DE69034060T2

DE69034060T2 - Nukleinsäure, die für das menschliche testikulare angiotensin konvertierende enzym (ace) kodiert, und seine anwendungen, insbesondere für die in vitro-detektion des enzyms im organismus

Info

Publication number: DE69034060T2
Application number: DE69034060T
Authority: DE
Inventors: Florent Soubrier; François ALHENC-GELAS; Christine Hubert; Pierre Corvol
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1989-07-05
Filing date: 1990-07-05
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2010-07-06
Also published as: ES2195992T3; CA2035888C; FR2649412B1; DK0432254T3; EP0432254B1; CA2035888A1; JPH04500612A; ATE238423T1; EP0432254A1; DE69034060D1; US5801040A; FR2649412A1; WO1991000354A1

Description

Die Endung betrifft eine Nucleinsäure, die das Angiotensin konvertierende Enzym (ACE) in Keimzellen des menschlichen Hodens codiert, sowie Vektoren, die die Nucleinsäure enthalten, und ihre Anwendung zur Herstellung des Enzyms. Die Erfindung betrifft auch die Anwendungen der Nucleinsäure, insbesondere zur in vitro-Detektion des Enzyms im Organismus.
Das ACE oder Peptidyl-Dipeptidase A (EC 3.4.15.1) oder auch Kininase II spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Blutdrucks durch Hydrolyse des Angiotensins I (freigesetztes inaktives Peptid nach Spaltung des Angiotensinogens durch Renin) zu vasopressivem Angiotensin II, das eine wichtige Rolle in der Regulation des Blutdrucks spielt (SKEGGS, L.T. et al. (1956) J. Exp. Med. 103, 295–299).
Die Hemmung der Akivität des ACE durch EDTA und seine Metallchelatoren deutet an, dass es sich um eine Metallopeptidase handelt, spezieller um eine Zinkpeptidase, die nicht nur Angiotensin I hydrolysieren kann, sondern auch Bradykinin (ein Gefäß-erweiterndes und Natrium-uretisches Peptid, das in ein inaktives Heptapeptid umgewandelt wird), und zahlreiche andere Peptide mit biologischer Aktivität (YANG, H.Y.T. et al. (1970) Biochim. Biophys. Acta 214, 374–376; ERDOS, E.G. et al. (1987) Lab. Invest. 56, 345–348).
Das ACE ist eine im Organismus weit verbreitete Peptidase, die man zum Beispiel in der Form eines membranständigen Enzyms an der Oberfläche endothelialer, vaskulärer Zellen und epithelialer Nierenzellen findet, sowie in Form eines im Plasma zirkulierenden Enzyms (ERDOS et al. (1987) siehe oben; CARDWELL, P.R.B. et al. (1976) Science 191, 1050–1051; RYAN, U.S. et al. (1976) Tissue Cell 8, 125–145).
Verfahren zur Reinigung des menschlichen endothelialen ACE sind schon beschrieben worden (vor allem in BULL, H.G. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 2963–2972; HOOPER, N.M. et al. (1987) Biochem. J. 247, 85–93), und einige Peptidsequenzen des endothelialen ACE tierischen Ursprungs sind veröffentlicht worden (BERNSTEIN, K.E. et al. (1988) Kidney Int. 33, 652–655; HARRIS, R.B. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260, 2208–2211; IWATA, K. et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1097–1103; IWATA, K. et al. (1982) Arch. Biochem. Biophys. 227, 188–201; ST CLAIR, D.K. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 968–972; SOFFER, RL. et al. (1987) Clin. Exp. Hyp. A9, 229-234).
Einige Versuche der Clonierung der DNA, die das tierische ACE codiert, wurden ausgehend von zwei an ACE reichen Organen, den Nieren und den Lungen, durchgeführt, aber keine vollständige Nucleinsäure, die das tierische ACE codiert, wurde jedoch beschrieben; nur einige Fragmente einer solchen Nucleinsäure wurden beschrieben (DELUCA-FLAHERTY, C. et al. (1987) Int. J. Peptide Protein Res. 29, 678–684; BERNSTEIN, K.E. et al. (1988), 7. Biol. Chem. 263, 11021–11024). Die Mengen an Messenger-RNA (mRNA), die das ACE codiert, sind wahrscheinlich in diesen Organen für eine leichte Clonierung einer komplementären DNA (cDNA) dieser mRNA zu gering.
Die Clonierung der DNA, die das ACE menschlicher endothelialer Zellen codiert, wurde zum ersten Mal von den Autoren des vorliegenden Anspruchs durchgeführt; die vollständige Nucleotidsequenz der DNA, die das endotheliale ACE codiert, sowie ihre Aminosäuresequenz sind im Artikel von SOUBRIER, F. et al. beschrieben, der in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 9386–9390, erschienen ist.
Eine enzymatische Aktivität vom Typ des ACE wurde auch in menschlichen und tierischen Hoden nachgewiesen (LANZILLO, J.J. et al., J. Biol. Chem. 260, S. 14938–14944 (1985)). Außerdem haben Lanzillo et al. auch die Identifikation von zwei Formen des ACE in menschlichen Hoden berichtet (Biochem. Biophys. Res. Commun. 12P, S. 457–63 (1985)). Die Formen besitzen Molekulargewichte von 140.000 und 90.000 Da und waren gegenseitig in einem Verhältnis von 1 : 4 vorhanden (Lanzillo et al., Chemical Abstracts 102(23), S. 265 (1985), N°200077 s). Die zwei Formen des testikulären ACE waren ähnlich, was den katalytischen Gesichtspunkt betrifft, aber sie unterschieden sich in einem immunologischen Gesichtspunkt.
Aber die Struktur des ACE der menschlichen Hoden (oder noch durch den Begriff testikuläres ACE bezeichnet) ist bis heute nicht bekannt; und keine DNA-Sequenz, die dieses testikuläre ACE codiert, wurde bis jetzt beschrieben. S.N. ROY et al. behaupten 1988 in einem Artikel in Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 678–684, Clone isoliert zu haben, aber sie geben keine Sequenz der Clone an.,
Die vorliegende Erfindung hat genau die Clonierung und die Sequenzierung der Nucleinsäure zum Gegenstand, die das menschliche testikuläre ACE codiert; diese Arbeit wurde ausgehend von zwei Banken zur mRNA komplementärer DNA, die von menschlichen Hoden stammten, und Nucleotidsonden, die dem endothelialen ACE entsprechen, durchgeführt. Die für die Clonierung und die Sequenzierung der Nucleinsäure gemäß der Erfindung verwendeten Techniken werden in der detaillierten Beschreibung der Erfindung genauer beschrieben werden.
Es wird sich im folgenden auf die Figuren bezogen, in denen:
– die 1 die Nucleinsäure sowie das von ihr abgeleitete Polypeptid, das dem menschlichen testikulären ACE entspricht, darstellt;
– die 2 die entsprechenden Positionen der Nucleinsäuren der vier Clone darstellt, die zur Bestimmung der Nucleinsäure, die das menschliche testikuläre ACE codiert, verwendet werden.
Eine eingehende Untersuchung der Nucleinsäure der Erfindung sowie des davon abgeleiteten Polypeptids, das dem menschlichen testikulären ACE entspricht, führt zu folgenden Beobachtungen:

– die zusammengesetzte Sequenz der cDNA des testikulären ACE ist 2477 Nucleotide lang, begrenzt durch die Nucleotide, die den Positionen 1 und 2477 der 1 entsprechen. Die Nucleotidsequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 2224 der 1 befinden, enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid von 732 Aminosäuren codiert. Diese Nucleotidsequenz besteht aus einer DNA-Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die den Positionen 29 und 91 der 1 entsprechen, die ein Peptidsignal von 21 Aminosäuren codieren kann, und aus einer DNA-Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 92 und 2224 der 1 befinden, die ein reifes Protein von 711 Aminosäuren codieren kann;
– die Nucleotidsequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 228 und 2224 der 1 befinden, ist identisch zu der, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 1944 bis 3940 befinden, die die letzten 665 Aminosäuren des menschlichen endothelialen ACE codieren, und ist in der 2 des vorstehend erwähnten Artikels von SOUBRIER et al. dargestellt;
– die Nucleotidsequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 befinden, die die ersten 67 Aminosäuren des testikulären Präenzyms (oder Vorläufers des testikulären Enzyms) codieren, und genauer die Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 92 und 229 befinden, die die ersten 46 Aminosäuren des reifen testikulären Enzyms codieren, sind besonders spezifisch für das testikuläre ACE;
– das Polypeptid, umfassend eine His-Glu-Met-Gly-His-Sequenz, die den Aminosäuren entspricht, die sich in den Positionen 414-bis 418 der 1 befinden, kann einen Teil des aktiven Zentrums des testikulären ACE bilden. Die vorliegende Erfindung betrifft also die ganze Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie die ganze oder einen Teil der Nucleotidsequenz der 1 umfasst, wobei dieser Teil selbst 15 bis 201 Nucleotide der Nucleotidsequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 der 1 befinden, umfasst, und dass sie ein Polypeptid codiert,
– das von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern erkannt wird, die spezifisch das ganze Peptid ausgehend von der Peptidsequenz, begrenzt durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 bis 67 der 1 befinden, erkennen,
– und das gegebenenfalls Angiotensin I und/oder die Kinine, vor allem Bradykinin, hydrolysieren kann. Der vorliegende Anspruch beschreibt außerdem eine Nucleinsäure, die sich von der vorhergehenden in ihrer Nucleotidsequenz nur durch Substitutionen von Nucleotiden, die sich nicht in der Modifikation der Aminosäuresequenz des Polypeptids auswirken, unterscheidet, unter Bedingungen, die geeignet sind, dass es seine vorstehend erwähnten Eigenschaften verliert.

Mitten in der DNA-Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 bis 2224 der 1 befinden, und die das menschliche testikuläre Prä-ACE (oder Pro-Enzym) von 732 Aminosäuren codieren, stellen die ersten N-terminalen 21 Aminosäuren das Peptidsignal dar, und die verbleibenden 711 Aminosäuren stellen das reife menschliche testikuläre ACE dar.
Die Erfindung betrifft auch die ganze Nucleinsäure, die die DNA-Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 92 und 2224 der 1 befinden, umfasst und das reife menschliche testikuläre ACE codiert.
Unter den Nucleinsäuren gemäß der Erfindung führt man vor allem die an, die eine DNA-Sequenz umfasst, die sich einerseits zwischen einem Nucleotid, das sich zwischen den Positionen 1 bis 92 befindet, und andererseits einem Nucleotid, das sich zwischen den Positionen 229 bis 2224 der 1 befindet, erstreckt.
Die Erfindung hat genauer die ganze Nucleinsäure zum Gegenstand, umfassend den Teil der Nucleotidsequenz der 1, der spezifisch für das testikuläre ACE ist, nämlich die ganze Nucleinsäure, die die Nucleotidsequenz umfasst, die sich einerseits zwischen dem Nucleotid, das sich in der Position 29 befindet, und andererseits dem Nucleotid, das sich in der Position 229 der 1 befindet, erstreckt, oder die ganze Nucleinsäure, die eine von letzterer abgeleitete Sequenz umfasst.
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung auch:

– die ganze Nucleinsäure, umfassend eine DNA-Sequenz von etwa 15, bevorzugt 45, bis 201 Nucleotiden, abgeleitet von der Nucleinsäuresequenz, die sich zwischen dem Nucleotid, das sich an der Position 29 befindet und dem Nucleotid, das sich an der Position 229 der 1 befindet, erstreckt,
– die ganze Nucleinsäure, umfassend eine DNA-Sequenz von etwa 15, bevorzugt 45, bis 135 Nucleotiden, abgeleitet von der Nucleinsäuresequenz, die sich zwischen dem Nucleotid an der Position 92 und dem Nucleotid, das sich an der Position 229 der 1 befindet, erstreckt.

Der Anspruch beschreibt auch die Nucleinsäuren, die sich von den vorstehend erwähnten ableiten, und deren Nucleotidsequenzen in den durch die Degeneriertheit des genetischen Codes möglichen Grenzen verändert sind, derart dass die von diesen Nucleinsäuren codierten Polypeptide erhalten bleiben, sei es eine identische Primärstruktur, seien es ihre immunologischen und gegebenfalls enzymatischen Eigenschaften.
Solche nicht einschränkenden Modifikationen führen zum Beispiel zu Nucleinsäuren, die sich von den vorstehenden Nucleinsäuren unterscheiden:

– durch Hinzufügen und/oder
– Beseitigung eines oder mehrerer Nucleotide und/oder
– Modifikation eines oder mehrerer Nucleotide.

Die Erfindung hat genauer die ganze Nucleinsäure zum Gegenstand, die die Eigenschaft besitzt, spezifisch mit der Sequenz, begrenzt durch die Nucleotide 29 bis 229, der in 1 dargestellten Nucleinsäure zu hybridisieren, vor allem unter den nachstehend definierten Bedingungen:

– Denaturierung der Nucleinsäure (da sie in der Form doppelsträngiger DNA vorliegt), die mit der der 1 hybridisieren kann, vor ihrer Fixierung auf dem nachstehend definierten Träger durch Behandlung mit Hilfe einer alkalischen Lösung (0.5 M NaOH), gefolgt von einem Wechsel in einen neutralen pH-Wert.
– Prähybridisierungsbehandlung des Trägers (Nitrocellulosefilter oder Nylonmembran), auf dem die Nucleinsäure fixiert ist, die mit der der 1 hybridisieren kann, bei 50°C für 3 Stunden mit einer Lösung, die die folgende Zusammensetzung besitzt: 25 mM KPO₄, pH 7,4; 5 × SSC; 5 × Denhardt's; 50 μg/ml ultrabeschallte Lachssperma-DNA; 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS oder NaDod S0₄ ),
– Ersetzen der Prähybridisierungslösung, die mit dem Trägerin Kontakt ist, durch eine Pufferlösung, die eine identische Zusammensetzung mit der vorstehend angegebenen Prähybridisierungslösung hat (plus gegebenenfalls 10% Dextran), und die die Nucleinsäure der 1 sowie eine markierte Sonde, vor allem radioaktiv markiert, und vorher durch eine Behandlung bei 90°C für 3 Minuten denaturiert, enthält,
– Inkubation für 12 Stunden bei 60°C,
– aufeinanderfolgende Waschschritte mit den folgenden Lösungen:
– 2 × SSC, zweimal für 30 Minuten bei 60°C,
– 1 × SSC, 0.1% SDS ein- bis zweimal für 15 Minuten bei 65°C.

Man sollte sich erinnern, dass die Zusammensetzung der Denhardt-Lösung die folgende ist: 1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% BSA (Rinderserumalbumin), und dass 1 × SSC eine Lösung mit 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat, pH 7 ist.
Die Erfindung betrifft auch die ganze Nucleinsäure, die die Eigenschaft besitzt, spezifisch mit der Sequenz, begrenzt, durch die Nucleotide 29 bis 229 der Nucleinsäure der 1, unter nicht-stringenten Bedingungen zu hybridisieren, die die wesentlichen Eigenschaften der vorstehend definierten stringenten Bedingungen wiederaufnehmen, mit Ausnahme, was die Temperatur betrifft, die unter nicht-stringenten Bedingungen bei 40°C liegt, und den aufeinanderfolgenden Waschschritten, die unter nicht-stringenten Bedingungen mit 2 × SSC mit oder ohne SDS zweimal bei 45°C für 15 Minuten durchgeführt werden, und die darüber hinaus die Eigenschaft besitzt, ein Polypeptid zu codieren; wobei dieses Polypeptid:

– von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern erkannt wird, die die Peptidsequenz, begrenzt durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 bis 67 der 1 befinden, spezifisch erkennen,
– und gegebenenfalls Angiotensin I und/oder die Kinine, vor allem Bradykinin, hydrolysieren kann.

Der vorliegende Anspruch beschreibt auch die ganze Nucleinsäure, die mit den Nucleinsäuren hybridisieren kann, die sich von der der 1 ableiten, wie die vorstehend definierten oder ihre komplementären Sequenzen, vor allem unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen.
Die Erfindung betrifft auch die Nucleotidsonden, die mit dem ganzen Fragment der Nucleinsäure der 1, wie vorstehend definiert, sowie mit der Messenger-RNA, die das testikuläre ACE codiert, vor allem unter den vorstehend definierten Hybridisierungsbedingungen, hybridisieren können, oder ihre komplementären Sequenzen.
Es versteht sich von selbst, dass die vorstehend definierten stringenten oder nichtstringenten Hybridisierungsbedingungen bevorzugte Bedingungen zur Hybridisierung darstellen, aber keineswegs einschränkend sind und verändert werden können, ohne deswegen die Eigenschaften der Erkennung und Hybridisierung der Sonden und vorstehend erwähnten Nucleinsäuren zu beeinflussen.
Die Salz- und Temperaturbedingungen, während der Hybridisierung und des Waschens der Membranen, können im Sinne einer stärkeren oder schwächeren Stringenz verändert werden, ohne dass der Nachweis der Hybridisierung beeinflusst wird. Zum Beispiel ist es möglich, einen variablen Prozentsatz Formamid hinzuzufügen, um die Temperatur während der Hybridisierung zu senken.
Die Erfindung beschreibt auch das Polypeptid der 1, das dem menschlichen testikulären ACE entspricht, sowie alle Polypeptide, die von den vorstehend erwähnten DNA-Fragmenten, abgeleitet von der Nucleinsäure der 1, codiert werden, die von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern erkannt werden können, die spezifisch das ganze Peptid erkennen, das sich von der Peptidsequenz ableitet, begrenzt durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 bis 67 der 1 befinden, und genauer der, die durch die Aminosäuren begrenzt ist, die sich in den Positionen 22 bis 67 der 1 befinden, und gegebenenfalls eine enzymatische Aktivität vom Typ des testikulären ACE besitzen kann.
Unter den vorstehend erwähnten, im Anspruch beschriebenen Polypeptiden, unterscheidet man vor allem:

– das Polypeptid, das sich zwischen den Aminosäuren, die den Positionen 1 und 732 der 1 entsprechen, erstreckt;
– das Polypeptid, das sich zwischen den Aminosäuren, die den Positionen 22 und 732 entsprechen, erstreckt und die folgenden Peptide, die Gegenstand der Erfindung sind:
– das Polypeptid, dessen Peptidsequenz durch die Aminosäuren, die sich in Positionen 1 und 67 der 1 befinden, begrenzt ist,
– das Polypeptid, dessen Peptidsequenz durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 22 und 67 befinden, begrenzt ist,
– das Polypeptid, charakterisiert durch die Peptidsequenz von etwa 5 bis 67 Aminosäuren, abgeleitet von der Peptidsequenz, die durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 und 67 der 1 befinden, begrenzt ist,
– das Polypeptid, charakterisiert durch die Peptidsequenz von etwa.5 bis. 45 Aminosäuren, abgeleitet von der Peptidsequenz, die durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 22 und 67 der 1 befinden, begrenzt ist.

Die vorangehenden Polypeptide können demnach verändert werden, so dass sie die vorstehend definierten biochemischen oder immunologischen oder pharmakologischen Eigenschaften behalten.
Polypeptide im Rahmen der Erfindung können sich zum Beispiel und auf nichteinschränkende Art von den vorstehend definierten Polypeptiden unterscheiden:

– durch Hinzufügen und/oder
– Beseitigen einer oder mehrerer Aminosäuren und/oder
– Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren unter dem Vorbehalt, dass die vorstehend angezeigten biochemischen oder immunologischen oder pharmakologischen Eigenschaften erhalten bleiben.

Gegebenenfalls betrifft die Erfindung ein Polypeptid wie die vorstehend erwähnten, wobei das Polypeptid an Rinderserumalbumin, an KLH oder LPH (siehe nachstehend) gekoppelt ist.
Man versteht, dass der Fachmann die Fähigkeit besitzt, die Polypeptide zu identifizieren, ja sogar auszuwählen, die kürzere Sequenzen besitzen, die im Rahmen der Endung enthalten sind. Als eines der allgemeinen Mittel, die es ihm erlauben, zu dieser Identifizierung zu gelangen, erwähnt man zum Beispiel die Behandlung des Polypeptids der 1 mit einer Protease, die das vorstehend erwähnte Polypeptid an einer ausgewählten Peptidstelle spaltet, sei es in einem N-terininalen Bereich, sei es in einem C-terminalen Bereich, gefolgt von der Abtrennung des N-terminalen Fragments oder des C-terminalen Fragments vom Rest des Polypeptids, wobei dieser „Rest" dann auf seine Eigenschaften getestet wird, von einem monoclonalen oder polyclonalen Antikörper erkannt zu werden, der gegen ein Peptid gerichtet ist, das von der Peptidsequenz abgeleitet ist, die durch die Aminosäuren begrenzt wird, die sich in den Positionen 22 bis 67 der 1 befinden, und, gegebenenfalls, auf seine enzymatische Aktivität gegen Angiotensin und/oder Bradykinin. Im Fall einer positiven Antwort hätte man dadurch begründet, dass das N-terminale oder C-terminale Fragment keine bedeutende Rolle spielt, wenn es nicht für die Ausprägung der immunologischen und/oder enzymatischen Eigenschaften des Polypeptids wichtig ist. Der Vorgang kann eventuell wiederholt werden, indem man eine Protease verwendet, die eine andere spezifische Stelle in der Nähe eines N-terminalen oder C-terminalen Endes des verbleibenden Polypeptids erkennen kann. Der Verlust der immunologischen und/oder enzymatischen Eigenschaften des längeren Fragments, von dem es abgeleitet ist, durch das kleiner erkannte Polypeptid kann zu der Hypothese führen, dass das letzte abgetrennte Fragment eine bedeutende Rolle in der Ausprägung der enzymatischen Eigenschaften des Polypeptids der 1 spielte.
Eine andere Variante, einfacher als die vorangegangene, zur Detektion der Bereiche des testikulären ACE, die für ihre Ausprägung der enzymatischen Aktivitäten wesentlich sind, kann auf enzymatischen Behandlungen einer Nucleinsäure, die das testikuläre ACE codiert, basiert werden. Diese Behandlung wird vor dem Einbau der so erhaltenen Nucleinsäure durchgeführt, von der angenommen wird, dass sie ein Polypeptid codiert, das immunologische und/oder enzymatische Aktivitäten vom Typ des testikulären ACE besitzt, in den Expressionsvektor, der für die Durchführung eines Verfahrens zur Herstellung des Polypeptids im geeigneten zellulären Wirt verwendet wird (Verfahren, das im folgenden genauer ausgeführt wird). Diese enzymatische Behandlung kann also entweder aus einer Verkürzung der Enden der anfänglichen Nucleinsäure (die zum Beispiel das Polypeptid der 1 in seiner Gesamtheit codiert) bestehen, zum Beispiel durch ein exonucleolytisches Enzym, wie Bal31, oder durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme, ausgewählt nach ihren jeweiligen Erkennungsstellen (gegebenenfalls verändert durch, gerichtete punktuelle Mutagenese) in der Sequenz der anfänglichen Nucleinsäure, oder durch Hinzufügen eines synthetischen DNA-Verbindungsfragments zwischen der Schnittstelle des Restriktionsenzyms und dem Anfang des zu exprimierenden Bereichs. Man kann so ausgehend vom 3-Ende der Messenger-RNA Sequenzen zunehmender Länge durch Ersetzen durch ein Stopcodon der Transkription beseitigen. Die gleiche Maßnahme kann am 5-Ende angewendet werden, aber es besteht die Notwendigkeit, ein Startcodon (ATG), das Signalpeptid oder die ganze andere Sequenz, die die Sekretion des Peptids erlaubt, und den offenen Leserahmen aufrechtzuerhalten.
Die erhaltene verkürzte Nucleinsäure kann also nach Einbau in den gewählten Vektor und Transformation des zellulären Wirts mit dem erhaltenen rekombinanten Vektor auf ihre Fähigkeit getestet werden, ein entsprechendes verkürztes Polypeptid zu exprimieren, das noch die vorstehend beschriebenen immunologischen und/oder enzymatischen, Eigenschaften besitzt, oder im Gegensatz zu die Sequenzen, die eine wichtige, wenn nicht essentielle Rolle in der Ausprägung der immunologischen und/oder enzymatischen Eigenschaften des testikulären ACE spielen, diese nicht mehr besitzt, daher die Möglichkeit, wie in der vorhergehenden Variante, diese mitten im Polypeptid der 1 zu identifizieren.
Die Erfindung beinhaltet auch die ganze rekombinante Nucleinsäure, die das ganze DNA-Fragment des vorstehend beschriebenen Typs enthält, das das menschliche testikuläre Prä-ACE oder das reife menschliche testikuläre ACE oder außerdem das ganze Polypeptid codiert, das eine immunologische und/oder enzymatische Aktivität vom Typ des testikulären ACE besitzen kann, verbunden mit einem Promotor und/oder Terminator der Transkription, der von den Polymerasen der Wirtszelle, in die die rekombinante Nucleinsäure eingeführt werden kann, erkannt wird.
Die Einführung der rekombinanten Nucleinsäure in die Wirtszelle wird vorteilhafterweise mit Hilfe von Vektoren, insbesondere vom Plasmidtyp, durchgeführt, die sich in der Wirtszelle replizieren und dort die Expression der das Enzym codierenden Sequenz erlauben können.
Die rekombinante Nucleinsäure kann auch mit Hilfe eines viralen Vektors (rekombinanter Virus) in die Wirtszelle eingeführt werden, der die Wirtszelle infizieren kann, oder mit Hilfe eines retroviralen Vektors, der sich in das Genom der Wirtszelle integrieren und dort die Expression des Polypeptids erlauben kann, das von einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung codiert wird, wobei letztere unter der Kontrolle eines viralen oder retroviralen, in der Wirtszelle aktiven Promotors steht.
Als Beispiele für Vektoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann man den Leukämievirus vom Typ Moloney (oder M-MuLV), der die NIH 3T3-Zellen infizieren kann, oder den Baculovirus, der verwendet wird, um die Insektenzellen zu infizieren, anführen.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Herstellung menschlichen testikulären ACE oder der vorstehend erwähnten Polypeptide, die von dem testikulären ACE abgeleitet sind, das die Transformation der Wirtszellen mittels den vorstehend beschriebenen Vektoren, die Inkulturnahme der transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Medium und die Wiedergewinnung der Polypeptide, entweder direkt aus dem Kulturmedium, wenn letztere dorthin sekretiert werden (vor allem in dem Fall, in dem den betrachteten Polypeptiden eine Signalsequenz bei ihrer Synthese in der Wirtszelle vorausgeht), oder nach Lyse der Zellwand der Wirtszelle in dem Fall, in dem die Polypeptide nicht aus dieser heraus sekretiert werden, umfasst.
Die zur Durchführung des. vorstehend erwähnten Verfahrens verwendeten. Wirtszellen können prokaryotische Zellen sein, vor allem Zellen von E. coli, oder vorteilhafterweise eukaryotische Zellen, die es vor allem erlauben, Proteine in ihrer glycosylierten und reifen Form zu erhalten (Hefen, CHO-Zellen oder andere Zellen oder mit Baculovirus infizierte Insektenzellen).
Die Erfindung zielt ebenso auf ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten neuen Polypeptide durch Synthese, das entweder das schrittweise Hinzufügen ausgewählter Peptidreste mit dem Hinzufügen oder Entfernen irgendwelcher Schutzgruppen mit Amin- und Carboxylfunktionen oder das Hinzufügen ausgewählter Peptidreste, um Fragmente herzustellen, gefolgt von einem Zusammenfügen der Fragmente in einer Sequenz von geeigneten Aminosäuren mit dem Hinzufügen oder Entfernen ausgewählter Schutzgruppen umfasst.
Die Erfindung bezieht sich auch auf spezifische Antikörper, die gegen die vorstehenden Polypeptide gerichtet sind. Vor allem zielt die Erfindung auf polyclonale oder monoclonale Antikörper, die gegen die vorstehend erwähnten Peptidsequenzen gerichtet sind.
Eine Art, polyclonale Antikörper gegen ein Peptid, das von der Sequenz des testikulären ACE abgeleitet ist, zu erhalten, wird kurz nachstehend zusammengefasst:

– das Peptid, dessen minimale Größe etwa 5 bis 15 Aminosäuren beträgt, ist gekoppelt
– entweder an Rinderserumalbumin oder KLH (Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebs (Megathura crenulata), wenn das Peptid ein Cystein enthält, das auf künstliche Weise zu der natürlichen Sequenz hinzugefügt werden kann. Dieses Cystein wird zuvor durch SPDP = Ester N-Hydroxysuccinimid der (Pyridyldithio-2)-3-propionsäure aktiviert,
– oder an KLH oder LPH (Hämocyanin der Hämolymphe von Limulus polyhemas) durch das Intermediat von Benzoquinon;
– oder an LPH durch Glutaraldehyd, – oder an LPH durch Carbodiimid,
– das gekoppelte Peptid wird anschließend in ein Kaninchen im gleichen Volumen wie das Freundsche Adjuvans und in die Fußsohle der Hinterpfoten der Kaninchen injiziert. Nach der letzten Injektion wird komplettes Freundsches Adjuvans verwendet. Danach wird inkomplettes Adjuvans verwendet,
– eine Wiederholungsinjektion wird alle 3 bis 4 Wochen durchgeführt,
– zwischen jeder Injektion wird eine Blutentnahme vorgenommen, um den Antikörperfiter zu messen (der Titer an Antikörpern wird bestimmt durch Messen der Verdünnung, bei der das Peptid, das bei den Injektionen verwendet wurde und das radioaktiv markiert ist, zu 50% an den Antikörper gebunden ist).

Die vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper können mittels der Hybridomatechnik hergestellt werden, deren allgemeines Prinzip nachstehend wiederholt wird.
Zuerst impft man eines der nachstehenden Polypeptide einem ausgewählten Tier (zum Beispiel Mäuse des Typs Biozzi oder Balb/c), dessen B-Lymphocyten dann Antikörper gegen dieses Polypeptid herstellen können. Das Injektionsprotokoll umfasst zum Beispiel drei Injektionen, wobei die erste mit komplettem Freundschen Adjuvans gemacht wurde. Die Tiere können eine I.V.-Injektion des Polypeptids einige Stunden vor der Isolierung der Zellen der Ratte erhalten. Die Milzzellen des injizierten Tieres werden anschließend mit „unsterblichen" Zellen der Myelomazellinie fusioniert, gemäß des von DI PAULI beschriebenen Verfahrens (DI PAULI R., und RASCHKE, W.C. (1978), in Current topics in Microbiology and Immunology, Bd. 81, F. MELCHERS, M. POTTE, und N.L. WARMER, Herausgeber, Springer-Verlag, Berlin, 37–39), mit Hilfe von Polyethylenglycol. Die Zellen, die fusioniert sind (Hybridoma), werden anschließend wieder in Kultur genommen und in einem Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium selektioniert. Ausgehend von dem heterogenen Gemisch der so erhaltenen Zellen führt man dann eine Selektion der Zellen, die einen speziellen Antikörper herstellen und sich unbegrenzt teilen können, durch.
Die Antikörper herstellenden Hybridomen werden dann cloniert und subcloniert, am besten mittels eine Zellsortierers. Die Hybridomen werden dann wieder in das Bauchfell der Tiere, vor allem der Mäuse Balb/c; die mit dem Pristan behandelt wurden, injiziert. Die Aszites wurden darin auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, und die im Aszites vorhandenen Immunglobuline wurden auf einer Affinitätssäule gereinigt, vor allem auf Protein-A Sepharose.
Mono- oder polyclonale Antikörper können auch gegen das ganze Molekül der ACE hergestellt werden.
Unter den zur Herstellung der vorstehend erwähnten polyclonalen oder monoclonalen Antikörper verwendeten Polypeptiden erwähnt man vor allem die für das testikuläre ACE spezifischen Polypeptide, nämlich die; die durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 und 67 der 1 befinden, begrenzt werden, oder weiter die, die mindestens 5 Aminosäuren besitzen, die sich von der Peptidsequenz ableiten, die von den Aminosäuren begrenzt wird, die sich in den Positionen 1 und 67 der 1 befinden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis oder der Dosierung in vitro des ACE oder eines Produkts, das in vivo die Eigenschaften des ACE besitzt, und genauer eines Produkts, das von dem testikulären ACE abstammt, wie die vorstehend erwähnten Polypeptide, in einer biologischen Probe, die sie enthalten kann.
Ein solches Verfahren gemäß der Endung kann entweder mit Hilfe der vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper oder mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Nucleotidsonden durchgeführt werden.
Die Erfindung hat genauer die Verwendung der polyclonalen oder monoclonalen Antikörper zum Gegenstand, die ausgehend vom Polypeptid, begrenzt durch die Aminosäuren an den Positionen 1 und 67, oder dem, begrenzt durch die Aminosäuren an den Positionen 22 und 67, oder auch dem, abgeleitet von der Peptidsequenz, begrenzt durch die Aminosäuren an den Positionen 1 und 67 der 1, erhalten werden und die diese Polypeptide spezifisch erkennen, um ein Verfahren zum Nachweis oder der Dosierung in vitro des menschlichen testikulären ACE durchzuführen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nucleotidsonden, vor allem der, die mit den Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die die vorstehend beschriebenen spezifischen Polypeptide des menschlichen testikulären ACE codieren, um das vorstehend erwähnte Verfahren zum Nachweis oder der Dosierung durchzuführen.
Die vorstehend erwähnte biologische Probe wird entweder aus flüssigen Geweben, wie dem Blut, oder aus Organen entommen, wobei der letztere Typ von Probe es vor allem erlaubt, feine Schnitte an Geweben zu erhalten, auf denen die Antikörper oder die vorstehend erwähnten Sonden letztlich fixiert werden.
Das Verfahren der Dosierung gemäß der Erfindung, was über das Intermediat der vorstehend erwähnten Antikörper verläuft, umfasst insbesondere die folgenden Schritte:

– das Inkontaktbringen eines Antikörpers, der das testikuläre ACE oder ein Polypeptid, das von dem testikulären ACE gemäß der Erfindung stammt, spezifisch erkennt, mit der vorstehend erwähnten biologischen Probe unter Bedingungen, die die eventuelle Herstellung eines immunologischen Komplexes, der zwischen dem testikulären ACE oder dem davon abgeleiteten Produkt und dem vorstehend erwähnten Antikörper gebildet wird, erlauben;
– der Nachweis mit Hilfe jedes geeigneten Mittels des vorstehend erwähnten immunologischen Komplexes.

Vorteilhafterweise sind die verwendeten Antikörper zur Durchführung eines solchen Verfahrens insbesondere enzymatisch oder radioaktiv markiert.
Ein solches Verfahren gemäß der Erfindung kann vor allem nach dem ELISA-Verfahren (Enzym-gebundener Adsorptionstest) durchgeführt werden, der die folgenden Schritte umfasst:

– Fixierung einer vorher bestimmten Menge Antikörper auf einem festen Träger, insbesondere auf der Oberfläche einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte;
– Zugabe der biologischen Probe (in flüssiger Form) auf den besagten Träger;
– Inkubation für eine gewisse Zeit, ausreichend, um die immunologische Reaktion zwischen den Antikörpern und dem testikulären ACE oder dem vorstehend erwähnten davon abgeleiteten Produkt zu erlauben;
– Entfernung der nicht-fixierten Anteile der biologischen Probe und Waschen des festen Trägers (vor allem der Vertiefungen der Mikrotiterplatte);
– Zugabe eines Immunglobulins, markiert mit einem Enzym, das ein spezifisches Substrat dieses Enzyms aktivieren kann;
– Zugabe eines spezifischen Substrats der enzymatischen Aktivität, die durch die vorhergehende immunologische Reaktion freigesetzt wird;
– Nachweis mit Hilfe irgendeines geeigneten Mittels des Abbaus des Substrat durch das Enzym; und
– Korrelation der Menge der freigesetzten Enzyme mit der Konzentration menschlichen ACE, die anfänglich in der biologischen Probe vorhanden ist.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des Dosierungsverfahrens der Erfindung werden die vorstehend erwähnten Antikörper nicht markiert, und der Nachweis der zwischen den Polypeptiden und den erwähnten Antikörpern gebildeten immunologischen Komplexe wird mit Hilfe eines markierten Immunglobulins, das die Komplexe erkennt, durchgeführt.
Das Dosierungsverfahren gemäß der Erfindung kann auch mittels einer immunenzymatischen Technik durchgeführt werden, die nach einem Kompetitionsmechanismus zwischen den Polypeptiden, die in der biologischen Probe enthalten sein können, und vorher bestimmter Mengen der gleichen Polypeptide gegenüber den vorstehend erwähnten Antikörpern erfolgt. Im letzteren Fall sind die Polypeptide der Erfindung in vorher bestimmter Menge vorteilhafterweise mit Hilfe eines enzymatischen Markers markiert.
Die Erfindung beschränkt sich in keiner Weise, auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Dosierung in vitro der Polypeptide der Erfindung, wobei die Dosierung mit Hilfe jedes anderen geeigneten immunologischen Verfahrens durchgeführt werden kann.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis oder zur Dosierung in vitro eines ACE oder eines Produkts, das in vivo die Eigenschaften des ACE besitzt, und genauer des menschlichen testikulären ACE, wobei dieses Verfahren mittels Nachweis oder Dosierung einer Nucleinsäure entsprechend dem allgemeinen genetischen Code des ganzen oder eines Teils des ACE und ausgehend von einer biologischen Probe, die die Nucleinsäure enthalten kann, durchgeführt wird. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

– das Inkontaktbringen einer vorstehend beschriebenen Nucleotidsonde mit der vorstehend erwähnten biologischen Probe unter Bedingungen, die die eventuelle Herstellung eines Hybridisierungskomplexes, der zwischen der nachzuweisenden Nucleinsäure und der Sonde gebildet wird, erlauben;
– der Nachweis mit Hilfe jedes geeigneten Mittels des vorstehend genannten Hybridisierungskomplexes.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die vorstehend erwähnte biologische Probe vor der Durchführung der Detektion so behandelt, so dass die Zellen, die sie enthalten, lysiert werden, und so dass das genomische Material, das in diesen Zellen enthalten ist, eventuell mit Hilfe von Restriktionsenzymen des Typs EcoRI, BamHI etc... fragmentiert wird, oder dass die RNAs daraus isoliert werden, vor allem gemäß des in THOMAS, P.S. (1983) Methods Enzymol. 100, 255–266, beschriebenen Verfahrens.
Vorteilhafterweise sind die Nucleotidsonden der Erfindung markiert, vor allem durch Einbau eines (oder mehrerer) Nucleotide, entweder radioaktiver oder an ein Hapten gekoppelter, was ihre Detektion durch einen Antikörper erlaubt, wobei letzterer mit einem Enzym verbunden ist, dessen Aktivität leicht nachgewiesen werden kann (zum Beispiel alkalische Phosphatase). Die DNAs oder RNAs, die von der biologischen Probe abgeleitet sind, werden auf einem geeigneten Träger fixiert, vor allem auf einem Nitrocellulosefilter oder einem anderem, zum Beispiel einer Nylonmembran; auf die anschließend die vorstehend erwähnten Sonden zugegeben werden.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Art der Durchführung des vorstehend erwähnten Verfahrens der Erfindung werden histologische Schnitte ausgehend von der vorstehend erwähnten biologischen Probe angefertigt, und die Nucleotidsonden der Erfindung werden direkt mit den histologischen Schnitten zum Nachweis der Nucleinsäuren der Erfindung durch in situ-Hybridisierung in Kontakt gebracht.
Die Erfindung betrifft auch die Anwendung des Detektionsverfahrens oder der Dosierung des vorstehend erwähnten testikulären ACE für in vitro-Diagnostik von spezifischen Pathologien der Hoden (insbesondere der Keimzellen), vor allem von Tumoren der Hoden (auch Seminome genannt), der Reifung von männlichen Keimzellen, von Hypofertilität und männlicher Sterilität.
Im Rahmen der Diagnostik der Hypofertilität und der männlichen Sterilität wird das vorstehend erwähnte Verfahren vorteilhafterweise ausgehend von Sperma oder von Keimzellen oder von Samenplasma, isoliert aus Sperma, oder ausgehend von testikulärer Biopsie durchgeführt.
Die Endung hat auch zum Gegenstand notwendige Bestandteile oder Kits zur Durchführung der Detektionsverfahren oder der vorstehend erwähnten Dosierung in vitro.
Als Beispiel umfassen solche Kits vor allem:

– eine bestimmte Menge eines der vorstehend erwähnten polyclonalen oder monoclonalen Antikörper, die zu einer spezifischen immunologischen Reaktion mit dem testikulären ACE oder mit einem der Polypeptide, die sich von dem testikulären ACE gemäß der Erfindung ableiten, führen können;
– und/oder eine bestimmte Menge des testikulären ACE oder eines Polypeptids, das zu einer immunologischen Reaktion mit den vorstehend erwähnten Antikörpern führen kann;
– vorteilhafterweise ein geeignetes Medium zur Bildung einer immunologischen Reaktion zwischen dem ACE oder den Polypeptiden der Erfindung und den vorstehend erwähnten Antikörpern;
– vorteilhafterweise Reagenzien, die den Nachweis der immunologischen Komplexe erlauben, die bei der vorstehend erwähnten immunologischen Reaktion gebildet werden.

Im Rahmen der Durchführung eines Detektionsverfahrens in vitro, das Nucleotidsonden verwendet, umfassen die verwendeten Kits zum Beispiel:

– einte bestimmte Menge einer der vorstehend erwähnten Nucleotidsonden, die zu einer Hybridisierungsreaktion mit einer der vorstehend erwähnten Nucleinsäuren führen können, die das testikuläre ACE oder. ein Polypeptid codieren, das sich von dem testikulären ACE gemäß der Erfindung ableitet;
– vorteilhafterweise Reagenzien, die den Nachweis der Hybridisierungskomplexe erlauben, die bei der vorstehend erwähnten Hybridisierungsreaktion gebildet werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Polypeptids der 1 oder des ganzen geeigneten Peptidfragments, das sich von letzterem ableitet, zum Entwurf neuer Inhibitoren des menschlichen ACE, wirksamer und/oder spezifischer für letzteres, als es die aktuellen Inhibitoren des ACE sind.
Die Erfindung hat auch zum Objekt ein Detektions- oder. Dosierungsverfahren eines Inhibitors des ACE oder der Quantifizierung seines Inhibitionspotentials, das das Inkontaktbringen des Polypeptids der 1 oder des ganzen Peptidfragments, das sich von letzterem ableitet und eine enzymatische Aktivität vom Typ des ACE besitzt, mit dem Inhibitor und die Bestimmung der Dissoziatioriskonstante [Ki] für diese Inhibitoren und der notwendigen Konzentration zu einer 50%igen Hemmung [IC₅₀] des Enzyms umfasst.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Polypeptids der 1 oder des ganzen Fragments des letzteren, wie vorstehend beschrieben, das die Kinine, vor allem Bradykinin, hydrolysieren kann, zur Behandlung von inflammatorischen oder infektiösen Krankheiten, der akuten Pankreatitis und allgemeiner von Krankheiten, in denen eine Freisetzung von Kininen im Organismus eine pathogene Rolle spielen kann.
Daher betrifft die Endung spezieller pharmazeutische Zusammensetzungen zur . Behandlung der vorstehend angezeigten Krankheiten, gekennzeichnet durch Assoziation des ganzen oder eines Teils des Polypeptids der 1, das die Kinine, vor allem Bradykinin, hydrolysieren kann, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die vorliegende Endung hat ebenso zum Gegenstand die Verwendung von Nucleotidsonden der Erfindung, die mit dem verantwortlichen Gen der Expression des menschlichen testikulären ACE unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen hybridisieren können, zur Bestimmung verschiedener allelischer Formen des vorstehend erwähnten Gens.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand die ganze Nucleotidsequenz von etwa 15 bis etwa 30 Nucleotiden, die sich von, der Nucleotidsequenz der 1 ableitet, oder eine komplementäre Sequenz der letzteren oder auch eine Sequenz von etwa 15 bis 30 Nucleotiden, die mit der Sequenz von etwa 15 bis 30 Nucleotiden, abgeleitet von der 1, (unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen) hybridisieren kann, und die Verwendung solcher Sequenzen als Primer, die die spiegelbildliche Amplifikation der ganzen oder eines Teils der Nucleotidsequenz der 1 erlauben, vor allem gemäß des Amplifikationsverfahrens, das in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 86/302.298.4 vom 27.03.1986 beschrieben wird.
Diese Oligonucleotidprimer sind besonders nützlich im Rahmen der Synthese des testikulären ACE durch den Fachmann der Genetik, wie die vorstehend beschriebene, in der den vorstehend beschriebenen verschiedenen Schritten ein Amplifikationschritt des Gens, das das testikuläre ACE codiert, vor dem Transformationschritt der Wirtszellen vorausgeht.
Die Erfindung betrifft auch ein Detektionsverfahren in vitro der mRNA, die das testikuläre ACE codiert, wie vorstehend beschrieben, das einen vorhergehenden Schritt der Amplifikation der ganzen oder eines Teils dieser mRNA (oder die Amplifikation der DNA-Kopie der RNA, die das testikuläre ACE codiert) umfasst, gegebenenfalls aus anderen zellulären Bestandteilen isoliert, mit Hilfe eines oder mehrerer Primerpaare, wie vorstehend definiert.
In diesem Sinn hat die Erfindung ebenso zum Gegenstand diagnostische Kits, wie vorstehend beschrieben, und die auch mindestens ein vorstehend erwähntes Primerpaar enthalten, wobei diese Primerpaare die Kopienzahl der nachzuweisenden Nucleinsäure in Anwesenheit einer geeigneten Polymerase und geeigneter Mengen der 4 verschiedenen Desoxynucleotidtriphosphate, dATP, dGTP, dCTP und dTTP, amplifizieren können.
Ergänzende Charakteristika der Erfindung werden noch im Laufe der folgenden Beschreibung der Clonierung der das menschliche testikuläre ACE codierenden Nucleinsäure sowie der für die Clonierung verwendeten Sonden erscheinen, wobei sich versteht, dass diese Beschreibung nicht derart verstanden werden darf, dass sie die Reichweite der Ansprüche einschränkt.
I – SEQUENZIERUNG DER KOMPLEMENTÄREN DNA DES MENSCHLICHEN TESTIKULÄREN ACE
Eine cDNA-Bank von menschlichen Hoden, geprimt mit Oligo(dT), hergestellt im Phagen λgt11 (Clontech Laboratories Inc.), wurde mit der nachstehend beschriebenen Sonde durchsucht.
Die Hybridisierungen mit den Phagen wurden nach dem Verfahren von Benton WD und Davis RW, Science (WASHINGTON) 1977, 196, 180–182 durchgeführt. Genauer wurden die Hybridisierungen in einer Lösung, bestehend aus 6 × SSC (1 × SSC entspricht NaCl 150 mM, Natriumcitrat- 15 mM), 0,1% NaDodSO₄; NaPO₄-Puffer 50 mM bei pH 6,8, 0,1 mg/ml denaturierter Lachssperma-DNA, bei 65°C durchgeführt.
Die als Sonde verwendete Sequenz ist im Bacteriophagen λ19–22 gehalten und stellt die letzten 3248 Nucleotide der komplementären DNA-Sequenz dar (Position 691 bis 4024), wie im vorstehend erwähnten Artikel von SOUBRIER F. et al. beschrieben. Sie wurde ausgewählt, da sie mit der Messenger-RNA des ACE im menschlichen Hoden hybridisiert. Die clonierte Sequenz der DNA des endothelialen ACE wurde als Sonde verwendet, mittels statistischer Markierung mit Hilfe der DNA-Polymerase I von E. coli, und Oligonucleotidprimern, gemäß des von FEINBERG AP et al. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13, beschriebenen Verfahrens. Unter Verwendung von alpha-[³²P]-Desoxycytidintriphosphat mit einer spezifischen Aktivität von 3000 Curie/mmol besitzt die Sonde eine spezifische Aktivität von 2 bis 8 × 10⁹ cpm/μg DNA. Die Konzentration der radioaktiven Sonde in der Hybridisierungslösung der Filter beträgt 10⁶ cpm/ml. Die Filter wurden anschließend unter Bedingungen hoher Stringenz bei 68°C für 30 Minuten gewaschen (letzter Waschschritt in O,1 × SSC, 0,1% NaDodSO₄). Das Durchsuchen von 2 × 10⁶ Clonen der Bank hat erlaubt, 17 positive Clone zu isolieren. Unter ihnen wurden zwei positive Clone isoliert. Die in die rekombinanten Phagen eingefügten DNA-Fragmente wurden gereinigt und in die EcoRI-Stelle des pBluescript-Plasmids (Stratagene) eingefügt. Die Sequenz der Insertionen wurde entweder direkt auf der doppelsträngigen DNA der Plasmide oder über Isolierung einzelsträngiger DNA durch Infektion der Kulturen mit dem Helferphagen KO7 erhalten.
Die Bestimmung der Nucleotidsequenz. dieser Clone wurde mittels des Verfahrens von Sanger (SANGER, F: et al. (1977) Proc. Natl. Acad.Sci., USA 74, 5463–5467) unter Verwendung entweder der Klenow-DNA-Polymerase oder der veränderten T7-Polymerase (Sequenaee, US Biochemical) durchgeführt. Einige Bereiche wurden unter Verwendung des Desoxyinosintriphosphat (dITP) oder des Deaza-desoxyguanosintriphosphats (7-Deaza-dGTP) anstelle des Desoxyguanosintriphosphats (dGTP) sequenziert. Die Elektrophorese mit [³⁵S]dATP markierter Fragmente wurde auf einem Harnstoff-Polyacrylamidgel durchgeführt. Die Sequenzen wurden durch Synthese von dicht auf den etwa 350 Basenpaaren nebeneinanderliegenden Oligomeren bestimmt, die als verteilte Primer entlang der Sequenz dienten.
Der Clon λht10 enthält eine Sequenz einer Länge von 2217 Nucleotiden, und die sich von der Position 260 bis 2477 der Sequenz der testikulären cDNA der 1 erstreckt. Dieser Clon erstreckt sich im 3' Bereich der Messenger-RNA bis zur Polyadenylierungssequenz und umfasst eine kurze Poly(A)-Sequenz. Der Clon λht16 einer Länge von 2263 Nucleotiden entspricht einem Bereich der testikulären cDNA zwischen der Position 50 und 2313 der 1. Ein Oligomer einer Länge von 22 Nucleotiden wurde synthetisiert und verwendet, um erneut die Bank zu durchsuchen, um Clone zu erhalten, die dem Bereich, der am weitesten 5' der Messenger-RNA liegt, entsprechen. Die Sequenz dieses Oligomers ist in der Sequenz des Clons λht16 enthalten (Position 59 bis 80). Das Oligomer wurde mit λ[³²P]Adenosintriphosphat ATP (spezifische Aktivität 5000 Curie/mmol) mit Hilfe der T4-Polynucleotidkinase markiert. Die spezifische Aktivität der Sonde ist 5 × 10⁶ cpm/pmol. Die Filter wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend ausgeführt mit Ausnahme der folgenden Veränderungen durchsucht: die Hybridisierungstemperatur war 60°C und die Waschtemperatur 65°C in einer 2 × SSC-Lösung. Das Durchsuchen erlaubte, den Clon λht341 zu isolieren, von einer Länge von 2,2 kb, der sich 5' bis zum Nucleotid 31 der testikulären cDNA des ACE erstreckt.
Um die komplementäre DNA, die dem 5'-Ende der Messenger-RNA, die das testikuläre ACE codiert, entspricht, zu erhalten, wurde eine andere Bank bestimmter cDNAs unter Verwendung von 5 μg RNA hergestellt, isoliert aus menschlichen testikulärem Gewebe, erhalten bei einem chirurgischen Eingriff. Die komplementäre DNA-Bank wurde gemäß des Verfahrens von Gübler und Hoffman (Gene (1983) 25, 263–269) unter Verwendung von zwei Primern hergestellt. Einerseits ein spezifischer Primer der Messenger-RNA des ACE, bestimmt durch die vorstehend erhaltene Sequenz der Clone. Es handelt sich um ein Oligomer von 17 Basen (ATH17), komplementär zu einer Sequenz, die an der Position 228–244 der 1 liegt. Der zweite Primer entspricht den Oligo(dT)12-18meren (Pharmacia). Die doppelsträngigen komplementären DNAs wurden synthetisiert, anschließend in den Phagen λgt10, gespalten von dem Enzym EcoRI, gemäß des Verfahrens von Koenig et al. (Koenig M. et al. (1987) Cell 50, 509–517) eingefügt. Die rekombinanten Phagen (1 × 10⁶ rekombinante Phagen) wurden mit Hilfe des Oligomers TH16, wie vorstehend markiert, durchsucht. Die Durchsuchungsbedingungen der Bank sind identisch mit den vorstehend mit der gleichen Sonde beschriebenen. Unter den erhaltenen positiven Clonen wurde der Clon λht221, von einer Länge von 244 Basenpaaren, sequenziert. Er enthält den Teil, der am weitesten 5' der Messenger-RNA, die das testikuläre ACE codiert, liegt.
Die Sequenz der testikulären Messenger-RNA, wie sie von der zusammengesetzten Nucleotidsequenz der testikulären cDNA, erhalten ausgehend von 4 Clonen, abgeleitet werden kann, ist 2477 Nucleotide lang. Sie stellt eine Nucleotidsequenz dar, die zu der der endothelialen Messenger-RNA an 3' der Position 228 der testikulären cDNA identisch ist. An 5' dieser Position unterscheiden sich die zwei Messenger-RNAs, die testikuläre und endotheliale, und die bestimmte spezifische testikuläre Sequenz ist 228 Nucleotide lang. Nach dem ersten Codon ATG bis zum Stopcodon gibt es einen offenen Leserahmen, der 732 Aminosäuren codiert. Die Analyse der von der Nucleotidsequenz abgeleiteten Peptidsequenz zeigt, dass es ein Peptid nach dem Start-Methionin der Transkription gibt, das die Eigenschaften eines Signalpeptids besitzt, und unter Verwendung des von VON HEIJNE beschriebenen Programms (Nucleic Acids Research (1986) 14, 4683–4690) zur Vorhersage von Spaltungsstellen eines Signalpeptids scheint die Spaltungsstelle des Signalpeptids zwischen der Aminosäure an Position 21 und der an Position 22 zu, liegen. Auf diese. Signalsequenz folgend ist die spezifische Peptidsequenz des testikulären ACE sehr reich an Serin und Threonin, mögliche Glycosylierungsstellen, und diese Art der Sequenz ruft gruppierte O-Glycosylierung hervor.
Die enzymatischen Eigenschaften des testikulären Enzyms, sind identisch zu denen des endothelialen Enzyms, besonders was den Km, die Vmax und Kcat gegen Angiotensin I entspricht, und der Vergleich seiner Struktur mit der des endothelialen Enzyms liefert interessante Informationen, die die Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität im ACE-Molekül betreffen. Tatsächlich besteht das endotheliale Enzym aus zwei großen Domänen, sehr homolog untereinander. Jede dieser Domänen enthält eine kurze Consensus-Aminosäuresequenz des aktiven Zentrums der Zink-Metallopeptidasen, wie das Thermolysin, die Kollagenase oder die neutrale Endopeptidase. Das testikuläre Converting-Enzym enthält nur die carboxyterminale Domäne der endothelialen ACE, was anzuzeigen scheint, dass diese Domäne allein die Strukturen trägt, die für die enzymatische Aktivität verantwortlich sind. Eine andere Hypothese wäre, dass das testikuläre Enzym in Form eines Dimers agiert, jedoch besitzt das native testikuläre Enzym des Kaninchens, getestet unter nicht-denaturierenden Bedingungen durch Dichtegradientenzentrifugation, ein deutlich unter dem der endothelialen ACE liegendes Molekulargewicht.

Claims

Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz umfasst, die das menschliche Testikel-Angiotensin-Converting-Enzym codiert, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz wie in 1 dargestellt oder aus einem Teil dieser Sequenz, wobei dieser Teil selbst zwischen 15 und 201 Nucleotide der Nucleinsäuresequenz umfasst, die begrenzt wird durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 der 1 befinden, und dass sie ein Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid: – von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern erkannt wird, die insbesondere alle von der Peptidsequenz stammenden Peptide erkennen, die von den Aminosäuren begrenzt wird, die sich in den Positionen 1 bis 67 der 1 befinden, – und, gegebenenfalls, fähig ist, das Angiotensin 1 und/oder die Kinine, insbesondere Bradykinin, zu hydrolysieren.
Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit jedem Fragment der Nucleotidsequenz der 1 hybridisiert, die spezifisch ist für das menschliche Testikel-Angiotensin-Converting-Enzym (ACE), wobei die spezifische Sequenz begrenzt ist durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 der 1 befinden, unter den folgenden stringenten Hybridisierungsbedingungen: – Denaturierung der Nucleinsäure (DNA), die geeignet ist zur Hybridisierung mit der Nucleinsäure der 1, durch Behandlung mit Hilfe einer Alkalilösung (0,5 M . NaOH), gefolgt von einer Passage bei einem neutralem pH-Wert, – Prähybridisierungsbehandlung des Trägers (Nitrocellulosefilter oder Nylonmembran), auf dem die Nucleinsäure nach 1 fixiert ist, bei 50°C über 3 Stunden mit einer Lösung, die die folgende Zusammensetzung hat: 25 mM KPO₄, pH 7,4; 5 × SSC; 5 × Denhardts; 50 μg/ml DNA von beschalltem Lachssperma; 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS oder NaDod S04 ), – Ersetzen der Prähybridisierungslösung mit Trägerkontakt durch eine Pufferlösung, die eine identische Zusammensetzung hat wie die vorstehend beschriebene Prähybridisierungslösung, (und gegebenenfalls 10% Dextran) und die die Nucleinsäure der 1 als, insbesondere radioaktiv, markierte Sonde umfasst, und die vorher durch eine Behandlung bei 90°C über 3 Minuten denaturiert wurde, – Inkubation über 12 Stunden bei 60°C, – wiederholtes Waschen mit den folgenden Lösungen: –2 × SSC, über 30 Minuten bei 60°C mit 2 Wiederholungen, –1 × SSC, 0,1% SDS 1 bis 2 Mal 15 Minuten bei 65°C.
Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit jedem Fragment der Nucleotidsequenz der 1 hybridisiert, die spezifisch für das menschliche Testikel-Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) ist, wobei die spezifische Sequenz begrenzt wird durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 der 1 befinden, unter nicht stringenten Bedingungen, wobei die essentiellen Merkmale der in Anspruch 2 definierten stringenten Bedingungen übernommen werden, außer im Bezug auf die Temperatur, die unter den nicht stringenten Bedingungen 40°C beträgt, und auf das wiederholte Waschen, das unter nicht stringenten Bedingungen mit Hilfe von 2 × SSC durchgeführt wird, mit oder ohne SDS bei 45°C über 15 Minuten mit 2 Wiederholungen, und dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid: – von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern erkannt wird, die insbesondere die Peptidsequenz erkennen, die von den Aminosäuren begrenzt wird, die sich in den Positionen 1 bis 67 der 1 befinden, – und, gegebenenfalls, fähig ist, das Angiotensin 1 und/oder die Kinine, insbesondere Bradykinin, zu hydrolysieren.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz umfasst, die von den Nucleotiden begrenzt wird, die sich in den Positionen 92 und 2224 der 1 befinden, codierend das reife ACE des menschlichen Testikels.
Nucleinsäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Sequenz, die das reife ACE des menschlichen Testikels codiert, eine DNA-Sequenz , vorausgeht, begrenzt durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 91 der 1 befinden, die wiederum ein Signalpeptid mit 21 Aminosäuren codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz umfasst, die sich erstreckt zwischen auf der einen Seite dem Nucleotid, das sich zwischen den Positionen 1 bis 92 befindet, und auf der anderen Seite dem Nucleotid, das sich zwischen den Positionen 229 bis 2224 der 1 befindet.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz von etwa 15 bis 201 Nucleotiden umfasst, die hervorgegangen ist aus der Nucleotidsequenz, die sich erstreckt zwischen dem Nucleotid, das sich in der Position 29 befindet, und' dem Nucleotid, das sich in der Position 229 der 1 befindet.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA-Sequenz von etwa 15 bis 135 Nucleotiden umfasst, die hervorgegangen ist aus der Nucleotidsequenz, die sich erstreckt zwischen dem Nucleotid, das sich in der Position 92 befindet, und dem Nucleotid, das sich in der Position 229 der 1 befindet.
Polypeptid, bestehend aus einer Peptidsequenz von 5 bis 67 Aminosäuren, die hervorgegangen ist aus der Peptidsequenz, die begrenzt wird von den Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 und 67 der 1 befinden.
Polypeptid, bestehend aus einer Peptidsequenz von 5 bis 45 Aminosäuren, die hervorgegangen ist aus der Peptidsequenz, die begrenzt wird von den Aminosäuren, die sich in den Positionen 22 und 67 der 1 befinden.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch, gekennzeichnet, dass es mit Rinderserumalbumin, KLH oder LPH gekoppelt ist.
Polypeptid, umfassend eine Peptidsequenz aus 5 bis 67 Aminosäuren, die hervorgegangen ist aus der Peptidsequenz, die begrenzt wird durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 1 und 67 der 1 befinden, dadurch gekennzeichnet, dass es an Rinderserumalbumin, KLH oder LPH gekoppelt ist.
Polypeptid, umfassend eine Peptidsequenz aus 5 bis 45 Aminosäuren, die hervorgegangen ist aus der Peptidsequenz, die begrenzt wird durch die Aminosäuren, die sich in den Positionen 22 und 67 der 1 befinden, dadurch gekennzeichnet, dass es an Rinderserumalbumin, KLH oder LPH gekoppelt ist.
Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, die mit einem Promotor verbunden ist, unter dessen Kontrolle die Transkription der Sequenz durchgeführt werden kann, und gegebenenfalls eine DNA-Sequenz, die Transkriptionsterminationssignale codiert.
Rekombinanter Vektor, insbesondere ein rekombinantes Plasmid oder ein rekombinantes Virus, das in der Lage ist, eine geeignete Wirtszelle zu transformieren oder zu infizieren, insbesondere eine eukaryotische Zelle, wobei der Vektor eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, unter Kontrolle von Regulationselementen, die die Expression dieses DNA-Fragments in der Wirtszelle erlauben, insbesondere eines Promotors, der von den Polymerasen der Wirtszelle erkannt wird.
Verfahren zur Herstellung von reifem oder nicht reifem menschlichem Testikel-ACE, oder eines Polypeptids, das aus dem menschlichen Testikel-ACE hervorgegangen ist, wobei dieses Verfahren die Transformation von Wirtszellen mit Hilfe des Vektors nach Anspruch 15, die Züchtung von transformierten Wirtszellen in einem geeigneten Kulturmedium und die Gewinnung des Enzyms aus diesen Zellen oder aus diesem Kulturmedium umfasst.
Polyclonaler oder monoclonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 oder 10 gerichtet ist.
Nucleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusammengesetzt ist aus einer Nucleotidsequenz, die mit jedem Fragment der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hybridisiert, die spezifisch ist für das menschliche Testikel-ACE, wobei die spezifische Sequenz begrenzt ist durch die Nucleotide, die sich in den Positionen 29 und 229 der 1 befinden, unter den Bedingungen wie in Anspruch 2 definiert.
Nucleotidprimer, dadurch gekennzeichnet, dass er zusammengesetzt ist aus einer Folge von etwa 15 bis 30 Nucleotiden, die aus einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hervorgegangen sind, die für das menschliche Testikel-ACE spezifisch ist, wobei die spezifische Sequenz begrenzt ist von den Nucleotiden, die sich in den, Positionen 29 und 229 der 1 befinden, oder für eine komplementäre Sequenz der Letzteren.
Verfahren zur in-vitro-Erkennung oder -Bestimmung eines ACE oder eines Produktes, das in vivo die Eigenschaften des ACE und, insbesondere, des menschlichen Testikel-ACE hat, in einer biologischen Probe, die dieses enthalten kann, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – Inkontaktbringen eines Antikörpers nach Anspruch 17 mit der obengenannten biologischen Probe unter Bedingungen, die die mögliche Produktion eines immunologischen Komplexes zwischen dem ACE oder dem davon abgeleiteten Produkt und dem obengenannten Antikörper erlauben; – Nachweis des obengenannten immunologischen Komplexes.
Verfahren zur in-vitro-Erkennung oder -Bestimmung eines ACE oder eines Produktes, das in vivo die Eigenschaften des ACE und, insbesondere, des menschlichen Testikel-ACE hat, in einer biologischen Probe, die dieses enthalten kann, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – gegebenenfalls Amplifikation der Anzahl der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure mit Hilfe eines Primerpaares nach Anspruch 19, – Inkontaktbringen einer Nucleotidsonde nach Anspruch 18 mit der obengenannten biologischen Probe unter Bedingungen, die die mögliche Produktion eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der nachzuweisenden Nucleinsäure erlauben, – Nachweis des obengenannten Hybridisierungskomplexes.
Verfahren zur in-vitro-Erkennung nach Anspruch 20 oder 21, angewendet bei der in-vitro-Diagnostik im Zusammenhang mit der Reifung von männlichen Keimzellen beim Menschen, mit Fällen von Hypofertilität und Sterilität beim Mann oder auch im Bezug auf Testikeltumoren (oder Seminomen).
Kit zur Anwendung eines Verfahrens zum in-vitro-Erkennen nach den Ansprüchen 20 und 22, umfassend: – eine bestimmte Menge eines Antikörpers nach Anspruch 17, der eine Immunreaktion mit einem nachzuweisenden Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 13 hervorrufen kann; – vorzugsweise ein geeignetes Medium für die Entstehung einer Immunreaktion zwischen dem Polypeptid und den obengenannten Antikörpern; – vorzugsweise Reagenzien, die den Nachweis der Immunkomplexe erlauben, die während der obengenannten Immunreaktion zwischen dem Polypeptid und dem Antikörper gebildet wurden.
Kit zur Anwendung eines Verfahrens zum in-vitro-Erkennen nach Anspruch 21, umfassend: – gegebenenfalls mindestens ein Primerpaar nach Anspruch 19, – eine bestimmte Menge einer Nucleotidsonde nach Anspruch 18, die eine Hybridisierungsreaktion mit einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hervorrufen kann; – vorzugsweise ein zur Bildung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Nucleinsäure und der obengenannten Sonde geeignetes Medium; – vorzugsweise Reagenzien, die den Nachweis der Hybridisierungskomplexe erlauben, die während der obengenannten Hybridisierungsreaktion zwischen der Nucleinsäure und der Sonde gebildet wurden.
Zusammensetzungen zur Behandlung von entzündlichen oder infektiösen Erkrankungen, besonders von akuter Bauchspeicheldrüsenentzündung und von Erkrankungen, bei denen Kinine eine pathogene Rolle spielen, gekennzeichnet durch das Zusammengeben eines nach dem Verfahren nach Anspruch 16 erhaltenen Polypeptids mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.