CN101142236B - Adam-9调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴定和表征疾病和癌症相关抗原KID24的方法。本发明也提供了KID24的调节剂，其包括结合抗原KID24的单克隆抗体家族，并且提供了诊断和治疗各种KID24相关的人类癌症和疾病的方法。

Description

ADAM-9调节剂
技术领域
本发明属于生物学和免疫疗法领域。更具体而言，其涉及发现已知抗原ADAM-9及结合该抗原的多克隆和单克隆抗体以及其他试剂。本发明还提供了用ADAM-9调节剂诊断和/或治疗多种ADAM-9相关的人类疾病和癌症的方法，其中所述的ADAM-9调节剂包括激动剂、拮抗物和结合ADAM-9的肽，包括抗ADAM-9抗体。 
发明背景 
除了已知抗体在诊断中的用途以外，还表明抗体可用作治疗剂。例如，近年来已经使用免疫疗法，或者将抗体用于治疗目的来治疗癌症。被动免疫疗法涉及在癌症治疗中使用单克隆抗体。见例如Cancer：Principles andPractice of Oncology，第6版(2001)，第20章，495-508页。这些抗体可通过直接抑制肿瘤细胞生长或存活和通过其募集身体免疫系统的天然细胞杀伤活性的能力具有固有的治疗性生物活性。这些试剂可单独施用或者与放射或化疗剂联合施用。经批准分别用于治疗非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌的利妥希玛和司徒曼布是此类治疗剂中的两个实例。备选地，抗体可用于制备抗体缀合物，其中抗体与毒性剂连接并通过特异性结合至肿瘤而指导该毒性剂到达肿瘤。吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamidn)为经批准用于治疗白血病的抗体缀合物实例。结合癌细胞并具有潜在的诊断和治疗用途的单克隆抗体已经在出版物中公开。见例如下列专利申请(其尤其公开了一些靶蛋白的分子量)：美国专利号6,054,561(200 kD的c-erbB-2(Her2)和其它大小为40-200 KD的未知抗原)和美国专利号5,656,444(50 kD和55 kD的胎性癌蛋白质)。临床试验中和/或经批准用于治疗实体瘤的抗体实例包括：司 徒曼布(抗原：180 kD，HER2/neu)、依决洛单抗(Edrecolomab)(抗原：40-50kD，Ep-CAM)、抗人乳脂肪球(HMFGl)抗体(抗原＞200 kD，HMW黏蛋白)、西妥昔单抗(Cetuximab)(抗原：150 kD和170 kD，EGF受体)、阿来组单抗(Alemtuzumab)(抗原：21-28 kD，CD52)和利妥希玛(抗原：35 kD，CD20)。 
用于治疗乳腺癌的司徒曼布的抗原靶标(Her-2受体)和处于治疗多种癌症临床试验中的西妥昔单抗的抗原靶标(EGF受体)以一种可检测的水平存在于大量正常人成体组织上，包括皮肤、结肠、肺、卵巢、肝脏和胰腺。使用这些治疗剂的安全范围可以由这些位置中表达水平的差异或抗体的接近或活性差异来提供。 
抗体除抗癌症靶标以外，还在抗慢性炎症和其它免疫紊乱中有效。经批准用于治疗免疫紊乱的抗体治疗剂实例为英夫单抗(抗原：TNFα)。 
另一类型的免疫疗法为主动免疫疗法，或者为用存在于特定癌症上的抗原或指导抗原表达的DNA构建体免疫接种，之后其在个体中诱发免疫反应，即诱导个体主动产生抗其自身癌症的抗体。主动免疫接种与被动免疫疗法或免疫毒素相比不太常用。 
已经提出了几种疾病(包括癌症)进程模型。理论从单一感染/转化事件延伸至日益“类似疾病”或“类似癌症”的组织类型的进化，所述组织类型最终导致完全致病或恶性能力的组织类型。一些人争辩说，例如对癌症来说，单一突变事件足以造成恶性肿瘤，而其他人认为后续改变也是必需的。其他一些人提出，提高的突变负荷和肿瘤级别是通过细胞水平的连续突变-选择事件瘤形成起始和发展所必需的。一些癌症靶标只在肿瘤组织中发现，而其它靶标存在于正常组织中并在肿瘤组织中上调和/或过量表达。在这样的情况下，一些研究者提出过量表达与恶性的获得有关，而其他研究者提出过量表达仅仅为增加的疾病状态趋势的标志。 
理想的诊断和/或治疗抗体对存在于大量癌症组织上，但在任何正常组织上缺乏或仅以低水平存在的抗原特异。对与癌症特异性结合的新抗原的发现、表征和分离在许多方面是有用的。首先，抗原可用于制备抗该抗原的单克隆抗体。抗体可理想地具有抗癌细胞的生物活性并能募集免疫系统 对外源抗原的反应。抗体可单独作为治疗剂施用或与当前治疗联合施用或者用于制备与毒性剂连接的免疫连接物。单独施用时具有相同特异性但生物活性低或无生物活性的抗体也是有用的，因为抗体可用于制备具有放射性同位素、毒素或者化疗剂或含化疗剂的脂质体的免疫连接物，缀合形式利用指导毒素到达含抗原细胞的抗体而具有生物活性。 
对于理想的诊断和/或治疗抗体而言所需要的一个方面是对多种癌症相关抗原的发现和表征。只有少数抗原在许多类型的癌细胞上表达(例如“泛癌”抗原)并且在非癌细胞上有限的表达。此种抗原的分离和纯化可用于制备靶向该抗原的抗体(例如诊断性的或治疗性的)。与抗只与一种特异类型癌症相关的抗原的抗体相比，结合“泛癌”抗原的抗体能靶向在不同组织中发现的多种癌症。抗原也可用于药物发现(例如小分子)和用于进一步表征细胞调节、生长和分化。 
ADAM(A Disintegrin and Metalloprotease Domain，解联蛋白和金属蛋白酶结构域)为在很多生物过程中(如细胞粘附、细胞融合和蛋白酶解)重要的蛋白质家族。通常，它们是与蛇毒液蛋白质(具有降解基底膜成分并结合整联蛋白的能力，从而破坏细胞-基质相互作用)具有同源性的跨膜蛋白。由于其与蛇毒液蛋白质在功能上的相似性，所以ADAM也称为MDC蛋白质(Metalloprotease-like，Disintegrin，Cysteine-rich；金属蛋白酶样、解联蛋白、富含半胱氨酸)。 
MDC9或ADAM-9(解联蛋白酶γ)是ADAM/MDC蛋白质家族的成员。蛋白质序列在美国专利申请号20040091473和20020042368中描述。已经在大鼠肾中发现ADAM-9的表达，用蛋白质微阵列还表明其在肝细胞癌中上调，然而该发现对癌症进程的意义还不清楚。还表明ADAM-9参与结合肝素的表皮生长因子(HB-EGF)的脱落、淀粉状蛋白前体蛋白的加工并作为多种整联蛋白的配体。虽然其在小鼠、人和爪蟾属(Xenopus)中高度保守并在不同组织中广泛表达，但是缺少ADAM-9的敲除小鼠不表现明显的病理异常。抗ADAM-9的多克隆和单克隆抗体已在蛋白质微阵列中用于鉴定肝细胞癌相关的新蛋白质(Tannapfel等人，J of Pathology 2003；201： 238-49)并且也在使用静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的动脉粥样硬化模型中用于测定ADAM-9表达(Al-Fakhri等人，Cellular Biochem(2003)89：808-823)，然而ADAM-9作为标志物的意义还不清楚。该现有技术没有教导或提出ADAM-9抗体可作为治疗剂，或者ADAM-9的表达在癌症中起诱因作用。 
所需要的是患病细胞和/或癌细胞表面的新靶标，其可用于使用特异识别细胞表面靶标的抗体和其它试剂诊断和治疗此类疾病和/或癌症。基于本文公开的发现，还需要特异识别细胞表面靶标的新抗体或其它试剂，其可调节(降低或提高)ADAM-9的疾病促进活性。本发明的目的是鉴定能抑制疾病相关活性的人ADAM-9拮抗物。另一个目的是提供新的化合物，其用于测定ADAM-9并用作免疫原或用于选择抗人ADAM-9抗体。 
正如在下文中更详细描述的，本发明者创造了涉及已知多肽ADAM-9的发现，ADAM-9在本文称为KID24，其被鉴定为本文所提供的新拮抗物、调节剂和抗体的抗原靶标。 
本文公开的所有参考文献、出版物和专利申请全部引用作为参考。 
发明简述 
本文公开的发明涉及如本文所示存在于多种原发性和转移性人类癌症中的已知多肽ADAM-9(在本文也称为KID24)的发现和抗KID24抗体可用于治疗此类癌症的发现。本发明提供了与多种人癌细胞上表达的结合KID24的KID24拮抗物、调节剂和单克隆抗体。 
在一个方面，本发明为结合KID24的单克隆抗体家族。在另一方面，本发明为由于2003年5月2日保藏于美国典型培养物保藏中心的宿主细胞系KIDNEY.5.3F2.2G8(专利保藏号为PTA#5174)产生的抗KID24单克隆抗体。 
还在另一方面，本发明为产生与患病细胞和/或癌性细胞反应的抗KID24单克隆抗体的方法，其包括下列步骤：(a)用免疫原免疫宿主哺乳动物；(b)从哺乳动物获得淋巴细胞；(c)融合淋巴细胞(b)与骨髓瘤细胞系以产 生杂交瘤；(d)培养(c)的杂交瘤以产生单克隆抗体；和(e)筛选抗体以选择只结合患病细胞和/或癌性细胞或细胞系但不结合非癌性或正常细胞或细胞系，或者以低水平或不同方式结合正常细胞的那些抗体。 
在另一方面，本发明为产生抗KID24抗体的方法，其包括在允许产生抗体的条件下培养编码此种抗体的宿主细胞或其后代并纯化抗KID24抗体。 
在另一方面，本发明提供了产生本文所述的任何一种抗体(或多肽)的方法，其包括在适当的细胞中表达编码抗体的一种或多种多核苷酸(其可单独表达为单个轻链或重链，或者从一个载体表达轻链和重链)，一般在之后回收和/或分离目的抗体或多肽。 
在另一方面，本发明为竞争性抑制抗KID24抗体与KID24优先结合的抗KID24抗体或多肽(其可以是或可以不是抗体)。在一些实施方案中，本发明为优先结合KID24上与其它抗KID24抗体的结合表位相同或不同的表位的抗体或多肽(其可以是或可以不是抗体)。 
在另一方面，本发明为竞争性抑制抗KID24抗体与KID24优先结合的KID24调节剂(可以是或可以不是多肽)。在一些实施方案中，本发明可为优先结合KID24上与其它抗KID24抗体的结合表位相同或不同的表位的小分子或化合物。 
还在另一方面，本发明为包含由KID24表位特异性抗体结合的KID24的组合物。在一个实施方案中，抗体为抗KID24的抗体。在其它实施方案中，施用两种或更多种结合KID24上两个或更多个不同表位的抗KID24抗体。在一些实施方案中，抗KID24抗体与治疗剂或可检测标记连接。 
在另一方面，本发明为包含抗KID24抗体的片段或区域的抗体。在一个实施方案中，片段为抗体的轻链。在另一个实施方案中，片段为抗体的重链。还在另一个实施方案中，片段含有来自抗体轻链和/或重链的一个或更多个可变区。还在另一个实施方案中，片段含有来自抗体轻链和/或重链的一个或更多个互补决定区(CDR)。 
在另一方面，本发明提供了包含任何下列的多肽(可以是或可以不是抗 体)：抗KID24抗体的(a)来自轻链或重链的一个或更多个CDR(或其片段)；(b)来自轻链的三个CDR；(c)来自重链的三个CDR；(d)来自轻链的三个CDR和来自重链的三个CDR；(e)轻链可变区；(f)重链可变区。 
在另一方面，本发明为人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含非人类抗KID24抗体的一个或更多个CDR。在一些实施方案中，人源化抗体结合与其它抗KID24抗体的结合表位相同或不同的表位。通常，本发明的人源化抗体包含一个或更多个(一个、两个、三个、四个、五个、六个)与原始非人类抗KID24抗体的CDR相同和/或衍生自原始非人类抗KID24抗体CDR的CDR(或其片段)。在一些实施方案中，人类抗体结合与其它抗KID24抗体的结合表位相同或不同的表位。在另一方面，本发明为包含衍生自非人类抗KID24抗体重链或轻链可变区的可变区以及衍生自人类抗体重链和轻链恒定区的恒定区的嵌合抗体。 
在另一方面，本发明为编码由保藏号ATCC PTA#5174的宿主细胞或其后代产生的小鼠抗KID24抗体的分离多核苷酸。该发明包括具有任何一种上述抗体的固有结合活性或生物活性的抗体多肽。在另一方面，本发明提供了编码本文所述的任何抗体(包括抗体片段)以及任何其它多肽的多核苷酸。 
在另一方面，本发明为包含本文所述的任何多肽(包括本文所述的任何抗体)或多核苷酸的药物组合物，如包含与化疗剂连接的抗KID24抗体、含抗KID24抗体片段的抗体、非人类KID24抗体的人源化抗体、含衍生自非人类抗KID24抗体可变区的可变区和衍生自人类抗体的恒定区的嵌合抗体、或者具有非人类抗KID24抗体的一种或更多种特性或本文所述与化疗剂(如放射性部分)连接的抗KID24抗体的一种或更多种特性的人类抗体和可药用赋形剂的药物组合物。 
在一个方面，本发明为包含抗KID24抗体的组合物，所述抗体与患病细胞或癌性细胞上存在的KID24结合。在优选的实施方案中，癌细胞选自肾癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞和乳腺癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是分离的。在一些实施方 案中，癌细胞在生物样品中。通常，生物样品来自个体，如人。 
在另一方面，本发明为通过检测个体细胞上的KID24来诊断个体中的疾病，尤其是个体中的炎症反应或自身免疫应答相关的疾病或紊乱的方法。在本发明的其它方面提供了调节个体中炎症反应和自身免疫应答的方法。以举例方式而非限制方式，可用本发明的组合物和方法进行治疗的由炎症和自身免疫紊乱造成的疾病和病症包括：多发性硬化、脑膜炎、脑炎、中风、其它脑创伤、炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆病)、重症肌无力、狼疮、类风湿性关节炎、气喘、急性青少年型糖尿病、AIDS痴呆、动脉粥样硬化、肾炎、视网膜炎、异位皮炎、银屑病、心肌缺血和急性白细胞介导的肺损伤。 
本发明的抗体和其它治疗剂可治疗的其它适应症包括向处于器官排斥或移植排斥风险中的个体施用。经过最近几年，用于移植组织和器官(如皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺和骨髓)的外科技术的效率已经有了长足改进。可能主要的突出问题是缺少令人满意的用于在受体中诱导对移植的同种异体移植物或器官的免疫耐受的试剂。当同种异体的细胞或器官移植到宿主中时(即供体和受体为相同物种的不同个体)，宿主免疫系统可能发动针对移植物中外源抗原的免疫应答(宿主抗移植物疾病)，从而导致移植组织的破坏。 
在另一方面，本发明为诊断个体是否患有癌症的方法，其包括测定所选择的个体细胞上是否有KID24表达，其中KID24在所述细胞上的表达指示着该癌症。在一些实施方案中，用抗KID24抗体测定KID24的表达。在一些实施方案中，此方法涉及检测细胞的KID24表达水平。本文所用的术语“检测”包括参照或不参照对照的定性和/或定量检测(测量水平)。 
还在另一个方面，本发明为通过检测个体细胞上的或从个体细胞上释放的KID24来诊断个体中癌症的方法，其中癌症选自但不限于：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、骨癌(釉质上皮瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、 脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤，尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等等)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)的癌细胞。 
在另一方面，本发明为辅助诊断个体中癌症(例如但不限于肾癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌或乳腺癌)的方法，其包括测定来自个体的生物样品中KID24的表达。在一些实施方案中，用抗KID24抗体测定KID24的表达。在一些实施方案中，方法为检测细胞的KID24表达的水平。从癌释放的KID24促成体液(例如血液、唾液或肠粘蛋白分泌物)中可检测的KID24或其部分的水平的提高。 
还在另一方面，本发明为通过施用足以降低癌性细胞生长的有效量的结合KID24的抗体来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，抗体为抗KID24抗体。在某些实施方案中，癌性细胞选自但不限于：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、骨癌(釉质上皮瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤，尤因瘤、骨外粘 液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等等)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)的癌细胞。在某些优选的实施方案中，癌性细胞选自实体瘤，其包括但不限于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肉瘤、肾转移癌、甲状腺转移癌和透明细胞癌。 
还在另一方面，本发明为预防或延迟患有或已患有原发性肿瘤的个体中转移癌发展的方法，其包括施用有效量的KID24调节剂。这种调节剂可单独施用或与其它疗法(如放疗、化疗或外科手术)联合施用。在某些优选的实施方案中，原发性肿瘤在施用KID24调节剂前已经进行至少一轮的外科手术、放疗和/或化疗。在其它实施方案中，KID24调节剂在用外科手术、放疗和/或化疗治疗个体前施用或与之同时施用。在某些特别优选的实施方案中，该KID24调节剂至少为一种抗KID24抗体。 
在另一方面，本发明为在体外或在个体中抑制癌细胞生长和/或增殖的方法，其包括向细胞培养物或样品或者个体施用有效量的包含与化疗剂结合(包括连接)的抗KID24抗体的组合物。 
还在另一方面，本发明为通过向个体施用有效量的至少一种特异性结合KID24的抗体家族成员将治疗剂递送到癌性细胞的方法。在其它实施方案中，抗KID24抗体与另一种治疗剂联合(包括连接)递送到个体中。 
在一些实施方案中，抗KID24抗体为衍生自本文指定抗体的人源化抗 体(通常，但不必需包含抗体的一个或更多个部分或完整的CDR)。在一些实施方案中，抗KID24抗体为具有所指定抗体的一种或更多种特性的人类抗体。在一些实施方案中，将化疗剂(如毒素或放射性分子)递送(内化)到癌细胞中。在一些实施方案中，试剂为肥皂草毒蛋白。 
在另一方面，本发明为治疗个体中癌症的方法，其包括向个体施用有效量的包含与化疗剂结合(包括连接)的抗KID24抗体的组合物。 
本发明还提供了调节(增强或降低)KID24与胞质信号配偶体结合的方法。细胞表面上存在的KID24分子与调节信号配偶体与KID24结合的试剂的接触可影响KID24与胞质信号配偶体的结合。阻断或降低KID24与其结合配偶体和/或信号配偶体结合的试剂可用于调节参与KID24介导的炎症反应或免疫应答的生物学过程或病理过程。参与这种活动的病理过程包括肿瘤相关的细胞生长。 
可检测试剂阻断、降低、增强或调节KID24与结合配偶体(如抗KID24抗体)结合的能力。具体而言，可通过将包含KID24相互作用位点(一般处于其在完整活细胞上存在的天然构象中)的肽与结合配偶体和测试试剂一起孵育并测定测试试剂是否降低或增强了结合配偶体与KID24肽的结合，来检测试剂调节此种相互作用的能力。 
KID24功能的激动剂、拮抗物和其它调节剂明显地包括在本发明的范围之内。这些激动剂、拮抗物和调节剂为包含KID24中一种或更多种抗原决定位点的多肽，或者包含一种或更多种此类位点片段、此类位点变体或此类位点肽模拟物的多肽。这些激动剂、拮抗物和KID24调节剂化合物以线性或环形形式提供并任选地包含至少一种一般天然不存在的氨基酸残基或者至少一种酰胺等构物。这些化合物可被糖基化。本发明的KID24功能的激动剂、拮抗物和其它调节剂可良好地用于上述的有关抗体的所有实施方案和方法中。 
本发明的其它方面涉及所鉴定的抗原ADAM-9，在本文称为KID24。这个抗原适于用作免疫原和用于多种研究、诊断和治疗目的。 
在某些方面，本发明为辅助诊断个体中疾病的方法，其包括下列步骤： (i)测定从个体获得的血液或组织样品中KID24的存在；(ii)检测与正常(未患病的)血液或组织样品相比该样品中KID24标志物的数量是否增加；和(iii)将增加的所述标志物数量与疾病阳性诊断关联起来或者将不存在所述标志物的数量增加与疾病阴性诊断关联起来。在某些实施方案中，用抗KID24抗体检测标志物。在某些实施方案中，此方法通过选自放射性核素显像、流式细胞术和免疫组织化学技术实现。 
附图简述 
图1显示了用小鼠抗KID24抗体的对肾瘤细胞系A498细胞裂解物免疫沉淀(ippt)，随后用小鼠抗KID24抗体进行蛋白质印迹的结果。箭头指示小鼠抗KID24抗体ippt样品中～75kDa的特异性条带。图1也显示了用商业化ADAM9抗体对A498细胞裂解物免疫沉淀(ippt)，随后用小鼠抗KID24抗体进行蛋白质印迹的结果。标为“PG”的泳道代表G蛋白预清除对照条件下的样品。标为“IgG”的泳道代表用对照IgG抗体免疫沉淀的样品。标为“KID24”的泳道代表用小鼠抗KID24抗体免疫沉淀的样品。 
图2显示了小鼠抗KID24抗体和Mab-ZAP(与肥皂草毒蛋白缀合的抗IgG抗体)对人卵巢癌细胞系ES-2和人胰腺癌细胞系HPAF-II生长的影响的图示结果。图2A显示了小鼠抗KID24抗体和Mab-ZAP对ES-2细胞生长的影响的图示结果，图2B显示了小鼠抗KID24抗体和Mab-ZAP对HPAF-II细胞生长的影响的图示结果。 
图3显示了来源于植入裸鼠肾包膜下的梅克尔细胞的典型肿瘤。从肿瘤移植后的21天开始每周两次用PBS对照或者50毫克/千克的小鼠抗KID24抗体处理小鼠3周。 
图4显示了解剖自肾包膜下中植入梅克尔细胞肿瘤的裸鼠的典型网膜。从肿瘤移植后的21天开始每周两次用PBS对照或者50毫克/千克的小鼠抗KID24抗体处理小鼠3周。图4A显示了PBS对照处理小鼠的解剖网膜。箭头指向网膜中存在的转移瘤。图4B显示了小鼠抗KID24抗体处理小鼠的网膜。未观察到可见的转移瘤。 
发明详述 
本发明提供了在各种组织类型的癌性细胞上表达的抗原ADAM-9(KID24)，包括但不限于胰腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。此外，本发明提供了结合KID24的单克隆抗体和多肽，并且提供了制备和使用这些抗体和多肽诊断和治疗各种疾病的方法，所述的疾病包括但不限于KID24表达和/或过量表达相关的人类癌症。 
I.常规技术 
除非另外提到，本发明的实践利用本领域技术范围之内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中完整地说明，如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：LaboratoryProcedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wileyand Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；GeneTransfer Vectors for mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑，1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(CA.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：apractical approach(D.C atty.编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonalantibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)和Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑，J.B.Lippincott Company，1993)。 
II.定义 
“KID24”指本发明的抗体所靶向的(在还原条件下)分子量大约为75kDa的新多肽抗原。KID24抗原为抗KID24抗体结合的细胞表面蛋白质并存在于胰腺癌和多种类型的癌上。这种抗原可具有一个以上的不同表位，并且本发明的一些实施方案包含针对KID24抗原的两个或更多个特异性表位之一的KID24调节剂。目前认为与其正常组织对应物相比KID24可能在某些癌细胞中过量表达。 
KID24功能的激动剂、拮抗物和其它调节剂明显地包括在本发明的范围之内。这些激动剂、拮抗物和调节剂为包含KID24中一个或更多个抗原决定位点的多肽，或者为包含一个或更多个此类位点的片段、此类位点的变体或此类位点的肽模拟物的多肽。这些激动剂、拮抗物和KID24调节化合物以线性或环形形式提供，并任选地包含至少一个一般天然不存在的氨基酸残基或者至少一个酰胺等构物。这些化合物可被糖基化。 
更具体而言，本文所用的术语“KID24调节剂”定义为这样的化合物：(1)能破坏或阻断人KID24与其天然配体或抗KID24抗体的相互作用；(2)能结合人KID24和其天然配体或抗KID24抗体；(3)含有可用于产生能结合人KID24及其天然配体或抗KID24抗体的抗体的抗原位点；(4)含有可用于筛选能结合人KID24及其天然配体或抗KID24抗体的抗体的抗原位点；(5)含有可用于产生能破坏或阻断人KID24与其天然配体或抗KID24抗体相互作用的抗体的抗原位点；(6)含有可用于筛选能破坏或阻断人KID24与其天然配体或抗KID24抗体相互作用的抗体的抗原位点。分别取决于其活性是否增强或抑制正常KID24生物活性，KID24调节剂可为 “KID24激动剂”或“KID24拮抗物”。 
KID24激动剂、拮抗物和调节剂包括KID24变体、KID24肽拮抗物、肽模拟物和小分子、抗KID24抗体和免疫球蛋白变体、人KID24的氨基酸变体(包括氨基酸取代、缺失和添加变体或其任意组合)以及嵌合免疫球蛋白。本发明的KID24激动剂、拮抗物和调节剂基于发明者对参与人KID24与其天然配体或抗KID24抗体结合的KID24结构域的鉴定。因此，本发明提供了具有复制或模拟人KID24的一个或更多个抗KID24抗体结合结构域的分子结构的KID24激动剂、拮抗物和调节剂。 
如本文所用，术语“KID24变体”指人KID24的任何氨基酸变体，包括氨基酸取代、缺失和添加变体或其任意组合。此定义包括嵌合分子，如人KID24/非人类嵌合体和其它杂合分子。同样包括在定义中的是包含分子的变体或杂合区域的KID24变体分子的任何片段。 
“抗体”为通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，此术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、天然存在的变体、含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体和含所需特异性的抗原识别位点的任何其它免疫球蛋白分子的修饰构型。 
“单克隆抗体”指均相的抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原选择性结合的(天然存在的或非天然存在的)氨基酸组成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和含具有所需特异性和结合抗原的能力的抗原识别位点的任何其它免疫球蛋白分子的修饰构型。并不意在限制抗体的来源或者其制备方式(例如通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等等)。术语包括“抗体”定义下的上述全部免疫球蛋白和片段等等。 
“人源化”抗体指嵌合分子，其通常用重组技术制备，具有衍生自非人类物种免疫球蛋白的抗原结合位点并且分子的其余免疫球蛋白结构基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含与恒定结构域融合的完整可变结构域或者只包含移植到可变结构域中适当构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可为野生型的或由一个或更多个氨基酸取代修饰。这去掉了在人类个体中作为免疫原的恒定区，但是保留了对外源可变区发生免疫应答的可能性(LoBuglio，A.F.等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：4220-4224)。另一种方法不仅集中在提供人类来源的恒定区，还集中在也修饰可变区以尽可能接近人类形式地重构它们。已知重链和轻链的可变区含有侧翼为四个构架区(FR)(在给定的物种中相对保守并推测为CDR提供支架)的三个互补决定区(CDR)(对目的抗原反应而变化并决定结合能力)。当对特定抗原制备非人类抗体时，可通过将衍生自非人类抗体的CDR移植到待修饰人类抗体中存在的FR上而“重构”或者“人源化”可变区。将这种方法应用于各种抗体已在下列文献中报道：Sato，K.等人，(1993)Cancer Res 53：851-856；Riechmann，L.等人，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen，M.等人，(1988)Science 239：1534-1536；Kettleborough，C.A.等人，(1991)Protein Engineering 4：773-3783；Maeda，H.等人，(1991)Human Antibodies Hybridoma 2：124-134；Gorman，S.D.等人，(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88：4181-4185；Tempest，P.R.等人，(1991)Bio/Technology 9：266-271；Co，M.S.等人，(1991)Proc Natl Acad Sci USA88：2869-2873；Carter，P.等人，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：4285-4289和Co，M.S.等人，(1992)J Immunol 148：1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有小鼠抗体全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施方案中，人源化抗体具有一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)(这依据原始抗体而变化)，也称为“衍生自”原始抗体一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。 
与抗体或多肽“特异性结合”或“优先结合”(在本文可互换地使用)的表位是本领域明确理解的术语，并且测定此种特异性或优先结合的方法也 是本领域所熟知的。如果与分子与备选细胞或物质反应或结合相比，分子更频繁、更迅速、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力与特定细胞或物质反应或结合，那么称它为表现“特异性结合”或“优先结合”。如果与其结合其它物质相比，抗体以更高的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长的持续时间结合，那么抗体“特异性结合”或“优先结合”靶标。例如，特异性或优先结合KID24表位的抗体为与其结合其它KID24表位或非KID24表位相比以更高的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长持续时间结合此KID24表位的抗体。通过阅读此定义也应理解到，例如特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。像这样，“特异性结合”或“优先结合”不必需需要(虽然其可以包括)专一结合。通常提到结合意思是指优先结合，但不必需指优先结合。 
关于具有免疫活性的或“保持免疫活性的”表位的术语“免疫活性”指抗体(例如抗KID24抗体)在不同条件下(例如将表位置于还原或变性条件下之后)结合表位的能力。 
不同的生物学功能与抗KID24抗体相关，包括但不限于与KID24(包括癌细胞上的KID24，所述的癌细胞包括但不限于胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞或前列腺癌细胞)结合的能力、在体内或体外与暴露于活细胞表面(尤其是癌细胞表面)的KID24的部分结合的能力、将化疗剂递送到表达KID24的癌性细胞(如胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞或前列腺癌细胞)的能力、将治疗剂或可检测标志物递送进入表达KID24的癌细胞中的能力。如本文所讨论的，本发明的多肽(包括抗体)可具有这些特征的任何一个或更多个。 
“抗KID24的等效抗体”或“抗KID24的等效多肽”指具有抗KID24抗体相关的一个或更多个生物学功能(如结合特异性)的抗体或多肽。 
如本文所用，“试剂”指生物学、药学或化学化合物。非限制的实例包括简单的或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化疗化合物。 可合成各种化合物，例如小分子和寡聚体(例如寡肽和寡核苷酸)、基于各种核心结构的合成有机化合物。此外，各种天然来源可提供用于筛选的化合物，如植物或动物提取物等等。技术人员可容易地认识到，对本发明试剂的结构特性没有限制。 
本发明的方法中使用的试剂可随机选择或者合理选择或设计。如本文所用，当不考虑参与KID24与其天然结合配偶体或已知抗体结合的特异序列而随机选择试剂时，称试剂为随机选择的。随机选择试剂的实例为使用化学文库或肽组合文库。 
如本文所用，当在考虑靶点序列和/或试剂作用相关的构象的非随机基础上而选择试剂时，称试剂为合理选择或设计的。对抗KID24试剂来说，目前认为KID24上至少有三个可产生抗体的表位并且因此至少有三个阻断KID24/抗KID24抗体相互作用的试剂的作用位点。本发明也包括在KID24和其天然结合配偶体的相互作用位点发挥作用的试剂，但是目前已知或将来鉴定的其它配体和其活性KID24相互作用位点也包括在本发明的范围之内。可通过利用组成受体/配体和/或KID24/抗KID24抗体复合物的完整位点的肽序列合理选择或合理设计试剂。例如合理选择的肽试剂可为氨基酸序列与KID24在其天然环境中暴露于活细胞表面出现的表位相同的肽。此种试剂会如所需要通过结合抗KID24抗体或天然配体降低或阻断抗KID24抗体与KID24的结合或者KID24与其天然配体的结合。 
如本文所用，关于抗体的术语“标记的”意在包括通过偶联(即物理连接)可检测物质(如放射性试剂或荧光团，例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE))与抗体的抗体直接标记以及通过与可检测物质反应的探针或抗体的间接标记。 
如本文所用，关于抗体的术语“结合”包括共价或非共价地与试剂(例如化疗剂)连接或结合。抗体可通过直接结合或由与共同平台连接的间接结合与试剂(例如化疗剂)结合，以使抗体指导试剂到达抗体结合的癌性细胞，其中抗体和试剂在生理条件下基本不解离致使试剂不到达抗体结合的同一癌性细胞或者试剂的效能不降低。 
“生物样品”包括从个体获得的多种样品类型并可用于诊断和监测测定法。此定义包括唾液、血液和生物来源的其它液体样品；固体组织样品，如活检样品或组织培养物或从其来源的细胞及其后代，例如从怀疑患有癌症的个体收集的组织样品中获得的细胞(在优选的实施方案中从卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳腺组织获得)。定义也包括在获得之后以任何方式处理的样品，如用试剂处理、增溶或富集某些成分(如蛋白质或多核苷酸)或者为切片目的包埋在半固体或固体基质中。术语“生物样品”包括临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。 
“宿主细胞”包括可以是或者已经是载体(整合有多核苷酸插入物)的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代或者由于天然的、偶然的或有意的突变而与原始亲代细胞(在形态学上或在基因组DNA组上)不完全相同的后代。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。 
如本文所用，“预防或延迟转移瘤发展”是指终止、延迟、干扰、放慢、延缓、稳定和/或推迟转移的发展。取决于癌症的历史和/或待治疗个体，这种延迟可以为多种时间长度。如本领域技术人员所了解的，充分的或显著的延迟在实际上可包括预防，因为个体不会发生转移。 
在一个实施方案中，药物组合物的“有效量”为足以实现有益的或所需的结果的数量，其中所述的结果不限制地包括临床结果，如缩小肿瘤大小(在癌症的情况下，例如乳腺癌或前列腺癌)；推迟癌性细胞生长；延迟转移的发展；减少疾病造成的症状；提高患病个体的生活质量；降低治疗疾病所需的其它药物的剂量；如通过靶向和/或内化提高另一种药物的效果；延缓疾病的进程和/或延长个体的生命。可在一次或更多次给药中施用有效量。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量为足以直接或间接地降低(或破坏)癌性细胞增殖的数量和降低和/或延迟癌性细胞转移瘤发展或生长的数量。在一些实施方案中，药物、化合物或药物组合物的有效量可与或可不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因 此，在施用一种或更多种化疗剂的情况中要考虑“有效量”，并且如果单个试剂与另一种或更多种试剂联合时，为得到所需要的结果要考虑以有效量给药。随着个体的变化而确定每一种成分的有效量的最佳范围在本领域的技术范围之内。典型的剂量包括0.1-100毫克/千克体重。优选的剂量包括1-100毫克/千克体重。优选的剂量包括10-20毫克/千克体重和10-100毫克/千克体重，最优选的剂量包括大约1-10毫克/千克体重。 
如本文所用，当该核酸分子、试剂、抗体、组合物或细胞等等基本与其来源的污染核酸分子、抗体、试剂、组合物或细胞等等分离时称核酸分子或试剂、抗体、组合物或细胞等等为“分离的”。 
“个体”为脊椎动物，优选地为哺乳动物，更优选地为人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。 
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用以指任何长度的氨基酸多聚体。多聚体可为线性的或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，并且可由非氨基酸中断。此术语也包括经天然或插入修饰的氨基酸多聚体，例如形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记成分缀合。定义中也包括，例如含有一个或更多个氨基酸类似物(包括，例如非天然的氨基酸等等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解，因为本发明的多肽是基于抗体的，所以多肽可以作为单链或结合的多条链出现。 
抗体的“可变区”指单独的或联合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。 
抗体的“恒定区”指单独的或联合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。 
同样包括在本发明范围之内的是本文所述的KID24肽激动剂、拮抗物和调节剂(包括抗KID24抗体)的肽模拟物。此类肽模拟物包括至少一个氨基酸残基由一般天然不存在的氨基酸残基(如氨基酸的D异构体或氨基酸的N烷基化种类)取代的肽。在其它实施方案中，肽模拟物通过用酰胺等构物替换KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂中至少一个酰胺键(-C(＝O)-NH-) 而构建。适当的酰胺等构物包括--CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S(O)n-(其中n为1或2)、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(E或Z)、-C(＝O)-CH2-、-CH(CN)-NH-、-C(OH)-CH2-和-O-C(＝O)-NH-。KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂中适于作为酰胺等构物替换的候选的酰胺键包括可由KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂治疗的预期对象的内源酯酶或蛋白酶水解的键。 
如本文所用，“基本上纯的”指至少50％的纯度(即没有污染物)，更优选地至少90％的纯度，更优选地至少95％的纯度，更优选地至少98％的纯度，更优选地至少99％的纯度或更高纯度的物质。 
“毒素”指在细胞中引起不利反应的任何物质。例如，指向癌性细胞的毒素会对癌性细胞有不利的，有时是有害的影响。毒素的实例包括但不限于放射性同位素、加利车霉素和美登木素生物碱。 
如本文所用，“治疗”为用于获得有益的或所需的结果，包括且优选地包括临床结果的方法。为了本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于下列结果中的一个或更多个：减少(或破坏)癌性细胞或其它患病细胞的增殖、减少癌症中发现的癌性细胞的转移、缩小肿瘤大小、减少疾病造成的症状、提高患病个体的生活质量、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、延缓疾病的进程和/或延长个体的生命。 
如本文所用，“治疗剂”是指用于治疗(在此通常为癌症的情况)的任何试剂，其包括抗肿瘤药物、毒素或细胞毒素、细胞毒素试剂和放射性试剂。 
“主动免疫应答”指对通过静脉内、肌内、皮下或其它任何施用方式给宿主哺乳动物施用含或不含佐剂的抗原或编码该抗原的DNA载体发生应答在体内产生或持续产生抗抗原的抗体。主动免疫应答也可包括免疫应答的其它方面，如细胞免疫应答。 
III.制备抗体和多肽的方法 
制备单克隆抗体的方法为本领域已知。一种可使用的方法为Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)的方法或其修改的方法。一般地， 单克隆抗体在非人类物种中产生，如在小鼠中产生。通常用小鼠或大鼠免疫，但是也可使用其它动物。通过用免疫原性数量的含人KID24的细胞、细胞提取物或蛋白质制品免疫小鼠产生抗体。免疫原可以是但不限于原代细胞、培养细胞系、癌性细胞、核酸或组织。在一个实施方案中使用人胎儿肾上皮细胞。在另一个实施方案中使用人膀胱或胰腺祖细胞。分离和培养人胎儿肾细胞的方法在实施例1中详述。用于免疫的细胞(例如人胎儿肾细胞)可在用作免疫原前培养一段时间(至少24小时)。细胞(例如人胎儿肾细胞)可自己用作免疫原或与非变性佐剂(如Ribi)联合用作免疫原。当用作免疫原时通常应保持细胞完整并优选地保持细胞有活力。与破裂细胞相比完整的细胞可允许免疫的动物更好地检测抗原。使用变性或粗制(harsh)佐剂(如弗氏佐剂)可能使人胎儿肾细胞或其它细胞破裂，因此不鼓励使用。可以以定期的间隔(如两周一次或一周一次)多次施用免疫原，或者可以以在动物中(例如组织重组体)保持活力的方式施用。实施例2描述了用于产生抗KID24抗体并可用于产生其它结合KID24的单克隆抗体的方法。 
在一个实施方案中，用过量表达作为免疫原的KID24的宿主细胞获得结合KID24的单克隆抗体。此类细胞以举例方式而非限制方式包括人胎儿肾细胞和人胰腺癌细胞。 
为监测抗体反应，可从动物获得小量的生物样品(例如血液)并针对免疫原检测抗体滴度。可取出脾脏和/或数个大淋巴结并离解成单个细胞。如果需要，可通过将细胞悬液放于抗原包被的平板中或孔中(在去除非特异粘连细胞之后)筛选脾细胞。表达对抗原特异的膜结合免疫球蛋白的B细胞会结合平板并且不与其它悬液一起被漂洗掉。然后可将得到的B细胞或所有离解的脾细胞与骨髓瘤细胞(例如X63-Ag8.653和从Salk Institute，CellDistribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚州获得的骨髓瘤细胞)融合。可用聚乙二醇(PEG)融合脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞以形成杂交瘤。然后在选择培养基中(例如次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶培养基，另外称为“HAT培养基”)培养杂交瘤。然后通过有限稀释将得到的杂交瘤铺于平板上并用FACS或免疫组织化学(IHC筛选)测定特异结合免疫原(例如人 胎儿肾细胞的表面、癌细胞系的表面、Ag-KID24等等)的抗体的产生。然后在体外(例如在组织培养瓶中或中空纤维反应器)或体内(例如小鼠腹水)培养所选的分泌单克隆抗体的杂交瘤。实施例3提供了用来获得和筛选抗KID24抗体的方法的其它细节。 
作为细胞融合技术的另一种备选方案，可用EBV永生化B细胞产生本发明的单克隆抗体。如果需要将杂交瘤扩大并亚克隆，并通过常规测定流程(例如FACS、IHC、放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法等等)测定上清液的抗免疫原活性。 
在另一种备选方案中，抗KID24的单克隆抗体和任何其它等效抗体可进行测序并通过本领域已知的方法(例如人源化，用转基因小鼠产生完全人类抗体，噬菌体展示技术等等)重组产生。在一个实施方案中，对抗KID24的单克隆抗体进行测序然后将多核苷酸序列克隆到用于表达和增殖的载体中。编码目的抗体的序列可保存于宿主细胞中的载体中然后可将宿主细胞扩大并冷冻以便将来使用。 
抗KID24的单克隆抗体和任何其它等效抗体的多核苷酸序列可用于遗传操作以产生“人源化”抗体，以提高抗体的亲和力或其它特性。人源化抗体的通用原理包括保留抗体的抗原结合部分的基本序列，同时用人抗体序列对换抗体的其余非人类部分。人源化单克隆抗体有四个通用步骤。它们是(1)确定起始抗体轻链可变结构域和重链可变结构域的核苷酸序列和预测的氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪一个抗体构架区；(3)真正的人源化方法/技术和(4)转染和人源化抗体的表达。见例如美国专利号4,816,567；5,807,715；5,866,692和6,331,415。 
已经描述了含来源于非人类免疫球蛋白的抗原结合位点的大量“人源化”抗体分子，包括具有与人恒定结构域融合的啮齿类动物V区或修饰的啮齿类动物V区和其相关的互补决定区(CDR)的嵌合抗体。见例如Winter等人，Nature 349：293-299(1991)；Lobuglio等人，Proc.Nat.Acad.Sd.USA86：4220-4224(1989)；Shaw等人，J Immunol 138：4534-4538(1987)和Brown等人，Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其它参考文献描述了与 适当人类抗体恒定结构域融合前移植到人支撑构架区(FR)中的啮齿类动物CDR。见例如Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)和Jones等人，Nature 321：522-525(1986)。另一个参考文献描述了重组veneered啮齿类动物构架区支撑的啮齿类动物CDR。见例如欧洲专利公开号519,596。设计这些“人源化”分子以最小化不需要的针对啮齿类动物抗人类抗体分子的免疫应答，其限制了那些部分在人类受体中治疗应用的持续时间和效果。也可使用的其它人源化抗体的方法在Daugherty等人，Nucl.Acids Res.，19：2471-2476(1991)和美国专利号6,180,377；6,054,297；5,997,867和5,866,692中公开。 
本发明也包括本发明抗体(如小鼠抗KID24抗体)的单链可变区片段(“scFv”)。通过用短连接肽连接轻链和/或重链可变区制备单链可变区片段。Bird等人，(1988)Science 242：423-426中描述了桥连一个可变区羧基端和另一个可变区氨基端间大约3.5nm的连接肽的实例。已经设计和使用了其它序列的接头(Bird等人，1988)。可反过来修饰接头以获得其它功能，如附着药物或附着固体支持物。单链变体可重组生产或合成生产。可使用自动合成仪合成生产scFv。为重组生产scFv，可将含编码scFV的多核苷酸的适当质粒引入适当宿主细胞中(真核细胞，如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者原核细胞，如大肠杆菌)。编码目的scFV的多核苷酸可通过常规操作(如连接多核苷酸)制备。得到的scFv可用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。 
本发明包括KID24激动剂、拮抗物、调节剂和抗体(包括功能等效抗体和不显著影响其特性的多肽以及活性增强或降低的变体)的修饰。修饰多肽是本领域的常规实践并且不需要在本文详述。修饰的多肽的实例包括带有氨基酸残基保守取代、一个或更多个不显著有害地改变功能活性的氨基酸缺失或添加或使用化学类似物的多肽。可由另一个氨基酸残基保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸、缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸、天冬酰胺/谷胺酰胺、天冬氨酸/谷氨酸、丝氨酸/苏氨酸、赖氨酸/精氨酸以及苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽也包括糖基化的和非糖基化的多肽，以及带 有其它翻译后修饰的多肽，如用不同的糖糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代为保守的，即取代的氨基酸具有与来源氨基酸相似的化学特性。此类保守取代为本领域已知并在上文提供了实例。氨基酸修饰可以从改变或修饰一个或更多个氨基酸到完全重新设计一个区域，如可变区。可变区的变化可改变亲合力和/或特异性。其它修饰方法包括用本领域已知的偶联技术，这包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。例如修饰可用于附着用于免疫测定法的标签，如附着用于放射免疫测定法的放射性部分。修饰的多肽用本领域的确定方法制备并可用本领域已知的标准测定法筛选。 
本发明也包括含有本发明多肽或抗体的一个或更多个片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供了包含可变轻链区域的至少10个连续氨基酸和可变重链区域的至少10个氨基酸的融合多肽。在另一个实施方案中，融合多肽含有异源免疫球蛋白恒定区。在另一个实施方案中，融合多肽含有由本文所述保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体的轻链可变区和重链可变区。为了本发明的目的，抗体融合蛋白含有一个或更多个抗KID24多肽和在天然分子中其不附着的另一氨基酸序列，例如异源序列或另一区域的同源序列。 
抗KID24多肽和其它KID24激动剂、拮抗物和调节剂可通过本领域已知的方法产生，例如合成性或重组性产生。一种产生KID24肽激动剂、拮抗物和调节剂的方法包括化学合成多肽，然后在适于获得天然构象(也就是正确的二硫键连接)的氧化条件下处理。这可用本领域技术人员熟知的方法完成(见Kelley，R.F.和Winkler，M.E.Genetic Engineering Principlesand Methods，Setlow，J.K.编辑，Plenum Press，N.Y.，第12卷，1-19页(1990)；Stewart，J.M.和Young，J.D.Solid Phase Peptide Synthesis PierceChemical Co.Rockford，Ill.(1984)；也见于美国专利号4,105,603；3,972,859；3,842,067和3,862,925)。 
本发明的多肽可方便地用固相肽合成法制备(Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85：2149(1964)；Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5132 (1985))。 
还在另一个备选实施方案中，可用经工程化表达特异的人类免疫球蛋白蛋白质的商业化小鼠获得完全的人类抗体。经设计产生更适合需要(例如完全的人类抗体)或更强烈的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化的或人的抗体。此种技术的实例为Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse
Figure 2006800087418_0
和TCMouseTM。 
在备选的实施方案中，抗体可重组地制备并用任何本领域已知的方法表达。可通过首先分离从宿主动物制备的抗体，获得基因序列并用基因序列在宿主细胞中(例如CHO细胞)重组地表达抗体来重组地制备抗体。另一种可使用的方法为在植物中(例如烟草)或转基因奶牛中表达抗体序列。已经公开了在植物或奶牛中重组表达抗体的方法。见例如Peeters等人，(2001)Vaccine 19：2756；Lonberg，N.和D.Huszar(1995)Int.Rev.Immunol 13：65和Pollock等人，(1999)J Immunol Methods 231：147。本领域已知制备抗体衍生物(例如人源化抗体、单链抗体等等)的方法。在另一个备选的实施方案中，可通过噬菌体展示技术重组地制备抗体。见例如美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；6,265,150和Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。 
抗体或目的蛋白质可通过本领域技术人员所熟知的Edman降解法进行测序。来源于质谱或Edman降解法的肽信息可用于设计克隆目的蛋白质的探针或引物。 
克隆目的蛋白质的备选方法为用纯化的KID24或其部分“淘选”表达抗体或目的蛋白质的细胞。“淘选”方法可如下进行：从表达抗体或目的蛋白质的组织或细胞获得cDNA文库，在第二细胞类型中过量表达cDNA并筛选第二细胞类型的转染细胞中特异结合KID24的细胞类型。本领域可找到用于通过“淘选”克隆编码细胞表面蛋白质的哺乳动物基因的方法的详述。见例如Aruffo，A.和Seed，B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，8573-8577(1987)和Stephan，J.等人，Endocrinology 140：5841-5854(1999)。 
可通过根据本领域的标准方法反转录特定细胞类型的mRNA获得编码抗KID24抗体和其它KID24肽激动剂、拮抗物和调节剂的cDNA。具体而言，可根据上文Sambrook等人建立的方法用各种裂解酶或化学溶液分离mRNA或根据生产商提供的附带说明书通过商业购买的结合核酸的树脂(例如Qiagen、Invitrogen、Promega)提取mRNA。然后将合成的cDNA引入适当的表达载体以在第二类型细胞中产生抗体或目的蛋白质。不言而喻，表达载体作为附加体或染色体DNA的整合部分在宿主细胞中是可复制的。适当的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒)和粘粒。 
可通过大量适当方法中的任何一种将含目的多核苷酸的载体引入宿主细胞，其中所述的适当方法包括电穿孔；利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE葡萄糖或其它物质的转染；微粒轰击、脂质转染法和感染(例如载体为感染性试剂，如牛痘病毒)。经常取决于宿主细胞的性质选择引入的载体或多核苷酸。 
能过量表达异源DNA的任何宿主细胞可用于分离编码抗体、多肽或目的蛋白质的基因。非限制性的哺乳动物宿主细胞的实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选地，宿主细胞以比宿主细胞中相应内源抗体或目的蛋白质(如果存在的话)的表达水平高大约5倍，更优选地高10倍，甚至更优选地高20倍的水平表达cDNA。通过免疫测定法或FACS完成特异性结合KID24的宿主细胞的筛选。可鉴定过量表达抗体或目的蛋白质的细胞。 
现在可用于产生突变体KID24肽激动剂、拮抗物和调节剂(与亲代KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂分子相比，所得蛋白质中氨基酸序列带有添加、缺失或改变)的各种技术也是可以获得的。 
本发明包括含有本发明的抗体的氨基酸序列的多肽。可通过本领域已知的方法制备本发明的多肽。可通过抗体的蛋白水解或其它降解方法，通过上述重组方法(即单个或融合多肽)或通过化学合成产生多肽。抗体的多肽，尤其是至多约50个氨基酸的较短多肽通过化学合成常规制备。化学合 成的方法为本领域已知并可商业购买。例如可通过使用固相方法的自动肽合成仪产生抗KID24的多肽。 
IV.筛选多肽和单克隆抗体的方法 
可用多种方法筛选结合KID24的多肽和单克隆抗体。应当理解，“结合”指生物学或免疫学相关的结合，即对(免疫球蛋白分子对其编码的或多肽所针对的)唯一抗原特异的结合。不是指当以非常高的浓度针对非特异靶标使用免疫球蛋白时可能出现的非特异性结合。在一个实施方案中，用标准的筛选技术筛选结合KID24的单克隆抗体。以这种方式获得抗KID24的单克隆抗体。根据布达佩斯条约，产生抗KID24的单克隆抗体的杂交瘤已在2003年5月2日以专利保藏号PTA#5174保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Blvd.，Manassas VA 20110-2209。 
针对结合癌组织和非癌组织筛选了结合KID24的单克隆抗体。在一个实施方案中，选择结合KID24并且也与人癌性细胞或组织交叉反应但不与正常细胞或组织以相同程度交叉反应的单克隆抗体。一种可用于筛选的方法为免疫组织化学(IHC)。本领域技术人员已知标准的免疫组织化学技术。见例如Animal Cell Culture Methods(J.P.Mather和D.Barnes编辑，Academic Press，第57卷，18和19章，314-350页，1998)。可从活体解剖、尸体解剖或尸体剖检获得生物样品(例如组织)。为确定KID24是否只存在于癌性细胞上，可用抗KID24抗体检测患有癌症的个体的组织上KID24的存在，而患有癌症的个体的其它非癌性组织或未患癌症的个体的组织用作对照。可将组织包埋于防止冷冻过程中破坏的固体或半固体物质中(例如琼脂糖凝胶或OCT)然后切片以进行染色。可用不同器官和不同阶段的癌症筛选单克隆抗体。可用于筛选目的的组织实例包括但不限于卵巢、乳腺、肺、前列腺、结肠、肾脏、皮肤、甲状腺、脑、心脏、肝脏、胃、神经、血管、骨、上消化道和胰腺。可用于筛选目的的不同癌症类型的实例包括但不限于癌、腺癌、肉瘤、腺肉瘤、淋巴瘤和白血病。 
还在另一个备选的实施方案中，癌性细胞系如BT474(ATCC# HTB-20)、MCF7(ATCC#HTB-22)、ES-2(ATCC#CRL-1978)、SKOV3(ATCC#HTB-77)、SKMES-1(ATCC#HTB-58)、CA130(Raven拥有的肺腺癌细胞系)、CaLu3(ATCC#HTB-55)、9926(Raven拥有的胰腺癌细胞系，AsPC-1(ATCC#CRL-1682)、Hs700T(ATCC#HTB-147)、Colo205(ATCC#CCL-222)、HT-29(HTB-38)、Cos7(ATCC#CRL-1651)、RL-65(ATCC#CRL-10345)、A204(ATCC#HTB-82)、G292(ATCC#CRL-1423)、HT1080(ATCC#CCL-121)、MG63(ATCC#CRL-1427)、RD(ATCC#CCL-136)、RD-ES(ATCC#HTB-166)、SKES-1(ATCC#HTB-86)、SKLMS-1(ATCC#HTB-88)、SKUT-1(ATCC#HTB-114)、SW684(ATCC#HTB-91)、SW872(ATCC#HTB-92)、786-O(ATCC#CRL-1932)、A498(ATCC#HTB-44)、Caki-2(ATCC#HTB-47)、22RV1(ATCC#CRL-2505)、DU145(ATCC#HTB-81)、LNCaP(ATCC#CRL-1740)、HMEC(BioWhittaker  CC-2251)、HuVEC(原代内皮细胞)、MDA-MB-175-VII(ATCC#HB-25)、MDA-MB-361(ATCC#HB-27)、SK-BR-3(ATTC#HTB-30)、9979(Raven拥有的肺癌细胞系)、A549(ATCC#CCL-185)、SW480(ATCC#CCL-228)、SW948(ATCC#CCL-237)、293(ATCC#CRL-1573)、PC3(ATCC#CRL-1435)、TDH-1(Raven拥有的前列腺癌细胞系)、Hs746T(ATCC#HTB-135)、NCI-N87(ATCC#CRL-5822)和其各个组织的正常细胞可用于筛选对癌性组织特异的单克隆抗体。衍生自不同器官(包括但不限于肾脏、卵巢、乳腺、肺、前列腺、结肠、肾张、皮肤、甲状腺、主动脉平滑肌和内皮细胞)正常组织的原代或低传代细胞培养物可用作阴性对照。如WO 01/43869所述，癌性细胞或非癌性细胞可在载玻片或盖玻片上生长，或者在塑料表面上生长，或者在CellArrayTM中制备，并如上文所述用IHC筛选结合抗体的组织。备选地，可用非蛋白水解方法将细胞从生长表面取下并沉淀成沉淀物，然后将其进行如上文所述用于IHC分析的组织的包埋并处理。细胞可接种到免疫缺陷动物中，允许肿瘤生长，然后这个肿瘤可以收获、包埋并用作IHC分析的组织来源。在另一个备选的实施方案中，可通过与初级 抗体、与荧光分子连接的次级“报告”抗体孵育然后用荧光激活细胞分选(FACS)仪分析筛选单个细胞。还在另一个备选的实施方案中，可用活细胞ELISA筛选对癌细胞系(如上文所列的癌细胞系)和其各个组织的正常细胞特异的抗体。可将细胞铺到96孔板中然后生长到汇合。然后去掉生长培养基并用封闭缓冲液封闭细胞。可加入初级抗体，然后洗涤平板，加入次级抗体，通过加入底物显色，可用平板读出器检测颜色变化。 
可用多种不同检测系统检测抗体与组织切片的结合。一般地，免疫组织化学包括初级抗体与组织的结合，然后产生与初级抗体反应的次级抗体并缀合可检测标志物(例如辣根过氧化物酶，HRP或苯二胺，DAB)。一种可用的备选方法为多克隆镜像互补抗体或者polyMICA。D.C.Mangham和P.G.Isaacson(Histopathology(1999)35(2)：129-33)所述的PoIyMICA(多克隆镜像互补抗体)技术可用于检测初级抗体(例如抗KID24抗体)与正常组织或癌性组织的结合。多种polyMICATM检测试剂盒可从The BindingSite Limited(P.O.Box 4073 Birmingham B29 6AT England)商业购买。产品号HK004.D为使用DAB发色团的polyMICATM检测试剂盒。产品号HK004.A为使用AEC发色团的polyMICATM检测试剂盒。备选地，初级抗体可用可检测标志物直接标记。 
选择适当抗体的IHC筛选法中的第一步为小鼠中产生的初级抗体(例如抗KID24抗体)与一种或更多种免疫原(例如细胞或组织样品)结合。在一个实施方案中，组织样品为不同器官冷冻组织的切片。细胞或组织样品可为癌性的或非癌性的。 
冷冻组织可经固定或不经固定制备或切片，并通过本领域技术人员已知的大量方法中的任何一种进行IHC。见例如Stephan等人，Dev.Biol.212：264-277(1999)和Stephan等人，Endocrinology 140：5841-54(1999)。 
V.表征抗KID24抗体的方法 
多种方法可用于表征抗KID24抗体。一种方法是鉴定其结合的表位。可从各种来源商业获得表位作图，如Pepscan System(Edelhertweg 15，8219 PH Lelystad，荷兰)。表位作图可用于确定抗KID24抗体结合的序列。表位可为线性表位(即包含在一段连续氨基酸中)或氨基酸三维相互作用形成的构象表位(不必需包含在一个连续片段中)。可分离或合成(例如重组地合成)不同长度的肽(例如至少4-6个氨基酸长)并用于抗KID24抗体的结合测定法。可通过用衍生自胞外序列的重叠肽并测定抗KID24抗体的结合在系统筛选法中确定抗KID24抗体结合的表位。 
另一种也可用来表征抗KID24抗体的方法为使用已知结合相同抗原(即KID24)的其它抗体的竞争测定法确定抗KID24抗体是否结合于其它抗体相同的表位。可以获得可商业购买的KID24抗体并可用本文所教导的结合测定法鉴定。竞争测定法为本领域技术人员所熟知，此类方法和用作说明的数据在实施例中进一步详述。抗KID24抗体可通过其结合的组织、癌症类型或肿瘤类型进一步表征。 
另一种表征抗KID24抗体的方法是通过其结合的抗原。抗KID24抗体用于多种人类癌症的细胞裂解物的蛋白质印迹。如本领域技术人员所了解的，蛋白质印迹可包括细胞裂解物和/或细胞级分的变性和非变性凝胶电泳，将蛋白质转移到硝酸纤维素纸上，然后用抗体(例如抗KID24抗体)探测印迹以观察抗体结合哪些蛋白质。这种方法在实施例4中进一步详述。KID24与不同组织的各种人类癌症相关，这包括但不限于结肠、乳腺、卵巢、胰腺和肺。实施例6和7给出了KID24的进一步描述。 
VI.用抗KID24抗体和KID24调节剂诊断癌症的方法 
为诊断目的，通过本文公开的方法制备的KID24单克隆抗体可用于为诊断目的鉴定多种组织中癌性细胞的存在或不存在，其中所述的组织包括但不限于卵巢、乳腺、肺、前列腺、结肠、肾脏、胰腺、皮肤、甲状腺、脑、心脏、肝脏、胃、神经、血管、骨和上消化道。通过本文公开的方法制备的KID24单克隆抗体也可用于鉴定从实体瘤释放后在血液中循环的癌性细胞的存在或不存在或其水平。此种循环抗原可为完整的KID24抗原，或保留可根据本文所教导的方法检测的能力的其片段。此种检测可用 本领域常用的标准方法通过FACS分析来实现。 
这些用途可涉及KID24和特异性结合KID24的抗体形成复合物。此类抗体的实例包括但不限于保藏于ATCC的杂交瘤(保藏号PTA#5174)所产生的那些抗KID24的单克隆抗体。此种复合物可在体外或体内形成。不希望受理论的束缚，抗KID24的单克隆抗体可通过KID24的胞外结构域结合KID24，然后被内化。 
在本发明诊断方法的优选实施方案中，抗体带有可检测的标记。可以使用的标记的实例包括放射性试剂或荧光团，如荧光异硫氰酸盐或藻红蛋白。 
当使用用于诊断和治疗目的的其它商业化已知抗体时，本发明的靶抗原在正常组织中广泛表达。它也在一些肿瘤中上调。因此，用作诊断剂或治疗剂的本发明抗体的特定剂量和递送途径根据当前的特定肿瘤或疾病状态以及待治疗的特定个体个别制定。 
用抗体诊断的一种方法为体内肿瘤影像，其连接抗体与放射性的或不透射线的试剂，给个体施用抗体，用X射线或其它成像仪器观察表达抗原的癌细胞表面标记的抗体的位置。抗体以在生理条件下促进结合的浓度施用。 
检测KID24的体外技术是本领域的常规工作并包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和蛋白质印迹分析。 
在本发明的一些方面，肿瘤或瘤的放射影像方法，或者测量放射性标记抗体治疗方法的效果的方法包括按照本发明的实践给个体施用放射性标记的肿瘤特异性抗体的步骤。放射性标记的抗体可为包含放射性标记的单克隆或多克隆抗体，放射性标记优选地选自锝-99m、铟-111、碘-131、铼-186、铼-188、钐-153、镥-177、铜-64、钪-47、钇-90。尤其优选的是用治疗性放射性核素(如碘-131、铼-188、钬-166、钐-153和钪-47)标记的单克隆抗体，其不包含抗体的免疫反应性且在体内不降解。本领域的技术人员了解其它放射性同位素是已知的，并可适于特定的应用。可用单光子发射计 算机断层显像(SPECT)、正电子发射断层显像(PET)、计算机断层显像(CT)或磁共振成像(MRI)进行放射成像。也考虑了允许通过放射免疫影像定位转移瘤位置的更高解剖学界定的相关成像术。 
在其它方法中，去除癌性细胞并通过本领域已知的方法(例如经固定或不经固定包埋于冷冻化合物中、冷冻、切片；使用或不使用各种抗原修复和反染色方法的固定和石蜡包埋)制备用于免疫组织化学的组织。单克隆抗体也可用于鉴定不同发展阶段的癌性细胞。抗体也可用于确定哪一个体的肿瘤以预定水平在其表面表达抗原并因此成为使用抗所述抗原的抗体的免疫疗法的候选。抗体可识别肾脏、卵巢、前列腺和胰腺的原发性癌症和转移癌症以及表达KID24的肺原发性癌症。如本文所用，检测可包括定性和/或定量检测并且包括比较对正常细胞所测量的水平与在癌性细胞中表达的提高的KID24水平。 
本发明也提供了用结合KID24的任何抗体辅助诊断个体中癌症(如胰腺癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌)的方法和可用于测定KID24表达水平的任何其它方法。如本文所用，“辅助诊断”的方法是指这些方法帮助进行有关癌症分类或本质的临床测定，并且可用于或不用于最后的明确诊断。因此，辅助诊断癌症的方法可包括检测个体生物样品中KID24的水平和/或测定样品中KID24表达水平的步骤。识别抗原或其部分的抗体也可用于建立检测体液中(包括但不限于血液、唾液、尿、肺液或腹水)活的癌细胞或濒死的癌细胞释放或分泌的抗原的诊断性免疫测定法。 
并非特定目的肿瘤中的所有细胞都表达KID24，其它组织中的癌性细胞可能表达KID24，因此应该筛选个体癌性细胞上存在或缺乏KID24来确定个体中免疫疗法的有用性。通过本文所公开方法制备的抗KID24抗体可用于确定诊断为癌症的个体是否可认为是使用抗KID24抗体的免疫疗法的候选者。在一个实施方案中，可用抗KID24的抗体检测癌性肿瘤或活体解剖样品的KID24表达。具有表达KID24的癌细胞的个体为使用抗KID24抗体的免疫疗法的适当候选者。用抗KID24抗体的染色也可用于区分癌性组织与正常组织。 
将抗KID24抗体用于诊断目的的方法在任何形式的抗癌治疗(例如化学疗法或放射治疗)之前或之后都可用于确定哪些肿瘤最可能对给定治疗产生反应，预测患有癌症的个体、肿瘤亚型或转移性疾病的来源以及疾病进程或治疗反应。 
本发明的组合物也适于在其它患病细胞(非癌性细胞)的应用中用上文广泛描述的方法诊断除癌症外的疾病状态。适用于本发明的方法的疾病状态包括但不限于个体中炎症反应或自身免疫应答相关的疾病或紊乱。上述方法可用于调节个体中的炎症反应或自身免疫应答。可用本发明的组合物和方法进行诊断和/或治疗的由炎症和自身免疫紊乱造成的疾病和病症以描述方式而非限制方式地包括多发性硬化、脑膜炎、脑炎、中风、其它脑外伤、炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆病)、重症肌无力、狼疮、类风湿性关节炎、气喘、急性青少年型糖尿病、AIDS痴呆、动脉粥样硬化、肾炎、视网膜炎、异位皮炎、银屑病、心肌缺血和急性白细胞介导的肺损伤。 
本发明的抗体和其他治疗剂可诊断和/或治疗的其它适应症还包括向处于器官排斥或移植排斥风险中的个体施用。最近几年，移植组织和器官(如皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺、胰腺和骨髓)的外科技术效率已有了长足改进。可能主要的突出问题是缺少令人满意的用于在受体中诱导对所移植同种异体移植物或器官免疫耐受的试剂。当同种异体的细胞或器官移植到宿主中时(即供体和受体为相同物种的不同个体)，宿主免疫系统可能发动对移植物中外源抗原的免疫应答(宿主抗移植物疾病)，从而导致移植组织的破坏。 
在本申请中描述的用途(描述抗KID24抗体的用途)也包括本文所述的其它KID24激动剂、拮抗物和调节剂的用途。在此类实施方案中，KID24激动剂、拮抗物或其它非抗体调节剂在所述步骤中替换为KID24抗体，并且在本领域普通技术人员能力范围内对其修改以适于针对KID24调节组合物的方法。 
VII.本发明的组合物 
本发明也包括组合物，这包括药物组合物，其包含抗KID24抗体、衍生自抗KID24抗体的多肽、含编码抗KID24抗体的序列的多核苷酸和本文所述的其它试剂。如本文所用，组合物还包含结合KID24、KID24激动剂、拮抗物、调节剂的一种或更多种抗体、多肽和/或蛋白质和/或含编码结合KID24的一种或更多种抗体、多肽和蛋白质的序列的一种或更多种多核苷酸。 
本发明还提供了任何KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂和支持预期功能或者特定KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂的功能的其它化学结构的缀合物。这些缀合物包括与大分子共价连接的KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂，如本文所讨论的用于诊断、筛选或纯化方法的任何不溶的、固体的支持基质。适当的基质材料包括化学惰性的，具有高孔隙度并具有大量能与肽配体形成共价键的官能团的任何物质。基质材料的实例和制备基质-配体缀合物的方法在Dean等人编辑，Affinity Chromatography：APractical Approach，IRL Press(1985)；Lowe，“An Introduction to AffinityChromatography”，Work等人编辑的Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第7卷，第II部分，North-Holland(1979)；Porath等人，“Biospecific Affinity Chromatography”，Neurath等人编辑的The Proteins，第三版，第1卷，95-178页(1975)和Schott，Affinity Chromatography，Dekker(1984)中描述。 
本文也提供了KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂与本文所讨论的诊断方法中所用的任何报告部分的缀合物。 
通过任何(一个或更多个)下列标准进一步鉴定和表征本发明的KID24肽激动剂、拮抗物或调节剂、多肽和蛋白质(包括抗KID24抗体)：(a)结合KID24的能力(包括癌细胞上的KID24，包括但不限于胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞或前列腺癌细胞)；(b)竞争性抑制已知的抗KID24抗体优先结合KID24的能力，包括优先结合原始抗体所优先结合的相同KID24表位的能力；(c)在体外或体内结合暴露于活细胞表面的KID24的一部分 的能力；(d)结合暴露于活的癌细胞(例如但不限于卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞或乳腺癌细胞)表面的KID24的一部分的能力；(e)递送化疗剂或可检测标志物到表达KID24的癌性细胞(例如但不限于卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞或乳腺癌细胞)的能力；(f)递送治疗剂进入表达KID24的癌性细胞(例如但不限于肺癌细胞)的能力。 
在一些实施方案中，本发明的抗体为保藏号为ATCC编号PTA#5174的宿主细胞或其后代所产生的抗体。本发明也包括这些保藏的杂交瘤所产生的各种抗体试剂和等效抗体或多肽片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等等)、嵌合抗体、单链(ScFv)、其突变体、含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体和任何这些抗体或等效抗体(具有所需特异性的抗原(KID24)识别位点)的任何其它修饰构象。本发明也提供了表现抗KID24抗体家族一个或更多个生物学特性的人类抗体。通过上述五个标准中的任何一个(一个或更多个)鉴定和表征抗KID24抗体家族的等效抗体(包括人源化抗体和人类抗体)、多肽片段和包含任何这些片段的多肽。 
在一些实施方案中，结合KID24的本发明的抗体、多肽和蛋白质为竞争性抑制本文所述的抗KID24抗体与KID24优先结合的抗体、多肽和蛋白质。在一些实施方案中，抗体、多肽和蛋白质优先结合KID24上小鼠抗KID24抗体所优先结合的同一表位。 
因此，本发明提供了任何下列(或组合物，包括含下列成分的药物组合物)：(a)上文所确定保藏号的宿主细胞或其后代产生的抗体；(b)此种抗体的人源化形式；(c)包含此种抗体的轻链和/或重链的一个或更多个可变区的抗体；(d)嵌合抗体，其包含与此种抗体重链和轻链的可变区同源或衍生自此种抗体重链和轻链的可变区的可变区和与人类抗体的重链和轻链的恒定区同源或衍生自人类抗体的重链和轻链的恒定区的恒定区；(e)包含此种抗体的轻链和/或重链的一个或更多个(至少一个、两个、三个、四个、五个或六个)CDR的抗体；(f)包含此种抗体重链和/或轻链的抗体；(g)与此种抗体等效的人类抗体。抗体的人源化形式可具有或不具有与原始抗体或上 文所确定保藏号的宿主细胞产生的抗体相同的CDR。确定CDR区域为本领域技术人员所熟知。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一个CDR的抗体，其中所述的CDR与上文所确定保藏号的杂交瘤之一所产生的抗体的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个CDR基本同源(或者在一些实施方案中，与这些抗体之一的所有六个CDR或衍生自这些抗体之一的六个CDR基本同源)，或者上文所确定保藏号的宿主细胞产生的抗体。其它实施方案包括具有与如上文所确定保藏的杂交瘤所产生抗体或者衍生自此种抗体抗体的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR基本同源的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。应理解到虽然为了本发明的目的通常保留结合特异性和/或全部活性(其以递送化疗剂到癌性细胞中的方式降低癌细胞的生长和/或增殖，诱导癌细胞的编程性细胞死亡，延迟转移的发生和/或镇静治疗)，但是活性的程度与保藏的杂交瘤所产生的抗体的活性相比可能改变(可能更高或更低)。本发明也提供了制备任何这些抗体的方法。制备抗体的方法为本领域已知并在本文描述。 
本发明也提供包含本发明抗体的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，多肽包含抗体轻链和/或重链的一个或更多个可变区。在一些实施方案中，多肽包含抗体轻链和/或重链的一个或更多个CDR。在一些实施方案中，多肽包含抗体轻链和/或重链的三个CDR。在一些实施方案中，多肽包含抗体的氢基酸序列，其具有下列中任何一个特点：原始抗体序列的至少5个连续氢基酸，至少8个连续氨基酸，至少大约10个连续氨基酸，至少大约15个连续氨基酸，至少大约20个连续氨基酸，至少大约25个连续氨基酸，至少大约30个连续氨基酸，其中至少3个氨基酸来自抗体的可变区。在一个实施方案中，可变区来自原始抗体的轻链。在另一个实施方案中，可变区来自抗体的重链。在另一个实施方案中，5个(或更多个)连续氨基酸来自抗体的互补决定区(CDR)。 
在本发明的一些实施方案中，直接给个体施用表达本发明的KID24、KID24的部分、抗KID24抗体或其它KID24结合多肽的本发明的细胞以 调节该个体的内源体内KID24生物活性。 
VIII.将KID24调节剂和抗KID24抗体用于治疗目的的方法 
KID24的单克隆抗体可在患有癌症或其它疾病的个体中用于治疗目的。用抗KID24抗体的疗法可包括如上文所述在体外和体内形成复合物。在一个实施方案中，抗KID24单克隆抗体可结合癌性细胞并降低癌性细胞的增殖。应理解到抗体以在生理(例如体内)条件下促进结合的浓度施用。在另一个实施方案中，KID24的单克隆抗体可用于针对不同组织(如胰腺、结肠、肺或前列腺)癌性细胞和其它类型癌症(如肉瘤)的免疫疗法。在另一个实施方案中，抗KID24单克隆抗体可单独结合癌细胞并降低癌细胞的细胞分裂。在另一个实施方案中，抗KID24单克隆抗体可结合癌性细胞并延迟转移的发生。还在另一个实施方案中，给患有癌症的个体进行用抗KID24抗体的镇静治疗。癌症个体的镇静治疗包括治疗或减轻疾病的不利症状或对疾病进行的不直接影响癌症进程的其它治疗造成的医原性症状。这包括减轻疼痛、营养供给、性问题、心理痛苦、抑郁症、疲劳、精神紊乱、恶性、呕吐等等的治疗。 
在此类情况中，抗KID24抗体可与增强或指导宿主自身免疫应答的试剂一起施用，如与增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的试剂一起施用。 
在其它实施方案中，从该抗体的寡聚糖中去除抗KID24抗体中存在的至少一个岩藻糖残基，所述的寡聚糖为增强ADCC的修饰。在类似的实施方案中，修饰抗KID24抗体中存在的岩藻糖残基以改变其组成以便达到与原始的非修饰抗体相比增强ADCC所需的程度。 
还在另一个实施方案中，抗KID24抗体与放射性分子、毒素(例如加利车霉素)、化疗分子、脂质体或其它含化疗化合物的载体缀合或结合并给需要此种治疗的患者施用以指导这些化合物到达含抗体所识别的抗原的癌细胞，从而消灭癌性细胞或患病细胞。不局限于任何一种特定理论，抗KID24抗体由表面带有KID24的细胞内化，从而递送缀合部分到达细胞以诱导治疗作用。还在另一个实施方案中，抗体在手术去掉表达抗原的癌症时可用作辅助治疗以延迟转移的发生。抗体也可在患有表达抗原的肿瘤的 个体中于手术前(新辅助治疗)施用以缩小肿瘤大小从而能够进行并简化手术，在手术过程中节约组织和/或减少随之而来的损容。 
在本发明的实践中考虑细胞周期给药。在此类实施方案中，在预定阶段用化疗剂同步化肿瘤或其它靶患病细胞的细胞周期。随后施用本发明的抗KID24抗体(单独施用或与额外治疗部分一起施用)。在备选的实施方案中，抗KID24抗体用于在进行第二轮治疗前同步化细胞周期和降低细胞分裂，第二轮治疗可施用抗KID24抗体和/或额外治疗部分。 
化疗剂包括放射性分子、毒素(也称为细胞毒素或细胞毒性剂，包括任何对癌性细胞活力有害的试剂)、试剂和脂质体或其它含化疗化合物的载体。适当化疗剂的实例包括但不限于1-去氢睾酮、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、阿霉素、阿地流津、烷化剂、别嘌呤醇钠、六甲密胺、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑、氨茴霉素(AMC)、抗有丝分裂剂、顺-二氯二胺铂(II)((DDP)(顺铂)、二氨基二氯铂、氨茴菌素、抗生素、抗代谢物、天冬酰胺酶、活BCG(膀胱内)、倍他米松磷酸钠和醋酸倍他米松、比卡鲁胺、硫酸博来霉素、白消安、亚叶酸钙、加利车霉素、卡培他滨、卡铂、罗氮芥(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉曲滨、秋水仙碱、缀合雌激素、环磷酰胺、Cyclothosphamide、阿糖胞苷、阿糖胞苷、细胞松弛素B、环磷酰胺、达卡巴嗪、放线菌素D、放线菌素D(以前为放线菌素)、盐酸柔红霉素、柠檬酸柔红霉素、denileukin diftitox、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羟蒽二酮、多西他赛、甲磺酸多拉司琼、盐酸阿霉素、屈大麻酚、大肠杆菌L-天冬酰胺酶、依米丁、阿法依泊汀、欧文氏菌(Erwinia)L-天冬酰胺酶、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸纳、溴乙啡啶、炔雌醇、依替膦酸钠、依托泊苷、亚叶酸钙、磷酸依托泊苷、非格司亭、氟尿苷、氟康唑、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟利坦、甲酰叶酸、盐酸吉西他滨、糖皮质激素、醋酸性瑞林、短杆菌肽D、盐酸格雷西隆、羟基脲、盐酸去甲柔霉素、异环磷酰胺、干扰素α-2b、盐酸依立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、盐酸左旋咪唑、利多卡因、罗氮芥、美登木素生物碱、盐酸 氮芥胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、盐酸苯丙氨酸氮芥、硫醇嘌呤、美司钠、甲氨喋呤、甲基睾酮(methyltestosterone)、光辉霉素、丝裂霉素C、曼托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、醋酸善得定、盐酸恩丹西酮(ondansetronHCL)、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷托他丁、盐酸毛果芸香碱、plimycin、带卡莫司汀植入物的聚苯丙生20、卟吩姆钠、环酯汞撒利、盐酸甲基苄肼、普萘洛尔、利妥希玛、沙格司亭、链脲霉素、他莫西芬、紫杉醇、替尼泊苷、替尼泊苷、睾内酯、丁卡因、噻替派、苯丁酸氮芥、硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、盐酸拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬(toremifene citrate)、司徒曼布、维A酸、戊柔比星、硫酸长春碱、硫酸长春新碱和长春瑞宾。 
在优选的实施方案中，细胞毒素尤其在分裂的或快速分裂的细胞中发挥作用，以致于非分裂细胞相对不受毒性作用影响。 
本发明的抗体可内化到其所结合的患病细胞或癌细胞中，因此对治疗应用特别有用，例如用于递送需要内化发挥其有害活性的毒素到细胞中。此类毒素的实例包括但不限于肥皂草毒蛋白、加利车霉素、auristatin和美登木素生物碱。 
本发明的抗体或多肽可直接或间接地与放射性分子、毒素或其它治疗剂、脂质体或者其它含共价连接或非共价连接的治疗剂的载体结合(包括缀合或连接)。抗体就可与放射性分子、毒素或化疗分子在抗体上的任何位置连接，只要抗体能结合其靶标KID24即可。 
毒素或化疗剂可直接或间接地(例如通过接头基团或备选地通过具有适当结合位点的连接分子，如美国专利5,552,391中所述的平台分子)与适当的单克隆抗体偶联(例如共价键偶联)。本发明的毒素和化疗剂可用本领域已知的方法直接与特定靶蛋白偶联。例如，当每一个具有能互相反应的取代基时，试剂与抗体可能直接反应。例如在一个上所具有的亲核基团(如氨基或巯基)能与在另一个上的含羰基团(如酐或酰基卤)反应或者含良好离去基团(例如卤)的烷基反应。 
抗体或多肽也可由微载体与化疗剂连接。微载体指生物可降解的或非生物可降解的颗粒，其不溶于水并且大小为小于大约150、120或100mm， 更通常地小于大约50-60μm，优选地小于大约10、5、2.5、2或1.5μm。微载体包括“纳载体”，其为大小小于大约1μm，优选地小于大约500nm的微载体。此类颗粒为本领域已知。固相微载体可以是生物适合的天然存在多聚体、合成多聚体或合成共聚物形成的颗粒，其可包括或不包括琼脂糖或交联琼脂糖以及本领域已知的其它生物可降解材料形成的微载体。生物可降解的固相微载体可由哺乳动物生理条件下可降解的(例如聚乳酸、聚乙醇酸和其共聚物)或可腐蚀的(例如聚原酸酯，如3，9-二亚乙基-2，4，8，10-四氮杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)或聚酐，如癸二酸的聚酐)多聚体形成。微载体也可为液相(例如基于油或脂类)，如不含抗原的脂质体、iscoms(免疫刺激复合物，其为胆固醇与磷脂、佐剂激活的皂苷的稳定复合物)或者水包油或油包水的乳浊液中的液滴或微团，条件是液相微载体为生物可降解的。生物可降解的液相微载体一般地掺入本领域已知的大量生物可降解的油，包括鲨烯和植物油。微载体一般为球形，但是非球形微载体也可接受(例如椭圆体、杆形等等)。由于其不溶性质(对于水而言)，微载体可从水中和基于水的(含水的)溶液中过滤。 
本发明的抗体或多肽缀合物可包括含能偶联到毒性剂或化疗剂的基团和能偶联到抗体的基团的双功能接头。接头可作为隔离抗体与试剂以避免干扰结合能力的间隔。接头可为可切割的或不可切割的。接头也可帮助增强试剂上或抗体上的取代基的化学反应性，并从而增强偶联效率。化学反应性的增强也可促进利用试剂、试剂上的官能团，否则这些试剂、试剂上的官能团是不可能的。双功能接头可通过本领域已知的方法偶联到抗体上。例如，含活性酯部分的接头(如N-羟基琥珀酰胺酯)可用于通过酰胺键偶联到抗体中的赖氨酸残基上。在另一个实施例中，含亲核胺或肼残基的接头可偶联到抗体碳水化合物残基糖解氧化所产生的醛基上。除了这些直接偶联方法以外，接头可通过中间载体(如氨基葡聚糖)的方法间接偶联到抗体上。在这些实施方案中，修饰的连接是通过赖氨酸、碳水化合物或中间载体。在一个实施方案中，接头以位点选择性地偶联到蛋白质中的游离硫羟残基上。适于选择性连接到蛋白质上的硫羟基的部分为本领域所熟知。实 例包括二硫化合物、α-卤羰基和α-卤羰基化合物以及马来酰亚胺。当亲核胺官能团存在于与α-卤羰基或羧基相同的分子中时，可能存在通过胺的分子内烷基化发生环化的可能性。防止这个问题的方法为本领域技术人员所熟知，例如通过制备胺和α-卤官能团由刚性基团(如芳基或反式烯烃)分隔的分子以使在立体化学上不易形成不需要的环化。见例如制备通过二硫化物部分缀合的美登木素生物碱和抗体的缀合物的美国专利号6,441,163。 
可用于制备抗体-药物缀合物的一种可切割接头是基于顺-乌头酸的酸不稳定接头，其利用不同胞内区室的酸性环境，如受体介导的内吞作用过程中遇到的内体和溶酶体。见例如Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048-1054(1981)(用于制备道诺红菌素与大分子载体的缀合物)；Yang等人，J.Natl.Cane.Inst.80：1154-1159(1988)(用于制备道诺红菌素与抗黑素瘤抗体的缀合物)；Dillman等人，Cancer Res.48：6097-6102(1988)(以与制备道诺红菌素与抗T细胞抗体的缀合物类似的方式使用酸不稳定的接头)；Trouet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.79：626-629(1982)(通过肽间隔臂将道诺红菌素连接到抗体上)。 
本发明的抗体(或多肽)可通过本领域已知的任何方法缀合(连接)到放射性分子上。为讨论放射性标记抗体的方法见“Cancer Therapy withMonoclonal antibodiesT”，D.M.Goldenberg编辑(CRC Press，BocaRaton，1995)。 
备选地，抗体可缀合到第二抗体上以形成Segal在美国专利号4,676,980中所述的抗体异缀合物。交联抗体的形成可靶向免疫系统到特定类型的细胞，例如表达KID24的癌细胞或患病细胞。 
本发明也提供了通过施用抗KID24抗体或其它KID24调节剂预防或延迟患有或已患有原发性肿瘤(包括但不限于胰腺癌、结肠癌、肺癌或前列腺癌)的个体中转移发生的方法。这种调节剂可单独给予或与其它疗法联合给予，如与放射疗法、化学疗法或手术联合。在某些优选的实施方案中，原发性肿瘤在施KID24调节剂前已进行至少一轮的手术、放射疗法和/或化学疗法。在一些情况中，原发性肿瘤可表现出通过先前的治疗完全去除。 在其它实施方案中，在用手术、放射疗法和/或化学疗法治疗个体之前或与之同时施用KID24调节剂。在一些实施方案中，这些预防或延迟患有或已患有癌症的个体中转移瘤发展的方法包括施用与另一种治疗性部分(如可检测标志物或化疗剂)联合(或连接)的KID24调节剂(如结合KID24的抗体)。在一些实施方案中，抗体为非人类抗KID24抗体的人源化或嵌合形式。 
还在另一个实施方案中，抗体可在手术去除表达抗原的癌的时候用作辅助治疗以延迟转移的发生。抗体或结合化疗剂的抗体也可在患有表达抗原的肿瘤的个体中手术前(新辅助治疗)施用以缩小肿瘤大小并从而能够进行或简化手术、在手术中节约组织和/或减少损容。 
在另一个实施方案中，任何KID24调节剂(如抗KID24抗体)可在治疗(例如手术、放疗、化学治疗等等)原发性肿瘤之后用作治疗剂以延迟或预防转移瘤的发展。KID24调节剂可单独或与化疗剂连接施用。在一些实施方案中，抗体为非人类抗KID24抗体的人源化或嵌合形式。 
还在另一个实施方案中，本文所述的任何KID24结合实体可结合表达KID24的癌性细胞并诱导针对表达KID24的癌性细胞的主动免疫应答。在一些情况中，主动免疫应答可造成癌性细胞的死亡(例如抗体结合癌细胞诱导的编程性细胞死亡)或者抑制癌性细胞的生长(例如阻断细胞周期进程)。在其它情况中，本文所述的任何新抗体可结合癌性细胞并且依赖抗体的细胞毒性(ADCC)可消灭抗KID24的抗体结合的癌性细胞。因此，本发明提供了刺激免疫应答的方法，包括施用本文所述的任何组合物。 
在一些情况中，抗体结合也可激活细胞和体液免疫应答并募集更多的天然杀伤细胞或增强进一步刺激个体免疫系统破坏癌性细胞的细胞因子(例如IL-2、IFN-g、IL-12、TNF-a、TNF-b等等)的产生。还在另一个实施方案中，抗KID24抗体可结合癌性细胞，并且巨噬细胞或其它吞噬细胞可调理癌性细胞。 
各种抗KID24抗体或其片段的制剂可用于施用。在一些实施方案中，抗KID24抗体或其片段可有序施用。除药物活性剂之外，本发明的组合物 可含有适当的可药用载体，其包含本领域所熟知并且是相对惰性的物质(利于施用药学有效物质或者利于将活性化合物加工成可药学使用以递送到作用位点的制品)的赋形剂和辅剂。例如，赋形剂可给出形状或稠度，或者作为稀释液。适当的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、提供各种摩尔渗透压浓度的盐、胶囊化剂、缓冲液和皮肤穿透增强剂。 
用于肠胃外施用的适当制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶的盐。此外，可施用适于含油注射悬浮液的活性化合物悬浮液。适当的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如乙基油酸酯或三酰甘油)。水成注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质并包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含稳定剂。也可施用脂质体包被试剂以递送到细胞中。 
根据本发明的用于全身施用的药物制剂可以制备成用于肠内、肠胃外或局部施用。三种类型的制剂的确都可同时使用以实现有效成分的全身施用。Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，MackPublishing(2000)中提出了赋形剂以及肠胃外和非肠胃外药物递送的制剂。 
口服施用的适当制剂包括硬质或软质明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮剂、糖浆或吸入剂和其可控释放形式。 
通常，制备这些试剂以通过注射(例如腹膜内、静脉内、皮下或肌内等等)施用，但是也可使用其它施用形式(例如口腔、粘膜等等)。因此，抗KID24抗体优选地与可药用媒介物组合，如盐水、林格溶液、葡萄糖溶液等等。 
特定的剂量方案(即剂量、时间和重复)取决于特定的个体和该个体的医疗史。通常，施用100微克/千克体重，更优选的至少大约250微克/千克体重，甚至更优选地至少大约750微克/千克体重，甚至更优选地至少大约3毫克/千克体重，甚至更优选地至少大约5毫克/千克体重，甚至更优选地至少大约10毫克/千克体重的剂量。 
经验(如半衰期)通常会帮助确定剂量。与人免疫系统相容的抗体(如人源化抗体或完全人类抗体)可用于延长抗体的半衰期并防止抗体受宿主免疫系统的攻击。施用的频率可在治疗过程中确定和调整，并且基于降低癌 性细胞的数量、保持癌性细胞的减少、减少癌性细胞的增殖或延迟转移的发生。备选地，持续释放的抗KID24抗体制剂是适合的。实现持续释放的各种制剂和设备为本领域已知。 
在一个实施方案中，可在已接受一次或更多次施用的个体中经验性确定抗KID24抗体的剂量。个体接受增加剂量的抗KID24抗体。可依据特异性癌症疾病状态的标志物评价抗KID24抗体的效力。这包括通过触诊和目视观察直接测量肿瘤大小；通过X-射线或其它影像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活检和肿瘤样品显微镜检查评价的改善；测量间接肿瘤标志物(例如对于前列腺癌的PSA)，疼痛或麻痹的减轻；语言、视觉、呼吸和其它肿瘤相关的能力丧失的改善；食欲增加；或通过可接受的测试测量的生活质量的提高或生命的延长。本领域的技术人员了解剂量取决于个体、癌症类型、癌症阶段、癌症是否开始转移到个体中的其它位置和过去及现在所用的治疗而改变。 
其它制剂包括本领域已知的适当递送形式，包括但不限于载体，如脂质体。见例如Mahato等人，(1997)Pharm.Res.14：853-859。脂质体制品包括但不限于细胞转染剂、多层囊泡和单层囊泡。 
在一些实施方案中可存在一种以上的抗体。抗体可为单克隆的或多克隆的。此类组合物可含有对癌、腺癌、肉瘤和腺肉瘤反应的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同抗体。抗KID24抗体可与对包括但不限于卵巢、乳腺、肺、前列腺、结肠、肾脏、皮肤、甲状腺、骨、上消化道和胰腺的器官中的癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤反应的一种或更多种抗体混合。在一个实施方案中，使用不同抗KID24抗体的混合物。如在本领域经常提到的，抗体混合物可尤其用于治疗大范围的个体群体。 
提供下列实施例以说明但非限制本发明。 
实施例 
实施例1.制备作为免疫原的人肾细胞 
10-18周孕龄的人胎儿肾从Advanced Biosciences Research(Alameda County，加利福尼亚)获得。获得肾并在湿冰上于组织培养瓶中运到实验室。一到达立即将肾转移到清洗培养基中(冷的PBS，含青霉素/链霉素和庆大霉素)。用镊子去掉外膜并在70％乙醇中短暂清洗肾，然后在清洗培养基中漂洗两次。在100mm的干燥培养皿中用手术剪将肾剪成1mm的方块。将组织块铺于10ml无血清限定培养基中(在本文称为I/3F)。这种培养基在美国临时申请号60,504,674中描述，其公开在本文引用作为参考。虽然可在本发明的实践中使用多种常用细胞培养基，但是目前优选的实施方案使用无血清、基于果糖的细胞培养基。 
将组织块转移到15ml离心管中并以1000g将组织块离心5分钟。将组织块重悬于含胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)、表皮生长因子(20ng/ml)、生长激素(0.005IU/ml)、猪垂体提取物(0.2％)、鸡血清(0.1％)、庆大霉素(100μg/ml)、青霉素/链霉素(1×)和胶原酶/分散酶(0.1％)的I/3F培养基中并在4℃孵育过夜。第二天将组织块以1000g离心5分钟并用I/3F培养基清洗两次。将沉淀重悬于含胰岛素(10μg/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)、表皮生长因子(20ng/ml)、生长激素(0.005IU/ml)、猪垂体提取物(0.2％)、鸡血清(0.1％)的10ml I/3F培养基中并在预包被纤粘连蛋白的10cm平板中培养。 
在这些培养条件下，人胎儿肾细胞粘附到底物包被的平板上并长成单层。每周更换两次培养基。 
细胞单层用不含钙和镁的Hanks盐溶液漂洗一次，然后在含10mMEDTA的Hanks盐溶液中于37℃孵育15分钟以收获细胞。通过温和吹打使细胞从培养表面脱离。通过1000g离心5分钟沉淀细胞悬液。去掉上清液并将细胞重悬于无血清培养基中(I/3F培养基)，如果适当的话无血清培养基含非变性佐剂。 
实施例2产生单克隆抗体 
将非变性佐剂(Ribi、R730、Corixa、Hamilton MT)再水合到2ml磷酸盐缓冲液中。然后将100μl此再水合佐剂与实施例1的一些细胞沉淀轻 轻混合用于免疫。一周大约一次或两次通过爪垫注射大约每个小鼠106个人胎儿肾细胞到Balb/c小鼠中。精确的免疫方案如下：第零天，加Ribi免疫。第3天，加Ribi免疫。第7天，加Ribi免疫。第24天，不加Ribi免疫。第29天，不加Ribi免疫。第32天，不加Ribi免疫。第36天，不加Ribi免疫。第44天，不加Ribi免疫。第51天，不加Ribi免疫。第69天，取血进行滴度检测。第71天，加Ribi免疫。第74天，加Ribi免疫。第81天，加Ribi免疫。第91天，加强(无Ribi)。第104天，收获淋巴结用于融合。 
在第69天，从每一个免疫动物的尾部取一滴血以便用FACS分析法检测抗人胎儿肾细胞的抗体滴度。当滴度达至少1∶2000时用CO2和之后通过颈脱位法处死小鼠。收获淋巴结用于杂交瘤制备。 
用35％的聚乙二醇4000将小鼠的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653融合。融合后的第10天通过荧光激活细胞分选(FACS)筛选杂交瘤上清液中是否存在人胎儿肾细胞特异性单克隆抗体。每一种杂交瘤的条件培养基与等份的人胎儿肾细胞孵育30分钟。孵育之后清洗细胞样品，重悬于0.1ml稀释液中并与1μg/ml的FITC缀合的山羊抗小鼠IgGF(ab’)2片段在4℃孵育30分钟。清洗细胞，重悬于0.2ml FACS稀释液中并用FACScan细胞分析仪(Becton Dickinson；圣何塞，加利福尼亚)分析。选择杂交瘤克隆以通过FACS基于其结合人胎儿肾细胞的表面来进一步扩大、克隆和表征。选择产生称为小鼠抗KID24抗体(结合称为KID24的抗原)的单克隆抗体的杂交瘤。进一步在适于维持杂交瘤生长和抗体纯化的生长培养基中扩大产生小鼠抗KID24抗体的杂交瘤。 
实施例3.纯化抗KID24抗体，包括小鼠抗KID24抗体 
在存在10.0mM EDTA的条件下将人胎儿肾细胞从组织培养瓶脱离，以1400转/分离心5分钟并重悬于含1％BSA和2mM EDTA的PBS中(FACS稀释液)。计数细胞并调整到107个细胞/毫升。大约0.1ml细胞与100μl FACS稀释液在37℃孵育30分钟。用蛋白-G亲和层析从组织培养上清 液中纯化结合人胎儿肾细胞的单克隆抗体。如果需要的话，组织培养上清液可首先通过牛IgG柱以去除上清液中过量的牛IgG。下列材料用于抗体纯化过程：杂交瘤组织培养上清液、Immunopure(G)IgG结合缓冲液(Pierce#21011 Rockford，IL)、Immunopure IgG洗脱缓冲液(Pierce#21009)、浓HCl(用于调整pH值)、Corning 1升PES(聚醚砜)、0.22μm滤器(Corning#431098，Corning，NY)、Amersham Pharmacia AKTAExplorer系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、Protein-GSepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences#17-0618-03)、3M硫氰酸钾/50mM Tris pH 7.8组成的蛋白印迹膜再生液和PBS(磷酸盐缓冲液)、3MTris pH 9.0。 
为纯化在本文称为小鼠抗KID24抗体的小鼠抗人KID24抗体，测量上清液的体积并在上清液中加入等体积的结合缓冲液。允许混合物平衡到室温。通过0.22μm的滤器使上清液澄清。用AKTA Explorer系统(Amersham Biosciences)将上清液加到蛋白-G Sepharose柱上然后用5-10个柱体积的结合缓冲液洗涤。用洗脱缓冲液洗脱单克隆抗体并收集级分。级分一经洗脱在空管中，则加入3M Tris，pH 9.0(级分的1/60体积)中和级分。混合含单克隆抗体的峰级分。将混合样品注入预先湿润的slidealyzer盒(截至10,000 MW；Pierce#66810)中并于4℃在1×PBS中透析(更换3次缓冲液，每次更换透析至少4小时)。无菌过滤纯化的单克隆抗体(0.2μmAcrodisc)并保存在2-8℃。 
取纯化抗体的样品通过UV吸收(A280)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定浓度。SDS-PAGE在非还原和还原条件下进行以分析分子量、确定单克隆抗体的典型带型并评价纯度。 
从杂交瘤上清液中纯化小鼠抗KID24单克隆抗体之后再次检测其是否结合人胎儿肾细胞。如上所述制备细胞样品并与不同浓度的纯化的抗体孵育。孵育之后洗涤细胞，重悬于0.1ml稀释液中并在4℃与1μgFITC缀合的山羊抗小鼠IgG的F(ab)’2片段孵育30分钟。洗涤细胞，重悬于0.5ml FACS稀释液中并用FACScan细胞分选仪(Becton Dickinson，圣何塞， 加利福尼亚)分析。在FACScan柱形图上向右偏移表明纯化的抗体仍结合人胎儿肾细胞。 
在其它实验中，用活细胞ELISA检测小鼠抗KID24抗体对KID24的结合。使用下列方法，但是其它本领域通常已知的方法也是可用的。细胞(HT-29、SKOV3、SKMES-1、SW480、SKBR-3和HPAFII)在组织培养处理的96孔板上(Falcon)于含10％胎牛血清(FBS)的培养基中生长到汇合。用PBS洗涤细胞然后以所需浓度在含1％BSA和0.1％叠氮化钠的Hank平衡盐溶液(HBSS)中与50μl所需抗体室温孵育1小时。然后用每孔100μl的HBSS洗涤细胞三次，之后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体(每孔50μl，稀释于HBSS中)在室温孵育30分钟。最后用HBSS洗涤细胞三次，以每孔100μl在每一个孔中加入显色底物(TMB底物，KPL)。每孔加入100μl的1M磷酸终止颜色变化反应。然后平板在O.D.450nm读数。结果在下文总结于表4中。 
实施例4.癌细胞系A498中KID24表达的免疫沉淀分析 
肾癌细胞系A498在175cm2的培养皿上生长到汇合。用PBS漂洗细胞然后在裂解缓冲液中(HBSS+，含2％Triton X-100，2mM PMSF，0.1％叠氮化钠和每5ml裂解缓冲液1片无EDTA的mini蛋白酶混合物(RocheMolecular Biochemicals))刮出并收集裂解物。裂解物在4℃以14,000g离心1小时。然后将澄清的裂解物用5μl人IgG缀合的(1mg/ml)CNBr 4MBSepharose珠(Amersham Pharmacia)在4℃预清除2小时。离心并去除人IgG珠，然后将预清除的裂解物与缀合到CNBr 4MB sepharose珠(以1mg/ml缀合)上的小鼠抗KID24单克隆抗体在4℃孵育2小时。孵育2小时后离心并去除小鼠抗KID24抗体珠。人IgG和小鼠抗KID24抗体珠用1ml裂解缓冲液洗涤三次然后用1ml HBSS+洗涤一次。通过加入30μlSDS-PAGE样品缓冲液并在99℃煮沸5分钟从所洗涤珠上洗脱。 
然后将样品在4-20％的Novex梯度胶(Invitrogen)上分析，转移到0.2μm的硝酸纤维素膜上(Invitrogen)并通过用每张印迹膜5微克的小鼠抗 KID24抗体或5微克山羊抗ADAM-9抗体的蛋白质印迹观察。 
对于用辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素检测，首先用封闭缓冲液(5％脱脂奶粉，溶于含0.05％Tween-20的Tris盐缓冲液(TBST，SigmaChemicals))封闭硝酸纤维素膜1小时。将HRP缀合的链霉抗生物素以1μg/ml稀释到PBST中并在室温暴露于硝酸纤维素膜30分钟。然后用PBST洗涤硝酸纤维素膜三次，之后用ECL+观察。 
使用这种方案和小鼠抗KID24抗体在还原条件下显示大约75 kDa的特异分子量条带。当使用山羊抗ADAM-9抗体时在相同分子量处也出现了特异性条带。这个实验的结果示于图1。 
实施例5.用串联质谱(MS/MS)表征小鼠抗KID24抗体多结合的抗原 
分离小鼠抗KID24抗体所结合的抗原并根据Kane等人，J Bio Chem.2002年6月21日；277(25)：22115-8的方法进行串联质谱。通过SDS-PAGE分离蛋白质，凝胶用胶态考马斯兰试剂(Invitrogen)染色。在凝胶中用胰蛋白酶消化目的蛋白质。如Wu等人，Nature 405：477-82(2000)所述在离子阱质谱仪上(Thermo-Finnigan LCDQ DECA XP)通过毛细管液相层析MS/MS将胰蛋白酶消化的肽测序。备选地，其它通常已知的质谱方法，如MALDI质谱也可用于实践本发明。 
实施例6.免疫组织化学方法 
将癌症患者的冷冻组织样品包埋于OCT化合物中并用干冰在异戊烷中迅速冷冻。用Leica 3050 CM切片机以8-10μm的厚度切出冷冻切片并解冻粘贴到SuperFrost Plus载玻片上(VWR#48311-703)。用10℃的75％丙酮/25％乙醇固定切片并允许其室温风干2-4小时。将固定的切片保存在-80℃直到使用。 
对于免疫组织化学，回收组织切片，在Tris缓冲的0.05％Tween(TB-T)中洗涤，在封闭缓冲液中(TB-T，5％正常山羊血清和100μg/ml抗生物素蛋白)室温封闭30分钟。然后将片子与稀释于封闭缓冲液中(1μg/ml)的小 鼠抗KID24抗体和对照单克隆抗体在室温孵育60-90分钟。然后用封闭缓冲液洗涤切片三次。在0.1 M醋酸钠缓冲液(pH 5.05，0.003％过氧化氢)(Sigma目录号H1009)中用山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)F(ab’)2-过氧化物酶缀合物和过氧化物酶底物二氨基联苯胺(1mg/ml，Sigma目录号D5637)检测结合的单克隆抗体。染色的片子用苏木精负染并在Nikon显微镜下观察。 
在一些情况中，石蜡包埋甲醛固定的组织在使用适当的抗原修复方法之后可用于免疫组织化学。一种此类抗原修复方法由Mangham和Isaacson，Histopathology 35：129-33(1999)描述。其它抗原修复和/或检测的方法可由本领域的技术人员使用。从使用冰冻组织或者(根据需要)进行抗原修复的固定组织以及polyMICA检测开展的实验中获得结果。评价抗KID24抗体与多种正常组织和癌症组织的结合。在所有的情况中，对照固定组织中的抗体结合与冷冻组织的抗体结合相关。如果两种结合在对照中不匹配，那么仅使用冷冻组织的结果。 
为方便起见，使用不同来源的冷冻手术组织的多个实验的组合结果示于下面的表1、表2和表3中。 
Figure 2006800087418A00800011
Figure 2006800087418A00800021
Figure 2006800087418A00800022
实施例7.免疫组织化学结果 
用小鼠抗KID24单克隆抗体检测与不同组织类型来源的各种细胞系的反应性。弱阳性染色的结果评定为“+”，中度阳性染色评定为“++”，强阳性染色评定为“+++”，阴性染色评定为“-”。 
用WO 01/43869中所述的CellArrayTM技术获得免疫组织化学结果。来自所建立的不同细胞系的细胞从生长表面取下(不使用蛋白酶)，填充并包埋于OCT化合物中。细胞进行冷冻和切片，然后用标准的IHC方法染色。 
为方便起见，将小鼠抗KID24抗体与各种建立的人类正常和肿瘤细胞系结合的结果汇总在表4中。表4展示的实验包括使用本文所述方法的活细胞ELISA和CellArrayTM结合实验。 
Figure 2006800087418A00800023
[0215] 
Figure 2006800087418A00800031
*CC-2251-BioWhittaker 
用本领域所熟知的标准流式细胞术方法检测其它正常人类细胞系和肿瘤细胞系是否结合小鼠抗KID24抗体。结果总结于下面的表5。 
Figure 2006800087418A00800041
实施例8.小鼠抗KID24抗体结合固定的人ADAM-9 
用标准的ELISA流程和纯化的人ADAM-9进一步进行小鼠抗KID24抗体的表征。简言之，将纯化的人ADAM-9以饱和浓度包被到96孔板上。小鼠抗KID24抗体的剂量曲线允许以0-150纳克/孔结合并用标准的ELISA流程观察ADAM-9与小鼠抗KID24抗体的结合。结果表明，小鼠抗KID24抗体以剂量反应方式结合纯化的人ADAM-9。这些结果与前面表明小鼠抗KID24抗体可免疫沉淀抗ADAM-9特异性条带的蛋白质印迹结果一致。 
实施例9.小鼠抗KID24抗体可在体外阻断ADAM-9酶活性 
用重组人ADAM-9胞外结构域(ECD)和小鼠抗KID24抗体开展体外酶活性测定。在存在锌的条件下ADAM-9 ECD能在体外切割肽底物(R&D Systems#E S003)。一经切割，肽发射能用荧光平板读数器在320nm的激发波长(450nm的发射波长)检测的荧光信号。根据制造商的方法开展体外酶测定法。简言之，将200ng/rxn的rhADAM-9 ECD(R&D Systems#939-AD-020)加到25mM Tris，2.5μM ZnCl2和0.005％Brij 35，pH 9.0中。也加入各种浓度的小鼠抗KID24抗体，此反应在室温柔和搅拌孵育5分钟。加入10μM荧光肽底物(R&D Systems#ES003)以使终体积为100微升/孔。将反应在37℃孵育过夜。然后以O.D.405nm在荧光平板读数器上对平板读数。无ADAM-9 ECM的对照条件(无酶)没有显示荧光，这是所预料的，因为只有切割底物才有荧光。无小鼠抗KID24抗体的阳性对照条件显示最大量的荧光。小鼠抗KID24的抗体能以依赖剂量的方式阻断ADAM-9 ECM活性。这些结果表明小鼠抗KID24抗体可在体外阻断ADAM-9酶活性。 
实施例10.小鼠抗KID24抗体能抑制结肠肿瘤细胞系HCT116、SW620和HT29的软琼脂集落形成 
对三种结肠肿瘤细胞系HCT116、SW620和HT29检测小鼠抗KID24抗体的体外作用。使用本领域熟知的软琼脂集落形成的标准方法。与对照相比，终浓度1μg/ml小鼠抗KID24抗体能抑制大约60％的HCT116细胞的软琼脂集落形成。对SW620细胞(与对照相比抑制14％)和HT29细胞(与对照相比抑制22％)观察到类似的结果。 
实施例11.小鼠抗KID24抗体的内化和缀合毒素的抗小鼠IgG抗体 
Mab-ZAP(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA)为与肥皂草毒蛋白(抑制蛋白质合成的毒素)缀合的抗小鼠IgG抗体。此毒素为细胞膜不渗透的。如果单克隆抗体结合可内化的细胞表面抗原，毒素缀合物可结合所结合的单克隆抗体并被内化，最后杀死细胞。依赖于内化以显示毒性，Mab-ZAP可帮助评价给定的表面抗原是否作为取决于内化以显示细胞毒性作用的任何毒素的适当靶标。这样，Mab-ZAP作为此类依赖内化的毒素 如美登木素生物碱和加利车霉素的模型。 
为检测肿瘤细胞内化小鼠抗KID24抗体和肥皂草毒蛋白缀合的抗小鼠IgG抗体以及肥皂草毒蛋白内化后杀伤肿瘤细胞的作用，用10mMEDTA将人卵巢癌细胞系ES-2和人胰腺癌细胞系HPAF-II从保藏瓶中取出并离心。将细胞以50,000个细胞/毫升重悬于适当的生长培养基中并在96孔板中每孔铺100μl。立即以10×浓缩液将小鼠抗KID24抗体加入适当的孔中使终浓度为10μg/ml。室温15分钟之后，以10×浓缩液将Mab-ZAP(目录号IT-04)加入适当的孔中使终浓度为0.001-10nM。培养4天后，在37℃加入MTT(5mg/ml的PBS储液，在孔中1∶10稀释)4小时。然后从所有的孔中去掉培养基并加入100微升/孔的DMSO。轻柔涡旋平板以溶解蓝色MTT沉淀物然后在O.D.540nm于平板读数器中对平板读数。 
当加入高于0.01nM的Mab-ZAP时，与缺乏小鼠抗KID24抗体的染色相比，ES-2和HPAF-II细胞在存在小鼠抗KID24抗体条件下的染色都降低，表明在存在小鼠抗KID24抗体和Mab-ZAP的条件下人癌细胞ES-2和HPAF-II的生长受到抑制并且小鼠抗KID24抗体和毒素缀合的抗小鼠IgG抗体被内化。根据本实施例的方法的内化实验结果示于图2，表明小鼠抗KID24抗体被内化。 
实施例12.小鼠抗KID24抗体在人肿瘤皮下胁腹模型中的抗肿瘤作用 
设计本研究使用D54细胞(神经胶质瘤细胞系)组成的人肿瘤在皮下胁腹模型中检测抗KID24抗体的剂量反应性抗肿瘤活性。 
将培养的D54细胞以5×105个细胞的密度悬于Matrigel(无酚红，Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware)和PBS(1∶1)的溶液中并通过皮下注射植入裸鼠的胁腹。接种后19天，得到的异种移植物大约为100mm3，将小鼠随机分组，称重并用100毫克/千克的小鼠抗KID24抗体或Mab对照处理。通过IP注射每周施用三次抗体。对照组给予载体假注射以平衡给药产生的压力。在处理过程中每天检查动物并每周估计平均肿瘤体积(MTV)三次。通过测定体重变化和死亡率评价动物毒性。 
在研究的最后(接种后42天)，与载体和对照抗体处理的小鼠相比，用小鼠抗KID24抗体处理的小鼠具有明显较小的肿瘤(大约小45％，p＜0.02)。在60毫克/千克剂量的小鼠抗KID24抗体处理中也观察到类似的趋势。 
也在SCID-Beige小鼠中进行了使用人纤维肉瘤细胞HT1080的其它实验。将5×105个细胞悬于PBS中并与等体积的Matrigel(无酚红，BectonDickinson Biosciences Discovery Labware)混合然后接种到SCID-Beige小鼠的胁腹中。接种后5天用IP注射载体(PBS)、100毫克/千克的对照抗体或100毫克/千克的小鼠抗KID24抗体处理小鼠。肿瘤体积表达为平均值±SEM，n＝10个动物/组。在研究的最后(接种后16天)测定通过肿瘤大小测量的抑制百分比。 
与载体和对照抗体处理的小鼠相比，小鼠抗KID24抗体处理的小鼠具有明显较小的肿瘤(小19％，p＜0.05)。 
实施例13.小鼠抗KID24抗体在肾包膜下肿瘤模型中的抗肿瘤和抗转移作用 
设计本研究用从梅克尔细胞癌(皮肤的神经内分泌癌)培养的梅克尔细胞在肾包膜下肿瘤模型中检测抗KID24抗体的剂量反应性抗肿瘤活性。 
通过标准方法制备I型鼠尾胶原。简言之，去掉成熟饲养大鼠的尾巴，分离腱并称重。1克腱产生100ml胶原溶液，每一条尾巴产生大约1-1.5克腱。为提取胶原，将腱置于含青霉素、链霉素和两性霉素B的稀释的醋酸溶液中(每克腱200μl冰醋酸，溶于100ml水)并在4℃温和搅拌至少一周。然后离心溶液并将胶原上清液存于4℃直到使用。 
为进行本研究，通过在装置中的含Earle氏平衡盐溶液(EBSS)、NaOH和NaHCO3的溶液中聚合鼠尾胶原制备50μl胶原扣(collagen button)。聚合之后，每个胶原扣加入5×105个梅克尔细胞。移植前细胞于37℃在胶原中孵育过夜。 
为将细胞植入肾包膜下，用三溴乙醇完全麻醉小鼠。在肾包膜中做一个口袋以允许放入细胞，这通过左肾或右肾的附腰手术方法完成。在一些 研究中，两个肾都接受异种移植物。手术之后，让动物在热表面苏醒，并观察直到完全从麻醉中苏醒。手术后10天去掉伤口钳。 
对每一个治疗剂量组来说，小鼠抗KID24抗体在PBS中适当稀释，以0.01毫升/克体重的浓度施用。对照组接受PBS(0.01毫升/克体重)。给药从移植后第二天开始，小鼠抗KID24抗体和PBS对照剂量以快速注射到腹膜腔每周施用两次，持续三周。 
给药阶段的最后处死小鼠，取出肿瘤和临近的组织，在含蛋白酶K(1.45mg/ml)和RNA酶A(0.07mg/ml)的消化缓冲液中于55℃孵育过夜以进行PCR分析。 
为产生PCR分析的模板，根据制造商的说明用Wizard SV基因组纯化系统(Promega)从肿瘤中分离基因组DNA。每一个DNA样品重悬于200μl的终体积中。 
在Applied Biosystems SDS7000系统上用实时PCR定量肿瘤中人DNA的数量，其中使用人核糖体基因RPL19特异性引物和探针。 
每一个样品最开始用BstX1消化以确保有效扩增。每一个反应混合物包含5μl模板DNA、5μl Taqman Gold 10×反应缓冲液(AppliedBiosystems)、5个单位的BstX1、4mM MgCl2、每一种2.5mM的脱氧核糖核苷酸混合物、引物各250mM、150nM探针、1.5个单位的Taqgold(Applied Biosystems)并加入水到终体积50μl。所用的热循环条件为45℃30分钟以进行BstX1消化，95℃10分钟以进行BstX1灭活，之后时40个循环的95℃20秒(变性)和60℃1分钟(延伸)。 
用每一反应400-0.09纳克DNA的人基因组DNA(BD BiosdencesClonetech)的四倍连续稀释产生标准曲线。从标准曲线内推样品DNA浓度。在一式三份的PCR反应中分析每一肿瘤样品并测定平均DNA浓度。从这些实验中来看，当与对照PBS处理的肿瘤比较时，用50毫克/千克浓度的小鼠抗KID24抗体处理的梅克尔细胞肿瘤表现人DNA的数量降低50％。 
用建立的梅克尔细胞肿瘤进行类似的肾包膜下实验。如上所述处理梅克尔细胞并如上所述移植。使用抗体前允许肿瘤生长21天。肿瘤移植后 21天，小鼠以50毫克/千克小鼠抗KID24抗体或PBS对照给药，每周两次，持续三周。在研究的最后处死小鼠并取出肿瘤。如图3所示，用小鼠抗KID24抗体处理小鼠后的肿瘤显著小于PBS处理小鼠的肿瘤。同样显著的是与PBS处理小鼠相比用小鼠抗KID24抗体处理小鼠中转移的数量。可在PBS处理小鼠的网膜、膈膜、脾、卵巢和肺中发现转移瘤。在用小鼠抗KID24抗体处理小鼠中没有发现转移瘤。图4A显示了PBS处理小鼠的网膜。箭头指示出组织中发现的转移瘤。图4B显示了用小鼠抗KID24抗体处理小鼠的网膜。没有在组织上(解剖显微镜下)见到转移瘤。 
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅为说明目的，本领域技术人员而言可以想到各种微小的修饰和改变，并且它们包括在本申请的精神和范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请以似乎每一出版物、专利和专利申请被明确且单独引用作为参考的程度全部引用作为参考。 

Claims (21)

1.纯化的免疫球蛋白或其抗原结合片段，所述纯化的免疫球蛋白由具有ATCC No.PTA#5174的保藏编号的杂交瘤产生，所述纯化的免疫球蛋白或其抗原结合片段特异性结合KID24，并且优先结合KID24上小鼠抗KID24抗体所优先结合的同一表位，并具有下列特征的至少一个：
a.结合癌细胞上KID24的能力；
b.在体外或体内结合暴露于活的癌细胞表面的KID24的一部分的能力；
c.递送治疗剂或可检测标志物到表达KID24的癌细胞的能力；和
d.递送治疗剂或可检测标志物进入表达KID24的癌细胞中的能力。
2.权利要求1的纯化的免疫球蛋白或抗原结合片段，其中所述的癌细胞选自肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌、子宫癌和梅克尔细胞癌的癌细胞。
3.编码权利要求1的免疫球蛋白或其抗原结合片段的分离的核酸序列。
4.权利要求3的核酸，其中核酸与启动子可操作性连接。
5.权利要求4的核酸，其中启动子和核酸包含在表达载体中。
6.权利要求3的核酸，其中免疫球蛋白为单克隆抗体。
7.用含权利要求3的核酸的载体转染、转化或感染的细胞系。
8.产生权利要求1的所述纯化的免疫球蛋白或其抗原结合片段的方法，其包括下列步骤：
a.在表达免疫球蛋白多肽或抗原结合片段的条件下培养用权利要求3的核酸转化的细胞系；和
b.收获表达的免疫球蛋白多肽或抗原结合片段。
9.权利要求8的方法，其中免疫球蛋白为单克隆抗体。
10.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1的纯化的免疫球蛋白或抗原结合片段以及可药用载体。
11.药物组合物，其包含治疗有效量的单克隆抗体或其抗原结合片段以及可药用载体，所述单克隆抗体由具有ATCC No.PTA#5174的保藏编号的杂交瘤产生，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合KID24，且具有下列特征的至少一个：
a.结合癌细胞上KID24的能力；
b.在体外或体内结合暴露于活的癌细胞表面的KID24的一部分的能力；
c.递送治疗剂或可检测标志物到表达KID24的癌细胞的能力；和
d.递送治疗剂或可检测标志物进入表达KID24的癌细胞中的能力。
12.权利要求11的药物组合物，其中组合物包含额外的治疗性部分。
13.分离的细胞系，其具有ATCC No.PTA#5174的保藏编号或为其后代。
14.含有与化疗剂结合的权利要求1的所述纯化的免疫球蛋白或其抗原结合片段的组合物在制备用于递送所述化疗剂到癌细胞的药物中的用途，其中所述的癌细胞选自肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌、子宫癌和梅克尔细胞癌的癌细胞。
15.权利要求14的用途，其中向个体施用化疗剂。
16.含有与化疗剂结合的权利要求1的所述纯化的免疫球蛋白或其抗原结合片段的组合物在制备抑制个体中癌细胞生长的药物中的用途，其中所述的癌细胞选自肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌、子宫癌和梅克尔细胞癌的癌细胞。
17.权利要求16的用途，其中将化疗剂递送进入癌细胞中。
18.权利要求11的药物组合物在制备预防或延迟患有原发性肿瘤的个体中转移瘤发展的药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中药物组合物包含额外的诊断性或治疗性部分。
20.权利要求18的用途，其中原发性肿瘤在之前已经通过手术、放射或化学疗法治疗过。
21.权利要求18的用途，其中原发性肿瘤选自肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌症、脑转移瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠滋养层成瘤性疾病、生殖细胞肿瘤、头颈部癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌腺瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、神经母细胞瘤、神经内分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿童癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤、罕见的血液疾病、肾转移癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑囊肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌、子宫癌和梅克尔细胞癌。
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