CN1377409A

CN1377409A - Meg－1蛋白

Info

Publication number: CN1377409A
Application number: CN00813812A
Authority: CN
Inventors: 宫田敏男
Original assignee: Individual
Current assignee: Hei Chuanqing; Miyata Kiyoshi; Tokai University Educational System
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2002-10-30
Also published as: NO20020794L; WO2001014552A1; AU6596500A; CA2376404A1; AU776341B2; KR20020033763A; EP1209231A1; NO20020794D0; EP1209231A4

Abstract

在肾小球膜细胞中高频表达的DNA,以及该DNA编码的蛋白(meg－1)。这些物质可用于鉴定肾小球膜细胞,检测肾小球膜细胞的异常,等等。此外,肾小球膜细胞的功能可根据上述蛋白的功能加以阐明。因而有可能据此而揭示与肾小球膜细胞相关的疾病的病因。这些物质还有可能用于与肾小球膜细胞相关的疾病的治疗、诊断等等方面。

Description

MEG-1蛋白

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及对肾细胞的基因的分离。

背景技术

体内60万亿个各种细胞基本上包含相同的基因组DNA。就正常生理功能而言，这些基因的表达由细胞系和细胞所接受的信号来严格控制。因此，阐明每类细胞中所表达的基因是非常重要的。

肾小球膜细胞在维持肾小球的结构和功能时起关键作用，它们还是每种类型的肾炎的病理生理学关键因素。例如，肾小球膜细胞的增生以及肾小球膜细胞外基质的积累被认为是各类肾小球疾病(如慢性肾炎和糖尿病性肾炎)患者体内肾小球坏死的重要病理学发现。因此，对肾小球膜细胞中特异性表达的基因的鉴定以及对其功能的阐述有助于理解肾小球膜细胞的生物学功能和与肾小球膜细胞相关的疾病的病因，并因此可对与肾小球膜细胞相关的疾病进行治疗或诊断。

已知Thy1抗原是大鼠肾小球膜细胞的标志。但该基因并非肾小球膜细胞所特有，而且它不在人类的肾小球膜细胞中表达(Miyata T.等，免疫学，1989，67：531-533；和Miyata T.等，免疫学，1990，69：391-395)。已知肾小球膜细胞被激活时表达平滑肌肌动蛋白，但该基因也不是肾小球膜细胞特有的。迄今未见任何肾小球膜细胞特征性基因的报道。

本发明人曾报道MEGSIN是肾小球膜细胞中特异性表达的蛋白(临床研究杂志(J.Clin.Invest)，1998年8月15日，120：4，828-36)。本发明涉及具有不同于MEGSIN的结构的新蛋白。

发明内容

本发明的一个目的是对肾小球膜细胞中高表达的基因进行分离。

本发明人从人类肾小球膜细胞的体外培养物中分离出mRNA用于构建3’侧cDNA文库。然后，随机选择cDNA文库中的多个克隆，测定它们的序列。接着，将所测序列与得自各种器官和细胞的3’侧cDNA克隆的已知核苷酸序列进行比较，以确定肾小球膜细胞中表达的克隆。从这些克隆中选出一个在肾小球膜细胞中频繁出现的克隆，用5’RACE法分离其全长cDNA(3928bp)。测定该全长cDNA的完整核苷酸序列，从而完成本发明。确定Kozak翻译起始密码子，然后估计其开放读码框(ORF)。本发明人将带有该推导的氨基酸序列的本发明蛋白命名为Meg-1。人类Meg-1 cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

利用SwissProt数据库对该氨基酸序列进行的氨基酸序列同源性搜索证实Meg-1是一种新蛋白。此外，还对推导的Meg-1氨基酸序列进行了基元(motif)搜索，结果发现了一个在多种已知的蛋白磷酸酶中常见的基元。由于它的核定位信号很强，因此提示它可能是一种核蛋白。

此外，当通过Northern印迹检测Meg-1的分布时，在心脏和胎盘中观察到Meg-1的高水平表达，其次是在脑、骨骼肌、肾脏和胰腺中的表达。另外，可在肝脏中观察到弱表达，在肺中几乎观察不到Meg-1的表达。特别是，在各种原代培养的细胞中，它尤其在肾小球膜细胞中高水平表达。本发明是在这些发现的基础上完成的。

本发明具体涉及以下多核苷酸、蛋白质以及它们的应用。

(1)一种多核苷酸，其选自以下(a)-(d)：

(a)一种多核苷酸，其含有SEQ ID NO：1的蛋白编码区的核苷酸序列；

(b)一种多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；

(c)一种含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列但其中已取代、缺失、插入和/或添加了一或多个氨基酸的多核苷酸，该多核苷酸编码与含有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白功能等价的蛋白；

(d)一种多核苷酸，其可在严谨条件下与含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA杂交，该多核苷酸编码与含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白功能等价的蛋白。

(2)一种蛋白，其由如(1)所述的多核苷酸编码。

(3)一种载体，其含有如(1)所述的多核苷酸。

(4)一种转化体，其携有如(1)所述的多核苷酸或如(3)所述的载体。

(5)一种产生如(2)所述的蛋白的方法，该方法包括培养如(4)所述的转化体并回收表达产物。

(6)一种链长至少为15个核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸含有互补于SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列。

(7)一种检测含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸的方法，该方法包括使如(6)所述的寡核苷酸与待检样品接触并观察所述寡核苷酸的杂交。

(8)一种合成含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸的方法，该方法包括使如(6)所述的寡核苷酸与待检样品接触，并用该寡核苷酸作为引物合成互补链。

(9)一种用于检测肾小球膜细胞的试剂，该试剂含有如(6)所述的寡核苷酸。

(10)一种检测肾小球膜肾炎的方法，该方法包括测定生物样品中如(1)所述多核苷酸的表达水平，将该水平与得自正常样品的水平进行比较。

(11)如(10)所述的方法，其中所述生物样品是肾小球膜细胞。

(12)如(10)所述的方法，其中所述表达水平用含有选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的mRNA作为指标进行测量。

(13)如(10)所述的方法，其中所述表达水平用如(2)所述的蛋白或其片段作为指标进行测量。

(14)一种针对如(1)所述多核苷酸或其部分的反义多核苷酸。

(15)一种识别如(2)所述的蛋白的抗体。

(16)如(15)所述的抗体，其识别含有选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白中的一部分。

(17)一种免疫学测定法，其根据针对如(2)所述蛋白或其部分的如(15)所述抗体的免疫结合来测定如(2)所述的蛋白或其片段。

(18)一种用于免疫测定如(2)所述蛋白或其片段的试剂，该试剂含有如(15)所述的抗体。

(19)一种转基因非人脊椎动物，其中编码Meg-1的基因的表达水平已改变。

(20)如(19)所述的转基因非人脊椎动物，其中所述非人脊椎动物是小鼠。

(21)如(20)所述的转基因非人脊椎动物，其中所述转基因非人脊椎动物是一种基因敲除小鼠，该小鼠中编码Meg-1的基因的表达受到抑制。

为了实现以上所述，本发明人使用了一种3’-引导性(directed)cDNA文库。该方法避免了由于DNA大小的差异所致的克隆效力的差异。3’区的序列是每种基因特征性的，近200-300 bp的序列就足以证实该基因的特征(Yasuda Y.，Miyata T.等，Kidney Int，1998 Jan，53：1，154-8)。

编码本发明的人类Meg-1的多核苷酸可以通过制备肾小球膜细胞的mRNA并用已知方法将它们转化为双链cDNA来获得。mRNA可通过例如异硫氰酸胍-氯化铯法(Chirwin等，生物化学18，5294，1979)，和在有脱氧核糖核酸酶存在的情况下用一种表面活性剂以及酚处理(Berger &Birkenmeier，生物化学18，5143，1979)等来获得。从总RNA制备poly(A)⁺RNA可通过，例如用结合于寡聚(dT)的Sepharose、纤维素、乳胶颗粒等进行亲和层析来实现。cDNA(第一链)可通过将上述所获的mRNA作为模板，将互补于poly(A)链3’端的寡聚(dT)和对应于Meg-1之部分氨基酸序列的随机引物或合成寡核苷酸作为引物，经逆转录酶的处理来获得。杂合子中的由mRNA及其互补cDNA组成的mRNA用大肠杆菌RNA酶H进行部分消化。以消化后的mRNA为引物，利用大肠杆菌DNA聚合酶I可合成cDNA(第二链)。最后，双链cDNA可通过用大肠杆菌DNA连接酶进行处理来获得。

可将肾小球膜细胞的poly(A)⁺RNA作为模板，用根据人类Meg-1基因的核苷酸序列合成的引物经RT-PCR来克隆DNA。或者，不利用PCR，而是利用根据人类Meg-1基因的核苷酸序列合成的探针筛选cDNA文库而获得靶cDNA。通过在由这些方法获得的多种基因中证实本发明基因的核苷酸序列而选出本发明的基因。除人类以外的其它物种，如小鼠或大鼠中的Meg-1 cDNA同系物可利用类似方法获得。

另外，Meg-1 cDNA同系物可如下分离。用上述人类Meg-1 cDNA的核苷酸序列作探针，通过菌落杂交和空斑杂交筛选cDNA文库，从而分离出编码Meg-1同系物的cDNA。可将分离自小鼠或大鼠组织、培养的肾小球膜细胞等的mRNA作为模板合成所述cDNA文库。也可使用市售cDNA文库(Funakoshi，等)。参照本发明的人类Meg-1的cDNA，设计位于ORF之前和之后的简并引物来进行PCR，这是另一种扩增cDNA同系物的可能方法。

人类Meg-1基因组可通过筛选基因组文库来获得。可通过，例如制备人类B淋巴母细胞的基因组，用Sau3对DNA进行部分消化，将其插入噬菌体载体EMBL3，从而合成基因组文库(血液(Blood)，第83卷，第11期，1994：第3126-3131页)。可通过对所述基因组文库进行空斑杂交来获得含有所需基因组的克隆(见最新细胞生物学实验方案，Shujun-sha，pp79-92)。Meg-1cDNA中完整的开放阅读框区(2850bp)，或利用所述cDNA的一部分作为引物经PCR扩增人类基因组DNA所得的每一外显子-内含子部分都可作为探针使用。可将人类的培养型肾小球膜细胞来源的mRNA或人类的肾mRNA(购自Clontech)作为模板，通过5’RACE法(5’-Full RACE Core Set，参照Takara的方案)测定控制区序列的5’UTR。

本发明的基因还可利用核酸的化学合成经以下标准方法来产生，如亚磷酰胺(phosphoamidite)法(Mattencci，M.D.& Caruthers，M.H.美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103，3185，1981)、亚磷酸三酯法(Hunkapiller，M.等，自然310，105，1984)。

真核基因常表现出多形性，如人类干扰素基因，可利用这种多形性取代一或多个氨基酸但总体上维持蛋白的活性。一般情况下，即使有一或多个氨基酸已被修饰，也可维持蛋白的活性。因此，通过利用编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人工修饰性基因获得的蛋白，只要该蛋白具有本发明基因的典型功能，就可将编码该蛋白的多核苷酸包括在本发明中。当蛋白中SEQID NO：2的氨基酸序列已被人为修饰时，只要该蛋白仍具有本发明蛋白的特征，就可包括在本发明中。

本发明的蛋白包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其中已有一或多个氨基酸被取代、缺失、添加、和/或插入且功能等价于本发明的Meg-1蛋白的氨基酸序列。本发明中“功能等价”指具有与Meg-1相同的生物学功能。例如，本发明人已发现Meg-1的以下生物学功能。

首先，Meg-1显示与来自各种物种包括人在内的蛋白磷酸酶2A(PP2A)的亚单位A(调节亚单位)有20-30％的氨基酸序列同源性。已知PP2A形成一种三聚体，其中亚单位C(具有酶活性的催化亚单位)与亚单位A的C末端区结合，而亚单位B(另一种调节亚单位，为组织和细胞特异性)与亚单位A的N末端区结合。亚单位A和C在各种组织和细胞之间具有一种共同结构，但亚单位B被认为是组织和细胞特异性的。根据该信息，带有同源于PP2A的本发明Meg-1作为亚单位A的那种亚单位B有可能是一种肾小球膜细胞特异性蛋白。带有Meg-1作为亚单位A的那种亚单位B被认为与肾小球膜细胞特异性活性的调节机制相关。

此外，Meg-1的表达特征是，在原代培养的肾小球膜细胞中以特别高的水平表达。在其它原代细胞培养中，可观察到在肾皮质上皮细胞和真皮成纤维细胞中的表达，以及在脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞中的痕量表达。当比较不同组织中的表达时，在心脏和胎盘中观察到Meg-1的丰富表达，其次是在脑、骨骼肌、肾脏和胰腺中的表达。另外，可在肝脏中观察到弱表达，在肺中观察不到Meg-1的表达。在肿瘤细胞系中，该基因的高水平表达可见于HeLa细胞系S3，慢性髓细胞白血病细胞系K-562，淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4，结肠腺癌细胞系SW480和肺癌细胞系A549。此外，早幼粒细胞白血病细胞系HL-60和黑素瘤细胞系G361也表达该基因。Burkitt淋巴瘤Raji中的表达几乎察觉不到。对大鼠中Meg-1表达的分析显示，Meg-1在人类和大鼠中都是在肾脏(尤其肾小球膜细胞)中高水平表达。可利用所述每种组织的样品所制备的mRNA，并利用，例如选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列为探针，通过Northern印迹试验了解每种组织和培养细胞中的Meg-1表达。

在上述生物学特性方面功能等价的所有蛋白组成本发明的Meg-1。因此，本发明不仅包括结构已了解清楚的人类Meg-1，还包括在结构和功能方面等价的来自其它物种的同系物。

在通过同源性搜索验证的已知氨基酸序列中，PP4_R1(J.Biol.Chem.274(9)，5339-5347，1999)的结构与Meg-1最相似。但是，据报道PP4_R1是一种分离自牛小肠的、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶4之调节亚单位的人类同系物。在它们的结构中，位于PP4_R1的N末端第18位的丝氨酸残基在Meg-1中被18-氨基酸残基FGVDDYSSESDVIIIPSA取代。因此，这两种蛋白的结构不同。此外，从功能的角度来看，它们也是不同的，因为PP4_R1分离自神经上皮细胞，基于来自牛小肠的蛋白的氨基酸序列，而Meg-1是在肾小球膜细胞中强表达。由于这两种蛋白有连续的氨基酸序列互不相同，因此有可能Meg-1和PP4_R1是一组基因编码的同种型，或它们是剪接变体。

本发明的多核苷酸包括编码这些功能等价蛋白的多核苷酸。编码这些蛋白的多核苷酸可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA、RNA、以及由核苷酸衍生物组成的人工多核苷酸分子。

目标氨基酸的密码子是已知的，可任选，并根据标准方法，例如根据所用宿主中密码子的使用频率来确定(Grantham，R.等，核酸研究9，r43，1981)。因此，本发明包括已经利用密码子的简并性进行了适当修饰的多核苷酸。利用定点诱变法等(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984，81：5662)对这些核苷酸序列的密码子进行部分改变是可能的，这些方法以化学合成的编码所需修饰的寡核苷酸作为引物。

与包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸杂交并能编码具有本发明Meg-1的典型功能的蛋白的多核苷酸，也包括在本发明的多核苷酸中。能与特定序列在严谨条件下杂交的序列被认为与该特定序列所编码的蛋白具有相似的活性。严谨条件通常指以下条件。即，在4×SSC中于65℃进行杂交，然后在0.1×SSC中于65℃洗涤1小时。杂交和洗涤的温度可大大影响严谨度，它们可根据解链温度(Tm)来调节。Tm根据将要杂交的碱基对中碱基组成的比例，以及杂交溶液的组成(盐浓度、甲酰胺浓度和十二烷基硫酸钠浓度)来改变。因此，本领域技术人员可根据经验来考虑上述条件，以便设定能产生类似严谨度的条件。

本发明的多核苷酸，包括突变体的核苷酸序列可用于基于已知技术的各种目的。

可将如上述克隆的Meg-1编码基因插入适当的表达载体DNA，然后转化其它原核或真核宿主。此外，可通过在所述表达载体中导入适当启动子以及与表型表达相关的序列，使该基因在每个宿主细胞中表达。可使用的表达载体有，用于大肠杆菌的pET-3(Studier & Moffatt，分子生物学杂志189，113，1986)等，用于COS细胞的pEF-BOS(核酸研究18，5322，1990)，pSV2-gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，2072，1981)等，以及用于CHO细胞的pVY1(WO89/03874)等。目标蛋白可表达为靶基因与编码另一种多肽的基因的融合体所衍生的融合蛋白。可较方便地对这类融合蛋白进行纯化并分离出所需蛋白。组氨酸标签、c-myc标签、MBP标签、GST标签等是已知可用于融合的蛋白。能表达融合了这些标签的插入子的载体已有商品。

例如，大肠杆菌可在本发明的表达系统中作为原核宿主细胞使用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等是可作为微生物宿主细胞使用的真核生物。哺乳动物宿主细胞有COS细胞、CHO细胞、BHK细胞等。本发明的转化体可在适当选择的适于培养宿主细胞的条件下进行培养。

如上述，可通过对编码靶Meg-1的基因所转化的转化体进行培养，从细胞或培养上清中回收得到Meg-1。可将其纯化成基本纯的蛋白。Meg-1作为本发明的目标蛋白，可通过常用的蛋白分离和纯化方法进行分离和纯化，对所用方法无特别限制。例如，可通过适当选择并组合各种层析法来分离并纯化Meg-1。

除了上述方法，本发明的基因，包含该基因的重组载体，携有该载体的转化体，以及利用基因操作产生Meg-1，都可通过“分子克隆-实验室手册”(冷泉港实验室，纽约)所述的标准方法进行。

此外，可根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计用于检测Meg-1基因的探针。还可设计用于扩增含这些核苷酸序列的DNA和RNA的引物。根据给定序列设计探针和引物是本领域技术人员常规可完成的。包含设计的核苷酸序列的寡核苷酸可化学合成。这些寡核苷酸可用于各种形式的杂交试验，或用于核酸的合成反应，如PCR(如果已经有适当标记)。用作探针或引物的寡核苷酸有至少15个碱基，优选25-50个碱基。Meg-1和PP4_R1的核苷酸序列几乎完全相同，但Meg-1上有一段18氨基酸-编码区(74-127)与PP4_R1存在结构差异，因此可将区分Meg-1和PP4_R1的探针(或引物)设计为包含所述编码区的一部分的核苷酸序列。

本发明提供以下多核苷酸，其包含至少15个核苷酸并互补于含有SEQID NO：1之核苷酸序列或其互补链的多核苷酸。本文中术语“互补链”定义为双链多核苷酸中与另一条链组成A：T(在RNA中，以U代替T)和G：C碱基对的链。此外，“互补”定义为在含有至少15个核苷酸的一段连续区域中完全配对的那些，以及在上述区域中具有至少70％、优选80％、更优选90％、最优选95％或更高同源性的那些。同源性可用本文所述算法确定。由于Meg-1在肾小球膜细胞中高水平表达，因此检测本发明Meg-1基因的探针和引物可用于鉴定和检测肾小球膜细胞。引物尤其可用于扩增Meg-1基因。必要时，可在本发明的寡核苷酸上添加标记或结合标签。

本发明还提供用Meg-1表达作为指标检测肾小球膜肾炎的方法。本发明多核苷酸的表达在发生了肾小球膜肾炎的肾脏组织的肾小球膜细胞中增加。这可在以下工作实施例中得到支持，即当给与大鼠抗Thy1单克隆抗体而诱发肾小球膜肾炎后，在大鼠肾小球膜细胞中大鼠Meg-1 mRNA的表达增强。因此，通过测定生物样品中Meg-1的表达，并与正常样品的测定值比较，当Meg-1的表达增加时可检测出肾小球膜肾炎。可使用肾小球膜细胞、尿液和血液作为生物样品。可通过测定Meg-1 mRNA或其翻译产物Meg-1蛋白或其片段来比较Meg-1的表达。测定生物样品中这些成分的方法是已知的。例如，可用Northern印迹或RT-PCR法检测Meg-1 mRNA。用识别Meg-1的抗体来检测Meg-1蛋白或其片段。当使用肾小球膜细胞作为生物样品时，可用原位杂交或免疫组化检测来说明这些成分的细胞内定位。

此外，能调节Meg-1表达的反义多核苷酸可根据本发明所公开的Meg-1编码基因的核苷酸序列来提供。本发明的反义多核苷酸是用于证实Meg-1在肾小球膜细胞中的作用的重要工具。它还可用于调节因Meg-1基因的加速表达所致的疾病状况。反义多核苷酸对靶基因表达的抑制效应如下。通过形成三链而抑制转录起始，通过与RNA聚合酶所致局部开环结构的位点形成杂合体而抑制转录，通过与合成的RNA形成杂合体而抑制转录，通过在内含子与外显子的连接处形成杂合体而抑制剪接，通过与剪接体形成区形成杂合体而抑制剪接，通过与mRNA形成杂合体而抑制mRNA从细胞核向细胞质的转移，通过与加帽区及poly(A)附着区形成杂合体而抑制剪接，通过与翻译起始因子结合区形成杂合体而抑制翻译的起始，通过与起始密码子附近的核糖体结合区形成杂合体而抑制翻译，通过与mRNA的翻译区以及多体结合区形成杂合体而中断蛋白质链的延伸，通过与核酸-蛋白相互作用区形成杂合体而抑制基因表达，等等。这些通过抑制转录、剪接、或翻译过程而抑制靶基因的表达(Hirashima和Inoue，新生物化学实验2核酸IV基因的复制和表达，日本生物化学协会编，Tokyo Kagaku Dojin，第319-347页，1993)。

本发明所用的反义序列可通过上述任何一种效应抑制靶基因的表达。在一个实施方案中，如果设计了与基因mRNA5’端附近的非翻译区互补的反义序列，它可有效抑制该基因的翻译。但也可使用与编码区或与3’端非翻译区互补的序列。在这种方式下，本发明所利用的反义多核苷酸包括含有基因翻译区的反义序列以及非翻译区序列的反义序列的多核苷酸。可将所用反义多核苷酸插入适当启动子下游，并优选在3’端插入含有转录终止信号的序列。可将如此制备的DNA用已知方法转化至所需宿主。优选地，该反义多核苷酸应包含与待转化之宿主的内源基因(或其同源基因)或其部分互补的序列。但只要基因表达被有效抑制，不必完全互补。

可将以反义多核苷酸为模板转录的RNA设计为与靶基因的转录产物具有优选90％，最优选95％的互补性。用于有效抑制靶基因表达的反义多核苷酸的长度为至少15个核苷酸或更多，优选100个核苷酸或更多，更优选500个核苷酸或更多。通常，所用反义RNA的长度小于2.5kb。

基因组中Meg-1基因的启动子区和增强子区可根据本发明Meg-1 cDNA的核苷酸序列来获得。具体是，可如未审查已公开的日本专利申请平成6年-181767；免疫学杂志，1995，155，2477-2486；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，3561-3565等所述获得这些控制区。本文中，启动子区指位于转录起始位点上游、能控制基因表达的DNA区，增强子区指位于内含子或3’UTR中、能控制基因表达的DNA区。

具体地，可用如下方法获得启动子区。

1)可用Meg-1 cDNA的5’端位点作为探针从人类基因组文库中克隆Meg-1的启动子区。

2)用限制酶消化Meg-1基因以获得含有启动子区的DNA并测定核苷酸序列，其中所述启动子位于含Meg-1基因翻译起始密码子的上游区(2-5kbp)。用人类肾小球膜细胞的poly(A)⁺RNA为模板，通过利用选自Meg-1基因5’端位点的cDNA序列的引物DNA经引物延伸法测定转录起始位点(+1)。可能含有启动子活性的位点通过搜寻核苷酸序列中的转录因子结合序列而预测。

3)将已从2)所得DNA中排除了Meg-1基因编码区的DNA片段再克隆至一种质粒，并在该DNA片段下游2-5kbp处连接一个报道基因，如氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或萤光素酶基因，从而构建一种报道质粒。类似地，对应于Meg-1基因上游各种位点，且5’和3’端位点已经逐个除去的DNA片段可通过用限制酶消化，或通过PCR来制备，以便包括可能的启动子区。将CAT基因或萤光素酶基因作为报道基因连接在这些DNA片段的下游，以构建报道质粒。

4)可通过测量用3)所制备的报道质粒转化的动物细胞中CAT或萤光素酶的活性，从而获得位于Meg-1基因上游的启动子区。

可用Meg-1 cDNA作探针，以相同于上述对启动子的方式，从人类基因组文库中克隆出人类Meg-1的基因组基因，从而获得3’UTR以及内含子中的增强子区。

控制Meg-1基因表达的转录因子可用已知方法获得，如“新的细胞生物学实验方案，Shujun-sha”，“Biomanual series 5关于转录因子的研究，Yodo-sha”，“DNA及细胞生物学13，731-742，1994”所述的亲和层析法，South-western法，指纹分析法，凝胶滞后法，或一步杂交法。本文中，转录因子指控制Meg-1基因转录的因子，其包括诱导转录起始反应的转录起始因子和上调或下调转录的转录控制因子。

亲和层析可通过在亲和层析柱上应用核提取物(其中将如上述获得的启动子和增强子区固定在Sepharose或乳胶颗粒上)而实施，然后洗柱，用含有与层析柱固相相同序列的DNA洗脱所结合的转录因子，回收能控制Meg-1基因表达的转录因子。

如果利用South-Western法，可用每种标记探针筛选已插入大肠杆菌表达载体(如λgt11)的cDNA的表达产物。例如，待筛选的cDNA被表达为与β-半乳糖苷酶的融合蛋白，并被吸附至硝酸纤维素膜上。然后，通过以启动子区或增强子区的放射性同位素标记之DNA片段作为探针，筛选能合成具有结合活性的融合蛋白的噬菌体，可获得能调节Meg-1基因表达的转录因子。

凝胶滞后法是基于DNA在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳迁移性因与蛋白质的结合而发生改变。启动子区和增强子区的DNA片段可作为探针使用，通过与含有转录因子的样品(如核蛋白提取物)混合，可在低离子强度下利用电泳对它们进行分析。对转录因子的结合可检测为迁移性不同于游离DNA的带。凝胶滞后法允许以较高敏感性从蛋白质混合物中分离出转录因子。

经凝胶滞后法获得的DNA-转录因子复合物通过进一步的指纹分析能测定出转录因子结合位点。指纹分析法利用了以下现象：蛋白质当与DNA结合时不被DNA酶I消化。即，末端带有³²P标记的启动子区和增强子区DNA，在有转录因子存在时，仅被DNA酶I部分消化，然后可利用测定核苷酸序列所用的变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离。与没有转录因子时相同处理的结果进行比较，发现由于转录因子的结合使一条带消失了，因此可估计结合区。

本发明还提供识别Meg-1的抗体。本发明的抗体包括，例如针对含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的抗体。抗本发明的Meg-1或其部分肽的抗体(例如，多克隆抗体，单克隆抗体)或抗血清可利用已知用于产生抗体和抗血清的方法制备，所用抗原如本发明的Meg-1，本发明Meg-1的部分肽，或融合蛋白如本发明的c-myc-(His)₆-Tag-Meg-1或MBP-Meg-1。

本发明的Meg-1或其部分肽可与已知载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加抗体产量，可将完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂与抗原一起给药。免疫接种每1-6周进行一次，共进行约2-10次。温血动物可使用如猴子、家兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、和小鸡，优选小鼠和大鼠。

选择已免疫的温血动物如小鼠，测定其体内的抗体滴度，末次免疫的2-5天后获得该动物的脾脏或淋巴结，将这些组织中所含抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能产生单克隆抗体的杂交瘤，从而可制备单克隆抗体生成细胞。通过，例如，使下述标记性Meg-1与抗血清反应，测量与该抗体结合的标记的活性，便可测定抗血清中的抗体滴度。细胞融合可用已知方法实施，如Kohler和Milstein(自然，256，495，1975)所述。聚乙二醇(PEG)，仙台病毒等可作为融合增强剂使用，优选PEG。

骨髓瘤细胞实例有X-63Ag8，NS-1，P3U1，SP2/0，AP-1等，优选X-63Ag8。抗体生成细胞(脾细胞)与骨髓瘤细胞的比例为1∶20-20∶1。可加入约10％-80％的PEG(优选PEG1000-PEG6000)，并在20-40℃，优选30-37℃保温1-10分钟，使细胞有效融合。能产生抗Meg-1抗体的杂交瘤可用各种方法筛选，例如将杂交瘤培养上清加入已直接或通过载体间接吸附了Meg-1抗原的固相(例如微滴板)，然后加入已用放射性物质、酶等标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞来自小鼠时，用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或加入蛋白A，检测与固相结合的抗Meg-1单克隆抗体；将杂交瘤培养上清加入已吸附了抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相上，然后加入已标记了放射性物质、酶等的Meg-1，检测与固相结合的抗Meg-1单克隆抗体。

抗-Meg-1单克隆抗体可用已知方法或其改良法，在添加了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸腺嘧啶核苷)的常规动物细胞培养基中进行选择和克隆。可使用任何用于选择、克隆、和培养的培养基，只要杂交瘤可在其中生长。例如，可使用含1-20％，优选10-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Dainippon Pharmaceutical)，含1-10％胎牛血清的GIT培养基(Wako PureChemicals)，或用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，NissuiPharmaceutical)。保温温度通常为20-40℃，优选约37℃。保温时间通常为5天至3周，优选1-2周。保温通常在5％CO₂环境中进行。可按上文对抗血清中抗Meg-1抗体滴度的测量所述相同的方法测定杂交瘤培养上清中的抗体滴度。克隆通常用已知方法进行，如半固体琼脂法，或有限稀释法。已克隆的杂交瘤优选在无血清培养基中培养，以便在上清中产生最佳量的抗体。目标单克隆抗体可在腹水中获得。

通过选择，本发明的单克隆抗体能识别Meg-1特异性表位而不与除Meg-1以外的其它蛋白发生交叉反应。蛋白质特异性表位通常由该蛋白的氨基酸序列中至少7个或更多个，优选10-20个连续氨基酸残基组成。因此，能识别由具有选自SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的肽组成的表位且包含至少7个连续氨基酸残基的单克隆抗体可以是本发明的Meg-1特异性单克隆抗体。更具体地，例如一种能识别与PP4_R1有结构差异的18氨基酸区域(自N末端起的第18-35位残基)，并能区别与高度同源蛋白如PP4_R1的结构差异的抗体是识别本发明Meg-1的优选抗体。

可用通常用于分离和纯化多克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化抗-Meg-1单克隆抗体。已知的纯化方法包括，例如，盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、应用离子交换剂(如DEAE)进行的吸附和脱附、超速离心、凝胶过滤、或特异性纯化方法(其中通过一种抗原结合固相或诸如蛋白A或蛋白G等活性吸附剂排他性收集抗体，然后解除结合作用，获得该抗体)。

如此所得的识别本发明Meg-1的单克隆抗体和多克隆抗体可用于诊断和治疗与肾小球膜细胞相关的疾病。这些抗体可用作鉴别或检测肾小球膜细胞的工具，因为Meg-1是一种在肾小球膜细胞中高表达的蛋白。用于免疫检测细胞蛋白的方法是已知的。用这些抗体测量Meg-1的方法有夹心试验(使Meg-1与结合至不溶性载体的抗体和标记抗体反应，检测该反应产生的夹心复合物中的Meg-1)或竞争试验(使标记的人类Meg-1与样品中的人类Meg-1竞争与抗体的反应，根据与该抗体反应的标记抗原的量测定样品中的人Meg-1)。

利用夹心法测量人类Meg-1，可以分两步进行：使固相抗体与Meg-1反应，通过洗涤彻底除去未反应的物质，以及加入标记的抗体以形成固相抗体Meg-1标记抗体的复合物；也可一步完成：将固相抗体、标记的抗体、及Meg-1同时混合。

测量中所用的不溶性载体的实例有，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，聚酯，聚丙烯酸酯，尼龙，聚缩醛，合成树脂如氟化物树脂等，多糖如纤维素，琼脂糖，等，玻璃，金属等。不溶性载体的形式多样，包括盘，球，颗粒，纤维，杆，板，容器，小室，试管等。吸附了抗体的载体应在加有适当防腐剂如叠氮钠的情况下低温保存。

抗体可用已知的化学结合或物理吸附法固定。化学结合法包括，如利用了戊二醛的方法，利用了N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯、N-琥珀酰亚氨基-2-马来酰亚氨基乙酸酯等的马来酰亚胺法，利用了1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物等的碳二亚胺法。此外，马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚氨酯法，N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯法，双二唑化(bisdiazolated)联苯胺法，及二棕榈基赖氨酸(dipalmityllysine)法。备选地，可使两种不同抗体与待检物质反应以形成复合物，由经上述方法固定的第三抗体来捕获表位。

对免疫分析所用标记无限制。具体可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、金属螯合剂等。优选的标记性酶有，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-类固醇异构酶，α-甘油磷酸脱氢酶，三糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，以及乙酰胆碱酯酶等。优选的荧光物质有，异硫氰酸荧光素，藻胆蛋白，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，以及邻苯二醛。优选的发光物质有异鲁米诺，光泽精，鲁米诺，芳香族吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓盐及其修饰型酯，萤光素，萤光素酶，和水母发光蛋白。优选的放射性物质有¹²⁵I，¹²⁷I，¹³¹I，¹⁴C，³H，³²P，³⁵S等。

与上述标记物结合的方法是已知的。具体可使用直接和间接标记法。常用的直接标记法是，将抗体或抗体片段与标记物通过一种交联剂以化学共价键结合。交联剂有N，N’-邻亚苯基二马来酰亚胺，4-(N-马来酰亚氨甲基)环己酸N-琥珀酰亚氨酯，6-马来酰亚氨己酸N-琥珀酰亚氨酯，4，4’-二硫代吡啶，及其它已知的交联剂。交联剂可通过已知方法与酶和抗体反应，这取决于交联剂的特性。间接标记法的实例有，将抗体与低分子量半抗原如生物素、二硝基苯、吡哆醛、或荧光胺结合，以及将抗体用该半抗原的结合配对物间接标记。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可用作生物素的识别配体，而二硝基苯、吡哆醛、或荧光胺均用于标记能识别这些半抗原的抗体。辣根过氧化物酶可用于标记抗体。此酶十分有效，因为它能与多种底物反应，且能通过过碘酸盐法轻易与抗体结合。有时也使用抗体的片段如Fab’，Fab，F(ab’)₂作为抗体。多克隆和单克隆抗体都可通过相同的方法用一种酶标记。用上述交联剂获得的酶标抗体可用已知方法，如亲和层析等来纯化，以便在更敏感的免疫分析系统中使用。可将纯化的酶标抗体与防腐剂如硫柳汞和稳定剂如甘油一起保存。标记的抗体可冻干并在低温避光保存很长时间。

当标记物为酶时，其底物和(必要时)显色剂可用于测定其活性。当使用过氧化物酶时，以H₂O₂作为底物溶液，并以2，2’-连氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]铵盐(ABTS)、5-对氨基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基氨替比林(aminoantipyrine)、或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，以邻硝基苯磷酸酯、对硝基苯磷酸酯等作为底物。当使用β-D-半乳糖苷酶时，可将荧光素-二-(β-D-半乳糖吡喃糖苷)，4-甲基伞形酮基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖吡喃糖苷等用作底物。本发明还包括用于Meg-1的免疫分析试剂(包括标记的或固相化的单克隆或多克隆抗体)，还包括一种试剂盒，其含有上述试剂、用于检测标记物的指示剂和对照样品等等。

可使用任何生物样品，如血浆、血清、血液、尿、组织液或脑脊液等体液作为测定本发明Meg-1的样品，只要它们含有Meg-1或其前体或片段。

此外，本发明涉及一种转基因非人类脊椎动物，该动物中Meg-1基因的表达水平已改变。本文中，Meg-1基因包括编码Meg-1的cDNA、基因组DNA、或合成的DNA。基因表达包括转录和翻译步骤。本发明的转基因动物可用于研究Meg-1的功能和表达的控制，澄清与人类肾小球膜细胞相关的疾病的发病机理，开发用于筛选和检验药物安全性的疾病模型动物。

在本发明中，可通过修饰Meg-1而人为增加或减少其表达水平(相对于最初的基因)，方法是在控制Meg-1基因正常表达的某些重要位点(增强子、启动子、内含子等)的一部分中导入诸如缺失、取代、插入等突变。这些修饰改变了Meg-1基因的转录。另一方面，可通过缺失某个外显子的一部分，或用终止密码子取代特定密码子而修饰蛋白质的翻译，方法是在编码区导入点突变。这些突变可利用已知获得转基因动物的方法导入。

转基因动物，在狭义上指通过基因重组在生殖细胞中人为导入了外源基因的动物，在广义上指在早期发育阶段将外源基因稳定地导入了染色体的动物，其中所述基因可作为基因型传给后代，所述动物包括特定基因的功能已被反义RNA抑制了的反义转基因动物，特定基因已经利用胚胎干细胞(ES细胞)实施了基因敲除的动物，已在DNA中导入了点突变的动物。本文所用转基因动物包括除人类以外的所有脊椎动物。

转基因动物的制备方法有，将基因与卵(egg)混合并用磷酸钙处理该混合物的方法，显微注射法(在相差显微镜下用显微移液管将基因直接注射至前核卵的核中(显微注射法，美国专利4,873,191))，以及利用胚胎干细胞(ES细胞)的方法。其它方法包括，将基因插入逆转录病毒以感染卵的方法，将基因通过精子导入卵的精子载体法等。精子载体法是通过使外源基因附着于精子或经电穿孔等掺入精细胞中并与卵受精，从而导入外源基因的遗传重组方法(M.Lavitranoet等，细胞，57，717，1989).

可使用体外定点基因重组如噬菌体P1的cre/loxP重组系统，酿酒酵母的FLP重组系统等。还报道了利用逆转录病毒将靶蛋白的转基因导入非人类动物的方法。

经显微注射制备转基因动物的方法可如下实施。提供基本由调节表达的启动子、编码特定蛋白的基因、以及poly(A)信号组成的转基因。应证实所有谱系的表达模式和水平，因为特定分子的表达模式和水平取决于启动子活性，所制备的转基因动物在各种谱系之间不同，这取决于拷贝数和转基因在染色体上的导入位点。当表达水平因非编码区和剪接而不同时，可在poly(A)信号的上游导入待剪接的内含子序列。导入受精卵时所用的基因尽可能纯，这是非常重要的。可使用的动物有，用于收获受精卵的小鼠(5-6周龄)，用于交配的雄性小鼠，假孕的雌性小鼠，已结扎的雄性小鼠等。

为了有效获得受精卵，可利用促性腺激素等诱导排卵。收获受精卵，用注射管经显微注射方式将基因注射至卵的雄性前核中。准备好能将已处理过的卵重新放回输卵管中的动物(假孕的雌性小鼠等)，每只小鼠植入约10-15个卵。新生小鼠是否已导入了转基因可如下证实：从尾尖部提取DNA并通过Southern杂交或PCR法进行检测，或利用阳性克隆法，其中插入只能由同源重组活化的标记基因。转基因的表达可通过经Northern杂交或RT-PCR法检测转基因的转录子而证实。也可用蛋白特异性抗体经Western印迹法进行检测。

本发明的基因敲除小鼠可制备成丧失了小鼠Meg-1基因的功能。基因敲除小鼠指一种转基因小鼠，其中通过同源重组技术使某个基因的功能丧失。基因敲除小鼠可通过用ES细胞进行同源重组，然后筛选其中一种等位基因已被修饰并被破坏的那些ES细胞而制备。例如，可将已遗传改造的ES细胞注射至胚细胞或8-细胞胚胎期的受精卵中，以便获得具有来自ES细胞和来自胚的两种细胞的嵌合小鼠。其中一种等位基因的所有形式已经得到修饰并被破坏的那些杂合子小鼠可通过使嵌合小鼠(嵌合指由来自两个或更多个受精卵的体细胞组成的个体)与正常小鼠杂交而产生。杂合子小鼠相互交配可产生纯合子小鼠。本发明的转基因动物包括杂合子和纯合子。

同源重组指核苷酸序列相同或十分相似的两种基因之间利用基因重组机制发生的重组。发生了同源重组的细胞可通过PCR来筛选。利用待导入基因的一部分序列和该基因预期将插入的染色体区的一部分序列作为引物，进行PCR，然后检测产生了扩增产物的细胞，便可证实同源重组。ES细胞中所表达的基因的同源重组可通过已知方法或它们的改良法轻易地筛选，所述方法如将新霉素抗新基因与待导入的基因结合，使细胞在导入完成后具有新霉素抗性。

附图简述

图1是一张显微照片(放大倍数40)，显示用Meg-1特异性探针在正常人肾小球组织中进行原位杂交的结果。

图2是一张显微照片，显示在高于图1的放大倍数(放大倍数80)下，用Meg-1特异性探针在正常人肾小球组织中进行原位杂交的结果。

图3的照片显示由抗Thy1抗体诱发了肾小球膜肾炎的大鼠肾小球中总mRNA的电泳结果(图中表示为“总RNA”)，另一张显示用Meg-1特异性探针进行Northern印迹分析的结果(图中表示为“大鼠Meg-1”)。

实施本发明的最佳模式

本发明参照以下实施详细例举例说明，但并非限制。

实施例1：人类肾小球膜细胞的原代培养

从58岁男性切除的正常人类肾脏，分离人的肾小球膜细胞。将肾皮质无菌分离，切碎，通过多个筛网。所用筛网的孔径逐步减小，将75-200μm孔径的筛网所捕获的肾小球洗涤后，与100μg/ml胶原酶(WashingtonBiochemical)37℃保温20分钟。洗涤后，将肾小球重悬于含25mM Hepes，10％ Nu-血清(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)，和抗生素(10μg/ml青霉素，链霉素和两性霉素B)的199培养基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中，在5％CO₂培养箱中培养。培养至第三代后，根据一系列标准鉴定肾小球膜细胞，这些标准有典型的形态学特征，对胰蛋白酶、嘌呤霉素、和D-缬氨酸的抗性，对肌动蛋白(Zymed Laboratories，SanFrancisco，CA)、抗极晚期抗原(VLA)-1，3，5(Immunotech)的免疫染色阳性，以及对VIII因子(Dako，CA)的免疫染色阴性。

实施例2：从培养的人类肾小球膜细胞分离mRNA

用异硫氰酸胍(GTC)法从培养至第6代的人肾小球膜细胞中分离总RNA。在实施例1所述细胞的含血清培养基中已经长满的肾小球膜细胞培养物用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后溶于5.5mM GTC溶液中。使溶液通过18号针头以除去DNA。核以及其他细胞碎片通过在5,000×g离心90秒而沉淀。小心将上清上样至三氟乙酸铯(CsTFA)的上层，在15℃以125,000×g离心24小时。将RNA沉淀溶于TE缓冲液中。用oligo dT纤维素层析柱(Pharmacia)分离Poly(A)⁺RNA。

实施例3：3’导向的-cDNA文库的构建

以 poly(A)⁺RNA为模板，用基于pUC19(Norrander J.等，Gene，26，101-106，1983)的载体引物合成cDNA。该载体引物DNA带有HincII末端和PstI末端以及一个T tale，并在MboI位点(GATC)发生dam-甲基化。合成了第二链后，该cDNA序列以及载体上LacZ基因中的BamHI位点分别用MboI和BamHI消化，在较低DNA浓度下进行环化和连接。用连接混合物的一部分转化大肠杆菌。随机选择所得转化体，仅通过加热使它们分别解体。cDNA插入序列用侧翼于pUC19克隆位点的引物(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’/SEQ ID NO：3和5’-ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3’/SEQ ID NO：4)经成对PCR进行扩增。用所得较短的双链DNA进行循环测序反应并通过自动测序仪进行分析。

实施例4：在肾小球膜细胞中特异性表达的基因的分离

为了鉴定在肾小球膜细胞中特异性表达的基因，本发明人用计算机进行了大批量DNA测序及数据处理。各种不同细胞和器官中的转录子可同时比较(Y.Yasuda等，Kidney International 53：154-158，1998；K.Matsubara等，Gene.135，265(1993)；K.Okubo等，Nat.Gen.2，173(1992))。对培养的人类肾小球膜细胞3’-结构域cDNA文库进行大批量DNA测序，测出随机选取的1836个克隆的部分序列。用FASTA程序比较这些克隆之间的序列同源性，并进一步与DNA数据库GenBank中的序列比较。来自各种器官和细胞的mRNA用斑点印迹进行分析，以选出在肾小球膜细胞中特异性表达的克隆。结果获得在肾小球膜细胞cDNA文库中以极高频率检测到的一些克隆。

实施例5：用5′RACE克隆全长cDNA

用“5′-Full RACE Core Set”(Takara shuzo有限公司)进行以下实验。在0.5ml小试管中添加4.0μl来自人肾小球膜细胞培养物的人poly(A)⁺RNA(0.5μg/μl)，1.5μl 10×RT缓冲液，0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1μl AMV逆转录酶XL(5U/μl)以及1μl 5′-端磷酸化RT引物(5′-pTCAGAGAGGTCATTC/SEQ ID NO：5，200pmol/μl)，用7μl不含RNA酶的dH₂O将总体积调整为15μl。将该反应混合物置于“Takara PCR热循环仪”(Takara shuzo有限公司)中，30℃保温10分钟，50℃保温60分钟，80℃保温2分钟及4℃保温10分钟，从而获得第一链cDNA。

将15μl反应液添加至含有15μl 5×杂交RNA变性缓冲液及45μl H₂O的0.5ml小试管中。加入1μlRNA酶H后，30℃反应1小时。反应后，向该反应混合物中加入150μl乙醇，然后-70℃冷却30分钟。将混合物离心，除去上清，收获沉淀。

向沉淀中加入8μl 5× RNA(ssRNA)连接缓冲液，20μl 40％PEG#600以及12μl H₂O并充分混合。然后向该混合物中加入1μl T₄连接酶，再于16℃保温15小时以获得环状单链cDNA。

将所得环状单链cDNA用TE缓冲液1∶10稀释后作为模板，进行首轮PCR。反应条件为5μl 10×LA PCR缓冲液II(加Mg²⁺)，8μl dNTP混合物(2.5mM)，0.5μl首轮PCR的S1引物(5′-TCATTGATGGGTCCTCAA/SEQ IDNO：6，20pmol/μl)，0.5μl首轮PCR的A1引物(5′-AGATTCTTGAGCTCAGAT/SEQ ID NO：7，20pmol/μl)，0.5μl Takara LA TaqTM(5U/μl)，用无菌水将混合物总体积调整为50μl。将该混合物置于“Takara PCR热循环仪”中，94℃加热3分钟，然后进行25轮以下反应：94℃30秒，60℃30秒和72℃2分钟。

用1μl上述首轮反应液作为模板，向其中加入5μl 10×LA PCR TM缓冲液II(加Mg²⁺)，8μl dNTP混合物(2.5mM)，0.5μl第二轮PCR的S2引物(5′-AATGGTGGCATAAACATG/SEQ ID NO：8，20pmol/μl)，0.5μl第二轮PCR的A2引物(5’-ACAGACAAATTGAACTTC/SEQ ID NO：9，20pmol/μl)，和0.5μl Takara LA TaqTM(5U/μl)，用无菌水将混合物总体积调整为50μl。将该混合物置于“Takara PCR热循环仪”中，将94℃30秒、60℃30秒和72℃2分钟的反应进行30轮。

通过0.75％琼脂糖凝胶电泳验证了泳带后，取1μl反应液使用“originalTA克隆试剂盒”(Invitrogen)进行再克隆。插入所收获的质粒中的基因片段的核苷酸序列经双脱氧终止法测定。

结果显示，所得核苷酸序列含有编码基因产物N-末端部分的区域，并含有约50个额外的核苷酸作为5′-非翻译区。起始密码子ATG的预测位置与共有序列中的位置一致，并给出了最长的ORF(符号“第一ATG法则”)。基于上述cNDA序列中发现的最长ORF、由950个氨基酸残基组成的氨基酸序列被测定为上述基因产物的推导的氨基酸序列。具有该氨基酸序列的蛋白被本发明人命名为Meg-1。Meg-1 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，Meg-1的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。

实施例6：肾小球膜特异性基因的功能分析(1)

用FASTA程序在SwissProt数据库中进行的氨基酸同源性搜索证实，Meg-1是一种新的蛋白质。此外还证实，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶4相关蛋白PP4_R1显示同源性。Meg-1氨基酸序列与PP4_R1有97.9％的同源性，Meg-1的cDNA的核酸序列与PP4_R1有98.3％的同源性。此外，SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的一部分(跨778-950位的173个氨基酸)的核苷酸序列与作为胎脑EST提交的cDNA的核苷酸序列(HSU 79267)有99.4％相同，与其氨基酸序列100％相同。该克隆来自IMAGE consortium的Soares文库1NIB，而EST仅仅是功能和结构(bodymap)还完全未知的一段部分测序的序列。

然后，对Meg-1的氨基酸序列进行基元搜索。用PSORTWWW服务器(http：//psort.nibb.ac.jp：8800/)以及MOTIF(http：//www.motif.genome.ad.jp/)进行搜索。结果表明，Meg-1含有数个磷酸化基元。具体地，以下显示的由激酶进行磷酸化的基元的存在已得到鉴定。此外，还验证了6个N-糖基化位点。而且，还提示了一个核定位信号的存在。预计核定位为52.2％。

酪蛋白激酶II磷酸化位点：22

蛋白激酶C磷酸化位点：11

酪氨酸激酶磷酸化位点：2

此外，根据以上事实，可证实上文预测的具有950个氨基酸残基的序列对应于Meg-1的氨基酸序列。具有该氨基酸序列的蛋白的理论pI为4.49。

实施例7：Meg-1的功能分析(2)-组织分布

对Meg-1如下进行Northern印迹分析。3’导向的cDNA library(实施例3)中阳性克隆插入子用RI经随机DNA标记法标记，并作为探针。从下述用作样品的细胞中分离的Poly(A)⁺RNA(2μg)在含2.2M甲酰胺的1％琼脂糖凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜上。将此膜在Rapid Hyb溶液(Amersham，Arlington Heights，IL)中杂交。然后，用0.1×SSPE/0.1％SDS，60℃的最终严谨度洗涤。

用于多重(multiple)人类原代培养细胞和组织的Northern印迹分析，以及用于人类癌细胞系的Northern印迹分析的样品购自Clontech(Palo Alto，CA)。原代细胞培养的样品可以是来自人类肾小球膜细胞、人类皮肤上皮细胞、人类肾皮质上皮细胞、人类脐静脉内皮细胞、及人类平滑肌细胞的原代培养细胞的poly(A)⁺RNA 2μg。在人类癌细胞系的Northern印迹分析中，可使用来自早幼粒细胞白血病HL-60、HeLa细胞S3、慢性髓样白血病K-562、淋巴母细胞白血病MOLT-4、Burkitt淋巴瘤Raji、大肠腺癌SW480，肺癌A549、及黑素瘤G361的poly(A)⁺RNA 2μg作为样品。在组织的Northern印迹分析中，可使用来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺的poly(A)⁺RNA 2μg作为样品。杂交和洗涤如上述进行。结果示于表1-3。表1

原代培养细胞
原代培养细胞		人类肾小球膜细胞	+++
人类真皮成纤维细胞	++	人类肾小球膜细胞	+++
人类真皮成纤维细胞	++	人类肾皮质上皮细胞	++
人类脐静脉内皮细胞	±	人类肾皮质上皮细胞	++
人类脐静脉内皮细胞	±	人类平滑肌细胞	±

表2

人类癌细胞系
人类癌细胞系		早幼粒细胞白血病HL-60	++
HeLa细胞S3	+++	早幼粒细胞白血病HL-60	++
HeLa细胞S3	+++	慢性髓样白血病K-562	+++
淋巴母细胞白血病MOLT-4	+++	慢性髓样白血病K-562	+++
淋巴母细胞白血病MOLT-4	+++	Burkitt淋巴瘤Raji	-至±
大肠腺癌SW480	+++	Burkitt淋巴瘤Raji	-至±
大肠腺癌SW480	+++	肺癌A549	+++
黑素瘤G361	++	肺癌A549	+++

表3

人类组织
人类组织		心脏	+++
脑	++	心脏	+++
脑	++	胎盘	+++
肺	-	胎盘	+++
肺	-	肝脏	+
骨骼肌	++	肝脏	+
骨骼肌	++	肾脏	++
胰腺	++	肾脏	++

在利用Meg-1 cDNA作为探针进行的Northern印迹分析中，在培养的肾小球膜细胞中发现了单一转录产物(约4.5kb)。人类原代细胞培养物的特征之一是，Meg-1基因在肾小球膜细胞中以非常高的水平表达。在其它原代细胞培养物中，在肾皮质上皮细胞和真皮成纤维细胞中均有表达，在脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞中可见弱表达。此外，当比较组织中的表达时，心脏和胎盘中的Meg-1高表达，其次是在脑、骨骼肌、肾脏和胰腺中。此外，在肝脏中的表达较弱，肺中未发现表达。在各种培养的癌细胞系中，在HeLa细胞S3，慢性髓样白血病K-562，淋巴母细胞白血病MOLT-4，大肠腺癌SW480和肺癌A549中有强表达。在早幼粒细胞白血病HL-60以及黑素瘤G361中也有表达。在Burkitt淋巴瘤Raji中几乎无表达。

实施例8：Meg-1的功能分析(3)-原位杂交

通过原位杂交评估正常人肾组织中的Meg-1 mRNA表达。原位杂交按已知方法(Kidney Int.52：111(1997))实施。用对应于人类Meg-1(SEQ ID NO：10)中2879-2912位的核苷酸序列作为探针。如图1和2所示，经证实肾小球的膜区域中的细胞都为Meg-1 mRNA阳性。

实施例9：大鼠Meg-1

尝试获得Meg-1的大鼠同系物。

从大鼠肾小球膜细胞收集总RNA并合成cDNA。以该cDNA为模板，用基于人Meg-1的核苷酸序列的各种简并引物进行PCR。在对应于人Meg-1的以下区段的部分中设计简并引物：

有义链：1-18位核苷酸；

反义链：2852-2872位核苷酸。

将具有预期大小的扩增产物克隆，并测定其核苷酸序列。此外，用marathorn方法(用于分离和鉴定megsin的方法)对3′末端进行部分测序。所得核苷酸序列见SEQ ID NO：11，推导的氨基酸序列见SEQ ID NO：12。

结果分离一种大鼠Meg-1同系物，其核苷酸序列迄今未见报道。大鼠Meg-1与人Meg-1在结构上高度保守，基因水平保守性为74.3％，蛋白水平的保守性为86.3％。

此外，用实施例7所述方法以不同的样品和探针分析了大鼠Meg-1在大鼠细胞和组织中的定位。结果如下：

脑 +

肺 +++

心脏 +

肝 +

脾 ++

肾 ++

平滑肌 -到+

肾小球膜细胞 +++

肾上皮细胞 -到+

肾内皮细胞 -到+

由于Meg-1在包括人和大鼠在内的多个物种中于肾内(尤其肾小球膜细胞中)高水平表达，它因此有可能是与肾小球膜细胞的功能相关的功能性基因之一。

实施例10：Meg-1在肾小球膜肾炎诱导的肾小球中的特异性表达。

已知可通过给予针对大鼠Thy1抗原的单克隆抗体而在大鼠中诱导肾小球膜肾炎(YagiM，Yamamoto T，Nagano N，Kato S，Kusaka M，Kawasaki K，Yaoita E，Kihara T：在伴有抗Thy-1抗体诱导的肾小球膜增生性损伤的肾小球中I型胶原的瞬时表达。Pathol Int 45：409-414，1995)。根据该方法，在大鼠肾小球中诱导了肾小球膜肾炎，并用Northern印迹分析法检测了该部位的Meg-1表达。

抗大鼠Thy1单克隆抗体用产生该抗体的杂交瘤系(购自欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collecfion of Animal Cell Cultures)(Sulisbury，UK)来制备(Salant DJ，Darby C，Couser WG：大鼠实验性膜性肾小球肾炎。J ClinInvest 66：71-81，1980)。简言之，将所述杂交瘤细胞培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，然后将悬浮于0.5ml RPMI-1640中的1×10⁶个细胞接种至10周龄雄性Balb/c小鼠腹腔中，该小鼠已于7天前腹膜内注射了不完全弗氏佐剂。注射了杂交瘤的2周后，从该小鼠收获腹水。将腹水液离心去除不溶物质，收集上清。然后，将汇总的腹水对PBS透析，富含IgG的级分用50％饱和度的硫酸铵沉淀。将粗制的抗体上样至HiTrap蛋白A层析柱(Pharmarcia Biotech，Tokyo，Japan)以便纯化IgG。将吸附在该层析柱上的IgG洗脱至洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH5)中，对PBS透析后备用。

如下检测诱发了肾小球膜肾炎的大鼠肾小球中Meg-1 mRNA的表达。所有动物实验按《动物实验指南》，Faculty of Medicine，东京大学进行。将6周龄的雄性Wistar大鼠(购自Charles River Japan(YoKo hama，Japan))喂养1周，对它们静脉注射IgG1小鼠单克隆抗Thy1抗体(OX7)或赋形剂(对照)，1.2mg/kg体重。在所述给药之前，以及所述给药的2，4，7，14和28天后，分别切取6只大鼠的肾脏并剪成碎片。过滤分离大鼠肾小球。从这些肾小球分离总RNA并进行Northern印迹分析。用具有大鼠Meg-1中第841-1979位核苷酸的序列(SEQ ID NO：13)的片段作为探针。该区因与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的亚单位A(调节亚单位)同源性低而适于作为探针。该探针可通过以大鼠肾小球膜细胞cDNA为模板经PCR扩增一种片段，并将其再克隆至pGEM-Teasy中，然后用EcoRI进行消化而制得。

Northern印迹分析的结果证实，在抗Thy1抗体诱导了肾小球膜肾炎的那些肾小球中，Meg-1的表达显著增加(图3)。

工业应用性

本发明提供了以高频率表达于肾小球膜细胞中的DNA，该DNA编码的蛋白质，结合该蛋白的抗体等。它们被认为与肾小球膜细胞的特异性生物学活性密切相关并可用于，例如鉴定肾小球膜细胞，和检测肾小球膜细胞中的异常。此外，该蛋白还可用于阐明肾小球膜细胞的功能，并因此研究与肾小球膜细胞相关的疾病的病因。预计本发明可用于对与肾小球膜细胞相关的疾病，如肾小球膜肾炎进行治疗和诊断等。

具体地，肾小球肾炎的发生或进展可能能通过，例如人为调节Meg-1而得到调节。或者，对体液及肾小球膜细胞中Meg-1的mRNA或蛋白的定量可能能诊断诸如肾小球肾炎之类的肾脏疾病。在肾小球肾炎中，功能性异常可见于肾小球膜区，导致肾小球膜细胞增生或加速从这些细胞产生基质。Meg-1参与这些疾病的可能性很大。

本发明的Meg-1，以及由本发明人以前报道的MEGSIN在肾小球膜细胞中高表达方面具有共同特征。但本发明的Meg-1因与磷酸酶同源而可能是一种具有核定位信号的核蛋白，而MEGSIN是与SERPIN超家族(一种蛋白酶抑制剂)同源的蛋白质。此外，本发明的Meg-1可在各种组织中表达，这与MEGSIN的特征不同，其特异性表达于肾小球膜细胞中。因此，本发明的Meg-1可能是支持肾小球膜细胞的功能的一种重要蛋白质。阐述了这种重要蛋白质的本发明因此具有重要意义。

序列表<110>宫田敏男(MIYATA，TOSHIO)

黑川清(KUROKAWA，KIYOSHI)<120>Meg-1蛋白<130>KRK-102PCT<140><141><150>JP 1999-233301<151>1999-08-19<160>13<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3901<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(23)..(2872)<400>1gggaggaggg ggcgaccaca ag atg gcg gac ctc tcg ctg ctt cag gag gac 52

Met Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gln Glu Asp

1 5 10ctg cag gag gac gca gac gga ttt ggt gtg gat gac tac agc tca gag 100Leu Gln Glu Asp Ala Asp Gly Phe Gly Val Asp Asp Tyr Ser Ser Glu

15 20 25tct gat gtg att att ata cct tca gcc ctg gac ttt gtc tca caa gat 148Ser Asp Val Ile Ile Ile Pro Ser Ala Leu Asp Phe Val Ser Gln Asp

30 35 40gaa atg ttg acg ccc ctg ggg aga ttg gac aag tat gct gca agt gag 196Glu Met Leu Thr Pro Leu Gly Arg Leu Asp Lys Tyr Ala Ala Ser Glu

45 50 55aac ata ttt aac aga caa atg gtg gcc cgg agt ttg ctc gat acc ttg 244Asn Ile Phe Asn Arg Gln Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Asp Thr Leu

60 65 70agg gaa gtc tgc gat gat gaa aga gat tgt att gct gtt ttg gaa aga 292Arg Glu Val Cys Asp Asp Glu Arg Asp Cys Ile Ala Val Leu Glu Arg75 80 85 90att agc aga ttg gcc gat gat tca gaa cca act gtg aga gcg gag ctg 340Ile Ser Arg Leu Ala Asp Asp Ser Glu Pro Thr Val Arg Ala Glu Leu

95 100 105atg gaa cag gtg cct cac atc gca ctg ttt tgt caa gaa aac cgg cct 388Met Glu Gln Val Pro His Ile Ala Leu Phe Cys Gln Glu Asn Arg Pro

110 115 120tca ata cca tat gct ttt tca aaa ttc tta cta cct att gtg gtt aga 436Ser Ile Pro Tyr Ala Phe Ser Lys Phe Leu Leu Pro Ile Val Val Arg

125 130 135tac ctt gca gat cag aat aat cag gtg agg aaa aca agt cag gca gct 484Tyr Leu Ala Asp Gln Asn Asn Gln Val Arg Lys Thr Ser Gln Ala Ala

140 145 150ttg ctg gct ctg ttg gag cag gag ctc att gaa cga ttt gat gtg gag 532Leu Leu Ala Leu Leu Glu Gln Glu Leu Ile Glu Arg Phe Asp Val Glu155 160 165 170acc aaa gtg tgg cct gtc ctc ata gag ctg aca gcc cca gat agc aat 580Thr Lys Val Trp Pro Val Leu Ile Glu Leu Thr Ala Pro Asp Ser Asn

175 180 185gat gat gtg aaa aca gaa gct gtg gct ata atg tgc aaa atg gct ccc 628Asp Asp Val Lys Thr Glu Ala Val Ala Ile Met Cys Lys Met Ala Pro

190 195 200atg gtt ggg aag gat att aca gag cgt ctt atc ctc cct agg ttt tgt 676Met Val Gly Lys Asp Ile Thr Glu Arg Leu Ile Leu Pro Arg Phe Cys

205 210 215gag atg tgc tgc gat tgc aga atg ttt cac gtt cga aag gtc tgt gct 724Glu Met Cys Cys Asp Cys Arg Met Phe His Val Arg Lys Val Cys Ala

220 225 230gcc aat ttt gga gat att tgc agt gta gtt ggc cag caa gct act gaa 772Ala Asn Phe Gly Asp Ile Cys Ser Val Val Gly Gln Gln Ala Thr Glu235 240 245 250gaa atg ttg ctg ccc aga ttt ttc cag ctt tgt tct gat aat gta tgg 820Glu Met Leu Leu Pro Arg Phe Phe Gln Leu Cys Ser Asp Asn Val Trp

255 260 265gga gtc cga aag gct tgt gct gaa tgc ttc atg gcg gtt tca tgt gca 868Gly Val Arg Lys Ala Cys Ala Glu Cys Phe Met Ala Val Ser Cys Ala

270 275 280aca tgt caa gaa atc cga cgg acc aaa tta tca gca ctt ttt att aat 916Thr Cys Gln Glu Ile Arg Arg Thr Lys Leu Ser Ala Leu Phe Ile Asn

285 290 295ttg atc agt gat cct tca cgt tgg gtt cgc caa gca gct ttt cag tct 964Leu Ile Ser Asp Pro Ser Arg Trp Val Arg Gln Ala Ala Phe Gln Ser

300 305 310ctg gga cct ttc ata tct act ttt gct aat cca tct agc tca ggc cag 1012Leu Gly Pro Phe Ile Ser Thr Phe Ala Asn Pro Ser Ser Ser Gly Gln315 320 325 330tat ttt aaa gaa gaa agc aaa agt tca gaa gag atg tca gta gaa aac 1060Tyr Phe Lys Glu Glu Ser Lys Ser Ser Glu Glu Met Ser Val Glu Asn

335 340 345aaa aat agg acc aga gat caa gaa gcc cca gag gat gta caa gtc agg 1108Lys Asn Arg Thr Arg Asp Gln Glu Ala Pro Glu Asp Val Gln Val Arg

350 355 360cca gag gat act cct tca gat ctc agt gtt agt aat tcc agt gtc ata 1156Pro Glu Asp Thr Pro Ser Asp Leu Ser Val Ser Asn Ser Ser Val Ile

365 370 375ctg gaa aac acg atg gaa gac cat gct gct gag gca tcc ggg aag cct 1204Leu Glu Asn Thr Met Glu Asp His Ala Ala Glu Ala Ser Gly Lys Pro

380 385 390cta ggt gaa att agt gtt cca ctg gac agc tct tta ctt tgt act ttg 1252Leu Gly Glu Ile Ser Val Pro Leu Asp Ser Ser Leu Leu Cys Thr Leu395 400 405 410tcc tca gaa tct cac cag gaa gca gct agt aat gag aat gat aaa aaa 1300Ser Ser Glu Ser His Gln Glu Ala Ala Ser Asn Glu Asn Asp Lys Lys

415 420 425cct ggt aac tac aaa tct atg tta cga cca gag gtt ggc acc act tca 1348Pro GIy Asn Tyr Lys Ser Met Leu Arg Pro Glu Val Gly Thr Thr Ser

430 435 440caa gat tca gct ctc tta gat cag gaa ttg tat aac tcc ttc cat ttc 1396Gln Asp Ser Ala Leu Leu Asp Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Phe His Phe

445 450 455tgg agg act cct ctt cct gaa ata gat cta gac ata gag ctt gaa cag 1444Trp Arg Thr Pro Leu Pro Glu Ile Asp Leu Asp Ile Glu Leu Glu Gln

460 465 470aac tct ggg gga aaa ccc agc cca gag gga cca gag gaa gaa tct gag 1492Asn Ser Gly Gly Lys Pro Ser Pro Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser Glu475 480 485 490ggc cct gtg ccc agt tct cca aac atc acc atg gcc acc aga aag gaa 1540Gly Pro Val Pro Ser Ser Pro Asn Ile Thr Met Ala Thr Arg Lys Glu

495 500 505ctg gaa gaa atg ata gaa aat cta gag ccc cac att gat gat cca gat 1588Leu Glu Glu Met Ile Glu Asn Leu Glu Pro His Ile Asp Asp Pro Asp

510 515 520gtt aaa gca caa gtg gaa gtg ctg tcc gct gca cta cgt gct tcc agc 1636Val Lys Ala Gln Val Glu Val Leu Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Ser

525 530 535ctg gat gca cat gaa gag acc atc agt ata gaa aag aga agt gat ttg 1684Leu Asp Ala His Glu Glu Thr Ile Ser Ile Glu Lys Arg Ser Asp Leu

540 545 550caa gat gaa ctg gat ata aat gag cta cca aat tgt aaa ata aat caa 1732Gln Asp Glu Leu Asp Ile Asn Glu Leu Pro Asn Cys Lys Ile Asn Gln555 560 565 570gaa gat tct gtg cct tta atc agc gat gct gtt gag aat atg gac tcc 1780Glu Asp Ser Val Pro Leu Ile Ser Asp Ala Val Glu Asn Met Asp Ser

575 580 585act ctt cac tat att cac aac gat tca gac ttg agc aac aat agc agt 1828Thr Leu His Tyr Ile His Asn Asp Ser Asp Leu Ser Asn Asn Ser Ser

590 595 600ttt agc cct gat gag gaa agg aga act aaa gta caa gat gtt gta cct 1876Phe Ser Pro Asp Glu Glu Arg Arg Thr Lys Val Gln Asp Val Val Pro

605 610 615cag gcg ttg tta gat cag tat tta tct atg act gac cct tct cgt gca 1924Gln Ala Leu Leu Asp Gln Tyr Leu Ser Met Thr Asp Pro Ser Arg Ala

620 625 630cag acg gtt gac act gaa att gct aag cac tgt gca tat agc ctc cct 1972Gln Thr Val Asp Thr Glu Ile Ala Lys His Cys Ala Tyr Ser Leu Pro635 640 645 650ggt gtg gcc ttg aca ctc gga aga cag aat tgg cac tgc ctg aga gag 2020Gly Val Ala Leu Thr Leu Gly Arg Gln Asn Trp His Cys Leu Arg Glu

655 660 665acg tat gag act ctg gcc tca gac atg cag tgg aaa gtt cga cga act 2068Thr Tyr Glu Thr Leu Ala Ser Asp Met Gln Trp Lys Val Arg Arg Thr

670 675 680cta gca ttc tcc atc cac gag ctt gca gtt att ctt gga gat caa ttg 2116Leu Ala Phe Ser Ile His Glu Leu Ala Val Ile Leu Gly Asp Gln Leu

685 690 695aca gct gca gat ctg gtt cca att ttt aat gga ttt tta aaa gac ctc 2164Thr Ala Ala Asp Leu Val Pro Ile Phe Asn Gly Phe Leu Lys Asp Leu

700 705 710gat gaa gtc agg ata ggt gtt ctt aaa cac ttg cat gat ttt ctg aag 2212Asp Glu Val Arg Ile Gly Val Leu Lys His Leu His Asp Phe Leu Lys715 720 725 730ctt ctt cat att gac aaa aga aga gaa tat ctt tat caa ctt cag gag 2260Leu Leu His Ile Asp Lys Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Gln Leu Gln Glu

735 740 745ttt ttg gtg aca gat aat agt aga aat tgg cgg ttt cga gct gaa ctg 2308Phe Leu Val Thr Asp Asn Ser Arg Asn Trp Arg Phe Arg Ala Glu Leu

750 755 760gct gaa cag ctg att tta ctt cta gag tta tat agt ccc aga gat gtt 2356Ala Glu Gln Leu Ile Leu Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Arg Asp Val

765 770 775tat gac tat tta cgt ccc att gct ctg aat ctg tgt gca gac aaa gtt 2404Tyr Asp Tyr Leu Arg Pro Ile Ala Leu Asn Leu Cys Ala Asp Lys Val

780 785 790tct tct gtt cgt tgg att tcc tac aag ttg gtc agc gag atg gtg aag 2452Ser Ser Val Arg Trp Ile Ser Tyr Lys Leu Val Ser Glu Met Val Lys795 800 805 810aag ctg cac gcg gca aca cca cca acg ttc gga gtg gac ctc atc aat 2500Lys Leu His Ala Ala Thr Pro Pro Thr Phe Gly Val Asp Leu Ile Asn

815 820 825gag ctt gtg gag aac ttt ggc aga tgt ccc aag tgg tct ggt cgg caa 2548Glu Leu Val Glu Asn Phe Gly Arg Cys Pro Lys Trp Ser Gly Arg Gln

830 835 840gcc ttt gtc ttt gtc tgc cag act gtc att gag gat gac tgc ctt ccc 2596Ala Phe Val Phe Val Cys Gln Thr Val Ile Gln Asp Asp Cys Leu Pro

845 850 855atg gac cag ttt gct gtg cat ctc atg ccg cat ctg cta acc tta gca 2644Met Asp Gln Phe Ala Val His Leu Met Pro His Leu Leu Thr Leu Ala

860 865 870aat gac agg gtt cct aac gtg cga gtg ctg ctt gca aag aca tta aga 2692Asn Asp Arg Val Pro Asn Val Arg Val Leu Leu Ala Lys Thr Leu Arg875 880 885 890caa act cta cta gaa aaa gac tat ttc ttg gcc tct gcc agc tgc cac 2740Gln Thr Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Phe Leu Ala Ser Ala Ser Cys His

895 900 905cag gag gct gtg gag cag acc atc atg gct ctt cag atg gac cgt gac 2788Gln Glu Ala Val Glu Gln Thr Ile Met Ala Leu Gln Met Asp Arg Asp

910 915 920agc gat gtc aag tat ttt gca agc atc cac cct gcc agt acc aaa atc 2836Ser Asp Val Lys Tyr Phe Ala Ser Ile His Pro Ala Ser Thr Lys Ile

925 930 935tcc gaa gat gcc atg agc aca gcg tcc tca acc tac tagaaggctt 2882Ser Glu Asp Ala Met Ser Thr Ala Ser Ser Thr Tyr

940 945 950gaatctcggt gtctttcctg cttccatgag agccgaggtt cagtgggcat tcgccacgca 2942tgtgacctgg gatagctttc gggggaggag agaccttcct ctcctgcgga cttcattgca 3002ggtgcaagtt gcctacaccc aataccaggg atttcaagag tcaagagaaa gtacagtaaa 3062cactattatc ttatcttgac tttaagggga aataatttct cagaggatta taattgtcac 3122cgaagcctta aatccttctc ttcctgactg aatgaaactt gaattggcag agcattttcc 3182ttatggaagg gatgagattc ccagagacct gcattgcttt ctcctggttt tatttaacaa 3242tcgacaaatg aaattcttac agcctgaagg cagacgtgtg cccagatgtg aaagagacct 3302tcagtatcag ccctaactct tctctcccag gaaggacttg ctgggctctg tggccagctg 3362tccagcccag ccctgtgtgt gaatcgtttg tgacgtgtgc aaatgggaaa ggaggggttt 3422ttacatctcc taaaggacct gatgccaaca caagtaggat tgacttaaac tcttaagcgc 3482agcatattgc tgtacacatt tacagaatgg ttgctgagtg tctgtgtctg attttttcat 3542gctggtcatg acctgaagga aatttattag acgtataatg tatgtctggt gtttttaact 3602tgatcatgat cagctctgag gtgcaacttc ttcacatact gtacatacct gtgaccactc 3662ttgggagtgc tgcagtcttt aatcatgctg tttaaactgt tgtggcacaa gttctcttgt 3722ccaaataaaa tttattaata agatctatag agagagatat atacactttt gattgttttc 3782tagatgtcta ccaataaatg caatttgtga cctgtattaa tgatttaaag tggggaaact 3842agattaaaat atttgtcttt taaaaaaata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3901<210>2<211>950<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gln Glu Asp Leu Gln Glu Asp Ala Asp1 5 10 15Gly Phe Gly Val Asp Asp Tyr Ser Ser Glu Ser Asp Val Ile Ile Ile

20 25 30Pro Ser Ala Leu Asp Phe Val Ser Gln Asp Glu Met Leu Thr Pro Leu

35 40 45Gly Arg Leu Asp Lys Tyr Ala Ala Ser Glu Asn Ile Phe Asn Arg Gln

50 55 60Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Asp Thr Leu Arg Glu Val Cys Asp Asp65 70 75 80Glu Arg Asp Cys Ile Ala Val Leu Glu Arg Ile Ser Arg Leu Ala Asp

85 90 95Asp Ser Glu Pro Thr Val Arg Ala Glu Leu Met Glu Gln Val Pro His

100 105 110Ile Ala Leu Phe Cys Gln Glu Asn Arg Pro Ser Ile Pro Tyr Ala Phe

115 120 125Ser Lys Phe Leu Leu Pro Ile Val Val Arg Tyr Leu Ala Asp Gln Asn

130 135 140Asn Gln Val Arg Lys Thr Ser Gln Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Glu145 150 155 160Gln Glu Leu Ile Glu Arg Phe Asp Val Glu Thr Lys Val Trp Pro Val

165 170 175Leu Ile Glu Leu Thr Ala Pro Asp Ser Asn Asp Asp Val Lys Thr Glu

180 185 190Ala Val Ala Ile Met Cys Lys Met Ala Pro Met Val Gly Lys Asp Ile

195 200 205Thr Glu Arg Leu lle Leu Pro Arg Phe Cys Glu Met Cys Cys Asp Cys

210 215 220Arg Met Phe His Val Arg Lys Val Cys Ala Ala Asn Phe Gly Asp Ile225 230 235 240Cys Ser Val Val Gly Gln Gln Ala Thr Glu Glu Met Leu Leu Pro Arg

245 250 255Phe Phe Gln Leu Cys Ser Asp Asn Val Trp Gly Val Arg Lys Ala Cys

260 265 270Ala Glu Cys Phe Met Ala Val Ser Cys Ala Thr Cys Gln Glu Ile Arg

275 280 285Arg Thr Lys Leu Ser Ala Leu Phe Ile Asn Leu Ile Ser Asp Pro Ser

290 295 300Arg Trp Val Arg Gln Ala Ala Phe Gln Ser Leu Gly Pro Phe Ile Ser305 310 315 320Thr Phe Ala Asn Pro Ser Ser Ser Gly Gln Tyr Phe Lys Glu Glu Ser

325 330 335Lys Ser Ser Glu Glu Met Ser Val Glu Asn Lys Asn Arg Thr Arg Asp

340 345 350Gln Glu Ala Pro Glu Asp Val Gln Val Arg Pro Glu Asp Thr Pro Ser

355 360 365Asp Leu Ser Val Ser Asn Ser Ser Val Ile Leu Glu Asn Thr Met Glu

370 375 380Asp His Ala Ala Glu Ala Ser Gly Lys Pro Leu Gly Glu Ile Ser Val385 390 395 400Pro Leu Asp Ser Ser Leu Leu Cys Thr Leu Ser Ser Glu Ser His Gln

405 410 415Glu Ala Ala Ser Asn Glu Asn Asp Lys Lys Pro Gly Asn Tyr Lys Ser

420 425 430Met Leu Arg Pro Glu Val Gly Thr Thr Ser Gln Asp Ser Ala Leu Leu

435 440 445Asp Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Phe His Phe Trp Arg Thr Pro Leu Pro

450 455 460Glu Ile Asp Leu Asp Ile Glu Leu Glu Gln Asn Ser Gly Gly Lys Pro465 470 475 480Ser Pro Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser Glu Gly Pro Val Pro Ser Ser

485 490 495Pro Asn Ile Thr Met Ala Thr Arg Lys Glu Leu Glu Glu Met Ile Glu

500 505 510Asn Leu Glu Pro His Ile Asp Asp Pro Asp Val Lys Ala Gln Val Glu

515 520 525Val Leu Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Ser Leu Asp Ala His Glu Glu

530 535 540Thr Ile Ser Ile Glu Lys Arg Ser Asp Leu Gln Asp Glu Leu Asp Ile545 550 555 560Asn Glu Leu Pro Asn Cys Lys Ile Asn Gln Glu Asp Ser Val Pro Leu

565 570 575Ile Ser Asp Ala Val Glu Asn Met Asp Ser Thr Leu His Tyr Ile His

580 585 590Asn Asp Ser Asp Leu Ser Asn Asn Ser Ser Phe Ser Pro Asp Glu Glu

595 600 605Arg Arg Thr Lys Val Gln Asp Val Val Pro Gln Ala Leu Leu Asp Gln

610 615 620Tyr Leu Ser Met Thr Asp Pro Ser Arg Ala Gln Thr Val Asp Thr Glu625 630 635 640Ile Ala Lys His Cys Ala Tyr Ser Leu Pro Gly Val Ala Leu Thr Leu

645 650 655Gly Arg Gln Asn Trp His Cys Leu Arg Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Ala

660 665 670Ser Asp Met Gln Trp Lys Val Arg Arg Thr Leu Ala Phe Ser Ile His

675 680 685Glu Leu Ala Val Ile Leu Gly Asp Gln Leu Thr Ala Ala Asp Leu Val

690 695 700Pro Ile Phe Asn Gly Phe Leu Lys Asp Leu Asp Glu Val Arg Ile Gly705 710 715 720Val Leu Lys His Leu His Asp Phe Leu Lys Leu Leu His Ile Asp Lys

725 730 735Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Gln Leu Gln Glu Phe Leu Val Thr Asp Asn

740 745 750Ser Arg Asn Trp Arg Phe Arg Ala Glu Leu Ala Glu Gln Leu Ile Leu

755 760 765Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Arg Asp Val Tyr Asp Tyr Leu Arg Pro

770 775 780Ile Ala Leu Asn Leu Cys Ala Asp Lys Val Ser Ser Val Arg Trp Ile785 790 795 800Ser Tyr Lys Leu Val Ser Glu Met Val Lys Lys Leu His Ala Ala Thr

805 810 815Pro Pro Thr Phe Gly Val Asp Leu Ile Asn Glu Leu Val Glu Asn Phe

820 825 830Gly Arg Cys Pro Lys Trp Ser Gly Arg Gln Ala Phe Val Phe Val Cys

835 840 845Gln Thr Val Ile Glu Asp Asp Cys Leu Pro Met Asp Gln Phe Ala Val

850 855 860His Leu Met Pro His Leu Leu Thr Leu Ala Asn Asp Arg Val Pro Asn865 870 875 880Val Arg Val Leu Leu Ala Lys Thr Leu Arg Gln Thr Leu Leu Glu Lys

885 890 895Asp Tyr Phe Leu Ala Ser Ala Ser Cys His Gln Glu Ala Val Glu Gln

900 905 910Thr Ile Met Ala Leu Gln Met Asp Arg Asp Ser Asp Val Lys Tyr Phe

915 920 925Ala Ser Ile His Pro Ala Ser Thr Lys Ile Ser Glu Asp Ala Met Ser

930 935 940Thr Ala Ser Ser Thr Tyr945 950<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>3tgtaaaacga cggccagt 18<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>4accatgatta cgccaagctt g 21<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<220><223>5’-磷酸化<400>5tcagagaggt cattc 15<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>6tcattgatgg gtcctcaa 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>7agattcttga gctcagat 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>8aatggtggca taaacatg 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>9acagacaaat tgaacttc 18<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>10ctcatggaag caggaaagac accgagattc aagc 34<210>11<211>3568<212>DNA<213>RATTUS NORVEGICUS<220><221>CDS<222>(7)..(2862)<400>11cacaag atg gcg gac ctc tcg ctg ctc cag gag gac ctg ccg gag gac 48

Met Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gln Glu Asp Leu Pro Glu Asp

1 5 10gcg gac gga ctt ggt gtg gat gac tac agc tca gag tct gat gtg att 96Ala Asp Gly Leu Gly Val Asp Asp Tyr Ser Ser Glu Ser Asp Val Ile15 20 25 30att ata cct tca gcc ctg gac ttc gtc tca caa gat gaa atg ttg aca 144Ile Ile Pro Ser Ala Leu Asp Phe Val Ser Gln Asp Glu Met Leu Thr

35 40 45ccc ttg ggg agg ctg gac aag tat gct gca agt gag aac gtc ttt aac 192Pro Leu Gly Arg Leu Asp Lys Tyr Ala Ala Ser Glu Asn Val Phe Asn

50 55 60aga caa atg gtg gcc cgg agt ttg ctg gat act ctg agg gaa gtc tgt 240Arg Gln Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Asp Thr Leu Arg Glu Val Cys

65 70 75ggt gag gag aga gac tgc att gct gtc ttg gaa agg atc agc cga ttg 288Gly Glu Glu Arg Asp Cys Ile Ala Val Leu Glu Arg Ile Ser Arg Leu

80 85 90gct gat gac tca gaa cca acc gtg aga gcc gag ctg atg gaa cag gtg 336Ala Asp Asp Ser Glu Pro Thr Val Arg Ala Glu Leu Met Glu Gln Val95 100 105 110ccg cac atc gca ctg ttt tgt caa gag aac cga cct tcc ata cca tat 384Pro His Ile Ala Leu Phe Cys Gln Glu Asn Arg Pro Ser Ile Pro Tyr

115 120 125gcc ttt tcc aag tac tta ctg cca atc gtg gtt aga tac ctt gca gac 432Ala Phe Ser Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Val Val Arg Tyr Leu Ala Asp

130 135 140cag aat aac cag gtg agg aaa acc agc cag gca gct ttg ctg gct ctg 480Gln Asn Asn Gln Val Arg Lys Thr Ser Gln Ala Ala Leu Leu Ala Leu

145 150 155ctg gag cag gag ctg att gag cga ctc gat gtg gag acc aag gtg tgc 528Leu Glu Gln Glu Leu Ile Glu Arg Leu Asp Val Glu Thr Lys Val Cys

160 165 170ccc gtc ctc ata gac ttg act gcc cca gac agc aat gac gat gtg aag 576Pro Val Leu Ile Asp Leu Thr Ala Pro Asp Ser Asn Asp Asp Val Lys175 180 185 190aca gag gcc gtg gct ata atg tgc aag atg gcc ccc atg gtt ggg aaa 624Thr Glu Ala Val Ala Ile Met Cys Lys Met Ala Pro Met Val Gly Lys

195 200 205gat att aca gag cgt ctc atc ctc cct agg ttt tgt gag atg tgc tgt 672Asp Ile Thr Glu Arg Leu Ile Leu Pro Arg Phe Cys Glu Met Cys Cys

210 215 220gac tgt aga atg ttt cac gtc cga aag gtc tgt gct gcc aat ttt gga 720Asp Cys Arg Met Phe His Val Arg Lys Val Cys Ala Ala Asn Phe Gly

225 230 235gac att tgc agc gta gtt ggc cag caa gct aca gaa gaa atg ctg ctg 768Asp Ile Cys Ser Val Val Gly Gln Gln Ala Thr Glu Glu Met Leu Leu

240 245 250ccc agg ttc ttc cag ctg tgt tct gac aat gtg tgg ggc gtc cgg aag 816Pro Arg Phe Phe Gln Leu Cys Ser Asp Asn Val Trp Gly Val Arg Lys255 260 265 270gcc tgt gct gag tgc ttc atg gcc gtc tcc tgc gcg aca tgc caa gaa 864Ala Cys Ala Glu Cys Phe Met Ala Val Ser Cys Ala Thr Cys Gln Glu

275 280 285atc cga cgg aca aag ttg tca gca ctg ttt att aac ttg atc agt gat 912Ile Arg Arg Thr Lys Leu Ser Ala Leu Phe Ile Asn Leu Ile Ser Asp

290 295 300cct tca cgt tgg gtt cgc caa gca gcc ttt cag tcc ctg ggg cct ttc 960Pro Ser Arg Trp Val Arg Gln Ala Ala Phe Gln Ser Leu Gly Pro Phe

305 310 315ata tcc aca ttt gct aat cca tca agc tcg ggc cag tgc ttc aaa gat 1008Ile Ser Thr Phe Ala Asn Pro Ser Ser Ser Gly Gln Cys Phe Lys Asp

320 325 330gag agc aaa agc tca gaa gac aaa gac agg atc aga gac gat ggt gtt 1056Glu Ser Lys Ser Ser Glu Asp Lys Asp Arg Ile Arg Asp Asp Gly Val335 340 345 350gta caa gaa gag cag agc agg cca gag gac gca cct tca gac ctc agt 1104Val Gln Glu Glu Gln Ser Arg Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser

355 360 365gcc cct cac tcc agt gcc agg ctg gac ggc aca ctt gaa ggc tgt gct 1152Ala Pro His Ser Ser Ala Arg Leu Asp Gly Thr Leu Glu Gly Cys Ala

370 375 380gcc gag acg cct ggg gac tct gca ggt gac atg cgt gtt cca gcg gac 1200Ala Glu Thr Pro Gly Asp Ser Ala Gly Asp Met Arg Val Pro Ala Asp

385 390 395agc tcc tta ctc tgt act ttg tcc tca gag tct cct cag gaa gca gct 1248Ser Ser Leu Leu Cys Thr Leu Ser Ser Glu Ser Pro Gln Glu Ala Ala

400 405 410agt gac gct gag agt ggt aaa aag cac gat aac aac agc aag tct gcg 1296Ser Asp Ala Glu Ser Gly Lys Lys His Asp Asn Asn Ser Lys Ser Ala415 420 425 430tcc cgg cca gac gtt ggc acc agc tcc cca gag ccc act ccc tta gat 1344Ser Arg Pro Asp Val Gly Thr Ser Ser Pro Glu Pro Thr Pro Leu Asp

435 440 445cag gaa atg ttc aac tcc ttc cat ttc tgg agg act cct cta ccc cag 1392Gln Glu Met Phe Asn Ser Phe His Phe Trp Arg Thr Pro Leu Pro Gln

450 455 460ata gat ctt gat aaa gag ctc caa cag gac cct ggg gag agg ccc agc 1440Ile Asp Leu Asp Lys Glu Leu Gln Gln Asp Pro Gly Glu Arg Pro Ser

465 470 475cca gag aga aca gga gat gca cct gca gcc cct gta cca ggt tct ccc 1488Pro Glu Arg Thr Gly Asp Ala Pro Ala Ala Pro Val Pro Gly Ser Pro

480 485 490agt atc acc atg gct acc cgg aag gaa cta gaa gaa atg ata gaa aac 1536Ser Ile Thr Met Ala Thr Arg Lys Glu Leu Glu Glu Met Ile Glu Asn495 500 505 510cta gag ccg cac atg gat gac ccg gat gtt aaa gcc cag gtg gaa gtg 1584Leu Glu Pro His Met Asp Asp Pro Asp Val Lys Ala Gln Val Glu Val

515 520 525ctg tcg gcc gcc ctg cgc gct tct acc ctg gat gct cac gac gag gct 1632Leu Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Thr Leu Asp Ala His Asp Glu Ala

530 535 540ggc ggt gca gag cag cgg agt gag ctg cag gac gac gca gtg ggt gcc 1680Gly Gly Ala Glu Gln Arg Ser Glu Leu Gln Asp Asp Ala Val Gly Ala

545 550 555ggc ggc gag ctt cca aac tgt agc atc agc gaa gac act tct gag cct 1728Gly Gly Glu Leu Pro Asn Cys Ser Ile Ser Glu Asp Thr Ser Glu Pro

560 565 570ctg gtc atc gct gct gag gag aat atg gag gcc act cct gac tat atc 1776Leu Val Ile Ala Ala Glu Glu Asn Met Glu Ala Thr Pro Asp Tyr Ile575 580 585 590cat gga ggt gcg gat gta ggc ccc ggt ggc ggt ggt ggc ttc agc ccg 1824His Gly Gly Ala Asp Val Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Phe Ser Pro

595 600 605gat gaa gag agg aga ccc aaa gtc cag gat gtc gta cca caa gcg tta 1872Asp Glu Glu Arg Arg Pro Lys Val Gln Asp Val Val Pro Gln Ala Leu

610 615 620cta gac cag tac ctg tca atg acc gac cct tct cga gca cag aca gtc 1920Leu Asp Gln Tyr Leu Ser Met Thr Asp Pro Ser Arg Ala Gln Thr Val

625 630 635gac acc gag atc gct aag cac tgt gca tac agt ctg ccg ggt gtg gct 1968Asp Thr Glu Ile Ala Lys His Cys Ala Tyr Ser Leu Pro Gly Val Ala

640 645 650ctg acc ctt ggc aga cag aac tgg cac tgc ttg aga gag act tac gag 2016Leu Thr Leu Gly Arg Gln Asn Trp His Cys Leu Arg Glu Thr Tyr Glu655 660 665 670acc cta gcg tca gac atg cag tgg aaa gtt cga aga act ctg gcc ttc 2064Thr Leu Ala Ser Asp Met Gln Trp Lys Val Arg Arg Thr Leu Ala Phe

675 680 685tcc atc cat gag ctc gcg gtg att ctc ggg gac cag ctg aca gca gca 2112Ser Ile His Glu Leu Ala Val Ile Leu Gly Asp Gln Leu Thr Ala Ala

690 695 700gac ctg gtt ccg att ttt aat ggg ttt tta aaa gat ctt gac gaa gtc 2160Asp Leu Val Pro Ile Phe Asn Gly Phe Leu Lys Asp Leu Asp Glu Val

705 710 715agg ata ggt gtt ctc aaa cac ttg cat gac ttt ctg aag ctt ctt cat 2208Arg Ile Gly Val Leu Lys His Leu His Asp Phe Leu Lys Leu Leu His

720 725 730att gat aaa aga aga gag tac ctt tat caa ctc cag gag ttt ttg gtg 2256Ile Asp Lys Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Gln Leu Gln Glu Phe Leu Val735 740 745 750aca gac aac agt aga aat tgg cgg ttt cga gct gaa ctg gca gaa cag 2304Thr Asp Asn Ser Arg Asn Trp Arg Phe Arg Ala Glu Leu Ala Glu Gln

755 760 765ctg att tta ctt cta gaa tta tat agt ccc aga gat gtt tat gat tac 2352Leu Ile Leu Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Arg Asp Val Tyr Asp Tyr

770 775 780tta cgt ccc att gct ctg aat ctg tgt gca gac aaa gtt tct tca gtc 2400Leu Arg Pro Ile Ala Leu Asn Leu Cys Ala Asp Lys Val Ser Ser Val

785 790 795cgt tgg att tcc tac aag ttg gtc agt gag atg gtg aag aag cta cac 2448Arg Trp Ile Ser Tyr Lys Leu Val Ser Glu Met Val Lys Lys Leu His

800 805 810atg gcg acg ccg cca acg ttc gga gtc gag ctc atc aat gag ctg gtg 2496Met Ala Thr Pro Pro Thr Phe Gly Val Glu Leu Ile Asn Glu Leu Val815 820 825 830gag aac ttc ggc agg tgt cca aag tgg tcg ggc cgg cag gcc ttc gtc 2544Glu Asn Phe Gly Arg Cys Pro Lys Trp Ser Gly Arg Gln Ala Phe Val

835 840 845ttc gtg tgc cag act gtc att gag gac gac tgc ctc ccc atg gac cag 2592Phe Val Cys Gln Thr Val Ile Glu Asp Asp Cys Leu Pro Met Asp Gln

850 855 860ttt gct gtg cac ctg atg cca cat ttg ctg acc ttg gca aat gac agg 2640Phe Ala Val His Leu Met Pro His Leu Leu Thr Leu Ala Asn Asp Arg

865 870 875gtt ccc aac gtt aga gtg ctg ctt gca aaa acc ctt cga cag act cta 2688Val Pro Asn Val Arg Val Leu Leu Ala Lys Thr Leu Arg Gln Thr Leu

880 885 890cta gag aaa gaa tac ttc tta gcc tct gcc agc tgt cat cag gag gcc 2736Leu Glu Lys Glu Tyr Phe Leu Ala Ser Ala Ser Cys His Gln Glu Ala895 900 905 910gtg gag cag aca atc atg gcc ctt cag atg gat cga gac agt gac gtc 2784Val Glu Gln Thr Ile Met Ala Leu Gln Met Asp Arg Asp Ser Asp Val

915 920 925aag tac ttt gca agc atc cac ccg tcc agt acc aaa ctc tct gaa gac 2832Lys Tyr Phe Ala Ser Ile His Pro Ser Ser Thr Lys Leu Ser Glu Asp

930 935 940gca atg agt aca gct tcc tcc acc tac tga cccctgaccc acggtgtcct 2882Ala Met Ser Thr Ala Ser Ser Thr Tyr

945 950tcctgcatcc gcgagagcct ggcctcagcc gcctgcgcca ctcgggacag ctgtggtggt 2942ggggcctccc tcctgccagc tcattcgcag gtgcaagttg cctactccca taccagtggt 3002tttaagagtc aagagaaagt acagtaaaca ctattatctt atcttgactt agggaaagta 3062aactctcaga ggattataat tgtcaccaaa gccttaactc attacttcct cttcctgact 3122gaatgacttg aattggcaga gcattttccc ttcgggaagg aggargttcc cagagacctg 3182cgctgctttc tcctggtttt atttaacgnt ggtaaatggc attcttaccg ccggaaggtg 3242gacacgcacc ggacagggag gcctgggtat tagcccaagc acttgtccca ggtgcgagtc 3302tgctcggctc ntgggctgcc ctgcccagcc ctaagtgtga atagttcttg gcgtgtataa 3362atgacaggag tttttcctct cctaagggct tgatgttaac actaagtaga atntgatttt 3422gactcctaat gcagcacatt gctgtacaca tttacagaat gtttgcagac tctctcccga 3482ctcttttcat gctggtcatg acgtgaaggg gacttctcag cagatattgt gtcaggtgtt 3542cttaacttga tcatggtcag ctctgaggtg cgactttcct tcccatgctg cacacccctg 3602tggccacgct ggggcatgca gccttaatca tgctgttaga actgttgtgg cacaag 3658<210>12<211>951<212>DNA<213>RATTUS NORVEGICUS<400>12Met Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gln Glu Asp Leu Pro Glu Asp Ala Asp1 5 10 15Gly Leu Gly Val Asp Asp Tyr Ser Ser Glu Ser Asp Val Ile Ile Ile

20 25 30Pro Ser Ala Leu Asp Phe Val Ser Gln Asp Glu Met Leu Thr Pro Leu

35 40 45Gly Arg Leu Asp Lys Tyr Ala Ala Ser Glu Asn Val Phe Asn Arg Gln

50 55 60Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Asp Thr Leu Arg Glu Val Cys Gly Glu65 70 75 80Glu Arg Asp Cys Ile Ala Val Leu Glu Arg Ile Ser Arg Leu Ala Asp

85 90 95Asp Ser Glu Pro Thr Val Arg Ala Glu Leu Met Glu Gln Val Pro His

100 105 110Ile Ala Leu Phe Cys Gln Glu Asn Arg Pro Ser Ile Pro Tyr Ala Phe

115 120 125Ser Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Val Val Arg Tyr Leu Ala Asp Gln Asn

130 135 140Asn Gln Val Arg Lys Thr Ser Gln Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Glu145 150 155 160Gln Glu Leu Ile Glu Arg Leu Asp Val Glu Thr Lys Val Cys Pro Val

165 170 175Leu Ile Asp Leu Thr Ala Pro Asp Ser Asn Asp Asp Val Lys Thr Glu

180 185 190Ala Val Ala Ile Met Cys Lys Met Ala Pro Met Val Gly Lys Asp Ile

195 200 205Thr Glu Arg Leu Ile Leu Pro Arg Phe Cys Glu Met Cys Cys Asp Cys

245 250 255Phe Phe Gln Leu Cys Ser Asp Asn Val Trp Gly Val Arg Lys Ala Cys

260 265 270Ala Glu Cys Phe Met Ala Val Ser Cys Ala Thr Cys Gln Glu Ile Arg

275 280 285Arg Thr Lys Leu Ser Ala Leu Phe Ile Asn Leu Ile Ser Asp Pro Ser

290 295 300Arg Trp Val Arg Gln Ala Ala Phe Gln Ser Leu Gly Pro Phe Ile Ser305 310 315 320Thr Phe Ala Asn Pro Ser Ser Ser Gly Gln Cys Phe Lys Asp Glu Ser

325 330 335Lys Ser Ser Glu Asp Lys Asp Arg Ile Arg Asp Asp Gly Val Val Gln

340 345 350Glu Glu Gln Ser Arg Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ser Ala Pro

355 360 365His Ser Ser Ala Arg Leu Asp Gly Thr Leu Glu Gly Cys Ala Ala Glu

370 375 380Thr Pro Gly Asp Ser Ala Gly Asp Met Arg Val Pro Ala Asp Ser Ser385 390 395 400Leu Leu Cys Thr Leu Ser Ser Glu Ser Pro Gln Glu Ala Ala Ser Asp

405 410 415Ala Glu Ser Gly Lys Lys His Asp Asn Asn Ser Lys Ser Ala Ser Arg

420 425 430Pro Asp Val Gly Thr Ser Ser Pro Glu Pro Thr Pro Leu Asp Gln Glu

435 440 445Met Phe Asn Ser Phe His Phe Trp Arg Thr Pro Leu Pro Gln Ile Asp

450 455 460Leu Asp Lys Glu Leu Gln Gln Asp Pro Gly Glu Arg Pro Ser Pro Glu465 470 475 480Arg Thr Gly Asp Ala Pro Ala Ala Pro Val Pro Gly Ser Pro Ser Ile

485 490 495Thr Met Ala Thr Arg Lys Glu Leu Glu Glu Met Ile Glu Asn Leu Glu

500 505 510Pro His Met Asp Asp Pro Asp Val Lys Ala Gln Val Glu Val Leu Ser

515 520 525Ala Ala Leu Arg Ala Ser Thr Leu Asp Ala His Asp Glu Ala Gly Gly

530 535 540Ala Glu Gln Arg Ser Glu Leu Gln Asp Asp Ala Val Gly Ala Gly Gly545 550 555 560Glu Leu Pro Asn Cys Ser Ile Ser Glu Asp Thr Ser Glu Pro Leu Val

565 570 575Ile Ala Ala Glu Glu Asn Met Glu Ala Thr Pro Asp Tyr Ile His Gly

580 585 590Gly Ala Asp Val Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly Phe Ser Pro Asp Glu

595 600 605Glu Arg Arg Pro Lys Val Gln Asp Val Val Pro Gln Ala Leu Leu Asp

610 615 620Gln Tyr Leu Ser Met Thr Asp Pro Ser Arg Ala Gln Thr Val Asp Thr625 630 635 640Glu Ile Ala Lys His Cys Ala Tyr Ser Leu Pro Gly Val Ala Leu Thr

645 650 655Leu Gly Arg Gln Asn Trp His Cys Leu Arg Glu Thr Tyr Glu Thr Leu

660 665 670Ala Ser Asp Met Gln Trp Lys Val Arg Arg Thr Leu Ala Phe Ser Ile

675 680 685His Glu Leu Ala Val Ile Leu Gly Asp Gln Leu Thr Ala Ala Asp Leu

690 695 700Val Pro Ile Phe Asn Gly Phe Leu Lys Asp Leu Asp Glu Val Arg Ile705 710 715 720Gly Val Leu Lys His Leu His Asp Phe Leu Lys Leu Leu His Ile Asp

725 730 735Lys Arg Arg Glu Tyr Leu Tyr Gln Leu Gln Glu Phe Leu Val Thr Asp

740 745 750Asn Ser Arg Asn Trp Arg Phe Arg Ala Glu Leu Ala Glu Gln Leu Ile

755 760 765Leu Leu Leu Glu Leu Tyr Ser Pro Arg Asp Val Tyr Asp Tyr Leu Arg

770 775 780Pro Ile Ala Leu Asn Leu Cys Ala Asp Lys Val Ser Ser Val Arg Trp785 790 795 800Ile Ser Tyr Lys Leu Val Ser Glu Met Val Lys Lys Leu His Met Ala

805 810 815Thr Pro Pro Thr Phe Gly Val Glu Leu Ile Asn Glu Leu Val Glu Asn

820 825 830Phe Gly Arg Cys Pro Lys Trp Ser Gly Arg Gln Ala Phe Val Phe Val

835 840 845Cys Gln Thr Val Ile Glu Asp Asp Cys Leu Pro Met Asp Gln Phe Ala

850 855 860Val His Leu Met Pro His Leu Leu Thr Leu Ala Asn Asp Arg Val Pro865 870 875 880Asn Val Arg Val Leu Leu Ala Lys Thr Leu Arg Gln Thr Leu Leu Glu

885 890 895Lys Glu Tyr Phe Leu Ala Ser Ala Ser Cys His Gln Glu Ala Val Glu

900 905 910Gln Thr Ile Met Ala Leu Gln Met Asp Arg Asp Ser Asp Val Lys Tyr

915 920 925Phe Ala Ser Ile His Pro Ser Ser Thr Lys Leu Ser Glu Asp Ala Met

930 935 940Ser Thr Ala Ser Ser Thr Tyr945 950<210>13<211>1132<212>DNA<213> RATTUS NORVEGICUS<400> 13gtctcctgcg cgacatgcca agaaatccga cggacaaagt tgtcagcact gtttattaac 60ttgatcagtg atccttcacg ttgggttcgc caagcagcct ttcagtccct ggggcctttc 120atatccacat ttgctaatcc atcaagctcg ggccagtgct tcaaagatga gagcaaaagc 180tcagaagaca aagacaggat cagagacgat ggtgttgtac aagaagagca gagcaggcca 240gaggacgcac cttcagacct cagtgcccct cactccagtg ccaggctgga cggcacactt 300gaaggctgtg ctgccgagac gcctggggac tctgcaggtg acatgcgtgt tccagcggac 360agctccttac tctgtacttt gtcctcagag tctcctcagg aagcagctag tgacgctgag 420agtggtaaaa agcacgataa caacagcaag tctgcgtccc ggccagacgt tggcaccagc 480tccccagagc ccactccctt agatcaggaa atgttcaact ccttccattt ctggaggact 540cctctacccc agatagatct tgataaagag ctccaacagg accctgggga gaggcccagc 600ccagagagaa caggagatgc acctgcagcc cctgtaccag gttctcccag tatcaccatg 660gctacccgga aggaactaga agaaatgata gaaaacctag agccgcacat ggatgacccg 720gatgttaaag cccaggtgga agtgctgtcg gccgccctgc gcgcttctac cctggatgct 780cacgacgagg ctggcggtgc agagcagcgg agtgagctgc aggacgacgc agtgggtgcc 840ggcggcgagc ttccaaactg tagcatcagc gaagacactt ctgagcctct ggtcatcgct 900gctgaggaga atatggaggc cactcctgac tatatccatg gaggtgcgga tgtaggcccc 960ggtggcggtg gtggcttcag cccggatgaa gagaggagac ccaaagtcca ggatgtcgta 1020ccacaagcgt tactagacca gtacctgtca atgaccgacc cttctcgagc acagacagtc 1080gacaccgaga tcgctaagca ctgtgcatac agtctgccgg gtgtggctct ga 1132

Claims

1.一种多核苷酸，其选自以下(a)-(d)：

2.一种蛋白，其由权利要求1的多核苷酸编码。

3.一种载体，其含有权利要求1的多核苷酸。

4.一种转化体，其携有权利要求1的多核苷酸或权利要求3的载体。

5.一种产生权利要求2的蛋白的方法，该方法包括培养权利要求4的转化体并回收表达产物。

6.一种链长至少为15个核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸含有互补于SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列。

7.一种检测含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸的方法，该方法包括使权利要求6的寡核苷酸与待检样品接触并观察所述寡核苷酸的杂交。

8.一种合成含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸的方法，该方法包括使权利要求6的寡核苷酸与待检样品接触，并用该寡核苷酸作为引物合成互补链。

9.一种用于检测肾小球膜细胞的试剂，该试剂含有权利要求6的寡核苷酸。

10.一种检测肾小球膜肾炎的方法，该方法包括测定生物样品中权利要求1所述多核苷酸的表达水平，将该水平与得自正常样品的水平进行比较。

11.权利要求10的方法，其中所述生物样品是肾小球膜细胞。

12.权利要求10的方法，其中所述表达水平用含有选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的mRNA作为指标进行测量。

13.权利要求10的方法，其中所述表达水平用权利要求2的蛋白或其片段作为指标进行测量。

14.一种针对权利要求1所述多核苷酸或其部分的反义多核苷酸。

15.一种识别权利要求2的蛋白的抗体。

16.权利要求15的抗体，其识别含有选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白中的一部分。

17.一种免疫学测定法，其根据针对权利要求2所述蛋白或其部分的权利要求15所述抗体的免疫结合来测定权利要求2的蛋白或其片段。

18.一种用于免疫测定权利要求2所述蛋白或其片段的试剂，该试剂含有权利要求15的抗体。

19.一种转基因非人脊椎动物，其中编码Meg-1的基因的表达水平已改变。

20.权利要求19的转基因非人脊椎动物，其中所述非人脊椎动物是小鼠。

21.权利要求20所述的转基因非人脊椎动物，其中所述转基因非人脊椎动物是一种基因敲除小鼠，该小鼠中编码Meg-1的基因的表达受到抑制。