JP2021518748A - カルシトニン遺伝子関連ペプチド(cgrp)アンタゴニスト抗体 - Google Patents
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Abstract
本願は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)に特異的に結合する、単離された抗体およびその抗原結合断片を提供する。これら抗CGRP抗体、またはその抗原結合断片は、CGRPに高親和性を有し、CGRPを阻害するよう機能し、所定の種(例えば、ヒト)におけるその未修飾の親抗体と比べて免疫原性が低く、また現行のCGRPアンタゴニスト治療に伴う有害な副作用を避けながらCGRP−関連疾患を治療するのに用いることができる。【選択図】図1
Description
本出願は、2018年2月23日に出願された米国仮出願第62/634,643号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれている。
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、中枢神経系と末梢神経系の神経により分泌される37アミノ酸長の多機能神経ペプチドである。CGRPの2つの形態、CGRP−αとCGRP−βの形態がヒトに存在し、同様の活性を有する。CGRP−αとCGRP−βは、ヒトにおいては3個のアミノ酸が異なり、異なる遺伝子に由来する。ペプチドのCGRPファミリーは、アミリン、アドレノメデュリン、およびカルシトニンを含むが、それぞれ別個の受容体と生物学的活性を有する(Doods,H.,Curr.Op.Invest Drugs,2(9):1261−68(2001))。
CGRPは、脳および硬膜血管の拡張、マスト細胞からの炎症メディエーターの放出、および頭蓋内血管から神経系への侵害受容情報の伝達を含む、病態生理学的プロセスのいくつかに関与すると想定される、強力なペプチド血管拡張物質であり、また疼痛の伝達において機能することができる(Durham PL,N Engl J Med.,350:1073−1074,2004))。いくつかの発見により片頭痛におけるCGRPの役割が裏付けられている。まず、CGRPの血清中の濃度は、片頭痛の発作ならびに群発頭痛等のその他神経血管性頭痛タイプのエピソードの間に上昇する。さらに、トリプタンによる片頭痛の疼痛の寛解は、CGRPの血中濃度の低下または正常化と同時に起きる。選択CGRP受容体アンタゴニストが血管拡張および神経原性炎症を低減し、かつ片頭痛において臨床的利点を与えるとの知見はさらに、CGRPの片頭痛における欠かせない役割を裏付ける(Durham PL,Headache,June 46(1):S3−S8,2006))。
CGRP量の上昇はまた、顎関節症患者ならびに心不全、高血圧や敗血症等の様々な他の疾患において報告されてきた(Gotoら、Ann NY Acad Sci.657:194−203,1992;Joyceら、Surgery.108(6):1097−101,1990))。CGRPが、高血圧や高血圧、糖尿病、肥満および関節炎に伴う心血管系病態の発症を防ぐのに有益であることを示唆する証拠は山のようにある(Russellら、Physiological Reviews.94(4):1099−1142,2014))。フレマネズマブ、CGRPαおよびβに対するヒト化モノクローナル抗体は、群発頭痛/片頭痛について第III相臨床試験中である(例えば、ClinicalTrials NCT02964338を参照)。
これら疾病や疾患におけるCGRPの予期される関与のため、有害な副作用を避ける一方で、CGRP関連の疾病や疾患の予防または治療に有用な組成物および方法が当該技術分野において依然として必要とされている。特に、有害な副作用を避ける一方で、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常等のCGRP−関連疾患を予防または治療するのに有用な組成物または方法が当該技術分野において依然として必要とされている。
本発明によれば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)に特異的に結合する単離された抗体およびその抗原結合断片が提供されている。これらのCGRP抗体またはその抗原結合断片は、CGRPに対して高い親和性を有し、CGRPを阻害する機能を有し、特定の種(例えば、ヒト)の非修飾親抗体と比較して免疫原性が低く、ヒトの行基(例、がん)、感染症、その他の疾患の治療に使用できる。
様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Fab断片、Fab’断片、Fab2断片、F(ab)’2断片、ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、またはH鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するヒンジ領域に少なくとも1つの変異を有するIgG4抗体から選択される。様々な実施形態において、抗体はキメラ抗体である。様々な実施形態において、抗体はヒト化抗体である。様々な実施形態において、抗体は完全ヒト抗体である。様々な実施形態において、SEQ ID NO:1のヒトCGRPタンパク質に抗親和性を有する単離された抗体およびその抗原結合断片を提供する。
様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、少なくとも約1x10−6M、少なくとも約1x10−7M、少なくとも約1x10−8M、少なくとも約1x10−9M、少なくとも約1x10−10M、少なくとも約1x10−11M、または少なくとも約1x10−12Mの解離定数(KD)でCTLA−4タンパク質に結合する。
一態様では、本発明の単離抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)配列番号27〜31から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR3;(b)配列番号12〜16から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;(c)(a)の軽鎖CDR3配列および(b)の重鎖配列;のいずれかを含む。
様々な実施形態において、単離された抗体または抗原結合断片は:(d)配列番号17〜21から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(e)配列番号22〜26から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(f)配列番号2〜6から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(g)配列番号7〜11から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(h)(d)のCDR1配列の軽鎖CDR配列および(f)の重鎖CDR1配列;または(i)(e)の軽鎖CDR2配列および(g)の重鎖CDR2配列;から選択されたアミノ酸配列をさらに含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)SEQ ID NO:17〜21から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号22〜26から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号27〜31から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2〜6から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号7〜11から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(f)配列番号12〜16から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を含む
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)配列番号17と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1;(b)配列番号22と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号27と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2と実質的に同一または実質的に類似同一する重鎖CDR1配列;(e)配列番号7と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(f)配列番号12と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列:を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)配列番号18と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号23と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号28と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号3と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号8と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(f)配列番号13と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列:を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)配列番号19と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号24と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号29と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号4と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号9と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(f)配列番号14と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し:(a)重鎖および/または軽鎖可変ドメインであって、可変ドメインは、配列番号9〜11、12〜13、および14〜16と同一、実質的に同一または実質的に類似する3つの軽鎖、CDR1、CDR2およびCDR3の1セット、および/または配列番号2、3〜5、および6〜8と同一、実質的に同一または実質的に類似する3つの重鎖、CDR1、CDR2、およびCDR3の1セットを有する;および(b)ヒト免疫グロブリン(IgG)由来の4つの可変領域フレームワーク領域の1セット、のいずれかを含む。様々な実施形態において、抗体はヒンジ領域を任意に含むことができる。様々な実施形態において、フレームワーク領域は、ヒト生殖系列エキソンXH、JH、VκおよびJκ配列から選択される。様々な実施形態において、抗体は、完全ヒト化抗体である。様々な実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体である。
様々な実施形態において、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号17に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号23に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号19に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号21に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号27に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
様々な実施形態において、単離された抗体または抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合した場合:(a)参照抗体と実質的に同じまたはそれ以上のKdを有するヒトCGRPに結合する;(b)参照抗体を有するヒトCGRPへの結合に競合する;または、(c)参照抗体よりもヒト被験体における免疫原性が低く、この参照抗体が、配列番号39および49に示されている重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたキメラ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号29と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する重鎖、および配列番号31と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する軽鎖を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号33、35、37および39と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する重鎖可変領域、および配列番号34、36、38および40と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43、45、47および49と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する重鎖、および配列番号49、51、53および55と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列、および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列、および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列、および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列、および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列、および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列、および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列、および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列、および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列、および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列、および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列、および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列、および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列、および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列、および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列、および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列、および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。
別の態様では、本発明は、本発明の薬学的に許容される担体と混合した単離された抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。様々な実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と混合した単離されたヒト抗体を含む。様々な実施形態において、医薬組成物は、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、静脈内注射、動脈内注射、くも膜下腔内注射、脳室内注射、尿道内注射、頭蓋内注射、関節滑液内注射または注入から成る群から選択される経路によって、投与するために調剤される。
別の態様では、本発明はCGRP−関連疾患を患う対象を治療する方法に関し、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を該対象に投与することを含む。様々な実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択される。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は:前兆ありまたは無しの片頭痛;片麻痺性片頭痛;群発頭痛;片頭痛様神経痛;慢性頭痛;緊張型頭痛;その他医学的状態により生ずる頭痛(感染または腫瘍による頭蓋内圧の上昇等); 慢性発作性片側頭痛;器質的病変に伴わない各種の頭痛;非血管性頭蓋内疾患に伴う頭痛;物質の投与またはその中止に伴う頭痛;頭部以外の感染症に伴う頭痛;代謝疾患に伴う頭痛;頭蓋、首、眼、耳、鼻、洞、歯、口またはその他顔面もしくは頭蓋構造の疾患に伴う頭痛;頭部神経痛;ならびに神経幹痛および求心路遮断性疼痛から成る群から選択される頭痛である。
別の態様では、本発明はCGRP−関連疾患を治療するべく設計された併用療法に関し、治療有効量の、本発明の単離された抗体または抗原結合断片およびb)特定のCGRP−関連疾患を治療するために有用な1つ以上の追加薬剤を対象に投与することを含む。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択される。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は頭痛であり、1つ以上の追加薬剤は:5−HT1様アゴニスト(およびその他5−HT1部位で作用するアゴニスト)、および非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDs)から成る群から選択される。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は顔面紅潮であり、また1つ以上の追加薬剤はホルモン系処理剤である。
別の態様では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、付加的な機能的部分、例えば望ましい薬物動態特性を与える標識または部分に共有結合し得る(または安定的に結合し得る)。様々な実施形態において、標識は、蛍光標識、放射性標識、および特有の核磁気共鳴サインを有する標識から成る群から選択される。
別の態様では、本発明は、例えば、ヒトCGRP関連疾患を診断するために、試料のヒトCGRP抗原の存在をin vitroまたはin vivoに検出する方法を提供する。
別の態様では、本明細書で開示する抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。本発明の核酸を含む発現ベクターも提供される。本発明の発現ベクターを含む単離された細胞も提供される。様々な実施形態において、細胞は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞である。様々な実施形態において、細胞がハイブリドーマであり、細胞の染色体が本発明の核酸を含む。さらに、本発明の抗体または抗原結合断片を作製する方法が提供されており、これは細胞が本発明の抗体または抗原結合断片を発現可能な条件下で細胞を培養またはインキュベートすることを含む。
本発明は、抗体等の抗原結合タンパク質、またはヒトCGRPに特異的に結合するその抗原結合断片に関する。一態様において、単離された抗体およびその抗原結合断片を提供し、CGRPに特異的に結合し、CGRPに高親和性を有し、CGRPを阻害するように機能し、所与の種(例えばヒト)の未変性の親抗体に比べて、免疫原性が低く、ヒト疾患(例えば癌)、感染症、およびCGRPによって媒介されるその他の障害を治療するために使用することができる。また、核酸分子ならびにその誘導体および断片を提供し、抗CGRP抗体、抗体断片または抗体誘導体の全てまたは部分をコードする核酸等のCGRPに結合するポリペプチドの全てまたは部分をコードするポリヌクレオチドの配列を含む。また、核酸を含むベクターおよびプラスミド、ならびに核酸および/またはベクターおよびプラスミドを含む細胞もしくは細胞株を提供する。また、抗CGRP抗体等のヒトCGRPに結合する抗原結合タンパク質を作製、識別または単離する方法、抗原結合タンパク質がCGRPに結合するかどうかを確認する方法、ヒトCGRPに結合する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物等の組成物を作製する方法、ならびに、対象にCGRPに結合する抗体またはその抗原結合断片を投与する方法、例えば、CGRPによって媒介される病態を治療する方法を提供する。
本明細書に他に規定のない限り、本発明に関係して使用される科学および技術用語は、当業者によって共通して理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は、複数のものを含み、複数形の用語は、単数のものを含む。概して、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションは、共通して使用されるものであり、当該技術分野で周知である。本発明の方法および技術は、概して、当該技術分野で周知であり、他に指示されていない限り、本明細書全体で記載され、検討される様々な一般的、より詳細な参考文献に記載される通常の方法に従って実施される。例えば、Green and Sambrook、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2012)を参照されたい、参照により本明細書に援用される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で広く達成され、または本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学および医薬品化学および製薬化学の実験的手順および技術に関係して使用される命名法は、広く使用され、当該技術分野で周知されている。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、配合および送達ならびに対象の治療に使用される。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、標準的な1または3文字の略語を使用して示される。他に断りのない限り、ポリペプチド配列は、左側にアミノ末端および右側にカルボキシ末端を有し、ならびに単鎖核酸配列および二重鎖核酸配列の上部の鎖は、左側に5’末端を、右側に3’末端を有する。ポリペプチドの特定のセクションは、アミノ酸80〜119等のアミノ酸残基数によって示すことができ、またはSer80〜Ser119等の部位の実際の残基によって示すことができる。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、参照配列との差異の程度に基づいて記載することもできる。特定の軽鎖および重鎖可変領域のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、L1(「軽鎖可変領域1」)およびH1(「重鎖可変領域1」)で示される。軽鎖および重鎖を含む抗体は、軽鎖の名前と重鎖可変領域の名前を組み合わせることによって示される。例えば、「L4H7」は、例えば、L4の軽鎖可変領域およびH7の重鎖可変領域を含む抗体を示す。
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的または部分的にコードされた1つ以上のポリペプチドを含み、腫瘍抗原に対する特異性または病理において過剰発現した分子に対する特異性を有するタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびにこれらの遺伝子のサブタイプおよび無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖(LC)は、カッパまたはラムダの何れかとして分類される。重鎖(HC)は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを規定する。典型的な免疫グロブリン(例えば抗体)構造単位は、テトラボディを含む。各テトラボディは、ポリペプチド鎖の2つの同一対から構成され、それぞれ、1つの「軽」鎖(約25kD)および1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原の認識を担う約100〜110個以上のアミノ酸の可変領域を規定する。
全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHとして省略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つの領域CH1、CH2およびCH3(およびいくつかの例ではCH4)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLとして省略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つの領域CLから構成される。VHおよびVLは、さらに、超変異性の領域に細分することができ、相補性決定領域(CDR)と呼ばれ、より保存された、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域と間を置く。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。フレームワーク領域およびCDRの範囲は規定されている。異なる軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の配列は、比較的、ヒト等の種の中で保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成的軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、3次元空間で、位置決めおよびCDRを整列する役割を担う。免疫グロブリン分子は、任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスでもよい。
CDRは主に、抗原のエピトープに結合する役割を有する。各鎖のCDRは、概して、CDR1、CDR2、CDR3と呼ばれ、N末端から連続して始まって番号が付けられ、また、概して特定のCDRが位置する鎖によっても識別される。したがって、VH CDR3はそれが見つけられる抗体の重鎖の可変領域に位置し、VL CDR1は、それが見つけられる抗体の軽鎖の可変領域からのCDR1である。異なる特異性(すなわち、異なる抗原について異なる結合部位)を有する抗体は、異なるCDRを有する。CDRは抗体ごとに異なるが、CDR内の限られた数のアミノ酸の位置は、抗原結合に直接的に関与する。CDR内のこれらの位置は、特異性決定残基(SDR)と呼ばれる。
Kabatの定義が抗体の残基のナンバリングの標準であり、概して、CDR領域を識別するために使用される。Kabatのデータベースは、今でもオンラインに保持され、CDR配列を決定することができ、例えば、IMGT/V−QUESTプログラムバージョン:3.2.18.、2011年3月29日、インターネットで入手可能およびBrochet,X.等,Nucl.Acids Res.36,W503−508,2008を参照のこと。Chothiaの定義は,Kabatの定義に類似するが,Chothiaの定義は、特定の構造的ループ領域の位置を考慮している。例えば、Chothia等、J.Mol.Biol.,196:901−17,1986;Chothia等,Nature,342:877−83,1989を参照のこと。AbMの定義は,抗体構造をモデル化するOxford Molecular Groupによって作製されたコンピュータプログラムの統合された一揃いを使用する。例えば,Martin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268−9272,1989;“AbM(商標),A Computer Program forModeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK;Oxford Molecular,Ltd.を参照のこと。AbMの定義は,知識データベースおよびab initio法の組み合わせを使用して,一次配列から抗体の三次構造をモデル化し,例えば,Samudrala等,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach”,PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194−198,1999に記載されている。接触定義は,利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。例えば,MacCallum等,J.Mol.Biol.,5:732−45,1996を参照のこと。
「Fc領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用され、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る。Fc領域は、未変性配列Fc領域または変異体Fc領域であってもよい。免疫グロブリンのFc領域は、概して、2つの定常ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、CH4ドメインを含んでもよい。抗体のFc部分は、いくつかの重要なエフェクタ機能、例えば、サイトカイン誘導、ADCC、食作用、補体依存性細胞傷害(CDC)ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期/クリアランス率(例えば、新生児FcR(FcRn)は、エンドソームにおいて、酸性のpHで、IgGのFc領域に結合し、IgGを分解から保護し、それによってIgGの長い血清半減期に寄与する)を媒介する。Fc部分のアミノ酸残基を置換して抗体のエフェクタ機能を変化させることは、当該技術分野で周知である(例えば、Winter等、米国特許第5,648,260号および5,624,821号を参照のこと)。
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または、はっきりとした特徴の断片のメンバーとして存在する。このような断片として、Fab断片、Fab’断片、Fab2、F(ab)’2断片、単鎖Fvタンパク質(「scFv」)およびジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)が挙げられ、標的抗原に結合する。scFvタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合した融合タンパク質であり、dsFvでは、鎖が変異して、ジスルフィド結合を誘導し、鎖の結合が安定化されている。様々な抗体断片は、インタクトな抗体の消化の点から規定され、当業者は、このような断片が化学的または組み換えDNA方法を使用することによって、デノボに合成することができることを理解する。したがって、本明細書で使用する場合、抗体という用語は、例えば、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、望ましい生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド結合されたFvs(sdFv)、細胞内抗体、エピトープ結合断片または上記の抗原結合断片を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片を生成し、それぞれ1つの抗原結合部位を有する。「Fab断片」は、1つの軽鎖およびCH1ならびに1つの重鎖の可変領域を含む。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Fab’断片」は、VHドメインおよびCH1ドメインを含む1つの軽鎖および1つの重鎖の部分を含み、また、CH1とCH2ドメインの間の領域も含み、鎖間ジスルフィド結合が2つのFab’断片の2つの重鎖の間に形成されて、F(ab’)2分子を形成することができる。
抗体のペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋結合することができるF(ab’)2断片を産生する。「F(ab’)2断片」は、CH1とCH2の間の定常領域の部分を含む2つの軽鎖および2つの重鎖を含み、2つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成する。F(ab’)2断片は、2つの重鎖の間にジスルフィド結合によって一緒に保持される2つのFab’断片から構成される。
「Fv領域」は、重鎖と軽鎖の両方から可変領域を含むが、定常領域を欠失している。
「単鎖抗体」は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が可撓性のリンカーによって接続されて、1つのポリペプチド鎖を形成し、抗原結合領域を形成する。単鎖抗体は、国際特許出願第WO88/01649号、米国特許第4,946,778号および第5,260,203号に詳細に記述され、その開示は参照により援用される。
「抗原結合断片」および「抗原結合タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の標的抗原に結合するタンパク質を意味する。「抗原結合断片」は、限定されないが、免疫学的に機能的断片等の抗体およびその結合部分を含む。抗体の抗原結合断片の例は、重鎖および/または軽鎖CDR、または重鎖および/または軽鎖可変領域である。
抗体または免疫グロブリン鎖(重鎖または軽鎖)抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片(または単純に断片)」は、本明細書で使用する場合、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠失しているが、抗原に特異的に結合することができる抗体の部分(どのようにしてその部分を得るまたは合成するかに関わらず)を含む抗原結合タンパク質の種である。このような断片は、標的抗原に結合し、所与のエピトープに結合するために、インタクトな抗体を含むその他の抗原結合タンパク質と競合する可能性がある点において、生物活性である。いくつかの実施形態において、断片は断片を中和している。一態様において、このような断片は、全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、いくつかの実施形態において、単一の重鎖および/または軽鎖またはその部分を含む。これらの生物活性な断片は、組み換えDNA技術によって産生することができ、またはインタクトな抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的切断によって産生することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片として、限定されないが、Fab、ダイアボディ、Fab’、F(ab’)2、Fv、ドメイン抗体および単鎖抗体が挙げられ、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科またはウサギを含む哺乳動物源に由来し得る。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば1つ以上のCDRは、第2タンパク質または小分子に共有結合して、身体の特定の標的に向けられる治療薬を作製することができ、二機能性治療特性を有し、または長い血清半減期を有する。
ダイアボディは、2つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、リンカーによって接続されるVHおよびVL領域を含み、リンカーは短すぎて、同鎖の2つの領域の間で対になることができず、したがって、各領域は別のポリペプチド鎖の相補的領域と対になることができる(例えば、Holliger等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444−48、1993;およびPoljak等、Structure、2:1121−23、1994を参照のこと)。ダイアボディの2つのポリペプチド鎖が同一である場合、対になることから生じるダイアボディは、2つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、2つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ3つおよび4つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、それぞれ3つおよび4つの抗原結合部位を形成し、同じであっても異なっていてもよい。
二重特異性抗体または断片は、いくつかの構成からなり得る。例えば、二重特異性抗体は、単一の抗体(または抗体断片)に類似しているかもしれないが、2つの異なる抗原結合部位(可変領域)を有する。様々な実施形態において、二重特異性抗体は、化学技術(Kranz等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:5807、1981;「ポリドーマ」(polydoma)技術(例えば、米国特許第4,474,893号を参照のこと)、または組み換えDNA技術によって生成することができる。様々な実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原の少なくとも1つに、少なくとも2つの異なるエピトープについて結合特異性を有し得る。様々な実施形態において、抗体および断片は異種抗体でもあり得る。異種抗体は、2つ以上の抗体、または一緒に結合する抗原結合断片(例えば、Fab)であり、それぞれ、異なる特異性を有する抗体または断片である。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個別の抗体は、可能性として少量存在し得る自然発生の変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一抗原に対して向けられる。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対して向けられる異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の1つの決定基に対して向けられる。修飾因子の「モノクローナル」は、特定の方法によって抗体を産生する必要があるものとして解釈されない。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト等の1つの種からのフレームワーク残基を有する抗体および標的抗原に特異的に結合するマウス抗体等の別の種からの(概して、抗原結合を与える)CDRを指す。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒト抗体は、例えば、CDRおよび特定のCDR3のヒト生殖系列免疫グロブリン配列(例えば、in vitroのランダムまたは部位特異的変異原性によって導入される変異)によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体を指す。ヒト化抗体は、CDRを提供するドナー抗体として同抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから採取されたアミノ酸によって限定された数の置換を有し得る。ヒト化またはその他のモノクローナル抗体は、抗原結合またはその他の免疫グロブリン機能に実質的に影響しない付加的な保護的アミノ酸置換を有する可能性がある。様々な実施形態において、フレームワーク領域は、ヒト生殖系列エキソンXH、JH、VκおよびJκ配列から選択される。例えば、VHドメインのFRのヒト化についてのアクセプター配列は、本物のVHエキソンVH1−18(Matsuda等、Nature Genetics3:88−94、1993)またはVH1−2(Shin等、EMBO J.10:3641−3645、1991)から選択することができ、ヒンジ領域(JH)については、エキソンJH−6から選択することができる(Mattila等、Eur.J.Immunol.25:2578−2582、1995)。他の例では、生殖系列VκエキソンB3(Cox等、Eur.J.Immunol.24:827−836、1994)およびJκエキソンJκ−1(Hieter等、J.Biol.Chem.257:1516−1522、1982)をVLドメインヒト化についてアクセプター配列として選択することができる。
「組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体;組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体;ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入の動物(例えばマウス)から単離された抗体;その他のDNA配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与するその他の方法によって調製、発現、作製または単離された抗体等の組み換え方法によって調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。様々な実施形態において、しかしながら、このような組み換えヒト抗体は、in vitroの変異原性(例えば、ヒトIg配列に遺伝子導入の動物を使用する場合は、in vivoの体細胞性変異原性)に供され、したがって、組み換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、関係しながら、in vivoのヒト抗体生殖系列レパートリーの内部に自然に存在し得ない配列である。このような組み換え方法の全ては、当業者に周知である。
「抗CGRPアンタゴニスト抗体」(同義に「抗CGRP抗体」と呼ぶ)という用語は、CGRPに結合可能であり、またCGRP生物活性および/またはCGRPシグナル伝達により媒介される下流経路を阻害する抗体を指す。抗CGRPアンタゴニスト抗体は、例えば受容体結合および/またはCGRPへの細胞応答の誘発などのCGRPシグナル伝達により媒介される下流経路を含む、CGRP生物活性を(顕著に)遮断、アンタゴナイズ、抑制または低減する抗体を包含する。本発明の目的のため、「抗CGRPアンタゴニスト抗体」という用語が、先に明らかにした全ての用語、表題、ならびに、CGRP自身、CGRP生物活性(頭痛のどんな側面をも媒介するその能力に限らず)または生物活性の結果が、あらゆる意味のある程度に、実質的に無効、低下または中和される、機能的状態および特徴を包含することは、はっきりと理解されるであろう。いくつかの実施形態において、抗CGRPアンタゴニスト抗体はCGRPに結合し、CGRPのCGRP受容体への結合を防ぐ。他の実施形態において、抗CGRP抗体はCGRPに結合し、CGRP受容体の活性化を防ぐ。抗CGRPアンタゴニスト抗体例は本明細書において提供する。
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる、または分子と相互作用することができるタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、概して、アミノ酸、炭水化物または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面グルーピングから成り、概して、三次元構造特徴および特別な変化特徴を有する。エピトープは、「線形」または「立体構造」であり得る。線形のエピトープでは、タンパク質と(抗体等の)相互作用する分子との相互作用点は全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体構造のエピトープでは、相互作用点は、互いに離れているタンパク質のアミノ残残基に沿って生じる。抗原の望ましいエピトープが決定されると、例えば、本開示に記載の技術を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見の過程で、抗体の生成および特徴化が望ましいエピトープについての情報を明らかにし得る。この情報から、同エピトープに結合するための抗体を競合的に選別することが可能である。この選別を達成するためのアプローチは、クロスコンペティション試験を行って、互いに競合的に結合する抗体、例えば、抗原との結合について競合する抗体を見つけることである。
抗体を含む抗原結合タンパク質は、少なくとも1x10−6M、または少なくとも1x10−7M、または少なくとも1x10−8M、または少なくとも1x10−9M、または少なくとも1x10−10M、または少なくとも1x10−11Mの解離定数(以下に定義するKD、または対応するKb)の値によって決定される高結合親和性を有する抗原に結合する場合、抗原と「特異的に結合する」。目的のヒト抗原と特異的に結合する抗原結合タンパク質は、同じまたは異なる親和性で、同様にその他の種からの目的の同抗原に結合し得る。「KD」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、BIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、SwedenおよびPiscataway、N.J.)を使用して、バイオセンサーマトリックスの内部のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム生体分子特異的相互作用を分析することが可能な光学的現象を指す。さらなる記述については、Jonsson U.等、Ann.Biol.Clin.,51:19−26、1993;Jonsson U.等、Biotechniques、11:620−627、1991;Jonsson B.等、J.Mol.Recognit.,8:125−131、1995;およびJohnsson B.等、Anal.Biochem、198:268−277、1991を参照されたい。
「免疫原性」という用語は、本明細書で使用する場合、レシピエントに投与されたときに免疫反応(体液性または細胞性)を発揮する抗体または抗原結合断片の能力、例えば、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応を指す。HAMA反応は、対象からのT細胞が投与された抗体に対して免疫反応を起こすときに開始される。T細胞は、その後B細胞をリクルートして、特異的「抗抗体」抗体を生成する。
「免疫細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原に対する免疫反応を調節することを伴う造血系列の細胞を意味する(例えば、自己抗原)。様々な実施形態において、免疫細胞は、例えば、T細胞、B細胞、樹状細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞またはKuffer細胞である。
「ポリペプチド、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同じ意味で使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。様々な実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アルファ炭素がペプチド結合によって結合されるアミノ酸の鎖である。鎖の一端の末端アミノ酸(アミノ末端)は、したがって、遊離アミノ基を有し、鎖の他方の端の末端アミノ酸(カルボキシ末端)は、遊離カルボキシル基を有する。本明細書で使用する場合、「アミノ末端」(省略するとN末端)という用語は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α−アミノ基を指し、またはペプチド内のその他の位置のアミノ酸のα−アミノ基(ペプチド結合に属する場合、イミノ基)を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端の遊離カルボキシル基またはペプチド内のその他の位置のアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドは、本質的に、限定されないが、アミド結合と反対側のエーテルによって接続されるアミノ酸等のペプチド模倣物を含むポリアミノ酸も含む。
「組み換えポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されるポリペプチド等の組み換え方法によって、調製、発現、作製され、そこから生じる、または単離される融合分子を含む全てのポリペプチドを含むことを意図している。
本開示のポリペプチドは、任意の方法および理由で改変されたポリペプチドを含み、例えば、(1)タンパク質分解に対する感受性を減少させ、(2)酸化に対する感受性を減少させ、(3)タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させ、(4)結合親和性を変化させ、および(5)その他の物理化学的または機能的特性を与えるまたは修正する。例えば、単一または複数のアミノ酸置換(例えば、保護的アミノ酸置換)は、自然に発生する配列に(例えば、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分に)作製され得る。「保護的アミノ酸置換」は、機能的に類似するアミノ酸で、アミノ酸のポリペプチドの置換を指す。以下の6つの基は、それぞれ、互いに保護的置換であるアミノ酸を含む。
アラニン(A)、セリン(S)およびスレオニン(T)
アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)
アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)
アルギニン(R)およびリジン(K)
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)およびバリン(V)
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)およびトリプトファン(W)
アラニン(A)、セリン(S)およびスレオニン(T)
アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)
アスパラギン(N)およびグルタミン(Q)
アルギニン(R)およびリジン(K)
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)およびバリン(V)
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)およびトリプトファン(W)
「非保護的アミノ酸置換」は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスからのメンバーに置換することを意味する。このような変化が行われるときに、様々な実施形態において、アミノ酸のヒドロパシー指数が考えられ得る。それぞれのアミノ酸は、嫌気性および電荷特徴に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てる。ヒドロパシー指数は、イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)である。
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えるヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、技術分野で理解されている(例えば、Kyte等、1982、J.Mol.Biol.157:105〜131を参照のこと)。特定のアミノ酸が同様のヒドロパシー指数またはスコアを有するその他のアミノ酸に置換され得、同様の生物活性を保持し続け得ることは周知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化するときに、様々な実施形態において、ヒドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。様々な実施形態において、ヒドロパシー指数が±1以内のアミノ酸が含まれ、様々な実施形態において、±0.5以内のアミノ酸が含まれる。
また、このようなアミノ酸は親水性に基づいて効率的に置換され、特に、それにより作製された生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドは、本明細書に開示されるように、免疫学的実施形態に使用されることを意図することが理解される。様々な実施形態において、タンパク質の最も大きい局所的平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって管理されるように、免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物活性に相関する。
以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に割り当てられ、アルギニン(+3.0);リシン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0.+−.1);グルタミン酸(+3.0.+−.1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5.+−.1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5)およびトリプトファン(−3.4)である。同様の親水性値に基づいて変化するときに、様々な実施形態において、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が含まれ、様々な実施形態において、±1以内のアミノ酸の置換が含まれ、様々な実施形態において、±0.5以内のアミノ酸の置換が含まれる。例示的なアミノ酸置換を表1に記載する。
「ポリペプチド断片」および「短縮されたポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、対応する全長タンパク質に比べて、アミノ末端および/またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。様々な実施形態において、断片は、例えば、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900または少なくとも1000アミノ酸長であり得る。様々な実施形態において、断片は、また、例えば、最大1000、最大900、最大800、最大700、最大600、最大500、最大450、最大400、最大350、最大300、最大250、最大200、最大150、最大100、最大50、最大25、最大10または、最大5アミノ酸長であり得る。断片はさらに、端の片側または両側に1つ以上の付加的なアミノ酸、例えば、異なる自然発生のタンパク質(例えば、Fcまたはロイシンジッパードメイン)または人工アミノ酸配列(例えば、人工的リンカー配列)からのアミノ酸の配列を含み得る。
「ポリペプチド変異体(polypeptide variant/mutant)」という用語は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、1つ以上のアミノ酸残基が別のポリペプチド配列に対して、アミノ酸配列に挿入され、削除され、および/または置換される。様々な実施形態において、挿入、欠失または置換されるアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450または少なくとも500アミノ酸長であり得る。本開示の変異体は融合タンパク質を含む。
ポリペプチドの「誘導体」は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)等の別の化学的部分との結合、リン酸化、およびグリコシル化されたポリペプチドである。
「%配列同一性」という用語は、本明細書では、「%同一性」という用語と同義に使用され、配列整列プログラムを使用して整列するとき、2つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性のレベルまたは2つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用する場合、80%の同一性は、所定のアルゴリズムによって決定された80%の配列同一性と同じものを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列と少なくとも80%同一であることを意味する。様々な実施形態において、%同一性は、例えば、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%以上、所与の配列と同一の配列から選択される。様々な実施形態において、%同一性は、例えば、約60%〜約70%、約70%〜約80%、約80%〜約85%、約85%〜約90%、約90%〜約95%または約95%〜約99%の範囲にある。
「%配列相同性」という用語は、本明細書では、「%相同性」という用語と同義に使用され、配列整列プログラムを使用して整列するとき、2つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列相同性のレベルまたは2つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用する場合、80%の相同性は、所定のアルゴリズムによって決定された80%の配列相同性と同じものを意味し、したがって、所与の配列の相同性が、所与の配列の長さより80%超の配列相同性を有する。様々な実施形態において、%相同性は、例えば、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%以上、所与の配列と相同の配列から選択される。様々な実施形態において、%相同性は、例えば、約60%〜約70%、約70%〜約80%、約80%〜約85%、約85%〜約90%、約90%〜約95%または約95%〜約99%の範囲にある。
2つの配列間の同一性を決定するために使用することができる例示的なコンピュータプログラムとして、限定されないが、BLASTプログラムの組、例えば、BLASTN、BLASTX、およびTBLASTX、BLASTPおよびTBLASTNが挙げられ、NCBIウェブサイトのインターネットで一般に利用可能である。Altschul等、J.Mol.Biol.215:403−10、1990(公開されたデフォルト設定を特別に参照して、すなわち、パラメータw=4、t=17)およびAltschul等、Nucleic Acids Res.、25:3389−3402、1997も参照されたい。配列の検索は、一般に、GenBank Protein Sequencesおよびその他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、所与のアミノ酸配列を評価する場合、BLASTPプログラムを使用して実行される。GenBank Protein Sequencesおよびその他の公開データベースのアミノ酸配列に対する全リーディングフレームに翻訳された核酸配列を検索するには、BLASTXプログラムが好ましい。BLASTPもBLASTXも、11.0のオープンギャップペナルティおよび1.0の拡張ギャップペナルティのデフォルト値を使用して実行され、BLOSUM−62マトリックスを使用する。例えば、Idを参照されたい。
%配列同一性を計算する他に、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析を行う(例えば、Karlin&Altschul、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA、90:5873−5787、1993を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定法は、smallest sum probability(P(N))であり、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間で偶然に一致する確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において、smallest sum probabilityが約0.1未満、約0.01未満、または約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
ポリペプチド配列の文脈で「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、ポリペプチド領域が、参照配列に対して、少なくとも70%、一般に少なくとも80%、より一般に少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列類似性を有することを示す。例えば、ポリペプチドは、例えば、2つのペプチドが1つ以上の保護的置換によって異なる場合、第2のポリペプチドに実質的に類似する。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位から成るポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(「DNA」)およびリボ核酸(「RNA」)ならびに核酸類似体等の自然発生の核酸を含む。核酸類似体は、自然発生ではない塩基、自然発生のホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの結合に関与するヌクレオチドを含むもの、またはホスホジエステル結合以外の結合によって結合される塩基を含むものを含む。したがって、ヌクレオチド類似体として、例えば、限定されないが、ホスホロチオエート、ジチオリン酸(phosphorodithioate)、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、ボラノリン酸、メチルホスホン酸、キラル−メチルホスホン酸、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)が挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、自動DNA合成機を使用して、合成することができる。「核酸」という用語は、概して、大きいポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して、約50ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列をDNA配列(すなわちA、T、G、C)によって示す場合、「T」を「U」に置き換えるRNA配列(すなわちA、U、G、C)も含む。
通常の表記法を本明細書で使用して、ポリヌクレオチド配列を記載し、一本鎖ポリヌクレオチドの左端は5’−末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は5’−方向として示される。発生期のRNA転写物にヌクレオチドの5’〜3’方向の追加は、転写方向として示される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」として示され、そのDNAから転写されるmRNAと同じ配列を有し、RNA転写物の5’〜5’末端に位置するDNA鎖の配列は、「上流配列」として示され、RNAと同じ配列を有し、コードRNA転写物の3’〜3’末端であるDNA鎖の配列は、「下流配列」として示される。
「相補的」は、トポロジカルな適合性または2つのポリヌクレオチドの相互作用する表面を一緒に適合することを指す。したがって、2つの分子は、相補的として記載することができ、さらに接触面の特徴が互いに相補的である。第1のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第2のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、または第1のポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、第2のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる場合、第2のポリヌクレオチドと相補的である。
「特異的にハイブリダイズすること」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「〜に選択的にハイブリダイズする」は、配列が混合物(例えば、全て細胞性の)DNAまたはRNAに存在する場合、ストリンジェントな条件下で、好ましくは特定のヌクレオチド配列に、核酸分子を結合、二重化する、またはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが、好ましくはその標的配列に、少ない範囲でまたは全てではないがその他の配列にハイブリダイズする条件を指す。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈で、「ストリンジェントハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、環境パラメータが異なれば異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲のガイドは、Tijssen、1993、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes、part I、chapter 2“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”、Elsevier、N.Y.;Sambrook等、2001、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、3.sup.rd ed.、NY;and Ausubel等、eds.、Current Edition、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYに見つけることができる。
概して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびpHで特定の配列について、熱融点(Tm)より低い約5℃になるように選択される。Tmは、標的配列の50%が完全に適合したプローブにハイブリダイズする(所定のイオン強度およびpH下の)温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてTmと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットのフィルター上の約100超の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについての例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、42℃の1mgのヘパリンを有する50%のホルマリンであり、一晩ハイブリダイゼーションを実施する。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、0.15MのNaCl、72℃、約15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、0.2xSSC洗浄、65℃、15分間である。SSC緩衝液の記載についてはSambrook等を参照されたい。高いストリンジェンシー洗浄の前に低いストリンジェンシー洗浄を行って、バックグラウンドプローブシグナルを取り除くことができる。二重の例えば約100個超のヌクレオチドについて、中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、15分間の45℃の1xSSCである。二重の例えば約100個超のヌクレオチドについて、低いストリンジェンシー洗浄の例は、15分間の40℃の4〜6xSSCである。概して、特定のハイブリダイゼーションアッセイの関係のないプローブについて観察したものより2倍(またはそれ以上の)ノイズ比に対するシグナルは、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
「プライマー」は、示されたポリヌクレオチドテンプレートに特異的にハイブリダイズし、相補的ポリヌクレオチドの合成に開始点を提供することができるポリヌクレオチドを指す。このような合成は、すなわち、ヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチドテンプレートおよびDNAポリメラーゼ等の重合のための薬剤の存在下で、合成が誘導される条件下に、ポリヌクレオチドプライマーが置かれた場合に生じる。プライマーは、概して一本鎖であるが二本鎖でもよい。プライマーは、概してデオキシリボ核酸であるが、様々な合成および自然発生のプライマーが多くの用途に有用である。プライマーは、ハイブリダイズして、合成の開始部位として提供されるように設計されたテンプレートに相補的であるが、テンプレートの厳密な配列を反映する必要はない。このような場合では、テンプレートへのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色素生産性、放射性または蛍光部分で標識することができ、検出可能な部分として使用することができる。
「プローブ」は、ポリヌクレオチドを参照して使用する場合、別のポリヌクレオチドの示された配列に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを指す。プローブは、標的相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、テンプレートの厳密な相補的配列を反映する必要はない。このような場合では、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、色素生産性、放射性または蛍光部分で標識することができ、検出可能な部分として使用することができる。プローブが相補的ポリヌクレオチドの合成についての開始点を提供する例では、プローブはプライマーであってもよい。
「ベクター」は、ベクターに結合された別の核酸を細胞に導入するために使用することができるポリヌクレオチドである。ベクターの1つの種類は「プラスミド」であり、付加的な核酸セグメントを連結することができる線形または環状二本鎖DNA分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり(例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。特定のベクターは導入される宿主細胞に自律増殖することが可能である(例えば、複製およびエピソームの哺乳動物ベクターの細菌起源を含む細菌ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに統合され、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現に向かうことができるベクターの種類である。
「制御配列」は、操作可能に結合する核酸の発現(例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置)に影響する核酸である。制御配列は、例えば、直接的にまたは1つ以上の他の分子(例えば、制御配列および/または核酸に結合するポリペプチド)の活性によって、制御された核酸に影響を及ぼす。制御配列の例として、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)が挙げられる。制御配列のさらなる例は、例えば、Goeddel、1990、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif.およびBaron等、1995、Nucleic Acids Res.23:3605−06に記載されている。ヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現(例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置)に影響する場合、制御配列に「操作可能に連結する」。
「宿主細胞」は、本開示のポリヌクレオチドを発現させるために使用することができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えばE.coliであってもよく、または真核生物、例えば単細胞真核生物(例えば、酵母菌またはその他の真菌類)、植物細胞(例えば、タバコまたはトマト植物細胞)、動物細胞(例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞)またはハイブリドーマであってもよい。概して、宿主細胞は、ポリペプチドコード核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる培養細胞であり、宿主細胞に発現することができる。「組み換え宿主細胞」というフレーズは、核酸で形質転換またはトランスフェクトされて、発現した宿主細胞を示すために使用され得る。宿主細胞は、また、核酸を含むが、宿主細胞が操作可能に核酸に結合するように制御配列を宿主細胞に導入しない限り、望ましいレベルで発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、その細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、変異または環境的影響によって特定の改変が次の世代に生じうるため、このような子孫は、実際には親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用する用語の範囲に含まれる。
「単離された分子」という用語は、(分子が例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである場合)、起源または由来源によって、(1)天然状態で不随する天然結合成分に結合していなく、(2)同種の他の分子を実質的に含まず、(3)異なる種からの細胞によって発現し、または(4)自然発生しない分子である。したがって、化学合成され、または天然起源の細胞とは異なる細胞システムに発現する分子は、天然結合成分から「単離」される。当該技術分野で周知の精製技術を使用して、単離によって、分子は天然結合成分を実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均一性は、当該技術分野で周知のいくつかの方法によって分析され得る。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および当該技術分野で周知の技術を使用して、ゲルを染色してポリペプチドを可視化することで分析してもよい。特定の目的のために、HPLCまたは精製について当該技術分野で周知のその他の方法を使用することによって、高分解能を提供してもよい。
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60%〜75%が1つの種類のポリペプチドを示す場合、「実質的に純粋」、「実質的に均一」または「実質的に精製」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は単量体であっても、多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、概して、約50%、60%、70%、80%または90%W/Wのタンパク質試料を含み、より通常は約95%、好ましくは99%以上純粋である。タンパク質の純度または均一性は、当該技術分野で周知のいくつかの方法によって示され、次に当該技術分野で周知の染料でゲルを染色して1つのポリペプチドバンドを可視化してもよい。特定の目的のために、HPLCまたは精製について当該技術分野で周知のその他の方法を使用することによって、高分解能を提供してもよい。
「リンカー」は、例えば、5’末端の1つの相補的配列および3’末端の別の相補的配列にハイブリダイズする核酸分子を共有結合、またはイオンまたはファンデルワールスまたは水素結合の何れかで2つのその他の分子を連結する分子を指し、したがって2つの非相補的配列を接続する。「開裂可能なリンカー」は、開裂可能なリンカーによって接続された2つの成分を分離するために分解または切断することができるリンカーを指す。開裂可能なリンカーは、概して、酵素、通常は、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ等によって開裂される。開裂可能なリンカーは、また、例えば、温度、pH、塩濃度等の変化等の環境的要因によっても開裂し得る。
「標識」または「標識する」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体の別の分子を組み込むことを指す。一実施形態において、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射標識されたアミノ酸を組み込む、または印付きのアビジン(例えば、蛍光マーカーを含むストレプトアビジンまたは光学的もしくは熱量測定方法によって検出することができる酵素活性)によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドに付着させることである。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療用、例えば、薬物複合体またはトキシンであり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野で周知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例として、限定されないが、放射性同位体または放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)、ガドリニウムキレート等の磁気剤、百日咳毒素等のトキシン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。いくつかの実施形態において、ラベルは、様々な長さのスペーサーアームによって付着して、潜在的な立体障害を減少させる。
「免疫複合体」または「融合タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、エフェクタ分子に直接または間接的に結合(または連結する)抗体またはその抗原結合断片を含む分子を指す。エフェクタ分子は、検出可能な標識、免疫毒素、サイトカイン、ケモカイン、治療薬または化学療法薬であり得る。抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを介してエフェクタ分子に結合し得る。免疫複合体および/または融合タンパク質は、抗体または抗原結合断片の免疫反応性を保持し、例えば、抗体または抗原結合断片の結合後の抗原を結合する能力は、結合前とほぼ同じ、または僅かに減少する。本明細書で使用する場合、免疫複合体は、抗体薬物複合体(ADC)としても示され得る。免疫複合体および/または融合タンパク質は、元々、例えば、抗体およびエフェクタ分子等の別の機能性を有する2つの分子から調製され、「キメラ分子」と呼ばれることもある。
「医薬組成物」は、動物の医学的使用に適した組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的有効量の活性剤および薬学的に許容される担体を含む。「薬理学的有効量」は、意図した薬理学的結果を生み出すのに効率的な薬剤の量を指す。「薬学的に許容される担体」は、標準の薬学的担体、ビヒクル、緩衝液、賦形剤、例えば、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖の5%水溶液および乳濁液、例えば、油/水または水/油乳濁液ならびに様々な種類の湿潤剤および/またはアジュバントを指す。適切な薬学的担体および製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、21版、2005、Mack Publishing Co、Eastonに記載されている。「薬学的に許容される塩」は、例えば、金属塩(ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等)およびアンモニアの塩または有機アミンを含む医学的使用のために、化合物に配合することができる塩である。
「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語は、生物学的疾患および/またはそれに不随する症状の少なくとも1つを緩和または抑制する方法を指す。疾患、障害または病態を「緩和する」ことは、本明細書で使用する場合、疾患、障害または病態の症状の重症度および/または発生頻度を減少させることを意味する。「治療」は、本明細書で使用する場合、恩恵的または望ましい臨床結果を得るための方法である。本発明の目的について、恩恵的または望ましい臨床結果として、限定されないが、1つ以上の症状の緩和、疾患の範囲を無くすこと、疾患の拡散(転移、例えば、肺またはリンパ節への転移)を予防または遅延させること、疾患の再発を予防または遅らせること、疾患の進行を遅延または緩徐すること、疾患状態を改善すること、および緩解(部分的または全体的にも)が挙げられる。増殖性疾患の病理学的結果の減少も「治療」に含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの態様の1つ以上を考慮する。
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定される疾患、状態または疾病を治療、例えば、1つ以上のその症状を回復、緩和、軽減、および/または遅延させるために充分な化合物または組成物の量を指す。
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「から成る」および/または「から本質的に成る」ことが理解される。
本明細書の「約」値またはパラメータの参照は、その値またはパラメータ自体に関する変形例を含む(記載する)。例えば、「約X」を示す記述は、「X」という記述を含む。
本明細書および添付の請求項に使用する場合、単数形「a」、「または」および「the」は他に明白な断りの無い限り、複数のものを含む。本明細書に記載の本発明の態様および変形例は、態様および変形例「から成る」および/または「から本質的に成る」ことが理解される。
CGRP
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、37アミノ酸長の神経ペプチドであり、カルシトニン、アドレノメデュリンおよびアミリンを含むペプチドのファミリーに属する。ヒトにおいて、2つの形態のCGRP(α−CGRPとβ−CGRP)が存在し、また同様の活性を有する。これらCGRPは3個のアミノ酸が異なり、異なる分布を呈する。少なくとも2つのCGRP受容体サブタイプもまた異なる活性に相当し得る。CGRPは、免疫組織学的(ELISA等)および放射性免疫測定法により、心臓、末梢および脳血管や腎臓を神経支配する神経において検出されてきた。CGRPは、様々な組織で同定されてきた特定の細胞表面受容体に結合することによりその生物学的応答を媒介することが示されてきた。CGRPは、片頭痛(前兆有りまたは無し)および群発頭痛を含む、血管性頭痛の全形態等のその他血管運動症状の病理学に関係するとされてきた、強力な血管拡張物質である(Durham,N.Engl.J.Med.350:1073−1075,2004)。CGRPは、顔面紅潮や寝汗等の血管運動症状(VMS)に関連する可能性について注目されてきた(Wyonら、Scand.J.Urol.Nephrol.35:92−96(2001);Wyonら、Menopause 7(1):25−30,2000)。CGRPは皮膚における最も顕著な神経ペプチドであり、また骨や関節等のその他組織においてもみられる。CGRPはケラチノサイト、すなわち表皮細胞の増殖を刺激する(Takahashiら、J Invest Dermatol,101(5):646−651,1993)。CGRPは創傷治癒に大変重要な神経ペプチド(NP)であり、またその過程で放出される第一NPである。CGRPは、大変強力な血管拡張物質であり、また遅延型過敏反応(DTH)の強力な阻害剤である。
カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、37アミノ酸長の神経ペプチドであり、カルシトニン、アドレノメデュリンおよびアミリンを含むペプチドのファミリーに属する。ヒトにおいて、2つの形態のCGRP(α−CGRPとβ−CGRP)が存在し、また同様の活性を有する。これらCGRPは3個のアミノ酸が異なり、異なる分布を呈する。少なくとも2つのCGRP受容体サブタイプもまた異なる活性に相当し得る。CGRPは、免疫組織学的(ELISA等)および放射性免疫測定法により、心臓、末梢および脳血管や腎臓を神経支配する神経において検出されてきた。CGRPは、様々な組織で同定されてきた特定の細胞表面受容体に結合することによりその生物学的応答を媒介することが示されてきた。CGRPは、片頭痛(前兆有りまたは無し)および群発頭痛を含む、血管性頭痛の全形態等のその他血管運動症状の病理学に関係するとされてきた、強力な血管拡張物質である(Durham,N.Engl.J.Med.350:1073−1075,2004)。CGRPは、顔面紅潮や寝汗等の血管運動症状(VMS)に関連する可能性について注目されてきた(Wyonら、Scand.J.Urol.Nephrol.35:92−96(2001);Wyonら、Menopause 7(1):25−30,2000)。CGRPは皮膚における最も顕著な神経ペプチドであり、また骨や関節等のその他組織においてもみられる。CGRPはケラチノサイト、すなわち表皮細胞の増殖を刺激する(Takahashiら、J Invest Dermatol,101(5):646−651,1993)。CGRPは創傷治癒に大変重要な神経ペプチド(NP)であり、またその過程で放出される第一NPである。CGRPは、大変強力な血管拡張物質であり、また遅延型過敏反応(DTH)の強力な阻害剤である。
本明細書で使用される「CGRP」という用語は、ヒトCGRP(hCGRP)、hCGRPの変異体、アイソフォームおよび種相同体、およびhCGRPと共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。様々な実施形態において、本明細書で使用されるhCGRPは配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み得る。
ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF(配列番号1)
ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF(配列番号1)
様々な実施形態において、CGRPは、配列番号1のヒトCGRP配列と、例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の相同性が観察されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号1のヒトCGRP配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の相同性、配列番号1のヒトCGRPの活性の少なくとも1x、少なくとも1.5x、少なくとも2x、少なくとも2.5x、または少なくとも3xの活性を有する。CGRPの変異体は、配列番号1の223アミノ酸配列における所定の位置に存在するアミノ酸残基の付加、欠失または置換を参照として本明細書に記載され得る。したがって、例えば、「P29W」という用語は、配列番号1中29位の「P」(プロリン、標準1文字表記)残基が、「W」(トリプトファン、標準1文字表記)と置換されたことを示す。
抗体
ヒトCGRPポリペプチドに結合する新規抗体を生成する方法は、当業者に周知である。例えば、CGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫反応を刺激するのに有効なCGRPポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与することを含み得、マウスの抗体産生細胞(例えば、膵臓からの細胞)を得て、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを得て、抗体産生ハイブリドーマに試験を行って、CGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを識別することを含み得る。一度得られると、ハイブリドーマは細胞培地、任意に、ハイブリドーマ由来細胞がCGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件で増殖することができる。モノクローナル抗体は、細胞培地から精製され得る。特定の望ましい抗体を識別するために、様々な異なる技術を抗体:抗原相互作用の試験に使用可能である。
ヒトCGRPポリペプチドに結合する新規抗体を生成する方法は、当業者に周知である。例えば、CGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫反応を刺激するのに有効なCGRPポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与することを含み得、マウスの抗体産生細胞(例えば、膵臓からの細胞)を得て、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを得て、抗体産生ハイブリドーマに試験を行って、CGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを識別することを含み得る。一度得られると、ハイブリドーマは細胞培地、任意に、ハイブリドーマ由来細胞がCGRPポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件で増殖することができる。モノクローナル抗体は、細胞培地から精製され得る。特定の望ましい抗体を識別するために、様々な異なる技術を抗体:抗原相互作用の試験に使用可能である。
必要な特異性の抗体を産生し、または単離するその他の適切な方法を使用することができ、例えば、ライブラリから組み換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)の免疫化に依存する方法を含む。例えば、Jakobovits等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:2551−2555、1993;Jakobovits等、Nature、362:255−258、1993;Lonberg等、米国特許第5,545,806号;Surani等、米国特許第5,545,807号を参照されたい。
抗体は多くの方法で操作することができる。抗体は、単鎖抗体(小分子免疫薬またはSMIP(商標))、FabおよびF(ab’)2断片等として作製することができる。抗体は、ヒト化、キメラ化、脱免疫化(deimmunized)、完全ヒトにすることができる。多くの刊行物が多くの種類の抗体およびこのような抗体を操作する方法を記載している。例えば、米国特許第6,355,245号;第6,180,370号;第5,693,762号;第6,407,213号;第6,548,640号;第5,565,332号;第5,225,539号;第6,103,889号;および第5,260,203号を参照されたい。
キメラ抗体は、当該技術分野で周知の組み換えDNA技術によって産生することができる。例えば、マウス(またはその他の種)モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子は、制限酵素で消化されて、マウスFcをコードする領域を取り除き、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の等価部分は置換される(Robinson等、国際特許公開PCT/US86/02269;Akira等、欧州特許出願第184,187号;Taniguchi,M.、欧州特許出願第171,496号;Morrison等、欧州特許出願第173,494号;Neuberger等、国際特許出願WO86/01533;Cabilly等米国特許第4,816,567号;Cabilly等、欧州特許第125,023号;Better等、Science、240:1041−1043、1988;Liu等、PNAS USA、84:3439−3443、1987;Liu等、J.Immunol.139:3521−3526、1987;Sun等、PNAS USA、84:214−218、1987;Nishimura等、Canc.Res.47:999−1005、1987;Wood等、Nature 314:446−449、1985;およびShaw等、J.Natl Cancer Inst.、80:1553−1559、1988を参照されたい)
抗体をヒト化する方法は当該技術分野に記載されている。実際には、ヒト化抗体は、概して、いくつかの高頻度可変領域の残基および可能性としてのいくつかのフレームワーク領域の残基は、げっ歯類の抗体の類似の部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり、非ヒト種の対応する配列によって置換されたインタクトなヒト可変領域より実質的に少ない。ある程度まで、このヒト化は、適切なライブラリを使用して、ヒト化の技術および表示技術に関連して達成することができる。マウス抗体またはその他の種の抗体は、当該技術分野で周知の技術を使用してヒト化または霊長類化(primatized)することができる(例えば、Immunol Today、14:43−46、1993;およびWright等、Crit.Reviews in Immunol.、12125−168、1992を参照のこと)。目的の抗体は、組み換えDNA技術によって操作して、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメインおよび/またはフレームワークドメインを対応するヒト配列に置換してもよい(国際特許第92/02190号および米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号、および第5,777,085号を参照のこと)。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子を構築するためにIg cDNAを使用することは、当該技術分野で周知である(Liu等、P.N.A.S.84:3439、1987;J.Immunol.139:3521、1987)。mRNAは、ハイブリドーマまたは抗体を産生するその他の細胞から単離され、cDNAを産生するために使用される。目的のcDNAは、特定のプライマーを使用してポリメラーゼ鎖反応によって増幅してもよい(米国特許第4,683,195号および第4,683,202号)。あるいは、ライブラリを作製し、スクリーニングを行って、目的の配列を単離する。その後、抗体の可変領域をコードするDNA配列は、ヒト定常領域配列に融合する。遺伝子に対するヒト定常領域の配列は、Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、N.I.H.publication no.91〜3242に見つけることができる。ヒトC領域遺伝子は周知のクローンから容易に利用することができる。アイソタイプの選択は、補体結合反応、または抗体依存性細胞傷害活性等の望ましいエフェクタ機能によって誘導される。様々な実施形態において、アイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4から成る群から選択される。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれかを使用してもよい。キメラ、ヒト化抗体は、通常の方法によって発現される。
Queen等の米国特許第5,693,761号は、抗体をヒト化することについて、Winter等を改良したものを開示し、立体的またはその他の化学的不適合性があるために、結合活性の喪失がCDRをマウス抗体に見つけられる結合可能な構造に折りたたむことを妨げるヒト化フレームワークの構造的モチーフにおける問題に起因するという前提に基づいている。この問題に対処するために、Queenは、ヒト化されたマウス抗体のフレームワーク配列に対して直鎖ペプチド配列に密接に相同のヒトフレームワーク配列を使用することを示す。したがって、Queenの方法は、種間のフレームワーク配列を比較することに焦点を置いている。概して、全ての使用可能なヒト可変領域を特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基間の同一性の確率を計算する。最も高い確率のヒト可変領域を選択して、ヒト化プロジェクトにフレームワーク配列を提供する。Queenはまた、結合可能な構造において、CDRを支持するのに欠かせないマウスのフレームワークから特定のアミノ残基をヒト化フレームワークに保持することが重要であることを示している。潜在的な臨界は分子モデルから評価する。保持について候補となる残基は、概して、CDRに対して直鎖配列に隣接する、または6ÅのCDR残基に物理的に存在する残基である。
その他のアプローチでは、一度、低い結合活性のヒト化構築物を得ると1つの残基をマウス配列に復帰する、およびRiechmann等、1988に記載のように抗原結合をアッセイすることによって、特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性が実験的に決定される。フレームワーク配列の重要なアミノ酸を識別する別の例示的なアプローチは、Carter等の米国特許第5,821,337号、およびAdair等の米国特許第5,859,205号によって開示されている。これらの参考文献は、フレームワークの特定のKabat残基の位置を開示し、ヒト化抗体において、対応するマウスアミノ酸で置換して、結合活性を保持することを必要とし得る。
「フレームワークシャッフリング」と呼ばれる抗体をヒト化する別の方法は、個別のヒト生殖系列フレームワークにフレームに融合された非ヒトCDR可変領域を有するコンビナトリアルライブラリを生成することに依存する(Dall’Acqua等、Methods、36:43、2005)。その後、ライブラリをスクリーニングして、良好な結合を保持するヒト化抗体をコードするクローンを識別する。
望ましいヒト化抗体を作製するのに使用される軽鎖および重鎖の両方のヒト可変領域の選択は、抗原性を減少させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、げっ歯類の抗体の可変領域の配列を周知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。げっ歯類の配列にもっと近いヒト配列は、その後、ヒト化抗体について、ヒトフレームワーク領域(フレームワーク領域)として許容される(Sims等、J.Immunol.、151:2296、1993;Chothia等、J.Mol.Biol.、196:901、1987)。別の方法は、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同フレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る(Carter等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285、1992;Presta等、J.Immunol.、151:2623、1993)。
ヒト可変領域に置換するための非ヒト残基の選択は、様々な要因の影響を受ける可能性がある。これらの要因として、例えば、特定の位置のアミノ酸の希少性、CDRまたは抗原の何れかとの相互作用の確率、ならびに軽鎖および重鎖可変領域間のインターフェース間のインターフェースに関与する確率が挙げられる(例えば、米国特許第5,693,761号、第6,632,927号および第6,639,055号を参照のこと)。これらの要因を分析する1つの方法は、非ヒトおよびヒト化配列の3次元モデルの使用による。3次元免疫グロブリンモデルは、使用されることが多く、当業者になじみのあるモデルである。選択された候補の免疫グロブリン配列の予想される3次元構造を示し、表示するコンピュータプログラムを使用することができる。これらの表示を検査することで、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割を分析することができ、例えば、候補の免疫グロブリンの抗原に結合する能力に影響する残基を分析することができる。このように、標的抗原の親和性の増加等の望ましい抗体の特徴を達成するために、非ヒト残基を選択し、ヒト可変領域残基に置換することができる。
完全ヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野に記載されている。例として、抗CGRP抗体またはその抗原結合断片を産生する方法は、ファージにヒト抗体のライブラリを合成し、ライブラリをCGRPまたはその抗体結合部分でスクリーニングし、CGRPに結合するファージを単離し、およびファージから抗体を得るステップを含む。別の例として、ファージ表示技術に使用される抗体のライブラリを調製する1つの方法は、CGRPを有するヒト免疫グロブリン遺伝子座またはその抗原性部分を含む非ヒト動物を免疫化して、免疫反応を作り、免疫化した動物から抗体産生細胞を抽出し;本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを抽出した細胞から単離し、RNAを逆転写してcDNAを産生し、プライマーを使用してcDNAを増幅し、ならびに抗体をファージに発現するようにcDNAをファージ表示ベクターに挿入するステップを含む。本発明の組み換え抗CGRP抗体は、このように得ることができる。
本発明の組み換えヒト抗CGRP抗体は、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることによって単離することもできる。好ましくは、ライブラリは、scFvファージ表示ライブラリであり、B細胞から単離されたmRNAから調製されるヒトVLおよびVH cDNAを使用して生成される。このようなライブラリを調製し、スクリーニングする方法は、当該技術分野で周知である。ファージ表示ライブラリを生成するキットは市販されている(例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、catalog no.27−9400−01;およびthe Stratagene SurfZAP(商標)ファージ表示キット、catalog no.240612)。抗体表示ライブラリを生成およびスクリーニングするのに使用することができるその他の方法および試薬もある(例えば、米国特許第5,223,409号;PCT出願WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690;Fuchs等、Bio/Technology 9:1370−1372(1991);Hay等、Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85、1992;Huse等、Science 246:1275−1281、1989;McCafferty等、Nature 348:552−554、1990;Griffiths等、EMBO J.12:725−734、1993;Hawkins等、J.Mol.Biol.226:889−896、1992;Clackson等、Nature 352:624−628、1991;Gram等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576−3580、1992;Garrad等、Bio/Technology 9:1373−1377、1991;Hoogenboom等、Nuc.Acid Res.19:4133−4137、1991;およびBarbas等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978−7982、1991を参照のこと、それぞれ、ファージ表示ライブラリの調製およびスクリーニングを示すために、参照により本明細書に援用される)。
また、ヒトIgE抗原、例えば、XenoMouse(商標)動物(Abgenix、Inc./Amgen、Inc.、Fremont、Calif.)で、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座のいくつかまたは全てをそのゲノムに含む非ヒト、トランスジェニック動物を免疫化することによって、ヒト抗体が産生される。XenoMouse(商標)は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きい断片を含む操作されたマウス株であり、マウス抗体産生が欠乏している。例えば、Green等、Nature Genetics 7:13−21、1994;米国特許第5,916,771号、第5,939,598号、第5,985,615号、第5,998,209号、第6,075,181号、第6,091,001号、第6,114,598号、第6,130,364号、第6,162,963号、および第6,150,584号を参照されたい。また、WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560、およびWO00/037504も参照されたい。XenoMouse(商標)マウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒト抗体を生成する。いくつかの実施形態において、XenoMouse(商標)マウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のメガベースの大きさの生殖系列構成断片を酵母人工染色体(YAC)に導入することで、ヒト抗体V遺伝子レパートリーの約80%を含む。他の実施形態において、XenoMouse(商標)マウスは、さらに、ほぼ全てのヒトラムダ軽鎖遺伝子座を含む。Mendez等、Nature Genetics 15:146−156、1997、Green and Jakobovits、J.Exp.Med.188:483−495(1998)およびWO98/24893を参照されたい(それぞれ、完全ヒト抗体の調製を示すために、参照によりその全体が本明細書に援用される)。別の態様では、本発明は、CTLA−4抗原を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することによって、非ヒト、非マウス動物から抗CTLA−4抗体を作製する方法を提供する。前述の文献に記載の方法を使用してこのような動物を作製することができる。
抗原に対する抗体結合の特徴化
CGRPへの結合について、例えば、標準ELISAによって本発明の抗体を試験することができる。例として、マイクロタイタープレートをPBSの精製されたCGRPで被覆し、その後、PBSの5%ウシ血清アルブミンで遮断する。抗体の希釈液(例えば、CGRP免疫化マウスの血漿の希釈液)を各ウェルに添加し、37℃で1〜2時間インキュベートする。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、アルカリホスファターゼに結合した二次試薬(例えば、ヒト抗体については、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬)でインキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質(1Mg/ml)で発達させ、405〜650のODで分析する。好ましくは、最も高い力価を発現するマウスを融合に使用する。ELISA分析を使用して、CGRP免疫原に陽性の反応を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。高い結合活性でCGRPに結合するハイブリドーマをサブクローン化し、さらに特徴付けを行う。各ハイブリドーマの1つのクローンは、親細胞の反応性を(ELISAにより)保持し、−140℃で保存した5〜10バイアルの細胞バンクを作製し、抗体の精製のために選択することができる。
CGRPへの結合について、例えば、標準ELISAによって本発明の抗体を試験することができる。例として、マイクロタイタープレートをPBSの精製されたCGRPで被覆し、その後、PBSの5%ウシ血清アルブミンで遮断する。抗体の希釈液(例えば、CGRP免疫化マウスの血漿の希釈液)を各ウェルに添加し、37℃で1〜2時間インキュベートする。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、アルカリホスファターゼに結合した二次試薬(例えば、ヒト抗体については、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬)でインキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質(1Mg/ml)で発達させ、405〜650のODで分析する。好ましくは、最も高い力価を発現するマウスを融合に使用する。ELISA分析を使用して、CGRP免疫原に陽性の反応を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。高い結合活性でCGRPに結合するハイブリドーマをサブクローン化し、さらに特徴付けを行う。各ハイブリドーマの1つのクローンは、親細胞の反応性を(ELISAにより)保持し、−140℃で保存した5〜10バイアルの細胞バンクを作製し、抗体の精製のために選択することができる。
選択した抗CGRPモノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合したかどうかを判断するために、各抗体を市販の試薬(Pierce、Rockford、Ill.)でビオチン化することができる。非標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用した競合試験を前述のCGRP被覆されたELISAプレートを使用して実施することができる。ビオチン化mAbを連鎖球菌−アビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出することができる。精製された抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用してアイソタイプELISAを実施することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、microtiterプレートのウェルを1.mu.g/mlの抗ヒト免疫グロブリンで、4℃で一夜被覆することができる。1%のBSAで遮断した後、プレートを1μg/ml以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプコントロールと、周囲温度で1〜2時間、反応させる。ウェルは、その後、ヒトIgG1またはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合プローブの何れかと反応することができる。プレートは発達し、前述のように分析する。
抗CGRPヒトIgGのウエスタンブロットによるCGRP抗原との反応性についてさらに試験を行うことができる。端的には、CGRPは、調製し、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動の後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移動し、10%のウシ胎仔血清で遮断し、モノクローナル抗体でプローブして、試験を行う。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを使用して検出することができ、BCIP/NBT基質タブレット(Sigma Chem.Co.、St.Louis、Mo.)で発生することができる。
抗CGRP抗体の識別
本発明は、CGRP抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片を提供する。
本発明は、CGRP抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片を提供する。
本発明には、本発明の抗CGRP抗体と同じエピトープに結合する抗体がさらに含まれている。抗体が、本発明の抗CGRP抗体が結合するエピトープと同じエピトープへの結合に競合できるかどうかを決定するためには、クロスブロッキングアッセイ、例えば競合ELISAアッセイを実施する。例示的な競合ELISAアッセイでは、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングされたCGRPが、候補競合抗体の有無にかかわらずプレインキュベートされ、その後、本発明のビオチン標識化抗CGRP抗体を添加する。ウェル中のCGRP抗原に結合した標識化抗CGRP抗体の量は、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体と適切な基質を使用して測定する。この抗体は、放射性標識または蛍光標識、またはその他の検出可能かつ測定可能な標識で標識化できる。抗原に結合した標識化抗CGRP抗体の量は、同じエピトープへの結合に競合する候補競合抗体(試験抗体)の能力と間接的な相関関係がある。すなわち、同じエピトープに対する試験抗体の親和性が高いほど、抗原コーティングウェルに結合される標識化抗体がより少なくなる。候補競合抗体は、候補抗体がCGRP抗体の結合を、候補競合抗体の非存在下で並行して実施された対照と比較して、少なくとも20%、好ましくは少なくとも20〜50%、さらにより好ましくは少なくとも50%ブロックできる場合、本発明の抗CGRP抗体と実質的に同じエピトープに実質的に結合するか、または同じエピトープへの結合に競合する抗体であると考えられる。このアッセイの変形を実行して、同じ定量値に到達できることが理解される。
本明細書に記載のように生成された3つのマウス抗体、6G5C8C4(以下「A1」とも称する)、6G5C8C4(以下「A2」とも称する)、および6G5C8C4(以下「A3」とも称する)の重鎖CDRおよび軽鎖CDRのアミノ酸配列を下表2に示す。
本発明の様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号17の重鎖可変領域配列:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAVITIVPYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号17)
および配列番号23の軽鎖可変領域配列:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSRVPDRFSGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNSYPYTFGAGTKLELK(配列番号23)
を含む、マウス抗体、6G5C8C4(「A1」)である。
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAVITIVPYYFDYWGQGTTLTVSS(配列番号17)
および配列番号23の軽鎖可変領域配列:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSRVPDRFSGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNSYPYTFGAGTKLELK(配列番号23)
を含む、マウス抗体、6G5C8C4(「A1」)である。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号17に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号18:
gaggtccagctgcaacaatctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaacaatggtggtactacttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagtcattactatagtcccctactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(配列番号18)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号23に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号24:
gacattgttatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtagtaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctttcgttacagtagagtccctgatcgcttctcaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagactatttctg tcagcaatataacagttatccttacacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(配列番号24)
を含む。
gaggtccagctgcaacaatctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaacaatggtggtactacttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagtcattactatagtcccctactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(配列番号18)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号23に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号24:
gacattgttatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtagtaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctttcgttacagtagagtccctgatcgcttctcaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagactatttctg tcagcaatataacagttatccttacacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(配列番号24)
を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号19の重鎖可変領域配列:
EVQLLQSGPELMKPGTSVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGDTTYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPLYFDFWGQGTTLAVSS (配列番号19)
および配列番号25の軽鎖可変領域配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGINVAWYQQKPGQSPKALLYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVKSGDLAEYFCQQYNTYPYTFGGGTKLEIK (配列番号25)
を含む、マウス抗体、24G7B10G2(「A2」)である。
EVQLLQSGPELMKPGTSVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGDTTYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPLYFDFWGQGTTLAVSS (配列番号19)
および配列番号25の軽鎖可変領域配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGINVAWYQQKPGQSPKALLYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVKSGDLAEYFCQQYNTYPYTFGGGTKLEIK (配列番号25)
を含む、マウス抗体、24G7B10G2(「A2」)である。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は、配列番号19に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号20:
gaggtccagc tgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctca(配列番号20)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は配列番号25に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号26:
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtattaatgtagcctggtatcaacagaagccaggacaatctcctaaagcactgctttactcggcatcctaccgatatagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggttctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgaagtctggagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacacctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(配列番号26)
を含む。
gaggtccagc tgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctca(配列番号20)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は配列番号25に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号26:
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtattaatgtagcctggtatcaacagaagccaggacaatctcctaaagcactgctttactcggcatcctaccgatatagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggttctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgaagtctggagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacacctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(配列番号26)
を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号21の重鎖可変領域配列:
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSS(配列番号21)
および配列番号27の軽鎖可変領域配列:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIK (配列番号 27)
を含む、マウス抗体、30B8G9B11(「A3」)である。
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSS(配列番号21)
および配列番号27の軽鎖可変領域配列:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIK (配列番号 27)
を含む、マウス抗体、30B8G9B11(「A3」)である。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は重鎖可変領域を含み、該重鎖可変領域は配列番号21に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号22:
gaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca (配列番号22)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号27に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号28:
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtcctaatgtagcctggtatcgacagaaaccaggacaatctcctaaagctctgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcaatctgaagacttggcagactatatctgtcagcagtataactactatccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaa(配列番号28)
を含む。
gaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca (配列番号22)
を含み、軽鎖は軽鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号27に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号28:
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtcctaatgtagcctggtatcgacagaaaccaggacaatctcctaaagctctgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcaatctgaagacttggcagactatatctgtcagcagtataactactatccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaa(配列番号28)
を含む。
様々な実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号18、20または22の配列を有する重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号18、20または22の配列を有する重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインは、配列番号24、26または28の配列を有する軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインは、配列番号24、26または28の配列を有する軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
様々な実施形態において、本発明の抗体はマウス抗体A1と同じエピトープに結合する抗体を含む。様々な実施形態において、本発明の抗体はマウス抗体A2と同じエピトープに結合する抗体を含む。様々な実施形態において、本発明の抗体はマウス抗体A3と同じエピトープに結合する抗体を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、マウス抗体A3およびヒトIgG4に由来するマウス−ヒトキメラ抗体であり、配列番号29の重鎖配列、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号29)
である、および配列番号31の軽鎖配列、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号31)
である、を含む。
MGWSWILLFLLSVTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号29)
である、および配列番号31の軽鎖配列、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号31)
である、を含む。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含むマウス−ヒトキメラ抗体であり、重鎖は、配列番号29に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号30:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag(配列番号30)
を含み、
また軽鎖は、配列番号31に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約 85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号32:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctcacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(配列番号32)
を含む。
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag(配列番号30)
を含み、
また軽鎖は、配列番号31に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約 85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号32:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctcacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(配列番号32)
を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片はヒトCGRPに結合し、配列番号33、35、37および39と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号34、36、38および40と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号35に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号37に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片。様々な実施形態において抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号36に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号38に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。様々な実施形態において抗体は、配列番号39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33、35、37および39に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインの配列と、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1または0位の残基でのみ異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、このような配列の相違はそれぞれ独立して1個のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換である。様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33、35、37および39に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において, 本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片はヒトCGRPに結合し、配列番号34、36、38および40に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインの配列と、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1または0位の残基でのみ異なる、アミノ酸の配列を含み、このような配列の相違はそれぞれ独立して、1個のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換である。様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号34、36、38および40に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体は、配列番号41の重鎖配列(「H1」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列であり:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号41)
および配列番号49の軽鎖配列(「L1」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号49)である、を含むヒト化IgGである。
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号41)
および配列番号49の軽鎖配列(「L1」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号49)である、を含むヒト化IgGである。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は、配列番号41に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号42:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaagtgaagaaacccggagcaagtgtgaaggtgtcatgcaaagcctcaggatatacattcacagactactatatgaactgggtgcgacaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccatgacacgcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagcgacgataccgccgtctactattgcgctagaattactattgtgcccgtgtattttgatttttggggacagggaactctggtcaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag(配列番号42)
を含み、軽鎖は、配列番号49に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号50:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccctcattcctgtccgcaagtgtgggcgaccgagtcaccatcacctgtaaggcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtaccagcagaagcccgggaaagcccctaagctgctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaattagctccctgcagcccgaagacttcgccacctactattgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcagggcactaaactggaaatcaaacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号50)
を含む。
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaagtgaagaaacccggagcaagtgtgaaggtgtcatgcaaagcctcaggatatacattcacagactactatatgaactgggtgcgacaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccatgacacgcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagcgacgataccgccgtctactattgcgctagaattactattgtgcccgtgtattttgatttttggggacagggaactctggtcaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag(配列番号42)
を含み、軽鎖は、配列番号49に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号50:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccctcattcctgtccgcaagtgtgggcgaccgagtcaccatcacctgtaaggcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtaccagcagaagcccgggaaagcccctaagctgctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaattagctccctgcagcccgaagacttcgccacctactattgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcagggcactaaactggaaatcaaacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号50)
を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体は、配列番号43の重鎖配列(「H2」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号43)
であり、
および配列番号51の軽鎖配列(「L2」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号51)
である、
を含むヒト化IgGである。
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号43)
であり、
および配列番号51の軽鎖配列(「L2」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号51)
である、
を含むヒト化IgGである。
特定の代替実施形態では, 抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は、配列番号43に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号44:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggagcagaggtcgtgaaacccggagcaagcgtcaaggtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaggcaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggccgggtgaccatgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactatcgtgcccgtctactttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号44)
を含み、軽鎖は、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号52:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccatccttcctgagcgcaagcgtcggagacagagtgaccattacctgcaaagcatcccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaagcccctaaggctctgatctattctgccagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgctacctacatttgtcagcagtacaactattatccttacacctttgggcagggcactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号52)
を含む。
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggagcagaggtcgtgaaacccggagcaagcgtcaaggtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaggcaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggccgggtgaccatgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactatcgtgcccgtctactttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号44)
を含み、軽鎖は、配列番号51に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号52:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccatccttcctgagcgcaagcgtcggagacagagtgaccattacctgcaaagcatcccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaagcccctaaggctctgatctattctgccagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgctacctacatttgtcagcagtacaactattatccttacacctttgggcagggcactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号52)
を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体は配列番号45の重鎖配列(「H3」)、ここでアミノ酸1〜19が、リーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号45)である、
および配列番号53の軽鎖配列(「L3」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号53)
である、を含むヒト化IgGである。
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号45)である、
および配列番号53の軽鎖配列(「L3」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号53)
である、を含むヒト化IgGである。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は、配列番号45に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号46:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaggtggtcaaacccggagcaagcgtgaaagtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaagcaggcaccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccctgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactattgtgcccgtctattttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号46)
を含み、
軽鎖は、配列番号53に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号54:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagagcccttccttcctgagcacaagcgtcggagatagagtcacaatcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggaccaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号54)
を含む。
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaggtggtcaaacccggagcaagcgtgaaagtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaagcaggcaccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccctgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactattgtgcccgtctattttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号46)
を含み、
軽鎖は、配列番号53に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号54:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagagcccttccttcctgagcacaagcgtcggagatagagtcacaatcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggaccaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号54)
を含む。
本発明の様々な実施形態において、抗体は、配列番号47の重鎖配列(「H4」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号47)
である、
および配列番号55の軽鎖配列(「L4」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号55)
である、を含むヒト化IgGである。
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号47)
である、
および配列番号55の軽鎖配列(「L4」)、ここでアミノ酸1〜19がリーダー配列:
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号55)
である、を含むヒト化IgGである。
特定の代替実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含む抗体であり、重鎖は、配列番号47に記載のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号48:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtgcagctggtccagtcaggggcagaggtcgtcaaacccggagcaagcgtgaagattagttgtaaggcatcaggctatactttcacagactactatatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggcaaccctgacagtggacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtctactattgcgcttccattaccattgtgccagtctattttgatttttggggacagggaactctgctgacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号48)
を含み、
軽鎖は、配列番号55に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号56:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagatgacccagtccccctccttcctgagcacaagcgtgggcgatagagtcaccgtcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtgccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccgtccagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号56)
を含む。
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtgcagctggtccagtcaggggcagaggtcgtcaaacccggagcaagcgtgaagattagttgtaaggcatcaggctatactttcacagactactatatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggcaaccctgacagtggacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtctactattgcgcttccattaccattgtgccagtctattttgatttttggggacagggaactctgctgacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag (配列番号48)
を含み、
軽鎖は、配列番号55に記載のアミノ酸配列と少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の同一性を有する配列、またはその対応ポリヌクレオチド配列、配列番号56:
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagatgacccagtccccctccttcctgagcacaagcgtgggcgatagagtcaccgtcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtgccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccgtccagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (配列番号56)
を含む。
本開示の様々な実施形態において、抗体は、配列番号41、43、45および47のいずれかに記載の重鎖配列を含む抗体と同じかそれよりも高い抗原結合親和性を有する抗CGRP抗体であり得る。様々な実施形態において、抗体は、配列番号 41、43、45および47のいずれかに記載の重鎖配列を含む抗体と同じエピトープに結合する抗CGRP抗体であり得る。様々な実施形態において、抗体は、配列番号41、43、45および47のいずれかに記載の重鎖配列を含む抗体と競合する抗CGRP抗体である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号41、43、45および47のいずれかに記載の重鎖配列の少なくとも1つ(例えば2つまたは3つ)のCDRを含む抗CGRP抗体であり得る。
様々な実施形態において、抗体は、配列番号41、43、45および47のいずれかと例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の観察される相同性を有する重鎖アミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、抗体は、配列番号42、44、46および48のいずれかと例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の観察される相同性を有する重鎖核酸配列を含む。
本開示の様々な実施形態において、抗体は、配列番号49、51、53および55のいずれかに記載の軽鎖配列を含む抗体と同じかそれより高い抗原結合親和性を有する抗CGRP抗体であり得る。様々な実施形態において、抗体は、配列番号49、51、53および55のいずれかに記載の軽鎖配列を含む抗体と同じエピトープに結合する抗CGRP抗体であり得る。様々な実施形態において、抗体は、配列番号49、51、53および55のいずれかに記載の軽鎖配列を含む抗体と競合する抗CGRP抗体である。様々な実施形態において、抗体は、配列番号49、51、53および55のいずれかに記載の軽鎖配列の少なくとも1つ(例えば2つまたは3つ)のCDRを含む抗CGRP抗体であり得る。
様々な実施形態において、抗体は、配列番号49、51、53および55のいずれかと例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の観察される相同性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、抗体は、配列番号50、52、54および56のいずれかと例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の観察される相同性を有する核酸配列を含む。
様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号33、35、37および39と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号34、36、38および40と同一、実質的に同一または実質的に類似する配列を有する軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列および 配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片はヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片はヒトCGRPに結合し、配列番号41に記載の重鎖配列および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号43に記載の重鎖配列および配列番55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号45に記載の重鎖配列および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列および配列番号49に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列および配列番号51に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列および配列番号53に記載の軽鎖配列を含む。様々な実施形態において、本発明の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCGRPに結合し、配列番号47に記載の重鎖配列および配列番号55に記載の軽鎖配列を含む。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で周知の定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ又はラムダタイプの軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ又はラムダタイプの軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミュータイプの重鎖定常領域、例えば、IgA−、IgD−、IgE−、IgG−及びIgMタイプの重鎖定常領域であり得る。様々な実施形態において、軽鎖又は重鎖定常領域は、自然発生の定常領域の断片、誘導体、変異体又は変異タンパク質である。
目的の抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を生じさせる技術、すなわちサブクラススイッチングは周知である。したがって、IgG抗体は、IgM抗体、例えば、その逆からも生じ得る。このような技術により、所与の抗体(親抗体)の抗原結合特性を有する新しい抗体を調製することができるが、親抗体とは異なる抗体のアイソタイプまたはサブクラスに関連する生物特性も表すことができる。組み換えDNA技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローンDNA、例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常領域をコードするDNAをこのような方法に使用してもよい。Lanitto等、Methods Mol.Biol.178:303−16、2002も参照されたい。
様々な実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖カッパもしくはラムダ定常領域、またはその断片をさらに含み、重鎖定常領域またはその断片をさらに含む。例示される抗体に使用される軽鎖定常領域および重鎖定常領域、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドの配列を以下に提供する。
軽鎖(カッパ)定常領域
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 57)
軽鎖(ラムダ)定常領域
Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs (SEQ ID NO: 58)
重鎖定常領域
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 59)
軽鎖(カッパ)定常領域
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 57)
軽鎖(ラムダ)定常領域
Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs (SEQ ID NO: 58)
重鎖定常領域
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 59)
本発明の抗体は、交差反応性の観点で記載または特定することもできる。ヒトCGRPに対して(当該技術分野で周知のおよび本明細書に記載の方法を使用して計算した場合)少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、および少なくとも50%の同一性を有するCGRPポリペプチドに結合する抗体も、本発明に含まれる。
さらに、本発明の抗CGRP抗体と同じエピトープに結合する抗体が本発明に含まれている。抗体が、本発明の抗CGRP抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合することについて競合する可能性があるかどうかを判断するために、クロスブロッキングアッセイ、例えば競合性ELISAアッセイを実施することができる。例示的な競合ELISAアッセイにおいて、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆したCGRPを競合抗体候補のある場合またはない場合とでプレインキュベートし、その後、ビオチン標識化した本発明の抗CGRP抗体を添加する。アビジン−ペルオキシダーゼ接合体と適切な基体を使用して、ウェルのCGRP抗原に結合した標識化された抗CGRP抗体の量を測定する。放射性または蛍光標識、またはいくつかの検出可能で測定可能な標識で抗体に標識を付けることができる。抗原に結合した標識された抗CGRP抗体は、競合抗体候補(試験抗体)の同エピトープとの結合に競合する能力に間接的な相関を有し、すなわち、同エピトープについて、試験抗体の親和性が大きいほど、標識された抗体は抗原を被覆したウェルに結合しにくくなる。競合抗体候補は、競合抗体候補が存在しない状態で平行して行われるコントロールと比較して、候補抗体が少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%、CGRP抗体の結合を遮断することができる場合、同エピトープに実質的に結合し、または本発明CGRPの抗CGRP抗体と同じエピトープとの結合に競合する抗体として考えられる。このアッセイの変形例を行って、同じ定量的値を得ることができることが理解される。
特定の代替実施形態では、本発明の抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内の位置またはそれ以上の残基を修飾することにより、または定常領域内の残基を修飾することにより操作して、例えば、抗体のエフェクタ機能を変更することができる。様々な実施形態において、抗体の可変領域は、公開DNAデータベースまたは公開された参考文献(例:Tomlinson、IM、et al.,J.Mol.Biol.227:776−798、1992;およびCox,JPL et al.,Eur.J.Immunol.24:827−836、1994; それぞれの内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれている)から入手することができるフレームワーク配列を使用してCDR移植を実施することにより修飾される。様々な実施形態において、抗体は、部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発を用いて修飾してVHおよび/またはVLに突然変異を導入し、結合親和性を改善し、および/または免疫原性を低下させることができる。様々な実施形態において、抗体は、抗体の血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細胞傷害性を変更する目的でFc領域で修飾することができる。種々の実施形態において、抗体は、抗体のグリコシル化を改変する目的で修飾することができる。本明細書に記載された各修飾および他の修飾を実行する方法は、当業者に知られている。
医薬組成物
別の態様では、本発明は、前述の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物、方法および用途は、そのため、以下に詳細するその他の活性剤との併用(共投与)の実施形態も含む。
別の態様では、本発明は、前述の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物、方法および用途は、そのため、以下に詳細するその他の活性剤との併用(共投与)の実施形態も含む。
概して、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と関連して製剤として投与するのに適している。「賦形剤」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明の化合物以外の成分を記載するために使用する。賦形剤の選択は、広い範囲で、特定の投与様式、賦形剤の可溶性および安定性に与える影響、ならびに剤形の性質に依存する。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、生理的に適合性である全ての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張性および吸収遅延剤等を含む。薬理学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびその組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール等のポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。薬学的に許容される物質の付加的な例は、湿潤剤または少量の補助剤、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液であり、抗体の貯蔵寿命または有効性を向上させる。本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者に容易に明らかである。このような組成物およびその調製方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、19版(Mack Publishing Company、1995)に見つけることができる。医薬組成物は、好ましくはGMP条件下で製造される。
本発明の医薬組成物は、単位用量として、または複数の単位用量として、調製され、包装され、または大量に販売され得る。「単位用量」は、所定量の有効成分を含む別々の量の医薬組成物である。有効成分の量は、概して、対象に投与され得る有効成分の用量、または例えば、使いやすい少量の用量、例えば、当該用量の2分の1、3分の1に等しい。
当該技術に許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与する方法は、本発明の抗体および部分に適切に適用され得る。
本発明の医薬組成物は、概して、非経口投与に適している。医薬組成物の「非経口投与」は、本明細書で使用する場合、対象の組織を物理的に破ること、および組織の破れた箇所を通って医薬組成物を投与することを特徴とする投与経路を含み、したがって、概して、血流、筋肉、または内臓に直接投与する。非経口投与として、限定されないが、医薬組成物の注射、外科的切開による組成物の適用、組織貫通の非外科的創傷による組成物の適用等が挙げられる。特に、非経口投与は、限定されないが、皮下、腹腔内脳室内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、関節滑液嚢内注射または注入、および腎臓透析注入技術が挙げられることが理解される。様々な実施形態は、静脈内および皮下経路を含む。
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、概して、薬学的に許容される担体、例えば、無菌水または無菌等張食塩水と合わせた有効成分を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売され得る。注入可能な製剤は、アンプルまたは保存剤を含有する反復投与等の単位剤形で調製、包装、または販売され得る。非経口投与の製剤として、限定されないが、油状または水性ビヒクル、ペースト等の懸濁液、溶液、乳剤が挙げられる。このような製剤は、限定されないが、懸濁剤、安定剤または分散剤を含む1つ以上の付加的な成分をさらに含み得る。非経口投与の製剤の一実施形態において、有効成分は、再構成された組成物を非経口投与する前に、適切なビヒクル(無菌の発熱物質を含まない水)で再構成された乾燥形態で提供される。非経口投与は、また、塩、炭水化物および緩衝剤(pHは3〜9が好ましい)等の賦形剤を含み得る水溶液を含むが、いくつかの適用では、非経口製剤は、無菌非水溶液として、または乾燥形態としてより適切に調合されて、無菌の発熱物質を含まない水等の適切なビヒクルと一緒に使用され得る。例示的な非経口投与形態として、無菌水溶液の溶液または懸濁液、例えば、水性プロピレングリコールまたはブドウ糖溶液が挙げられる。このような剤形は、望まれる場合、適切に緩衝することができる。その他の有用な非経口投与可能な製剤として、微結晶性形態またはリポソーム調製物中の有効成分を含む製剤が挙げられる。非経口投与の製剤は、即時放出および/または徐放するように配合され得る。徐放性製剤として、遅延性、持続性、パルス性、制御性、標的型およびプログラム放出が挙げられる。
例えば、一態様において、無菌の注入可能な溶液は、必要量の適切な溶剤に、上に挙げた成分の1つまたは組み合わせと共に抗CGRP抗体を組み込み、必要な場合、次にろ過殺菌を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、塩基性分散媒および上に挙げた物質から必要とされるその他の成分を含有する無菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注入可能な溶液の調製について無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥、および有効成分の粉末、およびそれに加えて、その事前にろ過殺菌された溶液から付加的な所望の成分を産生する凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。注入可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含ませることによってもたらすことが可能である。
本発明の抗体は、概して乾燥粉末の形態で(単独で、混合物として、または混合された成分粒子として、例えば、適切な薬学的に許容される賦形剤と混合して)、乾燥粉末吸入器から、加圧容器からのエアロゾルスプレー、ポンプ、スプレー、噴霧器(好ましくは、微細な霧を作製するために電気流体力学を使用した噴霧器)、または適切な噴霧剤を使用する場合もしくは使用しない場合でネブライザーとして、または点鼻液として投与することも可能である。
加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器またはネブライザーは、概して、例えば、溶剤として活性の噴霧剤を分散、可溶化、または徐放するのに適した薬剤を含む本発明の抗体の溶液または懸濁液を含有する。
乾燥粉末または懸濁液製剤で使用する前に、薬剤は、概して、吸入による送達に適した大きさに微粒子化される(一般に5ミクロン未満)。これは、スパイラルジェットミリング、流動層ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧均質化、または噴霧乾燥等の適切な粉砕方法によって達成され得る。
吸入器または注入器に使用されるカプセル、ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、適切な粉末ベースおよび性能改良剤を含むように配合され得る。
例えば、メントールおよびレボメントール等の適切な香料サッカリンまたはサッカリンナトリウム等の甘味料を、吸入/鼻腔内投与を意図した本発明の製剤に添加してもよい。
吸入/鼻腔内投与の製剤は、即時放出および/または徐放するように配合され得る。徐放性製剤として、遅延性、持続性、パルス性、制御性、標的型およびプログラム放出が挙げられる。
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合、単位剤形は、計量された量を送達する弁によって測定される。本発明に準じた単位剤形は、概して、配置されて、計測された量または「ひと吹き」の本発明の抗体が投与される。全体の投与量は、概して、単一用量で、または通常は、1日に用量を分けて投与される。
本発明の抗体および抗体部分は、また、経口投与のために配合され得る。経口投与は飲み込むことを伴い得、化合物は、消化器官に進入し、および/または化合物が口から直接的に血流に進入する頬側、舌側または舌下に投与される。
経口投与に適した製剤として、錠剤等の固形、半固体および液体系;複数またはナノ複合微粒子、液体または粉末を含有する軟質または硬質のカプセル;(液体充填を含む)トローチ;噛むもの、ゲル、即時分散剤形;フィルム;腔坐剤;スプレー;および頬側/粘膜付着性パッチが挙げられる。
経口使用を意図した医薬組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野で周知の方法に従って調製され得、このような組成物は、薬学的にエレガントに口に合う製剤を提供するために、甘味剤から成る群から選択される1つ以上の薬剤を含有し得る。例えば、経口に送達可能な錠剤を調製するために、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも1つの薬学的賦形剤と混合され、固体製剤は圧縮されて、消化器官に送達するために、周知の方法に従って錠剤を形成する。錠剤の組成物は、概して、添加物、例えば、糖類またはセルロース担体、デンプンのりまたはメチルセルロース等の結合剤、充填剤、崩壊剤、または通常、医療用調製物の製造に使用されるその他の添加物と一緒に配合される。経口送達可能なカプセルを調製するために、DHEAを少なくとも1つの薬学的賦形剤と混合し、固体製剤は、消化器官への送達に適したカプセル容器に配置される。抗体またはその抗原結合断片を含む組成物は、概して、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、1990(Mack Publishing Co. Easton Pa.18042)、89節に記載されており、参照により本明細書に援用される。
様々な実施形態において、医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された抗体またはその抗原結合断片を含有する経口送達可能な錠剤として配合される。これらの賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤;造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチンまたはアカシア、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってもよい。錠剤は、被覆されていなくてもよく、または周知の技術で被覆して消化器官における崩壊および吸収を遅延させて、それにより長時間の徐放作用を提供してもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン単独、またはワックスと共に遅延材料を使用してもよい。
様々な実施形態において、医薬組成物は、抗体またはその抗原結合断片を不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合する硬質ゼラチンカプセルとして配合され、または抗体またはその抗原結合断片を水性または油媒体物、例えば、落花生油、ピーナツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油と混合する軟質ゼラチンカプセルとして配合される。
液体製剤として、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。このような製剤は、軟質または硬質カプセル(例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される)に充填剤として適用され得、通常、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適した油、および1つ以上の乳化剤および/または懸濁剤を含む。液体製剤は、また、固形物、例えば、小袋から再構成することによって調製してもよい。
治療用途
別の態様では、本発明はCGRP−関連疾患を患う対象の治療方法に関し、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片をそうした対象に投与することを含む。様々な実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害もしくは炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択される。
別の態様では、本発明はCGRP−関連疾患を患う対象の治療方法に関し、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片をそうした対象に投与することを含む。様々な実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害もしくは炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択される。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は:前兆ありまたは無しの片頭痛;片麻痺性片頭痛;群発頭痛;片頭痛様神経痛;慢性頭痛;緊張型頭痛;その他医学的状態により生ずる頭痛(感染または腫瘍による頭蓋内圧の上昇等);慢性発作性片側頭痛;器質的病変に伴わない各種の頭痛;非血管性頭蓋内疾患に伴う頭痛;物質の投与またはその中止に伴う頭痛;頭部以外の感染症に伴う頭痛;代謝疾患に伴う頭痛;頭蓋、首、眼、耳、鼻、洞、歯、口またはその他顔面もしくは頭蓋構造の疾患に伴う頭痛;頭部神経痛;ならびに神経幹痛および求心路遮断性疼痛から成る群から選択される頭痛である。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、分泌性下痢, 浸透圧性下痢, 滲出性下痢、運動性下痢、炎症性下痢、および赤痢から成る群から選択される下痢である。
「治療有効量」または「治療上有効な用量」は、治療対象の疾患の症状の1つ以上をいくらか軽減する投与する治療薬の量を指す。
治療上有効な用量は、IC50を決定することによって細胞培養アッセイから最初に推定することができる。動物モデルで用量を配合して、細胞培養で決定されるIC50を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、HPLCによって測定することができる。厳密な組成物、投与経路および用量は、対象の状態の観点から個別の臨床医によって選択され得る。
投与計画を調節して、最適な望ましい反応(例えば、治療的または予防的反応)を提供することができる。例えば、単回のボーラス投与を行うことができ、いくつかに分けられた用量(複数、反復または維持)を経時的に投与することができ、用量を治療的状況の緊急事態によって示されるように比例的に減少または増加させることができる。投与の簡便性または容量の均一性のために、単位剤形の親組成物を配合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療を受ける哺乳動物対象の一体型剤形として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と連携して望ましい治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形の詳述は、抗体のユニークな特徴および達成される特定の治療的または予防的効果によって主に規定される。
したがって、当業者は、本明細書で提供する開示に基づいて、用量および投与計画を治療技術で周知の方法に準じて調節されることを理解する。すなわち、最大耐容量を容易に確立することができ、対象に検出可能な治療的利益を提供する有効量も決定することができ、同様に、対象に検出可能な治療的利益を提供するために各薬剤の投与についての経時的な必要条件も決定することができる。したがって、特定の用量および投与計画を本明細書で例示する場合、これらの例は、本開示を実施するときに対象に提供され得る用量および投与計画を限定するものではない。
用量の値は、軽減する予定の病態の種類および重症度によって変化し得、単回用量または複数用量を含み得る。特定の対象について、特定の投与計画は、個別の必要性および組成物を投与する、または投与を管理する人間の専門的判断に従って経時的に調節されるべきであり、本明細書に記載の用量範囲は例示に過ぎず、請求の組成物の範囲または実施を限定することを意図していないことがさらに理解される。さらに、本開示の組成物による投与計画は、疾患の種類、年齢、体重、性別、対象の健康状態、病態の重症度、投与経路および使用する特定の抗体を含む様々な要因に基づき得る。したがって、投与計画は広く変化する可能性があるが、標準的方法を使用して、ルーチン的に決定することができる。例えば、用量は、毒性効果および/または実験室の値等の臨床効果を含み得る薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて調節することができる。したがって、本開示は、当業者によって決定されるように、対象内用量漸増を包含する。適切な用量および計画を決定することは、関連の技術で周知であり、本明細書に開示される指示事項を提供すれば、当業者によって包含されることが理解される。
ヒト対象への投与について、本開示の抗体またはその抗原結合断片の全体の月単位の用量は、当然のこととして、投与様式に依存して、対象につき0.5〜1200Mg、対象につき0.5〜1100、対象につき0.5〜1000Mg、対象につき0.5〜900Mg、0.5〜800Mg、対象につき0.5〜700Mg、対象につき0.5〜600Mg、対象につき0.5〜500Mg、対象につき0.5〜400Mg、対象につき0.5〜300Mg、対象につき0.5〜200Mg、対象につき0.5〜100Mg、対象につき0.5〜50Mg、対象につき1〜1200Mg、対象につき1〜1100Mg、対象につき1〜1000Mg、対象につき1〜900Mg、対象につき1〜800Mg、対象につき1〜700Mg、対象につき1〜600Mg、対象につき1〜500Mg、対象につき1〜400Mg、対象につき1〜300Mg、対象につき1〜200Mg、対象につき1〜100Mg、または、対象につき1〜50Mgの範囲であり得る。例えば、月毎の静脈内投与の用量は、約1〜1000Mg/対象であり得る。様々な実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、対象につき約1〜200Mg、対象につき1〜150Mgまたは対象につき1〜100Mgであり得る。全体の月単位の用量は、単回または分割量で投与され得、臨床医の判断で、本明細書で与えた典型的な範囲の外にある可能性がある。
本開示の抗体またはその抗原結合断片の治療的または予防的有効量についての非限定的な1日あたりの用量範囲は、kg体重あたり、0.001〜100Mg/kg、0.001〜90Mg/kg、0.001〜80Mg/kg、0.001〜70Mg/kg、0.001〜60Mg/kg、0.001〜50Mg/kg、0.001〜40Mg/kg、0.001〜30Mg/kg、0.001〜20Mg/kg、0.001〜10Mg/kg、0.001〜5Mg/kg、0.001〜4Mg/kg、0.001〜3Mg/kg、0.001〜2Mg/kg、0.001〜1Mg/kg、0.010〜50Mg/kg、0.010〜40Mg/kg、0.010〜30Mg/kg、0.010〜20Mg/kg、0.010〜10Mg/kg、0.010〜5Mg/kg、0.010〜4Mg/kg、0.010〜3Mg/kg、0.010〜2Mg/kg、0.010〜1Mg/kg、0.1〜50Mg/kg、0.1〜40Mg/kg、0.1〜30Mg/kg、0.1〜20Mg/kg、0.1〜10Mg/kg、0.1〜5Mg/kg、0.1〜4Mg/kg、0.1〜3Mg/kg、0.1〜2Mg/kg、0.1〜1Mg/kg、1〜50Mg/kg、1〜40Mg/kg、1〜30Mg/kg、1〜20Mg/kg、1〜10Mg/kg、1〜5Mg/kg、1〜4Mg/kg、1〜3Mg/kg、1〜2Mg/kg、または1〜1Mg/kgであり得る。
数日間かもっと長い期間にわたる繰り返し投与については、条件次第で、治療は、例えば疼痛を減らすために、症状の所望の抑制が生じるまでかまたは充分な治療レベルが達成されるまで持続する。例示的投与計画は、初回用量約2mg/kg、続いて毎週の維持用量約1mg/kgの抗CGRP抗体を投与、または、続いて維持用量約1mg/kgを隔週で投与することを含む。しかし、他の投与計画は、開業医が達成したい薬物動態学的崩壊のパターン次第で、有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、週に1〜4回の投与が考えられる。この治療の進行は従来の技術やアッセイによって簡単にモニターされる。投与計画(使用CGRPアンタゴニストを含む)は、経時で変化され得る。様々な実施形態において、抗CGRPアンタゴニスト抗体の適切な用量は、用いられる抗CGRPアンタゴニスト抗体(またはその組成物)、治療する頭痛(例えば、片頭痛)の種類および重症度、薬剤が予防目的で投与されるか、または治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴や薬剤への反応、および立ち合いの医師の自由裁量に依存する。典型的には、臨床医は、抗CGRPアンタゴニスト抗体を、所望の結果を達成するまでの量を投与する。用量および/または投与回数は治療過程にわたって様々となり得る。
用量の値は、軽減させる病態の種類および重症度によって変化し得る。特定の対象について、特定の投与計画は、個別の必要性、および組成物を投与するかまたは投与を管理する人間の専門的判断に従って経時的に調節されるべきであり、本明細書に記載の用量範囲は例示に過ぎず、請求の組成物の範囲または実施を限定することは意図しないことがさらに理解される。
様々な実施形態において、投与される全用量により、例えば、約1〜1000μg/ml、約1〜750μg/ml、約1〜500 μg/ml、約1〜250 μg/ml、約10〜1000μg/ml、約10〜750μg/ml、約10〜500μg/ml、約10〜250μg/ml、約20〜1000 μg/ml、約20〜750μg/ml、約20〜500μg/ml、約20〜250μg/ml、約30〜1000μg/ml、約30〜750μg/ml、約30〜500μg/ml、約30〜250μg/mlの範囲の血漿中抗体濃度を達成する。
本発明の医薬組成物の毒性および治療指数は、細胞培養物または実験用動物における標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、LD50(集団の50%に対する致死的用量)およびED50(集団の50%に対する治療有効量)を決定する。毒性と治療有効量との間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が、概して好ましい。
様々な実施形態において、医薬組成物の単回または複数回投与は、対象によって必要とされ、許容される用量および回数に依存して投与される。任意の事象において、組成物は、本明細書に開示の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも1つを充分な量で提供して、対象を効率的に治療するべきである。1回投与することができるが、治療的結果を達成するまで、または副作用が治療の中断の正当な理由になるまで、定期的に投与してもよい。
医薬組成物の抗体またはその抗原結合断片の投与回数は、治療の性質および治療対象の特定の疾患に依存する。対象は、所望の治療的結果が達成されるまで、毎週または毎月といった規則的な間隔で治療を受けることができる。例示的な投与回数として、限定されないが、間断なく週に1回;週に1回、隔週に1回;2週間に1回;3週間に1回;間断なく毎週を2週間、その後毎月;間断なく毎週を3週間、その後毎月;毎月;隔月に1回;3か月に1回;4か月に1回;5か月に1回;または6か月に1回、または1年に1回が挙げられる。
併用療法
「共投与」、「共投与される」、および「併用して」という用語は、本明細書で使用する場合、本開示の抗体またはその抗原結合断片および1つ以上の他の治療薬は、以下を意味し、まさに指し、含むことを意図する:本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に同時投与し、このとき、成分は単一剤形に共に配合され、対象に実質的に同時に放出する;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に実質的に同時に投与し、このとき、成分は、対象によって実質的に同時に投与される別々の剤形に互いに分かれて配合され、成分は、対象に実質的に同時に放出される;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に連続投与し、このとき、成分は、各投与の間の重要な時間間隔で、対象によって連続して摂取される別々の剤形に互いに分かれて配合され、成分は、対象に実質的に異なる時間に放出される;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に連続投与し、このとき、成分は、制御されて放出される単一剤形に一緒に配合され、成分は、同時および/または異なる時間に同時に、連続的に、および/または重複的に放出され、各部分が同じまたは異なる経路によって投与され得る。
「共投与」、「共投与される」、および「併用して」という用語は、本明細書で使用する場合、本開示の抗体またはその抗原結合断片および1つ以上の他の治療薬は、以下を意味し、まさに指し、含むことを意図する:本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に同時投与し、このとき、成分は単一剤形に共に配合され、対象に実質的に同時に放出する;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に実質的に同時に投与し、このとき、成分は、対象によって実質的に同時に投与される別々の剤形に互いに分かれて配合され、成分は、対象に実質的に同時に放出される;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に連続投与し、このとき、成分は、各投与の間の重要な時間間隔で、対象によって連続して摂取される別々の剤形に互いに分かれて配合され、成分は、対象に実質的に異なる時間に放出される;本開示の抗体またはその抗原結合断片および治療薬の組み合わせを治療を必要とする対象に連続投与し、このとき、成分は、制御されて放出される単一剤形に一緒に配合され、成分は、同時および/または異なる時間に同時に、連続的に、および/または重複的に放出され、各部分が同じまたは異なる経路によって投与され得る。
別の態様では、本発明は対象におけるCGRP−関連疾患を治療するために設計された併用療法に関し、対象に治療有効量の本発明の単離された抗体または抗原結合断片、およびb)CGRP−関連疾患の治療に有用な1つ以上の追加薬剤を投与することを含む。様々な実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択される。
様々な実施形態において、頭痛は:前兆ありまたは無しの片頭痛;片麻痺性片頭痛;群発頭痛;片頭痛様神経痛;慢性頭痛;緊張型頭痛;その他医学的状態により生ずる頭痛(感染または腫瘍による頭蓋内圧の上昇等);慢性発作性片側頭痛;器質的病変に伴わない各種の頭痛;非血管性頭蓋内疾患に伴う頭痛;物質の投与またはその中止に伴う頭痛;頭部以外の感染症に伴う頭痛;代謝疾患に伴う頭痛;頭蓋、首、眼、耳、鼻、洞、歯、口またはその他顔面もしくは頭蓋構造の疾患に伴う頭痛;頭部神経痛;ならびに神経幹痛および求心路遮断性疼痛から成る群から選択される。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は頭痛であり、また1つ以上の追加薬剤は:5−HT1−様アゴニスト(およびその他5−HT1部位で作用するアゴニスト)および非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)から成る群から選択される。様々な実施形態において、5−HT1アゴニストはスマトリプタン、ゾルミトリプタン、ナラトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、アルモトリプタン、およびフロバトリプタンから成る群から選択されるトリプタンである。様々な実施形態において、1つ以上の追加薬剤は、ナプロキセン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、メフェナム酸、およびピロキシカムから成る群から選択されるNSAIDである。様々な実施形態において、1つ以上の追加薬剤は、NSAIDであって;セレコキシブ;ロフェコキシブ;メロキシカム;JTE−522;L−745,337;NS398;およびその薬学的に許容される塩から成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤である。様々な実施形態において、1つ以上の追加薬剤は、酒石酸エルゴタミン、マレイン酸エルゴノビン、およびメシル酸エルゴロイド(例えば、ジヒドロエルゴコルニン、ジヒドロエルゴクリスチン、ジヒドロエルゴクリプチン、およびメシル酸ジヒドロエルゴタミン(DHE45))から成る群から選択される麦角アルカロイドである。様々な実施形態において、共投与時には、単離された抗体または抗原結合断片と追加治療剤との間に相乗作用が存在する。
様々な実施形態において、CGRP−関連疾患は顔面紅潮であり、1つ以上の追加薬剤としてはエストロゲンおよび/またはプロゲスチンを含むホルモン系処理剤が挙げられるが、これに限られるものではない。
様々な実施形態において、併用療法は、抗体またはその抗原結合断片と1つ以上の追加治療剤の同時投与を含む。様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片組成物と1つ以上の追加治療剤は順次投与される、すなわち、抗体またはその抗原結合断片組成物は、1つ以上の追加治療剤の投与前または後のいずれかに投与される。
様々な実施形態において抗体またはその抗原結合断片組成物の投与と、1つ以上の追加治療剤の投与は同時に行われる、すなわち、抗体またはその抗原結合断片組成物の投与期間と1つ以上の追加治療剤の投与期間は互いに重なる。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片組成物の投与と1つ以上の追加治療剤の投与は同時に行われない。例えば、様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片組成物の投与は、1つ以上の追加治療剤の投与前に終了する。様々な実施形態において、1つ以上の追加治療剤の投与は、抗体またはその抗原結合断片組成物の投与前に終了する。
本明細書に開示の抗体またはその抗原結合断片が、1つ以上の追加治療剤と組み合わせて、同時的または順次的のいずれかで投与される場合、このような抗体またはその抗原結合断片は、1つ以上の追加治療剤の治療的効果を増強または1つ以上の追加治療剤に対する細胞抵抗性を克服し得る。このことは1つ以上の追加治療剤の投与量または投与期間の低減を可能とし、これによって、望ましくない副作用を減らすかまたは1つ以上の追加治療剤の有効性を回復させる。
診断用途
別の態様では、本発明は、例えば、ヒトCGRP関連疾患を診断するために、試料のヒトCGRP抗原の存在をin vitroまたはin vivoに検出する方法を提供する。いくつかの方法において、抗体とヒトCGRPの間で複合体を形成することができる条件下で、試験対象の試料を、コントロール試料と共に、本発明のヒト配列抗体またはヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分(または二重特異性もしくは多特異性分子)に接触させることによって達成される。両方の試料において(ELISAを使用して)複合体の形成を検出し、試料間の複合体の形成における統計学的有意差は、試験試料のヒトCGRP抗原の存在を示す。
別の態様では、本発明は、例えば、ヒトCGRP関連疾患を診断するために、試料のヒトCGRP抗原の存在をin vitroまたはin vivoに検出する方法を提供する。いくつかの方法において、抗体とヒトCGRPの間で複合体を形成することができる条件下で、試験対象の試料を、コントロール試料と共に、本発明のヒト配列抗体またはヒトモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分(または二重特異性もしくは多特異性分子)に接触させることによって達成される。両方の試料において(ELISAを使用して)複合体の形成を検出し、試料間の複合体の形成における統計学的有意差は、試験試料のヒトCGRP抗原の存在を示す。
様々な実施形態において、癌を検出し、対象の癌の診断を確認する方法を提供する。方法は、対象の生体試料を本発明の単離された抗体またはその抗原結合断片に接触させ、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と試料との結合を検出することを含む。単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片のコントロール試料に比べて、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の試料に対する結合が増加することは、対象の癌を検出し、対象の癌の診断を確認する。コントロールは、癌を有していないことが知られている対象の試料または標準値である。試料は、限定されないが、生検の組織、剖検および病理病変を含む試料であり得る。生体試料は、また、組織の部分、例えば、組織学的目的のために採取された凍結された部分を含む。生体試料は、体液、例えば、血液、血清、血漿、痰および髄液をさらに含む。
一実施形態において、血液試料等の生体試料においてCGRPを検出するためのキットを提供する。ポリペプチドを検出するキットは、概して、本明細書に開示の抗体の何れか等のCGRPに特異的に結合するヒト抗体を含む。いくつかの実施形態において、Fv断片等の抗体断片はキットに含まれる。in vivo用途について、抗体はscFv断片であり得る。更なる実施形態において、抗体は(例えば、蛍光、放射性、または酵素標識で)標識される。
一実施形態において、キットは、CGRPに特異的に結合する抗体の使用方法を開示する説明資料を含む。説明資料は、電子形態(コンピュータフロッピーディスクまたはコンパクトディスク)で書かれていても、または(ビデオファイル等の)視覚映像であってもよい。キットは、また、キットに示される特定の使用を促進するための付加的な要素を含む。したがって、例えば、キットは、付加的に、標識を検出する方法を含む(例えば、酵素標識の酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体等の適切な二次標識等)。キットは、さらに、特定の方法を実施するために通常使用される緩衝液およびその他の試薬を含む。このようなキットおよび適切な内容物は当業者に周知である。
一実施形態において、診断キットは免疫アッセイを含む。免疫アッセイの詳細は、使用される特定フォーマットによって変化し得るが、生体試料においてCGRPを検出する方法は、概して、免疫学的に反応する条件下で、CGRPに特異的に反応する抗体に生体試料を接触させるステップを含む。抗体は、免疫学的に反応する条件下で、特異的に結合して免疫複合体を形成することができ、免疫複合体(結合抗体)の存在が直接的、または間接的に検出される。
様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片を診断目的に標識することもでき、または標識しないこともできる。概して、診断アッセイは、抗体がCGRPに結合することから生じる複合体の形成を検出することを伴う。抗体は、直接的に標識することができる。限定されないが、放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド(例えば、ビオチン、ハプテン)を含む様々な標識を使用することができる。多くの適切な免疫アッセイは当業者に周知である(例えば、米国特許第3,817,827号;第3,850,752号;第3,901,654号;および第4,098,876号を参照のこと)。抗体は、標識しない場合、凝集アッセイ等のアッセイに使用することができる。標識されていない抗体は、例えば、第1抗体(例えば、抗イディオタイプ抗体または非標識の免疫グロブリンに特異的なその他の抗体)に反応性の標識抗体(例えば第2抗体)または適切な試薬(標識タンパク質A)等の抗体を検出するために使用することができる別の(1つ以上の)適切な試薬と組み合わせて使用することもできる。
本明細書で提供する抗体または抗原結合断片は、また、哺乳動物の特定の疾患にり患している可能性を検出する方法に使用され得る。例示的に、この方法は、細胞に存在するCGRPの量および/または哺乳動物のCGRP陽性細胞の数に基づいて進行する哺乳動物の疾患への感受性を検出するために使用することができる。一実施形態において、その適用は、哺乳動物の腫瘍に対する感受性を検出する方法を提供する。この実施形態において、試験対象の試料を抗体に結合するのに適切な条件下で、CGRPまたはその部分に結合する抗体に接触させ、試料は正常な個体においてCGRPを発現する細胞を含む。抗体の結合および/または結合量を検出し、そのことが個体の腫瘍に対する感受性を示し、高いレベルの受容体は個体の腫瘍に対する感受性の増加に相関する。
様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、検出することが可能な標識(例えば、放射同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子)に付着する。活性部分は放射性剤、例えば、鉄キレート剤、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート剤、酸素、窒素、鉄、炭素もしくはガリウム43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132Iまたは99Tcの陽電子放射体等の放射性重金属であってもよい。このような部分に付着した結合剤は、イメージング剤として使用し得、ヒト等の哺乳動物の診断使用に有効な量で投与され、その後、イメージング剤の局所化および蓄積を検出する。イメージング剤の局所化および蓄積は、放射性シンチグラフィー(radioscintigraphy)、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影またはポジトロン断層撮影によって検出され得る。
CGRPにおいて検出される抗体または抗原結合断片を使用した免疫シンチグラフィーを使用して、癌および脈管構造を検出および/または診断することができる。例えば、99テクネチウム、111インジウムまたは125ヨウ素で標識されたCGRPマーカーに対するモノクローナル抗体をこのようなイメージングに効率的に使用することができる。当業者に明らかであるように、投与する放射同位体の量は、その放射同位体に依存する。当業者は、活性部分として使用される所要の放射性核種の特定の作用およびエネルギーに基づいて投与されるイメージング剤の量を容易に処方することができる。概して、イメージング剤の1用量につき0.1〜100ミリキュリー、または1〜10ミリキュリーまたは2〜5ミリキュリーを投与する。したがって、開示される組成物は、放射性部分に結合する標的部分を含むイメージング剤として有用であり、0.1〜100ミリキュリー、いくつかの実施形態では1〜10ミリキュリー、いくつかの実施形態では2〜5ミリキュリー、いくつかの実施形態では1〜5ミリキュリーを含む。
二重特異性分子
別の態様では、本発明は、本発明の抗CGRP抗体またはその抗原結合断片を含む二重特異性分子に注目する。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、別の抗体または受容体のリガンド)に誘導体化または結合して、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本発明の抗体は、実際には、1つ以上の他の機能分子に誘導体化または結合して、2つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多特異性分子を生成し得、このような多特異性分子は、また、本明細書で使用される「二重特異性分子」によって包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体は、別の抗体、別の断片、ペプチドまたは結合模倣物等の1つ以上のその他の結合分子に、(例えば、化学的カップリング、遺伝子的融合、非共有結合またはその他によって)機能的に結合することができ、二重特異性分子が生じる。様々な実施形態において、本発明は、FcγRまたはFcαR発現エフェクタ細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(PMN))とPDを発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。このような実施形態において、二重特異性分子はエフェクタ細胞に対してCGRP発現細胞を標的にし、Fc受容体媒介性エフェクタ細胞活性、例えば、CGRP発現細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、サイトカイン放出またはスーパーオキシドアニオンの生成を駆動する。本発明の二重特異性分子を調製する方法は、当該技術分野で周知である。
別の態様では、本発明は、本発明の抗CGRP抗体またはその抗原結合断片を含む二重特異性分子に注目する。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、別の抗体または受容体のリガンド)に誘導体化または結合して、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本発明の抗体は、実際には、1つ以上の他の機能分子に誘導体化または結合して、2つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多特異性分子を生成し得、このような多特異性分子は、また、本明細書で使用される「二重特異性分子」によって包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体は、別の抗体、別の断片、ペプチドまたは結合模倣物等の1つ以上のその他の結合分子に、(例えば、化学的カップリング、遺伝子的融合、非共有結合またはその他によって)機能的に結合することができ、二重特異性分子が生じる。様々な実施形態において、本発明は、FcγRまたはFcαR発現エフェクタ細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(PMN))とPDを発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子を含む。このような実施形態において、二重特異性分子はエフェクタ細胞に対してCGRP発現細胞を標的にし、Fc受容体媒介性エフェクタ細胞活性、例えば、CGRP発現細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、サイトカイン放出またはスーパーオキシドアニオンの生成を駆動する。本発明の二重特異性分子を調製する方法は、当該技術分野で周知である。
ポリヌクレオチドおよび抗体発現
本出願は、抗CTLA−4抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。遺伝子的コードの縮重があるために、様々な核酸配列がそれぞれの抗体アミノ酸配列をコードする。本出願は、例えば本明細書に規定されるように、ストリンジェントまたは低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、ヒトCTLA−4に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに提供する。
本出願は、抗CTLA−4抗体またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。遺伝子的コードの縮重があるために、様々な核酸配列がそれぞれの抗体アミノ酸配列をコードする。本出願は、例えば本明細書に規定されるように、ストリンジェントまたは低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、ヒトCTLA−4に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに提供する。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、限定されないが、約45℃で6xSSCのフィルター結合DNAにハイブリダイズして、次に約50〜65℃で0.2xSSC/0.1%SDSに1回以上洗浄すること、約45℃で6xSSCのフィルター結合DNAにハイブリダイズして、次に約60℃で0.1xSSC/0.2%SDSに1回以上洗浄する高いストリンジェント条件、または当業者に周知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が挙げられる(例えば、Ausubel,F.M.等、編1989 Current Protocols in Molecular Biology、vol.1、Green Publishing Associates,Inc.およびJohn Wiley and Sons,Inc.、NY、頁6.3.1〜6.3.6および2.10.3を参照こと)。
ポリヌクレオチド、および当該技術分野で周知の方法によって決定されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を得てもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が分かっている場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeier等、BioTechniques 17:242(1994)に記載)から構築されてもよく、端的には、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、連結し、その後、連結したオリゴヌクレオチドをPCRによって増幅することを伴う。一実施形態において、使用されるコドンは、ヒトまたはマウスに典型的なコドンを含む(例えば、Nakamura,Y.、Nucleic Acids Res.28:292(2000)を参照のこと)。
抗体をコードするポリヌクレオチドは、また、適切な源からの核酸から生成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンを使用することができないが、抗体分子の配列が分かっている場合、配列の3’および5’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用してPCR増幅することにより、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローン化することによって、免疫グロブリンをコードする核酸を化学合成し、または適切な源(例えば、抗体cDNAライブラリ、またはそこから生成されるcDNAライブラリ、または核酸、好ましくは、抗体を発現する組織もしくは細胞から単離されたポリA+RNA、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞)から得て、抗体をコードするcDNAライブラリから例えばcDNAクローンを識別してもよい。PCRによって生成された増幅された核酸は、その後、当該技術分野で周知の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化してもよい。
本発明は、また、CTLA−4ポリペプチドおよび/または本発明の抗CTLA−4抗体を発現する宿主細胞に関する。例えば、原核生物(細菌)および真核生物発現系(酵母菌、バキュロウイルス、植物、哺乳動物およびその他の動物細胞、トランスジェニック動物およびハイブリドーマ細胞)ならびにファージ表示発現系を含む当該技術分野で周知の多様な宿主発現系を使用して、本発明の抗体を発現することができる
本発明の抗体は、宿主細胞の免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組み換え発現によって調製することができる。組み換え的に抗体を発現するために、宿主細胞を、宿主細胞に発現する抗体の免疫グロブリン軽鎖および/または重鎖をコードするDNA断片を有する1つ以上の組み換え発現ベクターに形質転換、形質導入、または感染させる。重鎖および軽鎖は、1つのベクターに操作可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得、またはあるいは重鎖および軽鎖は、1つは重鎖を発現しもう1つは軽鎖を発現する2つのベクターに操作可能に連結する異なるプロモーターから独立して発現し得る。任意に、重鎖および軽鎖は異なる宿主細胞に発現し得る。
さらに、組み換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体軽鎖および/または重鎖の分泌を促すシグナルペプチドをコードすることができる。抗体軽鎖および/または重鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに操作可能に連結されるように、ベクターにクローン化することができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性のシグナルペプチドであり得る。好ましくは、組み換え抗体は、宿主細胞を培養する培地に分泌され、そこから抗体が回収され、または精製することができる。
HCVRをコードする単離されたDNAは、HCVRコーディングDNAを重鎖定常領域をコードする別のDNA分子に操作可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト、およびその他の哺乳動物、重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で周知である。これらの領域を包含するDNA断片は、例えば、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、任意の種類(例えば、IgG、IgA、IgE、IgMまたはIgD)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)またはKabat(前述)に記載のサブクラス定常領域およびその異常型変異体であり得る。
LCVR領域をコードする単離されたDNAは、LCVRコーディングDNAを軽鎖定常領域をコードする別のDNA分子に操作可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子に変換することができる。ヒト、およびその他の哺乳動物、軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で周知である。これらの領域を包含するDNA断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
抗体重鎖および/または軽鎖遺伝子の他に、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞の抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を有する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図し、必要に応じて、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルのような要因に依存し得る。哺乳動物宿主細胞の発現について好ましい制御配列として、高レベルの哺乳動物細胞のタンパク質発現を方向付けるウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、adenovirusMajor late promoter(AdMLP))および/またはポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。
さらに、本発明の組み換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞のベクターおよび1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子の複製を制御する配列を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。例えば、通常、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞上のG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬に耐性を与える。好ましい選択可能なマーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅を有するdhfr−マイナス宿主細胞に使用される)、(G418の選択について)ネオ遺伝子、および選択/増幅について、GS陰性細胞株(NSO等)のグルタミンシンテターゼ(GS)が挙げられる。
軽鎖および/または重鎖の発現について、重鎖および/軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術、例えば、電気泳動、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン形質転換、形質導入、感染等によって、宿主細胞に導入される。原核または真核生物の宿主細胞に本発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、真核生物細胞が好ましく、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞であり、これは、このような細胞は、適切に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体を確立および分泌する可能性が高いためである。本発明の組み換え抗体を発現する好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)[dhfrマイナスCHO細胞を含み、Urlaub and Chasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−20、1980、DHFR選択可能マーカーと共に使用され、例えば、Kaufman and Sharp、J.Mol.Biol.159:601−21、1982に記載]、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2/0細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞に抗体を発現することができ、より好ましくは、宿主細胞が当該技術分野で周知の適切な条件下で培養される培地に抗体を分泌することが可能な充分な時間、宿主細胞を培養することによって、抗体は産生する。抗体は、標準の精製方法を使用して、宿主細胞および/または培地から回収することができる。
本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む1つ以上のベクターまたは構築物を含む。例えば、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入された細胞であり、ベクターは、本発明の抗体のLCVRをコードするポリヌクレオチドおよび/または本発明のHCVRをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明は、また、本発明の2つのベクターが導入された宿主細胞を提供し、1つベクターは本発明の抗体のLCVRをコードするポリヌクレオチドを含み、もう1つのベクターは本発明の抗体に存在するHCVRをコードするポリヌクレオチドを含み、それぞれ、エンハンサー/プロモーター制御要素(例えば、SV40、CMV)、アデノウイルス等、例えば、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター制御要素、またはSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター制御要素)に操作可能に連結して、高レベルの遺伝子の転写レベルを駆動する。
一度発現すると、本発明のインタクトな抗体、個々の軽鎖および重鎖、またはその他の免疫グロブリン形態は、当該技術の標準の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性(例えば、タンパク質A)、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従って精製することができる。治療用抗体の標準の精製方法は、例えば、Feng L1、Joe X. Zhou、Xiaoming Yang、Tim Tressel、およびBrian Lee、文献名「Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization」(BioProcessing Journal、2005年9月/10月)(治療用抗体の精製を示すために、参照によりその全体が援用される)に記載されている。さらに、組み換え的に発現された抗体調製物からウイルスを除去する標準方法についても当該技術で周知である(例えば、Gerd Kern andMani Krishnan、“Viral Removal by Filtration:Points to Consider”(Biopharm International、2006年10月))。治療用抗体の調製物からウイルスを除去するためにろ過することの有効性は、ろ過される溶液のタンパク質および/または抗体の濃度に少なくとも部分的に依存することが知られている。本発明の抗体の精製方法は、ろ過をして1つ以上のクロマトグラフィー操作のメインストリームからウイルスを除去するステップを含み得る。好ましくは、医薬品グレードのナノフィルターによってろ過を行って、ウイルスを除去する前に、本発明の抗体を含むクロマトグラフィーメインストリームを希釈または濃縮して、約1g/L〜約3g/Lの全タンパク質および/または全抗体濃度を得る。さらに好ましくは、ナノフィルターはDV20ナノフィルターである(例えば、Pall Corporation;East Hills、N.Y.)。少なくとも約90%、約92%、約94%または約96%の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましくは、約98〜約99%以上の均一性が医薬用途に最も好ましい。部分的または望ましい均一性に精製されると、無菌の抗体は、本明細書に記載のように、治療に使用してもよい。
前述の考察において、本発明は、さらに、限定されないが、哺乳動物、植物、細菌、トランスジェニック動物、または核酸が発現するように、本発明の抗体をコードする核酸分子を含むポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換されたトランスジェニック植物細胞を含む宿主細胞を培養するステップ、任意に、宿主細胞の培地から抗体を回収するステップを含む工程によって得ることができる抗体に関する。
特定の態様において、本出願は、ハイブリドーマ細胞株、およびこれらのハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体を提供する。開示の細胞株は、モノクローナル抗体の産生以外の用途を有する。例えば、細胞株はその他の細胞(例えば、適切に薬物符号の付いたヒト骨髄腫、マウス骨髄腫、ヒト−マウス)と融合して異種骨髄腫(heteromyeloma)またはヒトリンパ芽球様細胞)に融合して、追加のハイブリドーマを産生し、したがって、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を導入することができる。さらに、細胞株を抗CGRP免疫グロブリン鎖をコードする核酸の源として使用することができ、(例えば、適切な技術を使用してその他の細胞に導入すると(例えば、Cabilly等、米国特許第4,816,567号;Winter、米国特許第5,225,539号を参照のこと))単離され、発現することができる。例えば、再配置された抗CGRP軽鎖または重鎖を含むクローンを(PCRによって)単離することができ、cDNAライブラリを細胞株から単離されたmRNAから調製することができ、抗CGRP免疫グロブリン鎖をコードするcDNAクローンを単離することができる。したがって、様々な宿主T細胞またはin vitroの翻訳系の特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその変異体(例えば、ヒト免疫化グロブリン)の産生について、組み換えDNA技術に従って、抗体の重鎖および/または軽鎖またはその部分をコードする核酸を得て、使用することができる。例えば、ヒト免疫化グロブリンまたは免疫グロブリン鎖等の変異体をコードするcDNAまたはその誘導体を含む核酸を適切な原核生物または真核生物のベクター(例えば、発現ベクター)に配置し、適切な方法(例えば、形質転換、トランスフェクション、電気泳動、感染)によって、適切なT細胞に導入することができ、核酸が1つ以上の発現制御要素に操作可能に連結する(例えば、ベクターに、または宿主T細胞ゲノムに統合される)。産生のために、宿主T細胞を発現に適した条件下で(誘導因子、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助等を補充した適切な培地の存在下で)維持することができ、それによってコードされたポリペプチドが産生する。望ましい場合、コードされたタンパク質は、(例えば、宿主T細胞または培地から)回収および/または単離することができる。産生方法はトランスジェニック動物の宿主T細胞の発現を含むことが理解される(例えば、WO92/03918、GenPharm International、1992年3月19日に公開)(参照によりその全体が援用される)。
宿主細胞は、また、インタクトな抗体の部分または断片、例えば、Fab断片またはscFv分子を通常の技術によって産生するために使用することができる。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖の何れかをコードするDNAで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい。組み換えDNA技術を使用して、ヒトCGRPへの結合に重要ではない軽鎖または重鎖の何れかまたはその両方をコードするいくつかのDNAまたは全てのDNAが除去され得る。このような切断されたDNA分子から発現される分子は、また、本発明の抗体によって包含される。
E.coli等の細菌から単鎖抗体を含む単鎖抗体を発現し、および/または適切な活性形態にリフォールディングする方法は、記載されており、周知であり、本明細書抗体に適用することができる(例えば、Buchner等、Anal.Biochem.205:263−270、1992;Pluckthun、Biotechnology 9:545、1991;Huse等、Science 246:1275、1989およびWard等、Nature 341:544、1989を参照のこと、全て参照により本明細書に援用される)。
しばしば、E.coliまたはその他の細菌からの機能的異種性タンパク質を封入体から探知し、強力な変性剤を使用して可溶化し、次にリフォールディングする必要がある。可溶化のステップの最中、当該技術で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しているにちがいない。還元剤を有する例示的な緩衝液は、0.1MのトリスpH8、6Mのグアニジン、2mMのEDTA、0.3MのDTE(ジチオエリトリトール)である。ジスルフィド結合の再酸化は、Saxena等、Biochemistry 9:5015−5021、1970、参照により本明細書に援用される、およびBuchner等、前述のように、還元および酸化形態で低分子量のチオール試薬の存在下で生じ得る。
概して、変性および還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に(例えば、100倍)希釈することによって、再生が達成される。例示的な緩衝液は、0.1Mのトリス、pH8.0、0.5MのL−アルギニン、8mMの酸化型グルタチオン(GSSG)、および2mMのEDTAである。
2つの鎖抗体精製プロトコルの修正として、重鎖および軽鎖領域を分離して可溶化し、還元し、その後、リフォールディング溶液に合わせる。あるタンパク質のモル過剰量が他のタンパク質より5倍を超えないようなモル比で、これらの2つのタンパク質を混合すると、例示的な収率が得られる。酸化還元−混合の終了後に、過剰な酸化グルタチオンまたはその他の酸化している低分子量の化合物をリフォールディング溶液に添加することができる。
組み換え方法の他に、本明細書に開示される抗体、標識された抗体およびその抗原結合断片は、標準のペプチド合成を使用して全体的または部分的に構築することもできる。約50アミノ酸長未満のポリペプチドの固相合成は、配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、次に配列の残りのアミノ酸を連続添加することによって達成することができる。固相合成の技術は、Barany&Merrifield、The Peptides:Analysis、Synthesis、Biology.Vol.2:Special Methods in Peptide Synthesis、Part A. pp.3−284;Merrifield等、J.Am.Chem.Soc.85:2149−2156、1963、およびStewart等、Solid Phase Peptide Synthesis、2版、Pierce Chem.Co.、Rockford、Ill.、1984に記載されている。より長いタンパク質は、短い断片のアミノおよびカルボキシル末端を縮合することによって合成され得る。(例えば、カップリング試薬N,N’−ジシルオヘキシルカルボドイミドを使用することで)カルボキシル末端の活性化によってペプチド結合を形成する方法は当該技術分野で周知である。
下記実施例を本発明をより完全に例示するために提示するがその範囲を限定すると解釈されるものではない。
実施例1
ヒトCGRPを特異的に標的とするモノクローナル抗体の生成
雌のBaIb/cおよびC57BI/6マウスを3回免疫した(隔週)。第1の免疫化については、マウスは、それぞれ50μgのCGRPタンパク質(R&Dシステム、Cat#3012)で皮下に免疫した。抗原はフロイント完全アジュバント(シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国)との1:1の混合物として注射した。第2および第3の免疫化については、マウスは、それぞれ25μgのCGRPタンパク質で腹腔内に免疫した。抗原は、第2および第3の投与において、フロイント不完全アジュバント(シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国)との1:1の混合物として注射した。マウスには、腹腔内に25μgのCGRPで最終的に追加免疫を行い、ATCCからの骨髄腫細胞株NS0との融合のため脾細胞は4日後に回収した(アレンデール、ニュージャージー州、米国)。電気的融合法を用いてハイブリドーマ細胞を得て、次いでハイブリドーマ上清を、抗原結合、リガンドブロッキング、IgG結合、参照抗体結合、およびFACS結合についてスクリーニングする。サブクローニングのための最初のスクリーニングにより、20個のマウスmAbを最終的に選択した(限界希釈法)。BD Cell MAb培地を用いてハイブリドーマをローラーボトル中で増殖させ、抗体産生のため上清を回収した。mAbは、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。mAbの推定純度は、SDS−PAGEクーマシー染色に基づいて90%より高かった。15個の精製mAb(6G5A6B9、37B1F8B3、37H5E2H9、37H5C2D2、30B8G9B11、6G5D2B1、30B8F4C8、24G7B5G11、24G7G12C7、37B1B5B3、37H5G5E1、37B1D4D7、6G5C8C4、24G7B10G2、24G7B7B12)を、ヒトCGRP結合アビディティアッセイ(ELISA)、マウスCGRP交差反応性アッセイ(ELISA)、霊長類CGRP交差反応性アッセイ(ELISA)、SK−N−MC細胞CGRPアッセイ、およびエピトープ結合スクリーニング、を含む2次スクリーニングのため選択した。
ヒトCGRPを特異的に標的とするモノクローナル抗体の生成
雌のBaIb/cおよびC57BI/6マウスを3回免疫した(隔週)。第1の免疫化については、マウスは、それぞれ50μgのCGRPタンパク質(R&Dシステム、Cat#3012)で皮下に免疫した。抗原はフロイント完全アジュバント(シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国)との1:1の混合物として注射した。第2および第3の免疫化については、マウスは、それぞれ25μgのCGRPタンパク質で腹腔内に免疫した。抗原は、第2および第3の投与において、フロイント不完全アジュバント(シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国)との1:1の混合物として注射した。マウスには、腹腔内に25μgのCGRPで最終的に追加免疫を行い、ATCCからの骨髄腫細胞株NS0との融合のため脾細胞は4日後に回収した(アレンデール、ニュージャージー州、米国)。電気的融合法を用いてハイブリドーマ細胞を得て、次いでハイブリドーマ上清を、抗原結合、リガンドブロッキング、IgG結合、参照抗体結合、およびFACS結合についてスクリーニングする。サブクローニングのための最初のスクリーニングにより、20個のマウスmAbを最終的に選択した(限界希釈法)。BD Cell MAb培地を用いてハイブリドーマをローラーボトル中で増殖させ、抗体産生のため上清を回収した。mAbは、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製した。mAbの推定純度は、SDS−PAGEクーマシー染色に基づいて90%より高かった。15個の精製mAb(6G5A6B9、37B1F8B3、37H5E2H9、37H5C2D2、30B8G9B11、6G5D2B1、30B8F4C8、24G7B5G11、24G7G12C7、37B1B5B3、37H5G5E1、37B1D4D7、6G5C8C4、24G7B10G2、24G7B7B12)を、ヒトCGRP結合アビディティアッセイ(ELISA)、マウスCGRP交差反応性アッセイ(ELISA)、霊長類CGRP交差反応性アッセイ(ELISA)、SK−N−MC細胞CGRPアッセイ、およびエピトープ結合スクリーニング、を含む2次スクリーニングのため選択した。
CGRP受容体は、受容体成分タンパク質(RCP)へと細胞質に連結されるカルシトニン受容体様受容体(CLR、Gタンパク質共役型受容体)および受容体活性修飾タンパク質(RAMP)−1からなるヘテロ三量体の複合体である。CGRPのその受容体への結合は、cAMP産生の刺激をもたらす。ヒト神経上皮腫瘍細胞株SK−N−MCは自然にCGRP受容体を発現し、抗CGRP抗体がCGRP誘導性cAMP産生を阻害可能であるかを評価するのに使用できる(RJ Benschopら、Osteoarthritis and Cartilage、22:578−585,2014;Shiら、J Pharmacol Exp Ther.,356:223−231,2016)。SK−N−MC 細胞株を、15個の精製mAb(6G5A6B9、37B1F8B3、37H5E2H9、37H5C2D2、30B8G9B11、6G5D2B1、30B8F4C8、24G7B5G11、24G7G12C7、37B1B5B3、37H5G5E1、37B1D4D7、6G5C8C4、24G7B10G2、24G7B7B12)の効果の評価に用いた。簡単に述べると、15個の精製Abを30pMのCGRPで30分間、室温にてプレインキュベートしてからSK−N−MC細胞中に2倍希釈して、5%CO2インキュベーター中で30分間37℃でインキュベートする。25μLのcAMP−d2/溶解緩衝液および25μLの抗cAMP−クリプタート/溶解緩衝液を次いで各ウェルに加える。プレートを密閉して4℃で1時間インキュベートする。SK−N−MC細胞アッセイ培地は、アッセイ期間中、固定濃度のCGRP(100pM)を含む。阻害効果は、対照に対してのCGRPの減少として検出される。cAMP量の指標としてのOD665/620比をPerkinElmerのEnvisionにて測定した。
15個のマウスmAbについての2次アッセイデータを、図1、図2、および表3にまとめる:
表3に示すように、抗CGRPマウスモノクローナル抗体はヒトおよびマカクCGRPに高い親和性で結合し、SK−N−MCアッセイにおいて、臨床mAb治療薬で求められる、92〜435pMのIC50でcAMPの産生を阻害する。
表3に示すように、抗CGRPマウスモノクローナル抗体はヒトおよびマカクCGRPに高い親和性で結合し、SK−N−MCアッセイにおいて、臨床mAb治療薬で求められる、92〜435pMのIC50でcAMPの産生を阻害する。
2次アッセイの累計結果に基づき、精製マウスmAb、6G5C8C4 (「A1」)、24G7B10G2(「A2」)および30B8G9B11(「A3」)を、配列決定および更なる分析のために選択した。TRIzo(registered trademark)Reagentの技術マニュアルにしたがって、凍結ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。全RNAをアガロースゲル電気泳動により分析した。PrimeScriptTM第1鎖cDNA合成キットの技術マニュアルにしたがい、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを用いて全RNAをcDNAに逆転写した。PCRを行って、抗体の可変領域(重鎖および軽鎖)を増幅し、さらにそれぞれ標準的なクローニングベクターにクローニングし、配列決定を行った。マウスmAb、6G5C8C4(「A1」)、24G7B10G2(「A2」)および30B8G9B11(「A3」)はすべてエピトープbin1からのIgG2a、kアイソタイプ抗体であり、それぞれ配列番号17、19および21に記載の重鎖可変領域配列およびそれぞれ配列番号23、25および27に記載の軽鎖可変領域配列を含む。mAb、6G5C8C4(「A1」)、24G7B10G2(「A2」)および30B8G9B11(「A3」)の重鎖可変領域は、それぞれ配列番号18、20および22に記載の核酸配列によってコードされ、またmAb、6G5C8C4(「A1」)、24G7B10G2(「A2」)および30B8G9B11(「A3」)の軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号24、26および28に記載の核酸配列によってコードされによってコードされる。
実施例2
ヒトCGRPを標的とするキメラIgG4の生成
mAb、30B8G9B11(「A3」)のHCVRおよびLCVR配列を用いて、配列番号29に記載の重鎖配列および配列番号31に記載の軽鎖配列を含むマウス−ヒトIgG4キメラFab(以下、「キメラIgG4」)を調製した。キメラIgG4の重鎖および軽鎖は、それぞれ 配列番号30および32に記載の核酸によってコードされる。リーダー配列を含む配列番号30および配列番号32にコードされる核酸を増幅し、pTT5に挿入して全長キメラIgG4の発現プラスミドを作成した。重鎖と軽鎖発現プラスミドを用いて100mLのHEK293−6E細胞にコトランスフェクトした。培地中に分泌された組換えIgG4を、プロテインAアフィニティーを用いて精製した。精製抗体をPD−10脱塩カラムを用いてPBS中にバッファー交換した。非還元条件下でのSDS−PAGEにて、精製キメラIgG4は 〜170kDaのバンドとして、還元条件下では〜55kDaおよび〜30kDAのバンドとして移動した。キメラIgG4の純度は>85%であり、また100mL培養からの収量は〜2.4mg/Lであった。
ヒトCGRPを標的とするキメラIgG4の生成
mAb、30B8G9B11(「A3」)のHCVRおよびLCVR配列を用いて、配列番号29に記載の重鎖配列および配列番号31に記載の軽鎖配列を含むマウス−ヒトIgG4キメラFab(以下、「キメラIgG4」)を調製した。キメラIgG4の重鎖および軽鎖は、それぞれ 配列番号30および32に記載の核酸によってコードされる。リーダー配列を含む配列番号30および配列番号32にコードされる核酸を増幅し、pTT5に挿入して全長キメラIgG4の発現プラスミドを作成した。重鎖と軽鎖発現プラスミドを用いて100mLのHEK293−6E細胞にコトランスフェクトした。培地中に分泌された組換えIgG4を、プロテインAアフィニティーを用いて精製した。精製抗体をPD−10脱塩カラムを用いてPBS中にバッファー交換した。非還元条件下でのSDS−PAGEにて、精製キメラIgG4は 〜170kDaのバンドとして、還元条件下では〜55kDaおよび〜30kDAのバンドとして移動した。キメラIgG4の純度は>85%であり、また100mL培養からの収量は〜2.4mg/Lであった。
キメラIgG4と抗原CGRPとの間の結合親和性を表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサー、Biacore T200 (GEヘルスケア)を用いて測定した。30B8G9B11(「A3」)およびキメラIgG4をそれぞれアミンカップリング法を用いてセンサーチップ上に固定した。抗原CGRPタンパク質を検体として用いた。解離(kd)および結合(ka)速度定数のデータは、Biacore T200評価ソフトウェアを用いて取得した。平衡解離定数(KD)は、kd/kaの比から算出した。結果を表4にまとめる:
実施例3
ヒトCGRPを特異的に標的とするヒト化Abの生成
CDRグラフティングと復帰突然変異法を用いて、マウスmAb、30B8G9B11(「A3」)由来のヒト化抗CGRP mAbを調製した。簡単に述べると、親マウス抗体A3のCDRをヒトアクセプターに移植して親抗体のためヒト化軽鎖とヒト化重鎖を得る。VHおよびVLについて選択されたヒトアクセプターはそれぞれGenBank AAP97932.1およびAKU38886.1であった。ヒトアクセプターのCDRおよびHVループを、マウスのその相当部分と置換し(CDRグラフティング)、配列番号60に記載の重鎖可変領域配列および配列番号61に記載の軽鎖可変領域配列を含む、以下に「CGRP移植Ab」とする移植抗体の配列を得た。
ヒトCGRPを特異的に標的とするヒト化Abの生成
CDRグラフティングと復帰突然変異法を用いて、マウスmAb、30B8G9B11(「A3」)由来のヒト化抗CGRP mAbを調製した。簡単に述べると、親マウス抗体A3のCDRをヒトアクセプターに移植して親抗体のためヒト化軽鎖とヒト化重鎖を得る。VHおよびVLについて選択されたヒトアクセプターはそれぞれGenBank AAP97932.1およびAKU38886.1であった。ヒトアクセプターのCDRおよびHVループを、マウスのその相当部分と置換し(CDRグラフティング)、配列番号60に記載の重鎖可変領域配列および配列番号61に記載の軽鎖可変領域配列を含む、以下に「CGRP移植Ab」とする移植抗体の配列を得た。
結合活性のために重要であると信じられる、移植抗体内のCDR中のカノニカル残基、フレームワーク領域およびVH−VLインターフェース上の残基を選択し、相当する親抗体と置換した。CGRP抗体Fv断片のホモロジーモデリングを行った。Fv断片のためにベストのテンプレートを識別するために、特にドメインインターフェースを構築するために、CGRP配列を、PDBの抗体データベースに対して、BLAST検索にかけた。構造テンプレート1I3G(アンピシリン1本鎖fvの結晶構造、フォーム1を選択、同一性=75%であった。全体では、17個のアミノ酸が存在し、HCVRから9個(K12V、V20I、R38K、M48I、V68A、M70L、R72V、R98SおよびV115L)およびLCVRから8個(L4M、A13T、I21V、Q37R、A43S、L46A、L78VおよびY87I)が置換について確認された。復帰突然変異抗体は次いでHEK293細胞において発現され、評価された。この評価に基づいて、リードヒト化抗体のスクリーニングに用いるために構築されたヒト化重鎖はH1、H2、H3、およびH4と名付けられ、これらはそれぞれ配列番号41、43、45および47に記載の配列を含み、また、得られたヒト化軽鎖はL1、L2、L3およびL4と名付け、これらはそれぞれ配列番号49、51、53および55に記載の配列を含む。
H1〜H4とL1〜L4の各種組み合わせを用いて、16個のヒト化抗体をHEK293−6E 細胞に発現させた。簡単に述べると、それぞれリーダー配列を含む、配列番号42(H1)、44(H2)、46(H3)または48(H4)のいずれか、および配列番号50(L1)、52(L2)、54(L3)または56(L4)のいずれかによってコードされる核酸を増幅し、pTT5に挿入して全長IgGの発現プラスミドを作成した。重鎖および軽鎖発現プラスミドを用いて100mLのHEK293−6E細胞にコトランスフェクトした。培地中に分泌された組換えIgGをプロテインAアフィニティーを用いて精製した。精製抗体をPD−10脱塩カラムを用いてPBS中にバッファー交換した。精製IgGは、非還元条件下のSDS−PAGEにおいて〜170kDaのバンドとして移動し、また、100mLの培養物からの収量は20mg/Lより高かった。16個のヒト化CGRP抗体についてのHC とLCアミノ酸配列を表5にまとめる:
Biacore T200(GEヘルスケア)を用いて、16個のヒト化IgGの親和性についてランキングを行った。抗ヒトFcガンマ特異抗体を、アミンカップリング法を用いてセンサーチップ上に固定した。培養培地に分泌された16個のヒト化抗体と親抗体を注入し、個々にFc(捕捉反応相)を経て抗ヒトFc抗体によって捕捉した。平衡後、Ag CGRPを300秒注入し(結合相)次いで900秒泳動用緩衝液を注入した(解離相)。各サイクルの間、参照フローセル(フローセル1)の反応を、ヒト化抗体フローセルの反応から差し引いた。他のヒト化抗体を注入する前に表面を再生した。全抗体を分析するまで、このプロセスを繰り返した。Biacore T200評価ソフトウェアを用いて、実験データを局所的に1:1の相互作用モデルにフィットさせて、ヒト化抗体の解離速度を得た。抗体をその解離速度定数によってランク付けした(解離速度、kd)。親抗体と同様の親和性をもってAg CGRPと相互作用する結合剤を選択した。
親和性ランキングに基づいて、4個のIgG:1)IgG10(H3/L2)(以下「REMD128」とも称する);2)IgG11(H3/L3)(以下「REMD128.1」とも称する);3)IgG15(H4/L3)(以下「REMD128.2」とも称する)および4)IgG14 (H4/L2)(以下「REMD128.3」とも称する)を選択し、HEK293細胞培養物において発現させた。培地に分泌される組換えIgGをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。SDS−PAGEで評価したところ、ヒト化IgGの純度は全て90%を超えていた。精製抗体のCGRPへの結合親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサー、Biacore 8kを用いて測定した。抗体を、アミンカップリング法によってセンサーチップ上に固定した。抗原CGRPを検体として用いた。解離(kd)および結合(ka)速度定数のデータは、Biacore 8k評価ソフトウェアを用いて得た。平衡解離定数(KD)をkd/kaの比から算出した。結果を表7にまとめる:
表7に示すように、4つのヒト化抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合親和性を保持する。
表7に示すように、4つのヒト化抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合親和性を保持する。
次いで4つのヒト化抗体を、実施例1に記載のSK−N−MC細胞に基づくアッセイで評価した。結果を図3および表8にまとめる:
表7に示すように、4つのヒト化抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合親和性を保持し、臨床mAb治療薬で求められる、49〜60pM AbのIC50でcAMPの産生を阻害した。
表7に示すように、4つのヒト化抗体は、キメラ抗体と同等の抗原結合親和性を保持し、臨床mAb治療薬で求められる、49〜60pM AbのIC50でcAMPの産生を阻害した。
本明細書に開示および特許請求されるすべての物品および方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行することができる。本発明の物品および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく物品および方法に変形を適用できることは当業者には明らかであろう。現存するか、または後に開発されるかにかかわらず、当業者に明らかなそのような変形および等価物はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内にあるとみなされる。本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを示している。すべての特許、特許出願、および刊行物は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、個々の出版物がすべての目的のために参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じである。本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素がなくても適切に実施することができる。したがって、本発明を好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示したが、本明細書に開示された概念の修正および変形は当業者に頼ることができ、そのような修正および変形は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。
[配列表]
添付の配列表に挙げられた核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準的な文字略語を用いて示され、アミノ酸については米国特許法施行規則(37CFR)第1.822条に規定の3文字コードで示される。
配列番号1は、ヒトCGRPを含むアミノ酸配列である。
配列番号2は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR1のアミノ酸配列である。
配列番号3〜5は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR2のアミノ酸配列である。
配列番号6〜8は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR3のアミノ酸配列である。
配列番号9〜11は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR1のアミノ酸配列である。
配列番号12〜13は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR2のアミノ酸配列である。
配列番号14〜16は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR3のアミノ酸配列である。
配列番号17、19および21は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号18、20および22は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
配列番号23、25および27は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号24、26および28は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
配列番号29は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号30は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の重鎖の核酸配列である。
配列番号31は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号32は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖の核酸配列である。
配列番号33、35、37および39は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号34、36、38および40は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号41、43、45および47は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号42、44、46および48は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖の核酸配列である。
配列番号49、51、53および55は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号50、52、54および56は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖の核酸配列である。
配列番号57および58は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号59は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号60は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号61は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
[配列表]
配列番号1−CGRPアミノ酸配列
ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF
配列番号2−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR1アミノ酸配列
DYYMN
配列番号3−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DINPNNGGTTYNQKFKG
配列番号4−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DVNPNNGDTTYNQKFKG
配列番号5−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DVNPNNGGTHYNQKFKG
配列番号6−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPYYFDY
配列番号7−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPLYFDF
配列番号8−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPVYFDF
配列番号9−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGSNVA
配列番号10−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGINVA
配列番号11−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGPNVA
配列番号12−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR2アミノ酸配列
SASFRYS
配列番号13−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR2アミノ酸配列
SASYRYS
配列番号14−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNSYPYT
配列番号15−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNTYPYT
配列番号16−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNYYPYT
配列番号17−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAVITIVPYYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgcaacaatctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaacaatggtggtactacttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagtcattactatagtcccctactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
配列番号19−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLLQSGPELMKPGTSVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGDTTYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPLYFDFWGQGTTLAVSS
配列番号20−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctca
配列番号21−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSS
配列番号22−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
配列番号23−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSRVPDRFSGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNSYPYTFGAGTKLELK
配列番号24−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgttatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtagtaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctttcgttacagtagagtccctgatcgcttctcaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagactatttctgtcagcaatataacagttatccttacacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
配列番号25−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGINVAWYQQKPGQSPKALLYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVKSGDLAEYFCQQYNTYPYTFGGGTKLEIK
配列番号26−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtattaatgtagcctggtatcaacagaagccaggacaatctcctaaagcactgctttactcggcatcctaccgatatagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggttctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgaagtctggagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacacctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
配列番号27−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIK
配列番号28−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtcctaatgtagcctggtatcgacagaaaccaggacaatctcctaaagctctgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcaatctgaagacttggcagactatatctgtcagcagtataactactatccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaa
配列番号29−マウス−ヒトキメラ抗体の重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号30−マウス−ヒトキメラ抗体の重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号31−マウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号32−マウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctcacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号33−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号34−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号35−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号36−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号37−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号38−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号39−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSS
配列番号40−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号41−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号42−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaagtgaagaaacccggagcaagtgtgaaggtgtcatgcaaagcctcaggatatacattcacagactactatatgaactgggtgcgacaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccatgacacgcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagcgacgataccgccgtctactattgcgctagaattactattgtgcccgtgtattttgatttttggggacagggaactctggtcaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号43−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号44−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggagcagaggtcgtgaaacccggagcaagcgtcaaggtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaggcaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggccgggtgaccatgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactatcgtgcccgtctactttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号45−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号46−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaggtggtcaaacccggagcaagcgtgaaagtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaagcaggcaccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccctgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactattgtgcccgtctattttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号47−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号48−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtgcagctggtccagtcaggggcagaggtcgtcaaacccggagcaagcgtgaagattagttgtaaggcatcaggctatactttcacagactactatatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggcaaccctgacagtggacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtctactattgcgcttccattaccattgtgccagtctattttgatttttggggacagggaactctgctgacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号49−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号50−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccctcattcctgtccgcaagtgtgggcgaccgagtcaccatcacctgtaaggcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtaccagcagaagcccgggaaagcccctaagctgctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaattagctccctgcagcccgaagacttcgccacctactattgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcagggcactaaactggaaatcaaacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号51−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号52−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccatccttcctgagcgcaagcgtcggagacagagtgaccattacctgcaaagcatcccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaagcccctaaggctctgatctattctgccagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgctacctacatttgtcagcagtacaactattatccttacacctttgggcagggcactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号53−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号54−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagagcccttccttcctgagcacaagcgtcggagatagagtcacaatcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggaccaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号55−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号56−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagatgacccagtccccctccttcctgagcacaagcgtgggcgatagagtcaccgtcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtgccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccgtccagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号57−軽鎖定常領域アミノ酸配列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号58−軽鎖定常領域アミノ酸配列
Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
配列番号59−重鎖定常領域アミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号60−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号61−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ PEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
[配列表]
添付の配列表に挙げられた核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準的な文字略語を用いて示され、アミノ酸については米国特許法施行規則(37CFR)第1.822条に規定の3文字コードで示される。
配列番号1は、ヒトCGRPを含むアミノ酸配列である。
配列番号2は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR1のアミノ酸配列である。
配列番号3〜5は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR2のアミノ酸配列である。
配列番号6〜8は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における重鎖CDR3のアミノ酸配列である。
配列番号9〜11は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR1のアミノ酸配列である。
配列番号12〜13は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR2のアミノ酸配列である。
配列番号14〜16は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体における軽鎖CDR3のアミノ酸配列である。
配列番号17、19および21は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号18、20および22は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
配列番号23、25および27は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号24、26および28は、CGRPに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
配列番号29は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号30は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の重鎖の核酸配列である。
配列番号31は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号32は、CGRPに特異的に結合するマウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖の核酸配列である。
配列番号33、35、37および39は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号34、36、38および40は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号41、43、45および47は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号42、44、46および48は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖の核酸配列である。
配列番号49、51、53および55は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号50、52、54および56は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖の核酸配列である。
配列番号57および58は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号59は、CGRPに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
配列番号60は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号61は、CGRPに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
[配列表]
配列番号1−CGRPアミノ酸配列
ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF
配列番号2−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR1アミノ酸配列
DYYMN
配列番号3−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DINPNNGGTTYNQKFKG
配列番号4−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DVNPNNGDTTYNQKFKG
配列番号5−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR2アミノ酸配列
DVNPNNGGTHYNQKFKG
配列番号6−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPYYFDY
配列番号7−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPLYFDF
配列番号8−マウスモノクローナル抗体重鎖CDR3アミノ酸配列
ITIVPVYFDF
配列番号9−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGSNVA
配列番号10−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGINVA
配列番号11−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR1アミノ酸配列
KASQNVGPNVA
配列番号12−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR2アミノ酸配列
SASFRYS
配列番号13−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR2アミノ酸配列
SASYRYS
配列番号14−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNSYPYT
配列番号15−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNTYPYT
配列番号16−マウスモノクローナル抗体軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYNYYPYT
配列番号17−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCAVITIVPYYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgcaacaatctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatattaatcctaacaatggtggtactacttacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccaccacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcagtcattactatagtcccctactactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
配列番号19−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLLQSGPELMKPGTSVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGDTTYNQKFKGKATLTIDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPLYFDFWGQGTTLAVSS
配列番号20−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctca
配列番号21−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSS
配列番号22−マウスモノクローナル抗体重鎖可変領域核酸配列
gaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
配列番号23−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGSNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSRVPDRFSGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYNSYPYTFGAGTKLELK
配列番号24−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgttatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtagtaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctttcgttacagtagagtccctgatcgcttctcaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagactatttctgtcagcaatataacagttatccttacacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
配列番号25−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGINVAWYQQKPGQSPKALLYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVKSGDLAEYFCQQYNTYPYTFGGGTKLEIK
配列番号26−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtattaatgtagcctggtatcaacagaagccaggacaatctcctaaagcactgctttactcggcatcctaccgatatagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggttctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgaagtctggagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacacctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
配列番号27−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIK
配列番号28−マウスモノクローナル抗体軽鎖可変領域核酸配列
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtcctaatgtagcctggtatcgacagaaaccaggacaatctcctaaagctctgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcaatctgaagacttggcagactatatctgtcagcagtataactactatccgtacacgttcggaggggggaccaaactggaaataaaa
配列番号29−マウス−ヒトキメラ抗体の重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号30−マウス−ヒトキメラ抗体の重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgcaacaatctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtggtactcactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagtattacgattgtacctgtttactttgacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号31−マウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYNYYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号32−マウス−ヒトキメラ抗体の軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgaggtccagctgttacaatctggacctgagctgatgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatggtaagagccttgagtggattggagatgttaatcctaacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactatagacaagtcctccagcacagcctacatggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctactactgtgcaagtattacgattgttcctctttactttgacttctggggccaaggcaccactctcgcagtctcctcacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号33−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号34−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号35−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号36−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号37−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号38−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号39−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSS
配列番号40−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
配列番号41−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号42−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaagtgaagaaacccggagcaagtgtgaaggtgtcatgcaaagcctcaggatatacattcacagactactatatgaactgggtgcgacaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccatgacacgcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagcgacgataccgccgtctactattgcgctagaattactattgtgcccgtgtattttgatttttggggacagggaactctggtcaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号43−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号44−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggagcagaggtcgtgaaacccggagcaagcgtcaaggtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaggcaggcaccaggacagggactggagtggatgggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggccgggtgaccatgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactatcgtgcccgtctactttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcatccgcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号45−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号46−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtccagctggtccagtcaggggcagaggtggtcaaacccggagcaagcgtgaaagtctcatgcaaagcaagcggctatacattcacagactactatatgaactgggtgaagcaggcaccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggtgaccctgacagtcgacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtgtactattgcgcttccattactattgtgcccgtctattttgacttctggggacaggggacactggtgaccgtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号47−ヒト化重鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDVNPNNGGTHYNQKFKGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASITIVPVYFDFWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号48−ヒト化重鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagccaggtgcagctggtccagtcaggggcagaggtcgtcaaacccggagcaagcgtgaagattagttgtaaggcatcaggctatactttcacagactactatatgaactgggtgaagcaggctccaggacagggactggagtggatcggggatgtcaaccctaacaatggcgggactcactacaatcagaagttcaaaggcagggcaaccctgacagtggacactagcatctccaccgcctatatggaactgtctcggctgagaagtgacgataccgccgtctactattgcgcttccattaccattgtgccagtctattttgatttttggggacagggaactctgctgacagtctcctcagcctctacaaagggcccctccgtgtttccactggctccctgcagcaggtctacatccgagagcaccgctgctctgggatgtctggtgaaggattacttccctgagccagtgaccgtgagctggaactccggagctctgacatccggagtgcacacctttcctgctgtgctgcagagctctggcctgtacagcctgtccagcgtggtgacagtgccatcttccagcctgggcaccaagacatatacctgcaacgtggaccataagcccagcaataccaaggtggataagagagtggagtctaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagctcctgagtttctgggaggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatctctcgcacacccgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggatcctgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgctaagaccaagcctagggaggagcagtttaacagcacataccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtataagtgcaaggtgagcaataagggcctgccatcttccatcgagaagacaatctctaaggctaagggacagcctagggagccacaggtgtacaccctgcccccttcccaggaggagatgacaaagaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaagggcttctatccttctgacatcgctgtggagtgggagtccaatggccagccagagaacaattacaagaccacaccacccgtgctggactccgatggcagcttctttctgtattccaggctgaccgtggataagagccggtggcaggagggcaatgtgttttcttgttccgtgatgcacgaagcactgcacaaccactacactcagaagtccctgtcactgtccctgggcaag
配列番号49−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号50−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccctcattcctgtccgcaagtgtgggcgaccgagtcaccatcacctgtaaggcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtaccagcagaagcccgggaaagcccctaagctgctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaattagctccctgcagcccgaagacttcgccacctactattgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcagggcactaaactggaaatcaaacgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号51−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号52−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagtccccatccttcctgagcgcaagcgtcggagacagagtgaccattacctgcaaagcatcccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaagcccctaaggctctgatctattctgccagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgctacctacatttgtcagcagtacaactattatccttacacctttgggcagggcactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号53−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQLTQSPSFLSTSVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号54−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagctgacccagagcccttccttcctgagcacaagcgtcggagatagagtcacaatcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtcccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccctgcagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggaccaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号55−ヒト化軽鎖アミノ酸配列
MGWSWILLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSTSVGDRVTVTCKASQNVGPNVAWYRQKPGKSPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFATYICQQYNYYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号56−ヒト化軽鎖核酸配列
atgggctggagctggatcctgctgttcctcctgagcgtgacagcaggagtgcacagcgacatccagatgacccagtccccctccttcctgagcacaagcgtgggcgatagagtcaccgtcacctgtaaagcaagccagaacgtgggccccaacgtggcatggtacaggcagaagcccgggaaaagccctaaggccctgatctattctgctagttaccggtattctggcgtgccaagcagattctcaggcagcgggtccggaactgagtttaccctgacaatcagctccgtccagcccgaagacttcgccacctacatttgtcagcagtacaactattacccatacaccttcgggcaggggactaaactggaaatcaagcgaacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
配列番号57−軽鎖定常領域アミノ酸配列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号58−軽鎖定常領域アミノ酸配列
Gqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
配列番号59−重鎖定常領域アミノ酸配列
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号60−ヒト化重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGDVNPNNGGTHYNQKFKGRVTMTRDTSISTA YMELSRLRSDDTAVYYCARITIVPVYFDFWGQGTLVTVSS
配列番号61−ヒト化軽鎖可変領域アミノ酸配列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGPNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ PEDFATYYCQQYNYYPYTFGQGTKLEIK
Claims (26)
- ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)に特異的に結合し、(a)配列番号14〜16から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(b)配列番号6〜8から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;または(c)(a)の軽鎖CDR3配列と(b)の重鎖CDR3配列;のいずれかを具えることを特徴とする、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- (d)配列番号9〜11から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(e)配列番号12〜13から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(f)配列番号2から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(g)配列番号3〜5から選択されるCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;(h)(d)の軽鎖CDR1配列と(f)の重鎖CDR1配列;および(i)(e)の軽鎖CDR2配列と(g)の重鎖CDR2配列;から選択されるアミノ酸配列をさらに具えることを特徴とする、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、(a)配列9〜11から選択されたCDR1配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号12〜13から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号14〜16から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号3〜5から選択されたCDR2配列と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;および(f)配列番号6〜8から選択されたCDR3配列と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を具えることを特徴とする、単離された抗体、またはその抗原結合断片。
- (a)配列番号9と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号12と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号14と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号3と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;および(f)配列番号6と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を具えることを特徴とする、請求項3に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- (a)配列番号10と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号13と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号15と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号4と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR2配列;および(f)配列番号7と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を具えることを特徴とする、請求項3に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- (a)配列番号11と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR1配列;(b)配列番号13と同一、実質的に同一または実質的に類似する軽鎖CDR2配列;(c)配列番号16と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖CDR3配列;(d)配列番号2と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR1配列;(e)配列番号5と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖CDR2配列;および(f)配列番号8と同一、実質的に同一または実質的に類似する重鎖CDR3配列;を具えることを特徴とする、請求項3に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し:(a)重鎖および/または軽鎖可変ドメイン、すなわち配列番号9〜11、12〜13および14〜16と同一、実質的に同一、または実質的に類似する3つの軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の1セット、および/または配列番号2、3〜5、および6〜8と同一、実質的に同一、または実質的に類似する3つの重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3の1セットを有する可変ドメイン;ならびに(b)ヒト免疫グロブリン(IgG)由来の4つの可変領域フレームワーク領域の1セット、のいずれかを具えることを特徴とする、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 参照抗体と実質的に同じまたはそれ以上のKdでヒトCGRPに結合し:(b)ヒトCGRPへの結合に関して前記参照抗体と競合する;または、(c)前記参照抗体よりもヒト対象者において免疫原性が低く、前記参照抗体が、配列番号21の重鎖可変ドメイン配列と配列番号27の軽鎖可変ドメイン配列を具えることを特徴とする、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 少なくとも約1×10−6M、少なくとも約1×10−7M、少なくとも約1×10−8M、少なくとも約1×10−9M、少なくとも約1×10−10M、少なくとも約1×10−11M、または少なくとも約1×10−12Mの解離定数(KD)でCGRPタンパク質に結合する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 抗体または抗原結合断片が、H−鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するヒンジ 領域に少なくとも1つの変異を有するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Fab断片、Fab’断片、Fab2断片、F(ab)’2断片、ドメイン抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、またはIgG4抗体から選択されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、配列番号33、35、37および39と同一、実質的に同一、または実質的に類似する重鎖可変領域配列と、配列番号34、36、38および40と同一、実質的に同一、または実質的に類似する軽鎖可変領域配列を具えることを特徴とする、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、配列番号45に記載の重鎖配列と、配列番号51に記載の軽鎖配列を具えることを特徴とする、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、配列番号45に記載の重鎖配列と、配列番号53に記載の軽鎖配列を具えることを特徴とする、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、配列番号47に記載の重鎖配列と、配列番号53に記載の軽鎖配列を具えることを特徴とする、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトCGRPに特異的に結合し、配列番号47に記載の重鎖配列と、配列番号51に記載の軽鎖配列を具えることを特徴とする、単離されたヒト化抗体または抗原結合断片。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片を、薬学的に許容される担体と混合して含むことを特徴とする医薬組成物。
- CGRP−関連疾患を患う対象を治療する方法であって、請求項1〜15のいずれか1項に記載の治療有効量の抗体またはその抗原結合断片の前記対象への投与を含むことを特徴とする方法。
- CGRP−関連疾患が、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択されることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- CGRP−関連疾患が、前兆ありまたは無しの片頭痛;片麻痺性片頭痛;群発頭痛;片頭痛様神経痛;慢性頭痛;緊張型頭痛;その他医学的状態により生ずる頭痛(例えば感染または腫瘍による頭蓋内圧の上昇);慢性発作性片側頭痛;器質的病変に伴わない各種の頭痛;非血管性頭蓋内疾患に伴う頭痛;物質の投与またはその中止に伴う頭痛;頭部以外の感染症に伴う頭痛;代謝疾患に伴う頭痛;頭蓋、首、眼、耳、鼻、洞、歯、口またはその他顔面もしくは頭蓋構造の疾患に伴う頭痛;頭部神経痛;ならびに神経幹痛および求心路遮断性疼痛から成る群から選択される頭痛であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- CGRP−関連疾患に罹患している対象を治療する方法であって、a)請求項1〜15のいずれか1項に記載の治療有効量の抗体またはその抗原結合断片、およびb)特定のCGRP−関連疾患を治療するために有用な1つ以上の追加薬剤、の前記対象への投与を含むことを特徴とする、方法。
- CGRP−関連疾患が、頭痛、顔面紅潮、慢性疼痛、II型糖尿病、腸の機能障害または炎症性腸疾患、下痢、乾癬、関節炎および皮膚疾患に伴う疼痛および痒み、心血管障害、ならびに内毒素血症、敗血症、肥満、糖尿病および関節炎に伴う血行動態異常から成る群から選択されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
- CGRP−関連疾患が:前兆ありまたは無しの片頭痛;片麻痺性片頭痛;群発頭痛;片頭痛様神経痛;慢性頭痛;緊張型頭痛;その他医学的状態により生ずる頭痛(例えば感染または腫瘍による頭蓋内圧の上昇);慢性発作性片側頭痛;器質的病変を伴わない各種の頭痛;非血管性頭蓋内疾患に伴う頭痛;物質の投与またはその中止に伴う頭痛;頭部以外の感染症に伴う頭痛;代謝疾患に伴う頭痛;頭蓋、首、眼、耳、鼻、洞、歯、口またはその他顔面もしくは頭蓋構造の疾患に伴う頭痛;頭部神経痛;ならびに神経幹痛および求心路遮断性疼痛から成る群から選択される頭痛であることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- CGRP−関連疾患が片頭痛であり、および1つ以上の追加薬剤が:5−HT1−様アゴニスト(およびその他5−HT1部位で作用するアゴニスト)、および非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)から成る群から選択されることを特徴とする、請求項22に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、単離された核酸。
- 請求項24に記載の単離された核酸を含むことを特徴とする、組換え発現ベクター。
- 請求項25に記載のベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
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