CN1774445A - 用于治疗rage相关病症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白，该融合蛋白含有高级糖基化终产物配体结合元件受体(RAGE－LBE)和免疫球蛋白元件。本发明也公开了含有RAGE－LBE和二聚化区域的融合蛋白。本发明还公开了编码上述融合蛋白的核酸，以及利用该公开核酸和蛋白质，例如，治疗RAGE相关病症的方法。本发明也公开了其它组合物和方法。

Description

用于治疗RAGE相关病症的组合物和方法
相关申请
本申请要求美国临时申请No.60/404,205的提交日期的益处，该申请的提交日为2002年8月16日，且该申请被命名为“Methods andCompositions for Treating Rage Associated Diseases(用于治疗RAGE相关疾病的方法和组合物)”。该参考临时申请的完整内容被引入此处，作为参考。
发明背景
许多严重的人类病症均与高级糖基化终产物受体配体(RAGE配体)生成增加或与RAGE本身生成增加相关。这些病症中的大部分，包括例如多种癌症、慢性炎性疾病、糖尿病、淀粉样变性和心血管疾病，尚无始终有效的治疗方法。因此，获得RAGE相关病症的疗法是有益的。
发明概述
在某些方面，本申请涉及一种融合蛋白，该融合蛋白含有高级糖基化终产物配体结合元件受体(RAGE-LBE)和免疫球蛋白元件。在某些实施方案中，该RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些方面，该RAGE-LBE含有图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在进一步的实施方案中，本申请融合蛋白包含具有图7所示氨基酸序列中的Ig1、Ig2和Ig3区；Ig1和Ig2区；或Ig1区的RAGE-LBE。在另一些实施方案中，RAGE-LBE具有一个或多个点突变，其中该点突变提高了RAGE-LBE对高级糖基化终产物结合配偶体受体(RAGE-BP)的结合亲和力。
在某些方面，本申请涉及含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白，其中该免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件包括Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白重链选自IgM、IgD、IgE和IgA重链。在进一步的方面中，该免疫球蛋白重链选自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白元件包括第一类免疫球蛋白的CH1区，和第二类免疫球蛋白的CH1区，其中该第一类免疫球蛋白与第二类免疫球蛋白不同。
在另一些实施方案中，本申请涉及一种融合蛋白，该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，进一步包括二聚化多肽。
在某些实施方案中，本申请也涉及一种包含本发明融合蛋白和药学可接受载体的组合物。
本申请还涉及一种融合蛋白，该融合蛋白含有RAGE-LBE和第二区，该第二区选自二聚化多肽、纯化多肽、稳定化多肽和导向多肽。在某些实施方案中，二聚化多肽包括两亲性多肽。该两亲性多肽可包含最多达50个氨基酸、最多达30个氨基酸、最多达20个氨基酸或最多达10个氨基酸。在某些实施方案中，该二聚化多肽具有肽螺旋束。在某些实施方案中，该二聚化多肽具有亮氨酸拉链。该亮氨酸拉链可以是jun拉链或fos拉链。在某些实施方案中，该二聚化多肽包括具有带正电或负电荷残基的多肽，其中该多肽可与带相反电荷的另一个肽结合。
在进一步的实施方案中，本申请涉及一种具有特定氨基酸序列的融合蛋白，该氨基酸序列与图3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。在某些方面，本申请涉及编码特定多肽融合体的核酸序列，该多肽融合体包含RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。在某些实施方案中，本申请涉及编码一种多肽的核酸序列，该多肽与图3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。在某些实施方案中，该核酸序列编码可通过C-或N-末端氨基或羧基与免疫球蛋白元件融合的RAGE-LBE。该RAGE-LBE可包括RAGE的胞外部分。在某些实施方案中，本申请核酸序列编码RAGE-LBE，包含图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在进一步的实施方案中，该RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3区；Ig1和Ig2区；或Ig1区。在另一些实施方案中，本申请涉及编码RAGE-LBE多肽的核酸序列，该RAGE-LBE多肽具有一个或多个点突变，其中该点突变提高了RAGE-LBE对RAGE-BP的结合亲和力。在某些实施方案中，该核酸序列编码具有一个或多个点突变的RAGE-LBE，其中该点突变提高了RAGE-LBE对RAGE-BP的结合亲和力。
在某些方面，本申请涉及编码特定融合蛋白的核酸序列，该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，其中免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件包括Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白重链选自IgM、IgD、IgE和IgA重链。在进一步的方面中，该免疫球蛋白重链选自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白元件包括第一类免疫球蛋白的CH1区，和第二类免疫球蛋白的CH1区，其中该第一类免疫球蛋白与第二类免疫球蛋白不同。
在另一些实施方案中，本申请涉及编码特定融合蛋白的核酸序列，该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，进一步包括第二区，该第二区选自二聚化多肽、稳定化多肽、纯化多肽或导向多肽。
在一种进一步的实施方案中，本申请核酸进一步含有被可操作性地连接至特定核苷酸序列的转录调节序列，从而使本申请核酸适合被用作表达载体。在某些实施方案中，该核酸进一步含有启动子，其中该启动子增强了该核酸分子在哺乳动物细胞中的表达。本申请还涉及含有本申请核酸的表达载体。在某些实施方案中，该表达载体可在原核细胞和真核细胞中的至少一种细胞内复制。本申请进一步涉及由本申请表达载体转染的宿主细胞。此外，本申请提供了一种制备RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白的方法，该方法包括在适合表达该融合蛋白的细胞培养基中培养本申请宿主细胞，任选地，该方法可进一步包括纯化程序，以提高融合蛋白的纯度。
在某些实施方案中，本申请提供了一种分离的抗体或其片段，该分离抗体或其片段可与图3A所示氨基酸序列的表位进行特异性免疫反应。在某些实施方案中，该抗体可与图7所示氨基酸序列中氨基酸残基1-330、1-321、1-230或1-118的表位进行特异性免疫反应。在某些实施方案中，该抗体抑制RAGE与一个或多个RAGE-BP的结合。在某些实施方案中，本申请提供了一种分离的抗体或其片段，该分离抗体或其片段可与图3A所示氨基酸序列的表位进行特异性免疫反应，其中该抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段和单链抗体。任选地，该抗体标记有可检测标记。本申请还涉及本申请多克隆抗体的纯化制剂。
在一种进一步的实施方案中，本申请涉及一种蛋白质复合体，该蛋白质复合体含有一种或多种融合蛋白，其中该融合蛋白选自：a)含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白；和b)含有RAGE-LBE和第二区的融合蛋白，该第二区选自二聚化区、稳定化区、纯化区和导向区。
本申请还涉及含有RAGE-LBE和TNF-α抑制剂的药物组合物。在某些实施方案中，本申请涉及含有融合蛋白和TNF-α抑制剂的药物组合物，其中该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。本申请进一步涉及含有融合蛋白的药物组合物，其中该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。在某些方面，该RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些实施方案中，该RAGE-LBE含有图7所示氨基酸序列的氨基酸残基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在某些实施方案中，该RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3区、Ig1和Ig2区；或Ig1区。
在某些方面，本申请药物组合物中的RAGE-LBE具有一个或多个点突变，其中该点突变提高了RAGE-LBE对RAGE-BP的结合亲和力。在某些实施方案中，本申请药物组合物含有TNF-α抑制剂，其中该TNF-α抑制剂选自小分子、抗体、肽模拟物和TNFRII-Fc融合蛋白。
在某些实施方案中，本申请药物组合物含有免疫球蛋白元件，其中该免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件包括Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白重链选自IgM、IgD、IgE和IgA重链。在进一步的方面中，该免疫球蛋白重链选自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白元件包括第一类免疫球蛋白的CH1区，和第二类免疫球蛋白的CH1区，其中该第一类免疫球蛋白和第二类免疫球蛋白不同。在另一些实施方案中，本申请涉及一种药物组合物，该药物组合物含有RAGE-LBB，进一步包括二聚化多肽。
在某些实施方案中，本申请涉及一种鉴定化合物的方法，该化合物可抑制RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用，其中RAGE-BP多肽选自S100和两性蛋白(amphoterin)，受体多肽选自RAGE、RAGE-LBE和RAGE-LBE-免疫球蛋白融合体，该方法包括：a)在特定条件，即不存在试验化合物，且RAGE-BP多肽与受体多肽相互作用的条件下，形成反应混合物，该混合物包括：i)RAGE-BP多肽，为S100或两性蛋白；ii)受体多肽，为RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合体；和iii)试验化合物；并b)检测RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用，其中与无试验化合物条件下RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用水平相比，试验化合物存在条件下RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用减弱，说明该试验化合物具有抑制活性。在某些实施方案中，该RAGE-BP为S100(诸如S100B或S100a12)或两性蛋白。
本申请进一步涉及一种鉴定化合物的方法，该化合物可抑制RAGE-BP多肽诱导的RAGE信号传递活性，该RAGE-BP多肽选自S100和两性蛋白，该方法包括：a)使细胞接触RAGE-BP多肽，即S100或两性蛋白；b)在特定条件，即不存在试验化合物，且RAGE信号传递活性正常发生的条件下，使细胞接触试验化合物；并c)检测该RAGE-BP诱导的RAGE信号传递活性，其中与无试验化合物条件下的信号传递活性的水平相比，该试验化合物存在条件下RAGE-BP所诱导的RAGE信号传递活性降低，说明该试验化合物具有抑制活性。在某些实施方案中，该RAGE-BP为S100(诸如S100B或S100a12)或两性蛋白。在某些方面，抑制RAGE-BP所诱导RAGE信号传递活性的化合物可抑制NF-kB转录活性的活化，或促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)活性的活化。
在另一种实施方案中，本申请提供了一种抑制RAGE与RAGE-BP之间相互作用的方法，该方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在另一种实施方案中，本申请涉及一种抑制RAGE与RAGE-BP之间相互作用的方法，该方法包括施用可与图3A所示氨基酸序列中的表位进行特异性免疫反应的抗体或其片段。本申请进一步涉及一种抑制RAGE和RAGE-BP之间相互作用的方法，该方法包括施用可通过本申请方法鉴定的化合物。
在某些实施方案中，本申请提供了一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在某些方面，本申请涉及一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用可与图3A所示氨基酸序列中的表位进行特异性免疫反应的抗体或其片段。在另一种实施方案中，本申请涉及一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用可通过本申请方法鉴定的化合物。
在某些实施方案中，本申请涉及一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在某些实施方案中，本申请涉及一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用可与图3A所示氨基酸序列中的表位进行特异性免疫反应的抗体或其片段。还有另一种实施方案，本申请涉及一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用可通过本申请方法鉴定的化合物。在某些方面，本申请组合物与一种或多种药剂联合施用，其中该药剂用于治疗选自下列的一种或多种状况，即淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。任选地，该药剂选自抗炎剂、抗氧化剂、β阻断剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、降脂剂、抗血管发生剂和化学疗法。一种实施方案中，该药剂为氨甲蝶呤。另一种实施方案中，急性炎性疾病为脓毒症。还有一种实施方案中，心血管疾病为再狭窄。
在某些方面，上述方法中的RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些实施方案中，该RAGE-LBE含有图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在某些实施方案中，该RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3区；Ig1和Ig2区；或Ig1区。在某些实施方案中，该RAGE-LBE具有一个或多个点突变，其中该点突变可提高RAGE-LBE对RAGE-BP的结合亲和力。
在某些实施方案中，上述方法中的免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件包括Fc区。在某些方面，该免疫球蛋白重链选自IgM、IgD、IgE和IgA重链。在进一步的方面中，该免疫球蛋白重链选自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重链。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc区。在某些情况中，该免疫球蛋白元件包括第一类免疫球蛋白的CH1区，和第二类免疫球蛋白的CH1区，其中该第一类免疫球蛋白与第二类免疫球蛋白不同。
在另一种实施方案中，本申请提供了一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用一种组合物，该组合物含有TNF-α抑制剂和至少一种RAGE-LBE，或一种含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。本申请还涉及一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用一种组合物，该组合物包含至少一种含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
可通过本申请方法治疗的RAGE相关病症包括淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。在某些方面，该RAGE相关病症为阿尔茨海默氏病。可通过本申请方法治疗的慢性炎性疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、肠易激疾病、多发性硬化、银屑病、狼疮或任意其它自身免疫病。可通过本申请方法治疗的急性炎性疾病包括脓毒症。可通过本申请方法治疗的心血管疾病包括动脉粥样硬化和再狭窄。
附图简述
图1A显示了鼠可溶性RAGE-Fc融合蛋白的核苷酸序列。
图1B显示了鼠可溶性RAGE-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
图2A显示了鼠可溶性TNFRII的核苷酸序列。
图2B显示了鼠可溶性TNFRII的氨基酸序列。
图3A显示了与突变IgG1重链的CH2、CH3和铰链区融合的人RAGE的氨基酸序列。
图3B显示了与突变IgG1重链的CH2、CH3和铰链区融合的人RAGE的核苷酸序列。
图4显示了对特定小鼠的躯体评分，这些小鼠被诱导出现了CIA，并在诱导CIA后的不同时期分别接受了RAGE-LBE融合蛋白、sTNFRII或空载体治疗。
图5为示意图，显示了RAGE-LBE融合蛋白的多个实例。
图6显示RAGE-LBE-Fc融合蛋白与RAGE配体结合。
图7显示了人RAGE的氨基酸序列。
图8显示了人RAGE的核酸序列。
图9显示RAGE-LBE-Fc由CHO细胞分泌。将温育过夜+/-N-聚糖酶(以除去N连接的寡糖)的条件培养基上样至SDS-PAGE(还原的)。利用对Fc区具有特异性的抗体检测RAGE-LBE-Fc。分子量偏移说明存在N连接的寡糖。多个hRAGE-LBE-Fc种类说明可能存在其它翻译后修饰。
图10显示了对人RAGE的序列分析结果。对人RAGE-Fc的分析结果显示：1)N末端残基为已环化并形成焦谷氨酸的谷氨酰胺(Q)；且2)成熟肽2位上的天冬酰胺(N)存在N连接的修饰。
发明详述
1.定义
为方便起见，此处集中了本说明书、实施例及所附权利要求中所应用的某些术语。如无另外指明，此处所用的所有技术和学术术语均与本发明所属领域任一普通技术人员通常理解的意义相同。
冠词“一个”和“一种”在此文中被用于指该冠词在语法上的一个或一个以上(即至少一个)宾语。例如，“一个元件”意为一个元件或一个以上的元件。
术语“二聚化多肽”或“二聚化区”包括任何可与另一个多肽形成二聚体(或高级复合体，诸如三聚体、四聚体等)的多肽。任选地，该二聚化多肽与其它相同二聚化多肽相连，可形成同多聚体。IgG Fc元件是一个可形成同多聚体的二聚化区实例。任选地，该二聚化多肽与其它不同二聚化多肽相连时，可形成异多聚体。Jun亮氨酸拉链区可与Fos亮氨酸拉链区形成二聚体，这也是一个可形成异多聚体的二聚化区实例。二聚化区既可形成异多聚体，也可形成同多聚体。
“表达构建体”指任意重组核酸，包括足以介导在合适宿主细胞中表达的可表达核酸和调节元件。
术语“融合蛋白”和“嵌合蛋白”可互换使用，指具有特定氨基酸序列的蛋白质或多肽，该氨基酸序列含有与来源自两种或两种以上蛋白质的氨基酸序列对应的部分。来源自两种或两种以上蛋白质的序列可以是这些蛋白质的整体或部分(即片段)。融合蛋白也可含有位于特定部分之间的氨基酸连接区域，该特定部分与上述蛋白质来源序列部分对应。这种融合蛋白可通过重组法制备，其中通过核酸酶和连接酶的处理，将相应核酸连接，并整合进表达载体中。融合蛋白的制备已普遍被本领域普通技术人员理解。
术语“核酸”指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，并在合适的地方指核糖核酸(RNA)。该术语也应被理解为包括等同物，即由核苷酸类似物形成的RNA或DNA类似物，并且当该术语应用于本文所描述的实施方案时，还包括单(有义或反义)和双链多核苷酸。
如上下文未另外指明，术语“或”在此文中意为术语“和/或”，并可与其互换使用。
术语“同一性百分率”两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的序列同一性。通过比较各序列中的一个位置便可确定同一百分率，其中出于比较的目的，序列可以被比对。同一性百分率表达式指被比较序列共有位置上相同氨基酸或核酸的数量的函数。可采用多种比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作为GCG序列分析程序包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分被提供，并可利用例如，默认设置。ENTREZ可通过NationalCenter for Biotechnology Information(美国国家生物技术信息中心)、National Library of Medicine(美国国家医学图书馆)、National Institutes of Health(美国国家卫生研究院)，Bethesda，Md.获得。一种实施方案中，两个序列的同一性百分率可由GCG程序确定，该程序所用空位权重为1，例如，每个氨基酸空位被加权为两个序列之间单个氨基酸或核苷酸错配。
在由Harcourt Brace & Co.，San Diego，California，USA的一个部门，即Doolittle，Academic Press，Inc.所编辑的Methods inEnzymology，vol.266：Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(酶学方法，266卷：用于大分子序列分析的计算机方法)(1996)中，描述了其它序列比对技术。优选采用允许序列中存在空位的序列比对程序对序列进行比对。Smith-Waterman是一种允许序列比对中存在空位的算法。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。同样，利用Needleman和Wunsch序列比对法的GAP程序也可被用于比对序列。一种可选的研究方案采用了可在MASPAR计算机上运行的MPSRCH软件。MPSRCH采用了Smith-Waterman算法，可在大规模并行计算机上对序列评分。该方法提高了选取远距离相关匹配的能力，并且尤其能够容许小空位和核苷酸序列误差的存在。编码氨基酸序列的核酸可被用于搜寻蛋白质和DNA数据库。
术语“多肽”和“蛋白质”在此文中可互换使用。
“高级糖基化终产物配体结合元件受体”或“AGE-LBE”包括跨膜RAGE多肽(例如，可溶性RAGE)的任意胞外部分，及其保留了结合RAGE配体能力的片段。
“高级糖基化终产物结合配偶体的受体”或“RAGE-BP”包括任何可在生理学环境中与RAGE蛋白(受体多肽，诸如，RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的胞外部分结合的物质(例如多肽、小分子、糖类结构等)。
“RAGE相关病症”或“RAGE关联病症”包括被感染细胞或组织表现为RAGE或一个或多个RAGE配体的表达和/或活性提高或降低的任何病症。RAGE相关病症也包括任何可通过削弱RAGE功能(包括例如，施用可破坏RAGE∶RAGE-BP之间相互关系的药剂)而得以治疗(即一种或多种症状可被消除或改善)的病症。
术语“重组核酸”包括任何含有至少两个序列的核酸，而且这两个序列并不一起存在于自然中。重组核酸可体外生成，例如，通过利用分子生物学方法生成，或体内生成，例如，通过同源或非同源重组将核酸插入在新的染色体位置上。
与被试者相关的术语“治疗”指改善了该被试者所患疾病或病症的至少一种症状。该治疗可使上述疾病或病症痊愈或使其改善。
术语“载体”指一种核酸分子，该核酸分子可转运与之连接的另一个核酸。一种类型的载体是附加体，即能够在染色体外复制的核酸。另一种类型的载体是被设计为与宿主细胞遗传物质重组的整合载体。载体既可自发复制，也可自发整合，该特性根据细胞环境的不同而不同(即载体可在一种宿主细胞类型中自发复制，而在另一种宿主细胞类型中则仅仅是整合)。能够引导特定可表达核酸的表达的载体在此文中被称为“表达载体”，其中该可表达核酸与该载体被可操作性地连接在一起。
2.融合蛋白
在某些方面，本申请提供了含有高级糖基化终产物配体结合元件受体(RAGE-LBE)的融合蛋白。在某些实施方案中，本申请提供了含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白(例如，如图1B或3A所示)。在进一步的实施方案中，该融合蛋白含有RAGE-LBE和第二区，该第二区选自二聚化区、导向区、稳定化区和纯化区。
RAGE-LBE可以是RAGE蛋白中保留了结合RAGE配体能力的任意胞外部分。在许多生物体中，该RAGE蛋白为跨膜蛋白，具有该蛋白质位于细胞内的一部分(胞内部分)和该蛋白质位于细胞外的一部分(胞外部分)。术语“RAGE配体”涵盖了在生理学环境中可与RAGE或RAGE-LBE结合的任何物质。典型的RAGE配体包括非酶促糖基化加合物(高级糖基化终产物)、S100/钙粒蛋白家族的促炎细胞因子样分子、两性蛋白(也被称为HMG-1或HMGB-1)和诸如那些在淀粉样结构中被发现的β折叠原纤维。
在某些实施方案中，RAGE-LBE含有保留了结合RAGE配体能力的RAGE片段。在某些方面，本发明融合蛋白含有保留了结合RAGE配体能力的RAGE片段和免疫球蛋白元件。在进一步的实施方案中，该融合蛋白含有保留了结合RAGE配体能力的RAGE片段和选自二聚化区、导向区、稳定化区和纯化区的第二区。
如上所述，在某些实施方案中，RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分，该胞外部分保留了RAGE结合RAGE配体的能力。在一个方面中，该RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3区。在另一个方面中，该RAGE-LBE具有Ig1和Ig2区。在另一些方面中，该RAGE-LBE具有RAGE的Ig1区。还有一个方面中，该RAGE-LBE具有图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。
还有一种实施方案中，本发明包括了RAGE-LBE的氨基酸序列变体。制备这些RAGE-LBE变体具有多个目的，诸如提高该RAGE-LBE对其配体的亲和力，有助于该结合配偶体的稳定、纯化和制备，改善其血浆半衰期，提高疗效，并减轻利用此处所描述组合物治疗期间所产生副作用的严重程度或减少其发生。在一种例证性的实施方案中，该变体RAGE-LBE融合蛋白含有与图3A所示氨基酸序列存在至少90％同一性的氨基酸序列。
RAGE-LBE的氨基酸序列变体可属于三类变体中的一种或几种，这三类变体是插入、置换或缺失变体。这些变体可通过熟练技术人员所熟知的方法制备，诸如在编码RAGE-LBE的DNA中进行核苷酸位点特异性诱变，通过该方法可获得编码该变体的DNA，并随后在重组细胞培养物中表达该DNA。但通过体外合成可方便地制备出具有最多达大约100-150个氨基酸残基的片段。
RAGE-LBE的氨基酸序列变体可以是自然中未发现的预定变体，或者是天然存在的等位基因。该RAGE-LBE变体典型地表现出与天然存在内源RAGE相同的定性生物学特性，例如配体结合活性。
虽然导入氨基酸序列变异的位点可预先设定，但突变本身无需被预先设定。例如，为最优化特定位点上的突变表现，在目标密码子上进行随机或饱和诱变(插入全部20个可能的残基)，并筛选出具有最佳理想活性组合的表达RAGE-LBE变体。该筛选法是本领域普通技术人员已知的。
氨基酸插入通常在大约1～10个氨基酸残基的数量级上；置换典型地导入单个残基；而缺失范围则为大约1～30个残基。缺失或插入优选地在相邻残基对中发生，即缺失2个残基或插入2个残基。从下文论述中可充分理解的是，为获得最终构建体，置换、缺失、插入或这几种方式的任意组合均可被导入或组合。
RAGE-LBE的插入型氨基酸序列变体指将与RAGE-LBE无关的一个或多个氨基酸残基导入目标RAGE-LBE中的预定位点，并取代已存残基，从而形成的变体。
对功能的大体改变可通过选择较少保守性的置换而得以实现，即选择在影响某些特性的维持方面存在更显著差异的残基，其中上述特性为：a)置换区域中的多肽主链结构，例如折叠片或螺旋构象；b)目标位点上分子的电荷或疏水性；或c)侧链的体积。通常，被认为最大程度改变了RAGE-LBE特性的置换是：(a)亲水残基，例如丝氨酰基或苏氨酰基被置换为疏水残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸被置换为其它任意残基；(c)具有正电性侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基被置换为负电性残基，例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有庞大侧链的残基，例如苯丙氨酸被置换为无侧链的残基，例如甘氨酸。
通常，可合理地预期将例如，亮氨酸单独置换为异亮氨酸或缬氨酸，天冬氨酸单独置换为谷氨酸，苏氨酸单独置换为丝氨酸，或类似地将一种氨基酸置换为一种结构上相关的氨基酸(即保守突变)，对所获分子的生物学活性将不会有较大影响。保守性置换指在某一氨基酸家族范围内发生的置换，该氨基酸家族成员在侧链上相关。遗传编码氨基酸可被划分为四个家族：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同划分为芳香族氨基酸。以类似方式可将氨基酸所有成员分为：(1)酸性类＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性类＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)脂肪族类＝甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，丝氨酸和苏氨酸可被任选地单独划分为脂肪族羟基类；(4)芳香族类＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺类＝天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含硫类＝半胱氨酸和蛋氨酸(参见例如，由L.Stryer，W.H.Freeman and Co.，1981年编辑的Biochemistry，2nd ed.)。多肽的氨基酸序列中的变化是否导致了功能同系物的产生，可通过评估该变体多肽以特定方式在细胞中产生应答的能力而得以轻松确定，该方式与野生型蛋白质的应答方式类似。例如，可评估该RAGE-LBE变体形式的，例如与RAGE配体结合的能力。以相同方式可轻松检验发生了一个以上置换的多肽。
如上所述，有些缺失、插入和置换不会从根本上改变RAGE-LBE分子的特性。不过，当难以在实施置换、缺失或插入之前预测其确切作用时，例如当修饰免疫表位时，本领域技术人员应理解该作用可通过常规筛选实验评估。例如，典型地通过下述方法制备变体，即对RAGE-LBE编码核酸进行位点特异性诱变，在重组细胞培养物中表达该变体核酸，并任选地，从该细胞培养物中纯化该变体核酸，例如，通过在多克隆抗RAGE-LBE柱上进行免疫亲和吸附(以通过至少一个残留的免疫表位吸附该变体)。随后，在合适的筛选实验中筛选出具有理想特征的细胞溶解产物或已纯化RAGE-LBE变体的活性。
RAGE-LBE的置换变体也包括通过常规方法将其它蛋白质的功能同源区置换为一个或多个如上已确定RAGE-LBE区所获得的变体。当该变体为RAGE-LBE特定区域的一个片段时，优选但并非必须地与相应的RAGE-LBE区具有至少大约70％的同源性。类似的置换也可理想地适用于信号序列、Ig1、Ig2或Ig3区。
如上所述，本发明提供了含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白。免疫球蛋白元件可以是免疫球蛋白的任意部分。在某些实施方案中，该免疫球蛋白元件包括IgG重链的一个或多个区域。例如，免疫球蛋白元件可包括来源自IgG、IgD、IgA或IgM的重链或其部分。免疫球蛋白重链恒定区包括任意种类免疫球蛋白重链的CH1、CH2、CH3和CH4，这些免疫球蛋白重链种类包括γ、α、ε、μ和δ类。尤其优选的免疫球蛋白重链恒定区是人CH1。免疫球蛋白可变区包括VH、Vκ或Vγ。
一种实施方案中，RAGE-LBE在C末端与免疫球蛋白恒定区的N末端融合，以取代其可变区，但该结合配偶体的N末端融合也可被构建。该融合典型地至少保留了免疫球蛋白重链恒定区中具有功能活性的铰链、CH2和CH3区。恒定区Fc部分的C末端也可被融合，或是N末端直接与重链的CH1或轻链的相应区域融合。通过构建合适的DNA序列，并于重组细胞培养物中将其表达，通常便可实现该融合。但可选地，可根据已知方法合成本发明多肽。
在某些实施方案中，杂种免疫球蛋白被装配为单体、或异源或同多聚体，尤其是二聚体或四聚体。通常，这些装配免疫球蛋白应具有如下图所示的已知单位结构。基础四链结构单位是IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单位在较高分子量的免疫球蛋白中被重复；IgM通常以五聚体形式存在，该五聚体是由基础四链单位通过二硫键结合在一起形成的。IgA球蛋白，有时和IgG球蛋白，也可以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况中，各四链单位可相同或不同。
在某些实施方案中，RAGE-LBE与二聚化区融合。二聚化区基本上可以是任何与另一个多肽形成二聚体(或更高级复合体，诸如三聚体、四聚体等)的多肽。任选地，二聚化多肽与其它相同二聚化多肽相连，可形成同多聚体。IgG Fc元件是一个倾向于形成同多聚体的二聚化区实例。任选地，二聚化多肽与其它不同二聚化多肽相连，则形成异多聚体。Jun亮氨酸拉链区可与Fos亮氨酸拉链区形成二聚体，这是一个倾向于形成异多聚体的二聚化区实例。二聚化区既可形成异多聚体，也可形成同多聚体。
融合蛋白的不同元件可以与预期功能性一致的任意方式排列。例如，RAGE-LBE可被置于免疫球蛋白元件的C末端，或可选地，免疫球蛋白元件被置于RAGE-LBE的C末端。在融合蛋白中，RAGE-LBE和免疫球蛋白元件或二聚化多肽无需相邻，且在任一区域的C或N末端，或两个区域之间均可包括其它区域或氨基酸序列。
应当理解的是，本发明RAGE-LBE蛋白或RAGE-LBE融合蛋白可通过天然加工方法，诸如加工和其它翻译后修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术而获得修饰。可出现在本发明蛋白中的已知修饰包括，但不仅限于，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、由转移RNA介导对蛋白质的氨基酸加成，诸如精氨酰化，以及遍在蛋白化。这些修饰是技术人员所熟知的，并已被详尽描述于学术文献中。包括糖基化、脂质附着、硫酸化、羟基化和ADP-核糖基化的几个尤其常见的修饰在大部分基础课本中均有描述，诸如T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993的Proteins-Structure And Molecular Properties，2nd Ed.。也可参考与该主题相关的详细评论。见，例如Wold，F.，在AcademicPress，New York，1983年出版，B.C.Johnson编辑的Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白质的翻译后共价修饰)一书中第1-12页的Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects(翻译后蛋白质修饰：前景与展望)；Seifter等人在Meth.Enzymol.，1990，182：626-646中的“Analysis for protein modifications and nonproteincofactors，(对蛋白质修饰和非蛋白质辅因子的分析)”和Rattan等人在Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，663：48-62中的“ProteinSynthesis：Posttranslational Modifications and Aging，(蛋白质合成：翻译后修饰和老化)”。
3.核酸
在某些方面，本发明提供了编码此处所公开融合蛋白的核酸，诸如RAGE-LBE-免疫球蛋白元件融合蛋白和RAGE-LBE-二聚化区融合蛋白，包括上述所有典型融合蛋白。一种实施方案中，编码本发明融合蛋白的核酸包括图8所示编码人RAGE的核酸或该核酸的一个部分。
编码融合蛋白的核酸也可包括编码RAGE-LBE变体、免疫球蛋白元件或二聚化区的核酸(例如图1A或3B所示的核酸序列)。变体核苷酸序列包括相差一个或多个核苷酸置换、插入或缺失的序列，诸如等位变体；并因此包括与RAGE、免疫球蛋白或二聚化区的核苷酸序列不同的编码序列。任选地，变体应与基准序列存在至少80％、90％、95％或99％的同一性(例如图3B所示序列)。变体也应包含在严格条件(即相当于比大约1M盐中形成的DNA双螺旋的解链温度(Tm)低20-27℃)下可与相关基准核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一种例证性的实施方案中，变体核酸编码的RAGE-LBE融合蛋白含有与图3A所示氨基酸序列存在至少901％同一性的氨基酸序列。
本领域任一普通技术人员均易于理解的是，可促进DNA杂交的合适严格条件是可以改变的。例如，可在大约45℃，6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，并随后于50℃，在2.0xSSC中进行洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从低严格条件，即50℃、大约2.0xSSC，到高严格条件，即50℃、大约0.2xSSC中选择。此外，该洗涤步骤中的温度可从室温，大约22℃的低严格条件提高至大约65℃的高严格条件。温度和盐浓度可被同时改变，或者在改变二者中一个变量的同时，保持另一变量不变。一种实施方案中，本发明提供了可在低严格条件下杂交的核酸，该低严格条件即为于室温、6xSSC中进行杂交，并随后于室温、2xSSC中进行洗涤。
在本发明的另一方面，本发明核酸被提供在含有特定核苷酸序列的表达载体中，并与至少一个调节序列可操作性地连接，其中上述特定核苷酸序列编码本发明融合多肽。可操作性地连接意指核苷酸序列以特定方式被连接至调节序列，该方式可实现上述核苷酸序列的表达。调节序列是本领域所公认的，并被选择用于引导本发明融合多肽的表达。相应地，术语“调节序列”包括启动子、增强子及其它表达控制元件。在Academic Press，San Diego，CA(1990)出版的Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)中描述了典型的调节序列。例如，广泛多种特定表达控制序列中的任意一种均可应用于上述载体，以表达编码融合蛋白的DNA序列，其中上述特定表达控制序列与DNA序列可操作性地连接时，便可控制该DNA序列的表达。这些有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、由T7RNA聚合酶引导表达的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、针对fd外壳蛋白的控制区、针对3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5、酵母a-交配因子的启动子、杆状病毒系统及其它特定序列的多面体启动子，该特定序列是已知可调控原核或真核细胞或其病毒的基因表达的序列，及上述表达控制序列的多种组合。应当理解的是，可根据特定因素设计表达载体，这些特定因素即对待转化宿主细胞和/或希望被表达的蛋白质类型的选择。此外，也应考虑该载体的拷贝数量、控制拷贝数量的能力，以及控制该载体所编码其它任意蛋白质，诸如抗生素标记的表达的能力。
显而易见，可采用本发明基因构建体，以使本发明融合多肽在培养中增殖的细胞内表达，例如，生成可用于纯化的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽。
本发明也涉及经由特定重组基因转染的宿主细胞，该重组基因包括与一个或多个本发明融合蛋白对应的编码序列。该宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，但本发明并不涵盖属于人体部分的细胞。例如，本发明多肽可在细菌细胞，诸如大肠杆菌，昆虫细胞(例如，采用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中得以表达。优选的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
相应地，本发明进一步涉及制备本发明融合多肽的方法。例如，可在合适条件下培养经由特定表达载体转染的宿主细胞，该表达载体编码融合多肽，上述合适条件是可使该融合多肽实现表达的条件。该多肽可被分泌，并可从含有该多肽的细胞与培养基的混合物中分离获得。可选地，该多肽可被保留在胞质中，这时便需收获细胞，将其溶解，并分离目标蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基及其它副产品。用于细胞培养的合适培养基是本领域熟知的。采用本领域已知用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳，以及利用对本发明多肽的特定表位具有特异性的抗体所进行的免疫亲和纯化，均可从细胞培养基、宿主细胞或二者混合物中分离获得本发明多肽。在某些实施方案中，该融合蛋白含有有助于其纯化的区域，诸如GST部分或六组氨酸部分。优选的纯化部分可以容易地与该融合蛋白的其余部分裂解。
本发明融合蛋白可通过下述方法制备，即将相关克隆基因或其部分连接进特定载体中，该载体适合在原核细胞或真核细胞中表达，或者在二者中均可表达。用于制备重组融合蛋白的表达载体包括质粒及其它载体。例如，适用于表达融合蛋白的合适载体包括下述类型的质粒：pBR322-衍生质粒、pEMBL-衍生质粒、pEX-衍生质粒、pBTac-衍生质粒以及用于在原核细胞，诸如大肠杆菌中表达的pUC衍生质粒。
有大量载体可被用于在酵母中表达重组蛋白。例如，YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17均是有助于将遗传构建体导入酿酒酵母的克隆和表达载体(见例如，Broach等人(1983)在M.InouyeAcademic Press出版的Experimental Manipulation of GeneExxpression(基因表达实验操作)第83页，将其引入此处作为参考)。这些载体之所以能在大肠杆菌中复制，要归因于pBR322 ori的存在，之所以能在酿酒酵母中复制，则归因于酵母2微米质粒中复制决定子的存在。此外，也可采用抗药性标记，诸如氨苄青霉素。
优选的哺乳动物表达载体既含有有助于该载体在细菌内增殖的原核序列，也含有一个或多个可于真核细胞中表达的真核转录单元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生载体均为适用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体实例。在这些载体中，若干载体被修饰后具有来源自细菌质粒，诸如pBR322的序列，有助于原核和真核细胞中的复制和抗药性筛选。可选地，在真核细胞中，可采用病毒衍生物，诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或埃-巴二氏病毒(pHEBo、pREP来源和p205)，以瞬时表达蛋白质。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统的实例可参见下文对基因治疗送递系统的描述。制备质粒和转化宿主生物体所应用的多种方法均是本领域熟知的。即可用于原核细胞，又可用于真核细胞的其它合适表达系统，以及通用重组操作方法，可参见由Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)编辑的Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，(分子克隆实验指南，第二版)，第16和17章。在某些情况中，通过利用杆状病毒表达系统以表达融合蛋白的方法是理想的。这种杆状病毒表达系统的实例包括pVL-衍生载体(诸如pVL1392，pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生载体(诸如pAcUW1)，和pBlueBac衍生载体(诸如含β-ga1的pBlueBac III)。
在另一种实施方案中，编码纯化前导序列，诸如位于重组蛋白指定部分N末端的poly-(His)/肠激酶裂解位点序列，的融合基因有助于通过采用Ni2+金属树脂的亲和色谱法对已表达融合蛋白的纯化。随后，可通过利用肠激酶进行处理，将该纯化前导序列除去，从而获得已纯化的融合蛋白(例如，参见Hochuli et al.，(1987)J.Chromatography 411：177；和Janknecht et al.，(1991)PNAS USA88：8972)。
制备融合基因的技术是人们熟知的。编码不同多肽序列的多个DNA片段的连接基本上是根据常规技术进行的，即采用用于连接的钝头或交错头末端、限制酶消化以提供合适末端、恰当补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，以及酶连接。在另一种实施方案中，可通过包括自动化DNA合成仪在内的常规技术合成本发明融合基因。可选地，可采用特定锚定引物对基因片段进行PCR扩增，该锚定引物可在两个连续基因片段之间形成互补突出端，其中上述两个连续基因片段可随后被退火，从而形成嵌合基因序列(见，例如Ausubel et al.，John Wiley & Sons：1992编辑的Current Protocolsin MolecularBiology。
通过本领域已知的多种方法，包括电穿孔、脂染和磷酸钙介导的转染，均可将克隆的DNA序列导入培养的哺乳动物细胞中。
4.抗体及其用途
本发明的另一个方面涉及分离的抗体，该抗体可与图3A所示RAGE氨基酸序列的一个或多个表位进行特异性免疫反应。优选地，可与该抗体进行特异性免疫反应的表位选自图7所示RAGE氨基酸序列中的氨基酸残基1-330、1-321、1-230和1-118。
在某些实施方案中，本发明抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段和单链抗体。例如，可通过标准操作方法制备抗-蛋白质/抗-肽抗血清或单克隆抗体(见，例如由Harlow和Lane(Cold SpringHarbor Press：1988)编辑的Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册))。任选地，该抗体被标记有可检测标记。
在某些实施方案中，本发明抗体抑制RAGE与一个或多个RAGE-BP的结合。例如，可与图7所示RAGE氨基酸序列中氨基酸残基1-330的表位进行特异性免疫反应的抗体可破坏RAGE与其至少一个配体，诸如高级糖基化终产物(AGEs)、成淀粉样肽/多肽、两性蛋白及S100/钙粒蛋白的结合。
本发明也设想了多克隆抗体的纯化制剂，该多克隆抗体可与图3A所示RAGE氨基酸序列的一个或多个表位进行特异性免疫反应。
采用免疫原性形式的本发明肽(例如，图7所示RAGE氨基酸序列的氨基酸残基1-330，或可激发抗体应答的抗原片段，或上述融合蛋白)可使哺乳动物，诸如小鼠、仓鼠或兔免疫。可使蛋白质或肽具有免疫原性的技术包括，使该蛋白质或肽与载体结合，或本领域熟知的其它技术。多肽的免疫原性部分可在佐剂的存在条件下被施用。通过检测血浆或血清中的抗体滴度，可监测免疫作用的进展。标准ELISA或其它免疫测定可采用免疫原作为抗原，以评估抗体水平。
在采用本发明多肽的抗原制剂使动物免疫之后，可获得抗血清，并且如果需要，可从该血清中分离获得多克隆抗体。为制备单克隆抗体，可从已免疫动物收获抗体生成细胞(淋巴细胞)，并采用标准体细胞融合操作，使其与无限增殖化细胞，诸如骨髓瘤细胞融合，以获得杂交瘤细胞。这些技术均是本领域熟知的，包括例如，杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein研发(1975)Nature，256：495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbar et al.，(1983)Immunology Today，4：72)以及可制备人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。对杂交瘤细胞可进行免疫化学筛选，以生成可与RAGE多肽的一个表位特异性反应的抗体，并从含有上述杂交瘤细胞的培养物中分离获得单克隆抗体。
术语“抗体”在此文中意指包括其片段，该片段也可与RAGE多肽的一个表位特异性反应。利用常规技术可将抗体片段化，并可筛选出可以特定方式应用的片段，该方式与上文针对完整抗体所描述的方式相同。例如，通过采用胃蛋白酶对抗体进行处理，可生成F(ab)2片段。对所获F(ab)2片段进行处理，以还原二硫键，便可获得Fab片段。
本发明抗体进一步意指包括对本发明任意一种多肽具有亲和力的双特异性、单链、嵌合和人源化分子，其中亲和力由本发明抗体的至少一个CDR区赋予。在优选实施方案中，该抗体进一步包括与其附着并可被检测的标记(例如，该标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。
在某些实施方案中，本发明抗体可作为联合治疗的一部分，与其它药剂结合施用。例如，在炎症情况中，本发明抗体可与一种或多种用于治疗炎性疾病或病症的其它药剂结合施用。在心血管疾病情况中，尤其是由动脉粥样硬化斑引发，并被认为存在实际炎性成分的心血管疾病情况中，本发明抗体可与一种或多种用于治疗心血管疾病的其它药剂结合施用。在癌症的情况中，本发明抗体可与一种或多种抗血管生成因子、化学治疗结合施用，或者作为放射治疗的佐剂施用。本发明进一步设想的是，本发明抗体的施用应作为癌症治疗方案的一部分，该癌症治疗方案可结合多种不同的癌症治疗剂。在I BD的情况中，本发明抗体可与一种或多种抗炎剂结合施用，并可另外结合改良的饮食方案。
本发明抗体的施用可被用于治疗RAGE-相关病症，或者可与其它药剂和治疗方案结合应用，以治疗RAGE-相关病症。
5.抑制RAGE-LBE与RAGE-BP之间相互作用的方法
本发明的某些方面涉及抑制RAGE-LBE与RAGE-BP之间相互作用的方法。优选地，该方法被用于治疗RAGE-相关病症。
在一种优选实施方案中，该方法包括施用此处公开的RAGE-LBE融合蛋白。在另一种实施方案中，该方法包括施用上述可与图3A所示RAGE氨基酸序列的一个或多个表位进行特异性免疫反应的抗体。还有一种实施方案，该方法包括施用可抑制RAGE与一个或多个RAGE-BP结合的化合物。下文分项6中论述了鉴定该化合物的典型方法。
在某些实施方案中，是在体外抑制该相互作用，诸如在含有已纯化蛋白、细胞、生物样品、组织、人工组织等的反应混合物中。在某些实施方案中，是在体内抑制该相互作用，例如，通过施用RAGE-LBE融合蛋白，或者在体内引发生成RAGE-LBE融合蛋白。
在某些方面，本发明涉及通过抑制RAGE-LBE与RAGE-BP之间相互作用，以治疗RAGE相关病症的方法。该方法包括施用上述RAGE-LBE融合蛋白、抗RAGE抗体，或者施用已被鉴定可抑制RAGE与一个或多个RAGE-BP结合的化合物。
6.抑制RAGE或RAGE-BP表达的方法
本发明的某些方面设想了抑制RAGE或RAGE-BP(例如S 100或两性蛋白)表达或二者表达均被抑制的方法。优选地，该方法可被用于治疗RAGE相关病症。
在一种实施方案中，本发明涉及利用反义核酸以减少RAGE或RAGE-BP的表达。该反义核酸可以例如，作为表达质粒被送递，当其在细胞内转录时，可生成与特定细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA，其中特定细胞mRNA编码RAGE或RAGE-BP多肽。可选地，该构建体是体外生成的寡核苷酸，且当其被导入细胞时，可通过与mRNA和/或编码生物标记多肽的基因组序列杂交，从而抑制表达。这种寡核苷酸探针是经过任意修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸对内源核酸酶，例如外切核酸酶和/或内切核酸酶具有抗性，因此在体内是稳定的。可作为反义寡核苷酸应用的典型核酸分子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(也可参见美国专利Nos.5,176,996；5,264,564和5,256,775)。另外，构建可用于核酸治疗的寡聚体的通用方法已由例如，van der Krol等人在Biotechniques 6：958-976(1988)；和Stein等人在Cancer Res 48：2659-2668(1988)中进行了论述。
在另一种实施方案中，本发明涉及利用RNA干扰(RNAi)以影响RAGE或RAGE-BP基因的拆卸。RNAi构建体包括可特异性阻断目标基因表达的双链RNA。“RNA干扰”或“RNAi”是一个术语，最初被用于指在植物和蠕虫中观测到的一种现象，在该现象中，双链RNA(dsRNA)以一种特异性和转录后方式阻断了基因表达。RNAi提供了一种抑制体外或体内基因表达的有效方法。RNAi构建体可包含dsRNA的长序列或短序列，其中长序列与目标核酸序列一致或基本一致，短序列则仅与目标核酸序列的一个区域一致或基本一致。
任选地，该RNAi构建体含有特定核苷酸序列，该核苷酸序列可在细胞的生理条件下，与待抑制基因(例如“目标”基因)mRNA转录产物的至少一个部分的核苷酸序列杂交。该双链RNA仅需与具有介导RNAi能力的天然RNA充分相似。因此，本发明的一个优势在于，能够耐受可能是由于遗传突变、菌株多态性或进化趋异而产生的序列变异。目标序列与该RNAi构建体序列之间的容许核苷酸错配数目为5个碱基对中不超过1对，或10个碱基对中不超过1对，或20个碱基对中不超过1对，或50个碱基对中不超过1对。在siRNA双螺旋中心的错配最为关键，并且基本上可以破坏目标RNA的裂解。与之相比，位于特定siRNA链3’末端的核苷酸对目标识别特异性无显著影响，其中该特定siRNA链与目标RNA互补。序列同一性可通过本领域已知的序列比较和排列算法最优化(参见Gribskov和Devereux，Sequence AnalysisPrimer，Stockton Press，1991，将其引入此处作为参考)，并且可通过例如，在BESTFIT软件程序中执行的Smith-Waterman算法，并利用默认参数，计算核苷酸序列之间的差异百分比(例如Universityof Wisconsin Genetic Computing Group)。在抑制性RNA与目标基因的特定部分之间，大于90％的序列同一性，或者甚至100％的序列同一性是优选的。可选地，该RNA的双螺旋区可在功能上被定义为能够与目标基因转录产物的一部分杂交(例如，400mM NaCl、40mM PIPESpH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃杂交12-16小时；随后进行洗涤)的核苷酸序列。
该双链结构可由单条自体互补RNA链或两条互补RNA链形成。RNA双螺旋的形成可在细胞内或外部启动。该RNA可以特定数量被导入，该数量可实现每个细胞至少一个拷贝的送递。双链物质的较高剂量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可获得更为有效的抑制，而较低剂量也可被用于特定用途。抑制作用是序列特异性的，其中与RNA双螺旋区对应的核苷酸序列是遗传抑制的目标。
本发明RNAi构建体可以是“小干扰RNAs”或“siRNAs”。这些核酸的长度大约为19-30个核苷酸，还要更为优选的长度大约为21-23个核苷酸。siRNAs被认为可结合核酸酶复合体，并通过与特定序列配对，将该复合体引导至目标mRNA。结果是目标mRNA被该蛋白质复合体中的核酸酶降解。在一种特定实施方案中，含21-23个核苷酸的siRNA分子具有3’羟基。在某些实施方案中，通过在例如，dicer酶的存在条件下，加工较长的双链RNA，便可生成该s iRNA构建体。该组合可在特定条件下被维持，在该条件下，dsRNA被加工为含有大约21～大约23个核苷酸的RNA分子。该siRNA分子可通过本领域技术人员已知的多种技术纯化。例如，可采用凝胶电泳纯化siRNAs。可选地，可采用非变性方法，诸如非变性柱层析，以纯化siRNA。另外，可采用色谱(例如尺寸排阻色谱)、甘油梯度离心、利用抗体进行的亲和纯化，以纯化siRNA。
RNAi构建体的制备可通过化学合成法，或通过重组核酸技术实现。经处理细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或者可采用克隆的RNA聚合酶用于体外转录。该RNAi构建体可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，例如，以降低对细胞核酸酶的易感性、提高生物利用率、改善配方特性和/或改变其它药物代谢动力学特性。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以被修饰，从而包括至少一个氮或硫杂原子。RNA结构中的修饰可以被特制，从而允许特异性的遗传抑制，并同时避免了对dsRNA的一般性应答。同样，碱基也可以被修饰，从而阻断腺苷脱氨酶的活性。该RNAi构建体可通过酶促法或部分/全有机合成法制备，并且，通过体外酶促或有机合成法，可导入任何已修饰核糖核苷酸。化学修饰RNA分子的方法可被调整用于修饰RNAi构建体(见，例如Heidenreich et al.(1997) Nucleic Acids Res.25：776-780；Wilson et al.(1994) J Mol Recog 7：89-98；Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：2661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7：55-61)。仅为例证起见，可采用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合磷酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸、含有寡聚体或糖修饰的5-丙炔基-嘧啶(例如，2’被置换的核糖核苷，a-构型)修饰RNAi构建体的主链。
该RNAi构建体也可为长双链RNA形式。在某些实施方案中，该RNAi构建体具有至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，该RNAi构建体的长度为400-800个碱基。该双链RNAs被细胞内消化后，例如，可在细胞内生成siRNA序列。但体内利用长双链RNAs并不总是可行，可能是有害效应所致，该有害效应可能是不依赖序列的dsRNA应答所引起的。在这些实施方案中，利用可减弱干扰素或PKR作用的局部送递系统和/或药剂是优选的。
可选地，该RNAi构建体为发夹结构形式(被称为发夹RNA)。该发夹RNAs可以被外源合成，或者可以通过在体内由RNA聚合酶III启动子转录形成。制备并采用该发夹RNAs用于哺乳动物细胞内的基因沉默的实例被描述于，例如Paddison et al.， Genes Dev.2002，16：948-58；McCaffrey et al.， Nature，2002，418：38-9；McManuset al.， RNA，2002，8：842-50；Yu et al.， Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99：6047-52)中。优选地，在细胞或动物中工程改造该发夹RNAs，以确保对所需基因的连续和稳定抑制。本领域已知的是，可于细胞内加工发夹RNA，从而获得siRNAs。
PCT申请WO01/77350描述了一种典型载体，该载体可被用于双向转录转基因，从而在真核细胞内获得同一转基因的有义和反义RNA转录产物。相应地，在某些实施方案中，本发明提供了一种具有下述独特特征的重组载体，这些特征是：它含有一种病毒复制子，该复制子具有两个以相反方向排列，并位于与目标RNAi构建体对应的转基因两侧的重叠转录单位，其中这两个重叠转录单位可在宿主细胞内，由同一转基因获得有义和反义RNA转录产物。
在另一种实施方案中，本申请涉及利用智能配体以影响(例如，抑制)RAGE多肽或RAGE-BP的活性。智能配体是被选择用于特异性结合指定分子结构的寡核苷酸。智能配体典型地是RNA，但也可以是DNA或其类似物或衍生物，诸如，不仅限于，肽核酸(PNAs)和硫代磷酸酯核酸。此处所用术语“智能配体”，例如RNA智能配体或DNA智能配体，包括可与目标分子特异性结合的单链寡核苷酸。智能配体可与目标分子紧密且特异性结合；大部分智能配体与蛋白质结合的Kd(平衡解离常数)值范围是1pM～1nM。
智能配体典型地是亲和选择过程的产物，该亲和选择过程与噬菌体展示的亲和选择相似(也被称为体外分子进化)。该过程包括进行若干串联重复的亲和分离，例如，采用可与所需免疫原结合的固体支持体，随后通过聚合酶链反应(PCR)，以扩增与该免疫原结合的核酸。因此，每一循环的亲和分离均可将富集与所需免疫原成功结合的分子的核酸群体。以该方式，可“训练”随机核酸库，以获得可与目标分子特异性结合的智能配体。智能配体序列可根据本领域技术人员已知的方法生成，包括，例如下述参考文献中所描述的SELEX法：美国专利Nos.5,475,096；5,595,877；5,670,637；5,696,249；5,773,598；5,817,785。智能配体及其制备方法在例如，E.N.Brody et al.(1999)Mol.Diagn.4：381-388中也有所描述，其内容被引入此处作为参考。
在另一种实施方案中，本发明涉及利用核酶分子，该核酶分子经设计后可催化裂解mRNA转录产物，从而阻止mRNA的翻译(见，例如1990年10月4日出版的PCT国际申请WO90/11364；Sarver et al.，1990，Science 247：1222-1225；和美国专利No.5,093,246)。虽然可采用在位点特异性识别序列上裂解mRNA的核酶，以破坏特定mRNAs，优选的仍然是采用锤头状核酶。锤头状核酶裂解mRNAs的位置受侧翼区支配，其中该侧翼区可与目标mRNA形成互补碱基对。唯一要求是该目标mRNA具有含两个碱基的下述序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的构建和制备方法是本领域熟知的，Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591更为详尽地描述了这些方法。本发明核酶也包括RNA核糖核酸内切酶(下文参见“Cech型核酶”)，诸如天然存在于嗜热四膜虫中，并已被大量描述的RNA核糖核酸内切酶(被称为IVS或L-19IVS RNA)(见，例如Zaug，et al.，1984，Science，224：574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，et al.，1986，Nature，324：429-433；由University Patents Inc.出版的国际专利申请No.WO88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47：207-216)。
在进一步的实施方案中，本发明涉及利用DNA酶抑制RAGE或RAGE-BP基因的表达。DNA酶合并了反义与核酶技术二者的某些机制特征。DNA酶经设计后，与反义寡核苷酸很相似，可识别特定的目标核酸序列，但也与核酶类似，因为它可以催化并特异性裂解该目标核酸。简言之，为设计一种可特异性识别并裂解目标核酸的理想DNA酶，本领域任一技术人员均应首先鉴定独特的目标序列。优选地，该独特或基本独特的序列是富含G/C、且含大约18～22个核苷酸的序列。高G/C含量帮助确保了DNA酶与目标序列之间较强的相互作用。合成该DNA酶时，可将酶定位至识别信息的反义识别序列被分开，使其含有DNA酶的两个臂，并将该DNA酶环置于两个特定的臂之间。制备并施用DNA酶的方法可参见，例如美国专利No.6,110,462。
7.治疗方法
本发明的某些实施方案涉及治疗RAGE相关病症的方法。RAGE相关病症通常可以被表征为包括，被感染细胞表现出RAGE或一个或多个RAGE配体表达升高的任何病症。RAGE相关病症也可被表征为，可通过削弱RAGE功能而得以治疗(即可消除或改善一种或多种症状)的任何病症。例如，通过施用可破坏RAGE与RAGE-BP之间相互作用的药剂，可削弱RAGE功能。可选地，通过施用可抑制上述RAGE或RAGE-BP基因表达的药剂(例如反义核酸或RNAi构建体)，也可削弱RAGE功能。
RAGE的表达提高与若干病变有关，诸如糖尿病血管病、肾病、视网膜病、神经病及其它病症，包括阿尔茨海默氏病和血管壁的免疫/炎性反应。在感染了多种炎症的组织中均可生成RAGE配体，这些炎症包括关节炎(诸如类风湿性关节炎)。在受糖尿病影响的组织中，RAGE的生成被认为是高级糖基化终产物过度产生所导致的。结果导致了氧化应力和内皮细胞功能异常，而这些结果在糖尿病情况中可引起血管疾病。
淀粉状蛋白在组织中的沉积导致了对细胞的多种毒性作用，且其特征是一系列均可被称为淀粉样变性的疾病。RAGE结合β折叠片状原纤维物质，这种物质可出现在诸如，淀粉状蛋白-β肽、Abeta、支链淀粉、血清淀粉状蛋白A和朊病毒衍生肽中。RAGE在具有淀粉状蛋白结构的组织中也可以上升水平被表达。因此，RAGE与淀粉样变性症有关。RAGE与淀粉状蛋白的相互作用被认为导致了氧化应力，而该氧化应力可引起神经元变性。
在发炎组织中可生成多种RAGE配体，尤其是S100/钙粒蛋白家族成员。该观测结果的确存在于急性炎性疾病和慢性炎性疾病中，对急性炎性疾病而言，例如，可在对脂多糖激发的应答中发现(如在脓毒症情况中)，对慢性炎性疾病而言，例如，可在多种形式的关节炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病等疾病中发现。心血管疾病，尤其是由动脉粥样硬化斑引发的心血管疾病也被认为存在实际炎性成分。这些疾病包括闭塞、血栓形成和内陷病，分别例如咽峡炎、脆性噬菌斑病症和血栓性中风。上述所有疾病均被认为是RAGE相关病症。
肿瘤细胞也显示存在RAGE配体，尤其是两性蛋白的上升表达，说明癌症也是RAGE相关病症。此外，慢性炎性疾病的氧化效应及其它方面对某些肿瘤的发生可能起了促进作用。
因此，可采用本发明组合物治疗的RAGE相关病症包括：淀粉样变性(诸如阿尔茨海默氏病)、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病(诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、肠易激疾病、多发性硬化、银屑病、狼疮及其它自身免疫病)、急性炎性疾病(诸如脓毒症)，休克(例如败血症性休克、出血性休克)、心血管疾病(例如动脉粥样硬化、中风、脆性噬菌斑病症、咽峡炎和再狭窄)、糖尿病(尤其是糖尿病情况中出现的心血管疾病)、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、癌症、脉管炎及其它脉管炎症状，诸如坏死性脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。
在某些优选实施方案中，本发明涉及一种治疗关节炎的方法，该方法包括施用RAGE-LBE融合蛋白。任选地，该融合蛋白可作为多肽施用，例如作为药物组合物的一部分。在一种尤其优选的实施方案中，该融合蛋白可通过施用特定核酸而得以施用，该核酸编码该融合蛋白，并被设计为可在被试者细胞中表达该融合蛋白。
在某些方面，本发明提供了本发明融合蛋白的施用方法。该融合蛋白可于体外或体内施用，且其表达可通过施用本发明融合蛋白本身，或通过施用编码该融合蛋白的核酸而得以实现。在某些实施方案中，本发明融合蛋白或核酸被作为药物组合物施用。在若干其它实施方案中，本发明融合蛋白或核酸与一种或多种其它药剂一起被施用。本发明还有另一个方面，即本发明融合蛋白的施用是治疗特定病症的治疗方案的一部分。可通过单独施用本发明蛋白/核酸，或者通过与其它药剂一起结合施用本发明蛋白/核酸，而得以治疗的病症包括RAGE相关病症。例如，RAGE相关病症包括，但不仅限于，类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性肠病、动脉粥样硬化、脉管炎及其它脉管炎症状，诸如坏死性脉管炎，阿尔茨海默氏病，癌症，糖尿病并发症，诸如糖尿病视网膜病，自身免疫病，诸如银屑病和狼疮。RAGE相关病症进一步包括急性炎性疾病(例如脓毒症)、慢性炎性疾病及其它因炎症而加剧的病症(即其症状可通过减少炎症而得以缓解)。
广泛多种可被用于送递编码特定蛋白的核酸(例如编码本发明融合蛋白的核酸)的方法均是本领域熟知的。可体外或体内施用的表达构建体可以被配制在任何生物学有效载体(例如，任何能够有效送递该表达构建体的配方或组合物)中，而一起被施用。方法包括将本发明基因插入特定的病毒载体中，该病毒载体可通过直接转染细胞而发挥作用。典型的病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒-1和慢病毒。其它方法包括利用重组细菌或真核质粒。通过利用例如，阳离子脂质体(lipofectin)或其衍生物(例如，结合了抗体)、聚赖氨酸偶联物、短杆菌素S、人工病毒被膜或其它类似的细胞内载体，以及CaPO4沉淀，均可帮助送递质粒DNA。在某些情况中，表达构建体可通过被注射至需要该表达的特定细胞或组织中而得以直接送递。本领域任一技术人员均可根据需要该表达的细胞或组织的不同、给药是全身性还是局部，以及表达的理想剂量，而轻松地在上述送递系统中进行选择。
一种被用于施用可表达本发明融合蛋白的核酸(表达构建体)的特定方法是通过利用含有特定核酸的病毒载体，其中该特定核酸编码本发明融合蛋白。采用病毒载体感染细胞的优势在于，大部分目标细胞均可接受该核酸。此外，在该病毒载体内，由例如，该病毒载体所含cDNA编码的分子均可在接收该载体的细胞内被有效表达。
逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体通常被认为是可被选择用于将外源基因转移进体内，尤其是人体内的重组基因送递系统。这些载体可将基因有效送递进细胞内，并可将被转移的核酸稳定地整合进宿主染色体DNA中。对逆转录病毒的应用而言，一个主要前提是需确保其应用的安全性，尤其是野生型病毒可能在该细胞群体中扩散时的情况下。仅可生成复制缺陷逆转录病毒的专用细胞系(被称为“包装细胞系”)的发展提高了基因治疗所用逆转录病毒的效用，并且对基因治疗用途而言，该缺陷逆转录病毒在基因转移方面的应用已获得很好的表征(参见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271中的论述)。因此，可构建特定的重组逆转录病毒，在该逆转录病毒中，逆转录病毒编码序列部分(gag，pol，env)已被编码本发明融合蛋白的核酸替代，从而造成了该逆转录病毒的复制缺陷。该复制缺陷逆转录病毒随后被包装进特定的病毒体中，通过标准技术并利用辅助病毒，可将该病毒体用于感染目标细胞。制备重组逆转录病毒和利用该病毒体外或体内感染细胞的方法可参见Greene Publishing Associates，(1989)出版Ausubel，F.M.等人(编辑)的Current Protocols in MolecularBiology中的9.10-9.14节及其它标准实验室手册。合适的逆转录病毒实例包括本领域技术人员熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。可用于制备亲宅性和兼嗜性逆转录病毒系统的合适包装病毒系实例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。逆转录病毒已被用于将多种基因导入许多不同的细胞类型中，包括体外和/或体内的上皮细胞(见例如Eglitis，et al.(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Huber et al.(1991)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury etal.(1991)Science 254：1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3：641-647；Dai et al.(1992)P roc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150：4104-4115；美国专利No：4,868,116；美国专利No：4,980,286；PCT公开物W089/07136；PCT公开物WO89/02468；PCT公开物WO89/05345；和PCT公开物WO 92/07573)。
此外，已有研究显示，通过修饰病毒颗粒表面上的病毒包装蛋白，便可能限制逆转录病毒的感染谱，并从而限制以逆转录病毒为基础的载体的感染谱(见例如，PCT公开物WO93/25234和WO94/06920)。例如，修饰逆转录病毒载体感染谱的方法包括：将特异于细胞表面抗原的抗体偶联至该病毒env蛋白(Roux et al.(1989)PNAS86：9079-9083；Julan et al.(1992)J.Gen Virol 73：3251-3255；和Goud et al.(1983)Virology 163：251-254)；或者将细胞表面受体配体偶联至该病毒env蛋白(Neda et al.(1991)JBiol Chem266：14143-14146)。偶联的形式可以是与一个蛋白质或其它多种受体-配体药物化学交联，也可通过生成融合蛋白(例如单链抗体/env融合蛋白)实现偶联。
可应用于本发明的另一种病毒基因送递系统利用了腺病毒衍生载体。腺病毒的基因组可以被操纵，从而编码并表达目标基因产物，但其在正常裂解病毒生活周期中的复制能力被钝化了。参见，例如Berkner et al.(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252：431-434；和Rosenfeld et al.(1992)Cell68：143-155。由腺病毒菌株Ad型5d1324或其它腺病毒菌株衍生的合适腺病毒载体(例如，Ad2、Ad3、Adz等)均是本领域技术人员熟知的。该病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，并且如上所述，可以被修饰，从而影响感染谱。另外，被导入的腺病毒DNA(及其所含外源DNA)未被整合进宿主细胞的基因组内，仍保持了游离状态，从而避免了在将导入DNA整合进宿主基因组内(例如，逆转录病毒DNA)时，因插入诱变所导致出现的潜在难题。此外，对外源DNA而言，该腺病毒基因组的负载力比其它基因送递载体大(高达8千碱基对)(Berkneret al.出处同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57：267)。目前通用并因而被本发明所偏爱的大部分复制缺陷腺病毒载体均缺失了全部或部分病毒E1和E 3基因，但仍保留了最多达80％的腺病毒遗传物质(见，例如Jones et al.(1979)Cell 16：683；Berkner et al.，同上；和Graham et al.在Methods in MolecularBiology，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，NJ，1991)vol.7.pp.109-127)。插入基因的表达可以受例如，E1A启动子、主要晚期启动子(MLP)和相关前导序列、E3启动子，或外源插入启动子序列的控制。
另一种有助于送递本发明基因和编码本发明融合蛋白的基因的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是天然存在的缺陷病毒，该缺陷病毒需要以另一种病毒，诸如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒，才可进行有效复制，并具有生产性生活周期。(相关论述可参见Muzyczka et al.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)158：97-129)。它也是少数几种可将其自身DNA整合进非分裂细胞，并显示高频率稳定整合的病毒中的一种(参见，例如Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356；Samulskietal.(1989)J.Virol.63：3822-3828；和McLaughlin et al.(1989)J.Virol.62：1963-1973)。含有少至300个碱基对AAV的载体可以被包装，也可被整合。与外源DNA对应的空间被限定为大约4.5kb。AAV载体，诸如Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5：3251-3260所描述的AAV载体，可被用于将本发明基因或编码本发明融合蛋白的核酸导入细胞中。已有多种核酸通过AAV载体被导入不同的细胞类型中(参见例如Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.4：2072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.2：32-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51：611-619；和Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)。
从疱疹病毒、牛痘病毒、慢病毒及若干RNA病毒已衍生获得了可被用于施用表达构建体的其它病毒载体系统。
除了诸如上述方法的病毒转移法外，也可采用非病毒方法施用包括细菌和真核表达构建体在内的表达构建体。基因转移的大部分非病毒方法依赖于哺乳动物细胞摄取并细胞内转运大分子的正常机制。在优选实施方案中，本发明的非病毒基因送递系统依赖于内吞途径，以通过被锚定细胞摄取本发明基因或编码本发明融合蛋白的基因。该类型的典型基因送递系统包括脂质体衍生系统、聚赖氨酸偶联物和人工病毒包膜。
在一种代表性的实施方案中，本发明基因或编码本发明融合蛋白的核酸可被包埋进特定脂质体中，该脂质体表面带有正电荷(例如lipofectins)，并(任选地)标记有与细胞表面抗原对应的抗体或配体(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Geka 20：547-551；PCT公开物WO91/06309；日本专利申请1047381；和欧洲专利申请EP-A-43075)。在另一个实例中，该脂质体可被标记有特定的单克隆抗体，该单克隆抗体对关节中存在的抗原具有特异性(例如，对治疗关节炎及软骨和/或关节的其它病症而言)。类似地，该方法可被改良用于将本发明蛋白特异性地锚定任意组织，以更为特异性地治疗影响该组织的病症(例如特定组织的癌症、IBD、类风湿性关节炎、脉管炎等)。
上述任意一种基因送递系统的实际给药均可通过本领域熟知的大量方法中的任意一种而得以实现。例如，该基因送递系统的药物制剂可被全身性导入，例如，通过静脉内注射，且因转染特异性由基因送递载体、细胞型或组织型表达，或这几种情况的组合所提供，使得本发明蛋白质在目标细胞中主要发生特异性转导，其中上述细胞型或组织型表达取决于控制受体基因表达的转录调节序列。在另一些实施方案中，该重组基因被完全定位地导入动物体内，从而使该重组基因的初期送递更为有限。例如，通过导管(参见美国专利5,328,470)、立体定位注射(例如Chen et al.(1994)PNAS 91：3054-3057)或电穿孔(Dev et al.(1994)Cancer Treat Rev 20：105-115)，均可将该基因送递载体导入特定组织中。
基因治疗构建体的药物制剂可以基本上由被稀释在可接受稀释剂中的基因送递系统组成，或者可以包括缓释基质，从而将基因送递载体包埋其中。可选地，当重组细胞可完整地生成整个基因送递系统，例如逆转录病毒载体时，该药物制剂可包含一种或多种可生成该基因送递系统的细胞。
施用以核酸为基础或以蛋白质为基础的组合物的方法可通过本领域熟知的诸多方法中的任意一种而得以实现。这些方法包括局部或全身性给药，并进一步包括真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口和鼻内的给药途径。另外，通过任意合适途径，包括心室内和鞘内注射，将本发明药物组合物导入中枢神经系统可能是理想的。心室内注射可通过心室内导管，例如，将该导管与储存器，诸如Ommaya储存器相连。导入方法也可由可再充电或生物可降解装置提供。此外，预期可通过包被装置、植入物、支架或假体从而实现给药。
例如，可将被关节疾病，诸如类风湿性关节炎和骨关节炎严重损害的软骨完全或部分地置换为多种假体。有多种合适的可移植材料存在，包括那些以胶原-糖胺聚糖模板为基础的可移植材料(Stone et al.(1990)Clin Orthorp Relat Red 252：129)、以分离的软骨细胞为基础的可移植材料(Grande et al.(1989)J Orthop Res 7：208；和Takigawa et al.(1987)Bone Miner 2：449)，和以附着在天然或合成聚合物上的软骨细胞为基础的可移植材料(Walitani et al.(1989)J Bone Jt Surg 71B：74；Vacanti et al.(1991)PlastReconstr Surg 88：753；von Schroeder et al.(1991)J BiomedMater Res 25：329；Freed et al.(1993)J Biomed Mater Res 27：11；和Vacanti et al.的美国专利No.5,041,138)。例如，软骨细胞可在生物可降解、生物相容高度多孔支架上的培养物中生长，这些支架由诸如聚乙醇酸、聚乳酸、琼脂糖凝胶的聚合物，或其它聚合物形成，该些聚合物可随时间，按照多聚物主链水解函数，降解为无害单体。上述基质被设计为在移植进行前一直能够与细胞进行充分的营养物质和气体交换。该细胞可被体外培养，直至具有对可移植细胞而言足够的细胞体积和密度为止。上述基质的一个优势在于它们可以根据个体的不同而被浇铸或定型为指定形状，从而使最终产物近似于患者自身的耳或鼻(举例来说)，或者可以采用柔性基质，有助于移植时的操作，例如在关节中的情况。
上述及其它植入物和假体均可经由本发明融合蛋白或含特定核酸的表达构建体处理，该特定核酸可表达本发明融合蛋白。这样，便可将本发明融合蛋白直接施用于特定的感染组织处(例如，受损关节处)。
在本发明的另一种实施方案中，本发明融合蛋白或抗体可作为联合治疗的一部分，与其它药剂一起被施用。联合治疗指结合了两种或两种以上不同治疗性化合物的任何给药形式，从而在施用第二种化合物时，预先被施用的治疗性化合物在体内仍然有效(例如，两种化合物在患者体内同时有效，这可能包括两种化合物的协同作用)。例如，不同的治疗性化合物可在同一配方或不同配方中，被伴随或相继施用。因此，接受该治疗的个体可获得不同治疗性化合物的联合(协同)效果。
例如，在炎症情况中，本发明蛋白或抗体可结合一种或多种用于治疗炎性疾病或病症的药剂一起被施用。用于治疗炎性疾病或病症的药剂包括，但不仅限于，抗炎剂或消炎剂。消炎剂包括，例如糖皮质激素，诸如可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、氟可龙、氟羟脱氢皮甾醇、甲基强的松龙、泼尼立定、帕拉米松、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟泼尼定、去氧米松、肤轻松、氟米松、二氟米松、氯可托龙、氯倍他索和氟考丁酯；免疫抑制剂，诸如抗TNF剂(例如依那西普、英利西单抗)和IL-1抑制剂；青霉胺；非甾族抗炎剂(NSAIDs)，包括抗炎、镇痛和退热药，诸如水杨酸、塞来昔布、difunisal，也包括来自于取代苯乙酸盐或2苯基丙酸盐的非甾族抗炎剂，诸如阿氯芬酸、异丁芬酸、布洛芬、clindanac、苯克洛酸、酮洛芬、非诺洛芬、吲哚洛芬、芬氯酸、环氟拉嗪、氟比洛芬、吡洛芬、萘普生、苯恶洛芬、卡洛芬和环洛芬；昔康衍生物，诸如吡罗昔康；邻氨基苯甲酸衍生物，诸如甲灭酸、氟灭酸、托灭酸和甲氯灭酸、苯胺基取代烟酸衍生物，诸如fenamates miflumic acid、氯尼辛和氟尼辛；杂芳基乙酸，其中杂芳基为2-吲哚-3-基或.吡咯-2-基团，诸如茚甲新、oxmetacin、intrazol、阿西美辛、桂美辛、佐美酸、托美汀、氯吡酸和噻洛芬酸；苏灵大型茚基乙酸；具有止痛活性的杂芳氧基乙酸，诸如benzadac；苯丁唑酮；依托度酸；萘丁美酮；和改善病情抗风湿药(DMARD)，诸如氨甲蝶呤、金制剂、羟化氯喹、柳氮磺胺吡啶、环孢霉素、硫唑嘌呤和来氟米特。
用于治疗炎性疾病或病症的其它疗法包括抗氧化剂。抗氧化剂可以是天然或合成的。抗氧化剂诸如超氧化物歧化酶(SOD)、21-氨基类固醇/氨基色满、维生素C或E等。其它的许多抗氧化剂也是本领域技术人员熟知的。
本发明蛋白或抗体可充当炎症治疗方案的一部分，该方案可结合多种不同的抗炎剂。例如，本发明融合蛋白或抗体可结合一种或多种NSAID、DMARD或免疫抑制剂一起被施用。在本发明的一种实施方案中，本发明融合蛋白可与氨甲蝶呤一起被施用。在另一种实施方案中，本发明融合蛋白可与TNF-α抑制剂一起被施用。
在被认为存在实际炎性成分的心血管疾病，尤其是由动脉粥样硬化斑引发的心血管疾病情况中，本发明蛋白或抗体可结合一种或多种其它用于治疗心血管疾病的药剂一起被施用。用于治疗心血管疾病的药剂包括，但不仅限于β阻断剂，诸如卡维地洛、美多心安、布新洛尔、比索洛尔、氨酰心安、心得安、萘羟心安、噻吗心安、心得静和柳胺苄心定；抗血小板剂，诸如阿司匹林和噻氯匹定；血管紧张肽转化酶(ACE)的抑制剂，诸如卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、喹那普利、雷米普利、螺普利和莫昔普利.；和降脂剂，诸如美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀和罗素他汀。
在癌症的情况中，本发明蛋白或抗体可结合一种或多种抗血管生成因子、化学疗法，或者作为放射疗法的佐剂被施用。进一步展望本发明蛋白或抗体的施用可作为癌症治疗方案的一部分，该癌症治疗方案可结合多种不同的癌症治疗剂。在IBD的情况中，本发明融合蛋白或抗体可结合一种或多种抗炎剂一起被施用，并可另外结合改良的饮食制度。
本发明融合蛋白的施用(或作为蛋白组合物，或作为编码本发明蛋白的核酸组合物)可被用于治疗RAGE相关病症，或者可结合其它药剂和治疗方案一起被用于治疗RAGE相关病症。
8.药物筛选实验
在某些实施方案中，本发明提供了鉴定特定试验化合物的实验方法，该试验化合物可抑制RAGE-BP(例如S100或两性蛋白)与受体多肽(例如上述RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的结合。
在某些实施方案中，该实验检测了可调节RAGE受体信号传递活性的试验化合物，该信号传递活性由选自S100和两性蛋白的RAGE-BP诱导。该信号传递活性包括，但不仅限于，与其它细胞组成结合、活化酶，诸如促分裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)，活化NF-kB转录活性等。
有多种实验形式均满足需要，并且根据本公开内容，此处未详述的实验形式仍可被本领域任意一位普通技术人员理解。实验形式大致为诸如蛋白质复合体形成、酶活性的条件，且该实验形式可以多种不同形式产生，并包括以无细胞体系，例如已纯化的蛋白或细胞溶解产物为基础的实验，以及以细胞为基础，即利用完整细胞的实验。简单结合实验可被用于检测抑制RAGE-BP(例如S100或两性蛋白)与受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)之间相互作用的化合物。待检化合物可由，例如细菌、酵母或其它生物体生成(例如天然产物)，也可通过化学法或重组法制备(例如小分子，包括肽模拟体)。
在许多实施方案中，采用候选化合物温育细胞后，操纵并测定细胞的RAGE受体信号传递活性，该活性由RAGE-BP(例如S100或两性蛋白)诱导。在某些实施方案中，对该活性的生物测定可以包括NF-kB活性测定(例如NF-kB荧光素酶或GFP报道基因测定)。
典型的NF-kB荧光素酶或GFP报道基因测定可参照Shona et al.(2002)FEBS Letters.515：119-126所述方法进行。简言之，采用NF-kB-荧光素酶报道基因转染细胞。随后，采用候选化合物温育该转染细胞。接着，在经由该化合物处理，或未经该化合物处理的细胞中测定NF-kB激发的荧光素酶活性。可选地，采用NF-kB-GFP报道基因(Stratagene)转染细胞。随后，采用候选化合物温育该转染细胞。接着，通过采用荧光/可见光显微镜装置测定GFP表达，或通过FACS分析，以监测NF-kB激发的基因活性。
在某些实施方案中，本发明提供了重组蛋白制剂，该制剂含有受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)，和一种或多种RAGE-BP(例如S100或两性蛋白)。本发明的实验包括体外标记蛋白质相互结合实验、对蛋白质结合的免疫测定等。纯化蛋白也可被用于测定三维晶体结构，该测定可被用于模拟分子间的相互作用。
在本发明实验的某些实施方案中，RAGE-BP多肽(例如S100或两性蛋白)或受体多肽(例如RAGE)可以是被选择用于进行实验的细胞的内源多肽。可选地，RAGE-BP多肽或受体多肽(例如RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)可以是外源多肽。例如，通过重组技术(例如通过利用表达载体)，和通过显微注射本发明融合蛋白本身或编码该融合蛋白的mRNA，便可将融合蛋白导入细胞中。
在本发明实验进一步的实施方案中，可在完整细胞内生成RAGE-BP与受体多肽形成的复合体，同时利用了细胞培养技术以利于本发明实验的进行。例如，如上所述，在真核细胞培养系统，包括哺乳动物和酵母细胞中，可构成该复合体。在完整细胞内进行本发明实验的优势包括具有检测特定化合物的能力，其中该特定化合物在更近似于其治疗用途所需条件的环境中发挥了功能，而该功能包括化合物进入细胞的能力。此外，在本发明实验的某些体内实施方案中，诸如下述实例，均可对候选化合物实现高通量的分析。
在本发明实验的某些体外实施方案中，重组复合体包括至少被半纯化的蛋白质的重组混合物。半纯化指上述重组混合物中利用的蛋白质已预先与其它细胞蛋白分离。例如，与细胞溶解产物相比，该复合体形成所含蛋白质在混合物中的纯度相对于该混合物中所有其它蛋白质的纯度，至少为50％，且更优选的纯度是90-95％。在本发明方法的某些实施方案中，重组蛋白混合物是通过将高度纯化的蛋白质混合而获得的，因此，该重组混合物基本上缺乏其它蛋白质(诸如来源于细胞的那些蛋白)，而这些蛋白可能干扰或以其它方式改变测定该复合体装配和/或分解的能力。
在某些实施方案中，可在任何适合容纳反应物的容器中实现候选化合物存在和缺乏情况下的测定。该容器实例包括微量滴定板、试管和微离心管。
在某些实施方案中，可形成具有如下特征的药物筛选实验，即该实验基于试验化合物干扰特定复合体装配、稳定性或功能的能力对其进行检测，其中该复合体由RAGE-BP(例如S100或两性蛋白)和受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)形成。在一种典型的结合实验中，试验化合物与含有RAGE-LBE-免疫球蛋白融合多肽和RAGE-BP，诸如S100或两性蛋白的混合物接触。对上述复合体的检测和定量提供了测定化合物特定功效的途径，该功效即化合物在抑制上述复合体两种组成之间相互作用方面的功效。化合物的该功效可通过特定数据所生成的剂量反应曲线而得以评估，该特定数据是通过采用多个浓度的试验化合物获得的。此外，也可进行对照实验，以提供基线用于比较。在对照实验中，复合体的形成是在缺乏试验化合物的条件下被定量的。
在某些实施方案中，可通过多种技术检测复合体中两种多肽(例如RAGE-BP和受体多肽)之间的结合，这些技术中的许多技术已在上文得到了描述。例如，复合体形成中的调节可采用，例如可检测标记蛋白(例如放射标记、荧光标记或酶标记的)，通过免疫测定，或通过色谱检测而得以定量。表面等离子共振系统，诸如BiacoreInternational AB(Uppsala，Sweden)可提供的表面等离子共振系统也可被用于检测蛋白质之间的相互作用。
在某些实施方案中，含有RAGE-BP和受体多肽的复合体中的一种多肽可以被固定，从而有利于从未复合形式的其它多肽中分离该复合体，也配合了该实验的自动化操作。在一种例证性的实施方案中，可提供一种插入了特定区域的融合蛋白，该区域可使该蛋白质与不溶性基质结合。例如，GST-RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白可被吸收至谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，随后使该谷胱甘肽琼脂糖珠或谷胱甘肽衍生的微量滴定板与可能相互作用的蛋白质(例如标记有35S的S100多肽)结合，并在有助于复合体形成的条件下温育该试验化合物。温育结束后，洗涤珠体，以除去所有未结合的相互作用蛋白，并直接测定与该基质珠结合的放射性标记(例如将珠体置入闪烁体中)，或者在复合体解离后，在上清液中测定与基质珠结合的放射性标记，例如在采用微量滴定板的情况中。可选地，洗掉未结合蛋白质后，可使复合体与基质解离，通过SDS-PAGE凝胶分离，并采用标准电泳技术从凝胶中定量出基质结合部分中存在相互作用的多肽水平。
在另一种实施方案中，可采用双杂交实验(也被称为相互作用陷阱实验)检测RAGE-LBE与RAGE-BP所形成复合体中两种多肽的相互作用(也可参见美国专利NO：5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell72：223-232；Madura et al.(1993)J.Biol Chem 268：12046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14：920-924；和Iwabuchi etal.(1993)Oncogene 8：1693-1696)，也可将该双杂交实验继续用于检测可抑制RAGE-LBE-免疫球蛋白融合多肽与RAGE-BP多肽结合的试验化合物。该实验包括提供宿主细胞，例如，酵母细胞(优选的)、哺乳动物细胞或细菌细胞类型。该宿主细胞含有特定报道基因，该报道基因具有与诱饵蛋白所用转录激活因子的DNA结合区对应的结合位点，因此该报道基因被转录激活时，便可表达可检测基因产物。实验提供了第一嵌合基因，该基因可在上述宿主细胞内被表达，并编码“诱饵”融合蛋白。该实验也提供了第二嵌合基因，该基因也可在上述宿主细胞中被表达，并编码“鱼”融合蛋白。一种实施方案中，第一和第二嵌合基因均以质粒形式被导入宿主细胞中。但优选地使第一嵌合基因位于宿主细胞的染色体上，而将第二嵌合基因作为质粒部分导入宿主细胞中。
在某些实施方案中，本发明提供了双杂交实验以鉴定特定试验化合物，该化合物可抑制RAGE-BP多肽(例如S100和两性蛋白)与受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的结合。例如，将含有受体多肽的“诱饵”蛋白，和含有RAGE-BP多肽(例如S100或两性蛋白)的“鱼”蛋白导入宿主细胞中。使细胞处于特定条件下，可使诱饵和鱼融合蛋白均以足够活化报道基因的量表达。两种融合多肽的相互作用导致了可检测信号的出现，该信号由报道基因表达生成。因此，在试验化合物存在和缺乏的两种情况中，两种融合蛋白之间的相互作用水平可通过检测各情况中报道基因的表达水平而得以评估。根据本发明方法可采用多种报道构建体，这些构建体包括，例如可产生下述可检测信号的报道基因，该可检测信号选自酶信号、荧光信号、磷光信号和抗药性。
在许多测试化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，为使指定时限内所鉴定化合物的数量最大化，采用高通量分析是理想的。可在无细胞体系中进行的本发明实验，诸如可采用已纯化或半纯化蛋白或溶解产物进行的实验通常被称为“初级”筛选，该筛选的进行可使针对分子目标中的变化的检测快速进行并相对简单，其中分子目标中的变化由试验化合物所介导。此外，在体外系统中，通常可以忽略试验化合物的细胞毒性和/或生物利用率的影响，实验主要关注的是药物对分子目标的作用，该作用可通过分子目标与其它蛋白结合亲和力的改变或该分子目标酶特性的变化而得以显现。
在某些实施方案中，可通过免疫沉淀和对共免疫沉淀蛋白的分析，或通过亲和纯化和对共纯化蛋白的分析，评估RAGE-BP与受体之间的复合体形成。以荧光共振能量转移(FRET)为基础的实验也可被用于确定该复合体形成。具有合适发射和激发光谱的荧光分子被带入彼此接近的位置时，便可显示出FRET。该荧光分子是特选的，因而其中一个分子(供体分子)的发射光谱与另一个分子(受体分子)的激发光谱重叠。供体分子被其激发光谱范围内合适强度的光所激发。随后该供体便以荧光形式发射被吸收的能量。它所产生的荧光能量被受体分子淬灭。FRET可通过供体来源荧光信号强度的降低、供体被激发状态寿命的缩短，和/或受体较长波长(较低能量)特征处荧光的再发射而得以显现。当荧光蛋白在物理上分散时，FRET效应便被削弱或消除了(见例如，美国专利No.5,981,200)。
FRET的发生也导致供体荧光部分的荧光寿命缩短了。荧光寿命的变化可通过利用被称为荧光寿命成像技术(FLIM)测定(Verveer et al.(2000)Science 290：1567-1570；Squire et al.(1999)J.Microsc.193：36；Verveer et al.(2000)Biophys.J.78：2127)。人们已研发出可用于分析FLIM数据的整体分析技术。这些算法利用了一种认识，即供体荧光部分仅存在于有限数量的状态中，各状态均具有独特的荧光寿命。各状态的定量图可在逐个像素的基础上生成。
为进行以FRET为基础的实验，需将RAGE-BP多肽(例如S100或两性蛋白)和受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)二者荧光标记。根据本说明书，合适的荧光标记是本领域熟知的。下文提供了实例，但本领域技术人员也可采用此处未具体论述的合适荧光标记。荧光标记可通过将多肽与一种荧光蛋白，例如分离自水母、珊瑚虫及其它腔肠动物的荧光蛋白一起作为融合蛋白表达而得以实现。典型的荧光蛋白包括来源自Aequoria victoria水母的绿色荧光蛋白(GFP)的许多变体。变体可以是发光体、变光体，或者具有不同的激发和/或发射光谱。某些变体被改变后不再出现绿色，并可能出现蓝色、蓝绿色、黄色或红色(分别被称为BFP、CFP、YFP和RFP)。荧光蛋白可通过多种共价和非共价连接，包括，例如肽键(例如作为融合蛋白表达)、化学交联和生物素-链霉抗生物素蛋白偶联，与多肽稳定附着。荧光蛋白的实例参见美国专利Nos.5,625,048；5,777,079；6,066,476；6,124,128；Prasher et al.(1992)Gene，111：229-233；Heim et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：12501-04；Ward et al.(1982)Photochem.Photobiol.，35：803-808；Levine et al.(1982)Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85；Tersikh et al.(2000)Science 290：1585-88。
以FRET为基础的实验可被应用在以细胞为基础的实验和无细胞实验中。以FRET为基础的实验应按照高通量筛选方法进行，该方法包括荧光激活细胞分类术和微滴阵列的荧光筛选。
通常，在筛选实验为结合实验的情况中(无论是蛋白质相互结合，还是化合物-蛋白质结合等)，分子中的一个或多个均可与一个标记连接，其中该标记可直接或间接地提供可检测信号。多种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子，例如磁性粒子等。特异性结合分子包括配对的结合分子，诸如生物素和链霉抗生物素蛋白、异羟基洋地黄毒苷原和抗异羟基洋地黄毒苷原等。根据已知的操作方法，对特异性结合的成员而言，互补成员通常应被标记有可供检测的分子。
筛选实验可包括其它多种试剂。这些试剂包括那些可被采用以利于蛋白质-蛋白质最佳结合和/或减少非特异性或背景相互作用的试剂，如盐、中性蛋白，例如白蛋白，去污剂等。可提高实验效率的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物化合物等试剂也可被采用。混合物各组分可以任意顺序添加，但该顺序应为必需的结合做准备。温育可在任意合适温度下进行，典型地为4℃～40℃。温育期是针对最适活性而特选的，但也可被最优化以利于快速高通量的筛选。
在某些实施方案中，本发明提供了不依赖复合体的实验，该实验直接针对，诸如(RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的复合体中的单个多肽。该实验包括对试验化合物的鉴定，该试验化合物是抑制RAGE-BP与受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)结合的候选抑制剂。
在一种典型的实施方案中，通过采用受体RAGE-LBE多肽，可鉴定与受体多肽结合的化合物。在一种例证性的实施方案中，RAGE-LBE-免疫球蛋白的融合蛋白可插入一个附加区域，该区域可使融合蛋白与不溶性基质结合。例如，与GST蛋白融合的RAGE-LBE-免疫球蛋白可被吸收至谷胱苷肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱苷肽衍生的微量滴定板上，谷胱苷肽琼脂糖珠或谷胱苷肽衍生的微量滴定板随后与潜在的已标记结合化合物结合，并在有助于结合的条件下被温育。温育结束后，洗涤珠体，以除去所有未结合的化合物，并直接测定与基质珠结合的标记，或者在已结合化合物解离后在上清液中进行测定。
在某些实施方案中，标记可直接或间接提供可检测信号。多种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子，例如磁性粒子等。特异性结合分子包括配对的结合分子，诸如生物素和链霉抗生物素蛋白、异羟基洋地黄毒苷原和抗异羟基洋地黄毒苷原等。根据已知操作方法，对特异性结合成员而言，互补成员通常应标记有可供检测的分子。在某些实施方案中，该方法包括在体外形成混合物。在某些实施方案中，该方法通过在体内形成混合物，包括了以细胞为基础的实验。在某些实施方案中，该方法包括使表达受体多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)或其变体的细胞与试验化合物接触。
在某些实施方案中，实验不仅可以无细胞体系，例如已纯化的蛋白或细胞溶解产物为基础，还可以细胞为基础，利用完整细胞。简单结合实验可被用于检测与受体多肽相互作用的化合物。待检化合物可由，例如细菌、酵母或其它生物体生成(例如天然产物)，也可通过化学法或重组法生成(例如，小分子，包括肽模拟体)。
任选地，由上述实验鉴定的试验化合物可被用于治疗RAGE相关病症。
9.药物制剂
本发明的蛋白或核酸最为优选地以合适组合物的形式被施用。就合适组合物而言，可列举出所有通常被用于全身性或局部施用药物的组合物。药学可接受载体基本上应为惰性，因而不与活性组分反应。合适的惰性载体包括水、酒精、聚乙二醇、矿物油或凡士林、丙二醇等。该药物制剂(包括本发明融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸)可被配制用于以适用于人类或兽用药品的任意方便途径进行的给药。
因此，本发明的另一方面提供了药学可接受组合物，该组合物含有有效量的本发明融合蛋白，并连同配制了一种或多种药学可接受载体(添加剂)和/或稀释剂。如下文所具体描述的，本发明的药物组合物可被特别配制，以适用于固体或液体形式的给药方式，包括适用于下述给药的方式：(1)口服，例如兽用顿服药(水性或非水性溶液或悬液)、片剂、大丸剂、粉剂、粒剂、应用于舌部的糊剂；(2)肠胃外给药，例如，通过皮下、肌内或静脉内注射，例如，无菌溶液或悬液；(3)体表应用，例如，以乳膏、软膏或喷雾剂形式应用于皮肤；或(4)阴道内或直肠内给药，例如，以阴道栓剂、乳膏或泡沫形式给药。不过，在某些实施方案中，本发明药剂可以仅溶解或悬浮于无菌水中。在某些实施方案中，该药物制剂无热原性，即不提高患者的体温。
此处所用短语“有效量”指可在动物体内有效产生某些预期效果的一种或多种药剂、物质或组合物的量，该组合物含有本发明的一种或多种药剂。应当认可的是，当药剂被用于实现疗效时，包括“有效量”在内的实际剂量应根据多种情况而改变，这些情况包括被治疗的特定病症、该疾病的严重程度、患者的个体大小或身体状况、给药途径等。一个熟练的医师可利用医学领域熟知的方法轻松确定合适剂量。
此处所用短语“药学可接受的”指属于合理医学判断范畴，适用于与人类和动物的组织接触，且不引起过多毒性、刺激、变态反应或其它难题或并发症，相当于具有合理效益/风险比的化合物、物质、组合物和/或剂型。
此处所用短语“药学可接受载体”指参与将本发明药剂从肌体的一个器官或部分负载或转运至肌体的另一个器官或部分的药学可接受物质、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。各载体在与配方中其它组分相容的意义上必须是“可接受的”。可充当药学可接受载体的物质的某些实例包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；(9)油剂，诸如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无致热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；及(21)其它被应用在药物配方中的无毒性相容物质。
在某些实施方案中，一种或多种药剂可含有碱性功能基团，诸如氨基或烷氨基，从而能够与药学可接受的酸形成药学可接受的盐。在这个方面，术语“药学可接受的盐”指本发明化合物中相对无毒性的无机和有机酸加成盐。这些盐可在本发明化合物的最终分离和纯化期间被原位制备，或者通过使本发明已纯化的化合物以其游离碱形式分别与合适的有机或无机酸反应，并分离所形成的盐，而得以制备。代表性的盐包括溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(见例如Berge et al.(1977)“PharmaceuticalSalts，”J.Pharm.Sci.66：1-19)。
药剂中的药学可接受盐包括化合物中的常规无毒性盐或季铵盐，例如衍生自无毒性有机或无机酸的常规无毒性盐或季铵盐。例如，这种常规无毒性盐包括由无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的盐；由有机酸，诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2乙酸基苯甲酸、延胡索酸、甲苯亚磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸等制备的盐。
在其它情况中，一种或多种药剂可含有一个或多个酸性功能基团，从而能够与药学可接受的碱形成药学可接受的盐。这些盐同样可在化合物的最终分离和纯化期间被原位制备，或者通过使已纯化的化合物以其游离酸形式分别与合适的碱，诸如药学可接受金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐反应，或与氨、药学可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应，而得以制备。代表性的碱或碱土盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。适用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(见例如Berge et al.，同上)。
润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁，以及着色剂、隔离剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和加香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于本发明组合物中。
药学可接受抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸盐、丁化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的配方包括适用于口、鼻、体表(包括面颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药的配方。该配方可方便地以单位剂型存在，并可通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体物质结合并获得单一剂型的有效成分的量应根据接受治疗的宿主和特定给药方式的不同而变化。可与载体物质结合并获得单一剂型的有效成分的量通常应为可产生疗效的化合物的量。通常，在100％的范围中，有效成分的量的范围应是大约1％～大约99％，优选的范围应是大约5％～大约70％，最为优选的范围应是大约10％～大约30％。
制备上述配方或组合物的方法包括使药剂与载体，以及任选的一种或多种助剂联合的步骤。通常，该配方是通过使本发明药剂与液体载体，或细碎的固体载体，或与二者一起均匀且紧密地联合而得以制备，并且如有必要，随后还可对产品塑型。
适用于口服的本发明配方可为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(采用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、粉剂、粒剂形式，或者为在水性或非水性液体中形成的溶液或悬液形式，或者为水包油或油包水液体乳剂形式，或者为酏剂或糖浆形式，或者为锭剂(采用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)形式和/或漱口剂形式等，各种配方形式所含有效成分均为预定量的本发明化合物。本发明化合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂形式施用。
在本发明用于口服的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、粒剂等)中，有效成分与一种或多种药学可接受载体，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或下述任一物质混合：(1)填充剂或增容剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯砒咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和皂土；(9)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸月桂酯钠及它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，药物组合物也可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可作为填充剂应用在软和硬填充明胶胶囊中，这些胶囊采用了诸如乳糖，以及高分子量聚乙二醇等作为赋形剂。
片剂可通过压缩或塑型而得以制备，任选地含有一种或多种助剂。压缩片剂可采用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟基乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性或分散剂而得以制备。塑型片剂可通过在合适的机器中对经由惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物混合物进行塑型而得以制备。
本发明药物组合物的片剂及其它固体剂型，诸如糖锭剂、胶囊、丸剂和粒剂，均可任选地经过涂层和外壳的修整或制备，诸如药物配制领域熟知的肠溶衣及其它涂层。也可采用，例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体对上述剂型进行配制，使其所含有效成分得以缓释或控释，其中采用羟丙基甲基纤维素时，可使其比例变化，从而获得要求的释放分布图。上述剂型可通过下述方法得以灭菌，例如通过挡菌滤器进行过滤，或通过加入无菌固体组合物形式的灭菌剂，并在使用前立即溶解于无菌水或其它无菌注射介质中。上述组合物也可任选地含有乳浊剂，并可属于这样一种组合物，即其仅仅释放有效成分，或优先在胃肠道的特定部位中，可选地以延迟方式释放有效成分。可采用的包埋组合物实例包括聚合物和蜡。有效成分也可为微胶囊形式，如适当，可采用一种或多种上述赋形剂以形成该微胶囊。
本发明化合物适用于口服的液体剂型包括药学可接受乳剂、微乳剂、溶液、悬液、糖浆和酏剂。除了有效成分外，液体剂型还可含有本领域通用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其它溶剂、加溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢基呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，及它们的混合物。
除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。
除了有效化合物以外，悬液还可含有助悬剂，诸如，乙氧基化的异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂和西黄蓍胶，及它们的混合物。
本发明药物组合物适用于直肠或阴道给药的配方可为栓剂形式，可通过将本发明的一种或多种化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合而得以制备，合适的无刺激性赋形剂或载体包括，例如可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，且该栓剂室温下为固体，体温下则为液体，因此可在直肠或阴道腔内融化并释放药剂。
本发明适用于阴道给药的配方还包括含有本领域已知适用的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾配方。
本发明化合物适用于体表或经皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、膜片和吸入剂。该活性化合物可在无菌条件下与药学可接受载体混合，也可能需要混合任意防腐剂、缓冲剂或推进剂。
上述软膏、糊剂、乳膏和凝胶除含有本发明的活性化合物以外，还可含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、皂土、硅酸、滑石和氧化锌，或它们的混合物。
粉剂和喷雾剂除含有本发明化合物以外，还可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或它们的混合物。喷雾剂可另外含有通用的推进剂，诸如含氯氟烃，和挥发性未被取代的烃，诸如丁烷和丙烷。
经皮药贴具有另一个优势，即可提供本发明化合物到肌体的受控送递。这种剂型可通过将药剂溶解或分散于合适介质中而得以制备。也可采用吸收增强剂以提高药剂跨越皮肤的通量。该通量的速率可通过采用速度控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中而得到控制。
眼科配方，眼部软膏、粉剂、溶液等也被认为属于本发明的范畴。
本发明适用于肠胃外给药的药物组合物包括本发明的一种或多种化合物，还组合了一种或多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬液或乳剂，或可于使用前在无菌可注射溶液或分散体中重构的无菌粉剂，该药物组合物可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及可使配方与预期受体血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
可应用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及它们合适的混合物，还包括植物油，诸如橄榄油，以及可注射有机酯，诸如油酸乙酯。通过例如，利用涂料，诸如卵磷脂，或通过在分散体情况中维持必需的粒度，以及通过利用表面活性剂，均可维持适当的流动性。
上述组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保预防微生物的作用。将等渗剂，诸如糖类、氯化钠等包括在该组合物中也是理想的。另外，通过包含可延迟吸收的物质，诸如单硬脂酸铝和明胶，便可延长可注射药物形式的吸收。
在某些情况中，为延长药效，减缓皮下或肌内注射药剂的吸收是理想的。可通过利用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液体悬液而实现吸收减缓。药剂的吸收率则取决于其溶解速率，反过来可能取决于结晶粒度和晶形。可选地，延迟肠胃外施用药剂的吸收可通过使药剂溶解或悬浮于油性媒介物中而得以实现。
通过使本发明化合物在生物可降解聚合物，诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微胶囊基质，可制备成可注射的贮存形式。根据药剂与聚合物的比例，以及所应用特定聚合物的性质，可控制药剂释放速率。其它生物可降解聚合物实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。贮存可注射配方也可通过将药剂包入脂质体或与肌体组织相容的微乳剂中而得以制备。
当将本发明化合物作为药物施用于人和动物时，可施用该化合物本身，或者以药物组合物形式施用，该药物组合物除含有例如，0.1～99.5％(更为优选的是0.5～90％)有效成分，并组合了一种药学可接受载体。
除了上述组合物，还可由含有适当量治疗剂的掩蔽物，诸如石膏、绷带、敷料剂、纱布等组成应用。如上文所具体描述的，治疗性组合物可存在于支架、装置、假体和植入物上，从而一起被施用/送递。
实施例
本发明现已得到一般性描述，通过参考下述实施例可更轻松地理解本发明，将下述实施例包括在内仅为例证本发明的某些方面和实施方案，对本发明并不构成限制。
实施例1：对类风湿性关节炎患者体内被正或负调节的基因的鉴定
该实施例描述了对若干基因的鉴定，其中与这些基因在正常被试者PBMCs中的表达相比，这些基因在类风湿性关节炎(R.A.)患者的外周血单核细胞(PBMCs)中被正或负调节了。
如下从9名R..A.患者和13名正常志愿者体内分离PMBCs。将8毫升血液吸入CPT Vacutainer管中，倒置若干次。将管置于旋翼式转子中，以室温、1500×g(2700rpm)离心。除去血清，并将PBMCs转移进15毫升圆锥形离心管中。通过加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并于450g(1200rpm)离心5分钟，以洗涤细胞。抛弃上清液，并再次重复洗涤操作。除去上清液后，采用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Hidden，Germany)，并根据厂商的操作方法分离总RNA。
如下，在由6,800和12,000个人类基因(分别为AffymetrixHu6800和HgU95A芯片组)组成的寡核苷酸阵列上分析RNA。
如下制备用于杂交的目标核酸。通过使PBMC来源的5pg总RNA和100pM T7/T24标记的寡dt引物(在Genetics Institute，Cambridge，MA合成)于70℃变性10分钟，并于冰上冷却，从而制备获得用于杂交的总RNA。cDNA第一链的合成在下述缓冲条件下进行：1×第一链缓冲剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)、10mM DTT(GIBCO/Invitrogen)、分别为500μM的各种dNTP(Invitrogen LifeTechnologies)、400单位Superscript RT II(Invitrogen LifeTechnologies)和40单位RNAase抑制剂(Ambion，Austin，TX)。反应在47℃进行1小时。通过添加终浓度如下的下列试剂合成cDNA第二链：1X第二链缓冲剂(Invitrogen Life Technologies)、额外的分别为200μM的各种dNTP(Invitrogen Life Technologies)、40单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Invitrogen Life Technologies)、2单位大肠杆菌RNAaseH(Invitrogen Life Technologies)和10单位大肠杆菌DNA连接酶。反应在15.8℃进行2小时，并在该反应进行的最后5分钟内加入6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。如下利用BioMag羧基终止粒子纯化通过上述步骤获得的双链cDNA：通过采用0.5M EDTA洗涤三次，以平衡0.2mg的BioMag粒子(Polysciences In.，Warrington，PA)，并将其重悬浮在0.5MEDTA中，浓度为22.2mg/ml。稀释该双链cDNA反应物，至终浓度为10％PEG/1.25M NaCl，并加入珠悬液至最终珠浓度为0.614mg/ml。室温温育反应10分钟。采用300μl、70％乙醇洗涤cDNA/珠复合体，将乙醇除去后，风干试管。通过加入pH7.8、20μl、10mM的Tris-乙酸洗脱cDNA，温育2-5分钟，并移出含cDNA的上清液。
随后，将10μl已纯化的双链cDNA加入体外转录(IVT)溶液中，该溶液含有1×IVT缓冲剂(Ambion，Austin，TX)、5,000单位T7 RNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)、3mM GTP、1.5mMATP、1.2mM CTP和1.2mM UTP(Amersham/Pharmacia)、各为0.4mM的bio-16UTP和bio-11CTP(Enzo Diagnostics，Farmingdale，NY)和80单位RNase抑制剂(Ambion，Austin，TX)。反应于37℃进行16小时。利用RNeasy(Qiagen)纯化已标记RNA。通过测定260nm处的吸光度可定量该RNA的产量。
如下进行阵列杂交和荧光检测。94℃条件下，在pH8.0、含有100mM乙酸钾和30mM乙酸镁、40mM的Tris-乙酸中温育35分钟，使12μg的IVT片段化。在杂交缓冲液中稀释该片段化的标记RNA探针，该杂交缓冲液所含最终组分为1×2-N吗啉乙磺酸(MES(缓冲液(pH6.5)、50pM Bio948(可与探针阵列(Genetics Institute，Cambridge，MA)上的界标特征杂交的对照生物素化寡体)、100μg/ml鲱鱼精子DNA(Promega，Madison，WI)、500μg/ml乙酰化BSA(Invitrogen LifeTechnologies)和1μl/μg的标准曲线试剂(由Gene Logic，Gaithersburg，MD提供的专利试剂)。45℃条件下，采用两种玻璃珠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)与上述杂交溶液预杂交过夜。将杂交溶液移至干净试管中，95℃加热1-2分钟，并高速微离心2分钟，使不溶性碎屑沉淀。采用非严格性洗涤缓冲液(0.9M NaCl、60mM磷酸钠、6mM EDTA和0.01％Tween20)预先湿润Affymetrix寡核苷酸阵列盒(人6800阵列P/N900183和人U95A(Affymetrix，Santa Clara，CA))，并于45℃旋转条件下温育5-10分钟。从Affymetrix盒移除缓冲液，并于45□、45-60rpm旋转条件下，采用180μl杂交溶液与该阵列杂交过夜。温育过夜后，除去杂交溶液，并在盒内充满非严格性洗涤缓冲液。采用Affymetrix射流状态洗涤阵列盒，该状态为25℃条件下，采用非严格性洗涤缓冲液进行10个循环的2次混合/循环，随后采用严格性洗涤缓冲液(100mM MES、0.1M Na+、0.01％Tween20和0.005％消泡剂)进行4个循环的15次混合/循环。随后于25℃条件下，在SAPE溶液(100mM MES、1M Na+、0.05％Tween20、0.005％消泡剂、2mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen Life Technologies)，和10μg/mlR藻红蛋白链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR))中，对探针阵列进行第一次染色10分钟。第一次染色后，于25℃条件下，采用非严格性洗涤缓冲液进行10个循环的4次混合/循环，洗涤探针阵列。随后，于25℃条件下，在抗体溶液(100mM MES、1M Na+、0.05％Tween20、0.005％消泡剂、2mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen LifeTechnologies)、100μg/ml山羊I gG(SIGMA，St.Louis，MO)和3μg/ml生物素化抗链霉生物素蛋白抗体(山羊)(VectorLaboratories))中，对探针阵列染色10分钟。在第二次染色后，于25℃，在SAPS溶液中，对探针阵列再次染色10分钟。最后，于30℃，采用非严格性洗涤缓冲液进行15个循环的4次混合/循环，洗涤探针阵列。采用Affymetrix基因芯片扫描仪(Affymetrix，Santa Clara，CA)扫描阵列。该扫描仪含有扫描共焦显微镜，采用了氩离子激光器作为激发源，并通过530nm带通滤波器(荧光素0或560长通滤波器(藻红蛋白))的光电倍增管检测发射。
利用GENECHIP 3.0或4.0软件，并对内部对照进行归一化/标度，进行数据分析。对每一患者而言，采用了两个参数过滤数据：1)“绝对判定(Absolute Decision)”，可指出特定RNA样品内某一基因RNA的存在(P)或缺乏(A)；2)“频率”，可测定RNA样品内特定RNA的拷贝数量，且该数值被表示为拷贝数与一百万转录产物的比例。如基因被认为“缺乏”，其频率不被用于计算该基因的平均频率。如果在Hu6800数据中，对4个以上的患者而言；或在HgU95A数据中，对2个以上的患者，或6个以上的正常研究对象而言，基因均被认为“缺乏”，便不计算平均频率。仅对正常志愿者而言具有平均频率的基因被标记为“正常”，而仅对患者而言具有平均频率的基因被标记为“疾病”。通过用正常志愿者的平均基因频率除患者的平均基因频率，可计算基因表达中的倍数变化。被选定用于分析的基因符合下述标准：1)倍数变化大于1.95或小于-1.95，以及2)这些基因被标记为“正常”或“疾病”。
尤应指出的是，RAGE配体S100a9和S100a12在类风湿性关节炎患者的细胞中均被过度表达。
实施例2：对在患有类风湿性关节炎的动物模型中被正或负调节的 基因的鉴定
该实施例描述了对若干基因的鉴定，其中与正常小鼠相比，该基因在患有胶原诱导关节炎的小鼠(CIA)体内被正或负调节了。基因表达在小鼠爪部、PBMCs和滑膜中测定。
CIA是被公认的类风湿性关节炎动物模型。如下在小鼠体内诱导该疾病。采用雄性DBA/I(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)小鼠进行所有实验。利用鸡II型胶原(Sigma，St.Louis，MO)或牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)诱导关节炎。将鸡胶原溶解于0.01M乙酸中，并采用等体积的完全弗氏佐剂(CFA；Difco Labs，Detroit，MI)将其乳化，该完全弗氏佐剂含有1mg/ml结核杆菌(菌株H37RA)。第0天，将200μg鸡胶原皮内注射进小鼠尾根处。第21天，对小鼠腹膜内注射含有100μg鸡II型胶原的PBS溶液。将牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)溶解于0.1M乙酸中，并采用含有1mg/ml结核杆菌(菌株H 37RA)的等体积CFA(Sigma)将其乳化。第0天，将200μg牛胶原皮下注射进小鼠尾根处。第21天，对小鼠尾根处皮下注射一种溶液，该溶液由含200μg牛胶原的0.1M乙酸与等体积不完全弗氏佐剂(Sigma)混合而成。使首次用于实验的动物接受相同的注射方案，但不含胶原。监控小鼠的疾病进展，一周至少三次。根据指数：0＝正常；P＝关节炎前期，特征为趾尖上的病灶红斑；1＝可见红斑，伴随以1-2个肿胀爪趾；2＝显著红斑，特征为爪部肿胀和/或多个爪趾肿胀；3＝延伸至踝或腕关节处的大量肿胀；4＝难以活动僵硬的肢体或关节，对个体小鼠的肢体进行临床评分。对任意特定小鼠的全部肢体评分的总和可获得的最大总体评分为16。
在疾病的不同阶段，使动物安乐死，并收获组织。在一组实施例中，将每只动物的至少两只爪瞬间冷冻于液氮中，以用于RNA分析。利用研钵、研棒和液氮，将冷冻的小鼠爪磨成细粉。采用PromegaRNAgents总RNA分离系统(Promega，Madison，WI)纯化RNA。采用RNeasy微型试剂盒进一步纯化RNA。将其余的爪固定在组织学所用的10％福尔马林中。
在另一组实施例中，在小鼠PBMC中测定基因表达。通过心脏穿刺，将血液收集进EDTA包被的收集管中。根据相近的总体评分(正常、关节炎前期，评分为1、3、4、5、6和7-9)，将血样混合进15ml圆锥形管中。采用PBS以1∶1稀释血样，该PBS含有2mM EDTA，并在等体积Lympholyte-M(Cedar Lane Labs，Hornby，Ontario，Canada)上形成分层。在Sorvall离心机(型号为RT6000D)中，以1850rpm无制动离心混合物20分钟。收集界面上的细胞，将其加入新试管中。通过加入10ml含有2mM EDTA的PBS洗涤细胞，并于1200rpm离心10分钟。重复该洗涤2次。溶解残留红细胞，并将细胞沉淀分散在2ml冷0.2％NaCl中，于冰上温育45-60秒。通过加入2ml的1.6％NaCl终止溶解，并于1200rpm离心细胞10分钟。将PBMC重悬浮于5ml含有2mM EDTA的PBS中，并记数。于1200rpm离心细胞10分钟，从用于RNA分离的制备物中抛弃上清液。采用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Hidden，Germany)从PBMC中分离总RNA。
还有另一组实施例，从分离自患病动物的滑膜中获得RNA。在解剖显微镜下，从患病和对照动物体内解剖获得关节滑膜。将从具有相近疾病评分的5只或5只以上动物体内获得的组织混合，并采用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hidden，Germany)分离RNA。
在寡核苷酸阵列Affymetrix鼠IIK芯片组上分析基因表达，其中Affymetrix鼠IIK芯片组由两种芯片上的11,000个鼠基因组成，这两种芯片分别为鼠11KsubA P/N900188和鼠11KsubB P/N900189。
如上述实施例，采用来源自爪部或滑膜组织的5μg PBMC RNA或7μg RNA，制备可被用于与上述芯片杂交的已标记目标核酸。
利用GENECHIP 3.0软件，并对内部对照进行归一化/标度，进行数据分析。在双文本分析中，将各实验样本与时间匹配的对照样本作比较。接着将数据输入GeneSpring(Silicon Genetics，Redwood City，CA)分析程序中。以分级方式过滤数据。首先，根据爪部评分将数据分组。针对每一个评分创建一个基因列表，这些基因被认为“存在”于特定评分组和对照组中的所有样本中。通过将所有被认为在各评分组至少半数以上的样本中未“增加”或“减少”(在程序中的定义)的基因剔除，可进一步精确化上述列表。随后对上述列表进行过滤，以获得在少于5个样本的所有样本中，或在超过70％的样本中显示倍数变化大于或等于1.95，或者小于或等于-1.95的基因。
尤应指出的是，被认为是RAGE配体的Saa3蛋白在关节炎患鼠来源的PBMC中被过度表达了。
实施例3：对鼠可溶性RAGE-Fc的生化评估
(a)RAGE配体S100B的生物素化
将S100B(Sigma，St.Louis，MO)溶解在N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[3-丙磺酸](EPPS；Sigma，St.Louis，MO)缓冲液中，终浓度为50μM。该EPPS缓冲液由25mM EPPS、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2组成，pH＝7.5。将生物素(EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-biotin；Pierce，Rockford，IL)加入该S100B溶液中，其终浓度为250mM，室温放置30分钟。当于4℃条件下，利用截留分子量为3,500道尔顿的Slide-A-LyzerTM透析组件(Pierce，Rockford，IL)，并采用磷酸盐缓冲盐水透析该溶液时，便可终止生物素化反应。透析结束后，利用BioRad Protein Assay(Bio-Rad，Hercules，CA)测定S100B蛋白的浓度。
(b)鼠RAGE-LBE-Fc蛋白的制备
采用HeLa细胞表达RAGE-LBE-Fc蛋白，并将其分泌在细胞培养基中。细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的Dul becco改良细胞培养基(DME)中生长至80％铺满。除去培养基，并更换为含有2％FBS和Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP的DME，其中Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP的浓度大约为每个细胞含10,000个病毒颗粒。37℃温育2小时后，将另一份含10％FBS的DME加至细胞单层，温育26小时。收集条件培养基，进行离心，以除去细胞碎屑。将抑肽酶(17μg/ml)加入该条件培养基中，并随后保存于约80℃。利用Fc特异性ELISA测定条件培养基中的RAGE-LBE-Fc浓度约为6μg/ml。
(c)对RAGE-LBE-Fc：S100B结合的评估
将生物素化的S100B蛋白(0.3-3μM)加至200μL条件培养基中，如上所述，该条件培养基来自经由Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP感染的HeLa细胞。通过加入EPPS缓冲液，使反应体积升至0.3mL，并将其在室温下温育1.5小时。应指出的是，某些反应含有45μM高速游动族蛋白1(HMG-1)或未标记的S100B蛋白(Sigma，St.Louis，MO)。加入交联试剂双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯(BS3；Pierce，Rockford，IL)，终浓度为标示的5mM，并于室温另外温育反应物45分钟。通过加入Tris(Sigma，St.Louis，MO)至终浓度200mM，以终止交联。加入A蛋白琼脂糖CL-4B(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，并置于室温下1.5小时，使RAGE-LBE-Fc从溶液中沉淀出来。采用pH＝7.5，由50mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween-20组成的洗涤缓冲液(TBST)，每次1ml，对琼脂糖沉淀洗涤5次。通过加入含有200mM二硫苏糖醇(Sigma，St.Louis，MO)和4M尿素(Sigma，St.Louis，MO)的4X NuPageTM LDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使琼脂糖释放其捕获的蛋白。利用4-12％梯度凝胶(NuPageTMBis-iris；Invitrogen，Carlsbad，CA)，并通过SDS-PAGE，解析蛋白质，并利用转移槽装置(Hoefer Scientific，San Francisco，CA)将蛋白质转移至硝化纤维素上。采用含有5％脱脂奶粉(NFDM)的TBST封闭硝化纤维素，并在含有5％NFDM的TBST中，采用1∶10,000稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶偶联物(ImmunoPureStreptavidin-HRP；Pierce，Rockford，IL)，对该硝化纤维素进行探测。利用增强化学发光溶液(Western Lightning，Perkin ElmerLife Sciences，Boston，MA)检测链霉抗生物素蛋白-HRP：生物素复合体。
由代表性免疫印迹获得的结果如图6所示。＞176千道尔顿的条带(泳道4-8)与被交联至sRAGE-Fc的生物素化S100B对应。当对来自Ad-GFP感染细胞的条件培养基(泳道1和2)进行评估时，未出现该条带。另外，当不添加交联剂BS3时，RAGE-LBE-Fc条件培养基中也未出现该条带。存在BS3时，S100B-生物素与RAGE-LBE-Fc以浓度依赖方式结合(泳道4-6)。但存在过量HMB-1(另一种RAGE配体)和未标记的S100B时，该相互作用受到抑制(泳道7和8分别与泳道5作比较)。综合起来，上述结果证实Ad-RAGE-LBE-Fc表达载体编码可与溶液中的RAGE配体结合的可分泌RAGE-Fc。
实施例4：对可于CIA患鼠体内表达mRAGE mRNA的细胞的鉴定
该实施例描述了对一种细胞的鉴定，该细胞可于CIA患鼠体内表达mRAGE基因。
如实施例2所描述方法，诱导小鼠爪部的CIA，并在将对照小鼠爪部固定在4％多聚甲醛中24小时后，采用EDTA将其脱钙。对组织进行修剪、加工、石蜡包埋，并制成5μm切片用于原位杂交。原位杂交方法与实施例3所描述方法相同。如下制备与mRAGE对应的有义和反义探针。
通过从相应的转录产物中生成2种独立的PCR产物，获得反-有义鼠RAGE和有义鼠RAGE核糖核酸探针。寡核苷酸 5′-GACTGATAAT ACGACTCACT ATAGGGCGAATGCCAGCGGG GACAGCAGCTAGAG-3′(SEQ IDNO：29)和5′-AGAGGCAGGA TCCACAATTT CTGGCTTCCC AGGAAT-3′(SEQID NO：30)被用于生成鼠RAGE有义探针， 5′-GACTGATAAT ACGACTCACT ATAGGGCGAA GAGGCAGGAT CCACAATTTC TGGCTT-3′(SEQ ID NO：31)和5′ATGCCAGCGG GGACAGCAGC TAGAGCCTGG GTGCTGGTT-3′(SEQ IDNO：32)则被用于生成鼠RAGE反义探针。
PCR扩增后，采用T7RNA聚合酶和体外转录，生成探针。将T7RNA聚合酶结合位点整合进上述寡核苷酸中，以插入T7结合位点，该位点被插入在与有义核糖核酸探针对应的PCR产物的5′末端，或者在与反义核糖核酸探针对应的PCR产物的3′末端。采用DIG RNA标记混合物(Roche Diagnostics，Mannheirn，Germany)，并根据厂商描述的方法，结合采用T7RNA聚合酶(Roche Diagnostics)，以制备洋地黄毒苷标记探针。
如实施例3所述方法，以洋地黄毒苷标记该探针。采用抗洋地黄毒苷抗体与辣根过氧化物酶偶联形成的复合物(Roche)检测标记探针2小时，其中上述复合物已被2％正常绵羊血清/0.1％Triton X-100以1∶50稀释。采用3，3′-二氨基联苯胺(Vector Laboratory，Buflingame，CA)使标记探针显影15分钟，在水中洗涤，并由Mayers苏木精(Sigma，St.Louis，MO)短暂染色，通过逐级乙醇脱水，将其脱水至二甲苯中，并在显微检验前将其封固在DPX封固剂中。
杂交结果如表I所示。针对每一份经由mRAGE染色的组织，检测是否存在特异性染色。在mRAGE的情况中，当检测到特异性染色时，可将反应性的强度定级为轻度、中度和重度。当细胞具有褐色粒状胞质着色(DAB色原)，且阳性和阴性对照切片具有足够反应性时，阳性染色被认为是特异性的。在该研究中，有义对照切片(阴性对照)是针对每一份经由mRAGE染色的组织制备的。
表I：对CIA患鼠关节炎爪和对照爪中mRAGE mRNA阳性细胞的原位杂交评估
  探针/样本ID   mRAGEmRNA对照爪   mRAGEmRNA小鼠No.30(关节炎爪)
  巨噬细胞   无   P3
  淋巴细胞   无   阴性*
  嗜中性白细胞   无   阴性*
  成熟成纤维细胞   P1   P1
  未成熟成纤维细胞   无   P3
  活化的软骨细胞   阴性   P3
  滑膜细胞   阴性   阴性
  活性成骨细胞   阴性   P3
  动脉平滑肌   阴性   P2
  脂肪细胞   P1   P2
  表皮/滤泡/皮脂腺   P2   P3
P代表具有不同阳性度水平的胞质阳性度，P1被定义为轻度阳性，P2为中度阳性，P3为重度阳性。
在患有诱导关节炎的小鼠爪部，被鉴定为mRAGE阳性的细胞为巨噬细胞、活化的成骨细胞、成熟和未成熟成纤维细胞、活化的软骨细胞、具有滤泡和皮脂腺的表皮，以及动脉平滑肌。
具有滤泡和皮脂腺的表皮、成熟成纤维细胞和脂肪细胞在患有和不患有关节炎的爪部均为阳性。
实施例5：RAGE-LBE融合蛋白的施用缓解了小鼠体内的CIA
该实施例显示对CIA患鼠施用可溶性RAGE后，显著缓解了该疾病，其作用与可溶性肿瘤坏死因子受体II(TNFRII)Fc融合蛋白相似。
通过PCR从患有胶原诱导关节炎的DBA/1小鼠爪部分离鼠RAGE。将该鼠RAGE从1位ATG到1029位的编码区融合至鼠IgG2a突变Fc。通过将mRAGE-IG2a_Fc序列(SEQ ID NO：37和具有SEQ ID NO：38的编码蛋白；也可参见图1)克隆进由EcoRI和NotI消化的腺病毒载体Adori1-2中，衍生出Adoril-1mRAGE_Fc。通过PCR从DBA/1小鼠的CIA患爪中分离鼠TNFRII中1-774的胞外域，并将其融合至鼠IgG2a突变Fc。将含有与鼠IgG2a突变Fc(SEQ ID NO：39和具有SEQID NO：40的编码蛋白；也可参见图2)融合的小鼠TNFRII胞外部分的cDNA克隆进Adori1-2中的EcoRI和Not1位点，所获质粒被称为Adori1-2 msolTNFRII_Fc。AdoriI-1空载体不含有该插入部分。通过广泛限制消化分析和对上述质粒内cDNA插入部分的测序，可验证所有构建体。所有上述cDNAs的表达均由巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和增强子驱动。
通过在人胚胎肾细胞系293中进行同源重组，可生成具有或不具有RAGE-IgG2a_Fc或sTNFRII-IgG2a_Fc(也被称为“sTNFRII_Fc”和“mso1TNFRII_Fc”)的Ad5E1a缺失(d1327)重组腺病毒，即Ad-RAGE_Fc和Ad-msTNFRII_Fc(可应用于CIA模型的载体)，其中上述Ad5 Ela缺失(d1327)重组腺病毒被称为Ad-空载体。分离重组腺病毒，并在293细胞上扩增。通过3个循环的冷冻解冻，该病毒从感染的293细胞中被释放出来。通过2次氯化铯梯度离心，并于4℃，采用pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)对其进行透析，可进一步纯化该病毒。透析后，加入甘油至10％浓度，使用前一直将病毒保存于-80℃。通过转基因的表达、293细胞上的空斑形成单位、颗粒/毫升、内毒素测定结果、对该病毒的PCR分析结果，以及对该病毒编码区的序列分析结果，表征上述病毒。
该实施例检验了可溶性mRAGE-Fc改善胶原诱导关节炎(CIA)患鼠模型体内症状的能力。采用雄性DBA/I小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)进行所有实验。利用牛II型胶原(Chondrex，Redmond，WA)诱导关节炎。将牛II型胶原溶解在0.1M乙酸中，并采用等体积CFA(Sigma)将其乳化，该CFA含有1mg/ml结核杆菌(菌株H37RA)。第0天，将100μg牛胶原皮下注射进小鼠尾根处。第21天，对小鼠尾根处皮下注射一种溶液，该溶液由含100μg牛胶原的0.1M乙酸与等体积不完全弗氏佐剂(Sigma，St.Louis，MO)混合而成。第20天，小鼠静脉内接受剂量均为5×1010个颗粒的空病毒颗粒、msolTNFRIII_Fc或mRAGE-LBE-Fc。
监控小鼠的疾病进展，一周至少三次。根据指数：0＝正常；P＝关节炎前期，特征为趾尖上的病灶红斑；1＝可见红斑，并伴以1-2个爪趾的肿胀；2＝显著红斑，特征为爪部肿胀和/或多个爪趾肿胀；3＝延伸至踝或腕关节处的大量肿胀；4＝难以活动僵硬的肢体或关节，对个体小鼠的肢体进行临床评分。对任意特定小鼠的全部肢体评分的总和可获得最大总体评分为16。
如图4所示的结果显示RAGE-LBE融合蛋白的施用将总体评分保持得非常低，说明RAGE-LBE融合蛋白的施用显著缓解并预防了CIA。
实施例6：稳定表达并分泌RAGE-LBE-Fc蛋白的细胞系
对稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行工程改造，使其表达鼠和人RAGE-LBE-Fc蛋白。将该鼠和人RAGE-LBE-Fc克隆进哺乳动物表达载体中，线型化，并采用lipofectin方法将其转染进CHO细胞中(Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185：537-66；Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185：487-511；Pittman，D.D.et al.(1993)，Methodsin Enzymology 222：236)。在20nM和50nM氨甲蝶呤中进一步选择细胞，并从单个克隆中收获条件培养基，通过SDS十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹对其进行分析，以证实表达。
培养可表达人和鼠RAGE-LBE-Fc的CHO细胞，并收获条件培养基用于蛋白质纯化。采用标准方法纯化蛋白。对已纯化蛋白进行还原和非还原SDS-PAGE，并通过考马斯蓝染色(Current Protocols inProtein Sciences Wiley Interscience)目测蛋白。所获分析结果显示纯化蛋白具有预期的分子量。
作为参考引入
此处所提及的所有出版物和专利均被完整引入作为参考，如同每一单独出版物或专利被特定并单独指出将被引入作为参考。如果存在矛盾，包括此处所述任何定义在内的本申请将起主导作用。
等同方案
虽然本文论述了本发明的若干特定实施方案，但上述说明仅具有例证性，不具有限制性。根据本说明书和下列权利要求的论述，本领域技术人员可理解本发明的许多变化。通过参考权利要求及其完整范畴的等同方案，和本说明书及其变化，便可确定本发明的完整范畴。
序列表
<110>Wveth
     Pittman，Debra D.
     Clancy，Brian
     Larsen，Glenn
     Trepicchio，William L.
     Brennan，Fionula Mary
     Feldman，Marc
     Foxwell，Brian John Maurice
     Feldman，Jeffrey L.
<120>用于治疗RAGE相关病症的组合物和方法
<130>WYTH-PW0-002
<140>PCT/US03/25996
<141>2003-08-18
<150>60/404,205
<151>2002-08-16
<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2057
<212>DNA
<213>鼠可溶性RAGE_FC
<400>1
atgccagcgg ggacagcagc tagagcctgg gtgctggttc ttgctctatg gggagctgta         60
gctggtggtc agaacatcac agcccggatt ggagagccac ttgtgctaag ctgtaagggg        120
gcccctaaga agccgcccca gcagctagaa tggaaactga acacaggaag aactgaagct        180
tggaaggtcc tctctcccca gggaggcccc tgggacagcg tggctcaaat cctccccaat        240
ggttccctcc tccttccagc cactggaatt gtcgatgagg ggacgttccg gtgtcgggca        300
actaacaggc gagggaagga ggtcaagtcc aactaccgag tccgagtcta ccagattcct        360
gggaagccag aaattgtgga tcctgcctct gaactcacag ccagtgtccc taataaggtg        420
gggacatgtg tgtctgaggg aagctaccct gcagggaccc ttagctggca cttagatggg        480
aaacttctga ttcccgatgg caaagaaaca ctcgtgaagg aagagaccag gagacaccct         540
gagacgggac tctttacact gcggtcagag ctgacagtga tccccaccca aggaggaacc         600
acccatccta ccttctcctg cagtttcagc ctgggccttc cccggcgcag acccctgaac         660
acagccccta tccaactccg agtcagggag cctgggcctc cagagggcat tcagctgttg         720
gttgagcctg aaggtggaat agtcgctcct ggtgggactg tgaccttgac ctgtgccatc         780
tctgcccagc cccctcctca ggtccactgg ataaaggatg gtgcaccctt gcccctggct         840
cccagccctg tgctgctcct ccctgaggtg gggcacgcgg atgagggcac ctatagctgc         900
gtggccaccc accctagcca cggacctcag gaaagccctc ctgtcagcat cagggtcaca         960
gaaaccggcg atgaggggcc agctgaaggc tctgtgggtg agtctgggct gggtacgcta        1020
gccctggccg agccccgcgg accgacaatc aagccctgtc ctccatgcaa atgcccaggt        1080
aagtcactag accagagctc cactcccggg agaatggtaa gtgctataaa catccctgca        1140
ctagaggata agccatgtca agatccattt ccatctctcc tcatcagcac ctaacctcga        1200
gggtggacca tccgtcttca tcttccctcc aaagatcaag gatgtactca tgatctccct        1260
gagccccata gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag atgtccagat        1320
cagctggttt gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc atagagagga        1380
ttacaacagt actctccggg tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg actggatgag        1440
tggcaaggct ttcgcatgcg ccgtcaacaa caaagacctc ccagcgccca tcgagagaac        1500
catctcaaaa cccaaaggtg agagctgcag cctgactgca tgggggctgg gatgggcata        1560
aggataaagg tctgtgtgga cagccttctg cttcagccat gacctttgtg tatgtttcta        1620
ccctcacagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca gaagaagaga        1680
tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt        1740
acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc        1800
tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag aagaactggg        1860
tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat caccacacga        1920
ctaagagctt ctcccggact ccgggtaaat gagctcagca cccacaaaac tctcaggtcc      1980
aaagagacac ccacactcat ctccatgctt cccttgtata aataaagcac ccagcaatgc      2040
ctgggaccat gtaatag                                                     2057
<210>2
<211>343
<212>PRT
<213>鼠可溶性RAGE_FC
<400>2
Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Gln Ile Leu Pro Asn
65                  70                  75                  80
Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe
                85                  90                  95
Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr
            100                 105                 110
Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val
    130                 135                 140
Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly
145                 150                 155                 160
Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr
                165                 170                 175
Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr
            180                 185                 190
Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser
        195                 200                 205
Phe Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile
    210                 215                 220
Gln Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu
225                 230                 235                 240
Val Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
                245                 250                 255
Thr Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys
            260                 265                 270
Asp Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro
        275                 280                 285
Glu Val Gly His Ala Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His
    290                 295                 300
Pro Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr
305                 310                 315                 320
Glu Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly
                325                 330                 335
Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala
        340
<210>3
<211>1810
<212>DNA
<213>鼠colTNFRII_FC
<400>3
atggcgcccg ccgccctctg ggtcgcgctg gtcttcgaac tgcagctgtg ggccaccggg         60
cacacagtgc ccgcccaggt tgtcttgaca ccctacaaac cggaacctgg gtacgagtgc        120
cagatctcac aggaatacta tgacaggaag gctcagatgt gctgtgctaa gtgtcctcct        180
ggccaatatg tgaaacattt ctgcaacaag acctcggaca ctgtgtgtgc ggactgtgag        240
gcaagcatgt atacccaggt ctggaaccag tttcgtacat gtttgagctg cagttcttcc        300
tgtagcactg accaggtgga gacccgcgcc tgcactaaac agcagaaccg agtgtgtgct        360
tgcgaagctg gcaggtactg cgccttgaaa acccattctg gcagctgtcg acagtgcatg        420
aggctgagca agtgcggccc tggcttcgga gtggccagtt caagagcccc aaatggaaat        480
gtgctatgca aggcctgtgc cccagggacg ttctctgaca ccacatcatc cacagatgtg        540
tgcaggcccc accgcatctg tagcatcctg gctattcccg gaaatgcaag cacagatgca        600
gtctgtgcgc ccgagtcccc aactctaagt gccatcccaa ggacactcta cgtatctcag        660
ccagagccca caagatccca acccctggat caagagccag ggcccagcca aactccaagc        720
atccttacat cgttgggttc aacccccatt attgaacaaa gtaccaaggg tggcgagccc        780
cgcggaccga caatcaagcc ctgtcctcca tgcaaatgcc caggtaagtc actagaccag        840
agctccactc ccgggagaat ggtaagtgct ataaacatcc ctgcactaga ggataagcca        900
tgtacagatc catttccatc tctcctcatc agcacctaac ctcgagggtg gaccatccgt        960
cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc tccctgagcc ccatagtcac       1020
atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc cagatcagct ggtttgtgaa       1080
caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga gaggattaca acagtactct        1140
ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg atgagtggca aggctttcgc        1200
atgcgccgtc aacaacaaag acctcccagc gcccatcgag agaaccatct caaaacccaa        1260
aggtgagagc tgcagcctga ctgcatgggg gctgggatgg gcataaggat aaaggtctgt        1320
gtggacagcc ttctgcttca gccatgacct ttgtgtatgt ttctaccctc acagggtcag        1380
taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact aagaaacagg        1440
tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg gagtggacca        1500
acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac tctgatggtt        1560
cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa agaaatagct        1620
actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag agcttctccc        1680
ggactccggg taaatgagct cagcacccac aaaactctca ggtccaaaga gacacccaca        1740
ctcatctcca tgcttccctt gtataaataa agcacccagc aatgcctggg accatgtaat        1800
aggaattatc                                                               1810
<210>4
<211>258
<212>PRT
<213>鼠colTNFRII_FC
<400>4
Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Phe Glu Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Gln Val Val Leu Thr Pro Tyr
            20                  25                  30
Lys Pro Glu Pro Gly Tyr Glu Cys Gln Ile Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp
        35                  40                  45
Arg Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys Pro Pro Gly Gln Tyr Val
    50                  55                  60
Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Glu
65                  70                  75                  80
Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln Phe Arg Thr Cys Leu Ser
                85                  90                  95
Cys Ser Ser Ser Cys Ser Thr Asp Gln Val Glu Thr Arg Ala Cys Thr
            100                 105                 110
Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu Ala Gly Arg Tyr Cys Ala
        115                 120                 125
Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln Cys Met Arg Leu Ser Lys
    130                 135                 140
Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser Arg Ala Pro Asn Gly Asn
145                 150                 155                 160
Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile
            180                 185                 190
Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Pro Glu Ser Pro Thr
        195                 200                 205
Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro Ser
225                 230                 235                 240
Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Gln Ser Thr Lys
                245                 250                 255
Gly Gly
<210>5
<211>585
<212>PRT
<213>与Fc元件融合的人RAGE-LBE
<220>
<221>misc_feature
<222>(423)..(423)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>5
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Asn Ile Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser
            100                 105                 110
Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Glu Lys Pro Glu Ile Val
        115                 120                 125
Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr
    130                 135                 140
Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu
145                 150                 155                 160
Asp Gly Lys Pro Leu Val Leu Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu
                165                 170                 175
Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu
            180                 185                 190
Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala
    210                 215                 220
Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln
225                 230                 235                 240
Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val
                245                 250                 255
Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp
            260                 265                 270
Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile
        275                 280                 285
Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala
    290                 295                 300
Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser
305                 310                 315                 320
Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly
                325                 330                 335
Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Ser Gly
            340                 345                 350
Ser Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        355                 360                 365
Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Asp
    370                 375                 380
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
385                 390                 395                 400
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
                405                 410                 415
Tyr Val Asp Gly Val Glu Xaa Gln Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
            420                 425                 430
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
        435                 440                 445
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
    450                 455                 460
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
465                 470                 475                 480
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
                485                 490                 495
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
            500                 505                 510
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
        515                 520                 525
Lys Cys Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
    530                 535                 540
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
545                 550                 555                 560
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
                565                 570                 575
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            580                 585
<210>6
<211>1701
<212>DNA
<213>与Fc元件融合的人RAGE-LBE
<220>
<221>misc_feature
<222>(1205)..(1205)
<223>n是肌苷
<400>6
atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta       60
gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg      120
gcccccaaga aaccacccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc      180
aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag      240
gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt      300
cctgagaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag      360
gtggggacat gtgtgtcaga gggaagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat      420
gggaagcccc tggtgctgaa tgagaaggga gtatctgtga aggaacagac caggagacac         480
cctgagacag ggctcttcac actgcagtcg gagctaatgg tgaccccagc ccggggagga         540
gatccccgtc ccaccttctc ctgtagcttc agcccaggcc ttccccgaca ccgggccttg         600
cgcacagccc ccatccagcc ccgtgtctgg gagcctgtgc ctctggagga ggtccaattg         660
gtggtggagc cagaaggtgg agcagtagct cctggtggaa ccgtaaccct gacctgtgaa         720
gtccctgccc agccctctcc tcaaatccac tggatgaagg atggtgtgcc cttgcccctt         780
ccccccagcc ctgtgctgat cctccctgag atagggcctc aggaccaggg aacctacagc         840
tgtgtggcca cccattccag ccacgggccc caggaaagcc gtgctgtcag catcagcatc         900
atcgaaccag gcgaggaggg gccaactgca ggctctgtgg gaggatcagg gctgggaact         960
ctagccctgg cctgcgcagg tagcggctcc ggaagtgggg agcccaaatc ttgtgacaaa        1020
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccctgg gggcaccgtc agtcttcctc        1080
ttccccgaca aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg        1140
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg        1200
gaggngcaga atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg        1260
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag        1320
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag        1380
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag        1440
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag        1500
agcaatgggc agccggagaa caagtgcaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc        1560
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc        1620
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc        1680
ctgtccccgg gtaaatgagt g                                                  1701
<210>7
<211>404
<212>PRT
<213>人RAGE
<400>7
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                  30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu
    50                  55                  60
Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr His Ser Asn
            100                 105                 110
Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp
        115                 120                 125
Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys
    130                 135                 140
Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp
145                 150                 155                 160
Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln
                165                 170                 175
Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu
            180                 185                 190
Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys
        195                 200                 205
Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro
    210                 215                 220
Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu
225                 230                 235                 240
Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr
                245                 250                 255
Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met
            260                 265                 270
Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu
        275                 280                 285
Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr
    290                 295                 300
His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile
305                 310                 315                 320
Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser
                325                 330                 335
Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Leu Gly Gly Leu Gly
            340                 345                 350
Thr Ala Ala Leu Leu Ile Gly Val Ile Leu Trp Gln Arg Arg Gln Arg
        355                 360                 365
Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu
    370                 375                 380
Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser
385                 390                 395                 400
Thr Gly Gly Pro
<210>8
<211>1436
<212>DNA
<213>人RAGE
<400>8
gtccctggaa ggaagcagga tggcagccgg aacagcagtt ggagcctggg tgctggtcct         60
cagtctgtgg ggggcagtag taggtgctca aaacatcaca gcccggattg gcgagccact        120
ggtgctgaag tgtaaggggg cccccaagaa accaccccag cggctggaat ggaaactgaa        180
cacaggccgg acagaagctt ggaaggtcct gtctccccag ggaggaggcc cctgggacag        240
tgtggctcgt gtccttccca acggctccct cttccttccg gctgtcggga tccaggatga        300
ggggattttc cggtgccagg caatgaacag gaatggaaag gagaccaagt ccaactaccg        360
agtccgtgtc taccagattc ctgggaagcc agaaattgta gattctgcct ctgaactcac        420
ggctggtgtt cccaataagg tggggacatg tgtgtcagag ggaagctacc ctgcagggac        480
tcttagctgg cacttggatg ggaagcccct ggtgcctaat gagaagggag tatctgtgaa        540
ggaacagacc aggagacacc ctgagacagg gctcttcaca ctgcagtcgg agctaatggt        600
gaccccagcc cggggaggag atccccgtcc caccttctcc tgtagcttca gcccaggcct        660
tccccgacac cgggccttgc gcacagcccc catccagccc cgtgtctggg agcctgtgcc        720
tctggaggag gtccaattgg tggtggagcc agaaggtgga gcagtagctc ctggtggaac        780
cgtaaccctg acctgtgaag tccctgccca gccctctcct caaatccact ggatgaagga        840
tggtgtgccc ttgccccttc cccccagccc tgtgctgatc ctccctgaga tagggcctca        900
ggaccaggga acctacagct gtgtggccac ccattccagc cacgggcccc aggaaagccg         960
tgctgtcagc atcagcatca tcgaaccagg cgaggagggg ccaactgcag gctctgtggg        1020
aggatcaggg ctgggaactc tagccctggc cctggggatc ctgggaggcc tggggacagc        1080
cgccctgctc attggggtca tcttgtggca aaggcggcaa cgccgaggag aggagaggaa        1140
ggccccagaa aaccaggagg aagaggagga gcgtgcagaa ctgaatcagt cggaggaacc        1200
tgaggcaggc gagagtagta ctggagggcc ttgaggggcc cacagacaga tcccatccat        1260
cagctccctt ttctttttcc cttgaactgt tctggcctca gaccaactct ctcctgtata        1320
atctctctcc tgtataaccc caccttgcca agctttcttc tacaaccaga gcccccacaa        1380
tgatgattaa acacctgaca catctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa            1436
<210>9
<211>40
<212>PRT
<213>N末端人RAGE序列
<400>9
Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu
1               5                   10                      15
Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu
            20                  25                      30
Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly
        35                  40
<210>10
<211>54
<212>DNA
<213>引物
<400>10
 gactgataat acgactcact atagggcgaa tgccagcggg gacagcagct agag            54
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>引物
<400>11
agaggcagga tccacaattt ctggcttccc aggaat                             36
<210>12
<211>56
<212>DNA
<213>引物
<400>12
gactgataat acgactcact atagggcgaa gaggcaggat ccacaatttc tggctt       56
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>引物
<400>13
atgccagcgg ggacagcagc tagagcctgg gtgctggtt                          39

Claims (84)

1.一种融合蛋白，含有高级糖基化终产物配体结合元件受体(RAGE-LBE)和免疫球蛋白元件。
2.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。
3.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-344。
4.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-330。
5.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-321。
6.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-230。
7.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括图7所示氨基酸序列中的氨基酸残基1-118。
8.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1、Ig2和Ig3区。
9.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1和Ig2区。
10.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1区。
11.权利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括一个或多个点突变，其中这些点突变提高了RAGE-LBE与高级糖基化终产物结合配偶体受体(RAGE-BP)的结合亲和力。
12.权利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重链。
13.权利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括Fc区。
14.权利要求12的融合蛋白，其中免疫球蛋白重链选自IgM、IgD、IgE和IgA重链。
15.权利要求12的融合蛋白，其中免疫球蛋白重链选自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重链。
16.权利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括CH1和Fc区。
17.权利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括第一类免疫球蛋白的CH1区，和第二类免疫球蛋白的CH1区，其中第一类免疫球蛋白与第二类免疫球蛋白不同。
18.权利要求1的融合蛋白，进一步包括二聚化多肽。
19.一种组合物，包含权利要求1～18中任意一项的融合蛋白和药学可接受载体。
20.一种融合蛋白，含有RAGE-LBE和第二区，该第二区选自二聚化多肽、纯化多肽、稳定化多肽和导向多肽。
21.权利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽包括两亲性多肽。
22.权利要求21的融合蛋白，其中两亲性多肽含最多达50个氨基酸。
23.权利要求22的融合蛋白，其中两亲性多肽含最多达30个氨基酸。
24.权利要求22的融合蛋白，其中两亲性多肽含最多达20个氨基酸。
25.权利要求22的融合蛋白，其中两亲性多肽含最多达10个氨基酸。
26.权利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽含有肽螺旋束。
27.权利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽含有亮氨酸拉链。
28.权利要求27的融合蛋白，其中亮氨酸拉链为jun拉链。
29.权利要求27的融合蛋白，其中亮氨酸拉链为fos拉链。
30.权利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽包括具有带正电或负电荷残基的多肽，其中该多肽可与带相反电荷的另一个肽结合。
31.一种组合物，包括权利要求20～30中任意一项的融合蛋白和药学可接受载体。
32.一种融合蛋白，所含氨基酸序列与图3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。
33.编码多肽融合体的核酸序列，该多肽融合体含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。
34.编码多肽的核酸序列，该多肽与图3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。
35.权利要求33的核酸，其中RAGE-LBE通过C-或N-末端氨基或羧基与免疫球蛋白元件融合。
36.一种表达载体，含有权利要求33的核酸。
37.权利要求36的表达载体，可在原核细胞和真核细胞中的至少一种细胞内复制。
38.一种经由权利要求37的表达载体转染的宿主细胞。
39.一种制备RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括在适合表达该融合蛋白的细胞培养基中培养权利要求38的细胞。
40.权利要求39的方法，进一步包括纯化程序，以提高上述融合蛋白的纯度。
41.一种分离抗体或其片段，可与图3A所示氨基酸序列中的一个表位进行特异性免疫反应。
42.一种蛋白质复合体，含有一种或多种融合蛋白，其中该融合蛋白选自：
a)含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白；和
b)含有RAGE-LBE和第二区的融合蛋白，该第二区选自二聚化区、稳定化区、纯化区和导向区。
43.一种药物组合物，含有RAGE-LBE和TNF-α-抑制剂。
44.一种含有融合蛋白和TNF-α-抑制剂的药物组合物，其中融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。
45.一种鉴定化合物的方法，该化合物可抑制选自S100和两性蛋白的RAGE-BP多肽与选自RAGE、RAGE-LBE和RAGE-LBE-免疫球蛋白融合体的受体多肽之间的相互作用，该方法包括：
a)在无试验化合物，且RAGE-BP多肽与受体多肽相互作用的条件下，形成反应混合物，该混合物包括：i)RAGE-BP多肽，为S100或两性蛋白；ii)受体多肽，为RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合体；和iii)试验化合物；并
b)检测RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用，
其中与无试验化合物条件下RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用水平相比，试验化合物存在条件下RAGE-BP多肽与受体多肽之间的相互作用减弱，说明试验化合物具有抑制活性。
46.权利要求45的方法，其中RAGE-BP为S100。
47.权利要求45的方法，其中RAGE-BP为两性蛋白。
48.一种鉴定特定化合物的方法，该化合物可抑制RAGE-BP多肽所诱导的RAGE信号传递活性，该RAGE-BP多肽选自S100和两性蛋白，该方法包括：
a)使细胞接触RAGE-BP多肽，即S100或两性蛋白；
b)在无试验化合物存在，且RAGE信号传递活性正常发生的条件下，使细胞接触试验化合物；并
c)检测RAGE-BP所诱导的RAGE信号传递活性，其中与无试验化合物条件下信号传递活性的水平相比，试验化合物存在条件下RAGE-BP所诱导的RAGE信号传递活性降低，说明试验化合物具有抑制活性。
49.权利要求48的方法，其中RAGE-BP为S100。
50.权利要求48的方法，其中RAGE-BP为两性蛋白。
51.权利要求48的方法，其中信号传递活性是活化NF-kB转录活性。
52.权利要求48的方法，其中信号传递活性是活化促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)活性。
53.一种抑制高级糖基化终产物受体(RAGE)与RAGE结合配偶体(RAGE-BP)之间相互作用的方法，该方法包括施用一种融合蛋白，该融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白。
54.一种抑制高级糖基化终产物受体(RAGE)与RAGE结合配偶体(RAGE-BP)之间相互作用的方法，该方法包括施用权利要求41的抗体。
55.一种抑制高级糖基化终产物受体(RAGE)与RAGE结合配偶体(RAGE-BP)之间相互作用的方法，该方法包括施用一种通过权利要求45或48的方法鉴定的化合物。
56.一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用一种含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
57.一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用权利要求41的抗体。
58.一种降低内源RAGE活性的方法，该方法包括施用一种通过权利要求45或48的方法鉴定的化合物。
59.一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用一种含RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
60.权利要求59的方法，其中含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白与一种或多种用于治疗选自下组的一种或多种状况的药剂联合施用：淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。
61.一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用权利要求41的抗体。
62.权利要求61的方法，其中抗体与一种或多种用于治疗选自下组的一种或多种状况的药剂联合施用：淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。
63.一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用通过权利要求45或48的方法鉴定的化合物。
64.权利要求63的方法，其中化合物与一种或多种用于治疗选自下组的一种或多种状况的药剂联合施用：淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。
65.权利要求60、62和64中任意一项的方法，其中药剂选自：抗炎剂、抗氧化剂、β阻断剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、降脂剂、抗血管发生剂和化学疗法。
66.权利要求60、62和64中任意一项的方法，其中药剂为氨甲蝶呤。
67.权利要求60、62和64中任意一项的方法，其中急性炎性疾病为脓毒症。
68.权利要求60、62和64中任意一项的方法，其中心血管疾病为再狭窄。
69.权利要求53、56和59中任意一项的方法，其中RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。
70.一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用一种组合物，该组合物包含TNF-α抑制剂和至少一种RAGE-LBE或含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
71.一种治疗RAGE相关病症的方法，该方法包括施用一种组合物，该组合物包含至少一种含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
72.权利要求59-64和70-71中任意一项的方法，其中RAGE相关病症选自淀粉样变性、癌症、关节炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并发症、朊病毒相关病症、脉管炎、肾病、视网膜病和神经病。
73.权利要求72的方法，其中RAGE相关病症为阿尔茨海默氏病。
74.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为类风湿性关节炎。
75.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为骨关节炎。
76.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为肠易激疾病。
77.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为多发性硬化。
78.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为银屑病。
79.权利要求72的方法，其中慢性炎性疾病为狼疮或任意其它自身免疫病。
80.权利要求72的方法，其中急性炎性疾病为脓毒症。
81.权利要求72的方法，其中心血管疾病为动脉粥样硬化。
82.权利要求72的方法，其中心血管疾病为再狭窄。
83.权利要求46或49中任意一项的方法，其中S100为S100B。
84.权利要求46或49中任意一项的方法，其中S100为S100a12。
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