DE60127656T2

DE60127656T2 - Integrin antagonisten

Info

Publication number: DE60127656T2
Application number: DE60127656T
Authority: DE
Inventors: William C. Normandy Park FANSLOW; Douglas Pat Seattle CERRETTI; Kurt Matthew Seattle POINDEXTER; Roy Alvin Seattle BLACK
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-02-25
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2021-02-24
Also published as: AU4721901A; AU2001247219B2; NZ521437A; US20020042368A1; US20060177443A1; ATE358718T1; WO2001062905A2; WO2001062905A3; CA2400040A1; IL151032A0; EP1259595A2; EP1259595B1; JP2003523768A; US7074408B2; DE60127656D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die für das Antagonisieren der Interaktion zwischen Integrinen und ihren Liganden nützlich sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von ADAM Disintegrin-Domänen zum Antagonisieren der Interaktion zwischen Integrinen und ihren Liganden.
Hintergrund der Erfindung
A. Integrine und Disintegrine
Integrine sind eine Familie von Zelloberflächenproteinen, die die Adhäsion zwischen Zellen (Zell-Zell-Adhäsion) und zwischen Zellen und extrazellulären Matrixproteinen (Zell-ECM-Adhäsion) vermitteln. Integrine sind heterodimere Strukturen, die aus nicht-kovalent verbundenen α- und β-Untereinheiten bestehen. Bei Menschen verbinden sich zumindest fünfzehn unterschiedliche α-Untereinheiten und acht unterschiedliche β-Untereinheiten, um Integrine mit diversen biologischen Aktivitäten und Ligand-Spezifitäten zu bilden. Integrine spielen wichtige Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Blutplättchen-Aggregation, Immunreaktionen, Gewebe-Reparatur und Remodellierung, Knochenresorption und Tumorinvasion und Metastasen. Integrine sind deshalb wichtige Ziele für die therapeutische Intervention bei menschlicher Erkrankung.
Die Disintegrine sind eine Familie von löslichen, Cystein-reichen Peptiden mit niederem Molekulargewicht, die aus Schlangengift isoliert wurden (besprochen in Niewiarowski et al., Seminars in Hematology 31(4):289, 1994). Die Schlangengift-Disintegrine enthalten typischerweiser ein RGD (Arg-Gly-Asp, SEQ ID NO: 19)-Motiv. Das RGD-Motiv wird durch viele Integrine erkannt, und ist in mehreren Integrin-Liganden vorhanden, einschließlich Fibronektin, Vitronektin, und von Willebrand-Faktor. Disintegrine unterbrechen die normalen Adhäsionsvorgänge durch Inhibieren der Bindung von Zelloberflächen-Integrine an ihre Liganden.
Disintegrin-artige Domänen wurden in zellulären Proteinen von sowohl von Invertebraten als auch Vertebraten identifiziert (siehe z.B. Westcamp und Blobel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2748, 1994; Wolfsberg et al., Dev. Bio. 169:378, 1995; Alfandari et al., Dev. Biol. 182:314, 1997), einschließlich die ADAM Familie von Transmembranproteinen.
B. ADAMs
Die ADAMs, die auch MDCs genannt werden, sind eine Familie von Typ I Transmembran Cystein-reichen Glycoproteinen (Westkamp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:2748, 1994; Wolfsberg et al., Dev. Biol 169:378, 1995). Die Multidomän-Struktur der ADAMs umfasst typischerweise eine Amino-terminale Metalloprotease-Domäne, eine Disintegrin-Domäne, eine Cystein-reiche Region (die Region zwischen der Disintegrin-Domäne und der Transmembrandomäne), eine Transmembran-Region und eine cytoplasmatische Domäne. Zumindest 30 ADAM Familienmitglieder wurden in einer Vielzahl von Tierarten identifiziert. Die Sturktur der ADAMs deutet an, dass sie in einer Vielzahl von biologischen Vorgängen eingebunden sein können, einschließlich der Zelladhäsion, Zellfusion, Signaltransduktion, und Proteolyse. Es wurde tatsächlich gezeigt, dass die Mitglieder der ADAM Familie Rollen in der Sperma-Ei-Bindung und Fusion, Myotube-Bildung, Neurogenese, und Proteolyse spielen.
ADAM-15, auch MDC-15 oder Metargidin genannt, ist das einzige ADAM, das bis heute identifiziert wurde, welches ein RGD Motiv innerhalb seiner Disintegrin-Domäne enthält. Zhang et al. (J. Biol. Chem. 273(13):7345, 1998) haben berichtet, dass die isolierte Disintegrin-Domäne von ADAM-15, in E. coli als ein Glutathion S-Transferase Fusionsprotein exprimiert, insbesondere mit α_vβ₃-Integrin interagiert und dass die Interaktion durch die RGD-Tripeptidsequenz vermittelt wird. Das rekombinante Fusionprotein interagierte nicht mit anderen untersuchten Integrinen, einschließlich α_IIbβ₃ und α₅β₁. Nath et al. (J. Cell Science 112:579, 1999) haben berichtet, dass die gesamte ADAM-15 extrazelluläre Domäne, in COS-Zellen als ein Fc-Fusionsprotein exprimiert, mit α_vβ₃ und α₅β₁-Integrinen auf hämatopoietischen Zellen interagiert und dass die Interaktion durch die RGD Tripeptidsequenz vermittelt wird. Zhang et al. und Nath et al. kommentierten, dass die RGD-abhängige Interaktion zwischen ADAM-15 und α_vβ₃-Integrin auf eine Rolle in Vorgängen, wie Malignität und Angiogenese hinweist.
C. Angiogenese
Angiogenese, die Erzeugung neuer Blutgefäße, ist ein räumlich und zeitlich regulierter Vorgang, bei welchem Endothel- und glatte Muskelzellen proliferieren, migrieren, und sich zu Röhren zusammenlagern, als Reaktion auf endogene positive und negative regulatorische Moleküle. Die Angiogenese spielt wichtige Rollen sowohl in der normalen als auch pathologischen Physiologie.
Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Angiogenese in die fötale und embryonale Entwicklung, Wundheilung, Organ-Regenerierung, und weiblichen Fortpflanzungs-Umbauprozesse, einschließlich der Bildung des Endometriums, Corpus luteum, und Plazenta, eingebunden. Angiogenese ist unter normalen Bedingungen strikt reguliert, inbesondere in erwachsenen Tieren, und Störung der regulatorischen Kontrolle kann zur pathologischen Angiogenese führen.
Die pathologische Angiogenese wurde mit der Manifestation und/oder Progression von entzündlichen Erkrankungen, bestimmten Augenkrankheiten und Krebs in Zusammenhang gebracht. Insbesondere unterstützen mehrere Beweislinien das Konzept, dass die Angiogenese für das Wachstum und die Persistenz von soliden Tumoren und ihren Metastasen essentiell ist (siehe z.B., Folkman, N. Engl. J. Med. 285:1182, 1971; Folkman et. al., Nature 339:58, 1989; Kim et al., Nature 362:841, 1993; Hori et al., Cancer Res., 51:6180, 1991; Zetter, Annu Rev. Med. 49:407, 1998). Die Bildung von neuen Blutgefäßen versorgt einen wachsenden Tumor mit Sauerstoff, Nährstoffen, entfernt Abfälle und bietet einen Kanal, durch welchen invasive Zellen in das Zirkulationssystem eindringen und entfernte Metastasen etablieren können. Verschiedene Klassen von Angiogenese-Inhibitoren werden zurzeit für die Verhinderung (z.B. Behandlung von premalignen Zuständen), Intervention (z.B., Behandlung von kleinen Tumoren), und Regression (z.B. Behandlung von großen Tumoren) von Krebs (siehe, z.B., Bergers et al., Science 284:808, 1999) und andere Formen von pathologischer Angiogenese entwickelt und getestet. Da viele Schritte in dem angiogenen Vorgang, einschließlich der Endothelzellmigration, Proliferation, und Morphogenese, die vasuläre Zelladhäsion benötigen, wurden bestimmte Integrin-Antagonisten als antiangiogene Wirkstoffe getestet.
Mehrere Integrine werden auf der Oberfläche von kultivierten Endothel- und glatten Muskelzellen, einschließlich α_vβ₃-Integrin, exprimiert. Das α_vβ₃-Interfin ist ein Endothelzellrezeptor für von Willebrand Faktor, Fibrin, Fibrinogen, und Fibronektin, und ein Marker von angiogenem vaskulärem Gewebe. Brooks et al. haben berichtet, dass monoklonale Antikörper gegen α_vβ₃ Integrin, sowie zyklische Peptidinhibitoren die Angiogenese stören und dass α_vβ₃-Antikörper die Tumorregression fördern (Science 264:569, 1994; Cell 79:1157, 1994). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass α_vβ₃-Integrin ein nützliches therapeutisches Ziel für Krankheiten ist, die durch pathologische Angiogenese gekennzeichnet sind.
Es gibt einen großen Bedarf an zusätzlichen Zusammensetzungen und Verfahren zum Antagonisieren der Interaktion zwischen Integrinen und ihren Liganden. Insbesondere gibt es einen großen Bedarf an zusätzlichen Zusammensetzungen und Verfahren zum Inhibieren der Angiogenese für die Verhinderung, Aufhebung und Linderung von Krankheitsvorgängen, die von der pathologischen Angiogenese abhängen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, das ADAM Disintegrin-Domänen für die Inhibierung der biologischen Aktivität von Integrinen und für das Inhibieren der Endothelzellmigration und Angiogenese nützlich sind, einschließlich der unerwarteten Entdeckung, dass sich diese inhibitorischen Aktivitäten in ADAM Disintegrin-Domänen befinden, denen ein RGD Motiv fehlt.
Die Erfindung zielt auf Verfahren zum Antagonisieren der Bindung eines Integrins auf seine Liganden ab, und dadurch Inhibieren der Angiogenese-Aktivität des Integrins, wobei die Verfahren das In Kontakt bringen des Integrins mit einer effektiven Menge eines ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptids aufweist. Die Erfindung zielt weiters auf Verfahren zum Inhibieren der Endothelzellmigration und Verfahren zum Inhibieren der Angiogenese ab, welche die Verwendung eines ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptids bei der Herstellung eines Medikamentes zum Inhibieren der Angiogenese in einem Säugetier aufweist. Bei einigen Ausführungsformen liegt das ADAM Disintegrin-Domäne-Polypeptid in Form eines Multimers vor, vorzugsweise eines Leucin-Zipper-Multimers oder eines Fc-Polypeptids. Die ADAM Disintegrin-Domäne wird vorzugsweise in einer rekombinanten Zelle erzeugt, und ist vorzugsweise in einer Zusammensetzung vorhanden, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Das ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Aminosäuren 1-465 oder 23-235 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1-446 oder 23-216 von SEQ ID NO:10, Aminosäuren 1-535 oder 23-305 von SEQ ID NO: 12, Aminosäuren 1-523 oder 23-293 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 1-542 oder 23-312 von SEQ ID NO:16, Aminosäuren 1-540 oder 23-310 von SEQ ID NO:18, Aminosäuren 1-528 oder 23-298 von SEQ ID NO:22. In einigen mehr bevorzugten Ausführungsformen weist das ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Aminosäuren 34-99 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 34- 93 von SEQ ID NO: 10, Aminosäuren 34-91 von SEQ ID NO: 12, Aminosäuren 34-91 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 34-92 von SEQ ID NO: 16, Aminosäuren 34-91 von SEQ ID NO: 18, und Aminosäuren 34-91 von SEQ ID NO:22. In einigen am meisten bevorzugten Ausführungsformen weist das ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Aminosäuren 87-99 von SEQ ID NO: 6, Aminosäuren 79-93 von SEQ ID NO: 10, Aminosäuren 78-91 von SEQ ID NO: 12, Aminosäuren 78-91 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 79-92 von SEQ ID NO: 16, Aminosäuren 78-91 von SEQ ID NO: 18, und Aminosäuren 78-91 von SEQ ID NO: 22.
In einigen Ausführungsformen wird eine therapeutisch effektive Menge der ADAM Disintegrin-Domäne verwendet, um ein Medikament für die Inhibierung der Angiogenese in einem Säugetier, das einer solchen Behandlung bedarf, herzustellen. In bevorzugten Ausführungsformen leidet das Säugetier an einem Zustand, der durch Angiogenese vermittelt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Augenerkrankung, malignen und metastatischen Zuständen, entzündlicher Erkrankung, unangemessener Plättchenaktivierung, -rekrutierung, oder -aggregation, Thrombose oder einem Zustand, der die Gewebeinstandsetzung oder Wundheilung benötigt. Die ADAM Disintegrin-Domäne wird, in einigen Ausführungsformen, in Kombination mit Strahlentherapie und/oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die die Endothelzellmigration inhibieren, oder die die Angiogenese inhibieren, wobei diese Verfahren das Kombinieren einer Testverbindungen mit einem Integrin oder mit Endothelzellen und mit einem ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptid, wie oben definiert, das an das Integrin oder Endothelzellen bindet, und das Bestimmen aufweist, ob die Testverbindung die Bindung des ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptids an das Integrin oder Endothelzellen verändert.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, Beispiele, und Ansprüche offensichtlicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. In der Spezifikation verwendete Abkürzungen und Terminologie

„4-1BB" und „4-1BB Ligand" (4-1BB-L) sind Polypeptide, die unter anderem im U.S. Patent Nr. 5.674.704 beschrieben sind, einschließlich löslicher Formen davon.
„ADAMs" sind eine Famile von Transmembran-Glycoproteinen mit Disintegrin und Metalloproteinase-Domänen, auch MDC, Metalloprotease/Disintegrin/Cysteinreiche Proteine genannt.
„Dis" ist eine Disintegrin-Domäne; „ADAMdis" ist eine ADAM Disintegrin-Domäne.
„CD40 Ligand" (CD40L) ist ein Polypeptid, das unter anderem im U.S. Patent Nr. 5.716.805 beschrieben ist, einschließlich löslicher Formen davon.
„CD148" ist eine Protein-Tyrosinphosphatase, auch als DEP-1, ECRTP, und PTPRJ bezeichnet. CD 148 Bindungsproteine sind in Daniel et al., PCT Veröffentlichungs nr. WO 00/15258, 23. März 2000 beschrieben.
„DMEM" ist Dulbecco's Modified Eagle Medium. "FACS" ist Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung.
"F1t3L" ist Flt3 Ligand, ein Polypeptid, das unter anderem im U.S. Patent Nr. 5.554.512 beschrieben ist, einschließlich löslicher Formen davon.
„HRMEC" sind humane renale mikrovaskuläre Endothelzellen. „HMVEC-d" sind humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen. „mAb" ist ein monoklonaler Antikörper.
„MDC" ist eine Familie von Cystein-reichen Proteinen mit Metalloprotease- und Disintegrin-Domänen, auch als ADAM bezeichnet.
„Nectin-3" ist ein Zelladhäsionsmolekül in der Nectinfamilie (welche unter anderem in Satoh-Horikawa et al., J. Biol. Chem. 275(14):10291, 2000 beschrieben ist). Die GenBank-Zugangsnummer der humanen Nectin-3-Nukleinsäure und Polypeptidsequenzen sind AF282874 bzw. AAF97597 (Reymond et al., 2000).
„PMA" ist Phorbol-l2-myristat-l3-acetat.
„Tek", welches auch als Tie2 und ork bezeichnet wurde, ist eine Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), die hauptsächlich in vaskulärem Endothelium exprimiert wird. Die molekulare Klonierung von humanem Tek (ork) wurde von Ziegler, U.S. Patent Nr. 5.447.860 beschrieben. „Tek Antagonisten" sind unter anderem in Cerretti et al., PCT Veröffentlichungsnr. WO 00/75323, 14. Dezember 2000 beschrieben.
„TNF" ist Tumornekrosefaktor. „TNFR" ist ein Tumornekrosefaktor-Rezeptor, einschließlich löslicher Formen davon. „TNFR/Fc" ist ein Tumornekrosefaktor-Fc-Fusionspolypeptid.
„TRAIL" ist TNF-verwandter-Apoptosis-induzierender Ligand, ein Typ II Transmembran-Polypeptid in der TNF Familie, beschrieben unter anderem im U.S. Patent Nr. 5.763.223, einschließlich löslicher Formen davon.
„TWEAK" ist TNF-schwacher Effektor der Apoptose, ein Typ II Transmembran Polypeptid in der TNF Familie, beschrieben unter anderem in Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272(51):32401, 1997, einschließlich löslicher Formen davon. „TWEAK-R" ist der „TWEAK Rezeptor", welcher unter anderem in U.S. Seriennummer 60/172,878 und 60/203,347 und Feng et al., Am. J. Pathol. 156(4):1253, 2000 beschrieben ist, einschließlich löslicher Formen davon. TWEAK-R/Fc ist ein TWEAK Rezeptor-Fc Fusionspolypeptid.
„VEGF" ist vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, auch als VPF oder vaskulärer Permeabilitätsfaktor bekannt.

B. ADAM Polypeptide und ADAM Disintegrin Domän-Polypeptide
Zumindest dreißig ADAMs wurden beschrieben. Tabelle 1 bietet Referenzinformation für ausgewählte humane ADAMs.
ADAM Disintegrin-Domänen zeigt Sequenzhomologie zu den Schlangengift-Disintegrinen, und sind durch ein Rahmenwerk von Cysteinen gekennzeichnet. Zum Beispiel weist eine typische Disintegrin-Sequenz ein Rahmenwerk auf, wie:
CDCGX_3-5CX_3-6CCX_2-4CX₇CX_4-6CCX_2-4CX₈CX_5-7CX_3-5C (SEQ ID NO:20)
Die Sequenzen von mehreren ADAM Disintegrin-Domänen sind in Tabelle 2 und in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von verschiedenen Formen von ADAM Disintegrin-Domänen, die zumindest eine Aktivität beibehält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Integrinbindungsaktivität, Inhibierung der Endothelzell-Migration, und Inhibierung der Angiogenese. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff „ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid" Polypeptide, die die gesamte oder einen Teil einer nativen ADAM Disintegrin-Domäne, mit oder ohne anderen ADAM Domänen (wie die Cystein-reiche Region) enthält, sowie verwandte Formen umfasst, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein: (a) Fragmente, (b) Varianten, (c) Derivate, (d) Fusionspolypeptide, und (e) multimere Formen (Multimere). Die Fähigkeit dieser verwandten Formen, die Integrinbindung, Endozthelzellmigration zu inhibieren und/oder Angiogenese zu inhibieren, kann in vitro oder in vivo durch Verwenden von Verfahren, wie jenen, die unten beispielhaft erläutert sind, oder durch Verwenden anderer im Stand der Technik bekannter Untersuchungen bestimmt werden. Tabelle 1 Ausgewählte Mitglieder der ADAM Familie
Der Begriff "Variante" umfasst Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu nativen ADAM Disintegrin-Domänen sind, jedoch eine Aminosäuresequenz aufweisen, die von jener einer nativen ADAM Disintegrin-Domäne aufgrund einer oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen abweicht. Besondere Ausführungsformen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide, die von einer bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäure-Reste aufweisen, im Vergleich zu einer nativen ADAM Disintegrin-Domän-Sequenz. Als Varianten von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide eingeschlossen sind jene Varianten, die natürlich vorkommen, wie allele Formen und alternativ-gespleißte Formen, sowie Varianten, die durch Modifizieren der Aminosäure-Sequenz eines ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptids oder der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure, die ein ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid kodiert, hergestellt wurden.
Im Allgemeinen sollten die Substitutionen von einer vor mehreren Aminosäuren, die in dem nativen Polypeptid vorhanden sind, konservativ gemacht werden. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen Substitutionen von Aminosäuren außerhalb der aktiven Domäne(n), und Substitutionen von Aminosäuren, die die sekundär und/oder Tertiärstruktur der ADAM Disintegrin-Domäne nicht verändern. Zusätzliche Beispiele umfassen das Substituieren eines aliphatischen Restes durch einen anderen, wie Ile, Val, Leu, oder Ala für einander, oder Substitutionen eines polaren Restes für einen anderen, wie zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn, oder Substitutionen eines aromatischen Restes für einen anderen, wie Phe, Trp, oder Tyr für einander. Andere solche konservative Substitutionen, zum Beispiel Substitutionen von gesamten Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften, sind im Stand der Technik bekannt.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 70% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne; in einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 80% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne. In einigen noch mehr bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 90% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne; in einigen noch mehr bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 95% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne. In einigen am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 98% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne; in einigen am meisten bevorzugten Ausführungsformen ist die ADAM Disintegrin-Domän-Variante zumindest etwa 99% identisch in der Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz einer nativen ADAM-Disintegrin-Domäne.
Die prozentuelle Identität, sowohl im Fall von Polypeptiden als auch von Nukleinsäuren, kann durch visuelle Begutachtung bestimmt werden. Die prozentuelle Identität kann unter Verwendung des Ausrichtungsverfahrens von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970) bestimmt werden, wie durch Smith und Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981) revidiert wurde. Vorzugsweise wird die prozentuelle Identität unter Verwendung eines Computerprogramms bestimmt, zum Beispiel dem GAP Computerprogramm Version 10.x, erhältlich von der Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI, siehe auch Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984). Die bevorzugten Standardeinstellungen für das GAP Programm umfassen: (1) ein unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten enthält) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, wie durch Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reserach Foundation, S. 353-358, 1979 für Amionsäuren; (2) einen Strafpunkt von 30 (Aminosäuren) oder 50 (Nukleotide) für jede Lücke und einen zusätzlichen Strafpunkt von 1 (Aminosäuren) oder 3 (Nukleotide) für jedes Symbol in jeder Lücke; (3) keinen Strafpunkt für Endlücken; und (4) keine maximale Strafe für große Lücken. Andere Programme, die durch Fachleute auf dem Gebiet des Sequenzvergleiches verwendet werden, können auch verwendet werden. Für Fragmente von ADAM Disintegrin-Domänen wird die prozentuelle Identität basierend auf dem Abschnitt der ADAM Disintegrin-Domäne, die in dem Fragment vorhanden ist, berechnet.
Wenn eine Deletion- oder Insertionsstrategie adoptiert wird, muss die potentielle Wirkung der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität (wie Integrin-Bindungsaktivität, Inhibierung der Endothelzell-Migration oder Inhibierung der Angiogenese) berücksichtigt werden. Untereinheiten der erfindungsgemäßen Polypeptide können durch das Deletieren von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen konstruiert werden. Zusätzliche Anleitung, wie zu den Arten von Mutationen, die gemacht werden können, wird durch ein Vergleich der Sequenz der ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide mit Polypeptiden, die ähnliche Strukturen besitzen, sowie durch Durchführen einer Strukturanalyse der erfindungsgemäßen Polypeptiden bereitgestellt.
Der Begriff „Variante" umfasst auch ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die zum Hybridisieren unter mäßig stringenten Bedingungen (z.B. Vorwaschlösung von 5XSSC, 0,5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von 50 °C, 5 X SSC, über Nacht) oder höher stringenten Bedingungen an DNA Sequenzen, die ADAM Disintegrin-Domän-Polypetide kodieren, in der Lage sind und Polypeptide kodieren, die zumindest eine Aktivität beibehalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Integrin-Bindungsaktivität, Inhibierung von Endothelzell-Migration, und Inhibierung der Angiogenese. Der Fachmann kann zusätzliche Kombinationen von Salz und Temperatur bestimmen, die mäßige Hybridisierungsstringenz darstellen. Bedingungen höherer Stringenz umfassen höhere Temperaturen für die Hybridisierungs und Posthybridisierungswaschungen, und/oder niedere Salzkonzentrationen.
Mutationen können in Nukleinsäuren eingeführt werden, indem Oligonukleotide, die eine mutierte Sequenz enthalten, synthetisiert werden, die durch Restriktionsstellen flankiert sind, die die Ligation in Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Im Anschluss an die Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz eine Variante mit der gewünschten Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion. Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutagenese-Verfahren eingesetzt werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, in welchem bestimmte Kodons gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Das weithin bekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren kann auch verwendet werden, um einen DNA Sequenz, die ein gewünschtes Polypeptid oder Fragment davon kodiert, zu erzeugen oder zu amplifizieren. Oligonukleotide, die die gewünschten Termini der DNA Fragmente definieren, werden als 5' und 3' Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können zusätzlich Erkennungsstelle für Restriktionsendonukleasen enthalten, um die Insertion des amplifizierten DNA Fragments in einen Expressionsvektor zu fördern.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiters die Verwendung von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide mit oder ohne assoziiertem nativem Glycosylierungsmuster. ADAM-Disintegrin-Domäne, die in Hefe oder Säugetier Expresssionsystemen (z.B. COS-1 oder COS-7 Zellen) exprimiert wird, kann zu einem nativen ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid hinsichtlich des Molekulargewichtes und Glcosylierungsmuster ähnlich sein oder zu diesem signifikant unterschiedlich sein, in Abhängigkeit der Wahl des Expressionssystems. Expression von ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptide in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, liefert nicht-glycosylierte Moleküle. Unterschiedliche Wirtszellen können auch Polypeptide unterschiedlich bearbeiten, was zu heterologen Mischungen von Polypeptiden mit variablen N- oder C-Termini führt.
Die primäre Aminosäure-Struktur von ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptide kann modifiziert werden, um Derivate zu erzeugen, indem kovalente oder aggregative Konjugate mit anderen chemischen Anteilen, wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphate, Acetylgruppen und dergleichen gebildet werden. Kovalente Derivate von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide können durch Verbinden von bestimmten funktionellen Gruppen an die ADAM Disintegrin-Domän-Aminosäure-Seitenketten oder an den N-Terminus oder C-Terminus eines ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid hergestellt werden.
Fusionspolypeptide von ADAM-Disintegrin-Domänen, die beim Ausführen der Erfindung nützlich sind, umfassen kovalente oder aggregative Konjugate von ADAMdis oder seinen Fragmenten mit anderen Polypeptiden, wie z.B. durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Eine Klasse von Fusionspolypeptiden ist unten im Zusammenhang mit ADAM Disintegrin-Oligomeren diskutiert. Als ein anderes Beispiel kann ein Fusionspolypeptid ein Signalpeptid (welches auch abwechselnd als eine Signalsequenz, Leitpeptid, Leitsequenz, oder Leader bezeichnet wird) an der N-terminalen Region oder C-terminalen Region eines ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptids aufweisen, welches den Transfer des Polypeptids von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand co-translatorisch oder post-translatorisch steuert. Es ist besonders vorteilhaft, ein Signalpeptid, das die extrazelluläre Sekretion fördert, an den N-Terminus eines löslichen ADAMdis-Polypeptids zu fusionieren. In diesem Fall wird das Signalpeptid typischerweise bei der Sekretion des löslichen Polypeptids aus der Zelle abgeschnitten.
Sezernierte lösliche Polypeptide können durch Trennen intakter Zellen, die das gewünschte Polypeptid exprimieren, von dem Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugation, und Untersuchen des Mediums (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Polypeptids identifiziert werden (und von seinen nicht-löslichen Membran-gebundenen Gegenstücken unterschieden werden). Die Gegenwart des gewünschten Polypeptids im Medium deutet an, dass das Polypeptid aus den Zellen sezerniert wurde und somit eine lösliche Form des Polypeptids ist. Lösliche Polypeptide können durch eine beliebige von einer Reihe von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine DNA Sequenz, die ein gewünschtes lösliches Polypeptid kodiert, kann in einen Expressionsvektor für die Herstellung des Polypeptids subkloniert werden, oder das gewünschte kodierende DNA Fragment kann chemisch synthetisiert werden.
Lösliche ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide weisen die gesamte oder einen Teil der ADAM Disintegrin-Domäne auf, mit oder ohne zusätzliche Segmente von dem extrazellulären Abschnitt der ADAM (wie die Cystein-reiche Region), jedoch fehlt im Allgemeinen eine Transmembran-Domäne, die die Zurückhaltung des Polypeptids an der Zelloberfläche bewirken würde. Lösliche Polypeptide können einen Teil der Transmembran-Domäne oder die gesamte oder einen Teil der cytoplasmatischen Domäne enthalten, solange das Polypeptid aus der Zelle, in welcher es erzeugt wird, sezerniert wird. Beispiele von löslichen ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden sind in den Beispielen bereitgestellt. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine multimere Form eines löslichen ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptids verwendet, um die Integrinbindung an Liganden und somit die Integrin biologische Aktivität zu inhibieren. Das lösliche ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid wird verwendet, um die Endothelzell-Migration und/oder Angiogenese zu inhibieren. Diese inhibitorischen Aktivitäten können sowohl Integrin-vermittelte und Integrin-unabhängige Mechanismen umfassen.
ADAM Disintegrin-Domän-Multimere sind kovalent-gebundene oder nichtkovalent-gebundene Multimere, einschließlich von Dimeren, Trimeren und höheren Multimeren. Oligomere können durch Disulfidbindungen, die zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden gebildet sind, verbunden sein. Eine Ausführungsform der Erfindung ist auf Multimere gerichtet, die mehrere ADAM Disintegrin-Domän Polypeptide aufweisen, die über kovalente oder nicht-kovalente Interaktionen zwischen den Peptidanteilen, die an die ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide fusioniert sind, verbunden sind. Solche Peptide können Peptidlinker (Spacer), oder Peptide sein, die die Eigenschaft des Förderns der Multimerisierung besitzen. Leucin-Zipper und bestimmte Polypeptide, die von Antikörper abgeleitet sind, sind unter den Peptiden, die die Multimerisierung von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden, die daran angehängt sind, fördern, wie später detaillierter beschrieben ist. In bestimmten Ausführungsformen weisen die Multimere von zwei bis vier ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide auf.
In einigen Ausführungsformen wird ein ADAM Disintegrin-Domän-Multimer unter Verwendung von Polypeptiden, die von Immunglobulinen abgeleitet sind, hergestellt. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide aufweisen, die an verschiedene Abschnitte von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, wurde z.B. durch Ashkenazi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535, 1991); Byrn et al., (Nature 344:677, 1990); und Hollenbaugh und Aruffo („Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins" in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, Seiten 10.19.1-10.19.11, 1992) beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein ADAM Disintegrin-Domän (ADAMdis) Dimer gerichtet, das zwei Fusionspolypeptide aufweist, die durch Fusionieren einer ADAM Disintegrin-Domäne an ein Fc-Polypeptid erzeugt wurden. Eine Genfusion, die das ADAMdis-Fc-Fusionspolypeptid kodieren, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt. ADAMdis-Fc-Fusionspolypeptide werden in Wirtszellen exprimiert, die dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind, und es wird ihnen ermöglicht, sich ähnlich wie Antikörpermoleküle zusammenzufinden, woraufhin sich Interketten-Disulfidbinden zwischen den Fc-Anteilen bilden, um divalente lösliche ADAMdis-Polypeptide zu ergeben. Der Begriff „Fc-Polypeptid", so wie hierin verwendet, umfasst native und Muteinformen von Polypeptiden, die von der Fc Region eines Antikörpers abgeleitet sind. Verkürzte Formen von solchen Polypeptiden, die die Hinge-Region enthalten, die die Dimerisation fördert, sind ebenfalls eingeschlossen.
Ein geeignetes Fc Polypeptid, beschrieben in der PCT Anmeldung WO 93/10151, ist ein Einzelkettenpolypeptid, das sich von der N-terminalen Hinge-Region zu dem nativen C-Terminus der Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein anderes nützliches Fc Polypeptid ist das im U.S. Patent 5.457.035 und von Baum et al., EMBO J. 13:3992, 1994 beschriebene Fc Mutein. Die Aminosäuresequenz dieses Muteins ist identisch zu jener der nativen Fc Sequenz, die in WO 93/10151 dargestellt ist, im Ausnahme, dass die Aminosäure 19 von Leu auf Ala geändert wurde, die Aminosäure 20 von Leu auf Glu geändert wurde, und Aminosäure 22 von Gly auf Ala geändert wurde. Das Mutein zeigt eine verringerte Affinität für Fc Rezeptoren. Fusionspolypeptide, die Fc Anteile aufweisen, und davon gebildete Multimere, bieten einen Vorteil der leichten Reinigung durch Affinitätschromatographie über Protein A oder Protein G Säulen, und Fc Fusionspolypeptide können eine längere in vivo Halbwertszeit bieten, die bei therapeutischen Anwendungen nützlich ist, als unmodifizierte Polypeptide.
In anderen Ausführungsformen kann ein lösliches ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid durch den variablen Abschnitt einer schweren oder leichten Kette eines Antikörpers ersetzt werden. Falls Fusionsproteine mit sowohl der schweren als auch den leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein ADAM Disintegrin-Domäm-Multimer mit bis zu vier löslichen ADAM Disintegrin Domän-Polypeptiden zu bilden.
Alternativ ist das ADAM Disintegrin-Domän-Multimer ein Fusionspolypeptid, das multiple ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide aufweist, mit oder ohne Peptidlinker (Spacer), oder Peptide aufweist, die die Eigenschaft des Fördern der Multimerisierung besitzen. Unter den geeigneten Peptidtinkern sind jene, die im U.S. Patent 4.751.180 und 4.935.233 beschrieben sind. Eine DNA Sequenz, die einen gewünschten Peptidlinker kodiert, kann zwischen, und in den gleichen Leserahmen wie, die DNA Sequenzen, die ADAMdis kodieren, unter Verwendung von herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das den Linker kodiert, zwischen Sequenzen, die die ADAMdis kodieren, ligiert werden. In bestimmten Ausführungsformen weist ein Fusionsprotein von zwei bis vier ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide auf, die durch Peptidlinker getrennt sind.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen von ADAM Disintegrin-Domän-Multimeren umfasst die Verwendung einer Leucin-Zippers-Domäne. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die die Multimerisierung der Proteine, in welchen sie gefunden werden, fördern. Leucin-Zippers wurden ursprünglich in mehreren DNA-Bindungsproteinen identfiziert (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988) und wurden seit damals in einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen gefunden. Unter den bekannten Leucin-Zippers sind natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren. Beispiel von Leucin-Zipper Domänen, die für das Herstellen von löslichen oligomeren Proteinen geeignet sind, sind in der PCT Anmeldung WO 94/10308 beschrieben, und der von dem Lungen-Surfactant-Protein D (SPD) abgeleitete Leucin-Zipper, der in Hoppe et al. FEBS Lett. 344:191, 1994 beschrieben ist. Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers, der die stabile Trimerisierung eines daran fusionierten heterologen Proteins ermöglicht, ist in Fanslow et al., Semin. Immunol. 6:267, 1994 beschrieben. Rekombinante Fusionspolypeptide, die ein ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid aufweisen, die an ein Leucin-Zipper-Peptid fusioniert sind, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert, und das ADAM Disintegrin-Domän-Multimer, das sich bildet, wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
C. Rekombinante Herstellung von ADAM Disintegrin Domän-Polypeptiden
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide können unter Verwendung eines rekombinanten Expressionssystems hergestellt werden. Mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der das ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid kodiert, transformierte Wirtszelle werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der ADAM Disintegrin-Domäne fördern und die ADAM Disintegrin-Domäne wird gewonnen. ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide können auch in transgenen Pflanzen oder Tieren erzeugt werden.
Jedes geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden. Rekombinante Expressionsvektoren beinhalten DNA, die ein ADAM-Disintegrin-Domän-Polypeptid kodieren, die mit geeigneten transkriptionalen und translationalen regulatorischen Nukleotidsequenzen, wie jene, die von einem Säugetier, mikrobiellen, viralen, oder Insektengen abgeleitet sind, wirksam verbunden sind. Nukleotidsequenzen sind wirksam verbunden, wenn die regulatorische Sequenz, die ADAM Disintegrin-Domän-DNA Sequenz funktionell betrifft. Folglich ist eine Promotor Nukleotidsequenz mit einer ADAM Disintegrin-Domän DNA Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn die Promotor Nukleotidsequenz die Transkription der ADAM- Disintegrin-Domän DNA Sequenz steuert. Beispiele von regulatorischen Sequenzen umfassen transkriptionale Promotoren, Operatoren, oder Enhancer, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle, und geeignete Sequenzen, die die Transkription und Translation-Initiierung und Termination steuern. Eine Sequenz, die ein geeignetes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodiert, kann in Expressionsvektoren eingeführt werden. Eine DNA Sequenz für ein Signalpeptid (Signalsequenz) kann im Rahmen an die ADAM Disintegrin Domän-Sequenz fusioniert sein, so dass das ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptid anfänglich als ein Fusionsprotein, das das Signalpeptid aufweist, translatiert wird. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktionell ist, fördert die extrazelluläre Sekretion des ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem ADAM Disintegrin- Domän-Polypeptid bei der Sekretion aus der Zelle abgespalten. Geeignete Wirtszellen für die Expression von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden umfassen Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryotische Zellen, einschließlich Insekten- und Säugetierzellen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe, Insekten-, und Säugetierzellwirten sind im Stand der Technik bekannt.
Unter Verwendung der Techniken von rekombinanter DNA, einschließlich Mutagenese und der Polymerase Kettenreaktion (PCR), kann der Fachmann DNA Sequenzen erzeugen, die ADAM Disintegrin Domän Polypeptide kodieren, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäure-Resten oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen aufweisen, einschließlich ADAM Disintegrin-Domän-Fragmenten, Varianten, Derivaten, Multimeren, und Fusionspolypeptiden.
Die Prozeduren für das Reinigen von exprimierten ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden wird gemäß dem eingesetzten Wirtsystem variieren und ob das rekombinante Polypeptid sezerniert wird oder nicht. ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide können unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden, einschließlich von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion, Affinitätsreinigung, HPLC, oder Größenauschlusschromatographie-Schritten. Fusionspolypeptide, die Fc Anteile aufweisen (und davon gebildete Multimere) bieten den Vorteil der leichteren Reinigung durch Affinitätschromatographie an Protein A oder Protein G Säulen.
D. Therapeutische Verfahren
Die offenbarte Verwendung von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden bei der Herstellung eines Medikamentes kann verwendet werden, um die Integrinbindung und Integrin biologische Aktivität zu inbibieren und um die Endothelzellmigration und/oder Angiogenese in einem Säugetiere, das Bedarf an einer solchen Behandlung hat, zu inhibieren. Das Medikament wird vorteilhafterweise verabreicht, um den Ausbruch oder die Wiederkehr einer Krankheit oder eines Zustandes, die/der durch ein Integrin vermittelt ist, zu verhindern oder um ein Säugetier zu behandeln, das eine Krankheit oder einen Zustand aufweist, die/der durch ein Integrin vermittelt ist.
Beispiele von den therapeutischen Verwendungen von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden und Zusammensetzungen davon umfassen die Behandlung von Individuen, die an Erkrankungen leiden, die durch Angiogenese vermittelt sind, wie z.B. Augenkrankheiten, dermatologische Erkrankungen, und maligne oder metastatische Zustände, entzündliche Erkrankungen, Osteoporose und andere Zustände, die durch eine beschleunigte Knochenresorption vermittelt sind, Restenose, unangemessen Blutplättchen-Aktivierung, -Rekrutierung, oder Aggregation, Thrombose, oder einen Zustand, der die Gewebereparatur oder Wundheilung erfordert.
Unter den Augenkrankheiten, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Augenkrankheiten, die durch okulare Neovaskularisierung gekennzeichnet sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, diabetische Retinopathie (eine Hauptkomplikation von Diabetes), Retinopathie bei Frühgeburt (diese verheerende Augenkrankheit, die häufig zu chronischen Sehproblemen führt und ein hohes Risiko für Blindheit besitzt, ist eine schwere Komplikation, während der Pflege von Frühgeburten), neovasuläres Glaucom, Retinobalstom, retrokristalline Fibroplasie, Rubeosis, Uveitis, Makuladegeneration, und Hornhaut-Transplantat-Neovaskularisierung. Andere entzündliche Augenkrankheiten, okulare Tumore, und Krankheiten, die mit choroidaler oder Iris-Neovaskularisierung assoziiert sind, können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um maligne und metastatische Zustände zu behandeln, wie solide Tumore. Solide Tumore umfassen sowohl primäre als auch metastatische Sarkome und Karzinome.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um entzündliche Krankheiten zu behandeln, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Arthritis, Rheumatismus, entzündliche Darmkrankheit, und Psoriasis.
Unter den Zuständen, die durch eine unangemessene Blutplättchen-Aktivierung, Rekrutierung, Aggregation oder Thrombose vermittelt sind, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Koronararterie-Erkrankung oder Verletzung, Myokardinfarkt oder Verletzung, im Anschluss an einen Myokardinfarkt, Schlaganfall, unstabile Angina, Atherosklerose, Arteriosklerose, Präeklampsie, Blutplättchen-assoziierte ischämische Störungen, einschließlich Lungenischämie, koronare Ischämie, und cerebrale Ischämie, Restenosis im Anschluss an perkutane koronare Intervention einschließlich Angioplastie, Atherektomie, Stent-Einbringung, und Bypass-Operation, thrombotische Störungen, einschließlich Koronararterien-Thrombose, cerebrale Arterienthrombose, endokardiale Thrombose, periphere Arterienthrombose, venöse Thrombose, Thrombose und Koagulopathien, die mit der Exposition zu einer fremden oder verletzten Gewebeoberfläche assoziiert sind, und Reokklusion im Anschluss an Thrombose, tiefe Venenthrombose (DVT), pulmonale Embolie (PE), vorübergehende ischämische Attacken (TIAs), und andere Zustände, bei denen die vaskuläre Okklusion ein häufiges zugrundeliegendes Merkmal ist. Bei einigen Ausführungsformen werden die Verfahren gemäß der Erfindung in Individuen verwendet, die ein hohes Risiko für die Thrombus-Bildung oder Reformation, vorgeschrittene Koronararterie-Erkrankung, oder für Okklusion, Reokklusion, Stenose, und/oder Restenose von Blutgefäßen oder Schlaganfall besitzten. Die Verfahren gemäß der Erfindung können in Kombination mit Angioplastie-Verfahren, wie Ballon-Angioplastie, Laser-Angioplastie, koronare Atherektomie, oder ähnliche Techniken, Karotisendarterektomie, Anastomose von vaskulären Transplantaten, Operation mit einem hohen Thrombusbildungsrisiko (z.B. koronare Bypass-Operation, Insertion eines prosthetischen Ventils oder Gefäßes und der gleichen), Atherektomie, Stent-Einbringung, Anordnung eines chronischen kardiovaskulären Gerätes, wie eines Dauerkatheters oder prosthetischen Ventils oder Gefäßes, Organtransplantat, oder Bypass-Operation.
Andere Krankheiten und Zustände, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen benigne Tumore und präneoplastische Zustände und mykcardiale Angiogenese.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können in in vivo Tiermodellen für die gewünschte prophylaktische oder therapeutische Aktivität getestet werden, sowie um die optimale therapeutische Dosierung vor der Verabreichung an Menschen zu bestimmen.
Die Menge eines bestimmten ADAM Disintegrin Domän Polypeptids, die bei einem bestimmten Behandlungsverfahren effektiv sein wird, hängt vom Alter, Art und Schwere des zu behandelnden Zustandes, Körpergewicht, gewünschte Behandlungsdauer, Verabreichungsmethode und anderen Parametern ab. Effektive Dosierungen werden durch einen Arzt oder durch anderes qualifiziertes medizinisches Personal bestimmt. Typische wirksame Dosierungen sind etwa 0,01 mg/kg bis etwa 100mg/kg Körpergewicht. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosierung etwa 0,1-50 mg/kg; in einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosierung etwa 0,5-10 mg/kg. Die Dosierung für die lokale Verabreichung ist üblicherweise geringer als für die systemische Verabreichung. Bei einigen Ausführungsformen ist eine einzelne Verabreichung ausreichend; in einigen Ausführungsformen wird die ADAM Disintegrin-Domäne in mehreren Dosen über einen oder mehrere Tage verabreicht.
Die ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide sind typischerweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger aufweist. Zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern zählen Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Adjuvanzien, Exzipienten, und Vehikel, die für die Verabreichungsroute pharmazeutisch akzeptabel sind, und können wässrige und ölige Suspensionen sein, die unter Verwendung geeigneter Dispergiermittel, Benetzungs- und Suspendiermittel formuliert sind.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Allgemeinen sterile und pryrogenfreie Mittel, und können Wasser, Öle, Lösungsmittel, Salze, Zucker, und andere Kohlenhydrate, Emulgatoren, Puffer, antimikrobielle Substanzen, und Chelatbildner beinhalten. Der jeweilige pharmazeutisch akzeptable Träger und das Verhältnis des aktiven Wirkstoffs zu Träger werden durch die Löslichkeit und chemischen Eigenschaften der Zusammensetzung, die Verabreichungsart und pharmazeutische Standardpraxis bestimmt.
Die ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide werden einem Patienten auf eine Art und Weise verabreicht, die für die Indikation angemessen ist. Somit können zum Beispiel die ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptide, oder pharmazeutische Zusammensetzungen davon, intravenös, transdermal, intradermal, intraperitoneal, intramuskuläre, intranasal, epidural, oral, topisch, subkutan, intrakavitär, verzögerte Freisetzung aus Implantaten, peristaltische Wege, oder durch jede andere geeignete Technik verabreicht werden. Parenterale Verabreichung ist bevorzugt.
In bestimmten Ausführungsformen der beanspruchten Erfindung weist die Behandlung weiters das Behandeln des Säugetiers mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffen auf. Die zusätzlichen therapeutischen Wirkstoffe können vor, gleichzeitig mit oder im Anschluss an die Verabreichung des ADAM Disintegrin Domän Polypeptids verabreicht werden. Die Verwendung von mehr als einem therapeutischen Wirkstoff ist besonders vorteilhaft, wenn das behandelte Säugetier einen soliden Tumor aufweist. In einigen Ausführungsformen der beanspruchten Erfindung weist die Behandlung weiters das Behandeln des Säugetiers mit Strahlung auf. Strahlung, einschließlich Brachytherapie und Teletherapie, kann vor, gleichzeitig mit, oder im Anschluss an die Verabreichung des ADAM Disintegrin Domän Polypeptids und/oder zusätzlichem(n) therapeutischen Wirkstoff(en) verabreicht werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Verabreichung von, zusätzlich zu einem ADAM Disintegrin Domän Polypeptid, einem oder mehreren Therapeutika, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten, Vinca-Alkaloiden und anderen von Pflanzen-abgeleiteten Chemotherapeutika, Antitumor-Antibiotika, Antitumor-Enzyme, Topoisomerase-Inhibitoren, Platin-Analoga, adrenokortikale Suppressiva, Hormone und Antihormone, Antikörper, Immuntherapeutika, Radiotherapeutika und Modifikatoren der biologischen Reaktion.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Verabreichung von, zusätzlich zu einem ADAM Disintegrin Domän Polypeptid, einem oder mehreren Therapeutika, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cisplatin, Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Melphalan, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, und Vinblastin, Lymphokinen und Cytokinen wie Interleukinen, Interferonen (alpha, beta, oder delta) und TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff, Methylhydrazin, Mitotan, Tamoxifen, Fluoxymesteron, IL-8 Inhibitoren, Angiostatin, Endostatin, Kringle5, Angiopoietin-2 oder andere Antagonisten von Angiopoietin-1, Antagonisten des Blutplättchen-aktivierenden Faktors, Antagonisten des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors und COX-2 Inhibitoren.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Verabreichung von, zusätzlich zu einem ADAM Disintegrin Domän Polypeptid, einem oder mehreren therapeutischen Polypeptiden, einschließlich löslichen Formen davon, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Flt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, anti-4-1BB Antikörper, TRAIL, TNF Antagonisten und TNF Rezeptor-Antagonisten, einschließlich TNFR/Fc, Tek Antagonisten, TWEAK Antagonisten und TWEAK-R Antagonisten, einschließlich TWEAK-R/Fc, VEGF Antagonisten einschließlich anti-VEGF Antikörper, VEGF Rezeptor-Antagonisten (einschließlich VEGF-R1 und VEGF-R2, auch als F1t1 und F1k1 oder KDR bekannt), CD148 Bindungsproteine (auch als DEP-1, ECRTP, und PTPRJ bezeichnet, siehe Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10:2135-45, 1999; und PCT Veröffentlichungsnummer WO 00/15258, 23. März 2000) und Nectin-3-Antagonisten.
Die ADAM Disintegrin Domän-Polypeptide der Erfindung können als eine Komponente von, oder in Kombination mit einer „metronomischen Therapie" verwendet werden, so wie jene die von Browder et al., und Klement et al. (Cancer Research 60:1878, 2000; J. Clin. Invest. 105(8):R15, 2000; siehe auch Barinaga, Science 288:245, 2000) beschrieben ist.
So wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe „Therapie", „therapeutisch", „behandeln", und „Behandlung" die Prophylaxe, d.h. Verhinderung, zusätzlich zu der Therapie oder Behandlung einer bestehenden Krankheit oder eines bestehenden Zustandes. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden als eine Erstlinien-Behandlung, für die Behandlung der verbleibenden Krankheit im Anschluss an die primäre Therapie, oder als einen Zusatz zu anderen Therapien. Verfahren zum Messen der biologischen Wirksamkeit sind im Stand der Technik bekannt und werden in den Beispiel später beschrieben.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind beabsichtigt, um bestimmte Ausführungsformen zu illustrieren und nicht, um den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
ADAM Disintegrin Domän Polypeptide
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren für die rekombinante Herstellung von ADAM Disintegrin Domän Polypeptiden.
Expressionskassetten, die eine IgKappa Leitsequenz, ADAM Disintegrin-Domäne und C-terminale Fc Region kodieren, wurden in bakteriellen Plasmiden konstruiert, dann in eukaryotische Expressionvektoren (pDC409, EMBO J. 10:2821, 1991, oder anderen Säugetier Expressionsvektoren) transferiert. Die Kodierungsregionen von verschiedenen Konstrukten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Zusätzlich zu der Disintegrin-Domäne kodieren diese Konstrukte zusätzliche Abschnitte des extrazellulären Abschnittes des ADAMs (z.B. die Cystein-reiche Region und EGF-artige Domäne).
Die Expressionsvektoren wurden in COS-1, CV-1/EBNA, oder 293/EBNA Zellen transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit ³⁵S für vier Stunden markiert. Überstände und Gesamtzelllysate wurden hergestellt und Aliquote wurden unter Verwendung von Protein-A-Sepharosekügelchen immunpräzipitiert, um die Fc-markierten Polypeptide einzufangen. ³⁵S markierte ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide wurden auf 8-16% reduzierenden Gelen analysiert und mittels Autoradiographie ermittelt.
Der Zelltyp, der das meiste lösliche Protein im Überstand erzeugt, wurde in einer transienten Transfektion in einem großen Maßstab (T-175 Format, 20 Flaschen) verwendet, und etwa ein Liter Überstand wurde nach einer Woche geerntet. ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide wurden aus den Überständen unter Verwendung der Affinitätschromatographie (Protein A Säule) gereinigt. Die Polypeptide wurden durch Bestimmen der N-terminalen Aminosäure-Sequenz, Aminosäure-Zusammensetzung und Protein-Integrität (SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen) charakterisiert, bevor die Polypeptide im FACS, Immunpräzipitation, und biologische Untersuchungen, wie jene, die später beschrieben sind, verwendet wurden. Tabelle 2 ADAM Disintegrin Domän-Polypeptid-Konstrukte

¹ Reste in der Polypeptid-Sequenz
² die vorausgesagte Spaltungsstelle ist nach Rest 20
³ des Konstruktes, das ADAMdis umfasst, aber auch zusätzliche ADAM Sequenz enthalten kann
⁴ Disintegrin-Rahmenwerk, z.B., SEQ ID NO: 20

Beispiel 2
Bindung von ADAM Disintegrin-Domän-Polypeptiden an Zellen
A. Bindung an Endothelzellen
Dieses Beispiel beschreibt eine flusszytometrische Intregin mAb basierende Bindungsinhibierungsuntersuchung, welche verwendet wird, um die Bindung von ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptiden an Integrine, die auf der Oberfläche von Endothelzellen exprimiert werden, zu zeigen. Humane Endothelzellen exprimieren α_vβ₃, α_vβ₅, β₁, β₄, α₁, α₂, α₃, α₄, α₅ und α₆ Integrine.
Primäre humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEC-d) wurden in ergänztem endothelialem-Wachstumsmedium (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) gehalten. Es wurde von den im Beispiel 1 erzeugten ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide gezeigt, dass sie spezifisch an HMVEC-d binden. Es wurde gezeigt, dass monoklonale Antikörper, die für humane Integrine α_vβ₃ (LM609, anti CD51/61, Chemicon, Temecula, CA Brooks et al., Science 264:569, 1994), α₂β₁ (BHA2.1 anti CD49b, Chemicon, Wang et al., Mol. Biol of the Cell 9:865, 1998), α₅β₁ (SAM-1 anti CD49e, Biodesign, A. te Velde et al., J. Immunol. 140:1548, 1988); α₃β₁ (ASC-6 anti CD49c, Chemicon, Pattaramalai et al., Exp. Cell. Res. 222:281, 1996), α₄β₁ (HP2/1 anti CD49d, Immunotech, Marseilles, France, Workshop der 4. Internationalen Konferenz über humane Leukozyten-Differenzierungsantigene, Wien, Österreich, 1989, Workshop-Nr. p091), α₆β₁ (GoH3 anti CD49f, Immunotech, Workshop der 4. Internationalen Konferenz über humane Leukozyten-Differenzierungsantigene, Wien, Workshop-Nr. p055), α₆β₄ (439-9B anti CD104, Pharmingen, San Diego, CA., Schlossman et al., 1995 Leukocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York), und α_vβ₅ (MAB 1961, Chemicon International, monoklonal anti-human integrin α_vβ₅ mAb, Igel isotype, inhibits α_vβ₅ mediated binding/adhesion to vitronectin/fibronectin; Weinaker, et al., J. Biol. Chem. 269:6940, 1994) spezifisch sind, ebenfalls spezifisch an HMVEC-d binden. Jeder dieser Antikörper ist bekannt dafür, dass er die Bindung des angegebenen Integrins an seine Liganden (z.B. Fibronektin, Vitronektin, Figrinogen) spezifisch blockiert. Die Fähigkeit von Integrin mAbs, die Bindung von ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptiden zu inhibieren, offenbarte, welche Integrine die Disintegrin-Domänen binden, und indirekt, welche Integrin-Bindungsaktivitäten in der Lage sind, die Disintegrin-Domänen zu antagonisieren. Die Fähigkeit der Antikörper, die Bindung der ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide an Endothelzellen zu inhibieren, wurde wie unten beschrieben getestet.
Vor dem Durchführen der Bindungsstudien wurden die HMVEC-d aus den Kulturgefäßen unter Verwendung von Trypsin-EDTA entfernt. Die Zellen wurden in Medien, die Serum enthalten, gewaschen und in Bindungsmedium, das aus PBS, das 1 mM Ca2+, 1 mM Mg2+ und 0,5 mM Mn2+, 0,1 % Natriumazid, 10% normales Ziegenserum, 2% Kaninchenserum und 2% fötales Rinderserum enthält, besteht, resuspendiert. Unter diesen Bindungsbedingungen banden alle ADAM-8, -9, -10, -15, -17, -20, -21, -22, -23, und -29dis-Fc an humane Endothelzellen.
Ein Hundert Mikroliter Zellsuspension, die 200.000 bis 500.000 HMVEC-d enthalten, wurden in 12 × 75 mm Plastikteströhrchen gegeben. Monoklonale Antikörper, die für eines der Integrine spezifisch sind, oder ein monoklonaler Kontroll-Antikörper (CD29 oder M15) wurden zu der Zellsuspension bei einer Konzentration von 100 μg/ml (5-8 facher Massenüberschuss) 15 Minuten vor der Zugabe von Disintegrin-Fc-Fusionproteinen hinzugefügt. ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide und Kontroll- Fc Fusionspolypeptide (P7.5II.Fc) wurden bei verschiedenen Konzentrationen von 12,5 bis 20 μg/ml zu der Zellsuspensionen hinzugefügt und für 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Ungebundene Fc Polypeptide wurden durch Zentrifugation der Zellen in 2ml Bindungsmedien weggewaschen. Die gewaschenen Zellpellets wurden in Bindungsmedium resuspendiert und dann bei 30°C für 30 Minuten mit Ziegen-anti-humanem Fc-spezifischem biotinyliertem Antikörper bei einer Konzentration von 2,5 μg/ml für 30 Minuten inkubiert. Nach der Zentrifugation und Waschen der Zellpellets wurden die Zellen in Bindungsmedium resuspendiert und gebundenes anti-humanes Fc-Biotin wurde durch Hinzufügen von Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat zu der Zellsuspension bei einer 1:1000 Verdünnung (1μg/ml) und Inkubation bei 30°C für 30 Minuten ermittelt. Das ungebundene Streptavidin-Phycoeryrhtin wurde weggewaschen und die Zellen in Bindungsmedium, das Propidumiodid enthält, resuspendiert. Das Ausmaß der Fluoreszenzbindung (Disintegring-Fc-Bindung) wurde durch Flusszytometrie bestimmt.
Das Ausmaß der Bindung von jedem ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptid wurde in der Gegenwart von Anti-Integrin-spezifischen mAb und in der Gegenwart von Kontroll-mAb bestimmt. Sowohl die Intensität der Bindung (MFI) und der Prozentsatz an bindenden Zellen wurden bestimmt. Die prozentuelle Inhibierung wurden unter Verwendung der Formel [1-(MFI-Kontrolle-MFI Integrin mAb)/MFI Kontrolle] berechnet. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
ADAM-15, -17, -20, und -22 Disintegrin Domän Polypeptide banden an α_vβ₃; ADAM 23 Disintegrin Domän Polypeptid band an α₂β₁; ADAM-15,-21,-22 und -23 Disintegrin-Domän-Polypeptide banden an α₅β₁; ADAM-10, -17, -22, und -23 Disintegrin Domän Polypeptide banden an α₆-Integrine; ADAM-10 und -152 Disintegrin Domän Polypeptide banden an α_vβ₅. Ein Überschuss an einem nicht blockierenden α_vβ₅-Antikörper beeinflusste die Bindung von ADAM-10, -22, und -23 Disintegrin-Polypeptiden an Endothellzellen signifikant, was darauf hinweist, dass diese ADAMdis-Polypeptide mit Integrinstellen, abgesehen von oder zusätzlich zu den Liganden (z.B. Fibronektin, Vitronektin) Bindungsstellen interagieren. Basierend auf den Ergebnissen von einer unterschiedlichen Untersuchungsart haben Cal et al. berichtet, dass die ADAM-23 Disintegrin-Domäne mit dem α_vβ₃-Integrin durch einen RGD-unabhängigen Mechanismus interagiert (Molec. Biol. of the Cell, 11:1457, 2000).
Bindungsexperimente wurden unter Verwendung anderer ADAM Disintegrin-Domänen und anderer monoklonaler Antikörper wiederholt. ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide, die an ausgewählte Integrine binden, werden weiters auf die Fähigkeit getestet, die Integrin-Ligand-Interaktionen zu stören und um die Endothelzellfunktion, Angiogenese, und andere biologische Aktivitäten in vitro und in vivo zu modulieren.
B. Bindung an primäre humane T-Zellen
Primäre humane T-Zellen wurden aus Vollblut gereinigt. Diese Zellen wurden in FACS Experimenten verwendet, um die Zelloberflächenbindung von gereinigten ADAMdis-Fc-Polypeptiden zu beurteilen. Die ADAMdis-Fc-Bindung wurde mit und ohne Con A (5 μg/ml) oder immobilisiertem OTK3 Antikörper (1 mg/ml immobilisiert für 1 Stunde, 37°C) Stimulation beurteilt. ADAMdis-Fc-Polypeptide (20 μ/ml) wurden entweder bei 4°C oder 30°C in der Gegenwart von Kationen (Ca++, Mg++, Mn++, jeweils 0,5 mM) gebunden. Die Zelloberflächen-Integrinexpression wurde unter Verwendung einer Gruppe von Maus und Ratten antihumanen Integrin-Antikörpern beurteilt. α_vβ₅, α₁, α₃, α₄, α₆, β₁ und β₇-Integrine wurden auf der Oberfläche dieser Zellen detektiert. ADAMdis-Fc Polypeptide banden nicht an primäre T-Zellen bei 4°C. ADAM-8-, ADAM-9-, ADAM-15-, ADAM-20-, ADAM-21-, ADAM-22-, und ADAM-23-dis-Fc-Polypeptide banden primäre T-Zellen bei 30°C mit ConA Stimulation. ADAMdis-Fc-Bindung wurde durch einen dreifachen molaren Überschuss an Antikörpern gegen die oben aufgelisteten Integrine nicht inhibiert.
C. Bindung an ruhende Blutplättchen
Bindung von ADAMdis-Fc-Polypeptiden an mit Citrat-verstetzten, gewaschenen, ruhenden Blutplättchen wurde bei 4°C oder 30°C durchgeführt. Die Bindung wurde durch Flusszytometrie unter Verwendung eines biotionylierten antihumanen Fc spezifischen Antikörpers und Strepatvidin-PE analysiert. Ruhende Blutplättchen exprimieren die Integrine CD41/CD61 und CD49e. ADAM-9dis-Fc und ADAM-8dis-Fc banden ruhende Blutplättchen bei 30°C, nicht jedoch bei 4°C. ADAM-9dis-Fc Bindung an ruhende Blutplättchen bei 30°C wurde durch einen zehnfachen Überschuss an CD41 a mAb nicht inhibiert.
Bindung 3
Aktivität von ADAM Disintegrin Domän-Polypeptiden in einer Wundverschlussuntersuchung
Eine planare Endothelzell-Migration (Wundverschluss) Untersuchung wurde verwendet, um die Inhibierung der Angiogenese durch ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptiden in vitro zu quantifizieren. In dieser Untersuchung wird die Endothelzell-Migration als die Verschlussrate einer kreisförmigen Wunde in einer kultivierten Zellmonoschicht gemessen. Die Rate des Wundverschlusses ist linear und wird durch Mittel, die die Angiogenese in vivo stimulieren und inhibieren, dynamisch reguliert.
Primäre humane renale mikrovaskuläre Endothelzellen, HRMEC, wurde isoliert, kultiviert, und bei dem dritten Durchgang nach dem Auftauen verwendet, wie in Martin et al., In vitro Cell Dev Biol 33:261, 1997 beschrieben. Replikatzirkuläre Läsionen, „Wunden", (600-800 Mikron Durchmesser) wurden in konfluenten HRMEC Monoschichten unter Verwendung einer Silicon-bestückten Bohrmaschine erzeugt. Zu dem Zeitpunkt des Verwundens wurde das Mediums (DMEM + 1 % BSA) mit 20 ng/m1 PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat), einem Bereich von Konzentrationen von ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptid, oder Kombinationen von PMA und ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptid ergänzt. Der restliche Wundbereich wurde als eine Funktion der Zeit (0-12 Stunden) unter Verwendung eines Mikroskops und Bildanalyse-Software (Bioquant, Nashville, TN) gemessen. Die relative Migrationsrate wurde für jeden Wirkstoff und jede Wirkstoffkombination durch lineare Regression der restlichen Wundfläche, dargestellt über die Zeit, berechnet. Die Inhibierung von PMA-induzierter Endothelzellmigration durch ADAM-Disintegrin-Fc-Polypeptide ist in Tabelle 4 gezeigt.
Die Wirkung von ADAM-dis-Fc-Polypetpide auf EGF-induzierte Migration wurde auch bestimmt. Für diese Experimente wurde EGF (epidermaler Wachstumsfaktor, 40 ng/ml) zu dem Medium, anstelle von PMA, zum Zeitpunkt des Verwundens hinzugefügt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 4 Wirkung von ADAM-15, -17, -20 und -23dis-Fc Polypeptiden in PMA-induzierter Endothelzell-Wundverschluss-Migrationsuntersuchung

¹Steigung zu im Durchschnitt Triplikat Y-Werten und als ein einzelner Datenpunkt behandelt, um zu testen, ob die Steigungen signifikant unterschiedlich sind.
²Daten in Klammer sind die +/– Standardfehler der Steigungen
³Prozentuelle im Vergleich zur Migrationsrate, die in Gegenwart von PMA beobachtet wurde.

¹Steigung zu im Durchschnitt Triplikat Y-Werten und als ein einzelner Datenpunkt behandelt, um zu testen, ob die Steigungen signifikant unterschiedlich sind.
²Daten in Klammer sind die +/– Standardfehler der Steigungen
³Prozentuelle Inhibierung im Vergleich zur Migrationsrate, die in Gegenwart von EGF allein beobachtet wurde.

ADAM-20 und -23dis-Fc Polypeptide zeigten die stärkste Inhibierung von sowohl EGF- als auch PMA-induzierter endothelialer Migration bei 15 μg/ml. ADAM-15 und -17dis-Fc-Polypeptide waren beim Inhibieren der Endothelzellmigration bei 15 μg/ml weniger wirksam. Hu IgG inhibierten die EGF- oder PMA-induzierte Endothelzellmigration in irgendeinem der durchgeführten Experimente nicht, wo es als ein Kontroll-Fc-Protein eingeschlossen war.
Beispiel 4
Eine Maus korneale Pocketuntersuchung wird verwendet, um die Inhibierung der Angiogenese durch ADAM-Disintegrin-Fc-Polypeptide in vivo zu quantifizieren. In dieser Untersuchung werden Wirkstoffen, die auf angiogene oder anti-angiogene Aktivität getestet werden, in einer verzögerten Freisetzungsform in einem Hydronpellet immobilisiert, die in Mikrotaschen implantiert werden, die in dem kornealen Epithelium von anästhesierten Mäusen gebildet sind. Die Vaskularisierung wird als das Erscheinen, Dichte und Ausmass des Gefäßeinwuchses von dem vaskularisierten kornealen Limbus in die normale avaskuläre Hornhaut gemessen.
Hydronpellets, wie in Kenyon et al., Inverst. Opthamol. & Visual Science 37:1625, 1996 beschrieben, umfassen Sucralfat mit bFGF (90 ng/Pellet), bFGF und IgG (11 μg/Pellet, Kontrolle), oder bFGF und einen Bereich von Konzentrationen von ADAM Disintegrin-Fc Polypeptiden. Die Pellets werden durch eine Operation in korneale stromale Mikrotaschen, die durch Mikrodissektion erzeugt werden, 1 mm medial zu dem lateralen kornealen Limbus von 6-8 Wochen alten männlichen C57BL Mäusen implantiert. Nach fünf Tagen, an der Spitze der neovaskulären Reaktion auf bFGF, wurden die Hornhäute unter Verwendung einer Zeiss-Spaltlampe, bei einem Eintrittswinkel von 35-50° von der Polarachse in dem Meridian, der das Pellet enthält, photographiert. Die Bilder wurden digitalisiert und durch substraktive Farbfilter (Adobe Photoshop 4,0) bearbeitet, um etablierte Mikrogefäße durch Hämoglobingehalt zu beschreiben. Bildanalyse-Software (Bioquant, Nashville, TN) wird verwendet, um die Fraktion des Hornhautbildes, die vaskularisiert ist, die Gefäßdichte innerhalb des vaskularisierten Bereiches und die Gefäßdichte innerhalb der Gesamthornhaut zu berechnen. Die Inhibierung von bFGF-induzierter kornealer Angiogenese, als eine Funktion der Dosis von ADAM-Disintegrin-Fc-Polypeptid, wird bestimmt.
Beispiel 5
Inhibierung der Neovaskularisierung durch ADAM Disintegrin Domän-Polypeptide in einem murinen Transplantatmodell.
Überleben von heterotopisch transplantiertem Herzgewebe von einem Mausdonator zu der Ohrhaut von einer anderen genetisch ähnlichen Maus erfordert die angemessene Neovaskularisation durch das transplantierte Herz und das umgebende Gewebe, um das Überleben und die Energie für die Herzmuskelfunktion zu fördern. Die unangemessene Vaskulatur an der Transplantationsstelle verursacht eine exzessive Ischämie des Herzens, Gewebeschädigung, und das Versagen des Gewebes, sich einzupflanzen. Wirkstoffe, die Faktoren, die in der Endothelzellmigration und Gefäßbildung eingebunden sind, antagonisieren, können die Angiogenese an der Transplantationsstelle verringern, wodurch die Transplantat-Gewebefunktion und schlussendlich die Aufpfropfung selbst beschränkt wird. Ein murines heterotopisches Herzisotransplantatmodell wird verwendet, um die antagonistische Wirkung von ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptiden auf die Neovaskularisation zu demonstrieren. Weibliche BALB/c (≈ 12 Wochen alt) Empfänger bekommen neonatale Herztransplantate von Donatormäusen desselben Stammes. Das Donator Herzgewebe wird in die linke Ohrpinnae des Empfängers am Tag 0 aufgepfropft und die Mäuse wurden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe empfängt humanes IgG (Hu IgG), während die andere Gruppe ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptid erhält, beide intraperitoneal. Die Behandlungen werden für fünf aufeinanderfolgende Tage fortgesetzt. Die Funktionalität der Transplantate wird durch Überwachen der sichtbaren pulsierenden Aktivitiät an den Tagen 7 und 14 nach der Aufpfropfung bestimmt. Die Inhibierung der funktionellen Aufpfropfung wird als eine Funktion der Dosis von ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptid bestimmt. Die Histologie des transplantierten Herzens wird untersucht, um die Wirkungen der ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptide auf das Ödem an der Transplantationsstelle und die Wirt- und Donatorgewebe-Vaskulator (z.B. unter Verwendung der Faktor VIII Färbung) zu visualisieren.
Beispiel 6
Behandlung von Tumoren mit ADAM Disintegrin Domän Polypeptiden ADAM Disintegrin-Fc-Polypeptiden werden in Tiermodellen von soliden Tumoren getestet. Die Wirkung der ADAM-Disintegrin-Fc-Polypeptide wird durch Messen der Tumorhäufigkeit und des Tumorwachstums bestimmt.
Die biologische Aktivität von ADAM-Disintegrin-Fc-Polypeptiden wird auch in anderen in vitro, ex vivo, und in vivo Untersuchungen, die dem Fachmann bekannt sind, wie Kalziummobilitätsuntersuchungen und Untersuchungen, um die Blutplättchen-Aktivierung, -Rekrutierung oder -Aggregation zu messen, demonstriert.
Die oben dargestellten Beispiele sind nicht beabsichtigt, vollständig zu sein oder den Umfang der Erfindung zu beschränken. Sequenzprotokoll:

Claims

Verwendung eines ADAM Disintegrindomäne-Polypetids, wobei die Disintegrindomäne eine RGD Sequenz nicht enthält, und wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, dies ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Aminosäuren 1-465 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 23-235 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1-446 von SEQ ID NO: 10, Aminosäuren 23-216 von SEQ ID NO:10, Aminosäuren 1-535 von SEQ ID NO:12, Aminosäuren 23-305 von SEQ ID NO: 12, Aminosäuren 1-523 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 23-293 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 1-542 von SEQ ID NO:16, Aminosäuren 23-312 von SEQ ID NO:16, Aminosäuren 1-540 von SEQ ID NO:18, Aminosäuren 23-310 von SEQ ID NO:18, Aminosäuren 1-528 von SEQ ID NO:22, Aminosäuren 23-298 von SEQ ID NO:22; (b) Fragmenten der Polypeptide von (a), wobei die genannten Fragmente die Inhibierung von Angiogeneseaktivität beibehalten; (c) Varianten der Polypeptide von (a) oder (b), wobei die genannten Varianten die Inhibierung von Angiogeneseaktivität beibehalten; und (d) Fusionspolypeptide, die die Polypeptide von (a), (b) oder (c) aufweisen, wobei die genannten Fusionspolypeptide die Inhibierung von Angiogeneseaktivität beibehalten, bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Angiogenese in einem Säugetier.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die ADAM Disintegrindomäne in Form eines Multimers vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Multimer ein Dimer oder Trimer ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Multimer ein Fc Polypeptid oder einen Leucinzipper enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die ADAM Disintegrindomäne eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäure 34-99 von SEQ ID NO:6, 34-93 von SEQ ID NO: 10, 34-91 von SEQ ID NO: 12, 34-91 von SEQ ID NO: 14, 34-92 von SEQ ID NO: 16, 34-91 von SEQ ID NO: 18, oder 34-91 von SEQ ID NO:22.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid eine Variante ist, die wenigstens zu 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, oder 99% identisch mit einer Aminosäuresequenz eines Polypeptides ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus: (a) Aminosäuren 1-465 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 23-235 von SEQ ID NO:6, Aminosäuren 1-446 von SEQ ID NO: 10, Aminosäuren 23-216 von SEQ ID NO:10, Aminosäuren 1-535 von SEQ ID NO:12, Aminosäuren 23-305 von SEQ ID NO: 12, Aminosäuren 1-523 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 23-293 von SEQ ID NO: 14, Aminosäuren 1-542 von SEQ ID NO:16, Aminosäuren 23-312 von SEQ ID NO:16, Aminosäuren 1-540 von SEQ ID NO:18, Aminosäuren 23-310 von SEQ ID NO:18, Aminosäuren 1-528 von SEQ ID NO:22, Aminosäuren 23-298 von SEQ ID NO:22; und (b) Fragmenten der Polypeptide von (a), wobei die genannten Varianten-Polypeptide die Inhibierung von Angiogeneseaktivität beibehalten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Sequenz ausweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nukleotide 25-1419 von SEQ ID NO:5, Nukleotide 91-729 von SEQ ID NO:5, Nukleotide 25-1362 von SEQ ID NO:9, Nukleotide 91-672 von SEQ ID NO:9, Nukleotide 25-1629 von SEQ ID NO:11, Nukleotide 91-939 von SEQ ID NO:11, Nukleotide 25-1593 von SEQ ID NO: 13, Nukleotide 91-903 von SEQ ID NO: 13, Nukleotide 25-1650 von SEQ ID NO:15, Nukleotide 25-1644 von SEQ ID NO:17, Nukleotide 91-960 von SEQ ID NO: 15, Nukleotide 91-954 von SEQ ID NO: 17, Nukleotide 118-1701 von SEQ ID NO:21, Nukleotide 184-1011 von SEQ ID NO:21; (b) Sequenzen, welche auf Grund der Degeneration des genetischen Kodes ein Polypeptid, das durch eine Nukleinsäure von (a) kodiert wird, kodiert; und (c) Sequenzen, die unter moderat oder streng stringenten Bedingungen mit einer Sequenz von (a) oder (b) hybridisieren und ein Polypeptid kodieren, das die Inhibierung von Angiogeneseaktivität beibehalten hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Angiogeneseaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Integrinbindungsaktivität und Endothelzellmigration.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid hergestellt wurde durch Züchtung einer rekombinanten Zelle, die das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid kodiert, unter Bedingungen, die die Expression des ADAM Disintegrindomäne-Polypeptids erlaubt, und Gewinnen des ADAM Disintegrindomäne-Polypeptids.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid in einer Zusammensetzung vorhanden ist, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in Kombination mit einer Bestrahlungstherapie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in Kombination mit einem zweiten therapeutischen Wirkstoff.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Vincaalkaloiden und anderen pflanzenabgeleiteten Chemotherapeutika, Antitumorantibiotika, Antitumorenzymen, Topoisomeraseinhibitoren, Platinanaloga, adrenocorticalen Suppressiva, Hormonen und Antihormonen, Antikörper, Immunotherapeutika, Strahlentherapeutika und Modifikatoren der biologischen Reaktion.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Cisplatin, Cyclophosphamid, Bleomycin, Carboplatin, Fluoruracil, 5-Fluoruracil, 5-Fluordeoxyuridin, Methotrexat, Taxol, Asparaginase, Vincristin, Vinblastin, Mechloretamin, Melphalan, 5-Fluordeoxyuridin, Lymphokinen und Cytokinen wie Interleukinen, Interferonen (alpha, beta, oder delta) und TNF, Chlorambucil, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Semustin, Streptozocin, Dacarbazin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Vindesin, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicamycin, Mitomycin, L-Asparaginase, Hydroxyharnstoff, Methylhydrazin, Mitotan, Tamoxifen, Fluoxymesteron und COX-2 Inhibitoren.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff ein Polypeptid ist, einschließlich der löslichen Form desselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Flt3 Ligand, CD40 Ligand, Interleukin-2, Interleukin-12, 4-1BB Ligand, anti-4-1BB Antikörper, TRAIL, TNF Antagonisten und TNF Rezeptor-Antagonisten, einschließlich TNFR/Fc, Tek Antagonisten, TWEAK Antagonisten und TWEAK-R Antagonisten, einschließlich TWEAK-R/Fc, VEGF Antagonisten einschließlich anti-VEGF Antikörper, VEGF Rezeptor-Antagonisten, CD148 Bindungsproteine und Nectin-3-Antagonisten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Medikament für die Verwendung bei einem durch Angiogenese vermittelten Zustand bestimmt ist, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Augenerkrankungen, malignen und metastatischen Zuständen, entzündlichen Erkrankungen, unangemessener Plättchenaktivierung, -beschaffung, oder -aggregation, oder einem Zustand, der Gewebeinstandsetzung oder Wundheilung bedarf.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Augenerkrankung durch okulare Neovaskularisation gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Augenerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Retinopathia diabetica, Retinopathia praematurorum, neovaskulärem Glaukom, Retinoblastom, retrolentale Fibroplasie, Rubeosis, Uveitis, Maculadegeneration und Hornhauttransplantat-Neovaskularisation.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der maligne und metastatische Zustand ein solider Tumor ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der solide Tumor ein Sarcom oder ein Karzinom ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die entzündliche Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arthritis, Rheumatismus, entzündliche Darmerkrankung und Psoriasis.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der durch unangemessene Plättchenaktivierung, -beschaffung, oder -aggregation vermittelte Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erkrankung oder Schädigung der Coronararterie, Myocardinfarkt oder Schädigung nach einem Myocardinfarkt, Schlaganfall, instabiler Angina, Atherosklerose Arteriosklerose, Praeeclampsia, Embolismus, und Plättchen assoziierter ischämischer Erkrankungen, einschließlich Lungenischämie, Coronarischämie und Cerebralischämie.
In vitro Verfahren zur Inhibierung der Angiogeneseaktivität eines Integrins, welches das Kontaktieren des Integrings mit einer inhibitorisch wirksamen Menge von einem ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid aufweist, und wobei die ADAM Disintegrindomäne eine RGD Sequenz nicht enthält, wobei das ADAM Disintegrindomänen Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a), (b), (c), (d), wie in Anspruch 1 definiert.
In vitro Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die Endothelzellmigration und/oder Angiogenese inhibiert, welches aufweist: (i) Zusammenbringen einer Testverbindung mit endothelialen Zellen und mit einem ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid, das an Endothelzellen bindet; und (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die Bindung des ADAM Disintegrindomäne-Polypeptids an die Endothelialzellen verändert; wobei die ADAM Disintegrindomäne eine RGD Sequenz nicht enthält und wobei das ADAM Disintegrindomäne-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a), (b), (c), (d), wie in Anspruch 1 definiert.