JP2019517539A - 併用療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌及び病原体関連疾患の治療のための併用療法を対象とし、上記併用療法は：（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）；及び（２）疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばダイアボディ、ＢｉＴｅ、二重特異性抗体、ＣＡＲ等）の投与を含む。本発明は特に、上記標的細胞の上記標的転換殺滅を仲介できる上記分子が、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合部位と、上記標的細胞のエピトープ（即ち癌抗原又は病原体関連抗原等の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合部位とを含む、二重特異性結合分子である、実施形態に関する。本発明はまた、１つ又は複数の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。【選択図】 図８Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／３４６，８５４号（２０１６年６月７日出願；係属中）及び米国特許出願第６２／４３２，２９９号（２０１６年１２月９日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、各上記出願はその全体が本出願に援用される。
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：1301_0142PCT_ST25.txt、２０１７年５月３１日作成、サイズ：２２５，３３５バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
本発明は、癌及び病原体関連疾患の治療のための併用療法を対象とし、上記併用療法は：（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）；及び（２）疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばダイアボディ、ＢｉＴｅ、二重特異性抗体、ＣＡＲ等）の投与を含む。本発明は特に、上記標的細胞の上記標的転換殺滅を仲介できる上記分子が、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合部位と、上記標的細胞のエピトープ（即ち癌抗原又は病原体関連抗原等の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合部位とを含む、二重特異性結合分子である、実施形態に関する。本発明はまた、１つ又は複数の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
Ｉ．哺乳類免疫系
哺乳類免疫系は、例えば創傷、感染及び新生物を含む多様な状態に対する防御として機能する。ヒト及び他の哺乳類が病原体、外来物質及び癌抗原に対する免疫応答を発現する効率は、２つの特徴：抗原認識に対する免疫応答の優れた特異性、及び同一の抗原による再活性化に対するより迅速かつより活発な応答を可能とする免疫記憶に基づくものである(非特許文献１〜３）。
健康な個体では、免疫系は静止状態であり、多様な阻害性受容体及びリガンドによって阻害される。癌抗原、微生物病原体又はアレルゲンを認識すると、活性化受容体及び受容体リガンドのアレイは、免疫系の活性化を誘発するようトリガされる。このような活性化は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化につながり、様々なサイトカインの放出を促進し、これらのサイトカインは全て、被検体の健康に対する知覚された脅威に対抗するよう作用する（非特許文献４〜６）。免疫系は、相殺阻害性免疫シグナルが活性化免疫シグナルよりも大きい場合に、その正常な静止状態に戻ることができる。
よって、癌の疾患状態（及び実際には感染性疾患の疾患状態）は、被検体の免疫系の十分な活性化の失敗を反映したものであると考えることができる。このような失敗は、活性化免疫シグナルの不十分な提示を反映したものであってよく、又は被検体における阻害性免疫シグナルを軽減する能力が不十分であることを反映したものであってよい。いくつかの例では、研究者により、癌細胞が免疫系を組み込むことによって、上記免疫系に検出されるのを避けることができることが判明した（非特許文献３）。
哺乳類免疫系は、２つの別個の、ただし相互に関連した系：体液免疫系及び細胞免疫系によって仲介される。一般に、体液系は、Ｂ細胞によって産生される可溶性分子（抗体又は免疫グロブリン）によって仲介される。上記分子は、身体にとって外来物であると認識された抗原と化合してこれを中和する能力を有する。細胞免疫系は、多様な治療的役割を果たす「Ｔ細胞」と呼ばれる特定の細胞の可動化を伴う。Ｔ細胞は、胸腺において成熟して、組織、リンパ系及び循環器系の間を循環する、リンパ球である。外来構造（抗原）の存在及び認識に応答して、Ｔ細胞は「活性化され（activated）」た状態となり、免疫応答を開始する。多くの例では、これらの外来抗原は、新生物又は感染の結果として宿主細胞上に発現する。Ｔ細胞自体は抗体を分泌しないが、Ｔ細胞は通常、第２の分類のリンパ球であるＢ細胞（これは骨髄に由来する）による抗体分泌のために必要である。重要なことに、Ｔ細胞は、卓越した免疫学的特異性を示すことによって、抗原を互いに識別できる。
Ｔ細胞活性化には２つの相互作用が必要となる（非特許文献５、６）。第１の相互作用では、細胞は、ナイーブＴリンパ球のＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体；「ＴＣＲ」）に結合できるよう、細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex：「ＭＨＣ」）に結合する適切な標的抗原を提示しなければならない。ほとんど全ての細胞タイプが抗原提示細胞として作用できるが、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞といった一部の細胞は、外来抗原の提示に特化されており、「プロフェッショナル」「抗原提示細胞」である。抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ分子に結合する抗原の免疫学的検出は、細胞毒性Ｔ細胞の産生につながる。抗原提示細胞のＭＨＣ ＩＩ分子に結合する抗原の免疫学的検出は、細胞毒性Ｔ細胞の産生につながる。第２の相互作用では、抗原提示細胞のリガンドはＴ細胞の共受容体に結合しなければならない（非特許文献４、７）。両方の刺激シグナルを受けたＴ細胞は、サイトカイン（インターロイキン２及びインターロイキン１２等）に応答できる。
ＴＣＲ関与中に両方の共刺激シグナルが存在しない場合、Ｔ細胞は機能的に無反応な状態に入り、これはクローンアネルギー（clonal anergy）と呼ばれる（非特許文献８）。病的状態においては、Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ及び多発性硬化症といった様々な臓器特異的自己免疫疾患において重要な役割を果たす（非特許文献４）。
このような免疫「チェックポイント（checkpoint）」経路は、自己寛容性を維持する（即ち被検体が自身の細胞に対する免疫系の攻撃を発生させること（「自己免疫（autoimmune）」応答）を防止する）にあたって、及び抗菌又は抗アレルギ性免疫応答中の付帯的な組織損傷を制限するにあたって、重要である。Ｔ細胞の接触により、２つの必要なシグナルのうちの一方のみが生成される場合、Ｔ細胞は活性化されず、適合した免疫応答が発生しない。従ってＴ細胞活性化の「２シグナル」機序は、免疫系が、望ましくない応答、例えば被験者自身の細胞に対する免疫系の攻撃をもたらす自己抗原に対する応答（「自己免疫」応答）を回避するための方法を提供する。
ＩＩ．細胞免疫系の細胞表面分子
Ａ．ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８
免疫系の細胞は、特化された糖タンパク質細胞表面分子の発現を特徴とする。このような分子と他の細胞の分子との間の相互作用は、免疫応答をトリガするか、維持するか、又は弱める。特に全てのＴ細胞は、ＣＤ３の発現を特徴とする。ＣＤ３は、４つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である（非特許文献９、１０、２）。
哺乳類では、上記複合体ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成するためにＴＣＲと会合する（非特許文献１１）。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（非特許文献１２）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しない（非特許文献１３〜１５を参照）。
Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体の不変ＣＤ３εシグナリング成分は、Ｔ細胞と癌細胞との間の免疫学的シナプスの形成を強制するための標的として使用されてきた。ＣＤ３及び腫瘍抗原の共関与はＴ細胞を活性化し、腫瘍抗原を発現する癌細胞の溶解をトリガする（非特許文献１６）。このアプローチにより、二重特異性抗体は、癌細胞に対する高い特異性を有するＴ細胞コンパートメントと全体的に相互作用し、またこのアプローチは、幅広い細胞表面腫瘍抗原に広く適用可能であり、病原体感染細胞を標的化するためにも実装されている（例えば非特許文献１７、特許文献１、２を参照）。
「ヘルパーＴ細胞」として知られるＴ細胞の第１のサブセットは、ＣＤ４の発現を特徴とする（即ちこれらは「ＣＤ４+」である）。ＣＤ４+Ｔ細胞は、殆どの哺乳類免疫及び自己免疫応答の必須のオーガナイザである（非特許文献４）。ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化は、抗原：抗原提示細胞（例えばＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞）の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子複合体と、いずれもナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の表面上に配列された２つの分子の複合体、即ちＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３細胞表面受容体リガンドとの間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。活性化されたＴヘルパー細胞は、標的細胞への炎症応答を仲介できるＴｈ１細胞を増殖させることができる。
「細胞毒性Ｔ細胞」として知られるＴ細胞の第２のサブセットは、ＣＤ８の発現を特徴とする（即ちこれらは「ＣＤ８+」であり、かつＣＤ３+である）。ＣＤ８は、細胞毒性Ｔ細胞上に発現される、２つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である（非特許文献１８）。ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化は、抗原：標的細胞の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子複合体と、ＣＤ８+Ｔ細胞の表面上に配列されたＣＤ８及びＴ細胞受容体の複合体との間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている（非特許文献１９）。特定の免疫系のみによって発現する主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子とは異なり、ＭＨＣ Ｉ分子は極めて広範に発現する。従って細胞毒性Ｔ細胞は、広範な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は、細胞毒であるパーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンの放出によって、細胞殺滅を仲介する。パーフォリンの作用により、グランザイムは標的細胞の細胞質に入り、グランザイムのセリンプロテアーゼ機能によって、最終的に標的細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）につながる一連のシステインであるカスパーゼカスケードをトリガする。
Ｂ．ＣＤ２
ＣＤ２は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に確認される細胞接着分子である。ＣＤ２は、恐らくＮＫ細胞ナノチューブ形成のプロモータとして、ＮＫ細胞の細胞毒性を増強させる（非特許文献２０、２１）。
Ｃ．Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）
Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞が自然に発現するものであり、これらの細胞が、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質によって結合及び提示される抗原ペプチドを認識できるようにする。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド‐ＭＨＣ）の認識は、サイトカインの産生及び抗原提示細胞の溶解につながる、細胞免疫応答の伝播を開始させる（例えば非特許文献２２〜２４参照）。ＣＤ３はＴＣＲに結合する受容体である（非特許文献１２、２、２６、２７、１１、２８）。
（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７としても知られる）ＣＤ３ζ鎖ゼータ鎖を伴うＴＣＲとＣＤ３との複合体は、ＴＣＲ複合体を含む（非特許文献２９、９）。上記複合体は、多数（１０個）の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するため、特に重要である。
Ｄ．Ｆｃ受容体：ＣＤ１６、ＣＤ３２及びＣＤ６４
以下で詳細に議論するように、天然ＩｇＧ抗体は、４つのポリペプチド鎖：２つの同一の「軽（light）」鎖及び２つの同一の「重（heavy）」鎖からなる。重鎖は、Ｃ末端「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」ドメインを含有し、上記２つの重鎖の結合は、複数のタイプの免疫系細胞（例えばＢリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞）の表面上に見られる受容体（単数で「Ｆｃガンマ受容体」「ＦｃγＲ」、及び集合的に「ＦｃγＲｓ」と呼ばれる）と結紮（結合）できる「Ｆｃドメイン」を生成する。このような受容体は、（これによってＦｃドメインと結紮できる）「細胞外」部分、（細胞膜を通って延在する）「膜透過」部分、及び（細胞の内側に位置する）「細胞質」部分を有する。複数のタイプのＦｃγＲ：ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）が同定されている。このような結合により、活性化又は阻害シグナルが免疫系に伝達される。
ＣＤ１６は、活性化性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）の一般名である。ＣＤ１６は、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているがモノマーではないヒトＩｇＧに結合する組織マクロファージによって発現される（非特許文献３０〜３４）。これらの受容体はＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合することにより、サイトカインの放出をトリガする。このような抗体が、細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の表面上に発現された疾患抗原に結合した場合、上述の放出は、標的化された細胞の殺滅を仲介する。このような殺滅は抗体依存性であるため、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ＡＤＣＣ）と呼ばれる。
ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）（非特許文献３５〜３７）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（非特許文献３８〜４１）は、マクロファージ、好中球、好酸球及び樹状細胞上で（ＣＤ３２Ａに関しては、血小板及びランゲルハンス細胞上でも）発現される活性化性Ｆｃ受容体である。対照的に、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）は、Ｂリンパ球（マクロファージ、好中球及び好酸球）上の阻害性Ｆｃ受容体である（非特許文献４２〜４４、３７）。
様々なＦｃγＲの、正反対の機能を仲介する能力は、それらの構造的な差異、特にＦｃγＲが免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif：「ＩＴＡＭ」）を有するか、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif：「ＩＴＩＭ」）を有するかを反映する。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、Ｆｃドメイン（例えば免疫複合体中に存在する凝集Ｆｃドメイン）に結合した場合に免疫系を活性化する。ＦｃγＲＩＩＢは、現在知られている唯一の天然ＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり；凝集Ｆｃドメインに結合した場合に、免疫系を弱めるか、又は阻害する働きをする。
Ｅ．ＮＫＧ２Ｄ受容体
ナチュラルキラーグループ２Ｄ（Natural Killer Group 2D：「ＮＫＧ２Ｄ」）受容体は、全てのヒト（及び他の哺乳類）のナチュラルキラー細胞上（非特許文献４５、４６）並びに全てのＣＤ８+Ｔ細胞上（非特許文献４７、４６）で発現する。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、正常な細胞の表面上には全く存在しないか又は低いレベルでしか存在しないが、感染細胞、形質転換細胞、老化細胞又はストレスを受けた細胞によって過剰発現される。このような結合リガンド、及び特に正常な細胞上で発現しないものとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸初期誘導性遺伝子‐１（ＲＡＥ‐１）の産物、及びマウスＵＬ１６結合タンパク質様転写物１（ＭＵＬＴ１）が挙げられる（非特許文献４８、４９）。
ＩＩＩ．免疫系細胞の相互作用分子
異なる複数の種類の抗原提示細胞分子及びＴ細胞分子が関与する相互作用は、免疫応答の、必要とされる第２の相互作用に影響を及ぼす。
Ａ．ＣＤ８０／ＣＤ８６及びＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４
抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドと、ＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合は、免疫応答の必要とされる第２の相互作用にとって特に重要である（非特許文献５０、４、７）。ＣＤ２８に対するＢ７．１及びＢ７．２の結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７．１及びＢ７．２の結合は上記活性化を阻害する（非特許文献４、７、５１）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上で恒常的に発現され（非特許文献５２）、一方ＣＴＬＡ‐４発現は、Ｔ細胞活性化に続いて迅速に上方制御される（非特許文献５３）。ＣＴＬＡ‐４は高親和性受容体である（非特許文献５０、３）ため、結合はまず（ＣＤ２８によって）Ｔ細胞増殖を開始させ、その後これを（ＣＴＬＡ‐４の初期発現によって）阻害することにより、増殖がこれ以上必要でない場合にその効果を減衰させる。
Ｂ．ＰＤ‐１及びＢ７‐Ｈ１／Ｂ７‐ＤＣ
プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」、「ＣＤ２７９」としても公知）は、免疫応答を幅広く下方制御するＴ細胞制御因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４ファミリーのＩ型膜タンパク質メンバーである（非特許文献５４、特許文献３〜１１）。
ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４はいずれも阻害免疫シグナルを提供するが、ＰＤ‐１が提供するシグナルは疾患の経過の後期にマウントされ、疾患応答性Ｔ細胞の初期産生（「バースト（ｂｕｒｓｔ）」）を制限することによって、免疫応答を大幅に低減できる。従ってＰＤ‐１は、潜在的に効果的なＴ細胞応答を、寛容なものに部分的に変換できる（非特許文献３）。
ＰＤ‐１系の受容体‐リガンド相互作用は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４系のものよりもはるかに複雑なものと思われる。ＰＤ‐１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び単球上で（非特許文献５５、５６）、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞中において低レベルで（非特許文献５７、５８）、発現する。
ＰＤ‐１の細胞外領域は、ＣＴＬＡ‐４の同等のドメインに対して２３％の同一性を有する単一免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖドメインで構成される（非特許文献５８）。細胞外ＩｇＶドメインには、膜透過性領域及び細胞内テールが続く。細胞内テールは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ内に位置する２つのリン酸化部位を含有し、これは、ＰＤ‐１がＴＣＲシグナルを下方制御することを示唆している（非特許文献５４、５９）。
ＰＤ‐１は、Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣへの結合によって、免疫系の阻害を仲介する（ＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２として公知）（非特許文献６０、特許文献１２〜１９）。
Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣは、心臓、胎盤、筋肉、胎児の肝臓、脾臓、リンパ節及び胸腺、並びにマウスの肝臓、肺、腎臓、膵臓の島細胞及び小腸といった、多くのタイプのヒト及びマウス組織の表面上で広く発現する（非特許文献５８）。ヒトでは、Ｂ７‐Ｈ１タンパク質発現は、ヒト内皮細胞（非特許文献６１〜６３）、心筋（非特許文献６４）、合胞体栄養細胞（非特許文献６５）において見られた。上記分子はまた、いくつかの組織の常在性マクロファージによって、インターフェロン（ＩＦＮ）‐γ又は腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ）‐αによって活性化されたマクロファージによって（非特許文献６６）、及び腫瘍内において（非特許文献６７）も発現される。
Ｂ７‐Ｈ１とＰＤ‐１との間の相互作用は、Ｔ及びＢ細胞に対する重大な下方共刺激シグナル（非特許文献５８）、並びに細胞死誘導因子としての機能（非特許文献５４、６８）を提供することが分かっている。より具体的には、低濃度のＰＤ‐１受容体とＢ７‐Ｈ１リガンドとの間の相互作用は、抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を強く阻害する阻害シグナルの伝達をもたらすことが分かっており；高濃度では、ＰＤ‐１との相互作用はＴ細胞増殖を阻害しないものの、複数のサイトカインの産生を明らかに低減させる（非特許文献５０）。休止ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞並びに既に活性化されたＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方、更には臍帯血由来のナイーブＴ細胞による、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生は、可溶性Ｂ７‐Ｈ１‐Ｆｃ融合タンパク質によって阻害されることが分かっている（非特許文献６９、６６、７０、５０）。
Ｔ細胞活性化及び増殖におけるＢ７‐Ｈ１及びＰＤ‐１の役割は、これらの生体分子が、炎症及び癌の治療のための治療標的として機能し得ることを示唆している。従って、感染及び腫瘍の治療並びに適応免疫応答の上方調節のための抗ＰＤ‐１抗体の使用が提案されている（特許文献２０、２１、２２、４、２３〜２８を参照）。ＰＤ‐１に特異的に結合できる抗体は、非特許文献５５及び７１によって報告されている（特許文献２９〜３７、２９、３８、２７、３９、４０、４１、２８、４２〜４６も参照）。
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哺乳類の免疫応答に関与する分子の同定がこのように進歩しているにもかかわらず、癌及び感染性疾患の治療のための改善された療法に対する需要は存在し続けている。本発明はこの目標、及びその他の目標を対象とする。
本発明は、本発明は、癌及び病原体関連疾患の治療のための併用療法を対象とし、上記併用療法は：（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）；及び（２）疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばダイアボディ、ＢｉＴｅ、二重特異性抗体、ＣＡＲ等）の投与を含む。本発明は特に、上記標的細胞の上記標的転換殺滅を仲介できる上記分子が、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合部位と、上記標的細胞のエピトープ（即ち癌抗原又は病原体関連抗原等の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合部位とを含む、二重特異性結合分子である、実施形態に関する。本発明はまた、１つ又は複数の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
詳細には、本発明は、それを必要とする被験者に、治療的有効量の：
（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子、及び
（２）標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子であって、上記標的細胞は：
（ａ）癌抗原を発現する癌細胞；又は
（ｂ）病原体関連抗原を発現する病原体感染細胞
である、分子
を投与するステップを含む、癌又は病原体関連疾患の治療のための方法を提供する。
本発明は特に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記分子が、ＰＤ‐１とＰＤ‐１の天然リガンドとの間の結合を阻害できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記方法が、合計３つのエピトープ結合ドメインを含む２つの結合分子の投与を含み、上記２つの結合分子が：
（Ａ）ＰＤ‐１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン、又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含む、結合分子；並びに
（Ｂ）（１）上記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン；及び
（２）上記標的細胞の上記癌抗原又は上記病原体抗原に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン
を含む、結合分子
であり、
上記結合分子（Ａ）の上記エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合でき、上記結合分子（Ｂ）の上記エピトープ結合ドメイン（１）及び（２）は、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子がダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体又はＴａｎｄＡｂを含み、上記結合分子（Ｂ）が二重特異性ダイアボディ、ＣＡＲ、ＢｉＴｅ又は二重特異性抗体を含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１に結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１に結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、上記エピトープ結合ドメインは：
（ａ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
（ｂ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合しない、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインが同一のＰＤ‐１分子に同時に結合できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、上記エピトープ結合ドメインは：
（ａ）ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
（ｂ）ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合しない、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＰＤ‐１リガンド‐エピトープ結合ドメインが、ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一の分子に同時に結合できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドではない分子のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２のエピトープ結合ドメインが、ＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子の上記第３のエピトープ結合ドメインが、上記エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記エフェクタ細胞の２つの異なる細胞表面分子に結合できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記標的細胞の癌抗原又は病原体関連抗原に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子の上記第３のエピトープ結合ドメインが、上記標的細胞の異なる癌抗原又は異なる病原体抗原に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記標的細胞の２つの異なる癌抗原又は２つの異なる病原体抗原に結合できる、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記癌抗原が、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記方法が医薬組成物の投与を含み、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に：
（Ａ）治療的有効量の：
（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子；及び
（２）癌抗原又は病原体抗原を発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子；並びに
（Ｂ）薬学的に許容可能なキャリア
を含む、医薬組成物を提供する。
本発明は更に、上記医薬組成物が、合計３つのエピトープ結合ドメインを含む２つの結合分子を含み、上記２つの結合分子が：
（Ａ）ＰＤ‐１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン、又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含む、結合分子；並びに
（Ｂ）（１）上記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン；及び
（２）上記標的細胞の癌抗原又は病原体抗原に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン
を含む、結合分子
であり、
上記結合分子（Ａ）の上記エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合でき、上記結合分子（Ｂ）の上記エピトープ結合ドメイン（１）及び（２）は、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記結合分子（Ａ）がダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体又はＴａｎｄＡｂを含み、上記結合分子（Ｂ）がダイアボディ、ＣＡＲ、ＢｉＴｅ又は二重特異性抗体を含む、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記分子が、ＰＤ‐１に結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記分子が、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記分子が、ＰＤ‐１に結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、上記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインは：
（ａ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
（ｂ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合しない、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインが同一のＰＤ‐１分子に同時に結合できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、上記エピトープ結合ドメインは：
（ａ）ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
（ｂ）ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合しない、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＰＤ‐１リガンド‐エピトープ結合ドメインが、ＰＤ‐１の上記天然リガンドの同一の分子に同時に結合できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる上記結合分子が、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドではない分子のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含む、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２のエピトープ結合ドメインが、ＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記分子が、第３のエピトープ結合ドメインを含み、３つの上記エピトープ結合ドメインは同時結合が可能であり、また上記第３のエピトープは、上記エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに結合できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子の上記第３のエピトープ結合ドメインが、上記エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記エフェクタ細胞の２つの異なる細胞表面分子に結合できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記標的細胞の癌抗原又は病原体関連抗原に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子の上記第３のエピトープ結合ドメインが、上記標的細胞の異なる癌抗原又は異なる病原体関連抗原に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる上記結合分子が、上記標的細胞の２つの異なる癌抗原又は２つの異なる病原体関連抗原に結合できる、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記癌抗原が、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、上記医薬組成物の実施形態に関する。
本発明は更に、上述の医薬組成物のうちのいずれかを含み、上記医薬組成物の結合分子が、１つ又は複数の容器に仕分けられている、キットを提供する。
図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図２は、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃドメイン含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃドメイン含有ダイアボディを示す。 図４Ａ〜４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を含むＦｃドメインを形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的なＦｃドメイン含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインを示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を含む。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、ＦｃドメインのＮ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、ＦｃドメインのＣ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図７は、５×１０6個のＬＯＸ‐ＩＭＶＩヒト転移性黒色腫癌細胞（ＩＤ）及び１０6個のヒトＰＢＭＣ（ＩＰ）を投与されたＭＨＣＩ-/-マウスに、ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＣＤ３×Ｂ７‐Ｈ３二重特異性ダイアボディ、ＤＡＲＴ‐Ａ、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びＤＡＲＴ‐Ａの両方、又はビヒクル単体（対照）を供給した結果を示す。 図８Ａ〜８Ｂは、５×１０6個のＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト転移性咽頭癌細胞（ＩＤ）及び１０6個のヒトＰＢＭＣ（ＩＰ）を投与されたＭＨＣＩ-/-マウスに、ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＣＤ３×Ｂ７‐Ｈ３二重特異性ダイアボディ、ＤＡＲＴ‐Ａ、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及びＤＡＲＴ‐Ａの両方、又はビヒクル単体（対照）を供給した結果を示す。図８Ａは、ビヒクル対照、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）（Ｑ７Ｄｘ５）、ＤＡＲＴ‐Ａ（Ｑ７Ｄｘ５）、及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）＋ＤＡＲＴ‐Ａ（Ｑ７Ｄｘ５）に関する結果を示す。図８Ｂは、ビヒクル対照、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）（Ｑ７Ｄｘ５）、ＤＡＲＴ‐Ａ（Ｑ７Ｄｘ５）、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）＋ＤＡＲＴ‐Ａ（Ｑ７Ｄｘ５）、及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）＋ＤＡＲＴ‐Ａ（Ｑ１４Ｄｘ３）に関する結果を示す。 図９は、本発明の併用療法の投与の効果に関する研究の結果を示す。これらの結果は、ＣＤ３+細胞の濃度の上昇によって決定されるように、レシピエント動物の免疫応答の増強を示す。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ルシフェラーゼレポータアッセイにおけるＴ細胞シグナリングに対する本発明の併用療法の投与の効果に関する研究の結果を示す。ＰＤ‐１及びＢ７‐Ｈ３を発現するＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１腫瘍標的細胞を、ＭＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、エフェクタ：標的細胞比１：１（図１０Ａ）又は３：１（図１０Ｂ）で混合し、単独で、又は固定濃度（１２．５ｎＭ）のＰＤ‐１結合分子ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＤＡＲＴ‐１、若しくは対照抗体（ｈＩｇＧ）とともに、ＤＡＲＴ‐Ａの濃度を上昇させて培養した。これらの結果は、発光の増大によって決定されるように、両方の分子の存在下でのシグナリング活性の増強を示す。 図１１Ａ〜１１Ｂは、本発明の併用療法の投与により、アネルギー性Ｔ細胞の存在下での腫瘍再発が低減されることを示す。５×１０6個のＡ３７５ ＩＮＦγ処理済み黒色腫細胞及び５×１０6個の活性化又はアネルギー性ヒトＴ細胞を投与されたＮＯＧマウスに、ビヒクル単体、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐２（Ｑ７Ｄｘ４）、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｂ（ＱＤｘ１）、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐２（Ｑ７Ｄｘ４）及び０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｂ（ＱＤｘ１）両方を供給した。図１１Ａは、活性化Ｔ細胞を投与されたマウスに関する結果を示し、図１１Ｂは、アネルギー性Ｔ細胞を投与されたマウスに関する結果を示す。 図１２Ａ〜１２Ｈは、ＰＤ‐１に結合できる分子及び標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の併用療法の、これらの分子単独での投与に対する予期せぬ便益を実証する。Ａ３７５黒色腫細胞が引き起こす腫瘍体積を時間の関数として測定し、これを図１２Ａ〜１２Ｈに示す。図１２Ａは、５０日目までの、グループ１、２、５及び６に関する結果を示し、図１２Ｂ〜１２Ｈは、８０日目までの、グループ２（図１２Ｂ）、グループ５（図１２Ｃ）、グループ６（図１２Ｄ）、グループ３（図１２Ｅ）、グループ７（図１２Ｆ）、グループ４（図１２Ｇ）及びグループ８（図１２Ｈ）中の個々の動物に関するスパイダープロットを示す。
本発明は、本発明は、癌及び病原体関連疾患の治療のための併用療法を対象とし、上記併用療法は：（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＴａｎｄＡｂ等）；及び（２）疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばダイアボディ、ＢｉＴｅ、二重特異性抗体、ＣＡＲ等）の投与を含む。本発明は特に、上記標的細胞の上記標的転換殺滅を仲介できる上記分子が、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合部位と、上記標的細胞のエピトープ（即ち癌抗原又は病原体関連抗原等の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合部位とを含む、二重特異性結合分子である、実施形態に関する。本発明はまた、１つ又は複数の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
本発明の分子の結合ドメインは、「免疫特異的な（immunospecific）」様式でエピトープに結合する。本明細書中で使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に、別のエピトープに対してよりも頻繁に、迅速に、長期間、及び／又は高い親和性で反応又は会合する場合に、該エピトープに「免疫特異的に（immunospecifically）」結合すると表現される。例えば、ウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、該抗体が他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに結合するよりも、高い親和性で、高い結合活性で、より迅速に、及び／又はより長期間結合する抗体である。この定義を読むと、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合するものであっても、そうでなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（immunospecific binding）」は、必ずしも排他的な結合を要求しない（ただしこれを含み得る）。一般には、結合に関する言及は「免疫特異的な」結合を意味するが、必ずしもそうではない。２つの分子は、これらの結合が、それぞれのリガンドに受容体が結合する際の特異性を示す場合に、「生理特異的に（physiospecific）」様式で互いに結合できると表現される。
上述のように、本発明の治療用分子は特に、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できるエピトープ結合部位と、疾患抗原を発現する標的細胞のエピトープに免疫特異的に結合できるエピトープ結合部位とを含む、二重特異性結合分子を含む。本明細書中で使用される場合、用語「疾患抗原（Disease antigen）」は、異常若しくは感染細胞の表面上で発現し、上記異常若しくは感染の特徴となる抗原、又は外来細胞の表面上で発現し、このような外来源の特徴となる抗原を指す。本明細書中で使用される場合、細胞表面上に疾患抗原を発現し、従って本発明の治療用分子によって束縛され得、これによって上記治療用分子による殺滅の標的となる細胞は、「標的細胞（target cell）」である。本発明に特に関連するのは、「癌抗原（Cancer antigen）」又は「病原体関連抗原（Pathogen-Associated antigen）」である疾患抗原である。
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の結合分子は抗体であってよい。「抗体（antibody）」は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody及びantibodies）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（epitope）」）が存在するためである。エピトープ含有分子は、免疫学的活性を有することができ、これにより、動物における抗体産生応答を誘発する。このような分子を「抗原（antigen）」と呼ぶ。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ断片等）、単鎖（ｓｃＦｖ）結合分子及びその突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、並びに必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの「重鎖（Heavy Chain）」と複合体化した２つの「軽鎖（Light Chain）」からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）及び定常ドメイン（「ＣＬ」）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨ」）、３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）」領域（「Ｈ」）を含有する。対照的に、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を連結することによって作製された、単鎖分子である。
従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有する四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。
Ａ．抗体可変ドメインの特徴
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及びフレームワークセグメント（「ＦＲ」）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合断片（epitope-binding fragment）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる分子の断片を指す。エピトープ結合断片は、抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４若しくは５個を含有してよく、又は抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。ある抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片等）を含んでよい。明記されていない場合、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端への（N-terminal to C-terminal）」方向である。
本発明は特に、ヒト化抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインを含むエピトープ結合分子も包含する。用語「ヒト化抗体（humanized antibody）」は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。本発明の抗ヒトＰＤ‐１抗体は、抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ １、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４又はＰＤ‐１ ｍＡｂ １５の、ヒト化、キメラ又はイヌ化変異体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
エピトープ結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでよい。エピトープ結合ドメインは野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of FrameworkResidues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多数のヒト化抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
Ｂ．抗体定常領域の特徴
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス（EU index as in Kabat）」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てており、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲH１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
１．重鎖の定常領域：Ｆｃドメイン
抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖の「ＣＬ」定常領域と複合体化し、介在ヒンジドメインを介して重鎖ＣＨ２ドメインに付着する。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
ある例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：ERKCCVECPPCPである。
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書中で記載されるように、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的なＳ２２８Ｐ安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７）：ESKYGPPCPPCPである。
抗体の２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用して「Ｆｃドメイン（Fc domain）」を形成し、これは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに受容されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃドメインは、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに対してよりも、あるＩｇＧアイソタイプに対して最も相同性が高い場合に、この特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであると表現される。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けた結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
２．軽鎖の定常領域
上述のように、抗体の軽鎖は、１つの可変ドメイン（「ＶＬ」）及び１つの定常ドメイン（「ＣＬ」）を含有する。
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
ＩＩ．キメラ抗原受容体
あるいは、標的細胞（即ち癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる、本発明の結合分子は、癌抗原又は病原体関連抗原に結合できる単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が組み込まれたキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）等の単一特異性単鎖分子であってよい。上述のように、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を連結することによって作製される。第１世代ＣＡＲは典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ζ‐鎖からの細胞内ドメインを有していた。第２世代ＣＡＲは、Ｔ細胞に更なるシグナルを供給するために、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ等）からＣＡＲの細胞質側末端への、更なる細胞内シグナリングドメインを有していた。第３世代ＣＡＲは、効力を更に増強するために、ＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐ＯＸ４０といった複数のシグナリングドメインを併せ持っている（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
本発明のＣＡＲの細胞内ドメインは好ましくは：４１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ｂ２ｃ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８ｍｕｔ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ８‐ＣＤ３ζ、ＦｃeＲＩγ、ＦｃεＲＩγＣＡＩＸ、へレグリン‐ＣＤ３ζ、ＩＬ‐１３‐ＣＤ３ζ、又はＬｙ４９Ｈ‐ＣＤ３ζのうちのいずれの細胞内ドメインから選択される（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
ＩＩＩ．二重特異性抗体及び多重特異性ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエプトープ結合ドメインのうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種にのみ結合できる（即ちこれらは単一特異性である）が、これらは上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
抗体の官能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体系分子を生成することによって、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関して更に高い価数（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体系分子を生成することによって、増強できる。
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号；国際公開第２００９／１３２８７６号；国際公開第２００８／００３１０１３号；国際公開第２００７／１４６９６８号；国際公開第２００９／０１８３８６号；国際公開第２０１２／００９５４４号；国際公開第２０１３／０７０５６５参照）、その殆どは、更なるエピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合断片（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号；国際公開第２００６／１０７７８６号；国際公開第２００６／１０７６１７号；国際公開第２００７／０４６８９３号）。国際公開第２０１３／１７４８７３号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を開示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。国際公開第２０１３／１６３４２７号、及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを含む融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。国際公開第２０１０／０２８７９７号；国際公開第２０１００２８７９６号；及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃドメインが追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。国際公開第２０１４／０２２５４０号；国際公開第２０１３／００３６５２号；国際公開第２０１２／１６２５８３号；国際公開第２０１２／１５６４３０号；国際公開第２０１１／０８６０９１号；国際公開第２００８／０２４１８８号；国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／０７５２７０号；国際公開第１９９８／００２４６３号；国際公開第１９９２／０２２５８３号；及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.);米国特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
ダイアボディの設計は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインが短い連鎖ペプチドを用いて連結されている、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）の構造に基づく。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）の提供は、異なるエピトープを発現する異なる複数の細胞を共連結及び／若しくは共存させるために十分な「トランス（trans）」結合能力、並びに／又は同一の細胞が発現する異なる複数の分子を共連結及び／又は共存させるために十分な「シス（cis）」結合能力を含むがこれに限定されない、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）は、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225）。
二重特異性ダイアボディを産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞毒性Ｔ細胞と、疾患抗原を発現する癌細胞又は病原体感染細胞等の標的細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Sloan et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233）。あるいは又は更に、二重特異性ダイアボディを（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結ドメインを含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現される、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ等といったいずれの免疫細胞の表面決定因子を対象としてよい。特に、免疫エフェクタ細胞上に存在する細胞表面受容体を対象とするエピトープ結合ドメインは、標的転換細胞殺滅を仲介できる多重特異性結合分子の生成に有用である。
しかしながら、上述の二重特異性ダイアボディの利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止する（即ちホモ二量体化を防止する）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）（Dual Affinity Re-Targeting）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号、並びにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ又は複数のペアを互いに共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号参照）、また本明細書中で提供される。
二重特異性又は４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、「ＢｉＴＥ」とも呼ばれる、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ分子（例えば国際公開第１９９３／１１１６１号；及び国際公開第２００４／１０６３８１号参照）並びに「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体（例えば米国公開特許第２０１１-０２０６６７２号；欧州公開特許第２３７１８６６号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）を含むが、これに限定されない。ＢｉＴＥは、タンデム結合されたｓｃＦｖを含む単一のポリペプチド鎖から形成され、またＴａｎｄＡｂは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される。
本発明は、疾患抗原を発現する標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる二重特異性結合分子を提供する。このような二重特異性結合分子は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合でき、これらのエピトープは互いに同一ではない。このような二重特異性分子は、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、及び第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインを含む。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第２の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在又は配向のみに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの１つは、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）のエピトープであり、また他のエピトープは、疾患抗原（例えば癌抗原又は病原体関連抗原）のエピトープである。特定の実施形態では、二重特異性分子は、３つ以上のエピトープ結合部位を含む。本発明は特に、本明細書中で提供される方法のうちのいずれかを用いて生成される、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、抗体及びＴａｎｄＡｂを包含する。
Ａ．Ｆｃドメインを含まないダイアボディ
一実施形態では、本発明のダイアボディは二重特異性であり、第１及び第２のエピトープ両方に結合できるドメインを含むことになるが、Ｆｃドメインを含まず、従ってＦｃγＲ分子には結合できない。二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬエヒ゜トーフ゜1又はＶＬエヒ゜トーフ゜2）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜1を含有する場合は）第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜2を含有する場合は）第１のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬエヒ゜トーフ゜1又はＶＬエヒ゜トーフ゜2；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（即ちＶＨエヒ゜トーフ゜1又はＶＨエヒ゜トーフ゜2；及び上記ＶＨドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。ある特定のエピトープに対して特異的な、採用されるＶＬ及びＶＨドメインは、好ましくは同一のモノクローナル抗体から得られる、又は同一のモノクローナル抗体に由来する。しかしながらこれらのドメインは、これらのドメインが会合して、上記エピトープに免疫特異的に結合できる官能性結合部位を形成する場合、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。このような異なる抗体は、本明細書では「対応する（corresponding）」抗体と呼ばれる。
第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、上記エピトープのうちの１つ（例えば第１のエピトープ）に対して特異的な第１の官能性エピトープ結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、他方のエピトープ（即ち第２のエピトープ）に対して特異的な第２の官能性エピトープ結合部位を形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、第１のエピトープ及び第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらが合わせて、ＶＬエヒ゜トーフ゜1／ＶＨエヒ゜トーフ゜1及びＶＬエヒ゜トーフ゜2／ＶＨエヒ゜トーフ゜2を含む）ように、調整される。
最も好ましくは、介在スペーサペプチド（即ち上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる「リンカー１」）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ又は複数のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列GGCGGG（配列番号１５）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号１６）、LGGGSG（配列番号１７）、GGGSGGGSGGG（配列番号１８）、ASTKG（配列番号１９）、LEPKSS（配列番号２０）、APSSS（配列番号２１）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号２２）又はVEPKSC（配列番号２３）又はAEPKSC（配列番号２４）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号２５）又はFNRGEC（配列番号２６）であってもよい（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号２７：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）、又はリシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号２８：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）とを含む。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連付けが促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ又は複数のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２９）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３０）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号３１）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号３１の「脱免疫化（deimmunized）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP（配列番号３２）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号３３）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号３４）を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号１６：GGGSである。
Ｂ．Ｆｃドメインを含むダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃドメインを含む第１及び第２のエピトープ（即ち同一の抗原分子の異なるエピトープ、又は異なる抗原である分子のエピトープ）に同時に結合できる、多重特異性ダイアボディ（例えば二重特異性、三重特異性、四重特異性等）に関する。このような分子のＦｃドメインは、いずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよい。上記分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインを含んでよい。ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが存在する場合、これらはいずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃドメインと同一のアイソタイプのものである。
上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃドメインが形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。このようなダイアボディは、ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、第１のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成できる配列を有する、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号２２）、VEPKSC（配列番号２３）又はAEPKSC（配列番号２４）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号２５）又はFNRGEC（配列番号２６）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２７：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号２８：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号２９：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号３０：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を含むペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディ分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含み、任意にＩｇＧヒンジドメインの全体又は一部分（好ましくはＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号１６）、LGGGSG（配列番号１７）、GGGSGGGSGGG（配列番号１８）、ASTKG（配列番号１９）、LEPKSS（配列番号２０）、APSSS（配列番号２１）、APSSSPME（配列番号３５）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３６）、LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３７）、DKTHTCPPCP（配列番号３８）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりにLEPKSS（配列番号２０）を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又はLEPKSS（配列番号２０）の直後にDKTHTCPPCP（配列番号３８）を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号３９）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号４０）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジドメインを組み込んでよい。例示的なヒンジドメインとしては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号４）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号５）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号６）；及び鎖交換を低減するための安定化Ｓ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号７）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表１に提示する。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、２つの第１のエピトープ結合部位及び２つの第２のエピトープ結合部位を含む。
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１又は第２のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合部位、及び上記エピトープ農地のもう一方に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位を形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃ領域含有ダイアボディは、２つの配向（表２）のうちのいずれを有してよい。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１又は第２のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び上記エピトープのうちのもう一方に対して特異的に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位を含む。
更なる実施形態では、上記Ｆｃドメイン含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメインを形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃドメインを形成する。このような多重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、多価ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表３に示す。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な２つのエピトープ結合ドメインを有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な３つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な１つのエピトープ結合部位を含む。上述のように、ＶＬ及びＶＨドメインは、三重特異性結合が可能となるように選択してよい。従って本発明は、三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディも包含する。本発明の三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、第２の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第３のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合部位を含む。
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号８）、ＩｇＧ２（配列番号９）、ＩｇＧ３（配列番号１０）及びＩｇＧ４（配列番号１１）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
Ｆｃドメインの修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃドメイン含有結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、Ｆｃドメイン仲介型エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
従って特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、操作された可変Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表４は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、単一、二重、三重、四重及び五重置換のリスト（（ＥＵインデックスに従った）番号付与及び置換は、上で提示した配列番号８のアミノ酸配列に対するものである）を示す。
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。
特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子のＦｃドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号８）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、ＡＤＣＣエフェクタ機能が低下したＩｇＧ Ｆｃドメインを含む。ある好ましい実施形態では、このような結合分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ、３つ又は４つを含む。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号８）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃドメインのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号９）又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン（配列番号１１）を含む。ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号７参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号４１）：
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ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃドメインの結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（half-life）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被検体の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って（野生型Ｆｃドメインを含む場合に対して）増大した半減期を有する、変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ又は複数の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む、変異型ＩｇＧ Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメイン含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。
いくつかの実施形態では、半減期が増強された本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃドメインを有する。ある具体的実施形態では、上記分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ Ｆｃ領域を有してよい。
ある好ましい実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲ結合を変化させる、１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ又は複数の突然変異
を含む可変Ｆｃドメインを有する、上記結合分子を包含する。
アミノ酸配列が異なる複数のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖を有することが望まれる（例えばＦｃドメイン含有第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではないことが望まれる）特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３のドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
好ましいノブは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃドメイン含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持第３のポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
本発明のＦｃドメイン含有分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧアミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号４２）：
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を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
２つのポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖）を有する、本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧアミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号４３）：
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を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
後に記載されるように、配列番号４２及び配列番号４３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号８）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃドメインのエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ又は複数の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
第１のポリペプチド鎖が、配列番号４２のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４３）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４２）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃドメイン含有結合分子を包含する。
ＩＶ．Ｆｃドメインを含有する３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープ（ここで上記エピトープのうちの少なくとも１つは、別のエピトープと同一ではない）に同時に結合できるＦｃドメインを含む、三重特異性３価結合性分子に関する。このような三重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合ドメインを含み、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びに国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。このような３価結合分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価結合分子の「第３の」エピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、上述のように、ダイアボディ中に存在するエピトープ結合のタイプである。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合ドメインである。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合部位しか含まないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を含むという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合ドメインしか含まないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（dividing）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｃ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。３価結合分子の生成に有用なＣＨ２及びＣＨ３ドメインは上述されており、ノブ担持及びホール担持ドメインを含む。
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表４（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１４）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ又は複数の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合部位を形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４４）を有する。
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって単一特異性、二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が第１のエピトープに対する２つの結合部位及び第２のエピトープに対する１つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位及び第２のエピトープに対する２つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位、第２のエピトープに対する１つの結合部位及び第３のエピトープに対する１つの結合部位、を含むように選択される。
本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表５で提供する。
上述のように、このような３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
Ｖ．本発明の実施形態
上述のように、本発明は：
（１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子；及び
（２）標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばダイアボディ、ＢｉＴｅ、二重特異性抗体等）
の投与を含む、癌を治療するための併用療法を対象とする。
本発明はまた、１つ又は複数の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
本明細書中で使用される場合、用語「投与（administration）」は、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドの結合と、標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅との両方をレシピエントに提供するための、ある相対投薬量での、時間的に近接した、上記分子の提供に関する。
ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子に関して、本発明は特に、ＰＤ‐１の阻害活性を阻害する（即ちこれをブロックする又はこれに干渉する）ために、上記分子が、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合する能力を有する実施形態に関する。例えば上記分子はＰＤ‐１に結合することにより、細胞シグナリングを阻害し、及び／又はＰＤ‐１とＰＤ‐１の天然リガンドとの間の結合を阻害できる。あるいは上記分子は、ＰＤ‐１の天然リガンド（例えばＢ７‐Ｈ１又はＢ７‐ＤＣ）に結合することによって、上記天然リガンドの阻害活性を阻害する（即ちこれをブロックする又はこれに干渉する）ことができる。例えば上記分子は、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合することにより、細胞シグナリング及び／又は上記リガンドとＰＤ‐１との間の結合を阻害できる。一実施形態では、上記分子は単一特異性であり、従ってただ１つのエピトープ（例えばＰＤ‐１のエピトープ又はＰＤ‐１の天然リガンドのエピトープ）に結合する能力を有する。あるいは上記分子は多重特異性であってよく、即ちＰＤ‐１の２つ若しくは３つ以上のエピトープ（例えばＰＤ‐１の２、３、４若しくは５個以上のエピトープ）に結合できるか、又はＰＤ‐１の１つ又は複数の天然リガンドの２つ若しくは３つ以上の（例えば２、３、４若しくは５個以上のエピトープ）に結合できるか、又はＰＤ‐１の少なくとも１つのエピトープ及びＰＤ‐１の天然リガンドの少なくとも１つのエピトープに結合できる。あるいは上記多重特異性分子は、ＰＤ‐１の少なくとも１つのエピトープに結合でき、かつＰＤ‐１ではない異なる分子の少なくとも１つのエピトープに結合できるか、又はＰＤ‐１の天然リガンドの少なくとも１つのエピトープに結合でき、かつＰＤ‐１の天然リガンドではない異なる分子の少なくとも１つのエピトープに結合できる。好ましくは、上記異なる分子のエピトープは、免疫細胞の表面上に存在する免疫チェックポイントの調節に関与する分子のエピトープ（例えばＢ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ＣＴＬＡ‐４、ガレクチン‐９、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＫＩＲ、ＬＡＧ‐３、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ１Ｈ、ＰＶＲ、ＳＩＲＰａ、ＴＣＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡ、特にＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡ、例えば国際公開第２０１５／２００１１９号及び国際公開第２０１１／１５９８７７号を参照）である。従って例えば、上記分子は：
（１）ＰＤ‐１の単一のエピトープ；
（２）ＰＤ‐１の２つ以上のエピトープ；
（３）ＰＤ‐１の天然リガンドの単一のエピトープ；
（４）ＰＤ‐１の同一の天然リガンドの２つ以上のエピトープ；
（５）ＰＤ‐１の第１の天然リガンドの１つのエピトープ、及びＰＤ‐１の第２の天然リガンドの１つのエピトープ；
（６）ＰＤ‐１の第１の天然リガンドの２つ以上のエピトープ、及びＰＤ‐１の第２の天然リガンドの１つ又は複数のエピトープ；
（７）ＰＤ‐１の１つ又は複数のエピトープ、及びＰＤ‐１の天然リガンドの１つ又は複数のエピトープ；
（８）ＰＤ‐１の１つ又は複数のエピトープ、及び異なる分子の１つ又は複数のエピトープ；あるいは
（９）ＰＤ‐１の天然リガンドの１つ又は複数のエピトープ、及び異なる分子の１つ又は複数のエピトープ
に結合してよい。
標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子に関して、本発明は特に、上記分子が、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合部位、及び上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合部位を含む、実施形態に関する。一実施形態では、上記分子は、エフェクタ細胞の細胞表面分子のただ１つのエピトープ、及び上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のただ１つのエピトープに結合する能力を有する。あるいは、いずれの又は両方の結合特異性に関して、エフェクタ細胞の１つ又は複数の細胞表面分子の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープに結合でき、かつ１つ又は複数の疾患抗原の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープに結合できるものであってよい。
従って例えば、上記分子は：
（１）エフェクタ細胞の細胞表面分子のただ１つのエピトープ、及び上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のただ１つのエピトープ；
（２）上記エフェクタ細胞の細胞表面分子のただ１つのエピトープ、及び上記疾患抗原の２つ又は３つ以上のエピトープ；
（３）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子のただ１つのエピトープ、及び上記疾患抗原の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ、及び異なる疾患抗原の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ；
（４）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及び上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ；
（５）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及び上記疾患抗原の２つ又は３つ以上のエピトープ；
（６）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及び上記疾患抗原の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ、及び上記異なる疾患抗原の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ；
（７）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の１つ、２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及びエフェクタ細胞（これは同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の異なる細胞表面分子の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ、及び上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ；
（８）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の１つ、２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及びエフェクタ細胞（これは同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の異なる細胞表面分子の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ、及び上記疾患抗原の２つ又は３つ以上のエピトープ；あるいは
（９）上記エフェクタ細胞の上記細胞表面分子の１つ、２つ若しくは３つ以上のエピトープ、及びエフェクタ細胞（これは同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の異なる細胞表面分子の１つ、２つ又は３つ以上のエピトープ、及び上記疾患抗原の２つ又は３つ以上のエピトープ、及び上記異なる疾患抗原の２つ又は３つ以上のエピトープ
に結合してよい。
一例として、本発明は：(エフェクタ細胞の細胞表面分子としての）ＣＤ３のエピトープに免疫特異的に結合できる、第１のエピトープ結合部位；上記標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる、第２のエピトープ結合部位；及び（エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子としての）ＣＤ８のエピトープに免疫特異的に結合できる、第３のエピトープ結合部位を含む、結合分子について考察する。
表６Ａは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる本発明の例示的な分子の、可能性のある結合特異性の組み合わせを示す。表６Ｂは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンド及びＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンド以外の分子に結合できる本発明の例示的な多重特異性分子の、可能性のある結合特異性の組み合わせを示す。表７は、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の例示的な分子の、可能性のある結合特異性の組み合わせを示す。
本発明の分子によって結合され得るエピトープ又は追加のエピトープの特性については、このような追加の結合能力によって、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドの結合を阻害できる分子の上記結合が妨害されず、また標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の上記標的転換殺滅が妨害されないことを除いて、制限はない。
Ａ．ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる例示的な分子
１．ＰＤ‐１に対して免疫特異的な結合分子
ＰＤ‐１に対して免疫特異的な抗体は公知であり、本発明によるＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子（例えばダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体、ＣＡＲ、ＴａｎｄＡｂ等）として採用してよいか、上記分子として機能するよう適合させることができる（例えば米国特許出願第６２／１９８，８６７号；米国特許出願第６２／２３９，５５９号：米国特許出願第６２／２５５，１４０号；特許文献２９；特許文献３０；特許文献４４〜４６を参照）。ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる好ましい分子は、ヒトＰＤ‐１（ＣＤ２７９）の連続した又は不連続の（例えば立体配置の）部分に結合する能力を示し、また好ましくは１つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種（及び特にカニクイザル等の霊長類種）のＰＤ‐１分子への結合能力も呈する。更に望ましい抗体は、ＰＤ‐１又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマの単離によって作製してよい。代表的なヒトＰＤ‐１ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２；２０アミノ酸残基のシグナル配列（下線を付して示されている）及び２６８アミノ酸残基の成熟タンパク質を含む）は、アミノ酸配列（配列番号４５）：
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWRPGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
を含む。
ＰＤ‐１に結合するために使用してよい好ましいＰＤ‐１結合分子は、以下の基準のうちのいずれか（１つ又は複数）を特徴とする：
（１）刺激ヒトＴ細胞の表面に内在的に発現したヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（２）平衡結合定数（ＫD）４０ｎＭ以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（３）平衡結合定数（ＫD）５ｎＭ以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（４）オン速度（Ｋa）１．５×１０4Ｍ-1分-1以上でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（５）オン速度（Ｋa）９０．０×１０4Ｍ-1分-1以上でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（６）オフ速度（Ｋd）７×１０-4分-1以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（７）オフ速度（Ｋd）２×１０-4分-1以下でヒトＰＤ‐１に特異的に結合する；
（８）非ヒト霊長類ＰＤ‐１（例えばカニクイザルのＰＤ‐１）に特異的に結合する；
（９）ＰＤ‐１に対するＰＤ‐１リガンド（ＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐Ｌ２）の結合／阻害活性を阻害する（即ちブロックするか若しくはこれに干渉する）；
（１０）免疫応答を刺激する；及び／又は
（１１）抗ヒトＬＡＧ‐３抗体との相乗効果により、抗原特異性Ｔ細胞応答を刺激する。
ＰＤ‐１に結合するために使用してよい本発明の好ましいＰＤ‐１結合分子は、マウス抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３」、「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４」又は「ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５」のヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し、より好ましくは、このような抗体の、ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。本発明は特に、以下：
（Ａ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（４）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＨ１のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＬ１のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｂ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（４）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＨ１のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＬ１のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｃ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（Ｄ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（Ｅ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（Ｆ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（Ｇ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＨドメインの３つのＣＤＲH；
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＬドメインの３つのＣＤＲL；
（４）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１、又は ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ２のＶＨドメイン；
（５）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ１、又は ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ ３のＶＬドメイン；
（６）ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．１）、又は ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．２）、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．３）、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（２．１）、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（２．２）、又はｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（２．３）のＶＨ及びＶＬドメイン；
（Ｈ）（１）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＨドメインの３つのＣＤＲH;
（２）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
（３）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＨドメインの３つのＣＤＲH、及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＬドメインの３つのＣＤＲL;
を有するか、又はＰＤ‐１ ｍＡｂ １、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４若しくはＰＤ‐１ ｍＡｂ １５と同一のエピトープに結合する、若しくは結合に関して競合する、ＰＤ‐１結合ドメインを含む上記ＰＤ‐１結合分子に関する。
（ａ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWNWIRQ FPGNKLEWMG
HITYSGSTSY NPSLKSRISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCARDY
GSGYPYTLDYWGQGTSVTVS S
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲH１（配列番号４７）：NDYAWN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲH２（配列番号４８）：HITYSGSTSYNPSLKS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲH３（配列番号４９）：DYGSGYPYTLDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTCSATSIVS YVYWYQQKPG SSPQPWIYLT
SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG
TKLEIK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲL１（配列番号５１）：SATSIVSYVY
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲL２（配列番号５２）：LTSNLAS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲL３（配列番号５３）：QQWSDNPYT
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ １を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインを含む抗体を、「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １」と呼ぶ。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWNWIRQ PPGKGLEWIG
HITYSGSTSY NPSLKSRLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCARDY
GSGYPYTLDYWGQGTTVTVS S
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITCSATSIVS YVYWYQQKPG QAPQPLIYLT
SNLASGIPAR FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG
TKVEIK
（ｂ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLS
DYFDYWGQGT TLTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲH１（配列番号５７）：SFGMH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲH２（配列番号５８）：YISSGSMSISYADTVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲH３（配列番号５９）：LSDYFDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFCSQTTHVP
WTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲL１（配列番号６１）：RSSQSLVHSTGNTYLH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲL２（配列番号６２）：RVSNRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲL３（配列番号６３）：SQTTHVPWT
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインを含むいずれの抗体を、「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２」と呼ぶ。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS
DYFDYWGQGT TVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQ
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP
WTFGQGTKLE IK
（ｃ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）；
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMHWVKQT PVHGLEWIGT
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTREK
ITTIVEGTYW YFDVWGTGTT VTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲH１（配列番号６７）：DYVMH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲH２（配列番号６８）：TIDPETGGTAYNQKFKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲH３（配列番号６９）： EKITTIVEGTYWYFDV
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGDTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHLP
YTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲL１（配列番号７１）：RSSQNIVHSNGDTYLE
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲL２（配列番号７２）：KVSNRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲL３（配列番号７３）：FQGSHLPYT
（ｄ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLT
DYFDYWGQGT TLTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL１（配列番号７５）：SFGMH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL２（配列番号７６）：YISSGSMSISYADTVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL３（配列番号７７）：LTDYFDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYFHW YLQKPGQSPK
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP
WTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL１（配列番号７９）：RSSQSLVHSTGNTYFH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL２（配列番号８０）：RVSNRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲL３（配列番号８１）：SQTTHVPWT
（ｅ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMNWMKQR PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH
YGSSPFAYWG QGTLVTVSA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲH１（配列番号８３）：AYWMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲH２（配列番号８４）：VIHPSDSETWLNQKFKD
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲH３（配列番号８５）：EHYGSSPFAY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIYAASNQGSGVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FCQQSKEVPY
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲL１（配列番号８７）：RANESVDNYGMSFMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲL２（配列番号８８）：AASNQGS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲL３（配列番号８９）：QQSKEVPYT
（ｆ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PEKRLEWVAT
ISGGGSDTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCARQK
ATTWFAYWGQ GTLVTVST
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲH１（配列番号９１）：SYGMS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲH２（配列番号９２）：TISGGGSDTYYPDSVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲH３（配列番号９３）：QKATTWFAY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMNWF QQKPGQPPKL
LIYPASNQGSGVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPW
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲL１（配列番号９５）：RASESVDNYGISFMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲL２（配列番号９６）：PASNQGS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲL３（配列番号９７）：QQSKEVPWT
（ｇ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDKATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲH１（配列番号９９）：SYWMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲH２（配列番号１００）：VIHPSDSETWLDQKFKD
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲH３（配列番号１０１）：EHYGTSPFAY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGSGVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPY
TFGGGTKLEI K
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲL１（配列番号１０３）：RANESVDNYGMSFMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲL２（配列番号１０４）：AASNQGS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲL３（配列番号１０５）：QQSKEVPYT
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ１」、「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２」及び「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３」と呼ばれる３つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれが、ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合し得る。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを含むいずれの抗体を、「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２を含むヒト化抗体は、具体的に「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．２）」と呼ばれる。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWAGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGSGVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI K
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGSGVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI K
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNRGSGVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI K
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３の両方のＶＬドメインのＣＤＲL１は、アスパラギンからセリンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：RASESVDNYGMSFMN（配列番号１１１、置換されたセリンは下線を付して示されている）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
更にｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＶＬドメインのＣＤＲL２は、グルタミンからアルギニンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：AASNRGS（配列番号１１２、置換されたアルギニンは下線を付して示されている）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＣＤＲL２ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
（ｈ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVKQN HGKSLEWIGD
INPKNGDTHY NQKFKGEATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCASDF
DYWGQGTTLT VSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲH１（配列番号１１４）：DYYMN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲH２（配列番号１１５）：DINPKNGDTHYNQKFKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲH３（配列番号１１６）：DFDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQTPLS LPVGLGDQAS ISCRSSQTLV YSNGNTYLNW FLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
FTFGSGTKLE IK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲL１（配列番号１１８）：RSSQTLVYSNGNTYLN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲL２（配列番号１１９）：KVSNRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲL３（配列番号１２０）：SQSTHVPFT
（ｉ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQT PEKRLEWVAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCARYG
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲH１（配列番号１２２）：SYLVS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲH２（配列番号１２３）：TISGGGGNTYYSDSVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲH３（配列番号１２４）：YGFDGAWFAY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ９（配列番号１２５）のＶＬドメインのアミノ酸配列を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITCRASENIY SYLAWYQQKQ EKSPQLLVYN
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYCQH HYAVPWTFGG
GTRLEIT
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲL１（配列番号１２６）：RASENIYSYLA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲL２（配列番号１２７）：NAKTLAA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲL３（配列番号１２８）： QHHYAVPWT
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ１」及び「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ１」及び「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２」と呼ばれる２つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれが、ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合し得る。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを含むいずれの抗体を、一般に「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９」と呼び、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを、具体的なＶＨ／ＶＬドメインに対する参照によって呼称する。例えばｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ１及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２を含むヒト化抗体は、具体的に「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９（１．２）」と呼ばれる。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARYG
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVGWVRQA PGKGLEWTAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCARYG
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ２のＶＨドメインのＣＤＲH１は、セリンからグリシンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：SYLVG（配列番号１３１、置換されたグリシンは下線を付して示されている）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＣＤＲH１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ
GTKLEIK
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ
GTKLEIK
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL１は、セリンからアスパラギンへのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：RASENIYNYLA（配列番号１３４、置換されたアスパラギンは下線を付して示されている）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＣＤＲL１ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＶＬドメインのＣＤＲL２は、アスパラギンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換を含み、アミノ酸配列：DAKTLAA（配列番号１３５、置換されたアスパラギン酸は下線を付して示されている）を有する。同様の置換は、上述のＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＣＤＲL２ドメインのいずれにも組み込むことができると考えられる。
（ｊ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMSWVRQT PEKRLEWVAS
ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCARQE
LAFDYWGQGT TLTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲH１（配列番号１３７）：NYLMS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲH２（配列番号１３８）：SISGGGSNIYYPDSVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲH３（配列番号１３９）：QELAFDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRTSQDIS NFLNWYQQKP DGTIKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GSTLPWTFGG
GTKLEII
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲL１（配列番号１４１）：RTSQDISNFLN
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲL２（配列番号１４２）：YTSRLHS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲL３（配列番号１４３）：QQGSTLPWT
（ｋ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMHWVKQR PGQGLKWMGA
IYPGNSDTHY NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTTGT
YSYFDVWGTG TTVTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲH１（配列番号１４５）：GYWMH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲH２（配列番号１４６）：AIYPGNSDTHYNQKFKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲH３（配列番号１４７）：GTYSYFDV
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TSIHWYQHRT NGSPRLLIKY
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SNSWLTFGAG
TKLELK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲL１（配列番号１４９）：RASQSIGTSIH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲL２（配列番号１５０）：YASESIS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲL３（配列番号１５１）：QQSNSWLT
（ｌ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMHWVKQT PVHGLEWIGT
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSRER
ITTVVEGAYW YFDVWGTGTT VTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲH１（配列番号１５３）：DYEMH
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲH２（配列番号１５４）：TIDPETGGTAYNQKFKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲH３（配列番号１５５）：ERITTVVEGAYWYFDV
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLICKVSTRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
YTFGGGTKLE IK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲL１（配列番号１５７）：RSSQNIVHSNGNTYLE
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲL２（配列番号１５８）：KVSTRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲL３（配列番号１５９）：FQGSHVPYT
（ｍ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMSWVRQT PEKRLEWVAT
ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCARQA
YYGNYWYFDVWGTGTTVTVS S
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲH１（配列番号１６１）：SHTMS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲH２（配列番号１６２）：TISGGGSNIYYPDSVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲH３（配列番号１６３）：QAYYGNYWYFDV
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYCQQ LDSIPWTFGG
GTKLEIK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲL１（配列番号１６５）：LASQTIGTWLA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲL２（配列番号１６６）：AATSLAD
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲL３（配列番号１６７）：QQLDSIPWT
（ｎ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWITWVKQR PGQGLQWIGN
IYPGTDGTTY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCATGL
HWYFDVWGTG TTVTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲH１（配列番号１６９）：SYWIT
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲH２（配列番号１７０）：NIYPGTDGTTYNEKFKS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲH３（配列番号１７１）：GLHWYFDV
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQSVG TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASSRFSGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNSYPYTFGG
GTKLEIK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲL１（配列番号１７３）：KASQSVGTNVA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲL２（配列番号１７４）：SASSRFS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲL３（配列番号１７５）：QQYNSYPYT
（ｏ）ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLISWVRQT PEKRLEWVAA
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTRRG
TYAMDYWGQG TSVTVSS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲH１（配列番号１７７）：SYLIS
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲH２（配列番号１７８）：AISGGGADTYYADSVKG
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲH３（配列番号１７９）：RGTYAMDY
マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYCQQ LYSIPWTFGG
GTKLEIK
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲL１（配列番号１８１）：LASQTIGTWLA
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲL２（配列番号１８２）：AATSLAD
ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲL３（配列番号１８３）：QQLYSIPWT
上述のマウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５を、抗原エピトープが識別された場合にヒト化し、更に脱免疫化して、ヒトレシピエントへの投与時にその抗原性を低減するための抗ヒトＰＤ‐１抗体のヒト化の能力を実証した。ヒト化により、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＨ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＨドメインと、ここでは「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＬ１」と呼ばれる１つのヒト化ＶＬドメインとが得られた。上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ＶＬドメインを含む抗体を「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５」と呼ぶ。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１８４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAA
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRG
TYAMDYWGQG TLVTVSS
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKAPKLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYCQQ LYSIPWTFGQ
GTKLEIK
（ｐ）更なる抗ＰＤ‐１抗体
ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子の生成に有用な代替的な抗ＰＤ‐１抗体は、抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４‐９４‐４；５Ｃ４、ＢＭＳ‐９３６５５８、ＯＮＯ‐４５３８、ＭＤＸ‐１１０６としても公知；Bristol‐Myers SquibbがＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販）；ペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブとして公知）；ＣＡＳ登録番号：１３７４８５３‐９１‐４；ＭＫ‐３４７５、ＳＣＨ‐９００４７５としても公知；MerckがＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）として市販）；ＥＨ１２．２Ｈ７（Dana Farber）；ピジリズマブ（ＣＡＳ登録番号：１０３６７３０‐４２‐３；ＣＴ‐０１１としても公知、CureTech,）、又は表８中の抗ＰＤ‐１抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、これらの抗ＰＤ‐１モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。ニボルマブ（WHO Drug Information, 2013, Recommended INN: List 69, 27(1):68-69）、ペンブロリズマブ（WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 75, 28(3):407）及びピジリズマブ（WHO Drug Information, 2013, Recommended INN: List 70, 27(3):303-304）の完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である。本発明の方法及び組成物において有用な、独自の結合特性を有する更なる抗ＰＤ‐１抗体は、近年同定されている（米国特許出願第６２／１９８，８６７号；米国特許出願第６２／２３９，５５９号；米国特許出願第６２／２５５，１４０号を参照）。
（ｑ）例示的なＩｇＧ４ ＰＤ‐１抗体
特定の実施形態では、本発明の方法及び組成物において有用な抗ＰＤ‐１抗体は、上で提示した抗体のうちのいずれ（例えばＰＤ‐１ ｍＡｂ １、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８等、又は表６の抗ＰＤ‐１抗体のうちのいずれ）の、ＶＬ及びＶＨドメイン、κＣＬドメイン（配列番号１２）、及びＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み、任意にＣ末端リシン残基を含まない。このような抗体は好ましくは、ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）及びヒンジドメインを含み、より好ましくはＳ２２８Ｐ置換を含む安定化ＩｇＧ４ヒンジ（ここで番号付与はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるものである；配列番号７）及びＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号７）を含む。
「ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）」と呼ばれる例示的な抗ＰＤ‐１抗体は、ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体である。上述のように、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．２）は、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１のＶＨドメイン及び抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２のＶＬドメインを含む。
ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７ （１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の完全重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８６である（ＣＤＲH残基及びＳ２２８Ｐ残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY
TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL
MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL
PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD
GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
配列番号１８６では、残基１〜１１９は、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１のＶＨドメイン（配列番号１０６）に対応し、アミノ酸残基１２０〜２１７は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）に対応し、アミノ酸残基２１８〜２２９は、Ｓ２２８Ｐ置換を含むヒトＩｇＧ４ヒンジドメインに対応し（配列番号７）、アミノ酸残基２３０〜２４５は、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号１１、Ｘは不在）に対応する。
抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の完全軽鎖のアミノ酸配列は、κ定常領域を有し、これは（配列番号１８７）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
配列番号１８７では、アミノ酸残基１〜１１１は、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２のＶＬドメイン（配列番号１０９）に対応し、アミノ酸残基１１２〜２１８は、軽鎖κ定常領域（配列番号１２）に対応する。
ＩｇＧ４定常領域を有する他の例示的な抗ＰＤ‐１抗体は、ヒト抗体であるニボルマブ、及びヒト化抗体であるペンブロリズマブである。これらはそれぞれ上述のように、κＣＬドメイン、ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン、安定化ＩｇＧ４ヒンジ、及びＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含む。
（ｒ）ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に結合できる例示的な二重特異性分子
上述のように、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子は、二重特異性分子であってよい。特定の実施形態では、二重特異性分子は好ましくは、上述の抗ＰＤ‐１抗体（例えばＰＤ‐１ ｍＡｂ １、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８等、又は表６の抗ＰＤ‐１抗体のうちのいずれか）のいずれかのＶＬ及びＶＨドメインと、ＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープに結合できる抗体のＶＬ及びＶＨドメインとを含む。このような二重特異性分子は、ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、二重特異性抗体、又は３価結合分子であってよい。
「ＤＡＲＴ‐１」と呼ばれる、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に結合できる例示的な二重特異性分子は、４つのポリペプチド鎖を含むダイアボディである。ＤＡＲＴ‐１は、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、及びシステイン含有Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディである（例えば図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐１の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（配列番号２７４中の下線部）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１ ＶＨドメイン（配列番号１０６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２９））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号７）；アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号１１）；及びＣ末端を含む。ＤＡＲＴ‐１の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７４）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA
ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
である。
ＤＡＲＴ‐１の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２のＶＬドメイン（配列番号１０９）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号１４））；ＬＡＧ‐３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（配列番号２７５中の下線部）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号１５））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３０）；及びＣ末端を含む。ＤＡＲＴ‐１の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７５）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
「ＤＡＲＴ‐２」と呼ばれる、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に結合できる別の例示的な二重特異性分子は、ＤＡＲＴ‐１と同一の構造を有するものの、異なるＬＡＧ‐３ ＶＬ及びＶＨドメインを組み込んでいる。
２．ＰＤ‐１の天然リガンドに対して免疫特異的な結合分子
上述のように、ＰＤ‐１の天然リガンド、例えばＢ７‐Ｈ１（ＰＤ‐Ｌ１）及びＢ７‐ＤＣ（ＰＤ‐Ｌ２）が既に記述されている（Ohigashi et al. (2005) “Clinical Significance Of Programmed Death-1 Ligand-1 And Programmed Death-1 Ligand-2 Expression In Human Esophageal Cancer,” Clin. Cancer Res. 11:2947-2953; Dong, H. et al. (1999) “B7-H1, A Third Member Of The B7 Family, Co-Stimulates Cell Proliferation And Interleukin-10 Secretion,” Nat. Med. 5:1365-1369; Freeman, G.J. et al. (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation,” J. Exp. Med. 192:1027-1034; Tseng, S.Y. et al. (2001) “B7-DC, A New Dendritic Cell Molecule With Potent Costimulatory Properties For T Cells,” J. Exp. Med 193:839-846; Latchman, Y. et al. (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation,” Nat. Immunol. 2:261-268; Iwai et al. (2002) “Involvement Of PD-L1 On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 99:12293-12297）。
代表的なヒトＢ７‐Ｈ１（ＰＤ‐Ｌ１）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、予想された１８アミノ酸シグナル配列を含む）は、アミノ酸配列（配列番号１８８）：
MRIFAVFIFM TYWHLLNAPY NKINQRILVV DPVTSEHELT CQAEGYPKAE
VIWTSSDHQV LSGKTTTTNS KREEKLFNVT STLRINTTTN EIFYCTFRRL
DPEENHTAEL VIPELPLAHP PNERTHLVIL GAILLCLGVA LTFIFRLRKG
RMMDVKKCGI QDTNSKKQSD THLEET
を有する。
代表的なヒトＢ７‐ＤＣ （ＰＤ‐Ｌ２）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿０７９５１５．２、予想された１８アミノ酸シグナル配列を含む）は、アミノ酸配列（配列番号１８９）：
MIFLLLMLSL ELQLHQIAAL FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV
NLGAITASLQ KVENDTSPHR ERATLLEEQL PLGKASFHIP QVQVRDEGQY
QCIIIYGVAW DYKYLTLKVK ASYRKINTHI LKVPETDEVE LTCQATGYPL
AEVSWPNVSV PANTSHSRTP EGLYQVTSVL RLKPPPGRNF SCVFWNTHVR
ELTLASIDLQ SQMEPRTHPT WLLHIFIPFC IIAFIFIATV IALRKQLCQK
LYSSKDTTKR PVTTTKREVN SAI
を有する。
Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣは、アミノ酸配列の３４％の相同性を共有しているが、これらの発現は異なる様式で調節されることが示唆されている（Youngnak, P. et al. (2003) “Differential Binding Properties Of B7-H1 And B7-DC To Programmed Death-1,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:672-677; Loke, P. et al. (2003) “PD-L1 And PD-L2 Are Differentially Regulated By Th1 And Th2 Cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:5336-5341）。ＰＤ‐Ｌ１は、抗原特異的Ｔ細胞クローンのアポトーシスを増大させることによって、腫瘍免疫においてある役割を果たすことが示唆されている（Dong et al. (2002) “Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion,” Nat Med 8:793-800）。また、Ｂ７‐Ｈ１が腸粘膜炎症に関与している可能性があり、Ｂ７‐Ｈ１の阻害によって、大腸炎に関連する消耗性疾患が抑制されることも示唆されている（Kanai et al. (2003) “Blockade Of B7-H1 Suppresses The Development Of Chronic Intestinal Inflammation,” J. Immunol. 171:4156-4163）。Ｂ７‐Ｈ１発現は、ヒト肺癌、卵巣癌及び結腸癌、並びに黒色腫において報告されている（Dong et al. (2002) “Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion,” Nat Med 8:793-800）。一方、腫瘍におけるＢ７‐ＤＣの機能は大半が未知のままである（Liu, X. et al. (2003) “B7-DC/PD-L2 Promotes Tumor Immunity By A PD-1-Independent Mechanism,” J. Exp. Med. 197:1721-1730; Radhakrishnan, S. et al. (2004) “Immunotherapeutic Potential Of B7-DC (PD-L2) Cross-Linking Antibody In Conferring Antitumor Immunity,” Cancer Res 64:4965-4972）。癌細胞上でのＢ７‐ＤＣ発現は、抗腫瘍免疫の誘導期及びエフェクタ期の両方においてＣＤ８ Ｔ細胞仲介型拒絶反応を促進することが示されている（Liu, X. et al. (2003) “B7-DC/PD-L2 Promotes Tumor Immunity By A PD-1-Independent Mechanism,” J. Exp. Med. 197:1721-1730）。
抗Ｂ７‐Ｈ１抗体は、上述のＢ７‐Ｈ１アミノ酸配列を有するタンパク質を免疫原として用いて得ることができる。あるいは、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子の生成に有用な抗Ｂ７‐Ｈ１抗体は、抗ヒトＢ７‐Ｈ１抗体アテゾリズマブ（ＣＡＳ登録番号：１３８０７２３‐４４‐３；ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても公知）、デュルバルマブ（ＣＡＳ登録番号：１４２８９３５‐６０‐７；ＭＥＤＩ‐４７３６としても公知）、アベルマブ、ＭＤＸ１１０５（ＣＡＳ登録番号：１５３７０３２‐８２‐８；ＢＭＳ‐９３６５５９、５Ｈ１としても公知）；（米国特許第９，２７３，１３５号、米国特許第９，０６２，１１２号、米国特許第８，９８１，０６３号、米国特許第８，７７９，１０８号、米国特許第８，６０９，０８９号及び米国特許第８，４６０，９２７号；McDermott, D.F. et al. (2016) “Atezolizumab, an Anti-Programmed Death-Ligand 1 Antibody, in Metastatic Renal Cell Carcinoma: Long-Term Safety, Clinical Activity, and Immune Correlates From a Phase Ia Study,” J. Clin. Oncol. 34(8):833-842; Antonia, S. et al. (2016) “Safety And Antitumour Activity Of Durvalumab Plus Tremelimumab In Non-Small Cell Lung Cancer: A Multicentre, Phase 1b Study,” Lancet Oncol. 17(3):299-308; Boyerinas, B. et al. (2015) “Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activity of a Novel Anti-PD-L1 Antibody Avelumab (MSB0010718C) on Human Tumor Cells,” Cancer Immunol Res. 3(10):1148-1157; Katy, K. et al. (2014) “PD-1 And PD-L1 Antibodies For Melanoma,” Hum. Vaccin. Immunother. 10(11):3111-3116; Voena, C. et al. (2016) “Advances In Cancer Immunology And Cancer Immunotherapy,” Discov. Med. 21(114):125-133も参照）の、並びに／又は市販の抗体（例えばウサギ抗ヒトＰＤＬ‐１モノクローナル、１：２５、クローンＳＰ１４２；Ventana（アリゾナ州トゥーソン）の、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有してよい。
本発明に従って使用してよい例示的な抗ヒトＢ７‐Ｈ１抗体としては、アテゾリズマブ、デュルバルマブ及びアベルマブが挙げられる。アテゾリズマブ（WHO Drug Information、2015、Recommended INN: List 74、29(3):387）、デュルバルマブ（WHO Drug Information、2015、Recommended INN: List 74、29(3):393-394）及びアベルマブ（WHO Drug Information、2016、Recommended INN: List 74、30(1):100-101）の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である。
抗Ｂ７‐ＤＣ抗体は同様に、上述のＢ７‐ＤＣアミノ酸配列を有するタンパク質を免疫原として用いて得ることができる。あるいは、上述の抗Ｂ７‐ＤＣ抗体（例えば２Ｃ９、ＭＩＨ１８等）又は市販の抗Ｂ７‐ＤＣ抗体（例えばMIH18、Affymetrix eBioscience）を、本発明に従って採用してよい（米国特許出願公開第２０１５／０２９９３２２号；Ritprajak, P. et al. (2012) “Antibodies Against B7-DC With Differential Binding Properties Exert Opposite Effects,” Hybridoma (Larchmt). 31(1):40-47; Tsushima, F. et al. (2003) “Preferential Contribution Of B7-H1 To Programmed Death-1-Mediated Regulation Of Hapten-Specific Allergic Inflammatory Responses,” Eur. J. Immunol. 33(10):2773-2782を参照）。
本発明に従って使用してよい例示的な抗ヒト抗Ｂ７‐ＤＣ抗体は、市販の抗Ｂ７‐ＤＣ抗体ＭＩＨ１８（eBioscience, Inc.）である。
Ｂ．標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子
標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞)の標的転換殺滅を仲介する能力を有する、本発明の分子は、好ましくは２つの結合親和性を有する。第１には、上記分子は、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合する能力を有する。第２には、上記分子は、標的細胞の表面上に配列された疾患抗原（例えば癌抗原又は病原体関連抗原）のエピトープに免疫特異的に結合する能力を有する。両方の結合親和性が合わせて存在することは、標的細胞の部位にエフェクタ細胞を局在化させる（即ちエフェクタ細胞を「標的転換（redirect）」させる）役割を果たし、従ってこれは、標的細胞の殺滅を仲介する。上述のように、このような分子は二重特異性であってよく、又は３つ以上のエピトープに結合できるものであってよい。
１．エフェクタ細胞の例示的な細胞表面分子
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクタ細胞（effector cell）」は、標的細胞（例えば外来細胞、感染細胞又は癌細胞）の殺滅を直接的又は間接的に仲介する細胞を指す。エフェクタ細胞の例としては、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞（抗体分泌Ｂ細胞）、マクロファージ及び顆粒球が挙げられる。このような細胞の好ましい細胞表面分子としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄ受容体が挙げられる。従って、上記分子のエピトープに、又は他のエフェクタ細胞表面分子に免疫特異的に結合できる分子を、本発明の原理に従って使用してよい。標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の構築にＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を、以下に提供する。
（ａ）ＣＤ２結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ２のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ２に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ２抗体「ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａ」が挙げられる。
ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号１９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号１９１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ
PLIYLVSKLESGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP
YTFGAGTKLE LK
（ｂ）ＣＤ３結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ３のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ３に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ３抗体「ＣＤ３ ｍＡｂ １」及び「ＯＫＴ３」が挙げられる。抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １は、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）に結合できる。
ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
このような抗体の好ましい変異型は「ＣＤ３ ｍＡｂ １（Ｄ６５Ｇ）」と呼ばれ、Ｄ６５Ｇ置換を有するＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＨドメイン（Ｋａｂａｔ６５位、配列番号１９２の残基６８に対応）と、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１９３）とを含む。ＣＤ３ ｍＡｂ １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、置換位置（Ｄ６５Ｇ）は二重下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
あるいは、ＣＤ３ ｍＡｂ １の親和性変異型を採用してよい。変異型としては、「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｌｏｗ」と呼ばれる低親和性変異型、及び「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｆａｓｔ」と呼ばれる、オフレートが速い変異型が挙げられる。ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｌｏｗ及びＣＤ３ ｍＡｂ １ ＦａｓｔそれぞれのＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に提供する。
抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ １ ＬｏｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ １ ＦａｓｔのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１９３）は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｌｏｗ及び ＣＤ３ ｍＡｂ１ Ｆａｓｔと共通であり、既に提供されている。
利用してよい別の抗ＣＤ３抗体は、抗体ムロモナブ‐ＣＤ３「ＯＫＴ３」である（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678）。
ＯＫＴ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY
DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQWSSNPFTFGSG
TKLEINR
利用してよい更なる抗ＣＤ３抗体としては、国際公開第２００８／１１９５６６号及び国際公開第２００５／１１８６３５号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｃ）ＣＤ８結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ８のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ８に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」及び「ＴＲＸ２」が挙げられる。
（ｉ）ＯＫＴ８
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２００）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV
LIYLASNLESGVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY
TFGGGTKLEI KR
（ｉｉ）ＴＲＸ２
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDSWGQGTLVTVS S
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIK
（ｄ）ＣＤ１６結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ１６のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ１６に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ１６抗体「３Ｇ８」及び「Ａ９」が挙げられる。ヒト化Ａ９抗体は、国際公開第０３／１０１４８５号に記載されている。
（ｉ）３Ｇ８
３Ｇ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL
AHIWWDDDKRYNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI
NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
３Ｇ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLESGIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY
TFGGGTKLEI K
（ｉｉ）Ａ９
Ａ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD
IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA
SWYFDVWGAR TTVTVSS
Ａ９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG
LIGHTNNRAPGVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW
VFGGGTKLTVL
利用してよい更なる抗ＣＤ１９抗体としては、国際公開第０３／１０１４８５号及び国際公開第２００６／１２５６６８号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｅ）ＴＣＲ結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＴＣＲのエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＴＣＲ抗体「ＢＭＡ０３１」が挙げられる（欧州特許第０４０３１５６号；Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366-4373）。
ＢＭＡ０３１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY
INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS
YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
ＢＭＡ０３１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG
TKLEIK
（ｆ）ＮＫＧ２Ｄ結合能
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＮＫＧ２Ｄ受容体のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体「ＫＹＫ‐１．０」及び「ＫＹＫ‐２．０」が挙げられる（Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156；及びＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１）。
（ｉ）ＫＹＫ‐１．０
ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD
DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVWDDNNDEWVFG
GGTQLTVL
（ｉｉ）ＫＹＫ‐２．０
ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
GLGDGTYFDYWGQGTTVTVS S
ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCAAWDDSLNGPV
FGGGTKLTVL
Ｃ．癌細胞の表面上に配列された例示的な癌抗原
本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原（cancer antigen）は、癌細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫変調分子によって治療され得る、抗原を指す。癌抗原の例としては、限定するものではないが：結腸癌、胃癌ムチンにおいて確認される１９．９；４．２；Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. (2006), “In vitro and in vivo Characterization of 177Lu-huA33: A Radioimmunoconjugate Against Colorectal Cancer,” Nucl Med Biol. 33(8):991-998）；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；胃癌において確認されるＡＨ６；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；ＡＰＯ‐１（悪性ヒトリンパ球抗原）(Trauth, B.C. et al.(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304);Ｂｌ（Egloff, A.M. et al. (2006), “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer,” Cancer Res. 66(l):6-9）；Ｂ７‐Ｈ３（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7）. Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. 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更なる癌抗原及びこれらに結合する分子（例えば抗体）は、表１０に開示されている。５ Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１２３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２、ＲＯＲ１、及びＶＥＧＦは、本発明の特に好ましい「癌抗原」である。
Ｄ．癌抗原に結合できる例示的な抗体
癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子を構成するために、ＶＨ及びＶＬドメインを使用できる、例示的な抗体は、上の表１０に列挙されており、癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子を構成するために使用できる更なる抗体を以下に提供する。
１．Ｂ７‐Ｈ３に結合する抗体
Ｂ７‐Ｈ３は、多種多様な固形腫瘍に過剰発現する癌抗原であり、免疫調節に関与する分子のＢ７ファミリーのメンバーである（米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第２０１４／０３２８７５０号；米国特許第２０１３／０１４９２３６号；Loo, D. et al. (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845を参照）。特に、ヒト悪性癌細胞（例えば神経芽細胞腫並びに胃癌、卵巣癌及び非小細胞肺癌の癌細胞）が、Ｂ７‐Ｈ３タンパク質の発現の顕著な増大を示すこと、並びにこの発現の増大が、疾患の重篤度の上昇に関連することが、複数の独立した研究によって示されており（Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279）、これは、Ｂ７‐Ｈ３が免疫回避経路として腫瘍に利用されることを示唆している（Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278）。
Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を共刺激することが分かっている。Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＩＦＮ‐γ産生及びＣＤ８＋溶解活性も刺激する（Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274；非特許文献５０）。しかしながらこのタンパク質は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞に関する核内因子）、ＮＦ‐κＢ（核内因子κＢ）及びＡＰ‐１（活性化タンパク質１）因子を通してＴ細胞活性化を阻害するようにも作用する可能性がある（Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）、Ｂ７‐Ｈ３はまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７をインビボで阻害すると考えられる（Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells,” J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice,” Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）。
好ましいＢ７‐Ｈ３結合分子は、抗ヒトＢ７‐Ｈ３モノクローナル抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」、「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」若しくは「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３」、又は本明細書で提供される抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、このような抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。特に好ましいのは、「エノブリツズマブ」（ＭＧＡ２７１としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５３４８５‐３８‐７）を含むがこれに限定されないヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有するＢ７‐Ｈ３結合分子である。エノブリツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介するＦｃ最適化モノクローナル抗体である。エノブリツズマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2017、Recommended INN: List 77、31(1):49を参照）。
本発明は具体的には、Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３に結合できるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性結合分子、特に抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １、Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２若しくはＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のうちのいずれ、又は本明細書で提供されるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性結合分子のうち、又は国際公開第２０１７／０３０９２号で提供されるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性結合分子のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
（ａ）Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT
IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
本明細書において「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ１」、及び「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ２」と呼ばれるＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂの２つの例示的なヒト化ＶＨドメイン、並びに本明細書において「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ１」及び「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ２」と呼ばれるＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂの２つの例示的なヒト化ＶＬドメインを、以下に提供する。ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ２はＣＤＲL１及びＣＤＲL２中にアミノ酸置換を含むこと、並びにｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ２はＣＤＲH２中にアミノ酸置換を含むことに留意されたい。上記ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれは、上記ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合して、Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインを生成する。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを含むいずれの抗体は一般に「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １」と呼ばれ、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせは、その特定のＶＨ／ＶＬドメインを照合することによって呼称される。例えばｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ１及びｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ２を含むヒト化抗体は、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １（１．２）」と具体的に呼称される。
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２１５）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
である。
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２１６）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
である。
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２１８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQGNTLPPTFGG
GTKLEIK
（ｂ）Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQYNNYPFTFGS
GTKLEIK
「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ１」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ２」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ３」及び「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ４」と呼ばれるＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２の４つの例示的なヒト化ＶＨドメイン、並びに「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ１」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ２」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ３」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ４」、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ５」及び「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ６」と呼ばれるＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２の６つの例示的なヒト化ＶＬドメインを、以下に提供する。上記ヒト化ＶＬドメインのうちのいずれは、上記ヒト化ＶＨドメインのうちのいずれと対合して、Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインを生成する。従って、上記ヒト化ＶＨドメインと対合した上記ヒト化ＶＬドメインのうちの１つを含むいずれの抗体は一般に「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２」と呼ばれ、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせは、その特定のＶＨ／ＶＬドメインを照合することによって呼称される。例えばｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ１及びｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ２を含むヒト化抗体は、「ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２（１．２）」と具体的に呼称される。
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２２１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２２２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２２３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２２４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYCARGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
（ｃ）Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD
GGAMDYWGQG TSVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG
GGTNLEIK
（ｄ）他の抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子
上で同定した好ましい抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子に加えて、本発明は、以下の抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子：ＬＵＣＡ１；ＢＬＡ８；ＰＡ２０；又はＳＫＮ２（米国特許第７，５２７，９６９号；米国特許第８，７７９，０９８号及び国際公開第２００４／００１３８１号を参照）；Ｍ３０；ｃＭ３０；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ３；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ４；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ５；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ６；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ７；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ３；及びＭ３０‐Ｈ４‐Ｌ４（米国特許出願公開第２０１３／００７８２３４号及び国際公開第２０１２／１４７７１３号を参照）；並びに８Ｈ９（米国特許第７，６６６，４２４号；米国特許第７，７３７，２５８号；米国特許第７，７４０，８４５号；米国特許第８，１４８，１５４号；米国特許第８，４１４，８９２号；米国特許第８，５０１，４７１号；米国特許第９，０６２，１１０号；米国特許出願公開第２０１０／０１４３２４５号、及び国際公開第２００８／１１６２１９号を参照）のうちのいずれの使用も考える。
２．ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に結合する抗体
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）及び６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌（国際公開第２０１１／０３４６６０号）、並びに特に、結腸直腸癌、胃腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、乳癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌及び子宮癌腫（Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11）を含む様々なタイプの癌に関連していることが分かっている。
ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸癌、結腸直腸癌及び膵臓癌の９０％、非小細胞肺癌細胞の７０％並びに乳癌の５０％において過剰発現することが分かっている（Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366）。 過剰発現した癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺髄様癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌を含む多様なヒト癌の侵襲及び転位において重要な役割を果たす（国際公開第２０１１／０３４６６０号；Deng, X. et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,” Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15）。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に免疫特異的に結合する抗体は市販されている（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC;Abnova Corporation）。
（ａ）抗体１６Ｃ３
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL
ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD
YSGSRYWFAYWGQGTLVTVS S
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG
ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG
GTKLEIK
（ｂ）抗体ｈＭＮ１５
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF
IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR
DMGIRWNFDVWGQGTPVTVS S
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT
STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG
TKVEIKR
本発明は具体的には、ＣＥＡＣＡＭ５及び／又はＣＥＡＣＡＭ６に結合できるＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６結合分子（例えばＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６モノクローナル抗体１６Ｃ３又はｈＭＮ１５の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
３．ＥＧＦＲに結合する抗体
上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor：ＥＧＦＲ）は、特定の転移性大腸癌、転移性非小細胞癌及び頭頸部癌の癌抗原である。ヒトＥＧＲＦに結合する例示的な抗体は、「セツキシマブ」及び「パニツムマブ」である。セツキシマブは、組み換えヒト‐マウスキメラ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s; Bou-Assaly, W. et al. (2010) “Cetuximab (Erbitux),” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627）。パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）は、完全ヒト化上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ２モノクローナル抗体である（Foon, K.A. et al. (2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990; Yazdi, M.H. et al. (2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144）。
（ａ）セツキシマブ
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV
IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT
YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA
GTKLELKR
（ｂ）パニツムマブ
パニツムマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２３９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWTWIR QSPGKGLEWI
GHIYYSGNTNYNPSLKSRLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVRD
RVTGAFDIWG QGTMVTVSS
パニツムマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYD
ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQHFDHLPLAFGG
GTKVEIKR
本出願は具体的には、ＥＧＦＲに結合できるＥＧＦＲ結合分子（例えばＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ又はパニツムマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
４．ＥｐｈＡ２に結合する抗体
受容体チロシンキナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）は通常、成体の上皮組織の細胞間接触部位に発現するが、最近の研究により、ＥｐｈＡ２が様々なタイプの上皮癌においても、転移性病変において観察される最も高いレベルのＥｐｈＡ２発現で過剰発現することが分かった。高発現レベルのＥｐｈＡ２は、前立腺癌、乳癌、非小細胞肺癌及び黒色腫を含む、広範な癌及び多数の癌細胞株において確認されている（Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295）。ＥｐｈＡ２は単なる癌のマーカーとは思われないが、多数のヒト癌において持続的に過剰発現し、機能的に変化するようである（Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41-46）。ヒトＥｐｈＡ２に結合する例示的な抗体は、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」及び「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」である。
（ａ）ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIK
（ｂ）ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI K
（ｃ）ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIK
本出願は具体的には、Ｅｐｈａ２に結合できるＥｐｈＡ２結合分子（例えばＥｐｈＡ２×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２及びＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
５．ｇｐＡ３３に結合する抗体
４３ｋＤ膜貫通糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）は、全ての結腸直腸癌の＞９５％において発現する（Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263）。ヒトｇｐＡ３３に結合する例示的な抗体は、「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」である。
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２４８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIK
本出願は具体的には、ｇｐＡ３３に結合できるｇｐＡ３３結合分子（例えばｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １、又は国際公開第２０１５／０２６８９４号において提供された抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
６．ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する抗体
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、化学的に処置されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産生として元来同定された、１８５ｋＤａ受容体である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、複数のヒト癌腫及び哺乳類の発生において機能するため、広く研究されてきた（Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する例示的な抗体としては、「マルゲツキシマブ」、「トラスツズマブ」及び「ペルツズマブ」が挙げられる。マルゲツキシマブ（ＭＧＡＨ２２としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５０６２４‐７５‐７）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介する、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体である。トラスツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ４Ｄ５としても公知、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：１８０２８８‐６９‐１；米国特許第５，８２１，３３７号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体４Ｄ５のヒト化バージョンである。ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ２Ｃ４としても公知、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：３８０６１０‐２７‐５；例えば国際公開第２００１／０００２４５号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体２Ｃ４のヒト化バージョンである。
本出願は具体的には、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合できるＨｅｒ２／Ｎｅｕ結合分子（例えばＨｅｒ２／Ｎｅｕ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕモノクローナル抗体マルゲツキシマブ、トラスツズマブ又はペルツズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
（ａ）マルゲツキシマブ
マルゲツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２４９）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR
IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
である。
マルゲツキシマブ のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５０）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS
ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQHYTTPPTFGG
GTKVEIK
である。
マルゲツキシマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2014、Recommended INN: List 71、28(1):93-94を参照）。
（ｂ）トラスツズマブ
トラスツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５１）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR
IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
である。
トラスツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５２）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQHYTTPPTFGQ
GTKVEIK
である。
（ｃ）ペルツズマブ
ペルツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５３）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD
VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL
GPSFYFDYWG QGTLVTVSS
である。
ペルツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５４）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYYIYPYTFGQ
GTKVEIK
である。
（ｄ）他の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体
上で同定された好ましい抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子に加えて、本発明は、以下の抗Ｈｅｒ‐２結合分子：１．４４．１；１．１４０；１．４３；１．１４．１；１．１００．１；１．９６；１．１８．１；１．２０；１．３９；１．２４；及び１．７１．３（米国特許第８，３５０，０１１号；米国特許第８，８５８，９４２号；及び国際公開第２００８／０１９２９０号）；Ｆ５及びＣ１（米国特許第７，８９２，５５４号；米国特許第８，１７３，４２４号；米国特許第８，９７４，７９２号；及び国際公開第９９／５５３６７号）；並びに米国特許出願公開第２０１３０１７１１４号並びに国際公開第２０１１／１４７９８６号及び国際公開第２０１２／１４３５２４号の抗Ｈｅｒ‐２結合分子のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ結合分子を考える。本発明は更に、国際公開第２０１２／１４３５２４号で提供されている例示的なＨｅｒ２／Ｎｅｕ×ＣＤ３二重特異性結合分子も含み、またこれらを包含する。
７．ＶＥＧＦに結合する抗体
ＶＥＧＦ‐Ａは、多様な疾患、特に転移性大腸癌等の特定の転移性癌、並びに特定の肺癌、腎臓癌、卵巣癌及び脳の多形性膠芽腫において血管新生を刺激する、化学シグナルである。
ヒトＶＥＧＦ‐Ａに結合する例示的な抗体は、「ベバシズマブ」（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。ベバシズマブは、組み換えヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Midgley, R. et al. (2005) “Bevacizumab - Current Status And Future Directions,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004; Hall, R.D. et al. (2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC),” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523; Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765）。
ベバシズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２５５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
ベバシズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ
GTKVEIKR
本出願は具体的には、ＶＥＧＦに結合できるＶＥＧＦ結合分子（例えばＶＥＧＦ×ＣＤ３二重特異性結合分子）並びに特に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
８．５Ｔ４に結合する抗体
癌胎児性タンパク質５Ｔ４は、腎臓癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌を含む多くの癌腫の細胞膜上、及び急性リンパ芽球性白血病において発現する、腫瘍関連タンパク質である（Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6を参照）。ヒト５Ｔ４に結合する例示的な抗体としては、「５Ｔ４ ｍＡｂ １」及び「５Ｔ４ ｍＡｂ ２」が挙げられる。
（ａ）５Ｔ４ ｍＡｂ １
５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２５７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQYDDFPWTFGQ
GTKLEIK
（ｂ）５Ｔ４ ｍＡｂ ２
５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２５９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２６０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IK
本出願は具体的には、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １若しくは５Ｔ４ ｍＡｂ ２の、又は国際公開第２０１３／０４１６８７号若しくは国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗５Ｔ４抗体のうちのいずれかの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、５Ｔ４に結合できる５Ｔ４結合分子（例えば５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性結合分子）を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている例示的な５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
更に本出願は具体的には、５Ｔ４、ＣＤ３及びＣＤ８に結合できる５Ｔ４×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性結合分子、並びに特に、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １若しくは５Ｔ４ ｍＡｂ ２の、又は国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗5T4モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／あるいは、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗ＣＤ８ モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている例示的な５Ｔ４×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性分子を含み、またこれらを包含する。
９．ＩＬ１３Ｒα２に結合する抗体
インターロイキン‐１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）は、グリア芽腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、多発性黒色腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌及び肺癌を含む多様な癌において過剰発現する（国際公開第２００８／１４６９１１号；Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。ＩＬ１３Ｒα２に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている(Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals;国際公開第２００８／１４６９１１号も参照)。ヒトＩＬ１３Ｒα２に結合する例示的な抗体としては、「ｈｕ０８」が挙げられる（例えば国際公開第２０１４／０７２８８８号を参照）。
ｈｕ０８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT
VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
ｈｕ０８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２６２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG
GTKVEIK
本出願は具体的には、ＩＬ１３Ｒα２に結合できるＩＬ１３Ｒα２結合分子（例えばＩＬ１３Ｒα２×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＩＬ１３Ｒα２モノクローナル抗体ｈｕ０８の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。
１０．ＣＤ１２３に結合する抗体
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体α、ＩＬ‐３Ｒａ）は４０ｋＤａ分子であり、インターロイキン３受容体複合体の一部である（Stomski, F.C. et al. (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046）。インターロイキン３（ＩＬ‐３）は、多能性幹細胞の、赤血球細胞、骨髄細胞及びリンパ球系前駆細胞への早期分化を促進する。ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む幅広い血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現していることが報告されている（Munoz, L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261-1269）。ＣＤ１２３の過剰発現は、ＡＭＬの不良な予後に関連する（Tettamanti, M.S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401）。
ヒトＣＤ１２３に結合し、本発明で採用できる例示的抗体は、「ＣＤ１２３ ｍＡｂ １」である（例えば国際公開第２０１５／０２６８９２号を参照）。
ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD
IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH
LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２６４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY
PYTFGQGTKL EIK
本出願は具体的には、ＣＤ１２３に結合できるＣＤ１２３結合分子（例えばＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体ＣＤ１２３ ｍＡｂ １並びに米国特許第２０１７／０８１４２４号及び国際公開第２０１６／０３６９３７号で開示されている抗ＣＤ１２３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、フロテツズマブ（ＭＧＤ００７としても公知；ＣＡＳ登録番号：１６６４３５５‐２８‐５）、ＪＮＪ‐６３７０９１７８（Johnson & Johnson、国際公開第２０１６／０３６９３７号も参照）及びＸｍＡｂ１４０４５（Xencor、米国特許第２０１７／０８１４２４号も参照）を含む、例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
１１．ＣＤ１９に結合する抗体
ＣＤ１９（Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ２８１７０）は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の構成要素であり、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫に関する閾値を変調するＢ細胞シグナリングの正の調節因子である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統中に最も偏在的に発現される抗原の１つであり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の＞９５％において発現される。特に、ＣＤ１９発現は、抗ＣＤ２０療法に対する耐性を示すようになったＢ細胞リンパ腫において維持される（Davis et al. (1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999）。ＣＤ１９はまた、自己免疫疾患を治療するための標的としても示唆されている（Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577）。
ヒトＣＤ１９に結合し、本発明において採用してよい例示的な抗体は、国際公開第２０１６／０４８９３８号で開示されている抗ＣＤ１９抗体（本明細書では「ＣＤ１９ ｍＡｂ １」と呼ばれる）である。
ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM
ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２６６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA
SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG
TKLEIK
本出願は具体的には、ＣＤ１９に結合できるＣＤ１９結合分子（例えばＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＣＤ１９ ｍＡｂ １、又は米国特許第７，１１２，３２４号で開示されている抗ＣＤ１９抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は具体的には、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標）；WHO Drug Information、2009、Recommended INN: List 62、23(3):240-241に見られるアミノ酸配列）及びドゥボルツキシズマブ（ＭＧＤ０１１としても公知；WHO Drug Information、2016、Proposed INN: List 116、30(4):627-629に見られるアミノ酸配列）を含む、本発明で採用してよい例示的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
Ｅ．例示的な病原体関連抗原
本明細書中で使用される場合、用語「病原体抗原（Pathogen Antigen）」は、病原体感染細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫調節分子を用いて処置できる、抗原を指す。病原体抗原の例としては、限定するものではないが：単純ヘルペスウイルス（例えば感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、ｇＤ等）；水痘帯状疱疹ウイルス；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；エプスタイン‐バーウイルス（例えばＬＭＰ‐１、ＬＭＰ‐２Ａ、ＬＭＰ‐２Ｂ等）；サイトメガロウイルス（例えばＵＬ１１等）；ヒト免疫不全ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１等）；ヒトパピローマウイルス（例えばＥ６、Ｅ７等）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ６４、ｇｐ４６、ｇｐ２１等）；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニア）に感染した細胞の表面上に発現される抗原が挙げられる。このような抗体は、多数のソースから市販されており、又は（モノクローナル抗体の産生のために含まれている）マウス若しくは他の動物を上記抗原で免疫化することによって得ることができる。
Ｆ．病原体関連抗原に結合できる例示的な抗体
病原体感染細胞の表面上に配列された病原体抗原に結合できる分子を構築するためにＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を以下で提供する。更なる抗体が当該技術分野において公知である。
ＨＩＶのｅｎｖタンパク質は、例示的な病原体関連抗原であり、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質に結合する抗体は、病原体関連抗原に結合できる例示的な抗体である。
ＨＩＶ‐１感染の最初のステップは、細胞表面ＣＤ４が三量体ＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、膜貫通型糖タンパク質（ｇｐ４１）及び表面糖タンパク質（ｇｐ１２０）のヘテロ二量体に結合することによって発生する。ｇｐ１２０及びｇｐ４１糖タンパク質は初め、単一のｇｐ１６０ポリペプチドとして合成され、これはその後切断されて、非共有結合ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体が生成される。ｅｎｖの外部ドメインは、全ｇｐ１２０成分と約２０ｋＤａのｇｐ４１とからなる、質量約１４０ｋＤａのヘテロ二量体である（Harris, A. et al. (2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445）。ｅｎｖタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３； Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655；国際公開第２０１２／１６２０６８号；及び国際公開第２０１６／０５４１０１号を参照）。ＨＩＶ ｅｎｖに結合する例示的な抗体としては、「７Ｂ２」（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３）及び「Ａ３２」（国際公開第２０１４／１５９９４０号）が挙げられる。
７Ｂ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS
７Ｂ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２６８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH
PPTFGHGTRV EIK
Ａ３２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSS
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２７０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV
FGGGTKLTVL
本出願は具体的には、ＨＩＶに結合できるＨＩＶ結合分子（例えばＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２、Ａ３２、及び国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は具体的には、国際公開第２０１４／１５９９４０号、国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、及び国際公開第２０１７／０１１４１４号において提供されている例示的なＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
更に本発明は具体的には、ＨＩＶ、ＣＤ３及びＣＤ８に結合できるＨＩＶ×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性結合分子、並びに特に、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２若しくはＡ３２又は国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／あるいは国際公開第２０１５／１８４２０３号において提供されている抗ＣＤ８モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は具体的には、国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、及び国際公開第２０１７／０１１４１４号において提供されている例示的なＨＩＶ×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
Ｇ．本発明の例示的な結合分子
以下で議論するように、本発明を、投与される２つの分子：ＰＤ‐１に結合できる分子（例えば上述のｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＤＡＲＴ‐１又はＤＡＲＴ‐２）；及び腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えば以下に記載の「ＤＡＲＴ‐Ａ」又は「ＤＡＲＴ‐Ｂ」）の併用療法を用いて説明する。
ＤＡＲＴ‐Ａは、エフェクタ細胞のＣＤ３細胞表面分子及びＢ７‐Ｈ３癌抗原に結合できる、二重特異性ダイアボディである。これは、Ｂ７‐Ｈ３に対する１つの結合部位、Ｂ７‐Ｈ３に対する１つの結合部位、ノブ及びホール担持ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、並びにＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する３つのポリペプチド鎖からなる、Ｆｃ領域含有ダイアボディである（例えば図４Ａを参照）。
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ２）（配列番号２２６）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１４））；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＨ）（配列番号１９２）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１５））；ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２７））；介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号３９））；「ノブ担持」Ｆｃドメイン（配列番号４２）；Ｃ末端を含む。よって、ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は：配列番号２２６─配列番号１４─配列番号１９２─配列番号１５─配列番号２７─配列番号３９─配列番号４２からなる。ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７１）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK
である。
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＬ）（配列番号１９３）；介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１４））；Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ２）（配列番号２２２）；介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号1５））；ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン(KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２８））；及びＣ末端を含む。よって、ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチドは：配列番号１９３─配列番号１４─配列番号２２２─配列番号１５─配列番号２８からなる。ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７２）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF
GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ
MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
である。
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号３８））；「ホール担持」Ｆｃドメイン（配列番号４３）；及びＣ末端を含む。よって、ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチドは：配列番号３８─配列番号４３からなる。ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号２７３）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる別の例示的な分子は、ＤＡＲＴ‐Ｂである。ＤＡＲＴ‐Ｂは、エフェクタ細胞のＣＤ３細胞表面分子及びＩＬ１３Ｒα２癌抗原に結合できる、二重特異性ダイアボディである。ＤＡＲＴ‐Ｂは３つのポリペプチド鎖からなり、ＤＡＲＴ‐Ａと同一の一般構造を有する。
本発明の方法において使用してよい、腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる更なる例示的な分子としては：ＣＤ１９及びＣＤ３（例えば米国特許第７，２３５，６４１号及び国際公開第２０１６／０４８９３８号を参照）；ＣＤ１２３及びＣＤ３（例えばKuo, S.R. et al. , (2012) “Engineering a CD123xCD3 bispecific scFv immunofusion for the treatment of leukemia and elimination of leukemia stem cells,” Protein Eng Des Sel. 25:561-9；国際公開第２０１５／０２６８９２号を参照）；ｇｐＡ３３及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照）；ＣＥＡ及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１３／０１２４１４号を参照）；Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１７／０３０９２６号を参照）；ＨＥＲ２及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１２／１４３５２４号を参照）；５Ｔ４及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号及び国際公開第２０１３／０４１６８７号を参照）に結合できる二重特異性分子、並びに三重特異性分子（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号及び国際公開第２０１５／１８４２０７号を参照）が挙げられる。
ＶＩ．産生方法
最も好ましくは、本発明の分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明の結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
本発明は、本開示の結合分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
本発明は、ＰＤ‐１（若しくはＰＤ‐１の天然リガンド）に結合する抗体、又はエフェクタ細胞の細胞表面分子に結合する抗体、又は疾患抗原（例えば癌抗原若しくは病原体関連抗原）に結合する抗体の、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのうちの１つ又は複数を含む、融合タンパク質を包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＰＤ‐１（若しくはＰＤ‐１の天然リガンド）又はエフェクタ細胞の細胞表面分子に特異的に結合し、かつ天然分子においては上記抗体融合タンパク質が結合しない別のアミノ酸配列、例えば異種配列又は別の領域由来の同種配列を含有する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
本発明は特に、診断又は治療用部分にコンジュゲートする上記結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。診断を目的として、本発明の結合分子を、検出可能な物質と連結させてよい。このような結合分子は、臨床試験手順の一部としての疾患の発症又は進行の監視及び／又は予後判定、例えば特定の療法の有効性の決定に有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（例：アビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えばアンベリフェロン、フルオレセイン又はフィコエリスリン）、発光材料（例えばルミノール）、生物発光材料（例えばルシフェラーゼ又はエクオリン）、放射性材料（例えば炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５又は亜鉛６５）、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。上記検出可能な物質は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
治療を目的として、本発明の結合分子を、細胞毒素等の治療成分（例えば細胞増殖抑制剤若しくは細胞破壊剤）、治療剤又はαエミッタ等の放射性金属イオンとコンジュゲートさせてよい。細胞毒素又は細胞傷害剤としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシンアブリン、サポリン、及びこれらの作用剤の細胞傷害性断片といった、細胞に有害ないずれの作用剤が挙げられる。治療剤としては、障害を予防的又は治療的に処置するための治療効果を有するいずれの作用剤が挙げられる。このような治療剤は、化学治療剤、タンパク質又はポリペプチド治療剤であってよく、所望の生物活性を有する、及び／又は所与の生物応答を修正する治療剤を含んでよい。治療剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤、及び細胞増殖性疾患の治療に有用な抗体が挙げられる。治療用部分は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
ＶＩＩ．本発明の結合分子の使用
上述のように、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子及び標的細胞（即ち癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介できる分子は、例えば癌又は感染症に罹患した被験者において治療を目的として使用してよい。よって本発明の結合分子は、上記標的細胞の表面上での疾患抗原、特に癌抗原若しくは病原体関連抗原の発現に関連する、又は上記発現を特徴とする、いずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。よって、限定するものではないが、本発明の結合分子は、癌、特に癌抗原の発現を特徴とする癌の治療に採用できる。本発明の結合分子は、感染症、特に病原体関連抗原の発現を特徴とする感染症の治療に採用できる。
特に本発明は：ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子が、ＰＤ‐１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含み；標的転換殺滅を仲介できる分子が、エフェクタ細胞（例えばヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞（抗体分泌性Ｂ細胞）、マクロファージ及び顆粒球）の細胞表面分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ等）に結合できるエピトープ結合ドメインを含み、かつ（標的転換細胞殺滅（例えば標的転換Ｔ細胞細胞毒性）を仲介することによって）標的細胞の標的転換殺滅を仲介するために、標的細胞の表面上の疾患抗原（特に癌抗原又は病原体関連抗原）に結合できるエピトープ結合ドメインを含む、上記方法を包含する。
ある具体的実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子は抗体であり、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子はダイアボディである。別の具体的実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子は抗体であり、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子は３価結合分子である。
ある具体的実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子はダイアボディであり、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子はダイアボディである。別の具体的実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子はダイアボディであり、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子は３価結合分子である。
一実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子と、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子とは、同時に投与される。本明細書中で使用される場合、この「同時（concurrent）」投与は：
（Ａ）ＰＤ‐１若しくはＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子及び標的転換細胞殺滅を仲介できる分子の両方を含有する単一の医薬組成物の投与；又は
（Ｂ）２つ以上の医薬組成物の別個の投与であって、上記医薬組成物のうちの１つの組成物はＰＤ‐１若しくはＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子を含有し、上記医薬組成物のうちの別の１つの組成物は標的転換細胞殺滅を仲介できる分子を含有し、上記組成物は４８時間の期間内に投与される、投与
を指すことを意図している。
第２の実施形態では、上記分子は「順次（sequentially）」投与される（例えば、ＰＤ‐１若しくはＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子を投与した後、標的転換細胞殺滅を仲介できる分子を投与するか、又はその逆）。このような順次投与では、２番目に投与される組成物は、最初に投与される組成物の投与の少なくとも４８時間以上後に投与される。
「療法を提供する（providing a therapy）」、又は「治療する（treating）」は：疾患に由来する症状の低減；感染症の症状（例えばウイルス量、発熱、疼痛、敗血症等）の軽減；腫瘍（癌の文脈では、例えば乳癌、胃癌若しくは前立腺癌の腫瘍）のサイズの縮小；癌細胞成長の遅延；転移の発生、成長若しくは進行の遅延；疾患に由来する症状の低減；レシピエント被験者のＱＯＬの向上；被験者の疾患の治療のために提供される他の薬物の用量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による、別の薬物の効果の増強；疾患の進行の遅延：並びに／又はレシピエント被験者の生存期間の延長といったいずれの臨床的結果を含むがこれに限定されない、有益な又は所望の結果のいずれの兆候に関連する、組成物のいずれの投与を指す。
治療の被験者としては、動物、最も好ましくは非霊長類（例えばウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類種が挙げられる。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
本発明の様々な実施形態によって治療できる例示的な障害としては、限定するものではないが、増殖性障害、細胞増殖性障害、及び癌（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合できる癌抗原を発現する癌）、病原体関連疾患（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合される病原体関連抗原の発現に関連する慢性ウイルス感染症）が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、被験者の疾患又は障害の治療、予防又は管理のための方法及び組成物を包含し、これは、治療的有効量のＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子及び標的細胞（例えば腫瘍細胞、病原体感染細胞又は外来細胞）の標的転換殺滅を仲介できる分子を被験者に投与するステップを含む。このような分子の組み合わせは、原発性腫瘍の成長の予防、阻害、低減又は退縮、及び腫瘍の転移の予防、阻害、低減のため、並びに病原体量の低減又は病原体感染細胞の排除のために特に有用である。特定の作用機序による束縛を意図したものではないが、上記分子は、標的細胞に対するエフェクタ機能を仲介してよく、標的細胞、架橋細胞表面抗原及び／又は標的細胞上の受容体に対する免疫系の活性化を促進してよく、またアポトーシス又は負の成長調節シグナリングを増強してよく、又はこれらの組み合わせを実現してよく、これにより、標的細胞の除去及び／又はその個数の低減をもたらす。
本発明の分子によって、及び本発明の方法によって治療できる癌としては、限定するものではないが：副腎癌（褐色細胞腫又は副腎皮質癌を含むがこれらに限定されない）；エイズ関連癌；歯槽軟部肉腫；星状細胞腫；基底細胞癌；膀胱癌（移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌又は癌肉腫を含むがこれらに限定されない）；骨及び結合組織肉腫（限定するものではないが、骨肉腫（bone sarcoma、osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫又は滑膜肉腫等）；脳癌（神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍（nonglial tumor）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、又は原発性脳リンパ腫を含むがこれらに限定されない）；脳及び脊髄癌；乳癌（腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病又は炎症性乳癌を含むがこれらに限定されない）；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌（扁平上皮癌又は腺癌を含むがこれらに限定されない）；胆管癌（乳頭状、結節状、又はびまん性胆管癌を含むがこれらに限定されない）；軟骨肉腫；脊索腫；腎明細胞癌；明細胞癌；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；眼癌（虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫及び毛様体黒色等の眼内黒色腫並びに腫網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない）；食道癌（扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌を含むがこれらに限定されない）；ユーイング腫；骨外性粘液性軟骨肉腫；線維形成不全骨；骨の線維性異形成；胆嚢癌又は胆管癌（腺癌を含むがこれらに限定されない）；胃癌（gastric cancer）；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；重鎖病；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；白血病（急性白血病を含むがこれに限定されない）；急性リンパ性白血病；急性骨髄性白血病（限定するものではないが、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性若しくは赤白血病性白血病、又は骨髄異形成症候群等）；慢性白血病（限定するものではないが、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病等）；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍；肝臓癌（肝細胞癌又は肝芽腫を含むがこれらに限定されない）；リンパ腫（限定するものではないがホジキン病等）；非ホジキン病；肺癌（非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌又は小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない）；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；良性単クローン性免疫グロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫（限定するものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫等）；骨髄異形成症候群；神経芽腫；神経内分泌腫瘍；口腔癌（扁平上皮癌を含むがこれに限定されない）；卵巣癌（卵巣上皮癌、ボーダーライン腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍を含むがこれらに限定されない）；膵臓癌（インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、脂肪腫、ソマトスタチン分泌腫瘍、又は癌様体若しくは膵島細胞腫瘍を含むがこれらに限定されない）；副甲状腺腫瘍；小児癌；陰茎癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；咽頭癌（扁平上皮癌又は水疱性癌を含むがこれらに限定されない）；下垂体癌（クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、又は糖尿病性小児腫瘍を含むがこれらに限定されない）；前立腺癌（腺癌、平滑筋肉腫又は横紋筋肉腫を含むがこれらに限定されない）；真性赤血球増加症；後部ブドウ膜黒色腫；まれな血液障害；腎臓癌（腺癌、過腎腫、線維肉腫、腎転移癌又は移行上皮癌（腎盂及び／若しくは尿管）を含むがこれらに限定されない）；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；唾液腺癌（腺癌、粘表皮癌又は腺様嚢胞癌を含むがこれらに限定されない）；肉腫；皮膚癌（基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在性増殖性黒色腫、結節性黒色腫、水晶体悪性黒色腫又は末端黒子型黒色腫を含むがこれらに限定されない）；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌（stomach cancer）（腺癌、真菌性（ポリープ状）、潰瘍性、表在性、びまん性又は悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫を含むがこれらに限定されない）；滑膜肉腫；精巣癌（胚性腫瘍、セミノーマ、未分化、古典的（典型的）、精細胞性、非セミノーマ、胚性癌、奇形腫癌、又は絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）を含むがこれらに限定されない）；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌（限定するものではないが、甲状腺乳頭若しくは濾胞癌、転移性甲状腺癌、甲状腺髄様癌又は未分化甲状腺癌等）；子宮癌（子宮内膜癌又は子宮肉腫を含むがこれらに限定されない）；膣癌（扁平上皮癌、腺癌又は黒色腫を含むがこれらに限定されない）；外陰癌（扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫又はパジェット病を含むがこれらに限定されない）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；あるいはウィルムス腫瘍が挙げられる。更に、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、及び乳頭状腺癌が挙げられる（これらの障害の概観に関しては、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.を参照）。
特に、本発明の結合分子は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、バーケットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌の治療に使用できる。
本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる病原体関連疾患としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明は、ＰＤ‐１若しくはＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子、腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子、又はこれらの分子の組み合わせを含む、組成物を包含する。本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量のＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子、標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子又はこれらの分子の組み合わせと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。ある好ましい態様では、上記組成物は略精製済みである（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を略含まない）。
２つ以上の治療剤を投与する場合、これらの作用剤は、同一処方中に共に配合してよく、又は別個の組成物中に配合してよい。従っていくつかの実施形態では、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子と、標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子とは、同一の医薬組成物中に共に配合される。代替実施形態では、これらの分子は別個の医薬組成物中に配合される。
ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子、標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子、又はこれらの分子の組み合わせの様々な処方を、投与に用いてよい。１つ又は複数の薬理学的有効成分に加えて、本発明の組成物は、好適な、薬学的に許容可能なキャリアを含有してよく、上記キャリアは、当該技術分野において公知の賦形剤及び助剤を含み、また薬理学的に有効な物質の投与を促進する、又は上記活性化合物の、作用部位への送達のために薬学的に使用できる調製物への加工を促進する、比較的不活性の物質である。例えば賦形剤は、形状若しくは粘度を与えることができ、又は希釈剤として作用できる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、並びに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（carrier）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明の結合分子で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含むことができる
投与方法
本発明の組成物は、有効量の、ＰＤ‐１若しくはＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる本発明の分子を含む医薬組成物及び腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子、又は本発明のこれらの分子の組み合わせを含む医薬組成物を、被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
本発明の分子又は組成物を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。
本発明はまた、本発明の結合分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
凍結乾燥された本発明の結合分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このような結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の上記調製物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（effective amount）」は：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。単独で投与される個々の有効成分に対して適用される場合、この用語は、上記成分のみを指す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、治療効果をもたらす複数の有効成分の合計量を指し、上記有効成分が組み合わせた状態で投与されるか、順次投与されるか、又は同時に投与されるかにかかわらない。
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：癌細胞の殺滅及び／若しくは増殖の低減；並びに／又は癌の原発部位からの転移の進展の排除、低減及び／若しくは遅延；又は感染病原体の増殖（又はその影響）の低減；並びに病原体仲介型疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被検体の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被検体の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上である。
本発明の結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
患者に投与される本発明の結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
本発明の組成物が、本発明の結合分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードする結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Biolistic、Dupont）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
治療的又は予防的有効量の本発明の結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、本発明の医薬組成物を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間にわたって処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは本発明の医薬組成物は、１日２回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは、本発明の医薬組成物は、１日３回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
これまで本発明を概説してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、特段の記載がない限り、本発明を限定することを意図したものではない。
［実施例１］ 併用治療研究：ＬＯＸ‐ＩＭＶＩ腫瘍モデル
本発明の原理を説明するために、ヒトＰＢＭＣを用いて再構成したＭＨＣＩ-/-マウスにＬＯＸ‐ＩＭＶＩヒト転移性黒色腫癌細胞を皮下注射した再構成済み腫瘍モデルを用いて、併用治療研究を実施した。その後マウスに、ビヒクル又は以下の治療剤を投与した：
（１）ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、この抗体はＰＤ‐１に結合できる分子である；及び／又は
（２）ＣＤ３×Ｂ７‐Ｈ３二重特異性ダイアボディＤＡＲＴ‐Ａ、このダイアボディは、エフェクタ細胞の細胞表面分子（即ちＣＤ３）及び癌抗原（即ちＢ７‐Ｈ３）に結合できる分子であり、これによって、Ｂ７‐Ｈ３を発現する癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる。
投与された上記分子のアミノ酸配列は、既に記載されている。表１１は、本研究のパラメータを示す。各グループは６体のメスのマウスからなっていた。全てのグループに関して、マウスに、５×１０6個のＬＯＸ‐ＩＭＶＩ癌細胞（ＩＤ；研究３３日目に投与）、及び１０6個のヒトＰＢＭＣ（ＩＰ；研究０日目に投与）を投与した。治療（研究４２日目に開始される１つ若しくは複数の投与分子又はビヒクル）を、週１回３週間提供した（Ｑ７Ｄ×３）；用量は静脈内注射によって投与した。
腫瘍体積を時間の関数として測定した。図７は本研究の結果を示し、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）のみ又はＤＡＲＴ‐Ａのみの投与に対する、併用療法の予想外の便益を実証している。
［実施例２］ 併用治療研究：Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍モデル
本発明の原理を更に説明するために、ヒトＰＢＭＣを用いて再構成したＭＨＣＩ-/-マウスにＤｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト転移性咽頭癌細胞を皮下注射した再構成済み腫瘍モデルを用いて、併用治療研究を実施した。その後マウスに、ビヒクル対照、１ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ、又は１ｍｇ／ｋｇのｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）及び０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａの両方を投与した。表１２は、本研究のパラメータを示す。各グループは８体のオスのマウスからなっていた。全てのグループに関して、マウスに、５×１０6個のＤｅｔｒｏｉｔ５６２癌細胞（ＩＤ）及び１０6個のヒトＰＢＭＣ（ＩＰ；研究０日目に投与）を投与した。治療（研究７日目に開始される１つ若しくは複数の投与分子又はビヒクル）を、週１回４週間（Ｑ７Ｄ×４）、又は１４日毎に２用量（Ｑ１４Ｄ×２）提供した；用量は静脈内注射によって投与した。
腫瘍体積を時間の関数として測定した。図８Ａ〜８Ｂは本研究の結果を示し、これもまた、ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）のみ又はＤＡＲＴ‐Ａのみの投与に対する、併用療法の予想外の便益を実証している。図８Ａはグループ１〜３及び５に関する結果を示し；図８Ｂはグループ１〜４及び６に関する結果を示す。
マウス中のＣＤ３+の濃度を、研究の終了時に決定した。驚くべきことに、上記細胞の濃度は、併用療法を受けたマウス（図９）において上昇したことが分かり、これは即ち、本発明の療法が動物の免疫応答を増強したことを示している。
［実施例３］ シグナリングモデル
本発明の原理を更に説明するために、Ｔ細胞／腫瘍細胞共培養システムにおいて、Ｊｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ‐ＮＦＡＴ／腫瘍細胞ルシフェラーゼレポータアッセイを用いて、協調的なＴ細胞シグナル伝達を試験した。簡潔に述べると、ＰＤ‐１及びＢ７‐Ｈ３を発現するＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１腫瘍標的細胞を、ＭＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、エフェクタ：標的細胞比１：１（図１０Ａ）又は３：１（図１０Ｂ）で混合し、単独で、又は固定濃度（１２．５ｎＭ）のＰＤ‐１結合分子ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＤＡＲＴ‐１、対照抗体と共に、ＤＡＲＴ‐Ａの濃度を上昇させながら培養した。細胞活性化及びシグナリングのインジケータとして、発光を測定した。図１０Ａ〜１０Ｂは、本研究の結果を示し、これは、ＰＤ‐１に結合できる分子（例えばｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＤＡＲＴ‐１）と標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばＤＡＲＴ‐Ａ）との組み合わせが、エフェクタ細胞シグナリング活性を増強することを実証している。
［実施例４］ 併用治療研究：Ａ３７５腫瘍モデルにおける、正常なＴ細胞とアネルギー性Ｔ細胞との比較
本発明の原理を更に説明するために、活性化又はアネルギー性ヒトＴ細胞を用いて再構成したＮＯＧマウスにＡ３７５ヒト黒色腫細胞を皮下注射した再構成済み腫瘍モデルと用いて、併用治療研究を実施した。その後マウスに、ビヒクル又は以下の治療剤を投与した：
（１）ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ：ＤＡＲＴ‐２、このダイアボディは、ＰＤ‐１に結合できる分子である；及び／又は
（２）ＣＤ３×ＩＬ１３Ｒα２二重特異性ダイアボディＤＡＲＴ‐Ｂ、このダイアボディは、エフェクタ細胞の細胞表面分子（即ちＣＤ３）及び癌抗原（即ちＩＬ１３Ｒα２）に結合できる分子であり、これによって、ＩＬ１３Ｒα２を発現する癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる。
精製済みヒトＴ細胞を、ＩＬ‐２の存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを用いて２ラウンド培養することによって、活性化Ｔ細胞を調製した。精製済みヒトＴ細胞を、ＩＬ‐２の存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを用いて１ラウンド培養した後、ＩＬ‐２の不在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを用いて１ラウンド培養することによって、アネルギー性Ｔ細胞を調製した。マウスの複数のグループ（ｎ＝８体のメス）に、研究０日目に、５×１０6個のＡ３７５黒色腫細胞（０．１μｇ／ｍＬのＩＦＮγで２４時間予備処理済み）及び５×１０6個のヒトＴ細胞（活性化又はアネルギー性）を皮下接種し、その後、ビヒクル対照、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐２、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｂ、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐２及び０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ｂ両方を投与した。治療（１つ若しくは複数の投与分子又はビヒクル）を、週１回４週間（Ｑ７Ｄ×４）、又は研究０日目の単回治療として（ＱＤ（ＳＤ））、提供した；用量は静脈内注射によって投与した。表１３は、本研究のパラメータを示す。
腫瘍体積を時間の関数として測定した。図１１Ａ〜１１Ｂは本研究の結果を示し、これは、ＰＤ‐１に結合できる分子（例えばｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７（１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）、ＤＡＲＴ‐１、ＤＡＲＴ‐２）と、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えばＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ｂ）との併用療法が、アネルギー性Ｔ細胞の存在下において腫瘍再発を低減することを実証している。またこれらの結果は、ＰＤ‐１に結合できる分子と標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子との併用療法の、各分子単独の投与に対する予想外の便益を実証している。図１１Ａは、正常な活性化Ｔ細胞を接種したグループ１〜４に関する結果を示し；図１１Ｂは、アネルギー性Ｔ細胞を接種したグループ５〜８に関する結果を示す。
［実施例５］ 併用治療研究：Ａ３７５腫瘍モデル
本発明の原理を更に説明するために、ヒトＴ細胞を用いて再構成したＮＯＧマウスにＡ３７５黒色腫細胞を皮下注射した共混合腫瘍モデルを用いて、併用治療研究を実施した。その後マウスに、ビヒクル又は以下の治療剤を投与した：
（１）ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ：ＤＡＲＴ‐２、このダイアボディは、ＰＤ‐１に結合できる分子である；及び／又は
（２）ＣＤ３×ＩＬ１３Ｒα２二重特異性ダイアボディＤＡＲＴ‐Ｂ、このダイアボディは、エフェクタ細胞の細胞表面分子（即ちＣＤ３）及び癌抗原（即ちＩＬ１３Ｒα２）に結合できる分子であり、これによって、ＩＬ１３Ｒα２を発現する癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる。
表１４は、本研究のパラメータを示す。各グループは８体のメスのマウスからなっていた。全てのグループに関して、マウスに、１．２５×１０6個のヒトＴ細胞（１２０μｇ／ｍｌのＤＡＲＴ‐２で２０分間予備処理済み）と共混合した１．２５×１０6個のＡ３７５黒色腫細胞（１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで２４時間予備処理済み）を投与した（ＳＣ；研究０日目に投与）。グループ５〜８のマウスは、細胞注射前（研究−１日目）にＤＡＲＴ‐２（５００μｇ／ｋｇ）で２４時間予備処理され、追加用量のＤＡＲＴ‐２（５００μｇ／ｋｇ）を、研究７日目から開始して７日毎に、合計１０用量投与された。グループ２〜４及び６〜８のマウスは、単回用量のＤＡＲＴ‐Ｂ（１、５又は１０μｇ／ｋｇ）を研究０日目に投与された。グループ１は、ビヒクルのみを投与された。全ての用量は静脈内注射によって投与した。
腫瘍体積を時間の関数として測定し、図１２Ａ〜１２Ｈにプロットした。図１２Ａは、５０日目までの、グループ１、２、５及び６に関する結果を示し；図１２Ｂ〜１２Ｈは、８０日目までの、グループ２（図１２Ｂ）、グループ５（図１２Ｃ）、グループ６（図１２Ｄ）、グループ３（図１２Ｅ）、グループ７（図１２Ｆ）、グループ４（図１２Ｇ）及びグループ８（図１２Ｈ）中の個々の動物に関するスパイダープロットを示す。本研究の結果は、ＰＤ‐１に結合できる分子と標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子との併用療法の、各分子単独の投与に対する予想外の便益を実証している。
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン
配列番号２：例示的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン
配列番号３：例示的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン
配列番号４：例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメイン
配列番号５：例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン
配列番号６：例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン
配列番号７：例示的なＳ２２８Ｐ安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン
配列番号８：例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号９：例示的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１０：例示的なヒトＩｇＧ３ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１１：例示的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１２：例示的なヒトＣＬκドメイン
配列番号１３：例示的なヒトＣＬλドメイン
配列番号１４：好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）
配列番号１５：好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）
配列番号１６〜２１：代替的なスペーサペプチド（リンカー２）
配列番号２２〜２６：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２７：「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２８：「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２９：システイン含有「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号３０：システイン含有「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号３１：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号３２〜３４：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異型
配列番号３５〜３８：介在スペーサペプチド（リンカー）
配列番号３９〜４０：代替的なリンカー
配列番号４１：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換を有する例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号４２：「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号４３：「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、ＸＡＡはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号４４：好ましい介在スペーサペプチド
配列番号４５：シグナル配列を含むヒトＰＤ‐１タンパク質（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２）、ヒトＰＤ‐１タンパク質（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２）のシグナル配列、ヒトＰＤ‐１タンパク質（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２）の成熟タンパク質
配列番号４６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号４７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＨ１
配列番号４８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＨ２
配列番号４９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＨ３
配列番号５０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号５１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＬ１
配列番号５２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＬ２
配列番号５３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １のＣＤＲＬ３
配列番号５４：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号５５：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号５６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＨドメイン
配列番号５７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＨ１
配列番号５８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＨ２
配列番号５９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＨ３
配列番号６０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン
配列番号６１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＬ１
配列番号６２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＬ２
配列番号６３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２のＣＤＲＬ３
配列番号６４：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号６５：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ２ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号６６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＨドメイン
配列番号６７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＨ１
配列番号６８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＨ２
配列番号６９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＨ３
配列番号７０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＶＬドメイン
配列番号７１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＬ１
配列番号７２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＬ２
配列番号７３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３のＣＤＲＬ３
配列番号７４：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＨドメイン
配列番号７５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＨ１
配列番号７６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＨ２
配列番号７７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＨ３
配列番号７８：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＶＬドメイン
配列番号７９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＬ１
配列番号８０：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＬ２
配列番号８１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４のＣＤＲＬ３
配列番号８２：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＨドメイン
配列番号８３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＨ１
配列番号８４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＨ２
配列番号８５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＨ３
配列番号８６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＶＬドメイン
配列番号８７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＬ１
配列番号８８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＬ２
配列番号８９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５のＣＤＲＬ３
配列番号９０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＨドメイン
配列番号９１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＨ１
配列番号９２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＨ２
配列番号９３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＨ３
配列番号９４：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＶＬドメイン
配列番号９５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＬ１
配列番号９６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＬ２
配列番号９７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６のＣＤＲＬ３
配列番号９８：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＨドメイン
配列番号９９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＨ１
配列番号１００：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＨ２
配列番号１０１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＨ３
配列番号１０２：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＶＬドメイン
配列番号１０３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＬ１
配列番号１０４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＬ２
配列番号１０５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７のＣＤＲＬ３
配列番号１０６：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号１０７：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号１０８：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号１０９：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号１１０：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＶＬドメイン
配列番号１１１：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ２及びｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＶＬドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１１２：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７ ＶＬ３のＣＤＲＬ２
配列番号１１３：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＨドメイン
配列番号１１４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＨ１
配列番号１１５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＨ２
配列番号１１６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＨ３
配列番号１１７：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＶＬドメイン
配列番号１１８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＬ１
配列番号１１９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＬ２
配列番号１２０：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８のＣＤＲＬ３
配列番号１２１：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＶＨドメイン
配列番号１２２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＨ１
配列番号１２３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＨ２
配列番号１２４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＨ３
配列番号１２５：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＶＬドメイン
配列番号１２６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＬ１
配列番号１２７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＬ２
配列番号１２８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９のＣＤＲＬ３
配列番号１２９：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号１３０：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号１３１：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＨ２のＣＤＲＨ１
配列番号１３２：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号１３３：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号１３４：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＣＤＲＬ１
配列番号１３５：ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ９ ＶＬ２のＣＤＲＬ２
配列番号１３６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＶＨドメイン
配列番号１３７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＨ１
配列番号１３８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＨ２
配列番号１３９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＨ３
配列番号１４０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＶＬドメイン
配列番号１４１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＬ１
配列番号１４２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＬ２
配列番号１４３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０のＣＤＲＬ３
配列番号１４４：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＶＨドメイン
配列番号１４５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＨ１
配列番号１４６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＨ２
配列番号１４７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＨ３
配列番号１４８：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＶＬドメイン
配列番号１４９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＬ１
配列番号１５０：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＬ２
配列番号１５１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１のＣＤＲＬ３
配列番号１５２：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＶＨドメイン
配列番号１５３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＨ１
配列番号１５４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＨ２
配列番号１５５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＨ３
配列番号１５６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＶＬドメイン
配列番号１５７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＬ１
配列番号１５８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＬ２
配列番号１５９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２のＣＤＲＬ３
配列番号１６０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＶＨドメイン
配列番号１６１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＨ１
配列番号１６２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＨ２
配列番号１６３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＨ３
配列番号１６４：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＶＬドメイン
配列番号１６５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＬ１
配列番号１６６：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＬ２
配列番号１６７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３のＣＤＲＬ３
配列番号１６８：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＶＨドメイン
配列番号１６９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＨ１
配列番号１７０：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＨ２
配列番号１７１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＨ３
配列番号１７２：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＶＬドメイン
配列番号１７３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＬ１
配列番号１７４：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＬ２
配列番号１７５：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４のＣＤＲＬ３
配列番号１７６：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＶＨドメイン
配列番号１７７：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＨ１
配列番号１７８：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＨ２
配列番号１７９：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＨ３
配列番号１８０：マウス抗ヒトＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＶＬドメイン
配列番号１８１：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＬ１
配列番号１８２：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＬ２
配列番号１８３：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １５のＣＤＲＬ３
配列番号１８４：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号１８５：ヒト化抗ヒトｈＰＤ‐１ ｍＡｂ １５ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号１８６：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７ （１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の重鎖
配列番号１８７：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体ｈＰＤ‐１ ｍＡｂ７ （１．２）ＩｇＧ４（Ｐ）の軽鎖
配列番号１８８：ヒトＢ７‐Ｈ１（ＰＤ‐Ｌ１）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１）、予想された１８アミノ酸シグナル配列を含む、予想されたシグナル配列
配列番号１８９：ヒトＢ７‐ＤＣ （ＰＤ‐Ｌ２）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿０７９５１５．２）、予想された１８アミノ酸シグナル配列を含む、予想されたシグナル配列
配列番号１９０：抗ヒトＣＤ２抗体ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメイン
配列番号１９１：抗ヒトＣＤ２抗体ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメイン
配列番号１９２：抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号１９３：抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号１９４：抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン
配列番号１９５：抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＬｏｗのＶＨドメイン
配列番号１９６：抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＦａｓｔのＶＨドメイン
配列番号１９７：抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＶＨドメイン
配列番号１９８：抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＶＬドメイン
配列番号１９９：抗ヒトＣＤ８抗体ＯＫＴ８のＶＨドメイン
配列番号２００：抗ヒトＣＤ８抗体ＯＫＴ８のＶＬドメイン
配列番号２０１：抗ヒトＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＨドメイン
配列番号２０２：抗ヒトＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＬドメイン
配列番号２０３：抗ヒトＣＤ１６抗体３Ｇ８のＶＨドメイン
配列番号２０４：抗ヒトＣＤ１６抗体３Ｇ８のＶＬドメイン
配列番号２０５：抗ヒトＣＤ１６抗体Ａ９のＶＨドメイン
配列番号２０６：抗ヒトＣＤ１６抗体Ａ９のＶＬドメイン
配列番号２０７：抗ヒトＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１のＶＨドメイン
配列番号２０８：抗ヒトＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１のＶＬドメイン
配列番号２０９：抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメイン
配列番号２１０：抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメイン
配列番号２１１：抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメイン
配列番号２１２：抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメイン
配列番号２１３：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２１４：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２１５：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号２１６：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号２１７：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号２１８：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ １ ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号２１９：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２のＶＨドメイン
配列番号２２０：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン
配列番号２２１：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ１のＶＨドメイン
配列番号２２２：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ２のＶＨドメイン
配列番号２２３：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ３のＶＨドメイン
配列番号２２４：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＨ４のＶＨドメイン
配列番号２２５：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ１のＶＬドメイン
配列番号２２６：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ２のＶＬドメイン
配列番号２２７：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ３のＶＬドメイン
配列番号２２８：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ４のＶＬドメイン
配列番号２２９：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ５のＶＬドメイン
配列番号２３０：ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ２ ＶＬ６のＶＬドメイン
配列番号２３１：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のＶＨドメイン
配列番号２３２：抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ ３のＶＬドメイン
配列番号２３３：ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３のＶＨドメイン
配列番号２３４：ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３のＶＬドメイン
配列番号２３５：ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５のＶＨドメイン
配列番号２３６：ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５のＶＬドメイン
配列番号２３７：キメラ抗ＥＧＦＲ抗体「セツキシマブ」のＶＨドメイン
配列番号２３８：キメラ抗ＥＧＦＲ抗体「セツキシマブ」のＶＬドメイン
配列番号２３９：ヒト化抗ヒトＥＧＦＲ抗体「パニツムマブ」のＶＨドメイン
配列番号２４０：ヒト化抗ヒトＥＧＦＲ抗体「パニツムマブ」のＶＬドメイン
配列番号２４１：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２４２：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２４３：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメイン
配列番号２４４：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン
配列番号２４５：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメイン
配列番号２４６：抗ヒトＥｐｈＡ２抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメイン
配列番号２４７：抗ヒトｇｐＡ３３抗体ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２４８：抗ヒトｇｐＡ３３抗体ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２４９：親和性最適化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体マルゲツキシマブのＶＨドメイン
配列番号２５０：親和性最適化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体マルゲツキシマブのＶＨドメイン
配列番号２５１：ヒト化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体トラスツズマブのＶＨドメイン
配列番号２５２：ヒト化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体トラスツズマブのＶＬドメイン
配列番号２５３：ヒト化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体ペルツズマブのＶＨドメイン
配列番号２５４：ヒト化抗ヒトＨｅｒ２／Ｎｅｕ抗体ペルツズマブのＶＬドメイン
配列番号２５５：ヒト化抗ヒトＶＥＧＦ抗体ベバシズマブのＶＨドメイン
配列番号２５６：ヒト化抗ヒトＶＥＧＦ抗体ベバシズマブのＶＬドメイン
配列番号２５７：抗ヒト５Ｔ４抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２５８：抗ヒト５Ｔ４抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２５９：抗ヒト５Ｔ４抗体５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＨドメイン
配列番号２６０：抗ヒト５Ｔ４抗体５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＬドメイン
配列番号２６１：抗ヒトＩＬ１３Ｒα２抗体ｈｕ０８のＶＨドメイン
配列番号２６２：抗ヒトＩＬ１３Ｒα２抗体ｈｕ０８のＶＬドメイン
配列番号２６３：抗ヒトＣＤ１２３抗体ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２６４：抗ヒトＣＤ１２３抗体ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２６５：抗ヒトＣＤ１９抗体ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＨドメイン
配列番号２６６：抗ヒトＣＤ１９抗体ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＬドメイン
配列番号２６７：抗ＨＩＶ ｅｎｖ抗体７Ｂ２のＶＨドメイン
配列番号２６８：抗ＨＩＶ ｅｎｖ抗体７Ｂ２のＶＬドメイン
配列番号２６９：抗ＨＩＶ ｅｎｖ抗体Ａ３２のＶＨドメイン
配列番号２７０：抗ＨＩＶ ｅｎｖ抗体Ａ３２のＶＬドメイン
配列番号２７１：ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号２７２：ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖
配列番号２７３：ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖
配列番号２７４：ＤＡＲＴ‐１の第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２７５：ＤＡＲＴ‐１の第２及び第４のポリペプチド鎖

Claims (38)

  1. 治療的有効量の：
    （１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子、及び
    （２）標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子であって、前記標的細胞は：
    （ａ）癌抗原を発現する癌細胞；又は
    （ｂ）病原体関連抗原を発現する病原体感染細胞
    である、分子
    を、治療を必要とする被験者に投与するステップを含む、癌又は病原体関連疾患の治療のための方法。
  2. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記分子は、ＰＤ‐１とＰＤ‐１の天然リガンドとの間の結合を阻害できる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法は、合計３つのエピトープ結合ドメインを含む２つの結合分子の投与を含み、
    前記２つの結合分子は：
    （Ａ）ＰＤ‐１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン、又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含む、結合分子；並びに
    （Ｂ）（１）前記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン；及び
    （２）前記標的細胞の前記癌抗原又は前記病原体抗原に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン
    を含む、結合分子
    であり、
    前記結合分子（Ａ）の前記エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合でき、前記結合分子（Ｂ）の前記エピトープ結合ドメイン（１）及び（２）は、前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる、請求項１に記載の方法。
  4. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体又はＴａｎｄＡｂを含み、
    前記結合分子（Ｂ）は、二重特異性ダイアボディ、ＣＡＲ、ＢｉＴｅ又は二重特異性抗体を含む、請求項３に記載の方法。
  5. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１に結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、請求項３又は４に記載の方法。
  6. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、請求項３又は４に記載の方法。
  7. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１に結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、
    前記エピトープ結合ドメインは：
    （ａ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
    （ｂ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合しない、請求項５に記載の方法。
  8. 前記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインは、同一のＰＤ‐１分子に同時に結合できる、請求項７に記載の方法。
  9. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、
    前記エピトープ結合ドメインは：
    （ａ）ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
    （ｂ）ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合しない、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ＰＤ‐１リガンド‐エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一の分子に同時に結合できる、請求項９に記載の方法。
  11. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドではない分子のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含む、請求項５又は６に記載の方法。
  12. 前記第２のエピトープ結合ドメインは、ＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子は、前記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子の前記第３のエピトープ結合ドメインは、前記エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子が、前記エフェクタ細胞の２つの異なる細胞表面分子に結合できる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子は、前記標的細胞の癌抗原又は病原体関連抗原に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子の前記第３のエピトープ結合ドメインは、前記標的細胞の異なる癌抗原又は異なる病原体抗原に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子が、前記標的細胞の２つの異なる癌抗原又は２つの異なる病原体抗原に結合できる、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記エフェクタ細胞の前記細胞表面分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記癌抗原は、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記方法は、前記医薬組成物の前記投与を含み、
    前記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. （Ａ）治療的有効量の：
    （１）ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる分子；及び
    （２）癌抗原又は病原体抗原を発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子；並びに
    （Ｂ）薬学的に許容可能なキャリア
    を含む、医薬組成物。
  21. 前記医薬組成物は、合計３つのエピトープ結合ドメインを含む２つの結合分子を含み、
    前記２つの結合分子は：
    （Ａ）ＰＤ‐１に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン、又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含む、結合分子；並びに
    （Ｂ）（１）前記エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン；及び
    （２）前記標的細胞の癌抗原又は病原体抗原に結合できる抗体のエピトープ結合ドメイン
    を含む、結合分子
    であり、
    前記結合分子（Ａ）の前記エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合でき、前記結合分子（Ｂ）の前記エピトープ結合ドメイン（１）及び（２）は、前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記結合分子（Ａ）は、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、抗体又はＴａｎｄＡｂを含み、
    前記結合分子（Ｂ）は、ダイアボディ、ＣＡＲ、ＢｉＴｅ又は二重特異性抗体を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記分子は、ＰＤ‐１に結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
  24. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記分子は、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合する抗体のエピトープ結合ドメインを含む、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
  25. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記分子は、ＰＤ‐１に結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、
    前記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインは：
    （ａ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
    （ｂ）ＰＤ‐１の同一のエピトープへの結合に関して競合しない、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 前記ＰＤ‐１‐エピトープ結合ドメインは、同一のＰＤ‐１分子に同時に結合できる、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含み、
    前記エピトープ結合ドメインは：
    （ａ）ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合するか；又は
    （ｂ）ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一のエピトープへの結合に関して競合しない、請求項２４に記載の医薬組成物。
  28. 前記ＰＤ‐１リガンド‐エピトープ結合ドメインは、ＰＤ‐１の前記天然リガンドの同一の分子に同時に結合できる、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドに結合できる前記結合分子は、ＰＤ‐１又はＰＤ‐１の天然リガンドではない分子のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合ドメインを含む、請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。
  30. 前記第２のエピトープ結合ドメインは、ＣＤ１３７、ＬＡＧ‐３、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ‐３又はＶＩＳＴＡのエピトープに結合する、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記分子は、第３のエピトープ結合ドメインを含み、３つの前記エピトープ結合ドメインは同時結合が可能であり、また前記第３のエピトープは、前記エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに結合できる、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  32. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子の前記第３のエピトープ結合ドメインは、前記エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子が、前記エフェクタ細胞の２つの異なる細胞表面分子に結合できる、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子は、前記標的細胞の癌抗原又は病原体関連抗原に結合できる第３のエピトープ結合ドメインを含む、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  34. 前記標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子の前記第３のエピトープ結合ドメインは、前記標的細胞の異なる癌抗原又は異なる病原体関連抗原に結合でき、これにより、標的転換殺滅を仲介できる前記結合分子が、前記標的細胞の２つの異なる癌抗原又は２つの異なる病原体関連抗原に結合できる、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記エフェクタ細胞の前記細胞表面分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  36. 前記癌抗原は、癌抗原：１９．９、４．２、Ａ３３、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  37. 前記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１等、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  38. 請求項２０〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物のうちのいずれかを含み、
    前記医薬組成物の結合分子は、１つ又は複数の容器に仕分けられている、キット。
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