CN1665840A - 含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型蛋白质(INSP052)，它经本发明鉴定为一种含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，以及涉及该蛋白质和编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用。

Description

含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子

技术领域

本发明涉及新型蛋白质(称之INSP052和INSP055)，经本发明鉴定为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，以及涉及该蛋白质和编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用。

本文所引用的出版物、专利和专利申请，均纳入其全文作为参考。

发明背景

目前，药物发现方法正蕴酿着一场根本革命，因为功能基因组学年代已经来临。术语“功能基因组学”应用于使用生物信息学工具将功能归因于感兴趣的蛋白质序列的方法。这些工具正日益显示其必要性，因为序列数据产生的速度远远高于研究实验室将功能划分给这些蛋白质序列的能力。

随着生物信息学工具的功效和准确性提高，这些工具正快速取代生物化学特性鉴定的常规技术。事实上，鉴定本发明所用的先进生物信息学工具现在能够输出可获得较高置信度的结果。

各所研究院和商业机构正在检查已有的序列数据，并且逐渐获得重大发现。然而，仍然有必要鉴定和特性分析其他基因和它们编码的多肽，作为研究和药物发现的目标。

本发明的申请人最近研制了一个卓越工具，用于评价未知功能的序列。此工具是一个数据库系统(命名为Biopendium搜索数据库)，它是WO 01/69507的主题。该数据库系统由利用专有技术(proprietary technology)建立的综合数据资源组成，含有对全部已有蛋白质或核酸序列所作的逐一对比而获得的信息。

将不同数据资源的这些序列数据综合的目的在于把涉及序列本身和每一序列相关信息的尽可能多的数据集合成一个综合资源。将涉及每一序列的所有已有数据(若有的话，包括编码蛋白质的三维结构数据)综合在一起，以便更好地利用各个序列的已知信息，从而通过对这些序列作对比获得最佳的预测结果。从数据库就每个序列输入项目产生的诠释可了解该序列信息的生物相关内容。

该数据资源使得仅从序列即可准确预测蛋白质功能成为可能。若使用常规技术，只能针对与同一功能家族的其他蛋白质有高度序列同一性(约20-30％同一性以上)的蛋白质。而准确预测与未知功能的其他相关蛋白质有低程度序列同源性的蛋白质是不可能的。

含有信号肽的蛋白质

细胞制造和分泌胞外蛋白质的能力是许多生物过程的关键。酶、生长因子、胞外基质蛋白和信号传导分子全部由细胞分泌出来。这是分泌小泡与质膜融合所致。多数情况下，但不是所有情况，蛋白质被信号肽导入内质网，并进入分泌小泡。信号肽是顺式作用序列，影响多肽链从细胞质转运至膜结合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌进入胞外基质，或者留在质膜内。留在质膜内的多肽有一或多个跨膜结构域。在细胞机能中发挥中心作用的并含有信号肽的蛋白质的例子是细胞因子、激素、胞外基质蛋白、粘附分子、受体、蛋白酶及生长和分化因子。

含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子

已经显示，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子在多种生理功能中起作用，其中很多能在疾病过程中扮演角色。改变它们的活性是改变疾病表型的一个工具，因此鉴定新颖的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子与之密切相关，因为它们可能在许多疾病中起作用，尤其是炎症疾病、肿瘤、和心血管疾病。含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子参与广泛的生物过程，包括胚胎形成(Martin-Bermudo，M.D.等，Development.2000127(12)：2607-15；Chen，L.M.，等，J Neurosci.2000 20(10)：3776-84；Zweegman，S.，等，Exp Hematol.2000 28(4)：401-10；Darribere，T.，等，Biol Cell.2000 92(1)：5-25)，维持组织完整性(Eckes，B.，等，J Cell Sci.2000 113(Pt 13)：2455-2462；Buckwalter，J.A.，等，Instr Course Lect.2000 49：481-9；Frenette，P.S.，等，.J Exp Med.2000 191(8)：1413-22；Delmas，V.，等，Dev Biol.1999 216(2)：491-506；Humphries，M.J.，等，Trends Pharmacol Sci.2000 21(1)：29-32；Miosge，N.，等，Lab Invest.1999 79(12)：1591-9；Nagaoka T，等Am J Pathol 2000 Jul 157：1 237-47；Nwariaku FE，等J Trauma 1995 39(2)：285-8；Zhu X，等ZhonghuaZheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1)：53-5)，白细胞外渗/发炎(Lim，L.H.，等Am J Respir Cell Mol Biol.2000 22(6)：693-701；Johnston，B.，等，Microcirculation.2000 7(2)：109-18；Mertens，A.V.，等，Clin Exp Allergy.199323(10)：868-73；Chcialowski，A.，等，Pol Merkuriusz Lek.2000 7(43)：13-7；Rojas，A.I.，等，Crit Rev Oral Biol Med.1999 10(3)：337-58；Marinova-Mutafchieva，L.，等，Arthritis Rheum.2000 43(3)：638-44；Vijayan，K.V.，等，J Clin Invest.2000 105(6)：793-802；Currie，A.J.，等，.J Immunol.2000164(7)：3878-86；Rowin，M.E.，等，Inflammation.2000 24(2)：157-73；Johnston，B.，等，J Immunol.2000 164(6)：3337-44；Gerst，J.L.，等，J Neurosci Res.200059(5)：680-4；Kagawa，T.F.，等，Proc Natl Acad Sci USA.2000 97(5)：2235-40；Hillan，K.J.，等，Liver.1999 19(6)：509-18；Panes，J.，1999 22(10)：514-24；Arao，T.，等，J Clin Endocrinol Metab.2000 85(1)：382-9；Souza，H.S.，等，Gut.1999 45(6)：856-63；Grunstein，M.M.，等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2000 278(6)：L1154-63；Mertens，AV.，等，Clin Exp AHergy.1993 23(10)：868-73；Berends，C.，等，Clin Exp Allergy.1993 23(11)：926-33；Fernvik，E.，等，Inflammation.2000 24(1)：73-87；Bocchino，V.，等，J Allergy Clin Immunol.2000105(1 Pt 1)：65-70；Jones SC，等，Gut 1995 36(5)：724-30；Liu CM，等，AnnAllergy Asthma Immunol 1998 81(2)：176-80；McMurray RW Semin ArthritisRheum 1996 25(4)：215-33；Takahashi H，等Eur J Immunol 1992 22(11)：2879-85；Carlos T，等J Heart Lung Transplant 1992 11(6)：1103-8；Fabrega E，等，Transplantation 2000 69(4)：569-73；Zohrens G，等，Hepatology 1993 18(4)：798-802；Montefort S，等Am J Respir Crit Care Med 1994 149(5)：1149-52)，肿瘤生成(Orr，F.W.，等，Cancer.2000 88(S12)：2912-2918；Zeller，W.，等，JHematother Stem Cell Res.1999 8(5)：539-46；Okada，T.，等，Clin Exp Metastasis.1999 17(7)：623-9；Mateo，V.，等，Nat Med.1999 5(11)：1277-84；Yamaguchi，K.，等，J Exp Clin Cancer Res.2000 19(1)：113-20；Maeshima，Y.，等，J BiolChem.2000 275(28)：21340-8；Van Waes，C.，等，Int J Oncol.2000 16(6)：1189-95；Damiano，J.S.，等，Leuk Lymphoma.2000 38(1-2)：71-81；Seftor，R.E.，等，Cancer Metastasis Rev.1999 18(3)：359-75；Shaw，L.M.，J Mammary Gland BiolNeoplasia.1999 4(4)：367-76；Weyant，M.J.，等，Clin Cancer Res.2000 6(3)：949-56)，血管生成(Koch AE，等Nature 1995 376(6540)：517-9；Wagener C&Ergun S.Exp Cell Res 2000 261(1)：19-24；Ergun S，等Mol Cell 2000 5(2)：311-20)，骨再吸收(Hartman GD，&Duggan ME.Expert Opin Investig Drugs 20009(6)：1281-91；Tanaka Y，等J Bone Miner Res 1995 10(10)：1462-9；Lark MW，等J Pharmacol Exp Ther 1999 291(2)：612-7；Raynal C，等Endocrinology 1996137(6)：2347-54；Ilvesaro JM，等Exp Cell Res 1998 242(1)：75-83)，神经功能异常(Ossege LM，等Int Immunopharmacol 2001 1：1085-100；Bitsch A，等，Stroke 1998 29：2129-35；Iadecola C&Alexander M.Curr Opin Neurol 2001 14：89-94；Becker K，等Stroke 2001 32(1)：206-11；Relton JK，等Stroke 2001 32(1)：199-205；Hamada Y，等J Neurochem 1996 66：1525-31)，血栓形成(Wang，Y.G.，等，J Physiol(Lond).2000 526(Pt 1)：57-68；Matsuno，H.，等，Nippon YakurigakuZasshi.2000 115(3)：143-50；Eliceiri，B.P.，等，Cancer J Sci Am.2000 6(Suppl 3)：S245-9；von Beckerath，N.，等，Blood.2000 95(11)：3297-301；Topol，E.J.，等，Am Heart J.2000 139(6)：927-33；Kroll，H.，等，Thromb Haemost.2000 83(3)：392-6)，以及细菌病原体侵入/粘附在宿主细胞上(Dersch P，等EMBO J 199918(5)：1199-1213)。

对一些含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族的结构和功能的详细特征鉴定，已使得很多医药公司积极开展计划以研制用于治疗包括炎症、肿瘤、神经病、免疫和心血管功能等疾病的调节剂。事实上，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子参与生物学上的每一方面，从胚胎生成至细胞凋亡。它们对大部分组织的结构完整性和自身稳定功能是必不可少的。因此，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子存在缺陷能致病，并且许多疾病涉及对含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的功能进行调节，此种现象是不奇怪的。该家族成员列于表1中。

含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族实际上含有多个不同家族。在这些家族中，有些因为具备小分子牵引性(tractability)而有特定的药学价值。它们包括：

1.免疫球蛋白粘附分子代表整联蛋白反受体，包括胞内粘附分子(ICAM)和血管细胞粘附分子(VCAM)。成员由球状结构域、免疫球蛋白样结构域、胞外结构域等多个成员组成。该家族的某些成员，例如PECAM-1(CD31)和NCAM，介导同质粘附。而该家族的另一些成员，例如ICAM-1和VCAM-1，通过与整联蛋白相互作用来介导粘附。

2.细胞表面生长因子受体。生长因子位于细胞外，它们与靶细胞质膜上的具有特异性高亲和力的受体相互作用而发挥生物作用。各种不同生长因子受体的分子特性揭示它们属于定义的家族：酪氨酸激酶受体、G-蛋白相关的七个跨膜受体、以及丝氨酸/苏氨酸激酶受体。酪氨酸激酶受体的特征为一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞内结构域，它们均具有酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶生长因子受体的例子是VEGFR、PDGFR、FGFR、CSF-1R和c-KIT，它们在胞外结构域还含有免疫球蛋白结构域。对生长因子功能作Dys-调节，产生许多不同疾病的表型，包括但不限于：肿瘤(Bartucci M等，(2001)Cancer Res.Sep 15；61(18)：6747-54，Dias S等，(2001)Proc Natl AcadSci U S A.Sep 11；98(19)：10857-62，Djavan B等，(2001)World J Urol.19(4)：225-33)，炎症(Fiocchi C.(2001)J Clin Invest.Aug；108(4)：523-6，Hodge S等，(2001)Respirology.Sep；6(3)：205-211，Fenwick SA等，(2001)J Anat.Sep；199(Pt 3)：231-40)，神经(Cooper JD等，(2001)Proc Natl Acad Sci USA98(18)：10439-44，Fahnestock M等，(2001)Mol Cell Neurosci 18(2)：210-20)，以及新陈代谢(Vickers MH等，(2001)Endocrinology.142(9)：3964-73)。

表1：含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子

受体	配体	分布
			ICAM-15Ig结构域	LFA-1(CD11a/CD18)Mac-1(CD11b/CD18)，CD43	分布广泛，内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、单核细胞、淋巴细胞、树突状细胞、软骨细胞
ICAM-22Ig结构域	LFA-1(CD11b)	内皮细胞(高)、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱细胞、血小板(低)
			ICAM-35Ig结构域	LFA-1(αd/CD18)	淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞
VCAM-16或7Ig结构域	α4β1，α4β7	内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞、树突状细胞、骨髓基质细胞、成肌细胞
			LFA-36Ig结构域	CD2	内皮细胞、白细胞、上皮细胞
PECAM-1(CD31)	CD31，肝素	内皮细胞(在EC-EC接合点)、T细胞亚群、血小板、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、单核细胞、平滑肌细胞、骨髓干细胞
			NCAM	NCAM，硫酸肝素	神经细胞、肌肉
MAdCAM-14Ig结构域	α4β7，L-选择蛋白	淋巴集结(Peyer’s patch)、肠系膜淋巴结、粘膜内皮细胞、脾
			CD2	CD58，CD59，CD48	T淋巴细胞
VEGFR	VEGF	分布广泛，视网膜、脐静脉、肾上腺、NT2神经元前体细胞
			FGFR	FGF	分布广泛，脑、结肠、卵巢
KIT	干细胞因子，MGF	分布广泛，胎儿、黑素细胞、胆囊、小脑、胃上皮细胞(低)
			PDGFR	PDGF	分布广泛，乳房、胎盘、成纤维细胞、肺、卵巢、皮肤、心脏
CSF-1R	CSF	分布广泛，胎盘、肝脏、多发性硬皮病损伤、脾、肺、乳房

因此，业已证明，含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子在多种生理功能中起作用，它们当中很多能在疾病过程中扮演角色。改变它们的活性是改变疾病表型的一个工具，因此鉴定新颖的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子与之密切相关，因为它们可能在许多疾病中起作用，尤其是炎症疾病、肿瘤、心血管疾病、中枢神经系统疾病和感染。

发明内容

本发明基于如下发现：INSP052和INSP055蛋白质起着含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的功能。含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的例子列于表1中。

本发明第一方面的一实施例提供一种多肽，该多肽：

(i)包含或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或INSP052的胞外结构域组成；

(ii)是其具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者

(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。

“(i)的多肽的活性”指的是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性。而含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性指的是包含能被鉴定为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子家族内保守性特征的氨基酸序列或结构特征的多肽。

下文将具有SEQ ID NO：2所示的序列的多肽称为“INSP052外显子1多肽”。将具有SEQ ID NO：4所示的序列的多肽称为“INSP052外显子2多肽”。将具有SEQ ID NO：6所示的序列的多肽称为“INSP052外显子3多肽”。将具有SEQ ID NO：8所示的序列的多肽称为“INSP052外显子4多肽”。将具有SEQ ID NO：10所示的序列的多肽称为“INSP052外显子5多肽”。将具有SEQ ID NO：12所示的序列的多肽称为“INSP052外显子6多肽”。将具有SEQ ID NO：14所示的序列的多肽称为“INSP052外显子7多肽”。将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14组合得到SEQ ID NO：16所示的序列。将具有SEQ ID NO：16所示的序列的多肽称为“INSP052多肽”。

本文所用的术语“INSP052外显子多肽”包括如下的多肽：含有或由INSP052外显子1多肽、INSP052外显子2多肽、INSP052外显子3多肽、INSP052外显子4多肽、INSP052外显子5多肽、INSP052外显子6多肽、INSP052外显子7多肽、INSP052多肽以及INSP052的胞外结构域组成。

在一实施例中的多肽由SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成，或者是其片段或其功能等同物。而另一实施例的多肽由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQID NO：14所示的氨基酸序列组成，或者是其变体。

本发明第一方面的一实施例提供一种多肽，该多肽：

(i)包含或由INSP052胞外结构域的氨基酸序列组成；

(ii)是其具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者

(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。

INSP052胞外结构域对应于氨基酸1-240(参见实施例部分)。也可见图7所示的INSP052胞外结构域。

本发明第一方面的第二个实施例提供一种多肽，该多肽：

(i)包含或由SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列组成；

(ii)是其具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者

(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。

“(i)的多肽的活性”指的是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性。

较佳的是，本实施例的多肽由SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列组成，或者是其片段或其功能等同物。

下文将具有SEQ ID NO：18所示的序列的多肽称为“INSP055多肽”。

本发明第二方面提供一种编码本发明第一方面的多肽的纯化核酸分子。

较佳的是，该纯化核酸分子包含或由SEQ ID NO：1所示的核酸序列(编码INSP052A外显子1多肽)、SEQ ID NO：3所示的核酸序列(编码INSP052外显子2多肽)、SEQ ID NO：5所示的核酸序列(编码INSP052外显子3多肽)、SEQ ID NO：7所示的核酸序列(编码INSP052外显子4多肽)、SEQ ID NO：9所示的核酸序列(编码INSP052外显子5多肽)、SEQ ID NO：11所示的核酸序列(编码INSP052外显子6多肽)、SEQ ID NO：13所示的核酸序列(编码INSP052外显子7多肽)、SEQ ID NO：15所示的核酸序列(编码INSP052多肽)、或者SEQ ID NO：17所示的核酸序列(编码INSP055多肽)组成，或者是这些序列中任何一个的冗余等同物或片段。

将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列组合得到SEQ ID NO：15所示的序列。

本发明第二方面的一个实施例提供一种核酸分子，其编码包含或由INSP052胞外结构域组成的多肽。较佳的是，该核酸分子包含或由图7所示的核酸序列或图7所示的核酸序列的编码部分组成。

本发明第三方面提供一种在高度严谨条件下与本发明第二方面的核酸分子杂交的纯化核酸分子。

本发明第四方面提供一种含有本发明第二或第三方面的核酸分子的载体，例如表达载体。

本发明第五方面提供一种用本发明第四方面的载体转化的宿主细胞。

本发明第六方面提供一种配体，它特异性地结合，优选抑制本发明第一方面的多肽的活性。

“本发明的多肽的活性”及类似表达形式指的是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的特征活性。

本发明第七方面提供一种化合物，它能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者能调节本发明第一方面的多肽的活性。

本发明第七方面的化合物可增加(激动)或者减少(拮抗)多肽的基因表达水平或活性。重要的是，对INSP052和INSP055多肽功能的鉴定允许设计能够鉴定有效地治疗和/或诊断疾病的化合物的筛选方法。本发明第六和第七方面的配体和化合物可通过某些方法鉴定。这些方法也包括在本发明的内容之中。

本发明第八方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在治疗或诊断中的应用。这些分子还可用来制造治疗如下疾病但不限于：细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其他病理病征的药物。这些疾病优选包括：肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、肝病、克劳恩(Cohn′s)病、胃炎、溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其他涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的病征。本发明第一、第二、第三、第四、第六或第七方面的这些分子还可应用于制造治疗这些疾病的药物。

本发明第九方面提供一种诊断患者疾病的方法，该方法包括评估所述患者组织中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性，并将所述表达水平或者活性与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法最好在体外进行。可用类似方法监测对患者疾病的治疗，其中多肽或核酸分子的表达水平或活性在一段时间内趋向于对照水平，表示该疾病获得缓解。

检测本发明第一方面的多肽的优选方法包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将本发明第六方面的一种配体，例如抗体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。

本领域的读者将懂得，本发明第九方面的方法有很多种，各不相同，例如，核酸与短探针杂交法、点突变分析法、聚合酶链式反应(PCR)扩增法以及使用抗体检测异常蛋白水平的方法。类似方法的使用可以是短期或长时间的，以便治疗患者被监测的疾病。本发明还提供一些用于这些方法中诊断疾病的试剂盒。

较佳的是，用本发明第九方面的方法诊断的疾病是涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的疾病，如上所述。

本发明第十方面提供本发明第一方面的多肽作为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的应用。Ig结构域在细胞表面受体中的重要性在LokkerNA等人的″Functional importance of platelet-derived growth factor(PDGF)receptor extracellular immunoglobulin-like domains.Identification of PDGFbinding site and neutralizing monoclonal antibodies，″J Biol Chem 1997 Dec 26；272(52)：33037-44中有描述。

本发明也提供使用本发明第二或第三方面的核酸分子表达具有含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性的蛋白质。本发明还提供实施含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的活性的方法，所述方法采用本发明第一方面的多肽。

本发明第十一方面提供一种药物组合物，该组合物含有本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物，并结合药学上可接受的载体。

本发明第十二方面提供本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物在诊断或治疗中的应用。这些分子还可用来制造治疗如下疾病但不限于：细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其他病理病征的药物。这些疾病优选包括：肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、白血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、肝病、克劳恩(Cohn′s)病、胃炎、溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其他涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的病征。

本发明第十三方面提供一种治疗患者疾病的方法，该方法包括把本发明第一方面的多肽，或者本发明第二或第三方面的核酸分子，或者本发明第四方面的载体，或者本发明第五方面的宿主细胞，或者本发明第六方面的配体，或者本发明第七方面的化合物给予该患者。

当与健康受试者中编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达水平或者本发明第一方面的多肽的活性相比，病患者的该表达水平或活性较低的，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是激动剂。相反，当与健康受试者中所述多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性较高的，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应该是拮抗剂。拮抗剂的例子包括反义核酸分子、核酶和配体，例如抗体。

本发明第十四方面提供转基因或剔除非人动物，它们被转化为表达更高水平、更低水平或者不表达本发明第一方面的多肽。这些转基因动物是研究疾病极为有用的模型，也可用在鉴定有效治疗或诊断这样一种疾病的化合物的筛选方案中。

较佳的是，该疾病是是涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的疾病，如上所述。

应当知道，针对本发明的多肽和核酸的保护范围不会延伸至以它们天然来源形式存在的核酸或多肽。更正确地说，本发明要求保护的多肽和核酸可视为被“分离的”或“纯化的”。本文所用的术语“分离的”和“纯化的”指的是从它的天然来源核酸或多肽所含的至少一个成分(例如核酸或多肽)分离得到的核酸或多肽。因此，例如组织提取物含有的多肽可构成“分离的”或“纯化的”多肽，就如合成或重组生成的多肽一样。在一实施例中，核酸或多肽仅在溶剂、缓冲液、离子，或它们的溶液中通常所带有的其他成分存在下(如果有的话)找到。

应当注意，术语“分离的”和“纯化的”并不表示获得多肽或核酸的方法或者制成品的纯化程度。因此，这些分离的或纯化的物质可重组生产，从感兴趣的细胞或组织直接分离，或者基于已测定的序列合成生产。

以下，给出为实施本发明而可采用的标准技术和步骤的概要。应明白，本发明并不限于所述的这些具体方法、方案、细胞系、载体和试剂。还应明白，本文所用的术语目的仅在于描述具体实施例，该术语不应该被看成为限定本发明的范围。本发明的范围只由所附权利要求书的术语限定。

本说明书中使用核苷酸和氨基酸标准缩写。

除非另有指出，本发明的做法是采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，它们都已为本领域技术人员所掌握。

这些技术在有关文献中已有详细解释。例如，可参考以下特别适用的文献：Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154&155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein Purification：Principles and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。

本文所用的术语“多肽”包括含有相互间以肽键或修饰肽键连接的两个或以上氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽同构物(isostere)。该术语指短链(肽和寡肽)和长链(蛋白质)。

本发明的多肽可以是成熟蛋白质形式，或者可以是前蛋白质，其可被前部分切割激活而产生活性成熟多肽。这些多肽中的前序列可以是先导序列或者分泌序列或者是用来纯化成熟多肽序列的序列。

本发明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，有利的往往包括一或多个附加氨基酸序列，这些附加氨基酸序列可含有分泌序列或先导序列、前序列(pro-sequences)、有助纯化的序列、或者例如在重组生产中赋予蛋白质更高稳定性的序列。另一个选择或者另一方面是，成熟多肽可与另一种化合物，例如与延长该多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。

多肽可含有除20个基因编码的氨基酸外的由天然过程，例如翻译后加工，或者由本领域公知的化学修饰技术修饰的氨基酸。在已知的修饰中，本发明的多肽通常带有的修饰是糖基化、脂质附着、硫酸化、例如谷氨酸残基的γ-羧酸化，羟基化和ADP-核糖基化。其他可能的修饰包括乙酰化、酰化、酰胺化、黄素的共价附着、血素分子的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、GPI锚着形成、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、转移-RNA介导的蛋白质中插入氨基酸例如精氨酰化，以及遍在蛋白化。

修饰可发生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。事实上，天然存在的肽和合成肽一般通过共价修饰封闭肽的氨基或羧基末端，或者封闭二者，这样的修饰存在于本发明的多肽中。

发生在多肽内的修饰通常随制成该多肽而变化。对于重组制成的多肽，通过特定宿主细胞翻译后修饰能力以及存在于所述多肽的氨基序列中的修饰信号来确定大部分修饰的性质和程度。例如，不同类型的宿主细胞之间糖基化型式是不同的。

本发明的多肽可以任何合适的方式制成。这些多肽包括分离的天然存在的多肽(例如自细胞培养基中纯化而来)、重组产生的多肽(包括融合蛋白)、合成产生的多肽或者通过这些方法组合所产生的多肽。

本发明第一方面的功能等同多肽可以是与INSP052和INSP055多肽同源的多肽。如果一个多肽的序列与另一个多肽的序列具有足够高程度的同一性或相似性，本文就用术语“同源的”来形容该两个多肽。“同一性”表示在对比序列的任何特定位置上，两个序列之间的氨基酸残基是相同的。“相似性”表示在对比序列的任何特定位置上，两个序列的氨基酸残基是相似的。同一性和相似性的程度不难计算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，yon Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。

所以，同源多肽包括INSP052和INSP055多肽的天然生物变体(例如，产生多肽的物种内等位基因变体或地理变体)和突变体(例如，含有氨基酸取代、插入或缺失的突变体)。这些突变体可包括其中一或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代的多肽，这样一个取代的氨基酸残基可以或不必是遗传密码编码的残基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或者在芳香族残基Phe和Tyr之间进行。特别优选的是这样一些变体：有多个氨基酸，即5至10个氨基酸，1至5个氨基酸，1至3个氨基酸，1至2个氨基酸，或者仅有1个氨基酸以任意组合取代、缺失或插入的变体。特别优选的是不改变该蛋白质的性质和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特别优选的还有保守性取代。这些突变体也包括其中一或多个氨基酸残基包括一取代基团的多肽。

通常，两个多肽之间的同一性大于30％，就认为它们在功能上是等同的。本发明第一方面的功能等同多肽与INSP052和INSP055多肽，或其活性片段的序列同一性优选大于80％。更好的多肽分别具有大于85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

本发明第一方面的功能等同多肽还可以是已用一或多种结构对比技术鉴定的多肽。例如，可以应用Inpharmatica Genome Threader^TM技术(它构成用于产生Biopendium检索数据库的检索工具的其中一部分，参见共同待审批国际专利申请号PCT/GB01/01105，公开号为WO 01/69507)来鉴定现时具有未知功能的多肽，这些多肽虽然与INSP052和INSP055多肽具有较低的序列同一性，但由于与INSP052和INSP055多肽序列共享较高水平的结构同源性，故可预计它们是含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子，所述方法采用本发明第一方面多肽。“较高水平的结构同源性”指用Inpharmatica GenomeThreader^TM预测两个蛋白质确定共享至少10％，更好是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和以上的结构同源性。

本发明第一方面的多肽还包括INSP052和INSP055多肽的片段、INSP052和INSP055多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子活性，或者带有与INSP052和INSP055多肽相同的抗原性决定簇。

本文所用的术语“片段”指氨基酸序列与INSP052和INSP055多肽或它的其中一种功能等同物的部分而非全部氨基酸序列相同的多肽。这些片段应包括所述序列的至少n个连续氨基酸，取决于特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性决定簇。

这些片段可以是“独立的(free-standing)”，即不是其他氨基酸或多肽的一部分，也不与其他氨基酸或多肽融合，或者它们可包含在它们构成其中一部分或区域的较大多肽之内。当包含在较大多肽之内时，本发明的片段最好构成单个连续区域。例如，一些优选实施例涉及一个片段，其具有与该片段的氨基末端融合的前多肽区域，和/或具有与该片段的羧基末端融合的附加区域。然而，单一个较大多肽内可含有多个片段。

本发明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一个抗原性决定簇)可被应用来产生对这些多肽有免疫特异性的配体，例如多克隆或单克隆抗体。这些抗体可用于分离或鉴定表达本发明的多肽的克隆，或者用于亲和力层析法纯化这些多肽。抗体还可用来帮助诊断或治疗，以及其他应用，这对本发领域技术人员是显而易见的。

术语“免疫特异性”指抗体对本发明的多肽的亲和力远远大于它们对现有领域其他相关多肽的亲和力。本文所用的术语“抗体”指能够与所述抗原性决定簇结合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，这些抗体与本发明第一方面的多肽结合。

“远远较大的亲和力”指的是与已知的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的亲和力相比，本发明多肽的亲和力有可测量的增大。

较佳的是，对本发明多肽的亲和力相对于已知的含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子至少增大1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，10³倍，10⁴倍，10⁵倍或10⁶倍。

如果需要多克隆抗体，可用本发明第一方面的多肽使一种选定哺乳动物免疫，例如小鼠、兔、山羊或马。用来免疫动物的多肽可通过重组DNA技术产生，或者可通过化学方法合成。有需要的时候，可将多肽与一载体蛋白质连接。通过化学方法与多肽偶联的常用载体包括牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血蓝蛋白。然后，用偶联的多肽来免疫动物。采集该免疫动物的血清，再按公知的程序，例如免疫亲和力层析法加以处理。

本领域技术人员可轻易地生产针对本发明第一方面的多肽的单克隆抗体。应用杂交瘤技术生产单克隆抗体的一般方法已为人所公知(例如，参见Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 4：72(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。

可针对各种性质，即同种型、表位、亲和力等，筛选对本发明第一方面的多肽产生的多系列单克隆抗体。单克隆抗体特别用于纯化它们所针对的各种多肽。另一方面，编码感兴趣的单克隆抗体的基因可通过例如本领域公知的PCR技术在杂交瘤中分离出来，并可在适当载体中克隆和表达。

还可使用嵌合抗体，其中非人的可变区与人稳定区连接或融合(例如，参见Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。

可对抗体进行修饰，例如通过使它人源化，以便在某一个体内的免疫原性减弱(参见ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的术语“人源化抗体”指非人供体抗体的重链和/或轻链可变区内CDR氨基酸和选定的其他氨基酸已经被人抗体的等同氨基酸所取代的抗体分子。所以，人源化抗体与人抗体极为相近，但具有该供体抗体结合的能力。

另一个选择是，抗体可以是“双特异性”抗体，即它是一种有两个不同抗原结合区的抗体，每一结合区针对不同表位。

可应用噬菌体展示技术选择基因，所述基因编码具有与本发明多肽结合的活性的抗体，它们来自筛选用来加工有关抗体的以PCR技术扩增的人淋巴细胞V基因库，或者天然文库(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。这些抗体的亲和力也可通过链改组加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。

以上述技术产生的多克隆抗体或单克隆抗体得到额外应用，因为它们可用作免疫测定法、放射性免疫测定法(RIA)或者酶联免疫吸附测定法(ELISA)中的试剂。在这些应用中，可使用可分析检测到的试剂，例如放射性同位素、萤光分子或酶来标记抗体。

本发明第二和第三方面的优选核酸分子是编码SEO ID NO：2、SEO IDNO：4、SEO ID NO：6、SEO ID NO：8、SEO ID NO：10、SEO ID NO：12、SEO ID NO：14和/或SEO ID NO：16，或者SEO ID NO：18所示的多肽序列的那些分子和功能等效多肽。这些核酸分子可用于本文描述的方法和应用中。本发明的核酸分子最好含有至少n个本文所公开的序列中的连续核苷酸，取决于特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。

本发明的核酸分子还包括上述核酸分子的互补序列(例如，用于反义或探测目的)。

本发明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因组DNA。这样一些核酸分子可通过克隆、化学合成技术或其组合获得。例如，核酸分子可通过应用诸如固相亚磷酰胺化学合成从基因组或cDNA文库化学合成，或者从生物体中分离而制备。RNA的产生是运用DNA序列的体内或体外转录。

核酸分子可以是双链或单链。单链DNA可以是编码链，也称有义链，或者它可以是非编码链，也称反义链。

术语“核酸分子”还包括DNA和RNA类似物，例如含有修饰骨架的那些类似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的术语“PNA”指反义分子或反基因试剂，其含有长至少5个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与最好以赖氨酸为末端的氨基酸残基肽骨架连接。该末端赖氨酸使组合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延长它们在细胞内的停留时间，在细胞内它们优先与补体单链DNA和RNA结合，并终止转录延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)AnticancerDrug Des.8：53-63)。

这些分子还可以有另一个不同序列，因为遗传密码简并性，该不同序列编码SEO ID NO：2、SEO ID NO：4、SEO ID NO：6、SEO ID NO：8、SEOID NO：10、SEO ID NO：12、SEO ID NO：14和/或SEO ID NO：16，或者SEO ID NO：18所示的多肽。这样一些核酸分子可包括，但不限于，成熟多肽自身的编码序列；成熟多肽的编码序列加上附加编码序列，例如编码先导序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的编码序列，加上或不加上前述附加编码序列，再加上另外一些非编码序列，包括非编码5’和3’序列，例如在转录(包括终止信号)、核糖体结合和mRNA稳定性中发挥作用的转录非翻译序列。核酸分子还包括编码附加氨基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些氨基酸。

本发明第二和第三方面的核酸分子也可编码本发明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。这样一种核酸分子可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体，或者该分子可以是非天然存在的变体。核酸分子的非天然存在的变体可通过诱变技术制成，包括适用于核酸分子、细胞或生物体的那些技术。

就此而言，这些变体是通过核苷酸取代、缺失或插入而不同于上述核酸分子的变体。取代、缺失或插入可涉及一或多个核苷酸。变体可在编码区或非编码区或者二者内发生变化。编码区内的变化可产生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。

本发明的核酸分子也可以采用本领域公知的方法为多种原因而进行改造，这些原因包括修饰克隆、加工、和/或基因产物(多肽)的表达。可用来改造核苷酸序列的技术还包括应用随机断裂所作的DNA改组、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新装配。可利用定点诱变插入新的限制位点，改变糖基化模式，修改密码子偏向，产生剪接变体，引入突变等等。

编码本发明第一方面的多肽的核酸分子可与异源序列连接，以致该组合核酸分子编码融合蛋白。这样一些组合核酸分子包括在本发明第二和第三方面之内。例如，要在肽库中筛选抑制多肽活性的抑制剂，用这种组合核酸分子表达可被市售抗体识别的融合蛋白是有用的。融合蛋白还可被改造成含有位于本发明多肽的序列与异源蛋白质的序列之间的切割位点，以致该多肽可被切割，并从该异源蛋白质中纯化出来。

本发明的核酸分子还包括一些反义分子，它们与编码本发明的多肽的核酸分子部分互补，因而能与编码核酸分子杂交。如本领域普通技术人员所知，这些反义分子，例如寡核苷酸，可设计成识别、特异性地结合以及防止编码本发明多肽的靶核酸的转录(例如，参见Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。

本文所用的术语“杂交”指两个核酸分子通过氢键相互缔合。通常，将一个分子固定于固相支持物上，而另一个分子在溶液中游离。然后，在有利氢键键合的条件下使两个分子相互接触。影响键合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相分子与固相支持物非特异性附着的试剂(Denhardt′s试剂或BLOTTO)；分子的浓度；提高分子缔合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；杂交后洗涤条件的严谨程度(参见上述文献Sambrook等)。

应用本领域公知的杂交测定法(例如，参见上述文献Sambrook等)，可检查一个完全互补分子与靶分子杂交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152：399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152：507-511)的教导，在不同严谨程度的条件下，使基本上同源的分子竞争并抑制完全同源的分子与靶分子的结合。

“严谨程度”指在杂交反应中与不同的分子缔合相比，有利于极度相似的分子缔合的条件。高度严谨杂交条件定义为42℃下在一溶液中培养过夜，该溶液含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑鱼精子DNA，然后，约65℃下在0.1XSSC中洗涤过滤器。低度严谨条件涉及在35℃下进行的杂交反应(参见上述文献Sambrook等)。杂交使用的优选条件是高度严谨杂交条件。

本发明该方面的优选例子是其全长至少有70％与编码INSP052和INSP055多肽(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17)的核酸分子相同的核酸分子以及基本上与这些核酸分子互补的核酸分子。本发明该方面的优选核酸分子含有一区域，该区域的全长至少有80％与SEQ ID NO：1所示的SEQ ID NO：2编码序列、SEQ ID NO：3所示的SEQ ID NO：4编码序列、SEQ ID NO：5所示的SEQ ID NO：6编码序列、SEQ ID NO：7所示的SEQ ID NO：8编码序列、SEQ ID NO：9所示的SEQ ID NO：10编码序列、SEQ ID NO：11所示的SEQ ID NO：12编码序列、SEQ ID NO：13所示的SEQ ID NO：14编码序列、SEQ ID NO：15所示的SEQ ID NO：16编码序列、SEQ ID NO：17所示的SEQ ID NO：18编码序列相同，或者是它们的一个互补核酸分子。就此而言，特别优选的是其全长至少有90％，优选至少95％，更好至少98％或99％与所述核酸分子相同的核酸分子。优选的例子是编码基本上保留与INSP052和INSP055多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。

本发明还提供一种检测本发明核酸分子的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在杂交条件下，将本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；以及

(b)检测所形成的任何双链体。

下文另外讨论关于本发明可采用的测定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因组DNA的杂交探针，分离编码INSP052和INSP055多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与编码该多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因组克隆。

在这点上，可以使用以下技术，其中包括已为本领域技术人员所知的，为了举例说明讨论如下。DNA的测序和分析方法已为人公知，在本领域中可以获得到，事实上这些方法也用于以下讨论的本发明很多实施例中。这些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列诺片段测序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐热T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者这些酶的组合，以及校读外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE扩增系统中找到的那些外切核酸酶。优选的测序方法可应用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、PeltierThermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化剂以及373和377 DNA测序仪(Perkin Elmer)等仪器进行自动操作。

一种分离编码具有与INSP052和INSP055多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本领域公认的标准程序用天然或人工设计的探针探测基因组或cDNA文库(例如，参见″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，Greene Publishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特别有用的探针：含有至少15个，优选至少30个，更好是至少50个邻接碱基，这些碱基对应于，或者与适当的编码基因的核酸序列(SEQID NO：l、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：17)互补。使用可分析检测到的试剂标记这些探针，方便鉴定。有用的试剂包括，但不限于，放射性同位素、萤光染料和能够催化待检测产物形成的酶。有了这些探针，本领域普通技术人员就能够从人、哺乳动物或其他动物来源中分离出感兴趣的基因组DNA、cDNA或RNA聚核苷酸编码蛋白质的互补拷贝，并能够在这些来源中筛选出有关序列，例如该家族、类型和/或亚型的额外成员。

多数情况下，分离的cDNA序列是不完整的，因为编码多肽的区域通常在5’端被截短。现时有一些方法可获得全长cDNA，或者将短cDNA延长。应用部分核苷酸序列和本领域公知的各种方法检测上游序列，例如启动子和调控元件，可将这些序列延长。例如，可采用的一种方法是基于快速扩增cDNA末端的方法(RACE；例如参见Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)对这种技术进行了改进，例如使较长cDNA的检索大大简化。另一种稍稍不同的技术称为“限制位点”PCR，它使用通用探针检索邻接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2：318-322)。以基于已知区域的趋异性引物，也可用反向PCR来扩增或延长序列(Triglia，T.等，(1988)NucleicAcids Res.16：8186)。捕捉PCR是可使用的另一种方法，它涉及通过PCR技术扩增邻接人和酵母人工染色体DNA中一已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用来检索未知序列的另一种方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic Acids Res.19：3055-3060)。另外，人们可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文库来查看基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。这种方法不需要筛选文库，可用于寻找内含子/外显子接合。

当筛选全长cDNA时，最好用已经按大小进行选择包含了较大cDNA的文库。优选的还有随机引物文库，因为它们含有较多含基因5’区的序列。对于寡d(T)文库不能产生全长cDNA的情形，最好使用随机引物文库。基因组文库可用来将序列延伸进入5’非转录调控区。

在本发明一实施例中，本发明的核酸分子可用来进行染色体定位。在这一技术中，核酸分子特异性靶向，并能与单个人染色体的特定位置杂交。对本发明染色体的相关序列作图谱，是确认那些序列与基因相关性疾病相互关系的重要步骤。一旦将序列与准确染色体位置在图谱反映出来，就可以将染色体上序列的物理位置与基因图谱数据关联起来。这些数据例如可以在人类孟德尔遗传学数据库中找到(Johns Hopkins大学韦尔奇医学库在线提供)。然后，通过连锁分析(物理相邻基因的共同继承)确定基因与定位在同一个染色体区的疾病之间的关系。这为研究人员用定位克隆或其他基因发现技术检索疾病基因提供了有价值的信息。一旦通过遗传连锁分析粗略确定了疾病或综合征位于特定基因组区，定位在该区域的任何序列代表相关或调控基因，可作进一步研究。核酸分子还可用来检测由于正常、载体或染病个体之间移位、反转等造成染色体位置的差异。

本发明的核酸分子对于组织定位也是有价值的。这些技术通过检测编码多肽的mRNA可以确定该多肽在组织中的表达模式。这些技术包括原位杂交技术和核苷酸扩增技术，例如PCR。从研究中获得的结果可知道生物体中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表达模式与突变基因编码的mRNA的正常表达模式之间的比较研究为理解突变多肽在疾病中的作用提供了有价值的认知。不适当表达可以是时间、空间或量化。

还可采取基因沉默方法使编码本发明多肽的基因内源表达下调。一种方法是RNA干扰(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用来使序列特异性翻译后基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在体外合成，并导入细胞中。这些dsRNA寡核苷酸的序列特异性结合引发靶mRNA降解，从而减少或消除靶蛋白质表达。

上述评估基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上测量多肽的表达(例如，Western印迹)。

本发明的载体包含本发明的核酸分子，可以是克隆或表达载体。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，它们可用本发明的载体转化、转染或转导。

本发明的多肽可以重组形式制备，方法是在宿主细胞所含的载体内表达它们的编码核酸分子。这些表达方法已为本领域技术人员公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez与Hoeffler的书(1998，eds.″Gene expressionsystems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)详细叙述。

一般而言，可使用适合维持、繁殖或表达核酸分子在一所需宿主内产生多肽的任何系统或载体。应用各种公知的常规技术，例如上述Sambrook中描述的技术，可将适当的核苷酸序列插入一表达系统中。通常，可使编码基因受控于调控元件，例如启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)，任选地是操纵子，以便将编码所希望的多肽的DNA序列转录至转化宿主细胞的RNA内。

例如，适当的表达系统的例子包括染色体系统、附加体系统和病毒衍生系统，包括例如衍生自以下物质的载体：细菌质粒、噬菌体、转位子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒，或者其组合，例如从质粒和噬菌体遗传因子所产生的载体，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色体(HACs)也可用来输送在质粒中所含有和表达的较大DNA片段。

特别适合的表达系统包括微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达系统转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或者用细胞表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用来产生本发明的多肽。

参照许多标准实验手册，例如Davis等(Basic Methods in MolecularBiology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可将编码本发明的多肽的核酸分子导入宿主细胞内。特别适合的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微量注射、阳离子质粒介导的转染、电穿孔、转导、划痕加载、弹导导入或感染(参见上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman&Leinwald，1998)。在真核细胞中，表达系统可以是暂时的(例如附加体)或者永久的(染色体整合)，取决于该系统的需要。

编码核酸分子可以包括或不包括编码调控序列例如信号肽或先导序列的序列，有需要的时候，例如将翻译的多肽分泌到内质网腔、胞质间隙或胞外环境中。这些信号可以与该多肽内源，或者它们可以是异源信号。先导序列可在翻译后加工中被细菌宿主除去。

除了调控序列之外，希望可以加入能调节与宿主细胞生长有关的多肽表达的调节序列。调节序列的例子是可引起基因的表达对化学和物理刺激，包括调节化合物的存在，或者对各种温度或代谢条件的应答增大或减少的序列。调节序列是载体的那些非翻译区，例如增强子、启动子以及5’和3’非翻译区。它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。这些调节序列的强度和特异性可以是不同的。取决于所用的载体系统和宿主，可使用任何数量的适当转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如在细菌系统内克隆时，可使用诱导型启动子，例如Bluescript噬菌粒的杂交lacZ启动子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportl^TM质粒(Gibco BRL)等等。在昆虫细胞内可用杆状病毒多角体蛋白启动子。由植物细胞基因组(例如，热激、RUBISCO和贮藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒启动子或先导序列)衍生而来的启动子或增强子可克隆到载体中。哺乳动物细胞系统优选使用哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有序列的多个拷贝的细胞系，可使用基于SV40或EBV的载体和一适当选择性标记物。

构建一个表达载体，以致于使特定核酸编码序列位于该带有适当调节序列的载体内，所述编码序列相对于调节序列的定位和方向使得该编码序列在该调节序列的“控制”下转录，即在调控序列下与DNA分子结合的RNA聚合酶转录该编码序列。在一些情况下，有需要将序列修饰成它可以适当方向附着于调控序列，即维持读框。

调控序列和其他调节序列可在插入载体之前先连接到核酸编码序列。另一个选择是，直接将编码序列克隆到已经含有调控序列和适当限制位点的表达载体中。

对于长时间高得率地生产重组多肽，最好有稳定的表达。例如，稳定地表达感兴趣的多肽的细胞系可以用含有病毒来源复制的表达载体和/或同一个或不同载体上的内源性表达元件和选择性基因转化。导入载体之后，允许细胞先在富集培养基中生长1-2天，再转移到选择培养基中。选择性标记物的目的是为选择带来抗性，它的存在可以使成功表达导入序列的细胞生长和恢复。稳定转化的细胞的抗性克隆可应用适合细胞类型的组织培养技术进行增殖。

本领域技术人员已知哺乳动物细胞系可用作表达宿主，而哺乳动物细胞系包括美国典型菌种保藏中心(ATCC)的许多无限增殖化细胞系，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK 293细胞、Bowes黑色素瘤细胞和人肝细胞癌(例如Hep G2)细胞以及其他许多细胞系。

杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的物质在市场上以试剂盒形式提供，可以购自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(“MaxBac”试剂盒)。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特别适合该系统使用的宿主细胞包括昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和草地夜蛾Sf9细胞。

本领域已经知道很多植物细胞培养基和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的例子包括美国专利US 5,693,506；US 5,659,122；和US 5,608,143中描述的系统。植物细胞培养基的遗传表达的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。

具体地说，可使用原生质体被分离和培养得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有转移基因。特别是所有植物可从培养细胞或组织中再生，包括但不限于甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其他树木、豆类和蔬菜的所有主要种属。

特别优选的细菌宿主细胞的例子包括链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌细胞。

特别适合真菌表达的宿主细胞的例子包括酵母细胞(例如酿酒酵母)和曲霉菌细胞。

本领域已经知道许多选择系统，它们都可用来回收转化细胞系。例如，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等，(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell 22：817-23)基因可分别用在tk-或aprt±细胞中。

另外，选择的基础可以是抗代谢物、抗生素或除草剂抗性；例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt赋予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等，(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)，als或pat分别赋予绿黄隆和草丁膦乙酰转移酶抗性。此外，还描述了其他选择性基因，它们的例子为本领域技术人员所知。

虽然标记基因表达的存在或不存在提示感兴趣的基因也是存在的，但它的存在和表达有待确认。例如，如果在一标记基因序列中插入相关的基因，标记基因功能不存在则可以确定含有适当序列的转化细胞。另一个选择是，在单个启动子控制下将标记基因与编码本发明的多肽的序列串联放置。标记基因应答诱导或选择的表达通常也表示串联基因的表达。

另外，含有编码本发明的多肽的核酸序列，并表达所述多肽的宿主细胞可通过本领域技术人员公知的各种程序进行鉴定。这些程序包括但不限于：DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物分析，例如，萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术(例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA))，包括用来检测和/或定量分析核酸或蛋白质的膜、溶液或晶片技术(参见Hampton，R.等，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。

本领域技术人员公知的各种各样标记和连接技术可用在不同的核酸和氨基酸试验中。产生标记杂交的装置或者检测与编码本发明的多肽的核酸分子有关的序列的PCR探针包括，寡标记、镍翻译、末端标记或使用标记聚核苷酸的PCR扩增。另外，也可将编码本发明的多肽的序列克隆到载体内，以产生mRNA探针。这些载体是本领域公知的，可通过商业途径获得，加入诸如T7、T3或SP6等适当RNA聚合酶和标记核苷酸可在体外合成RNA探针。这些步骤使用市场上供应的各种试剂盒(Pharmacia&Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))进行。

易于检测的合适报导分子或标记包括放射性核、酶和萤光、化学发光或发色试剂和物质、协同因子、抑制剂、磁性粒子等等。

本发明的核酸分子还可用来制造转基因动物，特别是啮齿动物。这些转基因动物构成本发明的另一方面。这可通过局部修饰体细胞，或者通过种系治疗引入遗传修饰来实现。这些转基因动物特别适用于制作动物模型，分析作为本发明多肽的调节剂的药物分子。

从重组细胞培养基中回收和纯化多肽的方法是公知的，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阳离子或阴离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水基相互作用层析法、亲和力层析法、羟磷灰石层析法和血凝素层析法。高效液相层析法特别适用于纯化。当分离和/或纯化期间多肽发生变性时，可应用蛋白质再折迭的公知技术来再产生活性构造。

也可利用特异性载体结构来帮助蛋白质纯化，有需要的时候，将编码本发明的多肽的序列与编码有利于可溶性蛋白质纯化的多肽结构域的核酸序列连接。有利于纯化的结构域的例子包括金属螯合肽，例如允许在固定金属上纯化的肌氨酸-色氨酸组件，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域，以及用在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的结构域。为了方便纯化，可以采用可切割的接头序列的内含物，例如在纯化结构域与本发明的多肽之间的对XA因子或肠激酶有特异性的序列。一种这样的表达载体为融合蛋白的表达提供准备，所述融合蛋白含有本发明的多肽，与硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前面的多个肌氨酸残基融合。肌氨酸残基有利于固定金属离子亲和力层析法(IMAC)的纯化，参见Porath，J.等的描述(Prot.Exp.Purif.3：263-281，(1992))，而硫氧还蛋白或肠激酶切割位点为从融合蛋白纯化多肽提供了一种手段。Kroll，D.J.等对含有融合蛋白的载体进行了讨论(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)。

如果多肽的表达是用在筛选测定中，通常最好是在它表达的宿主细胞表面上产生该多肽。在此情况下，宿主细胞可在用于筛选测定之前，例如用萤光激活细胞分类术(FACS)或免疫测定技术之前收获。如果多肽分泌到培养基中，可回收该培养基以便回收和纯化表达多肽。如果多肽是在细胞内产生，则回收多肽之前必须先溶解细胞。

本发明的多肽可用来筛选各种药物筛选技术使用的化合物库。这些化合物可以激活(激动)或抑制(拮抗)本发明多肽的基因的表达水平或活性，构成本发明的另一方面。优选的化合物是能有效地改变编码本发明第一方面的多肽的天然基因的表达，或者调节本发明第一方面的多肽的活性。

激动剂或拮抗剂化合物可从，例如，细胞制剂、无细胞制剂、化学库或天然混合产物中分离出来。这些激动剂或拮抗剂可以是天然的或者是经修饰的基质、配体、酶、受体或者结构或功能类似物。关于这些筛选技术的综述，可参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(1991)。

最有可能成为良好拮抗剂的化合物是与本发明的多肽结合但在结合后又不会诱导该多肽生物作用的分子。潜在的拮抗剂包括有机小分子、肽、多肽和抗体，它们与本发明的多肽结合，由此抑制或消除它的活性。以这种方式，多肽与正常细胞结合分子的结合可被抑制，从而抑制该多肽的正常生物活性。

用在此筛选技术中的本发明的多肽可以在溶液中游离，附着于固相支持物上，留在细胞表面或位于细胞内。一般而言，这些筛选程序可涉及使用表达与测试化合物接触的多肽的适当细胞或细胞膜，观察结合、或功能反应的刺激或抑制。再将与测试化合物接触的细胞和不接触测试化合物的对照细胞的功能反应作比较。借助适当检测系统，这种测定方法可以评估测试化合物是否导致多肽激活产生一个信号。一般情况下，在已知激动剂的存在下分析激活的抑制剂，在测试化合物存在下观察对激动剂激活的影响。

一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括：

(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合。

(b)通过测定化合物与多肽相互作用所产生的信号水平来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。

另一种鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂化合物的优选方法包括：

(a)在允许与多肽结合的条件下，将在其表面上表达本发明第一方面的多肽的细胞与待筛选化合物接触，所述的多肽与能够在化合物与该多肽结合之后提供可检测信号的第二成分缔合。

(b)通过对化合物与多肽相互作用所产生的信号水平与在该化合物不存在下的信号水平作比较来确定该化合物是否结合和激活或抑制该多肽。

在另一优选实施例中，上述的通用方法还包括在多肽的标记或无标记配体存在下对激动剂或拮抗剂进行鉴定。

在另一实施例中，鉴定本发明的多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括：

在允许结合多肽的条件和候选化合物存在下，测定配体与其表面上带有本发明的多肽的细胞、或者与含有这样一种多肽的细胞膜结合的抑制，并测定与该多肽结合的配体数量。能够引起配体结合减少的化合物就认为是激动剂或拮抗剂。配体最好是带标记的。

更具体地说，筛选多肽拮抗剂或激动剂化合物的方法包括以下步骤：

(a)使标记的配体与在细胞表面上表达本发明的多肽的全细胞，或者与含有本发明的多肽的细胞膜培养，

(b)测定与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量，

(c)在步骤(a)的标记配体和全细胞或者细胞膜的混合物中加入候选化合物，使该混合物达到平衡；

(d)测定步骤(c)之后与全细胞或细胞膜结合的标记配体数量；以及

(e)比较步骤(b)和(d)中结合的标记配体之差值，将引起步骤(d)的结合减少的化合物看成激动剂或拮抗剂。

上述一些实施例可应用简单结合试验，其中测试化合物与带有多肽的表面的附着用直接或间接与该测试化合物结合的标记检测，或者可应用涉及与标记竞争物竞争的试验检测。另一个实施例采用竞争药物筛选测定法，其中能够结合多肽的中和抗体与测试化合物特异性地竞争结合。以此方式可用抗体检测对多肽有特异性结合亲和力的任何测试化合物的存在。

本领域技术人员将能够设计鉴定本发明多肽的调节剂的试验。此方面感兴趣的是Lokker NA等人在J Biol Chem 1997 Dec 26；272(52)：33037-44中的描述，文章记载了一个鉴定拮抗剂的试验(此试验为中和抗体)。

也可将试验设计成检测加入的测试化合物对细胞内编码多肽的mRNA产生的作用。例如，ELISA可构建成通过本领域公知的标准方法以单克隆抗体或多克隆抗体测量多肽的分泌或细胞相关水平，这可用来检索抑制或增强在适当操纵的细胞或组织中产生多肽的化合物。然后，测定多肽与测试化合物之间的结合复合物的形成。

本发明包括的试验是在过表达或切除检测中涉及使用本发明的基因和多肽的试验。这些试验涉及细胞内这些基因/多肽水平的操纵，以及该操纵事件对被操纵细胞生理的影响的评估。例如，这些实验揭示与特定基因/多肽有关联的信号传导和代谢通道的详细信息，产生关于与待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，并提供调节相关基因和蛋白质的方法的思路。

可采用另一种药物筛选技术，它高通量筛选对感兴趣的多肽具有适当结合亲和力的化合物(参见国际专利申请WO84/03564)。在这一方法中，在固相基质上合成大量不同的小测试化合物，它们再与本发明的多肽反应，洗涤。一种固定多肽的方法是用非中和抗体。以本领域公知的方法可检测结合多肽。纯化的多肽也可直接铺在板上，用于上述药物筛选技术中。

通过本领域公知的标准受体结合技术，例如配体结合和交联试验，本发明的多肽可用来鉴定膜结合或可溶性受体，其中在配体结合和交联试验中，多肽用放射性同位素标记，以化学方法修饰，或者与有利于它的检测或纯化的肽序列融合，并与推定受体来源(例如，细胞组合物、细胞膜、细胞上清液、组织抽提物或体液)一起培育。结合的效率可用生物物理技术，如表面胞质基因共振和光谱测定。结合试验用于纯化和克隆受体，但也可鉴定多肽的激动剂和拮抗剂，这些激动剂和拮抗剂与其受体竞争结合多肽。进行筛选测定的标准方法已为本领域所熟悉。

本发明还包括一种筛选试剂盒，它可用在鉴定上述的激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质、酶的方法中。

本发明包括激动剂、拮抗剂、配体、受体、基质和酶以及通过上述方法发现的能调节本发明的多肽的活性或抗原性的其他化合物。

本发明还提供一些药物组合物，其含有本发明的多肽、核酸、配体或化合物，以及合适的药物载体。这些组合物适合用作治疗或诊断试剂、疫苗、或其他免疫原性组合物，下文将作详细说明。

根据本文的术语，当组合物中以X+Y的总重量计时至少85％是X，认为含有多肽、核酸、配体或化合物[X]的组合物“基本上不含”杂质[本文以Y表示]。优选X占组合物中X+Y总重量的至少约90％，更好至少约95％、98％或者甚至99％(重量)。

药物组合物最好含有治疗有效量的本发明的多肽、核酸分子、配体或化合物。本文所用的术语“治疗有效量”指需要治疗、缓解、或预防目标疾病或病征，或者具有可检测的治疗或预防作用的治疗药剂的用量。任何一种化合物的有效治疗剂量最初可在例如肿瘤细胞的细胞培养试验、或者动物模型通常是小鼠、兔、狗、或猪模型中估计。动物模型还可用来确定适当的浓度范围和给药途径。有了这些信息，就可以确定给予人的有用给药剂量和途径。

人受试者的准确有效剂量取决于疾病状态的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应灵敏度，以及治疗耐受性/反应。该用量可以常规实验测定，由医生判断。通常，有效剂量从0.01毫克/千克至50毫克/千克，优选从0.05毫克/千克至10毫克/千克。组合物可单独给予患者，或者与其他药剂、药物或激素结合给予。

一种药物组合物还可含有药学上可接受的载体，作为治疗试剂给予。这些载体包括抗体和其他多肽、基因和其他治疗试剂，例如脂质体，只要该载体本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，而且载体的给予不会产生过高毒性。合适的载体可以是大的代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。

还可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)对药学上可接受的载体作了详尽讨论。

治疗组合物中药学上可接受的载体也可含有水、盐水、甘油和乙醇等液体。另外，这些组合物还可含有辅助物质，例如，湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。这些载体能将药物组合物配制成供患者摄取的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等等。

一旦配成以后，本发明的组合物可直接给予受试者。接受治疗的受试者可以是动物；特别是人受试者。

本发明使用的药物组合物可以任何途径给予，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、脊髓内、鞘内、心室内、透皮或经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹腔内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。本发明的药物组合物也可用基因枪或无针注射器给予。一般将治疗组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制成适合注射前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式。

通过注射可将组合物直接输送到皮下、腹腔内、静脉内或肌内，或者送到组织间质空间。组合物也可施加在病变部位。剂量治疗可分单剂或多剂。

如果本发明的多肽的活性在一特定疾病状态中是过度的，有多种方法可采用。其中一种方法包括把上述抑制剂化合物(拮抗剂)与药学上可接受的载体一起给予受试者，抑制剂化合物的量为通过例如阻断配体、基质、酶、受体的结合，或者抑制第二信号而抑制多肽的功能，从而缓解异常状况的有效量。这些拮抗剂优选是抗体。这些拮抗剂最好是嵌合抗体和/或人源化抗体，如前所述，可使它们的免疫原性减至最低。

另一种方法是给予保留了对上述配体、基质、酶、受体有结合亲和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相关部分的片段的形式给予。

在一替换方法中，应用表达封闭技术，例如用内部产生或另外给予的反义核酸分子(如上所述)，抑制编码多肽的基因表达。设计编码多肽的基因的调控区、5’区或调节区(信号序列、启动子、增强子和内含子)的互补序列或反义核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可获得对基因表达的修饰。类似地，用“三螺旋体”碱基成对方法可实现抑制。三螺旋体成对是有用的，这是因为它能引起抑制双螺旋体充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。应用三螺旋DNA的治疗取得最新进展，在文献中已有描述(Gee，J.E.等，(1994)In：Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，FuturaPublishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互补序列或反义分子还可设计成防止转录子与核糖体结合，从而封闭mRNA的翻译。这些寡核苷酸可给予，或在体内表达中原位产生。

另外，使用对它的编码mRNA序列有特异性的核糖体，可防止表达本发明的多肽。核糖体是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，参见Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可设计合成核糖体，在选定位置上特异性切割mRNA，从而防止mRNA翻译为功能多肽。核糖体通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然碱基合成。另一个选择是，核糖体可用非天然骨架，例如2’-氧-甲基RNA合成，保护核糖核酸酶免于降解，还可含有经修饰的碱基。

可对RNA分子进行修饰，以增加胞内稳定性和延长半衰期。可能的修饰包括但不限于，在分子的5’和/或3’末端加入侧翼序列或在分子的骨架内使用硫代磷酸或2’-氧-甲基而不用磷酸二酯酶连锁。这一概念对于产生PNA是固有的，可延伸至所有这些分子中，方法是包含非常规碱基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修饰鸟苷(butosine)以及乙酰基-、甲基-、硫代-、及类似修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它们不易被内源性内切核酸酶识别。

有一些方法治疗与本发明的多肽表达不足够或其活性相关的异常征状。其中一种方法包括把治疗有效量的能激活该多肽的化合物，即上述激动剂给予患者，缓解异常征状。另外，也可以给予治疗量的多肽与适当药物载体，以恢复多肽的相关生理平衡。

基因疗法可用来在受试者体内通过相关细胞内源性产生多肽。基因疗法以修正治疗基因置换缺陷基因，永久治疗多肽的不适当产生。

本发明的基因疗法可发生于体内或体外。体外基因疗法需要分离和纯化患者的细胞，导入治疗基因，以及将经基因改造的细胞再引入患者体内。与之相反，体内基因疗法不需要分离和纯化患者的细胞。

治疗基因往往被“包装”以方便给予患者。基因输送赋形剂可以是非病毒，例如脂质体，或者复制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利US5,252,479所述的腺伴随病毒(AVV)载体。例如，可对编码本发明的多肽的核酸分子进行改造，以在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达。然后，分离这种表达构造体，导入用含有编码多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞内，使该包装细胞现在能产生含有感兴趣的基因的感染病毒粒子。将这些生产细胞给予患者，以体内改造细胞和体内表达多肽(参见“Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches”(纳入作为文献参考)，Human MolecularGenetics(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd)。

另一种方法是给予“裸露DNA”，其中治疗基因直接注入血流或肌肉组织。

对于本发明的多肽或核酸分子是致病试剂的情形，本发明提出它们可用在疫苗中，产生针对疾病引发剂的抗体。

本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或者是治疗性的(即感染后治疗疾病)。这些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白质或核酸，通常与前述药学上可接受的载体结合，包括本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的任何载体。这些载体还可用作免疫刺激剂(“辅助剂”)。此外，抗原或免疫原可与细菌类毒素例如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌和其他致病原的类毒素偶联。

因为多肽可以在胃内分解，所以含有多肽的疫苗最好肠胃外给予(例如皮下、肌内、静脉内、或皮内注射)。适合肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与接受者的血液等渗的溶解物，以及无菌水悬浮液或非水悬浮液，可包括悬浮剂或增稠剂。

本发明的疫苗制剂可制成单剂或多剂容器。例如，密封安瓿和小瓶可储存于冻干条件下，只要在使用之前加入无菌液体载体。剂量取决于疫苗的比活性，通过常规实验可轻易测定。

还可通过基因传送与本发明的多肽结合抗体，例如参见国际专利申请WO 98/55607。

在配制疫苗组合物时也可使用“快速注射”技术(例如见www.powderject.com)。

国际专利申请WO 00/29428描述了许多接种疫苗和疫苗输送系统的合适方法。

本发明还涉及本发明的核酸分子作为诊断试剂的应用。检测以本发明的核酸分子为特点，并与功能障碍相关的基因的突变形式提供一种诊断工具，它可增加或限定因为基因的表达不足、过度表达或者空间或时间表达发生改变而引起的疾病或疾病易感性的诊断。通过各种技术可在DNA水平上检测携带基因突变的个体。

用于诊断的核酸分子可从受试者的细胞中获得，例如从血液、尿、唾液、组织活体或尸体材料中获得。基因组DNA可直接用作检测，或者在分析前用PCR、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或者其他扩增技术酶解扩增(参见Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。

在一实施例中，本发明该方面提供一种诊断患者疾病的方法，该方法包括评估编码本发明的多肽的天然基因的表达水平，并将所述表达水平与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。这种方法包括以下步骤：

(a)在允许本发明的核酸分子和核酸探针形成杂交复合物的严谨条件下，将患者的组织样品与探针接触；

(b)在与步骤(a)相同的条件下，将对照样品与所述探针接触；

(c)以及检测所述样品中是否存在杂交复合物；

其中，检测到患者样品中杂交复合物的水平与对照样品中杂交复合物不同，表示患病。

本发明另一方面包括一种诊断方法，其包括以下步骤：

(a)从待测试疾病的患者中获得组织样品；

(b)从所述组织样品中分离本发明的核酸分子；

(c)通过检测与疾病相关的核酸分子是否存在突变，诊断患者疾病。

为了帮助上述方法检测核酸分子，可包括扩增步骤，例如利用PCR技术。

将扩增产物大小的变化与正常基因型比较，可检测到缺失或插入。将扩增DNA与本发明的标记RNA，或者与本发明的标记反义DNA序列杂交，可以鉴定点突变。以核糖核酸酶消化或评估熔点温度的差异，发现完全匹配的序列与错配的双链体截然不同。患者是否存在突变可这样检测：将DNA与在严谨条件下和该DNA杂交的核酸探针接触，形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关的突变的任何部分具有核酸探针链的未杂交部分；检测探针链的未杂交部分是否存在即表示该DNA链的对应部分存在或不存在与疾病相关的突变。

这样的诊断特别适用于产前，甚至新生儿测试。

参考基因与“突变体”基因之间的点突变和其他序列差异可通过公知技术鉴定，例如，直接DNA测序或单链构象多态性(参见Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，测序引物可与改良PCR产生的双链PCR产物或单链模板分子一起使用。以使用放射性标记核苷酸的常规程序或者通过使用萤光标记的自动测序程序，进行序列测定。克隆DNA节段也可用作检测特异性DNA片段的探针。当与PCR结合时该方法的灵敏度大大提高。另外，点突变和其他序列变异，例如多态性，可参照上述方法检测，例如使用等位基因特异性寡核苷酸对不同于单个核苷酸的序列进行PCR扩增。

在变性试剂存在或不存在下改变DNA片段的凝胶电泳迁移率，或直接对DNA测序都可以检测到DNA序列的差异(例如Myers等，Science(1985)230：1242))。特定位置的序列变化可通过核酸酶保护试验揭示，例如RNase和S1保护，或者化学切割方法发现(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)85：4397-4401)。

除了常规凝胶电泳和DNA测序之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突变也可用原位分析加以检测(例如，参见Keller等，DNA Probes，2ndEd.，Stockton Press，NewYork，N.Y.，USA(1993))，换言之，可分析细胞内DNA或RNA序列的突变，无需分离或固定在膜上。萤光原位杂交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的综述已有很多报导(例如，参见Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，and Trask等，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。

本发明另一实施例中，构建包括本发明核酸分子的寡核苷酸探针阵列，对遗传变体、突变和多态性进行有效筛选。阵列技术方法是公知的，获得广泛应用，可用来解释分子遗传方面的各种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(例如，参见M.Chee等，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。

在一实施例中，按照PCT申请WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等((1996)Nat.Biotech.14：1675-1680))；以及Schena，M.等((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619))描述的方法制作和使用阵列。寡核苷酸对的范围从2至1,000,000以上。应用光引导化学法在基质的指定区域上合成低聚物。基质可以是纸、尼龙或其他种类的膜、过滤器、晶片、玻璃载片或其他任何合适的固相支持物。另外，参照PCT申请WO95/25116(Baldeschweiler等)中描述的方法，使用化学偶联程序和喷墨应用装置可在基质表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系统、热学、紫外线、机械或化学结合程序，以类似斑点(或狭线)印迹的“栅格”阵列将cDNA片段或寡核苷酸设置和连接于基质表面上。阵列，例如上述的那些阵列，可用人手或现有设备(斑点印迹或狭线印迹装置)、材料(任何合适的固相支持物)和机器(包括自动仪器)制作，它们可含有8、24、96、384、1536或6144个寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之间的任何数目，该数目能够使阵列有效地应用于市场上买到的仪器中。

除了上述讨论的方法之外，通过包括测定受试者样品中多肽或mRNA水平异常增加或减少的方法可以诊断疾病。采用本领域公知的任何方法可以在RNA水平上测定表达减少或增加，以便对聚核苷酸作定量分析，例如核酸扩增，如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹和其他杂交方法。

可用来确定从宿主获得的样品中本发明的多肽水平的测定技术已为本领域技术人员所知，在上文提到的一些文献中已有讨论(包括放射性免疫试验、竞争结合试验、Western印迹分析和ELISA试验)。本发明该方面提供一种诊断方法，其包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将上述一种配体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。

测定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS还可为诊断多肽表达的变化或异常水平提供基础。在适合形成复合物的条件下将正常哺乳动物受试者，优选是人的体液或细胞抽提物与针对多肽的抗体结合，确立多肽表达的正常值或标准值。标准复合物形成的数量可用各种方法定量测定，例如光度计装置。

特异性结合本发明的多肽的抗体可用来诊断以多肽表达为特点的征状或疾病，或者用在试验中监测以本发明的多肽、核酸分子、配体和其他化合物治疗的患者。用于诊断目的的抗体可以用上述关于治疗所述的相同方法制成。对多肽的诊断分析包括利用抗体和标记检测人体液或者细胞或组织抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修饰或不作修饰，将它们与报导分子共价或非共价结合加上标记。可以应用本领域已知的各种各样报导分子，其中一些已在上文作了描述。

将在受试者活体组织获得的对照样品和患病样品中表达的多肽数量与标准值作比较。标准值与受试者值之间的偏差建立诊断疾病的参数。可用诊断分析区分多肽不存在、存在和过度表达，并监测治疗干预期间多肽水平的调节。这些分析也可用来评估动物研究、临床试验或个体患者的监测治疗中特定治疗方案的疗效。

本发明的一种诊断试剂盒可包括：

(a)本发明的核酸分子；

(b)本发明的多肽；或者

(c)本发明的配体。

本发明一方面提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括第一容器，其含有在严谨条件下与本发明的核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，其含有用来扩增该核酸分子的引物；以及为方便诊断疾病而使用的该探针和引物的使用说明书。这种试剂盒还可包括装有消化未杂交RNA的试剂的第三容器。

本发明另一方面也提供一种诊断试剂盒，该试剂盒可包括核酸分子阵列，其中至少一个核酸分子是本发明的核酸分子。

为了检测本发明的多肽，一种诊断试剂盒可包括一或多种与本发明的多肽结合的抗体；一种用来检测该抗体与多肽之间结合反应的试剂。

这些试剂盒都可用于诊断疾病或疾病易感性，包括但不限于如下疾病：细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其他病理病征。这些疾病优选包括：肿瘤、癌症、脑瘤、神经胶质瘤、骨癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、结肠癌、血管瘤、骨髓增生性疾病、自血病、血液病、中性白细胞减少症、血小板减少症、血管生成障碍、皮肤病、衰老、创伤、烧伤、纤维变性、心血管疾病、再狭窄、心脏病、周边血管疾病、冠状动脉病、水肿、血栓栓塞、月经不调、子宫内膜异位、先兆子痫、肺病、COPD、哮喘骨病、肾病、肾小球性肾炎、肝病、克劳恩(Cohn′s)病、胃炎、.溃疡性结肠炎、溃疡、免疫疾病、自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、银屑病、大疱性表皮松解症、全身性红斑性狼疮、强直性脊椎炎、莱姆病、多发性硬化症、神经退化、中风、脑/脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、柏金森氏症、运动神经元病、神经肌肉病、HIV、AIDS、细胞肥大病毒感染、真菌感染、视觉障碍、黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病、高眼压及其他涉及含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的病征。

以下，将通过举例说明，特别是结合INSP052和INSP055多肽对本发明的各个方面和实施例进行描述。

应明白，在不脱离本发明的范围的情况下可以作出各种改变。

附图说明

图1：使用全长INSP052多肽序列在NCBI非冗余数据库通过BLAST得到的结果。

图2：在全长INSP052多肽序列与最接近相关序列胆糖蛋白H(小鼠)之间通过BLAST产生的序列对比。

图3：使用全长INSP055多肽序列在NCBI非冗余数据库通过BLAST得到的结果。

图4：在全长INSP055多肽序列与最接近相关序列胆糖蛋白H(小鼠)之间通过BLAST产生的序列对比。

图5：INSP052的预测核苷酸序列和翻译(SEQ ID NO：36)。 下划线序列 表示预测的信号肽。 表示预测的跨膜结构域。

图6：基因组DNA内的INSP052编码外显子组构。下＝INSP052.cDNA，1251bp，上＝chr11.基因组_DNA。 下划线为推定胞外结构域的编码序列。启动和终止密码子用粗体表示。

图7：克隆INSP052胞外结构域的核苷酸序列和翻译。

图8：pENTR-INSP052-EC-6HIS的图谱。

图9：pEAK12d-INSP052-EC-6HIS的图谱。

具体实施方式

实施例1 INSP052和INSP055

将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16结合所产生的多肽序列代表INSP052的连续外显子的翻译，该多肽序列可通过人基因组序列产生。代表INSP055的多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18分别是INSP052的小鼠直向基因同源物(orthologue)的多核苷酸和多肽。小鼠直向基因同源物的存在支持人序列INSP052的基因模型。

可以预测，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18分别代表的INSP052和INSP055多肽序列含有信号肽序列和一个跨膜跨越结构域。

将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16结合所产生的多肽序列代表INSP052的连续外显子的翻译，该多序列可用作NCBI非冗余序列数据库的BLAST查询序列。最上面的10个匹配见图1，它们全部为含有免疫球蛋白结构域的蛋白质。

图2所示为INSP052查询序列与已知的最高匹配蛋白质胆糖蛋白H(小鼠)序列的对比。

多肽序列INSP055用作NCBI非冗余序列数据库的BLAST查询序列。最上面的10个匹配见图3。图4所示为INSP055查询序列与已知的最高匹配蛋白质胆糖蛋白H(小鼠)序列的对比。

代表人和小鼠的INSP052和INSP055转录物的表达序列标记(EST)来自以下cDNA文库：脑，包括小脑、皮层、海马、下丘脑、延脑；内耳和乳房。转录物也可用寡枝神经胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤和多发性硬化症病变的EST表示。这提示INSP052可采用上述组织克隆，而且可能与上述组织的疾病有关连。因此，本文所述的多肽、抗体及其他分子部分可应用于治疗上述组织之一的疾病。

实施例2通过外显子装配克隆INSP052胞外结构域

INSP052全长预测序列编码VEGF/PDGF受体相关的长416个氨基酸的I型膜蛋白，它属于免疫球蛋白超家族。预测的核苷酸序列始于聚腺苷酸尾的启动ATG密码子，长2025个核苷酸(图5)。编码序列(cds)跨越7个外显子(图6)。推定信号序列(编码氨基酸1-33)位于外显子1内。编码预测跨膜(TM)结构域的序列(编码氨基酸241-263)位于外显子3-4边界。

编码氨基酸1-240的胞外(EC)结构域的克隆通过基因组DNA的外显子装配。以下对外显子装配方法作简要的全面概述。

-通过PCR技术从基因组DNA扩增各个外显子1、2和3。外显子3的反向引物与外显子4的5’序列有11个碱基重叠。

-将凝胶纯化的外显子混合，进行第二次PCR反应以扩增重新装配的DNA。

-凝胶纯化对应于INSP052 EC结构域的全长PCR产物，然后用Invitrogen Gateway^TM方法将其亚克隆至pDONR 201(Gateway入门载体)和pEAK12d(表达载体)。

1.对基因组cDNA的编码INSP052胞外结构域的外显子进行PCR扩增

分别设计PCR引物，扩增外显子1、2和3(表1)。外显子1的正向引物(INSP052-B1P-exon1F)还含有Gateway attB1位点部分序列(5’GCAGGCTTC)和Kozak序列(5’GCCACC)。外显子1的反向引物(INSP052-exon1R)与外显子2的5’端有18个碱基重叠。外显子2的正向引物(INSP052-exon2F)与外显子1的5’端有18bp重叠。外显子2的反向引物(INSP052-exon2R)与外显子3的5’端有18个碱基重叠。外显子3的正向引物(INSP052-exon3F)与外显子2的5’端有17bp重叠。外显子3的反向引物(INSP052-exon3R)与外显子4的5’端有11个碱基重叠。

要扩增INSP052外显子1，在50微升终体积中进行PCR扩增，该终体积含有1.5μl人基因组DNA(0.1μg/μl，Novagen cat.no.69237)、2μl 5mMdNTPs(Amersham Pharmacia Biotech)、6μl INSP052-B1P-exon1F(10μM)、6μlINSP052-exon1R、5μl 10X Pwo缓冲液和0.5μl Pwo聚合酶(5U/μl)(Roche，cat.no.1 644 955)。PCR条件为：94℃，2分钟；94℃循环35次，30秒，60℃，30秒以及72℃，7分钟；加上70℃的延长循环，5分钟；4℃持续循环。将反应产物装在1.5％琼脂糖凝胶(1X TAE)上，对正确大小(118bp)的PCR产物进行凝胶纯化，采用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen cat.no.28704)，在50μl洗脱缓冲液(Qiagen)中洗脱。

在相同反应条件下对外显子2进行扩增，所用引物为INSP052-exon2F和INSP052-exon2R。按照上述方法纯化378bp的PCR产物。

在相同反应条件下对外显子3进行扩增，所用引物为INSP052-exon3F和INSP052-exon3R。按照上述方法纯化321bp的PCR产物。

2 INSP052的编码胞外结构域的外显子的装配

在PCR反应中重新装配外显子1、2和3-4，该反应含有各个凝胶纯化的外显子各5μl、2μl 5mM dNTPs、6μl INSP052-B1P-exon1F(10μM)、6μlINSP052-5HIS-R(10μM)、5μl 10X Pfu缓冲液、14.5μl水和0.5μl Pfu聚合酶(3U/μl；Promega cat.no.M774B)。反应条件为：94℃，4分钟，94℃循环10次，30秒，48℃，30秒，以及70℃，2分钟；94℃循环25次，30秒，52℃，30秒，以及70℃，2分钟；还加上一个延长步骤：70℃，10分钟；4℃持续循环。在1.5％琼脂糖凝胶(1X TAE)上对反应产物作分析。对正确大小(750bp)的PCR产物进行凝胶纯化，采用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen cat.no.28704)，在50μl洗脱缓冲液(Qiagen)中洗脱。

得到的产物(INSP052 EC ORF)含有在5’末端有attB1重组位点和Kozak序列，在3’末端有5HIS标记编码序列的INSP052 EC结构域的ORF。

3 INSP052 EC结构域ORF亚克隆至pDONR201

在50μl终体积的PCR反应中将AttB1和attB2重组位点加至全长INSP052 EC结构域序列的5’和3’端，该反应含有2μl凝胶纯化的INSP052EC ORF、2μl 5mM dNTPs(Amersham Pharmacia Biotech)、6μl GCP-正向引物(10μM)、6μl GCP-反向引物(10μM)、5μl 10X Vent缓冲液和0.5μl VentDNA聚合酶(2U/μl)(New England Biolabs，cat.no.M0254S)。PCR条件为：94℃，2分钟；94℃循环30次，30秒；55℃，30秒以及72℃，1分钟；还加上一个延长步骤：72℃，3分钟；4℃持续循环。在1.5％琼脂糖凝胶(1XTAE)上对反应产物作分析，并对正确大小(808bp)的PCR产物进行凝胶纯化，采用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen cat.no.28704)，在50μl洗脱缓冲液(Qiagen)中洗脱。采用BP克隆酶按以下条件将纯化得到的PCR产物(Gateway修饰的INSP052 EC结构域)转移到pDONR201：5μl Gateway-修饰的INSP052 EC结构域与1.5μl pDONR201(0.1μg/μl)、2μl BP缓冲液和1.5μlBP克隆酶酶混合物(Invitrogen)在室温培育1小时。加入蛋白酶K(2μg)终止反应，在37℃培育多10分钟。取此反应的一等分试样(1μl)，使用Biorad基因脉冲仪通过电穿孔使该试样转化至20μl大肠杆菌DH10B细胞(用水稀释1/5)。加入1ml SOC培养基稀释电穿孔细胞并于37℃培育1小时。将转化体铺在LB-卡那酶素板上，37℃培育过夜。利用Qiaprep Turbo 9600自动系统(Qiagen)从1-10个得到的克隆分离出质粒mini prep DNA，并按照制造商的使用说明，用BigDyeTerminator系统(Applied Biosystems cat.no.4390246)和pENTR-F1和pENTR-R1测序引物进行DNA测序。测序反应用Dye-Ex柱(Qiagen)或Montage SEQ 96清除板(Millipore cat.no.LSKS09624)纯化，并用Applied Biosystems 3700测序仪作分析。

4 INSP052 EC结构域ORF亚克隆至表达载体pEAK12d

重组反应使用含有INSP052 EC结构域正确序列的pDONR201克隆(质粒ID#13497)的质粒洗脱液(1.5μl)，该反应的终体积为10μl，含有1.5μlpEAK12d(0.1μg/μl)、2μl LR缓冲液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)。混合物室温培育1小时，加入蛋白酶K(2μg)终止反应，37℃培育多10分钟。取此反应的一等分试样(1μl)，按照上述方法通过电穿孔使该试样转化至大肠杆菌DH10B细胞。加入1ml SOC培养基稀释电穿孔细胞并于37℃培育1小时。将转化体铺在LB-卡那酶素板上，37℃培育过夜。利用Qiaprep Turbo 9600自动系统(Qiagen)从4个克隆制备mini prep DNA，并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。每个mini prep各取2μl，在50μl总反应体积中进行PCR，该反应含有2μl 5mM dNTPs、6μl 10μM pEAK12-F、6μl 10μM pEAK12-R、5μl 10XAmpliTaq^TM缓冲液和0.5μl AmpliTaq^TM(Applied Biosystems cat.no.N808-0155)。循环条件如下：94℃，2分钟；94℃循环30次，30秒，55℃，30秒，以及72℃，1分钟；72℃循环1次，3分钟。作进一步分析之前，使样品保持在4℃(持续循环)。

从克隆分离得到质粒mini prep DNA，获得预测的PCR产物大小(1074bp)，其再用pEAK12-F和pEAK12-R测序引物进行DNA测序。

从500ml已确定序列的克隆培养基制备质粒pEAK12d-INSP052EC-6HIS(plasmid ID#13495)的maxi-prep DNA并用CsCl梯度纯化(Sambrook J.等，in Molecular Cloning，a Laboratory Manual，2^ndedition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，重悬于无菌水中，浓度为1μg/μl，储存于-20℃。

                 表2：INSP052 EC结构域克隆和测序的引物

下划线序列 ＝Kozak序列

粗体        ＝终止密码子

斜体序列    ＝His标记

 ＝与相邻外显子重叠的碱基

实施例3克隆的带His标记的INSP052-6His-V1(质粒No.13495)在哺乳动物细胞中的表达

表达埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎肾293细胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)保持在无Ex-cell VPRO血清的培养基悬浮液中(种子储备，维持培养基，JRH)。转染前16至20小时(第1天)，将细胞接种在2×T225烧瓶中(每个烧瓶50毫升，接种在含有2％FBS移种培养基(JRH)的DMEM/F12(1∶1)中，密度为2×10⁵个细胞/毫升)。第二天(转染第0天)，用JetPEI^TM试剂进行转染(2μl/μg质粒DNA，PolyPlus-transfection转染试剂)。每个烧瓶中，113μgcDNA(质粒No.13495)与2.3μg GFP(萤光报导基因)共转染。再将转染混合物加入2x T225烧瓶中，37℃(5％CO₂)培育6天。为了增加获得更多材料的机会，我们在两个附加烧瓶中重复该程序，共得到200ml。在第1和第6天定性萤光检验确认为阳性转染(Axiovert 10 Zeiss)。

在第6天(收获天)，将四个烧瓶中的上清液(200ml)合并，离心(4℃，400g)，并置于带有独特鉴定器的器皿内。

保留一等分试样(500μl)，对带6His标记的蛋白质作QC(内部生物加工QC)。

纯化方法

将含有C端带6His标记的重组蛋白质的200ml培养基样品用冷冻缓冲液A(50mM磷酸二氢钠；600mM氯化钠；8.7％(重量/体积)甘油，pH 7.5)稀释至终体积200ml。样品经0.22μm无菌过滤器(Millipore，500毫升过滤装置)过滤，4℃储存于250ml无菌方形培养瓶中(Nalgene)。

4℃下用连接到样品自动装载器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)进行纯化。纯化程序由两个连续步骤组成：在装有镍离子的Poros20MC(Applied Biosystems)柱(4.6×50mm，0.83ml)上进行金属亲和力层析，再在Sephadex G-25培养(Amersham Pharmacia)柱(1.0×10cm)上进行凝胶过滤。

第一个层析步骤的金属亲和柱用30柱体积的EDTA溶液(100mMEDTA；1M NaCl；pH 8.0)再生，用15柱体积的100mM硫酸镍溶液洗涤重新装载镍离子，用10柱体积的缓冲液A和7柱体积的缓冲液B(50mM磷酸二氢钠；600mM氯化钠；8.7％(重量/体积)400mM甘油；咪唑，pH 7.5)洗涤，最后用15柱体积含15mM咪唑的缓冲液A平衡。样品用Labomatic的样品装载器转移到200毫升定量环，然后以10ml/min的速率装到镍金属亲和柱上。亲和柱用12柱体积的缓冲液A和28柱体积含20mM咪唑的缓冲液A洗涤。在20mM咪唑洗涤期间，附着比较松散的污染蛋白质从柱中洗脱出来。重组的带His标记的蛋白质最后用10柱体积的缓冲液B洗脱，流速为2ml/min，洗脱出来的蛋白质收集得到1.6毫升馏分。

第二层析步骤的Sephadex G-25凝胶过滤柱用2毫升缓冲液D(1.137M氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；pH 7.2)再生，然后用4柱体积的缓冲液C(137mM氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；20％(重量/体积)甘油；pH 7.4)平衡。从镍柱洗脱出来的峰值馏分自动通过装在Sephadex G-25柱并连接到VISION的整合型样品装载器，蛋白质用缓冲液C洗脱，流速为2ml/min。去盐后样品回收得到2.2毫升馏分。该馏分经过0.22μm无菌离心过滤器(Millipore)过滤，冻存于-80℃。取样品的一等分试样以考马斯亮蓝染色以及使用抗His抗体的Western印迹在SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝胶；Novex)上进行分析。

考马斯亮蓝染色：NuPAGE凝胶用0.1％考马斯亮蓝R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)室温染色1小时，然后用20％甲醇，7.5％乙酸去色，直至背景澄清，蛋白质带清晰可见。

Western印迹：电泳后在4℃、290mA、1小时内将蛋白质从凝胶电转移到硝基纤维素膜上。室温下用在缓冲液E(137mM氯化钠；2.7mM氯化钾；1.5mM磷酸二氢钾；8mM磷酸二氢钠；0.1％Tween 20，pH 7.4)中的5％奶粉封闭纤维素膜1小时，再于4℃在2.5％在缓冲液E中的奶粉中与2种兔多克隆抗His抗体(G-18和H-15，各0.2μg/ml；Santa Cruz)混合物培养过夜。室温再培养1小时之后，膜用缓冲液E(3×10分钟)洗涤，再与结合HRP的第二抗兔抗体(DAKO，HRP 0399)室温培养2小时，所述第二抗体用含2.5％奶粉的缓冲液E稀释至1/3000。用缓冲液E(3×10分钟)洗涤之后，膜用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia)显影1分钟。然后，将膜与超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接触，使超膜显影，对Western印迹影像作目测分析。

蛋白质测定：用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)确定蛋白质的浓度，以牛血清白蛋白为标准。从200ml培养基回收得到890μg纯化蛋白质。

                           序列表

备注：对于外显子-外显子连接编码的氨基酸，它们将被指定为more 5’外显子。

SEQ ID NO 1：(INSP052外显子1核苷酸序列)

     1  ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT

    61  GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAG

SEQ ID NO 2：(INSP052外显子1多肽序列)

    1  MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTD

SEQ Id NO 3：(INSP052外显子2核苷酸序列)

      1  ACCCCCTGGA GGGGGTGAAC ATCACCAGCC CCGTGCGCCT GATCCATGGC ACCGTGGGGA

     61  AGTCGGCTCT GCTTTCTGTG CAGTACAGCA GTACCAGCAG CGACAGGCCT GTAGTGAAGT

    121  GGCAGCTGAA GCGGGACAAG CCAGTGACCG TGGTGCAGTC CATTGGCACA GAGGTCATCG

    181  GCACCCTGCG GCCTGACTAT CGAGACCGTA TCCGACTCTT TGAAAATGGC TCCCTGCTTC

    241  TCAGCGACCT GCAGCTGGCC GATGAGGGCA CCTATGAGGT CGAGATCTCC ATCACCGACG

    301  ACACCTTCAC TGGGGAGAAG ACCATCAACC TTACTGTAGA TG

SEQ ID NO 4：(INSP052外显子2蛋白质序列)

     1  PLEGVNITSP VRLIHGTVGK SALLSVQYSS TSSDRPVVKW QLKRDKPVTV VQSIGTEVIG

    61  TLRPDYRDRI RLFENGSLLL SDLQLADEGT YEVEISITDD TFTGEKTINL TVDV

SEQ ID NO 5：(INSP052外显子3核苷酸序列)

      1  TGCCCATTTC GAGGCCACAG GTGTTGGTGG CTTCAACCAC TGTGCTGGAG CTCAGCGAGG

     61  CCTTCACCTT GAACTGCTCA CATGAGAATG GCACCAAGCC CAGCTACACC TGGCTGAAGG

    121  ATGGCAAGCC CCTCCTCAAT GACTCGAGAA TGCTCCTGTC CCCCGACCAA AAGGTGCTCA

    181  CCATCACCCG CGTGCTCATG GAGGATGACG ACCTGTACAG CTGCATGGTG GAGAACCCCA

    241  TCAGCCAGGG CCGCAGCCTG CCTGTCAAGA TCACCGTATA CA

SEQ ID NO 6：(INSP052外显子3多肽序列)

     1  PISRPQVLVA STTVLELSEA FTLNCSHENG TKPSYTWLKD GKPLLNDSRM LLSPDQKVLT

    61  ITRVLMEDDD LYSCMVENPI SQGRSLPVKI TVYR

SEQ ID NO 7：(INSP052外显子4核苷酸序列)

     1  GAAGAAGCTC CCTTTACATC ATCTTGTCTA CAGGAGGCAT CTTCCTCCTT GTGACCTTGG

    61  TGACAGTCTG TGCCTGCTGG AAACCCTCCA AAAG

SEQ ID NO 8：(INSP052外显子4多肽序列)

1  RSSLYIILST GGIFLLVTLV TVCACWKPSK R

SEQ ID NO 9：(INSP052外显子5核苷酸序列)

     1  GAAACAGAAG AAGCTAGAAA AGCAAAACTC CCTGGAATAC ATGGATCAGA ATGATGACCG

    61  CCTGAAACCA GAAG

SEQ ID NO 10：(INSP052外显子5多肽序列)

    1  KQKKLEKQNS LEYMDQNDDR LKPEA

SEQ ID NO 11：(INSP052外显子6核苷酸序列)

     1  CAGACACCCT CCCTCGAAGT GGTGAGCAGG AACGGAAGAA CCCCATGGCA CTCTATATCC

    61  TGAAGGACAA G

SEQ ID NO 12：(INSP052外显子6多肽序列)

    1  DTLPRSGEQE RKNPMALYIL KDK

SEQ ID NO 13：(INSP052外显子7核苷酸序列)

      1  GACTCCCCGG AGACCGAGGA GAACCCGGCC CCGGAGCCTC GAAGCGCGAC GGAGCCCGGC

     61  CCGCCCGGCT ACTCCGTGTC TCCCGCCGTG CCCGGCCGCT CGCCGGGGCT GCCCATCCGC

    121  TCTGCCCGCC GCTACCCGCG CTCCCCAGCG CGCTCCCCAG CCACCGGCCG GACACACTCG

    181  TCGCCGCCCA GGGCCCCGAG CTCGCCCGGC CGCTCGCGCA GCGCCTCGCG CACACTGCGG

    241  ACTGCGGGCG TGCACATAAT CCGCGAGCAA GACGAGGCCG GCCCGGTGGA GATCAGCGCC

    301  TGA

SEQ ID NO 14：(INSP052外显子7多肽序列)

     1  DSPETEENPA PEPRSATEPG PPGYSVSPAV PGRSPGLPIR SARRYPRSPA RSPATGRTHS

    61  SPPRAPSSPG RSRSASRTLR TAGVHIIREQ DEAGPVEISA

SEQ ID NO：15(INSP052外显子1，2，3，4，5，6和7组合的核苷酸序列)

       1  ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCCAGA GCCTCCAGGG CCCTGCGCCT TGCTCCTTTT

      61  GTCTACCTTC TTCTGATCCA GACAGACCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCCGTG

     121  CGCCTGATCC ATGGCACCGT GGGGAAGTCG GCTCTGCTTT CTGTGCAGTA CAGCAGTACC

     181  AGCAGCGACA GGCCTGTAGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGGG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG

     241  CAGTCCATTG GCACAGAGGT CATCGGCACC CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGA

     301  CTCTTTGAAA ATGGCTCCCT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCCGATGA GGGCACCTAT

     361  GAGGTCGAGA TCTCCATCAC CGACGACACC TTCACTGGGG AGAAGACCAT CAACCTTACT

     421  GTAGATGTGC CCATTTCGAG GCCACAGGTG TTGGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC

     481  AGCGAGGCCT TCACCTTGAA CTGCTCACAT GAGAATGGCA CCAAGCCCAG CTACACCTGG

     541  CTGAAGGATG GCAAGCCCCT CCTCAATGAC TCGAGAATGC TCCTGTCCCC CGACCAAAAG

     601  GTGCTCACCA TCACCCGCGT GCTCATGGAG GATGACGACC TGTACAGCTG CATGGTGGAG

     661  AACCCCATCA GCCAGGGCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CCGTATACAG AAGAAGCTCC

     721  CTTTACATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCTTGGT GACAGTCTGT

     781  GCCTGCTGGA AACCCTCCAA AAGGAAACAG AAGAAGCTAG AAAAGCAAAA CTCCCTGGAA

     841  TACATGGATC AGAATGATGA CCGCCTGAAA CCAGAAGCAG ACACCCTCCC TCGAAGTGGT

     901  GAGCAGGAAC GGAAGAACCC CATGGCACTC TATATCCTGA AGGACAAGGA CTCCCCGGAG

     961  ACCGAGGAGA ACCCGGCCCC GGAGCCTCGA AGCGCGACGG AGCCCGGCCC GCCCGGCTAC

    1021  TCCGTGTCTC CCGCCGTGCC CGGCCGCTCG CCGGGGCTGC CCATCCGCTC TGCCCGCCGC

    1081  TACCCGCGCT CCCCAGCGCG CTCCCCAGCC ACCGGCCGGA CACACTCGTC GCCGCCCAGG

    1141  GCCCCGAGCT CGCCCGGCCG CTCGCGCAGC GCCTCGCGCA CACTGCGGAC TGCGGGCGTG

    1201  CACATAATCC GCGAGCAAGA CGAGGCCGGC CCGGTGGAGA TCAGCGCCTG A

SEQ ID NO：16(INSP052外显子1，2，3，4，5，6和7组合的多肽序列)

      1  MKRERGALSR ASRALRLAPF VYLLLIQTDP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST

     61  SSDRPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY

    121  EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW

    181  LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCMVE NPISQGRSLP VKITVYRRSS

    241  LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKRKQ KKLEKQNSLE YMDQNDDRLK PEADTLPRSG

    301  EQERKNPMAL YILKDKDSPE TEENPAPEPR SATEPGPPGY SVSPAVPGRS PGLPIRSARR

    361  YPRSPARSPA TGRTHSSPPR APSSPGRSRS ASRTLRTAGV HIIREQDEAG PVEISA

SEQ ID NO：17(INSP055小鼠虚拟cDNA)

       1  ATGAAGAGAG AAAGGGGAGC CCTGTCAAGA GCCTCCAGGG CTCTGCGCCT CTCTCCTTTT

      61  GTCTACCTGC TTCTCATCCA GCCAGTCCCC CTGGAGGGGG TGAACATCAC CAGCCCAGTA

     121  CGTCTGATCC ACGGCACAGT GGGGAAGTCG GCCCTGCTTT CCGTGCAGTA CAGTAGCACC

     181  AGCAGCGACA AGCCCGTGGT GAAGTGGCAG CTGAAGCGTG ACAAGCCAGT GACCGTGGTG

     241  CAGTCTATAG GCACAGAGGT CATTGGCACT CTGCGGCCTG ACTATCGAGA CCGTATCCGG

     301  CTCTTTGAAA ATGGCTCCTT GCTTCTCAGC GACCTGCAGC TGGCGGATGA GGGAACCTAT

     361  GAAGTGGAGA TTTCCATCAC TGACGACACC TTCACCGGGG AGAAGACCAT CAACCTCACC

     421  GTGGATGTGC CCATTTCAAG GCCGCAGGTA TTAGTGGCTT CAACCACTGT GCTGGAGCTC

     481  AGTGAGGCCT TCACCCTCAA CTGCTCCCAT GAGAATGGCA CCAAGCCTAG CTACACGTGG

     541  CTGAAGGATG GCAAACCCCT CCTCAATGAC TCCCGAATGC TCCTGTCCCC TGACCAAAAG

     601  GTGCTCACCA TCACCCGAGT ACTCATGGAA GATGACGACC TGTACAGCTG TGTGGTGGAG

     661  AACCCCATCA GCCAGGTCCG CAGCCTGCCT GTCAAGATCA CTGTGTATAG AAGAAGCTCC

     721  CTCTATATCA TCTTGTCTAC AGGAGGCATC TTCCTCCTTG TGACCCTGGT GACAGTTTGT

     781  GCCTGCTGGA AACCCTCAAA AAAGTCTAGG AAGAAGAGGA AGTTGGAGAA GCAAAACTCC

     841  TTGGAATACA TGGATCAGAA TGATGACCGC CTAAAATCAG AAGCAGATAC CCTACCCCGA

     901  AGTGGAGAAC AGGAGCGGAA GAACCCAATG GCACTCTATA TCCTGAAGGA TAAGGATTCC

     961  TCAGAGCCAG ATGAAAACCC TGCTACAGAG CCACGGAGCA CCACAGAACC CGGTCCCCCT

    1021  GGCTACTCCG TGTCGCCGCC CGTGCCCGGC CGCTCTCCGG GGCTTCCCAT CCGCTCAGCC

    1081  CGCCGCTACC CGCGCTCCCC AGCACGTTCC CCTGCCACTG GCCGGACGCA CACGTCGCCA

    1141  CCGCGGGCCC CGAGCTCGCC AGGCCGCTCG CGCAGCTCTT CGCGCTCACT GCGGACTGCA

    1201  GGCGTGCAGA GAATCCGGGA GCAGGACGAG TCAGGGCAGG TGGAGATCAG TGCCTGA

SEQ ID NO：18(INSP055小鼠预测蛋白)

      1  MKRERGALSR ASRALRLSPF VYLLLIQPVP LEGVNITSPV RLIHGTVGKS ALLSVQYSST

     61  SSDKPVVKWQ LKRDKPVTVV QSIGTEVIGT LRPDYRDRIR LFENGSLLLS DLQLADEGTY

    121  EVEISITDDT FTGEKTINLT VDVPISRPQV LVASTTVLEL SEAFTLNCSH ENGTKPSYTW

    181  LKDGKPLLND SRMLLSPDQK VLTITRVLME DDDLYSCVVE NPISQVRSLP VKITVYRRSS

    241  LYIILSTGGI FLLVTLVTVC ACWKPSKKSR KKRKLEKQNS LEYMDQNDDR LKSEADTLPR

    301  SGEQERKNPM ALYILKDKDS SEPDENPATE PRSTTEPGPP GYSVSPPVPG RSPGLPIRSA

    361  RRYPRSPARS PATGRTHTSP PRAPSSPGRS RSSSRSLRTA GVQRIREQDE SGQVEISA

Claims (43)

1.一种多肽，其特征在于：所述多肽

(i)包含或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或如图7所示的INSP052的胞外结构域组成；

(ii)是其具有(i)的多肽的活性，或者具有与(i)的多肽相同的抗原决定簇的片段；或者

(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽包含或由SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于：所述多肽由SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成。

4.一种多肽，它是权利要求1(iii)所述的功能等同物，其特征在于：所述多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列同源，并具有含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子活性。

5.一种多肽，它是上述权利要求中任何一项所述的片段或功能等同物，其特征在于：所述多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或与其活性片段具有84％以上的序列同一性，优选85％、90％、95％、98％或99％以上的序列同一性。

6.一种多肽，它是上述权利要求中任何一项所述的功能等同物，其特征在于：所述多肽与氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的肽有较高的结构同源性。

7.一种多肽，它是上述权利要求中任何一项所述的片段，其特征在于：所述多肽具有与权利要求1(i)的多肽相同的抗原决定簇，由SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的7或以上(例如8、10、12、14、16、18、20或以上)个氨基酸残基组成。

8.一种编码上述权利要求中任何一项所述的多肽的纯化核酸分子。

9.如权利要求8所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的核酸序列或者是其冗余等同物或片段。

10.如权利要求9所述的纯化核酸分子，其特征在于：所述核酸分子由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的核酸序列组成或者是其冗余等同物或片段。

11.一种在高度严谨条件下与权利要求8至10中任何一项所述的核酸分子杂交的纯化核酸分子。

12.一种含有权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子的载体。

13.一种用权利要求12所述的载体转化的宿主细胞。

14.一种配体，其特征在于：所述配体特异性地结合权利要求1至7中任何一项所述的多肽，最好抑制所述多肽的活性。

15.如权利要求14中所述的配体，其特征在于：所述配体是一种抗体。

16.一种增加或降低权利要求1至7中任何一项所述的多肽的表达水平或活性的化合物。

17.如权利要求16所述的化合物，其特征在于：所述化合物与权利要求1至7中任何一项所述的多肽结合，并且不会诱导该多肽的任何生物作用。

18.如权利要求17所述的化合物，其特征在于：所述化合物是天然或修饰的基质、配体、酶、受体或者结构或功能类似物。

19.如权利要求1至7中任何一项所述的多肽、如权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子、如权利要求12所述的载体、如权利要求13所述的宿主细胞、如权利要求14或15所述的配体、或者如权利要求16至18中任何一项所述的化合物，在治疗或诊所疾病中的应用。

20.一种诊断患者疾病的方法，其特征在于：所述方法包括评估所述患者组织中编码权利要求1至7中任何一项所述的多肽的天然基因的表达水平或者评估权利要求1至7中任何一项所述的多肽的活性，并将所述表达水平或者活性与对照水平作比较，若该水平与所述对照水平不同，则表示患病。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述方法在体外进行。

22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，将权利要求14或15所述的配体与生物样品接触；以及(b)检测所述复合物。

23.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)在允许权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子和核酸探针之间形成杂交复合物的严谨条件下，将患者的组织样品与核酸探针接触；

(b)在步骤(a)采用的相同条件下，将对照样品与所述探针接触；以及(c)检测所述样品中是否存在杂交复合物，其中，检测到患者样品中杂交复合物的水平与对照样品中杂交复合物水平不同，表示患病。

24.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)在允许权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子和核酸引物之间形成杂交复合物的严谨条件下，将患者组织的核酸样品与该引物接触；

(b)在步骤(a)采用的相同条件下，将对照样品与所述引物接触；以及

(c)扩增样品中的核酸；以及

(d)检测患者和对照样品中扩增核酸的水平；其中，检测到患者样品的扩增核酸水平与对照样品的扩增核酸水平明显不同，表示患病。

25.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于：所述方法包括：

(a)从有待测试疾病的患者中获得组织样品；

(b)从所述组织样品中分离权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子；以及

(c)通过检测作为患病指标的核酸分子中与疾病相关的突变是否存在，诊断患者疾病。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于：所述方法还包括扩增核酸分子以形成扩增产物，以及检测该扩增产物中是否存在突变。

27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于：所述患者是否存在突变是这样检测的：将所述核酸分子与在严谨条件下和所述核酸分子杂交的探针接触，形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关的突变的任何部分具有核酸探针链的未杂交部分；以及检测探针链的未杂交部分存在或不存在，则表示与疾病相关的突变存在或不存在。

28.如权利要求20至27中任何一项所述的方法，其特征在于：所述疾病是细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统疾病、精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其他病理病征。

29.如权利要求1至7中任何一项所述的多肽作为含有免疫球蛋白结构域的细胞表面识别分子的应用。

30.一种药物组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1至7中任何一项所述的多肽、权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子、权利要求12所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求14或15所述的配体、或者权利要求16至18中任何一项所述的化合物。

31.一种疫苗组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1至7中任何一项所述的多肽或权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子。

32.如权利要求1至7中任何一项所述的多肽、如权利要求10至11中任何一项所述的核酸分子、如权利要求12所述的载体、如权利要求13所述的宿主细胞、如权利要求14或15所述的配体、或者如权利要求16至18中任何一项所述的化合物、或者如权利要求30所述的药物组合物在制备治疗以下疾病的药物中的应用：细胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神经系统和精神障碍、发育障碍、遗传病、代谢性疾病、感染和其他病理病征。

33.一种治疗患者疾病的方法，其特征在于：所述方法包括把权利要求1至7中任何一项所述的多肽、权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子、权利要求12所述的载体、权利要求13所述的宿主细胞、权利要求14或15所述的配体、或者权利要求16至18中任何一项所述的化合物、或者权利要求30所述的药物组合物给予该患者。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于：当与健康受试者中多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性是较低的，给予该患者的多肽、核酸分子、载体、配体、化合物或组合物是激动剂。

35.如权利要求33所述的方法，其特征在于：当与健康受试者中多肽的天然基因的表达水平或者活性相比，病患者的该表达水平或活性是较高的，给予该患者的多肽、核酸分子、载体、配体、化合物或组合物是拮抗剂。

36.一种监测患者疾病治疗的方法，其特征在于：所述方法包括在一段时间内监测患者组织中权利要求1至7中任何一项所述的多肽的表达水平或活性、或权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子的表达水平，若在该时间内所述表达水平或活性趋向于对照水平，表示该疾病获得缓解。

37.一种鉴定有效地治疗和/或诊断疾病的化合物的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1至7中任何一项所述的多肽、或者权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子与怀疑对所述多肽或核酸分子有结合亲和力的一或多种化合物接触，以及选择能特异性地结合所述核酸分子或多肽的化合物。

38.一种用于诊断疾病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一容器，它含有在严谨条件下与权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，它含有用来扩增该核酸分子的引物；以及为方便诊断疾病而使用的该探针和引物的使用说明书。

39.如权利要求38所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括装有消化未杂交RNA的试剂的第三容器。

40.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核酸分子阵列，其中至少一个核酸分子是权利要求8至11中任何一项所述的核酸分子。

41.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一或多种与权利要求1至7中任何一项所述的多肽结合的抗体；以及一种用来检测所述抗体与所述多肽之间结合反应的试剂。

42.一种转基因或剔除非人动物，其特征在于：所述动物被转化为表达更高水平、更低水平或不表达权利要求1至7中任何一项所述的多肽。

43.一种筛选有效治疗疾病的化合物的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求42所述的非人转基因动物与候选化合物接触，并测定该化合物对动物疾病的影响。

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