JP7337079B2 - 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用 - Google Patents

変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用 Download PDF

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Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／６３１，０４３号（２０１８年２月１５日出願；係属中）、及び米国特許出願第６２／７３８，６３２号（２０１８年９月２８日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、各上記出願は参照によりその全体が本出願に援用される。
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ以上の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１５０ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１９年１月３０日作成、サイズ：２９５，０３７バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
本発明は、ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原（「ＤＡ」）のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、多重特異性結合分子（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、３価分子、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）等）（例えば「ＤＡ×ＣＤ３結合分子」）を対象とする。本発明は特に、変異型ＣＤ３結合ドメイン（「ｖＣＤ３結合ドメイン」）を含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関し、上記ｖＣＤ３結合ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含み、そのうちの少なくとも１つは、基準ＣＤ３結合ドメイン（「ｒＣＤ３結合ドメイン」）の対応するＣＤＲのアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、上述のようなｖＣＤ３結合ドメインを含む上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、上述のようなｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、ＣＤ３に対する親和性が変化する。本発明は特に、ＣＤ３に対する親和性が低下し、ＤＡを発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介でき、またｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べてサイトカイン放出のレベルが低い、ｖＣＤ３結合ドメインを含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
Ｉ．哺乳類免疫系
哺乳類免疫系は、例えば創傷、感染及び新生物を含む多様な状態に対する防御として機能する。ヒト及び他の哺乳類が病原体、外来物質及び癌抗原に対する免疫応答を発現する効率は、２つの特徴：抗原認識に対する免疫応答の優れた特異性、及び同一の抗原による再活性化に対するより迅速かつより活発な応答を可能とする免疫記憶に基づくものである(非特許文献１～３）。
健康な個体では、免疫系は静止状態であり、多様な阻害性受容体及びリガンドによって阻害される。癌抗原、微生物病原体又はアレルゲンを認識すると、活性化受容体及び受容体リガンドのアレイは、免疫系の活性化を誘発するようトリガされる。このような活性化は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化につながり、様々なサイトカインの放出を促進し、これらのサイトカインは全て、被験者の健康に対する知覚された脅威に対抗するよう作用する（非特許文献４～６）。免疫系は、相殺阻害性免疫シグナルが活性化免疫シグナルよりも大きい場合に、その正常な静止状態に戻ることができる。
よって、癌の疾患状態（及び実際には感染性疾患の疾患状態）は、被験者の免疫系の十分な活性化の失敗を反映したものであると考えることができる。このような失敗は、活性化免疫シグナルの不十分な提示を反映したものであってよく、又は被験者における阻害性免疫シグナルを軽減する能力が不十分であることを反映したものであってよい。いくつかの例では、研究者により、癌細胞が免疫系を組み込むことによって、上記免疫系に検出されるのを避けることができることが判明した（非特許文献３）。
哺乳類免疫系は、２つの別個の、ただし相互に関連した系：体液免疫系及び細胞免疫系によって仲介される。一般に、体液系は、Ｂ細胞によって産生される可溶性分子（抗体又は免疫グロブリン）によって仲介される。上記分子は、身体にとって外来物であると認識された抗原と化合してこれを中和する能力を有する。細胞免疫系は、多様な治療的役割を果たす「Ｔ細胞」と呼ばれる特定の細胞の可動化を伴う。Ｔ細胞は、胸腺において成熟して、組織、リンパ系及び循環器系の間を循環する、リンパ球である。外来構造（抗原）の存在及び認識に応答して、Ｔ細胞は「活性化され（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」た状態となり、免疫応答を開始する。多くの例では、これらの外来抗原は、新生物又は感染の結果として宿主細胞上に発現する。Ｔ細胞自体は抗体を分泌しないが、Ｔ細胞は通常、第２の分類のリンパ球であるＢ細胞（これは骨髄に由来する）による抗体分泌のために必要である。重要なことに、Ｔ細胞は、卓越した免疫学的特異性を示すことによって、抗原を互いに識別できる。
Ｔ細胞活性化には２つの相互作用が必要となる（非特許文献５、６）。第１の相互作用では、細胞は、ナイーブＴリンパ球のＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体；「ＴＣＲ」）に結合できるよう、細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ：「ＭＨＣ」）に結合する適切な標的抗原を提示しなければならない。ほとんど全ての細胞タイプが抗原提示細胞として作用できるが、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞といった一部の細胞は、外来抗原の提示に特化されており、「プロフェッショナル」「抗原提示細胞」である。抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ分子に結合する抗原の免疫学的検出は、細胞傷害性Ｔ細胞の産生につながる。抗原提示細胞のＭＨＣ ＩＩ分子に結合する抗原の免疫学的検出は、細胞傷害性Ｔ細胞の産生につながる。第２の相互作用では、抗原提示細胞のリガンドはＴ細胞の共受容体に結合しなければならない（非特許文献４、７）。両方の刺激シグナルを受けたＴ細胞は、サイトカイン（インターロイキン２及びインターロイキン１２等）に応答できる。
ＴＣＲ関与中に両方の共刺激シグナルが存在しない場合、Ｔ細胞は機能的に無反応な状態に入り、これはクローンアネルギー（ｃｌｏｎａｌ ａｎｅｒｇｙ）と呼ばれる（非特許文献８）。病的状態においては、Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ及び多発性硬化症といった様々な臓器特異的自己免疫疾患において重要な役割を果たす（非特許文献４）。
このような免疫「チェックポイント（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）」経路は、自己寛容性を維持する（即ち被験者が自身の細胞に対する免疫系の攻撃を発生させること（「自己免疫（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）応答」）を防止する）にあたって、及び抗菌又は抗アレルギ性免疫応答中の付帯的な組織損傷を制限するにあたって、重要である。Ｔ細胞の接触により、２つの必要なシグナルのうちの一方のみが生成される場合、Ｔ細胞は活性化されず、適合した免疫応答が発生しない。従ってＴ細胞活性化の「２シグナル」機序は、免疫系が、望ましくない応答、例えば被験者自身の細胞に対する免疫系の攻撃をもたらす自己抗原に対する応答（「自己免疫」応答）を回避するための方法を提供する。
ＩＩ．細胞免疫系の細胞表面分子
Ａ．ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８
免疫系の細胞は、特化された糖タンパク質細胞表面分子の発現を特徴とする。このような分子と他の細胞の分子との間の相互作用は、免疫応答をトリガするか、維持するか、又は弱める。特に全てのＴ細胞は、ＣＤ３の発現を特徴とする。ＣＤ３は、４つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である（非特許文献９、１０、２）。
哺乳類では、上記複合体ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成するためにＴＣＲと会合する（非特許文献１１）。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（非特許文献１２）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しない（非特許文献１３～１５を参照）。
Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体の不変ＣＤ３εシグナリング成分は、Ｔ細胞と癌細胞との間の免疫学的シナプスの形成を強制するための標的として使用されてきた。ＣＤ３及び腫瘍抗原の共関与はＴ細胞を活性化し、腫瘍抗原を発現する癌細胞の溶解をトリガする（非特許文献１６）。このアプローチにより、二重特異性抗体は、癌細胞に対する高い特異性を有するＴ細胞コンパートメントと全体的に相互作用し、またこのアプローチは、幅広い細胞表面腫瘍抗原に広く適用可能であり、病原体感染細胞を標的化するためにも実装されている（例えば非特許文献１７、特許文献１、２を参照）。
「ヘルパーＴ細胞」として知られるＴ細胞の第１のサブセットは、ＣＤ４の発現を特徴とする（即ちこれらは「ＣＤ４+」、かつＣＤ３+である）。ＣＤ４+Ｔ細胞は、殆どの哺乳類免疫及び自己免疫応答の必須のオーガナイザである（非特許文献４）。ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化は、抗原：抗原提示細胞（例えばＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞）の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子複合体と、いずれもナイーブＣＤ４+Ｔ細胞の表面上に配列された２つの分子の複合体、即ちＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３細胞表面受容体リガンドとの間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。活性化されたＴヘルパー細胞は、標的細胞への炎症応答を仲介できるＴｈ１細胞を増殖させることができる。
「細胞傷害性Ｔ細胞」として知られるＴ細胞の第２のサブセットは、ＣＤ８の発現を特徴とする（即ちこれらは「ＣＤ８+」、かつＣＤ３+である）。ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される、２つの別個の鎖からなるＴ細胞共受容体である（非特許文献１８）。ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化は、抗原：標的細胞の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子複合体と、ＣＤ８+Ｔ細胞の表面上に配列されたＣＤ８及びＴ細胞受容体の複合体との間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている（非特許文献１９）。特定の免疫系のみによって発現する主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子とは異なり、ＭＨＣ Ｉ分子は極めて広範に発現する。従って細胞傷害性Ｔ細胞は、広範な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞毒であるパーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンの放出によって、細胞殺滅を仲介する。パーフォリンの作用により、グランザイムは標的細胞の細胞質に入り、グランザイムのセリンプロテアーゼ機能によって、最終的に標的細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）につながる一連のシステインであるカスパーゼカスケードをトリガする。
Ｂ．Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）
Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞が自然に発現するものであり、これらの細胞が、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質によって結合及び提示される抗原ペプチドを認識できるようにする。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド‐ＭＨＣ）の認識は、サイトカインの産生及び抗原提示細胞の溶解につながる、細胞免疫応答の伝播を開始させる（例えば非特許文献２２～２４参照）。ＣＤ３はＴＣＲに結合する受容体である（非特許文献１２、２、２６、２７、１１、２８）。
（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７としても知られる）ＣＤ３ζ鎖ゼータ鎖を伴うＴＣＲとＣＤ３との複合体は、ＴＣＲ複合体を含む（非特許文献２９、９）。上記複合体は、多数（１０個）の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するため、特に重要である。
国際公開第２０１４／１５９９４０号 国際公開第２０１６／０５４１０１号
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ＣＤ３結合ドメインと、標的細胞上に発現される疾患抗原（「ＤＡ］）に対して特異的な結合ドメインとを含む、多重特異性分子は、このような標的細胞の標的転換Ｔ細胞殺滅を仲介できる。しかしながら、ＣＤ３に対するこのような分子の親和性により、上記分子は、刺激されたＴ細胞からの望ましくないサイトカイン放出を呈してしまうほど強すぎるものとなる場合がある。よって、哺乳類の免疫応答に関与する分子の同定のこれまでの進歩にもかかわらず、癌及び感染性疾患の治療のための改善された療法に対する需要は存在し続けている。本発明は、このような多重特異性分子の細胞殺滅及び／又はサイトカイン放出活性を変調して治療ウィンドウを強化するために使用できる、ある範囲の結合動態を有する変異型ＣＤ３結合ドメインのパネルを提供する。本発明はこの目標、及びその他の目標を対象とする。
本発明は、ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原（「ＤＡ」）のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、多重特異性結合分子（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、３価分子、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）等）（例えば「ＤＡ×ＣＤ３結合分子」）を対象とする。本発明は特に、変異型ＣＤ３結合ドメイン（「ｖＣＤ３結合ドメイン」）を含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関し、上記ｖＣＤ３結合ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含み、そのうちの少なくとも１つは、基準ＣＤ３結合ドメイン（「ｒＣＤ３結合ドメイン」）の対応するＣＤＲのアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、上述のようなｖＣＤ３結合ドメインを含む上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、上述のようなｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、ＣＤ３に対する親和性が変化する。本発明は特に、ＣＤ３に対する親和性が低下し、ＤＡを発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介でき、またｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べてサイトカイン放出のレベルが低い、ｖＣＤ３結合ドメインを含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
詳細には、本発明は、ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子を提供し、上記ＣＤ３結合ドメインは：
（Ｉ）（Ａ）配列番号９９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、及び配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、及び配列番号１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
（ＩＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号１０９及び配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン：又は
（ＩＶ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号１１３及び配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン
を含む。
本発明は更に、上記ＣＤ３結合ドメインが：
（Ｉ）（Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
（Ｂ）配列番号９８、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、及び配列番号１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
（Ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン
を含む、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性ＴａｎｄＡｂ、又は３価結合分子である、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が、２つ以上の疾患抗原及び／又はエフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、特に、エフェクタ細胞の上記異なる細胞表面分子が、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、又はＮＫＧ２Ｄである、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記疾患抗原が癌抗原又は病原体関連抗原である、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記癌抗原が、癌抗原：１９．９、４．２、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記癌抗原が、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ、５Ｔ４、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、又はＲＯＲ１である、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が、互いに対して共有結合する第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ドメイン１であって：
（１）疾患抗原の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬDA）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を含み、上記サブドメイン１Ａ及び上記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
（ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２
を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）疾患抗原の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨDA）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を含み、上記サブドメイン１Ａ及び上記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
（ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２であって、上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖との上記ヘテロ二量体促進ドメインは異なる、ドメイン２
を含み、
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインとは、会合して上記疾患抗原結合ドメインを形成し、上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインとは、会合して上記ＣＤ３結合ドメインを形成するか；又は
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインとは、会合して上記ＣＤ３結合ドメインを形成し、上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインとは、会合して上記疾患抗原結合ドメインを形成する、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインであり、上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであるか；又は
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであり、上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインである、
上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第１のポリペプチド鎖又は上記第２のポリペプチド鎖が、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むドメイン３を更に含む、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第３のポリペプチド鎖を更に含む、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子がＣＤ８結合ドメインを更に含む、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が：
（Ｉ）（Ａ）配列番号１７９を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１７５を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＩＩ）（Ａ）配列番号１９６を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８６を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＶ）（Ａ）配列番号１９７を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９２を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（Ｖ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＶＩ）（Ａ）配列番号１７９を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１７５を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＶＩＩ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＶＩＩＩ）（Ａ）配列番号１９６を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８６を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＩＸ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド
を含む、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子のうちのいずれ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物に関する。
本発明は更に、それを必要とする被験者に、治療的有効量の上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は上述の医薬組成物のうちのいずれを投与するステップを含む、疾患の治療のための方法に関する。
本発明は更に、上記疾患が癌である、上述の方法の実施形態に関し、これは、上記癌が、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される実施形態を含む。
本発明は更に、上記疾患が病原体関連疾患である、上述の方法の実施形態に関し、これは、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される実施形態を含む。
本発明は更に、疾患の治療における、上述のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は上述の医薬組成物のうちのいずれの使用に関する。
本発明は更に、上記疾患が癌である、上述の使用の実施形態に関し、これは、上記癌が、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される実施形態を含む。
本発明は更に、上記疾患が病原体関連疾患である、上述の使用の実施形態に関し、これは、上記病原体関連抗原が、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される実施形態を含む。
図１Ａ～Ｂは、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。システイン残基は、リンカー中（図１Ａ）及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中（図１Ｂ）に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図２は、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図３Ａ～３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ～３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合ドメインを有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃドメイン含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃドメイン含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、ヘテロ二量体化を促進するために抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃドメイン含有ダイアボディを示す。 図４Ａ～４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を含むＦｃドメインを形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図６Ａ～６Ｆは、３つのエピトープ結合ドメインを有する、代表的なＦｃドメイン含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインを概略図で示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を含む。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、ＦｃドメインのＮ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、ＦｃドメインのＣ末端にある２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ～６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図７Ａ～７Ｄは、ＣＴＬアッセイ及び結合アッセイの結果を示す。図７Ａは、ＣＤ３ ｍＡｂ １；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１５；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９；及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２０のＶＬ及びＶＨドメインを含有するＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディ構築物によって仲介される代表的な標的転換細胞殺滅の結果（ＣＴＬアッセイにおける％細胞傷害性）を示す。図７Ｂ～７Ｃは、親和性定数（図７Ｂ：ＫＤ；図７Ｃ：ｋａ；及び図７Ｄ：ｋｄ）と、表１１～１２で報告されているＣＴＬ活性（１８時間における細胞溶解のＥＣ50）との間の相関をプロットしたものである。 図８Ａ～８Ｅは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＶ‐４‐１１白血病標的細胞を用いた、ＣＤ３ ｍＡｂ １；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ７；ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３；及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１５のＶＬ及びＶＨドメインを含有するＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。パーセント細胞傷害性が図８Ａにプロットされている。サイトカイン応答が図８Ｂ～８Ｅにプロットされている（図８Ｂ：ＩＦＮ‐γ；図８Ｃ：ＴＮＦ‐α；図８Ｄ：ＩＬ‐６；図８Ｄ：ＩＬ‐２）。ＮｅｇＣｔｒｌ：陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）。 図９Ａ～９Ｂは、ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、疾患抗原に結合する能力を示す。図９Ａは、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、ＣＤ１２３発現性ＭＯＬＭ‐１３細胞に結合する能力を示す。図９Ｂは、５Ｔ４‐ＷＴ、５Ｔ４‐Ｍ１、５Ｔ４‐Ｍ２、及び５Ｔ４‐Ｍ１８ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、５Ｔ４発現性Ａ４９８細胞に結合する能力を示す。結合は、ダイアボディのＥ／Ｋコイルに対して特異的なビオチン化抗体、及びストレプトアビジン‐フィコエリスリン（ＰＥ）を用いて検出した。 図１０Ａ～１０Ｂは、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ａ）及びＣＤ４+Ｔ細胞（図１０Ｂ）に結合する能力を示す。 図１１Ａ～１１Ｑは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３急性単球性白血病（ＡＭＬ）標的細胞を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物：ＣＤ１２３‐ＷＴ（図１１Ｂ、１１Ｆ、１１Ｊ、及び１１Ｎ）、ＣＤ１２３‐Ｍ２（図１１Ｃ、１１Ｇ、１１Ｋ、及び１１Ｏ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８（図１１Ｄ、１１Ｈ、１１Ｌ、及び１１Ｐ）、ＨＩＶ‐ＷＴ（図１１Ｅ、１１Ｉ、１１Ｍ、及び１１Ｑ）によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。パーセント細胞傷害性が図１１Ａにプロットされている。サイトカイン応答及びパーセント細胞傷害性が図１１Ｂ～１１Ｑにプロットされている（図１１Ｂ～１１Ｅ：ＩＦＮ‐γ；図１１Ｆ～１１Ｉ：ＴＮＦ‐α；図１１Ｊ～１１Ｍ：ＩＬ‐６；図１１Ｎ～１１Ｑ：ＩＬ‐２）。 図１２Ａ～１２Ｅは、ＰＢＭＣエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３ ＡＭＬ標的細胞を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。パーセント細胞傷害性が図１２Ａにプロットされている（Ｅ：Ｔ＝１５：１、２４時間）。サイトカイン応答が図１２Ｂ～１２Ｅにプロットされている（図１２Ｂ：ＩＦＮ‐γ；図１２Ｃ：ＴＮＦ‐α；図１２Ｄ：ＩＬ‐６；図１２Ｅ：ＩＬ‐２）。 図１３Ａ～１３Ｑは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＡ４９８腎細胞癌標的細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１、２４時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物５Ｔ４‐ＷＴ（図１３Ｂ、１３Ｆ、１３Ｊ、及び１３Ｎ）、５Ｔ４‐Ｍ２（図１３Ｃ、１３Ｇ、１３Ｋ、及び１３Ｏ）、５Ｔ４‐Ｍ１８（図１３Ｄ、１３Ｈ、１３Ｌ、及び１３Ｐ）、ＨＩＶ‐ＷＴ（図１３Ｅ、１３Ｉ、１３Ｍ、及び１３Ｑ）によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。細胞傷害性が図１３Ａにプロットされている。サイトカイン応答及びパーセント細胞傷害性が図１３Ｂ～１３Ｑにプロットされている（図１３Ｂ～１３Ｅ：ＩＦＮ‐γ；図１３Ｆ～１３Ｉ：ＴＮＦ‐α；図１３Ｊ～１３Ｍ：ＩＬ‐６；図１３Ｎ～１３Ｑ：ＩＬ‐２）。 図１４Ａ～１４Ｊは、ＰＢＭＣ（図１４Ａ～１４Ｅ）又はＰａｎ‐Ｔエフェクタ細胞（図１４Ｆ～１４Ｊ）（ＰＢＭＣについてはＥ：Ｔ＝３０：１、Ｐａｎ‐Ｔ細胞についてはＥ：Ｔ＝１０：１、２４～４８時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１９×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。パーセント細胞傷害性（４８時間）が図１４Ａ（ＰＢＭＣ）及び図１４Ｆ（Ｐａｎ‐Ｔ細胞）にプロットされている。ＰＢＭＣを用いた４８時間時点におけるサイトカイン応答が、図１４Ｂ～１４Ｅ（ＰＢＭＣ）及び図１４Ｇ～１４Ｊ（Ｐａｎ Ｔ細胞）にプロットされている（図１４Ｂ及び１４Ｇ：ＩＦＮ‐γ；図１４Ｃ及び１４Ｈ：ＴＮＦ‐α；図１４Ｄ及び１４Ｉ：ＩＬ‐６；図１４Ｅ及び１４Ｊ：ＩＬ‐２）。 図１５Ａ～１５Ｅは、代表的なＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、Ｔ細胞活性化を仲介する能力を示す。Ｔ細胞活性化は、上記ダイアボディの、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現に影響を及ぼす能力を評価することによって測定された。パーセント細胞傷害性が図１５Ａにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｂにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｃにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｄにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｅにプロットされている。 図１６Ａ～１６Ｅは、代表的な５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、Ｔ細胞活性化を仲介する能力を示す。Ｔ細胞活性化は、上記ダイアボディの、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現に影響を及ぼす能力を評価することによって測定された。パーセント細胞傷害性が図１６Ａにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｂにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｃにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｄにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｅにプロットされている。 図１７Ａ～１７Ｂは、例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスに、ＣＤ１２３‐ＷＴ（５０μｇ／ｋｇ）又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（５μｇ／ｋｇ若しくは５０μｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を３５日にわたって評価した。図１７Ａ：ＣＤ４；図１７Ｂ：ＣＤ８。 図１８Ａ～１８Ｄは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスに、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２、又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（０．５、５、５０、若しくは５００μｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を３５日にわたって評価した。図１８Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ；図１８Ｂ：ＣＤ１２３‐Ｍ２；図１８Ｃ：ＣＤ１２３‐Ｍ１８；図１８Ｄ：ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１８、５０μｇ／ｋｇ及び５００μｇ／ｋｇの治療群。 図１９Ａ～１９Ｄは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＭＶ４‐１１細胞を受け取ったマウスに、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２、又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（０．５、５、５０、若しくは５００μｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を３５日にわたって評価した。図１９Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ；図１９Ｂ：ＣＤ１２３‐Ｍ１８；図１９Ｃ：ＣＤ１２３‐Ｍ２；図１９Ｄ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２及びＣＤ１２３‐Ｍ１８、５００μｇ／ｋｇの治療群。 図２０Ａ～２０Ｂは、５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＳＫＯＶ３細胞を受け取ったマウスに、５Ｔ４‐ＷＴ（１０、５０、１００、若しくは５００μｇ／ｋｇ）、５Ｔ４‐Ｍ１８（１０、５０、１００、若しくは５００μｇ／ｋｇ）、又は５Ｔ４‐Ｍ２（５００μｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を４５日にわたって評価した。図２０Ａ：５Ｔ４‐ＷＴ；図２０Ｂ：５Ｔ４‐Ｍ１８及び５Ｔ４‐Ｍ２。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディによって誘発されるサイトカイン放出プロファイルに対する生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスにＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（５０又は５００μｇ／ｋｇ）を投与した６時間後に、血清サイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を評価した。図２１Ａ：ＩＦＮ‐γ；図２１Ｂ：ＴＮＦ‐α；図２１Ｃ：ＩＬ‐６；及び図２１Ｄ：ＩＬ‐２。 図２２Ａ～２２Ｃは、ＣＤ１２３×ＣＤ３×ＣＤ８ ３価型分子であるＴ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８の、細胞表面抗原に結合する能力を示す。図２２Ａ：ＣＤ１２３発現性ＭＯＬＭ‐１３細胞への結合；図２２Ｂ：ＣＤ４+Ｔ細胞への結合；図２２Ｃ：ＣＤ８+Ｔ細胞への結合。 図２３Ａ～２３Ｇは、異なる複数のＴ細胞集団を用いた、Ｔ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８というＣＤ１２３×ＣＤ３×ＣＤ８ ３価型分子によって仲介される標的転換細胞殺滅の代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。ＣＤ３+Ｐａｎ‐Ｔ細胞（図２３Ａ）；ＣＤ４+Ｔ細胞（図２３Ｂ）；及びＣＤ８+Ｔ細胞（図２３Ｃ）を用いたパーセント細胞傷害性が図２３Ａ～２３Ｃにプロットされている。ＣＤ３+Ｐａｎ‐Ｔ細胞を用いたサイトカイン応答が、図２３Ｄ～２３Ｇにプロットされている。図２３Ｄ：ＩＦＮ‐γ；図２３Ｅ：ＴＮＦ‐α；図２３Ｆ：ＩＬ‐６；及び図２３Ｇ：ＩＬ‐２。 図２４Ａ～２４Ｊは、ＣＤ１２３‐Ｍ１８（１０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇ）又はＣＤ１２３‐ＷＴ（０．００３ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルにおいて観察された、血清サイトカインレベル、Ｋｉ６７発現、及び臨床病理学マーカーレベルを示す。図２４Ａ：ＩＦＮ‐γ；図２４Ｂ：ＴＮＦ‐α；図２４Ｃ：ＩＬ‐６；図２４Ｄ：ＩＬ‐２；図２４Ｅ：ＩＬ‐１５；図２４Ｆ：Ｋｉ６７陽性ＣＤ４+Ｔ細胞；図２４Ｇ：Ｋｉ６７陽性ＣＤ８+Ｔ細胞；図２４Ｈ：血小板；図２４Ｉ：Ｃ反応性タンパク質；図２４Ｊ：血中尿素窒素。 図２５Ａ～２５Ｇは、ＡＭＬ患者からの末梢血試料においてＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８によって仲介されるＡＭＬ芽球欠乏の代表的な研究の結果を示す。図２５Ａ：対照の百分率としてのＡＭＬ３４+芽球数；図２５Ｂ：ＣＤ４+細胞増殖；図２５Ｃ：ＣＤ８+細胞増殖；図２５Ｄ‐Ｇ：サイトカイン放出（図２５Ｄ：ＩＦＮ‐γ；図２５Ｅ：ＴＮＦ‐α；図２５Ｆ：ＩＬ‐６；及び図２５Ｇ：ＩＬ‐２）。 図２６Ａ～２６Ｅは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３ ＡＭＬ標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１５：１、４８‐９６時間）を用いた、ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディ構築物ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１９によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究（ＣＴＬアッセイ）の結果を示す。放出された％ＬＤＨの関数としての細胞傷害性が、図２６Ａにプロットされている。サイトカイン応答が図２６Ｂ～２６Ｅにプロットされている（図２６Ｂ：ＩＦＮ‐γ；図２６Ｃ：ＴＮＦ‐α；図２６Ｄ：ＩＬ‐６；図２６Ｅ：ＩＬ‐２）。 図２７Ａ～２７Ｄは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３ ＡＭＬ標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１５：１、４８‐９６時間）を用いた、ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディ構築物ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、ＣＤ１２３‐Ｍ１９、及びＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴによって仲介される４‐７標的転換細胞殺滅アッセイ（ＣＴＬアッセイ）及びサイトカイン放出研究からの累積結果を提示する。ＣＴＬ活性のＥＣ50値（単位：ｐＭ）が図２７Ａにプロットされている。ＣＤ１２３‐ＷＴのＥＣ50値の倍数としてのＣＴＬ活性が、図２７Ｂにプロットされている。ＣＤ１２３‐ＷＴの百分率としてのＣＴＬ活性Ｅmaxが図２７Ｃにプロットされている。ＣＤ１２３‐ＷＴに対して正規化された、算出された治療指数（ＴＩ＝Ｅmax（ＣＴＬ）：Ｅmax（サイトカイン））が、図２７Ｄにプロットされている。 図２８Ａ～２８Ｂは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスに、ＣＤ１２３‐ＷＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８又はＣＤ１２３‐Ｍ１３（０．００５、０．０５、０．５、及び１ｍｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を４２日間にわたって評価した。図２８Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１８。図２８Ｂ：ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１３。 図２９Ａ～２９Ｂは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディ構築物の、生体内での腫瘍の縮小を仲介する能力に関する、生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスに、ＣＤ１２３‐ＷＴ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、又はＣＤ１２３‐Ｍ１７（０．００５、０．０５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）を供給し、腫瘍体積を４２日間にわたって評価した。図２９Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１８。図２９Ｂ：ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１７。 図３０Ａ～３０Ｂは、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディによって誘発されるインターロイキン‐２サイトカイン放出プロファイルに対する生体内研究の結果を示す。ＫＧ１Ａ細胞を受け取ったマウスにＣＤ１２３‐ＷＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（０．０５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）を投与した６時間後に、血清サイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を評価した。図３０Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８；並びに図３０Ｂ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８。 図３１Ａ～３１Ｆは、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣからのＣＤ１９‐ＷＴ、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８、及びＨＩＶ‐Ｍ１８による自己Ｂ細胞欠乏の代表的な研究の結果を示す。ＣＤ２０+Ｂ細胞の欠乏が、図３１Ａ（ヒトＰＢＭＣ）及び図３１Ｂ（ｃｙｎｏ ＰＢＭＣ）にプロットされている。処置済みのヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出が、図３１Ｃ～Ｆにプロットされている。（図３１Ｃ：ＩＦＮ‐γ；図３１Ｄ：ＴＮＦ‐α；図３１Ｅ：ＩＬ‐６；及び図３１Ｆ：ＩＬ‐２）。 図３２Ａ～３２Ｄは、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８（１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）又はＣＤ１２３‐ＷＴ（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルの末梢血中で観察されるＢ細胞レベルの低減を示す。投与前のＢ細胞レベルが図３２Ａに示されている（Ｂ細胞集団は楕円で示されている）。１日目、８日目、及び１５日目のレベルが、それぞれ図３２Ｂ～３２Ｄに示されている。 図３３Ａ～３３Ｃは、陽性対照ＣＤ１９‐ＷＴ（図３３Ａ：０．１ｍｇ／ｋｇ）又はＣＤ３変異型ＣＤ１９．１‐Ｍ１８（図３３Ｂ：１０ｍｇ／ｋｇ；及び図３３Ｃ：３０ｍｇ／ｋｇ）での処置前及び処置後７日目のカニクイザルからのリンパ節中のＢ細胞の免疫組織化学染色を示す。 図３４は、ＣＤ１９．１‐Ｍ１３（１ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１９．１‐Ｍ１７（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＤ１９‐ＷＴ（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルの末梢血中で観察されるＢ細胞レベルの低減を示す。 図３５Ａ～３５Ｅは、ＣＤ１９．１‐Ｍ１３（１ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１９．１‐Ｍ１７（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＤ１９‐ＷＴ（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルで観察される血清サイトカインレベルを示す。図３５Ａ：ＴＮＦ‐α、図３５Ｂ：ＩＦＮ‐γ、図３５Ｃ：ＩＬ‐２、図３５Ｄ：ＩＬ‐６；及び図３５Ｅ：ＩＬ‐１５。 図３６Ａ～３６Ｂは、ＣＤ１９．１‐Ｍ１３（１ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１９．１‐Ｍ１７（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＣＤ１９‐ＷＴ（０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたカニクイザルで観察されるＴ細胞の増殖を示す。図３６Ａ：Ｋｉ６７陽性Ｔ細胞であるＣＤ４+Ｔ細胞；図３６Ｂ：Ｋｉ６７陽性ＣＤ８+Ｔ細胞。
本発明は、ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原（「ＤＡ」）のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、多重特異性結合分子（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、３価分子、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ＢｉＴＥ（登録商標）等）（例えば「ＤＡ×ＣＤ３結合分子」）を対象とする。本発明は特に、変異型ＣＤ３結合ドメイン（「ｖＣＤ３結合ドメイン」）を含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関し、上記ｖＣＤ３結合ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含み、そのうちの少なくとも１つは、基準ＣＤ３結合ドメイン（「ｒＣＤ３結合ドメイン」）の対応するＣＤＲのアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、上述のようなｖＣＤ３結合ドメインを含む上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、上述のようなｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、ＣＤ３に対する親和性が変化する。本発明は特に、ＣＤ３に対する親和性が低下し、ＤＡを発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介でき、またｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べてサイトカイン放出のレベルが低い、ｖＣＤ３結合ドメインを含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
上述のように、本発明の治療用分子は特に、エフェクタ細胞の細胞表面分子のエピトープに免疫特異的に結合できるエピトープ結合ドメインと、疾患抗原を発現する標的細胞のエピトープに免疫特異的に結合できるエピトープ結合ドメインとを含む、二重特異性結合分子を含む。本明細書中で使用される場合、用語「疾患抗原（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｔｉｇｅｎ）」（「ＤＡ」と略される）は、異常若しくは感染細胞の表面上で発現し、上記異常若しくは感染の特徴となる抗原、又は外来細胞の表面上で発現し、このような外来源の特徴となる抗原を指す。本明細書中で使用される場合、細胞表面上に疾患抗原を発現し、従って本発明の治療用分子によって束縛され得、これによって上記治療用分子による殺滅の標的となる細胞は、「標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）」である。本発明に特に関連するのは、「癌抗原（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）」又は「病原体関連抗原（Ｐａｔｈｏｇｅｎ‐Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）」である疾患抗原である。
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明のＤＡ×ＣＤ３結合分子は、抗体であってよく、又は（例えば抗体ポリペプチドの断片化、切断等によって、若しくは抗体分子のアミノ酸配列の、若しくはこのようなポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（若しくはその配列）の使用等によって）抗体から誘導可能であってよい。
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の分子の特定のドメイン又は部分又は立体配座（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。エピトープ含有分子は、免疫原性活性を有してよく、従ってエピトープ含有分子は動物の体内で抗体産生応答を誘発する。このような分子は「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」と呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合ドメインを包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合ドメインを含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に「免疫特異的に結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」）が存在するためである。
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、並びに必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125を参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、以下で詳述するように、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。
本発明の結合分子は、その結合ドメインを介して、「免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式でエピトープに結合する。本明細書中で使用される場合、抗体、ダイアボディ、又は他のエピトープ結合分子は、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に、代替的なエピトープに対してよりも頻繁に、迅速に、長期間、及び／又は高い親和性で反応又は会合する場合に、該分子（即ちエピトープ）に「免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」結合すると表現される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、該抗体が他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに結合するよりも、高い親和性で、高い結合活性で、より迅速に、及び／又はより長期間結合する抗体である。この定義を読むと、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合するものであっても、そうでなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、必ずしも排他的な結合を要求しない（ただしこれを含み得る）。一般には、結合に関する言及は「免疫特異的な」結合を意味するが、必ずしもそうではない。
この数十年、抗体の治療能力に対する関心が再燃しており、抗体は、バイオテクノロジー由来薬物の主要な分類の１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体ベースの薬物について、その使用が承認されているか、又は開発中である。
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの「重鎖（Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ）」と複合体化した２つの「軽鎖（Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ）」からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）及び定常ドメイン（「ＣＬ」）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨ」）、３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）」領域（「Ｈ」）を含有する。対照的に、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を連結することによって作製された、単鎖分子である。
従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、２つの軽鎖及び２つの重鎖を有する四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００～１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。無傷の修飾されていない抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、可変ドメインの存在及びその配列に左右される。特段の記載がない限り、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端への（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｏ Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」方向である。
Ａ．抗体可変ドメインの特徴
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触する抗体のアミノ酸残基を含有する３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及びフレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる４つの介在する非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワーク領域は、上記ＣＤＲセグメントを隔て、また一般にＣＤＲの残基の構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、上記ＣＤＲがエピトープに接触できるようにする（ただし特定のフレームワーク残基もこのような接触においてある役割を果たすことができる）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有し、ここでｎ及びｃはそれぞれ、ドメインのＮ末端及びＣ末端を表す。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ある抗体がある特定のエピトープに結合できるかどうかを決定する。
免疫グロブリンの成熟した重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内でのアミノ酸の位置によって指定される。Kabat et al.（Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」）、参照により本出願に援用される）は、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を同定し、残基番号を各アミノ酸に割り当てている。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるように同定される（Chothia, C. & Lesk, A. M.(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲH１は、残基５個分前から始まることが理解されるだろう）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、その大要に含まれていない抗体に対して、保存されたアミノ酸を参照して上記抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列のうちの１つと整列させることにより、拡張可能である。残基番号を割り当てるこの方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ変異型又はヒト化変異型を含む異なる抗体の同一の位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同一位置を占める。
抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って、本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合ドメイン（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）」は、結合分子の、あるエピトープに免疫特異的に結合できる能力に寄与する、該結合分子の断片又は部分（あるいはこのような断面又は部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を含むドメインを指す。エピトープ結合ドメインは、抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４若しくは５個を含有してよく、又は抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。エピトープ結合ドメインは、ＣＤＲの一部のみ、即ちＣＤＲ残基の、結合に必要なサブセットのみを含有してよい（これは「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」と呼ばれる；Kim, J.H. et al. (2012) “Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting,” Methods Mol. Biol. 907:237-245; Kim, K.S. et al. (2010) “Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231-237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) “SDR Grafting - A New Approach To Antibody Humanization,” Methods 36(1):25-34; Gonzales, N.R. et al. (2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity,” Mol. Immunol. 41:863-872）。しかしながら好ましくは、エピトープ結合ドメインは、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。ある抗体のあるエピトープ結合ドメインは、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片等）を含んでよい。
本発明は特に、ヒト化抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインを含むエピトープ結合分子も包含する。用語「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合ドメインと、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。本発明の抗ヒトＰＤ‐１抗体は、抗体ＰＤ‐１ ｍＡｂ １、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ５、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ６、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ７、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ８、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ９、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １０、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １１、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １３、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １４又はＰＤ‐１ ｍＡｂ １５の、ヒト化、キメラ又はイヌ化変異体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合ドメインの塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
エピトープ結合ドメインは、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでよい。エピトープ結合ドメインは野生型であってよく、又は１つ以上のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of FrameworkResidues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An 抗p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
非ヒト免疫グロブリン由来のエピトープ結合ドメインを含む多数のヒト化抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
Ｂ．抗体定常領域の特徴
本明細書全体を通して、ＩｇＧの定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス（ＥＵ ｉｎｄｅｘ ａｓ ｉｎ Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付与を指す。
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個の重鎖アロタイプ（「Ｇｍアロタイプ」）が公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けた結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
１．重鎖の定常領域：Ｆｃドメイン
抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖の「ＣＬ」定常領域と複合体化し、介在ヒンジドメインを介して重鎖ＣＨ２ドメインに付着する。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
ある例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：ERKCCVECPPCPである。
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ３ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７）：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK
SCDTPPPCPR CP
である。
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書中で記載されるように、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的なＳ２２８Ｐ安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：ESKYGPPCPPCPである。
抗体の２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＩｇＧ抗体の「Ｆｃドメイン（Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）」を形成し、これは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに受容されない細胞Ｆｃ受容体によって認識される。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃドメインは、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに対してよりも、あるＩｇＧアイソタイプに対して最も相同性が高い場合に、この特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであると表現される。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：

231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
２．軽鎖の定常領域
上述のように、抗体の軽鎖は、１つの可変ドメイン（「ＶＬ」）及び１つの定常ドメイン（「ＣＬ」）を含有する。
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１５）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
ＩＩ．多重特異性分子
抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、該抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在及びそのアミノ酸配列に依存する。抗体の軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエピトープ結合ドメインのうちの１つを形成する。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは単一特異である）が、天然抗体は、該種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
抗体の官能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体系分子を生成することによって、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に関して更に高い価数（即ち３つ以上のエピトープ結合ドメイン）を有する抗体系分子を生成することによって、増強できる。
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、広範な組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／０７０５６５号を参照）、その大半は、更なるエピトープ結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合ドメイン（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号）。国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。国際公開第２０１３／１６３４２７号及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを含む融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号、及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃドメインが追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号、及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性若しくは多価性に加えて又はこれらに代えて、二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；米国公開特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.）；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）；Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）；Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked 抗CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric 抗CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
特に、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体非単一特異性ダイアボディが開発されている；例えばSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B-Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)；米国特許第８，０４４，１８０号；米国特許第８，１３３，９８２号；米国特許第８，１８７，５９３号；米国特許第８，１９３，３１８号；米国特許第８，５３０，６２７号；米国特許第８，６６９，３４９号；米国特許第８，７７８，３３９号；米国特許第８，７８４，８０８号；米国特許第８，７９５，６６７号；米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第８，８０２，０９３号；米国特許第８，９４６，３８７号；米国特許第８，９６８，７３０号；及び米国特許第８，９９３，７３０号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２０１１／００８１３４７号；米国公開特許第２０１１／００９７３２３号；米国公開特許第２０１１／０１１７０８９号；米国公開特許第２０１２／０００９１８６号；米国公開特許第２０１２／００３４２２１号；米国公開特許第２０１２／０１４１４７６号；米国公開特許第２０１２／０２９４７９６号；米国公開特許第２０１３／０１４９２３６号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１４／００１７２３７号；及び米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；欧州特許第１８６８６５０号；欧州特許第２１５８２２１号；欧州特許第２２４７３０４号；欧州特許第２２５２６３１号；欧州特許第２２８２７７０号；欧州特許第２３２８９３４号；欧州特許第２３７６１０９号；欧州特許第２５４２２５６号；欧州特許第２６０１２１６号；欧州特許第２７１４０７９号；欧州特許第２７１４７３３号；欧州特許第２７８６７６２号；欧州特許第２８３９８４２号；欧州特許第２８４００９１号；並びに国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０２７７９７号；国際公開第２０１０／０３３２７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１１／１０９４００号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１４／１５９９４０号；国際公開第２０１５／０２１０８９号；国際公開第２０１５／０２６８９２号；及び国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ以上のシステイン残基を、採用したポリペプチド種（これらはジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ以上のペアを互いに共有結合させることができる）それぞれの中へと組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
最も単純なＤＡＲＴ（登録商標）は、２つのポリペプチド鎖を含み、これらはそれぞれ３つのドメインを含む（図１Ａ～１Ｂ）。第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）のエピトープ結合領域を含むドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）のエピトープ結合領域を含む、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ‐Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）を含む。第２のポリペプチド鎖は：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメイン（「ヘテロ二量体促進ドメイン」）を含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。一実施形態では、第１及び第２のポリペプチド鎖の第３のドメインはそれぞれ、システイン（図面では「Ｃマーク（Ｃを丸で囲んだマーク）」として表されている）残基を含有し、このシステイン残基は、共有ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチド鎖のうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、あるダイアボディのポリペプチドと別のダイアボディのポリペプチドとの複合体化によって、Ｆｃドメインが形成される。このようなＦｃドメインは、ダイアボディの生物学的半減期を変化させる役割を果たすことができ、その免疫原性を低減でき、及び／又は細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合して、エフェクタ機能を増強若しくは阻害できる。このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号参照）、また本明細書中で提供される。
最近、２つのダイアボディ型結合ドメイン及び１つの非ダイアボディ型ドメイン並びに１つのＦｃドメインが組み込まれた３価構造体が記載されている（例えば国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号参照）。このような３価結合分子を利用して、単一特異性、二重特異性、又は三重特異性分子を生成でき、これらは以下で更に詳細に提供される。３つの異なるエピトープに結合できることによって、能力が増強される。
二重特異性又は４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、「ＢｉＴＥ」とも呼ばれる、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ分子（例えば国際公開第１９９３／１１１６１号；及び国際公開第２００４／１０６３８１号参照）並びに「ＴａｎｄＡｂ（登録商標）」とも呼ばれる４価タンデム抗体（例えば米国公開特許第２０１１‐０２０６６７２号；欧州公開特許第２３７１８６６号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）を含むが、これに限定されない。ＢｉＴＥは、タンデム結合されたｓｃＦｖを含む単一のポリペプチド鎖から形成され、またＴａｎｄＡｂは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される。
多重特異性結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価分子等）を産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞傷害性Ｔ細胞と、疾患抗原を発現する癌細胞又は病原体感染細胞等の標的細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Sloan et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233）。あるいは（又は更に）、多重特異性分子を（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結ドメインを含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現される、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）等といったいずれの免疫細胞の表面決定因子を対象としてよい。特に、免疫エフェクタ細胞上に存在する細胞表面受容体を対象とするエピトープ結合ドメインは、標的転換細胞殺滅を仲介できる多重特異性結合分子の生成に有用である。
本発明は、疾患抗原（「ＤＡ」）を発現する標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる結合分子を提供する。このような結合分子は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合でき、これらのエピトープのうちの一方はＣＤ３のエピトープであり、これらのエピトープのうちのもう一方は疾患抗原のエピトープである。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在及び配向のみに関連する。よって、本発明の二重特異性分子は、ＣＤ３のエピトープに結合できる「ＶＬCD3」／「ＶＨCD3」ドメイン、及び疾患抗原のエピトープに結合できる「ＶＬDA」／「ＶＨDA」ドメインを含む。本発明は特に、本明細書中で提供される方法のうちのいずれかを用いて生成される、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、抗体、ＴａｎｄＡｂ、及び３価結合分子を包含する。
Ａ．Ｆｃドメインを含まない二重特異性ダイアボディ
一実施形態では、本発明のＤＡ×ＣＤ３結合分子は二重特異性ダイアボディであり、第１及び第２のエピトープ両方に結合できるドメインを含むものの、Ｆｃドメインを含まず、従ってＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によるＦｃγＲ分子への結合が不可能である。二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD3又はＶＬDA）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCD3を含有する場合は）疾患抗原のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン、又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬDAを含有する場合は）ＣＤ３のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ～１Ｂ）。
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬCD3又はＶＬDA；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（即ちＶＨCD3又はＶＨDA；及び上記ＶＨドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１Ａ～１Ｂ）。ある特定のエピトープに対して特異的な、採用されるＶＬ及びＶＨドメインは、好ましくは同一のモノクローナル抗体から得られる、又は同一のモノクローナル抗体に由来する。しかしながらこれらのドメインは、これらのドメインが集合して、上記エピトープに免疫特異的に結合できる官能性結合部位を形成する場合、異なるモノクローナル抗体に由来してもよい。このような異なる抗体は、本明細書では「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」抗体と呼ばれる。
第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、上記エピトープのうちの１つ（例えば第１のエピトープ）に対して特異的な第１の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、他方のエピトープ（即ち第２のエピトープ）に対して特異的な第２の官能性エピトープ結合ドメインを形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、第１のエピトープ及び第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらが合わせて、ＶＬCD3／ＶＨCD3及びＶＬDA／ＶＨDAを含む）ように、「調整（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）」される。
最も好ましくは、介在スペーサペプチド（即ち上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる「リンカー１」）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ以上のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、３～２０個のアミノ酸残基を含む。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列GGCGGG（配列番号１７）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号２４）又はVEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）を含むか、又はこれらからなってよい（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）、又はリシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ヘテロ二量体促進ドメイン（配列番号３０：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含む。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連付けが促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ以上のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号３１）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号３２）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号３３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALPである。
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号３３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66NAKS 70 A 71EGVKALIDE ILAALP（配列番号３４）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号３５）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70 VEGVKALIA 79E ILAALP（配列番号３６）
を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号１８：GGGSである。
Ｂ．Ｆｃドメインを含むダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃドメインを含み、またＣＤ３のエピトープと疾患抗原のエピトープとに同時に結合できる、多重特異性ダイアボディ（例えば二重特異性、三重特異性、四重特異性等）に関する。このような分子のＦｃドメインは、いずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよい。上記分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインを含んでよい。ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが存在する場合、これらはいずれのアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃドメインと同一のアイソタイプのものである。
上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃドメインが形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。このようなダイアボディは、ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、第１のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成できる配列を有する、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ～３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号２４）、VEPKSC（配列番号２５）又はAEPKSC（配列番号２６）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号２７）又はFNRGEC（配列番号２８）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号２９：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK又は配列番号３０：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号３１：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE又は配列番号３２：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を含むペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディ分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３～２０個のアミノ酸残基を含み、任意にＩｇＧヒンジドメインの全体又は一部分（好ましくは、１個、２個、３個、若しくは４個以上のシステイン残基を有するＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号１８）、LGGGSG（配列番号１９）、GGGSGGGSGGG（配列番号２０）、ASTKG（配列番号２１）、LEPKSS（配列番号２２）、APSSS（配列番号２３）、APSSSPME（配列番号３７）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３８）、LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３９）、DKTHTCPPCP（配列番号４０）、ｓｃＦｖリンカー：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）；「長い（ｌｏｎｇ）」リンカー：GGGGSGGGSGGG（配列番号４２）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりにLEPKSS（配列番号２２）を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又はLEPKSS（配列番号２２）の直後にDKTHTCPPCP（配列番号４０）を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号４３）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号４４）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジドメインを組み込んでよい。例示的なヒンジドメインとしては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号５）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号６）；ＩｇＧ３からの ELKTPLGDTT HTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP（配列番号７）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号８）；及び鎖交換を低減するための安定化Ｓ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号９）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
図３Ａ～３Ｃに提示されているように、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表１に提示する。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ～３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、２つの第１のエピトープ結合ドメイン及び２つの第２のエピトープ結合ドメインを含む。
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１又は第２のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープ農地のもう一方に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃドメイン含有ダイアボディは、２つの配向（表２）のうちのいずれを有してよい。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ～４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１又は第２のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び上記エピトープのうちのもう一方に対して特異的に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを含む。
更なる実施形態では、上記Ｆｃドメイン含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメインを形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合ドメインを形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃドメインを形成する。このような多重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、多価ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位、及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表３に示す。
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な２つのエピトープ結合ドメインを有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合ドメインを有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに免疫特異的な３つのエピトープ結合ドメイン、及び第２のエピトープに特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。上述のように、ＶＬ及びＶＨドメインは、三重特異性結合が可能となるように選択してよい。従って本発明は、三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディも包含する。本発明の三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディは、第１のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合ドメイン、第２の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメイン、及び第３のエピトープに対して免疫特異的な１つのエピトープ結合ドメインを含む。
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１０）、ＩｇＧ２（配列番号１１）、ＩｇＧ３（配列番号１２）及びＩｇＧ４（配列番号１３）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
Ｆｃドメインの修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃドメイン含有結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、Ｆｃドメイン仲介型エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
従って特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、操作された可変Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、１つ以上のＦｃ受容体（例えば１つ以上のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ以上の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ以上の挿入及び／若しくは１つ以上の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表４は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、単一、二重、三重、四重及び五重置換のリスト（（ＥＵインデックスに従った）番号付与及び置換は、上で提示した配列番号１０のアミノ酸配列に対するものである）を示す。
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ３９６Ｌ置換を含有し、ここでの番号付与は、Kabat中のEUインデックスの番号付与である。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ置換を含有する。
特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子のＦｃドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号１０）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、抗体依存性細胞仲介型細胞傷害性（ＡＤＣＣ）エフェクタ機能が低下したＩｇＧ Ｆｃドメインを含む。ある好ましい実施形態では、このような結合分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ、３つ又は４つを含み、ここでの番号付与は、Kabat中のEUインデックスの番号付与である。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号１０）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃドメインのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号１１）、ＩｇＧ３ Ｆｃドメイン（配列番号１２）、又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン（配列番号１３）を含む。ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号９参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号４５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃドメインの結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って（野生型Ｆｃドメインを含む場合に対して）増大した半減期を有する、変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ以上の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む、変異型ＩｇＧ Ｆｃドメインを含み、ここでの番号付与は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である。Ｆｃドメイン含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。
いくつかの実施形態では、半減期が増強された本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃドメインを有する。ある具体的実施形態では、上記分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ Ｆｃ領域を有してよい。
ある好ましい実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有結合分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲ結合を変化させる、１つ以上の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ以上の突然変異
を含む変異型Ｆｃドメインを有する、上述のような結合分子を包含する。
半減期の増大を提供する（及びカニクイザルＦｃＲｎ及びヒトＦｃＲｎの両方への結合が１０倍増大した本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ１配列（Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524）は、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含む（配列番号４６）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａによって提供されるエフェクタ機能の低下又は消失と、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅによって提供される血清半減期の増大とが組み合わさった、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１配列は、配列番号４７：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
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によって提供され、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
アミノ酸配列が異なる複数のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖を有することが望まれる（例えばＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖が同一ではないことが望まれる）特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、同一の鎖（例えば２つの第１のポリペプチド鎖、又は２つの第３のポリペプチド鎖）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
好ましいノブは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃドメイン含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、ポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持ポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、ノブ担持ポリペプチド鎖上のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持ポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号４８）を有する：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
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ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ノブ担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子のあるＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号４９：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列を有する（配列番号５０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
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ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換及び「ホール担持」配列を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子の他方のＦｃドメイン含有ポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する別のＩｇＧ１アミノ酸配列は、配列番号５１：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
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であり、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
後に記載されるように、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１０）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃドメインのエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ以上の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
本発明のＦｃドメイン含有分子の上記１つのＦｃドメイン含有ポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関するＩｇＧ４アミノ酸配列は、Ｙ２５２／Ｔ２５４／Ｅ２５６を有することにより、（ＩｇＧ１ ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに比べて）血清半減期が増大する（配列番号５２）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
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ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
このようなＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ノブ担持」変異型は、配列番号５３：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
のアミノ酸配列を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
このようなＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３アミノ酸配列の「ホール担持」変異型は、配列番号５４：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSLGX
のアミノ酸配列を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
第１のポリペプチド鎖が、配列番号４８又は配列番号４９のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号５０又は配列番号５１）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４８又は配列番号４９）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む、Ｆｃドメイン含有結合分子を包含する。
ＩＩＩ．Ｆｃドメインを含有する３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープ（ここで上記エピトープのうちの少なくとも１つは、別のエピトープと同一ではない）に同時に結合できるＦｃドメインを含む、三重特異性３価結合性分子に関する。このような三重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合ドメインを含み、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ～６Ｆ、並びに国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。このような３価結合分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価結合分子の「第３の」エピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、上述のように、ダイアボディ中に存在するエピトープ結合ドメインのタイプである。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合ドメインである。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか含まないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を含むという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合ドメインしか含まないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ～６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｃ～６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ～６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ、及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。３価結合分子の生成に有用なＣＨ２及びＣＨ３ドメインは上述されており、ノブ担持及びホール担持ドメインを含む。
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表４（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合ドメインを形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ以上の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合ドメインを形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号４１）を有する。
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって単一特異性、二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が第１のエピトープに対する２つの結合部位及び第２のエピトープに対する１つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位及び第２のエピトープに対する２つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位、第２のエピトープに対する１つの結合部位、及び第３のエピトープに対する１つの結合部位、を含むように選択される。
本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ～６Ｆ及び表５で提供する。
上述のように、このような３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
ＩＶ．本発明の実施形態
上述のように、本発明は、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子を対象とし、上記ｖＣＤ３結合ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含み、そのうちの少なくとも１つは、ｒＣＤ３結合ドメインの対応するＣＤＲのアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる。特定のｖＣＤ３結合ドメインをとのこのような比較において採用されることになる上記ｒＣＤ３結合ドメインは、このような特定のｖＣＤ３結合ドメインとＣＤＲ配列の最大の同一性を呈する、単離されたＣＤ３結合後退のＣＤ３結合ドメインである。上記ｒＣＤ３結合ドメインはまた、フレームワーク領域において少なくとも９５％～１００％の同一性を示すことが好ましい。ある好ましいｒＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ‐１のＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含む。
このようなｖＣＤ３結合ドメインを含む本発明のＤＡ×ＣＤ３結合分子は、上述のようなｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、ＣＤ３に対する親和性が変化する。本発明は特に、ＣＤ３に対する親和性が低下し、疾患抗原を発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介でき、またｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べてサイトカイン放出のレベルが低い、ｖＣＤ３結合ドメインを含む上述のようなＤＡ×ＣＤ３結合分子に関する。本発明は特に、癌及び病原体関連疾患の治療における、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の上記分子を含む医薬組成物も対象とする。
よって本発明は、ｖＣＤ３結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬドメインのうちの１つ以上、又は更に好ましくは、このようなドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２、及びＣＤＲH３、並びにＣＤＲL１、ＣＤＲL２、及びＣＤＲL３部分を含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子を包含する。本発明のある好ましい実施形態では、このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は更に、１つ、２つ、又は３つ以上の疾患抗原のエピトープにこのような分子を結合させるために十分な結合ドメインを含有することになる。本発明の別の好ましい実施形態では、このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は更に、エフェクタ細胞の表面上で発現される別の分子、例えばＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞、又は他の単核細胞上で発現されるＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ等の、１つ以上のエピトープに結合させるために十分な結合ドメインを含有することになる。
本発明はまた、１つ以上のこのようなＤＡ×ＣＤ３結合分子を含む医薬組成物を対象とする。
ＣＤ３及び疾患抗原への免疫特異的な結合に十分な結合ドメインを有することにより、本発明の分子は、その表面に疾患抗原が配列された標的細胞（例えば癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介する能力を有する。このような２つの結合親和性の共存は、ＣＤ３発現性エフェクタ細胞を標的細胞の部位に局在化させる（即ちエフェクタ細胞を「標的転換（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）」させる）役割を果たし、これにより、上記エフェクタ細胞は標的細胞の殺滅を仲介できる。上述のように、このような分子は二重特異性であってよく、又は３つ以上のエピトープに結合できるもの（例えば三重特異性）であってもよい。
ＣＤ３結合分子を採用するための努力は、このような療法によって引き起こされる高レベルの免疫活性化、及びこれに付随する、一部の患者におけるサイトカインの高レベルの有害な産生によって妨げられてきた。よって、抗ＣＤ３療法はレシピエント患者に、効力の大幅な増加と相関する相当な程度の免疫活性化をもたらしたものの、このような分子の使用は、顕著な毒性と関連している（Frey, N.V. et al. (2016) “Cytokine Release Syndrome With Novel Therapeutics For Acute Lymphoblastic Leukemia,” Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ Program. (1):567-572; Teachey, D.T. et al. (2013) “Cytokine Release Syndrome After Blinatumomab Treatment Related To Abnormal Macrophage Activation And Ameliorated With Cytokine-Directed Therapy,” Blood 121(26):5154-5157; Le Jeune, C. et al. (2016) “Potential For Bispecific T-Cell Engagers: Role Of Blinatumomab In Acute Lymphoblastic Leukemia,” Drug Des. Devel. Ther. 10:757-765; Newman, M.J. et al. (2016) “A Review Of Blinatumomab, A Novel Immunotherapy,” J. Oncol. Pharm. Pract. 22(4):639-645; Fitzgerald, J.C. et al. (2017) “Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia,” Crit. Care Med. 45(2):e124-e131; Teachey, D.T. et al. (2016) “Identification of Predictive Biomarkers for Cytokine Release Syndrome after Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia,” Cancer Discov. 6(6):664-679; Goebeler, M.E. et al. (2016) “Blinatumomab: A CD19/CD3 Bispecific T Cell Engager (Bite) With Unique Anti-Tumor Efficacy,” Leuk. Lymphoma 57(5):1021-1032; Barrett, D.M. et al. (2014) “Toxicity Management For Patients Receiving Novel T-Cell Engaging Therapies,” Curr. Opin. Pediatr. 26(1):43-49）。
本発明は、ＤＡ×ＣＤ３結合分子に組み込んだ場合に高い細胞傷害性及び高いサイトカイン放出の両方を呈する親ＣＤ３結合ドメイン（即ちｒＣＤ３結合ドメイン）を操作することによって、標的転換殺滅を仲介でき、かつｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に対してサイトカイン放出のレベルが低下した、ＣＤ３に対する親和性が変化した変異型（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を生産できることを実証することにより、上述のような妨げに対処する。特に、本発明によるｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は：ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及び／又はＩＬ‐６のうちのいずれの１つ以上の放出のレベルの低下を示す。
本発明は、細胞傷害性とサイトカイン放出とが、ＤＡ×ＣＤ３結合分子の分離可能な特性であるという認識に部分的に由来する。本発明は、サイトカイン放出のレベルが低下しながらも高いレベルの細胞傷害性を保持する変異型ＣＤ３結合ドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）、及びこのようなｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の、疾患の治療における使用を包含する。本明細書中で使用される場合、このようなＣＤ３結合ドメインに関する用語「変異型（ｖａｒｉａｎｔ）」は、「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」ＣＤ３結合ドメイン（即ちｒＣＤ３結合ドメイン）の「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」ＣＤＲH及び／又はＣＤＲLとは異なる少なくとも１つのＣＤＲH及び／又は少なくとも１つのＣＤＲLを有するＣＤ３結合ドメインを指すことを意図している。本明細書中で使用される場合、「対応する」ＣＤＲH及び／又はＣＤＲLという用語は、２つのＣＤＲ配列間の比較であって、このようなＣＤＲがいずれもＣＤＲH１ドメインである、このようなＣＤＲがいずれもＣＤＲH２ドメインである、このようなＣＤＲがいずれもＣＤＲH３ドメインである、このようなＣＤＲがいずれもＣＤＲL１ドメインである、このようなＣＤＲがいずれもＣＤＲL２ドメインである、又はこのようなＣＤＲがいずれもＣＤＲL３ドメインである、比較を表す。本明細書に記載の例示的なｖＣＤ３結合ドメインに関する好ましいｒＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤＲ：ＣＤ３ ｍＡｂ １のＣＤＲH１、ＣＤＲH２、ＣＤＲH３、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２、及びＣＤＲL３のうちの少なくとも５つ、少なくとも４つ、少なくとも３つ、少なくとも２つ、又は少なくとも１つを有するＣＤ３結合ドメインである。好ましくは、このような例示的なｖＣＤ３結合ドメインは、以下のＣＤＲ：ＣＤ３ ｍＡｂ １のＣＤＲH１、ＣＤＲH２、ＣＤＲH３、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２、及びＣＤＲL３のうちの少なくとも５つを有することになる。ｖＣＤ３結合ドメインは、ｒＣＤ３結合ドメインの１つ以上のＣＤＲの化学修飾によって得ることができるが、より好ましくは、所望のｖＣＤ３結合ドメインをコードするような変更を除いて、ｒＣＤ３結合ドメインの１つ以上のＣＤＲをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを形成し、続いて適切なタンパク質発現系（例えば細胞、又は生体外翻訳系）中でこのようなポリヌクレオチドを発現することによって得られる。細胞傷害性は、いずれの好適な方法（例えばＥＣ50、最大値を決定するためのＣＴＬアッセイ）で測定してよい。サイトカイン放出は、いずれの好適な方法（例えばＥＣ50、最大値を決定するためのＣＴＬアッセイ）で：ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、又はＩＬ‐２のうちのいずれの１つ以上をアッセイすることによって測定してよい。
特に、最大細胞傷害性及びサイトカイン放出の絶対的なレベルは、候補であるＣＤ３結合ドメインが本発明に包含される好適なｖＣＤ３結合ドメインであるかどうかを評価するために使用される唯一の基準ではない。更に、又はあるいは、ＥＣ50値を採用してよい。本明細書中で提供されるように、好適なｖＣＤ３結合ドメインは、ＤＡ×ＣＤ３結合分子に組み込んだ場合に、サイトカイン放出のレベルが低いまま、高いレベルの細胞傷害性（即ち低いＥＣ50濃度）を仲介できるものである。
特定の実施形態では、本発明は、ＤＡ×ＣＤ３結合分子に組み込んだ場合に、細胞の標的転換細胞殺滅を、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が仲介する細胞傷害性の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％の、（例えば１８～４８時間においてＣＴＬアッセイで測定される）最大の細胞傷害性まで仲介する、ｖＣＤ３結合ドメインを提供する。更に、又はあるいは、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が呈するものより約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、約９０％未満、約１００％未満、約２００％未満、約３００％未満、約４００％未満、又は約５００％未満だけ高い、（例えば１８～４８時間においてＣＴＬアッセイで測定される）細胞傷害性のＥＣ50を呈する。更に、又はあるいは、（例えば１８～２４時間においてＣＴＬアッセイで測定される）本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の細胞傷害性のＥＣ50の、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に対する比率（ＥＣ50変異型／ＥＣ50基準）は、約２未満、約５未満、約１０未満、約２０未満、約４０未満、約６０未満、約８０未満、約１００未満、又は約２００未満である。
特定の実施形態では、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が呈するものより少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％だけ低い、（例えば１８～２４時間においてＣＴＬアッセイで測定される）１つ以上のサイトカインの最大放出を呈する。更に、又はあるいは、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が呈するものより少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上だけ高い、（例えば１８～４８時間においてＣＴＬアッセイで測定される）１つ以上のサイトカインの放出のＥＣ50を呈する。特定の実施形態では、放出されるサイトカインは：ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びＩＬ‐６からなる群から選択される。更に、又はあるいは、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の（例えば１８～２４時間においてＣＴＬアッセイで測定される）１つ以上のサイトカインの放出のＥＣ50の、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に対する比率（ＥＣ50変異型／ＥＣ50基準）は、約１超、約２超、約５超、約１０超、約２０超、約４０超、約６０超、約８０超、約１００超、又は約２００超である。
更に、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が呈する生体内活性（例えば抗腫瘍、抗病原体活性）の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％を保持している。本開示を考慮すると、ｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が呈するものの少なくとも約５０％以上の生体内活性を達成するような、比較的高い用量で投与してよいが、このような比較的高い用量は、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べてサイトカイン放出のレベルの低下を呈することになることを理解されたい。
一実施形態では、本発明のこのようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は単一特異性であり、従ってＣＤ３の単一のエピトープのみ、及び疾患抗原の単一のエピトープのみに結合する能力を有する。
あるいは、このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は多重特異性であってよく、即ち１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のエピトープに結合でき、これらは、ＣＤ３の１つ、２つ、又は３つ以上のエピトープ、及び１つ以上の疾患抗原の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のエピトープに結合するよう、いずれの方法で割り当てることができる。
このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子が単一の疾患抗原のみに免疫特異的に結合できる、特定の実施形態では、上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は：１つだけのＣＤ３エピトープ、及び上述のような疾患抗原の１つ、２つのエピトープ（２つのエピトープは同一であっても異なっていてもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよく；あるいは、１つだけのＣＤ３エピトープ、及び上述のような疾患抗原の３つのエピトープ（３つの疾患抗原エピトープは同一であっても、異なっていても、又は２つの同一のエピトープ及び１つの異なるエピトープであってもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよい。
このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子が２つの異なる疾患抗原（例えば第１の疾患抗原及び第２の疾患抗原）に免疫特異的に結合できる、他の実施形態では、上記分子は：１つだけのＣＤ３エピトープ、及び第１の疾患抗原の１つ又は２つのエピトープ（２つの第１の疾患抗原エピトープは同一であっても異なっていてもよい）、及び第２の疾患抗原の２つ又は１つのエピトープ（２つの第２の疾患抗原エピトープは同一であっても異なっていてもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよい。
更に他の実施形態では、このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は、３つの異なる疾患抗原（例えば第１の疾患抗原、第２の疾患抗原、及び第３の疾患抗原）、並びに１つだけのＣＤ３エピトープに免疫特異的に結合できるものであってよい。
更に他の実施形態では、このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は、１つ又は２つの異なる疾患抗原（例えば第１の疾患抗原及び第２の疾患抗原）、１つだけのＣＤ３エピトープ、及びエフェクタ細胞（これは同一のタイプのエフェクタ細胞であっても異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の１つ又は２つの異なる細胞表面分子（これらは同一の細胞表面分子であっても異なる表面分子であってもよい）に免疫特異的に結合できるものであってよい。
よって、例えばこのようなＤＡ×ＣＤ３結合分子は：
（１）ＣＤ３の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ；
（２）ＣＤ３の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された同一の疾患抗原の２つのエピトープ；
（３）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の１つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（４）ＣＤ３の単一のエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された同一の疾患抗原の３つのエピトープ；
（５）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の２つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（６）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の１つのエピトープ、及び標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ；
（７）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の単一のエピトープ、及びエフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の細胞表面分子の単一のエピトープ；
（８）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の２つのエピトープ、及びエフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の細胞表面分子の単一のエピトープ；
（９）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第１の疾患抗原の１つのエピトープ、標的細胞の表面上に配列された第２の疾患抗原の１つのエピトープ、及びエフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の細胞表面分子の単一のエピトープ；
（１０）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の１つのエピトープ、及びエフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の細胞表面分子の２つのエピトープ；又は
（１１）ＣＤ３の単一のエピトープ、標的細胞の表面上に配列された疾患抗原の１つのエピトープ、エフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の第１の細胞表面分子の１つのエピトープ、及びエフェクタ細胞（これはＣＤ３を配列するエフェクタ細胞と同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の表面上に配列されたＣＤ３以外の第２の細胞表面分子の１つのエピトープ
に結合してよい。
よって本発明は、ＣＤ３のエピトープに免疫特異的に結合できる第１のエピトープ結合ドメインと、上述のような標的細胞の表面上に配列された疾患抗原のエピトープに免疫特異的に結合できる第２のエピトープ結合ドメインと、エフェクタ細胞（これは同一のタイプのエフェクタ細胞であっても、異なるタイプのエフェクタ細胞であってもよい）の異なる細胞表面分子のエピトープの免疫特異的に結合できる第３のエピトープ結合ドメインとを含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子を考える。ある具体的実施形態では、エフェクタ細胞の異なる細胞表面分子はＣＤ８である。表６は、本発明の例示的な分子の結合特異性の可能な組み合わせを示す。
更に複雑な分子を形成することにより、ＣＤ３及び１つ以上の疾患抗原、並びにエフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合でき、かつ５つ以上のエピトープ結合ドメインを有する、ＤＡ×ＣＤ３結合分子を得ることができる。本発明の分子が結合し得るエピトープ又は追加のエピトープの性質については、このような追加の結合能力によって、ＣＤ３のエピトープに結合できる分子又はその結合ドメインの、ＣＤ３のエピトープへの結合が妨げられず、また疾患抗原のエピトープに結合できる分子又はその結合ドメインの、疾患抗原のエピトープへの結合が妨げられないことを除いて、一切の制約が課されないため、１つ以上の上記分子は、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる。
Ｖ．例示的な結合分子
本発明は、ＣＤ３と、癌抗原又は病原体関連抗原等の疾患抗原とに結合できる、ＤＡ×ＣＤ３結合分子（例えばダイアボディ、二重特異性抗体、二重特異性３価分子、ＢｉＴｅ、ＴａｎｄＡｂ等）を対象とする。このような結合分子は、抗体のＣＤＲから、並びに抗体のＶＬ及びＶＨドメインから、容易に製造できる。以下に列挙されるのは、本発明の結合分子及び併用療法の製造に使用できる例示的な抗体である。
Ａ．抗ＣＤ３抗体ＣＤ３ ｍＡｂ １
本発明は、抗ヒトＣＤ３抗体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、又はそのＣＤ３結合部分を含み、またＣＤ３への変異型結合を仲介する、変異型ＣＤ３結合ドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を使用する。本明細書中で使用される場合、用語「変異型結合（ｖａｒｉａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、変異型ＣＤ３結合ドメインのＣＤＲに対する配列同一性が最も高いＣＤＲを有する基準抗体のＣＤ３結合ドメインが示すものに匹敵する結合を指すことを意図している。本発明の例示的なｖＣＤ３結合ドメインに対するＣＤ３結合基準抗体は、ＣＤ３ ｍＡｂ １であり、そのｒＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３と、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）のＣＤ３とに結合できる。
ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKXRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
「ＣＤ３ ｍＡｂ １」のｒＣＤ３結合ドメインは、配列番号５５の残基６８に対応するＫａｂａｔ６５位にアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）を有する（即ち配列番号５５中のＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である）ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＨドメインと、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）とを含む。よって例えば、このようなＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＨドメインがその残基６８としてグリシン（Ｇ）を有する場合、その配列は、以下に示す配列番号６３である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、Ｋａｂａｔ６５位は二重下線を付して示されている）：

本発明のｖＣＤ３結合ドメインを有するＣＤ３結合分子は、ＣＴＬアッセイを用いて認識でき、このＣＴＬアッセイでは：
（１）ｖＣＤ３結合ドメインを潜在的に有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディ（例えばＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディ又は５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディ）、及び
（２）対応するｒＣＤ３結合ドメイン（例えばＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメイン）を有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディ
を、エフェクタＰａｎ‐Ｔ細胞（又はＰＢＭＣ）及び標的腫瘍細胞（例えばＭＯＬＭ‐１３又はＡ４９８細胞）を、例えばエフェクタ：標的細胞比５：１（又はＰＢＭＣに関しては１５：１）で用いて、１８、２４、又は４２時間にわたって別個にインキュベートし、（例えばＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより）パーセンテージ細胞傷害性（即ち細胞殺滅）及び／又はＥＣ50を決定する。一実施形態では、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐２サイトカインの放出を、ＣＴＬアッセイの終了時に決定できる。またＣＴＬアッセイの終了時に、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御に関して、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔリンパ球集団を評価することもできる。ｖＣＤ３結合ドメインを潜在的に有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディに関するパーセンテージ細胞傷害性及び／又はＥＣ50と、ｒＣＤ３結合ドメインを有する癌抗原×ＣＤ３ダイアボディに関するパーセンテージ細胞傷害性及び／又はＥＣ50とを比較することにより、所望の変異型ＣＤ３結合及び／又はサイトカイン放出のレベルの低下を呈するｖＣＤ３結合ドメインが同定される。
あるいは、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを有するＣＤ３結合分子は、結合アッセイを用いて認識でき、この結合アッセイでは：
（１）ｖＣＤ３結合ドメインを潜在的に有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディ、及び
（２）ｒＣＤ３結合ドメイン（例えばＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメイン）を有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディ
を、ＦＡＣＳ分析によって、腫瘍抗原発現性細胞株の細胞（ＭＯＬＭ‐１３又はＡ４９８細胞）の表面に結合する能力に関して別個に評価する。簡潔に述べると、細胞を、（１０％ヒトＡＢ血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液中の）ダイアボディ分子を用いて、マイクロタイタープレート中でインキュベートする。続いて細胞を洗浄し、ストレプトアビジン‐フィコエリトリンと混合された、標識抗ヒトＦｃ二次抗体、又はダイアボディのＥコイル／Ｋコイル（ＥＫ）ヘテロ二量体促進ドメインを認識するビオチン標識マウス抗ＥＫコイル抗体で、インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁してフローサイトメトリーで分析し、比較する。
あるいは、本発明のｖＣＤ３結合ドメインを有するＣＤ３結合分子は、例えばＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス等の混合異種移植片モデルを用いて認識できる。このようなアッセイでは、マウスに、活性化ヒトＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞と混合した腫瘍細胞（例えばＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞）（Ｅ：Ｔ＝１：５）を注射する。ｖＣＤ３結合ドメインを潜在的に有する二重特異性癌抗原×ＣＤ３ダイアボディ、又はｒＣＤ３結合ドメインを有する癌抗原×ＣＤ３ダイアボディを、これらの動物に注射し、腫瘍成長の程度を監視及び比較する。
あるいは、本明細書において「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３」～「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６」と呼ばれるＣＤ３ ｍＡｂ １の例示的な変異型のうちのいずれの１つ、２つ、又は３つ以上を使用して、本発明のＤＡ×ＣＤ３結合分子のｖＣＤ３結合ドメインを提供できる。本発明は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６のうちのいずれのＶＬ及びＶＨドメインを有する抗ＣＤ３抗体を全体的に考慮し、ここでＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ６５位のアスパラギン酸（Ｄ）又はＫａｂａｔ６５位のグリシン（Ｇ）を有する。ＣＤ３ ｍＡｂ １の例示的な変異型であるＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６は、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、ＣＤＲH３ドメイン、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、及びＣＤＲL３ドメインを含むｖＣＤ３結合ドメインを有し、これらのうちの少なくとも１つは、ｒＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３ ｍＡｂ １）の対応するＣＤＲのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、また、上記ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合ドメインに比べて、上記ｖＣＤ３結合ドメインを含む。ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、変化した親和性でＣＤ３に結合し、標的転換殺滅を仲介でき、低いサイトカイン放出のレベルを呈する。
本発明の好ましい変異型抗ＣＤ３ ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号55の変異型であり、配列番号２０７（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS X 1 X 2 X 3 MNWVRQA
PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKX 4 RF TISRDDSKNS
LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HX 5 NX 6 X 7 NSX 8 ST X 9 FAX 10 WGQGTL
VTVSS
で表され、ここで：Ｘ1はＴ、Ｄ、又はＥであり；Ｘ2はＹ、Ｄ又はＴであり；Ｘ3はＡ又はＧであり；Ｘ4はＤ又はＧであり；Ｘ5はＧ、Ｄ、Ｅ、又はＫであり；Ｘ6はＦ又はＩであり；Ｘ7はＧ又はＩであり；Ｘ8はＹ、Ａ、Ｇ、又はＱであり；Ｘ9はＷ、Ｆ、又はＹであり；Ｘ10はＹ又はＥである。
本発明の好ましい変異型抗ＣＤ３ ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５６の変異型であり、配列番号２０８（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GX 1 TNX 2 RAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC AX 3 WYSNLWVF
GGGTKLTVLG
で表され：Ｘ1はＧ又はＤであり；Ｘ2はＫ又はＧであり；及びＸ3はＬ、Ｅ、又はＱである。
Ｂ．変異型抗ＣＤ３抗体
１．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１は、ＣＤ３ ｍＡｂ １の低親和性変異型であり、従って「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｌｏｗ」とも呼ばれる。ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨドメインのアミノ酸配列を、配列番号６４（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）として以下に示す。配列番号５５に比べて、配列番号６４は、Ｓ１００ｄＴ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号６４の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
２．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２は、ＣＤ３ ｍＡｂ １よりも速いオフレートを有し、従って「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｆａｓｔ」とも呼ばれる。ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメインのアミノ酸配列を、配列番号６６（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）として以下に示す。配列番号５５に比べて、配列番号６６は、Ｋａｂａｔに従って番号付与されているＧ９６Ｋ及びＳ１００ｄＴ置換（配列残基１１０、二重下線で示されている）を含有し；更に、配列番号６６の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
３．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号６８は、Ｇ９９Ｉ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号６８の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
４．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ４
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号７０は、Ｙ１００ｂＡ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号７０の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ４のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
５．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ５
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号７２は、Ｙ１００ｂＧ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号７２の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ５のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
６．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ６
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号７４は、Ｙ１００ｂＱ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号７４の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ６のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
７．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ７
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号７６は、Ｇ９６Ｄ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号７６の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ７のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
８．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ８
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号７８は、Ｇ９９Ｅ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号７８の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ８のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
９．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ９
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号８０は、Ｇ９９Ｋ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号８０の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ９のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１０．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１０
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号８２は、Ｆ９８Ｉ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号８２の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１０のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１１．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１１
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号８４は、Ｗ１００ｅＦ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号８４の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１１のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１２．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１２
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号８６は、Ｗ１００ｅＹ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号８６の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１２のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１３．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号８８は、Ｙ１０２Ｅ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号８８の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１４．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１４
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号９０は、Ｔ３１Ｄ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号９０の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１４のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１５．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１５
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号９２は、Ｔ３１Ｅ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号９２の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１５のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１６．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１６
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号９４は、Ｙ３２Ｄ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号９４の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１６のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１７．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号９６は、Ｙ３２Ｔ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号９６の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１８．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号９８は、Ａ３３Ｇ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号９８の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
１９．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１００）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号１００は、Ｇ９６Ｋ及びＦ９８Ｉ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号１００の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
２０．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２０
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号１０２は、Ｇ９６Ｋ及びＹ１００ｂＧ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号１０２の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２０のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
２１．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２１
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号１０４は、Ｇ９６Ｋ及びＷ１００ｅＦ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号１０４の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２１のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
２２．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２２
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。配列番号５５に比べて、配列番号１０６は、Ｇ９６Ｋ及びＷ１００ｅＹ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有し；更に、配列番号１０６の、Ｋａｂａｔによる番号付与での６５位（これもまた二重下線で示されている）は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）であってよい：
ここでＸはアスパラギン酸（Ｄ）又はグリシン（Ｇ）である
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２２のＶＬドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５６である。
２３．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２３
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２３のＶＨドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５５又は配列番号６３である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１０８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。配列番号５６に比べて、配列番号１０８は、Ｌ９５Ｅ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有する：
２４．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２４
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２４のＶＨドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５５又は配列番号６３である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。配列番号５６に比べて、配列番号１１０は、Ｌ９５Ｑ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有する：
２５．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２５
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２５のＶＨドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５５又は配列番号６３である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。配列番号５６に比べて、配列番号１１２は、Ｇ５０Ｄ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有する：
２６．ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６のＶＨドメインの好ましいアミノ酸配列は、配列番号５５又は配列番号６３である。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。配列番号５６に比べて、配列番号１１４は、Ｋ５３Ｇ置換（二重下線で示され、Ｋａｂａｔに従って番号付与されている）を含有する：
Ｃ．エフェクタ細胞の細胞表面分子に結合する例示的な抗体
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクタ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）」は、標的細胞（例えば外来細胞、感染細胞又は癌細胞）の殺滅を直接的又は間接的に仲介する細胞を指す。エフェクタ細胞の例としては、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞（抗体分泌Ｂ細胞）、マクロファージ及び顆粒球が挙げられる。このような細胞の好ましい細胞表面分子としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ及びＮＫＧ２Ｄ受容体が挙げられる。従って、上記分子のエピトープに、又は他のエフェクタ細胞表面分子に免疫特異的に結合できる分子を、本発明の原理に従って使用してよい。標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子の構築にＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を、以下に提供する。
１．例示的な抗ＣＤ２抗体
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ２のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ２に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ２抗体「ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａ」が挙げられる。
ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号１１６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）:
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
ＣＤ２ ｍＡｂ Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号１１７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ
PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP
YTFGAGTKLE LK
２．例示的な抗ＣＤ８抗体
一実施形態では、標的細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の分子は、エフェクタ細胞に、上記エフェクタ細胞の表面上に存在するＣＤ８のエピトープに免疫特異的に結合することによって結合する。ＣＤ８に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」及び「ＴＲＸ２」が挙げられる。
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV
LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY
TFGGGTKLEI KR
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIK
ＶＩ．例示的な癌及び病原体関連抗原
Ａ．癌細胞の表面上に配列された例示的な癌抗原
本明細書中で使用される場合、用語「癌抗原（ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫変調分子によって治療され得る、抗原を指す。癌抗原の例としては、限定するものではないが：結腸癌、胃癌ムチンにおいて確認される１９．９；４．２；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；胃癌において確認されるＡＨ６；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；ＡＰＯ‐１（悪性ヒトリンパ球抗原）(Trauth, B.C. et al. (1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304);Ｂｌ（Egloff, A.M. et al. (2006), “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer,” Cancer Res. 66(l):6-9）；Ｂ７‐Ｈ３（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7）. Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. 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スフィンゴ脂質；ＳＳＥＡ‐１；ＳＳＥＡ‐３；ＳＳＥＡ‐４；ｓＴｎ（Holmberg, L.A. (2001) “Theratope Vaccine (STn-KLH),” Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体由来ペプチド（Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy, " Cancer J Sci Am. 4:62-71を参照）；骨髄細胞において確認されるＴ5Ａ7；ＴＡＧ‐７２（Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms, " Cancer Res. 52:3402-3408）；ＴＬ５（血液型Ａ）；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ‐α受容体、ＴＮＦ‐β受容体；ＴＮＦ‐γ受容体）（van Horssen, R. et al. (2006) “TNF-Alpha In Cancer Treatment: Molecular Insights, Antitumor Effects, And Clinical Utility,” Oncologist 11(4):397-408；Gardnerova, M. et al. (2000) “The Use Of TNF Family Ligands And Receptors And Agents Which Modify Their Interaction As Therapeutic Agents,” Curr. Drug Targets l(4):327-364）；ＴＲＡ‐１‐８５（血液型Ｈ）；トランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；国際公開第０５／１２１１７９号）；５Ｔ４（ＴＰＢＧ、栄養膜糖タンパク質；Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6）；ＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープを含む抗原ウイルス誘発型腫瘍抗原や、結腸、膀胱腫瘍胎児抗原のＣＥＡといった癌胎児抗原‐アルファ‐フェトプロテイン等の、胚性癌細胞において確認されるＴＳＴＡ腫瘍特異性移植抗原（Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas, " Cancer. Res. 45 :2210-2188）；ＶＥＧＦ（Pietrantonio, F. et al. (2015) “Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians,” Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272-281; Grabowski, J.P. (2015) “Current Management Of Ovarian Cancer,” Minerva Med. 106(3):151-156; Field, K.M. (2015) “Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies,” Cancer 121(7):997-1007; Suh, D.H. et al. (2015) “Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014,” J. Gynecol. Oncol. 26(2):156-167; Liu, K.J. et al. (2015) “Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Tumour Biol. 36(3):1323-1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) “Bevacizumab Treatment In The Elderly Patient With Metastatic Colorectal Cancer,” Clin. Interv. Aging 10:127-133）；ＶＥＧＦ受容体（O’Dwyer. P.J. (2006) “The Present And Future Of Angiogenesis-Directed Treatments Of Colorectal Cancer,” Oncologist. 11(9):992-998）；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；ＶＩＭ‐Ｄ５；並びに胚性癌細胞において確認されるＹヘプタン、Ｌｅｙが挙げられる。更なる癌抗原及びこれらに結合する分子（例えば抗体）は、表７に開示されている。５Ｔ４、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１２３、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒα２、ＲＯＲ１、及びＶＥＧＦは、本発明の特に好ましい「癌抗原」である。
癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる本発明の結合分子を構成するために、ＶＨ及びＶＬドメインを使用できる、例示的な抗体は、上の表に列挙されており、癌細胞の表面上に配列された癌抗原に結合して上記癌細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子を構成するために使用できる更なる抗体を以下に提供する。
１．例示的な抗Ｂ７‐Ｈ３抗体
Ｂ７‐Ｈ３は、多種多様な固形腫瘍に過剰発現する癌抗原であり、免疫調節に関与する分子のＢ７ファミリーのメンバーである（米国特許第８，８０２，０９１号；米国特許第２０１４／０３２８７５０号；米国特許第２０１３／０１４９２３６号；Loo, D. et al. (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845を参照）。特に、ヒト悪性癌細胞（例えば神経芽細胞腫並びに胃癌、卵巣癌、膵臓癌、及び非小細胞肺癌の癌細胞）が、Ｂ７‐Ｈ３タンパク質の発現の顕著な増大を示すこと、並びにこの発現の増大が、疾患の重篤度の上昇に関連することが、複数の独立した研究によって示されており（Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279）、これは、Ｂ７‐Ｈ３が免疫回避経路として腫瘍に利用されることを示唆している（Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278）。
Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞増殖を共刺激することが分かっている。Ｂ７‐Ｈ３はまた、ＩＦＮ‐γ産生及びＣＤ８＋溶解活性も刺激する（Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274；Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126）。しかしながらこのタンパク質は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞に関する核内因子）、ＮＦ‐κＢ（核内因子κＢ）及びＡＰ‐１（活性化タンパク質１）因子を通してＴ細胞活性化を阻害するようにも作用する可能性がある（Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）、Ｂ７‐Ｈ３はまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７をインビボで阻害すると考えられる（Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells,” J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice,” Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4,” Immunol. Rev. 229:145-151）。
好ましいＢ７‐Ｈ３結合分子は、ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３モノクローナル抗体「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ」、「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｃ」、「Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｄ」、又は本明細書中で提供される抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のうちのいずれのＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、このような抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体のＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。
ヒト化すると、抗体Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂから２つの変異型ＶＨドメイン：Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＨ１及びＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＨ２と、２つの変異型ＶＬドメイン：Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＬ１及びＢ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＬ２とが得られ、これらをＶＨ／ＶＬドメインのいずれの組み合わせで使用して、官能性Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインを得ることができる。
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２２である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２３である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２４である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐Ｂ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２５である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
ヒト化Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐ＣのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２６である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD
GGAMDYWGQG TTVTVSS
ヒト化Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐ＣのＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２７である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG
QGTRLEIK
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐ＤのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１２８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）。
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHG
YRYEGFDYWG QGTTVTVSS
Ｂ７‐Ｈ３ ｍＡｂ‐ＤのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１２９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）。
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
特に好ましいのは、「エノブリツズマブ」（ＭＧＡ２７１としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５３４８５‐３８‐７）を含むがこれに限定されないヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有するＢ７‐Ｈ３結合分子である。エノブリツズマブは、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介するＦｃ最適化モノクローナル抗体である。エノブリツズマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2017、Recommended INN: List 77、31(1):49を参照）。エノブリツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３０である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
エノブリツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３１である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK
上で同定した好ましい抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子に加えて、本発明は、以下の抗Ｂ７‐Ｈ３結合分子：ＬＵＣＡ１；ＢＬＡ８；ＰＡ２０；又はＳＫＮ２（米国特許第７，５２７，９６９号；米国特許第８，７７９，０９８号及び国際公開第２００４／００１３８１号を参照）；Ｍ３０；ｃＭ３０；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ３；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ４；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ５；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ６；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ７；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ３；及びＭ３０‐Ｈ４‐Ｌ４（米国特許出願公開第２０１３／００７８２３４号及び国際公開第２０１２／１４７７１３号を参照）；並びに８Ｈ９（米国特許第７，６６６，４２４号；米国特許第７，７３７，２５８号；米国特許第７，７４０，８４５号；米国特許第８，１４８，１５４号；米国特許第８，４１４，８９２号；米国特許第８，５０１，４７１号；米国特許第９，０６２，１１０号；米国特許出願公開第２０１０／０１４３２４５号、及び国際公開第２００８／１１６２１９号を参照）のうちのいずれの使用も考える。
２．例示的な抗ＣＥＡＣＡＭ５及び抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）及び６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌（国際公開第２０１１／０３４６６０号）、並びに特に、結腸直腸癌、胃腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、乳癌、甲状腺癌、胃癌、卵巣癌及び子宮癌腫（Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11）を含む様々なタイプの癌に関連していることが分かっている。
ＣＥＡＣＡＭ５は、胃腸癌、結腸直腸癌及び膵臓癌の９０％、非小細胞肺癌細胞の７０％並びに乳癌の５０％において過剰発現することが分かっている（Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366）。過剰発現した癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺髄様癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌を含む多様なヒト癌の侵襲及び転位において重要な役割を果たす（国際公開第２０１１／０３４６６０号；Deng, X. et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis,” Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,” Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15）。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６に免疫特異的に結合する抗体は市販されている（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC;Abnova Corporation）。
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL
ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD
YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG
ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG
GTKLEIK
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF
IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR
DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（国際公開第２０１１／０３４６６０号）のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT
STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG
TKVEIKR
本発明は具体的には、ＣＥＡＣＡＭ５及び／又はＣＥＡＣＡＭ６に結合できるＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６結合分子（例えばＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６モノクローナル抗体１６Ｃ３又はｈＭＮ１５の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような分子を含み、またこれらを包含する。
３．例示的な抗ＥＧＲＦ抗体
上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor：ＥＧＦＲ）は、特定の転移性大腸癌、転移性非小細胞癌及び頭頸部癌の癌抗原である。ヒトＥＧＲＦに結合する例示的な抗体は、「セツキシマブ」及び「パニツムマブ」である。セツキシマブは、組み換えヒト‐マウスキメラ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s; Bou-Assaly, W. et al. (2010) “Cetuximab (Erbitux),” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627）。パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）は、完全ヒト化上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＩｇＧ２モノクローナル抗体である（Foon, K.A. et al. (2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990; Yazdi, M.H. et al. (2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144）。
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV
IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT
YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
キメラ抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA
GTKLELKR
パニツムマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１３８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWTWIR QSPGKGLEWI
GHIYYSGNTN YNPSLKSRLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVRD
RVTGAFDIWG QGTMVTVSS
パニツムマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１３９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYD
ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQH FDHLPLAFGG
GTKVEIKR
本出願は具体的には、ＥＧＦＲに結合できるＥＧＦＲ結合分子（例えばＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ又はパニツムマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。
４．例示的な抗ＥｐｈＡ２抗体
受容体チロシンキナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）は通常、成体の上皮組織の細胞間接触部位に発現するが、最近の研究により、ＥｐｈＡ２が様々なタイプの上皮癌においても、転移性病変において観察される最も高いレベルのＥｐｈＡ２発現で過剰発現することが分かった。高発現レベルのＥｐｈＡ２は、前立腺癌、乳癌、非小細胞肺癌及び黒色腫を含む、広範な癌及び多数の癌細胞株において確認されている（Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295）。ＥｐｈＡ２は単なる癌のマーカーとは思われないが、多数のヒト癌において持続的に過剰発現し、機能的に変化するようである（Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41-46）。ヒトＥｐｈＡ２に結合する例示的な抗体は、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １」、「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２」及び「ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３」である。
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIK
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI K
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIK
本出願は具体的にはＥｐｈＡ２に結合できるＥｐｈＡ２結合分子（例えばＥｐｈＡ２×ＣＤ３二重特異性分子）、特に、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ １、ＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ２及びＥｐｈＡ２ ｍＡｂ ３の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。
５．例示的な抗ｇｐＡ３３抗体
４３ｋＤ膜貫通糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）は、全ての結腸直腸癌の＞９５％において発現する（Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263）。ヒトｇｐＡ３３に結合する例示的な抗体は、「ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １」である。
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１４６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１４７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIK
本出願は具体的には、ｇｐＡ３３に結合できるｇｐＡ３３結合分子（例えばｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体ｇｐＡ３３ ｍＡｂ １、又は国際公開第２０１５／０２６８９４号において提供された抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、国際公開第２０１５／０２６８９４号で提供されている例示的なｇｐＡ３３×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
６．例示的な抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、化学的に処置されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産生として元来同定された、１８５ｋＤａ受容体である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、（乳癌及び胃癌を含む）複数のヒト癌腫、並びに哺乳類の発生において機能するため、広く研究されてきた（Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する例示的な抗体としては、「マルゲツキシマブ」、「トラスツズマブ」及び「ペルツズマブ」が挙げられる。マルゲツキシマブ（ＭＧＡＨ２２としても公知；ＣＡＳ登録番号：１３５０６２４‐７５‐７）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合してＡＤＣＣ活性の増強を仲介する、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体である。トラスツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ４Ｄ５としても公知、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：１８０２８８‐６９‐１；米国特許第５，８２１，３３７号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体４Ｄ５のヒト化バージョンである。ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ２Ｃ４としても公知、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）として市販；ＣＡＳ登録番号：３８０６１０‐２７‐５；例えば国際公開第２００１／０００２４５号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体２Ｃ４のヒト化バージョンである。
本出願は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕに結合できるＨｅｒ２／Ｎｅｕ結合分子（例えばＨｅｒ２／Ｎｅｕ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕモノクローナル抗体マルゲツキシマブ、トラスツズマブ又はペルツズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。
マルゲツキシマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１４８である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR
IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
マルゲツキシマブ のＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１４９である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS
ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG
GTKVEIK
マルゲツキシマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野において公知である（例えばWHO Drug Information、2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94を参照）。
トラスツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５０である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR
IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG
GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
トラスツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５１である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIK
ペルツズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５２である（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD
VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL
GPSFYFDYWG QGTLVTVSS
ペルツズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５３である（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYIYPYTFGQ
GTKVEIK
上で同定された好ましい抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合分子に加えて、本発明は、以下の抗Ｈｅｒ‐２／ｎｅｕ結合分子：１．４４．１；１．１４０；１．４３；１．１４．１；１．１００．１；１．９６；１．１８．１；１．２０；１．３９；１．２４；及び１．７１．３（米国特許第８，３５０，０１１号；米国特許第８，８５８，９４２号；及び国際公開第２００８／０１９２９０号）；Ｆ５及びＣ１（米国特許第７，８９２，５５４号；米国特許第８，１７３，４２４号；米国特許第８，９７４，７９２号；及び国際公開第９９／５５３６７号）；並びに米国特許出願公開第２０１３０１７１１４号並びに国際公開第２０１１／１４７９８６号及び国際公開第２０１２／１４３５２４号の抗Ｈｅｒ‐２結合分子のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ結合分子を考慮する。本発明は更に、国際公開第２０１２／１４３５２４号で提供されている例示的なＨＥＲ２／Ｎｅｕ×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
７．例示的な抗ＶＥＧＦ抗体
ＶＥＧＦ‐Ａは、多様な疾患、特に転移性大腸癌等の特定の転移性癌、並びに特定の肺癌、腎臓癌、卵巣癌及び脳の多形性膠芽腫において血管新生を刺激する、化学シグナルである。ヒトＶＥＧＦ‐Ａに結合する例示的な抗体は、「ベバシズマブ」（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。ベバシズマブは、組み換えヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Midgley, R. et al. (2005) “Bevacizumab - Current Status And Future Directions,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004; Hall, R.D. et al. (2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC),” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523; Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765）。
ベバシズマブのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP
HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
ベバシズマブのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF
TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ
GTKVEIKR
本出願は具体的には、ＶＥＧＦに結合できるＶＥＧＦ結合分子（例えばＶＥＧＦ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。
８．例示的な抗５Ｔ４抗体
癌胎児性タンパク質５Ｔ４は、腎臓癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌を含む多くの癌腫の細胞膜上、及び急性リンパ芽球性白血病において発現する、腫瘍関連タンパク質である（Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6を参照）。ヒト５Ｔ４に結合する例示的な抗体としては、「５Ｔ４ ｍＡｂ １」及び「５Ｔ４ ｍＡｂ ２」が挙げられる。
５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIK
５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１５８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
５Ｔ４ ｍＡｂ ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１５９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IK
本出願は具体的には、５Ｔ４に結合でき、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １若しくは５Ｔ４ ｍＡｂ ２の、又は国際公開第２０１３／０４１６８７号若しくは国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗５Ｔ４抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、５Ｔ４結合分子（例えば５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性結合分子）を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている例示的な５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
更に本出願は具体的には、５Ｔ４、ＣＤ３及びＣＤ８に結合できる５Ｔ４×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性結合分子、並びに特に、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４ ｍＡｂ １若しくは５Ｔ４ ｍＡｂ ２の、又は本明細書中で提供されている抗５Ｔ４モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／あるいは、国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗ＣＤ８モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
９．例示的な抗ＩＬ‐１３Ｒα２抗体
インターロイキン‐１３受容体α２（ＩＬ‐１３Ｒα２）は、グリア芽腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、多発性黒色腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌及び肺癌を含む多様な癌において過剰発現する（国際公開第２００８／１４６９１１号；Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685)。ＩＬ‐１３Ｒα２に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている(Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals;国際公開第２００８／１４６９１１号も参照)。ヒトＩＬ‐１３Ｒα２に結合する例示的な抗体としては、「ｈｕ０８」が挙げられる（例えば国際公開第２０１４／０７２８８８号を参照）。
ｈｕ０８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT
VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
ｈｕ０８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG
GTKVEIK
本出願は具体的には、ＩＬ１３Ｒα２に結合できるＩＬ１３Ｒα２結合分子（例えばＩＬ１３Ｒα２×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗ＩＬ１３Ｒα２モノクローナル抗体ｈｕ０８の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１６×ＩＬ１３Ｒα２結合分子を含み、またこれらを包含する。
１０．例示的な抗ＣＤ１２３抗体
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体α、ＩＬ‐３Ｒａ）は４０ｋＤａ分子であり、インターロイキン３受容体複合体の一部である（Stomski, F.C. et al. (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046）。インターロイキン３（ＩＬ‐３）は、多能性幹細胞の、赤血球細胞、骨髄細胞及びリンパ球系前駆細胞への早期分化を促進する。ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む幅広い血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現していることが報告されている（Munoz, L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261-1269）。ＣＤ１２３の過剰発現は、ＡＭＬの不良な予後に関連する（Tettamanti, M.S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401）。
ヒトＣＤ１２３に結合し、本発明で採用できる例示的抗体は、「ＣＤ１２３ ｍＡｂ １」である（例えば国際公開第２０１５／０２６８９２号を参照）。
ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６２）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD
IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH
LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６３）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY
PYTFGQGTKL EIK
本出願は具体的には、ＣＤ１２３に結合できるＣＤ１２３結合分子（例えばＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体ＣＤ１２３ ｍＡｂ １、又は米国特許第２０１７／０８１４２４号及び国際公開第２０１６／０３６９３７号で開示されている抗ＣＤ１２３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は更に、フロテツズマブ（ＭＧＤ００７として公知；ＣＡＳ登録番号１６６４３５５‐２８‐５）、ＪＮＪ‐６３７０９１７８（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開第２０１６／０３６９３７号も参照）、及びＸｍＡｂ１４０４５（Ｘｅｎｃｏｒ、米国特許第２０１７／０８１４２４号も参照）を含む、例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
１１．例示的な抗ＣＤ１９抗体
ＣＤ１９（Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ２８１７０）は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の構成要素であり、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫に関する閾値を変調するＢ細胞シグナリングの正の調節因子である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統中に最も偏在的に発現される抗原の１つであり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の＞９５％において発現される。特に、ＣＤ１９発現は、抗ＣＤ２０療法に対する耐性を示すようになったＢ細胞リンパ腫において維持される（Davis et al. (1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999）。ＣＤ１９はまた、自己免疫疾患を治療するための標的としても示唆されている（Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577）。
ヒトＣＤ１９に結合し、本発明において採用してよい例示的なヒト価抗体は、国際公開第２０１６／０４８９３８号で開示されている抗ＣＤ１９抗体（本明細書では「ＣＤ１９ ｍＡｂ １」と呼ばれる）である。
ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM
ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA
SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG
TKLEIK
ＣＤ１９ ｍＡｂ １の代替的なＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている):
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG
TKLEIK
本発明は具体的には、ＣＤ１９に結合できるＣＤ１９結合分子（例えばＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合分子）、特に、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＣＤ１９ ｍＡｂ １、又は米国特許第７，１１２，３２４号で開示されている抗ＣＤ１９抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、このような結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は具体的には、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標）；WHO Drug Information, 2009, Recommended INN: List 62, 23(3):240-241に見られるアミノ酸配列）、及びズボルツキシマブ（ＭＧＤ０１１として公知、WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629に見られるアミノ酸配列）を含む、本発明で採用できる例示的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
Ｂ．例示的な病原体関連抗原
本明細書中で使用される場合、用語「病原体抗原（Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）」は、病原体感染細胞の表面上に特徴的に発現し、従って抗体系分子又は免疫調節分子を用いて処置できる、抗原を指す。病原体抗原の例としては、限定するものではないが：単純ヘルペスウイルス（例えば感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、ｇＤ等）；水痘帯状疱疹ウイルス；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；エプスタイン‐バーウイルス（例えばＬＭＰ‐１、ＬＭＰ‐２Ａ、ＬＭＰ‐２Ｂ等）；サイトメガロウイルス（例えばＵＬ１１等）；ヒト免疫不全ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１等）；ヒトパピローマウイルス（例えばＥ６、Ｅ７等）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えばｅｎｖタンパク質ｇｐ６４、ｇｐ４６、ｇｐ２１等）；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニア）に感染した細胞の表面上に発現される抗原が挙げられる。このような抗体は、多数のソースから市販されており、又は（モノクローナル抗体の産生のために含まれている）マウス若しくは他の動物を上記抗原で免疫化することによって得ることができる。
病原体感染細胞の表面上に配列された病原体抗原に結合できる分子を構築するためにＶＨ及びＶＬドメインを使用してよい例示的な抗体を以下で提供する。更なる抗体が当該技術分野において公知である。
１．例示的な抗ＨＩＶ‐ｅｎｖ抗体
ＨＩＶのｅｎｖタンパク質は、例示的な病原体関連抗原であり、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質に結合する抗体は、病原体関連抗原に結合できる例示的な抗体である。
ＨＩＶ‐１感染の最初のステップは、細胞表面ＣＤ４が三量体ＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）、膜貫通型糖タンパク質（ｇｐ４１）及び表面糖タンパク質（ｇｐ１２０）のヘテロ二量体に結合することによって発生する。ｇｐ１２０及びｇｐ４１糖タンパク質は初め、単一のｇｐ１６０ポリペプチドとして合成され、これはその後切断されて、非共有結合ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体が生成される。ｅｎｖの外部ドメインは、全ｇｐ１２０成分と約２０ｋＤａのｇｐ４１とからなる、質量約１４０ｋＤａのヘテロ二量体である（Harris, A. et al. (2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445）。ｅｎｖタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３； Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655；国際公開第２０１２／１６２０６８号；及び国際公開第２０１６／０５４１０１号を参照）。ＨＩＶ ｅｎｖに結合する例示的な抗体としては、「７Ｂ２」（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＱ３１５０３）及び「Ａ３２」（国際公開第２０１４／１５９９４０号）が挙げられる。フレームワーク領域１及び／又は４に若干の変化を有する抗体Ａ３２の複数のＶＨドメインが、当該技術分野において報告されている（例えばタンパク質データベース受託番号ＰＤＢ：４ＹＢＬ＿Ｈ、米国公開特許第２０１５／０２３９９６１号、及び国際公開第２００６／０４４４１０号を参照）。これらの変異型抗体Ａ３２ ＶＨドメインのいずれを、本発明に従って使用してよい。
７Ｂ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６６）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS
７Ｂ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６７）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH
PPTFGHGTRV EIK
Ａ３２の例示的なＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１６８）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG
TRLRTLRNAF DIWGQGTXVT VSS
ここでＸはＬ又はＭである。
ＸがＬである、Ａ３２のこのような例示的なＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２０９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG
TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSS
Ａ３２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１６９）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV
FGGGTKLTVL
本出願は具体的には、ＨＩＶに結合できるＨＩＶ結合分子（例えばＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性結合分子）、並びに特に、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２、Ａ３２、及び国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記結合分子を含み、またこれらを包含する。本発明は具体的には、国際公開第２０１４／１５９９４０号、国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、及び国際公開第２０１７／０１１４１４号において提供されている例示的なＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
更に本発明は具体的には、ＨＩＶ、ＣＤ３及びＣＤ８に結合できるＨＩＶ×ＣＤ３×ＣＤ８三重特異性結合分子、並びに特に、抗ＨＩＶモノクローナル抗体７Ｂ２若しくはＡ３２又は国際公開第２０１５／１８４２０３号、国際公開第２０１６／０５４１０１号、国際公開第２０１７／０１１４１３号、国際公開第２０１７／０１１４１４号で開示されている抗ＨＩＶ抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／あるいは国際公開第２０１５／１８４２０３号において提供されている抗ＣＤ８モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、上記三重特異性結合分子を含み、またこれらを包含する。
２．例示的な抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体
更なる例示的な病原体関連抗原は、ＲＳＶ糖タンパク質Ｆである。例示的な抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体は、パリビズマブ（例えばタンパク質データバンク（ＰＤＢ）ＩＤ Ｎｏ．２ＨＷＺを参照）である。別の抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体としては、モタビズマブ（例えばＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．３ＩＸＴを参照）、及びパリビズマブのＣＤＲL１からシステイン残基を除去するよう加工されたパリビズマブの変異型が挙げられる。パリビズマブの変異型のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１７０）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL
ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS
MITNWYFDVW GAGTTVTVSS
パリビズマブの変異型のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１７１）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG
TKLEIK
ＶＩＩ．本発明の例示的な結合分子
以下で説明されるように、腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる分子（例えば以下に記載の「ＤＡＲＴ‐Ａ」型ダイアボディ又は「ＤＡＲＴ‐Ｂ」型ダイアボディ又は３価型分子）を含む異なる構造を有するいくつかのＤＡ×ＣＤ３結合分を用いて、本発明を例示する。
Ａ．ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディ
ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディは、Ｆｃドメインを含まない、ＣＤ３及び疾患抗原（例えば癌抗原）に結合できる二重特異性ダイアボディである。ここで提供されるのは、ＣＤ３のための１つの結合部位と、癌抗原ＣＤ１２３のための１つの結合部位とを有する、２つのポリペプチド鎖からなる例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディである（例えば図１を参照）。
（「ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ」と呼ばれる）例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディは、配列番号１７２：
のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６２）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、ここでＫａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３０）に対応する。
このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７３：
のアミノ酸配列を有する。
このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴの残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３８は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１６３）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖の残基２３９～２４４（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。
本開示を考慮して認識されるように、別の疾患抗原のための結合部位を有する、及び／又は変異型抗ＣＤ３抗体のＣＤ３結合ドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を有する、更なるＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディを、（例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディのＶＬ及びＶＨドメインの代わりにこのような抗体のＶＬ及びＶＨドメインを採用することによって）同様に構成できる。同様に、本明細書中で提供されるように、別のリンカー及び／又は別のヘテロ二量体促進ドメインを組み込んだ別のＤＡＲＴ‐Ａ型分子を、同様に構成できる。例えば、上で提供したＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴダイアボディと同一の構造を有するものの、上で提供したＣＤ３ ｍＡｂ １変異型（Ｍ１～Ｍ２６）のうちの１つのＶＬ及びＶＨドメインを含む、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの例示的なパネルを生成した。
上記パネルの例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディはそれぞれ、配列番号１８９：
のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖を有し、ここで：Ｘ1はＴ、Ｄ、又はＥであり；Ｘ2はＹ、Ｄ又はＴであり；Ｘ3はＡ又はＧであり；Ｘ4はＤ又はＧであり；Ｘ5はG、Ｄ、Ｅ、又はＫであり；Ｘ6はＦ又はＩであり；Ｘ7はＧ又はＩであり；Ｘ8はＹ、Ａ、Ｇ、又はＱであり；Ｘ9はＳ又はＴであり；Ｘ10はＷ、Ｆ、又はＹであり；Ｘ11はＹ又はＥである。
例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６２）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６；二重下線部）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２２のＶＨドメイン（配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４又は１０６）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３０）に対応する。
このような例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１９０：
のアミノ酸配列を有し、ここで：Ｘ1はＧ又はＤであり；Ｘ2はＫ又はＧであり；Ｘ3はＬ、Ｅ又はＱである。
例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２３～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６のＶＬドメイン（配列番号１０８、１１０、１１２、及び１１４）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６；二重下線部）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３８は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１６３）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第２のポリペプチド鎖の残基２３９～２４４（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７；下線部）に対応する。例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの上記パネルの第２のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １変異型のＶＬ及びＶＨドメインを含む例示的なＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディのパネルのアミノ酸配列及び呼称を、以下の表８に示す。
Ｂ．ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ
ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、Ｆｃドメインを含む、ＣＤ３及び疾患抗原（例えば癌又は感染症抗原）に結合できる二重特異性ダイアボディである。ここで提供されるのは、３つのポリペプチド鎖からなり、ＣＤ３のための１つの結合部位と、癌抗原ＣＤ１２３、５Ｔ４、又はＣＤ１９のための１つの結合部位とを有する、例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディである（例えば図４Ａを参照）。
１．第１の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐ＷＴ（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １）
（「ＣＤ１２３‐ＷＴ」と呼ばれる）第１の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、配列番号１７４：
のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２９４‐５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ１２３‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖は、配列番号１７５：
のアミノ酸配列を有する。
ＣＤ１２３‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３８は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１６２）に対応する。第２のポリペプチド鎖の残基２３９～２４４（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３０）に対応する。
ＣＤ１２３‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖は、配列番号１７６：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
のアミノ酸配列を有する。
ＣＤ１２３‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖の残基１～１０は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖の残基１１～２２７は、ＩｇＧ１「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応する。
認識されるように、ＣＤ１２３‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖は、いずれのエピトープ結合ドメインも含有しないため、このようなＤＡＲＴ‐Ｂ型構造を有する様々なＤＡ×ＣＤ３結合分子に採用できる。
２．第２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ１（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１）
第２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ１」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１はＣＤ３ ｍＡｂ １の低親和性変異型である（「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｌｏｗ」とも呼ばれる）。これもまた上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ１）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１７７）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ１の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
３．第３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ２（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２）
第３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐Ｍ１ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ２」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２は、ＣＤ３ ｍＡｂ １よりも速いオフレートを有し、従って「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｆａｓｔ」とも呼ばれる。これもまた上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ２）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１７８）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメイン（配列番号５９）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ２の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
４．第４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ１８（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８）
第４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐Ｍ２ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ１８」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ１８）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１７９）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメイン（配列番号９８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ１８の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
５．第５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ１３（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３）
第５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ１３」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ１３）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９８）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメイン（配列番号８８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ１３の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
６．第６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ１７（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７）
第６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ１７」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ１７）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９９）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメイン（配列番号９６）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ１７の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
７．第７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐Ｍ１９（ＣＤ１２３×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９）
第７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１２３‐Ｍ１９」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １と同一のアミノ酸配列を有する。
従って、第７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１２３‐Ｍ１９）は、以下のアミノ酸配列（配列番号２００）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１３は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６３）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１１４～１２１（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１２２～２４６は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメイン（配列番号１００）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２５２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２５３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２８１～２８３は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２８４～２９３（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２９４～５１０は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７５）と同一である。同様に、ＣＤ１２３‐Ｍ１９の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
８．第８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ５Ｔ４‐ＷＴ（５Ｔ４×ＣＤ３ ｍＡｂ １）
第８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐Ｍ１８ダイアボディと同様であるが、ＣＤ１２３‐Ｍ１８ダイアボディのＣＤ１２３結合ドメインの代わりに５Ｔ４結合ドメインを含む。更に、この第８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメインを含有する。この第８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「５Ｔ４‐ＷＴ」と呼ばれる。
よって、第８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（５Ｔ４‐ＷＴ）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８０）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１～１０７は、５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１５７）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１０８～１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１１６～２４０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はグリシン（Ｇ）である。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４１～２４６（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２７４は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２７５～２７７は、GGGリンカーに対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２７８～２８７（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２８８～５０４は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８１）：
を有する。
５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３６は、５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１５６）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２３７～２４２（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。５Ｔ４‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２４３～２８０は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３０）に対応する。
５Ｔ４‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖と同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１７６）を有する。
９．第９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ５Ｔ４‐Ｍ１（５Ｔ４×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１）
第９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述の５Ｔ４‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨドメインを含み、「５Ｔ４‐Ｍ１」と呼ばれる。
従って、第９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（５Ｔ４‐Ｍ１）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８２）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０７は、５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１５７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１０８～１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基１１６～２４０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨドメイン（配列番号６４）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２４１～２４６（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２７４は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２７５～２７７は、GGGリンカーに対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２７８～２８７（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１の第１のポリペプチド鎖の残基２８８～５０４は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、５Ｔ４‐Ｍ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、５Ｔ４‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１８１）と同一である。同様に、５Ｔ４‐Ｍ１の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１０．第１０の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ５Ｔ４‐Ｍ２（５Ｔ４×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２）
第１０の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述の５Ｔ４‐Ｍ１ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメインを含み、「５Ｔ４‐Ｍ２」と呼ばれる。
従って、第１０の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（５Ｔ４‐Ｍ２）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８３）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０７は、５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１５７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１０８～１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基１１６～２４０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメイン（配列番号６６）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２４１～２４６（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２７４は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２７５～２７７は、GGGリンカーに対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２７８～２８７（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ２の第１のポリペプチド鎖の残基２８８～５０４は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、５Ｔ４‐Ｍ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、５Ｔ４‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１８１）と同一である。同様に、５Ｔ４‐Ｍ２の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１１．第１１の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ５Ｔ４‐Ｍ１８（５Ｔ４×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８）
第１１の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述の５Ｔ４‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインを含み、「５Ｔ４‐Ｍ１８」と呼ばれる。
従って、第１１の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（５Ｔ４‐Ｍ１８）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８４）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０７は、５Ｔ４ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１５７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１０８～１１５（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１６～２４０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメイン（配列番号９８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４１～２４６（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４７～２７４は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７５～２７７は、GGGリンカーに対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７８～２８７（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。５Ｔ４‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８８～５０４は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、５Ｔ４‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、５Ｔ４‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１８１）と同一である。同様に、５Ｔ４‐Ｍ１８の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１２．第１２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＨＩＶ‐ＷＴ（ＨＩＶ×ＣＤ３ ｍＡｂ １）
第１２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのＣＤ１２３結合ドメインの代わりに、抗ＨＩＶ抗体Ａ３２のＨＩＶ結合ドメインを含む。この第１２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「ＨＩＶ‐ＷＴ」と呼ばれる。
よって、第１２の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＨＩＶ‐ＷＴ）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８５）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１６９）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１１９～２４３は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はグリシン（Ｇ）である。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４４～２４８（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１；下線部）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４９～２７６は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号３１）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２７９は、GGGリンカーに対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２８０～２８９（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０；下線部）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２９０～５０６は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号１８６）：
を有する。
ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２４１は、Ａ３２のＶＨドメイン（配列番号２０９（即ちＸがＬである配列番号１６８））に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２４２～２４６（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１）に対応する。ＨＩＶ‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２４７～２７４は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３２）に対応する。
ＨＩＶ‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖と同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１７６）を有する。
１３．第１３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＨＩＶ‐Ｍ１８（ＨＩＶ×ＣＤ３ ｍＡｂ １８）
第１３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＨＩＶ‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインを含有する。この例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「ＨＩＶ‐Ｍ１８」と呼ばれる。
よって、第１３の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＨＩＶ‐Ｍ１８）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９６）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、Ａ３２のＶＬドメイン（配列番号１６９）に対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１９～２４３は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はグリシン（Ｇ）である。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４４～２４８（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１；下線部）に対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４９～２７６は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号３１）に対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２７９は、GGGリンカーに対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８０～２８９（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０；下線部）に対応する。ＨＩＶ‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２９０～５０６は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＨＩＶ‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＨＩＶ‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１８６）と同一である。同様に、ＨＩＶ‐Ｍ１８の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１４．第１４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９‐ＷＴ（ＣＤ１９×ＣＤ３ ｍＡｂ １）
第１４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＨＩＶ‐ＷＴダイアボディと同様であるが、Ａ３２結合ドメインの代わりに、ＣＤ１９ ｍＡｂ １を含む。この第１４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「ＣＤ１９‐ＷＴ」と呼ばれる。
よって、第１４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９‐ＷＴ）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９１）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６５）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号５５）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はグリシン（Ｇ）である。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４４（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１；下線部）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号３１）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２７３～２７５は、GGGリンカー（二重下線部）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２７６～２８５（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第１のポリペプチド鎖の残基２８６～５０２は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９２）：
を有する。
ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３８は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１６４）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２３９～２４３（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１）に対応する。ＣＤ１９‐ＷＴの第２のポリペプチド鎖の残基２４４～２７１は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３２）に対応する。
ＣＤ１９‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖と同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１７６）を有する。
１５．第１５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９‐Ｍ１８（ＣＤ１９×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８）
第１５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１９‐ＷＴダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインを含有する。この第１５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「ＣＤ１９‐Ｍ１８」と呼ばれる。
よって、第１５の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９‐Ｍ１８）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９７）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号１６５）に対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメイン（配列番号９８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はグリシン（Ｇ）である。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４４（下線部）は、リンカー２（ASTKG；配列番号２１；下線部）に対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号３１）に対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７３～２７５は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７６～２８５（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８６～５０２は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１９‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１９‐ＷＴダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１９２）と同一である。同様に、ＣＤ１９‐Ｍ１８の第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖と同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１７６）を有する。
１６．第１６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９．１‐Ｍ１８（ＣＤ１９．１×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８）
第１６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１２３‐Ｍ１８ダイアボディと同様であるが、ＣＤ１２３‐Ｍ１８のＣＤ１２３結合ドメインの代わりに、ＣＤ１９ ｍＡｂ １の別のＶＬドメインを含有するＣＤ１９結合ドメインを含む。この例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、「ＣＤ１９．１‐Ｍ１８」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
よって、第１６の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９．１‐Ｍ１８）は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９３）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １の別のＶＬドメイン（配列番号１９５）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメイン（配列番号９８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４５（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２４６～２７３は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７４～２７６は、GGGリンカー（二重下線部）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２８６（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第１のポリペプチド鎖の残基２８７～５０３は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号１９４）：
を有する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖の残基１～１１０は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメイン（配列番号５６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖の残基１１１～１１８（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖の残基１１９～２３８は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １のＶＨドメイン（配列番号１６４）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖の残基２３９～２４４（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第２のポリペプチド鎖の残基２４５～２７２は、ヘテロ二量体促進「Ｋコイル」（KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE；配列番号３０）に対応する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１７．第１７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９．１‐Ｍ１３（ＣＤ１９．１×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３）
第１７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１９．１‐Ｍ１８ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１９．１‐Ｍ１３」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
よって、第１７の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９．１‐Ｍ１３）は、以下のアミノ酸配列（配列番号２０１）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １の別のＶＬドメイン（配列番号１９５）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメイン（配列番号８８）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４５（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２４６～２７３は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２７４～２７６は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２８６（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第１のポリペプチド鎖の残基２８７～５０３は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１９４）と同一である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１３の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１８．第１８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９．１‐Ｍ１７（ＣＤ１９．１×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７）
第１８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１．１‐Ｍ１８ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１９．１‐Ｍ１７」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
よって、第１８の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９．１‐Ｍ１７）は、以下のアミノ酸配列（配列番号２０２）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １の別のＶＬドメイン（配列番号１９５）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメイン（配列番号９６）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４５（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２４６～２７３は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２７４～２７６は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２８６（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第１のポリペプチド鎖の残基２８７～５０３は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１９４）と同一である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
１９．第１９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１９．１‐Ｍ１９（ＣＤ１９．１×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９）
第１９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１．１‐Ｍ１８ダイアボディと同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメインを含有し、「ＣＤ１９．１‐Ｍ１９」と呼ばれる。上述のように、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬドメインと同一のアミノ酸配列を有する。
よって、第１９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ（ＣＤ１９．１‐Ｍ１９）は、以下のアミノ酸配列（配列番号２０３）：
を有する第１のポリペプチド鎖を有する。
ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、ＣＤ１９ ｍＡｂ １の別のＶＬドメイン（配列番号１９５）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１０７～１１４（二重下線部）は、リンカー１（GGGSGGGG；配列番号１６）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基１１５～２３９は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメイン（配列番号１００）に対応し、Ｋａｂａｔ６５位（二重下線部）はアスパラギン酸（Ｄ）である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２４０～２４５（下線部）は、リンカー２（GGCGGG；配列番号１７）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２４６～２７３は、ヘテロ二量体促進「Ｅコイル」（-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK；配列番号２９）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２７４～２７６は、GGGリンカーに対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２７７～２８６（下線部）は、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号４０）に対応する。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第１のポリペプチド鎖の残基２８７～５０３は、ＩｇＧ１「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４８）に対応する。
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＬドメインは、ＣＤ３ ｍＡｂ １のものと同一であるため、ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８ダイアボディの第２のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１９４）と同一である。ＣＤ１９．１‐Ｍ１９の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディの第３のポリペプチド鎖のもの（即ち配列番号１７６）と同一である。
具体的に考慮される更なるＣＤ１９×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディは、上述のＣＤ１９‐ＷＴ（第１４の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディを参照）と同様であるが、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３、Ｍ１７、又はＭ１９のＶＨドメインを含む。このようなダイアボディは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する第１のポリペプチド鎖を含む：
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３のＶＨドメインを含むこのようなダイアボディのための、配列番号２０４：
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７のＶＨドメインを含むこのようなダイアボディのための、配列番号２０５：
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１９のＶＨドメインを含むこのようなダイアボディのための、配列番号２０６：
このようなダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、ＣＤ１９‐ＷＴと同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１９２）を有し、またこのようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は、ＣＤ１２３‐ＷＴの第３のポリペプチド鎖と同一のアミノ酸配列（即ち配列番号１７６）を有する。
本開示を考慮して認識されるように、別の疾患抗原のための結合部位を有する、及び／又は別の変異型抗ＣＤ３抗体のＣＤ３結合ドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を有する、更なるＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディを、（このような抗体のＶＬ及びＶＨドメインを採用することによって）同様に構成できる。同様に、本明細書中で提供されるように、別のリンカー及び／又は別のヘテロ二量体促進ドメインを組み込んだ別のＤＡＲＴ‐Ｂ型分子を、同様に構成できる。
本発明の方法において使用できる、疾患抗原を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）の標的転換殺滅を仲介できる更なる例示的な分子としては：ＣＤ１９及びＣＤ３（例えば米国特許第７，２３５，６４１号、及び国際公開第２０１６／０４８９３８号を参照）；ＣＤ１２３及びＣＤ３（例えばKuo, S.R. et al. , (2012) “Engineering a CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells,” Protein Eng Des Sel. 25:561-9；国際公開第２０１５／０２６８９２号；国際公開第２０１６／０８６１８９号を参照）；ｇｐＡ３３及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照）；ＣＥＡ及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１３／０１２４１４号；国際公開第２０１７／１１８６７５号を参照）；Ｂ７‐Ｈ３及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１７／０３０９２６号を参照）；ＨＥＲ２及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１２／１４３５２４号を参照）；５Ｔ４及びＣＤ３（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号、及び国際公開第２０１３／０４１６８７号を参照）に結合できる二重特異性分子、並びにＣＤ３結合ドメインを有する他の分子（例えば国際公開第２０１３／０２６８３５号、国際公開第２０１３／１５８８５６号、国際公開第２０１４／１１０６０１号、国際公開第２０１６／１８２７５１号、国際公開第２０１７／０５３４６９号等を参照）が挙げられる。本開示を考慮して認識されるように、本発明のｖＣＤ３結合ドメインは、このような分子に組み込むことができる。
Ｃ．３価型分子
３価型分子は、最大３つの異なるエピトープに結合できる３価分子である。特に、本発明の３価型分子は、ＣＤ３及び疾患抗原（例えば癌又は感染症抗原）に結合でき、更に、更なる疾患抗原（例えば癌若しくは感染症抗原）又はエフェクタ細胞の表面上に発現される更なる抗原（例えばＣＤ８）といった更なる抗原に結合でき、あるいは、ＣＤ３の２３のエピトープ又は上記疾患抗原の第２のエピトープに結合できる。３価型分子は、Ｆｃドメインを含む。本明細書において提供されるのは、４つのポリペプチド鎖からなる例示的な３価型ダイアボディであり、ＣＤ３のための１つの結合部位、癌抗原ＣＤ１２３のため又は癌抗原５Ｔ４のための１つの結合部位、及びＣＤ８のための１つの結合部位を有する（例えば図６Ａを参照）。本発明の例示的な３価型分子は、上で提供されているＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖を、以下で提供される例示的な第３及び第４のポリペプチド鎖（これらはＣＤ８結合ドメインを提供する）と組み合わせて使用して生成される。第１及び第２のポリペプチド鎖はＣＤ３及びＤＡ結合ドメインを形成し、その一方で第３及び第４のポリペプチド鎖はＣＤ８結合ドメインを形成する。第１及び第３のポリペプチド鎖はＦｃドメインを形成する。
以下で提供される例示的な３価型分子にはそれぞれ、配列番号１８７のアミノ酸配列：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K
を有する第３のポリペプチド鎖が組み込まれている。
このような例示的な３価型分子の第３のポリペプチド鎖の残基１～１２１は、抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＨドメイン（配列番号１２０）に対応する。このような例示的な３価型分子の第３のポリペプチド鎖の残基１２１～２１９は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号１）に対応する。このような例示的な３価型分子の第３のポリペプチド鎖の残基２２０～２３４は、ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号５）に対応する。残基２３５～４５１は、ＩｇＧ１「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号５０）に対応する。
以下で提供される例示的な３価型分子にはそれぞれ、配列番号１８８のアミノ酸配列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC
を有する第４のポリペプチド鎖が組み込まれている。
このような例示的な３価型分子の第４のポリペプチド鎖の残基１～１０６は、抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＬドメイン（配列番号１２１）に対応する。残基１０７～２１３は、ＣＬκドメイン（配列番号１４）に対応する。
例示的な３価型分子のポリペプチド鎖の配列番号を表１０にまとめる。
１．第１の例示的な３価型分子Ｔ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ（ＣＤ１２３ ｍＡｂ １×ＣＤ３ ｍＡｂ １×ＴＲＸ２）
（「Ｔ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ」と呼ばれる）第１の例示的な３価型分子は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン、並びに抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。上述のように、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのもの（配列番号１７４）と同一である。同様に、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのもの（配列番号１７５）と同一である。これもまた上述のように、例示的な３価型分子の第３及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８７及び配列番号１８８である。
２．第２の例示的な３価型分子Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１（ＣＤ１２３ ｍＡｂ １×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１×ＴＲＸ２）
（「Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１」と呼ばれる）第２の例示的な３価型分子は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１のＶＨ及びＶＬドメイン、並びにＴＲＸ２のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。上述のように、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐Ｍ１ダイアボディのもの（配列番号１７７）と同一である。同様に、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのもの（配列番号１７５）と同一である。これもまた上述のように、全ての例示的な３価型分子の第３及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８７及び配列番号１８８である。
３．第３の例示的な３価型分子Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２（ＣＤ１２３ ｍＡｂ １×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２×ＴＲＸ２）
Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２と呼ばれる第３の例示的な３価型分子は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨ及びＶＬドメイン、並びにＴＲＸ２のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。上述のように、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐Ｍ２ダイアボディのもの（配列番号１７８）と同一である。同様に、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのもの（配列番号１７５）と同一である。これもまた上述のように、全ての例示的な３価型分子の第３及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８７及び配列番号１８８である。
４．第４の例示的な３価型分子Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８（ＣＤ１２３ ｍＡｂ １×ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８×ＴＲＸ２）
Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８と呼ばれる第４の例示的な３価型分子は、ＣＤ１２３ ｍＡｂ １のＶＨ及びＶＬドメイン、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨ及びＶＬドメイン、並びにＴＲＸ２のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。上述のように、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐Ｍ１８ダイアボディのもの（配列番号１７９）と同一である。同様に、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、上述のＣＤ１２３‐ＷＴダイアボディのもの（配列番号１７５）と同一である。これもまた上述のように、全ての例示的な３価型分子の第３及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８７及び配列番号１８８である。
本開示を考慮して認識されるように、別の疾患抗原のための結合部位を有する、及び／又は別の変異型抗ＣＤ３抗体のＣＤ３結合ドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を有する、更なる３価型ダイアボディを、（このような抗体のＶＬ及びＶＨドメインを採用することによって）同様に構成できる。同様に、本明細書中で提供されるように、別のリンカー及び／又は別のヘテロ二量体促進ドメインを組み込んだ別の３価型分子を、同様に構成できる。
本発明の方法において使用できる、疾患抗原を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）の標的転換殺滅を仲介できる更なる例示的な分子としては：Ｂ７‐Ｈ３、ＣＤ３及びＣＤ８（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）；５Ｔ４、ＣＤ３及びＣＤ８（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）；ＲＯＲ１、ＣＤ３及びＣＤ８（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号、及び国際公開第２０１７／１０６０６１号を参照）；ＨＩＶ、ＣＤ３及びＣＤ８（例えば国際公開第２０１５／１８４２０３号；国際公開第２０１７／０１１４１３号；及び国際公開第２０１７／０１１４１４号を参照）；ｇｐＡ３３、ＣＤ３及びＤＲ５（例えば国際公開第２０１５／１８４２０７号を参照）；ＥｐｈＡ２、ＣＤ３及びＤＲ５（例えば国際公開第２０１５／１８４２０７号を参照）；ｇｐＡ３３、ＣＤ３及びＥｐｈＡ２（例えば国際公開第２０１５／１８４２０７号を参照）に結合できる３価分子、並びに他の３価分子（例えば国際公開第２０１６／１０５４５０号；国際公開第２０１６／１１５２７４号；国際公開第２０１７／１８０９１３号を参照）が挙げられる。本開示を考慮して認識されるように、本発明のｖＣＤ３結合ドメインは、このような分子に組み込むことができる。
ＶＩＩＩ．産生方法
最も好ましくは、本発明の分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明の結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
本発明は、本開示の結合分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大幅に又は劣化するように変化させない１つ以上の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ以上のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＣＤ３、又はＣＤ３と疾患抗原との両方に特異的に結合し、かつ天然分子においては上記抗体融合タンパク質が結合しない別のアミノ酸配列、例えば異種配列又は別の領域由来の同種配列を含有する、１つ以上のポリペプチドドメインを含有する。
本発明は特に、診断又は治療用部分にコンジュゲートする上記結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。診断を目的として、本発明の結合分子を、検出可能な物質と連結させてよい。このような結合分子は、臨床試験手順の一部としての疾患の発症又は進行の監視及び／又は予後判定、例えば特定の療法の有効性の決定に有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（例：アビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えばアンベリフェロン、フルオレセイン又はフィコエリスリン）、発光材料（例えばルミノール）、生物発光材料（例えばルシフェラーゼ又はエクオリン）、放射性材料（例えば炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５又は亜鉛６５）、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。上記検出可能な物質は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
治療を目的として、本発明の結合分子を、細胞毒素等の治療成分（例えば細胞増殖抑制剤若しくは細胞破壊剤）、治療剤又はαエミッタ等の放射性金属イオンとコンジュゲートさせてよい。細胞毒素又は細胞傷害剤としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ～Ｆ、リシンアブリン、サポリン、及びこれらの作用剤の細胞傷害性断片といった、細胞に有害ないずれの作用剤が挙げられる。治療剤としては、障害を予防的又は治療的に処置するための治療効果を有するいずれの作用剤が挙げられる。このような治療剤は、化学治療剤、タンパク質又はポリペプチド治療剤であってよく、所望の生物活性を有する、及び／又は所与の生物応答を修正する治療剤を含んでよい。治療剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤、及び細胞増殖性疾患の治療に有用な抗体が挙げられる。治療用部分は、直接的に、又は当該技術分野において公知の技法を用いて、介在物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合分子と連結又はコンジュゲートさせてよい。
ＩＸ．本発明の結合分子の使用
上述のように、ＣＤ３及び疾患抗原に結合できる分子は、細胞表面上にこのような疾患抗原を発現する標的細胞（即ち癌細胞又は病原体感染細胞）の標的転換殺滅を仲介できる。このような分子は、治療目的のために、例えば癌又は感染症を有する被験者において使用できる。よって本発明の結合分子は、上記標的細胞の表面上での疾患抗原、特に癌抗原若しくは病原体関連抗原の発現に関連する、又は上記発現を特徴とする、いずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。よって、限定するものではないが、本発明の結合分子は、癌、特に癌抗原の発現を特徴とする癌の治療に採用できる。本発明の結合分子は、感染症、特に病原体関連抗原の発現を特徴とする感染症の治療に採用できる。
特に本発明は：ＣＤ３に結合できる分子が、ＣＤ３に結合できる抗体のエピトープ結合ドメインを含み、かつ（標的転換細胞殺滅（例えば標的転換Ｔ細胞殺滅）を仲介することによって）標的細胞の標的転換殺滅を仲介するために、標的細胞の表面上の疾患抗原（特に癌抗原又は病原体関連抗原）に結合できるエピトープ結合ドメインを含む、上記方法を包含する。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３及び疾患抗原に結合できる分子は、二重特異性抗体又は（二重特異性ｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ、ＴａｎｄＡｂを含む）そのエピトープ結合ドメインを含む分子である。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３及び疾患抗原に結合できる分子は、二重特異性ダイアボディである。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３及び疾患抗原に結合できる分子は、３価結合分子である。
「療法を提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ａ ｔｈｅｒａｐｙ）」、又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は：疾患に由来する症状の低減；感染症の症状（例えばウイルス量、発熱、疼痛、敗血症等）の軽減；腫瘍（癌の文脈では、例えば乳癌、胃癌若しくは前立腺癌の腫瘍）のサイズの縮小；癌細胞成長の遅延；転移の発生、成長若しくは進行の遅延；疾患に由来する症状の低減；レシピエント被験者のＱＯＬの向上；被験者の疾患の治療のために提供される他の薬物の用量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による、別の薬物の効果の増強；疾患の進行の遅延：並びに／又はレシピエント被験者の生存期間の延長といったいずれの臨床的結果を含むがこれに限定されない、有益な又は所望の結果のいずれの兆候に関連する、組成物のいずれの投与を指す。
治療の被験者としては、動物、最も好ましくは非霊長類（例えばウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類種が挙げられる。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
本発明の様々な実施形態によって治療できる例示的な障害としては、限定するものではないが、増殖性障害、細胞増殖性障害、及び癌（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合できる癌抗原を発現する癌）、病原体関連疾患（特に標的転換細胞殺滅を仲介できる分子によって結合される病原体関連抗原の発現に関連する慢性ウイルス感染症）が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、被験者の疾患又は障害の治療、予防又は管理のための方法及び組成物を包含し、これは、治療的有効量の本発明の結合分子を被験者に投与するステップを含む。このような分子は、原発性腫瘍の成長の予防、阻害、低減又は退縮、及び腫瘍の転移の予防、阻害、低減のため、並びに病原体量の低減又は病原体感染細胞の排除のために特に有用である。特定の作用機序による束縛を意図したものではないが、上記分子は、標的細胞に対するエフェクタ機能を仲介してよく、標的細胞、架橋細胞表面抗原及び／又は標的細胞上の受容体に対する免疫系の活性化を促進してよく、またアポトーシス又は負の成長調節シグナリングを増強してよく、又はこれらの組み合わせを実現してよく、これにより、標的細胞の除去及び／又はその個数の低減をもたらす。
本発明の分子によって、及び本発明の方法によって治療できる癌としては、限定するものではないが：副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌が挙げられる。
特に、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３結合分子、ＣＤ１９×ＣＤ３×ＣＤ８結合分子、ＣＤ１２３×ＣＤ３結合分子、及びＣＤ１２３×ＣＤ３×ＣＤ８結合分子は、急性リンパ性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）、ＣＬＬのリヒター症候群又はリヒター転化を含む慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、全身性肥満細胞症、並びにバーキットリンパ腫を含むがこれらに限定されない、血液癌の治療に使用できる。
本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる病原体関連疾患としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＬＡＧ‐３結合分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
Ｘ．医薬組成物
本発明は、ＣＤ３に結合でき、かつ疾患抗原に結合できる分子（即ち、例えばＤＡ×ＣＤ３×ＣＤ８結合分子、ＤＡ×ＣＤ３×ＤＡ結合分子等を含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子）を含む、組成物を包含する。本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験者又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量のＣＤ３に結合でき、かつ疾患抗原に結合できることにより、標的細胞（例えば癌細胞、病原体感染細胞等）の標的転換殺滅を仲介できる分子、又はこれらの分子の組み合わせと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。ある好ましい態様では、上記組成物は略精製済みである（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を略含まない）。
このような組成物の様々な処方を、投与に用いてよい。１つ以上の薬理学的有効成分に加えて、本発明の組成物は、好適な、薬学的に許容可能なキャリアを含有してよく、上記キャリアは、当該技術分野において公知の賦形剤及び助剤を含み、また薬理学的に有効な物質の投与を促進する、又は上記活性化合物の、作用部位への送達のために薬学的に使用できる調製物への加工を促進する、比較的不活性の物質である。例えば賦形剤は、形状若しくは粘度を与えることができ、又は希釈剤として作用できる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、並びに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明の結合分子で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ以上のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明の結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ以上のコンテナ内に含むことができる
ＸＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の医薬組成物を、被験者に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。ある好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験者は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
本発明の分子又は組成物を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。
本発明はまた、本発明の結合分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験者への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
凍結乾燥された本発明の結合分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃～８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このような結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の上記調製物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。単独で投与される個々の有効成分に対して適用される場合、この用語は、上記成分のみを指す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、治療効果をもたらす複数の有効成分の合計量を指し、上記有効成分が組み合わせた状態で投与されるか、順次投与されるか、又は同時に投与されるかにかかわらない。
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：癌細胞の殺滅及び／若しくは増殖の低減；並びに／又は癌の原発部位からの転移の進展の排除、低減及び／若しくは遅延；又は感染病原体の増殖（又はその影響）の低減；並びに病原体仲介型疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ以上の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ以上の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含される結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ以上である。
本発明の結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
患者に投与される本発明の結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
治療的又は予防的有効量の本発明の結合分子を用いた被験者の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験者は、本発明の医薬組成物を用いて、約１～１０週間、好ましくは２～８週間、より好ましくは約３～７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間にわたって処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは本発明の医薬組成物は、１日２回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。あるいは、本発明の医薬組成物は、１日３回投与でき、この投与は１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等のスケジュールで行われる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
ＸＩＩ．本発明の具体的実施形態
本発明の具体的実施形態は、以下の実施形態Ｅ１‐Ｅ２７を含む。
Ｅ１．ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子であって、上記ＣＤ３結合ドメインは：
（Ｉ）（Ａ）配列番号９９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、及び配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、及び配列番号１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
（ＩＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号１０９及び配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン：又は
（ＩＶ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（Ｅ）配列番号１１３及び配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
（Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン
を含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ２．上記ＣＤ３結合ドメインは：
（Ｉ）（Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
（Ｂ）配列番号９８、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、及び配列番号１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
（Ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン
を含む、Ｅ１に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ３．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性ＴａｎｄＡｂ、又は３価結合分子である、Ｅ１又はＥ２に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ４．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子が、２つ以上の疾患抗原、及び／又はエフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合できる、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ５．上記疾患抗原は癌抗原である、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ６．上記疾患抗原は病原体関連抗原である、Ｅ１～Ｅ４のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ７．エフェクタ細胞の上記異なる細胞表面分子は、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ、ＮＫｐ４６、又はＮＫＧ２Ｄである、Ｅ４～Ｅ６のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ８．上記癌抗原は、癌抗原：１９．９、４．２、ＡＤＡＭ‐９、ＡＨ６、ＡＬＣＡＭ、Ｂ１、Ｂ７‐Ｈ３、ＢＡＧＥ、β‐カテニン、血液型ＡＬｅb／Ｌｅy、バーキットリンパ腫抗原‐３８．１３、Ｃ１４、ＣＡ１２５、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ３１７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＯ１７‐１Ａ、ＣＯ‐４３、ＣＯ‐５１４、ＣＴＡ‐１、ＣＴＬＡ‐４、サイトケラチン８、Ｄ１．１、Ｄ1５６‐２２、ＤＲ５、Ｅ1シリーズ、ＥＧＦＲ、エフリン受容体、ＥｐｈＡ２、Ｅｒｂ、ＧＡＧＥ、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２ガングリオシド、ＧＩＣＡ１９‐９、ｇｐ１００、Ｇｐ３７、ｇｐ７５、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＦＧ、ヒトパピローマウイルス‐Ｅ６／ヒトパピローマウイルス‐Ｅ７、ＨＭＷ‐ＭＡＡ、Ｉ抗原、ＩＬ１３Ｒα２、インテグリンβ６、ＪＡＭ‐３、ＫＩＤ３、ＫＩＤ３１、ＫＳ １／４汎癌腫抗原、Ｌ６、Ｌ２０、ＬＥＡ、ＬＵＣＡ‐２、Ｍ１：２２：２５：８、Ｍ１８、Ｍ３９、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ‐１、ＭＵＭ‐１、Ｍｙｌ、Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ糖タンパク質、ＮＳ‐１０、ＯＦＡ‐１、ＯＦＡ‐２、オンコスタチンＭ、ｐ１５、ｐ９７、ＰＥＭ、ＰＥＭＡ、ＰＩＰＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性リン酸塩、Ｒ24、ＲＯＲ１、スフィンゴ脂質、ＳＳＥＡ‐１、ＳＳＥＡ‐３、ＳＳＥＡ‐４、ｓＴｎ、Ｔ細胞受容体由来ペプチド、Ｔ5Ａ7、ＴＡＧ‐７２、ＴＬ５、ＴＮＦ‐受容体、ＴＮＦ‐γ受容体、ＴＲＡ‐１‐８５、トランスフェリン受容体、５Ｔ４、ＴＳＴＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＰ８、ＶＥＰ９、ＶＩＭ‐Ｄ５、及びＹハプテン、Ｌｅyからなる群から選択される、Ｅ５又はＥ７に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ９．上記疾患抗原は、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ、５Ｔ４、ＩＬ１３Ｒα２、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、又はＲＯＲ１である、Ｅ８に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１０．上記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、Ｅ６又はＥ７に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１１．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、互いに対して共有結合する第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ドメイン１であって：
（１）疾患抗原の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬDA）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を含み、上記サブドメイン１Ａ及び上記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
（ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２
を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）疾患抗原の上記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨDA）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を含み、上記サブドメイン１Ａ及び上記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
（ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２であって、上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖との上記ヘテロ二量体促進ドメインは異なる、ドメイン２
を含み、
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインとは、会合して上記疾患抗原結合ドメインを形成し、上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインとは、会合して上記ＣＤ３結合ドメインを形成するか；又は
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインとは、会合して上記ＣＤ３結合ドメインを形成し、上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインと、上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメインとは、会合して上記疾患抗原結合ドメインを形成する、Ｅ１～Ｅ１０のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１２．（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインであり、上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであるか；又は
（ｂ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであり、上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインである、
Ｅ１１に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１３．上記第１のポリペプチド鎖又は上記第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むドメイン３を更に含む、Ｅ１１又はＥ１２に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１４．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第３のポリペプチド鎖を更に含む、Ｅ１３に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１５．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子はＣＤ８結合ドメインを更に含む、Ｅ１１～Ｅ１４のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
Ｅ１６．上記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は：
（Ｉ）（Ａ）配列番号１７９を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１７５を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＩ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＩＩ）（Ａ）配列番号１９６を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８６を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＩＶ）（Ａ）配列番号１９７を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９２を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（Ｖ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；及び
（Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
（ＶＩ）（Ａ）配列番号１７９を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１７５を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＶＩＩ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＶＩＩＩ）（Ａ）配列番号１９６を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１８６を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
（ＩＸ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド
を含む、Ｅ１１～Ｅ１５のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子の実施形態に関する。
Ｅ１７．Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子のうちのいずれ、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
Ｅ１８．それを必要とする被験者に、治療的有効量のＥ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又はＥ１７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、疾患の治療のための方法。
Ｅ１９．上記疾患は癌である、Ｅ１８に記載の方法。
Ｅ２０．上記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．上記疾患は病原体関連疾患である、Ｅ１８に記載の方法。
Ｅ２２．上記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ２３．疾患の治療において使用するための、Ｅ１～Ｅ１６のいずれか１つに記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又はＥ１６に記載の医薬組成物。
Ｅ２４．上記疾患は癌である、Ｅ２３に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
Ｅ２５．上記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、Ｅ２４に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
Ｅ２６．上記疾患は病原体関連疾患である、Ｅ２３に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
Ｅ２７．上記病原体関連抗原は、病原体関連抗原：単純ヘルペスウイルス感染細胞タンパク質（ＩＣＰ）４７、単純ヘルペスウイルスｇＤ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐１、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ａ、エプスタイン‐バーウイルスＬＭＰ‐２Ｂ、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ４１、ヒトパピローマウイルスＥ６、ヒトパピローマウイルスＥ７、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ６４、ヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ４６、及びヒトＴ細胞白血病ウイルスｇｐ２１からなる群から選択される、Ｅ２６に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
これまで本発明を概説してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、特段の記載がない限り、本発明を限定することを意図したものではない。
実施例１
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ３～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６の評価
２９個のＣＤＲ位置におけるＣＤ３ ｍＡｂ １ ｓｃＦｖ飽和突然変異体ライブラリを構築し、大腸菌において拡張した（ＸＬ‐１ Ｂｌｕｅ）。可溶性ｓｃＦｖの製造には複数ウェルフォーマットを使用した。ｓｃＦｖ含有上清を抗Ｈｉｓ表面上で捕捉し、Ａｔｔａｎａバイオセンサを用いて、組み換えＣＤ３（ε／γ鎖Ｆｏｓ／Ｊｕｎヘテロ二量体）への結合に関してスクリーニングして、ｖＣＤ３結合ドメインを同定した。
同定されたｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインを含む、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディ（ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴと呼ばれる；アミノ酸配列は上で提供されている）の変異型を生成した。このようにして、ｖＣＤ３結合ドメイン（このようなｖＣＤ３結合ドメインは、それぞれ「ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６」と呼ばれる）を含む、ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１～ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２６と呼ばれるＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディのパネルを生成した。ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１～ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２６のＣＤ３結合動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）で測定して、ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴと比較した。表１１は、ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１～ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２６のｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディのＣＤ３結合動態を、ｋaでランク付けしてまとめたものである（Ｒは、（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴに対する、（ｖＣＤ３結合ドメインを含む）変異型ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディのｋa、ｋd、又はｋD比である）。
（ｖＣＤ３結合ドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１～ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２６の、Ｔ細胞標的転換細胞殺滅を仲介する能力を、ＣＴＬアッセイで測定し、（ｒＣＤ３結合ドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴと比較した。簡潔に述べると、エフェクタＰａｎ‐Ｔ細胞及びＭＯＬＭ‐１３標的腫瘍細胞を、エフェクタ：標的細胞比５：１で用いて、ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディを１８及び４２時間にわたってインキュベートし、損傷した細胞による媒体中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を（例えば、ＬＤＨ放出を定量的に測定するＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を用いて）測定することによって、ＥＣ50を決定した。ＣＤ３ ｍＡｂ １のＣＤ３結合ドメインを有する４４２０×ＣＤ３フルオレセイン結合ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディを、陰性対照として採用した。更に、ＤＳＦを用いてＴｍを測定することにより、ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの安定性を評価した。ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１５；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１７；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１８；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１９；及びＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２０に関する代表的な細胞傷害性曲線を、図７Ａに示す。表１２は、ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１～ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２６の細胞傷害性（即ちＴ細胞標的転換殺滅活性）を、１８時間のＥＣ５０でランク付けしてまとめたものであり、（Ｒは、（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む）ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴに対する（ｖＣＤ３結合ドメインを含む）変異型ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの比を表す）；ΔＴｍは、ＷＴ（Ｔｍ＝６３℃）と比較したＴｍの変化を表す。動態パラメータと細胞溶解力との関係が、図７Ｂ～７Ｄにプロットされている（図７Ｂ：親和性と細胞溶解（１８時間ＥＣ50）、図７Ｃ：会合速度と細胞溶解（ＥＣ50）、図７Ｄ：解離速度と細胞溶解（ＥＣ50））。ＣＤ３ ｍＡｂ１（○）、Ｍ１８（■）、Ｍ２（黒の三角）、及びＭ１（黒の逆三角）変異型が示されている。
表１１～１２に示すように、ＤＡＲＴ‐Ａ～Ｍ１～ＤＡＲＴ‐Ａ～Ｍ２６変異型は、熱安定性を保持したまま、幅広い結合動態及びＣＴＬ活性を示した。このようなＤＡ×ＣＤ３結合分子、及びそれらのｖＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３結合、標的転換Ｔ細胞活性、及び／又はＴ細胞刺激活性の変調に有用である。
実施例２
代表的な変異型のＣＴＬ活性及びサイトカイン放出
ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ２；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ７；ＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１３；及びＤＡＲＴ‐Ａ‐Ｍ１５を、エフェクタ：標的細胞比５：１でのＰａｎ‐Ｔ細胞エフェクタ細胞及びＭＶ‐４‐１１白血病標的腫瘍細胞の存在下で２４時間インキュベートすることにより、変異型ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＬ又はＶＨドメインを含むＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディの代表的なセットの細胞殺滅（ＣＴＬ）活性及びサイトカイン放出プロファイルを評価した。損傷した細胞による媒体中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を（例えば、ＬＤＨ放出を定量的に測定するＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を用いて）測定することによって、パーセンテージ細胞傷害性（即ち細胞殺滅）及び／又はＥＣ50を決定した。これは図８Ａにプロットされている。ＣＴＬ中に上清に放出されるサイトカインを、（例えば酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ又はミリプレックスサイトカインアッセイを用いて）測定した。サイトカイン放出は、図８Ｂ～８Ｅにプロットされている（図８Ｂ：ＩＮＦ‐γ、図８Ｃ：ＴＮＦ‐α、図８Ｄ：ＩＬ‐６、及び図８Ｅ：ＩＬ‐２）。細胞傷害性及びサイトカイン放出に関するＥＣ50値を、表１３で提供する。ＣＤ３ ｍＡｂ １のＣＤ３結合ドメインを有する４４２０×ＣＤ３フルオレセイン結合ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディを、陰性対照（ＮｅｇＣｔｒｌ）として採用した。
これらの研究の結果は、親和性が変化しているｖＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が、ｒＣＤ３結合ドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、１つ以上のサイトカイン応答（最大応答及び／又はＥＣ50）の低減を呈することを示している。
実施例３
ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの生成
ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨドメインを有するダイアボディを、更なる特性決定、並びにＣＤ３ ｍＡｂ １、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１、及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２のＶＨドメインを有するダイアボディとの比較のために選択した。このようにして、癌抗原ＣＤ１２３、５Ｔ４、又はＣＤ１９に結合する疾患抗原（ＤＡ）結合ドメインを含む、表９のＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディを調製した。各鎖のアミノ酸配列は、本明細書中で詳細に提供されている（上述の第１～第１９の例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディを参照）。簡潔に述べると、ダイアボディはＣＨＯ細胞内で発現され（一時的又は安定的にトランスフェクトされ）、タンパク質Ａ親和性樹脂（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ）、及びそれに続いてＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによって精製された。
実施例４
ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、疾患抗原に結合する能力
このようなダイアボディの、ＭＯＬＭ‐１３白血病（ＣＤ１２３）又はＡ‐４９８腎臓癌（５Ｔ４）標的癌細胞上のそれぞれの疾患抗原（即ちＣＤ１２３又は５Ｔ４）に結合する能力を、ＦＡＣＳを用いて評価した。簡潔に述べると、細胞を、マイクロタイタープレート中で、（１０％ヒトＡＢ血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液中の）ダイアボディ分子を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、ダイアボディのＥコイル／Ｋコイル（ＥＫ）ヘテロ二量体促進ドメインを認識するビオチン結合マウス抗ＥＫコイル抗体と、ストレプトアビジン‐フィコエリトリンとを混合して用いてインキュベートした。このようなアッセイの代表的なデータを図９Ａ～９Ｂに示す。このデータは、これらの代表的なダイアボディがそれぞれの疾患抗原に結合できたことを示す。
実施例５
ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞に結合する能力
ＣＤ１２３結合ダイアボディ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８の、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞に結合する能力も、ＦＡＣＳを用いて評価した。ＣＤ３ ｍＡｂ １のＣＤ３結合ドメインを有する４４２０×ＣＤ３フルオレセイン結合ＤＡＲＴ‐Ａ型ダイアボディを、ＣＤ３結合に関する対照として採用した（「４４２０‐ＣＤ３」）。簡潔に述べると、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を、マイクロタイタープレート中で、（１０％ヒトＡＢ血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液中の）ダイアボディ分子を用いてインキュベートした。細胞を洗浄し、標識抗ヒトＦｃ二次抗体を用いてインキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。このようなアッセイの代表的なデータを図１０Ａ（ＣＤ８+Ｔ細胞への結合）及び図１０Ｂ（ＣＤ４+Ｔ細胞への結合）に示す。Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、ＣＤ３発現性のＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞に対する結合の低下を示した。
ＣＤ１２３結合ダイアボディ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ２及びＣＤ１２３‐Ｍ１８の、ヒトＣＤ３及びＣＤ１２３に結合する能力も、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いて評価した。簡潔に述べると、濃度６２．５～１０００ｎＭのダイアボディを、表面に対して不動化された可溶性ヒトＣＤ３に通した（正規化；１：１結合フィット）。弱いＣＤ３相互作用に関するパラメータの評価を可能とするために、高い分析物濃度（６２．５～１０００ｎＭ）を用いたが、分析物の高い濃度は、非特異的結合の寄与と関連付けられる場合がある。別の研究では、濃度６２．５～１００ｎＭのダイアボディを、Ｈｉｓタグを付与されて抗ＰｅｎｔａＨｉｓ表面に捕捉された可溶性ＣＤ３に通した（正規化；１：１結合フィット）。表１４は、これらの研究から算出されたｋa、ｋd及びＫＤを提示する。
５Ｔ４結合ダイアボディ：５Ｔ４‐ＷＴ、５Ｔ４‐Ｍ１、５Ｔ４‐Ｍ２、及び５Ｔ４‐Ｍ１８の、ＣＤ３に結合する能力も、上述のようにＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いて評価した。表１５Ａは、算出されたｋa、ｋd及びＫＤを提示する。
更なる研究では、ＣＤ１２３結合ダイアボディ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、及びＣＤ１２３‐Ｍ１９の、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に対する結合も、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を用いて評価した。簡潔に述べると、濃度６．２５～４００ｎＭのダイアボディを、不動化されたヒトＣＤ３又はカニクイザルＣＤ３に通した（１：１ラングミュア結合フィット）。表１５Ｂは、これらの研究から算出されたｋa、ｋd及びＫＤを提示する。
実施例６
例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、標的転換細胞殺滅を仲介する能力
例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディを、標的転換細胞殺滅を仲介する能力に関して評価した。特に示されていない限り、ＨＩＶ‐ＷＴ又はＨＩＶ‐Ｍ１８（上述）は癌抗原に結合しないため、ここでは陰性対照として使用される。ＨＩＶ‐ＷＴ及びＨＩＶ‐Ｍ１８ダイアボディは、細胞表面においてＡ３２抗体（ＨＩＶ ｅｎｖ）によって結合されるエピトープを発現する細胞（例えばＨＩＶ感染細胞）に結合し（例えば国際公開第２０１４／１５９９４０１号、及び国際公開第２０１６／０５４１０１号を参照）、このような細胞の標的転換細胞殺滅を仲介できることが理解されるだろう。
例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の代表的な研究の結果を、図１１Ａ～１１Ｑ、図１２Ａ～１２Ｅ、及び図２６Ａ～２６Ｅに示す。例示的な５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の代表的な研究の結果を図１３Ａ～１３Ｑに示す。例示的なＣＤ１９×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の代表的な研究の結果を図１４Ａ～１４Ｊに示す。これらのアッセイは基本的に、上で示されているエフェクタ及び標的細胞、エフェクタ：標的細胞比、並びに以下に記載のインキュベート時間を用いて、上述のように実施された（図１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、及び１４Ａも参照）。特に示されていない限り、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐２サイトカインの放出を、標準的な市販の試薬を用いたＣＴＬアッセイの終了時に決定した。
図１１Ａ～１１Ｑは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３急性単球性白血病（ＡＭＬ）標的細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１、２４時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究の結果を示す。細胞傷害性が図１１Ａにプロットされている。サイトカイン応答及び細胞傷害性が図１１Ｂ～１１Ｑにプロットされている（図１１Ｂ～１１Ｅ：ＩＦＮ‐γ；図１１Ｆ～１１Ｉ：ＴＮＦ‐α；図１１Ｊ～１１Ｍ：ＩＬ‐６；図１１Ｎ～１１Ｑ：ＩＬ‐２）。図１１Ｂ、１１Ｆ、１１Ｊ、及び１１Ｎ：ＣＤ１２３‐ＷＴ；図１１Ｃ、１１Ｇ、１１Ｋ、及び１１Ｏ：ＣＤ１２３‐Ｍ２；図１１Ｄ、１１Ｈ、１１Ｌ、及び１１Ｐ：ＣＤ１２３‐Ｍ１８；図１１Ｅ、１１Ｉ、１１Ｍ、及び１１Ｑ：ＨＩＶ‐ＷＴ（陰性対照）。同様の細胞傷害性を、別のＡＭＬ細胞株ＭＶ‐４‐１１に対して観察した。
図１１Ａは、異なるＣＤ３ ｍＡｂ １変異型を含むＣＤ１２３×ＣＤ３結合分子が、特にＥＣ50の比較によって測定される、細胞傷害性を仲介する著しく異なる能力を呈したものの、同等の最大細胞傷害性に到達したことを示す。更に、これらの分子は、サイトカイン応答を仲介する異なる能力を呈した。例えば図１１Ｂ～１１Ｑで確認されるように、ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、ＣＤ１２３‐ＷＴが呈するものと同等の最大細胞傷害性レベルを呈したが、ＣＤ１２３‐Ｍ１８による処置によって放出されるサイトカインＩＦＮ‐α、ＴＮＦ‐α、及びＩＬ‐６のレベルは、ＣＤ１２３‐ＷＴによる処置によって放出されるレベルのおよそ５０％であり、ＣＤ１２３‐Ｍ１８を用いて観察されるＩＬ‐２のレベルは、ＣＤ１２３‐ＷＴを用いて観察されるＩＬ‐２のレベルより大幅に低かった。よって、ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、ＣＤ１２３‐ＷＴより少ない副作用でＣＤ１２３‐ＷＴに匹敵する治療的価値を提供できることが分かった。
図１２Ａ～１２Ｅは、ＰＢＭＣエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３ ＡＭＬ標的細胞を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究の結果を示す。パーセント細胞傷害性が図１２Ａにプロットされている（Ｅ：Ｔ＝１５：１、２４時間）。（ミリプレックスサイトカインアッセイで測定された）サイトカイン応答が図１２Ｂ～１２Ｅにプロットされている（図１２Ｂ：ＩＦＮ‐γ；図１２Ｃ：ＴＮＦ‐α；図１２Ｄ：ＩＬ‐６；図１２Ｅ：ＩＬ‐２）。
ここでもまた、結果は、ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１８が同等のレベルの最大細胞傷害性を呈するものの、ＣＤ１２３‐Ｍ１８が著しく低下したサイトカイン応答を呈したことを実証している。更に、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、又はＩＬ‐６の放出に関するＣＤ１２３‐Ｍ１８のＥＣ50値は、ＣＤ１２３‐ＷＴのものより大幅に大きかった。これは、ＣＤ１２３‐Ｍ１８による処置が、ＣＤ１２３‐ＷＴによる処置に比べて大幅に少ないサイトカイン放出をもたらすことを示している。
図２６Ａ～２６Ｄ及び図２７Ａ～２７Ｄは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＭＯＬＭ‐１３急性単球性白血病（ＡＭＬ）標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１５：１、４８‐９６時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ構築物ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１９によって仲介される標的転換細胞殺滅の研究の結果を示す。放出された％ＬＤＨの関数としての細胞傷害性が、図２６Ａにプロットされている。以下に記載されるように、一部の研究では、比較要素としてＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴを含んでいた。図２６Ａ～２６Ｄは、４８時間にわたって実施された代表的な研究の結果を示す。図２６Ａでは、細胞傷害性が、％ＬＤＨ放出の関数としてプロットされている。サイトカイン応答及び細胞傷害性が図２６Ｂ～２６Ｅにプロットされている（図２６Ｂ：ＩＦＮ‐γ；図２６Ｃ：ＴＮＦ‐α；図２６Ｄ：ＩＬ‐６；図２６Ｅ：ＩＬ‐２）。図２７Ａ～２７Ｄは、ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴを含む、４８時間及び９６時間にわたって実施された４～７つの上述のような研究からの結果をまとめたものである。図２７Ａ～２７Ｃは、４つのこのような研究からの、４８時間及び９６時間における細胞傷害性（ＣＴＬ）活性の比較プロットを提供する（図２７Ａ：ＣＴＬ活性のＥＣ50値（単位：ｐＭ）；図２７Ｂ：ＣＤ１２３‐ＷＴのＥＣ50値の倍数としてのＣＴＬ活性；図２７Ｃ：ＣＤ１２３‐ＷＴの百分率としてのＣＴＬ活性Ｅmax）。図２７Ｄは、サイトカインＩＬ‐２に対するＣＴＬ活性に対して、治療指数をプロットしたものである。
図２６Ａは、異なるＣＤ３ ｍＡｂ １変異型を含むＣＤ１２３×ＣＤ３結合分子が、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８及びＣＤ１２３‐Ｍ１９によって、著しく異なる細胞傷害性曲線を呈したものの、同等の最大細胞傷害性に到達できたことを示す。上で確認したように、各変異型は比較的低いサイトカイン応答を仲介した。例えば図２６Ｂ～２６Ｄで確認されるように、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１９は、ＣＤ１２３‐ＷＴが呈するものと同等の最大細胞傷害性レベルを呈したが、放出されるサイトカインＩＦＮ‐α、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐２のレベルは、ＣＤ１２３‐ＷＴによる処置によって放出されるレベルより大幅に低かった。よって、ＣＤ３ ｍＡｂ １変異型Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、及びＭ１９を含む各ダイアボディ分子は、より少ない副作用で、野生型ＣＤ３ ｍＡｂ １を含むダイアボディ構築物に匹敵する治療的価値を提供できることが分かった。
図２７Ａ～２７Ｃに示されている結果は更に、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１９が、著しく異なる細胞傷害性ＥＣ50値を呈するものの、ＣＤ１２３‐ＷＴ、及びＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴに匹敵する最大ＣＴＬ活性に到達することを実証している。代表的なサイトカインとしてＩＬ‐２を使用した場合、治療指数（ＴＩ）は以下のように決定された：
ＴＩ＝Ｅmax（ＣＴＬ）：Ｅmax（サイトカイン）
ＣＤ１２３‐ＷＴに関する値に対して正規化された、算出されたＴＩ値は、図２７Ｄにプロットされており、これは更に、ＣＤ３ ｍＡｂ １変異型Ｍ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、及びＭ１９を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が、野生型ＣＤ３ ｍＡｂ １を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子を上回る、増大したＴＩを呈することを実証している。
図１３Ａ～１３Ｑは、Ｐａｎ‐Ｔエフェクタ細胞及びＡ４９８腎細胞癌標的細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１、２４時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物５Ｔ４‐ＷＴ、５Ｔ４‐Ｍ１、５T４‐Ｍ２、及び５Ｔ４‐Ｍ１８によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究の結果を示す。パーセント細胞傷害性が図１３Ａにプロットされている。サイトカイン応答及び細胞傷害性が図１３Ｂ～１３Ｑにプロットされている（図１３Ｂ～１３Ｅ：ＩＦＮ‐γ；図１３Ｆ～１３Ｉ：ＴＮＦ‐α；図１３Ｊ～１３Ｍ：ＩＬ‐６；図１３Ｎ～１３Ｑ：ＩＬ‐２）。図１３Ｂ、１３Ｆ、１３Ｊ、及び１３Ｎ：５Ｔ４‐ＷＴ；図１３Ｃ、１３Ｇ、１３Ｋ、及び１３Ｏ：５Ｔ４‐Ｍ２；図１３Ｄ、１３Ｈ、１３Ｌ、及び１３Ｐ：５Ｔ４‐Ｍ１８；図１３Ｅ、１３Ｉ、１３Ｍ、及び１３Ｑ：ＨＩＶ‐ＷＴ（陰性対照）。細胞傷害性は、ＪＩＭＴ‐１乳癌細胞に対しても観察された。これらの結果は、５Ｔ４‐ＷＴ及び５Ｔ４‐Ｍ１８が同等のレベルの最大細胞傷害性を呈するものの、著しく異なるサイトカイン応答を呈し、５Ｔ４‐Ｍ１８が５Ｔ４‐ＷＴに比べて大幅にレベルが低下したサイトカイン放出を呈することを実証している。
図１４Ａ～１４Ｊは、Ｐａｎ‐Ｔ又はＰＢＭＣエフェクタ細胞及びＲａｊｉリンパ芽球様標的細胞（ＰＢＭＣについてはＥ：Ｔ＝３０：１、Ｐａｎ‐Ｔ細胞についてはＥ：Ｔ＝１０：１、２４～４８時間）を用いた、（Ｆｃドメインを有する）ＣＤ１９×ＣＤ３ ＤＡＲＴ Ｂ型ダイアボディ構築物、ＣＤ１９‐ＷＴ、及びＣＤ１９．１‐Ｍ１８によって仲介される標的転換細胞殺滅の、代表的な研究の結果を示す。パーセント細胞傷害性（４８時間）が図１４Ａ（ＰＢＭＣ）及び図１４Ｆ（Ｐａｎ‐Ｔ細胞）にプロットされている。ＰＢＭＣを用いた４８時間時点におけるサイトカイン応答が、図１４Ｂ‐１４Ｅ（ＰＢＭＣ）及び図１４Ｇ‐１４Ｊ（Ｐａｎ Ｔ細胞）にプロットされている（図１４Ｂ及び１４Ｇ：ＩＦＮ‐γ；図１４Ｃ及び１４Ｈ：ＴＮＦ‐α；図１４Ｄ及び１４Ｉ：ＩＬ‐６；図１４Ｅ及び１４Ｊ：ＩＬ‐２；ＨＩＶ‐Ｍ１８（陰性対照））。ＣＤ１９．１‐Ｍ１８は、Ｄａｕｄｉ標的細胞に対して、同等の細胞傷害性及び低下したサイトカイン放出を呈した。これらの結果は、ＣＤ１９‐ＷＴ及びＣＤ１９．１‐Ｍ１８が同等のレベルの最大細胞傷害性を呈するものの、著しく異なるサイトカイン応答を呈し、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８がＣＤ１９‐ＷＴに比べて大幅にレベルが低下したサイトカイン放出を呈することを実証している。
上述の研究の結果は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８変異型を含む構成物が、Ｍ１及びＭ２変異型を含むものよりも高い細胞傷害（ＣＴＬ）活性を呈したことを裏付けるものである。このＣＴＬに関する研究はまた、Ｍ１８変異型を含む構成物が、ＷＴに比べて低く、かつ比較的活性が低いＭ２変異型が呈するものよりもごくわずかに高い、サイトカイン応答を呈したことを示している。よって、Ｍ１８変異型は、ＣＴＬ活性対サイトカイン放出に関して比較的大きなウィンドウを有すると思われる。
実施例７
例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの、Ｔ細胞活性化を仲介する能力
上記ダイアボディの、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞集団における、Ｔ細胞活性化のマーカーであるＣＤ２５及びＣＤ６９の発現に影響を及ぼす能力を評価することによって、Ｔ細胞活性化を仲介する能力を測定した。Ｔ細胞集団は、基本的に上述のように実施されたＣＴＬアッセイによって得られた。特に示されていない限り、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔリンパ球集団を、ＣＴＬアッセイの終了時に、フローサイトメトリーによって、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の上方制御に関して評価した。
ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ構築物に関する代表的なデータを、図１５Ａ～１５Ｅに示す。細胞傷害性が図１５Ａにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｂにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｃにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｄにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１５Ｅにプロットされている。
５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ構築物に関する代表的なデータを、図１６Ａ～１６Ｅに示す。細胞傷害性が図１６Ａにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｂにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ４+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｃにプロットされている。ＣＤ２５の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｄにプロットされている。ＣＤ６９の測定によって決定されたＣＤ８+Ｔ細胞の活性化が、図１６Ｅにプロットされている。
これらの研究の結果は、ＣＤ３‐Ｍ１８変異型を含む構成物が、Ｍ１及びＭ２変異型を含む構成物に比べて増強されたＴ細胞活性化活性を呈したことを示す。
実施例８
マウスモデルにおける例示的なＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの生体内活性
ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１８の生体内活性を、混合ＫＧ１Ａ細胞ＡＭＬモデル（Ｅ：Ｔ＝１：５）で評価した。簡潔に述べると、０日目に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（１群あたり６匹）に、活性化ヒトＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞と混合されたＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞を注射した。続いて、ビヒクル対照であるＣＤ１２３‐ＷＴ（５０μｇ／ｋｇ）、又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（５μｇ／ｋｇ若しくは５０μｇ／ｋｇ）を投与した。研究の経過全体を通して、腫瘍体積を監視した。
この研究の結果を、図１７Ａ（ＣＤ４+Ｔ細胞）及び図１７Ｂ（ＣＤ８+Ｔ細胞）で提供する。これらの結果は、Ｍ１８変異型を含む構成物が、ＷＴ ＣＤ３結合ドメインを含む構成物に匹敵する抗腫瘍活性を呈したことを示す。
０日目に５×１０6個のＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞をＭＨＣＩ-/-マウス（１群あたりメス５匹）に皮下（ＳＣ）注射した再構成腫瘍モデルを用いて、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの生体内活性を評価するための更なる研究を実施した。９日目、１×１０7個のＰＢＭＣ細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。ビヒクル対照であるＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ２、又はＣＤ１２３‐Ｍ１８（それぞれ０．５、５、５０、又は５００μｇ／ｋｇ）を、１５日目から開始して週２回（２ＱＷ）静脈内（ＩＶ）投与した。研究の経過全体を通して、腫瘍体積を監視した。
この研究の結果を図１８Ａ～１８Ｄで提供する。これらの結果は、ＣＤ１２３‐Ｍ２がこのモデルでは活性を全く呈さなかった（図１８Ｂ）ことを示す。対照的に、ＣＤ１２３‐Ｍ１８（図１８Ｃ）は、特に５０μｇ／ｋｇ及び５００μｇ／ｋｇの用量において、ＣＤ１２３‐ＷＴ（図１８Ａ）に匹敵する抗腫瘍活性を呈した（図１８Ｄ）。
０日目にＭＨＣＩ-/-マウス（１群あたりオス６匹）に５×１０6個のＭＶ４‐１１（白血病）細胞のＳＣ注射及び１×１０7個のＰＢＭＣ細胞の後眼窩（ＲＯ）注射を実施したＰＢＭＣ生着モデルを用いて、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの生体内活性を評価するための別の研究を実施した。ビヒクル対照であるＣＤ１２３‐ＷＴ（０．５、５、５０、若しくは５００μｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８又はＣＤ１２３‐Ｍ２（それぞれ５、５０、５００又は１０００μｇ／ｋｇ）を、１４日目から開始して週２回（２ＱＷ）静脈内（ＩＶ）投与した。研究の経過全体を通して、腫瘍体積を監視した。
この研究の結果を図１９Ａ～１９Ｄで提供する。これらの結果は、ＣＤ１２３‐ＷＴが０．５μｇ／ｋｇ以上において抗腫瘍活性を呈した（図１９Ａ）ことを示す。ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、５０μｇ／ｋｇ以上において抗腫瘍活性を呈した（図１９Ｂ）。対照的に、ＣＤ１２３‐Ｍ２は、１０００μｇ／ｋｇでしか抗腫瘍活性を呈さなかった（図１９Ｃ）。図１９Ｄに示すように、ＣＤ１２３‐Ｍ１８の抗腫瘍活性は、５００μｇ／ｋｇにおいてＣＤ１２３‐ＷＴに匹敵するが、ＣＤ１２３‐Ｍ２はこの濃度では抗腫瘍活性をほとんど又は全く呈さなかった。
０日目にＭＨＣＩ-/-マウス（１群あたりメス８匹）に５×１０6個のＳＫＯＶ３（卵巣癌）細胞のＳＣ注射及び１×１０7個のＰＢＭＣ細胞のＲＯ注射を実施したＰＢＭＣ生着モデルで、５Ｔ４×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディ５Ｔ４‐ＷＴ、５Ｔ４‐Ｍ１、及び５Ｔ４‐Ｍ１８の生体内活性を評価した。ビヒクル対照である５Ｔ４‐ＷＴ（１０、５０、１００、若しくは５００μｇ／ｋｇ）、５Ｔ４‐Ｍ１８（１０、５０、１００、若しくは５００μｇ／ｋｇ）、又は５Ｔ４‐Ｍ２（５００μｇ／ｋｇ）を、７日目から開始して週２回（２ＱＷ）静脈内（ＩＶ）投与した。研究の経過全体を通して、腫瘍体積を監視した。
この研究の結果を図２０Ａ～２０Ｂで提供する。これらの結果は、５Ｔ４‐ＷＴが、試験した全ての用量において強力な抗腫瘍活性を呈した（図２０Ａ）ことを示す。５Ｔ４‐Ｍ１８は、５００μｇ／ｋｇにおいて５Ｔ４‐ＷＴに匹敵する用量依存性の抗腫瘍活性を呈したが、５Ｔ４‐Ｍ２は５００μｇ／ｋｇにおいてはるかに低い活性を呈した（図２０Ｂ）。
ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディによって誘発される生体内サイトカイン放出プロファイルを、ＰＢＭＣ混合モデルにおいて検査した。簡潔に述べると、５×１０6個のＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞及び１×１０7個のＰＢＭＣ細胞を混合して一晩インキュベートし、翌日、この混合された細胞を、ＮＳＧマウス（１群あたりオス６匹）にＳＣ注射し、単回用量のビヒクル対照であるＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、又はＣＤ１２３‐Ｍ２（それぞれ５０又は５００μｇ／ｋｇ）を静脈内（ＩＶ）投与した。投与の６時間後に血清サイトカインレベルを評価した。サイトカイン放出プロファイルが図２０Ａ～２０Ｄにプロットされている（図２１Ａ：ＩＦＮ‐γ；図２１Ｂ：ＴＮＦ‐α；図２１Ｃ：ＩＬ‐６；及び図２１Ｄ：ＩＬ‐２）。これらの研究の結果は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８の変異型ＶＬ及びＶＨドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子による処置が、低いレベルのサイトカイン放出を示すことを示す。
ＰＢＭＣ再構成済みの（０日目に８×１０6個のＰＢＭＣを後眼窩注射された）ＮＳＧ／ＭＨＣＩ-/-マウス（１群あたり７～８匹のマウス）に７日目に５×１０6個のＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞を皮下（ＳＣ）注射した再構成腫瘍モデルを用いて、ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディの生体内活性を評価するための２つの更なる研究を実施した。一方の研究では、ＣＤ１２３‐ＷＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１３（０．００５、０．０５、０．５、及び１ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクルを、２８日目から開始して週２回（２ＱＷ）静脈内（ＩＶ）投与した。もう一方の研究では、ＣＤ１２３‐ＷＴ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１８及びＣＤ１２３‐Ｍ１７（０．００５、０．０５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクルを、２８日目から開始して週２回（２ＱＷ）静脈内（ＩＶ）投与した。研究の経過全体を通して、腫瘍体積を監視した。
この研究の結果を図２８Ａ～２８Ｂ（ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１３を用いた処置）並びに図２９Ａ～２９Ｂ（ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１７を用いた処置）で提供する。これらの結果は、ＣＤ１２３‐Ｍ１８の抗腫瘍活性が、０．５ｍｇ／ｋｇ以上の用量においてＣＤ１２３‐ＷＴと同等である（図２８Ａ及び２９Ａ）こと、並びにＣＤ１２３‐Ｍ１３及びＣＤ１２３‐Ｍ１７が、わずか０．０５ｍｇ／ｋｇというＣＤ１２３‐Ｍ１８の１０倍低い用量において、ＣＤ１２３‐ＷＴと同等の抗腫瘍活性を呈した（図２８Ｂ及び２９Ｂ）ことを示す。
ＣＤ１２３×ＣＤ３ ＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８によって誘発される生体内サイトカイン放出プロファイルを、ＰＢＭＣ混合モデルにおいて検査した。簡潔に述べると、５×１０６個のＫＧ１Ａ（ＡＭＬ）細胞及び１×１０７個のＰＢＭＣ細胞を混合して一晩インキュベートし、翌日、この混合された細胞を、ＮＳＧマウス（１群あたり７～８匹）にＳＣ注射し、単回用量のＣＤ１２３‐ＷＴ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＤ１２３‐Ｍ１３、ＣＤ１２３‐Ｍ１７、並びにＣＤ１２３‐Ｍ１８（０．０５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）、又はビヒクルを静脈内（ＩＶ）投与した。投与の６時間後に血清サイトカインレベルを評価した。ある研究では、動物をＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１３で処置し、別個の研究では、動物をＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１７で処置した。ＩＬ‐２サイトカイン放出プロファイルが図３０Ａ～３０Ｂにプロットされており（図３０Ａ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８及びＣＤ１２３‐Ｍ１３；図３０Ｂ：ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及びＣＤ１２３‐Ｍ１７）、これは、変異型ＣＤ３ ｍＡｂ １ ＶＬ及びＶＨドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子を用いた処置が、野生型ＶＬ及びＶＨドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて低いレベルのサイトカイン放出をもたらすことを示す。
これらの動物の研究の結果は、ＣＤ３ ｍＡｂ １の変異型ＶＬ及びＶＨドメイン、特にＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３、ＣＤ３ ｍＡｂ Ｍ１７、及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８の変異型ＶＬ及びＶＨドメイン（即ちｖＣＤ３結合ドメイン）を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子の投与が、ＣＤ３ ｍＡｂ １のＶＬ及びＶＨドメイン（即ちｒＣＤ３結合ドメイン）を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子に比べて、サイトカイン放出のレベルの低下をもたらすことを示している。特に、これらの研究の結果は、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３、ＣＤ３ ｍＡｂ Ｍ１７、及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８の変異型ＶＬ及びＶＨドメインを含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が、生体内での抗腫瘍活性を保持したまま、低いレベルのサイトカイン放出を呈することを実証している。
実施例９
３価型分子の生成
ＣＤ３ ｍＡｂ １、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ２、又はＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８のＶＨ及びＶＬドメインを用いて、癌抗原ＣＤ１２３に結合する疾患抗原（ＤＡ）結合ドメイン、及びエフェクタ細胞抗原ＣＤ８に結合する結合ドメインを含む、３価型分子（「ＤＡ×ＣＤ３×ＣＤ８ ３価型分子」）を生成した。表１０は、ＣＤ３結合ドメイン、及び各ポリペプチド鎖の配列番号をまとめたものである。各鎖のアミノ酸配列は、本明細書中で詳細に提供されている（上述の第１～第４の例示的な３価型分子を参照）。
実施例１０
ＤＡ×ＣＤ３×ＣＤ８ ３価型分子の特性決定
Ｔ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８の、ＭＯＬＭ‐１３細胞上で発現されるＣＤ１２３に結合する能力を、基本的に上述のようにして評価した。更に、これらの分子の、ＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞に結合する能力を、基本的に上述のようにして評価した。これらの研究は、比較のためにＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐ＷＴを含んでいる。これらの研究の代表的なデータを、図２２Ａ（ＭＯＬＭ‐１３細胞への結合）、図２２Ｂ（ＣＤ４+Ｔ細胞細胞への結合）、及び図２２Ｃ（ＣＤ８+Ｔ細胞細胞への結合）で提供する。試験した分子は全て、ＣＤ１２３発現性のＭＯＬＭ‐１３細胞、及びＣＤ８発現性のＣＤ８+Ｔ細胞への同等の結合を呈する。Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、ＣＤ３発現性のＣＤ４+Ｔ細胞に対して、ＭＦＩ（幾何平均）で測定される大幅に低減された結合を呈する。ＣＤ８+Ｔ細胞への結合は、この３価型分子中に存在するＣＤ３結合ドメイン及びＣＤ８結合ドメインの両方によって仲介される。
Ｔ‐ＣＤ１２３‐ＷＴ、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１、Ｔ‐ＣＤ１２３‐Ｍ２、及びＴ‐ＣＤ１２３‐Ｍ１８の、標的転換細胞殺滅を仲介する能力を評価した。簡潔に述べると、Ｐａｎ‐Ｔ細胞又は精製されたＣＤ４+若しくはＣＤ８+Ｔ細胞エフェクタ細胞、及びＭＯＬＭ‐１３標的腫瘍細胞の、エフェクタ：標的細胞比１：１での存在下で、３価型分子を４８時間にわたってインキュベートした。損傷した細胞による媒体中への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を（例えば、ＬＤＨ放出を定量的に測定するＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）等を用いて）測定することによって、細胞傷害性を決定した。サイトカイン応答を、Ｐａｎ‐Ｔ細胞試料で検査した。これらの研究は、比較のためにＤＡＲＴ‐Ｂ型ダイアボディＣＤ１２３‐ＷＴを含む。パーセント細胞傷害性が図２３Ａ～２３Ｃにプロットされている（図２３Ａ：Ｐａｎ‐Ｔ細胞；図２３Ｂ：ＣＤ４+Ｔ細胞；及び図２３Ｃ：ＣＤ８+Ｔ細胞）。サイトカイン応答が図２３Ｄ～２３Ｇにプロットされている（図２３Ｄ：ＩＦＮ‐γ；図２３Ｅ：ＴＮＦ‐α；図２３Ｆ：ＩＬ‐６；図２３Ｇ：ＩＬ‐２）。
実施例１１
毒性学研究
代表的なＣＤ１２３×ＣＤ３結合分子の安全性及びサイトカイン放出プロファイルを、カニクイザルでの投薬研究で評価した。この研究では、反復点滴静注で投与した場合の、（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１８を含む）ＣＤ１２３‐Ｍ１８、及び（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む）ＣＤ１２３‐ＷＴの潜在的な毒性及びサイトカイン放出プロファイルを評価した。細胞殺滅活性は、このモデルでは容易に評価されない。この研究の設計を表１６に示す。
ＣＤ１２３‐Ｍ１８処置群（１０及び２０ｍｇ／ｋｇ）において、死亡率、体重減少、又は他の有害な観察結果は観察されなかった。更に、これらの群では、血液学又は臨床化学の有意な変化は観察されなかった。対照的に、ＣＤ１２３‐ＷＴ分子（０．００３ｍｇ／ｋｇ）は十分な忍容性を有していなかった。この群では、サイトカイン放出症候群及び死亡率（１／３）が観察された。血清サイトカインレベル（０～９日目）が図２４Ａ～２４Ｅにプロットされている（図２４Ａ：ＩＦＮ‐γ、図２４Ｂ：ＴＮＦ‐α、図２４Ｃ：ＩＬ‐６、図２４Ｄ：ＩＬ‐２、及び図２４Ｅ：ＩＬ‐１５）。更に、増殖細胞のマーカーとしてＫｉ６７の発現を用いたＦＡＣＳによって、Ｔ細胞増殖を検査した。Ｋｉ６７に関して陽性のＣＤ４+又はＣＤ８+細胞の百分率（０～１４日目）として、図２４ＦはＣＤ４+Ｔ細胞の増殖をプロットしており、図２４ＧはＣＤ８+Ｔ細胞をプロットしている。図２４Ｈ～２４Ｉは、処置群の動物に関して有意だったいくつかの血液学及び臨床化学マーカーのプロットを提示する（図２４Ｈ：血小板数；図２４Ｉ：Ｃ反応性タンパク質；図２４Ｊ：尿素窒素）。この研究の結果は、ｖＣＤ３結合ドメインＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子がカニクイザルにおいて十分な忍容性を有し、また、計画された治療レベルを超える用量においてさえ、ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、及びＩＬ‐６の放出の最小限かつ一時的な増大しか呈さず、また複数の臨床化学マーカーにおいて比較的小さな変化しか呈さないことを示す。更に、ｖＣＤ３結合ドメインＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１８を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子は、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激することが観察された。
１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで投薬される（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１３を含む）ＣＤ１２３‐Ｍ１３、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで投薬される（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１７を含む）ＣＤ１２３‐Ｍ１７、並びに１０ｍｇ／ｋｇで投薬される（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１９を含む）ＣＤ１２３‐Ｍ１９を用いて、更なる毒性学的研究を実施した。これらの研究では、ＣＤ１２３‐Ｍ１３が、特に１０ｍｇ／ｋｇの群において、ＣＤ１２３‐Ｍ１７又はＣＤ１２３‐Ｍ１９よりも高いサイトカイン放出を呈することが観察された。この研究では、特にＣＤ１２３‐Ｍ１３の高用量群において多少の死亡が観察され、一時的な血液学的変化及び臨床化学的変化が観察された。表１７は、ＣＤ１２３‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐Ｍ１９を用いたこの研究及び過去の毒性学的研究から観察された死亡の概要を提供する。
表１７に示すように、わずか３μｇ／ｋｇ（０．００３ｍｇ／ｋｇ）の（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む）ＣＤ１２３‐Ｍ１３で処置された動物において死亡が観察されたが、ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、及びＭ１９を含むＣＤ１２３×ＣＤ３結合分子は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含むＣＤ１２３‐Ｍ１３に比べて、はるかに高い用量において忍容性を有し、低下したサイトカイン放出プロファイルを呈する。これらの研究からの忍容用量ランキングは、ＣＤ１２３‐Ｍ１８≧ＣＤ１２３‐Ｍ１９＞ＣＤ１２３‐Ｍ１７＞ＣＤ１２３‐Ｍ１３＞ＣＤ１２３‐ＷＴである。これらの発見は、上で提供された治療指数の評価と一致する。
実施例１２
例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３分子の、ＡＭＬブラスト欠乏を仲介する能力
例示的なＣＤ１２３×ＣＤ３ダイアボディを、ＡＭＬ患者からの末梢血試料からのＡＭＬ芽細胞欠乏を仲介する能力について評価した。簡潔に述べると、ＡＭＬ患者からの末梢血細胞を、増大する濃度のＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐ＷＴ、ＣＤ１２３‐Ｍ１、及びＣＤ１２３‐Ｍ１８の存在下で、補充培地中でインキュベートした。細胞充実性（ＣＤ３４+芽細胞、ＣＤ３+細胞、及びＣＤ８+Ｔ細胞）を、０日目及び６日目にフローサイトメトリーで分析し、未処置対照の百分率として、又はベースラインの増加倍率としてプロットする。インキュベーションの４日目に回収された上清において、サイトカインビーズアレイ（ＢＤ）によってサイトカインレベルを分析した。この研究の結果を図２５Ａ～２５Ｇに提示する。図２５Ａに示すように、ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、ＤＡＲＴ‐Ａ‐ＷＴ及びＣＤ１２３‐ＷＴと同程度まで、ＡＭＬ芽細胞の欠乏を仲介できた。しかしながら、ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、Ｔ細胞集団（図２５Ｂ：ＣＤ４+Ｔ細胞；図２５Ｃ：ＣＤ８+Ｔ細胞）の増殖の大幅な低下を呈した。更に、ＣＤ１２３‐Ｍ１８は、大幅に低いレベルのサイトカイン放出（図２５Ｄ：ＩＦＮ‐γ；図２５Ｅ：ＴＮＦ‐α；図２５Ｆ：ＩＬ‐６；及び図２５Ｇ：ＩＬ‐２）を呈した。
これらの結果は、ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１８を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が、強度がわずかに低下した最大殺滅能力を保持していたものの、標的によって誘発された生体外及び生体内におけるサイトカイン放出は同じ程度に低下したことを実証している。このようなｖＣＤ３結合ドメインをＤＡ×ＣＤ３結合分子に組み込むことにより、標的転換Ｔ細胞殺滅用途における治療指数を拡張できる。
実施例１３
例示的なＣＤ１９×ＣＤ３分子の、自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力
ある研究のセットにおいて、例示的なＣＤ１９×ＣＤ３ダイアボディＣＤ１９‐ＷＴ（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む陽性対照）、及び（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１８を含む）ＣＤ１９．１‐Ｍ１８を、生体外及び生体内において自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力について評価した。生体外研究に関しては、ヒト及びカニクイザルからのＰＭＢＣを利用した。簡潔に述べると、ヒト又はカニクイザルから単離したＰＭＢＣを、増大する濃度のＣＤ１９‐ＷＴ（陽性対照）若しくはＣＤ１９．１‐Ｍ１８、又は陰性対照ＨＩＶ‐Ｍ１８の存在下で、補充培地中でインキュベートした。インキュベーションの４８時間後に、（ＣＤ２０をＢ細胞マーカーとして使用した）フローサイトメトリーによって、Ｂ細胞レベルを分析した。ヒト試料からの上清中のサイトカインレベルを、サイトカインビーズアレイ（ＢＤ）によって分析した。この研究の結果を図３１Ａ～３１Ｆに提示する。図３１Ａ～３１Ｂに示すように、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８は、ＣＤ１９‐ＷＴと同程度まで、ヒト及びカニクイザル両方のＰＭＢＣから自己Ｂ細胞を欠乏させることができた。更に、ＣＤ１９．１‐Ｍ１８は、大幅に低いレベルのサイトカイン放出（図３１Ｃ：ＩＦＮ‐γ；図３１Ｄ：ＴＮＦ‐α；図３１Ｅ：ＩＬ‐６；及び図３１Ｆ：ＩＬ‐２）を呈した。
陽性対照であるＣＤ１９‐ＷＴ及び（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１８を含む）ＣＤ１９．１‐Ｍ１８の、生体内で自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力を、カニクイザルの投薬研究で評価した。この研究の設計を表１８に示す。
０日目に、２時間の点滴静注１回によってＣＤ１９×ＣＤ３ダイアボディを投与した。末梢血試料を、投薬前に、及び投与後に周期的に採取した。末梢血試料中のＢ細胞レベルを、（ＣＤ２０をＢ細胞マーカーとして使用した）フローサイトメトリーで分析した。群１～３で処置された２頭のサルのうちの１頭からの代表的なデータを図３２Ａ～３２Ｄに示す（図３２Ａ：投薬前の０日目；図３２Ｂ：１日目；図３２Ｃ：８日目；図３２Ｄ：１５日目；Ｂ細胞集団は楕円で示されている）。更に、投与前、７日目、及び１５日目に収集された鼠径リンパ節を、（ＣＤ２０をＢ細胞マーカーとして使用して）Ｂ細胞について染色した。群１、３、及び４で処置された２頭のサルのうちの１頭からの投与前及び７日目の試料からの代表的な免疫組織化学画像を、図３３Ａ～３３Ｃに示す（図３３Ａ：群１；図３３Ｂ：群３；図３３Ｃ：群４；左側が投与前、右側が７日目；染色されたＢ細胞は暗色に見える）。この生体内研究の結果は、末梢血中のＢ細胞の欠乏が１日以内に効率的に発生したこと、及びこの欠乏が、例示的なＣＤ１９×ＣＤ３ダイアボディＣＤ１９．１‐Ｍ１８の単回用量の投与後、最大１５日間持続した（図３２Ａ～３２Ｄを参照）ことを示している。同様に、リンパ節におけるＢ細胞の欠乏は７日（投与後に検査した最初の時点）以内に効率的に発生し、これは、わずか１ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤ１９．１‐Ｍ１８が、生体内でのＴ細胞標的転換殺滅によって、ＣＤ１９‐ＷＴ陽性対照と同程度まで、自己Ｂ細胞欠乏を仲介できることを実証している。
更なるＣＤ１９×ＣＤ３結合分子の、自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力を、カニクイザルで評価した。この研究では、ＣＤ１９‐ＷＴ（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む陽性対照）；（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１３を含む）ＣＤ１９．１‐Ｍ１３；及び（ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメインＭ１７を含む）ＣＤ１９．１‐Ｍ１７の活性を、反復点滴静注で投与した場合に自己Ｂ細胞欠乏を仲介する能力に関して、評価した。この研究の設計を表１９に示す。
死亡率、体重減少、又は他の有意な有害な観察結果は観察されず、投薬後、群３の１頭の動物において１日目に、及び群２の１頭の動物において８日目に、肢の冷えが観察されたが、これらはいずれも翌日までに回復した。（投薬前に、及び投薬後周期的に採取した）末梢血試料中のＢ細胞レベルを、（ＣＤ２０をＢ細胞マーカーとして使用した）フローサイトメトリーで分析した。更に、組織試料（脾臓、骨髄、及びリンパ節（ＬＮ））を、ＣＤ２０染色の免疫組織化学によって評価した。群１～３からのフローサイトメトリーデータが図３４に示されており、各動物（及び未処置の陰性対照動物）からの組織染色データが表２０にまとめられている。研究の全経過にわたって（投薬前に、及び投薬後周期的に）、血清サイトカインレベルを評価した。各処置群に関するＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐１５の血清レベルが、それぞれ図３５Ａ～３５Ｅにプロットされている。更に、末梢血中のＴ細胞集団を、Ｋｉ６７の発現を細胞の増殖のマーカーとして用いたＦＡＣＳによって検査した。（投薬前に、及び投薬後周期的に得られた）Ｋｉ６７に関して陽性のＣＤ４+又はＣＤ８+細胞の百分率として、図３６ＡはＣＤ４+Ｔ細胞の増殖をプロットしており、図３６ＢはＣＤ８+Ｔ細胞の膨張をプロットしている。
この研究の結果は、ｖＣＤ３結合ドメインＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３又はＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７を含むＣＤ１９×ＣＤ３結合分子が活性であり、１ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９．１‐Ｍ１３で処置された動物が、ＣＤ１９‐ＷＴ陽性対照と同程度の自己Ｂ細胞欠乏を呈したことを示す。１ｍｇ／ｋｇのＣＤ１９．１‐Ｍ１７で処置された動物も自己Ｂ細胞欠乏を呈したがその程度は陽性対照よりわずかに低かった。ＣＤ１９．１‐Ｍ１７は、より高い投薬量と同等の欠乏を達成すると予測される。これらの変異型は、ＩＮＦ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、及びＩＬ‐６の放出のはるかに小さな増加、並びにＩＬ‐１５の放出のわずかな減少を仲介した。更に、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３及びＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１７を含む結合分子は、Ｔ細胞の増殖を刺激することが観察され、ＣＤ３ ｍＡｂ １ Ｍ１３を含む分子がより高いレベルの増殖を呈した。更にこれらの分子はいずれも、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖の優先的な刺激を呈した。
上述の実施例で提供された研究を合わせると、ＣＤ３ ｍＡｂ １のｖＣＤ３結合ドメイン（例えばＭ１３、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９）を含むＤＡ×ＣＤ３結合分子が、多様な結合親和性、多様な細胞傷害性ＥＣ50値を呈するものの、これら全てが、ＣＤ３ ｍＡｂ １のｒＣＤ３結合ドメインを含む分子に匹敵する最大ＣＴＬ活性に到達し、従って増大した治療指数を呈することが示される。これらの研究は更に、このような分子が、Ｔ細胞標的転換細胞殺滅の仲介、並びにＴ細胞の活性化及び生体内増殖を刺激することにおいて、忍容性が高くかつ活性であることを示す。
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。

Claims (23)

  1. ＣＤ３のエピトープに結合できるＣＤ３結合ドメインと、疾患抗原のエピトープに結合できる疾患抗原結合ドメインとを含む、疾患抗原×ＣＤ３（ＤＡ×ＣＤ３）結合分子であって、
    前記疾患抗原は、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＲＦ、ＥｐｈＡ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ、５Ｔ４、ＩＬ１３Ｒα２、又はＣＤ１９であり、
    前記ＣＤ３結合ドメインは：
    （Ｉ）（Ａ）配列番号９９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、及び配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
    （Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
    （Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
    （Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
    （Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
    （Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
    （ＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
    （Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
    （Ｃ）配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、及び配列番号１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
    （Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
    （Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
    （Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン；又は
    （ＩＩＩ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
    （Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
    （Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
    （Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
    （Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
    （Ｆ）配列番号１０９及び配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン：又は
    （ＩＶ）（Ａ）配列番号５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
    （Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
    （Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
    （Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
    （Ｅ）配列番号１１３及び配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；並びに
    （Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン
    を含む、ＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  2. 前記ＣＤ３結合ドメインは：
    （Ａ）配列番号９９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、及び配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ H １ドメイン；
    （Ｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ H ２ドメイン；
    （Ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ H ３ドメイン；
    （Ｄ）配列番号６０のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ L １ドメイン；
    （Ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ L ２ドメイン；並びに
    （Ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ L ３ドメイン；
    を含む、請求項１に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  3. 前記ＣＤ３結合ドメインは：
    （Ｉ）（Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （Ｂ）配列番号９８、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、及び配列番号１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は
    （ＩＩ）（Ａ）配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （Ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン
    を含む、請求項１に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  4. 前記ＣＤ３結合ドメインは：
    （Ａ）配列番号５６のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；
    を含む、請求項３に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  5. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性ＴａｎｄＡｂ、又は３価結合分子である、請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  6. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、２つ以上の疾患抗原、及び／又はエフェクタ細胞の異なる細胞表面分子に結合できる、請求項１～５のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  7. 前記疾患抗原は、５Ｔ４又はＣＤ１９である、請求項１～６のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  8. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、互いに対して共有結合する第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み：
    （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
    （ｉ）ドメイン１であって：
    （１）疾患抗原の前記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬDA）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
    （２）ＣＤ３の前記エピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
    を含み、前記サブドメイン１Ａ及び前記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
    （ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２
    を含み；
    （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
    （ｉ）ドメイン１であって：
    （１）ＣＤ３の前記エピトープに結合できる前記モノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
    （２）疾患抗原の前記エピトープに結合できる前記モノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨDA）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
    を含み、前記サブドメイン１Ａ及び前記サブドメイン１Ｂは、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
    （ｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインである、ドメイン２であって、前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖との前記ヘテロ二量体促進ドメインは異なる、ドメイン２
    を含み、
    前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメインと、前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインとは、会合して前記疾患抗原結合ドメインを形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨドメインと、前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬドメインとは、会合して前記ＣＤ３結合ドメインを形成する、請求項１～７のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  9. （ａ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであるか；又は
    （ｂ）前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインはＫコイルドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインはＥコイルドメインである、
    請求項８に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  10. 前記第１のポリペプチド鎖又は前記第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むドメイン３を更に含む、請求項８又は９に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  11. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は、免疫グロブリンＦｃドメインのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第３のポリペプチド鎖を更に含む、請求項１０に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  12. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子はＣＤ８結合ドメインを更に含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  13. 前記ＤＡ×ＣＤ３結合分子は：
    （Ｉ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；及び
    （Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
    （ＩＩ）（Ａ）配列番号１９７を含む第１のポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１９２を含む第２のポリペプチド；及び
    （Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
    （ＩＩＩ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；及び
    （Ｃ）配列番号１７６を含む第３のポリペプチド；又は
    （ＩＶ）（Ａ）配列番号１８４を含む第１のポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１８１を含む第２のポリペプチド；
    （Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
    （Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド；又は
    （Ｖ）（Ａ）配列番号１９３を含む第１のポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１９４を含む第２のポリペプチド；
    （Ｃ）配列番号１８７を含む第３のポリペプチド；及び
    （Ｄ）配列番号１８８を含む第４のポリペプチド
    を含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  14. 前記疾患抗原は：
    （Ｉ）（Ａ）（ｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；（ｉｖ）配列番号１２８のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｖ）配列番号１３０のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；（ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；（ｉｖ）配列番号１２９のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３４のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＩＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３８のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３９のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＩＶ）（Ａ）（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１４４のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１４３のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （Ｖ）（Ａ）配列番号１４６のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１４７のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＶＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号１５１のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１５３のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＶＩＩ）（Ａ）配列番号１５４のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１５５のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＶＩＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    （ＩＸ）（Ａ）配列番号１６０のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１６１のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は
    （Ｘ）（Ａ）配列番号１６４のアミノ酸配列のＣＤＲ H １ドメイン、ＣＤＲ H ２ドメイン、及びＣＤＲ H ３ドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１６６のアミノ酸配列のＣＤＲ L １ドメイン、ＣＤＲ L ２ドメイン、及びＣＤＲ L ３ドメイン；
    を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  15. 前記疾患抗原は：
    （Ｉ）（Ａ）（ｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；（ｉｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；（ｉｖ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｖ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；（ｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；（ｉｉｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；（ｉｖ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｖ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＩＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＩＶ）（Ａ）（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１４４のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；（ｉｉ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （Ｖ）（Ａ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＶＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；（ｉｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；（ｉｉ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉｉ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＶＩＩ）（Ａ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＶＩＩＩ）（Ａ）（ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    （ＩＸ）（Ａ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は
    （Ｘ）（Ａ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む、ＶＨドメイン；及び
    （Ｂ）（ｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；又は（ｉｉ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む、ＶＬドメイン；
    を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子。
  16. 有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、疾患の治療のための医薬組成物。
  17. 前記疾患は癌である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は請求項１６に記載の医薬組成物を含む、疾患の治療のための薬剤。
  19. 前記疾患は癌である、請求項１８に記載の薬剤。
  20. 前記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項１９に記載の薬剤。
  21. 疾患の治療において使用するための、請求項１～１５のいずれか１項に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は請求項１６に記載の医薬組成物。
  22. 前記疾患は癌である、請求項２１に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
  23. 前記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠芽腫、腎臓癌、非小細胞肺癌、血液癌、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、精巣癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項２２に記載のＤＡ×ＣＤ３結合分子又は医薬組成物。
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