EA037647B1 - Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения - Google Patents

Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения Download PDF

Info

Publication number
EA037647B1
EA037647B1 EA201790530A EA201790530A EA037647B1 EA 037647 B1 EA037647 B1 EA 037647B1 EA 201790530 A EA201790530 A EA 201790530A EA 201790530 A EA201790530 A EA 201790530A EA 037647 B1 EA037647 B1 EA 037647B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antigen
heavy chain
antibody
antibodies
Prior art date
Application number
EA201790530A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201790530A1 (ru
Inventor
Франсуа Годе
Рикардо Аттар
Бенджамин К. Харман
Инчжэ Ли
Цзиньцюань Ло
Ронан Макдейд
Стивен К. Померантц
Сьюзан Х. Тэм
Алексей Тепляков
Джон Уилер
Шэн-Дзюн Ву
Дженнифер Ф. Немет
Original Assignee
Янссен Фармацевтика Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Фармацевтика Нв filed Critical Янссен Фармацевтика Нв
Publication of EA201790530A1 publication Critical patent/EA201790530A1/ru
Publication of EA037647B1 publication Critical patent/EA037647B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

В документе предлагаются антитела, иммуноспецифически связывающиеся с CD123. Также описываются родственные полинуклеотиды, способные кодировать предложенные CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, клетки, экспрессирующие предложенные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, а также соответствующие векторы и меченные с возможностью обнаружения антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Кроме того, описываются способы применения предложенных антител. Например, предложенные антитела можно использовать для диагностики, лечения или контроля прогрессирования, регрессирования или стабильности течения рака с экспрессией CD123; для определения того, следует ли проводить лечение рака у пациента; или для определения того, поражен ли субъект раковым заболеванием с экспрессией CD123 и, следовательно, ответит ли он на лечение CD123-специфическим противораковым препаратом, например мультиспецифическими антителами к CD123 и CD3, описанными в настоящем документе.

Description

Область техники
Предлагаемое описание относится к моноклональным антителам, иммуноспецифически связывающимся с кластером дифференцировки 123 (CD123; также известен как IL-3Ra), мультиспецифическим антителам, иммуноспецифически связывающимся с CD123 и кластером дифференцировки 3 (CD3), и способам получения и применения описанных антител.
Предпосылки создания изобретения
Новый случай рака крови диагностируют приблизительно каждые три минуты. Наиболее распространенными видами рака крови являются лейкоз, лимфома и миелома, диагноз которых в 2014 г. в США поставят впервые 156420 людям. Приблизительно каждые 10 мин в США кто-то умирает от рака крови. Рак крови представляет собой группу заболеваний, поражающих костный мозг, клетки крови, лимфоузлы и другие части лимфатической системы. Эти виды рака непропорционально часто поражают молодых людей, причем лейкоз является самым распространенным типом рака у детей и подростков до 20 лет.
Один тип клеток рака крови экспрессирует клеточный маркер, известный как CD123 (IL-3Ra). Примеры раковых клеток крови, экспрессирующих CD123, включают бласты и лейкозные стволовые клетки. Заболевания, связанные с экспрессией CD123, включают острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS; низкого и высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) и бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN).
В настоящее время варианты лечения этих заболеваний включают более 50 конкретных лекарственных препаратов и другие препараты находятся в процессе исследований и клинических испытаний. Для лечения рака крови также часто применяют лучевую терапию (RT) и иногда используют ее вместе с лекарственной терапией. Также применяют иммунотерапию, генную терапию и персонализированные препараты. Однако эти виды лечения могут иметь существенные побочные эффекты и нежелательные реакции. Следовательно, существует потребность в новых и улучшенных видах терапии онкологических заболеваний крови с экспрессией CD123 (IL-3Ra).
Изложение сущности изобретения
В настоящем документе предлагаются антитела, иммуноспецифически связывающиеся с CD123, а также их антигенсвязывающие фрагменты. Также описываются родственные полинуклеотиды, способные кодировать предложенные CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты, клетки, экспрессирующие предложенные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, а также соответствующие векторы и меченные с возможностью обнаружения антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Кроме того, описываются способы применения антител и антигенсвязывающих фрагментов. Например, CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для диагностики или контроля прогрессирования, регрессирования или стабильности течения рака с экспрессией CD123; для определения того, следует ли проводить лечение рака у пациента; или для определения того, поражен ли субъект раковым заболеванием с экспрессией CD123 и, следовательно, ответит ли он на лечение СО123-специфическим противораковым препаратом, например мультиспецифическими антителами к CD123 и CD3, описанными в настоящем документе.
Также в настоящем документе предлагаются мультиспецифические антитела, иммуноспецифически связывающиеся с CD123 и CD3, а также их мультиспецифические антигенсвязывающие фрагменты. Также описываются родственные полинуклеотиды, способные кодировать предложенные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3, клетки, экспрессирующие предложенные антитела, а также соответствующие векторы и меченные с возможностью обнаружения мультиспецифические антитела. Кроме того, описываются способы применения предложенных мультиспецифических антител. Например, мультиспецифические антитела к CD123 х CD3 можно использовать для диагностики или контроля прогрессирования, регрессирования или стабильности течения рака с экспрессией CD123; для определения того, следует ли проводить лечение рака у пациента; или для определения того, поражен ли субъект раковым заболеванием с экспрессией CD123 и, следовательно, ответит ли он на лечение CD123-специфическим противораковым препаратом, например мультиспецифическими антителами к CD123 х CD3, описанными в настоящем документе. CD123-специфические антитела.
В настоящем документе описываются выделенные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, специфические в отношении CD123. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты связывают человеческий CD123 SP1 (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты связывают человеческий CD123 SP2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления CD123специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты связывают человеческий CD123 SP1 и SP2. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты связывают человеческий CD123 SP1 и CD123 яванского макака (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления CD123-специфuческuе антитела и антигенсвязывающие фрагменты связываются с эпитопом, включающим в себя один или более остатков из (i) сегмента внеклеточного домена (ECD) CD123 SP2, содержащего остатки 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), и/или сегмента CD123 SP2
- 1 037647
ECD, содержащего остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)), или (ii) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: (229)). Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1х10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание с CD123 с CD123-специфическим антителом или антигенсвязывающим фрагментом, связывающимся с эпитопом, включающим в себя один или более остатков из (i) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), или (ii) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)). Антитела или фрагменты, связывающиеся, по меньшей мере, с одним остатком в этих эпитопах, также могут связываться с дополнительными остатками в CD123 ECD, включая один или более остатков из (i) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)), или ii) один или более остатков из сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). Такое CD123специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты, например, описанные в двух предыдущих абзацах, представляют собой нейтрализующие антитела. Нейтрализующее CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент включает те, которые способны ингибировать связывание IL-3 с CD123, что определяют посредством измерения снижения фосфорилирования STAT5 при стимуляции клеток TF-1 при помощи rhIL-3.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут предотвращать связывание IL-3 с рецептором CD123(IL3Ra)/CD131(IL3Rb). В других вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут предотвращать ассоциацию цепей α и β рецептора IL3R, (CD123(IL3Ra)/CD131(IL3Rb)). Антитела или антигенсвязывающие фрагменты включают те, которые способны ингибировать связывание IL3 и/или способны ингибировать гетеромеризацию CD123/CD133, что определяют посредством измерения снижения ассоциации между CD123 и CD131 и измерения утраты гетеромеризации при увеличении концентрации антител. В табл. 1 представлена сводная информация о примерах некоторых CD123-специфических антител, описанных в настоящем документе.
Таблица 1
Последовательности CDR mAb, полученных путем фагового пэннинга относительно человеческого CD123 (SEQ ID NO:)
ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ H-CDR1 НОМЕР H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
I3RB1 DYGMS VIRGGGSSKYYAHSGSFRFNELD KSSQSVLYSSNNK WASTRE QQYYSTP
(6) DSVKG Y NYLA (7) (8) (9) S LT (10) (11)
I3RB2 GYWMH AIRSDGSSKYYADGVIEDTFDY RASQSVSSYLA DASNRA QQRSNWP
(12) DSVKG (14) (15) (13) T LT (16) (17)
I3RB3 SYWMS GIKYDGGSKYYAKWMSYFDY KSSQSVLYSSNNK WASTRE QQYYSTP
(18) DSVKG (20) NYLA (19) (9) S LT (10) (11)
I3RB4 GYGMS AISGSGGSTYYAGNWYYGLGFDY RASQSVSSSYLA GASSRAQQYGSSP
(21) DSVKG (23) (24) (22) T LT (25) (26)
I3RB5 GYWMS GINYDGGSTYYADHFLAEFDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(27) DSVKG (29) (30) (28) S LT (31) (32)
I3RB6 SYAIS GIIPIFGTANYAGLFNWSNVALD RASQSIS S YLN AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG Y (30) (34) (35) S LT (31) (32)
I3RB7 SYAIS GI I PI FGTANYAGKRWLADAGDF RASQS IS S YLN AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG DY (30) (34) (36) S LT (31) (32)
I3RB8 SYAIS GIIPIFGTANYAHGFAWNDYSLL RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG DY (30) (34) (37) S LT (31) (32)
I3RB9 SYAIS GIIPIFGTANYAGARWFNPPENL RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG DY (30) (34) (38) S LT (31) (32)
I3RB10 SYGIS WI SAI FGNTNYAGGLLYYASYLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(39) QKFQG Y (30) (40) (41) S LT (31) (32)
I3RB11 SYGIS GIIPIFGTANYADLFSWRYSNFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(39) QKFQG Y (30) (34) (42) S LT (31) (32)
I3RB12 SYAIS GIIPIFGTANYAADRVWDYYLDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG (43) (30) (34) S LT (31) (32)
- 2 037647
ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ H-CDR1 НОМЕР H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
I3RB13 SYGIS (39) GII PI FGNTNYAQSGFYWRLDY RASQSVS SYLA QKFQG (45) (15) (44) DASNRA QQRSNWP T LT (16) (17)
I3RB14 SYGIS (39) WISAI FGTTNYAGGPLRYYNHFD RASQSISSYLN QKFQG Y (30) (46) (47) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB15 SYAIS (33) GIIPIFGTANYADLFSLRYSFLD RASQSISSYLN QKFQG Y (30) (34) (48) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB16 SYAIS (33) GIIPIFGTANYAGAVWGDQWFDY RASQSISSYLN QKFQG (49) (30) (34) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB17 SYAIS (33) GIIPIFGTANYAGALSLWYSFLD RASQSISSYLN QKFQG Y (30) (34) (50) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB18 SYWIS (51) IIDPSDSDTRYS GDGSTDLDY RASQSVSSSYLA PSFQG (53) (24) (52) GASSRAQQDYGFP T WT (25) (54)
I3RB19 NYAMS (55) GIRGNGSSTYYAGGPIGARFPDY RASQSIGDFLN DSVKG LDY (58) (56) (57) YASSLQ QQSYSTP S LT (59) (32)
I3RB20 SYAIS (33) GIIPIFGTANYADDQIWGSYHLD RASQSISSYLN QKFQG Y (30) (34) (60) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB21 SYAIS (33) GIIPIFGTANYAEGWWGQGKFDY RASQSVANFLA QKFQG (61) (62) (34) AASNRA QQYFHWP T YT (63) (64)
I3RB22 SYAIS (33) GIIPIFGTANYANLFYWADSVYL RASQSVNKWLA QKFQG DY (66) (34) (65) YASNRA QQGIDWP T RT (67) (68)
I3RB23 SYGIS (39) GIIPIFGTANYAEGSSWKNPRYV RASQSISSYLN QKFQG FDY (30) (34) (69) AASSLQ QQYFDFP S LT (31) (70)
I3RB24 SYAIS (33) GIIPIFGTANYAHTDAWGYRLDY RASQSISSYLN QKFQG (71) (30) (34) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB25 SYGIS (39) GI SAI FGNANYARFKWWESYFDY RASQSISSYLN QKFQG (73) (30) (72) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB26 SYGIS (39) GIIPIFGTANYANGFAWSVSGNL RASQSVDNWLA QKFQG DY (75) (34) (74) GASNRAQQSISAP T YT (76) (77)
I3RB27 SYAIS (33) GI I PI FGTANYAAGWWNLRYGLD RASQSVAKSLA QKFQG Y (79) (34) (78) AASNRA QQFIGWP T IT (63) (80)
I3RB28 SYAIS (33) GI I PI FGTANYAAPFTWDYSRLD RASQS IS S YLN QKFQG Y (30) (34) (81) AASSLQ QQSYSTP S LT (31) (32)
I3RB29 SYAIS (33) GIIPIFGTANYADSRIWSFSLDY RASQSIGEWLN QKFQG (82) (83) (34) AASSLQ QQYYHFP S LT (31) (84)
I3RB30 SYAIS (33) WIIPIFGTANYALVYSSDFDY RASQSVANWLA QKFQG (86) (87) YASNRA QQYDGWP T RT
ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ H-CDR1 НОМЕР H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
I3RB31 SYAIS (85) GISAYFGNANYASYFGDAYFDY RASQSVDKDLA (67) (88) GASNRA QQYDRAP
I3RB32 (33) SYGIS QKFQG (90) (91) (89) GII PI FGTANYAGAWWAYDTYLD RASQSIS S YLN T IT (76) (92) AASSLQ QQSYSTP
I3RB33 (39) SYGIS QKFQG Y (30) (34) (93) GIIPIFGTANYAGYWHWNYDYLD RASQSVNDWLA S LT (31) (32) GASNRA QQYKRAP
I3RB34 (39) SYAIS QKFQG Y (95) (34) (94) GIIPIFGTANYAGWSYYRLDY RASQSVDKWLA T YT (76) (96) YASNRAQQFDRAP
I3RB35 (33) SYAIS QKFQG (97) (98) (34) GIIPIFGTANYAHLFWDAGPLDY RASQSISSYLN T FT (67) (99) AASSLQ QQYFSPP
I3RB36 (33) SYGIS QKFQG (100) (30) (34) GIIPIFGTANYADLHVWAYSNFD RASQSISSYLN S YT (31) (101) AASSLQ QQSYSTP
I3RB37 (39) SYAIS QKFQG Y (30) (34) (102) GIIPIFGTANYADKTDFPSRLDY RASQSIATWLN S LT (31) (32) AASSLQ QQYITFP
I3RB38 (33) SYGIS QKFQG (103) (104) (34) GI I PI FGTANYADLMIWRFENFD RASQS IS S YLN S LT (31) (105) AASSLQ QQSYSTP
I3RB39 (39) SYAIS QKFQG Y (30) (34) (106) GIIPIFGTANYAEYGSLDY RASQSVADFLA S LT (31) (32) KASNRA QQYNGWP
I3RB40 (33) SYAIS QKFQG (107) (108) (34) GI I PI FGTANYAGQWWADTWFDY RASQSVAKWLA T WT (109) (110) GASNRA QQYHTAP
I3RB41 (33) SYAMS QKFQG (111) (112) (34) AISGSGGSTYYAVAYWEFFVYES RASQSVSSSYLA T WT (76) (113) GASSRAQQYGSSP
I3RB42 (114) SYAMS DSVKG LDY (24) (22) (115) AISGSGGSTYYAHDWAFWIVFLD RASQSVSSYLA T LT (25) (26) DASNRA QQRSNWP
I3RB43 (114) SYWMH DSVKG Y (15) (22) (116) AIRSDGSSKYYADGIVMDTFDY RASQSVSSYLA T LT (16) (17) DASNRA QQRSNWP
I3RB44 (117) SYWIS DSVKG (118) (15) (13) IIDPSDSDTRYSGDGSTDLDY RASQSISSYLN T LT (16) (17) AASSLQ QQSYSTP
I3RB47 (51) SYAIS PSFQG (53) (30) (52) GIIPIFGTANYADLFSWRYSNFD RASQSISSYLN S LT (31) (32) AASSLQ QQSYSTP
(33) QKFQG Y (30) (34) (42) S LT (31) (32)
В некоторых вариантах осуществления предлагается CD123-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления предлагается CD123специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, CD123-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует за связывание с CD123 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1.
Класс IgG у людей делится на четыре изотипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Они имеют более чем 95%ную гомологию в аминокислотной последовательности областей Fc, но обладают существенными отличиями в аминокислотном составе и структуре шарнирной области. Область Fc опосредует эффекторные функции, например антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC). При ADCC область Fc-антитела связывается с Fc-рецепторами (FcgR) на поверхности эффекторных иммунных клеток, например естественных киллеров и макрофагов, что приводит к фагоцитозу и лизису клеток-мишеней. При CDC антитела уничтожают клетку-мишень, запуская каскад реакций комплемента на клеточной поверхности. Антитела, описанные в настоящем документе, включают антитела с описанными особенностями вариабельных доменов в комбинации с любым из изотипов IgG, включая модифицированные версии, в которых последовательность Fc модифицирована с целью влияния на различные эффекторные функции.
При многих видах применения терапевтических антител опосредованные Fc эффекторные функции не являются частью механизма действия. Эти опосредованные Fc эффекторные функции могут быть вредными и потенциально создающими риск для безопасности посредством токсичности, связанной с побочным механизмом действия. Изменить эффекторную функцию можно путем конструирования Fcобластей для уменьшения их связывания с рецепторами FcgR или факторами системы комплемента. Связывание IgG с активирующими (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa и FcgRIIIb) и ингибирующими (FcgRIIb) рецепторами FcgR или с первым компонентом комплемента (C1q) зависит от остатков, размещенных в шарнирной области и в домене СН2. В IgG1, IgG2 и IgG4 были внедрены мутации для снижения или прекращения функций Fc. Антитела, описанные в настоящем документе, могут включать в себя эти моди
- 4 037647 фикации.
В одном варианте осуществления антитело содержит область Fc, обладающую одним или более из следующих свойств: (а) сниженной эффекторной функцией по сравнению с исходной Fc; (b) сниженной аффинностью к Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb и/или Fcg RIIIa; (с) сниженной аффинностью к FcgRI; (d) сниженной аффинностью к FcgRIIa; (е) сниженной аффинностью к FcgRIIb; (f) сниженной аффинностью к Fcg RIIIb или (g) сниженной аффинностью к FcgRIIIa.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой IgG или его производные, например изотипы IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgG1, антитело содержит замену(ы) L234A, L235A и/или K409R в области Fc. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgG4, антитело содержит замены S228P, L234A и L235A в области Fc. Антитела, описанные в настоящем документе, могут включать в себя эти модификации.
В некоторых вариантах осуществления описанные антитела способны связываться с CD 123 с константой диссоциации 5 нМ или менее, измеренной методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитела содержат области CDR антител, представленных в табл. 1 выше. Анализы по измерению аффинности методом SPR включают в себя анализы, выполненные с использованием прибора BIAcore 3000 или Biacore Т200, причем анализ проводят при комнатной температуре (например, при температуре, составляющей 25°С или близкой к ней), причем антитела, способные связываться с CD123, захватывают на сенсорном чипе BIAcore при помощи антитела к Fc (например, козьего антитела, специфического к человеческому IgG Fc производства Jackson ImmunoResearch laboratories продукт № 109-005-098) в количестве около 75 ОЕ, с последующим сбором данных об ассоциации и диссоциации при скорости протока 40 мкл/мин.
Наряду с описанными CD123-специфuческими антителами и антигенсвязывающими фрагментами также предлагаются полинуклеотидные последовательности, способные кодировать описанные антитела и антигенсвязывающие фрагменты. Также предлагаются векторы, содержащие описанные полинуклеотиды, а также клетки, экспрессирующие CD123-специфuческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в настоящем документе. Также описываются клетки, способные экспрессировать описанные векторы. Эти клетки могут представлять собой клетки млекопитающих (например, клетки 293F, клетки СНО), клетки насекомых (например, клетки Sf7), клетки дрожжей, клетки растений или бактериальные клетки (например, Е. coli). Описанные антитела также могут продуцироваться гибридомными клетками.
Способы применения CD123-специфическuх антител.
Также описываются способы применения CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов. Конкретные антитела, предназначенные для применения в способах, описанных в этом разделе, включают антитела с набором CDR, описанных для антител из табл. 1 выше, или антител, конкурирующих за связывание с CD123 с одним из антител из табл. 1. Например, эти антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут применяться при лечении рака путем ингибирования биологического эффекта IL-3 посредством предотвращения связывания IL-3 с IL-3R или, там где антитело конъюгируют с токсином, направляя токсин к раковому поражению, экспрессирующему CD123. Кроме того, данные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут применяться для обнаружения наличия CD123 в биологическом образце, например в крови или сыворотке; для количественного определения CD123 в биологическом образце, например в крови или сыворотке; для диагностики рака с экспрессией CD123; определения способа лечения субъекта, пораженного раком; или контроля прогрессирования рака с экспрессией CD123 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 может представлять собой гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). Описанные способы можно осуществлять до того, как субъект получит лечение по поводу рака с экспрессией CD123, например лечение мультиспецифическим антителом к CD123 и CD3. Кроме того, описанные способы можно осуществлять после того, как субъект получит лечение по поводу рака с экспрессией CD123, например лечение мультиспецифическим антителом к CD123 и CD3, описанным в настоящем документе.
Описанные способы обнаружения CD123 в биологическом образце включают воздействие на биологический образец одним или более из CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
Описанные способы диагностирования рака с экспрессией CD123 у субъекта также включают воздействие на биологический образец одним или более из CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе; однако способы также включают определение количества CD123, присутствующего в образце; сравнение количества CD123, присутствующего в образце, с известным стандартным или эталонным образцом; и определение того, подпадают ли уровни CD123 субъекта в пределы уровней CD123, связанных с раком.
Также в настоящем документе описаны способы контроля рака с экспрессией CD123 у субъекта.
- 5 037647
Описанные способы включают воздействие на биологический образец одним или более из CD123специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе; определение количества CD123, присутствующего в образце, и связавшегося с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; сравнение количества CD123, присутствующего в образце, либо с известным стандартным или эталонным образцом, либо с количеством CD123 в подобном образце, полученном от субъекта ранее; и определение того, являются ли уровни CD123 у субъекта показателями прогрессирования, регрессирования или стабильного течения заболевания на основании разницы количества CD123 в сравниваемых образцах.
Образцы, полученные от субъектов, представляют собой биологические образцы, например мочу, кровь, сыворотку, плазму, слюну, асцитную жидкость, циркулирующие клетки, циркулирующие опухолевые клетки, клетки, не связанные с тканями, ткани, хирургически иссеченную ткань опухоли, материалы биопсии, образцы, полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии или гистологические препараты.
Описанные CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно метить описанными способами или другими способами, известными специалистам в данной области. Например, антитела, описанные в настоящем документе, или их антигенсвязывающие фрагменты можно пометить радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой, эпитопной меткой, биотином, хромофорной меткой, ECL-меткой, ферментом, рутением, '[n-DOTA. 111In-диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTPA), пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и β-галактозидазой, или полигистидином, или подобными метками, известными специалистам.
Наборы CD123-специфических антител.
В настоящем документе описываются наборы, включающие описанные CD123-специфические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Описанные наборы можно использовать для осуществления способов применения CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, предложенных в настоящем документе, или других способов, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления описанные наборы могут включать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, и реагенты, предназначенные для применения в обнаружении наличия CD123 в биологическом образце. Соответственно, описанные наборы могут включать одно или более антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, сосуд для хранения антитела или фрагмента, когда они не используются, инструкции по применению антитела или фрагмента, антитело или фрагмент, иммобилизованные на твердой подложке, и/или меченные с возможностью обнаружения формы антитела или фрагмента, как описано в настоящем документе.
Мультиспецифические антитела к CD123 х CD3.
В настоящем документе описаны выделенные мультиспецифические антитела, связывающиеся с CD123 и CD3 (мультиспецифические антитела к CD123 х CD3) и их мультиспецифические антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления предлагается выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноспецифически связывающиеся с CD123 SP2 (IL3-Ra) и CD123 SP1 (IL3-Ra).
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфическое плечо мультиспецифического антитела связывается с человеческим CD123 и/или CD123 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфическое плечо мультиспецифических антител к CD123 х CD3 или антигенсвязывающих фрагментов связывается с фрагментом SP1 и/или SP2 человеческого CD123. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3 или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления предлагается выделенное биспецифическое антитело к CD123 (IL3-Roc) х CD3, содержащее: а) первую тяжелую цепь (HC1); b) вторую тяжелую цепь (НС2); с) первую легкую цепь (LC1) и d) вторую легкую цепь (LC2), причем HC1 и LC1 спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD123 (IL3-Ra), a HC2 и LC2 спариваются с образованием второго антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD3; или его биспецифический фрагмент, связывающийся с CD123 (IL3-Ra) х CD3. В другом варианте осуществления предлагается выделенная клетка, экспрессирующая антитело или биспецифический связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления CD123-связывающее плечо (или CD123-специфическое плечо) мультиспецифического антитела к CD123 х CD3 получено из антитела к CD123, описанного в настоящем документе (например, из антитела, имеющего последовательности CDR, перечисленные в табл. 1).
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфическое плечо мультиспецифических антител к CD123 х CD3 или антигенсвязывающих фрагментов представляет собой IgG или его производные. В некоторых вариантах осуществления описанные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3 способны связываться с CD123 с константой диссоциации 5 нМ или менее, измеренной методом поверхностного плазмонного резонанса или MSD-CAT.
В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо (или CD3-специфическое плечо)
- 6 037647 мультиспецифического антитела к CD123 х CD3 получено из мышиного моноклонального антитела SP34, мышиного изотипа IgG3/X (Pessano, S., et. al., 1995. EMBO J. 4, 337-344). В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо мультиспецифического антитела к CD123 х CD3 содержит один домен VH и один домен VL, выбранные из табл. 2. В табл. 2 представлена сводная информация по примерам некоторых тяжелых цепей и легких цепей CD3-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов.
Таблица 2 Тяжелые цепи и легкие цепи CD3-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов
VH VL
CD3H141 (SEQ ID NO: 184): IGHV3-72*01 с мышиными CDR+Gly49Ala EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAT YYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKT EDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS CD3L63 (SEQ ID NO:188): IGLV746*01 с мышиными CDR+F38V, A48G, Y51G, W59G QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVT T SNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGT PARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3H142 (SEQ ID NO:185): IGHV3- 23*01 с мышиными CDR+Ser49Ala EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAT YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS CD3L64 (SEQ ID NO: 189): IGLV1-51*O1 с мышиными CDR+Y38V, L48G, Y51G QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVT TSNYANWVQQLPGTAPKGLIGGTNKRAPGI PDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3H143 (SEQ ID NO: 186): IGHV3-23*01 с мышиными CDR+Ser49Ala, Ala99Val EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN TYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAT YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS CD3L66 (SEQ ID NO: 190) : IGLV7-43*01 с мышиными CDR+F38V, A48G, Y51G, W59G QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVT T SNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGT PARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3H144 (SEQ ID NO: 187): IGHV3-73*01 с мышиными CDR+Asn57Gly EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFN TYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYAT YYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKT EDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS
В некоторых вариантах осуществления CD3-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат тяжелую цепь из табл. 3 и легкую цепь из табл. 3. В табл. 3 представлена сводная информация о матрицах тяжелых и легких цепей CD3-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов.
- 7 037647
Таблица 3
Антитела, образованные путем объединения тяжелых и легких цепей
Тяжелая цепь Легкая цепь
CD3L63 CD3L64 CD3L66
CD3H141 CD3B143 CD3B144 CD3B146
CD3H142 CD3B147 CD3B148 CDB150
CD3H143 CD3B151 CD3B152 CD3B154
CD3H144 CD3B155 CD3B156 CD3B158
Класс IgG у людей делится на четыре изотипа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Они имеют более чем 95%ную гомологию в аминокислотной последовательности областей Fc, но обладают существенными отличиями в аминокислотном составе и структуре шарнирной области. Область Fc опосредует эффекторные функции, например антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC). При ADCC область Fc антитела связывается с Fc-рецепторами (FcgR) на поверхности эффекторных иммунных клеток, например естественных киллеров и макрофагов, что приводит к фагоцитозу и лизису клеток-мишеней. При CDC антитела уничтожают клетку-мишень, запуская каскад реакций комплемента на клеточной поверхности.
При многих видах применения терапевтических антител опосредованные Fc-эффекторные функции не являются частью механизма действия. Эти опосредованные Fc-эффекторные функции могут быть вредными и потенциально создающими риск для безопасности посредством токсичности, связанной с побочным механизмом действия. Изменить эффекторную функцию можно путем конструирования Fcобластей для уменьшения их связывания с рецепторами FcgR или факторами системы комплемента. Связывание IgG с активирующими (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa и FcgRIIIb) и ингибирующими (FcgRIIb) рецепторами FcgR или с первым компонентом комплемента (C1q) зависит от остатков, размещенных в шарнирной области и в домене СН2. В IgG1, IgG2 и IgG4 были внедрены мутации для снижения или прекращения функций Fc. Прекращающие функцию мутации могут включать, без ограничений, IgG1 AA (F234A, L235A), или IgG4 РАА (S228P, F234A, L235A), или IgG2 AA (V234A, G237A), или IgG1 FEA (L234F, L235E, D265A), или IgG1 FES (L234F/L235E/P331S).
В одном варианте осуществления антитело содержит область Fc, обладающую одним или более из следующих свойств: (а) сниженной эффекторной функцией по сравнению с исходной Fc; (b) сниженной аффинностью к FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIb, FcgRIIIb и/или FcgRIIIa; (с) сниженной аффинностью к FcgRI; (d) сниженной аффинностью к FcgRIIa; (е) сниженной аффинностью к FcgRIIb; (f) сниженной аффинностью к FcgRIIIb или (g) сниженной аффинностью к FcgRIIIa.
В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, представляет собой IgG или его производное. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, представляет собой IgG1 или его производное. В некоторых вариантах осуществления, например, область Fc CD3-специфического антитела IgGl, из которого получено CD3-связывающее плечо, содержит замены L234A, L235A и F405L в области Fc. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3специфическое плечо мультиспецифического антитела, представляет собой IgG4 или его производное. В некоторых вариантах осуществления, например, область Fc CD3-специфического антитела IgG4, из которого получено CD3-связывающее плечо, содержит замены S228P, L234A, L235A, F405L и R409K в области Fc. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, представляет собой IgG-AA Fc. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, представляет собой IgG-AA Fc-L234A, L235A и F405L (где L234A, L235A и F405L представляют собой мутации). В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, связывает CD3ε на первичных человеческих Т-клетках и/или первичных Т-клетках яванского макака. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, из которого получено CD3-специфическое плечо мультиспецифического антитела, активирует первичные человеческие Т-клетки CD4+ и/или первичные Т-клетки CD4+ яванского макака. В некоторых вариантах осуществления описанные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3 способны связываться с CD3 на Т-клетках человека или яванского макака с константой диссоциации менее 500, или
- 8 037647 менее 100, или менее 20 нМ, определенной по данным измерения конкурентного связывания с меченным антителом к CD3, обладающим известной аффинностью.
Наряду с описанными мультиспецифическими антителами к CD123 х CD3 также предлагаются полинуклеотидные последовательности, способные кодировать описанные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3. В некоторых вариантах осуществления предлагается выделенный синтетический полинуклеотид, кодирующий НС1, НС2, LC1 или LC2 биспецифического антитела к CD123 (IL3-Ra) х CD3 или биспецифического связывающего фрагмента. В настоящем документе также предлагаются векторы, содержащие описанные полинуклеотиды, а также клетки, экспрессирующие мультиспецифические антитела к CD123 х CD3. Также описываются клетки, способные экспрессировать описанные векторы. Эти клетки могут представлять собой клетки млекопитающих (например, клетки 293F, клетки СНО), клетки насекомых (например, клетки Sf7), клетки дрожжей, клетки растений или бактериальные клетки (например, Е. coli). Описанные антитела также могут продуцироваться гибридомными клетками. В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы получения биспецифического антитела к CD123 (IL3Ra) х CD3 или биспецифического связывающего фрагмента путем культивирования клеток.
Также в настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие мультиспецифические антитела к CD123 (IL3-Ra) х CD3 или антигенсвязывающие фрагменты и фармацевтически приемлемый носитель.
Способы применения мультиспецифических антител к CD123 х CD3.
Также описываются способы применения мультиспецифических антител к CD123 х CD3 или их мультиспецифических антигенсвязывающих фрагментов. Например, мультиспецифические антитела к CD123 х CD3 и их мультиспецифические антигенсвязывающие фрагменты можно использовать при лечении рака с экспрессией CD123 у нуждающегося в таком лечении субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 представляет собой гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN).
Описанные способы лечения рака с экспрессией CD123 у нуждающегося в таком лечении субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного мультиспецифического антитела к CD123 х CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, предпочтительно человеком. В предпочтительных вариантах осуществления предлагаются способы лечения субъекта, пораженного раком, путем введения терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3-Ra) х CD3 или биспецифического антигенсвязывающего фрагмента нуждающемуся в этом пациенту в течение времени, достаточного для лечения рака.
Дополнительно в настоящем документе предлагаются способы ингибирования роста или пролиферации раковых клеток путем введения терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3-Ra) х CD3 или биспецифического связывающего фрагмента для ингибирования роста или пролиферации раковых клеток.
Также в настоящем документе предлагаются способы перенаправления Т-клетки к экспрессирующей CD123 раковой клетке путем введения терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3-Ra) х CD3 или биспецифического связывающего фрагмента для перенаправления Т-клетки к раковому поражению.
Наборы с CD123 х CD3-специфическим к антителом.
В настоящем документе описываются наборы, содержащие описанные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3. Описанные наборы можно использовать для осуществления способов применения мультиспецифических антител к CD123 х CD3, предложенных в настоящем документе, или других способов, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления описанные наборы могут включать антитела, описанные в настоящем документе, и реагенты, предназначенные для лечения рака с экспрессией CD123. Соответственно, описанные наборы могут включать одно или более мультиспецифических антител или их мультиспецифических антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, сосуд для хранения антитела или фрагмента, когда они не используется и/или инструкции по применению антитела или фрагмента, антитело или фрагмент, иммобилизованные на твердой подложке, и/или меченные с возможностью обнаружения формы антитела или фрагмента, как описано в настоящем документе.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен вектор pDisplay, используемый для клонирования внеклеточных доменов CD123;
на фиг. 2 (фиг. 2А, 2В и 2С) - анализ связывания с клетками, демонстрирующий потенциал связывания положительных по связыванию компонентов фаговой панели с клетками, экспрессирующими CD123;
на фиг. 3 - конкурентный анализ ELISA между панелью антител и антителом 7G3 к CD123;
- 9 037647 на фиг. 4 (фиг. 4А и 4В) - клеточный функциональный анализ на CD123 по STAT5. На фиг. 4С представлен дозозависимый клеточный функциональный анализ на CD123 по STAT5 для антител I3RB18 и 7G3;
на фиг. 5 (фиг. 5А, 5В и 5С) - связывание моноклональных антител I3RB2, I3RB18 и 7G3 с эндогенным CD123, экспрессированным на клеточной линии AML, OCI-AML5;
на фиг. 6 (фиг. 6А и 6В) - анализ конкурентного связывания меченными mAb I3RB2 и I3RB18 и другими антителами к CD123, выявленными при скрининге;
на фиг. 7 (фиг. 7А (SEQ ID NO: 232) и 7В (SEQ ID NO: 232)) - результаты исследований по картированию эпитопа методом водород/дейтериевой обменной масс-спектроскопии (HDX-MS), демонстрирующие различие в уровнях дейтерия для CD123 SP2 в присутствии и в отсутствие Fab;
на фиг. 8 - остатки антител, участвующие в связывании CD123 sp2, по данным наблюдения структуры сокристалла scFv, полученного из I3RB18, и CD123 SP2 ECD. Нумерация: CD123 sp2 в овалах; CDR из I3RB18 в квадратах;
на фиг. 9А - структура сокристаллов CD123 sp2:I3RB18 (меченный В18), а на фиг. 9В - структура сокристаллов CD123 sp1:CSL362 Fab, гуманизированной формы mAb 7G3, код доступа 4JZJ в PDB;
на фиг. 10 - аминокислотная последовательность SP34 с последовательной нумерацией. CDR в определении AbM (K.R. Abhinandan and А.С. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839) подчеркнуты. Ser230 представляет собой последний остаток НС в расщепленном папаином Fab. Остатки 231-455 получены из IGHG3_MOUSE (мышиный IgG3, изоформа 2);
на фиг. 11 - вариабельный домен SP34 с показанными ключевыми остатками в зоне контакта VL/VH. Остатки 38, 48 и 51 в VL (меченые) контактируют с CDR-H3;
на фиг. 12 - адаптированные для человеческого каркаса (HFA) варианты VH (SEQ ID NO: 5 и 184187, соответственно, в порядке появления) и VL (SEQ ID NO: 4 и 188-190, соответственно, в порядке появления). Нумерация является последовательной; CDR в определении AbM подчеркнуты; остатки, отличающиеся от SP34, выделены жирным шрифтом; обратные мутации в вариантах HFA выделены жирным шрифтом и подчеркнуты;
на фиг. 13 - связывание HFA-вариантов SP34 с первичными человеческими Т-клетками;
на фиг. 14 - связывание HFA-вариантов SP34 с первичными Т-клетками яванского макака;
на фиг. 15 показано, что HFA-варианты SP34 активируют первичные человеческие Т-клетки in vitro. Отрицательные контроли показаны белым, а положительные контроли показаны черным;
на фиг. 16 показано, что HFA-варианты SP34 активируют первичные Т-клетки яванского макака in vitro. Отрицательные контроли показаны белым, а положительные контроли показаны черным;
на фиг. 17 - корреляция связывания и активации HFA-вариантами SP34. Значения среднего связывания и средней интенсивности флуоресценции (СИФ) CD69 представлены в зависимости друг от друга для человека (фиг. 17А) и яванского макака (фиг. 17В);
на фиг. 18 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6587 (фиг. 18А) и донора М7020 (фиг. 18В) с использованием клеточной линии MV4-11;
на фиг. 19 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6587 (фиг. 19А) и донора М7020 (фиг. 19В) с использованием клеточной линии OCI-M2;
на фиг. 20 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6587 (фиг. 20А) и донора М7020 (фиг. 20В) с использованием клеточной линии OCI-AML;
на фиг. 21 - эффективность I3RB186 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1;
на фиг. 22 - эффективность I3RB186 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 на 30-й день для клеток периферической крови CD45+ (фиг. 22А) и CD8+/CD4+ (фиг. 22В) по данным цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS);
на фиг. 23 - эффективность I3RB186 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 на 53-й день после имплантации опухоли по данным FACS-анализа периферической крови для клеток CD45+ (фиг. 23А) и CD8+/CD4+ (фиг. 23В);
на фиг. 24 - эффективность I3RB186 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 25 - эффективность биспецифического антитела к CD123 х CD3 I3RB186 в сравнении с контрольными биспецифическими антителами I3RB191 и I3RB192 с пустым плечом в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1;
на фиг. 26 - эффективность биспецифических антител к CD123 х CD3 I3RB186 в сравнении с контрольными биспецифическими антителами I3RB191 и I3RB192 с пустым плечом в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по данным FACS-анализа на 36-й день после имплантации опухоли для клеток CD45+ (фиг. 26А) и CD8+/CD4+ (фиг. 26В);
на фиг. 27 - эффективность биспецифических антител к CD123 х CD3 I3RB186 в сравнении с контрольными биспецифическими антителами I3RB191 и I3RB192 с пустым плечом в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по данным FACS-анализа на 63-й день после имплантации опухоли для клеток CD45+ (фиг. 27А) и CD8+/CD4+ (фиг. 27В);
- 10 037647 на фиг. 28 - эффективность биспецифического антитела к CD123 х CD3 I3RB186 в сравнении с контрольными биспецифическими антителами I3RB191 и I3RB192 с пустым плечом в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 29 - кривые насыщения связывания, использованные для определения аффинности связывания с клетками (Kd) SP34-2 на первичных человеческих Т-клетках (фиг. 29А) и Т-клетках яванского макака (фиг. 29В);
на фиг. 30 - эксперименты по конкурентному связыванию на первичных человеческих Т-клетках (фиг. 30А) и Т-клетках яванского макака (фиг. 30В) с применением меченого антитела Alexa FluorR 488B146 и увеличивающихся концентраций немеченных антител к CD123 х CD3;
на фиг. 31 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6948 (фиг. 31А) и донора М6521 (фиг. 31В) с использованием клеточной линии OCI-AML;
на фиг. 32 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6948 (фиг. 32А) и донора М6521 (фиг. 32В) с использованием клеточной линии KG-1;
на фиг. 33 - анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности для донора М6948 (фиг. 33А) и донора М6521 (фиг. 33В) с использованием клеточной линии JIM3;
на фиг. 34А, В, С и D - влияние антител к CD123 х CD3 на индуцированную IL-3 гетеромеризацию CD123 и CD131 для I3RB218 (фиг. 34А), 8747 (фиг. 34В), I3RB217 (фиг. 34С) и 7959 (фиг. 34D);
на фиг. 35 - эффективность антител 7959 и 9958 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам сравнения среднего объема опухолей;
на фиг. 36 - эффективность антитела 3978 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам сравнения среднего объема опухолей;
на фиг. 37 - эффективность антитела 8747 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам сравнения среднего объема опухолей;
на фиг. 38 - эффективность антитела 8876 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам сравнения среднего объема опухолей;
на фиг. 39 - эффективность антител 7959 и 9958 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 40 - эффективность антитела 3978 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 41 - эффективность антитела 8747 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 42 - эффективность антитела 8876 к CD123 х CD3 в модели ксенотрансплантации опухоли KG-1 по результатам изменения массы тела в период лечения;
на фиг. 43 - фармакокинетика биспецифических антител 3978, 7955, 7959, 9958 к CD123 х CD3 у мышей in-vivo.
Подробное описание иллюстративных вариантов осуществления
Определения.
В настоящем описании и пунктах формулы изобретения используются различные термины, относящиеся к аспектам описания. Такие термины должны иметь смысл, который они обычно имеют в этой области, если не указано иное. Другие конкретно определенные термины следует толковать согласно приведенным в настоящем документе определениям.
В настоящем описании и в прилагаемых пунктах формулы изобретения формы единственного числа включают и множественные обозначения, если только содержание текста не определяет иного. Так, например, обозначение клетка включает в себя комбинацию двух или более клеток и т.п.
Используемый в настоящем документе термин около при указании измеримой величины, такой как количество, продолжительность во времени и т.п., считается охватывающим отклонения до ±10% от указанного значения, поскольку такие отклонения приемлемы для реализации раскрываемых способов. Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, характеристик, таких как молекулярная масса, условий реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином около. Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, указанные в последующей спецификации и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут колебаться в зависимости от нужных свойств, которые требуется получить посредством настоящего изобретения. В самом крайнем случае, но не в качестве попытки ограничить применение теории эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр должен, по меньшей мере, рассматриваться с учетом числа представленных значащих цифр и с использованием стандартных методик округления.
Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, устанавливающие широкий объем объекта изобретения, являются приблизительными, числовые значения, указанные в конкретных примерах, представлены настолько точно, насколько это возможно. Любое числовое значение, тем не менее, по своей природе содержит определенные ошибки, неизбежно вытекающие из стандартного отклонения, обнаруживаемого при соответствующих тестовых измерениях.
- 11 037647
Термин выделенный означает, что биологический компонент (например, нуклеиновая кислота, пептид или белок) был, по существу, отделен, получен отдельно от или очищен от других биологических компонентов организма, в котором компонент встречается в природе, т.е. от других хромосомных и внехромосомных ДНК, РНК и белков. Таким образом, нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, которые были выделены, включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными способами очистки. Выделенные нуклеиновые кислоты, пептиды и белки могут быть частью композиции и все еще считаться выделенными, если такая композиция не является частью исходной среды нуклеиновой кислоты, пептида или белка. Термин также включает нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты. При использовании в настоящем документе термин выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент, по существу, не содержащий других антител или антигенсвязывающих фрагментов, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, специфически связывающееся с CD123, по существу, не содержит антител, специфически связывающихся с антигенами, отличными от CD123). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом CD123, может иметь перекрестную реактивность в отношении других родственных антигенов, например, от других видов (таких как видовые гомологи CD123).
Термин полинуклеотид, который является синонимом термину молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотид или нуклеиновая кислота, относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Полинуклеотиды включают, без ограничений, одно- и двухцепочечные ДНК, ДНК, являющиеся смесью одно- и двухцепочечных областей, одно- и двухцепочечные РНК, РНК, являющиеся смесью одно- и двухцепочечных областей, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более типично, двухцепочечными, или представлять собой смесь одно- и двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотидом называют трехцепочечные области, содержащие РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Термин полинуклеотид также относится к ДНК или РНК, содержащим одно или более модифицированных оснований, и к ДНК или РНК с основными цепями, модифицированными для стабильности или для других целей. Модифицированные основания включают в себя, например, тритилированные основания и нетипичные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК могут быть внесены различные модификации; следовательно, термин полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, обычно встречающихся в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. Термин полинуклеотид также охватывает относительно короткие цепи нуклеиновых кислот, часто называемые олигонуклеотидами.
Значение термина по существу такой же может отличаться в зависимости от контекста, в котором он используется. Вследствие того, что в природной последовательности легких и тяжелых цепей и кодирующих их генов возможны вариации, можно ожидать встретить определенный уровень вариаций в пределах аминокислотных последовательностей или генов, кодирующих антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, которые не влияют или мало влияют на их уникальные свойства связывания (например, специфичность и аффинность). Такое ожидание отчасти обусловлено вырожденностью генетического кода, а также эволюционной успешностью консервативных вариантов аминокислотных последовательностей, которые не меняют ощутимо природу кодируемого белка. Соответственно, в контексте нуклеотидных последовательностей по существу такой же означает по меньшей мере 65%-ную идентичность между двумя или более последовательностями. Предпочтительно термин относится по меньшей мере к 70%-ной идентичности между двумя или более последовательностями, более предпочтительно по меньшей мере 75%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 85%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 91%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 92%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 93%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 94%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 96%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 97%-ной идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ной идентичности и более предпочтительно по меньшей мере 99%-ной или более идентичности. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии=кол-во идентичных положений/общее кол-во положений х 100), принимая во внимание количество гэпов и длину каждого гэпа, вводимого для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентную идентичность между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями можно определить, например, с помощью алгоритма Е. Meyers и W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), используя весовую таблицу остатков РАМ120 со штрафом за длину гэпа 12 и штрафом за гэп 4. Кроме этого, процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм Needleman и Wunsch, J.
- 12 037647
Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
Степень вариации, возможная в пределах аминокислотной последовательности белка без существенного влияния на функцию белка, намного ниже, чем в нуклеотидной последовательности, поскольку принципы вырожденности не применимы к аминокислотным последовательностям. Соответственно, в контексте антитела или антигенсвязывающего фрагмента по существу такой же означает антитела или антигенсвязывающие фрагменты, имеющие 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%-ную идентичность описанным антителам или антигенсвязывающим фрагментам. Другие варианты осуществления включают в себя CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые имеют каркас, основу или другие не связывающиеся области, которые не обладают существенной идентичностью с антителами и антигенсвязывающими фрагментами, описанными в настоящем документе, но обязательно включают в себя одну или более CDR или других последовательностей, необходимых для осуществления связывания, которые обладают 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%-ной идентичностью с последовательностями, описанными в настоящем документе. Вектор представляет собой репликон, например плазмиду, фаг, космиду или вирус, в который можно функционально ввести сегмент другой нуклеиновой кислоты так, чтобы обеспечить репликацию или экспрессию этого сегмента.
Под термином клон понимается популяция клеток, полученная из одной клетки или общего предшественника путем митоза. Под термином клеточная линия понимается клон первичной клетки, способный к стабильному росту in vitro в течение многих поколений. В некоторых примерах, представленных в настоящем документе, клетки трансформируют путем трансфицирования в них ДНК.
Термины экспрессирует и продуцирует используются в настоящем документе как синонимы и обозначают биосинтез продукта гена. Эти термины охватывают транскрипцию гена в РНК. Эти термины также охватывают трансляцию РНК в один или более полипептидов и дополнительно охватывают все естественно возникающие посттранскрипционные и посттрансляционные модификации. Экспрессия или продукция антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может происходить внутри цитоплазмы клетки или во внеклеточной среде, например в ростовой среде для культивирования клеток.
Термин лечение относится к любому успеху или признаку успеха в ослаблении или облегчении симптомов травмы, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как ослабление боли, ремиссия, ослабление симптомов или перевод состояния в легче переносимую пациентом форму, замедление скорости развития дегенеративных изменений или угасания функции, перевод конечной точки дегенеративных изменений в менее угнетающую пациента форму, улучшение общего физического или умственного состояния пациента или продление выживаемости. Лечение можно оценивать по объективным или субъективным параметрам, включая результаты врачебного осмотра, неврологического осмотра или психиатрической экспертизы.
Термин эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела к CD123 х CD3 может меняться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса тела пациента и от способности антитела вызывать желаемый ответ у пациента. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое количество, в котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.
Антителом называются все изотипы иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD и IgY), включая различные мономерные, полимерные и химерные формы, если иное не указано особо. В частности, термин антитело охватывает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb) и антителоподобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела.
Антигенсвязывающие фрагменты представляют собой любую белковую структуру, способную проявлять аффинность связывания с конкретным антигеном. Антигенсвязывающие фрагменты включают в себя фрагменты, полученные любым известным методом, например ферментативным расщеплением, пептидным синтезом и рекомбинантными методами. Некоторые антигенсвязывающие фрагменты состоят из частей интактных антител, сохраняющих антигенсвязывающую специфичность исходной молекулы антитела. Например, антигенсвязывающие фрагменты могут содержать по меньшей мере одну вариабельную область (вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи) или одну или более областей CDR антитела с известным связыванием с конкретным антигеном. Примеры приемлемых антигенсвязывающих фрагментов включают, без ограничений, диатела и одноцепочечные молекулы, а также молекулы Fab, F(ab')2, Fc, Fabc и Fv, одноцепочечные (Sc) антитела, отдельные легкие цепи антител, отдельные тяжелые цепи антител, химерные слияния цепей антител или CDR с другими белками, белковые каркасы, мономеры или димеры тяжелых цепей, мономеры или димеры легких цепей, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1, или одновалентное антитело, описанное в WO 2007059782, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области, Fd-фрагмент, состоящий, по существу, из доменов V.sub.H и С.sub.H1; Fv-фрагмент, состоящий, по существу, из доменов VL и VH одного плеча антитела, dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который состоит, по существу, из домена VH и также называется доменным антителом (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov.;
- 13 037647 (11):484-90); антитело верблюжьего типа (камелид) или нанотела (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24); выделенные области, определяющие комплементарность (CDR) и т.п. Для получения антигенсвязывающих фрагментов можно использовать все изотипы антител. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя неантительные белковые каркасы, в которые могут успешно встраиваться полипептидные сегменты в ориентации, придающей аффинность к данному интересующему антигену, например белковые каркасы. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинантным способом или в результате ферментативного или химического расщепления интактных антител. Фраза антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может использоваться для обозначения того, что данный антигенсвязывающий фрагмент включает в себя один или более аминокислотных сегментов антитела, указанного во фразе. При использовании в настоящем документе в контексте двух или более антител или антигенсвязывающих фрагментов термин конкурирует с или перекрестно конкурирует с означает, что два или более антител или антигенсвязывающих фрагментов конкурируют за связывание с CD123, например конкурируют за связывание с CD123 в анализе, описанном в примере 9. Для некоторых пар антител или антигенсвязывающих фрагментов конкуренция или блокировка в анализе, приведенном в примерах, наблюдается только в том случае, когда одно антитело нанесено в качестве покрытия на планшет, а другое используется для конкуренции, и не наоборот. Если иное не определяется или не отвергается контекстом, термины конкурирует с или перекрестно конкурирует с в настоящем документе также должны охватывать такие пары антител или антигенсвязывающих фрагментов.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы обычно состоят из поверхностно расположенных групп молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, а также обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не теряется связывание со вторыми. Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, и другие аминокислотные остатки, непосредственно не участвующие в связывании, например аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются или закрываются пептидом, специфически связывающим антиген (иными словами, аминокислотный остаток находится в пределах зоны, закрытой пептидом, специфически связывающим антиген).
Термины специфическое связывание, или иммуноспецифическое связывание или их производные при использовании применительно к антителам и фрагментам антител представляют связывание посредством доменов, кодируемых генами или фрагментами генов иммуноглобулинов, с одним или более эпитопами интересующего белка и предпочтительно отсутствие связывания с другими молекулами в образце, содержащем смешанную популяцию молекул. Как правило, антитело связывается с родственным антигеном с Kd менее чем около 1 х 10-8 М, по данным метода поверхностного плазмонного резонанса или анализа связывания с клетками. Такие фразы, как [антиген]специфическое антитело (например, CD123-специфическое антитело) означают, что упомянутое антитело специфически связывается с упомянутым антигеном.
Термин kd (c-1) при использовании в настоящем документе означает константу скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Этот показатель также называется koff.
Термин ka (M-1 c-1) при использовании в настоящем документе означает константу скорости ассоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Термин KD (M) при использовании в настоящем документе означает константу равновесия при диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Термин KA (M-1) при использовании в настоящем документе означает константу равновесия при ассоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген, и ее получают делением ka на kd.
Термин субъект означает человека и не относящихся к человеку животных, включая всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, например нечеловекообразных приматов, мышей, кроликов, овец, собак, кошек, лошадей, коров, цыплят, амфибий и рептилий. Во многих вариантах осуществления описанных способов субъект представляет собой человека.
Термин образец при использовании в настоящем документе означает набор сходных текучих сред, клеток или тканей (например, хирургически иссеченную ткань опухоли, материал биопсии, включая полученный с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), выделенных у субъекта, а также текучие среды, клетки или ткани, находящиеся внутри тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биологическую текучую среду. Биологические текучие среды, как правило, представляют собой жидкости при физиологических температурах и могут включать в себя текучие среды природного происхождения, находящиеся внутри субъекта или биологического источника, отобранные, экспрессированные или иным образом извлеченные из него. Некоторые биологические текучие среды происходят из конкретных тканей, органов или локализованных областей, а некоторые другие биологические текучие среды могут иметь более глобальное или системное расположение в организме субъекта или биологическом источнике. Примеры биологических текучих сред включают кровь, сыворотку и серозные текучие среды, плазму, лимфу, мочу, слюну, содержимое кисты, слезы, фекалии, мокроту, секрет слизистой секреторных тканей и органов, вагинальные секреты, асцитные текучие сре
- 14 037647 ды, например, связанные с несолидными опухолями, текучие среды плевральной, перикардиальной, перитонеальной, абдоминальной и других полостей тела, текучие среды, полученные смывом из бронхов и т.п. Биологические текучие среды также включают в себя жидкие растворы, контактировавшие с субъектом или биологическим источником, например среду для культивирования клеток или органов, в том числе среду, кондиционированную клетками или органами, промывные текучие среды и т.п. Термин образец при использовании в настоящем документе охватывает материалы, извлеченные из организма субъекта, или материалы, находящиеся в организме субъекта.
Известный стандарт может представлять собой раствор, включающий в себя известное количество или концентрацию CD123, где раствор может представлять собой раствор природного происхождения, например образец от пациента, имеющего по известным данным раннюю, среднюю или позднюю стадию рака, прогрессирующий или стабильный рак, или раствор может представлять собой синтетический раствор, например водный буфер, содержащий известное количество разведенного в нем CD123. Известные стандарты, описанные в настоящем документе, могут включать в себя CD123, выделенный из организма субъекта, а также рекомбинантный или очищенный белок CD123 или значение концентрации CD123, связанной с состоянием заболевания.
Термин CD3 относится к человеческому белковому комплексу CD3, состоящему из множества субъединиц. Состоящий из множества субъединиц белковый комплекс CD3 состоит из 6 отдельных полипептидных цепей. Он включает цепь CD3y (SwissProt P09693), цепь CD35 (SwissProt P04234), две цепи CD3ε (SwissProt P07766) и один гомодимер цепи CD3ς (SwissProt 20963), причем комплекс связан с цепями α и β Т-клеточного рецептора. Термин CD3 при отсутствии особых указаний включает в себя любой вариант, изоформу и видовой гомолог CD3, в природе экспрессируемый клетками (включая Тклетки), или который может экспрессироваться на клетках, трансфицированных генами или кДНК, кодирующей эти полипептиды.
При использовании в настоящем документе взаимозаменяемые термины α-субъединица рецептора IL-3, IL3Ra, CD123, цепь IL3Ra и субъединица IL3Ra означают антигенную детерминанту, определяемую на лейкозных клетках-предшественниках, которая иммунологически связывает интерлейкин-3 (IL3). В конкретном варианте осуществления CD123 представляет собой CD123 человека. В одном конкретном варианте осуществления CD123 представляет собой CD123 яванского макака. В конкретном варианте осуществления CD123 представляет собой CD123 SP1. В конкретном варианте осуществления CD123 представляет собой CD123 SP2. Если не указано иное, термин CD123 включает в себя любой вариант, изоформу и видовой гомолог CD 123.
Антитело к CD123 х CD3 представляет собой мультиспецифическое антитело, необязательно, биспецифическое антитело, которое содержит две разных антигенсвязывающих области, одна из которых специфически связывается с антигеном CD123, а другая специфически связывается с CD3.
Мультиспецифическое антитело может представлять собой биспецифическое антитело, диатело или сходную молекулу (см., например, публикацию PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993), в которой приведено описание диател). Биспецифические молекулы, диатела и т.п., предложенные в настоящем документе, могут связываться с любой приемлемой мишенью в дополнение к части CD123. Термин биспецифическое антитело следует понимать как антитело, имеющее две разные антигенсвязывающие области, определяемые разными последовательностями антитела. Это можно понимать как связывание с разными мишенями, но также сюда входит связывание с разными эпитопами на одной мишени.
Эталонный образец представляет собой образец, который можно сравнить с другим образцом, например исследуемым образцом, чтобы сравниваемый образец можно было охарактеризовать. Эталонный образец будет иметь какое-либо охарактеризованное свойство, которое служит основой для сравнения с исследуемым образцом. Например, эталонный образец можно использовать как опорное значение концентраций CD123, которые служат показателем наличия рака у субъекта. Эталонный образец не обязательно следует анализировать параллельно с исследуемым образцом, следовательно, в некоторых случаях эталонный образец может представлять собой ранее определенное числовое значение или диапазон, характеризующий данное состояние, например уровни CD123, которые служат показателями наличия рака у субъекта. Термин также включает в себя образцы, используемые для сравнительных целей, и которые по имеющимся данным связаны с физиологическим состоянием или состоянием заболевания, например, раком с экспрессией CD123, но имеющие неизвестное количество CD123.
Термин прогрессирование при использовании в контексте прогрессирования рака с экспрессией CD123 включает в себя изменение состояния рака от менее тяжелого к более тяжелому. Прогрессирование может включать в себя увеличение количества или тяжести опухолей, степени метастазирования, скорости, с которой рак растет или распространяется и т.п. Например, прогрессирование рака толстой кишки включает в себя прогрессирование такого рака из менее тяжелого в более тяжелое состояние, например прогрессирование от стадии I до стадии II, от стадии II до стадии III и т.п.
Термин регрессирование при использовании в контексте регрессирования рака с экспрессией CD123 включает в себя изменение состояния рака от более тяжелого к менее тяжелому. Регрессирование может включать в себя снижение количества или тяжести опухолей, степени метастазирования, скоро- 15 037647 сти, с которой рак растет или распространяется, и т.п. Например, регрессирование рака толстой кишки включает в себя регрессирование такого рака из более тяжелого в менее тяжелое состояние, например прогрессирование от стадии III до стадии II, от стадии II до стадии I и т.п.
Термин стабильный при использовании в контексте стабильного рака с экспрессией CD123 описывает состояние заболевания, которое не изменяется или не изменилось существенно в течение клинически значимого периода времени, чтобы его можно было считать прогрессирующим или регрессирующим раком.
Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, не ограничиваются конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, конечно, могут варьироваться.
CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты.
В настоящем документе описываются выделенные моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся с CD123. Общая структура молекулы антитела содержит антигенсвязывающий домен, включающий в себя тяжелую и легкую цепи, и Fc-домен, который выполняет различные функции, включая фиксацию комплемента и связывание с рецепторами антител.
К описанным CD123-специфическим антителам или антигенсвязывающим фрагментам относятся все изотипы, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и синтетические мультимеры четырехцепочечной структуры иммуноглобулинов. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты также включают изотип IgY, обычно обнаруживаемый в сыворотке курицы или индейки и в желтке яйца курицы или индейки.
CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно получать из любого вида, используя рекомбинантные методы. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут представлять собой их мышиные, крысиные, козьи, свиные, коровьи, куриные, кроличьи, верблюжьи, ослиные, человеческие или химерные варианты. В целях введения человеку антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно подвергнуть генетическому или структурному изменению, чтобы они были менее антигенны при введении пациенту-человеку.
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты являются химерными. При использовании в настоящем документе термин химерный означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, некоторую часть по меньшей мере одного вариабельного домена, полученного из аминокислотной последовательности антитела не относящегося к человеку млекопитающего, грызуна или рептилии, в то время как оставшиеся части антитела или его антигенсвязывающего фрагмента имеют человеческое происхождение.
В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой гуманизированные антитела. Гуманизированные антитела могут представлять собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (например, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина не относящегося к человеку животного. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками из области, определяющей комплементарность, не относящегося к человеку вида (антитело-донор), например мыши, крысы или кролика, обладающей желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все по меньшей мере из одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все CDR-области соответствуют таковым в иммуноглобулине от не относящегося к человеку животного, а все или, по существу, все каркасные области соответствуют таковым последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут иметь различные формы, но должны включать в себя одну или более CDR антитела, как показано в табл. 1.
В настоящем документе описываются выделенные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, иммуноспецифически связывающиеся с CD123. В некоторых вариантах осуществления CD123специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой человеческий IgG или его производные. Хотя CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера в настоящем документе, являются человеческими, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, приведенные в качестве примера, можно подвергнуть химеризации.
В некоторых вариантах осуществления предлагается CD123-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления предлагается CD123специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1, и легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 любого одного из антител, описанных в табл. 1.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 006, CDR2 тяжелой цепи, содержа- 16 037647 щую SEQ ID NO: 007, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 008. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 006, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 007, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 008, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 009, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 010, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 011. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 119, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 119, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 164, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 012, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 013, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 014. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 012, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 013, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 014, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 015, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 016, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 017. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 120, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 120, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 165, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 018, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 019, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 020. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 018, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 019, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 020, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 009, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 010, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 011. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 121. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 121, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 164, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 021, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 023. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 021, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 023, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 024, CDR2
- 17 037647 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 025, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 026. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 122, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 122, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 166, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 027, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 028, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 029. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 027, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 028, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 029, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 123, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 123, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 035. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 035, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 124, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 124, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанные в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 036. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 036, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М
- 18 037647 или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1х10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 125, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 125, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 037. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 037, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 126, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 126, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 038. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 038, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 127, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 127, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 040, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 041. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 040, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 041, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 128, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариа- 19 037647 бельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 128, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 042. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 042, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 129, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 129, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 043. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 043, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 130, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 130, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 044, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 045. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 044, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 045, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 015, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 016, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 017. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 131, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 131, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 165, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представля- 20 037647 ет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 046, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 047. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 046, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 047, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 132, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 132, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфuческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 048. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 048, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 133, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 133, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфuческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 049. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 049, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 134, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 134, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфuческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 050. В некоторых вариантах
- 21 037647 осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 050, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфичесkие антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 135, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 135, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 051, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 052, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 053. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 051, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 052, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 053, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 024, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 025, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 054. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 136, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 136, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 168, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 055, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 056, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 057. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 055, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 056, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 057, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 058, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 059, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 137, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 137, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 169, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 060. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 060, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это
- 22 037647
CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 χ 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 χ 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 χ 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 138, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 138, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 061. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 061, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 062, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 063, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 064. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 χ 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 χ 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 χ 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 139, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 139, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 170, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 065. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 065, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 066, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 067, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 068. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 χ 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 χ 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 χ 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 140, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 140, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 171, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 069. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 069, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 070. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 χ 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 χ 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 χ 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осу
- 23 037647 ществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 141, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 141, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 172, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 071. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 071, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 109 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу такой же, как SEQ ID NO: 142, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 142, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 072, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 073. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 072, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 073, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 143, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 143, или идентичный, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 167, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 074. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 074, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 075, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 076, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 077. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 144, или идентичный. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 144, или идентичный, и вариа- 24 037647 бельный домен легкой цепи, по существу, такой же, как SEQ ID NO: 173, или идентичный. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD 123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 078. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 078, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 079, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 063, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 080. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 145. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 145, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 174. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 081. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 081, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 146. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 146, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 082. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 082, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 083, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 084. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 147. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 147, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 175. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
- 25 037647
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 085, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 086. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 085, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 086, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 087, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 067, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 088. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 148. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 148, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 176. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 089, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 090. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 089, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 090, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 091, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 076, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 092. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 149. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 149, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 177. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 093. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 093, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 150. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 150, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 094. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тя
- 26 037647 желой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 094, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 0 95, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 076, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 096. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 151. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 151, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 178. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 097. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 097, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 098, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 067, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 099. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 152. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 152, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 179. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 100, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 101. Это CD123специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1х10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х 10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 153. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 153, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 180. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 102, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие кар
- 27 037647 касные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 154. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 154, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 103, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 104, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 105. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 155. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 155, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 181. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 039, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 106, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 156. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 156, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 107. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 107, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 108, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 109, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 110. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный
- 28 037647 домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 157. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 157, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 182. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 111. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 111, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 112, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 076, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 113. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1х10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 158. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 158, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 183. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 114, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 115. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 114, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 115, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 024, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 025, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 026. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 159. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 159, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 166. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 114, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 116. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 114, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 022, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 116, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 015, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 016, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 017. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 160. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 160, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 165. Вариабельный домен тяжелой
- 29 037647 цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 117, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 013, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 118. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 117, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 013, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 118, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 015, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 016, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 017. Это CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфuческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 161. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 161, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 165. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 051, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 052, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 053. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 051, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 052, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 053, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 162. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 162, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 042. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 033, CDR2 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 034, CDR3 тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 042, CDR1 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 030, CDR2 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 031, и CDR3 легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 032. Это CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может содержать человеческие каркасные последовательности. Такое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может связываться с CD123 с аффинностью 5х10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или 1 х 10-9 М или менее. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 163. В некоторых вариантах осуществления CD123-специфические антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 163, и вариабельный домен легкой цепи, по существу, такой же или идентичный SEQ ID NO: 167. Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антител, описанных в настоящем абзаце, являются приемлемыми для введения в биспецифические конструкты, в которых одно плечо представляет собой плечо антитела к CD123.
Антитела к CD123 и антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в изобретении, также вклю- 30 037647 чают в себя антитела, конкурирующие с описанными выше антителами за связывание. Конкуренцию за связывание можно определить с помощью анализа конкурентного связывания ELISA в соответствии с методикой, описанной ниже в примере 5. Конкурентное связывание можно определить путем обнаружения, по меньшей мере, 20% ингибирования связывания первого антитела вторым антителом независимо от порядка, в котором антитела связываются с CD123 (т.е. если при связывании антитела А с CD123 до антитела В наблюдается только 10% ингибирование, но при связывании антитела В с CD123 до антитела А наблюдается 30% ингибирование, то поскольку в одном из экспериментов наблюдается более чем 20% ингибирование, можно сделать вывод о конкурентном связывании).
В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой IgG или его производные, например изотипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgG1, антитело содержит замену(ы) L234A, L235A и K409R в области Fc. В некоторых вариантах осуществления, в которых антитело имеет изотип IgG4, антитело содержит замены S228P, L234A и L235A в области Fc. Специфические антитела, определяющиеся последовательностями CDR и/или вариабельных доменов, описанными в абзацах выше, могут включать в себя эти модификации.
Также описываются выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, иммуноспецифически связывающиеся с CD123. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать сегменты вариабельных доменов, предлагаемые в настоящем документе, можно включать в одни и те же или разные векторы для продукции антител или антигенсвязывающих фрагментов.
Полинуклеотиды, кодирующие рекомбинантные антигенсвязывающие белки, также входят в пределы объема изобретения. В некоторых вариантах осуществления описанные полинуклеотиды (и пептиды, которые они кодируют) включают в себя лидерную последовательность. Можно использовать любую лидерную последовательность, известную специалистам. Лидерная последовательность может включать в себя, без ограничений, сайт рестрикции или сайт инициации трансляции.
CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, включают в себя варианты, имеющие одиночные или множественные аминокислотные замены, делеции или присоединения, сохраняющие биологические свойства (например, аффинность связывания или иммунную эффекторную активность) описанных CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов. В контексте настоящего изобретения при отсутствии особых указаний для описания мутаций используются следующие обозначения: i) замена аминокислоты в заданном положении записывается, например, как K409R, что означает замену лизина в положении 409 на аргинин; и ii) для конкретных вариантов используются конкретные трехбуквенные или однобуквенные коды, включая коды Хаа и X для обозначения любого аминокислотного остатка. Таким образом, замена лизина на аргинин в положении 409 обозначается как K409R, а замена лизина в положении 409 на любой аминокислотный остаток обозначается как К4О9Х. Делеция лизина в положении 409 обозначается K409*. Специалист может получать варианты, содержащие одиночные или множественные замены, делеции или присоединения аминокислот.
Такие варианты могут включать в себя: (а) варианты, в которых один или более аминокислотных остатков заменяются консервативными или неконсервативными аминокислотами, (b) варианты, в которых одна или более аминокислот присоединяются к полипептиду или удаляются из него, (с) варианты, в которых одна или более аминокислот включают в себя группу-заместитель, и (d) варианты, в которых полипептид сливают с другим пептидом или полипептидом, таким как партнер слияния, белковая метка или другая химическая группировка, способная придавать полипептиду полезные свойства, например, эпитоп для антитела, полигистидиновая последовательность, остаток биотина и т.п. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут включать в себя варианты, в которых аминокислотные остатки одного вида заменены соответствующими остатками другого вида (в консервативных или неконсервативных положениях). В других вариантах осуществления аминокислотные остатки в неконсервативных положениях заменены консервативными или неконсервативными остатками. Методики получения таких вариантов, включая генетические (делеции, мутации и т.п.), химические и ферментативные, известны специалистам в данной области.
CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут относиться к нескольким изотипам антител, таким как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В некоторых вариантах осуществления изотип антитела представляет собой изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно изотип IgG1 или IgG4. Специфичность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по большей части определяется аминокислотной последовательностью и расположением CDR. Следовательно, CDR одного изотипа можно перенести на другой изотип, не изменив антигенной специфичности. В альтернативном варианте осуществления были установлены методики, вызывающие переключение гибридом с выработки одного изотипа антител на другой (переключение изотипа) без изменения антигенной специфичности. Соответственно, такие изотипы антител входят в пределы объема описанных антител или антигенсвязывающих фрагментов.
CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, имеют аффинность связывания с CD123 SP1 с константой диссоциации (KD) менее чем около
- 31 037647
5х10-7 М, предпочтительно менее чем около 5х10-8 М. В некоторых вариантах осуществления CD123специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, имеют аффинности связывания с CD123 SP2 с константой диссоциации (KD) менее чем около 5х10-7 М, предпочтительно менее чем около 5х10-8 М. Аффинность описанных CD123-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов можно определить различными способами, известными специалистам, например способами на основе поверхностного плазмонного резонанса или на основе анализа ELISA. Анализы по измерению аффинности методом SPR включают в себя анализы, выполненные с использованием прибора BIAcore 3000, причем анализ проводят при комнатной температуре (например, при температуре, составляющей или близкой к 25°С), причем антитела, способные связываться с CD123, захватывают на сенсорном чипе BIAcore при помощи антитела к Fc (например, козьего антитела, специфичного к человеческому IgG Fc, производства Jackson ImmunoResearch laboratories продукт № 109-005-098) в количестве около 75 ОЕ с последующим сбором данных об ассоциации и диссоциации при скорости потока 40 мкл/мин.
Также предлагаются векторы, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящем документе. Векторы могут представлять собой экспрессионные векторы. Следовательно, рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие последовательность, кодирующую интересующий полипептид, считаются входящими в пределы объема этого изобретения. Экспрессионный вектор может содержать одну или более дополнительных последовательностей, например, без ограничений, регуляторные последовательности (например, промотор, энхансер), маркер селекции и сигнал полиаденилирования. Векторы для трансформации широкого спектра клеток-хозяев широко известны, и к ним относятся, без ограничений, плазмиды, фагмиды, космиды, бакуловирусы, бакмиды, искусственные бактериальные хромосомы (ВАС), искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), а также другие бактериальные, дрожжевые и вирусные векторы.
К рекомбинантным экспрессионным векторам, входящим в объем настоящего описания, относятся синтетические, геномные или происходящие от кДНК фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере один рекомбинантный белок, который может быть функционально связан с подходящими регуляторными элементами. К таким регуляторным элементам могут относиться промотор транскрипции, последовательности, кодирующие надлежащие участки связывания мРНК с рибосомой, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции.
Экспрессионные векторы, в особенности экспрессионные векторы млекопитающих, также могут содержать один или несколько нетранскрибируемых элементов, например точку начала репликации, подходящий промотор и энхансер, связанные с экспрессируемым геном, другие 5' или 3' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5' или 3' нетранслируемые последовательности (например, необходимые участки связывания с рибосомой), сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Также может быть встроена точка начала репликации, придающая способность к репликации в клетке-хозяине.
Последовательности контроля транскрипции и трансляции в экспрессионных векторах, предназначенных для трансформации клеток позвоночных, могут быть получены из вирусных источников. Примеры векторов, которые можно сконструировать, описаны в публикации Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 2 80 (1983).
В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, помещают под контроль эффективного конститутивного промотора, как, например, промоторы следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, β-актина, человеческого миозина, человеческого гемоглобина, человеческого мышечного креатина и других. Кроме того, многие вирусные промоторы функционируют конститутивно в эукариотических клетках и могут быть использованы в описанных вариантах осуществления. К таким вирусным промоторам относятся, без ограничений, немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), ранний и поздний промоторы SV40, промотор вируса опухоли молочной железы у мышей (MMTV), длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Малони, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса Эпштейна-Барра (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV) и других ретровирусов и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. В одном варианте осуществления кодирующую последовательность CD123-специфического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента помещают под контроль индуцибельного промотора, например промотора металлотионеина, промотора, индуцируемого тетрациклином, промотора, индуцируемого доксициклином, промоторов, содержащих один или несколько стимулируемых интерфероном реагирующих элементов (ISRE), промоторы протеинкиназы R 2',5'-олигоаденилатсинтаз, генов Mx, ADAR1 и т.п.
Векторы, описанные в настоящем документе, могут содержать один или более участков внутренней посадки рибосомы (IRES). Включение последовательности IRES в слитые векторы может быть полезно для усиления экспрессии некоторых белков. В некоторых вариантах осуществления векторная система может включать в себя один или более участков полиаденилирования (например, SV40), которые могут находиться выше или ниже любой из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот. Ком- 32 037647 поненты вектора могут быть сшиты друг с другом или расположены так, чтобы обеспечить оптимальное пространство для экспрессии генных продуктов (т.е. путем введения спейсерных нуклеотидов между открытыми рамками считывания) или расположены другим способом. Регуляторные элементы, такие как мотив IRES, также могут быть расположены с возможностью обеспечения оптимального пространства для экспрессии.
Векторы могут содержать селективные маркеры, хорошо известные специалистам в данной области. К селективным маркерам относятся маркеры положительной и отрицательной селекции, гены устойчивости к антибиотикам (например, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к пенициллину), гены глутаматсинтазы, HSV-TK, производные HSV-TK для ганцикловирной селекции или ген бактериальной пуриннуклеозидфосфорилазы для селекции по 6-метилпурину (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Нуклеотидная последовательность, кодирующая селективный маркер или участок клонирования, может располагаться выше или ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей нужный полипептид или участок клонирования.
Векторы, описанные в настоящем документе, можно использовать для трансформации различных клеток генами, кодирующими описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Например, векторы можно использовать для получения клеток, продуцирующих CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Следовательно, другой аспект изобретения описывает клетки-хозяева, трансформированные векторами, содержащими нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающий CD123, например антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные и подтвержденные примером в настоящем документе.
Специалистам в данной области известны многочисленные способы внедрения в клетки чужеродных генов, и их можно использовать для конструирования рекомбинантных клеток в целях осуществления описанных способов согласно различным вариантам осуществления, описанным и подтвержденным примерами в настоящем документе. Используемая методика должна обеспечивать стабильный перенос гетерологичной последовательности гена в клетку-хозяин таким образом, чтобы гетерологичная последовательность могла наследоваться и экспрессироваться потомством клетки, и так, чтобы не нарушалось необходимое развитие и физиологические функции клеток-реципиентов. К методикам, которые можно использовать, относятся, без ограничений, перенос хромосом (например, слияние клеток, опосредованный хромосомами перенос генов, опосредованный микроклетками перенос генов), физические способы (например, трансфекция, слияние со сферопластом, микроинъекция, электропорация, липосомный носитель), вирусный перенос вектора (например, рекомбинантные ДНК-вирусы, рекомбинантные РНКвирусы) и т.п. (описано в публикации Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Также для трансформации клеток можно применять кальций-фосфатную преципитацию и индуцированное полиэтиленгликолем (ПЭГ) слияние бактериальных протопластов с клетками млекопитающих.
К клеткам, подходящим для применения в экспрессии CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, предпочтительно относятся эукариотические клетки, более предпочтительно клетки, происходящие от растения, грызуна или человека, например, без ограничений, клеточные линии NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, клетки HEK293, cOs7, T98G, CV-1/EBNA, L-клетки, С127, 3Т3, HeLa, NS1, миеломные клетки Sp2/0, BHK и др. Кроме этого, экспрессию антител можно осуществлять с применением гибридомных клеток. Способы получения гибридом хорошо известны в данной области.
Клетки, трансформированные экспрессионными векторами, описанными в настоящем документе, можно подвергнуть селекции или скринингу для рекомбинантной экспрессии антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. Положительные по рекомбинации клетки размножают и проводят скрининг субклонов, проявляющих нужный фенотип, например высокий уровень экспрессии, усиленные характеристики роста или способность вырабатывать белки с нужными биохимическими свойствами, например, из-за модификации белков или видоизмененных посттрансляционных модификаций. Эти фенотипы могут быть обусловлены внутренними свойствами данного субклона или мутацией. Мутации можно осуществлять при помощи химических агентов, УФ-света, радиации, вирусов, инсерционных мутагенов, ингибирования коррекции ошибок спаривания ДНК или комбинации подобных способов.
Способы применения CD123-специфических антител для лечения.
В настоящем документе предлагаются CD123-специфические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты для применения в терапии. В частности, эти антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно применять при лечении рака, например рака с экспрессией CD123. Соответственно, в изобретении предлагается способ лечения рака, включающий введение антитела, описанного в настоящем документе, например CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов. Например, применение может осуществляться путем ингибирования биологического эффекта IL-3 посредством предотвращения связывания IL-3 с IL-3R или, где антитело конъюгируют с токсином, таким образом, направляя токсин к раковой опухоли, экспрессирующей CD123. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический син- 33 037647 дром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). Антитела, предназначенные для применения в этих способах, включают антитела, описанные выше в настоящем документе, например CD123специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с эпитопом, включающим в себя один или более остатков из сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)). Также в этих способах могут применяться антитела со свойствами, описанными в табл. 1, например, с последовательностями CDR или вариабельных доменов, а также описанными в дальнейшем обсуждении этих антител.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, иммуноэффекторные свойства CD123-специфических антител могут быть усилены или ослаблены за счет модификаций Fc с помощью методик, известных специалистам в данной области. Например, эффекторные функции Fcфрагмента, такие как связывание Clq, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клетки; BCR) и т.д., могут обеспечиваться и/или управляться модифицирующими остатками в Fc-фрагменте, ответственными за эти действия.
Антителозависимая клеточная цитотоксичность, или ADCC, представляет собой клеточноопосредованную реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие рецепторы Fc (FcRc) (например, естественные киллерные клетки (EK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени.
Способность моноклональных антител индуцировать ADCC можно усилить путем конструирования их олигосахаридного компонента. Человеческие IgG1 или IgG3 подвергаются N-гликозилированию по Asn297 большинством гликанов в хорошо известных 2-антенарных формах GO, GOF, G1, G1F, G2 или G2F. Антитела, продуцируемые несконструированными клетками СНО, как правило, имеют содержание фукозы в гликанах по меньшей мере около 85%. Удаление центральной фукозы из олигосахаридов типа 2-антенарного комплекса, присоединенных к областям Fc, усиливает ADCC антител посредством улучшенного связывания FcYRIIIa без изменения связывания с антигеном или CDC-активности. Такие mAb можно получать с помощью различных способов, которые, по имеющимся данным, приводят к успешной экспрессии антител с относительно высокой степенью дефукозилирования, несущих Fcолигосахариды типа 2-антенарного комплекса, такими способами, как контроль осмоляльности культуральной среды (Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012), применение в качестве линии клеток-хозяев вариантной линии СНО Lec13 (Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002), применение в качестве линии клеток-хозяев вариантной линии клеток СНО ЕВ66 (Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; электронное издание до печатного издания; PMID:20562582), применение крысиной гибридомной клеточной линии YB2/0 в качестве линии клеток-хозяев (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:34 66-3473, 2003), введение малых интерферирующих РНК, в особенности к гену а-1,6-фукозилтрансферразы (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004) или коэкспрессия β-1,4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III и αманнозидазы II Гольджи или эффективного ингибитора α-маннозидазы I, кифунензина (Ferrara et al., J. Biol. Chem. 281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, ADCC, вызванную антителами к CD123, также можно усилить путем введения некоторых замен в Fc-область антитела. Примерами замен являются, например, замены в положениях аминокислот 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 или 430 (нумерация остатков соответствует EU-индексу), как описано в патенте США № 6737056.
Способы обнаружения CD123.
В настоящем документе предлагаются способы обнаружения CD123 в биологическом образце путем приведения образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, описанным в настоящем документе. Как описано в настоящем документе, образец может быть получен из мочи, крови, сыворотки, плазмы, слюны, асцитной жидкости, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, хирургически иссеченной ткани опухоли, материалов биопсии, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т.п. В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают в себя обнаружение CD123 в биологическом образце путем приведения образца в контакт с любым из CD123-специфичесkих антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления образец можно привести в контакт с более чем одним из CD123-специфических антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем докумен
- 34 037647 те. Например, образец можно привести в контакт с первым CD123-специфическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, а затем привести в контакт со вторым CD123-специфическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, причем первое антитело или антигенсвязывающий фрагмент и второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент не являются одним и тем же антителом или антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления перед приведением в контакт с образцом первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть прикреплено к поверхности, например, многолуночного планшета, чипа или к сходному субстрату. В других вариантах осуществления перед приведением в контакт с образцом первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть ни к чему не фиксирован/не прикреплен.
Описанные CD123-специфическuе антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть помечены с возможностью обнаружения. В некоторых вариантах осуществления меченые антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут облегчать обнаружение CD123 посредством методов, описанных в настоящем документе. Специалисту в данной области хорошо известны многие подобные метки. Например, приемлемые метки включают в себя, без ограничений, радиоактивные метки, флуоресцентные метки, эпитопные метки, биотин, хромофорные метки, ECL-метки или ферменты. Более конкретно, описанные метки включают в себя рутений, '[n-DOTA. 111In-диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и β-галактозидазу, полигистидин (HIS-метку), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители, красители Alexa Fluor® и т.п.
Описанные CD123-специфическuе антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно использовать в разных анализах для обнаружения CD123 в биологическом образце. Некоторые приемлемые анализы включают, без ограничений, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ, метод поверхностного плазмонного резонанса, иммунофлуориметрию, иммунопреципитацию, равновесный диализ, иммунодиффузию, электрохемилюминесцентный (ECL) иммунологический анализ, иммуногистохимию, цитометрию посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или ELISA.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, обнаружение экспрессирующих CD123 раковых клеток у субъекта можно использовать для определения того, можно ли субъекта лечить терапевтическим агентом, направленным против CD123.
CD123 присутствует в определимых концентрациях в образцах крови и сыворотки. Таким образом, в настоящем документе предлагаются способы обнаружения CD123 в образце, полученном из крови, например образце сыворотки, путем приведения образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, специфически связывающимся с CD123. Образец крови или его производное можно разводить, фракционировать или иным способом обрабатывать для получения образца, на котором можно осуществить описанный способ. В некоторых вариантах осуществления CD123 можно обнаруживать в образце крови или в его производном при помощи любого количества анализов, известных специалистам в данной области, например, без ограничений, таких как вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ, метод поверхностного плазмонного резонанса, иммунофлуориметрия, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, электрохемилюминесцентный (ECL) иммунологический анализ, иммуногистохимия, цитометрия посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или ELISA.
Способы диагностики рака.
В настоящем документе предлагаются способы диагностики рака с экспрессией CD123 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластозы, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). В некоторых вариантах осуществления, как описано выше, обнаружение CD123 в биологическом образце, например в образце крови или сыворотки, обеспечивает возможность диагностики рака у субъекта, от которого был получен образец. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления для оценки того, имеется ли рак у субъекта, от которого был получен образец, можно использовать другие образцы, например гистологический образец, образец, полученный с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии, хирургически иссеченную ткань опухоли, циркулирующие клетки, циркулирующие опухолевые клетки и т.п. В некоторых вариантах осуществления уже может быть известно, что субъект, от которого получен образец, имеет рак, но тип рака, имеющийся у субъекта, может еще не быть диагностирован, или предварительный диагноз может быть неточным, и, следовательно, обнаружение CD123 в биологическом образце, полученном от субъекта, может позволить поставить или уточнить диагноз рака. Например, может быть известно, что у субъекта имеется рак, но может быть неизвестно или неочевидно, является ли рак у данного субъекта раком с экспрессией CD123.
В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают в себя оценку того, поражен ли субъект раком с экспрессией CD123, путем определения количества CD123, присутствующего в биологическом образце, полученном от субъекта; и сравнения наблюдаемого количества CD123 с количест
- 35 037647 вом CD123 в контрольном или эталонном образце, причем разница между количеством CD123 в образце, полученном от субъекта, и количеством CD123 в контрольном или эталонном образце служит указанием на то, что субъект поражен раком с экспрессией CD123. В другом варианте осуществления количество CD123, наблюдаемое в биологическом образце, полученном от субъекта, можно сравнить с уровнями CD123, которые, по имеющимся данным, ассоциированы с определенными формами или стадиями рака с целью определения формы или стадии рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления количество CD123 в образце, полученном от субъекта, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который иммуноспецифически связывается с CD123, например с CD123-специфическими антителами, описанными в настоящем документе. Образец, оцениваемый на наличие CD123, может быть получен из мочи, крови, сыворотки, плазмы, слюны, асцитной жидкости, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, хирургически иссеченной ткани опухоли, материалы биопсии, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т.п. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.
В некоторых вариантах осуществления способ диагностики рака с экспрессией CD123 будет включать в себя: приведение биологического образца субъекта в контакт с CD123-специфическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом (например, производными антител и фрагментов, представленных в табл. 1), определение количества CD123, присутствующего в образце, который связался с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, сравнение количества CD123, присутствующего в образце, с известным стандартным или эталонным образцом; и определение того, попадают ли уровни CD123 субъекта в пределы уровней CD123, связанных с раком. В дополнительном варианте осуществления за проведением диагностического способа может следовать дополнительный этап введения или назначения специфического противоракового лечения. В другом варианте осуществления за проведением диагностического способа может следовать дополнительный этап передачи результатов определения для облегчения лечения рака. В некоторых вариантах осуществления специфическое противораковое лечение может быть направлено против типов рака с экспрессией CD123, как, например, мультиспецифические антитела к CD123 х CD3, описанные в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают в себя оценку того, поражен ли субъект раком с экспрессией CD123, путем определения количества CD123, присутствующего в образце крови или сыворотки, полученном от субъекта; и сравнения наблюдаемого количества CD123 с количеством CD123 в контрольном или эталонном образце, причем разница между количеством CD123 в образце, полученном от субъекта, и количеством CD123 в контрольном или эталонном образце служит указанием на то, что субъект поражен раком с экспрессией CD123.
В некоторых вариантах осуществления контрольный или эталонный образец может быть получен от субъекта, не пораженного раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления контрольный или эталонный образец может быть получен от субъекта, пораженного раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления, в которых контрольный или эталонный образец получен от субъекта, не пораженного раком с экспрессией CD123, наблюдаемое увеличение количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с наблюдаемым количеством в контрольном или эталонном образце, является указанием на то, что субъект поражен раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления, в которых контрольный образец получен от субъекта, не пораженного раком с экспрессией CD123, наблюдаемое уменьшение или сходство количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с наблюдаемым количеством в контрольном или эталонном образце, является указанием на то, что субъект не поражен раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления, в которых контрольный или эталонный образец получен от субъекта, пораженного раком с экспрессией CD123, наблюдаемое сходство количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с наблюдаемым количеством в контрольном или эталонном образце, является указанием на то, что субъект поражен раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления, в которых контрольный или эталонный образец получен от субъекта, пораженного раком с экспрессией CD123, наблюдаемое уменьшение количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с наблюдаемым количеством в контрольном или эталонном образце, является указанием на то, что субъект не поражен раком с экспрессией CD123.
В некоторых вариантах осуществления количество CD123 в образце, полученном от субъекта, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с CD123, например с антителами, описанными в настоящем документе. Образец, оцениваемый на наличие CD123, может быть получен из образца крови, образца сыворотки, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е свободных клеток), тканей (например, хирургически иссеченной ткани опухоли, материалов биопсии, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т.п.
- 36 037647
В различных аспектах количество CD123 определяют, приводя образец в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, специфически связывающимся с CD123. В некоторых вариантах осуществления образец можно привести в контакт более чем с одним типом антител или их антигенсвязывающих фрагментов, связывающихся с CD123. В некоторых вариантах осуществления образец можно привести в контакт с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с CD123, а затем привести в контакт со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с CD123. CD123-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, такие как описанные в настоящем документе, можно использовать в этом качестве.
Для осуществления описанных способов диагностики в качестве первого и второго антитела и антигенсвязывающего фрагмента можно применять различные комбинации CD123-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную Вкрупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN).
В некоторых вариантах осуществления количество CD123 определяют таким методом, как вестернблоттинг, радиоиммунологический анализ, иммунофлуориметрия, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, электрохемилюминесцентный (ECL) иммунологический анализ, иммуногистохимия, цитометрия посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или ELISA.
В различных вариантах осуществления описанных способов диагностики используют контрольный или эталонный образец. Этот образец может представлять собой положительный или отрицательный аналитический контроль, гарантирующий, что анализ работает должным образом; например аналитический контроль такого рода можно обычно использовать для иммуногистохимических анализов. Альтернативно, образец может представлять собой стандартизованный эталон количества CD123 в биологическом образце от здорового субъекта. В некоторых вариантах осуществления уровни CD123, наблюдаемые у исследуемого субъекта, можно сравнивать с уровнями CD123, наблюдаемыми в образцах от субъектов с известным диагнозом рака с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления контрольный субъект может быть поражен конкретным интересующим видом рака. В некоторых вариантах осуществления известно, что контрольный субъект имеет раннюю стадию рака, который может быть или может не быть раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления известно, что контрольный субъект имеет промежуточную стадию рака, который может быть или может не быть раком с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления известно, что контрольный субъект имеет позднюю стадию рака, который может быть или может не быть раком с экспрессией CD123.
Способы контроля рака.
В настоящем документе предлагаются способы контроля рака с экспрессией CD123 у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). В некоторых вариантах осуществления описанные способы включают в себя оценку того, прогрессирует, регрессирует или остается стабильным рак с экспрессией CD123, путем определения количества CD123, присутствующего в биологическом образце, полученном от субъекта; и сравнения наблюдаемого количества CD123 с количеством CD123 в биологическом образце, полученном сходным образом у субъекта в более ранний момент времени, причем различие между количеством CD123 в исследуемом образце и более раннем образце служит показателем того, является ли рак прогрессирующим, регрессирующим или стабильным. В этом отношении увеличенное количество CD123 в исследуемом образце по сравнению с более ранним образом может указывать на прогрессирование рака с экспрессией CD123. Напротив, уменьшенное количество CD123 в исследуемом образце по сравнению с более ранним образом может указывать на регрессию рака с экспрессией CD123.
Соответственно, несущественное различие количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с более ранним образом может указывать на стабильное течение рака с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления количество CD123 в биологическом образце, полученном от субъекта, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом или фрагментом антитела, специфически связывающимся с CD123, например с антителами, описанными в настоящем документе. Образец, оцениваемый на наличие CD123, может быть получен из мочи, крови, сыворотки, плазмы, слюны, асцитной жидкости, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, хирургически иссеченной ткани опухоли, материалы биопсии, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т.п. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.
В некоторых вариантах осуществления способы контроля рака с экспрессией CD123 будут включать в себя приведение биологического образца от субъекта в контакт с CD123-сπецифическим антите- 37 037647 лом или его антигенсвязывающим фрагментом (например, производными антител и фрагментов, представленных в табл. 1), количественную оценку CD123, присутствующего в образце, сравнение количества CD123, присутствующего в образце, с количеством CD123, определенном в биологическом образце, полученном сходным образом от того же субъекта в более ранний момент времени; и определение того, изменился ли уровень CD123 у субъекта со временем. Увеличенное количество CD123 в исследуемом образце по сравнению с количеством в более раннем образце может указывать на прогрессирование рака. Напротив, уменьшенное количество CD123 в исследуемом образце по сравнению с более ранним образом может указывать на регрессию рака с экспрессией CD123. Соответственно, несущественное различие количества CD123 в исследуемом образце по сравнению с более ранним образцом может указывать на стабильное течение рака с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления уровни CD123 в образце можно сравнивать с известным стандартом или эталонным образцом отдельно или в качестве дополнения к сравнению с уровнями CD123, наблюдавшимися в образце в более ранний момент времени. В дополнительном варианте осуществления за проведением диагностического способа может следовать дополнительный этап назначения специфического противоракового лечения. В некоторых вариантах осуществления специфическое противораковое лечение может быть направлено против типов рака с экспрессией CD123, как, например, мультиспецифические антитела к CD123 х CD3, описанные в настоящем документе.
В различных аспектах количество CD123 определяют, приводя образец в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, специфически связывающимся с CD123. В некоторых вариантах осуществления образец можно привести в контакт более чем с одним типом антител или их антигенсвязывающих фрагментов, связывающихся с CD123. В некоторых вариантах осуществления образец можно привести в контакт с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с CD123, а затем привести в контакт со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, который специфически связывается с CD123. Антитела, такие как описаны в настоящем документе, можно использовать в этом качестве.
Для осуществления описанных способов контроля в качестве первого и второго антитела и антигенсвязывающего фрагмента можно применять различные комбинации антител и антигенсвязывающих фрагментов, представленных в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 включает в себя гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN).
В некоторых вариантах осуществления количество CD123 определяют таким методом, как вестернблоттинг, радиоиммунологический анализ, иммунофлуориметрия, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, электрохемилюминесцентный (ECL) иммунологический анализ, иммуногистохимия, цитометрия посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) или ELISA.
Наборы для обнаружения CD123.
В настоящем документе предлагаются наборы для обнаружения CD123 в биологическом образце. Эти наборы включают в себя одно или более CD123-специфических антител, описанных в настоящем документе, или их антигенсвязывающих фрагментов и инструкции по применению набора.
Предлагаемое CD123-специфическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент может находиться в растворе; быть лиофилизированным; прикрепленным к субстрату, носителю или планшету; или может быть меченым с возможностью обнаружения.
Описанные наборы также могут включать в себя дополнительные компоненты, используемые для осуществления способов, описанных в настоящем документе. В качестве примера наборы могут содержать средства для получения образца от субъекта, контрольный или эталонный образец, например образец от субъекта с медленно прогрессирующим раком и/или субъекта без рака, одно или более отделений для образцов и/или материалы инструкций, описывающие осуществление способов изобретения, и тканеспецифические контроли или стандарты.
Средства для определения уровня CD123 могут дополнительно включать, например, буферы и другие реагенты, предназначенные для применения в анализе для определения уровня CD123. Инструкции могут представлять собой, например, печатные инструкции по выполнению анализа и/или инструкции по оценке уровня экспрессии CD123.
Описанные наборы также могут включать в себя средства для выделения образца у субъекта. Эти средства могут содержать один или более элементов оборудования или реагентов, которые можно использовать для получения текучей среды или ткани от субъекта. Средства для получения образца у субъекта также могут представлять собой средства для выделения компонентов крови, таких как сыворотка, из образца крови. Предпочтительно набор предназначен для применения у человеческого индивида.
Мультиспецифические антитела.
Связывающие домены антител к CD123, описанные в настоящем документе, распознают клетки, экспрессирующие на своей поверхности CD123. Как отмечалось выше, экспрессия CD123 может являться показателем раковой клетки. Более специфического нацеливания на конкретные субпопуляции клеток
- 38 037647 можно добиться путем получения биспецифических молекул, например, антител или фрагментов антител, которые связываются с CD123 и с другой мишенью. Примеры таких дополнительных мишеней включают CD3 и CD33. Этого достигают путем получения молекулы, содержащей первую область, связывающуюся с CD123, и вторую область, связывающуюся с дополнительным антигеном. Антигенсвязывающие области могут иметь любую форму, позволяющую специфически распознавать мишень, например связывающая область может представлять собой или может включать в себя вариабельный домен тяжелой цепи или Fv (комбинацию вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи). Соответственно, предлагаются биспецифические молекулы, содержащие две антигенсвязывающие области, которые связываются с CD123 и с другим антигеном соответственно.
Некоторые мультиспецифические антитела, описанные в настоящем документе, содержат две разные антигенсвязывающие области, которые связываются с CD123 и CD3 соответственно. В предпочтительном варианте осуществления предлагаются мультиспецифические антитела, связывающиеся с CD123 и CD3 (мультиспецифические антитела к CD123 х CD3), и их мультиспецифические антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3 содержит первую тяжелую цепь (НС1) и первую легкую цепь (LC1), которые спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD123, и вторую тяжелую цепь (НС2) и вторую легкую цепь (LC2), которые спариваются с образованием второго антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD3. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее CD123-специфическое плечо, которое содержит первую тяжелую цепь (НС1) и первую легкую цепь (LC1), которые спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD123, и CD3-специфическое плечо, которое содержит вторую тяжелую цепь (НС2) и вторую легкую цепь (LC2), которые спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD3. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела настоящего изобретения включают в себя антитела, имеющие полноразмерную структуру антитела. Термин полноразмерное антитело в настоящем документе означает антитело, имеющее две полноразмерные тяжелые цепи антитела и две полноразмерные легкие цепи антитела. Полноразмерная тяжелая цепь антитела (НС) включает в себя вариабельные и константные домены тяжелой цепи VH, CHI, CH2 и СН3. Полноразмерная легкая цепь антитела (LC) включает в себя вариабельные и константные домены легкой цепи VL и CL. Полноразмерное антитело может не содержать С-концевого лизина (K) либо в одной, либо в обеих тяжелых цепях. Термин Fab-плечо или полумолекула означает одну пару тяжелая цепь-легкая цепь, специфически связывающуюся с антигеном.
CD123-связывающее плечо мультиспецифических антител, предложенных в настоящем документе, может быть получено из любого из CD123-специфических антител, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления CD123-связывающее плечо связывается с эпитопом, включающим в себя один или более остатков из (i) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 173-178 (TEQVRDR (SEQ ID NO: 233)), или (ii) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: (229)). В некоторых вариантах осуществления CD123-связывающее плечо конкурирует за связывание с CD123 с CD123-специфическим антителом или антигенсвязывающим фрагментом, связывающим эпитоп, который включает в себя один или более остатков из (i) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 173-178 (TEQVRDR (SEQ ID NO: 233)), или (ii) сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)), и/или сегмента CD123 SP2 ECD, содержащего остатки 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). CD123связывающие плечи, которые связываются по меньшей мере с одним остатком из этих эпитопов, могут также связываться с дополнительными остатками в CD123 ECD. В некоторых вариантах осуществления связывающееся с CD123 плечо является нейтрализующим. Нейтрализующее CD123-связывающее плечо включает в себя те, которые способны ингибировать связывание IL-3 с CD123, что определяют посредством измерения снижения фосфорилирования STAT5 при стимуляции клеток TF-1 при помощи rhIL-3. В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо связывается с человеческим CD123 SP1, предпочтительно с его внеклеточным доменом.
В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит области CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, полученные из клона антитела, представленного в табл. 1. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит области CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и области CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, полученные из клона антитела, представленного в табл. 1. В некоторых примерах осуществления таких
- 39 037647
CD123 SPl-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 или I3RB47. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 или I3RB47. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из клона антитела, представленного в табл. 1. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, полученные из клона антитела, представленного в табл. 1. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 или I3RB47. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP1-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40 или I3RB47.
В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо связывается с человеческим CD123 SP2, предпочтительно с его внеклеточным доменом. В предпочтительных вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо связывается с человеческим CD123 SP1 и человеческим CD123 SP2 и более предпочтительно с их внеклеточными доменами. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP2-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19 или I3RB30. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP2-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19 или I3RB30. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP2-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19 или I3RB30. В некоторых примерах осуществления таких CD123 SP2-связывающих плеч первая антигенсвязывающая область, которая связывается с CD123, содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи клона I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB18, I3RB19 или I3RB30.
В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо также связывается с CD123 яванского макака, предпочтительно с его внеклеточным доменом.
В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо получено из CD123-специфического антитела, которое конкурирует за связывание с CD123 с клоном антитела I3RB2, I3RB60, I3RB70, I3RB79 или I3RB118. В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD123-связывающее плечо получено из CD123-специфического антитела, которое конкурирует за связывание с CD123 с клоном антитела I3RB18, I3RB49 или I3RB55. Конкуренцию за связывание можно определить с помощью анализа конкурентного связывания ELISA в соответствии с методикой, описанной ниже в примере 5. Конкурентное связывание можно определить путем обнаружения по меньшей мере 20% ингибирования связывания первого антитела вторым антителом независимо от порядка, в котором антитела связываются с CD123 (т.е. если при связывании антитела А с CD123 до антитела В наблюдается только 10% ингибирование, но при связывании антитела В с CD123 до антитела А наблюдается 30% ингибирование, то поскольку в одном из экспериментов наблюдается более чем 20% ингибирование, можно сделать вывод о конкурентном связывании).
В некоторых вариантах осуществления CD123-связывающее плечо мультиспецифического антитела представляет собой IgG или его производное, например изотипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления, в которых CD123-связывающее плечо имеет изотип IgG1, оно содержит замену(ы) L234A, L235A и K409R в области Fc. В некоторых вариантах осуществления, в которых CD123связывающее плечо имеет изотип IgG4, оно содержит замену(ы) S228P, L234A и L235A в области Fc.
В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител второе антигенсвязывающее плечо связывается с человеческим CD3. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления CD3специфическое плечо биспецифического антитела к CD123 х CD3 получено из CD3-специфического антитела, которое связывает и активирует первичные Т-клетки человека и/или первичные Т-клетки яванского макака. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо связывается с эпитопом
- 40 037647 на N-конце CD3ε. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо контактирует с эпитопом, включающим в себя шесть N-концевых аминокислот CD3ε. В некоторых вариантах осуществления CD3-специфическое связывающее плечо биспецифического антитела получено из мышиного моноклонального антитела SP34, мышиного изотипа IgG3/λ. В некоторых вариантах осуществления CD3связывающее плечо содержит CDR антитела SP34. Такие CD3-связывающие плечи могут связываться с CD3 с аффинностью 5х 10-7 М или менее, например 1 х 10-7 М или менее, 5х 10-8 М или менее, 1 х 10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее или lx10-9 M или менее. CD3-специфическое связывающее плечо может представлять собой гуманизированный вариант плеча мышиного моноклонального антитела SP34. Для гуманизации антитела к CD3, из которого получают CD3-специфическое плечо, можно использовать адаптацию для человеческого каркаса (HFA). В некоторых вариантах осуществления биспецифических антител CD3-связывающее плечо содержит пару из тяжелой и легкой цепей, выбранных из табл. 2. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо биспецифического антитела к CD123 х CD3 получено из вариантов, представленных в табл. 3.
В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо представляет собой IgG или его производное. В некоторых вариантах осуществления CD3-связывающее плечо представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления, в которых CD3-связывающее плечо имеет изотип IgG1, оно содержит замену(ы) L234A, L235A и F405L в области Fc. В некоторых вариантах осуществления, в которых CD3-связывающее плечо имеет изотип IgG4, оно содержит замену(ы) S228P, L234A, L235A, F405L и R409K в области Fc. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой IgG-АА Fc. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой IgG-AA Fc-L234A, L235A и F405L. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD3ε на первичных человеческих Т-клетках. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD3ε на первичных Т-клетках яванского макака. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD3ε на первичных Т-клетках человека и яванского макака. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты активируют первичные человеческие Т-клетки CD4+. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты активируют первичные Т-клетки CD4+ яванского макака.
В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD123-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466. В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD123-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466. В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD3-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466. В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD3-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466. В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD123-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, mAb7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466, и CD3-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466. В некоторых вариантах осуществления предлагается биспецифическое антитело к CD123 х CD3, имеющее CD123-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466, и CD3-связывающее плечо, которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь клона антитела I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab7959, Ab3978, Ab7955, Ab9958, Ab8747, Ab8876, Ab4435 или Ab5466.
Предпочтительные биспецифические антитела к CD123 х CD3 представлены в табл. 13 и 17.
Описаны разные форматы биспецифических антител, и обзор по ним недавно был представлен в публикации Chames and Baty (2009) Curr. Opin. Drug. Disc. Dev. 12: 276.
В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело настоящего изобретения представляет собой диатело, кросстело или биспецифическое антитело, полученное путем контролируемого
- 41 037647 обмена Fab-плечами, например способами, описанными в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела включают в себя IgG-подобные молекулы с комплементарными доменами СН3 для усиления гетеродимеризации; рекомбинантные IgGподобные молекулы с двойным нацеливанием, причем каждая из двух сторон молекулы содержит Fabфрагмент или часть Fab-фрагмента по меньшей мере двух разных антител; слитые молекулы IgG, в которых полноразмерные антитела IgG сливают с дополнительным Fab-фрагментом или частями Fabфрагмента; слитые молекулы Fc, в которых одноцепочечные молекулы Fv или стабилизированные антитела сливают с константными доменами тяжелой цепи, Fc-областями или их частями; слитые молекулы Fab, в которых сливают друг с другом разные Fab-фрагменты; антитела из тяжелых цепей на основе ScFv и диател (например, доменные антитела, нанотела), в которых разные одноцепочечные молекулы Fv, или разные диатела, или разные антитела из тяжелых цепей (например, доменные антитела, нанотела) сливают друг с другом, или с другим белком, или молекулой-носителем.
В некоторых вариантах осуществления IgG-подобные молекулы с комплементарными доменами СН3 включают в себя молекулы Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotechthe), выступы во впадины (Genentech), CrossMAb (Roche) и электростатически-спариваемые (Amgen), LUZ-Y (Genentech), сконструированное посредством обмена цепей доменное антитело (SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) и DuoBody (Genmab A/S).
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные IgG-подобные молекулы с двойным нацеливанием включают в себя молекулы (DT)-Ig двойного нацеливания (GSK/Domantis), антитело два в одном (Genentech), поперечно-сшитые Mab (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) и CovX-body (CovX/Pfizer).
В некоторых вариантах осуществления слитые молекулы IgG включают в себя молекулы (DVD)-Ig с двойным вариабельным доменом (Abbott), IgG-подобную биспецифическую молекулу (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (Medlmmune/AZ) и BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) и TvAb (Roche).
В некоторых вариантах осуществления слитые Fc-молекулы включают в себя слияния ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), антитело, полученное в соответствии с технологией двойного перенаправления аффинности (Fc-DART) (MacroGenics) и Dual(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine, Китай).
В некоторых вариантах осуществления к биспецифические антитела со слитыми Fab включают в себя F(ab)2 (Medarex/AMGEN), двойного действия или Bis-Fab (Genentech), причал на замке (DNL) (ImmunoMedics), двухвалентное биспецифическое (Biotecnol) и Fab-Fv (UCB-Celltech). Антитела на основе ScFv, диатела и доменные антитела включают в себя, без ограничений, биспецифический Тклеточный энгейджер (BITE) (Micromet), тандемное диатело (Tandab) (Affimed), антитело, полученное в соответствии с технологией двойного перенаправления аффинности (DART) (MacroGenics), одноцепочечное диатело (Academic), TCR-подобные антитела (AIT, ReceptorLogics), слияние ScFv человеческого сывороточного альбумин альбумина (Merrimack) и COMBODY (Epigen Biotech), нанотела с двойным нацеливанием (Ablynx), доменные антитела с двойным нацеливанием, имеющие только тяжелую цепь.
Полноразмерные биспецифические антитела настоящего изобретения можно создать, например, путем обмена Fab-плечами (или обмена полумолекулами) между двумя моноспецифическими двухвалентными антителами, введя в СН3-интерфейс тяжелой цепи в каждой полумолекуле замены, способствующие образованию гетеродимера из двух полумолекул антител, имеющих разную специфичность, либо in vitro в бесклеточной среде, либо с использованием коэкспрессии. Реакция обмена Fab-плечами является результатом реакции изомеризации дисульфидной связи и диссоциации-ассоциации СН3-доменов. Восстанавливаются дисульфидные связи тяжелых цепей в шарнирных участках исходных моноспецифических антител. Полученные свободные цистеины одного из исходных моноспецифических антител образуют дисульфидную связь тяжелых цепей с цистеиновыми остатками второй исходной молекулы моноспецифического антитела, и одновременно СН3-домены исходных антител высвобождаются, и происходит переформирование путем диссоциации-ассоциации. СН3-домены Fab-плеч могут быть сконструированы так, чтобы они способствовали гетеродимеризации, а не гомодимеризации. Полученный продукт представляет собой биспецифическое антитело, имеющее два Fab-плеча, или полумолекулы, каждое из которых связывается с отдельным эпитопом, т.е. эпитопом на CD123 (IL3-Ra) и эпитопом на CD3.
Термин гомодимеризация в настоящем документе обозначает взаимодействие двух тяжелых цепей, имеющих идентичные аминокислотные последовательности СН3. Термин гомодимер в настоящем документе обозначает антитело, имеющее две тяжелые цепи с идентичными аминокислотными последовательностями СН3.
Термин гетеродимеризация в настоящем документе обозначает взаимодействие двух тяжелых цепей, имеющих неидентичные аминокислотные последовательности СН3. Термин гетеродимер в настоящем документе обозначает антитело, имеющее две тяжелые цепи с неидентичными аминокислотными последовательностями СН3.
Для создания полноразмерных биспецифических антител можно использовать стратегию выступ во впадину (см., например, международную публикацию РСТ № WO 2006/028936). Вкратце, выбранные аминокислоты, образующие интерфейс между доменами СН3 в человеческом IgG, можно подвергнуть
- 42 037647 мутации в положениях, влияющих на взаимодействия доменов СН3, стимулируя образование гетеродимера. Аминокислоту с короткой боковой цепью (впадина) вводят в тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном, а аминокислоту с длинной боковой цепью (выступ) вводят в тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном. После коэкспрессии двух антител в результате предпочтительного взаимодействия тяжелой цепи с впадиной и тяжелой цепи с выступом образуется гетеродимер. Примерами пар замен в СН3, образующих выступ и впадину, являются следующие (указано как модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S и T366W/T366S_L368A_Y407V.
Можно использовать другие стратегии, например стимулирование гетеродимеризации тяжелых цепей с использованием электростатических взаимодействий путем введения замен положительно заряженных остатков на одной поверхности СН3 и отрицательно заряженных остатков на другой поверхности СН3, как описано в патентной публикации США № US 2010/0015133; патентной публикации США № US 2009/0182127; патентной публикации США № US 2010/028637 или патентной публикации США № US 2011/0123532. В других стратегиях гетеродимеризацию можно стимулировать путем следующих замен (указано модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T34W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/
F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F_Y407A/T366A_K409F или T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в патентной публикации США № US 2012/0149876 или патентной публикации США № US 2013/0195849.
В дополнение к вышеописанным способам биспецифические антитела настоящего изобретения можно создавать in vitro в бесклеточной среде, вводя асимметричные мутации в СН3-областях двух моноспецифических гомодимерных антител и образуя биспецифическое гетеродимерное антитело из двух исходных моноспецифических гомодимерных антител в восстановительных условиях, что способствует изомеризации дисульфидной связи, в соответствии со способами, описанными в международной патентной публикации № WO 2011/131746. В этих способах первое моноспецифическое двухвалентное антитело (например, антитело к CD123 (IL3-Ra)) и второе моноспецифическое двухвалентное антитело (например, антитело к CD3) конструируют так, чтобы они имели определенные замены в домене СН3, обеспечивающие стабильность гетеродимера; антитела инкубируют вместе в восстановительных условиях, достаточных, чтобы цистеины в шарнирной области подверглись изомеризации дисульфидной связи; и в результате обмена плечами Fab образуется биспецифическое антитело. Условия инкубации можно оптимально вернуть к невосстанавливающим условиям. К примерам пригодных для использования восстанавливающих агентов относятся 2-меркаптоэтиламин (2-МЕА), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), L-цистеин и β-меркаптоэтанол, предпочтительно восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из: 2-меркаптоэтиламина, дитиотреитола и трис-(2-карбоксиэтил)фосфина. Например, можно использовать инкубацию в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°С в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-МЕА или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при значении рН от 5 до 8, например при рН 7,0 или при рН 7,4.
Наряду с описанными мультиспецифическими антителами к CD123 х CD3 также предлагаются полинуклеотидные последовательности, способные кодировать описанные мультиспецифические антитела к CD123 х CD3. В настоящем документе также предлагаются векторы, содержащие описанные полинуклеотиды, а также клетки, экспрессирующие мультиспецифические антитела к CD123 х CD3. Также описываются клетки, способные экспрессировать описанные векторы. Эти клетки могут представлять собой клетки млекопитающих (например, клетки 293F, клетки СНО), клетки насекомых (например, клетки Sf7), клетки дрожжей, клетки растений или бактериальные клетки (например, Е. coli). Описанные антитела также могут продуцироваться гибридомными клетками.
Терапевтическая композиция и способы лечения с применением мультиспецифических антител и их мультиспецифических антигенсвязывающих фрагментов.
Биспецифические антитела к CD123, описанные выше, например вышеописанные биспецифические антитела к CD123 х CD3, полезны в терапии. В частности, биспецифические антитела к CD123 полезны при лечении рака. Также в настоящем документе предлагаются терапевтические композиции для лечения гиперпролиферативного расстройства у млекопитающих, содержащие терапевтически эффективное количество мультиспецифического антитела или мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. В
- 43 037647 одном варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения рака с экспрессией CD123, включая (без ограничений) следующие виды рака: гемобластозы с экспрессией CD123, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN); и другие виды рака, которые пока не определены как имеющие экспрессию CD123. Конкретные биспецифические антитела, которые можно применять для лечения рака, например гемобластоза, включая конкретные виды рака, описанные выше, включают в себя антитела 7959, 3978, 7955, 9958, 8747, 4435 и 5466. Одним примером биспецифического антитела, полезного для лечения рака, например гемобластоза, включая эти конкретные виды рака, является антитело 9958. Другим примером биспецифического антитела, полезного для лечения рака, например гемобластоза, включая эти конкретные виды рака, является антитело 3978. Другим примером биспецифического антитела, полезного для лечения рака, например гемобластоза, включая эти конкретные виды рака, является антитело 8747. Другим примером биспецифического антитела, полезного для лечения рака, например гемобластоза, включая эти конкретные виды рака, является антитело 7959.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем документе, содержат: а) эффективное количество мультиспецифического антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения, и b) фармацевтически приемлемый носитель, который может быть инертным или физиологически активным. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. Термин фармацевтически приемлемые носители в этом описании включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры приемлемых носителей, разбавителей и/или эксципиентов включают одно или более из воды, солевого раствора, фосфатно-солевого буферного раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также любую их комбинацию. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, такие как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия. В частности, соответствующие примеры приемлемого носителя включают: (1) фосфатно-солевой буферный раствор по Дульбекко, рН около 7,4, содержащий или не содержащий от около 1 до 25 мг/мл человеческого сывороточного альбумина, (2) 0,9% солевой раствор (0,9% мас./об. хлорида натрия (NaCl)) и (3) 5% (мас./об.) декстрозу; и также он может содержать антиоксидант, например триптамин, и стабилизирующий агент, такой как Твин 20®.
Композиции, описанные в настоящем документе, также могут содержать дополнительный терапевтический агент, являющийся необходимым для конкретного расстройства, которое лечат. Предпочтительно, чтобы мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела и дополнительное активное соединение имели комплементарные виды активности, отрицательно не влияющие друг на друга. В предпочтительном варианте осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой цитарабин, антрациклин, гистамина дигидрохлорид или интерлейкин 2. В предпочтительном варианте осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент.
Композиции изобретения могут быть представлены в различных формах. Эти формы включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, но предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и от терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции имеют форму растворов, пригодных для инъекции или инфузии. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, интраперитонеальный, подкожный). В предпочтительном варианте осуществления выполняют внутривенное болюсное введение композиции изобретения или ее вводят в виде непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени. В другом предпочтительном варианте осуществления их вводят внутримышечно, подкожно, внутрисуставно, внутрь опухоли, около опухоли, в пораженную ткань или около пораженной ткани, чтобы они оказывали локальный и системный терапевтические эффекты.
Стерильные композиции для парентерального введения можно получать, вводя антитело, фрагмент антитела или конъюгат антитела настоящего изобретения в нужном количестве в подходящий растворитель с последующей стерилизацией посредством микрофильтрации. В качестве растворителя или носителя можно использовать воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинацию. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, такие как сахара, многоатомные спирты или хлорид натрия. Эти композиции также могут содержать вспомогательные вещества, в частности смачивающие, изотонизирующие, эмульгирующие, диспергирующие и стабилизирующие агенты. Стерильные композиции для парентерального введения также можно получать в виде стерильных твердых композиций, растворяемых во время применения в стерильной воде или любой другой пригодной для инъекций стерильной среде.
Мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела также можно вводить перорально. В каче
- 44 037647 стве твердых композиций для перорального применения можно использовать таблетки, пилюли, порошки (желатиновые капсулы, саше) или гранулы. В этих композициях активный ингредиент настоящего изобретения в потоке аргона смешивают с одним или более инертными разбавителями, такими как крахмал, целлюлоза, сахароза, лактоза или диоксид кремния. Эти композиции также могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например, одно или более смазывающих веществ, таких как стеарат магния или тальк, красители, покрытия (таблетка с сахарным покрытием) или глазурь.
В качестве жидких композиций для перорального введения можно использовать фармацевтически приемлемые растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода, этанол, глицерин, растительные масла или парафиновое масло. Эти композиции могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например смачивающие вещества, подсластители, загустители, ароматизирующие или стабилизирующие продукты.
Дозы зависят от желаемого эффекта, продолжительности лечения и применяемого способа введения; как правило, они составляют от 5 до 1000 мг в сутки перорально для взрослых, при разовых дозах в диапазоне от 1 до 250 мг активного вещества. В целом соответствующую дозировку определяет врач в зависимости от возраста, массы тела и других факторов, специфичных для субъекта, подлежащего лечению.
Также в настоящем документе предлагаются способы уничтожения клеток CD123+ путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, мультиспецифического антитела, которое связывается с указанным CD123 и способно рекрутировать Т-клетки для уничтожения указанных клеток CD123+ (т.е. перенаправление Т-клеток). В терапевтических целях можно применять любые из мультиспецифических антител или фрагментов антител настоящего изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент.
В предпочтительном варианте осуществления мультиспецифические антитела или фрагменты антител применяют для лечения гиперпролиферативного расстройства у млекопитающих. В более предпочтительном варианте осуществления для лечения гиперпролиферативного расстройства у млекопитающих применяют одну из вышеописанных фармацевтических композиций, содержащих мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела. В одном варианте осуществления упомянутое расстройство представляет собой рак. В частности, рак представляет собой рак с экспрессией CD123, включая (без ограничений) следующие виды рака: гемобластозы с экспрессией CD123, например, острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN); и другие виды рака, которые пока не определены как имеющие экспрессию CD123. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент.
Соответственно, фармацевтические композиции изобретения могут применяться для лечения или профилактики различных видов рака, включая (без ограничений), следующие: рак с экспрессией CD123, включая (без ограничений) следующие виды рака: гемобластозы с экспрессией CD123, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN); и другие виды рака, которые пока не определены как имеющие экспрессию CD123.
Аналогично, в настоящем документе дополнительно предлагается способ ингибирования роста выбранных популяций клеток, включающий в себя приведение экспрессирующих CD123 клеток-мишеней или ткани, содержащей такие клетки, в контакт с эффективным количеством мультиспецифического антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения, отдельно или в комбинации с другими цитотоксическими или терапевтическими агентами, в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой цитарабин, антрациклин, гистамина дигидрохлорид или интерлейкин 2. В предпочтительном варианте осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. Способ ингибирования роста выбранных популяций клеток можно использовать на практике in vitro, in vivo или ex vivo.
- 45 037647
Примеры использования in vitro включают в себя обработку аутогенного костного мозга перед его трансплантацией тому же пациенту с целью уничтожения пораженных или злокачественных клеток; обработку костного мозга перед его трансплантацией с целью уничтожения компетентных Т-клеток и предотвращения реакции трансплантат против хозяина (GVHD); обработку клеточных культур с целью уничтожения всех клеток, за исключением нужных вариантов, которые не экспрессируют антигенмишень; или с целью уничтожения вариантов, экспрессирующих нежелательный антиген. Условия неклинического применения in vitro может легко определить специалист в данной области.
Примерами клинического применения ex vivo являются удаление опухолевых клеток из костного мозга перед аутотрансплантацией при лечении рака. Лечение можно проводить описанным ниже образом. Костный мозг берут у пациента или другого субъекта, а затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавлен цитотоксический агент изобретения. Диапазон концентраций составляет от около 10 до 1 мкМ, период времени от около 30 мин до около 48 ч при температуре около 37°С. Точные условия по концентрации и времени инкубации, т.е. дозе, может легко определить специалист в данной области. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают пациенту путем в/в инфузии в соответствии с известными способами. В тех случаях, в которых между моментом отбора костного мозга и обратного введения обработанных клеток пациент получает другие виды лечения, например курс абляционной химиотерапии или облучения всего тела, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте с использованием стандартного медицинского оборудования.
При клиническом применении in vivo терапевтически эффективное количество мультиспецифического антитела или антигенсвязывающего фрагмента вводят требующему этого субъекту. Например, мультиспецифические антитела к CD123 х CD3 и их мультиспецифические антигенсвязывающие фрагменты можно использовать при лечении рака с экспрессией CD123 у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления рак с экспрессией CD123 представляет собой гемобластоз, например острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром (MDS, низкого или высокого риска), острый лимфолейкоз (ALL, включая все подтипы), диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), хронический миелолейкоз (CML) или бластную плазмоцитоидную дендритноклеточную опухоль (DPDCN). В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, предпочтительно человеком. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде раствора, протестированного на стерильность.
Схемы дозировки при вышеописанных способах лечения и применения корректируют для обеспечения оптимального желательного ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно выполнить одно болюсное введение, ввести несколько разделенных доз в течение некоторого периода времени, либо доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена по показаниям, требуемым терапевтической ситуацией. Парентеральные композиции могут готовить в виде стандартных единиц дозирования для упрощения введения и для унификации дозирования.
Эффективные дозировки и схемы дозирования мультиспецифических антител и фрагментов зависят от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистом в данной области. Не имеющим ограничительного характера примером диапазона терапевтически эффективного количества соединения настоящего изобретения является диапазон около 0,001-10 мг/кг, например около 0,001-5 мг/кг, например около 0,001-2 мг/кг, например около 0,001-1 мг/кг, например около 0,001, около 0,01, около 0,1, около 1 или около 10 мг/кг.
Врач или ветеринар, являющийся специалистом в данной области, может легко определить и назначить необходимое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с более низких доз мультиспецифического антитела или фрагмента в фармацевтической композиции, чем необходимо для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желаемого эффекта. В целом, приемлемой суточной дозой биспецифического антитела настоящего изобретения будет такое количество соединения, которое является наименьшей дозой, вызывающей терапевтический эффект. Введение может быть, например, парентеральным, таким как внутривенное, внутримышечное или подкожное. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело или фрагмент можно вводить путем инфузии в еженедельной дозе, рассчитанной в мг/м2 Такие дозы, например, можно рассчитать на основании дозы в мг/кг, описанной выше, согласно следующей формуле: доза (мг/кг) х 70 : 1,8. Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, например от 3 до 5 раз. Введение можно осуществлять путем непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело или фрагмент можно вводить путем медленной непрерывной инфузии в течение длительного времени, например более 24 ч, чтобы уменьшить побочные токсические эффекты.
- 46 037647
В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело или фрагмент можно вводить в еженедельной дозе, рассчитанной как фиксированная доза, вводимая до восьми раз, например от четырех до шести раз, один раз в неделю. Такую схему можно повторять один или более раз по мере необходимости, например через шесть месяцев или двенадцать месяцев. Такие фиксированные дозы могут основываться, например, на вышеуказанных дозах в мг/кг в расчете на предполагаемую массу тела 70 кг. Дозу можно определять или корректировать, измеряя количество биспецифического антитела настоящего изобретения в крови после введения, например, путем отбора биологического образца и использования антиидиотипических антител, нацеленных на CD123-связывающую область мультиспецифических антител настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело или фрагмент можно вводить в виде поддерживающей терапии, например, один раз в неделю в течение периода шесть или более месяцев.
Мультиспецифическое антитело или фрагмент можно также вводить профилактически, чтобы снизить риск развития рака, замедлить начало развития событий при прогрессировании рака и/или снизить риск рецидива в случае ремиссии рака.
Мультиспецифические антитела и их фрагменты, описанные в настоящем документе, также можно вводить в составе комбинированной терапии, т.е. в комбинации с другими терапевтическими агентами, релевантными для лечения заболевания или состояния. Соответственно, в одном варианте осуществления лекарственное средство, содержащее антитело, предназначено для комбинирования с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, например химиотерапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления этот другой терапевтический агент представляет собой цитарабин, антрациклин, гистамина дигидрохлорид или интерлейкин 2. Такое комбинированное введение может быть одновременным, раздельным или последовательным, в любом порядке. При одновременном введении агенты можно вводить в виде одной композиции или в виде отдельных композиций в зависимости от ситуации.
В одном варианте осуществления предлагается способ лечения у субъекта расстройства с вовлечением клеток, экспрессирующих CD123, причем способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества мультиспецифического антитела или фрагмента, например биспецифического антитела к CD123 х CD3, описанного в настоящем документе, и проведения лучевой терапии. В одном варианте осуществления предлагается способ лечения или предотвращения рака, причем способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества мультиспецифического антитела или фрагмента, например антитела к CD123 х CD3, описанного в настоящем документе, и проведение лучевой терапии. Предлагается лучевая терапия, которая может включать в себя облучение или соответствующее введение радиофармацевтических препаратов пациенту. Источник излучения может быть внешним или внутренним по отношению к получающему лечение пациенту (лучевая терапия может, например, представлять собой наружную дистанционную лучевую терапию (EBRT) или брахитерапию (ВТ)). Радиоактивные элементы, которые можно использовать на практике для этих способов, включают в себя, например, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111.
Наборы.
Также в настоящем документе предлагаются наборы, например, содержащие описанное мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и инструкции по применению антитела или фрагмента для уничтожения определенных типов клеток. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. Инструкции могут включать в себя указания по использованию мультиспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента in vitro, in vivo или ex vivo.
Как правило, набор имеет отделение, содержащее мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть в лиофилизированном виде, жидком виде или другом виде, пригодном для включения в набор. Набор также может содержать дополнительные элементы, необходимые для практического использования описанного способа согласно инструкциям к набору, например стерилизованный раствор для разведения лиофилизированного порошка, дополнительные агенты для комбинации с мультиспецифическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом перед введением пациенту, и инструменты, помогающие вводить мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент пациенту.
Диагностические виды применения.
Мультиспецифические антитела и фрагменты, описанные в настоящем документе, также можно применять для диагностических целей. Следовательно, также предлагаются диагностические композиции, содержащие мультиспецифическое антитело или фрагменты, описанные в настоящем документе, и
- 47 037647 их применение. В предпочтительных вариантах осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент, а более предпочтительно биспецифическое антитело к CD123 х CD3, как описано в настоящем документе, или его биспецифический к CD123 х CD3 антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предлагается набор для диагностики рака, содержащий контейнер, который содержит биспецифическое антитело к CD123 х CD3 и один или более реагентов для обнаружения связывания антитела с CD123. Реагенты могут включать в себя, например, флуоресцентные метки, ферментативные метки и другие обнаруживаемые метки. Реагенты также могут включать вторичные или третичные антитела или реагенты для ферментативных реакций, причем в результате ферментативных реакций образуется продукт, который можно визуализировать. Например, мультиспецифические антитела, описанные в настоящем документе, или их антигенсвязывающие фрагменты можно пометить радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой, эпитопной меткой, биотином, хромофорной меткой, ECL-меткой, ферментом, рутением, '[n-DOTA. 111In-диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTPA), пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и βгалактозидазой, или полигистидином, или подобными метками, известными специалистам.
Представленные ниже примеры приводятся в качестве дополнения к приведенному выше описанию и в целях лучшего понимания объекта изобретения, описанного в настоящем документе. Эти примеры не следует считать ограничивающими описанный объект изобретения. Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей, и в свете этого специалистам будут очевидны различные модификации и изменения, которые следует включать в объем изобретения, и которые можно вносить, не отклоняясь от объема изобретения.
Пример 1. Материалы.
Создание клеточных линий CD123.
Был получен набор векторов pDisplay™, презентирующих человеческий CD123 SP1 ECD (аминокислоты 20-305) (SEQ ID NO: 1), человеческий CD123 SP2 ECD (аминокислоты 19-227 из SEQ ID NO: 2) и CD123 ECD яванского макака (аминокислоты 19-305 из SEQ ID NO: 3) для применения в качестве инструментов скрининга при оценке лидерных антител к CD123. Был использован экспрессионный вектор млекопитающих pDisplay (Invitrogen), позволяющий отображать белки на клеточной поверхности (фиг. 1). Белки, экспрессированные в pDisplay™, сливали на N-конце с лидерной последовательностью κ-цепи мышиного Ig, которая направляет белок по секреторному пути, а на С-конце - с трансмембранным доменом рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), который фиксирует белок в плазматической мембране, отображая его на внеклеточной стороне. Рекомбинантные белки, экспрессируемые из pDisplay™, содержат эпитопы гемагглютинина А и myc для обнаружения методом вестерн-блоттинга или иммунофлуоресценции. Экспрессией управляет промотор CMV.
Векторы были на временной основе трансфицированы в клетки HEK293T с использованием стандартных способов. Прикрепляющиеся трансфицированные клетки 293F отбирали по стабильной интеграции плазмиды, затем сортировали отдельные клетки и количественно оценивали экспрессию поверхностного рецептора CD123 методом FACS с применением набора BangsLabs Quantum FITC-5kit (кат. № 855, Bangs Laboratories, Inc). Для скрининга отбирали по 10 клонов отдельных клеток для каждой клеточной линии и проводили количественную оценку экспрессии CD123 ECD. Клеточные линии, использованные для последующего скрининга хитов, экспрессировали на своей поверхности приблизительно 500000 копий CD123 ECD на клетку.
Получение растворимого белка CD123 ECD.
Рекомбинантный человеческий белок CD123 SP1 ECD с His-меткой (партия № LV081110A), соответствующий аминокислотам 20-305 CD123 SP1 (SEQ ID NO: 1) получали от R&D Systems (№ 301R3/CF), и применяли в фаговом пэннинге и скрининге хитов. Перед применением белок тестировали на эндотоксин и биотинилировали для исследований с фаговым пэннингом. Этот материал также использовали для измерений связывания и аффинности.
Рекомбинантный человеческий белок CD123 SP2 ECD, соответствующий аминокислотам 18-225 человеческого CD123 SP2 (SEQ ID NO: 2), очищали для применения в измерении связывания и аффинности. кДНК получали с использованием методов генного синтеза (патент США № 6670127; патент США № 6521427). Плазмиды для экспрессии CD123 ECD SP2 получали с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Фрагмент гена CD123 ECD SP2 с N-концевой сигнальной последовательностью gp67 и С-концевой 6-His-меткой клонировали в сайты EcoRI и NotI вектора pFastbacl (Invitrogen) и экспрессировали с системой Вас to Вас (Invitrogen) в клетках High Five (Invitrogen). Секретированный белок (SEQ ID NO: 226) очищали с использованием колонок HisTrap (GE) и Superdex 75 (GE). Этот материал также использовали для измерений связывания и аффинности и для картирования эпитопов.
Растворимые белки CD123 ECD биотинилировали при помощи набора для биотинилирования SureLink Biotinylation Kit (KPL № 86-00-01) согласно инструкциям производителя. Для подтверждения мономерного состояния проводили электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецил
- 48 037647 сульфата натрия (SDS/PAGE).
Антитело к CD3 для рентгенокристаллографии.
Моноклональное антитело SP34, мышиный изотип IgG3/λ, приобретенное в BD Biosciences Pharmingen (г. Сан Диего, штат Калифорния, США), кат. № 556611, и содержащее легкие и тяжелые цепи, показано в SEQ ID NO: 4 и 5 соответственно.
Пример 2. Определение mAb к CD123 человека.
Пэннинг в растворе полученных de novo человеческих библиотек Fab-pIX [Shi, L., et al., J. Mol. Biol., 2010, 397(2), p. 385-396. WO 2009/085462], состоящих из библиотек тяжелых цепей VH1-69, 3-23 и 5-51 в паре с библиотеками легких цепей VK1-39, 3-11, 3-20 и 4-1, выполняли с использованием метода захвата на магнитных гранулах, покрытых стрептавидином, биотинилированного антигена, как описано (Rothe et al., J. Mol. Biol. 376:1182-1200, 2008; Steidl et al., Mol. Immunol. 46: 135-144, 2008) за четыре последовательных раунда.
Г ен pIX вырезали из фагемидной ДНК после четвертого раунда пэннинга и получали растворимые кодирующие Fab-области с his-метками. Fab-области экспрессировали в Е. coli и подвергали скринингу на связывание с рекомбинантным человеческим белком CD123 SP1 ECD, меченным His, в анализе ELISA. Коротко, 96-луночные планшеты Nunc Maxisorp (Nunc № 437111) покрывали овечьими антителами к человеческому Fd (The Binding Site № PC075) в PBS с концентрацией 1 мкг/мл в течение ночи при 4°C. Колонии бактерий, содержащих экспрессионный вектор Fab, культивировали в 450 мкл 2xYT (карбенециллин) в глубоколуночных культуральных планшетах до помутнения (ОП 600 » 0,6). Экспрессию Fab индуцировали путем добавления IPTG в концентрации 1 мМ. Культуры растили в течение ночи при 30°С, а затем очищали путем центрифугирования. Покрытые антителами к Fd планшеты Maxisorp промывали однократно TBS с 0,5% твин-20 (Sigma № 79039-10PAK) и блокировали добавлением 200 мкл PBS-твин (0,5%)+обезжиренного сухого молока (3%) на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. На этом и всех последующих этапах планшеты трехкратно промывали TBS с 0,5% твин-20 (Sigma № 79039-10PAK). В каждую лунку вводили по 50 мкл супернатанта Fab, после чего инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли 50 мкл биотинилированного CD123 и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли 50 мкл комплекса стрептавидин: HRP (Pierce № 21130) в разведении 1:5000, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли 50 мкл хемилюминесцентного субстрата PoD (Roche № 121-5829500001) согласно инструкциям производителя. Далее планшеты просканировали на люминесценцию на планшетном сканере Envision (Perkin Elmer). Хитами считали лунки, в которых сигнал более чем в 5 раз превышал фоновый уровень.
Клоны, демонстрирующие связывание с рекомбинантным человеческим белком CD123 SP1 ECD с His-меткой, секвенировали по вариабельным областям тяжелой (НС) и легкой (LC) цепей. Всего посредством фагового пэннинга идентифицировали 52 уникальные последовательности Fab, и 45 в конечном счете были преобразованы в изотип IgG1 клонированием методом in-fusion (табл. 1). Клонирование методом in-fusion выполняли путем ПЦР-амплификации вариабельных областей НС и LC с использованием набора для ПЦР SuperMix High Fidelity (Life Technologies № 10790-020) и клонирования в участки Esp3I вектора VDR149 для НС и вектора VDR157 для LC с использованием набора In-Fusion® HD Cloning Plus (Clontech № 638909). Области VH и VL для хитов показаны ниже в табл. 4.
- 49 037647
Таблица 1
Последовательности CDR для mAb, полученные в результате фагового пэннинга против рекомбинантного человеческого белка CD123 SP1 ECD с His-меткой (соответствующие SEQ ID NO показаны в скобках)
ИДЕНТИФИКАЦИОНН ЫЙ НОМЕР Н- CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
I3RB1 DYGMS VIRGGGSSKYYADS HSGSFRFNELD KSSQSVLYSSNNK WASTRE QQYYSTPL
(6) VKG γ NYLA S T
(7) (8) (9) (10) (11)
I3RB2 GYWMH AIRSDGSSKYYADS DGVIEDTFDY RASQSVSSYLA DAS N RA QQRSNWPL
(12) VKG (14) (15) T T
(13) (16) (17)
I3RB3 SYWMS GIKYDGGSKYYADS KWMSYFDY KSSQSVLYSSNNK WASTRE QQYYSTPL
(18) VKG (20) NYLA S T
(19) (9) (10) (11)
I3RB4 GYGMS AISGSGGSTYYADS GNWYYGLGFDY RASQSVSSSYLA GASSRA QQYGSSPL
(21) VKG (23) (24) T T
(22) (25) (26)
I3RB5 GYWMS GINYDGGSTYYADS DHFLAEFDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(27) VKG (29) (30) S T
(28) (31) (32)
I3RB6 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GLFNWSNVALD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
(34) (35) (31) (32)
I3RB7 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GKRWLADAGDF RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG DY (30) S T
(34) (36) (31) (32)
I3RB8 SYAIS GIIPIFGTANYAQK HGFAWNDYSLL RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG DY (30) S T
(34) (37) (31) (32)
I3RB9 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GARWFNPPENL RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG DY (30) S T
(34) (38) (31) (32)
I3RB10 SYGIS WISAIFGNTNYAQK GGLLYYASYLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(40) (41) (31) (32)
ИДЕНТИФИКАЦИОНН Η- H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
ЫЙ НОМЕР CDR1
I3RB11 SYGIS GIIPIFGTANYAQK DLFSWRYSNFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(34) (42) (31) (32)
I3RB12 SYAIS GIIPIFGTANYAQK ADRVWDYYLDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG (43) (30) S T
(34) (31) (32)
I3RB13 SYGIS GIIPIFGNTNYAQK QSGFYWRLDY RASQSVSSYLA DAS N RA QQRSNWPL
(39) FQG (45) (15) T T
(44) (16) (17)
I3RB14 SYGIS WISAIFGTTNYAQK GGPLRYYNHFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(46) (47) (31) (32)
I3RB15 SYAIS GIIPIFGTANYAQK DLFSLRYSFLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
(34) (48) (31) (32)
I3RB16 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GAVWGDQWFDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG (49) (30) S T
(34) (31) (32)
I3RB17 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GALSLWYSFLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
(34) (50) (31) (32)
I3RB18 SYWIS IIDPSDSDTRYSPS GDGSTDLDY RASQSVSSSYLA GASSRA QQDYGFPW
(51) FQG (53) (24) T T
(52) (25) (54)
I3RB19 NYAMS GIRGNGSSTYYADS GGPIGARFPDY RASQSIGDFLN YASSLQ QQSYSTPL
(55) VKG LDY (58) S T
(56) (57) (59) (32)
I3RB20 SYAIS GIIPIFGTANYAQK DDQIWGSYHLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
(34) (60) (31) (32)
I3RB21 SYAIS GIIPIFGTANYAQK EGWWGQGKFDY RAS QS VAN FLA AASNRA QQYFHWPY
(33) FQG (61) (62) T T
(34) (63) (64)
I3RB22 SYAIS GIIPIFGTANYAQK NLFYWADSVYL RASQSVNKWLA YAS N RA QQGIDWPR
(33) FQG DY (66) T T
(34) (65) (67) (68)
I3RB23 SYGIS GIIPIFGTANYAQK EGSSWKNPRYV RASQSISSYLN AASSLQ QQYFDFPL
(39) FQG FDY (30) S T
(34) (69) (31) (70)
I3RB24 SYAIS GIIPIFGTANYAQK HTDAWGYRLDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG (71) (30) S T
(34) (31) (32)
I3RB25 SYGIS GISAIFGNANYAQK RFKWWESYFDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG (73) (30) S T
(72) (31) (32)
I3RB26 SYGIS GIIPIFGTANYAQK NGFAWSVSGNL RASQSVDNWLA GAS N RA QQSISAPY
(39) FQG DY (75) T T
(34) (74) (76) (77)
I3RB27 SYAIS GIIPIFGTANYAQK AGWWNLRYGLD RASQSVAKSLA AASNRA QQFIGWPI
(33) FQG γ (79) T T
(34) (78) (63) (80)
I3RB28 SYAIS GIIPIFGTANYAQK APFTWDYSRLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
- 50 037647
ИДЕНТИФИКАЦИОНН ЫЙ НОМЕР Н- CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
(34) (81) (31) (32)
I3RB29 SYAIS GIIPIFGTANYAQK DSRIWSFSLDY RASQSIGEWLN AASSLQ QQYYHFPL
(33) FQG (82) (83) S T
(34) (31) (84)
I3RB30 SYAIS WIIPIFGTANYAQK LVYSSDFDY RASQSVANWLA YAS N RA QQYDGWPR
(33) FQG (86) (87) T T
(85) (67) (88)
I3RB31 SYAIS GISAYFGNANYAQK SYFGDAYFDY RASQSVDKDLA GAS N RA QQYDRAPI
(33) FQG (90) (91) T T
(89) (76) (92)
I3RB32 SYGIS GIIPIFGTANYAQK GAWWAYDTYLD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(34) (93) (31) (32)
I3RB33 SYGIS GIIPIFGTANYAQK GYWHWNYDYLD RASQSVNDWLA GAS N RA QQYKRAPY
(39) FQG γ (95) T T
(34) (94) (76) (96)
I3RB34 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GWSYYRLDY RASQSVDKWLA YAS N RA QQFDRAPF
(33) FQG (97) (98) T T
(34) (67) (99)
I3RB35 SYAIS GIIPIFGTANYAQK HLFWDAGPLDY RASQSISSYLN AASSLQ QQYFSPPY
(33) FQG (100) (30) S T
(34) (31) (101)
I3RB36 SYGIS GIIPIFGTANYAQK DLHVWAYSNFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(34) (102) (31) (32)
I3RB37 SYAIS GIIPIFGTANYAQK DKTDFPSRLDY RASQSIATWLN AASSLQ QQYITFPL
(33) FQG (103) (104) S T
(34) (31) (105)
I3RB38 SYGIS GIIPIFGTANYAQK DLMIWRFENFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(39) FQG γ (30) S T
(34) (106) (31) (32)
I3RB39 SYAIS GIIPIFGTANYAQK EYGSLDY RASQSVADFLA KASNRA QQYNGWPW
(33) FQG (107) (108) T T
(34) (109) (110)
I3RB40 SYAIS GIIPIFGTANYAQK GQWWADTWFDY RASQSVAKWLA GAS N RA QQYHTAPW
(33) FQG (111) (112) T T
(34) (76) (113)
I3RB41 SYAMS AISGSGGSTYYADS VAYWEFFVYES RASQSVSSSYLA GASSRA QQYGSSPL
(114) VKG LDY (24) T T
(22) (115) (25) (26)
I3RB42 SYAMS AISGSGGSTYYADS HDWAFWIVFLD RASQSVSSYLA DAS N RA QQRSNWPL
(114) VKG γ (15) T T
(22) (116) (16) (17)
I3RB43 SYWMH AIRSDGSSKYYADS DGIVMDTFDY RASQSVSSYLA DAS N RA QQRSNWPL
(117) VKG (118) (15) T T
(13) (16) (17)
I3RB44 SYWIS IIDPSDSDTRYSPS GDGSTDLDY RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(51) FQG (53) (30) S T
(52) (31) (32)
I3RB47 SYAIS GIIPIFGTANYAQK DLFSWRYSNFD RASQSISSYLN AASSLQ QQSYSTPL
(33) FQG γ (30) S T
(34) (42) (31) (32)
Таблица 4
Последовательности VH и VL mAb, полученные путем пэннинга фагов относительно CD123
Идентификат op mAb АА Аминокислотная последовательное ть VH SEQ ID NO: Аминокислотная последовательность VL SEQ ID NO
I3RB01 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSDY GMSWVRQAPGKGLEWV SVIRGGGSSKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKHSGSFRFNELDYWG QGTLVTVSS 119 DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKS SQSVLYS SNNKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPLTFGQGTKVEIK 164
I3RB02 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSGY WMHWVRQAPGKGLEWV SAIRSDGSSKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKDGVIEDTFDYWGQG TLVTVSS 120 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPLTFGQ GTKVEIK 165
I3RB03 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSY WMSWVRQAPGKGLEWV SGIKYDGGSKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKKWMSYFDYWGQGTL VTVSS 121 DIVMTQSPDSLAVSLGERA TINCKS SQSVLYS SNNKNY LAWYQQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFSGSGSGTD FTLTISSLQAEDVAVYYCQ QYYSTPLTFGQGTKVEIK 164
I3RB04 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSGY GMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKGNWYYGLGFDYWGQ GTLVTVSS 122 EIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQYGSSPLTFG QGTKVEIK 166
I3RB05 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSGY WMSWVRQAPGKGLEWV SGINYDGGSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKDHFLAEFDYWGQGT LVTVSS 123 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB06 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADESTSTAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGLFNWSNVALDYWG 124 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB07 I3RB08 I3RB09 I3RB10 I3RB11 QGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGKRWLADAGDFDYW GQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADESTSTAY MELSSLRSEDTAVYYC ARHGFAWNDYSLLDYW GQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADESTSTAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGARWFNPPENLDYW GQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GWISAIFGNTNYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGGLLYYASYLDYWG QGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARDLFSWRYSNFDYWG QGTLVTVSS 125 126 127 128 129 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167 167 167 167 167
I3RB12 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARADRVWDYYLDYWGQ GTLVTVSS 130 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
- 52 037647
I3RB13 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGNTNYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARQSGFYWRLDYWGQ GTLVTVSS 131 EIVLTQSPATLSLSPGERA TLSCRASQSVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATG IPARFSGSGSGTDFTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRSNWP LTFGQGTKVEIK 165
I3RB14 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GWISAIFGT TNYAQKF QGRVT I TADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGGPLRYYNHFDYWG QGTLVTVSS 132 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB15 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVT I TADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARDLFSLRYSFLDYWG QGTLVTVSS 133 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB16 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVT I TADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGAVWGDQWFDYWGQ GTLVTVSS 134 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB17 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVT I TADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGALSLWYSFLDYWG QGTLVTVSS 135 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRAS QSIS SYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB18 EVQLVQSGAEVKKPGE SLKISCKGSGYSFTSY WISWVRQMPGKGLEWM GIIDPSDSDTRYSPSF QGQVTISADKSISTAY LQWSSLKASDTAMYYC ARGDGSTDLDYWGQGT LVTVSS 136 EIVLTQSPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLE PEDFAVYYCQQDYGFPWTFG QGTKVEIK 168
I3RB19 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSNY AMSWVRQAPGKGLEWV SGIRGNGSSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY 137 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSIGDFLNWYQQ KPGKAPKLLIYYASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP 169
LQMNSLRAEDTAVYYC AKGGPIGARFPDYLDY WGQGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
I3RB20 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADESTSTAY MELSSLRSEDTAVYYC ARDDQIWGSYHLDYWG QGTLVTVSS 138 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB21 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC AREGWWGQGKFDYWGQ GTLVTVSS 139 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVANFLAWYQQKP GQAPRLLIYAASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQYFHWPYT FGQ GTKVEIK 170
I3RB22 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARNLFYWADSVYLDYW GQGTLVTVSS 140 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVNKWLAWYQQKP GQAPRLL IYYASNRATGI PA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQGIDWPRTFGQ GTKVEIK 171
I3RB23 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC AREGS SWKNPRYVFDY WGQGTLVTVSS 141 EIVLTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQYFDFP LTFGQGTKVEIK 172
I3RB24 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY AISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARHTDAWGYRLDYWGQ GTLVTVSS 142 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB25 QVQLVQ S GAEVKKP G S SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GGISAIFGNANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARRFKWWESYFDYWGQ GTLVTVSS 143 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
- 53 037647
I3RB26 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY GISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARNGFAWSVSGNLDYW GQGTLVTVSS 144 DIQMTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVDNWLAWYQQKP GQAPRLLIYGASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQSISAPYT FGQ GTKVEIK 173
I3RB27 QVQLVQSGAEVKKPGS EIVLTQSPATLSLSPGERA
SVKVSCKASGGTFSSY TLSCRASQSVAKSLAWYQQ
AISWVRQAPGQGLEWM KPGQAPRLLIYAASNRATG
GGIIPIFGTANYAQKF 145 IPARFSGSGSGTDFTLTIS 174
QGRVTITADE STS TAY SLEPEDFAVYYCQQFIGWP
MELSSLRSEDTAVYYC ARAGWWNLRYGLDYWG QGTLVTVSS ITFGQGTKVEIK
I3RB28 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIS SYLNWYQQ
AISWVRQAPGQGLEWM KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GGIIPIFGTANYAQKF 146 VPSRFSGSGSGTDFTLTIS 167
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQSYSTP
MELSSLRSEDTAVYYC ARAPFTWDYSRLDYWG QGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
I3RB29 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIGEWLNWYQQ
AISWVRQAPGQGLEWM KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GGIIPIFGTANYAQKF 147 VPSRFSGSGSGTDFTLTIS 175
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQYYHFP
MELSSLRSEDTAVYYC ARDSRIWSFSLDYWGQ GTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
I3RB30 QVQLVQSGAEVKKPGS EIVLTQSPATLSLSPGERAT
SVKVS CKAS GGT ES S Y LSCRASQSVANWLAWYQQKP
AISWVRQAPGQGLEWM GQAPRLL IYYASNRATGI PA
GW11PIFGTANYAQK F 148 RFSGSGSGTDFTLTISSLEP 176
QGRVTITADE STS TAY EDFAVYYCQQYDGWPRTFGQ
MELSSLRSEDTAVYYC ARLVYSSDFDYWGQGT LVTVSS GTKVEIK
I3RB31 QVQLVQSGAEVKKPGS EIVLTQSPATLSLSPGERAT
SVKVSCKASGGTFSSY LSCRASQSVDKDLAWYQQKP
AISWVRQAPGQGLEWM GQAPRLLIYGASNRATGIPA
GGISAYFGNANYAQKF 149 RFSGSGSGTDFTLTISSLEP 177
QGRVTITADE STS TAY EDFAVYYCQQYDRAPIT FGQ
MELSSLRSEDTAVYYC ARSYFGDAYFDYWGQG TLVTVSS GTKVEIK
I3RB32 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIS SYLNWYQQ 167
GISWVRQAPGQGLEWM 150 KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GGIIPIFGTANYAQKF VPSRFSGSGSGTDFTLTIS
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQSYSTP
MELSSLRSEDTAVYYC ARGAWWAYDTYLDYWG QGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
I3RB33 QVQLVQSGAEVKKPGS EIVLTQSPATLSLSPGERAT
SVKVSCKASGGTFSSY LSCRASQSVNDWLAWYQQKP
GISWVRQAPGQGLEWM GQAPRLLIYGASNRAT GIPA
GGIIPIFGTANYAQKF RFSGSGSGTDFTLTISSLEP 178
QGRVTITADE STS TAY EDFAVYYCQQYKRAPYTFGQ
MELSSLRSEDTAVYYC ARGYWHWNYDYLDYWG QGTLVTVSS GTKVEIK
I3RB34 QVQLVQSGAEVKKPGS EIVLTQSPATLSLSPGERAT
SVKVSCKASGGTFSSY LSCRASQSVDKWLAWYQQKP
AISWVRQAPGQGLEWM GQAPRLLIYYASNRAT GIPA
GGIIPIFGTANYAQKF 152 RFSGSGSGTDFTLTISSLEP 179
QGRVTITADE STS TAY EDFAVYYCQQFDRAPFTFGQ
MELSSLRSEDTAVYYC ARGWSYYRLDYWGQGT LVTVSS GTKVEIK
I3RB35 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIS SYLNWYQQ
AISWVRQAPGQGLEWM KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GGIIPIFGTANYAQKF VPSRFSGSGSGTDFTLTIS 180
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQYFSPP
MELSSLRSEDTAVYYC ARHLFWDAGPLDYWGQ GTLVTVSS YTFGQGTKVEIK
I3RB36 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIS SYLNWYQQ
GISWVRQAPGQGLEWM KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GG11PIFGTANYAQK F 154 VPSRFSGSGSGTDFTLTIS 167
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQSYSTP
MELSSLRSEDTAVYYC ARDLHVWAYSNFDYWG QGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
I3RB37 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVT
SVKVS CKAS G G T FS S Y ITCRASQSIATWLNWYQQKP
AISWVRQAPGQGLEWM GKAPKLLIYAASSLQSGVPS
GGIIPIFGTANYAQKF RFSGSGSGTDFTLTISSLQP 181
QGRVTITADE STS TAY EDFATYYCQQYITFPLTFGQ
MELSSLRSEDTAVYYC ARDKTDFPSRLDYWGQ GTLVTVSS GTKVEIK
I3RB38 QVQLVQSGAEVKKPGS DIQMTQSPSSLSASVGDRV
SVKVSCKASGGTFSSY TITCRAS QSIS SYLNWYQQ
GISWVRQAPGQGLEWM KPGKAPKLLIYAASSLQSG
GGIIPIFGTANYAQKF 156 VPSRFSGSGSGTDFTLTIS 167
QGRVTITADE STS TAY SLQPEDFATYYCQQSYSTP
MELSSLRSEDTAVYYC ARDLMIWRFENFDYWG QGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
- 54 037647
I3RB39 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AI SWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC AREYGSLDYWGQGTLV TVSS 157 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVADFLAWYQQKP GQAPRLLIYKASNRAT GIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQYNGWPWT FGQ GTKVEIK 182
I3RB40 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AI SWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY MELSSLRSEDTAVYYC ARGQWWADTWFDYWGQ GTLVTVSS 158 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVAKWLAWYQQKP GQAPRLLIYGASNRAT GIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQYHTAPWT FGQ GTKVEIK 183
I3RB41 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKVAYWE FFVYE S LDY WGQGTLVTVSS 159 EIVLTQSPGTLSLSPGERA TLSCRASQSVSSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQYGSS PLTFGQGTKVEIK 166
I3RB42 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSY AMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKHDWAFWIVFLDYWG QGTLVTVSS 160 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRAT GIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPLT FGQ GTKVEIK 165
I3RB43 EVQLLESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSSY WMHWVRQAPGKGLEWV SAIRSDGSSKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYC AKDGIVMDTFDYWGQG TLVTVSS 161 EIVLTQSPATLSLSPGERAT LSCRASQSVSSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRAT GIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPLT FGQ GTKVEIK 165
I3RB44 EVQLLESGAEVKKPGE SLKISCKGSGYSFTSY WISWVRQMPGKGLEWM GIIDPSDSDTRYSPSF QGQVTIS ADKSIS TAY LQWSSLKASDTAMYYC ARGDGSTDLDYWGQGT LVTVSS 162 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP LTFGQGTKVEIK 167
I3RB47 QVQLVQSGAEVKKPGS SVKVSCKASGGTFSSY AI SWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTANYAQKF QGRVTITADE STS TAY 163 DIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISSYLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTP 167
MELSSLRSEDTAVYYC ARDLFSWRYSNFDYWG QGTLVTVSS LTFGQGTKVEIK
Пример 3. Связывание клеток с hCD123 SP1, hCD123 SP2 и cynoCD123 SP1 по данным анализа методом MSD.
Связывание антител к CD123 со сконструированными клетками pDisplay оценивали с помощью анализа связывания клеток MSD (Mesoscale). Целью данного скринингового анализа была идентификация антител, связывающихся с клетками, экспрессирующими hCD123 SP1 и SP2, а также перекрестной реактивности с клетками, экспрессирующими cynoCD123 SP1.
Клетки иммобилизовали и фаги оценивали в трех повторах. Коротко, экспрессионные супернатанты или очищенные антитела к CD123 нормализовали к 10 мкг/мл. Высевали по 5000 клеток в лунку 384луночного планшета (МА6000, кат. L21XB, MSD) и оставляли для прикрепления на 2 ч. После этого клетки блокировали 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в PBS (Gibco) в течение 15 мин. Затем добавляли супернатанты антител и оставляли при комнатной температуре на 1 ч. Клетки промывали 3 раза PBS, после чего добавляли меченные рутением вторичные антитела (Jackson Immuno Research) в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем выполняли дополнительный этап промывки, после которого добавляли по 35 мкл в лунку буфера для считывания MSD Read buffer T (без поверхностно-активных веществ) и инкубировали в течение 30 мин для обнаружения. Далее выполняли сканирование прибором Sector Imager 2400 (MSD). Данные нормализовали к контрольным значениям и отображали на графике с использованием программного обеспечения GraphPad Prism, версия 5. Молекулы с положительным связыванием считалось хитом, если сигнал в 3 раза превышал фоновый уровень (фиг. 2А, В и С). Анализ повторяли для непротиворечивости данных, и лучше всего связывающиеся молекулы отбирали для дальнейшей разработки. Следующие хиты имели позитивное связывание со всеми тремя клеточными линиями: I3RB2, I3RB5, I3RB8, I3RB18, I3RB20, I3RB21 и I3RB35.
Пример 4. Измерение аффинности методом SPR.
Измерения аффинности методом ProteOn.
Аффинность связывания 29 потенциальных антител к CD123 с рекомбинантным человеческим CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением матричной системы белковых взаимодействий ProteOn XPR36 (BioRad).
Для каждого варианта измеряли скорости ассоциации и диссоциации с CD123 SP1 ECD или CD123 SP2 ECD. Поверхность биосенсора подготовили методом ковалентного связывания козьих антител к человеческому IgG (Fc) с поверхностью чипа GLC (BioRad) согласно инструкциям производителя по про- 55 037647 ведению химической реакции связывания аминов. Иммобилизовали 8800 ОЕ (отвечающих единиц) козьих антител к человеческому IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories продукт № 109-005-098). Иммобилизованные ОЕ также включали в себя козье антитело к мышиному Fc, которое было добавлено для захвата других антител, не включенных в число отмеченных в описании. Поскольку использовалась смесь 1:1, предполагается, что около 50% этих иммобилизованных ОЕ представляли собой козьи антитела к человеческому Fc. Кинетические эксперименты проводили при 25°С в подвижном буфере (PBS рН 7,4, 0,005% Р20, 3 мМ EDTA). Приготовили 4-кратные (1:3) последовательные разведения человеческого CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD, начиная с концентрации 400 нМ, в подвижном буфере. В среднем на каждый канал сенсорного чипа было захвачено 300 ОЕ mAb (174-600). В качестве эталонной поверхности использовали эталонные пятна (поверхность, модифицированную козьими антителами к человеческому IgG (Fc)), не содержащие захваченного потенциального антитела. После захвата mAb проводили 3-минутную инъекцию (фаза ассоциации) раствора антигена в концентрации 40 мкл/мин, затем 10минутную инъекцию проточного буфера (фаза диссоциации). Поверхность чипа регенерировали путем инъекции 0,85% фосфорной кислоты со скоростью 100 мкл/мин. Данные обрабатывали на программном обеспечении прибора. Проводили двойное эталонное вычитание данных, вычитая графики, полученные при инъекции буфера, из эталонных графиков, полученных при инъекциях анализируемых веществ. Кинетический анализ данных проводили, используя лэнгмюровскую модель связывания 1:1 с аппроксимацией групп. Результат для каждого mAb представлен в формате Ka (kon или скорость ассоциации), Kd (koff или скорость диссоциации), KD (равновесная константа диссоциации) (табл. 5).
Результаты показали, что все 29 mAb связывались с CD123 SP1 ECD, но только шесть из них связывались с CD123 SP2 ECD. Для оценки воспроизводимости данных четыре антитела анализировали по меньшей мере в двух повторах. В целом результаты продемонстрировали хорошую воспроизводимость при повторах, за исключением варианта I3RB1, показавшего низкие скорости ассоциации.
Таблица 5
Оценка аффинности для хитов в фаговой панели 1 методом SPR
CD123 SP1 CD123 SP1 CD123 SP2
Названы е образца коп (1/Мс) koff (1/с) KD (нМ) коп (1/Мс) koff (1/с) KD (нМ)
I3RB1 2,37Е+0 4 5,69Е- 04 24,00 1,48Е+0 4 4,57Е- 04 30, 8
I3RB1 6,22Е+0 3 1,88Е- 04 30,30 3,52Е+0 3 3,70Е- 04 105
I3RB1 5,97Е+0 4 7,82Е- 05 1,31 2,67Е+0 4 < 5е-5 < 1, 87
I3RB1 6,06Е+0 4 2,45Е- 04 4,05 1,57Е+0 4 1,50Е- 04 9, 59
I3RB2 1,06Е+0 6 4,77Е- 03 4,50 1,81Е+0 6 3,35Е- 03 1,85
I3RB5 8,91Е+0 5 1,14Е- 02 12,80 1,32Е+0 6 6,43Е- 03 4,88
I3RB5 8,61Е+0 5 1,11Е- 02 12,90 1,52Е+0 6 6,23Е- 03 4,09
I3RB6 5,14Е+0 5,93Е- 11,50 NBO
- 56 037647
5 03
I3RB7 9,54Е+0 5 1,47Е- 02 15,40 NBO
I3RB8 5,68Е+0 5 1,95Е- 03 3,43 NBO
I3RB9 6,80Е+0 5 8,43Е- 03 12,40 NBO
I3RB11 8,74Е+0 5 2,53Е- 03 2,89 NBO
I3RB12 8,12Е+0 5 7,80Е- 03 9, 61 NBO
I3RB16 4,24Е+0 5 2,12Е- 03 5, 00 NBO
I3RB16 3,87Е+0 5 2,23Е- 03 5, 77 NBO
I3RB17 5,85Е+0 5 2,01Е- 03 3,44 NBO
I3RB18 1,44Е+0 6 8,20Е- 04 0,57 2,69Е+0 6 9,78Е- 04 0,363
I3RB19 2,11Е+0 5 2,51Е- 02 119,00 3,34Е+0 5 1,61Е- 02 48,3
I3RB20 6,31Е+0 5 1,0 6Е- 03 1, 68 NBO
I3RB21 5,21Е+0 5 1,14Е- 03 2,19 NBO
I3RB22 2,57Е+0 5 1,0 6Е- 03 4,12 NBO
I3RB24 1,13Е+0 6 2,2 6Е- 01 201,00 NBO
I3RB28 5,28Е+0 5 2,11Е- 03 3, 99 NBO
I3RB29 2,24Е+0 5 1,32Е- 03 5, 90 NBO
I3RB30 7,25Е+0 5 3,02Е- 03 4,17 1,45Е+0 5 4,80Е- 02 330
I3RB32 8,68Е+0 5 9,42Е- 04 1,09 NBO
I3RB33 4,17Е+0 5 1,77Е- 03 4,23 NBO
I3RB34 4,97Е+0 5 2,83Е- 02 56, 80 NBO
I3RB35 1,04Е+0 6 2,93Е- 03 2,83 NBO
I3RB36 6,75Е+0 5 1,66Е- 03 2,47 NBO
I3RB37 1,07Е+0 6 б,69Е03 6, 27 NBO
I3RB37 1,21Е+0 6 б,21Е03 5, 15 NBO
I3RB38 8,88Е+0 5 4,34Е- 04 0,49 NBO1
I3RB40 5,74Е+0 5 3,4 6Е- 03 6, 02 NBO
I3RB47 1,59Е+0 5 2,12Е- 03 13,40 NBO
1 NBO=связывание не наблюдалось.
Измерения аффинности методом Biacore.
Аффинность нескольких антител к CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD также измерили методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) как в формате антител (Ab), так и в формате Fab, с использо
- 57 037647 ванием прибора Biacore. Кинетические исследования выполняли при 25°С, используя прибор Biacore 3000 (BIAcore, Inc., в настоящее время входит в GE Healthcare). Специфическое козье антитело к человеческому IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories продукт № 109-005-098) ковалентно присоединили к двум проточным ячейкам (обычно 1 и 2) с золотыми поверхностями, покрытыми карбоксиметилдекстраном (чип СМ-5, Biacore). Специфическое овечье антитело к человеческому Fd (The Binding Site продукт № PC075) ковалентно присоединили к двум проточным ячейкам (обычно 3 и 4) с золотыми поверхностями, покрытыми карбоксиметилдекстраном (чип СМ-5, Biacore). Карбоксиметильные группы декстрана активировали при помощи N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и Nгидросукцинимида (NHS). Антитела присоединяли при рН 4,5 в 10 мМ растворе ацетата натрия. Оставшиеся реакционноспособные сайты на поверхности блокировали путем реакции с этаноламином. Для кинетических измерений связывания антитела к CD123 захватывали на специфическом антителе к человеческому Fcy, тогда как Fab захватывали на специфическом антителе к Fd, путем введения молекул этих антител к CD123 со скоростью потока 5 или 6 мкл/мин. Было захвачено около 75 ОЕ антител и около 50 ОЕ Fab соответственно. После захвата Ab и Fab выполняли инъекцию человеческого CD123 SP1 или человеческого CD123 SP2 в концентрациях от 1,6 до 400 нМ со скоростью 40 мкл/мин. Данные об ассоциации собирали в течение 2 мин, после чего в течение 10 мин собирали данные о диссоциации. Поверхность регенерировали, используя 30 мкл 100 мМ Н3РО4, 100 мкл/мин. Все пробы готовили в буферном растворе D-PBS, содержащем 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20. Приведенные данные представляют собой разность сигнала SPR между проточной ячейкой, содержащей захваченное антитело или Fab, и эталонной ячейкой, не содержащей захваченного антитела или Fab. Дополнительно погрешность, вносимую прибором в сигнал, устраняли, вычитая данные ввода холостой пробы из сигнала с вычтенным эталонным сигналом. Данные получали в трех повторах и анализировали, аппроксимируя фазы ассоциации и диссоциации при всех концентрациях (глобальная аппроксимация) моделью связывания 1:1, используя программное обеспечение BIAevaluation (BIAcore, Inc.). Были проведены дублирующие эксперименты, показавшие хорошее согласование. Представленные данные являются средними.
Результаты показали, что аффинность связывания CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD с mAb (I3RB2, I3RB18, I3RB35, I3RB37) согласуется с соответствующими Fab (I3RB120, I3RB119, I3RB121, I3RB122) (табл. 6). Результаты для всех проанализированных молекул антител к CD123 также показали, что диапазон аффинности связывания Fab с CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD составляет 1,8-46,9 нМ и 0,4-12,5 нМ соответственно; а диапазон аффинности для связывания mAb составляет 1,2-52 нМ и 0,3-11,7 нМ соответственно.
Таблица 6
Аффинность и значения скорости ассоциации/диссоциации для хитов фаговой панели 1 ______антител к CD123, полученные методом SPR (Biacore)______
Конструкт Класс rhCD123 SP1 KD (нМ) rhCD123 SP2 KD (нМ) rhCD123 SP1 k on средн. (M ^-1) rhCD123 SP1 k off средн. (c-1)
I3RB2 МАЬ 7,7 1,4 4,81E+05 3,72E-03
I3RB120 Fab 8,5 1,4 3,57E+05 3,04E-03
I3RB18 MAb 1,2 0,3 6,88E+05 8,08E-04
I3RB119 Fab 1,8 0,4 4,93E+05 8,91E-04
I3RB35 MAb 4,8 ND 5,40E+05 2,58E-03
I3RB121 Fab 6, 3 1,2** 3,87E+05 2,45E-03
I3RB37 Mab 9, 7 ND 5,45E+05 5,30E-03
I3RB122 Fab 11,5 ND 3,93E+05 4,50E-03
** Ответ в анализе ниже ожидаемого;
ND: очевидное связывание, но сигнал за пределами критериев приемлемости;
(<5 ОЕ и низкое качество данных или неправильная сенсограмма).
Пример 5. Конкуренция с 7G3.
Конкурентный анализ связывания с CD123 методом ELISA.
Провели скрининг панели антител к CD123 в конкурентном анализе связывания 7G3 методом ELISA. 7G3 представляет собой нейтрализующее моноклональное антитело, эпитоп которого локализован в первых 50 аминокислотах антигена CD123 SP1 (US 6177078 B1). Моноклональное антитело 7G3
- 58 037647 было приобретено в BD Biosciences Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния, США, кат. № 554526) и помечено NHS-эфиром MSD Sulfo-Tag™ согласно инструкциям производителя (Meso Scale Discovery).
Для анализа конкурентного связывания с CD123 методом ELISA в 96-луночные прозрачные планшеты Maxisorb наносили по 100 мкл/лунка 2 мкг/мл раствора антител к 6х гистидину (R&D Systems кат. № МАВ050) в бикарбонатном буфере, рН 9,4 (Pierce № 28382) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Далее планшеты трижды промывали промывочным буфером для ELISA (PBS, 0,01% твин-20) и блокировали 300 мкл/лунка раствора StartingBlock, содержащего твин-20, PBST (Thermo Scientific № 37539). Во все лунки вносили 1 нг рекомбинантного huCD123 ECD SP1, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Несвязанный huCD123 ECD SP1 отмывали промывочным буфером для ELISA. Готовили раствор 7G3 или IgG2A (mIgG2A) в среде для экспрессии (Freestyle™ Expression media. Gibco № 12338-018) в концентрации 20 мкг/мл и добавляли в двух повторах в планшет в соответствующие лунки по 50 мкл/лунка, а исследуемые mAb к CD123 добавляли в оставшиеся лунки по 50 мкл/лунка в концентрации 2 мкг/мл или без разведения и планшеты инкубировали в течение 1 ч комнатной температуре при умеренном встряхивании. Затем добавляли биотинилированные 7G3 в конечной концентрации 100 нг/мл во все лунки, и планшеты инкубировали еще 1 ч. После этого планшеты промывали трехкратно промывочным буфером для ELISA, и связавшиеся биотинилированные 7G3 обнаруживали с использованием конъюгата SA-HRP при оптической плотности 450 нм.
mAb к CD123, ингибирующие связывание 7G3:CD123, определялись при уровне ингибирования активности 20%. Таким образом, антитело считалось ингибитором, если оно было способно ингибировать связывание биотинилированного 7G3 с человеческим CD123 ECD по меньшей мере на 20%. На основании этого критерия отбора были выявлены три ингибитора: 13RB18, 13RB34 и 13RB44 (фиг. 3).
Пример 6. Функциональный анализ по pSTAT5.
Для оценки агонистической или антагонистической активности антител провели скрининг панели в клеточном анализе индуцированного IL-3-фосфорилирования STAT5 с использованием клеток TF-1 (где закуплены). Присутствие ингибиторных mAb к CD123 приводило к снижению фосфорилирования STAT5 при стимуляции rhIL-3. Для функционального анализа по STAT5 использовали 20% критерий ингибирования (20% ингибирование активности rhIL-3).
Высевали приблизительно по 50000 клеток TF-1 (человеческий эритролейкоз) в каждую лунку 96луночного планшета в 60 мкл среды RPMI, содержащей 10% FBS, и инкубировали при 37°С в термостате с подачей 5% СО2 в течение ночи. Все образцы готовили в среде для экспрессии (FreeStyle™ Expression media. Gibco № 12338-018). Для получения контрольных образцов вводили по 70 мкл/лунка раствора 20 мкг/мл либо 7G3, либо изотипического контроля mIgG2A. В оставшиеся лунки вводили по 70 мкл/лунка образцов mAb к человеческому CD123 в концентрации 2 мкг/мл или неразведенного. Все образцы инкубировали в течение 1 ч при 37°С в термостате с подачей 5% СО2. После этого к клеткам добавляли рекомбинантный человеческий IL-3 rhIL-3 (PeproTech кат. № 200-03) в конечной концентрации 10 нг/мл в среде RPMI, содержащей 10% FBS, за исключением клеток с обработкой холостым раствором, 7G3 или изотипическим контролем. Далее образцы инкубировали еще 15 мин при 37°С в термостате с подачей 5% СО2. Клетки лизировали, добавляя 46,7 мкл ледяного полного лизирующего буфера в каждую лунку, и образцы инкубировали на льду в течение 30 мин. Лизаты перемешивали путем пипетирования вверхвниз 10 раз. Далее определяли фосфорилированный STAT5 (pSTAT5a,b), используя набор Phospho(Tyr694)/Total STAT5a,b производства Meso Scale Discovery (MSD № K15163D-2) и согласно инструкциям производителя.
mAb к CD123, ингибирующие фосфорилирование STAT5 при помощи rhIL-3, определялись при 20% уровне ингибирования активности. Таким образом, антитело считалось ингибитором, если оно было способно ингибировать фосфорилирование STAT5 при помощи rhIL-3 по меньшей мере на 20%.
Пять mAb продемонстрировали способность блокировать индуцированную IL-3 стимуляцию STAT5 (фиг. 4А). К этим пяти антителам относились 13RB18, а также 13RB19, 13RB30, 13RB34 и 13RB44. Однако при тестировании концентрации 1 мкг/мл только одно антитело, 13RB18, блокировало индуцированную IL-3 стимуляцию фосфорилирования STAT5 в клетках TF-1 (фиг. 4В). Более того, 13RB18 (В18) продемонстрировало в этом анализе дозовую зависимость (фиг. 4С). На основании этих данных был сделан вывод, что I3RB18 является единственным антагонистическим антителом.
Пример 7. Подтверждение одновалентной аффинности hCD123.
Связывание Fab из двух хитов антител к CD123 (I3RB120 (I3RB2 Fab), I3RB119 (I3RB18 Fab), с экспрессированными на клеточной поверхности молекулами CD123 SP1 человека или яванского макака анализировали в двух повторах методом MSD-Cell Affinity Technology с получением показателя одновалентного связывания с экспреесированным на клеточной поверхности CD123.
Одновалентные аффинности выбранных лидеров антител к CD123 к экспрессированным на клеточной поверхности hCD123 или cynoCD123 получали с использованием методики MSD-Cell Affinity Technique (MSD-CAT). MSD-CAT был разработан как собственный метод без использования меток, предназначенный для определения аффинности на интактных клетках в формате, обеспечивающем высокую производительность. Эти эксперименты выполняли для оценки аффинности и специфичности связыва- 59 037647 ния потенциальных антител к CD123 с экспрессированными на клеточной поверхности молекулами CD123 SP1 человека или яванского макака (cyno). Этот анализ позволил сравнить аффинности потенциальных антител к CD123 с антигеном человека или яванского макака в отсутствие рекомбинантного растворимого cynoCD123. Использовались клеточные линии pDisplay CD123 SP1 человека и pDisplay CD123 SP1 яванского макака. Чтобы измерить аффинность этих взаимодействий с использованием метода MSDCAT, приготовили серию смесей с фиксированной концентрацией антител к CD123 (1000, 200, 40 и/или 8 пМ) и различными концентрациями клеток (1,5х107-0,762х107 клеток/мл) и дали им достичь равновесия путем вращательного перемешивания планшетов в течение 24 ч при 4°С. Эти образцы были приготовлены в среде DMEM Glutamax, содержащей 0,05% азида, 1% BSA и 3 мМ EDTA. Количества рецепторов, составлявшие (3,15-4,18) х 106 hCD123/клетка и (4,78-9,24) 106 cyCD123/клетка, конвертировали в молярную концентрацию рецепторов в смеси, основываясь на объеме реакционной смеси, плотности клеток (клеток/л) и числе Авогадро. В результате получили диапазон концентраций от 104 нМ до 5,3 пМ для человеческого CD123 и от 12 нМ до 0,6 пМ для CD123 яванского макака. После доведения до равновесия планшет центрифугировали в течение 5 мин при ~1000 об/мин и определяли в супернатанте свободные антитела к CD3. Свободные антитела к CD123 в смеси определяли по электрохемилюминесценции (ECL) с использованием сканера Mesoscale Discovery (MSD). Для определения антител к CD123 в доведенной до равновесия смеси методом электрохемилюминесцентного иммуноанализа (ECL) были приготовлены планшеты для обнаружения. Чтобы приготовить планшеты для обнаружения (антиген, связанный с планшетами SA-MSD), стандартные планшеты MSD со стрептавидином блокировали буфером для анализа по 50 мкл/лунка (PBS, (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0,05% твин 20, 0,2% BSA) в течение 5 мин. Буфер для анализа удаляли без промывки и в планшеты MSD добавляли по 50 мкл/лунка 0,7 мкг/мл биотинилированного антигена в буфере для анализа и инкубировали в течение ночи (~16 ч при 4°С). После инкубации в течение ночи планшеты блокировали, добавляя по 150 мкл/лунка буфера для анализа без удаления покрывающего антигена, инкубировали в течение ~1 ч при температуре окружающей среды и промывали 5 раз промывочным буфером (буфер для анализа без BSA). Из планшета с образцами переносили по 50 мкл/лунка супернатантов в покрытые антигеном планшеты, инкубировали в течение 60 мин, а затем трижды промывали промывочным буфером. После этого добавляли по 50 мкл на лунку меченных рутением детектирующих антител (к человеческим H+L) и инкубировали в течение 1 ч. Через 1 ч планшеты промывали и добавляли по 150 мкл на лунку буфера для считывания MSD Read Buffer (приготовлен путем разведения 1:4 маточного раствора в дист. Н2О). После этого планшеты сразу же сканировали на сканере MSD Sector Imager 6000, определяя уровни люминесценции. Сигнал ECL, определенный сканером MSD, выражали в % свободного антитела в смеси и данные анализировали для определения аффинности с применением пользовательского уравнения (выведенного на основании закона действующих масс), введенного в программное обеспечение Prism. Данные показывают, что I3RB18 и его Fabфрагмент (I3RB119) лучше всего связываются с экспрессированными на поверхности CD123 SP1 с пикомолярной аффинностью (или кажущейся аффинностью в случае mAb), но > в 10 раз слабее связываются с CD123 SP1 яванского макака. В случае I3RB18 и его Fab-фрагмента (I3RB119) было невозможно получить значение аффинности для mAb или Fab в отношении клеток, экспрессирующих cynoSP1. Все, что можно сказать, это что аффинность была >12 нМ. Однако, хотя I3RB120 связывается с наномолярной аффинностью с обоими антигенами, он связывается с равной или <5-кратной аффинностью с CD123 SP1 человека и яванского макака. Аффинности, полученные методом SPR для hCD123 SP1, являются более слабыми, чем наблюдаемые на клетках. Эта разница наиболее вероятно обусловлена презентированием антигена на клеточной поверхности и местоположением эпитопа антитела. Результаты приведены в табл. 7.
Таблица 7
Значения аффинности Fab-фрагментов к клеткам с CD123, полученные методом MSD-CAT
Клетки hCD123 Клетки hCD123 Клетки cynoCD123 Клетки cynoCD123
KD (анализ-1) KD (анализ-2) KD (анализ-1) KD (анализ-2)
Fab I3RB119 2 93 пМ 3 67 пМ >15 нМа > 11,9 нМа
Fab I3RB120 ~ 3,37 пМ 3,44 нМь ~ 3,84 нМ 3,81 нМь 2,4 нМ > 11,9 нМа
mAb I3RB18 55е пМ 343е пМ 832е пМ > 11,9е нМа
mAb 7G3 - 154 пМ - 57 пМ
a Это значение KD больше, чем указанное, но определить реальное значение не представляется возможным.
b При этой аппроксимации параметр, именуемый Во, был ограничен, чтобы получить точное значение вместо приблизительного. Алгоритм аппроксимации иногда дает аппроксимацию, когда в кривой присутствует вариабельность.
c Это кажущееся значение KD, поскольку на него может влиять авидность, обусловленная двухвалентным связыванием.
- 60 037647
Измеренная аффинность I3RB2 Fab согласуется с данными по mAb, полученными с использованием Proteon. Кроме того, имеется хорошее связывание данного Fab с клетками cynoCD123, и это четко показывает, что I3RB2 является перекрестно-реагирующим хитом. Оценка mAb I3RB18 и соответствующего ему Fab-фрагмента (I3RB119) показывает, что полученные при помощи Proteon аффинности к рекомбинантному CD123 SP1 слабее, чем наблюдаемые на клетках; 1 нМ для рекомбинантного белка в сравнении с 55-300 пМ для клеток. Эта разница наиболее вероятно обусловлена презентированием антигена на клеточной поверхности и местоположением эпитопа антитела. Было невозможно получить значение аффинности ни для mAb, ни для Fab (аффинность >12 нМ). Это может означать, что в одновалентной форме антитело не является перекрестно-реагирующим. Предыдущие данные о связывании с клетками показали перекрестную реактивность, которая, скорее всего, была обусловлена двухвалентным связыванием с клеточной поверхностью.
Пример 8. Эндогенное связывание с клетками.
Для подтверждения измеряли связывание I3RB2 и I3RB18 с эндогенным CD123 на клетках AML. Клетки OCI-AML5 (DSMZ), которые экспрессируют приблизительно 75000 копий CD123 на клеточной поверхности, использовали в анализе дозозависимого клеточного связывания MSD. Связывание антител к CD123 с клетками AML оценивали с помощью анализа на связывание клеток MSD (Mesoscale). Коротко, экспрессионные супернатанты или очищенные антитела к CD123 использовали в диапазоне концентраций от 40 до 0,039 мкг/мл. Клетки высевали по 50000 в лунку 96-луночного планшета (Mesoscale high bind plate) и оставляли прикрепляться на 2 ч. Далее клетки блокировали 20% FBS в PBS с добавлением Fc-блокатора (Fc-блокатор представляет собой очищенный Fc-фрагмент расщепленного папаином антитела (SEQ ID NO: 209)) в течение 15 мин. Затем добавляли супернатанты антител и оставляли при комнатной температуре на 1 ч. Клетки промывали 3 раза PBS, после чего добавляли меченные рутением вторичные антитела (Jackson Immuno Research) в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем выполняли дополнительный этап промывки, после которого добавляли по 150 мкл в лунку буфера для считывания MSD Read buffer T (без поверхностно-активных веществ) и инкубировали в течение 30 мин для обнаружения. Далее выполняли сканирование прибором Sector Imager 2400 (MSD). Данные нормализовали к контрольным значениям и отображали на графике с использованием программного обеспечения GraphPad Prism, версия 5.
Результаты показали, что I3RB2 и I3RB18 связываются с эндогенным CD123, экспрессированным на клетках OCI-AML5, дозозависимым способом (фиг. 5 А и В). Для сравнения в это исследование также включали положительный контроль, mAb 7G3 (фиг. 5C).
Пример 9. Конкурентный анализ связывания mAb к CD123 с 13RB2 и 13RB18.
Провели анализ на конкуренцию 13RB2 и 13RB18 относительно других перекрестно-реагирующих хитов к CD123 SP1/SP2 и контрольных антител 7G3 для определения конкурентных групп антител к CD123 или эпитопных корзин.
При конкурентном ELISA 5 мкл очищенного человеческого белка CD123 ECD (20 мкг/мл), синтезированного в соответствии с описанием, приведенным в примере 1, вносили как покрытие в лунки планшета MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) и выдерживали 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 150 мкл аликвоты 5% блокирующего буфера A MSD (Meso Scale Discovery) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали буфером 0,1М HEPES, рН 7,4, затем добавляли смесь меченых mAb к CD123 с разными конкурирующими агентами mAb к CD123. Меченые антитела (20 нМ) инкубировали с 2 мкМ немеченых антител к CD123, затем смесь вносили в обозначенные лунки в объеме 25 мкл. После 2 ч инкубации с осторожным встряхиванием при комнатной температуре планшеты 3 раза промывали буфером 0,1М HEPES (рН 7,4). Буфер считывания MSD Read Buffer T разбавляли дистиллированной водой (4-кратно), разливали в объеме по 150 мкл/лунка и анализировали с помощью SECTOR Imager 6000.
Антитела метили эфиром MSD Sulfo-Tag™ NHS согласно инструкции производителя (Meso Scale Discovery).
Результаты конкурентного ELISA показывают, что I3RB2 конкурирует с 13RB60, 13RB70, 13RB79 и 13RB118, но не конкурирует с другими антителами, включая I3RB18 (фиг. 6А). Следует отметить, что когда молекула I3RB2 была меченной, наблюдалась конкуренция с I3RB60; однако когда меченной была молекула I3RB60, конкуренция не наблюдалась. Одной возможной причиной этого являются некоторые неспецифические связывающие взаимодействия. При оценке I3RB18 было обнаружено, что эта молекула конкурирует с 13RB49 и 13RB55, но не с 13RB2 (фиг. 6В).
Анализ конкурентного связывания выявил две конкурентные группы среди перекрестнореагирующих антител к CD123 SP1/SP2 (табл. 8). Моноклональное антитело I3RB2 не конкурирует с I3RB18, и они принадлежат к разным эпитопным группам. Группа 1 (окрашена в темно-серый цвет) включает mAb 13RB2, 13RB60, I3RB70, I3RB79 и I3R118. Группа 2 (окрашена в светло-серый цвет) состоит из антител I3RB18, I3RB49 и I3RB55. Коммерческие mAb 7G3 не конкурируют ни с одними из разработанных антител к CD123.
- 61 037647
Таблица 8
Результаты по конкурентному связыванию меченных рутением I3RB2 и I3RB18, и антител к CD123
Ru-меченное антитело
Конкурент I3RB2 I3RB70 I3RB79 I3RB18 I3RB55 I3RB60 7G3
13RB2 + + + - - - -
13RB60 + + + - ± + -
13RB70 + + + - ± - -
13RB79 + + + - ± - -
13RB118 (В102) + + + - - - -
13RB18 - - - + ± - -
13RB49 - - - + + - -
13RB55 - - - + + - -
7G3 - - - - - - +
Пример 10. Картирование эпитопов I3RB2 и I3RB18.
Исследования с заменой H/D.
Для идентификации эпитопов для I3RB2 и I3RB18 на человеческом CD123 была выполнена водород/дейтерийобменная масс-спектрометрия (HDX-MS) с использованием соответствующих Fab. При замене H/D процедуры, используемые для анализа возмущения Fab-фрагментами, были аналогичны описанным ранее (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14:171-182, 2003; Horn, J.R., et al., Biochemistry, 45: 8488-8498, 2006) с некоторыми модификациями. Для этих исследований использовали антиген CD123 SP2 ECD, поскольку этот антиген менее сложен, чем молекула SP1, из-за меньшего количества участков гликозилирования.
Рекомбинантный CD123 SP2 ECD (SEQ ID NO: 226) инкубировали в растворе на основе дейтерированной воды в течение указанного периода времени, при этом в него внедрялся дейтерий, заменяющий атомы водорода. Дейтерированный CD123 SP2 ECD находился в комплексе либо с I3RB119 (Fabфрагмент из I3RB18), либо I3RB120 (Fab-фрагмент из I3RB2) в 43 мкл оксида дейтерия (D2O) при 4°С в течение 30 с, 2 мин, 10 мин и 60 мин. Реакцию обмена гасили при помощи низкого рН, и белки расщепляли пепсином. Уровни дейтерия в выявленных пептидах отслеживали по сдвигу масс на ЖХ-МС. В качестве эталонного контроля использовали образец CD123 SP2 ECD, обрабатываемый сходным образом, за исключением того, что он не находился в комплексе с молекулами Fab. Областями, связанными с Fab, считались те, в которых замена дейтерия на водород происходила в минимальной степени, и, таким образом, в них содержалось больше дейтерия, чем в эталонном образце CD123 SP2 ECD. Около 94% белка можно было картировать относительно специфических пептидов.
Решения карты возмущений HDX-MS для CD123 ECD SP2 в комплексе с I3RB119 и I3RB120 представлены на фиг. 7А и 7В соответственно. Один сегмент, остатки 176-184 (RARERVYEF (SEQ ID NO: 227)), соответствующие аминокислотным остаткам 195-202 CD123 sp2, хорошо защищен при помощи I3RB119. Две другие области, остатки 145-156 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) и остатки 165-170 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)), соответствующие остаткам 164-175 и остаткам 184-189 CD123 sp2, соответственно, распознавались I3RB120. Эти результаты HDX-MS указывают на пептидном уровне на эпитопы I3RB119 и I3RB120. У этих двух антител не было перекрывающихся эпитопных областей.
Эти результаты согласуются с предыдущими данными по конкурентному связыванию об отсутствии конкуренции между I3RB2 и I3RB18.
Пример 11. Картирование эпитопов антитела к CD123 I3RB18 по кристаллической структуре.
Эпитоп связывания антитела I3RB18 определяли методом рентгенокристаллографии.
Получали одноцепочечный Fv-фрагмент моноклонального антитела к CD123 I3RB18 в следующей форме: VL-(Gly4Ser)4-VH-Gly-His6 (SEQ ID NO: 230). Его экспрессировали в клетках HEK293 Expi и очищали аффинной (HisTrap) и ионообменной (Source 15S и Mono S) хроматографией.
Изоформу sp2 человеческого CD123 ECD (SEQ ID NO: 231) с С-концевой SxHis-меткой экспрессировали в инфицированных бакуловирусом клетках насекомых и очищали аффинной (HisTrap) и эксклюзионной (Superdex 75) хроматографией.
Комплекс CD123:I3RB18 scFv получали, смешивая 1,8 мг CD123 (1,1 мг/мл) с 2,4 мг одноцепочечного Fv (scFv) (1,6 мг/мл) с приблизительным молярным соотношением 1:1,2 (избыток scFv) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Образование небольшого количества (150 мкг) SEC указывало на формирование комплекса. Этот белок концентрировали до 18 мг/мл в 20 мМ HEPES, рН 7,5; 100 мМ NaCl.
Кристаллизацию проводили методом диффузии паров при 20°С в формате сидячей капли на 2луночных планшетах MRC для кристаллизации (Swissci). Кристаллы комплекса, подходящие для рентгеновского эксперимента, получали при следующих условиях: 2,0М (NH4)2SO4, 0,1М буфер MES, рН 6,5. Данные кристаллографии приводятся в табл. 9. Один кристалл был перенесен в маточный раствор с добавлением 24% глицерина, заморожен в жидком азоте и использован для получения данных рентгеновской дифракции. Структуру определяли с разрешением 3,5 А.
- 62 037647
Таблица 9
Параметры кристалла, данные рентгенографического анализа и статистика оптимизации
Параметры кристалла.
Пространственная группа Ρ4Χ2Χ2
Оси элементарной ячейки (А) 111,32, 111,32, 192,19
Молекулы/асимм. ячейка 2
Vm (А3/Да) 2,86
Содержание растворителя (%) 57
Данные рентгеноструктурного анализа.
Разрешение (А) 50- (3,70-3,56) 3,56
Число измеряемых отражений 136 (5 853) 381
Число уникальных отражений 13 977 (929)
Полнота (%) 93,4 (64,2)
Избыток 9,8 (6,3)
R-объединение 0,195 (0,490)
<Ι/σ> 10,8 (2,3)
В-фактор (Уилсон) (А2) 66, 1
Оптимизация.
Разрешение (А) 20- 3,56
Число отражений, использованных 13 128
при оптимизации
Полнота (%) 92,1
Число всех атомов 6568
Число молекул воды 0
R-фактор (%) 23,1
R-свободные (%) (данные 5%) 32,3
RMSD длин связей (А) 0,005
RMSD углов связей (°) 1,1
Средний В-фактор (А2) 120,3
В скобках показаны значения для оболочки с наивысшим разрешением.
I3RB18 связывается с CD123 sp2 на С-концевом (ближнем к клеточной поверхности) домене ECD. Эпитоп является конформационным и включает три сегмента цепи CD123 sp2, остатки 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)), 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)) и 195-202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)), соответствующие остаткам 234-239, 251-256 и 273-280 из CD123 sp1. Взаимодействия антитело-антиген являются преимущественно электростатическими. Эпитоп на CD123 sp2 содержит большое количество основных остатков, тогда как CDR-области I3RB18 населены кислотными остатками. Остатки антител, вовлеченные в связывание с CD123, включают в себя 7 остатков из легкой цепи и 9 остатков из тяжелой цепи (фиг. 8). В связывании участвуют все CDR, кроме LCDR2.
Связывание I3RB18 с CD123 sp2 (фиг. 9А) отличается от другого антитела к CD123, 7G3, которое связывается с N-концевым доменом 1 в CD123 sp1 ECD, как показывают данные кристаллической структуры гуманизированного 7G3 Fab, CSL362, в комплексе с CD123 sp1 (фиг. 9В) (pdb:4JZJBroughton et al. Cell Rep. 2014; 8:410-419).
Пример 11. Кристаллическая структура Fab-фрагмента антитела к CD3.
Кристаллическую структуру SP34 Fab определяли с разрешением 2,1 А. Была выявлена полная аминокислотная последовательность и выявлены возможные мышиные зародышевые линии, из которых получен mAb SP34.
Материалы.
Моноклональное антитело SP34, мышиный изотип IgG3/λ, приобретенное в BD Biosciences Pharmingen (г. Сан Диего, штат Калифорния, США), кат. № 556611. Согласно данным спецификации они были очищены из супернатанта тканевой культуры аффинной хроматографией и хранились при 4°С. Fabфрагмент был получен путем папаинового расщепления mAb (Pierce, кат. № 44985, Thermofisher) и отделен от Fc с использованием колонки Nab Protein A Plus Spin (Pierce, кат. № 44985, Thermofisher) согласно протоколу производителя. Fab дополнительно очищали на колонке MonoS HR (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ MES, рН 6,5 (буфер А). Элюирование проводили буфером А в градиенте 13-28% 1М NaCl в 50 объемах колонки. Фракции, соответствующие основному пику, объединяли, концентрировали до 9,2 мг/мл и использовали для кристаллизации.
Кристаллизация.
Кристаллизацию проводили методом диффузии паров при 20°С в формате сидячей капли на 96- 63 037647 луночных планшетах Corning 3550. Кристалл Fab, использованный для рентгенокристаллографического анализа, был получен из 12% PEG 3350, 0,2М тартрата K/Na (рН 7,4), 3% изопропанола и 3% диоксана.
Данные кристаллографии приводятся в табл. 10.
Таблица 10
Параметры кристалла, данные рентгенографического анализа и статистика оптимизации
Параметры кристалла.
Пространственная Р21
группа Оси элементарной ячейки (А) 55,14, 141, 23, 61,29
Углы элементарной ячейки (°) Молекулы/асимм. ячейка Vm (АЗ/Да) Содержание растворителя (%) Данные рентгеноструктурного анализа. Разрешение (А) 90, 99,02, 90 2 2,48 50 30-2,1 (2,15-2,10)*
Число измеряемых отражений 179 420 (11 506)
Число уникальных отражений 53 483 (3 667)
Полнота (%) 98,9 (92 ,5)
Избыток 3, 4 (3, 1)
R-объединение 0, 038 (0, 393)
<Ι/σ> 18,7 (3, 8)
В-фактор (Уилсон) (А2) Оптимизация. Разрешение (А) Число отражений, использованных при оптимизации Полнота (%) Число всех атомов Без молекул воды R-фактор (%) R-свободные (%) RMSD длин связей (А) 45, 4 15-2,1 52 212 96, 8 6 886 219 20,5 26,2 0, 008
RMSD углов связей (°) RMSD В-фактора основной цепи (А2) 1,2 2,7
Средний В-фактор (А2) 53,7
* Числа в скобках относятся к оболочке с наивысшим разрешением.
Регистрация данных рентгеновской кристаллографии и определение структуры.
Для сбора данных рентгена один кристалл замачивали на несколько секунд в маточном растворе с добавлением 20% глицерина и мгновенно замораживали в жидком азоте. Данные по дифракции получали в Advanced Photon Source (Argonne, Иллинойс, США), канал излучения IMCA, с использованием детектора Pilatus CCD. Статистика данных рентгенографического анализа представлена в табл. 10.
Структуру разрешали с использованием молекулярной замены с применением модели Fab, созданной по мышиному антителу к антигену Томсона-Фриденрайха Jaa-F11 (PDB 3gnm), относящегося к изотипу IgG3/K. Все кристаллографические расчеты проводили с использованием пакета ССР4 программ [ССР4. 1994, Acta Crystallogr. D50:760-763]. Коррекцию модели осуществляли с помощью программы
- 64 037647
COOT [Emsley P., and Cowtan K. 2004. Acta Crystallogr. D60:2126-2132]. Данные по оптимизации приведены в табл. 10.
Последовательность SP34 показана на фиг. 10, причем остатки 1-215 легкой цепи и остатки 1-230 тяжелой цепи получены непосредственно из карты электронных плотностей, а остатки 231-455 получены из IGHG3_MOUSE (мышиный IgG3, изоформа 2).
Пример 12. Адаптация к человеческому каркасу антитела SP34 к CD3.
Мышиное антитело SP34 к человеческому CD3 было гуманизировано способом адаптации к человеческому каркасу (Fransson, et al., JMB, 2010 398 (2):214-31). Четыре разные тяжелые цепи комбинировали с тремя разными легкими цепями, получив 12 гуманизированных вариантов.
Гуманизация SP34 и созревание аффинности.
Выбор человеческих зародышевых линий.
Для исследования выбрали матрицу из человеческих последовательностей вариабельных участков четырех тяжелых и трех легких цепей. Выбор человеческих последовательностей основывался исключительно на общем сходстве последовательностей с SP34 в каркасной области (FR). При отборе не учитывались ни последовательности CDR, ни их канонические структуры.
Самыми близкими совпадениями для тяжелой цепи были человеческие зародышевые линии IGHV372 и IGHV3-73. Другая зародышевая линия, IGHV3-23, была выбрана из-за высокой частоты встречаемости в репертуаре человеческих В-клеток.
Самыми близкими совпадениями для легкой цепи были человеческие зародышевые линии IGLV743 (также известна как 7а), IGLV7-46 (также известна как 7b) и IGLV1-51 (также известна как 1b). IGLV7-46 является практически идентичной IGLV7-43, но имеет благоприятный признак присутствия Ala в положении 2, т.е. как в SP34.
В качестве J-областей были выбраны следующие: IGHJ1 для тяжелой цепи; IGLJ3 для легкой цепи лямбда.
Обратные мутации.
Чтобы сохранить конформацию CDR-H3, необходимо было сохранить остатки в нескольких каркасных областях в VL, наиболее существенными из которых являются Val38, Gly48 и Gly51 (фиг. 11). Эти обратные мутации были добавлены в план гуманизации.
Остаток Asn в положении 57 тяжелой цепи в этой структуре не имеет хорошей плотности боковой цепи. Также он находится в середине CDR-H2 и направлен от типичного сайта связывания. На основании этого анализа, он может не вносить существенного вклада в связывание. Кроме этого, такая геометрия каркаса находится в области, наиболее благоприятной для остатка Gly на графике Рамачадрана. Следовательно, в плане созревания он был обрезан до Gly, чтобы обеспечить необходимую гибкость и потенциально повысить стабильность (путем снижения связанного с неглициновым остатком локального структурного напряжения) без влияния на связывание.
При разработке плана гуманизации присутствовали еще несколько соображений. Во-первых, в человеческих зародышевых линиях IGLV7-46 и IGLV7-43 вводится остаток Trp в положении 59 с нежелательным окислительным потенциалом. В двух других зародышевых линиях в этом положении находится Gly, что соответствует мышиной последовательности. Следовательно, в обоих вариантах IGLV7-46 и IGLV7-43 сохранили Gly59. Наконец, Ala в положении 49 в VH может быть важным. Также на связывание с антигеном может влиять остаток в положении 99 (Val в SP34). Для проверки этих положений в некоторых вариантах были введены обратные мутации (фиг. 12).
Матрица HFA.
Матрица адаптации для человеческого каркаса (HFA) (табл. 11) состоит из четырех вариантов VH и трех вариантов VL (фиг. 12). Для целей HFA используется определение CDR от AbM (K.R. Abhinandan and А.С. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839).
- 65 037647
Варианты VH:
CD3H141 (SEQ ID NO: 184) : IGHV3-72*01 с мышиными
CDR+Gly49Ala
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SS
CD3H142 (SEQ ID NO: 185) : IGHV3-23*01 с мышиными
CDR+Ser49Ala
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SS
CD3H143 (SEQ ID NO: 186) : IGHV3-23*01 с мышиными
CDR+Ser49Ala, Ala99Val
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYA TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SS
CD3H144 (SEQ ID NO: 187) : IGHV3-73*01 с мышиными
CDR+Asn57Gly
EVQLVE S GGGLVQPGGS LKLS CAAS GET ENTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYA TYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SS
Варианты VL:
CD3L63 (SEQ ID NO: 188) : IGLV7-46*01 с мышиными CDR+F38V, A48G, Y51G, W59G
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPG TPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L64 (SEQ ID NO: 189) : IGLV1-51*O1 с мышиными CDR+Y38V, L48G, Y51G
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVTTSNYANWVQQLPGTAPKGLIGGTNKRAPG IPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
CD3L66 (SEQ ID NO: 190) : IGLV7-43*01 с мышиными CDR+F38V,
A48G, Y51G, W59G
QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPG TPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
- 66 037647
Таблица 11
Матрица тяжелых и легких цепей для CD3 (все были получены с использованием IgG1-AA Fc, содержащего L234A, L235A и F405L)
CD3L63 (LV7-46/W59G) SEQ ID NO. 188 CD3L64 (LV1-51) SEQ ID NO: 189 CD3L66 (LV743/W59G) SEQ ID NO: 190
CD3H141 (HV3-72+G49A) SEQ ID NO: 184 CD3B143 CD3B144 CD3B146
CD3H142 (HV3-23+S49A) SEQ ID NO: 185 CD3B147 CD3B148 CD3B150
CD3H143 (HV3-23 +S49A, A99V) SEQ ID NO: 186 CD3B151 CD3B152 CD3B154
CD3H144 (VH3-73 c G49) SEQ ID NO: 187 CD3B155 CD3B156 CD3B158
Аминокислотные последовательности подвергли обратной трансляции в ДНК, и методами генного синтеза получили кДНК (патент США № 6670127; патент США № 6521427). Вариабельные области тяжелых цепей (НС) субклонировали на человеческий IgG1-AA Fc, содержащий мутации L234A, L235A и F405L, с применением экспрессионного вектора собственной разработки с промотором CMV, используя стандартные методы молекулярной биологии. Вариабельные области легких цепей (LC) субклонировали на человеческие константные области лямбда (λ) с применением экспрессионного вектора собственной разработки с промотором CMV, используя стандартные методы молекулярной биологии. Полученные плазмиды трансфицировали в клетки Expi293F (Invitrogen) и выполняли экспрессию mAb. Очистку выполняли стандартными способами на колонке с белком А (колонка hiTrap MAbSelect SuRe). После элюирования пулы диализировали в D-PBS, рН 7,2. Последовательности VH и VL антител показаны в табл. 12.
Таблица 12
Последовательности VH и VL антител к CD3
mAb HC Аминокислотная последовательн ость VH SEQ ID NO: LC Аминокислотная последовательн ость VL SEQ ID NO:
CD3B14 3 CD3H 141 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYAASVKGRF TISRDDSKNSLYLQ MNSLKTEDTAVYYC ARHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 184 CD3 L63 QAWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQKP GQAPRGLIGGTNKR APGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTKLTVL 188
CD3B14 4 CD3H 141 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYAASVKGRF TISRDDSKNSLYLQ MNSLKTEDTAVYYC ARHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 184 CD3 L64 QSVLTQPPSVSAAP GQKVTISCRSSTGA VTTSNYANWVQQLP GTAPKGLIGGTNKR APGIPDRFSGSKSG TSATLGITGLQTGD EADYYCALWYSNLW VFGGGTKLTVL 189
CD3B14 6 CD3H 141 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYAASVKGRF TISRDDSKNSLYLQ MNSLKTEDTAVYYC ARHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 184 CD3 L66 QTWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQKP GQAPRGLIGGTNKR APGTPARFSGSLLG GKAALTLSGVQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTKLTVL 190
CD3B14 7 CD3H 142 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC ARHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 185 CD3 L63 QAWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQKP GQAPRGLIGGTNKR APGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTKLTVL 188
- 67 037647
CD3B14 8 CD3H 142 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG RGLEWVARIRSRYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC AKHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 185 CD3 L64 QSVLTQPPSVSAAP GQRVTISCRSSTGA VTTSNYANWVQQLP GTAPRGLIGGTNRR APGIPDRFSGSRSG TSATLGITGLQTGD EADYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 189
CD3B15 0 CD3H 142 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC AKHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 185 CD3 L66 QTWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQRP GQAPRGLIGGTNRR APGTPARFSGSLLG GRAALTLSGVQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 190
CD3B15 1 CD3H 143 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGET FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC VKHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 186 CD3 L63 QAWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQRP GQAPRGLIGGTNRR APGTPARFSGSLLG GRAALTLSGAQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 188
CD3B15 2 CD3H 143 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC VKHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 186 CD3 L64 QSVLTQPPSVSAAP GQRVTISCRSSTGA VTTSNYANWVQQLP GTAPRGLIGGTNRR APGIPDRFSGSRSG TSATLGITGLQTGD EADYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 189
CD3B15 4 CD3H 143 EVQLLESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQAPG KGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYC VKHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 186 CD3 L66 QTWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQRP GQAPRGLIGGTNRR APGTPARFSGSLLG GRAALTLSGVQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 190
CD3B15 5 CD3H 144 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQASG KGLEWVGRIRSKYN GYATYYAASVKGRF TISRDDSKNTAYLQ MNSLKTEDTAVYYC TRHGNFGNSYVSWF 187 CD3 L63 QAWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQRP GQAPRGLIGGTNRR APGTPARFSGSLLG GRAALTLSGAQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 188
AYWGQGTLVTVSS
CD3B15 6 CD3H 144 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQASG RGLEWVGRIRSRYN GYATYYAASVRGRF TISRDDSRNTAYLQ MNSLRTEDTAVYYC TRHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 187 CD3 L64 QSVLTQPPSVSAAP GQRVTISCRSSTGA VTTSNYANWVQQLP GTAPRGLIGGTNRR APGIPDRFSGSRSG TSATLGITGLQTGD EADYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 189
CD3B15 8 CD3H 144 EVQLVESGGGLVQP GGSLRLSCAASGFT FNTYAMNWVRQASG RGLEWVGRIRSRYN GYATYYAASVRGRF TISRDDSRNTAYLQ MNSLRTEDTAVYYC TRHGNFGNSYVSWF AYWGQGTLVTVSS 187 CD3 L66 QTWTQEPSLTVSP GGTVTLTCRSSTGA VTTSNYANWVQQRP GQAPRGLIGGTNRR APGTPARFSGSLLG GRAALTLSGVQPED EAEYYCALWYSNLW VFGGGTRLTVL 190
Было создано моноспецифическое антитело CD3B143 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 184 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A, F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B144 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 184 и VL с SEQ ID NO: 189 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B146 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 184 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B147 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 185 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B148 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 185 и VL с SEQ ID NO: 189 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B150 к CD3,
- 68 037647 содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 185 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B151 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 186 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B152 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 186 и VL с SEQ ID NO: 189 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B154 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 186 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B155 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 187 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B156 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 187 и VL с SEQ ID NO: 189 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L. Было создано моноспецифическое антитело CD3B158 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 187 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и F405L.
Пример 13. Эндогенное клеточное связывание гуманизированных хитов антител к CD3 с первичными Т -клетками.
Полученную панель антител к CD3 протестировали на связывание с CD3ε клеточной поверхности на первичных человеческих Т-клетках. Для этого связывание антител из экспрессионных супернатантов визуализировали с использованием поликлонального вторичного антитела к иммуноглобулину человека и анализировали методом проточной цитометрии. Коротко, связывание антител к CD3 с CD3ε на клеточной поверхности анализировали методом проточной цитометрии с использованием человеческих Тлимфоцитов, очищенных отрицательной селекцией (Biological Specialty, Colmar, USA). Экспрессионные супернатанты или очищенные антитела нормализовали к 10 мкг/мл в среде или в буфере для FACS (BD BioSciences) соответственно. Аликвоты по 2х105 клеток вносили в лунки 96-луночного круглодонного планшета (CoStar) для мечения. Антитела в экспрессионном супернатанте добавляли к клеткам и инкубировали в течение 45 мин при 4°С. После центрифугирования при 1300 об/мин в течение 3 мин и удаления супернатанта 50 мкл вторичного антитела к IgG человека (H+L) Alexa Fluor 647 (Life technologies Inc.) инкубировали с клетками в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин при 4°С в месте, защищенном от прямого света. Затем промывали и ресуспендировали в 30 мкл буфера для FACS (BD BioSciences). Сбор образцов выполняли в системе Intellicyt HTFC с использованием программного обеспечения ForeCyt. Перед анализом связывания проводили селекцию жизнеспособных одиночных клеток, используя зеленый или красный фиксируемый краситель для живых/мертвых клеток (Life Technologies Inc.) и параметры площади и высоты для прямого/бокового рассеяния соответственно. Графики получали в программном обеспечении GraphPad Prism версии 5, используя средние значения интенсивности флуоресценции.
Хотя была выполнена серия титрований, на фиг. 13 для ясности представлена промежуточная концентрация. В качестве контролей использовали два полученных с использованием фагов терапевтических антитела собственной разработки с одинаковой областью Fc: в качестве положительного контроля использовали не обладающее перекрестной реактивностью с яванским макаком агонистическое антитело G11 (НС SEQ ID NO: 222, LC SEQ ID NO: 223), а в качестве не связывающегося/не агонистического антитела для оценки неспецифического связывания использовали CD3B94 (HC - SEQ ID NO: 224, LC - SEQ ID NO: 225). Коммерческое антитело SP34 в этом исследовании для сравнения не использовали, поскольку это мышиное антитело, и использование другого вторичного детектирующего реагента не позволило бы напрямую сравнивать исследуемые варианты.
Данные продемонстрировали матрицу потенциала связывания в панели гуманизированных хитов антител к CD3, где два антитела (CD3B144, CD3B152) продемонстрировали полную потерю связывания с человеческими Т-клетками. Остальные антитела продемонстрировали некоторый диапазон потенциала связывания, который в широком смысле можно разделить на сильно связывающиеся и слабо связывающиеся, используя в качестве порога связывание антитела G11. По этим параметрам в панели вариантов были идентифицированы семь сильно связывающихся и семь слабо связывающихся антител (фиг. 13).
Затем проводили анализ связывания хитов антител к CD3 с первичными Т-клетками CD4+ яванского макака, чтобы оценить сохранение перекрестной реактивности. Использовали очищенные Т-клетки CD4+ из периферической крови яванского макака (Zen Bio, Triangle Research Park, США). Протоколы исследований были сходными с описанными выше. Поскольку антитело G11 не обладает перекрестной реактивностью к CD3ε яванского макака, в качестве положительного контроля в данном анализе использовали CD3B124, химерное антитело собственной разработки, полученное из SP34, имеющее VH и VL от SP34, мышиный каркас и Fc человеческого IgG1 (фиг. 14). Интересно, что несколько вариантов продемонстрировали сниженный потенциал связывания по сравнению с наблюдаемым на человеческих клетках. Сюда относились сильно связывающиеся антитела CD3B150, CD3B151 и CD3B154, у которых связывание было снижено, и несколько слабо связывающихся антител, у которых связывание выше фонового более не определялось. Такая утрата связывания не была связана с какой-то конкретной цепью имму- 69 037647 ноглобулина, и это может означать, что в потере перекрестной реактивности играет роль комбинация тяжелой и легкой цепей. В сочетании эти анализы позволили идентифицировать варианты, сохраняющие перекрестную реактивность к CD3ε человека и яванского макака.
Пример 14. Функциональный анализ гуманизированных хитов антител к CD3 в первичных Тклетках.
Анализ связывания показал, что панель хитов антител к CD3 демонстрирует некоторый диапазон связываний с Т-клетками человека и яванского макака. Чтобы исследовать способность каждого варианта к индукции активации через перекрестное связывание с CD3ε, первичные Т-клетки культивировали в течение ночи в присутствии антитела, конъюгированного с гранулами. На следующий день клетки собирали и метили антителом к CD69 для измерения активации (фиг. 15). Гуманизированные антитела к CD3 связывали с покрытыми белком А магнитными гранулами (SpheroTech, г. Лейк Форест, США) путем инкубации в течение ночи с антителом в концентрации 10 мкг/мл. На следующий день высевали по 2х 105 первичных человеческих Т-клеток на круглодонные культуральные планшеты в трех повторах и добавляли по 2х105 гранул с покрытием. После инкубации в течение ночи при 37°С клетки собирали и метили антителом к CD69 Alexa Fluor® 488 (клон FN50; Biolegend) для оценки повышения уровня этого маркера активации. Сбор образцов и анализ проводили, как описано выше применительно к связыванию. Использовали несколько отрицательных контролей, в том числе только Т-клетки, Т-клетки с гранулами без покрытия и Т-клетки с гранулами, покрытыми изотипическим контролем (CD3B94). Все эти контроли демонстрировали сходные средние значения интенсивности флуоресценции, сопоставимые с неокрашенными Т-клетками, и это означает, что фон в данном анализе был низким. Для сравнения использовали несколько положительных контролей, включая ОКТ3 (US 5929212) и коммерческие антитела SP34-2.
Гуманизированные хиты антител к CD3 далее тестировали на способность активировать первичные Т-клетки CD4+ яванского макака (Zen Bio, Triangle Research Park, США) в том же анализе (фиг. 16). Антитело FN50 к CD69 описано как перекрестно-реагирующее с нечеловеческим белком, и, следовательно, его можно использовать для проверки активации этих клеток.
Данные об активации у человека и яванского макака коррелировали с данными о связывании в том, что панель хитов продемонстрировала некоторый диапазон потенциалов активации. Ряд молекул с сильным связыванием продемонстрировал способность активировать человеческие Т-клетки в равной или большей степени по сравнению с коммерческими антителами SP34-2. Несколько вариантов продемонстрировали потенциал активации более низкий, чем у SP34-2, а некоторые связывающиеся антитела не проявили признаков стимуляции CD69. Неспособность к активации наблюдалась только у вариантов, не проявлявших или проявлявших слабое связывание, а все варианты с сильным связыванием проявили какой-либо уровень активации, что указывает на корреляцию между связыванием и потенциалом активации как в случае человека (фиг. 17А), так и в случае яванского макака (фиг. 17В).
Пример 15. Получение антител в биспецифическом формате в IgG1 L234A, L235A.
Несколько моноспецифических антител к CD123 экспрессировали в виде IgG1, имеющих в Fc замены L234A, L235A и K409R (на антителе к CD123) (нумерация согласно реестру ЕС) в Fc-областях. Моноспецифические антитела экспрессировали в клеточных линиях HEK. Моноспецифические антитела к CD3 представляли собой IgG1 с заменами в Fc L234A, L235A и F405L.
Было создано моноспецифическое антитело I3RB135-K409R к CD123, содержащее области VH и VL антитела I3RB2 к CD123, имеющего VH с SEQ ID NO: 120 и VL с SEQ ID NO: 165 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и K409R.
Было создано моноспецифическое антитело I3RB125-K409R к CD123, содержащее области VH и VL антитела I3RB18 к CD123, имеющего VH с SEQ ID NO: 136 и VL с SEQ ID NO: 168 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и K409R.
В качестве контроля было создано моноспецифическое антитело В21М к RSV, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 191 и VL с SEQ ID NO: 192 и константную область IgG1 с заменами L234A, L235A и либо K409R, либо F405L, для сочетания в качестве пустого плеча либо с CD3-, либо с CD123-плечом биспецифического антитела.
Моноспецифические антитела очищали с помощью стандартных способов с использованием колонки с белком А (колонка HiTrap MabSelect SuRe). После элюирования пулы диализировали в D-PBS, рН 7,2.
Моноспецифические антитела к CD123 объединяли во время обмена Fab-плечами in vitro в матрице с созданием биспецифических антител, которые впоследствии дополнительно характеризовали (табл. 13).
- 70 037647
Таблица 13
Матрица моноклональных антител CD123 х CD3 для получения биспецифических антител
ПЛЕЧИ CD123 Контроль
I3RB135 I3RB125 В21М, 409R
(I3RB2) (I3RB18)
mAb CD3 CD3B146 I3RB179 I3RB186 I3RB192
CD3B147 I3RB180 I3RB187 I3RB193
CD3B151 I3RB181 I3RB188 I3RB194
CD3B154 I3RB182 I3RB189 I3RB195
CD3B155 I3RB183 CD3B191 I3RB196
Контроль mAb В21М, F405L I3RB185 I3RB191 I3RB198
Биспецифические антитела к CD123 х CD3 создавали, объединяя моноспецифическое mAb к CD3 и моноспецифическое mAb к CD123 во время обмена Fab-плечами in-vitro (как описано в WO 2011/131746). Вкратце, около 1-20 мг/мл антитела к CD123/CD3 в молярном соотношении 1,08:1 в PBS, рН 7-7,4, и 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-МЕА) смешивали вместе и инкубировали при 25-37°С в течение 2-6 ч, после чего удаляли 2-МЕА посредством диализа, диафильтрации, тангенциальной поточной фильтрации и/или фильтрации в вихревой ячейке с помощью стандартных способов. Сходным образом были получены контрольные биспецифические антитела с плечом к RSV-(B21M).
Созданные моноспецифические антитела к CD3 и CD123 смешивали для обмена Fab-плечами in vitro в матрице и охарактеризовывали с помощью различных анализов. Биспецифическое антитело I3RB179-Ab содержит плечо mAb CD3B146-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB135-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB186-Ab содержит плечо mAb CD3B146-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB180-Ab содержит плечо mAb CD3B147-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB135K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB187-Ab содержит плечо mAb CD3B147-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB181-Ab содержит плечо mAb CD3B151-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB135-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB188-Ab содержит плечо mAb CD3B155-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB182-Ab содержит плечо mAb CD3B154-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB135-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB189-Ab содержит плечо mAb CD3B154-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB183-Ab содержит плечо mAb CD3B155-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB135-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB191-Ab содержит плечо mAb CD3B155-F405L, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123.
Для получения контрольных биспецифических антител антитело к RSV, B21M (НС SEQ ID NO: 207 показано с мутацией F405L, LC SEQ ID NO: 208), объединяли либо с плечом CD3, либо с плечом CD123, как описано ниже. Биспецифическое антитело I3RB185-Ab содержит плечо mAb B21M-F405L, связывающееся с RSV, и плечо mAb I3RB135-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB191-Ab содержит плечо mAb B21M-F405L, связывающееся с RSV, и плечо mAb I3RB125-K409R, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело I3RB192-Ab содержит плечо mAb B21M-K409R, связывающееся с RSV, и плечо mAb CD3B146-F405L, связывающееся с CD3. Биспецифическое антитело I3RB193-Ab содержит плечо mAb B2M-F409R, связывающееся с RSV, и плечо mAb CD3B147-F405L, связывающееся с CD3. Биспецифическое антитело I3RB194-Ab содержит плечо mAb B2M-F409R, связывающееся с RSV, и плечо mAb CD3B151-F405L, связывающееся с CD3. Биспецифическое антитело I3RB195-Ab содержит плечо mAb B21M-K4O9R, связывающееся с RSV, и плечо mAb CD3B154-F405L, связывающееся с CD3. Биспецифическое антитело I3RB196-Ab содержит плечо mAb B21M-K409R, свя- 71 037647 зывающееся с RSV, и плечо mAb CD3B155-F405L, связывающееся с CD3.
Тяжелые и легкие цепи биспецифических антител к CD123 х CD3 представлены ниже в табл. 14.
Таблица 14
Последовательности тяжелых и легких цепей биспецифических антител IgG1
Антитело Аминокислотная последовательность
I3RB179 Тяжелая цепь 1 CD3B146 (SEQ ID NO: 193) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMN WVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRF ТISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B146 (SEQ ID NO: 194) QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 203) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMH WVRQAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDT FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW
- 72 037647
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 204) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
I3RB180 Тяжелая цепь 1 CD3B147 (SEQ ID NO: 195) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B147 (SEQ ID NO: 196) QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMH WVRQAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTI
- 73 037647
(SEQ ID NO: 203) SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDT FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 204) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
I3RB181 Тяжелая цепь 1 CD3B151 (SEQ ID NO: 197) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B151 (SEQ ID QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG
- 74 037647
NO: 198) GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 203) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMH WVRQAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDT FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 204) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
I3RB182 Тяжелая цепь 1 CD3B154 (SEQ ID NO: 199) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE
- 75 037647
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B154 (SEQ ID NO: 200) QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 203) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMH WVRQAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDT FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 204) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
I3RB183 Тяжелая цепь 1 EVQLVE S GGGLVQPGGS LKLS CAAS GET ENTYAMN
- 76 037647
CD3B155 (SEQ ID NO: 201) WVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRF TISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B155 (SEQ ID NO: 202) QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 203) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMH WVRQAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDT FDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAW
- 77 037647
I3RB135 (I3RB2) (SEQ ID NO: 204) YQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
I3RB186 Тяжелая цепь 1 CD3B146 (SEQ ID NO: 193) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMN WVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRF TISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B146 (SEQ ID NO: 194) QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 205) EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTI SADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARGDGS TDL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY EPE PVTVSWNS GAL T S GVHT FPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP
- 78 037647
PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 2 I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 206) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
I3RB187 Тяжелая цепь 1 CD3B147 (SEQ ID NO:195) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B147 (SEQ ID NO: 196) QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
- 79 037647
Тяжелая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 205) EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTI SADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARGDGSTDL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPE PVTVSWNS GAL T S GVHT FPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 206) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
I3RB188 Тяжелая цепь 1 CD3B151 (SEQ ID NO: 197) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
- 80 037647
Легкая цепь 1 CD3B151 (SEQ ID NO: 198) QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 205) EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTI SADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARGDGSTDL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPE PVTVSWNS GAL T S GVHT FPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 206) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
I3RB189 Тяжелая цепь 1 CD3B154 (SEQ ID NO: 199) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMN WVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV
- 81 037647
NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь 1 CD3B154 (SEQ ID NO: 200) QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS
Тяжелая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 205) EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTI SADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARGDGS TDL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPE PVTVSWNS GAL T S GVHT FPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 206) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF
- 82 037647
NRGEC
CD3B191 Тяжелая цепь 1 CD3B155 (SEQ ID NO: 201) Легкая цепь 1 CD3B155 (SEQ ID NO: 202) Тяжелая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 205) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMN WVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAASVKGRF TISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFG NSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYA NWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTK LTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIS WVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTI SADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARGDGS TDL DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWNS GAL T S GVHT FPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Легкая цепь I3RB125 (I3RB18) (SEQ ID NO: 206) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLA WYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
Пример 16. Оценка биспецифических антител в функциональном анализе уничтожения клеток.
Анализ опосредуемой Т-клетками цитотоксичности представляет собой функциональный анализ по оценке способности биспецифических антител CD123 х CD3 к лизису клеток с использованием Т-клеток от здоровых доноров.
Был использован протокол Laszlo, et al. (Laszlo, G., et al. 2014 BLOOD 123:4, 554-561). Коротко, эффекторные клетки собирали, подсчитывали, промывали и ресуспендировали в концентрации 1 х 106 клеток/мл в среде RPMI (10% FBS). Клетки-мишени метили CFSE (Invitrogen #C34554) и ресуспендировали в концентрации 2х105 клеток/мл в RPMI (Invitrogen № 61870-036) с 10% FBS (Invitrogen № 10082-147). Эффекторные клетки (Е) и меченные CFSE клетки-мишени (Т) смешивали в соотношении Е:Т=5:1 в сте
- 83 037647 рильных 96-луночных круглодонных планшетах. В лунки добавляли аликвоту 5 мкл каждого биспецифического антитела с разными концентрациями. Культуры инкубировали 48 ч при 37°С в условиях 5% СО2. Через 48 ч к образцам добавляли буфер для окрашивания мертвых клеток LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (life technologies кат. № L10119), культуры инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, промывали и ресуспендировали в 170 мкл буфера для FACS. Вызванную препаратом цитотоксичность определяли, используя проточный цитометр CANTO II (BD Biosciences), и анализировали, используя программное обеспечение FlowJo или Dive (BD Biosciences). Интерес представляет популяция дважды позитивных клеток CFSE+/живые/мертвые+.
Представлены результаты по опосредованному Т-клетками лизису клеточных линий AML MV4-11 (фиг. 18 А и В), OCI-AML5 (фиг. 19 А и В) и OCI-M2 (фиг. 20 А и В) после 48 ч инкубации при 37°С, 5% СО2. MV4-11 и OCI-AML5 представляют собой клеточные линии с экспрессией CD123, a OCI-M2 имеет весьма низкую экспрессию CD123. Соотношение эффектор/мишень для данного исследования составляло 5:1. Для блокировки функции Fc добавляли аликвоту 2 мг/мл Fc-блокатора.
Как антитело I3RB2, так и I3RB18 при комбинировании с антителом к CD3 в биспецифический формат, эффективно уничтожают клетки CD123+. Кроме этого, данные позволяют четко ранжировать биспецифические антитела с I3RB135 (на основе I3RB2) и I3RB125 (на основе I3RB18), и биспецифические антитела I3RB125 х CD3 являются более эффективными, чем биспецифические антитела I3RB135 х CD3. В пределах каждого семейства биспецифические антитела на основе CD3B146 и CD3B155 (mAb с более высокой аффинностью) были более эффективны, чем биспецифические антитела на основе CD3B151 и CD3B154. На линии клеток OCI-M2 с низкой экспрессией CD123 наблюдается низкий уровень дозозависимой фоновой цитотоксичности.
Пример 17. Оценка биспецифического антитела I3RB186 в модели опухолевого заболевания.
Материалы и способы.
Клеточная линия. Чтобы определить эффективность биспецифического антитела I3RB186 in vivo, были выбраны опухолевые клеточные линии с высокой экспрессией CD123. Опухолевые клетки KG-1 (DSMZ, кат. № АСС 14) человеческого острого миелолейкоза (AML) культивировали in vitro в среде RPMI с добавлением инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (10% об./об.) при 37°С в воздушной атмосфере с 5% СО2. Клетки регулярно пересевали два-три раза в неделю. Клетки, достигшие фазы экспоненциального роста, собирали и подсчитывали для инокуляции клеток опухоли.
Подготовка человеческих РВМС для трансплантации. Для тестирования молекул hIgG1-AA использовали обогащенные мононуклеарами клетки человека Mononuclear Enriched Cells (кат. № 213-15-04), полученные от Biological Specialty Corporation (Colmar, штат Пенсильвания, США). РВМС выделяли путем разделения в градиенте плотности фиколла (Ficoll-Paque™ Plus, GE Healthcare Bio-Sciences AB, кат. № 17-1440-03) и добавляли аликвоты по 50х106 клеток во флаконы со средой для замораживания (Recovery Cell Culture Freezing Medium, Gibco, кат. № 12648-010). Флаконы хранили при -80°С приблизительно 24 ч, а затем переносили в жидкий азот для долговременного хранения. Для тестирования молекулы IgG4 использовали флаконы с замороженными выделенными мононуклеарными клетками периферической крови (100х106 клеток во флаконе, кат. № РВ009-3), полученные от HemaCare (г. Ван-Найс, штат Калифорния, США). Для размораживания РВМС замороженные флаконы помещали на водяную баню при 37°С. Клетки переносили в коническую пробирку, содержащую холодную среду для размораживания. Коническую пробирку центрифугировали и клетки ресуспендировали в стерильном PBS. Жизнеспособность клеток определяли методом вытеснения трипанового синего. Клетки ресуспендировали в концентрации 50х 106 клеток/мл в стерильном PBS для инъекций.
Сбор периферической крови для анализа FACS. Для этого 50 мкл крови отбирали у каждого животного через ретроорбитальный синус в пробирки, покрытые гепарином лития. Аликвоту крови 25 мкл из каждого образца помещали в 175 мкл среды (RPMI с 10% FBS) в каждый из двух 96-луночных планшетов. Планшеты центрифугировали и эритроциты лизировали, используя трехкратную обработку лизирующим буфером ACK. Оставшиеся клетки для каждого образца объединяли и окрашивали на CD45, CD3, CD8 и CD4 для количественной оценки циркулирующих человеческих Т-лимфоцитов (см. протокол Сбор/окрашивание мышиной периферической крови: протокол выделения лейкоцитов и анализа FACS).
Протокол анализа лейкоцитов методом FACS. Периферическую кровь отбирали до двух раз в ходе исследования циркулирующих человеческих РВМС методом цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). Цельную кровь (25 мкл) разводили в 175 мкл среды RPMI в 96луночных планшетах. Планшеты центрифугировали при 1400 об/мин 4 мин и супернатант сливали. Клетки ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера ACK и инкубировали на льду 5 мин. После центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 мин супернатант отбирали аспирацией. Клетки обрабатывали лизирующим буфером ACK еще два раза, промывали один раз в 200 мкл PBS и снова центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл/лунка коктейля антител в PBS, содержащего краситель Live/Dead (Invitrogen, кат. № L10119, 0,25 мкл/лунка маточного раствора. Маточный раствор представляет собой 1 флакон, разводимый в 150 мкл DMSO), и инкубирова
- 84 037647 ли при комнатной температуре в темноте 30 мин. Для мечения клеток использовали следующие антитела: CD4 (Becton Dickinson кат. № 557922, 0,5 мкл/лунка), CD8 (Invitrogen, Q010055, 0,5 мкл разведенного 1:10 в PBS/лунка), CD3 (Becton Dickinson, кат. 558117, 0,5 мкл/лунка), CD45 (BioLegend кат. 304006, 0,5 мкл/лунка). Клетки промывали 3 раза буфером для FACS (200 мкл/лунка) и ресуспендировали в 170 мкл буфера для FACS. Отбор образцов выполняли на проточном цитометрическом анализаторе BD LSR Fortessa Flow. Перед анализом связывания проводили селекцию жизнеспособных одиночных клеток, используя краситель для живых/мертвых клеток Near-IR (Life Technologies Inc.) и параметры площади и высоты для прямого/бокового рассеяния соответственно. Данные анализировали, используя программное обеспечение BD FACS Diva версии 7.
Дизайн эксперимента in vivo. Самкам мышей линии NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) подкожно вводили клетки KG-1 (5х106 клеток в фосфатно-солевом буферном растворе в объеме 200 мкл) в заднюю боковую зону каждого животного. День инокуляции опухолевыми клетками обозначали как день 0. Контроль размеров опухоли проводили дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации, пока объем опухоли не достигал 100-150 мм3 (четырнадцатый день после имплантации), и в это время мышей рандомизировали по объему опухоли на экспериментальные группы. Далее мышам внутривенно (в латеральную вену хвоста) прививали человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) (10х106 в фосфатно-солевом буферном растворе в объеме 200 мкл). Сразу после имплантации РВМС мышам проводили внутривенную терапию биспецифическими антителами I3RB186 (биспецифическое антитело разводили в PBS и вводили в объеме 100 мкл). Лечение проводили приблизительно каждый второй день, всего пять доз (точные дни введения дозы см. в табл. 15). Два раза в неделю регистрировали размер опухолей и массу тела.
Конечными точками исследований были ингибирование роста опухоли, максимальная опухолевая нагрузка (среднее значение по группе меньше 1500 мм3) и потеря массы тела больше 20% от массы тела в момент начала лечения. Размер опухоли измеряли дважды в неделю в двух направлениях с использованием штангенциркуля; объем выражали в мм3 с использованием формулы: V=0,5 a х b2, где а и b представляют собой большой и малый диаметры опухоли соответственно. Полную регрессию опухоли (CR) определяли как уменьшение опухолей до предела, который не обнаруживается при пальпации (50 мм3). Частичную регрессию опухоли (PR) определяли как уменьшение опухолей относительно исходного объема опухоли. Чтобы CR или PR расценивались как устойчивые, требовалось, чтобы CR или PR определялись минимум в течение трех или более последовательных измерений опухоли.
Приживление человеческих РВМС в конечном счете вызывало у мышей реакцию трансплантат против хозяина (GVHD), при которой имплантированные донорские Т-клетки активировались и проникали в ткани хозяина, приводя к органной недостаточности, сверхсильной потере веса и неизбежной гибели. Для отслеживания начала и тяжести GVHD в этой модели массу тела регистрировали дважды в неделю и выражали в граммах (г). Процентное изменение массы тела вычисляли по формуле: изменение массы тела = [(C - I)/I] х 100, где С представляет собой текущую массу тела, а I представляет собой массу тела при начале лечения.
В соответствующих таблицах исследований приводится сводная статистика, включая среднее и стандартную погрешность среднего (СПс) по объему опухолей и различия в объеме опухоли в каждой группе для каждой временной точки. Статистический анализ различий по объему опухоли между группами проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для повторяющихся измерений с последующим тестом Бонферрони при помощи программного обеспечения GraphPad Prism версия 5.01. Значения р <0,05 считали статистически достоверными.
Эффективность биспецифических антител к CD123 х CD3 IgG1, F234A, L235A.
Мышам NSG подкожно имплантировали клетки KG-1, а затем внутривенно трансплантировали человеческие РВМС, описанные выше, и после того как сформировались опухоли (средний объем опухоли = 102±5,9 мм3), вводили биспецифическое антитело I3RB186 к CD123 х CD3 в дозах 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг на животное, как описано выше. Подгруппе мышей с наличием опухоли не прививали РВМС, но вводили антитела, и они являлись контрольной группой для механизма действия биспецифических антител в отсутствие контрольных биспецифических антител. Кроме того, части мышей, не имевших опухолей, прививали РВМС и вводили антитела, и они были контролем для FACS-анализа периферической крови (схема эксперимента приведена в табл. 15).
- 85 037647
Таблица 15
График введения дозы для оценки эффективности I3RB186 in-vivo
Групп а Колво Опухоль РВМС Лечение Доза (мкг/животн ое) Путь введени я График введений (дни после имплантации опухоли) Отбор крови (дни после имплантаци и опухоли)
1 10 + - PBS 0 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
2 10 + - I3RB186 10 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
3 10 + - I3RB186 1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
4 10 + - I3RB186 0, 1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
5 10 + - I3RB186 0,01 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
6 10 + + PBS 0 в/в 14, 17, 20, 30
22, 24
7 10 + + I3RB186 10 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
8 10 + + I3RB186 1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
9 10 + + I3RB186 0,1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
10 10 + + I3RB186 0,01 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30
11 5 - + PBS 0 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
12 5 - + I3RB186 10 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
13 5 - + I3RB186 1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
14 5 - + I3RB186 0,1 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
15 5 - + I3RB186 0,01 в/в 14, 17, 20, 22, 24 30, 53
Результаты анализа эффективности in-vivo.
На фиг. 21 показана эффективность биспецифических антител к CD123 х CD3 IgG1-AA, I3RB186 IgG1, F234A, L235A при ксенотрансплантации клеток человеческого острого миелолейкоза (AML) KG-1 в присутствии человеческих РВМС при двух дозировках 0,1 и 1 мкг на животное (р <0,001). Биспецифические антитела в дозе 1 мкг на животное (серый заштрихованный квадрат) демонстрируют более быстрый противоопухолевый эффект, чем доза 0,1 мкг, причем полная регрессия наблюдалась у 3 из 8 животных, а частичная регрессия наблюдалась у 3 из 8 животных. Однако у 6 из 8 животных начиная с 55-го дня после имплантации опухоли наблюдали возобновление ее роста. Биспецифические антитела в дозе 0,1 мкг на животное (серый заштрихованный ромб) демонстрировали замедленную, но лучшую эффективность, и у всех животных наблюдалась полная или частичная регрессия опухоли. Эти данные демонстрируют необходимость в присутствии эффекторных Т-лимфоцитов для уничтожения клеток-мишеней биспецифическими антителами.
На фиг. 22 показан анализ методом FACS периферической крови, взятой у мышей на 30-й день после имплантации опухоли. Увеличение количества клеток CD45+, обусловленное увеличением числа Тлимфоцитов CD8+, было очевидным у мышей с наличием опухоли, получавших биспецифические антитела в дозе 0,1 и 1 мкг. Такое увеличение количества Т-лимфоцитов CD8+ происходило только при наличии клеток-мишеней (KG-1) в тех группах, где наблюдалась противоопухолевая эффективность. Напротив, доза 10 мкг биспецифического антитела, по-видимому, устраняла клетки РВМС CD45+ из периферической крови. Такое устранение эффекторных клеток может объяснять недостаток эффективности, наблюдаемый при этой дозе.
На фиг. 23 показан анализ методом FACS периферической крови, взятой у мышей на 53-й день после имплантации опухоли. Количества клеток CD45+, CD8+ и CD4+ были сходными у мышей с наличи- 86 037647 ем опухоли, получавших биспецифическое антитело в дозах 0,1 и 1 мкг, а также у мышей без опухолей, получавших PBS и дозы биспецифического антитела 0,01 и 0,1 мкг. Мыши без опухолей, получавшие биспецифическое антитело в дозах 1 и 10 мкг, имели очень низкие уровни клеток CD45+, CD8+ и CD4+;
причина этого в настоящий момент неизвестна.
На фиг. 24 показано среднее изменение массы тела в экспериментальных группах с течением времени. Как описывалось ранее, потеря массы тела коррелирует с началом и тяжестью GVHD, вызванной активированными Т-клетками. Как у мышей без опухолей, так и у мышей с опухолями потеря массы тела была наиболее тяжелой при введении 0,1 мкг биспецифического антитела. Мыши с опухолями, получавшие биспецифическое антитело в дозе 1 мкг, не испытывали резкой потери массы тела. Т-лимфоциты присутствовали на 53-й день после имплантации опухоли (по данным анализа FACS, фиг. 23), однако отсутствие потери массы тела и начало реакции GVHD указывает на отсутствие активированных Тклеток, что может объяснять возобновление роста опухоли, наблюдаемое в этой группе, начиная с 55-го дня после имплантации опухоли (фиг. 21).
Пример 18. Оценка I3RB186 и контрольных биспецифических антител (I3RB191 и I3RB192) in vivo.
Во втором эксперименте in vivo были добавлены контрольные биспецифические антитела I3RB191 с пустым плечом CD3 и I3RB192 с пустым плечом CD123. Протокол был тот же, что и в примере 16. Опухолевые ксенотрансплантаты клеток KG-1 человеческой AML подкожно имплантировали самкам мышей NSG. Через четырнадцать дней после имплантации мышей рандомизировали по объему опухоли по экспериментальным группам. Человеческие РВМС имплантировали внутривенно, а затем внутривенно вводили I3RB186 и контрольные биспецифические антитела I3RB191 и I3RB192 в дозе 1 мкг на животное (см. график введения дозы в табл. 16). Лечение проводили на 14, 16, 18, 21 и 23-й дни после имплантации опухоли. Стрелки на фигуре показывают дни введения биспецифического Ab.
Таблица 16
График дозирования для 2-го эксперимента in vivo
Групп а Колво Опухол ь РВМС Лечение Доза (мкг/животн ое) Путь введени я График введений (дни после имплантации опухоли) Отбор крови (дни после имплантации опухоли)
1 8 + + PBS 0 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36
2 8 + + I3RB192 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36
3 8 + + I3RB191 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36
4 8 + + I3RB186 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36, 63
5 8 + - PBS 0 в/в 14, 16, 18, 21, 23 н/д
6 8 + - I3RB192 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 н/д
7 8 + - I3RB191 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 Н/д
8 8 + - I3RB186 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 Н/д
9 4 - + PBS 0 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36, 63
10 4 - + I3RB186 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 36, 63
Противоопухолевая активность биспецифических Ab показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени (фиг. 25). Лечение антителом I3RB186 в дозе 1 мкг достоверно ингибировало рост опухоли (р <0,001) по сравнению с животными, получавшими PBS и контрольные биспецифические антитела.
На 36-й день после имплантации опухоли выполняли отбор периферической крови для FACSанализа циркулирующих человеческих клеток РВМС. В отличие от первого исследования не было отмечено различия в частоте появления человеческих РВМС CD45+ (а) или Т-лимфоцитов CD8+ и CD4+ (b) у животных, получавших I3RB186, по сравнению с PBS и I3RB191 (фиг. 26). Клетки CD45+, CD8+ и CD4+ реже встречались у животных с опухолями и животных без опухолей, получавших I3RB192, контрольные биспецифические антитела с пустым плечом CD123.
На 63-й день после имплантации опухоли выполняли отбор периферической крови для FACSанализа циркулирующих человеческих клеток РВМС. Из мышей с опухолями выжили только животные, получавшие I3RB186 в дозе 1 мкг (фиг. 27). Не было отмечено увеличения частоты встречаемости человеческих РВМС CD45+ (а) и Т-лимфоцитов CD8+ (b) у мышей с опухолями, получавших 1 мкг I3RB186, по сравнению с мышами без опухолей, получавших PBS или 1 мкг I3RB186 (фиг. 25). Т-лимфоциты CD4+ с равной частотой встречались во всех оставшихся группах. Мыши без опухолей, получавшие PBS
- 87 037647 и 1 мкг I3RB186, имели очень низкую частоту появления клеток CD45+, CD8+ и CD4+.
На фиг. 28 показано среднее изменение массы тела в экспериментальных группах с течением времени. Как описывалось ранее, потеря массы тела коррелирует с началом и тяжестью GVHD, вызванной активированными Т-клетками. У мышей с опухолями была отмечена более выраженная потеря массы тела при лечении 1 мкг биспецифического антитела по сравнению со всеми другими группами. Это противоречит первому исследованию, в котором мыши с опухолями, получавшие 1 мкг биспецифического антитела, не испытывали резкой потери массы тела. Т-лимфоциты присутствовали на 63-й день после имплантации опухоли (фиг. 27), однако эффективность дозы 1 мкг была не так выражена, как в первом исследовании (фиг. 21, 25).
Пример 19. Получение антител в биспецифическом формате в IgG4 S228P, F234A, L235A.
Несколько моноспецифических антител к CD3 и CD123 экспрессировали в виде IgG4, S228P, F234A и L235Ax (плечо CD123) или имеющего в Fc-областях замены S228P, F234A, L235A, F405L и R409K (плечо CD3) (нумерация согласно индексу ЕС).
Моноспецифические антитела экспрессировали в клеточных линиях СНО под контролем промоторов CMV.
Было создано моноспецифическое антитело CD3B219 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 184 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, L235A, F405L и R409K. Было создано моноспецифическое антитело CD3B217 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 186 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, L235A, F405L и R409K. Было создано моноспецифическое антитело CD3B218 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 186 и VL с SEQ ID NO: 190 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, L235A, F405L и R409K. Было создано моноспецифическое антитело CD3B220 к CD3, содержащее области VH и VL, имеющее VH с SEQ ID NO: 187 и VL с SEQ ID NO: 188 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, L235A, F405L и R409K.
Было создано моноспецифическое антитело I3RB218 к CD123, содержащее области VH и VL антитела I3RB2 к CD123, имеющего VH с SEQ ID NO: 120 и VL с SEQ ID NO: 165 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A. Было создано моноспецифическое антитело I3RB217 к CD123, содержащее области VH и VL антитела I3RB18 к CD123, имеющего VH с SEQ ID NO: 136 и VL с SEQ ID NO: 168 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A и L235A.
В качестве контроля было создано моноспецифическое антитело к RSV, полученное из В21М, которое содержит области VH и VL, имеющие VH из SEQ ID NO: 191 и VL с SEQ ID NO: 192 и константную область IgG4 с заменами S228P, F234A, L235A или F234A, L235A, R409K, F405L для сочетания в качестве пустого плеча либо с CD3-, либо с CD123-плечом биспецифического антитела.
Эти моноспецифические антитела были очищены, и полученные моноспецифические антитела к CD3 и CD123 смешивали для обмена Fab-плечами in vitro в матрице (табл. 12), как описывалось ранее в примере 15, и охарактеризовали различными видами анализов. Биспецифическое антитело Ab7959 содержит плечо mAb CD3B219-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB217-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab3978 содержит плечо mAb CD3B217-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB217-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab7955 содержит плечо mAb CD3B218-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB217R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab9958 содержит плечо mAb CD3B220F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB217-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab8747 содержит плечо mAb CD3B219-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB218-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab8876 содержит плечо mAb CD3B217-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB218-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab4435 содержит плечо mAb CD3B218-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB218-R409, связывающееся с CD123. Биспецифическое антитело Ab5466 содержит плечо mAb CD3B220-F405L, R409K, связывающееся с CD3, и плечо mAb I3RB218-R409, связывающееся с CD123.
В качестве контрольных биспецифических антител создавали антитела В2М1 в формате IgG4 PAA, очищали их и объединяли либо с плечом CD3, либо с плечом CD123 согласно матрице, приведенной в табл. 17 ниже.
- 88 037647
Матрица биспецифических антител IgG4
CD3B219 (I3RB146) SEQ ID NO: 210, 211 CD3B217 (I3RB151) SEQ ID NO: 212, 213 CD3B218 (I3RB154) SEQ ID NO: 214, 215 CD3B220 (I3RB155) SEQ ID NO: 216, 217 B21M IgG4, F045L CD3 пустое
I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 218, 219 7959 3978 7955 9958 CDS пустое 1 (4309)
I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 220, 221 8747 8876 4435 5466 CD3 пустое 2 (6601)
B21M IgG4, K409R CD123 пустое CD123 пустое 1 CD123 пустое 2 CD123 пустое 3 CD123 пустое 4 CD123 CDS пустое (3244)
Таблица 17
Тяжелые и легкие цепи биспецифических антител к CD123 х CD3 представлены в табл. 18.
Таблица 18
Последовательности тяжелых и легких цепей биспецифических антител IgG4-PAA
Антитело Цепь Аминокислотная последовательность
7959 Тяжелая цепь 1 CD3B219 (I3RB146) SEQ ID NO: 210 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSK NSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 1 CD3B219 (I3RB146) SEQ ID NO: 211 QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 218 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVR QMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSI STAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIЕКТISKAKGQPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
- 89 037647
ID NO: 219 SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3978 Тяжелая цепь 1 CD3B217 (I3RB151) SEQ ID NO: 212 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 1 CD3B217 (I3RB151) SEQ ID NO: 213 QAWT QE P S L T VS P GGT VT L T CRS S T GAVT T S NYANWVQ QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPS VTLFPPSSEELQANKATLVCLISDΕΥPGAVTVAWKADSS PVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYS CQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 218 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQ MPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYS PS FQGQVTISADKS1ST AYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 219 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
7955 Тяжелая цепь EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ
- 90 037647
1 CD3B218 (I3RB154) SEQ ID NO: 214 APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 1 CD3B218 (I3RB154) SEQ ID NO: 215 QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 218 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQ MPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYS PS FQGQVTISADKS1ST AYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 219 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9958 Тяжелая цепь 1 CD3B220 (I3RB155) SEQ ID NO: 216 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTENTYAMNWVRQ ASGKGLEWVGRIRSKYNAYATYYAASVKGRFTISRDDSK NTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT
- 91 037647
VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD3B220 (I3RB155) SEQ ID NO: 217 QAWT QE P S L T VS PGG T VT L T CRS S T GAVT T SNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGA QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 218 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQ MPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIST AYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB217 (I3RB18) SEQ ID NO: 219 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISR LEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
8747 Тяжелая цепь 1 CD3B219 (I3RB146) SEQ ID NO: 210 EVQLVE S GGGLVQPGGS LRLS CAAS GET ENTYAMNWVRQ APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSK NSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP
- 92 037647
QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 1 CD3B219 (I3RB146) SEQ ID NO: 211 QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 220 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVR QAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDTFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 221 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
88761 Тяжелая цепь 1 CD3B217 (I3RB151) SEQ ID NO: 212 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
- 93 037647
Легкая цепь 1 CD3B217 (I3RB151) SEQ ID NO: 213 QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPS VTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSS PVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYS CQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 220 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVR QAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDTFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 221 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
4435 Тяжелая цепь 1 CD3B218 (I3RB154) SEQ ID NO: 214 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 1 CD3B218 (I3RB154) QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGV QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA
- 94 037647
SEQ ID NO: 215 GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 220 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVRQ APGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDTFDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 221 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
5466 Тяжелая цепь 1 CD3B220 (I3RB155) SEQ ID NO: 216 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ ASGKGLEWVGRIRSKYNAYATYYAASVKGRFTISRDDSK NTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
CD3B220 (I3RB155) SEQ ID NO: 217 QAWT QE P S L T VS PGG T VT L T CRS S T GAVT T SNYANWVQQ KPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGA QPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKA GVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS
Тяжелая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 220 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHWVR QAPGKGLEWVSAIRSDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGVIEDTFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PE PVTVSWNSGALT SGVHT FPAVLQS SGL YS LS SWTV PSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Легкая цепь 2 I3RB218 (I3RB2) SEQ ID NO: 221 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
- 95 037647
Пример 20. Одновалентная аффинность биспецифических антител к CD123 в формате IgG4-PAA при использовании рекомбинантного антигена.
Были проведены эксперименты методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для определения кинетики и аффинности связывания биспецифических антител CD3 х CD123 с человеческими
CD123 SP1 ECD и CD123 SP2 ECD.
Аффинности биспецифических антител 3978, 7955, 7959, 9958, 8876, 8747, 5466 к CD123 х CD3 к рекомбинантному человеческому CD123 SP1 и рекомбинантному человеческому CD123 SP2 ECD измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением прибора Biacore. Кинетические исследования выполняли при 25°С, используя прибор Biacore T200 (Biacore, Inc., в настоящее время входит в GE Healthcare). Специфическое козье антитело к человеческому IgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories продукт № 109-005-098) ковалентно присоединили к покрытым карбоксиметилдекстраном золотым поверхностям сенсорного чипа СМ-5 (GE Healthcare). Карбоксиметильные группы декстрана активировали при помощи N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и Nгидросукцинимида (NHS). Антитела к Fc присоединяли при рН 4,5 в 10 мМ растворе ацетата натрия. Оставшиеся реакционноспособные сайты на поверхности блокировали путем реакции с этаноламином. Для измерений кинетики связывания антитела к CD123 захватывали на антитела, специфичные к человеческому Fcy. Было захвачено 40-70 ОЕ антител. После захвата антител выполняли инъекцию человеческого CD123 SP1 или человеческого CD123 SP2 в концентрациях от 0,4 до 400 нМ со скоростью 40 мкл/мин. Данные об ассоциации собирали в течение 2 мин, после чего в течение 10 мин собирали данные о диссоциации. Поверхность регенерировали, используя 30 мкл 100 мМ Н3РО4, 100 мкл/мин, а затем 50 мМ NaOH. Образцы для кинетического анализа готовили в буфере на основе PBS (D-PBS, содержащий 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20). Приведенные данные представляют собой разность сигнала SPR между проточной ячейкой, содержащей захваченное антитело и эталонной ячейкой, не содержащей захваченного антитела. Дополнительно погрешность, вносимую прибором в сигнал, устраняли, вычитая данные пустой инъекции из сигнала с вычтенным эталонным сигналом. Данные анализировали, аппроксимируя фазы ассоциации и диссоциации при всех концентрациях (глобальная аппроксимация) моделью связывания 1:1, используя программное обеспечение BIAevaluation (BIAcore, Inc.). В табл. 20 и 21 приводятся сводные результаты по кинетике и аффинности, полученные Biacore. В обеих таблицах приводятся данные, полученные в трех или более независимых экспериментах.
Данные Biacore показывают, что в пределах одного семейства биспецифические антитела, полученные из I3RB18, и биспецифические антитела, полученные из I3RB2, имеют сходные аффинности связывания с CD123 SP1 (табл. 19) и сходные аффинности связывания с CD123 SP2 (табл. 20). Биспецифические антитела, полученные из I3RB18, связываются с рекомбинантным CD123 SP1 более чем в 10 раз сильнее, чем биспецифические антитела, полученные из I3RB2, с аффинностями ~1 нМ и 14 нМ соответственно. При связывании с рекомбинантным CD123 SP2 биспецифические антитела, полученные из I3RB18, связываются более чем в 5 раз сильнее, чем биспецифические антитела, полученные из I3RB2, с аффинностями ~0,3 нМ и 1,7 нМ соответственно. Стандартные отклонения в табл. 19 и 20 показывают очень высокую воспроизводимость данных.
- 96 037647
Таблица 19
Полученные с помощью Biacore данные по кинетике и аффинности связывания биспецифических
антител с рекомбинантным человеческим CD123 SP1
ID образц а Обычное название Средн. коп (М^с-1) Станд. откл. коп (М^с-1) Средн. kOff (С1) Станд. откл. kOff (С1) Средн . KD (нМ) Станд. откл. KD (нМ)
3978 CD123(В18) X CD3(В151) 5,64Е+ 05 3,82Е+04 8, ЗОЕ-04 4,70Е-05 1,47 0,129
7955 CD123(В18) CD3(В154) 5,62Е+ 05 4,53Е+04 8,40Е-04 5,ЗОЕ-05 1,49 0,153
7959 CD123(В18) CD3(В146) 5,79Е+ 05 3,55Е+04 8,80Е-04 5,40Е-05 1,53 0,132
9958 CD123(В18) X CD3(В155т) 5,87Е+ 05 4,57Е+04 7,90Е-04 5,00Е-05 1,34 0,135
8876 CD123(В2) CD3(В151) 3,43Е+ 05 1,10Е+04 4,90Е-03 1,20Е-04 14,4 0,583
4435 CD123(В2) X CD3(В154) 3,37Е+ 05 1,25Е+04 4,80Е-03 1,60Е-04 14,3 0,713
8747 CD123(В2) CD3(В146) 3,37Е+ 05 1,25Е+04 4,80Е-03 2,10Е-04 14,3 0,821
5466 CD123(В2) 3,71Е+ 6,43Е+03 5,10Е-03 6,70Е-05 13,7 0,298
X CD3(В155т) 05
3244 В21М х В21М НС НС НС НС НС НС
I3RB18 тАЪ для Fab I3RB119 7,73Е+ 05 5,68Е+04 7,20Е-04 3,60Е-05 0,935 0,083
НС - нет связывания
- 97 037647
Таблица 20
Полученные с помощью Biacore данные по кинетике и аффинности связывания биспецифических антител к CD123 с рекомбинантным человеческим CD123 SP2
ID образц а Обычное название Средн. kon Станд. откл. kon (ΜΎ1) Средн. kOff (С1) Станд. откл . kOff (o'1) Средн. KD (нМ) Станд. откл. KD (нМ)
3978 CD123(B18) х CD3(В151) 3,12E+06 6,34E+05 l,10E-03 5,30E-05 0,356 0,074
7955 CD123(B18) х CD3(В154) 3,33E+06 9,37E+05 l,10E-03 2,90E-05 0,344 0,097
7959 CD123(B18) х CD3(В146) 3,78E+06 5,43E+05 l,30E-03 1,30E-04 0,335 0,06
9958 CD123(B18) x CD3(B155m) 3,57E+06 9,82E+05 l,10E-03 6,90E-05 0,311 0,088
8876 CD123(B2) x CD3(B151) 2,83E+06 4,07E+05 5,00E-03 1,30E-04 1,75 0,255
4435 CD123(B2) x CD3(B154) 2,88E+06 5,51E+05 5,00E-03 3,20E-04 1,74 0,349
8747 CD123(B2) x CD3(B146) 3,19E+06 1,05E+06 5,20E-03 4,50E-04 1,63 0,558
5466 CD123(B2) x CD3(B155m) 2,88E+06 2,86E+05 4,90E-03 2,80E-04 1,69 0,193
3244 B21M x B21M HC HC HC HC HC HC
НС - нет связывания
Пример 21. Одновалентная аффинность биспецифических антител к CD123 в формате IgG4-PAA к антигену, экспрессированному на поверхности клеток, по данным MSD-CAT.
Одновалентные аффинности выбранных биспецифических антител к CD123 к экспрессированным на клеточной поверхности hCD123 SP1 и SP2 получали с использованием методики MSD-Cell Affinity Technique (MSD-CAT). MSD-CAT был разработан как собственный метод без использования меток, предназначенный для определения аффинности на интактных клетках в формате, обеспечивающем высокую производительность. Эти эксперименты выполняли для оценки аффинности и специфичности связывания потенциальных антител к CD123 с экспрессированными на клеточной поверхности молекулами CD123 SP1 и CD123 SP2 человека. Использовались человеческие клеточные линии pDisplay CD123SP1 и pDisplay CD123SP2. Использовали антитело, являющееся отрицательным контролем, для проверки того, связывается ли каркас биспецифических антител неспецифическим образом с клетками, и для дифференциации неспецифического и специфического связывания с CD123. Чтобы измерить аффинность этих взаимодействий с использованием метода MSD-CAT, приготовили серию смесей с фиксированной концентрацией антител к CD123 (800, 160, 32 и 6 пМ) и различными концентрациями клеток (от 20 миллионов до 1016 клеток/мл) и дали им достичь равновесия путем вращательного перемешивания планшетов в течение 24 ч при 4°С. Эти образцы были приготовлены в среде DMEM Glutamax, содержащей 0,05% азида, 1% BSA и 3 мМ EDTA. Количества рецепторов, составлявшие (0,29-1,08)х106 hCD123 SP1/клетка и (0,57-1,5)х106 hCD123 SP2/клетка, конвертировали в молярную концентрацию рецепторов в смеси, основываясь на объеме реакционной смеси, плотности клеток (клеток/л) и числе Авогадро. Это давало концентрации в диапазоне от 35 нМ до 0,5 М для человеческого CD123 SP1; и от 49 нМ до 0,97 пМ для человеческого CD123 SP2. После доведения до равновесия планшет центрифугировали в течение 5 мин при ~1000 об/мин и определяли в супернатанте свободные антитела к CD3. Свободные антитела к CD123 в смеси определяли по электрохемилюминесценции (ECL) с использованием сканера Mesoscale Discovery (MSD). Для определения антител к CD123 в доведенной до равновесия смеси методом электрохемилю- 98 037647 минесцентного иммуноанализа (ECL) были приготовлены планшеты для обнаружения. Чтобы приготовить планшеты для обнаружения (антиген, связанный с планшетами SA-MSD), стандартные планшеты MSD со стрептавидином блокировали буфером для анализа по 50 мкл/лунка (PBS, (Life Sciences GIBCO 14190-136), 0,05% твин 20, 0,2% BSA) в течение 5 мин. Буфер для анализа удаляли без промывки и в планшеты MSD добавляли по 50 мкл/лунка 0,7 мкг/мл биотинилированного антигена в буфере для анализа и инкубировали в течение ночи (~16 ч при 4 °С). После инкубации в течение ночи планшеты блокировали, добавляя по 150 мкл/лунка буфера для анализа без удаления покрывающего антигена, инкубировали в течение ~1 ч при температуре окружающей среды и промывали 5 раз промывочным буфером (буфер для анализа без BSA). Из планшета с образцами переносили по 50 мкл/лунка супернатантов в покрытые антигеном планшеты, инкубировали в течение 60 мин, а затем 3 раза промывали промывочным буфером. После этого добавляли по 50 мкл в лунку меченных рутением детектирующих антител (к человеческим H+L) и инкубировали в течение 1 ч. Через 1 ч планшеты промывали промывочным буфером и добавляли по 150 мкл в лунку буфера для считывания MSD (Read Buffer T 4X, R92TD-2, MSD). После этого планшеты сразу же сканировали на сканере MSD Sector Imager 6000а, определяя уровни люминесценции. Сигнал ECL, определенный сканером MSD, выражали в % свободного антитела в смеси и данные анализировали для определения аффинности с применением пользовательского уравнения (выведенного на основании закона действующих масс), введенного в программное обеспечение Prism. Результаты экспериментов с MSD-CAT представлены в табл. 21.
Таблица 21
Полученные методом MSD-CAT данные об аффинности антител к CD123 с экспрессированным на поверхности клеток человеческим CD123 SP1 и человеческим CD123 SP2
Данные были аппроксимированы моделью связывания 1:1 с помощью нелинейного метода наименьших квадратов.
ID образца KD, [пМ] человека Клетки CD123 SP1 KD, [пМ] человека Клетки CD123 SP2
3978 153 ± 124 528 ± 296
7955 136 ± 105 436 ± 255
7959 149 ± 98 461 ± 290
9958 121 ± 80 538 ± 430
8876 1291 ± 556 2450 ± 2104
4435 1531 ± 1093 3701 ± 1898
8747 1761 ± 1337 2211 ± 1003
5466 2431 ± 1222 1722 ± 1638
3244 Нет связывания Нет связывания
mAb I3RB18 * 47 ± 14 * 49 ± 36
mAb I3RB2 н/д * 36 ± 20
Н/Д=нет данных, анализ не выполнялся
Измеренные методом MSD-CAT аффинности биспецифических антител к экспрессированному на поверхности клеток CD123 SP1 были более чем в 6 раз выше, чем по данным SPR для рекомбинантного CD123 SP1; однако аффинности к экспрессированному на поверхности клеток CD123 SP2 были сходными с аффинностями к рекомбинантному CD123 SP2 (разница < чем в 2 раза). Разница в аффинностях к CD123 SP1 по данным SPR и MSD-CAT, вероятнее всего, обусловлена презентацией антигена на клеточной поверхности в сравнении с рекомбинантным антигеном. Анализ MSD-CAT показал, что биспецифические антитела, полученные из I3RB18 (3978, 7955, 7959, 9958), лучше всего связываются с экспрессированным на поверхности клеток человеческим CD123 SP1 и человеческим CD123 SP2 с пикомолярными аффинностями. Аффинности биспецифических антител, полученных из I3RB18, приблизительно в 10 раз и приблизительно в 5 раз выше, чем аффинности биспецифических антител, производных от I3RB2, по отношению к экспрессированному на поверхности CD123 SP1 и CD123 SP2 соответственно. Аффинно- 99 037647 сти биспецифических антител в пределах одного семейства были сходными.
В целом анализы молекулярных взаимодействий методами Biacore и MSD-CAT согласуются, демонстрируя, что биспецифические антитела, полученные из I3RB18, прочнее связываются с рекомбинантным и экспрессированным на поверхности клеток CD123 (SP1 и SP2), чем биспецифические антитела, полученные из I3RB2.
Пример 22. Одновалентная аффинность к CD123 биспецифических антител в формате IgG4-PAA к антигену, экспрессированному на поверхности клеток, по данным проточной цитометрии.
Проточную цитометрию использовали для измерения значений аффинности нескольких биспецифических антител к CD123 х CD3 к CD3 на человеческих Т-клетках (Biological Specialty, Colmar, США) и Т-клетках яванского макака (Zen Bio, Triangle Research Park, США). Формат исследования включал в себя конкурентное связывание с использованием фиксированной концентрации меченых mAb к CD3 известной аффинности и повышающихся концентраций немеченых исследуемых mAb (Ashkenazi A. et al. PNAS: 88:10535, 1991). Использовали моноклональное антитело к CD3 CD3B146 hu IgG1-AlaAla F405L со значением аффинности, сходным с SP34-2. Величину Kd для SP34-2 определяли с использованием связывания с насыщением, и примеры кривых связывания с Т-клетками человека и яванского макака показаны на фиг. 29. На фиг. 30 представлено конкурентное связывание с меченым В146 и с различными концентрациями немеченых биспецифических антител к CD123 х CD3, полученное для Т-клеток человека (фиг. 30 А) и яванского макака (фиг. 30В). Значения, полученные для Т-клеток человека и яванского макака, были сопоставимыми. Среди проанализированных образцов наблюдались три группы аффинности к CD3: высокая (9-15 нМ), средняя (25-50 нМ) и низкая (110-270 нМ), данные по которым сведены в табл. 22.
Таблица 22 Значения аффинности (Kd) биспецифических антител CD123 х CD3 к Т-клеткам человека и яванского макака - конкурентное связывание с использованием меченых антител B146 и повышающихся концентраций немеченых антител
Т-клетки человека Т-клетки яванского макака
Биспецифически е антитела Kd (нМ) Kd (нМ)
3978 241,2 + /- 57,3 215,0 +/- 17,1
8876 169,2 + /- 27,9 109,6 +/- 4,8
CD123 пустое 2 266 +/- 78,0 217 +/- 18,0
7955 209,6 + /- 31,8 169,1 +/- 8,8
4435 173,6 + /- 48,6 138,9 +/- 2,8
CD123 пустое 3 200,5 + /- 67,3 236, 7 +/- 16,4
7959 11,0 +/- 4,3 11,2 +/- 0,3
8747 9, 6 +/- 1,5 9,5 +/- 0,1
CD123 пустое 1 13,2 +/- 3,0 13,4 +/- 0,3
9958 43,0 +/- 10, 6 29,1 +/- 1,2
5466 27,9 +/- 9,3 25,3 +/- 1,1
CD123 пустое 4 48,6 +/- 14,8 36, 8 +/- 0,5
CD3B146 3,2 +/- 1,2 1,1 +/- 0,1
Пример 23. Оценка биспецифических антител IgG4-PAA CD123 х CD3 в функциональном тесте уничтожения клеток.
Анализ опосредуемой Т-клетками цитотоксичности, описанный в примере 16, использовали для оценки способности биспецифических антител CD123 х CD3 к лизису клеток с использованием Т-клеток от двух здоровых доноров. Для этих экспериментов использовали клетки OCI-AML5, KG-1 и JIM3. JIM3 представляет собой миеломную клеточную линию без экспрессии CD123, и она была использована в качестве контроля. Клетки обрабатывали биспецифическими антителами в течение 48 ч. Соотношение Е:Т
- 100 037647 для этого исследования составило 5:1, и для блокирования функций Fc-области был добавлен блокатор
Fc в концентрации 2 мг/мл.
Представлены результаты по опосредованному Т-клетками лизису клеточных линий OCI-AML (фиг. 31), KG-1 (фиг. 32) и JIM3 (фиг. 33) после 48 ч инкубации при 37°С, 5% CO2. MV4-11 и OCI-AML 5 представляют собой клеточные линии с экспрессией CD123, а JIM3 не имеет или имеет очень низкую экспрессию CD123. Соотношение эффектор/мишень для данного исследования составляло 5:1. Для блокировки функции Fc добавляли аликвоту 2 мг/мл Fc-блокатора.
Результаты сходны с предыдущими экспериментами по уничтожению клеток с использованием биспецифических антител к CD123 х CD3 в формате IgG1-AA. Как антитело I3RB217 (I3RB18), так и антитело I3RB218 (I3RB2) при объединении с антителом к CD3 в биспецифический формат эффективно осуществляли специфическое уничтожение клеток CD123+. Уничтожение клеток является специфичным к CD123-содержащим клеткам, что подтверждается отсутствием эффекта в отношении клеток JIM3. Более того, данные позволяют четко ранжировать биспецифические антитела I3RB218 (на основе I3RB2) и I3RB217 (на основе I3RB18), причем биспецифические антитела I3RB217 х CD3 являются более эффективными, чем биспецифические антитела I3RB218 х CD3, что согласуется с предыдущими данными по уничтожению клеток.
Пример 24. Анализ биспецифических антител в тесте на гетеродимеризацию рецептора.
Тест на димеризацию рецептора DiscoveRx для IL3RA/CD131 (DiscoveRx 93-0969-C1) применили для анализа способности антител к CD123 предотвращать индуцированную IL3 гетеродимеризацию IL3Ra(CD123)/IL3RP(CD131). Молекулы CD123 и CD131 метили при помощи ProLink™ (PK) или Enzyme Acceptor (EA). При индуцированной IL3 активации эти белки димеризуются с образованием рецептора к IL3, заставляя два компонента β-gal дополнять друг друга и формировать активный фермент. Активный β -gal генерирует сигнал хемилюминесценции в присутствии субстрата. Антитела к CD123 или биспецифические антитела, демонстрирующие уменьшение сигнала при увеличении концентрации антител, способны предотвращать гетеродимеризацию.
Клетки тестировали на увеличение ферментативной активности в присутствии лиганда IL-3 с применением проявляющих реагентов PathHunter® (DiscoveRx) согласно протоколу производителя. Клеточные линии HEK293 IL3RA-PK/CSF2RB-EA высевали в 20 мкл среды для анализа в четырех повторах на 384-луночные планшеты по 5000 клеток/лунка. Маточные растворы антител последовательно разводили в 0,1% BSA/PBS так, чтобы высокая концентрация соединения составляла 10 мкг/мл. Высокую дозу последовательно разводили в соотношении 1:3 и тестировали 11 доз. В лунки добавляли по 5 мкл разведенного антитела. Клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Маточный раствор рекомбинантного человеческого IL-3 с концентрацией 100 мкг/мл разводили таким образом, чтобы в каждую лунку добавлять по 5 мкл раствора с концентрацией 60 нг/мл IL-3. Итоговая концентрация IL-3 составила 10 нг/мл. Клетки инкубировали в течение дополнительных 6 ч при 37°С. К клеткам добавляли проявляющий реагент PathHunter Flash Detection Reagent, содержащий лизирующий буфер и субстрат фермента, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и сканировали на люминометре Envision. Данные проанализировали с помощью статистического программного пакета GraphPad Prism 6. Кривые аппроксимировали сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном (четырехпараметрической), без ограничений; метод аппроксимации=наименыпие квадраты (нормальная подгонка).
В анализе тестировали биспецифические антитела IgG4 PAA 8747 и 7959, а также их исходные антитела I3RB218 и I3RB217. Анализ проводили два независимых раза в присутствии 10 нг/мл IL-3, а для сравнения в исследовании применяли положительный контроль антитело 7G3 к CD123. Антитела, содержавшие последовательность плеча к CD123 антитела I3RB18, т.е. I3RB217 и 7959 (фиг. 34С и D), оказались способны предотвращать образование функционального рецептора к IL-3 в присутствии лиганда IL-3. Антитела, содержавшие последовательность плеча к CD123 антитела I3RB2, т.е. I3RB218 и 8747 (фиг. 34 А и В), не предотвращали в этом тесте образование функционального рецептора к IL-3. Это согласуется с предыдущими данными, показавшими, что I3RB18 может ингибировать нижележащую сигнализацию, связанную с функциональным рецептором IL-3.
Пример 24. Оценка нескольких биспецифических антител в модели опухоли KG-1.
Несколько биспецифических антител CD123 х CD3 оценивали на эффективность в модели острого миелолейкоза (AML) на мышах с клетками KG-1, как описано выше. Протокол был таким же, как в исследованиях по примерам 16 и 17, за исключением того, что для тестирования биспецифических антител IgG4 использовали флаконы с выделенными человеческими мононуклеарами периферической крови (100х106 клеток во флаконе, кат. № РВ009-3), приобретенные в компании HemaCare (г. Ван-Найс, штат Калифорния, США). Мышам NSG подкожно инокулировали клетки KG-1, а затем после формирования опухоли (средний объем опухоли=135,7±4,7 мм3), им внутривенно прививали человеческие РВМС. Далее мышам вводили биспецифические антитела IgG4 РАА к CD123 х CD3 с различными аффинностями и контрольные биспецифические антитела в разных дозах, как описано в табл. 23.
- 101 037647
Таблица 23
График введения доз для 3-го исследования in vivo
Групп а Колво Опухол ь РВМС Лечение Доза (мкг/ животное) Путь введения График введений (дни после имплантации опухоли) Отбор крови (дни после имплантаци и опухоли)
1 10 + + PBS 0 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
2 10 + + 7959 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
3 10 + + 7959 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
4 10 + + 9958 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
5 10 + + 9958 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
6 10 + + 8747 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
7 10 + + 8747 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
8 10 + + 8747 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
9 10 + + 3978 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
10 10 + + 3978 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
11 10 + + 3978 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
12 10 + + 8876 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
13 10 + + 8876 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
14 10 + + 8876 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
15 10 + + CD3 пустое 1 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
16 10 + + CD3 пустое 1 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
17 10 + + CD3 пустое 1 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
18 10 + + CD3 пустое 2 о,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
19 10 + + CD3 пустое 2 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
20 10 + + CD3 пустое 2 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
21 10 + + CD123 пустое 1 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
22 10 + + CD123 пустое 1 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
23 10 + + CD123 пустое 1 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
24 10 + + CD123 пустое 2 0,1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
25 10 + + CD123 пустое 2 1 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
26 10 + + CD123 пустое 2 10 в/в 14, 16, 18, 21, 23 31
Результаты исследования эффективности in vivo нескольких биспецифических антител к CD123 х CD3 представлены на фиг. 35-42. На фиг. 35-38 показана эффективность биспецифических антител CD123 х CD3 IgG4-PAA с разными аффинностями и разными дозами при ксенотрансплантации клеток KG-1 человеческого AML. На фиг. 35 биспецифические антитела с высокоаффинными плечами CD123 и CD3 проявили существенную эффективность в сравнении с PBS и контрольными биспецифическими антителами с 25-го по 36-й день после имплантации опухоли (р <0,001). Биспецифическое антитело 9958 в дозе 1 мкг имело существенную эффективность по сравнению с дозой 0,1 мкг и обеими дозами биспецифического антитела 7959 к 36-му дню после имплантации опухоли (р <0,01). Это указывает, что высокая аффинность плеч CD123 и CD3 является необходимой для выраженной эффективности в данной модели.
На фиг. 36 показано, что биспецифическое антитело 3978 в дозе 10 мкг проявило существенную эффективность в сравнении с PBS и контрольными биспецифическими антителами, начиная с 28-го дня (р <0,05) и до 36-го дня (р <0,001) после имплантации опухоли, в дозе 1 мкг с 32-го дня (р <0,05) и до 36го дня (р <0,01) после имплантации опухоли, а в дозе 0,1 мкг с 32-го дня (р <0,01) и до 36-го дня (р <0,001) после имплантации опухоли. У данного биспецифического антитела имеется дозозависимый ответ, что указывает на то, что высокоаффинное плечо CD123 в высокой дозе может обеспечивать эффективность в этой модели.
На фиг. 37 показано, что биспецифическое антитело 8747 в дозе 0,1 мкг проявило существенную
- 102 037647 эффективность в сравнении с PBS и контрольными биспецифическими антителами с 32-го по 36-й день после имплантации опухоли (р <0,001) и по сравнению с дозами 1 и 10 мкг к 36-му дню после имплантации опухоли (р <0,001). Это показывает, что высокоаффинное плечо CD3 при низкой дозе обеспечивает эффективность в этой модели.
На фиг. 38 показано, что биспецифическое антитело 8876 не проявляло существенной эффективности в сравнении с PBS и контрольными биспецифическими антителами ни в одной из доз.
На фиг. 39-42 показано среднее изменение массы тела в экспериментальных группах с течением времени. Как описывалось ранее, потеря массы тела коррелирует с началом и тяжестью GVHD, вызванной активированными Т-клетками.
Животные, получавшие биспецифическое антитело 7959 в дозе 0,1 мкг или биспецифическое антитело 9958 в дозе 1 мкг, имели более выраженную и раньше начинающуюся потерю массы тела по сравнению с животными, получавшими PBS, контрольные биспецифические антитела и другие дозы биспецифических антител 7959 и 9958 (фиг. 39). Эти данные коррелируют с существенной противоопухолевой эффективностью, наблюдаемой при введении дозы 1 мкг биспецифического антитела 9958 (фиг. 35).
Животные, получавшие биспецифическое антитело 3978 в дозе 10 мкг, имели более выраженную и раньше начинающуюся потерю массы тела по сравнению с животными, получавшими PBS и контрольные биспецифические антитела (фиг. 40). У мышей, получавших дозы 1 и 0,1 мкг, наблюдалась дозозависимая потеря массы тела. Эта дозозависимая потеря массы тела коррелировала с дозозависимой противоопухолевой эффективностью, показанной на фиг. 36).
Животные, получавшие биспецифическое антитело 8747 в дозе 0,1 мкг, имели потерю массы тела, сходную с таковой у группы, получавшей PBS, однако мыши снова набирали массу тела, начиная с 39-го дня после имплантации опухоли (фиг. 41). При использовании доз 1 или 10 мкг потеря массы тела не наблюдалась. Потеря массы тела при дозе 0, 1 мкг коррелировала с противоопухолевой эффективностью, наблюдаемой при этой дозе (фиг. 37).
У животных, получавших биспецифическое антитело 8876, не наблюдали потерю массы тела, отличную от таковой у мышей, получавших PBS или контрольные биспецифические антитела (фиг. 42), что согласовалось с отсутствием противоопухолевого эффекта у этого биспецифического антитела (фиг. 38).
Таким образом, биспецифические антитела к CD123 х CD3 проявляли устойчивую эффективность относительно экспрессирующих CD123 клеток человеческого AML, KG-1, только в присутствии эффекторных клеток (Т-лимфоцитов). Экспансия Т-клеток наблюдалась вскоре после введения препарата и только при наличии заболевания (ксенотранспланта KG-1). Кроме этого, эффективность биспецифических антител коррелировала с началом реакции трансплантат против хозяина (GVHD) согласно данным по снижению массы тела, и это указывает на присутствие активированных Т-лимфоцитов. В совокупности эти данные показывают, что биспецифическое антитело к CD123 х CD3 обладало противоопухолевой эффективностью, опосредованной через предполагаемый механизм, с вовлечением клетокмишеней и эффекторных клеток, и уничтожение мишеней Т-клетками.
Пример 24. Фармакокинетические исследования in vivo на мышах.
Исследуемые препараты антител были приготовлены в фосфатно-солевом буферном растворе в концентрации 0,2 мг/мл. Концентрации были подтверждены с помощью спектрофотометра Nanodrop, а затем препараты стерильно профильтровали через 0,2-микронные шприцевые фильтры.
Трансгенные животные, использованные в этих исследованиях, были получены от мышей C57BL/6. Линия Tg32, лицензированная Jackson Laboratory (Bar Harbor), имеет нокаут гена эндогенного мышиного FcRna и является трансгенной по человеческому гену FcRna, находящемуся под контролем нативного промотора человеческого гена. Линия Tg32 hemi представляет собой мышей, гемизиготных по трансгену FcRn, и она была получена путем скрещивания гомозиготных трансгенных мышей с мышами, нокаутными по FcRna. Наблюдается существенная корреляция между фармакокинетикой человеческих антител или фармакокинетикой антител приматов и мышиной моделью Tg32 hemi, и, следовательно, она была использована в последующих фармакокинетических исследованиях для оценки периода полужизни антител. Разведение мышей полностью проводили в SAGE Research Labs Boyertown, Пенсильванское отделение, США.
Для настоящего исследования использовали мышей в возрасте 6 недель, и 48 самкам мышей Tg32 hemi внутривенно вводили биспецифические антитела hIgG4-PAA, разделив мышей на группы по 5 животных. В одни и те же сроки выполняли отбор крови из ретроорбитального синуса.
После отбора образцов проводили анализ сыворотки. Концентрацию человеческого IgG в образцах сыворотки определяли с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа в формате MESO Scale Discovery (MSD). На планшеты MSD со стрептавидином наносили 50 мкл/лунка раствора биотинилированного F(ab')2 козьего антитела к человеческому IgG (H+L, Jackson lot 109-066-08) в концентрации 2 мкг/мл в буфере Starting Block T20 (Thermo) на ночь, 4°С. Планшеты промывали буфером PBS и образцы разводили в 10% мышиной сыворотке (Bioreclamations, г. Нью-Йорк, США) в буфере Starting Block T20. На каждый планшет помещали стандартную калибровку каждого исследуемого препарата, начиная от 0,1
- 103 037647 мг/мл, с последовательными 2-кратными разведениями. Планшеты инкубировали 2-3 ч при комнатной температуре, промывали, а затем инкубировали с 2 мкг/мл MSD-TAG (меченное рутением mAb к человеческому IgG, R10Z8E9, MSD) в течение 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе. Планшеты промывали, добавляли 200 мкл буфера для считывания MSD Read Buffer (MSD) и сканировали на приборе MSD Sector Imager 6000.
Чтобы определить, имеются ли в образцах сыворотки для фармакокинетических (ФК) исследований заметные иммунные титры, способные повлиять на ФК исследуемых образцов, был выполнен анализ ELISA на планшетах Maxisorb (Nunc), покрытых соответствующим исследуемым препаратом в концентрации 10 мкг/мл и проинкубированных в течение ночи при 4°С. Образцы сыворотки разводили в 1% BSA-PBS и инкубировали на планшетах в течение 2-3 ч со встряхиванием при комнатной температуре. Конъюгированные с пероксидазой хрена ослиные антитела к мышиному IgG (Jackson ImmunoResearch) использовали для обнаружения захваченного антитела; после чего наносили 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Fitzgerald) для проявления субстрата. Планшеты сканировали и положительными считали показания спектрофотометра, в три раза превышающие показания для буфера или контрольной сыворотки. Иммунные титры выражали в виде 1/разведение сыворотки. Иммунные титры не наблюдались (данные не показаны).
И, наконец, определяли фармакокинетику молекул. Расчеты конечного периода полужизни (t1/2) фазы элиминации в ФК-исследованиях проводили с использованием 1-фазной модели экспоненциального спада, с аппроксимацией линейной регрессией зависимости натурального логарифма концентрации от времени с использованием программного обеспечения Prism версии 5.01 (GraphPad Software, Inc.). Двухфазные модели были исключены, поскольку для каждого исследуемого препарата моделью с наилучшей аппроксимацией была 1-фазная модель экспоненциального спада, что определялось незначимостью Fкритерия дополнительной суммы квадратов (р >0,05) для большинства животных. Модель нелинейного спада, полученная методом наименьших квадратов, взвешивалась по величине 1/аппроксимированная концентрация. Период полужизни для фазы элиминации определялся по формуле t1/2=ln2/e, где β представляет собой наклон линии, аппроксимированной в регрессионном анализе методом наименьших квадратов, начиная после первой дозы.
В описанном здесь ФК-исследовании конечный период полужизни антитела определяли, взяв среднее от значений t1/2, вычисленных для каждого животного в экспериментальной группе. Резкими отклонениями при исследовании считали животных, либо демонстрирующих титр мышиных антител к человеческому IgG больше, чем 1 к 1000 приблизительно через 7 дней после введения дозы, либо с исходным значением для сыворотки, более чем в 2 раза ниже, чем у других мышей в группе, что могло быть обусловлено неполным введением.
Прогнозы ФК для человека по данным на мышах основывались на наблюдавшихся различиях в периоде полужизни у трансгенных по huFcRn мышей и у человека для панели из восьми человеческих антител IgG, на выведение которых, как считается, существенно не влияет их связывание с мишенью ни у мышей, ни у человека. На основании этих анализов предположили, что конечный период полужизни для биспецифических антител CD123 х CD3 будет в 2-4 раза дольше, чем наблюдаемый у трансгенных по huFcRn мышей, и при этой экстраполяции подразумевается, что влияние связывания с мишенью на выведение у мышей и у человека сопоставимо. В таблице 24 сведены наблюдавшиеся значения периода полужизни различных вариантов биспецифических антител и соответствующие прогнозируемые значения для человека, отражающие указанное допущение. Поскольку общеизвестный способ прогнозирования ФК для человека, основанный на аллометрическом масштабировании для разных видов, не прошел валидацию по данным мышиной ФК, аллометрическое масштабирование для прогнозирования не использовали. Результаты по ФК представлены на фиг. 43 с графиком зависимости концентрации в сыворотке от времени. Профили ФК демонстрируют линейный спад концентрации в сыворотке в течение 28 дней. Расчетные значения периода полужизни для всех биспецифических антител к CD123 х CD3 были сходными, 5,2-6,6 дня. Во всех группах наблюдались минимальные иммунные титры (<1:40). Данные по ФК у мышей (среднее значение ± стандартное отклонение), а также прогнозируемый клиренс и период полужизни у человека сведены в табл. 24. При прогнозе периода полужизни у человека делается допущение, что связывание с мишенью у человека не превышает таковое у мышей.
Для биспецифических антител IgG4-PAA наблюдались сходные значения в группах I3RB2 и I3RB18 у мышей. Расчеты периода полужизни фазы элиминации проводили с использованием 1-фазной модели экспоненциального спада, с аппроксимацией линейной регрессией зависимости натурального логарифма концентрации от времени, как указано в описании. Значения периода полужизни, вычисленные для восьми биспецифических антител на мышах Tg32 hemi, составили 3978, 6,6 ± 0,7 дня; 7955, 5,2 ± 0,4 дня; 7959, 6,6 ± 0,6 дня; 9958, 6,4 ± 0,7 дня; 8876, 4,1 ± 0,7 дня; 4435, 5,4 ± 1,0 дня; 8747, 6,4 ± 0,4 дня; 5466, 5,6 ± 0,1 дня. Прогнозы ФК для человека по данным на мышах основывались на наблюдавшихся различиях во времени полужизни у трансгенных по huFcRn мышей и у человека. На основании этих анализов конечный период полужизни у человека биспецифических антител CD123 х CD3 будет в 2-4 раза продолжительнее, чем наблюдавшийся у трансгенных по huFcRn мышей, при допущении, что влияние
- 104 037647 связывания с мишенью на выведение у мышей и у человека сопоставимо. В табл. 24 сведены наблюдавшиеся значения периода полужизни различных биспецифических антител и соответствующие прогнозируемые значения для человека, отражающие указанное допущение.
Таблица 24
Сводные данные по ФК биспецифических антител IgG4-PAA к CD 123 х CD3
Биспецифичес кое антитело Животное № Т1/2 (дни) Средн. расч. Т1/2 (дни) Прогноз hTl/2 (дни)
3978 2 5 7 22 28 6,71 7,08 5,44 7,02 6,71 6,5 9 + 0,66 13,2-26,4
7955 1 6 8 9 10 4,85 4,80 5,31 5,39 5,85 5,24+0,43 10,5-21,0
7959 3 12 13 16 33 6, 31 7,53 6,28 6,86 6, 16 6,63+0,57 13,2-26,4
9958 4 15 18 19 20 7,15 5,60 6,88 5,77 6,40 6,36+0,68 12,7-25,4
8876 21 22 23 24 35 4,65 6, 05 4,40 5,10 5,73 5,19+0,70 10,4-20,8
4435 17 27 29 30 36 5,39 3,96 5,66 5,47 6, 60 5,42+0,95 10,8-21,6
8747 14 25 31 32 34 6, 38 6,49 5,78 6,80 6,41 6,37+0,37 12,7-25,4
5466 26 37 38 39 40 4,81 5,68 4,53 6, 61 6, 54 5,64+0,96 11,3-22,6
Результаты фармакокинетических исследовании биспецифических антител к CD123 х CD3 на мышах показывают, что наблюдавшиеся у мышей Tg32 hemi значения t1/2 выгодно сравнимы с 8 клиническими антителами, профиль которых был получен сходным образом.(Tam, et al., MAbs (2013) 5(3):3987405).

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело к CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
    a) тяжелую цепь и легкую цепь, имеющие
    CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 012,
    CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 013,
    CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 014,
    CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 015,
    CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 016 и
    - 105 037647
    CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 017; или
    b) тяжелую цепь и легкую цепь, имеющие
    CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 051,
    CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 052,
    CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 053,
    CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 024,
    CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 025 и
    CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 054.
  2. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, а легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 165.
  3. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в котором тяжелая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, а легкая цепь антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168.
  4. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, которые имеют изотип IgG1 или IgG4.
  5. 5. Выделенное биспецифическое антитело к CD123 (IL3-Ra)xCD3 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие первую тяжелую цепь (HC1), вторую тяжелую цепь (НС2), первую легкую цепь (LC1) и вторую легкую цепь (LC2), причем
    НС1 и LC1 спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD123 (IL3-Ra), а
    HC2 и LC2 спариваются с образованием второго антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD3, или его биспецифический фрагмент, связывающийся с CD123 (IL3-Ra)xCD3, при этом
    i) HC1 и LC1 содержат любую из следующих пар:
    a) SEQ ID NO: 203 и SEQ ID NO: 204; или
    b) SEQ ID NO: 205 и SEQ ID NO: 206 соответственно; и ii) HC2 и LC2 содержат любую из следующих пар:
    a) SEQ ID NO: 193 и SEQ ID NO: 194;
    b) SEQ ID NO: 195 и SEQ ID NO: 196;
    c) SEQ ID NO: 197 и SEQ ID NO: 198;
    d) SEQ ID NO: 199 и SEQ ID NO: 200 или
    e) SEQ ID NO: 201 и SEQ ID NO: 202 соответственно.
  6. 6. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором НС1 содержит SEQ ID NO: 203, и LC1 содержит SEQ ID NO: 204, НС2 содержит SEQ ID NO: 193, и LC2 содержит SEQ ID NO: 194.
  7. 7. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.5, в котором НС1 содержит SEQ ID NO: 205, и LC1 содержит SEQ ID NO: 206, НС2 содержит SEQ ID NO: 193, и LC2 содержит SEQ ID NO: 194.
  8. 8. Выделенное биспецифическое антитело к CD123 (IL3-Ra)xCD3 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие первую тяжелую цепь (НС1), вторую тяжелую цепь (НС2), первую легкую цепь (LC1) и вторую легкую цепь (LC2), причем
    НС1 и LC1 спариваются с образованием первого антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD123 (IL3-Ra), а
    НС2 и LC2 спариваются с образованием второго антигенсвязывающего участка, который иммуноспецифически связывается с CD3, или его биспецифический фрагмент, связывающийся с CD123 (IL3-Ra)xCD3, где
    a) спаренные тяжелая и легкая цепи иммуноспецифически связываются с CD3, где указанная тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 184, и указанная легкая цепь содержит SEQ ID NO: 190; и
    b) спаренные тяжелая и легкая цепи иммуноспецифически связываются с CD123, где
    i) указанная тяжелая цепь содержит SEQ ID NO: 120, а указанная легкая цепь содержит SEQ ID NO: 165; или ii) указанная тяжелая цепь содержит SEQ ID NO:136, а указанная легкая цепь содержит SEQ ID NO: 168.
  9. 9. Выделенная клетка, экспрессирующая выделенное биспецифическое антитело к CD123 (IL3Ra)xCD3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.5-8.
  10. 10. Способ лечения субъекта, имеющего рак с клетками, экспрессирующими CD123, включающий введение терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3Ra)xCD3 или биспецифического связывающего фрагмента по любому из пп.5-8 пациенту в течение времени, достаточного для лечения рака.
    - 106 037647
  11. 11. Способ ингибирования роста или пролиферации раковых клеток, экспрессирующих CD123, включающий введение терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3Ra)xCD3 или биспецифического связывающего фрагмента по любому из пп.5-8 для ингибирования роста или пролиферации раковых клеток.
  12. 12. Способ перенаправления Т-клеток к экспрессирующей CD123 раковой клетке, включающий введение терапевтически эффективного количества биспецифического антитела к CD123 (IL3Ra)xCD3 или биспецифического связывающего фрагмента по любому из пп.5-8 для перенаправления Тклетки к раковому поражению.
  13. 13. Фармацевтическая композиция для лечения рака с клетками, экспрессирующими CD123, содержащая биспецифическое антитело к CD123 (IL3-Ra)xCD3 или биспецифический связывающий фрагмент по любому из пп.5-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
  14. 14. Выделенный синтетический полинуклеотид, кодирующий антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.5-8.
  15. 15. Набор для детекции клеток, экспрессирующих CD123, отличающийся тем, что содержит биспецифическое антитело к CD123 (IL3-Ra)xCD3 или биспецифический связывающий фрагмент по любому из пп.5-8.
  16. 16. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.5-8, которые иммуноспецифически связываются с CD123 SP2 (IL-3Ra) и CD123 SP1 (IL3Ra).
EA201790530A 2014-09-05 2015-09-03 Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения EA037647B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462046682P 2014-09-05 2014-09-05
PCT/US2015/048316 WO2016036937A1 (en) 2014-09-05 2015-09-03 Cd123 binding agents and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201790530A1 EA201790530A1 (ru) 2018-03-30
EA037647B1 true EA037647B1 (ru) 2021-04-27

Family

ID=54150667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790530A EA037647B1 (ru) 2014-09-05 2015-09-03 Агенты, связывающиеся с cd123, и виды их применения

Country Status (39)

Country Link
US (1) US9850310B2 (ru)
EP (2) EP3722315A1 (ru)
JP (2) JP6805130B2 (ru)
KR (1) KR102540192B1 (ru)
CN (1) CN107074956B (ru)
AR (1) AR101765A1 (ru)
AU (1) AU2015311931B2 (ru)
BR (1) BR112017004322A2 (ru)
CA (1) CA2959171C (ru)
CL (1) CL2017000515A1 (ru)
CO (1) CO2017002196A2 (ru)
CR (1) CR20170079A (ru)
CY (1) CY1122858T1 (ru)
DK (1) DK3189081T3 (ru)
EA (1) EA037647B1 (ru)
EC (1) ECSP17020812A (ru)
ES (1) ES2791249T3 (ru)
HR (1) HRP20200745T1 (ru)
HU (1) HUE048791T2 (ru)
IL (1) IL250770B (ru)
JO (1) JO3568B1 (ru)
LT (1) LT3189081T (ru)
MA (2) MA40609B1 (ru)
ME (1) ME03724B (ru)
MX (1) MX2017002891A (ru)
MY (1) MY186337A (ru)
NI (1) NI201700025A (ru)
PE (1) PE20171556A1 (ru)
PH (1) PH12017500472A1 (ru)
PL (1) PL3189081T3 (ru)
PT (1) PT3189081T (ru)
RS (1) RS60305B1 (ru)
SG (1) SG11201701599UA (ru)
SI (1) SI3189081T1 (ru)
TW (1) TWI693233B (ru)
UA (1) UA120060C2 (ru)
UY (1) UY36289A (ru)
WO (1) WO2016036937A1 (ru)
ZA (1) ZA201702369B (ru)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103097417B (zh) * 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
MA40801A1 (fr) 2015-01-23 2018-07-31 Sanofi Sa Anticorps anti-cd3, anticorps anti-cd123 et anticorps bispécifiques se liant spécifiquement à cd3 et/ou cd123
US10100118B2 (en) 2015-04-08 2018-10-16 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind CD123
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
JP7203497B2 (ja) 2015-06-29 2023-01-13 イミュノジェン・インコーポレーテッド 抗ｃｄ１２３抗体、ならびにその複合体及び誘導体
EA038329B1 (ru) 2015-08-28 2021-08-10 Амьюникс Фармасьютикалз, Инк. Химерный полипептидный комплекс и способы его получения и применения
BR112018011781A2 (pt) 2015-12-14 2018-12-04 Macrogenics Inc molécula biespecífica possuindo um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de pd-1 e um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de ctla-4, e composição farmacêutica
SG11201810331YA (en) 2016-05-20 2018-12-28 Harpoon Therapeutics Inc Single chain variable fragment cd3 binding proteins
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
CN109641047A (zh) 2016-05-20 2019-04-16 哈普恩治疗公司 单结构域血清白蛋白结合蛋白质
WO2017211731A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Fusion proteins for ophthalmology with increased eye retention
WO2017214092A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Macrogenics, Inc. Combination therapy
TWI790206B (zh) * 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
TWI781108B (zh) * 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
CN107840889A (zh) * 2016-09-19 2018-03-27 上海吉倍生物技术有限公司 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
AU2017331256A1 (en) 2016-09-21 2019-04-04 Aptevo Research And Development Llc CD123 binding proteins and related compositions and methods
MX2019006045A (es) 2016-11-23 2019-11-11 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso.
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
CA3049689A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for augmenting antibody mediated receptor signaling
WO2018156740A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US20220127322A1 (en) * 2017-03-14 2022-04-28 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Dual-target fusion proteins comprising the fc portion of an immunoglobulin
JP7090347B2 (ja) 2017-05-12 2022-06-24 ハープーン セラピューティクス，インク． メソテリン結合タンパク質
CA3063362A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Harpoon Therapeutics, Inc. Msln targeting trispecific proteins and methods of use
US11472880B2 (en) 2017-08-14 2022-10-18 Morphosys Ag Humanized antibodies for CD3
US20210061911A1 (en) * 2017-09-07 2021-03-04 Macrogenics, Inc. Dosing Regiments of Bi-Specific CD123 x CD3 Diabodies in the Treatment of Hematologic Malignancies
CR20200195A (es) 2017-10-13 2020-08-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b
KR102569133B1 (ko) 2017-10-13 2023-08-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이적 단백질 및 사용 방법
JP7324749B2 (ja) * 2017-10-27 2023-08-10 ファイザー・インク Ｃｄ１２３に特異的な抗体および抗体－薬物コンジュゲートならびにその使用
CN111465618A (zh) 2017-12-12 2020-07-28 宏观基因有限公司 双特异性cd16-结合分子及其在疾病治疗中的用途
MX2020008489A (es) 2018-02-15 2020-09-25 Macrogenics Inc Dominios de union a cd3 variantes y su uso en terapias de combinacion para el tratamiento de enfermedades.
AU2019235523A1 (en) * 2018-03-14 2020-10-29 Novimmune Sa Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof
CA3100157A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of t cell redirecting therapeutics
WO2019224713A2 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Janssen Biotech, Inc. Monospecific and multispecific anti-tmeff2 antibodies and there uses
JOP20190116A1 (ar) * 2018-05-24 2019-11-24 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتل التمايز 33 (cd33)، والأجسام المضادة ثنائية النوعية لتكتل التمايز 33 (cd33)/تكتل التمايز 3 (cd3) واستخداماتها
KR20210015902A (ko) 2018-05-24 2021-02-10 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Psma 결합제 및 이의 용도
CN113286817A (zh) 2018-09-25 2021-08-20 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
AU2019362131A1 (en) * 2018-10-17 2021-05-27 Good T Cells, Inc. Binding molecule specific to Lrig-1 protein, and use thereof
MX2021010857A (es) * 2019-03-11 2021-12-15 Janssen Biotech Inc Anticuerpos biespecificos anti-v(beta17)/anti-cd123.
CA3136888A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating prostate cancer with an anti- psma/cd3 antibody
CN113912697B (zh) * 2019-07-24 2023-05-30 暨南大学 靶向cd133的结合蛋白与应用
GB201912681D0 (en) 2019-09-04 2019-10-16 Eth Zuerich Bispecific binding agent that binds to cd117/c-kit and cd3
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
IL302351A (en) 2020-03-13 2023-06-01 Janssen Biotech Inc Materials and methods for binding SIGLEC-3/CD33
AU2021274151A1 (en) * 2020-05-19 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Compositions comprising a T cell redirection therapeutic and a VLA-4 adhesion pathway inhibitor
US20220162314A1 (en) * 2020-10-23 2022-05-26 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
EP4271709A1 (en) 2020-12-31 2023-11-08 Sanofi Multifunctional natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and cd123
CA3202891A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Kara Olson Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
BR112023024209A2 (pt) * 2021-05-18 2024-01-30 Janssen Biotech Inc Composições que compreendem um agente terapêutico de redirecionamento de células t e um agente terapêutico anti-cd44
WO2023019121A2 (en) * 2021-08-09 2023-02-16 Merck Patent Gmbh Proteins that decouple t cell-mediated tumor cytotoxicity from release of pro-inflammatory cytokines
WO2023138666A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Circular rna and use thereof
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012021934A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
EP2426148A1 (en) * 2009-04-27 2012-03-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
WO2013173820A2 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1997024373A1 (en) 1995-12-29 1997-07-10 Medvet Science Pty. Limited Monoclonal antibody antagonists to haemopoietic growth factors
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ATE294860T1 (de) 1997-09-16 2005-05-15 Egea Biosciences Llc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US9885711B2 (en) * 2009-09-25 2018-02-06 Xoma Technology Ltd. Screening methods
CN103097417B (zh) 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
WO2013063702A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2426148A1 (en) * 2009-04-27 2012-03-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
WO2012021934A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 Csl Limited Humanized anti-interleukin 3 receptor alpha chain antibodies
WO2013173820A2 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Scott & White Healthcare Bispecific scfv immunofusion (bif)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOVOLENTA C, PILOTTI E, MAURI M, TURCI M, CIANCIANAINI P, FISICARO P, BERTAZZONI U, POLI G, CASOLI C.: "Human T-cell leukemia virus type 2 induces survival and proliferation of CD34(+) TF-1 cells through activation of STAT1 and STAT5 by secretion of interferon-gamma and granulocyte macrophage-colony-stimulating factor.", BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, vol. 99, no. 1, 1 January 2002 (2002-01-01), US, pages 224 - 231, XP002751220, ISSN: 0006-4971, DOI: 10.1182/blood.V99.1.224 *
BROUGHTON S E, HERCUS T R, HARDY M P, MCCLURE B J, NERO T L, DOTTORE M, HUYNH H, BRALEY H, BARRY E F, KAN W L, DHAGAT U, SCOTNEY P: "Dual mechanism of interleukin-3 receptor blockade by an anti-cancer antibody.", CELL REPORTS, ELSEVIER INC, US, vol. 8, no. 2, 21 July 2014 (2014-07-21), US, pages 410 - 419, XP002751221, ISSN: 2211-1247, DOI: 10.1016/j.celrep.2014.06.038 *
CHEN J, OLSEN J, FORD S, MIRZA S, WALKER A, MURPHY J M, YOUNG I G: "A new isoform of interleukin-3 receptor {alpha} with novel differentiation activity and high affinity binding mode.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 284, no. 9, 27 February 2009 (2009-02-27), pages 5763 - 5773, XP002751219, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M808197200 *
SHU-RU KUO, LUCAS WONG AND JEN-SING LIU: "Engineering a CD123xCD3 bispecific scFvimmunofusion for the treatment of leukemiaand elimination of leukemia stem cells", PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION, OXFORD JOURNAL, LONDON, GB, vol. 25, no. 10, 1 October 2012 (2012-10-01), GB, pages 561 - 569, XP002721301, ISSN: 1741-0126, DOI: 10.1093/protein/gzs040 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2959171A1 (en) 2016-03-10
EP3189081B1 (en) 2020-02-19
SI3189081T1 (sl) 2020-07-31
JP2017529838A (ja) 2017-10-12
PT3189081T (pt) 2020-05-25
US9850310B2 (en) 2017-12-26
BR112017004322A2 (pt) 2017-12-05
PE20171556A1 (es) 2017-10-27
EA201790530A1 (ru) 2018-03-30
KR102540192B1 (ko) 2023-06-02
CL2017000515A1 (es) 2018-03-16
WO2016036937A1 (en) 2016-03-10
DK3189081T3 (da) 2020-05-04
TW201625687A (zh) 2016-07-16
PL3189081T3 (pl) 2020-10-05
ES2791249T3 (es) 2020-11-03
RS60305B1 (sr) 2020-07-31
TWI693233B (zh) 2020-05-11
JP6805130B2 (ja) 2020-12-23
CA2959171C (en) 2023-11-14
US20160068605A1 (en) 2016-03-10
LT3189081T (lt) 2020-05-11
CN107074956B (zh) 2021-11-26
IL250770A0 (en) 2017-04-30
UA120060C2 (uk) 2019-09-25
MA53145A (fr) 2021-05-19
MX2017002891A (es) 2017-10-11
AU2015311931B2 (en) 2020-09-03
EP3722315A1 (en) 2020-10-14
JO3568B1 (ar) 2020-07-05
EP3189081A1 (en) 2017-07-12
HRP20200745T1 (hr) 2020-08-07
AU2015311931A1 (en) 2017-03-16
UY36289A (es) 2016-04-01
AR101765A1 (es) 2017-01-11
ZA201702369B (en) 2018-12-19
JP2021050216A (ja) 2021-04-01
CN107074956A (zh) 2017-08-18
MA40609B1 (fr) 2020-05-29
ME03724B (me) 2021-01-20
CY1122858T1 (el) 2021-05-05
ECSP17020812A (es) 2018-07-31
SG11201701599UA (en) 2017-03-30
CR20170079A (es) 2017-04-27
NI201700025A (es) 2017-06-22
IL250770B (en) 2020-10-29
PH12017500472A1 (en) 2017-07-31
KR20170049554A (ko) 2017-05-10
HUE048791T2 (hu) 2020-09-28
MY186337A (en) 2021-07-13
CO2017002196A2 (es) 2017-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9850310B2 (en) CD123 binding agents and uses thereof
JP7469432B2 (ja) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体、ｇｐｒｃ５ｄとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用
US20190270826A1 (en) Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
EA044685B1 (ru) Антитела к gprc5d, биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают gprc5d и cd3, и их применение