DE69434612T2

DE69434612T2 - Monoklonale Antikörper gegen recombinantes Stratum Corneum chymotryptisches Enzym (SCCE)

Info

Publication number: DE69434612T2
Application number: DE69434612T
Authority: DE
Inventors: Egelrud Thorbjörn; Lennart Hansson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-20
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: CZ333595A3; DE69433280D1; BR9407015A; HU9503618D0; PL312189A1; NO955110L; AU6935294A; DE69433280T2; FI956075A0; ATE315584T1; ATE252884T1; DE69434612D1; SK158695A3; EP0703985B1; AU684518B2; SK284599B6; US5981256A; EP0703985A1; CN1128047A; FI119027B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ein Polypeptid erkennt, das in seiner aktiven Form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) abzubauen, wobei das Abbauen durch das Polypeptid durch Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und das Polypeptid:

a) eine Aminosäuresequenz hat, die eine Homologie von mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz 1–224 in SEQ ID NR:2 hat;
b) eine Aminosäuresequenz hat, aus der eine konstitutive Abfolge von 20 Aminosäuren homolog ist bis zu einem Grad von mindestens 95% mit einer Abfolge von Aminosäuren der selben Länge, ausgewählt aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz; oder
(c) eine Untersequenz des Polypeptids in a) ist, umfassend 50 bis 250 Aminosäuren.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Haut als Organ ist unter biologischen, medizinischen und kosmetologischen Gesichts-punkten von Interesse. Es gibt eine große Anzahl von Hautkrankheiten, die entweder organ-spezifisch sind, z.B. Psoriasis und Ekzeme, oder die Äußerungen eines allgemeinen Krankheitszustands sind, wie allgemeine allergische Reaktionen. Die Tatsache, daß es hautspezifische Krankheiten gibt, kann als Beweis für die Existenz molekularer Mechanismen angesehen werden, die nur bei der Haut vorkommen. Analogerweise sind Studien von hautspezifischen molekularen Vorgängen bedeutsam für das Verständnis und die Behandlung von Hautkrankheiten. Es erscheint naheliegend anzunehmen, daß einige dieser Vorgänge in der einen oder anderen Weise mit der am meisten spezialisierten Funktion der Haut zusammenhängen, nämlich der Bildung einer physikalisch-chemischen Barriere zwischen dem Körperäußeren und dem Körperinneren. Die physikalisch-chemische Hautbarriere befindet sich in der äußersten Schicht der Haut, dem Stratum corneum.
Das Stratum corneum ist die am stärksten spezialisierte Struktur der Haut. Es ist das Endprodukt des Differenzierungsprozesses der Epidermis, das heißt des geschichteten schuppigen Epithels, das den äußersten Teil der Haut bildet. Die Mehrzahl der Zellen der Epidermis besteht aus Keratinocyten in verschiedenen Differenzierungsstadien. Die untersten Keratinocyten, die Basalzellen, sitzen auf einer Basalmembran in Kontakt mit der Dermis, das heißt dem Verbindungsgewebe der Haut, und sind die einzigen zur Teilung befähigten Keratinocyten. Ständig verläßt ein Teil der Basalzellen die Basalmembran und durchläuft einen Differenzierungsprozeß, der die Zellen schließlich zu Baublöcken des Stratum corneum werden läßt. In diesem Prozeß durchlaufen die Keratinocyten eine Anzahl von adaptiven Veränderungen. Der Gehalt an Cytoskelett, das aus epidermisspezifischen Cytokeratinen besteht, steigt. Die intermediären Filamente der benachbarten Zellen werden durch eine erhöhte Anzahl von Desmosomen zu einer funktionellen Einheit zusammengefaßt. Die dramatischsten Veränderungen finden während des Übergangs von der obersten lebenden Zellschicht, dem Stratum granulosum, zum nicht lebensfähigen Stratum corneum statt, in einem Prozeß, der gewöhnlich Keratinisierung genannt wird. Kovalent kreuzgebundene Proteine werden in der Nähe der inneren Seite der Plasmamembran abgelagert und bilden eine sehr widerstandsfähige Zellhülle. Darüberhinaus wird eine lipidreiche Substanz, die aus einem keratinocytenspezifischen Zellorganell stammt, in den extrazellulären Raum sekretiert und bildet, durch die Ausbildung von Lipidlamellen, die die Zellen des Stratum corneum umgeben, die Permeabilitätsbarriere gegen hydrophile Substanzen. Schließlich verschwinden alle intrazellulären Strukturen außer den dicht gepackten Cytokeratinfilamenten.
Die Zellen des Stratum corneum, die Corneocyten, sind somit nicht lebensfähig. Das bedeutet, daß die Regulation der verschiedenen Prozesse im Stratum corneum das Ergebnis einer „Programmierung" in einem Stadium sein muß, in dem die Keratinocyten noch lebensfähig sind. Die Umschichtung der Epidermis, die sich normalerweise in etwa vier Wochen vollzieht, während derer die Zellen ungefähr zwei Wochen lang Teile des Stratum corneum sind, wird durch das Abschuppen der Zellen von der Hautoberfläche im Vorgang der Desquamation beendet. Dieser Vorgang ist ein Beispiel der „Programmierung" des Stratum corneum. Eine Vorbedingung für die Funktion des Stratum corneum als physikalisch-chemische Barriere ist, daß seine einzelnen Zellen durch mechanisch widerstandsfähige Strukturen, nämlich Desmosomen, zusammengehalten werden. Die Degradation von Desmosomen, die eine Vorbedingung für die Desquamation ist, muß so reguliert werden, daß sich ein Zellabschuppen von der Hautoberfläche ergibt, das die Neuproduktion des Stratum corneum ausgleicht, ohne die Barrierefunktion des Gewebes zu beeinträchtigen.
Störungen der Keratinisierung
Unter einer großen Zahl von pathologischen Zuständen der Haut von unterschiedlichem Schweregrad finden sich auch Störungen des Keratinisierungsvorgangs. Bei der Psoriasis han-delt es sich, zusätzlich zu einer typischen chronischen Entzündung, um Überproduktion eines unreifen Stratum corneum, was zur typischen Schuppenbildung dieser Krankheit führt. Es gibt eine Gruppe ererbter Hautkrankheiten, die durch ein verdicktes Stratum corneum gekennzeichnet sind, das zur Bildung von „Fischschuppen" führt, die sogenannten Ichthyosen. Bei einigen Ichthyosen ist die Rate der Desquamation geringer. Obwohl weniger schwer als die Ichthyosen, ist die „trockene Haut" (Xeroderma) ebenfalls durch ein Stratum corneum gekennzeichnet, von dem Corneocyten abgeschuppt werden; und zwar nicht wie unter normalen Bedingungen als einzelne Zellen oder als kleine Zellaggregate, sondern als große, makroskopisch sichtbare Schuppen. Diese Störung ist unter älteren Menschen und Atopikern, das heißt Individuen mit einer verringerten Widerstandsfähigkeit gegen Hautirritationen und einer Veranlagung zur Entwicklung einer charakteristischen Form von endogenen Ekzemen, weit verbreitet. Bei den Aknekrankheiten ist die Keratinisierung in den Gängen der Talgdrüsen gestört, was zur Bildung von Mitessern und Verstopfungen führt. Der Bildung von Mitessern folgt die entzündliche Akne, von der man annimmt, daß sie durch jene hervorgerufen wird.
Proteolytische Enzyme sind an der Keratinisierung beteiligt
Es gibt mehrere Stadien im Keratinisierungsvorgang und während der Umschichtung des Stratum corneum, in denen proteolytische Enzyme wichtige Rollen zu spielen scheinen. Mit Sicherheit muß das Verschwinden aller intrazellulären Strukturen außer den Cytokeratinfilamenten, das sich während des Übergangs von den lebensfähigen zu den verhornten Epidermisschichten vollzieht, Proteolyse beinhalten. Die Transformation von Profilaggrin in Filaggrin, ein Protein, von dem man annimmt, daß es bei dem speziellen Typ der Aggregation von Cytokeratinfilamenten während der Keratinisierung wirkt, könnte durch eine spezifische Proteinase katalysiert werden. Im Stratum corneum wird Filaggrin weiter zu Bestandteilen von niederem Molekulargewicht abgebaut, die möglicherweise als „natürliche Feuchtigkeitsspender" von Bedeutung sind. Weiterhin gibt es proteolytische Veränderungen von Cytokeratinpolypeptiden während des Keratinisierungsvorgangs. Schließlich ist es noch wahrscheinlich, daß proteolytische Vorgänge entscheidende Rollen beim Abbau intrazellulärer kohäsiver Strukturen im Stratum corneum bei Vorgängen spielen, die schließlich zur Desquamation führen.
Zellkohäsion im Stratum corneum und Desquamation. Die Rolle der Desmosomen
Die interzelluläre Kohäsion im Stratum corneum sowie in den lebensfähigen Teilen der Epidermis wird zu einem bedeutenden Teil durch Desmosomen bewirkt. Ein Desmosom besteht aus zwei symmetrischen Hälften, von denen jede aus zwei benachbarten Zellen gebildet wird. Jede desmosomale Hälfte hat einen interzellulären Teil, der an die Cytokeratinfilamente gebunden ist, und einen Teil, der aus intrazellulär und mit transmembranalen und extra-zellulären Teilen verankerten Glykoproteinen aufgebaut ist. Die extrazellulären Teile dieser Proteine, die Desmogleine, sind Adhäsionsmoleküle, und durch ihre gegenseitige Wechselwirkung im extrazellulären Raum wird eine kohäsive Struktur gebildet. Der Abbau von Desmosomen scheint im Stratum corneum der Handflächen und Fußsohlen im Vergleich zum nicht-palmo-plantaren Stratum corneum auf etwas unterschiedlichem Weg zu erfolgen. In letzterem Gewebe verschwinden etwa 85% der Desmosomen kurz nachdem die Zellen voll-ständig verhornt sind. Die verbleibenden Desmosomen, die vorzugsweise an den villibesetzten Rändern der extrem abgeflachten Zellen gelegen sind, bleiben scheinbar bis zu dem Niveau intakt, auf dem die Desquamation stattfindet. In palmo-plantarem Stratum corneum sind die Corneocyten viel weniger abgeflacht, und es kommt nicht zu einer extensiven Degradation von Desmosomen in den tieferen Schichten des Gewebes. In beiden Geweben geht die Desquamation mit desmosomaler Degradation einher. Es wurde gezeigt, daß sowohl in ichthyolytischer Haut als auch in „trockener Haut" die Zahl der Desmosomen in den oberflächennahen Schichten des Stratum corneum erhöht ist.
Interzelluläre Lipide des Stratum corneum
Der Unterschied zwischen der desmosomalen Degradation in palmo-plantarem und nicht-palmo-plantarem Stratum corneum könnte mit dem Unterschied in den Mengen extra-zellulärer Lipide in den beiden Gewebetypen zusammenhängen. Der Lipidgehalt ist in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum bedeutend höher. Demzufolge ist die Wirksamkeit dieses Gewebes als Permeabilitätsbarriere gegen Wasser und andere hydrophile Substanzen höher als die des Stratum corneum der Handflächen und Fußsohlen. Da Desmosomen ein beträchtliches Volumen einnehmen, und da intakte Desmosomen eine Ausweitung des extrazellulären Raumes verhindern, könnte die desmosomale Degradation ein Mechanismus sein, durch den mehr extrazellulärer Raum für Lipide verfügbar gemacht wird. Die extrazellulären Lipide des Stratum corneum hängen auch in mehrfacher anderer Weise mit der Desquamation zusammen. Da sie Hauptbestandteile des extrazellulären Raumes sind, steht zu erwarten, daß sie bedeutende Einflüsse auf die Aktivitäten von Enzymen haben, die an diesem Ort wirksam sind, z.B. Enzyme, die für die desmosomale Degradation verantwortlich sind. Tatsächlich wurde gezeigt, daß verschiedene Störungen des Fettstoffwechsels die wahrscheinliche Ursache für mehrere Typen von Ichthyosen sind. Es ist auch wahrscheinlich, daß Lipide selbst bis zu einem gewissen Grad zur Kohäsion der Zellen des Stratum corneum beitragen. Mehr noch, die Sekretion von Lipide in den extrazellulären Raum des Stratum corneum ist wahrscheinlich auch mit der Sekretion einer Anzahl von Enzymen verbunden. Vorläufer der Lipide sind in den oberen lebensfähigen Keratinocyten in spezifischen Organellen eingelagert. Es wurde gezeigt, daß diese sogenannten Lamellarkörperchen eine Anzahl hydrolytischer Enzyme enthalten. Man nimmt deshalb an, daß ein Enzym, das für die desmosomale Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist, möglicherweise in einer inaktiven Vorform von den Keratinocyten synthetisiert wird, in Lamellarkörperchen gelagert und während der Keratinisierung in den extra-zellulären Raum des Stratum corneum sekretiert wird, wo es aktiviert werden kann, und daß seine Aktivität neben anderen Faktoren durch die Zusammensetzung der extrazellulären Lipide weiter gesteuert wird.
Störungen der Zellkohäsion in lebensfähiger Epidermis
Es gibt eine Anzahl von Hautkrankheiten, bei denen die Kohäsion zwischen Keratinocyten und den nichtverhornten lebensfähigen Epidermisschichten beeinträchtigt ist. Diese Krankheiten sind durch ein Acantholyse genanntes Phänomen gekennzeichnet, nämlich ein Zusammenbruch der desmosomalen Kontakte zwischen ansonsten scheinbaren normaleren Keratinocyten. Wahrscheinlich wird dieser Vorgang von Proteinasen verursacht, die bisher noch nicht genau bestimmt wurden. Die Acantholyse, die, wenn sie große Bereiche erfaßt, zur Blasenbildung führen kann, ist ein Charakteristikum der Autoimmunkrankheiten Pemphigus vulgaris und Pemphigus foliaceus, des ererbten milden familiären Pemphigus (Hayley-Hayley'sche Krankheit) und der ererbten Dyskeratosis follicularis (Darier'sche Krankheit).
Die Epidermis spielt eine aktive Rolle bei immunologischen und entzündlichen Reaktionen
Zusätzlich zu ihrer Funktion als Erbauer der physikalisch-chemischen Barriere zwischen Körperinnerem und -äußerem fungiert die Epidermis auch als aktive immunologische Barriere. Die Keratinocyten haben die Fähigkeit, eine große Anzahl von Cytokinen und anderen Entzündungsbewirkern herzustellen sowie auf diese zu antworten, wodurch sie mit Zellen des immunologischen und inflammatorischen Systems kommunizieren und wechselwirken. Dies ist von großer Bedeutung bei der Verteidigung des Wirtes gegen mikrobielle Infektionen und bei der Wundheilung. Die moderne Forschung hat auch gezeigt, daß die Keratinocyten wahrscheinlich eine aktive Rolle bei vielen Entzündungskrankheiten der Haut, wie Psoriasis und Ekzeme spielen.
Epidermale Proteinasen können bei Entzündungen wichtig sein
Eines der Cytokine, das von Keratinocyten produziert wird, ist Interleukin 1 (Il-1). Es gibt zwei Formen von I1-1, Il-1α und Il-1β, die beide in der Epidermis vorkommen. Während Il-1α schon in der synthetisierten Form voll aktiv ist, wird Il-1β als inaktive 31 kD-Vorform synthetisiert. Pro-I1-1β wird durch eine spezifische Proteinase, die z.B. in Monocyten vorkommt, die aber bisher in normaler Epidermis nicht festgestellt wurde, in die aktive 17 kD-Form konvertiert. Eine Anzahl von Serinproteinasen mit chymotrypsinartiger Substratspezifität (pankreatisches Chymotrypsin und Cathepsin G aus neutrophilen Granulocyten) können jedoch auch als Pro-I1-1β-Aktivatoren dienen.
Wie von Norris (1990) vorgeschlagen, könnten die im intrazellulären Raum des Stratum corneum vorhandenen proteolytischen Enzyme unter bestimmten Bedingungen in der Lage sein, inaktive Cytokinformen in aktive Formen zu konvertieren. Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang das biologisch inaktive Pro-Interleukin-1β, von dem gezeigt wurde, daß es von Keratinocyten produziert wird (Mizutani et al., 1991). Bisher wurden keine epidermalen Enzyme mit der Fähigkeit gefunden, Pro-Interleukin-1β in aktives Interleukin-1β zu konvertieren. Da jedoch Chymotrypsin und Cathepsin G (ein chymotrypsinähnliches Enzym) die Fähigkeit haben, die Umwandlung von inaktivem rekombinantem 31 kD-Pro-Interleukin-1β in eine voll aktive 17 kD-Form zu katalysieren, ist es möglich, daß auch epidermale chymotrypsinähnliche Enzyme diese Umwandlung katalysieren könnten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der specifisch ein Enzym erkennt, das als Stratum corneum chymotryptisches Enzym (SCCE) bezeichnet wurde, und von dem man annimmt, daß es für die desmosomale Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist. In Beispiel 1 werden Hinweise darauf vorgestellt, die zeigen, daß die Zellabschuppung von der Oberfläche der verhornten Oberflächenschicht der Haut mit der Degradation desmosomaler Proteine einhergeht, und daß das dafür verantwortliche Enzym eine chymotrypsinähnliche Serinproteinase zu sein scheint, die durch sind Zinkionen gehemmt werden kann.
Beispiel 2 beschreibt die Entdeckung des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE); eine Proteinase, die die Kriterien dafür erfüllt, die Verantwortliche für die Degradation der intrazellulären kohäsiven Strukturen im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo zu sein. Beispiel 3 beschreibt die teilweise Charakterisierung der Aktivität des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE) mittels chromogener Substrate.
Die Ergebnisse zeigen, daß SCCE sich von anderen chymotryptischen Proteinasen enzymologisch unterscheidet. Das Inhibitorprofil und die Fähigkeit, zwei verschiedene Substrate von chymotrypsinartigen Enzymen zu degradieren, ist bei SCCE im Vergleich zu Rinder-Chymotrypsin und menschlichem Cathepsin G signifikant verschieden. SCCE scheint auch von menschlicher Mastzellen-Chymase signifikant verschieden zu sein. Das letztere Enzym katalysiert wirkungsvoll die Degradation von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (vgl. Schwartz et al., 1987 und Schechter et al., 1989) – was SCCE nicht tut – und wird nicht durch Aprotinin oder SBTI gehemmt (Schechter et al., 1983 und Wintroub et al, 1986), was bei SCCE der Fall ist.
Beispiel 4 beschreibt die teilweise Reinigung von SCCE aus KCl-Extrakten von Corneocyten mittels der Affinitätschromatographie auf unlöslich gemachtem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI) und die Bestimmung der N-terminalen Arninosäuresequenz von SCCE. Mit nichtreduzierten Proben waren die Erträge in den Stufen 1–6 gut, fielen aber in den Stufen 7 und 9 auf Null, und die Erträge in den nachfolgenden Schritten waren bedeutend verringert. Auch mit reduzierten Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate festgestellt werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen Derivate festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen Abfälle der Erträge. Das Ergebnis legt nahe, daß in den Positionen 7 und 9 Cysteine vorhanden sind. Es war jedoch nicht möglich, in den Schritten 7 und 9 nach einer Reduktion und Behandlung mit Jodessigsäure (100 mM) carboxymethyliertes Cystein festzustellen. Die erhaltene Sequenz (13, SEQ ID NR: 3) war bei reduzierten und nicht-reduzierten Proben identisch.
Beispiel 5 beschreibt die Herstellung SCCE-spezifischer monoklonaler Antikörper und polyclonaler SCCE-spezifischer Hühner- und Kaninchenantikörper sowie immunhistochemische Studien mit den monoklonalen Antikörpern.
Beispiel 6 beschreibt das Clonieren und die Sequenzierung einer cDNA, die menschliches SCCE codiert. Zunächst wurde eine cDNA-Bank, die aus von adulten menschlichen Keratinocyten epidermalen Ursprungs abgeleiteter mRNA hergestellt worden war, mit polyclonalen Anti-SCCE-Antikörpern von Kaninchen abgesucht. Einer der Antikörper gab ein starkes Hintergrundsignal und wurde zu einem frühen Zeitpunkt aus der ausgedehnten Absuchungsstudie ausgeschieden. Unter Verwendung eines anderen polyclonalen Antikörpers (D-5) wurde eine Anzahl immunreaktiver Plaques in der für echte positive Plaques erwarteten Weise angereichert. Es wurde jedoch bei keinem der Plaques eine Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern moAb4 und moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzym-Charakterisierung und PCR-Charakterisierung von elf ausgewählten Plaques ergab, daß keine Ähnlichkeiten zwischen den verschiedenen Plaques festgestellt werden konnten. Da dieser Versuch, einen „Fingerabdruck" einer möglichen SCCE-cDNA-Sequenz zu definieren, gescheitert war, mußte die Strategie modifiziert werden.
Trotz der bevorzugten Feststellung immunreaktiven SCCE-Materials in den suprabasalen Keratinocyten, wurde eine cDNA-Bank, die aus gezüchteten menschlichen Keratinocyten hergestellt worden war, zum Absuchen von SCCE-cDNA verwendet. Es kann erwartet werden, daß eine solche Bank nur cDNA aus basalen Keratinocyten enthält. Dieser Versuch basierte auf der Beobachtung einer schwachen aber möglicherweise signifikanten Immunfärbung bei Verwendung von monoklonalen SCCE-Antikörpern, ebenfalls aus basalen Keratinocyten.
Die Plaques wurden mit einer synthetischen 17-mer-OligoNukleotidsonde abgesucht, die auf der Basis des zuverlässigsten Teils der Aminosäuresequenz, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NR: 10, As 1–As 6) der experimentell bestimmten aminoterminalen Sequenz des nativen SCCE-Enzyms wie in Beispiel 4 beschrieben entwickelt worden war. Aufgrund der Unsicherheit innerhalb der experimentell bestimmten Aminosäuresequenz, wurde dieses Hexapeptid als einer der zuverlässigsten Teile erachtet. Auch führten die möglichen Codons, die dieses Hexapeptid codieren, zur geringstmöglichen Degeneration der DNA-Sonde. Die längere, experimentell bestimmte Sequenz Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID NR: 3, As 15–As 24) wurde aufgrund des hohen Grades von Degeneration einer Sequenz, die diese Peptidsequenzen codiert, ausgeschlossen. Vierzehn positive Plaques wurden im ersten Suchvorgang festgestellt. Diese positiven Plaques wurden erneut abgesucht, wobei die gleiche Sonde und die gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben verwendet wurden. Nach diesem erneuten Suchvorgang wurden zwei positive Plaques festgestellt. Die beiden ausgewählten Plaques wurden ein weiteres Mal gereinigt, und die Größe der Inserts durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601, die zu den zwei Phagenarmen komplementär waren, als Primer und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden. Dieses clonierte Fragment wurde einer partiellen Sequenzanalyse unterworfen.
Die Übersetzung der erhaltenen DNA-Sequenz ergab eine Aminosäuresequenz, die zu der experimentell bestimmten Proteinsequenz homolog war. Jedoch fehlte der Sequenz ein Translationsstartcodon. Um eine cDNA von voller Länge zu isolieren, wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel separiert und als Sonde verwendet, die eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erlaubte. Um eine DNA von voller Länge zu erhalten, wurde die cDNA-Bank mit dieser Sonde zweimal erneut abgesucht, wobei die gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt wurden, außer daß die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bei 65°C geschah. Diese Versuche führten zur Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques, die anfangs mit PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 oder SYM 1601 in Verbindung mit SYM 3208 als PCR-Primer für die Bestimmung einer Plaque, die den ganzen 5' offenen Leserahmen enthielt, verwendet wurde.
Nach weiterem Absuchen und weiterer Sequenzanalyse wurden die erhaltenen, aus diesen Phagen abgeleiteten amplifizierten PCR-Fragmente wie detailliert im Beispiel 6 beschrieben cloniert, und die Ergebnisse zeigten, daß einer der Phagen, 205.2.1, ein Insert von voller Länge enthielt. Die komplette Nukleotidsequenz des cDNA-Fragments wurde bestimmt. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) enthielt einen offenen Leserahmen, der ausreichte, um die ganze Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins von 253 Aminosäuren einschließlich eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids (SEQ ID NR: 2) zu codieren.
Beispiel 7 beschreibt die Entdeckung von zwei SCCE-mRNA-Spezies in menschlicher Epidermis, die in der Lage waren, mit cDNA-Sonden zu hybridisieren, die auf der Grundlage einer SCCE-cDNA-Sequenz hergestellt worden waren.
Beispiel 8 beschreibt die Expression rekombinanten SCCE in E. coli. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, rekombinantes SCCE in Bakterien herzustellen.
Beispiel 9 beschreibt die Expression rekombinanten menschlichen SCCE in Säugerzellen. Es werden drei Proteine hergestellt, die eine Reaktion mit allen verfügbaren polyclonalen Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern sowie mit den hinterlegten polyclonalen Antikörpern zeigen. Die rekombinanten Proteine, die mit den gegen natives SCCE hervorgerufenen Antikörpern reaktiv sind, weisen ein etwa 1 kDa größeres scheinbares Molekulargewicht auf als gereinigtes, natives menschliches SCCE. Das rekombinante Protein zeigt keinerlei proteolytische Aktivität.
Die Reinigung, Aktivierung und weitere Charakterisierung von rekombinantem SCCE wird im Beispiel 10 beschrieben. Die inaktive Vorform von rekombinantem SCCE kann durch proteolytische Spaltung mit Trypsin oder Endopeptidase Lys-C aktiviert werden. Man nimmt an, daß eine Anzahl anderer Proteasen, die ein Peptid nach einer basischen Aminosäure spalten, wie etwa Endoproteinase Lys-C, Papain und Plasmin, in der Lage sein werden, Pro-S CCE zu aktivem SCCE zu aktivieren. Es wurde gefunden, daß das Signalpeptid aus 22 Aminosäuren besteht, und beruhend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz von nativem, aktivem SCCE besteht das Propeptid aus sieben Aminosäuren. Weiterhin wird gezeigt, daß das erzeugte rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten Formen und in einer nichtglykosylierten Form vorkommt, was analog zu den mit aktiver nativer SCCE erhaltenen Ergebnissen ist.
Unter dem Begriff „Stratum corneum chymotryptisches Enzym (SCCE)" oder „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" wird in seinem weitesten Sinn eine Serinproteinase oder eine Vorform einer solchen, wie ein Proenzym (Pro-5 CCE) oder ein Fusionsprotein, das durch proteolytische Spaltung aktiviert werden kann, verstanden, wobei dieses Enzym in seiner aktiven Form von den gleichen Inhibitoren und in ähnlicher Weise gehemmt wird, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit Proben verhornter Haut hervorgerufen werden kann, die bei neutralem oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur inkubiert werden.
Spezifischer gesehen, definiert der Begriff „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" somit ein Polypeptid, das von Chymotrypsin und Cathepsin G verschieden ist, und das in seiner aktiven Form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) abzubauen, wobei der Abbau durch das Polypeptid von Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und zwar im wesentlichen wie in den Beispielen 3 und 13 beschrieben und in 9 und Tabelle 5 veranschaulicht.
Noch spezifischer umfaßt der Begriff „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" ein Polypeptid, das in der Lage ist, die proteolytische Degradation des desmosomalen Proteins Desmoglein I während der in vitro-Inkubation von plantarem Stratum corneum zu verursachen.
Ein solches Polypeptid wird im allgemeinen auch mit Antikörpern reagieren, die gegen natives SCCE, das aus einem Extrakt von dissoziierten plantaren Stratum corneum-Zellen gereinigt wurde, hervorgerufen wurden. Beispiele solcher Antikörper sind die polyclonalen Antikörper, die wie in 5.2 beschrieben hergestellt werden, und die monoklonalen Antikörper TE4b und TE9b, die wie in Beispiel 5.1 beschrieben hergestellt werden. Die monoklonalen Antikörper werden von den Hybridomen TE4b und TE9b produziert, die gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags unter den Zugangsnummern ECACC 93061817 bzw. ECACC 93061816 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich, hinterlegt wurden.
Das Clonieren und die Sequenzierung einer cDNA, die menschliches SCCE codiert, wird im Beispiel 6 beschrieben. Es wurde eine Nukleotidsequenz gefunden, die einen offenen Lese-rahmen enthält, der ausreicht, um die ganze Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins von 253 Aminosäuren einschließlich eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids zu codieren. Die Nukleotidsequenz wird in SEQ ID NR: 1 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von „Stratum corneum chymotryptischem Enzym (SCCE)" in SEQ ID NR: 2 gezeigt.
Mit dem Begriff „Pro-SCCE oder ein Analogon oder eine Variante davon" ist ein Polypeptid gemeint, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz hat, die produziert wird, wenn eine Nukleotidsequenz der Erfindung in einem geeigneten Expressionssystem exprirniert wird, und die nach proteolytischer Aktivierung eine Serinproteinase ergibt, die von den gleichen Inhibitoren gehemmt werden kann, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit Proben verhornter Hautschichten induziert werden kann, die bei neutralem oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur, d.h. etwa 37°C inkubiert werden. Im allgemeinen wird das Protein mit Antikörpern reagieren, die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen wurden.
Mit dem Begriff „ein SCCE oder ein Analogon oder eine Variante davon" ist ein Polypeptid gemeint, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz hat, die produziert wird, wenn eine Nukleotidsequenz der Erfindung in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird, und die eine Serinproteinase ist, die von den gleichen Inhibitoren gehemmt werden kann, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit Proben verhornter Hautschichten induziert werden kann, die bei neutralem oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur, d.h. etwa 37°C inkubiert werden. Im allgemeinen wird das Protein mit Antikörpern reagieren, die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen wurden.
Mit dem Begriff „ein Analogon oder eine Variante davon" ist somit ein Polypeptid gemeint, das nichtgenau die gleiche Aminosäuresequenz hat, wie in SEQ ID NR: 2 gezeigt, aber noch „SCCE-Aktivität" wie vorstehend definiert hat. Im allgemeinen werden solche Polypeptide Polypeptide sein, die im Vergleich zu dem in den Beispielen beschriebenen SCCE-Protein bis zu einem gewissen Grad variieren, z.B. hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung oder in den posttranslationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung oder Phosphorylierung.
Der Begriff „Analogon" oder „Variante" wird also im vorliegenden Zusammenhang gebraucht, um ein Protein oder Polypeptid von einer ähnlichen Aminosäurezusammensetzung oder -Sequenz wie die charakteristische Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 zu bezeichnen, das vom SCCE-Protein wie in Beispiel 6 beschrieben abgeleitet ist, wobei kleinere Abweichungen möglich sind, die die Aminosäuresequenz verändern, z.B. Deletionen, stellengerichtete Mutationen, Insertionen zusätzlicher Aminosäuren oder Kombinationen davon, um so SCCE-Proteinanaloga zu erzeugen. Diese Modifikationen können interessante und nützliche neuartige Eigenschaften des Analogons ergeben. Das analoge Polypeptid oder Protein kann von einem Tier oder einen Menschen abgeleitet oder teilweise oder komplett synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann auch durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken abgeleitet sein.
Eine wichtige Auführungsform, die ein Polypeptid angeht, in dem mindestens ein Aminosäurerest durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt wurde, und/oder bei dem mindestens ein Aminosäurerest deletiert oder hinzugefügt wurde, so daß sich ein Polypeptid ergibt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NR: 2 oder einer Untersequenz dieser Aminosäuresequenz, wie nachstehend definiert, verschieden ist, doch im wesentlichen die vorstehend definierte SCCE-Aktivität hat.
Eine interessante Ausführungsform betrifft ein Polypeptid, das ein Analogon oder eine Untersequenz des Polypeptids der Erfindung ist, und das 50 bis 250 Aminosäuren umfaßt, z.B. mindestens 70 Aminosäuren, mindestens 100 Aminosäuren, mindestens 150 Aminosäuren oder mindestens 200 Aminosäuren.
Besonders wichtige Auführungsformen sind das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz -7-224 in SEQ ID NR: 2 (SCCE) (pro-SCCE) und das Polypeptids mit der Aminosäuresequenz 1-224 in SEQ ID NR:2 (SCCE).
Der Begriff „enzymatisch aktive Untersequenz" bezeichnet eine Polypeptidsequenz, die nur einen Teil der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Polypeptidsequenz umfaßt, und die enzymatische Aktivität aufweist. Dazu zählen auch Polypeptidsequenzen, die durch Modifikationen wie hier erklärt analogisiert wurden. Das spezifische Polypeptid (oder die Polypeptide), das die enzymatisch aktive Stelle umfaßt, wird als besonders interessant erachtet.
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 wurde mit den Aminosäuresequenzen der Enzyme menschliches Chymotrypsin (Toulta et al., 1989), menschliches Cathepsin G (Salvesen et al., 1987) und menschliche Mastzellen-Chymase (Caughey et al., 1991) verglichen. Obwohl die abgeleitete Aminosäuresequenz die konservierten aktiven Regionen von Serinproteinasen enthält, ist der Grad der Homologie ziemlich niedrig, ungefähr 33–38%. In dieser Hinsicht erscheint es somit, daß SCCE nur eine mäßige Ähnlichkeit mit bisher bekannten Serinproteinasen hat. Andererseits ist SCCE eine typische Serinproteinase, was die Histidin-, Aspartat- und Serinreste des aktiven Zentrums und die konservierten Regionen in der Nähe dieser Stellen betrifft. Dies gilt auch für die meisten der Cysteinreste und der anderen hochgradig konservierten Regionen von Serinproteinasen. Am Boden der primären Spezifitätstasche (Rest 189 bei Chymotrypsin) befindet sich ein Serinrest in menschlichem Chymotrypsin, in Mastzellen-Chymase und in prostataspezifischem Antigen, und ein Alaninrest in menschlichem Cathepsin G. Beim SCCE hingegen wird diese Position von einem Asparaginrest eingenommen. Dies könnte den Befund erklären, daß SCCE, obwohl es zweifellos chymotryptische Aktivität hat, sich in seiner relativen Aktivität verschiedenen chromogenen Peptidsubstraten gegenüber von Chymotrypsin und Cathepsin G unterscheidet, so, wie dies auch die Inhibitionswirkung von Chymostatin, einem Inhibitor chymotrypsinartiger Enzyme von geringer Molekularmasse tut.
Einen Vergleich zwischen den Sequenzen von menschlichem Chymotrypsin, menschlichem Cathepsin G und menschlicher Mastzellen-Chymase und der von SCCE ist in der folgenden Aufstellung der Sequenzen gezeigt.
Die Ausrichtung geschah manuell.

HUMCTRP: = menschliches Chymotrypsin (Touita et al., BBRC 158: 569–575, 1989)
HUMCHTG: = menschliches Cathepsin G (Salvesen et al., Biochemistry 26: 2289–2293, 1987)
HUMCHYM: = menschliche Mastzellen-Chymase (Caughey et al., J. Biol. Chem. 266: 12956–12963, 1991)

Homologien:

HUMCTRP/SCCE: 85/224 = 38%
HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33%
HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33%
HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48%

Die Numerierung bezieht sich auf Chymotrypsinogen.
Unterstreichungen:
Konservierte Regionen in der Nähe des aktiven Zentrums (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 bei Chymotrypsin und der primären Spezifitätstasche von Chymotrypsin (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 bei Chymotrypsin).
Sternchen:

Mögliche Glykosylierungsstellen bei SCCE.

Eine wichtige Ausührungsform, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, von der eine fortlaufende Abfolge von 20 Aminosäuren zu mindestens 80% zu einer ebenso langen Abfolge von Aminosäuren aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz homolog ist.
Polypeptidsequenzen, die eine Homologie von mindestens 80%, wie mindestens 85%, z.B. 90% mit dem in SEQ ID NR: 2 gezeigten Polypeptid haben, sind wichtig. Da die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Sequenz ziemlich einzigartig zu sein scheint, der Schutzbereich umfasst Polypeptide, für die der Homologiegrad zu einer ähnlichen fortlaufenden Abfolge von 20 Aminosäuren, die aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt werden, nicht über 55%, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 70% beträgt. Solche Sequenzen können von ähnlichen Proteinen von anderen Arten, z.B. anderen Säugern, wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein oder Rind sein. Da kleinere Teile der Sequenz beträchtliche Ähnlichkeiten zu anderen Serinproteinasen aufweisen können, beinhaltet der Schutzbereich auch Peptide mit einem Homologiegrad von mindestens 95% und, am meisten vorzuziehen, mindestens 99% Homologie zu einer ähnlichen fortlaufenden Abfolge von 20 Aminosäuren, die aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt werden.
Mit dem Begriff „Sequenzhomologie" ist die Identität der Aminosäuresequenzen in Abschnitten von zwei oder mehr Aminosäuren des Gegenstückes hinsichtlich Identität und Position der Aminosäuren der Polypeptide gemeint.
Der Begriff „homolog" wird somit hier dazu verwendet, den Grad der Identität zwischen der Aminosäuresequenz eines gegebenen Polypeptids und der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz zu veranschaulichen. Die Aminosäuresequenz, die mit der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz verglichen werden soll, kann aus einer Nukleotidsequenz, wie einer DNA- oder RNA-Sequenz abgeleitet werden; z.B. durch Hybridisierung, wie nachstehend definiert erhalten sein, oder sie kann durch konventionelle Aminosäuresequenzierungsverfahren erhalten werden. Der Homologiegrad wird vorzugsweise anhand der Aminosäuresequenz eines reifen Polypeptids bestimmt, das heißt, ohne irgendwelche Leader-Sequenzen in Betracht zu ziehen. Im allgemeinen werden nur codierende Regionen verwendet, wenn Nukleotidsequenzen untereinander verglichen werden, um ihre interne Homologie zu bestimmen.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „Polypeptid, das von mindestens einem der hinterlegten Antikörper erkannt wird" auch eine Aminosäuresequenz einschließen, die Aminosäuren umfaßt, die einen hinsichtlich linearer oder räumlicher Anordnung im wesentlichen zusammenhängenden Bereich einer beliebigen Untersequenz des in SEQ ID NR: 2 gezeigten Polypeptids darstellen, der von mindestens einem der hinterlegten Antikörper erkannt wird. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt, können auch die sekundäre oder tertiäre Anordnung interessante und nützliche Eigenschaften haben und Epitope darstellen. Die hinterlegten Antikörper TE4b und TE9b scheinen Konformationsepitope des SCCE zu erkennen.
Es wurde gezeigt, daß ein wie in Beispiel 5.2.2 hergestellter polyclonaler Antikörper von Kaninchen in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine körnige Färbung des Stratum granulosum und eine ziemlich diffuse Färbung des unteren Stratum corneum hervorrief. Antikörper, die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen wurden, werden im allgemeinen an suprabasale Zellen in keratinisiertem (verhorntem) menschlichem schuppigen Epithel binden, nicht aber an Epithelzellen in nichtverhorntem schuppigem Epithel. Diese Antikörper werden auch an den interzellulären Raum der verhornten Schicht der menschlichen Haut binden.
Antikörper nach Anspruch 1 sind für eine Reihe von Zwecken geeignet, wie nachfolgend aufgeführt:
Zur Reinigung von Proteinen:
Die Antikörper können zur Reinigung des Proteins/der Proteine oder seiner/ihrer Analoga aus biologischen Proben verwendet werden, wozu die Verfahren der Affinitätschromatographie oder Immunfällung verwendet werden.
Für die Diagnose und Therapie:
Die monoklonalen Antikörper gegen das Polypeptid/die Polypeptide oder seiner/ihrer Analoga kann bei der Diagnose und Therapie von Krankheitszuständen bei Tieren und Menschen verwendet werden. Das Diagnosemittel kann ein Antikörper mit der Spezifität für das Polypeptid wie vorstehend definiert sein. Der Antikörper kann an ein anderes Protein oder an einen festen Träger gekoppelt sein, und/oder er kann in den Agglutinationstests oder den Farbentwicklungstests verwendet werden. Solche Antikörper können auch dazu verwendet werden, SCCE-Polypeptide oder Analoga davon in biologischen Proben mittels der standardmäßigen histochemischen oder immunchemischen Verfahren zu quantifizieren.
Die Beschreibung beschreibt eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, codiert. Im Einzelnen behandelt die Beschreibung eine Nukleotidsequenz, die im wesentlichen die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Sequenz umfaßt. Andere wichtige Ausführungsformen betreffen eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Untersequenz der Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 codiert, wie eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz -7-224 von SEQ ID NR: 2, oder ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz 1-224 von SEQ ID NR: 2 umfaßt.
Die Beschreibung behandelt auch eine Nukleotidsequenz, die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert, wie in Beispiel 7 und Beispiel 9 beschrieben.
In einem anderen Aspekt behandelt die Beschreibung eine Nukleotidsequenz, die die in SEQ ID NR:1 gezeigte Nukleotidsequenz oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon hat, die

1) eine Homologie mit der in SEQ ID NR:1 gezeigten Sequenz von mindestens 90% hat, und/oder
2) ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz mindestens 80% mit der in SEQ ID NR:2 gezeigten Aminosäuresequenz homolog ist, und/oder
3) ein Polypeptid codiert, das durch dem monoklonalen Antikörper gebunden ist, der von der Hybridomzelllinie TE4b erzeugt ist, die am 18. Juni 1993 bei ECACC hinterlegt wurde und die provisorische Hinterlegungsnummer ECACC 93061817 erhalten hat, oder der monoklonale Antikörper, der von der Hybridomzelllinie TE9b erzeugt ist, die am 18. Juni 1993 bei ECACC hinterlegt wurde und die provisorische Hinterlegungsnummer 93061816 erhalten hat, und/oder
4) ein Polypeptid codiert, das durch ein polyklonales Antiserum gebunden ist, das gegen native SCCE hergestellt ist, die von einem Extrakt dissociierten plantar stratum corneum Zellen gereinigt ist.

Innerhalb des Schutzbereichs ist auch eine modifizierte Nukleotidsequenz, die sich von der oben definierten Nukleotidsequenz insoweit unterscheidet, daß mindestens ein Nukleotid entfernt, ersetzt oder modifiziert worden ist, oder mindestens ein zusätzliches Nukleotid eingesetzt worden ist, um in einer Nukleotidsequenz zu resultieren, die ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität codiert.
Der Begriff „Analogon" hinsichtlich der DNA-Fragmente der Erfindung soll eine Nukleotidsequenz bezeichnen, die ein Polypeptid codiert, das identisch oder im wesentlichen identisch mit dem Polypeptid ist, das von einem DNA-Fragment der Erfindung codiert wird. Es ist all-gemein bekannt, daß die gleiche Aminosäure von verschiedenen Codons codiert werden kann, wobei die Codonverwendung unter anderem mit der Präferenz des betreffenden, Nukleotidsequenz-exprimierenden Organismus zusammenhängt. So können ein oder mehrere Nukleotide oder Codons des DNA-Fragment der Erfindung gegen andere ausgetauscht werden, die, wenn sie exprimiert werden, zu einem Polypeptid führen, das mit dem vom betreffenden DNA-Fragment codierten Polypeptid identisch oder im wesentlichen identisch ist.
Der Begriff „Analogon" wird im vorliegenden Zusammenhang auch dazu verwendet, ein DNA-Fragment oder eine DNA-Sequenz von einer ähnlichen Nukleotidzusammensetzung oder -sequenz wie die charakteristische DNA-Sequenz SEQ ID NR: 1, welche die das SCCE-Polypeptid bildende Aminosäuresequenz codiert, zu bezeichnen; hierbei sind geringfügige Variationen zulässig, die keine wesentliche widrige Auswirkung auf die Enzymaktivität des Analogons im Vergleich zur Aktivität von nativem SCCE-Protein haben, wie in Beispiel 3 beschrieben. Mit dem Begriff „wesentliche widrige Auswirkung" ist gemeint, daß die Enzymaktivität des Analogons mindestens 50%, stärker vorzuziehen mindestens 60%, noch stärker vorzuziehen mindestens 70%, wie mindestens 75% der Enzymaktivität des nativen SCCE, wenn z.B. wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt, betragen sollte. Das analoge DNA-Fragment oder die DNA-Sequenz kann von einem Organismus, wie einem Tier oder einem Menschen abgeleitet sein, oder kann teilweise oder komplett synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann auch durch die Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren abgeleitet sein.
Darüberhinaus sollen die Begriffe „Analogon" und „Untersequenz" Abweichungen in der Sequenz, wie Substitution, Insertion (einschließlich Introns), Addition und Neuanordnung eines oder mehrerer Nukleotide zulassen, die keine wesentliche widrige Auswirkung auf das von dem DNA-Fragment codierten Polypeptid oder eine Untersequenz davon haben.
Der Begriff „Substitution" soll die Ersetzung eines oder mehrere Nukleotide in der vollen Nukleotidsequenz mit einem oder mehreren verschiedenen Nukleotiden bedeuten, unter „Addition" wird die Hinzufügung eines oder mehrerer Nukleotide an jedem beliebigen Ende der vollen Nukleotidsequenz verstanden, „Insertion" soll die Einführung von einem oder mehreren Nukleotiden in die volle Nukleotidsequenz bedeuten, „Deletion" soll anzeigen, daß ein oder mehrere Nukleotide aus der vollen Nukleotidsequenz entfernt wurden, ob an einem beliebigen Ende der Sequenz oder an jedem geeigneten Punkt innerhalb derselben, und „Neuanordnung" soll bedeuten, daß zwei oder mehr Nukleotidreste innerhalb der DNA bzw. der Polypeptidsequenz ausgetauscht wurden. Das DNA-Fragment kann jedoch auch durch Mutagenese entweder vor oder nach seiner Einführung in den Organismus verändert werden.
Im Sprachgebrauch der vorliegenden Erfindung und der Ansprüche sollen die Begriffe „Fragment", „Sequenz", „Untersequenz" und „Analogon" hinsichtlich Fragmenten, Sequenzen, Untersequenzen und Analoga gemäß der Erfindung selbstverständlich so verstanden werden, daß sie nicht diese Phänomene in ihrer natürlichen Umgebung umfassen, sondern vielmehr z.B. in isolierter, gereinigter, in vitro- oder rekombinanter Form.
Die in der vorliegenden Beschreibung behandelten Polypeptide können unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden. Eine wichtige Ausführungsform betrifft ein Expressionssystem, das eine Nukleotidsequenz umfaßt.
Der Organismus, der für die Herstellung des Polypeptids benützt wird, kann ein höherer Organismus, z.B. ein Tier oder ein niederer Organismus, z.B. ein Mikroorganismus wie E. coli sein. Ungeachtet des verwendeten Organismentyps wird das DNA-Fragment in den Organismus entweder direkt oder mittels eines geeigneten Vektors eingeführt. Alternativ können die Polypeptide durch Einführen des DNA-Fragments der Erfindung oder eines Analogons oder einer Untersequenz desselben entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors in Säuger-Zellinien hergestellt werden.
Das DNA-Fragment oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon kann in einen geeigneten stabilen Expressionsvektor cloniert werden und dann in eine geeignete Zellinie gesetzt werden. Die Zellen, die die gewünschten Polypeptide herstellen werden dann auf der Grundlage des Produktivitätsniveaus unter Bedingungen, die für den Vektor und die verwendete Zellinie geeignet sind, selektiert. Die selektierten Zellen werden weitergezüchtet und bilden eine sehr wichtige und kontinuierliche Quelle der gewünschten Polypeptide.
Ein Beispiel eines spezifischen Analogon der DNA-Sequenz der Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder einen Teil davon umfaßt, und die besonders an eine Expression in E. coli angepaßt ist. Diese DNA-Sequenz ist eine, die, wenn sie zusammen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen in E. coli insertiert wird, zur Expression eines Polypeptids führt, das im wesentlichen die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon hat. Somit umfaßt diese DNA-Sequenz spezifische Codons, die von E. coli erkannt werden. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist in Beispiel 8 beschrieben.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff „Gen" verwendet, um eine DNA-Sequenz zu bezeichnen, die an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist, und die Regionen beinhaltet, die der codierenden Region (5'-Stromaufwärts- und 3'-Stromabwärts-Sequenzen) vor-ausgehen oder ihr nachfolgen, sowie intervenierende Sequenzen, Introns, die zwischen einzelnen codierenden Segmenten, Exons, oder in der 5'-Stromaufwärts- oder 3'-Stromabwärts-Region gelegen sind. Die 5'-Stromaufwärts-Region umfaßt eine regulatorische Sequenz, die die Expression des Gens steuert, typischerweise einen Promotor. Die 3'-Stromabwärts-Region umfaßt Sequenzen, die an der Termination der Transkription des Gens beteiligt sind, und wahlweise Sequenzen, die für die Polyadenylierung des Transkripts und der 3'-nichtübersetzten Region verantwortlich sind.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend Gesagten betrifft die Erfindung ein Expressionssystem, das eine Nukleotidsequenz wie die vorstehend beschriebene umfaßt, die ein Polypeptid codiert, wobei das System eine 5'-flankierende Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, die Expression jener Nukleotidsequenz zu vermitteln.
Im Einzelnen behandelt die Beschreibung einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine Nukleotidsequenz enthält und in der Lage ist, deren Expression zu vermitteln. Eine spezifische Ausführungsform betrifft einen als pS507 bezeichneten replizierbaren Expressionsvektor, der gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer DSM 8282 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt wurde, und Expressionsvektoren, die Nukleotidsequenzen exprimieren, welche von der Nukleotidsequenz dieses hinterlegten Vektors abweichen, welche aber das gleiche Polypeptid oder ein Analogon oder eine Variante davon mit SCCE-Aktivität codieren.
Mit anderen Worten behandelt die Beschreibung auch einen replizierbaren Expressionsvektor wie vorstehend beschrieben, wobei die exprimierte Nukleotidsequenz sich von der Nukleotidsequenz des hinterlegten Vektors darin unterscheidet, daß mindestens ein Nukleotid deletiert, substituiert oder modifiziert oder mindestens ein zusätzliches Nukleotid insertiert wurde, so daß sich eine Nukleotidsequenz ergibt, die ein Polypeptid mit SCCEAktivität codiert.
Weiterhin behandelt die Beschreibung ein als pS500 bezeichnetes Plasmid, das gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer DSM 8281 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) hinterlegt wurde, und Plasmide, die eine Nukleotidsequenz haben, welche von der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz abweicht, die aber das in SEQ ID NR: 2 gezeigte Polypeptid oder ein Analogon oder eine Variante davon, die SCCE-Aktivität aufweisen, codiert, oder die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Teil davon unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
Innerhalb des Schutzbereiches liegt auch ein nichtmenschlicher Organismus, der einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung enthält. Organismen, die in dieser Hinsicht der Erfindung verwendet werden können, umfassen Mikroorganismen, wie ein Bakterium der Gattung Bacillus, Escherichia oder Salmonella, eine Hefe, wie Saccharomyces, Pichia, eine Protozoen- oder eine aus einem mehrzelligen Organismus abgeleitete Zelle, wie ein Pilz, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Säugerzelle oder eine Zellinie. Wenn der Organismus ein Bakterium ist, ist ein Bakterium der Gattung Escherichia vorzuziehen, z.B. E. coli.
Die Beschreibung behandelt ferner einen Plasmidvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid oder ein Fusionspolypeptid wie hierin definiert codiert. In einer besonders wichtigen Ausführungsform kann das DNA-Fragment oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon oder ein hier definiertes fusioniertes DNA-Fragment in einem replizierbaren Expressionsvektor enthalten sein, der in der Lage ist, sich in einem Wirtsorganismus oder eine Zellinie zu replizieren.
Im Einzelnen kann der Vektor ein Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom oder Virus sein. In einer interessanten Ausführungsform kann der Vektor ein Vektor sein, der, in eine Wirtszelle eingeschleust, in das Wirtszellengenom eingebaut wird.
Wenn ein höherer Organismus verwendet wird, können transgene Techniken für die Produktion der Polypeptide angewandt werden. Beispiele geeignete Tiere sind Schafe, Rinder, Schweine usw. Ein DNA-Fragment, das ein Polypeptid codiert, wird im gewünschten Gewebe unter der Steuerung gewebespezifischer regulatorischer Elemente exprimiert. Das so erhaltene Protein kann dann posttranslationalen Modifikationen unterworfen werden, um damit ein Polypeptid zu erhalten.
Die transgenen nicht-menschlichen Säugetieren der Erfindung werden erzeugt, indem ein „Transgen" in eine embryonale Zielzelle des Tieres der Wahl eingeschleust wird. Unter einem Gesichtspunkt ist ein Transgen eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen gewünschten Phänotypen hervorzubringen, wenn sie im Genom von Zellen eines transgenen nicht-menschlichen Säugers enthalten ist. In spezifischen Ausführungsformen umfaßt das Transgen eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid codiert, wobei das Transgen in der Lage ist, exprimiert zu werden, wodurch das Polypeptid hergestellt wird.
Der Einbau des Expressionssystems in die Keimbahn des Säugers kann mit jedem beliebigen geeigneten Verfahren geschehen, z.B. wie bei Hogan et al., 1986 oder in WO 93/04172 beschrieben.
Ein Aspekt betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids wie vorstehend definiert, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Insertion einer Nukleotidsequenz in einen Expressionsvektor,
(b) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem in Schritt (a) hergestellten Vektor,
(c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind,
(d) Gewinnung des Polypeptids, und
(e) wahlweise posttranslationale Modifikation des Polypeptids.

Innerhalb des Schutzbereiches liegt auch ein Verfahren wie vor-stehend beschrieben, bei dem das erzeugte Polypeptid durch ein Verfahren isoliert wird, das einen oder mehrere Schritte umfaßt, wie Affinitätschromatographie mit immobilisiertem nativem oder rekombinantem SCCE-Polypeptid oder mit Antikörpern, die mit diesem Polypeptid reagieren und/oder anderen chromatographischen und elektrophoretischen Verfahren.
Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Polypeptid kann posttranslationalen Modifikationen als Ergebnis von Wärmebehandlung, chemischer Behandlung (Formaldehyd, Glutaraldehyd usw.) oder Enzymbehandlung (Peptidasen, Proteinasen und Proteinmodifikationsenzyme) unterworfen werden. Wenn das Polypeptid in einem Organismus hergestellt wurde, kann es in anderer Weise als in seiner natürlichen Herstellungsumgebung behandelt werden. Z.B. wird Glykosylierung oft erreicht, wenn das Polypeptid durch eine Zelle eines höheren Organismus, wie Hefe oder vorzugsweise ein Säuger exprirniert wird. Die Glykosylierung findet sich normalerweise in Verbindung mit den Aminosäureresten Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin. Es kann vorteilhaft sein oder auch nicht, die durch den betreffenden Wirtsorganismus bedingten Verarbeitungsmerkmale zu entfernen oder abzuändern.
Im Anschluß an die Expression des Polypeptids in einem Organismus oder einer Zellinie, kann das Polypeptid entweder als solches verwendet werden, oder es kann zuerst aus dem Organismus oder der Zellinie gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als sekretiertes Produkt exprimiert wird, kann es direkt gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als assoziiertes Produkt exprimiert wird, kann eine teilweise oder vollständige Zerstörung des Wirts vor der Reinigung erforderlich sein. Beispiele für Verfahren, die für die Reinigung von Polypeptiden angewandt werden sind: (i) Immunfällung oder Affinitätschromatographie mit Antikörpern, (ii) Affinitätschromatographie mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere chromatographische Verfahren, wie Gelfiltration, Ionenaustausch oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder aus den obigen abgeleitete Verfahren, (iv) elektrophoretische Verfahren, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese, denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Agarose-Gelelektrophorese und Isoelektrische Fokussierung, (v) jedes andere spezifische Solubilisierungs- und/oder Reinigungsverfahren.
Die vorliegende Beschreibung behandelt auch ein im wesentlichen reines SCCE-Polypeptid. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „im wesentlichen rein", daß das betreffende Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Bestandteilen, z.B. anderen Polypeptiden oder Kohlenhydraten ist, die von der Herstellung und/oder Gewinnung des Polypeptids herrühren oder sonst wie zusammen mit dem Polypeptid vorkommen könnten. Die Reinheit eines Proteins kann durch SDS-Gelelektrophorese, die wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt wird, abgeschätzt werden.
Das Polypeptid kann wie in Beispiel 4 beschrieben durch SBTI-Affinitätschromatographie auf einem irrmobilisierten Antikörper, wie dem Antikörper TE4b, nach Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, gereinigt werden. Ein hoher Reinheitsgrad des Polypeptids kann vorteilhaft sein, wenn das Polypeptid in einer pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung verwendet werden soll. Das im wesentlichen reine Polypeptid kann eben wegen seiner hohen Reinheit für die meisten Zwecke in einer geringeren Menge verwendet werden, als ein Polypeptid von konventioneller, geringerer Reinheit.
Unter einem Gesichtspunkt kann das reine Polypeptid aus einer geeigneten Zellinie, die ein Polypeptid exprimiert, wie in Beispiel 9 beschrieben, erhalten werden. Auch kann ein Polypeptid nach den allgemein bekannten Verfahren der Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese durch Aneinanderkoppeln der einzelnen Aminosäuren der Polypeptidsequenz hergestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid durch Aneinanderkoppeln einzelner Aminosäuren synthetisiert werden, die Fragmente der Polypeptidsequenz bilden, und die später ihrerseits aneinandergekoppelt werden und so das gewünschte Polypeptid ergeben. Diese Methoden konstituieren einen anderen interessanten Aspekt.
Es wird angenommen, daß in der cutanen Umgebung ein „Kaskadensystem" proteolytischer Enzyme existiert, das dem Plasminogen-Aktivierungssystem ähnelt.
Man nimmt an, daß SCCE eines der Endprodukte dieses Systems ist. Es wird angenommen, daß die Aktivität von SCCE mit Hilfe eines „SCCE-Inhibitors" gehemmt werden kann.
Bei einer Anzahl von Hautkrankheiten, wie Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder acantholytische Krankheiten, z.B. Familien-Pemphigus und Darier'scher Krankheit ist die Kohäsion zwischen Keratinocyten und der nichtverhornten, lebensfähigen Epidermisschicht beeinträchtigt (vgl. Störungen der Zellkohäsion in lebensfähiger Epidermis). Es wird angenommen, daß dieser Vorgang von Proteinasen bewirkt wird, und daß er somit durch Verabreichung einer Zusammensetzung behandelt werden kann, die in der Lage ist, die Enzymaktivität von nativem SCCE zu hemmen. Es könnte auch vorteilhaft sein, bei Zuständen, bei denen eine entzündliche Komponente die vorherrschende Erscheinung ist, einen SCCE-Inhibitor zur Behandlung von Psoriasis und anderen entzündlichen Hautkrankheiten zu verabreichen.
Es wird somit angenommen, daß ein SCCE-Inhibitor, der eine hemmende Auswirkung auf die Enzymaktivität von nativem SCCE hat, zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder acantholytischen Krankheiten, z.B. Familien-Pemphigus und Darier'sche Krankheit verwendbar ist.
Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Begriff „SCCE-Inhibitor" einen schon existierenden oder neuartigen Wirkstoff, der in der Lage ist, mit einer enzymatisch aktiven Polypeptidsequenz oder -untersequenz der Erfindung oder einem Analogon davon in einer solchen Weise zu interagieren, daß die SCCE-Aktivität vermindert ist. Eine Verminderung kann z.B. durch Ausführen eines Versuchs wie in Beispiel 3.2 umrissen gemessen werden, wobei der potentielle SCCE-Inhibitor als Inhibitor verwendet wird. Diese Wirkstoffe können organische Moleküle, kleine Peptide oder große Polypeptide oder Derivate der vorstehend Genannten sein. Eine solche Vorgehensweise kann Anwendung in einem Durchmusterungsprogramm zur Bestimmung von SCCE-Inhibitoren finden.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
1. Unipolare Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro. Die Gewebeoberfläche, die in vivo nach außen zeigte, zeigt in der Figur nach oben. Beachte, daß während der Inkubation an dieser Oberfläche eine fortschreitende Zelldissoziation stattfand, an den anderen Oberflächen jedoch keine Dissoziation stattfand.
2. Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin auf die Zellabgabe von plantarem Stratum corneum, das ohne (Kreise) und mit (Dreiecke) Aprotinin inkubiert wurde. Der Mittelwert (kumulative Werte für vier Gewebestücke) und der Schwankungsbereich sind angegeben.
3. Anti-Desmoglein- (anti-DG I)- reaktive Bestandteile in kohärentem plantarem Stratum corneum und in dissoziierten Zellen. A. Coomassieblau gefärbte SDS-PAGE. B. Immunblot. 1–3: Zusammenhängendes Gewebe, unverdünnt (1), verdünnt 1/3 (2), verdünnt 1/9 (3). 4–5: Dissoziierte Zellen, unverdünnt (4), verdünnt 1/3 (5). Beachte das nur scheinbar intakte DG I mit Mr 160 kD in zusammenhängendem Gewebe, und nur Degradationsprodukte von DG I mit Mr 95 und 80 kD in dissoziierten Zellen.
4. Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum corneum, das in vitro-Zellabschuppung mitmacht. Densitometrische Scans von Immunblots von Extrakten aus plantarem Stratum corneum, das in Abwesenheit (A) und in Gegenwart (B) von Aprotinin (15 μM) inkubiert wurde. Die Spitzen bei 95 und 80 kD entsprechen den Degradationsprodukten dieses Proteins (vgl. 3). Beachte die wirksame Hemmung der Degradation von DG I durch Aprotinin.
5. Die Wirkung von Zinkionen (A), Chymostatin und Leupeptin (B) auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum corneum während der in vitro-Zellabschuppung. Beachte die Inhibition der Transformation der anti-DG Ipositiven Bestandteile von 160 kD bis 95 und 80 kD durch Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin.
6. Mit den plantaren Stratum corneum-Zellen zusammenhängende peptidhydrolysierende Aktivität. Die Hydrolyse der zwei Substrate wurde mittels Messung der Veränderung der Absorption bei 405 nm verfolgt. Mittelwerte aus Inkubationen in dreifachem Ansatz. Quadrate = S-2586; Kreise = S-2288.
7. pH-Abhängigkeit der mit den Corneocyten zusammenhängenden Hydrolyseaktivität von S-2586. Mittelwerte aus Inkubationen in dreifachem Ansatz. Quadrate = Natriumacetat, Kreise = Natriumphosphat, Dreiecke = Tris-HCl.
8. Zymographie, die die caseinolytische Aktivität in Extrakten aus dissoziierten plantaren Stratum corneum-Zellen zeigt. Vgl. auch den Text von Beispiel 2.2 zu Versuchsdetails.

A: Vergleich des Enzyms aus plantaren Corneocyten, das mit Laemmli'schem Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (sc/s) und KC1 (sc/k) mit Rinder-Chymotrypsin, 0,125 ng (c) und Rinder-Trypsin 0,5 ng (t) extrahiert wurden. Vor der Elektrophorese wurde der KCl-Extrakt gegen 5 mM Tris-HCl, pH 6.8, und bis zu einer Endkonzentration wie beim Probenpuffer hinzu-gefügtem SDS und Glcerin dialysiert; 10 μl wurden zu allen Reihen hinzugefügt. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite.
B: pH-Abhängigkeit des Inkubationspuffers. Enzymquelle = SDS-Extrakte dissoziierter plantarer Corneocyten. Puffer zur Vorbehandlung mit Triton X-100 und Inkubation: 0,1 M Natriumacetat (pH 4.0 und pH 5.5), und 0,1 M Tris-HCl (pH 7.0 und pH 8.0). Die anderen Bedingungen wie in A.
C: die Auswirkung von Inhibitoren. sc = SDS-Extrakt von plantaren Corneocyten; c = Rinder-Chymotrypsin; t = Rinder-Trypsin. Die Inhibitoren waren während der Vorbehandlung mit Triton X-100 und der anschließenden Inkubation vorhanden. Die Endkonzentration von Leu-peptin war 160 μM, die von Aprotinin 15 μM, die von Chymostatin 40 μM und die von Zinkionen (als Sulfat) 100 μM. Leupeptin und Chymostatin wurden als Lösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Puffer für die Vorbehandlung und Inkubation = 0,1 M Tris-HCl, pH 8 mit einer DMSO-Endkonzentration von 1% (v/v). Die anderen Bedingungen wie in A.

9. Vergleich von SCCE, Rinder-Chymotrypsin und menschlichem Cathepsin G hinsichtlich der Wirkung von Inhibitoren (A; Aprotinin, B; Chymostatin, C; Zinksulfat) und Substratspezifität (D). In A–C wurde die Enzymaktivität ohne Vorhandensein eines Inhibitors auf 100% standardisiert. In D wurde die Enzymaktivität mit MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA auf 1 willkürliche Einheit standardisiert.
10. Affinitätschromatographie auf kovalent gebundenem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI). Punktierte Linie: Absorption bei 280 nm, die die Proteinkonzentration des Eluats widerspiegelt. Durchgezogene Linie mit offenen Quadraten: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2586 als Substrat, die als Veränderung der Absorption bei 405 nm angegeben wird. Durchgezogene Linie mit offenen Kreisen: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2288 als Substrat, die als zehnmal multiplizierte Veränderung der Absorption bei 405 nm angegeben wird.
11. SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung (A) und Zymograpie nach SDS-PAGE mit co-polymerisiertem Casein (B) der Fraktionen 2, 6 und 10 aus dem in 10 gezeigten Chromatogramm. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite. In B: 1: Gruppe caseinolytischer Bestandteile, die durch Leupeptin (160 μM) gehemmt werden konnten. c: Gruppe caseinolytischer Bestandteile, die durch Chymostatin (40 μM) gehemmt werden konnten.
12. SDS-PAGE von SCCE, gereinigt durch Affinitätschromatographie auf SBTI-Affigel 15. 12,5% Gel. 1: Nichtreduzierte Probe. 2: Reduzierte Probe. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite.
13. N-terminale Arninosäuresequenz von SCCE. Sternchen bezeichnen Unsicherheiten bei den angenommenen Cysteinen in den Positionen 7 und 9. Fragezeichen geben die Positionen an, in denen keine Aminosäurederivate festgestellt werden konnten, wo aber bei den nachfolgen-den Schritten keine Ertragsabfälle auftraten.
14. Charakterisierung der monoklonalen Antikörper TE4b und TE9b mittels Immunfällung und Immunblotting.

a: Coomassie-gefärbte 12,5%-SDS-PAGE, nichtreduzierende Bedingungen.

Reihe 1:	Molekulargewichtsmarker
Reihe 2:	KC1-Extrakt, aus dissoziierten plantaren Corneocyten wie in Beispiel 3.1 beschrieben hergestellt
Reihe 3:	SCCE, durch Affinitätschromatographie auf unlöslich gemachtem Sojabohnen-Trypsininhibitor wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt.

b: Zymographie von Immunpräzipitaten in 12,5% SDS-PAGE mit 0,1% co-polymerisiertem, hitzedenaturiertem Casein, Coomassie-gefärbtem Gel.

Reihe 1:	Molekulargewichtsmarker
Reihe 2:	KCl-Extrakt, wie in a dialysiert
Reihe 3–6:	Solubilisierte Immunpräzipitate mit (von links nach rechts) moab TE4b (20 μg), moab TE9b (10 μg), moab PZ (10 μg), und phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Moab PZ ist ein monoklonaler Mäuse-Antikörper vom IgG 1-Kappa-Typ gegen α2-PAG (pregnancy zone protein) und wurde als nicht verwandte Kontrolle verwendet.

c: Immunblot von 12,5% der SDS-PAGE (nichtreduzierende Bedingungen).

Reihe 1:	Biotinylierte, mit Alkaliphosphatase-konjugiertem Avidin (BioRad) festgestellte Molekulargewichtsmarker. Die elektrophoresierten Proben in den Reihen 2, 4, und 6 sind die gleichen wie in Reihe 2 in a, und in den Reihen 3, 5 und 7 die gleichen wie in Reihe 3 in a.
Reihen 2 u. 3:	Erster Antikörper = moab TE4b, 0,2 μg pro ml.
Reihen 4 u. 5:	Erster Antikörper = moab TE9b, 0,1 μg pro ml.
Reihen 6 u. 7:	Erster Antikörper = moab PZ, 0,1 μg pro ml.
	Die Pfeilspitzen in a–c bezeichnen die relativen Molekulargewichte (von oben nach unten 93, 66, 45, 31, 22 bzw. 14 kD.

15. 15 zeigt das Plasmid pS500. Dieses Plasmid enthält die in pUC19 clonierte cDNA des menschlichen SCCE in voller Länge. Zu Details siehe Beispiel 6.
16. Northern Blots mit aus menschlicher Epidermis hergestellter mRNA. Poly-T-gereinigte RNA, entsprechend etwa 100 g Gesamt-RNA wurde in jeder Reihe aufgebracht. 1: Hybridisierung mit einer Sonde aus einem 1070 bp-Hinc 2/Hinc 2-Fragment SCCE-cDNA. 2: Hybridisierung mit einer Sonde aus einem 655 bp-Hinc 2/Bgl2-Fragment SCCE-cDNA.
17.

a: Coomassie-gefärbte SDS-PAGE, 12,5%-Gel. 1 und 2: PBS-Triton X-100-unlösliche Präzipitate ultraschallzertrümmerter TG 2-Zellen, die mit pS510 bzw. pS511 transformiert und mit IPTG induziert wurden. 3: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum gereinigtes SCCE.
b: Immunblots mit Hühner-Präimmunserum (1–3) und Hühner-anti-SCCE (4–6). 1 und 4: Mit pS510 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen, 2 und 5: Mit pS511 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen. 3 und 6: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum gereinigtes SCCE.

Die Proben wurden durch Kochen in Probenpuffer mit Mercaptoethanol hergestellt.
18. 18 zeigt eine zirkuläre Karte des Expressionsvektors pS507, der wie im Beispiel 9 beschrieben konstruiert wurde. Der Vektor pS507 vermittelt die Expression von rekombinantem menschlichem SCCE in Säugerzellen.

19. 19 zeigt die Analyse der Expression des rekombinanten menschlichen SCCE-Gens von pS507 in Säugerzellen.

Reihe 1:	RNA aus C127-Zellen.
Reihe 2:	RNA aus einem isolierten Clon, 1 : 24, von mit pS507 transfizierten C127-Zellen.
Reihe 3:	RNA aus einem Populationsgemisch von mit pS507 transfizierten C127 Clones.
Reihen 4 u. 5:	RNA aus C127-Zellen, die mit einem Expressionsvektor, pS147, transfiziert wurden, der außer dem Fehlen der SCCE-cDNA-Sequenz mit pS507 identisch ist. Die Größenmarker sind links angegeben.

20. SDS-PAGE mit anschließendem Immunblotting von in C127-Zellen-exprimiertem SCCE.

Reihen 1 u. 6:	Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 um 18,5 kDa)
Reihe 2:	pS507/C127, Gemisch, T-Kolben
Reihe 3:	pS507/C127, Gemisch, Roller A
Reihe 4:	pS507/C127, Gemisch, Roller B
Reihe 5:	Negative Kontrolle pS522/C127
Reihe 7:	Aus Stratum corneum hergestelltes natives SCCE
Reihe 8:	pS507/C127, Clon 24, T-Kolben
Reihe 9:	pS507/C127, Clon 24, Roller A
Reihe 10:	pS507/C127, Clon 24, Roller B

21. SDS-PAGE (A) und Immunblotting (B) von rekombinantem SCCE, gereinigt aus C127 Zellkulturmedium mit Zellen, die das Plasmid pS507 enthalten.

Reihen 1 u. 5:	Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa)
Reihe 2:	Zellmedium vor der Reinigung
Reihe 3:	Ungebundenes, aus der Chromatographie gewonnenes Material
Reihe 4:	Mit dem Niedrig-pH-Puffer eluiertes gebundenes Material

22. Aktivitätstest von nativem SCCE und aktiviertem rekombinantem SCCE auf einem Casein-Polyacrylamidgel.

Reihen 1 u. 10:	Molekulargewichtsmarker (Pharmacia 14–94 kDa)
Reihe 2:	Natives SCCE.
Reihe 3:	Natives SCCE.

Reihen 4–6:	Rekombinantes SCCE, 1 Stunde lang, 3 Stunden lang bzw. über Nacht gespaltet (460 ng/Vertiefung).
Reihe 7:	Trypsin in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch in Abwesenheit von APMSF.
Reihe 8:	Trypsin in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch in Anwesenheit der gleichen Menge APMSF wie in den Proben.
Reihe 9:	Wie Reihe 3.

23. Immunblot von N-Glycosidase F^®-behandeltem nativem und rekombinantem SCCE. Die Proben wurden auf 8–18% SDS-PAGE getrennt und wie vorstehend beschrieben immungeblottet.

Reihe 1:	Molekulargewichtsmarker (Molekularmassen von oben nach unten: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa.
Reihen 2 u. 3:	Rekombinantes SCCE, 0,3 bzw. 3 μg.
Reihen 4 u. 5:	Rekombinantes SCCE, 1,5 bzw. 1,8 μg. Die Proben in den Reihen 3 und 5 wurden mit N-Glycosidase F^® behandelt.

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Hinweise auf die Tatsache, daß die Zellabschuppung von der Oberfläche der verhornten Oberflächenschicht der Haut mit der Degradation der desmosomalen Proteine einhergeht, und daß das dafür verantwortliche Enzym eine Chymotrypsinähnliche Serinproteinase zu sein scheint, die durch Zinkionen gehemmt werden kann
1.1 Desquamation im Stratum corneum
Ziel der Studie war es, die Natur der für die Zellkohäsion und Oberflächenzelldissoziation (Desquamation) verantwortlichen Mechanismen in der verhornten Schicht der Haut, dem Stratum corneum, zu erhellen. Ein Stück Stratum corneum von 0,3–0,6 mm Dicke wurde parallel zur Hautoberfläche von unter der Ferse eines Probanden mit normaler Haut herausgeschnitten. Das Gewebestück wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Natriumazid eingeweicht, und die an der in vivo nach außen gerichteten Seite lose anhaftenden Zellen wurden abgeschabt. Ein mm dicke, senkrecht zur Gewebeoberfläche geschnittene Scheiben wurden dann in ein Medium gelegt, das 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und 0,45% Agarose enthielt; dies geschah unmittelbar vor dem Gelieren des Mediums aufgrund des Agarosegehalts. Nach Inkubationszeiten von 0,5 und 15 Stunden bei 37 °C wurden Gelstücke mit Gewebe auf Trockeneis eingefroren. Auf einem Kryostaten wurden 20 μm-Kryostatschnitte senkrecht zur Hautoberfläche geschnitten, aufgezogen und in einem Phasenkontrastmikroskop untersucht. Es wurde ein kontinuierliches, unipolares Abschuppen der Zellen von Stücken von plantarem Stratum corneum, die in vitro inkubiert worden waren, beobachtet (1). Die Zellen schuppten nur von der Seite ab, die in vivo nach außen gezeigt hatte. Der beobachtete Vorgang glich somit der Desquamation.
1.2. Auswirkungen von Temperatur, pH-Wert und Enzyminhibitoren
Dann wurde ein Verfahren zum Quantifizieren der Zellabschuppung entwickelt, das Studien zu den Auswirkungen verschiedener Parameter, wie Temperatur, pH-Wert und Enzyminhibitoren erlaubte. Mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug wurden aus dem Gewebestück, das wie vor-stehend in 1.1 beschrieben entnommen und von lose anhaftenden Oberflächenzellen befreit worden war, Zylinder von 3 mm Durchmesser von plantarem Stratum corneum ausgestochen. Die Zylinder (mit einer definierten Fläche, die in vivo nach außen gezeigt hatte) wurden in 0,5 ml Medium mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und mit oder ohne Aprotinin (4 × 10^–6 mol/l) (Boehringer Mannheim, Deutschland) in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen 5, 10 und 20 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann 10 Sek. auf einem Vortex-Mixer geschüttelt, um dissoziierte Oberflächenzellen freizusetzen. Das verbleibende Gewebe wurde entfernt und zur weiteren Inkubation in frisches Medium gegeben. Die Röhrchen mit den freigesetzten Zellen wurden 2 Minuten lang bei 5000 g zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellpräzipitate wurden einmal mit 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und dann 1,5 Stunden lang bei 60 °C mit 0,6 ml 1 M Natriumhydroxyd behandelt. Das alkalilösliche Protein wurde gemäß Lowry et al., 1951 quantifiziert und als Maß für die Menge der freigesetzten Zellen genommen. Die Ergebnisse werden in 2. gezeigt.
In ähnlicher Weise wurden die Auswirkungen verschiedener potentieller Inhibitoren (Aprotinin, Sojabohnen-Trypsininhibitor, Pepstatin (Boehringer Mannheim, Deutschland) und Jodacetamid (Sigma, St. Louis, MO) untersucht. Es wurden einzelne 2 mm-Gewebezylinder her-gestellt und mit Medium mit oder ohne verschiedenen potentiellen Inhibitoren in den in der Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, und die freigesetzten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben quantifiziert. Beachte, daß dem Inkubationsmedium EDTA (das ein Inhibitor von Metallproteinasen ist) hinzugefügt wurde, um optimale Zellfreisetzungsraten zu erhalten.
TABELLE 1 Auswirkung von Proteaseinhibitoren auf die Zellfreisetzung von plantarem Stratum corneum in vitro. Mittelwert und Standardabweichung aus 5 inkubierten Gewebestücken.
Es zeigte sich, daß die Serinproteinaseninhibitoren Aprotinin und Sojabohnen-Trypsininhibitor die Zellabschuppung wirksam hemmten (2 und Tabelle 1 vorstehend). Da diese zwei Substanzen hemmend wirkten, aber die Inhibitoren von Metallproteinasen (EDTA), Thiolproteinasen (Jodacetamid) und Aspartoproteasen (Pepstatin) nicht, wurde daraus geschlossen, daß an dem beobachteten Vorgang eine Serinprotease teilnimmt. Es wurde auch geschlossen, daß die Zellkohäsion im Stratum corneum von Proteinstrukturen abhängt, und daß ein dem in vitro beobachteten ähnlicher Mechanismus auch bei der in vivo-Abschuppung wirken muß (Lundström und Egelrud, 1988).
In weiteren Studien zur Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro wurde her-ausgefunden, daß der Vorgang in zwei separate Schritte aufgeteilt werden konnte. Der erste Schritt findet unabhängig davon statt, ob EDTA im Inkubationsmedium vorhanden ist oder nicht. Der zweite Schritt geschieht nur in Gegenwart von EDTA. Der erste Schritt konnte außer durch Aprotinin durch Chymostatin und Zinkionen gehemmt werden. Der zweite Schritt konnte durch Aprotinin und Chymostatin gehemmt werden (Lundström und Egelrud, 1990 a). Chymostatin ist ein Proteinaseninhibitor von niederem Molekulargewicht mit chymotrypsinartiger Substratspezifität. Es ist weiterhin festgestellt worden (Lundström und Egelrud, 1990 a), daß Leupeptin, ein Proteinaseninhibitor von niederem Molekulargewicht mit trypsinartiger Substratspezifität, keinen Einfluß auf die in vitro-Zellabschuppung hatte.
Die Proteinstrukturen, die am wahrscheinlichsten für die Zellkohäsion im Stratum corneum verantwortlich sind, und die somit mögliche Kandidaten für eine Degradation im Zug der vor-stehend beschriebenen desquamationsartigen Zellabschuppung darstellen, sind die Desmosomen. Ein Desmosom besteht aus zwei symmetrischen Hälften, die sich in benachbarten Zellen befinden. Die beiden Hälften sind im extrazellulären Raum durch Desmogleine genannte Transmembranproteine verbunden.
1.3. Das Schicksal von Desmoglein I (DG I) während der Zellabschuppung in vitro
Es wurde das Schicksal von Desmoglein I (DG I) während der Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro untersucht. Plantares Stratum corneum wurde wie vorstehend in 1.1 beschrieben inkubiert, und noch zusammenhängendes Gewebe wurde von dissoziierten Zellen getrennt. Zellen und Gewebe wurden in einem Puffer von 0,1 M Tris-HCl, pH 9,9 M Harnstoff, 2% Natriumdodecylsulfat, 1% Mercaptoethanol, 1 ml Puffer auf 20 mg Gewebe 15 Stunden lang bei 37°C extrahiert. Die Extrakte wurden für Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 7,5%-Gelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) nach Laemmli (Laemmli, 1970) vorbereitet, gefolgt von elektrophoretischem Transfer (Towbin et al., 1979) auf eine Nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Richmond, CA), die mit einem polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen aus Rindermäulern gereinigtes DG I hergestellt worden war, (Gorbsky et al., 1985), sondiert wurde. Gebundene Antikörper wurden mit Alkaliphosphatasekonjugierten anti-Kaninchen Immunglobulinen von Ziegen (BioRad, Richmond, CA) festgestellt (Blake et al., 1984).
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Die Probenmengen, die zum Immunblot hinzugefügt wurden, wurden so eingestellt, daß sich für zusammenhängendes Gewebe und dissoziierte Zellen ungefähr die gleichen Proteinkonzentrationen (durch visuelle Inspektion der mit Coomassieblau gefärbten SDS-PAGE-Gele abgeschätzt) ergaben. Es wurden Durchgänge mit mehreren Verdünnungen vorgenommen, um einen semiquantitativen Vergleich der verschiedenen anti-DG Ireaktiven Bestandteile in zusammenhängendem Stratum corneum und dissoziierten Zellen zu ermöglichen.
Wenn noch zusammenhängendes Gewebe und dissoziierte Zellen getrennt extrahiert wurden, zeigte es sich, daß, während das noch zusammenhängende Gewebe nur scheinbar intaktes DG I enthielt, die dissoziierten Oberflächenzellen nur mutmaßliche Degradationsprodukte dieses Proteins enthielten (3).
In 4 und 5 werden die Auswirkungen von Aprotinin, Zinkionen, Chymostatin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) und Leupeptin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) auf die Degradation von DG I während der Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro gezeigt.
Zuerst wurde der zeitliche Verlauf und die Auswirkung von Aprotinin auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum corneum im Zug der Zellabschuppung in vitro untersucht. Es wurden Extrakte aus plantaren Stratum corneum wie vorstehend in 1.2 be-schrieben (aber ohne Abtrennung des zusammenhängenden Gewebes von dissoziierten Zellen vor der Extraktion) in Abwesenheit oder Gegenwart von Aprotinin (15 μM) inkubiert und nach 0, 6, 12 oder 24 Stunden extrahiert. SDS-PAGE und Immunblotting wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Das densitometische Scannen der Immunblots wurde auf einem Shimadzu CS-9000 Lichtpunktscanner (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit reflektiertem Licht bei 560 nm im Zickzackmodus ausgeführt. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Beachte die wirksame Inhibition der Degradation von DG I durch Aprotinin.
Dann wurde die Auswirkung von Zinkionen, Chymostatin und Leupeptin auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) im plantarem Stratum corneum während der Zellabschuppung in vitro untersucht. Der Versuch war wie vorstehend umrissen aufgebaut. Die Inkubationen wurden 24 Stunden lang mit Zinksulfat bei Konzentrationen von 0, 1 oder 5 mM und mit Chymostatin oder Leupeptin bei Konzentrationen von 330 μM ausgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Inhibition der Transformation von anti-DG I-positiven Bestandteilen von 160 kD bis 95 und 80 kD durch Zinkionen und Chymostatin, aber nicht durch Leupeptin.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß Aprotinin, Zinkionen und Chymostatin hemmend wirkten, Leupeptin hingegen nicht. Somit war das inhibitorische Profil für die Degradation von DG I das gleiche wie für die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro (Lundström und Egelrud, 1990 b).
Es wurde als wichtig erachtet, zu demonstrieren, daß Mechanismen, die jenen der Zellabschuppung von palmo-plantarem Stratum corneum ähneln, auch im Stratum corneum der Haut von anderen Körperstellen als den Handflächen und Fußsohlen wirken. Takahashi et al. (Takahashi et al., 1987) hatte berichtet, daß ein Gemisch der der Detergentien N,N-Dimethyldodecylaminoxid (Sigma, St. Louis, MO) und Natriumdodecylsulfat (Bio-Rad, Richmond, CA) in einer molaren Verhältnis von 8 : 2 in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum, das durch Trypsinisierung von ganzer Epidermis präpariert worden war, Zeltdissoziation hervorrief. Um eine Kontamination durch exogenes Trypsin zu vermeiden, wurden die Stanzbiopsien von normaler menschlicher Haut aus der glutealen Region bei pH 8 mit dem vorgenannten Detergentiengemisch und EDTA (Egelrud und Lundström, 1990) inkubiert. Es stellte sich heraus, daß die verhornte Schicht unter diesen Bedingungen zu einzelnen Zellen dissoziierte. Die Hinzufügung von Aprotinin zum Inkubationsmedium verhinderte diese Zelldissoziation. Daraus wurde geschlossen, daß auch in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum die Zellkohäsion von Proteinstrukturen abhängt, daß die Desquamation in diesem Gewebe von Proteolyse abhängt, und daß das Gewebe eine Proteinase enthält, die diese Proteolyse katalysieren kann. Da die Zelldissoziation nur das Stratum corneum und nicht die tieferen, nichtverhornten Epidermisschichten betraf, wurde gefolgert, daß die verantwortliche Proteinase in den tieferen Schichten in einem inaktiven oder inhibierten Zustand vorhanden ist.
BEISPIEL 2
Die Entdeckung des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE): eine Proteinase, die die Kriterien erfüllt, um für die Degradation intrazellulärer kohäsiver Strukturen im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo verantwortlich zu sein.
Aus den in Beispiel 1 dargestellten Versuchen wurde gefolgert, daß die für die unipolare Oberflächen-Zelldissoziation im in vitro-Modell der Desquamation in plantarem Stratum corneum verantwortliche Proteinase folgende Eigenschaften haben müßte:

1. Sie muß im Stratum corneum anwesend sein.
2. Sie muß eine Serinproteinase sein.
3. Sie müßte eine chymotrypsinartige Substratspezifität und ein Inhibitorprofil aufweisen, das jenem ähnlich ist, das bei der in vitro-Zellabschuppung und bei der damit einher-gehenden Degradation von Desmoglein I beobachtet wurde.
4. Sie müßte eine extrazelluläre Lokalisierung im Stratum corneum haben.
5. Sie müßte eine pH-Abhängigkeit haben, die es ihr erlaubt, unter physiologischen Bedingungen aktiv zu sein, wobei der pH-Wert des Stratum corneum um die 4.5-6 beträgt.
6. Da die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro über lange Inkubationszeiten hinweg kontinuierlich fortschreitet, selbst wenn das Volumen des Inkubations-mediums im Vergleich zum Volumen der inkubierten Gewebestücke sehr groß ist, oder wenn das Inkubationsmedium während des Inkubationsverlaufs zu wiederholten Malen gewechselt wird, scheint Grund zur Annahme zu bestehen, daß das verantwortliche Enzym in einer Weise an das Gewebe gebunden ist, die seine Extraktion ins Inkubations-medium während des Inkubationsverlaufs nicht erlaubt.

Die folgenden beiden Versuche führten zur Entdeckung von SCCE (Egelrud und Lundström, 1991):
2.1. Mit der Dissoziation plantarer Corneocyten verbundene Enzymaktivität
Dissoziierte plantare Stratum corneum-Zellen (Corneocyten) wurden durch Inkubation von plantarem Stratum corneum wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Zellen wurden durch ein Nylonnetz mit 100 pm Durchlaßgröße filtriert und dann dreimal in zehn Volumina von 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 mM EDTA und dreimal in 0,1 M Tris-HCl, pH 8 gewaschen. Dann wurden die Zellen mit zwei Typen chromogener Proteinasesubstrate, S-2288 oder S-2586 (Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden) inkubiert: Ile-Pro-Arg-p-Nitroanilid (S-2288) wird von einem breiten Spektrum von Serinproteinasen mit Argininspezifität (z.B. Trypsin) gespaltet. Arg-Pro-Tyr-p-Nitroanilid (S-2586) ist ein Substrat für chymotrypsinartige Proteinasen.
In einem Gesamtvolumen von 120 μl enthielt jedes Reaktionsgemisch 0,07 M Tris-HCl, pH 8, 0,1% Natriumazid, 1, 2,5, 5 oder 10 μl einer 25%igen Suspension von gewaschenen plantaren Corneocyten und 1,04 mM (S-2586) oder 1,25 mM (S-2288) Substrat. Nach 5stündiger Inkubation bei 37 °C in Mikrotiterplatten wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 125 μl 10%iger Essigsäure gestoppt. Die Zellen wurden sedimentieren gelassen und 200 μl von je-dem Überstand in neue Vertiefungen transferiert. Die Hydrolyse der beiden Substrate wurde durch Messen der Veränderung des Absorptionsverhaltens bei 405 nm verfolgt, nachdem die Zellen in einem Behring-Elisaverarbeitungsgerät (Behringwerke, Marburg, Deutschland) entfernt worden waren.
Wie in 6 gezeigt, existierte eine mit der Dissoziation plantarer Corneocyten einhergehen-de Enzymaktivität, die die Hydrolyse von S-2586 katalysierte. Im Vergleich dazu war die Aktivität gegenüber S-2288 niedrig.
Dann wurde die pH-Abhängigkeit der 5-2586-hydrolysierenden Aktivität untersucht. Der Versuchsaufbau war wie vorstehend umrissen, wobei 10 μl einer 25%igen Suspension gewaschener plantarer Corneocyten und Puffer mit verschiedenen pH-Werten (Natriumacetat, Natriumphosphat oder Tris-HCl) verwendet wurden. Die Endkonzentrationen der Puffer waren 0,07 M. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt, aus welcher hervorgeht, daß die Aktivität bei pH 7–8 optimal, aber auch bei pH 5.5 signifikant war.
In einem weiteren Versuch wurden die Auswirkungen von EDTA, Metallionen und Proteinaseninhibitor auf die Hydrolyse von S-2586 bei pH 8 durch die mit suspendierten plantaren Stratum corneum-Zellen assoziierte Proteinase untersucht. Der Versuchsaufbau war wie vor-stehend und in Tabelle 2 umrissen. TABELLE 2 Auswirkungen von EDTA, Metallionen und Proteinaseinhibitoren auf die Hydrolyse von S-2586 durch die mit den plantaren Stratum corneum-Zellen assoziierte Proteinase (Enzym-quelle: suspendierte Zellen)

^a in der Testmischung vorhandene Substanz
^b eine 25%ige Suspension von plantaren Stratum corneum Zellen, die wie im Text beschrieben hergestellt worden war, wurde 1 Stunden lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1 mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO) in 2-Propanol aufgelöst (Endkonzentration von 2-Propanol 4% v/v). Die Kontrollen wurden nur mit 4% 2-Propanol inkubiert.
^c Inhibitor in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Alle Medien, einschließlich der Kontrollen, enthielten 5% (v/v) DMSO.

Wie in der vorstehenden Tabelle 2 gezeigt, inhibierten Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF; ein genereller Inhibitor von Serinproteinasen), Aprotinin, Sojabohnen-Trypsininhibitor, Chymostatin (ein Chymotrypsininhibitor) und Zinkionen, nicht aber Leupeptin (ein Trypsininhibitor) die Hydrolyseaktivität des S-2586. Das Inhibitorprofil war somit jenem sehr ähnlich, das bei der in vitro-Zellabschuppung und der damit einhergehenden Degradation von Desmoglein I beobachtet wurde.
2.2. Zymographie von dissoziiertem plantarem Stratum corneum
Es wurde festgestellt, daß das in 2.1 entdeckte, für die S-2586-hydrolysierende Aktivität verantwortliche Enzym solubilisiert werden konnte, wenn die Corneocyten mit 1 M KCl in 0,1 M Tris-HCL, pH 8 extrahiert wurden. Deshalb wurden Versuche mit Zymographie ausgeführt. Zu diesem Zweck wurden KCl-Extrakte aus Corneocyten gemäß Laemmli (Laemmli, 1970) für die Elektrophorese hergestellt, aber ohne Reduktionsmittel im Probenpuffer und ohne Erhitzen der Proben. Es wurden auch Proben mittels Extraktion von dissoziierten plantaren Corneocyten mit Laemmli'schem Probenpuffer ohne Reduktionsmittel bei Raumtemperatur hergestellt. Für die Zymographie wurde eine Modifikation des Verfahrens von Horie et al. (Horie et al., 1984) angewandt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) wurde gemäß Laemmli in 12,5%-Gelen mit 1% co-polymerisiertem, hitzedenaturiertem Casein ausgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Puffer von 2% Triton X-100 getränkt, um das SDS zu entfernen und dann 15 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Gele wurden dann mit Coomassieblau gefärbt. Die separierten caseinolytischen Enzyme traten als helle Banden gegen einen blauen Hintergrund auf. Vgl. auch die Legende zu 8 zu Versuchsdetails.
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Die Extrakte aus plantaren Corneocyten enthielten ein caseinolytisches Hauptenzym mit einem scheinbaren Molekulargewicht von um die 25 kD. Es gab auch kleinere caseinolytische Enzyme mit Molekulargewichten um die 30 kD. (Diese kleineren Bestandteile sind in der Figur nicht klar zu sehen. Später wurde herausgefunden, daß sie durch Leupeptin, nicht aber durch Chymostatin gehemmt werden konnten.) Das 25 kD-Enzym hatte eine signifikante Aktivität bei pH 5.5 bis 8. Es wurde durch Aprotinin, Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin gehemmt. Somit hatte es das gleiche Inhibitorprofil wie die vorstehend beschriebene 5-2586-hydrolysierende Aktivität. Bei Versuchen mit Gelausschlußchromatographie (nicht gezeigt) zeigte es sich, daß das caseinolytische 25 kD-Enzym mit der 5-2586-hydrolysierenden Aktivität co-chromatographierte.
In weiteren Versuchen (nicht gezeigt) mit der gleichen Technik, wie vorstehend für 2.2 beschrieben, ergab sich, daß nicht-palmo-plantares Stratum corneum ein Enzym mit Eigenschaften enthält, die mit jenen der 25 kD-Proteinase, die mit plantaren Corneocyten assoziiert ist, identisch ist, und das von jetzt an Stratum corneum chymotryptisches Enzym (SCCE) (Lund-ström und Egelrud, 1991) genannt wird.
Es war auch möglich, Hinweise darauf zu gewinnen, daß SCCE mit plantaren Corneocyten in einer Weise assoziiert ist, die es ihm erlaubt, im extrazellulären Raum des Stratum corneum aktiv zu sein. Dies geschah, indem zuerst gezeigt wurde, daß die dissoziierten Corneocyten für Meerrettichperoxidase (Mr 44 kD) impermeabel sind. Dann wurde gezeigt, daß menschliches Fibrinogen (Mr 340 kD) von einer Corneocytensuspension degradiert werden konnte, und daß diese Degradation von den gleichen Inhibitoren wie SCCE gehemmt werden konnte. Es konnte ausgeschlossen werden, daß die Degradation von Fibrinogen aufgrund von solubilisiertem Enzym geschah (Egelrud, 1992).
BEISPIEL 3
Teilweise Reinigung von Stratum corneum chymotryptischem Enzym (SCCE) und Proteinase-tests mit chromogenen Substraten
3.1 Herstellung von KCl-Extrakten aus plantaren Corneocyten
Die Herstellung dissoziierter plantarer Corneocyten, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in größerem Maßstab durchgeführt, und es wurden wie in Beispiel 2 beschrieben KCl-Extrakte aus gewaschenen plantaren Corneocyten, die SCCE enthielten, hergestellt.
Die Herstellung von KCl-Extrakten aus plantaren Corneocyten wird nachstehend in Tabelle 3 schematisch dargestellt. Hyperplastisches menschliches plantares Stratum corneum wurde durch Zusammenarbeit mit der Gesellschaft der schwedischen Pediküristen gewonnen. Es wurde nur Material verwendet, das durch Abzwicken oder Abschneiden gewonnen worden war. Von Füßen mit gestörter Abschuppung wurde kein Material gewonnen. Vor dem Versand wurde das Stratum corneum luftgetrocknet und in Plastiksäckchen verpackt. Im Labor wurde es bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
TABELLE 3 Schematische Darstellung der Herstellung von SCCE-haltigen KCl-Extrakten aus dissoziierten plantaren Corneocyten.
Für jeden nachfolgenden Affinitätschromatographieschritt wurden die Extrakte 1 und 2 aus zwei Präparaten von jeweils 50 g plantarem Stratum corneum vereinigt.
3.2. Proteinasetests mit chromogenen Substraten
Es wurde ein Vergleich von SCCE, Rinder-Chymotrypsin und menschlichem Cathepsin G hinsichtlich der Auswirkungen der Inhibitoren Aprotinin, Chymostatin, Zinksulfat und der Substratspezifität gemacht.
Es wurde eine Vorratslösung von MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) in destilliertem Wasser, eine von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Boehringer, Mannheim, Deutschland) in 1-Methyl-2-Pyrrolidon (Endkonzentration des Lösungsmittels in den Inkubationsgemischen 4%) und von Chymostatin in Dimethylsulfoxid (Endkonzentration des Lösungsmittels in den Inkubationsgemischen 1%) hergestellt. Cathepsin G aus eitrigem menschlichem Auswurf wurde von E. Lotti, Genf, Schweiz bezogen. Die SCCE-Quelle war KCl-Extrakt aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde. Die Quellen der Inhibitoren Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat waren wie vorstehend beschrieben.
Die Inkubationen wurden bei 37°C in Mikrotiterplatten vorgenommen. Das gesamte Inkubationsvolumen betrug 135 μl. Jedes Inkubationsgemisch enthielt Tris-HCl, pH 8.0 (Endkonzentration 0,18 M), KCl (Endkonzentration 0,2 M), 100 μl Substratlösung, 25 μl Enzymquelle (angemessen verdünnt in 0,1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1,1 M KCl) und 10 μl Inhibitorlösung.
In 9, A–C, wurde MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586, Anfangskonzentration 1,2 mM) als Substrat verwendet. In D betrug die Anfangskonzentration beider Substrate 1,2 mM.
Am Ende der Inkubationen (1,5 Stunden) wurden zu jeder Vertiefung 125 μl 11%iger Essig-säure hinzugefügt und die Absorption bei 405 nm abgelesen, wobei die Inkubationsgemische ohne hinzugefügte Enzyme als Nullproben dienten. Die Menge der hinzugefügten Enzyme wurde so eingestellt, daß sich am Ende der Inkubationen eine Veränderung der Absorption bei 405 nm von 0,3–0,7 ergab.
Die Ergebnisse sind in 9, A–D zusammengefaßt. Für die Untersuchungen zur Auswirkung von Inhibitoren wurde S-2586 als Substrat verwendet. Die Wirksamkeit von Aprotinin als Inhibitor von SCCE und Chymotrypsin war hoch und für die beiden Enzyme ungefähr gleich. Die Auswirkung auf Cathepsin G hingegen war viel geringer (9A). Chymostatin bewirkte eine Hemmung aller drei Enzyme, doch die Inhibitorkonzentration, die 50% Hemmung bewirkte, war für SCCE mehr als drei Größenordnungen höher als für Chymotrypsin und Cathepsin G (9B). Zinksulfat war ein wirksamer Inhibitor von SCCE, nicht aber von Chymotrypsin und Cathepsin G (9C). Die Aktivität der drei Enzyme gegen die Substrate MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) und Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA werden in 9D verglichen. Da es darum ging, Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen den untersuchten Enzymen herauszufinden, wurden diese Versuche nur bei einer Anfangskonzentration für jedes Substrat vorgenommen. Während Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA für Chymotrypsin und Cathepsin G ein wesentlich besseres Substrat als S-2586 zu sein schienen, ergab sich für SCCE das Gegenteil.
BEISPIEL 4
Reinigung und Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von Stratum corneum chymotryptischem Enzym
4.1. Reinigung von SCCE aus KCl-Extrakten von Corneocyten mittels Affinitätschromatographie auf unlöslich gemachtem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI)
10 zeigt die Ergebnisse der Affinitätschromatographie auf SBTI. Das Affinitätsgel wurde durch Verbinden von 50 mg SBTI (Boehringer, Mannheim, Deutschland) mit 12 ml sedimentiertem Affigel 15 (BioRad, Richmond, CA) nach den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Verbleibende aktive Gruppen auf dem Gel wurden mit Ethanolamin blockiert. Kombinierte KCl-Extrakte aus 100 9 (Trockengewicht) plantarem Stratum corneum (Gesamtvolumen 700 ml) wurden durch ein in eine Glassäule gepacktes 0,8 × 2 cm-Bett von SBTI-Affigel 15 laufen gelassen, Durchflußrate 42 ml/Stunde, wobei die Absorption des Eluats bei 280 nm kontinuierlich aufgezeichnet wurde. Die Säule wurde mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 1 M KCl gewaschen, bis die Absorption des Eluats unter 0,01 lag, und dann mit 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8. Die schrittweise Elution des gebundenen Materials wurde mit HCl bei 1, 10 und 100 mM ausgeführt. Das Eluant wurde gewechselt, wenn die Absorption des Eluats auf unter 1,01 gesunken war. In Teströhrchen, die Tris-HCl, pH 8, Gesamtvolumen 0,4 ml, enthielten, wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt, wobei die Menge so berechnet wurde, daß sie genügte, den pH-Wert des Eluats auf über 7 einzustellen. Der pH-Wert jeder einzelnen Fraktion wurde sofort überprüft und wenn nötig mit kleinen Volumina 1 M Tris-HCl, pH 8, auf etwa pH 7 eingestellt. Die Analysen der peptidhydrolysierenden Aktivität mit S-2586 (Substrat für SCCE) und S-2288 (Substrat für trypsinartige Enzyme) wurden wie in Beispiel 2.1. beschrieben ausgeführt. Die Anfangskonzentration beider Substrate in den Testgemischen betrug 1,1 mM. Etwa 90% der S-2586-hydrolysierenden Aktivität wurde an das Gel gebunden. Durch schrittweise Elution des gewaschenen Gels mit 10–100 mM HCl konnten ungefähr 60% der gesamten S-2586-hydrolysierenden Aktivität im verwendeten KCl-Extrakt wiedergewonnen werden. Von der gesamten S-2288-hydrolysierenden Aktivität wurden um die 20% an das Affinitätsgel gebunden, und 10% konnten im Eluat wiedergewonnen werden.
11 zeigt Analysen des Eluats aus der SBTI-Affinitätschromatographie mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von SDS (SDS-PAGE) und mit Zymographie. Es wurden nichtreduzierte Proben auf 12,5%-Gelen durchlaufen gelassen. Vgl. auch Egelrud und Lundström, 1991 und Beispiel 2, 2.2 zu Versuchsdetails. Bevor sie für die Elektrophorese vorbereitet wurden, waren die Proben in A mittels Zentrifugenfiltration mit Ultrafree-MC-Filter (Abtrennung bei 10 kD; Millipore, Bedford, MA) ungefähr 20fach konzentriert und in B 10fach verdünnt worden.
In 12 wird ein Vergleich mittels SDS-PAGE zwischen einer nichtreduzierten und einer reduzierten Probe der SBTI-Affinitätschromatographie gezeigt. Wie in den 10 und 11 gezeigt, ergab die SBTI-Affinitätschromatographie ein Protein, das zu mehr als 90% rein war (wie nach den Coomassieblau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen beurteilt wurde), mit scheinbarem Molekulargewicht um die 25 kD in nichtreduzierter Form und um die 28 kD in reduzierter Form. Darüberhinaus gab es eine kleine Coomassieblau-positive Komponente mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das etwa 1 kD größer war, als das der Hauptkomponente. Auf den Zymographiegelen war eine größere und eine kleinere Bande mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität wie die beiden auf den Coomassieblau-gefärbten Gelen bei nichtreduzierten Proben festgestellten Banden. Diese caseinolytischen Komponenten konnten beide durch Chymostatin gehemmt werden. Weiterhin zeigte die Zymographie kleinere Komponenten mit scheinbaren Molekulargewichten um die 30 kD, die durch Leupeptin gehemmt werden konnten. Es wurde gefolgert, daß der Hauptanteil des gereinigten Proteins SCCE war.
4.2 Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von SCCE
Zweihundert Mikroliter einer Fraktion aus einem Chromatogramm mit SBTI-Affigel 15, A_280nm 0,2, wurden für SDS-PAGE mit und ohne Reduktion vorbereitet und auf einem 12,5%-Polyacrylamidgel (Dicke 1 mm, Schlitzbereite 73 mm) durchlaufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Proteine elektrophoretisch auf einen Immobilon-Filter (Millipore) transferiert und mit Coomassieblau gemäß Matsuidaira, I987 gefärbt. Die Hauptproteinbande wurde ausgeschnitten und in einem Applied Biosystems 477A Puls-Flüssigphasen-Aminosäuresequenzanalysator mit einem PTH 120A Online-Analysator (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) verarbeitet. Die Sequenzierung geschah mit regulären Zyklusprogrammen und Chemikalien vom Hersteller. Die Anfangs- und die Wiederholungserträge betrugen 25% bzw. 97%, von den Standardproteinen her gerechnet.
Die Erträge von Aminosäurederivaten waren mit nur einem der sequenzierten Peptide kompatibel. Bei nichtreduzierten Proben waren die Erträge in den Schritten 1–6 gut, fielen aber in den Schritten 7 und 9 auf Null. Die Erträge in den nachfolgenden Schritten waren deutlich verringert. Auch bei reduzierten Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate festgestellt werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen Derivate festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen Abfälle der Erträge. Diese Ergebnisse legen nahe, daß sich in den Positionen 7 und 9 Cysteine befinden. Es war jedoch nicht möglich, in den Schritten 7 und 9 nach der Reduktion und Behandlung mit Jodessigsäure (100 mM) carboxymethylierte Cysteine zu entdecken. Die erhaltene Sequenz (13, SEQ ID NR: 3) war für reduzierte und nichtreduzierte Proben identisch.
BEISPIEL 5
5.1. Die Herstellung SCCE-spezifischer monoklonaler Antikörper
BALB/c-Mäuse (Bomholtgaard, Dänemark) erhielten ungefähr 30 μg natives SCCE, das wie in Beispiel 4.1 beschrieben in Freund'schem vollständigem Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) gereinigt worden war, als subcutane Injektionen. Die Injektionen mit der gleichen Menge SCCE in Freund'schem unvollständigem Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI) wurden nach einem Monat wiederholt. Vier Monate nach der ersten Injektion erhielt eine Maus an drei aufeinanderfolgenden Tagen intravenöse Auffrischungsimpfungen; 30 μg Antigen pro Injektion. Die Hybridome wurden mit dem bei Carlsson et al., 1985 beschriebenen Verfahren mit Zellen der SP2/0-Myelomzellinie (ATCC CRL 1581) hergestellt. Die Bestimmung der mit dem gereinigten SCCE-Präparat reagierenden Antikörper wurde mit einer ELISA-Technik ausgeführt. Die Kulturtberstände von positiven Clones wurden mittels Immunoblotting nach SDS-PAGE weiter analysiert. Clone, die Antikörper produzierten, die in diesem Test mit SCCE reagierten, wurden in Mäuse-Ascitesfluid propagiert, und die Antikörper wurden durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt und mit dem in Carlsson et al., 1985 beschriebenen Verfahren klassifiziert. Es wurden zwei nutzbare Antikörper erhalten, moab TE4b moab TE9b, die beide als IgG₁-Kappa klassifiziert wurden.
Die Charakterisierung der moabs TE4b und TE9b mittels Immunfällung und Immunblotting wird in 14 gezeigt.
14a (Reihe 2) zeigt ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel mit einem konzentrierten KCl-Extrakt aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der wie in Beispiel 3.1. beschrieben hergestellt wurde. Die Probe wurde 4 Stunden lang gegen 0,1 M Natriumacetat, pH 4, dialysiert und durch Ultrafiltration etwa 100fach konzentriert, bevor sie für die Elektrophorese vorbereitet wurde. 14a (Reihe 3) zeigt ein SCCE-Präparat, das wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt wurde.
14b zeigt die Ergebnisse eines Immunfällungsversuchs, bei dem Antikörper mit einem KCl-Extrakt von Corneocyten inkubiert worden waren und dann mit unlöslich gemachtem Protein A zurückgewonnen wurden. Die resolubilisierten und dissoziierten Antigen-Antikörper-Komplexe wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durch Zymographie analysiert.
250 μl eines KCl-Extraktes aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der durch Ultrafiltration 5fach konzentriert und gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert worden war, und zu dem Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) bis zu einer Endkonzentration von 10 mg pro ml hinzugefügt worden war, wurde mit 10 μl Antikörperlösung oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung vermischt und 15 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Dann wurde zu den Röhrchen 25 μl sedimentierte Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) hin-zugefügt, und die Inkubation ging mit leichtem Schütteln über 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter. Das Gel wurde durch Zentrifugierung wiedergewonnen und fünfmal mit 1 ml 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) in 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl gewaschen. Nach den letzten Waschen wurde das Gel mit 100 μl Laemmli'schem Probenpuffer mit Reduktionsmittel 1 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte wurden durch Zentrifugieren gereinigt und auf das Gel aufgetragen.
Die moabs TE4b und TE9b fällten beide ein caseinolytisches Enzym mit dem gleichen Mr wie gereinigtes SCCE und das entsprechende caseinolytische Hauptenzym im KCl-Extrakt. Die Antikörper fällten keine kleineren caseinolytischen Enzyme mit Mr um die 30 kDa, von denen gezeigt wurde, daß sie durch Leupeptin, einem Inhibitor trypsinartiger Serinproteinasen gehemmt werden. Zusätzlich zu den caseinolytischen 25 kDa-Enzymen schienen die Antikörper noch eine kleinere proteolytische Komponente mit Mr um die 80 kDa zu binden. Diese Komponente findet sich gewöhnlich in KCl-Extrakten von plantaren Corneocyten, die aus Gewebe hergestellt wurden, das vor der Präparation getrocknet worden war; sie findet sich jedoch nicht in Präparaten aus frischem Gewebe (T. Egelrud, unveröffentlichte Beobachtung). Sie findet sich nicht in SCCE-Präparaten, die durch Affinitätschromatographie gereinigt wurden, und sie könnte ein Aggregationsprodukt darstellen. Es war nicht möglich, eine entsprechende Komponente festzustellen, die mit den Antikörpern auf Immunblots reagierte.
Auf Immunblots von SDS-PAGE-Gelen, die unter nichtreduzierenden Bedingungen gefahren wurden (14c), reagierten die moabs TE4b und TE9b mit einer in KCl-Extrakten von plantaren Corneocyten (14c, Reihen 2 und 4) und im gereinigten SCCE-Präparat (14c, Reihen 3 und 5) vorhandenen Komponente, die beide das gleiche Mr wie das gereinigte Haupt-Protein und die caseinolytische Hauptkomponente in Zymogrammen hatten. Die Antikörper reagierten nicht mit Proben, die in Gegenwart von SDS reduziert worden waren, was die Annahme nahelegt, daß sie gegen konformationsabhängige Epitope gerichtet sind.
Zusätzlich zum Hauptprotein mit Mr um die 25 kD in nichtreduzierter Form, enthält das gereinigte SCCE-Präparat eine kleinere, Coomassie-positive Komponente mit Mr um die 26 kD (nicht reduziert; vgl. Beispiel 3). Auf Zymogrammen findet sich eine entsprechende caseinolytische Komponente, die mit Chymostatin in einer Weise gehemmt werden kann, die der der caseinolytischen 25 kD-Hauptkomponente ähnelt (vgl. Beispiel 3). Bei höherer Konzentration der moabs TE4b und TE9b (Ergebnisse nicht gezeigt) konnte man sehen, daß auch diese kleinere Komponente auf Immunblots mit den Antikörpern reagierte. Ähnliche Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden mit einem polyclonalen, gegen die Coomassie-positive Hauptkomponente hervorgerufenen Kaninchenantikörper erhalten, der durch vorbereitende Elektrophorese gereinigt worden war. Die genaue Verwandtschaft zwischen den zwei Proteinen mit SCCE-artiger Aktivität und anscheinender immunologischer Kreuzreaktion ist nicht bekannt.
5.2. SCCE-spezifische polyclonale Antikörper
5.2.1. Hühner-anti-SCCE
45 μg SCCE, die durch SBTI-Affinitätschromatographie wie im Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt worden waren, in 0,2 ml 0,1 M Tris-HCl, wurden 60 Minuten lang bei 60°C hitzedenaturiert und in einem gleichen Volumen Freund'schem vollständigem Adjuvans (Difco Laboratories) homogenisiert. Die erhaltene Emulsion wurde Derco-Hühnchen, etwa 20 Wochen alt, subcutan injiziert, von denen eine Blutprobe zur Herstellung von Präimmunserum genommen worden war. Nach 3, 5 und 7 Wochen erhielten die Hühner weitere subcutane Injektionen von Emulsionen, die wie vorstehend beschrieben, jedoch mit Freund'schem unvollständigem Adjuvans und 30 μg gereinigtem, hitzedenaturiertem SCCE (Gesamtvolumen jeder Emulsion 250 μl) hergestellt waren. 2 Wochen nach der letzten Injektion wurde den Hühnern Blut abgenommen. Das Blut wurde sofort mit 2 Volumina Alsever'scher Lösung (auf 100 ml: 100 ml 1,87 g Glucose, 0,8 g Natriumcitrat, 1,62 g Natriumchlorid, Zitronensäure bis pH 6.1) vermischt und zentrifugiert. Das Hühner-anti-SCCE, das für weitere Untersuchungen gewählt wurde, wurde in der Verdünnung 1/2000 bei Versuchen mit Immunblotting verwendet. Vgl. 17, Beispiel 8 zu einer Illustration der Spezifität des Antiserums.
5.2.2. Kaninchen-anti-SCCE
Durch SBTI-Affinitätschromatographie gereinigtes SCCE wurde wie in Beispiel 4.1 beschrieben auf 15 mm dicken Gelen gemäß Laemmli, 1970, SDS-PAGE ohne Reduktion unterworfen. Die Hauptproteinbande, von der vorhin gezeigt wurde, daß sie SCCE war, wurde mit dem Kupferchlorid-Färbungsverfahren nach Lee et al., 1987 sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Nach Entfernung des Kupferchlorids mit EDTA gemäß Lee et al. wurden die Gelscheiben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert. Proben homogenisierter Gelscheiben wurden in gleichen Volumina von Freund'schem Adjuvans suspendiert. Etwa 30 μg reines SCCE, die auf diese Weise in vollständigem Adjuvans hergestellt wurden, wurden einem Kaninchen subcutan verabreicht. Nach 3, 5 und 7 Wochen wurde die Injektion mit der gleichen Menge SCCE aber mit unvollständigem Adjuvans wiederholt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde dem Kaninchen Blut abgenommen.
Das so erhaltene Kaninchen-anti-SCCE (D-5) wurde in der Verdünnung 1/500-1/1000 in Immunblot-Versuchen mit Alkaliphosphatase-konjugierten anti-Kaninchen-Immunglobulinen als zweiter Antikörper benützt.
Bei allen Immunblotting-Versuchen wurden gebundene zweite Antikörper gemäß Blake et al., 1984 festgestellt (bezieht sich auf Beispiele 5, 8 und 9).
Der Kaninchen-anti-SCCE Bo-1 wurde in der gleichen Weise, aber mit SCCE, das vor der SDS-PAGE als Antigen reduziert worden war, hergestellt.
5.3. Immunhistochemische Studien mit den monoklonalen Antikörpern
In immunhistochemischen Studien mit SCCE-spezifischen monoklonalen Antikörpern, konnte SCCE in hohen suprabasalen Zellen der menschlichen keratinisierenden schuppigen Epithelien (Epidermis, innere Wurzelschicht der Haarfollikel, harter Gaumen) festgestellt werden, nicht jedoch in den nichtkeratinisierenden schuppigen Epithelien (innere Wurzelschicht der Haarfollikel, Lippen- und Mundschleimhäute). Somit könnte SCCE spezifisch in keratinisierenden schuppigen Epithelien exprimiert werden. SCCE-Expression wurde weiterhin in hohen suprabasalen Zellen der menschlichen Epidermis gefunden, die in vitro rekonstruiert worden waren und an der Luft-Wasser-Grenzfläche gezüchtet wurden. Wenn dem Medium Retinolsäure in einer Konzentration hinzugefügt wurde, die die Keratinocytenvermehrung stimulierte aber die Bildung eines Stratum corneum hemmte, wurde SCCE nicht mehr exprimiert. Dies legt die Annahme nahe, daß die SCCE-Expression Teil des epidermalen Differenzierungsprogramms sein könnte.
Die Ergebnisse der immunelektromikroskopischen Versuche mit SCCE-spezifischen monoklonalen Antikörpern sind mit einer Rolle von SCCE bei der desmosomalen Degradation und somit bei der Desquamation kompatibel. Die Antikörper markierten spezifisch die Lamellarkörperchen, die die Sekretion in den interzellulären Raum zwischen den obersten granulären Zellen und den untersten Stratum corneum-Zellen durchmachten, wogegen die Antikörper im Stratum corneum Epitope erkannten, die eng mit den Desmosomen im extrazellulären Raum assoziiert waren.
BEISPIEL 6
Clonierung und Sequenzierung der menschliches SCCE codierenden cDNA
Restriktionsenzyme wurden von Promega, Madison, MI, und TAQ-Polymerase von Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT bezogen. Eine menschliche λgt11-KeratinocytencDNA-Bank, die aus von adulten menschlichen Keratinocyten epidermalen Ursprungs abgeleiteter mRNA hergestellt war, wurde von Clontech, Laboratories Palo Alto, CA bezogen (Katalog-Nr. HL 1045 b). Zuerst wurde die Bank mit den polyclonalen anti-SCCE-Seren von Kaninchen D-5 und Bo-1 (vgl. Beispiel 5.2.2) abgesucht. Da das polyclonale anti-SCCE-Serum Bo-1 hohe Hintergrundsignale ergab, wurde es zu einem frühen Zeitpunkt von der ausgedehnten Durchsuchungsstudie ausgeschlossen. Mit dem D-5-Antiserum wurde eine Anzahl immun-reaktiver Plaques angereichert, wie dies für tatsächlich positive Plaques erwartet worden war. Bei keiner der Plaques wurde eine Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern moAb4 und moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzymcharakterisierung und PCR-Charakterisierung von elf isolierten Plaques ergab, daß zwischen den verschiedenen Plaques keine Ähnlichkeiten festgestellt werden konnten. Das Vorhandensein solcher teilweiser Ähnlichkeiten zeigt an, daß die Plaques homologe DNA-Inserts von der selben cDNA-Sequenz enthalten. Aufgrund des gescheiterten Versuchs, einen „Fingerabdruck" einer wahrscheinlichen SCCE-cDNA-Sequenz zu definieren, wurde die Strategie abgeändert.
Die Plaques wurden in E. coli Y 1090 (Clontech) durch Plaquehybridisierung abgesucht, wo-bei ein degeneriertes synthetisches OligoNukleotid als Sonde benützt wurde. Die OligoNukleotidsonde war auf der Basis der experimentell bestimmten aminoterminalen Sequenz des nativen SCCE-Enzyms wie in Beispiel 4.2. beschrieben entwickelt. Der verläßlichste Teil der Aminosäuresequenz, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NR: 3, As 1–As 6) wurde zur Konstruktion einer synthetischen 17-mer OligoNukleotidsonde 5'-ATHATHGAYGGNGCNCC-3' (H = A oder C oder T; Y = C oder T; N = A oder C oder G oder T) ausgewählt, die SYM3067 benannt wurde, SEQ ID NR: 4. Die OligoNukleotidsonde wurde mit Hilfe eines Beckman 200A-DNA-Synthetisierers mit dem Phosphoramiditverfahren nach den Anleitungen des Verkäufers synthetisiert.
E. coli Y 1090-Bakterien wurden über Nacht in LB-Medium (Sambrook et al., 1989) mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO_4– gezüchtet. 0,4 ml der Kultur wurden dann mit verdünntem Vorrat von Phagenbank vermischt und 20 Minuten lang bei 37°C adsorbiert. Die infizierte Kultur wurde mit 6 ml Weichagarose (0,75% Agarose in LB und 11 mM MgSO₄) vermischt. Das Weichagarosegemisch wurde in zehn 150 mm-LA-Schalen gegossen. Die Schalen wurden 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert und bei 4°C über Nacht gelagert. Insgesamt enthielten die Schalen etwa 4 × 10⁵ Plaques.
Zur Immobilisierung der Plaques wurde jede Schale zwei Minuten lang mit NEN DuPont Colony/Plaque Screen Membranen (DuPont, Wilmington, DE) abgedeckt. Die Membranen wurden 2 mal 2 Minuten mit 0,5 M NaOH, 2 mal zwei Minuten mit Tris-HCl, pH 7,5 durchtränkt und an der Luft trocknen gelassen. Diese Membranen wurden dann für einen Hybridisierungsversuch wie nachstehend beschrieben verwendet. Die Membranen wurden in 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS-Lösung mit 100 mg/ml denaturierter Heringsperma-DNA (Sigma, St. Louis, MO) 5 Stunden lang bei 65°C vorhybridisiert. Die Sonde, SYM-3067, wurde unter Verwendung von T4-PolyNukleotidkinase (Promega, Madison, WI) [λ-³²P] dATP-markiert und zum Vorhybridisierungsgemisch hinzugefügt. Die Hybridisierung wurde 12–18 Stunden bei 42°C ausgeführt.
Nach der Hybridisierung wurden die Membranen viermal 5 Minuten in 2 × SSC bei Raumtemperatur, 1% SDS bei 42°C und schließlich in 0,1 SSC 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Membranen wurden auf Röntgenfilm (Hyperfilm-MP, Amersham, UK) autoradiographies. Irn ersten Suchdurchgang wurden vierzehn positive Plaques festgestellt. Diese positiven Plaques wurden mit der gleichen Sonde und mit den gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben erneut abgesucht. Nach dem erneuten Absuchen wurden zwei positive Plaques festgestellt. Die zwei ausgewählten Plaques wurden eine weitere Zeitlang gereinigt, und die Größe der Inserts wurde durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601 als Primer und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden. Diese beiden Primer sind komplementär zu dem linken beziehungsweise rechten Arm des Phagen λgt 11. Das aus dem Phagen A 6.2.2 generierte amplifizierte DNA-Fragment von etwa 0,9 kb wurde dann mit EcoRI verdaut und in EcoRI-verdauten pUC19 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pS496, cloniert. Dieses clonierte Fragment wurde einer teilweisen Sequenzanalyse unter Verwendung von zu pUC19 komplementären Primern unterworfen. Die Nukleotidsequenz wurde mit Hilfe des T7-Sequenzierungskits (Pharmacia, Uppsala, Schweden, oder USB, Cleveland, Ohio) bestimmt.
Die Übersetzung der erhaltenen DNA-Sequenz ergab eine Arninosäuresequenz, die zu der der experimentell bestimmten Proteinsequenz homolog war. Jedoch fehlte der Sequenz ein Übersetzungs-Startcodon. Um eine cDNA von voller Länge zu isolieren, wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel getrennt und als Sonde benützt, die die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erlaubte. Diese Sonde wurde mit Hilfe des multiprime DNA-Markierungssystems (Amersham, UK) durch folgendes Verfahren ³²P-markiert: Es wurde Wasser im Verhältnis von 3 ml pro Gramm Gel hinzugefügt und das Ganze sieben Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gestellt, um das Gel zu schmelzen und die DNA zu denaturieren. Das Röhrchen kam dann für mindestens 10 Minuten in ein Wasserbad von 37°C. Ein Volumen DNA/Agarose-Lösung, das ungefähr 25 ng DNA enthielt, wurde gemäß den Anleitungen des Lieferanten zur Markierungsreaktion hinzugefügt.
Um eine cDNA von voller Länge zu erhalten, wurde die cDNA-Bank mit dieser Sonde zwei-mal erneut abgesucht, wobei die gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt wurden, außer daß die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bei 65°C stattfand. Diese Versuche führten zur Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques, die anfänglich durch PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3'; SEQ ID NR: 5) oder SYM 1601 (5'-ACA CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3'; SEQ ID NR: 6) in Kombination mit SYM 3208 als PCR-Primer zur Bestimmung einer Plaque eingesetzt wurden, die den ganzen 5' offenen Leserahmen enthält. SYM 3208, 5'-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3'; SEQ ID NR: 7; der dem 5'-Teil der SCCE-cDNA zumindest teilweise komplementär ist, wurde auf der Basis der von pS496 gewonnenen DNA-Sequenzinformation entworfen. Nach diesem Absuchen wurden vier Phagen zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Für die Sequenzanalyse wurden die so erhaltenen amplifizierten PCR-Fragmente, die von diesen Phagen abgeleitet waren, wie vorstehend be-schrieben in pUC19 cloniert. Die Ergebnisse zeigten, daß einer der Phagen, 205.2.1, ein Insert von voller Länge enthielt.
DNA aus dem Phagenisolat 205.2.1 wurde gemäß Sambrook et al., 1989 präpariert, und das DNA-Präparat wurde mit EcoRI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Agarose-Elektrophorese getrennt, und ein Fragment von etwa 1 kb wurde isoliert und in EcoRI-verdauten pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pS500 bezeichnet (15). Die komplette Nukleotidsequenz des cDNA-Fragments wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Als Primer für die Sequenzierungsreaktionen wurden spezifische, zu den pUC19-oder SCCE-Sequenzen komplementäre OligoNukleotide verwendet. Die Nukleotidsequenzen (SEQ ID NR:1) enthielten einen offenen Leserahmen, der zur Codierung der gesamten Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins von 253 Aminosäuren, einschließlich eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids ausreicht (SEQ ID NR: 2).
Ein anderer Phage, der als 106.1.2. bezeichnet wurde, enthielt eine SCCE-cDNA-Sequenz, der die 5'-nichtübersetzte Sequenz und die ersten drei Codons fehlten. Dieses Insert wurde als 954 bp-EcoRI-Fragment isoliert und in EcoRI-linearisierten pUC19 cloniert, wodurch man das Plasmid pS498 erhielt. Dieses Plasmid wurde teilweise sequenziert.
Ein dritter, als 108.1.2 bezeichneter Phage enthielt eine SCCE-cDNA-Sequenz, der ebenfalls die 5'-nichtübersetzte Sequenz und sieben Nukleotide der übersetzten Region fehlten. Dieses cDNA-Insert hat eine längere Variante der 3'-nichtübersetzten Region, die sich 1057 bp stromabwärts des Stoppcodons erstreckt. Dieses 1884 bp-EcoRI-Fragment wurde isoliert und in EcoRI-linearisierten pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde komplett sequenziert und als pS501 bezeichnet.
BEISPIEL 7
Feststellung von SCCE-mRNA in menschlicher Epidermis
Präparation der Gesamt-RNA aus menschlicher Epidermis
Diese wurde gemäß Chomczynski und Sacchi, 1987 ausgeführt. Durch plastische Chirurgie wurde krankheitsfreie menschliche Abdominalhaut gewonnen. Sie wurde sofort nach dem Abnehmen auf Eis gekühlt. Innerhalb von weniger als 15 Minuten wurde die Epidermis durch kräftiges Abschaben mit einem Skalpell gewonnen, in Lösung D (Chomczynski und Sacchi, 1987) getaucht und mit einem Glas-Homogenisierer homogenisiert. Dann wurde das von Chomczynski und Sacchi beschriebene Verfahren befolgt. Die präzipitierte Gesamt-RNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –20°C in 70% Ethanol gelagert.
Präparation der Messenger-RNA
Fünfhundert Mikrogramm der gesamten Epidermis-RNA wurden mit dem Poly A Tract-Kit (Promega) gemäß den Anleitungen des Lieferanten verarbeitet.
RNA-Elektrophorese und Blotting
Die Agarosegele (1,4%) wurden mit 0,66 M Formaldehyd in 1 × MOPS-Puffer und 0,6 g/ml Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO) präpariert. Es wurde mRNA entsprechend 100 μg Gesamt-RNA in RNA-Probenpuffer (50% Formamid, 2,2 M Formaldehyd, 3% Ficoll, 1 × MOPS) aufgelöst und vor dem Auftragen 5 Minuten lang bei 60°C erhitzt. Die RNA-Marker (BRL, Gaithersburg, MD) wurden ähnlich behandelt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele 5 Minuten lang in destilliertem Wasser getränkt; es folgten 30 Minuten in 50 mM NaOH und 30 Minuten in 0,1 M Tris-HCl, pH 7.5. Das Blotting auf GeneScreen Plus-Membranen (NEN DuPont, Wilmington, DE) wurde mit der Vacu-Gene-Ausrüstung (Pharmacia, Uppsala, Schweden) 1 Stunde lang in 10 × SCC ausgeführt. Dann wurden die Membranen in 3 × SCC gewaschen, über Nacht getrocknet und 2 Stunden bei 80°C gebacken. Die RNA auf den Membranen wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht.
cDNA-Sonden
Das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellte Plasmid pS501 wurde mit HincII und BglII verdaut. Diese cDNA enthält eine HincII-Stelle bei bp Nr. 1060 und eine BglII-Stelle bei bp Nr. 1715. Das 1070-bp-Fragment (HincII-Stelle in Mehrfachclonierungsstelle von pUC19 – endogene HincII-Stelle) enthält die SCCE-codierende Region mit der Ausnahme von 7 bp am 5'-Ende und einer nichtübersetzten Region einschließlich der Polyadenylierungsstelle bei bp 944 bis 951, die allen SCCE-cDNAs, die isoliert wurden, gemeinsam ist. Das 655 bp-HincII-BgIII-Fragment, das den Poly A-Schwanz nicht enthält, kommt einzig bei der SCCE-cDNA 108-1-2 vor. Die Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und zur Herstellung von ³²PdCTP-markierten Sonden mit dem Multiprime DNA-Markierungskit (Amersham, Buckinghamshire, UK) verwendet.
Hybridisierung
Die Membranen wurden 30 Minuten lang in 1% SDS in 1 × TE gekocht und bei 60°C in 1% SDS, 1 M NaCl, 10% Dextransulfat, Heringsperma-DNS 0,1 mg/ml 3 Stunden lang vorhybridisiert. Die Hybridisierung geschah in der gleichen Lösung bei 60°C über Nacht. Gewaschen wurden 2 × 30 Minuten bei 60°C in 1% SDS in 2 × SCC und 3 Stunden in 0,1 × SCC bei Raumtemperatur. Dann wurden die Membranen der Autoradiographie unterworfen.
Ergebnisse:
Es konnte das Vorhandensein von zwei mRNA-Spezies mit Größen um die 1,2 kb bzw. 2,0 kb in menschlicher Epidermis demonstriert werden (16). Dies ist in guter Übereinstimmung mit den aus den Clonierungsversuchen erhaltenen Hinweisen, bei denen zwei Typen von cDNAs gefunden wurden.
BEISPIEL 8
Expression rekombinanten SCCE in E. Coli
Konstruktion des Plasmids pGEX-2T/SCCE-Plasmide
1. Sinn-PCR-Primer

1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT (SYM 3367; SEQ ID NR: 8), unterstrichener 3'-Teil codiert die N-terminalen Aminosäuren IIDGAPC von aktivem nativem SCCE, 5'-Teil mit BamHI-Stelle und einer zusätzlichen Sequenz codiert die Faktor Xa-Stelle IEGR.
1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; SEQ ID NR: 9), unterstrichener 3'-Teil entspricht dem Basenpaaren 76–96 in der vollständigen SCCE-cDNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz LETAGEE codiert, 5'-Teil wie in 1a.

2. Gegensinn-PCR-Primer
TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3371; komplementär zu den Basenpaaren 285–304 in der vollständigen SCCE-cDNA-Sequenz, SEQ ID NR: 1, mit der SacI-Stelle bei bp 294).
Eine Sequenz von pS498 (Beispiel 6) wurde mit den Primern 1a/2 und 1b/2 PCR-amplifiziert. Die erhaltenen Produkte wurden durch Phenolextraktion rind Ethanolfällung gereinigt, mit BamHI/SacI verdaut und durch Agarose-Elektrophorese gereinigt. Sie wurden dann zusammen mit den 3' 673 Basenpaaren von SCCE 106-1-2, die durch Verdauung von pS489 mit SacI und EcoRI erhalten worden waren, in TG2-Zellen in pGEX-2T (Pharmacia) cloniert, der mit BamHI/EcoRI verdaut worden war. Aus den für Expressionsversuche verwendeten bakteriellen Clones wurden Plasmide isoliert (pS510, das den nativen N-terminus neben der Faktor Xa-Stelle codiert, und pS511, das das vorgeschlagene Propeptid neben der Faktor Xa-Stelle codiert), und die den aus PCR-Produkten abgeleiteten Inserts entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden mit dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung eines T7-Sequenzierungskits (Pharmacia, Uppsala, Schweden) überprüft.
Expressionsstudien
Übernacht-Kulturen von TG2-Zellen mit pS510 und pS511 in LB-Medium mit 50 μg/ml Carbenicillin (Sigma, St. Louis, MO) wurden in frischem Medium zehnfach verdünnt und 3 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Es wurde IPTG (Sigma, St. Louis, MO) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mM hinzugefügt und die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Bakterielle Präzipitate wurden in PBS 1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) ultraschallzertrümmert. Nach 15-minütiger Zentrifugierung bei 10000 × g wurden die Überstände und Niederschläge mit SDS-PAGE und Immunblotting mit einem polyclonalen SCCE-spezifischen Antiserum von Hühnern untersucht.
In den in PBS-Triton X-100 unlöslichen Niederschlägen wurden große Mengen von IPTG-induzierbaren Proteinen mit Mr von etwa 50 kD (pS510) und 52 kD (pS511) mit SCCE-artiger Immunreaktivität gefunden (vgl. 17).
Die Überstände nach Ultraschallzertrümmerung in PBS-Triton X-100 enthielten GST/SCCEFusionsproteine von der gleichen Größe wie die unlöslichen Niederschläge, doch die Mengen waren im Vergleich zu jenen der unlöslichen Niederschläge gering.
Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, SCCE als ein Fusionsprotein mit GST herzustellen, und daß Sequenzen, die den spezifischen Protease-Spaltungsstellen in der Prä-pro-SCCEAminosäuresequenz entsprechen, es ermöglichen werden, diesen Versuch mit dem Ziel zu wiederholen, rekombinantes SCCE in Bakterien zu erzeugen. Das erzeugte Protein kann in Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid solubilisiert und dann wegen des hohen isoelektrischen Punkts von SCCE durch Kationenaustauschchromatographie gereinigt werden. Das gereinigte Protein kann durch Dialyse gegen Puffer mit niedrigerer Konzentration von denaturierenden Mitteln renaturiert und dann mit Faktor Xa gespaltet werden, um das GST-Polypeptid aus SCCE oder Pro-SCCE freizusetzen. Die GST/SCCE-Fusionsproteine werden auch als Immunogene zur Herstellung von SCCE-spezifischen Antikörpern und als Immunsorbentien bei der Antikörperreinigung verwendet werden.
BEISPIEL 9
Expression von rekombinantem menschlichem SCCE in Säugerzellen
Um einen Expressionsvektor für die Herstellung von rekombinantem SCCE zu generieren, wurden menschliche cDNA-Sequenzen aus dem Plasmid pS500 als 897 bp-EcoRI/DraI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in EcoRI- und SmaI-verdautes pUC19 subcloniert, wodurch man pS502 erhielt. Das Plasmid pS502 wurde dann mit EcoRI und SalI verdaut, um die SCCE-cDNA-Sequenzen als ein 0,9 kb-Fragment zu isolieren, das seinerseits in eine pUC19-Variante, der die HindIII-Stelle fehlt, subcloniert wurde, wodurch man das Plasmid pS503 erhielt. Diese pUC19-Variante wurde durch Verdauung von pUC19 mit HindIII, Auffüllen mittels Klenow-Enzym und Religierung generiert. Um das Clonieren in einen Expressionsvektor zu erleichtern, wurde eine HindIII-Stelle in das 5'-Ende der SCCE-cDNA eingebaut. Dies geschah durch Verdauung von pS503 mit EcoRI und Insertion eines Linkers, der die Stelle in HindIII, SYM3603, 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQ ID NR: 10 konvertiert. Das so erhaltene Plasmid, das den proteincodierenden Teil der SCCE-cDNA mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende bzw. einer SalI-Stelle am 3'-Ende enthält, wurde als pS505 bezeichnet.
Der endgültige Expressionsvektor wurde durch Ligierung von drei verschiedenen DNA-Fragmenten erhalten. Erstens wurde pS505 mit HindIII und SalI verdaut und ein 0,9 kb-Fragment isoliert.
Zweitens wurde, um den distalen Teil des stromaufwärts gelegenen regulatorischen Elements des murinen Metallthioneins zur Verfügung zu stellen, die Rinderpapillomvirussequenzen, die genomischen Betaglobinfragmente des Kaninchens, die mRNA-verarbeitende Signale liefern, und die Plasmidsequenzen pML2d, die Selektion und Replikation in E. coli erlauben (Waldenström et al., 1992), der Vektor pS 147 mit SacI und SalI verdaut und ein Fragment von etwa 12 kb isoliert.
Drittens wurde, um den proximalen Teil des murinen Metallthioneinpromotors zu isolieren, das Plasmid pS42, bei dem die in der Leadersequenz gelegene native BglII- in eine HindIII-Stelle umgewandelt worden ist, mit SacI und HindIII verdaut und ein Fragment von ungefähr 220 bp isoliert.
Die Ligierung dieser drei Fragmente ergab den SCCE-Expressionsvektor pS507 (vgl. 18).
Der Expressionsvektor pS507 wurde mit einem Vektor, der ein vom 5'-Long Terminal Repeat des Harvey-Sarkomvirus gesteueres Neomycin-Resistenzgen und SV41-Polyadelylierungssignale (Lusky und Botchan, 1984) enthielt, in murine C127-Zellen co-transfiziert (ATCC CRL 1616). Die Transfektionsversuche wurden nach dem Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren (Graham und Van der Eb, 1973) ausgeführt. Die Zellen wurden in Ham's Fl2/Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) (1:1), das mit 10% fötalem Kälberserum (HyClone, Logan, UT) angereichert war, gezüchtet. Die neomycinresistenten Zellclone wurden mit 1,5 mg/ml G418 (Gibco BRL) selektiert, und nach 10–15 Tagen der Selektion wurden die resistenten Clone bestimmt und von den Ursprungsschalen isoliert und weiterer Analyse zugeführt.
Um die Expression der rekombinanten SCCE-Gene zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus den isolierten Zellinien präpariert. Die Gesamt-RNA wurde aus Cl27-Zellen präpariert und auf 1% Formaldehyd-Agarosegel separiert, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einer ³²P-markierten SCCE-Sonde hybridisiert. Die Sonde war das 1070 bp-HincIIFragment der SCCE-DNA, das durch HinclI-Verdauung von pS500 und Agaroseelektrophorese erhalten wurde. Bei den Versuchen wurde nach Ausubel et al., 1992 vorgegangen. Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit ³²P-markierter SCCE-cDNA zeigten, daß rekombinante SCCE-mRNA in mehreren Zellinien, die den SCCE-Vektor pS507 enthielten, feststellbar war. Bei den Kontrollproben, die aus C 127-Zellinien abgeleitet waren, die einen außer hinsichtlich der SCCE-cDNA identischen Vektor enthielten, wurde keine Hybridisierung gefunden (19). Die Größe 1,4 kB entspricht der erwarteten Größe.
Es wurden Proben von konditioniertem Zellkulturmedium genommen und durch Immun-blotting analysiert. Die SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970) ausgeführt, und für das Immunblotting wurde anti-natives SCCE von Hühnern als feststellender Antikörper benützt. Ein Alkaliphosphatase-markiertes anti-Hühner-IgG (Sigma, St. Louis, MO) wurde zur Enzymmarkierung benützt. Die Ergebnisse werden in 20 gezeigt.
Um die Expression des rekombinanten SCCE zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus C127-Zellen, die mit dem Expressionsvektor pS507 transfiziert waren, präpariert. Als Kontrollproben wurde die Gesamt-RNA sowohl aus transfizierten C127-Zellen als auch aus mit dem Expressionsvektor pS 147 transfizierten C 127-Zellen präpariert. Der Vektor pS 147 ähnelt pS507, außer daß er die cDNA für menschliche gallensalzstimulierte Lipase (Nilsson et al., 1990) anstatt der menschlichen SCCE-cDNA enthält. Die RNA wurde nach Ausubel et al. (1992) präpariert. Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit ³²P-markierter SCCE-cDNA zeigten, daß in den C127-Zellen, die den SCCE-Vektor, pS507 enthielten, rekombinante SCCE-mRNA von etwa 1,4 kb feststellbar war (19). Bei den Kontroll-proben, die aus C127-Zellinien abgeleitet waren, die pS 147 enthielten, oder in nichttransfizierten C 127-Zellen wurde keine Hybridisierung gefunden. Die Länge der rekombinanten SCCE-mRNA war wie erwartet.
Es wurden Proben von konditioniertem Zellkulturmedium genommen und durch SDS-PAGE und Immunblotting analysiert. Der Blot wurde wie bei Blake et al., 1984 beschrieben entwikkelt. Die erhaltenen Resultate (vgl. 20) zeigen, daß C127-Zellen, die pS507 enthalten, drei Proteine erzeugen, die eine Reaktion mit allen verfügbaren polyclonalen Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern, sowie mit den wie in Beispiel 5 hergestellten monoklonalen anti-SCCE zeigen. Die rekombinanten SCCE-reaktiven Proteine zeigen ein scheinbares Molekulargewicht, das etwa 1 kDa größer als gereinigtes, natives menschliches SCCE ist. Das rekombinante Protein zeigt keinerlei proteolytische Aktivität. Durch Vergleich der abgeleiteten SCCE-Aminosäuresequenz mit dem experimentell bestimmten NH-2-Ende von nativem menschlichem SCCE und mit Sequenzen andere chymotrypsinartiger Proteasen kann geschlossen werden, daß das in C127-Zellen hergestellte rekombinante SCCE in seiner Proenzymform ist. Die Sequenzdaten deuten darauf hin, daß dieses Proenzym durch proteolytische Spaltung an der C-terminalen Seite des Lysins in der Sequenz ...AQGDKIIDGAP... aktiviert werden kann; die unterstrichene Sequenz ist die NH-2-Sequenz von nativem menschlichem SCCE (SEQ ID NR: 2, aa 5–aa 6).
BEISPIEL 10
Reinigung und Charakterisierung von rekombinantem SCCE
Reinigung
1,3 mg des gegen natives SCCE gerichteten monoklonalen Antikörpers TE4b wurde an 1,5 ml von CNBr-aktivierter Sepharose (Pharmacia-LKB Biotech, Uppsala, Schweden) gekoppelt, wobei das vom Hersteller beschriebene Verfahren angewandt wurde. 40 ml SCCE-haltiges Medium wurden durch ein 0,45 μm-Filter filtriert und dann auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mehrere Male mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7.2 gewaschen und dann mit 0,1 M Glycin-HC1, pH 2.5 eluiert. Das eluierte Protein wurde sofort durch Hin-zufügen von 0,1 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 8,0 neutralisiert.
Aktivierung
Das rekombinante SCCE (4,6 pg in 200 μl), das mit dem Gel mit dem gekoppelten monoklonalen Antikörper (vgl. vorstehend) gereinigt worden war, wurde mit 4,6 μl 0,1 mg/ml Trypsin (Massenverhältnis 10 : 1) bei 37°C verdaut. Die Proben (50 μl) wurden nach 20 Minuten, 1 Stunde, 3 Stunden und 20 Stunden herausgenommen, und es wurden 5 μl 10 pM (4-Amidinophenyl)methan-sulfonyl (APMSF; Boehringer Mannheim, Deutschland) hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Aktivität des gespalteten SCCE wurde durch nicht-reduzierende SDS-PAGE auf Caseingelen wie in Beispiel 2.2 beschrieben getestet. Die Identität der gespalteten Formen von SCCE wurde durch reduzierende SDS-PAGE und anschließendem Immunblotting mit anti-nativem SCCE von Hühnern und anschließend alkaliphosphatasemarkiertem anti-Hühner IgG und Nitroblau-Tetrazol und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat als Substrat für Alkaliphosphatase getestet.
N-terminale Sequenzierung
Affinitätsgereinigtes (wie vorstehend beschrieben) SCCE, ungefähr 35 μg, wurde mit einer Bio-Dot SP-Einheit (Bio-Rad, Richmond, CA) auf eine Immobilon – Membran (Millipore, Bedford, MA) slot-geblottet; dann wurde die Membran mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um alles Tris und Glycin zu entfernen. Der Teil der Membran, wo das Protein gebunden war, wurde ausgeschnitten und mit einem Applied Biosystems (Foster City, CA) 477A Puls-Flüssigphasensequenzierer mit einem PTH 120 A Online-Analysator sequenziert. Die Sequenzierung wurde mit regulären Zyklusprogrammen und Chemikalien des Herstellers ausgeführt. Die in den ersten sechs Positionen erhaltene Sequenz war glu-glu-ala-gln-gly-asp, entsprechend den Aminosäuren –7 bis –2 aus SEQ ID NR: 2. Wie aus diesem Ergebnis geschlossen werden kann, besteht das Signalpeptid aus 22 Aminosäuren, und basierend auf der N-terminalen Arninosäuresequenz von nativem aktivem SCCE, besteht das Propeptid aus sie-ben Aminosäuren.
Deglykosylierung
Gereinigtes rekombinantes SCCE (5 μg) und natives SCCE (20 μg) wurden 3 Minuten lang in 20 μl 0,5% SDS und 0,1 M β-Mercaptoethanol gekocht. Die Proben wurden mit Natriumphosphatpuffer, pH 8,6 und Nonidet P-40 bis zu Endkonzentrationen von 0,2 M bzw. 1,25% verdünnt. Es wurde N-Glycosidase F^® (Boehringer Mannheim) hinzugefügt (für rekombinantes Protein 0,6 Einheiten und für natives Protein 1,2 Enzymeinheiten), und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Endkonzentration von SDS im Probentest war 0,17%. N-Glycosidase F^®-behandeltes SCCE wurde auf 8–18% SDS-PAGE und anschließendem Immunblotting wie vorstehend beschrieben analysiert. Die erhaltenen Ergebnis-se zeigten eine Verringerung des scheinbaren Molekulargewicht der beiden oberen Banden, während das scheinbare Molekulargewicht der untersten Bande unverändert war (23). Dies zeigt, daß das in C127-Zellen hergestellte rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten Formen und in einer nichtglykosylierten Form existiert. Das Resultat ist zu dem analog, was bei aktivem nativem SCCE beobachtet werden kann (23).
BEISPIEL 11
Desmosomenverdauende Aktivität von rekombinantem SCCE
Corneocyten, die intakte Desmosomen enthielten, wurden durch „tape stripping" bis zu den tieferen Schichten des Stratum corneum von der Haut abgezogen, und die Schuppen wurden mit Hexan abgelöst und portionsweise eingetrocknet. Die Corneocytenportionen (3 mg) wurden mit 1 M Natriumchlorid bei 4°C extrahiert, um die darin befindlichen Proteasen zu solubilisieren, und dann ausgiebig mit Inkubationspuffer (0,1 M Tris/HCl, pH 8.0) gewaschen, um die endogene proteolytische Aktivität aus den Präparaten zu entfernen. Die Inkubationen wurden in 0,1 M Tris, pH 8.0 mit oder ohne 10 μg rekombinantem SCCE 24 Stunden lang bei 37°C ausgeführt. Die desmosomale Verdauung durch das Enzym wurde nachgewiesen, indem die Spiegel des Desmosomen-Markerproteins Desmoglein I (DG I) gemessen wurden. Dieses wurde durch Extraktion in einem 8 M Harnstoff/2% SDS/β-Mercaptoethanol-Puffer mit an-schließender Reinigung des DG I-Glykoproteins mittels Concanavalin A-Affinitätschromatographie aus den Hautschuppen isoliert. Das Concanavalin A-Eluat wurde durch SDS-PAGE fraktioniert und elektrophoretisch für das Immunblotting auf eine PDVF-Membran übertragen. DG I wurde mit einem spezifischen Antiserum bestimmt und mit verstärkter Chemolumineszenz festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
TABELLE 4
Die in Tabelle 4 vorgestellten Ergebnisse zeigen, daß rekombinantes SCCE in der Lage ist, intrazelluläre kohäsive Strukturen im Stratum corneum in einem in vitro-Test zu degradieren.
BEISPIEL 12
Auswirkung von Inhibitoren auf die Aktivität von rekombinantem SCCE Es wurden die Auswirkungen der Inhibitoren Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat auf die S-2586-hydrolysierende Aktivität von rSCCE untersucht. Der Versuchsaufbau war wie in Bei-spiel 3.2 umrissen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
TABELLE 5
Wie in der vorstehenden Tabelle 5 gezeigt, hemmten Aprotinin, Chymostatin und Zinkionen die S-2586-hydrolysierendee Aktivität von rekombinantem SCCE in ähnlicher Weise, wie die des nativen Enzyms.
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– WO 93/04172 (filed by Symbicom Aktiebolag oa 19 August 1992)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rulc 13bis)

Form PCT/RO/134 (July 1992)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rulc 13bis)

Form PCT/RO/134 (July 1992)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rulc 13bis)

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PCT/RO/134 (July 1992)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper, der spezifisch ein Polypeptid erkennt, das in seiner aktiven form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) abzubauen, wobei das Abbauen durch das Polypeptid durch Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und das Polypeptid: a) eine Aminosäuresequenz hat, die eine Homologie von mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz 1-224 in SEQ ID NR:2 hat; b) eine Aminosäuresequenz hat, aus der eine konstitutive Abfolge von 20 Aminosäuren homolog ist bis zu einem Grad von mindestens 95% mit einer Abfolge von Aminosäuren der selben Länge, ausgewählt aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR: 2 gezeigt ist; oder (c) eine Untersequenz des Polypeptids in a) ist, umfassend 50 bis 250 Aminosäuren.
Antikörper nach Anspruch 1, der an ein Protein oder einem festen Träger gebunden ist.
Monoklonaler Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert, zur Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren.
Monoklonaler Antikörper, wie in Anspruch 1 definiert, zur Anwendung bei der Diagnose von Erkrankungen bei Menschen und Tieren.