、1000mM NaCl、0.01％辛酸钠，pH5.5)至50％百分比的缓冲液B的线性递增盐梯度。在280、254和210nm光学吸光度下监测整个运行。通过软件运行评价表中记录的280nm信号的峰积分进行分析。在该测定中，命名为“CL-1 x I2C-6His”的分子(SEQ ID NO:131)的同质性显示具有82.5％的值。
在另一个测定中，将Bio SCX分析型CIEX柱(安捷伦公司(Agilent)，德国法兰克福(Frankfurt,Germany))连接至UPLC设备(沃特斯公司(Waters)，德国埃施波恩(Eschborn,Germany))，并用由50mM MES(pH 5.6)、0.05％叠氮化钠组成的缓冲液A(结合缓冲液)平衡。将10μg抗体构建体单体应用于柱并与柱基质结合。在样品结合之后，用另外的结合缓冲液B进行洗涤步骤。对于蛋白质洗脱，应用使用由50mM MES、1000mM氯化钠pH 5.6、0.05％叠氮化钠组成的缓冲液B至50％百分比的缓冲液B的线性递增盐梯度。在280nm光学吸光度下监测整个运行。通过软件运行评价表中记录的280nm信号的峰积分进行分析。在该测定中，命名为“CL-1 x I2C-scFc”的分子(SEQ ID NO:132)显示具有97.6％的同质性(主峰的曲线下面积(＝AUC))。
实例12
如通过HIC丁基测量的表面疏水性
在疏水性相互作用色谱HIC中在流通模式中测试抗体构建体CL-1 x I2C-scFc和CL-1 x I2C-6His的表面疏水性。
将50μg单体抗体构建体用通用配制缓冲液稀释至终体积500μl(10mM柠檬酸、75mM赖氨酸HCl、4％海藻糖，pH 7.0)并应用于连接至
Figure BDA0002918294490001071
净化器FPLC系统的1ml丁基琼脂糖凝胶FF柱上。在280、254和210nm光学吸光度下监测整个运行。通过
Figure BDA0002918294490001072
Unicorn软件运行评价表中记录的280nm信号的峰积分进行分析。通过比较蛋白质信号的上升和下降的面积和速度来评价洗脱行为，从而表明抗体构建体与基质的相互作用的强度。
抗体构建体具有良好的洗脱行为，其快速且完整。
实例13
CLDN18.2 x CD3抗体构建体在NOD/SCID小鼠的GSU-luc晚期胃癌模型中的功效评价
在雌性NOD/SCID小鼠模型中测试了具有SEQ ID NO:132的CLDN18.2 x CD3抗体构建体(CL-1 x I2C-scFc)的抗肿瘤活性，该小鼠在第1天用5x106个GSU-luc(萤光素酶)细胞皮下注射。在第8天腹膜内注射2x 107个效应细胞(体外扩增和激活的人CD3+ T细胞)。治疗发生在第12天、第19天和第26天(Q7D x 3)。将两个对照组(一个没有T细胞(第1组)、另一个具有T细胞(第2组))用0.1ml/施用的运载体(25mM L-赖氨酸、0.002％(w/v)聚山梨醇酯80于0.9％(w/v)氯化钠pH 7.0中)通过静脉内推注注射进行治疗。将抗体构建体以1mg/kg/施用的浓度在0.1ml的终体积中通过静脉内推注注射施用(第3组)。每组的小鼠数目为5只(第1组)、10只(第2组)和10只(第3组)。
在研究期间通过卡尺测量肿瘤并且通过肿瘤体积(TV)的组间比较评价进展。通过将肿瘤体积计算为T/C(％)＝100x(分析组的中值TV)/(对照组的中值TV)来确定第x天的肿瘤生长抑制T/C[％]，并且将计算的值描述在表8中。
表8：NOD/SCID小鼠中GSU-luc晚期胃癌模型的T/C[％]值。“中值”＝分析组的中值肿瘤体积。
Figure BDA0002918294490001081
此外，将结果显示在图8中。在本发明的晚期肿瘤分析中，在NOD/SCID小鼠模型中显示出显著的肿瘤生长抑制。此外，用CLDN18.2 x CD3抗体构建体治疗对小鼠的体重没有影响(数据未显示)。
实例14
CLDN18.2 x CD3抗体构建体在雌性无胸腺裸鼠的SNU620-luc肿瘤形成异种移植模型中的抗肿瘤活性的评价
在雌性无胸腺裸鼠模型中测试了具有SEQ ID NO:132的CLDN18.2 x CD3抗体构建体(CL-1 x I2C-scFc)的抗肿瘤活性，该小鼠在第1天用在50％基质胶中的SNU620-luc(5x106个靶细胞)/PBMC(2.5x106个效应细胞)混合物皮下注射。第1-4组的治疗发生在第3天、第10天和第17天(Q7D)。将接受肿瘤/PBMC混合物(第1组)的对照组用运载体(25mM L-赖氨酸、0.002％(w/v)聚山梨醇酯80于0.9％(w/v)氯化钠pH 7.0中)以0.1ml/施用通过静脉内推注注射施用。将抗体构建体以1mg/kg/施用(第2组)、0.1mg/kg/施用(第3组)和0.01mg/kg/施用(第4组)的浓度以0.1ml的体积通过静脉内推注注射施用。每组的小鼠数目为10只。
在研究期间通过卡尺测量肿瘤并且通过肿瘤体积(TV)的组间比较评价进展。通过将肿瘤体积计算为T/C(％)＝100x(分析组的中值TV)/(对照组的中值TV)来确定第x天的肿瘤生长抑制T/C[％]，并且将计算的值描述在表9中。
表9：雌性无胸腺裸鼠的SNU620-luc肿瘤形成异种移植模型的T/C[％]值。“中值”＝分析组的中值肿瘤体积。
Figure BDA0002918294490001091
此外，将结果显示在图9中。使用所有测试浓度的CLDN18.2 x CD3抗体构建体在无胸腺裸鼠模型中显示显著的肿瘤生长抑制。此外，用CLDN18.2 x CD3抗体构建体治疗对小鼠的体重没有影响(数据未显示)。
实例15
食蟹猴探索性毒理学研究
使用CLDN18.2 x CD3抗体构建体CL-1 x I2C-6His(SEQ ID NO:131)通过静脉内施用进行探索性NHP耐受性研究。在25μg/kg/天的起始剂量(约20x人EC90)之后达到的全身暴露耐受性良好。剂量递增至125μg/kg/天(约120x人EC90)导致从靶向CLDN18.2的T细胞接合抗体构建体预期的临床和组织病理学效应。
实例16
体外组合疗法研究
用CL-1 x I2C-scFc治疗激活人T细胞，导致T细胞上PD-1的上调(数据未显示)。该治疗还可能导致肿瘤细胞上PD-L1的上调。将CLDN18.2阳性的GSU和NUG-C4胃癌细胞系工程化以过表达PD-L1。在不存在或存在抗PD-1抗体的情况下，将细胞与CL-1 x I2C-scFc和与激活的人T细胞一起孵育，该抗PD-1抗体具有如SEQ ID NO:360中所描述的重链氨基酸序列和如SEQ ID NO:361中所描述的轻链氨基酸序列。在孵育24h之后评估细胞毒性。将结果显示在下表10中。
表10：对两种不同细胞系的两个单独的细胞毒性测定各自的EC50和EC90值[pM]
Figure BDA0002918294490001101
该测定证明，添加抗PD-1抗体增加了本发明的CD3 x CLDN18.2抗体构建体的功效。
实例17
小鼠中的组合疗法研究
使用人/鼠嵌合CD3ε敲入小鼠模型，评价抗体/抗体构建体的治疗组合潜在地增强如本文所述的双特异性抗体构建体的功效。产生双特异性单链抗人CD3(“I2C”scFv)x抗小鼠CLDN18.2(scFv)-scFc替代抗体构建体。该分子在体外展示了针对小鼠CLDN18.2表达细胞的有效活性。然后在遗传修饰的免疫活性小鼠模型(人/鼠嵌合CD3ε敲入)中测试该分子与抗小鼠PD-1、抗小鼠CTLA4和抗小鼠4-1BB(CD137)抗体组合对抗CLDN18.2阳性皮下植入肿瘤(B16F10 muCLDN18.2同源模型)的抗肿瘤活性。根据研究设计，在第10天将具有约50-100mm3的肿瘤体积的小鼠随机化。在每组中包括10只小鼠。在第11天和第18天施用(i.v.)CD3 x CLDN18.2抗体构建体(150μg/kg)或对照(抗CD3 x抗EGFRvIII，150μg/kg)双特异性抗体构建体(iv)，并且在第11天、第14天、第17天和第20天施用抗体(抗PD-1 100μg；抗4-1BB 150μg；抗CTLA4 300μg；抗体同种型作为对照)。在第10天、第13天、第17天、第20天和第25天(终末收获，所有组)测量肿瘤体积。
所有三种抗体都增强了双特异性构建体的功效。激动性抗4-1BB单克隆抗体证明没有针对CLDN18.2阳性肿瘤的单一药剂活性。具体地，将在第25天的肿瘤生长抑制(TGI)确定如下：
对照双特异性抗体构建体+抗体同种型→0％(标准)
对照双特异性抗体构建体+抗4-1BB ab→不显著
对照双特异性抗体构建体+抗CTLA-4ab→21％
CD3 x CLDN18.2抗体构建体+抗体同种型→36％
对照双特异性抗体构建体+抗PD-1ab→57％
CD3 x CLDN18.2抗体构建体+抗CTLA-4ab→76％
CD3 x CLDN18.2抗体构建体+抗4-1BB ab→77％
CD3 x CLDN18.2抗体构建体+抗PD-1ab→79％
序列表
<110> 安进研发(慕尼黑)股份有限公司
安进公司
<120> 针对CLDN18.2和CD3的抗体构建体
<130> AMG16502PCT
<150> US 62/714,366
<151> 2018-08-03
<160> 371
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val
1 5 10 15
Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly
20 25 30
Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met
35 40 45
Leu Gln Ala Val Arg
50
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly
1 5 10 15
Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 5
<211> 211
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile
20 25 30
Tyr Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Thr Ala Gln Ala Met Tyr Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Ser Gln Ser Thr Gly Gln Ile Gln Cys
50 55 60
Lys Val Phe Asp Ser Leu Leu Asn Leu Ser Ser Thr Leu Gln Ala Thr
65 70 75 80
Arg Ala Leu Met Val Val Gly Ile Leu Leu Gly Val Ile Ala Ile Phe
85 90 95
Val Ala Thr Val Gly Met Lys Cys Met Lys Cys Leu Glu Asp Asp Glu
100 105 110
Val Gln Lys Met Arg Met Ala Val Ile Gly Gly Ala Ile Phe Leu Leu
115 120 125
Ala Gly Leu Ala Ile Leu Val Ala Thr Ala Trp Tyr Gly Asn Arg Ile
130 135 140
Val Gln Glu Phe Tyr Asp Pro Met Thr Pro Val Asn Ala Arg Tyr Glu
145 150 155 160
Phe Gly Gln Ala Leu Phe Thr Gly Trp Ala Ala Ala Ser Leu Cys Leu
165 170 175
Leu Gly Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Arg Lys Thr Thr Ser
180 185 190
Tyr Pro Thr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Pro Ala Pro Ser Ser Gly Lys
195 200 205
Asp Tyr Val
210
<210> 6
<211> 230
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Ala Ser Leu Gly Leu Gln Leu Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Ala Met Leu Leu Pro Ser Trp Lys Thr
20 25 30
Ser Ser Tyr Val Gly Ala Ser Ile Val Thr Ala Val Gly Phe Ser Lys
35 40 45
Gly Leu Trp Met Glu Cys Ala Thr His Ser Thr Gly Ile Thr Gln Cys
50 55 60
Asp Ile Tyr Ser Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Asp Ile Gln Ala Ala
65 70 75 80
Gln Ala Met Met Val Thr Ser Ser Ala Ile Ser Ser Leu Ala Cys Ile
85 90 95
Ile Ser Val Val Gly Met Arg Cys Thr Val Phe Cys Gln Glu Ser Arg
100 105 110
Ala Lys Asp Arg Val Ala Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Ile Leu Gly
115 120 125
Gly Leu Leu Gly Phe Ile Pro Val Ala Trp Asn Leu His Gly Ile Leu
130 135 140
Arg Asp Phe Tyr Ser Pro Leu Val Pro Asp Ser Met Lys Phe Glu Ile
145 150 155 160
Gly Glu Ala Leu Tyr Leu Gly Ile Ile Ser Ser Leu Phe Ser Leu Ile
165 170 175
Ala Gly Ile Ile Leu Cys Phe Ser Cys Ser Ser Gln Arg Asn Arg Ser
180 185 190
Asn Tyr Tyr Asp Ala Tyr Gln Ala Gln Pro Leu Ala Thr Arg Ser Ser
195 200 205
Pro Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Lys Ser Glu Phe Asn Ser Tyr
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Tyr Val
225 230
<210> 7
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20 25 30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50 55 60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala
115 120 125
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg
130 135 140
Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly
145 150 155 160
Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr
180 185 190
Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val
210 215 220
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val
20 25 30
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35 40 45
Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile Val Ala Ala Leu Gly Val Leu
85 90 95
Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala
115 120 125
Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile
130 135 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro
180 185 190
Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr
195 200 205
Val
<210> 9
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15
Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu
85 90 95
Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp
100 105 110
Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser
115 120 125
Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
130 135 140
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
180 185 190
Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
210 215 220
<210> 10
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly
100 105 110
Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala
115 120 125
Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
130 135 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg
180 185 190
Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala
195 200 205
Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val
210 215
<210> 11
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
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Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 12
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
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100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
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145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
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Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
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210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
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Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 13
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
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35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 14
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
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115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
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165 170 175
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180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 15
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
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1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
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Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
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Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
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Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 16
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
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<210> 17
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
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<210> 18
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
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245 250 255
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260
<210> 19
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
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Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
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145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260
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<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
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Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 21
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 22
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Gln Val Val Trp Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Met Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 23
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50 55 60
Val Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
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Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Ile
130 135 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile
165 170 175
Gly Gly Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu
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Thr Asn Tyr Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala
195 200 205
Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr
210 215 220
Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val
225 230 235 240
Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val
245 250
<210> 24
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
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Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
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Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
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Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
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210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
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Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
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Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 25
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
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Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
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<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
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Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
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165 170 175
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Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu
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<210> 27
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
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Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
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Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
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65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
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Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gly Ala Ser Leu Phe Val
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Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met Cys
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Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Val
195 200 205
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210 215 220
Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr
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245 250 255
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260
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
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1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Ile Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Ser
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Phe Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr
20 25 30
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<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
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50 55 60
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<210> 36
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr
20 25 30
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50 55 60
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
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Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
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Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Lys Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 45
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 46
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Phe Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Phe Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 53
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1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
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Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 60
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
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<210> 82
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 82
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<223> 合成多肽
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 84
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
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<211> 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 86
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<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
His Arg Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 88
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<211> 109
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
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<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 90
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Ala
180 185 190
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195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<400> 92
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<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Val Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 95
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Lys
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp Ala Tyr
1 5 10
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Lys Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 98
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Lys Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Trp Trp
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
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Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
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180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
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210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 100
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
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<210> 101
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp Ala Tyr
1 5 10
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
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Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 109
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 110
Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 111
Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 112
Lys Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 113
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 113
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1 5 10 15
Val Lys Asp
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 114
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 116
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
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<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
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Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
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Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn
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180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 118
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
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Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 119
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 119
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
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Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
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Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 120
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
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165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 121
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 121
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 122
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 123
Asp Arg Ile Thr Val Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 124
Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 125
Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 127
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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65 70 75 80
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 129
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Trp Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser
180 185 190
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 130
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Trp Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser
180 185 190
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
245 250 255
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260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn
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Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp
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<223> 合成多肽
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65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
245 250 255
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu
260 265 270
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp
275 280 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg
290 295 300
Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
305 310 315 320
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
325 330 335
Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
340 345 350
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly
355 360 365
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro
385 390 395 400
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser
405 410 415
Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln
420 425 430
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu
435 440 445
Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
450 455 460
Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr
465 470 475 480
Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
485 490 495
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
500 505 510
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
515 520 525
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
530 535 540
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
545 550 555 560
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
565 570 575
Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr
580 585 590
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
595 600 605
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
610 615 620
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
625 630 635 640
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
645 650 655
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
660 665 670
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
675 680 685
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
690 695 700
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
705 710 715 720
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly
725 730 735
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
740 745 750
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
755 760 765
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
770 775 780
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
785 790 795 800
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
805 810 815
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
820 825 830
Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu
835 840 845
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
850 855 860
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
865 870 875 880
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
885 890 895
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
900 905 910
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
915 920 925
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
930 935 940
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
945 950 955 960
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
965 970 975
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
980 985
<210> 155
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 155
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 156
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 157
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 157
Gly Gly Gly Gly Gln
1 5
<210> 158
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 158
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 159
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 159
Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 160
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 160
Pro Gly Gly Asp Gly Ser
1 5
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 161
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 162
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 163
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 164
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 165
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 166
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 166
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 167
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 167
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 168
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 169
His His His His His His
1 5
<210> 170
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 170
Arg Asp Trp Asp Phe Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val Gly Gly
1 5 10 15
<210> 171
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 171
Gln Arg Phe Val Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Xaa Pro Ala Asn Gly
1 5 10 15
<210> 172
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 172
Gln Arg Phe Val Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Ala Asn Gly
1 5 10 15
<210> 173
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 173
Gln Arg Phe Val Thr Gly His Phe Gly Gly Leu His Pro Ala Asn Gly
1 5 10 15
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 174
Thr Gly His Phe Gly Gly Leu His Pro
1 5
<210> 175
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 175
Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu His Pro Cys Asn Gly
1 5 10 15
<210> 176
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 177
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 177
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Gly Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Ala Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 178
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 178
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 179
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 179
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
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210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Asp Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Lys Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 206
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 207
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
100 105 110
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
145 150 155 160
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
165 170 175
Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu
180 185 190
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
195 200 205
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
245 250 255
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly
275 280 285
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
290 295 300
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
305 310 315 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 208
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 209
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp
100 105 110
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
130 135 140
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
145 150 155 160
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
165 170 175
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
180 185 190
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
195 200 205
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
210 215 220
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
225 230 235 240
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
245 250 255
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
260 265 270
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
275 280 285
Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
290 295 300
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
305 310 315 320
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325 330 335
Gly Lys
<210> 210
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 211
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 212
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 213
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 214
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 215
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 216
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 217
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 218
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Pro
225
<210> 219
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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225
<210> 220
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
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Pro
225
<210> 221
<211> 227
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
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<223> 合成多肽
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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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<220>
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<400> 245
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<220>
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<400> 246
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195 200 205
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<400> 247
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 248
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 248
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Phe Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 249
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 249
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Tyr Phe
100 105 110
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115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
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145 150 155 160
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly
180 185 190
Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 250
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 250
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Trp
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
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145 150 155 160
Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn
165 170 175
Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Ala
180 185 190
Thr Asp Met Arg Pro Ser Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
195 200 205
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 251
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 251
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Tyr
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115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 252
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 252
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
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Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
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Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 253
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 253
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
130 135 140
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210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 254
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
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Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 255
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val
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Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp
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Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 256
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人
<400> 256
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
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20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
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100 105
<210> 257
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 257
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
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20 25
<210> 258
<211> 96
<212> PRT
<213> 普通狨
<400> 258
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Cys Pro Arg Tyr Asp
20 25 30
Gly His Glu Ile Lys Trp Leu Val Asn Ser Gln Asn Lys Glu Gly His
35 40 45
Glu Asp His Leu Leu Leu Glu Asp Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Val Glu Val Asp
85 90 95
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<211> 27
<212> PRT
<213> 普通狨
<400> 259
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
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<211> 96
<212> PRT
<213> 绒顶柽柳猴
<400> 260
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<211> 27
<212> PRT
<213> 绒顶柽柳猴
<400> 261
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
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<210> 262
<211> 96
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 262
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Ile Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Cys Pro Arg Tyr Asp
20 25 30
Gly Gln Glu Ile Lys Trp Leu Val Asn Asp Gln Asn Lys Glu Gly His
35 40 45
Glu Asp His Leu Leu Leu Glu Asp Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Ala Cys Leu Ser Lys Glu Thr Pro Thr Glu Glu Ala Ser His
65 70 75 80
Tyr Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Val Glu Val Asp
85 90 95
<210> 263
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 263
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Ile Gly Asp Thr Thr Gln Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
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<210> 264
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 265
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<210> 266
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 266
Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr
1 5 10
<210> 267
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 267
Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
1 5 10
<210> 268
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 268
Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly
1 5 10 15
Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 269
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 269
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 270
His His His His His His His
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 271
His His His His His His His His
1 5
<210> 272
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 272
Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile
1 5
<210> 273
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 273
Thr Asp Phe Tyr Leu Lys
1 5
<210> 274
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 274
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 275
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 275
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 276
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 276
Gln Tyr Pro Ala Leu Thr
1 5
<210> 277
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 277
Ser Ser Thr Ser Ser Asp Phe Arg Asp Arg
1 5 10
<210> 278
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 278
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 279
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 279
Glu Tyr Met Pro Met Glu
1 5
<210> 280
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 280
Glu Phe Met Pro Met Glu
1 5
<210> 281
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 281
Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Phe His Ala His Ala
1 5 10 15
His Asn Lys
<210> 282
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 282
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp
1 5
<210> 283
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 283
Lys Pro Pro Thr Pro Pro Pro Glu Pro Glu Thr
1 5 10
<210> 284
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 284
Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 285
Asn Ala Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe
1 5
<210> 286
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 286
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1 5 10 15
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 287
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 288
Ala Trp Ala His Pro Gln Pro Gly Gly
1 5
<210> 289
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 289
His Thr Thr Pro His His
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 290
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 291
Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Asn Tyr Gly Met His
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 294
Asp Pro Ser Ser Leu Thr Gly Ser Thr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 295
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Cys
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Glu Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 298
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Ser Ser Leu Thr Gly Ser Thr Gly Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 299
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Glu Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 300
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Ser Ser Leu Thr Gly Ser
115 120 125
Thr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
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<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 301
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp
35 40 45
Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Tyr Gln Asp Arg Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr
85 90 95
Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser
100 105 110
Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
130 135 140
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
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Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
165 170 175
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
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Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
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Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Ser Tyr Asp Met Ser
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 303
Leu Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 304
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 304
Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 305
<211> 11
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 305
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 306
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 307
Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro His Thr
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 308
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 309
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 310
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ala Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Leu Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Pro Ser Gly His Tyr Phe Tyr Ala
115 120 125
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 311
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Ala Asp Ser Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
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Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 312
Asp Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 313
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 313
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 314
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 314
Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 315
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 315
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr
1 5 10
<210> 316
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 316
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 317
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 317
Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His Arg Val
1 5 10
<210> 318
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 318
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 319
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 319
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 320
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 320
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Val Asp Asp Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser
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100 105 110
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115 120 125
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
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355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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465 470
<210> 321
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 321
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
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Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser
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Gly Asn His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
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Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
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Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
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Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
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Gly
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<223> 合成多肽
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<210> 352
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 352
Asp Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 353
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 353
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 354
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 354
Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 355
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 355
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr
1 5 10
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 356
Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 357
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 357
Tyr Ser Thr Asp Ala Ser Gly Asn His Arg Val
1 5 10
<210> 358
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 358
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 359
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 359
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ala Ser Gly Asn His
85 90 95
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 360
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 360
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Val Asp Asp Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn
115 120 125
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 361
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 361
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Ser Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala
85 90 95
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ala Ser
100 105 110
Gly Asn His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230
<210> 362
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 362
Asp Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 363
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 363
Gly Ile Asn Trp Asn Ala Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 364
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 364
Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 365
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 365
Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr
1 5 10
<210> 366
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 366
Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 367
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 367
Tyr Ser Thr Asp Ala Ser Gly Asn His Arg Val
1 5 10
<210> 368
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 368
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ala Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 369
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 369
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ala Ser Gly Asn His
85 90 95
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 370
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 370
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Val Asp Asp Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ala Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Asn Asn Phe Glu Ser Asn
115 120 125
Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 371
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 371
Met Ala Trp Ala Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys
35 40 45
Lys Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu
50 55 60
Val Ile Ser Glu Asp Ala Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala
85 90 95
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ala Ser
100 105 110
Gly Asn His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230

Claims (19)

1.一种抗体构建体，其包含
·与靶细胞表面上的CLDN18.2结合的第一结构域，以及
·与T细胞表面上的人CD3结合的第二结构域，其中
该第一结构域与如下抗体或抗体构建体一样结合相同的CLDN18.2表位，该抗体或抗体构建体包含如下结构域，该结构域与靶细胞表面上的CLDN18.2结合并且包含：
a)VH区以及VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:123中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；
b)VH区和/或VL区，该VH区包含如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:134中所描述的CDR-H2和如SEQ ID NO:135中所描述的CDR-H3，该VL区包含如SEQ ID NO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3；
c)如SEQ ID NO:127中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:128中所描述的VL区；或
d)如SEQ ID NO:139中所描述的VH区，以及如SEQ ID NO:140中所描述的VL区。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中该第二结构域结合人CD3ε和普通狨或松鼠猴CD3ε。
3.根据权利要求1或2所述的抗体构建体，其中
a)该抗体构建体是单链抗体构建体，
b)该第一结构域处于scFv的形式，
c)该第二结构域处于scFv的形式，
d)该第一结构域和该第二结构域经由接头连接，和/或
e)该抗体构建体包含提供延长的血清半衰期的结构域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域不结合或不显著结合CLDN18.1、CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN6和/或CLDN9。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含含有选自下组的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有选自下组的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，该组由以下组成：
a)如SEQ ID NO:121中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:122中所描述的CDR-H2和如SEQID NO:123中所描述的CDR-H3，如SEQ ID NO:124中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:125中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:126中所描述的CDR-L3；以及
b)如SEQ ID NO:133中所描述的CDR-H1、如SEQ ID NO:134中所描述的CDR-H2和如SEQID NO:135中所描述的CDR-H3，以及如SEQ ID NO:136中所描述的CDR-L1、如SEQ ID NO:137中所描述的CDR-L2和如SEQ ID NO:138中所描述的CDR-L3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQID NO:127或SEQ ID NO:139中所描述的氨基酸序列的VH区。
7.根据前述权利要求中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQID NO:128或SEQ ID NO:140中所描述的氨基酸序列的VL区。
8.根据前述权利要求中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含VH区和VL区，该VH区和VL区具有如SEQ ID NO:127+128或SEQ ID NO:139+140中所描述的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中的一项所述的抗体构建体，其中该第一结构域包含具有如SEQID NO:129或SEQ ID NO:141中所描述的氨基酸序列的多肽。
10.根据前述权利要求中的一项所述的抗体构建体，其包含如下多肽或由其组成，该多肽具有选自在SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144中所描述的那些氨基酸序列的组的氨基酸序列。
11.一种多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所定义的抗体构建体。
12.一种载体，其包含如权利要求11中所定义的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其用如权利要求11中所定义的多核苷酸或用如权利要求12中所定义的载体转化或转染。
14.一种用于产生如权利要求1至10中任一项所定义的抗体构建体的方法，所述方法包括：在允许表达所述抗体构建体的条件下培养如权利要求13中所定义的宿主细胞并且从培养物中回收所产生的抗体构建体。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求1至10中任一项所定义的或根据权利要求14所述的方法产生的抗体构建体。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的或根据权利要求14所述的方法产生的抗体构建体，用于在预防、治疗或缓解疾病、优选赘生物中使用。
17.根据权利要求16所述的抗体构建体，其中该疾病或赘生物选自下组，该组由以下组成：胃肠癌、卵巢癌和肺癌。
18.根据权利要求17所述的抗体构建体，其中该胃肠癌选自下组，该组由以下组成：胃癌、食管癌、胃食管癌、胰腺癌和结直肠癌。
19.一种试剂盒，其包含如权利要求1至10中任一项所定义的抗体构建体、根据权利要求14所述的方法产生的抗体构建体、如权利要求11中所定义的多核苷酸、如权利要求12中所定义的载体、和/或如权利要求13中所定义的宿主细胞。
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