DE69233214T2

DE69233214T2 - Für säugetierphosphodiesterasen kodierende dns

Info

Publication number: DE69233214T2
Application number: DE69233214T
Authority: DE
Inventors: A. Joseph BEAVO; Kelley J. BENTLEY; Harry Charbonneau; K. William SONNENBURG
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-20
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2012-04-21
Also published as: JP3408526B2; US20020151024A1; DE69233785D1; WO1992018541A1; EP0535216A4; US6642040B2; CA2085881A1; ATE250629T1; DE69233214D1; JPH05508079A; JP3354149B2; US5602019A; CA2085881C; US6015677A; ES2348458T3; US7122363B2; DK0535216T3; EP0535216A1; HK1013297A1; US5389527A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue gereinigte und isolierte Nukleotidsequenzen, die für Ca²⁺/Calmodulin-stimulierte Phosphodiesterasen aus Säugetieren (CaM-PDEs) kodieren. Ebenfalls werden die entsprechenden rekombinanten Expressionsprodukte der Nukleotidsequenzen, immunologische Reagenzien, die spezifisch damit reagieren, und Verfahren, um Verbindungen zu identifizieren, die die enzymatische Aktivität solcher Expressionsprodukte modulieren, zur Verfügung gestellt.
Von zyklischen Nukleotiden ist bekannt, daß diese eine große Vielzahl von zellulären Antworten auf biologische Reize hin vermitteln. Die Phosphodiesterasen (PDEs), die mit zyklischen Nukleotiden reagieren, katalysieren die Hydrolyse von 3', 5'-zyklischen Nukleotiden, wie z. B. zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und zyklisches Guanosin-monophosphat (cGMP), in ihre entsprechenden 5'-Nukleotidmonophosphate und sind demzufolge zur Kontrolle der zellulären Konzentration zyklischer Nukleotide wichtig. Die PDEs sind wiederum durch Transmembransignale oder Second-Messenger-Liganden wie z. B. Kalziumionen (Ca²⁺) oder cGMP reguliert. Die PDEs haben somit eine zentrale Rolle beim Regulieren des Informationsflusses von extrazellulären Hormonen, Neurotransmittern oder anderen Signalen, die die zyklischen Nukleotide als Botenstoffe verwenden.
PDEs sind eine große und komplexe Gruppe von Enzymen. Sie sind überall in den Zellen und Geweben der meisten eukaryotischen Organismen weit verbreitet, sind aber üblicherweise nur in Spuren vorhanden. Es sind mindestens fünf verschiedene Familien von PDEs beschrieben worden, basierend auf Charakteristika wie z. B. Substratspezifität, kinetische Eigenschaften, zelluläre Regulationskontrolle, Größe und in einigen Fällen die Modulation durch selektive Inhibitoren. [Beavo, Adv. in Second Mess. and Prot. Phosph. Res. 22: 1–38 (1988)]. Die fünf Familien sind:

I Ca²+/Calmodulin-stimulierte
II cGMP-stimulierte
III cGMP-inhibierte
IV cAMP-spezifische
V cGMP-spezifische

Innerhalb jeder Familie finden sich vielfache Formen von nahe verwandten PDEs. Siehe Beavo, „Multiple Phosphodiesterase Isozymes Background, Nomenclature and Implications", Seiten 3–15; Wang et al., „Calmodulin-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", Seiten 19–59; und Manganiello et al., „Cyclic GMP-Stimulated Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases" Seiten 62–85; alle in Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, Beavo, J. and Houslay, M. D., Eds.; John Wiley & Sons, New York (1990).
Die Ca²⁺/Calmodulin-abhängigen PDEs (CaM-PDEs) sind durch ihre Empfindlichkeit gegenüber intrazellulärem Calcium charakterisiert, was zu einer verminderten intrazellulären Konzentration von cAMP und/oder cGMP fünf. Eine unverwechselbare Eigenschaft von cGMPstimulierten Phosphodiesterasen (cGS-PDEs) ist ihre Eigenschaft, durch cGMP stimuliert zu werden, und dabei die cAMP-Hydrolyse herbeizuführen.
In vitro-Studien haben eine erhöhte PDE-Aktivität als Antwort auf Ca¹⁺/Calmodulin in nahezu jedem untersuchten Gewebe aus Säugetieren ebenso wie in Drosophila, Dictyostelium und Trypanosomen gezeigt. Das Ausmaß an CaM-PDE in Geweben und zellulären und subzellulären Kompartimenten variiert stark. Die meisten Zellen enthalten mindestens eine geringe Menge an CaM-PDE-Aktivität, wobei die höchsten Mengen in Geweben im Gehirn gefunden wurden, insbesondere in den synaptischen Bereichen. Greenberg et al. Neuropharmacol., 17: 737–745 (1978) and Kincaid et al., PNAS (USA), 84: 1118–1122 (1987). Ein Absinken des cAMP in Astrocytoma-Zellen als Antwort auf eine Stimulierung mit Muscarin kann im Calcium-abhängigen Ansteigen der CaM-PDE-Aktivität begründet liegen. Tanner et al., Mol. Pharmacol. 29: 455–460 (1986). Ebenso kann die CaM-PDE ein wichtiger Regulator von cAMP in Thyroidgewebe sein. Erneux et al., Mol. Cell. Endocrinol., 43: 123–134 (1985).
Frühe Studien haben vorgeschlagen, daß eindeutige gewebsspezifische Isoenzyme von CaM-PDEs existieren. Verschiedene Mitglieder der CaM-PDE-Familie sind bisher beschrieben worden, einschließlich eines 59 kDa-Isoenzyms, isoliert aus Rinderherz, und 61 und 63 kDa-Isoenzyme, isoliert aus Rinderhirn. LaPorte et al., Biochemistry, 18: 2820–2825 (1979); Hansen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2788–2792 (1982); und Sharma et al., J. Biol. Chem., 261: 14160–14166 (1986) siehe auch Sharma et al. J. Biol. Chem, 250: 9248–9254 (1984). Mögliche Gegenstücke zu den 59 und 61 kDa-Isoenzymen aus Rind sind auch aus Rattengeweben isoliert worden, Hansen et al., J. Biol. Chem, 261: 14636–14645 (1986), wo bei vorgeschlagen wurde, daß diese zwei Isoenzyme in weiteren Säugetierarten exprimiert werden könnten.
Zusätzlich zum Kriterium des Molekulargewichts unterstützt ein anderer Hinweis sowohl die Ähnlichkeiten als auch die Unterschiede zwischen den Isoenzymen der CaM-PDE-Familie. So unterscheiden sich z. B. das 59 kDa-Isoenzyme aus Herz und das 61 kDa-Isoenzym aus Hirn der CaM-PDEs im Laufverhalten auf einer SDS-PAGE und in der Elutionsposition bei einer DEAE-Chromatographie, und das 59 kDa-Isoenzym hat mindestens eine 10–20-fach höhere Affinität zu Calmodulin. Oncomodulin, ein fötales/onco-Calcium-bindendes Protein, das in sehr hohen Konzentrationen in der Plazenta und transformierten Zellen vorhanden ist, bindet ebenfalls an das 59 kDa-Enzym mit einer höheren Affinität, als an das 61 kDa-Enzym. Es werden jedoch beide, das 61 kDa-Isoenzym aus Hirn und das 59 kDa-Isoenzym aus Herz mit Hilfe eines einzelnen monoklonaren Antikörpers erkannt. Dieser Antikörper bindet an den Ca²⁺/CaM-PDE-Komplex mit einer 100-fach höheren Affinität als an PDE allein. Hansen et al., 1986, supra. Die 59 und 61 kDA-Isoenzyme haben annähernd identische Substratspezifitäten und kinetische Konstanten. Krinks et al., Adv. Cyc. Nucleotide Prot. Phosphorylation Res., 16: 31–47 (1984) haben vorgeschlagen, basierend auf Peptid-Mapping-Experimenten, daß das 59 kDa-Protein aus Herz eine proteolytische Form des 61 kDa-Isoenzyms aus Hirn sein könnte.
Das 63 kDa-Isoenzym aus Rinderhirn unterscheidet sich wesentlich von den 59 und 61 kDa-Isoenzymen. Das 63 kDa-Enzym wird nicht durch den monoklonalen Antikörper erkannt, der an die 59 und 61 kDa-Enzyme bindet. Hansen et al., 1986, supra. Das 63 kDa-Protein wird in vitro nicht durch die cAMP-abhängige Proteinkinase phosphoryliert, wobei das 61 kDa-Protein phosphoryliert wird. Weiterhin wird nur das 63 kDa-Protein durch CaM-Kinase II phosphoryliert. Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 2603–2607 (1985); und Hashimoto et al., J. Biol. Chem., 264: 10884–10887 (1989). Die 61 und 63 kDa CaM-PDE-Isoenzyme aus Rinderhirn scheinen jedoch ähnliche CaM-Bindungsaffinitäten zu besitzen. Aufgrund von Peptidkarten, erzeugt mit Hilfe begrenzter Proteolyse mit V8-Protease aus Staphylococcus, Sharma et al., J. Biol. Chem., 259: 9248 (1984), ist vorgeschlagen worden, daß die 61 und 63 kDa-Proteine verschiedene Aminosäuresequenzen aufweisen.
Es ist vorgeschlagen worden, daß die cGMP-stimulierten PDEs (cGS-PDEs) eine nichtkatalytische, cGMP-spezifische Stelle aufweisen, die für die Stimulierung der cAMP- Hydrolyse durch cGMP verantwortlich sein könnte. Stoop et al., J. Biol. Chem., 264: 13718 (1989). Bei physiologischen Konzentrationen an zyklischen Nukleotiden antwortet das Enzym auf erhöhte cGMP-Konzentrationen mit einer verstärkten Hydrolyse von cAMP. Somit ermöglicht es cGS-PDE bei Ansteigen der cGMP-Konzentration, die cAMP-vermittelten Antworten zu verlangsamen oder zu inhibieren. Die Primärsequenz, die kürzlich bei LeTrong et al., Biochemistry, 29: 10280 (1990) präsentiert wurde, wobei die hierin genannten Erfinder Co-Autoren waren, stellt das molekulare Netzwerk zum Verständnis der regulatorischen Eigenschaften und Domain-Struktur dieses Enzyms und zum Vergleichen desselben mit anderen PDE-Isoenzymen, die auf verschiedene Signale antworten, zur Verfügung. Diese Veröffentlichung erwähnt ebenfalls die Klonierung eines 2,2 kb-cDNA-Fragments aus der Nebennierenrinde von Rindern, das cGS-PDE kodiert. Siehe auch Thompson et al., FASEB J., 5(6): A1592 (Abstract No. 7092), die von der Klonierung einer „Typ II PDE" aus Pheochromocytoma-Zellen aus Ratten berichten.
Mit der Entdeckung der großen Anzahl verschiedener PDEs und ihrer entscheidenden Rolle bei der intrazellulären Signalübertragung, haben sich die Anstrengungen darauf fokussiert, Agenzien zu finden, die selektiv spezifische PDE-Isoenzyme aktivieren oder inhibieren. Agenzien, die die zelluläre PDE-Aktivität beeinflussen und somit das zelluläre cAMP verändern, können möglicherweise verwendet werden, um ein breites Spektrum an Krankheiten und physiologischen Zuständen zu kontrollieren. Einige Arzneimittel, die das cAMP-Niveau durch Inhibieren von PDEs erhöhen, sind bereits in Verwendung, aber reagieren im allgemeinen als breite, unspezifische Inhibitioren und haben schädliche Nebenwirkungen auf die cAMP-Aktivität in Geweben und Zelltypen, die nicht als Ziel gedacht sind. Demzufolge werden Agenzien benötigt, die für ausgewählte PDE-Isoenzyme spezifisch sind. Selektive Inhibitoren spezifischer PDE-Isoenzyme können als kardiotonische Agenzien, Antidepressiva, Antihypertensiva, Antithrombotika und andere Agenzien nützlich sein. Durchmusterungsstudien auf Agonisten/Antagonisten wurden jedoch verkompliziert, da bei der Identifizierung der einzelnen PDE-Isoenzyme, die in einer speziellen Testaufarbeitung vorhanden sind, Schwierigkeiten auftraten. Darüberhinaus katalysieren alle PDEs dieselbe basische Reaktion; alle haben überlappende Substrat-Spezifitäten; und alle treten nur in Spuren auf.
Die Unterscheidung verschiedener PDEs ist mit Hilfe verschiedener Mittel versucht worden. Der klassische enzymologische Ansatz, jedes neue Isoenzym zu isolieren und zu untersuchen, wird durch die laufenden Einschränkungen bei den Reinigungstechniken und dem Unvermö gen, genau zu bestimmen, ob eine vollständige Auflösung eines Isoenzyms erreicht worden ist, erschwert. Ein zweiter Ansatz war es, Isoenzym-spezifische Testbedingungen zu identifizieren, die die Mitwirkung eines Isoenzyms bevorzugen und diejenige anderer minimieren können. Ein anderer Ansatz ist die immunologische Identifizierung und Trennung in Familiengruppen und/oder individuelle Isoenzyme gewesen. Es bestehen offensichtlich Schwierigkeiten mit jedem dieser Ansätze; für die eindeutige Identifizierung und Untersuchung eines bestimmten Isoenzyms muß eine große Anzahl von Unterscheidungskriterien etabliert werden, was häufig zeitraubend und in einigen Fällen technisch relativ schwierig ist. Als Ergebnis sind die meisten Studien mit nur teilweise reinen PDE-Zubereitungen durchgeführt worden, die wahrscheinlich mehr als ein Isoenzym enthielten. Desweiteren sind viele der PDEs in den meisten Geweben sehr empfindlich gegenüber einer begrenzten Proteolyse und bilden leicht aktive proteolytische Produkte, die unterschiedliche kinetische, regulatorische und physiologische Eigenschaften ihrer Ursprungsform aufweisen.
Die Entwicklung neuer und spezifischer Agenzien zur PDE-Regulierung würde durch die Möglichkeit, gewebsspezifische PDEs in großen Mengen durch rekombinante Mittel zu isolieren, wesentlich vereinfacht werden. Bisher sind relativ wenige PDE-Gene kloniert worden, und von den Klonierten gehören die meisten zur cAMP-spezifischen Familie der Phosphodiesterasen (cAMP-PDEs). Siehe Davis, „Molecular Genetics of the Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases", Seiten 227–241, in Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation, and Drug Action, Beavo, J. and Houslay, M. D., Eds.; John Wiley & Sons, New York; 1990. Siehe auch bsw. Faure et al., PNAS (USA), 85: 8076 (1988) – D. discoideum; Sass et al., PNAS (USA), 83: 9303 (1986) – S. cerevisiae, PDE class IV, bezeichnet als PDE2; Nikawa et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3629 (1987) – S. cerevisiae, bezeichnet als PDE1; Wilson et al., Mol. Cell. Biol., 8: 505 (1988) – S. cerevisiae, bezeichnet als SRA5; Chen et al., PNAS (USA), 83: 9313 (1986) – D. melanogaster, bezeichnet als dnc⁺; Ovchinnikow et al., FEBS, 223: 169 (1987) – Retina aus Rind, bezeichnet als GMP PDE; Davis et al., PNAS (USA), 86: 3604 (1989) – Rattenleber, bezeichnet als rat dnc-1; Colicelli et al., PNAS (USA), 86: 3599 (1989) – Rattenhirn, bezeichnet als DPD; Swinnen et al., PNAS (USA), 86: 5325 (1989) – Hoden aus Ratte, rat PDE1, PDE2, PDE3 und PDE4; und Livi et al., Mol. Cell. Biol., 10: 2678 (1990) – Monocyten aus Mensch, bezeichnet als hPDEI. Siehe auch LeTrong et al., supra and Thompson et al., supra.
Es ist eine Komplementierungsuntersuchung durchgeführt worden, um cDNA-Klone, die für bestimmte Typen von PDEs kodieren, zu dedektieren und zu isolieren. Colicelli et al., PNAS (USA), 86: 3599 (1989) beschrieben die Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus Rattengehirn in einem S. cerevisiae-Expressionsvektor und die Isolierung von Genen daraus, die die Fähigkeit besitzen, in Hefe die phänotypischen Auswirkungen von RAS2^val19 einer Mutationsform des RAS2-Gens, analog zu einer onkogenen Mutante des humanen HRAS-Gens, zu supprimieren. Eine so klonierte und als DPD (dunce-like Phosphodiesterase aus Ratte) bezeichnete cDNA hat die Fähigkeit, den Verlust der Wachstumskontrolle im Zusammenhang mit einem aktivierten RAS2^val19-Gen, das sich im Hefestamm TK161-R2V (A.T.C.C. 74050) befand, zu komplementieren oder zu „retten", ebenso wie den analogen wachstumskontrolldefekten Phänotyp der Hefemutante 10DAB (A.T.C.C. 74049); der an beiden Hefe-PDE-Genloci (pde^–1, pde^–2) defekt ist. Das Gen kodiert für eine cAMP-spezifische Phosphodiesterase mit hoher Affinität, wobei die Aminosäuresequenz zu der cAMP-spezifischen Phosphodiesterase, kodiert vom Dunce-Lokus der Drosophila melanogaster, hoch homolog ist.
Bis einschließlich des Einreichungsdatums der US-Anmeldung Nr. 07/688,356, von der die Priorität in Anspruch genommen wird, sind keine Veröffentlichungen der Klonierung und Expression von DNA-Sequenzen, die für irgendeine der Ca²⁺/Calmodulin-stimulierten oder cGMP-stimulierten PDEs aus Säugetieren kodieren (PDE-Familien I und II), gemacht worden und dementsprechend besteht auch weiterhin ein Bedürfnis im Stand der Technik, die Nukleotidsequenzinformation für diese PDEs zu vervollständigen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neu gereinigte und isolierte Polynukleotidsequenzen (z. B. DNA und RNA, einschließlich Sense- und Antisense-Stränge) zur Verfügung, die für die Expression von Ca²⁺/Calmodulin-stimulierten zyklischen Nukleotidphosphodiesterasen, wie in SEQ NO. 48, 50 oder 52 dargestellt, aus Säugetierarten (z. B. Mensch und Rind) kodieren. Genomische Sequenzen und cDNA-Sequenzen, die durch die Erfindung zur Verfügung gestellt werden, können mit homologen oder heterologen Spezies von Expressions-Kontroll-DNA-Sequenzen wie z. B. Promotoren, Operatoren, Regulatoren, Terminatoren und ähnliches assoziiert sein, um eine in vivo- und in vitro-Transkription in Messenger-RNA und wiederum die Translation der mRNAs zu ermöglichen, um funktionsfähige Phosphodiesterasen und verwandte Polypeptide in großen Mengen zur Verfügung zu stellen.
Insbesondere werden durch die Erfindung DNA-Sequenzen aus Säugetieren zur Verfügung gestellt, die für Phosphodiesterasen kodieren, wie in den SEQ ID NO: 49, 51 angegeben, die als DNA-Inserts aus Säugetieren in bakteriellen Plasmiden und viralen Vektoren vorhanden sind, die der Hinterlegungsgegenstand für die American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 11. und 15. April 1991 und am 14. April 1992 im Einklang mit dem US Patent und Markenamt und den Budapester Vertragsbestimmungen waren. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hinterlegten DNAs umfassen:

1. Plasmid pCAM-40 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68576), das ein cDNA-Insert aus Rinderhirn enthält, kodierend für ein 61 kDa CaM-PDE-Isoenzym;
2. Plasmid p12.3A in E. coli (A.T.C.C. 68577), das ein cDNA-Insert aus Rinderhirn enthält, kodierend für ein 63 kDa CaM-PDE-Isoenzym;
3. Bakteriophage λ CaM H6a (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 75000), enthaltend ein cDNA-Insert aus menschlichem Hippokampus, das den Teil eines 61 kDa CaM-PDE-Isoenzyms kodiert;
4. Plasmid pHcam 61-6N-7 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68963), das ein zusammengesetztes humanes cDNA-Insert enthält, kodierend für ein 61 kDa CaM-PDE-Isoenzym.
5. Plasmid pcamH3EF in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68964), das ein cDNA-Insert aus humanem Hippokampus enthält, kodierend für eine neue PDE, welche homolog zu einer 61 kDa CaM-PDE ist;
6. Plasmid pcamHella in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68965), das ein cDNA-Insert aus humanem Herz enthält, kodierend für eine neue PDE, welche homolog zu einer 61 kDa CaM-PDE ist;
7. Plasmid p3CGS-5 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68579), das ein cDNA-Insert aus Rindernebenniere enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzym;
8. Plasmid aus pBBCGSPDE-5 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68578), das ein cDNA-Insert aus Rinderhirn enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzym-Fragment;
9. Plasmid pBBCGSPDE-7 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68580), das eine cDNA aus Rinderhirn enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzym;
10. Plasmid pGSPDE 6.1, in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68583), das eine cDNA aus humanem Herzen enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzymfragment;
11. Plasmid pGSPDE 7.1 in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68585), das ein cDNA-Insert aus humanem Hippokampus enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzymfragment; und
12. Plasmid pGSPDE 9.2 (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68584), das ein cDNA-Insert aus humanem Hippokampus enthält, kodierend für ein cGS-PDE-Isoenzymfragment.
13. Plasmid pHcgs6n in E. coli (A.T.C.C. Zugangs-Nr. 68962), das ein cDNA-Insert aus Mensch enthält, kodierend für eine cGS-PDE.

In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung DNA-Konstrukte, die einen Transkriptions-Promotor, eine DNA-Sequenz, die für PDE oder ein Fragment derselben kodiert, und einen Transkriptions-Terminator umfaßt, wobei alle funktionfähig miteinander zur Expression des Enzyms oder des Enzymfragments verbunden sind. Die Konstrukte werden bevorzugt verwendet, um Wirtszellen zu transformieren oder transfizieren, bevorzugt eukaryotische Zellen und besonders bevorzugt Säugetier- oder Hefezellen. Für die Erzeugung im großen Maßstab kann die exprimierte PDE aus den Zellen durch z. B. Immunaffinitätsreinigung isoliert werden.
Der Einbau von DNA-Sequenzen in prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen mit Hilfe von Standardtransformations- und Transfektionsverfahren, die möglicherweise geeignete virale DNA- und RNA-Vektoren und zirkuläre DNA-Plasmid-Vektoren einschließen, ist ebenfalls von der Erfindung umfaßt, und es wird angenommen, daß sie nützliche Proteine in Mengen, wie sie aus natürlichen Quellen nicht zur Verfügung stehen, zur Verfügung stellen. Die von der Erfindung zur Verfügung gestellten Systeme beinhalten transformierte E. coli-Zellen, einschließlich solcher, wie sie oben genannt sind, ebenso wie transformierte eukaryotische Zellen, einschließlich Hefe- und Säugetierzellen. Aufgrund der Verwendung von Säugewirtszellen wird erwartet, daß post-translationale Modifikationen (z. B. Trunkierung, Lipidisierung und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung) gewährleistet werden, wie sie benötigt werden könnten, um den rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung eine optimale biologische Aktivität zu verleihen.
Neue Proteinprodukte der Erfindung beinhalten Expressionsprodukte der zuvor genannten Nukleinsäuresequenzen und Polypeptide, die die primäre strukturelle Konformation (d. h. Aminosäuresequenz) der CaM-PDE- und cGS-PDE-Proteine aufweisen, ebenso wie Peptidfragmente derselben und synthetische Peptide, die so zusammengestellt sind, daß die Aminosäuresequenzen derselben verdoppelt werden. Proteine, Proteinfragmente und synthetische Peptide der Erfindung sind so entworfen worden, daß sie zahlreiche Verwendungen aufweisen, einschließlich therapeutische, diagnostische und prognostische Verwendungen, und sie werden die Basis zur Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern zur Verfügung stellen, die mit den Proteinen der Erfindung eine spezifische Immunreaktion aufweisen.
Ebenfalls werden durch die vorliegende Erfindung Antikörpersubstanzen zur Verfügung gestellt (einschließlich polyklonale und monoklonale Antikörper, chimere Antikörper, Einzelkettenantikörper und ähnliche), die durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind, mit einer hohen Immunspezifität an die Proteine der Erfindung und ihre Fragmente und Peptide zu binden und damit einzigartige Epitope erkennen, die sich von anderen Proteinen unterscheiden. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können zur Affinitätsreinigung von CaM-PDEs und cGS-PDEs verwendet werden, siehe z. B. Hansen et al., Meth. Enzymol., 159: 543 (1988).
Ebenfalls werden durch die vorliegende Erfindung neue Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von normalen, anormalen oder mutierten Formen von CaM-PDEs ebenso wie Nukleinsäuren (z. B. DNA und mRNA), die damit verbunden sind, zur Verfügung gestellt. Veranschaulichend bedeutet das, daß die erfindungsgemäßen Antikörper in bekannten immunologischen Verfahren zur quantitativen Detektion dieser Proteine in flüssigen Proben und Gewebeproben verwendet werden können und erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die geeignet markiert sein können, zur quantitativen Detektion von mRNA, die für diese Proteine kodiert, verwendet werden können.
Unter den vielfachen Aspekten der vorliegenden Erfindung befinden sich daher die Bereitstellung von (a) neuen CaM-PDE-kodierenden Polynukleotidsequenzen, (b) Polynukleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die die Aktivität einer CaM-PDE aus Säugetieren aufweisen, die mit der neuen CaM-PDE hybridisieren und für Sequenzen unter Hybridisierungsbedingungen der gleichen oder einer größeren Stringenz als die hierin beschriebenen Bedingungen kodieren und bei der anfänglichen Isolierung von cDNAs der Erfindung verwendet werden, und (c) Polynukleotidsequenzen, die dieselben (oder allele Varianten oder analoge Polypeptide) durch die Verwendung von mindestens teilweise degenerierten Codons kodieren. Dementsprechend werden virale DNA- und RNA-Vektoren oder zirkuläre Plasmid-DNA-Vektoren, die Polynukleotidsequenzen beinhalten, und prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen, transformiert oder transfiziert mit solchen Polynukleotidsequenzen und Vektoren, ebenso wie neue Verfahren zur rekombinanten Herstellung dieser Proteine durch Wachstumskulturen solcher Wirte und eine Isolierung der exprimierten Proteine aus den Wirten oder deren Kulturmedien zur Verfügung gestellt.
In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Verfügung, die eine PDE-Aktivität modulieren können. Solche Verfahren umfassen das Inkubieren einer Verbindung, die auf ihre PDE-modulierende Aktivität hin untersucht werden soll, mit eukaryotischen Zellen, die ein rekombinantes PDE-Polypeptid exprimieren und das Bestimmen der Wirkung der Verbindung auf die PhosphodiesteraseAktivität, die durch die Genexpression zur Verfügung gestellt wird. Das Verfahren ist entweder mit ganzen Zellen oder Zellysat-Zubereitungen erfolgreich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle eine Hefezelle oder eine Säugetierzelle, der eine endogene Phosphodiesteraseaktivität fehlt. Die Wirkung der Verbindung auf die Phosphodiesteraseaktivität kann durch biochemische Tests mit Überwachung der Hydrolyse von cAMP und/oder cGMP oder durch Verfolgen der Wirkung der Verbindung auf die Veränderung eines phänotypischen Stamms der eukaryotischen Zelle, in Verbindung mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen des rekombinanten PDE-Polypeptids, bestimmt werden.
Andere Aspekte und Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden bei Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung derselben offensichtlich, die zahlreiche erläuternde Beispiele der Praxis der Erfindung beinhaltet, wobei auf die Zeichnung verwiesen wird, wobei:
1 die Ergebnisse der Aminosäuresequenzbestimmungen für die isolierten 59 kDa (Rinderherz) und 63 kDa (Rinderhirn) CaM-PDE-Proteine im Vergleich mit der vollständigen Sequenz des 61 kDa (Rinderhirn) Isoenzyms zur Verfügung stellt. Die Übereinstimmungen der 59 und 63 kDa-Proteine zum 61 kDa-Isoenzym sind unterstrichen. Vorläufige Indentifizierungen sind in Kleinbuchstaben dargestellt und Bindestriche geben die nicht-identifizierten Reste an. Der N-Terminus des 59 kDa-Isoenzyms, wie durch die Subtraktion eines Methionyl-Peptids (mDDHVTIRRK) von der Zusammensetzung eines aminoterminal blockierten Lysolpeptids bestimmt, befindet sich in Klammern. Ausgefüllte Balken befinden sich über den Resten innerhalb der CaM-Bindungsstellen, die in den 61 und 59 kDa-Isoenzymen identifiziert wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden Beispiele stellen die Praxis der Erfindung dar. Beispiel I bezieht sich auf die Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung der 61 kDa CaM-PDE-cDNA aus Rinderhirn und auf die Expression desselben in einer Säugetierwirtszelle. Beispiel II bezieht sich auf die Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung einer 59 kDa CaM-PDE aus Rinderlunge und auf die Expression derselben in einer Säugetierwirtszelle. Beispiel III bezieht sich auf die Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung einer 63 kDa CaM-PDE-cDNA aus Rinderhirn und auf die Expression derselben in einer Säugetierwirtszelle. Beispiel IV bezieht sich auf die Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung einer cGS-PDE-cDNA aus der Nebennierenrinde aus Rind, ebenso wie auf die Expression der DNA in Säugetierwirtszellen. Beispiel V bezieht sich auf die Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung von cGS-PDE-cDNA aus Rinderhirn und auf die Expression derselben in einer Säugetierwirtszelle. Beispiel VI bezieht sich auf die Verwendung von cGS-PDE aus Nebennieren-cDNA aus Rind, um humane cGS-PDE-cDNAs zu erhalten und auf die Entwicklung einer cDNA aus Mensch, die eine cGS-PDE kodiert. Beispiel VII bezieht sich auf die Verwendung von CaM-PDE 61 kDa-cDNA aus Rinderhirn, um eine humane CaM-PDE 61 kDa-cDNA und eine neue, strukturell verwandte cDNA zu erhalten. Beispiel VIII bezieht sich auf die Expression von PDE-cDNAs aus Rind und Mensch zur Komplementierung von phänotypischen Defekten in Hefen und zum Nachweis der Phosphodiesterase-Aktivität für das Expressionsprodukt. Beispiel IX bezieht sich auf Gewebeexpressionsstudien, die Northern-Analysen und RNase-Protektionsstudien beinhalten und erfindungsgemäße Polynukleotide (spezifische cDNAs und Antisense-RNAs) verwenden.
In den Teilen des Textes, der sich auf die Bildung von redundanten Oligonukleotiden bezieht, werden die folgenden Empfehlungen für Einzelbuchstaben-Codes der Tabelle I für mehrdeutige Nukleotidsequenzen, wie bei J. Biol. Chem., 261: 13–17 (1986) beschrieben, verwendet:
TABELLE I
BEISPIEL I
Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung der 61 kDa-CaM-PDE-cDNA aus Rinderhirn
In diesem Beispiel wurde eine cDNA-Sequenz, die den Teil eines Gens für die 61 kDa-CaM-PDE aus Rinderhirn darstellt, die den Aminoterminus des Proteins kodiert, durch PCR aus einer Ansammlung von Erststrang-cDNAs, erzeugt aus Rinderhirn-mRNA, isoliert. Das PCRerzeugte Fragment wurde dann verwendet, um eine Vollängensequenz der CaM-PDE aus Rinderhirn zu isolieren.
Es wurde Gesamt-RNA aus Rinderherz unter Verwendung des Verfahrens von Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156–159 (1987) präpariert, und mRNA wurde unter Verwendung eines Poly(A) QuikTm-mRNA-Reinigungskits unter Verwendung des Protokolls des Herstellers selektiert. Die Erststrang-cDNA wurde durch Hinzufügen von 80 Einheiten der AMV Reversen Transkriptase zu einem Reaktionsgemisch (40 μl Endvolumen), enthaltend 50 mM Tris HCl (pH 8,3 bei 42°), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM (jeweils) Desoxynukleotidtriphosphate, 50 mM KCl, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 5 μg Desoxythymidylsäure-Oligomere (12–18 Basen) und 5 μg Rinderherz-mRNA, für 15 min bei 65°C denaturiert, synthetisiert. Der Einbau von 1 ul [³²P]-markiertem dCTP (3000 Ci/mMol) wurde verwendet, um die Erststrang-cDNA-Synthese zu quantifizieren. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit Phenol/CHCl₃ extrahiert und mit EtOH präzipitiert. Das Nukleinsäurepellet wurde in 50 μ1 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/0,1 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 15 ng pro μm resuspendiert.
Es wurden redundante Sense- und Antisense-Oligomere, die den 61 kDa-Peptidsequenzen nach 1 entsprachen, entworfen, indem sie minimal redundant waren, aber lang genug, um spezifisch mit der Ziel-Matritze zu hybridisieren.
Ein erstes 23 Basen-Oligomer, bezeichnet als CaM PCR-2S, wurde mit Hilfe eines Applied Biosystems, Inc. DNA-Syntheseapparats synthetisiert. Das Oligomer hatte die folgende Sequenz, SEQ ID NO: 1
welche die folgende Aminosäuresequenz ergibt, SEQ ID NO: 2
Ein zweites 23 Basen-Oligomer, bezeichnet als CaM PCR-3AS, wurde mit der folgenden Sequenz synthetisiert, SEQ ID NO: 3
welche die folgende Aminosäuresequenz ergibt, SEQ ID NO: 4
Ein 612 bp-CaM-PDE-cDNA-Fragment wurde unter Verwendung der PCR-Amplifikationstechnik durch Hinzufügen von 15 ng der Erststrang-cDNA zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 0,1% Triton X-100, 0,2 mM (jeweils) Desoxynukleotidtriphosphate, 1 μM (jeweils) CaM PCR-2S- und CaM PCR-3AS-Oligomere und 2,5 Einheiten einer DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, synthetisiert. Die Reaktion wurde für 30 Zyklen, die wie folgt waren, inkubiert: 94° für 1 min; 50° für 2 min; und 72° für 2 min. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung von 0,04 M Tris-Acetat/0,001 M EDTA-Puffer, enthaltend 0,5 μg/ml Ethidiumbromid, gereinigt. Die DNA-Produkte wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht, sauber mit einer Rasierklinge aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung des Geneclean II-Reagenzkits gereinigt und in eine Eco RV-geschnittene pBluescript-Vektor-DNA ligiert.
Um zu bestimmen, ob die PCR-Amplifikationsprodukte CaM-PDE-cDNAs waren, wurden die subklonierten PCR-DNA-Produkte von den Enden her unter Verwendung von T3- und T7-Promotor-Primern und entweder des Sequenase- oder Taq-Polymerase-Sequenzierungskits sequenziert. Es wurden ungefähr 250 Basen von jedem Ende dieses Stücks der DNA sequenziert und die abgeleitete Aminosäuresequenz der cDNA entsprach denen in 1 dargestellten Aminosäuresequenzen der 59 und 61 kDa CaM-PDEs, was bestätigte, daß das PCR-DNA-Produkt ein Teil der CaM-PDE-cDNA war.
Mit dem Lambda-ZAP-Vektor (freundlicherweise von Ronald E. Diehl, Merck, Sharp & Dohme zur Verfügung gestellt) wurde eine cDNA-Bibliothek aus Rinderhirn erzeugt und mit der durch PCR-Amplifikation radioaktiv erhaltenen, markierten 615 by CaM-PdE-cDNA durchgemustert. Die Sonde wurde unter Verwendung des Verfahrens von Feinberg et al., Anal. Biochem., 137: 266–267 (1984) erzeugt und die [³²P]-markierte DNA wurde unter Verwendung der Elutip-D^® Säulen gereinigt. Die Plaques (700.000 Plaques auf 12–150 mm-Platten), die an die Filterkreise gebunden waren, wurden bei 42°C über Nacht in einer Lösung hybridisiert, die 50% Formamid, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1X Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS und 10⁶ cpm/ml [³²P]-markierter Sonde (10⁹ cpm/μg) enthielt. Die Filter wurden dreimal für 15 min mit 2X SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatw gewaschen, gefolgt von zwei 15-min Waschschritten mit 0,1X SSC/0,1% SDS bei 45°C. Ein Röntgenfilm wurde über Nacht den Filtern ausgesetzt.
Von den 56 Plaques, die mit den [³²P]-markierten Sonden hybridisierten, wurden acht zufällig ausgewählte Klone durch mehrere Runden von erneutem Plattieren und Durchmustern gereinigt [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 545 pp. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)], und die inserierten cDNAs wurden in pBluescript SK(-) durch in vivo-Ausschneiden [Short et al., Nuc. Acids Res., 16: 7583–7599 (1988)], wie durch den Hersteller empfohlen, subkloniert.
Plasmid-DNA, die von Kulturen jeden Klons präpariert worden war, wurde einer Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI unterzogen. Zwei Klone einer geeigneten Länge wurden für eine Sequenzanalyse unter Verwendung von Taq Tak^® und Sequenase – Sequenzierungskits ausgewählt. Die zwei Klone waren pCAM-40 (2,3 kb) und pCAM-34 (2,7 kb). Die Sequenzinformation dieses Verfahrens bestätigte, daß das Insert von pCAM-40 die 61 kDa CaM-PDE aus Rinderhirn in voller Länge kodierte. Die Sequenz dieses Klons und die Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet wurde, sind in den SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Es wurde eine transiente Expression der 61 kDa CaM-PDE-cDNA in COS-7-Zellen (A.T.C.C. CRL 1651) wie folgt durchgeführt. Der Vektor pCDM8 [Seed, Nature, 329: 840– 843 (1987)] in E. coli-Wirtszellen MC1061-p3 wurde freundlicherweise von Dr. Brian Seed, Massachussetts General Hospital, Boston, MA, zur Verfügung gestellt. Dieser Vektor ist auch käuflich von Invitrogen, Inc. (San Diego, CA) zu erwerben. Das Plasmid pCAM-40 wurde mit HindIII und NotI verdaut, was ein 2,3 kb-Fragment ergab, welches in die CDM8-Vektor-DNA ligiert wurde, die mit HindIII und NotI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde in MC1061-p₃-Zellen vermehrt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Verfahrens der alkalischen Lyse von Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1 : 1.7.1 (john Wiley & Sons, New York, 1989) präpariert und unter Verwendung von Qiagen-Tip 500-Säulen (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA) gereinigt, entsprechend des Herstellerprotokolls.
Es wurden COS-7-Zellen mit dem p-CAM-40/CDM8-Konstrukt (oder mit dem CDM8-Vektor allein transfiziert) unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens von Ausubel et al., supra at 1 : 9.2 et seq transfiziert. Im speziellen wurden 10 μg Ethanol-präzipitierter DNA in 80 μl TBS-Puffer resuspendiert und zu 160 μl von 10 mg pro ml DEAE-Dextran topfenweise zu einer 100 mm-Platte von 50% konfluenten COS-7-Zellen in 4 ml DMEM, angereichert mit 10% NuSerum, hinzugegeben und durch Wirbeln vermischt. Die Zellen wurden für 3–4 Stunden bei 37° in einer wassergesättigten Athmosphäre mit 7% CO₂ inkubiert. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden sofort mit 10% DMSO in PBS für 1 Minute behandelt. Im Anschluß an diese Behandlung wurden die Zellen mit PBS, dann DMEM gewaschen und schließlich in DMEM, angereichert mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika (50 μg/ml Streptomycinsulfat) in einem 7%-CO₂ Inkubator für 36 Stunden kultiviert.
Die COS-Zellen wurden von den Platten abgeschabt und in einem Puffer, der 40 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 5 mM EDTA, 15 mM Benzamidin, 15 mM beta-Mercaptoethanol, 1 μg pro ml Pepstatin A und 1 μg pro ml Leupetin enthielt, unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators (1 ml pro 100 mm Platte) homogenisiert. Die Homogenate wurden auf PDE-Aktivität hin entsprechend der Verfahren von Hanson et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci., U.S.A., 79: 2788–2792 (1982) unter Verwendung von [³H]cGMP als Substrat getestet. Die Reaktionen wurden bei 30°C für 10 Minuten in einem Puffer durchgeführt, der 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 20 mM Imidazol (pH = 7,5), 3 mM MgCl₂, 15 mM Magnesiumacetat, 0,2 mg pro ml BSA und 1 μM ³H-cAMP mit entweder 2 mM EGTA oder 0,2 mM CaCl₂ und 4 μg pro ml CaM enthielt. Die Tests wurden durch Inkubieren der Gefäße in einem 90°-Wasserbad für eine Minute gestoppt. Nach dem Abkühlen wurden 10 μl von 2, 5 mg/ml Schlangengift zu jedem Test hinzugegeben und bei 37° für 5 Minuten inkubiert. Die Proben wurden mit 250 μl 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5) verdünnt und sofort auf 0,7 ml A-25-Ionaustauschersäulen aufgebracht. Die Säulen wurden dreimal mit 0,5 ml 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5) gewaschen, und das Eluat wurde in Szintillationsgefäßen aufgefangen. Die Proben wurde für 1 Minute unter Verwendung eines Packard Model 1600TR-Szintillationszählgeräts gezählt. Die spezifische hydrolytische Aktivität gegen zyklische Nukleotide wurde als Picomol hydrolysiertem cAMP oder cGMP pro Minute pro mg-Protein ausgedrückt. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Verfahren von Bradford, Anal. Biochem., 72: 248–254 (1976), unter Verwenung von BSA als Standard bestimmt. Beim Vergleich mit den Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert worden waren, enthielten die Extrakte der Zellen, die mit pCAM-40-cDNA transfiziert worden waren, größere cAMP- und cGMP-hydrolytische Aktivitäten bei Anwesenheit von EGTA. Tests der pCAM-40-cDNA-transfizierten Zellen in Anwesenheit von Calcium und CaM führten zur Stimulierung der cAMP- und cGMP-Hydrolyse.
BEISPIEL II
Isolierung, Reinigun und Sequenzbestimmung von 59 kDa CaM-PDE aus Rinderlunge
Es wurde ein voll degeniertes Sense-Oligonukleotid, entsprechend der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 7
aus der 59 kDa CaM-pde aus Rinderherz synthetisiert. Die Nukleotidsequenz dieses Oligonukleotids ist SEQ ID NO: 8
Ein Antisense-Oligonukleotid wurde nach der Sequenz der 1 der 61 kDa CaM-PDE aus Rinderhirn entworfen, welches der folgenden Aminosäuresequenz entsprach SEQ ID NO: 9
und die Sequenz SEQ ID NO: 10
hat.
Dieses Primerpaar wurde verwendet, um eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Erststrang-cDNA aus Rinderherz (wie in Beispiel I hergestellt) als eine Matritze zu starten. Es wurde ein PCR-Produkt von 75 by vorhergesagt, von denen 54 by eine einzigartige 59 kDa-Sequenz waren und 21 by desselben sich zwischen den 59 kDa und 61 kDa-Isoenzymen aufteilten. Die PCR-Produkte wurden durch auftrennende Agarosegelelektrophorese analysiert und eine Bande, die bei 75 by lief, wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde in pBluescript KS⁺ subkloniert und im blauweiß-Selektionsschema positive Kolonien wurden mit Hilfe der PCR unter Verwendung von Primern, die gegen die Vektorsequenzen gerichtet waren, durchgemustert. Die Kolonien mit Inserts der geeigneten Größe wurden selektiert und einer dieser (pCaM59/75.14) wurde zur Sequenzierung ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer Qiagen-P20-Drucksäule hergestellt und als Matritze zur Sequenzierung nach dem Didesoxyverfahren verwendet. Die Sequenz des PCR-Produkts ist SEQ ID NO: 11
Die Analyse der Sequenz offenbart Unterschiede in zwei Codons zwischen der Sequenz, die erhalten worden war, und der vorhergesagten Sequenz. Eine erneute Untersuchung der Primersequenz des Sense-Oligonukleotids offenbarte, daß eine versehentliche Tranposition von zwei Codons zu einem Fehler in der Gestaltung des Oligonukleotids geführt hat. Es wurde ein zweites Set von Oligonukleotid-PCR-Primern hergestellt, mit Hilfe derer ein 54 bp-Produkt mit minimaler Überschneidung zwischen den 59 und 61 kDa-Isoenzymen vorausberechnet werden konnte; und zusätzlich beinhaltete der zweite Sense-Primer eine Korrektur des Fehlers im Entwurf des ursprünglichen Sense-Primers. Das Sense-Oligonukleotid hatte die Sequenz SEQ ID NO: 12
und das Antisense-Oligonukleotid hatte die Sequenz SEQ ID NO: 13
Dieses Primerpaar wurde verwendet, um eine PCR-Reaktion zu starten, die eine ErststrangcDNA aus Rinderherz als Matrize verwendete, und die PCR-Produkte wurden genauso wie oben beschrieben subkloniert und durchgemustert. Zwei Klone (pCaM59/54.9 und pCaM59/54.10) wurden zur Sequenzierung ausgewählt, basierend auf der Insert-Größe, und wie oben beschrieben sequenziert; beide Klone enthielten 54 bp-Inserts der vorhergesagten Sequenz SEQ ID NO: 14
welche die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 15
ergibt.
Es wurde eine cDNA-Bibliothek aus inRNA aus Rinderlunge hergestellt und unter Verwendung von Verfahren, wie sie in Beispiel IV, infra, im Hinblick auf das Durchmustern einer Bibliothek aus Rindernebennierenrinde beschrieben sind, durchgemustert. Ungefähr 1,2 × 10⁶ Plaque-bildende Einheiten wurden mit einem ³²P-markierten 1,6 kb-Produkt der pCAM-40-cDNA, geschnitten mit der Restruktionsendonuklease EcoRI, hybridisiert. Diese erste Durchmusterung erzeugte 4 mögliche 59 kDa CaM-PDE-cDNA-Klone. Die vorausgegangene Sequenzanalyse ergab, daß ein Klon, bezeichnet als p59KCAMPDE-2, die vollständige kodierende Sequenz der möglichen 59 kDa CaM-PDE enthielt. Von dem p59KCAMPDE-2-Plasmid wurden eine Reihe von ineinander verschachtelten Deletionen erzeugt [Siehe Sonnenburg et al., J. Biol., Chem., 266(26): 17655–17661 (1991)] und die erhaltenen Matrizen wurden mit Hilfe eines angepaßten Verfahrens nach Sanger unter Verwendung des Taq Dye-Deoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kits und eines Applied Biosystems Modell 373A-DNA-Sequenzierungssystems sequenziert. Die DNA- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in den entsprechenden SEQ ID NO: 16 und 17 dargestellt. Ein großer offener Leserahmen innerhalb der cDNA kodiert ein Polypeptid mit 515 Resten mit einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 59 Kilodalton, das annähernd identisch zu der erwarteten Aminosäuresequenz für die 18 aminoterminalen Reste der 61 kDa CaM-PDE ist. Darüberhinaus ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens des p59KCAMPDE-2 zu der zur Verfügung stehenden Sequenz der aus Rinderherz gereinigten 59 kDa CaM-PDE identisch, Novack et al., Biochemistry, 30: 7940–7947 (1991). Diese Ergebnisse zeigen, daß die cDNA des p59KCAMPDE-2 eine mRNA-Spezies darstellt, die für die 59 kDa CaM-PDE kodiert.
Die transiente Expression der 59 kDa-PDE aus Rinderlunge wurde wie in Beispiel I durchgeführt. Insbesondere wurde ein 2,66 kb EcoRI/blunt-geendetes Fragment der p59KCAMPDE-2-cDNA in pCDM8 subkloniert, der mit XhoI-verdaut und blunt-geendet war. Das rekombinante Plasmid, bezeichnet als p59KCAMPDE-2/CDM8, wurde verwendet, um COS-7-Zellen transient zu transfizieren, und es wurden aus den transfizierten COS-7-Zellen Extrakte hergestellt und auf CaM-PDE-Aktivität hin unter Verwendung von 2 μM cAMP untersucht. COS-7-Zellen, die mit der p59KCAMPDE-2-cDNA transifiziert worden waren, ergaben eine cAMP-hydrolytische Aktivität, die 4–5-fach bei Anwesenheit von Calcium und Calmodulin stimuliert wurde. Mit Leerkonstrukten transfizierte COS-7-Zellen zeigten keine dedektierbare Calmodulin-stimulierte cAMP-hydrolytische Aktivität.
BEISPIEL III
Isolierung, Reinigung und Sequenzbestimmung der 63 kDa-CaM-PDE-cDNA aus Rinderhirn
Mehrere vollständige und teilweise redundante Oligonukleotide, die der in 1 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen, wurden synthetisiert, um bei dem Versuch, einen cDNA-Klon für die 63 kDa-CaM-PDE zu erhalten, verwendet zu werden. Die für die Polymerasekettenreaktionen verwendeten Anlagerungstemperaturen, wurden zwischen 2 bis 20°C unter der theoretischen Schmelzpunkttemperatur für das am niedrigsten schmelzende Oligonukleotid jedes Sense-Antisense-Paares variiert. Mit Ausnahme der Proben 63–12 s und 63– 13a, welche unten diskutiert werden, ergaben die PCR-Produkte jedes Oligonukleotidpaares bei einer großen Bandbreite von Bedingungen mehrere Ethidiumbromidbanden, wenn sie auf einer Agarosegelelektrophorese aufgetrennt wurden. Die Verwendung von 63–12s und 63–13a führte zu einem PCR-Produkt, das nach der Sequenzierung für die 63kDa-CaM-PDE kodierte.
Es wurde ein vollständig redundantes Sense-23-mer-Oligonukleotid, bezeichnet als 63–12s, mit der folgenden Sequenz zusammengestellt SEQ ID NO: 18
basierend auf einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 19
welche in den 61 kDa-CaM-PDEs aus Rind konserviert ist (siehe 1). Ein teilweise redundantes Antisense-32-mer-Oligonukleotid, bezeichnet als 63-13a, hatte die Sequenz SEQ ID NO: 20
und basierte auf der folgenden konservierten Sequenz in der 63 kDa-CaM-PDE, SEQ ID NO: 21
Es wurde Messenger-RNA aus dem zerebralen Cortex aus Rinderhirn hergestellt und poly-A⁺-selektiert. Unter Verwendung von AMV- oder MMLV-Reverse Transkriptase wurde eine komplementäre Erststrang-DNA erzeugt. Es wurden de-tritylierte Oligonukleotide unter Verwendung von 1 mM [γ-³²P]ATP mit 1 × 10⁶ cpm/nMol und T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Nach der Trennung von 5'³²P-markierten Oligonukleotiden von freiem ATP unter Verwendung von NENsorb 20-Säulen wurde jedes als eine 20 μM (5' Phosphat)-Stammlösung resuspendiert und schließlich mit jeweils 400 nM in der PCR vereinigt. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 50 ng Gesamt-cDNA und 200 μM dNTP durchgeführt, um ungefähr 1 μg des PCR-Produkts zu erhalten. Die Reaktion wies einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94°C für 5 min auf, gefolgt von 30 Zyklen zu 1 min 94°C Denaturierung, einem Anlagerungsschritt bei 50°C für 1 min und einem Verlängerungsschritt für 2 min bei 72°C. Bei diesen Reaktionsbedingungen wurde eine einzelne Ethidiumbromidgefärbte Bande von 450 Basenpaaren bei einer Agarosegelelektrophorese von 100 ng des PCR-Produkts erhalten. 5 μg des 5'-phosphorylierten PCR-Produkts wurden mit 15 ng EcoRV-geschnittenem Bluescript KS (+)-Plasmid unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in 5% PEG-6000 für 12 h bei 21°C ligiert. Mögliche Positive von XL 1-Blau-Transformationen waren weiße Kolonien bei Verwendung von Isopropylthiogalactosid (IPTG) und Brom-Chlor-Indolylgalactosid (Xgal) zur chromogenen Selektion. Solche Kolonien wurden unter Verwendung von T3- oder T7-Primern, Didesoxynukleotidterminatoren und Sequenase sequenziert.
Ein sich daraus ergebender Klon (p11.5B) zeigte die in der Sequenz SEQ ID NO: 22 und SEQ ID NO: 23 entsprechend zur Verfügung gestellte Nukleotid- und translatierte Aminosäuresequenz. Die Codons für die im Oligonukleotid 63–12 s gefundenen Aminosäuren YEH waren durch Codons für die Aminosäuresequenz NTR in p11.5B ersetzt worden. Dies war wahrscheinlich auf eine Verunreinigung in 63–12 s zurückzuführen. Da der translatierte offene Leserahmen (ORF) ähnlich zu dem in 1 für die 63 kDa-CaM-PDE war, wurde p11.5B verwendet, um eine cDNA-Bibliothek aus Rinderhirn auf einen Vollängen-cDNA-Klon hin zu durchmustern.
Es wurde eine cDNA-Bibliothek aus Rinderhirn in λ ZAP II konstruiert. Die ErststrangcDNA wurde mit RNase H, E. coli DNA-Polymerase und E. coli DNA-Ligase behandelt, um die Zweitstrang-cDNA zu synthetisieren. Die cDNA wurde mit Hilfe von T4-DNA- Polymerase blunt-geendet; EcoRI-Schnittstellen in der cDNA wurden mit EcoRI-Methylase geschützt und S-Adenosylmethionin und EcoRI-Linker wurden mit T4-DNA-Ligase daran ligiert. Nach der Restriktionsendonukleasebehandlung mit EcoRI wurden freie Linker von der cDNA durch Gelfiltration über Sepharose CL-4B getrennt. Es wurden λ ZAP II-Überhänger an die cDNA ligiert und durch einen in vitro Gigapack Gold Packaging-Kit, bezogen von Stratagene, gepackt. Zusammen mit 5,8% nicht-rekombinanter Plaques, berechnet durch Ausplattieren mit IPTG und X-Gal, wurden 9,5 × 10⁵ Rekombinante erhalten. Die Bibliothek wurde einmal durch das Platten-Lysatverfahren amplifiziert, um 1,4 × 10⁷ pfu/ml zu erhalten.
Es wurde ein erstes Durchmustern einer Gesamt-cDNA-Bibliothek aus Rinderhirn in λ ZAP II durchgeführt. Es wurden 700.000 pfu unter Verwendung des ³²P-markierten Oligonukleotids 63–1 s bei einer Hybridisierungs- und Waschtemperatur von 40°C durchgemustert. Das Oligonukleotid 63–1 s war ein vollständig redundantes 23-Mer mit der Sequenz SEQ ID NO: 24
entsprechend zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 25
Eine Gesamtzahl von 21 möglichen Positiven wurde gepickt. Daran anschließende erneute Durchmusterungen wurden durch den sehr hohen Hintergrund, der bei Verwendung dieses Durchmusterungsverfahrens auftauchte, behindert. Deshalb wurden Aliquots von jedem primären Klon vereinigt und 50.000 pfu des Pools erneut ausplattiert und erneut mit p11.5B, radioaktiv durch Zufallsprimer und [α-³²P]dCTP durchgemustert. Es wurde ein positiver Klon erhalten, Plaque-gereinigt und als Plasmid p12.3a aufbewahrt. Seine DNA-Sequenz ist in der SEQ ID NO: 26 zur Verfügung gestellt. Anschließend wurde die Bibliothek aus zerebralem Cortex aus Rinderhirn mit p11.5B weiter durchgemustert. Zwei weitere unabhängige Klone, p12.27.9 und p12.27.11, wurden aus dem ersten Durchmustern von 1,4 × 10⁶ pfu erhalten. Sie wurden Plaque-gereinigt und zur Sequenzierung aufbewahrt.
Der Klon p12.3a kodiert für eine Proteinsequenz mit den meisten der verglichenen Peptide, isoliert aus der 63 kDa-CaM-PDE aus Rind, wie in 1 gezeigt. SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 27 zeigen die kodierende Region (d. h. die 1844 Nukleotide eines ungefähr 2,5 Kilobasen großen Inserts) von p12.3a. Die Basen 248–290 kodieren für die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 28
während das vergleichbare Peptid (1) die Sequenz SEQ ID NO: 29
hat.
Die Basen 942–990 kodieren für eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 30
während die isolierte Peptidsequenz (1) SEQ ID NO: 31
ist.
Keine der nicht-verglichenen 63 kDa-Peptidsequenz wurde in irgendeinem Leserahmen von p12.3a gefunden; also ist das Molekulargewicht des offenen Leserahmens von p12.3a, wenn er translatiert wird, 60.951 und nicht 63.000. Somit könnte diese cDNA eine Isoenzym-Variante des 63 kDa-Proteins darstellen. Die anderen zwei unabhängigen Klone (p12.27.9 und p12.27.11) scheinen eine zu p12.3a identische ORF-Sequenz zu besitzen. Der offene Leserahrrien eines Klons beginnt am Nukleotid 823 von p12.3a und ist bis zum Terminationscodon von p12.3a identisch. Der andere Klon beginnt am Nukleotid 198 und ist über seine ganze Länge mit p12.3a identisch. Keiner dieser drei Klone zeigt eine anormale NTR-Peptidsequenz wie in p11.5B; alle drei haben YEH wie die 61 kDa-CaM-PDE.
Die transiente Expression der 63 kDa-CaM-PDE-cDNA in COS-7-Zellen wurde wie folgt durchgeführt. Ein Fragment des cDNA-Inserts des Plasmids p 12.3, einschließlich der Proteinkodierenden Region der SEQ ID NO: 26 und flankiert von BamHI Restriktionsschnittstellen wurde mit Hilfe der PCR hergestellt. Insbesondere wurden Oligonukleotide, entsprechend zu den Basen 94–117 (mit dem wahrscheinlichen Initiationscodon) und dem Antisense der Basen 1719–1735 (mit der Sequenz, unmittelbar 3' von Terminationscodon) der SEQ ID NO: 26 mit zwei Tandem-BamHI-Stellen an ihren 5' -Enden synthetisiert. Die zwei Prirner hatten die folgenden Sequenzen: SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 33
Die zwei Oligonukleotide wurden in einer PCR verwendet, die 30 Zyklen von 1 min Inkubation bei 94°C bis zu einer 2-minütigen 72°C-Inkubation und einer abschließenden 10 min-Verlängerungsreaktion bei 72°C umfaßte. Die 100 μl-Reaktion verwendete 20 μM von jedem Oligonukleotid und 100 pg p12.3a als Matrize, um 5 μg eines 1665 Basenpaar-langen Produkts zu erzeugen.
Das Produkt wurde einmal mit einem gleichen Volumen 1 : 1 Phenol : Chloroform extrahiert, auf 0,3 M mit Natriumacetat eingestellt und mit zwei Volumen Ethanol über Nacht präzipitiert. Das Präzipitat wurde getrocknet, in 50 μl rehydriert und die cDNA wurde mit 5 Einheiten BamHI Restriktionsendonuklease für eine Stunde bei 37°C verdaut. Anschließend wurde die Lösung einmal mit einem gleichen Volumen 1 : 1 Phenol : Chloroform extrahiert. Die 1.641 Basenpaar-lange cDNA mit BamHI an den 5'- und 3'-Enden wurde aus der wäßrigen Phase über Qiagen Q-20-Säulen (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt.
Das geschnittene, gereinigte PCR-Produkt wurde in ein Bluescript KS(+)-Plasmid kloniert, das mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das Ligationsprodukt wurde in XL1-Zellen subkloniert; die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe einer Sequenzierung durchgemustert. Ein Transformant (bezeichnet als p11.6.c6) wurde isoliert, bei dem das BamHI-Insert so orientiert war, daß die Bluescript KS(+)-HindIII-Restriktionsschnittstelle 30 Basen 5' zur Sequenz des Inserts lag, welche das Startcodon kodiert. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und XbaI Restriktionsendonukleasenverdaut, um das 1689 Basenpaar-große Fragment freizusetzen. Das Fragment wurde in HindIII- und Xba-Iverdaute CDM8-Vektor-DNA wie in Beispiel I ligiert.
COS-7-Zellen wurden mit dem p12.3.a/CDM8-Konstrukt oder einer Leerkontrolle, d. h. mit dem CDM8-Konstrukt alleine, unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, transfiziert. Ein Verhältnis von 10 μg DNA/400 μg DEAE-Dextran wurde verwendet, mit einer Endkonzentration von DEAE-Dextran im Medium von 100 μg/ml. Nach 48 h wurden die Zellen in 1 ml Homogenisierungspuffer (40 mM Tris HCl, pH = 7,5, 15 mM Benzamidin-HCl, 15 mM ß-Mercaptoethanol, 0,7 μg/ml Pepstatin A, 0,5 μg/ml Leupeptin und 5 mM Na₄EDTA) resuspendiert und auf Eis unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators zerstört. Die Homogenate wurden 1 zu 2 verdünnt, um eine Endkonzentration von 50% (v/v) Glycerol zur Lagerung bei –20°C zu erhalten und wurden entweder dazu verwendet, um Phosphodiesteraseaktivität zu testen, oder um die Proteinkonzentration zu bestimmen. CaM-abhängige und unabhängige Aktivitäten wurden wie in Beispiel 1 bestimmt. Die mit einer p12.3.a-DNA transfizierten Zellen hatten eine 15-fach erhöhte CaMstimulierte cAMP Phosphodiesteraseaktivität und eine 12-fach erhöhte CaM-stimulierte cGMP Phosphodiesteraseaktivität über den Grundniveaus. Mit Leerkontrollen transfizierte COS-7-Zellen zeigten keine PDE-Aktivität über den Grundniveaus, selbst nach CaM-Stimulierung.
BEISPIEL IV
Isolierung, Reinigung, Sequenzbestimmung und Expression von cGS-PDE-cDNA aus Nebennierenrinde aus Rind
Es wurde Gesamt-RNA aus der äußeren Rinde von Nebennieren aus Rind unter Verwendung des Verfahrens nach Chomczynski et al., supra, hergestellt. Unter Verwendung des Poly(A) QuickTm mRNA-Reinigungskits entsprechend des Herstellerprotokolls wurde polyadenylierte RNA aus Gesamt-RNA-Zubereitungen gereinigt. Erststrang-cDNA wurde durch Hinzufügen von 80 Einheiten AMV-Reverse Transkriptase zu einem Reaktionsgemisch (40 μl Endvolumen), enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 42°), 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM (jeweils) Desoxynukleotidtriphosphate, 50 mM KCl, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 5 μg Desoxythymidylsäure-Oligomere (12–18 Basen) und 5 μg mRNA aus Nebennierenrinde aus Rind, denaturiert für 15 min bei 65°C, synthetisiert. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min inkubiert. Der Zweitstrang wurde unter Verwendung des Verfahrens von Watson et al., DNA Cloning: A Practical Approach, 1: 79–87 (1985) synthetisiert und die Enden der cDNA wurden mit T4-DNA-Polymerase blunt-geendet. EcoRI-Restriktionsendonukleaseschnittstellen wurden [Maniatis et al., supra] unter Verwendung einer EcoRI-Methylase (Promega) methyliert, und EcoRI-Linker (50-fach molarer Überschuß) wurden an die cDNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Der Überschuß an Linkern wurde durch Verdauen der cDNA mit EcoRI-Restriktionsendonuclease, gefolgt von einer Sepharose CL-4B-Chromatographie, entfernt. Ausubel et al., supra. Die cDNA (25–50 ng pro μg Vektor) wurde in EcoRI-verdaute, dephosphorylierte Arme des ZAP^® II (Stratagene) ligiert [Short et al., Nuc. Acids Res., 16: 7583–7599 (1988)] und mit Gigapack^® Gold-Extrakten entsprechend des Herstellerprotokolls [Maniatis et al., supra] verpackt.
Zunächst wurde eine nicht-amplifizierte cDNA-Bibliothek aus der Nebennierenrinde aus Rind hergestellt und mit einer redundanten 23-mer-Antisense-Oligonukleotidsonde, End-markiert mit y-[³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase, durchgemustert. Die Oligomere, die den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 34
und SEQ ID NO: 35
entsprechen, wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380A-DNA-Syntheseapparats hergestellt. Ihre Sequenzen sind die folgenden: SEQ ID NO: 36
SEQ ID NO: 37
Duplikate von Nitrozellulosefilterkreisen, die die Plaques von 12 konfluenten 150 mm-Platten (ungefähr 50.000 pfu/Platte) trugen, wurden bei 45°C über Nacht in einer Lösung, die 6X SSC, 1X Denhardt's Lösung, 100 μg/ml Hefe – tRNA, 0,05 % Natriumpyrophosphat und 10⁶ cpm/ml radioaktiv-markierte Sonde ( > 10⁶ cpm pro pmol) enthielt, hybrididisiert. Die Filter wurden dreimal mit 6X SSC bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt hörerer Stringenz mit 6X SSC bei 10°C unterhalb der minimalen Schmelztemperatur der Oligomersonden, und ein Röntgenfilm wurde ihnen über Nacht ausgesetzt.
Ein einzelner 2,1 kb-cDNA Klon (bezeichnet als pcGS-3: 2. 1) wurde isoliert und sequenziert. Die Aminosäuresequenz, umfaßt vom großen ORF dieses Klons, war zu den Peptidsequenzen der cGS-PDE identisch, die aus der Überstandsfraktion eines Homogenats aus Rinderherz gereinigt worden war. LeTrong et al., supra.
Eine zweite ampifizierte cDNA-Bibliothek aus der Nebennierenrinde aus Rind wurde unter Verwendung der [³²P]-markierten CGS-3: 2.1 partiellen cDNA durchgemustert und ergab eine 4,2 kb-cDNA (bezeichnet als 3CGS-5).
Die Bibliothek wurde hergestellt, wie bei Maniatis et al., supra, beschrieben amplifiziert, ausplattiert und mit dem cDNA-Insert aus Rind aus Klon CGS-3: 2.1 durchgemustert. Die Sonde wurde unter Verwendung des Verfahrens von Feinberg et al., supra, hergestellt und die radioaktiv markierte DNA wurde unter Verwendung von Elutip-D^®-Säulen gereinigt. Plaques (600.000 pfu auf zwölf 150 mm-Platten), gebunden an Filterkreise, wurden bei 42°C über Nacht in einer Lösung hybridisiert, die 50% Formamid, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1X Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat, 0,11 % SDS und 10⁶ cpm/ml [³²P]-markierter Sonde (10⁹ cpm/μg) enthielt. Die Filter wurden dreimal für 15 Minuten mit 2X SSC / 0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei 15-minütigen Waschschritten mit 0,1X SSC / 0,1% SDS bei 45°C. Ein Röntgenfilm wurde den Filtern über Nacht ausgesetzt. Ausubel et al., supra.
Bei dieser ersten Durchmusterung wurden 52 mögliche Klone identifiziert. Zwanzig dieser Klone wurden zufällig ausgewählt, über mehrere Runden des erneuten Plattierens und Durchmusterns [Maniatis et al., supra] gereinigt, und die cDNA-Inserts wurden in pBluescript SK(-) durch Ausschneiden in vitro [Short et al., supra], wie durch den Hersteller empfohlen, subkloniert. Aus diesen Klonen präparierte Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsanalyse und/oder Sequenzierung analysiert. Bei dieser Überprüfung wurde eine 4,2 kb-cDNA, die den größten offenen Leserahmen darstellt, identifiziert. Die cDNA-Inserts der anderen vermeintlichen Klone waren kürzer und schienen, basierend auf der Nukleotidsequenz der Insert-Enden, identisch zu sein.
Die vermeintlichen cGS-PDE-cDNAs wurden mit Hilfe einer Abänderung des Sanger-Verfahrens [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463–5467] unter Verwendung von Sequenase^® oder Taq Trak^® – Kits, wie durch den Hersteller angegeben, sequenziert. Die Matrizen wurden aus den cDNAs hergestellt, indem eine Reihe von verschachtelten Deletionen [Henikoff Gene, 28: 351–359 (1984)] im Vektor pBluescript SK (-) (Stratagene) unter Verwendung von Exonuklease III und Nuklease aus Mungobohne entsprechend des Herstellerprotokolls konstruiert wurden. In den Fällen, wo überlappende Matrizen durch dieses Verfahren nicht erhalten werden konnten, wurden die cDNAs an geeigneten Restriktionsendonukleaseschnittstellen geschnitten und in pBluescript subkloniert, oder es wurden spezifische Oligomere hergestellt, um zur Sequenzierung an die Matrize zu binden. Einzelsträngige DNA-Matrizen wurden durch Isolieren der DNA vom Phagemid erhalten, wie durch den Hersteller (Stratagene) empfohlen, sekretiert durch XL1-Zellen, die mit Helferphagen infiziert worden waren, und die das pBluescript-Plasmid [Levinson et al., supra] trugen. Es wurden Homologierecherchen bei GENBANK- (Version 66.0), EMBL- (Version 25.0) und NBRF nucleic acid (Version 36.0) and protein- (Version 26.0) Datenbanken unter Verwendung von Wordsearch-, FASTA- und TFASTA-Programmen mit dem Genetics Computer Group Software package zur Verfügung gestellt, Devereux et al., Nuc. Acids Res., 12: 387–395 (1984).
Die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz, kodiert vom großen offenen Leserahmen des p3CGS-5-cDNA-Insert-Klons wird in SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 39 zur Verfügung gestellt. Beginnend mit dem ersten Methionincodon kodiert die cDNA ein Polypeptid mit 921 Resten mit einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 103.000. Obwohl keine Stopcodons dieser Sequenz vorangehen, ist eine Initiator-Methionin-Konsensussequenz [Kozak, J. Cell Biol., 108: 229–241 (1989)] identifiziert worden. Das Vorhandensein von 36 Adenosinresten am 3'-Ende der cDNA, der eine Transkriptions-Terminations-Konsensussequenz vorausgeht [Birnstiel et al., Cell, 41: 349–359 (1985)], legt nahe, daß die gesamte der 3'-nicht-translatierten Sequenz der cGS-PDE-mRNA in diesem Klon vorhanden ist.
Ein vermeintlich Phophodiersterase-defizienter (PPD) Stamm von S49-Zellen [Bourne et al., J. Cell. Physiol., 85: 611–620 (1975)] wurde transient mit der cGS-PDE-cDNA unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens transient transfiziert. Die cGS-PDE-cDNA wurde in die einzige BamHI-Klonierungsstelle in einem Säugetierexpressionsvektor, bezeichnet als pZEM 228, ligiert, gefolgt von einem Zink-induzierbaren Metallothioninpromotor und vor einer SV40-Transkriptionsterminationssequenz. Die DNA wurde von Plasmidpräparationen im großen Maßstab unter Verwendung von Qiagen pack-500-Säulen, entsprechend nach den Hinweisen des Herstellers, gereinigt. PPD-S49-Zellen wurden in DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 50 μg/ml Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycinsulfat bei 37°C in einer wassergesättigten 7% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Vor den Transfektionen wurden konfluente 100 mm-Schalen von Zellen erneut auf ein Fünfzigstel der ursprünglichen Dichte plattiert und für 24–36 h inkubiert. In einem typischen Transfektionsexperiment wurden PPD-S49-Zellen (50–80% konfluent) mit Tris-gepufferter Salzlösung gewaschen und ungefähr 2 X 10 Zellen mit 10 μg DNA, gemischt mit 400 μg DEAE-Dextran in einem ml TBS, transfiziert. Die Zellen wurden bei 37°C für eine Stunde unter vorsichtigem Schwenken alle 20 min inkubiert. Anschließend wurde DMSO in einer Endkonzentration von 10% hinzugegeben, und es wurde schnell durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Nach 2 min wurden die Zellen mit 15 Volumen TBS verdünnt, durch Zentrifugation gesammelt und nacheinander mit TBS und DMEM gewaschen. Die Zellen wurden in Vollmedium resuspendiert und in frische 100 mm-Platten (1–2 X 107 Zellen/10 ml/Platte) ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit TBS allein oder enthaltend Zinksulfat (Endkonzentration = 125 μM) behandelt und für weitere 24 h inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und einmal mit TBS gewaschen. Die endgültigen Zellpellets wurden in zwei Millilitern Homogenisierungspuffer (40 mM Tris-HCl; pH 7,5, 15 mM Benzamidin, 15 mM β-Mercaptoethanol, 0,7 μg/ml Pepstatin A, 0,5 μg/ml Leupeptin und 5 mM EDTA) resuspendiert und auf Eis unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators zerstört. Die Homogenate wurden bei 10.000 × g für 5 min bei 4°C zentrifugiert und die Überstände auf Phophodiesteraseaktivität hin untersucht und die Proteinkonzentration bestimmt.
Die cGS-PDE-Aktivität wurde mit Hilfe eines zuvor beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von [³H]cAMP als Substrat bestimmt, wie bei Martins et al., J. Biol. Chem., 257: 1973–1979 (1982) beschrieben.
Die Phosphodiesterasetests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Der Bradford-Test [Bradford, Anal. Biochem., 72: 248–254 (1976)] wurde verwendet, um Protein unter Verwendung von BSA als Standard zu quantifizieren.
Bei Fehlen einer Zinkbehandlung wurde kein Ansteigen der Grundaktivität oder cGMPstimulierten Phosphodiesteraseaktivität in PPD S49-Zellen, transfiziert mit dem cGS-PDE-ZEM 228-Konstrukt oder dem Vektor allein, detektiert. Mit Zink behandelte Zellen jedoch, die mit cGS-PDE-cDNA, aber nicht mit dem Vektor allein transfiziert wurden, exprimierten cGMP-verstärkte cAMP-Phosphodiesteraseaktivität, was darauf hindeutet, daß die cDNA eine cGS-PDE kodiert. Die Gesamtaktivität der Homogenate und der bei 50.000 g erhaltenen Überstände war nicht signifikant voneinander verschieden.
Die transiente Expression der cGS-PDE-cDNA in COS-7-Zellen wurde wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt. Ein 4,2 kb-Fragment von p3CGS-5 wurde unter Verwendung von HindIII und NotI isoliert und in das Plasmid pCDM8 hineingebracht, welches mit denselben Enzymen verdaut worden war. Die Eigenart der in den COS-7-Zellen erzeugten Produkte, die mit dem p3CGS-5/pCDM8-Konstrukt transformiert worden waren, ist unten in Beispiel V diskutiert.
BEISPIEL V
Isolierung, Reinigung und Bestimmung der Teilsequenz von cGS-PDE-cDNA aus Rinderhirn
A. Isolierung von Rinderhirn cGSPDE-cDNA-Klon, pBBCGSPDE-5
Eine cDNA-Bibliothek aus Rinderhirn, hergestellt mit dem λ ZAP-Vektor (freundlicherweise von Ronald E. Diehl, Merck, Sharp & Dohme zur Verfügung gestellt), wurde mit einem 450 by EcoRUApaI-Restriktionsendonuclease-geschnittenen Fragment der p3CGS-5-cDNA, die den Nukleotidnummern 1–452 (p3CGS-5) entspricht, durchgemustert. Die Sonde wurde unter Verwendung des Verfahrens von Feinberg et al., supra, durchgeführt, und die [³²P]-markierte DNA wurde unter Verwendung von Elutip D^®-Säulen gereinigt. An Filterkreise gebundene Plaques (eine Gesamtzahl von 600.000 Plaques auf 12–150 mm-Platten) wurden bei 42°C über Nacht in einer Lösung hybridisiert, die 50% Formamid, 20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1X Denhardt's Lösung , 10% Dextransulfat, 0,1% SDS und 10⁶ cpm/ml [³²P]-markierter Sonde (10⁹ cpm/μg) enthielt. Die Filter wurden dreimal für 15 Minuten mit 2X SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei 15-minütigen Waschschritten mit 0,1X SSC/0,1% SDS bei 45°. Ein Röntgenfilm wurde über Nacht den Filtern ausgesetzt.
Vierzig vermeintliche Klone wurden von diesem ersten Durchmustern gepickt, von denen sechs zufällig ausgewählt und durch mehrere Runden des erneuten Plattierens und Durchmusterns gereinigt wurden [Maniatis et al., supra]. Die cDNA-Inserts wurden in pBluescript SK(-) durch Ausschneiden in vivo, wie durch den Hersteller empfohlen, subkloniert. Die aus Kulturen hergestellte Plasmid-DNA jedes Klons wurde von den Enden her unter Verwendung von Sequenase- und Taq Trak Sequenzierungskits sequenziert. Die aus diesen Experimenten erhaltene Sequenz bestätigte, daß der cDNA-Klon aus Rinderhirn pBBCGSPDE-5 eine cGS-PDE-cDNA war, und daß er sich von der cGS-PDE-cDNA aus Nebenniere am 5 '-Ende unterschied.
Die Analyse der Teilsequenz des pBBCGSPDE-S-Inserts am 5'-Ende (kodierend den aminoterminalen Teil des Proteins) ergab den Sense-Strang, der in SEQ ID NO: 40 dargestellt ist, während die Sequenzierung des 3'-Endes des Inserts die Antisense-Sequenz der SEQ ID NO: 41 ergab.
B. Isolierung von Rindehirn cGS-PDE-cDNA-Klon, pBBCGSPDE-7
Jeder der vierzig vermeintlichen Klone, ausgewählt aus der ersten Runde der oben beschriebenen Reinigung, wurde einzeln in einen Rasen von XL1-Wirtszellen gegeben und über Nacht bei 37° inkubiert. Die Plaques wurden mit einem 370 bp-Fragment der p3CGS-5-cDNA (das der Nukleotidpositionsnummern 2661–3034 von p3CGS-5 entspricht) die mit PstI/SmaI-Restriktionsendonucleasen geschnitten worden war, durchgemustert. Die Sonde wurde unter Verwendung des Verfahrens von Feinberg et al., supra, hergestellt und die [³²P]-markierte DNA wurde unter Verwendung von Elutip-D^®-Säulen gereinigt. Die an Filterkreise gebundenen Plaques wurden bei 42°C über Nacht in einer Lösung hybridisiert, die 50% Formamid, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1X Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS und 10⁶ cpm/ml [³²P]-markierter Sonde (10⁹ cpm/μg) erhielt. Die Filter wurden dreimal für 15 Minuten mit 2X SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei 15 minütigen Waschschritten mit 0,1X SSC/0,1% SDS bei 45°. Ein Röntgenfilm wurde über Nacht den Filtern ausgesetzt.
Nach mehreren Runden des Ausplattierens und erneuten Durchmusterns wurden sechs vermeintliche Klone gereinigt und von ihren Enden her sequenziert. Die Sequenz des 5'-Endes des cDNA-Klons pBBCGSPDE-7 war zum Klon pBBCGSPDE-5 identisch, aber nicht zum Klon p3CGS-5, der aus der Nebenniere stammte. Die Sequenz des 3'-Endes des pBBCGSPDE-7-cDNA-Klons war zu der Insert-Sequenz des p3CGS-5 identisch.
Die Sequenzanalyse des pBBCGSPDE-7-Inserts ergab die in SEQ ID NO: 42 dargestellte DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 43.
Der große offenen Leserahmen kodiert ein Polypeptid, das eine Größe von 942 Resten aufweist und annähernd identisch zu dem cGS-PDE-Isozym aus der Nebenniere (921 Reste) ist. Der Unterschied in der Primärstruktur dieser zwei Isozyme liegt in den aminoterminalen Resten 1–46 der cGS-PDE aus Hirn und den Resten 1–25 der cGS-PDE aus Nebenniere. Die verbleibenden carboxyterminalen Reste der cGS-PDE aus Hirn und Nebenniere sind identisch.
Zur transienten Expression in COS-7-Zellen wurde ein 3,8 kb-Fragment von pBBCGSPDE-7 unter Verwendung von HindIII und NotI isoliert und in das Plasmid pCDM8 eingefügt, welches zuvor mit HindIII und NotI-Restriktionsendonukleasen geschnitten worden war. Das rekombinante pBBCGSPDE-7/CDM8-Konstrukt wurde verwendet, um COS-7-Zellen transient zu transfizieren. Die Eigenschaften der Produkte des pBBCGSPDE-7/CDM8-Konstrukts und des p3CGS-5/CDM8-Konstrukts, hergestellt in Beispiel IV, wurden anschließend verglichen. Membran- und Überstandsfraktionen wurden aus Extrakten transfizierter COS-7-Zellen hergestellt und auf cGS-PDE-Aktivität hin getestet. Sowohl die pBBCGSPDE-7/CDM8- als auch die p3CGS5/CDM8-Plasmidkonstrukte erzeugten cGS-PDE-Aktivitäten in COS-7-Zellextrakten, und die meiste Aktivität wurde in den Überstandsfraktionen detektiert. Es wurde jedoch ein 10-fach höherer Prozentsatz an Gesamt-cGS-PDE-Aktivität in Membranen von COS-7-Zellextrakten, die mit dem pBBCGSPDE-7/CDM8-Konstrukt transfiziert worden waren, festgestellt, als in Membranen, erzeugt aus p3CGS-5/CDM8-transfizierten COS-7-Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, daß, relativ zur cGS-PDE aus Nebenniere, das durch die pBBCGSPDE-7-cDNA kodierte Isoenzym bevorzugt mit Zellmembranen assoziiert.
BEISPIEL VI
Verwendung von cGS-PDE-cDNA aus Nebenniere aus Rind, um humane cGS-PDEcDNAs zu erhalten
Verschiedene cDNA-Klone aus Mensch, homolog zu einem cDNA-Klon, der für die durch zyklisches GMP stimulierte Phosphodiesterase aus Rind kodiert, wurden durch Hybridisierung unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde, abgeleitet von der Rinder-cDNA, isoliert. Eine Kombination von Sequenzanalyse- und Hybridisierungsstudien zeigten, daß diese humanen cDNA-Klone einen offenen Leserahmen umfassen, der einer Phosphodiesterase aus Mensch entspricht.
Es wurden cDNA-Bibliotheken mit einer DNA-Sonde aus dem Plasmid p3CGS-5 hybridisiert, wobei das Plasmid ein 4,2-kb-cDNA-Insert enthielt, das für die cGS-PDE aus Rind kodierte. Dieses Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI und EcoRI verdaut. Das ungefähr 3,0 kb-große Fragment, abgeleitet von dem cDNA-Insert, wurde isoliert und über Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment enthielt den gesamten offenen Leserahmen der PDE. Das Fragment wurde mit radioaktiven Nukleotiden durch Zufallspriming markiert.
Die cDNA-Bibliotheken wurden auf einer 150 mm-Petrischale in einer Dichte von ungefähr 50.000 Plaques pro Platte ausplattiert. Duplizierte Nitrozellulosefilterreplikas wurden erzeugt. Die radioaktive Nukleinsäuresonde wurde verwendet, um die Filter über Nacht bei 42°C in 50% Formamid, 5x SSPE (0,9 M NaCl, 0,05 M NaHP₂O₄·H₂O, 0,04 M NaOH und 0,005 M Na₂EDTA·₂H₂O), 0,5% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 5x Denhardt's Lösung, zu hybridisieren. Die Filter wurden anfänglich bei Raumtemperatur und anschließend bei 65°C in 2x SSC, enthaltend 0,1% SDS, gewaschen. Positive Plaques wurden gereinigt, und ihre Inserts wurden in einen geeigneten Sequenzierungsvektor zur DNA-Sequenzanalyse mit Hilfe von Standardtechniken subkloniert.
Zuerst wurde eine λgt10-cDNA-Bibliothek aus humaner Hippokampus-mRNA (Clontech, Zufalls- und dT-geprimt) durchgemustert. Von den ungefähr 500.000 untersuchten Plaques hybridisierten 33 mit der Sonde. Einer dieser Phagen wurde mit EcoRI verdaut, um das cDNA-Insert zu entfernen. Dieses Insert-enthaltene EcoRI-Fragment wurde in Bluescript KS kloniert, wobei der Vektor zuvor mit EcoRI verdaut und dann mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm behandelt worden war. Ein Erzeugnis dieser Reaktion war das Plasmid pGSPDE9.2, welches beim Vergleich mit der cGS-PDE-cDNA aus Rind zwei wesentliche Unterschiede zeigte. Die 5'-0,4 kb des pGSPDE9.2-Inserts wichen von der Rinder-cDNA ab. Ungefähr 0,7 kb vom 5'-Ende der humanen cDNA befand sich eine 0,7 kb-Region, die von der Rinder-cDNA abwich. Diese Region könnte ein Intron sein. Fünfundzwanzig der verbleibenden Hippokampus-Plaques, die mit der Rindersonde hybridisierten, wurden durch PCR, Hybridisierung und/oder Sequenzierung untersucht. Es wurde keiner gefunden, der über die Regionen hinausreichte, die zwischen den Rinder- und humanen cDNAs unterschiedlich waren.
Die Phagen λ GSPDE7.1 und λ GSPDE7.4, zwei andere Phagen aus der Hippokampus-Bibliothek, wurden mit EcoRI und HindIII verdaut. Jeder ergab ein 1,8 kb-Fragment, das den größten Teil des cDNA-Inserts und ungefähr 0,2 kb Lambdaphagen-DNA enthielt. Die λ-DNA war in dem Fragment vorhanden, da in jedem Fall eine der EcoRI-Schnittstellen, die typischerweise ein cDNA-Insert einklammern, zerstört worden war, möglicherweise, als die Bibliothek hergestellt wurde. Die EcoRI/HindIII-Fragmente wurden in Bluescript KS kloniert, der mit EcoRI und HindIII verdaut worden war. Dieses Verfahren ergab die Plasmide pGSPDE7.1 und pGSPDE7.4. Die cDNA-Inserts kodierten DNA, die zu dem 3 '-Teil der Posphodiesterase-cDNA aus Rind homolog ist. Beide der cDNA-Inserts in diesen Klonen starteten an einer EcoRI-Stelle, und die an diese Stelle angrenzenden Sequenzen waren homolog.
Teile der cDNA-Inserts von pGSPDE7.1 und pGSPDE7.4 wurden sequenziert und sind bis auf eine kleine Region an ihren 3'-Enden identisch. Das cDNA-Insert in pGSPDE7.1 endet mit einer Sequenz von ungefähr 70 Adeninbasen, während das cDNA-Insert in pGSPDE7.4 mit drei zusätzlichen Nukleotiden endet, die in pGSPDE7.1 nicht vorhanden sind, gefolgt von einer Sequenz aus ungefähr 20 Adeninbasen.
Im folgenden wurde ein cDNA-Bibliothek in λ ZapII (Stratagene) aus mRNA aus Menschenherz hergestellt, die einen hybridisierenden Plaque von den ungefähr 500.000 durchgemusterten ergab. Das Bluescript SK(-)-Plasmid pGSPDE6.1, das das hybridisierende Insert enthielt, wurde in vivo aus dem λ ZapII-Klon herausgeschnitten. Die Sequenzanalyse zeigte, daß das Insert zu der cDNA der Phosphodiesterase aus Rind homolog ist. Die homologe Region erstreckt sich über die Position der EcoRI-Stelle, die in der Sequenz gefunden wurde, welche sich aus dem Zusammenfügen der Sequenz des Inserts von pGSPDE9.2 mit der Sequenz des Inserts von pGSPDE7.1 oder pGSPDE7.4 gebildet hatte. Somit wird angenommen, daß die zwei Klone vom Hippokampus einen vollständigen offenen Leserahmen bilden.
Eine dritte λ gt10-Bibliothek, abgeleitet von mRNA aus humaner Plazenta, ergab fünf hybridisierende Plaques von ungefähr 800.000 durchgemusterten. Diese cDNA-Klone aus Plazenta waren kurz und ihre Sequenzen waren zu Teilen der Hippokampus-cDNA aus pGSPDE9.2 identisch. Das Durchmustern von 5 × 10⁵ Plaques aus der U118 cDNA-Bibliothek aus Glioblastom, 5 × 10⁵ aus einer cDNA-Bibliothek aus Milz und 5 × 10⁵ aus einer Bibliothek aus Nebenniere (Cushing-Krankheit) ergab keine hybridisierenden Plaques.
In Anbetracht der Homologie zwischen der Menge an cGS-PDE-Sequenzen aus Mensch und Rind wurde entschieden, mehrere unabhängige cDNA-Klone zu erhalten, die das 5 '-Ende der humanen cGS-PDE enthalten, um zu bestimmen, ob die 0,4 kb-5'-Sequenz ein Artefakt war. Ein ungefähr 0,95 kb EcoRI-HindII-Fragment des 5'-Endes des Plasmids p3cgs mit der cGScDNA aus Rind wurde zufallsgeprimt und als eine Sonde verwendet, um eine Anzahl von humanen cDNA-Bibliotheken zu durchmustern. Das Durchmustern der Hippokampus-Bibliothek wurde unter den gleichen Durchmusterungsbedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Alle verbleibenden Durchmusterungen wurden so durchgeführt, wie im Hin blick auf die Durchmusterungen der cDNA-Bibliotheken in Beispiel VII unten beschrieben worden ist. Beim Durchmustern von 5 × 10⁵ Plaques einer humanen T-Zell-Bibliothek (Hut78, dT-geprimt), 10⁶ Plaques einer cDNA-Bibliothek aus Hippokampus (zufalls- und dTgeprimt), 5 × 10⁵ Plaques einer humanen cDNA-Bibliothek aus Leber (dT-geprimt, 5'-verlängert, Clontech), 5 × 10⁵ Plaques einer humanen SW1088 cDNA-Bibliothek aus Glioblastom (dT-geprimt), 5 × 10⁵ Plaques einer gleichen cDNA-Bibliothek aus Herz (zufalls- und dTgeprimt) und 1,5 × 10⁶ Plaques einer humanen cDNA-Bibliothek aus Lunge (zufallsgeprimt) wurden keine Positiven erhalten. Zwei Positive wurden beim Durchmustern von 5 × 10⁵ Plaques einer humanen cDNA-Bibliothek aus fötalem Hirn (zufalls- und dT-geprimt, Stratagene) erhalten. Diese wurden als HFB9.1 und HFB9.2 bezeichnet.
Die Bluescript SK(-)-Plasmide pHFB9.2 und pHFB9.1 wurden in vivo aus den λZapII-Klonen herausgeschnitten. Die DNA-Sequenzanalyse ergab, daß HFB9.1 ungefähr 80 Nukleotide weiter 3' startet als HFB9.2 und ungefähr 1,9 kb in eine Intron des HFB9.2 hineinliest. HFB9.2 deckt den gesamten offenen Leserahmen der cGS-PDE ab, liest aber darin hinein, was ein Intron 59 Nukleotide nach dem Stopcodon sein könnte. Beiden fehlt das 5'-0,4 kb und das vermutete Intron, was in pGSPDE9.2 gefunden wurde. Der vollständige offene Leserahmen von HFB9.2 wurde isoliert und in den Hefeexpressionsvektor pBNY6N gebracht. Das so erhaltene Plasmid, bezeichnet als pHcgs6n, beinhaltet die kodierende Region der cDNA als ein EcoRI/XhoI-Insert. Die DNA- und abgeleiteten Aminosäurensequenzen für das Insert snd in der SEQ ID NO: 44 und 45 entsprechend zur Verfügung gestellt.
BEISPIEL VII
Verwendung von CaM-PDE 61 kDa-cDNA aus Rinderhirn, um humane CaM-PDE 61 kDa-cDNA zu erhalten
Die humanen cDNA-Klone, λ CaM H6a und λ CaM H3a, welche zu der cDNA homolog sind, die die 61 kDa CaM-PDE aus Rind kodiert, wurden durch Hybridisierung unter Verwendung einer Nukleinsäuresonde, abgeleitet von der cDNA, die das Enzym aus der Gattung Rind kodiert, erhalten. Eine Kombination von Sequenzanalyse und Hybridisierungsstudien ergab, daß λ Cam H6a den Großteil eines offenen Leserahmens, der für eine humane CaM-PDE kodiert, enthält.
Die Hybridisierungssonde, die verwendet wurde, um die humane DNA zu isolieren, stammte von der Erststrang-cDNA aus Rinderlungengewebe durch PCR-Behandlung. Insbesondere wurde das 23-mer-Oligonukleotid, bezeichnet als PCR-2S in Beispiel I (siehe SEQ ID NO: 1) in einer PCR-Reaktion mit cDNA aus Rinderlunge und einem redundanten Antisense-23-mer-Oligonukleotid (PCR-SAS), basierend auf dem pCAM-Insert, kombiniert, das die Sequenz hatte SEQ ID NO: 46
welche die Aminosäuresequenz ergibt SEQ ID NO: 47
entsprechend den allgemeinen Verfahren der Beispiele I und III, um ein 1.098 bp-cDNA-Fragment zu erzeugen, welches einen großen Teil der kodierenden Region des pCAM-40-Inserts darstellt. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung von 0,4 M Tris-Acetat/0,001 M EDTA-Puffer gereinigt, der 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt. Die DNA-Produkte wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht, sauber aus dem Gel mit einer Rasierklinge herausgeschnitten, unter Verwendung des Geneclean II-Reagenzkits gereinigt und in EcoRV-geschnittene pBluescript-Vektor-DNA ligiert.
Um zu bestimmen, ob die PCR-Amplifikationsprodukte CAM-PDE-cDNAs waren, wurden die subklonierten PCR-DNA-Produkte von den Enden her unter Verwendung von T3- und T7-Promotorprimern und entweder des Sequenase- oder Taq-Polymerase-Sequenzierungskits sequenziert. Ungefähr 250 Basen von jedem Ende dieser DNA wurden dann mit der Aminosäuresequenz von CAM-PDE aus Rind verglichen, was bestätigte, daß das PCR-DNA-Produkt eine unvollständige CAM-PDE-cDNA war. Dieser Klon wurde als pCAM-1000 bezeichnet und enthielt ein 1,1 kb-Insert der Nukleinsäure, das den Nukleotiden 409 bis 1505 des Inserts von pCAM-40 entspricht. pCaM 1000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut. Das 1,1 kb-Fragment wurde über eine Agarosegelelektrophorese gerei nigt und dann mit dem Restriktionsenzym AccI verdaut. Die zwei Fragmente wurden getrennt und über Agarosegelelektrophorese gereinigt. Diese getrennten Fragmente wurden mit radioaktiven Nukleotiden durch Zufallspriming markiert.
Humane cDNA-Bibliotheken wurden auf 150 mm-Petrischalen in einer Dichte von ungefähr 50.000 Plaques pro Schale ausplattiert und es wurden auf Nitrozellulosefilter Kopien mit Hilfe von Duplikaten angefertigt. Jede Sonde wurde mit einem getrennten Set von den duplizierten Filtern hybridisiert. Die Filter wurden über Nacht bei 65°C in 3x SSC, 0,1% Sarkosyl, 50 μg/m1 Lachssperma-DNA, 10x Denhardt's Lösung, 20 mM Natriumphosphat (pH 6,8) hybridisiert. Sie wurden bei 65°C in 2x SSC, enthaltend 0,1% SDS, gewaschen.
Eine λ gt10-Bibliothek, erzeugt aus humaner Hippokampus-mRNA, ergab drei hybridisierende Plaques von den ungefähr 500.000 durchgemusterten. Von diesen drei hybridisierenden Plaques hybridisierten zwei mit beiden Sonden, und der dritte hybridisierte mit der längeren der beiden Sonden. Der λ Cam H6a-Klon enthält ein Insert von ungefähr 2 kb, das homolog zur cDNA ist, die den Rinderklon von pCAM-40 kodiert.
Die λ cam H6a-cDNA wurde in das Plasmid Bluescript KS zur Sequenzanalyse subkloniert. Obwohl die cDNA-Bibliothek mit EcoRI-Linkern konstruiert worden war, ließ sich eine der EcoRI-Stellen, die das cDNA-Insert hätte flankieren sollen, nicht mit EcoR schneiden. Somit wurde die cDNA in Form von zwei Fragmenten subkloniert: ein ungefähr 0,7 kb-EcoRI/HindIII-Fragment (pcamH6C) und ein ungefähr 1,6 kb-HindIII-Fragment, das ungefähr 1,3 kb der cDNA und 0,25 kb der flankierenden λgt10-Vektor-DNA (pcamH6B) enthielt. Die DNA-Sequenzanalyse ergab, daß es den größten Teil einer humanen CaM-PDE kodierte, die zu der 61 k-CaM-PDE aus Rind homolog war, mit dem Unterschied, daß der humanen cDNA anscheinend zwei Basenpaare in der Mitte der kodierenden Region fehlte. Diese fehlenden Nukleotide entsprachen den Positionen 626 und 627 der humanen cDNA-Sequenz, wenn diese mit der 61 kDa-CaM-PDE aus Rind in pCAM-40 (SEQ ID NO: 5) auf maximale Homologie hin verglichen wurde.
Ein anderer der cDNA-Klone aus der cDNA-Bibliothek aus Hippokampus, der mit den 61 kDa-CaM-PDE-Sonden durchgemustert worden war, war λcamH2a. Er enthielt ein ungefähr 1,0 kb-Insert. Wie es für die λcamH6a-cDNA der Fall war, ließ sich nur eine der zwei EcoRI-Stellen, die an den Enden des Inserts hätten vorhanden sein sollen, schneiden. Die ursprüngli the Subklonierungs- und DNA-Sequenzanalyse für diese cDNA verwendete PCR-Fragmente, die mit Oligos in den flankierenden λgt10-Vektorarmen erzeugt worden waren. Diese cDNA überlappte stark mit dem 5'-Ende des Inserts in λcamH6a und enthielt die zusätzlichen zwei durch die Rindersequenz vorhergesagten Nukleotide, die notwendig waren, um den offenen Leserahmen der PDE zu erhalten. Das λcamH2a-Insert schien auch zwei Introns zu enthalten; eines 5' des Anfangsmethionins und eines stromabwärts der HindIII-Stelle. Das Eco-RI/HindIII-Fragment von λcamH2a (entsprechend zu der von pcamH6C abgedeckten Region) wurde in das Plasmid Bluescript SK" subkloniert und als pcamH2A-16 bezeichnet. Dieses wurde dann als Quelle für die zwei zusätzlichen by bei der Konstruktion des Hefeexpressionsplasmids, was unten beschrieben ist, verwendet.
Es wurden zwei verschiedene Plasmide für die humane CaM-PDE-Expression in Hefe konstruiert. Ein Plasmid, pHcam61-6N-7, enthält den gesamten offenen Leserahmen. Das zweite Plasmid, pHcam61met140, beginnt an einem internen Methionin (startet an der Nukleotidposition 505) und erstreckt sich bis zum Ende des offenen Leserahmens. Diese Expressionsplasmide wurden durch Veränderung des 3'-Teils des offenen Leserahmens und anschließendem Hinzufügen der zwei unterschiedlich modifizierten 5 '-Enden aus 3 '-Ende konstruiert. Die Sequenz des cDNA-Inserts von pHcam71-6N-7 ist in der SEQ ID NO: 48 dargestellt und die abgeleitete Aminosäuresequenz der CaM-PDE, die hiervon kodiert wird, ist in der SEQ ID NO: 49 dargestellt. Während der Konstruktion des cDNA-Inserts wurde das Nukleotid an Position 826 von 7 zu C verändert, aber die kodierende Aminosäure blieb erhalten. Das Plasmid pHcam61met140, wie oben erwähnt, weist ein cDNA-Insert auf, welchem die ersten 140 Codons der kodierenden Region des pHcam61-6N-7 fehlten, aber ansonsten identisch zu demselben ist.
Eine dritte cDNA, λcamH3a, enthielt ein Insert von ungefähr 2,7 kb. Dieses cDNA-Insert wurde zur Sequenzanalyse subkloniert. Obwohl die cDNA-Bibliothek mit EcoRI konstruiert worden war, konnte die in λcamH3a eingebrachte cDNA nicht mit EcoRI herausgeschnitten werden. Wahrscheinlich war eine der EcoRI-Stellen während der Konstruktion der Bibliothek zerstört worden. Das cDNA-Insert wurde aus dem λ-Klon durch Verdau mit HindIII und EcoRI herausgeschnitten. Dieser Verdau ergab zwei relevante Fragmente, ein 0,6 kb-HindIII-Fragment, welches einen Teil der DNA des linken Arms von λgt10, angeheftet an das cDNA-Insert, und ein ungefähr 2,4 kb-HindIII/EcoRI-Fragment, das den Rest des cDNA-Inserts umfaßt. Diese zwei Fragmente wurden in dem Plasmid Bluescript KS zusammengebaut, um ein ungefähr 3 kb-Fragment zu erhalten. Die Orientierung des kleinen HindIII-Fragments war dieselbe wie im ursprünglichen λ-Klon. Dieser Subklon ist bekannt als pcamH3EF. Obwohl diese cDNA mit der Rindersonde aus der CaM-PDE-61 kDa-cDNA aus Rind hybridisiert, ergab die Sequenzanalyse, daß es sich scheinbar um das Produkt eines anderen CaM-PDE-Gens handelt. Das Plasmid pcamH3EF enthält einen Bereich, der der gesamte offene Leserahmen sein könnte und würde für ein Protein kodieren, was ungefähr 75% zu dem Protein homolog ist, was durch das Insert des pHcam61-6N-7 über seine gesamte Länge kodiert wird. Die DNA- und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in den SEQ ID NOS: 50 und 51 entsprechend dargestellt. Die DNA-Sequenz zwischen den Nukleotiden 80 und 100 von pcamH3EF ist unsicher. Dieser Bereich liegt 5' zum Start-Methionin-Codon und beeinflußt somit den offenen Leserahmen nicht.
Ein ungefähr 2,4 kb-Fragment von pcamH3EF wurde über ein Gel gereinigt, gefolgt vom Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI. Dieses Fragment wurde verwendet, um zusätzliche humane cDNA-Bibliotheken in einer ähnlichen Weise wie dem oben beschriebenen Durchmustern, durchzumustern. Das Durchmustern von ungefähr 5 × 10⁵ Plaques einer humanen cDNA-Bibliothek aus Herz (Stratagene) ergab zwei Plaques, die mit der pcamH3EF-Sonde hybridisierten. Das Bluescript SK-Plasmid pcamHella wurde in vivo aus einem dieser positiven λZapII-Klone ausgeschnitten. Die DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz für das cDNA-Insert ist in der SEQ ID NO: 52 und 53 entsprechend dargestellt. Die Sequenzanalyse von pcamHella zeigte, daß das Insert an der Nukleotidposition 610 von pcamH3EF startete und bis zur Nukleotidposition 2.066 annährend identisch war, wobei an diesem Punkt die DNA-Sequenz von der des pcamH3EF divergierte. Das cDNA-Insert von pcamHella ging für ungefähr 0,6 kb weiter. Die Schlußfolgerung dieser Divergenz ist es, den Carboxyterminus des Proteins zu ändern, der durch den offenen Leserahmen innerhalb der cDNA kodiert werden würde. Die pcamH3EF-cDNA könnte ein Protein von 634 Aminosäuren (MW72.207) kodieren. Angenommen, das 5'-Ende der pcamHella-cDNA ist dasselbe wie das 5'-Ende von pcamH3EF (5' von der Nukleotidposition 610), dann könnte pcamHella ein Protein kodieren, das 709 Aminosäuren lang ist (MW 80.759). Diese divergierenden 3'-Enden können das Ergebnis eines alternativen Spleißens, fehlenden Spleißens oder nicht-verwandter DNA-Sequenzen sein, die während des Klonierungsverfahrens nebeneinander gestanden haben.
BEISPIEL VIII
Expression von PDE-cDNAs aus Rind und Mensch zur Komnlementierung des phänotypischen Defekts in Hefen
Das vorliegende Beispiel bezieht sich auf die Expression von PDE-Klonen aus Rind in Hefe und zeigt das Leistungsvermögen von funktionalen PDE-Expressionsprodukten, den Hitzeschockphänotyp zu unterdrücken, der mit der Mutation von Hefe-Phosphodiesterasegenen assoziiert ist und auch zu dem biochemischen Test von Expressionsprodukten in Beziehung steht. Die in diesen Verfahren verwendeten Wirtszellen waren S. cerevisiae Hefestämme 10DAB (ATCC Hinterlegungs-Nr. 74049) und YKS45, wobei beide pde^1–pde^2– waren, was zu einem Phänotyp führt, der durch Hitzeschocksensitivität charakterisiert ist, d. h., die Unfähigkeit der Zellen, das Angesetztsein gegenüber erhöhten Temperaturen im Bereich von 55–56°C zu überleben. In diesen Komplementierungsverfahren wurde beobachtet, daß das eingeführte Genprodukt den Hitzeschockphänotyp deutlich verändert. Diese Eigenschaft wiederum zeigt die Ausführbarkeit von Systemen, die entworfen wurden, um chemische Verbindungen auf ihre Fähigkeit hin zu untersuchen, die in vivo-enzymatische Aktivität von Säugetier-Ca²⁺/Calmodulin-stimulierter und cGMP-stimulierter zyklischer Nukleotidphosphodiesterase zu modifizieren (und insbesondere ihre Fähigkeit zu inhibieren).
A. Hefe-Phänotyp-Komplementierun durch Expression einer cDNA, die für CaM-PDE kodiert
Ein 2,2 kb-cDNA-Fragment, angepaßt an das Einbringen in die Hefeexpressionsplasmide pADNS (ATCC Hinterlegungs-Nr. 69588) und pADANS (ATCC Hinterlegungs-Nr. 68587) wurde vom Plasmid pCAM-40 (Beispiel I) durch Polymerasekettenreaktion abgeleitet. Kurz gesagt, die folgende PCR-Amplifikation wurde verwendet, um das pCAM-40-DNA-Insert zu verändern, damit es geeignet auf dem ADHI-Promotor in den Vektoren abgestimmt ist.
Ein Oligonukleotidprimer (Oligo A), der in der PCR-Reaktion verwendet wurde SEQ ID NO: 54
bindet an den pCaM-40-cDNA-Klon an den Basenpaarpositionen 100–116 und beinhaltete eine HindIII-Stelle vor dem Startmethionincodon. Ein zweiter Oligonukleotidprimer (Oligo B) SEQ ID NO: 55
wurde entworfen, um an die Positionen 520–538 zu binden, und er beinhaltete ebenfalls eine HindIII-Stelle, zwei Basen vor einem Methionincodon. Das dritte Oligonukleotid SEQ ID NO: 56
band an eine Position in dem Plasmid, die 3 ' vom Insert lag. Für eine Reaktion wurden Oligo A und Oligo C als Primer mit pCAM-40 als Matrize verwendet. Das Nukleinsäureprodukt dieser Reaktion beinhaltete den gesamten offenen Leserahmen. Eine zweite Reaktion verwendete Oligo B und Oligo C als Primer mit der Matrize pCAM-40 und ergab ein Nukleinsäureprodukt, dem der Teil der cDNA-Sequenz fehlte, der für die Calmodulin-Bindedomäne kodiert. Diese amplifizierten Produkte wurden mit HindIII und NotI verdaut und in die HindI(HindIII)II/NotI-verdauten Hefeexpressionsvektoren pADNS und pADANS ligiert. Plasmidklone, die Inserts enthielten, wurden selektiert und in S. cerevisiae Stamm 10DAB mit Hilfe der Lithiumacetat-Transformation transformiert.
Transformierte Hefen wurden in Stücken auf Agarplatten, die synthetisches Medium enthielten denen die Aminosäure Leucin (SC-Leucinagar) fehlte, ausgestrichen und für drei Tage bei 30°C kultiviert. Replikas dieser Agarplatten wurden mit drei Arten von Agarplatten hergestellt: eine Replika auf SC-Leucinagar, eine Replika auf Raumtemperatur-YPD-Agar und drei Replikas auf YPD-Agarplatten, die auf 56°C erwärmt worden waren. Die drei erwärmten Platten wurden bei 56°C für 10, 20 oder 30 Minuten gehalten. Diesen Replikas wurde es dann ermöglicht, auf Raumtemperatur abzukühlen und alle Platten wurden dann bei 30°C kultiviert. Die mit den Plasmiden, hergestellt, um CaM-PDE zu exprimieren, transformierten Hefen waren gegenüber dem thermischen Puls resistent. Genauer gesagt waren sowohl das Kon strukt, was entworfen worden war, um den vollständigen Leserahmen zu exprimieren, als auch das Konstrukt, das entworfen worden war, um das trunkierte Protein zu exprimieren (einschließlich der katalytischen Region aber ohne die Calmodulin-Bindungsdomäne), entweder in pADNS oder pADANS in der Lage, den Hitzeschock-sensitiven Phänotyp der 10DAB-Wirtszellen zu komplementieren, d. h., sie machten diese resistent gegenüber dem 56°C-Temperaturpuls.
In einer ähnlichen Weise wurden die Plasmide pHcam61-6N-7 und pHcam61met140 (Beispiel VII) in den Hefewirt 10DAB transformiert. Die Hitzeschockphänotypen wurden in beiden Transformanten supprimiert.
B. Biochemischer Test auf Exnressionsprodukte
Das CaM-PDE-Expressionsprodukt aus Rind wurde durch Erzeugen eines zellfreien Extrakts aus den 10DAB-Hefezellen und der Messung der biochemischen Phosphodiesteraseaktivität der Extrakte ebenfalls evaluiert. Zu diesem Zweck wurden 200 ml-Kulturen der transformierten Hefe in flüssigem SC-Leucin bis zu einer Dichte von ungefähr 6 Millionen Zellen pro ml kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und die Zellpellets wurden eingefroren. Die Extrakte wurden durch Auftauen der gefrorenen Zellen auf Eis, durch Mischen der Zellen mit 1 ml PBS und einem gleichen Volumen Glasperlen, Vortexen derselben, um die Hefezellen zu zerstören und Zentrifugieren der zerstörten Zellen bei ungefähr 12.000 × g für 5 min, um die unlöslichen Bestandteile zu entfernen, hergestellt. Der Überstand wurde auf Phosphodiesteraseaktivität hin untersucht.
Die Extrakte von Hefezellen, bis zu 50 μl, wurden auf Phosphorasediesteraseaktivität hin in 50 mM Tris (pH 8,0), 1,0 mM EGTA, 0,01 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin), [³H]-zyklisches Nukleotid (4–10.000 cpm/pmol) und 5 mM MgCl₂ in einem Endvolumen von 250 μl bei 30°C in 10 × 75 mm Glastestgefäßen getestet. Die Inkubationen wurden durch Hinzufügen von 250 μl 0,5 M Natriumcarbonat, pH 9,3, 1 M NaCl und 0,1% SDS beendet. Die Produkte der Phosphodiesterasereaktion wurden von dem zyklischen Nukleotid durch Chromatographie auf 8 × 33 mm-Säulen von BioRad Affi-Gel 601 boronic acid gel aufgetrennt. Die Säulen wurden mit 0,25 M Natriumbicarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl äquillibriert. Die Reaktionsansätze wurden auf die Säulen gegeben. Die Testgefäße wurden mit 0,25 M Natriumbicarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl gespült und diese Flüssigkeit wurde auf die Säulen gegeben. Die borierten Säulen wurden zweimal mit 3,75 ml 0,25 M Natriumbicarbonat (pH 9,3) und 0,5 M NaCl, gefolgt von 0,5 ml 50 mM Natriumacetat (pH 4,5) gewaschen. Das Produkt wurde mit 2,5 ml 50 mM Natriumacetat (pH 4,5), enthaltend 0,1 M Sorbitol, eluiert und in Szintillaitonsgefäßen gesammelt. Das Eluat wurde mit 4,5 ml Ecolite Scintillation Cocktail gemischt und die Radioaktivität durch Flüssig-Szintillationsspektrometrie gemessen.
Sowohl das Konstrukt, entworfen, um den vollständigen offenen Leserahmen vom Rind zu exprimieren, als auch das Konstrukt, entworfen, um ein trunkiertes Protein zu exprimieren, exprimierten entweder in pADNS oder pADANS aktives Protein, wie durch einen biochemischen Phosphodiesterasetest mit Hilfe von Zellextrakten bestimmt wurde. Die Extrakte von 10DAB, die pcam61met140 trugen, ergaben eine meßbare Phosphodiesteraseaktivität (siehe unten, zweites Verfahren von Teil D), während dem Extrakt von 10DAB-Zellen, die pcamH61-6N-7 trugen, eine dedektierbare Aktivität fehlte.
C. Komulementierung des Hefephänotyps durch Expression einer cDNA, die für eine cGS-PDE kodiert
Das Plasmid p3CGS-5, das ein 4,2 kb-DNA-Fragment enthält, das für cGS-PDE aus Rind kodiert, wurde zur Klonierung in pADNS und pADANS durch das Ersetzen der ersten 147 Basen der cDNA durch eine Restriktionsschnittstelle, geeignet zur Verwendung beim Einbau in Plasmide, angepaßt. Das Oligonukleotid BS1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 57
kodiert eine HindIII-Stelle und lagert sich an die Position 148–165 des cDNA-Inserts an. Ein Oligonukleotid, bezeichnet als BS3, SEQ ID NO: 58
lagert sich an die Positionen 835–855, gerade 3' von einer einzelnen NsiI-Stelle, an. Das erhaltene PCR-erzeugte Fragment wurde nach dem Verdau mit HindIII und NsiI in HindIII- und NsiI-verdauten p3CGS-5 ligiert, wobei das ursprüngliche 5'-Ende der cDNA aus Rind ersetzt wurde. Ein Plasmid, abgeleitet von dieser Ligation, wurde mit HindIII und NotI verdaut, um das modifizierte cDNA-Insert zu verändern. Das Insert wurde in pADNS und pADANS an ihre HindIII- und NotI-Stellen kloniert. Diese Plasmide wurden dann in den Hefestamm 10DAB mit Hilfe des Lithiumacetatverfahrens transformiert, und die transformierten Zellen wurden kultiviert und sie wurden erhöhten Temperaturen, wie in Abschnitt A oben beschrieben, ausgesetzt. Die Hefen, die mit den Plasmiden transformiert worden waren, die konstruiert worden sind, um cGS-PDE aus Rind zu exprimieren, waren gegenüber dem thermischen Puls resistent.
In einer ähnlichen Weise wurde das Plasmid pHcgs6n (Beispiel VI) in den Hefewirtsstamm YKS45 mit Hilfe der Lithiumacetattransformation transformiert. Die Hitzeschockanalyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, daß die Platten ursprünglich zwei Tage bei 30°C kultiviert wurden und die warmen Platten bei 56°C für 10, 20, 30 und 45 Minuten gehalten worden sind. Die Hefe, die mit dem Plasmid transformiert worden ist, das entworfen wurde, um die Vollängen-cGS-PDE aus Mensch zu exprimieren, war gegenüber dem thermischen Puls resistent.
D. Biochemischer Test des Expressionsprodukts
Die Expression der cGS-PDE aus Rind wurde ebenfalls durch die Erzeugung eines zellfreien Extrakts aus der Hefe und Messung der biochemischen Phosphodiesteraseaktivität des Extrakts evaluiert. Zu diesem Zweck wurden 50 ml-Kulturen transformierter 10DAB-Hefezellen in flüssigem SC-Leucin bis zu einer Dichte von ungefähr 10 Millionen Zellen pro ml kultiviert. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986). Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, die Zellpellets einmal mit Wasser gewaschen und die endgültigen Zellpellets eingefroren. Um ein Extrakt herzustellen, wurden die gefrorenen Zellen auf Eis aufgetaut, mit 1 ml PBS und einem gleichen Volumen Glasperlen vermengt, gevortext, um die Hefezellen zu zerstören und zentrifugiert, um die Bruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde dann auf Phosphodiesteraseaktivität hin, wie in Abschnitt B oben beschrieben, getestet. Die Konstrukte entweder in pADNS oder pADANS exprimierten aktives Protein, wie mit Hilfe des biochemischen Phosphodiesterasetests der Zellextrakte bestimmt werden konnte.
YKS45, transformiert mit dem Plasmid pHcgs6n, wurden in SC-Ieu-Medium bis zu 1-2 × 10⁷ Zellen/ml kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und die Zellpellets wurden eingefroren. Ein gefrorenes Zellpellet, das typischerweise 10¹⁰ Zellen enthielt, wurde mit Lysispuffer (25 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM o-Phenathrolin, 0,5 mM AEBSF, 0,01 mg/ml Pepstatin, 0,01 mg/ml Leupeptin, 0,01 mg/ml Aprotinin, 0,1% 2-Mercaptoethanol) gemischt, um das Gesamtvolumen auf 2,5 ml zu bringen. Das Gemisch wurde auf Eis aufgetaut und dann zu einem gleichen Volumen Glasperlen hinzugegeben. Die Zellen wurden durch mehrere Runden von Vortexen und Kühlen auf Eis zerstört, dann wurde zusätzlicher Lysispuffer zu den zerstörten Zellen gegeben, um den Gesamtlysispuffer auf 5 ml zu bringen. Die Suspension wurde für 5 min bei 12.000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und entweder sofort getestet oder schnell in einem Trockeneis-Ethanol-Bad eingefroren und bei –70°C gelagert.
Die Phosphodiesteraseaktivität wurde durch Mischen eines Aliquots des Zellextrakts mit (40 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EGTA, 0,1 mg/ml BSA), enthaltend 5 mM MgCl₂ und radioaktives Substrat, Inkubieren bei 30°C für bis zu 30 min gemessen, und die Reaktion wurde mit Stoppuffer (0,1 M Ethanolamin, pH 9,0, 0,5 M Ammoniumsulfat, 10 mM EDTA, 0,05% SDS, Endkonzentration) beendet. Das Produkt wurde von dem zyklischen Nukleotidsubstrat durch Chromatographie auf BioRad Affi-Gel 601 getrennt. Die Probe wurde auf eine Säule aufgebracht, die ungefähr 0,25 ml des Affi-Gels 601 enthielt, äquillibriert in Säulenpuffer (0,1 M Ethanolamin, pH 9,0, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat). Die Säule wurde fünfmal mit 0,5 ml Säulenpuffer gewaschen. Das Produkt wurde mit vier 0,5 ml-Aliquots 0,25 M Essigsäure eluiert und mit 5 ml Ecolume (ICN Biochemicals) durchmischt. Das radioaktive Produkt wurde durch Szintillationszählung gemessen. Die Hefeextrakte, die die humane cGS-PDE exprimierten, hydrolysierten sowohl zyklisches AMP als auch zyklisches GMP, wie von diesem Isoenzym erwartet worden war.
BEISPIEL IX
Gewebeexnressionsstudien, die CaM-PDE und cGS-PDE Polynukleotide involvieren
A. Northern Blot-Analyse
Die in den Beispielen I, III und IV oben isolierten DNAs wurden verwendet, um Sonden zum Durchmustern von Gesamt- oder Poly A-selektierten RNAs, isoliert aus einer Vielzahl von Geweben, zu entwickeln, und die Ergebnisse sind unten zusammengefaßt.

1. Eine Northern-Analyse wurde mit mRNA, hergestellt aus einer Auswahl von Geweben aus Nebennierenrinde, Nebennierenrindenmark, Herz, Aorta, zerebralem Cortex, Basalganglion, Hippokampus, Zerebellum, Medulla/Rückemark, Leber, Nierenrinde, Nierenmark, Nierenpapille, Trachea, Lunge, Milz und T-Lymphozyten unter Verwendung eines geeigneten 3 kb radioaktiv-markierten cDNA-Fragments, isoliert aus dem Plasmid p3CGS-5 durch Verdau mit EcoRI und SmaI, durchgeführt. Eine einzelne 4,5 kb mRNA-Spezies wurde in den meisten Geweben entdeckt. Die Größe der cGS-PDE-mRNA erschien ein wenig größer (ungefähr 4,6 kb) bei der RNA zu sein, die aus zerebralem Cortex, Basalganglion und Hippokampus isoliert worden war. Von der cGS-PDE-mRNA war am meisten in der Nebennierenrinde vorhanden. Es war auch reichlich im Nebennierenmark und Herz vorhanden. Sie schien differentiell in anatomisch unterschiedlichen Regionen des Hirns und der Niere exprimiert zu sein. Unter den aus fünf verschiedenen Hirnregionen isolierten RNAs war die cGS-PDE-mRNA im Hippokampus, zerebralem Cortex und Basalganglion am meisten vorhanden. Sehr wenig cGS-PDE-Transkript wurde in den RNAs des Zerebellums oder Medulla und des Rückenmarks detektiert. Obwohl die cGS-PDE-mRNA in allen Regionen der Niere detektiert worden war, schien sie am meisten im äußeren roten Mark und den Papillen vorhanden zu sein. Die cGS-PDEmRNA wurde auch in RNAs aus Leber, Luftröhre, Lunge, Milz und T-Lymphozyten detektiert. Sehr wenig cGS-PDE-mRNA wurde in RNA detektiert, die aus der Aorta isoliert worden war.
2. Radioaktiv markierte DNA-Sonden wurden aus zufälligen Hexamer-geprimten Fragmenten, verlängert an Hitze-denaturierten 1,6 kb EcoRI-Restriktions-Endonukleasefragmenten des cDNA-Inserts des Plasmids pCAM-40, hergestellt. In Northern-Analysen hybridisierten die DNA-Sonden mit 3,8 und 4,4 kb-mRNAs in Hirn und den meisten der anderen analysierten Geweben, einschließlich zerebralem Cortex, Basalganglion, Hippokampus, Zerebellum, Medulla und Rückenmark, Herz, Aorta, Nierenmark, Nierenpapillen und Lunge. Die Hybridisierung der Sonde mit der 3,8 kb-mRNA aus Leber, Nierenrinde und Luftröhre wurde nur nach langer autoradiographischer Exposition detektiert.
3. Es wurde eine Northern Blot-Analyse von mRNA verschiedener Gewebe des zentralen Nervensystems unter Verwendung eines subklonierten, markierten p12.3a-DNA-Fragments (das den größten Teil der konservierten katalytischen Domäne der PDE enthält) als eine Sonde durchgeführt. Das intensivste Hybridisierungssignal wurde in der mRNA des Basalganglions beobachtet, und es wurden auch starke Signale in der mRNA anderer Gewebe, einschließlich Nierenpapille und Nebennierenmark gesehen.

B. RNAse-Schutz

1. Drei Antisense-Ribosonden wurden hergestellt. Sonde III entspricht dem Bereich von p3cGS-5, der für die katalytische Domäne kodiert (273 by entsprechend zu den Basen 2393 bis 2666 der SEQ ID NO: 38); Sonde II entspricht dem Bereich, der für die cGMP-Bindungsdomäne kodiert (468 by entsprechend zu den Basen 959 bis 1426); und Sonde I entspricht dem 5'-Ende und Teilen des Aminoterminal-kodierenden Bereichs (457 Basen entsprechend zu den Basen 1 bis 457). Aus all den untersuchten Geweben extrahierte Gesamt-RNAs schützten die Sonden II und III vollständig. Ein beinahe vollständiger Schutz (457 Basen) der Ribosonde I mit RNAs, isoliert aus Nebennierenrinde, Nebennierenmark und Leber wurde ebenfalls beobachtet. Jedoch schützte RNA, isoliert aus zerebralem Cortex, Basalganglion und Hippokampus nur ein ungefähr 268-Basen-Fragment der Ribosonde I. Eine relativ kleines Stück der teilweise geschützten Sonde I, identisch in der Größe mit den Hauptfragmenten, die in RNA-Proben aus Gehirn beobachtet wurden, wurde auch in RNAs detektiert, die aus allen untersuchten Geweben mit Ausnahme der Leber isoliert worden war. Interessanterweise ergab RNA aus Herz sowohl den vollständigen Schutz (457 Basen) der Ribosonde als auch, wie RNA aus Hirn, den Schutz eines 268-Basen-Fragments. Im Gegensatz dazu erschien jedoch das Schutzmuster, was bei Verwendung von RNAs, isoliert aus irgendeinem der anderen Gewebe, beobachtet wurde, für das teilweise geschützte Fragment der Ribosonde I stärker zu sein. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß zwei verschiedene cGS-PDE-RNA-Spezies exprimiert wurden.
2. Es wurden radioaktiv markierte Antisense-Ribosonden, entsprechend zu einem Teil entweder der CaM-Bindungsdomäne oder der katalytischen Domäne von CaM-PDE, aus mit Restriktonsendonuklease geschnittenen Fragmenten (AccI/SstI und Tth111I/HincII) der pCAM- 40-cDNA herstellt. Aus fünf verschiedenen Hirnregionen (zerebraler Cortex, Basalganglion, Hippokampus, Zerebellum und Medulla/Rückenmark) isolierte Gesamt-RNAs schützten die Antisense-Ribosonden, die sowohl für die CaM-Bindungs- und katalytische Domäne kodieren, vollständig. Gesamt-RNAs aus Herz, Aorta, Lunge, Luftröhre und Niere schützten die Ribosonde vollständig entsprechend der katalytischen Domäne, schützten, aber nur 150 Basen der CaM-Bindungsdomäne der Ribosonde, was vermuten läßt, daß eine Isoform strukturell zu der 61 kD CaM-PDE, die in diesen Geweben exprimiert wird, verwandt ist.
3. Es wurden Antisense-Ribosonden erzeugt, die auf dem Plasmid p12.3a basierten und den Basen –1 bis 363 und 883–1278 der SEQ ID NO: 26 entsprachen. Die frühere Sonde beinhaltete 113 Basen der 5'-nicht-kodierenden Sequenz ebenso, wie das Startmethionincodon bis zur möglichen CaM-Bindungsdomäne, während die letztere die katalytische Domäne kodiert. Unter allen getesteten Geweben schützte die RNA des Basalganglions am stärksten jede Sonde. Starke Signale einer Größe, entsprechend zu der Sonde, die den Aminoterminus präsentiert, wurden beim Schutz durch RNAs des zerebralen Cortex, Zerebellums, Basalganglions, Hippokampus und Nebennierenmarks beobachtet. Kein Schutz war bei dieser Sonde durch Nierenpapillen- oder Hoden-RNA zu erreichen, obwohl das Gewebe in der Northern-Analyse und dem RNAse-Schutz der konservierten Domänen-Sonde Signale zeigte, was vermuten läßt, daß ein strukturell verwandtes Isoenzym in diesem Gewebe exprimiert wird.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das die DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Ca²⁺/Calmodulin-stimuliertes zyklisches-Nukleotid-Phosphodisteraseenzym aus Säugetieren kodiert, wie in den SEQ ID NO: 48, 50 oder 52 dargestellt.
cDNA-Sequenz nach Anspruch 1.
Genomische DNA-Sequenz nach Anspruch 1.
Prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, die mit einer Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1 stabil transformiert ist.
Hefe-Wirtszelle nach Anspruch 4.
DNA-Vektor, der eine darin eingefügte Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1 aufweist.
DNA-Vektor nach Anspruch 6, bezeichnet als pcamHella (A.T.C.C. 68965).
DNA-Vektor nach Anspruch 6, bezeichnet als pcamH3EF (A.T.C.C. 68964).
DNA-Vektor nach Anspruch 6, bezeichnet als λ CaM H6a (A.T.C.C. 75000).
DNA-Vektor nach Anspruch 6, bezeichnet als pHcam61-6N-7 (A.T.C.C. 68963).
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die enzymatische Aktivität eines Ca¹⁺/Calmodulin-stimulierten zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesteraseenzyms aus Säugetieren aufweist, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Stabiles Transformieren oder Transfizieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1; und (b) Kultivieren der in Schritt (a) erzeugten Wirtszelle in einem Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression des Polynukleotids in der Wirtszelle ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 11, das weiterhin den Schritt des Isolierens des Polypeptidprodukts der Expression der Polynukleotidsequenz in der Wirtszelle beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Wirtszelle eine Hefe-Wirtszelle ist.
Gereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das ein Polypeptid kodiert, das die enzymatische Aktivität von Ca²⁺/Calmodulin-stimuliertem zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesteraseenzym aus Säugetieren aufweist, wobei das Polynukleotid unter stringenten Bedingungen mit dem Antisense-Strang der Sequenz, wie in den SEQ ID NO: 48, 50 oder 52 dargestellt, hybridisiert.
Isoliertes und gereinigtes Ca²⁺/Calmodulin-stimuliertes zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesterasepolypeptid, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz, die in den SEQ ID NO: 49, 51 oder 53 dargestellt ist, umfaßt.
Polypeptidprodukt der Expression in einer transformierten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle einer Polynukleotidsequenz, die für eine Ca²⁺/Calmodulinstimulierte zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesterase aus Säugetieren kodiert, wie in den SEQ ID NO: 49, 51 oder 53 dargestellt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die enzymatische Aktivität einer Ca²⁺/Calmodulin-stimulierten zyklisches-Nukoleotid-Phosphodiesterase aus Säugetieren aufweist, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Stabiles Transformieren oder Transfizieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle mit einer Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1; und (b) Kultivieren der in Schritt (a) erzeugten Wirtszelle in einem Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz in der Wirtszelle ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 17, das weiterhin den Schritt des Isolierens des Polypeptidprodukts der Expression der Polynukleotidsequenz in der Wirtszelle umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Wirtszelle eine Hefe-Wirtszelle ist.
Testverfahren zum Identifizieren eines chemischen Agens, das die enzymatische Aktivität einer Ca²⁺/Calmodulin-sensitiven zyklisches-Nukleotid-Phophodiesterase aus Säugetieren modifiziert, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Stabiles Transformieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle die eine phänotypische Eigenart aufweist, die gegenüber einer Änderung nach der Expression der Polynukleotidsequenz empfänglich ist, mit einer Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1; (b) Kultivieren der in Schritt (a) erzeugten Wirtszelle in einem Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression der Polynukleotidsequenz in der Wirtszelle ermöglichen, begleitet von der entsprechenden Veränderung im Phänotyp der Wirtszelle; (c) Kontaktieren der Wirtszellen, die entsprechend des Schritts (b) kultiviert wurden, mit einem chemischen Agens, um getestet zu werden; (d) Bestimmen jeder Modifikation in der Änderung des Phänotyps der Wirtszellen, die mit dem chemischen Agens in Schritt (c) kontaktiert wurden.
Testverfahren nach Anspruch 20, wobei die Wirtszelle eine Hefe-Wirtszelle ist.
Testverfahren zum Identifizieren eines chemischen Agens, das die enzymatische Aktivität einer Ca²⁺/Calmodulin-sensitiven zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesterase aus Säugetieren modifziert, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Stabiles Transformieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle die eine phänotypische Eigenart aufweist, die gegenüber einer Änderung nach der Expression der Polynukleotidsequenz empfänglich ist, mit einer Polynukleotidsequenz nach Anspruch 1; (b) Kultivieren der in Schritt (a) erzeugten Wirtszelle in einem Nährmedium unter Bedingungen, die die Expression der Polynukleotidsequenz in der Wirtszelle ermöglichen, begleitet von der entsprechenden Änderung im Phänotyp der Wirtszell; (c) Identifizieren von Wirtszellen, die einen veränderten Phänotyp aufweisen; (d) Aufschließen der veränderten Wirtszellen; (e) Isolieren des Cytosols von der aufgeschlossenen Wirtszelle; und (f) Bestimmen, ob sich die enzymatische Aktivität im Cytosol verändert hat.
Testverfahren nach Anspruch 22, wobei die Wirtszelle eine Hefe-Wirtszelle ist.
Antikörper, der spezifisch mit einem Ca²⁺/Calmodulin-stimulierten zyklisches-Nukleotid-Phosphodiesterasepolypeptid aus Säugetieren immunreaktiv ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe, die aus den SEQ ID NO: 49, 51 oder 53 besteht, ausgewählt ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 24.
Hybridomazellinie, die den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 25 erzeugt.