CN1306576A - G－β－γ调控的磷脂酰肌醇－3'激酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码受G蛋白调控的磷脂酰肌醇－3’激酶的核苷酸的发现、鉴定和表征。该激酶是一种异源二聚体酶,在与三聚体的G蛋白结合的受体的激活下产生胞内信使,磷脂酰肌醇(3,4,5)－三磷酸。这一新型蛋白质包括一个催化亚基p120,和一个调控亚基p101,它存在于造血源细胞中并参与导致炎症的免疫系统反应。p101亚基的存在是活化的三聚体G蛋白存在下,激酶活性被强烈地激活的主要原因。本发明包括编码p101和p120的核苷酸。宿主细胞表达体系、p101和p120蛋白、融合蛋白、多肽和肽、这些蛋白的抗体、表达p101或p120转基因的转基因动物、或不表达p101或p120基因的重组敲除细胞和动物、该酶的拮抗剂和激动剂、其它调节p101或p120基因表达或酶活性的可被用于诊断、药物筛选、临床试验剂量测定、和/或用于炎性紊乱的治疗的化合物。

Description

G-β-γ调控的磷脂酰肌醇-3’激酶
1．导言
本发明涉及新型的G-蛋白调控的磷酸肌醇3OH-激酶，该酶从造血谱系细胞中分离，其参与细胞信号传导途径，本发明还涉及这些新型的酶在疾病的治疗和诊断中的应用。
2．发明背景
磷酸肌醇3OH-激酶(PI3K)是一个酶类大家族，可以3-磷酸化至少一种胞内磷酸肌醇。(Whitman等，1988，自然(Nature)332:644-646；Ayger等，1989，细胞(Cell)57:167-175)3-磷酸化的磷酸肌醇存在于所有高等真核细胞中。越来越多的证据表示出PI3K和此酶的一个脂类产物，磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(以下简称“PtdIns(3,4,5)P3”)，是新型的重要的细胞信号传导中第二信使系统的一部分。这一新型的基于PtdIns(3,4,5)P3的信号系统的成分看来独立于已表征的基于肌醇磷脂的信号途径，在后者中磷酸肌醇酶C(phosphoinositidase C)(PIC)水解PtdIns(4,5)P2释放结构独特的第二信使肌醇(1,4,5)-三磷酸(Ins(1,4,5)P3)和二酰甘油。
所选的胞外激动剂和生长因子将刺激胞内PI3K的活性并导致快速且短暂的胞内PtdIns(3,4,5)P3的累积。令人吃惊的是，多种不同类型的细胞表面受体的刺激，包括受体酪氨酸激酶、与src家族非受体性酪氨酸激酶结合的受体、细胞因子类生长因子及G蛋白偶联受体，都将激活PI3K家族的成员(综述见Stephens等，1993,Biochemica et Biophysica Acta,1179:27-75)。例如，酪氨酸激酶受体，其激活后导致PtdIns(3,4,5)P3的累积增加的有PDGF受体、EGF受体、FGF受体家族的成员、CSF-1受体、胰岛素受体、IGF-1受体和NGF受体。刺激PtdIns(3,4,5)P3的累积增加的与src家族非受体性酪氨酸激酶结合的受体有Ⅱ-2受体、Ⅱ-3受体、mIgM受体、CD4受体、CD2受体和CD3/T细胞受体。另外，细胞因子Ⅱ-4受体和与G蛋白结合的凝血酶受体、ATP受体和fMLP受体，它们均刺激PI3K的活性，随后导致PtdIns(3,4,5)P3的累积。这样看来，PtdIns(3,4,5)P3在非常不同的信号途径中作为第二信使。
PI3K的活性和PtdIns(3,4,5)P3的产生是产生这些多种多样的受体的信号传导的一个生理相关途径这一命题，特别是从以下两组不同的实验证据中得到了支持：一个实验是真菌代谢物抑制PI3K活性，一个是观察直接的蛋白连接。渥曼青霉素(一种真菌代谢物)通过以共价方式连接在PI3K的催化结构域而不可逆地抑制其活性。渥曼青霉素对PI3K活性的抑制消除了随后的因胞外因子产生的细胞反应。例如，通过刺激PI3K并合成PtdIns(3,4,5)P3，嗜中性粒细胞应答趋化因子fMet-Leu-Phe(fMLP)。PtdIns(3,4,5)P3的合成与在嗜中性粒细胞破坏入侵微生物过程中的呼吸爆发(respiratory burst)的激活相关。用渥曼青霉素处理嗜中性粒细胞避免了fMLP诱导的呼吸爆发反应(Thelen等，1994,PNAS,USA 91:4960-4964)。确实，这些渥曼青霉素实验以及其它实验证据表明，在造血谱系细胞中，特别是嗜中性粒细胞、单核细胞及其它类型白细胞中PI3K的活性参与很多与急性和慢性炎症相关的非记忆性免疫反应。
这些PI3K酶与一些活化的受体酪氨酸激酶直接相互作用，并可被共同提纯。纯化后发现，与受体酪氨酸激酶相结合的PI3K包含一些170-200kD的异源二聚体(Otsu等，1991，细胞65:91-104,Pons等，1994，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)15:4453-4465,Inukai等，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:5317-5320)，二聚体中包含一个催化亚基和一个衔接(或调控)亚基。
催化亚基的两个不同的同源物，p110α和p110β，已描述并克隆。可与渥曼青霉素不可逆结合的该催化亚基，与一个高度相关的调控亚基小家族，p55α、p55PIK、p85α和p85β中的一个或其它成员紧密地结合，形成上述的170-200kD的异源二聚体。已知的这些调控亚基中包含很多蛋白质与蛋白相互作用结构域，包括两个SH2结构域(Cantley等，1991，细胞64:281-302)。
SH2结构域的存在认为负责P13K异源二聚体与受体酪氨酸激酶结合并刺激受体酪氨酸激酶的活化。这些活化的受体在局部共有序列中的关键的酪氨酸残基上被在55-87kD的PI3K衔接亚基中发现的SH2结构域磷酸化(Songyang等，1993，细胞72:767-778)。一旦PI3K异源二聚体结合，就直接激活P13K催化亚基，(尽管这一效应在体外相对较小，Carpenter等，1993，生物化学杂志268:9478-9483，Backer等，1992,EMBO J.11:3469-3479)，并将胞质PI3K转移为它的磷脂底物的来源。这些因子的共同作用导致PtdIns(3,4,5)P3的大量涌现。很明显，这些PI3K的同工型(p100α/p110β/p55α、p55PIK)看来结构上适合在受体调控的酪氨酸激酶下游作为所用的信号传导者，很象τ家族的PI-PLC受由体敏感的酪氨酸激酶调控的方式(Lee和Rhee,1995,Current Biol.7:193-189)。
利用异源三亚基聚合体GTP酶传导其信号(例如，fMLP、PAF、ATP和凝血酶)的细胞表面受体的激活可导致PtdIns(3,4,5)P3的产生，但是PI3K的p110/p85亚家族看来并不参与这样的PtdIns(3,4,5)P3的产生。这些类型的细胞表面受体已在造血源细胞(hematopoietic origin)中被描述，其活性参与了免疫系统的炎性反应。近来的证据表示，色谱形不同的另一型渥曼青霉素敏感型PI3K存在于U937细胞和嗜中性粒细胞中，具有相近的相对分子量约220kD(Stephens等，1994，细胞77:83-93)。这种PI3K活性可以被Gβγ亚基，而不是Gα-GTP亚基特异性激活。一种相似的PI3K活性也已在一种骨肉瘤细胞系中描述(Morris等，1995，分子药物(Mol.Pharm.)48:532-539)。血小板也包含Gβγ敏感型PI3K，但是还不清楚它是否是一个p85/p110PI3K家族成员(Thomason等，1994，生物化学杂志269:16525-16528)。似乎这一性质知之甚少的Gβγ敏感型PI3K在对激动剂如ATP、fMLP等的应答中很可能负责PtdIns(3,4,5)P3的产生。
Stoyanov等(1995)最近发表从人骨髓cDNA文库中克隆并表达渥曼青霉素敏感的PtdIns(4,5)P2选择性PI3K，称为p110γ。p110γ以PCR的方法扩增，其引物的设计是以潜在的PI3K的以及PtdIns4激酶的催化中心为靶位。它明显区别于p110α和p110β，因为，比如说，缺少一个与p85衔接家族成员结合的氨基端结合结构域。基于p110γ在体外对Gα-GTP和Gβγ亚基的敏感性和在骨髓来源的细胞中的表达，推测它在结合异源三聚体的GTP酶的受体的下游具有PI3K活性。然而，这一假说留下了几个未解决的涉及更早的生物化学证据的问题，该证据指出，应答Gβγ的PI3K不受Gα-GTP亚基刺激，并具有大得多的约220kD的分子量。
认为Gβγ亚基对p110γ的作用是通过一种推定的NH2端血小板-白细胞C激酶底物同源(PH)结构域介导的。然而，随着对越来越多的Gβγ调控的效应物的描述，很多证据表示PH结构域并不代表被广泛应用的Gβγ结合结构域。近来的工作，即，利用仅存在于被Gβγ活化的腺苷酸环化酶(AC2和AC4)中的结构域的序列的一组相对小的肽，应用这些肽特异性阻断几个效应物受Gβγ的激活或抑制，提示可能会有证据确证Gβγ亚基包含一个广泛应用的效应物活化结构域。另外，与这一效应物活化结构域相互作用的不同效应物上的区域显示出很大的序列相似性。接下来，作为这些关于肽的研究重点的AC2上的结构域中的一个基序(Gln-X-X-Glu-Arg)，在钾离子通道和β-ARK上的一些区域出现，而这些区域已经涉及Gβγ亚基的调控(Chen等，1995，科学(Science)268:1166-1169)。然而，这一基序并不在所有的已知由Gβγ亚基调控的蛋白中重现，所以迄今为止依靠序列分析还不能预测是否一种蛋白质将受Gβγ亚基的调控。
PI3K活性由通过与G蛋白结合的受体传导其信号的细胞激动剂激活，这一机理仍缺乏鉴定。需要指出的是绝大多数激活参与炎性反应的嗜中性粒细胞呼吸爆发的激动剂将更倾向于结合G蛋白偶联受体，而不是受体酪氨酸激酶。这样，PI3K应答这些类型的趋化因子而受调控的机理看来非常不同于依靠生长因子的通过酪氨酸激酶传导信号的调控。本发明依靠鉴定、纯化以及新型的特异类型的由三聚体G蛋白的βγ亚基激活的PI3K的克隆来解决这一问题。
3．发明概述
本发明涉及编码受三聚体G蛋白调控的PI3K的核苷酸的发现、鉴定、纯化和克隆，PI3K是一种新型的蛋白，在与G蛋白结合的受体的激活下可产生第二信使PtdIns(3,4,5)P3的累积。这一新型的G蛋白调控的PI3K包含一个催化亚基p120，和一个调控亚基p101。p120催化亚基与PI3K的催化亚基p110α、p110β和p110γ具有部分氨基酸序列同源性。另一方面，p101是一个全新的蛋白质，与其它以前的可获得的序列没有可鉴定的同源性。在不存在p101调控亚基的情况下，活化的G蛋白亚基诱导一个依靠p120催化亚基的温和的催化活性的激活。然而，在p101亚基存在时，PI3K催化亚基的活性借助活化的G蛋白激活提高100倍以上。
编码猪的p101和p120以及人的p101和p120的cDNA已经被克隆并测序，并在此描述。猪的p101和p120cDNA分别编码约877个氨基酸和约1102个氨基酸的蛋白质(图2和图4)，而人的p101和p120的cDNA分别编码约880个氨基酸和约1102个氨基酸的蛋白质(图11和图13)。尽管p120蛋白的氨基酸序列与其它那些已知的PI3K催化亚基同源，但在此描述的p120cDNA与编码已知的PI3K催化亚基的cDNA有区别，特别是在，例如，羧基端(氨基酸残基1075至1102)。
p101转录物主要存在于造血谱系的细胞中。p120以及其它PI3K催化亚基蛋白，看来有一个非常广泛的组织和细胞类型分布。值得注意的是，三聚体G蛋白敏感的PI3K的活性仅存在于有限数量的造血谱系细胞中(例如，嗜中性粒细胞、血小板等)。这样看来，应答与三聚体G蛋白结合的受体刺激激活PI3K酶的能力主要取决于p101亚基的存在。
本发明包含下列核苷酸、表达该核苷酸的宿主细胞和该核苷酸的表达产物：(a)编码哺乳动物p101和p120蛋白的核苷酸，包括猪p101和p120以及人p101和p120，以及p101和p120基因产物，包括猪和人的基因产物；(b)编码与其功能结构域相对应的p101和p120的部分的核苷酸，以及如下核苷酸序列定义的多肽产物，包括但不限于编码，例如，p101Gβγ相互作用结构域，或催化亚基结合结构域，或来自猪p101的从约1延伸至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877，或来自人p101的从约1延伸至160、80-120、161至263、264至416、417至567、568至709、710-835和/或836至880的p101核苷酸，和编码p120膜结合结构域、或调控亚基结构域、或从约173至302和310至315的氨基酸残基的p120核苷酸；(c)编码p101和p120突变体的核苷酸(其中，结构域之一的所有或部分序列缺失或改变)，以及如下核苷酸序列定义的多肽产物，包括，但不局限于p101的突变体(其中编码G蛋白相互作用结构域，或催化亚基结合结构域，或从氨基酸残基约1至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877的核苷酸缺失)，和p120突变体(其中编码膜结合结构域，或调控亚基结构域，或从约173至302和310至315的氨基酸残基的核苷酸缺失)；(d)编码融合蛋白，包含p101蛋白或其结构域之一(即，Gβγ相互作用结构域，或催化亚基结合结构域，或从约1至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877氨基酸残基的所描述的结构域)，或与另一多肽融合的p120蛋白或其结构域之一(即，膜结合结构域，或调控亚基结构域，或从约173至302和310至315的氨基酸残基)的核苷酸。
本发明还包括G蛋白调控的PI3K的激动剂和拮抗剂，包括小分子、大分子、与天然p101蛋白竞争的p101蛋白突变体和抗体，以及可用于抑制p101基因表达(如，反义和核酶分子，和基因或调控序列替代构建体)或增强p101基因表达(如，置于强启动子系统控制下的p101基因的表达构建体)的核苷酸序列，以及表达一种p101转基因或不表达p101的“敲除”的转基因细胞和动物。
另外，本发明还包含一些用于诊断性评价、分类和预测免疫系统疾病(包括炎症)以及用于鉴定倾向于这些情况的被试验者的方法和组合物。例如，本发明中的p101核酸分子可被用来作为诊断性杂交探针或作为用来对p101基因中的基因突变、等位变异和调控缺陷进行鉴定的PCR分析的引物。本发明还提供用于在实际中应用这些方法的诊断试剂盒。
此外，本发明还涉及一些方法，这些方法是关于p101基因和/或p120基因的产物在用于鉴定某些调节G蛋白调控的PI3K基因的表达和/或p101基因和/或p120基因产物的活性(即作为激动剂和拮抗剂)的用途。这样的化合物可以用作控制免疫系统紊乱的试剂和，特别是，用作治疗炎性紊乱例如关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘、过敏、再灌注损伤、动脉粥状硬化、阿尔茨海默病和癌症的治疗性试剂。
更进一步，本发明包含一些用于治疗炎性紊乱例如关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘、过敏症、再灌注损伤、动脉粥状硬化、阿尔茨海默病和癌症的方法和组合物。这些方法和组合物可以调节p101基因表达的水平和/或p101或p120基因产物活性的水平。
本发明部分地基于一个令人惊讶的发现，即在分离出来的嗜中性粒细胞中G蛋白刺激的PI3K活性的发现；基于包含一个p101亚基和一个p120亚基的该活性物质即异源二聚体PI3K蛋白的纯化和表征；基于从猪嗜中性粒细胞mRNA、人单核细胞mRNA和人白细胞mRNA制备的文库中p101cDNA的鉴定和克隆；基于从猪嗜中性粒细胞mRNA和人白细胞mRNA制备的文库中p120cDNA的鉴定和克隆；基于新型序列的表征；以及基于在昆虫细胞、U937细胞和Cos-7细胞中的分离的重组表达的p101和p120蛋白的研究。3.1定义
在此应用的下列条目，无论用单数还是复数，均含有下面所示的含义：
G蛋白调控的PI3K：指一种PI3K酶，其活性由活化的三聚体G蛋白(如Gβγ亚基和/或Gα-GTP亚基)刺激。
p101：指G蛋白调控的PI3K的调控亚基，也称为衔接亚基。p101包括与p101同源或结合于p120并在三聚体G蛋白的激活下刺激PI3K催化活性的分子。具有N-末端Glu标记(特别是MEEEEFMPMPMEF)的p101融合蛋白在本文称为(EE)101融合蛋白，而具有N-末端myc表位标记的p101融合蛋白在本文称为myc101融合蛋白。
p101核苷酸或编码序列：指编码p101调控亚基蛋白、p101蛋白的多肽或肽片段或p101融合蛋白的核苷酸序列。p101核苷酸序列包含DNA，包括基因组DNA(如p101基因)或cDNA、或RNA。
p120：指G蛋白调控的PI3K的催化亚基。p120蛋白的多肽或肽片段称为p120多肽或p120肽。p120或p120多肽或肽片段与无关蛋白的融合在此称为p120融合蛋白。(EE)120融合蛋白具有N末端Glu标记的MEEEEFMPMEFSS。p120的功能等同物指一种在体内或体外以高亲合性结合于p101调控亚基的PI3K催化亚基蛋白。其它的p120的功能等同物是G蛋白调控的PI3K的同源催化亚基，如p117。
p120核苷酸或编码序列：指编码p120催化亚基蛋白、p120蛋白的多肽或肽片段或p120融合蛋白的核苷酸序列。p120核苷酸序列包含DNA，包括基因组DNA(如p120基因)或cDNA或RNA。
4．图的描述
图1A、1B、1C和1D.猪p101衔接亚基核苷酸序列。(SEQ IDNo:1)
图2．推导的猪p101氨基酸序列。(SEQ ID No:2)经蛋白测序鉴定的胰蛋白酶(tryptic)肽下画实线。
图3A、3B和3C.猪p120催化亚基核苷酸序列。(SEQ ID No:3)
图4．推导的猪p120催化亚基序列。(SEQ ID No:4)经蛋白质测序鉴定的胰蛋白酶肽下画实线。与已公开的p110γ的氨基酸序列不同的区域下画虚线。
图5．在嗜中性粒细胞胞质溶胶中的Gβγ敏感的PI3K与p85/p110PI3K不同。从Q-sepharose色谱图得到的每一收集流分等，或者进行Western杂交并以αp85α或αp85β的单克隆抗体探查并以HRP连接的二抗检出(图5的上半部分)，或者与100nM的[3H]-17-羟基-渥曼青霉素温育，以SDS-PAGE(6％丙烯酰胺并作荧光自显影)解析(图5的下半部分)。Gβγ敏感的PI3K活性洗脱在第20-24流分中。
图6．经过最后一步Mini Q柱纯化之后的B峰包含Gβγ敏感的PI3K活性。对B峰活性的最后一步纯化产物经Mini Q柱分离后，在活化的Gβγ亚基(βγ)、酪氨酸磷酸化的肽(YP-肽)、渥曼青霉素和/或Gαi-GDP亚基(αi-GDP)存在与不存在下对其进行了分析。
图7．在Sf9细胞中重组表达的游离p120和p101/p120 PI3K的药理学特性和调控特性。实验包括以下内容：与不同试剂温育的7nMp101/p120或36nM p120(终浓度)；10mM NaF和30μMAlCl3(A/F)；1μMGβγ亚基(βγ)；2μMGα-GDP；100nM渥曼青霉素(W)或50μM酪氨酸磷酸化的肽(PY)，实验前15分钟(0℃下)加入[γ32p]-ATP；定量掺入[32p]的[32p]-PtdIns(3,4,5)P3。所示数据为平均值(n=2)。
图8.U937细胞中的p101与Gβγ激活的PI3K的活性相关。U937细胞瞬时地由编码(EE)120或(EE)101的哺乳动物表达载体转染，其由编码myc101、myc120或无关的对照myc融合蛋白的哺乳动物表达载体共转染，如文中所述。共用40μg载体DNA。共转染后，细胞裂解、预洗并与共价交联有α-(EE)单克隆抗体的G蛋白sepharose免疫沉淀，在实施例中所详述。所得免疫沉淀物经洗涤并鉴定Gβγ激活的(1μM,终浓度)PI3K活性。来自用无关(EE)-标记的蛋白的转染细胞中的免疫沉淀中检测出的PI3K活性，从所示数据中减去或不减去Gβγ(这些是分别为存在与不存在Gβγ时1896dpm和2862dpm的平均值)。以[35S]-蛋氨酸标记的平行的转染显示了[35S]-p101和[35S]-p120在免疫沉淀中的量，其当共转染时下降40％(数据未显示)。
图9．体内p101/p120受Gβγ的调控。Cos-7细胞由编码Gβγ亚基(“β1γ2”)、p101(“101”)和/或p120(“120”)的哺乳动物表达载体转染，如文中所述。经48小时的瞬时表达，每个转染的细胞或者进行Western杂交以检测“相关蛋白”，或者对PtdIns(3,4,5)P3的累积(带阴影的条框)进行鉴定。对于Western杂交，样品以α-(myc)单克隆抗体作探针对不同的(myc)标记的蛋白的表达进行定量。给出的结论与所有4个关键载体存在时所得到的表达相关；(myc)-p120和(myc)-p101的绝对水平非常相似，均为10倍于(myc)-γ2的水平。平行批次的细胞以[32p]-Pi标记；90分钟后将脂类抽提、去酰基化并且对溶解的水溶头部基团进行阴离子交换HPLC，由液体闪烁记数法定量。所示数据为平均值(n=2)+/-变化范围。[32P]-PtdIns(3,4,5)P3的数据在无关DNA对照(972±41dpm)之上。
图10A和10B．人p101衔接亚基核苷酸序列。(SEQ ID No:11)
图11．推导的人p101氨基酸序列。(SEQ ID No:12)
图12A和12B．人p120催化亚基核苷酸序列。(SEQ ID No:13)
图13．推导的人p120催化亚基序列。(SEQ ID No:14)
5．发明详述
本发明涉及一种特定类型的由三聚体G-蛋白的βγ亚基激活的PI3K的鉴定、纯化和克隆。在此首次进行描述的p101是一种G-蛋白调控的PI3K的新型亚基。在此同作描述的是G-蛋白调控的PI3 K的催化亚基p120的鉴定、克隆和序列的修正。
PI3K是一种酶，它在3d位磷酸化磷脂酰肌醇以产生胞内信号分子PtdIns(3,4,5)P3。尽管已显示PI3K的活性在多种细胞类别中一经酪氨酸激酶受体的刺激即被诱导，但是由与三聚体的G-蛋白结合的受体激活的PI3K活性仅在有限数量的造血谱系来源的细胞(例如血小板、单核细胞和淋巴细胞)中检测出来。有趣的是，在这些细胞中PtdIns(3,4,5)P3的累积与很多参与急、慢性炎症的免疫应答有关。例如，嗜中性粒细胞特别是由应答微生物感染所释放的趋化因子fMLP所激活。这一激动剂结合到百日咳毒素敏感的G蛋白偶联受体上并激活嗜中性粒细胞呼吸爆发，导致超氧化物的产生和细胞毒性。呼吸爆发反应与一快速并瞬时的胞内PI3K活性的增加相关。
对嗜中性粒细胞的研究表明，选择性抑制PI3K的催化成分的渥曼青霉素导致超氧化物产生的停止。由于绝大多数激活这一呼吸爆发的激动剂结合于与G蛋白结合的受体，G蛋白调控的PI3K的活性代表一种主导性效应物途径的候选物，其抑制将减轻炎症的破坏细胞的作用。然而，渥曼青霉素不是一个临床上合适的这一途径的抑制剂，因为渥曼青霉素抑制PI3K的所有催化活性，包括参与其它细胞途径，如生长因子的活性。
在此报道的发现，即G-蛋白调控的PI3K由两个亚基组成：催化亚基(p110γ,p117或p120)和p101调控亚基。PI3K对可刺激Gβγ亚基从活化的三聚体G-蛋白释放的细胞表面受体的反应能力主要取决于p101调控亚基的存在。尽管催化亚基在体外有Gβγ亚基存在下也会表现出对PI3K活性一个小的刺激(约1.7倍)，但p101蛋白的加入将提高Gβγ对PI3K活性的刺激100倍。对p101的中和、去除或干扰p101结合于其结合伴侣，将使细胞失去应答激活的Gβγ亚基产生大量增加的胞内信号PtdIns(3,4,5)P3的能力。这样看来，在骨髓来源的细胞中有限的p101亚基的分布是对这一应答的细胞类型特异性的关键因素。此外，p101上没有明显的与其它任何已鉴定的序列的同源物。这一发现使p101和p101/p120复合物成为非特异性效应最小的抑制、激活或调节G蛋白激活的PI3K的可选择的靶位。
本发明还包括p101和p120的核苷酸、p101和p120的蛋白和肽以及抗p101和p120的抗体(比如，其能够作为p101和p120的激动剂或拮抗剂)、抑制G蛋白激活的PI3K的活性或表达的拮抗剂或者一些激活G蛋白激活的PI3K的活性或增加其表达的激动剂，这些激动剂在动物比如人类中，治疗造血谱系细胞激活紊乱，包括但不仅限于，与急、慢性炎症相关的免疫应答。例如，Gβγ激活的PI3K的拮抗剂可用于治疗包括类风湿性关节炎在内的关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘和其它肺部疾病、过敏、再灌注损伤、动脉粥状硬化和其它心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症，在此仅列出一些炎性紊乱。另外，p101核苷酸和p101调控亚基，以及p120核苷酸和p120催化亚基，在鉴定有效的治疗参与G蛋白激活的PI3K的造血谱系细胞激活紊乱的化合物时是很有用的。
进一步，本发明包含p101和p120核苷酸、p101和p120蛋白和肽、以及在造血谱系细胞激活紊乱诊断中抗p101和p120抗体的用途。在一个病人中p101调控亚基或p120催化亚基的异常，或在G蛋白激活的PI3K信号传导途径中的异常的诊断，将同样有助于制订一个合适的疗法或治疗方案。
特别地，下面一段内容描述的发明包含p101调控亚基、相应于p101调控亚基功能结构域的多肽或肽(例如，催化亚基结合结构域，或与激活的G蛋白相互作用的结构域)、突变的截短的或缺失的p101调控亚基(例如，缺失了一个或多个功能结构域或部分的p101调控亚基)、p101调控亚基融合蛋白(例如，p101调控亚基或p101调控亚基的一个功能结构域，其融合于一个不相关的蛋白或肽，例如一种表位标记，即myc表位)、编码这些产物的核苷酸序列和可产生这些p101调控亚基产物的宿主细胞表达体系。
另外，本发明还包括p120催化亚基蛋白、多肽、p120亚基的功能结构域(例如，催化结构域)、突变的截短的或缺失的p120调控亚基蛋白、p120融合蛋白、编码这些产物的核苷酸序列和可产生这些p120催化亚基产物的宿主细胞表达体系。
本发明还包括抗体和抗独特型抗体(包括Fab片段)、G蛋白激活的PI3K的拮抗剂和激动剂以及抑制p101或p120基因表达(转录因子抑制剂、反义和核酶分子、或基因或调控序列替代构建体)、或启动p101调控亚基的表达(例如，一些表达构建体，其中p101编码序列与表达控制元件例如启动子、启动子/增强子等有效地结合)的化合物或核苷酸构建体。本发明还涉及基因工程改造了的宿主细胞和动物，以表达人p101调控亚基(或其突变体)，或抑制或“敲除”动物内源性p101调控亚基的表达。
进一步，本发明特别地包含防止p101调控亚基与其结合伴侣的结合的拮抗剂，包括p120和其它PI3K催化亚基蛋白例如p117和p110γ，以及活化的三聚体G蛋白蛋白，包括Gβγ亚基。
p101调控亚基蛋白或肽、p101调控亚基融合蛋白、p101核苷酸序列、抗体、拮抗剂和激动剂可用于在免疫疾病诊断中突变的p101调控亚基或不适当地表达的p101调控亚基的检测。p101和p120亚基蛋白或肽、p101和p120亚基融合蛋白、p101和p120核苷酸序列、宿主细胞表达体系、抗体、拮抗剂、激动剂和基因工程细胞和动物可用于筛选对这些免疫疾病的治疗有效的药物。基因工程宿主细胞和/或动物的应用可以提供一个优点，即这些系统不仅允许鉴定结合于p101调控亚基的化合物，而且允许鉴定作用于由活化的p101调控亚基传导的信号的化合物，特别是胞内信号分子PtdIns(3,4,5)P3的产生。
最后，p101调控亚基蛋白产物和融合蛋白产物、抗体和抗独特型抗体(包括Fab片段)、拮抗剂或激动剂(包括调节可作用于p101调控亚基信号传导途径中作用于下游靶位的信号传导的化合物)可用于上述疾病的治疗。例如，编码功能性p101调控亚基、突变的p101调控亚基、以及反义和核酶分子的核苷酸构建体可用于“基因治疗”，该“基因治疗”涉及在造血谱系细胞激活紊乱的治疗中p101调控亚基的表达和/或活性的调节。这样，本发明也包括用于造血谱系细胞激活紊乱的治疗的药物制剂和方法。
本发明部分地基于，猪嗜中性粒细胞中新型PI3K酶这一令人惊讶的发现。与其它PI3K蛋白相似，这些酶3-磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2底物，并且被100nM的渥曼青霉素完全抑制。然而，不同于以前描述过的PI3K p85/p101蛋白复合物，PI3K的活性在与Gβγ亚基一同温育后被激活超过100倍。Gα-GDP亚基的加入可以抑制这一Gβγ的激活。更进一步，PI3K活性不被磷酸化的酪氨酸肽激活。纯化时，鉴定了两种不同的异源二聚体蛋白复合物：一种p117/p101复合物和一种p120/p101复合物。肽测序揭示p101蛋白在各复合物中是一样的。p120和p117蛋白是同源的，除了氨基末端(见下面实施例)。之后基于肽的序列，应用简并性探针从猪嗜中性粒细胞mRNA合成的cDNA的表达文库筛选猪p101和p120 cDNA。应用从猪的cDNA序列得到的探针从人单核细胞和淋巴细胞cDNA文库筛选人p101和p120的克隆。尽管猪和人亚基的序列分析揭示p120蛋白与以前克隆的PI3K催化亚基同源(虽然它们在远端羧基端有很大差异)，但p101蛋白与数据库中的任何序列都不相关。
猪与人p101和p120同源物氨基酸序列比较揭示了在这两个种间的高度保守性。这一在两个哺乳动物种间高度的保守性暗示，哺乳动物种间可能普遍存在一个相似的程度的保守性。相同于猪的序列用于克隆人同源物的方法，本领域技术人员应用已公开的人和/或猪的序列以及在本说明书中描述的方法可从其它哺乳动物种类中克隆p101和p120同源物。
这里叙述的实验，即在昆虫细胞中表达p101和/或p120融合蛋白，说明p101以1∶1的化学计算摩尔比紧密地与p120结合。能够表现PI3K活性的游离的经过纯化的p120对Gα亚基和酪氨酸磷酸化的肽的存在不敏感，并且仅微弱地受Gβγ亚基刺激。然而，当与p101结合后，p120的PI3K活性在Gβγ亚基存在下刺激增加100倍。当p101单独在昆虫细胞中表达时，p101并不表现PI3K活性。
当p101在人U937细胞中以标记的融合蛋白的形式表达时，一个有趣的结果出现了。当这个重组表达的猪p101通过融合蛋白标记进行免疫沉淀时，这些免疫沉淀物确实包含G蛋白调控的PI3K活性。p120与p101的共表达轻微地降低可沉降的PI3K的活性量。这些结果说明人U937细胞包含一种PI3K催化亚基，这一亚基能够与p101调控亚基结合，并由其激活。这些结果表明除了高度保守的氨基酸序列，来自不同哺乳动物种类的同源物相互间在功能和结构上很相似。
此外，用编码p101、p120和/或Gβγ亚基构建体在Cos-7细胞中进行瞬时转染，其在应答活化的G蛋白时一般并不刺激PI3K活性。当存在p101下共表达时，表达p120的构建体的转染仅以一种依赖Gβγ的方式产生胞内PtdIns(3,4,5)P3水平的明显提高。
本发明的各种方面在下面这一部分进行更详细的描述。5.1 p101和p120基因
在图1和2中分别列出猪p101调控亚基的cDNA序列(SEQ ID No:1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。一个相对普通的等位突变发生于开放阅读框架中483位氨基酸残基；一个丝氨酸可在此位被甘氨酸取代。
在图10和11中分别列出人p101调控亚基的cDNA序列(SEQ IDNo:11)和推导的氨基酸序列(SEQ ID No:12)。
认为编码猪p101调控亚基开始的733个氨基酸(相应于人亚基的前736氨基酸)的核苷酸序列足够与催化亚基结合。然而，没有另外145个羧基端氨基酸，此结合于p120的截短的p101不能应答Gβγ亚基刺激PI3K活性。因此，认为催化亚基相连的结构域包含在前732氨基酸内(对于人为735)，且733到877位羧基端氨基酸(对于人为736到880位)可能参与应答Gβγ亚基。
猪p101的其它结构域由以下氨基酸残基描述，从约1到160、80到120、161到263、264到414、415到565、566到706、707到832和/或833到877。相应的人p101结构域由以下氨基酸残基描述，从约1到160、80到120、161到263、264到416、417到567、568到709、710到835和/或836到880。编码从约161到263氨基酸残基的核苷酸序列定义一种血小板-白细胞C激酶底物同源(“PH”)结构域(PROSITE:PS50003)。PH结构域可参与蛋白质与Gβγ亚基的结合(Touhara等，1994，生物化学杂志269:10217)，以及与膜磷脂的结合(见Shaw,1996，生物鉴定(Bioessays),18:35-46)。如此，p101的PH结构域可能参与这两类事件。
编码p101的1到160氨基酸的核苷酸序列可能负责结合p120催化亚基。分析p101蛋白此区域二级结构时，可预见其有自身包含的交替的α-螺旋/β-折叠结构。在此结构内发现与“WW结构域”的同源区(Staub等，1996，结构4:495-499和TIBS 21:161-163)。此WW结构域可能结合于在p120蛋白N端发现的富含脯氨酸的结构域(残基310到315)。如此，p101的WW结构域可能参与介导调节亚基和催化亚基之间的相互作用。
分别在图3和4中显示猪p120 cDNA序列(SEQ ID No:3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID No:4)。分别在图12和13显示人p120 cDNA序列(SEQ ID No:13)和推导的氨基酸序列(SEQ ID No:14)。隐义的凝血酶切割位点出现在开始的约40个氨基酸残基后。缺乏这些约40个氨基端残基的截短的p120蛋白仍能结合p101，但PI3K活性降低约20％到30％。换言之，具有SEQ ID No:4(猪p120推导的氨基酸序列)部分从约氨基酸残基41延伸到残基1102的氨基酸序列的蛋白质保留了全长p120的功能。基于猪和人p120高度序列同源性，具有SEQ ID No:14(人p120推导的氨基酸序列)部分从约氨基酸残基41延伸到残基1102的氨基酸序列的蛋白质，也将保留全长p120的功能。尽管Stoyanov等(1995)报道p120蛋白质与早先克隆的p110γ蛋白高度同源，但p120C末端在氨基酸残基1075与报导的p110γ蛋白质不同；因此，p120最后的28个氨基酸残基在任一同源蛋白质的报告中并未公布。如上所述，编码包括p120残基310到315的富脯氨酸区域的核苷酸可能参与p120与p101之间的相互作用。另外，编码p120从约173到302氨基酸残基的核苷酸定义了弱PH结构域，它可能是关于膜结合和/或Gβγ与p101/p120复合物的相互作用的候选者。
实施例中呈现的数据，如下，证明p120 cDNA编码Gβγ激活的PI3K的催化亚基。p101 cDNA编码结合于p120亚基的新的调控亚基蛋白质。此异源二聚体应答于三聚体G蛋白连接受体的激活从而3-磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2。
本发明的p101核苷酸序列包括：(a)如图1或10所示的DNA序列或包含于保藏号为97636的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的cDNA克隆pCMV3mycp101的DNA序列；(b)编码如图2或图10所示氨基酸序列的核苷酸序列，或由保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101编码的p101调控亚基氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在高度严格条件下杂交于如图1或图10所示DNA序列互补物的任何核苷酸序列或包含于保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101中的任何核苷酸顺序，例如，在0.5M NaHPO4,7％十二烷基硫酸钠(SDS),1mm EDTA在65℃条件下与结合在膜上的DNA杂交，并在0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下清洗，(Ausubel F.M.等，编1989，当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology),Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&sons,Inc.,纽约，p.2.10.3)，以及编码功能等同基因产物的任何核苷酸序列；以及(d)在以次高度严格条件下例如在中等严格条件下，如，0.2×SSC/0.1％SDS在42℃清洗(Ausubel等，1989，出处同前)杂交于编码如图1或图10所示氨基酸序列的DNA序列的互补物的任何核苷酸序列，或包括于保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101中，还仍然编码功能等同p101基因产物的任何核苷酸序列。p101调控亚基功能等同物包括存在于其它物种的天然发生p101调控亚基，以及无论天然发生还是设计的保留至少p101一些功能活性(即和p120或p117催化亚基结合，应答Gβγ亚基的催化活性的激活，和/或与Gβγ亚基相互作用)的突变p101调控亚基。本发明还包括从(a)到(d)序列的简并性变异体。
本发明还包括杂交于前段中从(a)到(d)核苷酸序列并且因此是其互补物的核酸分子，优选的是DNA分子。此杂交条件可能是如上所述的高度严格或次高度严格条件。在核酸分子是脱氧寡核苷酸(“寡聚物”)时的情况下，高度严格条件可以指例如在6×SSC/0.05％焦磷酸钠在37℃(对于14-碱基寡聚物)、48℃(对于17-碱基寡聚物)、55℃(对于20-碱基寡聚物)和60℃(对于23-碱基寡聚物)下清洗。这些核酸分子可以编码或作为p101反义分子，例如用于p101基因调控(在p101基因核酸序列的扩增反应中用于和/或作为反义引物)。关于p101基因调控，这些技术可用于调控例如炎性免疫应答。进一步，这些序列可被用作核酶和/或三螺旋序列的一部分，也可用于p101基因调控。再进一步，这些分子可被用作诊断方法的组成部分，例如，通过负责引起一种炎性反应的特定p101等位基因的存在可检测到诸如关节炎。
除上述的p101核苷酸序列之外，通过本领域中众所周知的分子生物学技术且无需过度的实验，可以鉴定并且很易分离出来存在于相同物种中全长p101 cDNA或基因序列和/或存在于其它物种的p101基因同源物。于此所述实验证据显示p101蛋白质在不同哺乳动物中是保守的。例如，用得自猪p101 cDNA序列的探针从单核细胞和白细胞库中克隆人p101，并且发现推导的人和猪氨基酸序列高度保守。通过实验证明了两个同源物结构和功能的相似性，该实验显示当猪p101在U937细胞中表达时，猪p101与催化亚基的人同源物结合。另外，酪氨酸激酶调控的PI3K蛋白质家族的成员，例如p110/p85 PI3K在不同哺乳动物中也保守。因此p101和p120同源物可从已知或怀疑含有三聚体G蛋白调控的PI3K的哺乳动物细胞，特别是造血源细胞以及更特别是血小板、单核细胞、白细胞、破骨细胞和嗜中性粒细胞中分离。
在相关物种中p101同源物的鉴定可用于以发现药物为目的的与人更紧密相关的动物模型系统的开发。例如，得自目的生物体的嗜中性粒细胞mRNA合成的cDNAs表达文库，可用得自该物种标记的催化亚基例如p120、p117或p110γ催化亚基融合蛋白来筛选。另外，这些得自目的生物体的cDNA文库或基因组DNA文库可用在此描述为杂交或扩增探针的核苷酸通过杂交进行筛选。而且，在基因组内其它基因座上编码与p101基因产物一个或多个结构域有广泛同源性的蛋白质的基因也可经由相同技术鉴定。至于cDNA文库，这些筛选技术可鉴定得自在相同或不同物种中可选择的剪接转录物的克隆。
可使用多重滤膜通过滤膜杂交进行筛选。标记的探针包含如图1和10分别所示的人或猪p101核苷酸序列中至少15-30个碱基对。当cDNA文库来源于不同于得到标记序列的生物体类型的生物体时，所使用的杂交冲洗条件应该是较低严格性的。关于用猪和/或人p101探针克隆哺乳动物p101同源物，可通过杂交，例如，可在Church缓冲液(7％SDS,250mM NaHPO4,2μMEDTA,1％BSA)中于65℃过夜进行。可用2×SSC,0.1％SDS，在65℃下清洗以及然后在0.1×SSC,0.1％SDS,在65℃的条件下进行清洗。
低度严格条件对本领域技术人员来说是众所周知的，并且依赖于文库以及衍生标记的序列的特定生物体而相应地变化。关于这些条件的指南见，例如Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册，冷泉港出版社，N.Y.；以及Ausubel等，1989，当代分子生物学方法，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience,N.Y.。
另外，仍旧使用合适的严格条件，标记的p101核苷酸探针可用于筛选来自目标生物体的基因组文库。人基因组克隆的鉴定和表征对设计诊断实验和用于治疗人类造血谱系细胞激活紊乱的治疗临床方案有帮助。例如，得自人基因内含子/外显子边界邻近区域的序列可用于设计能用于诊断的在检测外显子、内含子、剪接位点(例如剪切接受体和/或供体位点)等中突变的扩增分析中的引物。
此外，p101基因同源物可通过使用基于在此公开的p101基因产物内氨基酸序列设计的两简并性寡核苷酸引物库进行PCR从目的生物体的核酸中分离出来。反应的模板可为得自mRNA反转录物的cDNA，此mRNA从例如，已知或怀疑表达p101等位基因的人类或非人类细胞系或细胞型如嗜中性粒细胞中制备。
PCR产物可被亚克隆和测序以确保所扩增的序列代表p101基因序列。然后PCR片段可用于各种方法以分离全长cDNA克隆。例如，扩增片段可被标记并用于筛选cDNA文库，诸如噬菌体cDNA文库。此外，标记的片段可用于经由基因组文库的筛选分离基因组克隆。
PCR技术还可用于分离全长cDNA序列。例如，依据标准步骤可从合适细胞源(即已知或怀疑表达p101基因如，嗜中性粒细胞或白细胞的其它类型的细胞)中分离RNA。使用对引发第一条链合成的扩增片段的最5’末端特异的寡核苷酸引物，可在RNA上进行逆转录反应。然后得到的RNA/DNA杂合体使用标准末端转移酶反应用鸟苷酸“加尾”，杂交体可用RNAase H消化并且使用ploy C引物引发第二条链合成。如此，扩增片段的cDNA序列上游很容易被分离。可能用到的克隆策略见例如，Sambrook等，1989，出处同前。
p101基因序列可额外地用于分离突变p101等位基因。这些突变等位基因可从已知或者推定有与造血谱系细胞激活紊乱症状，如炎症有关的基因表型的个体中分离。然后突变等位基因及突变等位基因产物用于如下所述的治疗和诊断系统中。额外地，这些p101基因序列可用于检测影响造血谱系细胞激活的p101基因调控(例如：启动子或启动子/增强子)缺陷。
例如可使用本领域技术人员周知的PCR技术分离突变p101基因的cDNA。在这种情况下，第一条cDNA链可通过将寡聚dT寡核苷酸杂交于分离自已知或怀疑推断的带有突变p101等位基因个体中的细胞的mRNA，并且用反转录酶延伸新链来合成。然后用特异性杂交于正常基因5’末端的寡核苷酸来合成cDNA第二条链。使用这两个引物，然后通过PCR扩增产物，克隆进合适载体并通过本领域技术人员周知的技术进行DNA序列分析。通过比较突变p101等位基因和正常p101等位基因的DNA序列，可确定负责突变p101基因产物功能缺失或改变的突变。
另外，可用得自怀疑或已知带有突变p101等位基因个体的DNA构建基因组文库或使用得自已知或怀疑表达突变p101等位基因细胞型的RNA构建cDNA文库。由此，正常p101基因或其任何合适片段可被标记并用作为在这些文库中鉴定相应突变p101等位基因的探针。然后纯化含有突变p101基因序列的克隆并根据本领域技术人员周知的方法进行序列分析。
另外，使用从例如分离自怀疑或已知带有此突变等位基因的个体中的已知或怀疑表达突变p101等位基因的细胞型的RNA合成的cDNA构建表达文库。用此法，推测的突变细胞型制造的基因产物可用标准抗体筛选技术连同抗正常p101基因产物的抗体(如以下5.3部分所述)表达和筛选(筛选技术见例如，Harlow,E.和Lane.编,1988，“抗体：实验室手册”，冷泉港出版社，冷泉港)。另外，可通过应用标记的融合蛋白比如，(EE)120或myc120融合蛋白的筛选方法完成筛选。在p101突变导致功能改变的表达基因产物(例如，错义或移码突变的结果)产生的情况下，抗p101调控亚基抗体的多克隆系易于和突变p101调控亚基基因产物交叉反应。经由其和这些标记的抗体反应检测的文库克隆可被纯化并根据本领域技术人员周知的方法进行序列分析。
本发明还包括编码突变p101调控亚基、p101调控亚基的肽段、截短的p101调控亚基和p101调控亚基融合蛋白的核苷酸序列。这些包括但不限于编码如下5.2部分所述突变p101调控亚基；与催化结合相关的多肽或肽，或p101调控亚基Gβγ亚基的结合结构域或这些结构域的部分；其中一或两个结构域缺失的截短的p101调控亚基或截短的无功能p101调控亚基的核苷酸序列。编码融合蛋白的核苷酸可包括但不限于全长p101调控亚基、截短的p101调控亚基或与不相关蛋白质或肽融合的p101调控亚基肽片段，比如，协助纯化或检测所得融合蛋白的表位标记；或可用作标记物的酶、荧光蛋白、发光蛋白。
本发明还包括(a)含任何前述p101调控亚基编码序列和/或它们的互补物(即反义)的DNA载体；(b)含任何与指导编码序列表达的调控元件序列有效地结合的前述p101调控亚基编码序列的DNA表达载体；以及(c)含任何与指导编码序列在宿主细胞中表达的调控元件有效地结合的前述p101调控亚基编码序列的基因工程宿主细胞。在此使用的调控元件包括但不限于可诱导的和非可诱导的启动子、增强子、操纵子和其它本领域技术人员已知的驱动和调控表达的元件。这些调控元件包括但不限于杆状病毒启动子、巨细胞病毒hCMV极早期基因启动子、SV40腺病毒早期或晚期启动子、1ac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子以及酵母α-交配因子启动子。
最后，本发明还包括编码p120亚基蛋白质的核苷酸，这些蛋白质包括新近描述的此催化亚基羧基端，p120亚基蛋白质的缺失变异体，在高度严格条件下杂交于这些核苷酸并编码功能等同物的120等位基因变异体的核苷酸，包括保藏号为97637的保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp120(例如，突变等位基因或天然发生的等位基因，诸如在483位氨基酸残基等位基因变异)，以及用如上所述本发明p101核苷酸的分离方法从不同生物体分离的p120核苷酸等同物。此外，本发明包括用于重组生产p120的表达载体和宿主细胞。5.2p101和p120蛋白质和多肽
可制备p101调控亚基和p120催化亚基，p101调控亚基和/或p101调控亚基融合蛋白以及p120催化亚基和/或p120催化亚基融合蛋白的多肽和肽片段、突变的、截短的或缺失的形式以用于多种用途，包括但不仅限于可作为诊断分析中的试剂的抗体的产生和其它参与造血谱系细胞激活调控的细胞基因产物的鉴定，这些基因产物可用作在筛选可用作治疗造血谱系细胞激活紊乱的化合物的试剂以及用于与Gβγ激活的P13K相关的造血谱系细胞激活紊乱的药物试剂的筛选。
图2和11分别显示了猪和人p101调控亚基蛋白质的氨基酸序列。图4和13分别显示了猪和人p120催化亚基蛋白质的氨基酸序列。图4上的虚线强调p120与公开的PI3K催化亚基p110α,p110β和p110γ有分歧的区域。
p101调控亚基序列在与翻译起始位点相一致的DNA序列中以蛋氨酸开始。猪和人p101调控亚基的预计分子量都为97KD。
本发明p101调控亚基氨基酸序列包括图2(SEQ ID No:2)或图4(SEQ ID No:12)所示氨基酸序列或由保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101编码的氨基酸序列。而且，本发明包括其它物种的p101调控亚基。事实上，由上述的p101核苷酸序列编码的任何p101调控亚基蛋白都在本发明的范围内。
本发明p120催化亚基氨基酸序列包括保藏于美国典型培养物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp120。本发明还包括其它物种的p120催化亚基以及由在前面部分描述的p120核苷酸序列编码的p120蛋白。
本发明还包括由上述核苷酸序列编码的功能等同于p101调控亚基的蛋白质，这是通过许多标准的任何一种评定包括但不限于结合催化亚基的能力，与催化亚基的结合亲和力，应答激活的三聚体G蛋白激活催化亚基的PI3K活性的能力，催化亚基结合以及应答三聚体G蛋白激活引起的生物学效应，例如信号传导、细胞代谢改变(例如PtdIns(3,4,5)P3的产生)或在合适细胞型中存在(如中性粒细胞超氧化爆发)时p101调控亚基等同物时表型改变。这些功能等同的p101调控亚基蛋白包括但不限于由上述的p101核苷酸序列编码的氨基酸序列中氨基酸残基的增加或取代(但却导致沉默突变)所产生的功能等同的基因产物。氨基酸取代可在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或有关残基两性特性的相似性基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。相似的，本发明还包括上述p120蛋白的功能等同物。
尽管可对p101 DNA进行随机突变(用本领域技术人员周知的随机突变技术)并且检测所得的p101调控亚基突变体活性，可设计p101编码序列的定点突变(使用本领域技术人员周知的定点突变技术)以产生使功能增加，例如对催化亚基的更高的结合亲和力，和/或更大的信号传导能力；或功能降低，例如对催化亚基的较低的结合亲和力，和/或减小的信号传导能力的突变p101调控亚基。
例如，猪p101的氨基酸序列可以与人p101调控亚基的序列进行比较。可设计p101调控亚基突变体以使物种间相同的区域得以保持而可变的残基通过例如，氨基酸残基的缺失、或插入、或一个或多个不同氨基酸残基的取代被改变。可设计在可变位置的保守性改变以产生保留功能的p101调控亚基突变体；例如，催化亚基结合亲和力或激活的G蛋白的传导能力或二者均有。可以在这些可变位置设计非保守性变化以改变功能，例如催化亚基结合亲和力或信号传导能力，或两者都有。另外，想要改变功能的地方，也可设计保守区域的缺失或非保守性改变。使用此处提到的教导，本领域技术人员可以很容易检测这些突变或缺失的p101调控亚基的这些改变。
可对p101编码序列进行其它突变以产生更适合于在所选宿主细胞中表达和放大等等的p101调控亚基。例如，每个氨基酸的三联密码子可以被修饰以形成更为接近宿主细胞翻译机制使用的偏好密码子。
相应于p101调控亚基(例如p120结合结构域，G蛋白相互作用结构域，或从约1到150、151到300、301到450、451到600、601到732(猪)或601到735(人)和733到877(猪)或736到881(人))的一个或多个结构域(或一个结构域的一部分)，截短的或缺失的p101调控亚基(例如，其中一个或多个以上结构域的部分缺失的p101调控亚基)以及全长p101调控亚基，其中全长p101调控亚基、p101调控亚基肽或截短的p101调控亚基融合进一种不相关蛋白的融合蛋白也都在本发明的范围内，并且可在本部分及以上部分公开的p101核苷酸和p101调控亚基氨基酸序列的基础上进行设计。这些融合蛋白包括但不限于融合进一种表位标记(如在下面的实例中举例说明)；或融合进一种提供标记功能的酶、荧光蛋白或发光蛋白。
尽管p101调控亚基多肽和肽可被化学合成(例如，见Creighton,1983，蛋白质：结构和分子原则(Proteins:Structures andMolecular Principles)，W.H.Freeman & Co.N.Y.)，得自p101调控亚基的大多数肽和全长p101调控亚基本身可使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术有利地生产，以表达含p101基因序列和/或编码序列的核酸。这些方法可用于构建含上述p101核苷酸序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。见例如Sambrook等，1989(出处同前)和Ausubel等，1989，(出处同前)中所述的技术。另外，能编码p101核苷酸序列的RNA可使用比如合成仪化学合成。见如“寡核苷酸合成”，1984,Gait,M.J.编，IRL出版社，Oxford所述的技术，在此全文引入作为参考。
利用各种宿主表达载体系统来表达本发明的p101核苷酸序列。当p101调控亚基肽或多肽是可溶性衍生物时，可从培养物回收肽或多肽，即在p101调控亚基肽或多肽不分泌的情况下从宿主细胞中回收以及在p101调控亚基肽或多肽可由细胞分泌情况下从培养基中回收。然而，如此构建的宿主细胞本身可用于不仅保持p101调控亚基结构和功能特性很重要，而且在例如药物筛选分析中评估生物活性也很重要的情况中。
用于本发明之目的的表达体系包括但不限于微生物，诸如经重组噬菌体DNA转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))，含p101核苷酸序列的质粒DNA或粘粒DNA表达载体；经含p101核苷酸序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)；经含p101核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞体系；经重组病毒表达载体(例如菜花花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或经含p101核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞体系；或包含得自哺乳动物细胞(例如金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞体系(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3、U937)。
在细菌体系中，依赖以p101基因产物表达为目的的用途有利地选择许多表达载体。例如，大量生产此蛋白质以产生p101调控亚基蛋白的药物组合物或产生抗p101调控亚基蛋白抗体时，需要例如，指导易被纯化的融合蛋白高水平表达的质粒。这些载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983,EMBO J.2:1791)，其中的p101编码序列被单个地连接于载体lacZ编码区域框架中以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989，生物化学杂志264:5503-5509)；等等。pGEX载体也可用来以谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达外源性多肽。如果插入的序列编码相对较小的多肽(小于25KD)，这些融合蛋白一般可溶并且吸附入谷胱甘肽-琼脂糖小珠后在游离谷胱甘肽存在下洗脱很易从裂解细胞中纯化。设计pGEX载体以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使克隆的目的基因产物可从GST部分释放出来。另外，如果所得融合蛋白不溶并在宿主细胞中形成包涵体，可用本领域技术人员所周知的技术纯化包涵体并且溶解重组蛋白。
在昆虫体系中，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)核多汗(polyhidrosis)病毒(AcNPV)可用作载体来表达外源基因(例如，见Smith等，1983，病毒学杂志(J.Virol.)46:584；Smith,U.S.专利4,215,051)。在以下所述特定的实施方案中，Sf9昆虫细胞被表达6×HIS标记的p120构建体或表达(EE)标记的p101构建体的杆状病毒载体感染。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达体系。以下更详细描述的特定实施方案中用CMV启动子在U937细胞或Cos-7细胞中瞬时表达重组蛋白来表达标记的p101或p120cDNA序列。另外，本领域中众所周知的逆转录病毒载体系统可用于在宿主细胞中插入重组表达构建体。例如，在公开的PCT申请WO96/09400和WO94/29438中描述的转导造血细胞的逆转录病毒载体系统。
在腺病毒用作表达载体的情况下，目的p101核苷酸序列可被连于一种腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组将此嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组非必需区域(例如区域E1或E3)将导致有生存能力并能在所感染的宿主中表达p101基因产物的重组病毒(例如见Logan & Shenk,1984,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:3655-3659)。插入的p101核苷酸序列的有效翻译还需要特异起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及邻近序列。在完整的包括自身起始密码子和邻近序列的p101基因或cDNA插入合适的表达载体的情况下，不需要额外翻译控制信号。然而，在仅仅插入p101编码序列一部分的情况下，必须提供包括可以是ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。而且，起始密码子必须和所需要的编码序列的阅读框架方向相同以确保全部插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可为各种来源，天然的和合成的。表达效率可被包括合适的转录增强子元件、转录终止子等等提高(见Bittner等，1987，酶学方法(Methods in Enzymol.)153:516-544)。
另外，要选择调节插入序列的表达或以所需特殊方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。这些蛋白产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对蛋白质的功能很重要。不同宿主细胞有对蛋白质和基因产物的翻译后加工及修饰的特征性和特异性的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白正确的修饰和加工。为此目的，可使用有合适的加工初级转录产物的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和U937细胞。
对于重组蛋白长期、高产量的生产优选可以稳定地表达。例如，可构建稳定地表达上述p101序列的细胞系。不使用含病毒来源的复制起点的表达载体，宿主细胞可用合适表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷化位点等)控制的DNA及选择性标记转化。引入外源DNA后，允许构建的细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予选择抗性并且允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体并且可生长和形成依次可被克隆和扩展成细胞系的细胞转化灶。使用这种方法可有利地构建表达p101基因产物的细胞系。这些构建的细胞系在筛选和评价影响p101基因产物内源性活性的化合物上尤其有用。
可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，细胞11:223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Azybalski,1962，美国国家科学院院报48:2026)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，细胞22:817)基因可分别用在tk-、hgprt-或aprt-细胞中。而且，抗代谢产物抗性可用作下列基因筛选的基础：dhfr，赋予氨甲喋呤抗性(Wigler等，1980，美国国家科学院院报77:3567；O’Hare等，1981，美国国家科学院院报78:1527)；gpt，赋予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg,1981，美国国家科学院院报78:2072)；neo，赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)150:1)；以及hygro，赋予潮霉素抗性(Santerre等，1984，基因30:147)。
p101基因产物也可以在转基因动物中表达。任何种类的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、小型猪、山羊以及非人的灵长类例如狒狒、猴子、黑猩猩均可以用于产生p101转基因动物。
本领域中任何已知技术均可用于向动物中引入p101转基因以产生转基因动物的创立系。这些技术包括但不限于原核显微注射(Hoppe.P.C.和Wagner,T.E.,1989，美国专利4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转入胚系(Van der Putten等，1985，美国国家科学院院报82:6148-6152)；在胚胎干细胞中基因打靶(Thompson等，1989，细胞56:313-321)；胚胎的电穿孔(Lo.1983，分子细胞生物学(Mol Cell.Biol.)3:1803-1814)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989，细胞57:717-723)等。这些技术的综述见于Gordon,1989，转基因动物(Transgenic Animals),Intl.Rev.Cytol.115:171-229，此处全文引入作为参考。
本发明提供所有其细胞中带有p101转基因的转基因动物，以及在其部分细胞而并非所有细胞中带转基因的动物，即，嵌合动物。转基因可以以单个转基因或多联体例如头对头串连或头对尾的方式被整合。根据例如Lasko等的教导(Lasko,M等，1992，美国国家科学院院报89:6232-6236)转基因也可被选择性地引入特异细胞型并在其中激活。这样的细胞类型特异性激活所需的调控序列将取决于特定的目的细胞类型并且对本领域技术人员是显而易见的。当期望将p101基因的转基因整合进内源性p101基因的染色体位点时，优选基因打靶。简言之，当运用此技术时，设计含与内源性p101基因同源的一些核苷酸序列的载体以通过和染色体序列同源性重组而整合进内源性p101基因的核苷酸序列并打乱其功能。通过此法，内源性p101基因的表达可被在内源性基因中插入非功能序列而取消。转基因也可被选择性引入特定的细胞类型，这样根据例如Gu等(Gu等，1994，科学265:103-106)的教导仅在该细胞类型中使内源性p101基因失活。此种细胞类型特异性失活所需的调控序列将依赖于特定的目的细胞类型并且对本领域技术人员是显而易见的。
一旦产生转基因动物，可用标准技术来分析重组p101基因的表达。通过Southern杂交分析或PCR技术完成初始筛选来分析动物组织以鉴定转基因的整合是否发生。也可应用包括但不限于得自动物细胞类型样品的Northern杂交分析、原位杂交分析及RT-PCR来评价在转基因动物组织中的转基因mRNA的表达水平。表达p101基因的组织的样品可用如下所述的特异于p101转基因产物的抗体用免疫细胞化学方法评估。5.3抗p101和p120蛋白的抗体
本发明还包含了特异性识别p101调控亚基一个或多个表位或p101调控亚基保守性变异体的表位或p101调控亚基肽片段的抗体。本发明还包含识别p120蛋白的一个或多个表位尤其是新型羧基端的抗体。这些抗体包含但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人源化的或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体以及以上任一种的表位结合片段。
本发明的抗体可用于例如生物学样品中的p101调控亚基或p120的检测并且因此可用作诊断或预后技术的一部分，凭此，检测病人的这些蛋白质的量是否异常。这些抗体也可结合例如如下部分5.5所述的化合物筛选方案用以评价受试化合物对p101或p120基因产物的表达和/或活性的影响。另外，这些抗体可结合如下5.6部分所述的基因治疗技术来用于，例如在将他们引入病人之前，评价正常的和/或构建的表达p101调控亚基表达的细胞。这些抗体还可额外地用作抑制异常p101调控亚基或p120活性的方法。这样，这些抗体因此可用作炎性紊乱治疗方法的一部分。
为生产抗体，通过注射p101调控亚基、p101调控亚基肽、截短的p101调控亚基多肽、p101调控亚基的功能等同物或p101调控亚基的突变体来免疫多种宿主动物。另外，通过注射p120催化亚基或p120亚基的肽段来免疫宿主动物。这些宿主动物包括但不限于兔、小鼠和大鼠，此处只举出一些。使用多种佐剂以提高免疫学反应，依赖于宿主的种类，包括但不限于弗氏佐剂(完全以及不完全)，矿物胶诸如氢氧化铝，表面活性物质诸如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油性乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基苯酚以及可能有用的人佐剂诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。多克隆抗体是得自免疫动物血清的抗体分子的异源性群体。
抗特定抗原抗体的同源性群体的单克隆抗体可通过提供在培养基中连续细胞系生产抗体分子的任一技术得到。这些包括但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975，自然256:495-497；以及美国专利第4,376,110号)，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，今日免疫学(Immunology today)4:72；Cole等，1983,80:2026-2030)以及EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Alan R.,Liss,Inc.,pp77-96)。这些抗体可能属于任一类免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及它们的亚类。产本发明的单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。体内高效价单克隆抗体的产生使其成为目前优选的生产方法。
另外，可以使用通过剪接得自合适的抗原特异性的鼠抗体分子的基因以及得自合适的生物学活性的人抗体分子的基因以生产“嵌合抗体”所发展的技术(Morrison等，1984，美国国家科学院院报，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314:452-454)。嵌合抗体为一种分子，其中的不同部分来源于不同动物种属诸如有得自猪单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的部分。
另外，可以修改描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird,1988，科学242:423-426；Huston等，1988，美国国家科学院院报85:5879-5883；以及Ward等，1989，自然334:544-546)以生产抗p101基因产物的单链抗体。通过一种氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链，产生单链多肽可形成单链抗体。
用已知的技术可产生识别特异性表位的抗体片段。例如，这些片段包括但不限于：由胃蛋白酶酶解抗体分子产生的F(ab’)2片段以及由还原F(ab’)2片段二硫桥产生的Fab片段。另外，构建Fab表达文库(Huse等，1989，科学，246:1275-1281)以允许快速及方便地鉴定带有所需特异性的单克隆Fab片段。
使用本领域中周知的技术，抗p101调控亚基或p120催化亚基抗体可依次用于产生分别“模拟”p101调控亚基或p120亚基的抗独特型抗体(见，例如，Greenspan&Bona,1993,FASEB J.7(5):437-444；和Nissinoff,1991，免疫学杂志(J.Immunol.)147(8):2429-2438)。例如，结合于p101调控亚基并且竞争性抑制催化亚基与p101调控亚基结合的抗体可用于产生“模拟”p101调控亚基并且因此结合和中和催化亚基的抗独特型抗体。这些中和抗独特型或这些抗独特型的Fab片段的抗体可在治疗方案中使用以中和催化亚基并且减轻炎症。5.4造血细胞激活紊乱的诊断
运用多种方法诊断性和预后性评价造血谱系细胞激活紊乱，包括炎性紊乱以及对这些疾病倾向的病人的鉴定。
这些方法可以例如使用诸如上述的p101和p120核苷酸序列以及5.3部分中所述的p101调控亚基和p120抗体的试剂。特别的是，这些试剂可用于例如：(1)检测p101或p120基因突变的出现，或检测与非造血谱系细胞激活紊乱状态相关的p101或p120mRNA的过度或者低下表达；(2)检测与非造血谱系细胞激活紊乱状态相关的p101或p120基因产物的过度或者低下冗余(under-abundance)；以及(3)检测由p101调控亚基和p120催化亚基介导的信号传导途径中的干扰或异常。
此处描述的方法可通过例如使用含至少一种特异性p101或p120核苷酸序列或此处描述的p101或p120调控亚基抗体试剂的预先包装的诊断试剂盒来进行，此试剂盒可很方便地用在例如临床设备中以诊断呈现造血谱系细胞激活紊乱异常的病人。
为检测p101或p120突变，可用任何有核细胞作为基因组核酸的起始来源。为检测p101或p120基因表达或p101或p120基因产物，可运用其中表达p101或p120基因的任一细胞类型或组织例如，嗜中性粒细胞。
基于核酸的检测技术在以下5.4.1部分描述。肽检测技术在以下5.4.2部分描述。5.4.1 p101基因和转录物的检测
可使用很多技术检测p101或p120基因内的突变。可用任何有核细胞的核酸作为这些分析技术的起点，并且那些本领域技术人员周知的标准核酸制备步骤进行分离。
可在生物样品的杂交或扩增分析中使用DNA以检测有关基因结构的异常，包括点突变、插入、缺失和染色体重排。这些分析包括但不限于Southern分析，单链构象多形态分析(SSCP)以及PCR分析。
检测p101或p120基因特异性突变的这些诊断方法可包括例如在适宜于这些试剂和在p101或p120基因内它们的互补序列特异性退火的条件下，用一种或多种核酸反应物包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并性变异体接触并培养得自样品例如得自病人的样品或其它合适的细胞来源的核酸包括上述的重组DNA分子、克隆的基因或它们的简并性变异体。优选的，这些核苷酸反应物长度至少为15到30个核苷酸。温育后，从核酸分子杂合体中除去所有未退火的核酸。然后检测这种已杂交的核苷酸分子，如果有任何这样的分子存在的话。使用这样的检测方案，得自目标细胞类型或组织的核酸被固定于例如固态支持物(诸如膜或如微孔板或聚苯乙烯珠)上的塑料表面。在这种情况下，温育后，很易除去上述类型的未退火的标记的核苷酸反应物。用本领域技术人员所周知的标准技术完成剩余的退火的标记的p101或p120核酸反应物的检测。核酸反应物所退火结合的p101或p120基因序列可与正常基因序列预期的退火模式作比较以确定是否存在基因突变。
用于在病人样品或其它合适细胞来源中检测p101或p120基因特异性核酸分子的替代诊断方法可包括它们的扩增，例如通过PCR(实验实施方案列于Mullis,K.B.,1987,U.S.专利4,683,202)，其后使用为本领域技术人员所周知的技术检测扩增的分子。如果被扩增的核酸仅含p101或p120基因的正常拷贝，所得的扩增序列可与预期的那些作比较以确定是否存在基因突变。
另外，使用众所周知的基因分型技术以鉴定带有p101或p120基因突变的个体。这些技术包括例如限制性片段长度多形体(RFLP)的使用，此多形体包括与使用的特异性限制酶识别位点之一中的序列变异。
通过检测和测定p101或p120转录也可分析p101或p120基因表达的水平。例如，得自已知或怀疑表达p101或p120基因的细胞类型或组织诸如造血谱系细胞，尤其是骨髓细胞和血小板的RNA可运用上述的杂交或PCR技术来分离和检测。分离的细胞来源于细胞培养物或病人。取自培养物的细胞的分析是评价用作基于细胞的基因治疗技术的一部分或检测化合物对p101或p120基因表达的影响中的必需步骤。这些分析可揭示p101或p120基因表达模式的质量和数量，包括p101或p120基因表达的激活或失活。5.4.2p101基因产物的检测
以上5.3部分描述的针对野生型或突变p101或p120基因产物或保守的变异体或其肽片段的抗体也可用作此处所述的造血谱系细胞激活紊乱的诊断和预后。这些诊断方法可用于检测p101或p120基因表达水平的异常或用于检测p101调控亚基的结构和/或暂时的组织、细胞或亚细胞位置的异常，并且可在体内或体外进行例如在活检组织上。
待分析的组织或细胞类型一般包括那些已知或怀疑含表达p101或p120基因的细胞，如渗入炎性组织的嗜中性粒细胞。此处运用的蛋白分离方法可以是例如Harlow和Lane所述的那些方法(Harlow,E.和Lane,D.,1988.“抗体：实验室手册”。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。此处全文引入作为参考。分离的细胞可来源于细胞培养物或病人。取自培养物的细胞分析在评价用作基于细胞的基因治疗技术或者检测化合物对p101或p120基因表达的影响的细胞中为必需步骤。
例如，用于本发明中的诸如以上5.3部分所述的抗体或抗体片段可用于在定性或定量检测是否存在p101或p120基因产物或其保守的变异体或它们的肽片段。例如可通过应用荧光标记的抗体(见此部分以下)结合光学显微镜、细胞流式测量术或荧光测量检测的免疫荧光技术来完成。
为原位检测p101或p120基因产物或保守的变异体或其肽片段或为检测催化亚基的结合(在标记的催化亚基融合蛋白情况下)，本发明中有用的抗体(或它们的片段)或融合的或连接的蛋白可额外地在组织学上用于免疫荧光、免疫电子显微镜或非免疫分析。
从病人取得组织学样品并且还应用本发明标记的抗体或融合蛋白完成原位检测。优选的通过在生物学样品上覆盖标记的抗体(或片段)的方式应用抗体(或片段)或融合蛋白。在这个方法使用过程中，不仅可以确定p101或p120基因产物或保守变异体或肽片段的存在也可确定它在所检测的组织中的分布。使用本发明，本领域普通技术人员可以看出可改造多种组织学方法(诸如染色步骤)的任一种以实现样品的原位检测。
p101或p120基因产物或保守变异体或它们的肽片段的免疫分析和非免疫分析典型地包括温育样品，诸如生物学液体、组织提取物、新收集的细胞和在可检出的能鉴定p101或p120基因产物或保守变异体或它们的肽片段的标记的抗体存在下培养在细胞培养基的细胞裂解产物以及通过任何一种本领域周知的方法检测结合的抗体。
生物学样品可拿来接触并固定于固态支持物或载体诸如硝酸纤维素膜或能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白的其它固相支持物上。然后用合适缓冲液清洗支持物，之后用可检测到的标记的p101调控亚基或p120亚基抗体或融合蛋白处理。用缓冲液第二次冲洗固相支持物以除去未结合的抗体或融合蛋白。然后用传统方法检测固相支持物上结合的标记量。
“固相支持物或载体”意在包含任何能结合抗原或抗体的支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩以及磁铁矿。用于本发明目的的载体特性可以是某些程度可溶或不溶。支持材料实际上可有任何可能的结构形状，只要偶联的分子能和抗原或抗体结合。这样，支持物的形状可为圆球形如珠中、圆柱形，如试管内表面或杆的外表面上。另外，表面可为平的例如片状，试验条状等等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员知道或能通过使用常规实验确定许多其它适合结合抗体或抗原的载体。
根据众所周知的方法确定给定的许多p101调控亚基或p120亚基抗体或融合蛋白的结合活性。本领域技术人员能确定通过常规实验方法各自确定有效的和最佳分析条件。
就抗体而言，抗体被可检测标记的方法之一为将抗体和一种酶连接并用于酶免疫分析(EIA)(Voller，“酶联免疫吸附分析(ELISA)”1978，诊断水平2:1-7，微生物学联合季刊出版物，Walkersville,MD)；Voller等，1978，临床病理学杂志，31:507-520；Butler,1981，酶学方法，73:482-523；Maggio(编)1980，酶免疫分析，CRC出版社，BocaRaton,FL；Ishikawa等(编)1981，酶免疫分析，Kgaku Shoin，东京)。与抗体结合的酶将与合适的底物反应，优选的是产色底物，其反应方式如产生通过例如色谱法、荧光法或通过可见方法可检测的化学部分。用于可检测性标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶以及乙酰胆碱酯酶。通过应用酶的产色底物的比色法完成检测。也可通过与相似地制备的标准相比较的底物酶反应程度的可见比较完成检测。
使用各种其它任一免疫分析也可完成检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，可通过放射免疫分析检测(RIA)(见，例如，Weintraub,B.放射免疫分析原理，放射性配体分析技术第七期训练班，内分泌学会，1986，此处引入作为参考)p101调控亚基。放射性同位素可通过诸如使用γ-计数器或闪烁计或放射自显影的方法检测。
也可用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露于合适波长的光时，因荧光可检测抗体的存在。最经常使用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白以及荧光胺。
使用产荧光性金属诸如152Eu或镧系的其它金属也可将抗体可检测地标记。使用诸如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团可将这些金属连于抗体上。
还可通过将其偶联于化学发光化合物上可检测地标记抗体。然后检测化学反应过程中存在产生的发光确定化学发光标记的抗体的存在。尤其有用的化学发光标记化合物的实例有鲁米诺、异鲁米诺，theromatic吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓盐以及草酸酯。
相似地，生物发光化合物可用于标记本发明的抗体。生物发光化合物是在生物体系中发现的一类化学发光物，其中催化性蛋白增加了化学发光反应的效率。通过检测发光检测生物发光蛋白质的存在。重要的用于标记的生物发光化合物有荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。5.5调节G-蛋白激活的PI3K的表达或活性的化合物的筛选实验
设计以下实验用于鉴定下列化合物，与p101调控亚基或p120催化亚基相互作用(例如，结合)的化合物，与一些与p101调控亚基和/或p120催化亚基相互作用(例如，结合)的胞内蛋白相互作用的化合物，干扰p101调控亚基与p120催化亚基或与其它参与G蛋白刺激的PI3K介导的信号传导的胞内蛋白的相互作用的化合物，和调节p101或p120基因活性(例如，调节p101或p120基因表达水平)或调节p101或p120的水平的化合物。另外可能用到可以鉴定结合于p101或p120基因调控序列(例如，启动子序列)和鉴定调节p101或p120基因表达的化合物的实验。见例如，Platt,K.A.,1994，生物化学杂志269:28558-28562，在此全文引入作为参考。
依照本发明筛选的化合物包括但不限于与p101调控亚基或p120催化亚基结合并且模拟天然配体激活活性(例如，激动剂)或者抑制天然配体激活活性(即，拮抗剂)的肽、抗体及其片段、前列腺素、脂质、其它有机化合物(即，萜二醇，拟肽(peptidomimetics))；以及模拟p101调控亚基或p120催化亚基(或其一部分)并且结合以及“中和”天然配体的肽、抗体或其片段。
这样的化合物包括但不限于肽，如可溶性肽；包括但不限于随机肽文库的成员(见例如，Lam,K.S.等，1991，自然354:82-84；Houshten,R.等，1991，自然354:84-86)，以及由D-和/或L-构型氨基酸组成的来自组合化学的分子文库肽、磷酸肽(包括，但不限于随机或部分简并性，指导磷酸肽文库的成员；见例如，Songyang,Z.等，1993，细胞72:767-778)；抗体(包括但不限于多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合的或单链抗体，及FAb、F(ab′)2和FAb表达文库片段及其表位结合片段)；以及小的有机或无机分子。
依据本发明筛选的其它化合物包括但不限于能进入合适细胞(例如，嗜中性粒细胞)并且影响p101或p120基因或其它一些参与p101调控亚基信号传导途径(例如，通过与调控区域或参与基因表达的转录因子相互作用)的基因的表达的小有机分子；或影响p101调控亚基活性，例如通过抑制或增强p101与PI3K的催化亚基结合或p101与其它一些参与p101调控亚基信号传导途径的细胞内因子诸如Gβγ结合的化合物。
计算机模拟和检索技术允许鉴定化合物，或改善已鉴定的化合物，其中这些化合物能调节p101调控亚基或p120催化亚基表达或活性。鉴定这样的化合物或组合物后，鉴定活性位点或区域。这样的活性位点典型的是结合伴侣位点，诸如，p120催化亚基与p101调控亚基自身的相互作用结构域。使用本领域中公知的方法包括，例如从肽的氨基酸序列，从核酸的核苷酸序列，或从带有自然配体的相关化合物或组合物复合物的研究鉴定活性位点。在后一种情况下，可用化学或X-射线结晶法通过寻找因子上发现复合配体的地方发现活性位点。
其次，确定活性位点的三维几何结构。这可以通过已知的方法包括能确定完整分子结构的X-射线结晶法。另一方面，可用固相或液相NMR确定一定的内分子距离。可用确定结构的任何其它实验方法得到部分或完整的几何结构。可用天然的或人工的复合配体测定几何结构，这可提高确定的活性位点结构的准确性。
如果确定了不完全的或不够准确的结构，可使用基于数字模拟的计算机方法完成其结构或提高其准确性。可使用任何识别模型，包括特异于特定的生物多聚体诸如蛋白质或核酸的参数化模型，基于计算分子运动的分子动力学模型，基于热集合的统计力学模型或组合模型。对于大多数模型种类需要代表组成原子和基团之间力的标准分子力场，并且可从物理化学中已知的力场选择。不完全的或不太准确的实验结构可作为用这些模型方法得到完全和较准确的结构的约束。
最后，或通过实验性地或通过模拟或通过组合确定活性位点的结构后，搜寻含有化合物以及有关它们分子结构信息的数据库鉴定候选的调节化合物。这样的搜寻寻找有与所确定的活性位点结构相匹配的并且与所定义的活性位点的基团相互作用的化合物。这样的搜寻可以是人工的，但优选计算机辅助的。从此研究发现的这些化合物为潜在的G蛋白激活的PI3K调节化合物。
另外，这些方法可用于鉴定从已知调控化合物或配体改进的调控化合物。已知化合物的组分可被修饰并且使用应用于新组合物的上述实验和计算机模拟方法确定修改的结构效应。然后改变的结构与化合物的活性位点结构相比较以确定是否发生改进的相互配合或相互作用。在这种方法中诸如通过改变侧基能很快评价组分中的系统性改变以得到提高特异性或活性的修饰过的调控配体。
对于鉴定基于p120催化亚基、p101调控亚基和相关转导和转录因子的活性位点的确定的调节化合物有用的进一步实验和计算机模拟方法对本领域技术人员而言是显而易见的。
分子模拟系统的例子为CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，Waltham,MA)。CHARMm行使能量最小化和分子动力学功能。QUANTA进行分子结构构建、图示模型及分析。QUANTA允许分子之间相互行为作用的相互作用构建、修饰、可见化和分析。
许多文章综述了与特定蛋白相互作用的药物的计算机模拟，诸如Rotivinen等，1988,Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166；Ripka，新科学家(New Scientist)54-57(6月16,1988)；McKinaly和Rossmann,1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:111-122；Perry和Davies，药物设计中的定量结构活性关系(QSAR:Quantitative Stucture-ActivityRelationships in Drug Design)PP.189-193(Alzn R.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989,Proc.R.Soc.Lond.236:125-140和141-162；以及关于核酸组分的模型受体，Askew等，1989，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)111:1082-1090。筛选和图示描述化学物质的其它计算机程序可得自诸如BioDesign,Inc.(Pasadena,CA.),Allelix,Inc.(Mississauga,Ontario，加拿大)，以及Hypercube,Inc.(Cambridhe,Ontario)等公司。尽管这些最初是为应用于针对特定蛋白的药物，一旦DNA或RNA区域被鉴定，它们就可被改造以适合于设计针对此DNA或RNA区域的药物。
尽管上述涉及到能改变结合的化合物的设计和产生，一种作为抑制剂或激动剂的化合物也能从已知化合物包括天然产物或合成化学物质以及生物学活性物质(包括蛋白质)的文库中筛选。
通过诸如此处描述的那些分析鉴定的化合物可能用于例如详尽阐述p101或p120基因产物的生物学功能以及用于改善造血谱系细胞激活紊乱。下面5.54部分中讨论了为检测例如通过诸如5.5.1到5.5.1部分描述的那些技术鉴定的化合物的有效性的分析方法。5.5.1结合于p101调控亚基的化合物的体外筛选实验
设计体外系统以鉴定能与p101调控亚基或p120催化亚基相互作用(例如，结合)的化合物。被鉴定的化合物可用于例如调节野生型和/或突变型p101或p120基因产物活性；也可用于为鉴定破坏正常p101调控亚基/催化亚基相互作用的化合物的筛选；或用于鉴定它们自身破坏这样的相互作用。
用于鉴定与p101调控亚基结合的化合物的实验原理包含：在足够允许p101调控亚基与受试化合物相互作用和结合的条件和时间下制备两种成分的反应混合物，这样在反应混合物中形成可被去除和/或被检测的复合物。所使用的p101调控亚基种类取决于筛选实验的目的。例如，全长p101调控亚基，或含融合进在实验系统中(例如，所得的复合物的标记、分离等等)提供便利的蛋白质或多肽的p101调控亚基的融合蛋白均可用于寻找天然配体的激动剂。
可用各种方法进行筛选实验。例如，进行这种鉴定的一种方法包含：在固相上锚定p101调控亚基蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受试底物并且检测反应末期锚定在固相上的p101调控亚基/受试化合物复合物。在这样的方法的一种实施方案中，p101调控亚基反应物可被锚定在固体表面上，并且未被锚定的受试化合物可被直接或间接标记。在此方法的另一实施方案中，锚定在固相上的p101调控亚基蛋白与标记的催化亚基诸如p120形成复合物。然后，即可进行受试化合物破坏p101/p120复合物结合的能力的分析实验。
在实践中，微孔板可很方便地用作固相。可由非共价或共价吸附固定锚定的组分。用蛋白质溶液简单包被在固体表面并且干燥可完成非共价吸附。另外，对被固定的蛋白质有特异性的固定化抗体，优选单克隆抗体可用于将蛋白质锚定在固体表面。固体表面可提前制备并贮存。
为了进行鉴定，未固定的组分加到含有锚定组分的包被的表面。反应结束后，在形成的任何复合物均可在固体表面保持固定的条件下去除未反应组分(例如，通过清洗)。可用很多方法完成对锚定在固体表面的复合物的检测。若未固定组分是预先标记过的，固定在表面的标记的检出即提示形成了复合物。如未预标记未固定组分，可用一种间接标记的方法检测锚定在表面上的复合物，例如，使用对未固定组分特异性的标记过的抗体(抗体可依次用标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记)。
另外，可在液相中进行反应，从未反应组分分离反应产物并且检测复合物；例如，使用针对p101调控亚基蛋白、多肽、肽或融合蛋白或催化亚基蛋白或融合蛋白、或受试化合物的一种固定化抗体锚定溶液中形成的任何复合物以及使用针对可能的复合物的其它组分的标记抗体以检测锚定的复合物。5.5.2与p101或p120蛋白质相互作用的细胞内蛋白的鉴定
合适检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法均被用于鉴定和p101调控亚基和/或p120催化亚基相互作用的细胞内蛋白质。传统方法中可使用的有共免疫沉淀、交联以及通过梯度或色谱柱对细胞裂解物或得自细胞裂解物的蛋白质和裂解物中与p101调控亚基相互作用的待鉴定的蛋白质及p101调控亚基蛋白质的共纯化。对于这些实验，使用的p101调控亚基组分可为全长p101调控亚基或截短的肽。相似地，组分可为p120催化亚基或p101调控亚基和p120催化亚基的复合物。一旦被分离，这样的细胞内蛋白质可被鉴定并且结合标准技术反过来用于鉴定与其相互作用的蛋白质。例如，使用本领域技术人员周知的技术诸如通过Edman降解技术(见，例如，Creighton,1983，《蛋白质：结构和分子机理》(“Proteins:Stuctures and Molecular Principles”)W.H.Freeman &Co.N.Y.,PP.34-39)确定与p101调控亚基、PI3K(p101/p120复合物)或p120催化亚基相互作用的细胞内蛋白质的氨基酸序列的至少一部分。得到的氨基酸序列可用作用于筛选编码这样的细胞内蛋白质的基因序列的寡核苷酸混合物生产的指导。例如通过标准杂交或PCR技术完成筛选。产生寡核苷酸混合物和筛选的技术是众所周知的(见，例如，Ausubel，出处同前，《PCR方法：方法与应用指南》(PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications),1990,Innis,M.Et等编.Academic出版社，Inc.,纽约)。
另外，可应用同时鉴定编码与p101调控亚基和/或p120催化亚基和/或PI3K相互作用的细胞内蛋白质的基因的方法。这些方法包括，例如，探查表达(probing expression)、文库、以与众所周知的λgt11文库抗体探查技术相似的方式，使用标记的p101调控亚基蛋白质或p101调控亚基多肽、肽或融合蛋白，例如，p101调控亚基多肽或融合进一种标记(例如酶、荧光、发光蛋白质或染料)的p101调控亚基结构域，或Ig-Fc结构域。
一种体内检测蛋白质相互作用的方法，双杂交系统在此详尽描述，其仅仅为了说明而不意在限制。此系统的一个版本已被描述并且可从Clontech(Palo Alto,CA)购得。
简而言之，使用这样的系统，构建编码两种杂合蛋白质的质粒：一种质粒包括编码融合进编码p101调控亚基、p101调控亚基多肽、肽或融合蛋白的p101核苷酸序列的转录激活子蛋白的DNA结合结构域的核苷酸，另一种质粒包括编码融合进一种cDNA的转录激活子蛋白的激活结构域的核苷酸，此cDNA编码已被重组进此质粒作为cDNA文库一部分的未知蛋白质。DNA结合结构域融合质粒和cDNA文库被转化进含有一种报告基因(例如，HBS或LacZ)的酵母啤酒酵母(Saccharomycescerevisae)中。该报告基因其调节区域含转录激活子的结合位点。任何一种杂合蛋白单独不能激活报告基因的转录；DNA结合结构域杂合体不能激活是因为它不提供激活功能；并且激活结构域杂合体不能激活是因为它不能定位于激活子的结合位点。两个杂合体蛋白质的相互作用重新组成有功能的激活子蛋白质并且导致报告基因的表达，这可以通过分析报告基因产物的实验检测。
双杂交系统或相关方法学均可用于筛选激活结构域文库以得到与“诱饵”基因产物相互作用的蛋白质。通过举例而不意在限制的方式，P101调控亚基可用作诱饵基因产物。总的基因组或cDNA序列被融合进编码一种激活结构域的DNA中。此文库和编码融合进DNA结合结构域的诱饵p101基因产物杂合体的质粒被共转化进一种酵母报告株，并且从中筛选表达报告基因的那些转化体。例如，不意在限制的，如图1中描述的诱饵p101基因序列诸如p101(或p101的结构域)的开放阅读框可被克隆进一种载体中，以使载体通过翻译被融合进编码GAL4蛋白的DNA结合结构域的DNA中。纯化这些克隆并且分离负责报告基因表达的文库质粒。然后用DNA测序鉴定文库质粒编码的蛋白质。
使用本领域中常规运用的方法建立细胞系的cDNA文库，由此检测与诱饵p101基因产物相互作用的蛋白质。根据此处描述的特定系统，例如将cDNA片段插入载体以使它们通过翻译被融合进GAL4的转录激活结构域。此文库可与诱饵p101基因-GAL4融合质粒共转染进含有由带GAL4激活序列的启动子驱动的LacZ基因的酵母株。cDNA编码的蛋白质(其融合进与诱饵p101基因产物相互作用的GAL4转录激活结构域。)重组成活性GAL4蛋白质并且因此驱使HIS3基因的表达。可通过它们在含缺乏组氨酸的半固体琼脂基质培养基的培养皿上生长检测表达HIS的克隆。然后从这些菌株纯化cDNA并使用本领域常规运用的技术使cDNA用于产生和分离诱饵p101基因-相互作用蛋白。5.5.3干扰p101调控亚基/细胞内大分子相互作用的化合物的鉴定
为此讨论的目的，与p101调控亚基相互作用的大分子被称为“结合伴侣”。这些结合伴侣可能参与p101调控亚基信号传导途径，并且因此参与造血谱系细胞激活调控p101调控亚基的作用。已知的结合伴侣为PI3K激酶的催化亚基诸如p120、p117以及某些p110蛋白。其它结合伴侣可能为激活的三聚体G蛋白诸如Gβγ亚基和/或脂质。因此，想要鉴定干扰或破坏这样的结合伴侣与p101之间相互作用的化合物，其可用于调节p101调控亚基活性并因此控制与p101调控亚基活性相关的造血谱系细胞激活紊乱。
用于鉴定干扰p101调控亚基与其结合伴侣或伴侣之间相互作用的化合物的实验系统的基本原理包含：在足够允许5.5.1和5.5.2部分中所述的p101调控亚基蛋白、多肽、肽或融合蛋白与结合伴侣相互作用并结合，形成复合物的条件和时间下，制备含这些蛋白和结合伴侣的反应混合物。为了检验化合物的抑制活性，于存在或不存在受试化合物的情况下制备反应混合物。受试化合物可最初包括在反应混合物中或在加入p101调控亚基一部分及其结合伴侣之后的某个时刻被加入。温育无受试化合物或有安慰剂的对照反应混合物。然后检测p101调控亚基部分和结合伴侣之间形成的任何复合物。对照反应中而不是含受试化合物的反应混合物中复合物的形成提示化合物干扰p101调控亚基蛋白与相互作用的结合伴侣之间的相互作用。另外，含受试化合物和正常p101调控亚基蛋白的反应混合物内复合物的形成也与含受试化合物和突变的p101调控亚基的反应混合物内复合物的形成相比较。在想要鉴定破坏突变的而不是正常的p101调控亚基相互作用的化合物时，此比较很重要。
干扰p101调控亚基与结合伴侣之间相互作用的化合物的鉴定可以异源性或同源性方式进行。异源性鉴定包含将p101调控亚基一部分产物或结合伴侣锚定到固相上以及检测反应末期锚定在固相上的复合物。在同源性鉴定中，全部反应在液相中进行。任一种方法中，可改变反应物加入的顺序以得到关于受试化合物的不同信息。例如，通过竞争干扰相互作用的受试化合物可通过在受试物质存在下进行反应来鉴定；即，通过在加p101调控亚基一部分和相互作用的结合伴侣之前或同时将受试物质加入反应混合物中。另一可选的方法是，破坏预先形成复合物的受试化合物，例如有较高结合常数可取代复合物成分之一的化合物，可通过形成复合物后将受试化合物加入反应混合物中进行检测。以下简短描述不同的格式。
异源性鉴定体系中，将p101调控亚基一部分或相互作用的结合伴侣锚定在固体表面上，同时直接或间接标记未锚定的物种。实践中，可很方便地使用微孔板。通过非共价或共价吸附固定锚定物种。简单地在固体表面铺p101或p120基因产物或结合伴侣的溶液并干燥可完成非共价吸附。另一可选的方法是，可用针对被固定物种的固定化抗体将物种固定在固体表面。提前制备表面并贮存。
为进行鉴定，将固定化物种的伴侣暴露于有或无受试化合物的包被表面。反应结束后，除去未反应组分(例如，通过清洗)并且形成的任何复合物将保持固定在固体表面。可用许多方法完成锚定在固体表面上化合物的检测。对于预先标记的未固定物种，检测到固定在表面上标记提示形成了复合物。对于没有预先标记的固定物种，可用间接标记以检测锚定在表面上的复合物；例如，使用对起初未固定物种特异的标记抗体(用标记的抗-Ig抗体依次直接标记或间接标记抗体)。依赖加入反应组分的顺序，可检测抑制复合物形成或破坏预先形成复合物的受试化合物。
另一可选的方法是。在有或无受试化合物存在下在液相中进行反应，从未反应组分中分离反应产物，并且检测复合物；例如，使用对锚定溶液中形成的任何复合物的结合组分之一有特异性的抗体，以及对检测锚定的复合物的其它伴侣特异性的标记抗体。再次，依赖将反应物加入液相的顺序，鉴定抑制复合物或破坏预先形成的复合物的受试化合物。
在本发明另一实施方案中，可使用同源性鉴定。此方法中，制备预先形成的p101调控亚基一部分与相互作用的结合伴侣的复合物，其中或p101调控亚基或其结合伴侣被标记，但标记产生的信号因复合物的形成被淬灭(见，例如，为免疫分析使用此方法的Rubenstein的美国专利号4,109,496)。与其竞争且置换得自预先形成的复合物的物种之一的受试物质的加入将导致背景上信号的产生。以此方法，可鉴定破坏p101调控亚基/细胞内结合伴侣相互作用的受试物质。
在一特定的实施方案中，可制备p101调控亚基的融合蛋白用于固定。例如，使用融合质粒如pGEX-5X-1将p101调控亚基或肽片段，(例如，相应于CD)，融合进谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因，以此在得到的融合蛋白中维持其结合活性。使用本领域中以及以上5.3部分描述的常规使用方法纯化相互作用的结合伴侣并用于产生单克隆抗体。例如通过本领域中常规使用的方法用放射性同位素125I标记此抗体。在异源性鉴定中，例如GST-p101调控亚基融合蛋白可被锚定在谷胱甘肽-琼脂糖珠上。然后以允许相互作用和结合发生的方式在有或无受试化合物时加入相互作用的结合伴侣。反应阶段的后期，清洗除去未结合的物质，并且将标记的单克隆抗体加入系统中并允许与复合物的组分结合。p101或p120基因产物与相互作用的结合伴侣之间的相互作用可通过测定保持与谷胱甘肽-琼脂糖珠结合的放射性量而检测。受试化合物对相互作用的成功抑制将导致测定的放射性降低。
另一可选的方法是，在无固态谷胱甘肽-琼脂糖珠存在下，GST-p101调控亚基融合蛋白和相互作用的结合伴侣可在液体中一起混合。在允许的物种相互作用期间或在相互作用之后向其中加入受试化合物。然后将此混合物加入谷胱甘肽-琼脂糖珠并且清洗除去未结合的物质。再次通过加入标记的抗体并测定结合于珠上的放射性检测p101调控亚基/结合伴侣相互作用的抑制程度。
在本发明的另一实施方案中，使用相应于p101调控亚基和/或相互作用或结合伴侣(在结合伴侣是蛋白质的情况下)的结合结构域的肽片段，而不是一种或两种全长蛋白质，可运用这些相同技术。本领域中常规使用的任何一种方法均可用于鉴定和分离结合位点。这些方法包括但不限于编码其中一种蛋白质的基因的突变并且对共免疫沉淀分析中结合的破坏进行筛选。然后选择编码复合物中第二物种的基因中的补偿突变。编码各自蛋白质基因的序列分析揭示了相应于参与相互作用的结合的蛋白质区域的突变。另一可选的方法是，使用上述的方法将一种蛋白质锚定到固体表面并且允许其与经蛋白水解酶诸如胰蛋白酶处理过的标记的结合伴侣相互作用和结合。清洗后，含结合结构域的标记的肽保持与固态物质结合，其可被分离以及通过氨基酸测序鉴定。而且，一旦得到编码细胞内结合伴侣的基因，可构建短基因片段以表达随后测定结合活性并且被纯化或合成的蛋白质的肽片段。
例如，而不意在限制，通过制造GST-p101调控亚基融合蛋白质并允许其与谷胱甘肽琼脂糖珠结合可将p101基因产物锚定于如上所述的固态物质。用放射性同位素诸如35S标记相互作用结合伴侣，并且用蛋白水解酶诸如胰蛋白酶切割。然后将切割产物加到锚定的GST-p101融合蛋白中并允许结合。清洗除去未结合的肽后，洗脱代表细胞内结合伴侣结合结构域的标记的结合物质，用公知的方法纯化并分析其氨基酸序列。合成生产如此鉴定的肽或使用重组DNA技术融合进合适的蛋白中。5.5.4改善炎性紊乱的化合物的鉴定
化合物，包括但不限于通过诸如以上5.5.1到5.5.3部分中描述的那些鉴定技术鉴定的化合物，可检测其改善免疫系统紊乱症状包括炎症的能力。上述的分析可鉴定影响p101调控亚基活性的化合物(例如，与p101调控亚基结合、抑制天然配体的结合，以及激活信号传导(激动剂)或阻断激活(拮抗剂)，以及与p101调控亚基的天然配体结合并中和配体活性的化合物)；或影响p101或p120基因活性的化合物(通过影响p101或p120基因表达，包括影响或干扰剪接事件以调节p101调控亚基全长或截短形式的分子表达的，例如，蛋白质或小有机分子)。然而，应该注意此处描述的鉴定也鉴定调节p101调控亚基信号传导(例如，影响下游信号传递事件的化合物，诸如参加传导通过与p101调控亚基结合的催化亚基产生的PtdIns(4,5)P3信号传导的活性的抑制子或增强子)的化合物。影响p101或p120基因和/或p101或p120基因产物参与的p101调控亚基信号传导途径中另一步骤的化合物的鉴定和使用，因通过影响相同途径可调节p101调控亚基对造血谱系细胞激活紊乱发展的影响均包括在本发明的范围内。这样的化合物可用作处理造血谱系细胞激活紊乱的治疗方法的一部分。
本发明包含基于细胞的和基于动物模型的鉴定以鉴定显示改善造血谱系细胞激活紊乱症状的能力的化合物。这样的基于细胞的鉴定系统也可用作鉴定天然配体、催化亚基包括重组或合成产生的催化亚基和催化亚基突变体的标准。
基于细胞的系统可用于鉴定起改善造血谱系细胞激活紊乱症状作用的化合物。这样的细胞系统包括，例如表达p101和/或p120基因的重组或非重组细胞诸如细胞系。例如可使用白细胞或衍生自白细胞的细胞系。另外，基因工程改造的以表达功能性的p101/p120 PI3K并且应答由天然配体Gβγ亚基激活的表达宿主细胞(例如，COS细胞、CHO细胞、成纤维细胞、Sf9细胞)，例如通过测量化学或表型改变、另一宿主细胞基因的引入、细胞内信使水平的改变(例如，PtdIns(3,4,5)P3，等)可被用作鉴定的终点。
在使用这样的细胞系统中，在足够浓度和足够在暴露的细胞中引起这样的造血谱系细胞激活紊乱症状的改善的时间下，可将细胞与怀疑有改善造血谱系细胞激活紊乱症状能力的化合物接触。接触后，分析细胞以测定p101或p120基因表达的改变，例如通过分析细胞裂解物的p101或p120mRNA转录物(例如，通过Northern分析)或细胞中表达的p101或p120蛋白；调控或调节p101或p120基因表达的化合物是治疗的有价值的候选者。另一可选的方法是，检查细胞以确定一或多种造血谱系细胞激活紊乱样细胞表型是否已被改变以与更正常的或更野生型的表型或更可能产生较低发生率或严重性的紊乱症状的表型相似。更进一步，鉴定p101调控亚基是其一部分的信号传导途径组分的表达和/或活性，或p101调控亚基信号传导途径本身的活性。
例如，细胞接触化合物后，分析细胞裂解物中存在的第二信使PtdIns(3,4,5)P3水平的增高，与得自未接触的对照细胞相比较。在这些鉴定系统中受试化合物抑制第二信使产生的能力表明受试化合物抑制通过p101调控亚基激活开始发起的信号传导。用阴离子交换型HPLC可很容易的分析细胞裂解物。另一可选的方法是，以如此处全文引入作为参考的如Wymann等，1987，分析生物化学，165:371-378中所述通过监测源自辣根过氧化酶催化的鲁米诺氧化化学发光分析超氧化产生或O2的水平。最后，使用本领域技术人员周知的技术鉴定完整细胞的细胞粘附性的改变。
另外，基于包括例如小鼠的动物的造血谱系细胞激活紊乱系统可用于鉴定能改善造血谱系细胞激活紊乱样症状的化合物。这样的动物模型可用作鉴定在治疗这样的紊乱中有效的药物、药剂、疗法以及干预的检验系统。例如，将怀疑有改善造血谱系细胞激活紊乱症状的化合物以在所接触的动物中足以显示改善造血谱系细胞激活紊乱症状的浓度和时间接触动物模型。通过评价与造血谱系细胞激活紊乱相关的紊乱诸如炎症的逆转来监测动物对接触的反应。至于干预，任何逆转造血谱系细胞激活紊乱样症状的任一方面的治疗可被看作人造血谱系细胞激活紊乱治疗干预的候选者。通过得自如下讨论的剂量-反应曲线确定受试试剂的剂量。5.6与G蛋白激活的P13K的刺激相关的疾病，包括炎性紊乱的治疗
本发明还包含修饰造血谱系细胞激活和处理造血谱系细胞激活紊乱，包括炎性紊乱的方法和组合物。例如通过降低p101基因表达水平和/或p101调控亚基基因活性，和/或下调p101调控亚基途径的活性(例如，通过干扰p101调控亚基与p120催化亚基之间的相互作用，或通过以下游信号传递为靶的事件)，白细胞对激活三聚体G蛋白偶联受体的因子(诸如细胞因子)的反应可被降低并且慢性炎性紊乱的症状可得到改善。相反的，通过增加p101调控亚基活性可增强白细胞对G蛋白偶联受体的激活的反应。例如，这样的增强可用作促进免疫系统对感染的反应。5.6.1抑制p101衔接子的表达或p101衔接子的活性以降低G蛋白激活的PI3K活性并减轻炎症
中和催化亚基或抑制p101或p120基因的表达(或者转录或者翻译)的任何方法可用以减轻炎性反应。这样的方法可用以治疗炎性反应紊乱诸如关节炎(包括类风湿性关节炎)、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘以及其它肺部疾病、过敏、再灌注损伤、动脉粥状硬化以及其它心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症，此处仅例举了一些炎性紊乱。
在一个实施方案中，设计免疫疗法以降低内源性p101或p120基因表达水平，例如，使用反义或核酶方法以抑制或阻止p101或p120 mRNA转录物的翻译；三螺旋方法以抑制p101或p120基因的转录；或靶向同源重组以使p101或p120基因或其内源性启动子失活或“敲除”。
反义方法包含与p101或p120调控亚基mRNA互补的寡核苷酸(或者DNA或者RNA)的设计。反义寡核苷酸与互补的p101或p120mRNA转录物结合并阻止翻译。尽管优选，但不必绝对互补。如此处提及的与一种RNA的一部分“互补”的序列意味着有足够互补能与RNA杂交形成一种稳定双螺旋的序列。在双链反义核酸情况下，这样可检测双螺旋DNA的一条单链，或鉴定三螺旋形成。杂交的能力取决于互补的程度和反义核酸长度。通常，杂交的核酸越长，它所含的与RNA碱基的错配就越多并且仍可形成稳定双螺旋(或三螺旋，如情况可能)。本领域技术人员可通过使用确定杂交复合物融点的标准方法确保错配在一个可接受的程度。
互补于信息5′端的寡核苷酸，例如，直到并包括AUG起始密码子的5′翻译序列应该在抑制翻译中最为有效。然而，最近表明互补于mRNA的3′非翻译序列在抑制mRNA的翻译中也有效。一般见Wagner,R.,1994，自然，372:333-335。这样，互补于图1和图3所示p101或p120的5′或3′非翻译、非编码区的寡核苷酸可用于抑制内源性p101或p120 mRNA的翻译的反义方法。与mRNA的5′非翻译区域互补的寡核苷酸应该包括AUG起始密码子的互补物。互补于mRNA编码区域的反义寡核苷酸是较低效率的翻译抑制剂但根据本发明仍可使用。无论设计杂交于p101调控亚基mRNA的5′、3′或编码区域，反义核酸长度至少应该为六个核苷酸，并且优选从6到大约50个核苷酸长度的寡核苷酸。在特殊情况下，寡核苷酸至少为10个核苷酸，或至少17个核苷酸，或至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
不考虑靶序列的选择，优选首先进行体外研究来定量反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。这些研究优选使用区别于反义基因抑制和寡核苷酸的非特异性生物学效应的对照。这些研究也优选比较靶RNA或蛋白质与内在对照RNA或蛋白质的水平。另外，可预见使用反义寡核苷酸得到的结果与使用对照寡核苷酸得到的结果进行比较。优选与受试寡核苷酸长度大约相同的寡核苷酸且其与反义序列的差异不超过防止特异性地杂交于靶序列必需的程度。
寡核苷酸可为单链的或多链的DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或它们的修饰版本。可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处修饰寡核苷酸，以提高例如分子、杂交等的稳定性。寡核苷酸可包括其它附属基团诸如肽(例如，用于体内定位于宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的试剂(见，例如，Letsinger等，1989，美国国家科学院院报86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美国国家科学院院84:648-652；PCT公开文本WO88/09810,1988.12.15出版)，或杂交引发的裂解试剂(见，例如，Krol等，1988，生物技术6:958-976)，或嵌入试剂(见，例如，Zon,1988，药学研究5:539-549)。最后，寡核苷酸可与另一分子连接，例如，肽、杂交引发的交联试剂、转运试剂、杂交引发的裂解试剂，等等。
反义寡核苷酸包含至少一个修饰过的碱基部分，其选自包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-酰基胞嘧啶，5-羧羟甲基尿嘧啶，5-羧甲氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲氨甲基尿嘧啶，双氢尿嘧啶，β-D-galactosyl queosine，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-双甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosyl queosine，5′-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羟乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2,6-双氨基嘌呤的基团。
反义寡核苷酸也包含至少一种修饰过的糖部分其选自包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖以及己糖的基团。
在另一实施方案中，反应寡核苷酸包含至少一处修饰过的磷酸骨架选自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基硫代磷酸酯，氨基磷酸盐，二氨基磷酸盐，甲基膦酸盐，烷基磷酸三酯，以及formacetal或其类似物的基团。
在又一实施方案中，反义寡核苷酸是α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与和通常β-单位相反的链之间平行走向的互补RNA形成特殊的双链杂合体(Gautier等，1987，核酸研究，15:6625-6641)。此寡核苷酸为2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究15:6131-6148)，或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987,FEBS Lett.215:327-330)。
本发明的寡核苷酸可通过本领域中已知的标准方法合成，例如，通过使用自动DNA合成仪(诸如购于Biosearch,Appiled Biosystems，等)。作为例子，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Stein等，1988，核酸研究，16:3209的方法来合成。使用控制的微孔玻璃多聚支持物制备甲基磷酸寡核苷酸(Sarin等，1988，美国国家科学院院报85:7448-7451)。
虽然可使用与p101或p120编码区域序列互补的反义核苷酸。但优选那些与被转录的非翻译区互补的。
将反义分子输运至在体内表达p101调控亚基的细胞，例如，造血来源的细胞诸如血小板、嗜中性粒细胞以及其它白细胞。已发展了许多方法用于将反义DNA或RNA输运至细胞；例如，直接将反义分子注射进组织或细胞衍生位点，或全身性施用被设计定向于所期望的细胞(例如，连接于肽或针对特异性结合的受体或表达在靶细胞表面抗原的抗体的反义分子)的修饰过的反义分子。
然而，通常很难达到有效抑制内源性mRNA翻译的反义分子的细胞内浓度。因此，优选的方法使用含置于强polⅢ或polⅡ启动子控制下的反义寡核苷酸的重组DNA构建体。使用这样的构建体转染病人的细胞将导致足够量的单链RNA转录此RNA与内源性p101或p120转录物形成互补碱基对并且因此阻止p101或p120 mRNA的翻译。例如，将载体在体内导入以使被细胞吸收并且指导反义RNA的转录。这样的载体保持游离着或与染色体整合，只要它能被转录以产生所要的反义RNA。可用本领域中重组DNA技术标准方法构建这样的载体。载体可为在哺乳动物细胞中用于复制和表达的质粒、病毒、或本领域中已知的其它种类。编码反义RNA序列的表达可通过本领域中已知的在哺乳动物优选为人类细胞中起作用的任何启动子。这样的启动子可为诱导型或组成型。这样的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,1981，自然，290:304-310)，包含在劳氏肉瘤病毒3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等，1980，细胞22:787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院报78:1441-1445)，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，自然296:39-42)等等。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体均可用于制备可直接引入组织或细胞衍生位点内例如，骨髓的重组DNA构建体。另一可选的方法是，在以另一途径完成给药的情况下(例如，全身性地)可使用选择性感染所要的组织或细胞类型的病毒载体(例如，感染造血谱系细胞的病毒)。
被设计催化性裂解p101或p120mRNA转录产物的核酶分子也可用于阻止p101或p120mRNA的翻译以及p101调控亚基的表达(见，例如，PCT国际公开文本WO90/11364,199010月4日公开；Sarver等，1990，科学247:1222-1225)。虽然可使用在识别序列特异的位点裂解mRNA的核酶破坏p101或p120 mRNA，优选使用锤头核酶。锤头核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域支配的位置切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA有如下两个碱基的序列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和生产为本领域众所周知并在Haseloff和Gerlach,1988，自然，334；585-591中有详细描述。人类p101或p120cDNA核苷酸序列中有好几百可能的锤头核酶切割位点(图3)。优选的改造核酶以使切割识别位点位于p101或p120mRNA的5′端附近；即，提高效率并且使非功能性mRNA转录物的细胞内积累最小。
本发明的核酶也包括RNA核糖核酸内切酶(此处往下“Cech-型核酶”)诸如嗜热四膜虫(已知如IVS，或L-19IVS RNA)中天然存在并且已被Thomas Cech及合作者(Zaug等，1984，科学，224:574-578；Zaug和Cech,1986，科学，231:470-475；Zaug等，1986，自然，324:429-433；大学专利公司公开的国际专利申请No.WO88/04300；Been和Cech,1986，细胞47:207-216)详尽描述的那种。Cech-型核酶有与靶RNA序列杂交的八个碱基对活性位点，之后发生靶RNA的切割。本发明包含那些指向p101或p120中存在的八个碱基对活性位点序列的Cech-型核酶。
在反义方法中，核酶可由修饰过的寡核苷酸组成(例如，为改善的稳定性，靶向性，等等)并且被输送至体内表达p101调控亚基的细胞，例如，嗜中性粒细胞。优选的输送方法包括在强组成型polⅢ或polⅡ启动子控制下使用“编码”核酶的DNA构建体，以使被转染的细胞产生足以破坏内源性p101或p120信息并抑制翻译的核酶。因为不象反义分子，核酶是催化性的，为保证效率需较低的细胞内浓度。
利用靶向同源性重组使p101或p120基因或其启动子失活或“敲除”也可降低内源性p101或p120基因表达(例如，见Smithies等，1985，自然317:230-234；Thomas & Capecchi,1987，细胞51:503-512；Thompson等，1989，细胞，5:313-321；此处全文引入作为参考)。例如，有或无选择性标记和/或负性选择性标记时使用侧翼与内源性p101或p120基因(p101或p120基因的编码区域或调控区域)同源的DNA的突变的非功能性的p101调控亚基(或完全不相关的DNA序列)转染体内表达p101调控亚基的细胞。通过靶向同源重组DNA构建体的插入导致p101或p120基因的失活。这样的方法尤其适合于使用对ES(胚胎干)细胞作修饰产生带失活p101调控亚基的动物后代的农业领域(例如，见Thomas和Capecchi,1987以及Thompson 1989，出处同前)。然而，可修改此方法用于人体，只要运用合适的病毒载体在体内直接施用重组DNA构建体或靶向体内所期望的位点。
另一可选的方法是，通过定向于与p101或p120基因的调控区域(即，p101或p120启动子和/或增强子)互补的脱氧核苷酸序列以形成阻止体内靶细胞中p101或p120基因转录的三螺旋结构，可降低内源性p101或p120基因表达(一般见，Helene,C.,1991,Anticancer Drug Des.,6(6):569-84；Helene,C.等，1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660；27-36；以及Maher,L.J.,1992，生物鉴定(Bioassays)14(12):807-15)。
在本发明另一实施方案中，使用“显性失活(dorminant negative)”方法干扰PI3K的三聚G蛋白PI3K的活化可降低p101调控亚基的活性。至此，编码缺陷型p101调控亚基的构建体可用于基因治疗方法中使合适的靶细胞中p101调控亚基的活性消失。例如，其中Gβγ相互作用结构域缺失或突变的指导p101调控亚基的宿主细胞表达核苷酸序列可被引入造血细胞(通过上述的或体内体外基因治疗方法)。另外，仅编码p101功能性结构域的核苷酸序列可用作天然p101/p120相互作用的抑制剂。另一可选的方法是，靶向同源重组可用于将这样的缺失或突变引入受治疗者骨髓中的内源性p101或p120基因。构建的细胞将表达非功能性受体(即，能结合催化亚基但不能刺激应答G蛋白激活的催化活性的调节亚基)。这样的构建细胞，即嗜中性粒细胞或其它白细胞谱系，证明对于细胞外趋化因子的G蛋白偶联受体的激活反应消失，导致炎性表型减少。5.6.2恢复或提高p101调控亚基的表达或活性以促进免疫系统激活
关于正常p101或p120基因表达水平及/或p101调控亚基基因产物活性的提高，可用p101或p120核酸序列治疗造血谱系细胞激活紊乱，包括免疫系统对趋化因子的反应性降低。如果导致免疫系统功能失调的原因是缺陷的p101调控亚基，可采用例如基因置换治疗的疗法。具体而言，正常p101基因的单或多拷贝或指导表达具有正常功能的p101基因产物的p101基因的一部分，可利用载体注射入患者或动物体内的适当细胞中。载体包括但不仅限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和疱疹病毒载体，还包括其它将DNA导入细胞的粒子如脂质体。
由于p101或p120基因在造血谱系细胞内，包括嗜中性粒细胞和其它白细胞内表达，这种基因置换治疗的技术应当可以将p101或p120基因序列输运入患者的这些细胞类型中。或者，可利用靶向同源重组来校正合适细胞类型中的例如，骨髓细胞或嗜中性粒细胞和/或其它白细胞缺陷型内源p101或p120基因。对于动物，靶向同源重组可用于校正ES细胞中的缺陷，以得到具有校正了的基因的后代。
最后，上述已鉴定的化合物可用于刺激免疫系统，这些复合物通过激活p101调控亚基刺激、增强或改变激活的p101调控亚基传导的信号，例如，可通过激活p101调控亚基级联中下游信号传递蛋白并因此避开缺陷的p101调控亚基。给药的制剂和方式则依赖于该化合物的理化性质。5.7药物制备和给药方法
已鉴定可影响p101或p120基因表达或p101调控亚基活性的这些化合物，或影响p101与它的任何结合伴侣的相互作用(结合伴侣包括但不限于催化亚基)的上述化合物可以按治疗有效剂量给予患者，以治疗或改善造血谱系细胞激活紊乱，包括炎性反应紊乱例如关节炎象风湿性关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘和其它肺病、过敏、再灌注损伤、动脉粥状硬化和其它心血管疾病、阿尔茨海默病以及癌症。治疗有效剂量是指化合物的量足以导致造血谱系细胞激活紊乱症状的改善。5.7.1有效剂量
上述化合物的毒性和疗效可以用细胞培养和实验动物的标准药学方法检测，例如，检测LD50(使群体的50％死亡的剂量)和ED50(对群体的50％有效的剂量)。毒性和疗效的剂量比例是治疗指数，它可表示为比例LD50/ED50。优选显示高治疗指数的化合物。虽然可以使用有毒副作用的化合物，但应当注意的是应设计一个精细的输运体系，使该化合物定位到所要影响的组织的位点，以最大程度地减少对未感染细胞潜在的伤害，由此减少副作用。
从细胞培养鉴定和动物研究获得的数据可以为人用剂量制定出范围。该化合物的剂量优选在包含极少或无毒性的ED50的血药浓度范围之内。剂量可依据所采用的剂型和给药途径在此范围内浮动。对于本发明中的方法所用的任何化合物，治疗有效剂量可以从细胞培养鉴定中进行初步估计。调配用于动物模型的剂量以得到包括了细胞培养所确定的IC50(即，达到将症状半数抑制的所测化合物的浓度)的血浆浓度范围。上述结果可用于更精确地确定用于人的剂量。可用例如高效液相色谱的方法测定血浆中的浓度。5.7.2配方与使用
用于符合本发明的药物组合物可用一种或多种药学可接受的载体或赋形剂以传统方式进行调配。
因而，化合物和其药学可接受的盐以及溶剂化物可以通过吸入或吹入(通过口或鼻)给药，或口服、面颊给药，或肠胃外或直肠给药。
对于口服给药，药物组合物可以采用例如片剂或胶囊的形式，用药学可接受的赋形剂诸如结合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充物(例如乳糖，微晶体纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如，土豆淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或湿化剂(例如，十二烷基硫酸钠)通过常规方法制备。可用本领域中众所周知的方法包被片剂。用于口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可为干性产物，使用前与水或其它合适载体配制。这样的液体制剂可通过使用药学可接受的添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸盐或山梨酸)的常规方法制备。制剂也包含缓冲盐、调味剂、着色剂以及合适的甜味剂。
合适地配制用于口服给药的制剂以使活性化合物受控释放。
用于面颊给药组合物可采用以常规方法配制的片剂或锭剂。
对于吸入途径给药，用于根据本发明的化合物可很方便地以合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体采用得自加压包装或喷洒器气溶胶喷雾的形式进行输送。在加压气溶胶的情况下，可通过提供一阀门以运送可确定的量来确定剂量单位。用在吸入剂或吹入剂中的例如明胶的片剂或药筒可被配制成含化合物和合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
用于注射例如通过药团注射或连续注入的化合物可配制为用于胃肠外给药的形式。用于注射的制剂可配制为以单位剂量形式，例如在安瓶管或多剂量容器中连同附加的防腐剂提供。组合物可采用诸如悬浮液、溶液或油性或水性载体中的乳液的形式，以及可含有调配剂诸如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，活性成分可为粉末形式，使用前与合适的载体例如，无菌无致热原水配成。
化合物也可配制成直肠组合物诸如栓剂或滞留灌肠剂，例如，含传统栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯。
除前述配方外，化合物也可配制成储存制剂。这样可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌肉注射给药长效制剂。因此，例如，可用合适的多聚或疏水物质(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂、或微溶性衍生物例如微溶性盐配制化合物。
如果需要，组合物可存在于含活性成分的一种或多种单位剂量形式的包装或配药设备中。包装可包含例如金属或塑料薄片，诸如发泡包装。包装或配药设备应配有用药说明。
提供以下实施例以说明本发明并且帮助本领域普通技术人员制造和使用它们。无论如何，此实施例并非为了限制关于这个特许专利所授予的公开或保护的范围。
6．实施例：猪Gβγ-活化的PI3K活性的纯化和定性6.1材料与方法6.1.1 PI3K鉴定
源于Sf9或猪嗜中性粒细胞胞浆的P13K纯化的等分样品用冰冷的0.12M NaCl,25mM HEPES,1mM EGTA,1mM DTT,1mg/ml BSA,1％甜菜碱，0.02％,w/v,Tween-20,pH7.4,0℃下稀释到合适程度，然后以5μl等分样品保存于冰上直至鉴定。如果P13K鉴定是在得自U937细胞的免疫沉淀物上进行(见后续实施例)，则将在以上所述冰冷的缓冲液中将P13K固定在10μl包被的蛋白G Sepharose珠上。将30μl带有或不带有Gβγ和/或Gα(或GDP结合的或活化的)的磷脂混合物加入5μl流分中或10μl Sepharose珠中并且混合。冰浴10分钟后，加入补加MgCl2至现存鉴定体积的终浓度为3.5mM的5-10μl最末一次冲洗缓冲液，并混匀。6分钟后，加入含有[γ32p]-ATP(通常每次鉴定10μCi,Amersham,PB10168)和3.5mM MgCl2的5μl最末一次冲洗缓冲液(得到终体积50μl)，将试管内容物混合并转移到30℃水浴。15分钟后以500μl氯仿∶甲醇∶水(29∶54∶13.1,v/v/v)终止反应。随后加入1μl 100mMATP,103μl2.4 HCl和434μl氯仿形成一种两相′Folch′溶媒分配。混合、离心后，移去下层相并转移到干净的含有424μl新鲜‘上层相’(甲醇∶1M HCl∶氯仿；48∶47∶3,v/v/v)试管中。混合、离心后，下层相转移到干净试管中(在纯化猪嗜中性粒细胞P13K过程中，[32P]-脂质产物在这一步用盖革记数器定量)，真空干燥，以TLC在PEI板上去酰化及解析(用0.6M HCl；PtdIn(3,4,5)P3的Rf值为0.47)(Stephens等，1994，细胞77:83-93)。在有些实验中，干燥脂质重溶于氯仿∶甲醇/2∶1,v/v)，加于浸过草酸钾的TLC板并在氯仿∶丙酮∶甲醇∶乙酸∶水(40∶15∶13∶12∶8,v/v/v/v/v；Traynor-Kaplan等，1988)混合物中解析。
脂质/G蛋白亚基混合物制备如下：真空干燥PtdIn(4,5)P2(由Folch磷酸肌醇流分2次通过固化新霉素的色谱循环制备)和PtdEtn(Sigma)(鉴定中分别足以形成50μM和0.5mM的最终浓度)。在有些实验中包括PtdIns4P(制备方法与PtdIns(4,5)P2相似)和/或PtdIns(Sigma)。干燥的脂质在补加0.1％胆酸钠的最终冲洗缓冲液(如上文)中超声破碎(室温下)。冰浴冷却后，以部分已分散的脂质原料与每次鉴定总共1μl的一种混合物混匀，该混合物包括Gβγ存储缓冲液(1％胆酸盐；50mM HEPES,pH7.5,4℃,0.1M NaCl；1mM DTT；0.5mM EDTA)，活性Gβγ，或得自3-7mg/ml原液的在存储缓冲液中煮沸过的等量Gβγ。在有些实验中，这1μl混合物成分包括Gα亚基或在Gβγ与Gα亚基(或GDP结合的或激活的，见下文)在冰上预先混合10分钟情况下的存储缓冲液。
通过与10mM NaF,30μM AlCl3(A/F)冰浴10分钟激活Gα亚基(Gα:o,i,i2和i3的等摩尔比混合物，如文中所述进行制备，并存储在与Gβγ亚基相同的但不包括10μM GDP的缓冲液)；这些亚基被稀释的分析液也含有A/F。a)蛋白质纯化
直接将猪血(42批次)收集到21个容器中的抗凝剂中。在40分钟的收集中血样/抗凝剂与3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP,360KD)与等渗盐液(4.2份血混合物：0.8份PVP)混合。静置35分钟(25个容器中)后，红细胞已充分沉降，可将上清虹吸出来并在1L的容器中离心(8分钟，1000×g)。回收约28L这种初级上清液。沉淀的细胞重悬于Hank′s液使最终积累体积可放入两个1L的离心瓶中。细胞经离心沉淀(8分钟，1000×g)。吸出上清，细胞团块加入70ml冰冷水进行低渗压冲击(以裂解任何残余的污染红细胞)。混合20-30秒后，加入77 ml 10×Hank′s液(无钙离子)。用Hank′s液冲洗后，将细胞收集到离心瓶中，沉淀并重悬于冰冷的500 ml 40 mM TRIS,pH7.5，4℃；0.12M NaCl；2.5mM MgCl2的溶液中。加入2-异丙基氟磷酸(终浓度0.5mM)置冰上5分钟后,沉淀细胞(约80-90ml总体积)并重悬于300ml冰冷的40mM TRIS,pH7.5；0.1M NaCl；2.5mM MgCl2；1mM EGTA；0.2mM EDTA和抗蛋白酶Ⅰ中。超声处理细胞悬液(Heat SystemsProbe公司超声器，设定为9.25,4×15秒，每次爆破间混合一分钟，所有操作在冰上进行)后离心(2000×g,10分钟)以沉淀未破碎细胞及细胞核(小于5％的细胞仍保持完整)。离心上清(100000×g,60分钟，4℃)，轻轻倒出上清，合并后与EDTA、甜菜碱和DTT(终浓度分别为5mM、1％和1mM)混合，最后在液氮中冰冻及保存于-80℃。经这一方式制备的胞浆组分很典型地蛋白浓度为8-9mg/ml(每次制备约2.5g蛋白)。一旦收集相当于750L血液(18到42份制备，9×1012个细胞，40g蛋白质)的胞浆并冻存于-80℃，应间隔5小时分三批融化。这一步之后所有步骤均应在2-4℃进行。
新鲜融化的胞浆中补加Tween-20(终浓度0.05％,w/v)，离心(20000×g,30分钟，2℃)，过滤(5μm硝酸纤维素膜，直径4.5cm,Whatman)后以缓冲液K(见下文)稀释约2.5倍至最终导电率为200μS(4℃)，然后上样于一根经缓冲液K平衡的800ml(直径5cm)Fast Flow Q Sepharose柱(用蠕动泵12.5ml/分钟)。稀释后胞浆总体积约15.5升。一旦加样，以1升缓冲液K洗柱，再用4.5升含0.1-0.6M NaCl线性梯度的缓冲液K以8ml/分钟流速洗脱。收集五十份1ml的流分。连续监测(后续步骤也如此)柱洗脱物的导电率和吸光率(280nm)。缓冲液K包括如下成份：40mM TRIS/HC1,1mM EGTA,0.2 mM EDTA,1％甜菜碱，0.05％w/v Tween 20,5mMβ-甘油磷酸，4℃时pH7.5，含抗蛋白酶、亮肽素(leupeptin)、苯丁抑制素、抑胃酶肽A和抑肽酶各4μg/ml及0.1mM PMSF(‘抗蛋白酶ⅠⅠ’)的15mMβ-巯基乙醇。这一溶液及其后者均经0.2μm微孔过滤。
一旦相关流分经P13K方法鉴定，将它们汇集后立即加样(10ml/分钟)于1.8L Sephadex-G25-fine柱(直径5cm)，此柱已由18升缓冲液L预平衡(仅最后2升含抗蛋白酶Ⅱ)，(缓冲液L包括：5mMβ-甘油磷酸，20mM KCl,0.05％w/vTween 20,1％甜菜碱，0.1mM EDTA,10mM磷酸钾，4℃时pH7.0,15mMβ-巯基乙醇加抗蛋白酶Ⅱ)。Q Sepharose柱脱盐的汇集物立即上样(5ml/分钟)于80ml羟基磷灰石(直径2.6cm,Macropprep-ceramic,BioRad公司)，此柱已经由1升缓冲液M(5mMβ-甘油磷酸，10mM磷酸钾，4℃下pH7.0,0.05％w/vTween20,1％甜菜碱，15mMβ-巯基乙醇)以10ml/分钟流速预平衡后，在上样前立即加入100ml缓冲液N(包含补加了0.1mM EDTA和抗蛋白酶Ⅰ的缓冲液M)。上样后，以100ml缓冲液N洗柱，再用100ml含0.05-0.35M磷酸钾线性梯度的缓冲液N洗脱(4ml/分钟)。收集25ml流分用于鉴定Gβγ-激活的PI3K活性。
合并相关流分(典型地终体积100ml)，以缓冲液O(导电率为250μS,4℃)稀释并且上样于肝素Sepharose HR柱(直径1.6cm，已经150ml缓冲液O以2ml/分钟流速预平衡(见下文))。上样后，以缓冲液O(30ml)洗柱，再以140ml含0.1-0.7M KCl线性梯度的缓冲液O洗脱(流速1ml/分钟)，于5ml单位流分收集洗脱物。缓冲液O为：20mM HEPES,1mM EGTA,0.2 EDTA,0.05％w/vTween 20,1.0％丁烷，1mMβ-甘油磷酸，pH7.2,4℃,15mMβ-巯基乙醇，加上抗蛋白酶Ⅱ。
自肝素Sepharose HR中洗脱下来Gbγ激活的PI3K活性存在于两个峰中，称为A和B峰。A和B峰产物均由组成同样的柱子连续纯化。A峰共15ml(0.4M KCl)并用缓冲液P(见下文)稀释8倍(至最终导电率200μS,4℃)，B峰共15ml(0.6M KCl)并用缓冲液P稀释10倍(至终导电率200μS,4℃)。稀释后立即以1ml/分钟速度上样于预先用20ml缓冲液P平衡过的Mono Q5/5 HR柱。上样后，以5ml缓冲液P洗柱。洗脱物收集于0.5ml单位流分中。缓冲液P包含：10mM Tris,1mM EGTA,0.2 EDTA,0.05％w/vTween 20,1.0％甜菜碱，1mMβ-甘油磷酸，pH7.1,4℃,15mMβ-巯基乙醇，加上抗蛋白酶Ⅱ。
得自Mono Q(A)和(B)的相应流分各自合并(两者总体积均为3ml)，经超滤器(以缓冲液P预冲洗，50 KD截留分子量)浓缩至0.8ml，离心(10,000×g,10分钟，0℃)，然后直接上样(0.25ml/分钟)于预先用缓冲液Q(见下文，2升无抗蛋白酶Ⅱ，然后150ml加抗蛋白酶Ⅱ)平衡过的高效体积排阻色谱柱(V 72ml,Vt 172ml)。在Vt以前收集1.5ml单位流分。缓冲液Q包含：0.17M KCl,1.0％甜菜碱，0.05％w/vTween 20.,1mMβ-甘油磷酸，1mM EGTA,0.2mM EDTA,1.5mM磷酸钾，40mM HEPES,4℃时pH6.9,15mMβ-巯基乙醇。
得自A和B的相关流分各自合并(两者总体积均有6ml)用缓冲液R稀释到24ml(终导电率250μS,4℃)，并上样(0.8ml/分钟)于一个丙烯酸基质阳离子交换型HPLC柱(体积2.5ml,BioRad)，以25ml其中含KCl(0.1-0.6M线性梯度)的缓冲液R洗脱。洗脱物收集于1ml单位流分中。缓冲液R包含：1.0％甜菜碱，0.05％ w/v Tween 20,1mM EGTA,0.2 EDTA,20 mM HEPES,4℃时pH6.8,15mMβ-巯基乙醇加上抗蛋白酶Ⅱ。
合并相关流分((A)3ml,(B)2ml)，用缓冲液S(终导电率180μS,4℃)稀释7倍，然后上样(0.15ml/分钟)于Mini Q柱(0.24ml，工作于Parmacia Smart系统)。此柱以1ml缓冲液S冲洗，并用含0.1-0.5M NaCl线性梯度的缓冲液S以0.1ml/分钟流速洗脱。洗脱物收集于75μl单位流分中。缓冲液S包含：1.0％甜菜碱，0.05％w/vTween 20,1mM EGTA,0.2mM EDTA,2 mMβ-甘油磷酸，10mM Tris,4℃时pH7.7,1mM DTT(无抗蛋白酶)。
整个纯化过程中蛋白质浓度按以下四种方式估计：(a)利用蛋白结合染色(BioRad，这一方法仅用于裂解物、胞浆和Q Sepharose流分)；(b)通过积分280nm吸收峰区(这一方法可由染色结合鉴定校正)；(c)过滤器上的蛋白经丽春红S染色，并与相近固定化标准定义的组分的染色强度比较；以及(d)经SDS-PAGE凝胶解析后的蛋白质，用考马斯R250染色，并与同一胶上已知浓度的蛋白组分比较。
PI3K的最终制备物(首步纯化品)与100nM[3H]-17-羟基-渥曼青霉素(17.7 Ci mmol-1,Amersham，定制)温育，经SDS-PAGE解析，考马斯兰染色，并拍照。然后用荧光自显影检测[3H]。6.2结果
经离子交换色谱分析猪嗜中性粒细胞胞浆表明它包含有Gβγ激活的PI3K活性，与已在U937细胞及骨癌细胞中描述的有相似性质。用[3H]-17-羟基-渥曼青霉素作为探针鉴定由表观大小为117KD、120KD的蛋白双联体，此双联体洗脱于含有Gβγ激活的PI3K活性的流分中，而且其含量为由p110α和/或p110β结合的[3H]-17-羟基-渥曼青霉素水平的2-4％(见图5)。进一步纯化此Gβγ激活的PI3K活性峰(所有图、表详述了经最终测序的PI3K制品的纯化过程)。在此过程中，它被分成的两个峰(A和B)均表现出明显的、内在的、相关的220KD分子量。一旦基本纯化，如考马斯染色SDS-PAGE胶鉴定所示，就明确表现出两种活性与两种蛋白质共同迁移：(A)117KD蛋白(其特异性结合[3H]-17-羟基-渥曼青霉素并因此被推定为催化亚基)和101KD蛋白；以及(B)120KD蛋白(也结合[3H]-17-羟基-渥曼青霉素)和101KD蛋白。这一结果表明PI3K活性物在其天然状态下是p117/p101和p120/p101异源二聚体。在其最终形式中，PI3K的A和B从嗜中性粒细胞裂解物中被纯化约180,000倍和380,000倍(从血液中纯化了1,000,000,000倍)且活性总回收率为5.5％。表1表明了每个步骤中蛋白质和PI3K活性的回收率。
表1猪白细胞G蛋白Bγ亚基激活的PI3K的纯化
  活性汇集物 汇集物总蛋白 汇集物体积 汇集物总活性 纯化倍数
     胞浆     40g     151     100％     1
 Q-Sepharose脱盐     1.5g(1.5g)     40ml(450ml)     90％(124％)     24
   羟基磷灰石     162mg     100ml     125％    309
肝素Sepharose 峰A     19mg     15ml     46％    970
      峰B     12mg     15ml     53％    1769
  Mono Q汇集物A     5.4mg      3ml     16％    1187
       B     1.4mg      3ml     15％    4291
体积排阻(采用850μl)A    0.722mg      6ml     16％    8902
       B     0.2mg      6ml     15.5％    51038
  阳离子交换A    0.13mg      3ml     6％    18489
       B   0.014mg      2ml     9.5％    271761
 Mini Q汇集物获自A     15μg   0.225ml     2.2％    58754
     获自B     10μg   0.225ml     3.1％    174151
与p85/p110家族成员对比，这种浓缩的程度与这些蛋白质结合的[3H]-17-羟基-渥曼青霉素的量一致。因此所有这些蛋白认为是低丰度的。
PI3K A和B的纯化制品就其脂肪激酶活性而言没有差异。两种制品均(a)以Gα-GDP敏感方式被Gβγ亚基激活超过100倍；(b)可被100nM渥曼青霉素(鉴定中含5μM ATP)完全抑制；(c)在有或无Gβγs时对可激活p85/p110家族PI3K达5倍(见图6)的酪氨酸磷酸化肽不敏感；(d)能3磷酸化PtdIns,PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2(这些产物可由依次去酰化和脱甘油后用[3H]-内标记标准物进行[32p]-标记的水溶性产物的阴离子交换型HPLC分析来鉴定)。更进一步，通过利用γ-磷酸化的ATP作为磷酸供体，PI3K的A和B纯化制品表现出了后一底物最低的表观Km值(A和B分别为8和10μM)(结果未发表)。7．实施例：猪Gβγ-活化的PI3K A和B的肽的序列测定
在此实施例中，以氨基酸测序分析两种猪PI3K蛋白。自相当于40g胞浆蛋白纯化的PI3K A和B被Western杂交印记在硝酸纤维素膜上，经丽春红S染色，切下相应于所有四种亚基的条带，用胰酶处理后再进行内部氨基酸序列分析。7.1材料与方法
肽生成与肽测序。用于测序的蛋白等分试样用western杂交点于(用湿点样器)硝酸纤维素膜(0.45μM孔径BA 85,Schleicher和Schuell)上。转移缓冲液包含：192mM甘氨酸，25mM TRIS和10％v/v甲醇。在最终转移单位安装前，凝胶/滤膜三明治(-)边上支撑的Whatman No.1滤纸以及凝胶(1mm厚)浸于(2-3分钟)含0.0005％(w/v)SDS的转移缓冲液。采用恒定35V(0.25-0.35安培，5℃)共转移16小时。滤膜用含于1％乙酸中的0.1％丽春红S染色1分钟，然后在1％乙酸中脱色1分钟。上样于凝胶的约85-90％的蛋白可由滤膜回收。从硝酸纤维素膜中切出感兴趣的条带，按文献(Tempst等，1990，电泳，11:537-552)经修正(Liu等，1990)后进行内部氨基酸序列分析。简述如下：用0.5μg胰酶(Promega,Madison,WI)在25μl 100mMNH4HCO3中(补加1％两性试剂3-16)于37℃进行原位蛋白水解2小时。所获得的肽混合物分别用0.1％β-巯基乙醇(BioRad,Richmond,CA)和0.3％4-乙烯基嘧啶(Aldnich,Milwankee,WI)还原及S-烷基化，并利用反相HPLC分步收集。也在一个相同大小的硝酸纤维素膜条上处理酶空白对照。
HPLC溶剂和系统结构可见文献(Elicone等，1994)，除了使用2.1mm214 TP54 Vydac C4柱(Separations Group,Hesperia,CA)且带有梯度洗脱，流速为100μl/分钟。含Try肽的鉴定可通过297nm和277nm处光吸收比的分析手工进行，采用Applied Biosystems(Foster City,CA)100OS型二极阵列检测仪(Erdjument-Bromage等，1994)进行实时检测。手工收集流分，在走柱期间将其置于冰上，然后于分析前置于-70℃保存。
分析纯化的肽段采用自动Edman降解及矩阵辅助激光吸收离子飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪联合进行；这种联合方法的细节，包括质量辅助的化学后测序路径，能在其它地方查到(Geromanos等，1994，蛋白质化学技术(Techniques in Protein Chemistry)V 143-150；Elicone等，1994，色谱杂志(J.Chromatogr.)676:121-137；Erdjument-Bromage等，1994，蛋白质科学(Protein Sci.)3:2435-2446)。保存后，在上样于测序仪圆盘和质谱仪屏极上之前，柱流分补加洁净TPA(以达到终浓度10％)。质量分析(2％等分样品上)利用Voyager RP MALDI-TOF仪器(Vestec/PerSeptive,Framingham,MA)连同337nm输出氮激光，1.3m飞行管和作为基质的α-氰基-4-羟基桂度酸(购自Linear Sci.,Reno,NV的预制溶液)以线形模式进行。采用30KV离子加速电压(栅极电压70％，指导线电压为0.1％)和-2.0KV多重电压。利用TDS 520 Tektronix(Beaverton,OR)数码示波器，根据特异最大值的最佳偏转来调节激光通量和获取数量。利用GRAMS(Galactic,Salem,NH)数据分析软件自飞行时间文件中可产生Mz(质荷比)光谱。每个样品按文献(Genomanos等，1994)在有和无两种校正物(APID和P8930，每个25飞摩尔)分析两次。化学测序(95％的样本)采用477A型Applied Biosystems(AB)仪器进行。逐步释放的PTH-氨基酸用装有PTH C18(2/1×220mm；颗粒大小5μm)柱(AB)的′在线′120A HPLC系统(AB)来鉴定。根据文献(Erdjument-Bromage等，1994，蛋白质科学，3:2435-2446；Tempst等，1994,Methods Companion Meth.Enzymol.6:284-261)仪器和步骤按飞摩尔级水平的带硫海因(thihydantoin)氨基酸分析进行了优化。
肽平均异构体质量用ProComp 1.2版软件(从P.C.Andrews博土，Michigan大学，Ann Arbor,MI处获得)根据已知氨基酸残基(包括推定的那些)加和而成。
根据PDGFβR中酪氨酸740和751附近序列在Babraham研究所利用显微化学设备制备两重酪氨酸磷酸化的肽(18个残基)。7.2结果
肽测序数据立即解决了关于这些蛋白之间关系的一些问题。来源于PI3K A和B的p101是相同的并且在开放阅读框架的483位点鉴定出相对共同的等位基因变异体(注明在图4)，即一个丝氨酸被甘氨酸代替。p117和p120表现出完全相同的胰蛋白酶HPLC峰形，并且除一个源于p117的氨基端封闭的肽外，从两个物种已测序的所有明显共有的肽段是相同的(见下文)。然后肽序列信息用于设计钓出编码这些蛋白的核苷酸序列的探针。8．实施例：编码猪的p120和p101的cDNA的克隆
以猪p120肽序列和猪p101肽序列为基础的简并性寡核苷酸探针用于筛选以寡聚dT为引物的扩增的cDNA文库(从猪嗜中性粒细胞poly-A选择性RNA制成)。以下叙述编码p101和p120蛋白的cDNA的克隆和表征。8.1材料与方法
我们从4.2×109个猪嗜中性粒细胞中制备0.7mg总RNA(Chomczynsk& Sacchi,1987，分析生物化学(Anal.Biochemistry)162:156-159)。Stragene(San Diego,CA)使用此RNA产生Poly A选择性mRNA，由此他们在λZAPⅡ中制备寡聚dT引物和随机引物的cDNA文库(分别约为5.4×106和3.2×106初级p.f.u.)。扩增文库由约2×106个原始重组子构建而成，并通过标准方法用于筛选p120和p101 cDNA。
利用基于得自p120肽序列的[32p]-标记的寡聚物[CA(T/C)GA(T/C)TT(T/C)ACI CA(A/G)CA(A/G)GTI CA(A/G)GTI AT(T/C/A)GA(T/C)ATG](SEQ ID NO:5)来筛选得自以寡聚dT为引物的2.5×106个空斑。基于质粒和两条测序过的DBA链如BluescriptTM分离鉴定了12个阳性克隆(在Babraham研究所采用ABI自动测序设备)。这些质粒的插入序列代表带有两个定义编码所有源于p117/p120胰酶消化物的全部肽序列的全长开放阅读框架的一系列重叠的克隆(图4)。
用[32p]-标记的基于得自p101的肽序列的寡聚物[GCI TA(T/C)ATG GA(A/G)GA(T/C)ATI GA(A/G)GA](SEQ ID No:6)从寡聚dT引物文库中筛选衍生0.9×106个空斑。对一个阳性克隆进行了检定、分离、测序。此克隆的5′端(D11)代表了胰酶水解肽段之一的一部分序列，因此鉴定它为一个部分克隆。利用源自D11的[32p]标记的ClaⅠ限制性酶切片段进一步从以寡聚dT引物文库中筛选了0.6×105个空斑。鉴定了66个阳性克隆，分离了其中49个，对其中一些进行部分测序。这些克隆代表一系列部分重叠克隆，它们均含有D11序列但都小于D11自身。再用得自D11的[32p]标记的ApaⅠ限制性酶切片段从随机引物文库中筛选了3.5×106个空斑。检定出98个阳性克隆。这些克隆再用基于PCR的方法，以针对BluescriptTM载体设计的引物(正向或反向引物)和内部D11序列，对这些克隆进行再筛选(在初级空斑分离物的阶段)。这使我们能够鉴定(不依赖于方向)最长的编码p101序列的可能的N端延伸。分离及测序带有最大PCR片段的三个克隆进行。这些代表部分重叠的克隆与D11一起，确定了一个编码源自p101胰酶消化物所有肽序列的全长开放阅读框架(图1和图2)。8.2结果
两个克隆确定了一个编码所有p117/p120胰酶消化肽的全长开放阅读框架(见图1-4)。在三个可能的起始蛋氨酸中，基于对氨基端封闭的p120衍生的多肽的测量分子量与由三个蛋氨酸中每个作为起始翻译点所推出的氨基端肽的理论分子量之间的精确比较，确定中间的一个有活性(与Stoyanov等1995，科学269:690-693的假定相反)。这样，p120的理论大小为126KD。比较由p117得到的氨基端封闭的肽与p120氨基端相关区域，表明两者没有精确重合(允许正常氨基端封闭)。这样p117既不象是从p120蛋白水解性修饰或翻译后修饰而成的，也不像由p120内的第二翻译起始点而得到的。但是编码p117开放阅读框架的cDNA还未分离出来。
用定义p120的蛋白和DNA序列在数据库中寻找相似的结构。鉴定与所有已被克隆的PI3K的相似性。然而，序列除种属差异外，与p110γ几乎一样(Stoyanov等，1995)，我们得到的序列与Stoyanov等人的唯一显著不同发现在远端COOH端中。仅根据一级结构，还不能肯定p120中COOH端血小板-白细胞C激酶底物同源性区域的鉴定。
通过利用来自猪嗜中性粒细胞的源于寡聚dT和随机引物的cDNA文库的几个重叠片段，定义了一个编码源于p101所有肽序列的全长开放阅读框架。鉴定了一个源于p101的氨基端封闭的肽；它的大小精确等同于从所述开放阅读框架预测起点所定义的前12个残基的预计的氨基端乙酰化的形式的分子量。预测的相应p101分子量是97kD。虽然在蛋白和DNA序列库中寻找过相似结构或亚结构，但没有发现有明显相同的序列。9．实施例：编码人p120和p101的cDNA的克隆
源于猪p101和p120 cDNA序列放射性标记的PCR产物被成功地用于筛选人类cDNA文库中的同源物。编码人p101和p120 cDNA的克隆及表征叙述如下：9.1人p101
用相应于猪p101 cDNA序列887-1287的放射性标记PCR产物筛选人类单核细胞cDNA文库(Clontech,Palo Alto,CA；mRNA来源：U937细胞系，50ng/ml PMA处理3.5天)。含有人类cDNA文库的λgtll噬菌体按Clontechλ文库操作手册所述铺板，并转移到尼龙滤膜。结合于滤膜的DNA经高压消毒膜1分钟而变性，之后滤膜在42℃预杂交液中进行2小时预杂交，预杂交液包括50％甲醛、5×Denhardts、5×SSC、0.05mg/ml鲑鱼精DNA、0.05M pH6.8的NaPO4、1mM焦磷酸钠和1％SDS。放射性标记的PCR探针经煮沸5分钟变性，在冰上冷却15分钟，然后以终浓度1百万cpm/ml加入处于杂交缓冲液的滤膜上。杂交在持续搅动下于42℃过夜进行。之后滤膜在室温用2×SSC,1％SDS洗20分钟，42℃下用2×SSC 1％SDS再洗20分钟，最后在42℃下用0.2×SSC,1％SDS洗20分钟。放射自显影后，根据Clontech文库手册，采集阳性克隆本身及周围区域，并将噬菌体洗脱到噬菌体稀释缓冲液中，从而分离阳性克隆。噬菌体再以可以分离到单噬菌斑的密度重辅板，生长过夜，转移到尼龙滤膜。滤膜用与上述同样的放射性PCR探针杂交，洗涤并进行放射自显影。挑选单个、纯的阳性噬菌班，噬菌体洗脱入噬菌体稀释缓冲液，然后重辅板产生一个平辅生长的菌苔。空斑纯化的菌苔被洗脱入噬菌体缓冲液根据Clontech文库操作手册分离λ噬菌体DNA。
用限制性酶EcoRⅠ酶切纯化的λDNA，在琼脂糖凝胶上分离后，分离这些EcoRⅠ处理的DNA插入片段且重组进EcoRⅠ线性化的Bluescript KS+。对这些含DNA插入片段的Bluescript质粒进行测序。各自分离的cDNA克隆中有五个包含与猪p101 cDNA 1137到位于3021处的终止密码子间同源的序列。与猪p101序列相比，已分离的人克隆含有一个3′端544bp的非翻译序列。
由于猪的序列在5′端富含GC，所以在寡聚dT引物文库中发现一个全长克隆的可能性非常低。因此，为了增大发现富GC含5′端区之克隆的可能性，我们决定采用同为寡聚dT引物和随机引物的引物文库。运用同样的猪p101序列放射性标记的PCR产物和上述同样方法，我们筛选了一个人白细胞5′端Stretch加cDNA文库(Clontech,mRNA来源：正常外周血白细胞)和几个已分离的克隆，其中一个包含人p101序列的5′端。这一克隆包括大约编码序列上游的300bp和编码序列的前1612bp。将白细胞克隆5′端克隆(从起始密码子上游77bp处的HindⅢ点到1262点处的SacⅠ点)与单核细胞克隆(从SacⅠ点到3014点的XbaⅠ点，即终止密码子下游305bp处)融合构建成一个含人类p101序列全部编码区域的全长cDNA的克隆。这一全长cDNA的序列已全部确定，其编码的氨基酶序列也已推定。
由于这个全长克隆源于两个不同文库的不同克隆，所以确证了在白细胞文库中p101克隆3′端的存在。利用不同的五套PCR引物，我们证明了克隆自单核细胞文库的p101的3′端存在于单核细胞文库和白细胞文库中。9.2人p120
猪p120的人类同源物经过筛选一个白细胞cDNA文库(Clontech,mRNA来源：正常外周血白细胞)而克隆，实验根据上述人p101的克隆方法，采用了猪序列中875至1315bp的一个放射性标记的PCR片段。我们独立分离出了两个含人p120 5′端的克隆，它们相应于Stephen等人报道的猪序列6至2414。人类序列在2408处有一个EcoRⅠ位点，由于cDNA文库是以EcoRⅠ接头构建的，所以全长人类序列必包括于两个分离的克隆，一个包括5′端EcoRⅠ片段，另一个包括3′端EcoRⅠ片段。因此用来自猪p120序列3′端(2801-3395bp)的放射性标记的PCR片段在上述相同条件下对文库进行再筛选。我们独立分离出两个包含从位点2408(人类序列)到5128的polyA尾起始点序列的3′端的克隆。分离含有5′和3′端EcoRⅠ片段的两个噬菌体的DNA插入片段，于EcoRⅠ位点处融合产成一个全长cDNA克隆(1至5128)，它包括全部人类p120同源物编码区(84至3390)。已确定全长cDNA克隆的全部序列并推断出编码的氨基酸序列。10．实施例：猪p120和p101在昆虫细胞中的表达
制备重组的克隆的杆状病毒(rbv)，该病毒带有氨基端6×HIS标记的p120(pAcHLT p120)cDNA或氨基端(EE)-标记的p101 cDNA((pAcO-G1)p101)，并用于在昆虫(Sf9)细胞中驱动上述蛋白的产生。10.1材料与方法10.1.1表达载体的构建
利用N端PCR和适合的限制性内切酶位点，将猪p120和p101开放阅读框架改造成一种可插入多种表达载体的形式。在每种情形中，在N端标记后的第一个编码的氨基酸是起始蛋氨酸。p120cDNA3’非翻译区全长利用，而p101cDNA的则在BamHⅠ位点(第192位核苷酸，图1)截断。用于在Sf9细胞中杆状病毒驱动表达的载体是pAcHLT(它编码其后为一凝血酶切点的N端‘6xHis-标记’，Phanminogen；p120开放阅读框架被插入XhoⅠ-EcoRⅠ位点)和pAcO-G1(它编码一个N端‘EE-标记’，ONYX Pharmaceutials；p101开放阅读框架被插入EcoRⅠ-NotⅠ位点)。所有载体在使用前经过N端测序。10.1.2 Sf9细胞转染和重组蛋白产生
Sf9细胞在含11％HI-FBS的TNM FH的旋转摇瓶中生长，并使细胞数量维持在0.5至2×106个细胞/ml。建议采用带有线性化baculo-gold DNA(Pharminogen)的InsectinTM(Invitrogen)脂质体和相关的杆状病毒转移载体转染Sf9细胞(Invitrogen)。所得重组杆状病毒经空斑纯化和放大以产生高滴度的病毒贮液。pAcO-G1 p101病毒在27℃条件下感染吸附Sf9细胞2.2天；pAcHLT p120病毒可在27℃条件下在旋转培养基中感染(通常地)1.9天。细胞收集于冰冷的0.41％KCl；2.66％蔗糖；20mM MgCl2；8mMNaH2PO4 pH6.2,25℃溶液中；经1mM二异丙基氟磷酸(冰上5分钟)处理，并在收集溶液中冲洗一次。离心浓缩的分装细胞在液氮中冷冻并保存于-80℃。10.1.3 Sf9来源的蛋白的纯化
猪p120用一种金属离子鳌合柱(Talon,Clontech)纯化。细胞沉集物以每1升感染的Sf9细胞培养物50ml超声缓冲液的比率融化，超声缓冲液成分包括0.10M NaCl；50mM磷酸钾，pH8.0,4℃；10mM Tris.HCl，pH8.0,4℃；1mm MgCl2和抗蛋白酶Ⅰ(见上文)，并用探针超声破碎(冰上4×15秒破碎次)，并离心(120,000×g40分钟，4℃)。移去上清且合并收集(管中上端云雾状上清单独分离；先用0.45μM滤器低蛋白结合力的滤膜过滤之后合并其余上清)。细胞浆流分中加入Tween-20和甜菜碱(分别为0.05％,w/v，和1％)后泵入已用平衡液(1.2ml树脂每升原始Sf9感染物，线性流速20cm/小时)平衡的Talon柱，这一步以及以下步骤均在4℃进行。柱随后以如下诸液各20倍柱体积冲冼：缓冲液A，50mM磷酸钠，pH8.0,4℃；10mM Tris/HCl,pH8.0,4℃；0.15MNaCl；1％甜菜碱；0.05％,w/vTween-20；缓冲液B,1％,w/v,Triton X-100；0.15M NaCl；50mM磷酸钠，pH8.0,4℃；10mM Tris,pH8.0,4℃；1％甜菜碱；0.05％,w/v,Tween-20；缓冲液C,0.15M NaCl；50mM磷酸钠，pH7.1,4℃；1％甜菜碱；0.05％,w/v,Tween-20；缓冲液D,0.15M NaCl；30mM Tris,pH7.5,4℃；1％甜菜碱；0.02％,w/v,Tween-20 10％v/v，乙二醇；1mM MgCl2；然后加入8倍柱体积缓冲液E，其成份包括加入10mM咪唑的缓冲液D(pH7.5)。缓冲液E冲冼过程中，以2ml为单位进行分部收集。最后，以前述所用流量的一半，用缓冲液F冲洗柱，其成份包括，加入70mM咪唑的缓冲液D(pH7.5；终浓度)。以1ml为单位进行分部收集。基于Abs280nm踪迹(连续记录)依经验收集流分并立即加入1mM DTT和1mM EGTA(终浓度)。一般地，这个过程可在每升Sf9培养物中产生4mg p120。以这种方式制备的p120其纯度一般大于90％。p120最终汇集物经过一个装有以缓冲液G平衡的15ml G-25超细柱去除盐份。缓冲液G成份包括加入1mM DTT和1mM EGTA(终浓度)的缓冲液D。某些实验中所用的p120空白也与制备正常p120完全平行地制备，其过程中只是细胞用野生型杆状病毒感染或不感染起始细胞。源于这种空白制剂的最终流分也以一个“平行体积”收集，因为它实际上不含有蛋白。
p120的6×HIS标记包含一个凝血酶切割识别基序。通过利用凝血酶的仔细滴定及用6％聚丙烯酰胺SDS-凝胶分析发现了两个凝血酶位点，它们对凝血酶的敏感性相近，均在氨基端附近(因为有一种αCOOH-端抗体仍可将这种双切p120免疫沉淀)。其中一个位点位于预期中所设计的标记位置之内，另一个位点约距氨基端40个残基(此区域内没有凝血酶适合的识别序列)。在优化的条件下(2U/ml，凝血酶；0.2mg/mlp120；4小时，4℃，含1mm EGTA,1mMMgCl2)可制备凝血酶切割的p120制剂，其中含15％未切割的p120,50％切于真正的氨基端凝血酶位点，35％有约额外40个残基被切割。在这些实验中，凝血酶的作用经加入潜在的凝血酶抑制剂(sigma)来终止，该抑制剂为100nM N-乙酰基D-Phe Pro-2-氨基-5胍基丁硼酸。贯穿这一工作的自始至终，部分切割的p120与完全未切割的p120的制剂是平行使用的。已经明确的是(A)所有三种p120蛋白与p101的结合均有非常近似的亲和力，(B)Gβγ对与p120混合物结合的p101的激活程度与它对与未切割的p120结合的p101的激活程度相近，(C)部分切割与未切割的p120在无p101时事实上对Gβγ亚基不敏感(虽然完全的凝血酶切割可使整个p120催化活性下降20-30％，并且由Gβγ增加1.7倍的表观活性，在无p101的情况下增加2.5倍)。
猪(EE)-p101按以下方法从Sf9细胞冷冻沉淀物中纯化。从2升感染的Sf9培养物中收集的细胞，按上述在50ml的0.12M NaCl；1mM MgCl2；25mM HEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA加抗蛋白酶Ⅰ中进行超声处理。离心后(120,000×g,,4℃,40分钟)，移去上清(如上述)，加入1％w/vTriton X100,0.4％胆酸钠，0.4M NaCl(终浓度)，与2ml与α-(myc)不相关单克隆抗体共价交联的包装蛋白G琼脂糖(用平衡液冲洗)混合。在4℃混合30分钟后，沉淀珠子取出上清并与1ml与α-(EE)单克隆抗体共价交联的包装蛋白G琼脂糖(用平衡液冲洗)混合。4℃下混合2小时后，珠子用以下方式冲洗用于U937细胞α-(EE)免疫沉淀，除了(a)冲洗在20ml离心管中进行，且(b)珠子最终以缓冲液H冲洗3次，其组成包括带有1％,w/v,Triton X-100的缓冲液G。一些实验中所用的‘p101空白’(p101C)的制剂如上文所述，可从野生型杆状病毒感染或未感染的细胞制备。
用两种类型的重组杆状病毒共转染sfq细胞在体内形成的p101/p120异源二聚体用所述用于(EE)-p101的纯化方法纯化，除了免疫沉淀用缓冲液Ⅰ冲洗4次，缓冲液Ⅰ1％,w/v,Triton X-100；0.15M NaCl；20mMHEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA；用缓冲液J冲洗2次，其组成包括加入0.4M NaCl(终浓度)的缓冲液Ⅰ，然后以1个柱体积的缓冲液G中之150μg/ml(EE)肽洗脱前，用缓冲液G冲洗3次。这种(EE)肽，氨基端乙酰化EYMPTD，对α-(EE)单克隆抗体有很高的亲合性。当珠子与(EE)多肽在冰上共温育40分钟后，移取上清。洗脱蛋白的各等份进行稀释，并用于分析PI3K活性(见上文)或直接与SDS样品缓冲液混合。
在体外重构实验中，在含有1％,w/v,Triton X-100(这时等同于缓冲液H)之缓冲液G中的p120制品与仍结合于蛋白G基质的(EE)-p101(10:1蛋白摩尔比)混合，混合2小时(均在4℃)，然后如下文实施例中所述之体内重构的p101/120-PI3K纯化的方法用(EE)-多肽进行冲洗和洗脱。10.2结果
应用标记的单步纯化方式产生的纯化蛋白制品可由考马斯染色法鉴定，它们的表观大小与预期相符。此外，两者在Western杂交中通过特异性的COOH端定向以及由序列内定向均能正确地识别抗多肽兔多克隆血清(未展示)，这提示了其真实性。
以上情况中，p120以1∶1摩尔化学计量紧密地结合于p101，无论(a)在体外，当两个蛋白均各自独立纯化后混合(p101仍与用于分离的蛋白G基质结合)然后在用(EE)-肽洗脱前严格冲洗，或(b)在体内，当Sf9细胞用两种构型的rbv共感染且蛋白通过p101标记纯化(数据未展示)时。
游离的纯化的p120是一个PtdIns(4,5)P2选择的渥曼青霉素敏感的PI3K。Gβγ对游离p120PI3K活性有小的双模式(bi-modal)影响。结合于GDP的Gα′so、i1、i2和i3的等摩尔混合物(终总浓度2μM)在氟化铝的存在下，对游离p120PI3K活性没有明显影响(这是一种当以1.5倍摩尔过量加入时能够完全抑制Gβγ对PI3K作用的Gα制剂)。能够活化p85/p110-PI3K家族成员的酪氨酸磷酸化的肽也对p120PI3K活性没有可探测到的影响。当结合于p101(体内或体外)时，p120的PI3K活性可由Gβγ亚基激活增加100倍以上。酪氨酸磷酸化的肽和Gα-GDP/氟化铝对Gβγ活化的，或基础的，p101/p120PI3K活性没有影响。在无Gβγ的条件下，p101/p120复合物中p120的特异性活性低于游离p120的特异性活性但在有Gβγ存在时可提高50倍以上(见图7)。
在相同的、Gβγ刺激的实验条件下比较猪嗜中性粒细胞来源的PI3K(B)和Sf9来源的p101/120异源二聚体的特异催化活性，表明来源于Sf9的物质每毫克蛋白活性要高出2倍。这一结果与相近的从循环血嗜中性粒细胞制备的PI3K的年龄鉴定(‘age at assays’)实验并不矛盾，该实验通过4天纯化步骤实现，并提示重组PI3K的主体是正确折叠的，并且任何重要的翻译后修饰必是合适的。11．实施例：猪p120和p101在哺乳动物细胞中的表达
构建了一个可瞬时表达猪p101和p120的氨基端表位标记的形式((myc)或(EE))的哺乳动物表达载体家族。本实施例描述了从哺乳动物细胞中纯化的重组p101和p120融合蛋白的生产，接着分析了其性质。11.1材料与方法11.1.1细胞培养
U937细胞生长于含10％V/V热灭活的(H1)-FBS的RPMI 1640中并且每2天稀释4倍。Cos-7细胞生长于含10％HI-FBS的DMEM中。11.1.2表达载体的构建
利用N端PCR和恰当的限制内切酶位点，将猪p120和p101开放阅读框架处理成可插入多种表达载体的形式(在每种情形中在N-端标记后之第一个氨酸酸编码为起始蛋氨酸)。3’非翻译的p120cDNA区域(resin)全长利用而p101cDNA的则在BamH Ⅰ位点(核苷酸位点192，图1)截短。采用在哺乳细胞中巨细胞病毒驱动表达的载体(A)pCMV(EE)(编码一个氨基端MEEEEFMPMPMEF(SEQ ID NO:7)或MEEEEFMPMEFSS(SEQⅠD NO:8)‘EE-标记’分别用于p101或p120表达)和(B)pCMV(myc)(编码一个N端MEQKLISEEDLEF(SEQIDNO:9)或MEQKLISEEDLEFSS(SEQ ID NO:10)‘myc-标记’分别用于p101或P102表达)。在使用前所有载体均被氨基端测序。11.1.3 U937转染步骤
指数生长的U937细胞(12小时以前稀释)于室温，经2次PBS冲洗，重悬于无菌电穿孔培养基(EM)中，该培养基包括：30mM NaCl,0.12M KCl,8.1mM Na2HPO4,1.46mM KH2PO4和5mM MgCl2。环状质粒 DNA加入含细胞的1×EM中，形成终体积0.5ml，包括1.4×107个细胞和40μg总DNA(一般采用40μg有相同启动子和表达相近标记但不含相关蛋白的表达质粒)，然后转移到一个小杯中(0.4cm间隙，BioRad)。室温静置十五分钟之后，进行电穿孔(280v,960μF条件下，进行一个脉冲，采用BioRad Gene脉冲仪，时间常数定为18毫秒)，然后放于冰上8分钟，再以5ml含10％HI-FBS的RPMI稀释。放置5分钟以使死亡细胞聚集，细胞用补加青霉素和链霉素的含10％HI-FBS的35ml的RPMI稀释，然后加入TPA和ZnCl2(均在U937细胞中对CMV启动子的表达有放大作用)分别至终浓度5×10-8M和200μM。如果细胞要用[35S]-蛋氨酸(Translabel,ICN)标记，则电穿孔后所用的RPMI中应无蛋氨酸及亮氨酸，并含有2mM NaHCO3和25mM HEPES以及10％透析的HI-FBS并有细胞应重悬于含20μCi/ml[35S]-蛋氨酸/亮氨酸(phsTPA和ZnCl2，如上)终体积10毫升的培养液中。12小时后，(无论有无[35S])细胞悬液与二异丙基氟磷酸混合(终浓度1mM)，放置五分钟，然后离心收集，用PBS冲洗一次，裂解用于免疫沉淀。按如下方式对于来自U937细胞裂解产物的(EE)-表位标记的蛋白进行免疫沉淀。来自一次电穿孔的细胞裂解于1.25ml裂解缓冲液，其包括1％w/v Triton X-100,25mM HEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA,1mM MgCl2,0.15mM NaCl,0.1mM PMSF,10μg/ml亮肽素，10μg/ml抑酶肽，10μg/ml抗蛋白酶，10μg/ml抑胃酶肽A和10μg/ml甜菜碱(此后称为抗蛋白酶Ⅰ)。离心裂解产物(12,000rpm,0℃,15分钟)。所得上清取出并与4M NaCl(0.1ml),20％胆酸钠(25μl)和共价偶联于不相关的、异型配对的鼠单克隆抗体的蛋白G sepharose(40μl装体积)混合(约5-10mg/ml sepharose)。上清颠倒混合20分钟，沉淀珠子，上清转移至另一个装有共价偶联于α-(EE)-鼠单克隆抗体的蛋白G sepharose珠子(10μl装)的试管(约5-10mg/ml sepharose)。4℃下混合2小时之后，免疫沉淀物用1.0％,w/v,Triton X-100；0.4％胆酸盐；0.004％SDS；0.4M NaCl；1mM EGTA；25mM HEPES,pH7.4，于0℃下洗5次；用0.5M LiCl,0.1M Tris,pH8.0,4℃下洗1次；用0.12M NaCl；1mM EGTA；25mM HEPES,pH7.4,0℃下冲洗2次。最后一次缓冲液补加1mM DTT(终冲洗缓冲液)。如果免疫沉淀物从[35S]-蛋氨酸标记的细胞制备，最后一次冲洗可省略，珠子在SDS上样缓冲液中煮沸。另外，样品以下面所述进行PI3K活性的鉴定。11.1.4 COS-7细胞转染
指数生长的COS-7细胞在转染3小时前，用胰酶消化重铺板成50-70％铺满。在转染时再次胰酶消化，用10％FBS的DMEM稀释，计数，以PBS洗两次，并重悬于EM(每小瓶1×107个细胞)与环状质粒DNA混合(每小瓶40μg，组成为10μg EXV-(EE)-β1,10μg EXV-(myc)-τ2,10μgpCMV-(myc)-p120或10-40μg无关哺乳动物表达载体)，形成最终体积500μl，然后转移到电穿孔小杯(0.4cm间隙，BioRad公司)。室温10分钟后对细胞行电穿孔(250V,960μF)，置冰上8分钟，然后稀释于含10％FBS的DMEM中，让已凝结的细胞聚集，而当细胞等分入60cm圆盘(每小瓶4个圆盘)时应避免聚集。
48小时后，各自处理后的4个圆盘在HEPES缓冲的DMEM中冲洗，其中包括1mM NaHCO3和0.2％无脂肪酸的BSA。10小时后收集两份重复圆盘用于Western杂交(以α-(myc)单克隆抗体为第一检测试剂，α鼠-HRP为第二检测系统，并用ECL和密度扫描定量测定)。这两个圆盘用无磷酸盐含1mM NaHCO3 0.2％无脂肪酸的BSA的DMEM冲洗，然后再与300μCi[32p]-Pi每圆盘(4ml)37℃下再温育90分钟。吸出培养基加入1ml冰冷的1M HCl。刮下并移取细胞，圆盘用1.33ml甲醇冲洗。HCl和甲醇冲洗物与2.66ml氯仿合并(形成一个′Folch′两相溶媒分配)混合、离心。移取下层相并再与1.95ml含0.5m EDTA和1mM硫酸四丁基铵的新鲜上层相(见上文)混合。混合、离心后，移取下层相，干燥，去乙酰化并制备用于阴离子交换型HPLC(Stephen等，1991自然351:33-39，此处全文引入作为参考)。11.2结果
当在U937细胞内瞬时表达时，(EE)-p101和(EE)-p120能够约以等量从[35S]蛋氨酸标记的细胞中特异性地免疫沉淀出来(对于蛋氨酸相对的compliment；分别为8∶25，数据未显示)。严格冲洗的α-(EE)-p101免疫沉淀物包含有渥曼青霉素敏感的PtdIns(4,5)P2选择性及Gβγ敏感的PI3K活性，而这一点在对照中，无论是用无关单克隆抗体进行免疫沉淀或用一个编码(EE)标记的无关蛋白cDNA的表达产物，在用[35S]-蛋氨酸标记评价时均没有这一特性，其与(EE)-p101水平相近。
由Gβγτ产生的激活可由与2倍过量(摩尔数)的Gα-GDP预温育来阻断。此外，在这些p101免疫沉淀物中的PI3K活性对Gα-GDP/氟化铝不敏感。(myc)-p120与(EE)-p101共转染不能提高在α-(EE)免疫沉淀物中特异性地恢复的活性。事实上它下降了，可能是由于(EE)-p101的表达在(myc)-p120表达载体存在时相对较低。相反，用(EE)-p120α-(EE)免疫沉淀物转染的细胞无论在有无Gβγ时均几乎不能检测到PI3K活性。这些细胞中包含的[35S]蛋氨酸标记的p120的摩尔量与来自(EE)-p101转染细胞的α-(EE)免疫沉淀物中(EE)-p101的摩尔量相近。与(myc)-p101共转染，除了(EE)-p120表达下降外(用[35S]蛋氨酸标记评价)产生了一个实质性增加，尤其是Gβγ激活的可恢复的PI3K的活性(见图8)。这一数据提示U937细胞(人类)包含一个内源性PI3K催化亚基，它可与瞬时表达的p101(猪)结合。当结合p101(猪)后，内源性催化亚基就表现出主要由Gβγ进行调控，因为所有免疫沉淀物中的p120均与p101结合。
相反，从(EE)-p120转染的细胞中来的α-(EE)免疫沉淀物，大部分的p120与p101不结合，因此相对无活性(与有Gβγ存在时的结合于p101对比)。然而，在Gβγ存在条件下检测PI3K活性时，通过与(myc)-p101共转染明显放大。对这些数据的另一种解释---p120是“变性”的(虽可溶也可被免疫沉淀)除非在有p101条件下---不同于独立的源于Sf9纯化的蛋白所获得的数据所显示的。
为测试p101/p120在体内是否能由Gβγ活化并产生Ptdlns(3,4,5)P3,我们在Cos-7细胞内瞬时表达了(myc)-γ2、(EE)-β1、(myc)-p101和(myc)-p120的多种组合，并在转染后48小时测定它们对细胞中[35P]-磷酸肌醇水平的影响(见图9)。p120在有p101存在时以依赖β2γ2方式明显增加PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(3,4)P2的产生。这一结果不能够由引入的上述组合中不同的cDNA的相关表达中的变化来解释(见图9)。12．克隆的保藏
以下微生物或克隆已于所示日期保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland并分配了保藏号码：
克隆          ATCC保藏号    保藏日期
pCMV3mycp101    97636        6/27/96
pCMV3mycp120    97637        6/27/96
本发明不仅限于这里所述的仅仅意在对本发明各个方面加以单独说明的特定的实施方案，功能上等同的方法和组分也包括在本发明的范围中。确实，对本发明的各种修饰以及在此展示和描述的那些修饰，对于本领域技术人员依上述的描述和附图将是显而易见的。这样的修饰均会落入所附权利要求的范围。

Claims (67)

1．一种经分离的核酸分子，其包括p101基因的核苷酸序列。
2．一种编码p101调控亚基或其片段的经分离的核酸分子，具有如下核苷酸序列：
a)编码SEQ ID No:2，或编码由保藏号为97636的保藏于美国典型培养物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA编码的氨基酸序列；或
b)在严格条件下可与(a)的核苷酸序列或其互补物杂交的序列。
3．一种编码p101调控亚基或其片段的经分离的核酸分子，具有如下核苷酸序列：
a)编码SEQ ID No:12；或
b)在严格条件下可与(a)的核苷酸序列或其互补物杂交的序列
4．一种根据权利要求2或3的经分离的核酸分子，其中在中等严格条件下该核酸分子可与(a)的核苷酸序列或其互补物杂交，且其中该核酸分子编码p101基因产物的功能等同物。
5．一种根据权利要求2或3的经分离的核酸分子，其中在高度严格条件下该核酸分子可与(a)的核苷酸序列或其互补物杂交。
6．一种根据权利要求2或3的经分离的核酸分子，其中该核酸分子编码SEQ ID No:2，或编码由保藏号为97636的保藏于美国典型培养物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA编码的氨基酸序列。
7．一种根据权利要求2或3的经分离的核酸分子，其中该核酸分子编码SEQ ID No:12。
8．一种经分离的核苷酸序列，其编码相应于p101调控亚基蛋白的催化亚基相互作用结构域或Gβγ相互作用结构域的多肽，或相应于p101调控亚基蛋白的缺失突变体的多肽，其中此突变体的催化亚基相互作用结构域或Gβγ相互作用结构域被删除。
9．一种经分离的核苷酸序列，其编码包含权利要求1至8中任一项中的与一种异源多肽融合的多肽的一种嵌合蛋白质。
10．权利要求9的经分离的核苷酸序列，其中异源多肽为一种Glu标记或myc表位标记。
11．一种包含权利要求1到10中任一项中的核苷酸序列的核苷酸载体。
12．一种表达载体，其包含与在宿主细胞中控制该核苷酸序列表达的一种核苷酸调控序列有效地结合的权利要求1至10中任一项中的核苷酸序列。
13．权利要求12的表达载体，其中所述调控序列选自巨细胞病毒hCMV极早期基因启动子、SV40腺病毒早期或晚期启动子、杆状病毒启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子和酵母α交配因子启动子。
14．一种经基因工程改造以含有权利要求1到13中任一项中的核苷酸序列的宿主细胞。
15．一种根据权利要求14的宿主细胞，其中该宿主细胞经基因工程改造以含有与在宿主细胞中控制该核苷酸序列表达的一种核苷酸调控序列有效地结合的权利要求1到13中任一项中的核苷酸序列。
16．权利要求15的宿主细胞，其中该宿主细胞是Sf9细胞、中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞或U937细胞。
17．一种经基因工程改造的宿主细胞，其中天然p101基因序列或编码权利要求1到13中任一项中的核苷酸序列的序列被破坏，以便抑制或阻碍天然p101基因产物的表达。
18．一种经分离的G蛋白激活的PI3K，其包含一个p101调控亚基和一个p120催化亚基。
19．一种经分离的p101调控亚基蛋白。
20．一种经分离的p101调控亚基蛋白，其具有SEQ ID No:2的氨基酸序列，或由保藏号为97636的保藏于美国典型培养物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA编码的氨基酸序列。
21．一种经分离的p101调控亚基蛋白，其具有SEQ ID No:12的氨基酸序列。
22．一种多肽，其具有相应于p101调控亚基蛋白的催化亚基相互作用结构域或Gβγ相互作用结构域的氨基酸序列，或p101调控亚基蛋白的缺失突变体的氨基酸序列，其中该突变体的催化亚基相互作用结构域或Gβγ相互作用结构域被删除。
23．一种包含与一种异源多肽结合的权利要求19,20,21或22中的多肽的嵌合蛋白。
24．权利要求23的嵌合蛋白，其中所述异源多肽是一种Glu标记或myc表位标记。
25．一种与权利要求19、20、21或22的p101调控亚基蛋白免疫特异性结合的抗体。
26．一种诊断哺乳动物炎性应答紊乱的方法，包含检测哺乳动物基因组中所含的p101基因突变。
27．一种筛选治疗炎性应答紊乱的有效化合物的方法，包括用化合物接触G蛋白激活的PI3K和脂膜，并鉴定磷酸向脂膜的迁移。
28．权利要求27的方法，其中G蛋白激活的PI3K包含p101、p120和Gβγ。
29．权利要求27的方法，其中脂膜含有PtdIns(4,5)P2。
30．权利要求27的方法，其中磷酸向脂膜的迁移是通过定量迁移到脂质产物的32P标记的磷酸来测定。
31．一种筛选治疗炎性应答紊乱的有效化合物的方法，包括用化合物接触表达p101基因的培养的宿主细胞，检测p101基因表达的变化，由所培养的细胞表达的p101基因产物活性的变化，第二信使PtdIns(3,4,5)P3产生的变化，细胞粘附性的变化，或O2产量的变化。
32．权利要求31的方法，其中通过测定p101基因的mRNA转录物检测p101基因的表达。
33．权利要求31的方法，其中通过测定p101调控亚基蛋白检测p101基因的表达。
34．权利要求31的方法，其中通过阴离子交换型HPLC检测宿主细胞中PtdIns(3,4,5)P3的水平。
35．一种治疗哺乳动物炎性应答紊乱的方法，包括向哺乳动物施用一定量的足以通过p101调控亚基抑制G蛋白激活的PI3K的活化的化合物。
36．权利要求35的方法，其中炎性应答紊乱选自关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘、过敏症、再灌注损伤、动脉粥状硬化、阿尔茨海默病和癌症。
37．权利要求35的方法，其中该化合物被输运至造血源细胞。
38．权利要求35的方法，其中该化合物是与p101调控亚基结合的拮抗剂并抑制G蛋白介导的PI3K的活化。
39．权利要求35所述方法，其中该化合物阻断了P13K的催化亚基与p101调控亚基的相互作用。
40．权利要求35的方法，其中该化合物是一种编码信号传递缺陷的p101调控亚基或其片段的寡核苷酸构建体，这种寡核苷酸构建体被一个在体内靶细胞中指导信号传递缺陷亚基或片段的表达的调控序列所控制。
41．权利要求35的方法，其中该寡核苷酸构建体编码信号传递缺陷的p101调控亚基缺失突变体，该突变体中Gβγ相互作用结构域被删除。
42．一种治疗哺乳动物炎性应答紊乱的方法，包括向哺乳动物施用一定量的足以在体内抑制p101调控亚基表达的化合物。
43．权利要求42的方法，其中炎性应答紊乱选自关节炎、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎、哮喘、过敏症、再灌注损伤、动脉粥状硬化、阿尔茨海默病和癌症。
44．权利要求42的方法，其中该化合物被输运至造血源细胞。
45．权利要求42的方法，其中该化合物为抑制编码p101调控亚基的mRNA转录物翻译的一种反义寡核苷酸。
46．权利要求42的方法，其中该化合物是一种抑制编码p101调控亚基的mRNA转录物翻译的核酶。
47．权利要求42的方法，其中该化合物是一种与p101调控亚基基因的调控区形成一种三螺旋并抑制转录的寡核苷酸。
48．权利要求42的方法，其中该化合物是一种通过靶向同源重组灭活p101调控亚基基因或其调控区的重组DNA构建体。
49．一种治疗哺乳动物炎性应答紊乱的方法，包括向哺乳动物施用一定量的足以上调哺乳动物中功能性p101调控亚基表达的化合物。
50．根据权利要求49的方法，其中该化合物被输运至造血细胞。
51．权利要求49的方法，其中该哺乳动物表达一种缺陷的p101调控亚基，且该化合物包含一种编码由一个调控区控制的功能性p101调控亚基的核苷酸构建体，该调控区在哺乳动物靶细胞中指导功能性受体的表达。
52．权利要求49的方法，其中哺乳动物表达一种突变的p101调控亚基，且该化合物包含一种编码野生型p101调控亚基的核苷酸构建体，该构建体通过靶向同源重组纠正内源性突变。
53．一种包括p120基因核苷酸序列的经分离的核酸分子。
54．一种编码p120催化亚基或其片段的经分离的核酸分子，具有如下核苷酸序列：
a)编码SEQ ID No:4或编码保藏号为97637的保藏于美国典型培养物保藏中心的pCMV3mycp120的cDNA克隆中所含的cDNA编码的氨基酸序列；或
b)在严格条件下至少可与编码p120蛋白最后28个氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互补物杂交的序列。
55．一种编码p120催化亚基或其片段的经分离的核酸分子，具有如下核苷酸序列：
a)编码SEQ ID No:14；或
b)在严格条件下至少可与编码p120蛋白最后28个氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互补物杂交的序列。
56．一种根据权利要求54或55的经分离的核酸分子，其中该核酸分子在高度严格条件下至少可与编码p120蛋白最后28个氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互补物杂交的序列。
57．一种根据权利要求54的经分离的核酸分子，其中该核酸分子编码SEQ ID No:4或编码保藏号为97637的保藏于美国典型培养物保藏中心的pCMV3mycp120的cDNA克隆中所含的cDNA编码的氨基酸序列。
58．一种根据权利要求55的经分离的核酸分子，其中该核酸分子编码SEQ ID No:14。
59．一种表达载体，其包含与在宿主细胞中控制该核苷酸序列表达的一种核苷酸调控序列有效地结合的权利要求53到58中的任一项中的核苷酸序列。
60．一种经基因工程改造以含有权利要求53到58中的任一项中的核苷酸序列的宿主细胞。
61．一种经基因工程改造以含有权利要求1到13以及权利要求53到58中的任一项中的核苷酸序列的宿主细胞。
62．权利要求14的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种动物的一部分。
63．权利要求60的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种动物的一部分。
64．权利要求61的宿主细胞，其中该宿主细胞是一种动物的一部分。
65．一种编码p101调控亚基或其片段的经分离的核酸分子，其含有选自编码下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括编码1-160位氨基酸残基的SEQ ID No:2，编码161-263位氨基酸残基的SEQ ID No:2，编码1-732位氨基酸残基的SEQ ID No:2，编码733-877位氨基酸残基的SEQ ID No:2；编码1-160位氨基酸残基的SEQ ID No:12，编码161-263位氨基酸残基的SEQ ID No:12，编码1-735位氨基酸残基的SEQ ID No:12和编码736-880位氨基酸残基的SEQ ID No:12。
66．一种编码p120亚基或其片段的经分离的核酸分子，其含有选自编码下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括编码从约41延伸至1102位氨基酸残基的SEQ ID No:4和编码从约41延伸至1102位氨基酸残基的SEQ ID No:14。
67．一种编码p120亚基或其片段的经分离的核酸分子，其含有选自编码下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括编码173-302位氨基酸残基的SEQ ID No:4，或编码173-302位氨基酸残基的SEQ ID No:14。
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