DE69736983T2

DE69736983T2 - G-beta-gamma regulierte phosphatidylinositil-3' kinase

Info

Publication number: DE69736983T2
Application number: DE69736983T
Authority: DE
Inventors: Len Stephens; T. Phillip HAWKINS; Sylvia San Francisco BRASELMANN
Original assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-26
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2017-06-27
Also published as: WO1997049818A2; EP1676918A3; JP2000511062A; EP1676918A2; US5869271A; DK0939821T3; US5856132A; US6017763A; PT939821E; AU722324B2; ATE346154T1; JP4240537B2; US5856133A; AU3508397A; EP0939821B1; DE69736983D1; US5859201A; WO1997049818A3; US5874273A; CA2259143C

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Untereinheit eines G-Protein-regulierten Phopshoinositid-3OH-Kinaseenzyms, isoliert aus Zellen einer hämatopoetischen Linie, die an zellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sind, sowie die Verwendung dieser neuen Untereinheit bei der Behandlung und Diagnose einer Krankheit.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Phosphoinositid-3OH-Kinasen (PI3Ks) sind eine große Familien von Enzymen, die zur 3-Phosphorylierung von zumindest einem der zellulären Phosphoinositide fähig sind (Whitman et al., Nature 332, 644–646 (1988); Auger et al., Cell 57, 167–175 (1989)). 3-Phosphorylierte Phosphoinositide finden sich in allen höheren eukaryotischen Zellen. Es häufen sich Hinweise, die PI3K und ein Lipidprodukt dieses Enzyms, Phosphatidylinositol-(3,4,5)-triphosphat (hiernach „PtdIns(3,4,5)P₃"), als Teil eines neuen und wichtigen zweiten Messengersystems bei der zellulären Signaltransduktion implizieren. Die Komponenten dieses neuen auf PtdIns(3,4,5)P₃ basierenden Signalsystems scheinen vom früher charakterisierten Signalweg auf Basis von Inositolphospholipiden unabhängig zu sein, bei dem eine Phosphoinositidase C (PIC) Ptdlns(4,5)P₂ hydrolysiert, um die strukturell verschiedenartigen zweiten Messenger Inositol-(1,4,5)-triphosphat (Ins(1,4,5)P₃) und Diacylglycerin freizusetzen.
Ausgewählte extrazelluläre Agonisten und Wachstumsfaktoren stimulieren die intrazelluläre PI3K-Aktivität und bewirken die rasche und vorübergehende intrazelluläre Akkumulierung von PtdIns(3,4,5)P₃. Überraschenderweise aktiviert die Stimulation einer Anzahl von verschiedenen Typen von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich Rezeptor-Tyrosinkinasen, mit Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen der src-Familie assoziierten Rezeptoren, Cytokin-Wachstumsfaktoren und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Elemente der PI3K-Familie. (Im Überblick behandelt in Stephens et al., Biochemica et Biophysica Acta 1179, 27–75 (1993).) Beispielsweise sind Tyrosinkinase-Rezeptoren, die bei Aktivierung in erhöhter Akkumulierung von PtdIns(3,4,5)P₃ resultieren, der PDGF-Rezeptor, der EGF-Rezeptor, Elemente der FGF-Rezeptorfamilie, der CSF-1-Rezeptor, der Insulinrezeptor, der IGF-1-Rezeptor und der NGF-Rezeptor. Mit den Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen der src-Familie assoziierte Rezeptoren, die die Akkumulation von PtdIns(3,4,5)P₃ stimulieren, sind der II-2-Rezeptor, II-3-Rezeptor, mlgM-Rezeptor, der CD4-Rezeptor, der CD2-Rezeptor und der CD3/T-Zellen-Rezeptor. Außerdem stimulieren der Cytokin-II-4-Rezeptor und der G-Protein-gebundene Thrombinrezeptor, ATP-Rezeptor und der fMLP-Rezeptor alle die Aktivität einer PI3K, was in der anschließenden Akkumulation von PtdIns(3,4,5)P₃ resultiert. Daher scheint PtdIns(3,4,5)P₃ ein zweiter Messenger in äußerst verschiedenartigen Signalwegen zu sein.
Einen Rückhalt für die Behauptung, dass PI3K-Aktivität und Produktion von PtdIns(3,4,5)P₃ ein physiologisch relevanter Weg der Signaltransduktion für diese verschiedenartigen Rezeptoren ist, liefern unter anderem zwei verschiedene experimentelle Beweisführungen: Hemmung von P13K-Aktivität durch pilzliche Metaboliten und Beobachtungen direkter Proteinassoziationen. Wortmannin, ein Pilzmetabolit, hemmt PI3K-Aktivität irreversibel durch kovalente Bindung an die katalytische Domäne dieses Enzyms. Die Hemmung der PI3K-Aktivität durch Wortmannin eliminiert die anschließende zelluläre Reaktion auf den extrazellulären Faktor. Beispielsweise reagieren Neutrophile auf das Chemokin fMet-Leu-Phe (fMLP) durch Stimulieren von PI3K und Synthetisieren von PtdIns(3,4,5)P₃. Die Synthese korreliert mit Aktivierung des plötzlichen starken O₂-Verbrauchs, der an der Zerstörung von eindringenden Mikroorganismen durch Neutrophile beteiligt ist. Die Behandlung von Neutrophilen mit Wortmannin verhindert den fMLP-induzierten plötzlichen starken O₂-Verbrauch. Thelen et al., PNAS USA 91, 4960–4964 (1994). In der Tat zeigen diese Experimente mit Wortmannin sowie andere experimentelle Hinweise, dass PI3K-Aktivität in Zellen hämatopoetischer Linen, insbesondere Neutrophilen, Monozyten und anderen Typen von Leukozyten, an vielen der „Nicht-Erinnerungs"- („non memory") Immunreaktionen beteiligt ist, die mit akuter und chronischer Entzündung in Verbindung stehen.
PI3K-Enzyme Wechselwirken direkt mit aktivierten Formen mehrerer Rezeptor-Tyrosinkinasen oder können mit ihnen zusammen gereinigt werden. Es ist gefunden worden, dass mit Rezeptor-Tyrosinkinase assoziierte PI3K in gereinigter Form aus Heterodimeren mit 170–200 kD besteht (Otsu et al., Cell 65, 91–104 (1991), Pons et al., Mol. Cell. Biol. 15, 4453–4465 (1995), Inukai et al., J. Biol. Chem. 271, 5317–5320 (1996)), die eine Katalyseuntereinheit und eine Adaptor- (oder Regulations-) Untereinheit umfassen.
Zwei verschiedene Homologe der Katalyseuntereinheit, p110α und p110β, sind beschrieben und kloniert worden. Die Katalyseuntereinheit, die irreversibel an Wortmannin bindet, geht eine enge Verbindung mit einem oder anderen Elementen einer kleine Familie von nahe verwandten Regulationsuntereinheiten ein (p55α, p55P1K, p85α und p85β), um die Heterodimere von 170–200 kD auszubilden. Die bekannten Regulationsuntereinheiten enthalten ein große Ansammlung von Protein:Protein-Wechselwirkungsdomänen, einschließlich zwei SH2-Domänen (Cantley et al., Cell 64, 281–302 (1991)).
Es wird angenommen, dass die Gegenwart der SH2-Domänen für die Bindung und Stimulation von PI3K-Heterodimeren an aktivierte Rezeptor-Tyrosinkinasen verantwortlich sind. Aktivierte Rezeptoren werden an Tyrosin-Schlüsselresten phosphoryliert, die sich innerhalb der lokalen Consensussequenzen befinden, die von den SH2-Domänen bevorzugt werden, die sich in den PI3K-Adaptoren von 55–87 kD finden (Songyang et al., Cell 72, 767–778 (1993)). Sobald das PI3K-Hetrodimer bindet, aktiviert es direkt die PI3K-Katalyseuntereinheit (obgleich diese Wirkung in vitro relativ klein ist, Carpenter et al., J. Biol. Chem. 268, 9478–9483 (1993), Backer et al., EMBO J. 11, 3469–3479 (1992)) und transloziert das zytosolische PI3K zu einer Quelle ihres Phospholipidsubstrats. Die Kombination dieser Faktoren führt zu einem Schub an PtdIns(3,4,5)P₃-Produktion. Klarerweise scheinen diese Isoformen von PI3Ks (p100α/p110β/p55α, p55PIK) strukturell so angepasst zu sein, dass sie als zweckbestimmte Signaltransduktoren stromab der rezeptorregulierten Tyrosinkinasen fungieren, höchstwahrscheinlich in der Weise, wie die τ-Familie von PI-PLCs durch Rezeptor-sensitive Tyrosinkinasen reguliert wird (Lee und Rhee, Current Biol. 7, 193–189 (1995)).
Jedoch scheint die p110/p85-Unterfamilie von PI3Ks nicht an der Produktion von PtdIns(3,4,5)P₃ beteiligt zu sein, die als Resultat der Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren auftreten kann, die heterodimere GTPasen einsetzen, um ihre Signale zu übertragen (z.B. fMLP, PAF, ATP und Thrombin). Diese Typen von Zelloberflächenrezeptoren sind in erster Linie in Zellen hämatopoetischen Ursprungs beschrieben worden, deren Aktivierung an entzündlichen Reaktionen des Immunsystems beteiligt ist. Neuere Belege legen nahe, dass eine chromatographisch unterschiedliche Form von Wortmannin-sensitiver PI3K in U937-Zellen und Neutrophilen vorhanden ist, die eine native, relativ kleine Molmasse von etwa 220 kD besitzt (Stephens et al., Cell 77, 83–93 (1994)). Diese PI3K-Aktivität kann spezifisch durch Gβγ-Untereinheiten, nicht jedoch Gα-GTP-Untereinheiten stimuliert werden. Eine ähnliche PI3K-Aktivität ist außerdem in einer Osteosarkom-Zelllinie beschrieben worden (Morris et al., Mol. Pharm. 48, 532–539 (1995)). Blutplättchen enthalten ebenfalls eine Gβγ-sensitive PI3K, obgleich es unklar ist, ob diese ein Element der p85/p110-PI3K-Familie ist (Thomason et al., J. Biol. Chem. 269, 16525–16528 (1994)). Es schien wahrscheinlich zu sein, dass diese schlecht charakterisierte, Gβγ-sensitive PI3K möglicherweise für die Produktion von PtdIns(3,4,5)P₃ in Reaktion auf Agonisten wie ATP, fMLP usw. verantwortlich ist.
Stoyanov et al. (1995) haben neulich die Klonierung und Expression einer Wortmannin-sensitiven PtdIns(4,5)P₂-selektiven, p110γ genannten PI13K aus einer menschlichen Knochenmark-cDNA-Bibliothek veröffentlicht. p110γ wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die konstruiert waren, um auf potenzielle katalytische Zentren von PI3K sowie PtdIns(3,4,5)P₃ abzuzielen. Sie unterscheidet sich eindeutig von p110α und p110β, und es fehlt ihr beispielsweise eine Aminoterminus-Bindungsdomäne für ein Element der p85-Adaptorfamilie. Es wurde gemutmaßt, dass p110γ die PI13K-Aktivität stromab der heterotrimeren GTPase-gebundenen Rezeptoren ist, und zwar auf Basis ihrer Empfindlichkeit auf Gα-GTP- sowie Gβγ-Untereinheiten in vitro und ihre Expression in vom Knochenmark stammenden Zellen. Trotzdem hinterließ diese Hypothese mehrere ungelöste Fragen bezüglich der früheren biochemischen Belege, die darauf hinwiesen, dass die Gβγ-reaktive PI3K durch Gα-GTP-Untereinheiten nicht stimuliert wurde und dass sie eine sehr viel größere Molmasse von etwa 220 kD aufwies.
Es wurde vorgeschlagen, dass die Wirkungen der Gβγ-Untereinheiten auf p110γ über eine mutmaßliche NH₂-Terminus-Pleckstrin-Homologie-(PH-) Domäne vermittelt werden. Jedoch häufen sich mit der Beschreibung einer ansteigenden Zahl von Gβγ-regulierten Effektoren die Hinweise, dass PH-Domänen keine umfassend verwendete Gβγ-Bindungsdomäne darstellen. Neuere Arbeiten unter Verwendung einer Palette von relativ kleinen Peptiden auf Basis der Sequenz von Domänen, die sich nur in den Gβγ-aktivierten Adenylatcyclasen (ACs 2 und 4) finden, die spezifisch die Gβγ-Aktivierung oder Hemmung mehrerer Effektoren blockieren, haben nahe gelegt, dass es Grund zur Annahme gibt, dass Gβγ-Untereinheiten eine umfassend verwendete effektoraktivierende Domäne enthalten. Außerdem zeigen Regionen in verschiedenen Effektoren, die mit dieser Effektoraktivierungsdomäne wechselwirken, signifikante Sequenzähnlichkeiten. Daher tritt ein Motiv (Gln-X-X-Glu-Arg) innerhalb der Domäne in AC2, das von diesen Peptiduntersuchungen hervorgehoben wurde, auch in Regionen von Kaliumkanälen und β-ARKs auf, die bereits mit der Regulation durch Gβγ-Untereinheiten in Verbindung gebracht worden sind (Chen et al. Science 268, 1166–1169 (1995)). Jedoch wird dieses Motiv nicht in allen Proteinen repliziert, die bekanntermaßen durch Gβγ-Untereinheiten reguliert werden, und folglich kann die Sequenzanalyse gegenwärtig nicht vorhersagen, ob ein Protein durch Gβγ-Untereinheiten reguliert wird.
Es fehlt die Identifizierung von Mechanismen, durch die PI3K-Aktivität von zellulären Agonisten aktiviert wird, die ihre Signale über G-Protein-gebundene Rezeptoren signalisieren. Es ist wichtig anzumerken, dass die überwiegende Mehrheit von Agonisten, die den an der Entzündungsreaktion beteiligten plötzlichen starken O₂-Verbrauch von Neutrophilen aktivieren, an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und nicht an Rezeptor-Tyrosinkinasen binden. Daher ist der Mechanismus, durch den PI3K in Reaktion auf diese Typen von Chemokinen reguliert wird, wahrscheinlich sehr verschieden von der Regulation durch Wachstumsfaktoren, die über Tyrosinkinasen signalisieren. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Klärung dieser Frage durch die Identifizierung, Reinigung und Klonierung einer neuen spezifischen Form von PI3K, die durch βγ-Untereinheiten trimerer G-Proteine aktiviert wird.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung, Reinigung und Klonierung von Nucleotiden, die für die p101-Untereinheit der trimeren G-Protein-regulierten PI13K kodieren, einem neuen Protein, das die Akkumulation des zweiten Messengers PtdIns(3,4,5)P₃ in Reaktion auf die Aktivierung von G-Protein-gebundenen Rezeptoren hervorruft. Diese neue G-Protein-regulierte PI3K umfasst eine Katalyseuntereinheit, p120, und eine Regulationsuntereinheit, p101. Die p120-Katalyseuntereinheit weist eine partielle Aminosäuresequenzhomologie mit den P13K-Katalyseuntereinheiten p110α, p110β und p110γ auf. p101 ist andererseits ein völlig neues Protein mit keiner feststellbaren Homologie zu irgendeiner vorher verfügbaren Sequenz. In Abwesenheit der p101-Regulationsuntereinheit induzieren aktivierte G-Protein-Untereinheiten eine leichte Stimulation von katalytischer Aktivität durch die p120-Katalyseuntereinheit. Jedoch wird in Anwesenheit der p101-Untereinheit die PI3K-Aktivität der Katalyseuntereinheit durch aktivierte G-Proteine um mehr als das 100fache stimuliert.
Für Schweine-p101- und -p120 sowie menschliches p101 und p120 kodierende cDNAs sind kloniert und sequenziert worden und werden hierin beschrieben. Die Schweine-p101- und -p120-cDNAs kodieren für Proteine von etwa 877 Aminosäuren bzw. etwa 1.102 Aminosäuren (2 und 4), während menschliche p101- und p120-cDNAs für Proteine von etwa 880 Aminosäuren bzw. 1102 Aminosäuren kodieren (11 und 13). Obgleich die Aminosäuresequenzen der p120-Proteine zu jenen anderer bekannter PI3K-Katalyseuntereinheiten homolog sind, unterscheiden sich die hierin beschriebenen p120-cDNAs von jenen cDNAs, die für die bekannten PI3K-Katalyseuntereinheiten kodieren, insbesondere beispielsweise am Carboxylterminus (Aminosäurereste 1075–1102).
Das p101-Transkript findet sich in erster Linie in Zellen der hämatopoetischen Linie. p120 und andere PI3K-Katalyseuntereinheitenproteine scheinen eine weitaus breitere Gewebe- und Zelltypverteilung aufzuweisen. In besonderem Maße ist die Anwesenheit einer trimeren G-Protein-sensitiven PI3K-Aktivität nur in einer beschränkten Anzahl von Zellen der hämatopoetischen Linie (z.B. Neutrophile, Blutplättchen usw.) nachgewiesen worden. Daher scheint die Fähigkeit zur Aktivierung von PI3K-Enzymen in Reaktion auf die Stimulation von trimeren G-Protein-gebundenen Rezeptoren hauptsächlich von der Gegenwart der p101-Untereinheit abhängig zu sein.
Die Erfindung sieht die folgenden Nucleotide, derartige Nucleotide exprimierende Wirtszellen und Expressionsprodukte derartiger Nucleotide vor: (a) Nucleotide, die für Säugetier-p101-Proteine kodieren, einschließlich Schweine-p101 und menschliches p101, und die p101-Genprodukte, einschließlich die Schweine- und menschlichen Genprodukte; (b) Nucleotide, die für Abschnitte von p101 kodieren, die dessen funktionellen Domänen entsprechen, sowie die von derartigen Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, die p101-Nucleotide, die beispielsweise für die p101-Gβγ-Wechelwirkungsdomäne oder die Katalyseuntereinheiten-Assoziationsdomäne oder Aminosäurereste aus Schweine-p101 kodieren, die sich von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 414, 415 bis 565, 566-706, 707-832 und/oder 833 bis 877 erstrecken, oder für Aminosäurereste aus menschlichem p101, die sich von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 416, 417 bis 567, 568 bis 709, 710-835 und/oder 836 bis 880 erstrecken; (c) Nucleotide, die für Mutanten von p101 kodieren, in denen alle oder ein Teil von einer der Domänen deletiert oder verändert sind, und die durch derartige Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Mutanten von p101, worin die für die G-Protein-Wechselwirkungsdomäne oder die Katalyseuntereinheiten-Assoziationsdomäne oder Aminosäurereste von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 414, 415 bis 565, 566 bis 706, 707-832 und/oder 833 bis 877 kodierenden Nucleotide deletiert sind; (d) Nucleotide, die für Fusionsproteine kodieren, die das p101-Protein oder eine seiner Domänen (z.B. die Gβγ-Wechselwirkungsdomäne oder die Katalyseuntereinheiten-Assoziationsdo mäne oder die durch die Aminosäurereste von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 414, 415 bis 565, 566 bis 706, 707-832 und/oder 833 bis 877 beschriebenen Domänen) enthalten, die an ein anderes Polypeptid fusioniert ist.
Außerdem beschrieben werden hierin Agonisten und Antagonisten von G-Protein-regulierter PI3K, einschließlich kleine Moleküle, große Moleküle, mutierte p101-Proteine, die mit nativem p101 konkurrieren, und Antikörper sowie Nucleotidsequenzen, die verwendet werden können, um die p101-Genexpression zu hemmen (z.B. Antisense- und Ribozym-Moleküle und Gen- oder Regulationssequenzersatzkonstrukte) oder um die p101-Genexpression zu verstärken (z.B. Expressionskonstrukte, die das p101-Gen unter die Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen), und transgene Zellen und Tiere, die ein p101-Transgen exprimieren, oder „Knockout"-Tiere, die kein p101 exprimieren.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen für die diagnostische Beurteilung, Typisierung und Prognose von Immunsystemstörungen, einschließlich Entzündung, sowie für die Identifizierung von Patienten, die eine Prädisposition für derartige Leiden haben. Beispielsweise können p101-Nucleinsäuremoleküle der Erfindung als diagnostische Hybridisierungssonden oder als Primer für diagnostische PCR-Analyse zur Identifizierung von p101-Genmutationen, allelischen Variationen und Regulationsdefekten im p101-Gen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Diagnosesets für die praktische Durchführung derartiger Verfahren bereit.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der p101-Genprodukte zur Identifizierung von Verbindungen, die die G-Protein-regulierte PI3K-Genexpression und/oder p101-Genproduktaktivität modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten davon agieren. Derartige Verbindungen können als Mittel verwendet werden, um Immunsystemstörungen zu kontrollieren, und insbesondere als therapeutische Mittel für die Behandlung von Entzündungsstörungen, wie z.B. Arthritis, septischem Schock, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS), Pneumonie, Asthma, Allergien, Reperfusionsverletzung, Atherosklerose, Alzheimer-Krankheit und Krebs.
Außerdem beschrieben werden hierin Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Entzündungsstörungen, wie z.B. Arthritis, septischem Schock, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS), Pneumonie, Asthma, Allergien, Reperfusionsverletzung, Atherosklerose, Alzheimer-Krankheit und Krebs. Derartige Verfahren und Zusammensetzungen sind in der Lage, das Ausmaß an p101-Genexpression und/oder das Ausmaß an p101-Genproduktaktivität zu modulieren.
Diese Erfindung basiert teilweise auf der überraschenden Entdeckung einer G-Protein-stimulierten PI3K-Aktivität in isolierten Neutrophilen; der Reinigung und Charakterisierung dieser Aktivität als ein heterodimeres PI3K-Protein, das aus einer p101-Untereinheit und einer p120-Untereinheit besteht; der Identifizierung und Klonierung von p101-cDNA aus Bibliotheken, die aus Schweine-Neutrophil-mRNA, menschlicher Monozyten-mRNA und menschlicher Leukozyten-mRNA hergestellt wurde; der Identifizierung und Klonierung von p120-cDNA aus Bibliotheken, die aus Schweine-Neutrophil-mRNA und menschlicher Leukozyten-mRNA hergestellt wurde; Charakterisierung der neuen Sequenzen; und Untersuchungen von isoliertem rekombinant exprimiertem p101- und p120-Protein in Insektenzellen, U937-Zellen und Cos-7-Zellen.
3.1 DEFINITIONEN
Bei Verwendung hierin weisen die folgenden Ausdrücke im Singular sowie Plural die angegebenen Bedeutungen auf:
G-Protein-regulierte PI3K: bezieht sich auf ein PI3K-Enzym, dessen Aktivität durch aktivierte trimere G-Proteine, wie z.B. Gβγ-Untereinheiten und/oder Gα-GTP-Untereinheiten, stimuliert wird.
p101: ist die Regulationsuntereinheit der G-Protein-regulierten PI3K, die auch als Adaptoruntereinheit bekannt ist. p101 umfasst Moleküle, die zu p101 homolog sind oder die an p120 binden und die katalytische Aktivität von PI3K in Reaktion auf Aktivierung trimerer G-Proteine stimulieren. p101-Fusionsproteine, die eine N-terminale Glu-Markierung (im Speziellen MEEEEFMPMPMEF) aufweisen, werden hierin als (EE)101-Fusionsproteine bezeichnet, während p101-Fusionsproteine, die eine N-terminale myc-Epitpopmarkierung aufweisen, hierin als myc101-Fusionsproteine bezeichnet werden.
p101-Nucleotide oder für p101 kodierende Sequenzen: sind Nucleotidsequenzen, die für das p101-Regulationsunterinheitenprotein, -Polypeptid oder Peptidfragmente von p101-Protein oder p101-Fusionsproteine kodieren. p101-Nucleotidsequenzen umfassen DNA, einschließlich genomische DNA (z.B. das p101-Gen) oder cDNA oder RNA.
p120: ist die katalytische Untereinheit der G-Protein-regulierten PI3K. Polypeptide oder Peptidfragmente von p120-Potein werden als p120-Polypeptide oder p120-Peptide bezeichnet. Fusionen von p120 oder p120-Polypeptiden oder -Peptidfragmenten an ein nicht verwandtes Protein werden hierin als p120-Fusionsproteine bezeichnet. (EE)120-Fusionsproteine weisen die N-terminale Glu-Markierung MEEEEFMPMEFSS auf. Funktionelle Entsprechungen von p120 beziehen sich auf ein PI3K-Katalyseuntereinheitenprotein, das an die p101-Regulationsuntereinheit mit hoher Affinität in vivo oder in vitro bindet. Andere funktionelle Entsprechungen von p120 sind homologe Katalyseuntereinheiten einer G-Protein-regulierten PI3K, wie z.B. p117.
p120-Nucleotide oder für p120 kodierende Sequenzen: sind Nucleotidsequenzen, die für das p120-Katalyseuntereinheitenprotein, -Polypeptid oder Peptidfragmente von p120-Protein oder p120-Fusionproteine kodieren. p120-Nucleotidsequenzen umfassen DNA, einschließlich genomische DNA (z.B. das p120-Gen) oder cDNA oder RNA.
4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A, 1B, 1C und 1D. Nucleotidsequenz der Schweine-p101-Adaptoruntereinheit (Seq.-ID Nr. 1).
2. Abgeleitete Schweine-p101-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2). Mittels Proteinsequenzierung identifizierte tryptische Peptide sind mit einer durchgezogenen Linie unterstrichen.
3A, 3B und 3C. Nucleotidsequenz der Schweine-p120-Katalyseuntereinheit (Seq.-ID Nr. 3).
4. Abgeleitete katalytische Schweine-p120-Untereinheitsequenz (Seq.-ID Nr. 4). Mittels Proteinsequenzierung identifizierte tryptische Peptide sind mit einer durchgezogenen Linie unterstrichen. Die Region der Abweichung von der veröffentlichten Aminosäuresequenz von p110γ ist mit einer strichlierten Linie unterstrichen.
5. Gβγ-sensitive PI3K in Neutrophil-Cytosol unterscheidet sich von p85/p110-PI3Ks. Aliquoten von jeder der Fraktionen aus einem Q-Sepharose-Chromatographieprofil wurden entweder dem Western-Blotting unterzogen und mit den monoklonalen Antikörpern αp85α oder αp85β sondiert und mit einem HRP-gebundenen Sekundärantikörper sichtbar gemacht (obere Tafel in 5) oder mit 100 nM [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin inkubiert, mittels SDS-PAGE (6 % Acrylamid) aufgetrennt und der Fluorographie unterzogen (untere Tafel in 5). Die Gβγ-sensitive PI3K-Aktivität eluierte in den Fraktionen 20–24.
6. Peak B nach abschließender Mini-Q-Säulenreinigung enthält eine Gβγ-sensitive PI3K-Aktivität. Das Endprodukt der Reinigung der Peak-B-Aktivität wurde nach Isolierung aus einer Mini-Q-Säule in Gegenwart oder Abwesenheit von aktivierten Gβγ-Untereinheiten (βγ), einem Tyrosin-phosphorylierten Peptid (YP-Peptid), Wortmannin und/oder Gα_i-GDP-Untereinheiten (α_i-GDP) analysiert.
7. Pharmakologische und regulatorische Eigenschaften von freiem p120- und p101/p120-PI3K, rekombinant exprimiert in Sf9-Zellen. Tests enthielten entweder 7 nM p101/p120 oder 36 nM p120 alleine (Endkonzentrationen), die mit verschiedenen Reagenzien; 10 mM NaF und 30 μM AlCl₃ (A/F); 1 μM Gβγ-Untereinheiten (βγ); 2 μM Gα-GDP; 100 nM Wortmannin (W) oder 50 μM Tyrosin-phosphoryliertem Peptid (PY) für insgesamt 15 Minuten (bei 0°C) vor dem Start der Tests durch Zugabe von [γ³²P]ATP inkubiert wurden; in [³²P]PtdIns(3,4,5)P₃ inkorporiertes [³²P] wurde quantifiziert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte (n=2).
8. p101 kann mit einer Gβγ-stimulierten PI3K-Aktivität in U937-Zellen assoziieren. U937-Zellen wurden vorübergehend mit entweder für (EE)120 oder (EE)101 kodierenden Säugetierexpressionsvektoren transfiziert, in Kombination mit für myc101, myc120 oder ein irrelevantes Kontroll-myc-Fusionsprotein kodierenden Säugetier-Expressionsvektoren wie angegeben cotransfiziert. Insgesamt 40 μg Vektor-DNA wurden verwendet. Nach Cotransfektion wurden die Zellen lysiert, vorgereinigt und mit Protein-G-Sepharose immunpräzipitiert, die kovalent an monoklonalen α-(EE)-Antikörper vernetzt war, wie in den Beispielen hierin ausführlicher beschrieben wird. Die resultierenden Immunpräzipitate wurden gewaschen, und die Gβγ-aktivierte (1 μM, Endkonzentration) PI3K-Aktivität wurde getestet. Die PI3K-Aktivität, die in Immunpräzipitaten aus Zellen detektiert wurde, die mit irrelevantem (EE)-markiertem Protein entweder mit oder ohne Gβγs transfiziert worden sind, wurde von den gezeigten Daten subtrahiert (diese waren Mittelwerte von 1.896 dpm und 2.862 dpm in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Gβγs). Mit [³⁵S]-Methionin markierte Paralleltransfektionen zeigten, dass die Menge an [³⁵S]-101 und [³⁵S]-p120 in den Immunpräzipitaten um 40 % fiel, wenn sie cotransfiziert wurden (Daten nicht gezeigt).
9. Regulation von p101/p120 durch Gβγs in vivo. Cos-7-Zellen wurden mit Säugetier-Expressionsvektoren transfiziert, die für die Gβγ-Untereinheit („β₁γ₂"), p101 („101") und/oder p120 („120") wie angegeben kodierten. Nach 48 Stunden vorübergehender Expression wurden Zellen aus jeder Transfektion entweder dem Western-Blotting unterzogen, um „relative Expression" zu ermitteln, oder auf die Akkumulation von PtdIns(3,4,5)P₃ getestet (schraffierte Balken). Für das Western-Blotting wurden die Proben mit einem monoklonalen α-(myc)-Antikörper sondiert, um die Expression der verschiedenen (myc)-markierten Proteine zu quantifizieren. Die Ergebnisse sind relativ zur Expression angegeben, die in Gegenwart aller 4 Schlüsselvektoren erlangt wurde; die absoluten Werte von (myc)-p120 und (myc)-p101 waren sehr ähnlich und etwa 10 × höher als jene von (myc)-γ₂. Parallelansätze von Zellen wurden mit [³²P]Pi markiert; nach 90 Minuten wurden Lipide extrahiert, deacyliert und wasserlösliche Kopfgruppen mittels Anionenaustauscher-HPLC getrennt und mittels Flüssigszintillationszählung quantifiziert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte (n=2) +/– Bereiche. Die Daten für [³²P]PtdIns(3,4,5)P₃ liegen über der irrelevanten DNA-Kontrolle (972 +/– 41 dpm).
10A und 10B. Nucleotidsequenz der menschlichen p101-Adaptoruntereinheit (Seq.-ID Nr. 11).
11. Abgeleitete menschliche p101-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 12).
12A und 12B. Nucleotidsequenz der menschlichen p120-Katalyseuntereinheit (Seq.-ID Nr. 13).
13. Abgeleitete menschliche p120-Katalyseuntereinheitensequenz (Seq.-ID Nr. 14).
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung, Reinigung und Klonierung einer p101-Untereinheit einer speziellen Form von PI3K, die durch βγ-Untereinheiten trimerer G-Proteine aktiviert wird. p101, die hierin erstmals beschrieben wird, ist eine neue Untereinheit der G-Protein-regulierten PI3K. Ebenfalls beschrieben hierin ist die Identifizierung, Klonierung und korrekte Sequenz von p120, der Katalyseuntereinheit der trimeren G-Protein-regulierten PI3K.
PI3K sind Enzyme, die Phosphatidylinositole an der 3d-Position phosphorylieren, um das intrazelluläre Signalmolekül PtdIns(3,4,5)P₃ zu erzeugen. Obgleich gezeigt worden ist, dass PI3Ks in einer Vielzahl von Zelltypen nach Stimulation des Tyrosinkinase-Rezeptors induziert werden, sind PI3Ks, die durch trimere G-Protein-gebundene Rezeptoren aktiviert werden, nur in einer beschränkten Anzahl von Zeilen detektiert worden, die von der hämatopoetischen Linie stammen, wie z.B. Blutplättchen, Monozyten und Leukozyten. Interessanterweise ist die Akkumulation von PtdIns(3,4,5)P₃ in diesen Zellen mit zahlreichen der Immunreaktionen assoziiert, die an akuter und chronischer Entzündung beteiligt sind. Beispielsweise werden Neutrophile unter anderem durch das Chemokin fMLP aktiviert, das in Reaktion auf Infektion durch Mikroorganismen freigesetzt wird. Dieser Agonist bindet an einen Pertussis-Toxin-sensitiven, G-Protein-gekoppelten Rezeptor und aktiviert den plötzlichen starken O₂-Verbrauch von Neutrophilen, was in Superoxidproduktion und Zytotoxizität resultiert. Der plötzliche starke O₂-Verbrauch korreliert mit einer raschen und vorübergehenden intrazellulären Erhöhung der PI3K-Aktivität.
Untersuchungen in Neutrophilen belegen, dass Wortmannin, das die katalytische Komponente von PI3Ks selektiv hemmt, die Abschaltung der Superoxidproduktion bewirkt. Da die überwiegende Mehrheit von Agonisten, die diesen plötzlichen starken O₂-Verbrauch aktivieren, an G-Protein-gebundene Rezeptoren binden, stellt die G-Protein-regulierte PI3K-Aktivität einen Kandidaten für einen dominanten Effektor-Stoffwechselweg dar, dessen Hemmung die zerstörenden zellulären Wirkungen der Entzündung vermindern wird. Jedoch ist Wortmannin kein klinisch geeigneter Inhibitor dieses Stoffwechselwegs, da Wortmannin alle PI3K-Katalyseaktivitäten einschließlich jener hemmt, die an anderen zellulären Stoffwechselwegen beteiligt sind, wie z.B. Wachstumsfaktoren.
Hierin wird die Entdeckung berichtet, dass die G-Protein-regulierte PI3K aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist: der katalytischen Untereinheit (p110γ, p117 oder p120); und der p101-Regulationsuntereinheit. Die Fähigkeit von PI3K, auf Zelloberflächenrezeptoren zu reagieren, die die Freisetzung von Gβγ-Untereinheiten aus aktivierten trimeren G-Proteinen stimulieren, hängt hauptsächlich von der Gegenwart der p101-Regulationsuntereinheit ab. Obgleich katalytische Untereinheiten eine geringfügige Stimulation (ungefähr 1,7fach) der PI3K-Aktivität in vitro in Gegenwart von Gγβ-Untereinheiten zeigen, wird die Zugabe von p101-Proteinen die Gβγ-Stimulation der PI3K-Aktivität um das 100fache erhöhen. Die Neutralisation von p101, Entfernung von p101 oder Störung der p101-Bindung an seine Bindungspartner wird die Zellen unfähig machen, stark erhöhte Mengen des intrazellulären Signals PtdIns(3,4,5)P₃ in Reaktion auf aktivierte Gβγ-Untereinheiten zu erzeugen. Folglich scheint die eingeschränkte Verteilung der p101-Untereinheit in Zellen, die vom Knochenmark stammen, der entscheidende Faktor bei der Zelltyp-Spezifität dieser Reaktion zu sein. Darüber hinaus enthält p101 keine signifikanten Homologien mit jeglicher anderen identifizierten Sequenz. Diese Entdeckung macht p101 und den p101/p120-Komplex zu einem Ziel der Wahl zur Hemmung, Aktivierung oder Modulation von G-Protein-aktivierter PI3K mit minimalen unspezifischen Wirkungen.
Die Anmeldung beschreibt außerdem die Verwendung von p101- und p120-Nucleotiden, p101- und p120-Proteinen und -Peptiden sowie Antikörpern gegen p101 und p120 (die beispielsweise als Agonisten oder Antagonisten von p101 oder p120 agieren können), Antagonisten, die G-Protein-aktivierte PI3K-Aktivität oder -Expression hemmen, oder Agonisten, die G-Protein-aktivierte PI3K-Aktivität aktivieren und ihre Expression erhöhen, und zwar bei der Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, mit akuter und chronischer Entzündung in Verbindung stehenden Immunreaktionen in Tieren, wie z.B. Menschen. Beispielsweise werden Antagonisten von Gβγ-aktivierter PI3K bei der Behandlung von Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis, septischem Schock, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS), Pneumonie, Asthma und anderen Lungenleiden, Allergien, Reperfusionsverletzung, Atherosklerose und anderen Herz-Kreislauf-Krankheiten, Alzheimer-Krankheit und Krebs zweckdienlich sein, um nur einige wenige entzündliche Störungen zu nennen. Außerdem sind p101-Nucleotide und p101-Regulationsuntereinheiten sowie p120-Nucleotide und p120-Katalyseuntereinheiten zur Identifizierung von Verbindungen zweckdienlich, die bei der Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie wirksam sind, die G-Protein-aktivierte PI3Ks umfassen.
Außerdem umfasst die Erfindung die Verwendung von p101-Nucleotiden, p101-Proteinen und -Peptiden sowie Antikörpern gegen p101 bei der Diagnose von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie. Die Diagnose einer Abnormalität der p101-Regulationsuntereinheit in einem Patienten oder einer Abnormalität im G-Protein-aktivierten PI3K-Signaltransduktionsweg wird die Ausarbeitung einer geeigneten Behandlung oder eines therapeutischen Regimes unterstützen.
Im Speziellen umfasst die in den unten stehenden Unterabschnitten beschriebene Erfindung die p101-Regulationsuntereinheit, Polypeptide oder Peptide, die funktionellen Domänen der p101-Regulationsuntereinheit entsprechen (z.B. der Katalyseuntereinheiten-Assoziationsdomäne oder der Domäne entsprechen, die mit aktivierten G-Proteinen wechselwirkt), mutierte, trunkierte oder deletierte p101-Regulationsuntereinheiten (z.B. eine p101-Regulationsuntereinheit, bei denen eine oder mehrere funktionelle Domänen oder Abschnitte deletiert sind), p101-Regulationsuntereinheitenfusionsproteine (z.B. eine p101-Regulationsuntereinheit oder eine funktionelle Domäne der p101-Regulationsuntereinheit, die an ein nicht verwandtes Protein oder Peptid, wie z.B. eine Epitopmarkierung, d.h. ein myc-Epitop, fusioniert ist), Nucleotidsequenzen, die für derartige Produkte kodieren, und Wirtszellexpressionssysteme, die derartige p101-Regulationsuntereinheitenprodukte produzieren können.
Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung p120-Katalyseuntereinheitenproteine, Polypeptide, funktionelle Domänen der p120-Untereinheit (z.B. die Katalysedomäne), mutierte, trunkierte oder deletierte p120-Untereinheitenproteine, p120-Fusionsproteine, Nucleotidsequenzen, die für derartige Produkte kodieren, und Wirtszellexpressionssysteme, die derartige p120-Katalyseuntereinheitenprodukte produzieren.
Die Erfindung umfasst außerdem Antikörper und Anti-Idiotyp-Antikörper (einschließlich Fab-Fragmente), Antagonisten und Agonisten der G-Protein-aktivierten PI3K sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte, die die Expression des p101-Gens hemmen (Transkriptionsfaktorinhibitoren, Antisense- und Ribozym-Moleküle oder Gen- oder Regulationssequenzersatzkonstrukte) oder die Expression der p101-Regulationsuntereinheit fördern (z.B. Expressionskonstrukte, bei denen für p101 kodierende Sequenzen operativ mit Expressionskontrollelementen, wie z.B. Promotoren, Promotor/Enhancer usw., assoziiert sind). Die Erfindung betrifft außerdem Wirtszellen und Tiere, die genetisch verändert sind, so dass sie die menschliche p101-Regulationsuntereinheit (oder Mutanten davon) exprimieren oder die „Knockout"-Expression der endogenen p101-Regulationsuntereinheit des Tiers hemmen.
Außerdem umfasst die Erfindung insbesondere Antagonisten, die die Assoziation von p101-Regulationsuntereinheiten mit ihren Bindungspartnern, einschließlich p120- und anderen PI3K-Regulationsuntereinheitenproteinen, wie z.B. p117 und p110γ, sowie aktivierten trimeren G-Protein-Proteinen, einschließlich Gβγ-Untereinheiten, verhindern.
Die p101-Regulationsuntereinheitenproteine oder -peptide, p101-Regulationsuntereinheitenfusionsproteine, p101-Nucleotidsequenzen, Antikörper, Antagonisten und Agonisten können für die Detektion von mutierten p101-Regulationsuntereinheiten oder ungeeignet exprimierten p101-Regulationsuntereinheiten für die Diagnose von Immunstörungen zweckdienlich sein. Die p101- und p120-Untereinheitenproteine oder -peptide, p101- und p120-Untereinheiten-Fusionsproteine, p101- und p120-Nucleotidsequenzen, -Wirtszellexpressionssysteme, -Antikörper, -Antagonisten und -Agonisten und genetisch veränderte Zellen und Tiere können zum Screening von Wirkstoffen verwendet werden, die zur Behandlung derartiger Immunstörungen wirksam sind. Die Verwendung von genetisch veränderten Wirtszellen und/oder Tieren kann insofern einen Vorteil bieten, als dass derartige Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen ermöglichen, die an die p101-Regulationsuntereinheit binden, sondern auch Verbindungen identifizieren können, die das von der aktivier ten p101-Regulationsuntereinheit transduzierte Signal, im Speziellen die Produktion des intrazellulären Signalmoleküls PtdIns(3,4,5)P₃, beeinflussen.
Schließlich können die p101-Regulationsuntereinheitenproteinprodukte und -fusionsproteinprodukte, -Antikörper und -Anti-Idiotyp-Antikörper (einschließlich Fc-Fragmente), -Antagonisten oder -Agonisten (einschließlich Verbindungen, die die Signaltransduktion modulieren, die an Stromab-Targets im Signaltransduktionsweg der p101-Regulationsuntereinheit agieren könnten) zur Therapie derartiger Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise können Nucleotidkonstrukte, die für funktionelle p101-Regulationsuntereinheiten, mutierte p101-Regulationsuntereinheiten sowie Antisense- und Ribozym-Moleküle kodieren, bei „Gentherapie"-Ansätzen für die Modulation der Expression und/oder Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit bei der Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie verwendet werden. Daher umfasst die Erfindung auch pharmazeutische Formulierungen und Verfahren zur Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie.
Die Erfindung basiert teilweise auf der überraschenden Entdeckung neuer PI3K-Enzyme in Schweine-Neutrophilen. Wie andere PI3K-Proteine 3-phosphorylieren diese Enzyme PtdIns-, PtdIns4P- und PtdIns(4,5)P₂-Substrate und wurden durch 100 nM Wortmannin vollständig gehemmt. Jedoch wurde die PI3K-Aktivität im Gegensatz zu den früher beschriebenen PI3K-p85/p101-Proteinkomplexen durch Inkubation mit Gβγ-Untereinheiten um mehr als das 100fache stimuliert. Die Zugabe von Gα-GDP-Untereinheiten konnte diese Gβγ-Aktivierung hemmen. Darüber hinaus wurde die PI3K-Aktivität durch phosphorylierte Tyrosinpeptide nicht stimuliert. Nach der Reinigung wurden zwei unterschiedliche heterodimere Proteinkomplexe identifiziert: ein p117/p101 Komplex und ein p120/p101-Komplex. Die Peptidsequenzierung offenbarte, dass das p101-Protein in beiden Komplexen identisch war. Die p120- und p117-Proteine waren mit der Ausnahme des Aminoterminus homolog (siehe unten stehende Beispiele). Schweine-p101- und -p120-cDNAs wurden dann unter Verwendung degenerierter Sonden auf Basis der Peptidsequenz kloniert, um eine Ex pressionsbibliothek von cDNAs zu screenen, die aus Schweine-Neutrophilen-mRNA synthetisiert wurde. Menschliches p101 und p120 wurden unter Verwendung von Sonden kloniert, die von den Schweine-cDNA-Sequenzen stammen, um menschliche Monozyten- und Leukozyten-cDNA-Bibliotheken zu screenen. Während die Sequenzanalyse der Schweine- und menschlichen Untereinheiten offenbarte, dass die p120-Proteine zu früher klonierten PI3K-Katalyseuntereinheiten homolog sind (obgleich sie sich am äußersten Carboxylterminus signifikant unterscheiden), weisen die p101-Proteine keine Verwandtschaft zu irgendeiner Sequenz in den Datenbanken auf.
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der Schweine- und menschlichen Homologe von p101 und p120 offenbart einen hohen Konservierungsgrad zwischen den beiden Spezies. Dieser hohe Grad an Konservierung zwischen zwei Säugetierspezies legt nahe, dass ein ähnlicher Konservierungsgrad unter Säugetierspezies wahrscheinlich allgemein existiert. In derselben Weise, wie die Schweinesequenzen zur Klonierung ihrer menschlichen Homologe verwendet wurden, kann ein Fachmann p101- und p120-Homologe aus anderen Säugetierspezies unter Verwendung der offenbarten menschlichen und/oder Schweinesequenzen und der in dieser Patentbeschreibung beschriebenen Verfahren klonieren.
Hierin beschriebene Experimente, die p101- und/oder p120-Fusionsproteine in Insektenzellen exprimierten, bewiesen, dass p101 bei einer molaren Stöchiometrie von 1:1 fest an p120 bindet. Freies gereinigtes p120 zeigte PI3K-Aktivität, die auf die Gegenwart von Gα-Untereinheiten und Tyrosin-phosphorylierten Peptiden unempfindlich war und von Gβγ-Untereinheiten nur leicht aktiviert wurde. Bei Bindung an p101 wurde jedoch die PI3K-Aktivität von p120 durch die Gegenwart von Gβγ-Untereinheiten um das 100fache stimuliert. Wenn p101 alleine in Insektenzellen exprimiert wurde, zeigte p101 keine PI3K-Aktivität.
Ein interessantes Ergebnis trat auf, wenn p101 als markiertes Fusionsprotein in menschlichen U937-Zellen exprimiert wurde. Wenn dieses rekombinant exprimierte Schweine-p101 über die Fusionsproteinmarkierung immunpräzipitiert wurde, enthielten diese Immunpräzipitate G-Protein-regulierte PI3K-Aktivität. Die Coexpression von p120 mit p101 verminderte etwas die Menge an PI3K-Aktivität, die immunpräzipitiert werden konnte. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die menschlichen U937-Zellen eine PI3K-Katalyseuntereinheit enthielten, die an die Schweine-p101-Regulationsuntereinheit binden und dadurch aktiviert werden konnte. Diese Ergebnisse beweisen, dass sich Homologe aus verschiedenen Säugetierspezies gemeinsam mit ihren höchst konservierten Aminosäuresequenzen einander funktionell und strukturell ähneln.
Außerdem wurden vorübergehende Transfektionen in Cos-7-Zellen, die normalerweise die PI3K-Aktivität in Reaktion auf aktivierte G-Proteine nicht stimulieren, mit Konstrukten durchgeführt, die für p101-, p120- und/oder Gβγ-Untereinheiten kodieren. Die Transfektion eines Konstrukts, das nur p120 exprimierte, produzierte signifikante Erhöhungen der Ausmaße von PtdIns(3,4,5)P₃ auf eine Gβγ-abhängige Weise bei Coexpression in Gegenwart von p101.
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden in den unten stehenden Unterabschnitten ausführlicher beschrieben.
5.1 DIE p101- UND p120-GENE
Die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) der Schweine-p101-Regulationsuntereinheit sind in 1 bzw. 2 dargestellt. Eine relativ häufige allelische Variation tritt am Aminosäurerest 483 im offenen Leseraster auf; ein Serin kann an dieser Stelle durch ein Glycin ersetzt sein.
Die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 11) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 12) der menschlichen p101-Regulationsuntereinheit sind in 10 bzw. 11 gezeigt.
Von der für die ersten 733 Aminosäuren der Schweine-p101-Regulationsuntereinheit kodierenden Nucleotidsequenz, die den ersten 736 Aminosäuren der menschlichen Untereinheit entspricht, wird angenommen, dass sie ausreicht, um die Katalyseuntereinheit zu binden. Jedoch wird ohne die 145 carboxyterminalen Aminosäuren dieses trunkierte, an p120 gebundene p101 die PI3K-Aktivität in Reaktion auf Gβγ-Untereinheiten nicht stimulieren. Daher wird von der Katalyseuntereinheiten-Assoziationsdomäne angenommen, dass sie innerhalb der ersten 732 Aminosäuren (735 beim Menschen) enthalten ist, und die carboxyterminalen Aminosäuren 733 bis 877 (763 bis 880 bei Menschen) könnten an der Reaktion auf Gβγ-Untereinheiten beteiligt sein.
Andere Domänen von Schweine-p101 werden durch die Aminosäurereste von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 414, 415 bis 565, 566 bis 706, 707-832 und/oder 833 bis 877 dargestellt. Die entsprechenden Domänen von menschlichem p101 werden durch die Aminosäuren von etwa 1 bis 160, 80-120, 161 bis 263, 264 bis 416, 417 bis 567, 568 bis 709, 710-835 und/oder 836 bis 880 beschrieben. Die Nucleotidsequenzen, die für die Aminosäurereste von etwa 161 bis 263 kodieren, definieren eine Pleckstrin-Homologie- („PH"-) Domäne (PROSITE:PS50003). PH-Domänen könnten an der Bindung von Proteinen an Gβγ-Untereinheiten (Touhara et al., J. Biol. Chem. 269, 10217 (1994)) und an Membranphospholipide (siehe Shaw, Bioessays 18, 35–46 (1996)) beteiligt sein. Daher könnte die PH-Domäne von p101 an beiden dieser Ereignisse beteiligt sein.
Die für die Aminosäuren 1 bis 160 von p101 kodierenden Aminosäuren könnten für die Bindung an die p120-Katalyseuntereinheit verantwortlich sein. Wenn diese Region des p101-Proteins auf Sekundärstruktur analysiert wird, kann man vorhersagen, dass sie eine selbständige alternierende α-Helix/β-Faltblattstruktur aufweist. Innerhalb dieser Struktur findet sich eine Homologie zu einer „WW-Domäne" (Staub et al., Structure 4, 495–499 (1996) und TIBS 21, 161–163). Diese WW-Domäne könnte an eine an Prolin reiche Domäne binden, die sich innerhalb des N-Terminus des p120-Proteins findet (Rests 310 bis 315). Folglich könnte die WW-Domäne von p101 an der Vermittlung der Wechselwirkung zwischen der Regulationsuntereinheit und der Katalyseuntereinheit beteiligt sein.
Die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) von Schweine-p120 sind in 3 bzw. 4 gezeigt. Die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 13) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 14) von menschlichem p120 sind in 12 bzw. 13 gezeigt. Eine kryptische Thrombin-Spaltstelle ist nach den ersten etwa 40 Aminosäureresten vorhanden. Das trunkierte p120-Protein, dem diese ungefähr 40 aminoterminalen Reste fehlen, ist nach wie vor in der Lage, an p101 zu binden, jedoch ist die PI3K-Aktivität um etwa 20 bis 30 % vermindert. In anderen Worten behält ein Protein mit der Aminosäuresequenz jenes Abschnitts aus Seq.-ID Nr. 4 (abgeleitete Aminosäuresequenz von Schweine-p120), der sich etwa vom Aminosäurerest 41 bis zum Rest 1.102 erstreckt, die Funktionalität von p120 voller Länge bei. Auf Basis des hohen Grads an Sequenzhomologie zwischen Schweine-p120 und menschlichem p120 würde ein Protein mit der Aminosäuresequenz jenes Abschnitts aus Seq.-ID Nr. 14 (abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem p120), der sich etwa vom Aminosäurerest 41 bis zum Rest 1.102 erstreckt, ebenfalls die Funktionalität von p120 voller Länge beibehalten. Obgleich das p120-Protein höchst homolog zum früher klonierten p110γ-Protein war, das von Stoyanov et al. (1995) beschreiben worden ist, unterscheidet sich der äußerste C-Terminus von p120 vom beschriebenen p110γ-Protein am Aminosäurerest 1.075; folglich sind die letzten 28 Aminosäurereste von p120 in keinem der Berichte über homologe Proteine veröffentlicht worden. Wie oben erwähnt, könnten die für eine an Prolin reiche Region, einschließlich p120-Reste 310 bis 315, kodierenden Nucleotide an der Wechselwirkung zwischen p120 und p101 beteiligt sein. Außerdem definieren die für die p120-Aminosäurereste von etwa 172 bis 302 kodierenden Nucleotide eine schwache PH-Domäne, die ein Kandidat für Membranbindung und/oder Gβγ-Untereinheiten-Wechselwirkung des p101/p120-Komplexes sein könnte.
Die in den Arbeitsbeispielen (siehe unten) präsentierten Daten beweisen, dass die p120-cDNA für die Katalyseuntereinheit der Gβγ-aktivierten PI3K kodiert. Die p101- cDNA kodiert für ein neues Regulationsuntereinheitenprotein, das an die p120-Untereinheit bindet. Dieses Heterodimer 3-phosphoryliert PtdIns, PtdIns4P und PtdIns(4,5)P₂ in Reaktion auf die Aktivierung trimerer G-Protein-gebundener Rezeptoren.
Die p101-Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen: (a) die DNA-Sequenz, die in 1 oder 10 gezeigt oder im bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer 97636 hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist; (b) eine Nucleotidsequenz, die für die in 2 oder 11 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, oder die p101-Regulationuntereinheiten-Aminosäuresequenz, die vom bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 kodiert wird; (c) jegliche Nucleotidsequenz, die an das Komplement der in 1 oder 10 gezeigten oder im bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthaltenen DNA-Sequenz unter höchst stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 68°C (F.M. Ausubel (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York (1989), auf Seite 2.10.3), und für ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert; und (d) jegliche Nucleotidsequenz, die an das Komplement der DNA-Sequenzen hybridisiert, die für die in 1 oder 10 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert oder im bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist, und zwar unter weniger stringenten Bedingungen, wie z.B. mäßig stringenten Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 42°C (Ausubel et al. (1989), siehe oben), die jedoch nach wie vor für ein funktionell äquivalentes p101-Genprodukt kodiert. Funktionelle Äquivalente der p101-Regulationsuntereinheit umfassen natürlich vorkommende p101-Regulationsuntereinheiten, die in anderen Spezies vorhanden sind, und mutierte p101-Regulationsuntereinheiten, ob sie natürlich vorkommen oder verändert sind, die zumindest eine der funktionellen Aktivitäten von p101 beibehalten (d.h. Bindung an die p120- oder p117-Katalyseuntereinheit, Stimulation von Katalyseaktivität in Reaktion auf Gβγ- Untereinheiten und/oder Wechselwirkung mit Gβγ-Untereinheiten). Die Erfindung umfasst außerdem degenerierte Varianten der Sequenzen (a) bis (d).
Die Erfindung umfasst außerdem Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise DNA-Moleküle, die an die Nucleotidsequenzen (a) bis (d) im vorangehenden Absatz hybridisieren und daher Komplemente davon sind. Derartige Hybridisierungsbedingungen können hoch stringent oder weniger hoch stringent als die oben beschriebenen sein. In Fällen, bei denen die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide („Oligos") sind, können hochstringente Bedingungen sich z.B. auf Waschen in 6 × SSC/0,05 % Natriumpyrophosphat bei 37°C (für 14-Basen-Oligos), 48°C (für 17-Basen-Oligos), 55°C (für 20-Basen-Oligos) und 60°C (für 23-Basen-Oligos) beziehen. Diese Nucleinsäuremoleküle können für p101-Antisense-Moleküle kodieren oder als solche agieren, die beispielsweise bei der p101-Genregulation zweckdienlich sind (für und/oder als Antisense-Primer bei Amplifikationsreaktionen von p101-Gen-Nucleotidsequenzen). In Bezug auf p101-Genregulation können derartige Techniken verwendet werden, um beispielsweise entzündliche Immunreaktionen zu regulieren. Weiters können derartige Sequenzen als Teil von Ribozym- und/oder Dreifachhelix-Sequenzen verwendet werden, die ebenfalls für die p101-Genregulation zweckdienlich sind. Außerdem können derartige Moleküle als Komponenten von Diagnoseverfahren verwendet werden, mit denen beispielsweise die Gegenwart eines bestimmten p101-Allels, das für die Hervorrufung einer Entzündungsreaktion verantwortlich ist, detektiert werden kann.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen p101-Nucleotidsequenzen können p101-cDNA- oder -Gensequenzen, die in der selben Spezies vorhanden sind, und/oder Homologe des p101-Gens, die in anderen Spezies vorhanden sind, durch molekularbiologische Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, ohne übermäßiges Experimentieren identifiziert und leicht isoliert werden. Hierin beschriebene experimentelle Belege weisen darauf hin, dass die p101-Proteine in verschiedenen Säugetierspezies konserviert sind. Beispielsweise wurde menschliches p101 aus Monozyten- und Leukozyten-Bibliotheken unter Verwendung von Sonden klo niert, die sich von der Schweine-p101-cDNA-Sequenz herleiten, und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Mensch und Schwein erwiesen sich als höchst konserviert. Die strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit der beiden Homologe wird durch Experimente bewiesen, die zeigen, dass bei Expression von Schweine-p101 in U937-Zellen das Schweine-p101 an ein menschliches Homolog der Katalyseuntereinheit band. Außerdem sind Elemente der Tyrosinkinase-regulierten PI3K-Famiie von Proteinen, beispielsweise p110/p85-PI3qK unter verschiedenen Säugetierspezies ebenfalls konserviert. Daher können Homologe von p101 und p120 aus einer Vielzahl von Säugetierzellen isoliert werden, die bekanntermaßen oder mutmaßlich eine trimere G-Protein-regulierte PI3K enthalten, insbesondere aus Zellen hämatopoetischen Ursprungs und im Spezielleren Blutplättchen, Monozyten, Leukozyten, Osteoklasten und Neutrophilen.
Die Identifizierung von Homologen von p101 in verwandten Spezies kann zur Entwicklung von Tiermodellsystemen, die mit dem Menschen näher verwandt sind, zum Zwecke der Entdeckung von Wirkstoffen zweckdienlich sein. Beispielsweise können Expressionsbibliotheken von cDNAs, die aus Neutrophilen-mRNA synthetisiert werden, die vom Organismus von Interessen stammt, unter Verwendung einer markierten Katalyseuntereinheit gescreent werden, die sich aus dieser Spezies herleitet, z.B. ein p120-, p117 oder p110γ-Katalyseuntereinheiten-Fusionsprotein. Alternativ dazu können derartige cDNA-Bibliotheken oder genomische Bibliotheken, die aus dem Organismus von Interesse stammen, unter Verwendung der hierin beschriebene Nucleotide als Hybridisierungs- oder Amplifikationssonden gescreent werden. Darüber hinaus können Gene an anderen Genorten im Genom, die für Proteine kodieren, die eine ausgeprägte Homologie mit einer oder mehreren Domänen des p101-Genprodukts aufweisen, über ähnliche Techniken identifiziert werden. Im Falle von cDNA-Bibliotheken können derartige Screeningtechniken Klone identifizieren, die von alternativ gespleißten Transkripten in derselben oder einer anderen Spezies stammen.
Das Screening kann durch Filterhybridisierung unter Verwendung von Duplikatfiltern erfolgen. Die markierte Sonde kann zumindest 15–30 Basenpaare der menschlichen oder Schweine-p101-Nucleotidsequenz enthalten, wie in 1 bzw. 10 gezeigt ist. Die verwendeten Waschbedingungen der Hybridisierung sollten von niedrigerer Stringenz sein, wenn die cDNA-Bibliothek aus einem Organismus stammt, der sich vom Typ von Organismus unterscheidet, von der die markierte Sequenz abstammt. In Bezug auf die Klonierung eines Säugetier-p101-Homologs unter Verwendung von beispielsweise Schweine- und/oder menschlichen p101-Sonden kann die Hybridisierung beispielsweise bei 65°C über Nacht in Church-Puffer (7 % SDS, 250 mM NaHPO₄, 2 μM EDTA, 1 % BSA) durchgeführt werden. Waschvorgänge können mit 2 × SCC, 0,1 % SDS bei 65°C und dann mit 0,1 × SCC, 0,1 % SDS bei 65°C vorgenommen werden.
Niedrigstringente Bedingungen sind dem Fachmann wohlbekannt und werden vorhersehbar vom jeweiligen Organismus abhängen, aus dem die Bibliothek und die markierten Sequenzen abstammen. Anleitungen in Bezug auf derartige Bedingungen finden sich beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y (1989); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Alternativ dazu kann die markierte p101-Nucleotidsonde verwendet werden, um eine Genombibliothek zu screenen, die aus einem Organismus von Interesse stammt, wiederum unter Anwendung von geeignet stringenten Bedingungen. Die Identifizierung und Charakterisierung von menschlichen genomischen Klonen ist hilfreich für die Entwicklung von Diagnosetests und klinischen Protokollen zur Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie bei menschlichen Patienten. Beispielsweise können Sequenzen verwendet werden, die aus Regionen stammen, die den Intron/Exon-Begrenzungen des menschlichen Gens benachbart sind, um Primer zur Verwendung in Amplifikationstests zu konstruieren, um Mutationen innerhalb von Exons, Introns, Spleißstellen (z.B. Spleißakzeptor- und/oder -donorstellen) usw. zu detektieren, die bei der Diagnostik verwendet werden können.
Weiters kann ein p101-Genhomolog aus Nucleinsäure des Organismus von Interesse isoliert werden, indem PCR unter Verwendung von zwei degenerierten Pools von Oligonucleotidprimern durchgeführt wird, die auf Basis von Aminosäuresequenzen im hierin offenbarten p101-Genprodukt konstruiert wurden. Das Templat für die Reaktion kann cDNA sein, die durch reverse Transkription von mRNA erlangt wurde, die beispielsweise aus menschlichen oder nicht-menschlichen Zelllinien oder Zelltypen, wie z.B. Neutrophilen, hergestellt wurde, die bekanntermaßen oder mutmaßlich ein Allel des p101-Gens exprimieren.
Das PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um zu gewährleisten, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen eines p101-Gens darstellen. Das PCR-Fragment kann dann verwendet werden, um einen cDNA-Klon voller Länge mittels einer Reihe von Verfahren zu isolieren. Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment markiert und verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek, wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek, zu screenen. Alternativ dazu kann das markierte Fragment verwendet werden, um genomische Klone über das Screening einer genomischen Bibliothek zu isolieren.
PCR-Technologie kann außerdem eingesetzt werden, um cDNA-Sequenzen voller Länge zu isolieren. Beispielsweise kann RNA unter Befolgung von Standardverfahren aus einer geeigneten zellulären Quelle isoliert werden (d.h. aus einer, die bekanntermaßen oder mutmaßlich das p101-Gen exprimiert, wie z.B. Neutrophile oder andere Typen von Leukozyten). Eine reverse Transkriptionsreaktion kann an der RNA durchgeführt werden, wobei für das Primen der Erststrangsynthese ein Oligonucleotidprimer verwendet wird, der für das 5'-Ende des amplifizierten Fragments spezifisch ist. Die resultierende RNA/DNA-Hybride kann dann unter Anwendung einer standardmäßigen terminalen Transferasereaktion mit einem „Schwanz" von Guaninen versehen werden, die Hybride kann mit RNAase H verdaut werden, und die Zweitstrangsynthese kann dann mit einem Poly-C-Primer geprimt werden. Daher können cDNA-Sequenzen stromauf des amplifizierten Fragments leicht isoliert werden. Für einen Überblick über Klonierungsstrategien, die verwendet werden können, siehe z.B. Sambrook et al. (1989), siehe oben.
Die p101-Gensequenzen können außerdem verwendet werden, um mutierte p101-Genallele zu isolieren. Derartige mutierte Allele können aus Individuen isoliert werden, die einen bekannten oder vorgeschlagenen Genotyp aufweisen, der zu den Symptomen von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, wie z.B. der Entzündung, beiträgt. Mutierte Allele und mutierte Allelprodukte können dann in den unten beschriebenen therapeutischen und diagnostischen Systemen eingesetzt werden. Außerdem können derartige p101-Gensequenzen verwendet werden, um p101-Genregulations- (z.B. Promotor- oder Promotor/Enhancer-) Defekte zu detektieren, welche die Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie beeinträchtigen könnten.
Eine cDNA eines mutierten p101-Gens kann beispielsweise unter Anwendung von PCR isoliert werden, einer Technik, die dem Fachmann wohlbekannt ist. In diesem Fall kann der erste cDNA-Strang synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an aus Zellen isolierter mRNA hybridisiert wird, die bekanntermaßen oder vermutlich in einem Individuum exprimiert wird, das mutmaßlich das mutierte p101-Allel trägt, und indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird. Der zweite Strang der cDNA wird dann unter Verwendung eines Oligonucleotids synthetisiert, das spezifisch an das 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Unter Verwendung dieser beiden Primer wird das Produkt dann über PCR amplifiziert, in einen geeigneten Vektor kloniert und der DNA-Sequenzanalyse durch Verfahren unterzogen, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Durch Vergleichen der DNA-Sequenz des mutierten p101-Allels mit jener des normalen p101-Allels kann/können die für den Verlust oder die Veränderung der Funktion des mutierten p101-Genprodukts verantwortliche(n) Mutation(en) festgestellt werden.
Alternativ dazu kann eine genomische Bibliothek unter Verwendung von DNA konstruiert werden, die aus einem Individuum erlangt wurde, das mutmaßlich oder bekanntermaßen das mutierte p101-Allen trägt, oder es kann eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung von RNA aus einem Zelltyp konstruiert werden, der bekanntermaßen oder mutmaßlich das mutierte p101-Allel exprimiert. Das normale p101-Gen oder jegliches geeignete Fragment davon kann dann markiert und als Sonde zur Iden tifizierung des entsprechenden mutierten p101-Alles in derartigen Bibliotheken verwendet werden. Die mutierten p101-Gensequenzen enthaltende Klone können dann gereinigt und der Sequenzanalyse gemäß Verfahren unterzogen werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Außerdem kann eine Expressionsbibliothek konstruiert werden, indem cDNA eingesetzt wird, die aus beispielsweise RNA aus einem Zelltyp synthetisiert wurde, der bekanntermaßen oder mutmaßlich ein mutiertes p101-Allel in einem Individuum exprimiert, das mutmaßlich oder bekanntermaßen ein derartiges mutiertes Allel trägt. Auf diese Weise können durch diesen mutmaßlich mutierten Zelltyp hergestellte Genprodukte unter Abwendung von standardmäßigen Antikörper-Screeningtechniken in Verbindung mit Antikörpern exprimiert und gescreent werden, die gegen das normale p101-Genprodukt hergestellt worden sind, wie unten im Abschnitt 5.3 beschrieben wird. (Für Screeningtechniken siehe beispielsweise E. Harlow und Lane (Hrsg.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988).) Außerdem kann ein Screening durch Screening mit markierten Fusionsproteinen, wie z.B. den (EE)120- oder myc120-Fusionsproteinen, erzielt werden. In Fällen, wo eine p101-Mutation in einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion resultiert (z.B. als Resultat einer Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutation), wird ein polyklonaler Satz von Antikörpern gegen die p101-Regulationsuntereinheit wahrscheinlich mit dem mutierten p101-Regulationsuntereinheiten-Genprodukt kreuzreagieren. Über die Reaktion mit derartigen markierten Antikörpern detektierte Bibliotheksklone können gereinigt und der Sequenzanalyse gemäß Verfahren unterzogen werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Die Erfindung umfasst außerdem Nucleotidsequenzen, die für mutierte p101-Regulationsuntereinheiten, Peptidfragmente der p101-Regulationsuntereinheit, trunkierte p101-Regulationsuntereinheiten und p101-Regulationsuntereinheitenfusionproteine kodieren. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Nucleotidsequenzen, die für mutierte p101-Regulationsuntereinheiten kodieren, die unten im Abschnitt 5.2 beschrieben werden; Polypeptide oder Peptide, die der Katalysebin dungsdomäne oder Gβγ-Untereinheiten-Bindungsdomäne der p101-Regulationsuntereinheit oder Abschnitte dieser Domänen entsprechen; trunkierte p101-Regulationsuntereinheiten, bei denen eine oder zwei der Domänen deletiert sind, oder eine trunkierte, nicht funktionsfähige p101-Regulationsuntereinheit. Für Fusionsproteine kodierende Nucleotide können eine p101-Regulationsuntereinheit voller Länge, trunkierte p101-Regulationsuntereinheit oder Peptidfragmente einer p101-Regulationsuntereinheit umfassen, die an ein nicht verwandtes Protein oder Peptid wie z.B. eine Epitopmarkierung fusioniert sind, die bei der Reinigung oder Detektion des resultierenden Fusionsproteins hilfreich ist, sind aber nicht darauf beschränkt; oder ein Enzym, fluoreszierendes Protein, lumineszierendes Protein, das als Marker verwendet werden kann.
Die Erfindung umfasst außerdem (a) DNA-Vektoren, die jegliche der vorangehenden, für die p101-Regulationsuntereinheit kodierenden Sequenzen und/oder ihr Komplement (d.h. Antisense) enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die jegliche der vorangehenden, für die p101-Regulationsuntereinheit kodierenden Sequenzen enthalten, die operabel mit einem Regulationselement assoziiert sind, das die Expression der kodierenden Sequenzen steuert; und (c) genetisch veränderte Wirtszellen, die jegliche der vorangehenden, für die p101-Regulationsuntereinheit kodierenden Sequenzen enthalten, die operativ mit einem Regulationselement assoziiert sind, das die Expression der kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuert. Wie hierin verwendet umfassen Regulationselemente, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente, die die Expression antreiben und regulieren. Derartige Regulationselemente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, den Baculovirus-Promotor, unmittelbar frühen Zytomegalievirus-hCMV-Gen-Promotor, die frühen und späten Promotoren von SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Hauptoperator- und -Promotorregionen des Phagen A, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase, die Promotoren der sauren Phosphatase und die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren.
Schließlich beschreibt die vorliegende Anmeldung Nucleotide, die für p120-Untereinheitenproteine kodieren, einschließlich für den neu beschriebenen. Carboxylterminus dieser Katalyseuntereinheit, Deletionsvarianten der p120-Untereinheitenproteine, Nucleotide, die an diese Nucleotide unter hoch stringenten Bedingungen hybridisieren und die für funktionell äquivalente Produkte kodieren, einschließlich dem bei der ATCC unter der Zugangsnummer 97637 hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp120, allelische Varianten von p120 (z.B. mutierte Allele oder die natürlich vorkommenden Allele, wie z.B. die allelische Variation am Aminosäurerest 483) und äquivalente p120-Nucleotide aus anderen Organismen, die wie oben für die p101-Nucleotide der Erfindung beschrieben isoliert wurden. Außerdem werden hierin Expressionsvektoren und Wirtszellen für die rekombinante Produktion von p120 beschrieben.
5.2 p101- UND p120-PROTEINE UND -POLYPEPTIDE
Die p101-Regulationsuntereinheit und p120-Katalyseuntereinheit, -Polypeptide und -Peptidfragmente, mutierte, trunkierte oder deletierte Formen der p101-Regulationsuntereinheit und/oder p101-Regulationsuntereinheitenfusionsproteine und die p120-Katalyseuntereinheit und/oder p120-Katalyseuntereinheiten-Fusionsproteine können für eine Vielzahl an Verwendungen hergestellt werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Erzeugung von Antikörpern, als Reagenzien in Diagnosetests, die Identifizierung anderer zellulärer Genprodukte, die an der Regulation von Zellen der hämatopoetischen Linie beteiligt sind, als Reagenzien in Tests zum Screening auf Verbindungen, die bei der Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie verwendet werden können, und als pharmazeutische Reagenzien, die bei der Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zweckdienlich sind, die mit Gβγ-aktivierter PI3K in Verbindung stehen.
2 und 11 zeigen die Aminosäuresequenzen der Schweine- bzw. menschlichen p101-Regulationsuntereinheit. 4 und 13 zeigen die Aminosäuresequenz des Schweine- bzw. menschlichen p120-Katalyseuntereinheitenproteins. Die gestrichelte Linie in 4 unterstreicht jene Region in p120, die von den veröffentlichen Sequenzen der PI3K-Katalyseuntereinheiten p110α, p110β und p110γ abweicht.
Die Sequenz der p101-Regulationsuntereinheit beginnt mit einem Methionin in einem DNA-Sequenz-Kontext, der mit einer Translationsinitiationsstelle im Einklang steht. Die vorhergesagte Molmasse von Schweine- sowie menschlichen p101-Regulationsuntereinheiten beträgt 97 kD.
Die Aminosäuresequenzen der p101-Regulationsuntereinheit der Erfindung umfassen die in 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder 4 (Seq.-ID Nr. 12) gezeigten Sequenzen oder die Aminosäuresequenz, die vom bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 kodiert wird. Außerdem sind p101-Regulationsuntereinheiten anderer Spezies von der Erfindung umfasst. In der Tat liegt jegliches p101-Regulationsuntereinheitenprotein, das von den oben beschriebenen p101-Nucleotidsequenzen kodiert wird, im Schutzumfang der Erfindung.
Die p120-Katalyseuntereinheiten-Aminosäuresequenzen der Erfindung umfassen den bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp120. Die vorliegende Anmeldung beschreibt außerdem p120-Katalyseuntereinheiten anderer Spezies und die von den oben im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen p120-Nucleotidsequenzen kodierten p120-Proteine.
Die Erfindung umfasst außerdem Proteine, die funktionell zu der von den oben beschriebenen Nucleotidsequenzen kodierten p101-Regulationsuntereinheit äquivalent sind, wie aufgrund eines jeglichen einer Anzahl von Kriterien beurteilt werden kann, umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Fähigkeit zur Bindung der Katalyseuntereinheit, die Bindungsaffinität für die Katalyseuntereinheit, die Fähigkeit zur Stimulation von PI3K-Aktivität der Katalyseuntereinheit in Reaktion auf aktivierte trimere G-Proteine, die resultierende biologische Wirkung der Bindung der Katalyseuntereinheit und Reaktion auf Aktivierung trimerer G-Proteine, z.B. Signaltransduktion, ei ne Änderung des Zellmetabolismus (z.B. Erzeugung von PtdIns(3,4,5)P₃) oder Änderung des Phänotyps, wenn das Äquivalent der p101-Regulationsuntereinheit in einem geeigneten Zelltyp zugegen ist (wie z.B. dem Superoxid-Impuls in Neutrophilen). Derartige funktionell äquivalente p101-Regulationsuntereinheitenproteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Aminosäuresequenz, die von den oben beschriebenen p101-Nucleotidsequenzen kodiert werden, die jedoch in einer „stummen" Veränderung resultieren, was daher ein funktionell äquivalentes Genprodukt hervorbringt. Aminosäuresubstitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit hinsichtlich Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder amphipathischer Beschaffenheit der beteiligten Reste vorgenommen werden. Beispielsweise umfassen unpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; polar neutrale Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; positiv geladene (basische) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin; und negativ geladene (saure) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Gleichermaßen umfasst die Erfindung außerdem oben beschriebene funktionelle Äquivalente von p120-Protein.
Obgleich Zufallsmutationen an der p101-DNA vorgenommen (unter Anwendung von Mutagenesetechniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind) und die resultierenden mutierten p101-Regulationsuntereinheiten auf Aktivität getestet werden können, können ortsgerichtete Mutationen der für p101 kodierenden Sequenz konstruiert werden (unter Anwendung von ortsgerichteten Mutagenesetechniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind), um mutierte p101-Regulationsuntereinheiten mit verbesserter Funktion, z.B. höherer Bindungsaffinität für die Katalyseuntereinheit und/oder höherer Signalkapazität; oder verminderter Funktion, z.B. niedrigerer Bindungsaffinität für die Katalyseuntereinheit und/oder verminderter Signaltransduktionskapazität, zu erzeugen.
Beispielsweise kann die Schweine-p101-Aminosäuresequenz mit jener der menschlichen p101-Regulationsuntereinheit abgeglichen werden. Mutierte p101-Regula tionsuntereinheiten können so konstruiert werden, dass Regionen von Interspeziesidentität erhalten bleiben, wogegen die variablen Reste verändert werden, z.B. durch Deletion oder Insertion eines/mehrerer Aminosäurerests/e oder durch Substitution von einem oder mehreren verschiedenen Aminosäureresten. Konservative Veränderungen an den variablen Positionen können konstruiert werden, um eine mutierte p101-Regulationsuntereinheit herzustellen, die ihre Funktion beibehält: z.B. Bindungsaffinität für die Katalyseuntereinheit oder Fähigkeit zur aktivierten G-Protein-Transduktion oder beides. Nicht-konservative Änderungen können an diesen variablen Positionen konstruiert werden, um die Funktion zu verändern, z.B. die Bindungsaffinität für die Katalyseuntereinheit oder Signaltransduktionsfähigkeit oder beides. Alternativ dazu können, wo eine Veränderung der Funktion gewünscht ist, Deletionen oder nicht-konservative Änderungen der konservierten Regionen konstruiert werden. Ein Fachmann kann derartige mutierte oder deletierte p101-Regulationsuntereinheiten leicht auf diese Veränderungen der Funktion unter Anwendung der hierin dargestellten Lehren testen.
Andere Mutationen der für p101 kodierenden Sequenz können vorgenommen werden, um p101-Regulationsuntereinheiten zu erzeugen, die für Expression, Scale-up usw. in den gewählten Wirtszellen besser geeignet sind. Beispielsweise kann der Triplettcode für jede Aminosäure so modifiziert werden, dass er der bevorzugten Codonverwendung des Translationsapparats der Wirtszelle besser angepasst ist.
Peptide, die einer oder mehreren Domänen (oder einem Abschnitt davon) der p101-Regulationsuntereinheit (z.B. der p120-Bindungsdomäne, der G-Protein-Wechselwirkungsdomäne oder den Domänen, die durch die Aminosäurereste 1 bis 150, 151 bis 300, 301 bis 450, 451 bis 600, 601-732 (Schwein) oder 601-735 (Mensch) und 733-877 (Schwein) oder 736-881 (Mensch) definiert sind), trunkierten oder deletierten p101-Regulationsuntereinheiten (z.B. p101-Regulationsuntereinheit, in der Abschnitte einer oder mehrerer der obigen Domänen deletiert sind) sowie Fusionsproteinen entsprechen, bei denen die p101-Regulationsuntereinheit voller Länge, ein p101-Regulationsuntereinheitenpeptid oder eine trunkierte p101-Regulationsuntereinheit an ein nicht verwandtes Protein fusioniert ist, liegen ebenfalls im Schutzum fang der Erfindung und können auf Basis der in diesem Abschnitt und oben offenbarten p101-Nucleotid- und p101-Regulationuntereinheiten-Aminosäuresequenzen konstruiert werden. Derartige Fusionsproteine umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Fusionen an eine Epitopmarkierung (wie z.B. in den Beispielen unten beispielhaft dargelegt ist); oder Fusionen an ein Enzym, fluoreszierendes Protein oder lumineszierendes Protein, die eine Markerfunktion bereitstellen.
Während die p101-Regulationsuntereinheitenpolypeptide und -peptide chemisch synthetisiert werden können (siehe z.B. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y. (1983)), können große Polypeptide, die von der p101-Regulationsuntereinheit stammen, und die p101-Regulationsuntereinheit voller Länge selbst zweckmäßigerweise durch DNA-Rekombinationstechnologie unter Anwendung von Techniken hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Expression von Nucleinsäure wohlbekannt sind, die p101-Gensequenzen und/oder für p101 kodierende Sequenzen enthält. Derartige Verfahren können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die oben beschriebenen p101-Nucleotidsequenzen und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen enthalten. Diese Verfahren umfassen beispielsweise In-vitro-DNA-Rekombinationstechniken, synthetische Techniken und genetische Rekombination in vivo. Siehe beispielsweise die Techniken, die in Sambrook et al., (1989), siehe oben, und Ausubel et al. (1989), siehe oben, beschrieben sind. Alternativ dazu kann RNA, die zur Kodierung von p101-Nucleotidsequenzen fähig ist, chemisch synthetisiert werden, beispielsweise unter Verwendung von Synthesegeräten. Siehe beispielsweise die Techniken, die beschrieben werden in „Oligonucleotide Synthesis", M.J. Gait (Hrsg.), IRL Press, Oxford (1984), die hierin als Ganzes durch Verweis aufgenommen ist.
Es kann eine Vielzahl an Wirt-Expressionsvektor-Systemen eingesetzt werden, um die p101-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Wo das p101-Regulationsuntereinheitenpeptid oder -polypeptid ein lösliches Derivat ist, kann das Peptid oder Polypeptid aus der Kultur gewonnen werden, d.h. aus der Wirtszelle in Fällen, wo das p101-Regulationsuntereinheitenpeptid oder -polypeptid nicht sekretiert wird, und aus dem Kulturmedium in Fällen, wo das p101-Regulationsuntereinheitenpeptid oder -polypeptid von den Zellen sekretiert wird. Jedoch können derartige konstruierte Wirtszellen selbst unter Gegebenheiten verwendet werden, wo es wichtig ist, nicht nur die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der p101-Regulationsuntereinheit beizubehalten, sondern auch die biologische Aktivität zu beurteilen, z.B. bei Wirkstoff-Screeningtests.
Die Expressionssysteme, die zum Zwecke der Erfindung verwendet werden könnten, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind, die p101-Nucleotidsequenzen enthalten; Hefen (z.B. Saccharomyces, Pichia), die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren transformiert sind, die die p101-Nucleotidsequenzen enthalten; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert sind (z.B. Baculovirus), die die p101-Nucleotidsequenzen enthalten; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert sind (z.B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die p101-Nucleotidsequenzen enthalten; oder Säugetierzellsysteme (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3, U937), die rekombinante Expressionskonstrukte beherbergen, die Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugetierzellen (z.B. Metallothionein-Promotor) oder aus Säugetierviren (z.B. der späte Adenovirus-Promotor; der Promotor des Vakziniavirus 7.5K) stammen.
In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren zweckmäßigerweise in Abhängigkeit von der beabsichtigen Verwendung für das exprimierte p101-Genprodukt gewählt werden. Wenn beispielsweise eine große Menge eines derartigen Proteins herzustellen ist, beispielsweise zur Erzeugung pharmazeutischer Zusammensetzungen des p101-Regulationsuntereinheitenproteins oder zur Herstellung von Antikörpern gegen das p101-Regulationsuntereinheitenprotein, könnten Vektoren wünschenswert sein, die die Expression hoher Mengen an Fusionsproteinprodukten steuern, die leicht gereinigt werden können. Derartige Vektoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, den E.-coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al, EMBO J. 2, 1791 (1983)), bei dem die für p101 kodierende Sequenz individuell in den Vektor im Leseraster mit der für lacZ kodierenden Region ligiert werden kann, so dass ein Fusionsprotein produziert wird; pIN-Vektoren (Inouye und Inouye, Nucleic Acids Res. 13, 3101–3109 (1985); Van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503–5509 (1989)); und dergleichen. pGEX-Vektoren können ebenfalls verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Falls die insertierte Sequenz für ein relativ kleines Polypeptid (weniger als 25 kD) kodiert, sind derartige Fusionsproteine im Allgemeinen löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Perlen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so konstruiert, dass sie Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen umfassen, so dass das Target-Genprodukt von der GST-Gruppierung freigesetzt werden kann. Falls das resultierende Fusionsprotein unlöslich ist und Einschlusskörperchen in der Wirtszelle bildet, können alternativ dazu die Einschlusskörperchen gereinigt und das rekombinante Protein unter Anwendung von Techniken solubilisiert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
In einem Insektensystem kann das Kern-Hyperhidrose-Virus von Autographa californica (AcNPV) als Vektor verwendet werden, um fremde Gene zu exprimieren. (Siehe z.B. Smith et al., J. Virol. 46, 584 (1983); Smith, US-Patent Nr. 4.215.051). In einer speziellen, unten beschriebenen Ausführungsform werden Sf9-Insektenzellen mit einem Baculovirus-Vektor infiziert, der entweder ein 6 × HIS-markiertes p120-Konstrukt oder ein (EE)-markiertes p101-Konstrukt exprimiert.
Bei Säugetierwirtszellen kann eine Reihe von Virus-basierten Expressionssystemen eingesetzt werden. Spezielle Ausführungsformen, die unten ausführlicher beschrieben werden, exprimieren markierte p101- oder p120-cDNA-Sequenzen unter Verwendung eines CMV-Promotors, um rekombinantes Protein in U937-Zellen oder in Cos-7-Zellen vorübergehend zu exprimeren. Alternativ dazu können retrovirale Vektorsysteme, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, verwendet werden, um das rekombinante Expressionskonstrukt in Wirtszellen zu insertieren. Beispiels weise werden retrovirale Vektorsysteme für transduzierende hämatopoetische Zellen in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 96/09400 und WO 94/29438 beschrieben.
In Fällen, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die p101-Nucleotidsequenz von Interesse an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex, z.B. die späte Promotor- und dreiteilige Leadersequenz, insertiert werden. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch In-vitro- oder In-vivo-Rekombination insertiert werden. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virusgenoms (z.B. Region E1 oder E3) wird in einem rekombinanten Virus resultieren, der lebensfähig und in der Lage ist, das p101-Genprodukt in infizierten Wirten zu exprimieren. (Siehe z.B. Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655–3659 (1984).) Spezielle Initiationssignale können ebenfalls für die effiziente Translation von insertierten p101-Nucleotidsequenzen erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, wo ein vollständiges p101-Gen oder vollständige p101-cDNA, einschließlich sein/ihr eigenes Initiationscodon und benachbarte Sequenzen, in den geeigneten Expressionsvektor insertiert wird, sind möglicherweise keine weiteren Translationskontrollsignale erforderlich. Jedoch müssen in Fällen, wo nur ein Abschnitt der für p101 kodierenden Sequenz insertiert wird, exogene Translationskontrollsignale, einschließlich, möglicherweise, das ATG-Initiationscodon, bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss sich das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten kodierenden Sequenz befinden, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können verschiedensten natürlichen sowie synthetischen Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression kann durch Aufnahme geeigneter Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminatoren usw. verstärkt werden (siehe Bittner et al., Methods in Enzymol. 153, 516–544 (1987)).
Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der speziell gewünschten Weise modifiziert und prozessiert. Eine derartige Modifizierung (z.B. Glykosylierung) und Prozessierung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationelle Prozessierung und Modifizierung von Proteinen und Genprodukten. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die korrekte Modifizierung und Prozessierung des exprimierten fremden Proteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck können eukaryotische Wirtszellen verwendet werden, die die Zellausrüstung für die richtige Prozessierung der Primärtranskripte besitzen. Derartige Säugetierzellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3-, WI38- und U937-Zellen.
Für die langfristige Produktion rekombinanter Proteine in hoher Ausbeute wird die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien konstruiert werden, die die oben beschriebenen p101-Sequenzen stabil exprimieren. Anstatt Expressionsvektoren zu verwenden, die Virus-Replikationsstartpunkte enthalten, können Wirtszellen mit DNA transformiert werden, die durch geeignete Expressionskontrollelemente (z.B. Promotor, Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einen Selektionsmarker kontrolliert werden. Nach der Einführung der fremden DNA können die veränderten Zellen 1–2 Tage lang in einem angereicherten Medium gezüchtet und dann auf ein Selektivmedium umgestellt werden. Der Selektionsmarker im rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegen die Selektion und ermöglicht den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Zentren zu bilden, die wiederum kloniert und zu Zelllinien vermehrt werden können. Dieses Verfahren kann zweckdienlicherweise verwendet werden, um Zelllinien zu konstruieren, die das p101-Genprodukt exprimieren. Derartige konstruierte Zelllinien können beim Screening und bei der Evaluierung von Verbindungen besonders zweckdienlich sein, die die endogene Aktivität des p101-Genprodukts beeinflussen.
Es kann eine Reihe von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler et al., Cell 11, 223 (1977)), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase- (Szy balska und Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026 (1962)) und Adenin-Phosphoribosyltransferase- (Lowy et al., Cell 22, 817 (1980)) Gene, die in tk^–-, hgprt^–- oder aprt^–-Zellen eingesetzt werden können. Außerdem kann Antimetabolit-Resistenz als Basis der Selektion für die folgenden Gene verwendet werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527 (1981); gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)); neo, das Resistenz gegen das Aminoglykosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1 (1981)); und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre et al., Gene 30, 147 (1984)).
Die p101-Genprodukte können auch in transgenen Tieren exprimiert werden. Tiere jeglicher Spezies, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Mehrschweinchen, Schweine, Minischweine, Ziegen und nicht-menschliche Primaten, z.B. Paviane, Affen und Schimpansen, können verwendet werden, um p101-transgene Tiere zu erzeugen.
Jegliche auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Technik kann verwendet werden, um das p101-Transgen in nicht-menschliche Tiere einzuführen, um die Gründerlinie nicht-menschlicher transgener Tiere zu produzieren. Derartige Techniken umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Pronukleus-Mikroinjektion (P.C. Hoppe und T.E. Wagner, US-Patent Nr. 4.873.191 (1989)); Retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimbahnen (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–6152 (1985)); Gen-Targeting in nicht-menschliche Embryonalstammzellen (Thompson et al. Cell 56, 313–321 (1989)), Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell. Biol. 3, 1803–1814 (1983)); und Spermien-vermittelten Gentransfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717–723 (1989)); usw. Für einen Überblick über derartige Techniken siehe Gordon, Transgenic Animals, Inti. Rev. Cytol. 115, 171–229 (989).
Die vorliegende Erfindung stellt nicht-menschliche transgene Tiere bereit, die das p101-Transgen in allen ihren Zellen tragen, sowie Tiere, die das Transgen in manchen, nicht jedoch allen ihren Zeilen, z.B. in Mosaikzellen, tragen. Das Transgen kann als einzelnes Transgen oder in Konkatameren, z.B. Kopf-zu-Kopf-Tandems oder Kopf-zu-Schwanz-Tandems, integriert werden. Das Transgen kann außerdem in einen bestimmten Zelltyp selektiv eingeführt und aktiviert werden, indem beispielsweise die Lehren von Lasko et al. (M. Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232–6236 (1992)) befolgt werden. Die für eine derartige zellspezifische Aktivierung erforderlichen Regulationssequenzen werden vom jeweiligen Zelltyp von Interesse abhängen und werden dem Fachmann offensichtlich sein. Wenn gewünscht ist, dass das p101-Transgen in die chromosomale Stelle des endogenen p101-Gens insertiert wird, wird Gen-Targeting bevorzugt. Zusammenfassend werden bei Einsatz einer derartigen Technik Vektoren konstruiert, die einige zum endogenen p101 homologe Nucleotidsequenzen enthalten, und zwar zum Zwecke der Integration über homologe Rekombination mit chromosomalen Sequenzen in das endogene p101-Gen sowie Unterbrechung der Funktion der Nucleotidsequenz des endogenen p101-Gens. Auf diese Weise kann die Expression des endogenen p101-Gens auch durch Insertieren nicht-funktioneller Sequenzen in das endogene Gen eliminiert werden. Das Transgen kann auch selektiv in einen bestimmten Zelltyp eingeführt werden und so das endogene p101-Gen in nur diesem Zelltyp inaktivieren, indem beispielsweise die Lehre von Gu et al. (Gu et al., Science 265, 103–106 (1994)) befolgt wird. Die für eine derartige zelltypspezifische Inaktivierung erforderlichen Regulationssequenzen werden vom jeweiligen Zelltyp von Interesse abhängen und werden dem Fachmann offensichtlich sein.
Wenn einmal transgene Tiere erzeugt worden sind, kann die Expression des rekombinanten p101-Gens unter Einsatz von Standardtechniken getestet werden. Ein anfängliches Screening kann durch Southern-Blot-Analyse oder PCR-Techniken erzielt werden, um tierische Gewebe zu analysieren, um zu testen, ob die Integration des Transgens aufgetreten ist. Das Ausmaß der mRNA-Expression des Transgens in den Geweben der transgenen Tiere kann auch unter Anwendung von Techniken festgestellt werden, die Northern-Blot-Analyse von aus dem Tier erlangten Zelltypproben, In-situ-Hybridisierungsanalyse und RT-PCR umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Proben von das p101-Gen exprimierendem Gewebe können wie unten beschrieben immunzytochemisch unter Verwendung von Antikörpern beurteilt werden, die für das p101-Transgenprodukt spezifisch sind.
5.3 ANTIKÖRPER GEGEN p101- UND p120-PROTEINE
Antikörper, die spezifisch ein oder mehrere Epitope der p101-Regulationsuntereinheit oder Epitope konservierter Varianten der p101-Regulationsuntereinheit oder Peptidfragmente der p101-Regulationsuntereinheit erkennen, sind in der Erfindung ebenfalls umfasst. Außerdem werden hierin Antikörper beschrieben, die ein oder mehrere Epitope des p120-Proteins, insbesondere den neuen Carboxylterminus, erkennen. Derartige Antikörper umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelkettenantikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, Fragmente, die durch eine Fab-Expressionsbibliothek gebildet werden, Anti-Idiotyp-(Anti-Id-) Antikörper und Epitop-bindende Fragmente aller obigen.
Die Antikörper der Erfindung können beispielsweise bei der Detektion der p101-Regulationsuntereinheit oder p120 in einer biologischen Probe verwendet werden und können daher als Teil einer Diagnose- oder Prognosetechnik eingesetzt werden, mit der Patienten auf abnormale Mengen dieser Proteine getestet werden können. Derartige Antikörper können auch in Verbindung mit beispielsweise Screening-Schemata für Verbindungen, wie unten im Abschnitt 5.5 beschrieben, für die Beurteilung der Wirkung von Testverbindungen auf die Expression und/oder Aktivität der p101- oder p120-Genprodukte eingesetzt werden. Zusätzlich können derartige Antikörper in Verbindung mit Gentherapietechniken verwendet werden, die unten im Abschnitt 5.6 beschrieben werden, um beispielsweise die normalen und/oder veränderten, die p101-Regulationsuntereinheit exprimierenden Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu evaluieren. Derartige Antikörper können außerdem als Verfahren zur Hemmung abnormaler p101-Regulationsuntereinheiten- oder p120-Aktivität verwendet werden. Folglich können derartige Antikörper daher als Teil von Behandlungsverfahren von entzündlichen Störungen eingesetzt werden.
Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit der p101-Regulationsuntereinheit, einem p101-Regulationsuntereinheitenpeptid, trunkierten p101-Regulationsuntereinheitenpolypeptiden, funktionellen Äquivalenten der p101-Regulationsuntereinheit oder Mutanten der p101-Regulationsuntereinheit immunisiert werden. Außerdem können Wirtstiere durch Injektion mit der p120-Katalyseeinheit oder Peptiden der p120-Untereinheit immunisiert werden. Derartige Wirtstiere umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Kaninchen, Mäuse und Ratten, um einige wenige zu nennen. Es können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Reaktion in Abhängigkeit von der Wirtsspezies zu steigern, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Freundsches (komplettes und inkomplettes) Adjuvans, Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie z.B. Lysolecithin, Pluronic-Alkohole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Dinitrophenol und potenziell zweckdienliche menschliche Adjuvantien, wie z.B. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) und Corynebacterium parvum. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren der immunisierten Tiere stammen.
Monoklonale Antikörper, die homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können durch jegliche Technik erlangt werden, die für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur sorgt. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Hybridomtechnik von Kohler und Milstein (Nature 256, 495–497 (1975); und US-Patent Nr. 4.376.110), die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kosbor et al., Immunology Today 4, 72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026–2030 (1983)) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96 (1985)). Derartige Antikörper können jeder Immunglobulinklasse angehören, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder Unterklasse davon. Die Hybridome, die die mAb dieser Erfindung produzieren, können in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion hoher Titer von mAbs in vivo macht diese zum gegenwärtig bevorzugten Produktionsverfahren.
Außerdem können Techniken verwendet werden, die für die Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452–454 (1985)), indem die Gene aus einem Maus-Antikörpermolekül geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül geeigneter biologischer Aktivität gespleißt werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem verschiedene Abschnitte aus verschiedenen Tierspezies stammen, wie z.B. jene, die eine von einem Schweine-mAb stammende variable Region und eine menschliche konstante Immunglobulinregion aufweisen.
Alternativ dazu können Techniken, die zur Produktion von Einzelkettenantikörpern beschrieben wurden (US-Patent Nr. 4.946.778; Bird, Science 242, 423–426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879–5883 (1988); und Ward et al., Nature 334, 544–546 (1989)) adaptiert werden, um Einzelkettenantikörper gegen p101-Genprodukte herzustellen. Einzelkettenantikörper werden durch Verbinden der Schwer- und Leichtkettenfragmente der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was in einem Einzelkettenpolypeptid resultiert.
Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Derartige Fragmente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, sowie die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können. Alternativ dazu können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., Science 246, 1275–1281 (1989)), um die rasche und einfache Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen.
Antikörper gegen die p101-Regulationsuntereinheit oder die p120-Katalyseuntereinheit können wiederum eingesetzt werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper zu erzeugen, die die p101-Regulationsuntereinheit bzw. p120-Untereinheit „nachahmen", und zwar unter Anwendung von Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind. (Siehe z.B. Greenspan und Bona, FASEB J. 7(5), 437–444 (1993); und Nissinoff, J. Immunol. 147(8), 2429–2438 (1991)). Beispielsweise können Antikörper, die an die p101-Regulationsuntereinheit binden und die Bindung der Katalyseuntereinheit an die p101-Regulationsuntereinheit kompetitiv hemmen, verwendet werden, um Anti-Idiotypen zu erzeugen, die die p101-Regulationsuntereinheit nachahmen und daher die Katalyseuntereinheit binden und neutralisieren. Derartige neutralisierende Anti-Idiotypen oder Fab-Fragmente derartiger Anti-Idiotypen können in therapeutischen Regimen verwendet werden, um die Katalyseuntereinheit zu neutralisieren und Entzündungen zu vermindern.
5.4 DIAGNOSE VON STÖRUNGEN DER AKTIVIERUNG HÄMATOPOETISCHER ZELLEN
Eine Vielzahl von Verfahren kann für die diagnostische und prognostische Evaluierung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich entzündlichen Störungen, und für die Identifizierung von Patienten eingesetzt werden, die eine Prädisposition für derartige Störungen aufweisen.
Derartige Verfahren können beispielsweise Reagenzien, wie z.B. oben beschriebene p101- und p120-Nuleotidsequenzen, und die p101-Regulationsuntereinheit und p120-Antikörper wie im Abschnitt 5.3 beschrieben einsetzen. Im Speziellen können derartige Reagenzien beispielsweise verwendet werden für: (1) die Detektion der Gegenwart von p101- oder p120-Genmutationen oder die Detektion von entweder Über- oder Unterexpression von p101- oder p120-mRNA im Vergleich zum Störungszustand der Aktivierung von Zellen der nicht-hämatopoetischen Linie; (2) die Detektion einer erhöhten oder erniedrigten Häufigkeit von p101- oder p120-Genprodukt im Vergleich zum Störungszustand der Aktivierung von Zellen der nicht-hämatopoetischen Linie; und (3) die Detektion von Störungen oder Abnormalitäten im von der p101-Regulationsuntereinheit und p120-Katalyseuntereinheit vermittelten Signaltransduktionsweg.
Die hierin beschriebenen Verfahren können beispielsweise unter Einsatz von vorverpackten Diagnosesets durchgeführt werden, die zumindest ein(e) hierin beschriebe ne(s) spezifische(s) p101- oder p120-Nucleotidsequenz oder p101- oder p120-Regulationsuntereinheiten-Antikörperreagens umfassen, die zweckdienlicherweise verwendet werden können, z.B. unter klinischen Gegebenheiten zur Diagnose von Patienten, die Abnormalitäten der Aktivierungsstörung von Zellen der hämatopoetischen Linie aufweisen.
Für den Nachweis von p101- und p120-Mutationen kann jede kernhaltige Zelle als Ausgangsquelle für genomische Nucleinsäure verwendet werden. Zum Nachweis von p101- und p120-Genexpression oder p101- oder p120-Genprodukten kann jeglicher/s Zelltyp oder Gewebe, in dem das p101- oder p120-Gen exprimiert wird, wie z.B. Neutrophilen-Zellen, eingesetzt werden.
Auf Nucleinsäure basierende Detektionstechniken werden unten im Abschnitt 5.4.1 beschrieben. Detektionstechniken für Peptide werden unten im Abschnitt 5.4.2 beschrieben.
5.4.1 DETEKTION VON p101-GEN UND -TRANSKRIPTEN
Mutationen innerhalb der p101- oder p120-Gene können unter Einsatz einer Anzahl von Techniken detektiert werden. Nucleinsäure aus jeglicher kernhaltigen Zelle kann als Ausgangspunkt für derartige Testtechniken verwendet werden und kann nach standardmäßigen Nucleinsäurepräparationsverfahren isoliert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
DNA kann in Hybridisierungs- oder Amplifikationstests biologischer Proben verwendet werden, um Abnormalitäten zu detektieren, die die Genstruktur umfassen, einschließlich Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und chromosomale Umordnungen. Derartige Tests können Southern-Analysen, Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analysen (SSCP) und PCR-Analysen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Derartige Diagnoseverfahren zur Detektion von p101- oder p120-Gen-spezifischen Mutationen können beispielsweise das Kontaktieren und Inkubieren von Nucleinsäuren, einschließlich rekombinanten DNA-Molekülen, klonierten Genen der degenerierten Varianten davon, die aus einer Probe erlangt wurden, z.B. von einer Patientenprobe oder anderen geeigneten Quelle stammen, mit einer oder mehreren markierten Nucleinsäurereagenzien, einschließlich rekombinanten DNA-Molekülen, klonierten Genen oder degenerierten Varianten davon wie oben beschrieben, unter Bedingungen umfassen, die für die spezifische Anellierung dieser Reagenzien an ihre komplementären Sequenzen im p101- oder p120-Gen günstig sind. Vorzugsweise beträgt die Länge dieser Nucleinsäurereagenzien zumindest 15 bis 30 Nucleotide. Nach der Inkubation werden alle nicht anellierten Nucleinsäuren aus der Nucleinsäuremolekülhybride entfernt. Die Gegenwart von Nucleinsäuren, die hybridisiert haben, wird dann, falls irgendwelche derartigen Moleküle existieren, detektiert. Unter Anwendung eines derartigen Detektionsschemas kann die Nucleinsäure aus dem Zelltyp oder Gewebe von Interesse beispielsweise an einen festen Träger, wie z.B. eine Membran oder eine Kunststoffoberfläche, wie z.B. an einer Mikrotiterplatte oder an Polystyrolperlen, immobilisiert werden. In diesem Fall können nach der Inkubation nicht anellierte, markierte Nucleinsäurereagenzien des oben beschriebenen Typs leicht entfernt werden. Die Detektion der verbleibenden, anellierten, markierten p101- oder p120-Nucleinsäurereagenzien wird unter Anwendung von Standardtechniken erzielt, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Die p101- oder p120-Gensequenzen, an die die Nucleinsäurereagenzien anelliert haben, können mit dem Anellierungsmuster verglichen werden, das von einer normalen Gensequenz erwartet wird, um zu ermitteln, ob eine Genmutation zugegen ist.
Alternative Diagnoseverfahren zur Detektion von p101- oder p120-Gen-spezifischen Nucleinsäuremolekülen in Patientenproben oder anderen geeigneten Zellquellen können ihre Amplifikation, z.B. mittels PCR, umfassen (die in K.B. Mullis, US-Patent Nr. 4.683.202 (1987) dargelegte experimentelle Ausführungsform), gefolgt von der Detektion der amplifizierten Moleküle unter Anwendung von Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Die resultierenden amplifizierten Sequenzen können mit jenen verglichen werden, die zu erwarten wären, wenn die amplifizierte Nuclein säure nur normale Kopien des p101- oder p120-Gens enthielte, um zu ermitteln, ob eine Genmutation vorhanden ist.
Außerdem können wohlbekannte genetische Diagnosetechniken durchgeführt werden, um Individuen zu identifizieren, die p101- oder p120-Genmutationen tragen. Derartige Techniken umfassen beispielsweise die Verwendung von Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs), die Sequenzvariationen in einer der Erkennungsstellen für das speziell verwendete Restriktionsenzym umfassen.
Das Ausmaß der p101- oder p120-Genexpression kann auch durch Detektieren und Messen der p101- oder p120-Transkription getestet werden. Beispielsweise kann RNA aus einem Zelltyp oder Gewebe, der/das bekanntermaßen oder mutmaßlich das p101- oder p120-Gen exprimiert, wie z.B. Zellen der hämatopoetischen Linie, insbesondere Knochenmarkzellen und Blutplättchen, unter Einsatz von Hybridisierungs- oder PCR-Techniken, wie sie oben beschrieben sind, isoliert und getestet werden. Die Zellen können aus der Zellkultur oder aus einem Patienten stammen. Die Analyse von einer Kultur entnommenen Zellen kann ein notwendiger Schritt bei der Beurteilung von Zellen sein, die als Teil einer auf Zellen basierenden Gentherapietechnik zu verwenden sind, oder, alternativ dazu, um die Wirkung von Verbindungen auf die Expression des p101- oder p120-Gens zu testen. Derartige Analysen könnten quantitative sowie qualitative Aspekte des Expressionsmusters des p101- oder p120-Gens offenbaren, einschließlich die Aktivierung oder Inaktivierung der p101- oder p120-Genexpression.
5.4.2 DETEKTION DER p101-GENPRODUKTE
Gegen Wildform oder mutierte p101- oder p120-Genprodukte oder konservierte Varianten oder Peptidfragmente davon gerichtete Antikörper, die oben im Abschnitt 5.3 erörtert sind, können ebenfalls als Diagnostika oder Prognostika für die Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie verwendet werden, wie hierin beschrieben wird. Derartige Diagnoseverfahren können verwendet werden, um Abnormalitäten im Ausmaß der p101- oder p120-Genexpression oder Abnormalitäten in der Struktur und/oder zeitlichen, Gewebe-, zellulären oder subzellulären Lokalisation der p101-Regulationsuntereinheit zu detektieren, und können in vivo oder in vitro, wie z.B. an Biopsiegewebe, durchgeführt werden.
Das/der zu analysierende Gewebe oder Zelltyp wird im Allgemeinen jene umfassen, die bekanntermaßen oder mutmaßlich Zellen enthalten, die das p101- oder p120-Gen exprimieren, wie z.B. Neutrophilen-Zellen, die das entzündete Gewebe infiltriert haben. Die hierin eingesetzten Proteinisolierungsverfahren können beispielsweise jene sein, die in Harlow und Lane (E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)) beschrieben sind, was hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen ist. Die isolierten Zellen können aus Zellkultur oder aus einem Patienten stammen. Die Analyse von Zellen, die aus einer Kultur entnommen wurden, kann ein notwendiger Schritt bei der Beurteilung von Zellen sein, die als Teil einer auf Zellen basierenden Gentherapietechnik verwendet werden könnten, oder, alternativ dazu, um die Wirkung von Verbindungen auf die Expression des p101- oder p120-Gens zu testen.
Beispielsweise können Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, wie z.B. jene, die oben im Abschnitt 5.3 beschrieben und in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, verwendet werden, um quantitativ oder qualitativ die Gegenwart von p101- oder p120-Genprodukten oder konservierten Varianten oder Peptidfragmenten davon zu detektieren. Dies kann beispielsweise durch Immunfluoreszenztechniken erzielt werden, die einen fluoreszierend markierten Antikörper (siehe unten, dieser Abschnitt) gekoppelt mit lichtmikroskopischer, durchflusszytometrischer oder fluorometrischer Detektion einsetzen.
Die Antikörper (oder Fragmente davon) oder Fusions- oder konjugierten Proteine, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, können außerdem histologisch eingesetzt werden, wie z.B. bei Immunfluoreszenz-, Immunelektronenmikroskopie oder Nicht-Immuntests, und zwar für die In-situ-Detektion von p101- oder p120-Genprodukten oder konservierten Varianten oder Peptidfragmenten davon oder für die Katalyseuntereinheitenbindung (im Falle eines markierten Katalyseuntereinheiten-Fusionsproteins).
In-situ-Detektion kann erzielt werden, indem eine histologischen Probe aus einem Patienten entfernt und ein markierter/s Antikörper oder Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung auf diesen/s aufgegeben wird. Der Antikörper (oder das Fragment) oder das Fusionsprotein wird vorzugsweise durch Überschichten einer biologischen Probe mit dem markierten Antikörper (oder Fragment) aufgegeben. Durch Anwenden eines derartigen Verfahrens ist es möglich, nicht nur die Gegenwart des p101- oder p120-Genprodukts oder konservierter -Varianten oder -Peptidfragmente zu ermitteln, sondern auch ihre Verteilung im untersuchten Gewebe. Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann leicht erkennen, dass ein beliebiges einer breiten Vielfalt von biologischen Verfahren (wie z.B. Färbeverfahren) modifiziert werden kann, um einer derartige In-situ-Detektion zu erzielen.
Immuntests und Nicht-Immuntests für p101- oder p120-Genprodukte oder konservierte Varianten oder Peptidfragmente davon werden typischerweise das Inkubieren einer Probe, wie z.B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Gewebeextrakts, frisch geernteter Zellen oder von Lysaten von Zellen, die in Zellkultur inkubiert worden sind, in Gegenwart eines nachweisbar markierten Antikörpers, der in der Lage ist, p101- oder p120-Genprodukte oder konservierte Varianten oder Peptidfragmente davon zu identifizieren, und das Detektieren des gebundenen Antikörpers durch eine beliebige einer Anzahl von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken umfassen.
Die biologische Probe kann mit einem Festphasenträger, wie z.B. Nitrocellulose oder einem anderen festen Träger, in Kontakt gebracht und daran immobilisiert werden, der in der Lage ist, Zellen, Zellteilchen oder lösliche Proteine zu immobilisieren. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt von Behandlung mit dem nachweisbar markierten p101-Regulationsuntereinheiten- oder p120-Untereinheiten-Antikörper oder -Fusionsprotein. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um ungebundenen/s Antikörper oder Fusionsprotein zu entfernen. Die Menge an gebundener Markierung am festen Träger kann dann mit herkömmlichen Mitteln detektiert werden.
„Festphasenträger" umfasst jeglichen Träger, der in der Lage ist, ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbro und Magnetit. Die Beschaffenheit des Trägers kann entweder in gewissem Ausmaß löslich oder unlöslich zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sein. Das Trägermaterial kann nahezu jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, solange das gekoppelte Molekül fähig ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden. Folglich kann die Struktur des Trägers kugelförmig sein, wie bei einer Perle, oder zylindrisch, wie bei der Innenoberfläche eines Teströhrchens oder Außenfläche eines Stäbchens. Alternativ dazu kann die Oberfläche flach sein, wie z.B. ein Blatt, Teststreifen usw. Bevorzugte Träger umfassen Polystyrolperlen. Der Fachmann wird viele andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörpern oder Antigenen kennen oder wird in der Lage sein, dieselben durch Anwendung routinemäßiger Experimente zu ermitteln.
Die Bindungsaktivität einer gegebenen Charge eines p101-Regulationsuntereinheiten- oder p120-Untereinheiten-Antikörpers oder -Fusionsproteins kann nach wohlbekannten Verfahren ermittelt werden. Der Fachmann wird in der Lage sein, die operativen und optimalen Testbedingungen für jede Bestimmung durch Einsetzen routinemäßiger Experimente zu ermitteln.
In Bezug auf Antikörper ist eine der Art und Weisen, auf die der Antikörper nachweisbar markiert werden kann, die Bindung desselben an ein Enzym und die Verwendung in einem Enzymimmuntest (EIA) (Voller, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2, 1–7 (1978), Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al., J. Clin. Pathol. 31, 507–520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73, 482–523 (1981); Maggio (Hrsg.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL (1980); Ishikawa et al. (Hrsg.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)). Das Enzym, das an den Antikörper gebunden ist, wird mit einem geeigneten Substrat, vorzugsweise einem chromogenen Substrat, in einer Weise reagieren, dass eine chemische Gruppierung produziert wird, die detektiert werden kann, beispielsweise durch spektrophotometrische, fluorometrische oder visuelle Mittel. Enzyme, die verwendet werden können, um den Antikörper nachweisbar zu markieren, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Malatdehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease, Delta-5-steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, Alpha-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase. Die Detektion kann durch kolorimetrische Verfahren erzielt werden, die ein chromogenes Substrat für das Enzym einsetzen. Die Detektion kann auch durch visuellen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit ähnlich hergestellten Standards erzielt werden.
Eine Detektion kann außerdem unter Anwendung einer Vielzahl anderer Immuntests erzielt werden. Beispielsweise ist es durch radioaktives Markieren der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, die p101-Regulationsuntereinheit durch die Anwendung eines Radioimmuntests (RIA) zu detektieren (siehe beispielsweise B. Weintraub, Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, die hierin durch Verweis aufgenommen ist). Das radioaktive Isotop kann durch derartige Mittel wie die Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder mittels Autoradiographie detektiert werden.
Es ist außerdem möglich, den Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn der fluoreszierend markierte Antikörper Licht geeigneter Wellenlänge exponiert wird, kann seine Gegenwart dann aufgrund von Fluoreszenz detektiert werden. Unter den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen finden sich Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch unter Verwendung von Fluoreszenz-emittierenden Metallen, wie z.B. ¹⁵²Eu und anderen der Lanthanoidenreihe, nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung derartiger metallkomplexierender Gruppen wie z.B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) an den Antikörper gebunden werden.
Der Antikörper kann außerdem durch dessen Koppelung an eine chemilumineszierende Verbindung nachweisbar markiert werden. Die Gegenwart des chemilumineszierend markierten Antikörpers wird dann durch Detektieren der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt, die während des Verlaufs einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele von besonders zweckdienlichen chemilumineszierenden Markierungsverbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz oder -oxalatester.
Gleichermaßen kann eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um den Antikörper der vorliegenden Erfindung zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die sich in biologischen Systemen findet, bei denen ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszierenden Reaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszierenden Proteins wird durch Detektieren der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen zum Zwecke der Markierung sind Luciferin, Luciferase und Äquorin.
5.5 SCREENINGTESTS FÜR VERBINDUNGEN, DIE DIE G-PROTEIN-AKTIVIERTE EXPRESSION ODER AKTIVITÄT VON PI3K MODULIEREN
Die folgenden Tests sind konstruiert, um Verbindungen zu identifizieren, die mit der p101-Regulationsuntereinheit oder der p120-Katalyseuntereinheit wechselwirken (z.B. daran binden), Verbindungen, die mit intrazellulären Proteinen wechselwirken (z.B. daran binden), die mit der p101-Regulationsuntereinheit und/oder der p120-Katalyseuntereinheit wechselwirken, Verbindungen, die die Wechselwirkung der p101-Regulationsuntereinheit mit der p120-Katalyseuntereinheit oder mit anderer intrazellulären Proteinen stören, die an der G-Protein-stimulierten PI3K-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, sowie Verbindungen, die die Aktivität des p101- oder p120-Gens modulieren (d.h. das Ausmaß an p101- oder p120-Genexpression modulieren) oder die Menge von p101 oder p120 modulieren. Es können zusätzlich Tests eingesetzt werden, die Verbindungen identifizieren, die an p101- und p120-Genregulationssequenzen (z.B. Promotorsequenzen) binden und die die p101- oder p120-Genexpression modulieren können. Siehe z.B. K.A. Platt, J. Biol. Chem. 269, 28558–28562 (1994).
Die Verbindungen, die gemäß der Erfindung gescreent werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Peptide, Antikörper und Fragmente davon, Prostaglandine, Lipide und andere organische Verbindungen (z.B. Terpine, Peptidomimetika), die an die p101-Regulationsuntereinheit oder p120-Katalyseuntereinheit binden und entweder die von einem natürlichen Liganden ausgelöste Aktivität nachahmen (d.h. Agonisten) oder die von einem natürlichen Liganden ausgelöste Aktivität hemmen (d.h. Antagonisten); sowie Peptide, Antikörper oder Fragmente davon und andere organische Verbindungen, die die p101-Regulationsuntereinheit oder p120-Katalyseuntereinheit (oder einen Abschnitt davon) nachahmen und an einen natürlichen Liganden binden und diesen „neutralisieren".
Derartige Verbindungen können die folgenden umfassen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt: Peptide, wie z.B. lösliche Peptide, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Elemente von Zufalls-Peptidbibliotheken (siehe z.B. K.S. Lam, Nature 354, 82–84 (1991); R. Houghten et al., Nature 354, 84–86 (1991)) und Peptide aus molekularen, aus der kombinatorischen Chemie stammenden Bibliotheken, die aus D- und/oder L-Konfiguration-Aminosäuren bestehen, Phosphopeptide (einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Elemente von Zufalls- oder partiell degenerierten, gerichteten Phosphopeptid-Bibliotheken); Antikörper (einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, polyklonale, monoklonale, humanisierte, anti-idiotypische, chimäre oder Einzelketten-Antikörper und FAb-, F(ab')₂- und FAb-Expressionsbibliothekfragmente und Epitop-bindende Fragmente davon); und kleine organische und anorganische Moleküle.
Andere Verbindungen, die gemäß der Erfindung gescreent werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine organische Moleküle, die in der Lage sind, sich Zutritt zu einer geeigneten Zelle (z.B. zu einem Neutrophilen) zu verschaffen und die Expression des p101- oder p120-Gens oder eines anderen Gens zu beeinflussen, das am Signaltransduktionsweg der p101-Regulationsuntereinheit oder p120-Katalyseuntereinheit beteiligt ist (z.B. durch Wechselwirken mit der Regulationsregion oder Transkriptionsfaktoren, die an der Genexpression beteiligt sind); oder derartige Verbindungen, die die Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit beeinflussen, z.B. durch Hemmen oder Verstärken der Bindung von p101 an die Katalyseuntereinheit der PI3K oder die Bindung von p101 oder eines anderen intrazellulären Faktors, der am Signaltransduktionsweg der p101-Regulationsuntereinheit beteiligt ist, wie z.B. Gβγ.
Computermodellierungs- und Suchtechnologien ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen oder die Verbesserung von bereits identifizierten Verbindungen, die die Expression oder Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit oder p120-Katalyseuntereinheit modulieren können. Nach Identifizierung einer derartigen Verbindung oder Zusammensetzung werden die aktiven Stellen oder Regionen identifiziert. Derartige aktiven Stellen könnten typischerweise die Bindungspartnerstellen sein, wie z.B. die Wechselwirkungsdomänen der p120-Katalyseuntereinheit mit der p101-Regulationsuntereinheit selbst. Die aktive Stelle kann unter Anwendung von Verfahren identifiziert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. aus den Aminosäuresequenzen von Peptiden, aus den Nucleinsäuresequenzen von Nucleinsäuren oder aus der Untersuchung von Komplexen der maßgeblichen Verbindung oder Zusammensetzung mit seinem natürlichen Liganden. Im letzteren Fall können Verfahren der Röntgenstrahlenkristallographie angewendet werden, um die aktive Stelle zu finden, indem herausgefunden wird, wo am Faktor sich der komplexierte Ligand befindet.
Als Nächstes wird die dreidimensionale geometrische Struktur der aktiven Stelle ermittelt. Dies kann mittels bekannten Verfahren, einschließlich Röntgenstrahlenkristal lographie, durchgeführt werden. Andererseits kann Festphasen- oder Flüssigphasen-NMR verwendet werden, um bestimmte intramolekulare Abstände zu bestimmen. Jegliches andere experimentelle Verfahren der Strukturbestimmung kann angewendet werden, um partielle oder vollständige geometrische Strukturen zu erlangen. Die geometrischen Strukturen können mit einem komplexierten Liganden gemessen werden, der natürlich oder künstlich sein kann, was die Genauigkeit der ermittelten Struktur der aktiven Stelle erhöhen kann.
Falls eine unvollständige oder eine nicht ausreichend genaue Struktur ermittelt wird, können die Verfahren der computerbasierten numerischen Modellierung verwendet werden, um die Struktur zu vervollständigen oder ihre Genauigkeit zu verbessern. Es kann ein beliebiges anerkanntes Modellierungsverfahren verwendet werden, einschließlich parametrisierte Modelle, die auf bestimmte Biopolymere, wie z.B. Proteine oder Nucleinsäure, spezialisiert sind, Moleküldynamikmodelle auf Basis der Berechnung von Molekülbewegungen, statistische Mechanikmodelle auf Basis der thermischen Gesamtheit oder kombinierte Modelle. Für die meisten Modelltypen sind standardmäßige Molekülkraftfelder, die die Kräfte zwischen konstituierenden Atomen und Gruppen darstellen, notwendig und können aus Kraftfeldern ausgewählt werden, die aus der physikalischen Chemie bekannt sind. Die unvollständigen oder weniger genauen experimentellen Strukturen können als Zwangsbedingung für die vollständigen und genaueren Strukturen dienen, die aus diesen Modellierungsverfahren errechnet wurden.
Schließlich können nach der experimentell, durch Modellierung oder durch eine Kombination ermittelten Struktur der aktiven Stelle modulierende Kandidatverbindungen mittels Durchsuchen von Datenbanken identifiziert werden, die Verbindungen gemeinsam mit anderen Informationen über ihre molekulare Struktur enthalten. Eine derartige Suche sucht nach Verbindungen mit Strukturen, die mit der ermittelten Struktur der aktiven Stelle übereinstimmen und die mit den die aktive Stellen definierenden Gruppen Wechselwirken. Eine derartige Suche kann manuell sein, ist jedoch vorzugsweise computerunterstützt. Diese Verbindungen, die aus dieser Suche her vorgehen, sind dann potenzielle G-Protein-aktivierte PI3K-modulierende Verbindungen.
Alternativ dazu können diese Verfahren verwendet werden, um verbesserte modulierende Verbindungen aus einer/m bereits bekannten modulierenden Verbindung oder Liganden zu identifizieren. Die Zusammensetzung der bekannten Verbindung kann modifiziert werden, und die strukturellen Wirkungen der Modifikation können unter Anwendung der oben beschriebenen und auf die neuen Zusammensetzungen angewendeten experimentellen Verfahren und Computermodellierungsverfahren ermittelt werden. Die veränderte Struktur wird dann mit der Struktur der aktiven Stelle der Verbindung verglichen, um zu ermitteln, ob sich eine verbesserte Passung oder Wechselwirkung ergibt. Auf diese Weise können systematische Variationen der Zusammensetzung, wie z.B. durch Variieren der Seitengruppen, rasch evaluiert werden, um modifizierte modulierende Verbindungen oder Liganden verbesserter Spezifität oder Aktivität zu erlangen.
Weitere experimentelle und Computermodellierungsverfahren, die zur Identifizierung modulierender Verbindungen auf Basis der Identifizierung der aktiven Stellen von p120-Katalyseuntereinheit, p101-Regulationsuntereinheit und verwandten Transduktions- und Transkriptionsfaktoren zweckdienlich sind, sind dem Fachmann offensichtlich.
Beispiele von Molekülmodellierungssystemen sind die Programme CHARMm und QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm führt die Energieminimierungs- und Moleküldynamikfunktionen aus. QUANTA führt die Konstruktion, grafische Modellierung und Analyse der Molekülstruktur aus. QUANTA ermöglicht die interaktive Konstruktion, Modifikation, Visualisierung und Analyse des Verhaltens von Molekülen untereinander.
Eine Anzahl von Publikationen behandeln im Überblick die Computermodellierung von Wirkstoffen, die mit bestimmten Proteinen wechselwirken, wie z.B. Rotivinen et al., Acta Pharmaceutical Fennica 97, 159–166 (1988); Ripka, New Scientist 54–57 (16. Juni 1988); McKinaly und Rossmann, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 111–122 (1989); Perry und Davies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design, Alan R. Liss, Inc., S.189–193 (1989); Lewis und Dean, Proc. R. Soc. Lond. 236, 125–140 und 141–162 (1989); und in Bezug auf einen Modellrezeptor für Nucleinsäurekomponenten, Askew et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 1082–1090 (1989). Andere Computerprogramme, die Chemikalien screenen und grafisch darstellen, sind von Firmen, wie z.B. BioDesign, Inc. (Pasadena, CA), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada) und Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario), erhältlich. Obgleich diese in erster Line zur Anwendung auf Wirkstoffe ausgelegt sind, die für bestimmte Proteine spezifisch sind, können sie für die Konstruktion von Wirkstoffen adaptiert werden, die für Regionen von DNA oder RNA spezifisch sind, wenn diese Region einmal identifiziert ist.
Obgleich oben in Bezug auf Konstruktion und Erzeugung von Verbindungen beschrieben, die die Bindung verändern könnten, könnte man auch Bibliotheken von bekannten Verbindungen, einschließlich natürlichen Produkten oder synthetischen Chemikalien und biologisch aktiven Materialien, einschließlich Proteinen, auf Verbindungen screenen, die Hemmstoffe oder Aktivatoren sind.
Verbindungen, die über Tests wie die hierin beschriebenen identifiziert wurden, könnten beispielsweise bei der Ausarbeitung der Funktion des p101- oder p120-Gens und für die Besserung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zweckdienlich sein. Tests zum Testen der Wirksamkeit von Verbindungen, die beispielsweise durch Techniken, wie z.B. jene in den Abschnitten 5.5.1 bis 5.5.3 beschriebenen, identifiziert worden sind, werden unten im Abschnitt 5.5.4 erörtert.
5.5.1 In-vitro-SCREENINGTESTS FÜR VERBINDUNGEN, DIE AN DIE p101-REGULATIONSUNTEREINHEIT BINDEN
Es können In-vitro-Systeme konstruiert werden, um Verbindungen zu identifizieren, die zur Wechselwirkung mit einer (z.B. Bindung an eine) p101-Regulationsunter einheit oder p120-Katalyseuntereinheit fähig sind. Identifizierte Verbindungen können beispielsweise bei der Modulation der Aktivität von mutierten p101- oder p120-Genprodukten oder jenen der Wildform zweckdienlich sein; können für das Screening zum Identifizieren von Verbindungen eingesetzt werden, die die normalen Wechselwirkungen der p101-Regulationsuntereinheit oder p120-Katalyseuntereinheit unterbrechen; oder können selbst derartige Wechselwirkungen unterbrechen.
Das Prinzip der Tests, die zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die an die p101-Regulationsuntereinheit binden, umfasst das Herstellen eines Reaktionsgemischs der p101-Regulationsuntereinheit und der Testverbindung unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichten, um zu ermöglichen, dass die beiden Komponenten wechselwirken und binden und so einen Komplex bilden, der entfernt und/oder im Reaktionsgemisch detektiert werden kann. Die verwendete p101-Regulationsuntereinheitenspezies kann in Abhängigkeit vom Ziel des Screeningtests variieren. Wo beispielsweise Agonisten des natürlichen Liganden gesucht werden, kann die p101-Regulationsuntereinheit voller Länge oder ein Fusionsprotein eingesetzt werden, das die p101-Regulationsuntereinheit an ein Protein oder Polypeptid fusioniert enthält, das Vorteile im Testsystem liefert (z.B. Markierung, Isolierung des resultierenden Komplexes usw.).
Die Screeningtests können auf eine Vielzahl von Art und Weisen durchgeführt werden. Beispielsweise würde eines der Verfahren zur Durchführung eines derartigen Tests das Verankern des p101-Regulationsuntereinheitenproteins, -polypeptids, -peptids oder -fusionsproteins oder der Testsubstanz auf einer Festphase und das Detektieren von p101-Regulationuntreinheiten/Testverbindungs-Komplexen umfassen, die am Ende der Reaktion an der Festphase verankert sind. In einer der Ausführungsformen eines derartigen Verfahrens kann der p101-Regulationsuntereinheitenreaktant an einer Festphase verankert sein, und die Testverbindung, die nicht verankert ist, kann entweder direkt oder indirekt markiert sein. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird ein an der Festphase verankertes p101-Regulationsuntereinheitenprotein mit einer markierten Katalyseuntereinheit, wie z.B. p120, komplexiert. Dann könnte eine Testverbindung auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Assoziation des p101/p120-Komplexes aufzuspalten.
In der Praxis können Mikrotiterplatten zweckdienlicherweise als Festphase verwendet werden. Die verankerte Komponente kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindungen immobilisiert werden. Die nicht-kovalente Bindung kann erzielt werden, indem die feste Oberfläche einfach mit einer Lösung des Proteins beschichtet und getrocknet wird. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende Protein spezifisch ist, verwendet werden, um das Protein an der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können im Voraus hergestellt und gelagert werden.
Um den Test auszuführen, wird die nicht immobilisierte Komponente zu der die verankerte Komponente enthaltenden beschichteten Oberfläche zugegeben. Nachdem die Reaktion beendet ist, werden nicht umgesetzte Komponenten entfernt (z.B. durch Waschen), und zwar unter Bedingungen, so dass jegliche gebildeten Komplexe an der festen Oberfläche immobilisiert verbleiben. Die Detektion von an der festen Oberfläche verankerten Komplexen kann auf zahlreiche Weisen erzielt werden. Wo die vorher nicht immobilisierte Komponente vormarkiert ist, zeigt die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wo die vorher nicht immobilisierte Komponente nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um an der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren; z.B. unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der für die vorher nicht immobilisierte Komponente spezifisch ist (der Antikörper wiederum kann mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper direkt markiert oder indirekt markiert sein).
Alternativ dazu kann die Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt, die Reaktionsprodukte von nicht umgesetzten Komponenten abgetrennt und Komplexe detektiert werden; z.B. unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der für p101-Regulationsuntereinheitenprotein, -polypeptid, -peptid oder -fusionsprotein oder das Katalysedomänenuntereinheitenprotein oder -fusionsprotein oder die Testverbindung spezifisch ist, um jegliche in Lösung gebildeten Komplexe zu verankern, sowie eines markierten Antikörpers, der für die andere Komponente des möglichen Komplexes spezifisch ist, um verankerte Komplexe zu detektieren.
5.5.2 TESTS FÜR INTRAZELLULÄRE PROTEINE DIE MIT DEN p101- ODER p120-PROTEINEN WECHSELWIRKEN
Jegliches zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen geeignete Verfahren kann zur Identifizierung von intrazellulären Proteinen eingesetzt werden, die mit der p101-Regulationsuntereinheit und/oder p120-Katalyseuntereinheit wechselwirken. Unter den herkömmlichen Verfahren, die eingesetzt werden können, sind Co-Immunpräzipitation, Vernetzung und gemeinsame Reinigung über Gradienten oder chromatographische Säulen von Zelllysaten oder Proteinen, die aus Zelllysaten erlangt wurden, und der p101-Regulationsuntereinheit, um Proteine im Lysat zu identifizieren, die mit der p101-Regulationsuntereinheit wechselwirken. Für diese Tests kann die verwendete p101-Regulationsuntereinheitenkomponente eine p101-Regulationsuntereinheit voller Länge oder ein trunkiertes Peptid sein. Gleichermaßen kann die Komponente eine p120-Katalyseuntereinheit oder ein Komplex der p101-Regulationsuntereinheit mit der p120-Katalyseuntereinheit sein. Wenn es einmal isoliert ist, kann ein derartiges intrazelluläres Protein identifiziert werden und kann wiederum, in Verbindung mit Standardtechniken, verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, mit denen es wechselwirkt. Beispielsweise kann zumindest ein Abschnitt der Aminosäuresequenz eines intrazellulären Proteins, das mit der p101-Regulationsuntereinheit, PI3K (p101/p120-Komplex) oder p120-Katalyseuntereinheit wechselwirkt, unter Anwendung von Techniken ermittelt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie z.B. über die Edman-Abbau-Technik (siehe z.B. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., S. 34–49 (1983)). Die erlangte Aminosäuresequenz kann als Anhaltspunkt für die Erzeugung von Oligonucleotidgemischen verwendet werden, die zum Screening auf Gensequenzen verwendet werden können, die für derartige intrazelluläre Proteine kodieren. Das Screening kann beispielsweise durch standardmäßige Hybridisierungs- oder PCR-Techniken bewerkstelligt werden. Techniken zur Erzeugung von Oligonucleotidgemischen und Screening sind wohlbekannt. (Siehe z.B. Ausubel, siehe oben, und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. Innis et al. (Hrsg.), Academic Press, Inc., New York (1990).) Außerdem können Verfahren eingesetzt werden, die in der gleichzeitigen Identifizierung von Genen resultieren, die für die mit der p101-Regulationsuntereinheit und/oder p120-Katalyseuntereinheit und/oder die PI3K wechselwirkenden intrazellulären Proteine kodieren. Diese Verfahren umfassen beispielsweise das Sondieren von Expressionsbibliotheken auf eine der wohlbekannten Technik der Antikörpersondierung von λgt11-Bibliotheken ähnlichen Weise unter Verwendung von markiertem p101-Regulationsuntereinheitenprotein oder einem p101-Regulationsuntereinheitenpolypeptid, -peptid oder -fusionsprotein, z.B. einem p101-Regulationsuntereinheitenpolypeptid oder einer p101-Regulationsuntereinheitendomäne, fusioniert an einen Marker (z.B. ein Enzym, Fluorophor, lumineszierendes Protein oder einen Farbstoff), oder einer Ig-Fc-Domäne.
Eines der Verfahren, das Proteinwechselwirkungen in vivo detektiert, das Zwei-Hybriden-Verfahren, wird ausführlich nur zur Illustration und nicht zur Einschränkung beschrieben. Eine der Versionen dieses Systems ist beschrieben worden (Chein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)) und ist im Handel von Clontech (Palo Alto, CA) erhältlich.
Zusammenfassend werden unter Einsatz eines derartigen Systems Plasmide konstruiert, die für zwei Hybridproteine kodieren: eines der Plasmide besteht aus Nucleotiden, die für die DNA-bindende Domäne eines Transkriptionsaktivatorproteins kodieren, das an eine p101-Nucleotidsequenz fusioniert ist, die für eine p101-Regulationsuntereinheit, ein p101-Regulationsuntereinheitenpolypeptid, -peptid oder -fusionsprotein kodiert, und das andere Plasmid besteht aus Nucleotiden, die für Transkriptionsaktivatorprotein-Aktivierungsdomäne kodiert, die an eine cDNA fusioniert ist, die für ein unbekanntes Protein kodiert, das in dieses Plasmid als Abschnitt einer cDNA-Bibliothek rekombiniert worden ist. Das DNA-Bindungsdomänenfusionsplasmid und die cDNA-Bibliothek werden in einen Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert, der ein Reportergen enthält (z.B. HBS oder lacZ), dessen Regulationsregion die Bindungsstelle des Transkriptionsaktivators enthält. Keines der beiden Proteine alleine kann die Transkription des Reportergens aktivieren; die DNA-Bindungsdomänenhybride kann es nicht, da sie keine Aktivierungsfunktion bereitstellt, und die Aktivierungsdomänenhybride kann es nicht, da sie die Bindungsstellen des Aktivators nicht lokalisieren kann. Die Wechselwirkung der beiden Hybridproteine stellt das funktionelle Aktivatorprotein wieder her und resultiert in der Expression des Reportergens, das durch einen Test für das Reportergenprodukt detektiert wird.
Das Zwei-Hybriden-System oder eine ähnliche Methodik kann verwendet werden, um Aktivierungsdomänenbibliotheken auf Proteine zu screenen, die mit dem „Köder"-Genprodukt wechselwirken. Beispielhaft und zur Einschränkung kann die p101-Regulationsuntereinheit als das Köder-Genprodukt verwendet werden. Gesamtgenom- oder -cDNA-Sequenzen werden an die für eine Aktivierungsdomäne kodierende DNA fusioniert. Diese Bibliothek und ein Plasmid, das für eine Hybride eines Köder-p101-Genprodukts, fusioniert an die DNA-Bindungsdomäne, kodiert, werden in einen Hefe-Reporterstamm cotransformiert und die resultierenden Transformanten auf jene gescreent, die das Reportergen exprimieren. Beispielhaft und nicht zur Einschränkung kann eine Köder-p101-Gensequenz, wie z.B. das in 1 dargestellte offene Leseraster von p101 (oder einer Domäne von p101), so in einen Vektor kloniert werden, dass sie translationell an die DNA fusioniert wird, die für die DNA-bindende Domäne des GAL4-Proteins kodiert. Diese Kolonien werden gereinigt und die für die Expression des Reportergens verantwortlichen Bibliotheksplasmide der Bibliothek isoliert. DNA-Sequenzierung wird dann angewendet, um die von den Bibliothekplasmiden kodierten Proteine zu identifizieren.
Eine cDNA-Bibliothek der Zelllinie, aus der Proteine zu detektieren sind, die mit dem Köder-p101-Genprodukt wechselwirken, kann unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig praktiziert werden. Gemäß dem beispielsweise hierin beschriebenen speziellen System können die cDNA-Fragmente so in einen Vektor insertiert werden, dass sie translationell an die transkriptionelle Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert werden. Diese Bibliothek kann gemeinsam mit dem Köder-p101-Gen-GAL4-Fusionsplasmid in einen Hefestamm cotransfiziert werden, der ein lacZ-Gen enthält, der von einem Promotor angetrieben wird, der die GAL4-Aktivierungssequenz enthält. Ein cDNA-kodiertes Protein, fusioniert an eine GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne, die mit dem Köder-p101-Genprodukt wechselwirkt, wird ein aktives GAL4-Protein wiederherstellen und dadurch die Expression des HIS3-Gens antreiben. Kolonien, die HIS3 exprimieren, können aufgrund ihres Wachstums auf Petrischalen detektiert werden, die ein auf halbfestem Agar basierendes Medium enthalten, dem Histidin fehlt. Die cDNA kann dann aus diesen Stämmen gereinigt und verwendet werden, um das mit dem p101-Gen wechselwirkende Protein unter Anwendung von Techniken zu isolieren, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig praktiziert werden.
5.5.3 TESTS FÜR VERBINDUNGEN, DIE DIE WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN p101-REGULATIONSUNTEREINHEIT UND INTRAZELLULÄREN MAKROMOLEKÜLEN STÖREN
Die Makromoleküle, die mit der p101-Regulationsuntereinheit wechselwirken, werden zum Zwecke dieser Erörterung als „Bindungspartner" bezeichnet. Diese Bindungspartner sind wahrscheinlich am p101-Regulationsuntereinheiten-Signaltransduktionsweg beteiligt und daher an der Rolle der p101-Regulationsuntereinheit bei der Regulation der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie. Bekannte Bindungspartner sind Katalyseuntereinheiten der PI3K-Kinase wie z.B. p120, p117 und vielleicht gewisse p110-Proteine. Andere Bindungspartner sind wahrscheinlich aktivierte trimere G-Proteine, wie z.B. Gβγ-Untereinheiten, und/oder Lipide. Daher ist es wünschenswert, Verbindungen zu identifizieren, die die Wechselwirkung derartiger Bindungspartner mit p101 stören oder unterbrechen, was für die Regulation der Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit und daher für die Kontrolle von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zweckdienlich sein könnte, die mit p101-Regulationsuntereinheitenaktivität in Verbindung stehen.
Das grundlegende Prinzip des Testsystems, das zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wird, die die Wechselwirkung zwischen der p101-Regulationsuntereinheit und seinem/n Bindungspartner oder Bindungspartnern stören, umfasst das Herstellen eines Reaktionsgemischs, das p101-Regulationsuntereinheitenprotein, -polypeptid, -peptid oder -fusionsprotein wie in den obigen Abschnitten 5.5.1 und 5.5.2 beschrieben und den Bindungspartner unter Bedingungen und für eine Zeitspanne enthält, die ausreichen, um die Wechselwirkung und Bindung der beiden zu ermöglichen, so dass ein Komplex gebildet wird. Um eine Verbindung auf hemmende Aktivität zu testen, wird das Reaktionsgemisch in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung hergestellt. Die Testverbindung kann von Anfang an im Reaktionsgemisch enthalten sein oder kann zu einer Zeit nach der Zugabe der p101-Regulationsuntereinheitengruppierung und seines Bindungspartners zugegeben werden. Kontrollreaktionsgemische werden ohne Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Die Bildung jeglicher Komplexe zwischen der p101-Regulationsuntereinheitengruppierung und dem Bindungspartner wird dann detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, nicht jedoch im die Testverbindung enthaltenden Reaktionsgemisch zeigt an, dass die Verbindung die Wechselwirkung der p101-Regulationsuntereinheit und des wechselwirkenden Bindungspartners stört. Außerdem kann die Komplexbildung in Reaktionsgemischen, die die Testverbindung und normales p101-Regulationsuntereinheitemprotein enthalten, mit der Komplexbildung in Reaktionsgemischen verglichen werden, die Testverbindung und eine mutierte p101-Regulationsuntereinheit enthalten. Dieser Vergleich kann in Fällen wichtig sein, worin es wünschenswert ist, Verbindungen zu identifizieren, die Wechselwirkungen von mutierten, nicht jedoch normalen p101-Regulationsuntereinheiten unterbrechen.
Der Test auf Verbindungen, die die Wechselwirkung von p101-Regulationsuntereinheit und Bindungspartnern stören, kann in einem heterogenen oder homogenen Format durchgeführt werden. Heterogene Tests umfassen die Verankerung von entweder des p101-Regulationsuntereinheitengruppierungsprodukts oder des Bindungspartners auf einer festen Phase und das Detektieren von Komplexen, die an der festen Phase am Ende der Reaktion verankert sind. Bei homogenen Tests wird die gesamte Reaktion in einer flüssigen Phase durchgeführt. Bei beiden Ansätzen kann die Reihenfolge der Zugabe von Reaktanten variiert werden, um unterschiedliche Informationen über die getesteten Verbindungen zu erlangen. Beispielsweise können Testverbindungen, die die Wechselwirkung durch Konkurrenz stören, durch Ausführen der Reaktion in Gegenwart der Testsubstanz identifiziert werden; d.h. durch Zugeben der Testsubstanz zum Reaktionsgemisch vor oder gleichzeitig mit der p101-Regulationsuntereinheitengruppierung und dem wechselwirkenden Bindungspartner. Alternativ dazu können Testverbindungen, die vorgebildete Komplexe aufspalten, z.B. Verbindungen mit höheren Bindungskonstanten, die eine der Komponenten vom Komplex verdrängen, durch Zugeben der Testverbindung zum Reaktionsgemisch getestet werden, nachdem sich Komplexe gebildet haben. Die verschiedenen Formate werden unten kurz beschrieben.
In einem heterogenen Testsystem wird entweder die p101-Regulationsuntereinheitengruppierung oder der wechselwirkende Bindungspartner an einer festen Oberfläche verankert, während die nicht verankerte Spezies entweder direkt oder indirekt markiert ist. In der Praxis werden zweckdienlicherweise Mikrotiterplatten eingesetzt. Die verankerte Spezies kann durch nicht-kovalente oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Nicht-kovalente Bindung kann erzielt werden, indem die feste Oberfläche einfach mit einer Lösung des p101- oder p120-Genprodukts oder -Bindungspartners beschichtet und getrocknet wird. Alternativ dazu kann ein für die zu verankernde Spezies spezifischer, immobilisierter Antikörper verwendet werden, um die Spezies an der festen Oberfläche zu verankern. Die Oberflächen können im Voraus hergestellt und gelagert werden.
Um den Test durchzuführen, wird der Partner der immobilisierten Spezies an der beschichteten Oberfläche mit oder ohne Testverbindung exponiert. Nach Beendigung der Reaktion werden nicht umgesetzte Komponenten entfernt (z.B. durch Waschen), und jegliche gebildeten Komplexe werden an der festen Oberfläche immobilisiert bleiben. Die Detektion der an der festen Oberfläche verankerten Komplexe kann auf eine Reihe von Weisen erzielt werden. Wo die nicht immobilisierte Spezies vormarkiert ist, zeigt die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung an, dass Komplexe gebildet wurden. Wo die nicht immobilisierte Spezies nicht vormarkiert ist, kann eine indirekte Markierung verwendet werden, um Komplexe zu detektieren, die an der Oberfläche verankert sind; z.B. unter Verwendung eines markierten Antikörpers, der für die anfangs nicht immobilisierte Spezies spezifisch ist (der Antikörper wiederum kann direkt markiert und indirekt mit einem markierten Anti-Ig-Antikörper markiert sein). In Abhängigkeit von der Reihenfolge der Zugabe von Reaktionskomponenten können Testverbindungen detektiert werden, die die Komplexbildung hemmen oder die vorgebildeten Komplexe aufspalten.
Alternativ dazu kann die Reaktion in einer flüssigen Phase in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung durchgeführt werden, und die Reaktionsprodukte können von nicht umgesetzten Komponenten abgetrennt und Komplexe detektiert werden; z.B. unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der für eine der Bindungskomponenten spezifisch ist, um jegliche in Lösung gebildeten Komplexe zu binden, sowie eines markierten Antikörpers für den anderen Partner, um verankerte Komplexe zu detektieren. Wiederum können in Abhängigkeit von der Reihenfolge der Zugabe von Reaktanten zur Flüssigphase Testverbindungen identifiziert werden, die den Komplex hemmen oder die vorgebildeten Komplexe aufzuspalten.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein homogener Test verwendet werden. Bei diesem Ansatz wird ein vorgebildeter Komplex aus der p101-Regulationsuntereinheitengruppierung und dem wechselwirkenden Bindungspartner hergestellt, in dem entweder die p101-Regulationsuntereinheit oder ihr Bindungspartner markiert ist, jedoch das von der Markierung erzeugte Signal aufgrund der Bildung des Komplexes gequencht ist (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.109.496 von Rubenstein, welches diesen Ansatz für Immuntests einsetzt). Die Zugabe einer Testverbindung, die mit einer der Spezies aus dem vorgebildeten Komplex konkurriert oder diese verdrängt, wird in der Erzeugung eines über den Hintergrund hinausgehenden Signals resultieren. Auf diese Weise können Testsubstanzen identifiziert werden, die die Wechselwirkung zwischen p101-Regulationsuntereinheit und intrazellulärem Bindungspartner zerstören.
In einer speziellen Ausführungsform kann eine p101-Regulationsuntereinheitenfusion für die Immobilisierung hergestellt werden. Beispielsweise kann die p101-Regulationsuntereinheit oder ein -Peptidfragment, das z.B. der CD entspricht, an ein Glutathion-S-Transferase- (GST-) Gen unter Verwendung eines Fusionsvektors, wie z.B. pGEX-5X-1, auf eine solche Weise fusioniert werden, dass ihre/seine Bindungsaktivität im resultierenden Fusionsprotein erhalten bleibt. Der wechselwirkende Bindungspartner kann gereinigt und verwendet werden, um einen monoklonalen Antikörper herzustellen, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig praktiziert werden und oben im Abschnitt 5.3 beschrieben sind. Der Antikörper kann beispielsweise mit dem radioaktiven Isotop ¹²⁵I mittels Verfahren markiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung praktiziert werden. In einem heterogenen Test kann z.B. das GST-p101-Regulationsuntereinheitenfusionsprotein an Glutathion-Agarose-Perlen verankert werden. Der wechselwirkende Bindungspartner kann dann in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindung auf eine Weise zugegeben werden, die das Zustandekommen von Wechselwirkung und Bindung ermöglicht. Am Ende des Reaktionszeitraums kann ungebundenes Material ausgewaschen werden, und es kann der markierte monoklonale Antikörper dem System zugegeben werden, dem die Bindung an die komplexierten Komponenten ermöglicht wird. Die Wechselwirkung zwischen dem p101- oder p120-Genprodukt und dem wechselwirkenden Bindungspartner kann durch Messen der Menge an Radioaktivität detektiert werden, die mit den Glutathion-Agarose-Perlen assoziiert verbleibt. Eine erfolgreiche Hemmung der Wechselwirkung durch die Testverbindung wird in einer Abnahme der gemessenen Radioaktivität resultieren.
Alternativ dazu können das GST-p101-Regulationsuntereinheitenfusionsprotein und der wechselwirkende Bindungspartner in Flüssigphase in Abwesenheit der festen Glutathion-Agarose-Perlen miteinander vermischt werden. Die Testverbindung kann entweder während oder nach der Ermöglichung der Wechselwirkung der Spezies zugegeben werden. Dieses Gemisch kann dann den Glutathion-Agarose-Perlen zugegeben werden, und ungebundenes Material wird ausgewaschen. Wiederum kann das Ausmaß der Hemmung der Wechselwirkung zwischen p101-Regulationsunter einheit und Bindungspartner durch Zugeben des markierten Antikörpers und Messen der mit den Perlen assoziierten Radioaktivität detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können dieselben Techniken unter Verwendung von Peptidfragmenten eingesetzt werden, die den Bindungsdomänen der p101-Regulationsuntereinheit und/oder des wechselwirkenden Partners oder Bindungspartners (in Fällen, wo der Bindungspartner ein Protein ist) entsprechen, und zwar anstelle von einem oder beiden Proteinen voller Länge. Es kann jegliche Anzahl von Verfahren zur Identifizierung und Isolierung der Bindungsstellen angewendet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung routinemäßig praktiziert werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Mutagenese des für eines der Proteine kodierenden Gens und Screening auf Aufspaltung der Bindung in einem Coimmunpräzipitationstest. Kompensierende Mutationen im Gen, das für die zweite Spezies im Komplex kodiert, können dann ausgewählt werden. Die Sequenzanalyse der Gene, die für die jeweiligen Proteine kodieren, wird jene Mutationen offenbaren, die derjenigen Region des Proteins entsprechen, die an der wechselwirkenden Bindung beteiligt sind. Alternativ dazu kann eines der Proteine an eine feste Oberfläche unter Anwendung oben beschriebener Verfahren verankert und dessen Wechselwirkung mit und Bindung an dessen markierten Bindungspartner ermöglicht werden, der mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, behandelt worden ist. Nach dem Waschen kann ein kurzes, markiertes Peptid, das die Bindungsdomäne umfasst, mit dem festen Material assoziiert verbleiben, das isoliert und mittels Aminosäuresequenzierung identifiziert werden kann. Außerdem können, wenn das für den intrazellulären Bindungspartner kodierende Gen einmal erlangt ist, kurze Gensegmente konstruiert werden, um Peptidfragmente des Proteins zu exprimieren, die dann auf Bindungsaktivität getestet und gereinigt oder synthetisiert werden können.
Als Beispiel und nicht zur Einschränkung kann ein p101-Genprodukt wie oben beschrieben an ein festes Material verankert werden, indem ein GST-p101-Regulationsuntereinheitenfusionsprotein hergestellt und dessen Bindung an Glutathion-Agarose-Perlen ermöglicht wird. Der wechselwirkende Bindungspartner kann mit einem radioaktiven Isotop, wie z.B. ³⁵S, markiert und mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, gespalten werden. Spaltprodukte können dann dem verankerten GST-p101-Fusionsprotein zugegeben und deren Bindung ermöglicht werden. Nach dem Auswaschen ungebundener Peptide kann markiertes gebundenes Material, das die Bindungsdomäne des intrazellulären Bindungspartners darstellt, mittels wohlbekannter Verfahren eluiert, gereinigt und hinsichtlich Aminosäuresequenz analysiert werden. Auf diese Weise identifizierte Peptide können synthetisch produziert oder unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechnologie an geeignete Hilfsproteine fusioniert werden.
5.5.4 TESTS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON VERBINDUNGEN DIE ENTZÜNDLICHE STÖRUNGEN BESSERN
Verbindungen, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, bindende Verbindungen, die über Testtechniken, wie z.B. die oben in den Abschnitten 5.5.1 bis 5.5.3 beschriebenen, identifiziert worden sind, können auf die Fähigkeit getestet werden, die Symptome von Immunsystemstörungen, einschließlich Entzündungen, zu bessern. Die oben beschriebenen Tests können Verbindungen identifizieren, die die Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit beeinflussen (z.B. Verbindungen, die an die p101-Regulationsuntereinheit binden, die Bindung der natürlichen Liganden hemmen und entweder die Signaltransduktion aktivieren (Agonisten) oder die Aktivierung blockieren (Antagonisten), und Verbindungen, die an einen natürlichen Liganden der p101-Regulationsuntreeinheit binden und die Aktivität des Liganden neutralisieren); oder Verbindungen, die die p101- oder p120-Genaktivität beeinflussen (durch Beeinflussen der p101- oder p120-Genexpression, einschließlich Moleküle, z.B. Proteine oder kleine organische Moleküle, die Spleißereignisse beeinflussen oder diese stören, so dass die Expression der p101-Regulationsuntereinheit voller Länge oder ihrer trunkierten Form moduliert werden kann). Jedoch sollte erwähnt werden, dass die hierin beschriebenen Tests auch Verbindungen identifizieren können, die die Signaltransduktion der p101-Regulationsuntereinheit modulieren (z.B. Verbindungen, die Stromab-Signalereignisse beeinflussen, wie z.B. Inhibitoren oder Verstärker der Aktivitäten, die an der Transduktion des PtdIns(4,5)P₃-Signals teilhaben, das durch die Bindung der Katalyseuntereinheit an die p101-Regulationsuntereinheit erzeugt wird). Die Identifizierung und Verwendung derartiger Verbindungen, die einen weiteren Schritt im Signaltransduktionsweg der p101-Regulationsuntereinheit beeinflussen, an dem das p101- oder p120-Gen und/oder p101- oder p120-Genprodukt beteiligt ist, und die durch Beeinflussen desselben Wegs die Wirkung der p101-Regulationsuntereinheit auf die Entwicklung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie modulieren können, liegen im Schutzumfang der Erfindung. Derartige Verbindungen können als Teil eines therapeutischen Verfahrens für die Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie verwendet werden.
Die Erfindung umfasst auf Zellen basierende und auf Tiermodelle basierende Tests zur Identifizierung von Verbindungen, die eine derartige Fähigkeit zur Besserung von Symptomen von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zeigen. Derartige auf Zellen basierende Testsysteme können außerdem als Standard verwendet werden, um auf die Reinheit und Wirksamkeit des/der natürlichen Liganden, Katalyseuntereinheit, einschließlich rekombinant oder synthetisch hergestellten Katalyseeinheit, und Mutanten der Katalyseeinheit zu testen.
Auf Zellen basierende Systeme können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Symptome von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie bessern könnten. Derartige Zellsysteme können beispielsweise rekombinante oder nicht-rekombinante Zellen umfassen, wie z.B. Zelllinien, die das p101- oder p120-Gen exprimieren. Beispielsweise können Leukozytenzellen oder von Leukozytenzellen hergeleitete Zelllinien verwendet werden. Außerdem können Expressionswirtszellen (z.B. COS-Zellen, CHO-Zellen, Fibroblasten, Sf9-Zellen) als Endpunkt im Test verwendet werden, die genetisch so verändert sind, dass sie eine funktionelle p101/p120-PI3K exprimieren und auf die z.B. mittels chemischer oder phänotypischer Veränderung, Induktion eines weiteren Wirtszellengens, Veränderung von intrazellulären Messenger-Werten (z.B. PtdIns(3,4,5)P₃ usw.) gemessenen Aktivierung durch die natürlichen Liganden-Gβγ-Untereinheiten reagieren.
Unter Einsatz derartiger Zellsysteme können Zellen einer Verbindung exponiert werden, von der vermutet wird, dass sie eine Fähigkeit aufweist, Symptome der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zu bessern, und zwar bei einer Konzentration und für eine Zeitdauer, die ausreicht, um eine derartige Besserung von Symptomen der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie in den exponierten Zellen hervorzurufen. Nach der Exposition können die Zellen getestet werden, um Veränderungen hinsichtlich der Expression des p101- oder p120-Gens zu messen, z.B. durch Testen von Zelllysaten auf p101- oder p120-mRNA-Transkripte (z.B. durch Northern-Analyse) oder auf in der Zelle exprimiertes p101- oder p120-Protein; Verbindungen, die die Expression des p101- oder p120-Gens modulieren, sind wertvolle Kandidaten als Therapeutika. Alternativ dazu werden Zellen untersucht, um zu ermitteln, ob eine oder mehrere von zellulären, der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie ähnlichen Phänotypen so verändert worden ist, dass er einem normaleren oder der Wildform ähnlicheren Phänotyp oder einem Phänotyp gleicht, der eher einen) vermindertes/n Auftreten oder Schweregrad von Symptomen der Störung hervorruft. Außerdem kann die Expression und/oder Aktivität von Komponenten des Signaltransduktionswegs, wobei die p101-Regulationsuntereinheit ein Teil davon ist, oder die Aktivität des Signaltransduktionswegs der p101-Regulationsuntereinheit selbst getestet werden.
Beispielsweise können nach Exposition der Zellen Zelllysate auf die Gegenwart erhöhter Werte des zweiten Messengers PtdIns(3,4,5)P₃ im Vergleich zu Lysaten getestet werden, die von nicht exponierten Kontrollzellen stammen. Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Produktion des zweiten Messengers in diesen Testsystemen zu hemmen, zeigt an, dass die Testverbindung die von der Aktivierung der p101-Regulationsuntereinheit ausgelöste Signaltransduktion hemmt. Die Zelllysate können leicht unter Anwendung von Anionenaustausch-HPLC getestet werden. Alternativ dazu können die Ausmaße an Superoxidproduktion oder O₂ getestet werden, indem die Chemilumineszenz aus der durch Meerrettichperoxidase katalysierten Oxidation von Luminol wie in Wymann et al., Anal. Biochem. 165, 371–378 (1987), beschrieben gemessen wird. Schließlich kann eine Veränderung der Zelladhäsion intakter Zellen unter Anwendung von Techniken getestet werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Außerdem können auf Tiere basierende Systeme der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, beispielsweise Mäuse, verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die zur Besserung von Symptomen von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie fähig sind. Derartige Tiermodelle können als Testsysteme für die Identifizierung von Medikamenten, Pharmazeutika, Therapien und Interventionen verwendet werden, die bei der Behandlung derartiger Störungen wirksam sind. Beispielsweise können Tiermodelle einer Verbindung exponiert werden, von der vermutet wird, dass sie eine Fähigkeit aufweist, Symptome der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zu bessern, und zwar bei einer Konzentration und für eine Zeitdauer, die ausreicht, um eine derartige Besserung von Symptomen der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie in den exponierten Tieren hervorzurufen. Die Reaktion der Tiere auf die Exposition kann festgestellt werden, indem die Umkehrung von Störungen beurteilt wird, die mit Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, wie z.B. Entzündungen, assoziiert sind. In Bezug auf Intervention sollten jegliche Behandlungen, die irgendein der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetische Linie ähnliches Erscheinungsbild umkehren, als Kandidaten für die therapeutische Intervention bei der Störung der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie beim Menschen erwogen werden. Dosierungen von Testmitteln können durch Herleiten von Dosis-Wirkungs-Kurven wie unten erörtert ermittelt werden.
5.6 BEHANDLUNG VON MIT DER STIMULATION VON G-PROTEIN-AKTIVIERTER PI3K IN VERBINDUNG STEHENDEN STÖRUNGEN EINSCHLIESSLICH ENTZÜNDLICHEN STÖRUNGEN
Die Erfindung sieht außerdem Verfahren und Zusammensetzungen zur Modifizierung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie und zur Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich entzündlichen Störungen, vor. Beispielsweise kann durch Vermindern des Ausmaßes an p101-Genexpression und/oder p101-Regulationsuntereinheitengenaktivität und/oder Herabregulation der Aktivität des p101-Regulationsuntereinheitenstoffwechselwegs (z.B. durch Störung der Wechselwirkung der p101-Regulationsuntereinheit mit der p120-Katalyseuntereinheit oder durch Targeting von Stromab-Signalereignissen) die Reaktion von Leukozytenzellen auf Faktoren, die mit trimerem G-Protein assoziierte Rezeptoren aktivieren, wie z.B. Cytokinen, vermindert und die Symptome chronischer entzündlicher Krankheiten gebessert werden. Umgekehrt kann die Reaktion von Leukozytenzellen auf die Aktivierung von G-Protein-assoziierten Rezeptoren durch Erhöhen der Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit gesteigert werden. Beispielsweise kann eine derartige Steigerung dazu dienen, die Reaktion des Immunsystems auf Infektionen zu verstärken. Unterschiedliche Ansätze werden unten erörtert.
5.6.1 HEMMUNG DER P101-ADAPTOR-EXPRESSION ODER p101-ADAPTOR-AKTIVITÄT, UM G-PROTEIN-AKTIVIERTE PI3K-AKTIVITÄT ZU VERMINDERN UND ENTZÜNDUNGEN ZU VERMINDERN
Jegliches Verfahren, das die Katalyseuntereinheit neutralisiert oder die Expression des p101- oder p120-Gens (entweder Transkription oder Translation) hemmt, kann angewendet werden, um die Entzündungsreaktion zu vermindern. Derartige Ansätze können verwendet werden, um Entzündungsreaktionsstörungen, wie z.B. Arthritis, einschließlich rheumatoide Arthritis, septischen Schock, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS), Pneumonie, Asthma und andere Lungenleiden, Allergien, Reperfusionsverletzungen, Atherosklerose und andere Herz-Kreislauf-Krankheiten, Alzheimer-Krankheit und Krebs, zu behandeln, um nur einige wenige Entzündungsstörungen zu benennen.
In einer der Ausführungsformen kann Immuntherapie so konzipiert werden, dass das Ausmaß endogener p101- oder p120-Genexpression herabgesetzt wird, und zwar beispielsweise unter Anwendung von Antisense- oder Ribozym-Ansätzen, um die Translation von p101- oder p120-mRNA-Transkripten zu hemmen oder zu verhindern; Dreifachhelix-Ansätzen, um die Transkription des p101- oder p120-Gens zu hemmen; oder gezielter homologer Rekombination, um das p101- oder p120-Gen oder seinen endogenen Promotor zu inaktivieren oder ein „Knockout" desselben zu bewirken.
Antisense-Ansätze umfassen die Konstruktion von Oligonucleotiden (entweder DNA oder RNA), die zur mRNA der p101- oder p120-Regulationsuntereinheit komplementär sind. Die Antisense-Oligonucleotide werden an die komplementären p101- oder p120-mRNA-Transkripte binden und die Translation verhindern. Eine absolute Komplementarität ist, obgleich bevorzugt, nicht erforderlich. Unter einer Sequenz, die zu einem Abschnitt einer hierin genannten RNA „komplementär" ist, wird eine Sequenz verstanden, die eine ausreichende Komplementarität aufweist, um in der Lage zu sein, mit der RNA zu hybridisieren und einen stabilen Komplex zu bilden. Im Falle doppelsträngiger Antisense-Nucleinsäuren kann daher ein Einzelstrang der Doppelhelix-DNA getestet werden, oder es kann die Tripelhelixbildung getestet werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung wird vom Ausmaß der Komplementarität sowie der Länge der Antisense-Nucleinsäure abhängen. Je länger die hybridisierende Nucleinsäure, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer RNA wird sie im Allgemeinen enthalten und nach wie vor eine stabile Doppelhelix (bzw. Dreifachhelix) ausbilden. Ein Fachmann kann ein tolerierbares Ausmaß an Fehlpaarung feststellen, indem er Standardverfahren anwendet, um den Schmelzpunkt des hybridisierten Komplexes zu ermitteln.
Oligonucleotide, die zum 5'-Ende der mRNA, z.B. zur 5'-untranslatierten Sequenz bis zum und einschließlich des AUG-Initiationscodons, komplementär sind, sollten hinsichtlich der Hemmung der Translation am effizientesten sein. Jedoch erwiesen sich neulich Sequenzen, die zu den 3'-untranslatierten Sequenzen von mRNAs komplementär sind, ebenfalls als wirksam bei der Hemmung der Translation von mRNAs. Siehe allgemein R. Wagner, Nature 372, 333–335 (1994). Folglich könnten Oligonucleotide, die entweder zu 5'- oder zu 3'-nicht-translatierten, nicht-kodierenden Regionen von in 1 und 3 gezeigtem p101 oder p120 komplementär sind, in einem Antisense-Ansatz verwendet werden, um die Translation von endogener p101- oder p120-mRNA zu hemmen. Oligonucleotide, die zur 5'-untranslatierten Region der mRNA komplementär sind, sollten das Komplement des AUG-Startcodons umfassen. Antisense-Oligonucleotide, die zu kodierenden mRNA-Regionen komplementär sind, sind weniger effiziente Inhibitoren der Translation, könnten jedoch gemäß der Erfindung verwendet werden. Egal, ob sie zur Hybridisierung an die 5'-, 3'- oder an die kodierende Region der p101-Regulationsuntereinheiten-mRNA konstruiert sind, sollten Antisense-Nucleinsäuren eine Länge von zumindest sechs Nucleotiden aufweisen und sind vorzugsweise Oligonucleotide einer Länge im Bereich von 6 bis etwa 50 Nucleotiden. In speziellen Aspekten weist das Oligonucleotid zumindest 10 Nucleotide, zumindest 17 Nucleotide, zumindest 25 Nucleotide oder zumindest 50 Nucleotide auf.
Unabhängig von der Wahl der Zielsequenz wird bevorzugt, dass In-vitro-Untersuchungen zuerst durchgeführt werden, um die Fähigkeit des Antisense-Oligonucleotids zu quantifizieren, die Genexpression zu hemmen. Es wird bevorzugt, dass diese Untersuchungen Kontrollen einsetzen, die zwischen Antisense-Gen-Hemmung und unspezifischen biologischen Wirkungen von Oligonucleotiden unterscheiden können. Es ist außerdem bevorzugt, dass diese Untersuchungen Ausmaße von Target-RNA oder -Protein mit denen einer/s internen Kontroll-RNA oder -Proteins vergleichen. Zusätzlich ist vorgesehen, dass Ergebnisse, die unter Verwendung des Antisense-Oligonucleotids erlangt wurden, mit jenen verglichen werden, die unter Verwendung eines Kontroll-Oligonucleotids erlangt wurden. Es wird bevorzugt, dass das Kontroll-Oligonucleotid ungefähr dieselbe Länge wie das Test-Oligonucleotid aufweist und dass die Nucleotidsequenz des Oligonucleotids sich von der Antisense-Sequenz um nicht mehr unterscheidet als nötig ist, um eine spezifische Hybridisierung an die Target-Sequenz zu verhindern.
Die Oligonucleotide können DNA oder RNA oder chimäre Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen davon, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Das Oligonucleotid kann beispielsweise an der Basengruppierung, Zuckergruppierung oder am Phosphatgerüst modifiziert werden, um die Stabilität des Moleküls, Hybridisierung usw. zu verbessern. Die Oligonucleotide können andere angefügte Gruppen umfassen, wie z.B. Peptide (z.B. für das Targeting von Wirtzellrezeptoren in vivo) oder Agenzien, die den Transport durch die Zellmembran erleichtern (siehe z.B. Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553–6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 648–652 (1987); PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810, veröffentlicht am 15. Dezember 1988), oder Hybridisierungs-getriggerte Spaltmittel (siehe z.B. Krol et al., Bio/Techniques 6, 958–976 (1988)) oder interkalierende Agenzien (siehe z.B. Zon, Pharm. Res. 5, 539–549 (1988)). Zu diesem Zweck kann das Oligonucleotid an ein weiteres Molekül, z.B. ein Peptid, Hybridisierungs-getriggertes Vernetzungsmittel, Transportmittel, Hybridisierungs-getriggertes Spaltmittel usw., konjugiert sein.
Das Antisense-Oligonucleotid kann zumindest eine modifizierte Basengruppierung umfassen, die aus der Gruppe gewählt ist, die 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin umfasst, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
Das Antisense-Oligonucleotid kann außerdem zumindest eine modifizierte Zuckergruppierung umfassen, die aus der Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose umfassenden Gruppe gewählt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonucleotid zumindest ein modifiziertes Phosphatgerüst, das aus der aus einem Thiophosphat, einem Dithiophosphat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phos phordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal oder Analogon davon bestehenden Gruppe gewählt ist.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres Oligonucleotid bildet spezifisch doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA aus, bei denen die Stränge im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15, 6625–6641 (1987)). Das Oligonucleotid ist ein 2'-O-Methylribonucleotid (Inoue et al., Nucl. Acids. Res. 15, 6131–6148 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327–330 (1987)).
Oligonucleotide der Erfindung können mittels Standardverfahren synthetisiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie z.B. durch Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts (wie z.B. jener, die im Handel von Biosearch, Applied Biosystems usw. erhältlich sind). Als Beispiele können Thiophosphat-Oligonucleotide mit dem Verfahren von Stein et al., Nucl. Acids Res. 16, 3209 (1988), synthetisiert werden. Methylphosphonat-Oligonucleotide können unter Verwendung von Controlled-Pore-Glass-Polymerträgern hergestellt werden (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448–7451 (1988)).
Obgleich zur für p101 oder p120 kodierenden Sequenzregion komplementäre Antisense-Nucleotide verwendet werden könnten, sind jene insbesondere bevorzugt, die zur transkribierten untranslatierten Region komplementär sind.
Die Antisense-Moleküle sollten an Zellen abgegeben werden, die die p101-Regulationsuntereinheit in vivo exprimieren, z.B. an Zellen hämatopoetischen Ursprungs, wie z.B. Blutplättchen und Neutrophile und andere Leukozyten. Eine Reihe von Verfahren ist zur Abgabe von Antisense-DNA oder -RNA an Zellen entwickelt worden; z.B. können Antisense-Moleküle direkt in die Stelle der Herkunft des Gewebes oder der Zellen injiziert werden, oder es können modifizierte Antisense-Moleküle, die zum Targeting der gewünschten Zellen konstruiert sind (z.B. an Peptide oder An tikörper gebundene Antisense-Moleküle, die spezifisch Rezeptoren oder Antigene binden, die an der Target-Zelloberfläche exprimiert werden), systemisch verabreicht werden.
Jedoch ist es häufig schwierig, intrazelluläre Konzentrationen des Antisense-Moleküls zu erzielen, die ausreichen, um die Translation endogener mRNAs zu unterdrücken. Daher setzt ein bevorzugter Ansatz ein rekombinantes DNA-Konstrukt ein, in dem das Antisense-Oligonucleotid unter die Kontrolle eines starken pol-III- oder pol-II-Promotors gestellt wird. Die Verwendung eines derartigen Konstrukts zur Transfektion von Target-Zellen im Patienten wird in der Transkription ausreichender Mengen der einzelsträngigen RNAs resultieren, die komplementäre Basenpaare mit den endogenen p101- oder p120-Transkripten bilden und dadurch die Translation der p101- oder p120-mRNA verhindern werden. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo so eingeführt werden, dass er von einer Zelle aufgenommen wird und die Transkription von Antisense-RNA steuert. Ein derartiger Vektor kann episomal verbleiben oder chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA zu produzieren. Derartige Vektoren können durch Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie konstruiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung standardmäßig eingesetzt werden. Die Vektoren können Plasmid- oder Virus- oder andere Vektoren sein, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, die zur Replikation und Expression in Säugetierzellen verwendet werden. Die Expression der für die Antisense-RNA kodierenden Sequenz kann durch jeglichen Promotor erfolgen, von dem auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, dass er in Säugetierzellen, vorzugsweise menschlichen Zellen, funktionstüchtig ist. Derartige Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Derartige Promotoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: die frühe Promotorregion von SV40 (Bernoist und Chambon, Nature 290, 304–310 (1981)), den in der langen terminalen 3'-Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus enthaltenen Promotor (Yamamoto et al., Cell 22, 787–797 (1980)), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1441–1445 (1981)), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., Nature 296, 39–42 (1982)) usw. Jeglicher Typ von Plasmid-, Cosmid-, YAC- oder Virusvektor kann verwendet werden, um das rekombinante DNA-Konstrukt herzustellen, das direkt in die Gewebe- oder Zellen-Herkunftsstelle, z.B. in das Knochenmark, eingeführt werden kann. Alternativ dazu können Virusvektoren verwendet werden, die den gewünschten Gewebe- oder Zelltyp selektiv infizieren (z.B. Viren, die Zellen der hämatopoetischen Linie infizieren), wobei in diesem Fall die Verabreichung über einen anderen Weg (z.B. systemisch) erfolgen kann.
Ribozym-Moleküle, die zur Spaltung von p101- oder p120-mRNA-Transkripten konstruiert sind, können verwendet werden, um die Translation von p101- und p120-mRNA und Expression der p101-Regulationsuntereinheit zu verhindern (siehe z.B. Internationale PCT-Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al., Science 247, 1222–1225 (1990)). Obgleich Ribozyme, die mRNA an ortsspezifischen Erkennungssequenzen spalten, verwendet werden können, um p101- oder p120-mRNAs zu zerstören, ist die Verwendung von Hammerkopf-Ribozymen bevorzugt. Hammerkopf-Ribozyme spalten mRNAs an Stellen, die von den flankierenden Regionen bestimmt sind, die komplementäre Basenpaare mit der Target-mRNA bilden. Das einzige Erfordernis ist, dass die Target-mRNA die folgende Sequenz von zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Produktion von Hammerkopf-Ribozymen ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und wird in Haseloff und Gerlach, Nature 334, 585–591 (1988), ausführlicher beschrieben. Es gibt hunderte von potenziellen Hammerkopf-Ribozym-Spaltstellen in der Nucleotidsequenz von menschlicher p101- oder p120-cDNA (3). Vorzugsweise wird das Ribozym so konstruiert, dass die Spalterkennungsstelle sich nahe dem 5'-Ende der p101- oder p120-mRNA befindet; d.h. um die Wirksamkeit zu erhöhen und die intrazelluläre Anreicherung nicht-funktioneller mRNA-Transkripte zu minimieren.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung umfassen außerdem RNA-Endoribonucleasen (hiernach „Cech-Typ-Ribozyme" genannt), wie z.B. die eine, die in Tetrahymena thermophila natürlich vorkommt (als IVS oder L19-IVS-RNA bekannt) und die von Thomas Cech und Mitarbeitern ausführlich beschrieben worden ist (Zaug et al., Science 224, 574–578 (1984); Zaug und Cech, Science 231, 470–475 (1986); Zaug et al., Nature 324, 429–433 (1986); veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO 88/04300 von University Patents Inc.; Been und Cech, Cell 47, 207–216 (1986)). Die Cech-Typ-Ribozyme weisen eine aktive Stelle von acht Basepaaren auf, die an eine Target-RNA-Sequenz hybridisiert, worauf die Spaltung der Target-RNA stattfindet. Die Erfindung umfasst jene Cech-Typ-Ribozyme, die auf Acht-Basenpaar-Aktivstellensequenzen abzielen, die in p101 oder p120 vorhanden sind.
Wie beim Antisense-Ansatz können die Ribozyme aus modifizierten Basenpaaren zusammengesetzt sein (z.B. für verbessertes) Stabilität, Targeting usw.) und sollten an Zellen abgegeben werden, die die p101-Regulationsuntereinheit in vivo exprimieren, z.B. Neutrophile. Ein bevorzugtes Abgabeverfahren umfasst die Verwendung eines für das Ribozym „kodierenden" DNA-Konstrukts unter der Kontrolle eines starken konstitutiven pol-III- oder pol-II-Promotors, so dass transfizierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms produzieren werden, um endogene p101- oder p120-RNAs zu zerstören und die Translation zu hemmen. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch sind, wird für die Wirksamkeit eine niedrigere intrazelluläre Konzentration benötigt.
Endogene p101- oder p120-Genexpression kann außerdem vermindert werden, indem das p101- oder p120-Gen oder sein Promotor unter Anwendung gezielter homologer Rekombination inaktiviert wird oder ein „Knockout" erfährt (siehe z.B. Smithies et al., Nature 317, 230–234 (1985); Thomas und Capecchi, Cell 51, 503–512 (1987); Thompson et al., Cell 5, 313–321 (1989); alle davon hierin zur Gänze durch Verweis aufgenommen). Beispielsweise kann eine mutierte, nicht funktionsfähige p101-Regulationsuntereinheit (oder eine völlig unverwandte DNA-Sequenz), flankiert von DNA, die homolog zum endogenen p101- oder p120-Gen ist (entweder die kodierenden Regionen oder Regulationsregionen des p101- oder p120-Gens), mit oder ohne einen Selektionsmarker und/oder einen Negativselektionsmarker verwendet werden, um Zellen zu transfizieren, die die p101-Regulationsuntereinheit in vivo exprimieren. Die Insertion des DNA-Konstrukts über gezielte homologe Rekombination resultiert in der Inaktivierung des p101- oder p120-Gens. Derartige Ansätze sind insbesondere auf dem Gebiet der Landwirtschaft geeignet, wo Modifikationen an ES- (embryonalen Stamm-) Zellen verwendet werden können, um Tier- Nachzuchten mit einer inaktiven p101-Regulationsuntereinheit zu erzeugen (siehe z.B. Thomas und Capechi (1987) und Thompson (1989), siehe oben). Jedoch kann dieser Ansatz zur Verwendung im Menschen unter der Voraussetzung adaptiert werden, dass die rekombinanten DNA-Konstrukte unter Verwendung geeigneter Virusvektoren direkt an die erforderliche Stelle in vivo verabreicht oder abgegeben werden.
Alternativ dazu kann endogene p101- oder p120-Genexpression durch Targeting von Desoxyribonucleotidsequenzen vermindert werden, die zur Regulationsregion des p101- oder p120-Gens (d.h. p101- oder p120-Promotor und/oder -Enhancer) komplementär sind, um Dreifachhelix-Strukturen zu bilden, die die Transkription des p101- oder p120-Gens in Target-Zellen im Körper verhindern (siehe allgemein C. Helene, Anticancer Drug. Des. 6(6), 569–84 (1991); C. Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36 (1992), und L.J. Maher, Bioassays 14(12), 807–15 (1992)).
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit unter Verwendung eines „dominant negativen" Ansatzes zur Störung der trimeren G-Protein-Aktivierung von PI3K vermindert werden. Zu diesem Zweck können Konstrukte, die für defekte p101-Regulationsuntereinheiten kodieren, bei Gentherapieansätzen verwendet werden, um die Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit in geeigneten Target-Zellen zu vermindern. Beispielsweise können Nucleotidsequenzen, die die Wirtszellexpression von p101-Regulationsuntereinheiten steuern, bei denen die Gβγ-Wechselwirkungsdomäne deletiert oder mutiert ist, in hämatopoetische Zellen eingeführt werden (entweder durch In-vivo- oder Ex-vivo-Gentherapieverfahren, wie sie oben beschrieben sind). Alternativ dazu können Nucleotidsequenzen, die nur für eine funktionelle Domäne von p101 kodieren, als Inhibitor von nativen p101/p120-Wechselwirkungen verwendet werden. Alternativ dazu kann gezielte homologe Rekombination eingesetzt werden, um derartige Deletionen oder Mutationen in das endogene p101- oder p120-Gen des Patienten im Rückenmark einzuführen. Die veränderten Zellen werden nicht funktionsfähige Rezeptoren exprimieren (d.h. eine Regulationsuntereinheit, die fähig ist, an die Katalyseunterein heit zu binden, jedoch unfähig ist, die katalytische Aktivität in Reaktion auf G-Protein-Aktivierung zu stimulieren). Derartige veränderte Zellen, d.h. Neutrophile oder andere Leukozyten-Linien, sollten eine verminderte Reaktion auf die Aktivierung von G-Protein-gebundenen Rezeptoren auf extrazelluläre Chemokine zeigen, was in einer Verminderung des Entzündungsphänotyps resultiert.
5.6.2 WIEDERHERSTELLUNG ODER STEIGERUNG DER p101-REGULATIONSUNTEREINHEITENEXPRESSION ODER -AKTIVITÄT ZUR FÖRDERUNG DER IMMUNSYSTEMAKTIVIERUNG
In Bezug auf eine Steigerung des Ausmaßes an normaler p101- oder p120-Genexpression und/oder p101-Regulationsuntereinheitenproduktaktivität können p101- oder p120-Nucleinsäuresequenzen für die Behandlung von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich für verminderte Reaktionen des Immunsystems auf Chemokine, eingesetzt werden. Wo die Ursache der Immunsystemdysfunktion eine defekte p101-Regulationsuntereinheit ist, kann die Behandlung beispielsweise in Form einer Genersatztherapie verabreicht werden. Im Speziellen können eine oder mehrere Kopien eines normalen p101-Gens oder eines Abschnitts des p101-Gens, das die Produktion eines p101-Genprodukts mit normaler Funktion steuert, in die geeigneten Zellen eines Patienten oder Tiers insertiert werden, und zwar unter Verwendung von Vektoren, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Adenovirus-, Adeno-assoziierte Virus-, Retrovirus- und Herpesvirus-Vektoren zusätzlich zu anderen Teilchen, die DNA in Zellen einführen, wie z.B. Liposomen.
Da das p101- oder p120-Gen in den Zellen der hämatopoetischen Linie, einschließlich in Neutrophilen und anderen Leukozyten, exprimiert wird, sollten derartige Genersatztherapien in der Lage sein, p101- oder p120-Gensequenzen an diese Zelltypen im Inneren von Patienten abzugeben. Alternativ dazu kann gezielte homologe Rekombination eingesetzt werden, um das defekte endogene p101- oder p120-Gen im geeigneten Zelltyp zu korrigieren; z.B. in Knochenmarkzellen oder Neutrophilen und/oder anderen Leukozyten. Bei Tieren kann die gezielte homologe Rekombinati on verwendet werden, um den Defekt in ES-Zellen zu korrigieren, um Nachkommen mit einem korrigierten Merkmal zu erzeugen.
Schließlich können in den oben beschriebenen Tests identifizierte Verbindungen, die das von der aktivierten p101-Regulationsuntereinheit transduzierte Signal stimulieren, verstärken oder modifizieren (z.B. durch Aktivieren von Stromab-signalisierenden Proteinen in der p101-Regulationsuntereinheitenkaskade, wodurch die defekte p101-Regulationsuntereinheit umgangen wird), verwendet werden, um eine Immunsystemstimulation zu erzielen. Formulierung und Verabreichungsmodus werden von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung abhängen.
5.7 PHARMAZEUTISCHE PRÄPARATE UND VERABREICHUNGSVERFAHREN
Die Verbindungen, von denen ermittelt worden ist, dass sie die p101- oder p120-Genexpression oder die Aktivität der p101-Regulationsuntereinheit oder die Wechselwirkung von p101 mit jeglichem ihrer Bindungspartner, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Katalyseuntereinheit, beeinflussen, können einem Patienten in therapeutisch wirksamen Dosierungen verabreicht werden, um Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie, wie z.B. Arthritis, einschließlich rheumatoide Arthritis, septischen Schock, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen (ARDS), Pneumonie, Asthma und andere Lungenleiden, Allergien, Reperfusionsverletzungen, Atherosklerose und andere Herz-Kreislauf-Krankheiten, Alzheimer-Krankheit und Krebs, zu behandeln oder zu bessern. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf jene Menge der Verbindung, die ausreicht, um in einer Besserung von Symptomen von Störungen der Aktivierung von Zellen der hämatopoetischen Linie zu resultieren.
5.7.1 WIRKSAME DOSIS
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit derartiger Verbindungen kann mittels standardmäßiger pharmazeutischer Verfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren ermittelt werden, z.B. für die Bestimmung der LD₅₀ (der für 50 % der Population töd lichen Dosis) und der ED₅₀ (der für 50 % der Population wirksamen Dosis). Das Dosisverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indices zeigen, sind bevorzugt. Obgleich Verbindungen, die hohe toxische Nebenwirkungen aufweisen, verwendet werden können, sollte darauf geachtet werden, ein Abgabesystem zu konstruieren, das derartige Verbindungen an die Stelle des beeinträchtigen Gewebes führt, um die mögliche Schädigung nicht infizierter Zellen zu minimieren und dadurch Nebenwirkungen zu vermindern.
Die aus den Zellkulturtests und Tieruntersuchungen erlangten Daten können bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, der die ED₅₀ mit wenig oder ohne Toxizität umfasst. Die Dosierung kann um diesen Bereich in Abhängigkeit von der eingesetzten Dosierungsform und dem eingesetzten Verabreichungsweg variieren. Für jegliche im Verfahren der Erfindung verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosierung zuerst aus den Zellkulturtests abgeschätzt werden. Es kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich zu erzielen, der die in Zellkultur ermittelte IC₅₀ (das ist jene Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erzielt) einschließt. Derartige Informationen können verwendet werden, um zweckdienliche Dosen beim Menschen genauer bestimmen zu können. Werte im Plasma können beispielsweise mittels Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen werden.
5.7.2 FORMULIERUNGEN UND VERWENDUNG
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können auf herkömmliche Weise unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch annehmbaren Trägern oder Exzipienten formuliert werden.
Daher können die Verbindungen und ihre physiologisch annehmbaren Salze und Solvate für die Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch Mund oder Nase) oder orale, bukkale, parenterale oder rektale Verabreichung formuliert werden.
Für orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von beispielsweise Tabletten oder Kapseln einnehmen, die durch herkömmliche Mittel hergestellt werden, und zwar mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, wie z.B. Bindemitteln (z.B. vorgelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselerde); Abbaumitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natrium-Stärkeglycolat); oder Benetzungsmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat). Die Tabletten können mittels Verfahren beschichtet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Flüssige Präparate für orale Verabreichung können die Form von beispielsweise Lösungen, Sirup oder Suspensionen einnehmen, oder sie können als Trockenprodukt zur Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Verwendung vorliegen. Derartige flüssige Präparate können durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch annehmbaren Additiven hergestellt werden, wie z.B. mit Suspendiermitteln (z.B. Sorbitsirup, Cellulosederivaten oder hydriertem Speisefett); Emulgatoren (z.B. Lecithin oder Akaziengummi); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsmitteln (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Die Präparate können außerdem gegebenenfalls Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßstoffe enthalten.
Präparate für orale Verabreichung können in geeigneter Weise formuliert werden, um eine kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung bereitzustellen.
Für bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, die auf zweckdienliche Weise formuliert sind.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zweckdienlicherweise in Form einer Aerosolspray-Darbietung aus Druckbehältern oder einem Zerstäuber abgegeben, wobei ein geeignetes Treibmittel verwendet wird, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge ermittelt werden. Kapseln und Kartuschen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis, wie z.B. Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können für parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion, oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosisform, z.B. in Ampullen, oder in Multidosisbehältern mit einem zugesetzten Konservierungsmittel dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln einnehmen und können Formulierungsmittel, wie z.B. Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel, enthalten. Alternativ dazu kann der aktive Bestandteil vor der Verwendung in Pulverform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z.B. in sterilem, pyrogen-freiem Wasser, vorliegen.
Die Verbindungen können außerdem in rektale Zusammensetzungen, wie z.B. Suppositorien oder Retentionseinläufen, formuliert werden, die z.B. eine herkömmliche Suppositorienbasis, wie z.B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.
Zusätzlich zu den vorher beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depot-Präparat formuliert werden. Derartige, für einen langen Zeitraum wirkende Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Folglich können die Verbindungen mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z.B. als Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionentauscherharzen oder als schwerlösliche Derivate, beispielsweise als ein schwerlösliches Salz, formuliert werden.
Die Zusammensetzungen können, falls erwünscht, in einer Packungs- oder Spendervorrichtung dargeboten werden, die eine oder mehrere Einheitsdosisformen ent halten kann, die den aktiven Bestandteil enthalten. Die Packung kann beispielsweise Metall- oder Kunststofffolie umfassen, wie z.B. eine Blisterpackung. Die Packungs- oder Spendervorrichtung kann mit Anweisungen zur Verabreichung einhergehen.
Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um die vorliegende Erfindung zu illustrieren und einem Durchschnittsfachmann zu helfen, dieselbe herzustellen und zu verwenden. Die Beispiele beabsichtigen in keiner Weise die Einschränkung des Schutzumfangs der Offenbarung oder des Schutzes, der durch dieses Patent gewährt wird.
6. BEISPIEL: Reinigung und Charakterisierung von Schweine-Gβγ-aktivierten PI3K-Aktivitäten
6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
6.1.1 PI3K-TESTS
Gereinigte Aliquoten von Sf9-hergeleiteter oder Schweine-Neutrophilen-Cytosol-hergeleiteter PI3K wurden in eiskaltem 0,12 M NaCl, 25 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mg.ml^–1 BSA, 1 % Betain, 0,02 % (Gew./Vol.) Tween-20, pH 7,4, 0°C auf ein geeignetes Ausmaß verdünnt, worauf Aliquoten von 5 μl auf Eis bis zum Testen gelagert wurden. Falls die PI3K-Tests an Immunpräzipitaten aus U937-Zellen durchgeführt wurden (siehe folgende Beispiele), dann wurde die PI3K an 10 μl gepackter Protein-G-Sepharose-Perlen in einem oben definierten eiskalten Puffer immobilisiert. 30 μl eines Gemischs aus Phospholipiden mit oder ohne Gβγ und/oder Gα (entweder GDP-gebunden oder aktiviert) wurden zu den S-μl-Fraktionen oder zu den 10 μl Perlen zugegeben und vermischt. Nach 10 Minuten auf Eis wurden 5–10 μl des letzten Waschpuffers, ergänzt mit MgCl₂, im noch vorhandenen Testvolumen auf eine Endkonzentration von 3,5 mM zugegeben und vermischt. Sechs Minuten später wurden 5 μl des letzten Waschpuffers zugegeben (um ein Endtestvolumen von 50 μl zu liefern), der [γ³²P]-ATP (typischerweise 10 μCi.Test^–1, Amersham, PB10168) und 3,5 mM MgCl₂ enthielt, die Röhrchen gemischt und in ein Wasserbad mit 30°C überführt. Die Tests wurden nach 15 Minuten mit 500 μl Chloroform:Methanol:H₂O (29:54:13,1, Vol./Vol./Vol.) gequencht. Ein μl 100 mM ATP, 103 μl 2,4 HCl und 434 μl Chloroform wurden anschließend zugegeben, um eine Zweiphasen-„Folch"-Lösungsmittelverteilung zu erzeugen. Nach Vermischen und Zentrifugation wurden die unteren Phasen entfernt und in saubere Röhrchen überfragen, die 424 μl frischer „oberer Phase" enthielten (Methanol:1M HCl:Chloroform; 48:47:3, Vol./Vol./Vol.). Nach Vermischen und Zentrifugation wurde die untere Phase entfernt und in ein frisches Röhrchen überführt (während der Reinigung von Schweine-Neutrophilen-PI3Ks wurde [³²P]-Lipidprodukt an diesem Punkt mit einem Geigerzähler quantifiziert), unter Vakuum getrocknet, entacetyliert und mittels DC an PEI-Platten aufgetrennt (mit 0,6 M HCl; PtdIns(3,4,5)P₃ hat einen Rf-Wert von 0,47) (Stephens et al., Cell 77, 83–93 (1994)). In manchen Experimenten wurde das getrocknete Lipid in Chloroform:Methanol (2:1, Vol./Vol.) wiederaufgelöst, auf eine mit Kaliumoxalat imprägnierte DC-Platte aufgegeben und in einem Gemisch aus Chloroform:Aceton:Methanol:Essigsäure:H₂O (40:15:13:12:8, Vol./Vol./Vol./Vol./Vol.; Traynor-Kaplan et al. (1988)) aufgetrennt.
Die Lipid/G-Protein-Untereinheiten-Gemische wurden wie folgt hergestellt: PtdIns(4,5)P₂ (das aus Folch-Phosphoinositid-Fraktionen durch 2 Chromatographiezyklen an immobilisiertem Neomycin hergestellt wurde) und PtdEtn (Sigma) wurden unter Vakuum getrocknet (ausreichend, um Endkonzentrationen von 50 μM bzw. 0,5 mM im Test zu liefern). In manchen Experimenten waren PtdIns4P (auf ähnliche Weise wie PtdIns(4,5)P₂ hergestellt) und/oder PtdIns (Sigma) enthalten. Das getrocknete Lipid wurde (bei Raumtemperatur) in einem Bad in einen mit 0,1 % Natriumcholat ergänzten letzten Waschpuffer (siehe oben) beschallt. Nach dem Abkühlen auf Eis wurden Portionen dieser dispergierten Lipid-Stammlösung mit einem Gemisch, insgesamt 1 μl.Test^–1, aus Gβγ-Lagerpuffer (1 % Cholat; 50 mM HEPES, pH 7,5, 4°C, 0,1 M NaCl; 1 mM DTT; 0,5 mM EDTA), aktivem Gβγ oder einem gleichem Volumen von aufgekochtem Gβγ von 3 bis 7 mg.ml^–1 Stammlösung in Lagerpuffer vermischt. In manchen Experimenten enthielten die 1 μl Gα-Untereinheiten oder ih ren Lagerpuffer, wobei in diesem Fall die Gβγs mit den Gα-Untereinheiten (entweder GDP-gebunden oder aktiviert; siehe unten) 10 Minuten lang auf Eis vorgemischt wurden.
Gα-Untereinheiten (ein äquimolares Gemisch von Gα:o, i, i₂ und i₃, hergestellt wie bei den Gβγ-Untereinheiten beschrieben und im selben Puffer gelagert, jedoch ergänzt mit 10 μM GDP) wurden durch 10-minütige Inkubation auf Eis mit 10 mM NaF, 30 μM AlCl₃ (A/F) aktiviert; Tests, in die diese Untereinheiten verdünnt wurden, enthielten ebenfalls A/F.
a) Proteinreinigung
Blut aus Schweinen (42 Chargen) wurde direkt in Antikoagulans in 21 Behälter abgenommen. Innerhalb von 40 Minuten nach der Abnahme wurde das Blut/Antikoagulans mit 3 % (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon (PVP, 360 kD) und isotonischer Salzlösung gemischt (4,2 des Blutgemischs:0,8 PVP). Nach 35-minütigem Stehen (in 25 Behältern) hatten sich die Erythrozyten hinreichend abgesetzt, so dass der Überstand abgesaugt und in 1-Liter-Behälter zentrifugiert (8 Minuten, 1.000 × g) werden konnte. Ungefähr 28 Liter dieses ersten Überstands wurden gewonnen. Die sedimentierten Zellen wurden in Hank-Salzlösung resuspendiert, so dass das schließlich angesammelte Volumen in zwei 1-Liter-Zentrifugenflaschen enthalten war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert (8 Minuten bei 1.000 × g). Überstände wurden abgesaugt und das Zellpellet einem hypotonischen Schock unterzogen (um jegliche verbliebenen, verunreinigenden Erythrozyten zu lysieren), indem 70 ml eiskaltes H₂O zugegeben wurden. Nach 25–30 Sekunden Mischen wurden 77 ml 10 × Hank-Salzlösung (ohne Calcium) zugegeben. Nach einem Waschvorgang mit Hank-Salzlösung wurden die Zellen in eine Zentrifugenflasche vereinigt, pelletiert und resuspendiert, und zwar in 500 ml eiskaltem 40 mM TRIS, pH 7,5, 4°C; 0,12 M NaCl; 2,5 mM MgCl₂. Diisopropylfluorphosphat wurde zugegeben (Endkonzentration 0,5 mM) und die Zellen nach 5 Minuten auf Eis pelletiert (ungefähr 80–90 ml Packungsvolumen) und in 300 ml eiskaltem 40 mM TRIS, pH 7,5; 0,1 M NaCl; 2,5 mM MgCl₂; 1 mM EGTA; 0,2 mM EDTA und Antiproteasen I resuspendiert. Die Zellsuspension wurde beschallt (Ultraschallgerät Heat Systems Probe, Einstellung 9,25, 4 × 15 Sekunden mit 1 Minute Mischen, auf Eis, zwischen jeder Beschallung), dann zentrifugiert (2.000 × g, 10 Minuten), um nicht aufgebrochene Zellen und Kerne zu sedimentieren (weniger als 5 % der Zellen blieben intakt). Der Überstand wurde zentrifugiert (bei 100.000 × g 60 Minuten lang bei 4°C), und die Überstände wurden dekantiert, vereinigt, mit EDTA, Betain und DTT vermischt (Endkonzentrationen von 5 mM, 1 % bzw. 1 mM) und schließlich in Flüssigstickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Cytosolfraktionen, die auf diese Weise hergestellt wurden, wiesen üblicherweise eine Proteinkonzentration von 8 bis 9 mg.ml^–1 auf (ungefähr 2,5 g Protein pro Präparat). Nachdem das Cytosol aus einer 750 Litern entsprechenden Blutmenge (18 bis 42 Präparate, 9 × 10¹² Zellen, 40 g Protein) gesammelt und bei –80°C gelagert worden war, wurde es in getrennten Chargen im Abstand von 5 Stunden aufgetaut. Von diesem Punkt an wurden Prozeduren bei 2–4°C durchgeführt.
Das frisch aufgetaute Cytosol wurde mit Tween-20 (0,05 % (Gew./Vol.) Endkonzentration) ergänzt, zentrifugiert (20.000 × g für 30 Minuten, 2°C), filtriert (5 μm Zellulosenitrat, 4,5 cm Duchmesser; Whatman), ungefähr 2,5fach mit Puffer K (siehe unten) auf eine Endleitfähigkeit von 200 μS (bei 4°C) verdünnt, dann auf eine mit Puffer K äquilibrierte Säule aus Fast-flow-Q-Sepharose von 800 ml (5 cm Durchmesser) aufgegeben (12,5 ml.min^–1 mit einer peristaltischen Pumpe). Das Gesamtvolumen von verdünntem Cytosol betrug etwa 15,5 Liter. Nach der Beladung wurde mit Säule mit 1 Liter Puffer K gewaschen und dann mit 4,5 Liter eines linearen Gradienten aus 0,1 bis 0,6 M NaCl in Puffer K bei 8 ml.min^–1 eluiert. Es wurden 50 Fraktionen von 1 ml aufgefangen. Leitfähigkeit und Absorption (bei 280 nm) des Säuleneluats wurden fortlaufend (und in allen nachfolgenden Schritten) gemessen. Puffer K hatte die folgende Zusammensetzung: 40 mM TRIS/HCl, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 1 % Betain, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 5 mM β-Glycerophosphat pH 7,5 bei 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol mit jeweils 4 μg.ml^–1 Antipain, Leupeptid, Bestatin, Pepstatin A und Aprotinin und 0,1 mM PMSF („Antiproteasen II"). Diese Lösung sowie die folgenden wurden bei 0,2 μm filtriert.
Nachdem die maßgeblichen Fraktionen mittels PI3K-Tests identifiziert worden waren, wurden sie vereinigt und sofort auf eine Säule (5 cm Durchmesser) von 1,8 Litern aus Sephadex-G25-fine geladen (10 ml.min^–1), die mit 18 l Puffer L (nur die letzten beiden Liter mit Antiproteasen II) voräquilibriert worden war (Puffer L enthielt: 5 mM β-Glycerophosphat, 20 mM KCl, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1 % Betain, 0,1 M EDTA, 10 mM Kaliumphosphat pH 7,0 bei 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol plus Antiproteasen II). Der entsalzte Pool aus Q-Sepharose wurde sofort auf 80 ml Hydroxylapatitsäule (2,6 cm Durchmesser; Macroprep-ceramic, BioRad) geladen (5 ml.min^–1), die mit 1 Liter Puffer M (5 mM β-Glycerophosphat; 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, 4°C, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1 % Betain, 15 mM β-Mercaptoethanol) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml.min^–1 und dann mit 100 ml Puffer N (umfassend Puffer M, ergänzt mit 0,1 mM EDTA und Antiproteasen I) unmittelbar vor der Aufgabe der Probe äquilibriert worden war. Nach der Aufgabe wurde die Säule mit 100 ml Puffer N gewaschen und mit 100 ml eines linearen Gradienten aus 0,05 bis 0,35 M Kaliumphosphat in Puffer N (4 ml.min^–1) eluiert. Es wurden Fraktionen von 25 ml aufgefangen und auf Gβγ-stimulierte PI3K-Aktivität getestet.
Maßgebliche Fraktionen wurden vereinigt (typischerweise insgesamt 100 ml), 3fach mit Puffer O verdünnt (auf eine Leitfähigkeit von 250 μS, 4°C) und auf Heparin-Sepharose-HR (Säule von 1,6 cm Durchmesser, die mit 150 ml Puffer O voräquilibriert war (siehe unten, bei 2 ml.min^–1)) aufgegeben (bei 1,1 ml.min^–1). Nach der Beladung wurde die Säule mit Puffer O gewaschen (30 ml) und mit 140 ml eines linearen Gradienten aus 0,1–0,7 M KCl in Puffer O eluiert (Durchflussgeschwindigkeit 1 ml.min^–1); das Eluat wurde in Fraktionen von 5 ml aufgefangen. Puffer O war: 20 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0,1 EDTA, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1,0 % Betain, 1 mM β-Glycerophosphat pH 7,2, 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol plus Antiproteasen II.
Gβγ-stimulierte PI3K-Aktivität eluierte aus Heparin-Sepharose-HR in zwei Peaks, die als Peaks A und B bezeichnet werden. A sowie B wurden durch aufeinander folgende Verwendung derselben Kombination von Säulen gereinigt. Peak A befand sich in 15 ml (0,4 M KCl) und wurde 8fach in Puffer P verdünnt (siehe unten), und zwar auf eine Leitfähigkeit von 200 μS (4°C), Peak B befand sich in 15 ml (0,6 M KCl) und wurde 10fach in Puffer P verdünnt (auf eine Endleitfähigkeit von 200 μS, 4°C). Die Verdünnung erfolgte unmittelbar vor der Aufgabe bei 1 ml.min^–1 auf eine Säule Mono Q 5/5 HR, die mit 20 ml Puffer P voräquilibriert worden war. Nach der Beladung wurde die Säule mit 5 ml Puffer P gewaschen. Eluat wurde in Faktionen von 0,5 ml aufgefangen. Puffer P enthielt: 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 0,2 EDTA, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1 % Betain, 1 mM β-Glycerophosphat, pH 7,1, 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol plus Antiproteasen II.
Die maßgeblichen Fraktionen aus der Mono Q (A) und (B) wurden unabhängig vereinigt (beide hatten ein Gesamtvolumen von 3 ml), mit einer Ultrafiltrationseinheit auf 0,8 ml konzentriert (50 kD Cutoff, vorgewaschen mit Puffer P), zentrifugiert (10.000 × g 10 Minuten lang bei 0°C) und direkt auf eine Hochleistungs-Größenausschlusschromatographiesäule (V_e 72 ml, V_t 172 ml) aufgegeben (0,25 ml.min^–1), die mit Puffer Q voräquilibriert worden war (siehe unten; 2 Liter ohne Antiproteasen II, dann 150 ml mit Antiproteasen II). Fraktionen von 1,5 ml wurden unmittelbar vor dem V_e aufgefangen. Puffer Q enthielt: 0,17 M KCl, 1 % Betain, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1 mM β-Glycerophosphat, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 1,5 mM Kaliumphosphat, 40 mM HEPES, pH 6,9 bei 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol.
Maßgebliche Fraktionen von A und B wurden unabhängig voneinander vereinigt (beide hatten ein Gesamtvolumen von 6 ml), mit Puffer R auf 24 ml verdünnt (Endleitfähigkeit 250 μS, 4°C) und auf eine Kationentauscher-HPLC-Säule auf Acrylbasis (2,5 ml Volumen, BioRad) aufgegeben (0,8 ml.min^–1) und mit 25 ml eines linearen Gradienten von KCl (0,1 bis 0,6 M) in Puffer R eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 1 ml aufgefangen. Puffer R enthielt: 1 % Betain, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 6,8 bei 4°C, 15 mM β-Mercaptoethanol plus Antiproteasen II.
Maßgebliche Fraktionen wurden vereinigt (3 ml für (A), 2 ml für (B)), 7fach mit Puffer S verdünnt (auf eine Endleitfähigkeit von 180 μS, 4°C) und auf eine Mini-Q-Säule (0,24 ml, betrieben an einem Pharmacia-Smart^TM-System) aufgegeben (0,15 ml.min^–1). Die Säule wurde mit 1 ml Puffer S gewaschen und mit einem linearen Gradienten NaCl (0,1 bis 0,5 M NaCl) in Puffer S bei 0,1 ml.min^–1 gewaschen. Das Eluat wurde in Fraktionen von 75 μl aufgefangen. Puffer S enthielt: 1 % Betain, 0,05 (Gew./Vol.) Tween 20, 1 mM EGTA, 0,2 mM EDTA, 2 mM β-Glycerophosphat, 10 mM TRIS, pH 7,7, 4°C, 1 mM DTT (ohne Antiproteasen).
Proteinkonzentrationen über die gesamte Reinigung hinweg wurden auf vier Weisen abgeschätzt: (a) mit einem Proteinbindungsfarbstoff (BioRad; dies wurde nur an Lysaten-, Cytosol- und Q-Sepharose-Fraktionen angewendet); (b) durch Integration der Peakflächen der Absorption bei 280 nm (dies wurde durch Anwendung des Farbstoffbindungstests kalibriert); (c) Proteine an Filtern wurden mit Ponceau S gefärbt und mit der Färbeintensität von definierten Aliquoten eines auf ähnliche Weise immobilisierten Standards verglichen; und (d) mittels SDS-PAGE aufgetrennte und mit Coomassie R250 gefärbte Proteine wurden mit Aliquoten von Proteinen bekannter Konzentration verglichen, die am selben Gel mitliefen.
Das endgültige Präparat von PI3K (oder das gereinigte Material aus der ersten Stufe) wurde mit 100 nM [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin (17,7 Ci.mmol^–1, Amersham, auf Bestellung hergestellt) inkubiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt, mit Coomassie-Blau gefärbt und fotografiert. [³H] wurde dann fluorografisch nachgewiesen.
6.2. ERGEBNISSE
Die Analyse von Schweine-Neutrophilen-Cytosol mittels Anionenaustauschchromatographie zeigte, dass es eine Gβγ-aktivierte PI3K-Aktivität mit ähnlichen Eigenschaften enthielt, wie sie bereits in U937- und Osteosarkom-Zellen beschrieben wurde. Die Verwendung von [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin als Sonde identifizierte einen Doppelpeak einer scheinbaren Größe von 117 kD und 120 kD, der in den Gβγ- aktivierte PI3K-Aktivität enthaltenden Fraktionen eluierte, und außerdem, dass sie bei 2–4 % der Werte von [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin-gebunder p110α und/oder p110β lagen (siehe 5). Dieser Peak von Gβγ-aktivierter PI3K-Aktivität wurde weiter gereinigt (alle Figuren und Tabellen stellen ausführlich die Reinigung der Präparate von PI3Ks dar, die letztlich sequenziert wurden). Während dieses Prozesses spaltete er sich in zwei Peaks (A und B) auf, die beide scheinbare, native, relative Molmassen von 220 kD zeigten. Nachdem sie im Wesentlichen rein waren, wie mittels Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen festgestellt wurde, war klar, dass beide Aktivitäten gemeinsam mit zwei Proteinen wanderten: (A) mit Proteinen von 117 kD (das spezifisch [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin band und daher für die Katalyseuntereinheit gehalten wurde) und 101 kD; und (B) mit Proteinen von 120 kD (das ebenfalls [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin band) und 101 kD. Dieses Ergebnis zeigte an, dass die PI3K-Aktivitäten p117/p101- und p120/p101-Heterodimere in ihrem nativen Zustand waren. In ihren endgültigen Formen sind die PI3Ks A und B ungefähr 180.000 X und 380.000 X aus Neutrophilen-Lysaten (1.000.000.000 X aus Blut) mit einer Gesamtaktivitätsausbeute von 5,5 % gereinigt worden. Tabelle 1 definiert die Ausbeuten von Protein und PI3K-Aktivität über jeden Schritt.
TABELLE 1 Reinigung von Schweine-Leukozyten-G-Protein-βγ-Untereinheiten-aktivierten PI3Ks
Diese Werte der Anreicherung stehen im Einklang mit den an diese Proteine gebundenen Mengen an [³H]-17-Hydroxy-Wortmannin im Vergleich zu Elementen der p85/p110-Familie. Es wird daher angenommen, dass alle diese Proteine in geringer Menge vorkommen.
Gereinigte Präparate der PI3Ks A und B waren auf Basis ihrer Lipidkinaseaktivitäten unterscheidbar. Beide Präparate (a) wurden um mehr als das 100fache durch Gβγ-Untereinheiten auf Gα-GDP-sensitive Weise aktiviert, (b) wurden durch 100 nM Wortmannin vollständig gehemmt (mit 5 μM ATP in den Tests), (c) waren entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von Gβγs gegen Tyrosin-phosphorylierte Peptide unempfindlich, die PI3Ks der p85/p110 um das Fünffache aktivieren (siehe 6), und (d) waren zur 3-Phosphorylierung von PtdIns, PtdIns4P und PtsIns(4,5)P₂ fähig (die Identität der Produkte wurde durch sequentielle Entacetylierung und Glycerinentfernung, gefolgt von Anionenaustausch-HPLC-Analyse der [³²P]-markierten wasser löslichen Produkte mit intern [³H]-markierten Standards festgestellt). Außerdem zeigten die gereinigten Präparate von PI3K A und B die niedrigste scheinbare Km für letzteres Substrat (8 und 10 μM für A bzw. B) unter Einsatz des γ-Phosphats von ATP als Phosphatdonor (Ergebnisse nicht gezeigt).
7 BEISPIEL PEPTIDSEQUENZIERUNG VON SCHWEINE-Gβγ-AKTIVIERTER PI3K A UND B
In diesem Beispiel wurden beide Schweine-PI3K-Proteine durch Aminosäuresequenzierung analysiert. PI3Ks A und B, gereinigt aus einer 40 g entsprechende Menge Cytosolprotein, wurden dem Western-Blotting auf Nitrocellulose unterzogen, mit Ponceau S gefärbt, die allen vier Untereinheiten entsprechenden Banden herausgeschnitten, mit Trypsin behandelt und für die interne Aminosäuresequenzanalyse verarbeitet.
7.1. MATERIALIEN UND VERFAHREN
Erzeugung von Peptiden und Peptidsequenzierung. Aliquoten von Protein zur Sequenzierung wurden (im einen Nass-Blotter) mittels Western-Blotting auf Nitrocellulose (0,45 μm Porengröße BA85; Schleicher und Schüll) geblottet. Der Transferpuffer enthielt 192 mM Glycin, 25 mM TRIS und 10 Vol.-% Methanol. Vor dem Zusammenbau der fertigen Transfereinheit wurden die Filterpapierträger aus Whatman-Filterpapier Nr. 1 an der (–)-Seite des Gel/Filter-Sandwich und das Gel (1 mm stark) in 0,0005 % (Gew./Vol.) SDS enthaltendem Transferpuffer getränkt. Der Transfer erfolgte für 16 Stunden bei einer Festspannung von 35 V (0,25 bis 0,35 A bei 5°C). Die Filter wurden mit 0,1 % Ponceau S in 1 % Essigsäure 1 Minute lang gefärbt, dann 1 Minute lang in 1 % Essigsäure entfärbt. Ungefähr 85–90 % des auf das Gel aufgegebenen Proteins wurden aus dem Filter gewonnen. Die Banden von Interesse wurden aus der Nitrozellulose herausgeschnitten und für die interne Aminosäuresequenzanalyse wie beschrieben (Tempst et al., Electrophoresis 11, 537–552 (1990)) mit Modifizierungen (Lui et al. (1996)) verarbeitet. Zusammenfassend wurde eine proteolytische Spaltung in situ unter Verwendung von 0,5 μg Trypsin (Promega, Madison, WI) bei 37°C 2 Stunden lang durchgeführt. Das resultierende Peptidgemisch wurde mit 0,1 % β-Mercaptoethanol (BioRad, Richmond, CA) und 0,3 % 4-Vinylpyridin (Aldrich, Milwaukee, WI) reduziert bzw. S-alkyliert und mittels Umkehrphasen-HPLC fraktioniert. Ein Enzym-Blindwert wurde an einem gleich großen Streifen Nitrozellulose durchgeführt.
HPLC-Lösungsmittel sowie Systemkonfiguration waren die beschriebenen (Elicone et al. (1994)) mit der Ausnahme, dass eine Vydac-C4-Säule 214 TP54 mit 2,1 mm (Separations Group, Hesperia, CA) mit Gradientenelution bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 100 μl/min verwendet wurde. Die Identifizierung von Trp-enthaltenden Peptiden wurde durch manuelle Analyse des Verhältnisses der Absorptionen bei 297 und 277 nm durchgeführt, die in Echtzeit unter Verwendung eines Diodenarray-Detektors, Modell 1000S von Applied Biosystems (Foster City, CA), aufgezeichnet wurden (Erdjument-Bromage et al. (1994)). Fraktionen wurden händisch aufgefangen und für die Zeit des Laufs auf Eis gehalten und dann vor der Analyse bei –70°C gelagert.
Gereinigte Peptide wurden durch Kombination von automatischem Edman-Abbau und matrixbasierter Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-(MALDI-TOF-) Massenspektrometrie analysiert; Einzelheiten über diesen kombinierten Ansatz, einschließlich massenunterstützte Routineprozeduren nach chemischer Sequenzierung, finden sich anderswo (Geromanos et al., Techniques in Protein Chemistry V, 143–150 (1994); Elicone et al., J. Chromatogr. 676, 121–137 (1994); Erdjument-Bromage et al., Protein Sci. 3, 2435–2446 (1994)). Nach der Lagerung wurden Säulenfraktionen mit reiner TPA ergänzt (so dass eine Endkonzentration von 10 % erreicht wurde), bevor sie auf Sequenzierungsscheiben und Massenspektrometer-Targets aufgegeben wurden. Die Massenanalyse (an Aliquoten von 2 %) wurde unter Verwendung eines Voyager-RP-MALDI-TOF-Geräts (Vestec/PerSeptive, Framingham, MA) im Linearmodus durchgeführt, und zwar mit einem 337-nm-Stickstofflaser, einem Flugrohr von 1,3 m und α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Fertiglösung, erhalten von Li near Sci., Reno, NV) als Matrix. Eine Ionenbeschleunigungsspannung von 30 kV (Gitterspannung 70 %, Drahtführungsspannung 0,1 %) und –2,0, kV Multiplier-Spannung wurden verwendet. Laserfluenz und Anzahl an Akquisitionen wurden nach Beurteilung der optimalen Ablenkungen spezifischer Maxima unter Verwendung eines Digitalisieroszilloskops TDS 520 Tektronix (Beaverton, OR) eingestellt. Mz- (Masse zu Ladung) Spektren wurden aus den Flugzeitdateien unter Verwendung der Datenanalysesoftware GRAMS (Galactic Ind., Salem, NH) erzeugt. Jede Probe wurde zweimal analysiert, in Gegenwart und Abwesenheit von zwei Kalibriersubstanzen (jeweils 25 Femtomol APID und P8930), wie beschrieben (Geromanos et al. (1994)). Chemische Sequenzierung (an 95 % der Probe) wurde unter Verwendung eines Geräts von Applied Biosystems (AB), Modell 477A, durchgeführt. Schrittweise freigesetzte PTH-Aminosäuren wurden unter Verwendung eines „On-line"-120A-HPLC-Systems (AB), ausgestattet mit einer PTH-C18-Säule (2/1 × 220 mm; 5 Mikrometer Teilchengröße) (AB), identifiziert. Geräte und Verfahren wurden für die Phenylthihydantoin-Aminosäureanalyse im Femtomolbereich wie beschrieben optimiert (Erdjument-Bromage et al., Protein Sci. 3, 2435–2446 (1994); Tempst et al., Methods Companion Meth. Enzymol. 6, 284–261 (1994)).
Mittlere Isotopenmassen der Peptide wurden aus den identifizierten Resten (einschließlich den vermuteten) unter Verwendung der Software ProComp, Version 1.2, aufsummiert (erhalten von Dr. P.C. Andrews, University of Michigan, Ann Arbor, MI).
Ein doppelt Tyrosin-phosphoryliertes Peptid (18 Reste) auf Basis der umgebenden Tyrosine 740 und 751 in der PDGF-βR wurde von der mikrochemischen Anlage am Babraham Institute hergestellt.
7.2 ERGEBNISSE
Die Peptidsequenzdaten lösten sogleich mehrere Fragen bezüglich der Beziehungen zwischen diesen Proteinen. Die aus beiden PI3Ks A und B stammenden p101s waren identisch, und außerdem wurde eine relativ häufige allelische Variante an der Stelle 483 im ORF identifiziert (in 3 markiert), bei der ein Serin durch ein Glycin ersetzt war. p117 und p120 zeigten nahezu identische tryptische HPLC-Profile, und alle scheinbar gemeinsamen Peptide, die aus beiden Spezies sequenziert wurden, waren mit der Ausnahme eines aminoterminal blockierten Peptids aus p117 identisch (siehe unten). Peptidsequenzinformation wurde dann verwendet, um Sonden für die Wiedererlangung der für diese Proteine kodierenden Nucleotidsequenzen zu konstruieren.
8 BEISPIEL Klonierung der für Schweine-p120 und -p101 kodierenden cDNAs
Degenerierte Oligonucleotidsonden auf Basis der Sequenz eines Peptids aus Schweine-p120 und eines Peptids aus Schweine-p101 wurden verwendet, um eine Oligo-dT-geprimte, amplifizierte cDNA-Bibliothek zu screenen (hergestellt aus Schweine-Neutrophilen-Poly-A-selektierter RNA). Unten beschrieben ist die Klonierung und Charakterisierung von cDNAs, die für die p101- sowie p120-Proteine kodieren.
8.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
Die Erfinder stellten 0,7 mg Gesamt-RNA aus 4,2 × 10⁹ Schweine-Neutrophilen her (Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochemistry 162, 156–159 (1987)). Diese RNA wurde von Stratagene (San Diego, CA) verwendet, um PolyA-selektierte mRNA herzustellen, aus der sie oligodT- und zufallsgeprimte cDNA-Bibliotheken in λZAPII herstellten (ungefähr 5,4 × 10^–6 bzw. 3,2 × 10⁶ primäre p.f.u.). Amplifizierte Bibliotheken wurden aus ungefähr 2 × 10⁶ ursprünglichen Rekombinanten konstruiert, und diese wurden verwendet, um auf p120- und p101-cDNAs mittels Standardverfahren zu screenen.
2,5 × 10⁶ aus der oligodT-geprimten Bibliothek herstammende Plaques wurden gescreent, und zwar unter Verwendung eines [³²P]-markierten Oligos auf Basis der Peptidsequenz aus p120 [CA(T/C) GA(T/C) TT(T/C) ACI CA(A/G) CA(A/G) GTI CA(A/G) GTI AT(T/C/A) GA(T/C) ATG] (Seq.-ID Nr. 5). Zwölf positive Klone wurden identifiziert, als Bluescript^TM-basierte Plasmide isoliert und beide DBA-Stränge sequenziert (unter Verwendung der ABI-Einrichtung für automatische Sequenzierung am Babraham Institute). Die Inserte dieser Plasmide stellten ein Reihe von überlappenden Klonen dar, wobei zwei Klone ein ORF voller Länge definieren, das für die aus den tryptischen p117/p120-Verdauungen hergeleitete Peptidsequenz (4) kodiert.
0,9 × 10⁶ von der oligodT-geprimten Bibliothek herstammende Plaques wurden gescreent, und zwar unter Verwendung eines [³²P]-markierten Oligos auf Basis der Sequenz aus p101 [GCITA(T/C)ATGGA(A/G)GA(T/C)ATIGA(A/G)GA] (Seq.-ID Nr. 6). 1 positiver Klon wurde identifiziert, isoliert und sequenziert. Das 5'-Ende dieses Klons (D11) stellte einen Teil der Sequenz für eines der tryptischen Peptide dar und identifizierte es daher als einen partiellen Klon. Weitere 0,6 × 10⁶ Plaques aus der oligoT-geprimten Bibliothek wurden unter Verwendung eines aus D11 stammenden, [³²P]-markierten Cla-1-Restriktionsfragments gescreent. Sechsundsechzig positive Klone wurden identifiziert, wovon 49 isoliert und manche teilweise sequenziert wurden. Diese stellten eine Reihe überlappender Klone dar, von denen alle die D11-Sequenz enthielten, von denen jedoch alle kleiner als D11 selbst waren. 3,5 × 10⁶ Plaques aus der zufallsgeprimten Bibliothek wurden dann unter Verwendung eines aus D11 stammenden, [³²P]-markierten Apa-1-Restriktionsfragments gescreent. Achtundneunzig positive Klone wurden identifiziert. Diese Klone wurden nochmals gescreent (auf der Stufe der primären Plaque-Isolate), und zwar mittels eines PCR-basierten Ansatzes unter Verwendung von Primern, die gegen die Bluescript^TM-Vektor- (entweder „Vorwärts"- oder „Rückwärts"-Primer) und interne D11-Sequenz konstruiert waren. Dies ermöglichte den Erfindern die Identifizierung (unabhängig von der Ausrichtung) der längsten potenziellen N-terminalen, für die p101-Sequenz kodierenden Extensionen. Jene 3 Klone, die das längste PCR-Fragment lieferten, wurden isoliert und sequenziert. Diese stellten überlappende Klone dar, die zusammen mit D11 ein ORF voller Länge definierten, das für die gesamte aus dem tryptischen p101-Verdau stammende Peptidsequenz kodierte (1 und 2).
8.2 ERGEBNISSE
Zwei Klone definierten ein ORF voller Länge, das für alle der tryptischen p117/p120-Peptide kodierte (siehe 1–4). Von drei möglichen Startmethioninen wurde der zentrale als aktiv identifiziert (im Gegensatz zur Annahme von Stoyanov et al., Science 269, 690–693 (1995)), und zwar auf Basis der exakten Übereinstimmung zwischen der gemessenen Masse eines aminoterminal blockierten, von p120 abstammenden Peptids und der theoretischen Massen von aminoterminalen Peptiden, die sich als Resultat des Translationsstarts an jedem der drei Methionine ergeben würden. Als solches weist p120 eine theoretische Größe von 126 kD auf. Der Vergleich der Masse des aminoterminal blockierten Peptids, das aus p117 mit den maßgeblichen Regionen des aminoterminalen Endes von p120 produziert wird, zeigt keine exakten Übereinstimmungen auf (was die übliche aminoterminale Blockierung ermöglicht). Daher ist es unwahrscheinlich, dass p117 eine proteolytisch oder posttranslationell modifizierte Form von p120 ist. Es ist auch unwahrscheinlich, dass es aus der Verwendung eines zweiten Translationsstartpunkts in der p120-RNA resultiert. Jedoch ist eine cDNA mit einem für p117 kodierenden ORF nicht isoliert worden.
Die p120 definierenden Protein- und DNA-Sequenzen wurden verwendet, um Datenbanken auf ähnliche Strukturen zu durchsuchen. Ähnlichkeiten mit allen früher klonierten PI3Ks wurden identifiziert. Jedoch war die Sequenz unter Berücksichtigung von Speziesunterschieden nahezu identisch mit p110γ (Stoyanov et al. (1995)). Die einzige signifikante Abweichung zwischen der Sequenz der Erfinder und jener, die Stooyanov et al. fanden, findet sich am äußersten COOH-Terminus. Auf Basis der Primärstruktur alleine konnte die Identifizierung einer COOH-terminalen Pleckstrin-Homologiedomäne in p120 nicht bestätigt werden.
Durch Verwendung mehrerer überlappender Fragmente, hergeleitet von oligo-dT- und zufallsgeprimten, Schweine-Neutrophilen-hergeleiteten cDNA-Bibliotheken, ist ein ORF voller Länge definiert worden, das für die gesamte der von p101 stammen den Peptidsequenz kodiert. Ein p101-abstammendes, aminoterminal blockiertes Peptid wurde identifiziert; dessen Masse war exakt gleich jener, die für eine aminoterminal acetylierte Version der ersten 12 Reste vorhergesagt wurde, die von dem vorhergesagten Start im beschriebenen ORF definiert werden. Die vorhergesagte relative Molmasse von p101 beträgt 97 kD. Obgleich die Protein- und DNA-Sequenzdatenbasen auf ähnliche Strukturen und Substrukturen durchsucht wurden, konnten keine signifikanten Übereinstimmungen identifiziert werden.
9 BEISPIEL Klonierung der cDNAs die für menschliches p120 und p101 kodieren
Von den Schweine-p101- und -p120-cDNA-Sequenzen abstammende radiomarkierte PCR-Produkte wurden erfolgreich verwendet, um menschliche cDNA-Bibliotheken auf ihre menschlichen Homologe zu screenen. Die Klonierung und Charakterisierung von für menschliches p101 und p120 kodierenden cDNAs wird unten beschrieben.
9.1 MENSCHLICHES p101
Eine menschliche Monozyten-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA; mRNA-Quelle: U937-Zelllinie, PMA-behandelt bei 50 ng/ml für 3,5 Tage) wurde mit einem radiomarkierten PCR-Produkt gescreent, das den Basenpaaren 887–1.287 der Schweine-p101-cDNA-Sequenz entspricht. Die menschliche cDNA-Bibliothek enthaltenden λgt11-Phagen wurden wie im „Clontech Lambda Library Protocol Handbook" beschrieben ausplattiert und auf Nylonfilter übertragen. Filtergebundene DNA wurde durch einminütiges Autoklavieren der Filter denaturiert, worauf die Filter 2 Stunden lang bei 42°C in 50 % Formaldehyd, 5x Denhardt, 5x SSC, 0,05 mg/ml Lachsspermien-DNA, 0,05 M NaPO₄ bei pH 6,8, 1 mM Natriumpyrophosphat und 1 % SDS vorhybridisiert wurden. Die radiomarkierte PCR-Sonde wurde durch 5-minütiges Aufkochen denaturiert, 15 Minuten lang auf Eis gekühlt und dann den Filtern im Hybridisierungspuffer bei einer Endkonzentration von 1 Million cpm/ml zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 42°C unter ständiger Bewegung. Die Filter wurden dann einmal in 2x SSC, 1 % SDS bei Raumtemperatur 20 Minuten lang ge waschen, gefolgt von einem Waschvorgang in 2x SSC, 1 % SDS bei 42°C für zwanzig Minuten und einem letzten Waschvorgang bei 0,2x SSC, 1 % SDS bei 42°C für 20 Minuten. Nach Autoradiographie wurden positive Klone gemäß dem „Clontech Library Handbook" isoliert, indem der Bereich um den und einschließlich des positiven Klons entnommen und der Phage in „Phage Dilution Buffer" eluiert wurde. Die Phagen wurden dann wieder bei einer Dichte ausplattiert, welche die Isolation einer einzelnen Phagenplaque ermöglichte, über Nacht gezüchtet und auf Nylonfilter übertragen. Die Filter wurden mit derselben radioaktiven PCR-Sonde wie oben hybridisiert, gewaschen und der Autoradiographie unterzogen. Einzelne, reine, positive Phagenplaques wurden entnommen, die Phagen in „Phage Dilution Buffer" eluiert und dann neu ausplattiert, um einen konfluenten Rasen zu liefern. Der Plaquegereinigte Phagenrasen wurde in „Phage Buffer" eluiert und Lambda-Phagen-DNA gemäß dem Protokoll im „Clontech Library Protocol Handbook" isoliert.
Gereinigte Lambda-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten, an einem Agarosegel aufgetrennt und das EcoRI-DNA-Insert isoliert und in EcoRI-linearisierten Bluescript KS+ nochmals kloniert. Bluescript-Plasmide, die diese DNA-Inserte enthielten, wurden dann sequenziert. Fünf der unabhängig isolierten cDNA-Klone enthielten Sequenzen, die zur Schweine-p101-cDNA-Sequenz zwischen Nucleotid 1.137 und dem Stopcodon am Nucleotid 3.021 homolog waren. Relativ zur Schweine-p101-Sequenz enthielten die isolierten menschlichen Klone zusätzliche 544 bp 3'-untranslatierter Sequenz.
Da die Schweinesequenz am 5'-Ende sehr reich an GC ist, ist die Wahrscheinlichkeit niedrig, einen Klon voller Länge in einer oligo-dT-geprimten Bibliothek aufzufinden. Daher entschieden sich die Erfinder dafür, eine Bibliothek zu verwenden, die oligo-dT- sowie zufallsgeprimt war, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen Klon aufzufinden, der das GC-reiche 5'-Ende enthielt. Unter Verwendung desselben radiomarkierten PCR-Produkts der Schweine-p101-Sequenz und derselben Verfahren wie die oben beschriebenen screenten die Erfinder eine menschliche Leukozyten-5'-Stretch-Plus-cDNA-Bibliothek (Clontech; mRNA-Quelle: normale Peripherblutleukozyten) und isolierten mehrere Klone, wovon einer das 5'-Ende der menschlichen p101-Sequenz enthielt. Dieser Klon umfasste annähernd 300 bp stromauf der kodierenden Sequenz und die ersten 1.612 bp der kodierenden Sequenz. Ein cDNA-Klon voller Länge, der die gesamte kodierende Region der menschlichen p101-Sequenz enthielt, wurde dann konstruiert, indem das 5'-Ende des Leukozytenklons (von einer HindIII-Stelle 77 bp stromauf des Startcodons bis zu einer SacI-Stelle an Position 1.262) mit dem Monozytenklon (von der SacI-Stelle bis zu einer XbaI-Stelle an Position 3.014, 305 bp stromab des Stopcodons) fusioniert wurde. Die gesamte Sequenz des cDNA-Klons voller Länge wurde ermittelt und die kodierte Sequenz abgeleitet.
Da dieser Klon voller Länge von zwei verschiedenen Klonen aus zwei verschiedenen Bibliotheken abstammte, wurde die Existenz des 3'-Endes des p101-Klons in der Leukozytenbibliothek verifiziert. Unter Verwendung von fünf verschiedenen Sätzen von PCR-Primern bewiesen die Erfinder, dass das 3'-Ende von p101, das aus der Monozytenbibliothek kloniert wurde, sowohl in der Monozyten- als auch in der Leukozytenbibliothek vorhanden war.
9.2 MENSCHLICHES p120
Das menschliche Homolog von Schweine-p120 wurde durch Screenen einer Leukozyten-cDNA-Bibliothek (Clontech; mRNA-Quelle: normale Peripherblutleukozyten) mit einem radioaktiv markierten PCR-Fragment der Schweinesequenz von bp 875 bis 1.315 gemäß dem oben für die Klonierung von menschlichem p101 beschriebenen Protokoll kloniert. Die Erfinder isolierten unabhängig voneinander zwei Klone, die das 5'-Ende von menschlichem p120 enthielten, entsprechend bp 6 bis 2.414 in der Schweinsequenz, wie berichtet von Stephens et al. Die menschliche Sequenz enthält eine EcoRI-Stelle bei bp 2.408, und da die cDNA-Bibliothek mit EcoRI-Linkern konstruiert worden ist, musste die menschliche Sequenz voller Länge in zwei gesonderten Klonen enthalten sein, wovon einer das 5'-EcoRI-Fragment und der andere das 3'-EcoRI-Fagment enthielt. Die Bibliothek wurde daher nochmals unter denselben Bedingungen wie oben mit einem radioaktiv markierten PCR-Fragment vom 3'-Ende (bp 2.801 bis 3.395) der Schweine-p120-Sequenz gescreent. Die Erfinder isolierten unabhängig voneinander zwei Klone, die das 3'-Ende der Sequenz von Position 2.408 (menschliche Sequenz) bis zum Anfang der Poly-A-Schwanzes an Position 5.128 enthielten. Die DNA-Inserte der beiden Phagen, die das 5'- und 3'-EcoRI-Fragment enthielten, wurden isoliert und an der EcoRI-Stelle fusioniert, um einen cDNA-Klon voller Länge (1–5.128) zu liefern, der die gesamte kodierende Region (84 bis 3.390) des menschlichen p120-Homologs enthielt. Die gesamte Sequenz des cDNA-Klons voller Länge wurde ermittelt und die kodierte Aminosäuresequenz abgeleitet.
10. BEISPIEL: Expression von Schweine-p120 und -p101 in Insektenzellen
Rekombinante, klonale Baculoviren (rbv), die entweder eine aminoterminale, 6x-HIS-markierte p120- (pAcHLT-p120-) cDNA oder eine aminoterminale (EE)-markierte p101-cDNA (pAcO-GI-p101) beherbergten, wurden hergestellt und verwendet, um die Produktion der obigen Proteine in Insekten- (Sf9-) Zellen anzutreiben.
10.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
10.1.1 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN
Die Verwendung N-terminaler PCR und geeigneter Restriktionsstellen ermöglichte es, die Schweine-p120- und -p101-ORFs zu einer Form zu manipulieren, in der sie In-frame in verschiedene Expressionsvektoren insertiert werden konnten. In allen Fällen war die erste nach der N-terminalen Markierung kodierte Aminosäure das Start-Methionin. Die 3'-untranslatierte Region der p120-cDNA wurde vollständig und jene der p101-cDNA an einer BamHI-Stelle trunkiert (Nucleotid 192, 1) verwendet. Die für die Baculovirus-angetriebene Expression in Sf9-Zellen verwendeten Vektoren waren pAcHLT (der für einen N-terminalen „6x-His-Marker", gefolgt von einer Thrombinspaltstelle kodiert, Pharminogen; das p120-ORF wurde in die XhoI-EcoRI-Stellen insertiert) und pAcO-GI (der für einen N-terminalen „EE-Marker" kodiert, ONYX Pharmaceuticals; das p101-ORF wurde in die EcoRI-NotI-Stellen insertiert). Alle Vektoren wurden vor Verwendung N-terminal sequenziert.
10.1.2 Sf9-ZELLEN-TRANSFEKTIONEN UND PRODUKTION VON REKOMBINANTEN PROTEINEN
Sf9-Zellen wurden in TNM-FH mit 11 % HI-FBS in einer Spinnerflasche gezüchtet und wurden zwischen 0,5 und 2 × 10⁶ Zellen.ml^–1 gehalten. Sf9-Zellen wurden mit Insectin^TM-Liposomen (Invitrogen) mit linearisierter Baculo-Gold-DNA (Pharminogen) und maßgeblichen Baculovirus-Transfervektoren wie empfohlen (Invitrogen) transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Baculoviren wurden Plaque-gereinigt und amplifiziert, um Virus-Stammlösungen mit hohem Titer zu liefern. Die optimalen (für die Proteinproduktion) Verdünnungen wurden für jede Stammlösung mit hohem Titer ermittelt. pAcO-GI-p101-Viren wurde ermöglicht, anhaftende Sf9-Zellen 2,2 Tage lang bei 27°C zu infizieren; pAcHLT-p120-Viren wurde ermöglicht, in einer Spinnerkultur (üblicherweise) 1,9 Tage lang bei 27°C zu infizieren. Die Zellen wurden in eiskalte 0,41 % KCl; 2,66 % Saccharose; 20 mM MgCl₂; 8 mM NaH₂PO₄, pH 6,2, 25°C geerntet; mit 1 mM Diisopropylfluorphosphat behandelt (5 Minuten auf Eis) und einmal in Erntelösung gewaschen. Mittels Zentrifugation gepackte Aliquoten von Zellen wurden in flüssigem N₂ eingefroren und bei –80°C gelagert.
10.1.3 REINIGUNG VON VON Sf9-ABSTAMMENDEN PROTEINEN
Schweine-p120 wurde unter Verwendung einer Metallionen-Chelatbildner-Säule (Talon, Clontech) gereinigt. Zellpellets wurden in 0,10 M NaCl; 50 mM Natriumphosphat pH 8,0, 4°C; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 4°C; 1 mM MgCl₂ und Antiproteasen I (siehe oben) in einem Verhältnis von 1 Liter infizierter Sf9-Zellkultur in 50 ml Beschallungspuffer aufgetaut, mittels Sonde beschallt (4 × 15 Sekunden auf Eis) und zentrifugiert (120.000 × g für 40 Minuten, 4°C). Der Überstand wurde entfernt und vereinigt (trüber Überstand am oberen Ende des Röhrchens wurde gesondert entfernt, mit einem Filter von 0,45 μm mit niedriger Proteinbindung filtriert und dann mit dem verbleibenden Rest vereinigt). Die Cytosolfraktion wurde mit Tween-20 und Betain (0,05 (Gew./Vol.) bzw. 1 %) ergänzt, dann auf eine Säule von Talon-Harz gepumpt, die im gleichen Puffer äquilibriert war (1,2 ml Harz pro Liter infizierte Sf9-Originalkultur bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 20 cm.h^–1). Dieser und alle weiteren Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Säule wurde hintereinander mit 20 Säulenvolumina von jedem der folgenden Puffer gewaschen (selbe Durchflussgeschwindigkeit): Puffer A, 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 4°C; 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 4°C; 0,15 M NaCl; 1 % Betain; 0,05 %, Gew./Vol., Tween-20; Puffer B, 1 %, Gew./Vol., Triton X-100; 0,15 M NaCl; 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 4°C; 10 mM Tris, pH 8,0, 4°C; 1 % Betain 0,05 %, Gew./Vol., Tween-20; Puffer C, 0,15 M NaCl; 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 4°C; 1 % Betain; 0,05 %, Gew./Vol., Tween-20; Puffer D; 0,15 M NaCl; 30 mM Tris, pH 7,5, 4°C, 1 % Betain, 0,02 %, Gew./Vol., Tween-20; 10 %, Gew./Vol., Ethylenglykol; 1 mM MgCl₂; und dann 8 Säulenvolumina Puffer E, umfassend Puffer D, ergänzt mit 10 MM Imidazol (pH 7,5). Während des Waschvorgangs mit Puffer E wurden Fraktionen von 2 ml aufgefangen. Schließlich wurde die Säule bei der halben vorher verwendeten Durchflussgeschwindigkeit mit Puffer F gewaschen, der sich aus mit 70 mM Imidazol (pH 7,5; Endkonzentration) ergänztem Puffer D zusammensetzte. Typischerweise wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Mit Erfahrung wurden Fraktionen auf Basis der Absorption bei 280 nm (fortlaufend gemessen) vereinigt und sofort mit 1 mM DTT und 1 mM EGTA (Endkonzentrationen) ergänzt. Typischerweise lieferte dieses Verfahren 4 mg p120 pro Liter Sf9-Kultur. Das auf diese Weise hergestellte p120 wies üblicherweise eine Reinheit von über 90 % auf. Der endgültige Pool von p120 wurde über eine Säule von 15 ml aus G-25 Superfine entsalzt, die mit Puffer G äquilibriert war, der aus mit 1 mM DTT und 1 mM EGTA (Endkonzentrationen) ergänztem Puffer D bestand. Die in manchen Experimenten verwendeten „p120-Blindwert"-Präparate wurden exakt parallel zu normalen p120-Präparaten mit der Ausnahme hergestellt, dass die Ausgangszellen entweder mit Baculovirus der Wildform infiziert oder nicht infiziert waren. Die endgültigen Fraktionen, die aus diesen „Blindwert"-Präparaten stammten, wurden auf Basis eines „parallelen Volumens" aufgefangen, da sie praktisch kein Protein enthielten.
Der p120-6x-HIS-Marker enthielt ein Thrombinspaltungs-Erkennungsmotiv. Die sorgfältige Titration mit Thrombin und Analyse mit 6%igen Polyacrylamid-SDS-Gelen offenbarte zwei Thrombinstellen mit ähnlichen Empfindlichkeiten auf Thrombin, beide nahe dem Aminoterminus (da ein αCOOH-terminaler Antikörper das zweimal geschnittene p120 nach wie vor immunpräzipitierte). Eine der Stellen war der erwartete Ort für die in den Marker konstruierte Stelle; die andere Stelle befand sich ungefähr 40 Reste weiter innen vom Aminoterminus (in einer Region ohne bevorzugte Thrombinerkennungssequenzen). Unter optimierten Bedingungen (2 U.ml^–1 Thrombin; 0,2 mg.ml^–1 p120; 4 Stunden, 4°C, mit 1 mM EGTA und 1 mM MgCl₂) war es möglich, Präparate von Thrombin-gespaltenem p120 zu erzeugen, die 15 % ungeschnittenes p120, 50 % an der authentischen aminoterminalen Thrombinstelle geschnittenes und 35 % p120 mit zusätzlichen ungefähr 40 abgespaltenen Resten enthielten. Bei diesen Experimenten wurde die Thrombinwirkung durch Zugabe von 100 nM N-Acetyl-D-Phe-Pro-2-amido-5-guanidinobutanboronsäure, einem potenten Thrombininhibitor (Sigma), terminiert. Im gesamten Verlauf der Arbeit wurden Präparate von partiell gespaltenem p120 parallel mit völlig ungespaltenem p120 verwendet. Es war eindeutig, dass: (A) alle drei p120 an p101 mit ähnlicher Affinität banden, (B) an das p120-Gemisch gebundenes p101 durch Gβγs in einem ähnlichen Ausmaß wie an ungespaltenes p120 gebundenes p101 aktivierte, (C) ungespaltenes sowie partiell gespaltene p120s praktisch unempfindlich auf Gβγ-Untereinheiten in Abwesenheit von p101 waren (obgleich die vollständige Thrombinspaltung dazu neigte, die katalytische Gesamtaktivität von p120 um 20–30 % zu vermindern und die 1,7fache scheinbare Aktivierung durch Gβγ in Abwesenheit von p101 auf etwa das 2,5fache zu erhöhen).
Schweine-(EE)-p101 wurde aus gefrorenen Pellets von Sf9-Kulturen wie folgt gereinigt. Zellen aus 2 Litern infizierter Sf9-Kultur wurden in 50 ml 0,12 M NaCl; 1 mM MgCl₂; 25 mM HEPES, pH 7,4, 4°C; 1 mM EGTA plus Antiproteasen 1 wie oben beschrieben beschallt. Nach Zentrifugation (120.000 × g, 4°C, 40 Minuten) wurde der Überstand entfernt (wie oben beschrieben), mit 1 % (Gew./Vol.) Triton X100, 0,4 % Natriumcholat, 0,4 M NaCl (Endkonzentrationen) ergänzt und mit 2 ml gepackter Protein-G-Sepharose vermischt, die kovalent an einen irrelevanten monoklonalen α-(myc)-Antikörper vernetzt war (in einer äquivalenten Lösung gewaschen). Nach 30 Minuten Vermischen bei 4°C wurden die Perlen sedimentiert und der Überstand ent fernt und mit 1 ml Protein-G-Sepharose vermischt, die an einen monoklonalen α-(EE)-Antikörper kovalent vernetzt war (in einer äquivalenten Lösung äquilibriert). Nach 2 Stunden Vermischen bei 4°C wurden die Perlen wie unten für U973-Zellen-α-(EE)-Immunpräzipitationen beschrieben mit der Ausnahme gewaschen, dass (a) die Waschvorgänge in einem Zentrifugenröhrchen von 20 ml durchgeführt und (b) die Perlen schließlich 3 × mit Puffer H gewaschen wurden, der aus mit 1 %, Gew./Vol., Triton X-100 ergänztem Puffer G bestand. In manchen Experimenten verwendete „p101-Blindwert"- (p101C-) Präparate wurden genau wie oben beschrieben aus Zellen hergestellt, die entweder mit Baculovirus der Wildform infiziert oder nicht infiziert waren.
p101/p120-Heterodimere, die sich in vivo durch Coinfektion von Sf9-Zellen mit beiden Formen des rekombinanten Baculovirus bildeten, wurden wie für (EE)-p101 beschrieben mit der Ausnahme gereinigt, dass die Immunpräzipitate 4 × mit Puffer I, 1 %, (Gew./Vol.), Triton X-100; 0,15 M NaCl; 20 mM HEPES, pH 7,4, 4°C; 1 mM EGTA; 2 × mit Puffer J, der aus mit 0,4 M NaCl (Endkonzentration) ergänztem Puffer I bestand, dann 3 × mit Puffer G gewaschen wurden, bevor sie mit 1 Bettvolumen von 150 μg.ml^–1 (Endkonzentration) (EE)-Peptid in Puffer G eluiert wurden. Das (EE)-Peptid, aminoterminal acetyliertes EYMPTD, hat eine sehr hohe Affinität für den monoklonalen α-(EE)-Antikörper. Nachdem die Perlen mit (EE)-Peptid auf Eis 40 Minuten lang inkubiert worden sind, wurde der Überstand entfernt. Aliquoten der eluierten Proteine wurden verdünnt und auf PI3K-Aktivität getestet (siehe oben) oder direkt mit SDS-Probenpuffer vermischt.
Bei In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten wurden p120-Präparate in Puffer G, der mit 1 %, Gew./Vol., Triton X-100 ergänzt war (nunmehr äquivalent zum Puffer H), mit (EE)-p101 (10:1-Verhältnis an Protein) vermischt, das nach wie vor an die Protein-G-Matrix gebunden war, für 2 Stunden vermischt (Ende an Ende bei 4°C), dann gewaschen und mit (EE)-Peptid wie für die Reinigung von in vivo rekonstituierte p101/p120-PI3K in den unten stehenden Beispielen beschrieben eluiert.
10.2 ERGEBNISSE
Einschritt-Reinigungen unter Einsatz der Marker lieferten gereinigte Proteinpräparate, wie mittels Coomassie-Färbung festgestellt wurde; ihre scheinbaren Größen stimmen mit den Erwartungen überein. Außerdem wurden beide in Western-Blots durch spezifische, gegen den COOH-Terminus gerichtete und gegen die interne Sequenz gerichtete polyklonale Antipeptid-Kaninchen-Antiseren korrekt erkannt (nicht gezeigt), was auf ihre Authentizität hinweist.
p120 band fest und in einer molaren Stöchiometrie von 1:1 an p101 (a) in vitro, wenn beide Proteine unabhängig voneinander gereinigt, vermischt (wobei p101 nach wie vor mit der für seine Isolierung verwendeten Protein-G-Matrix assoziiert war) und dann stringent gewaschen worden sind, bevor sie mit (EE)-Peptid eluiert wurden, oder (b) in vivo, wenn Sf9-Zellen mit beiden Formen von rbv infiziert und Proteine über den p101-Marker gereinigt wurden (Daten nicht gezeigt).
Freies, gereinigtes p120 war eine PtdIns(3,4)P_s-selektive, Wortmannin-sensitive PI3K. Gβγs hatten eine geringe und bimodale Wirkung auf freie p120-PI3K-Aktivität. Ein äquimolares Gemisch (Endkonzentration von 2 μM) der Gαs o, i₁, i₂ und i₃ band an GDP und hatte in Gegenwart von Aluminiumfluorid keine signifikante Wirkung auf die freie p120-PI3K-Aktivität (dies war ein Präparat von Gas, das bei Zugabe in einem 1,5fachen molaren Überschuss die Wirkungen von Gβγs auf PI3K vollständig hemmen konnte). Zur Aktivierung von Elementen der p85/p110-PI3K-Familie fähige, Tyrosin-phosphorylierte Peptide hatten ebenfalls keine nachweisbare Wirkung auf die p120-PI3K-Aktivität. Wenn sie an p101 gebunden war (entweder in vivo oder in vitro), konnte die PI3K-Aktivität von p120 um mehr als das 100fache durch Gβγ-Untereinheiten aktiviert werden. Tyrosin-phosphorylierte Peptide und Gα-GDP/Aluminiumfluorid hatten keine Wirkung auf die Gβγ-aktivierte oder basale p101/p120-PI3K-Aktivität. Im Abwesenheit von Gβγs ist die spezifische Aktivität von p120 in einem p101/p120-Komplex niedriger als die spezifische Aktivität von freiem p120, wird jedoch in ihrer Gegenwart um mehr als das 50fache gesteigert (siehe 7).
Der Vergleich der spezifischen katalytischen Aktivitäten von Schweine-Neutrophilen-abstammender PI3K (B) und von Sf9-abstammenden p101/p120-Neterodimeren unter identischen Gβγ-stimulierten Testbedingungen zeigte, dass das Sf9-abstammende Material eine 2 X höhere Aktivität pro mg Protein aufwies. Dieses Ergebnis ist nicht unvereinbar mit dem wahrscheinlichen „Alter beim Test" eines PI3K-Präparats, das aus zirkulierenden Neutrophilen über ein 4-tägiges Reinigungsprotokoll stammt, und zeigt an, dass der Großteil der rekombinanten PI3K korrekt gefaltet ist und dass alle kritischen posttranslationellen Veränderungen vorhanden sein müssen.
11. BEISPIEL: Expression von Schweine-p101 und -p120 in Säugetierzellen
Ein Familie von Säugetier-Expressionsvektoren wurde konstruiert, welche die vorübergehende Expression von aminoterminal Epitop-markierten Formen (entweder (myc) oder (EE)) von Schweine-p101 und -p120 ermöglichten. Dieses Beispiel beschreibt die Produktion von gereinigten p101- und p120-Fusionsproteinen aus Säugetierzellen und die anschließende Analyse ihrer Eigenschaften.
11.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
11.1.1 ZELLKULTUR
U937-Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10 %, Gew./Vol., hitzeinaktiviertem (HI-) FBS gezüchtet und alle 2 Tage 4fach verdünnt. Cos-7-Zellen wurden in DMEM 10 % HI-FBS gezüchtet.
11.1.2 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN
Die Verwendung von N-terminaler PCR und geeigneten Restriktionsstellen ermöglichte die Manipulation der Schweine-p120- und -p101-ORFs zu einer Form, in der sie In-frame in verschiedene Expressionsvektoren insertiert werden konnten (in allen Fällen war die erste nach dem N-terminalen Marker kodierte Aminosäure Methionin).
Die 3'-untranslatierte Region der p120-cDNA wurde vollständig und jene der p101-cDNA an einer BamHI-Stelle trunkiert (Nucleotid 192, 1) verwendet. Die für die Cytomegalovirus-angetriebene (CMV-) Expression in Säugetierzellen verwendeten Vektoren waren (A) pCMV(EE) (für einen N-terminalen MEEEEFMPMPMEF- (Seq.-ID Nr. 7) oder MEEEEFMPMEFSS- (Seq.-ID Nr. 8) „EE-Marker" für p101- bzw. p120-Expression kodierend) und (B) pCMV (myc) (für einen N-terminalen MEQKLISEEDLEF- (Seq.-ID Nr. 9) oder MEQKLISEEDLEFSS- (Seq.-ID Nr. 10) „myc-Marker" für p101- bzw. p120-Expression kodierend). Alle Vektoren wurden vor Verwendung N-terminal sequenziert.
11.1.3 U937-TRANSFEKTIONSPROTOKOLLE
Exponentiell wachsende U937-Zellen (12 Stunden vorher verdünnt) wurden 2 × mit PBS gewaschen und in sterilem Elektroporationsmedium (EM) resuspendiert, das Folgendes enthielt: 30 mM NaCl, 0,12 M KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,46 mM KH₂PO₄ und 5 mM MgCl₂ bei Raumtemperatur. Zirkuläre Plasmid-DNA wurde in 1 × EM zu den Zellen zugegeben, um ein Endvolumen von 0,5 ml zu liefern, das 1,4 × 10⁷ Zellen und 40 μg Gesamt-DNA enthielt (üblicherweise auf 40 μg aufgefüllt mit einem Expressionsplasmid mit demselben Promotor, das ein ähnlich markiertes, jedoch irrelevantes Protein exprimiert), und wurden in eine Küvette (Spaltbreite 0,4 cm, Bio-Rad) überführt. Nach 15 Minuten Stehen bei Raumtemperatur wurden die Zellen elektroporiert (1 Puls bei 280 V und 960 μF mit einem Gen-Pulser von BioRad; Zeitkonstanten waren typischerweise 18 msec), dann weitere 8 Minuten lang auf Eis gegeben, bevor sie in 5 ml RPMI, 10 % HI-FBS verdünnt wurden. Nach 5-minütigem Stehen, um die Verklumpung toter Zellen zu ermöglichen, wurden die Zellen mit 35 ml RPMI, 10 % HI-FBS, das mit Penicillin und Streptomycin ergänzt war, verdünnt, worauf TPA und ZnCl₂ (die beide die Expression auf CMV-Promotoren in U937-Zellen wesentlich verstärken) auf Endkonzentrationen von 5 × 10^–8 M bzw. 200 μM zugegeben wurden. Falls die Zellen mit [³⁵S]-Methionin (Translabel, ICN) zu markieren waren, dann war das nach der Elektroporation verwendete RPMI frei von Methionin und Leucin und enthielt 2 mM NaHCO₃ und 25 mM HEPES und 10 % dialysiertes HI-FBS, und die Zellen wurden in einem Endvolumen von 10 ml mit 20 μCi/ml [³⁵S]-Methionin/Leucin (plus TPA und ZnCl₂, wie oben) resuspendiert. Nach 12 Stunden (entweder mit oder ohne [³⁵S]) wurden die Zellsuspensionen mit. Diisopropylfluorphosphat (1 mM Endkonzentration) vermischt, 5 Minuten lang stehen gelassen, dann mittels Zentrifugation gesammelt, 1 × mit PBS gewaschen und für die Immunpräzipitation lysiert. (EE)-Epitop-markierte Proteine wurden aus U937-Zelllysaten wie folgt immunpräzipitiert. Zellen aus 1 Elektroporation wurden in 1,25 ml Lysepuffer lysiert, der 1 %, Gew./Vol., Triton X-100, 25 mM HEPES, pH 7,4, 4°C; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl₂; 0,15 M NaCl und 0,1 mM PMSF, 10 μg ml^–1 Leupeptin, 10 μg ml^–1 Aprotinin, 10 μg ml^–1 Antipain, 10 μg ml^–1 Pepstatin A und 10 μg ml^–1 Bestatin (fortan als Antiproteasen I bekannt) enthielt. Die Lysate wurden zentrifugiert (120.000 U/min, 0°C, 15 Minuten). Die resultierenden Überstände wurden entfernt und mit 4 M NaCl (0,1 ml), 20 % Natriumcholat (25 μl) und Protein-G-Sepharose (40 μl Packungsvolumen) vermischt, die an einen irrelevanten, isotyp-übereinstimmenden, monoklonalen Maus-Antikörper kovalent gekoppelt war (bei ungefähr 5–10 mg.ml^–1 Sepharose). Die Überstände wurden über Kopf 20 Minuten lang vermischt und die Perlen dann sedimentiert und der Überstand in ein anderes Röhrchen mit Protein-G-Sepharose-Perlen (10 μl, gepackt) übertragen, die kovalent an den monoklonalen α-(EE)-Maus-Antikörper vernetzt waren (bei ungefähr 5–10 mg.ml^–1 Sepharose). Nach 2 Stunden Vermischen bei 4°C wurden die Immunpräzipitate 5 × mit 1,0 %, Gew./Vol., Triton X-100; 0,4 % Cholat; 0,004 % SDS; 0,4 M NaCl; 1 mM EGTA; 25 mM HEPES, pH 7,4, bei 0°C; 1 × mit 0,5 M LiCl, 0,1 M Tris, pH 8,0, 4°C; 2 × mit 0,12 M NaCl; 1 mM EGTA; 25 mM HEPES, pH 7,4, bei 0°C gewaschen. Der letzte Pufferwaschgang war mit 1 mM DTT (letzter Waschpuffer) ergänzt. Falls die Immunpräzipitate aus [³⁵S]-Methionin-markierten Zellen hergestellt wurden, wurde der letzte Waschgang ausgelassen und die Perlen in SDS-Probenpuffer aufgekocht. Ansonsten wurden die Proben wie unten beschrieben auf PI3K-Aktivität getestet.
11.1.4 TRANSFEKTION VON COS-7-ZELLEN
Exponentiell wachsende Cos-7-Zellen wurden trypsinisiert/bei etwa 50–70 % Konfluenz 3 Stunden vor der Transfektion neu ausplattiert. Zum Zeitpunkt der Transfek tion wurden sie wiederum trypsinisiert, in DMEM 10 % FBS verdünnt, gezählt, 2x in PBS gewaschen und in EM resuspendiert (1 × 10⁷ pro Küvette) und mit zirkulärer Plasmid-DNA vermischt (insgesamt 40 μg pro Küvette, zusammengesetzt aus Kombinationen von 10 μg EXV-(EE)-β₁, 10 μg EXV-(myc)-τ₂, 10 μg pCMV-(myc)-p120 oder 10–40 μg eines irrelevanten Säugetier-Expressionsvektors), um ein Endvolumen von 500 μl zu liefern, und dann in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Spaltbreite, BioRad) überführt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Zellen elektroporiert (250 V, 960 μF), 8 Minuten lang auf Eis gegeben und dann in DMEM 10 FBS verdünnt. Es wurde die Klumpenbildung aggregierter Zellen ermöglicht, die bei Aliquotierung der Zellen in 6-cm-Platten (vier aus jeder Küvette) vermieden wurden.
Nach 48 Stunden wurden die vier Platten aus jeder Behandlung in HEPES-gepuffertem DMEM gewaschen, das 1 mM NaHCO₃ und 0,2 % fettsäurefreies BSA enthielt. Nach 10 Stunden wurden zwei Parallelplatten für Western-Blotting (mit einem monoklonalen α-(myc)-Antikörper als 1. Detektionsreagens, α-Maus-HRP als 2. Detektionssystem und Quantifizierung mittels ECL und densitrometrischem Scanning) geerntet. Zwei Platten wurden in phosphatfreies DMEM mit 1 mM NaHCO₃ und 0,2 % fettfreiem BSA gewaschen, dann weitere 90 Minuten lang bei 37°C mit 300 μCi [³²P]-Pi pro Platte (in 4 ml) inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt, und 1 ml eiskalte 1 M HCl wurde zugegeben. Die Zellen wurden abgeschabt, entfernt und die Platten mit 1,33 ml Methanol gewaschen. Die HCl- und Methanol-Waschlösungen wurden mit 2,66 ml Chloroform vereinigt (um eine „Folch"-Zweiphasen-Lösungsmittelverteilung zu erzielen), vermischt und zentrifugiert. Die unteren Phasen wurden entfernt und mit 1,95 ml frischer oberer Phase (siehe oben) vermischt, die 0,5 mM EDTA und 1 mM Tetrabutylammoniumsulfat enthielt. Nach Vermischen und Zentrifugation wurden die unteren Phasen entfernt, getrocknet, deacyliert und zur Analyse mittels Anionenaustausch-HPLC vorbereitet (Stephens et al., Nature Lond. 351, 33–39 (1991)).
11.2. ERGEBNISSE
Wenn sie vorübergehend in U937-Zellen exprimiert wurden, konnten (EE)-p101 und (EE)-p120 spezifisch aus [³⁵S]-Methionin-markierten Zellen in ungefähr gleichen Mengen immunpräzipitiert werden (unter Berücksichtigung ihrer relativen Entsprechung an Methioninen; 8:25, Daten nicht gezeigt). Stringent gewaschen enthielten α-(EE)-p101-Immunpräzipitate eine Wortmannin-sensitive, PtdIns(4,5)P₂-selektive, Gβγ-sensitive PI3K-Aktivität, die in Kontrollen fehlte, bei denen entweder ein irrelevanter monoklonaler Antikörper für die Immunpräzipitation oder eine für ein (EE)-markiertes, irrelevantes Protein kodierende cDNA verwendet wurde, die exprimiert wurde, wie aufgrund von [³⁵S]-Methionin-Markierung in ähnlichen Ausmaßen wie bei (EE)-p101 festgestellt wurde.
Die Aktivierung von Gβγτs konnte durch Vorinkubation mit einem 2fachen Überschuss an Gα-GDP blockiert werden. Außerdem war die PI3K-Aktivität in diesen p101-Immunpräzipitaten gegen Gα-GDP/Aluminiumfluorid unempfindlich. Die Cotransfektion von (myc)-p120 mit (EE)-p101 erhöhte nicht die speziell aus α-(EE)-Immunpräzipitaten gewonnenen PI3K-Aktivität. In der Tat verminderte sie sich, wahrscheinlich deshalb, weil die Expression von (EE)-p101 in Gegenwart von (myc)-p120-Expressionsvektoren vergleichsweise niedriger war. Im Gegensatz dazu enthielten mit (EE)-p120-α-(EE)-Immunpräzipitaten transfizierte Zellen kaum nachweisbare PI3K-Aktivität in Gegenwart sowie Abwesenheit von Gβγs. Diese Zellen enthielten vergleichbare molare Mengen an [³⁵S]-Methionin-markiertem p120, wie (EE)-p101 in α-(EE)-Immunpräzipitaten aus (EE)-p101-transfizierten Zellen vorhanden war. Die Cotransfektion mit (myc)-p101 resultierte in einer wesentlichen Steigerung der speziellen Gβγτ-stimulierten PI3K-Aktivität, die gewonnen werden konnten, und zwar trotz eines Abfalls der Expression von (EE)-p120 (wie mittels [³⁵S]-Methionin-Markierung festgestellt) (siehe 8). Diese Daten zeigen an, dass U937-Zellen (menschlich) eine endogene PI3K-Katayseunterinheit enthalten, die an ein vorübergehend exprimiertes p101 (Schwein) binden kann. Wenn sie an p101 (Schwein) gebunden ist, zeigt diese endogene Katalyseuntereinheit eine substantielle Regulation durch Gβγs, da das gesamte in den Immunpräzipitaten vorhandene p120 an p101 gebunden ist.
Im Gegensatz dazu ist in α-(EE)-Immunpräzipitaten aus (EE)-p120-transfizierten Zellen ein Großteil von p120 nicht mit p101 assoziiert und daher relativ inaktiv (im Vergleich zu jenem, das an p101 gebunden ist und in Gegenwart von Gβγs). Jedoch wird diese PI3K-Aktivität, wenn sie in Gegenwart von Gβγs getestet wird, durch Cotransfektion mit (myc)-p101 wesentlich verstärkt. Die alternative Erklärung für diese Daten – dass p120 „denaturiert" (obgleich löslich und zur Immunpräzipitation fähig) ist, außer wenn es in Gegenwart von p101 exprimiert wird – ist in Anbetracht der mit unabhängigen Sf9-gereinigten, -abstammenden Proteinen erhaltenen Daten unwahrscheinlich.
Um auszutesten, ob die p101/p120-PI3K durch Gβγs aktiviert werden und PtdIns(3,4,5)P₃ in vivo produzieren könnte, exprimierten die Erfinder vorübergehend verschiedene Kombinationen von (mac)-γ₂, (EE)-β₁, (myc)-p101 und (myc)-p120 in Cos-7-Zellen und maßen ihre Wirkungen auf die Werte von [³⁵P]-Phosphoinositiden in Zellen 48 Stunden nach Transfektion (siehe 9). p120 alleine produzierte signifikante Steigerungen an PtdIns(3,4,5)P₃ und PtdIns(3,4)P₂ auf eine β₁γ₂-abhängige Weise in Gegenwart von p101. Dieses Muster von Ergebnisse konnten nicht durch Änderungen der relativen Expression der verschiedenen cDNAs bei Einführung in Kombinationen erklärt werden (siehe 9).
12. HINTERLEGUNG VON KLONEN
Die folgenden Mikroorganismen oder Klone wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, zum angegebenen Datum hinterlegt und erhielten die angegebenen Zugriffsnummern:
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird von den hierin beschriebenen Ausführungsformen, die als einzelne Illustrationen einzelner Aspekte der Erfindung gedacht sind, nicht eingeschränkt, und funktionell gleichwertige Verfahren und Komponenten liegen im Schutzumfang der Erfindung. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den einhergehenden Abbildungen offensichtlich. Derartige Modifikationen liegen im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für eine p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K kodiert, oder ein Fragment davon aus zumindest 30 Nucleotiden, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die: a) für Seq.-ID Nr. 2 oder für jene Aminosäuresequenz kodiert, für die jene cDNA kodiert, die in dem unter der Zugriffsnummer 97636 bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist; b) für Seq.-ID Nr. 12 kodiert; oder c) unter stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz unter (a) oder (b) oder an deren Komplement hybridisiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül unter mäßig stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz unter (a) oder (b) oder an deren Komplement hybridisiert und worin das Nucleinsäuremolekül für ein p101-Genprodukt kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül unter äußerst stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz unter (a) oder (b) oder an deren Komplement hybridisiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül für Seq.-ID Nr. 2 oder für jene Aminosäuresequenz kodiert, für die jene cDNA kodiert, die in dem unter der Zugriffsnummer 97636 bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das Nucleinsäuremolekül für Seq.-ID Nr. 12 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine aus der aus den Aminosäureresten 1-160 von Seq.-ID Nr. 2, den Aminosäureresten 161-263 von Seq.-ID Nr. 2, den Aminosäureresten 1-732 von Seq.-ID Nr. 2; den Aminosäureresten 733-877 von Seq.-ID Nr. 2; den Aminosäureresten 1-160 von Seq.-ID Nr. 12, den Aminosäureresten 161-263 von Seq.-ID Nr. 12, den Aminosäureresten 1-735 von Seq.-ID Nr. 12 und den Aminosäureresten 736-880 von Seq.-ID Nr. 12 bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz kodiert.
isolierte Nucleotidsequenz, die für ein chimäres Protein kodiert, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, fusioniert an ein heterologes Polypeptid umfasst.
Isolierte Nucleotidsequenz nach Anspruch 7, worin das heterologe Polypeptid eine Glu-Markierung oder eine myc-Epitopmarkierung ist.
Nucleotidvektor, der eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1–8 enthält.
Expressionsvektor, der eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1–8 in operativer Assoziation mit einer Nucleotidregulationssequenz enthält, welche die Expression der Nucleotidsequenz in einer Wirtszelle kontrolliert.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, worin die Regulationssequenz aus der aus dem unmittelbaren frühen Zytomegalievirus-hCMV-Promotor, dem frühen oder späten Promotor von SV40-Adenovirus, dem Baculovirus-Promotor, dem lac-System, dem trp-System, dem TAC-System, dem TRC-System, den Hauptoperator- und -promotorregionen von Phage λ, den Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, dem Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase, den Promotoren von saurer Phosphatase und den Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Wirtszelle, die genetisch so verändert wurde, dass sie einen Vektor nach einem der Ansprüche 9–11 enthält.
Nichtmenschliches transgenes Tier, das eine Wirtszelle nach Anspruch 12 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 12, worin die Wirtszelle so genetisch verändert wurde, dass sie einen Vektor nach Anspruch 11 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 14, worin die Wirtszelle eine Sf9-Zelle, eine Chinahamster-Ovarialzelle, eine COS-Zelle oder eine U937-Zelle ist.
Genetisch veränderte Wirtszelle, worin die native Gensequenz für die p101-Untereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K unterbrochen ist, sodass die Expression des nativen P101-Genprodukts gehemmt oder verhindert wird, worin die native Gensequenz für eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1–5 kodiert.
Isolierte p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K mit einer Aminosäuresequenz, für die eine Nucleotidsequenz kodiert, die: (a) für Seq.-ID Nr. 2 oder für jene Aminosäuresequenz kodiert, für die jene cDNA kodiert, die in dem unter der Zugriffsnummer 97636 bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist; b) für Seq.-ID Nr. 12 kodiert; oder c) unter stringenten Bedingungen an die Nucleotidsequenz unter (a) oder (b) oder an deren Komplement hybridisiert, worin die p101-Regulationsuntereinheit frei von der p120-Katalyseuntereinheit ist.
Isolierte p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K nach Anspruch 17, welche die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder jene Aminosäuresequenz aufweist, für die jene cDNA kodiert, die in dem unter der Zugriffsnummer 97636 bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist.
Isolierte p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K nach Anspruch 17, welche die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 12 aufweist.
Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der aus den Aminosäureresten 1-160 von Seq.-ID Nr. 2, den Aminosäureresten 161-263 von Seq.-ID Nr. 2, den Aminosäureresten 1-732 von Seq.-ID Nr. 2; den Aminosäureresten 733-877 von Seq.-ID Nr. 2; den Aminosäureresten 1-160 von Seq.-ID Nr. 12, den Aminosäureresten 161-263 von Seq.-ID Nr. 12, den Aminosäureresten 1-735 von Seq.-ID Nr. 12 und den Aminosäureresten 736-880 von Seq.-ID Nr. 12 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Chimäres Protein, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 17–20, fusioniert an ein heterologes Polypeptid umfasst.
Chimäres Protein nach Anspruch 21, worin das heterologe Polypeptid eine Glu-Markierung oder eine myc-Epitopmarkierung ist.
Antikörper, der immunspezifisch die p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K nach einem der Ansprüche 17–20 bindet.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose einer Entzündungsreaktionsstörung bei einem Säugetier, umfassend das Detektieren einer Mutation im Gen für eine p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K im Genom des Säugetiers, worin das Wildtyp-Gen für die p101-Regulationsuntereinheit einer G-Protein-regulierten PI3K ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1–5 exprimiert.
Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Entzündungsreaktionsstörungen zweckdienlich sind, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer kultivierten Wirtszelle nach Anspruch 12, welche die p101-Nucleinsäure für eine G-Protein-regulierte PI3K nach einem der Ansprüche 1–5 exprimiert, und das Detektieren einer Veränderung der Expression der p101-Nucleinsäure oder einer Veränderung der Aktivität des p101-Nucleinsäureprodukts, das von der kultivierten Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, worin die Expression des p101-Gens durch Messen von mRNA-Transkripten der p101-Nucleinsäure detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, worin die Expression der p101-Nucleinsäure durch Messen des p101-Regulationsuntereinheits-Proteins detektiert wird.
Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die zur Behandlung von Entzündungsreaktionsstörungen zweckdienlich sind, umfassend das Kontaktieren einer Verbindung mit einer kultivierten Wirtszelle nach Anspruch 12, die genetisch so verändert wurde, dass sie die p101-Nucleinsäure für eine G-Protein-regulierte PI3K exprimiert, und das Detektieren einer Veränderung der Produktion des zweiten Messengers PtdIns(3,4,5)P₃, einer Veränderung der Zelladhäsion oder einer Veränderung der Produktion von O₂.
Verfahren nach Anspruch 28, worin unter Einsatz von Anionenaustausch-HPLC auf PtdIns(3,4,5)P₃-Werte in der Wirtszelle gestestet wird.
Wirtszelle, die genetisch so verändert wurde, dass sie einen Vektor nach einem der Ansprüche 9–11 und ein Nucleinsäuremolekül enthält, das für eine p120-Katalyseuntereinheit von G-Protein-regulierter PI3K kodiert, mit einer Nucleotidsequenz, die: a) für Seq.-ID Nr. 4 oder für jene Aminosäuresequenz kodiert, für die jene cDNA kodiert, die in dem unter der Zugriffsnummer 97636 bei der ATCC hinterlegten cDNA-Klon pCMV3mycp101 enthalten ist; b) für Seq.-ID Nr. 14 kodiert; oder c) unter stringenten Bedingungen zumindest an die Nucleotidsequenz unter (a) oder (b) hybridisiert, die für zumindest 28 Aminosäuren der p120-Untereinheit kodieren, oder an das Komplement der Sequenz unter (a) oder (b), die für zumindest 28 Aminosäuren der p120-Untereinheit kodiert.
Nichtmenschliches transgenes Tier, das eine Wirtszelle nach Anspruch 30 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die zur Expression eines p101-Genprodukts in der Lage ist, umfassend das genetische Verändern einer Zelle, sodass sie eine Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–11 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines p101-Proteins, umfassend das Bereitstellen einer Wirtszelle nach Anspruch 12 oder Anspruch 30 und das Exprimieren der p101-Nucleotidsequenz und gegebenenfalls der p120-Nucleotidsequenz in der Zelle.
Verfahren zur Produktion eines p101-Proteins, umfassend: das genetische Verändern einer Zelle, sodass sie eine Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1–11 enthält; und das Exprimieren der p101-Nucleotidsequenz in der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, das weiters das Gewinnen des p101-Polypeptids und gegebenenfalls des p120-Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Wirtszelle einen pGEX-Vektor umfasst und worin das Gewinnen von p101-Polypeptid das Freisetzen des p101-Polypeptids aus der GST-Gruppierung umfasst.