CN111465618A - 双特异性cd16-结合分子及其在疾病治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合人CD16的表位的分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)(“CD16结合分子”)。本发明进一步涉及能够结合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”)的一个或多个表位的CD16结合分子(例如，“CD16x DA结合分子”)。本发明特别地涉及这样的CD16x DA结合分子，其是抗体，或者包含其表位结合结构域，或者是双抗体(包括
Figure DDA0002532907080000011
双抗体)、双特异性抗体、TandAbs、其它多特异性结合分子(例如，三价TRIDENTTM分子)等。本发明特别地涉及除了能够结合CD16外还能够结合疾病抗原即癌抗原或病原体相关抗原的CD16x DA结合分子。本发明特别地涉及这种CD16和CD16x DA结合分子在治疗癌症和病原体相关疾病中的用途。本发明也涉及包括这种分子的药物组合物。

Description

双特异性CD16-结合分子及其在疾病治疗中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求美国专利申请序列号62/597,800(在2017年12月12日提交；待决)的优先权，该申请通过引用以其全部并入本文。
序列表的引用
本申请按照37C.F.R.1.821以及以下各条包括一个或多个序列表，其在计算机可读介质上公开(文件名：1301_0153PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，创建于2018年12月4日，具有276,384个字节的大小)，其文件通过引用以其全部并入本文。
发明领域
本发明涉及能够结合人CD16的表位的分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)(“CD16结合分子”)。本发明进一步涉及能够结合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”)的一个或多个表位的CD16结合分子(例如，“CD16 x DA结合分子”)。本发明特别地涉及这样的CD16 x DA结合分子，其为抗体或者包括其表位结合结构域，或者为双抗体(包括
Figure BDA0002532907060000011
双抗体)、双特异性抗体、TandAb、其它多特异性结合分子(例如，三价TRIDENTTM分子)等。本发明特别地涉及CD16 x DA结合分子，所述CD16 x DA结合分子除了能够结合CD16外还能够结合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原体相关抗原。本发明特别地涉及这种CD16和CD16 x DA结合分子在治疗癌症和病原体相关疾病中的用途。本发明也涉及包括这类分子的药物组合物。
发明背景
哺乳动物免疫系统充当抵御各种病况、包括例如损伤、感染和瘤形成的防卫。人和其它哺乳动物形成对病原体、外来物质和癌抗原的免疫学应答的效率取决于两种特征：对抗原识别的免疫应答的高度特异性以及在用相同抗原重新激活后允许更快且更强的应答的免疫学记忆(Portolés,P.等(2009)“The TCR/CD3 Complex:Opening the Gate toSuccessful Vaccination,”Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy,C.S.等(2009)“Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex,”Immunol Rev.232(1):7-21；Topalian,S.L.等(2015)“Immune Checkpoint Blockade:ACommon Denominator Approach to Cancer Therapy,”Cancer Cell 27:450-461)。
在健康个体中，免疫系统处于静息状态，受到许多不同抑制性受体和受体配体的抑制。一旦识别到癌抗原、微生物病原体或过敏原，一系列激活受体和受体配体被触发以诱导免疫系统的激活。这种激活导致巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞和抗原特异性的、细胞毒性的T-细胞的激活，并且促进各种细胞因子的释放，其全部具有对抗所察觉到的对受试者健康的威胁的作用(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“CheckpointBlockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。当抗衡抑制性免疫信号胜过激活免疫信号时，免疫系统能够返回到其正常静息状态。
因此，癌症的疾病状态(以及实际上传染病的疾病状态)可被认为反映出未能充分激活受试者的免疫系统。这种故障可反映激活免疫信号的呈现不足，或者它可反映减弱受试者中的抑制性免疫信号的能力不足。在一些情况下，研究者已经确定癌症细胞可以拉拢免疫系统以避免被免疫系统检测到(Topalian,S.L.等(2015)“Immune CheckpointBlockade:A Common Denominator Approach to Cancer Therapy,”Cancer Cell 27:450-461)。
涉及免疫系统激活的受体有Fc受体：CD16、CD32和CD64。这些Fc受体见于多种类型的免疫系统细胞(例如，B淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的表面上。这种受体具有“胞外”部分(其因此能够连接到Fc区)、“跨膜”部分(其延伸通过细胞膜)、和“细胞质”部分(位于细胞内部)。已经鉴定了多种类型的FcγR：CD16A(FcγRIIIA)、CD16B(FcγRIIIB)、CD32A(FcγRIIA)、CD32B(FcγRIIB)、和CD64(FcγRI)。这些受体结合IgG抗体的Fc部分，由此触发激活或抑制性信号转导至免疫系统。
CD16是激活Fc受体FcγRIIIA(CD16A)和FcγRIIIB(CD16B)的总称。这些受体结合IgG抗体的Fc部分，由此触发细胞因子的释放。如果这种抗体被结合至在细胞(例如，癌症细胞、病原体感染的细胞等)表面上表达的疾病抗原，那么这种释放介导杀死靶细胞。
CD16A由结合聚集的而非单体的人IgG的自然杀伤(NK)细胞和组织巨噬细胞表达(Selvaraj,P.等(2004)“Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc GammaReceptors,”Immunol Res.29(1-3):219-230；Peltz,G.A.等(1989)“Human Fc GammaRIII:Cloning,Expression,And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two FcReceptors For IgG,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86(3):1013-1017；Bachanova,V.等(2014)“NK Cells In Therapy Of Cancer,”Crit.Rev.Oncog.19(1-2):133-141；Miller,J.S.(2013)“Therapeutic Applications:Natural Killer Cells In The Clinic,”Hematology Am.Soc.Hematol.Educ.Program.2013:247-253；Youinou,P.等(2002)“Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB(CD16)On PolymorphonuclearNeutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,”Autoimmun Rev.1(1-2):13-19；Peipp,M.等(2002)“Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,”Biochem.Soc.Trans.30(4):507-511；Unkeless,J.C.等(1995)“Function Of Human FcGamma RIIA And Fc Gamma RIIIB,”Semin.Immunol.7(1):37-44)。
由自然杀伤(NK)细胞表达CD16A尤其与本发明相关，因为这种细胞当它们的CD16分子结合至抗体的Fc区时释放细胞因子。因此，当天然抗体结合至靶细胞的疾病抗原时，其Fc区可被自然杀伤细胞的CD16分子识别，其然后介导靶细胞的杀伤。因为这种杀伤是抗体依赖性的，所以它被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC因此依赖于之前的抗体应答，并且如所述，要求表达FcγR的效应细胞(典型地自然杀伤(NK)细胞，以及巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的存在和参与。CD16A通过与NK细胞的CDξ蛋白相互作用发送ADCC信号，并且通过与巨噬细胞FcγR链相互作用发送巨噬细胞介导的杀伤的信号。
CD16A具有两种主要的多态形式F158和V158，其区别在于在残基158处具有苯丙氨酸或缬氨酸(如CD16A的胞外结构域的残基160所示(图7)，其对应于全长蛋白的残基176(Wu,J.等(1997)“A Novel Polymorphism of FcγRIIIa(CD16)Alters ReceptorFunction and Predisposes to Autoimmune Disease,”J.Clin.Invest.100(5):1059-1070；Ravetch,J.V.等(1989)“Alternative Membrane Forms Of FcγRIII(CD16)OnHuman Natural Killer Cells And Neutrophils,”J.Exper.Med.170:481-497；Koene,H.R.等(1997)“FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG byNatural Killer Cell FcγRIIIa,Independently of the FcγRIIIa-48L/R/HPhenotype,”Blood,90(3):1109-1114；van Sorge,N.M.(2003)“FcgammaR Polymorphisms:Implications For Function,Disease Susceptibility And Immunotherapy,”TissueAntigens 61(3):189-202；Fijen,C.A.(2000)“The Role Of Fcgamma ReceptorPolymorphisms And C3 In The Immune Defence Against Neisseria Meningitidis InComplement-Deficient Individuals,”Clin.Exp.Immunol.120(2):338-345)。50％的高加索人对于苯丙氨酸多态性是纯合的(F158/F158)，而39％高加索人对于这种多态性是杂合的(F158/V158)以及11％的高加索人对于缬氨酸多态性是纯合的(V158/V158)。
CD16B在中性粒细胞上表达，并且锚定到糖基磷脂酰肌醇(“GPI-锚定的”)(Meknache,N.等(2009)“Human Basophils Express TheGlycosylphosphatidylinositol-Anchored Low-Affinity IgG Receptor FcgammaRIIIB(CD16B),”J.Immunol.182(4):2542-2550；Fernandes,M.J.等(2006)“CD16b AssociatesWith High-Density,Detergent-Resistant Membranes In Human Neutrophils,”Biochem.J.393(Pt 1):351-359；Selvaraj,P.等(2004)“Functional Regulation OfHuman Neutrophil Fc Gamma Receptors,”Immunol Res.29(1-3):219-230；Unkeless,J.C.等(1995)“Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB,”Semin.Immunol.7(1):37-44)。尽管被认为是诱饵受体，但是它也可传递信号(Fernandes,M.J.(2005)“Signaling Through CD16b In Human Neutrophils Involves The TecFamily Of Tyrosine Kinases,”J.Leukoc.Biol.78(2):524-532)，并且在细胞激活后通过ADAM17下调/切割(Wang,Y.等(2013)“ADAM17 Cleaves CD16b(FcγRIIIb)In HumanNeutrophils,”Biochim.Biophys.Acta 1833(3):680-685；Guo,S.等(2012)“Role ofADAM10and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated By Different Stimulators,”Chin.Med.Sci.J.27(2):73-79)。
CD16B具有两种主要的多态形式NA1和NA2，其对于IgG1和IgG3亚类呈现不同的结合亲和力(Bournazos,S.等(2010)“FcγReceptor IIIb(CD16b)Polymorphisms AreAssociated With Susceptibility To Idiopathic Pulmonary Fibrosis,”Lung 188(6):475-481；van Sorge,N.M.(2003)“FcgammaR Polymorphisms:Implications ForFunction,Disease Susceptibility And Immunotherapy,”Tissue Antigens 61(3):189-202)。13％的高加索人和16％的印度人对于NA1多态性是纯合的(NA1/NA1)，而55％的高加索人和28％的印度人对于这种多态性是杂合的(NA1/NA2)以及32％的高加索人和55％的印度人对于NA2多态性是纯合的(NA2/NA2)。人CD16A和CD16B同种异型的比对显示在图7中。
CD32A(FcγRIIA)(Brandsma,A.M.(2015)“Fc Receptor Inside-Out SignalingAnd Possible Impact On Antibody Therapy,”Immunol Rev.268(1):74-87；van Sorge,N.M.等(2003)“FcgammaR Polymorphisms:Implications For Function,DiseaseSusceptibility And Immunotherapy,”Tissue Antigens 61(3):189-202；Selvaraj,P.等(2004)“Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,”Immunol.Res.29(1-3):219-230)和CD64(FcγRI)(Lu,S.等(2015)“Structural MechanismOf High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G,”Immunol.Rev.268(1):192-200；Swisher,J.F.等(2015)“The Many Faces Of FcγRI:Implications ForTherapeutic Antibody Function,”Immunol.Rev.268(1):160-174；Thepen,T.等(2009)“Fcgamma Receptor 1(CD64),A Target Beyond Cancer,”Curr.Pharm.Des.15(23):2712-2718；Rouard,H.等(1997)“Fc Receptors As Targets For Immunotherapy,”Int.Rev.Immunol.16(1-2):147-185)是在巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞上(对于CD32A，也在血小板和朗格罕细胞上)表达的激活型Fc受体。相反，CD32B(FcγRIIB)是在B淋巴细胞(巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)上表达的抑制型Fc受体(Stopforth,R.J.等(2016)“Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB,”J.Clin.Immunol.[2016Feb 27Epub],pp.1-7；Bruhns,P.等(2009)“SpecificityAnd Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants ForHuman IgG Subclasses,”Blood.113(16):3716-3725；White,A.L.等(2014)“FcγRIIB AsA Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy,”Curr.Top.Microbiol.Immunol.382:355-372；Selvaraj,P.等(2004)“FunctionalRegulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,”Immunol.Res.29(1-3):219-230)。
不同FcγRs介导截然相反的功能的能力反映了它们的结构不同，尤其是FcγR是否具有免疫受体酪氨酸激活基序(“ITAM”)或免疫受体酪氨酸抑制基序(“ITIM”)。不同细胞质酶募集到这些结构指示FcγR-介导的细胞应答的结果。含ITAM的FcγR包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，并且当结合至Fc区时激活免疫系统(例如，存在于免疫复合物中的聚集Fc区)。FcγRIIB是目前已知的唯一天然含ITIM的FcγR；它当结合至聚集的Fc区时起到减弱或抑制免疫系统的作用。
尽管针对特定疾病抗原表位的天然IgG抗体具有可与CD16相互作用以激活受试者的免疫应答的Fc区，但在许多疾病和许多受试者的情况下，这种免疫系统激活不足以提供对该疾病的有效治疗。因此，尽管之前在鉴定涉及哺乳动物免疫应答的分子方面已经有所进步，但是仍然需要用于治疗癌症和传染病的改进疗法。本发明的CD16-结合分子以及具体地本发明的CD16 x DA结合分子(其包括CD16结合结构域和对在靶细胞上表达的疾病抗原特异性的结合结构域)，能够将CD16-表达细胞共定位到表达疾病抗原的细胞位点。这种共定位通过增加针对疾病抗原表位的抗体的Fc部分将结合表达CD16的效应细胞的可能性而提高了ADCC-介导的目标细胞的杀伤，并且通过这种Fc-CD16相互作用，触发免疫系统激活以及针对靶细胞的细胞因子的释放。因此，本发明涉及提高受试者对疾病抗原和其他目标的免疫应答的激活。
发明内容
本发明涉及能够结合人CD16的表位的分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)(“CD16结合分子”)。本发明进一步涉及能够结合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”)的一个或多个表位的CD16结合分子(例如，“CD16 x DA结合分子”)。本发明特别地涉及这样的CD16 x DA结合分子，其为抗体、或者包括抗体的表位结合结构域、或者是双抗体(包括
Figure BDA0002532907060000061
双抗体)、双特异性抗体、TandAb、其它多特异性结合分子(例如，三价TRIDENTTM分子)等。本发明特别地涉及CD16 x DA结合分子，其除了能够结合CD16之外还能够结合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原体相关抗原。本发明特别地涉及这种CD16和CD16 x DA结合分子在治疗癌症和病原体相关疾病中的用途。本发明也涉及包括这种分子的药物组合物。
详细地，本发明提供CD16 x疾病抗原(CD16 x DA)结合分子，其包括能够结合CD16的表位的CD16结合结构域以及能够结合疾病抗原的表位的疾病抗原-结合结构域，其中所述CD16结合结构域包括下列中的一种或多种：
(I)(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域；
(II)(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域；
(III)包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(IV)包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；
(V)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；和
(VI)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的VL结构域；
(VII)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(VIII)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；和
(IX)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述分子是双特异性抗体、双特异性双抗体、双特异性TandAb、双特异性三价分子或双特异性CAR。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述分子能够结合多于一个的疾病抗原和/或多于一个的CD16的表位。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；或
(C)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(D)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(E)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；或
(F)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含或SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域；或
(C)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的VL结构域。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述疾病抗原是癌抗原并且所述疾病是癌症。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述癌症选自由下列组成的组：肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肾癌、非小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤(Burkett's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾细胞癌、睾丸癌和子宫癌。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述癌抗原选自由下列癌抗原组成的组：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-联蛋白、血型ALeb/Ley、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、细胞角蛋白8、D1.1、D156-22、DR5、E1系列、EGFR、肝配蛋白受体、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神经节苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳头瘤病毒-E6/人乳头瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整联蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、间皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙酰葡糖胺基转移酶、拟糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸盐、R24、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、TAG-72、TL5、TNF-受体、TNF-γ受体、TRA-1-85、转铁蛋白受体、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受体、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述疾病抗原是病原体相关抗原。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述病原体相关抗原选自由下列病原体相关抗原组成的组：单纯疱疹病毒感染的细胞蛋白(ICP)47、单纯疱疹病毒gD、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus)LMP-1、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2A、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2B、人类免疫缺陷病毒gp160、人类免疫缺陷病毒gp120、人类免疫缺陷病毒gp41等、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、人T细胞白血病病毒gp64、人T细胞白血病病毒gp46和人T细胞白血病病毒gp21。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述分子是：
(A)双抗体，所述双抗体是包含两条、或三条、四条或五条多肽链的共价结合的复合物；或
(B)三价结合分子，所述三价结合分子是包含三条、四条或五条多肽链的共价结合的复合物；或
(C)双特异性抗体。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述分子包含Fc区。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述Fc区具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式，其中所述Fc区是变体Fc区，包含：
(A)一个或多个氨基酸修饰，其减少所述变体Fc区对于FcγR的亲和力；和/或
(B)一个或多个氨基酸修饰，其增加所述变体Fc区的血清半衰期。
本发明另外涉及这种CD16 x疾病抗原结合分子的实施方式：
(A)减少所述变体Fc区对于FcγR的亲和力的所述修饰包括L234A；L235A；或L234A和L235A的置换；和
(B)增加所述变体Fc区的血清半衰期的所述修饰包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的置换，
其中所述编号是如Kabat中EU索引的编号。
本发明另外涉及CD16结合分子，其包含：
(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域。
本发明另外涉及这种CD16结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(A)包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；
(C)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；或
(D)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(E)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；或
(F)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
本发明另外涉及CD16结合分子，其包含：
(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域。
本发明另外涉及这种CD16结合分子的实施方式，其中所述分子包含：
(A)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含或SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域；或
(C)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列的VL结构域。
本发明另外涉及这种CD16结合分子的实施方式，其中所述分子选自由下列组成的组：抗体、多特异性抗体、Fab'片段、F(ab')2片段、(Fv)片段、单链(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、双抗体、三价结合分子和CAR-T分子。
本发明另外涉及药物组合物，其包括上述CD16 x疾病抗原结合分子中的任一种或CD16结合分子、和药学上可接受的载体。
本发明另外涉及上述药物组合物在治疗特征在于疾病抗原的表达的疾病中的用途。
本发明另外涉及用于治疗特征在于疾病抗原的表达的疾病的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。
本发明另外涉及这种用途或方法的实施方式，其中所述CD16 x疾病抗原结合分子能够结合多于一个的疾病抗原和/或多于一个的CD16的表位。
本发明另外涉及这种用途或方法，在所述CD16 x疾病抗原结合分子中，其中所述疾病抗原是癌抗原，并且所述疾病是癌症。
本发明另外涉及这种用途或方法，其中所述癌症选自由下列组成的组：肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肾癌、非小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾细胞癌、睾丸癌和子宫癌。
本发明另外涉及这种用途或方法，其中所述癌抗原选自由下列癌抗原组成的组：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-联蛋白、血型ALeb/Ley、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、细胞角蛋白8、D1.1、D156-22、DR5、E1系列、EGFR、肝配蛋白受体、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神经节苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳头瘤病毒-E6/人乳头瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整联蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、间皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙酰葡糖胺基转移酶、拟糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸盐、R24、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、TAG-72、TL5、TNF-受体、TNF-γ受体、TRA-1-85、转铁蛋白受体、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受体、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley。
本发明另外涉及这种用途或方法，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
本发明另外涉及这种用途或方法，在所述CD16 x疾病抗原结合分子中，其中所述疾病抗原是病原体相关抗原。
本发明另外涉及这种用途或方法，其中所述病原体相关抗原选自由下列病原体相关抗原组成的组：单纯疱疹病毒感染的细胞蛋白(ICP)47、单纯疱疹病毒gD、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-1、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2A、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2B、人类免疫缺陷病毒gp160、人类免疫缺陷病毒gp120、人类免疫缺陷病毒gp41等、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、人T细胞白血病病毒gp64、人T细胞白血病病毒gp46和人T细胞白血病病毒gp21。
本发明另外涉及这种用途或方法，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
附图说明
图1A-1B提供由两条多肽链构成的具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体的示意图，每条多肽链具有E-螺旋(E-coil)或K-螺旋(K-coil)异源二聚体-促进结构域(下面提供可替选的异源二聚体-促进结构域)。半胱氨酸残基可存在于连接体(图1A)和/或异源二聚体-促进结构域(图1B)。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。这个图以及所有提供结合分子结构域的示意图示的图中的波浪线(WWW)代表一个或多个任选的异源二聚体-促进结构域，其优选存在。
图2提供由两条多肽链构成的具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图，每条多肽链具有CH2和CH3结构域，使得相关链形成Fc区的全部或部分。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。
图3A-3E提供由两对多肽链(即总共四条多肽链)构成的具有四个表位结合位点的代表性共价结合的四价双抗体的示意图。每一对的一条多肽链具有CH2和CH3结构域，使得相关的链形成Fc区的全部或部分。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。两对多肽链可以相同。在其中所述两对多肽链相同并且VL和VH结构域识别不同表位的这种实施方式中(如图3A-3B所示)，所得分子具有四个表位结合位点并且关于每个结合的表位是双特异性的和二价的。在其中所述VL和VH结构域识别相同表位的这种实施方式中(例如，相同VL结构域CDR和相同VH结构域CDR被用于两条链上)，所得分子具有四个表位结合位点并且关于单个表位是单特异性的并且是四价的。可替选地，两对多肽可能是不同的。在所述两对多肽链不同并且每对多肽的VL和VH结构域识别不同表位的这种实施方式中(如图3C中的不同阴影和图案所示)，所得分子具有四个表位结合位点并且关于每个结合的表位是四特异性的并且是单价的。图3A显示含Fc区的双抗体，其包含含有半胱氨酸残基的异源二聚体-促进结构域的肽。图3B显示含Fc区的双抗体，其包含含有半胱氨酸残基和连接体(具有任选的半胱氨酸残基)的E-螺旋和K-螺旋异源二聚体-促进结构域。图3C显示含Fc区的双抗体，其包含抗体CH1和CL结构域。图3D-3E示例图3B中显示的结合结构域的选择如何能导致具有对CD16的表位特异性的两个结合位点和对DA的表位特异性的两个结合位点的CD16 x DA结合分子。图3D-3E示例如何选择结构域以产生具有不同取向的CD16 x DA结合分子(即，图3D采用VL CD16结构域作为结合分子的VL1结构域，VH CD16结构域作为结合分子的VH1结构域，VL DA结构域作为结合分子的VL2结构域，以及VH DA结构域作为结合分子的VH2结构域。相反，图3E采用VL DA结构域作为结合分子的VL1结构域，VH DA结构域作为结合分子的VH1结构域，VL CD16结构域作为结合分子的VL2结构域，以及VH CD16结构域作为结合分子的VH2结构域)。如下面所提供的，由多肽链的缔合所形成的VL/VH结合位点可以相同或不同以便允许四价结合是单特异性的、双特异性的、三特异性的或四特异性的。
图4A和4B提供由三条多肽链构成的具有两个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。多肽链中的两条具有CH2和CH3结构域，使得缔合的链形成Fc区的全部或部分。包含VL和VH结构域的多肽链进一步包含异源二聚体-促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。
图5A-5D提供由五条多肽链构成的具有四个表位结合位点的代表性共价结合的双抗体分子的示意图。图5A显示这种CD16 x DA结合分子的一般结构。多肽链中的两条具有CH2和CH3结构域，使得所缔合的链形成占Fc区的全部或部分的Fc区。包含连接的VL和VH结构域的多肽链进一步包含异源二聚体-促进结构域。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。图5B显示可替选CD16 x DA结合分子的结构，其中图5A中显示的可变结构域已经被选择以产生所得的CD16 x DA结合分子，其具有对示例性的DA、HER2/neu特异性的两个非双抗体型结合结构域，以及对CD16特异性的两个双抗体型结合结构域。图5C显示可替选CD16 x DA结合分子的结构，其中图5A中显示的可变结构域已经被选择以产生所得的CD16 x DA结合分子，其具有对CD16特异性的两个非双抗体型结合结构域以及对HER2/neu特异性的两个双抗体型结合结构域。图5D显示可替选CD16 x DA结合分子的结构，其中图5A中显示的可变结构域已经被选择以产生所得的CD16 x DA结合分子，其具有对CD16的表位特异性的两个非双抗体型结合结构域、对HER2/neu的表位特异性的一个双抗体型结合结构域以及对CD16的表位特异性的第二双抗体型结合结构域。这种CD16表位可以相同或不同。如将会理解的，通过适当选择图5A中显示的结合结构域，结合结构域中的任意三个可能已经被选择以结合CD16的表位。同样，结合结构域中的任意三个可能已经被选择以结合HER2/neu的表位。如下面所提供的，由多肽链的缔合所形成的VL/VH结合位点可以相同或不同以便允许四价结合是单特异性的、双特异性的、三特异性的或四特异性的。
图6A-6H提供代表性的具有三个表位结合位点的含Fc区的三价结合分子的示意图。图6A示意性地示例包含两个双抗体型结合结构域和具有不同结构域取向的Fab型结合结构域的三价结合分子的结构域，其中双抗体型结合结构域相对于Fc区是N-末端或C-末端的。图6B-6C显示CD16 x DA结合分子的示例性非限制性实例的结构，其中图6A中显示的可变结构域已经被选择以产生所得的CD16 x DA结合分子，其具有对CD16特异性的非双抗体型结合结构域、对示例性DA、HER2/neu特异性的双抗体型结合结构域和对CD16特异性的第二双抗体型结合结构域。图6D示意性地示例包含两个双抗体型结合结构域和具有不同结构域取向的Fab型结合结构域的三价结合分子的结构域，其中双抗体型结合结构域相对于Fc区是N-末端的或C-末端的。图6A-6D中的分子包含四条链。图6E和6F分别示意性地示例三价结合分子的结构域，其包含相对于Fc区处于N-末端的两个双抗体型结合结构域、以及其中轻链和重链经由多肽间隔子连接的Fab型结合结构域或scFv型结合结构域。图6G和6H中的三价结合分子分别示意性地示例三价结合分子的结构域，其包含相对于Fc区处于C-末端的两个双抗体型结合结构域、以及其中轻链和重链经由多肽间隔子连接的Fab型结合结构域或scFv型结合结构域。图6E-6H中的三价结合分子包含三条链。识别相同表位的VL和VH结构域用相同的阴影或填充图案显示。
图7显示人CD16A的158F异型(SEQ ID NO:146)、CD16A的158V异型(SEQ ID NO:147)、人CD16B的NA1异型(SEQ ID NO:148)、人CD16B的NA2异型(SEQ ID NO:149)和食蟹猴的CD16(SEQ ID NO:150)的胞外结构域(ECD)的比对。相对于人CD16A的158F异型的序列差别以下划线黑体显示。在所示的人CD16A分子的部分中，158F/158V多态性见于位置160。
图8显示人IgG的浓度增加对LNK16、DJ130c和CD16-M1的CD16结合结构域结合CD16的能力的影响。
图9A-9C显示与HIV x CD3双抗体(作为经由其CD3结合结构域的T细胞结合的阳性对照)、HIV x RSV双抗体(作为所有结合的阴性对照)和h3G8 x RSV双抗体比较分子相比，CD16结合分子：DART-F和DART-G结合至供体受试者的全血中的NK细胞(图9A；CD16A:na)、嗜中性粒细胞(图9B；CD16B:na)和T细胞(图9C)的能力。
图10A-10B显示与HIV x RSV双抗体(作为所有结合的阴性对照)和h3G8 x RSV双抗体比较分子相比，CD16结合分子：DART-F和DART-G结合至设门的(gated)淋巴细胞群(图10A)和设门的粒细胞群(图10B)的CD16A表达细胞的能力。
图11A-11B显示CD16-M1和h3G8的CD16结合结构域区分糖基化异型NA1(图11A)和NA2(图11B)的能力。
图12显示抗体hCD16-M1的CD16结合结构域(存在于DART-C)优先结合至全血中的NK细胞的能力。
图13展示人CD16(SEQ ID NO:183)、食蟹猴CD16(SEQ ID NO:184)和鼠CD16(SEQID NO:185)的氨基酸序列的比对。与人CD16的序列差别以下划线黑体显示。
图14A-14E显示在下列CD16 x HER2/neu结合分子：DART-C(具有hCD16-M1CD16结合结构域)、DART-D(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)、DART-1(具有h3G8CD16结合结构域)、阴性对照HER2/neu x RSV双抗体或阳性h3G8 x RSV双抗体的存在下，表达不同水平的HER2/neu和效应细胞(人PBMC(E:T＝30:1)或纯化的人NK细胞(E:T＝2:1))的靶癌细胞的24小时孵育所产生的细胞毒性百分比。图14A：N87HER2/neu靶细胞(HER2/neu表达：+++)/NK细胞；CD16A异型158F/158F；图14B：MCF7 HER2/neu靶细胞(HER2/neu表达：+/-)/NK细胞；CD16A异型158F/158F；图14C：MDA-MB-231HER2/neu靶细胞(HER2/neu表达：+/-)/PBMCs；CD16A异型，未评估；图14D：N87 HER2/neu靶细胞(HER2/neu表达：+++)/PBMCs；CD16A异型158F/158V；图14E：Hs700T HER2/neu靶细胞(HER2/neu表达：+/-)/PBMCs；CD16A异型158F/158V。
图15A-15C显示在下列CD16 x HIV env CD16结合分子：DART-F(具有hCD16-M1CD16结合结构域)、DART-G(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)或DART-2(具有h3G8 CD16结合结构域)的存在下，表达亚型HIV Env蛋白和效应细胞(人PBMC(E:T＝30:1)或纯化的人NK细胞(E:T＝3:1))的HEK/D371靶细胞的24小时孵育所产生的细胞毒性百分比。图15A：293HEKD371靶细胞/PBMCs；CD16A异型158F/158V；图15B：293HEK D371靶细胞/PBMCs；CD16A异型158F/158F；图15C：293HEK D371靶细胞/NK细胞；CD16A异型158F/158V。
图16A-16B显示在效应细胞(Jurkat/CD16A 158F(图16A)或158V/NFAT-Luc细胞(图16B))的存在下表达HIV env蛋白的靶HEK/D371细胞在用DART-X(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-Y(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)、DART-0(具有h3G8 CD16结合结构域)或DART-3(具有hCD16-M1 CD16结合结构域的CD16 x RSV双抗体)孵育后的细胞毒性百分比。
图17A-17C显示与hCD16-M1的亲本CD16结合结构域(存在于DART-C和DART-3)和h3G8的CD16结合结构域(存在于DART-1)相比，hCD16-M1A(存在于DART-I)、hCD16-M1B(存在于DART-J)、hCD16-M1AB(存在于DART-K)的优化的CD16结合结构域结合至PBMC样品中存在的人NK细胞(图17A)、食蟹猴NK细胞(图17B)和猕猴NK细胞(图17C)的能力。HER2/neu x RSV双抗体(缺少CD16结合结构域)被包括作为阴性对照。
图18A-18D显示hCD16-M1A(存在于DART-I)、hCD16-M1B(存在于DART-J)、和hCD16-M1AB(存在于DART-K)的优化的CD16结合结构域与人和食蟹猴效应细胞两者介导HER2/neu表达的靶细胞重定向的细胞杀伤的能力。所描绘的是在下列CD16x HER2/neu结合分子：DART-C(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-I(具有hCD16-M1A CD16结合结构域)、DART-J(具有hCD16-M1B结合结构域)、DART-K(具有hCD16-M1AB结合结构域)、DART-1(具有h3G8 CD16结合结构域)、或阴性对照HER2/neu x RSV双抗体的存在下，JIMT-1-Luc靶癌细胞和效应细胞(人PBMCs(图18A-18B)或食蟹猴PMBCs(图18C-18D))(E:T＝30:1)的24小时孵育所产生的细胞毒性，如在LDH重定向的细胞杀伤试验(以细胞毒性百分比描绘，图18A和18C)或LUM重定向的细胞杀伤试验(荧光(LUM)以相对光单位(RLU)描绘，图18B和18D)中所测量的。
图19A-19D显示hCD16-M1B(存在于DART-M)和hCD16-M1AB(存在于DART-N)的优化的CD16结合结构域与人效应细胞介导CD19表达靶细胞的重定向的细胞杀伤的能力。在下列CD16 x CD19结合分子：DART-L(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-M(具有hCD16-M1B结合结构域)、DART-N(具有hCD16-M1AB结合结构域)、duvortuxizumab(阳性对照CD3 xCD19双抗体)或阴性对照CD16 x RSV双抗体DART-5(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-6(具有hCD16-M1B结合结构域)、DART-7(具有hCD16-M1AB结合结构域)的存在下，Raji-Luc靶癌细胞和人PBMC效应细胞(E:T＝30:1)的24小时(图19A和19C)和48小时孵育(图19B和19D)之后测量的细胞毒性，如在LDH重定向的细胞杀伤试验(以细胞毒性百分比描绘，图19A和19B)或LUM重定向的细胞杀伤试验(LUM以RLU描绘，图19C和19D)中所测量的。
图20A-20D显示在离体人和食蟹猴PBMC样品中hCD16-M1B(存在于DART-M)和hCD16-M1AB(存在于DART-N)的优化的CD16结合结构域介导自体B细胞消耗的能力。在下列CD16 x CD19结合分子：DART-L(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-M(具有hCD16-M1B结合结构域)、DART-N(具有hCD16-M1AB结合结构域)、或阴性对照CD16 x RSV双抗体DART-5(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)、DART-6(具有hCD16-M1B结合结构域)的存在下，人(图20A-20B)或食蟹猴(图20C-20D)的PBMC在72小时(图20A和20C)、96小时(图20B)和144小时(图20D)孵育后的B细胞计数(CD3-/CD20+细胞)，如流式细胞术所测量的。
具体实施方式
本发明涉及能够结合人CD16的表位的分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)(“CD16结合分子”)。本发明进一步涉及能够结合人CD16的表位和疾病抗原(“DA”)的一个或多个表位的CD16结合分子(例如，“CD16 x DA结合分子”)。本发明特别地涉及这样的CD16 x DA结合分子，其是抗体、或者包含抗体的表位结合结构域、或者是双抗体(包括双抗体)、双特异性抗体、TandAb、其它多特异性结合分子(例如，三价TRIDENTTM分子)等。本发明特别地涉及CD16 x DA结合分子，其除了能够结合CD16外还能够结合疾病抗原，所述疾病抗原是癌抗原或病原体相关抗原。本发明特别地涉及这种CD16和CD16 x DA结合分子在治疗癌症和病原体相关疾病中的用途。本发明也涉及包括这种分子(一种或多种)的药物组合物。
I.抗体和其它结合分子
A.抗体
本发明的CD16 x DA结合分子可以是抗体，或可衍生自抗体(例如，通过抗体多肽的断裂、切割等，或者来自抗体分子的氨基酸序列或者编码这种多核苷酸等的多核苷酸(或其序列)的应用)。
抗体是能特异性结合分子，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的特定结构域或部分(moiety)或构造(“表位”)的免疫球蛋白分子。含表位的分子可具有免疫原性活性，使得其引起动物中的抗体产生应答；这样的分子被称为“抗原”。如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体(camelized antibody)、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的双特异性Fvs(sdFv)、胞内抗体和任意上的表位结合结构域。这种免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“单克隆抗体”是指同源性抗体群，其中单克隆抗体包括涉及抗原的选择性结合的氨基酸(天然产生的或非天然产生的)。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个表位(或抗原位点)。术语“单克隆抗体”不仅仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也涵盖其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包括具有结合抗原的必要特异性和能力的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。就抗体的来源或其制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)而言，其不旨在是限制性的。术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据“抗体”的定义描述的片段等。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等(1975)“Continuous Cultures Of Fused CellsSecreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用免疫原性量的细胞、细胞提取物或包含期望表位的蛋白质制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是但不限于原代细胞、培养细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。在其用作免疫原之前，用于免疫的细胞可被培养一段时间(例如，至少24小时)。细胞可本身或联合非变性佐剂(比如Ribi)用作免疫原(参见，例如Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in AntibodyProduction,”ILAR J.37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原时，细胞应保持完整并且优选地是活的。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被免疫的动物更好地检测到。变性佐剂或烈性佐剂(harsh adjuvants)，例如弗氏佐剂的使用，可使细胞破裂并且因此受阻。免疫原可以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以以维持在动物(例如，在组织重组体中)中的生存力这样的方式被施用。可替选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有的单克隆抗体和任意其它等效抗体可被测序，并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方式中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞内保持在载体中，然后可扩增和冷冻宿主细胞，用于将来的使用。这样的抗体的多核苷酸序列可用于基因操作，以生成本发明的单特异性或多特异性(例如，双特异性、三特异性和四特异性)分子以及亲和力优化的嵌合抗体、人源化抗体和/或犬源化(caninized)抗体，以改善抗体的亲和力或其它特征，如下所详述。
本发明的抗体和结合分子以“免疫特异性”方式经由它们的结合结构域结合表位。如本文所用，如果一个分子相对于可替选的表位与另一分子的一个表位更频繁、更迅速、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力结合或缔合，则认为该分子以“免疫特异性”方式(或免疫特异性地)结合所述另一分子的所述表位。例如，免疫特异性地结合病毒表位的抗体是相比于免疫特异性地结合其它病毒表位或非病毒表位以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间结合该病毒表位的抗体。通过阅读该定义同样理解，例如，免疫特异性地结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以特异性地或优先地结合至第二靶标或者可以不特异性地或不优先地结合第二靶标。照此，“免疫特异性结合”并不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。一般地，但不一定，提及“结合”意味着“免疫特异性”结合。天然抗体能够结合仅一个表位种类(即，它们是“单特异性的”)，虽然它们可免疫特异性地结合那个种类的多个拷贝(即，呈现出“二价”或“多价”)。如果结合呈现出受体结合其各自的配体的特异性的话，则两个分子被认为能够以“生理特异性”方式相互结合。
过去几十年已经看出对抗体的治疗潜力的关注的复苏，并且抗体已经变成生物技术衍生的药物的主导类别之一(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In TheTreatment Of Infectious Diseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。超过200种的基于抗体的药物已经批准使用或在开发中。
1.抗体的一般结构特征
天然产生的免疫球蛋白(例如IgG)的基本结构单元是四聚体，其由与两条较长的“重链”复合的两条较短的“轻链”构成；并且通常被表达为约150,000Da的糖蛋白。每条链由含“可变结构域”的氨基-末端(“N-末端”)部分和含至少一个“恒定结构域”的羧基-末端(“C-末端”)部分构成。IgG轻链由单“轻链可变结构域”(“VL”)和单“轻链恒定结构域”(“CL”)构成。因此，IgG分子的轻链的结构是n-VL-CL-c(其中n和c分别代表多肽的N-末端和C-末端)。IgG重链由单“重链可变结构域”(“VH”)、三个“重链恒定结构域”(“CH1”、“CH2”和“CH3”)和位于CH1和CH2结构域之间的“铰链”区(“H”)构成。因此，IgG重链的结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中n和c分别代表多肽的N-末端和C-末端)。完整的、未修饰的抗体(例如IgG抗体)结合抗原表位的能力取决于可变结构域的存在和序列。除非另外注明，否则本文描述的蛋白分子的结构域的顺序是呈“N-末端至C-末端”方向。
(a)恒定结构域
(i)轻链恒定结构域
优选的CL结构域是人IgG CLκ结构域。示例性人CLκ结构域的氨基酸序列是(SEQID NO:1)：
Figure BDA0002532907060000201
可替选地，示例性的CL结构域是人IgG CLλ结构域。示例性的人CLλ结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0002532907060000211
(ii)重链CH1结构域
抗体的两条重链的CH1结构域与抗体的轻链的“CL”恒定区复合，并且经由间插铰链结构域连接至重链CH2结构域。
示例性的CH1结构域是人IgG1 CH1结构域。示例性的人IgG1 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3)：
Figure BDA0002532907060000212
示例性的CH1结构域是人IgG2 CH1结构域。示例性的人IgG2 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4)：
Figure BDA0002532907060000213
示例性的CH1结构域是人IgG3 CH1结构域。示例性的人IgG3 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5)：
Figure BDA0002532907060000214
示例性的CH1结构域是人IgG4 CH1结构域。示例性的人IgG4 CH1结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6)：
Figure BDA0002532907060000215
(b)重链铰链区
一个示例性的铰链结构域是人IgG1铰链结构域。示例性的人IgG1铰链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7)：EPKSCDKTHTCPPCP。
另一示例性的铰链结构域是人IgG2铰链结构域。示例性的人IgG2铰链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8)：ERKCCVECPPCP。
另一示例性的铰链结构域是人IgG3铰链结构域。示例性的人IgG2铰链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9)：
Figure BDA0002532907060000216
另一示例性的铰链结构域是人IgG4铰链结构域。示例性的人IgG4铰链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10)：ESKYGPPCPSCP。如本文所述的，IgG4铰链结构域可包括稳定化突变，如S228P置换。示例性的稳定化的IgG4铰链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11)：ESKYGPPCPPCP。
(c)重链CH2和CH3结构域
两条重链的CH2和CH3结构域相互作用以形成IgG抗体的被细胞Fc受体识别的“Fc结构域”，细胞Fc受体包括但不限于Fcγ受体(FcγR)。如本文所用，术语“Fc区”用来限定IgG重链的C-末端区。一部分Fc区(包括含全部Fc区的部分)在本文中称为“Fc结构域”。如果Fc区的氨基酸序列相对于其他IgG同种型与该同种型最同源，那么认为Fc区具有特定的IgG同种型、类别或亚类。除了抗体已知的在诊断中的用途，已经显示抗体可用作治疗剂。
示例性的人IgG1的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12)：
Figure BDA0002532907060000221
如通过Kabat中所示的EU索引所编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG2的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13)：
Figure BDA0002532907060000222
Figure BDA0002532907060000231
如通过Kabat中所示的EU索引所编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG3的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14)：
Figure BDA0002532907060000232
如通过Kabat中所示的EU索引所编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG4的CH2-CH3结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:15)：
Figure BDA0002532907060000233
如通过Kabat中所示的EU索引所编号，其中X是赖氨酸(K)或不存在。
贯穿本申请说明书，IgG重链的恒定区中的残基的编号是按照Kabat等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NH1,MD(1991)(“Kabat”)中EU索引的编号，其通过引用清楚地并入本文。术语“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的恒定结构域的编号。来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变结构域的氨基酸也通过氨基酸在所述链中的位置命名。Kabat描述了抗体的许多氨基酸序列，鉴定了对于每个亚组的氨基酸共有序列，并且指定了对每个氨基酸的残基编号，并且如通过Kabat定义的，CDR被鉴定(应理解，如通过Chothia,C.&Lesk,A.M.所定义的CDRH1((1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901-917)提前五个残基开始)。Kabat的编号方案可通过参照保守氨基酸比对考虑中的抗体与Kabat中的共有序列之一扩展至不包括在其手册中的抗体。用于指定残基编号的该方法在本领结构域中已经变得标准化，并且易于鉴定在不同抗体(包括嵌合或人源化变体)中在等同位置处的氨基酸。例如，在人抗体轻链的位置50处的氨基酸占据与小鼠抗体轻链的位置50处的氨基酸等同的位置。
在抗体恒定区内在许多不同位置(例如Fc位置，包括但不限于通过Kabat中所示的EU索引所编号的位置270、272、312、315、356和358)已经观察到多态性，并且因此在所呈现的序列和现有技术中的序列之间可存在轻微差异。已经很好地表征了人免疫球蛋白的多态形式。目前，18个Gm异型是已知的：G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(Lefranc等“The Human IgG Subclasses:Molecular Analysis Of Structure,Function And Regulation.”Pergamon,Oxford,pp.43-78(1990)；Lefranc,G.等1979,Hum.Genet.:50,199-211)。具体考虑本发明的抗体可包含任何免疫球蛋白基因的任何同种异型(allotype)、同种型(isoallotype)或单体型(haplotype)，并且不限于本文提供的序列的同种异型、同种型或单体型。而且，在一些表达系统中，CH3结构域的C-末端氨基酸残基(以上粗体的)可被翻译后去除。因此，在本发明的CD16 x DA结合分子中，CH3结构域的C-末端残基是任选的氨基酸残基。具体地，通过本发明涵盖的是没有CH3结构域的C-末端残基的CD16 x DA结合分子。同样具体地，本发明涵盖的是包括CH3结构域的C-末端赖氨酸残基的这种构建体。
(d)可变结构域
IgG分子的可变结构域由三个“互补决定区”(“CDR”)以及称为“框架区”(“FR”)的间插非-CDR区段组成，CDR包含抗体的将与表位接触的氨基酸残基，FR大体上保持CDR环的结构并且确定CDR环的定位以允许这种接触(尽管某些框架残基也可接触表位)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。CDR的氨基酸序列确定抗体是否将能够结合特定的表位。抗体轻链与抗体重链的相互作用，以及特别地它们的VL和VH结构域的相互作用形成抗体的表位结合位点。
作为(或可以用作)抗体轻链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分别命名为：CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域。类似地，作为(或可以用作)抗体重链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分别命名为：CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域。因此，术语CDRL1结构域、CDRL2结构域、CDRL3结构域、CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域涉及这样的多肽，当其并入蛋白时引起蛋白能够结合至特定表位，而无论这种蛋白是具有轻链和重链的抗体还是双抗体或单链结合分子(例如scFv、BiTe等)，或是另一类型蛋白。
术语“表位结合结构域”意指结合分子的片段或部分(或者具有这种片段或部分的氨基酸序列的多肽)，其有助于结合分子免疫特异性地结合至表位的能力。表位结合结构域可包含抗体的VL或VH结构域，或者抗体的CDR结构域中的1个、2个、3个、4个或5个，或者可包含抗体的CDR结构域中全部的6个，并且，尽管能够免疫特异性地结合这种表位，但对不同于这种抗体的表位的这种表位可呈现免疫特异性、亲和力或选择性。表位结合结构域可仅仅包含CDR的部分，即结合所需的CDR残基的子集，被称为SDR(Kim,J.H.等(2012)“Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting,”Methods Mol.Biol.907:237-245；Kim,K.S.等(2010)“Construction Of A HumanizedAntibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues(SDR)-Grafting And De-Immunization,”Biochem.Biophys.Res.Commun.396(2):231-237；Kashmiri,S.V.等(2005)“SDR Grafting–A New Approach To AntibodyHumanization,”Methods 36(1):25-34；Gonzales,N.R.等(2004)“SDR Grafting Of AMurine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize ItsImmunogenicity,”Mol.Immunol.41:863-872)。然而，优选地，表位结合结构域将包含抗体的CDR结构域中全部的6个。表位结合结构域可以是单条多肽链(例如，scFv)，或者可包含两条或更多条多肽链，其可各自具有氨基端和羧基端(例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)，并且其可经由二硫键相互共价结合。
2.抗体的人源化
本发明也特别地包括结合分子，所述结合分子包括抗体的VL或VH结构域，并且优选抗体的VL和VH结构域两者。优选地，这种抗体是人源化抗体。单克隆抗体典型地在非人物种，诸如小鼠和兔子中制备。这种抗体的可变结构域和/或恒定结构域可被识别为免疫原，因此引起针对它们的免疫应答。然而，这种分子可通过引入一个或多个氨基酸置换“人源化”以便使得这种抗体更像人所产生的抗体，从而减少或消除它们的免疫原性。术语“人源化”抗体是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有来自非人物种的免疫球蛋白的表位结合位点和该分子的基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。这种抗体的可变结构域的多核苷酸序列可用于基因操纵以产生这种衍生物并且改善这种抗体的亲和力或其它特征。针对各种抗体的这种方法的应用由下列报道：LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And ImmuneResponse,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224；Sato,K.等(1993)Cancer Res53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies:GraftingAn Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The ImportanceOf Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibody Hybridoma 2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To InhibitHuman Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of AnAnti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies WithSpecificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施方式中，人源化抗体具有相对于原抗体序列不同的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个和/或六个)。
使抗体人源化的一般原则涉及保留抗体的表位结合结构域的基本序列，同时以人抗体序列交换非人剩余部分。存在使单克隆抗体人源化的四个常规步骤。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体或犬源化抗体，即，决定在人源化或犬源化过程中使用哪个抗体框架区；(3)实际的人源化或犬源化方法/技术；和(4)人源化抗体的转染和表达。参见，例如，美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692和6,331,415。
已经描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位结合结构域的许多人源化抗体分子，包括具有啮齿动物可变结构域或修饰的啮齿动物可变结构域和它们与人恒定结构域融合的相关的互补决定区(CDR)的嵌合抗体(参见，例如Winter等(1991)“Man-madeAntibodies,”Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989)“Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86:4220-4224(1989)；Shaw等(1987)“Characterization Of A Mouse/HumanChimeric Monoclonal Antibody(17-1A)To A Colon Cancer Tumor-AssociatedAntigen,”J.Immunol.138:4534-4538；和Brown等(1987)“Tumor-Specific GeneticallyEngineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,”Cancer Res.47:3577-3583)。其它参考文献描述了在与适当的人抗体恒定结构域融合之前移植至人支撑框架区(FR)的啮齿动物的CDR(参见，例如Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodiesfor Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping HumanAntibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；和Jones等(1986)“Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human AntibodyWith Those From A Mouse,”Nature 321:522-525)。另一参考文献描述了由重组修饰的啮齿动物框架区支撑的啮齿动物的CDR。参见，例如，欧洲专利公开号519,596。这些“人源化的”分子被设计为使得对啮齿动物抗人抗体分子的不利免疫应答最小化，所述不利免疫应答限制了这些部分在人接受者中治疗应用的持续时间和效力。也可使用人源化抗体的其它方法，其公开在以下文献中：Daugherty等(1991)“Polymerase Chain ReactionFacilitates The Cloning,CDR-Grafting,And Rapid Expression Of A MurineMonoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of LeukocyteIntegrins,”Nucl.Acids Res.19:2471-2476和美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867和5,866,692。本发明特别地涵盖这样的结合分子(包括抗体和双抗体)，其包含“人源化”抗体的VL和/或VH结构域。
尽管这种成功，优化用于治疗用途的稳定的、功能的异源二聚体的、非单特异性双抗体的生产可通过认真考虑和布置多肽链中采用的结构域而进一步改进。因此，本发明涉及提供特异性多肽，其被特别设计以通过共价结合形成能够同时结合CD16和疾病抗原的稳定和治疗有用的异源二聚体双抗体和异源二聚体Fc双抗体。
B.双特异性抗体
如以上指出的，天然抗体能够结合至仅一个表位种类，虽然它们可结合该种类的多个拷贝。抗体结合抗原的表位的能力取决于抗体的VL和VH结构域的存在和氨基酸序列。抗体的轻链和重链的相互作用，以及特别地其VL和VH结构域的相互作用形成天然抗体、诸如IgG的两个表位结合结构域中的一个。天然抗体能够结合仅仅一个表位种类(即，它们是单特异性的)，尽管它们能够结合该种类的多个拷贝(即呈现二价或多价)。
抗体的功能可通过产生能够同时结合两个独立且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)的基于多特异性抗体的分子和/或通过产生对相同表位和/或抗原具有较高价态(即，多于两个结合结构域)的基于抗体的分子来提高。
为了提供比天然抗体具有更大能力的分子，已经开发了广泛种类的重组双特异性抗体形式(参见，例如PCT公开号WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)。大多数这样的方法使用连接体肽以将另外的结合结构域(例如scFv、VL、VH等)与抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合或融合在抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)内，或将多个抗体结合部分相互融合(例如，两个Fab片段或scFv)。可替选的形式使用连接体肽以将结合蛋白(例如scFv、VL、VH等)与二聚结构域、诸如CH2-CH3结构域或可替选的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，这种方法涉及折中(compromises)和取舍(trade-offs)。例如，PCT公开号WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公开了连接体的使用可引起治疗设置中的问题，并且教导了三特异性抗体，其中CL和CH1结构域从其各自的天然位置转换并且已经使得VL和VH结构域多样化(WO 2008/027236；WO 2010/108127)，以使得它们结合多于一个的抗原。因此，这些文献中公开的分子用结合特异性换取(trade)用于结合另外的抗原种类的能力。PCT公开号WO 2013/163427和WO 2013/119903公开了修饰CH2结构域以包含包括结合结构域的融合蛋白加合物。文献指出CH2结构域可能在介导效应子功能中仅起到微小作用。PCT公开号WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公开了重组抗体，其Fc区已经以另外的VL和VH结构域替换，以形成三价结合分子。PCT公开号WO 2003/025018和WO2003012069公开了重组双抗体，其单独的链包含scFv结构域。PCT公开号WO 2013/006544公开了多价Fab分子，其被合成为单多肽链且然后经历蛋白水解以产生异源二聚体结构。因此，这些文献中公开的分子用介导效应子功能的全部或一些能力换取结合另外的抗原种类的能力。PCT公开号WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公开了将另外的结合结构域或官能团添加至抗体或抗体部分(例如将双抗体添加至抗体的轻链，或将另外的VL和VH结构域添加至抗体的轻链和重链，或添加异源融合蛋白或将多个Fab结构域相互链接)。因此，这些文献中公开的分子用天然的抗体结构换取用于结合另外的抗原种类的能力。
C.嵌合抗原受体
本发明的结合分子可以是嵌合抗原受体(“CAR”)，其包含能够结合CD16和疾病抗原的单链可变片段(scFv)。如上所示，通过经由短连接肽使轻链可变结构域和重链可变结构域连接在一起而形成scFv。第一代CAR典型地具有来自CD3ζ-链的胞内结构域，其是来自内源性TCR的信号的初级传递介质。第二代CAR具有从各种共激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS等)至CAR的胞质尾区的另外胞内信号传导结构域以便给T-细胞提供另外的信号。第三代CARs组合多个信号传导结构域，诸如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以便进一步增加功效(Tettamanti,S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia ByCytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific ChimericAntigen Receptor,”Br.J.Haematol.161:389-401；Gill,S.等(2014)“Efficacy AgainstHuman Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In AMouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,”Blood123(15):2343-2354；Mardiros,A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific ChimericAntigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And AntitumorEffects Against Human Acute Myeloid Leukemia,”Blood 122:3138-3148；Pizzitola,I.等(2014)“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens EfficientlyTarget Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,”Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62。
本发明的CAR的胞内结构域优选选自下列任意一种的胞内结构域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FcεRIγ、FcεRIγCAIX、调蛋白-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或者Ly49H-CD3ζ(Tettamanti,S.等(2013)“Targeting Of AcuteMyeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A NovelCD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,”Br.J.Haematol.161:389-401；Gill,S.等(2014)“Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation OfNormalHematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-ModifiedT Cells,”Blood123(15):2343-2354；Mardiros,A.等(2013)“T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic EffectorFunctions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,”Blood122:3138-3148；Pizzitola,I.等(2014)“Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells invivo,”Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。
II.双特异性双抗体
现有技术已经另外地指出在能够结合两个或更多个不同表位种类方面(即，除了二价或多价外，还表现出双特异性或多特异性)产生不同于天然抗体的双抗体的能力(参见，例如Holliger等(1993)“’Diabodies’:Small Bivalent And Bispecific AntibodyFragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)90:6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US2004/0220388(Mertens等.)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both TheEpidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor ReceptorFor Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO 02/02781(Mertens等.)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA DiabodyAllows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor TargetingApplications,”Protein Eng Des Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“MultimerizationOf A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated ThroughVariable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“ADiabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion OfHuman Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using ARefolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“BispecificT cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
双抗体的设计基于单链可变结构域片段(scFv)的结构，其中轻链和重链可变结构域利用短连接肽相互连接。Bird等人(1988)(“Single-Chain Antigen-BindingProteins,”Science 242:423-426)描述了在一个可变结构域的羧基端和另一可变结构域的氨基端之间架起约3.5nm的桥的连接肽的实例。已经设计和使用了其它序列的连接体(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。为了另外的功能、诸如药物的连接或连接至固体载体，又可对连接体进行修饰。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成产生，可以使用自动合成器。对于scFv的重组产生，包含编码scFv的多核苷酸的合适质粒可以被引入到合适的宿主细胞，真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。编码目标scFv的多核苷酸可以通过常规操作、诸如多核苷酸的连接进行制备。所得scFv可以采用本领域已知的标准蛋白质提纯技术进行分离。
提供非单特异性“双抗体”相对于抗体带来了显著的优势：共连接和共定位表达不同表位的细胞的能力。因此，双特异性双抗体具有广泛范围的应用，包括治疗和免疫诊断。双特异性允许在各种应用中在双抗体的设计和改造上具有很大的灵活性，提供对多聚体抗原的增强的亲合力、不同抗原的交联、并且依赖于两个靶抗原的存在定向靶向特定的细胞类型。由于它们的双价、低解离率和从循环中快速清除(对于小尺寸的双抗体，处于约50kDa或低于约50kDa)，本领域中已知的双抗体分子还在肿瘤造影领域中显示出特定用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide StabilizedDiabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221-1225)。
产生双特异性双抗体的能力已经导致它们用于(以“反式”)将两个细胞共同连接在一起，例如通过共同连接不同细胞表面上存在的受体(例如，将细胞毒性T-细胞交联到靶细胞，诸如表达疾病抗原的癌症细胞或病原体感染细胞)(Staerz等(1985)“HybridAntibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,”Nature 314:628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-CellsMediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”ActaPharmacol.Sin.26:649-658；Sloan等(2015)“Targeting HIV Reservoir in InfectedCD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)that Bind HIVEnvelope and Recruit Cytotoxic T Cells,”PLoS Pathog 11(11):e1005233.doi:10.1371/journal.ppat.1005233))。可替选地(或另外地)，双特异性(或多特异性)双抗体可用于(以“顺式”)共同连接存在于相同细胞表面上的分子、诸如受体等。不同细胞和/或受体的共同连接可用于调节效应子功能和/或免疫细胞信号传导。包含表位结合结构域的多特异性分子(例如，双特异性双抗体)可定向于在T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、抗原呈递细胞或其它单核细胞上表达的任何免疫细胞的表面决定子，诸如CD2、CD3、CD8、CD16、TCR、NKG2D等；或者定向于B细胞的表面决定子，诸如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74(Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules ToAchieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-CellLymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；Cheson,B.D.等(2008)“Monoclonal AntibodyTherapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,”N.Engl.J.Med.359(6):613-626；Castillo,J.等(2008)“NewerMonoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,”Exp.Hematol.36(7):755-768)。具体地，定向于免疫效应细胞上存在的细胞表面受体的表位结合结构域可用于能够介导重定向的细胞杀伤的多特异性结合分子的产生。
在许多研究中，结合效应细胞决定子、例如Fcγ受体(FcγR)的双抗体，也发现激活效应细胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic Tcells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T cell Activation In ColonCarcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916；WO 2006/113665；WO2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。通常，效应细胞激活经由Fc结构域-FcγR相互作用通过将结合抗原的抗体结合至效应细胞被触发；因此，在这点上，双抗体分子可呈现出像Ig一样的功能性，无论它们是否包括Fc结构域(例如，如本领域已知的或本文例证的任何效应子功能试验所测试的(例如ADCC试验))。通过交联肿瘤细胞和效应细胞，双抗体不仅将效应细胞带入靠近肿瘤细胞的位置内，而且引起有效的肿瘤杀伤(参见，例如Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。
然而，上述双特异性双抗体的优势付出了巨大的代价。这种非单特异性双抗体的形成需要成功组装两个或更多个截然不同的多肽(即，这种形成需要双抗体通过不同多肽链种类的异源二聚化形成)。该事实与单特异性双抗体相反，单特异性双抗体通过相同多肽链的同源二聚化形成。因为必须提供至少两个不相似的多肽(即两个多肽种类)以便形成非单特异性双抗体，并且因为这种多肽的同源二聚化导致非活性的分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)UsingA Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，所以这样的多肽的产生必须以防止相同种类的多肽之间的共价结合的方式完成(即，以便防止同源二聚化)(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)UsingA Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。因此，现有技术已经教导了这类多肽的非共价缔合(参见，例如，Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEADiabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A DiabodyFor Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human FcDomain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“ConstructionOf A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-LikeBispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
然而，现有技术已经认识到由非共价缔合的多肽组成的双特异性双抗体是不稳定的并且容易解离为非功能单多肽链单体(参见，例如Lu,D.等(2005)“A Fully HumanRecombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth FactorReceptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced AntitumorActivity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
在面对该挑战时，现有技术已经成功开发出稳定的、共价结合的异源二聚体非单特异性双抗体，命名为
Figure BDA0002532907060000331
双抗体，参见例如D.D.等(2015)“Targeting HIV Reservoirin Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules(DARTs)thatBind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,”PLoS Pathog.11(11):e1005233.doi:10.1371/journal.ppat.1005233；Al Hussaini,M.等(2015)“TargetingCD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting
Figure BDA0002532907060000332
Platform,”Blood pii:blood-2014-05-575704；Chichili,G.R.等(2015)“A CD3xCD123Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia:Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,”Sci.Transl.Med.7(289):289ra82；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-BasedDual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And InVivo B-Cell Depletion,”J.Molec.Biol.399(3):436-449；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIB(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Moore,P.A.等(2011)“Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell KillingOf B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；美国专利号8,044,180、8,133,982、8,187,593、8,193,318、8,530,627、8,669,349、8,778,339、8,784,808、8,795,667、8,802,091、8,802,093、8,946,387、8,968,730、和8,993,730；美国专利公开号2009/0060910、2010/0174053、2011/0081347、2011/0097323、2011/0117089、2012/0009186、2012/0034221、2012/0141476、2012/0294796、2013/0149236、2013/0295121、2014/0017237和2014/0099318；欧洲专利文献号EP 1868650、EP 2158221、EP 2247304、EP 2252631、EP2282770、EP 2328934、EP 2376109、EP 2542256、EP 2601216、EP 2714079、EP 2714733、EP2786762、EP 2839842、EP 2840091；和PCT公开号WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO2010/027797、WO 2010/033279、WO 2010/080538、WO 2011/109400、WO 2012/018687、WO2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892和WO2015/026894)。这种双抗体包括两个或更多个共价复合的多肽，并且涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化进入每个采用的多肽种类，其允许二硫键形成并且因此将一对或多对这样的多肽链相互共价结合。例如，已经显示将半胱氨酸残基添加至这种构建体的C-末端以允许在所涉及的多肽链之间二硫键键合，从而稳定化所得的异源二聚体，而不干扰双抗体的结合特征。
最简单的
Figure BDA0002532907060000341
双抗体包括两条多肽链，每条多肽链包括三个结构域(图1A-1B)。第一多肽链包括：(i)包含第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区的结构域(VL1)，(ii)包含第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区的第二结构域(VH2)，和(iii)用来促进与第二多肽链的异源二聚化(“异源二聚体促进结构域”)并且将双抗体的第一多肽链共价结合至第二多肽链的第三结构域。第二多肽链包含互补第一结构域(VL2结构域)、互补第二结构域(VH1结构域)和与第一多肽链的第三结构域复合以促进异源二聚化(“异源二聚体促进结构域”)和与第一多肽链的共价键合的第三结构域。这种分子是稳定的、有效的并且具有同时结合两个或更多个抗原的能力。在一个实施方式中，第一和第二多肽链的第三结构域各自包含半胱氨酸
Figure BDA0002532907060000342
残基，其用来通过二硫键将多肽结合在一起。一条或两条多肽链的第三结构域可另外地具有CH2-CH3结构域的序列，以使双抗体多肽的复合形成能够结合细胞(如B淋巴细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的Fc受体的Fc结构域。已经描述了这种分子的许多变型(参见，例如美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053、2007-0004909、2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)并且在本文中提供。已经描述了这种分子的许多变型(参见，例如美国专利公开号2015/0175697、2014/0255407、2014/0099318、2013/0295121、2010/0174053、2009/0060910、2007-0004909；欧洲专利公开号EP2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221、EP 1868650；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)并且在本文中提供。
对于期望双特异性或三价分子但是不需要Fc的应用来说可替选构建体在本领域是已知的，包括但不限于双特异性T细胞接合分子，也被称为“
Figure BDA0002532907060000351
抗体”(参见，例如，PCT公开号WO 1993/11161；和WO 2004/106381)，和四价串联抗体，也被称为
Figure BDA0002532907060000352
(参见，例如美国专利公开号2011-0206672；欧洲专利公开号EP 2371866；和PCT公开号WO1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)。BiTE由包含串联连接的scFv的单条多肽链形成，而TandAb通过两条相同多肽链的同源二聚化形成，该两条多肽链各自具有VH1、VL2、VH2和VL2结构域。
本发明提供能够增强针对表达疾病抗原的靶细胞(例如，癌症细胞或病原体感染的细胞、病原体等)的杀伤的免疫应答的双特异性结合分子。这种双特异性结合分子能够结合“第一表位”和“第二表位”，其中这种表位之一是CD16的表位且这种表位中的另一个是疾病抗原(“DA”)的表位。特定表位被命名为第一vs.第二表位是没有关系的；这种表示法仅仅与本发明结合分子的多肽链的结构域的存在和取向有关。因此，本发明的双特异性分子包括能够结合CD16的表位的“VLCD16”/“VHCD16”结构域和能够结合疾病抗原的表位的“VLDA”/“VHDA”结构域。本发明尤其包括利用本文提供的任意方法所产生的双特异性双抗体、BiTE、抗体和TandAb。
A.缺少Fc结构域的双抗体
在一种实施方式中，本发明的CD16结合分子将是双特异性双抗体并且将包括能够结合第一和第二表位两者的结构域，但将缺少Fc结构域，并且因此不能经由Fc-FcγR相互作用结合FcγR分子。然而，这种分子能经由它们的CD16结合结构域的SDR或CDR结合至CD16。Fc结构域的缺乏因此用于防止分子结合至非CD16 FcγR，诸如抑制性受体CD32B。
双特异性双抗体的这种实施方式的第一多肽链在N-末端至C-末端方向上优选包括：N-端、能够结合第一或第二表位的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD16或VLDA)、第一间插间隔子肽(连接体1)、能够结合疾病抗原的表位的单克隆抗体的VH结构域(如果这种第一多肽链包含VLCD16)或能够结合CD16的单克隆抗体的VH结构域(如果这种第一多肽链包含VLDA)、任选包含半胱氨酸残基的第二间插间隔子肽(连接体2)、异源二聚体-促进结构域和C-端(图1A-1B)。
双特异性双抗体的这种实施方式的第二多肽链在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能够结合第一或第二表位的单克隆抗体的VL结构域(即，VLCD16或VLDA，并且为不是选择用于包括在双抗体的第一多肽链中的VL结构域)、间插间隔子肽(连接体1)、能够结合第一或第二表位的单克隆抗体的VH结构域(即，VHCD16或VHDA，并且为不是选择用于包括在双抗体的第一多肽链中的VH结构域)、任选包含半胱氨酸残基的第二间插间隔子肽(连接体2)、异源二聚体-促进结构域和C-端(图1A-1B)。所采用的对于特定表位特异性的VL和VH结构域优选获自或衍生自相同单克隆抗体。然而，这种结构域可衍生自不同单克隆抗体，条件是它们缔合以形成能免疫特异性地结合这种表位的功能够结合结构域。这种不同的抗体在本文中被称为“相应”抗体。
第一多肽链的VL结构域与第二多肽链的VH结构域相互作用以形成对表位之一(例如，第一表位)特异性的第一功能表位结合结构域。同样，第二多肽链的VL结构域与第一多肽链的VH结构域以便形成对另一表位(即，第二表位)特异性的第二功能表位结合结构域。因此，对第一和第二多肽链的VL和VH结构域的选择进行“协调”，使得双抗体的两条多肽链共同地包括能够结合第一表位和第二表位两者的VL和VH结构域(即，它们共同地包括VLCD16/VHCD16和VLDA/VHDA)。
最优选地，对间插间隔子肽(即，“连接体1”，其分开这种VL和VH结构域)的长度进行选择以基本上或完全地防止多肽链的VL和VH结构域相互结合(例如，由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个间插连接体氨基酸残基组成)。因此，第一多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能够相互结合。同样，第二多肽链的VL和VH结构域基本上或完全不能相互结合。优选的间插间隔子肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:16)：GGGSGGGG。
第二间插间隔子肽(“连接体2”)的长度和组成基于一个或多个促进这种二聚化的多肽结构域(即，“异源二聚体-促进结构域”)的选择进行选择。典型地，第二间插间隔子肽(连接体2)将包含3-20个氨基酸残基。具体地，在所采用的异源二聚体-促进结构域包含/不包含半胱氨酸残基的情况下，使用包含半胱氨酸的第二间插间隔子肽(连接体2)。包含半胱氨酸的第二间插间隔子肽(连接体2)将包含1个、2个、3个或更多个半胱氨酸。优选的含半胱氨酸的间隔子肽(连接体2)具有序列GGCGGG(SEQ ID NO:17)。可替选地，连接体2不包含半胱氨酸(例如，GGG、GGGS(SEQ ID NO:18)、LGGGSG(SEQ ID NO:19)、GGGSGGGSGGG(SEQ IDNO:20)、ASTKG(SEQ ID NO:21)、LEPKSS(SEQ ID NO:22)、APSSS(SEQ ID NO:23)等)并且如下所述使用含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域。任选地，使用含半胱氨酸的连接体2和含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域两者。
异源二聚体-促进结构域可以是一条链上的GVEPKSC(SEQ ID NO:24)或VEPKSC(SEQ ID NO:25)或AEPKSC(SEQ ID NO:26)以及另一条多肽链上的GFNRGEC(SEQ ID NO:27)或FNRGEC(SEQ ID NO:28)(US2007/0004909)。
在优选的实施方式中，异源二聚体-促进结构域将包括相反电荷的串联重复螺旋结构域，例如“E-螺旋”异源二聚体-促进结构域(SEQ ID NO:29：
Figure BDA0002532907060000371
Figure BDA0002532907060000372
)，其谷氨酸残基将在pH 7时形成负电荷，或“K-螺旋”异源二聚体-促进结构域(SEQ ID NO:30：
Figure BDA0002532907060000373
)，其赖氨酸残基将在pH 7时形成正电荷。这种带电结构域的存在促进第一和第二多肽之间的缔合，并且因而促进异源二聚体形成。可以利用异源二聚体-促进结构域，其包含上述E-螺旋和K-螺旋序列的修饰以便包括一个或多个半胱氨酸残基。这种半胱氨酸残基的存在允许一条多肽链上存在的螺旋变得与另一条多肽链上存在的互补螺旋共价键合，由此使多肽链相互共价键合并且增加双抗体的稳定性。这种特别优选的异源二聚体-促进结构域的实例包括具有氨基酸序列
Figure BDA0002532907060000374
(SEQ ID NO:31)的修饰的E-螺旋，和具有氨基酸序列
Figure BDA0002532907060000375
Figure BDA0002532907060000376
(SEQ ID NO:32)的修饰的K-螺旋。
如在WO 2012/018687中所公开，为了提高双抗体的体内药代动力学特性，双抗体可以进行修饰以在双抗体的一个或个末端上包含血清结合蛋白的多肽部分。最优选地，血清结合蛋白的这种多肽部分将被安装在双抗体的多肽链的C-端。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白并且在人中具有19天的半衰期。白蛋白具有几个小分子结合结构域，这允许其非共价结合其它蛋白并且因此延长其血清半衰期。链球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的白蛋白-结合结构域3(ABD3)由形成稳定三螺旋束的46个氨基酸残基组成并且具有宽的白蛋白结合特异性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode OfInteraction For Bacterial Albumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120)。因此，用于提高双抗体的体内药物动力学特性的血清结合蛋白的特别优选的多肽部分是来自链球菌G蛋白的白蛋白-结合结构域(ABD)，并且更优选地链球菌菌株G148的G蛋白的白蛋白-结合结构域3(ABD3)(SEQ ID NO:33):LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKSAEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068(通过引用并入本文)中所公开，SEQ ID NO:33的“去免疫”变体具有减弱或消除MHC II类结合的能力。基于组合的突变结果，下述的置换组合被认为是用于形成这种去免疫ABD的优选置换：66D/70S+71A；66S/70S+71A；66S/70S+79A；64A/65A/71A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。变体ABD具有修饰L64A、I65A和D79A或者修饰N66S、T70S和D79A。特别优选的是具有下列氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060000381
(SEQ ID NO:34)、
或者氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060000382
(SEQ ID NO:35)、
或者氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060000383
(SEQ ID NO:36)的变体去免疫的ABD，因为这种去免疫的ABD呈现出基本上野生型的结合，同时提供减弱的MHC II类结合。因此，这种具有ABD的双抗体的第一多肽链包含第三连接体(连接体3)，其优选位于这种多肽链的E-螺旋(或K-螺旋)结构域的C-末端以便间插在E-螺旋(或K-螺旋)结构域和ABD(其优选为去免疫的ABD)之间。这种连接体3的优选序列是SEQ ID NO:18：GGGS。
B.包含Fc结构域的双抗体
本发明的一种实施方式涉及多特异性(例如，双特异性、三特异性、四特异性等)双抗体，其包含Fc结构域并且能同时结合CD16的表位和疾病抗原的表位。这种分子的Fc结构域可以是任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。所述分子可进一步包含CH1结构域和/或铰链结构域。当存在时，CH1结构域和/或铰链结构域可以是任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，并且优选具有与期望Fc结构域相同的同种型。
将IgG的CH2-CH3结构域添加至双抗体多肽链中的一者或两者，使得双抗体链的复合导致Fc结构域的形成、增加了双抗体的生物学半衰期和/或改变双抗体的价态。这种双抗体包含两条或更多条多肽链，其序列允许多肽链相互共价结合以形成能同时结合第一表位和第二表位的共价缔合的双抗体。将IgG的CH2-CH3结构域并入到双抗体多肽的两者上将允许形成两链双特异性含Fc结构域的双抗体(图2)。
可替选地，将IgG的CH2-CH3结构域并入双抗体多肽中的仅仅一个上将允许形成更复杂的四链双特异性含Fc结构域的双抗体(图3A-3C)。图3C显示具有恒定轻(CL)结构域和恒定重CH1结构域的代表性四链双抗体，然而可以可替选地采用这种结构域以及其它多肽的片段(参见，例如图3A和3B，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221以及PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。因此，例如，代替CH1结构域，可以采用衍生自人IgG的铰链结构域的具有氨基酸序列GVEPKSC(SEQ ID NO:24)、VEPKSC(SEQID NO:25)或AEPKSC(SEQ ID NO:26)的多肽，并且代替CL结构域，可以采用人κ轻链的C-末端的6个氨基酸，GFNRGEC(SEQ ID NO:27)或FNRGEC(SEQ ID NO:28)。代表性的含肽四链双抗体显示在图3A中。可替选地或者另外地，可以采用这样的肽，其包含相反电荷的串联螺旋结构域，诸如“E-螺旋”螺旋形结构域(SEQ ID NO:29：
Figure BDA0002532907060000391
Figure BDA0002532907060000392
或SEQ ID NO:31：
Figure BDA0002532907060000393
)；和“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:30：
Figure BDA0002532907060000394
或SEQ ID NO:32：
Figure BDA0002532907060000395
)。代表性的包含螺旋结构域的四链双抗体显示在图3B中。
本发明的包含Fc结构域的双抗体分子可包含另外的间插间隔子肽(连接体)，一般这样的连接体将被并入在异源二聚体结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3结构域之间和/或并入在CH2-CH3结构域和可变结构域(即，VH或VL)之间。典型地，另外的连接体将包含3-20个氨基酸残基并且可任选地包含IgG铰链结构域的全部或部分(优选地，IgG铰链结构域的具有1个、2个、3个或更多个半胱氨酸残基的含半胱氨酸部分)。可用在本发明的双特异性包含Fc结构域的双抗体分子中的连接体包括：GGGS(SEQ ID NO:18)、LGGGSG(SEQ IDNO:19)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:20)、ASTKG(SEQ ID NO:21)、LEPKSS(SEQ ID NO:22)、APSSS(SEQ ID NO:23)、APSSSPME(SEQ ID NO:37)、VEPKSADKTHTCPPCP(SEQ ID NO:38)、LEPKSADKTHTCPPCP(SEQ ID NO:39)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:40)、scFv连接体：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)；“长”连接体：GGGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:42)、GGC和GGG。LEPKSS(SEQ ID NO:22)可以代替GGG或GGC使用以便于克隆。另外，氨基酸GGG或LEPKSS(SEQID NO:22)可紧接DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:40)以形成可替选的连接体：GGGDKTHTCPPCP(SEQID NO:43)和LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:44)。除了连接体外，本发明的双特异性含Fc结构域的分子可包含IgG铰链结构域，或本发明的双特异性含Fc结构域的分子可包含代替连接体的IgG铰链结构域。示例性的铰链结构域包括：来自IgG1的EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNO:5)、来自IgG2的ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:6)、来自IgG3的ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKS CDTPPPCPRCP(SEQ ID NO:7)、来自IgG4的ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:8)和
Figure BDA0002532907060000402
(SEQ ID NO:9)，包含稳定化S228P置换(如按照Kabat中所示的EU索引所编号)以减少链交换的IgG4铰链变体。
如图3A-3C所提供，本发明的包含Fc结构域的双抗体可包含四条链。这种双抗体的第一和第三多肽链包含三个结构域：(i)含VL1的结构域、(ii)含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域和(iv)含CH2-CH3序列的结构域。第二和第四多肽链包含：(i)含VL2的结构域、(ii)含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域，其中异源二聚体-促进结构域促进第一/第三多肽链与第二/第四多肽链的二聚化。第三和第四多肽链的VL和/或VH结构域以及第一和第二多肽链的VL和/或VH结构域可以相同或不同，以便允许单特异性的、双特异性的或四特异性的四价结合。符号“VL3”和“VH3”分别表示结合这种双抗体的“第三”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。符号“VL4”和“VH4”分别表示结合这种双抗体的“第四”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。本发明的代表性四链双特异性含Fc结构域的双抗体的多肽链的一般结构提供在表1中：
Figure BDA0002532907060000401
HPD＝异源二聚体-促进结构域
在具体实施方式中，本发明的双抗体是由总计四条多肽链构成的双特异性的、三价的(即，具有四个表位结合结构域)含Fc的双抗体(图3A-3C)。本发明的双特异性的、三价的含Fc的双抗体包含两个第一表位结合结构域和两个第二表位结合结构域。
在进一步的实施方式中，本发明的含Fc结构域的双抗体可包含三条多肽链。这种双抗体的第一多肽包含三个结构域：(i)含VL1的结构域、(ii)含VH2的结构域和(iii)含CH2-CH3序列的结构域。这种双抗体的第二多肽包含：(i)含VL2的结构域、(ii)含VH1的结构域和(iii)促进与双抗体的第一多肽链异源二聚化和共价键合的结构域。这种双抗体的第三多肽包CH2-CH3序列。因此，这种双抗体的第一和第二多肽链一起缔合以形成能够结合第一或第二表位的VL1/VH1表位结合结构域、以及能够结合这种表位中的另一表位的VL2/VH2表位结合结构域。第一和第二多肽通过在它们各自的第三结构域中的涉及二硫键的半胱氨酸残基相互键合。特别地，第一和第三多肽链相互复合以形成经由二硫键稳定的Fc结构域。这种双特异性双抗体具有增强的功效。图4A和4B示例这种双抗体的结构。这种含Fc结构域的双抗体可具有两种取向的任一种(表2)：
Figure BDA0002532907060000411
HPD＝异源二聚体-促进结构域
在具体实施方式中，本发明的双抗体是由总计三条多肽链构成的双特异性的、二价的(即，具有两个表位结合结构域)含Fc的双抗体(图4A-4B)。本发明的双特异性的、二价的含Fc的双抗体包含一个对第一或第二表位免疫特异性的表位结合结构域、以及能够结合这种表位中的另一表位的VL2/VH2表位结合结构域。
在进一步的实施方式中，含Fc结构域的双抗体可包含总计五条多肽链。在特定的实施方式中，五条多肽链中的两条具有相同的氨基酸序列。这种双抗体的第一多肽链包含：(i)含VH1的结构域、(ii)含CH1的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。第一多肽链可以是抗体的包含VH1和重链恒定区的重链。这种双抗体的第二和第五多肽链包含：(i)含VL1的结构域和(ii)含CL的结构域。这种双抗体的第二和/或第五多肽链可以是抗体的包含与第一/第三多肽链的VH1互补的VL1的轻链。第一、第二和/或第五多肽链可分离自天然发生的抗体。可替选地，它们可重组构建。这种双抗体的第三多肽链包含：(i)含VH1的结构域、(ii)含CH1的结构域、(iii)含CH2-CH3序列的结构域、(iv)含VL2的结构域、(v)含VH3的结构域和(vi)异源二聚体-促进结构域，其中所述异源二聚体-促进结构域促进第三链与第四链的二聚化。这种双抗体的第四多肽包含：(i)含VL3的结构域、(ii)含VH2的结构域和(iii)促进与双抗体的第三多肽链的异源二聚化和共价键合的结构域。
因此，这种双抗体的第一和第二多肽链、以及第三和第五多肽链一起缔合以形成能够结合第一表位的两个VL1/VH1表位结合结构域。这种双抗体的第三和第四多肽链一起缔合以形成能够结合第二表位的VL2/VH2表位结合结构域、以及能够结合第三表位的VL3/VH3表位结合结构域。第一和第三多肽通过在它们各自的恒定区中的涉及二硫键的半胱氨酸残基相互键合。特别地，第一和第三多肽链相互复合以形成Fc结构域。这种多特异性双抗体具有增强的功效。图5示出这种双抗体的结构。应理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以相同或不同，以便允许单特异性的、双特异性的或三特异性的结合。
对多肽链的VL和VH结构域进行选择以便形成对期望表位特异性的VL/VH表位结合结构域。通过多肽链的缔合形成的VL/VH表位结合结构域可以相同或不同，以便允许单特异性的、双特异性的、三特异性的或四特异性的四价结合。具体地，VL和VH结构域可以进行选择，使得多价双抗体可包含针对第一表位的两个结合结构域和针对第二表位的两个结合结构域；或者针对第一表位的三个结合结构域和针对第二表位的一个结合结构域；或者针对第一表位的两个结合结构域、针对第二表位的一个结合结构域和针对第三表位的一个结合结构域(如图5中所描绘)。本发明的代表性五链含Fc结构域的双抗体的多肽链的一般结构被提供在表3中：
Figure BDA0002532907060000421
Figure BDA0002532907060000431
HPD＝异源二聚体-促进结构域
在具体实施方式中，本发明的双抗体是由总计五条多肽链构成的双特异性的、四价的(即，具有四个表位结合结构域)含Fc的双抗体，其具有对第一表位免疫特异性的两个表位结合结构域和对第二表位特异性的两个表位结合结构域。在另一实施方式中，本发明的双特异性的、四价的、含Fc的双抗体包含对第一表位免疫特异性的三个表位结合结构域和对第二表位特异性的一个表位结合结构域。如上所提供，VL和VH结构域可以进行选择以允许三特异性结合。因此，本发明也涵盖三特异性的、四价的、含Fc的双抗体。本发明的三特异性的、四价的、含Fc的双抗体包含对第一表位免疫特异性的两个表位结合结构域、对第二表位免疫特异性的一个表位结合结构域、和对第三表位免疫特异性的一个表位结合结构域。
在传统的免疫功能中，抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用导致广泛系列的应答，其范围从效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱粒和吞噬作用到免疫调节信号，诸如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用通过抗体或免疫复合物的Fc结构域与造血细胞上的专用细胞表面受体的结合而启动。如上所讨论，由抗体和免疫复合物触发的细胞应答的多样性起因于三个Fc受体的结构异质性：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是激活型(即，免疫系统增强型)受体；FcγRIIB(CD32B)是抑制型(即，免疫系统减弱型)受体。此外，与新生Fc受体(FcRn)的相互作用介导IgG分子从内体到细胞表面并且释放到血液中的再循环。上面呈现了示例性野生型IgG1(SEQ ID NO:12)、IgG2(SEQ ID NO:13)、IgG3(SEQID NO:14)和IgG4(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。
Fc结构域的修饰可导致表型改变，例如血清半衰期改变、稳定性改变、细胞酶敏感性改变或效应子功能改变。因此可期望例如就效应子功能而言修饰本发明的含Fc结构域的结合分子，以便增强这种分子在治疗癌症方面的有效性。Fc结构域介导的效应子功能的减少或消除在某些情况下是期望的，例如在其作用机理涉及带有靶抗原的细胞的阻截或对抗而非杀伤的抗体的情况下。增加的效应子功能当针对不期望的细胞、诸如肿瘤和外来细胞时一般是期望的，其中FcγR以低水平表达，例如具有低水平FcγRIIB的肿瘤特异性B细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。本发明的具有这种赋予的或改变的效应子功能的分子可用于疾病、障碍或感染的治疗和/或预防，其中效应子功能活性的疗效增加是期望的。
因此，在某些实施方式中，本发明的含Fc结构域的分子的Fc结构域可以是工程化的变体Fc结构域。尽管本发明的双特异性的含Fc结构域的分子的Fc结构域可具有结合一种或多种Fc受体(例如，FcγR)的能力，更优选地这种变体Fc结构域具有改变的结合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)(相对于野生型Fc结构域所呈现的结合)，例如将具有增强的结合激活型受体和/或将具有基本上减少的或没有结合一种或多种抑制型受体的能力。因此，本发明的含Fc结构域的分子的Fc结构域可以包括完整Fc结构域的CH2结构域的一些或全部和/或CH3结构域的一些或全部，或者可包含变体CH2和/或变体CH3序列(其相对于完整Fc结构域的CH2或CH3结构域可包括例如一个或多个插入和/或一个或多个缺失)。这种Fc结构域可包含非Fc肽部分，或者可包含非天然的完整Fc结构域的部分，或者可包含CH2和/或CH3结构域的非天然发生的取向(诸如，例如两个CH2结构域或两个CH3结构域、或者在N-末端至C-末端方向上，与CH2结构域连接的CH3结构域等)。
鉴别为改变效应子功能的Fc结构域修饰在本领域是已知的，包括增加结合激活型受体(例如，FcγRIIA(CD16A)和减少结合抑制型受体(例如，FcγRIIB(CD32B)的修饰(参见，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization Of Therapeutic AntibodiesEnhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls TumorExpansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,”CancerRes.57(18):8882-8890)。表4列出了增加结合激活型受体和/或减少结合抑制型受体的示例性修饰的示例性单重、两重、三重、四重或五重置换(编号(按照EU索引)和置换相对于上面所示的SEQ ID NO:12的氨基酸序列)。
Figure BDA0002532907060000451
Figure BDA0002532907060000461
具有减少的结合CD32B和/或增加的结合CD16A的人IgG1 Fc结构域的示例性变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P396L置换，其中所述编号是如Kabat中的EU索引的编号。这些氨基酸置换可以任意组合存在于人IgG1 Fc结构域中。在一种实施方式中，人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R292P和Y300L置换。在另一实施方式中，人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L置换。
在某些实施方式中，对于本发明含Fc结构域的结合分子的Fc结构域来说，优选的是呈现减少的(或基本上没有)结合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)(相对于野生型IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO:12)所呈现的结合)。在具体实施方式中，本发明的含Fc结构域的结合分子包含呈现减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应子功能的IgG Fc结构域。在优选的实施方式中，这种结合分子的CH2-CH3结构域包括下列置换中的任意1个、2个、3个或4个：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G，其中所述编号是如Kabat中的EU索引的编号。在另一实施方式中，CH2-CH3结构域包含N297Q置换、N297G置换、L234A和L235A置换或D265A置换，因为这些突变消除FcR结合。可替选地，利用固有地呈现减少的(基本上没有)结合FcγRIIIA(CD16a)和/或减少的效应子功能(相对于由野生型IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO:12)所呈现的结合和效应子功能)的天然发生的Fc结构域的CH2-CH3结构域。在具体实施方式中，本发明的含Fc结构域的结合分子包含IgG2 Fc结构域(SEQ ID NO:13)、IgG3 Fc结构域(SEQ ID NO:14)或IgG4 Fc结构域(SEQ ID NO:15)。当利用IgG4 Fc结构域时，本发明也包括引入稳定化突变，诸如上述铰链区S228P置换(参见，例如，SEQ ID NO:11)。由于N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A置换消除了效应子功能，所以在期望效应子功能的环境下，将优选不利用这些置换。
对于具有减少或消除的效应子功能的本发明的含Fc结构域的分子的CH2和CH3结构域来说，优选的IgG1序列将包括置换L234A/L235A(SEQ ID NO:45)：
Figure BDA0002532907060000462
Figure BDA0002532907060000471
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明的含Fc区的分子的CH2和CH3结构域来说，第二优选的IgG1序列包含S442C置换(下划线所显示)，以便允许两个CH3结构域经由二硫键相互共价键合或允许药物部分的接合。这种分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:46)：
Figure BDA0002532907060000472
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于本发明的含Fc区的分子的CH2和CH3结构域来说，第三优选的IgG1序列包含L234A/L235A置换(下划线所显示)，其减少或消除效应子功能；以及S442C置换(下划线所显示)，其允许两个CH3结构域经由二硫键相互共价键合或允许药物部分的接合。这种分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:47)：
Figure BDA0002532907060000473
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
包含Fc结构域的蛋白质的血清半衰期可通过增加Fc结构域对FcRn的结合亲和力而增加。如本文所用的术语“半衰期”意指分子的药物动力学特性，其是所述分子在其施用后平均生存时间的度量。半衰期可表示为从受试者(例如，人患者或其它哺乳动物)的身体或其特定区室消除已知量的百分之五十(50％)的分子需要的时间，例如，如在血清中测量的，即循环半衰期，或在其他组织中测量的。一般而言，半衰期的增加导致施用的分子在循环中的平均停留时间(MRT)的增加。
在一些实施方式中，本发明的含Fc结构域的结合分子包含变体Fc结构域，所述变体Fc结构域包含相对于野生型Fc结构域的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子具有增加的半衰期(相对于如果包含野生型Fc结构域的这种分子)。在一些实施方式中，本发明的含Fc结构域的结合分子包含变体IgG Fc结构域，所述变体IgG Fc结构域包含在选自由下列组成的组的一个或多个位置处的半衰期延长的氨基酸置换：238、250、252、254、256、257、256、265、272、286、288、303、305、307、308、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、433、434、435和436，其中所述编号是如Kabat中的EU索引的编号。能够增加含Fc结构域的分子的半衰期的许多突变在本领域是已知的，并且包括例如M252Y、S254T、T256E和其组合。例如，参见下列中描述的突变：美国专利号6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美国公开号2002/0147311、2007/0148164；和PCT公开号WO 98/23289、WO2009/058492和WO 2010/033279，其通过引用以其全部内容并入本文。
在一些实施方式中，呈现增加的半衰期的本发明的含Fc结构域的结合分子具有变体Fc结构域，所述变体Fc结构域包括在Fc结构域残基250、252、254、256、257、288、307、308、309、311、378、428、433、434、435和436中的两个或更多个上的置换。具体地，选自下列的两个或更多个置换：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I，其中所述编号是如Kabat中的EU索引的编号。在具体实施方式中，这种分子可具有变体IgG Fc结构域，所述变体IgG Fc结构域包括下列置换：
(A)M252Y、S254T和T256E；
(B)M252Y和S254T；
(C)M252Y和T256E；
(D)T250Q和M428L；
(E)T307Q和N434A；
(F)A378V和N434A；
(G)N434A和Y436I；
(H)V308P和N434A；或
(I)K288D和H435K。
在优选的实施方式中，本发明的含Fc结构域的CD16 x DA结合分子具有变体IgGFc区，所述变体IgG Fc区包含下列置换中的1个、2个或3个：M252Y、S254T和T256E。本发明进一步涵盖具有变体IgG Fc区的CD16 x DA结合分子，所述变体IgG Fc区包含：
(A)改变效应子功能和/或FcγR的一个或多个突变；和
(B)延长血清半衰期的一个或多个突变。
本发明的含Fc结构域的分子的CH2和CH3结构域的IgG1序列，其提供增加的半衰期(并且其在结合食蟹猴和人FcRn两者方面具有10倍增加)(Dall’Acqua,W.F.等(2006)“Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal FcReceptor(FcRn),”J.Biol.Chem.281(33):23514-23524)，将包含置换M252Y/S254T/T256E(SEQ ID NO:48)：
Figure BDA0002532907060000491
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
本发明的含Fc结构域的分子的CH2和CH3结构域的可替选IgG1序列，其组合了由置换L234A/L235A所提供的减少或消除的效应子功能和由置换M252Y/S254T/T256E所提供的增加的血清半衰期，由SEQ ID NO:49提供：
Figure BDA0002532907060000492
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
本发明的含Fc区的分子的CH2和CH3结构域的进一步优选的IgG1序列包含L234A/L235A置换(下划线所显示)，其减少或消除效应子功能；和M252Y、S254T和T256E置换(下划线所显示)，以便延长血清半衰期；和S442C置换(下划线所显示)，以便允许两个CH3结构域经由二硫键相互共价键合或允许药物部分的接合。这种分子的氨基酸序列是(SEQ ID NO:50)：
Figure BDA0002532907060000493
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
对于期望具有不同氨基酸序列的含Fc结构域的多肽链(例如，其含Fc结构域的多肽链期望是不相同的)的某些抗体、双抗体和三价结合分子，期望减少或防止同源二聚化发生在相同链的CH2-CH3结构域之间(例如，两条第一多肽链，或者两条第三多肽链的CH2-CH3结构域之间)。这种多肽链的CH2和/或CH3结构域在序列上不需要相同，并且有利地被修饰以促进两条多肽链之间的异源二聚体复合。例如，氨基酸置换(优选地，用包含形成“杵(knob)”的庞大侧基的氨基酸、例如色氨酸置换)可引入到CH2或CH3结构域，使得空间干扰将防止与类似的突变结构域的相互作用，并且将迫使突变的结构域与互补或适应性的突变已经被工程化到其中的结构域、即“臼(hole)”(例如，用甘氨酸置换)配对。这样的突变组可被工程化进入任意对的多肽，其包含形成促进异源二聚化的Fc结构域的CH2-CH3结构域。相对于同源二聚化，支持异源二聚化的蛋白质工程化方法是本领域众所周知的，特别是关于免疫球蛋白样的分子的工程化方面，并且该方法涵盖在本文中(参见，例如Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy ChainHeterodimerization,”Protein Engr.9:617-621；Atwell等(1997)“Stable HeterodimersFrom Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage DisplayLibrary,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of BispecificAntibody:Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor CellLysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101，其各自在此通过引用以其全部内容并入本文)。
优选的杵通过修饰IgG Fc结构域以包含修饰T366W形成。优选的臼通过修饰IgGFc结构域以包含修饰T366S、L368A和Y407V形成。为了有助于从最终的双特异性异源二聚体的含Fc结构域的分子中纯化带有臼的多肽链同源二聚体，多肽链的带有臼的CH2和CH3结构域的蛋白A结合结构域优选地通过在位置435处的氨基酸置换(H435R)而突变。因此，带有臼的多肽链同源二聚体将不会结合蛋白A，而双特异性异源二聚体将保留其经由蛋白A结合结构域结合蛋白A的能力。在可替选的实施方式中，带有臼的多肽链可在位置434和435处含有氨基酸置换(N434A/N435K)。
本发明的含Fc结构域的分子的一条含Fc结构域的多肽链的CH2和CH3结构域的优选IgG1氨基酸序列将具有“带有杵”的序列(SEQ ID NO:51)：
Figure BDA0002532907060000501
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
本发明的含Fc结构域的分子(其具有M252Y/S254T/T256E置换和“带有杵”的序列)的一条含Fc结构域的多肽链的CH2和CH3结构域的可替选IgG1氨基酸序列是SEQ ID NO:52：
Figure BDA0002532907060000502
Figure BDA0002532907060000511
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
本发明的具有两条多肽链的含Fc结构域的分子的另一条含Fc结构域的多肽链(或者具有三条、四条或五条多肽链的含Fc结构域的分子的第三多肽链)的CH2和CH3结构域的优选IgG1氨基酸序列将具有“带有臼的”序列(SEQ ID NO:53)：
Figure BDA0002532907060000512
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
本发明的含Fc结构域的分子的另一含Fc结构域的多肽链的CH2和CH3结构域的可替选IgG1氨基酸序列(其具有M252Y/S254T/T256E置换和“带有臼的”序列)是SEQ ID NO:54：
Figure BDA0002532907060000513
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
如将指出的，SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的CH2-CH3结构域包括在位置234处用丙氨酸的置换和在位置235处用丙氨酸的置换，并且因此形成呈现出减少(或基本上没有)的结合FcγRIA(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)或FcγRIIIB(CD16b)(相对于由野生型Fc结构域(SEQ ID NO:12)呈现出的结合)的Fc结构域。本发明也涵盖这种CH2-CH3结构域，其包括野生型丙氨酸残基，改变Fc结构域的效应子功能和/或FγR结合活性的可替选的和/或另外的置换。本发明也涵盖这种CH2-CH3结构域，其进一步包括一个或多个半衰期延长的氨基酸置换。具体地，本发明包括进一步包含M252Y/S254T/T256E的这种带有臼和这种带有杵的CH2-CH3结构域。
本发明含Fc结构域的分子的一条含Fc结构域的多肽链的CH2和CH3结构域的IgG4氨基酸序列由于其具有Y252/T254/E256而具有增加的血清半衰期(相对于IgG1的CH2和CH3结构域)(SEQ ID NO:55)：
Figure BDA0002532907060000521
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
这种IgG4的CH2-CH3氨基酸序列的“带有杵”的变体具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060000522
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
这种IgG4的CH2-CH3氨基酸序列的“带有臼”的变体具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060000523
其中X是赖氨酸(K)或不存在。
优选地，第一多肽链将具有“带有杵的”CH2-CH3序列，诸如SEQ ID NO:51或SEQ IDNO:52的序列。然而，如将所认识到的，“带有臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54)可以被应用在第一多肽链中，在这种情况下，“带有杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52)将被应用在本发明的具有两条多肽链的含Fc结构域的分子的第二多肽链中(或者被应用在具有三条、四条、或五条多肽链的含Fc结构域的分子的第三多肽链中)。
在其它实施方式中，本发明涵盖含Fc结构域的结合分子，其包含已经利用本领域已知的突变进行工程化以相比同源二聚化支持异源二聚化的CH2和/或CH3结构域，诸如在PCT公开号WO 2007/110205、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO2013/06867中所公开的那些，所有文献均以其全部内容通过引用并入本文。
III.包含Fc结构域的三价结合分子
本发明进一步的实施方式涉及三价结合分子，其包含能够同时结合第一表位、第二表位和第三表位的Fc结构域，其中这种表位中的至少一个表位与另一个表位不相同。这种三价结合分子包含三个表位结合结构域，其中两个是双抗体型结合结构域，其提供结合结构域A和结合结构域B，且其中之一是Fab型结合结构域或scFv型结合结构域，其提供结合结构域C(参见，例如，图6A-6H，PCT公开号WO 2015/184207和WO 2015/184203)。这种三价结合分子因此包含能够结合这种三价结合分子中的第一表位的“VL1”/“VH1”结构域和能够结合第二表位的“VL2”/“VH2”结构域以及能够结合“第三”表位的“VL3”和“VH3”结构域。“双抗体型结合结构域”是存在于双抗体中的那种表位结合结构域，如上所述。“Fab型结合结构域”和“scFv型结合结构域”中的每一种均是这样的表位结合结构域，其通过免疫球蛋白轻链的VL结构域和免疫球蛋白重链的互补VH结构域的相互作用形成。Fab型结合结构域与双抗体型结合结构域的区别在于形成Fab型结合结构域的两条多肽链仅包含单个表位结合结构域，而形成双抗体型结合结构域的两条多肽链包含至少两个表位结合结构域。类似地，scFv型结合结构域与双抗体型结合结构域的区别也在于它们仅包含单个表位结合结构域。因此，如本文所用，Fab型和scFv型结合结构域与双抗体型结合结构域是截然不同的。
典型地，本发明的三价结合分子将包含四条不同的多肽链(参见图6A-6B)，然而，所述分子可包含更少或更多数目的多肽链，例如通过将这样的多肽链相互融合(例如，经由肽键)、或者将这样的多肽链分开以形成另外的多肽链、或者通过将更少或另外的多肽链经由二硫键缔合。图6E-6F通过示意性地描绘具有三条多肽链的这种分子说明本发明的这一方面。如图6A-6H中所提供，本发明的三价结合分子可具有可替选的取向，其中双抗体型结合结构域是N-末端(图6A、6B、6C、6E和6F)或C-末端(图6D、6G和6H)至Fc结构域。可用于产生三价结合分子的CH2和CH3结构域在上文提供并且包括带有杵的和带有臼的结构域。
在某些实施方式中，本发明的这种三价结合分子的第一多肽链包含：(i)含VL1的结构域、(ii)含VH2的结构域、(iii)异源二聚体-促进结构域和(iv)含CH2-CH3序列的结构域。VL1和VL2结构域位于至含CH2-CH3的结构域的N-末端或C-末端，如表4所示(也参见图6A和6B)。这种实施方式的第二多肽链包含：(i)含VL2的结构域、(ii)含VH1的结构域和(iii)异源二聚体-促进结构域。这种实施方式的第三多肽链包含：(i)含VH3的结构域、(ii)含CH1的结构域和(iii)含CH2-CH3序列的结构域。第三多肽链可以是抗体的包含VH3和重链恒定区的重链，或者包含这种结构域的多肽。这种实施方式的第四多肽包含：(i)含VL3的结构域和(ii)含CL的结构域。第四多肽链可以是抗体的包含与第三多肽链的VH3互补的VL3的轻链，或者包含这种结构域的多肽。第三或第四多肽链可以分离自天然发生的抗体。可替选地，它们可以重组地、合成地或者通过其它手段构建。
第一和第二多肽链的轻链可变结构域通过间插间隔子肽与这种多肽链的重链可变结构域分开，所述间插间隔子肽的长度太短而不能允许第一和第二多肽链的VL1/VH2(或其VL2/VH1)结构域一起缔合以形成能够结合第一或第二表位的表位结合结构域。用于此目的的优选间插间隔子肽(连接体1)具有序列(SEQ ID NO:16)：GGGSGGGG。三价结合分子的其它结构域可以通过任选地包含半胱氨酸残基的间插间隔子肽(连接体)分开。具体地，如上所提供，这种连接体将典型地被并入在可变结构域(即，VH或VL)和肽异源二聚体-促进结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)之间以及在这样的肽异源二聚体-促进结构域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3结构域之间。用于产生三价结合分子的示例性连接体被在上文提供并且也被提供在PCT公开号：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076中。因此，这种三价结合分子的第一和第二多肽链缔合在一起以形成能够结合第一表位的VL1/VH1结合结构域，以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合结构域。这种三价结合分子的第三和第四多肽链缔合在一起以形成能够结合第三表位的VL3/VH3结合结构域。
如上所述，本发明的三价结合分子可包含三个多肽。包含三条多肽链的三价结合分子可在N-末端通过将第四多肽的结构域连接至第三多肽的含VH3的结构域(例如，利用间插间隔子肽(连接体4))获得。可替选地，使用本发明的三价结合分子的第三多肽链，其包含下列结构域：(i)含VL3的结构域、(ii)含VH3的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域，其中所述VL3和VH3通过间插间隔子肽彼此间隔开，所述间插间隔子肽足够长(至少9个或更多个氨基酸残基)以便允许这些结构域的缔合以形成表位结合结构域。用于此目的的一个优选的间插间隔子肽具有序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)。
将会理解，这种三价结合分子的VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3结构域可以不同以便允许结合是单特异性的、双特异性的或三特异性的。具体地，VL和VH结构域可以进行选择以便三价结合分子包含用于第一表位的两个结合结构域和用于第二表位的一个结合结构域；或者用于第一表位的一个结合结构域和用于第二表位的两个结合结构域；或者用于第一表位的一个结合结构域、用于第二表位的一个结合结构域和用于第三表位的一个结合结构域。
本发明的代表性三价结合分子的多肽链的一般结构在图6A-6H和表5中提供：
Figure BDA0002532907060000551
HPD＝异源二聚体-促进结构域
如上所提供，这种三价结合分子可包含三条、四条、五条或更多条多肽链。
IV.本发明的实施方式
如上所述，本发明涉及CD16 x DA结合分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)，其包含能够结合CD16的表位的结合结构域(即，“CD16-结合结构域”)和能够结合疾病抗原的表位的结合结构域(即，“疾病抗原-结合结构域”)。本发明因此包括这样的结合分子，其包含抗体的结合至CD16的VH和/或VL结构域中的一个或多个，或者更优选地，这种结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及CDRL1、CDRL2和CDRL3部分。在本发明的优选实施方式中，这种结合分子将另外包含结合结构域，其足以允许这种分子结合至一种、两种、三种或多于三种的疾病抗原的表位。本发明也涉及包含这种分子(一种或多种)的药物组合物。
通过具有足以免疫特异性地结合CD16和疾病抗原的结合结构域，本发明的分子具有将CD16表达细胞(和尤其天然杀伤细胞)共同定位到表达疾病抗原的细胞的位点的能力，以便提高ADCC-介导的杀伤靶细胞的可能性。如上所讨论，这种分子可以是双特异性的，或者可以能够结合多于两个的表位。
在一种实施方式中，本发明的CD16结合分子将是单特异性的，以便具有结合至CD16的仅仅单个表位和疾病抗原的仅仅单个表位的能力。
可替选地，这种分子可以是多特异性的，即能够结合一个、两个、三个或总计四个表位，其可以任何方式分配以结合CD16的一个、两个或三个表位(其两个或三个CD16表位可以相同或不同)和一个或多个疾病抗原的三个、两个或一个表位。
因此，在这种分子能免疫特异性地结合至仅仅单个疾病抗原的情况下，它们可以能够免疫特异性地结合至仅仅一个CD16表位以及疾病抗原中的一个、两个或三个表位(其两个疾病抗原表位可以相同或不同，并且其三个表位可以相同、或可以不同、或者可以是相同的两个表位和不同的一个表位)，或者它们可以能够免疫特异性地结合至仅仅两个CD16表位(其两个表位可以相同或不同)和疾病抗原的一个或两个表位(其两个疾病抗原表位可以相同或不同)，或者它们可以能够免疫特异性地结合至三个CD16表位(其三个表位可以相同、或可以不同、或者可以是相同的两个表位和不同的一个表位)和疾病抗原的一个表位。
类似地，在这种分子能够免疫特异性结合两种不同疾病抗原(例如，第一疾病抗原和第二疾病抗原)的情况下，它们可以能够免疫特异性地结合至仅仅一个CD16表位以及第一疾病抗原的一个或两个表位(其两个第一疾病抗原表位可以相同或不同)和第二疾病抗原的两个或一个表位(其两个第二疾病抗原表位可以相同或不同)，或者它们可以能够免疫特异性地结合至仅仅两个CD16表位(其两个表位可以相同或不同)以及第一疾病抗原的一个表位和第二疾病抗原的一个表位。
类似地，这种分子可以能够免疫特异性结合至三个不同的疾病抗原(例如，第一疾病抗原、第二疾病抗原和第三疾病抗原)和仅仅一个CD16表位。
因此，例如，这种分子可结合：
(1)CD16的单个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的单个表位；
(2)CD16的单个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的两个表位；
(3)CD16的单个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的三个表位；
(4)CD16的单个表位、排列在靶细胞表面上的第一疾病抗原的一个表位和排列在靶细胞表面上的第二疾病抗原的一个表位；
(5)CD16的单个表位、排列在靶细胞表面上的第一疾病抗原的两个表位和排列在靶细胞表面上的第二疾病抗原的一个表位；
(6)CD16的两个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的单个表位；
(7)CD16的两个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的两个表位；
(8)CD16的两个表位以及排列在靶细胞表面上的第一疾病抗原的一个表位和排列在靶细胞表面上的第二疾病抗原的一个表位；
(9)CD16的三个表位和排列在靶细胞表面上的疾病抗原的一个表位；
在其中结合至CD16或疾病抗原的多于一个表位的所有情况下，这样的表位可以相同或者可以不同、或者可以与一个这样的表位相同或者与另一个这样的表位不同。
表6示例本发明的示例性分子的可能的组合结合特异性。
Figure BDA0002532907060000571
通过形成更复杂的分子，可以获得能够结合一个或多个疾病抗原并且具有多于四个表位结合结构域的CD16-结合分子。因此，对可由本发明的分子结合的表位或另外的表位的性质没有限制，除了这种另外的结合能力不阻止能够结合CD16的表位的分子或其结合结构域进行这种结合并且不阻止能够结合疾病抗原的表位的分子或其结合结构域进行这种结合。因此，本发明的CD16结合分子可具有表位结合结构域可替选的或另外的表位结合结构域。作为实例，本发明考虑这样的结合分子，其包含能够免疫特异性地结合CD16的表位的第一表位结合结构域以及能够免疫特异性地结合排列在靶细胞表面上的疾病抗原的表位的第二表位结合结构域和能够免疫特异性地结合不同细胞表面分子(诸如天然杀伤细胞的非CD16的细胞表面分子)的第三表位结合结构域。
V.示例性结合分子
本发明涉及由于其具有CD16结合结构域而能够结合人CD16的分子(例如，抗体、双抗体、scFv、抗体、TandAb等)。本发明特别地涉及这样的CD-16结合分子，其为CD16 x DA结合分子。下面所列的是可用于产生本发明的结合分子和组合疗法的示例性抗体。
A.示例性抗人CD16抗体
1.CD16-M1和CD16-M2及其人源化衍生物hCD16-M1和hCD16-M2
本发明提供鼠抗人CD16单克隆抗体：CD16-M1和CD16-M2及其人源化衍生物：hCD16-M1和hCD16-M2，其是新型的高亲和力抗人CD16单克隆抗体，很好地结合至CD16 158F异型和CD16 158V异型两者，并且在不阻碍CD16-IgG结合的位点结合CD16。这种抗体对于的本发明的目的来说是特别优选的，因为它们可容易地应用在患者群体中，无论其158F/158VCD16A多态性。
(a)抗人CD16单克隆抗体
CD16-M1
鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:64)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000581
鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000582
抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的CDRs在表7中显示。
Figure BDA0002532907060000583
Figure BDA0002532907060000591
hCD16-M1是鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的人源化衍生物。hCD16-M1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:72)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000592
hCD16-M1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:73)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000593
hCD16-M1A是人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1的优化衍生物。hCD16-M1A包含hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)和在CDRH3中含有突变的优化VH结构域。hCD16-M1A的优化VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)显示在下面(突变的CDRH3残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000594
hCD16-M1B是人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1的优化衍生物。hCD16-M1B包含hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)和在CDRL3中含有突变的优化VL结构域。hCD16-M1B的优化VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:59)显示在下面(突变的CDRL3残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000595
hCD16-M1AB是人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1的优化衍生物。hCD16-M1AB包含hCD16-M1A的优化VH结构域(SEQ ID NO:58)和hCD16-M1B的优化VL结构域(SEQ ID NO:59)。
人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1和优化的抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1A、hCD16-M1B、hCD16-M1AB的CDRs在表8中显示。
Figure BDA0002532907060000601
Figure BDA0002532907060000611
如将要认识到的，hCD16-M1、hCD16-M1A、hCD16-M1B和hCD16-M1AB的CDRL1(RASQNVGTHVA；SEQ ID NO:74)在其第一残基不同于CD16-M1的CDRL1(KASQNVGTHVA；SEQ IDNO:69)。任一CDRL1可互换地应用，并且本发明涵盖人源化且优化的CD16结合分子，其包含具有下列CDRH中的1个、2个或3个和/或这种CDRL中的1个、2个或3个的氨基酸序列的CD16表位结合结构域。
(b)抗人CD16单克隆抗体
CD16-M2
鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:75)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000612
鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:76)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000613
抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的CDRs在表9中显示：
Figure BDA0002532907060000614
Figure BDA0002532907060000621
hCD16-M2是鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的人源化衍生物。人源化导致两个合适的VH结构域(hCD16-M2 VH1和hCD16-M2 VH2)，其中任何一个均可以与所获得的人源化VL结构域(hCD16-M2 VL1)一起使用。
hCD16-M2 VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000622
hCD16-M2 VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:84)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000623
如将要认识到的，hCD16-M2 VH1的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)与hCD16-M2VH2的氨基酸序列(SEQ ID NO:84)的区别在于在紧挨着CDRH3之前的残基中具有T98R置换(上面加框显示)。
hCD16-M2 VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:85)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000624
人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M2的CDRs在表10中显示。
Figure BDA0002532907060000625
Figure BDA0002532907060000631
B.结合至效应细胞的细胞表面的示例性抗体
本发明的CD16 x DA结合分子以及尤其本发明的三特异性CD16 x DA结合分子可包含用于效应细胞的非CD16细胞表面分子的结合位点。如本文所用，术语“效应细胞”表示直接或间接介导靶细胞(例如，外来细胞、感染细胞或癌症细胞)杀伤的细胞。效应细胞的实施例包括辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、浆细胞(抗体分泌B细胞)、巨噬细胞和粒细胞。这种细胞的优选细胞表面分子包括CD2、CD3、CD8、CD16、TCR和NKG2D受体。因此，能够免疫特异性地结合这种分子的表位或者结合至其它效应细胞表面分子的分子可以按照本发明的原理进行使用。下面提供了示例性的抗体，其VH和VL结构域可用于构建能够介导靶细胞的重定向的杀伤的分子。
1.示例性抗NKG2D抗体
天然杀伤效应细胞的优选的非CD16细胞表面分子是NKG2D受体。NKG2D受体在所有的人(和其它哺乳动物)的天然杀伤细胞上表达(Bauer,S.等(1999)“Activation Of NKCells And T Cells By NKG2D,A Receptor For Stress-Inducible MICA,”Science285(5428):727-729；Jamieson,A.M.等(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor InImmune Cell Activation And Natural Killing,”Immunity 17(1):19-29)以及所有CD8+T细胞上(Groh,V.等(2001)“Costimulation Of CD8αβT Cells By NKG2D Via EngagementBy MIC Induced On Virus-Infected Cells,”Nat.Immunol.2(3):255-260；Jamieson,A.M.等(2002)“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell ActivationAnd Natural Killing,”Immunity 17(1):19-29)。这种结合配体以及特别是不在正常细胞上表达的那些包括组织相容性60(H60)分子、视黄酸早期诱导基因-1的产物(RAE-1)、和鼠UL16-结合蛋白样转录物1(MULT1)(Raulet D.H.(2003)“Roles Of The NKG2DImmunoreceptor And Its Ligands,”Nature Rev.Immunol.3:781-790；Coudert,J.D.等(2005)“Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure ToAltered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,”Blood 106:1711-1717)。特异性地结合至NKG2D受体的分子包括抗NKG2D抗体“KYK-1.0”和“KYK-2.0”(Kwong,KY等(2008)“Generation,Affinity Maturation,And Characterization Of A Human Anti-HumanNKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,”J.Mol.Biol.384:1143-1156)。
KYK-1.0的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:86)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000641
KYK-1.0的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:87)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000642
KYK-2.0的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000643
KYK-2.0的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:89)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000644
结合至自然杀伤细胞的细胞表面的其它示例性抗体包括抗体：A1、AC2、EPR3678(2)、EPR20461、EPR20627和IMG17B5F11(其结合CD39)；TB01、HNK-1/Leu-7和NK1(其结合CD57)；FN50(其结合CD69)；5B5、B-L2、TS82b和C33(其结合CD82)；3B3、B199.2和EP7169(其结合CD161)；17D9(其结合CLEC1B)；2F9(其结合KIR2DL1)；EPR8825(其结合KIR2DL2)；mAb33(其结合KIR2DL4)；11E3、17B4、EPR4392(2)、EPR20261和EPR 20627(其结合淋巴细胞激活基因3)；A10、C7、CX5、1D11和MM0489-10R27(其结合NKG2D)；BMK13(其结合PRG2)；EPR9916(其结合SLAMF6)；等。能够结合各个这种示例性非CD16细胞表面分子的抗体可从Abcam plc和其它来源商购，并且可容易适应于本发明的目的。
2.示例性抗CD2抗体
在一种实施方式中，能够介导靶细胞的重定向杀伤的本发明分子将通过免疫特异性地结合这种效应细胞表面上存在的CD2的表位而结合效应细胞。特异性地结合CD2的分子包括抗CD2抗体“CD2 mAb Lo-CD2a”。
CD2 mAb Lo-CD2a(ATCC登录号：11423)的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000651
CD2 mAb Lo-CD2a(ATCC登录号：11423)的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:91)显示在下面(CDRL残基用下划线显示):
Figure BDA0002532907060000652
3.示例性抗CD8抗体
在一种实施方式中，能够介导靶细胞的重定向杀伤的本发明分子将通过免疫特异性地结合这种效应细胞表面上存在的CD8的表位而结合效应细胞。特异性地结合CD8的分子包括抗CD8抗体“OKT8”和“TRX2”。
OKT8的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:92)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000653
OKT8的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:93)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000654
TRX2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:94)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000655
TRX2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:95)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000661
VI.示例性的疾病抗原
本发明的疾病抗原包括具有癌症细胞特征的细胞表面抗原(“癌抗原”)以及具有病原体细胞或者被病原体感染的细胞特征的细胞表面抗原(病原体相关抗原”)。
A.排列在癌症细胞表面上的示例性癌抗原
如本文所用，术语“癌抗原”表示典型地在癌细胞表面上表达的并且因此可用抗体基分子或免疫调节分子治疗的抗原。癌抗原的实例包括但不限于：19.9，如结肠癌、胃癌粘蛋白中发现的；4.2；A33(结直肠癌抗原；Almqvist,Y.(2006)“In vitro and in vivoCharacterization of 177Lu-huA33:A Radioimmunoconjugate Against ColorectalCancer,”Nucl.Med.Biol.33(8):991-998)；ADAM-9(美国专利公开号2006/0172350；PCT公开号WO 06/084075)；AH6，如胃癌中发现的；ALCAM(PCT公开号WO 03/093443)；APO-1(恶性人淋巴细胞抗原)(Trauth,B.C.等(1989)“Monoclonal Antibody-Mediated TumorRegression By Induction Of Apoptosis,”Science 245:301-304)；B1(Egloff,A.M.等(2006)“Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In ImmunosurveillanceAnd Immunotherapy Of Cancer,”Cancer Res.66(1):6-9)；B7-H3(Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7).Chapoval,A.等(2001)“B7-H3:A Costimulatory Molecule For T Cell Activation andIFN-γProduction,”Nature Immunol.2:269–274；Sun,M.等(2002)“Characterization ofMouse and人B7-H3 Genes,”J.Immunol.168:6294-6297)；BAGE(Bodey,B.(2002)“Cancer-Testis Antigens:Promising Targets For Antigen Directed 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表11列出了示例性抗体，其VH和VL结构域可用于构建本发明的能够结合排列在癌症细胞表面上的癌抗原并且介导这种癌症细胞的重定向的杀伤的结合分子，下面提供了可用于构建能够结合排列在癌症细胞表面上的癌抗原并且介导这种癌症细胞的重定向的杀伤的分子的另外抗体。
1.示例性抗B7-H3抗体
B7-H3是在各种实体肿瘤类型上过表达的癌抗原并且是涉及免疫调节的分子的B7家族的成员(参见美国专利号8,802,091；US 2014/0328750；US 2013/0149236；Loo,D.等(2012)“Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody WithPotent Antitumor Activity,”Clin.Cancer Res.18(14):3834-3845)。具体地，数个独立的研究已经显示人恶性癌症细胞(例如，成神经细胞瘤以及胃癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的癌症细胞)呈现B7-H3蛋白表达的显著增加以及该增加的表达与增加的疾病严重性相关(Zang,X.等(2007)“The B7 Family And Cancer Therapy:Costimulation AndCoinhibition,”Clin.Cancer Res.13:5271-5279)，表明B7-H3被肿瘤利用为免疫逃逸路径(Hofmeyer,K.等(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)105(30):10277-10278)。
B7-H3也已经被发现共同刺激CD4+和CD8+T细胞增殖。B7-H3也刺激IFN-γ产生和CD8+溶解活性(Chapoval,A.等(2001)“B7-H3:A Costimulatory Molecule For T CellActivation and IFN-γProduction,”Nature Immunol.2:269–274；Sharpe,A.H.等(2002)“The B7-CD28 Superfamily,”Nature Rev.Immunol.2:116-126)。然而，该蛋白也可能通过NFAT(激活的T细胞的核因子)、NF-κB(核因子κB)、和AP-1(激活蛋白-1)因子作用以抑制T细胞激活(Yi.K.H.等(2009)“Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 AndB7-H4,”Immunol.Rev.229:145-151)。B7-H3也被认为体内抑制Th1、Th2或Th17(Prasad,D.V.等(2004)“Murine B7–H3 Is A Negative Regulator Of T Cells,”J.Immunol.173:2500-2506；Fukushima,A.等(2007)“B7–H3 Regulates The Development Of ExperimentalAllergic Conjunctivitis In Mice,”Immunol.Lett.113:52-57；Yi.K.H.等(2009)“FineTuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,”Immunol.Rev.229:145-151)。
优选的B7-H3-结合分子具有人源化抗人B7-H3单克隆抗体“B7-H3 mAb-B”、“B7-H3mAb-C”、“B7-H3 mAb-D”的VL和/或VH结构域，并且更优选地具有这种抗B7-H3单克隆抗体的VL区的CDRL中的1个、2个或所有的3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有的3个。
在人源化后，抗体B7-H3 mAb-B产生两个变体VH结构域：B7-H3 mAb-B VH1和B7-H3mAb-B VH2；和两个变体VL结构域：B7-H3 mAb-B VL1和B7-H3 mAb-B VL2，其可以以VH/VL结构域的任何组合来产生功能性的B7-H3结合结构域。
B7-H3 mAb-B VH1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:96)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000841
B7-H3 mAb-B VH2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:97)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000842
B7-H3 mAb-B VL1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:98)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000851
B7-H3 mAb-B VL2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:99)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000852
人源化B7-H3 mAb-C的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:100)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000853
人源化B7-H3 mAb-C的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:101)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000854
B7-H3 mAb-D的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:102)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000855
B7-H3 mAb-D的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:103)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000856
特别优选的是具有人源化VH和/或VL结构域的B7-H3-结合分子，其包括但不限于“恩比利珠单抗(Enoblituzumab)”(也被称为MGA271；CAS登录号1353485-38-7)。恩比利珠单抗是结合至HER2/neu并且介导提高的ADCC活性的Fc-优化的单克隆抗体。恩比利珠单抗的完整的重链和轻链的氨基酸序列在本领域是已知的(参见，例如，WHO DrugInformation,2017,推荐的INN:列表77,31(1):49)。
恩比利珠单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000861
恩比利珠单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:105)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000862
除了上面所鉴定的优选抗B7-H3结合分子，本发明还考虑使用下列抗B7-H3结合分子中的任一种：LUCA1；BLA8；PA20；或SKN2(参见美国专利号7,527,969；8,779,098和PCT专利公开WO 2004/001381)；M30；cM30；M30-H1-L1；M30-H1-L2；M30-H1-L3；M30-H1-L4；M30-H1-L5；M30-H1-L6；M30-H1-L7；M30-H4-L1；M30-H4-L2；M30-H4-L3；和M30-H4-L4(参见US专利公开2013/0078234和PCT专利公开WO2012/147713)；和8H9(参见美国专利号7,666,424；7,737,258；7,740,845；8,148,154；8,414,892；8,501,471；9,062,110；US专利公布2010/0143245和PCT专利公布WO2008/116219)。
本发明具体地包括并涵盖CD16 x B7-H3结合分子，其包含B7-H3 mAb-B、B7-H3mAb-B VH1、B7-H3 mAb-B VH2、B7-H3 mAb-B VL1、B7-H3 mAb-B VL2、B7-H3 mAb-C、B7-H3mAb-D、或恩比利珠单抗中的任一种或者本文提供的其它抗B7-H3抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个；并且更优选地具有这种抗B7-H3单克隆抗体的VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
2.示例性抗CEACAM5和抗CEACAM6抗体
癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)和细胞粘附分子6(CEACAM6)已经发现与各种类型的癌症相关，所述各种类型的癌症包括甲状腺髓样癌、结直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、造血系统癌症、白血病和卵巢癌(PCT公开号WO 2011/034660)，以及特别地，结直肠癌、胃肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫癌(Zheng,C.等(2011)“A NovelAnti-CEACAM5 Monoclonal Antibody,CC4,Suppresses Colorectal Tumor Growth andEnhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,”PLoS One 6(6):e21146,pp.1-11)。
CEACAM5已经发现在90％的胃肠癌、结直肠癌和胰腺癌、70％的非小细胞肺癌细胞和50％的乳腺癌中过表达(Thompson,J.A.等(1991)“Carcinoembryonic Antigen GeneFamily:Molecular Biology And Clinical Perspectives,”J.Clin.Lab.Anal.5:344-366)。过表达的癌胚抗原相关的细胞粘附分子6(CEACAM6)在各种人癌症的侵袭和转移中起着重要作用，其包括甲状腺髓样癌、结直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、乳腺癌、造血系统癌症、白血病和卵巢癌(PCT公开号WO2011/034660；Deng,X.等(2014)“Expression Profiling Of CEACAM6Associated WithThe Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,”Genet.Mol.Res.13(3):7686-7697；Cameron,S.等(2012)“Focal Overexpression Of CEACAM6ContributesTo Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression OfApoptosis,”Mol.Cancer 11:74,pp.1-11；Chapin,C.等(2012)“Distribution AndSurfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6In HumanLung,”Amer.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.302(2):L216-L25；Riley,C.J.等(2009)“Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-ChainVariable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,”Cancer Res.69(5):1933-1940；Lewis-Wambi,J.S.等(2008)“Overexpression Of CEACAM6 PromotesMigration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells,”Eur.J.Cancer 44(12):1770-1779；Blumenthal,R.D.等(2007)“Expression Patterns OfCEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,”BMC Cancer.7:2,pp.1-15)。免疫特异性地结合CEACAM5和CEACAM6的抗体是可商购的(Santa CruzBiotechnology,Inc.；Novus Biologicals LLC；Abnova Corporation)。
人源化抗CEACAM5/抗CEACAM6抗体16C3(EP 2585476)的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:106)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000871
人源化抗CEACAM5/抗CEACAM6抗体16C3(EP 2585476)的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:107)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000872
人源化抗CEACAM5/CEACAM6抗体hMN15(WO 2011/034660)的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:108)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000881
人源化抗CEACAM5/CEACAM6抗体hMN15(WO 2011/034660)的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:109)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000882
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x CEACAM5/CEACAM6结合分子，其包含抗CEACAM5/CEACAM6单克隆抗体16C3或hMN15的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
3.示例性抗EGRF抗体
表皮生长因子受体(EGFR)是某些转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌的癌抗原。示例性的结合人EGRF的抗体是“西妥昔单抗”和“帕尼单抗”。西妥昔单抗是重组人-小鼠嵌合表皮生长因子受体(EGFR)IgG1单克隆抗体(Govindan R.(2004)“CetuximabIn Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,”Clin.Cancer Res.10(12Pt 2):4241s-4244s；Bou-Assaly,W.等(2010)“Cetuximab(Erbitux),”Am.J.Neuroradiol.31(4):626-627)。帕尼单抗(
Figure BDA0002532907060000884
Amgen)是全人源化表皮生长因子受体(EGFR)IgG2单克隆抗体(Foon,K.A.等(2004)“Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF,A FullyHuman Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody,”Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.58(3):984-990；Yazdi,M.H.等(2015)“A ComprehensiveReview of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab andPanitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of MetastaticColorectal Cancer,”Avicenna J.Med.Biotechnol.7(4):134-144)。
嵌合抗EGFR抗体西妥昔单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000883
嵌合抗EGFR抗体西妥昔单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:111)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000891
帕尼单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000892
帕尼单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:113)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000893
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x EGFR结合分子，其包含抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗或帕尼单抗的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
4.示例性抗EphA2抗体
受体酪氨酸激酶——肝配蛋白型-A受体2(EphA2)在成年人上皮组织中的细胞与细胞接触位点正常表达，然而最近的研究已经表明它在各种类型的上皮癌中过表达，其中最大水平的EphA2表达在转移病灶中被观察到。EphA2的高表达水平已经在大范围的癌症和许多癌细胞系中发现，其包括前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤(Xu,J.等(2014)“High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With APoor Disease Outcome,”Oncol.Lett.Aug 2014；8(2):687-692；Miao,B.等(2014)“EphA2is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Targetin Melanoma,”Cancer Discov.pii:CD-14-0295)。EphA2并非似乎仅仅是癌症的标记物，而是似乎在许多人癌症中持续过表达并且功能上发生改变(Chen,P.等(2014)“EphA2Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate CancerCells,”Oncol.Lett.8(1):41-46)。示例性的结合人EphA2的抗体是“EphA2 mAb 1”、“EphA2mAb 2”和“EphA2 mAb 3”。
EphA2 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:114)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000894
EphA2 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:115)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000901
EphA2 mAb 2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:116)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000902
EphA2 mAb 2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000903
EphA2 mAb 3的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000904
EphA2 mAb 3的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000905
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x EphA2结合分子，其包含抗EphA2单克隆抗体EphA2 mAb 1、EphA2 mAb 2和EphA2 mAb 3的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
5.示例性抗gpA33抗体
43kD的跨膜糖蛋白A33(gpA33)在>95％的所有结直肠癌中表达(Heath,J.K.等(1997)“The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A NovelMember Of The Immunoglobulin Superfamily,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)94(2):469-474；Ritter,G.等(1997)“Characterization Of Posttranslational ModificationsOf Human A33 Antigen,A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of HumanGastrointestinal Epithelium,”Biochem.Biophys.Res.Commun.236(3):682-686；Wong,N.A.等(2006)“EpCAM and gpA33 AreMarkers Of Barrett's Metaplasia,”J.Clin.Pathol.59(3):260-263)。示例性的结合人gpA33的抗体是“gpA33 mAb 1”。
gpA33 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:120)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000911
gpA33 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:121)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000912
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x gpA33结合分子，其包含抗gpA33单克隆抗体gpA33 mAb 1、或者WO 2015/026894中提供的抗gpA33单克隆抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
6.示例性抗HER2/neu抗体
HER2/neu是185kDa受体蛋白，其最初被鉴定为来自化学处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。HER2/neu由于其在数种人癌症和哺乳动物发育中的作用而已经被进行了广泛的研究(Hynes等(1994)Biochim.Biophys.Acta 1198:165-184；Dougall等(1994)Oncogene 9:2109-2123；Lee等(1995)Nature 378:394-398)。示例性的结合人HER2/neu的抗体包括“玛格妥昔单抗(Margetuximab)”、“曲妥珠单抗(Trastuzumab)”和“帕妥株单抗(Pertuzumab)”。玛格妥昔单抗(也被称为MGAH22；CAS登录号1350624-75-7)是结合至HER2/neu并且介导提高的ADCC活性的Fc-优化的单克隆抗体。曲妥珠单抗(也被称为rhuMAB4D5，并且作为
Figure BDA0002532907060000913
出售；CAS登录号180288-69-1；参见美国专利号5,821,337)是抗体4D5的人源化版本，具有IgG1/κ恒定区。帕妥株单抗(也被称为rhuMAB2C4，并且作为PERJETATM出售；CAS登录号380610-27-5；参见例如WO2001/000245)是抗体2C4的人源化版本，具有IgG1/κ恒定区。
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x HER2/neu结合分子，其包含抗HER2/neu单克隆抗体玛格妥昔单抗、曲妥珠单抗、或帕妥株单抗的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
玛格妥昔单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:122)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000921
玛格妥昔单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:123)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000922
玛格妥昔单抗的完整的重链和轻链的氨基酸序列在本领域是已知的(参见，例如，WHO Drug Information,2014,推荐的INN:列表71,28(1):93-94)。
曲妥珠单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:124)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000923
曲妥珠单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:125)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000924
帕妥株单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:126)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000925
帕妥株单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000926
除了上面所鉴定的优选抗HER2/neu结合分子外，本发明还包括并且涵盖CD16 xHER2/neu结合分子，其包含下列抗HER2/neu结合分子中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个：1.44.1；1.140；1.43；1.14.1；1.100.1；1.96；1.18.1；1.20；1.39；1.24；和1.71.3(美国专利号8,350,011；8,858,942和PCT专利公开WO 2008/019290)；F5和C1(美国专利号7,892,554；8,173,424；8,974,792和PCT专利公开WO 99/55367)；以及US专利公布US2013017114和PCT专利公布WO2011/147986和WO 2012/143524的抗HER2/neu结合分子。
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x HER2/neu结合分子，其包含玛格妥昔单抗、曲妥珠单抗、或帕妥株单抗中的任一种或者本文提供的其它抗HER2/neu抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个；并且更优选地具有这种抗HER2/neu单克隆抗体的VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
7.示例性抗VEGF抗体
VEGF-A是刺激多种疾病，尤其某些转移癌，诸如转移性结肠癌，以及某些肺癌、肾癌、卵巢癌和脑的多形性成胶质细胞瘤中的血管生成的化学信号。示例性的结合至人VEGF-A的抗体是“贝伐珠单抗(Bevacizumab)”
Figure BDA0002532907060000933
贝伐珠单抗是重组人源化IgG1单克隆抗体(Midgley,R.等(2005)“Bevacizumab–Current Status And Future Directions,”Ann.Oncol.16(7):999-1004；Hall,R.D.等(2015)“Angiogenesis Inhibition As ATherapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC),”Transl.Lung CancerRes.4(5):515-523；Narita,Y.(2015)“Bevacizumab For Glioblastoma,”Ther.Clin.RiskManag.11:1759-1765)。
贝伐珠单抗的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:128)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000931
贝伐珠单抗的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:129)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000932
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x VEGF结合分子，其包含抗VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
8.示例性抗5T4抗体
癌胚蛋白5T4是在许多癌症(包括肾癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌)的细胞膜上以及在急性淋巴细胞性白血病中呈现的肿瘤相关蛋白(参见Boghaert,E.R.等(2008)“TheOncofetal Protein,5T4,Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-CancerChemotherapy With Calicheamicin,”Int.J.Oncol.32(1):221-234；Eisen,T.等(2014)“Naptumomab Estafenatox:Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,”Curr.Oncol.Rep.16:370,pp.1-6)。示例性的结合至人5T4的抗体包括“5T4 mAb 1”和“5T4mAb 2”。
5T4 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:130)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000941
5T4 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:131)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000942
5T4 mAb 2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000943
5T4 mAb 2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:133)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000944
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x 5T4结合分子，其包含抗5T4单克隆抗体5T4mAb 1或5T4 mAb 2或者WO 2013/041687或WO 2015/184203中提供的抗5T4抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
本申请另外具体地包括并且涵盖能够结合至5T4、CD16和CD8的CD16 x 5T4三特异性结合分子，以及尤其这样的三特异性结合分子，其包含抗5T4单克隆抗体5T4mAb 1或5T4mAb 2或者WO 2015/184203中提供的抗5T4单克隆抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个，和/或本文提供的抗CD8单克隆抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
9.示例性抗IL13Rα2抗体
白介素-13受体α2(IL13Rα2)在多种癌症中过表达，所述癌症包括成胶质细胞瘤、结直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、多发性黑素瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和肺癌(PCT公开号WO 2008/146911；Brown,C.E.等(2013)“Glioma IL13Rα2Is Associated WithMesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,”PLoSOne.18；8(10):e77769；Barderas,R.等(2012)“High Expression Of IL-13ReceptorΑ2InColorectal Cancer Is Associated With Invasion,Liver Metastasis,And PoorPrognosis,”Cancer Res.72(11):2780-2790；Kasaian,M.T.等(2011)“IL-13AntibodiesInfluence IL-13Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,”J.Immunol.187(1):561-569；Bozinov,O.等(2010)“Decreasing Expression Of TheInterleukin-13Receptor IL-13Ralpha2In Treated Recurrent Malignant Gliomas,”Neurol.Med.Chir.(Tokyo)50(8):617-621；Fujisawa,T.等(2009)“A Novel Role OfInterleukin-13Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis,”Cancer Res.69(22):8678-8685)。免疫特异性地结合至IL13Rα2的抗体是可商购的并且已经被描述在下列文献中(Abnova Corporation,Biorbyt,LifeSpan BioSciences,UnitedStates Biologicals；也参见PCT公开号WO 2008/146911)。示例性的结合至人IL13Rα2的抗体包括“hu08”(参见，例如PCT公开号WO 2014/072888)。
hu08的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:134)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000951
hu08的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:135)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000952
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x IL13Rα2结合分子，其包含抗IL13Rα2单克隆抗体hu08的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
10.示例性抗CD123抗体
CD123(白介素3受体α，IL-3Ra)是40kDa分子并且是白介素3受体复合物的一部分(Stomski,F.C.等(1996)“Human Interleukin-3(IL-3)Induces Disulfide-Linked IL-3Receptor Alpha-And Beta-Chain Heterodimerization,Which Is Required ForReceptor Activation But Not High-Affinity Binding,”Mol.Cell.Biol.16(6):3035-3046)。白介素3(IL-3)驱动多能干细胞早期分化成红系祖细胞、髓系祖细胞和淋巴样祖细胞的细胞。已经报道CD123在大范围的血液学恶性肿瘤(包括急性髓细胞样白血病(AML)和脊髓增生异常综合征(MDS))中的恶性细胞上过表达(
Figure BDA0002532907060000963
L.等(2001)“Interleukin-3Receptor Alpha Chain(CD123)Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,”Haematologica86(12):1261-1269)。CD123的过表达与AML中的较差的预后有关(Tettamanti,M.S.等(2013)“Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor,”Br.J.Haematol.161:389-401)。
示例性的结合至人CD123并且可用于本发明的抗体是“CD123 mAb 1”(参见，例如PCT专利公布WO 2015/026892)。
CD123 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:136)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000961
CD123 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000962
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x CD123结合分子，其包含抗CD123单克隆抗体CD123 mAb 1或者US 2017/081424和WO 2016/036937中公开的抗CD123抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
11.示例性抗CD19抗体
CD19(B淋巴细胞表面抗原B4，Genbank登录号M28170)是B细胞受体(BCR)复合物的组分，并且是调节B细胞激活和体液免疫的阈值的B细胞信号传导的正调节物。CD19是在B细胞谱系中最普遍存在表达的抗原之一并且在>95％的B细胞恶性肿瘤上表达，包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。特别地，CD19表达维持在对抗-CD20疗法变得抗性的B细胞淋巴瘤上(Davis等(1999)“Therapy ofB-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20Antigen Expression.”Clin Cancer Res,5:611-615,1999)。此外，建议CD19作为治疗自体免疫疾病的靶标(Tedder(2009)“CD19:A Promising B Cell Target For RheumatoidArthritis,”Nat.Rev.Rheumatol.5:572-577)。
示例性的结合至人CD19并且可用于本发明中的抗体是WO 2016/048938中公开的抗CD19抗体(本文也称为“CD19 mAb 1”)。
CD19 mAb 1的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:123)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000971
CD19 mAb 1的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:139)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000972
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x CD19结合分子，其包含抗CD19单克隆抗体CD19 mAb 1或者US专利US 7,112,324中公开的抗CD19抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
B.示例性的病原体相关抗原
如本文所用，术语“病原体相关抗原”意指被典型地表达在病原体感染细胞的表面上并且因此可用基于抗体的分子或免疫调节分子治疗的抗原。病原体相关抗原的实例包括但不限于在用下列感染的细胞的表面上表达的抗原：单纯疱疹病毒(例如，感染的细胞蛋白(ICP)47、gD等)、水痘-带状疮疹病毒、柯氏肉瘤相关的疱疹病毒(kaposi's sarcomaassociated herpes virus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr Virus)(例如，LMP-1、LMP-2A、LMP-2B等)、巨细胞病毒(例如，UL11等)、人免疫缺陷病毒(例如，env蛋白gp160、gp120、gp41等)、人乳头瘤病毒(例如，E6、E7等)、人T细胞白血病病毒(例如，env蛋白gp64、gp46、gp21等)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、芽孢杆菌纲(Bacilli)细菌、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)细菌、霍乱菌(Cholera)、白喉菌(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)细菌、淋球菌(Gonococci)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌、军团菌属(Legionella)细菌、脑膜炎球菌(Meningococci)、分枝杆菌(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、肺炎球菌(Pneumonococci)、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、沙雷氏属(Serratia)细菌、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)细菌、破伤风(Tetanus)、曲霉属真菌(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、皮肤芽孢杆菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毛霉菌目属(GenusMucorales)(毛霉菌(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、寄生蠕虫病(helminthparasite)(钩虫、绦虫、吸虫、扁虫(例如血吸虫(Schistosomia))、贾第虫(Giardialambia)、旋毛虫(trichinella)、脆双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani))。这种抗体可从多种来源商购，或者可以通过用这种抗原使小鼠或其它动物免疫获得(包括产生单克隆抗体)。
下面提供了示例性抗体，其VH和VL结构域可用于构建能够结合排列在病原体感染细胞的表面上的病原体相关抗原的分子，另外的抗体在本领域是已知的。
1.示例性抗HIV抗体
HIV的env蛋白是示例性的病原体相关抗原，并且结合HIV的env蛋白的抗体是示例性的能够结合病原体相关抗原的抗体。
HIV-1感染的初始步骤伴随着细胞表面CD4结合至三聚体HIV-1包膜糖蛋白(env)、跨膜糖蛋白(gp41)和表面糖蛋白(gp120)的异源二聚体发生。gp120和gp41糖蛋白初始被合称为单个gp160多肽，其随后被切割以产生非共价缔合的gp120/gp41复合物。Env的胞外结构域是质量约140kDa的异源二聚体，由整个gp120组分和约20kDa的gp41构成(Harris,A.等(2011)“Trimeric HIV-1Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1EnvelopeGlycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary MolecularArchitectures,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)108(28):11440-11445)。免疫特异性地结合至env蛋白的抗体可商购并且已经描述在下列文献中(参见，例如GenBank登录号AFQ31503；Buchacher,A.等(1994)“Generation Of Human Monoclonal AntibodiesAgainst HIV-1Proteins；Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation ForPeripheral Blood Lymphocyte Immortalization,”AIDS Res.Hum.Retroviruses 10(4):359-369；Shen,R.(2010)“GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type1Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,”J.Immunol.184(7):3648-3655；WO 2012/162068；和WO 2016/054101)。结合至HIV env的示例性抗体包括“7B2”(GenBank登录号AFQ31503)和“A32”(PCT公开号WO 2014/159940)。
抗体7B2(Genbank登录号JX188438和JX188439)是抗HIV env的人IgG1抗体，其在该分子的免疫显性螺旋-环-螺旋区中在598-604处结合HIV gp41(Sadraeian,M.等(2017)“Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A ChainFor Cells Expressing HIV Envelope,”Sci.Rep.7(1):7579doi:10.1038/s41598-017-08037-3)。利用爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒B细胞转化和异源杂交瘤产生从HIV-1慢性感染的受试者分离抗体(Pincus,S.H.等(2003)“In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41,But Not Anti-Glycoprotein 120,Immunotoxins In A Mouse Model Of HIVInfection,”J.Immunol.170(4):2236-2241)。抗体7B2已经发现能够识别病毒颗粒和感染细胞两者(Santra,S.等(2015)“Human Non-neutralizing HIV-1Envelope MonoclonalAntibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infectionin Rhesus Macaques,”PLoS Pathog.11(8):e1005042.doi:10.1371/journal.ppat.1005042；Tay,M.Z.等(2016)“Antibody-Mediated Internalization ofInfectious HIV-1Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses,”PLoSPathog.12(8):e1005817.doi:10.1371/journal.ppat.1005817)。
7B2的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:140)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000991
7B2的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:141)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060000992
单克隆抗体A32识别HIV-1Env gp120的C1区中的构象表位(Wyatt等(1995)“Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of HumanImmunodeficiency Virus Type 1gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding,”J.Virol.69:5723-5733)、介导强效的ADCC活性并且能阻断相当大比例的HIV-1感染个体中可检测的ADCC-介导的Ab活性(Ferrari,G.等(2011)“An HIV-1gp120 Envelope HumanMonoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope MediatesPotent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity(ADCC)Activity and Defines aCommon ADCC Epitope in Human HIV-1Serum,”J.Virol.85(14):7029-7036)。
在现有技术中已经报道了抗体A32的多个VH结构域，其具有所报道的构架区1和/或4中的最小变化(参见，例如Protein Data Base登录号PDB:4YBL_H，US2015/0239961和WO2006/044410)。这些变体抗体A32的VH结构域中的任何一个可根据本发明进行使用。A32的示例性VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:142)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001001
A32的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:143)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001002
A32的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:143)可与A32的示例性VH结构域(SEQID NO:142)或者与变体抗体A32的VH结构域中的任一种(参见，例如Protein Data Base登录号PDB:4YBL_H，US 2015/0239961和WO 2006/044410)一起使用以形成抗HIV-1Env gp120的表位结合位点。
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x HIV结合分子，其包含抗HIV单克隆抗体7B2或A32、或者在WO 2016196975、WO 2016/149710、WO 2016/149698、WO 2016/149695、WO 2015/048610、WO 2012/030904、WO 2013/163427、WO 2013/192589、WO 2014/063059、WO 20170/11413、WO 2016/054101、WO 2014/159940或WO 2017/011414中公开的抗HIV抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
本申请另外具体地包括并且涵盖能够结合至HIV、CD16和CD8的CD16 x HIV结合分子，尤其是这样的三特异性结合分子，其包含抗HIV单克隆抗体7B2或A32或者在WO 2015/184203、WO 2016/054101、WO 2017/011413、WO 2017/011414中公开的抗HIV单克隆抗体中的任一种的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
2.示例性抗RSV抗体
进一步例证性的病原体相关抗原是RSV糖蛋白F。示例性抗RSV糖蛋白F抗体是帕利珠单抗(Palivizumab)(参见，例如Protein Data Bank(PDB)ID号2HWZ)。可替选的抗RSV糖蛋白F抗体包括莫维珠单抗(motavizumab)(参见，例如PDB ID号3IXT)以及帕利珠单抗变体(本文也被称为“v帕利珠单抗”，其已经被改造以从帕利珠单抗的CDRL1中去除半胱氨酸残基。帕利珠单抗变体的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:144)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001011
帕利珠单抗变体的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:145)显示在下面(CDR残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001012
本发明具体地包括并且涵盖CD16 x RSV结合分子，其包含抗RSV单克隆抗体帕利珠单抗或v帕利珠单抗的VL和/或VH结构域，和/或VL区的CDRL中的1个、2个或所有3个和/或VH结构域的CDRH中的1个、2个或所有3个。
VII.本发明的示例性结合分子
本发明的原理通过一系列示例性CD16 x DA结合分子阐明，所述一系列示例性CD16 x DA结合分子含有不同的鼠或人源化抗CD16结合结构域并且具有对疾病抗原免疫特异性的结合结构域。这种示例性CD16 x DA结合分子的共价双抗体结构和序列汇总在表12中并且在下面进行详细描述。如将要认识到的，可同样构建类似的双抗体和其它双特异性分子(通过利用期望抗体的VL和VH结构域代替示例性CD16 x DA结合分子的VL和VH结构域)。
Figure BDA0002532907060001021
Figure BDA0002532907060001031
Figure BDA0002532907060001041
A.CD16 x HER2/neu结合分子，DART-A
被命名为“DART-A”的CD16 x HER2/neu结合分子是第一示例性CD16 x DA结合分子。DART-A是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的含Fc结构域的双特异性双抗体。DART-A由三条多肽链构成并且具有包含抗人CD16抗体CD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001053
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-A的第一多肽链具有SEQ ID NO:151的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001051
这种示例性CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:151)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线的)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-233对应于抗人CD16抗体CD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:64)。残基234-23对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线的)。第一多肽链的残基239-266对应于含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-A的第二多肽链具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001052
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:152)的残基1-107对应于抗人CD16抗体CD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:65)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线的)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ IDNO:21，带下划线的)。第二多肽链的残基241-268对应于含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
DART-A的第三多肽链具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001061
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第三多肽链(SEQ ID NO:153)的残基1-10对应于连接体(SEQ ID NO:40)。第三多肽链的残基11-227对应于“带有臼的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:53)，其包含H435R置换(加下划线显示)，并且其中最后的残基是赖氨酸。如上所述，H435R置换消除了该分子结合至结合蛋白A的能力。
如将要认识的，DART-A的第三多肽链不包含任何表位结合位点并且可因此用于各种CD16 x DA结合分子中。因此，DART-A的第三多肽链被称为“共同的双抗体多肽链”。
B.CD16 x HER2/neu结合分子，“DART-B”
被称为“DART-B”的CD16 x Her2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-B是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的含Fc结构域的双特异性双抗体。DART-B由三条多肽链构成，并且具有包含抗人CD16抗体CD16-M2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001063
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-B的第一多肽链具有SEQ ID NO:154的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001062
Figure BDA0002532907060001071
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:154)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带有双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-234对应于抗人CD16抗体CD16-M2的VH结构域(SEQ ID NO:75)。残基235-239对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基240-267对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基268-280对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基281-497对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-B的第二多肽链具有SEQ ID NO:155的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001072
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:155)的残基1-107对应于抗人CD16抗体CD16-M2的VL结构域(SEQ ID NO:76)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ IDNO:21，带下划线)。第二多肽链的残基241-268对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
DART-B的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
C.CD16 x HER2/neu结合分子，“DART-C”
被命名为“DART-C”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-C是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的包含Fc结构域的双特异性双抗体。DART-C由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001073
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-C的第一多肽链具有SEQ ID NO:156的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001081
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:156)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-233对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基234-238对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基239-266对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-C的第二多肽链具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001082
这种示例性的CD16 x DA结合分子的的第二多肽链(SEQ ID NO:157)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基241-268对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQID NO:32)。
DART-C的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
D.CD16 x HER2/neu结合分子，“DART-D”
被命名为“DART-D”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-D是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的包含Fc结构域的双特异性双抗体。DART-D由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001093
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-D的第一多肽链具有SEQ ID NO:158的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001091
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:158)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-234对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VH1结构域(SEQ ID NO:83)。残基235-239对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基240-267对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基268-280对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基281-497对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-D的第二多肽链具有SEQ ID NO:159的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001092
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:159)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VL1结构域(SEQ ID NO:85)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基241-268对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQID NO:32)。
DART-D的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
E.CD16 x HER2/neu结合分子，“DART-E”
被命名为“DART-E”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-E是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的双特异性双抗体。DART-E由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001102
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-E的第一多肽链具有SEQ ID NO:160的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001101
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:160)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-234对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VH2结构域(SEQ ID NO:84)。残基235-239对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基240-267对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基268-280对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基281-497对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-E的第二多肽链在序列上与DART-D的第二多肽链(SEQ ID NO:159)相同。
DART-E的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
F.CD16 x HIV env结合分子，“DART-F”
被命名为“DART-F”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-F是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-F由三条多肽链构成，具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含抗体A32的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001113
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-F的第一多肽链具有SEQ ID NO:161的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001111
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:161)的残基1-110对应于抗体A32的VL结构域(SEQ ID NO:143)。第一多肽链的残基111-118(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基119-236对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基237-241对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基242-269对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基270-282对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基283-499对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-F的第二多肽链具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001112
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:162)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-238对应于抗体A32的VH结构域(SEQ ID NO:142)。第二多肽链的残基239-243对应于连接体(SEQID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基244-271对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ IDNO:32)。
DART-F的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
G.CD16 x HIV env结合分子，“DART-G”
CD16 x HIV env结合分子被命名为“DART-G”是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-G是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-G由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含抗体A32的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001122
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-G的第一多肽链具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001121
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:163)的残基1-110对应于抗体A32的VL结构域(SEQ ID NO:143)。第一多肽链的残基111-118(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基119-237对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VH结构域(SEQ ID NO:83)。残基238-242对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基243-270对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基271-283对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基284-500对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-G的第二多肽链具有SEQ ID NO:164的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001131
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:164)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M2的VL结构域(SEQ ID NO:85)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-238对应于抗体A32的VH结构域(SEQ ID NO:142)。第二多肽链的残基239-243对应于连接体(SEQID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基244-271对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ IDNO:32)。
DART-G的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
H.CD16 x HIV env结合分子，“DART-H”
被命名为“DART-H”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-H是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-H由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含抗体7B2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001133
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-H的第一多肽链具有SEQ ID NO:165的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001132
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:165)的残基1-113对应于抗体7B2的VL结构域(SEQ ID NO:141)。第一多肽链的残基114-121(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基122-239对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基240-244对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基245-272对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基273-285对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基286-502对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-H的第二多肽链具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001141
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:166)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-241对应于抗体7B2的VH结构域(SEQ ID NO:140)。第二多肽链的残基242-246对应于连接体(SEQID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基247-274对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ IDNO:32)。
DART-H的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
I.CD16 x HER2/neu结合分子，“DART-I”
被命名为“DART-I”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-I类似于上述的DART-C，但包含hCD16-M1A的VH(包含突变的CDRH3)。如上所示，hCD16-M1A的VL结构域具有与hCD16-M1的VL结构域相同的氨基酸序列。
DART-I的第一多肽链具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001142
Figure BDA0002532907060001151
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:186)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-233对应于优化抗人CD16抗体hCD16-M1A的VH结构域(SEQ ID NO:58)。残基234-238对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基239-266对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
因为hCD16-M1A的VL结构域与hCD16-M1的VL结构域相同，所以DART-I的第二多肽链的氨基酸序列与DART-C的第二多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:157)。类似地，DART-I的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
J.CD16 x HER2/neu结合分子“DART-J”
被命名为“DART-J”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-J类似于上述DART-C，但包含hCD16-M1B的VL(包含突变的CDRL3)。如上所示，hCD16-M1B的VH结构域具有与hCD16-M1的VH结构域相同的氨基酸序列。
因为hCD16-M1B的VH结构域与hCD16-M1的VH结构域相同，所以DART-J的第一多肽链的氨基酸序列与DART-C的第一多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:156)。
DART-J的第二多肽链具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001152
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:157)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1B的VL结构域(SEQ ID NO:59)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线的)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线的)。第二多肽链的残基241-268对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
DART-J的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
K.CD16 x HER2/neu结合分子“DART-K”
被命名为“DART-K”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-K类似于上述DART-J，但也包含hCD16-M1A的VH(包含突变的CDRH3)。因此，DART-K包含hCD16-M1AB的VL和VH(包含突变的CDRL3和突变的CDRH3)。
因为DART-K包含hCD16-M1A的VH，所以DART-K的第一多肽链的氨基酸序列与DART-I的第一多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:186)。
因为DART-K包含hCD16-M1B的VL结构域，所以DART-K第二多肽链的的氨基酸序列与DART-J的第二多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:187)。
DART-J的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
L.CD16 x CD19结合分子“DART-L”
被命名为“DART-L”的CD16 x CD19结合分子是另一示例性的CD16 x DA结合分子。DART-L是能够结合CD16和CD19 B细胞肿瘤抗原的包含Fc结构域的双特异性双抗体。DART-L由三条多肽链构成，并且具有包含抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含CD19 mAb 1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD19癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和CD19癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001162
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-L的第一多肽链具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001161
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:188)的残基1-106对应于CD19 mAb 1的VL结构域(SEQ ID NO:139)。第一多肽链的残基107-114(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基115-232对应于抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基233-238对应于连接体(SEQ ID NO:17，带下划线)。第一多肽链的残基239-266对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-L的第二多肽链具有SEQ ID NO:189的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001171
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:189)的残基1-107对应于抗人CD16抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于CD19mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:138)。第二多肽链的残基236-241对应于连接体(SEQ ID NO:17，带下划线)。第二多肽链的残基242-269对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
DART-L的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
M.CD16 x CD19结合分子“DART-M”
被命名为“DART-M”的CD16 x CD19结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-M类似于上述DART-L，但包含hCD16-M1B的VL(包含突变的CDRL3)。如上所示，hCD16-M1B的VH结构域具有与hCD16-M1的VH结构域相同的氨基酸序列。
因为hCD16-M1B的VH结构域与hCD16-M1的VH结构域相同，所以DART-M的第一多肽链的氨基酸序列与DART-L的第一多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:188)。
DART-M的第二多肽链具有SEQ ID NO:190的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001181
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:190)的残基1-107对应于抗人CD16抗体hCD16-M1B的VL结构域(SEQ ID NO:59)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于CD19 mAb 1的VH结构域(SEQ ID NO:138)。第二多肽链的残基236-241对应于连接体(SEQID NO:17，带下划线)。第二多肽链的残基242-269对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ IDNO:32)。
DART-M的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
N.CD16 x CD19结合分子“DART-N”
被命名为“DART-N”的CD16 x CD19结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-N类似于上述DART-M，但也包含hCD16-M1A的VH(包含突变的CDRH3)。因此，DART-N包含hCD16-M1AB的VL和VH(包含突变的CDRL3和突变的CDRH3))。
DART-N的第一多肽链具有SEQ ID NO:191的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001182
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:191)的残基1-106对应于CD19 mAb 1的VL结构域(SEQ ID NO:139)。第一多肽链的残基107-114(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基115-232对应于抗人CD16抗体hCD16-M1A的VH结构域(SEQ ID NO:58)。残基233-238对应于连接体(SEQ ID NO:17，带下划线)。第一多肽链的残基239-266对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
因为DART-N包含hCD16-M1B的VL结构域，所以DART-N的第二多肽链的氨基酸序列与DART-M的第二多肽链的氨基酸序列相同(即，SEQ ID NO:190)。
DART-N的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
O.CD16 x HER2/neu结合分子“DART-1”
被命名为“DART-1”的CD16 x HER2/neu结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-1是能够结合CD16和HER2/neu癌抗原的双特异性双抗体。DART-1与DART-A实质上相同，除了它具有人源化抗人CD16抗体h3G8的VL和VH结构域(参见，例如U.S.专利公开号2004/0010124；PCT公开号WO 2017/142928；Li,W.等(2016)“Identification Of High-Affinity Anti-CD16A Allotype-Independent Hum Antibody Domains,”Exp.Mol.Pathol.101(2):281-289)：
人源化抗人CD16 mAb h3G8的VH结构域(SEQ ID NO:62)显示在下面(CDRH残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001191
人源化CD16 mAb h3G8的VL结构域(SEQ ID NO:63)显示在下面(CDRL残基用下划线显示)：
Figure BDA0002532907060001192
而不是存在于DART-A中的抗人CD16抗体CD16-M1的VH和VL结构域(分别地，SEQ IDNO:64和SEQ ID NO:65)。h3G8的VH和VL结构域在本文中被用作比较物(comparator)CD16结合位点。DART-1由三条多肽链构成，其具有包含抗人CD16抗体CD16-M1的VL和VH结构域的两个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含曲妥珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HER2/neu癌抗原的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HER2/neu癌抗原的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001194
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-1的第一多肽链具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001193
Figure BDA0002532907060001201
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:167)的残基1-107对应于曲妥珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:125)。第一多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基116-233对应于人源化抗人CD16抗体h3G8的VH结构域(SEQ ID NO:62)。残基234-238对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基239-266对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基267-279对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基280-496对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-1的第二多肽链具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001202
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:168)的残基1-111对应于人源化抗人CD16抗体h3G8的VL结构域(SEQ ID NO:63)。第二多肽链的残基112-119(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基120-239对应于曲妥珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:124)。第二多肽链的残基240-244对应于连接体(SEQ IDNO:21，带下划线)。第二多肽链的残基244-272对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
DART-1的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
P.CD16 x RSV结合分子“DART-2”
被命名为“DART-2”的CD16 x RSV结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-2是能够结合CD16和RSV糖蛋白F的双特异性双抗体。DART-2与DART-1实质上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗体v帕利珠单抗的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:144和SEQID NO:145)，而不是存在于DART-1双抗体中的曲妥珠单抗的VH和VL结构域(分别地，SEQ IDNO:124和SEQ ID NO:125)。因此，DART-2由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体h3G8的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含v帕利珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于RSV糖蛋白F的表位是免疫特异性的)。第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001212
双抗体(参见，例如图4A)。如上所示，h3G8的VH和VL结构域在本文被用作比较物CD16结合位点。
Q.CD16 x RSV结合分子“DART-3”
被命名为“DART-3”的CD16 x RSV结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。CD16 x RSV DART-3是能够结合CD16和RSV糖蛋白F的双特异性双抗体。DART-3由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含v帕利珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于RSV糖蛋白F的表位是免疫特异性的)。三条多肽链缔合以形成能免疫特异性地结合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001213
双抗体(参见，例如图4A)。
DART-3的第一多肽链具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001211
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:169)的残基1-106对应于v帕利珠单抗的VL结构域(SEQ ID NO:145)。第一多肽链的残基107-114(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基115-232对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基233-237对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基238-265对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基266-278对应于连接体(SEQ IDNO:43)。第一多肽链的残基279-495对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
DART-3的第二多肽链具有SEQ ID NO:170的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001221
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:170)的残基1-107对应于人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-235对应于v帕利珠单抗的VH结构域(SEQ ID NO:144)。第二多肽链的残基236-240对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基241-268对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQID NO:32)。
DART-3的第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。
R.CD16 x HIV env结合分子“DART-4
被命名为“DART-4”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-4是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-4与DART-1实质上相同，除了它具有抗HIV env蛋白抗体7B2的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:140和SEQ IDNO:141)，而不是存在于DART-1中的曲妥珠单抗的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125)。因此，DART-4由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体h3G8的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含7B2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001222
双抗体(参见，例如图4A)。如上所示，h3G8的VH和VL结构域在本文被用作比较物CD16结合位点。
S.CD16 x RSV结合分子“DART-5”
被命名为“DART-5”的CD16 x RSV结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-5是能够结合CD16和RSV糖蛋白F的双特异性双抗体。DART-5与DART-L实质上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗体v帕利珠单抗的VL和VH结构域(分别地，SEQ ID NO:144和SEQID NO:145)，而不是存在于DART-L中的CD19mAb 1的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139)。因此，DART-5由三条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含v帕利珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于RSV糖蛋白F的表位是免疫特异性的)。第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001231
双抗体(参见，例如图4A)。
T.CD16 x RSV结合分子“DART-6”
被命名为“DART-6”的CD16 x RSV结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-6是能够结合CD16和RSV糖蛋白F的双特异性双抗体。DART-6与DART-M实质上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗体v帕利珠单抗的VL和VH结构域(分别地，SEQ ID NO:144和SEQID NO:145)，而不是存在于DART-M中的CD19mAb 1的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139)。因此，DART-6由三条多肽链构成，并且具有包含优化的抗人CD16抗体hCD16-M1B的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含v帕利珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于RSV糖蛋白F的表位是免疫特异性的)。第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001232
双抗体(参见，例如图4A)。
U.CD16 x RSV结合分子“DART-7”
被命名为“DART-7”的CD16 x RSV结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-7是能够结合CD16和RSV糖蛋白F的双特异性双抗体。DART-7与DART-N实质上相同，除了它具有抗RSV糖蛋白F抗体v帕利珠单抗的VL和VH结构域(分别地，SEQ ID NO:144和SEQID NO:145)，而不是存在于DART-N中的CD19mAb 1的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139)。因此，DART-7由三条多肽链构成，并且具有包含优化的抗人CD16抗体hCD16-M1AB的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含v帕利珠单抗的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于RSV糖蛋白F的表位是免疫特异性的)。第三多肽链具有共同的双抗体多肽链的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)。三条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和RSV糖蛋白F的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001243
双抗体(参见，例如图4A)。
V.CD16 x HIV env分子“DART-X”
被命名为“DART-X”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-X是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-X由两条多肽链构成，并且具有包含抗人CD16抗体CD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含7B2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。两条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001244
双抗体(参见，例如图1A-1B)。
DART-X的第一多肽链具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001241
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:171)的残基1-113对应于7B2的VL结构域(SEQ ID NO:141)。第一多肽链的残基114-121(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基122-239对应于抗人CD16抗体CD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:64)。残基240-244对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基245-272对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。
DART-X的第二多肽链具有SEQ ID NO:172的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001242
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:172)的残基1-107对应于抗人CD16抗体CD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:65)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-241对应于7B2的VH结构域(SEQ ID NO:140)。第二多肽链的残基242-246对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基247-274对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
W.CD16 x HIV env结合分子“DART-Y”
被命名为“DART-Y”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-Y是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-Y由两条多肽链构成，并且具有包含抗人CD16抗体CD16-M2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含7B2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。两条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合CD16的表位和HIV env蛋白的表位的共价结合的
Figure BDA0002532907060001253
双抗体(参见，例如图1B)。
DART-Y的第一多肽链具有SEQ ID NO:173的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001251
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:173)的残基1-113对应于7B2的VL结构域(SEQ ID NO:141)。第一多肽链的残基114-121(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基122-240对应于抗人CD16抗体CD16-M2的VH结构域(SEQ ID NO:75)。残基241-245对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基246-273对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。
DART-Y的第二多肽链具有SEQ ID NO:174的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001252
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:174)的残基1-107对应于抗人CD16抗体CD16-M2的VL结构域(SEQ ID NO:76)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-241对应于7B2的VH结构域(SEQ ID NO:140)。第二多肽链的残基242-246对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第二多肽链的残基247-274对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
X.CD16 x HIV env结合分子“DART-0”
被命名为“DART-0的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-0是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-0与DART-X实质上相同，除了它具有人源化抗人CD16抗体h3G8的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:63)，而不是存在于DART-X中的抗人CD16抗体CD16-M1的VH和VL结构域(分别地，SEQ IDNO:64和SEQ ID NO:65)。因此，DART-0由两条多肽链构成，并且具有包含人源化抗人CD16抗体h3G8的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含7B2的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV Env蛋白的表位是免疫特异性的)。这些多肽链缔合以形成具有对于CD16的表位免疫特异性的一个结合结构域和对于HIV env蛋白的表位免疫特异性的一个结合结构域的由两条多肽链构成的共价结合的
Figure BDA0002532907060001263
双抗体(参见，例如图1A-1B)。如上所示，h3G8的VH和VL结构域在本文被用作比较物CD16结合位点。
Y.CD16 x HIV env结合分子“DART-Z”
被命名为“DART-Z”的CD16 x HIV env结合分子是进一步示例性的CD16 x DA结合分子。DART-Z是能够结合CD16和HIV env蛋白的双特异性双抗体。DART-Z与DART-X实质上相同，除了它具有抗HIV env抗体A32的VH和VL结构域(分别地，SEQ ID NOs:142和143)而不是抗HIV env抗体7B2的VH和VL结构域；并且它具有抗人CD16A scFv 4-LS21的VH和VL结构域(U.S.专利公开号2015/0218275)：
抗人CD16A scFv 4-LS21的VH结构域(SEQ ID NO:175)：
Figure BDA0002532907060001261
抗人CD16A scFv 4-LS21的VL结构域(SEQ ID NO:176)：
Figure BDA0002532907060001262
而不是存在于DART-X中的抗人CD16抗体CD16-M1的VH和VL结构域(分别地，SEQ IDNO:64和SEQ ID NO:65)。因此，DART-Z由两条多肽链构成，其具有包含抗人CD16A scFv 4-LS21的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和包含A32的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。这些多肽链缔合以形成具有对于CD16的表位免疫特异性的一个结合结构域和对于HIVenv蛋白的表位免疫特异性的一个结合结构域的由两条多肽链构成的共价结合的
Figure BDA0002532907060001272
双抗体(参见，例如图1A-1B)。4-LS21的VH和VL结构域在本文被用作比较物CD16结合位点。
Z.CD16 x HIV env x HIV env三价分子
本发明的CD16 x DA结合分子进一步通过包含Fc结构域的双特异性或三特异性的CD16 x HIV env x HIV env三价分子示例，其包含能够结合至HIV env蛋白的表位的两个结合结构域和能够结合至CD16的表位的一个结合结构域。HIV env蛋白的这种表位可以相同(如在CD16 x HIV env x HIV env三价分子“TRIDENT-A”中)，或者它们可以不同(如在CD16 x HIV env x HIV env三价分子“TRIDENT-B”中)。示例性的三价TRIDENTTM分子的结构和序列被汇总在表13中，并且在下面进行详细描述。
Figure BDA0002532907060001271
1.CD16 x HIV env x HIV env三价分子“TRIDENT-A”
被命名为“TRIDENT-A”的CD16 x HIV env x HIV env三价分子由四条多肽链构成，并且具有包含抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)和各自包含A32的VL和VH结构域的两个结合结构域(并且因此对于由抗体A32识别的HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。四条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合由抗体A32识别的HIV env蛋白表位的一个或两个拷贝以及CD16的表位的共价结合的TRIDENTTM分子(参见图6A)。
TRIDENT-A的第一多肽链具有SEQ ID NO:177的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001281
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第一多肽链(SEQ ID NO:177)的残基1-110对应于抗体A32的VL结构域(SEQ ID NO:143)。第一多肽链的残基111-118(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第一多肽链的残基119-236对应于抗人CD16抗体hCD16-M1的VH结构域(SEQ ID NO:72)。残基237-241对应于连接体(SEQ ID NO:21，带下划线)。第一多肽链的残基242-269对应于包含半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:31)。第一多肽链的残基270-282对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第一多肽链的残基283-499对应于“带有杵的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:51)，其中最后的残基是赖氨酸。
TRIDENT-A的第二多肽链具有SEQ ID NO:178的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001282
这种示例性的CD16 x DA结合分子的第二多肽链(SEQ ID NO:178)的残基1-107对应于抗体hCD16-M1的VL结构域(SEQ ID NO:73)。第二多肽链的残基108-115(带双下划线)对应于连接体1(GGGSGGGG；SEQ ID NO:16)。第二多肽链的残基116-238对应于抗体A32的VH结构域(SEQ ID NO:142)。第二多肽链的残基239-243对应于连接体(SEQ ID NO:43)。第二多肽链的残基244-271对应于包含半胱氨酸的K-螺旋(SEQ ID NO:32)。
TRIDENT-A的第三多肽链具有SEQ ID NO:179的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001291
第三多肽链(SEQ ID NO:179)的残基1-123对应于抗体A32的VH结构域(SEQ IDNO:142)。第三多肽链的残基124-221对应于人IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:3)。第三多肽链的残基222-236对应于IgG铰链结构域(SEQ ID NO:7，带下划线)。第三多肽链的残基237-453对应于“带有臼的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:53)，其中最后的残基是赖氨酸。
TRIDENT-A的第四多肽链具有SEQ ID NO:180的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001292
第四多肽链(SEQ ID NO:180)的残基1-110对应于抗体A32的VL结构域(SEQ IDNO:143)。第四多肽链的残基111-217对应于人CLκ结构域(SEQ ID NO:1)。
2.CD16 x HIV env x HIV env三价分子“TRIDENT-B”
被命名为“TRIDENT-B”的示例性CD16 x HIV env x HIV env三价分子也由四条多肽链构成。它具有包含抗人CD16抗体hCD16-M1的VL和VH结构域的一个结合结构域(并且因此对于CD16的表位是免疫特异性的)，包含A32的VL和VH结构域的结合结构域(并且因此对于由抗体A32识别的HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)和包含7B2的VL和VH结构域的另外的结合结构域(并且因此对于由抗体7B2识别的HIV env蛋白的表位是免疫特异性的)。四条多肽链缔合以形成能够免疫特异性地结合由抗体A32识别的HIV env蛋白的表位和/或由抗体7B2识别的HIV env蛋白的表位、和CD16的表位的共价结合的TRIDENTTM分子(参见图6A)。
TRIDENT-B的第一多肽链与TRIDENT-A的第一多肽链(SEQ ID NO:177)相同。
TRIDENT-B的第二多肽链与TRIDENT-A的第二多肽链(SEQ ID NO:178)相同。
TRIDENT-B的第三多肽链具有SEQ ID NO:181的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001301
第三多肽链(SEQ ID NO:181)的残基1-126对应于抗体7B2的VH结构域(SEQ IDNO:140)。第三多肽链的残基127-224对应于人IgG1 CH1结构域(SEQ ID NO:3)。第三多肽链的残基225-239对应于IgG铰链结构域(SEQ ID NO:7，带下划线)。第三多肽链的残基240-456对应于“带有臼的”IgG1 CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:53)，其中最后的残基是赖氨酸。
TRIDENT-B的第四多肽链具有SEQ ID NO:182的氨基酸序列：
Figure BDA0002532907060001302
第四多肽链(SEQ ID NO:182)的残基1-113对应于抗体7B2的VL结构域(SEQ IDNO:141)。第四多肽链的残基114-220对应于人CLκ结构域(SEQ ID NO:1)。
VIII.生产方法
本发明的分子最优选地通过编码这种多肽的核酸分子的重组表达生产，如本领域所熟知的。
本发明的多肽可方便地利用固相肽合成制备(Merrifield,B.(1986)“SolidPhase Synthesis,”Science 232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)“General MethodFor The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:SpecificityOf Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-PhaseSynthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
抗体可利用本领域已知的任何方法重组制备并且表达。抗体可通过首先分离从宿主动物制备的抗体、获得基因序列、和利用该基因序列在宿主细胞(例如CHO细胞)中重组表达抗体而重组制备。可以采用的另一方法是在植物(例如，烟草)或转基因牛奶中表达抗体序列。在植物或牛奶中重组表达抗体的合适方法已经被公开(参见，例如Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,”Vaccine19:2756；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production OfRecombinant Antibodies,”J.Immunol.Methods 231:147-157)。制备抗体衍生物(例如人源化、单链等)的合适方法在本领域是已知的，并且在上面已经进行描述。在另一替选方案中，抗体可通过噬菌体展示技术重组制备(参见，例如U.S.专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150；和Winter,G.等(1994)“Making Antibodies By Phage DisplayTechnology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
包含目标多核苷酸(例如，编码本发明的结合分子的多肽链的多核苷酸)的载体可通过许多合适手段中的任何一种引入到宿主细胞中，所述手段包括电穿孔；利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂质转染和感染(例如，其中载体是感染剂，诸如牛痘病毒)。引入载体或多核苷酸的选择将经常取决于宿主细胞的特征。
能够过表达异源DNA的任何宿主细胞可用于表达目标多肽或蛋白的目的。合适的哺乳动物宿主细胞的非限制性实施例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。
本发明包括包含本发明的结合分子的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽可通过本领域已知的程序制备。多肽可通过抗体的蛋白水解或其它降解、通过如上所述的重组方法(即，单个多肽或融合多肽)或通过化学合成产生。抗体的多肽、尤其高达约50个氨基酸的较短多肽，通过化学合成方便制备。化学合成的方法在本领域是已知的并且是可商购的。
本发明包括所公开的结合分子的变体，其包括不显著影响这种分子的性能的功能上等同的多肽以及具有增加的或减少的活性的变体。多肽的修饰在本领域是常规实践并且不需要在本文进行详细描述。修饰的多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守置换、没有显著影响或没有不利地改变化学类似物的功能活性或用途的氨基酸的一个或多个缺失或添加的多肽。可彼此保守置换的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；丝氨酸/苏氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其它翻译后修饰(诸如，例如用不同糖糖基化、乙酰化和磷酸化)的多肽。优选地，氨基酸置换将是保守的，即置换的氨基酸将具有与原始氨基酸相似的化学性能。这种保守置换是本领域已知的并且已经在上面提供实例。氨基酸修饰的范围可从改变或修饰一个或多个氨基酸至区域诸如可变结构域的完全重新设计。可变结构域的变化可改变结合亲和性和/或特异性。修饰的其它方法包括利用本领域已知的偶联技术，其包括但不限于酶促方式、氧化置换和螯合。修饰可用于，例如连接用于免疫测试的标签，诸如连接用于放射性免疫测试的放射性部分。修饰的多肽利用本领域建立的程序制备并且可利用本领域已知的标准测试筛选。
在一种实施方式中，提供了包含轻链、重链或者轻链和重链两者的融合多肽。在另一实施方式中，融合多肽包含异源免疫球蛋白恒定区。在另一实施方式中，融合多肽包含从表面上沉积的杂种瘤中生产的抗体的VH和VL结构域。为了本发明的目的，抗体融合蛋白包含能使蛋白质免疫特异性地结合CD16和疾病抗原两者的多肽结构域，并且其包含天然分子中未连接到其上的另一氨基酸序列，例如来自另一区的异源序列或同源序列(例如，去免疫化白蛋白-结合结构域、蛋白A识别序列、肽标签等)。
本发明特别地涵盖缀合到诊断或治疗部分的这种结合分子(例如，抗体、双抗体、三价结合分子等)。为了诊断目的，本发明的结合分子可被偶联到可检测物质。这种结合分子可用于监测和/或预后疾病的发展或进展作为临床测试程序的部分，诸如测定特定疗法的功效。可检测物质的实例包括各种酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)、辅基(例如，抗生物素蛋白/生物素)、荧光物质(例如，伞形酮、荧光素、或藻红蛋白)、发光物质(例如，鲁米诺)、生物发光物质(例如，荧光素酶或发光蛋白质)、放射性物质(例如，碳14、锰54、锶85或锌65)、正电子发光金属、和非放射性顺磁金属离子。可检测物质可被利用本领域已知的技术直接地或者通过中间体(例如连接体)间接地偶联或缀合至结合分子。
为了治疗目的，本发明的结合分子可被缀合至治疗部分，诸如细胞毒素(例如，细胞静止剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子，例如、α-发射剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂，诸如，例如假单胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素A至F、篦麻毒素、相思豆毒素、皂草素、和这种试剂的细胞毒素片段。治疗剂包括具有治疗效果以预防性地或治疗性地治疗障碍的任何试剂。这种治疗剂可以是化学治疗剂、蛋白质或多肽治疗剂，并且包括具有期望的生物学活性和/或改变给定的生物学应答的治疗剂。治疗剂的实例包括烷基化剂、血管生成抑制剂、抗有丝分裂剂、激素治疗剂和可用于治疗细胞增生性障碍的抗体。治疗部分可被利用本领域已知的技术直接地或者间接地通过中间体(例如连接体)偶联或缀合至结合分子。
IX.本发明的结合分子的用途
如上所讨论，能够结合CD16和疾病抗原的分子能够介导靶细胞(即，癌细胞或病原体感染细胞)的重定向的细胞杀伤，所述靶细胞(即，癌细胞或病原体感染细胞)在其细胞表面上表达这种疾病抗原。这种分子可用于治疗目的，例如在患有癌症或感染的受试者中。因此，本发明的结合分子具有治疗在这种靶细胞的表面上与疾病抗原(尤其癌抗原或病原体相关抗原)的表达相关或特征在于疾病抗原(尤其癌抗原或病原体相关抗原)的表达的任何疾病或病况的能力。因此，没有限制地，本发明的结合分子可用于治疗癌症，尤其特征在于表达癌抗原的癌症。本发明的结合分子可用于治疗感染，尤其特征在于表达病原体相关抗原的感染。
具体地，本发明涵盖这样的方法，其中所述能够结合CD16的分子包含能够结合CD16的抗体的表位-结合结构域并且也包含能够结合靶细胞表上的疾病抗原(具体地，癌抗原或病原体相关抗原)的表位-结合结构域以便介导靶细胞的重定向的杀伤(例如，通过介导重定向的细胞杀伤(例如，重定向的T细胞或重定向的NK细胞细胞毒性))。
在具体实施方式中，能够结合CD16和疾病抗原的分子是双特异性抗体、或其结合部分、(包括scFv)、BiTe、TandAb和CAR。
在具体实施方式中，能够结合CD16和疾病抗原的分子是双特异性双抗体。
在具体实施方式中，能够结合CD16和疾病抗原的分子是三价结合分子。
如本文所用，术语“提供治疗(providing a therapy)”和“治疗(treating)”是指与任何有利或期望结果的指征相关的组合物的任何施用，所述结果包括但不限于任何临床结果，诸如减少疾病所引起的症状；减轻感染的症状(例如，病毒载量、发烧、疼痛、脓毒症等)；肿瘤(在癌症背景下，例如乳腺癌、胃癌或前列腺癌的肿瘤)尺寸的缩小；癌症细胞生长的减缓；转移的开始、形成或进展的延迟；疾病所引起的症状的减少；受体受试者生活质量的增加；提供以治疗受试者疾病的其它药物剂量的减少；另一药物效果诸如经由靶向和/或内化的增强；疾病进展的延迟；和/或受试者存活的延长。
用于治疗的受试者包括动物，最优选地哺乳动物物种，诸如非灵长类(例如，牛、马、猫、犬、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴，人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。
可通过本发明的各种实施方式治疗的示例性障碍包括但不限于增生性障碍、细胞增殖性障碍、和癌症(尤其是表达由能够介导重定向细胞杀伤的分子所结合的癌抗原的癌症)、病原体相关的疾病(尤其是与由能够介导重定向细胞杀伤的分子所结合的病原体相关抗原的表达相关的慢性病毒感染)。在各种实施方式中，本发明涵盖用于治疗、预防或管理受试者中的疾病或障碍的方法或组合物，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的结合分子。这种分子尤其可用于预防、抑制、减少原发肿瘤的生长或进展和肿瘤的转移，以及用于减少病原体载量或消除病原体感染细胞。尽管不意欲受特定作用机理的束缚，但是这种分子可介导针对靶细胞的效应子功能、促进免疫系统对靶细胞的激活、使细胞表面抗原和/或受体交联在靶细胞上和增强细胞凋亡或负增长调节信号、或其组合，导致靶细胞的清除和/或数量减少。
可以由本发明的分子和由本发明的方法治疗的癌症包括但不限于：肾上腺癌，包括但不限于：嗜铬细胞瘤或肾上腺皮质癌；艾滋病相关癌症；腺泡状软组织肉瘤；星形细胞瘤；基底癌；膀胱癌，包括但不限于，移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌或癌肉瘤；骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于，骨瘤(bone sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨的纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma)(血管内皮瘤(hemangiosarcoma))、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、或滑膜肉瘤；脑癌，包括但不限于，神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非胶质瘤(nonglial tumor)、听神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体瘤、成松果体细胞瘤、或原发性脑淋巴瘤；脑和脊髓癌；乳腺癌，包括但不限于，腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特氏病、或炎性乳腺癌；颈动脉体瘤；宫颈癌，包括但不限于，鳞状细胞癌或腺癌；胆管癌，包括但不限于，乳头状、结节性、或弥漫性胆管癌；软骨肉瘤；脊索瘤；嫌色性肾细胞癌；透明细胞癌；结肠癌；结直肠癌；皮肤良性纤维组织细胞瘤；促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；室管膜瘤；眼癌，包括但不限于，眼黑色素瘤诸如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、和睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；食道癌，包括但不限于，鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；尤文氏瘤；骨外粘液样软骨肉瘤；骨纤维生成不良；骨纤维异常增殖症；胆囊癌或胆管癌，包括但不限于，腺癌；胃癌；妊娠滋养细胞疾病；生殖细胞瘤；头颈癌；肝细胞癌；重链疾病；胰岛细胞瘤；卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)；白血病，包括但不限于急性白血病；急性淋巴细胞性白血病；急性髓细胞样白血病，诸如，但不限于成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病白血病或骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于，慢性髓细胞(粒细胞)样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；脂肪瘤/良性脂肪瘤；脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤；肝癌，包括但不限于，肝细胞癌或肝母细胞癌；淋巴瘤，例如但不限于，霍奇金病(Hodgkin’s disease)；非霍奇金病；肺癌，包括但不限于，非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌或小细胞肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；脑膜瘤；良性单克隆丙种球蛋白病；一种意义不明的单克隆丙种球蛋白病；多发性内分泌腺瘤；多发性骨髓瘤、例如但不限于，郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；骨髓增生异常综合征；神经母细胞瘤；神经内分泌肿瘤；口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；卵巢癌，包括但不限于，卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤、和间质瘤；胰腺癌，包括但不限于，胰岛瘤、促胃液素瘤、高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长激素抑制素-分泌瘤、或良性肿瘤或胰岛细胞瘤；甲状旁腺肿瘤；儿科癌症；阴茎癌(penal cancer)；外周神经鞘肿瘤；嗜铬细胞瘤；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌、或疣状癌；垂体腺癌，包括但不限于，库欣病(Cushing’sdisease)、催乳激素-分泌肿瘤；肢端肥大症、或尿崩症肿瘤(diabetes insipius tumor)；前列腺癌，包括但不限于，腺癌、平滑肌肉瘤、或横纹肌肉瘤；真性红细胞增多症；后葡萄膜黑色素瘤(posterious uveal melanoma)；罕见血液病；肾癌，包括但不限于，腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、肾转移性癌、或移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；横纹肌样瘤；横纹肌肉瘤；唾腺癌，包括但不限于，腺癌、黏液表皮样癌、或腺样囊性癌；肉瘤；皮肤癌，包括但不限于，基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、小痣恶性黑色素瘤或肢端黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；胃癌，包括但不限于，腺癌，真菌样(息肉型)、溃疡型、浅表扩散性、弥漫扩散性、或恶性淋巴瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤，和癌肉瘤；滑膜肉瘤；睾丸癌，包括但不限于，胚组织瘤，精原细胞瘤，退行发育性、经典的(典型的)、精母细胞性、非精原细胞瘤，胚胎性癌，畸胎癌，或绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌，诸如但不限于，乳头状或滤泡性甲状腺癌、转移性甲状腺癌、甲状腺髓样癌或未分化甲状腺癌；子宫癌，包括但不限于，子宫内膜癌或子宫肉瘤；阴道癌，包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌或黑色素瘤；外阴癌，包括但不限于，鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤、或佩吉特病；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
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macroglobulinemia)；或维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(对于这些疾病的综述，参见Fishman等,1985,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia和Murphy等.,1997,InformedDecisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery,VikingPenguin,Penguin Books U.S.A.,Inc.)。
具体地，本发明的结合分子可用于治疗肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肾癌、非小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾细胞癌、睾丸癌和子宫癌。
可通过本发明的CD16结合分子治疗的病原体-相关疾病包括慢性的病毒性、细菌性、真菌性和寄生虫性的感染。可通过本发明的CD16结合分子治疗的慢性感染包括爱泼斯坦-巴尔病毒、甲型肝炎病毒(HAV)；乙型肝炎病毒(HBV)；丙型肝炎病毒(HCV)；疱疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、HHV-6、CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水泡性口炎病毒(VSV)、杆菌(Bacilli)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、霍乱(Cholera)、白喉(Diphtheria)、肠杆菌属(Enterobacter)、淋球菌(Gonococci)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningococci)、分枝杆菌(mycobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肺炎球菌属(Pneumonococci)、立克次氏体细菌(rickettsia bacteria)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、破伤风(Tetanus)、曲霉属(Aspergillus)(烟曲霉、黑曲霉等)、皮肤芽孢杆菌(Blastomyces dermatitidis)、念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌等(tropicalis)等)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(毛霉菌(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、钩端螺旋体病(Leptospirosis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、寄生蠕虫病(helminthparasite)(钩虫、绦虫、吸虫、扁虫(例如血吸虫(Schistosomia))、贾第虫(Giardialambia)、旋毛虫(trichinella)、脆双核阿米巴(Dientamoeba Fragilis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)和杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani))。
X.药物组合物
本发明涵盖包括能够结合CD16并且也能够结合至疾病抗原的分子的组合物。本发明的组合物包括可用于制备药物组合物的原料药组合物(例如，不纯或非灭菌的组合物)和可以以单位剂型的制剂使用的药物组合物(即，适合于施用至受试者或患者的组合物)。这种组合物包括预防或治疗有效量的能够结合CD16并且也能够结合至疾病抗原以便能够介导靶细胞(例如，癌症细胞、病原体感染细胞等)的重定向的杀伤的分子，或者这种试剂和药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的结合分子和药学上可接受的载体。在优选的方面，这种组合物是基本上纯化的(即，基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。
这种组合物的各种制剂可用于施用。除了药理活性剂之外，本发明的组合物可包含合适的药学上可接受的载体(包括赋形剂和辅料)，其是本领域熟知的并且其是有助于药学有效物质的施用或者有助于将活性化合物加工成可药学上用于递送至作用位点的制剂的相对惰性物质。例如，赋形剂可给予形状或稠度、或者充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变渗透压的盐、胶囊化剂、缓冲剂、和皮肤渗透增强剂。
在具体实施方式中，术语“药学上可接受的”指获得联邦政府或州政府管理机构的许可或列于美国药典或其他通常获得认可的药典中，用于动物，特别是用于人类。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介。通常，本发明组合物的成分被单独提供或以单位剂型的形式混合在一起，例如作为标明活性剂量的气封容器(如安瓿或袋(sachette))中的冻干粉或无水浓缩物。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌的药物级水或生理盐水(saline)的输注瓶分配。当通过注射施用所述组合物时，则可以提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿，以便可以在施用前混合所述成分。
本发明也提供了药物包(pack)或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充有单独的本发明的结合分子或填充有本发明的结合分子与这种药学上可接受的载体。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防或治疗的试剂也可包括在药物包或试剂盒中。本发明也提供了这样的药物包或试剂盒，其包括一个或多个容器，所述容器填充有本发明药物组合物中的一种或多种成分。任选地与这类容器关联的可以是以由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告示(notice)，所述告示反映了管理机构许可制造、使用或销售，供人类施用。
本发明提供可用于上述方法的试剂盒。试剂盒可包括本发明的结合分子中的任一种。试剂盒还可在一个或多个容器中包括用于治疗癌症的一种或多种其他预防和/或治疗的试剂。
XI.施用方法
本发明的组合物可提供为通过向受试者施用有效量的本发明的CD16 x DA药物组合物，用于治疗、预防和改善与疾病、障碍或感染相关的一种或多种症状。在优选的方面中，这类组合物是基本上纯的(即基本上不含限制其效果或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物，如非灵长类(例如牛科动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。
施用本发明的CD16 x DA结合分子或药物组合物的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服路径)。在具体实施方式中，肌内、静脉内或皮下施用本发明的结合分子。可通过任何方便的路径，例如通过输注或弹丸注射、通过经上皮或粘膜皮肤保护层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，施用所述组合物，并且所述组合物可与其他生物活性试剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本发明也提供了本发明的结合分子的制剂被包装在指示分子的数量的气密密封容器，如安瓿或袋中。在一个实施方式中，这种分子作为干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物提供在气密密封容器中并且可以例如用水或生理盐水重构至适当的浓度，以施用至受试者。优选地，本发明的结合分子作为干燥无菌的冻干粉末提供在气密密封容器中。
本发明的结合分子的冻干制剂应在它们的初始容器中储存在2℃和8℃之间并且该分子应在重构之后的12小时内、优选地6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内施用。在可替选的实施方式中，这种分子以液体形式提供在指示分子、融合蛋白或缀合分子的数量和浓度的气密密封容器中。优选地，液体形式提供的这种结合分子提供在气密密封的容器中。
可通过标准临床技术确定本发明的这种制剂有效治疗、预防或改善与障碍相关的一种或多种症状的量。制剂中采用的精确剂量也取决于施用的路径和病症的严重性，并且应根据医师的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线外推。
如本文使用的，药物组合物的“有效量”是足够实现有益的或期望的结果的量，所述结果包括但不限于临床结果，如减轻疾病引起的症状、缓解感染的症状(例如，病毒载量、发烧、疼痛、败血症等)或癌症的症状(例如癌症细胞的增殖、肿瘤存在、肿瘤转移等)，从而提高患有该疾病的那些人的生活质量、减少治疗该疾病需要的其它药物的剂量、增强另一药物治疗的效果(诸如经靶向和/或内化)、延迟疾病的进展、和/或延长个体的存活。当应用于单个活性成分、单独施用时，该术语是指单独这个成分。当应用于组合时，该术语是指无论组合地、连续地或者同时地施用，导致治疗效果的活性成分的组合量。
有效量可在一次或多次施用中施用。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是这样的量：其足以直接地或间接地杀死癌症细胞和/或减少癌症细胞的增殖，和/或消除、减少和/或延迟从癌症原发部位转移的发展；或降低传染性病原体的增殖(或效果)和降低和/或延迟病原体介导的疾病的发展。在一些实施方式中，药物、化合物或药物组合物的有效量可以结合或不结合另一药物、化合物或药物组合物而实现。因此，“有效量”可在施用一种或多种化疗剂的背景下考虑，并且如果结合一种或多种其他试剂，期望的结果可以实现或被实现，则可以考虑以有效量给予单一试剂。尽管个体需求不同，但是确定每个组分的有效量的最佳范围在本领域技术人员的技能范围内。
对于本发明涵盖的结合分子，优选基于接收受试者的体重(kg)确定施用至患者的剂量。对于本发明涵盖的结合分子，施用至患者的剂量通常是约0.01μg/kg受试者的体重至约30mg/kg受试者的体重、或更高。
可通过修饰、比如例如脂质化增强所述分子的吸收和组织渗透而降低或改变施用本发明的结合分子的剂量和频率。
可计算用作单一试剂疗法的施用至患者的本发明的结合分子的剂量。可替选地，所述分子可以结合其它治疗性组合物使用，并且施用至患者的剂量小于当所述分子用作单一试剂疗法时使用的剂量。
本发明的药物组合物可局部施用至需要治疗的区域；这可通过例如且无限制性地局部输注、通过注射或者通过移植物实现，所述移植物是多孔的、无孔的或胶状的材料，其包括膜，诸如
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膜，或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用所述分子不吸附至其上的材料。
本发明的组合物可以在囊泡、尤其脂质体中递送(参见Langer(1990)“NewMethods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等,in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327)。
利用治疗或预防有效量的本发明的结合分子治疗受试者可包括单次治疗，或优选地可包括一系列治疗。在优选的实例中，用本发明的药物组合物治疗受试者约1至10周之间，优选地2至8周之间，更优选地约3至7周之间，甚至更优选地约4周、5周或6周。本发明的药物组合物可以施用每天一次，其中这种施用一周发生一次、一周发生两次、每两周发生一次、一月发生一次、每六周发生一次、每两月发生一次、一年发生两次或一年发生一次等。可替选地，本发明的药物组合物可以施用一天两次，其中这种施用一周发生一次、一周发生两次、每两周发生一次、一月发生一次、每六周发生一次、每两月发生一次、一年发生两次或一年发生一次等。可替选地，本发明的药物组合物可以施用一天三次，其中这种施用一周发生一次、一周发生两次、每两周发生一次、一月发生一次、每六周发生一次、每两月发生一次、一年发生两次或一年发生一次等。也将认识到用于治疗的分子的有效剂量可随着特定治疗过程的推移而增加或减少。
实施例
已经总体上描述了本发明之后，通过参考下列实施例将更容易理解本发明，下列实施例通过例证的方式提供并且不意欲限制本发明，除非指明。
实施例1
CD16结合分子的表征
如上所讨论，产生了一系列
Figure BDA0002532907060001402
双抗体CD16 x DA结合分子，其并入了不同的鼠、人源化或优化抗CD16结合结构域并且具有对下列任一种免疫特异性的结合结构域：(1)HER2/neu肿瘤抗原(来自曲妥珠单抗的结合结构域)、(2)对HIV抗原免疫特异性的结合结构域(来自A32或7B2的结合结构域)、(3)CD19 B-细胞抗原(来自CD19 mAb1的结合结构域)或(4)对RSV抗原免疫特异性的结合结构域(来自帕利珠单抗的结合结构域)(表14)。
Figure BDA0002532907060001401
Figure BDA0002532907060001411
用两链双抗体(DART-X、DART-Y和DART-0)(包括鼠抗体CD16-M1、鼠抗体CD16-M2、人源化抗体3G8和两种普遍可商购的抗体：LNK16和DJ130c(Abcam等))进行竞争研究。进行ProteOn分析以评定测试制品与已经固定在芯片上的CD16分子的结合。CD16分子首先用捕获的5nM CD16-Fc(人IgG2)融合蛋白孵育，接着用10nM第一测试制品(测试制品1)孵育，接着用10nM第二测试制品(测试制品2)孵育。利用抗人Fc F(ab’)2片段检测结合。
该研究揭示CD16-M1、CD16-M2、LNK16和3G8结合结构域各自结合CD16的不同表位。CD16-M2被发现与用于结合CD16的抗体DJ130c竞争；DJ130c已经被报道在与CD16的Fc结合位点不重叠的位点结合CD16(Tamm,A.等(1996)“The Binding Epitopes Of Human CD16(Fc Gamma RIII)Monoclonal Antibodies.Implications For Ligand Binding,”J.Immunol.157(4):1576-1581；Tamm,A.等(1996)“The Igg Binding Site Of HumanFcgammaRIIIB Receptor Involves CC'And FG Loops Of The Membrane-ProximalDomain,”J.Biol.Chem.271(7):3659-3666)。
对CD16-M1、DJ130c和LNK16在IgG存在下结合CD16A的能力进行评价。发现IgG存在抑制NK16的结合，但是IgG存在不抑制CD16和CD16-M1之间的结合，并且CD16-M1不受IgG存在的抑制，而L则相反。3G8表位已经被报道与CD16的Fc结合位点重叠(Tamm,A.等(1996)J.Biol.Chem.271(7):3659-3666)。
增加人IgG(hIgG)的浓度降低抗体LNK16至CD16的结合，因此表明被LNK16识别的表位与CD16的Fc结合位点重叠；相反，通过DJ130c或CD16-M1的CD16结合结构域的结合基本上不受影响，因此表明被这些分子识别的CD16表位不与CD16的Fc结合位点重叠(图8)。
如上所讨论，CD16A具有两种主要的同种异型，反映了158F对158V多态性。如表15所示，CD16-M1和CD16-M2的CD16结合结构域被发现以类似的高亲和力结合至两种CD16同种异型(比h3G8好大约3-25倍，其相对于CD16 158V同种异型，具有对CD16 158F同种异型10倍低的亲和力。h3G8的结合结构域被发现呈现快的解离率(off-rate)。利用
Figure BDA0002532907060001422
格式进行分析，其中双抗体分子被捕获在山羊(Fab’)2抗人Fc表面上，并且人CD16A V/F分子(用Avitag标记)越过(passed over)捕获的双抗体(标准化；1:1结合拟合)。
Figure BDA0002532907060001421
Figure BDA0002532907060001431
进行ProteOn分析以评估所构建的双抗体的CD16结合结构域对已经固定在芯片上的CD16-His标记的分子(R&D Systems)的结合。CD16分子经由抗PentaHis抗体固定，然后用双抗体孵育。CD16结合研究的结果被汇总在表16中(DART-Z的CD16结合结构域衍生自scFv4-LS21，其对CD16A是特异性的)。
Figure BDA0002532907060001432
Figure BDA0002532907060001441
结果表明包含CD16-M1或CD16-M2CD16结合结构域的双抗体对CD16A的两个等位基因都呈现较高的亲和力并且与比较分子相比呈现较高的亲和力。包含hCD16-M2(VH1)CD16结合结构域的双抗体相比包含hCD16-M2(VH2)CD16结合结构域的双抗体呈现稍微更好的结合(比较DART-D与DART-E)。
实施例2
DART-F和DART-G CD16结合分子对NK细胞、嗜中性粒细胞和T细胞的结合
为了证明本发明的CD16 x DA结合分子结合CD16的能力，供体受试者的全血在CD16结合双抗体的存在下进行孵育：DART-F和DART-G、HIV x CD3双抗体(作为经由其CD3结合结构域的T细胞结合的阳性对照)、HIV x RSV双抗体(作为对于所有结合的阴性对照)和h3G8 x RSV双抗体比较分子。孵育后，细胞用下列进行标记：抗CD56-别藻蓝蛋白(CD56APC，NK细胞标记物)、抗CD66b-异硫氰酸荧光素(CD66b FITC，嗜中性粒细胞标记物)和抗CD3-多甲藻叶绿素蛋白-Cy5.5(CD3 PerCP Cy5.5，T细胞标记物)和抗人Fc-藻红蛋白(αhFcPE)，以检测双抗体结合和细胞表面。标记的细胞通过对NK细胞设门的流式细胞仪进行分析。对第一受试者研究的共染色结果显示在图9A-9C中，并且表明DART-F(hCD16-M1)相对于DART-G(hCD16-M2)在NK细胞表面上对CD16A具有更高的亲和力，这两者相比h3G8 x RSV双抗体比较分子均具有较高的亲和力(图9A)。相反，尽管h3G8 x RSV双抗体比较分子能够结合嗜中性粒细胞的CD16B，但DART-G具有较低的结合能力并且DART-F基本上没有结合能力(图9B)。如图9C所示，CD16结合分子不能够结合至T细胞。
利用第二供体受试者的全血观察到类似的结合。淋巴细胞结合(CD16A F/V)和嗜中性粒细胞结合(CD16B，未确定的同种异型)基本上如所描述的利用DART-F(hCD16-M1)、DART-G(hCD16-M1)和h3G8 x RSV双抗体比较物进行评价。研究结果显示在图10A-10B中。如图10A所示，DART-F(hCD16-M1)和DART-G(hCD16-M1)两者呈现对设门的淋巴细胞群的CD16A表达细胞的结合，其中DART-F呈现较大的结合；h3G8 x RSV双抗体比较分子呈现较弱的结合。如图10B所示，与均呈现结合的DART-G和h3G8x RSV双抗体比较分子相反，DART-F不能够结合设门的淋巴细胞系的CD16B表达细胞。
实施例3
抗CD16结合分子CD16-M1和CD16-M2的CD16B同种异型特异性
为了证明本发明的CD16 x DA结合分子区分CD16B的糖基化同种异型NA1和NA2的能力，DART-F(hCD16-M1)和h3G8 x RSV双抗体比较物在全血存在下进行孵育并且基本上如上所述进行分析。结果示出已经对CD66b+细胞(即嗜中性粒细胞和嗜酸粒细胞)设门的全血的双抗体染色。图11A-11B显示这种分析的结果，并且表明h3G8x RSV双抗体比较物呈现对NA1的强结合和对NA2的中等结合。相反，DART-F呈现对NA2的强结合和对NA1的弱结合。
实施例4
CD16结合分子CD16-M1和CD16-M2的CD16B同种异型特异性
为了进一步评估本发明的CD16 x DA结合分子结合白细胞的能力，对CD16-M1的CD16结合结构域结合来自全血的NK细胞和粒细胞的能力进行评价。DART-C在全血白细胞的存在下进行孵育并且基本上如上所述进行分析。结果示出已经对NK细胞(0.6％的白细胞)或粒细胞(49％的白细胞)设门的全血的双抗体染色。图12显示这种分析的结果，并且表明CD16-M1优先结合至NK细胞。
实施例5
CD16结合分子对人CD16、食蟹猴CD16和鼠CD16的结合
因为人CD16、食蟹猴CD16和鼠CD16的氨基酸序列享有不同程度的同源性(图13；分别地SEQ ID NOs:183、184和185)，所以研究了具有抗体CD16-M1、CD16-M2和3G8的CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子结合至人CD16、食蟹猴CD16和鼠CD16的能力。利用
Figure BDA0002532907060001462
格式进行分析，其中双抗体分子被捕获在Her2-His-标签表面上并且CD16分子(IgG2-Fc融合蛋白，25nM和100nM)越过捕获的双抗体(标准化；二价结合拟合估计)。研究的结果汇总在表17中。
Figure BDA0002532907060001461
h3G8的CD16结合结构域被发现能够结合食蟹猴的CD16a，其中相对于其与人CD16a的结合亲和力略微下降。DART-C(hCD16-M1)和DART-D(hCD16-M2)的CD16结合结构域被发现对食蟹猴CD16具有低的亲和力。所测试的CD16结合分子中没有一个被发现能够结合至鼠CD16，与其对人CD16的较低同源性相应。
实施例6
CD16结合分子介导的HER2/Neu阳性细胞的细胞毒性的评价
为了证明本发明的CD16 x DA结合分子介导细胞杀伤的能力，CD16 x HER2/neu结合分子:
DART-C(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)；
DART-D(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)；
DART-1(具有h3G8 CD16结合结构域)；
或HER2/Neux RSV双抗体(阴性对照)在效应细胞(人PBMC(E:T＝30:1)或纯化的人NK细胞(E:T＝2:1))的存在下分别以表达不同水平的HER2/neu的靶癌细胞孵育24小时。通过测量损伤细胞引起的乳酸脱氢酶(LDH)到介质中的释放测定细胞毒性(即，重定向的细胞杀伤)百分比，基本上如下所述。该研究的结果显示在图14A-14E中。图14A显示由纯化的NK细胞对N87 HER2/neu靶细胞所呈现的细胞毒性((HER2/neu表达：+++)；这种NK细胞的CD16A同种异型是158F/158F。图14B显示由纯化的NK细胞对MCF7 HER2/neu靶细胞所呈现的细胞毒性(HER2/neu表达：+/-)。图14C显示由PBMCs对MDA-MB-231HER2/neu靶细胞所呈现的细胞毒性(HER2/neu表达：+/-)；未评价这种PBMC制剂的NK细胞的CD16A同种异型。图14D显示由PBMCs对N87HER2/neu靶细胞所呈现的细胞毒性(HER2/neu表达：+++)；这种PBMC制剂的NK细胞的CD16A同种异型是158F/158V。图14E显示由PBMCs对Hs700T HER2/neu靶细胞所呈现的细胞毒性(HER2/neu表达：+/-)；这种PBMC制剂的NK细胞的CD16A同种异型是158F/158V。结果表明包含hCD16-M1 CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子相比包含hCD16-M2 CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子对HER2/neu-表达癌症细胞呈现更大的细胞毒性；并且包含这种CD16结合结构域的分子相比包含h3G8CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子呈现更大的细胞毒性。
实施例7
CD16结合分子介导的对HIV-感染细胞的细胞毒性的评价
为了进一步证明本发明的CD16 x DA结合分子介导细胞杀伤的能力，CD16 x HIVenv结合分子:
DART-F(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)；
DART-G(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)；
或DART-2(h3G8 x RSV双抗体，在这里被用作阴性对照))在效应细胞(人PBMC(E:T＝30:1)或纯化人NK细胞(E:T＝3:1)的存在下分别用表达HIV Env的靶293HEK D371孵育24小时。使用LDH重定向的细胞杀伤试验，通过测量损伤细胞引起的乳酸脱氢酶(LDH)到介质中的释放测定细胞毒性(即，重定向的细胞杀伤)百分比，基本上如下所述。该研究的结果显示在图15A-15C中。图15A显示由第一供体的PBMC对293HEK D371靶细胞所呈现的细胞毒性；这种PBMC制剂的NK细胞的CD16A同种异型是158F/158V。图15B显示由第二供体的PBMC对293HEK D371靶细胞所呈现的细胞毒性；这种PBMC制剂的NK细胞的CD16A同种异型是158F/158V。图15C显示由纯化的NK细胞对293HEK D371靶细胞MC所呈现的细胞毒性；NK细胞的CD16A同种异型是158F/158V。结果再次表明，包含hCD16-M1 CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子相比包含hCD16-M2 CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子对HIV env表达细胞呈现更大的细胞毒性。
如上所示，DART-F和DART-G均是由三条多肽链构成的含Fc结构域的双抗体。为了证明本发明的缺少Fc结构域的CD16 x DA结合分子介导细胞杀伤的能力，CD16x HIV env结合分子:
DART-X(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)；
DART-Y(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)；
DART-0(具有h3G8 CD16结合结构域)；
或DART-3(具有hCD16-M1 CD16结合结构域的CD16 x RSV双抗体，在这里被用作阴性对照)在效应细胞(Jurkat/CD16A 158F(图16A)或158V/NFAT-Luc细胞(图16B))的存在下分别用表达HIV env蛋白的靶HEK/D371细胞孵育。利用LDH重定向的细胞杀伤试验通过测量损伤细胞引起的乳酸脱氢酶(LDH)到介质中的释放测定细胞毒性(即，细胞杀伤)百分比，基本上如下所述。该研究的结果显示在图16A-16B中。
图16A-16B显示DART-X(具有hCD16-M1 CD16结合结构域)呈现比DART-Y(具有hCD16-M2 CD16结合结构域)更大的细胞毒性百分比。DART-0(具有h3G8 CD16结合结构域)发现比DART-Y介导更高水平的细胞毒性，但是该效果取决于具有158V同种异型的效应细胞(图16A与图16B)。相反，DART-X或DART-Y所介导的细胞毒性不依赖于CD16A同种异型(图16A与图16B)。
实施例8
与非人灵长类CD16结合的优化
如上所示，hCD16-M1被发现对食蟹猴CD16(cynoCD16)具有低的亲和力。随机诱变被用于在hCD16-M1的CDRL3(Kabat位置90-95)和CDRH3(Kabat位置96-100)结构域内引入置换。对突变体进行筛选以鉴定对非人灵长类CD16(例如，cynoCD16)具有增强的结合并且对人CD16的两个等位基因保持结合亲和力的克隆。选择被命名为“hCD16-M1A”的具有突变的CDRH3的变体和被命名为“hCD16-M1B”的具有突变的CDRL3的变体用于进一步分析。此外，生成组合CDRH3和CDRL3突变的第三变体并且将其命名为“hCD16-M1AB”。CDR以及VH和VL结构域的氨基酸序列已经提供在上面(参见，例如表8)。生成示例性的CD16 x DA结合分子，其并入了优化的抗CD16结合结构域：hCD16-M1A、hCD16-M1B或hCD16-M1AB，并具有抗HER2/neu结合结构域；并且将其分别命名为DART-I、DART-J和DART-K(对于总结参见表12并且对于详细描述和完整的氨基酸序列参见上面)。
包含优化的hCD16-M1A、hCD16-M1B和CD16-M1AB的示例性CD16 x HER2/neu结合分子用于结合在人(图17A)、食蟹猴(图17B)和猕猴(rhesus monkey)(图17C)的NK细胞的表面上表达的CD16的能力通过流式细胞仪进行检查。简言之，将PBMC分离并且在CD16-结合双抗体：DART-C(具有亲本hCD16-M1 VH和VL结构域)、DART-I、DART-J、DART-K(分别具有优化的hCD16-M1A、hCD16-M1B和hCD16-M1AB VH/VL结构域)、HER2/neu x RSV双抗体(作为用于CD16结合的阴性对照)、DART-3(具有亲本hCD16-M1 VH和VL结构域的CD16 x RSV双抗体对照)或DART-1(h3G8 x HER2/neu双抗体)比较分子的存在下孵育。孵育后，细胞用下列进行标记：抗CD56-别藻蓝蛋白(CD56 APC，NK细胞标记物)和抗CD3-多甲藻叶绿素蛋白-Cy5.5(CD3PerCP Cy5.5，T-细胞标记物)和抗人Fc-藻红蛋白(αhFc PE)，以检测双抗体结合和细胞表面。标记的细胞通过对NK细胞设门的流式细胞仪进行分析。
该研究的共染色结果显示在图17A-17C中并且显示包含优化变体尤其是hCD16-M1AB(DART-K)的CD16 x DA结合分子对非人灵长类CD16呈现提高的亲和力(图17B-17C)，尽管包含hCD16-M1B(DART-J)和hCD16-M1AB(DART-K)的分子在该试验中在与人CD16的结合方面呈现一些下降(图17A)。观察到阴性对照没有结合。
利用两种不同的重定向的细胞杀伤试验，评估具有优化的hCD16-M1A、hCD16-M1B、和hCD16-M1AB结合结构域的CD16 x DA结合分子与来自几个供体的人PBMCs(huPBMCs)或食蟹猴PBMC(cynoPBMCs)效应细胞一起介导JIMT-1-Luc靶细胞的重定向的细胞杀伤的能力。来自这些研究的代表性数据呈现在图18A-18D中，并且汇总在表18中。在两种试验中，DART-C(具有亲本hCD16-M1的VH和VL结构域)、DART-I、DART-J或DART-K(分别具有优化的hCD16-M1A、hCD16-M1B和hCD16-M1AB的VH/VL结构域)；阴性对照(HER2/neu x RSV双抗体或CD16 xRSV双抗体，DART-3)；或DART-1(h3G8 x HER2/neu双抗体)比较分子与以30:1的E:T比例的huPMBCs(图18A-18B)或cynoPBMCs(图18C-18D)和JIMT-1-Luc靶肿瘤细胞一起孵育并且测定细胞毒性(即，细胞杀伤)百分比。在一个试验中，利用LDH重定向的细胞杀伤试验通过测量损伤细胞引起的乳酸脱氢酶(LDH)到介质的释放测定细胞杀伤，基本上如上所述(图18A和18C)。在另一试验中，利用LUM重定向的细胞杀伤试验通过荧光(LUM)试验测量靶细胞的细胞荧光素酶活性测定细胞毒性，基本上如下所述(图18B和18D)。24小时和48小时孵育后LDH试验的EC50值(ng/mL)呈现在表18中。
Figure BDA0002532907060001501
这些数据表明，尽管包含hCD16-M1(DART-C)的CD16结合结构域的CD16 x DA结合分子以明显低的亲和力结合cynoCD16，但是它能够介导重定向的细胞杀伤。此外，与包含hCD16-M1的相同分子(DART-C)相比，包含优化的CD16结合结构域hCD16-M1A(DART-I)、hCD16-M1B(DART-J)或hCD16-M1AB(DART-K)的CD16 x DA结合分子与CynoPBMCs一起呈现提高的细胞毒性，而与huPBMCs一起呈现仅仅轻微的下降。
实施例9
CD16 x CD19结合分子
在进一步的研究中，生成了具有抗CD19结合结构域并且并入hCD16-M1的抗CD16结合结构域或者hCD16-M1B或hCD16-M1AB的优化的抗CD16结合结构域的示例性CD16 x DA结合分子，并且分别将其命名为DART-L、DART-M和DART-N(对于汇总参见表12并且对于详细描述和完整的氨基酸序列参见上面)。生成了三种另外的分子并且将其命名为DART-5(包含hCD16-M1)、DART-6(包含hCD16-M1A)和DART-7(包含hCD16-M1AB)，其中CD19结合结构域用抗RSV结合结构域替换(对于汇总参见表12并且对于详细描述参见上面)，这种示例性CD16x RSV结合分子在下面被用作用于CD19结合的阴性对照。
DART-L、DART-M和DART-N；对照分子：DART-5、DART-6和DART-7；或CD3 x CD19
Figure BDA0002532907060001511
双抗体duvortuxizumab(也被称为MGD011；在WHO Drug Information,2016,推荐的INN:列表116,30(4):627-629中发现的氨基酸序列)与人PBMCs(huPBMCs)效应细胞(E:T＝30:1)一起用于介导Raji-Luc靶细胞的重定向的细胞杀伤的能力在LDH和LUM细胞杀伤试验中进行评价，基本上如下所述。来自这些研究的代表性数据呈现在图19A-19D中。LDH试验的结果表明在24小时(图19A)和48小时(图19B)孵育后，CD16 x DA结合分子呈现与MGD011类似的细胞毒性活性，其中包含优化的CD16结合结构域hCD16-M1B(DART-M)或hCD16-M1AB(DART-N)的CD16 x DA结合分子相比包含hCD16-M1的相同分子(DART-L)与huPBMCs一起呈现类似的细胞毒性。在LUM试验中，24小时(图19C)和48小时(图19D)之后观察到类似结果。在这些研究中对于缺少CD19结合结构域的对照分子(DART-5、DART-6和DART-7)观察到最小的细胞毒性。
对于示例性CD16 x DA结合分子DART-L、DART-M、DART-N(具有对于B细胞抗原CD19的结合位点)和阴性对照：DART-5和DART-6(具有对于CD16的结合位点和对于RSV的结合位点)，评价其在体外介导自体B细胞消耗的能力。简言之，分离自人或食蟹猴的PMBCs在增加浓度的DART-L、DART-M、DART-N以及缺少CD19结合结构域的对照分子DART-5和DART-6的存在下在补充介质中进行孵育。对于huPBMCs来说在孵育后的72小时和96小时(分别地，图20A-20B)以及对于cynoPBMCs来说在孵育后的72小时和144小时(分别地，图20C-20D)通过流式细胞仪分析B细胞水平(将CD3用于阴性选择以及CD20用作B细胞标记物；CD3/CD20+)。这些研究的代表性数据呈现在图20A-20D中，并且表明所有CD16 x DA结合分子都能消耗来自huPBMCs(图20A-20B)和cynoPBMCs(图20C-20D)的自体B细胞。与包含hCD16-M1的相同分子(DART-L)相比，包含优化的CD16结合结构域hCD16-M1B(DART-M)或hCD16-M1AB(DART-N)的CD16 x DA结合分子与huPBMCs和cynoPBMCs两者一起介导B细胞更大的减少。然而，需要更大的浓度以消耗来自cynoPBMCs的B细胞。对于多个PBMC供体，观察到这一趋势。对于缺少CD19结合结构域的对照分子(DART-5和DART-6)，观察到最小的B细胞消耗。
实施例10
示例性重定向的细胞杀伤试验
LDH重定向的细胞杀伤试验：这些试验可以利用CytoTox
Figure BDA0002532907060001522
非放射性细胞毒性试验试剂盒(Promega)或者定量测量LDH释放的类似物进行，基本上如下所述。靶细胞(例如，肿瘤靶细胞)以4x105细胞/mL的密度(或者合适的密度以达到期望的E:T比)再悬浮在试验介质(例如，没有酚红的RPMI 1640，10％FBS，1％pen/strep)中，并且优选地，使用在试验开始时存活率高于90％并且以合适的密度(例如，4x105细胞/mL)悬浮在试验介质中以达到10:1或30:1的效应子对靶(E:T)细胞比例(或其它期望的E:T比)的分离的纯化效应细胞(例如，从人或非人灵长类(例如，食蟹猴)供体纯化的PBMC或NK细胞)。将靶细胞悬浮液的等分试样(例如，50μL，约20,000个细胞)、效应细胞悬浮液的等分试样(例如，100μL，对于10:1E:T比，约20,000个细胞)和连续稀释的测试制品(例如，5倍或10倍)的等分试样(例如，50μL)加入到微量滴定板的复制孔(duplicate wells)中并且孵育(37℃，含有5％CO2)24-96小时、或者更长时间，如果期望的话。在孵育结束时，将裂解溶液的等分试样(例如，30μL)加入并且将板孵育约10分钟以使靶细胞完全裂解。然后使板离心以将细胞碎片粒化(例如，212xg，5分钟)，并且将上清液的等分试样(例如，40μL)从试验板的各孔转移到平底ELISA板以及将LDH底物溶液的等分试样(例如，40μL)加入到各孔中。将板在黑暗中室温下孵育10-20分钟并且将终止液(Promega Cat#G183A)的等分试样(例如，40μL)加入。在Victor2Multilabel平板阅读器(Perkin Elmer#1420-014)或类似物上在490nm在1小时内测量光学密度。具体的的细胞裂解利用下式由光学密度(OD)数据进行计算：
Figure BDA0002532907060001521
其中，“AICC”是抗体非依赖性细胞毒性，“MR”是最大释放，并且“SR”是自发释放。剂量响应曲线利用GraphPad Prism 6软件(或类似物)通过将细胞毒性数值曲线拟合成S形剂量响应函数而产生。
发光(LUM)重定向的细胞杀伤试验：这些试验可利用Steady-Glo荧光素酶底物(Promega)或类似底物进行，并且在改造成表达荧光素酶(luc)报告基因的活靶细胞(例如，JIMT-1-Luc，Raji-Luc细胞)中定量测量细胞荧光素酶活性，基本上如下所述。用于这些试验的制剂和设置基本上与上述LDH试验相同。孵育后，培养基的等分试样(例如，100μL)从各孔去除并且将Steady-Glo荧光素酶底物((Promega)或类似物)的等分试样(例如，100μL)随后加入各孔，接着上下移液几次以使靶细胞完全裂解。板在黑暗中室温下孵育10分钟，然后利用VictorX4 Multilabel平板阅读器(Perkin Elmer#1420-014或类似物)测量发光强度，其中发光相对光单位(RLU)作为输出读出。RLU指示靶细胞的相对存活率。剂量响应曲线利用GraphPad Prism 6软件(或类似物)通过将RLU值曲线拟合成S形剂量响应函数而产生。
本说明书中提及的所有出版物和专利以相同的程度通过引用并入本文，如同每个出版物或专利申请被明确且单独地指出以其全部内容通过引用并入一样。尽管本发明已经结合其具体实施方式进行了描述，但是应当理解它能进一步改变，并且本申请意欲涵盖本发明的任何变化、应用或改编，其总体上遵循本发明的原理并且包括落入本发明所属领域内的已知或惯常实践内的并且可适用于前文所提出的实质特征的这种偏离。
序列表
<110> 宏观基因股份有限公司
Diedrich, Gundo
Liu, Liqin
Watson, Hua
Johnson, Leslie
<120> 双特异性CD16-结合分子及其在疾病治疗中的用途
<130> 1301.0153PCT
<150> US 62/597,800
<151> 2017-12-12
<160> 191
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 人IgG CL κ结构域
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> 人IgG CL λ结构域
<400> 2
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 3
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG1 CH1结构域
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 4
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG2 CH1结构域
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG3 CH1结构域
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 6
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG4 CH1结构域
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> 人IgG1铰链结构域
<400> 7
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 人IgG2铰链结构域
<400> 8
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(62)
<223> 人IgG3铰链结构域
<400> 9
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 人IgG4铰链结构域
<400> 10
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含稳定S228P置换的IgG4铰链结构域
<400> 11
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 示例性IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 12
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 13
<211> 216
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(216)
<223> 示例性IgG2 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (216)..(216)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 13
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 示例性IgG3 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 14
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 15
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(217)
<223> 示例性IgG4 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 15
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体1间隔肽
<400> 16
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 17
Gly Gly Cys Gly Gly Gly
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 18
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 19
Leu Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 20
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 22
Leu Glu Pro Lys Ser Ser
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体2含半胱氨酸间隔肽
<400> 23
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 含半胱氨酸异源二聚体-促进结构域
<400> 24
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 含半胱氨酸异源二聚体-促进结构域
<400> 25
Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 含半胱氨酸异源二聚体-促进结构域
<400> 26
Ala Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 含半胱氨酸异源二聚体-促进结构域
<400> 27
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 含半胱氨酸异源二聚体-促进结构域
<400> 28
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 29
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "E-螺旋"异源二聚体-促进结构域
<400> 29
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 30
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "K-螺旋"异源二聚体-促进结构域
<400> 30
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 31
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含半胱氨酸 "E-螺旋"异源二聚体-促进结构域
<400> 31
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含半胱氨酸 "K-螺旋"异源二聚体-促进结构域
<400> 32
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 33
<211> 46
<212> PRT
<213> 停乳链球菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(46)
<223> 链球菌菌株G148的蛋白G的白蛋白-结合结构域 3 (ABD3)
<400> 33
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌菌株G148的蛋白G的变体去免疫白蛋白-结合结构域 3 (ABD3)
<400> 34
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 35
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌菌株G148的蛋白G的变体去免疫白蛋白-结合结构域 3 (ABD3)
<400> 35
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 36
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌菌株G148的蛋白G的变体去免疫白蛋白-结合结构域 3 (ABD3)
<400> 36
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 37
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 38
Val Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 39
Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体肽
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv 连接体肽
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "长" 连接体肽
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体肽
<400> 43
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选连接体肽
<400> 44
Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 45
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 45
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 46
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有S442C置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 46
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 47
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A/S442C置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 47
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 48
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有M252Y/S254T/T256E置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 48
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 49
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 49
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 50
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/S442C置换的IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 50
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Cys Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 51
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "带有杵的"IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 51
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 52
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置换的"带有杵的"IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 52
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 53
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A置换的"带有臼的"IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 53
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 54
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置换的"带有臼的" IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 54
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215
<210> 55
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有M252Y/S254T/T256E置换的IgG4 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 55
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 56
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有M252Y/S254T/T256E置换的"带有杵的" IgG4 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 56
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 57
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有M252Y/S254T/T256E置换的"带有臼的" IgG1 CH2-CH3结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> Xaa是赖氨酸(K)或不存在
<400> 57
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1A的优化VH结构域
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gln Ser Ala Asn Ser Pro Val Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1B的优化VL结构域
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Tyr Thr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化抗人CD16单克隆hCD16-M1A和hCD16-M1AB的重链的CDR3
<400> 60
Gln Ser Ala Asn Ser Pro Val Pro Tyr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1B和hCD16-M1AB的人源化抗人CD16单克隆抗体的轻链的的CDR3
<400> 61
Gln Asp Tyr Thr Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 62
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16 mAb h3G8的VH结构域
<400> 62
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16 mAb h3G8的VL结构域
<400> 63
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 118
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体 CD16-M1的VH结构域
<400> 64
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体 CD16-M1的VH结构域
<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1、hCD16-M1A、hCD16-M1B和HCD16-M1AB的重链的CDR1
<400> 66
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1、hCD16-M1A、hCD16-M1B和HCD16-M1AB的重链的CDR2
<400> 67
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1和HCD16-M1B的重链的CDR3
<400> 68
Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr
1 5
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的人源化抗人CD16单克隆抗体的轻链的的CDR1
<400> 69
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His Val Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1、hCD16-M1A、hCD16-M1B和HCD16-M1AB的轻链的CDR2
<400> 70
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1和hCD16-M1A的轻链的CDR3
<400> 71
Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的人源化衍生物的VH结构域
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M1的人源化衍生物的VL结构域
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD16单克隆抗体hCD16-M1、hCD16-M1A、hCD16-M1B和HCD16-M1AB的轻链的CDR1
<400> 74
Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His Val Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(119)
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的VH结构域
<400> 75
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Lys Asn Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 鼠抗人CD16单克隆抗体CD16-M2的VL结构域
<400> 76
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Asp Ile Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的重链的CDR1
<400> 77
Ser Ser Ala Met His
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的重链的CDR2
<400> 78
Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的重链的CDR3
<400> 79
Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的轻链的CDR1
<400> 80
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的轻链的CDR2
<400> 81
Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> 抗人CD16单克隆抗体CD16-M2和hCD16-M2的轻链的CDR3
<400> 82
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 83
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体的VH结构域
hCD16-M2 VH1
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体的VH结构域
hCD16-M2 VH2
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗人CD16单克隆抗体的VL结构域
hCD16-M2 VL1
<400> 85
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗NKG2D单克隆抗体KYK-1.0的VH结构域
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Lys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Phe Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗NKG2D单克隆抗体KYK-1.0的VL结构域
<400> 87
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Pro Cys Gly Gly Asp Asp Ile Glu Thr Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asp Asp Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Phe Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Ser Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asp Asn Asn Asp Glu
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 88
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗NKG2D单克隆抗体KYK-2.0的VH结构域
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗NKG2D单克隆抗体KYK-2.0的VL结构域
<400> 89
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 90
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD2单克隆抗体CD2 mAb Lo-CD2a的VH结构域
<400> 90
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Lys Gln Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Ser Ile Asp Tyr Val Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Lys Phe Asn Tyr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD2单克隆抗体CD2 mAb Lo-CD2a的VL结构域
<400> 91
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Leu Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Thr Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Pro Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Phe
85 90 95
Thr His Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD8单克隆抗体OKT8的VH结构域
<400> 92
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Phe Arg Tyr Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD8单克隆抗体OKT8的VL结构域
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 94
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD8单克隆抗体TRX2的VH结构域
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD8单克隆抗体TRX2的VL结构域
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体的VH结构域B7-H3 mAb-B VH1
<400> 96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 97
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体的VH结构域B7-H3 mAb-B VH2
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体的VL结构域B7-H3 mAb-B VL1
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体的VL结构域B7-H3 mAb-B VL2
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 100
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体B7-H3 mAb-C的VH结构域
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体B7-H3 mAb-C的VL结构域
<400> 101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 102
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体B7-H3 mAb-D的VH结构域
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Tyr Arg Tyr Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体B7-H3 mAb-D的VL结构域
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 104
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体恩比利珠单抗的VH结构域
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人B7-H3单克隆抗体恩比利珠单抗的VL结构域
<400> 105
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CEACAM5 / CEACAM6单克隆抗体16C3的VH结构域
<400> 106
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Ser Gly Ser Arg Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CEACAM5 / CEACAM6单克隆抗体16C3的VL结构域
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Trp Gly Ala Ser Asn Leu Ala Asp Gly Met Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 108
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CEACAM5 / CEACAM6单克隆抗体hMN15的VH结构域
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ala Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Ala Asn Lys Ala Asn Gly His Thr Thr Asp Tyr Ser Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Asp Met Gly Ile Arg Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CEACAM5 / CEACAM6单克隆抗体hMN15的VL结构域
<400> 109
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Tyr Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 110
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的VH结构域
<400> 110
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 111
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人EGFR单克隆抗体西妥昔单抗的VL结构域
<400> 111
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人EGFR单克隆抗体帕尼单抗的VH结构域
<400> 112
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人EGFR单克隆抗体帕尼单抗的VL结构域
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 114
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb 1的VH结构域
<400> 114
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Lys His Gly Asn Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb 1的VL结构域
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 116
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb2的VH结构域
<400> 116
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 117
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb2的VL结构域
<400> 117
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 118
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb3的VH结构域
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Glu Ser Asp Arg Pro Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人EphA2单克隆抗体EphA2 mAb3的VL结构域
<400> 119
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser His Arg Ser Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Trp Ala Ser Thr Arg His Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Gly Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人gpA33单克隆抗体gpA33 mAb 1的VH结构域
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人gpA33单克隆抗体gpA33 mAb 1的VL结构域
<400> 121
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体玛格妥昔单抗的VH结构域
<400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体玛格妥昔单抗的VL结构域
<400> 123
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 124
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体曲妥珠单抗的VH结构域
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体曲妥珠单抗的VL结构域
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 126
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体帕妥株单抗的VH结构域
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 127
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人HER2/neu单克隆抗体帕妥株单抗的VL结构域
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 128
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗的VH结构域
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 129
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗的VL结构域
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 130
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人5T4单克隆抗体5T4 mAb 1的VH结构域
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Ala
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人5T4单克隆抗体5T4 mAb 1的VL结构域
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 132
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人5T4单克隆抗体5T4 mAb 2的VH结构域
<400> 132
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asn Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Thr Thr Val Val Asp Pro Asn Ser Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 133
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人5T4单克隆抗体5T4 mAb 2的VL结构域
<400> 133
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 134
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人IL13R(α)2单克隆抗体hu08的VH结构域
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Thr Thr Ala Leu Ala Thr Arg Phe Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人IL13R(α)2单克隆抗体hu08的VL结构域
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Ser Ala Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 136
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD123单克隆抗体CD123 mAb 1的VH结构域
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 137
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD123单克隆抗体CD123 mAb 1的VL结构域
<400> 137
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 138
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD19单克隆抗体CD19 mAb 1的VH结构域
<400> 138
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD19单克隆抗体CD19 mAb 1的VL结构域
<400> 139
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 140
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HIV env单克隆抗体7B2的VH结构域
<400> 140
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Phe Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser Pro Ser Ser
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu Gln Tyr Ile
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 141
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HIV env单克隆抗体7B2的VL结构域
<400> 141
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 142
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HIV env gp120单克隆抗体A32的VH结构域
<400> 142
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His Thr Ser Glu Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asn Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 143
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HIV env gp120单克隆抗体A32的VL结构域
<400> 143
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
85 90 95
His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 144
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕利珠单抗的抗RSV糖蛋白F单克隆抗体变体的VH结构域
<400> 144
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 145
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕利珠单抗的抗RSV糖蛋白F单克隆抗体变体的VL结构域
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 146
<211> 192
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(192)
<223> 人CD16A的158F异型的胞外结构域 (ECD)
<400> 146
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
<210> 147
<211> 192
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(192)
<223> 人CD16A的158V异型的胞外结构域 (ECD)
<400> 147
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
<210> 148
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(184)
<223> 人CD16B的NA1异型的胞外结构域 (ECD)
<400> 148
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Asn
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Val Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser
180
<210> 149
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(184)
<223> 人CD16B的NA2异型的胞外结构域 (ECD)
<400> 149
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Asn Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser
180
<210> 150
<211> 184
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(184)
<223> 食蟹猴的CD16的胞外结构域 (ECD)
<400> 150
Gly Met Arg Ala Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Arg Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Arg Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Ile Ala Ala Ala Arg
50 55 60
Val Asn Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Glu Ser Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Leu Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His Gln Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Asp Leu Ala Val Ser Ser Ile Ser
180
<210> 151
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-A"的第一多肽链
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Lys
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Asn Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
180 185 190
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ile Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val
225 230 235 240
Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 152
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-A"的第二多肽链
<400> 152
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 153
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子 "DART-A"的第三多肽链("共同的双抗体多肽链")
<400> 153
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 154
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-B"的第一多肽链
<400> 154
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Ser Ala Met His Trp Val Lys Lys Asn Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn
165 170 175
Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu
225 230 235 240
Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys
260 265 270
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys
<210> 155
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-B"的第二多肽链
<400> 155
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Asp Ile Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 156
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-C"的第一多肽链
<400> 156
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
180 185 190
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val
225 230 235 240
Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 157
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-C"的第二多肽链
<400> 157
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 158
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-D"的第一多肽链
<400> 158
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Ser Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn
165 170 175
Glu Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu
225 230 235 240
Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys
260 265 270
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys
<210> 159
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-D"的第二多肽链
<400> 159
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 160
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-E"的第一多肽链
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Ser Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn
165 170 175
Glu Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe Ala Ser Trp
210 215 220
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu
225 230 235 240
Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys
260 265 270
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
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405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys
<210> 161
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-F"的第一多肽链
<400> 161
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
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His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr
165 170 175
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195 200 205
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
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Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly
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275 280 285
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305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485 490 495
Pro Gly Lys
<210> 162
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-F"的第二多肽链
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
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260 265 270
<210> 163
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-G"的第一多肽链
<400> 163
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
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Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn Asp Gly Ile
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Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
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195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala Ser Trp Phe
210 215 220
Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
245 250 255
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly
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Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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485 490 495
Ser Pro Gly Lys
500
<210> 164
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-G"的第二多肽链
<400> 164
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
115 120 125
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Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr
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260 265 270
<210> 165
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-H"的第一多肽链
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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165 170 175
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195 200 205
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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500
<210> 166
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-H"的第二多肽链
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
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Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu
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Gln Tyr Ile Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala
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260 265 270
Lys Glu
<210> 167
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-1"的第一多肽链
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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325 330 335
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 168
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-1"的第二多肽链
<400> 168
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr
165 170 175
Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp
180 185 190
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr
210 215 220
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
225 230 235 240
Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 169
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x RSV结合分子"DART-3"的第一多肽链
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
195 200 205
Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala
225 230 235 240
Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His
260 265 270
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
340 345 350
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 170
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x RSV结合分子"DART-3"的第二多肽链
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
115 120 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr
165 170 175
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
180 185 190
Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala
195 200 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
210 215 220
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 171
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-X"的第一多肽链
<400> 171
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg
195 200 205
Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ile Arg Gln Ser Ala Arg Ala
210 215 220
Pro Glu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
225 230 235 240
Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
<210> 172
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-X"的第二多肽链
<400> 172
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Phe Lys
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Thr Glu Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Leu Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser
165 170 175
Pro Ser Ser Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
180 185 190
Ser Val Phe Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu
210 215 220
Gln Tyr Ile Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu
<210> 173
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-Y"的第一多肽链
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Ala Met His Trp Val Lys Lys
145 150 155 160
Asn Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn His Tyr Asn
165 170 175
Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
180 185 190
Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr
195 200 205
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Tyr Arg Tyr Ala
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys
<210> 174
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env结合分子"DART-Y"的第二多肽链
<400> 174
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Ser Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Val Glu Ser
65 70 75 80
Gly Asp Ile Ser Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Phe Lys
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Thr Glu Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Leu Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser
165 170 175
Pro Ser Ser Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
180 185 190
Ser Val Phe Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu
210 215 220
Gln Tyr Ile Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu
<210> 175
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD16A scFv 4-LS21的VH结构域
<400> 175
Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 176
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗人CD16A scFv 4-LS21的VL结构域
<400> 176
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 177
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-A"的第一多肽链
<400> 177
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
85 90 95
His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr
165 170 175
Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly
260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
290 295 300
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
405 410 415
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485 490 495
Pro Gly Lys
<210> 178
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-A"的第二多肽链
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
115 120 125
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys
145 150 155 160
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr
165 170 175
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His Thr Ser Glu
180 185 190
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asn Ala
210 215 220
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
225 230 235 240
Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 179
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-A"的第三多肽链
<400> 179
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His Thr Ser Glu Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asn Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 180
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-A"的第四多肽链
<400> 180
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
85 90 95
His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 181
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-B"的第三多肽链
<400> 181
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Phe Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser Pro Ser Ser
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu Gln Tyr Ile
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 182
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HIV env x HIV env三价结合分子 "TRIDENT-B"的第四多肽链
<400> 182
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
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Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 183
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(254)
<223> 人CD16
<400> 183
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
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Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
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115 120 125
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
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Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
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Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
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<210> 184
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(254)
<223> 食蟹猴CD16
<400> 184
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Ala Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Arg Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Arg Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Ile Ala Ala Ala Arg
65 70 75 80
Val Asn Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Glu Ser Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His Gln Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Asp Leu Ala Val Ser Ser Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Met Lys Lys Ser Ile Pro Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Glu Asp His Lys Phe Lys Trp Ser Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 185
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<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(267)
<223> 鼠CD16
<400> 185
Met Thr Leu Asp Thr Gln Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln
1 5 10 15
Trp Leu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp
20 25 30
Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro
35 40 45
Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly
50 55 60
Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Trp Ser
65 70 75 80
Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val
85 90 95
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100 105 110
Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr
115 120 125
Pro Gln Arg Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His
130 135 140
Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu
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Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys
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Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Arg Arg Asn Ile Gln Thr Pro Arg Asp Tyr Trp Arg Lys Ser Leu
245 250 255
Ser Ile Arg Lys His Gln Ala Pro Gln Asp Lys
260 265
<210> 186
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-I"的第一多肽链
<400> 186
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
180 185 190
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu
195 200 205
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Asn Ser Pro Val Pro Tyr Trp Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val
225 230 235 240
Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
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435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 187
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x HER2/neu结合分子"DART-J"的第二多肽链
<400> 187
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Tyr Thr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
165 170 175
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
225 230 235 240
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
245 250 255
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 188
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x CD19结合分子"DART-L"的第一多肽链
<400> 188
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
195 200 205
Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val
225 230 235 240
Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495
<210> 189
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x CD19结合分子"DART-L"的第二多肽链
<400> 189
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
115 120 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
165 170 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
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Asn Gln Val Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
195 200 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 190
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x CD19结合分子"DART-M"的第二多肽链
<400> 190
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Tyr Thr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
115 120 125
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
130 135 140
Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145 150 155 160
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
165 170 175
Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
180 185 190
Asn Gln Val Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
195 200 205
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 191
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 x CD19结合分子"DART-N"的第一多肽链
<400> 191
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
195 200 205
Tyr Cys Val Arg Gln Ser Ala Asn Ser Pro Val Pro Tyr Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val
225 230 235 240
Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr
260 265 270
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490 495

Claims (36)

1.CD16 x疾病抗原(CD16 x DA)结合分子，其包括能够结合CD16的表位的CD16结合结构域以及能够结合疾病抗原的表位的疾病抗原-结合结构域，其中所述CD16结合结构域包括下列的一种或多种：
(I)(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域；
(II)(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域；
(III)包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(IV)包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；
(V)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(VI)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域；
(VII)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(VIII)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；和
(IX)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
2.如权利要求1所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述分子是双特异性抗体、双特异性双抗体、双特异性TandAb、双特异性三价分子或双特异性CAR。
3.如权利要求1-2中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述分子能够结合多于一个的疾病抗原和/或多于一个的CD16的表位。
4.如权利要求1-3中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域。
5.如权利要求1-3中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；
(C)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(D)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(E)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；或
(F)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
6.如权利要求1-3中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域。
7.如权利要求1-3中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述CD16结合结构域包括：
(A)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含或SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域；或
(C)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是癌抗原并且所述疾病是癌症。
9.如权利要求6所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述癌症选自由下列组成的组：肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肾癌、非小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾细胞癌、睾丸癌和子宫癌。
10.如权利要求8和9中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述癌抗原选自由下列癌抗原组成的组：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-联蛋白、血型ALeb/Ley、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、细胞角蛋白8、D1.1、D156-22、DR5、E1系列、EGFR、肝配蛋白受体、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神经节苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳头瘤病毒-E6/人乳头瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整联蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、间皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙酰葡糖胺基转移酶、拟糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸盐、R24、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、TAG-72、TL5、TNF-受体、TNF-γ受体、TRA-1-85、转铁蛋白受体、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受体、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley。
11.如权利要求1-8中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
12.如权利要求1-7中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是病原体相关抗原。
13.如权利要求12所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述病原体相关抗原选自由下列病原体相关抗原组成的组：单纯疱疹病毒感染的细胞蛋白(ICP)47、单纯疱疹病毒gD、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-1、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2A、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2B、人类免疫缺陷病毒gp160、人类免疫缺陷病毒gp120、人类免疫缺陷病毒gp41等、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、人T细胞白血病病毒gp64、人T细胞白血病病毒gp46和人T细胞白血病病毒gp21。
14.如权利要求12或13所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
15.如权利要求1-14中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述分子是：
(A)双抗体，所述双抗体是包含两条、或三条、四条或五条多肽链的共价结合的复合物；或
(B)三价结合分子，所述三价结合分子是包含三条、四条或五条多肽链的共价结合的复合物；或
(C)双特异性抗体。
16.如权利要求15所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述分子包含Fc区。
17.如权利要求16所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述Fc区具有IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同种型。
18.如权利要求16或17所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述Fc区是变体Fc区，包含：
(A)一个或多个氨基酸修饰，其减少所述变体Fc区对于FcγR的亲和力；和/或
(B)一个或多个氨基酸修饰，其增加所述变体Fc区的血清半衰期。
19.如权利要求18所述的CD16 x疾病抗原结合分子，其中：
(A)减少所述变体Fc区对于FcγR的亲和力的所述修饰包括L234A、L235A、或L234A和L235A的置换；和
(B)增加所述变体Fc区的血清半衰期的所述修饰包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的置换，其中所述编号是如Kabat中EU索引的编号。
20.CD16结合分子，其包含：
(A)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDRL3结构域。
21.如权利要求20所述的CD16结合分子，其中所述分子包含：
(A)包含SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；
(C)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(D)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL结构域；
(E)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域；或
(F)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL结构域。
22.CD16结合分子，其包含：
(A)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDRH1结构域；
(B)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDRH2结构域；
(C)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDRH3结构域；
(D)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDRL1结构域；
(E)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDRL2结构域；和
(F)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDRL3结构域。
23.如权利要求22所述的CD16结合分子，其中所述分子包含：
(A)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域；
(B)包含或SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域；或
(C)包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL结构域。
24.如权利要求20-23中任一项所述的CD16结合分子，其中所述分子选自由下列组成的组：抗体、多特异性抗体、Fab'片段、F(ab')2片段、(Fv)片段、单链(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、双抗体、三价结合分子和CAR-T分子。
25.药物组合物，其包括权利要求1-19中任一项所述的CD16 x疾病抗原结合分子和药学上可接受的载体。
26.药物组合物，其包括权利要求20-24中任一项所述的CD16结合分子和药学上可接受的载体。
27.权利要求25所述的药物组合物在治疗特征在于表达所述疾病抗原的疾病中的用途。
28.用于治疗特征在于表达疾病抗原的疾病的方法，包括向需要其的受试者施用治疗有效量的权利要求25所述的药物组合物。
29.如权利要求27所述的用途或如权利要求28所述的方法，其中所述CD16 x疾病抗原结合分子能够结合多于一个的疾病抗原和/或多于一个的CD16的表位。
30.如权利要求27所述的用途或如权利要求28所述的方法，其中所述CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是癌抗原，并且所述疾病是癌症。
31.如权利要求30所述的用途或方法，其中所述癌症选自由下列组成的组：肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肾癌、非小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肾细胞癌、睾丸癌和子宫癌。
32.如权利要求30所述的用途或方法，其中所述癌抗原选自由下列癌抗原组成的组：19.9、4.2、A33、ADAM-9、AH6、ALCAM、B1、B7-H3、BAGE、β-联蛋白、血型ALeb/Ley、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、C14、CA125、羧肽酶M、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD36、CD40/CD154、CD45、CD56、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD103、CD123、CD317、CDK4、CEA、CEACAM5/CEACAM6、CO17-1A、CO-43、CO-514、CTA-1、CTLA-4、细胞角蛋白8、D1.1、D156-22、DR5、E1系列、EGFR、肝配蛋白受体、EphA2、Erb、GAGE、GD2/GD3/GM2神经节苷脂、GICA 19-9、gp100、Gp37、gp75、gpA33、HER2/neu、HMFG、人乳头瘤病毒-E6/人乳头瘤病毒-E7、HMW-MAA、I抗原、IL13Rα2、整联蛋白β6、JAM-3、KID3、KID31、KS 1/4泛癌抗原、L6、L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE、MART、间皮素、MUC-1、MUM-1、Myl、N-乙酰葡糖胺基转移酶、拟糖蛋白、NS-10、OFA-1、OFA-2、制瘤素M、p15、p97、PEM、PEMA、PIPA、PSA、PSMA、前列腺酸磷酸盐、R24、ROR1、鞘脂、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、TAG-72、TL5、TNF-受体、TNF-γ受体、TRA-1-85、转铁蛋白受体、5T4、TSTA、VEGF、VEGF受体、VEP8、VEP9、VIM-D5、和Y半抗原、Ley。
33.如权利要求32所述的用途或方法，其中所述疾病抗原是5T4、B7-H3、CEACAM5/CEACAM6、CD19、CD123、EGRF、EphA2、HER2/neu、IL13Rα2或VEGF。
34.如权利要求27所述的用途或如权利要求28所述的方法，其中所述CD16 x疾病抗原结合分子，其中所述疾病抗原是病原体相关抗原。
35.如权利要求34所述的用途或方法，其中所述病原体相关抗原选自由下列病原体相关抗原组成的组：单纯疱疹病毒感染的细胞蛋白(ICP)47、单纯疱疹病毒gD、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-1、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2A、爱泼斯坦-巴尔病毒LMP-2B、人类免疫缺陷病毒gp160、人类免疫缺陷病毒gp120、人类免疫缺陷病毒gp41等)、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7、人T细胞白血病病毒gp64、人T细胞白血病病毒gp46和人T细胞白血病病毒gp21。
36.如权利要求35所述的用途或方法，其中所述疾病抗原是HIV env抗原。
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