CN109476734B

CN109476734B - Cd70和cd3的抗体构建体

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Publication number: CN109476734B
Application number: CN201680044597.7A
Authority: CN
Inventors: T·劳姆; W·戴斯汀; C·布鲁麦尔; M·潘泽; P·霍夫曼; E·纳赫沃尔德; O·诺兰-史蒂沃克斯; R·路特布斯
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH; Array Biopharma Inc
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH; Array Biopharma Inc
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2036-08-01
Also published as: MX2018001156A; CN109476734A; US10851170B2; JP6879998B2; EP3328890A1; CA2988245A1; EA201890382A1; US20170129961A1; CL2021000717A1; WO2017021354A1; JP2018530996A; TW201706307A; SG10202000834WA; IL256870B; PE20181291A1; PH12018500216A1; ES2837134T3; AU2016302573A1; JO3714B1; KR20180037949A

Abstract

本公开涉及一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。此外，本公开提供了一种编码所述抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本公开提供了一种用于产生本公开的所述抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医疗用途和包含所述抗体构建体的试剂盒。

Description

CD70和CD3的抗体构建体

本发明涉及一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。此外，本发明提供一种编码所述抗体构建体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和用所述多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供一种用于产生本发明的所述抗体构建体的方法、所述抗体构建体的医疗用途和包含所述抗体构建体的试剂盒。

CD70(CD27L，TNFSF7)是II型整合膜蛋白，其正常表达局限于活化的T和B细胞、成熟树突状细胞和胸腺髓质上皮细胞的亚组。CD70的生物学功能经由结合到在淋巴细胞和NK细胞上表达的CD27受体而介导。CD70相互作用调控B细胞成熟、T细胞共刺激和记忆T细胞功能。小鼠中CD27的基因切除(其消除CD70信号传导)不影响B和T细胞的发育，但干扰对病毒再攻击的记忆响应。

除其高度受限的正常表达以外，已在60％的非霍奇金淋巴瘤(Non-HodgkinLymphoma，NHL)、70％的透明细胞肾细胞癌瘤(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)、40％的乳头状RCC和25％的胰腺癌瘤、22％的喉/咽癌瘤、15％的卵巢癌瘤和10％的肺腺癌瘤及胶质母细胞瘤中记录异常的CD70表达。

在美国，每年有14,080人死于转移性RCC(American Cancer Society：CancerFacts and Figures.2015)。虽然所有患者均用血管生成抑制剂(贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼)或mTOR抑制剂(坦罗莫司、依维莫司)加以治疗，但患有转移性RCC的患者的5年存活率却仍然低得令人沮丧(20％)(American Cancer Society：Cancer Facts andFigures 2015)。此疾病仍存在远未满足的医学需求，在美国，每年高达10,000名具有表达CD70的转移性ccRCC的患者可能受益于CD70靶向疗法。

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)为最大的NHL亚型，其每年在美国出现28,740例新病例(American Cancer Society：Cancer Facts and Figures，2015)。71％的DLBCL肿瘤表达CD70，且虽然大多数患者最初对护理标准疗法(美罗华(Rituxan)加环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)有响应，但许多复发或成为难治性的，且每年有19,790名患者死于此疾病(American Cancer Society：Cancer Facts and Figures 2015)。因此，DLCBL仍存在明显未满足的医学需求，并且在美国，每年高达14,000名具有表达CD70的DLBCL的患者可能受益于CD70靶向疗法。

基于在美国每年死于胰腺癌(40,560)、喉咽癌瘤(6,300)、卵巢癌瘤(14,180)和肺癌瘤(158,000)的患者的数量(American Cancer Society：Cancer Facts and Figures，2015)，且考虑到CD70表达在这些癌症类型中的普遍存在，在美国，每年高达30,000名具有表达CD70的实体肿瘤而医学需求未满足的其他患者可能受益于CD70靶向疗法。

因为仍需要具有可供用于治疗与CD70过表达相关的癌症疾病的另外选项(诸如上文所论述的选项)，所以在此提供以双特异性CD70xCD3抗体构建体形式解决此问题的手段和方法。

因此，在第一方面，本发明提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。

必须注意，如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数个提及物。因此，例如，对“一种试剂”的提及包括此类不同试剂中的一者或多者，且对“该方法”的提及包括本领域的普通技术人员已知的可针对本文所述的方法进行修改或代替的等效步骤和方法的提及。

除非另外指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每一要素。本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验就能确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效形式。本发明旨在涵盖此类等效形式。

每当在本文中使用时，术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的所有或任何其他组合”的含义。

如本文所用，术语“约”或“大致”意指在给定值或范围的±20％内，优选±15％内，更优选±10％内且最优选±5％内。

在本说明书通篇和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和诸如“包括(comprises)”和“含有(comprising)”的变化形式应理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。在本文中使用时，术语“包含”可被术语“含有”或“包括”代替，或有时在本文中使用时，被术语“具有”代替。

当在本文中使用时，“由......组成”排除所主张要素中未规定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除并不实质性影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

在本文中的各种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一者可用其他两个术语中的任一者替换。

术语“抗体构建体”是指其中结构和/或功能基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能的分子。因此，抗体构建体能够结合到其特异性靶标或抗原。此外，根据本发明的抗体构建体包含抗体的允许靶标结合的最小结构需要。此最小需要可例如通过存在至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)，优选所有六个CDR来定义。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化(deimmunized)抗体、人源化抗体和人抗体。

全长或完整抗体在根据本发明的“抗体构建体”的定义内，也包括骆驼抗体和通过生物技术或蛋白质工程改造方法或过程产生的其他免疫球蛋白抗体。这些全长抗体可为例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体和人抗体。全长抗体的片段(诸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)2或“r IgG”(“半抗体”))也在“抗体构建体”的定义内。根据本发明的抗体构建体也可为抗体的经修饰片段，也称为抗体变体，诸如scFv；di-scFv或bi(s)-scFv；scFv-Fc；scFv拉链(scFv-zipper)；scFab；Fab2；Fab3；双功能抗体(diabody)；单链双功能抗体；串联双功能抗体(Tandab)；串联di-scFv；串联tri-scFv；“微型抗体”，其由如下结构例示：(VH-VL-CH3)₂、(scFv-CH3)₂、((scFv)₂-CH3+CH3)、((scFv)₂-CH3)或(scFv-CH3-scFv)₂；多功能抗体，诸如三功能抗体或四功能抗体；和单结构域抗体，诸如纳米抗体，或仅含一个可变结构域(其可为VHH、VH或VL)的独立于其他V区或结构域而特异性结合抗原或表位的单可变结构域抗体。根据本发明的抗体构建体的更优选形式为交叉抗体(cross body)、最大抗体(maxi body)、杂Fc构建体和单Fc构建体。这些形式的实例将在下文描述。

结合结构域通常可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，无须同时包含这两者。例如，Fd片段具有两个VH区且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的另外实例包括(1)Fab片段，其为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab′)2片段，其为具有两个由二硫桥在铰链区连接的Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，其具有两个VH和CH1结构域；(4)Fv片段，其具有抗体的单个臂的VL和VH结构域；(5)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如来源于scFV文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例例如描述于WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272中。

此外，术语“抗体构建体”的定义包括单价、二价和多价构建体，且因此包括特异性结合到仅一种抗原结构的单特异性构建体以及经由不同结合结构域特异性结合超过一种抗原结构(例如两种、三种或更多种)的双特异性和多特异性构建体。此外，术语“抗体构建体”的定义包括仅由一条多肽链组成的分子以及由超过一条多肽链组成的分子，这些链可以相同(均二聚体、均三聚体或均寡聚物)或不同(杂二聚体、杂三聚体或杂寡聚物)。上文确定的抗体及其变体或衍生物的实例尤其描述于Harlow和Lane，Antibodies a laboratorymanual，CSHL Press(1988)；和Using Antibodies：a laboratory manual，CSHL Press(1999)；Kontermann和Dübel，Antibody Engineering，Springer，第2版，2010；和Little，Recombinant Antibodies for Immunotherapy，Cambridge University Press 2009中。

本发明的抗体构建体优选为“体外产生的抗体构建体”。该术语是指根据上述定义的抗体构建体，其中所有或一部分可变区(例如至少一个CDR)在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示)蛋白芯片或任何其他可测试候选序列结合到抗原的能力的方法中产生。因此，该术语优选排除仅通过在动物中在免疫细胞中进行基因组重排而产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或遗传工程改造而制备的抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)或单克隆抗体构建体是指从基本上均质的抗体的群获得的抗体，即构成该群的各个抗体除可以少量出现的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外是相同的。与通常包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相比，单克隆抗体对抗原上的单一抗原位点或决定簇具有高度特异性。除其特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于其通过杂交瘤培养而合成，因此不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征是从基本上均质的抗体群获得，且不应解释为需要通过任何特定的方法产生该抗体。

对于单克隆抗体的制备，可使用提供通过连续细胞系培养而产生的抗体的任何技术。例如，要使用的单克隆抗体可通过最初由Koehler等人，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制得。制备人单克隆抗体的另外技术的实例包括三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV杂交瘤技术(Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。

杂交瘤可随后使用标准方法筛选，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(BIACORE^TM)分析，以鉴别一个或多个产生与特定抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。任何形式的相关抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段、及其抗原肽。如BIAcore系统中所使用的表面等离子体共振可用于增加结合到靶抗原的表位(诸如CD70或CD3ε)的噬菌体抗体的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。

制备单克隆抗体的另一示例性方法包括筛选蛋白表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示例如描述于Ladner等人，美国专利第5,223,409号；Smith(1985)Science 228：1315-1317，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)。

除使用展示文库以外，可使用相关抗原使非人动物，例如啮齿类动物(诸如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)免疫。在一个实施方案中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段工程改造缺乏小鼠抗体产生的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可制备和选择来源于具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSE^TM、Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21、US 2003-0070185、WO96/34096和WO 96/33735。

单克隆抗体也可得自非人动物，且接着使用本领域已知的重组DNA技术修饰，例如人源化、去免疫化、使其嵌合等。经修饰的抗体构建体的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟”抗体(参见例如Hawkins等人J.Mol.Biol.254，889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30，10832-10837(1991))和具有改变的效应功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260；Kontermann和Dübel(2010)，上述引文和Little(2009)，上述引文)。

在免疫学中，亲和力成熟是在免疫反应过程期间使B细胞产生对抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。在反复暴露于相同抗原的情况下，宿主将产生具有相继增大的亲和力的抗体。与天然原型相同，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。体外亲和力成熟已成功地用于优化抗体、抗体构建体和抗体片段。CDR内的随机突变使用辐射、化学诱变剂或易错PCR引入。此外，遗传多样性可通过链改组而增加。使用展示方法(如噬菌体展示)的两轮或三轮突变和选择通常产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。

抗体构建体的氨基酸取代变型的优选类型包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体应相对于产生其的亲本抗体具有经改善的生物特性。产生此类取代变体的适宜方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使若干高变区位点(例如6-7个位点)突变以在各位点产生所有可能的氨基酸取代。因此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体粒子以与包装在各粒子内的M13的基因III产物的融合体形式展示。随后如本文所公开将噬菌体展示的变体针对其生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。为鉴别用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴别显著有助于抗原结合的高变区残基。或者或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别在结合结构域与例如人CD70之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基为根据本文中详述的技术进行取代的候选物。在产生此类变体后，如本文所述对变体组进行筛选，且可在一个或多个相关测定中选择具有优良特性的抗体用于进一步开发。

本发明的单克隆抗体和抗体构建体具体地讲包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列及此类抗体的片段(只要其表现出所需的生物活性即可)相同或同源(美国专利第4,816,567号；Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855(1984))。本文中所关注的嵌合抗体包括“灵长类化(primitized)”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，旧世界猴(OldWorld Monkey)、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已描述多种制备嵌合抗体的方法。参见例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452，1985；Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Boss等人，美国专利第4,816,397号；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。

抗体、抗体构建体、抗体片段或抗体变体也可通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中所公开的方法，通过人T细胞表位的特异性缺失(称为“去免疫”的方法)来修饰。简而言之，可针对结合到II类MHC的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽表示潜在T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为检测潜在T细胞表位，可应用称为“肽穿线(peptide threading)”的计算机建模法，且此外，可搜索人II类MHC结合肽的数据库中的VH和VL序列中所存在的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序结合到18种主要II类MHC DR同种异型中的任一者，且因此构成潜在T细胞表位。所检测的潜在T细胞表位可通过取代可变结构域中的少数氨基酸残基或优选通过单氨基取代换来消除。通常，进行保守取代。通常但非排他地，可使用对人种系抗体序列中的位置常见的氨基酸。人种系序列公开于例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today第16卷第5期：237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：14：4628-4638。V BASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，LA.等人MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK汇编)。这些序列可用作人序列的来源，例如用于构架区和CDR。也可使用共有人构架区，例如美国专利第6,300,064号中所述。

“人源化”抗体、抗体构建体、其变体或片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)为大部分人序列的抗体或免疫球蛋白，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(也为CDR)的残基经来自非人(例如啮齿类动物)物种(供体抗体)(诸如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基经相应非人残基置换。此外，如本文所用的“人源化抗体”也可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善且优化抗体效能。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于进一步细节，参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。

人源化抗体或其片段可通过用来自人Fv可变结构域的等效序列置换不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列而产生。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下文献提供：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人，(1986)BioTechniques 4：214；和US 5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762、US 5,859,205及US 6,407,213。这些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一者的免疫球蛋白Fv可变结构域的全部或一部分的核酸序列。此类核酸可得自产生针对如上所述的预定靶标的抗体的杂交瘤，以及得自其他来源。可接着将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆至适合的表达载体中。

人源化抗体也可使用表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的转基因动物(诸如小鼠)产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利第5,225,539号)。特定人抗体的全部CDR可用非人CDR的至少一部分置换，或仅一些CDR可用非人CDR置换。仅需要置换人源化抗体结合到预定抗原所需数目的CDR。

人源化抗体可通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化。此类经改变的免疫球蛋白分子可通过本领域已知的若干技术中的任一者制备(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，ImmunologyToday，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92：3-16，1982和EP 239 400)。

术语“人抗体”、“人抗体构建体”和“人结合结构域”包括具有基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的抗体区(诸如可变和恒定区或结构域)的抗体、抗体构建体和结合结构域，包括例如Kabat等人，(1991)(上述引文)所述的那些。本发明的人抗体、抗体构建体或结合结构域可例如在CDR尤其在CDR3中包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗体构建体或结合结构域可具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个经不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。如本文所用的人抗体、抗体构建体和结合结构域的定义也涵盖完全人抗体，其仅包括抗体的非人工和/或遗传改变的人序列，如可通过使用诸如Xenomouse的技术或系统获得的那些。

在一些实施方案中，本发明的抗体构建体为“经分离”或“基本上纯”的抗体构建体。“经分离”或“基本上纯”在用于描述本文所公开的抗体构建体时意指抗体构建体已从其产生环境的组分中鉴别、分离和/或回收。优选地，抗体构建体不或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分相关联。其产生环境的污染物组分(诸如由重组转染细胞产生的污染物组分)为通常干扰多肽的诊断性或治疗性用途的物质，且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。抗体构建体可例如占给定样品中总蛋白质的至少约5重量％或至少约50重量％。应当理解，视情况而定，经分离的蛋白质可占总蛋白质含量的5重量％至99.9重量％。多肽可通过使用诱导型启动子或高表达启动子以明显更高的浓度制备，以使得其以增加的浓度水平制得。该定义包括在本领域已知的多种多样的生物体和/或宿主细胞中制备抗体构建体。在优选的实施方案中，抗体构建体将(1)通过使用转杯式测序仪纯化至一定程度以足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝(Coomassie blue)或优选银染色纯化至均质。然而，通常的是，经分离的抗体构建体将通过至少一个纯化步骤制备。

与本发明相关，术语“结合结构域”表征的是：(特异性)结合到靶分子(抗原)(此处：分别是CD70和CD3)上的给定靶表位或给定靶位点/与所述给定靶表位或给定靶位点相互作用/识别所述给定靶表位或给定靶位点的结构域。第一结合结构域的结构和功能(识别CD70)且优选以及第二结合结构域的结构和/或功能(识别CD3)基于抗体(例如全长或完全免疫球蛋白分子)的结构和/或功能。根据本发明，第一结合结构域的特征在于存在三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。第二结合结构域优选还包含抗体的允许靶标结合的最小结构需要。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。据设想，第一和/或第二结合结构域通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可获得而非通过将来自预先存在的(单克隆)抗体的CDR序列移植到支架(scaffold)中产生或获得。

根据本发明，结合结构域呈一种或多种多肽的形式。此类多肽可包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂，诸如戊二醛)。蛋白质(包括其片段，优选生物活性片段和肽，通常具有少于30个氨基酸)包含两个或更多个经由共价肽键彼此偶合的氨基酸(产生氨基酸的链)。如本文所用的术语“多肽”描述分子的群，其通常由超过30个氨基酸组成。多肽可进一步形成多聚体，诸如二聚体、三聚体以及更高级的寡聚物，即由超过一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。此类多聚体的相应高级结构因此称为均二聚体或杂二聚体、均三聚体或杂三聚体等。杂多聚体的实例为抗体分子，其在其天然存在的形式下由两条相同多肽轻链和两条相同多肽重链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指经天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)实现。“肽”、“多肽”或“蛋白质”在本文提及时也可经化学修饰，诸如聚乙二醇化。此类修饰在本领域中是熟知的且在下文描述。

优选地，结合到CD70的结合结构域和/或结合到CD3的结合结构域为人结合结构域。包含至少一个人结合结构域的抗体和抗体构建体避免一些与具有非人诸如啮齿类动物(例如鼠类、大鼠、仓鼠或兔)可变和/或恒定区的抗体或抗体构建体有关的问题。此类啮齿类动物衍生的蛋白质的存在可引起抗体或抗体构建体的快速清除或可引起患者针对抗体或抗体构建体产生免疫反应。为避免使用源自啮齿类动物的抗体或抗体构建体，人或完全人抗体/抗体构建体可通过向啮齿类动物中引入人抗体功能以使得啮齿类动物产生全人抗体来产生。

在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座且将其引入小鼠种系中的能力提供一种阐明极大或粗略作图的基因座的功能组分以及产生人疾病的有用模型的强有力方法。此外，使用此类技术用人等效物取代小鼠基因座可提供对发育期间人基因产物的表达和调控、其与其他系统的联系及其参与疾病诱发和进展的独到见解。

此类策略的一个重要实际应用为小鼠体液免疫系统的“人源化”。向内源性Ig基因已失活的小鼠中引入人免疫球蛋白(Ig)基因座提供研究编程表达和抗体组装的潜在机制及其在B细胞发育中的作用的机会。此外，此类策略可提供产生完全人单克隆抗体(mAb)的理想来源，这是朝向实现人疾病的抗体疗法的前景的重要里程碑。预期，完全人抗体或抗体构建体使小鼠mAb或小鼠衍生的mAb固有的免疫原性和过敏反应降至最低，并因此提高所施用的抗体/抗体构建体的功效和安全性。使用完全人抗体或抗体构建体预期可在治疗需要反复施用化合物的慢性和复发性人疾病(诸如炎症、自身免疫和癌症)中提供实质性的优势。

朝向此目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程改造小鼠抗体产生缺陷型小鼠品系，预期此类小鼠将在不存在小鼠抗体的情况下产生大谱系的人抗体。大人Ig片段将保持大可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠机制实现抗体多样化和选择以及对人蛋白的免疫耐受性的缺乏，这些小鼠品系中再产生的人抗体谱将针对任何所关注抗原(包括人抗原)产生高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可容易地产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。此通用策略结合第一个XenoMouse小鼠品系的产生而展现(参见Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。用分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系构造片段的酵母人工染色体(YAC)工程改造XenoMouse品系，所述染色体含有核心可变和恒定区序列。含人Ig的YAC经证实与小鼠系统相容以用于抗体重排与表达，且能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人谱系和产生抗原特异性人mAb的能力展现。这些结果还表明引入含有较大量V基因的人Ig基因座的较大部分、额外的调控元件和人Ig恒定区可基本上概述针对感染和免疫发生的人体液反应所特有的完整谱系。Green等人的研究近来延伸至通过分别引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构造YAC片段来引入大于约80％人抗体谱系。参见Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)和美国专利申请第08/759,620号。

XenoMouse小鼠的产生进一步论述且描绘于美国专利申请第07/466,008系列号、第07/610,515系列号、第07/919,297系列号、第07/922,649系列号、第08/031,801系列号、第08/112,848系列号、第08/234,145系列号、第08/376,279系列号、第08/430,938系列号、第08/464,584系列号、第08/464,582系列号、第08/463,191系列号、第08/462,837系列号、第08/486,853系列号、第08/486,857系列号、第08/486,859系列号、第08/462,513系列号、第08/724,752系列号和第08/759,620系列号；及美国专利第6,162,963号、第6,150,584号、第6,114,598号、第6,075,181号和第5,939,598号以及日本专利第3 068 180 B2号、第3068 506 B2号和第3 068 507 B2号。另见Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。

在替代方法中，包括GenPharm International，Inc.的其他机构已使用“微小基因座”(minilocus)方法。在微小基因座方法中，通过包括来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟外源Ig基因座。因此，一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选为γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。此方法描述于授予Surani等人的美国专利第5,545,807号和各自授予Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号、第5,625,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318号、第5,877,397号、第5,874,299号和第6,255,458号，授予Krimpenfort和Berns的美国专利第5,591,669号和第6,023,010号，授予Berns等人的美国专利第5,612,205号、第5,721,367号和第5,789,215号，和授予Choi和Dunn的美国专利第5,643,763号，以及GenPharm国际美国专利申请第07/574,748号、第07/575,962号、第07/810,279号、第07/853,408号、第07/904,068号、第07/990,860号、第08/053,131号、第08/096,762号、第08/155,301号、第08/161,739号、第08/165,699号、第08/209,741号。另见EP 0546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884和美国专利第5,981,175号。另见Taylor等人(1992)，Chen等人(1993)，Tuaillon等人(1993)，Choi等人(1993)，Lonberg等人(1994)，Taylor等人(1994)和Tuaillon等人(1995)，Fishwild等人(1996)。

Kirin也已证明由小鼠产生人抗体，在该小鼠中已通过微细胞融合引入染色体的大碎片或完整染色体。参见欧洲专利申请第773 288号和第843 961号。XenerexBiosciences正在开发可能产生人抗体的技术。在此技术中，将SCID小鼠用人淋巴细胞(例如B细胞和/或T细胞)重建。随后用抗原使小鼠免疫且所述小鼠可产生针对该抗原的免疫反应。参见美国专利第5,476,996号、第5,698,767号和第5,958,765号。

人抗小鼠抗体(HAMA)反应已让该行业制备嵌合或者说是人源化抗体。然而，预期将观测到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其在抗体的长期或多剂量利用中。因此，将需要提供包含针对CD70的人结合结构域和/或针对CD3的人结合结构域的抗体构建体，以便消除HAMA或HACA反应的问题和/或效应。

如实施例2中所描述，表征在本发明的背景下产生的双特异性抗体构建体的CD70结合结构域的表位特异性。取决于在流式细胞术读数中观测到了结合损失的嵌合CD70分子，将结合子分成不同的组(I、II、III、IIIv、V、VI、VII和VIII，参见表4)。因此，根据优选的实施方案，本发明的抗体构建体的第一结合结构域结合到名为E3的区域(如SEQ ID NO：745所描绘的区域)内所含的CD70的表位。如下所描述，识别区域E3的结合结构域可识别另外的CD70区域。

此外，据设想，本发明的抗体构建体的第一结合结构域结合到选自以下的CD70区域的组合内所含的CD70的表位：

a)区域E2、E3、E4和E6，

b)区域E2、E3和E4，

c)区域E2、E3和E6，

d)区域E2和E3，

e)区域E3、E4和E6，

f)区域E3和E4，以及

g)区域E3和E6。

由抗CD70结合结构域识别的表位可以为线性的或构象的。人CD70蛋白质内上述区域E2、E3、E4和E6的位置及其序列标识符描述于实施例1中。

在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域不结合到名为E1的区域内所含的表位。另外地或替代性地，据设想，本发明的抗体构建体的第一结合结构域不结合到名为E7的区域内所含的表位。

根据本发明，术语“(特异性)结合到”、“(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“与......(特异性)反应”意指结合结构域与靶分子(抗原)(此处：分别是CD70和CD3)上的给定表位或给定靶位点相互作用或特异性相互作用。

术语“表位”是指与结合结构域、抗体或免疫球蛋白、或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体特异性结合的抗原上的位点。“表位”为抗原性的，并因此而言术语表位有时在本文中也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域为“抗原相互作用位点”。所述结合/相互作用也理解为定义“特异性识别”。

“表位”可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。“线性表位”是氨基酸一级序列包含所识别的表位的表位。线性表位在独特的序列中通常包含至少3个或至少4个，且更通常至少5个或至少6个或至少7个，例如约8至约10个氨基酸。

与线性表位相比，“构象表位”为这样的表位：其中构成表位的氨基酸的一级序列并非所识别的表位的唯一限定组分(例如这样的表位：其中氨基酸的一级序列并非必须由结合结构域识别)。通常，构象表位相对于线性表位包含增加数目的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原、优选地肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文中，针对第一结合结构域的抗原结构包含在CD70蛋白质内)。例如，当蛋白质分子折叠以形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽主链变得并置，使得抗体能够识别表位。确定表位的构象的方法包括但不限于x射线结晶学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱法和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱法。

下文描述一种表位作图方法：当人CD70蛋白质中的区域(连续氨基酸段)与非人和非灵长类动物CD70抗原(例如小鼠CD70，但也可设想其他物种，诸如鸡、大鼠、仓鼠、兔等)的其对应区互换/置换时，预期会发生结合结构域的结合降低，除非结合结构域对所使用的非人、非灵长类动物CD70具有交叉反应性。与结合到人CD70蛋白质中的相应区相比，所述降低优选为至少10％、20％、30％、40％或50％；更优选为至少60％、70％或80％，且最优选90％、95％或甚至100％，其中与人CD70蛋白质中相应区的结合设定为100％。据设想，前述人CD70/非人CD70嵌合体在CHO细胞中表达。还据设想，在嵌合分子的C端融合v5标签，例如经由GGGGS接头。该方法在实施例1和2中更详细地描述。

在表位作图的替代性或另外方法中，可产生若干截短形式的人CD70胞外结构域以便确定由结合结构域识别的特定区域。在这些截短形式中，从C端开始，逐步删除不同的胞外CD70结构域/子结构域或区。据设想，截短的CD70形式在CHO细胞中表达。还据设想，在截短分子的C端融合v5标签，例如经由GGGGS接头，这使得可以验证这些分子在细胞表面上的正确表达。预期这些截短的CD70形式会出现结合的降低或损失，这些形式不再涵盖由结合结构域识别的CD70区。结合的降低优选为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选为至少60％、70％、80％且最优选90％、95％或甚至100％，其中与完整人CD70蛋白质(或其胞外区或结构域)的结合设定为100％。

另一种确定靶抗原的特定残基对抗体构建体或结合结构域的识别的贡献的方法是丙氨酸扫描(参见例如Morrison KL和Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.2001年6月；5(3)：302-7)，其中待分析的每个残基被丙氨酸置换，例如经由定点诱变。使用丙氨酸的原因是其非庞大的、化学上惰性的甲基官能团，然而，仍模拟许多其他氨基酸具有的二级结构参考。有时，诸如缬氨酸或亮氨酸的庞大氨基酸可用于需要保持突变残基大小的情况。丙氨酸扫描是已使用了很长一段时间的成熟技术。

结合结构域与表位或包含表位的区域之间的相互作用暗示结合结构域对特定蛋白或抗原(此处：分别为CD70和CD3)上的表位/包含表位的区域表现出可测量的亲和力，且通常不与CD70或CD3之外的蛋白或抗原表现出显著的反应性。“可测量的亲和力”包括以约10^-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10^-12至10^-8M、10^-12至10^-9M、10^-12至10^-10M、10^-11至10^-8M、优选约10^-11至10^-9M时，结合视为特异性的。结合结构域是否与靶标特异性反应或特异性结合到靶标可尤其易于通过比较所述结合结构域与靶标蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与CD70或CD3之外的蛋白质或抗原的反应来测试。优选地，本发明的结合结构域本质上或基本上不结合到CD70或CD3之外的蛋白质或抗原(即第一结合结构域不能够结合到CD70之外的蛋白质且第二结合结构域不能够结合到CD3之外的蛋白质)。

术语“本质上/基本上不结合”或“不能够结合”意指本发明的结合结构域不结合CD70或CD3之外的蛋白质或抗原，即表现出与CD70或CD3之外的蛋白质或抗原不超过30％、优选不超过20％、更优选不超过10％、尤其优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的反应性，其中与CD70或CD3的结合分别设定为100％。

据信，特异性结合由结合结构域的氨基酸序列中的特异性基序和抗原实现。因此，结合因其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二级修饰而实现。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可替代地或另外地导致引发信号，例如由于诱导抗原构象变化、抗原寡聚化等。

优选地，本发明的双特异性抗体构建体的第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3选自以下项所描绘的那些：

在以上限定的抗体构建体中，发现以下构建体具有尤其有益的特征，如实施例3-16中所确定：包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域的双特异性抗体构建体，其中第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3选自以下所描绘的那些：

1)SEQ：ID NO：1044-1049；

2)SEQ：ID NO：1086-1091；

3)SEQ：ID NO：1142-1147；

4)SEQ：ID NO：1170-1175；

5)SEQ：ID NO：1184-1189；

6)SEQ：ID NO：1212-1217；

7)SEQ：ID NO：1226-1231；

8)SEQ：ID NO：1240-1245；

9)SEQ：ID NO：1254-1259；

10)SEQ：ID NO：1268-1273；

11)SEQ：ID NO：1338-1343；

12)SEQ：ID NO：1352-1357；

13)SEQ：ID NO：1366-1371；

14)SEQ：ID NO：1422-1427和

15)SEQ：ID NO：1436-1441。

这些构建体的特征在于例如尤其高的亲和力、高细胞毒性活性(低EC50值)和有益的种间亲和力差，以及VH和VL序列与人种系的高序列同一性、低单体向二聚体转化率、高热稳定性、高血浆稳定性、低浊度、高蛋白质均质性和有益的单体/二聚体效能差。在此上下文中，应当注意，这些CDR氨基酸序列具有相当高的序列相似性，其概述于下表1和2中。

表1：所选的CD70结合物(binder)的VH-CDR序列

	VH-CDR1	VH-CDR2	VH-CDR3	SEQ ID NO
					CD70-13D_CC	SYAMS	VISGSGGRPNYAESVKG	VDYSNYLFFDY	1044-1046
CD70-16D_CC	SYAMS	AISGSGGRTFYAESVEG	HDYSNYPYFDY	1086-1088
					CD70-21D_CC	TYAMS	AISGSGGRTFYAESVEG	HDYSNYPYFDY	1142-1144

CD70-24D_CC	SYAMS	AISGSGGSTFYAESVKG	HDYSNYPYFDY	1170-1172
					CD70-25D_CC	SYAMS	AISGSGGRTFYAESVEG	HDYSNYPYFDY	1184-1186
CD70_1-G2D_CC	SYAMS	AISGSGGSTFYAESVQG	HDYSNYPYFDY	1212-1214
					CD70-27D_CC	TYAMS	AISGSGGGTFYAESVKG	HDYSNYPYFDY	1226-1228
CD70-28D_CC	TYAMS	LISGSGGRTYYAESVKG	HDYSNYPYFDY	1240-1242
					CD70-31D_CC	SYAMS	AISGSGGRAQYAESVQG	HDYSNYPYFDY	1254-1256
CD70-32D_CC	SYAMS	AISGSGGRTFYAESVEG	HDYSNYPYFDY	1268-1270
					CD70-42D_CC	TYAMS	LISGSGGRTYYAESVKG	HDYSNYPYFDY	1338-1340
CD70-43D_CC	SYAMS	AISGSGGRTFYAESVEG	HDYSNYPYFDY	1352-1354
					CD70-48D_CC	SYAMS	VISGSGGITDFAESVKG	HDYSNYFFFDY	1366-1368
CD70-62D_CC	SYSMN	YISSSGGYIYYAESVKG	GDYSNYAYFDY	1422-1424
					CD70-13D_CC	VYAMS	TISGSGGSTFYAESVKG	HDYSNYAYFDY	1436-1438

表2：所选的CD70结合物的VL-CDR序列

	VL-CDR1	VL-CDR2	VL-CDR3	SEQ ID NO
					CD70-13D_CC	RAGQSVRSSYLG	GASSRAT	QQYGYSPPT	1047-1049
CD70-16D_CC	RASQSIRSSYLA	GASSRAT	QQYGDLPFT	1089-1091
					CD70-21D_CC	RASQSVRSTYLA	GASSRAT	QQYGDLPFT	1145-1147
CD70-24D_CC	RASQSVRSSYLA	GASSRAT	QQYGDLPFT	1173-1175
					CD70-25D_CC	RASQSVRSNYLA	GASSRAT	QQYGDLPFT	1187-1189
CD70_1-G2D_CC	RASQSVRGNYLA	GASSRAT	QQYGYSPFT	1215-1217
					CD70-27D_CC	RASQSIRSNYLA	GASSRAT	QQYGSSPFT	1229-1231
CD70-28D_CC	RASQSVRSNYLA	GASNRAT	QQYGISPPT	1243-1245
					CD70-31D_CC	RASQSVSSN-LA	GSSSRAT	QQYGSSPPP	1257-1259
CD70-32D_CC	RASQGVRSDYLA	GASSRAT	QQYGSTPPT	1271-1273
					CD70-42D_CC	RASQGVRSSYLA	GASSRAT	QQYGSSPPT	1341-1343
CD70-43D_CC	RASQSVRSNYLA	GASSRAT	QQYGSSPPT	1355-1357
					CD70-48D_CC	RASQGI-SNYLA	AASILQS	QQYFAYPIT	1369-1371
CD70-62D_CC	RASQGI-SNYLA	AASTLQS	QQYYSTPLT	1425-1427
					CD70-13D_CC	RASQSVRSSYLA	GASSRAT	QQYGDLPFT	1439-1441

在抗体构建体的常见生物学/生物化学特征的背景下该显著的序列相似性允许为六个VH和VL CDR描绘共有序列。在下文中鉴别这些共有序列。因此，本发明的目标是提供一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3(且在一个实施方案中，至少结合到猕猴CD3)的第二结合结构域，其中第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中

·所述CDR-H1具有氨基酸序列X₁YX₂MX₃(SEQ ID NO：1869)，其中X₁为S、T或V，X₂为A或S，并且X₃为S或N；

·所述CDR-H2具有氨基酸序列X₁ISX₂SGGX₃X₄X₅X₆AESVX₇G(SEQ ID NO：1870)，其中X₁为A、Y、V、L或T，X₂为G或S，X₃为R、Y、S、G或I，X₄为T、I、P或A，X₅为F、Y、N、Q或D，X₆为Y或F，并且X₇为E、K或Q；

·所述CDR-H3具有氨基酸序列X₁DYSNYX₂X₃FDY(SEQ ID NO：1871)，其中X₁为H、G或V，X₂为P、A、L或F，并且X₃为Y或F；

·所述CDR-L1具有氨基酸序列RAX₁QX₂X₃X₄X₅X₆X₇LX₈(SEQ ID NO：1872)，其中X₁为S或G，X₂为S或G，X₃为I或V，X₄为R、S或无氨基酸，X₅为S或G，X₆为S、N、T或D，X₇为Y或无氨基酸，并且X₈为A或G；

·所述CDR-L2具有氨基酸序列X₁X₂SX₃X₄X₅X₆(SEQ ID NO：1873)，其中X₁为G或A，X₂为A或S，X₃为S、T、N或I，X₄为R或L，X₅为A或Q，并且X₆为T或S；以及

·所述CDR-L3具有氨基酸序列QQYX₁X₂X₃PX₄X₅(SEQ ID NO：1874)，其中X₁为G、Y或F，X₂为D、S、Y、I或A，X₃为L、T、S或Y，X₄为F、L、P或I，并且X₅为T或P。

此外设想：

·所述CDR-H1具有氨基酸序列SYSMN(SEQ ID NO：1422)或X₁YAMS(SEQ ID NO：1875)，其中X₁为S、T或V；

·所述CDR-H2具有选自以下的氨基酸序列：YISSSGGYIYYAESVKG(SEQ ID NO：1423)、VISGSGGITDFAESVKG(SEQ ID NO：1367)和X₁ISGSGGX₂X₃X₄YAESVX₅G(SEQ ID NO：1876)，其中X₁为A、V、L或T，X₂为R、S或G，X₃为T、P或A，X₄为F、N、Y或Q，并且X₅为E、K或Q；

·所述CDR-H3具有选自以下的氨基酸序列：GDYSNYAYFDY(SEQ ID NO：1424)、HDYSNYFFFDY(SEQ ID NO：1368)和X₁DYSNYX₂X₃FDY(SEQ ID NO：1877)，其中X₁为H或V，X₂为P、L或A，并且X₃为Y或F；

·所述CDR-L1具有氨基酸序列RASQGISNYLA(SEQ ID NO：1425)或RAX₁QX₂X₃X₄X₅X₆YLX₇(SEQ ID NO：1878)，其中X₁为S或G，X₂为S或G，X₃为I或V，X₄为R或S，X₅为S或G，X₆为S、T、N或D，并且X₇为A或G；

·所述CDR-L2具有氨基酸序列AASXLQS(SEQ ID NO：1879)，其中X为T或I或GX₁SX₂RAT(SEQ ID NO：1880)，其中X₁为A或S，并且X₂为S或N；以及

·所述CDR-L3具有选自以下的氨基酸序列：QQYYSTPLT(SEQ ID NO：1427)、QQYFAYPIT(SEQ ID NO：1371)和QQYGX₁X₂PX₃X₄(SEQ ID NO：1881)，其中X₁为D、Y、S或I，X₂为L、S或T，X₃为F或P，并且X₄为T或P。

此外设想：

·所述CDR-H1具有氨基酸序列X₁YAMS(SEQ ID NO：1875)，其中X₁为S、T或V；

·所述CDR-H2具有氨基酸序列X₁ISGSGGX₂X₃X₄YAESVX₅G(SEQ ID NO：1876)，其中X₁为A、V、L或T，X₂为R、S或G，X₃为T、P或A，X₄为F、N、Y或Q，并且X₅为E、K或Q；

·所述CDR-H3具有氨基酸序列X₁DYSNYX₂X₃FDY(SEQ ID NO：1877)，其中X₁为H或V，X₂为P、L或A，并且X₃为Y或F；

·所述CDR-L1具有氨基酸序列RAX₁QX₂X₃X₄X₅X₆YLX₇(SEQ ID NO：1878)，其中X₁为S或G，X₂为S或G，X₃为I或V，X₄为R或S，X₅为S或G，X₆为S、T、N或D，并且X₇为A或G；

·所述CDR-L2具有氨基酸序列GX₁SX₂RAT(SEQ ID NO：1880)，其中X₁为A或S，并且X₂为S或N；以及

·所述CDR-L3具有氨基酸序列QQYGX₁X₂PX₃X₄(SEQ ID NO：1881)，其中X₁为D、Y、S或I，X₂为L、S或T，X₃为F或P，并且X₄为T或P。

此外设想：

·所述CDR-H1具有选自以下的氨基酸序列：SYAMS(SEQ ID NO：1044)、TYAMS(SEQID NO：1142)、VYAMS(SEQ ID NO：1436)和SYSMN(SEQ ID NO：1422)；

·所述CDR-H2具有选自以下的氨基酸序列：AISGSGGRTFYAESVEG(SEQ ID NO：1087)、VISGSGGRPNYAESVKG(SEQ ID NO：1045)、AISGSGGSTFYAESVKG(SEQ ID NO：1171)、AISGSGGSTFYAESVQG(SEQ ID NO：1213)、AISGSGGGTFYAESVKG(SEQ ID NO：1227)、LISGSGGRTYYAESVKG(SEQ ID NO：1241)、AISGSGGRAQYAESVQG(SEQ ID NO：1255)、TISGSGGSTFYAESVKG(SEQ ID NO：1437)、YISSSGGYIYYAESVKG(SEQ ID NO：1423)和VISGSGGITDFAESVKG(SEQ ID NO：1367)；

·所述CDR-H3具有选自以下的氨基酸序列：HDYSNYPYFDY(SEQ ID NO：1088)、VDYSNYLFFDY(SEQ ID NO：1046)、HDYSNYAYFDY(SEQ ID NO：1438)、GDYSNYAYFDY(SEQ IDNO：1424)和HDYSNYFFFDY(SEQ ID NO：1368)；

·所述CDR-L1具有选自以下的氨基酸序列：RASQSIRSSYLA(SEQ ID NO：1089)、RASQSVRSTYLA(SEQ ID NO：1145)、RAGQSVRSSYLG(SEQ ID NO：1047)、RASQSVRSSYLA(SEQ IDNO：1173)、RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：1187)、RASQSVRGNYLA(SEQ ID NO：1215)、RASQSIRSNYLA(SEQ ID NO：1229)、RASQSVSSNLA(SEQ ID NO：1257)、RASQGVRSDYLA(SEQ IDNO：1271)、RASQGVRSSYLA(SEQ ID NO：1341)和RASQGISNYLA(SEQ ID NO：1369)；

·所述CDR-L2具有选自以下的氨基酸序列：GASSRAT(SEQ ID NO：1048)、GASNRAT(SEQ ID NO：1244)、GSSSRAT(SEQ ID NO：1258)、AASTLQS(SEQ ID NO：1426)和AASILQS(SEQID NO：1370)；以及

·所述CDR-L3具有选自以下的氨基酸序列：QQYGDLPFT(SEQ ID NO：1091)、QQYGYSPPT(SEQ ID NO：1049)、QQYGYSPFT(SEQ ID NO：1217)、QQYGSSPFT(SEQ ID NO：1231)、QQYGISPPT(SEQ ID NO：1245)、QQYGSSPPP(SEQ ID NO：1259)、QQYGSTPPT(SEQ IDNO：1273)、QQYGSSPPT(SEQ ID NO：1343)、QQYYSTPLT(SEQ ID NO：1427)和QQYFAYPIT(SEQID NO：1371)。

术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域的部分在其序列中表现出可变性且参与决定特定抗体的特异性和结合亲和力(即“可变结构域”)。可变重链(VH)与可变轻链(VL)一起配对形成单一抗原结合位点。

可变性并不均匀地分布于抗体的整个可变结构域中；其集中于各重链和轻链可变区的子结构域中。这些子结构域称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即非高变)部分称为“构架”区(FRM或FR)，且在三维空间中为六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要采用β折叠构型，通过三个高变区连接，从而形成连接β折叠结构且在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。各链中的高变区通过FRM与另一链的高变区紧密结合在一起，有助于抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，上述引文)。

术语“CDR”和其复数形式“CDRs”是指互补决定区，其中三者构成轻链可变区的结合特征(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，三者构成重链可变区的结合特征(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的大部分残基，因此有助于抗体分子的功能活性：其为抗原特异性的主要决定因素。

精确界定的CDR边界和长度服从于不同的分类和编号系统。CDR可因此通过Kabat、Chothia、触点或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)提及。尽管边界不同，但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“高变区”方面具有一些程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可在长度和相对于相邻构架区的边界区域方面有所不同。参见例如Kabat(基于种间交叉序列可变性的方法)、Chothia(基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人，上述引文；Chothia等人，J.Mol.Biol，1987，196：901-917；和MacCallum等人，J.Mol.Biol，1996，262：732)。另一用于表征抗原结合位点的标准是由Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains.见于：Antibody EngineeringLab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。在两种残基鉴别技术定义重叠区域但非相同区域的程度上，它们可加以组合以定义混合CDR。然而，根据所谓的Kabat系统进行编号是优选的。

通常，CDR形成可分类为典型结构的环结构。术语“典型结构”是指由抗原结合(CDR)环采用的主链构象。从比较结构研究中发现六个抗原结合环中有五个仅具有有限谱系的可用构象。各典型结构的特征可在于多肽主链的扭转角。因此，抗体之间的对应环可具有极类似的三维结构，尽管在环的大部分中具有高氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，1987，196：901；Chothia等人，Nature，1989，342：877；Martin和Thornton，J.Mol.Biol，1996，263：800)。此外，在所采用的环形结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定典型类别的构象由环的长度和位于环内以及保守构架内(即环外)关键位置处的氨基酸残基决定。可因此基于这些关键氨基酸残基的存在而分配至特定的典型类别。

术语“典型结构”也可包括例如Kabat(Kabat等人，上述引文)所编录的关于抗体线性序列的考虑因素。Kabat编号方案(系统)是广泛采用的以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的标准，且也如本文其他地方所提及为本发明中所应用的优选方案。另外的结构考虑因素也可用于确定抗体的典型结构。例如，Kabat编号不能完全反映的那些差异可由Chothia等人的编号系统描述和/或由其他技术(例如结晶学和二维或三维计算机建模)揭示。因此，给定的抗体序列可归于尤其允许鉴别适当框架序列(chassis sequence)(例如基于在文库中包括多种典型结构的需要)的典型类别。如由Chothia等人(上述引文)所描述的抗体氨基酸序列的Kabat编号和结构考虑因素及其对于诠释抗体结构的典型方面的暗示描述于该文献中。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域熟知的。对于抗体结构的综述，参见Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Harlow等人编，1988。

轻链的CDR3且尤其是重链的CDR3可构成轻链和重链可变区内抗原结合的最重要决定簇。在一些抗体构建体中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间的主要接触区域。可使用仅CDR3变化的体外选择方案来改变抗体的结合特性或确定哪些残基有助于抗原结合。因此，CDR3通常是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，H3可短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。

在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，各轻(L)链通过一个共价二硫键连接至重(H)链，而两条H链取决于H链同型而定通过一个或多个二硫键彼此连接。最接近于VH的CH结构域通常称为CH1。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体活化。抗体的Fc区包含在重链恒定结构域内且例如能够与细胞表面定位的Fc受体相互作用。

组装和体细胞突变后的抗体基因的序列高度变化，且这些变化的基因估计编码10¹⁰个不同的抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编，Academic Press，SanDiego，CA，1995)。因此，免疫系统提供免疫球蛋白的谱系。术语“谱系”是指完全或部分来源于编码至少一种免疫球蛋白的至少一个序列的至少一个核苷酸序列。序列可通过重链的V、D和J区段和轻链的V和J区段的体内重排产生。或者，序列可响应于发生哪种重排(例如体外刺激)从细胞产生。或者，部分或所有序列可通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见例如美国专利5,565,332。谱系可仅包括一个序列或可包括多个序列，包括遗传性多样的集合中的序列。

根据本发明的优选抗体构建体也可定义为双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一(优选人)结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，其中第一结合结构域结合到与选自CD70-1至CD70-74和如以下项75至112所描绘的抗体的抗体相同的人CD70上的表位，所述75至112所描绘的抗体即包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区的抗体，其中所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3选自以下所描绘的那些：

抗体构建体是否与另一种给定抗体构建体结合到相同的CD70表位可例如通过用嵌合或截短目标分子进行表位作图来测量，例如如上文和实施例2中所描述。

根据本发明的优选抗体构建体也可定义为双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一(优选人)结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，其中第一结合结构域与选自CD70-1至CD70-74和如以上项75至112所描绘的抗体的抗体竞争结合，所述75至112所描绘的抗体即包含含有选自以上项1)至112)的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有选自以上项1)至112)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区的抗体。

抗体构建体是否与另一种给定抗体构建体竞争结合可在竞争测定诸如竞争性ELISA或基于细胞的竞争测定中测量。也可使用亲和素偶合的微粒(珠粒)。与亲和素包被的ELISA板类似，当与经生物素化的蛋白反应时，这些珠粒各自可用作可进行测定的基底。将抗原包被到珠粒上，接着用第一抗体预包被。添加第二抗体且测定任何额外的结合。经由流式细胞术进行读出。参见图2。

在一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VH区的VH区：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：107、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ IDNO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ IDNO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ IDNO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ IDNO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ IDNO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737、SEQ ID NO：920、SEQ ID NO：924、SEQ IDNO：928、SEQ ID NO：932、SEQ ID NO：936、SEQ ID NO：940、SEQ ID NO：944、SEQ ID NO：948、SEQ ID NO：952、SEQ ID NO：956、SEQ ID NO：960、SEQ ID NO：964、SEQ ID NO：968、SEQ IDNO：972、SEQ ID NO：976、SEQ ID NO：980、SEQ ID NO：984、SEQ ID NO：988、SEQ ID NO：992、SEQ ID NO：996、SEQ ID NO：1000、SEQ ID NO：1004、SEQ ID NO：1008、SEQ ID NO：1012、SEQID NO：1016、SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1024、SEQ ID NO：1028、SEQ ID NO：1032、SEQ IDNO：1036、SEQ ID NO：1040、SEQ ID NO：1050、SEQ ID NO：1054、SEQ ID NO：1064、SEQ IDNO：1068、SEQ ID NO：1078、SEQ ID NO：1082、SEQ ID NO：1092、SEQ ID NO：1096、SEQ IDNO：1106、SEQ ID NO：1110、SEQ ID NO：1120、SEQ ID NO：1124、SEQ ID NO：1134、SEQ IDNO：1138、SEQ ID NO：1148、SEQ ID NO：1152、SEQ ID NO：1162、SEQ ID NO：1166、SEQ IDNO：1176、SEQ ID NO：1180、SEQ ID NO：1190、SEQ ID NO：1194、SEQ ID NO：1204、SEQ IDNO：1208、SEQ ID NO：1218、SEQ ID NO：1222、SEQ ID NO：1232、SEQ ID NO：1236、SEQ IDNO：1246、SEQ ID NO：1250、SEQ ID NO：1260、SEQ ID NO：1264、SEQ ID NO：1274、SEQ IDNO：1278、SEQ ID NO：1288、SEQ ID NO：1292、SEQ ID NO：1302、SEQ ID NO：1306、SEQ IDNO：1316、SEQ ID NO：1320、SEQ ID NO：1330、SEQ ID NO：1334、SEQ ID NO：1344、SEQ IDNO：1348、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1362、SEQ ID NO：1372、SEQ ID NO：1376、SEQ IDNO：1386、SEQ ID NO：1390、SEQ ID NO：1400、SEQ ID NO：1404、SEQ ID NO：1414、SEQ IDNO：1418、SEQ ID NO：1428、SEQ ID NO：1432、SEQ ID NO：1442、SEQ ID NO：1446、SEQ IDNO：1456、SEQ ID NO：1460、SEQ ID NO：1470、SEQ ID NO：1474、SEQ ID NO：1484、SEQ IDNO：1488、SEQ ID NO：1498、SEQ ID NO：1502、SEQ ID NO：1512、SEQ ID NO：1516、SEQ IDNO：1526、SEQ ID NO：1530、SEQ ID NO：1540、SEQ ID NO：1544、SEQ ID NO：1554、SEQ IDNO：1558、SEQ ID NO：1568和SEQ ID NO：1572。

优选的是，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VH区的VH区：SEQ ID NO：1050、SEQ ID NO：1092、SEQ ID NO：1148、SEQ ID NO：1176、SEQ ID NO：1190、SEQ ID NO：1218、SEQ ID NO：1232、SEQ ID NO：1246、SEQ ID NO：1260、SEQ ID NO：1274、SEQ ID NO：1344、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1372、SEQ ID NO：1428和SEQ ID NO：1442。

在又一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VL区的VL区：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ IDNO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ IDNO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ IDNO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ IDNO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ IDNO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：921、SEQ ID NO：925、SEQ IDNO：929、SEQ ID NO：933、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：941、SEQ ID NO：945、SEQ ID NO：949、SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：957、SEQ ID NO：961、SEQ ID NO：965、SEQ ID NO：969、SEQ IDNO：973、SEQ ID NO：977、SEQ ID NO：981、SEQ ID NO：985、SEQ ID NO：989、SEQ ID NO：993、SEQ ID NO：997、SEQ ID NO：1001、SEQ ID NO：1005、SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1013、SEQID NO：1017、SEQ ID NO：1021、SEQ ID NO：1025、SEQ ID NO：1029、SEQ ID NO：1033、SEQ IDNO：1037、SEQ ID NO：1041、SEQ ID NO：1051、SEQ ID NO：1055、SEQ ID NO：1065、SEQ IDNO：1069、SEQ ID NO：1079、SEQ ID NO：1083、SEQ ID NO：1093、SEQ ID NO：1097、SEQ IDNO：1107、SEQ ID NO：1111、SEQ ID NO：1121、SEQ ID NO：1125、SEQ ID NO：1135、SEQ IDNO：1139、SEQ ID NO：1149、SEQ ID NO：1153、SEQ ID NO：1163、SEQ ID NO：1167、SEQ IDNO：1177、SEQ ID NO：1181、SEQ ID NO：1191、SEQ ID NO：1195、SEQ ID NO：1205、SEQ IDNO：1209、SEQ ID NO：1219、SEQ ID NO：1223、SEQ ID NO：1233、SEQ ID NO：1237、SEQ IDNO：1247、SEQ ID NO：1251、SEQ ID NO：1261、SEQ ID NO：1265、SEQ ID NO：1275、SEQ IDNO：1279、SEQ ID NO：1289、SEQ ID NO：1293、SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1307、SEQ IDNO：1317、SEQ ID NO：1321、SEQ ID NO：1331、SEQ ID NO：1335、SEQ ID NO：1345、SEQ IDNO：1349、SEQ ID NO：1359、SEQ ID NO：1363、SEQ ID NO：1373、SEQ ID NO：1377、SEQ IDNO：1387、SEQ ID NO：1391、SEQ ID NO：1401、SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1415、SEQ IDNO：1419、SEQ ID NO：1429、SEQ ID NO：1433、SEQ ID NO：1443、SEQ ID NO：1447、SEQ IDNO：1457、SEQ ID NO：1461、SEQ ID NO：1471、SEQ ID NO：1475、SEQ ID NO：1485、SEQ IDNO：1489、SEQ ID NO：1499、SEQ ID NO：1503、SEQ ID NO：1513、SEQ ID NO：1517、SEQ IDNO：1527、SEQ ID NO：1531、SEQ ID NO：1541、SEQ ID NO：1545、SEQ ID NO：1555、SEQ IDNO：1559、SEQ ID NO：1569和SEQ ID NO：1573。

优选的是，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VL区的VL区：SEQ ID NO：1051、SEQ ID NO：1093、SEQ ID NO：1149、SEQ ID NO：1177、SEQ ID NO：1191、SEQ ID NO：1219、SEQ ID NO：1233、SEQ ID NO：1247、SEQ ID NO：1261、SEQ ID NO：1275、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1359、SEQ ID NO：1373、SEQ ID NO：1429和SEQ ID NO：1443。

在另一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自如以下项所描绘的VH区和VL区的配对的VH区和VL区：SEQ ID NO：7+8、SEQ ID NO：17+18、SEQ ID NO：27+28、SEQ ID NO：37+38、SEQ ID NO：47+48、SEQ ID NO：57+58、SEQ ID NO：67+68、SEQ IDNO：77+78、SEQ ID NO：87+88、SEQ ID NO：97+98、SEQ ID NO：107+108、SEQ ID NO：117+118、SEQ ID NO：127+128、SEQ ID NO：137+138、SEQ ID NO：147+148、SEQ ID NO：157+158、SEQID NO：167+168、SEQ ID NO：177+178、SEQ ID NO：187+188、SEQ ID NO：197+198、SEQ IDNO：207+208、SEQ ID NO：217+218、SEQ ID NO：227+228、SEQ ID NO：237+238、SEQ ID NO：247+248、SEQ ID NO：257+258、SEQ ID NO：267+268、SEQ ID NO：277+278、SEQ ID NO：287+288、SEQ ID NO：297+298、SEQ ID NO：307+308、SEQ ID NO：317+318、SEQ ID NO：327+328、SEQ ID NO：337+338、SEQ ID NO：347+348、SEQ ID NO：357+358、SEQ ID NO：367+368、SEQID NO：377+378、SEQ ID NO：387+388、SEQ ID NO：397+398、SEQ ID NO：407+408、SEQ IDNO：417+418、SEQ ID NO：427+428、SEQ ID NO：437+438、SEQ ID NO：447+448、SEQ ID NO：457+458、SEQ ID NO：467+468、SEQ ID NO：477+478、SEQ ID NO：487+488、SEQ ID NO：497+498、SEQ ID NO：507+508、SEQ ID NO：517+518、SEQ ID NO：527+528、SEQ ID NO：537+538、SEQ ID NO：547+548、SEQ ID NO：557+558、SEQ ID NO：567+568、SEQ ID NO：577+578、SEQID NO：587+588、SEQ ID NO：597+598、SEQ ID NO：607+608、SEQ ID NO：617+618、SEQ IDNO：627+628、SEQ ID NO：637+638、SEQ ID NO：647+648、SEQ ID NO：657+658、SEQ ID NO：667+668、SEQ ID NO：677+678、SEQ ID NO：687+688、SEQ ID NO：697+698、SEQ ID NO：707+708、SEQ ID NO：717+718、SEQ ID NO：727+728、SEQ ID NO：737+738、SEQ ID NO：920+921、SEQ ID NO：924+925、SEQ ID NO：928+929、SEQ ID NO：932+933、SEQ ID NO：936+937、SEQID NO：940+941、SEQ ID NO：944+945、SEQ ID NO：948+949、SEQ ID NO：952+953、SEQ IDNO：956+957、SEQ ID NO：960+961、SEQ ID NO：964+965、SEQ ID NO：968+969、SEQ ID NO：972+973、SEQ ID NO：976+977、SEQ ID NO：980+981、SEQ ID NO：984+985、SEQ ID NO：988+989、SEQ ID NO：992+993、SEQ ID NO：996+997、SEQ ID NO：1000+1001、SEQ ID NO：1004+1005、SEQ ID NO：1008+1009、SEQ ID NO：1012+1013、SEQ ID NO：1016+1017、SEQ ID NO：1020+1021、SEQ ID NO：1024+1025、SEQ ID NO：1028+1029、SEQ ID NO：1032+1033、SEQ IDNO：1036+1037、SEQ ID NO：1040+1041、SEQ ID NO：1050+1051、SEQ ID NO：1054+1055、SEQID NO：1064+1065、SEQ ID NO：1068+1069、SEQ ID NO：1078+1079、SEQ ID NO：1082+1083、SEQ ID NO：1092+1093、SEQ ID NO：1096+1097、SEQ ID NO：1106+1107、SEQ ID NO：1110+1111、SEQ ID NO：1120+1121、SEQ ID NO：1124+1125、SEQ ID NO：1134+1135、SEQ ID NO：1138+1139、SEQ ID NO：1148+1149、SEQ ID NO：1152+1153、SEQ ID NO：1162+1163、SEQ IDNO：1166+1167、SEQ ID NO：1176+1177、SEQ ID NO：1180+1181、SEQ ID NO：1190+1191、SEQID NO：1194+1195、SEQ ID NO：1204+1205、SEQ ID NO：1208+1209、SEQ ID NO：1218+1219、SEQ ID NO：1222+1223、SEQ ID NO：1232+1233、SEQ ID NO：1236+1237、SEQ ID NO：1246+1247、SEQ ID NO：1250+1251、SEQ ID NO：1260+1261、SEQ ID NO：1264+1265、SEQ ID NO：1274+1275、SEQ ID NO：1278+1279、SEQ ID NO：1288+1289、SEQ ID NO：1292+1293、SEQ IDNO：1302+1303、SEQ ID NO：1306+1307、SEQ ID NO：1316+1317、SEQ ID NO：1320+1321、SEQID NO：1330+1331、SEQ ID NO：1334+1335、SEQ ID NO：1344+1345、SEQ ID NO：1348+1349、SEQ ID NO：1358+1359、SEQ ID NO：1362+1363、SEQ ID NO：1372+1373、SEQ ID NO：1376+1377、SEQ ID NO：1386+1387、SEQ ID NO：1390+1391、SEQ ID NO：1400+1401、SEQ ID NO：1404+1405、SEQ ID NO：1414+1415、SEQ ID NO：1418+1419、SEQ ID NO：1428+1429、SEQ IDNO：1432+1433、SEQ ID NO：1442+1443、SEQ ID NO：1446+1447、SEQ ID NO：1456+1457、SEQID NO：1460+1461、SEQ ID NO：1470+1471、SEQ ID NO：1474+1475、SEQ ID NO：1484+1485、SEQ ID NO：1488+1489、SEQ ID NO：1498+1499、SEQ ID NO：1502+1503、SEQ ID NO：1512+1513、SEQ ID NO：1516+1517、SEQ ID NO：1526+1527、SEQ ID NO：1530+1531、SEQ ID NO：1540+1541、SEQ ID NO：1544+1545、SEQ ID NO：1554+1555、SEQ ID NO：1558+1559、SEQ IDNO：1568+1569和SEQ ID NO：1572+1573。

优选的是，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自如以下项所描绘的VH区和VL区的配对的VH区和VL区：SEQ ID NO：1050+1051、SEQ ID NO：1092+1093、SEQ ID NO：1148+1149、SEQ ID NO：1176+1177、SEQ ID NO：1190+1191、SEQ ID NO：1218+1219、SEQ IDNO：1232+1233、SEQ ID NO：1246+1247、SEQ ID NO：1260+1261、SEQ ID NO：1274+1275、SEQID NO：1344+1345、SEQ ID NO：1358+1359、NO：1372+1373、SEQ ID NO：1428+1429和SEQ IDNO：1442+1443。

在又一个实施方案中，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ IDNO：219、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319、SEQ IDNO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419、SEQ ID NO：429、SEQ IDNO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ IDNO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649、SEQ IDNO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：922、SEQ ID NO：926、SEQ IDNO：930、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：958、SEQ ID NO：962、SEQ ID NO：966、SEQ ID NO：970、SEQ IDNO：974、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：986、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1006、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1014、SEQID NO：1018、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1026、SEQ ID NO：1030、SEQ ID NO：1034、SEQ IDNO：1038、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1052、SEQ ID NO：1056、SEQ ID NO：1066、SEQ IDNO：1070、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1084、SEQ ID NO：1094、SEQ ID NO：1098、SEQ IDNO：1108、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1122、SEQ ID NO：1126、SEQ ID NO：1136、SEQ IDNO：1140、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1154、SEQ ID NO：1164、SEQ ID NO：1168、SEQ IDNO：1178、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1192、SEQ ID NO：1196、SEQ ID NO：1206、SEQ IDNO：1210、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1224、SEQ ID NO：1234、SEQ ID NO：1238、SEQ IDNO：1248、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1262、SEQ ID NO：1266、SEQ ID NO：1276、SEQ IDNO：1280、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1294、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1308、SEQ IDNO：1318、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1332、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1346、SEQ IDNO：1350、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1364、SEQ ID NO：1374、SEQ ID NO：1378、SEQ IDNO：1388、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1402、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1416、SEQ IDNO：1420、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1434、SEQ ID NO：1444、SEQ ID NO：1448、SEQ IDNO：1458、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1472、SEQ ID NO：1476、SEQ ID NO：1486、SEQ IDNO：1490、SEQ ID NO：1500、SEQ ID NO：1504、SEQ ID NO：1514、SEQ ID NO：1518、SEQ IDNO：1528、SEQ ID NO：1532、SEQ ID NO：1542、SEQ ID NO：1546、SEQ ID NO：1556、SEQ IDNO：1560、SEQ ID NO：1570和SEQ ID NO：1574。

优选的是，本发明的抗体构建体的第一结合结构域包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ ID NO：1052、SEQ ID NO：1094、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1192、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1234、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1262、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1374、SEQ ID NO：1430和SEQ ID NO：1444。

如本文所用的术语“双特异性”是指“至少双特异性”的抗体构建体，即其至少包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中第一结合结构域结合到一种抗原或靶标(此处：CD70)，且第二结合结构域结合到另一种抗原或靶标(此处：CD3)。因此，根据本发明的抗体构建体包含针对至少两种不同抗原或靶标的特异性。本发明的术语“双特异性抗体构建体”也涵盖多特异性抗体构建体，诸如三特异性抗体构建体，后者包括三个结合结构域，或具有超过三种(例如四个、五个......)特异性的构建体。

鉴于根据本发明的抗体构建体为(至少)双特异性的，其不会天然存在且其明显不同于天然存在的产物。因此，“双特异性”抗体构建体或免疫球蛋白为具有至少两个特异性不同的不同结合位点的人工杂交抗体或免疫球蛋白。双特异性抗体构建体可通过包括杂交瘤融合或Fab′片段连接的多种方法产生。参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。

本发明的抗体构建体的至少两个结合结构域和可变结构域可包含或可不含肽接头(间隔肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含使本发明的抗体构建体的一个(可变和/或结合)结构域和另一(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列彼此连结的氨基酸序列。此类肽接头的基本技术特征在于其不包括任何聚合活性。适合的肽接头包括描述于美国专利第4,751,180号和第4,935,233号或WO 88/09344中的那些。也可使用肽接头将其他结构域或模块或区(诸如半衰期延长结构域)连接至本发明的抗体构建体。

在使用接头的情况下，此接头优选具有一定的长度和序列以足以确保第一和第二结构域中的每一者可彼此独立地保留其不同的结合特异性。对于连接本发明的抗体构建体中至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，优选为仅包含少数氨基酸残基(例如12个氨基酸残基或更少)的肽接头。因此，12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的上下文中尤其优选的“单一”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可由单一氨基酸Gly组成。肽接头的另一个优选实施方案的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄Ser(SEQ ID NO：771)，或其聚合物，即(Gly₄Ser)x，其中x为1或更大的整数(例如2或3)。优选的接头描绘于SEQ ID NO：770-778中。所述肽接头(不含促二级结构)的特征是本领域已知的，且例如描述于Dall′Acqua等人(Biochem.(1998)37，9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29，21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)。此外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域彼此的连接可由例如遗传工程改造提供，如实施例中所述。用于制备融合和可操作地连接的双特异性单链构建体和在哺乳动物细胞或细菌中表达所述构建体的方法是本领域熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。

如上文所述，本发明提供一个优选实施方案，其中抗体构建体呈选自以下的形式：(scFv)₂、scFv-单结构域mAb、双功能抗体和前述形式中的任一者的寡聚物。术语“呈......形式”不排除构建体可通过连接或融合至其他部分而进一步修饰，如本文所述。

根据一个尤其优选实施方案且如随附实施例中所记录，本发明的抗体构建体为“双特异性单链抗体构建体”，更优选双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，如前文所描述，所述合成接头使其能够制成单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整或全长抗体相同的方式评估片段的功能。单链可变片段(scFv)因此为通常用约10至约25个氨基酸、优选约15至20个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸以具有柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且可连接VH的N端与VL的C端，反之亦然。此蛋白尽管去除了恒定区且引入了接头但保留了原始免疫球蛋白的特异性。

双特异性单链分子是本领域已知的且描述于WO 99/54440，Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970，Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025，Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197，

Blood，(2000)，95，6，2098-2103，Brühl，Immunol.，(2001)，166，2420-2426，Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56。关于单链抗体的产生所述的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010)，上述引文和Little(2009)，上述引文)可适合于产生特异性识别所选靶标的单链抗体构建体。

具有形式(scFv)₂的二价(也称为双价)或双特异性单链可变片段(bi-scFv或di-scFv)可通过连接两个scFv分子(例如用如上文所述的接头)而工程改造。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性，则所得的(scFv)₂分子将优选地称为二价的(即对于相同靶标表位，其具有两个价位)。如果两个scFv分子具有不同的结合特异性，则所得的(scFv)₂分子将优选地称为双特异性的。连接可通过产生具有两个VH区和两个VL区的单一肽链进行，从而得到串联scFv(参见例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一可能性为产生具有接头肽的scFv分子，所述接头肽对于两个可变区而言太短而不能折叠在一起(例如约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚。此类型称为双功能抗体(参见例如Hollinger，Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 90(14)：6444-8.)。

根据本发明的抗体构建体的另一优选实施方案，结合结构域(结合到靶抗原CD70或CD3)的重链(VH)和轻链(VL)不经由如上文所描述的肽接头直接连接，但如关于双功能抗体所描述的那样形成结合结构域。因此，CD3结合结构域的VH可经由肽接头融合到CD70结合结构域的VL，且CD70结合结构域的VH经由此类肽接头融合到CD3结合结构域的VL。

单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，其能够独立于其他V区或结构域选择性结合到特定抗原。第一单结构域抗体从骆驼中发现的重链抗体工程改造而得，且它们称为V_HH片段。软骨鱼也具有重链抗体(IgNAR)，可从所述重链抗体获得称为V_NAR片段的单结构域抗体。替代性方法是将来自常见免疫球蛋白(例如来自人或啮齿类动物)的二聚可变结构域分裂成单体，从而获得单结构域Ab形式的VH或VL。尽管目前对单结构域抗体的大多数研究基于重链可变结构域，但来源于轻链的纳米抗体也展示出特异性结合到靶标表位。单结构域抗体的实例称为sdAb、纳米抗体或单一可变结构域抗体。

因此，(单结构域mAb)₂是由(至少)两个单结构域单克隆抗体构成的单克隆抗体构建体，所述单结构域单克隆抗体单独地选自VH、VL、V_HH和V_NAR。接头优选地为肽接头的形式。类似地，“scFv单结构域mAb”是由至少一个如上所述的单结构域抗体和一个如上所述的scFv分子组成的单克隆抗体构建体。同样，接头优选为肽接头的形式。

也设想本发明的抗体构建体除其结合到靶标分子CD70和CD3的功能外还具有另一功能。在此形式中，抗体构建体是三功能或多功能抗体构建体，其通过以下方式发挥作用：经由结合到CD70而靶向靶细胞，经由CD3结合而调节细胞毒性T细胞活性，以及经由募集如NK细胞的效应细胞、标记(荧光等)、诸如毒素或放射性核素的治疗剂和/或延长血清半衰期的物质等而提供另一功能(诸如调节抗体依赖性细胞毒性的完全功能性Fc恒定域)。

延长本发明的抗体构建体的血清半衰期的物质的实例包括融合或以其他方式连接至抗体构建体的肽、蛋白质或蛋白质结构域。肽、蛋白质或蛋白质结构域的组包括结合到人体中具有优选药代动力学特性的其他蛋白质(诸如血清白蛋白)的肽(参见WO 2009/127691)。此类半衰期延长的肽的替代性概念包括结合到新生儿Fc受体(FcRn，参见WO2007/098420)的肽，其也可用在本发明的构建体中。连接蛋白质的较大结构域或完整蛋白质的概念包括例如融合人血清白蛋白、人血清白蛋白的变体或突变体(参见WO 2011/051489、WO 2012/059486、WO 2012/150319、WO 2013/135896、WO 2014/072481、WO 2013/075066)或其结构域以及融合免疫球蛋白的恒定区(Fc结构域)及其变体。Fc结构域的此类变体可经优化/修饰以允许二聚体或多聚体的所需配对，从而消除Fc受体结合(例如Fcγ受体)或用于其他原因。本领域已知的延长小型蛋白质化合物在人体中的半衰期的另一个概念是诸如本发明的抗体构建体的化合物的聚乙二醇化。

在一个优选实施方案中，根据本发明的双特异性抗体构建体可与融合配偶体(诸如蛋白质或多肽或肽)连接(例如经由肽键)，例如用于延长构建体的血清半衰期的目的。这些融合配偶体可选自人血清白蛋白(“HSA”或“HALB”)及其序列变体、结合到HSA的肽、结合到FcRn的肽(“FcRn BP”)或包含(抗体源性)Fc区的构建体。这些融合配偶体的示例性序列描绘于SEQ ID NO：780-826中。通常，融合配偶体可直接(例如经由肽键)或经由诸如(GGGGS)_n(其中“n”为2或更大的整数，例如2或3或4)的肽接头连接至根据本发明的双特异性抗体构建体的N端或C端。适合的肽接头描绘于SEQ ID NO：770-778中。

因此，根据本发明的优选抗体构建体包含：

(a)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ IDNO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ IDNO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ IDNO：419、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：629、SEQ IDNO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ IDNO：922、SEQ ID NO：926、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：958、SEQ ID NO：962、SEQ IDNO：966、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：986、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1006、SEQID NO：1010、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1026、SEQ IDNO：1030、SEQ ID NO：1034、SEQ ID NO：1038、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1052、SEQ IDNO：1056、SEQ ID NO：1066、SEQ ID NO：1070、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1084、SEQ IDNO：1094、SEQ ID NO：1098、SEQ ID NO：1108、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1122、SEQ IDNO：1126、SEQ ID NO：1136、SEQ ID NO：1140、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1154、SEQ IDNO：1164、SEQ ID NO：1168、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1192、SEQ IDNO：1196、SEQ ID NO：1206、SEQ ID NO：1210、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1224、SEQ IDNO：1234、SEQ ID NO：1238、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1262、SEQ IDNO：1266、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1280、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1294、SEQ IDNO：1304、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1318、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1332、SEQ IDNO：1336、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1364、SEQ IDNO：1374、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1402、SEQ IDNO：1406、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1434、SEQ IDNO：1444、SEQ ID NO：1448、SEQ ID NO：1458、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1472、SEQ IDNO：1476、SEQ ID NO：1486、SEQ ID NO：1490、SEQ ID NO：1500、SEQ ID NO：1504、SEQ IDNO：1514、SEQ ID NO：1518、SEQ ID NO：1528、SEQ ID NO：1532、SEQ ID NO：1542、SEQ IDNO：1546、SEQ ID NO：1556、SEQ ID NO：1560、SEQ ID NO：1570和SEQ ID NO：1574；

·具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；和

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：835、SEQ ID NO：844、SEQ IDNO：853、SEQ ID NO：862、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：880、SEQ ID NO：889、SEQ ID NO：898、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：916和SEQ ID NO：919；和

·任选的His标签，诸如SEQ ID NO：779所描绘的；

(b)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：835、SEQ ID NO：844、SEQ IDNO：853、SEQ ID NO：862、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：880、SEQ ID NO：889、SEQ ID NO：898、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：916和SEQ ID NO：919；

·任选的具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自SEQ ID NO：780和786-815的氨基酸序列的多肽；和

·任选的His标签，诸如SEQ ID NO：779所描绘的；

(c)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLX₁PANG(SEQ ID NO：781)的多肽，其中X₁为Y或H；和

·具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；

·具有氨基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG(SEQ ID NO：783)或QRFCTGHFGGLHPCNG(SEQID NO：785)的多肽；和

·任选的His标签，诸如SEQ ID NO：779所描绘的；

(d)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：833、SEQ ID NO：842、SEQ IDNO：851、SEQ ID NO：860、SEQ ID NO：869、SEQ ID NO：878、SEQ ID NO：887、SEQ ID NO：896、SEQ ID NO：905、SEQ ID NO：914和SEQ ID NO：917；

·具有SEQ ID NO：777所描绘的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自以下的氨基酸序列接着是C端的丝氨酸残基的多肽：SEQ ID NO：8、SEQID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68、SEQID NO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ IDNO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ IDNO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ IDNO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQ ID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ IDNO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ IDNO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQ ID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ IDNO：738、SEQ ID NO：921、SEQ ID NO：925、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：933、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：941、SEQ ID NO：945、SEQ ID NO：949、SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：957、SEQ IDNO：961、SEQ ID NO：965、SEQ ID NO：969、SEQ ID NO：973、SEQ ID NO：977、SEQ ID NO：981、SEQ ID NO：985、SEQ ID NO：989、SEQ ID NO：993、SEQ ID NO：997、SEQ ID NO：1001、SEQ IDNO：1005、SEQ ID NO：1009、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1017、SEQ ID NO：1021、SEQ IDNO：1025、SEQ ID NO：1029、SEQ ID NO：1033、SEQ ID NO：1037、SEQ ID NO：1041、SEQ IDNO：1051、SEQ ID NO：1055、SEQ ID NO：1065、SEQ ID NO：1069、SEQ ID NO：1079、SEQ IDNO：1083、SEQ ID NO：1093、SEQ ID NO：1097、SEQ ID NO：1107、SEQ ID NO：1111、SEQ IDNO：1121、SEQ ID NO：1125、SEQ ID NO：1135、SEQ ID NO：1139、SEQ ID NO：1149、SEQ IDNO：1153、SEQ ID NO：1163、SEQ ID NO：1167、SEQ ID NO：1177、SEQ ID NO：1181、SEQ IDNO：1191、SEQ ID NO：1195、SEQ ID NO：1205、SEQ ID NO：1209、SEQ ID NO：1219、SEQ IDNO：1223、SEQ ID NO：1233、SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1247、SEQ ID NO：1251、SEQ IDNO：1261、SEQ ID NO：1265、SEQ ID NO：1275、SEQ ID NO：1279、SEQ ID NO：1289、SEQ IDNO：1293、SEQ ID NO：1303、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1317、SEQ ID NO：1321、SEQ IDNO：1331、SEQ ID NO：1335、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1349、SEQ ID NO：1359、SEQ IDNO：1363、SEQ ID NO：1373、SEQ ID NO：1377、SEQ ID NO：1387、SEQ ID NO：1391、SEQ IDNO：1401、SEQ ID NO：1405、SEQ ID NO：1415、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1429、SEQ IDNO：1433、SEQ ID NO：1443、SEQ ID NO：1447、SEQ ID NO：1457、SEQ ID NO：1461、SEQ IDNO：1471、SEQ ID NO：1475、SEQ ID NO：1485、SEQ ID NO：1489、SEQ ID NO：1499、SEQ IDNO：1503、SEQ ID NO：1513、SEQ ID NO：1517、SEQ ID NO：1527、SEQ ID NO：1531、SEQ IDNO：1541、SEQ ID NO：1545、SEQ ID NO：1555、SEQ ID NO：1559、SEQ ID NO：1569和SEQ IDNO：1573；

·具有SEQ ID NO：816所描绘的氨基酸序列的多肽；和

多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137、SEQID NO：147、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ ID NO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ ID NO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ ID NO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737；SEQ ID NO：920、SEQ ID NO：924、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：932、SEQ ID NO：936、SEQ ID NO：940、SEQID NO：944、SEQ ID NO：948、SEQ ID NO：952、SEQ ID NO：956、SEQ ID NO：960、SEQ ID NO：964、SEQ ID NO：968、SEQ ID NO：972、SEQ ID NO：976、SEQ ID NO：980、SEQ ID NO：984、SEQID NO：988、SEQ ID NO：992、SEQ ID NO：996、SEQ ID NO：1000、SEQ ID NO：1004、SEQ IDNO：1008、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1016、SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1024、SEQ IDNO：1028、SEQ ID NO：1032、SEQ ID NO：1036、SEQ ID NO：1040、SEQ ID NO：1050、SEQ IDNO：1054、SEQ ID NO：1064、SEQ ID NO：1068、SEQ ID NO：1078、SEQ ID NO：1082、SEQ IDNO：1092、SEQ ID NO：1096、SEQ ID NO：1106、SEQ ID NO：1110、SEQ ID NO：1120、SEQ IDNO：1124、SEQ ID NO：1134、SEQ ID NO：1138、SEQ ID NO：1148、SEQ ID NO：1152、SEQ IDNO：1162、SEQ ID NO：1166、SEQ ID NO：1176、SEQ ID NO：1180、SEQ ID NO：1190、SEQ IDNO：1194、SEQ ID NO：1204、SEQ ID NO：1208、SEQ ID NO：1218、SEQ ID NO：1222、SEQ IDNO：1232、SEQ ID NO：1236、SEQ ID NO：1246、SEQ ID NO：1250、SEQ ID NO：1260、SEQ IDNO：1264、SEQ ID NO：1274、SEQ ID NO：1278、SEQ ID NO：1288、SEQ ID NO：1292、SEQ IDNO：1302、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1316、SEQ ID NO：1320、SEQ ID NO：1330、SEQ IDNO：1334、SEQ ID NO：1344、SEQ ID NO：1348、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1362、SEQ IDNO：1372、SEQ ID NO：1376、SEQ ID NO：1386、SEQ ID NO：1390、SEQ ID NO：1400、SEQ IDNO：1404、SEQ ID NO：1414、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1428、SEQ ID NO：1432、SEQ IDNO：1442、SEQ ID NO：1446、SEQ ID NO：1456、SEQ ID NO：1460、SEQ ID NO：1470、SEQ IDNO：1474、SEQ ID NO：1484、SEQ ID NO：1488、SEQ ID NO：1498、SEQ ID NO：1502、SEQ IDNO：1512、SEQ ID NO：1516、SEQ ID NO：1526、SEQ ID NO：1530、SEQ ID NO：1540、SEQ IDNO：1544、SEQ ID NO：1554、SEQ ID NO：1558、SEQ ID NO：1568和SEQ ID NO：1572；

·具有SEQ ID NO：777所描绘的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自以下的氨基酸序列接着是C端的丝氨酸残基的多肽：SEQ ID NO：834、SEQ ID NO：843、SEQ ID NO：852、SEQ ID NO：861、SEQ ID NO：870、SEQ ID NO：879、SEQ IDNO：888、SEQ ID NO：897、SEQ ID NO：906、SEQ ID NO：915和SEQ ID NO：918；和

·具有SEQ ID NO：817所描绘的氨基酸序列的多肽；

(e)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：833、SEQ ID NO：842、SEQ ID NO：851、SEQ ID NO：860、SEQ ID NO：869、SEQ ID NO：878、SEQ ID NO：887、SEQ ID NO：896、SEQID NO：905、SEQ ID NO：914和SEQ ID NO：917；

·具有SEQ ID NO：777所描绘的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自以下氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：138、SEQID NO：148、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：248、SEQID NO：258、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：358、SEQID NO：368、SEQ ID NO：378、SEQ ID NO：388、SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：408、SEQ ID NO：418、SEQ ID NO：428、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：448、SEQ ID NO：458、SEQ ID NO：468、SEQID NO：478、SEQ ID NO：488、SEQ ID NO：498、SEQ ID NO：508、SEQ ID NO：518、SEQ ID NO：528、SEQ ID NO：538、SEQ ID NO：548、SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：568、SEQ ID NO：578、SEQID NO：588、SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：608、SEQ ID NO：618、SEQ ID NO：628、SEQ ID NO：638、SEQ ID NO：648、SEQ ID NO：658、SEQ ID NO：668、SEQ ID NO：678、SEQ ID NO：688、SEQID NO：698、SEQ ID NO：708、SEQ ID NO：718、SEQ ID NO：728、SEQ ID NO：738、SEQ ID NO：921、SEQ ID NO：925、SEQ ID NO：929、SEQ ID NO：933、SEQ ID NO：937、SEQ ID NO：941、SEQID NO：945、SEQ ID NO：949、SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：957、SEQ ID NO：961、SEQ ID NO：965、SEQ ID NO：969、SEQ ID NO：973、SEQ ID NO：977、SEQ ID NO：981、SEQ ID NO：985、SEQID NO：989、SEQ ID NO：993、SEQ ID NO：997、SEQ ID NO：1001、SEQ ID NO：1005、SEQ IDNO：1009、SEQ ID NO：1013、SEQ ID NO：1017、SEQ ID NO：1021、SEQ ID NO：1025、SEQ IDNO：1029、SEQ ID NO：1033、SEQ ID NO：1037、SEQ ID NO：1041、SEQ ID NO：1051、SEQ IDNO：1055、SEQ ID NO：1065、SEQ ID NO：1069、SEQ ID NO：1079、SEQ ID NO：1083、SEQ IDNO：1093、SEQ ID NO：1097、SEQ ID NO：1107、SEQ ID NO：1111、SEQ ID NO：1121、SEQ IDNO：1125、SEQ ID NO：1135、SEQ ID NO：1139、SEQ ID NO：1149、SEQ ID NO：1153、SEQ IDNO：1163、SEQ ID NO：1167、SEQ ID NO：1177、SEQ ID NO：1181、SEQ ID NO：1191、SEQ IDNO：1195、SEQ ID NO：1205、SEQ ID NO：1209、SEQ ID NO：1219、SEQ ID NO：1223、SEQ IDNO：1233、SEQ ID NO：1237、SEQ ID NO：1247、SEQ ID NO：1251、SEQ ID NO：1261、SEQ IDNO：1265、SEQ ID NO：1275、SEQ ID NO：1279、SEQ ID NO：1289、SEQ ID NO：1293、SEQ IDNO：1303、SEQ ID NO：1307、SEQ ID NO：1317、SEQ ID NO：1321、SEQ ID NO：1331、SEQ IDNO：1335、SEQ ID NO：1345、SEQ ID NO：1349、SEQ ID NO：1359、SEQ ID NO：1363、SEQ IDNO：1373、SEQ ID NO：1377、SEQ ID NO：1387、SEQ ID NO：1391、SEQ ID NO：1401、SEQ IDNO：1405、SEQ ID NO：1415、SEQ ID NO：1419、SEQ ID NO：1429、SEQ ID NO：1433、SEQ IDNO：1443、SEQ ID NO：1447、SEQ ID NO：1457、SEQ ID NO：1461、SEQ ID NO：1471、SEQ IDNO：1475、SEQ ID NO：1485、SEQ ID NO：1489、SEQ ID NO：1499、SEQ ID NO：1503、SEQ IDNO：1513、SEQ ID NO：1517、SEQ ID NO：1527、SEQ ID NO：1531、SEQ ID NO：1541、SEQ IDNO：1545、SEQ ID NO：1555、SEQ ID NO：1559、SEQ ID NO：1569和SEQ ID NO：1573；和

·具有SEQ ID NO：818所描绘的氨基酸序列的多肽；和

多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：77、SEQ IDNO：87、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：187、SEQ IDNO：197、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：257、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：277、SEQ ID NO：287、SEQ ID NO：297、SEQ IDNO：307、SEQ ID NO：317、SEQ ID NO：327、SEQ ID NO：337、SEQ ID NO：347、SEQ ID NO：357、SEQ ID NO：367、SEQ ID NO：377、SEQ ID NO：387、SEQ ID NO：397、SEQ ID NO：407、SEQ IDNO：417、SEQ ID NO：427、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：447、SEQ ID NO：457、SEQ ID NO：467、SEQ ID NO：477、SEQ ID NO：487、SEQ ID NO：497、SEQ ID NO：507、SEQ ID NO：517、SEQ IDNO：527、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：577、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：597、SEQ ID NO：607、SEQ ID NO：617、SEQ ID NO：627、SEQ IDNO：637、SEQ ID NO：647、SEQ ID NO：657、SEQ ID NO：667、SEQ ID NO：677、SEQ ID NO：687、SEQ ID NO：697、SEQ ID NO：707、SEQ ID NO：717、SEQ ID NO：727、SEQ ID NO：737；SEQ IDNO：920、SEQ ID NO：924、SEQ ID NO：928、SEQ ID NO：932、SEQ ID NO：936、SEQ ID NO：940、SEQ ID NO：944、SEQ ID NO：948、SEQ ID NO：952、SEQ ID NO：956、SEQ ID NO：960、SEQ IDNO：964、SEQ ID NO：968、SEQ ID NO：972、SEQ ID NO：976、SEQ ID NO：980、SEQ ID NO：984、SEQ ID NO：988、SEQ ID NO：992、SEQ ID NO：996、SEQ ID NO：1000、SEQ ID NO：1004、SEQID NO：1008、SEQ ID NO：1012、SEQ ID NO：1016、SEQ ID NO：1020、SEQ ID NO：1024、SEQ IDNO：1028、SEQ ID NO：1032、SEQ ID NO：1036、SEQ ID NO：1040、SEQ ID NO：1050、SEQ IDNO：1054、SEQ ID NO：1064、SEQ ID NO：1068、SEQ ID NO：1078、SEQ ID NO：1082、SEQ IDNO：1092、SEQ ID NO：1096、SEQ ID NO：1106、SEQ ID NO：1110、SEQ ID NO：1120、SEQ IDNO：1124、SEQ ID NO：1134、SEQ ID NO：1138、SEQ ID NO：1148、SEQ ID NO：1152、SEQ IDNO：1162、SEQ ID NO：1166、SEQ ID NO：1176、SEQ ID NO：1180、SEQ ID NO：1190、SEQ IDNO：1194、SEQ ID NO：1204、SEQ ID NO：1208、SEQ ID NO：1218、SEQ ID NO：1222、SEQ IDNO：1232、SEQ ID NO：1236、SEQ ID NO：1246、SEQ ID NO：1250、SEQ ID NO：1260、SEQ IDNO：1264、SEQ ID NO：1274、SEQ ID NO：1278、SEQ ID NO：1288、SEQ ID NO：1292、SEQ IDNO：1302、SEQ ID NO：1306、SEQ ID NO：1316、SEQ ID NO：1320、SEQ ID NO：1330、SEQ IDNO：1334、SEQ ID NO：1344、SEQ ID NO：1348、SEQ ID NO：1358、SEQ ID NO：1362、SEQ IDNO：1372、SEQ ID NO：1376、SEQ ID NO：1386、SEQ ID NO：1390、SEQ ID NO：1400、SEQ IDNO：1404、SEQ ID NO：1414、SEQ ID NO：1418、SEQ ID NO：1428、SEQ ID NO：1432、SEQ IDNO：1442、SEQ ID NO：1446、SEQ ID NO：1456、SEQ ID NO：1460、SEQ ID NO：1470、SEQ IDNO：1474、SEQ ID NO：1484、SEQ ID NO：1488、SEQ ID NO：1498、SEQ ID NO：1502、SEQ IDNO：1512、SEQ ID NO：1516、SEQ ID NO：1526、SEQ ID NO：1530、SEQ ID NO：1540、SEQ IDNO：1544、SEQ ID NO：1554、SEQ ID NO：1558、SEQ ID NO：1568和SEQ ID NO：1572；

·具有SEQ ID NO：777所描绘的氨基酸序列的肽接头；

·具有SEQ ID NO：819所描绘的氨基酸序列的多肽；

(f)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；

·具有SEQ ID NO：820所描绘的氨基酸序列的多肽；和

·具有SEQ ID NO：821所描绘的氨基酸序列的多肽；

(g)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ IDNO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ IDNO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ IDNO：419、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：629、SEQ IDNO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ IDNO：922、SEQ ID NO：926、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：958、SEQ ID NO：962、SEQ IDNO：966、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：986、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1006、SEQID NO：1010、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1026、SEQ IDNO：1030、SEQ ID NO：1034、SEQ ID NO：1038、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1052、SEQ IDNO：1056、SEQ ID NO：1066、SEQ ID NO：1070、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1084、SEQ IDNO：1094、SEQ ID NO：1098、SEQ ID NO：1108、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1122、SEQ IDNO：1126、SEQ ID NO：1136、SEQ ID NO：1140、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1154、SEQ IDNO：1164、SEQ ID NO：1168、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1192、SEQ IDNO：1196、SEQ ID NO：1206、SEQ ID NO：1210、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1224、SEQ IDNO：1234、SEQ ID NO：1238、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1262、SEQ IDNO：1266、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1280、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1294、SEQ IDNO：1304、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1318、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1332、SEQ IDNO：1336、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1364、SEQ IDNO：1374、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1402、SEQ IDNO：1406、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1434、SEQ IDNO：1444、SEQ ID NO：1448、SEQ ID NO：1458、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1472、SEQ IDNO：1476、SEQ ID NO：1486、SEQ ID NO：1490、SEQ ID NO：1500、SEQ ID NO：1504、SEQ IDNO：1514、SEQ ID NO：1518、SEQ ID NO：1528、SEQ ID NO：1532、SEQ ID NO：1542、SEQ IDNO：1546、SEQ ID NO：1556、SEQ ID NO：1560、SEQ ID NO：1570和SEQ ID NO：1574；和

·具有SEQ ID NO：822所描绘的氨基酸序列的多肽；和

多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有SEQ ID NO：823所描绘的氨基酸序列的多肽；

(h)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ IDNO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ IDNO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ IDNO：419、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ ID NO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519、SEQ IDNO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：579、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：629、SEQ IDNO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679、SEQ ID NO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ IDNO：922、SEQ ID NO：926、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：938、SEQ ID NO：942、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：958、SEQ ID NO：962、SEQ IDNO：966、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：982、SEQ ID NO：986、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1006、SEQID NO：1010、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1026、SEQ IDNO：1030、SEQ ID NO：1034、SEQ ID NO：1038、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1052、SEQ IDNO：1056、SEQ ID NO：1066、SEQ ID NO：1070、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1084、SEQ IDNO：1094、SEQ ID NO：1098、SEQ ID NO：1108、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1122、SEQ IDNO：1126、SEQ ID NO：1136、SEQ ID NO：1140、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1154、SEQ IDNO：1164、SEQ ID NO：1168、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1192、SEQ IDNO：1196、SEQ ID NO：1206、SEQ ID NO：1210、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1224、SEQ IDNO：1234、SEQ ID NO：1238、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1262、SEQ IDNO：1266、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1280、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1294、SEQ IDNO：1304、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1318、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1332、SEQ IDNO：1336、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1364、SEQ IDNO：1374、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1402、SEQ IDNO：1406、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1434、SEQ IDNO：1444、SEQ ID NO：1448、SEQ ID NO：1458、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1472、SEQ IDNO：1476、SEQ ID NO：1486、SEQ ID NO：1490、SEQ ID NO：1500、SEQ ID NO：1504、SEQ IDNO：1514、SEQ ID NO：1518、SEQ ID NO：1528、SEQ ID NO：1532、SEQ ID NO：1542、SEQ IDNO：1546、SEQ ID NO：1556、SEQ ID NO：1560、SEQ ID NO：1570和SEQ ID NO：1574的氨基酸序列的多肽；和

·具有SEQ ID NO：824所描绘的氨基酸序列的多肽；和

多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有SEQ ID NO：825所描绘的氨基酸序列的多肽；或

(i)多肽，其从N端开始按以下次序包含：

·具有选自SEQ ID NO：770-778的氨基酸序列的肽接头；

·具有SEQ ID NO：826所描绘的氨基酸序列的多肽。

如上所述，本发明的若干优选的抗体构建体通过与另一部分(诸如白蛋白或白蛋白变体)融合而修饰。如果这些融合构建体针对其特性(诸如具体地讲，其靶标亲和力或细胞毒性活性)进行表征，则技术人员将意识到，可预期类似的融合构建体或未修饰的双特异性抗体构建体具有类似(或可能甚至更佳的)特性。例如，如果与白蛋白融合的双特异性抗体构建体具有可测量或所需的细胞毒性活性或靶标亲和力，则可预期，对于无白蛋白的相同构建体将观测到相同/类似或甚至更高的细胞毒性活性/靶标亲和力。

根据另一个优选实施方案，本发明的双特异性抗体构建体包含(除两个结合结构域以外)含有两个多肽单体的第三结构域，所述多肽单体各自包含铰链、CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽(或多肽单体)经由肽接头彼此融合。优选地，所述第三结构域以N端至C端次序包含：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。所述第三结构域的优选氨基酸序列描绘于SEQ ID NO：1856-1863中。所述多肽单体中的每一者优选具有选自SEQ ID NO：1848-1855或与这些序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体的第一和第二结合结构域经由肽接头与第三结构域融合，所述肽接头例如选自SEQ ID NO：770、771、773、774、775、777和778。

根据本发明，“铰链”为IgG铰链区。该区域可通过使用Kabat编号的类比而鉴别，参见Kabat位置223-243。根据上文，对“铰链”的最小需要是与根据Kabat编号的D231至P243的IgG₁序列段对应的氨基酸残基。术语CH2和CH3是指免疫球蛋白重链恒定区2和3。这些区域也可通过使用Kabat编号的类比而鉴别，参见CH2的Kabat位置244-360和CH3的Kabat位置361-478。应当理解，就其IgG₁Fc区、IgG₂Fc区、IgG₃Fc区、IgG₄Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgDFc区和IgE Fc区而言，在免疫球蛋白之间存在一些变化(参见例如Padlan，MolecularImmunology，31(3)，169-217(1993))。术语Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区，和IgE和IgM的最后三个重链恒定区。Fc单体也可包括这些结构域的N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3和前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管免疫球蛋白的Fc部分的边界可以变化，但包含功能性铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可被定义为例如分别包含用于IgG₄的残基(铰链结构域的)D231至(CH3结构域C端的)P476或D231至L476，其中编号根据Kabat。

本发明的抗体构建体因此可按N端至C端次序包含：

(a)第一结合结构域；

(b)具有选自SEQ ID NO：771、777和778的氨基酸序列的肽接头；

(c)第二结合结构域；

(d)具有选自SEQ ID NO：770、771、773、774、775、777和778的氨基酸序列的肽接头；

(e)第三结构域的第一多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)；

(f)具有选自SEQ ID NO：1865、1866、1867和1868的氨基酸序列的肽接头；和

(g)第三结构域的第二多肽单体(包含铰链、CH2和CH3结构域)。

还优选的是，本发明的抗体构建体按N端至C端次序包含：

·具有选自以下的氨基酸序列的第一结合结构域：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：139、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：239、SEQ IDNO：249、SEQ ID NO：259、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：349、SEQ IDNO：359、SEQ ID NO：369、SEQ ID NO：379、SEQ ID NO：389、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：409、SEQ ID NO：419、SEQ ID NO：429、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：449、SEQ ID NO：459、SEQ IDNO：469、SEQ ID NO：479、SEQ ID NO：489、SEQ ID NO：499、SEQ ID NO：509、SEQ ID NO：519、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：559、SEQ ID NO：569、SEQ IDNO：579、SEQ ID NO：589、SEQ ID NO：599、SEQ ID NO：609、SEQ ID NO：619、SEQ ID NO：629、SEQ ID NO：639、SEQ ID NO：649、SEQ ID NO：659、SEQ ID NO：669、SEQ ID NO：679、SEQ IDNO：689、SEQ ID NO：699、SEQ ID NO：709、SEQ ID NO：719、SEQ ID NO：729、SEQ ID NO：739、SEQ ID NO：922、SEQ ID NO：926、SEQ ID NO：930、SEQ ID NO：934、SEQ ID NO：938、SEQ IDNO：942、SEQ ID NO：946、SEQ ID NO：950、SEQ ID NO：954、SEQ ID NO：958、SEQ ID NO：962、SEQ ID NO：966、SEQ ID NO：970、SEQ ID NO：974、SEQ ID NO：978、SEQ ID NO：982、SEQ IDNO：986、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：998、SEQ ID NO：1002、SEQ ID NO：1006、SEQ ID NO：1010、SEQ ID NO：1014、SEQ ID NO：1018、SEQ ID NO：1022、SEQ ID NO：1026、SEQ ID NO：1030、SEQ ID NO：1034、SEQ ID NO：1038、SEQ ID NO：1042、SEQ ID NO：1052、SEQ ID NO：1056、SEQ ID NO：1066、SEQ ID NO：1070、SEQ ID NO：1080、SEQ ID NO：1084、SEQ ID NO：1094、SEQ ID NO：1098、SEQ ID NO：1108、SEQ ID NO：1112、SEQ ID NO：1122、SEQ ID NO：1126、SEQ ID NO：1136、SEQ ID NO：1140、SEQ ID NO：1150、SEQ ID NO：1154、SEQ ID NO：1164、SEQ ID NO：1168、SEQ ID NO：1178、SEQ ID NO：1182、SEQ ID NO：1192、SEQ ID NO：1196、SEQ ID NO：1206、SEQ ID NO：1210、SEQ ID NO：1220、SEQ ID NO：1224、SEQ ID NO：1234、SEQ ID NO：1238、SEQ ID NO：1248、SEQ ID NO：1252、SEQ ID NO：1262、SEQ ID NO：1266、SEQ ID NO：1276、SEQ ID NO：1280、SEQ ID NO：1290、SEQ ID NO：1294、SEQ ID NO：1304、SEQ ID NO：1308、SEQ ID NO：1318、SEQ ID NO：1322、SEQ ID NO：1332、SEQ ID NO：1336、SEQ ID NO：1346、SEQ ID NO：1350、SEQ ID NO：1360、SEQ ID NO：1364、SEQ ID NO：1374、SEQ ID NO：1378、SEQ ID NO：1388、SEQ ID NO：1392、SEQ ID NO：1402、SEQ ID NO：1406、SEQ ID NO：1416、SEQ ID NO：1420、SEQ ID NO：1430、SEQ ID NO：1434、SEQ ID NO：1444、SEQ ID NO：1448、SEQ ID NO：1458、SEQ ID NO：1462、SEQ ID NO：1472、SEQ ID NO：1476、SEQ ID NO：1486、SEQ ID NO：1490、SEQ ID NO：1500、SEQ ID NO：1504、SEQ ID NO：1514、SEQ ID NO：1518、SEQ ID NO：1528、SEQ ID NO：1532、SEQ ID NO：1542、SEQ ID NO：1546、SEQ ID NO：1556、SEQ ID NO：1560、SEQ ID NO：1570和SEQ ID NO：1574；

·具有选自SEQ ID NO：771、777和778的氨基酸序列的肽接头；

·具有选自以下的氨基酸序列的第二结合结构域：SEQ ID NO：835、SEQ ID NO：844、SEQ ID NO：853、SEQ ID NO：862、SEQ ID NO：871、SEQ ID NO：880、SEQ ID NO：889、SEQID NO：898、SEQ ID NO：907、SEQ ID NO：916和SEQ ID NO：919；

·具有选自以下的氨基酸序列的肽接头：SEQ ID NO：770、771、773、774、775、777和778；和

·具有选自SEQ ID NO：1856-1863的氨基酸序列的第三结构域。

因此，在优选的实施方案中，本发明的抗体构建体包含选自SEQ ID NO：1576至1847所描绘的多肽的多肽或由其组成。优选的是选自SEQ ID NO：1696、SEQ ID NO：1702、SEQ ID NO：1710、SEQ ID NO：1714、SEQ ID NO：1716、SEQ ID NO：1720、SEQ ID NO：1722、SEQ ID NO：1724、SEQ ID NO：1726、SEQ ID NO：1728、SEQ ID NO：1738、SEQ ID NO：1740、SEQ ID NO：1742、SEQ ID NO：1750和SEQ ID NO：1752所描绘的多肽的那些多肽。

抗体构建体的共价修饰也包括在本发明的范围内，且通常但未必总在翻译后进行。例如，通过使抗体构建体的特定氨基酸残基与能够与所选侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应而将抗体构建体的数种类型的共价修饰引入分子中。

半胱氨酰基残基最常与α-卤代乙酸酯(及相应的胺)(诸如氯乙酸或氯乙酰胺)反应以产生羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸盐、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应而衍生。

组氨酰基残基通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应而衍生，这是因为此试剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴也是可用的；反应优选在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰基残基的电荷的作用。其他可用于衍生含有α-氨基的残基的试剂包括酰亚胺酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮和转胺酶催化的与乙醛酸酯的反应。

精氨酰基残基通过与一种或数种常规试剂(其中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮)反应而进行修饰。由于胍官能团具有高pKa，因此精氨酸残基的衍生化需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

可对酪氨酰基残基进行特定修饰，尤其关注的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰基残基中。最通常的是，分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。酪氨酰基残基使用¹²⁵I或¹³¹I碘化以制备用于放射免疫测定的经标记蛋白质，上文所述的氯胺T方法是适合的。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应而被选择性地修饰，其中R和R′为任选的不同烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。

用双功能试剂衍生化可用于使本发明的抗体构建体交联成多种方法中所用的不溶于水的支撑基质或表面。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮水杨酸的酯)、同双官能酰亚胺酯(包括二琥珀酰亚胺基酯，诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双功能马来酰亚胺(诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷)。诸如3-[(对叠氮苯基)二硫基]丙酰亚胺甲酯的衍生剂产生能够在光存在下形成交联的可光活化中间体。或者，如美国专利第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号和第4,330,440号中所描述的反应性水不溶性基质(诸如溴化氰活化的碳水化合物)和反应性底物用于蛋白固定。

常使谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基脱酰胺化以分别形成对应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基在适度酸性条件下脱酰胺化。这些残基的任一形式均落在本发明的范围内。

其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1983，第79-86页)；N端胺的乙酰化；和任何C端羧基的酰胺化。

本发明范围内包括的抗体构建体的另一类共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域已知，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如存在或不存在特定糖基化氨基酸残基，下文论述)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下文论述特定的表达系统。

多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)为碳水化合物部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列中的任一者均可产生潜在糖基化位点。O连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者连接至羟氨基酸(虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但最常使用丝氨酸或苏氨酸)。

向抗体构建体添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使得其含有上述三肽序列中的一者或多者而便利地实现(对于N连接的糖基化位点)。也可通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由其取代来进行改变(对于O连接的糖基化位点)。为了方便，抗体构建体的氨基酸序列优选通过在DNA水平上的变化而改变，尤其通过使编码多肽的DNA在预先选择的碱基处突变以使得产生将翻译成所需氨基酸的密码子。

增加抗体构建体上碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶合。这些程序是有利的，因为它们不需要在具有糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质来进行N连接和O连接的糖基化。取决于所用的偶合模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基，(e)芳族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页。

将存在于起始抗体构建体上的碳水化合物部分移除可以化学或酶促方式实现。化学脱糖基化作用需要将蛋白质暴露于三氟甲磺酸化合物或等效化合物中。此处理使得除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所有糖裂解，而留下完整的多肽。化学脱糖基化由Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350描述的多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现。在潜在糖基化位点处的糖基化可通过使用如由Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的衣霉素化合物而防止。衣霉素阻断蛋白-N-糖苷键的形成。

本文也考虑了抗体构建体的其他修饰。例如，抗体构建体的另一类型的共价修饰包括将抗体构建体以美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中所阐述的方式连接到各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，诸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。此外，如本领域已知，可在抗体构建体内的多个位置进行氨基酸取代，例如以促进聚合物(诸如PEG)的加成。

在一些实施方案中，本发明的抗体构建体的共价修饰包括添加一个或多个标记。标记基团可经由各种长度的间隔臂与抗体构建体偶合以降低潜在位阻。标记蛋白质的各种方法是本领域已知的且可用于执行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。一般而言，标记属于多种类别，具体取决于检测标记的测定，以下实例包括但不限于：

a)同位素标记，其可为放射性同位素或重同位素，诸如放射性同位素或放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)

b)磁性标记(例如磁性粒子)

c)氧化还原活性部分

d)光学染料(包括但不限于发色团、磷光体和荧光团)，诸如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、化学发光基团和可为“小分子”荧光或蛋白荧光的荧光团

e)酶类基团(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)

f)经生物素化的基团

g)由二级报告蛋白识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)

“荧光标记”意指可经由其固有荧光特性而检测的任何分子。适合的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、Malacite绿、茋、荧光黄(Lucifer Yellow)、Cascade BlueJ、得克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄(Cascade Yellow)和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明和得克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(AmershamLife Science，Pittsburgh，PA)。适合的光学染料(包括荧光团)描述于RichardP.Haugland的Molecular Probes Handbook。

适合的蛋白荧光标记也包括但不限于绿色荧光蛋白，包括GFP的海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)种(Chalfie等人，1994，Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories，Inc.，Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber，1998，Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)、荧光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019，美国专利第5,292,658号、第5,418,155号、第5,683,888号、第5,741,668号、第5,777,079号、第5,804,387号、第5,874,304号、第5,876,995号、第5,925,558号)。

亮氨酸拉链结构域是促进存在亮氨酸拉链结构域的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合蛋白中鉴别出(Landschulz等人，1988，Science 240：1759)，且此后在多种不同蛋白质中发现。已知的亮氨酸拉链包括二聚或三聚的天然存在的肽及其衍生物。适用于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请WO 94/10308，且来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人，1994，FEBS Letters344：191。经修饰的亮氨酸拉链允许与其融合的异源蛋白质发生稳定三聚化的用途描述于Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-78。在一种方法中，包含与亮氨酸拉链肽融合的CD70抗体片段或衍生物的重组融合蛋白在适合的宿主细胞中表达，且形成的可溶性寡聚CD70抗体片段或衍生物从培养物上清液中回收。

本发明的抗体构建体还可包含其他结构域，其例如有助于分离分子或与分子的经调适药代动力学特性有关。有助于分离抗体构建体的结构域可选自肽基序或二次引入的部分，其可在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施方案包括肽基序，称为Myc标签、HAT标签、HA标签、TAP标签、GST标签、几丁质结合结构域(CBD标签)、麦芽糖结合蛋白质(MBP标签)、Flag标签、Strep标签及其变体(例如StrepII标签)和His标签。由所鉴别的CDR表征的所有本文公开的抗体构建体优选包含His标签结构域，其一般称为分子的氨基酸序列中连续His残基的重复序列，优选五个且更优选六个His残基(六组氨酸)的重复序列。His标签可位于例如抗体构建体的N端或C端，其优选位于C端。最优选的是，六组氨酸标签(HHHHHH，参见SEQ ID NO：779)经由肽键连接至根据本发明的抗体构建体的C端。

本发明的抗体构建体的第一结合结构域结合到靶细胞表面上的人CD70。人CD70的优选氨基酸序列由SEQ ID NO：741表示。应当理解，在本发明的上下文中，术语“表面上”意指结合结构域特异性结合到包含在CD70胞外结构域内的表位(CD70 ECD)。因此，当根据本发明的第一结合结构域由天然表达细胞或细胞系和/或用CD70转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时，其优选结合到CD70。在一个优选实施方案中，当CD70在诸如BIAcore或Scatchard的体外结合测定中用作“靶标”或“配体”分子时，第一结合结构域也结合到CD70。“靶细胞”可为在其表面上表达CD70的任何原核或真核细胞；优选地，靶细胞是作为人或动物身体的一部分的细胞，诸如选自例如以下的特定癌细胞：肾癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌或头颈癌、黑素瘤、卡波氏肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)、胚胎癌瘤、脑肿瘤、白血病或淋巴瘤。

术语“CD70 ECD”是指CD70的一种形式，其基本上不含CD70的跨膜和胞质结构域。技术人员应当理解，针对本发明的CD70多肽所鉴别的跨膜结构域按照本领域中常规用于鉴别疏水性结构域类型的准则来鉴别。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最可能在本文具体提及的结构域的任一端处变化不超过约5个氨基酸。优选的人CD70 ECD示于SEQ ID NO：742中。

人CD70的第一结合结构域的亲和力优选≤20nM或≤15nM，更优选≤10nM，甚至更优选≤5nM，甚至更优选≤2nM，甚至更优选≤1nM，甚至更优选≤0.6nM，甚至更优选≤0.5nM，且最优选≤0.4nM。亲和力可例如在BIAcore测定中或在Scatchard测定中进行测量，例如，如实施例中所述。测定亲和力的其他方法也是技术人员熟知的。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起中心作用的一类淋巴细胞(自身为一类白细胞)。存在若干种T细胞亚群，各自具有不同功能。T细胞可通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而区别于其他淋巴细胞，诸如B细胞和NK细胞。TCR负责识别结合到主要组织相容性复合体(MHC)分子的抗原且由两条不同的蛋白质链组成。在95％的T细胞中，TCR由alpha(α)和beta(β)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，T淋巴细胞通过由相关酶、辅助受体、特殊衔接分子以及活化或释放的转录因子介导的一系列生物化学事件而活化。

CD3受体复合物是一种蛋白质复合物且由四条链构成。在哺乳动物中，该复合物含有CD3γ(gamma)链、CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(zeta)链相关联以形成T细胞受体CD3复合物且在T淋巴细胞中产生活化信号。CD3γ(gamma)、CD3δ(delta)和CD3ε(epsilon)链为含有单一细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白。CD3分子的胞内尾部含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称为ITAM的单一保守基序，其对TCR的信号传导能力至关重要。CD3ε分子是在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码的多肽。CD3ε的最优选表位包含在人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27内。

经由多特异性、至少双特异性抗体构建体募集T细胞来重定向靶细胞的溶解涉及溶细胞性突触的形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够进行连续靶细胞溶解，且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见例如WO2007/042261。

由CD70xCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性可以各种方式测量。参见实施例8.1至8.7。效应细胞可为例如经刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞为猕猴来源的或表达猕猴CD70或经猕猴CD70转染，则效应细胞也应为猕猴来源的，诸如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应表达CD70(至少其胞外结构域)，例如人或猕猴CD70。靶细胞可为用CD70(例如人或猕猴CD70)稳定或瞬时转染的细胞系(诸如CHO)。或者，靶细胞可为CD70阳性天然表达细胞系，诸如人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8。通常，预期在细胞表面上表达较高水平的CD70的靶细胞系的EC50值较低。效应细胞∶靶细胞(E∶T)比率通常为约10∶1，但也可以变化。CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性可在51-铬释放测定(孵育时间约18小时)或基于FACS的细胞毒性测定(孵育时间约48小时)中测量。修改测定的孵育时间(细胞毒性反应)也是可能的。测量细胞毒性的其他方法是技术人员熟知的且包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定(包括生物发光测定)、磺酰罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆生成测定和ECIS技术。

由本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体介导的细胞毒性活性优选在基于细胞的细胞毒性测定中测量。也可在51-铬释放测定中进行测量。其由EC₅₀值表示，该值对应于半最大有效浓度(引起基线与最大值之间的一半的细胞毒性反应的抗体构建体的浓度)。优选地，CD70xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值≤10.000pM或≤5000pM，更优选≤4000pM或≤3000pM，甚至更优选≤2000pM或≤1000pM，甚至更优选≤500pM或≤400pM，甚至更优选≤300pM或≤200pM，甚至更优选≤100pM或≤50pM，甚至更优选≤20pM或≤10pM，以及最优选≤5pM或≤2pM或≤1pM，或甚至≤0.5pM或≤0.2pM或≤0.1pM。

以上给定的EC₅₀值可以在不同的测定中测量。技术人员意识到，预期与未刺激的PBMC相比，在经刺激/富集的CD8+ T细胞用作效应细胞时EC50值可较低。此外，可预期与低靶标表达大鼠相比，当靶细胞表达大量靶抗原时EC50值较低。例如，当经刺激的/富集的人CD8+ T细胞用作效应细胞(且经CD70转染的细胞诸如CHO细胞或CD70阳性细胞系用作靶细胞)时，CD70 xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤1000pM，更优选≤500PM，甚至更优选≤250pM，甚至更优选≤100pM，甚至更优选≤50pM，甚至更优选≤10pM，且最优选≤5pM或≤2pM或≤1pM。当人PBMC用作效应细胞时，CD70xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤10.000pM或≤5000pM或≤4000pM(具体地讲当靶细胞为CD70阳性细胞系时)，更优选≤2000pM(具体地讲当靶细胞为经CD70转染的细胞，诸如CHO细胞时)，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤200pM，甚至更优选≤150pM，甚至更优选≤100pM，且最优选≤50pM或≤20pM，或更低。当诸如LnPx4119的猕猴T细胞系用作效应细胞且诸如CHO细胞的经猕猴CD70转染的细胞系用作靶细胞系时，CD70xCD3双特异性抗体构建体的EC₅₀值优选≤2000pM或≤1500pM，更优选≤1000pM或≤500pM，甚至更优选≤300pM或≤250pM，甚至更优选≤100pM，且最优选≤50pM或≤20pM，或更低，诸如≤10pM、≤5pM、≤1pM或≤0.5pM。

优选地，本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体不诱导/介导CD70阴性细胞诸如CHO细胞的裂解或基本上不诱导/介导CD70阴性细胞的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本上不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本上不介导溶解”意指本发明的抗体构建体不诱导或介导超过30％，优选不超过20％，更优选不超过10％，尤其优选不超过9％、8％、7％、6％或5％的CD70阴性细胞裂解，其中CD70阳性细胞系(参见上文)的裂解设定为100％。这通常适用于高达500nM的抗体构建体浓度。技术人员知晓如何在无需再费周折的情况下测量细胞裂解。此外，本说明书教导了如何测量细胞裂解的具体说明。

各个CD70xCD3双特异性抗体构建体的单体与二聚同种型之间的细胞毒性活性差异称为“效能差”(potency gap)。此效能差可例如以分子的单体与二聚形式的EC₅₀值之间的比率计算，参见实施例15。本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体的效能差优选≤5，更优选≤4，甚至更优选≤3，甚至更优选≤2或≤1.5且最优选≤1。

本发明的抗体构建体的第一和/或第二(或任何另外的)结合结构域优选地对于灵长类动物的哺乳动物纲的成员具有跨物种特异性。跨物种特异性CD3结合结构域例如描述于WO 2008/119567。根据一个实施方案，第一和/或第二结合结构域除分别结合到人CD70和人CD3之外还将结合到灵长类动物的CD70/CD3，所述灵长类动物包括(但不限于)新世界灵长类动物(诸如普通狨(Callithrix jacchus)、棉顶狨(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus))、旧世界灵长类动物(诸如狒狒和猕猴)、长臂猿、猩猩和非人人亚科(homininae)。据设想，本发明的抗体构建体的第一结合结构域(其结合到靶细胞表面上的人CD70)还至少结合到猕猴CD70，和/或第二结合结构域(其结合到T细胞表面上的人CD3)还至少结合到猕猴CD3。优选的猕猴为食蟹猴(Macaca fascicularis)。也设想了恒河猴(Macaca mulatta，Rhesus)。

本发明的优选双特异性抗体构建体包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3和至少猕猴CD3的第二结合结构域。

在本发明的一个方面，第一结合结构域结合到人CD70且进一步结合到猕猴CD70(诸如食蟹猴的CD70)，且更优选结合到猕猴CD70ECD。优选的食蟹猴CD70描绘于SEQ ID NO：755中。优选的猕猴CD70ECD描绘于SEQ ID NO：756中。猕猴CD70的第一结合结构域的亲和力优选≤50或≤40nM，更优选≤30nM或≤20nM或≤15nM，更优选≤10nM或≤5nM，甚至更优选≤2nM或≤1nM，甚至更优选≤0.5nM或≤0.2nM，最优选≤0.1nM。

优选地，根据本发明的抗体构建体结合猕猴CD70相比结合人CD70的亲和力差[maCD70：hu CD70](如例如通过BiaCore或通过Scatchard分析所测定)优选介于0.1与10之间，更优选介于在0.2与5或在0.2与2之间，甚至更优选介于0.3与4之间，甚至更优选介于0.5与3之间或介于0.5与2.5之间，且最优选介于0.5与2之间或介于0.6与2之间。参见实施例3和4。

在本发明的抗体构建体的一个实施方案中，第二结合结构域结合到人CD3ε和普通狨、棉顶狨或松鼠猴CD3ε。优选地，第二结合结构域结合到这些CD3ε链的细胞外表位。另据设想，第二结合结构域结合到人和恒河猴CD3ε链的细胞外表位。CD3ε的最优选表位包含在人CD3ε胞外结构域的氨基酸残基1-27内。甚至更具体地讲，表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。普通狨和棉顶狨均为属于狨猴科(Callitrichidae)的新世界灵长类动物，而松鼠猴为属于卷尾猴科(Cebidae)的新世界灵长类动物。

对于本发明的抗体构建体尤其优选的是，结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：27所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQID NO：28所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：29所描绘的CDR-L3；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：117所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：118所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：119所描绘的CDR-L3；和

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：153所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：154所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：155所描绘的CDR-L3。

在本发明的抗体构建体的一个替代性优选实施方案中，结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：12所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：13所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：14所描绘的CDR-H3；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：30所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：31所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：32所描绘的CDR-H3；

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：48所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：49所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：50所描绘的CDR-H3；

(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：66所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：67所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：68所描绘的CDR-H3；

(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：84所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQID NO：85所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：86所描绘的CDR-H3；

(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：102所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：103所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：104所描绘的CDR-H3；

(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：120所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：121所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：122所描绘的CDR-H3；

(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：138所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：139所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：140所描绘的CDR-H3；

(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：156所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：157所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：158所描绘的CDR-H3；和

(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：174所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO：175所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：176所描绘的CDR-H3。

对于本发明的抗体构建体更优选的是，结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自以下的VL区：如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35、39、125、129、161或165所描绘的VL区。

替代性优选的是，结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自以下的VH区：如WO 2008/119567的SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所描绘的VH区。

更优选地，本发明的抗体构建体特征在于结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，该第二结合结构域包含选自以下的VL区和VH区：

(a)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：17或21所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：15或19所描绘的VH区；

(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：35或39所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：33或37所描绘的VH区；

(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：53或57所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：51或55所描绘的VH区；

(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：71或75所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：69或73所描绘的VH区；

(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：89或93所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：87或91所描绘的VH区；

(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：107或111所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：105或109所描绘的VH区；

(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：125或129所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：123或127所描绘的VH区；

(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：143或147所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：141或145所描绘的VH区；

(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：161或165所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：159或163所描绘的VH区；和

(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO：179或183所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO：177或181所描绘的VH区。

根据本发明的抗体构建体的一个优选实施方案，结合结构域并且尤其是第二结合结构域(其结合到T细胞表面上的人CD3)具有以下形式：VH区和VL区的配对呈单链抗体(scFv)的形式。VH和VL区按VH-VL或VL-VH次序排列。优选的是，VH区位于接头序列的N端且VL区位于接头序列的C端。

上述本发明的抗体构建体的一个优选实施方案的特征为结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域包含选自以下的氨基酸序列：WO 2008/119567的SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。

因此，在一个实施方案中，本发明的抗体构建体包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：60、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：110、SEQID NO：120、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：220、SEQID NO：230、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：290、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：310、SEQ ID NO：320、SEQ ID NO：330、SEQID NO：340、SEQ ID NO：350、SEQ ID NO：360、SEQ ID NO：370、SEQ ID NO：380、SEQ ID NO：390、SEQ ID NO：400、SEQ ID NO：410、SEQ ID NO：420、SEQ ID NO：430、SEQ ID NO：440、SEQID NO：450、SEQ ID NO：460、SEQ ID NO：470、SEQ ID NO：480、SEQ ID NO：490、SEQ ID NO：500、SEQ ID NO：510、SEQ ID NO：520、SEQ ID NO：530、SEQ ID NO：540、SEQ ID NO：550、SEQID NO：560、SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：580、SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：610、SEQ ID NO：620、SEQ ID NO：630、SEQ ID NO：640、SEQ ID NO：650、SEQ ID NO：660、SEQID NO：670、SEQ ID NO：680、SEQ ID NO：690、SEQ ID NO：700、SEQ ID NO：710、SEQ ID NO：720、SEQ ID NO：730、SEQ ID NO：740、SEQ ID NO：923、SEQ ID NO：927、SEQ ID NO：931、SEQID NO：935、SEQ ID NO：939、SEQ ID NO：943、SEQ ID NO：947、SEQ ID NO：951、SEQ ID NO：955、SEQ ID NO：959、SEQ ID NO：963、SEQ ID NO：967、SEQ ID NO：971、SEQ ID NO：975、SEQID NO：979、SEQ ID NO：983、SEQ ID NO：987、SEQ ID NO：991、SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：999、SEQ ID NO：1003、SEQ ID NO：1007、SEQ ID NO：1011、SEQ ID NO：1015、SEQ ID NO：1019、SEQ ID NO：1023、SEQ ID NO：1027、SEQ ID NO：1031、SEQ ID NO：1035、SEQ ID NO：1039、SEQ ID NO：1043、SEQ ID NO：1053、SEQ ID NO：1057、SEQ ID NO：1067、SEQ ID NO：1071、SEQ ID NO：1081、SEQ ID NO：1085、SEQ ID NO：1095、SEQ ID NO：1099、SEQ ID NO：1109、SEQ ID NO：1113、SEQ ID NO：1123、SEQ ID NO：1127、SEQ ID NO：1137、SEQ ID NO：1141、SEQ ID NO：1151、SEQ ID NO：1155、SEQ ID NO：1165、SEQ ID NO：1169、SEQ ID NO：1179、SEQ ID NO：1183、SEQ ID NO：1193、SEQ ID NO：1197、SEQ ID NO：1207、SEQ ID NO：1211、SEQ ID NO：1221、SEQ ID NO：1225、SEQ ID NO：1235、SEQ ID NO：1239、SEQ ID NO：1249、SEQ ID NO：1253、SEQ ID NO：1263、SEQ ID NO：1267、SEQ ID NO：1277、SEQ ID NO：1281、SEQ ID NO：1291、SEQ ID NO：1295、SEQ ID NO：1305、SEQ ID NO：1309、SEQ ID NO：1319、SEQ ID NO：1323、SEQ ID NO：1333、SEQ ID NO：1337、SEQ ID NO：1347、SEQ ID NO：1351、SEQ ID NO：1361、SEQ ID NO：1365、SEQ ID NO：1375、SEQ ID NO：1379、SEQ ID NO：1389、SEQ ID NO：1393、SEQ ID NO：1403、SEQ ID NO：1407、SEQ ID NO：1417、SEQ ID NO：1421、SEQ ID NO：1431、SEQ ID NO：1435、SEQ ID NO：1445、SEQ ID NO：1449、SEQ ID NO：1459、SEQ ID NO：1463、SEQ ID NO：1473、SEQ ID NO：1477、SEQ ID NO：1487、SEQ ID NO：1491、SEQ ID NO：1501、SEQ ID NO：1505、SEQ ID NO：1515、SEQ ID NO：1519、SEQ ID NO：1529、SEQ ID NO：1533、SEQ ID NO：1543、SEQ ID NO：1547、SEQ ID NO：1557、SEQ ID NO：1561、SEQ ID NO：1571和SEQ ID NO：1575。

优选的是，本发明的抗体构建体包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ IDNO：1053、SEQ ID NO：1095、SEQ ID NO：1151、SEQ ID NO：1179、SEQ ID NO：1193、SEQ IDNO：1221、SEQ ID NO：1235、SEQ ID NO：1249、SEQ ID NO：1263、SEQ ID NO：1277、SEQ IDNO：1347、SEQ ID NO：1361、SEQ ID NO：1375、SEQ ID NO：1431和SEQ ID NO：1445。

还考虑了本文所描述的抗体构建体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体构建体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体构建体的氨基酸序列变体通过向抗体构建体核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成来制备。所有下述氨基酸序列修饰应产生仍保留未经修饰亲本分子的所需生物活性(结合到CD70和结合到CD3)的抗体构建体。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认定义的氨基酸，诸如选自以下的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(Val或V)，但可视需要使用经修饰、合成或罕见的氨基酸。一般而言，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)、带负电侧链(例如Asp、Glu)、带正电侧链(例如Arg、His、Lys)或不带电极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。

氨基酸修饰包括例如抗体构建体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需的特征。氨基酸变化也可改变抗体构建体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

例如，CDR中的每一者中可插入或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于其长度)，而FR中的每一者中可插入或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，氨基酸序列插入包括向含有一百个或更多个残基的多肽插入的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基的氨基和/或羧基端融合体，以及具有单个或多个氨基酸残基的序列内插入。本发明的抗体构建体的插入变体包括与酶的抗体构建体的N端或C端的融合体或与延长抗体构建体的血清半衰期的多肽的融合体。

取代诱变最受关注的位点包括重链和/或轻链的CDR，尤其是高变区，但也涵盖重链和/或轻链中的FR变化。取代优选地为如本文所描述的保守取代。优选地，取决于CDR或FR的长度，可取代CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而可取代构架区(FR)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。例如，如果CDR序列涵盖6个氨基酸，则可设想取代这些氨基酸中的一个、两个或三个。类似地，如果CDR序列涵盖15个氨基酸，则可设想取代这些氨基酸中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。

鉴别抗体构建体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)描述。在这里，鉴别抗体构建体内的一个残基或靶标残基的组(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)且由中性或带负电氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与表位的相互作用。

随后，通过在取代位点处或为取代位点引入另外的或其他的变体以优化对取代表现出功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，在预先确定用于引入氨基酸序列变化的位点或区域时，突变本身的性质无需预先确定。例如，为分析或优化给定位点处的突变的性能，可在靶标密码子或区进行丙氨酸扫描或随机诱变，且针对所需活性的最优组合筛选所表达的抗体构建体变体。在具有已知序列的DNA的预定位点处进行取代突变的技术是熟知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合活性测定(诸如CD70或CD3结合)进行突变体的筛选。

一般而言，如果取代重链和/或轻链的一个或多个或全部CDR中的氨基酸，则优选的是，随后获得的“经取代的”序列与“原始”CDR序列具有至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％且尤其优选90％或95％同一性。这意味着与“经取代的”序列相同的程度取决于CDR的长度。例如，具有5个氨基酸的CDR与其经取代的序列优选具有80％同一性以使至少一个氨基酸被取代。因此，抗体构建体的CDR可与其经取代的序列具有不同程度的同一性，例如CDRL1可具有80％，而CDRL3可具有90％。

优选的取代(或置换)为保守取代。然而，可设想任何取代(包括非保守取代或下表3中所列的“示例性取代”中的一者或多者)，只要抗体构建体保留其经由第一结合结构域结合到CD70且经由第二结合结构域结合到CD3或CD3ε的能力和/或其CDR与随后经取代的序列具有同一性(与“原始”CDR序列具有至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％且尤其优选90％或95％同一性)即可。

保守取代以标题“优选的取代”示于表3中。如果此类取代引起生物活性变化，则可引入表3中称为“示例性取代”或如下文提及氨基酸类别时进一步描述的更实质变化且针对所需特征筛选产物。

表3：氨基酸取代

本发明的抗体构建体的生物特性的实质改变可通过对取代进行选择而实现，所述取代在其对维持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的体积的作用上显著不同。天然存在的残基可根据共同的侧链性质而分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gin、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守取代需要将这些类别中的一者的成员换成另一类别。不参与维持抗体构建体的正确构象的任何半胱氨酸残基一般可经丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体添加半胱氨酸键以改善其稳定性(尤其是在抗体为诸如Fv片段的抗体片段的情况下)。

对于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性通过使用本领域已知的标准技术测定，所述技术包括但不限于Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部序列同一性算法；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的序列同一性比对算法；Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.)；由Devereux等人，1984，Nucl.AcidRes.12：387-395所述的最佳拟合序列程序，优选使用默认设置或通过检查。优选地，同一性百分比通过FastDB基于以下参数计算：错配罚分1；空位罚分1；空位大小罚分0.33；和接合罚分30，″Current Methods in Sequence Comparison and Analysis，″MacromoleculeSequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications，第127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc.。

可用的算法的实例为PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对来由一组相关序列产生多序列比对。其也可绘制显示用于产生比对的聚类关系的树形图(tree)。PILEUP使用Feng和Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的渐进比对方法的简化方法；该方法类似于Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5：151-153所述的方法。可用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。

可用的算法的另一个实例为BLAST算法，描述于：Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Aci ds Res.25：3389-3402；和Karin等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序，其得自Altschul等人，1996，Methods in Enzymology 266：460-480。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，其大多数设成默认值。使用以下值设定可调节的参数：重叠间隔＝1、重叠分数＝0.125、词阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值且通过程序本身取决于特定序列的组成和搜索所关注序列的特定数据库的组成而确立；然而可调整所述值以提高灵敏度。

另一种可用的算法是由Altschul等人，1993，Nucl.Acids Res.25：3389-3402报道的空位BLAST(Gapped BLAST)。空位BLAST使用BLOSUM-62取代计分；阈值T参数设为9；两命中法(two-hit method)用于触发无空位延伸，电荷空位长度k，代价为10+k；Xu设为16，且对于数据库搜索阶段Xg设定为40，对于算法输出阶段Xg设为67。空位比对通过对应于约22比特的分值触发。

通常，各个变体CDR之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为与本文所描绘的序列的至少60％，且更通常具有至少65％或70％，更优选至少75％或80％，甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的优选渐增的同源性或同一性。以类似方式，相对于本文所鉴别的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与抗体构建体的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体的方法使用设定为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其中重叠间隔和重叠分数分别设为1和0.125。

通常，编码各个变体CDR的核苷酸序列与本文所描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少60％，且更通常具有至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的优选渐增的同源性或同一性。因此，“变体CDR”是相对于本发明的亲本CDR具有指定同源性、相似性或同一性的CDR，且享有亲本CDR的生物功能，包括但不限于至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的特异性和/或活性。

在一个实施方案中，与根据本发明的抗体构建体的人种系的同一性百分比≥70％或≥75％，更优选≥80％或≥85％，甚至更优选≥90％，且最优选≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％、≥97％或≥98％。参见实施例7。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是在治疗期间降低治疗性蛋白引起患者针对药物的免疫反应的风险的重要特征。Hwang & Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”；Methods 36(2005)3-10)证明药物抗体构建体的非人部分的减少在治疗期间导致诱导患者的抗药物抗体的风险降低。通过比较大量临床上评估的抗体药物和相应免疫原性数据，显示出使抗体的V区人源化使蛋白质的免疫原性(平均5.1％的患者)低于带有未改变的非人V区的抗体(平均23.59％的患者)的趋势。因此，与人序列具有较高程度的同一性对于抗体构建体形式的基于V区的蛋白质疗法是期望的。出于确定种系同一性的该目的，可使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段的氨基酸序列进行比对(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，且氨基酸序列通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基的总数以百分比计算。也可对VH区段进行此计算(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，不同的是，可能由于VH CDR3的高多样性和缺乏现有人种系VH CDR3比对伴侣而将VH CDR3排除在外。可随后使用重组技术提高与人抗体种系基因的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体构建体在标准研究规模条件下(例如在标准两步纯化过程中)表现出高单体产量。优选地，根据本发明的抗体构建体的单体产量≥0.25mg/L上清液，更优选≥0.5mg/L，甚至更优选≥1mg/L，且最优选≥2.5mg/L上清液。

同样，可测定二聚抗体构建体同种型的产量并因此测定抗体构建体的单体百分比(即单体∶(单体+二聚体))。单体和二聚抗体构建体的生产率和所计算的单体百分比可例如在来自滚瓶中的标准化研究规模制备的培养物上清液的SEC纯化步骤中获得。在一个实施方案中，抗体构建体的单体百分比≥80％，更优选≥85％，甚至更优选≥90％，且最优选≥95％。

在一个实施方案中，抗体构建体具有≤8或≤7或≤6，更优选≤5或≤4，更优选≤3.5或≤3，甚至更优选≤2.5或≤2，且最优选≤1.5或≤1的优选的血浆稳定性(有血浆下的EC50与无血浆下的EC50的比率)。抗体构建体的血浆稳定性可通过将构建体在37℃下在人血浆中孵育24小时，然后在51-铬释放细胞毒性测定法中测定EC50来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可为经刺激的富集人CD8阳性T细胞。靶细胞可为例如经人CD70转染的CHO细胞。效应细胞∶靶细胞(E∶T)比率可选择为10∶1。用于此目的的人血浆库来源于通过涂布EDTA的注射器收集的健康供体的血液。通过离心移除细胞组分，并且收集上部血浆相，随后汇集。作为对照，稀释抗体构建体，随后立即在RPMI-1640培养基中进行细胞毒性测定。血浆稳定性以EC50(血浆孵育后)与EC50(对照)的比率的形式计算。参见实施例11。

此外优选的是，本发明的抗体构建体的单体向二聚体的转化较低。转化可在不同条件下测量且通过高效体积排阻色谱法分析。参见实施例9。例如，孵育抗体构建体的单体同种型可在37℃下执行7天且在培养箱中达到例如100μg/ml或250μg/ml的浓度。在这些条件下，优选的是，本发明的抗体构建体显示出≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，且最优选≤1％、≤0.6％或≤0.5％、≤0.3％，或甚至0％的二聚体百分比。

还优选的是，本发明的双特异性抗体构建体在多个冻/融循环后呈现极低的二聚体转化。例如，将抗体构建体单体例如在通用配制缓冲液中调节至250μg/ml的浓度且进行三个冻/融循环(在-80℃下冷冻30分钟，然后在室温下解冻30分钟)，再进行高效SEC以测定已转化成二聚抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。优选的是，双特异性抗体构建体例如在三个冻/融循环后的二聚体百分比≤5％，更优选≤4％，甚至更优选≤3％，甚至更优选≤2.5％，甚至更优选≤2％，甚至更优选≤1.5％，且最优选≤1％或甚至≤0.5％或0％。

本发明的双特异性抗体构建体优选显示出有利的热稳定性，其中聚集温度≥45℃或≥50℃，更优选≥52℃或≥54℃，甚至更优选≥56℃或≥57℃，且最优选≥58℃或≥59℃或≥60℃。热稳定性参数可如下依据抗体聚集温度来确定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移至一次性比色皿中且置于动态光散射(DLS)装置中。样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，其中持续获取测得的半径。使用指示蛋白熔融和聚集的半径增加计算抗体的聚集温度。参见实施例10。

或者，温度熔融曲线可通过差示扫描量热法(DSC)测定，以确定抗体构建体的固有生物物理学蛋白稳定性。这些实验使用MicroCal LLC(Northampton，MA，U.S.A)VP-DSC装置进行。与仅含有配制缓冲液的样品相比，从20℃至90℃记录含有抗体构建体的样品的能量吸收。将抗体构建体例如在SEC运行缓冲液中调节至250μg/ml的最终浓度。为记录相应熔融曲线，逐步提高整个样品温度。在各温度T下，记录样品和配制缓冲液参考品的能量吸收。相对于相应温度绘制样品减去参考品的能量吸收差值Cp(kcal/mol/℃)的图。熔融温度定义为能量吸收出现第一最大值时的温度。

此外设想本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体不与人CD70旁系同源物CD40L交叉反应(即基本上不结合)。此外，设想本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体不与猕猴/cyno CD70旁系同源物CD40L交叉反应(即基本上不结合)。参见实施例6。

此外设想，本发明的抗体构建体的第一结合结构域与人CD70的结合因存在可溶性CD27而降低≤25％，优选≤20％，更优选≤15％，更优选≤10％，甚至更优选≤5％，最优选≤2％。据设想，在此上下文中，CD27的浓度是生理性的，例如介于约100与约500pg/ml之间，或甚至更高，例如高达1μg/ml。对于该测定的细节，参见实施例16。

另据设想，本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体的浊度(如在纯化单体抗体构建体浓缩至2.5mg/ml且过夜孵育之后通过OD340所测量)≤0.2，优选≤0.15，更优选≤0.12，甚至更优选≤0.1，且最优选≤0.08或≤0.05。参见实施例12。

另据设想，本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体不由靶细胞内化或不由靶细胞显著内化。在没有T细胞存在下，可测量随着在靶细胞上预孵育构建体而变化的CD70xCD3双特异性抗体构建体的效能变化。如果抗体构建体被内化，则其应经历溶酶体降解。有效浓度应随时间降低，且因此而言表观效能也应降低。在其他靶标的情况下观察到这种效应，对于其他靶标这为为已知现象。

可例如如下测定内化率：对T细胞进行计数且在测定培养基中稀释至1×10⁵个/ml的浓度。对CD70阳性(例如，天然表达子)细胞进行计数且以2500个细胞/孔(cpw)铺板。抗体构建体以100nM的起始浓度以1∶2连续稀释。向培养物测定板中添加抗体构建体，允许孵育0小时、1小时或2小时，随后添加T细胞。接着以25000cpw对T细胞铺板，并在37℃下孵育分析物48小时。用

系统(25μl/孔)分析靶细胞存活。优选地，内化率在抗体构建体与靶细胞一起(预)孵育2小时之后≤20％，更优选≤15％，甚至更优选≤10％且最优选≤5％。

在另一个实施方案中，根据本发明的抗体构建体在酸性pH值下稳定。在非生理pH值诸如pH 5.5(例如操作阳离子交换层析所需的pH值)下，抗体构建体变现得越具有耐受性，相对于上样的蛋白质的总量从离子交换柱洗脱的抗体构建体的回收率越高。在pH 5.5下离子(例如阳离子)交换柱的抗体构建体回收率优选≥50％，更优选≥60％或≥65％，甚至更优选≥70％或≥72％或≥74％或≥76％或≥78％，甚至更优选≥80％，甚至更优选≥90％，甚至更优选≥95％且最优选≥99％。参见实施例13。

此外设想，本发明的双特异性抗体构建体表现出治疗功效或抗肿瘤活性。这可例如在如以下晚期人肿瘤异种移植模型的实例中所公开的研究中评定：

在研究的第1天，将人CD70阳性癌细胞系的5×10⁶个细胞皮下注射到雌性NOD/SCID小鼠的背部右侧。当平均肿瘤体积达到约100mm³时，将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠中，其通过将约2×10⁷个细胞注射到动物的腹腔中进行。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞且用作未移植对照来与媒介物对照组2(接受效应细胞)进行比较，以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。抗体处理在平均肿瘤体积达到约200mm³时开始。在处理开始当天各处理组的平均肿瘤尺寸不应在统计学上不同于任何其他组(方差分析)。小鼠通过静脉内推注0.5mg/kg/天的CD70xCD3双特异性抗体构建体而处理约15至20天。在研究期间通过卡尺测量肿瘤且通过组间比较肿瘤体积(TV)评估进展。通过以T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)计算TV来确定肿瘤生长抑制T/C[％]。

技术人员知晓如何修改或调整此研究的某些参数，诸如所注射的肿瘤细胞的数目、注射部位、所移植的人T细胞的数目、待施用的双特异性抗体构建体的量和时间表，而仍实现有意义且可复制的结果。优选地，肿瘤生长抑制T/C[％]≤70或≤60，更优选≤50或≤40，甚至更优选≤30或≤20且最优选≤10或≤5或甚至≤2.5。

本发明另外提供一种编码本发明的抗体构建体的多核苷酸/核酸分子。

多核苷酸为由13个或更多个共价键合于链中的核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(诸如cDNA)和RNA(诸如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是充当核酸分子(如DNA或RNA)的单体或亚基的有机分子。核酸分子或多核苷酸可为双链和单链、线性和环形的。其优选包含于载体中，该载体优选包含于宿主细胞中。所述宿主细胞例如在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗体构建体。出于该目的，多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。

遗传密码为遗传物质(核酸)内编码的信息翻译成蛋白质所用的规则组。活细胞中的生物学解码通过核糖体实现，核糖体使用tRNA分子运载氨基酸且一次读取mRNA的三个核苷酸而以mRNA规定的次序连接氨基酸。该密码限定这些核苷酸三联体(称为密码子)的序列如何指定在蛋白质合成期间随后将添加哪个氨基酸。核酸序列中三个核苷酸的密码子指定单个氨基酸，但有一些例外情形。因为绝大部分基因用完全相同的密码编码，所以该特定密码通常称为典型或标准遗传密码。虽然遗传密码决定给定编码区的蛋白质序列，但其他基因组区可影响这些蛋白质产生的时间和位置。

此外，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸/核酸分子。

载体是用作将(外来)遗传物质转移至细胞中的运载工具的核酸分子。术语“载体”涵盖(但不限于)质粒、病毒、粘粒和人工染色体。一般而言，工程改造的载体包含复制起点、多克隆位点和可选择标记。载体本身通常为核苷酸序列，一般为DNA序列，其包含插入序列(转基因)和充当载体的“主链”的较大序列。现代载体可涵盖除转基因插入序列和主链以外的额外特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体具体地讲用于在靶细胞中表达转基因，且通常具有控制序列。

术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。

核酸在其被置于与另一个核酸序列处于功能关系时为“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点经定位以便有助于翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的且在分泌性前导序列的情况下，连续且处于阅读框中。然而，增强子不必为连续的。连接通过在适宜的限制性位点处连接来实现。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成寡核苷酸连接子(adaptor)或接头。

“转染”是向靶细胞中故意引入核酸分子或多核苷酸(包括载体)的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开短暂的孔或“洞”以使得可吸收物质。转染可使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与产生脂质体(其与细胞膜融合且将其货物沉积到内部)的物质混合来进行。

术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌以及非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其因通过细胞膜从其环境直接吸收且随后并入外源性遗传物质(核酸分子)而引起。转化可由人工方式实现。为使转化发生，细胞或细菌必须处于感受态，其可作为对环境条件(诸如饥饿和细胞密度)的时间限制性反应而发生。

此外，本发明提供一种用多核苷酸/核酸分子或用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。

如本文所用，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可为或已为载体、外源性核酸分子和编码本发明的抗体构建体的多核苷酸的受体和/或抗体构建体本身的受体的任何单独的细胞或细胞培养物。将相应物质引入细胞中借助转化、转染等方法进行。术语“宿主细胞”也旨在包括单个细胞的子代或可能的子代。因为后续世代中由于天然、偶然或故意突变或由于环境影响可能发生某些修饰，所以实际上此类子代可能不与亲本细胞完全相同(在形态或基因组或总DNA互补序列上)，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。适合的宿主细胞包括原核或真核细胞，且也包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，诸如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如鼠类、大鼠、猕猴或人。

本发明的抗体构建体可在细菌中产生。在表达之后，本发明的抗体构建体以可溶性部分从大肠杆菌细胞浆料分离且可通过例如亲和层析和/或尺寸排阻纯化。可类似于纯化例如CHO细胞中表达的抗体的过程来进行最终纯化。

除原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是本发明的抗体构建体的适合的克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物之中最常使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母。然而，多种其他属、种和菌株通常可用且适用于本文，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402 226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyce)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，诸如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲菌(A.nidulans)和黑曲菌(A.niger)。

用于表达本发明的糖基化抗体构建体的适合宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴别多种杆状病毒株和变体以及来自诸如草地粘虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃和伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)的宿主的对应容许昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，且此类病毒可在本文用作根据本发明的病毒，尤其用于转染草地粘虫细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿、拟南芥(Arabidopsis)和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。可用于在植物细胞培养中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78，Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750和Fecker等人(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。

然而，脊椎动物细胞最受关注，且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆以用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌瘤细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。

在另一个实施方案中，本发明提供一种产生本发明的抗体构建体的方法，所述方法包括在使得本发明的抗体构建体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，和从培养物回收产生的抗体构建体。

如本文所用，术语“培养”是指在适合条件下在培养基中体外维持细胞、使其分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括参与产生本发明的抗体构建体的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

当使用重组技术时，抗体构建体可在细胞内、在周质间隙中产生或直接分泌到培养基中。如果抗体构建体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤而移除宿主细胞或已裂解片段的颗粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简而言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下经约30分钟解冻细胞浆料。可通过离心移除细胞碎片。在抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩此类表达系统的上清液。任一个前述步骤中均可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白分解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。

从宿主细胞制备的本发明的抗体构建体可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析回收或纯化。也可取决于待回收的抗体而利用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSE^TM层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。如果本发明的抗体构建体包含CH3结构域，则Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。

亲和层析是优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可用的。与可用琼脂糖实现的流动速率和处理时间相比，机械稳定性基质(诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)流动速率更快且处理时间更短。

此外，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体构建体或根据本发明方法产生的抗体构建体。

如本文所用，术语“药物组合物”涉及适于向患者(优选人患者)施用的组合物。本发明的尤其优选的药物组合物包含优选治疗有效量的一种或多种本发明的抗体构建体。优选地，药物组合物还包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的适合制剂。组合物的可接受的成分优选在所采用的剂量和浓度下对受体无毒性。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

本发明的组合物可包含药学上可接受的载剂。一般而言，如本文所用，“药学上可接受的载剂”意指与药物施用(具体地讲经肠胃外施用)相容的任何和全部水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)、水、悬浮液、乳液(诸如油/水乳液)、各种类型的湿润剂、脂质体、分散介质和包衣。此类介质和试剂在药物组合物中的用途为本领域熟知的，且包含此类载剂的组合物可通过熟知的常规方法配制。

某些实施方案提供包含本发明的抗体构建体和另外一种或多种赋形剂(诸如此部分和本文其他地方说明性描述的赋形剂)的药物组合物。就这一点而言，赋形剂在本发明中可用于多种多样的目的，诸如调节制剂的物理、化学或生物特性，诸如调节粘度，和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类制剂和对抗由于例如在制造、运输、储存、使用前制备、施用及之后出现的应力而降解和腐败的方法。

在某些实施方案中，药物组合物可含有用于调节、维持或保持例如组合物的pH值、渗透压、粘度、澄明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸收或渗透目的的制剂材料(参见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo编)，1990，Mack Publishing Company)。在此类实施方案中，适合的制剂材料可包括但不限于：

·氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电氨基酸，优选赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸

·抗微生物剂，诸如抗细菌剂和抗真菌剂

·抗氧化剂，诸如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；

·缓冲液、缓冲体系和缓冲剂，其用于使组合物维持在生理pH值或略微较低的pH值下，通常在约5至约8或9的pH值范围内；缓冲剂的实例为硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和乙酸盐；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液；

·非水性溶剂，诸如丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和注射用有机酯(诸如油酸乙酯)；

·水性载剂，包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质；

·可生物降解的聚合物，诸如聚酯；

·膨胀剂，诸如甘露醇或甘氨酸；

·螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；

·等渗和吸收延迟剂；

·复合剂，诸如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)

·填充剂；

·单糖、二糖和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可为非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇；

·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载剂，诸如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选来源于人；

·着色剂和调味剂；

·含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠

·稀释剂；

·乳化剂；

·亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮)

·成盐反离子，诸如钠；

·防腐剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例为：苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙基醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；

·金属络合物，诸如Zn-蛋白质络合物；

·溶剂和共溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；

·糖和糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露醇、山梨醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、丙三醇、环醇(例如肌醇(inositol))、聚乙二醇；和多羟基糖醇；

·悬浮剂；

·表面活性剂或湿润剂，诸如pluronic、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯类(诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal；表面活性剂可为分子量优选＞1.2KD的洗涤剂和/或分子量优选＞3KD的聚醚；优选的洗涤剂的非限制性实例为Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80和Tween 85；优选的聚醚的非限制性实例为PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000；

·稳定性增强剂，诸如蔗糖或山梨醇；

·张力增强剂，诸如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇山梨醇；

·肠胃外递送媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或固定油；

·静脉内递送媒介物，包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的补充剂)。

对于本领域的技术人员显而易见的是药物组合物的不同成分(例如上列成分)可具有不同的作用，例如氨基酸可充当缓冲剂、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可充当增量剂和/或张力增强剂；氯化钠可充当递送媒介物和/或张力增强剂；等等。

据设想，除本文所定义的本发明的多肽之外，本发明的组合物还可包含另外的生物学活性剂，这具体取决于组合物的预期用途。此类药剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞生长抑制剂(cytostatica)的药物、预防高尿酸血(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或诸如本领域已知的细胞因子的药剂。另据设想，本发明的抗体构建体应用于共同疗法，即与另一抗癌药剂组合。

在某些实施方案中，最佳的药物组合物将由本领域的技术人员根据例如预期施用途径、递送形式和所需剂量确定。参见例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗体构建体的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可为水性或非水性的。例如，适合的媒介物或载剂可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，其中可能补充有供肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在某些实施方案中，本发明的抗体构建体组合物可通过以冻干饼或水性溶液的形式混合具有所需纯度的选定组合物与任选的配制剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)来制备以供储存。另外，在某些实施方案中，本发明的抗体构建体可使用适当的赋形剂(诸如蔗糖)配制为冻干粉。

当考虑肠胃外施用时，本发明所用的治疗性组合物可以在药学上可接受的媒介物中包含所需的本发明的抗体构建体的无热原、肠胃外可接受的水溶液形式提供。特别适用于肠胃外注射的媒介物为无菌蒸馏水，本发明的抗体构建体在其中配制为恰当保存的无菌、等渗溶液。在某些实施方案中，制备可涉及所需分子与诸如可注射微球、生物易侵蚀粒子、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的试剂一起配制，所述试剂可提供可经由贮库注射(depot injection)而递送的产品的控制或持续释放。在某些实施方案中，也可使用玻尿酸，其具有促进循环的持久性持续的作用。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置以引入所需的抗体构建体。

另外的药物组合物对本领域的技术人员将是显而易见的，包括在持续或受控递送/释放制剂中包括本发明的抗体构建体的制剂。用于配制多种其他持续或控制递送方式(诸如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和贮库注射剂)的技术也是本领域的技术人员已知的。参见例如国际专利申请第PCT/US93/00829号，其描述用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可包括呈成形物品(例如膜或微囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公布第EP 058481号中所公开)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公布第EP 133,988号)。持续释放组合物也可包括可通过本领域已知的若干方法中的任一种制备的脂质体。参见例如Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公布第EP 036,676号、第EP 088,046号和第EP 143,949号。

抗体构建体也可裹入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、裹入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米囊)或巨乳液中。此类技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Oslo，A.编，(1980)。

用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂形式提供。可通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。当组合物经冻干时，使用此方法的灭菌可在冻干和复水之前或之后进行。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。肠胃外组合物一般置于具有无菌进入孔口的容器中，例如具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

本发明的另一个方面包括本发明的抗体构建体的自缓冲制剂，其可用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述。可获得关于蛋白质稳定和制剂材料及适用于此方面的方法的许多论述，诸如Arakawa等人，“Solventinteractions in pharmaceutical formulations，”Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，“Physical stabilization of proteins in aqueous solution”见于：RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE，Carpenter和Manning编Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)以及Randolph等人，“Surfactant-protein interactions”，Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，特别参见与赋形剂及其用于本发明的自缓冲蛋白质制剂的方法相关的部分，尤其关于蛋白质药物产品和用于兽医学和/或人医学用途的方法。

盐可根据本发明的某些实施方案用于例如调节制剂的离子强度和/或等张性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解性和/或物理稳定性。如所熟知的那样，离子可通过结合到蛋白质表面上的带电残基和通过遮蔽蛋白质中的带电和极性基团且减小其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度而使天然状态的蛋白质稳定。离子也可通过结合到尤其是蛋白质的变性肽键(--CONH)而使变性状态的蛋白质稳定。此外，离子与蛋白质中的带电基团和极性基团的相互作用也可减小分子间静电相互作用，由此防止或减少蛋白质聚集和不溶。

离子种类在其对蛋白质的作用方面有显著差异。已完善可用于配制根据本发明的药物组合物的许多类别等级的离子及其对蛋白质的作用。一个实例为霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)，其通过对蛋白质在溶液中的构象稳定性的作用排列离子和极性非离子溶质。使溶质稳定称为“亲液的”(kosmotropic)。使溶质不稳定称为“离液的”(chaotropic)。亲液剂通常以高浓度(例如＞1摩尔的硫酸铵)使用以使蛋白自溶液沉淀(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定其在霍夫梅斯特序列中的位置。

游离氨基酸可在根据本发明的各种实施方案的本发明的抗体构建体制剂中用作增量剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于使制剂中的蛋白质稳定。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。精氨酸可用于在液体和冻干制剂中抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。

多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨糖醇以及比如丙三醇和丙二醇的多元醇，和(出于本文论述的目的)聚乙二醇(PEG)及相关物质。多元醇为亲液的。它们是在液体和冻干制剂中适用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调节制剂的张力。可用于本发明的所选实施方案的多元醇为甘露醇，常用于确保冻干制剂中饼的结构稳定性。它确保饼的结构稳定性。其一般与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调节张力的优选试剂且充当在运输期间避免冻融应力或在制造过程期间避免产生结块的稳定剂。还原糖(其含有自由醛基或酮基)诸如葡萄糖和乳糖可使表面赖氨酸和精氨酸残基糖化。因此，其一般不在根据本发明使用的优选多元醇当中。此外，形成此类反应物质的糖，诸如在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖且因此引起糖基化的蔗糖，就这一点而言也不在本发明的优选多元醇当中。PEG可用于使蛋白质稳定并充当冷冻保护剂，且就这一点而言可用于本发明。

本发明的抗体构建体制剂的实施方案进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附到表面上和变性且随后在气-液、固-液和液-液界面聚集。这些作用一般与蛋白质浓度成反比。这些有害相互作用一般与蛋白质浓度成反比且通常因诸如在产品运送和处理期间产生的物理搅动而加剧。表面活性剂通常用于防止、最小化或减少表面吸附。就这一点而言，本发明中适用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。就这一点而言，表面活性剂的用途具有蛋白质特异性，因为任何给定的表面活性剂通常将使一些蛋白质稳定而使其他蛋白质不稳定。

聚山梨醇酯易于氧化降解且常常在供应时含有足够数量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链(尤其是甲硫氨酸)氧化。因此，聚山梨醇酯应谨慎使用且当使用时，应以其最低有效浓度使用。就这一点而言，聚山梨醇酯例示赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。

本发明的抗体构建体制剂的实施方案进一步包含一种或多种抗氧化剂。在一定程度上，可通过维持适当水平的环境氧气和温度以及通过避免曝光而在药物制剂中防止蛋白质的有害氧化。也可使用抗氧化剂赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。就这一点而言，可用的抗氧化剂为还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂的抗氧化剂优选为水溶性的且在产品的整个有效期中维持其活性。就这一点而言，EDTA是根据本发明的优选抗氧化剂。抗氧化剂可损害蛋白质。例如，还原剂(具体地讲，诸如谷胱甘肽)可破坏分子内二硫键。因此，选择用于本发明的抗氧化剂以尤其消除或充分降低其自身损害制剂中的蛋白质的可能性。

根据本发明的制剂可包含金属离子，其为蛋白质辅因子且为形成蛋白质配位复合物所需，诸如形成某些胰岛素悬浮液所需的锌。金属离子也可抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。Ca⁺²离子(至多100mM)可提高人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²可使rhDNase不稳定。类似地，Ca⁺²和Sr⁺²可使因子VIII稳定，因子VIII可因Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²不稳定，且其聚集可因Al⁺³离子增加。

本发明的抗体构建体制剂的实施方案进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及不止一次从相同的容器抽取的多剂量肠胃外制剂时，需要防腐剂。其主要功能是抑制微生物生长且在整个有效期或药品使用期确保产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。虽然防腐剂具有较长的与小分子肠胃外制剂一起使用的历史，但开发包括防腐剂的蛋白质制剂仍会具有挑战性。防腐剂几乎始终具有使蛋白质不稳定的效应(聚集)，并且这一点已变成限制其在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今，已配制的大多数蛋白质药物仅用于单次使用。然而，当多剂量制剂成为可能时，其具有使患者方便且增加销量的额外优势。很好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐制剂的开发已使得更方便、多次使用的注射笔呈现商业化。目前市场上可获得至少四种含有hGH防腐制剂的此类笔装置。Norditropin(液体，Novo Nordisk)、Nutropin AQ(液体，Genentech)和Genotropin(冻干--双腔药筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)与间甲酚一起配制。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干方面。药品中的有效防腐剂浓度必须经过优化。这需要测试剂型中的给定防腐剂，使得浓度范围赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性。

如可预期的那样，开发含有防腐剂的液体制剂比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产品可在无防腐剂的情况下冻干且在使用时用含有防腐剂的稀释剂复水。这缩短防腐剂与蛋白质接触的时间，使相关稳定性风险大大降至最低。在液体制剂的情况下，应经整个产品有效期(约18至24个月)维持防腐剂有效性和稳定性。要注意的重点是防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中展现。

本文所公开的抗体构建体也可配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或可用于向哺乳动物递送药物的表面活性剂构成的小囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体构建体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及W0 97/38731所述。循环时间增加的脂质体公开于美国专利第5,013,556号。尤其适用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。脂质体通过具有限定孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。本发明的抗体构建体的Fab′片段可如Martin等人J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述经由二硫键互换反应与脂质体缀合。脂质体内任选含有化学治疗剂。参见Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。

一旦药物组合物已配制，即可将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或脱水或冻干粉的形式储存在无菌小瓶中。此类制剂可以即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干形式)储存。

本文所定义的药物组合物的生物活性可例如通过细胞毒性测定来测定，如以下实例中、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)所述。如本文所用的“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化NCI反应标准对通过本发明的药物组合物进行的疗法的反应。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物用于其预期目的的有效性，即组合物引起其所需效应(即病理性细胞例如肿瘤细胞的消除)的能力。体内功效可通过对相应疾病实体建立的标准方法来监测，包括但不限于白细胞计数、差异、荧光活化细胞分选、骨髓抽吸。此外，可使用各种疾病特异性临床化学参数和其他已建立的标准方法。此外，可使用计算机辅助断层摄影、X射线、核磁共振断层摄影(例如，用于基于美国国家癌症研究所标准的反应评定[Cheson BD，Horning SJ，CoiffierB，Shipp MA，Fisher RI，Connors JM，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris NL，Armitage JO，Carter W，Hoppe R，Canellos GP.Report of an international workshop tostandardize response criteria for non-Hodgkin′s lymphomas.NCI SponsoredInternational Working Group.J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层摄影扫描、白细胞计数、差异、荧光活化细胞分选、骨髓抽吸、淋巴结活检/组织学和各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如，乳酸脱氢酶)和其他已建立的标准方法。

药物(诸如本发明的药物组合物)的开发中的另一项主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此，可建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某一疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容积、肝首过代谢和血清结合程度。给定药剂的功效可受上文所提及的参数中的每一者影响。

“半衰期”意指50％施用药物通过例如代谢、排泄等生物过程消除的时间。所谓“肝首过代谢”是指在首次与肝接触之后，即在首次经过肝脏期间药物将被代谢的倾向。“分布容积”意指药物遍及身体各个腔室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)的滞留程度，和这些腔室内药物的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(诸如白蛋白)相互作用且结合从而导致药物生物活性降低或损失的倾向。

药代动力学参数也包括给定量的施用药物的生物利用率、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收速率、更加起效和/或Cmax。“生物利用率”意指药物在血液腔室中的量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检出和可测性之间的时间延迟。“Tmax”为达到最大血药浓度前的时间，而“Cmax”为使用给定药物最大限度获得的血液浓度。达到实现生物学效果所需的药物血液或组织浓度的时间受所有参数影响。表现出跨物种特异性的双特异性抗体构建体的药代动力学参数(可如上文所概述在非黑猩猩灵长类动物的临床前动物测试中测定)也阐述于例如Schlereth等人的出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005)，1-12)。

一个实施方案提供本发明的抗体构建体或根据本发明方法产生的抗体构建体，其用于预防、治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病。据设想，该肿瘤或癌症或转移性癌症是表达CD70的。

本文所述的制剂可用作治疗、改善和/或预防有需要的患者的如本文所述的病理性医学病状的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施两者。治疗包括以治愈、痊愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改观或影响疾病、疾病症状或疾病倾向为目的，向来自患有疾病/病症、具有疾病/病症的症状或易患疾病/病症的患者的身体、分离组织或细胞施加或施用制剂。

如本文所用的术语“改善”是指患有如下文所说明的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的疾病病况的任何改善，其通过向有需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体来进行。此类改善也可视为患者的肿瘤或癌症或转移性癌症的进展减缓或停止。如本文所用的术语“预防”意指避免出现或再次出现患有如下文所说明的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者，其通过向有需要的受试者施用根据本发明的抗体构建体来进行。

术语“疾病”是指受益于用本文所述的抗体构建体或药物组合物治疗的任何病状。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所考虑的疾病的那些病理病状。

“赘生物”为组织的异常生长，通常但未必总会形成肿块。当也形成肿块时，一般称为“肿瘤”。赘生物或肿瘤可为良性的、潜在恶性的(癌前)或恶性的。恶性赘生物一般称为癌症。其通常侵入并破坏周围组织且可形成转移，即其扩散到身体的其他部分、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”涵盖向原始肿瘤外的其他组织或器官的转移。淋巴瘤和白血病为淋巴赘生物。出于本发明的目的，它们也通过术语“肿瘤”或“癌症”来涵盖。

在本发明的优选实施方案中，肿瘤或癌症疾病选自：肾、肺、胰腺、卵巢、乳腺、结肠、头颈、胃、直肠、胸腺和脑部肿瘤或癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、卡波氏肉瘤、胚胎癌瘤以及来源于前述任一者的转移性癌症疾病。

更具体地讲，肿瘤或癌症疾病可选自：肾细胞癌瘤(RCC)、透明细胞RCC(ccRCC)、乳头状RCC、嫌色细胞RCC、肉瘤样RCC、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状癌瘤、胰腺癌瘤(诸如胰管腺癌瘤)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状癌瘤、喉癌瘤、咽癌瘤、鼻咽癌瘤、鼻咽未分化性瘤瘤、淋巴上皮瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、T细胞白血病、成人T细胞白血病、B细胞谱系癌、B细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、节状小核裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(Lennert′s lymphoma)、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、中心母细胞(entroblastic)/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、卡斯尔曼病(Castleman′s disease)或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)。转移性癌症疾病可源自前述疾病中的任一者。

本发明还提供一种用于治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明的抗体构建体或根据本发明方法产生的抗体构建体的步骤。据设想，该肿瘤或癌症或转移性癌症是表达CD70的。

术语“有需要的受试者”或“需要治疗”的受试者包括已患病症的受试者以及要预防病症的受试者。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

本发明的抗体构建体一般将被设计成尤其在一定生物利用率和持久性范围下用于特定施用途径和方法、特定施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗。组合物的材料优选以施用位点可接受的浓度配制。

因此，可根据本发明设计制剂和组合物以通过任何适合的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于

·局部途径(诸如经上皮、吸入、经鼻、经眼、经耳、经阴道、经粘膜)；

·肠内途径(诸如经口、经胃肠、舌下、唇下、经颊、经直肠)；和

·肠胃外途径(诸如静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。

本发明的药物组合物和抗体构建体尤其适用于经肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射(诸如推注)或通过输注(诸如连续输注)。药物组合物可使用医疗装置施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述于美国专利第4,475,196号、第4,439,196号、第4,447,224号、第4,447,233号、第4,486,194号：第4,487,603号、第4,596,556号、第4,790,824号、第4,941,880号、第5,064,413号、第5,312,335号、第5,312,335号、第5,383,851号和第5,399,163号。

具体地讲，本发明提供适合组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断或基本上不间断即连续施用可通过患者佩戴的小泵系统计量治疗剂向患者身体中的流入来实现。包含本发明的抗体构建体的药物组合物可通过使用所述泵系统施用。此类泵系统通常为本领域众所周知的，且通常依赖于定期更换容纳待输注的治疗剂的药筒(cartridge)。在更换此类泵系统中的药筒时，可继而暂时中断治疗剂向患者身体的原本不间断的流动。在此情况下，在本发明的药物手段和方法的含义内，药筒更换前的施用阶段和药筒更换后的施用阶段仍被视为一起构成此类治疗剂的一个“不间断施用”。

连续或不间断施用本发明的抗体构建体可为静脉内或皮下施用，其借助于包括用于驱动流体离开贮存器的流体驱动机构和用于致动驱动机构的致动机构的流体递送装置或小泵系统。用于皮下施用的泵系统可包括用于穿过患者皮肤且向患者身体递送适合组合物的针或导管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或附接到患者的皮肤，从而使得泵系统与患者皮肤之间可直接接触。泵系统可附接到患者的皮肤24小时至数天。在小体积贮存器的情况下，泵系统可具有小尺寸。作为非限制性实例，用于待施用的适合药物组合物的贮存器的体积可介于0.1与50ml之间。

连续施用也可为借助于皮肤上佩戴的贴片经皮施用且以一定时间间隔更换。本领域的技术人员知道适用于此目的的用于药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮施用尤其适于不间断施用，因为更换第一用完贴片可通过例如在紧邻第一用完贴片的皮肤的表面上放置新的第二贴片且随后立即移除第一用完贴片而同时有利地实现。不会发生流动中断或电源电池故障的问题。

如果药物组合物已冻干，则经冻干的物质首先在适当的液体中复水，随后施用。经冻干的物质可在(例如)抑菌性注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或蛋白质在冻干之前所处的相同制剂中复水。

本发明的组合物可以适合的剂量向受试者施用，该适合的剂量可例如通过剂量递增研究通过向非黑猩猩灵长类动物(例如猕猴)施用渐增剂量的表现出跨物种特异性的本发明的抗体构建体来确定。如上文所阐述，表现出本文所描述的跨物种特异性的本发明的抗体构建体可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前试验和用作人药物。给药方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域熟知的那样，对于任何一名患者，剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。

术语“有效剂量”定义为足以实现或至少部分实现所需作用的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分遏止已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。有效用于此用途的量或剂量将取决于：视待治疗的病状(适应症)、递送的抗体构建体、治疗情形和目标、疾病的严重性、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的反应、施用途径、患者的体型(体重、体表面或器官尺寸)和/或状况(年龄和一般健康状况)和患者自身免疫系统的一般状态。适当的剂量可根据主治医师的判断来调整，以使得其可向患者一次性或经一系列施用而施用，且获得最佳治疗效果。

典型的剂量可在约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高的范围内，这具体取决于上文所提及的因素。在具体实施方案中，剂量可在1.0μg/kg至约20mg/kg、任选10μg/kg至约10mg/kg或100μg/kg至约5mg/kg的范围内。

治疗有效量的本发明的抗体构建体优选使疾病症状的严重性降低、无疾病症状期的频率或持续时间增加或预防因疾病困扰所致的损伤或残疾。对于治疗表达CD70的肿瘤，治疗有效量的本发明的抗体构建体(例如抗CD70/抗CD3抗体构建体)相对于未经治疗的患者优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可在预测在人肿瘤中的功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。

药物组合物可作为唯一治疗剂施用或与其他疗法(诸如视需要的抗癌疗法，例如其他蛋白质和非蛋白质药物)联合施用。这些药物可以适时定义的时间间隔和剂量与如本文所定义的包含本发明抗体构建体的组合物同时施用，或在施用所述抗体构建体之前或之后单独施用。

如本文所用的术语“有效且无毒的剂量”是指本发明的抗体构建体的可耐受剂量，其足够高以引起病理性细胞消除、肿瘤去除、肿瘤缩小或疾病稳定而无或基本上无大的毒性作用。此类有效且无毒的剂量可例如通过本领域中描述的剂量递增研究确定且应低于引起严重不良事件(剂量限制性毒性；DLT)的剂量。

如本文所用的术语“毒性”是指表现为不良事件或严重不良事件的药物毒性作用。这些不良事件可指一般缺乏药物耐受性和/或施用之后缺乏局部耐受性。毒性也可包括由药物引起的致畸或致癌作用。

如本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义施用药物而不会在施用后立即引起严重不良事件(局部耐受性)和不会在药物的较长期施用期间引起严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可在治疗和随访期间例如以常规间隔进行评估。测量包括临床评估，例如器官表现，和实验室异常的筛检。可进行临床评估，并根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码与正常所见相比的偏差。器官表现可包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等标准，如阐述于例如不良事件通用术语标准v3.0(CTCAE)。可测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血概况和尿液分析以及诸如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等其他体液的检查。因此，安全性可例如通过身体检查、成像技术(即超声波、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、采用技术装置的其他测量(即心电图))、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良事件来评定。例如，在根据本发明的用途和方法中，非黑猩猩灵长类动物中的不良事件可通过组织病理学和/或组织化学方法检查。

以上术语也例如在Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH SteeringCommittee meeting，1997年7月16日中提及。

在另一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明的抗体构建体、根据本发明方法产生的抗体构建体、本发明的多核苷酸/核酸分子、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。

在本发明的上下文下，术语“试剂盒”意指一起包装于容器、接收器或其他对象中的两种或更多种组成部分，其中一种对应于本发明的抗体构建体、药物组合物、载体或宿主细胞。因此，试剂盒可描述为足以实现某一目标的一组产品和/或器具，其可作为单个单元出售。

试剂盒可包含一个或多个任何适合形状、尺寸和材料(优选防水，例如塑料或玻璃)的接收器(诸如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，其含有适当剂量的本发明的抗体构建体或药物组合物供施用(参见上文)。试剂盒可另外含有使用说明(例如小册或说明手册的形式)、施用本发明的抗体构建体的构件(诸如注射器、泵、输注器等)、用于使本发明的抗体构建体复水的构件和/或用于稀释本发明的抗体构建体的构件。

本发明也提供用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒也可含有包含经干燥/冻干的抗体构建体的第一接收器和包含水性制剂的第二接收器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干品注射器(lyosyringe))的试剂盒。

附图显示了：

图1：

使用抗V5抗体，对用于在CHO细胞上进行表位作图的构建体的表达控制。参见实施例1。

图2：

多重表位分组(multiplex epitope binning)或竞争测定和FACS读数的示意性表示。将14个珠粒各自用不同抗体的预包被。添加第二抗体“X”，并测定额外的结合。如果无法测得额外的结合，则抗体彼此竞争结合。

图3：

表位作图分析的实验设置，参见实施例2。如所指示，V5标签经由甘氨酸/丝氨酸接头融合到嵌合分子的C端。

图4：

如实施例2中所述进行的scFc形式的若干示例性CD70xCD3双特异性结合物的表位作图结果。尽管未在图4A和图4B中具体指示，但所有构建体均为CD70xCD3(I2C)双特异性的且呈scFc形式。x轴描绘荧光补偿PE-A(PE＝藻红蛋白；A＝信号区域)，而y轴描绘针对模式归一化的计数(事件)。

图5：

如在实施例5和6中所分析，针对代表性数量的scFc形式的抗体构建体显示双特异性结合、种间交叉反应性和不存在结合到人CD70旁系同源物CD40L。x轴描绘荧光补偿PE-A(PE＝藻红蛋白；A＝信号区域)，而y轴描绘计数(事件)。

图6：

如在使用经人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞和未刺激的人PBMC作为效应细胞的基于FACS的细胞毒性测定中分析的CD70-21D_CCxI2C-scFc细胞毒性活性。如实施例8.5中所述进行测定。在平行方法中，以1ng/ml的浓度添加可溶性CD27。可溶形式的CD27的存在不损害所测试的抗体构建体的细胞毒性活性。

实施例：

以下实施例说明本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。本发明仅受权利要求书限制。

实施例1

产生表达野生型和截短CD70的CHO细胞

出于实施例1和2的目的，CD70抗原的胞外结构域可再分成由以下氨基酸位置界定的不同子结构域或区E1至E7：

对于构建用于表位作图的人/小鼠嵌合CD70分子(实施例2)，将相应七个人区以及两个相邻人区的五种组合(参见上文)的序列用来自鼠CD70的对应区置换。此外，V5标签(GKPIPNPLLGLDST)经由“GGGGS”接头融合到嵌合分子的C端。最终的嵌合分子序列描绘于SEQ ID NO：759-768中。另外，构建全长人CD70(SEQ ID NO：741)和全长小鼠CD70(SEQ IDNO：757)，两者均具有经由“GGGGS”接头融合到其C端的V5标签(GKPIPNPLLGLDST)。

为产生表达以上构建体的CHO dhfr-细胞，将相应编码序列克隆到名为pEF-DHFR的质粒中(pEF-DHFR描述于Raum等人Cancer Immunol Immunother 50(2001)141-150)。还生成了用人CD70转染但无V5标签的CHO细胞。所有克隆程序根据标准方案(Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，New York(2001))进行。对于各构建体，将对应质粒转染至用于真核表达的DHFR缺陷型CHO细胞中，如由Kaufman R.J.(1990)Methods Enzymol.185，537-566所述。

使用单克隆小鼠IgG2a抗v5标签抗体(1μg/ml；AbD Serotec，#MCA 1360)验证构建体在CHO细胞上的表达。结合的单克隆抗体用抗小鼠IgG Fc-γ-PE检测。作为阴性对照，将细胞与同型对照抗体而非第一抗体一起孵育。通过流式细胞术对样品进行测量。CHO转染子不表达单独的E5或E5+6。参见图1。

实施例2

抗CD70抗体构建体的表位作图

将如实施例1所述生成的CHO细胞用粗制、未稀释的含各个抗CD70scFv分子的周质提取物染色。用小鼠单克隆抗FLAG M2抗体(1μg/ml；Sigma F1804)然后用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100；Jackson Immunoresearch # 115-116-071)检测结合的scFv。所有抗体均在PBS/1.5％FCS中稀释。作为阴性对照，将细胞与PBS/2％FCS而非周质提取物一起孵育。通过流式细胞术对样品进行测量。虽然所有测试的抗CD70 scFv分子均能够结合到不含V5标签的人CD70(强FACS信号)，但它们均不能结合到鼠CD70(无FACS信号)。

取决于观测到结合损失的嵌合CD70分子，将结合物分成不同的组(I、II、III、IIIv、V、VI、VII和VIII)。结合损失在大多数情况下为完全的，但在一些情况下也可能为部分的。尤其对于名为E6的区域(参见组II、IIIv、VI和VIII)观测到仅部分结合损失，但在一些情况下，对其他区而言也观测到。对于所测试的一些结合物，用两个相邻区域的组合(E1+2、E3+4、E4+5、E6+7)获得的结果未必总是明确的。因此，分成不同的组主要由使用仅一个区被鼠对应区域置换的那些嵌合分子所获得的结果驱动。结果示于表4中。

表4：胞外CD70结构域的若干区域(E2、E3、E4、E6及其组合)被鉴定为包含由相应抗CD70结合分子识别的表位，如由FACS信号的完全或部分损失所检测。＊组和结合物的名称也用在序列表中。

抗CD70 scFv分子对“E1”或“E7”嵌合分子均未显示出结合损失。因此，本发明的抗体构建体的第一结合结构域似乎不结合到包含在名为E1的区域内的表位，且其似乎不结合到包含在名为E7的区域内的表位。在组VII中，V5标签在嵌合分子中的存在似乎干扰抗CD70scFv分子的结合。因此，无法确定表位。可以推测，该组抗CD70 scFv分子结合到包含在名为E7的区域内的表位，这是因为该区域与V5标签相邻。

图3显示实验设置，而图4A和B显示scFc形式的若干示例性双特异性结合物的表位作图结果。

实施例3

基于Biacore和Octet测定与人和猕猴CD70和CD3的抗体亲和力

Biacore分析实验使用与白蛋白的重组人/cyno CD70-ECD融合蛋白进行，以确定本发明的抗体构建体的靶标结合。

详细地讲，将CM5传感器芯片(GE Healthcare)用大致600-800RU的相应重组抗原使用乙酸盐缓冲液(pH 4.5)根据制造商手册来固定。CD70xCD3双特异性抗体构建体样品以以下浓度的稀释系列上样：在HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)中稀释的50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.13nM。流动速率为30μl/min持续3分钟，随后以30μl/ml的流动速率施加HBS-EP运行缓冲液持续8分钟至20分钟。芯片的再生使用10mM甘氨酸、10mM NaCl(pH 1.5)溶液进行。使用BiaEval软件分析数据集。一般进行两个独立实验。

此外，Octet分析实验使用重组人/cyno CD70-NHS-PEG生物素进行，以确定本发明的抗体构建体的靶标结合。详细地讲，将Streptavidin-Tip用大致0.1-0.2nm的相应重组抗原根据制造商手册来固定。CD70xCD3双特异性抗体构建体样品以以下浓度的稀释系列制备：在HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare)中稀释的300nM、150nm、75nM、37.5nM、18.8nM和9.4nM。对于每个稀释，将一个Streptavidin-Tip用抗原固定。在黑色96孔MTP中测量缔合。流动速率为1000rpm，进行8分钟的缔合。对于解离，在1000rpm的流动速率下，将tip在HBS-EP运行缓冲液中再次孵育15分钟至30分钟。使用ForteBio数据分析软件分析数据集。一般进行两个独立实验。

如通过Octet分析所测定，所分析的scFc形式的CD70xCD3双特异性抗体构建体显示出在1位数的纳摩尔范围内的与人CD70的极高亲和力(除一个构建体在极低的2位数的纳摩尔范围内以外)。对与猕猴CD70的结合进行平衡，也显示出在1位数的纳摩尔范围内的亲和力。亲和力值以及计算的亲和力差示于表5中。

表5：如通过Octet分析所测定的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体与人和猕猴CD70的亲和力，以及计算的种间亲和力差。所有构建体均在各自使用稀释系列的两个独立实验中测量，用(＊)标记的除外，它们仅在一个实验中测量。

此外，双特异性抗体构建体与人CD3和猕猴CD3的结合以及与人和cyno FcRn的结合在Biacore测定中得到确认，且证实较强且平衡良好。所分析的scFc形式的CD70xCD3双特异性抗体构建体显示出在极低的2位数或1位数纳摩尔范围内的与人CD3的高亲和力。平衡与猕猴CD3的结合，也显示出类似范围内的亲和力。亲和力值以及计算的亲和力差示于表6中。

表6：如通过Biacore分析所测定的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体与人和猕猴CD3的亲和力，以及计算的种间亲和力差。

实施例4

基于Scatchard分析CD70xCD3双特异性抗体构建体与靶抗原阳性细胞上人和猕猴CD70的亲和力，且测定种间亲和力差

CD70xCD3双特异性抗体构建体与用人或猕猴CD70转染的CHO细胞的亲和力也通过作为测量人与猕猴CD70之间的潜在亲和力差的最可靠方法的Scatchard分析来确定。对于Scatchard分析，使用单价检测系统进行饱和结合实验以准确确定CD70xCD3双特异性抗体构建体与相应细胞系的单价结合。

相应细胞系的2×10⁴个细胞(以重组方式表达人CD70的CHO细胞系，以重组方式表达猕猴CD70的CHO细胞系)各自与50μl以10-20nM起始的三倍稀释系列(以1∶2进行十二次稀释)的相应CD70xCD3双特异性抗体构建体(直至达到饱和)一起孵育，之后在4℃的搅拌下孵育16h，和一个剩余洗涤步骤。接着，将细胞与30μl CD3xALEXA488缀合物溶液再孵育一小时。在一个洗涤步骤之后，使细胞重悬于150μl含有3.5％甲醛的FACS缓冲液中，再孵育15分钟，离心，重悬于FACS缓冲液中且使用FACS CantoH机器和FACS Diva软件进行分析。从两组独立的实验(各一式三份)得到数据。计算相应Scatchard分析以推断最大结合(Bmax)。确定半最大结合下CD70xCD3双特异性抗体构建体的浓度，其反映相应KD。将一式三份测量的值绘制成双曲线和S形曲线，以表明从最小至最佳结合范围内的适当浓度。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表7。基于细胞的Scatchard分析证实本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体对人CD70和mac CD70的亲和力在较低的纳摩尔范围内，且呈现约为1的较小且极有利的cyno/人种间亲和力差。

表7：如在基于细胞的Scatchard分析中测定的CD70xCD3双特异性抗体构建体的亲和力(KD)，与计算的亲和力差KD猕猴CD70/KD人CD70。在两个独立的实验(各一式三份)中测量抗体构建体。

实施例5

双特异性结合和种间交叉反应性

为确认与人CD70和CD3以及cyno CD70和CD3的结合，通过流式细胞术使用以下细胞测试本发明的双特异性抗体构建体：

·分别用人CD70和猕猴CD70转染的CHO细胞，

·CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8(但是也可以想到其他CD70阳性人细胞系，诸如肾透明细胞癌瘤细胞系O-786)

·表达CD3的人T细胞白血病细胞系HPB-all(DSMZ，Braunschweig，ACC483)，和

·表达食蟹猴CD3的T细胞系LnPx 4119

对于流式细胞术，在4℃下将相应细胞系的200,000个细胞与50μl浓度为5μg/ml的纯化双特异性抗体构建体一起孵育60分钟。细胞在4℃下用PBS/2％FCS洗涤两次，接着与对双特异性抗体构建体的CD3结合部分具有特异性的内部小鼠抗体(2μg/ml)一起孵育30分钟。在洗涤之后，在4℃下将结合的小鼠抗体用山羊抗小鼠Fcγ-PE(1∶100)检测30分钟。通过流式细胞术对样品进行测量。使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于图5A-5C。所有测试的CD70xCD3构建体均染色经人CD70和cyno CD70转染的CHO细胞，并且它们也染色CD70阳性肾透明细胞腺癌瘤系O-786(天然表达子)。表达CD3的人和cyno T细胞系也由双特异性抗体构建体识别。此外，阴性对照细胞(经人CD40L转染的CHO细胞和未转染的CHO细胞)不存在染色。

实施例6

确认不存在与人旁系同源物的结合

将人CD70旁系同源物CD40L稳定转染进CHO细胞。在序列表(SEQ ID NO：769)中标识本发明实施例中所使用的旁系同源物的序列。在FACS分析中用特异性抗体确认蛋白质表达。如实施例5中所述进行流式细胞术测定。结果示于5A-C并且还在实施例5中提及。分析证实本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体均不与人CD70旁系同源物CD40L交叉反应。

实施例7：

与人种系的同一性

为分析抗体构建体与人抗体种系基因的序列的同一性/相似性，将本发明的CD70结合结构域如下比对：对包括所有CDR的完整VL进行比对；将包括CDR 1和2但不包括CDR3的完整VH针对人抗体种系基因(Vbase)进行比对。更多细节可现于本申请的说明书中。结果示于下表8中。所有变体均显示出高种系相似性。

表8：VH和VL与人种系的同一性百分比

实施例8

细胞毒性活性

在五个体外细胞毒性测定中分析本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体将效应T细胞针对表达CD70的靶细胞重定向的效能：

·在18小时51-铬释放测定中测量CD70xCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对人CD70转染的CHO细胞重定向的效能。

·在18小时51-铬释放测定中测量CD70xCD3双特异性抗体构建体将经刺激的人CD8+效应T细胞针对CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8(但也可以想到其他CD70阳性人细胞系)重定向的效能。

·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量CD70xCD3双特异性抗体构建体将未刺激的人PBMC中的T细胞针对人CD70转染的CHO细胞重定向的效能。

·在48小时基于FACS的细胞毒性测定中测量CD70xCD3双特异性抗体构建体将未刺激的人PBMC中的T细胞针对CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8(但也可设想其他CD70阳性人细胞系)重定向的效能。

·对于确认交叉反应性CD70xCD3双特异性抗体构建体能够将猕猴T细胞针对经猕猴CD70转染的CHO细胞重定向，用猕猴T细胞系作为效应T细胞进行48小时基于FACS的细胞毒性测定。

实施例8.1

使用经刺激的人T细胞进行的铬释放测定

如下文所述获得富集了CD8⁺ T细胞的经刺激的T细胞。在37℃下用最终浓度1μg/ml的市售抗CD3特异性抗体(OKT3，Orthoclone)包被培养皿(直径145mm，Greiner bio-oneGmbH，Kremsmünster)1小时。通过一个用PBS洗涤的步骤移除未结合的蛋白。将3-5×10⁷个人PBMC添加到预先包被的培养皿中的120ml具有稳定化谷氨酰胺/10％FCS/IL-2 20U/ml(

Chiron)的RPMI 1640中且刺激2天。在第三天，收集细胞且用RPMI 1640洗涤一次。添加IL-2至最终浓度为20U/ml且在与上文相同的细胞培养基中将细胞再培养一天。使用Dynal-Beads根据制造商的方案通过消耗CD4⁺ T细胞和CD56⁺NK细胞使CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)富集。

经Cyno CD70或人CD70转染的CHO靶细胞用PBS洗涤两次且在37℃下在最终体积为100μl的具有50％FCS的RPMI中用11.1MBq⁵¹Cr标记60分钟。随后，将经标记的靶细胞用5mlRPMI洗涤3次，接着用于细胞毒性测定。在96孔板中在总体积为200μl的E∶T比率为10∶1的补充型RPMI中进行测定。使用起始浓度0.01-1μg/ml的纯化双特异性抗体构建体及其三倍稀释液。测定的孵育时间为18小时。将细胞毒性确定为上清液中释放的铬相对于最大溶解(添加Triton-X)和自发溶解(无效应细胞)之差的相对值。一式四份地进行所有测量。上清液中铬活性的测量在Wizard 3”γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH，

Germany)中进行。对结果的分析用Prism 5 for Windows(5.0版，GraphPad SoftwareInc.，San Diego，California，USA)进行。使用通过分析程序由S形剂量反应曲线计算出的EC50值比较细胞毒性活性。

实施例8.2

将经刺激的人效应T细胞针对经人CD70转染的CHO细胞重定向的效能

在51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中使用用人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人CD8+ T细胞作为效应细胞来分析根据本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例8.1中所述进行实验。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表9。CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体显示出亚皮摩尔范围内的极有效的对经人CD70转染的CHO细胞的细胞毒性活性。

表9：使用经人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞和经刺激的人CD8 T细胞作为效应细胞的51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中分析的CD70xCD3双特异性抗体构建体的EC50值[pM]。

实施例8.3

将经刺激的人效应T细胞针对CD70阳性人细胞系重定向的效能

在51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中使用CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8作为靶细胞来源和经刺激的人CD8+ T细胞作为效应细胞来分析CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如实施例8.1中所述进行测定。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表10。根据使用经刺激的富集的人CD8+T淋巴细胞作为效应细胞和经人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞的51-铬释放测定的结果，本发明的CD70xCD3双特异性抗体构建体对天然表达靶细胞也具有极强效的细胞毒性活性，其中对天然表达细胞的细胞毒性活性在亚皮摩尔范围内。

表10：在使用CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8作为靶细胞来源和经刺激的富集人CD8 T细胞作为效应细胞的18小时51-铬(⁵¹Cr)释放细胞毒性测定中分析的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体的EC50值[pM]。

实施例8.4

使用未刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定

分离效应细胞

通过Ficoll密度梯度离心，从富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)(收集输注用血液的血库的副产物)制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供且在与血液收集的同一天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏PBS(Dulbecco’s PBS)(Gibco)充分洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH₄Cl，10mM KHCO₃，100μM EDTA)一起孵育而从PBMC移除剩余红细胞。在100xg下离心PBMC后，经由上清液移除血小板。剩余的淋巴细胞主要包括B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC保持在37℃/5％CO₂下的具有10％FCS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中培养。

消耗CD14⁺和CD56⁺细胞

对于CD14⁺细胞的消耗，使用人CD14 MicroBeads(Milteny Biotec，MACS，#130-050-201)，对于NK细胞的消耗，使用人CD56 MicroBeads(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数且在室温下以300xg离心10分钟。将上清液丢弃并将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液[80μL/10⁷个细胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)，0.5％(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。添加CD14 MicroBeads和CD56 MicroBeads(20μL/10⁷个细胞)且在4-8℃下孵育15分钟。用MACS分离缓冲液(1-2mL/10⁷个细胞)洗涤细胞。在离心(参见上文)之后，将上清液丢弃且将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μL/10⁸个细胞)中。接着使用LS柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。在培养箱中，在37℃下在补充有10％FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需氨基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸钠(Biochrom AG，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(Biochrom AG，#A2213)的RPMI完全培养基即RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215)中培养不含CD14+/CD56+细胞的PBMC直至需要。

靶细胞标记

对于用流式细胞术测定分析细胞裂解而言，使用荧光膜染料DiOC₁₈(DiO)(Molecular Probes，#V22886)标记作为靶细胞的经人CD70或猕猴CD70转染的CHO细胞，且将其与效应细胞相区分。简而言之，收获细胞，用PBS洗涤一次且在含有2％(v/v)FBS和膜染料DiO(5μL/10⁶个细胞)的PBS中调节至10⁶个细胞/mL。在37℃下孵育3分钟后，在完全RPMI培养基中洗涤细胞两次且将细胞数调节至1.25×10⁵个细胞/mL。使用0.5％(v/v)等张EosinG溶液(Roth，#45380)测定细胞活力。

基于流式细胞术的分析

此测定被设计成定量在CD70双特异性抗体构建体的连续稀释液存在下经cyno或人CD70转染的CHO细胞的裂解。混合等体积的DiO标记的靶细胞和效应细胞(即，不含CD14⁺细胞的PBMC)，从而产生10∶1的E∶T细胞比率。将160μl此悬浮液转移至96孔板的每个孔中。添加40μL CD70xCD3双特异性抗体构建体的系列稀释液和阴性对照双特异性抗体(识别不相关靶抗原的基于CD3的双特异性抗体构建体)或RPMI完全培养基作为额外的阴性对照。双特异性抗体介导的细胞毒性反应在7％CO₂加湿培养箱中进行48小时。随后将细胞转移至新的96孔板，且通过添加最终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI为膜不可渗透性染料，其通常被活细胞排斥，而死细胞则将其吸收且变得可由荧光发射鉴别。

通过流式细胞术在FACSCanto II仪器上测量样品且通过FACSDiva软件(均得自Becton Dickinson)分析。靶细胞鉴别为DiO阳性细胞。将PI阴性靶细胞归类为活靶细胞。根据下式计算细胞毒性的百分比：

n＝事件数

使用GraphPad Prism 5软件(Graph Pad Software，San Diego)，相对于对应的双特异性抗体浓度绘制细胞毒性百分比的图。用四参数逻辑回归模型分析剂量反应曲线以评估具有固定的希尔斜率(hill slope)的S形剂量反应曲线且计算EC50值。

实施例8.5

将未刺激的人PBMC针对经人CD70转染的CHO细胞重定向的效能

在使用用人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞和未刺激的人PBMC作为效应细胞的基于FACS的细胞毒性测定中分析CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如以上实施例8.4中所述进行测定。在另一个方法中，以1ng/ml的浓度添加可溶性CD27，以便验证可溶形式的CD27的存在是否会损害所测试的抗体构建体的细胞毒性活性。

针对代表数量的scFc形式的抗体构建体，用未刺激的人PBMC作为效应细胞和经人CD70转染的CHO细胞作为靶标的基于FACS的细胞毒性测定的结果示于表11中。EC50值不因CD27的存在而受到显著影响。另见图6，其显示构建体CD70-21D_CCxI2C-scFc的结果。

表11：在用未刺激的人PMBC作为效应细胞和经人CD70转染的CHO细胞作为靶细胞的48小时基于FACS的细胞毒性测定中测得的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体的EC50值[pM]。

预计与使用经刺激的人CD8+ T细胞的细胞毒性测定相比，在使用未刺激的PBMC作为效应细胞的细胞毒性测定中EC50值通常较高(参见实施例8.2)。

实施例8.6

将未刺激的人PBMC针对CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系重定向的效能

此外，在使用CD70阳性人卵巢癌瘤细胞系OVCAR 8作为靶细胞来源和未刺激的人PBMC作为效应细胞的基于FACS的细胞毒性测定中分析CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如以上实施例8.4中所述进行测定。scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表12。

表12：在使用未刺激的人PBMC作为效应细胞和人细胞系SHP-77作为靶细胞来源的48小时基于FACS的细胞毒性测定中测得的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体的EC50值[pM]。

实施例8.7

将猕猴T细胞针对表达猕猴CD70的CHO细胞重定向的效能

最后，在使用经猕猴(cyno)CD70转染的CHO细胞作为靶细胞和猕猴T细胞系4119LnPx(Knappe等人Blood 95：3256-61(2000))作为效应细胞来源的基于FACS的细胞毒性测定中分析CD70xCD3双特异性抗体构建体的细胞毒性活性。如上文所述进行经猕猴CD70转染的CHO细胞的靶细胞标记和细胞毒性活性的基于流式细胞术的分析。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表13。通过根据本发明的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体诱导了来自细胞系4119LnPx的猕猴T细胞有效杀灭经猕猴CD70转染的CHO细胞。在此测定中，抗体构建体强效呈现亚皮摩尔EC50值，证实它们在猕猴系统中活性极高。

表13：在用猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞和经猕猴CD70转染的CHO细胞作为靶细胞的48小时基于FACS的细胞毒性测定中测得的CD70xCD3双特异性抗体构建体的EC50值[pM]。

实施例9

在250μg/ml下(i)三个冻/融循环和(ii)孵育7天后单体向二聚体的转化

使双特异性CD70xCD3抗体单体构建体接受不同的应力条件，然后接受高效SEC，以确定已转化成二聚抗体构建体的最初单体抗体构建体的百分比。

(i)用通用制剂缓冲液将25μg单体抗体构建体调节至250μg/ml的浓度，接着在-80℃下冷冻30分钟，之后在室温下解冻30分钟。三个冻/融循环之后，通过HP-SEC测定二聚体含量。

(ii)用通用制剂缓冲液将25μg单体抗体构建体调节至250μg/ml的浓度，之后在37℃下孵育7天。通过HP-SEC测定二聚体含量。

将高分辨率SEC柱TSK Gel G3000 SWXL(Tosoh，Tokyo-Japan)连接至装备有A905自动进样器的

Purifier 10 FPLC(GE Lifesciences)。柱平衡和运行缓冲液由100mMKH2PO4-200mM Na2SO4(调节至pH 6.6)组成。将抗体溶液(25μg蛋白质)施加到经平衡的柱且在7MPa的最大压力下以0.75ml/min的流动速率进行洗脱。以280、254和210nm的吸光度监测整个运行。通过

Unicorn软件运行评估表中记录的210nm信号的峰积分进行分析。二聚体含量通过二聚体峰的面积除以单体加二聚体峰的总面积来计算。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表14。本发明的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体在三个冻/融循环之后呈现≤1.5％的二聚体百分比(其中大部分构建体呈现≤1.0％的二聚体百分比)，且在37℃下孵育7天之后呈现≤0.6％的二聚体百分比(其中大部分构建体呈现0％的二聚体百分比)。

表14：如通过高效体积排阻色谱法(HP-SEC)测定的单体相比二聚体CD70xCD3双特异性抗体的百分比。

实施例10

热稳定性

抗体聚集温度如下测定：将40μl 250μg/ml的抗体构建体溶液转移至一次性比色皿中且置于Wyatt动态光散射装置DynaPro Nanostar(Wyatt)中。样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，其中持续获取测得的半径。与DLS装置一起交付的软件包使用指示蛋白熔融和聚集的半径增加来计算抗体构建体的聚集温度。

所有测试的本发明的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体显示出聚集温度≥52.0℃的热稳定性，如下表15中针对scFc形式的代表性数量的抗体构建体所示。

表15：如通过DLS(动态光散射)所测定的CD70xCD3双特异性抗体构建体的热稳定性。

实施例11

在人血浆中孵育24小时后的稳定性

纯化的双特异性抗体构建体在37℃下在人血浆库中以1∶5的比率在2-20μg/ml的最终浓度下孵育96小时。在血浆孵育之后，在使用起始浓度为0.01-0.1μg/ml的且效应细胞与靶细胞(E∶T)比率为10∶1的经刺激的富集人CD8+ T细胞和经人CD70转染的CHO细胞的51-铬释放测定中，比较抗体构建体(如实施例8.1中所述的测定)。包括未孵育的新近解冻的双特异性抗体构建体作为对照。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表16。大多数测试的抗体构建体均具有≤3.0或≤2.5的极有利的血浆稳定性(EC₅₀血浆/EC₅₀对照)。

表16：进行和不进行血浆孵育的CD70xCD3(I2C)抗体构建体的EC50值和计算的血浆/对照值

实施例12

2500μg/ml抗体浓度下的浊度

通过旋转浓缩单元将1ml浓度为250μg/ml的纯化抗体构建体溶液浓缩至2500μg/ml。在5℃下储存16小时之后，通过针对通用制剂缓冲液的OD340nm光学吸收测量值来测定抗体溶液的浊度。

scFc形式的代表数量的CD70xCD3(I2C)抗体构建体的结果示于表17。所有测试的抗体构建体均具有≤0.05的极有利的浊度。

表17：在浓缩至2.5mg/ml过夜之后的抗体构建体的浊度

实施例13

通过高分辨率阳离子交换层析得到的蛋白均质性

通过高分辨率阳离子交换层析CIEX分析本发明的抗体构建体的蛋白均质性。

将50μg抗体构建体单体用50ml结合缓冲液A(20mM磷酸二氢钠、30mM NaCl、0.01％辛酸钠，pH 5.5)稀释且将40ml该溶液施加到连接至

Micro FPLC装置(GEHealthcare，Germany)的1ml BioPro SP-F柱(YMC，Germany)中。在样品结合之后，再用结合缓冲液实施洗涤步骤。对于蛋白洗脱，施加超过10倍柱体积的使用缓冲液B(20mM磷酸二氢钠、1000mM NaCl、0.01％辛酸钠，pH 5.5)直至50％缓冲液B的线性增加的盐梯度。以280、254和210nm的吸光度监测整个运行。通过

Unicorn软件运行评估表中记录的280nm信号的峰积分进行分析。

scFc形式的代表数量的CD70xCD3(I2C)抗体构建体的结果示于表18。所有测试的抗体构建体均具有≥60％(主峰的曲线下面积(＝AUC))的有利的均质性，15个构建体中有9个具有≥70％的均质性。

表18：抗体构建体的蛋白质均质性(主峰的AUC％)

实施例14

如通过HIC Butyl所测量的表面疏水性

在疏水性相互作用层析HIC中以流通模式(flow-through mode)测试本发明的双特异性抗体构建体的表面疏水性。

将50μg抗体构建体单体用通用制剂缓冲液稀释至500μl的最终体积(10mM柠檬酸、75mM盐酸赖氨酸、4％海藻糖，pH 7.0)且施加到连接至

Purifier FPLC系统(GEHealthcare，Germany)的1ml丁基琼脂糖FF柱(GE Healthcare，Germany)。以280、254和210nm的吸光度监测整个运行。通过

Unicorn软件运行评估表中记录的280nm信号的峰积分进行分析。洗脱行为通过比较蛋白信号的面积以及升高和下降速度来评估，由此指示BiTE白蛋白融合体与基质的相互作用的强度。

分析了scFc形式的代表数量的CD70xCD3(I2C)抗体构建体，并显示具有大多快速且完全的良好的洗脱行为。

实施例15

双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的效能差

为确定各个CD70xCD3双特异性抗体构建体的单体与二聚体同种型之间的细胞毒性活性差(称为效能差)，如上文所述用纯化的双特异性抗体构建体单体和二聚体进行18小时51-铬释放细胞毒性测定(实施例8.1)。效应细胞为经刺激的富集人CD8+ T细胞。靶细胞为经hu CD70转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E∶T)的比率为10∶1。效能差以EC50值之间的比率计算。

scFc形式的代表数量的抗体构建体的结果示于表19。所测试的CD70xCD3(I2C)双特异性抗体构建体的效能差在0.0与1.5之间。因此与其相应单体相比，不存在活性实质性更高的二聚体。

表19：单体与二聚体同种型之间的效能差

实施例16

CD27不抑制抗CD70 scFv分子的结合

执行该测定以测试可溶形式的CD27(136-458pg/ml可溶性CD27溶于人血清；HuangJ.等人(2013)J Immunol 190：1-9)是否会损害根据本发明的抗CD70结合结构域与CD70的结合。

为验证人CD27与经人CD70转染的CHO细胞的结合，将细胞与人CD27一起在4℃下孵育30分钟(1μg/ml；R&D #382-CD-100)。用抗HIS抗体(5μg/ml；AbD Serotec)接着用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100；Jackson Immunoresearch # 115-116-071)检测结合的CD27。作为阴性对照，将细胞与PBS/2％FCS而不是CD27一起孵育。

为测试抗CD70 scFv由CD27代替，将经人CD70转染的CHO细胞与或不与CD27一起在4℃下孵育30分钟(1μg/ml；R&D #382-CD-100)。之后，洗涤细胞两次，接着用含有结合到CD70的scFv的粗制、未稀释的周质提取物进行染色。用小鼠单克隆抗FLAG M2抗体(1μg/ml；Sigma F1804)接着用抗小鼠IgG Fc-γ-PE(1∶100；Jackson Immunoresearch # 115-116-071)检测结合的scFv。作为阴性对照，将细胞与非特异性scFv而不是抗CD70 scFv一起孵育。CD27和所有抗体均在含2％FCS的PBS中稀释。

对于所分析的本发明的CD70结合物中的任一者，在可溶性CD27与抗CD70 scFv之间未观测到竞争。

Claims

1.一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人CD70的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域，

其中所述第一结合结构域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区，其中所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3选自以下项所描绘的那些：

1) SEQ: ID NO: 1044-1049；

2) SEQ: ID NO: 1086-1091；

3) SEQ: ID NO: 1142-1147；

4) SEQ: ID NO: 1170-1175；

5) SEQ: ID NO: 1184-1189；

6) SEQ: ID NO: 1212-1217；

7) SEQ: ID NO: 1226-1231；

8) SEQ: ID NO: 1240-1245；

9) SEQ: ID NO: 1254-1259；

10) SEQ: ID NO: 1268-1273；

11) SEQ: ID NO: 1338-1343；

12) SEQ: ID NO: 1352-1357；

13) SEQ: ID NO: 1366-1371；

14) SEQ: ID NO: 1422-1427和

15) SEQ: ID NO: 1436-1441。

2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VH区的VH区：SEQ ID NO: 1050、SEQ ID NO: 1092、SEQ ID NO: 1148、SEQ ID NO:1176、SEQ ID NO: 1190、SEQ ID NO: 1218、SEQ ID NO: 1232、SEQ ID NO: 1246、SEQ IDNO: 1260、SEQ ID NO: 1274、SEQ ID NO: 1344、SEQ ID NO: 1358、SEQ ID NO: 1372、SEQID NO: 1428和SEQ ID NO: 1442。

3.根据权利要求1或2所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自以下项所描绘的VL区的VL区：SEQ ID NO: 1051、SEQ ID NO: 1093、SEQ ID NO: 1149、SEQ ID NO:1177、SEQ ID NO: 1191、SEQ ID NO: 1219、SEQ ID NO: 1233、SEQ ID NO: 1247、SEQ IDNO: 1261、SEQ ID NO: 1275、SEQ ID NO: 1345、SEQ ID NO: 1359、SEQ ID NO: 1373、SEQID NO: 1429和SEQ ID NO: 1443。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含VH区和VL区，所述VH区和VL区选自如以下项所描绘的VH区和VL区的配对：SEQ ID NO:1050+1051、SEQ ID NO:1092+1093、SEQ ID NO:1148+1149、SEQ ID NO:1176+1177、SEQ ID NO:1190+1191、SEQ ID NO:1218+1219、SEQ ID NO:1232+1233、SEQ ID NO:1246+1247、SEQ IDNO:1260+1261、SEQ ID NO:1274+1275、SEQ ID NO: 1344+1345、SEQ ID NO:1358+1359、NO:1372+1373、SEQ ID NO: 1428+1429和SEQ ID NO: 1442+1443。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ ID NO: 1052、SEQ ID NO: 1094、SEQ ID NO: 1150、SEQID NO: 1178、SEQ ID NO: 1192、SEQ ID NO: 1220、SEQ ID NO: 1234、SEQ ID NO: 1248、SEQ ID NO: 1262、SEQ ID NO: 1276、SEQ ID NO: 1346、SEQ ID NO: 1360、SEQ ID NO:1374、SEQ ID NO: 1430和SEQ ID NO: 1444。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其包含选自以下项所描绘的多肽的多肽：SEQ ID NO: 1053、SEQ ID NO: 1095、SEQ ID NO: 1151、SEQ ID NO: 1179、SEQ IDNO: 1193、SEQ ID NO: 1221、SEQ ID NO: 1235、SEQ ID NO: 1249、SEQ ID NO: 1263、SEQID NO: 1277、SEQ ID NO: 1347、SEQ ID NO: 1361、SEQ ID NO: 1375、SEQ ID NO: 1431和SEQ ID NO: 1445。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其包含选自以下项所描绘的多肽的多肽或由其组成：SEQ ID NO: 1696、SEQ ID NO: 1702、SEQ ID NO: 1710、SEQ ID NO:1714、SEQ ID NO: 1716、SEQ ID NO: 1720、SEQ ID NO: 1722、SEQ ID NO: 1724、SEQ IDNO: 1726、SEQ ID NO: 1728、SEQ ID NO: 1738、SEQ ID NO: 1740、SEQ ID NO: 1742、SEQID NO: 1750和SEQ ID NO: 1752。

8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域进一步结合到猕猴CD70。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第一结合结构域进一步结合到食蟹猴CD70。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域结合到人CD3ε并且结合到普通狨、棉顶狨或松鼠猴CD3ε。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体呈选自以下的形式：(scFv)₂、scFv-单结构域mAb、双功能抗体和上述形式的寡聚物。

12.一种多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所定义的抗体构建体。

13.一种载体，其包含如权利要求12所定义的所述多核苷酸。

14.一种宿主细胞，其用如权利要求12所定义的所述多核苷酸或用如权利要求13所定义的所述载体转化或转染。

15.一种用于产生根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体的方法，所述方法包括在允许所述抗体构建体表达的条件下培养如权利要求14所定义的宿主细胞和从所述培养物回收所产生的抗体构建体。

16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求15所述的方法产生的抗体构建体。

17.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体或根据权利要求15所述的方法产生的抗体构建体在制备用于治疗或改善肿瘤或癌症疾病或转移性癌症疾病的药物中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述肿瘤或癌症疾病选自：肾、肺、胰腺、卵巢、乳腺、结肠、头颈、胃、直肠、胸腺和脑部肿瘤或癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、卡波氏肉瘤、胚胎癌瘤以及来源于前述任一者的转移性癌症疾病。

19.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的抗体构建体、根据权利要求15所述的方法产生的抗体构建体、如权利要求12所定义的多核苷酸、如权利要求13所定义的载体或如权利要求14所定义的宿主细胞。