CN1169754A

CN1169754A - 人白介素-1受体辅助蛋白

Info

Publication number: CN1169754A
Application number: CN 96191567
Authority: CN
Inventors: 理查德·A·奇佐奈特; 格雷斯·W·朱
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1996-01-17
Publication date: 1998-01-07

Abstract

本发明涉及编码人IL－1受体辅助蛋白的多核苷酸、分离的IL－1受体辅助蛋白、和IL－1受体辅助蛋白的抗体。这种蛋白质特别用来预防由IL－1的作用而引发的炎症。

Description

人白介素-1受体辅助蛋白

本发明总的来说涉及细胞因子受体，更具体地说涉及白介素-1受体的辅助蛋白。

白介素-1(IL-1)是一种多肽激素，其对多种细胞类型起作用，且具有多种生物性能(Dinarello，《血液》(Blood)77：1627，1991)。IL-1是炎症和免疫反应的主要介体。因此，对IL-1活性的调节是一种控制和调变这些反应的手段。

现已对两种IL-1作了鉴定，即白介素1α(IL-1α)和白介素1β(IL-1β)，在本说明书中两者均认作IL-1。由IL-1产生的生物活性是通过与特异性质膜受体结合而介导的，该受体称为I型和II型IL-1受体。IL-1受体(IL-1R′s)是具有大约300个氨基酸的胞外结构区的跨膜蛋白，且是免疫球蛋白超家族分子的成员(Sims等，《科学》(Science)241：585，1988；Sims等《美国国家科学院院刊》(Prc.Natl.Acad.Sci.USA)86：8946，1989；Mc Mahan等，EMBOJ.10：2821，1991)。两种IL-1与每一种受体结合，且彼此完全竞争结合。

已设想I型IL-1R可编码整个功能性IL-1受体。用克隆的I型IL-1R的实验表明，当该受体蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中转染并表达时，其足以结合IL-1和转导IL-1信号(Curtis等，《美国国家科学院院刊》86：3045，1989)。在这些研究中没有测出仓鼠细胞内源性辅助蛋白的存在。曾认为II型IL-1R代表IL-1R的一条辅助链(Solari，《细胞因子》(Cytokine)2：21，1990)。但最近的研究表明II型IL-1R不可能起信号转导辅助蛋白的作用，而是以假受体起作用来结合过量的IL-1，并调节其活性(Colotta等，《科学》261：472，1993)。

因为结合IL-1受体的IL-1介导IL-1的生物功能，所有理解受体结合和激活作用的机理对于调节IL-1的活性都是重要的。用标记的IL-1进行亲和交联和结合的研究表明，IL-1受体以多蛋白复合体存在，这些蛋白能以不同亲和性结合IL-1(Lowenthal和Mac Donald，《药物实验杂志》(J.Exp.Med)164：1060，1986；Bensiman等《免疫》(J.Immunol.)143：1168，1989；Mc Mahan等，EMBO J.10：2821，1991)。对于鼠源单克隆(mAb)4C5现已有报导，认为它识别鼠细胞上的一种90 kDa蛋白，该蛋白与IL-1R相关且是信号转导和生物活性所必需的(Powers等，《AAI会刊》(AAI meeting)，Denver，CO，1993年5月2 1-25日)。目前还不知道在人细胞上是否存在一种等效蛋白，或者如果有，那末什么样的生物功能与这样一种蛋白相关。

在本发明之前，在鉴定人的IL-1R辅助蛋白或者克隆并表达编码该蛋白基因方面的努力皆因缺少纯的蛋白质，缺少识别该蛋白质的抗体，以及不能鉴别表达大量该蛋白质的细胞和其mRNA而遭受到很大障碍。即使是鼠源辅助蛋白也没有获得足够的量可用于鉴定相应的人辅助蛋白。表达该辅助蛋白已知的鼠细胞系只能获得极低的量(～1000个分子/细胞)，因而不能为得到非多义氨基酸序列的信息而纯化足够的蛋白质。还没有已知的mAb能识别4C5靶蛋白(鼠源辅助蛋白)的人同系物。另外，人们并不知道与IL-1进行结合是一种鉴定人辅助蛋白的有效筛选手段，因为已知很多辅助蛋白不结合配体或者只以很低的亲和性结合配体(Hibi等，《细胞》(Cell)63：1149，1990；Takeshita等，《科学》257：379，1992)。

本发明第一次获得纯化的人IL-1受体辅助蛋白，其可以用来调节IL-1的作用。可溶性辅助蛋白的加入抑制了IL-1对细胞的作用。因此，本发明的一个方面是通过加入足以抑制细胞被IL-1激活量的可溶性人的IL-1辅助蛋白(IL-1RAcP)来治疗由IL-1反应的细胞过量活性所引起的病理症状。该方法也可以变化，且该可溶性辅助蛋白可以用作药物的筛选剂。

总之，作为IL-1拮抗剂起作用的药物可通过阻断IL-1与IL-1R AcP的相互作用而达到治疗的目的。细胞膜中存在IL-1R AcP，对于允许IL-1与IL-1受体复合体有效地相互作用是必需的(有效相互作用是指结合受体复合体以引发生物学反应)。IL-1受体复合体包括与IL-1R AcP结合的I型或II型IL-1受体(另外的蛋白质也可以是该复合体的部分)。加入可溶性IL-1R AcP对这种相互作用的抑制是通过使IL-1或IL-1受体与该可溶性蛋白相互作用而不与细胞表面上IL-1R AcP相互作用，从而减少由IL-1引起的生物反应。本发明IL-1R AcP的抗体同样抑制细胞对IL-1的生物反应。通过结合IL-1R AcP，抗体防止了IL-1与IL-1受体有效地相互作用。由于阻断IL-1R AcP，这些抗体抑制IL-1与IL-1受体复合体的结合，这取决于它与IL-1R AcP的相互作用。IL-1R AcP将抑制IL-1与IL-1受体的相互作用，从而防止IL-1反应性细胞的激活作用且减少炎症反应。人们也可以使用该纯化的IL-1R AcP来筛选有效的药物。如果该药物阻断IL-1与IL-1R AcP结合，则它就是一种有效的IL-1拮抗剂。

本发明提供编码IL-1受体辅助蛋白或其活性片段的多核苷酸。优选的多核苷酸选自：(a)基本上具有一种从天然IL-1R AcP基团编码区衍生的核苷酸序列的多核苷酸，优选cDNA克隆，如图15[SEQ ID NO.1]所示；(b)在中等严格条件下能与(a)的cDNA克隆杂交的多核苷酸，其编码IL-1R AcP或其片段；和(c)由(a)和(b)中所定义的DNA序列的遗传密码简并结果的多核苷酸，该核苷酸可编码IL-1R AcP分子或其片段。特别优选的化合物是这样的一些核苷酸，它们编码人IL-1受体辅助蛋白，例如编码氨基酸序列[SEQ ID NO：3]或其活性片段，尤其是具有序列[SEQ ID NO：1]的多核苷酸。特别优选的化合物编码了可溶性IL-1受体辅助蛋白，例如，具有氨基酸序列[SEQ ID NO：9]的人可溶性IL-1受体辅助蛋白。多核苷酸[SEQ ID NO：7]编码了人的可溶性IL-1受体辅助蛋白。上述化合物的反义多核苷酸也是本发明的一部分。

本发明还提供载体和合适的宿主细胞，优选包含上面定义的DNA序列的表达载体，用该表达载体产生的重组IL-1R AcP，以及利用该表达载体产生重组辅助蛋白质分子的方法。

本发明获得由上面所定义的多核苷酸编码的IL-1受体辅助蛋白和其活性片段。优选的化合物是人IL-1受体辅助蛋白，优选具有氨基酸序列[SEQ ID NO：3]的蛋白质。尤其优选的是可溶性人IL-1受体辅助蛋白，例如具有氨基酸序列[SEQ ID NO：9]的蛋白质。带有一个或多个修饰侧基的IL-1R AcP也是本发明的一部分。

本发明也提供IL-1R AcP的抗体。这些抗体特异地结合人IL-1受体辅助蛋白，并防止IL-1受体复合体被IL-1激活，优选的抗体具有大约KD 0.1nM至大约KD 10nM对于IL-1受体辅助复合体的结合亲和性，其例子是单克隆抗体或其衍生物。

含有如上所述的反义多核苷酸、IL-1受体辅助蛋白或抗体的药物组合物也是本发明的一部分。这些药物组合物可以包括一种或多种其它细胞因子拮抗剂。

本发明还提供一种制备IL-1受体辅助蛋白的方法，包括步骤(a)在合适的宿主中表达由上述多核苷酸编码的多肽，(b)分离所述IL-1受体辅助蛋白，和(c)如果需要，将其转化为其中一个或几个侧基被修饰的类似物。而且本发明包括一种制备IL-1受体辅助蛋白抗体的方法，包括步骤(a)制备产生特异性结合IL-1受体辅助蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，和(b)产生并分离该单克隆抗体。用已知方法可以产生相应的多克隆抗体。

上面提到的化合物用作治疗活性物质，例如用于治疗炎症或用于免疫反应和/或用于调节并防止炎症或白介素-1的免疫活性。具体地说这些化合物用于治疗急性或慢性疾病，优选治疗类风湿性关节炎、肠炎、脓毒性休克、移植物排斥、牛皮癣、哮喘和I型糖尿病，或者用于治疗癌症，优选治疗急性和慢性骨髓性白血病。

除具体指明的外，这里所使用的IL-1包括IL-1α和IL-1β两者，IL-1受体包括I型和II型IL-1受体。附图简要说明

图1.室温下[¹²⁵I]-4C5与鼠EL-4细胞的平衡结合。EL-4细胞(1.5×10⁶个细胞)在室温下温育2小时，在不存在(○)或存在(_)100nM未标记的4C5下随[¹²⁵I]-4C5浓度增加的结合情况。如实施例1所述测定全部(○)和非特异(_)细胞结合放射活性。从总的结合数中扣除非特异结合，计算出[¹²⁵I]-4C5的特异性结合(●)。1A是EL-4细胞与[¹²⁵I]-4C5在温育后的结合。1B是根据Scatchard方法(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.5 1：660，1949)分析该结合的数据，用单一位点模型通过配体法测定(Munson和Rod bard，Anal.Biochem.107：220，1980；McPherson，J.Pharmacol.Methods 14：213，1985)。

图2.[¹²⁵I]-4C5与鼠70Z/3细胞的平衡结合。70Z/3细胞(1.5×10⁶)在室温下温育2小时，在不存在(○)或存在(_)100nM未标记的4C5时随[¹²⁵I]-4C5浓度增加的结合情况。如实施例1所述测定全部(○)和非特异(_)细胞结合放射性。从总的结合数中扣除非特异结合，计算出[¹²⁵I]-4C5的特异性结合(●)。2A是70Z/3细胞[¹²⁵I]-4C5在温育后的结合。2B是根据Scatchard方法(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660，1949)分析该结合的数据，用单一位点模型通过配体(Munson和Rodbard，Anal.Biochem.107：220，1980；McPherson，J.Pharmacol.Methods 14：213，1985)测定。

图3.单克隆抗体4C5、4E2和35F5对人[¹²⁵I]-1结合70Z/3细胞上IL-1受体的抑制。如实施例1所述进行抑制测试。所得数据以抑制百分率来表示，这是与不存在抗体时的特异结合相比，在存在指定浓度抗体时[¹²⁵I]-IL-1结合的抑制百分率。蛋白质是人的IL-1α(H-α)和人的IL-1β(H-β)。

图4.单克隆抗体4C5、4E2和35F5对人[¹²⁵I]-IL-1结合EL-4细胞上的受体的抑制。如实施例1所述进行抑制测试。所得数据以抑制百分率来表示，即与不存在抗体时的特异性结合相比较，在存在指定浓度抗体时[¹²⁵I]-IL-1结合的抑制百分率。蛋白质是人IL-1α(H-α)和人IL-1β(H-β)。

图5.通过4C5亲和层析从EL-4细胞溶解提取物中分离90和50kDa两种蛋白质。如实施例1所述，通过扁豆凝集素亲和层析，接着在含有抗-I型IL-1R抗体(7E6)、鼠IL-1α(Ma)或抗辅助蛋白抗体(4C5)的基质上进行亲和层析，由此而从EL-4细胞的除垢剂提取物中部分纯化蛋白质。EL-4细胞的除垢剂提取物中的蛋白质也直接在4C5亲和基质(4C5)上纯化。从柱中洗脱出来的蛋白质用SDS-PAGE分离，转移到硝基纤维素上，并用[¹²⁵I]-4C5探测。边缘标明的分子量的大小是由平行泳道中测得的分子量标准(Amersham Prestained Standards)估算的。暴露时间为1天。

图6.单克隆抗体4C5、4E2和35F5对IL-1诱导的脾B细胞增生的抑制。如实施例1所示进行抑制测试。所得数据以B细胞掺入的³H-胸苷(CPM)来表示，即与不存在抗体时掺入比较，在存在指定浓度抗体下掺入的³H-胸苷。蛋白质是：6A.人IL-1α(IL-1α)；6B.人IL-1β(IL-1β)。

图7.单克隆抗体4C5和35F5和人IL-1ra对IL-1诱导的D10.G4.1辅助T-细胞增生的抑制。如实施例1所述进行抑制测试。数据以D10细胞掺入的³H-胸苷(CPM)表示，即与不存在抗体或IL-1ra时相比较，在存在指定浓度抗体和IL-1ra时D10细胞掺入的³H-胸苷。蛋白质是：7A.人IL-1α，7B.人IL-1β。

图8.70Z/3细胞对IL-1诱导的卡巴轻链表达(Kappa Light ChainExpression)的抑制：单克隆抗体4C5、4E2和35F5的作用。卡巴轻链表达的诱导作用和用抗体的抑制作用如实施例1所述。数据以当与不存在抗体时细胞的百分数相比，在存在指定浓度抗体时表达卡巴轻链的细胞百分数来表示。蛋白质是人IL-1α(IL-1α)和人IL-1β(IL-1β)。

图9.单克隆抗体4C5和35F5对IL-1诱导的C57BL/6小鼠中血清IL-6的抑制。在皮下注射人IL-1α(α)或人IL-1β(β)(0.03μg)之前的4小时和10分钟用单克隆抗体处理小鼠。用IL-1后2小时，如实施例1所述测定血清IL-6浓度。MabX-7B2是一对照抗体。

图10.核苷酸序列和推导出的鼠IL-1R AcP氨基酸序列。10A是给出了鼠IL-1R AcP cDNA克隆E2-K的开放读框的核苷酸序列。上端的链是编码序列[SEQ ID NO：4]。10B是给出了从图10A所示编码序列中推导出的鼠IL-1R AcP氨基酸序列[SEQ ID NO：6]。预计信号肽切割位点出现在Ala-1之后，产生自Ser1至Val 550的550个氨基酸的成熟蛋白。该切割位点已由纯化的天然mu IL-1R AcP的NH₂-末端序列分析所证实(实施例10)。预测的跨膜结构域自Leu 340伸展到363。

图11.用mAbs 4C5和2E6将重组MuIL-1R AcP从转染的COS细胞中免疫沉淀。COS细胞用pEF-BOS/mu IL-1R AcP或单独用pEF-BOS(模拟试验)通过电穿孔而被转染。如实施例8所述，转染细胞用[³⁵S]Met进行代谢标记，如实施例8所述。标记的转染物与RIPA缓冲液一起溶解，并用mAb4C5或2E6(参见表2)免疫沉淀。来自COS细胞的两种mAbs免疫沉淀的标记的蛋白质用pEF-BOS/mu IL-1R AcP转染，其以70-90kDa之间宽带迁移。从模拟实验转染的COS细胞中在该大小范围没有检测到标记的蛋白质。较高分子量物种(＞200kDa)存在于模拟试验和mu IL-1R AcP转化的COS细胞两者中。

图12.[¹²⁵I]-标记的4C5和ZL-1与COS-7细胞中表达的鼠重组IL-1R AcP的平衡结合。用IL-1R AcP所表达的质粒[COS(AcP)]或对照质粒[COS(pEF-BOS)]转染的细胞[4-8×10⁴]，在没有(总计)或有(非特异性)100mM未标记的4C5或50nM未标记的IL-1α时随着[¹²⁵I]-4C5或[¹²⁵I]-IL-1α浓度增加的情况下，在4℃温育3小时。如实施例1所述测定总的(以总计表示)和非特异性(以非特异性表示)细胞结合放射性。从总结合中减去非特异性结合而计算出[¹²⁵I]-4C5(特异性)和[¹²⁵I]-IL-1α(特异性)的特异性结合。[¹²⁵I]-IL-1α与用对照质粒[COS(PEF-BOS)]转染的COS细胞的结合，显示出COS-7细胞自然表达大致为IL-1α的600个高亲和性结合位点。右侧一栏显示的是根据Scatchard方法[Scatchard，Ahn.N.Y.Aca d.Sci.51：660，1949)，通过用单一位点模型的配体(Munson和Rodbard，Anal.Biochem.107：220，1980；McPher son，J.Pharmacol.Methods 14：213，1985)测定的结合数据的分析。12A是COS(ACP)细胞与[¹²⁵I]-4C5温育的结合。12B是12A数据的Scatchard曲线。12C是COS(ACP)细胞与[¹²⁵I]-IL-1α温育的结合。12D是12C数据的Scatchard曲线。12E是[COS(PEF-BOS)]细胞与[¹²⁵I]-IL-1α温育的结合。12F是12E数据的Scatchard曲线。

图13.[¹²⁵I]-标记的35F5和IL-1与COS-7细胞中表达的鼠重组I型IL-1R的平衡结合。用I型IL-1R表达质粒[COS(Mu-IL-1R)]转染的细胞(4-8×10⁴)在没有(总计)或有(非特异性)100nM未标记的35F5或50nM未标记的IL-1时，随着[¹²⁵I]-35F5或[¹²⁵I]-IL-1α和[¹²⁵I]-IL-1β浓度的增加在4℃下温育3小时。如实施例1所示测定全部(总计)和非特异性(非特异性)细胞结合放射性。通过从总计结合中减去非特异性结合计算出[¹²⁵I]-35F5(特异性)和[¹²⁵I]-IL-1α或IL-1β(特异性)的特异性结合。右侧一栏显示的是根据Scatchard方法(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660，1949)通过用单一位点模型的配体[Munsan和Rodbard，Anal.Biochem.107：220，1980；McPherson，J.Pharmacol.Methods 14：213，1985)测定的结合数据的分析。13A是[COS(Mu-IL-1R)]细胞与[¹²⁵I]-35F5温育的结合。13B是13A数据的Scatchard曲线。13C是[COS(Mu-IL-1R)细胞与[¹²⁵I]-IL-1β温育的结合。13D是13C数据的Scatchard曲线。13E是[COS(Mu-IL-1R)]细胞与[¹²⁵I]-IL-1α温育的结合。13F是13E数据的Scatchard曲线。

图14.人IL-1R AcP全长cDNA克隆的构建。在图的上部显示出人IL-1R AcP cDNA插入克隆#3和#6的结构图解。克隆#3包含5′非编码序列，起始ATG密码子，和编码区的显著部分。克隆#6与克隆#3重叠，包含编码区的大部分，TGA终止密码子，和3′非编码序列。如实施例12和13所述，从克隆#3中分离846 bp Xba I/BstXI片段以及从克隆#6中分离≌2700bp BstXI/XbaI片段，并连接到表达载体pEF-BOS中。在底部线上给出了所得的编码全长人IL-1R AcP的cDNA图解。

图15.人IL-1R AcP核苷酸序列。给出了全长人IL-1R AcP cDNA(实施例13，图14)中开放读框的核苷酸序列。上部的链是编码序列(SEQ IDNO：1]。

图16.人IL-1R AcP氨基酸序列。给出了从图1 5中的核苷酸序列的翻译所推导出的人IL-1R AcP的氨基酸序列[SEQ ID NO：3]。预计该信号肽切割位点发生在Ala1之后，结果产生自Ser 1延伸至Val 550的550-氨基酸的成熟蛋白。该预计的跨膜结构域自Leu 340延伸至Leu 363。

图17.在MRC-5细胞中IL-1诱导IL-6产生：由IL-1受体拮抗剂和抗I型IL-1受体抗体4C1的抑制作用。在加湿温育箱中37℃下，将人胚胎肺的成纤维细胞MRC-5细胞(5×10⁴个细胞；ATCC#CCL-171)铺至24孔簇生器中(NO.3524；Costar)温育24小时。24小时的温育期后，用增加浓度的IL-1受体拮抗剂(IL-1RA；10^-2至10³pM)、抗-I型IL-1受体抗体4C1(10^-4至10¹μg/ml)或什么都不用，将该细胞在37℃预处理1小时。1小时之后加入或5pM或100pM人IL-1β，并在37℃继续温育24小时。温育期后，从每一孔中取出100μl细胞上清液并用Quantikine人IL-6测试药盒(R & Systems)测其IL-6浓度。该数据是表示在只有IL-1β或有IL-1β加抑制剂的情况下自MRC-5细胞分泌的IL-6的浓度(pg/ml)。也测定了肿瘤坏死因子-α(TNF α)浓度的增加对MRC-5细胞分泌的刺激作用的影响。在刺激IL-6自这些细胞中分泌方面，TNFα比IL-1β的效力低(～500倍)，并表现出该效力部分取决于这些细胞IL-1的自分泌。17A给出对于IL-1β、TNFα、和由IL-1ra引起的抑制作用的数据。17B给出了由mAb4C1引起的抑制作用。

图18.可溶性人IL-1R AcP的核苷酸序列。给出了可溶性人IL-1R AcPcDNA的核苷酸序列。上部的链是编码序列[SEQ ID NO：7]。

图19.可溶性人IL-1R AcP的氨基酸序列。给出了由图18核苷酸序列翻译推导出的可溶性人IL-1R AcP的氨基酸序列[SEQ ID NO：9]。

本发明涉及一种分离的多核苷酸，它编码IL-1R AcP(IL-1R AcP)或IL-1R AcP活性片段(即能抑制IL-1结合或抑制激活IL-1受体)，特别涉及编码人或鼠IL-1R AcP的多核苷酸。这种多核苷酸的例子是具有序列[SEQ ID NO：1]的DNA多核苷酸，和编码人IL-1R AcP具有氨基酸序列[SEQID NO：3]的DNA多核苷酸。如下文所述，本发明多核苷酸可以用作生产蛋白质IL-1R AcP的中间体。该蛋白质用于治疗涉及IL-1炎症活性的疾病。这些多核苷酸自身可以用于通过已知的反义形态而进行的治疗中。

本发明也涉及经分离而没有其它蛋白质的IL-1受体辅助蛋白，或者IL-1R AcP分离的活性片段。本发明的IL-1R AcP是一种能抑制IL-1结合或者激活IL-1受体的蛋白质或活性片段。

本发明的一部分涉及一种获得人IL-1R AcP的方法，该方法用下面化合物作中间体：编码鼠IL-1R AcP的多核苷酸、鼠IL-1R AcP、鼠IL-1R AcP的抗体，和编码人IL-1R AcP的多核苷酸。由编码人IL-1R AcP的多核苷酸可以获得可溶性IL-1R AcP和其抗体。本发明重要的第一中间体是对于鼠IL-1R辅助蛋白的分离的mAbs。这些mAbs可用鼠70Z/2前-B细胞经溶解和交联的IL-1α/IL-1R复合体经部分纯化的制剂通过免疫而得到(在实施例1中说明)。使用这种交联的配体-受体复合体是特别合适的，因为该辅助蛋白由于在这样一种复合体中其相互作用的结果才可能被纯化。然后用其中一种mAbs(4C5)来分离一种编码鼠IL-1R AcP的cDNA。使用这些鼠源cDNA来获得人同系物中部分基因组的克隆。然后使用自部分基因组克隆衍生的探针来分离人IL-1R AcP的全长cDNA。

这里所说的“多核苷酸”指一种分离的DNA或RNA聚合体，以一种独立的分子形式存在或作为大的DNA或RNA构建的一种成分，它是从DNA或RNA衍生的，经过至少一次分离而以基本上纯的形式存在，即不含污染内源物质，且将其定量或浓缩成能对该序列和其部分核苷酸序列通过标准生物化学方法(例如使用克隆载体)进行鉴定、操作和回收。这些序列优选以开放读框的形式存在，未被一般存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子所间断。但是可以证明，也可以使用包含相关序列的基因组DNA。非翻译的DNA序列可以是开放读框中的5′或3′，它们在其中不干扰编码区的操作或表达。

这些多核苷酸，例如DNA，包括那些包含一个或几个上述鉴定的DNA序列的多核苷酸和那些在严格杂交条件下(参见T.Maniatis等，《分子克隆.实验手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，1982，pp.387至389)与这些DNA序列杂交的序列。如此严格的杂交条件的例子是以A×SSC在65℃杂交，接着在0.1×SSC、65℃冲洗1小时。另一作为例子的严格杂交条件是于50％甲酰胺中，4×SSC，42℃。

在温和条件下与IL-1R AcP的序列杂交的且在具有IL-1R AcP生物性质的IL-1R AcP肽的表达中编码的多核苷酸也编码新的IL-1R AcP多肽。这种非严格杂交条件的例子是4×SSC，50℃或者在42℃在30-40％甲酰胺中杂交。实施例11中提到了其它的杂交条件。例如，与序列IL-1R AcP共有明显同源性的区(例如糖基化位点或二硫键)，且编码具有一种或几种IL-1RAcP生物性质的蛋白质。这样的DNA序列可清楚地编码IL-1R AcP多肽，即使该DNA序列不严格地与IL-1R AcP序列杂交。

本发明多核苷酸可用如实施例7-13所述的方法得到，即通过在真核细胞中表达鼠cDNA并用实施例7所述的实验方法筛选细胞表面蛋白质。鼠源cDNA克隆是用mAb 4C5表达蛋白质免疫反应性的结果。这种cDNA克隆用来获得同源人基因组克隆。主要是，用在实施例7中由鼠细胞获得的中间体鼠IL-1R AcP探针来筛选人基因组DNA。对这些克隆按所述的方法进行分离和测序。然后用部分人基因组克隆作为中间体来筛选人cDNA文库，并按照说明分离克隆和测定序列以获得编码人IL-1R AcP的本发明全长多核苷酸。

本发明的一个特定的多核苷酸具有序列[SEQ ID NO：1]。本发明的另一个多核苷酸编码具有氨基酸序列[SEQ ID NO：3]的人IL-1R AcP。任何能编码IL-1R AcP氨基酸序列的或尤其是[SEQ ID NO：3]的多核苷酸是本发明的一部分。本发明的另一多核苷酸具有序列[SEQ ID NO：4]。

编码IL-1R AcP活性片段的多核苷酸也是本发明的一部分。这样的多核苷酸是以上提出的多核苷酸的片段(它们是通过已知方法片段化，如限制性消化或剪切)，当用常规方法表达时，产生的蛋白质在下面说明的IL-1分析中能阻断IL-1活性。编码可溶性IL-1R AcP的多核苷酸是本发明优选的片段。这样的多核苷酸例如具有序列[SEQ ID NO：7]的一种多核苷酸。

编码IL-1R AcP和其活性片段的多核苷酸是用作中间体的，从中获得IL-1R AcP和其活性片段。另外，这些多核苷酸用作反义治疗剂阻断产生IL-1R AcP。反义治疗剂的用途如Akhtar和Zvinson的《天然基因》(NatureGenetics)4：215，1993中的说明。RNA或DNA多核苷酸两者都具有这些用途。与[SEQ ID NO：1]或该序列的片段互补的反义多核苷酸是本发明的一部分。这种多核苷酸可以通过已知方法获得如合成NDA或RNA以产生互补列。因此，本发明还有一部分是关于这种多核苷酸的任何DNA或RNA序列能在本领域已知的中等严格条件下与编码IL-1R AcP的DNA或RNA杂交，并由此杂交而能防止IL-1R AcP的合成。

本发明包括含有这里所描述的编码IL-1R AcP或活性片段的多核苷酸的载体。本领域公知的任何载体均可在该范围中使用，如质粒、噬菌粒、病毒载体，粘粒和其它载体。多核苷酸通过重组DNA技术领域公知的方法插入到载体中。表达载体是载体的具体例子。

这里所使用的“表达载体”一词是指一种载体，如质粒，包含下面几部分装配成的一种转录单位：(1)一个遗传因子或在基因表达中起调节作用的一些因子，例如，启动子或增加子，(2)被转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)合适的起转录作用和翻译作用的起始和终止序列。要用于各种真核表达系统中的结构元件优选包括一个信号序列能通过宿主细胞使被翻译的蛋白质发生胞外分泌。或者，如果重组蛋白在没有信号或转运序列下被表达，则其可以包括一个N-末端蛋氨酸残基。该残基接着可任选地从表达的重组蛋白上切割下来得到终产物。

包含表达IL-1R AcP或活性片段的表达载体的宿主细胞也是本发明的一部分，所述表达载体包含本发明多核苷酸。该多核苷酸插入到包含转录调控序列的载体中形成表达载体。然后这些表达载体通过转染，感染，电穿孔，或其它已知方法插入到宿主细胞中。这样的宿主细胞能从插入到其中的表达载体中产生蛋白。其它宿主细胞，例如酵母、中国仓鼠卵巢细胞、细菌细胞，可以与相关的和合适的表达载体一起使用。

如上文所指出的，本发明也涉及分离的没有其它蛋白的IL-1辅助蛋白(IL-1R AcP)，或IL-1R AcP的活性片段。本发明IL-1R AcP是一种蛋白质或活性片段它有抑制IL-1与其受体结合的能力或激活IL-1受体的能力，尤其是I型IL-1受体。抑制人IL-1受体激活通过人IL-1R AcP或活性片段进行，并且具有多种作用，特别是减少炎症。因此通过使用IL-1R AcP或活性片段，可能抑制细胞的IL-1激活从而减轻或缓解与炎症相关的症状。

IL-1R AcP活性片段可以通过获得蛋白质片段的常规方法得到。例如，本发明DNA可以通过限制性消化或剪切而片段化，并通过常规方法在宿主细胞中表达，得到IL-1R AcP片段。IL-1R AcP片段也可以通过本发明IL-1R AcP的蛋白酶解而获得。本发明活性片段可用下文说明的IL-1分析筛选活性的方法来测定。

可溶性IL-1R AcP是本发明的一种IL-1R AcP片段，其中缺失COOH末端序列，导致蛋白质分泌到培养基中。该可溶性IL-1R AcP相当于全部或部分IL-1R AcP胞外区。解释蛋白质COOH末端和胞外区的方法是已知的。所得蛋白质优选保持其与IL-1或I型和II型IL-1R相互作用的能力。特别优选的序列包括那些由于IL-1R AcP跨膜区和胞内功能区被缺失或替代而使辅助蛋白容易分泌到培养基中的序列。可溶性IL-1R AcP也可以包括部分跨膜区，前提是可溶性IL-1R AcP能从细胞中分泌。如实施例14和15所述得到可溶性IL-1R AcP。本发明特定的可溶性IL-1R AcP具有序列[SEQ ID NO：9]。

IL-1R AcP优选的例子具有氨基酸序列[SEQ ID NO：3]。由cDNA序列[SEQ ID NO：1]推导的IL-1R AcP的氨基酸序列见图16。上述影响IL-1结合的每个IL-1R AcP均包括在本发明中，例如具有其中一个或多个侧基已用已知方法修饰过的序列[SEQ ID NO：3]的类似物，该已知方法是例如通过附着化合物如聚乙二醇，或者通过在融合蛋白中掺入(用其它蛋白序列如免疫球蛋白序列)，或者掺入在通过如此修饰而另外保持或增强其活性的蛋白质中。也包括这样的一些蛋白，即它们抑制IL-1与其受体结合并其基本序列[SEQ ID NO：3]中可用如定点诱变等的已知技术将一个或几个氨基酸加入、删去或取代。氨基酸中的变化有局限性和保守性，从而保持蛋白质如所述的那样，它的全部或部分活性或者增强的活性方面与IL-1RAcP相同。在实施例5，6，16中描述了测定IL-1抑制活性的方法，包括抑制IL-1与其受体结合、抑制淋巴细胞增殖或卡巴轻链表达，也包括减少IL-1诱导的IL-6表达。

分离的无其它蛋白质的IL-1R AcP可以由编码IL-1R AcP的本发明多核苷酸获得。例如，可以通过一种常规的方法，即在宿主细胞中表达其中提供的编码IL-1R AcP的多核苷酸，优选DNA[SEQ ID NO：1]或[SEQ IDNO：7]，并分离所得蛋白质而获得IL-1R AcP。一旦获得IL-1R AcP，可以用常规方法分离不含其它蛋白的蛋白质。这些方法包括(但不限于)在用本发明抗体的抗体亲和柱上纯化；在离子交换或凝胶过滤柱上层析；用高效液相色谱纯化；以及用IL-1亲和柱纯化。

IL-1R AcP可以通过用已知方法附着聚亚烷基二醇而将其稳定。聚亚烷基二醇包括聚乙二醇，和可以是支化或未支化的其它的聚亚烷基二醇。该聚合物可以直接与蛋白质连接，或者可以用连接基团例如将聚合物的COOH与蛋白质赖氨酸的NH₂连接起来的方法进行连接。

本发明化合物可以直接用于结合或清除IL-1的治疗中，从而提供一种调节和防止炎症或IL-1的免疫活性的手段。在防止或逆转病理反应的应用中，可溶性IL-1R AcP或IL-1R AcP的抗体可以与其它细胞因子拮抗剂如IL-2受体的抗体、可溶性TNF受体、IL-1受体拮抗剂、可溶性IL-1受体等结合使用。另外，本发明分离的IL-1R AcP有用于产生其自身可用于治疗的IL-1R AcP抗体。产生这种抗体是可行的。因为本发明对抗体的产生能有足够量的IL-1R AcP。

因此，本发明也涉及人IL-1R AcP的抗体。如实施例15所述获得人IL-1R AcP的鼠或大鼠单克隆抗体。这些抗体通过用纯化的或部分纯化量的人IL-1R AcP免疫而获得，其在使用本发明DNA′s表达重组全长或可溶性人IL-1R AcP之后获得。人IL-1R AcP的cDNA′s的分离是用实施例2和3所述的单一mAb 4C5分离的本发明鼠IL-1R AcP。对于人IL-1R AcP的鼠或大鼠mAbs来说，可以使用本领域公知的杂交瘤技术来获得产生mAbs的杂交瘤。嵌合抗体和人源化抗体可以用已知方法由这些啮齿动物抗体获得(Brown等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci，USA88：266，1991；WO90/7861，EP 620276)或者通过产生异源双体双特异性抗体来获得(Kostelny等，《免疫杂志》(J.Immunol)，148：1547，1992)。

本发明人IL-1R AcP的抗体特异性结合人IL-1R AcP，并防止IL-1激活IL-1受体复合体。该活性可以通过本文所说明的分析来测定。具体地说，生物分析包括以抗体抑制IL-1反应细胞的增殖或抑制IL-1诱导前列腺素E₂和IL-6分泌的能力为基础的筛选。这些分析可以通过细胞生物学常规方法而进行。适于这些分析的合适的细胞包括脾B细胞，如人B细胞系RPMI 1788的细胞系(Vandenabeele等，《免疫方法》(J.ImmunolMeth.)135：25，1990)，和如人肺成纤维细胞系MRC-5的人成纤维细胞(Chin等，J.Exp.Med.165：70，1987)。实施例1，2，5和6说明了使用小鼠细胞的这些分析的方法。例如，可以使用体内测试来测定小鼠体内IL-1诱导的IL-6产生的抑制作用。这些测试可以使用实施例中提供的相同技术通过有效筛选所需活性的人细胞来进行。根据常规方法测定，优选的抗体具有大约K_D0.1nM至大约K_D10nM的对于IL-1受体辅助复合体的结合亲和性(Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660，1949)。

可以用已知方法结合与本发明抗体来缓解由IL-1的存在所引起的症状。特别是本发明抗体可用于减轻炎症。使用这些IL-1R AcP抗体的目的是例如抑制人体炎症或免疫反应。多种由炎症发生引起的疾病或症状(例如类风湿性关节炎、肠炎、和脓毒性休克)或由免疫反应引起的疾病或症状(例如I型糖尿病、移植物排斥、牛皮癣、和哮喘)与高水平的IL-1相关(Dinarello和Wolff，New Engl.J.Med.328：106，1993)。因此使用抑制IL-1与IL-1RAcP相互作用的抗体的治疗可以在急性或慢性疾病(如类风湿性关节炎、肠炎和I型糖尿病)的临床治疗中用来有效地抑制炎症或免疫反应。另外，抗体有用于治疗某些癌症，如急性和慢性骨髓性白血症(Rambaldi等，《血液》(Blood)78：3248，1991；Estrou等，Blood 78：1476，1991)。

本发明包括鼠IL-1R AcP抗体，具体地说有4C5，2B5，3F1，4C4，24C5，4D4(见表1)和1D2，2D6，2E6，1F6，2D4，2F6，3F5和4A1(参见表2)。如所说明的，这些抗体用来获得人IL-1R AcP。

如上文所指出的，抗体可以通过合适的细胞自然产生，或者通过修饰该抗体蛋白的重组表达载体而产生，例如，通过将抗体人源化(Brown等，Bol.Natl.Acad.Sci.USA 88：2663，1991)或通过产生能识别辅助蛋白和I型或II型IL-1R两者的异源双体双特异性抗体(Kostelny等，J.Immunol.148：1547，1992；WO90/7861，EP 620276)。

IL-1R AcP和其片段的给药剂量范围或者IL-1R AcP的抗体或反义多核苷酸的给药剂量范围不用特别实验就可由本领域普通技术人员确定。一般情况下，合适的剂量是足以产生所需效果，例如能阻断内源IL-1对细胞与IL-1的反应活性的剂量。该剂量不应该太大而引起副作用，如不利的交叉反应、过敏反应等等，剂量一般根据患者的年龄、症状、性别和疾病发展程度、禁忌症、或者免疫耐受性和其它这样的变数而不同，由各医生判断。IL-1R AcP和其片段或该蛋白质的抗体或反义多核苷酸的肠胃外给药可通过注射或在一段时间内逐渐灌注。它们也可以静脉内，腹膜内，肌内或皮下给药。

本发明包括含有减轻炎症有效量的本发明蛋白质和/或抗体和药学可接受载体(如下文描述的制剂和赋形剂)的药物组合物。如果需要，这种组合物可以包括其它活性化合物。对于蛋白质来说，有效量的例子是大约4至大约32mg/m²的范围内。对于抗体，有效量的例子是大约0.1至大约15mg/kg体重的范围内。

用于肠胃外给药的制剂包括无菌或含水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射有机酯如油酸乙酯。水溶液载体包括水、醇/水溶液、乳化液或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、格林葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的格林试剂，或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解液补充剂(如以格式葡萄糖为基础的那些试剂)、等等。防腐剂和其它添加剂也可以加入，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。一般情况下参见Remington药物科学，16版，Mack出版，1980。

下面的实施例是对本发明的进一步说明但不是为了限制本发明的任何方面

实施例1方法杂交瘤抗体的制备、筛选和纯化

用与来自鼠70Z/3前-B细胞(ATCC#TIB 158)交叉连接有亲和性的人IL-1α的去垢可溶性制剂，通过腹膜内(ip)途径对Lewis大鼠(查尔斯诃实验室)免疫接种(Gubler等，J.Immunol.136：2492，1986)。对于初次免疫接种，大鼠接受了溶解的IL-1α/IL-1R复合体(0.4ml)，该复合体是从1×10¹¹70Z/3细胞中制备和纯化的(Chizzonite等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：8029，1989)，并以1∶2的比例在弗氏完全质剂中乳化，再进行ip注射(下文说明)。六星期后，大鼠再接受由2.25×10¹¹细胞中制备和纯化的、以1∶2的比例在弗氏完全佐剂中乳化的溶解的IL-1α/IL-1R复合体(0.3ml)，经ip.注射在每一后脚板中。在最后免疫接种后的2和6星期时从大鼠身上采集血清，并测定其阻断[¹²⁵I]-IL-1β结合到70Z/3细胞上的IL-1R的活性。最后免疫接种后四个月用下面量的溶解在脾细胞分离物制剂中的IL-1β/IL-1R复合体免疫接种一只大鼠：用量为0.1ml的(自8×10¹⁰个细胞制备和纯化的)，是以1∶4比例和弗氏完全佐剂乳化，注射到每一后脚板，并皮下(S.C.)给药于每一后脚；用量为0.9ml的(自74×10¹¹0Z/3个细胞制备并纯化的)，是通过静脉内(i.V)和i.p.注射。两天后，大鼠免疫接种溶解的IL-1α/IL-1R复合体(0.5ml，从2×10¹¹个70OZ/3个细胞中制备和纯化)与磷酸缓冲盐水(PBS)，pH 7.4(0.5ml)的混合物，免疫注射每一后腿。该最后免疫接种后两天，从大鼠中分离脾细胞，并根据公开的方法(Fazekas等，J.Immunol.Meth.35：1，1980)用35％聚乙二醇(PEG4000，E.Merck)以1∶1(脾细胞：SP2/0细胞)的比例与SP2/0细胞(A7 CC CRL 1581)融合。该融合细胞以3×10⁵细胞/孔/ml的密度铺于补充有15％FBS、谷氨酸(2mM)、β-巯基乙醇(0.1mM)、庆大霉素(50μg/ml)、HEPES(10mM)5％ORIGIN杂交瘤克隆因子(IGEN，Inc.)、5％P388D1上清液(Nordon等，J.Immunol.139：813，1987)和100单位/ml重组人IL-6(Genezyme)的IMDM中的48孔板上。

对杂交瘤上清液中的对于IL-1R AcP和II型IL-1R有效的抑制性和非抑制性抗体，在以下四个测试中进行了筛选：1)对于抑制性抗体：[¹²⁵I]-IL-1β结合70Z/3和EL-4胸腺瘤细胞的抑制作用(下文说明)，2)对于非抑制性抗体：与II型IL-1R交联的[¹²⁵I]-IL-1β溶解复合体的免疫沉淀，3)对于特异于IL-1R AcP或II型IL-1R的抑制性抗体：[¹²⁵I]-IL-1β和[¹²⁵I]-IL-1α与表达重组体I型和II型IL-1R细胞结合的抑制作用，和4)消除任何特异于IL-1的抗体：[¹²⁵I]-IL-1α和[¹²⁵I]-IL-1β的免疫沉淀。通过有限的稀释克隆了分泌特异于II型IL-1R和IL-1R AcP的抗体的杂交瘤细胞系。根据厂商说明(Pharmacia)，在结合到琼脂糖凝胶4B快速流的蛋白质G上，用亲和层析法从大量杂交瘤培养物或腹水液中纯化抗体。培养的细胞和生物测定

如先前所述(Kilian等，J.Immunol.136：1，1986)保持小鼠EU-4.IL-2胸腺瘤细胞(TIB 181)和D10.G4.1(TIB 224)细胞。小鼠3T3L1(CL 173)和70Z/3前-B(TIB 158)细胞保持在600cm²皿中含有5％小牛血清的IMDM中。上述细胞从美国典型培养物收集中心获得，ATTC保藏号在括弧中。

在鼠D10增殖分析(Kaye等，J.Exp.Med.158：836，1983)中评估未标记的IL-1和[¹²⁵I]-IL-1蛋白质的生物活性。用[¹²⁵I]标记IL-1和纯化的单克隆抗体

如前所述(Kilian等，J.Immunol.136：1，1986；Gubler等，J.Immunol136：2492，1986)纯化重组鼠IL-1α、人IL-1α和人IL-1β，只不过鼠IL-1α在25mM Tris-HCl、0.4M Nacl中制备。蛋白质的测定是通过BCA蛋白分析(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)来进行。通过改进的Iodogen方法(Pierce Chemical Co.)用125I标记人IL-1α、人IL-1β、鼠IL-1α、鼠IL-1β和纯化的ZgG。Iodogen溶解于氯仿中，0.05mg在12×15mm硼硅酸盐玻璃试管中干燥。为进行放射标记，向含有0.05ml Tris-碘化的缓冲液(25mM Tris-HCl，pH7.5，0.4M NaCl，1mM EPDTA)的涂有Iodogen的试管中加入1.0mCi Na[¹²⁵I](Amersham，Chicaga，IL)并在室温下温育4分钟。激活的¹²⁵I溶液转移到含有0.05至0.1ml IL-1(5-13μg)或IgG(100μg)的Tris-碘化缓冲液的试管中，且反应物在室温下温育5-8分钟。温育完后，加入0.05ml Iodogen终止缓冲液(10mg/ml酪氨酸，10％Dulbecco′sPBS，pH 7.4中的甘油)，反应3分钟。然后混合物用1.0ml Tris-碘化缓冲液稀释，用于Bio-Gel P10DG脱盐柱(BioRad laboratories)上进行层析。柱子用Tris-碘化缓冲液洗脱，合并含有峰量标记蛋白的级分(1ml)，并用1％BSA在Tirs-碘化缓冲液中稀释至1×10⁸cpm/ml。TCA可沉淀放射性(10％TCA终浓度)一般是过量的95％总放射活性。放射特异活性对于纯化的抗体一般为2000至3500cpm/fmol，对于IL-1为3500至4500cpm/fmole。小鼠IL-1受体结合试验

通过先前描述的方法(Kilian等，J.Immunol.136：1，1986)测定放射标记的IL-1与悬浮培养基中生长的小鼠细胞的结合。简单地说，细胞在结合缓冲液(RPMI-1640，5％FBS，25mM HEPES，pH7.4)中冲洗一次，再悬浮于结合缓冲液中至细胞密度为1.5×10⁷个细胞/ml，并在4℃用各种浓度的[¹²⁵I]-IL-1(5-1000PM)孵育(1.5×10⁶个细胞)3-4小时。有放射性的细胞从游离的[¹²⁵I]-IL-1分离，分离的方法是将该分析的混合物在4℃通过0.1ml油混合物(Thomas Silicone Fluid 6428-R15：A.H.Thomas，and Sili cone Oil AR200：Gallard-Schlessinger的1∶2混合物)以10000×g离心90秒。切除含有细胞沉淀的管尖，并在γ计数计上测定有放射性的细胞。通过在该测定中包含50nM未标记的IL-1来测定非特异性结合。孵育重复两次或三次。受体结合数据是用非线性回归方程EBDA、LIGAND和Kinetic(Munson和Rodbard，Anal.Biochem 107：220，1980)，由Mc Pherson从EL Sevier-BIOSOFT而改编的IBM个人计算机程序(Mc Pherson，J.Phar macol.Methods14：213，1985)来进行分析。

放射碘化的IL-1蛋白与贴壁细胞的结合是通过在24孔或12孔板上、4℃、在摇荡器平板上的结合缓冲液(24)中将细胞和配体孵育4小时而完成的。然后单层细胞在4℃用结合缓冲液淋洗3次，用0.5ml 1％SDS加溶，并在γ计数器上计数释放的放射性。在50nM未标记的IL-1存在下测定非特异性结合。如上所述进行结合数据的分析。[¹²⁵I]标记的单克隆抗体与鼠细胞的平衡结合

鼠细胞在结合缓冲液(RPMI 1640，5％FBS，25mM Hepes，pH 7.4)中冲洗一次并再悬浮于结合缓冲液中至细胞密度为1.5×10⁷个细胞/ml。细胞(1.5×10⁶)与各种浓度的[¹²⁵I]特异性IgG(.005至2nM)在室温下孵育1.5-2小时。结合放射性的细胞用该分析混合物通过0.1ml聚硅氧烷油在4℃以10000×g离心90秒，使之从游离的[¹²⁵I]标记的抗体分离。切下含有细胞沉淀的管尖，在γ计数器上测定细胞结合放射性。通过在测定中包含100nM未标记抗体来测定非特异性结合。孵育重复进行两次或三次如上所述的用于IL-1与细胞结合的分析方法来分析受体结合数据。[¹²⁵I]-IL-1结合带有I型或II型IL-1受体鼠细胞的抗体介导的抑制作用

杂交瘤上清液、纯化的IgG、或抗血清抑制[¹²⁵I]-IL-1蛋白与带有IL-1受体的鼠细胞的结合能力测定如下：将连续稀释的培养上清液、纯化的IgG、或抗血清与在结合缓冲液(RPMI-1640，5％FBS，25mM Hepes，pH7.4)中的细胞(1-1.5×10⁶个细胞)混合，并在定轨摇床上在室温下孵育1小时。向各试管中加入[¹²⁵I]-IL-1(1×10⁵cpm；25pM)再在4℃孵育3-4小时。在该试验中包含50nM未标记IL-1，由此而测定非特异性结合。孵育重复进行两次或三次。如上所述，用离心的方法将测试液通过0.1ml油混合物而从游离[¹²⁵I]-IL-1中分离该带放射性的细胞。切下含有细胞沉淀的管尖，并在γ计数器上测定有放射性的细胞。对溶解的[¹²⁵I]-IL-1α/IL-1R复合体进行亲和性交联和纯化

使放射碘化IL-1蛋白与细胞发生亲和性交联的方法是按Riske等，J.Biol.Chem.266：11245，1991所说明的方法稍加改进而进行的。简单地说，在存在或不存在50mM未标记IL-1情况下，细胞(1.5×10⁷个细胞/ml)和放射标记的IL-1(60-300fmoles/ml)在4℃在结合缓冲液中孵育4小时。然后该细胞用冰冷的PBS，pH8.3(25mM磷酸钠，pH8.3，0.15M Nacl，1mMMgCl₂)冲洗，以5×10⁶个细胞/ml的浓度再悬浮于PBS，pH8.3中。加入辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)(Pierce化学公司)的二甲亚砜溶液至0.4mM的终浓度。在恒定搅动下在4℃持续孵育30-60分钟。该细胞用冰冷的25mM Tris-HCl，pH7.5，0.15M Nacl，5mM EDTA冲洗，并以0.5-1×10⁸个细胞/ml在增溶缓冲液(50mM磷酸钠，pH7.5，含有8mM CHAPS或1％Triton X-100，0.25M Nacl，5mM EDTA，40μg/ml苯甲磺酰氟，和0.05％NaN₃)中在4℃下增溶1小时。除垢提取物在120000×g下于4℃离心1小时，以去除细胞核和其它残渣。该提取物直接在8％预制凝胶(NOVEX)上用SDS-PAGE分析，接着放射自显影。或者，用与γ-结合G Plus(Pharmacia)结合的抗体使该提取物发生免疫沉淀。该沉淀的蛋白用Laemmli样品缓冲液(Laemmli，Nature 227：680，1970)处理而释放，用SDS-PAGE方法分离并用放射自显影法分析。

用稍加改进的上述方法制备作为免疫原的IL-1α/IL-1R的可溶性交联复合体。简要地说，将70Z/3细胞(0.5-1.0×10⁸个细胞/ml)与IL-1α(0.5至1.0nM)一起在4℃在结合测定缓冲液中孵育4小时。然后该细胞用冰冷的PBS，pH8.3冲洗，以5×10⁷个细胞/ml的浓度再悬浮于PBS，pH8.3中，并加入辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)(Pierce Chemical Co.)的二甲亚砜溶液，使其终浓度为0.4mM。在恒定搅动下在4℃持续孵育30-60分钟。该亲和交联过程的中止和该细胞的除垢增溶作用如上文所述。

为了纯化用作免疫原的可溶性IL-1α/IL-1R复合物。将70Z/3细胞的除垢提取物应用到固定在交联球化的琼脂糖上的山羊抗人IL-1α的亲和柱(10ml)(Affi-Gel 10，RioRad Laborafories)中。该山羊的抗人IL-1α亲和柱是根据厂商的说明以1mg/2gG/ml装载凝胶密度制备。施加除垢提取物后，用10柱体积没有Chaps或Trifon×-100的增溶缓冲液洗柱子直至280nM的吸收值在基线上。然后用3M硫代氰酸钾，25mM磷酸钠，pH7.5，5mMEDTA，40μg/ml苯甲磺酰氟，和0.05％NaN₃洗脱柱子。将从亲和柱上洗脱下来的蛋白质浓缩10至100倍并用于免疫。从鼠细胞加溶的蛋白质的免疫印迹分析

鼠70Z/3和EL-4细胞用冰冷的PBS冲洗3次，并在含有8mM CHAPS或含有1％Triton X-100和1mg/ml BSA的加溶缓冲液中在4℃加溶1小时。提取物在4℃以120000×g离心45分钟以去除细胞核和其它残渣。提取物与结合固定在交联琼脂糖上的蛋白质-G(γ结合G Plus，Pharmacia)的4C5(如实施例2所说明的获得的抗-IL-1R AcP)、 12A6(按照Chizzonite等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8029，1989中的说明而获得的抗I型IL-1R)或对照抗体一起孵育。沉淀的蛋白质通过用0.1M甘氨酸，pH2.3处理而释放；用3M Tris中和；与1/5体积5×Laemmli样品缓冲液混合；以及在8％预制丙烯酰胺凝胶(NOVEX)上用SDS/PAGE分离。分离的蛋白质在100伏下经16小时转移到在10mM Tris-HCl，pH8.3，76.8mM甘氨酸，20％甲醇和0.01％SDS中的硝基纤维素膜(0.2μm)上。用BLOTTO(50％W/V PBS中的脱脂干乳+.05％Tween 70)阻断硝基纤维素膜，在有和没有未标记4C5IgG(67nM)情况下用[¹²⁵I]-4C5IgG(1×10⁶cpm/ml，8mM CHAPS，PBS，0.25M NaCl，10％BSA和5mM EDTA)探测重复印迹。在COS细胞中表达鼠重组I和II型IL-1受体和IL-1R AcP，并测定[¹²⁵I]-标记的4C5、35F5和IL-1结合。

根据厂商说明，在BioRad Gene Pulser(250μF，250伏)中用表达重组鼠IL-1R蛋白质或IL-1R AcP的25μg质粒DNA通过电穿孔转染COS细胞(4-5×10⁷)。将该细胞铺在600cm²培养平板上，72小时后用No-Zyme(JRH Biologics)处理而收获该细胞，刮下，冲洗并再悬浮于结合缓冲液中。转染细胞(4-8×10⁴)与增加浓度的[¹²⁵I]-标记的4C5、35F5或IL-1蛋白质在4℃孵育3小时。如上文所述从游离[¹²⁵I]-标记的抗体或IL-1分离带放射性的细胞。70Z/3细胞在与IL-1反应中的卡巴轻链表达：由单克隆抗体35F5、4E2和4C5引起的抑制作用。

在有或没有100U/ml(0.19nM)人重组IL-1α或IL-1β的情况下，将70Z/3细胞(补充有10％FBS，β-巯基乙醇和庆大霉素在RPMI 1640中的1×10⁵/ml)孵育24小时或48小时。该细胞在加入IL-1之前，与30μg/ml指定的抗体在0.5ml总体积中预孵育1小时。向孔中加入另外0.5ml含IL-1的培养基或不含IL-1的培养基，使抗体终浓度为15μg/ml(100nM)。细胞在培养后冲洗一次，并用与FITC缀合的对照大鼠抗体或与FITC(Tago，Burlingame，Ca)缀合的大鼠抗鼠卡巴轻链抗体染色。然后在FACS can流动细胞计数器(Becton-Dickinson)上分析细胞的卡巴轻链表达。对IL-1应答中的鼠脾B细胞的增殖：由单克隆抗体35F5、4C5和4E2引起的抑制作用。

通过用抗-Thy1.2抗体和兔补体处理自C57BL/6小鼠分离的脾细胞，接着通过葡聚糖凝胶G10(Pharmacia)柱两个顺序的行程来纯化脾B细胞。在补加有10％FBS、β-巯基乙醇和庆大霉素的终体积为200μl RPMI1640培养基中，用山羊抗小鼠IgM(1μg/ml)(ZYMED)和二丁酰cAMP(10^-3M)处理B细胞(5×10⁵个细胞)。用和不用IL-1(100U/ml)和用和不用抗体35F5、4C5和4E2处理脾B细胞。在各种试剂存在下将该细胞孵育2天后用0.5μCi氚化了的胸苷脉冲，再孵育6小时并收获。在IL-1的应答中鼠D10.G4.1细胞的增殖：由单克隆抗体4C5和35F5和人IL-1ra引起的抑制作用

如所说明的方法(Kaye等，J.Exp.Med.158：836，1983；McIntyre等，J.Exp.Med.173：931，1991)保持D10.G4.1辅助T细胞，并按照先前所说明的方法(McIntyre等，J.Exp.Med.173：931，1991)用IL-1对该细胞进行刺激。细胞(1×10⁵，200μl)与0.2pM IL-1一起在含有5％FBS、β-巯基乙醇(5×10^-5M)、庆大霉素(8μg/ml)、2mML-谷氨酰胺、2.5μg/ml伴刀豆球蛋白A和指定浓度的抗体或人IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)的RPMI 1640中孵育。将该培养物孵育两天，用0.5μCi氚化了的胸苷脉冲，并在16小时后收获。IL-1对血清IL-6的体内诱导：由单克隆抗体35F5和4C5引起的抑制作用

如先前所述(McIntyre等，J.Exp.Med.173：931，1991)进行IL-1对血清IL-6的诱导。简要地说，C57BL/6小鼠在给与IL-1α或IL-1β(0.3μg/小鼠，皮下)之前4小时10分钟用250μg抗体预处理(腹膜内)。给与IL-1后2小时从小鼠体内采集血清，通过改进所述的B9杂交瘤细胞生物测定方法(Aarden等，Eur.J.Immunol.17：1411，1987)分析IL-6浓度。大鼠的抗小鼠IL-1辅助蛋白单克隆抗体4C5的制备、表征和传代如下：

实施例2特异于IL-1R AcP和II型IL-1R的单克隆抗体的制备、表征和鉴定

在制备II型IL-1受体抗体的过程中，检测到了该IL-1受体复合体的出乎意料的新成分的抗体。由于鼠70Z/3细胞几乎只表达II型IL-1R，用从这些细胞中溶解的纯化和交联的IL-1α/IL-1R复合体对大鼠的免疫接种是用来研制单克隆抗II型IL-1R抗体的最初策略。用这样的可溶性IL-1α/IL-1R复合体免疫接种大鼠产生的血清抗体阻断了[¹²⁵I]-IL-1β与70Z/3的结合，这表明存在阻断特异于II型IL-1R的抗体。该血清样品中也含有这样的抗体使由70Z/3细胞溶解的[¹²⁵I]-IL-1β/IL-1R复合体发生免疫沉淀，表明存在非阻断抗II型IL-IR抗体。[¹²⁵I]-IL-β用于IL-1R结合和免疫沉淀分析以去除特异于IL-1α而不是II型受体的抗体的鉴定。

从免疫的大鼠分离出的脾细胞融合产生的杂交瘤，对其进行筛选后的抗体能阻断IL-1β与70Z/3细胞(带有II型受体)和EL-4细胞(带有I型受体)两者结合。已鉴定出只阻断与70Z/3细胞结合的抗体并已从进一步分析中排除，因为它们是II型IL-1R的抗体；已鉴定出只阻断与EL-4细胞结合的抗体并也从进一步分析中排除，因为它们是I型IL-1R的抗体。阻断IL-1结合两种细胞类型的抗体对于IL-1R AcP是特异性的。

从起始融合物中鉴定了阻断IL-1β结合70Z/3细胞的七种抗体(表1)。其中的六种(2B5、4C5、3F1、4C4、24C5和4D4)阻断IL-1β结合70Z/3和EL-4细胞两者。这些抗体不阻断IL-1β与表达鼠重组I型IL-1R的CHO细胞进行结合，因此对IL-1R AcP是特异性的。一种抗体，4E2，只阻断IL-1β与70Z/3细胞结合，表明它对于II型IL-1R是特异性的。

从起始融合物中也筛选既特异于IL-1R AcP也特异于II型IL-1R的非阻断性抗体。八种抗体(1D2、2D6、2E6、1F6、2D4、2F6、3F5和4A1)免疫沉淀从70Z/3细胞溶解的IL-1β/IL-1R复合体(表2)。这些抗体也免疫沉淀从具有鼠细胞系的另外两种II型IL-1R，AMJ 2C11和P388D1中溶解出来的IL-1β/IL-1R复合体。这些抗体中的七种也免疫沉淀从EL-4细胞中溶解出的IL-1β/IL-1R复合体，证明它们识别IL-1RAcP。一种抗体，1F6，不结合从EL-4细胞溶解的IL-1β/IL-1R复合体，表明其是非阻断II型IL-1R抗体。

为了证明这些抗体不结合I型IL-1R，在用鼠可溶性I型IL-1R的免疫沉淀测试中对其进行试验(表2)。这些抗体都不免疫沉淀与重组可溶I型IL-1R(¹²⁵I-sMsR[bv])交联的[¹²⁵I]-IL-1β复合体。它们也不免疫沉淀在杆状病毒/昆虫细胞表达系统或在COS细胞表达系统中产生的[¹²⁵I]-标记的可溶性I型受体(表2)。

因为大鼠是用可溶性IL-1α/IL-1R复合体免疫接种，也在大鼠血清中检测到识别IL-1α的抗体。在用[¹²⁵I]-标记的鼠和人IL-1蛋白质的免疫沉淀测试中试验每一单克隆抗体，证明它们不结合IL-1。所有15种抗体(表1和表2)在这些测试中呈阴性。

表1抑制性抗-IL-IR AcP抗体的鉴定
表1抑制性抗-IL-IR AcP抗体的鉴定									单克隆抗体
抑制性测试¹7OZ/3(II型 IL-1R)AMJ2C11(II型 IL-1R)P388D1(II型 IL-1R)EL-4(I型 IL-1R)CHO(鼠I型 IIL-1R)	2B5++NDND+-	4C5+++++++-	3F1++NDND+-	4C4++NDND+-	24C5++NDND+-	4D4++NDND+-	4E2++NDND--		单克隆抗体
	2B5++NDND+-	4C5+++++++-	3F1++NDND+-	4C4++NDND+-	24C5++NDND+-	4D4++NDND+-	4E2++NDND--	配体免疫沉淀测试²rHuIL-1αrHuIL-1βrMuIL-1α	---	---	---	---	---	---	---

1.被抗体抑制的[¹²⁵I]-IL-1β与细胞系，70Z/3、AMJ2C11、P388D1、EL-4和CHO(鼠I型IL-1R)的结合，在实施例1中说明。2.[¹²⁵I]-标记的重组IL-1蛋白的免疫沉淀作用在实施例1中说明。3.rHuIL-1α＝人重组IL-1α。rHuIL-1β＝人重组IL-1β。rMuIL-1α＝鼠重组IL-1α。4.+.+和+；抗体阻断[¹²⁵I]-IL-1β结合。5.-；抗体在测试中呈现阴性。

表2非抑制性-IL-1RAcP抗体的鉴定
表2非抑制性-IL-1RAcP抗体的鉴定										单克隆抗体
配体免疫沉淀¹rHuIL-1αrHuIL-1βrMuIL-1α	1D2---	2D6---	2E6---	1F6---	2D4---	2F6---	3F5---	4A1---		单克隆抗体
配体免疫沉淀¹rHuIL-1αrHuIL-1βrMuIL-1α	1D2---	2D6---	2E6---	1F6---	2D4---	2F6---	3F5---	4A1---	交联复合体的免疫沉淀²70Z/3(II型 IL-1R)AMJ2C11(II型 IL-1R)P388D1(II型 IL-1R)EL-4(I型 IL-1R)sMuI型 IL-1R(bv)³	++++-	++++-	++++-	+++--	++++-	++++-	++++-	++++-
直接免疫沉淀测试4[¹²⁵I-sMuIL-1R(bv)][¹²⁵I-sMuIL-1R(Cos)]	--	--	--	--	--	--	--	--		++++-	++++-	++++-	+++--	++++-	++++-	++++-	++++-

1.如表1中所述。2.自指定细胞系溶解的[¹²⁵I]-I-IL-1β/IL-1R的复合体的免疫沉淀。3.与在杆状病毒系统中表达的可溶性鼠I型IL-1R发生亲和性交联的[¹²⁵I]-IL-1β复合体的免疫沉淀。4.在杆状病毒[¹²⁵I-sMuIL-1R(bv)]或COS细胞[¹²⁵I-sMsR(COS)]表达系统中表达的[¹²⁵I]-标记的可溶性I型IL-1R的免疫沉淀。

实施例3通过与抗-I型(35F5)、II型(4E2)和辅助蛋白(4C5)单克隆抗体的反应性表征鼠IL-R1s和IL-1R AcP

上文所述抗体的初次鉴定和表片后，4C5，一种推断的阻断IL-1RAcP(IL-1R AcP)抗体，和4E2，一种阻断II型IL-1R抗体，被选作进一步研究IL-1R AcP的探针。一种先前鉴定并表征的抗-I型IL-1R抗体，35F5，也包括在本项研究中(Chizzonite等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA86：8029，1989；McIntyre等，J.Exp.Med.173：931，1991)。

这三种抗体用来鉴定各种鼠细胞上I型和II型IL-1R以及IL-1R AcP的存在。使用[¹²⁵I]-标记的mAb 4C5的平衡结合试验，证明了在主要带有I型(EL-4细胞)或II型(70Z/3细胞)受体的鼠细胞上存在IL-1R AcP(图1和2)。其它主要带有I型(3T3L1细胞)或II型(P388D1细胞)受体的细胞也表达IL-1R AcP(表3)。不表达I型或II型IL-1R AcP的细胞(S49.1)不表达IL-1R AcP，表明IL-1R和IL-1R AcP表达之间的联系。在其初始鉴定中，mAb 4C5阻断[¹²⁵I]-人IL-1β结合EL-4和70Z/3细胞两者。进一步的研究表明，mAb 4C5也抑制放射标记的人IL-1α(图3)鼠IL-1α与IL-1β与70Z/3细胞的结合(表4)。与其对[¹²⁵I]-人IL-1β结合EL-4细胞的抑制作用相似，4C5也阻断[¹²⁵I]-鼠IL-1β结合这些细胞(表4)。

表3放射标记的IL-1，4C5和4E2对主要表达I型或II型IL-1R的鼠细胞的平衡结合
表3放射标记的IL-1，4C5和4E2对主要表达I型或II型IL-1R的鼠细胞的平衡结合												配体	细胞系
	EL-4⁷		S49.1⁸	3T3LI⁷		70Z/3⁴		P388DI⁴		COSII⁴		配体	细胞系
	EL-4⁷		S49.1⁸	3T3LI⁷		70Z/3⁴		P388DI⁴		COSII⁴		[¹²⁵I]-IL-1¹	KD²	S/C ³		K_D	S/C	K_D	S/C	K_D	S/C	K_D	S/C
rMuIL-1αrHuIL-1αrHuIL-1β	.05.05.1	120012001200	NSB⁵	.008	1640	.2	1500	.19	380	.21.33	19501200	[¹²⁵I]-IL-1¹	KD²	S/C ³		K_D	S/C	K_D	S/C	K_D	S/C	K_D	S/C
rMuIL-1αrHuIL-1αrHuIL-1β	.05.05.1	120012001200	NSB⁵	.008	1640	.2	1500	.19	380	.21.33	19501200	[¹²⁵I]-4C5	1.2	2800	NSB	.93.61	1920014200	1.4	3000	.77	1870	NSB
[¹²⁵I]-4E2	NSB		NSB	NSB		1.2	1900	ND		ND		[¹²⁵I]-4C5	1.2	2800	NSB	.93.61	1920014200	1.4	3000	.77	1870	NSB

1.IL-1蛋白质的缩写如表1所示。2.K_D＝平衡解离常数(nM)。3.S/C＝每个细胞的结合位点。4.表达鼠天然或重组II型IL-1R的细胞。5 NSB＝没有放射标记的配体的特异性结合。6.ND＝没有测定。7.表达鼠天然I型IL-1R的细胞。8.不表达鼠I型或II型IL-1R的细胞

但是，4C5不阻断放射标记的人IL-1α(图4)或鼠IL-1α(表4)结合EL-4细胞。而且4C5不阻断[¹²⁵I]-标记的IL-1蛋白对表达鼠重组I型或II型受体的CHO或COS细胞的结合。无论受体是否为天然或重组形式，抗I型受体抗体，35F5，和抗II型受体抗体，4E2，均抑制IL-1α和IL-1β两者结合它们各自的IL-1受体(表4)。对4C5介导的IL-1结合EL-4和/70Z/3细胞的抑制作用的IC50，至少比对结合表达重组I型或II型受体的细胞的抑制作用的IC₅₀低1000倍(表5)。这些IC₅₀数据给出两个结论：1)mAb 4C5与I型或II型IL-1R没有任何明显程度的交叉反应，和2)4C5阻断IL-1β而不阻断IL-1α结合天然IL-1R的能力的不同与抗体的亲和性不相关。

实施例4测定单克隆抗体4C5识别的IL-1R AcP的大小

EL-4细胞上由mAb 4C5识别的细胞表面蛋白质的分子量大小用亲和层析和免疫印迹测定大约是90kDa(图5)。从EL-4细胞制备的除垢提取物在扁豆凝集素亲和基质上纯化，接着在抗I型受体抗体(7E6)、鼠IL-1α(Ma)或4C5亲和性凝胶上亲和层析。从各亲和柱上洗脱下来的蛋白质用Laemmli样品缓冲液处理，在8％凝胶上用SDS-PAGE分离并转移到硝基纤维素膜上。固定在硝基纤维素上的蛋白质用[¹²⁵I]-4C5探测，并通过放射自显影鉴定免疫活性带。～90kDa的主要蛋白质和55kDa的少量蛋白质与放射标记的4C5有免疫反应性。如果EL-4提取物直接在4C5亲和基质上纯化，则这两种蛋白质也在免疫印迹上被鉴定。这些数据表明天然的糖基化的IL-1RAcP的表观分子量是～90kDa，而蛋白酶解过程可能将其大小减小至～55kDa。

表4抗受体抗体对IL-1蛋白质与鼠IL-1受体的不同亚型和形式的结合的抑制作用
表4抗受体抗体对IL-1蛋白质与鼠IL-1受体的不同亚型和形式的结合的抑制作用						IL-1s	I型			II型
天然	重组		天然	重组			I型			II型
天然	重组		天然	重组	EL-4⁴		CHO⁶	可溶⁷	70Z/3⁵	COS⁸
由35F5引起的抑制作用(抗I型)MuIL-1αMuIL-1βHuIL-1αHuIL-1βHuIL-ra	+¹+++50％	++++ND	+ND+++	-----	EL-4⁴		CHO⁶	可溶⁷	70Z/3⁵	COS⁸	-ND-NDND
由35F5引起的抑制作用(抗I型)MuIL-1αMuIL-1βHuIL-1αHuIL-1βHuIL-ra	+¹+++50％	++++ND	+ND+++	-----	由4C5引起的抑制作用(抗辅助蛋白)MuIL-1αMuIL-1βHuIL-1αHuIL-1βHuIL-1ra	-+-+-	----ND	-ND-NDND	++++ND	-ND--ND	-ND-NDND
由4E2引起的抑制作用(抗II型)MuIL-1αMuIL-1βHuIL-1αHuIL-1β	----	NDNDNDND	NDNDNDND	++++	由4C5引起的抑制作用(抗辅助蛋白)MuIL-1αMuIL-1βHuIL-1αHuIL-1βHuIL-1ra	-+-+-	----ND	-ND-NDND	++++ND	-ND--ND	+ND+ND

1. +和-；在0.1mg/ml时，抗体分别阻断100％和少于10％的IL-1的结合。2.MuIL-1α和mu IL-1β分别等于鼠IL-1α和IL-1β。3 HuIL-1α、Hu IL-1β和HuIL-1ra分别等于人IL-1α、IL-1β、和IL-1ra。4.鼠EL-4细胞大约表达2000I型IL-1R/细胞和未测定数目的II型IL-1R。5.鼠70Z/3细胞大约表达2000II型IL-1R/细胞和未测定数目的I型IL-1R。6.在CHO细胞中表达的重组全长I型IL-1R。7.在杆状病素系统中表达的重组I型IL-1R胞外结构域。8.在COS细胞中表达的重组II型IL-1R。

表5由抗受体抗体引起的对IL-1结合不同IL-1受体的抑制作用
表5由抗受体抗体引起的对IL-1结合不同IL-1受体的抑制作用									抗体	IC₅₀(μg/ml)
I型				II型						IC₅₀(μg/ml)
I型				II型				天然¹		重组体²		天然¹		重组体²
EL-4		70Z/3						天然¹				天然¹
EL-4		70Z/3		HuIL-1α³	HuIL-1β⁴	HuIL-Iα	HuIL-1β	HuIL-1α	HuIL-1β			HuIL-1α	HuIL-1β
35F5(抗I型)4E2(抗II型)4C5(抗辅助蛋白)	.0001＞100＞100	.0015＞10013	＜1＞100＞100	HuIL-1α³	HuIL-1β⁴	HuIL-Iα	HuIL-1β	HuIL-1α	HuIL-1β	＜1＞100＞100	＞100132	HuIL-1α	HuIL-1β	＞1002534	ND2＞100	NDND＞100
35F5(抗I型)4E2(抗II型)4C5(抗辅助蛋白)	.0001＞100＞100	.0015＞10013	＜1＞100＞100	1.用于抑制测定中的天然I型(EL-4细胞)和II型(70Z/3细胞)IL-1R的来源。2.重组I型或II型IL-1R在CHO或COS细胞中表达。3在测定中作为配体的[¹²⁵I]-HuIL-1α。4在测定中作为配体的[¹²⁵I]-HuIL-1β。										＞1002534	ND2＞100	NDND＞100

实施例5单克隆抗体4C5对IL-1β生物活性的中和作用

在三个生物测试中证明了在剂量依赖方式中mAb 4C5中和IL-1β生物活性的能力：1)IL-1诱导鼠脾B细胞的增殖，2)IL-1诱导D10.G4.1辅助T细胞的增殖，和3)IL-1诱导在70Z/3细胞中的卡巴轻链的表达。MAb 4C5证明了是IL-1β而不是IL-1α诱导脾B细胞增殖的剂量依赖性抑制作用(图6)。与mAb4C5相反，抗I型受体抗体35F5阻断IL-1α和IL-1β两者诱导B细胞的增殖。抗II型IL-1R抗体4E2不抑制IL-1α或IL-1β诱导的增殖。以相似的方式，mAb 4C5抑制IL-1α而不是IL-1β诱导D10.G4.1T细胞的增殖(图7)。mAb 35F5和人IL-1ra两者阻断IL-1α和IL-1β诱导的D10.G4.1细胞的增殖。mAb 4C5也阻断IL-1β而不是IL-1α诱导的70Z/3细胞上卡巴轻链的表达(图8)。在该测试中抗体35F5阻断IL-1α和IL-1β两者诱导的作用，而识别II型IL-1R的mAb 4E2是非活性的。对于这些测试，抗体或IL-1ra对IL-1活性的中和是以生物应答中剂量依赖性降低而检测的。应答中的阻断，依据抗体的效力，可以是100％抑制(即相当于没有IL-1加入)或抑制至较低水平。

实施例6单克隆抗体4C5对体内IL-1β生物活性的抑制

施用了IL-1的小鼠的血清中IL-6浓度呈现戏剧般的快速增长。血清IL-6增长的大小取决于IL-1剂量，并且可以被干扰IL-1结合I型IL-1R的因素所阻断。当在该IL-1生物模型中试验时，4C5被IL-1β而不是IL-1α阻断大约90％，引起血清IL-6的增加(图9)。抗I型IL-1R抗体35F5阻断IL-1α和IL-1β两者诱导的血清IL-6的增加。一种对照mAb X-7B2没有抑制性效果。

实施例7使用Mab 4C5的小鼠(鼠)IL-1R AcP的表达克隆RNA的提取

收获3T3-LI细胞，并根据说明(P.Chom-czynski和N.Sacchi，Anal.BioChem.162：156，1987)用异硫氰酸胍盐/苯酚提取全部的RNA。根据说明(K.Kuribayashi等，Nacl.Acids Res.Symposium Series 19：61，1988)通过一次成批吸附将聚A⁺RNA从全部RNA中分离成寡dT乳胶小球。该纯化过程中聚A⁺RNA的质量产率大约是6％。在变性条件下和2.2M甲醛存在时，有1.0％琼脂糖凝胶中通过分级分析RNA制剂的整合度(分子克隆，实验室手册，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Man latis，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。3T3-L1 cDNA文库构建

在哺乳动物表达载体pEF-BOS中(Mizushima和Nagata，Nacl.Acids Res.18：532，1990)由上述聚A⁺RNA建立一个cDNA文库。用RNaseH^-逆转录酶(GIBCOBRL Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)逆转录10μg聚A⁺RNA。通过已建立的方法(Gubler和Chua：基础分子生物技术，第二卷，T.A.Brown，editor，PP.39-56，IRL Press 1991)，将所得mRNA-cDNA杂交体转化成平头双链cDNA。 BstXI接头(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)84：8573，1987)连接到所得的cDNA，且通过经Sephacryl SF 500柱选择大于1000个碱基对(bp)的分子。将Sephacryl SF 500柱(0.8×29cm)重力填充10mM Tris-HCl pH7.8/1mM EDTA/100mM乙酸钠。将BstXI接头处理的cDNA加到柱上，并收集0.5ml级分。在1.0％琼脂糖凝胶中分级各级分的小等份。真空干燥凝胶，通过将凝胶曝露于X-射线膜而且测放射性cDNA的大小分布。收集含cDNA分子＞1000bp的级分并合并。cDNA通过乙醇沉淀而浓缩并连接到克隆载体。该克隆载体是已用BstXI限制酶消化的质粒pEF-BOS，并通过两个串联的琼脂糖凝胶纯化。在150μl连接缓冲剂(50mM Tris-HCl，PH7.8/10mM MgCl₂/10mM DTT/1mMrATP/25mg/ml牛血清白蛋白)中将375ng质粒DNA连接到来自上面的18.75ng大小选择的cDNA，在15℃反应过夜。第二天用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取连接反应液。在5μg牡蛎糖原存在下用乙醇沉淀核酸。沉淀物溶解于水，再用乙醇沉淀，接着用70％乙醇洗涤。所得最终沉淀物溶解于14μl水，并将1μl小份电穿孔到大肠杆菌菌株DH-10B(GIBCO-BRL)。通过这种方法产生了大约4×10⁶个重组体的文库。通过用单克隆抗体4C5淘选来筛选鼠IL-1受体辅助蛋白(muIL-1RAcP)cDNA

该淘选方法先前已有说明(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：8573，1987)。将10份来自各代表大约5×10⁴克隆的3T3-IL库的样品铺在含100μg/ml氨苄青霉素(amp)的LB琼脂平板上，在37℃生长过夜。第二天，将每一池中的菌落从平板上刮到分开的50ml等份的LB+amp中，培养物在37℃再生长2-3小时。接着质粒DNA用QIAGEN质粒盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)提取。然后通过DEAE葡聚糖技术用10个分开的DNA集液来转染COS-7细胞(5μg DNA/2×10⁶个细胞/9cm直径的皿)(分子克隆，实验室手册，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989)。转染72小时后，用0.5mM EDTA/0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)从平板上解吸COS细胞。由各集液制备单个细胞悬浮液。抗-muIL-1R AcP mAb 4C5在冰上与细胞结合1小时[(10μg/ml 4C5 mAb于3mlPBS/0.5mM EDTA/0.02％叠氮化钠/5.0％牛胎血清(FCS)]通过溶于上述缓冲液中的6ml的2％菲可，将3ml细胞-mAb悬浮液离心(～300×g，5分钟)，以去除未结合的mAb。将细胞小心悬浮于上述缓冲液中。来自各集液的细胞接着被加到单个细菌平板(9cm直径)上，该平板已包被有多克隆山羊抗大鼠IgG(20μg/ml，50mM Tris-HCl，pH9.5，室温，1.5小时)，并用PBS/1％BSA在室温下阻断过夜。轻微摇摆下使COS细胞在室温下置于细菌平板上2-3小时。用PBS冲洗，小心去除未粘着细胞。剩余的细胞通过加入0.8mlHirt裂解溶液(0.6％SDS/10mM EDTA)而裂解。将裂解液转移到1.5ml Eppendorf试管中并加入1M NaCl，在冰上孵育过夜，并在4℃以1500×g离心15分钟。上清液用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取一次，加入10μg牡蛎糖原，加入0.5体积7.5MNH₄OAc和2.5体积乙醇沉淀DNA两次。沉淀物用70％乙醇冲洗，干燥，并悬浮于1μlH₂O中。然后将每一淘选的DNA集液电穿孔到大肠杆菌菌株DH-10B中。电穿孔后，每一集液的5×10⁴个菌落如上所述生长，并如上述分离质粒DNA。该DNA代表该库的一轮淘选富集。总共三轮淘选，完成了使十个库集液充分分开。

第三轮淘选后，通过DEAE葡聚糖方法用十个集液中的每一个来转染COS细胞(1μg DNA/2×10⁵个细胞/孔，6孔COStar皿)。转染72小时后，通过用第二抗体包被的聚苯乙烯小球(Dynal Inc.，Great Neck，NY)进行花结来对集液筛选表达muIL-1R AcP的COS细胞。轻微摇摆下，在室温下，4C5mAb在PBS/2％FCS(2μg Ab/孔)中与转染的COS细胞结合1.5小时。去除抗体，细胞用PBS/2％FCS冲洗。加入1mlPBS/2％FCS/1μl山羊抗大鼠IgG包被的聚苯乙烯小球(～4×10⁵Dynabeads M-450)，并在轻微摇摆下在室温下孵育1.5小时。去除小球，细胞用PBS冲洗5-10次。然后通过在95％乙醇/5％乙酸中孵育固定细胞，并在显微镜上检查花结。发现十个集液中的一个(淘选集液#2)对于表面表达muIL-1R AcP是阳性的。

为鉴定阳性克隆，将100μlLB+amp置于两个96孔微量滴定平板的孔中，然后用来自#2淘选集液中的4个各个菌落接种每个孔。使细菌细胞在37℃下生长5-6小时。将来自每一平板的8行和12列的每一孔中的10μl等份样品合并成集液，保持各行和列分开。这些集液的每一个用来接种LB+amp中分开的5ml培养物，并在37℃生长过夜。第二天用QIAGEN质粒盒分离质粒DNA。每一DNA制剂代表来自#2淘选集液的48(行)或32(列)各分离物的集液。各微量滴定集液如上所述用来在6孔平板上转染COS细胞，并且在转染后72小时，如上所述对细胞筛选Dynabeads花结。发现两个阳性集液来自微量滴定平板中的一个，一个来自E行，一个来自2列。从列和行的交叉处的孔(E2孔)的中提取10ml份样品并平铺到LB琼脂+amp。过夜孵育后，40个单个菌落各自用来接种5mlLB+amp培养物。用QIAGEN质粒盒从这些培养基中分离质粒DNA。每质粒分离物用xbaI限制酶消化，释放cDNA插入物，并在1.0％琼脂糖凝胶上分级。分析表明只有三种大小的cDMA插入物存在于阳性微量滴定集液中。如上所述用三种质粒的每一个的单一代表在6孔板中转染COS细胞，通过用Dynabeads花结来筛选。用该方法鉴定出编码4C5反应性muIL-1R AcP的单一cDNA克隆(E2-K)。muIL-1R AcP cDNA的表征

首先通过对限制酶制图来表征cDNA克隆E2-K(pEF-BOS/muIL-1R AcP)。用xbaI消化该克隆释放-3.2千碱基对(kb)cDNA插入片段。该3.2kbxbaI片段是凝胶纯化的，并用ABI自动DNA测序仪与热稳定DNA聚合酶一起，且用染料标记的二脱氧核苷酸作为终止子来测定两个链的DNA序列。该DNA序列在5-引发半克隆中释放开放的读框(ORF)(参见下文)。用Intelligenetics计算机软件对限制酶的制图表明，在ORF中有一个1.4kb PstI限制片段。该1.4kb片段是凝胶分离的并用作鉴定另外的muIL-1R AcPcDNA克隆的探针。如上所述将大约6×10⁵来自先前说明的3T3-LIcDNA库的另外的克隆铺制平板。移取菌落(分子克隆，实验室手册，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)，且移取物用[³²P]-dCTP标记的1.4kb PstI限制片段，通过使用多引发DNA标记系统(Amer sham Co.Arliagton Heights，IL)的随机引发来探测。用这一方法，分离了两种另外的同源cDNA克隆。根据xbaI消化的测定，一个含有-1.0kb插入片段，另一个含-4.3kb插入片段。如上测定的4.3kb插入片段的DNA序列来证实muIL-1R AcP ORF的序列。muIL-1R AcP cDNA克隆的序列分析

muIL-1R AcP cDNA插入片段中开放读框的核苷酸序列见图10A。[SEQ ID NO：4]。该开放读框(ORF)由编码570个氨基酸的蛋白质的1710bp组成。该氨基酸序列，见图10B[SEQ ID NO：6]，预测了在Ala-1之后切割的20个氨基酸NH2-末端信号肽、自Ser1-Glu 339的胞外结构域、自Leu 340-Leu 363的疏水跨膜结构域和自Glu 364至COOH-末湍的胞质尾区。7个潜在的N-连接糖基化位点都包含在胞外结构域中。

应用Intelligenetics计算机程序用蛋白质序列进行数据库检索表明，muIL-1R AcP与来自鼠、人、鸡和大鼠的IL-1I型和IL-1II型受体两者都具有显著的同源性。对各蛋白质的同源性大约是25％，且在蛋白质序列中均匀分布。muIL-1R AcP的氨基酸序列的进一步分析表明其是免疫球蛋白超家族中的一员。保留在全部IL-1受体的胞外结构域中且对生成三个类IgG功能区起作用的三对半胱氨酸残基优选保留在muIL-1R AcP中。

实施例8Mab 4C5结合在COS细胞中表达的鼠重组IL-1R AcP。

为了证明muIL-1R AcP的cDNA编码与mAb 4C5反应的蛋白质，使重组muIL-1R AcP在转染的COS细胞上表达，并检验[¹²⁵I]-4C5的同向结合。通过标准技术用pEF-BOS/muIL-1R AcP对COS细胞电穿孔。电穿孔后，细胞以2-3×10⁵个细胞/孔接种到6孔组织培养板上。生长48-72小时后移取培养基，每孔中只加入含有1×10⁶cpm[125I]-4C5的1ml结合缓冲液(RPMI/5％FCS)(总结合)或者在存在2μ g未标记4C5作为冷抑制剂的情况下向每孔中加入含有1×10⁶cpm[¹²⁵I]-4C5的1ml结合缓冲液(RPMI/5％FCS)(非特异性结合)。总结合和非特异性结合两者均进行两次。在4℃孵育3小时后，去除结合缓冲液，该细胞用PBS冲洗三次。然后将细胞通过加入0.75ml0.5％SDS而裂解，收集裂解液并测定结合计数。从总数中减去非特异数计算出特异性结合。8％非特异结合背景下的特异计数大约是30 000cpm/孔，表明pEF-BOS/mu IL-1R AcP定向COS细胞中4C5免疫反应蛋白质的表达。

在COS细胞中表达的重组muIL-1R AcP的大小是通过用[³⁵S]一蛋氨酸对转染的COS细胞的代谢标记和用mAbs 4C5或2E6对标记的muIL-1RAcP的免疫沉淀而测定(表2)。用pEF-BOS/muIL-1R AcP电穿孔36小时后，取出培养基，COS细胞用无蛋氨酸的培养基[DMEM(高含量葡萄糖，无蛋氨酸-GIBCO-BRL)/10％FBS/1mM L-谷氨酰胺/1mM丙酮酸钠)]冲洗一次。加入新鲜的无蛋氨酸的培养基，在37℃孵育5-8小时后，对每毫升培养基加入50-100μCi³⁵S-蛋氨酸，并继续孵育24小时。然后取出培养基，细胞用冷的PBS冲洗2次。通过加入RIPA缓冲液(0.5％NP-40，0.5％Tween-20，0.5％脱氧胆酸盐，420mM NaCl，10mM KCl，20mM Tris pH7.5，1mM EDTA)来溶解细胞，并在冰上孵育15分钟。溶解物转移到试管中并以15000×g离心15分钟。通过向500μl细胞溶解液中加入40μlγ结合的G琼脂糖凝胶(50％V/V，RIPA缓冲液)(Phar-macia Biotech Inc.，Piscataxay，NJ)并在4℃下孵育过夜而使细胞溶解液预澄清。第二天在微量管中将预澄清的细胞溶解液离心30秒，并将细胞溶解液移至干净的试管中。另一份40μlγ结合G琼脂糖凝胶与20μg mAb 4C5或2E6(表2)一起加入，且在旋转下在4℃将免疫沉淀孵育3小时。将琼脂糖凝胶-Ab复合物离心沉降下来，并用RIPA缓冲液冲洗一次，用50mM HEPES pH7.9/200mMNaCl/1mM EDTA/0.5％NP-40冲洗一次，用25mM Tris pH 7.5/100mMNaCl/0.5％脱氧胆酸盐/1.0％Triton×-100/0.1％SDS冲洗一次。加入20μl2×Laemmli样品缓冲液(Laemmli，Nature 227：680，1970)使蛋白质从小球上释放出来。蛋白质通过在Tris-甘氨酸PAGE中电泳而分离并用放射自动显像目测。如图11所示，用mAb 4C5或2E6从转染的COS细胞中免疫沉淀出的重组muIL-1R AcP以70-90 kDa的宽泳带迁移。没有蛋白质从模拟转染的COS细胞中沉淀。

实施例9重组IL-1R AcP在COS细胞中的表达：与[¹²⁵I]-标记的IL-1蛋白质和单克隆抗体的反应性

测定了重组IL-1R AcP对于[¹²⁵I]-标记的IL-1、4C5和4E2的结合特征(图12)。根据[¹²⁵I]-4C5结合测定的数据显示重组IL-1RAcP[COS(4C5)]的高水平表达，但当与对照转染的COS细胞[COS(PEF-BOS)]比较时[¹²⁵I]-人IL-1α结合没有增长。为了比较，根据[¹²⁵I]-35F5结合测定的COS细胞[COS(mu-IL-1R)]中鼠重组I型受体的高水平表达伴随相应的放射标记的人IL-1β和IL-1α结合的增长(图13)。

实施例10从EL-4细胞中纯化天然的鼠IL-1受体辅助蛋白(IL-1R AcP)

鼠EL-4细胞(100gm)溶解在1升含有8mM CHAPS、5mM EDTA和蛋白酶抑制剂胃酶抑制剂(10μg/ml)、亮抑酶肽(10μg/ml)、苯甲脒(1mM)、抑肽酶(1μg/ml)和PMSF(0.2mM)的PBS中。以100000×g离心去除不溶物质后，将上清液以0.8ml/分钟的速度加到50ml麦胚凝集素(WGA)琼脂糖柱(Vector Laboratories，Inc.)上。柱子用平衡缓冲液(PBS，8mM CHAPS，5mMEDTA)冲洗后用含有0.5M NaCl的平衡缓冲液冲洗，用含有8mM CHAPS和0.3M N-乙酰基-D-葡糖胺的PBS洗脱结合的蛋白质。

从三个WGA琼脂糖柱洗脱得到的糖洗脱级分被合并装载到用含有8mM CHAPS的PBS以1ml/分钟平衡的5ml免疫亲和柱中[mAb 4C5抗体通过dimethyl pimelimidate交叉连接到蛋白质G琼脂糖(Stern，A.S.和Podlaski，FJ.，蛋白质化学中的技术IV，R.H.Anyeletti，ed.，pp.353-360，Academic Press，N.Y，1993)]。该柱子用平衡缓冲液，接着用含有1M NaCl的平衡缓冲液冲洗。用含有8mM CHAPS的50mM二乙胺缓冲液洗脱结合的蛋白质。含有IL-1R AcP的级分对含有4mM CHAPS的PBS透析并浓缩。

通过用mAb 4C5的SDS-PAGE/免疫印迹分析监测所有柱级分是否存在IL-1R AcP。在8-1 6％梯度凝胶(Novex)上进行SDS-PAGE，根据说明(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350，1979)将蛋白质转移到硝基纤维素上。用含有150mM NaCl₂和0.01％硫柳汞(pH7.5)的50mM Tris中的2.5％酪蛋白阻断硝基纤维素后，印迹与mAb 4C5(5μg/ml)孵育，接着与HRP-缀合的山羊(Fab)₂抗大鼠抗体(Tago Immunologicals)孵育。印迹用ECL系统(Amersham Life Science)展开。

最终蛋白质制剂的氨基酸组成(Hollfelder等，蛋白质化学期刊，12：435，1993)见表6；其与从cDNA克隆[SEQ ID NO：1]推导的蛋白质序列[SEQ IDNO：3]预计的组成相似(图16)。剩余的样品进行SDS-PAGE，转移到PVDF膜(Matsudaira，J.Biol Chem.262：10035，1987)并用考马斯兰R-250染色。染色的蛋白质带在80kDa(其与4C5抗体有免疫反应性)用NH₂末端序列分析法对其进行分析(Hollfelder等，J.Protein Chem.12：435，1993)。获得两个序列(每次循环1-3pmole的每一种氨基酸)，其中一个序列匹配由鼠IL-1R AcP表达克隆获得的推导的蛋白质序列的残基1-12(SER XDDWXLDTM)(图10B)。

根据用4C5抗体的免疫印迹分析测定，尽管由EL-4细胞溶解的IL-1R AcP具有Mr＝80kDa，但预计来自cDNA序列的蛋白质的分子量是66kDa。这一明显的差异可能是由于辅助蛋白的糖基化作用。为证明这一观点，用亲和纯化的IL-1R AcP进行SDS-PAGE，考马斯兰染色色相应于80kDa，4C5免疫反应性蛋白从凝胶中洗脱并用三氟甲磺酸进行化学去糖基化(Edge等，Anel.Biochem.118：131，1981)。去糖基化蛋白以Mr＝63-64kDa在SDS-PAGE中迁移，该值恰好与由cDNA序列预计的分子量相吻合。

实施例11分离人IL-1受体辅助蛋白的基因组克隆通过交叉杂交进行筛选

用鼠IL-1R AcP的序列通过交叉杂交来筛选人cDNA文库，从而来鉴定和分离编码人同源物IL-1R AcP的cDNA。

表6来自EL-4细胞的天然鼠IL-1受体辅助蛋白的氨基酸组成
表6来自EL-4细胞的天然鼠IL-1受体辅助蛋白的氨基酸组成		氨基酸	mole％
CysAsxThrSerGlxProGlyAlaValMetIleLeuThrPheHisLysTrpArg	n.d.10.55.35.113.1n.d.8.58.97.42.76.910.63.34.52.15.7n.d5 4	氨基酸	mole％
CysAsxThrSerGlxProGlyAlaValMetIleLeuThrPheHisLysTrpArg	n.d.10.55.35.113.1n.d.8.58.97.42.76.910.63.34.52.15.7n.d5 4	n.d.＝未测定

用鼠IL-1R AcP cDNA探测由RAJ1细胞或NC7细胞分离的mRNA制备的人cDNA文库，但最初的努力失败了，可能是因为人同源物在这些细胞中很低表达(参见实施例12)。我们决定筛选人基因组文库来分离能用来接着筛选人cDNA文库的特定序列。

用鼠IL-1R AcP cDNA克隆[3.2kb xbaI片段]和鼠IL-1R AcP cDNA克隆的限制片段[1.4kb PstI片段和843碱基对(bp)Bam HI/SalI片段]作为探针进行人基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)的低严格性Southem印迹分析。进行该分析是为了测定最佳杂交和冲洗条件，在该条件下鼠探针可以检测存在于人基因组中的同源序列。与鼠IL-1R AcP cDNA探针的杂交是在37℃在杂交缓冲液A(2×SSC，20％甲酰胺，2×Denhardt′s，100μg/ml醇母RNA，0.1％SDS)中进行过夜。使用Prime-ItII随机引物标记盒(Stratagene，La Jolla，CA)用[³²P]-dCTP标记探针。从37℃开始在各温度点用2×SSC和0.01％SDS冲洗该印迹。测定的最佳条件是使用[³²P]-843bp Bam HI/SalI片段，在杂交缓冲液A中在37℃杂交过夜，在55℃的2×SSC，0.01％SDS中冲洗。这些条件产生最低背景并用来筛选商售的人基因组文库。

为了鉴定IL-1R AcP的人基因组克隆，筛选λFIX#944201(Stratagene，La Jolla，CA)中人肺成纤维细胞库。用上述条件通过标准噬斑杂交技术(分子克隆，实验室手册，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)筛选4.8×10⁵噬斑。通过连续噬斑杂交纯化到6个杂交阳性噬菌体克隆。两个噬菌体克隆被进一步表征(#1和#7)。人基团组克隆的表征

用限制酶制图初步表征IL-1R AcP基因组克隆。用λSorb噬菌体吸附剂(Promega，MadiSon，WI)从克隆#1和#7中分离噬菌体λDNA。该噬菌体DNA用SacI消化以释放插入片段，然后该片段通过在1％琼脂糖凝胶上电泳而分开。两种克隆#1和#7的插入片段是～17kb大小。用xbaI和EcoRI进行克隆#1和#7的进一步制图。在1％琼脂糖上电泳分开消化的DNA，转移到尼龙膜(ICN，Irvine，CA)上，并交联，用于Southern印迹分析。该膜与先前说明的鼠IL-1R AcP的843bp(BamHI/SalI)片段杂交。使用Prime-ItII随机引物标记盒(Stratagene，La Jolla，CA)用[³²p]-dCTP标记探针。印迹杂交，并用先前说明的低严格性杂交条件冲洗。

来自EcoRI消化的一个4.5kb片段和来自xbaI消化的一个2.6kb片段被鉴定为与鼠IL-1R AcP序列杂交的阳性。从0.8％Seaplaque琼脂糖(PMC，Rockland，ME)分离该4.5kb片段和2.6kb片段，并用Qiae x(Qiagen，Chatsworth，(A)纯化。该片段亚克隆到载体pBluescript II SK+(Stratagene，La Jolla，CA)以有利于表征。用Qiagen质粒盒(Qiagen，Chatsworth，(A)制备质粒DNA。

进行Southem印迹分析以测定哪一片段更适于检测人基因组中的同源序列。该4.5kb和2.6kb片段用作探针。使用的低严格性杂交条件如下：5×SSC，50％甲酰胺，5×Denhardt′s，100μg/ml醇母RNA，0.1％SDS，37℃，过夜杂交。使用Prime-It II随机引物标记盒(Stratagene，La Jolla，CA)用[³²P]-dCTP标记探针。从37℃开始在各温度点用高度严格条件(0.1×SSC，0.01％SDS)冲洗膜。测定最佳条件以保证选择当筛选人cDNA库时特异于huIL-1RAcP的探针。这些最佳条件在实施例12中说明。人基因组克隆序列分析

用ABI自动DNA测序仪以及稳定DNA聚合酶，且用染料标记的二脱氧核苷酸为终止子，对pBluescript II SK⁺/2.6kb人基因组IL-1R AcP质粒DNA进行序列测定。初步的DNA序列分析显示该DNA包含与编码鼠IL-1R AcP的胞内功能区的序列有90％同源性的1 50-核苷酸区。

实施例12分离人IL-1R AcP的cDNA克隆YT细胞cDNA库构建

首先通过其与鼠IL-1R AcP的反应性来表征mAb 2E6(实施例2，表2)。初步的数据表明mAb 2E6检测人细胞上的IL-1R AcP。用[¹²⁵I]-2E6筛选一些人细胞系，并测定到与其它人细胞系如RAJI相比，YT细胞系(Yodoi等，免疫杂志，134：1623，1985)表达相对高数目的2E6反应位点/细胞。因此选择YT细胞系作为用于cDNA文库构建的RNA源。

从YT细胞中提取全部的RNA，并如本文所述由该RNA制得cDNA(实施例7：373-LI cDNA文库构建)。EcoRI衔接子(Stratagene，La Jolla，CA)与所得cDNA连接，并如本文所述通过Sephacryl SF500柱选择＞1 000bp的分子(实施例7：373-LI cDNA文库构建)。乙醇沉淀浓缩cDNA并与克隆载体连接。该克隆载体是已用EcoRI限制酶消化的并去磷酸化的(如供应商所提供)λZAPII噬菌体(Stratagene)。将由上面得到大小选定的cDNA的10个100ng等份各连接到5μl连接缓冲液(66mM Tris-HCl pH 7.5/5mM MgCl₂/1 mMDTE/1mM rATP)中的1μgλZAP II臂(EcoRI消化的并去磷酸化的)，反应在15℃过夜。第二天将该连接反应物合并，并用GigapackII包装提取物并根据厂商说明(Strata-gene)包装到12个4μl等份中的λ噬菌体中。包装的噬菌体通过在5mM异丙基-β-D-硫化吡喃半乳糖苷(IPTG)(BoehringerMannheim Co.，Indianapolis，IN)和4mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)(Boerhinger-Mannheim)存在下通过细菌菌株XLl-Blue-MRF′(Stra tagene)中的平板滴定来区别非重组噬菌体。第二天的噬斑计数表明获得3.55×10⁶重组体文库，非重组体背景＜0.1％。通过与人IL-1R AcP的基因组克隆片段杂交对人cDNA文库进行筛选

在低严格性杂交条件(5×SSC，50％甲酰胺，5×Denhar dt′s，100μg/ml醇母RNA，0.1％SDS，37℃过夜)、高严格性冲洗条件(0.1×SSC，0.01％SDS，40℃)下，使用先前说明的作为huIL-1R AcP特异探针的2.6kb xbaI限制片段来筛选YT cDNA文库。通过标准噬斑杂交技术(分子克隆，实验室手册，第二版，J.Sambrook，E.I.Fritsch，T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)筛选4.8×10⁵噬斑。鉴定了三个杂交阻性噬菌体克隆(#3，#5，和#6)并通过连续噬斑杂交而纯化。根据厂商说明从λZapII载体上切下包含插入DNA的pBluescript SK(-)噬粒。表征人cDNA克隆

通过限制酶制图进一步表征pBluescript SK(-)中人IL-1R AcP cDNA插入片段#3，#5和#6。首先通过快速沸腾方法(Holmes和Quigley，Anal.Biochem.114：193，1981)制备小量制备的质粒DNA。接着用Qiagen质粒盒制备质粒DNA。质粒DNA用EcoRI消化以释放该插入片段，并用1％琼脂糖电泳分离各插入片段。克隆#3包含一个2.3kb插入片段，克隆#5包含一个1.4kb插入片段，克隆#6包含一个2.7kb插入片段。进一步的限制制图表明在所有这三个克隆中存在单一PvuII位点。人IL-1R AcP cDNA克隆序列分析

使用ABI自动DNA测序仪以及热稳定的DNA聚合酶，并用染料标记的二脱氧核苷酸为终止子，对来自克隆#3、#5、和#6的质粒DNA作序列测定。初步的序列分析表明只有克隆#3和#6具有与鼠IL-1R AcPcDNA同源的插入片段。因此对克隆#3和#6插入片段进行完全序列分析。序列分析表明克隆#3和#6是重叠克隆。克隆#3和#6的示意图见图14。克隆#3包含ATG引发密码子和编码区的5′部分。克隆#6包含cDNA的3′部分和TGA终止密码子。这两个重叠克隆用来构建全长huIL-1R AcPcDNA。

实施例13构建全长人IL-1R AcP cDNA

限制内切酶制图和初步的序列分析表明克隆#3和克隆#6中存在单一BstXI位点。图14所示的是克隆#3和#6重叠克隆的示意图。克隆#3和#6用限制酶BstXI和xbaI消化。通过在0.7％Seaplaque琼脂糖(FMC，Rockland，ME)中电泳分别由克隆#3和克隆#6制备大约846bp和大约2700bp的片段并用Qiaex(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化。

通过亚克隆到哺乳动物表达载体pEF-BOS(Mizushima和Nagato，Nuc.Acids Res.18：5322，1990)中而制备全长人IL-1R AcP。pEF-BOS质粒DNA用xbaI消化，用牛结肠磷酸酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)处理，在0.7％Seaplaque琼脂糖凝胶上电泳分离，并用Qiaex(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化。上述846 bp和大约2700bp BstxI/xbaI片段连接到xbaI-切割的pEF-BOS表达载体上，并将该连接产物转化到MC 1061感受态细胞。将该转化细胞铺至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上并在37℃下生长过夜。第二天，取12个个别的菌落，接种到LB和氨苄青霉素(100μg/ml)中并在37℃孵育过夜。通过快速沸腾法(Holmes和Quigley，Anal.Biochem.114：193，1981)由各接种菌落制备小量制备的质粒DNA。限制内切酶分析证明，10个克隆在相对于pEF-BOS启动子区合适的取向中包含了适当的插入片段。

通过Qiagen方法(Qiagen，Chatsworth，CA)由两个阳性克隆#1和#9分离质粒DNA。如实施例7所述测定两个质粒两个链的核苷酸序列。包含在全长huIL-1R AcP cDNA中的1710 bp开放读框(ORF)的序列在图15[SEQID NO：1]中给出。图16[SEQ ID NO：3]中所示的推导的氨基酸序列将会编码一个由20个氨基酸信号肽(Met^-20-Ala^-1)、推断的胞外结构域(Ser1-Glu339)、疏水跨膜结构域(Leu 340-Leu 363)、和胞质尾区(Glu364-Val550)组成的有570个残基的蛋白质。7个潜在的N-连接糖基化位点全部包含在胞外结构域中。所有7个位点保留在鼠和人IL-1R AcP之间。

实施例14表达可溶性人IL-1R AcP

为了表达huIL-1R AcP，可溶形式的蛋白被改造为用于杆状病毒表达系统中的表达。该系统用于在真核细胞中大量生产重组蛋白(Luckow和Summers，Bio/Technology 6：47，1988)。使用聚合酶链反应(PCR)方法(InnisM.A.，等，PCR方法：方法和应用指南，Academic Press，San Diego)，产生一个编码了可溶形式hu IL-1R AcP胞外结构域的扩增子。简要地说，在应用生化系统合成仪上合成两个寡核苷酸引物。向前的引物包含BamHI位点和信号肽前11个氨基酸的密码子：(5′)GGCC GGATCC ATG ACACTT CTG TGGTGT GTAGTG AGT CTC TAC(3′)[SEQ ID NO：10]。逆引物序列编码跨膜结构域之前的11个氨基酸、Ala间隔臂、和Glu-Glu-Phe标记物，接着是末端密码子TAG和KphI位点：(5′)CGCGCG GGT ACC CTA GAA CTC TTCAGC TTC CAC TGT GTA TCT TGG AGC TGG CAC TTT CTGC(3′)[SEQ IDNO：11]。人工改造COOH-末端的Glu-Glu-Phe三肽标记以提供用于重组蛋白质抗体检测的表位。该三肽标记被商售的α-微管蛋白(Skinner等，生物化学杂志，266：14163，1991)的单克隆抗体所识别。

应用克隆#3(图14)为模板，用前向和反向引物扩增huIL-1R AcP的胞外结构域。得到的大约800bp PCR扩增子用BamHI和KpnI消化。消化的片段通过0.7％Seaplaque琼脂糖电泳，并用Qiqex(Qiagen，Chatsworth，CA)纯化。然后可溶性人IL-1R AcP胞外结构域亚克隆到pNR1，该pNR1是杆状病毒转移载体pVL941的一个衍生物(Phar Mingen，San Diego，CA)。通过去除在7196位的ECORI位点而由pVL941制备pNR1(用EcoRI切割，并用Klenow DNA聚合酶填充粘端)。然后使DNA连接后用BamHI和Asp 718(KpnI同裂酶)切割，并插入包含BamHI、EcoRI和Asp 718识别序列的下面的寡核苷酸：(5′)GATCCAGAATTCATAATAG(3′)[SEQ ID NO：12](3′)GTC TTAA GTA TTATCC ATG(5′)[SEQ ID NO：13]BamHI、EcoRI、和Asp718限制位点在pNR1中是单一的。

pNR1质粒DNA用BamHI和KpnI消化，并用Qiaex(Qiagen，Chatsworth，CA)由0.7％Seaplaque琼脂糖凝胶纯化。Bam HI/KphI大约800bp huIL-1R AcP PCR扩增子片段连接到BamHI/KpnI切割的pNR1表达载体。连接产物转化到MC1061感受态细胞，然后将其置于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂上，并在37℃生长过夜。第二天，取36个独立的菌落接种到LB和氨苄青霉素(100μg/ml)中。通过快速沸腾法(Holmes和Quiley，Anal.Biochem.114：193，1981)制备小量制备的DNA。用限制内切酶制图分析DNA。30个质粒克隆显示含有正确的插入片段。通过Qiagen方法(Qiagen，Chatsworth，CA)由两个阳性克隆(#11，#25)制备质粒DNA。这些克隆用序列分析证明。

使用BaculoGold转染盒(Phar Mingen，San Diego，CA)，用线性化的AcRP23·LacZ杆状病毒DNA(Phar Mingen，San Diego，CA)将pNR1/可溶性人IL-1R AcP DNA(克隆#25)转染到Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞中。转染后分离重组杆状病毒，根据说明的方法在Baculo Gold转染盒(Phar Mingen)中纯化噬斑。根据说明(Shanafelt，Biotechiques 11：330，1991)用MTT染色而且测噬斑。分离12个独立的病毒噬斑，并通过在旋转器上在4℃孵育过夜而将病毒颗粒从琼脂糖洗脱到0.5ml SF-9培养基(IPL-41+10％FBS-JRH Biosciences，Lenxa，KS)中。对于每一重组体病毒用PCR分析检测插入片段的存在和用免疫印迹分析检测重组人IL-1R AcP的表达。为进行PCR扩增，提取病毒DNA，与Taq DNA聚合酶和适当的pNR1正向和反向引物(相对于BamHI/Asp718克隆位点)一起孵育，并用标准PCR方法(Innis等，PCR方法，Academic Press，San Diego 1990)扩增。在1.5％琼脂糖上电泳分析每一扩增子。结果证明，试验的11个噬斑中的10个包含对应于合适插入片段大小的～1kb插入片段。

为进行免疫印迹分析，通过与固定在链霉亲和素-琼脂糖(Pierce，Rockford，IL)上的生物素化的抗微管蛋白抗体(YL1/2)(Harlan Bioproducts)反应而分离人IL-1R AcP+标记物(来自和重组病毒转染的Sf9细胞的上清液)。用0.2M甘氨酸pH2.7从抗微管蛋白抗体基质中洗脱蛋白，并用3M Tris碱中和级分。洗脱出的蛋白质用没有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液处理，在8％丙烯酰胺(Novex)板凝胶上分离，并转移到0.2μ硝基纤维素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。用YL1/2抗体(10μg/ml)和过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠抗体(1∶10 000稀释)(Boehringer Mannheim Biochemicals)探测固定的蛋白质。根据厂商说明用ECL(Amersham)目测免疫反应带。该分析鉴定了一种由包含人IL-1R AcP+标记物插入片段的重组病毒所表达的＞200kDa的蛋白质。

扩增来自噬斑#2和#12的重组病毒(免疫印迹分析鉴定为表达人IL-1R AcP+标记物)，得到的病毒原种用于为免疫目的而大量制备的人IL-1RAcP+标记物。Sf9细胞在27℃在含有1％牛胎血清的EXCELL 401(JRHBiosciences，Lenexa，KS)中作对数生长(1×10⁶个细胞/ml)培养，根据说明(O′Reilly等，杆状病表达载体，实验室手册，Oxford Univ.Press，1994)用重组杆状病毒感染，感染后第3-5天收获余下的培养基。离心，从余下的培养基中取出细胞，根据下面实施例15所述，通过由固定化YL1/2抗体组成的亲和基质来纯化可溶性人IL-1R AcP+标记物。纯化的人IL-1RAcP+标记物用来免疫小鼠。

实施例15特异于人IL-1受体辅助蛋白(huIL-1R AcP)的单克隆抗体的制备和筛选

用三种方法来研制特异于huIL-1R AcP的抗体用表达人重组IL-1R AcP的COS细胞免疫小鼠和大鼠

根据厂商说明在BioRad Gene Pulser以250μF和350伏用全长huIL-1R AcP表达质粒(20μg，实施例13中说明)经电穿孔转染COS细胞(4×107)。转染的细胞置于250mM×250mm Nunc组织培养盘中，生长72小时后收获。用NO-Zyme(JRH Biosciences)在37℃处理10分钟从组织培养皿中释放该转染的细胞。收获细胞，用PBS(pH7.4)冲洗，用于免疫。在0、7、14和28天用表达huIL-1R AcP的COS细胞(1×10⁷个细胞/动物)经腹膜内(i.p.)途径免疫小鼠和大鼠。在40天，喂养该动物，测定抗huIL-1R AcP抗体应答的滴定度(见下文的特异性测试)。40天后以2-4周的间隔对动物加强免疫(1×10⁷个细胞，i.p.)。在每次加强免疫后10-12天测定特异于huIL-1R AcP的血清抗体滴定度。当动物具有足够血清抗体滴定度时(例如，1/1000稀释的血清免疫沉淀物至少50％给定量的[¹²⁵I]-IL-1β与从人YT和RAJI细胞中溶解的IL-1R AcP交联的复合体)，在制剂中它们得到增强免疫，分离它们的脾细胞。这些最后增强免疫接种是1×10⁷个细胞，i.v.和i.p.给药，连续两天。最后免疫3天后，自动物体内分离脾细胞，并如先前所述生产杂交瘤细胞。分泌特异于huIL-1R AcP的抗体的杂交瘤细胞，通过下面说明的分析进行鉴定。杂交瘤细胞按照实施例1先前说明克隆。用纯化的人重组可溶性IL-1R AcP对小鼠和大鼠免疫接种

a.在COS细胞和杆状病毒表达系统中制备人重组可溶性IL-1RAcP。如上所述，用表达huIL-1R AcP胞外结构域的有一个标记物(Glu，Glu，Phe)(Skinner等，J.Biol.Chem.266：14163，1991)插入到C-末端(可溶性IL-1R AcP，氨基酸1-339+Ala+Glu+Phe)的质粒DNA转染COS细胞。该标记物编码被抗微管蛋白抗体YL1/2(Harlan Bioproducts)识别的序列。转染72小时后从细胞中收获培养基，根据下面的说明检测并纯化可溶性IL-1RAcP+标记物。

用标准方法(Gruenwald和Heitz，杆状病毒表达载体体系：程序和方法手册，第二版，1993，Phar Mingen，San Diego，CA)产生表达可溶性IL-1RAcP蛋白质的纯的重组杆状病毒。简要地说，编码人IL-1R AcP+标记物的可溶性胞外结构域的质粒DNA如实施例14所述插入到转移载体pNR1中。纯化重组转移载体，并与线性化的ACVW1.1ac Z DNA(Phar Mingen)共转染到Sf9(草地贪夜蛾)细胞中。分离重组杆状病毒并噬斑纯化。SF-9细胞(2×10⁶个细胞/ml)在27℃在TMH-FH培养基(Phar Mingen)中培养到对数生长期，用重组杆状病毒感染，3-5天后收获余下的培养基。离心，从余下的培养基中取出细胞，如下所述检测并纯化可溶性IL-1R AcP+标记物蛋白质。

b.制备由固定化YL1/2抗体组成的亲和性基质。可以用很多方法将YL1/2抗体固定到亲和基质上，包括与激活的琼脂糖凝胶如Affi-Gel10(BioRad Laboratories)或与含有固定化蛋白质G(Sterh和Podlaski，于：蛋白质化学技术IV，R.H.Angelletti，ed.，pp.353-360，Academic Press，NY，1993)的琼脂糖凝胶进行共价交联。但是，为了纯化可溶性IL-1R AcP，YL1/2抗体用NHS-LC-生物素(Perce化学公司)共价修饰，并固定在链毒亲和素-琼脂糖凝胶(Pierce化学公司)上。YL1/2抗体(3mg/ml)对0.1M硼酸缓冲液(pH8.5)透析，接着以40∶1的摩尔比(LC-生物素：YL1/2抗体)在室温下与NHS-LC-生物素反应2小时。用1M甘氨酸/0.1M硼酸缓冲液(pH8.4)使未反应的LC-生物素灭活。以1000×g用Centricon-30微浓缩器(Amicon)离心15-30分钟去除未反应且被灭活的NHS-LC-生物素。离心后，生物素化的YL1/2抗体用0.1M磷酸钠(pH7.0)稀释，该过程再重复两次。生物素化-YL1/2抗体(6mg于0.1M磷酸钠中，pH 7.0)与链霉亲和素-琼脂糖(6ml 50％悬浮液)在室温下反应2小时。链霉亲和素与固定化的生物素化的YL1/2抗体放入柱中并用10体积PBS(pH 7.4)冲洗。

c.纯化可溶性IL-1R AcP。来自COS细胞或Sf9细胞含有可溶性IL-1R AcP的培养基，以3ml/分钟的流速穿过YL1/2亲和柱。柱子连续用2个柱体积的PBS，pH7.4，5柱体积50mM磷酸钠，pH7.5，0.5M NaCl，0.2％Tween 20，0.05％NaN₃和2柱体积PBS，pH 7.4冲洗。可溶性IL-1RAcP+标记物用0.1M甘氨酸-HCl，pH2.8洗脱，级分(1ml)用3M Tris碱(每1ml级分0.015ml)中和。从柱中洗脱出来的蛋白质(纯化的可溶性的IL-1RAcP+标记物)通过12％丙烯酰胺板凝胶上还原和非还原SDS-PAGE，接其进行银染，以目测蛋白质泳带而表征。通过Western印迹方法也能鉴定存在于改变的培养基中来自COS细胞和杆状病毒表达体系和纯化的制剂中的可溶性IL-1R AcP+标记物。将该改变条件的培养基(0.04ml)中的蛋白质和纯化的可溶性IL-1R AcP+标记物(0.1至1μg)用没有β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液处理，在12％凝胶上用SDS-PAGE分离，并如上实施例1所述转移到硝基纤维素膜(0.2μM)上。固定在硝基纤维素上的蛋白质用YL1/2抗体(5μg/ml)和过氧化物酶缀合的山羊抗鼠或大鼠IgG抗体(1/1000稀释)(Boehringer Mannheim Biochemicals)探测。根据厂商说明用ECL技术(Amersham Inc.)鉴定免疫反应带。从COS细胞中和杆状病毒表达系统中纯化的可溶性IL-1R AcP应分别以大约65-67kDa和45-47kDa的蛋白质迁移。

d.用可溶性IL-1R AcP+标记物对小鼠和大鼠免疫接种

在0、14和28天用10-100μg可溶性IL-1R AcP+标记物经i.p.和足底途径对小鼠和大鼠免疫接种。如实施例1和2所述在弗氏完全佐剂中制备蛋白质用于初次免疫，在弗氏不完全佐剂中制备蛋白质用于第14天和28天的加强免疫。在第40天采集血清并试验其抗体反应性(参见下文分析)。以4周间隔给动物加强免疫(i.p.，10-25μg在弗氏不完全佐剂中制备的蛋白质，每次免疫两周后测定血清抗体的滴定度。当动物具有有效力的血清抗体滴定度(例如血清1/10⁴稀释给出EIA中50％应答)时，连续两天以10-100μg可溶性IL-1R AcP+标记物对其加强免疫。三天后，从动物中取出脾细胞，并如实施例1所述与SP2/0细胞融合以得到抗鼠IL-1R AcP抗体。通过下文说明的测试，对杂交瘤上清液筛选抑制性和非抑制性抗体。通过有限稀释克隆分泌抗huIL-1R AcP抗体的杂交瘤细胞系。如实施例1所述纯化抗-huIL-1R AcP抗体。

e.分析并检测特异于人IL-1R AcP的抗体

通过用固定在96孔板上的可溶性IL-1R AcP+标记物的酶免疫测试(EIA)测定血清中抗IL-1R AcP抗体的存在。简要地说，可溶性IL-1R AcP+标记物(1μg/ml)用50mM碳酸钠缓冲液，pH9.0，0.15M NaCl(BC盐水)稀释，在室温下被动吸附(100μl，100ng)于Nunc Maxisorb板的孔中16小时。冲洗后，该平板在37℃与PBS(pH 7.4)、1％牛血清白蛋白(BSA)反应1小时。血清样品的系列稀释液[1/100至1/10⁶于50mM磷钠，pH 7.5，0.5MNaCl，0.1％Tween-20，1％BSA和0.05％NaN₃(抗体结合缓冲液)]与固定化可溶性IL-1R AcP在室温下孵育2小时。用PBS，pH 7.4，0.05％Tween 20冲洗平板后，用过氧化物酶缀合的山羊抗鼠或抗大鼠IgG抗体(Boerhringer-Mannheim Inc.)检测结合的抗体，并用TMB(四甲基联苯胺)底物目测。在多道光度计中在450nM测定各孔的颜色密度，其与血清中抗IL-1R AcP抗体的浓度成正比。

通过FACS(荧光激活细胞分类)也对血清抗体试验了以下的反应性：1)在人细胞系YT，NC-37和RAJI上表达的天然huIL-1R AcP和2)在COS细胞上表达的重组huIL-1R AcP。细胞(1×10⁶)与PBS，pH 7.4中的血清稀释液(1/100至1/10⁴)(100μl)一起在4℃孵育1小时。用PBS，pH7.4冲洗细胞去除未结合抗体后，将该细胞与荧光素缀合的山羊抗小鼠或抗大鼠IgG抗体(Tago Laboratories)在4℃孵育30分钟。用PBS，pH7.4冲洗，在FACSort(Becton-Dickinson Co.)中通过荧光密度的增加来测定与细胞表面结合的抗体的量。

抗鼠IL-1R AcP抗体4C5和2E6(表2)分别证实了抗鼠细胞上表达的IL-1R AcP的抑制性和非抑制性活性。为了测定用人IL-1R AcP免疫的动物的血清中是否含有抑制性和非抑制性抗体两者，进行了两种类型的分析：1)[¹²⁵I]-IL-1β结合人细胞的抑制作用和2)[¹²⁵I]-IL-1β来自人细胞的细胞表面蛋白质交联的可溶性复合体的免疫沉淀。对于抑制测试，血清的系列稀释液与YT，NC-37和RAII细胞(1-2×10⁶)在结合缓冲液中在室温下孵育1小时。向各试管中加入[¹²⁵I]-IL-1β(25-250pM)，在4℃孵育3小时，如实施例1先前所述测定细胞结合放射性。抑制抗体的滴定度通过导致细胞结合放射性50％降低的血清稀释液测定。为进行免疫沉淀测试，血清稀释液在4℃与和huIL-1RAcP交联的可溶性[¹²⁵I]IL-1β的复合体在固定在琼脂糖小球上的蛋白质-G-Phus的存在下孵育16小时。用由人细胞系YT、NC-37和RAII制备的可溶性复合体检测每一血清样品的反应性。离心并冲洗蛋白质-G-Plus琼脂糖小球后，用SDS-PAGE分析免疫沉淀的蛋白质，并如实施例1所述对鼠IL-1R AcP抗体放射自显影。用与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的huIL-1R AcP肽对小鼠和大鼠免疫接种

用标准固相技术(Marglin和Merrifield，Ann.Rev.Biochem.39：841，1970)合成全长huIL-1R AcP的相应于序列1-10、54-64、68-77、265-273、285-294、490-499和505-515的肽。每一肽序列具有为共价连接KLH的目的而通过MBS技术加到C-末端的一个半胱氨酸。简要地说，KLH(1.5mg，于PBS，pH 7.4中)与0.32mg 3-马来酰亚胺苯甲酰(malemidobenoyl)-N-羟基-琥珀酰亚胺酯(MBS；Boehringer MannheimBio chemicals)在4℃反应1小时。反应混合物加到预载的Bio Gel P10柱(10ml)(Bio Rad Laboratories)上并用PBS，pH7.4层析。集中含有KLH-MBS缀合物的级分(2ml)，并与肽(2mg)在4℃下反应1小时。KLH-肽缀合物在Centricon 10微量浓缩器中浓缩并用于免疫接种。在0、7、14和28天用200-500μg KLH-肽缀合物经i.p.和足板途径对小鼠和大鼠免疫接种。在弗氏完全佐剂中制备缀合物用于初次免疫，在弗氏不完全佐剂中制备缀合物用于加强免疫。在第40天自动物采集血清并检测可溶性IL-1R AcP EIA中抗体反应性。以4周间隔对动物加强免疫(i.p.，100μg于弗氏不完全佐剂中制备的KLH-肽缀合物)，每次免疫两星期后测定血清抗体滴定度。当动物具有有效力的血清抗体滴定度时(1/10⁴稀释给出EZA中50％应答)，用无肽的(100μg，i.v.途径)和KLH-肽缀合物(500μg，i.p.途径)连续两天对动物加强免疫。三天后，从动物体内分离脾细胞，并如上述产生并鉴定分泌huIL-1R AcP抗体的杂交瘤细胞。

实施例16抗人IL-1R AcP抗体和IL-1R AcP的活性片段对IL-1β生物活性的中和作用

在用人胚胎肺成纤维细胞MRC-5细胞(ATCC#CCL-171)的IL-1诱导的IL-6测试中可以测定在剂量依赖方式中抗人IL-1RAcP抗体中和IL-1生物活性的能力。将MRC-5细胞置于96孔群集四中，并用增加浓度的抗人IL-1R AcP或IL-1R AcP活性片段预处理1小时。细胞用5pM人IL-1α或IL-1β刺激24小时。通过商售IL-6EIA(QuantikineAssay for Human IL-6，R & D Systems，Minneapolis，MN)测定应答IL-1中由细胞分泌的IL-6的量。通过测定存在或不存在抑制剂时IL-6分泌的降低来计算抗体和IL-1R AcP活性片段的抑制效果。例如，5pM和100pMIL-1β分别刺激来自MRC-5细胞的大约8100和9800pg/ml IL-6的分泌(图17)。IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)和抗人I型IL-1R抗体4C1阻断对IL-1β应答中的该IL-6分泌(图17)。对于IL-1RA和4C1，阻断5pMIL-1β的IC50分别为200pM和0.025μg/ml(图17)。由IL-1RA和4C1引起的抑制作用可以通过使IL-1β浓度增至100pM而被掩。用100pM IL-1β，对于IL-1RA和4C1抑制的IC₅₀分别＞1nM和10μg/ml。这些数据证明，来自MRC-5细胞的IL-1诱导的IL-6应答是特异于IL-1的，且是I型IL-1R-依赖性应答，同样鼠细胞中的IL-1-依赖性应答也是I型受体-依赖型的(图6、7和8)。这些用鼠细胞的IL-1生物测试用来中和抗鼠IL-1R AcP抗体的鉴定。类似地，用MRC-5细胞的IL-1生物测试用来鉴定中和抗-人IL-1R AcP抗体和IL-1R AcP的活性片段。

序列表(1)一般信息(i)申请人：

(A)姓名：F.HOFFMANN-LA ROCHE AG

(B)街道：Grenzacherstrasse 124

(C)城市：Basle

(D)州：BS

(E)国家：Switzerland

(F)邮编(ZIP)：CH-4010

(G)电话：061-6885108

(H)电传：061-6881395

(I)电报：962292/965542 hlr cn(ii)发明名称：人白介素-1受体辅助蛋白(iii)序列数目：13(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)当前申请数据：

申请号：EP(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1713个碱基对

(B)类型：核酸，

(C)链：单链

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(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：NO(iv)反义：NO(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CGCGCGGGTA CCCTAGAACT CTTCAGCTTC CACTGTGTAT CTTGGAGCTG GCACTTTCTG 60C 61(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：NO(iv)反义：NO(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GATCCAGAAT TCATAATAG 19(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假拟：NO(iv)反义：NO(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GTCTTAAGTA TTATCCATG 19

Claims

1.一种编码IL-1受体辅助蛋白或其活性片段的多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，包括选自下面的DNA序列。

(a)基本上具有序列[SEQ ID NO：1]的多核苷酸；或

(b)中等严格条件下与(a)中DNA杂交的多核苷酸；或

(c)由于遗传密码的简并而在密码子序列中有所区别的多核苷酸。

3.权利要求1或2的多核苷酸，其编码人IL-1受体辅助蛋白。

4.权利要求3的多核苷酸，其编码具有氨基酸序列[SEQ ID NO：3]或其活性片段的人IL-1受体蛋白。

5.权利要求4的多核苷酸，其具有序列[SEQ ID NO：1]。

6.权利要求1或2的多核苷酸，其编码可溶性IL-1受体辅助蛋白。

7.权利要求6的多核苷酸，其编码人可溶性IL-1受体辅助蛋白。

8.权利要求7的多核苷酸，其编码具有氨基酸序列[SEQ ID NO：9]或其活性片段的人可溶性IL-1受体蛋白。

9.权利要求8的多核苷酸，其具有序列[SEQ ID NO：7]。

10.权利要求1或2的多核苷酸，其是反义多核苷酸。

11.包含权利要求1至10中任一项多核苷酸的载体。

12.权利要求11的载体，其是一种表达载体。

13.包含权利要求11或12载体的宿主细胞。

14.IL-1受体辅助蛋白或其活性片段。

15.权利要求14的蛋白，其由权利要求2定义的多核苷酸编码。

16.权利要求14或15的蛋白质，其是人IL-1受体辅助蛋白。

17.权利要求16的蛋白质，其具有氨基酸序列[SEQ ID NO：3]。

18.权利要求14或15的蛋白，其是可溶性人IL-1受体辅助蛋白。

19.权利要求18的蛋白质，其具有氨基酸序列[SEQ ID NO：9]。

20.根据权利要求14至19中任一项的蛋白质，其具有一个或多个已被修饰的侧基。

21.一种特异性结合人IL-1受体辅助蛋白并防止IL-1受体复合体被IL-1激活的抗体。

22.一种权利要求21的抗体，其是单克隆抗体。

23.权利要求21或22的抗体，其具有大约KD0.1nM至大约KD10nM的与IL-1受体辅助复合体的结合亲和性。

24.一种药物组合物，其含有权利要求10和14-23中任一项的一种化合物和一种药用载体。

25.权利要求24的药物组合物，其与一种或多种其它细胞因子拮抗剂复合。

26.一种制备IL-1受体辅助蛋白的方法，包括下面步骤：

(a)在适合的宿主中表达由权利要求1～10中任一项的DNA编码的多肽，

(b)分离所述的IL-1受体辅助蛋白质，和

(c)如果需要，将其转化为其中一个或多个侧基被修饰的类似物。

27.一种制备IL-1受体辅助蛋白抗体的方法，包括以下步骤：

(a)制备生产特异性结合IL-1受体辅助蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系和

(b)产生并分离该单克隆抗体。

28.通过权利要求26或27要求的方法制备的权利要求14至23中任一项所要求的化合物。

29.根据权利要求10和14至23中任一项的化合物用作治疗活性物质。

30.根据权利要求10和14至23中任一项的化合物用于治疗炎症或免疫反应和/或用来调节和预防炎症或白介素-1免疫活性。

31.权利要求10和14至23中任一项的化合物用于治疗急性或慢性疾病，优选治疗类风湿性关节炎、肠炎、脓毒性休克、移植物排斥、牛皮癣、哮喘和I型糖尿病，或者用于治疗癌症，优选治疗急性和慢性骨髓性白血病。

32.权利要求10和14至23中任一项的化合物在制备用于控制或预防疾病的药物中的应用。

33.权利要求10和14至23的化合物在制备用于治疗炎症或免疫反应和/或用于调节和防止炎症或白介素-1免疫活性的药物中的应用。

34.权利要求10和14至23的化合物在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎、肠炎、脓毒性休克、移植物排斥、牛皮癣、哮喘和I型糖尿病或用于治疗或预防癌症，优选治疗急性和慢性骨髓性白血病的药物中的应用。

35.基本上按照说明书说明的新化合物、组合物、方法及其用途。