JP2023514167A - Ｃｄ１３７結合分子及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＣＤ１３７のエピトープに対して特異的な１つ以上のエピトープ結合部位を有する結合分子を対象とし、これは抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子を含む。本発明は更に、ＣＤ１３７のエピトープに対して特異的な１つ以上のエピトープ結合部位と、腫瘍抗原（「ＴＡ」）のエピトープに対して特異的な１つ以上のエピトープ結合部位とを含む、多重特異性結合分子（例えば「ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子」）を対象とする。一実施形態では、このようなＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は二重特異性分子となり、特に、ＣＤ１３７のエピトープに対してそれぞれ特異的な２つのエピトープ結合部位と、ＴＡのエピトープに対してそれぞれ特異的な２つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性４価ダイアボディとなる。あるいは、このようなＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、ＣＤ１３７のエピトープに対してそれぞれ特異的な２つのエピトープ結合部位と、ＴＡのエピトープに対してそれぞれ特異的な１つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性分子となる。本発明はまた、新規の結合分子、並びにその誘導体及びその使用を提供する。本発明は、このようなＣＤ１３７分子を含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療における、このような分子の使用方法を対象とする。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／９８０，０００号（２０２０年２月２１日出願；係属中）、米国特許出願第６３／１０４，６８５号（２０２０年１０月２３日出願；係属中）、及び米国特許出願第６３／１４７，５６５号（２０２１年２月９日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された、参照によりその全体が本出願に援用される配列表を含む。２０２１年２月１２日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＭＡＣ‐０１１１‐ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２２４，０６１バイトであり、このファイルは参照によりその全体が本出願に援用される。
本技術は、ＣＤ１３７のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、ＣＤ１３７結合分子を対象とする。本技術は更に、ＣＤ１３７のエピトープと、第２の抗原、特に腫瘍抗原（「ＴＡ」）のエピトープとの両方に結合できる、多重特異性ＣＤ１３７結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、３価結合分子等）（例えば「ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子」）を対象とする。本技術はまた、ＰＤ‐Ｌ１のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、新規のＰＤ‐Ｌ１結合分子、並びにその誘導体、並びにこれらの使用を提供する。本技術はまた、上記分子を含む医薬組成物を対象とする。本技術はまた、疾患、特に癌、又は抑制された免疫系の存在に関連する若しくはこれを特徴とする疾患若しくは状態の治療における、上記分子の使用を含む。
ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ及び「ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９」（「ＴＮＦＲＳＦ９」）としても公知）は、ＣＤ２８依存性及び非依存性Ｔ細胞共刺激を仲介する、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの共刺激性受容体メンバーである（非特許文献１、２）。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、及び免疫系の他の細胞によって誘導的に発現される。ＣＤ１３７の、そのリガンドＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢＬ；ＴＮＦＳＦ９）、又はアゴニスト抗体によるライゲーションは、細胞増殖、サイトカイン分泌の増大、及び活性化によって誘導される細胞死の防止といった、様々なＴ細胞応答を引き起こす。よって、ＣＤ１３７を刺激する抗体は、Ｔ細胞の生存及び増殖を誘導することにより、抗腫瘍免疫応答を強化できる。このような認識により、ＣＤ１３７に対して免疫特異的な抗体を用いて免疫系を活性化することで、癌に対する療法を提供できるという提案が生まれた（非特許文献３、４）。抗ＣＤ１３７抗体であるウトミルマブ及びウレルマブについて記述されているが、これらの臨床開発は、有効性の低さ（ウトミルマブ）又は重度の肝毒性（ウレルマブ）によって妨げられてきた。
Vinay, D.S. and Kwon, B.S. (1998) "Role of 4-1BB in immune responses," Semin Immunol. 10:481-489 Croft, M. (2009) "The Role Of TNF Superfamily Members In T-Cell Function And Diseases," Nat. Rev. Immunol. 9:271-285 Li, S.Y. et al. (2013) "Immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137," Clin. Pharmacol. 5:47-53 Bartkowiak, T. et al. (2015) "4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity," Frontiers Oncol. 5:117
架橋の不在下で高い活性を示す抗体に関連する毒性を回避しながら癌細胞を攻撃するように、身体の免疫系をより強力に刺激して指向させることができる、改良された組成物が提供される。というのは、適応免疫系は癌及び疾患に対する強力な防御メカニズムとなり得るものの、ＣＤ１３７の共刺激活性の低下／欠如によって仲介される腫瘍微小環境の免疫抑制／回避メカニズムによって、妨害されることが多いためである。更に、腫瘍環境内の腫瘍細胞、免疫細胞、及び間質細胞が発現する共阻害分子は、癌細胞に対するＴ細胞応答を支配的に弱化させ得る。
ＣＤ１３７結合分子、特にＣＤ１３７のエピトープと腫瘍抗原のエピトープとの両方に結合できるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子が提供される。このような二重特異性分子は、腫瘍細胞の表面上で発現される腫瘍抗原に結合でき、またＣＤ１３７発現性免疫細胞をこのような腫瘍細胞に共局在化できる。このような共局在化は、免疫細胞を上方制御して、免疫系の活性化又は継続的な活性化を促進する（例えば腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する）。これらの属性により、上記二重特異性分子は、免疫系の刺激、及び特に癌の治療において有用性を有することができる。本技術はこれらの目標及び他の目標を対象とする。
よって、特定の態様において提供されるのは、ＣＤ１３７のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、ＣＤ１３７結合分子である。本発明は更に、ＣＤ１３７のエピトープと、第２の抗原、特に腫瘍抗原（「ＴＡ」）のエピトープとの両方に結合できる、多重特異性ＣＤ１３７結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、３価結合分子等）（例えば「ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子」）を対象とする。本発明はまた、ＰＤ‐Ｌ１のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、新規のＰＤ‐Ｌ１結合分子、並びにその誘導体、並びにこれらの使用を提供する。本発明はまた、上記分子を含む医薬組成物を対象とする。本発明はまた、疾患、特に癌、又は抑制された免疫系の存在に関連する若しくはこれを特徴とする疾患若しくは状態の治療における、上記分子の使用を含む。
本発明は、特に多重特異性分子に組み込まれた場合に所望の特性を示す、新規のＣＤ１３７結合分子を提供する。本発明はまた、互いに会合することによって、ＣＤ１３７のエピトープに対してそれぞれ特異的な２つの結合部位と、ＴＡのエピトープに対してそれぞれ特異的な２つの結合部位とを形成するポリペプチド鎖で構成された、多重特異性ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を対象とする。本発明のこのようなＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、「二重特異性４価」と呼ばれる。本発明はまた、互いに会合することによって、ＣＤ１３７のエピトープに対してそれぞれ特異的な２つの結合部位と、ＴＡのエピトープに対して特異的な１つの結合部位とを形成するポリペプチド鎖で構成された、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を対象とする。本発明のこのようなＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、「二重特異性３価」と呼ばれる。本発明の結合分子（例えばＣＤ１３７結合分子）は場合によっては、第１の結合部位を含み、上記第１の結合部位が結合する抗原とは異なる抗原に免疫特異的に結合する第２の結合部位を含まない。従って、本発明の結合分子は場合によっては、第１の結合部位、並びに第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインのみを含み、上記第１の結合部位とは異なる抗原に結合する第２の結合部位、第２の軽鎖可変ドメイン又は第２の重鎖可変ドメインを含まず、このような結合分子の非限定的な例としては、ｓｃＦｖ、抗体及びＦａｂ結合分子が挙げられる。
本発明は、４つのポリペプチド鎖（「第１の」、「第２の」、「第３の」、及び「第４の」ポリペプチド鎖）を含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を提供し、ここで上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖とは互いに共有結合し、上記第３のポリペプチド鎖と上記第４のポリペプチド鎖とは互いに共有結合し、上記第１のポリペプチド鎖と上記第３のポリペプチド鎖とは互いに共有結合する。また、５つのポリペプチド鎖（「第１の」、「第２の」、「第３の」、「第４の」、及び「第５の」ポリペプチド鎖）を含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子が提供され、ここで上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖とは互いに共有結合し、上記第３のポリペプチド鎖と上記第４のポリペプチド鎖とは互いに共有結合し、上記第３のポリペプチド鎖と上記第５のポリペプチド鎖とは互いに共有結合し、上記第１のポリペプチド鎖と上記第３のポリペプチド鎖とは互いに共有結合する。
詳細には、本発明は、ＣＤ１３７のエピトープに免疫特異的に結合する第１の結合部位を含む、ＣＤ１３７結合分子を提供し、ここで上記第１の結合部位は、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第１の重鎖可変ドメインとを含み；
（Ａ）上記第１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第１の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）の重鎖ＣＤＲである。
本発明は更に、上記第１の重鎖可変ドメインが、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第１の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬｘ（配列番号５４）；
（Ｂ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）；
（Ｂ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５）；又は
（Ｃ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）
のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に：
（Ａ）上記第１の重鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第１の軽鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が、ＴＡに免疫特異的に結合する第２の結合部位を含む二重特異性分子であり、また上記第２の結合部位が、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第２の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第２の重鎖可変ドメインとを含む、上記ＣＤ１３７結合分子の上述の全ての実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡが表１～２に提示された腫瘍抗原から選択される、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり、また：
（Ａ）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５９）の重鎖ＣＤＲである、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に：
（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
（４）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
（５）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（６）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）；
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
（Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
（Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
（Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
（Ｆ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）；又は
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）
のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡが５Ｔ４であり：
（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）の軽鎖ＣＤＲであり；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（Ｂ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＬ（配列番号９５）の軽鎖ＣＤＲであり；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＨ（配列番号９６）の重鎖ＣＤＲである、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の重鎖可変ドメインが５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の軽鎖可変ドメインが５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡがＨＥＲ２であり：
（Ａ）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）の重鎖ＣＤＲである、上記ＣＤ１３７結合分子に関する。
本発明は更に：
（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）の軽鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
（３）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）の重鎖ＣＤＲである、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）；
（Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）；
（Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）；又は
（Ｄ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）
のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記第２の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）；
（Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）；
（Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）；又は
（Ｄ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）
のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が、抗体、二重特異性４価Ｆｃ担持ダイアボディ、又は二重特異性３価分子である、上記ＣＤ１３７結合分子の上述の全ての実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が二重特異性かつ４価であり、第１、第２、第３、第４、及び任意に第５のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖が共有結合複合体を形成する、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が二重特異性かつ３価であり、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖が共有結合複合体を形成する、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域を含み、また任意に上記分子がヒンジドメインを更に含む、全ての上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、変異型Ｆｃ領域であって、上記変異型Ｆｃ領域のＦｃγＲに対する親和性を低減する及び／又は血清半減期を延長する１つ以上のアミノ酸修飾を含む、変異型Ｆｃ領域であり、より詳細には、上記修飾が：
（Ａ）Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；
（Ｂ）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｄ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｅ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又は
（Ｆ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ；
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである、全ての上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖及び上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖及び上記第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７；
（Ｂ）配列番号１１８及び配列番号１１９；
（Ｃ）配列番号１２０及び配列番号１１９；
（Ｄ）配列番号１１８及び配列番号１２１；
（Ｅ）配列番号１２０及び配列番号１２１；
（Ｆ）配列番号１２０及び配列番号１２２；
（Ｇ）配列番号１２０及び配列番号１２３；
（Ｈ）配列番号１２０及び配列番号１２４；
（Ｉ）配列番号１２０及び配列番号１２５；
（Ｊ）配列番号１２０及び配列番号１２６；又は
（Ｋ）配列番号１２０及び配列番号１３９
を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が配列番号１２７、配列番号１３３、又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が配列番号１２８、配列番号１３４、又は配列番号１３６のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が配列番号１２９、又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含み；
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が配列番号１３０、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が：
（Ａ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３０；
（Ｂ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３１、及び配列番号１３２；
（Ｃ）配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３１、及び配列番号１３２；又は
（Ｄ）配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３１、及び配列番号１３２．
を含む、上記ＣＤ１３７結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上述のＣＤ１３７結合分子のうちのいずれかと、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物に関する。
本発明は更に、ＴＡの発現を特徴とする癌の治療における、上記ＣＤ１３７結合分子又は上記医薬組成物の使用に関する。
本発明は更に、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む重鎖可変ドメインとを含み：
（Ａ）上記軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
（４）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（５）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、ＰＤ‐Ｌ１結合分子に関する。
本発明は更に、上記重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
（Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
（Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
（Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
のアミノ酸配列を含む、上記ＰＤ‐Ｌ１結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記軽鎖可変ドメインがｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む、上記ＰＤ‐Ｌ１結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上記分子が抗体又はその抗原結合断片である、上記ＰＤ‐Ｌ１結合分子の実施形態に関する。
本発明は更に、上述のＰＤ‐Ｌ１結合分子のうちのいずれかと、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物に関する。
本発明は更に、抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、上記ＰＤ‐Ｌ１結合分子又は上記医薬組成物の使用に関する。
本発明は更に、抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする上記状態が癌である、上記使用に関する。
本発明は更に、上記癌が：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、全ての上記使用の実施形態に関する。
本発明は更に、腫瘍標的化剤の活性を増強する方法であって、上記腫瘍標的化剤を、上述のＣＤ１３７結合分子のうちのいずれか、上述のＰＤ‐Ｌ１結合分子のうちのいずれか、又は上述の医薬組成物のうちのいずれかと組み合わせて投与するステップを含む、方法に関する。
本発明は更に、抑制された免疫系に関連する又はＴＡの発現を特徴とする疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、上述のＣＤ１３７結合分子のうちのいずれか、上述のＰＤ‐Ｌ１結合分子のうちのいずれか、又は上述の医薬組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む、方法に関する。
本発明は更に、腫瘍標的化剤を投与するステップを更に含む、上記方法に関する。
本発明は更に、抑制された免疫系に関連する又は腫瘍ＴＡの発現を特徴とする上記状態が癌である、上記方法に関する。
本発明は更に、上記腫瘍標的化剤が、抗体、抗体のエピトープ結合断片、又は標的細胞のＴ細胞標的転換殺滅を仲介する作用剤である、上記方法の上述の全ての実施形態に関する。
本発明は更に、上記癌が：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、上記方法の実施形態に関する。
本発明は更に、上述の実施形態のうちのいずれかのＣＤ１３７結合分子、又は上述の実施形態のうちのいずれかのＰＤ‐Ｌ１結合分子をコードする、核酸に関する。
本発明は更に、上記核酸を含む発現ベクターに関する。
本発明は更に、上述の実施形態のうちのいずれかによる核酸、又は上述の実施形態のうちのいずれかの発現ベクターを含む、細胞に関する。
本発明は更に、上記細胞が哺乳類細胞である、上記細胞に関する。
図１Ａ～１Ｄは、Ｆｃ領域を含む代表的な共有結合ダイアボディを示す概略図を提供する。図１Ａ～１Ｄは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）で構成された４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な４価ダイアボディの概略図を示す。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、会合した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図１Ａ～１Ｂに示すように）ＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図１Ｃに示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図１Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃダイアボディを示す。図１Ｂは、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）で構成された、Ｆｃダイアボディを示す。この図、及び結合分子のドメインの概略図を提供する全ての図面における波状の線（ＷＷＷ）は、存在する１つ以上の任意のヘテロ二量体促進ドメインを表す。図示されているように、システイン残基は、リンカー内（メインの図）及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン内（囲みの中）に存在してよい。各ペアのうちの１つのポリペプチド鎖は、会合した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、システインを含むリンカー（このリンカーはヒンジ領域の全体又は一部分を含んでよい）と、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとを有する。図１Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図１Ｄは、３つのポリペプチド鎖で構成された２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図を示す。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、会合した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ここではシステイン残基を含むものとして示されているヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。 図２は、５つのポリペプチド鎖で構成された４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合型結合分子の概略図を提供する。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、会合した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、システインを含むリンカー（このリンカーはヒンジ領域の全体又は一部分を含んでよい）と、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとを有する。連結されたＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、リンカーと、ヘテロ二量体促進ドメインとを更に含む（図１Ｂにおいて更に説明されている）。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。ＴＡに対して特異的な２つの非ダイアボディ型結合ドメインと、ＣＤ１３７に対して特異的な２つのダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を得るために、上記可変ドメインを選択できる。あるいは、ＣＤ１３７に対して特異的な２つの非ダイアボディ型結合ドメインと、ＴＡに対して特異的な２つのダイアボディ型結合ドメインとを有する、結果的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を得るために、上記可変ドメインを選択できる。このような分子は二重特異性であり、ＣＤ１３７に対する２つの結合部位（これらは同一の又は異なるＣＤ１３７エピトープに結合してよい）と、ＴＡに対する２つの結合部位（これらは同一の又は異なるＴＡエピトープに結合してよい）とを有する。 図３Ａ～３Ｃは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図を提供する。図３Ａは、リンカー／ヘテロ二量体促進ドメインを介して共有結合した２つのダイアボディ型結合ドメイン（図１Ｂにおいて更に説明されている）と、結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端であるＦａｂ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを、概略図で示す。図３Ａの分子は４つの鎖を含む。図３Ｂ～３Ｃはそれぞれ、２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメインとを含む、又はｓｃＦｖ型結合ドメインを含む、３価結合分子のドメインの概略図を示す。図３Ｂ～３Ｃの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。 図４は、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、比較対象分子ＴＲＩＤＥＮＴ‐２、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の、改変ＣＨＯ細胞の表面上で発現されたＣＤ１３７に結合する能力を示す。 図５Ａ～５Ｂは、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の、改変ＣＨＯ細胞の表面上で発現されたＰＤ‐Ｌ１に結合する能力（図５Ａ）、及びＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイにおいてＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１相互作用を遮断する能力（図５Ｂ）を示す。 図６は、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、比較対象分子：ＤＡＲＴ‐２、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐２、ＤＡＲＴ‐３、ｒ‐ウレルマブ、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐１及びｈＩｇＧ１の、ＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて標的依存性シグナル伝達を仲介する能力を示す。 図７Ａ～７Ｂは、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、比較対象分子：ＤＡＲＴ‐２、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐２、ＤＡＲＴ‐３、ｒ‐ウレルマブ、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐１及びｈＩｇＧ１の、初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイにおいてサイトカインＩＮＦ‐γ（図７Ａ）及びＩＬ‐２（図７Ｂ）の標的依存性放出を仲介する能力を示す。 図８Ａ～８Ｃは、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの血清レベル、及びＣＤ１３７×ＴＡ結合分子ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａによる免疫細胞増殖の誘導を示す。１ｍｇ／ｋｇ（黒丸）又は１０ｍｇ／ｋｇ（白丸）のＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａで処理されたカニクイザルにおける、２０～２４日目の薬物動態（血清クリアランス）（図８Ａ）、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖（図８Ａ）、ＮＫ細胞増殖（図８Ａ）がプロットされている。 図９Ａ～９Ｂは、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）の脱免疫化／最適化多様体を含むＦａｂの結合活性を示す。Ｆａｂ多様体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｂ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｄ、及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ（図９Ａ）、並びにｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ａ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｃ、及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｅ（図９Ｂ）のＥＬＩＳＡ結合曲線がプロットされている。 図１０Ａ～１０Ｂは、脱免疫化又は最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、改変ＣＨＯ細胞の細胞表面上で発現されたＰＤ‐Ｌ１に結合する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ１、ＤＡＲＴ‐Ａ４、及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）（図１０Ａ）、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、及び陰性対照ｈＩｇＧ１（図１０Ｂ）の結合曲線がプロットされている。 図１１Ａ～１１Ｃは、脱免疫化及び／又は最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイにおいてＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１相互作用を遮断する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ１、ＤＡＲＴ‐Ａ４、及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）（図１１Ａ）、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、及び陰性対照ｈＩｇＧ１（図１１Ｂ）、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ８、ＤＡＲＴ‐Ａ９、及び陰性対照ｈＩｇＧ１（図１１Ｃ）の活性曲線がプロットされている。 図１２Ａ～１２Ｂは、脱免疫化ＣＤ１３７結合ドメイン及び／又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、改変ＣＨＯ細胞の表面上で発現されたＣＤ１３７に結合する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６（図１２Ａ）、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６（図１２Ｂ）の結合曲線がプロットされている。またどちらの図でも、比較対象ｒ‐ウレルマブ及び陰性対照ｈＩｇＧ１がプロットされている。 図１３Ａ～１３Ｂは、脱免疫化ＣＤ１３７結合ドメイン及び／又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＰＤ‐Ｌ１の発現が少ないＮ８７標的細胞（図１３Ａ）、又はＰＤ‐Ｌ１の発現が中程度であるＪＩＭＴ‐１標的細胞（図１３Ｂ）を用いて実施されたＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて標的依存性シグナル伝達を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、比較対象ｒ‐ウレルマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の活性がプロットされている。 図１４Ａ～１４Ｂは、脱免疫化ＣＤ１３７結合ドメイン及び脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイにおいてサイトカインＩＮＦ‐γ（図１４Ａ）及びＩＬ‐２（図１４Ｂ）の標的依存性放出を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、比較対象ｒ‐ウレルマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の活性がプロットされている。 図１５Ａ～１５Ｂは、親又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ１３７結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、改変ＣＨＯ細胞の細胞表面上で発現されたＰＤ‐Ｌ１（図１５Ａ）及びＣＤ１３７（図１５Ｂ）に結合する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）、及びｒ‐アテゾリズマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１（図１５Ａ）、ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、ｒ‐ウレルマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１（図１５Ｂ）の結合曲線がプロットされている。 図１６Ａ～１６Ｂは、親又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ１３７結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイにおいてＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１相互作用を遮断する能力を示す。４価分子ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０に関する結果が図１６Ａにプロットされており、３価分子ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６に関する結果が図１６Ｂにプロットされている。またどちらの図でも、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ及びｒ‐アテゾリズマブ、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１がプロットされている。 図１７Ａ～１７Ｂは、親又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ１３７結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＰＤ‐Ｌ１の発現が中程度であるＪＩＭＴ‐１標的細胞の存在下（図１７Ａ）又は標的細胞の不在下（図１７Ｂ）で実施されたＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて標的依存性シグナル伝達を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、比較対象ｒ‐ウレルマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の活性がプロットされている。 図１８Ａ～１８Ｂは、親又は脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＣＤ１３７結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、サイトカインＩＮＦ‐γ（図１８Ａ）及びＩＬ‐２（図１８Ｂ）の標的依存性放出を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ｒ‐アテゾリズマブとｒ‐ウレルマブとの組み合わせ（ｒ‐ａｔｅｚｏ＋ｒ‐ｕｒｅ ｃｏｍｂｏ）、及び陰性対照ｈＩｇＧ１の活性がプロットされている。 図１９Ａ～１９Ｃは、代表的なＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子（５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディ）と組み合わされた、いくつかの代表的なＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子：ＤＡＲＴ‐Ａ（図１９Ａ）、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ（図１９Ｂ）、又はＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４（図１９Ｃ）の、マウスＰＢＭＣ再構成異種移植モデルにおいて、腫瘍成長又はＲＫＯ結腸癌細胞の発病をインビボで予防又は阻害する能力を、ＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子のみ又はビヒクル対照と比較して示す。 図２０Ａ～２０Ｂは、代表的なＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子（５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディ）と組み合わされた、いくつかの代表的なＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子：ＤＡＲＴ‐Ａ６（図２０Ａ）、又はＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６（図２０Ｂ）の、マウスＰＢＭＣ再構成異種移植モデルにおいて、腫瘍成長又はＲＫＯ結腸癌細胞の発病をインビボで予防又は阻害する能力を、ＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子のみ又はビヒクル対照と比較して示す。 図２１Ａ～２１Ｂは、代表的なＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子（５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディ）と組み合わされた、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６結合ドメインのＶＨ／ＶＬを含むいくつかの代表的なＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子：ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、又は異なるＣＤ１３７結合ドメインのＶＨ／ＶＬを含む比較対象分子：ＴＲＩＤＥＮＴ‐２、ＤＵＯ‐１の、マウスＰＢＭＣ再構成異種移植モデルにおいて、腫瘍成長又はＲＫＯ結腸癌細胞の発病をインビボで予防又は阻害する能力を、ビヒクル対照と比較して示す。第１の研究からの代表的なデータが図２１Ａにプロットされており、第２の研究からの代表的なデータが図２１Ｂにプロットされている。 図２２Ａ～２２Ｂは、ＣＤ１３７結合ドメイン及びＨＥＲ２結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＨＥＲ２の発現が中程度であるＪＩＭＴ‐１細胞（図２２Ａ）又はＨＥＲ２の発現が多いＮ８７標的細胞（図２２Ｂ）を用いて実施されたＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて標的依存性シグナル伝達を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ｂ１、ＤＡＲＴ‐Ｂ２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２、親ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）抗体、並びに陰性対照ＤＡＲＴ‐４、ＤＡＲＴ‐５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐３、ＴＲＩＤＥＮＴ‐４の活性がプロットされている。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＣＤ１３７結合ドメイン及びＨＥＲ２結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、ＨＥＲ２の発現が中程度であるＪＩＭＴ‐１細胞（図２２Ａ及び２３Ｃ）又はＨＥＲ２の発現が多いＮ８７標的細胞（図２２Ｂ及び２３Ｄ）を用いて実施された初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイにおいてサイトカインＩＮＦ‐γ（図２３Ａ及び２３Ｂ）並びにＩＬ‐２（図２３Ｃ及び２３Ｄ）の標的依存性放出を仲介する能力を示す。ＤＡＲＴ‐Ｂ１、ＤＡＲＴ‐Ｂ２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２、親ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）抗体、並びに陰性対照ＤＡＲＴ‐４、ＤＡＲＴ‐５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐３、ＴＲＩＤＥＮＴ‐４の活性がプロットされている。
本発明は、ＣＤ１３７のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、ＣＤ１３７結合分子を対象とする。本発明は更に、ＣＤ１３７のエピトープと、第２の抗原、特に腫瘍抗原（「ＴＡ」）のエピトープとの両方に結合できる、多重特異性ＣＤ１３７結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、３価結合分子等）（例えば「ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子」）を対象とする。本発明はまた、ＰＤ‐Ｌ１のエピトープに結合できる、単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、新規のＰＤ‐Ｌ１結合分子、並びにその誘導体、並びにこれらの使用を提供する。本発明はまた、上記分子を含む医薬組成物を対象とする。本発明はまた、疾患、特に癌、又は抑制された免疫系の存在に関連する若しくはこれを特徴とする疾患若しくは状態の治療における、上記分子の使用を含む。
Ｉ．抗体及び他の結合分子
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、抗体であってよく、又は（例えば抗体ポリペプチドの断片化、切断等によって、若しくは抗体分子のアミノ酸配列の、若しくはこのようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（若しくはその配列）の使用等によって）抗体から誘導可能であってよい。
Ａ． 抗体
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、免疫グロブリン分子であって、該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの「エピトープ結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等（「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」）の分子の（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」）に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ及びａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリンの免疫学的活性を有する断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質若しくは非タンパク質分子に対して、上記分子上の特定のドメイン又は部分又は立体配座（「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」）の存在によって、「免疫特異的に結合（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」できる。本明細書中で使用される場合、「抗体のエピトープ結合断片（ｅｐｉｔｏｐｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、エピトープに免疫特異的に結合できる抗体の一部分を指すことが意図されている。本明細書中で使用される場合、上記用語は、ダイアボディの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2Ｆｖ等）及び単鎖（ｓｃＦｖ）、並びにエピトープ結合ドメインを包含する。本明細書中で使用される場合、抗体又はそのエピトープ結合断片は、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に、別のエピトープに対してよりも頻繁に、迅速に、長期間、及び／又は高い親和性又は結合活性で反応又は会合する場合に、該エピトープに「免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」結合すると表現される。この定義を読むと、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体又はそのエピトープ結合断片は、第２の標的に特異的又は優先的に結合するものであっても、そうでなくてもよいことも理解される。エピトープ含有分子は、免疫原性活性を有することによって、動物の体内での抗体産生応答を誘発でき、このような分子は「抗原」と呼ばれる。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ちこれらは「単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」である）が、天然抗体は、該種の複数の複製に結合できる（即ち「２価性（ｂｉｖａｌｅｎｃｙ）」又は「多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）」を示す）。
用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、並びに必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495‐497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、以下で詳述するように、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体のヒト化の一般的な原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、該抗体の非ヒト残部をヒト化抗体配列に交換するステップを伴う。
この数十年、抗体の治療能力に対する関心が再燃しており、抗体は、バイオテクノロジー由来薬物の主要な分類の１つとなっている。２００を超える抗体ベースの薬物について、その使用が承認されているか、又は開発中である。
Ｉ．抗体の一般的な構造的属性
自然発生した免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２つの長い「重鎖」と複合体化した２つの短い「軽鎖」で構成された四量体であり、通常約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として表される。各鎖は、「可変ドメイン」を含むアミノ末端（「Ｎ末端」）部分と、少なくとも１つの「定常ドメイン」を含むカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分とで構成される。ＩｇＧ軽鎖は、単一の「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬ」）と、単一の「軽鎖定常ドメイン」（「ＣＬ」）とで構成される。よって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造は、ｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ重鎖は、単一の「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨ」）、３つの「重鎖定常ドメイン」（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）で構成される。よって、ＩｇＧ重鎖の構造は、ｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。インタクトな修飾されていない抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、可変ドメインの存在及びその配列に左右される。
ａ）定常ドメイン
（１）軽鎖定常ドメイン
代表的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメインである。代表的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
あるいは、代表的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ ＣＬλドメインである。代表的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
（２）重鎖ＣＨ１ドメイン
代表的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。代表的なヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
別の代表的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインである。代表的なヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
別の代表的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインである。代表的なヒトＩｇＧ３ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
別の代表的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインである。代表的なヒトＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
（３）重鎖ヒンジ領域
代表的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。代表的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７）：
EPKSCDKTHT CPPCP
である。
別の代表的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。代表的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号８）：
ERKCCVECPP CP
である。
別の代表的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ３ヒンジ領域である。代表的なヒトＩｇＧ３ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号９）：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK
SCDTPPPCPR CP
である。
別の代表的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。代表的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１０）：
ESKYGPPCPS CP
である。
本明細書中で記載されるように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与した場合）Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。ある代表的な安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号１１）：
ESKYGPPCPP CP
である。
（４）重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、相互作用してＩｇＧ抗体の「Ｆｃ領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）」を形成し、これは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに受容されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域の一部分（Ｆｃ領域全体を包含する一部分を含む）を、本明細書では「Ｆｃドメイン」と呼ぶ。Ｆｃ領域は、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに対してよりも、あるＩｇＧアイソタイプに対して最も相同性が高い場合に、この特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであると表現される。診断における既知の用法に加えて、抗体は治療剤としても有用であることが示されている。
代表的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
代表的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
代表的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
代表的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１５）：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5thEd. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Kabat」）、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックス（ＥＵ ｉｎｄｅｘ ａｓ ｉｎ Ｋａｂａｔ）」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付与を指す。
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43‐78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けた、本発明の分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む分子である。
ｂ）可変ドメイン
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触することになる抗体のアミノ酸残基を含有する３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」）、及びフレームワーク領域（「ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）」）と呼ばれる介在性非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワーク領域は、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲループの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基もエピトープに接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。ＣＤＲのアミノ酸配列は、ある抗体がある特定のエピトープに結合できるかどうかを決定する。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特に、それぞれ別個のポリペプチド上に存在するこれらのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位を形成する。
免疫グロブリンの成熟した重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内でのアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔ（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)）は、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を同定し、残基番号を各アミノ酸に割り当てており、またＣＤＲ及びＦＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるように同定される（Chothia, C. & Lesk, A. M.(1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901‐917）によって定義されるＣＤＲH１は、残基５個分前から始まることが理解されるだろう）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、その大要に含まれていない抗体に対して、保存されたアミノ酸を参照して上記抗体をＫａｂａｔのコンセンサス配列のうちの１つと整列させることにより、拡張可能である。残基番号を割り当てるこの方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ変異型又はヒト化変異型を含む異なる抗体の同一の位置のアミノ酸が容易に同定される。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同一位置を占める。従って、ＶＬ及びＶＨドメイン内における、これらのＣＤＲが始まる及び終わる位置は、明確に定義され、ＶＬ及びＶＨドメインの配列の検査によって確認できる（例えばMartin, C.R. (2010) “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” In: Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann, R. and Dubel, S. (eds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Chapter 3 (pages 33-51)を参照）。
抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って、本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合断片（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、分子の、あるエピトープに免疫特異的に結合できる断片を指す。エピトープ結合断片は、抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４若しくは５個を含有してよく、又は抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。しかしながら典型的には、エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片等）を含んでよい。特段の記載がない限り、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端へ（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｏ Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ）」の方向である。
エピトープ結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでよい。エピトープ結合部位は野生型であってよく、又は１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されていてよい。
ｃ）抗体のヒト化
本発明は特に、ヒト化抗体のＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む（抗体及びダイアボディを含む）結合分子を包含する。用語「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのＦＲが隣接する３つのＣＤＲを内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
非ヒト免疫グロブリン由来のエピトープ結合部位を含む多数のヒト化抗体分子が記述されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連するＣＤＲとを有するキメラ抗体を含む（例えばLobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされる、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；及び米国特許第５，９９７，８６７号によって開示されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
２．ＣＤ１３７結合ドメイン
本発明は、ＣＤ１３７のエピトープに結合できる単一特異性抗体及びそのエピトープ結合断片を含む分子といった、ＣＤ１３７結合分子を対象とする。新規のヒトモノクローナル抗体のＣＤ１３７結合ドメイン「ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６」を以下に提供する。本発明は具体的には、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／若しくはＶＨドメインのＣＤＲdのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７結合分子、及びＣＤ１３７×ＴＡ結合分子等の多重特異性ＣＤ１３７結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、３価結合分子等）、あるいは以下に提供されるその多様体のうちのいずれかを含み、また包含する。
ａ）ヒトＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６は、新規のヒトモノクローナル抗体である。ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＶＨドメイン（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１）のアミノ酸配列（配列番号４６）は（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQP PGKGLEWIGR
IYTSGSTNYN PSLKSRVTMS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDGW
YDEDYNYYGM DVWGQGTTVT VSS
である。
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１のＣＤＲHのアミノ酸配列は：
ＣＤＲH１（配列番号４７）：SYYWS
ＣＤＲH２（配列番号４８）：RIYTSGSTNYNPSLKS
ＣＤＲH３（配列番号４９）：DGWYDEDYNYYGMDV
である。
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＶＬドメイン（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１）のアミノ酸配列は、（配列番号５０）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIK
である。
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１のＣＤＲLのアミノ酸配列は：
ＣＤＲL１（配列番号５１）：RASQSVSSNYLS
ＣＤＲL２（配列番号５２）：GASTRAT
ＣＤＲL３（配列番号５３）：QQDYDLPWT
である。
ｂ）脱免疫化ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６
以下の例で説明されるように、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＶＬドメインを脱免疫化することにより、配列番号５４のアミノ酸配列（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVMTQSPAT LSLX1PGERAT LSCRASQSVS SNYLSWX2QQX3 PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIK
（ここで、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3は独立して選択され、Ｘ1はＳ又はＴであり；Ｘ2はＦ又はＹであり；Ｘ3はＩ又はＫである）を有する、「ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬｘ」と命名されるＶＬドメインを得た。
特定の実施形態では、
Ｘ1はＳであり；Ｘ2はＹであり；Ｘ3はＫであるか；又は
Ｘ1はＳであり；Ｘ2はＦであり；Ｘ3はＫである。
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２、及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３と命名されたＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬドメインの多様体のアミノ酸配列を以下に提示する。これらの変異型ＶＬドメインのうちのいずれを、ＶＨドメインとペアにすることができる。ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを含む分子は、その特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照して呼称され、例えば結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３を含む分子は、具体的に「ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）」と呼ばれる。
多様体ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２のアミノ酸配列は、（配列番号５５）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIK
である。
多様体ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３のアミノ酸配列は、（配列番号５６）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIK
である。
上で提示されているＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬドメインの１つ以上の一般配列に包含されるいずれのものを含む、上述の完全ヒト及び／又は変異型ＶＨ及びＶＬ ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ドメインのＣＤＲ、ＶＬドメイン、及び／又はＶＨドメインを用いて、ＣＤ１３７に結合できる抗体、ダイアボディ又は結合分子を形成できる。特定の実施形態では、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を含む本発明のＣＤ１３７結合分子は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３を含む。
Ｂ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ、及び３価分子
上述のように、天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できないが、その種の複数のコピーに結合できる。抗体の、抗原のエピトープに結合する能力は、その抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在及びアミノ酸配列に依存する。抗体の軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエピトープ結合ドメインのうちの１つを形成する。天然抗体は１つのエピトープ種にしか結合できない（即ち単一特異性である）が、その種の複数のコピーに結合できる（即ち２価又は多価性を示す）。
抗体の機能性は、２つの別個の異なる抗原（若しくは同じ抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体系分子を生成することによって、並びに／又は同じエピトープ及び／若しくは抗原に対してより大きな価数（即ち３つ以上の結合ドメイン）を有する抗体系分子を生成することによって、強化できる。
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、このような二重特異性抗体の製造のための多様な組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されている。
このようなアプローチの大半は、更なる結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数の抗原結合部分（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を互いに融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号、国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号、国際公開第２００７／０４６８９３号）。国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わった多重特異性抗体を開示しており、国際公開第２００８／０２７２３６号、及び国際公開第２０１０／１０８１２７号は、ＶＬ及びＶＨドメインが多様化されることによって、２つ以上の抗原に結合できるようになった、抗体を開示している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号、及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３／０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号、及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444‐6448; 米国公開特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.）；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号（Mertens et al.）；Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1‐2):90‐94；Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG‐Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin‐Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665‐19672；Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide‐Linked Anti‐CEA Diabody Allows Site‐Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21‐27；Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941‐4944を参照）。
非単一特異性「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」の提供は、異なるエピトープを発現する細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という、抗体を上回る重要な利点を提供する。従って二重特異性ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び操作の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。
このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この課題をものともせず、本技術分野は、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えばChichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933‐1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B‐Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542‐4551；米国公開特許第２００７／０００４９０９号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２０１３０２９５１２１号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１６／００１７０３８号；米国公開特許第２０１６／０１９４３９６号；米国公開特許第２０１６／０２００８２７号；及び米国公開特許第２０１７／０２４７４５２号を参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ以上のシステイン残基を、採用したポリペプチド種それぞれの中へと組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化する。
Ｃ．本発明の代表的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の構成要素
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、ポリペプチドで構成され、２つ、３つ、４つ又は５つ以上のポリペプチド鎖で構成されてよい。本明細書中で使用される場合、用語「…で構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」は、非制限的なものであることが意図されており、従って、２つのポリペプチド鎖で構成される本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、更なるポリペプチド鎖を有してよい。このような鎖は、上記結合分子の別のポリペプチド鎖と同一の配列を有してよく、又は上記結合分子の他のいずれのポリペプチド鎖と異なる配列を有してよい。
１．代表的な「リンカー」ペプチド
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のポリペプチドは、リンカー１、リンカー２、リンカー３等の「リンカー」ペプチドが先行する、「リンカー」ペプチドが後に続く、及び／又は「リンカー」ペプチドによって互いに連結される、ドメインを含む。本発明は特定の具体的な「リンカー」ペプチドを利用するが、本明細書で提供される教示に照らして、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を得るために代替的なリンカーを容易に特定して採用できる。
ポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てるリンカー１の長さは、上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに結合するのを実質的に又は完全に防止するように選択される（例えば１２個以下のアミノ酸残基の長さ）。従って、第１のポリペプチド鎖のＶＬ１及びＶＨ２ドメインは、実質的に又は完全に、互いに結合できなくなり、第１又は第２の抗原に実質的に結合できるエピトープ結合部位を形成しない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ２及びＶＨ１ドメインは、実質的に又は完全に、互いに結合できなくなり、第１又は第２の抗原に実質的に結合できるエピトープ結合部位を形成しない。代表的な介在リンカーペプチド（リンカー１）はアミノ酸配列（配列番号１６）：GGGSGGGGを有し、これは、ｓｃＦｖ分子の生成に採用される、より長い介在リンカーペプチド（例えばGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１７））とは対照的に）同じポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインとを一体に複合体化するには短すぎる。
リンカー２の１つの目的は、ポリペプチド鎖のＶＨドメインを、任意に存在するそのポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインから隔てることである。多様なリンカーのうちのいずれを、リンカー２の目的のために使用できる。このようなリンカー２の代表的な配列は、アミノ酸配列：GGCGGG（配列番号１８）（これは、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とをジスルフィド結合によって互いに共有結合させるために使用できる、システイン残基を有する）、又はASTKG（配列番号１９）（これはＩｇＧ ＣＨ１ドメインに由来する）を含む。リンカー２、ASTKG（配列番号１９）は、このようなシステインを有しないため、このようなリンカー２の使用は典型的には、配列番号３９のＥコイル又は配列番号４０のＫコイル（以下を参照）といったシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの使用と関連付けられる。
リンカー３の１つの目的は、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインを、そのポリペプチド鎖のＦｃドメインから隔てることである。第２の目的は、システイン含有ポリペプチドドメインを提供することである。多様なリンカーのうちのいずれを、リンカー３の目的のために使用できる。このようなリンカー３の代表的な配列は、アミノ酸配列：DKTHTCPPCP（配列番号２０）を含む。リンカー３の別の代表的な配列は、アミノ酸配列：GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１）を含む。リンカー３の更に他の代表的な配列は、アミノ酸配列：LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０）、又はLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号３１）を含む。
リンカー４の１つの目的は、Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）を、ＶＬドメインのＮ末端から隔てることである。多様なリンカーのうちのいずれを、リンカー４の目的のために使用できる。このようなリンカー４の代表的な配列は、アミノ酸配列：APSSS（配列番号２２）、アミノ酸配列APSSSPME（配列番号２３）、アミノ酸配列GGGSGGGSGGG（配列番号２４）、又はアミノ酸配列GGGGSGGGSGGG（配列番号２５）を含む。
本発明のＦｃ領域含有分子は、更なる介在リンカーペプチド（リンカー）を含んでよく、一般にこのようなリンカーは、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれることになる。典型的には、上記更なるリンカーは、３～２０個のアミノ酸残基を含み、また任意に、ＩｇＧヒンジ領域の全体又は一部分（好ましくはＩｇＧヒンジ領域のシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGC、GGG、ASTKG（配列番号１９）、DKTHTCPPCP（配列番号２０）、APSSS（配列番号２２）、APSSSPME（配列番号２３）、GGGSGGGSGGG（配列番号２４）、GGGGSGGGSGGG（配列番号２５）、LGGGSG（配列番号２６）、GGGS（配列番号２７）、LEPKSS（配列番号２８）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号２９）、LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０）、及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号３１）が挙げられる。クローニングを容易にするために、LEPKSS（配列番号２８）をGGG又はGGCの代わりに使用してよい。更に、アミノ酸GGG、又はLEPKSS（配列番号２８）のすぐ後にDKTHTCPPCP（配列番号２０）を続けることによって、代替的なリンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号３１）を形成できる。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４抗体といったＩｇＧヒンジ領域、又はその一部分を組み込むことができる。
２．代表的なヘテロ二量体促進ドメイン
上述のように、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の形成は、２つ以上の異なるポリペプチド鎖の集合（即ちヘテロ二量体化）を伴う。第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、「ヘテロ二量体促進ドメイン」を含むことによって推進できる。ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上の、ＩｇＧのヒンジ領域のドメイン（即ち例えばGVEPKSC（配列番号３２）、VEPKSC（配列番号３３））又はAEPKSC（配列番号３４）といった、ヒンジ領域に由来するポリペプチド）、及び他方のポリペプチド鎖上のＣＬドメイン（即ち例えばGFNRGEC（配列番号３５）又はFNRGEC（配列番号３６）といった、ＣＬドメインに由来するポリペプチド）であってよい（米国公開特許第２００７／０００４９０９号）。
あるいは、本発明のヘテロ二量体促進ドメインは、反対の電荷を有する、タンデム状に反復するコイルドメイン、例えばｐＨ７において負の電荷を形成するグルタミン酸残基を有する「Ｅコイル」ヘリカルドメイン（配列番号３７：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を含むことになり、その一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの他方は、ｐＨ７において正の電荷を形成するリシン残基を有する４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号３８：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を含有するように操作される。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の会合が促進され、これによってヘテロ二量体化が促進される。別の実施形態では、配列番号３７の４つのタンデム「Ｅコイル」ヘリカルドメインのうちの１つがシステイン残基を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメイン：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）が利用される。同様に別の実施形態では、配列番号３８の４つのタンデム「Ｋコイル」ヘリカルドメインのうちの１つがシステイン残基を含有するように修飾された、ヘテロ二量体促進ドメイン：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）が利用される。
３．ポリペプチド鎖の共有結合
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、そのポリペプチド鎖のペアが、その長さに沿って位置決めされた１つ以上のシステイン残基を介して互いに対して共有結合して、共有結合分子複合体が生成されるよう、操作される。このようなシステイン残基は、上記ポリペプチドのＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる介在リンカーに導入できる。任意に、又はあるいは、リンカー２若しくはリンカー３、又は別のリンカーがシステイン残基を含有してよい。任意に、又はあるいは、コイル含有ヘテロ二量体促進ドメインの１つ以上のコイルドメインが、配列番号３９又は配列番号４０のようなシステイン残基を組み込んだアミノ酸置換を含む。
４．代表的なＦｃドメイン
本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域（例えば完全ＩｇＧ Ｆｃ領域）、又は完全Ｆｃ領域の断片のみを含んでよい。よって、本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの一部若しくは全体及び／又はＣＨ３ドメインの一部若しくは全体を含んでよく、あるいは（完全Ｆｃ領域のＣＨ２又はＣＨ３ドメインに対して例えば１つ以上の挿入及び／又は１つ以上の欠失を含み得る）変異型ＣＨ２及び／又は変異型ＣＨ３配列を含んでよい。本発明の二重特異性ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は非天然完全Ｆｃ領域の一部を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの、天然では発生しない配向（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３ドメイン；若しくはＮ末端からＣ末端への方向にＣＨ３ドメインと、これが連結されるＣＨ２ドメイン等）を含んでよい。
本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のＦｃドメインは、天然で発生するＦｃドメインのアミノ酸配列を含んでよいが、このようなＦｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、結果として得られるＦｃドメインのＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下する（例えば天然で発生するＦｃ領域のアミノ酸配列を有するＦｃドメインを有する場合に上記分子が示す結合の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、若しくは１０％未満）、又は（野生型Ｆｃ領域が示す結合に比べて）略検出不可能となるような、１つ以上の置換を含むことが望ましい場合がある。このような変化した結合を仲介できるＦｃ多様体及び変異体の形態は、当該技術分野で公知であり、２３４位、２３５位、２６５位、及び２９７位からなる群から選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含み、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである（例えば米国特許第５，６２４，８２１号を参照）。一実施形態では、本発明のＦｃ担持分子の第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ、３つ、又は４つを含む。あるいは、（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（配列番号１２）が示す結合及びエフェクタ機能に比べて）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）への結合が元々低い（若しくは実質的に結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元々低い、天然で発生するＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが利用される。ある具体的実施形態では、本発明のＦｃ担持分子は、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域（配列番号１３）又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域（配列番号１５）を含む。ＩｇＧ４ Ｆｃ領域が利用される場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１１を参照）といった安定化変異の導入も包含する。
ある代表的な実施形態では、本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の、採用されるＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、２３４位におけるアラニンでの置換、及び２３５位におけるアラニンでの置換（ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである）（配列番号４１）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を含み、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃ領域の結合親和性を増大させることによって延長できる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（ｈａｌｆ‐ｌｉｆｅ）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被験者の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の延長は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の延長につながる。
いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は変異型Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、（野生型Ｆｃ領域を含む分子に比べて）上記分子の半減期が延長されるように、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は変異型ＩｇＧ Ｆｃ領域を含み、上記変異型Ｆｃ領域は、半減期を延長させるアミノ酸置換を含む。Ｆｃ担持分子の半減期を延長させることができる多数のアミノ酸置換が当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第６，２７７，３７５号、米国特許第７，０８３，７８４号、米国特許第７，２１７，７９７号、米国特許第８，０８８，３７６号、米国公開特許第２００２／０１４７３１１号、米国公開特許第２００７／０１４８１６４、及び米国公開特許第２０１１／００８１３４７号に記載のアミノ酸置換を参照されたい。半減期が強化されたＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は：Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ、及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含んでよく、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。
特に、採用されるＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ；又は
（Ｊ）Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ
を含んでよく、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。
ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの代表的な配列は、ＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの多様体である配列番号４２若しくは配列番号４３、又はＩｇＧ４ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの多様体である配列番号４４のように、血清半減期を大幅に強化する、三重のアミノ酸置換：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）を含む（(Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524）：
配列番号42:
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号43:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号44:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
本発明はまた、ＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイ等において評価した場合に変化したエフェクタ機能、変化した血清半減期、変化した安定性、細胞酵素に対する変化した感受性、又は変化したエフェクタ機能を示す、変異型Ｆｃドメインを含むＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子も包含する。エフェクタ機能を変化させることが特定されているＦｃドメインの修飾は当該技術分野で公知であり、活性化受容体（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））への結合を増大させる修飾、及び阻害受容体（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））への結合を低減する修飾が挙げられる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。ＣＤ３２Ｂへの結合が低減された、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの代表的な多様体は、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン多様体はＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有し、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン多様体はＦ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有し、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン多様体はＬ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ置換を含有し、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのＣＨ２‐ＣＨ３担持ポリペプチド鎖間のヘテロ二量体化を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の変異は、二重特異性Ｆｃ担持ダイアボディ分子を含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができ更に上記ペアのポリペプチド鎖の、いずれの部分に導入することもできる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらの文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。一実施形態では、ノブは第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに導入され、ホールは第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに導入される。これにより、ノブは第１のポリペプチド鎖の２つの分子がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たす。この実施形態の第３のポリペプチド鎖はホール置換を含有するため、これは、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化する、及びそれ自体とホモ二量体化する能力を有することになる（ただしこのようなホモ二量体化は、エピトープ結合部位を有する分子を形成しない）。代表的なノブは、修飾Ｔ３６６Ｗを含有するように天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾することによって作成され、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。代表的なホールは、修飾Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有するように天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾することによって作成され、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。第１及び第３のポリペプチド鎖のヘテロ二量体を含む最終的な二重特異性Ｆｃ担持ダイアボディから、第３のポリペプチド鎖のホモ二量体を精製するのを支援するために、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位は好ましくは、４３５位のアミノ酸置換（１）Ｈ４３５Ｒ）によって変異され、ここで上記番号付与はＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスのものである。これにより、第３のポリペプチド鎖のホモ二量体はタンパク質Ａに結合しなくなり、その一方で、適切に組み立てられた二重特異性Ｆｃ担持ダイアボディは、第１のポリペプチド鎖上のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を保持する。
配列番号４５、配列番号１４６及び配列番号１４７は、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子で使用できる「ノブ担持（ｋｎｏｂ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの代表的な配列を提供する：
配列番号４５：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号146:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号147:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号１４８、配列番号１４９及び配列番号１５０は、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子で使用できる「ホール担持（ｈｏｌｅ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの代表的な配列を提供する：
配列番号１４８：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号１４９：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号１５０：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSLGX
（ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である）
配列番号４７及び５０のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはＩｇＧ４ドメインであり、配列番号４５、１４６、１４８及び１４９のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはＩｇＧ１ドメインである。配列番号４５、１４６、１４８及び１４９は、２３４位におけるアラニンでの置換、及び２３５位におけるアラニンでの置換を含むため、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が、野生型Ｆｃ領域（配列番号１２）が示す結合に比べて低下した（又は略結合しない）、Ｆｃドメインを形成することに留意されたい。本発明は具体的には、本明細書に記載の置換（例えばＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；Ｔ３６６Ｗ；Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ；及び／又はＨ４３５Ｒ）を含むいずれのクラスのヒトＩｇＧ由来のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含む、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を包含する。更に本発明は具体的には、上述のＣ末端リシン残基を含まないＣＤ１３７×ＴＡ結合分子構造を包含する。
上述の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４５、１４６、及び１４７の配列等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することになり、また第３のポリペプチド鎖は、配列番号１４８、１４９、及び１５０の配列等の「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することになる。しかしながら、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４８）を第１のポリペプチド鎖に採用してよく、この場合には「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４５）が第３のポリペプチド鎖に採用されることになることが認識されるだろう。
５．代表的な腫瘍抗原（ＴＡ）及び代表的な可変ドメイン
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、腫瘍抗原のエピトープに対して特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位を含む。本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子が結合できる代表的な腫瘍抗原（「ＴＡ」）としては、限定するものでないが表１に提示されているものが挙げられ、これらはここでは、一般名、略称、及び／又は遺伝子名で呼ばれ得る。
Figure 2023514167000002
Figure 2023514167000003
Figure 2023514167000004
Figure 2023514167000005
ＴＡを認識する抗体は当該技術分野で公知であるか、本明細書に記載のものを含む公知の方法を用いて生成できる。ＴＡに結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含み、従ってその配列又はポリペプチド鎖を本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の構築に採用できる、代表的な抗体が、表２に列挙されている。いくつかの腫瘍抗原に結合できる抗体の代表的なＶＨ及びＶＬドメインを以下に提示する。
Figure 2023514167000006
Figure 2023514167000007
Figure 2023514167000008
Figure 2023514167000009
Figure 2023514167000010
Figure 2023514167000011
ａ）ＰＤ‐Ｌ１結合ドメイン
ＰＤ‐Ｌ１（ＣＤ２７４及びＢ７‐Ｈ１としても公知）は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＤＣ、マクロファージの表面上、及び非血液細胞内で一般的に発現される、４０ｋＤａの膜貫通タンパク質である。更にＰＤ‐Ｌ１は、腫瘍細胞内で異常に高い発現も示し、これは、腫瘍の免疫逃避能力を促進する主な要因であると考えられる。ＰＤ‐Ｌ１とＴ細胞上のその受容体ＰＤ‐１との結合は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン生成及び放出、並びに細胞傷害性を阻害するシグナルを送達する、ＰＤ‐１受容体の下流シグナル伝達を活性化する。ＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１を遮断する抗体はＰＤ‐１軸を破壊することにより、Ｔ細胞抑制を逆転させ、内因性抗腫瘍免疫を強化する。ＰＤ‐Ｌ１に結合するＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、ＰＤ‐Ｌ１を発現する腫瘍細胞と、ＣＤ１３７を発現する免疫細胞とを共連結できる。いずれの特定の方法に限定されるものではないが、このような共局在化は、免疫細胞を刺激できると同時に、ＰＤ‐Ｌ１とＰＤ‐１との結合時に発生する免疫系阻害を弱める、又は遮断することもできる。
いずれの抗ＰＤ‐Ｌ１抗体のエピトープ結合部位を本発明に従って使用してよく、また本発明の原理は、ＰＤ‐Ｌ１腫瘍抗原に関して説明される。ヒトＰＤ‐Ｌ１に結合する代表的な抗体としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブが挙げられ、これらはそれぞれ近年、ヒトにおける使用が承認されている。アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標として市販）；ＣＡＳ登録番号１３８０７２３‐４４‐３；米国特許第９，８７３，７４０号を参照）は、修飾されたＩｇＧ１及びκ定常領域を有するヒト化モノクローナル抗体である。アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号１５３７０３２‐８２‐８；米国特許第９，８７３，７４０号を参照）は、ＩｇＧ１／λ定常領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体である。デュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号１４２８９３５‐６０‐７；米国特許第８，７７９，１０８号を参照）は、修飾されたＩｇＧ１及びκ定常領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体である。アテゾリズマブ（WHO Drug Information, 2015, Recommended INN: List 74, 29（3):387）、デュルバルマブ（WHO Drug Information, 2015, Recommended INN: List 74, 29（3):393‐394）、及びアベルマブ（WHO Drug Information, 2016, Recommended INN: List 74, 30（1):100‐101）の、完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知である。ヒト化抗ＰＤ‐Ｌ１抗体「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２」及びその最適化多様体を含む、更なる抗ＰＤ‐Ｌ１抗体も、本明細書において提供される。
（1）hPD‐L1 MAB‐2
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２のＶＨドメイン（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１）のアミノ酸配列は、（配列番号５７）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCARQG
LPYYFDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２のＶＬドメイン（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１）のアミノ酸配列は、（配列番号５８）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIK
である。
（２）脱免疫価及び最適化ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２
以下の例で説明されるように、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２を脱免疫化し、結合及び発現に関して最適化して、「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ」と命名された変異型ＶＨドメイン、及び「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ」と命名されたＶＬドメインを得た。特定の脱免疫化及び最適化変異型ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列が以下に提示され、更なる多様体は実施例において提供される。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘのアミノ酸配列は、（配列番号５９）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIX 4 GGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNX5LY LQMNSLX6X7ED TAVYYCARX 8 G
LPYYX 9 DYWGQ GTLVTVSS
であり、
Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、及びＸ9は独立して選択され、
Ｘ4はＧ又はＫであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＫ又はＲであり；Ｘ7はＡ又はＴであり；Ｘ8はＡ又はＱであり；Ｘ9はＦ又はＧである。
具体的実施形態では：
ａ）Ｘ4はＧであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＱであり；Ｘ9はＦであるか；
ｂ）Ｘ4はＫであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＱであり；Ｘ9はＧであるか；
ｃ）Ｘ4はＧであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＡであり；Ｘ9はＦであるか；
ｄ）Ｘ4はＫであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＡであり；Ｘ9はＦであるか；
ｅ）Ｘ4はＧであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＡであり；Ｘ9はＧであるか；又は
ｆ）Ｘ4はＫであり；Ｘ5はＳであり；Ｘ6はＲであり；Ｘ7はＡであり；Ｘ8はＱであり；Ｘ9はＦである。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘのＣＤＲHのアミノ酸配列は：
ＣＤＲH１（配列番号６０）：SYTMS
ＣＤＲH２（配列番号６１）：YISIX4GGTTYYPDTVKG
ＣＤＲH３（配列番号６２）：X8GLPYYX9DY
であり、ここで：Ｘ4はＧ又はＫであり；Ｘ8はＡ又はＱであり；Ｘ9はＦ又はＧである。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘのアミノ酸配列は、（配列番号６３）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN X 10 AVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIK
であり、Ｘ10はＥ又はＴである。
ある具体的実施形態では、Ｘ10はＥである。
ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘのＣＤＲLのアミノ酸配列は：
ＣＤＲL１（配列番号６４）：KASQDVNX10AVA
ＣＤＲL２（配列番号６５）：WASTRHT
ＣＤＲL３（配列番号６６）：QQHYNTPLT
であり、Ｘ10はＥ又はＴである。
本明細書において「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２」、「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３」、「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４」、「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５」、「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６」と命名された５つの変異型ＶＨドメイン、及び本明細書において「ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２」と命名された１つの変異型ＶＬドメインのアミノ酸配列を、以下に提示する。本明細書で開示される変異型ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨドメインのうちのいずれを、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬドメインのうちのいずれとペアにすることができる。ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ／ＶＬドメインの特定の組み合わせを含む分子は、その特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照して呼称され、例えば結合ドメインＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２を含む分子は、具体的に「ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）」と呼ばれる。これらの変異型ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列が以下に提供され、ＶＨ１又はＶＬ１と比較してのＣＤＲ内の置換には二重下線が付されている。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２のアミノ酸配列は、（配列番号６７）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
LPYYFDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３のアミノ酸配列は、（配列番号６８）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、置換には二重下線が付されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIKGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
LPYYGDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４のアミノ酸配列は、（配列番号６９）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、置換には二重下線が付されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARAG
LPYYFDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５のアミノ酸配列は、（配列番号７０）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIKGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARAG
LPYYFDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６のアミノ酸配列は、（配列番号７１）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARAG
LPYYGDYWGQ GTLVTVSS
である。
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２のアミノ酸配列は、（配列番号７２）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN EAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIK
である。
最適化ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２多様体のＣＤＲH２、ＣＤＲH３、及びＣＤＲL１のアミノ酸配列は、親分子中に存在するものとは異なることに留意されたい。これらの異なるＣＤＲを以下にまとめ、ＶＨ１及びＶＬ１と異なる部分に二重下線を付す。
Figure 2023514167000012
本発明は具体的には、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２及びこれらの多様体、又は本明細書中で提供される他の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを含み、より典型的には、上述のような抗ＰＤ‐Ｌ１モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを有する、ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｂ）ＨＥＲ２結合ドメイン
ＨＥＲ２は、化学的に処置されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産物として元来同定された、１８５ｋＤａの受容体である。ＨＥＲ２は、乳癌及び胃癌（gastric cancer）を含む多くのヒト癌腫において機能するため、広く研究されてきた。
いずれの抗ＨＥＲ２抗体のエピトープ結合部位を本発明に従って使用してよく、また本発明の原理は、ＨＥＲ２腫瘍抗原に関して説明される。ヒトＨＥＲ２に結合する代表的な抗体としては、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ及びペルツズマブが挙げられる。マルゲツキシマブ（ＭＧＡＨ２２としても公知；ＣＡＳ登録番号１３５０６２４‐７５‐７、例えば米国特許第８，８０２，０９３号を参照）は、ＨＥＲ２に結合してＡＤＣＣ活性の強化を仲介する、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体である。トラスツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ４Ｄ５としても公知、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号１８０２８８‐６９‐１；米国特許第５，８２１，３３７号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体４Ｄ５のヒト化バージョンである。ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡＢ２Ｃ４としても公知、Ｐｅｒｊｅｔ（登録商標）として市販；ＣＡＳ登録番号３８０６１０‐２７‐５；例えば国際公開第２００１／０００２４５号を参照）は、ＩｇＧ１／κ定常領域を有する、抗体２Ｃ４のヒト化バージョンである。マルゲツキシマブ（WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 70, 28（1):93‐94）、及びトラスツズマブ（トラスツズマブエムタンシンに関して、WHO Drug Information, 2011, Recommended INN: List 65, 25(1):89‐90を参照）、並びにペルツズマブのＦａｂドメイン（Protein Data Bank Accession No. 1l7i）の、完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知である。ＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１及びそのヒト化多様体を含む、更なる抗ＨＥＲ２抗体も、本明細書において提供される。
（１）ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１
抗体ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１は、ＨＥＲ２の、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ及びペルツズマブが認識するエピトープとは別個のエピトープに結合する、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である（例えば国際公開第２０１８／１５６７４０号を参照）。
ヒト化抗体のＶＨドメイン（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ）のアミノ酸配列は、（配列番号７８）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDX 1
X 2 YGNRVSYWG QGTLVTVSS
であり、Ｘ1はＤ又はＥであり、Ｘ2はＧ又はＩである。
上記ヒト化抗体のＶＬドメイン（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ）のアミノ酸配列は、（配列番号７９）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIX 3 X 4 YLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLX 5 X 6 GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIK
であり、Ｘ3はＮ又はＳであり；Ｘ4はＳ、Ｔ又はＮであり；Ｘ5はＶ又はＱであり；Ｘ6はＤ、Ｅ又はＳである。
以下の３つの変異型ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨドメインが単離された：ｈＨＥＲ２ＭＡＢ‐１ ＶＨ１、ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ２、及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ＶＨ３。これらの変異型ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に提示する。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ１のアミノ酸配列は、（配列番号８０）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲH３の第２及び第３の残基は、それぞれＤ及びＧである）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD
GYGNRVSYWG QGTLVTVSS
である。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ２のアミノ酸配列は、（配列番号８１）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲH３の第２及び第３の残基は、それぞれＥ及びＧである）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDE
GYGNRVSYWG QGTLVTVSS
である。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ３のアミノ酸配列は、（配列番号８２）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲH３の第２及び第３の残基は、それぞれＤ及びＩである）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD
IYGNRVSYWG QGTLVTVSS
である。
以下の３つの変異型ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬドメインが単離された：ｈＨＥＲ２ＭＡＢ‐１ ＶＬ１、ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ２、及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ＶＬ３。これらの変異型ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬドメインのアミノ酸配列を以下に提示する。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ１のアミノ酸配列は、（配列番号８３）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲL１の第７及び第８の残基は、それぞれＮ及びＳであり、ＣＤＲL２の第６及び第７の残基は、それぞれＶ及びＤである）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN SYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIK
である。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ２のアミノ酸配列は、（配列番号８４）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲL１の第７及び第８の残基は、それぞれＮ及びＴであり、ＣＤＲL２の第６及び第７の残基は、それぞれＶ及びＥである）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN TYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLVEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIK
である。
ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ３のアミノ酸配列は、（配列番号８５）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている；なお、ＣＤＲL１の第７及び第８の残基は、それぞれＳ及びＮであり、ＣＤＲL２の第６及び第７の残基は、それぞれＱ及びＳである）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIK
である。
上で提示されたｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ及び／又はＶＬドメインの１つ以上の一般的な配列に包含されるいずれのものを含む、上述のヒト化ＶＨ及びＶＬ ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ドメインのうちのいずれを用いて、ＨＥＲ２に結合できる抗体、ダイアボディ又は結合分子を形成できる。
（２）他のＨＥＲ２結合ドメイン
上で同定されたＨＥＲ結合ドメインに加えて、本発明は、以下の抗ＨＥＲ‐２結合ドメイン：１．４４．１；１．１４０；１．４３；１．１４．１；１．１００．１；１．９６；１．１８．１；１．２０；１．３９；１．２４；及び１．７１．３（米国特許第８，３５０，０１１号；米国特許第８，８５８，９４２号；及び国際公開第２００８／０１９２９０号）；Ｆ５及びＣ１（米国特許第７，８９２，５５４号；米国特許第８，１７３，４２４号；米国特許第８，９７４，７９２号；及び国際公開第９９／５５３６７号）；並びに米国公開特許第２０１１／００９７３２３号、米国公開特許第２０１３／０１７１１４号、米国公開特許第２０１４／０３２８８３６号、米国公開特許第２０１６／０１３０３６０号、及び米国公開特許第２０１６／０２５７７６１号、並びに国際公開第２０１１／１４７９８６号の抗ＨＥＲ２結合分子の結合分子のうちのいずれのエピトープ結合部位のうちのいずれの使用を企図する。
本発明は具体的には：マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１又は本明細書で提供されている他の抗ＨＥＲ２抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含み；より典型的には、このような抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する、ＣＤ１３７×ＨＥＲ２結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｃ）ＥｐｈＡ２ 結合ドメイン
受容体チロシンキナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２（ＥｐｈＡ２）は通常、成体の上皮組織の細胞間接触部位に発現するが、最近の研究により、ＥｐｈＡ２が様々なタイプの上皮癌においても、転移性病変において観察される最も高いレベルのＥｐｈＡ２発現で過剰発現することが分かった。高発現レベルのＥｐｈＡ２は、前立腺癌、乳癌、非小細胞肺癌及び黒色腫を含む、広範な癌及び多数の腫瘍細胞株において確認されている。ＥｐｈＡ２は単なる癌のマーカーとは思われないが、多数のヒト癌において持続的に過剰発現し、機能的に変化するようであるいずれの抗ＥｐｈＡ２抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。以下に提示されるのは、本発明の分子の生成に使用できるいくつかの代表的な抗ＥｐｈＡ２抗体である。
（１）ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐１
抗体ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐１は、マウス抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体である。ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８６）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM
IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG
NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
である。
ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG
TKLEIK
である。
（２）ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐２
抗体ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐２は、マウス抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体である。ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８８）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW
INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL
GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
である。
ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８９）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP
TFGSGTKLEI K
である。
（３）ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐３
抗体ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐３は、マウス抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体である。ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐３のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９０）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT
ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE
SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
である。
ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐３のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９１）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW
ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG
GTKLEIK
である。
（４）他のＥｐｈＡ２結合ドメイン
上で特定したＥｐｈＡ２結合ドメインに加えて、本発明は、以下の抗ＥｐｈＡ２抗体：ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５、又はＬＵＣＡ４０（国際公開第２００６／０８４２２６号を参照）；Ｂ１３（米国特許第７，１０１，９７６号を参照）；Ｄ７（米国特許第７，１９２，６９８号を参照）；Ｂ‐２３３、及びＥＡ２（国際公開第２００３／０９４８５９号を参照）のうちのいずれかのエピトープ結合部位のうちのいずれかの使用を企図する。
本発明は具体的には、抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐１、ＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐２又はＥｐｈＡ２ ＭＡＢ‐３の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＥｐｈＡ２結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｄ）５Ｔ４結合ドメイン
癌胎児性タンパク質５Ｔ４は、腎臓癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌を含む多くの癌腫の細胞膜上、及び急性リンパ芽球性白血病において発現する、腫瘍関連タンパク質である。いずれの抗５Ｔ４抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。以下で提示されるのは、２つの代表的な抗５Ｔ４抗体、即ちヒト化「５Ｔ４ ＭＡＢ‐１」及びマウス「５Ｔ４ ＭＡＢ‐２」である。更なる抗５Ｔ４抗体が当該技術分野において記述されている（例えば米国特許第８，０８４，２４９号；米国特許第８，４０９，５７７号；米国特許第８，７５９，４９５号；米国特許第８，４０９，５７７号；国際公開第２０１３／０４１６８７号；国際公開第２０１４／１３７９３１号；国際公開第２０１６／０２２９３９号を参照）。
（１）５Ｔ４ ＭＡＢ‐１
５Ｔ４ ＭＡＢ‐１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９２）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
である。
５Ｔ４ ＭＡＢ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９３）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIK
である。
（２）５Ｔ４ ＭＡＢ‐２
５Ｔ４ ＭＡＢ‐２のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９４）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
である。
５Ｔ４ ＭＡＢ‐２のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９５）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IK
である。
本発明は具体的には、抗５Ｔ４モノクローナル抗体５Ｔ４ ＭＡＢ‐１若しくは５Ｔ４ ＭＡＢ‐２の、又は国際公開第２００７／１０６７４４号、国際公開第２０１３／０４１６８７号若しくは国際公開第２０１５／１８４２０３号で提供されている抗５Ｔ４抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×５Ｔ４結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｅ）Ｂ７‐Ｈ３結合ドメイン
Ｂ７‐Ｈ３は、多種多様な固形腫瘍に過剰発現する腫瘍抗原であり、免疫調節に関与する分子のＢ７ファミリーのメンバーである。特に、ヒト悪性腫瘍細胞（例えば神経芽細胞腫並びに胃癌（gastric cancer）、卵巣癌及び非小細胞肺癌の腫瘍細胞）が、Ｂ７‐Ｈ３タンパク質の発現の顕著な増大を示すこと、並びにこの発現の増大が、疾患の重篤度の上昇に関連することが、複数の独立した研究によって示されており、これは、Ｂ７‐Ｈ３が免疫回避経路として腫瘍に利用されることを示唆している。
いずれの抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。ヒトＢ７‐Ｈ３に結合する１つの代表的なヒト化抗体は、「エノブリツズマブ」である。エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１としても公知；ＣＡＳ登録番号１３５３４８５‐３８‐７；例えば米国特許第８，８０２，０９１号を参照）は、Ｂ７‐Ｈ３に結合して、強化されたＡＤＣＣ活性を仲介する、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体である。エノブリツズマブの完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（WHO Drug Information, 2017, Recommended INN: List 77, 31（1):149）は、当該技術分野で公知である。更なる代表的な抗Ｂ７‐Ｈ３抗体を提示する。
（１）ｈＢＲＣＡ６９Ｄ
ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３ 抗体「ｈＢＲＣＡ６９Ｄ」の代表的なＶＨ及びＶＬドメインを以下に提示する。２つのヒト化ＶＨドメイン、即ちｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＨ１及びｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＨ２と；２つのヒト化ＶＬドメイン、即ちｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＬ１及びｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＬ２が以下で提供され、これらは、機能性ヒト化結合ドメインを得るために、ＶＨ／ＶＬのいずれの組み合わせで使用できる。
ｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９６）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
である。
ｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＨ２のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９７）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
である。
ｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９８）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
である。
ｈＢＲＣＡ６９Ｄ ＶＬ２のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９９）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK
である。
（２）ｈＰＲＣＡ１５７
別の代表的なヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体は、「ｈＰＲＣＡ１５７」である。ｈＰＲＣＡ１５７ ＶＨ１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１００）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD
GGAMDYWGQG TTVTVSS
である。
ｈＰＲＣＡ１５７ ＶＬ１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０１）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG
QGTRLEIK
である。
（３）他のＢ７‐Ｈ３結合ドメイン
上で特定したＢ７‐Ｈ３結合ドメインに加えて、本発明は、以下の抗Ｂ７‐Ｈ３抗体：ＬＵＣＡ１；ＢＬＡ８；ＰＡ２０；又はＳＫＮ２（米国特許第７，５２７，９６９号；米国特許第８，７７９，０９８号及び国際公開第２００４／００１３８１号を参照）；Ｍ３０；ｃＭ３０；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ３；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ４；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ５；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ６；Ｍ３０‐Ｈ１‐Ｌ７；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ１；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ２；Ｍ３０‐Ｈ４‐Ｌ３；及びＭ３０‐Ｈ４‐Ｌ４（米国特許出願公開第２０１３／００７８２３４号及び国際公開第２０１２／１４７７１３号を参照）；並びに８Ｈ９（米国特許第７，６６６，４２４号；米国特許第７，７３７，２５８号；米国特許第７，７４０，８４５号；米国特許第８，１４８，１５４号；米国特許第８，４１４，８９２号；米国特許第８，５０１，４７１号；米国特許第９，０６２，１１０号；米国特許出願公開第２０１０／０１４３２４５号、及び国際公開第２００８／１１６２１９号を参照）のうちのいずれかのエピトープ結合部位のうちのいずれかの使用を企図する。
本発明は具体的には、ヒト化ＢＲＣＡ６９Ｄ、ＰＲＣＡ１５７、ヒト化ＰＲＣＡ１５７、又はエノブリツズマブ、又は本明細書中で提供される他の抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、並びに／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを含み、より典型的には、上述のような抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ、若しくは３つ全てを有する、ＣＤ１３７×Ｂ７‐Ｈ３結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｆ）ＧｐＡ３３結合ドメイン
４３ｋＤ膜貫通糖タンパク質Ａ３３（ｇｐＡ３３）は、全ての結腸直腸癌の＞９５％において発現する。いずれの抗ｇｐＡ３３抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。代表的なヒト化抗ｇｐＡ３３抗体（「ｇｐＡ３３ ＭＡＢ‐１」）を以下に提示する。
ｇｐＡ３３ ＭＡＢ‐１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０２）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY
GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
である。
ｇｐＡ３３ ＭＡＢ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０３）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT
SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG
TKLEIK
である。
本発明は具体的には、抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体ｇｐＡ３３ ＭＡＢ‐１、又は国際公開第２０１５／０２６８９４号において提供された抗ｇｐＡ３３モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ｇｐＡ３３結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｇ）ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６結合ドメイン
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）及び６（ＣＥＡＣＡＭ６）は、甲状腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胃癌（gastric cancer）、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮体癌、乳癌、造血癌、白血病及び卵巣癌、並びに特に、結腸直腸癌、胃腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、乳癌、甲状腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌及び子宮癌腫を含む様々なタイプの癌に関連していることが分かっている。いずれの抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。代表的な抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体を以下に提示する。
（１）１６Ｃ３
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０４）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL
ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD
YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
である。
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体１６Ｃ３（欧州特許第２５８５４７６号）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０５）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG
ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG
GTKLEIK
である。
（２）ｈＭＮ１５
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（米国特許第８，２８７，８６５号）のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０６）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF
IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR
DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
である。
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６抗体ｈＭＮ１５（米国特許第８，２８７，８６５号）のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０７）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT
STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG
TKVEIKR
である。
本発明は具体的には、抗ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６モノクローナル抗体１６Ｃ３又はｈＭＮ１５の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｈ）ＣＤ１９結合ドメイン
ＣＤ１９（Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｍ２８１７０）は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の構成要素であり、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫に関する閾値を変調するＢ細胞シグナリングの正の調節因子である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統中に最も偏在的に発現される抗原の１つであり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の＞９５％において発現される。特に、ＣＤ１９発現は、抗ＣＤ２０療法に対する耐性を示すようになったＢ細胞リンパ腫において維持される。ＣＤ１９はまた、自己免疫疾患を治療するための標的としても示唆されている。
いずれの抗ＣＤ１９抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。ヒトＣＤ１９に結合し、本発明において採用してよい代表的なヒト化抗体は、国際公開第２０１６／０４８９３８号で開示されている抗ＣＤ１９抗体（本明細書では「ＣＤ１９ ＭＡＢ‐１」と呼ばれる）である。
ＣＤ１９ ＭＡＢ‐１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０８）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM
ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
である。
ＣＤ１９ ＭＡＢ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０９）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA
SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG
TKLEIK
である。
本発明は具体的には、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＣＤ１９ ＭＡＢ‐１、又は米国特許第７，１１２，３２４号で開示されている、若しくはブリナツモマブ（BLINCYTO（登録商標）；WHO Drug Information, 2009, Recommended INN: List 62, 23(3):240-241中に見られるアミノ酸配列）及びデュボルツキシズマブ（ＭＧＤ０１１としても公知；WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629中に見られるアミノ酸配列）中に存在する、抗ＣＤ１９抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＣＤ１９結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｉ）ＣＤ１２３結合ドメイン
ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体）は、４０ｋＤａの分子である独自のα鎖、ＩＬ‐３Ｒａを含む。インターロイキン３（ＩＬ‐３）は、多能性幹細胞の、赤血球細胞、骨髄細胞及びリンパ球系前駆細胞への早期分化を促進する。ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む幅広い血液悪性腫瘍中の悪性細胞上で過剰発現していることが報告されている。ＣＤ１２３の過剰発現は、ＡＭＬの不良な予後に関連する。
いずれの抗ＣＤ１２３抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。ヒトＣＤ１２３に結合し、本発明で採用できる代表的なヒト化抗体は、「ＣＤ１２３ ＭＡＢ‐１」である（例えば国際公開第２０１５／０２６８９２号を参照）。
ＣＤ１２３ ＭＡＢ‐１のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１０）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD
IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH
LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
である。
ＣＤ１２３ ＭＡＢ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１１）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY
PYTFGQGTKL EIK
である。
本発明は具体的には、抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体ＣＤ１２３ ＭＡＢ‐１、又は米国特許第２０１７／０８１４２４号及び国際公開第２０１６／０３６９３７号で開示されている、若しくはＪＮＪ‐６３７０９１７８（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開第２０１６／０３６９３７号も参照）及びＸｍＡｂ１４０４５（Ｘｅｎｃｏｒ、米国公開特許第２０１７／０８１４２４号も参照）中に存在する、抗ＣＤ１２３抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＣＤ１２３結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｊ）ＩＬ１３Ｒα２
インターロイキン‐１３受容体α２（ＩＬ１３Ｒα２）は、グリア芽腫、結腸直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、多発性黒色腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌及び肺癌を含む多様な癌において過剰発現する。ＩＬ１３Ｒα２に免疫特異的に結合する抗体は市販されており、当該技術分野において既に説明されている（例えば国際公開第２００８／１４６９１１号を参照）。ヒトＩＬ１３Ｒα２に結合する代表的なヒト化抗体としては、「ｈｕ０８」が挙げられる（例えば国際公開第２０１４／０７２８８８号を参照）。
ｈｕ０８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１１２）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT
VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
ｈｕ０８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１１３）を以下に示す（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG
GTKVEIK
本発明は具体的には、抗ＩＬ１３Ｒα２モノクローナル抗体ｈｕ０８の、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＩＬ１３Ｒα２結合分子を含み、またこれらを包含する。
ｋ）ＲＯＲ１
受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ‐Ｌｉｋｅ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １：「ＲＯＲ１」）は、細胞表面受容体のＲＯＲサブファミリーに属するＩ型膜タンパク質である。ＲＯＲ１は胚形成中に多くの組織によって発現される腫瘍胚性抗原であり、大半の成熟組織には存在せず、卵巣、結腸、肺、リンパ腫、皮膚、膵臓、精巣、膀胱、子宮、前立腺、副腎、乳房、及びＢ細胞の悪性腫瘍を含む、多数の血液及び固形悪性腫瘍中、並びに一部の癌幹細胞中で発現される。ＲＯＲ１の発現は、分化の程度が比較的低い形態の、高悪性度腫瘍に関連しており、臨床転帰不良と相関する。いずれの抗ＲＯＲ１抗体のエピトープ結合部位を、本発明に従って使用できる。以下に提示されるのは、本発明の分子の生成に使用できる代表的なヒト化／最適化抗ＲＯＲ１抗体であり、この抗体のバリエーションは国際公開第２０１７／１４２９２８号に記載されている。
（１）抗ＲＯＲ１
抗ＲＯＲ１抗体の代表的なＶＨのアミノ酸配列は、（配列番号１１４）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWXRQA PGKGLEWVAT
IYPSSGKTYY ADSAKGRLTI SSDNAKDSLY LQMNSLRAED TAVYYCTRDS
YADDAALFDI WGQGTTVTVS S
であり、ここでＸはＩ又はＶである。
抗ＲＯＲ１抗体の代表的なＶＬのアミノ酸配列は、（配列番号１１５）（ＣＤＲ残基は下線を付して示されている）：
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL
EGSGSYNKGS GVPDRFSGSS SGADWYLTIS SLQSEDEADY YCGTDYPGNY
LFGGGTQLTV LG
である。
（２）他のＲＯＲ１結合ドメイン
上で特定されているＲＯＲ１結合ドメインに加えて、本発明は、以下の抗ＲＯＲ１抗体：４Ａ５（米国特許第８，２１２，００９号を参照）；Ｒ１１、Ｒ１２、及びＹ３１（米国特許第９，７５８，５８６号を参照）；並びにＡ１‐Ａ１４（例えば米国特許第９，２２８，０２３号を参照）のうちのいずれかのエピトープ結合部位のうちのいずれかの使用を企図する。
本発明は具体的には、本明細書中で提供される抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／若しくはＶＨドメイン、並びに／又はＶＬ領域のＣＤＲＬのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て及び／又はＶＨドメインのＣＤＲＨのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを含む、ＣＤ１３７×ＲＯＲ１結合分子を含み、またこれらを包含する。
Ｄ．本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
本発明は特に、ＣＤ１３７及びＴＡに同時に結合できるＦｃ担持４価及び３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子、並びにＣＤ１３７及びＴＡに同時に結合できる他のＦｃ担持ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を対象とする。本発明は更に、癌並びに他の疾患及び状態の治療における、このような分子の使用を対象とする。
１．４価ＣＤ１３７×ＴＡ Ｆｃ担持ダイアボディ
本発明は特に、ＣＤ１３７及びＴＡに同時に結合できる多様なＦｃ担持ダイアボディを包含する。代表的なＣＤ１３７×ＴＡ Ｆｃ担持ダイアボディを以下で説明する。
このような４価Ｆｃ担持ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含むことになる。上記ポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、「第１の」抗原（ＣＤ１３７又はＴＡ）のエピトープに結合できる抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＬ１）、「第２の」抗原（ＶＬ１がＣＤ１３７に結合するように選択された場合はＴＡ、ＶＬ１がＴＡのエピトープに結合するように選択された場合はＣＤ１３７）のエピトープに結合できる抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ２）、システイン含有ドメイン、以下で更に詳細に提供される１つ以上の更なるドメイン、及びＣ末端を含有できる。上記ポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、「第２の」抗原（第１の抗原がＣＤ１３７であった場合はＴＡ、第１の抗原がＴＡであった場合はＣＤ１３７）のエピトープに結合できる抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＬ２）、「第２の」抗原（ＶＬ２がＣＤ１３７に結合するように選択された場合はＴＡ、ＶＬ２がＴＡのエピトープに結合するように選択された場合はＣＤ１３７）のエピトープに結合できる抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ２）、システイン含有ドメイン、以下で更に詳細に提供される１つ以上の更なるドメイン、及びＣ末端を含有できる。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１又はＶＬ２）を重鎖可変ドメイン（ＶＨ１又はＶＨ２）から隔てる。
特定の実施形態では、本発明のＦｃ担持ダイアボディは、４つのポリペプチド鎖を含む４つのエピトープ結合部位を有する、共有結合４価ダイアボディであり、図１Ａに示されている一般構造を有する。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化及び共有結合を促進する。ＶＨドメインは、システイン残基を含むことができる介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体促進ドメインに連結される。任意に、又は更に、ヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含んでよい。代表的なＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性Ｆｃ担持ダイアボディの実施形態では、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインのＣ末端が、リンカーペプチド（リンカー３）によって、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結される。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。以下の表３において、表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を、表３において提供する。
Figure 2023514167000013
特定の実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、合計４つのポリペプチド鎖で構成される、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ担持ダイアボディである（図１Ａ～１Ｃ）。本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、ＣＤ１３７に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＣＤ１３７の同一のエピトープ又はＣＤ１３７の異なるエピトープに結合できる）、及び腫瘍抗原に対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらは１つのＴＡの同一のエピトープ、又は１つのＴＡの異なるエピトープ、又は異なる複数のＴＡの異なるエピトープに結合できる）を含む、二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディである。
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは多くの場合、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは多くの場合：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは多くの場合、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従って多くの場合、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に会合して、上記第１又は第２のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合ドメイン、及びこれらのエピトープのうちの他方に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合ドメインを形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは多くの場合、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は多くの場合、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。図１Ｄはこのようなダイアボディの代表的な構造を示す。
上述の各実施形態において、第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と相互作用することによって、第１の抗原（即ちＴＡ又はＣＤ１３７）のエピトープに免疫特異的に結合できる機能性エピトープ結合部位を形成できるように、協調的に選択される。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と相互作用することによって、第２の抗原（即ちＴＡ又はＣＤ１３７）のエピトープに免疫特異的に結合できる機能性エピトープ結合部位を形成できるように、協調的に選択される。従って、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ＣＤ１３７及びＴＡに結合できるエピトープ結合部位を含むように、調整される。
本発明の更なるＦｃ担持ダイアボディは５つのポリペプチド鎖を含み、これは図２に示されている。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。一実施形態では、第２及び第５のポリペプチド鎖は同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第３の鎖と第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＨ３含有ドメイン又はＶＨ２含有ドメインのＣ末端は、介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体促進ドメインに連結され、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのＣ末端は、介在リンカーペプチド（リンカー４）によって、ＶＬ２含有ドメインに連結される。
従って、このようなダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖と第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１結合部位を形成する。このようなダイアボディの第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位と、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位とを含む、１つのダイアボディ結合ドメインを形成する。第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図２は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら、本明細書において提示されるように、これらのドメインは、ＣＤ１３７とＴＡとを結合するように選択される。
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、二重特異性ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図２に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表４に示す。
Figure 2023514167000014
特定の実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、合計５つのポリペプチド鎖で構成される、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ担持ダイアボディであり、ＣＤ１３７に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＣＤ１３７の同一のエピトープ又はＣＤ１３７の異なるエピトープに結合できる）、及びＴＡに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらは１つのＴＡの同一のエピトープ、又は１つのＴＡの異なるエピトープ、又は異なる複数のＴＡの異なるエピトープに結合できる）を有する。別の実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、ＣＤ１３７に対して免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＣＤ１３７の同一のエピトープ又はＣＤ１３７の２つ若しくは３つの異なるエピトープに結合できる）、及びＴＡに対して特異的な１つのエピトープ結合部位を含む、二重特異性、４価、Ｆｃ担持ダイアボディである。
２．３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
一実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は３価であり、第１のエピトープ結合部位（例えばＶＬ１及びＶＨ１）、第２のエピトープ結合部位（例えばＶＬ２及びＶＨ２）、並びに第３のエピトープ結合部位（例えばＶＬ３及びＶＨ３）を含み、従ってＴＡのエピトープ、ＣＤ１３７のエピトープ、及び第３のエピトープに結合でき、この第３のエピトープは：
（ａ）上記ＴＡの同じ若しくは異なるエピトープ；
（ｂ）ＣＤ１３７の同じ若しくは異なるエピトープ；又は
（ｃ）異なるＴＡのエピトープ
であってよい。
特定の実施形態では、本発明のこのような「３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子」は、ＣＤ１３７のエピトープ（このエピトープは同じものであっても異なっていてもよい）に対する２つのエピトープ結合部位と、ＴＡのエピトープに対する１つのエピトープ結合部位とを含む。
一般に、本発明のこのような３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は３つ、４つ、５つ、又は６つ以上のポリペプチド鎖で構成されり、これらのポリペプチド鎖は、このようなポリペプチドのペア間の１つ以上のジスルフィド結合によって、「ダイアボディ型結合ドメイン」及び「非ダイアボディ型結合ドメイン」を含む共有結合分子複合体を形成する。
「ダイアボディ型結合ドメイン」は、ダイアボディ、特にＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのエピトープ結合ドメインである。用語「ダイアボディ」及び「ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ」については上述した。「非ダイアボディ型」結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインの構造を有しない結合ドメインを指すことを意図している。典型的には、非ダイアボディ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメイン又はＳｃＦｖ型結合ドメインである。本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ型結合ドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的な免疫グロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合ドメインを指す。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか含まないのに対して、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合ドメインを含む点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。ＳｃＦｖ型結合ドメインは、同じポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインとが相互作用してエピトープ結合ドメインを形成する点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書中で使用される場合、Ｆａｂ型結合ドメイン及びＳｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個のものである。
従って、本発明の３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は：
（Ｉ）「第１の」エピトープに免疫特異的に結合できる「第１の」エピトープ結合ドメイン；
（ＩＩ）「第２の」エピトープに免疫特異的に結合できる「第２の」エピトープ結合ドメイン；
（ＩＩＩ）「第３の」エピトープに免疫特異的に結合できる「第３の」エピトープ結合ドメイン；及び
（ＩＶ）２つのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの互いに対する会合によって形成される、Ｆｃドメイン
を含み、
（Ａ）「第１の」エピトープ結合ドメイン及び「第２の」エピトープ結合ドメインはいずれも「ダイアボディ型結合ドメイン」であり；
（Ｂ）「第３の」エピトープ結合ドメインは非ダイアボディ型結合ドメインであり；
（Ｃ）上記「第１の」、「第２の」、又は「第３の」エピトープ結合ドメインのうちの１つは、ＴＡのエピトープに結合し、上記「第１の」、「第２の」、又は「第３の」エピトープ結合ドメインのうちの別の１つは、ＣＤ１３７のエピトープに結合する。
残りのエピトープ結合ドメインが結合するエピトープは、いずれの所望のエピトープ、例えばＣＤ１３７のエピトープであってよい。ＣＤ１３７エピトープと同じであっても異なっていてもよいこのようなエピトープに、上記分子の他のエピトープ結合ドメインが結合する。
図３Ａ～３Ｃは、代表的な３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のドメインの模式図を提供する。図３Ａは、４つのポリペプチド鎖の共有結合による複合体化から構成され、１つの非ダイアボディ型結合部位（ＶＬ３／ＶＨ３；従ってこのようなエピトープに対して１価である）と、２つのダイアボディ型結合部位（ＶＬ１／ＶＨ１及びＶＬ２／ＶＨ２；従ってこのようなエピトープそれぞれに対して１価である）とを有する、代表的な３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のドメインの概略図を示す。図３Ｂ～３Ｃは、３つのポリペプチド鎖の共有結合による複合体化から構成され、１つの非ダイアボディ型結合部位（ＶＬ３／ＶＨ３；従ってこのようなエピトープに対して１価である）と、２つのダイアボディ型結合部位（ＶＬ１／ＶＨ１及びＶＬ２／ＶＨ２；従ってこのようなエピトープそれぞれに対して１価である）とを有する、代表的な３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のドメインの概略図を示す。非ダイアボディ型結合部位は、図３Ａ～３ＢにおいてはＦａｂ型結合ドメインであり、図３ＣにおいてはｓｃＦｖ型結合ドメインである。以下で提供されるように、ポリペプチド鎖の会合によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同じものであっても異なっていてもよく、従って、単一特異性、二重特異性、又は三重特異性の３価結合が可能となる。
ＩＩ．代表的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
本発明は、ＣＤ１３７及びＴＡに同時かつ特異的に結合できる二重特異性４価Ｆｃダイアボディである、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を提供する。上述のように、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、３つ、４つ、又は５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ＣＤ１３７とＴＡ、ＰＤ‐Ｌ１又はＨＥＲ２とに結合できる代表的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のポリペプチド鎖を以下に提示する（「ＤＡＲＴ‐Ａ」、「ＤＡＲＴ‐Ａ１」、「ＤＡＲＴ‐Ａ２」、「ＤＡＲＴ‐Ａ３」、「ＤＡＲＴ‐Ａ４」、「ＤＡＲＴ‐Ａ５」、「ＤＡＲＴ‐Ａ６」、「ＤＡＲＴ‐Ａ７」、「ＤＡＲＴ‐Ａ８」、「ＤＡＲＴ‐Ａ９」、「ＤＡＲＴ‐Ａ１０」、「ＤＡＲＴ‐Ｂ１」、及び「ＤＡＲＴ‐Ｂ２」と命名される）。本発明は更に、ＣＤ１３７及びＴＡに同時かつ特異的に結合できる二重特異性３価結合分子である、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を提供する。上述のように、本発明の３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は４つのポリペプチド鎖を含んでよい。ＣＤ１３７とＴＡ、ＰＤ‐Ｌ１又はＨＥＲ２とに結合できる代表的な３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のポリペプチド鎖を以下に提示する（「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４」、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５」、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６」、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１」、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１」と命名される）。
Ａ．４価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
１．ＤＡＲＴ‐Ａ
ＤＡＲＴ‐Ａは、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａは４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図１Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａは、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐L1）（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９））、リンカー（LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む代表的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４３、ここでＸは不在である）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖は：配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１１６）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS
WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV
TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL
FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK
TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS
LSPG
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７））を含む、代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖を採用してもよい。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖は：配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成される。配列番号５８のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１）が配列番号７２のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２）で置換された、更なる代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖を採用してもよい。このような多数のポリペプチド鎖を含む代替的な分子を以下で説明する。
ＤＡＲＴ‐Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１、配列番号５７））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号５７‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１１７）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN
SLKTEDTAVY YCARQGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（例えばKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を含む、代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖を採用してもよい。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号５７‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。配列番号５０のアミノ酸残基（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１）が、配列番号５５（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２）若しくは配列番号５６（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３）のアミノ酸残基で置換された、及び／又は配列番号５７のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１）が配列番号６７（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２）、配列番号６８（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３）、配列番号６９（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４）、配列番号７０（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５）、若しくは配列番号７２（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６）のアミノ酸残基で置換された、更なる代替的なＤＡＲＴ‐Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖を採用してもよい。あるいは、ＰＤ‐Ｌ１のＶＬ／ＶＨドメインを、異なるＰＤ‐Ｌ１のエピトープに結合する又は異なるＴＡに結合するＴＡ結合分子のＶＬ／ＶＨドメインで置換してもよい。このような多数のポリペプチド鎖を含む代替的な分子を以下で説明する。
２．ＤＡＲＴ‐Ａ１
ＤＡＲＴ‐Ａ１は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ１は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ１は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（２．１）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ１の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐L1）（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９））、リンカー（LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む代表的なＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４３）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ１の第１及び第３のポリペプチド鎖は：配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ１の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１１８）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS
WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV
TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL
FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK
TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS
LSPGK
である。
ＤＡＲＴ‐Ａ１の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２、配列番号６７））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ１の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６７‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ１の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１１９）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARQGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６７‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
３．ＤＡＲＴ‐Ａ２
ＤＡＲＴ‐Ａ２は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ２は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ２は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（２．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐L1）（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９））、リンカー（LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む代表的なＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４３）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖は：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN EAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS
WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV
TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL
FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK
TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS
LSPGK
ＤＡＲＴ‐Ａ２の第２及び第４のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ１の第２及び第４のポリペプチド鎖（配列番号１１９）と同一である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ２の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ２の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ２の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６７‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
４．ＤＡＲＴ‐Ａ３
ＤＡＲＴ‐Ａ３は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ３は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．１）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ３の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ１の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１１８）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ３の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３、配列番号６８））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ３の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ３の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２１）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ３の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ３の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ３の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
５．ＤＡＲＴ‐Ａ４
ＤＡＲＴ‐Ａ４は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ４は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ４は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ４の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ４の第２及び第４のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ３の第２及び第４のポリペプチド鎖（配列番号１２１）と同一である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ４の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ４の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ４の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
６．ＤＡＲＴ‐Ａ５
ＤＡＲＴ‐Ａ５は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ５は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ５は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ５の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ５の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２、配列番号６８））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ５の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ５の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２２）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ５の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ５の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ５の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
７．ＤＡＲＴ‐Ａ６
ＤＡＲＴ‐Ａ６は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ６は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ６は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ６の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ６の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３、配列番号６８））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ６の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ６の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２３）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ６の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ６の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ６の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
８．ＤＡＲＴ‐Ａ７
ＤＡＲＴ‐Ａ７は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ７は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ７は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ７の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ７の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４、配列番号６９））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ７の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ７の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２４）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ７の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ７の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ７の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
９．ＤＡＲＴ‐Ａ８
ＤＡＲＴ‐Ａ８は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ８は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ８は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（５．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ８の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ８の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５、配列番号７０））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ８の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７０‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ８の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２５）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ８の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ８の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ８の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７０‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
１０．ＤＡＲＴ‐Ａ９
ＤＡＲＴ‐Ａ９は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ９は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ９は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（６．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ９の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ９の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６、配列番号７１））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ９の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７１‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ９の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２６）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARAGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ９の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ９の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ９の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７１‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
１１．ＤＡＲＴ‐Ａ１０
ＤＡＲＴ‐Ａ１０は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ａ１０は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図３Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ａ１０は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ａ１０の第１及び第３のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ａ２の第１及び第３のポリペプチド鎖（配列番号１２０）と同一である。
ＤＡＲＴ‐Ａ１０の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４、配列番号６９））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ａ１０の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ａ１０の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３９）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM
SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN
SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA
ALKEKVAALK EKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１０の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１０の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ａ１０の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
１２．ＤＡＲＴ‐Ｂ１
ＤＡＲＴ‐Ｂ１は、１つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＨＥＲ２に対する１つの結合部位とを有する、２価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｂ１は３つのポリペプチド鎖で構成され、ここで第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖は異なっている（図１Ｄを参照）。ＤＡＲＴ‐Ｂ１は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨHER2（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ１、配列番号８０））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７））、介在リンカーペプチド（GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む「ノブ担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４６）、並びにＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第１のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１４３）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTNYGM
NWVRQAPGQG LEWMGWINTN IGEPTYTEEF KGRVTMTRDT SISTAYMELS
RLRSDDTAVY YCARDDGYGN RVSYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
である。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬHER2（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ３、配列番号８５））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））、及びC末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第２のポリペプチド鎖は：配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８を含む。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１４４）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS
WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV
TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、リンカーDKTHTCPPCP（配列番号２０）、並びにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３５Ｒ置換を含む「ホール担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４９）を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖は：配列番号２０‐配列番号１４９で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ｂの第３のポリペプチド鎖は、いかなるエピトープ結合ドメインも含有せず、従って図１Ｄに示されているダイアボディ構造を有する様々なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子で採用できることが認識されるだろう。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖は、配列番号１４５のアミノ酸配列：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。
１２．ＤＡＲＴ‐Ｂ２
ＤＡＲＴ‐Ｂ２は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＨＥＲ２に対する２つの結合部位とを有する、４価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ×ＴＡ結合分子である。ＤＡＲＴ‐Ｂ１は４つのポリペプチド鎖で構成され、そのうち第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖とが同一であり、第２のポリペプチド鎖と第４のポリペプチド鎖とが同一である（図１Ｂを参照）。ＤＡＲＴ‐Ｂ１は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）の結合ドメインを含む。
ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬHER2）（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９））、リンカー（LEPKSADKTHTCPPCP（配列番号３０））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む代表的なＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４３、ここでＸは不在である）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第１及び第３のポリペプチド鎖は：配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５１）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS
WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV
TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL
FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK
TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS
LSPGK
である。
ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨHER2（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ１、配列番号８０））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０）、及びＣ末端を含む。
従って、ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第２及び第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＤＡＲＴ‐Ｂ２の第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５２）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTNYGM
NWVRQAPGQG LEWMGWINTN IGEPTYTEEF KGRVTMTRDT SISTAYMELS
RLRSDDTAVY YCARDDGYGN RVSYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
である。
システイン残基を含まないヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＤＡＲＴ‐Ｂ２の第１／第３の、及び第２／第４のポリペプチド鎖（例えばEVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７）及びKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＤＡＲＴ‐Ｂ２の第１の／第３のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３で構成され、またこのような代替的なＤＡＲＴ‐Ｂ２の第２の／第４の鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
Ｂ．３価ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
１．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａは、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａは４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）はＰＤ‐Ｌ１に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａは、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７））、介在リンカーペプチド（GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む「ノブ担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４６）、並びにＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２７）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（例えばKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２８）：
EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
である。
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメイン（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を含む、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１及び第２のポリペプチド鎖を採用してもよい。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ分子では、第１のポリペプチド鎖は場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。配列番号５０のアミノ酸残基（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１）が配列番号５５（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２）、又は配列番号５６（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３）のアミノ酸残基で置換された、更なる代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１及び第２のポリペプチド鎖を採用してもよい。１つのＣＤ１３７のＶＬ／ＶＨドメインのペアが、ＴＡ結合分子のＶＬ／ＶＨのペアで置換される場合があることも、特に企図される。このような多数のポリペプチド鎖を含む代替的な分子を以下で説明する。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１、配列番号５７））、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号７）、並びにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３５Ｒ置換を含む「ホール担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４９）を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は：配列番号５７‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１２９）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCARQG
LPYYFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐L1）（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号５８））、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメイン（配列番号１）、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖は：配列番号６９‐配列番号１で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
である。
配列番号５７のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１）が、配列番号６７（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２）、配列番号６８（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３）、配列番号６９（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４）、配列番号７０（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５）、若しくは配列番号７２（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６）のアミノ酸残基で置換された、及び／又は配列番号５８のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１）が配列番号７２のアミノ酸残基（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２）で置換された、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第３及び第４のポリペプチド鎖を採用してもよい。あるいは、ＰＤ‐Ｌ１のＶＬ／ＶＨドメインを、異なるＰＤ‐Ｌ１のエピトープに結合する又は異なるＴＡに結合するＴＡ結合分子のＶＬ／ＶＨドメインで置換してもよい。ＴＡ結合部位が第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖との会合によって形成される場合に、第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ／ＶＨドメインが、本明細書で提供されるＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ／ＶＨドメインのいずれかで置換される場合があることも、特に企図される。このような多数のポリペプチド鎖を含む代替的な分子を以下で説明する。
２．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４は４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）はＰＤ‐Ｌ１に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第１のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖（配列番号１２７）と同一である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第２のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖（配列番号１２８）と同一である。
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第１及び第２のポリペプチド鎖（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４では、第１のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD‐L1（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３、配列番号６８））、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号７）、並びにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３５Ｒ置換を含む「ホール担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４９）を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第３のポリペプチド鎖は：配列番号６８‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３１）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY
ISIKGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG
LPYYGDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＰＤ‐Ｌ１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD‐L1）（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号７２））、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメイン（配列番号１）、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第４のポリペプチド鎖は：配列番号７２‐配列番号１で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３２）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN EAVAWYQQKP GKAPKLLIYW
ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
である。
３．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５は４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）はＰＤ‐Ｌ１に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７））、介在リンカーペプチド（GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む「ノブ担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４６）、並びにＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第１のポリペプチド鎖は：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３３）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（例えばKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第２のポリペプチド鎖は：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３４）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
である。
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第１及び第２のポリペプチド鎖（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５では、第１のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第３のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第３のポリペプチド鎖（配列番号１３１）と同一である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５の第４のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第４のポリペプチド鎖（配列番号１３２）と同一である。
４．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６は４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）はＰＤ‐Ｌ１に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３７））、介在リンカーペプチド（GGGDKTHTCPPCP（配列番号２１））、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含む「ノブ担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４６）、並びにＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第１のポリペプチド鎖は：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３５）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６））、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１６））、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６））、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号１８））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（例えばKVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号３８））、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第２のポリペプチド鎖は：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１３６）：
EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY
GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW
SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS
VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第１及び第２のポリペプチド鎖（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６では、第１のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第３のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第３のポリペプチド鎖（配列番号１３１）と同一である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の第４のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の第４のポリペプチド鎖（配列番号１３２）と同一である。
５．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＨＥＲ２に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１は４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）はＨＥＲ２に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第１のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖（配列番号１２７）と同一である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第２のポリペプチド鎖は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖（配列番号１２８）と同一である。
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第１及び第２のポリペプチド鎖（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１では、第１のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨHER2（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＨ１、配列番号８０））、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号７）、並びにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３５Ｒ置換を含む「ホール担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４９）を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖は：配列番号８０‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５３）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD
GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＨＥＲ２に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬHER2）（ｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５））、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメイン（配列番号１）、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第４のポリペプチド鎖は：配列番号８５‐配列番号１で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５４）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
である。
６．ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２は、２つのＣＤ１３７結合部位と、代表的なＴＡであるＨＥＲ２に対する１つの結合部位とを有する、３価ＣＤ１３７×ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１は４つのポリペプチド鎖で構成される（図３Ａを参照、ＶＬ１／ＶＨ１（部位Ａ）はＶＬ３／ＶＨ３（部位Ｃ）と同一であってＣＤ１３７に結合し、またＶＬ２／ＶＨ２（部位Ｂ）はＨＥＲ２に結合する）。ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）の結合ドメインを含む。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第１のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第１のポリペプチド鎖（配列番号１４３）と同一である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第２のポリペプチド鎖は、ＤＡＲＴ‐Ｂ１の第２のポリペプチド鎖（配列番号１４４）と同一である。
システイン残基を含むヘテロ二量体促進（Ｅコイル及びＫコイル）ドメインを含み得る、代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第１及び第２のポリペプチド鎖（例えばEVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号３９）及びKVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４０））を採用することも、特に企図される。このような代替的なＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２では、第１のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６で構成され、第２のポリペプチド鎖は、場合によっては：配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１、配列番号４６）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号３）、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号７）、並びにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３５Ｒ置換を含む「ホール担持」ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（配列番号１４９）を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第３のポリペプチド鎖は：配列番号４６‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５５）：
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQP PGKGLEWIGR
IYTSGSTNYN PSLKSRVTMS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDGW
YDEDYNYYGM DVWGQGTMVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC
LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG
TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS
PGK
である。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１３７に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD137）（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０））、ヒトＩｇＧ ＣＬκドメイン（配列番号１）、及びＣ末端を含む。
従って、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第４のポリペプチド鎖は：配列番号５０‐配列番号１で構成される。
ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１５６）：
EDFAVYYCQQ DYDLPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA
SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
である。
Ｃ．代替的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子
本開示に鑑みて、上述の代表的な分子のうちのいずれかの一般的な構造を有し、かつ代替的なＴＡに対する結合部位を含む、更なるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を、抗ＰＤ‐Ｌ１又は抗ＨＥＲ２のＶＬ及びＶＨドメインの代わりに代替的な腫瘍抗原抗体のＶＬ及びＶＨドメインを採用することによって、構築できることが認識されるだろう。同様に、本明細書で提供されるように、代替的なリンカー及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン及び／又は抗体定常領域（例えばＣＬ、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）を組み込んだ代替的なＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を、同様にして構築できる。
Ｄ．対照分子
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の特性をより有意義に実証するために、対照Ｆｃ担持ダイアボディ並びに他の比較対象及び対照結合分子の生成のためにそのＶＬ及びＶＨドメインを使用できる比較対象及び対照抗体について、本明細書で説明する。
パリビズマブ（例えばProtein Data Bank (PDB）識別番号2HWZを参照）は、ＲＳＶのＦタンパク質のＡ抗原性部位中のエピトープを対象とするヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、対照ダイアボディ及び他の対照結合分子の生成のためにそのＶＬ及びＶＨドメインを使用できる、好適な対照抗体である。代替的な抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体としては、モタビズマブ（例えばPDB識別番号3IXTを参照）、及び軽鎖のＣＤＲ１からシステイン残基を除去する操作を施したパリビズマブの多様体が挙げられる。パリビズマブの多様体は、以下に記載の陰性対照分子の生成に使用された。
パリビズマブの多様体のＶＨドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３７）（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL
ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS
MITNWYFDVW GAGTTVTVSS
である。
パリビズマブの多様体のＶＬドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３８）（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG
TKLEIK
である。
ウレルマブ（ＢＭＳ‐６６３５１３としても公知、米国特許第８，１３７，６６７を参照）及びウトミルマブ（ＰＦ‐０５０８２５６６としても公知、米国特許第８，３３７，８５０号を参照）、並びにマウス及びヒト化ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（国際公開第２０１８／１５６７４０号を参照）を含む、上述の抗ＣＤ１３７抗体のエピトープ結合部位を含むいくつかの分子を、本明細書において比較目的で使用する。ウレルマブ（WHO Drug Information, 2011, Recommended INN: List 66, 25（3):334）、及びウトミルマブ（WHO Drug Information, 2017, Recommended INN: List 77, 31（1):140‐141）の、完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸は、当該技術分野で公知である。本明細書において比較対象として使用されるヒト化ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は、国際公開第２０１８／１５６７４０号（段落［００２５４］及び［００２６１］を参照）で提供されている。
Ｅ．ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子及び対照分子の概要
表５は、ＤＡＲＴ‐Ａ～ＤＡＲＴ‐Ａ９、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４～Ａ６のドメインの属性をまとめたものである。
Figure 2023514167000015
Figure 2023514167000016
表６は、比較対象及び陰性対照として調製された更なるＤＡＲＴ及びＴＲＩＤＥＮＴ分子の属性を示す。
Figure 2023514167000017
ＩＩＩ．製造方法
本発明の結合分子は、組み換えによって作製でき、また当該技術分野で公知のいずれの方法を用いて発現させることができる。上記分子は、該結合分子をコードする核酸を得て、この核酸を用いて、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内での該分子の組み換え発現に有用なベクターを生成することにより、組み換えによって作製できる。採用できる別の方法は、分子を植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で発現させることである。
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明の結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための技法は、当該技術分野において十分に確立されており、いずれの好適な技法を採用してよい。
関心対象の結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子）を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨＥＫ‐２９３、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞の培養方法は当該技術分野で公知である。
上記結合分子は典型的には、宿主細胞、培養培地等から単離及び／又は精製される。抗体ドメイン（例えばＦｃドメイン）を含む組み換え結合分子の精製のための技法は、当該技術分野で公知であり、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、又は（例えばタンパク質Ａ若しくはタンパク質Ｇを用いた）アフィニティークロマトグラフィーの使用が挙げられる。精製後、本発明の結合分子は、任意に、以下に記載の薬学的に許容可能な賦形剤又は他の物質と共に、医薬組成物へと処方できる。
ＩＶ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験者又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。本明細書において提供されるように、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性Ｆｃ担持ダイアボディと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
本発明はまた、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子と、免疫応答の刺激に有効な１つ以上の追加の分子（例えば免疫チェックポイント阻害剤）、及び／又は上述のような少なくとも１つの特定のＴＡに対して特異的な、腫瘍抗原に特異的に結合する１つ以上の追加の分子（例えば腫瘍特異的モノクローナル抗体若しくはダイアボディ）と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物も包含する。
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、食塩水、水性デキストロース及びグリセロール溶液といった水性キャリアが好ましい。
一般に、本発明の組成物の成分は、別個に、又は凍結乾燥粉末若しくは無水濃縮物として単位剤形にまとめて混合された状態で、又は例えば活性作用剤の量を示すアンプル若しくはサシェ等の気密性コンテナ中の液体の形態で、供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
本発明はまた、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を、単独で、又は他の作用剤、例えば薬学的に許容可能なキャリアと共に内包した、１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ以上のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ以上のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
キットは、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ以上のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、１つ以上の腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する１つ以上の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
Ｖ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の分子又は本発明の分子を含む医薬組成物を被験者に投与することによる、癌若しくは他の疾患又は障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験者は動物である。別の具体的実施形態では、被験者は非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。別の実施形態では、被験者はヒトである。
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。
本発明はまた、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、気密性コンテナ内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験者への投与に適切な濃度へと再構成できる。凍結乾燥された本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、その元々のコンテナ内で２～８℃で保管されなければならず、また上記分子は、再構成後１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内に投与しなければならない。
ある代替実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。特定の実施形態では、液体形態の本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子が気密性コンテナ内に入った状態で供給され、再構成は不要である。
障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
本明細書中で使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染疾患の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
このような有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びに疾患（例えば癌）の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ以上の追加の作用剤（例えば化学療法剤、又は特定の状態の標準治療と考えられる他の作用剤）を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ以上の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
本発明に包含されるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子に関して、患者に投与される投薬量は、レシピエント被験者の体重（ｋｇ）に基づいて決定されてよく、あるいは固定用量に基づくものであってもよい。
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によってＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
患者に投与される本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は他の治療用組成物と併用され、従って患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
治療的又は予防的有効量の本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を用いた被験者の治療は、単回治療を含むことができ、又は一連の複数回の治療を含むことができる。ある例では、被験者は、本発明の分子を用いて、約１～５２週間にわたって週１回、２週に１回（即ち１週間毎に１回）、又は３週間毎に１回、処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間にわたって増減させてよいことも理解されるだろう。
ＶＩ．本発明の組成物の使用
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、Ｔ細胞（ＡＰＣ）に（例えば上記Ｔ細胞の表面上で発現されるＣＤ１３７に結合することによって）結合する能力と、ＴＡ発現性腫瘍細胞に（例えば上記腫瘍細胞の表面上で発現されるＴＡに結合することによって）結合する能力とを有する。よって、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、Ｔ細胞をＴＡ発現性腫瘍細胞に対して共局在化する能力を有し、従ってＴＡの発現に関連する又はＴＡの発現を特徴とするいずれの疾患又は状態の治療に使用できる。よって、限定するものではないが、このような分子を含む医薬組成物は、以下を含むがこれらに限定されないＴＡを発現する癌の診断又は治療に採用できる：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌、特にＴＡを多く発現する癌。
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は更に、上述の状態の治療のための医薬品の製造において使用できる。
特定の実施形態では、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、癌の治療に有用な１つ以上の他の予防及び／又は治療剤と併用される。特定の実施形態では、上記他の予防又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、上記予防又は治療剤は、生物療法剤又はホルモン療法剤である。他の実施形態では、生物療法剤は、１つ以上の腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する抗体、抗体の抗原結合断片（例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＴａｎｄＡｂ等）、多重特異性結合分子（例えばダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合分子等）を含むがこれらに限定されない、細胞傷害性抗体系分子である。
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、腫瘍標的化剤の活性を増強できる。従って本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、所望のＴＡに結合できる抗体、抗体の抗原結合断片（例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＴａｎｄＡｂ等）、多重特異性結合分子（例えばダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合分子等）を含むがこれらに限定されない、他の腫瘍標的化剤と、更に併用できる。腫瘍標的化剤は、このような組み合わせで使用されるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子と、同一のＴＡに結合する場合も、異なるＴＡに結合する場合もあることが特に企図される。特定の実施形態では、腫瘍標的化剤は、ＴＡと、例えばＣＤ３及び／又はＣＤ８を含むＴ細胞上で発現されるエピトープとに結合して、Ｔ細胞標的転換殺滅を仲介する、多重特異性分子である。代表的な腫瘍標的化剤は、限定するものではないが、ＴＡ及びＣＤ３に結合する分子（「ＴＡ×ＣＤ３」）を含む。このような組み合わせにおいて使用できる、代表的なＴＡ×ＣＤ３結合分子（例えば二重特異性抗体、ＤＡＲＴ（登録商標）分子、ＢｉＴｅ（登録商標）分子、ＴａｎｄＡｂ等、及び３価分子）、並びにその作製方法は、当該技術分野で公知である（例えば国際公開第２０１３／０２６８３５号；国際公開第２０１３／１５８８５６号；国際公開第２０１４／０４７２３１号；国際公開第２０１４／１１０６０１号；国際公開第２０１４／１３１７１１号；国際公開第２０１５／０２６８９４号；国際公開第２０１５／０２６８９２号；国際公開第２０１５／１８４２０３号；国際公開第２０１５／１８４２０７号；国際公開第２０１６／０３６９３７号；国際公開第２０１６／１８２７５１号；国際公開第２０１７０９１６５６号；国際公開第２０１７／１４２９２８号；国際公開第２０１７／１１８６７５号を参照）。
本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を腫瘍標的化剤（例えばＴＡ×ＣＤ３結合分子）と併用することにより、阻害性免疫調節因子であるプログラム細胞死‐１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ‐１：「ＰＤ‐１」、「ＣＤ２７９」としても公知）の上方制御を得ることができる。ＰＤ‐１は、ＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２（Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣとしても公知）に結合することによって、その免疫系の阻害を仲介する（Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260；米国特許第６，８０３，１９２号；米国特許第７，７９４，７１０号）。よって、ＰＤ‐１の阻害活性を阻害する作用剤（「ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤」）を更に追加すると、ＰＤ‐１の発現を下方制御して、ＴＡ×ＣＤ３結合分子等のＣＤ１３７×ＴＡ及び腫瘍標的化剤の活性を更に増強できる。本発明は特に、ＰＤ‐１に結合する抗体のエピトープ結合部位を含む、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤を包含する。
従って、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は更に、他の腫瘍標的化剤と組み合わせて、また更にＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤と組み合わせて、使用できる。ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤としては、限定するものでないが、ＰＤ‐１及び／又はＰＤ‐Ｌ１に結合できる抗体、抗体の抗原結合断片（例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＴａｎｄＡｂ等）、多重特異性結合分子（例えばダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合分子等）が挙げられる。このような組み合わせで使用できる代表的なＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤、及びその作製方法は、当該技術分野で公知である。本発明の方法で使用できるＰＤ‐１結合分子は、以下を含む：ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号９４６４１４‐９４‐４、５Ｃ４、ＢＭＳ‐９３６５５８、ＯＮＯ‐４５３８、ＭＤＸ‐１１０６としても公知、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂがＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販）；ペムブロリズマブ（旧称ラムブロリズマブ、ＣＡＳ登録番号１３７４８５３‐９１‐４、ＭＫ‐３４７５、ＳＣＨ‐９００４７５としても公知、ＭｅｒｃｋがＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）として市販）；セミプリマブ（ＣＡＳ登録番号１８０１３４２‐６０‐８、ＲＥＧＮ‐２８１０、ＳＡＲ‐４３９６８４としても公知、ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）として市販）。ニボルマブ（WHO Drug Information, 2013, Recommended INN: List 69, 27（1):68‐69）、ペムブロリズマブ（WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 75, 28（3):407）、及びセミプリマブ（WHO Drug Information 2018, Proposed INN: List 119）の完全重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知である。本発明の方法及び組成物で使用できる独自の結合特性を有する更なる抗ＰＤ‐１抗体（例えばｈＰＤ‐１ ｍＡｂ ７（１．２））が、近年特定されている（国際公開第２０１７／０１９８４６号を参照）。
上述の組み合わせを採用する場合、上記分子のうちの１つ以上を被験者に「並行して（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」投与してよく（例えばＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を、ＴＡ×ＣＤ３結合分子及び／若しくはＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤が投与されるのと同時に投与してよく）、並びに／又は上記分子のうちの１つ以上のを「順次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）」投与してよい（例えばＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を投与した後で、ＴＡ×ＣＤ３結合分子及び／若しくはＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１チェックポイント阻害剤を投与する、若しくはその逆）。
ＶＩＩ．本発明の実施形態
ここまで本発明を概説してきたが、以下の番号付き実施形態（「Ｅ」）を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施形態は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
Ｅ１．ＣＤ１３７のエピトープに免疫特異的に結合する第１の結合部位を含む、ＣＤ１３７結合分子であって、上記第１の結合部位は、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第１の重鎖可変ドメインとを含み；
（Ａ）上記第１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第１の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）の重鎖ＣＤＲである、ＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２．上記第１の重鎖可変ドメインが、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３．上記第１の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬｘ（配列番号５４）；
（Ｂ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）；
（Ｃ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５）；又は
（Ｄ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ１又はＥ２に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４．（Ａ）上記第１の重鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第１の軽鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ５．（A）上記第１の重鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第１の軽鎖可変ドメインが：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ６．上記分子が、腫瘍抗原（ＴＡ）に免疫特異的に結合する第２の結合部位を含む二重特異性分子であり、また上記第２の結合部位が、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第２の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第２の重鎖可変ドメインとを含む、Ｅ１～Ｅ５のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ７．上記ＴＡが表１～２に提示された抗原から選択される、Ｅ６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ８．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり、また：
（Ａ）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５９）の重鎖ＣＤＲである、Ｅ６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ９．（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号６３）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号５８）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
（３）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５９）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（４）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
（５）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
（６）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（７）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、Ｅ８に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１０．上記第２の重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５９）；
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）；
（Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
（Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
（Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
（Ｆ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
（Ｇ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ９に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１１．上記第２の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）；
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）；又は
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ９又はＥ１０に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１２．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１３．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１４．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１５．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１６．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１７．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１８．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ１９．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２０．
（Ａ）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む、Ｅ１０又はＥ１１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２１．上記ＴＡが５Ｔ４であり：
（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）の軽鎖ＣＤＲであり；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（Ｂ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＬ（配列番号９５）の軽鎖ＣＤＲであり；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＨ（配列番号９６）の重鎖ＣＤＲである、Ｅ６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２２．上記第２の重鎖可変ドメインが５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含む、Ｅ２１に記載のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子。
Ｅ２３．上記第２の軽鎖可変ドメインが５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）のアミノ酸配列を含む、Ｅ２１又はＥ２２に記載のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子。
Ｅ２４．上記ＴＡがＨＥＲ２であり：
（Ａ）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）の重鎖ＣＤＲである、Ｅ６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２５．（Ａ）（１）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）の軽鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
（３）上記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）の重鎖ＣＤＲである、Ｅ２４に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２６．上記第２の重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）；
（Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）；
（Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）；又は
（Ｄ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ２５に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２７．上記第２の軽鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）；
（Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）；
（Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）；又は
（Ｄ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ２５又はＥ２６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２８．
（Ａ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含み；
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む；
又は
（Ｂ）（１）上記第２の重鎖可変ドメインが、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）のアミノ酸配列を含み；
（２）上記第２の軽鎖可変ドメインが、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）のアミノ酸配列を含む、Ｅ２４～Ｅ２６のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ２９．抗体、二重特異性抗体、二重特異性２価Ｆｃ担持ダイアボディ、又は二重特異性４価Ｆｃ担持ダイアボディ、又は二重特異性３価分子である、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３０．上記分子が二重特異性かつ２価であり、第１、第２、及び第３のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖が共有結合複合体を形成する、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３１．上記分子が二重特異性かつ４価であり、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖が共有結合複合体を形成する、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３２．上記分子が二重特異性かつ３価であり、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖が共有結合複合体を形成する、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３３．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり、また：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖及び上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号６３‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｉｉ）配列番号６３‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｉｉｉ）配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｉｖ）配列番号５８‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｖ）配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３；又は
（ｖｉ）配列番号７２‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖及び上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号５９‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号５９‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号５７‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号５７‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６７‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｖｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６７‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｖｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｖｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｘ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｘ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｘｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｘｉｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６８‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｘｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｘｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｘｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７０‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｘｖｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７０‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｘｖｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７１‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号７１‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｘｉｘ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号４０；又は
（ｘｘ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号６９‐配列番号１８‐配列番号３８
を含む、Ｅ３１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３４．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖及び上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１６、配列番号１１８、又は配列番号１２０のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖及び上記第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、Ｅ３１又はＥ３３に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３５．上記分子が：
（Ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７；
（Ｂ）配列番号１１８及び配列番号１１９；
（Ｃ）配列番号１２０及び配列番号１１９；
（Ｄ）配列番号１１８及び配列番号１２１；
（Ｅ）配列番号１２０及び配列番号１２１；
（Ｆ）配列番号１２０及び配列番号１２２；
（Ｇ）配列番号１２０及び配列番号１２３；
（Ｈ）配列番号１２０及び配列番号１２４；
（Ｉ）配列番号１２０及び配列番号１２５；
（Ｊ）配列番号１２０及び配列番号１２６；又は
（Ｋ）配列番号１２０及び配列番号１３９
を含む、Ｅ３４に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３６．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｖ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｖｉ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｖｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；又は
（ｖｉｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｖ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｖｉ）配列番号５５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｖｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；又は
（ｖｉｉ）配列番号５６‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０
を含み、
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５９‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；
（ｉｉ）配列番号５７‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；
（ｉｉｉ）配列番号６７‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；
（ｉｖ）配列番号６８‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；
（ｖ）配列番号６９‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；
（ｖｉ）配列番号７０‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；又は
（ｖｉｉ）配列番号７１‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９
を含み、
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号６３‐配列番号１；又は
（ｉｉ）配列番号７２‐配列番号１
を含む、Ｅ３２に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３７．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号５９‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；又は
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号５９‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号６３‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；又は
（ｉｉ）配列番号６３‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０
を含み、
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号４６‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９
を含み、
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１；又は
（ｉｉ）配列番号５０‐配列番号１
を含む、Ｅ３２に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３８．上記ＴＡがＰＤ‐Ｌ１であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が配列番号１２７、配列番号１３３、又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含み；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が配列番号１２８、配列番号１３４、又は配列番号１３６のアミノ酸配列を含み；
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が配列番号１２９、又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含み；
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が配列番号１３０、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、Ｅ３２又はＥ３６に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ３９．上記分子が：
（Ａ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３０；
（Ｂ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３１、及び配列番号１３２；
（Ｃ）配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３１、及び配列番号１３２；又は
（Ｄ）配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３１、及び配列番号１３２
を含む、Ｅ３８に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４０．上記ＴＡがＨＥＲ２であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖及び上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号７９‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｉｉ）配列番号７９‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３；
（ｉｉｉ）配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号３０‐配列番号４３；又は
（ｉｖ）配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号３０‐配列番号４３
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖及び上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号７８‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号７８‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号４０；又は
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号３８
を含む、Ｅ３１に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４１．上記ＴＡがＨＥＲ２であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；又は
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；又は
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０
を含み、
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号７８‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９；又は
（ｉｉ）配列番号８０‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９
を含み、
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号７９‐配列番号１；又は
（ｉｉ）配列番号８５‐配列番号１
を含む、Ｅ３２に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４２．上記ＴＡがＨＥＲ２であり：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号７８‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉ）配列番号５４‐配列番号１６‐配列番号７８‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６；
（ｉｉｉ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号８０‐配列番号１８‐配列番号３７‐配列番号２１‐配列番号１４６；又は
（ｉｖ）配列番号５０‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３９‐配列番号２１‐配列番号１４６
を含み、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号７９‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；
（ｉｉ）配列番号７９‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０；
（ｉｉｉ）配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号３８；又は
（ｉｖ）配列番号８５‐配列番号１６‐配列番号４６‐配列番号１８‐配列番号４０
を含み、
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号４６‐配列番号３‐配列番号７‐配列番号１４９
を含み、
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）配列番号５４‐配列番号１；又は
（ｉｉ）配列番号５０‐配列番号１
を含む、Ｅ３２に記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４３．上記分子が：
（Ａ）配列番号１５１、及び配列番号１５２；
（Ｂ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１５３、及び配列番号１５４；又は
（Ｃ）配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１５５、及び配列番号１６５
を含む、Ｅ４０～Ｅ４２のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子。
Ｅ４４．Ｅ１～４３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子と、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
Ｅ４５．上記ＴＡの発現に関連する又は上記ＴＡの発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、Ｅ６～Ｅ４３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子又はＥ４４に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ４６．ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＰＤ‐Ｌ１結合分子であって：
（Ａ）上記軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
（Ｂ）（１）上記重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
（２）上記重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
（３）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
（４）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
（５）上記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、ＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ４７．上記重鎖可変ドメインが：
（Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
（Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
（Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
（Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
（Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
のアミノ酸配列を含む、Ｅ４６に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ４８．上記軽鎖可変ドメインがｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む、Ｅ４６又はＥ４７に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ４９．上記分子が抗体又はその抗原結合断片である、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ５０．上記分子が多重特異性結合分子である、Ｅ４６～Ｅ４８のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ５１．上記分子が、二重特異性ダイアボディ、二重特異性抗体、又は３価結合分子である、Ｅ５０に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
Ｅ５２．Ｅ４６～Ｅ５１のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子と、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
Ｅ５３．抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、Ｅ４６～Ｅ５１のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子又はＥ５２に記載の医薬組成物の使用。
Ｅ５４．抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする上記疾患又は状態が癌である、Ｅ５３に記載の使用。
Ｅ５５．上記癌が：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、Ｅ４５又はＥ５４に記載の使用。
Ｅ５６．腫瘍標的化剤の活性を増強する方法であって、上記腫瘍標的化剤を、Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子、Ｅ４６～Ｅ５１のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子、又はＥ４４若しくはＥ５２に記載の医薬組成物と組み合わせて投与するステップを含む、方法。
Ｅ５７．抑制された免疫系に関連する又はＴＡの発現を特徴とする疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子、Ｅ４６～Ｅ５３のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子、又はＥ４４若しくはＥ５３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ５８．抑制された免疫系に関連する又はＴＡの発現を特徴とする上記状態が癌である、Ｅ５７に記載の方法。
Ｅ５９．腫瘍標的化剤を投与するステップを更に含む、Ｅ５７又はＥ５８に記載の方法。
Ｅ６０．上記腫瘍標的化剤が、抗体、抗体のエピトープ結合断片、又は標的細胞のＴ細胞標的転換殺滅を仲介する作用剤である、Ｅ５６又はＥ５９に記載の方法。
Ｅ６１．上記癌が：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、Ｅ５７～Ｅ６０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６２．Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載のＣＤ１３７結合分子、又はＥ４６～Ｅ５１のいずれか１つに記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子をコードする、核酸。
Ｅ６３．Ｅ６２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
Ｅ６４．Ｅ６２に記載の核酸、又はＥ６３に記載の発現ベクターを含む、細胞。
Ｅ６５．上記細胞が哺乳類細胞である、Ｅ６４に記載の細胞。
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。以下の実施例は、本発明の診断又は治療方法における組成物に関する様々な方法を示す。これらの実施例は本発明を限定することではなく、例示することを目的としている。
実施例１
方法
試験物品（例えば抗体、ダイアボディ、又は３価分子）の、ＮＦ／ｋＢ経路の標的依存性シグナル伝達を仲介する能力を、基本的に以下のように実施されるＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて、ＣＤ１３７発現性レポーター細胞株（Ｊｕｒｋａｔ‐ＮＦ‐κＢ‐Ｌｕｃ）を用いて評価した：二重特異性分子に関して、１００μＬのアッセイ培地（ＲＰＭＩ‐１６４０、１０％ＦＢＳ）中の標的細胞（タイプ及び数は図面及び以下で示される）を、滅菌アッセイマイクロプレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。２日目、ＣＤ１３７を過剰発現するＪｕｒｋａｔ‐ＮＦ‐κＢ‐Ｌｕｃレポーター細胞（５０μＬのアッセイ培地中に４×１０4～７．５×１０4細胞）と、５０μＬの段階希釈済み試験物品とを、標的細胞を含む各ウェル、及び標的細胞を含まない対照ウェルに、迅速に連続して加えた。プレートを３７℃で４～５時間インキュベートした。次にＢｉｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え（５０μＬ）、プレートを室温（「ＲＴ」）で更に５～１０分インキュベートし、シグナル伝達を、例えば、発光の相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＲＬＵ）を読み取り値として、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎデバイスを用いて発光を検出することによって測定した。単一特異性抗ＣＤ１３７抗体に関しては、標的細胞を使用せず、代わりに４倍過剰のヤギ抗マウス又はヤギ抗ヒト抗体を加えて抗体を架橋させた。
ＣＤ１３７結合に関して試験物品を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを、基本的に以下のように実施した：平底ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートを、それぞれ０．５又は１μｇ／ｍＬの可溶性ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７（Ｈｉｓタグ（ｓｈＣＤ１３７ Ｈｉｓ若しくはｓｃｙＣＤ１３７ Ｈｉｓ）に、又はヒトＦｃ領域（ｓｈＣＤ１３７ ｈＦｃ若しくはｓｃｙＣＤ１３７ ｈＦｃ）に融合した、ヒト又はカニクイザルＣＤ１３７の細胞外ドメイン）でコーティングした。プレートを洗浄し、０．５％のウシ血清アルブミン及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液でブロックし、試験物品（例えば細胞上清又は精製済みｍＡｂ）と共にインキュベートした。ハイブリドーマ上清に関しては、抗ＣＤ１３７抗体を、１．０μｇ／ｍＬ及び６回の３倍段階希釈で用いた。不動化されたＣＤ１３７（ヒト又はカニクイザル）に結合する試験物品の量を、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰ二次抗体を用いて評価した。全ての試料をプレートリーダ（Ｖｉｃｔｏｒ ２ Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で分析し、ＥＣ５０値を、非線形回帰分析による用量応答曲線から計算した。
（標的細胞の不在下で準最適刺激済み初代Ｔ細胞を用いた）Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイを、基本的に以下のように実施した：５０μＬの段階希釈済み試験物品（抗体（＋／－抗ヒトＦｃ（Ｆａｂ）’2との架橋））と、ビーズ２×１０6個／ｍＬで５０μＬの事前洗浄済みＤｙｎａｂｅａｄｓ αＣＤ３（ＲＥＦ １１１５１Ｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、又は類似のもの）と、１０6細胞／ｍＬで１００μＬ／ウェルの（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ １１３４４Ｄ）又は類似のものを、製造元のプロトコルに従って使用して、ドナーのＰＢＭＣから精製された）ヒトｐａｎ Ｔ細胞とを、アッセイプレートの各ウェルに加えた。プレート上の各ウェルの最終的な体積は２００μＬであった。試験物品又はαＣＤ３ビーズを含まない対照ウェルに関しては、合計体積が２００μＬとなるまでアッセイ培地を加え、プレートを組織培養インキュベーター内で７２時間インキュベートした。続いて各ウェルから上清をを回収し、ＩＬ‐２、ＩＬ‐１０、ＴＮＦ‐α、及びＩＦＮ‐γの放出されたサイトカインを、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈｕｍａｎ ＩＬ‐２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ （Ｃａｔ：ＤＹ２０２）、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ‐ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ （Ｃａｔ：ＤＹ２８５）、及びＨｕｍａｎ ＴＮＦ‐ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ：ＤＹ２１０）、又は類似の市販の試薬）を製造元の指示に従って使用して、測定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏをデータ分析に使用して、サイトカインレベルを外挿し、これらをＰｒｉｓｍを用いてプロットした。
細胞表面ＣＤ１３７への結合に関して試験物品を評価するためのＦＡＣＳ分析を、基本的に以下のように実施した：１００μＬの、ＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＤ１３７）（１．０×１０5～１×１０6細胞／ウェル）と、１００μＬの段階希釈済み試験物品又は対照とを、１つ以上のマイクロタイターアッセイプレートの各ウェルに加え、混合し、ＲＴで約３０分インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて二次抗体（ヤギ抗ヒトＡＰＣ、ＰＥ、又はＦＩＴＣ）を各ウェルに加え（１：１０００）、その後、構成要素を混合して、ウェルをＲＴで約３０分インキュベートした。細胞を洗浄して２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）で、細胞に関する一連のイベントに関して分析した。データ分析はＦｌｏＪｏ ｖ１０によって実施された。
ＣＤ１３７への結合に関する抗ＣＤ１３７抗体とＣＤ１３７リガンドとの競合を、Ｏｃｔｅｔバイオセンサ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でのリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉法アッセイを用いて、基本的に以下のように決定した：抗ＣＤ１３７抗体を抗ヒトＦｃバイオセンサ上に不動化した後、マウスＦｃドメインに融合したヒトＣＤ１３７の細胞外ドメイン（ｓｈＣＤ１３７ ｍＦｃ；１０μｇ／ｍＬ）と３０秒間会合させた。続いてセンサを組み換えヒトＣＤ１３７リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；５μｇ／ｍＬ）に３０秒間浸して、上記リガンドが、事前に形成されたＣＤ１３７／抗体複合体に結合するか、又はその結合がブロックされるかを監視した。
（ヒトＦｃ領域を有する）抗ＣＤ１３７抗体の結合動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＳＰＲ分析を用いて調査した。抗ＣＤ１３７抗体をＦａｂ’２ヤギ抗ヒトＦｃ表面に捕捉した。ｓｈＣＤ１３７ Ｈｉｓ又はｓｃｙＣＤ１３７ Ｈｉｓ（１２．５ｎＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ）の会合及び解離を監視し、１：１結合モデルを用いてセンソグラムの当てはめを行うことによって、会合及び解離の速度定数を計算し、ＫＤを決定した。
細胞表面ＰＤ‐Ｌ１への結合に関して試験物品を評価するためのＦＡＣＳ分析を、基本的に以下のように実施した：１００μＬの、ＰＤ‐Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１）（１．０×１０5～１．０×１０6細胞／ウェル）と、１００μＬの段階希釈済み試験物品とを、１つ以上のマイクロタイターアッセイプレートの各ウェルに加え、混合し、ＲＴで約３０分インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて二次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ、ＰＥ、又はＡＰＣ）を各ウェルに加え、その後、構成要素を混合して、ウェルをＲＴで約３０分インキュベートした。細胞を洗浄して２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）で、細胞に関する一連のイベントに関して分析した。データ分析はＦｌｏＪｏ ｖ１０によって実施された。
試験物品の、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する（即ちＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックして、Ｔ細胞応答の下方制御を防止する）能力を、基本的に以下のように実施されるＪｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ‐ＮＦＡＴ／ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１ルシフェラーゼＰＤ‐Ｌ１レポータアッセイにおいて評価した：ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１細胞を、１００μＬの培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ＋２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８）中に４０，０００／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。翌日、この培地を除去し、５０μＬのアッセイバッファ（ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ）中の１２５，０００細胞／ウェルのＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び５０μＬの段階希釈済み試験物品を各ウェルに追加し、３７℃で６時間インキュベートした。続いて８０μＬのＢｉｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに追加し、プレートをＲＴで更に５～１０分インキュベートし、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１の遮断を、発光の相対光単位（ＲＬＵ）を読み取り値として（例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎデバイスを用いて）発光を検出することによって、測定した。
（標的細胞の存在下で準最適刺激済み初代Ｔ細胞を用いた）Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイを、基本的に以下のように実施した：（ドナーＰＢＭＣから精製された（上記参照））ヒトｐａｎ Ｔ細胞をアッセイ培地中に再懸濁させ、細胞培養インキュベータに一晩入れた。ＴＡポジティブ標的細胞（例えばＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１細胞、ＪＩＭＴ‐１細胞、Ｎ８７細胞）、及び対照のＴＡネガティブ細胞（例えばＣＨＯ細胞）を、培養物から得た。洗浄後、標的細胞（数は図面及び以下で示される）を、平底透明９６ウェルプレートに予備播種し、細胞培養インキュベータに一晩入れた。翌日、静置されたヒトｐａｎ Ｔ 細胞を、密度及び生存率に関して、 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ‐Ｃｅｌｌカウンタを用いたトリパンブルー色素排除法で測定し、２×１０6細胞／ｍＬの密度となるように調整した。翌日、上清を廃棄し、５０μＬの段階希釈済み試験物品（抗体、ダイアボディ、３価分子等）と、ビーズ２．０×１０6個／ｍＬで５０μＬの事前洗浄済みＤｙｎａｂｅａｄｓ αＣＤ３（ＲＥＦ １１１５１Ｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｂｙ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、２．０×１０6細胞／ｍＬで５０μＬ／ウェルのヒトｐａｎ Ｔ細胞と、５０μＬのアッセイ培地とを、アッセイプレートの各ウェルに加えた。プレート上の各ウェルの最終的な体積は２００μＬであった。試験物品又はαＣＤ３ビーズを含まない対照ウェルに関しては、合計体積が２００μＬとなるまでアッセイ培地を加え、プレートを組織培養インキュベーター内で７２時間インキュベートした。続いて各ウェルから上清をを回収し、ＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐２の放出されたサイトカインを、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈｕｍａｎ ＩＬ‐２ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ （Ｃａｔ：ＤＹ２０２）、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ‐ｇａｍｍａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ （Ｃａｔ：ＤＹ２８５）、、又は類似の市販の試薬）を製造元の指示に従って使用して、測定した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏをデータ分析に使用して、サイトカインレベルを外挿し、これらをＰｒｉｓｍを用いてプロットした。
カニクイザル血清中のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の定量化を、基本的に以下のように実施した：アッセイプレートを、２．０μｇ／ｍＬの（ヒスチジン含有ペプチドに融合したヒトＣＤ１３７の細胞外部分を含有する）Ｈｉｓタグ付き可溶性ヒトＣＤ１３７融合タンパク質（ｈｕＣＤ１３７）で一晩コーティングした。非特異的部位を、０．１％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、即ちＰＢＳＴ中の、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした後、上記プレートを、ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の標準キャリブレータ、品質コントロール（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）、及び試験試料と共にインキュベートした。不動化されたｈｕＣＤ１３７‐Ｈｉｓは、標準キャリブレータ、品質管理、及び試験試料中に存在するＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を捕捉する。捕捉されたＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、０．０５μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（Ｆｃ）‐ＨＲＰの添加によって検出した。結合したＨＲＰの活性を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質を用いたルミネセンス光生成によって定量化した。相対光単位（ＲＬＵ）として表されるルミネセンス光の強度を、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４プレートリーダで測定した。ＡＥＸ３３７０標準からのＲＬＵシグナルを５パラメータのロジスティックモデルに当てはめることによって、標準曲線を生成した。血清試料中のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の濃度を、試料のＲＬＵシグナル及び標準曲線を記述する等式から補間した。このアッセイに関する定量化の下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＬＯＱ）は、６．１ｎｇ／ｍＬであった。
Ｔ細胞及びＮＫ細胞増殖アッセイを、基本的に以下のように実施した：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６及びＣＤ１５９ａを含む、パネルＴ細胞及びＮＫ細胞マーカー抗体を、カニクイザルの研究から得られた、十分に混合されて凝固防止処理された全血試料に加え、ピペットを用いて完全に混合し、室温かつ暗所で２５～３５分間インキュベートした。その後、１×ＢＤ ＦＡＣＳ溶解液を各ウェルに加え、ピペットを用いて混合し、続いて各プレートを室温かつ暗所で更に１０～２０分間インキュベートした。各プレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄ステップとして、ＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに加えて混合した。次に各ウェルを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を用いて再懸濁させ、２～８℃で２０～４０分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、各プレートを上述の洗浄ステップと同様にして洗浄し、細胞ペレットを、Ｋｉ６７抗体又はアイソタイプ対照を用いて再懸濁させ、２～８℃で３０～６０分間インキュベートした。Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を、それぞれＣＤ３+ＣＤ８+Ｋｉ６７+及びＣＤ５６+ＣＤ１５９ａ+Ｋｉ６７＋集団を監視することによって、定量化した。
実施例２
ヒト非ブロッキング抗ＣＤ１３７ ｍＡｂの単離及び特性決定
特に異なるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子に組み込まれた場合に改善された特性を有するＣＤ１３７結合ドメインを特定するために、ヒトＣＤ１３７に対して特異的な完全ヒト可変ドメインを有するモノクローナル抗体のパネルを、ＴＲＩＡＮＮＩ ＭＯＵＳＥ（登録商標）プラットフォームを用いて、（ヒスチジン含有ペプチドに融合したヒトＣＤ１３７の細胞外部分を含有する）Ｈｉｓタグ付き可溶性ヒトＣＤ１３７融合タンパク質（ｈｕＣＤ１３７）でマウスを免疫することによって生成した。得られたハイブリドーマからの上清を、ＣＤ１３７結合、ＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて用量依存的Ｔ細胞シグナル伝達を仲介する能力、及びＴ細胞からのサイトカイン（例えばＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α）放出を誘発する能力に関して評価した。いくつかのハイブリドーマのＶＨ及びＶＬドメインを、ＣＨＯ細胞中でクローニングしてヒトＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）抗体として発現させ、結合親和性、リガンドブロッキング活性、細胞表面上のＣＤ１３７への結合に関して、並びに再びＣＤ１３７レポーター及びサイトカイン放出アッセイで、評価した。無関係な陰性対照抗体、並びに／又は上述のキメラ抗ＣＤ１３７抗体ｃｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（国際公開第２０１８／１５６７４０及び上記を参照）を、これらの評価に含めた。上記評価に使用される方法は、上で提供されている。更なる研究のために、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）と命名された１つの抗体を選択した。ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は上で提供されており、これらの評価からの代表的な結果が、表７Ａ～Ｄにまとめられている。
Figure 2023514167000018
Figure 2023514167000019
Figure 2023514167000020
Figure 2023514167000021
エピトープのビニングを、交差競合研究によって実施した。これらの研究、及びリガンド結合の競合研究の結果は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６が、ウトミルマブの可変ドメインを含む比較対象抗体、ウレルマブの可変ドメインを含む比較対象抗体、及び国際公開第２０１８／１５６７４０号に記載されている、ｃｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３を含む全ての抗ＣＤ１３７抗体とは異なるエピトープに結合することを示している。要約すると、これらの研究は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６が独自の非ブロッキングエピトープに結合し、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイで決定した場合に上述のｃｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３より高い結合親和性を示すことを実証している。ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６はまた、Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイにおいてもより高い活性を示す。
実施例３
ＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の特性決定
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）及びｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１）のＶＨ及びＶＬドメインを組み込んだ、ＣＤ１３７と、代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１とに結合できるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を生成した。特に、２つの同一の二重特異性ダイアボディ結合ドメインを含み、かつ図１Ｂに示されている抗体様Ｙ構造を有する、「ＤＡＲＴ‐Ａ」と命名された４価二重特異性ダイアボディと、１つの単一特異性ダイアボディ型結合ドメイン及び非ダイアボディ型結合ドメインを含み、かつ図３Ａに示されている構造を有する、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ」と命名された３価結合分子とを、生成した。これらの分子、並びに同一の構造を有する特定の二重特異性対照及び比較対象分子の、ドメインの属性は、上述されている（例えば表５～６を参照）。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、（ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）の結合ドメインを含む）比較対象分子であるＴＲＩＤＥＮＴ‐２、及び陰性対照（ｈＩｇＧ１、アイソタイプ対照としての無関係な抗体）を、細胞表面ＣＤ１３７に結合する能力に関して、基本的に上述のように実施されるＦＡＣＳによって評価し、試験物品を１０μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。図４に示されている代表的なアッセイの結果は、全てのＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子が、細胞表面上で発現されるＣＤ１３７に対して効率的に結合できたことを実証している。このアッセイでは、比較対象分子が比較的良好な結合を示しているように見える。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１）、及び陰性対照ｈＩｇＧ１を、ＰＤ‐Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１）の表面に結合する能力に関して、ＦＡＣＳ分析によって評価し、またＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１軸に拮抗する（即ちＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１の相互作用をブロックして、Ｔ細胞応答の下方制御を防止する）能力に関して、Ｊｕｒｋａｔ‐ｌｕｃ‐ＮＦＡＴ／ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１ルシフェラーゼレポーターアッセイで評価した。これらのアッセイはいずれも、基本的に上述のように実施した。試験物品は、ＦＡＣＳ分析では１０μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用され、ＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイでは５０μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用された。図５Ａ～５Ｂに示されている代表的なアッセイの結果は、ＤＡＲＴ‐Ａ及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａが、細胞表面上で発現されるＰＤ‐Ｌ１に効率的に結合できたこと（図５Ａ）、及びＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１の相互作用をブロックできたこと（図５Ｂ）を実証している。２つのＰＤ‐Ｌ１結合部位を有する分子（ＤＡＲＴ‐Ａ、及びｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１））の結合曲線は、比較的迅速に飽和に達し、これは、上記分子の一部が２価結合を示す（即ち表面上の２つのＰＤ‐Ｌ１分子に結合する）ことを示していることに留意されたい。２価結合は、ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１細胞上で発現される標的リガンドが高濃度で存在する場合に、発生しやすくなる。また、２つのＰＤ‐Ｌ１結合部位を有する分子が、３価分子に比べて高いＰＤ‐Ｌ１ブロック活性を示すことも観察された。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、比較対象分子：ＤＡＲＴ‐２、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐２（それぞれｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）の結合ドメインを含む）、ＤＡＲＴ‐３（ウトミルマブの結合ドメインを含む）、アゴニスティック抗ＣＤ１３７ ｍＡｂであるウレルマブの複製（ｒ‐ウレルマブ）、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐１（ＲＳＶ×ＰＤ‐Ｌ１結合分子）及びｈＩｇＧ１の機能的活性を、ＰＤ‐Ｌ１発現性ＪＩＭＴ‐１細胞（１０，０００細胞／ウェル）の存在下及び不在下で基本的に上述のように実施されるＣＤ１３７レポーターアッセイで評価し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。図６に示されている代表的なアッセイの結果は、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む４価及び３価ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子（それぞれＤＡＲＴ‐Ａ及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ）がいずれも標的依存性シグナル伝達を仲介し、対照的に、標的細胞の存在下において、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）の結合ドメインを含む３価分子（ＴＲＩＤＥＮＴ‐２）だけが活性を示し、対応する４価分子であるＤＡＲＴ‐２はいかなる活性も示さなかったことを実証している。更に、試験された全ての４価分子の中で、ＤＡＲＴ‐Ａが最も高い活性を示した。上記ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子はいずれも、標的細胞の不在下では活性を示さなかった。予想されたように、アゴニストであるｒ‐ウレルマブは、ＰＤ‐Ｌ１発現性標的細胞の存在下及び不在下で活性を示し、陰性対照は活性を全く示さなかった。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、比較対象分子：ＤＡＲＴ‐２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐２、ＤＡＲＴ‐３、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐１及びｈＩｇＧ１の機能的活性を、基本的に上述のように実施される、ＰＤ‐Ｌ１発現性ＪＩＭＴ‐１細胞（１０，０００細胞／ウェル）の存在下での初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイで評価し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。代表的なサイトカインであるＩＮＦ‐γ及びＩＬ‐２に関する代表的な結果を、それぞれ図７Ａ及び７Ｂに示す。上記ＣＤ１３７レポーターアッセイで観察されたように、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む４価及び３価ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子（それぞれＤＡＲＴ‐Ａ及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ）はいずれもサイトカイン放出を仲介し、対照的に、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）の結合ドメインを含む３価分子（ＴＲＩＤＥＮＴ‐２）だけが活性を示し、４価分子ＤＡＲＴ‐２はいかなる活性も示さなかった。またここでも、試験された全ての４価分子の中で、ＤＡＲＴ‐Ａが最も高い活性を示し、陰性対照は活性を示さなかった。
これらの研究は、完全ヒト結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）が、４価及び３価ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子のいずれにおいても活性を有し、ＰＤ‐Ｌ１発現性標的細胞の不在下ではアゴニスト活性を示さないことを実証している。ＴＲＩＤＥＮＴ‐２がＣＨＯ／ＣＤ１３７細胞に対する比較的高い結合を示したものの、ＴＲＩＤＥＮＴ‐ＡとＴＲＩＤＥＮＴ‐２との活性は同等であり、一方でＤＡＲＴ‐２はいずれの機能アッセイにおいても活性を示さなかった。実際に、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）は、図１Ｂに示されている４価抗体様の構造において、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）又はウトミルマブの結合ドメインを含む分子よりも高い活性を有する。
実施例４
ＣＤ１３７×ＴＡ分子の薬物動態
３価ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子である（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合ドメインを含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ及び（ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）の結合ドメインを含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐２の薬物動態を、カニクイザルで評価した。簡潔に述べると、２頭のカニクイザル（メス）に、単回用量の各試験物品を１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで注入し（４グループ）、これらの動物を２２日間観察し、剖検は実施されなかった。動物を、摂餌量、体重、及び全血の血液学的側面について監視し、研究中には臨床化学的処置が実施された。肝酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びビリルビン）の一時的増加が観察された。試験物品は十分な忍容性を有し、副作用は観察されなかった。
上記分子の血清濃度を、基本的に上述されているようにして、経時的に観察した。Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ｔ１／２β、及びＣＬの値が表８に提示されており、これらは、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合ドメインを含む３価ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子が、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐３（１Ｂ．３）を含むものより約２倍長い血清半減期を示すことを示している。最初の１０日間（２４０時間）にわたるＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの血清濃度が、図８Ａにプロットされている。更に、ＣＤ８+Ｔ細胞（図８Ｂ）及びＮＫ細胞（図８Ｃ）の増殖を、基本的に上述されているようにして調査した。この研究は、新規の抗ＣＤ１３７抗体であるＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＣＤ１３７結合分子を含む代表的なＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子であるＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａが、遅いクリアランスを示したこと、及び投与が、ＣＤ８+Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方の増殖の一時的な誘発（これはこれらの免疫細胞の刺激を示す）と相関していることを示している。更に、上述されているように、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６は４価抗体様の構造においてより高い活性を有する。よってＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６結合ドメインは、上述のＣＤ１３７結合ドメインに比べていくつかの利点を提供する。
Figure 2023514167000022
実施例５
ｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１）可変ドメインの脱免疫化及び最適化
インタクトなｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１）抗体を、（Ａｂｚｅｎａが実施する）ＭＡＰＰｓアッセイを用いて分析し、抗原提示細胞によって提示され得るペプチドクラスタを特定した。これに続いて、ｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２（１．１）のＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列のｉＴｏｐｅ（商標）インシリコ分析を実施し、この分析では、ペプチドクラスタを重複する９‐ｍｅｒペプチド（隣接するペプチド間で８個のａａが重複）に分割し、ＨＬＡ‐ＤＲタンパク質に対する上記９‐ｍｅｒペプチドの結合親和性を予測し、また上記９‐ｍｅｒペプチドを、Ｔ細胞応答を刺激することが実験で示されているペプチドのデータベースに対してクロスチェックした。ｈＰＤ‐１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１のフレームワーク領域２（配列番号５７の残基７３～９２に対応）のＫａｂａｔ残基７２～８８内の潜在的なＴ細胞エピトープを特定した。更なる分析によって、この領域において３つの非生殖系列アミノ酸：Ｔ７７、Ｋ８３、及びＴ８４、（Ｋａｂａｔに従って番号付与：配列番号５７の残基Ｔ７８、Ｋ８７、及びＴ８８に対応）を特定し、以下の置換を導入した：Ｔ７７Ｓ；Ｋ８３Ｒ及びＴ８４Ａ；又はＴ７７Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＴ８４Ａ（Ｋａｂａｔに従って番号付与）。これらの置換を含む抗体の結合を、Ｈｉｓタグに融合した可溶性ＰＤ‐Ｌ１（ｓｈＰＤ‐Ｌ１）への結合に関して、プレートを０．５μｇ／ｍＬのｓｈＰＤ‐Ｌ１でコーティングしたこと、及びヤギ抗ヒトＩｇＧ‐ＨＲＰ二次抗体を使用したことを除いては基本的にＣＤ１３７結合に関して上述されているようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて、評価した。結果が表９にまとめられている。
Figure 2023514167000023
全ての脱免疫化多様体がｓｈＰＤ‐Ｌ１に結合し、Ｔ７７Ｓ、Ｋ８３Ｒ及びＴ８４Ａ置換を含む多様体は、親抗体と区別できない結合を示した。これらの変異を含むＶＨを、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２と命名した。
更に、変異の分析を実施して、ｓｈＰＤ‐Ｌ１への結合を増強する、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）のＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲのアミノ酸置換を特定した。結合の改善をもたらす多数の置換が特定され、これらは表１０に提供されており、ここでは置換はＫａｂａｔ番号付与システムを用いて表されており、上で提示された配列中の対応するアミノ酸残基が示されている。これらの置換の様々な組み合わせを含むＦａｂ断片の、ｓｈＰＤ‐Ｌ１‐ｈｉｓに対する結合を、ヤギ抗ヒトκ‐ＨＲＰ二次抗体を使用したことを除いては基本的に上述されているようなＥＬＩＳＡで、評価した。評価した代表的な多様体が表１１にまとめられており、結合曲線が図９Ａ～９Ｂに提示されている。これらの研究は、各多様体（図９ＡでプロットされているｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｂ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｄ、及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ；図９ＢでプロットされているｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ａ、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｃ、及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｅ）を含むＦａｂが、親ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）を含むＦａｂより高い親和性を示したことを示している。
Figure 2023514167000024
Figure 2023514167000025
ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２の多数の変異型ＶＨ及び／又はＶＬドメインを用いて、（全て２つのＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）結合部位を含む）ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子を生成した。使用した特定のｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２のＶＬ及びＶＨ多様体が表１２にまとめられており、これらの多様体のアミノ酸配列、及びこれらを含む二重特異性分子は上で提供されている。上述のように、ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２のＶＨ／ＶＬドメインを含む分子は、その特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照して呼称され、例えば結合ドメインＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２を含む分子は、具体的に「ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）」と呼ばれる。
Figure 2023514167000026
２つのＰＤ‐Ｌ１結合部位を含む以下の分子：（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（２．１）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ１；（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ４；及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）と、１つのＰＤ‐Ｌ１結合部位を含む以下の分子：ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ（上で詳述）；及び（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）を含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４とを、ＪＩＭＴ‐１細胞の表面上のＰＤ‐Ｌ１結合に関して、基本的に上述されているようなＦＡＣＳ分析で評価し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び４倍段階希釈で使用した。代表的なアッセイの結果を図１０Ａ～１０Ｂに示す。これらの分子を、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックする能力に関しても、２５μｇ／ｍＬ及び４倍段階希釈の試験物品を用いた、基本的に上述されているようなＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイで評価した。代表的なアッセイの結果を図１１Ａ～１１Ｂに示す。これらのデータは、脱免疫化／最適化ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）の結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子が、結合の改善（図１０Ａ～１０Ｂ）、及びＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用のより効率的なブロッキング（図１１Ａ～１１Ｂ）を示したことを示している。２つのＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含む４価分子（図１０Ａ及び１１ＡのＤＡＲＴ‐Ａ４）において中程度の改善が観察され、ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを１つしか含まない３価分子（図１０Ｂ及び１１ＢのＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４）において、より大きな活性の改善が観察された。２つのＰＤ‐Ｌ１結合部位を含む更なる分子：（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ４；（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ７；（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（５．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ８；及び（ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（６．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ９を、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックする能力に関して、１．５μｇ／ｍＬ及び２倍段階希釈の試験物品を用いた、基本的に上述されているようなＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイで評価した。代表的なアッセイの結果を図１１Ｃに示す。この研究は、代替的な脱免疫化／最適化ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（５．２）、及びｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（６．２）を含むＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子が、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）を含むＤＡＲＴ‐Ａ４に比べて同等の又は改善されたブロッキング活性を示すことを示している。
実施例６
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６の脱免疫化
免疫原性の可能性を最小限に抑えるために、置換をＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６のＶＬドメインのフレームワーク領域に導入して、非生殖系列残基を、ヒト生殖系列に存在する残基で置換した。特に以下の置換：Ｔ１４Ｓ、Ｆ３６Ｙ及びＩ３９Ｋ、（Ｋａｂａｔに従って番号付与；配列番号５０の残基１４、３７、４０に対応）の組み合わせを導入した。得られたＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬドメインは以下の表１３にまとめられており、これらを用いて、ＣＤ１３７と代表的なＴＡであるＰＤ‐Ｌ１とに結合できるＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子を生成した。これらの多様体のアミノ酸配列、及びこれらを含む二重特異性分子は、上で提供されている。
Figure 2023514167000027
２つのｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）結合部位を含む以下の分子：（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ４；（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ５；（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ６、１つのｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）結合部位を含む以下の分子：（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４；（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）を含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５；及び（ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）を含む）ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ウレルマブの複製（ｒ‐ウレルマブ）、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１とを、細胞表面ＣＤ１３７に結合する能力に関して、基本的に上述のように実施されるＦＡＣＳによって評価し、試験物品を３μｇ／ｍＬ及び４倍段階希釈で使用した。図１２Ａ～１２Ｂに示されている代表的なアッセイの結果は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）の結合ドメインを含む４価（図１２Ａ）及び３価（図１２Ｂ）ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子が、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合ドメインを含む同一の分子と略同等の結合プロファイルを示すものの、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）を含むものは結合の低下を示したことを実証している。
ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ｒ‐ウレルマブ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１の機能的活性を、ＰＤ‐Ｌ１発現性Ｎ８７標的細胞（１０，０００細胞／ウェル）又はＪＩＭＴ‐１細胞（２０，０００細胞／ウェル）の存在下及び不在下で基本的に上述のように実施されるＣＤ１３７レポーターアッセイで評価し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。図１３Ａ～１３Ｂに示されている代表的なアッセイの結果は、全ての分子が活性を標的依存的に示し、Ｎ８７細胞（ＰＤ‐Ｌ１+、図１３Ａ）の存在下に比べてＪＩＭＴ‐１細胞（ＰＤ‐Ｌ１++、図１３Ｂ）の存在下において活性がより高いことを実証している。ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）の結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合ドメインを含む同一の分子と略同等の活性プロファイルを示すが、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）を含むものは活性の低下を示した。上記ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子はいずれも、標的細胞の不在下では活性を示さなかった。予想されたように、アゴニストであるｒ‐ウレルマブは、ＰＤ‐Ｌ１発現性標的細胞の存在下及び不在下で活性を示し、陰性対照は活性を全く示さなかった。
ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ｒ‐ウレルマブ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１の機能的活性を、基本的に上述のように実施される、ＰＤ‐Ｌ１発現性ＪＩＭＴ‐１細胞（１０，０００細胞／ウェル）の存在下での初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイで調査し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。代表的なサイトカインであるＩＮＦ‐γ及びＩＬ‐２に関する代表的な結果を、それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂに示す。上記ＣＤ１３７レポーターアッセイで観察されたように、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）を含むＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合分子を含む同一の分子と略同等の、又はこれより若干良好な活性プロファイルを示すが、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．２）を含むものは活性の低下を示した。
実施例７
ＣＤ１３７×ＴＡ分子の更なる特性決定
ＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２、新規のＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６、又はその脱免疫化／最適化多様体のＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ１３７結合ドメインを含む、以下の代表的なＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子：ＤＡＲＴ‐Ａ；ＤＡＲＴ‐Ａ４；ＤＡＲＴ‐Ａ６；ＤＡＲＴ‐Ａ７；ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ；ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４；ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６；並びに更なる４価分子：（２つのｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）結合部位及び２つのＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）結合部位を含む）ＤＡＲＴ‐Ａ１０の活性を評価するために、更なるインビトロ研究を実施した。これらの分子のＣＤ１３７及びＰＤ‐Ｌ１結合ドメインは、上の表５にまとめられている。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、陰性対照ｈＩｇＧ１、及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体であるアテゾリズマブの複製（ｒ‐アテゾリズマブ）、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ又は‐ウレルマブを、ＰＤ‐Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＰＤ‐Ｌ１）又はＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＣＤ１３７）の表面に結合する能力に関して、基本的に上述されているようなＦＡＣＳ分析によって評価し、試験物品を、開始濃度３μｇ／ｍＬ及び３～４倍希釈で使用した。代表的なアッセイの結果を図１５Ａ～１５Ｂに示す。これらの結合研究は、最適化ＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子（ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０）が、ＤＡＲＴ‐Ａ（図１５Ａ）に比べて改善されたＰＤ‐Ｌ１への結合を示すことを実証している。同様のＰＤ‐Ｌ１結合プロファイルが、ＪＩＭＴ‐１（ＰＤ‐Ｌ１＋）細胞への結合に関して観察された。これらの研究はまた、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）及びＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）の結合ドメインを含むＣＤ１３７×ＴＡ結合分子が、ｒ‐ウレルマブに比べて改善された、同等の結合を示すことも実証している（図１５Ｂ）。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＤＡＲＴ‐Ａ７、ＤＡＲＴ‐Ａ１０、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ、ｒ‐アテゾリズマブ、及び陰性対照ｈＩｇＧ１を、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックする能力に関して、３μｇ／ｍＬ及び２倍段階希釈の試験物品を用いた、基本的に上述されているようなＰＤ‐Ｌ１レポーターアッセイで評価した。代表的なアッセイの結果を図１６Ａ～１６Ｂに示す。これらの研究もまた、脱免疫化／最適化ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（３．２）又はｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（４．２）の結合ドメインを含む４価（図１６Ａ）及び３価（図１６Ｂ）ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子が、親結合ドメインｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２（１．１）を含む分子に比べてより効率的な、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用のブロックを示し、増強された活性がＣＤ１３７結合ドメインに依存しなかったことを実証している。上述のように、このアッセイでは、１つのＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを含む３価分子において、より大きな活性の改善が観察され、活性は、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２Ｆ及びｒ‐アテゾリズマブ（これらはそれぞれ２つのＰＤ‐Ｌ１結合ドメインを有する）で観察される活性に近いものとなった。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ｒ‐ウレルマブ、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１の機能的活性を、ＰＤ‐Ｌ１発現性ＪＩＭＴ‐１細胞（１０，０００細胞／ウェル）の存在下及び不在下で基本的に上述のように実施されるＣＤ１３７レポーターアッセイで評価し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した（量は例えば図１４Ａの下部に示されている）。代表的なアッセイの結果が図１７Ａ～１７Ｂに示されており、これは、全ての２価分子が活性を標的依存的に示し、ＪＩＭＴ‐１細胞の存在下（図１７Ａ）において活性のレベルが高く、標的細胞の不在下（図１７Ｂ）において活性がないことを実証している。脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ１３７結合ドメインを含む分子は、親ドメインを含むものに比べて高い活性を示した（例えばＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６及びＤＡＲＴ‐Ａ１０）。このアッセイでは、３価分子がより高い活性を示し、また活性の上昇も３価分子に関して大きかった。
ＤＡＲＴ‐Ａ、ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＤＡＲＴ‐Ａ５、ＤＡＲＴ‐Ａ６、ｒ‐ウレルマブ、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ５、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ｒ‐ウレルマブとｒ‐アテゾリズマブとの組み合わせ、並びに陰性対照ｈＩｇＧ１の機能的活性も、基本的に上述のように実施される、ＰＤ‐Ｌ１発現性ＪＩＭＴ‐１細胞（１０，０００細胞／ウェル）の存在下での初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイで調査し、試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した（量は例えば図１４Ａの下部に示されている）。代表的なサイトカインであるＩＮＦ‐γ及びＩＬ‐２に関する代表的な結果を、それぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示す。上記ＣＤ１３７レポーターアッセイで観察されたように、脱免疫化／最適化ＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ１３７結合ドメインを含む３価ＣＤ１３７×ＰＤ‐Ｌ１二重特異性分子は、より高い活性を示した（例えばＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６）。
実施例８
マウス異種移植モデル
本明細書で提供されるように、本発明のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子は、他の腫瘍標的化剤と併用できる。代表的なＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子ＤＡＲＴ‐Ａ４、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ４の、代表的なＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子、５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディの抗腫瘍活性を強化する能力を、ヒトＰＢＭＣ再構築マウス異種移植モデルにおいてインビボで試験した（配列は以下で提供される）。簡潔に述べると、単離したばかりのＰＢＭＣ（８×１０6）を、研究日（Ｓｔｕｄｙ Ｄａｙ：ＳＤ）０日目に、ＭＨＣＩ－／－マウスに後眼窩注射した。ＳＤ７には、ＲＫＯ結腸癌細胞（５×１０6）を、マトリゲルとの１：１混合物として皮下注射した。ＳＤ７にマウスをＯＫＴ４で処理した。ＳＤ１４に、５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディを用いた処理（ＩＶ）（０．０２５ｍｇ／ｋｇで週２回）、及びＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子を用いた処理（１又は２ｍｇ／ｋｇで週１回）を開始した。腫瘍成長を、キャリパーで週２回測定した（Ｎ＝７／グループ）。図１９Ａ～１９Ｃに示されているように、上記ＴＡ×ＣＤ３は、試験された濃度では腫瘍成長に対する阻害を最小限しか示さなかった。しかしながら、ＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子と５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディとの組み合わせは、腫瘍成長を劇的に阻害した。この研究は、新規のＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６抗体の結合ドメインを含むＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子が、ＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子との組み合わせで、インビボで腫瘍成長を阻害できることを実証している。
別の研究では、それぞれＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．３）結合部位を含む、代表的なＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子であるＤＡＲＴ‐Ａ１０及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６の、５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディの抗腫瘍活性を強化する能力を調査した。この研究は、上記ＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子を０．５、１、又は２．５ｍｇ／ｋｇで５日（週末をまたぐ場合は４日）毎に投与することを除いて、基本的に上述のように実施された。腫瘍成長を、キャリパーで週２回測定した（Ｎ＝８／グループ）。図２０Ａ～２０Ｂに示されているように、ＤＡＲＴ‐Ａ１０及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６もまた、５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディと組み合わせると、腫瘍成長を阻害した。この研究は、脱免疫化ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６抗体の結合ドメインを含むＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子が、ＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子との組み合わせで、インビボで腫瘍成長を阻害できることを実証している。
更なる併用治療研究では、（それぞれＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６結合ドメインのＶＨ／ＶＬを含む）ＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子であるＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａの活性を、ＴＲＩＤＥＮＴ‐２、及び本明細書ではＤＵＯ‐１と略される、国際公開第２０１９／０２５５４５号に記載の「ＰＤ‐Ｌｌ‐５４７‐ＦＥＡＬｘＣＤ１３７‐００９‐ＨＣ７ＬＣ２‐ＦＥＡＲ」と命名されたＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７ ＤＵＯＢＯＤＹ（登録商標）二重特異性分子と比較した（アミノ酸配列は以下で提供される）。これらの研究は、上記ＰＤ‐Ｌ１×ＣＤ１３７二重特異性分子を異なる複数の実験において０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの濃度で５日（週末をまたぐ場合は４日）毎に投与することを除いて、基本的に上述のように実施された。腫瘍成長を、キャリパーで週２回測定した（Ｎ＝８／グループ）。２つの研究（注：ＴＲＩＤＥＮＴ‐２は研究１のみにおいて１ｍｇ／ｋｇで投薬された）からの代表的なデータが図２１Ａ及び２１Ｂにプロットされており、これは、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ及びＴＲＩＤＥＮＴ‐Ａ６が、ＴＲＩＤＥＮＴ‐２と同等か又はこれより若干良好な抗腫瘍活性を示し、またＤＵＯ‐１よりも高い活性を有することを示す。
上述のマウス異種移植研究で使用された代表的なＴＡ×ＣＤ３二重特異性分子である５Ｔ４×ＣＤ３ダイアボディは、５Ｔ４腫瘍抗原に対する１つの結合部位、及びＣＤ３に対する１つの結合部位を有する、２価ダイアボディである。上記分子は図１Ｄに示されている一般構造を有し、以下の３つのポリペプチド鎖を含む：
Figure 2023514167000028
上述のマウス異種移植研究で使用されたＰＤ‐Ｌｌ‐５４７‐ＦＥＡＬ×ＣＤ１３７‐００９‐ＨＣ７ＬＣ２‐ＦＥＡＲ二重特異性分子は、国際公開第２０１９／０２５５４５号に記載されている。この分子は、本明細書で提供されているものとは異なるＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ１３７結合特異性を備え、以下の４つのポリペプチド鎖を含む：
Figure 2023514167000029
実施例９
追加のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子の特性決定
ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）のＶＨ及びＶＬドメイン、並びにｈＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）のＶＨ及びＶＬドメインを組み込んだ、ＣＤ１３７と代表的なＴＡであるＨＥＲ２とに結合できるＣＤ１３７×ＴＡ結合分子を生成した。この研究では、多数の追加の二重特異性構成を調査した。特に、二重特異性ダイアボディドメインを含み、かつ図１Ｄに示されている非対称構造を有する、「ＤＡＲＴ‐Ｂ１」と命名された２価二重特異性ダイアボディと、二重特異性ダイアボディ型結合ドメイン（部位ＡはＣＤ１３７に結合し、部位ＢはＴＡに結合する）及び非ダイアボディ型結合ドメイン（ＣＤ１３７に結合する部位Ｃ）とを含み、かつ図３Ａに示されている構造を有する、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２」と命名された３価結合分子とを生成した。更に、既に特性決定されている分子と同一の一般構造を有する分子を生成した。特に、同一の二重特異性ダイアボディ結合ドメインを含み、かつ図１Ｂに示されている抗体様Ｙ構造を有する、「ＤＡＲＴ‐Ｂ２」と命名された４価二重特異性ダイアボディと、単一特異性ダイアボディ型結合ドメイン（部位Ａ及び部位ＢはＣＤ１３７に結合する）並びに非ダイアボディ型結合ドメイン（ＴＡに結合する部位Ｃ）を含む、「ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１」と命名された３価結合分子とを、生成した。これらの分子、並びに同一の構造を有する特定の二重特異性対照及び比較対象分子の、ドメインの属性は、上述されている（例えば表５～６を参照）。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１、ＤＡＲＴ‐Ｂ２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２、親ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）、及びＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）抗体、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐４、ＤＡＲＴ‐５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐３、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐４（各試験物品に相当する構造を有するＣＤ１３７×ＲＳＶ結合分子）の機能的活性を、ＨＥＲ２発現性細胞（ＪＩＭＴ‐１（ＨＥＲ２++）又はＮ８７（ＨＥＲ２+++）、２０，０００細胞／ウェル）の存在下及び不在下で基本的に上述のように実施されるＣＤ１３７レポーターアッセイで評価した。試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。ＪＩＭＴ‐１及びＮ８７細胞を用いた代表的なアッセイの結果が、それぞれ図２２Ａ及び２２Ｂに示されており、これらは、親抗体及び陰性対照は活性を示さなかった一方で、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む全てのＣＤ１３７×ＨＥＲ２二重特異性分子が標的依存性シグナル伝達を仲介したことを実証している。
ＤＡＲＴ‐Ｂ１、ＤＡＲＴ‐Ｂ２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２、親ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）、及びＨＥＲ２ ＭＡＢ‐１（１．３）抗体、並びに陰性対照：ＤＡＲＴ‐４、ＤＡＲＴ‐５、ＴＲＩＤＥＮＴ‐３、及びＴＲＩＤＥＮＴ‐４の機能的活性を、基本的に上述のように実施される、ＨＥＲ２発現性細胞（ＪＩＭＴ‐１及びＮ８７、１０，０００細胞／ウェル）の存在下での初代Ｔ細胞サイトカイン放出アッセイでも評価した。試験物品を１μｇ／ｍＬ及び５倍段階希釈で使用した。ＪＩＭＴ‐１細胞を用いた代表的なアッセイの結果が図２３Ａ（ＩＮＦ‐γ）及び２３Ｃ（ＩＬ‐２）に示されており、Ｎ８７細胞を用いた代表的なアッセイの結果が図２３Ｂ（ＩＮＦ‐γ）及び２３Ｄ（ＩＬ‐２）に示されている。ＣＤ１３７レポーターアッセイで確認されたように、親抗体及び陰性対照は活性を示さなかった一方で、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）を含む全てのＣＤ１３７×ＨＥＲ２二重特異性分子が、特に高ＨＥＲ２発現性Ｎ８７細胞の場合に、標的依存性サイトカイン放出を仲介した。
これらの研究は、結合ドメインＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６（１．１）（それぞれＤＡＲＴ‐Ｂ１、ＤＡＲＴ‐Ｂ２、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１／Ｂ２）を含む２価、４価、及び３価ＣＤ１３７×ＴＡ二重特異性分子が、標的依存性シグナル伝達を仲介したことを実証している。ＣＤ１３７結合ドメインの位置は、ＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ２中ではＴＲＩＤＥＮＴ‐Ｂ１に対して変位していることに留意されたい。この研究は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６が、追加の腫瘍抗原と多数の構成でペアとなった場合に機能性を有し、また単一の結合部位として存在する場合であっても機能性を有することを実証している。
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。

Claims (44)

  1. ＣＤ１３７のエピトープに免疫特異的に結合する第１の結合部位を含む、ＣＤ１３７結合分子であって、前記細胞第１の結合部位は、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第１の重鎖可変ドメインとを含み；
    （Ａ）前記第１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）前記第１の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）の重鎖ＣＤＲである、ＣＤ１３７結合分子。
  2. 前記第１の重鎖可変ドメインは、ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ１３７結合分子。
  3. 前記第１の軽鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５４）；
    （Ｂ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ１（配列番号５０）；
    （Ｂ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ２（配列番号５５）；又は
    （Ｃ）ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）
    のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＤ１３７結合分子。
  4. （Ａ）前記第１の重鎖可変ドメインは：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＨ１（配列番号４６）のアミノ酸配列を含み；
    （Ｂ）前記第１の軽鎖可変ドメインは：ｈＣＤ１３７ ＭＡＢ‐６ ＶＬ３（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子。
  5. 前記分子は、腫瘍抗原（ＴＡ）に免疫特異的に結合する第２の結合部位を含む二重特異性分子であり、また前記第２の結合部位は、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む第２の軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む第２の重鎖可変ドメインとを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子。
  6. 前記ＴＡは表１～２に提示された抗原から選択される、請求項５に記載のＣＤ１３７結合分子。
  7. 前記ＴＡはＰＤ‐Ｌ１であり、また：
    （Ａ）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬｘ（配列番号６３）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨｘ（配列番号５９）の重鎖ＣＤＲである、請求項５に記載のＣＤ１３７結合分子。
  8. （Ａ）（１）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
    （２）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）（１）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （２）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （３）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （４）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （５）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
    （６）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、請求項７に記載のＣＤ１３７結合分子。
  9. 前記第２の重鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ１（配列番号５７）；
    （Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
    （Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
    （Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
    （Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
    （Ｆ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
    のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＤ１３７結合分子。
  10. 前記第２の軽鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ１（配列番号５８）；又は
    （Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）
    のアミノ酸配列を含む、請求項８又は９に記載のＣＤ１３７結合分子。
  11. 前記ＴＡは５Ｔ４であり：
    （Ａ）（１）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （２）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
    （Ｂ）（１）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＬ（配列番号９５）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （２）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、５Ｔ４ ＭＡＢ‐２ ＶＨ（配列番号９６）の重鎖ＣＤＲである、請求項５に記載のＣＤ１３７結合分子。
  12. 前記第２の重鎖可変ドメインは５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＨ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子。
  13. 前記第２の軽鎖可変ドメインは５Ｔ４ ＭＡＢ‐１ ＶＬ（配列番号９３）のアミノ酸配列を含む、請求項１１又は１２に記載のＣＤ１３７×ＴＡ結合分子。
  14. 前記ＴＡはＨＥＲ２であり：
    （Ａ）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬｘ（配列番号７９）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨｘ（配列番号７８）の重鎖ＣＤＲである、請求項５に記載のＣＤ１３７結合分子。
  15. （Ａ）（１）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）の軽鎖ＣＤＲであるか；
    （２）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）の軽鎖ＣＤＲであるか；又は
    （３）前記第２の軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）（１）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （２）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
    （３）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）の重鎖ＣＤＲである、請求項１４に記載のＣＤ１３７結合分子。
  16. 前記第２の重鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ１（配列番号８０）；
    （Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ２（配列番号８１）；又は
    （Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＨ３（配列番号８２）
    のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＣＤ１３７結合分子。
  17. 前記第２の軽鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ１（配列番号８３）；
    （Ｂ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ２（配列番号８４）；又は
    （Ｃ）ｈＨＥＲ２‐ＭＡＢ‐１ ＶＬ３（配列番号８５）
    のアミノ酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載のＣＤ１３７結合分子。
  18. 前記分子は、抗体、又は二重特異性４価Ｆｃ担持ダイアボディ、又は二重特異性３価分子である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子。
  19. 前記分子は二重特異性かつ４価であり、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は共有結合複合体を形成する、請求項１～１７のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子。
  20. 前記分子は二重特異性かつ３価であり、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖は共有結合複合体を形成する、請求項１～１７のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子。
  21. 前記ＴＡはＰＤ‐Ｌ１であり：
    （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号１１６、配列番号１１８、又は配列番号１２０のアミノ酸配列を含み；
    （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＤ１３７結合分子。
  22. 前記分子は：
    （Ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７；
    （Ｂ）配列番号１１８及び配列番号１１９；
    （Ｃ）配列番号１２０及び配列番号１１９；
    （Ｄ）配列番号１１８及び配列番号１２１；
    （Ｅ）配列番号１２０及び配列番号１２１；
    （Ｆ）配列番号１２０及び配列番号１２２；
    （Ｇ）配列番号１２０及び配列番号１２３；
    （Ｈ）配列番号１２０及び配列番号１２４；
    （Ｉ）配列番号１２０及び配列番号１２５；
    （Ｊ）配列番号１２０及び配列番号１２６；又は
    （Ｋ）配列番号１２０及び配列番号１３９
    を含む、請求項２１に記載のＣＤ１３７結合分子。
  23. 前記ＴＡはＰＤ‐Ｌ１であり：
    （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１２７、配列番号１３３、又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含み；
    （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１２８、配列番号１３４、又は配列番号１３６のアミノ酸配列を含み；
    （Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は配列番号１２９、又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含み；
    （Ｄ）前記第４のポリペプチド鎖は配列番号１３０、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＣＤ１３７結合分子。
  24. 前記分子は：
    （Ａ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、及び配列番号１３０；
    （Ｂ）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３１、及び配列番号１３２；
    （Ｃ）配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３１、及び配列番号１３２；又は
    （Ｄ）配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３１、及び配列番号１３２．
    を含む、請求項２３に記載のＣＤ１３７結合分子。
  25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子と、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
  26. 前記ＴＡの発現に関連する又は前記ＴＡの発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項６～２４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
  27. ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３を含む軽鎖可変ドメインと、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＰＤ‐Ｌ１結合分子であって：
    （Ａ）前記軽鎖可変ドメインのＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）の軽鎖ＣＤＲであり；
    （Ｂ）（１）前記重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （２）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （３）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）の重鎖ＣＤＲであるか；
    （４）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）の重鎖ＣＤＲであるか；又は
    （５）前記第２の重鎖可変ドメインのＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３は、ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）の重鎖ＣＤＲである、ＰＤ‐Ｌ１結合分子。
  28. 前記重鎖可変ドメインは：
    （Ａ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ２（配列番号６７）；
    （Ｂ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ３（配列番号６８）；
    （Ｃ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ４（配列番号６９）；
    （Ｄ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ５（配列番号７０）；又は
    （Ｅ）ｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＨ６（配列番号７１）
    のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
  29. 前記軽鎖可変ドメインはｈＰＤ‐Ｌ１ ＭＡＢ‐２ ＶＬ２（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む、請求項２７又は２８に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
  30. 前記分子は抗体又はその抗原結合断片である、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子。
  31. 請求項２７～３０のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子と、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
  32. 抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項２７～３０のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
  33. 抑制された免疫系に関連する又はＰＤ‐Ｌ１の発現を特徴とする前記疾患又は状態は癌である、請求項３２に記載の使用。
  34. 前記癌は：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項２６又は３３に記載の使用。
  35. 腫瘍標的化剤の活性を増強する方法であって、前記腫瘍標的化剤を、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子、請求項２７～３０のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子、又は請求項２５若しくは３１に記載の医薬組成物と組み合わせて投与するステップを含む、方法。
  36. 抑制された免疫系に関連する又はＴＡの発現を特徴とする疾患又は状態を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子、請求項２７～３０のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子、又は請求項２５若しくは３１に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  37. 抑制された免疫系に関連する又はＴＡの発現を特徴とする前記状態は癌である、請求項３６に記載の方法。
  38. 腫瘍標的化剤を投与するステップを更に含む、請求項３６又は３７方法。
  39. 前記腫瘍標的化剤は、抗体、抗体のエピトープ結合断片、又は標的細胞のＴ細胞標的転換殺滅を仲介する作用剤である、請求項３５又は３８に記載の方法。
  40. 前記癌は：膀胱癌、骨癌、脳脊髄癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌又は胆管癌、胃癌（gastric cancer）、膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、肝臓癌、咽頭癌、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、頭頸部の扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌（stomach cancer）、精巣癌、胸腺癌、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のＣＤ１３７結合分子、又は請求項２７～３０のいずれか１項に記載のＰＤ‐Ｌ１結合分子をコードする、核酸。
  42. 請求項４１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  43. 請求項４１に記載の核酸、又は請求項４２に記載の発現ベクターを含む、細胞。
  44. 前記細胞は哺乳類細胞である、請求項４３に記載の細胞。
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