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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der
spezifisch ein Polypeptid erkennt, das in seiner aktiven Form in
der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
(S-2586) abzubauen, wobei das Abbauen durch das Polypeptid durch
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und das Polypeptid:
- a) eine Aminosäuresequenz hat, die eine Homologie
von mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz 1–224 in
SEQ ID NR:2 hat;
- b) eine Aminosäuresequenz
hat, aus der eine konstitutive Abfolge von 20 Aminosäuren homolog
ist bis zu einem Grad von mindestens 95% mit einer Abfolge von Aminosäuren der
selben Länge,
ausgewählt
aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz; oder
- (c) eine Untersequenz des Polypeptids in a) ist, umfassend 50
bis 250 Aminosäuren.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Haut als Organ ist unter biologischen, medizinischen und kosmetologischen
Gesichts-punkten von Interesse. Es gibt eine große Anzahl von Hautkrankheiten,
die entweder organ-spezifisch sind, z.B. Psoriasis und Ekzeme, oder
die Äußerungen
eines allgemeinen Krankheitszustands sind, wie allgemeine allergische Reaktionen.
Die Tatsache, daß es
hautspezifische Krankheiten gibt, kann als Beweis für die Existenz
molekularer Mechanismen angesehen werden, die nur bei der Haut vorkommen.
Analogerweise sind Studien von hautspezifischen molekularen Vorgängen bedeutsam
für das
Verständnis
und die Behandlung von Hautkrankheiten. Es erscheint naheliegend
anzunehmen, daß einige
dieser Vorgänge
in der einen oder anderen Weise mit der am meisten spezialisierten
Funktion der Haut zusammenhängen,
nämlich
der Bildung einer physikalisch-chemischen Barriere zwischen dem
Körperäußeren und
dem Körperinneren.
Die physikalisch-chemische Hautbarriere befindet sich in der äußersten
Schicht der Haut, dem Stratum corneum.
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Das
Stratum corneum ist die am stärksten
spezialisierte Struktur der Haut. Es ist das Endprodukt des Differenzierungsprozesses
der Epidermis, das heißt
des geschichteten schuppigen Epithels, das den äußersten Teil der Haut bildet.
Die Mehrzahl der Zellen der Epidermis besteht aus Keratinocyten
in verschiedenen Differenzierungsstadien. Die untersten Keratinocyten,
die Basalzellen, sitzen auf einer Basalmembran in Kontakt mit der
Dermis, das heißt
dem Verbindungsgewebe der Haut, und sind die einzigen zur Teilung
befähigten Keratinocyten.
Ständig
verläßt ein Teil
der Basalzellen die Basalmembran und durchläuft einen Differenzierungsprozeß, der die
Zellen schließlich
zu Baublöcken
des Stratum corneum werden läßt. In diesem
Prozeß durchlaufen
die Keratinocyten eine Anzahl von adaptiven Veränderungen. Der Gehalt an Cytoskelett,
das aus epidermisspezifischen Cytokeratinen besteht, steigt. Die
intermediären
Filamente der benachbarten Zellen werden durch eine erhöhte Anzahl
von Desmosomen zu einer funktionellen Einheit zusammengefaßt. Die
dramatischsten Veränderungen
finden während
des Übergangs
von der obersten lebenden Zellschicht, dem Stratum granulosum, zum
nicht lebensfähigen
Stratum corneum statt, in einem Prozeß, der gewöhnlich Keratinisierung genannt
wird. Kovalent kreuzgebundene Proteine werden in der Nähe der inneren
Seite der Plasmamembran abgelagert und bilden eine sehr widerstandsfähige Zellhülle. Darüberhinaus
wird eine lipidreiche Substanz, die aus einem keratinocytenspezifischen
Zellorganell stammt, in den extrazellulären Raum sekretiert und bildet,
durch die Ausbildung von Lipidlamellen, die die Zellen des Stratum
corneum umgeben, die Permeabilitätsbarriere
gegen hydrophile Substanzen. Schließlich verschwinden alle intrazellulären Strukturen
außer
den dicht gepackten Cytokeratinfilamenten.
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Die
Zellen des Stratum corneum, die Corneocyten, sind somit nicht lebensfähig. Das
bedeutet, daß die Regulation
der verschiedenen Prozesse im Stratum corneum das Ergebnis einer „Programmierung" in einem Stadium
sein muß,
in dem die Keratinocyten noch lebensfähig sind. Die Umschichtung
der Epidermis, die sich normalerweise in etwa vier Wochen vollzieht,
während
derer die Zellen ungefähr
zwei Wochen lang Teile des Stratum corneum sind, wird durch das
Abschuppen der Zellen von der Hautoberfläche im Vorgang der Desquamation
beendet. Dieser Vorgang ist ein Beispiel der „Programmierung" des Stratum corneum.
Eine Vorbedingung für
die Funktion des Stratum corneum als physikalisch-chemische Barriere
ist, daß seine
einzelnen Zellen durch mechanisch widerstandsfähige Strukturen, nämlich Desmosomen,
zusammengehalten werden. Die Degradation von Desmosomen, die eine
Vorbedingung für
die Desquamation ist, muß so
reguliert werden, daß sich
ein Zellabschuppen von der Hautoberfläche ergibt, das die Neuproduktion
des Stratum corneum ausgleicht, ohne die Barrierefunktion des Gewebes
zu beeinträchtigen.
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Störungen der
Keratinisierung
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Unter
einer großen
Zahl von pathologischen Zuständen
der Haut von unterschiedlichem Schweregrad finden sich auch Störungen des
Keratinisierungsvorgangs. Bei der Psoriasis han-delt es sich, zusätzlich zu
einer typischen chronischen Entzündung,
um Überproduktion
eines unreifen Stratum corneum, was zur typischen Schuppenbildung
dieser Krankheit führt.
Es gibt eine Gruppe ererbter Hautkrankheiten, die durch ein verdicktes
Stratum corneum gekennzeichnet sind, das zur Bildung von „Fischschuppen" führt, die
sogenannten Ichthyosen. Bei einigen Ichthyosen ist die Rate der
Desquamation geringer. Obwohl weniger schwer als die Ichthyosen,
ist die „trockene
Haut" (Xeroderma)
ebenfalls durch ein Stratum corneum gekennzeichnet, von dem Corneocyten
abgeschuppt werden; und zwar nicht wie unter normalen Bedingungen
als einzelne Zellen oder als kleine Zellaggregate, sondern als große, makroskopisch
sichtbare Schuppen. Diese Störung
ist unter älteren
Menschen und Atopikern, das heißt
Individuen mit einer verringerten Widerstandsfähigkeit gegen Hautirritationen
und einer Veranlagung zur Entwicklung einer charakteristischen Form
von endogenen Ekzemen, weit verbreitet. Bei den Aknekrankheiten
ist die Keratinisierung in den Gängen
der Talgdrüsen
gestört,
was zur Bildung von Mitessern und Verstopfungen führt. Der
Bildung von Mitessern folgt die entzündliche Akne, von der man annimmt,
daß sie
durch jene hervorgerufen wird.
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Proteolytische
Enzyme sind an der Keratinisierung beteiligt
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Es
gibt mehrere Stadien im Keratinisierungsvorgang und während der
Umschichtung des Stratum corneum, in denen proteolytische Enzyme
wichtige Rollen zu spielen scheinen. Mit Sicherheit muß das Verschwinden
aller intrazellulären
Strukturen außer
den Cytokeratinfilamenten, das sich während des Übergangs von den lebensfähigen zu
den verhornten Epidermisschichten vollzieht, Proteolyse beinhalten.
Die Transformation von Profilaggrin in Filaggrin, ein Protein, von
dem man annimmt, daß es
bei dem speziellen Typ der Aggregation von Cytokeratinfilamenten
während
der Keratinisierung wirkt, könnte
durch eine spezifische Proteinase katalysiert werden. Im Stratum
corneum wird Filaggrin weiter zu Bestandteilen von niederem Molekulargewicht
abgebaut, die möglicherweise
als „natürliche Feuchtigkeitsspender" von Bedeutung sind.
Weiterhin gibt es proteolytische Veränderungen von Cytokeratinpolypeptiden
während
des Keratinisierungsvorgangs. Schließlich ist es noch wahrscheinlich,
daß proteolytische
Vorgänge
entscheidende Rollen beim Abbau intrazellulärer kohäsiver Strukturen im Stratum
corneum bei Vorgängen
spielen, die schließlich
zur Desquamation führen.
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Zellkohäsion im
Stratum corneum und Desquamation. Die Rolle der Desmosomen
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Die
interzelluläre
Kohäsion
im Stratum corneum sowie in den lebensfähigen Teilen der Epidermis
wird zu einem bedeutenden Teil durch Desmosomen bewirkt. Ein Desmosom
besteht aus zwei symmetrischen Hälften,
von denen jede aus zwei benachbarten Zellen gebildet wird. Jede
desmosomale Hälfte
hat einen interzellulären
Teil, der an die Cytokeratinfilamente gebunden ist, und einen Teil,
der aus intrazellulär
und mit transmembranalen und extra-zellulären Teilen verankerten Glykoproteinen
aufgebaut ist. Die extrazellulären
Teile dieser Proteine, die Desmogleine, sind Adhäsionsmoleküle, und durch ihre gegenseitige
Wechselwirkung im extrazellulären
Raum wird eine kohäsive
Struktur gebildet. Der Abbau von Desmosomen scheint im Stratum corneum
der Handflächen
und Fußsohlen
im Vergleich zum nicht-palmo-plantaren Stratum corneum auf etwas unterschiedlichem
Weg zu erfolgen. In letzterem Gewebe verschwinden etwa 85% der Desmosomen
kurz nachdem die Zellen voll-ständig
verhornt sind. Die verbleibenden Desmosomen, die vorzugsweise an
den villibesetzten Rändern
der extrem abgeflachten Zellen gelegen sind, bleiben scheinbar bis
zu dem Niveau intakt, auf dem die Desquamation stattfindet. In palmo-plantarem
Stratum corneum sind die Corneocyten viel weniger abgeflacht, und
es kommt nicht zu einer extensiven Degradation von Desmosomen in
den tieferen Schichten des Gewebes. In beiden Geweben geht die Desquamation
mit desmosomaler Degradation einher. Es wurde gezeigt, daß sowohl
in ichthyolytischer Haut als auch in „trockener Haut" die Zahl der Desmosomen
in den oberflächennahen
Schichten des Stratum corneum erhöht ist.
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Interzelluläre Lipide
des Stratum corneum
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Der
Unterschied zwischen der desmosomalen Degradation in palmo-plantarem
und nicht-palmo-plantarem Stratum corneum könnte mit dem Unterschied in
den Mengen extra-zellulärer
Lipide in den beiden Gewebetypen zusammenhängen. Der Lipidgehalt ist in
nicht-palmo-plantarem Stratum corneum bedeutend höher. Demzufolge
ist die Wirksamkeit dieses Gewebes als Permeabilitätsbarriere
gegen Wasser und andere hydrophile Substanzen höher als die des Stratum corneum
der Handflächen
und Fußsohlen.
Da Desmosomen ein beträchtliches
Volumen einnehmen, und da intakte Desmosomen eine Ausweitung des
extrazellulären Raumes
verhindern, könnte
die desmosomale Degradation ein Mechanismus sein, durch den mehr
extrazellulärer
Raum für
Lipide verfügbar
gemacht wird. Die extrazellulären
Lipide des Stratum corneum hängen
auch in mehrfacher anderer Weise mit der Desquamation zusammen.
Da sie Hauptbestandteile des extrazellulären Raumes sind, steht zu erwarten,
daß sie
bedeutende Einflüsse
auf die Aktivitäten
von Enzymen haben, die an diesem Ort wirksam sind, z.B. Enzyme,
die für
die desmosomale Degradation verantwortlich sind. Tatsächlich wurde
gezeigt, daß verschiedene
Störungen
des Fettstoffwechsels die wahrscheinliche Ursache für mehrere Typen
von Ichthyosen sind. Es ist auch wahrscheinlich, daß Lipide
selbst bis zu einem gewissen Grad zur Kohäsion der Zellen des Stratum
corneum beitragen. Mehr noch, die Sekretion von Lipide in den extrazellulären Raum
des Stratum corneum ist wahrscheinlich auch mit der Sekretion einer
Anzahl von Enzymen verbunden. Vorläufer der Lipide sind in den
oberen lebensfähigen
Keratinocyten in spezifischen Organellen eingelagert. Es wurde gezeigt,
daß diese
sogenannten Lamellarkörperchen
eine Anzahl hydrolytischer Enzyme enthalten. Man nimmt deshalb an,
daß ein
Enzym, das für
die desmosomale Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist,
möglicherweise
in einer inaktiven Vorform von den Keratinocyten synthetisiert wird,
in Lamellarkörperchen
gelagert und während
der Keratinisierung in den extra-zellulären Raum des Stratum corneum
sekretiert wird, wo es aktiviert werden kann, und daß seine
Aktivität
neben anderen Faktoren durch die Zusammensetzung der extrazellulären Lipide
weiter gesteuert wird.
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Störungen der
Zellkohäsion
in lebensfähiger
Epidermis
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Es
gibt eine Anzahl von Hautkrankheiten, bei denen die Kohäsion zwischen
Keratinocyten und den nichtverhornten lebensfähigen Epidermisschichten beeinträchtigt ist.
Diese Krankheiten sind durch ein Acantholyse genanntes Phänomen gekennzeichnet,
nämlich
ein Zusammenbruch der desmosomalen Kontakte zwischen ansonsten scheinbaren
normaleren Keratinocyten. Wahrscheinlich wird dieser Vorgang von
Proteinasen verursacht, die bisher noch nicht genau bestimmt wurden.
Die Acantholyse, die, wenn sie große Bereiche erfaßt, zur
Blasenbildung führen
kann, ist ein Charakteristikum der Autoimmunkrankheiten Pemphigus
vulgaris und Pemphigus foliaceus, des ererbten milden familiären Pemphigus
(Hayley-Hayley'sche
Krankheit) und der ererbten Dyskeratosis follicularis (Darier'sche Krankheit).
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Die Epidermis
spielt eine aktive Rolle bei immunologischen und entzündlichen
Reaktionen
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Zusätzlich zu
ihrer Funktion als Erbauer der physikalisch-chemischen Barriere
zwischen Körperinnerem
und -äußerem fungiert
die Epidermis auch als aktive immunologische Barriere. Die Keratinocyten
haben die Fähigkeit,
eine große
Anzahl von Cytokinen und anderen Entzündungsbewirkern herzustellen
sowie auf diese zu antworten, wodurch sie mit Zellen des immunologischen
und inflammatorischen Systems kommunizieren und wechselwirken. Dies
ist von großer
Bedeutung bei der Verteidigung des Wirtes gegen mikrobielle Infektionen
und bei der Wundheilung. Die moderne Forschung hat auch gezeigt,
daß die
Keratinocyten wahrscheinlich eine aktive Rolle bei vielen Entzündungskrankheiten
der Haut, wie Psoriasis und Ekzeme spielen.
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Epidermale
Proteinasen können
bei Entzündungen
wichtig sein
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Eines
der Cytokine, das von Keratinocyten produziert wird, ist Interleukin
1 (Il-1). Es gibt zwei Formen von I1-1, Il-1α und Il-1β, die beide in der Epidermis
vorkommen. Während
Il-1α schon
in der synthetisierten Form voll aktiv ist, wird Il-1β als inaktive
31 kD-Vorform synthetisiert. Pro-I1-1β wird durch eine spezifische Proteinase,
die z.B. in Monocyten vorkommt, die aber bisher in normaler Epidermis
nicht festgestellt wurde, in die aktive 17 kD-Form konvertiert.
Eine Anzahl von Serinproteinasen mit chymotrypsinartiger Substratspezifität (pankreatisches
Chymotrypsin und Cathepsin G aus neutrophilen Granulocyten) können jedoch
auch als Pro-I1-1β-Aktivatoren
dienen.
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Wie
von Norris (1990) vorgeschlagen, könnten die im intrazellulären Raum
des Stratum corneum vorhandenen proteolytischen Enzyme unter bestimmten
Bedingungen in der Lage sein, inaktive Cytokinformen in aktive Formen
zu konvertieren. Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang
das biologisch inaktive Pro-Interleukin-1β, von dem gezeigt wurde, daß es von
Keratinocyten produziert wird (Mizutani et al., 1991). Bisher wurden
keine epidermalen Enzyme mit der Fähigkeit gefunden, Pro-Interleukin-1β in aktives
Interleukin-1β zu
konvertieren. Da jedoch Chymotrypsin und Cathepsin G (ein chymotrypsinähnliches
Enzym) die Fähigkeit
haben, die Umwandlung von inaktivem rekombinantem 31 kD-Pro-Interleukin-1β in eine
voll aktive 17 kD-Form zu katalysieren, ist es möglich, daß auch epidermale chymotrypsinähnliche
Enzyme diese Umwandlung katalysieren könnten.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der
specifisch ein Enzym erkennt, das als Stratum corneum chymotryptisches
Enzym (SCCE) bezeichnet wurde, und von dem man annimmt, daß es für die desmosomale
Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist. In Beispiel 1
werden Hinweise darauf vorgestellt, die zeigen, daß die Zellabschuppung
von der Oberfläche
der verhornten Oberflächenschicht der
Haut mit der Degradation desmosomaler Proteine einhergeht, und daß das dafür verantwortliche
Enzym eine chymotrypsinähnliche
Serinproteinase zu sein scheint, die durch sind Zinkionen gehemmt
werden kann.
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Beispiel
2 beschreibt die Entdeckung des Stratum corneum chymotryptischen
Enzyms (SCCE); eine Proteinase, die die Kriterien dafür erfüllt, die
Verantwortliche für
die Degradation der intrazellulären
kohäsiven Strukturen
im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo zu
sein. Beispiel 3 beschreibt die teilweise Charakterisierung der
Aktivität
des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE) mittels chromogener
Substrate.
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Die
Ergebnisse zeigen, daß SCCE
sich von anderen chymotryptischen Proteinasen enzymologisch unterscheidet.
Das Inhibitorprofil und die Fähigkeit,
zwei verschiedene Substrate von chymotrypsinartigen Enzymen zu degradieren,
ist bei SCCE im Vergleich zu Rinder-Chymotrypsin und menschlichem
Cathepsin G signifikant verschieden. SCCE scheint auch von menschlicher
Mastzellen-Chymase signifikant verschieden zu sein. Das letztere
Enzym katalysiert wirkungsvoll die Degradation von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
(vgl. Schwartz et al., 1987 und Schechter et al., 1989) – was SCCE
nicht tut – und
wird nicht durch Aprotinin oder SBTI gehemmt (Schechter et al.,
1983 und Wintroub et al, 1986), was bei SCCE der Fall ist.
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Beispiel
4 beschreibt die teilweise Reinigung von SCCE aus KCl-Extrakten
von Corneocyten mittels der Affinitätschromatographie auf unlöslich gemachtem
Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI) und die Bestimmung der N-terminalen
Arninosäuresequenz
von SCCE. Mit nichtreduzierten Proben waren die Erträge in den Stufen
1–6 gut,
fielen aber in den Stufen 7 und 9 auf Null, und die Erträge in den
nachfolgenden Schritten waren bedeutend verringert. Auch mit reduzierten
Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate festgestellt
werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen Derivate
festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen Abfälle der
Erträge.
Das Ergebnis legt nahe, daß in
den Positionen 7 und 9 Cysteine vorhanden sind. Es war jedoch nicht
möglich,
in den Schritten 7 und 9 nach einer Reduktion und Behandlung mit
Jodessigsäure
(100 mM) carboxymethyliertes Cystein festzustellen. Die erhaltene
Sequenz (13, SEQ ID NR: 3) war bei reduzierten
und nicht-reduzierten Proben identisch.
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Beispiel
5 beschreibt die Herstellung SCCE-spezifischer monoklonaler Antikörper und
polyclonaler SCCE-spezifischer Hühner-
und Kaninchenantikörper
sowie immunhistochemische Studien mit den monoklonalen Antikörpern.
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Beispiel
6 beschreibt das Clonieren und die Sequenzierung einer cDNA, die
menschliches SCCE codiert. Zunächst
wurde eine cDNA-Bank, die aus von adulten menschlichen Keratinocyten
epidermalen Ursprungs abgeleiteter mRNA hergestellt worden war,
mit polyclonalen Anti-SCCE-Antikörpern
von Kaninchen abgesucht. Einer der Antikörper gab ein starkes Hintergrundsignal
und wurde zu einem frühen
Zeitpunkt aus der ausgedehnten Absuchungsstudie ausgeschieden. Unter
Verwendung eines anderen polyclonalen Antikörpers (D-5) wurde eine Anzahl
immunreaktiver Plaques in der für
echte positive Plaques erwarteten Weise angereichert. Es wurde jedoch
bei keinem der Plaques eine Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern moAb4 und
moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzym-Charakterisierung
und PCR-Charakterisierung von elf ausgewählten Plaques ergab, daß keine Ähnlichkeiten
zwischen den verschiedenen Plaques festgestellt werden konnten.
Da dieser Versuch, einen „Fingerabdruck" einer möglichen
SCCE-cDNA-Sequenz
zu definieren, gescheitert war, mußte die Strategie modifiziert
werden.
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Trotz
der bevorzugten Feststellung immunreaktiven SCCE-Materials in den
suprabasalen Keratinocyten, wurde eine cDNA-Bank, die aus gezüchteten
menschlichen Keratinocyten hergestellt worden war, zum Absuchen
von SCCE-cDNA verwendet. Es kann erwartet werden, daß eine solche
Bank nur cDNA aus basalen Keratinocyten enthält. Dieser Versuch basierte
auf der Beobachtung einer schwachen aber möglicherweise signifikanten
Immunfärbung
bei Verwendung von monoklonalen SCCE-Antikörpern, ebenfalls aus basalen
Keratinocyten.
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Die
Plaques wurden mit einer synthetischen 17-mer-OligoNukleotidsonde
abgesucht, die auf der Basis des zuverlässigsten Teils der Aminosäuresequenz,
Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro
(SEQ ID NR: 10, As 1–As
6) der experimentell bestimmten aminoterminalen Sequenz des nativen
SCCE-Enzyms wie in Beispiel 4 beschrieben entwickelt worden war.
Aufgrund der Unsicherheit innerhalb der experimentell bestimmten
Aminosäuresequenz,
wurde dieses Hexapeptid als einer der zuverlässigsten Teile erachtet. Auch
führten
die möglichen
Codons, die dieses Hexapeptid codieren, zur geringstmöglichen
Degeneration der DNA-Sonde. Die längere, experimentell bestimmte
Sequenz Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID NR: 3, As
15–As
24) wurde aufgrund des hohen Grades von Degeneration einer Sequenz,
die diese Peptidsequenzen codiert, ausgeschlossen. Vierzehn positive
Plaques wurden im ersten Suchvorgang festgestellt. Diese positiven
Plaques wurden erneut abgesucht, wobei die gleiche Sonde und die
gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben verwendet wurden.
Nach diesem erneuten Suchvorgang wurden zwei positive Plaques festgestellt.
Die beiden ausgewählten
Plaques wurden ein weiteres Mal gereinigt, und die Größe der Inserts
durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601, die zu den zwei
Phagenarmen komplementär
waren, als Primer und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden.
Dieses clonierte Fragment wurde einer partiellen Sequenzanalyse
unterworfen.
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Die Übersetzung
der erhaltenen DNA-Sequenz ergab eine Aminosäuresequenz, die zu der experimentell
bestimmten Proteinsequenz homolog war. Jedoch fehlte der Sequenz
ein Translationsstartcodon. Um eine cDNA von voller Länge zu isolieren,
wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel separiert und als
Sonde verwendet, die eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen
erlaubte. Um eine DNA von voller Länge zu erhalten, wurde die
cDNA-Bank mit dieser Sonde zweimal erneut abgesucht, wobei die gleichen
Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt wurden, außer daß die Hybridisierung
unter stringenten Bedingungen bei 65°C geschah. Diese Versuche führten zur
Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques, die
anfangs mit PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 oder SYM
1601 in Verbindung mit SYM 3208 als PCR-Primer für die Bestimmung einer Plaque,
die den ganzen 5' offenen
Leserahmen enthielt, verwendet wurde.
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Nach
weiterem Absuchen und weiterer Sequenzanalyse wurden die erhaltenen,
aus diesen Phagen abgeleiteten amplifizierten PCR-Fragmente wie
detailliert im Beispiel 6 beschrieben cloniert, und die Ergebnisse
zeigten, daß einer
der Phagen, 205.2.1, ein Insert von voller Länge enthielt. Die komplette
Nukleotidsequenz des cDNA-Fragments
wurde bestimmt. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) enthielt einen
offenen Leserahmen, der ausreichte, um die ganze Aminosäuresequenz
eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren
einschließlich
eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids
(SEQ ID NR: 2) zu codieren.
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Beispiel
7 beschreibt die Entdeckung von zwei SCCE-mRNA-Spezies in menschlicher
Epidermis, die in der Lage waren, mit cDNA-Sonden zu hybridisieren,
die auf der Grundlage einer SCCE-cDNA-Sequenz hergestellt worden
waren.
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Beispiel
8 beschreibt die Expression rekombinanten SCCE in E. coli. Die Ergebnisse
zeigen, daß es möglich ist,
rekombinantes SCCE in Bakterien herzustellen.
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Beispiel
9 beschreibt die Expression rekombinanten menschlichen SCCE in Säugerzellen.
Es werden drei Proteine hergestellt, die eine Reaktion mit allen
verfügbaren
polyclonalen Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern sowie
mit den hinterlegten polyclonalen Antikörpern zeigen. Die rekombinanten
Proteine, die mit den gegen natives SCCE hervorgerufenen Antikörpern reaktiv
sind, weisen ein etwa 1 kDa größeres scheinbares
Molekulargewicht auf als gereinigtes, natives menschliches SCCE.
Das rekombinante Protein zeigt keinerlei proteolytische Aktivität.
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Die
Reinigung, Aktivierung und weitere Charakterisierung von rekombinantem
SCCE wird im Beispiel 10 beschrieben. Die inaktive Vorform von rekombinantem
SCCE kann durch proteolytische Spaltung mit Trypsin oder Endopeptidase
Lys-C aktiviert werden. Man nimmt an, daß eine Anzahl anderer Proteasen,
die ein Peptid nach einer basischen Aminosäure spalten, wie etwa Endoproteinase
Lys-C, Papain und Plasmin, in der Lage sein werden, Pro-S CCE zu
aktivem SCCE zu aktivieren. Es wurde gefunden, daß das Signalpeptid
aus 22 Aminosäuren
besteht, und beruhend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz
von nativem, aktivem SCCE besteht das Propeptid aus sieben Aminosäuren. Weiterhin
wird gezeigt, daß das
erzeugte rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten Formen und in
einer nichtglykosylierten Form vorkommt, was analog zu den mit aktiver
nativer SCCE erhaltenen Ergebnissen ist.
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Unter
dem Begriff „Stratum
corneum chymotryptisches Enzym (SCCE)" oder „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" wird in seinem weitesten
Sinn eine Serinproteinase oder eine Vorform einer solchen, wie ein
Proenzym (Pro-5 CCE) oder ein Fusionsprotein, das durch proteolytische
Spaltung aktiviert werden kann, verstanden, wobei dieses Enzym in
seiner aktiven Form von den gleichen Inhibitoren und in ähnlicher
Weise gehemmt wird, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen
mit Proben verhornter Haut hervorgerufen werden kann, die bei neutralem
oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur inkubiert
werden.
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Spezifischer
gesehen, definiert der Begriff „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" somit ein Polypeptid, das
von Chymotrypsin und Cathepsin G verschieden ist, und das in seiner
aktiven Form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
(S-2586) abzubauen,
wobei der Abbau durch das Polypeptid von Aprotinin, Chymostatin
und Zinksulfat gehemmt wird, und zwar im wesentlichen wie in den
Beispielen 3 und 13 beschrieben und in 9 und
Tabelle 5 veranschaulicht.
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Noch
spezifischer umfaßt
der Begriff „ein
Polypeptid mit SCCE-Aktivität" ein Polypeptid,
das in der Lage ist, die proteolytische Degradation des desmosomalen
Proteins Desmoglein I während
der in vitro-Inkubation von plantarem Stratum corneum zu verursachen.
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Ein
solches Polypeptid wird im allgemeinen auch mit Antikörpern reagieren,
die gegen natives SCCE, das aus einem Extrakt von dissoziierten
plantaren Stratum corneum-Zellen gereinigt wurde, hervorgerufen wurden.
Beispiele solcher Antikörper
sind die polyclonalen Antikörper,
die wie in 5.2 beschrieben hergestellt werden, und die monoklonalen
Antikörper
TE4b und TE9b, die wie in Beispiel 5.1 beschrieben hergestellt werden.
Die monoklonalen Antikörper
werden von den Hybridomen TE4b und TE9b produziert, die gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags unter den Zugangsnummern ECACC 93061817
bzw. ECACC 93061816 bei der European Collection of Animal Cell Cultures,
Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich,
hinterlegt wurden.
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Das
Clonieren und die Sequenzierung einer cDNA, die menschliches SCCE
codiert, wird im Beispiel 6 beschrieben. Es wurde eine Nukleotidsequenz
gefunden, die einen offenen Lese-rahmen enthält, der ausreicht, um die ganze
Aminosäuresequenz
eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren
einschließlich eines
Signalpeptids und eines Präpolypeptids
zu codieren. Die Nukleotidsequenz wird in SEQ ID NR: 1 und die daraus
abgeleitete Aminosäuresequenz
von „Stratum
corneum chymotryptischem Enzym (SCCE)" in SEQ ID NR: 2 gezeigt.
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Mit
dem Begriff „Pro-SCCE
oder ein Analogon oder eine Variante davon" ist ein Polypeptid gemeint, das die
Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz
hat, die produziert wird, wenn eine Nukleotidsequenz der Erfindung
in einem geeigneten Expressionssystem exprirniert wird, und die
nach proteolytischer Aktivierung eine Serinproteinase ergibt, die
von den gleichen Inhibitoren gehemmt werden kann, wie die spontane
Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit Proben verhornter Hautschichten
induziert werden kann, die bei neutralem oder fast neutralem pH-Wert
bei physiologischer Temperatur, d.h. etwa 37°C inkubiert werden. Im allgemeinen
wird das Protein mit Antikörpern
reagieren, die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE
hervorgerufen wurden.
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Mit
dem Begriff „ein
SCCE oder ein Analogon oder eine Variante davon" ist ein Polypeptid gemeint, das die
Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz
hat, die produziert wird, wenn eine Nukleotidsequenz der Erfindung
in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird, und die eine
Serinproteinase ist, die von den gleichen Inhibitoren gehemmt werden
kann, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit
Proben verhornter Hautschichten induziert werden kann, die bei neutralem
oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur, d.h.
etwa 37°C
inkubiert werden. Im allgemeinen wird das Protein mit Antikörpern reagieren,
die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen
wurden.
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Mit
dem Begriff „ein
Analogon oder eine Variante davon" ist somit ein Polypeptid gemeint, das
nichtgenau die gleiche Aminosäuresequenz
hat, wie in SEQ ID NR: 2 gezeigt, aber noch „SCCE-Aktivität" wie vorstehend definiert
hat. Im allgemeinen werden solche Polypeptide Polypeptide sein,
die im Vergleich zu dem in den Beispielen beschriebenen SCCE-Protein
bis zu einem gewissen Grad variieren, z.B. hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung
oder in den posttranslationalen Modifikationen, z.B. Glykosylierung
oder Phosphorylierung.
-
Der
Begriff „Analogon" oder „Variante" wird also im vorliegenden
Zusammenhang gebraucht, um ein Protein oder Polypeptid von einer ähnlichen
Aminosäurezusammensetzung
oder -Sequenz wie die charakteristische Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 zu
bezeichnen, das vom SCCE-Protein wie in Beispiel 6 beschrieben abgeleitet
ist, wobei kleinere Abweichungen möglich sind, die die Aminosäuresequenz
verändern,
z.B. Deletionen, stellengerichtete Mutationen, Insertionen zusätzlicher
Aminosäuren
oder Kombinationen davon, um so SCCE-Proteinanaloga zu erzeugen.
Diese Modifikationen können
interessante und nützliche
neuartige Eigenschaften des Analogons ergeben. Das analoge Polypeptid
oder Protein kann von einem Tier oder einen Menschen abgeleitet
oder teilweise oder komplett synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon
kann auch durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken abgeleitet sein.
-
Eine
wichtige Auführungsform,
die ein Polypeptid angeht, in dem mindestens ein Aminosäurerest durch
einen anderen Aminosäurerest
ersetzt wurde, und/oder bei dem mindestens ein Aminosäurerest
deletiert oder hinzugefügt
wurde, so daß sich
ein Polypeptid ergibt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die
von der Aminosäuresequenz
aus SEQ ID NR: 2 oder einer Untersequenz dieser Aminosäuresequenz,
wie nachstehend definiert, verschieden ist, doch im wesentlichen
die vorstehend definierte SCCE-Aktivität hat.
-
Eine
interessante Ausführungsform
betrifft ein Polypeptid, das ein Analogon oder eine Untersequenz des
Polypeptids der Erfindung ist, und das 50 bis 250 Aminosäuren umfaßt, z.B.
mindestens 70 Aminosäuren, mindestens
100 Aminosäuren,
mindestens 150 Aminosäuren
oder mindestens 200 Aminosäuren.
-
Besonders
wichtige Auführungsformen
sind das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz -7-224 in SEQ ID
NR: 2 (SCCE) (pro-SCCE) und das Polypeptids mit der Aminosäuresequenz
1-224 in SEQ ID NR:2 (SCCE).
-
Der
Begriff „enzymatisch
aktive Untersequenz" bezeichnet
eine Polypeptidsequenz, die nur einen Teil der in SEQ ID NR: 2 gezeigten
Polypeptidsequenz umfaßt,
und die enzymatische Aktivität
aufweist. Dazu zählen
auch Polypeptidsequenzen, die durch Modifikationen wie hier erklärt analogisiert
wurden. Das spezifische Polypeptid (oder die Polypeptide), das die
enzymatisch aktive Stelle umfaßt,
wird als besonders interessant erachtet.
-
Die
vorhergesagte Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 wurde mit den Aminosäuresequenzen der Enzyme menschliches
Chymotrypsin (Toulta et al., 1989), menschliches Cathepsin G (Salvesen
et al., 1987) und menschliche Mastzellen-Chymase (Caughey et al., 1991) verglichen.
Obwohl die abgeleitete Aminosäuresequenz
die konservierten aktiven Regionen von Serinproteinasen enthält, ist
der Grad der Homologie ziemlich niedrig, ungefähr 33–38%. In dieser Hinsicht erscheint
es somit, daß SCCE
nur eine mäßige Ähnlichkeit
mit bisher bekannten Serinproteinasen hat. Andererseits ist SCCE
eine typische Serinproteinase, was die Histidin-, Aspartat- und
Serinreste des aktiven Zentrums und die konservierten Regionen in
der Nähe
dieser Stellen betrifft. Dies gilt auch für die meisten der Cysteinreste
und der anderen hochgradig konservierten Regionen von Serinproteinasen.
Am Boden der primären
Spezifitätstasche
(Rest 189 bei Chymotrypsin) befindet sich ein Serinrest in menschlichem
Chymotrypsin, in Mastzellen-Chymase und in prostataspezifischem
Antigen, und ein Alaninrest in menschlichem Cathepsin G. Beim SCCE
hingegen wird diese Position von einem Asparaginrest eingenommen.
Dies könnte
den Befund erklären,
daß SCCE,
obwohl es zweifellos chymotryptische Aktivität hat, sich in seiner relativen
Aktivität
verschiedenen chromogenen Peptidsubstraten gegenüber von Chymotrypsin und Cathepsin
G unterscheidet, so, wie dies auch die Inhibitionswirkung von Chymostatin,
einem Inhibitor chymotrypsinartiger Enzyme von geringer Molekularmasse
tut.
-
Einen
Vergleich zwischen den Sequenzen von menschlichem Chymotrypsin,
menschlichem Cathepsin G und menschlicher Mastzellen-Chymase und
der von SCCE ist in der folgenden Aufstellung der Sequenzen gezeigt.
-
-
Die
Ausrichtung geschah manuell.
- HUMCTRP
- = menschliches Chymotrypsin
(Touita et al., BBRC 158: 569–575,
1989)
- HUMCHTG
- = menschliches Cathepsin
G (Salvesen et al., Biochemistry 26: 2289–2293, 1987)
- HUMCHYM
- = menschliche Mastzellen-Chymase
(Caughey et al., J. Biol. Chem. 266: 12956–12963, 1991)
-
Homologien:
-
- HUMCTRP/SCCE: 85/224 = 38%
- HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33%
- HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33%
- HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48%
-
Die
Numerierung bezieht sich auf Chymotrypsinogen.
-
Unterstreichungen:
-
Konservierte
Regionen in der Nähe
des aktiven Zentrums (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 bei Chymotrypsin
und der primären
Spezifitätstasche
von Chymotrypsin (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 bei Chymotrypsin).
-
Sternchen:
-
- Mögliche
Glykosylierungsstellen bei SCCE.
-
Eine
wichtige Ausührungsform,
die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, von der
eine fortlaufende Abfolge von 20 Aminosäuren zu mindestens 80% zu einer
ebenso langen Abfolge von Aminosäuren
aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz homolog ist.
-
Polypeptidsequenzen,
die eine Homologie von mindestens 80%, wie mindestens 85%, z.B.
90% mit dem in SEQ ID NR: 2 gezeigten Polypeptid haben, sind wichtig.
Da die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Sequenz ziemlich einzigartig zu
sein scheint, der Schutzbereich umfasst Polypeptide, für die der
Homologiegrad zu einer ähnlichen
fortlaufenden Abfolge von 20 Aminosäuren, die aus der in SEQ ID
NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
ausgewählt
werden, nicht über
55%, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 70% beträgt. Solche Sequenzen können von ähnlichen
Proteinen von anderen Arten, z.B. anderen Säugern, wie Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen,
Schwein oder Rind sein. Da kleinere Teile der Sequenz beträchtliche Ähnlichkeiten
zu anderen Serinproteinasen aufweisen können, beinhaltet der Schutzbereich
auch Peptide mit einem Homologiegrad von mindestens 95% und, am
meisten vorzuziehen, mindestens 99% Homologie zu einer ähnlichen fortlaufenden
Abfolge von 20 Aminosäuren,
die aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt werden.
-
Mit
dem Begriff „Sequenzhomologie" ist die Identität der Aminosäuresequenzen
in Abschnitten von zwei oder mehr Aminosäuren des Gegenstückes hinsichtlich
Identität
und Position der Aminosäuren
der Polypeptide gemeint.
-
Der
Begriff „homolog" wird somit hier
dazu verwendet, den Grad der Identität zwischen der Aminosäuresequenz
eines gegebenen Polypeptids und der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
zu veranschaulichen. Die Aminosäuresequenz,
die mit der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz verglichen werden
soll, kann aus einer Nukleotidsequenz, wie einer DNA- oder RNA-Sequenz
abgeleitet werden; z.B. durch Hybridisierung, wie nachstehend definiert
erhalten sein, oder sie kann durch konventionelle Aminosäuresequenzierungsverfahren
erhalten werden. Der Homologiegrad wird vorzugsweise anhand der
Aminosäuresequenz
eines reifen Polypeptids bestimmt, das heißt, ohne irgendwelche Leader-Sequenzen
in Betracht zu ziehen. Im allgemeinen werden nur codierende Regionen
verwendet, wenn Nukleotidsequenzen untereinander verglichen werden,
um ihre interne Homologie zu bestimmen.
-
Im
vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „Polypeptid, das von mindestens
einem der hinterlegten Antikörper
erkannt wird" auch
eine Aminosäuresequenz
einschließen,
die Aminosäuren
umfaßt,
die einen hinsichtlich linearer oder räumlicher Anordnung im wesentlichen
zusammenhängenden
Bereich einer beliebigen Untersequenz des in SEQ ID NR: 2 gezeigten
Polypeptids darstellen, der von mindestens einem der hinterlegten
Antikörper
erkannt wird. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt, können auch
die sekundäre oder
tertiäre
Anordnung interessante und nützliche
Eigenschaften haben und Epitope darstellen. Die hinterlegten Antikörper TE4b
und TE9b scheinen Konformationsepitope des SCCE zu erkennen.
-
Es
wurde gezeigt, daß ein
wie in Beispiel 5.2.2 hergestellter polyclonaler Antikörper von
Kaninchen in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine körnige Färbung des
Stratum granulosum und eine ziemlich diffuse Färbung des unteren Stratum corneum
hervorrief. Antikörper,
die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen
wurden, werden im allgemeinen an suprabasale Zellen in keratinisiertem
(verhorntem) menschlichem schuppigen Epithel binden, nicht aber
an Epithelzellen in nichtverhorntem schuppigem Epithel. Diese Antikörper werden
auch an den interzellulären
Raum der verhornten Schicht der menschlichen Haut binden.
-
Antikörper nach
Anspruch 1 sind für
eine Reihe von Zwecken geeignet, wie nachfolgend aufgeführt:
-
Zur Reinigung von Proteinen:
-
Die
Antikörper
können
zur Reinigung des Proteins/der Proteine oder seiner/ihrer Analoga
aus biologischen Proben verwendet werden, wozu die Verfahren der
Affinitätschromatographie
oder Immunfällung
verwendet werden.
-
Für die Diagnose und Therapie:
-
Die
monoklonalen Antikörper
gegen das Polypeptid/die Polypeptide oder seiner/ihrer Analoga kann bei
der Diagnose und Therapie von Krankheitszuständen bei Tieren und Menschen
verwendet werden. Das Diagnosemittel kann ein Antikörper mit
der Spezifität
für das
Polypeptid wie vorstehend definiert sein. Der Antikörper kann
an ein anderes Protein oder an einen festen Träger gekoppelt sein, und/oder
er kann in den Agglutinationstests oder den Farbentwicklungstests
verwendet werden. Solche Antikörper
können
auch dazu verwendet werden, SCCE-Polypeptide oder Analoga davon
in biologischen Proben mittels der standardmäßigen histochemischen oder
immunchemischen Verfahren zu quantifizieren.
-
Die
Beschreibung beschreibt eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid,
wie vorstehend definiert, codiert. Im Einzelnen behandelt die Beschreibung
eine Nukleotidsequenz, die im wesentlichen die in SEQ ID NR: 1 gezeigte
Sequenz umfaßt.
Andere wichtige Ausführungsformen
betreffen eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Untersequenz
der Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 codiert, wie eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid
codiert, das die Aminosäuresequenz
-7-224 von SEQ ID NR: 2, oder ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz
1-224 von SEQ ID NR: 2 umfaßt.
-
Die
Beschreibung behandelt auch eine Nukleotidsequenz, die mit der in
SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen
hybridisiert, wie in Beispiel 7 und Beispiel 9 beschrieben.
-
In
einem anderen Aspekt behandelt die Beschreibung eine Nukleotidsequenz,
die die in SEQ ID NR:1 gezeigte Nukleotidsequenz oder ein Analogon
oder eine Untersequenz davon hat, die
- 1) eine
Homologie mit der in SEQ ID NR:1 gezeigten Sequenz von mindestens
90% hat, und/oder
- 2) ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz mindestens 80% mit
der in SEQ ID NR:2 gezeigten Aminosäuresequenz homolog ist, und/oder
- 3) ein Polypeptid codiert, das durch dem monoklonalen Antikörper gebunden
ist, der von der Hybridomzelllinie TE4b erzeugt ist, die am 18.
Juni 1993 bei ECACC hinterlegt wurde und die provisorische Hinterlegungsnummer
ECACC 93061817 erhalten hat, oder der monoklonale Antikörper, der
von der Hybridomzelllinie TE9b erzeugt ist, die am 18. Juni 1993
bei ECACC hinterlegt wurde und die provisorische Hinterlegungsnummer
93061816 erhalten hat, und/oder
- 4) ein Polypeptid codiert, das durch ein polyklonales Antiserum
gebunden ist, das gegen native SCCE hergestellt ist, die von einem
Extrakt dissociierten plantar stratum corneum Zellen gereinigt ist.
-
Innerhalb
des Schutzbereichs ist auch eine modifizierte Nukleotidsequenz,
die sich von der oben definierten Nukleotidsequenz insoweit unterscheidet,
daß mindestens
ein Nukleotid entfernt, ersetzt oder modifiziert worden ist, oder
mindestens ein zusätzliches
Nukleotid eingesetzt worden ist, um in einer Nukleotidsequenz zu
resultieren, die ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität codiert.
-
Der
Begriff „Analogon" hinsichtlich der
DNA-Fragmente der Erfindung soll eine Nukleotidsequenz bezeichnen,
die ein Polypeptid codiert, das identisch oder im wesentlichen identisch
mit dem Polypeptid ist, das von einem DNA-Fragment der Erfindung
codiert wird. Es ist all-gemein bekannt, daß die gleiche Aminosäure von
verschiedenen Codons codiert werden kann, wobei die Codonverwendung
unter anderem mit der Präferenz
des betreffenden, Nukleotidsequenz-exprimierenden Organismus zusammenhängt. So
können
ein oder mehrere Nukleotide oder Codons des DNA-Fragment der Erfindung
gegen andere ausgetauscht werden, die, wenn sie exprimiert werden,
zu einem Polypeptid führen,
das mit dem vom betreffenden DNA-Fragment codierten Polypeptid identisch
oder im wesentlichen identisch ist.
-
Der
Begriff „Analogon" wird im vorliegenden
Zusammenhang auch dazu verwendet, ein DNA-Fragment oder eine DNA-Sequenz
von einer ähnlichen
Nukleotidzusammensetzung oder -sequenz wie die charakteristische
DNA-Sequenz SEQ ID NR: 1, welche die das SCCE-Polypeptid bildende
Aminosäuresequenz
codiert, zu bezeichnen; hierbei sind geringfügige Variationen zulässig, die
keine wesentliche widrige Auswirkung auf die Enzymaktivität des Analogons
im Vergleich zur Aktivität
von nativem SCCE-Protein haben, wie in Beispiel 3 beschrieben. Mit
dem Begriff „wesentliche
widrige Auswirkung" ist
gemeint, daß die
Enzymaktivität
des Analogons mindestens 50%, stärker
vorzuziehen mindestens 60%, noch stärker vorzuziehen mindestens 70%,
wie mindestens 75% der Enzymaktivität des nativen SCCE, wenn z.B.
wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt, betragen sollte. Das analoge
DNA-Fragment oder die DNA-Sequenz kann von einem Organismus, wie einem
Tier oder einem Menschen abgeleitet sein, oder kann teilweise oder
komplett synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann auch durch
die Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren abgeleitet sein.
-
Darüberhinaus
sollen die Begriffe „Analogon" und „Untersequenz" Abweichungen in
der Sequenz, wie Substitution, Insertion (einschließlich Introns),
Addition und Neuanordnung eines oder mehrerer Nukleotide zulassen,
die keine wesentliche widrige Auswirkung auf das von dem DNA-Fragment
codierten Polypeptid oder eine Untersequenz davon haben.
-
Der
Begriff „Substitution" soll die Ersetzung
eines oder mehrere Nukleotide in der vollen Nukleotidsequenz mit
einem oder mehreren verschiedenen Nukleotiden bedeuten, unter „Addition" wird die Hinzufügung eines
oder mehrerer Nukleotide an jedem beliebigen Ende der vollen Nukleotidsequenz
verstanden, „Insertion" soll die Einführung von
einem oder mehreren Nukleotiden in die volle Nukleotidsequenz bedeuten, „Deletion" soll anzeigen, daß ein oder
mehrere Nukleotide aus der vollen Nukleotidsequenz entfernt wurden,
ob an einem beliebigen Ende der Sequenz oder an jedem geeigneten
Punkt innerhalb derselben, und „Neuanordnung" soll bedeuten, daß zwei oder
mehr Nukleotidreste innerhalb der DNA bzw. der Polypeptidsequenz
ausgetauscht wurden. Das DNA-Fragment kann jedoch auch durch Mutagenese
entweder vor oder nach seiner Einführung in den Organismus verändert werden.
-
Im
Sprachgebrauch der vorliegenden Erfindung und der Ansprüche sollen
die Begriffe „Fragment", „Sequenz", „Untersequenz" und „Analogon" hinsichtlich Fragmenten,
Sequenzen, Untersequenzen und Analoga gemäß der Erfindung selbstverständlich so
verstanden werden, daß sie
nicht diese Phänomene
in ihrer natürlichen
Umgebung umfassen, sondern vielmehr z.B. in isolierter, gereinigter,
in vitro- oder rekombinanter Form.
-
Die
in der vorliegenden Beschreibung behandelten Polypeptide können unter
Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.
Eine wichtige Ausführungsform
betrifft ein Expressionssystem, das eine Nukleotidsequenz umfaßt.
-
Der
Organismus, der für
die Herstellung des Polypeptids benützt wird, kann ein höherer Organismus, z.B.
ein Tier oder ein niederer Organismus, z.B. ein Mikroorganismus
wie E. coli sein. Ungeachtet des verwendeten Organismentyps wird
das DNA-Fragment in den Organismus entweder direkt oder mittels
eines geeigneten Vektors eingeführt.
Alternativ können
die Polypeptide durch Einführen
des DNA-Fragments
der Erfindung oder eines Analogons oder einer Untersequenz desselben
entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors in Säuger-Zellinien
hergestellt werden.
-
Das
DNA-Fragment oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon kann
in einen geeigneten stabilen Expressionsvektor cloniert werden und
dann in eine geeignete Zellinie gesetzt werden. Die Zellen, die die
gewünschten
Polypeptide herstellen werden dann auf der Grundlage des Produktivitätsniveaus
unter Bedingungen, die für
den Vektor und die verwendete Zellinie geeignet sind, selektiert.
Die selektierten Zellen werden weitergezüchtet und bilden eine sehr
wichtige und kontinuierliche Quelle der gewünschten Polypeptide.
-
Ein
Beispiel eines spezifischen Analogon der DNA-Sequenz der Erfindung
ist eine DNA-Sequenz, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte DNA-Sequenz
oder einen Teil davon umfaßt,
und die besonders an eine Expression in E. coli angepaßt ist.
Diese DNA-Sequenz ist eine, die, wenn sie zusammen mit geeigneten
regulatorischen Sequenzen in E. coli insertiert wird, zur Expression
eines Polypeptids führt,
das im wesentlichen die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz
oder einen Teil davon hat. Somit umfaßt diese DNA-Sequenz spezifische
Codons, die von E. coli erkannt werden. Ein Beispiel dieser Ausführungsform
ist in Beispiel 8 beschrieben.
-
Im
vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff „Gen" verwendet, um eine DNA-Sequenz zu bezeichnen,
die an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist, und
die Regionen beinhaltet, die der codierenden Region (5'-Stromaufwärts- und
3'-Stromabwärts-Sequenzen)
vor-ausgehen oder ihr nachfolgen, sowie intervenierende Sequenzen,
Introns, die zwischen einzelnen codierenden Segmenten, Exons, oder
in der 5'-Stromaufwärts- oder
3'-Stromabwärts-Region
gelegen sind. Die 5'-Stromaufwärts-Region
umfaßt
eine regulatorische Sequenz, die die Expression des Gens steuert,
typischerweise einen Promotor. Die 3'-Stromabwärts-Region umfaßt Sequenzen,
die an der Termination der Transkription des Gens beteiligt sind,
und wahlweise Sequenzen, die für
die Polyadenylierung des Transkripts und der 3'-nichtübersetzten Region verantwortlich
sind.
-
In Übereinstimmung
mit dem vorstehend Gesagten betrifft die Erfindung ein Expressionssystem,
das eine Nukleotidsequenz wie die vorstehend beschriebene umfaßt, die
ein Polypeptid codiert, wobei das System eine 5'-flankierende Sequenz umfaßt, die
in der Lage ist, die Expression jener Nukleotidsequenz zu vermitteln.
-
Im
Einzelnen behandelt die Beschreibung einen replizierbaren Expressionsvektor,
der eine Nukleotidsequenz enthält
und in der Lage ist, deren Expression zu vermitteln. Eine spezifische
Ausführungsform
betrifft einen als pS507 bezeichneten replizierbaren Expressionsvektor,
der gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer
DSM 8282 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM) hinterlegt wurde, und Expressionsvektoren, die Nukleotidsequenzen
exprimieren, welche von der Nukleotidsequenz dieses hinterlegten
Vektors abweichen, welche aber das gleiche Polypeptid oder ein Analogon
oder eine Variante davon mit SCCE-Aktivität codieren.
-
Mit
anderen Worten behandelt die Beschreibung auch einen replizierbaren
Expressionsvektor wie vorstehend beschrieben, wobei die exprimierte
Nukleotidsequenz sich von der Nukleotidsequenz des hinterlegten Vektors
darin unterscheidet, daß mindestens
ein Nukleotid deletiert, substituiert oder modifiziert oder mindestens
ein zusätzliches
Nukleotid insertiert wurde, so daß sich eine Nukleotidsequenz
ergibt, die ein Polypeptid mit SCCEAktivität codiert.
-
Weiterhin
behandelt die Beschreibung ein als pS500 bezeichnetes Plasmid, das
gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer
DSM 8281 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSM) hinterlegt wurde, und Plasmide, die eine Nukleotidsequenz
haben, welche von der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz
abweicht, die aber das in SEQ ID NR: 2 gezeigte Polypeptid oder
ein Analogon oder eine Variante davon, die SCCE-Aktivität aufweisen,
codiert, oder die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nukleotidsequenz
oder einem Teil davon unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisiert.
-
Innerhalb
des Schutzbereiches liegt auch ein nichtmenschlicher Organismus,
der einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung
enthält.
Organismen, die in dieser Hinsicht der Erfindung verwendet werden
können,
umfassen Mikroorganismen, wie ein Bakterium der Gattung Bacillus,
Escherichia oder Salmonella, eine Hefe, wie Saccharomyces, Pichia,
eine Protozoen- oder eine aus einem mehrzelligen Organismus abgeleitete Zelle,
wie ein Pilz, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Säugerzelle
oder eine Zellinie. Wenn der Organismus ein Bakterium ist, ist ein
Bakterium der Gattung Escherichia vorzuziehen, z.B. E. coli.
-
Die
Beschreibung behandelt ferner einen Plasmidvektor, der eine DNA-Sequenz
enthält,
die ein Polypeptid oder ein Fusionspolypeptid wie hierin definiert
codiert. In einer besonders wichtigen Ausführungsform kann das DNA-Fragment
oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon oder ein hier definiertes
fusioniertes DNA-Fragment
in einem replizierbaren Expressionsvektor enthalten sein, der in
der Lage ist, sich in einem Wirtsorganismus oder eine Zellinie zu
replizieren.
-
Im
Einzelnen kann der Vektor ein Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom
oder Virus sein. In einer interessanten Ausführungsform kann der Vektor
ein Vektor sein, der, in eine Wirtszelle eingeschleust, in das Wirtszellengenom
eingebaut wird.
-
Wenn
ein höherer
Organismus verwendet wird, können
transgene Techniken für
die Produktion der Polypeptide angewandt werden. Beispiele geeignete
Tiere sind Schafe, Rinder, Schweine usw. Ein DNA-Fragment, das ein
Polypeptid codiert, wird im gewünschten
Gewebe unter der Steuerung gewebespezifischer regulatorischer Elemente
exprimiert. Das so erhaltene Protein kann dann posttranslationalen
Modifikationen unterworfen werden, um damit ein Polypeptid zu erhalten.
-
Die
transgenen nicht-menschlichen Säugetieren
der Erfindung werden erzeugt, indem ein „Transgen" in eine embryonale Zielzelle des Tieres
der Wahl eingeschleust wird. Unter einem Gesichtspunkt ist ein Transgen
eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen gewünschten Phänotypen hervorzubringen, wenn
sie im Genom von Zellen eines transgenen nicht-menschlichen Säugers enthalten
ist. In spezifischen Ausführungsformen
umfaßt
das Transgen eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid codiert, wobei
das Transgen in der Lage ist, exprimiert zu werden, wodurch das
Polypeptid hergestellt wird.
-
Der
Einbau des Expressionssystems in die Keimbahn des Säugers kann
mit jedem beliebigen geeigneten Verfahren geschehen, z.B. wie bei
Hogan et al., 1986 oder in WO 93/04172 beschrieben.
-
Ein
Aspekt betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids
wie vorstehend definiert, das die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) Insertion einer Nukleotidsequenz in einen
Expressionsvektor,
- (b) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem
in Schritt (a) hergestellten Vektor,
- (c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus
unter Bedingungen, die für
die Expression des Polypeptids geeignet sind,
- (d) Gewinnung des Polypeptids, und
- (e) wahlweise posttranslationale Modifikation des Polypeptids.
-
Innerhalb
des Schutzbereiches liegt auch ein Verfahren wie vor-stehend beschrieben,
bei dem das erzeugte Polypeptid durch ein Verfahren isoliert wird,
das einen oder mehrere Schritte umfaßt, wie Affinitätschromatographie
mit immobilisiertem nativem oder rekombinantem SCCE-Polypeptid oder
mit Antikörpern,
die mit diesem Polypeptid reagieren und/oder anderen chromatographischen
und elektrophoretischen Verfahren.
-
Das
wie vorstehend beschrieben hergestellte Polypeptid kann posttranslationalen
Modifikationen als Ergebnis von Wärmebehandlung, chemischer Behandlung
(Formaldehyd, Glutaraldehyd usw.) oder Enzymbehandlung (Peptidasen,
Proteinasen und Proteinmodifikationsenzyme) unterworfen werden.
Wenn das Polypeptid in einem Organismus hergestellt wurde, kann
es in anderer Weise als in seiner natürlichen Herstellungsumgebung
behandelt werden. Z.B. wird Glykosylierung oft erreicht, wenn das
Polypeptid durch eine Zelle eines höheren Organismus, wie Hefe
oder vorzugsweise ein Säuger
exprirniert wird. Die Glykosylierung findet sich normalerweise in
Verbindung mit den Aminosäureresten
Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin. Es kann vorteilhaft sein oder auch
nicht, die durch den betreffenden Wirtsorganismus bedingten Verarbeitungsmerkmale
zu entfernen oder abzuändern.
-
Im
Anschluß an
die Expression des Polypeptids in einem Organismus oder einer Zellinie,
kann das Polypeptid entweder als solches verwendet werden, oder
es kann zuerst aus dem Organismus oder der Zellinie gereinigt werden.
Wenn das Polypeptid als sekretiertes Produkt exprimiert wird, kann
es direkt gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als assoziiertes
Produkt exprimiert wird, kann eine teilweise oder vollständige Zerstörung des
Wirts vor der Reinigung erforderlich sein. Beispiele für Verfahren,
die für
die Reinigung von Polypeptiden angewandt werden sind: (i) Immunfällung oder
Affinitätschromatographie
mit Antikörpern,
(ii) Affinitätschromatographie
mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere chromatographische Verfahren,
wie Gelfiltration, Ionenaustausch oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
oder aus den obigen abgeleitete Verfahren, (iv) elektrophoretische
Verfahren, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese, denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
Agarose-Gelelektrophorese und Isoelektrische Fokussierung, (v) jedes
andere spezifische Solubilisierungs- und/oder Reinigungsverfahren.
-
Die
vorliegende Beschreibung behandelt auch ein im wesentlichen reines
SCCE-Polypeptid.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „im wesentlichen
rein", daß das betreffende
Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Bestandteilen, z.B.
anderen Polypeptiden oder Kohlenhydraten ist, die von der Herstellung
und/oder Gewinnung des Polypeptids herrühren oder sonst wie zusammen
mit dem Polypeptid vorkommen könnten.
Die Reinheit eines Proteins kann durch SDS-Gelelektrophorese, die wie in Beispiel
3 beschrieben ausgeführt
wird, abgeschätzt
werden.
-
Das
Polypeptid kann wie in Beispiel 4 beschrieben durch SBTI-Affinitätschromatographie
auf einem irrmobilisierten Antikörper,
wie dem Antikörper
TE4b, nach Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, gereinigt
werden. Ein hoher Reinheitsgrad des Polypeptids kann vorteilhaft
sein, wenn das Polypeptid in einer pharmazeutischen oder kosmetischen
Zusammensetzung verwendet werden soll. Das im wesentlichen reine
Polypeptid kann eben wegen seiner hohen Reinheit für die meisten
Zwecke in einer geringeren Menge verwendet werden, als ein Polypeptid
von konventioneller, geringerer Reinheit.
-
Unter
einem Gesichtspunkt kann das reine Polypeptid aus einer geeigneten
Zellinie, die ein Polypeptid exprimiert, wie in Beispiel 9 beschrieben,
erhalten werden. Auch kann ein Polypeptid nach den allgemein bekannten
Verfahren der Flüssig-
oder Festphasen-Peptidsynthese durch Aneinanderkoppeln der einzelnen Aminosäuren der
Polypeptidsequenz hergestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid
durch Aneinanderkoppeln einzelner Aminosäuren synthetisiert werden,
die Fragmente der Polypeptidsequenz bilden, und die später ihrerseits
aneinandergekoppelt werden und so das gewünschte Polypeptid ergeben.
Diese Methoden konstituieren einen anderen interessanten Aspekt.
-
Es
wird angenommen, daß in
der cutanen Umgebung ein „Kaskadensystem" proteolytischer
Enzyme existiert, das dem Plasminogen-Aktivierungssystem ähnelt.
-
Man
nimmt an, daß SCCE
eines der Endprodukte dieses Systems ist. Es wird angenommen, daß die Aktivität von SCCE
mit Hilfe eines „SCCE-Inhibitors" gehemmt werden kann.
-
Bei
einer Anzahl von Hautkrankheiten, wie Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten
oder acantholytische Krankheiten, z.B. Familien-Pemphigus und Darier'scher Krankheit ist
die Kohäsion
zwischen Keratinocyten und der nichtverhornten, lebensfähigen Epidermisschicht
beeinträchtigt
(vgl. Störungen
der Zellkohäsion
in lebensfähiger
Epidermis). Es wird angenommen, daß dieser Vorgang von Proteinasen
bewirkt wird, und daß er somit
durch Verabreichung einer Zusammensetzung behandelt werden kann,
die in der Lage ist, die Enzymaktivität von nativem SCCE zu hemmen.
Es könnte
auch vorteilhaft sein, bei Zuständen,
bei denen eine entzündliche
Komponente die vorherrschende Erscheinung ist, einen SCCE-Inhibitor
zur Behandlung von Psoriasis und anderen entzündlichen Hautkrankheiten zu
verabreichen.
-
Es
wird somit angenommen, daß ein
SCCE-Inhibitor, der eine hemmende Auswirkung auf die Enzymaktivität von nativem
SCCE hat, zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur
Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder acantholytischen
Krankheiten, z.B. Familien-Pemphigus
und Darier'sche
Krankheit verwendbar ist.
-
Im
vorliegenden Zusammenhang betrifft der Begriff „SCCE-Inhibitor" einen schon existierenden
oder neuartigen Wirkstoff, der in der Lage ist, mit einer enzymatisch
aktiven Polypeptidsequenz oder -untersequenz der Erfindung oder
einem Analogon davon in einer solchen Weise zu interagieren, daß die SCCE-Aktivität vermindert
ist. Eine Verminderung kann z.B. durch Ausführen eines Versuchs wie in
Beispiel 3.2 umrissen gemessen werden, wobei der potentielle SCCE-Inhibitor
als Inhibitor verwendet wird. Diese Wirkstoffe können organische Moleküle, kleine
Peptide oder große
Polypeptide oder Derivate der vorstehend Genannten sein. Eine solche
Vorgehensweise kann Anwendung in einem Durchmusterungsprogramm zur
Bestimmung von SCCE-Inhibitoren finden.
-
LEGENDEN ZU
DEN FIGUREN
-
1.
Unipolare Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro.
Die Gewebeoberfläche, die
in vivo nach außen
zeigte, zeigt in der Figur nach oben. Beachte, daß während der
Inkubation an dieser Oberfläche
eine fortschreitende Zelldissoziation stattfand, an den anderen
Oberflächen
jedoch keine Dissoziation stattfand.
-
2.
Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin auf die Zellabgabe von plantarem
Stratum corneum, das ohne (Kreise) und mit (Dreiecke) Aprotinin
inkubiert wurde. Der Mittelwert (kumulative Werte für vier Gewebestücke) und
der Schwankungsbereich sind angegeben.
-
3. Anti-Desmoglein- (anti-DG I)- reaktive
Bestandteile in kohärentem
plantarem Stratum corneum und in dissoziierten Zellen. A. Coomassieblau
gefärbte
SDS-PAGE. B. Immunblot.
1–3: Zusammenhängendes Gewebe,
unverdünnt
(1), verdünnt
1/3 (2), verdünnt
1/9 (3). 4–5:
Dissoziierte Zellen, unverdünnt
(4), verdünnt 1/3
(5). Beachte das nur scheinbar intakte DG I mit Mr 160 kD in zusammenhängendem
Gewebe, und nur Degradationsprodukte von DG I mit Mr 95 und 80 kD
in dissoziierten Zellen.
-
4. Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin
auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum
corneum, das in vitro-Zellabschuppung mitmacht. Densitometrische
Scans von Immunblots von Extrakten aus plantarem Stratum corneum,
das in Abwesenheit (A) und in Gegenwart (B) von Aprotinin (15 μM) inkubiert
wurde. Die Spitzen bei 95 und 80 kD entsprechen den Degradationsprodukten
dieses Proteins (vgl. 3). Beachte
die wirksame Hemmung der Degradation von DG I durch Aprotinin.
-
5. Die Wirkung von Zinkionen (A), Chymostatin
und Leupeptin (B) auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in
plantarem Stratum corneum während
der in vitro-Zellabschuppung. Beachte die Inhibition der Transformation
der anti-DG Ipositiven Bestandteile von 160 kD bis 95 und 80 kD
durch Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin.
-
6.
Mit den plantaren Stratum corneum-Zellen zusammenhängende peptidhydrolysierende
Aktivität.
Die Hydrolyse der zwei Substrate wurde mittels Messung der Veränderung
der Absorption bei 405 nm verfolgt. Mittelwerte aus Inkubationen
in dreifachem Ansatz. Quadrate = S-2586; Kreise = S-2288.
-
7.
pH-Abhängigkeit
der mit den Corneocyten zusammenhängenden Hydrolyseaktivität von S-2586.
Mittelwerte aus Inkubationen in dreifachem Ansatz. Quadrate = Natriumacetat,
Kreise = Natriumphosphat, Dreiecke = Tris-HCl.
-
8. Zymographie, die die caseinolytische
Aktivität
in Extrakten aus dissoziierten plantaren Stratum corneum-Zellen
zeigt. Vgl. auch den Text von Beispiel 2.2 zu Versuchsdetails.
- A: Vergleich des Enzyms aus plantaren Corneocyten,
das mit Laemmli'schem
Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (sc/s) und KC1 (sc/k) mit Rinder-Chymotrypsin,
0,125 ng (c) und Rinder-Trypsin 0,5 ng (t) extrahiert wurden. Vor
der Elektrophorese wurde der KCl-Extrakt gegen 5 mM Tris-HCl, pH
6.8, und bis zu einer Endkonzentration wie beim Probenpuffer hinzu-gefügtem SDS
und Glcerin dialysiert; 10 μl
wurden zu allen Reihen hinzugefügt.
Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite.
- B: pH-Abhängigkeit
des Inkubationspuffers. Enzymquelle = SDS-Extrakte dissoziierter
plantarer Corneocyten. Puffer zur Vorbehandlung mit Triton X-100
und Inkubation: 0,1 M Natriumacetat (pH 4.0 und pH 5.5), und 0,1
M Tris-HCl (pH 7.0 und pH 8.0). Die anderen Bedingungen wie in A.
- C: die Auswirkung von Inhibitoren. sc = SDS-Extrakt von plantaren
Corneocyten; c = Rinder-Chymotrypsin; t = Rinder-Trypsin. Die Inhibitoren
waren während
der Vorbehandlung mit Triton X-100 und der anschließenden Inkubation
vorhanden. Die Endkonzentration von Leu-peptin war 160 μM, die von
Aprotinin 15 μM, die
von Chymostatin 40 μM
und die von Zinkionen (als Sulfat) 100 μM. Leupeptin und Chymostatin
wurden als Lösungen
in Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Puffer für die Vorbehandlung
und Inkubation = 0,1 M Tris-HCl, pH 8 mit einer DMSO-Endkonzentration
von 1% (v/v). Die anderen Bedingungen wie in A.
-
9. Vergleich von SCCE, Rinder-Chymotrypsin
und menschlichem Cathepsin G hinsichtlich der Wirkung von Inhibitoren
(A; Aprotinin, B; Chymostatin, C; Zinksulfat) und Substratspezifität (D). In
A–C wurde die
Enzymaktivität
ohne Vorhandensein eines Inhibitors auf 100% standardisiert. In
D wurde die Enzymaktivität mit
MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA auf 1 willkürliche Einheit standardisiert.
-
10.
Affinitätschromatographie
auf kovalent gebundenem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI). Punktierte
Linie: Absorption bei 280 nm, die die Proteinkonzentration des Eluats
widerspiegelt. Durchgezogene Linie mit offenen Quadraten: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2586
als Substrat, die als Veränderung
der Absorption bei 405 nm angegeben wird. Durchgezogene Linie mit
offenen Kreisen: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2288 als Substrat,
die als zehnmal multiplizierte Veränderung der Absorption bei
405 nm angegeben wird.
-
11. SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung (A)
und Zymograpie nach SDS-PAGE mit co-polymerisiertem Casein (B) der
Fraktionen 2, 6 und 10 aus dem in 10 gezeigten
Chromatogramm. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite. In
B: 1: Gruppe caseinolytischer Bestandteile, die durch Leupeptin
(160 μM)
gehemmt werden konnten. c: Gruppe caseinolytischer Bestandteile,
die durch Chymostatin (40 μM)
gehemmt werden konnten.
-
12.
SDS-PAGE von SCCE, gereinigt durch Affinitätschromatographie auf SBTI-Affigel
15. 12,5% Gel. 1: Nichtreduzierte Probe. 2: Reduzierte Probe. Molekulargewichtsmarker
auf der linken Seite.
-
13.
N-terminale Arninosäuresequenz
von SCCE. Sternchen bezeichnen Unsicherheiten bei den angenommenen
Cysteinen in den Positionen 7 und 9. Fragezeichen geben die Positionen
an, in denen keine Aminosäurederivate
festgestellt werden konnten, wo aber bei den nachfolgen-den Schritten
keine Ertragsabfälle
auftraten.
-
14. Charakterisierung der monoklonalen
Antikörper
TE4b und TE9b mittels Immunfällung
und Immunblotting.
- a: Coomassie-gefärbte 12,5%-SDS-PAGE, nichtreduzierende
Bedingungen.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker |
Reihe
2: | KC1-Extrakt,
aus dissoziierten plantaren Corneocyten wie in Beispiel 3.1 beschrieben
hergestellt |
Reihe
3: | SCCE,
durch Affinitätschromatographie
auf unlöslich gemachtem
Sojabohnen-Trypsininhibitor wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt. |
- b: Zymographie von Immunpräzipitaten
in 12,5% SDS-PAGE mit 0,1% co-polymerisiertem,
hitzedenaturiertem Casein, Coomassie-gefärbtem Gel.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker |
Reihe
2: | KCl-Extrakt,
wie in a dialysiert |
Reihe
3–6: | Solubilisierte
Immunpräzipitate
mit (von links nach rechts) moab TE4b (20 μg), moab TE9b (10 μg), moab
PZ (10 μg),
und phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Moab PZ ist ein monoklonaler
Mäuse-Antikörper vom
IgG 1-Kappa-Typ gegen α2-PAG
(pregnancy zone protein) und wurde als nicht verwandte Kontrolle verwendet. |
- c: Immunblot von 12,5% der SDS-PAGE (nichtreduzierende Bedingungen).
Reihe
1: | Biotinylierte,
mit Alkaliphosphatase-konjugiertem Avidin (BioRad) festgestellte
Molekulargewichtsmarker. Die elektrophoresierten Proben in den Reihen
2, 4, und 6 sind die gleichen wie in Reihe 2 in a, und in den Reihen
3, 5 und 7 die gleichen wie in Reihe 3 in a. |
Reihen
2 u. 3: | Erster
Antikörper
= moab TE4b, 0,2 μg
pro ml. |
Reihen
4 u. 5: | Erster
Antikörper
= moab TE9b, 0,1 μg
pro ml. |
Reihen
6 u. 7: | Erster
Antikörper
= moab PZ, 0,1 μg
pro ml. |
| Die
Pfeilspitzen in a–c
bezeichnen die relativen Molekulargewichte (von oben nach unten
93, 66, 45, 31, 22 bzw. 14 kD. |
-
15. 15 zeigt das Plasmid pS500.
Dieses Plasmid enthält
die in pUC19 clonierte cDNA des menschlichen SCCE in voller Länge. Zu
Details siehe Beispiel 6.
-
16. Northern Blots mit aus menschlicher Epidermis
hergestellter mRNA. Poly-T-gereinigte
RNA, entsprechend etwa 100 g Gesamt-RNA wurde in jeder Reihe aufgebracht.
1: Hybridisierung mit einer Sonde aus einem 1070 bp-Hinc 2/Hinc
2-Fragment SCCE-cDNA.
2: Hybridisierung mit einer Sonde aus einem 655 bp-Hinc 2/Bgl2-Fragment
SCCE-cDNA.
-
17.
- a: Coomassie-gefärbte SDS-PAGE,
12,5%-Gel. 1 und 2: PBS-Triton X-100-unlösliche
Präzipitate
ultraschallzertrümmerter
TG 2-Zellen, die mit pS510 bzw. pS511 transformiert und mit IPTG
induziert wurden. 3: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum
gereinigtes SCCE.
- b: Immunblots mit Hühner-Präimmunserum
(1–3)
und Hühner-anti-SCCE
(4–6).
1 und 4: Mit pS510 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen,
2 und 5: Mit pS511 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen.
3 und 6: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum gereinigtes
SCCE.
-
Die
Proben wurden durch Kochen in Probenpuffer mit Mercaptoethanol hergestellt.
-
18. 18 zeigt eine zirkuläre Karte
des Expressionsvektors pS507, der wie im Beispiel 9 beschrieben
konstruiert wurde. Der Vektor pS507 vermittelt die Expression von
rekombinantem menschlichem SCCE in Säugerzellen.
-
19.
19 zeigt die Analyse der Expression
des rekombinanten menschlichen SCCE-Gens von pS507 in Säugerzellen.
Reihe
1: | RNA
aus C127-Zellen. |
Reihe
2: | RNA
aus einem isolierten Clon, 1 : 24, von mit pS507 transfizierten
C127-Zellen. |
Reihe
3: | RNA
aus einem Populationsgemisch von mit pS507 transfizierten C127 Clones. |
Reihen
4 u. 5: | RNA
aus C127-Zellen, die mit einem Expressionsvektor, pS147, transfiziert
wurden, der außer
dem Fehlen der SCCE-cDNA-Sequenz mit pS507 identisch ist. Die Größenmarker
sind links angegeben. |
-
20. SDS-PAGE mit anschließendem Immunblotting von in
C127-Zellen-exprimiertem SCCE.
Reihen
1 u. 6: | Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker
(Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 um 18,5 kDa) |
Reihe
2: | pS507/C127,
Gemisch, T-Kolben |
Reihe
3: | pS507/C127,
Gemisch, Roller A |
Reihe
4: | pS507/C127,
Gemisch, Roller B |
Reihe
5: | Negative
Kontrolle pS522/C127 |
Reihe
7: | Aus
Stratum corneum hergestelltes natives SCCE |
Reihe
8: | pS507/C127,
Clon 24, T-Kolben |
Reihe
9: | pS507/C127,
Clon 24, Roller A |
Reihe
10: | pS507/C127,
Clon 24, Roller B |
-
21. SDS-PAGE (A) und Immunblotting (B)
von rekombinantem SCCE, gereinigt aus C127 Zellkulturmedium mit
Zellen, die das Plasmid pS507 enthalten.
Reihen
1 u. 5: | Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker
(Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa) |
Reihe
2: | Zellmedium
vor der Reinigung |
Reihe
3: | Ungebundenes,
aus der Chromatographie gewonnenes Material |
Reihe
4: | Mit
dem Niedrig-pH-Puffer eluiertes gebundenes Material |
-
22. Aktivitätstest
von nativem SCCE und aktiviertem rekombinantem SCCE auf einem Casein-Polyacrylamidgel.
Reihen
1 u. 10: | Molekulargewichtsmarker
(Pharmacia 14–94
kDa) |
Reihe
2: | Natives
SCCE. |
Reihe
3: | Natives
SCCE. |
Reihen
4–6: | Rekombinantes
SCCE, 1 Stunde lang, 3 Stunden lang bzw. über Nacht gespaltet (460 ng/Vertiefung). |
Reihe
7: | Trypsin
in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch
in Abwesenheit von APMSF. |
Reihe
8: | Trypsin
in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch
in Anwesenheit der gleichen Menge APMSF wie in den Proben. |
Reihe
9: | Wie
Reihe 3. |
-
23. Immunblot von N-Glycosidase F
®-behandeltem
nativem und rekombinantem SCCE. Die Proben wurden auf 8–18% SDS-PAGE
getrennt und wie vorstehend beschrieben immungeblottet.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker
(Molekularmassen von oben nach unten: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5
und 18,5 kDa. |
Reihen
2 u. 3: | Rekombinantes
SCCE, 0,3 bzw. 3 μg. |
Reihen
4 u. 5: | Rekombinantes
SCCE, 1,5 bzw. 1,8 μg.
Die Proben in den Reihen 3 und 5 wurden mit N-Glycosidase F® behandelt. |
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Hinweise
auf die Tatsache, daß die
Zellabschuppung von der Oberfläche
der verhornten Oberflächenschicht
der Haut mit der Degradation der desmosomalen Proteine einhergeht,
und daß das
dafür verantwortliche
Enzym eine Chymotrypsinähnliche
Serinproteinase zu sein scheint, die durch Zinkionen gehemmt werden
kann
-
1.1 Desquamation im Stratum
corneum
-
Ziel
der Studie war es, die Natur der für die Zellkohäsion und
Oberflächenzelldissoziation
(Desquamation) verantwortlichen Mechanismen in der verhornten Schicht
der Haut, dem Stratum corneum, zu erhellen. Ein Stück Stratum
corneum von 0,3–0,6
mm Dicke wurde parallel zur Hautoberfläche von unter der Ferse eines Probanden
mit normaler Haut herausgeschnitten. Das Gewebestück wurde
3 Stunden lang bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit
0,1% Natriumazid eingeweicht, und die an der in vivo nach außen gerichteten
Seite lose anhaftenden Zellen wurden abgeschabt. Ein mm dicke, senkrecht
zur Gewebeoberfläche
geschnittene Scheiben wurden dann in ein Medium gelegt, das 0,1
M Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und 0,45% Agarose
enthielt; dies geschah unmittelbar vor dem Gelieren des Mediums
aufgrund des Agarosegehalts. Nach Inkubationszeiten von 0,5 und
15 Stunden bei 37 °C
wurden Gelstücke
mit Gewebe auf Trockeneis eingefroren. Auf einem Kryostaten wurden
20 μm-Kryostatschnitte
senkrecht zur Hautoberfläche
geschnitten, aufgezogen und in einem Phasenkontrastmikroskop untersucht.
Es wurde ein kontinuierliches, unipolares Abschuppen der Zellen
von Stücken
von plantarem Stratum corneum, die in vitro inkubiert worden waren,
beobachtet (1). Die Zellen schuppten nur
von der Seite ab, die in vivo nach außen gezeigt hatte. Der beobachtete
Vorgang glich somit der Desquamation.
-
1.2. Auswirkungen von
Temperatur, pH-Wert und Enzyminhibitoren
-
Dann
wurde ein Verfahren zum Quantifizieren der Zellabschuppung entwickelt,
das Studien zu den Auswirkungen verschiedener Parameter, wie Temperatur,
pH-Wert und Enzyminhibitoren erlaubte. Mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug
wurden aus dem Gewebestück,
das wie vor-stehend in 1.1 beschrieben entnommen und von lose anhaftenden
Oberflächenzellen
befreit worden war, Zylinder von 3 mm Durchmesser von plantarem
Stratum corneum ausgestochen. Die Zylinder (mit einer definierten
Fläche,
die in vivo nach außen
gezeigt hatte) wurden in 0,5 ml Medium mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,
5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und mit oder ohne Aprotinin (4 × 10–6 mol/l)
(Boehringer Mannheim, Deutschland) in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen 5, 10 und 20 Stunden
lang bei 37 °C
inkubiert und dann 10 Sek. auf einem Vortex-Mixer geschüttelt, um
dissoziierte Oberflächenzellen
freizusetzen. Das verbleibende Gewebe wurde entfernt und zur weiteren
Inkubation in frisches Medium gegeben. Die Röhrchen mit den freigesetzten
Zellen wurden 2 Minuten lang bei 5000 g zentrifugiert, um die Zellen
zu gewinnen. Die Zellpräzipitate
wurden einmal mit 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und
dann 1,5 Stunden lang bei 60 °C
mit 0,6 ml 1 M Natriumhydroxyd behandelt. Das alkalilösliche Protein
wurde gemäß Lowry
et al., 1951 quantifiziert und als Maß für die Menge der freigesetzten
Zellen genommen. Die Ergebnisse werden in 2. gezeigt.
-
In ähnlicher
Weise wurden die Auswirkungen verschiedener potentieller Inhibitoren
(Aprotinin, Sojabohnen-Trypsininhibitor, Pepstatin (Boehringer Mannheim,
Deutschland) und Jodacetamid (Sigma, St. Louis, MO) untersucht.
Es wurden einzelne 2 mm-Gewebezylinder her-gestellt und mit Medium
mit oder ohne verschiedenen potentiellen Inhibitoren in den in der
Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert,
und die freigesetzten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben quantifiziert.
Beachte, daß dem
Inkubationsmedium EDTA (das ein Inhibitor von Metallproteinasen
ist) hinzugefügt
wurde, um optimale Zellfreisetzungsraten zu erhalten.
-
TABELLE
1 Auswirkung
von Proteaseinhibitoren auf die Zellfreisetzung von plantarem Stratum
corneum in vitro. Mittelwert
und Standardabweichung aus 5 inkubierten Gewebestücken.
-
Es
zeigte sich, daß die
Serinproteinaseninhibitoren Aprotinin und Sojabohnen-Trypsininhibitor
die Zellabschuppung wirksam hemmten (2 und Tabelle
1 vorstehend). Da diese zwei Substanzen hemmend wirkten, aber die
Inhibitoren von Metallproteinasen (EDTA), Thiolproteinasen (Jodacetamid)
und Aspartoproteasen (Pepstatin) nicht, wurde daraus geschlossen,
daß an
dem beobachteten Vorgang eine Serinprotease teilnimmt. Es wurde
auch geschlossen, daß die
Zellkohäsion
im Stratum corneum von Proteinstrukturen abhängt, und daß ein dem in vitro beobachteten ähnlicher
Mechanismus auch bei der in vivo-Abschuppung wirken muß (Lundström und Egelrud,
1988).
-
In
weiteren Studien zur Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum
in vitro wurde her-ausgefunden, daß der Vorgang in zwei separate
Schritte aufgeteilt werden konnte. Der erste Schritt findet unabhängig davon
statt, ob EDTA im Inkubationsmedium vorhanden ist oder nicht. Der
zweite Schritt geschieht nur in Gegenwart von EDTA. Der erste Schritt
konnte außer
durch Aprotinin durch Chymostatin und Zinkionen gehemmt werden.
Der zweite Schritt konnte durch Aprotinin und Chymostatin gehemmt
werden (Lundström
und Egelrud, 1990 a). Chymostatin ist ein Proteinaseninhibitor von
niederem Molekulargewicht mit chymotrypsinartiger Substratspezifität. Es ist
weiterhin festgestellt worden (Lundström und Egelrud, 1990 a), daß Leupeptin, ein
Proteinaseninhibitor von niederem Molekulargewicht mit trypsinartiger
Substratspezifität,
keinen Einfluß auf
die in vitro-Zellabschuppung hatte.
-
Die
Proteinstrukturen, die am wahrscheinlichsten für die Zellkohäsion im
Stratum corneum verantwortlich sind, und die somit mögliche Kandidaten
für eine
Degradation im Zug der vor-stehend beschriebenen desquamationsartigen
Zellabschuppung darstellen, sind die Desmosomen. Ein Desmosom besteht
aus zwei symmetrischen Hälften,
die sich in benachbarten Zellen befinden. Die beiden Hälften sind
im extrazellulären Raum
durch Desmogleine genannte Transmembranproteine verbunden.
-
1.3. Das Schicksal von
Desmoglein I (DG I) während
der Zellabschuppung in vitro
-
Es
wurde das Schicksal von Desmoglein I (DG I) während der Zellabschuppung von
plantarem Stratum corneum in vitro untersucht. Plantares Stratum
corneum wurde wie vorstehend in 1.1 beschrieben inkubiert, und noch
zusammenhängendes
Gewebe wurde von dissoziierten Zellen getrennt. Zellen und Gewebe wurden
in einem Puffer von 0,1 M Tris-HCl, pH 9,9 M Harnstoff, 2% Natriumdodecylsulfat, 1%
Mercaptoethanol, 1 ml Puffer auf 20 mg Gewebe 15 Stunden lang bei
37°C extrahiert.
Die Extrakte wurden für
Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 7,5%-Gelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat
(SDS-PAGE) nach Laemmli (Laemmli, 1970) vorbereitet, gefolgt von
elektrophoretischem Transfer (Towbin et al., 1979) auf eine Nitrocellulosemembran
(Bio-Rad, Richmond, CA), die mit einem polyclonalem Kaninchen-Antiserum,
das gegen aus Rindermäulern
gereinigtes DG I hergestellt worden war, (Gorbsky et al., 1985),
sondiert wurde. Gebundene Antikörper
wurden mit Alkaliphosphatasekonjugierten anti-Kaninchen Immunglobulinen
von Ziegen (BioRad, Richmond, CA) festgestellt (Blake et al., 1984).
-
Die
Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Die
Probenmengen, die zum Immunblot hinzugefügt wurden, wurden so eingestellt,
daß sich
für zusammenhängendes
Gewebe und dissoziierte Zellen ungefähr die gleichen Proteinkonzentrationen
(durch visuelle Inspektion der mit Coomassieblau gefärbten SDS-PAGE-Gele
abgeschätzt)
ergaben. Es wurden Durchgänge
mit mehreren Verdünnungen
vorgenommen, um einen semiquantitativen Vergleich der verschiedenen
anti-DG Ireaktiven Bestandteile in zusammenhängendem Stratum corneum und
dissoziierten Zellen zu ermöglichen.
-
Wenn
noch zusammenhängendes
Gewebe und dissoziierte Zellen getrennt extrahiert wurden, zeigte es
sich, daß,
während
das noch zusammenhängende
Gewebe nur scheinbar intaktes DG I enthielt, die dissoziierten Oberflächenzellen
nur mutmaßliche
Degradationsprodukte dieses Proteins enthielten (3).
-
In 4 und 5 werden
die Auswirkungen von Aprotinin, Zinkionen, Chymostatin (Boehringer,
Mannheim, Deutschland) und Leupeptin (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
auf die Degradation von DG I während
der Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro gezeigt.
-
Zuerst
wurde der zeitliche Verlauf und die Auswirkung von Aprotinin auf
die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum corneum
im Zug der Zellabschuppung in vitro untersucht. Es wurden Extrakte
aus plantaren Stratum corneum wie vorstehend in 1.2 be-schrieben
(aber ohne Abtrennung des zusammenhängenden Gewebes von dissoziierten
Zellen vor der Extraktion) in Abwesenheit oder Gegenwart von Aprotinin
(15 μM)
inkubiert und nach 0, 6, 12 oder 24 Stunden extrahiert. SDS-PAGE
und Immunblotting wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Das
densitometische Scannen der Immunblots wurde auf einem Shimadzu
CS-9000 Lichtpunktscanner (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit reflektiertem
Licht bei 560 nm im Zickzackmodus ausgeführt. Die Ergebnisse werden
in 4 gezeigt. Beachte die wirksame
Inhibition der Degradation von DG I durch Aprotinin.
-
Dann
wurde die Auswirkung von Zinkionen, Chymostatin und Leupeptin auf
die Degradation von Desmoglein I (DG I) im plantarem Stratum corneum
während
der Zellabschuppung in vitro untersucht. Der Versuch war wie vorstehend
umrissen aufgebaut. Die Inkubationen wurden 24 Stunden lang mit
Zinksulfat bei Konzentrationen von 0, 1 oder 5 mM und mit Chymostatin
oder Leupeptin bei Konzentrationen von 330 μM ausgeführt. Die Ergebnisse zeigten
eine Inhibition der Transformation von anti-DG I-positiven Bestandteilen
von 160 kD bis 95 und 80 kD durch Zinkionen und Chymostatin, aber
nicht durch Leupeptin.
-
Diese
Ergebnisse zeigen eindeutig, daß Aprotinin,
Zinkionen und Chymostatin hemmend wirkten, Leupeptin hingegen nicht.
Somit war das inhibitorische Profil für die Degradation von DG I
das gleiche wie für
die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro (Lundström und Egelrud,
1990 b).
-
Es
wurde als wichtig erachtet, zu demonstrieren, daß Mechanismen, die jenen der
Zellabschuppung von palmo-plantarem Stratum corneum ähneln, auch
im Stratum corneum der Haut von anderen Körperstellen als den Handflächen und
Fußsohlen
wirken. Takahashi et al. (Takahashi et al., 1987) hatte berichtet,
daß ein Gemisch
der der Detergentien N,N-Dimethyldodecylaminoxid (Sigma, St. Louis,
MO) und Natriumdodecylsulfat (Bio-Rad, Richmond, CA) in einer molaren
Verhältnis
von 8 : 2 in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum, das durch Trypsinisierung
von ganzer Epidermis präpariert
worden war, Zeltdissoziation hervorrief. Um eine Kontamination durch
exogenes Trypsin zu vermeiden, wurden die Stanzbiopsien von normaler
menschlicher Haut aus der glutealen Region bei pH 8 mit dem vorgenannten
Detergentiengemisch und EDTA (Egelrud und Lundström, 1990)
inkubiert. Es stellte sich heraus, daß die verhornte Schicht unter
diesen Bedingungen zu einzelnen Zellen dissoziierte. Die Hinzufügung von
Aprotinin zum Inkubationsmedium verhinderte diese Zelldissoziation.
Daraus wurde geschlossen, daß auch
in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum die Zellkohäsion von
Proteinstrukturen abhängt,
daß die
Desquamation in diesem Gewebe von Proteolyse abhängt, und daß das Gewebe eine Proteinase
enthält,
die diese Proteolyse katalysieren kann. Da die Zelldissoziation
nur das Stratum corneum und nicht die tieferen, nichtverhornten
Epidermisschichten betraf, wurde gefolgert, daß die verantwortliche Proteinase
in den tieferen Schichten in einem inaktiven oder inhibierten Zustand
vorhanden ist.
-
BEISPIEL 2
-
Die
Entdeckung des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE): eine
Proteinase, die die Kriterien erfüllt, um für die Degradation intrazellulärer kohäsiver Strukturen
im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo verantwortlich
zu sein.
-
Aus
den in Beispiel 1 dargestellten Versuchen wurde gefolgert, daß die für die unipolare
Oberflächen-Zelldissoziation
im in vitro-Modell der Desquamation in plantarem Stratum corneum
verantwortliche Proteinase folgende Eigenschaften haben müßte:
- 1. Sie muß im
Stratum corneum anwesend sein.
- 2. Sie muß eine
Serinproteinase sein.
- 3. Sie müßte eine
chymotrypsinartige Substratspezifität und ein Inhibitorprofil aufweisen,
das jenem ähnlich ist,
das bei der in vitro-Zellabschuppung und bei der damit einher-gehenden
Degradation von Desmoglein I beobachtet wurde.
- 4. Sie müßte eine
extrazelluläre
Lokalisierung im Stratum corneum haben.
- 5. Sie müßte eine
pH-Abhängigkeit
haben, die es ihr erlaubt, unter physiologischen Bedingungen aktiv
zu sein, wobei der pH-Wert des Stratum corneum um die 4.5-6 beträgt.
- 6. Da die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro über lange
Inkubationszeiten hinweg kontinuierlich fortschreitet, selbst wenn
das Volumen des Inkubations-mediums im Vergleich zum Volumen der
inkubierten Gewebestücke
sehr groß ist,
oder wenn das Inkubationsmedium während des Inkubationsverlaufs
zu wiederholten Malen gewechselt wird, scheint Grund zur Annahme
zu bestehen, daß das
verantwortliche Enzym in einer Weise an das Gewebe gebunden ist,
die seine Extraktion ins Inkubations-medium während des Inkubationsverlaufs
nicht erlaubt.
-
Die
folgenden beiden Versuche führten
zur Entdeckung von SCCE (Egelrud und Lundström, 1991):
-
2.1. Mit der Dissoziation
plantarer Corneocyten verbundene Enzymaktivität
-
Dissoziierte
plantare Stratum corneum-Zellen (Corneocyten) wurden durch Inkubation
von plantarem Stratum corneum wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Die Zellen wurden durch ein Nylonnetz mit 100 pm Durchlaßgröße filtriert
und dann dreimal in zehn Volumina von 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 mM
EDTA und dreimal in 0,1 M Tris-HCl, pH 8 gewaschen. Dann wurden
die Zellen mit zwei Typen chromogener Proteinasesubstrate, S-2288
oder S-2586 (Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden) inkubiert: Ile-Pro-Arg-p-Nitroanilid
(S-2288) wird von einem breiten Spektrum von Serinproteinasen mit
Argininspezifität
(z.B. Trypsin) gespaltet. Arg-Pro-Tyr-p-Nitroanilid (S-2586) ist
ein Substrat für
chymotrypsinartige Proteinasen.
-
In
einem Gesamtvolumen von 120 μl
enthielt jedes Reaktionsgemisch 0,07 M Tris-HCl, pH 8, 0,1% Natriumazid, 1, 2,5,
5 oder 10 μl
einer 25%igen Suspension von gewaschenen plantaren Corneocyten und 1,04
mM (S-2586) oder 1,25 mM (S-2288)
Substrat. Nach 5stündiger
Inkubation bei 37 °C
in Mikrotiterplatten wurde die Reaktion durch Hinzufügen von
125 μl 10%iger
Essigsäure
gestoppt. Die Zellen wurden sedimentieren gelassen und 200 μl von je-dem Überstand
in neue Vertiefungen transferiert. Die Hydrolyse der beiden Substrate
wurde durch Messen der Veränderung
des Absorptionsverhaltens bei 405 nm verfolgt, nachdem die Zellen
in einem Behring-Elisaverarbeitungsgerät (Behringwerke, Marburg, Deutschland)
entfernt worden waren.
-
Wie
in 6 gezeigt, existierte eine mit der Dissoziation
plantarer Corneocyten einhergehen-de Enzymaktivität, die die
Hydrolyse von S-2586 katalysierte. Im Vergleich dazu war die Aktivität gegenüber S-2288 niedrig.
-
Dann
wurde die pH-Abhängigkeit
der 5-2586-hydrolysierenden Aktivität untersucht. Der Versuchsaufbau
war wie vorstehend umrissen, wobei 10 μl einer 25%igen Suspension gewaschener
plantarer Corneocyten und Puffer mit verschiedenen pH-Werten (Natriumacetat,
Natriumphosphat oder Tris-HCl) verwendet wurden. Die Endkonzentrationen
der Puffer waren 0,07 M. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt,
aus welcher hervorgeht, daß die
Aktivität
bei pH 7–8
optimal, aber auch bei pH 5.5 signifikant war.
-
In
einem weiteren Versuch wurden die Auswirkungen von EDTA, Metallionen
und Proteinaseninhibitor auf die Hydrolyse von S-2586 bei pH 8 durch
die mit suspendierten plantaren Stratum corneum-Zellen assoziierte
Proteinase untersucht. Der Versuchsaufbau war wie vor-stehend und
in Tabelle 2 umrissen. TABELLE
2 Auswirkungen
von EDTA, Metallionen und Proteinaseinhibitoren auf die Hydrolyse
von S-2586 durch die mit den plantaren Stratum corneum-Zellen assoziierte
Proteinase (Enzym-quelle: suspendierte Zellen)
- a in
der Testmischung vorhandene Substanz
- b eine 25%ige Suspension von plantaren
Stratum corneum Zellen, die wie im Text beschrieben hergestellt
worden war, wurde 1 Stunden lang bei Raumtemperatur in Gegenwart
von 1 mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO) in 2-Propanol aufgelöst (Endkonzentration von 2-Propanol
4% v/v). Die Kontrollen wurden nur mit 4% 2-Propanol inkubiert.
- c Inhibitor in Dimethylsulfoxid (DMSO)
aufgelöst.
Alle Medien, einschließlich
der Kontrollen, enthielten 5% (v/v) DMSO.
-
Wie
in der vorstehenden Tabelle 2 gezeigt, inhibierten Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF; ein genereller Inhibitor von Serinproteinasen), Aprotinin,
Sojabohnen-Trypsininhibitor,
Chymostatin (ein Chymotrypsininhibitor) und Zinkionen, nicht aber
Leupeptin (ein Trypsininhibitor) die Hydrolyseaktivität des S-2586.
Das Inhibitorprofil war somit jenem sehr ähnlich, das bei der in vitro-Zellabschuppung
und der damit einhergehenden Degradation von Desmoglein I beobachtet
wurde.
-
2.2. Zymographie von dissoziiertem
plantarem Stratum corneum
-
Es
wurde festgestellt, daß das
in 2.1 entdeckte, für
die S-2586-hydrolysierende Aktivität verantwortliche Enzym solubilisiert
werden konnte, wenn die Corneocyten mit 1 M KCl in 0,1 M Tris-HCL,
pH 8 extrahiert wurden. Deshalb wurden Versuche mit Zymographie
ausgeführt.
Zu diesem Zweck wurden KCl-Extrakte aus Corneocyten gemäß Laemmli
(Laemmli, 1970) für
die Elektrophorese hergestellt, aber ohne Reduktionsmittel im Probenpuffer
und ohne Erhitzen der Proben. Es wurden auch Proben mittels Extraktion
von dissoziierten plantaren Corneocyten mit Laemmli'schem Probenpuffer
ohne Reduktionsmittel bei Raumtemperatur hergestellt. Für die Zymographie
wurde eine Modifikation des Verfahrens von Horie et al. (Horie et
al., 1984) angewandt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart
von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) wurde gemäß Laemmli in 12,5%-Gelen mit
1% co-polymerisiertem, hitzedenaturiertem Casein ausgeführt. Nach
der Elektrophorese wurden die Gele 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
in einem Puffer von 2% Triton X-100 getränkt, um das SDS zu entfernen
und dann 15 Stunden lang bei 37°C
inkubiert. Die Gele wurden dann mit Coomassieblau gefärbt. Die
separierten caseinolytischen Enzyme traten als helle Banden gegen
einen blauen Hintergrund auf. Vgl. auch die Legende zu 8 zu Versuchsdetails.
-
Die
Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Die
Extrakte aus plantaren Corneocyten enthielten ein caseinolytisches
Hauptenzym mit einem scheinbaren Molekulargewicht von um die 25
kD. Es gab auch kleinere caseinolytische Enzyme mit Molekulargewichten
um die 30 kD. (Diese kleineren Bestandteile sind in der Figur nicht
klar zu sehen. Später
wurde herausgefunden, daß sie
durch Leupeptin, nicht aber durch Chymostatin gehemmt werden konnten.)
Das 25 kD-Enzym hatte eine signifikante Aktivität bei pH 5.5 bis 8. Es wurde
durch Aprotinin, Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin
gehemmt. Somit hatte es das gleiche Inhibitorprofil wie die vorstehend
beschriebene 5-2586-hydrolysierende Aktivität. Bei Versuchen mit Gelausschlußchromatographie
(nicht gezeigt) zeigte es sich, daß das caseinolytische 25 kD-Enzym
mit der 5-2586-hydrolysierenden Aktivität co-chromatographierte.
-
In
weiteren Versuchen (nicht gezeigt) mit der gleichen Technik, wie
vorstehend für
2.2 beschrieben, ergab sich, daß nicht-palmo-plantares
Stratum corneum ein Enzym mit Eigenschaften enthält, die mit jenen der 25 kD-Proteinase,
die mit plantaren Corneocyten assoziiert ist, identisch ist, und
das von jetzt an Stratum corneum chymotryptisches Enzym (SCCE) (Lund-ström und Egelrud,
1991) genannt wird.
-
Es
war auch möglich,
Hinweise darauf zu gewinnen, daß SCCE
mit plantaren Corneocyten in einer Weise assoziiert ist, die es
ihm erlaubt, im extrazellulären
Raum des Stratum corneum aktiv zu sein. Dies geschah, indem zuerst
gezeigt wurde, daß die
dissoziierten Corneocyten für
Meerrettichperoxidase (Mr 44 kD) impermeabel sind. Dann wurde gezeigt,
daß menschliches
Fibrinogen (Mr 340 kD) von einer Corneocytensuspension degradiert
werden konnte, und daß diese
Degradation von den gleichen Inhibitoren wie SCCE gehemmt werden
konnte. Es konnte ausgeschlossen werden, daß die Degradation von Fibrinogen
aufgrund von solubilisiertem Enzym geschah (Egelrud, 1992).
-
BEISPIEL 3
-
Teilweise Reinigung von
Stratum corneum chymotryptischem Enzym (SCCE) und Proteinase-tests
mit chromogenen Substraten
-
3.1 Herstellung von KCl-Extrakten
aus plantaren Corneocyten
-
Die
Herstellung dissoziierter plantarer Corneocyten, wie in Beispiel
1 beschrieben, wurde in größerem Maßstab durchgeführt, und
es wurden wie in Beispiel 2 beschrieben KCl-Extrakte aus gewaschenen
plantaren Corneocyten, die SCCE enthielten, hergestellt.
-
Die
Herstellung von KCl-Extrakten aus plantaren Corneocyten wird nachstehend
in Tabelle 3 schematisch dargestellt. Hyperplastisches menschliches
plantares Stratum corneum wurde durch Zusammenarbeit mit der Gesellschaft
der schwedischen Pediküristen
gewonnen. Es wurde nur Material verwendet, das durch Abzwicken oder
Abschneiden gewonnen worden war. Von Füßen mit gestörter Abschuppung
wurde kein Material gewonnen. Vor dem Versand wurde das Stratum
corneum luftgetrocknet und in Plastiksäckchen verpackt. Im Labor wurde
es bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
-
TABELLE
3 Schematische
Darstellung der Herstellung von SCCE-haltigen KCl-Extrakten aus
dissoziierten plantaren Corneocyten.
-
Für jeden
nachfolgenden Affinitätschromatographieschritt
wurden die Extrakte 1 und 2 aus zwei Präparaten von jeweils 50 g plantarem
Stratum corneum vereinigt.
-
3.2. Proteinasetests mit
chromogenen Substraten
-
Es
wurde ein Vergleich von SCCE, Rinder-Chymotrypsin und menschlichem
Cathepsin G hinsichtlich der Auswirkungen der Inhibitoren Aprotinin,
Chymostatin, Zinksulfat und der Substratspezifität gemacht.
-
Es
wurde eine Vorratslösung
von MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) in destilliertem Wasser, eine von
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Boehringer, Mannheim, Deutschland) in 1-Methyl-2-Pyrrolidon
(Endkonzentration des Lösungsmittels
in den Inkubationsgemischen 4%) und von Chymostatin in Dimethylsulfoxid
(Endkonzentration des Lösungsmittels
in den Inkubationsgemischen 1%) hergestellt. Cathepsin G aus eitrigem menschlichem
Auswurf wurde von E. Lotti, Genf, Schweiz bezogen. Die SCCE-Quelle
war KCl-Extrakt aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der wie
vorstehend beschrieben hergestellt wurde. Die Quellen der Inhibitoren
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat waren wie vorstehend beschrieben.
-
Die
Inkubationen wurden bei 37°C
in Mikrotiterplatten vorgenommen. Das gesamte Inkubationsvolumen
betrug 135 μl.
Jedes Inkubationsgemisch enthielt Tris-HCl, pH 8.0 (Endkonzentration
0,18 M), KCl (Endkonzentration 0,2 M), 100 μl Substratlösung, 25 μl Enzymquelle (angemessen verdünnt in 0,1
M Tris-HCl, pH 8.0, 1,1 M KCl) und 10 μl Inhibitorlösung.
-
In 9, A–C,
wurde MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586, Anfangskonzentration 1,2
mM) als Substrat verwendet. In D betrug die Anfangskonzentration
beider Substrate 1,2 mM.
-
Am
Ende der Inkubationen (1,5 Stunden) wurden zu jeder Vertiefung 125 μl 11%iger
Essig-säure
hinzugefügt
und die Absorption bei 405 nm abgelesen, wobei die Inkubationsgemische
ohne hinzugefügte
Enzyme als Nullproben dienten. Die Menge der hinzugefügten Enzyme
wurde so eingestellt, daß sich
am Ende der Inkubationen eine Veränderung der Absorption bei
405 nm von 0,3–0,7
ergab.
-
Die
Ergebnisse sind in 9, A–D zusammengefaßt. Für die Untersuchungen
zur Auswirkung von Inhibitoren wurde S-2586 als Substrat verwendet.
Die Wirksamkeit von Aprotinin als Inhibitor von SCCE und Chymotrypsin
war hoch und für
die beiden Enzyme ungefähr
gleich. Die Auswirkung auf Cathepsin G hingegen war viel geringer
(9A). Chymostatin bewirkte eine Hemmung aller drei
Enzyme, doch die Inhibitorkonzentration, die 50% Hemmung bewirkte,
war für
SCCE mehr als drei Größenordnungen
höher als
für Chymotrypsin und
Cathepsin G (9B). Zinksulfat war ein wirksamer
Inhibitor von SCCE, nicht aber von Chymotrypsin und Cathepsin G
(9C). Die Aktivität der drei Enzyme gegen die
Substrate MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
(S-2586) und Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA werden in 9D verglichen.
Da es darum ging, Ähnlichkeiten
oder Unterschiede zwischen den untersuchten Enzymen herauszufinden,
wurden diese Versuche nur bei einer Anfangskonzentration für jedes
Substrat vorgenommen. Während
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
für Chymotrypsin
und Cathepsin G ein wesentlich besseres Substrat als S-2586 zu sein schienen,
ergab sich für
SCCE das Gegenteil.
-
BEISPIEL 4
-
Reinigung und Bestimmung
der N-terminalen Aminosäuresequenz
von Stratum corneum chymotryptischem Enzym
-
4.1. Reinigung von SCCE
aus KCl-Extrakten von Corneocyten mittels Affinitätschromatographie
auf unlöslich gemachtem
Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI)
-
10 zeigt
die Ergebnisse der Affinitätschromatographie
auf SBTI. Das Affinitätsgel
wurde durch Verbinden von 50 mg SBTI (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
mit 12 ml sedimentiertem Affigel 15 (BioRad, Richmond, CA) nach
den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Verbleibende aktive
Gruppen auf dem Gel wurden mit Ethanolamin blockiert. Kombinierte
KCl-Extrakte aus 100 9 (Trockengewicht) plantarem Stratum corneum
(Gesamtvolumen 700 ml) wurden durch ein in eine Glassäule gepacktes
0,8 × 2
cm-Bett von SBTI-Affigel 15 laufen gelassen, Durchflußrate 42
ml/Stunde, wobei die Absorption des Eluats bei 280 nm kontinuierlich
aufgezeichnet wurde. Die Säule
wurde mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 1 M KCl gewaschen, bis die Absorption des
Eluats unter 0,01 lag, und dann mit 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8.
Die schrittweise Elution des gebundenen Materials wurde mit HCl
bei 1, 10 und 100 mM ausgeführt.
Das Eluant wurde gewechselt, wenn die Absorption des Eluats auf
unter 1,01 gesunken war. In Teströhrchen, die Tris-HCl, pH 8,
Gesamtvolumen 0,4 ml, enthielten, wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt,
wobei die Menge so berechnet wurde, daß sie genügte, den pH-Wert des Eluats
auf über
7 einzustellen. Der pH-Wert jeder einzelnen Fraktion wurde sofort überprüft und wenn
nötig mit
kleinen Volumina 1 M Tris-HCl, pH 8, auf etwa pH 7 eingestellt.
Die Analysen der peptidhydrolysierenden Aktivität mit S-2586 (Substrat für SCCE)
und S-2288 (Substrat für
trypsinartige Enzyme) wurden wie in Beispiel 2.1. beschrieben ausgeführt. Die
Anfangskonzentration beider Substrate in den Testgemischen betrug
1,1 mM. Etwa 90% der S-2586-hydrolysierenden Aktivität wurde
an das Gel gebunden. Durch schrittweise Elution des gewaschenen
Gels mit 10–100
mM HCl konnten ungefähr
60% der gesamten S-2586-hydrolysierenden Aktivität im verwendeten KCl-Extrakt
wiedergewonnen werden. Von der gesamten S-2288-hydrolysierenden Aktivität wurden
um die 20% an das Affinitätsgel
gebunden, und 10% konnten im Eluat wiedergewonnen werden.
-
11 zeigt Analysen des Eluats aus der SBTI-Affinitätschromatographie
mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von SDS (SDS-PAGE)
und mit Zymographie. Es wurden nichtreduzierte Proben auf 12,5%-Gelen
durchlaufen gelassen. Vgl. auch Egelrud und Lundström, 1991
und Beispiel 2, 2.2 zu Versuchsdetails. Bevor sie für die Elektrophorese
vorbereitet wurden, waren die Proben in A mittels Zentrifugenfiltration mit
Ultrafree-MC-Filter (Abtrennung bei 10 kD; Millipore, Bedford, MA)
ungefähr
20fach konzentriert und in B 10fach verdünnt worden.
-
In 12 wird
ein Vergleich mittels SDS-PAGE zwischen einer nichtreduzierten und
einer reduzierten Probe der SBTI-Affinitätschromatographie gezeigt.
Wie in den 10 und 11 gezeigt,
ergab die SBTI-Affinitätschromatographie
ein Protein, das zu mehr als 90% rein war (wie nach den Coomassieblau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen
beurteilt wurde), mit scheinbarem Molekulargewicht um die 25 kD
in nichtreduzierter Form und um die 28 kD in reduzierter Form. Darüberhinaus
gab es eine kleine Coomassieblau-positive Komponente mit einem scheinbaren
Molekulargewicht, das etwa 1 kD größer war, als das der Hauptkomponente.
Auf den Zymographiegelen war eine größere und eine kleinere Bande
mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität wie die beiden auf den Coomassieblau-gefärbten Gelen
bei nichtreduzierten Proben festgestellten Banden. Diese caseinolytischen
Komponenten konnten beide durch Chymostatin gehemmt werden. Weiterhin
zeigte die Zymographie kleinere Komponenten mit scheinbaren Molekulargewichten
um die 30 kD, die durch Leupeptin gehemmt werden konnten. Es wurde
gefolgert, daß der
Hauptanteil des gereinigten Proteins SCCE war.
-
4.2 Analyse der N-terminalen
Aminosäuresequenz
von SCCE
-
Zweihundert
Mikroliter einer Fraktion aus einem Chromatogramm mit SBTI-Affigel
15, A280nm 0,2, wurden für SDS-PAGE mit und ohne Reduktion
vorbereitet und auf einem 12,5%-Polyacrylamidgel (Dicke 1 mm, Schlitzbereite
73 mm) durchlaufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurden die
getrennten Proteine elektrophoretisch auf einen Immobilon-Filter
(Millipore) transferiert und mit Coomassieblau gemäß Matsuidaira, I987
gefärbt.
Die Hauptproteinbande wurde ausgeschnitten und in einem Applied
Biosystems 477A Puls-Flüssigphasen-Aminosäuresequenzanalysator
mit einem PTH 120A Online-Analysator (Applied Biosystems Inc., Foster City,
CA, USA) verarbeitet. Die Sequenzierung geschah mit regulären Zyklusprogrammen
und Chemikalien vom Hersteller. Die Anfangs- und die Wiederholungserträge betrugen
25% bzw. 97%, von den Standardproteinen her gerechnet.
-
Die
Erträge
von Aminosäurederivaten
waren mit nur einem der sequenzierten Peptide kompatibel. Bei nichtreduzierten
Proben waren die Erträge
in den Schritten 1–6
gut, fielen aber in den Schritten 7 und 9 auf Null. Die Erträge in den
nachfolgenden Schritten waren deutlich verringert. Auch bei reduzierten
Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate
festgestellt werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen
Derivate festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen
Abfälle
der Erträge.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß sich
in den Positionen 7 und 9 Cysteine befinden. Es war jedoch nicht
möglich,
in den Schritten 7 und 9 nach der Reduktion und Behandlung mit Jodessigsäure (100
mM) carboxymethylierte Cysteine zu entdecken. Die erhaltene Sequenz
(13, SEQ ID NR: 3) war für reduzierte und nichtreduzierte Proben
identisch.
-
BEISPIEL 5
-
5.1. Die Herstellung SCCE-spezifischer
monoklonaler Antikörper
-
BALB/c-Mäuse (Bomholtgaard,
Dänemark)
erhielten ungefähr
30 μg natives
SCCE, das wie in Beispiel 4.1 beschrieben in Freund'schem vollständigem Adjuvans
(Difco Laboratories, Detroit, MI) gereinigt worden war, als subcutane
Injektionen. Die Injektionen mit der gleichen Menge SCCE in Freund'schem unvollständigem Adjuvans
(Difco Laboratories, Detroit, MI) wurden nach einem Monat wiederholt.
Vier Monate nach der ersten Injektion erhielt eine Maus an drei
aufeinanderfolgenden Tagen intravenöse Auffrischungsimpfungen; 30 μg Antigen
pro Injektion. Die Hybridome wurden mit dem bei Carlsson et al.,
1985 beschriebenen Verfahren mit Zellen der SP2/0-Myelomzellinie
(ATCC CRL 1581) hergestellt. Die Bestimmung der mit dem gereinigten SCCE-Präparat reagierenden
Antikörper
wurde mit einer ELISA-Technik ausgeführt. Die Kulturtberstände von positiven
Clones wurden mittels Immunoblotting nach SDS-PAGE weiter analysiert.
Clone, die Antikörper
produzierten, die in diesem Test mit SCCE reagierten, wurden in
Mäuse-Ascitesfluid
propagiert, und die Antikörper wurden
durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt
und mit dem in Carlsson et al., 1985 beschriebenen Verfahren klassifiziert.
Es wurden zwei nutzbare Antikörper
erhalten, moab TE4b moab TE9b, die beide als IgG1-Kappa
klassifiziert wurden.
-
Die
Charakterisierung der moabs TE4b und TE9b mittels Immunfällung und
Immunblotting wird in 14 gezeigt.
-
14a (Reihe 2) zeigt ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel
mit einem konzentrierten KCl-Extrakt aus dissoziierten plantaren
Corneocyten, der wie in Beispiel 3.1. beschrieben hergestellt wurde.
Die Probe wurde 4 Stunden lang gegen 0,1 M Natriumacetat, pH 4,
dialysiert und durch Ultrafiltration etwa 100fach konzentriert,
bevor sie für
die Elektrophorese vorbereitet wurde. 14a (Reihe
3) zeigt ein SCCE-Präparat, das
wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt wurde.
-
14b zeigt die Ergebnisse eines Immunfällungsversuchs,
bei dem Antikörper
mit einem KCl-Extrakt von Corneocyten inkubiert worden waren und
dann mit unlöslich
gemachtem Protein A zurückgewonnen wurden.
Die resolubilisierten und dissoziierten Antigen-Antikörper-Komplexe
wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durch Zymographie analysiert.
-
250 μl eines KCl-Extraktes
aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der durch Ultrafiltration
5fach konzentriert und gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert
worden war, und zu dem Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO)
bis zu einer Endkonzentration von 10 mg pro ml hinzugefügt worden
war, wurde mit 10 μl
Antikörperlösung oder
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
vermischt und 15 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Dann wurde zu den
Röhrchen
25 μl sedimentierte
Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) hin-zugefügt, und
die Inkubation ging mit leichtem Schütteln über 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter.
Das Gel wurde durch Zentrifugierung wiedergewonnen und fünfmal mit
1 ml 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) in 0,05 M Tris-HCl, pH
7,5, 0,5 M NaCl gewaschen. Nach den letzten Waschen wurde das Gel mit
100 μl Laemmli'schem Probenpuffer
mit Reduktionsmittel 1 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. Die
Extrakte wurden durch Zentrifugieren gereinigt und auf das Gel aufgetragen.
-
Die
moabs TE4b und TE9b fällten
beide ein caseinolytisches Enzym mit dem gleichen Mr wie gereinigtes
SCCE und das entsprechende caseinolytische Hauptenzym im KCl-Extrakt.
Die Antikörper
fällten
keine kleineren caseinolytischen Enzyme mit Mr um die 30 kDa, von
denen gezeigt wurde, daß sie
durch Leupeptin, einem Inhibitor trypsinartiger Serinproteinasen
gehemmt werden. Zusätzlich
zu den caseinolytischen 25 kDa-Enzymen schienen die Antikörper noch
eine kleinere proteolytische Komponente mit Mr um die 80 kDa zu
binden. Diese Komponente findet sich gewöhnlich in KCl-Extrakten von
plantaren Corneocyten, die aus Gewebe hergestellt wurden, das vor
der Präparation
getrocknet worden war; sie findet sich jedoch nicht in Präparaten
aus frischem Gewebe (T. Egelrud, unveröffentlichte Beobachtung). Sie
findet sich nicht in SCCE-Präparaten,
die durch Affinitätschromatographie
gereinigt wurden, und sie könnte
ein Aggregationsprodukt darstellen. Es war nicht möglich, eine
entsprechende Komponente festzustellen, die mit den Antikörpern auf
Immunblots reagierte.
-
Auf
Immunblots von SDS-PAGE-Gelen, die unter nichtreduzierenden Bedingungen
gefahren wurden (14c), reagierten die moabs
TE4b und TE9b mit einer in KCl-Extrakten
von plantaren Corneocyten (14c,
Reihen 2 und 4) und im gereinigten SCCE-Präparat (14c,
Reihen 3 und 5) vorhandenen Komponente, die beide das gleiche Mr
wie das gereinigte Haupt-Protein und die caseinolytische Hauptkomponente in
Zymogrammen hatten. Die Antikörper
reagierten nicht mit Proben, die in Gegenwart von SDS reduziert
worden waren, was die Annahme nahelegt, daß sie gegen konformationsabhängige Epitope
gerichtet sind.
-
Zusätzlich zum
Hauptprotein mit Mr um die 25 kD in nichtreduzierter Form, enthält das gereinigte
SCCE-Präparat
eine kleinere, Coomassie-positive Komponente mit Mr um die 26 kD
(nicht reduziert; vgl. Beispiel 3). Auf Zymogrammen findet sich
eine entsprechende caseinolytische Komponente, die mit Chymostatin
in einer Weise gehemmt werden kann, die der der caseinolytischen
25 kD-Hauptkomponente ähnelt
(vgl. Beispiel 3). Bei höherer
Konzentration der moabs TE4b und TE9b (Ergebnisse nicht gezeigt)
konnte man sehen, daß auch
diese kleinere Komponente auf Immunblots mit den Antikörpern reagierte. Ähnliche
Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden mit einem polyclonalen, gegen
die Coomassie-positive Hauptkomponente hervorgerufenen Kaninchenantikörper erhalten,
der durch vorbereitende Elektrophorese gereinigt worden war. Die
genaue Verwandtschaft zwischen den zwei Proteinen mit SCCE-artiger
Aktivität
und anscheinender immunologischer Kreuzreaktion ist nicht bekannt.
-
5.2. SCCE-spezifische
polyclonale Antikörper
-
5.2.1. Hühner-anti-SCCE
-
45 μg SCCE, die
durch SBTI-Affinitätschromatographie
wie im Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt worden waren, in 0,2 ml
0,1 M Tris-HCl, wurden 60 Minuten lang bei 60°C hitzedenaturiert und in einem
gleichen Volumen Freund'schem
vollständigem
Adjuvans (Difco Laboratories) homogenisiert. Die erhaltene Emulsion wurde
Derco-Hühnchen,
etwa 20 Wochen alt, subcutan injiziert, von denen eine Blutprobe
zur Herstellung von Präimmunserum
genommen worden war. Nach 3, 5 und 7 Wochen erhielten die Hühner weitere
subcutane Injektionen von Emulsionen, die wie vorstehend beschrieben,
jedoch mit Freund'schem
unvollständigem
Adjuvans und 30 μg
gereinigtem, hitzedenaturiertem SCCE (Gesamtvolumen jeder Emulsion
250 μl)
hergestellt waren. 2 Wochen nach der letzten Injektion wurde den
Hühnern
Blut abgenommen. Das Blut wurde sofort mit 2 Volumina Alsever'scher Lösung (auf
100 ml: 100 ml 1,87 g Glucose, 0,8 g Natriumcitrat, 1,62 g Natriumchlorid,
Zitronensäure
bis pH 6.1) vermischt und zentrifugiert. Das Hühner-anti-SCCE, das für weitere
Untersuchungen gewählt
wurde, wurde in der Verdünnung
1/2000 bei Versuchen mit Immunblotting verwendet. Vgl. 17, Beispiel 8 zu einer Illustration der
Spezifität
des Antiserums.
-
5.2.2. Kaninchen-anti-SCCE
-
Durch
SBTI-Affinitätschromatographie
gereinigtes SCCE wurde wie in Beispiel 4.1 beschrieben auf 15 mm
dicken Gelen gemäß Laemmli,
1970, SDS-PAGE ohne Reduktion unterworfen. Die Hauptproteinbande, von
der vorhin gezeigt wurde, daß sie
SCCE war, wurde mit dem Kupferchlorid-Färbungsverfahren nach Lee et
al., 1987 sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Nach Entfernung des
Kupferchlorids mit EDTA gemäß Lee et
al. wurden die Gelscheiben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert.
Proben homogenisierter Gelscheiben wurden in gleichen Volumina von
Freund'schem Adjuvans
suspendiert. Etwa 30 μg
reines SCCE, die auf diese Weise in vollständigem Adjuvans hergestellt
wurden, wurden einem Kaninchen subcutan verabreicht. Nach 3, 5 und
7 Wochen wurde die Injektion mit der gleichen Menge SCCE aber mit
unvollständigem Adjuvans
wiederholt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde dem Kaninchen
Blut abgenommen.
-
Das
so erhaltene Kaninchen-anti-SCCE (D-5) wurde in der Verdünnung 1/500-1/1000 in Immunblot-Versuchen
mit Alkaliphosphatase-konjugierten anti-Kaninchen-Immunglobulinen als zweiter
Antikörper benützt.
-
Bei
allen Immunblotting-Versuchen wurden gebundene zweite Antikörper gemäß Blake
et al., 1984 festgestellt (bezieht sich auf Beispiele 5, 8 und 9).
-
Der
Kaninchen-anti-SCCE Bo-1 wurde in der gleichen Weise, aber mit SCCE,
das vor der SDS-PAGE als Antigen reduziert worden war, hergestellt.
-
5.3. Immunhistochemische
Studien mit den monoklonalen Antikörpern
-
In
immunhistochemischen Studien mit SCCE-spezifischen monoklonalen
Antikörpern,
konnte SCCE in hohen suprabasalen Zellen der menschlichen keratinisierenden
schuppigen Epithelien (Epidermis, innere Wurzelschicht der Haarfollikel,
harter Gaumen) festgestellt werden, nicht jedoch in den nichtkeratinisierenden schuppigen
Epithelien (innere Wurzelschicht der Haarfollikel, Lippen- und Mundschleimhäute). Somit
könnte SCCE
spezifisch in keratinisierenden schuppigen Epithelien exprimiert
werden. SCCE-Expression wurde weiterhin in hohen suprabasalen Zellen
der menschlichen Epidermis gefunden, die in vitro rekonstruiert
worden waren und an der Luft-Wasser-Grenzfläche gezüchtet wurden. Wenn dem Medium
Retinolsäure
in einer Konzentration hinzugefügt
wurde, die die Keratinocytenvermehrung stimulierte aber die Bildung
eines Stratum corneum hemmte, wurde SCCE nicht mehr exprimiert.
Dies legt die Annahme nahe, daß die
SCCE-Expression Teil
des epidermalen Differenzierungsprogramms sein könnte.
-
Die
Ergebnisse der immunelektromikroskopischen Versuche mit SCCE-spezifischen
monoklonalen Antikörpern
sind mit einer Rolle von SCCE bei der desmosomalen Degradation und
somit bei der Desquamation kompatibel. Die Antikörper markierten spezifisch
die Lamellarkörperchen,
die die Sekretion in den interzellulären Raum zwischen den obersten
granulären
Zellen und den untersten Stratum corneum-Zellen durchmachten, wogegen
die Antikörper
im Stratum corneum Epitope erkannten, die eng mit den Desmosomen
im extrazellulären
Raum assoziiert waren.
-
BEISPIEL 6
-
Clonierung und Sequenzierung
der menschliches SCCE codierenden cDNA
-
Restriktionsenzyme
wurden von Promega, Madison, MI, und TAQ-Polymerase von Perkin-Elmer-Cetus,
Norwalk, CT bezogen. Eine menschliche λgt11-KeratinocytencDNA-Bank,
die aus von adulten menschlichen Keratinocyten epidermalen Ursprungs
abgeleiteter mRNA hergestellt war, wurde von Clontech, Laboratories
Palo Alto, CA bezogen (Katalog-Nr. HL 1045 b). Zuerst wurde die
Bank mit den polyclonalen anti-SCCE-Seren von Kaninchen D-5 und
Bo-1 (vgl. Beispiel 5.2.2) abgesucht. Da das polyclonale anti-SCCE-Serum Bo-1
hohe Hintergrundsignale ergab, wurde es zu einem frühen Zeitpunkt
von der ausgedehnten Durchsuchungsstudie ausgeschlossen. Mit dem
D-5-Antiserum wurde eine Anzahl immun-reaktiver Plaques angereichert,
wie dies für
tatsächlich
positive Plaques erwartet worden war. Bei keiner der Plaques wurde
eine Reaktivität
mit den monoklonalen Antikörpern
moAb4 und moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzymcharakterisierung
und PCR-Charakterisierung von elf isolierten Plaques ergab, daß zwischen
den verschiedenen Plaques keine Ähnlichkeiten
festgestellt werden konnten. Das Vorhandensein solcher teilweiser Ähnlichkeiten
zeigt an, daß die
Plaques homologe DNA-Inserts von der selben cDNA-Sequenz enthalten.
Aufgrund des gescheiterten Versuchs, einen „Fingerabdruck" einer wahrscheinlichen
SCCE-cDNA-Sequenz
zu definieren, wurde die Strategie abgeändert.
-
Die
Plaques wurden in E. coli Y 1090 (Clontech) durch Plaquehybridisierung
abgesucht, wo-bei ein degeneriertes synthetisches OligoNukleotid
als Sonde benützt
wurde. Die OligoNukleotidsonde war auf der Basis der experimentell
bestimmten aminoterminalen Sequenz des nativen SCCE-Enzyms wie in
Beispiel 4.2. beschrieben entwickelt. Der verläßlichste Teil der Aminosäuresequenz,
Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro
(SEQ ID NR: 3, As 1–As
6) wurde zur Konstruktion einer synthetischen 17-mer OligoNukleotidsonde
5'-ATHATHGAYGGNGCNCC-3' (H = A oder C oder
T; Y = C oder T; N = A oder C oder G oder T) ausgewählt, die
SYM3067 benannt wurde, SEQ ID NR: 4. Die OligoNukleotidsonde wurde
mit Hilfe eines Beckman 200A-DNA-Synthetisierers
mit dem Phosphoramiditverfahren nach den Anleitungen des Verkäufers synthetisiert.
-
E.
coli Y 1090-Bakterien wurden über
Nacht in LB-Medium (Sambrook et al., 1989) mit 0,2% Maltose und
10 mM MgSO4– gezüchtet. 0,4
ml der Kultur wurden dann mit verdünntem Vorrat von Phagenbank
vermischt und 20 Minuten lang bei 37°C adsorbiert. Die infizierte
Kultur wurde mit 6 ml Weichagarose (0,75% Agarose in LB und 11 mM
MgSO4) vermischt. Das Weichagarosegemisch
wurde in zehn 150 mm-LA-Schalen gegossen. Die Schalen wurden 5 Stunden
lang bei 37°C
inkubiert und bei 4°C über Nacht
gelagert. Insgesamt enthielten die Schalen etwa 4 × 105 Plaques.
-
Zur
Immobilisierung der Plaques wurde jede Schale zwei Minuten lang
mit NEN DuPont Colony/Plaque Screen Membranen (DuPont, Wilmington,
DE) abgedeckt. Die Membranen wurden 2 mal 2 Minuten mit 0,5 M NaOH,
2 mal zwei Minuten mit Tris-HCl, pH 7,5 durchtränkt und an der Luft trocknen
gelassen. Diese Membranen wurden dann für einen Hybridisierungsversuch
wie nachstehend beschrieben verwendet. Die Membranen wurden in 10%
Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS-Lösung mit
100 mg/ml denaturierter Heringsperma-DNA (Sigma, St. Louis, MO)
5 Stunden lang bei 65°C
vorhybridisiert. Die Sonde, SYM-3067, wurde unter Verwendung von
T4-PolyNukleotidkinase (Promega, Madison, WI) [λ-32P]
dATP-markiert und
zum Vorhybridisierungsgemisch hinzugefügt. Die Hybridisierung wurde
12–18
Stunden bei 42°C
ausgeführt.
-
Nach
der Hybridisierung wurden die Membranen viermal 5 Minuten in 2 × SSC bei
Raumtemperatur, 1% SDS bei 42°C
und schließlich
in 0,1 SSC 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Membranen
wurden auf Röntgenfilm
(Hyperfilm-MP, Amersham,
UK) autoradiographies. Irn ersten Suchdurchgang wurden vierzehn
positive Plaques festgestellt. Diese positiven Plaques wurden mit
der gleichen Sonde und mit den gleichen Verfahren wie vorstehend
beschrieben erneut abgesucht. Nach dem erneuten Absuchen wurden zwei
positive Plaques festgestellt. Die zwei ausgewählten Plaques wurden eine weitere
Zeitlang gereinigt, und die Größe der Inserts
wurde durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601 als Primer
und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden. Diese beiden
Primer sind komplementär
zu dem linken beziehungsweise rechten Arm des Phagen λgt 11. Das
aus dem Phagen A 6.2.2 generierte amplifizierte DNA-Fragment von
etwa 0,9 kb wurde dann mit EcoRI verdaut und in EcoRI-verdauten
pUC19 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pS496, cloniert. Dieses clonierte
Fragment wurde einer teilweisen Sequenzanalyse unter Verwendung von
zu pUC19 komplementären
Primern unterworfen. Die Nukleotidsequenz wurde mit Hilfe des T7-Sequenzierungskits
(Pharmacia, Uppsala, Schweden, oder USB, Cleveland, Ohio) bestimmt.
-
Die Übersetzung
der erhaltenen DNA-Sequenz ergab eine Arninosäuresequenz, die zu der der
experimentell bestimmten Proteinsequenz homolog war. Jedoch fehlte
der Sequenz ein Übersetzungs-Startcodon. Um
eine cDNA von voller Länge
zu isolieren, wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel getrennt
und als Sonde benützt,
die die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erlaubte. Diese
Sonde wurde mit Hilfe des multiprime DNA-Markierungssystems (Amersham,
UK) durch folgendes Verfahren 32P-markiert:
Es wurde Wasser im Verhältnis
von 3 ml pro Gramm Gel hinzugefügt
und das Ganze sieben Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gestellt,
um das Gel zu schmelzen und die DNA zu denaturieren. Das Röhrchen kam dann
für mindestens
10 Minuten in ein Wasserbad von 37°C. Ein Volumen DNA/Agarose-Lösung, das
ungefähr
25 ng DNA enthielt, wurde gemäß den Anleitungen
des Lieferanten zur Markierungsreaktion hinzugefügt.
-
Um
eine cDNA von voller Länge
zu erhalten, wurde die cDNA-Bank mit dieser Sonde zwei-mal erneut abgesucht,
wobei die gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt
wurden, außer
daß die
Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bei 65°C stattfand.
Diese Versuche führten
zur Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques,
die anfänglich
durch PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT
CCT GGA GCC-3';
SEQ ID NR: 5) oder SYM 1601 (5'-ACA
CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3';
SEQ ID NR: 6) in Kombination mit SYM 3208 als PCR-Primer zur Bestimmung
einer Plaque eingesetzt wurden, die den ganzen 5' offenen Leserahmen enthält. SYM
3208, 5'-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3'; SEQ ID NR: 7; der
dem 5'-Teil der
SCCE-cDNA zumindest teilweise komplementär ist, wurde auf der Basis
der von pS496 gewonnenen DNA-Sequenzinformation entworfen. Nach
diesem Absuchen wurden vier Phagen zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Für die Sequenzanalyse
wurden die so erhaltenen amplifizierten PCR-Fragmente, die von diesen
Phagen abgeleitet waren, wie vorstehend be-schrieben in pUC19 cloniert.
Die Ergebnisse zeigten, daß einer
der Phagen, 205.2.1, ein Insert von voller Länge enthielt.
-
DNA
aus dem Phagenisolat 205.2.1 wurde gemäß Sambrook et al., 1989 präpariert,
und das DNA-Präparat
wurde mit EcoRI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Agarose-Elektrophorese
getrennt, und ein Fragment von etwa 1 kb wurde isoliert und in EcoRI-verdauten
pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pS500 bezeichnet
(15). Die komplette Nukleotidsequenz des cDNA-Fragments wurde wie vorstehend
beschrieben bestimmt. Als Primer für die Sequenzierungsreaktionen
wurden spezifische, zu den pUC19-oder SCCE-Sequenzen komplementäre OligoNukleotide verwendet.
Die Nukleotidsequenzen (SEQ ID NR:1) enthielten einen offenen Leserahmen,
der zur Codierung der gesamten Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren,
einschließlich
eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids
ausreicht (SEQ ID NR: 2).
-
Ein
anderer Phage, der als 106.1.2. bezeichnet wurde, enthielt eine
SCCE-cDNA-Sequenz,
der die 5'-nichtübersetzte
Sequenz und die ersten drei Codons fehlten. Dieses Insert wurde
als 954 bp-EcoRI-Fragment isoliert und in EcoRI-linearisierten pUC19
cloniert, wodurch man das Plasmid pS498 erhielt. Dieses Plasmid
wurde teilweise sequenziert.
-
Ein
dritter, als 108.1.2 bezeichneter Phage enthielt eine SCCE-cDNA-Sequenz,
der ebenfalls die 5'-nichtübersetzte
Sequenz und sieben Nukleotide der übersetzten Region fehlten.
Dieses cDNA-Insert hat eine längere
Variante der 3'-nichtübersetzten
Region, die sich 1057 bp stromabwärts des Stoppcodons erstreckt.
Dieses 1884 bp-EcoRI-Fragment wurde isoliert und in EcoRI-linearisierten
pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde komplett sequenziert
und als pS501 bezeichnet.
-
BEISPIEL 7
-
Feststellung von SCCE-mRNA
in menschlicher Epidermis
-
Präparation der Gesamt-RNA aus
menschlicher Epidermis
-
Diese
wurde gemäß Chomczynski
und Sacchi, 1987 ausgeführt.
Durch plastische Chirurgie wurde krankheitsfreie menschliche Abdominalhaut
gewonnen. Sie wurde sofort nach dem Abnehmen auf Eis gekühlt. Innerhalb
von weniger als 15 Minuten wurde die Epidermis durch kräftiges Abschaben
mit einem Skalpell gewonnen, in Lösung D (Chomczynski und Sacchi,
1987) getaucht und mit einem Glas-Homogenisierer homogenisiert. Dann wurde
das von Chomczynski und Sacchi beschriebene Verfahren befolgt. Die
präzipitierte
Gesamt-RNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –20°C in 70% Ethanol gelagert.
-
Präparation
der Messenger-RNA
-
Fünfhundert
Mikrogramm der gesamten Epidermis-RNA wurden mit dem Poly A Tract-Kit
(Promega) gemäß den Anleitungen
des Lieferanten verarbeitet.
-
RNA-Elektrophorese
und Blotting
-
Die
Agarosegele (1,4%) wurden mit 0,66 M Formaldehyd in 1 × MOPS-Puffer
und 0,6 g/ml Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO) präpariert.
Es wurde mRNA entsprechend 100 μg
Gesamt-RNA in RNA-Probenpuffer (50% Formamid, 2,2 M Formaldehyd,
3% Ficoll, 1 × MOPS)
aufgelöst
und vor dem Auftragen 5 Minuten lang bei 60°C erhitzt. Die RNA-Marker (BRL,
Gaithersburg, MD) wurden ähnlich
behandelt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele 5 Minuten lang
in destilliertem Wasser getränkt;
es folgten 30 Minuten in 50 mM NaOH und 30 Minuten in 0,1 M Tris-HCl,
pH 7.5. Das Blotting auf GeneScreen Plus-Membranen (NEN DuPont,
Wilmington, DE) wurde mit der Vacu-Gene-Ausrüstung (Pharmacia, Uppsala,
Schweden) 1 Stunde lang in 10 × SCC
ausgeführt.
Dann wurden die Membranen in 3 × SCC
gewaschen, über
Nacht getrocknet und 2 Stunden bei 80°C gebacken. Die RNA auf den
Membranen wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht.
-
cDNA-Sonden
-
Das
wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellte Plasmid pS501 wurde mit
HincII und BglII verdaut. Diese cDNA enthält eine HincII-Stelle bei bp
Nr. 1060 und eine BglII-Stelle
bei bp Nr. 1715. Das 1070-bp-Fragment (HincII-Stelle in Mehrfachclonierungsstelle
von pUC19 – endogene
HincII-Stelle) enthält
die SCCE-codierende Region mit der Ausnahme von 7 bp am 5'-Ende und einer nichtübersetzten
Region einschließlich
der Polyadenylierungsstelle bei bp 944 bis 951, die allen SCCE-cDNAs, die isoliert
wurden, gemeinsam ist. Das 655 bp-HincII-BgIII-Fragment, das den
Poly A-Schwanz nicht enthält,
kommt einzig bei der SCCE-cDNA 108-1-2 vor. Die Fragmente wurden
durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und zur Herstellung von 32PdCTP-markierten Sonden mit dem Multiprime
DNA-Markierungskit (Amersham, Buckinghamshire, UK) verwendet.
-
Hybridisierung
-
Die
Membranen wurden 30 Minuten lang in 1% SDS in 1 × TE gekocht und bei 60°C in 1% SDS,
1 M NaCl, 10% Dextransulfat, Heringsperma-DNS 0,1 mg/ml 3 Stunden
lang vorhybridisiert. Die Hybridisierung geschah in der gleichen
Lösung
bei 60°C über Nacht.
Gewaschen wurden 2 × 30
Minuten bei 60°C
in 1% SDS in 2 × SCC
und 3 Stunden in 0,1 × SCC
bei Raumtemperatur. Dann wurden die Membranen der Autoradiographie
unterworfen.
-
Ergebnisse:
-
Es
konnte das Vorhandensein von zwei mRNA-Spezies mit Größen um die
1,2 kb bzw. 2,0 kb in menschlicher Epidermis demonstriert werden
(16). Dies ist in guter Übereinstimmung mit den aus
den Clonierungsversuchen erhaltenen Hinweisen, bei denen zwei Typen
von cDNAs gefunden wurden.
-
BEISPIEL 8
-
Expression rekombinanten
SCCE in E. Coli
-
Konstruktion des Plasmids
pGEX-2T/SCCE-Plasmide
-
1. Sinn-PCR-Primer
-
- 1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT (SYM 3367; SEQ ID NR: 8),
unterstrichener 3'-Teil
codiert die N-terminalen Aminosäuren
IIDGAPC von aktivem nativem SCCE, 5'-Teil mit BamHI-Stelle und einer zusätzlichen
Sequenz codiert die Faktor Xa-Stelle IEGR.
- 1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM
3368; SEQ ID NR: 9), unterstrichener 3'-Teil entspricht dem Basenpaaren 76–96 in der
vollständigen
SCCE-cDNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz LETAGEE codiert,
5'-Teil wie in 1a.
-
2. Gegensinn-PCR-Primer
-
TGATCCTCTGAGCTCTCCTG
(SYM 3371; komplementär
zu den Basenpaaren 285–304
in der vollständigen
SCCE-cDNA-Sequenz, SEQ ID NR: 1, mit der SacI-Stelle bei bp 294).
-
Eine
Sequenz von pS498 (Beispiel 6) wurde mit den Primern 1a/2 und 1b/2
PCR-amplifiziert.
Die erhaltenen Produkte wurden durch Phenolextraktion rind Ethanolfällung gereinigt,
mit BamHI/SacI verdaut und durch Agarose-Elektrophorese gereinigt.
Sie wurden dann zusammen mit den 3' 673 Basenpaaren von SCCE 106-1-2, die durch Verdauung
von pS489 mit SacI und EcoRI erhalten worden waren, in TG2-Zellen
in pGEX-2T (Pharmacia) cloniert, der mit BamHI/EcoRI verdaut worden
war. Aus den für
Expressionsversuche verwendeten bakteriellen Clones wurden Plasmide
isoliert (pS510, das den nativen N-terminus neben der Faktor Xa-Stelle
codiert, und pS511, das das vorgeschlagene Propeptid neben der Faktor
Xa-Stelle codiert), und die den aus PCR-Produkten abgeleiteten Inserts
entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden mit dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren
unter Verwendung eines T7-Sequenzierungskits (Pharmacia, Uppsala, Schweden) überprüft.
-
Expressionsstudien
-
Übernacht-Kulturen
von TG2-Zellen mit pS510 und pS511 in LB-Medium mit 50 μg/ml Carbenicillin (Sigma,
St. Louis, MO) wurden in frischem Medium zehnfach verdünnt und
3 Stunden lang bei 37°C
gezüchtet. Es
wurde IPTG (Sigma, St. Louis, MO) bis zu einer Endkonzentration
von 0,1 mM hinzugefügt
und die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Bakterielle
Präzipitate
wurden in PBS 1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) ultraschallzertrümmert. Nach
15-minütiger Zentrifugierung
bei 10000 × g
wurden die Überstände und
Niederschläge
mit SDS-PAGE und Immunblotting mit einem polyclonalen SCCE-spezifischen Antiserum
von Hühnern
untersucht.
-
In
den in PBS-Triton X-100 unlöslichen
Niederschlägen
wurden große
Mengen von IPTG-induzierbaren Proteinen mit Mr von etwa 50 kD (pS510)
und 52 kD (pS511) mit SCCE-artiger Immunreaktivität gefunden (vgl. 17).
-
Die Überstände nach
Ultraschallzertrümmerung
in PBS-Triton X-100 enthielten GST/SCCEFusionsproteine von der gleichen
Größe wie die
unlöslichen
Niederschläge,
doch die Mengen waren im Vergleich zu jenen der unlöslichen
Niederschläge
gering.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß es
möglich
ist, SCCE als ein Fusionsprotein mit GST herzustellen, und daß Sequenzen,
die den spezifischen Protease-Spaltungsstellen in der Prä-pro-SCCEAminosäuresequenz entsprechen,
es ermöglichen
werden, diesen Versuch mit dem Ziel zu wiederholen, rekombinantes
SCCE in Bakterien zu erzeugen. Das erzeugte Protein kann in Harnstoff
oder Guanidinhydrochlorid solubilisiert und dann wegen des hohen
isoelektrischen Punkts von SCCE durch Kationenaustauschchromatographie
gereinigt werden. Das gereinigte Protein kann durch Dialyse gegen
Puffer mit niedrigerer Konzentration von denaturierenden Mitteln
renaturiert und dann mit Faktor Xa gespaltet werden, um das GST-Polypeptid
aus SCCE oder Pro-SCCE freizusetzen. Die GST/SCCE-Fusionsproteine
werden auch als Immunogene zur Herstellung von SCCE-spezifischen
Antikörpern
und als Immunsorbentien bei der Antikörperreinigung verwendet werden.
-
BEISPIEL 9
-
Expression
von rekombinantem menschlichem SCCE in Säugerzellen
-
Um
einen Expressionsvektor für
die Herstellung von rekombinantem SCCE zu generieren, wurden menschliche
cDNA-Sequenzen aus dem Plasmid pS500 als 897 bp-EcoRI/DraI-Fragment
isoliert. Dieses Fragment wurde in EcoRI- und SmaI-verdautes pUC19 subcloniert,
wodurch man pS502 erhielt. Das Plasmid pS502 wurde dann mit EcoRI
und SalI verdaut, um die SCCE-cDNA-Sequenzen als ein 0,9 kb-Fragment
zu isolieren, das seinerseits in eine pUC19-Variante, der die HindIII-Stelle fehlt, subcloniert
wurde, wodurch man das Plasmid pS503 erhielt. Diese pUC19-Variante
wurde durch Verdauung von pUC19 mit HindIII, Auffüllen mittels
Klenow-Enzym und Religierung generiert. Um das Clonieren in einen
Expressionsvektor zu erleichtern, wurde eine HindIII-Stelle in das
5'-Ende der SCCE-cDNA
eingebaut. Dies geschah durch Verdauung von pS503 mit EcoRI und
Insertion eines Linkers, der die Stelle in HindIII, SYM3603, 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQ ID NR: 10 konvertiert.
Das so erhaltene Plasmid, das den proteincodierenden Teil der SCCE-cDNA
mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende
bzw. einer SalI-Stelle am 3'-Ende
enthält,
wurde als pS505 bezeichnet.
-
Der
endgültige
Expressionsvektor wurde durch Ligierung von drei verschiedenen DNA-Fragmenten erhalten.
Erstens wurde pS505 mit HindIII und SalI verdaut und ein 0,9 kb-Fragment
isoliert.
-
Zweitens
wurde, um den distalen Teil des stromaufwärts gelegenen regulatorischen
Elements des murinen Metallthioneins zur Verfügung zu stellen, die Rinderpapillomvirussequenzen,
die genomischen Betaglobinfragmente des Kaninchens, die mRNA-verarbeitende Signale
liefern, und die Plasmidsequenzen pML2d, die Selektion und Replikation
in E. coli erlauben (Waldenström
et al., 1992), der Vektor pS 147 mit SacI und SalI verdaut und ein
Fragment von etwa 12 kb isoliert.
-
Drittens
wurde, um den proximalen Teil des murinen Metallthioneinpromotors
zu isolieren, das Plasmid pS42, bei dem die in der Leadersequenz
gelegene native BglII- in eine HindIII-Stelle umgewandelt worden
ist, mit SacI und HindIII verdaut und ein Fragment von ungefähr 220 bp
isoliert.
-
Die
Ligierung dieser drei Fragmente ergab den SCCE-Expressionsvektor
pS507 (vgl. 18).
-
Der
Expressionsvektor pS507 wurde mit einem Vektor, der ein vom 5'-Long Terminal Repeat
des Harvey-Sarkomvirus gesteueres Neomycin-Resistenzgen und SV41-Polyadelylierungssignale
(Lusky und Botchan, 1984) enthielt, in murine C127-Zellen co-transfiziert
(ATCC CRL 1616). Die Transfektionsversuche wurden nach dem Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
(Graham und Van der Eb, 1973) ausgeführt. Die Zellen wurden in Ham's Fl2/Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) (1:1), das mit 10% fötalem Kälberserum (HyClone, Logan,
UT) angereichert war, gezüchtet.
Die neomycinresistenten Zellclone wurden mit 1,5 mg/ml G418 (Gibco
BRL) selektiert, und nach 10–15
Tagen der Selektion wurden die resistenten Clone bestimmt und von
den Ursprungsschalen isoliert und weiterer Analyse zugeführt.
-
Um
die Expression der rekombinanten SCCE-Gene zu untersuchen, wurde
die Gesamt-RNA aus den isolierten Zellinien präpariert. Die Gesamt-RNA wurde
aus Cl27-Zellen präpariert
und auf 1% Formaldehyd-Agarosegel separiert, auf eine Nitrocellulosemembran
transferiert und mit einer 32P-markierten
SCCE-Sonde hybridisiert. Die Sonde war das 1070 bp-HincIIFragment
der SCCE-DNA, das durch HinclI-Verdauung von pS500 und Agaroseelektrophorese
erhalten wurde. Bei den Versuchen wurde nach Ausubel et al., 1992
vorgegangen. Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit 32P-markierter SCCE-cDNA zeigten, daß rekombinante
SCCE-mRNA in mehreren Zellinien, die den SCCE-Vektor pS507 enthielten,
feststellbar war. Bei den Kontrollproben, die aus C 127-Zellinien
abgeleitet waren, die einen außer
hinsichtlich der SCCE-cDNA identischen Vektor enthielten, wurde
keine Hybridisierung gefunden (19).
Die Größe 1,4 kB
entspricht der erwarteten Größe.
-
Es
wurden Proben von konditioniertem Zellkulturmedium genommen und
durch Immun-blotting analysiert. Die SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli
(1970) ausgeführt,
und für
das Immunblotting wurde anti-natives SCCE von Hühnern als feststellender Antikörper benützt. Ein
Alkaliphosphatase-markiertes anti-Hühner-IgG (Sigma, St. Louis, MO) wurde zur
Enzymmarkierung benützt.
Die Ergebnisse werden in 20 gezeigt.
-
Um
die Expression des rekombinanten SCCE zu untersuchen, wurde die
Gesamt-RNA aus C127-Zellen,
die mit dem Expressionsvektor pS507 transfiziert waren, präpariert.
Als Kontrollproben wurde die Gesamt-RNA sowohl aus transfizierten
C127-Zellen als auch aus mit dem Expressionsvektor pS 147 transfizierten
C 127-Zellen präpariert.
Der Vektor pS 147 ähnelt
pS507, außer
daß er
die cDNA für
menschliche gallensalzstimulierte Lipase (Nilsson et al., 1990)
anstatt der menschlichen SCCE-cDNA enthält. Die RNA wurde nach Ausubel
et al. (1992) präpariert.
Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit 32P-markierter
SCCE-cDNA zeigten, daß in
den C127-Zellen, die den SCCE-Vektor, pS507 enthielten, rekombinante
SCCE-mRNA von etwa 1,4 kb feststellbar war (19).
Bei den Kontroll-proben, die aus C127-Zellinien abgeleitet waren,
die pS 147 enthielten, oder in nichttransfizierten C 127-Zellen
wurde keine Hybridisierung gefunden. Die Länge der rekombinanten SCCE-mRNA
war wie erwartet.
-
Es
wurden Proben von konditioniertem Zellkulturmedium genommen und
durch SDS-PAGE und Immunblotting analysiert. Der Blot wurde wie
bei Blake et al., 1984 beschrieben entwikkelt. Die erhaltenen Resultate
(vgl. 20) zeigen, daß C127-Zellen, die pS507
enthalten, drei Proteine erzeugen, die eine Reaktion mit allen verfügbaren polyclonalen
Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern, sowie
mit den wie in Beispiel 5 hergestellten monoklonalen anti-SCCE zeigen.
Die rekombinanten SCCE-reaktiven Proteine zeigen ein scheinbares
Molekulargewicht, das etwa 1 kDa größer als gereinigtes, natives
menschliches SCCE ist. Das rekombinante Protein zeigt keinerlei
proteolytische Aktivität.
Durch Vergleich der abgeleiteten SCCE-Aminosäuresequenz mit dem experimentell
bestimmten NH-2-Ende von nativem menschlichem SCCE und mit Sequenzen
andere chymotrypsinartiger Proteasen kann geschlossen werden, daß das in
C127-Zellen hergestellte rekombinante SCCE in seiner Proenzymform
ist. Die Sequenzdaten deuten darauf hin, daß dieses Proenzym durch proteolytische
Spaltung an der C-terminalen Seite des Lysins in der Sequenz ...AQGDKIIDGAP... aktiviert werden
kann; die unterstrichene Sequenz ist die NH-2-Sequenz von nativem
menschlichem SCCE (SEQ ID NR: 2, aa 5–aa 6).
-
BEISPIEL 10
-
Reinigung und Charakterisierung
von rekombinantem SCCE
-
Reinigung
-
1,3
mg des gegen natives SCCE gerichteten monoklonalen Antikörpers TE4b
wurde an 1,5 ml von CNBr-aktivierter Sepharose (Pharmacia-LKB Biotech,
Uppsala, Schweden) gekoppelt, wobei das vom Hersteller beschriebene
Verfahren angewandt wurde. 40 ml SCCE-haltiges Medium wurden durch
ein 0,45 μm-Filter
filtriert und dann auf die Säule
aufgebracht. Die Säule
wurde mehrere Male mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7.2
gewaschen und dann mit 0,1 M Glycin-HC1, pH 2.5 eluiert. Das eluierte Protein
wurde sofort durch Hin-zufügen
von 0,1 Volumen 1 M Tris-HCl, pH 8,0 neutralisiert.
-
Aktivierung
-
Das
rekombinante SCCE (4,6 pg in 200 μl),
das mit dem Gel mit dem gekoppelten monoklonalen Antikörper (vgl.
vorstehend) gereinigt worden war, wurde mit 4,6 μl 0,1 mg/ml Trypsin (Massenverhältnis 10
: 1) bei 37°C
verdaut. Die Proben (50 μl)
wurden nach 20 Minuten, 1 Stunde, 3 Stunden und 20 Stunden herausgenommen,
und es wurden 5 μl
10 pM (4-Amidinophenyl)methan-sulfonyl (APMSF; Boehringer Mannheim, Deutschland)
hinzugefügt,
um die Reaktion zu beenden. Die Aktivität des gespalteten SCCE wurde
durch nicht-reduzierende SDS-PAGE auf Caseingelen wie in Beispiel
2.2 beschrieben getestet. Die Identität der gespalteten Formen von
SCCE wurde durch reduzierende SDS-PAGE und anschließendem Immunblotting
mit anti-nativem SCCE von Hühnern
und anschließend
alkaliphosphatasemarkiertem anti-Hühner IgG und Nitroblau-Tetrazol
und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat als Substrat für Alkaliphosphatase
getestet.
-
N-terminale
Sequenzierung
-
Affinitätsgereinigtes
(wie vorstehend beschrieben) SCCE, ungefähr 35 μg, wurde mit einer Bio-Dot SP-Einheit
(Bio-Rad, Richmond, CA) auf eine Immobilon – Membran (Millipore, Bedford,
MA) slot-geblottet; dann wurde die Membran mehrmals mit destilliertem
Wasser gewaschen, um alles Tris und Glycin zu entfernen. Der Teil
der Membran, wo das Protein gebunden war, wurde ausgeschnitten und
mit einem Applied Biosystems (Foster City, CA) 477A Puls-Flüssigphasensequenzierer
mit einem PTH 120 A Online-Analysator sequenziert. Die Sequenzierung
wurde mit regulären
Zyklusprogrammen und Chemikalien des Herstellers ausgeführt. Die
in den ersten sechs Positionen erhaltene Sequenz war glu-glu-ala-gln-gly-asp,
entsprechend den Aminosäuren –7 bis –2 aus SEQ
ID NR: 2. Wie aus diesem Ergebnis geschlossen werden kann, besteht
das Signalpeptid aus 22 Aminosäuren,
und basierend auf der N-terminalen Arninosäuresequenz von nativem aktivem
SCCE, besteht das Propeptid aus sie-ben Aminosäuren.
-
Deglykosylierung
-
Gereinigtes
rekombinantes SCCE (5 μg)
und natives SCCE (20 μg)
wurden 3 Minuten lang in 20 μl 0,5%
SDS und 0,1 M β-Mercaptoethanol
gekocht. Die Proben wurden mit Natriumphosphatpuffer, pH 8,6 und Nonidet
P-40 bis zu Endkonzentrationen von 0,2 M bzw. 1,25% verdünnt. Es
wurde N-Glycosidase F® (Boehringer Mannheim)
hinzugefügt
(für rekombinantes
Protein 0,6 Einheiten und für
natives Protein 1,2 Enzymeinheiten), und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Die Endkonzentration von SDS im Probentest war 0,17%.
N-Glycosidase F®-behandeltes
SCCE wurde auf 8–18%
SDS-PAGE und anschließendem
Immunblotting wie vorstehend beschrieben analysiert. Die erhaltenen
Ergebnis-se zeigten eine Verringerung des scheinbaren Molekulargewicht
der beiden oberen Banden, während
das scheinbare Molekulargewicht der untersten Bande unverändert war
(23). Dies zeigt, daß das in C127-Zellen hergestellte
rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten Formen und in einer nichtglykosylierten
Form existiert. Das Resultat ist zu dem analog, was bei aktivem
nativem SCCE beobachtet werden kann (23).
-
BEISPIEL 11
-
Desmosomenverdauende
Aktivität
von rekombinantem SCCE
-
Corneocyten,
die intakte Desmosomen enthielten, wurden durch „tape stripping" bis zu den tieferen Schichten
des Stratum corneum von der Haut abgezogen, und die Schuppen wurden
mit Hexan abgelöst
und portionsweise eingetrocknet. Die Corneocytenportionen (3 mg)
wurden mit 1 M Natriumchlorid bei 4°C extrahiert, um die darin befindlichen
Proteasen zu solubilisieren, und dann ausgiebig mit Inkubationspuffer
(0,1 M Tris/HCl, pH 8.0) gewaschen, um die endogene proteolytische
Aktivität
aus den Präparaten
zu entfernen. Die Inkubationen wurden in 0,1 M Tris, pH 8.0 mit
oder ohne 10 μg
rekombinantem SCCE 24 Stunden lang bei 37°C ausgeführt. Die desmosomale Verdauung
durch das Enzym wurde nachgewiesen, indem die Spiegel des Desmosomen-Markerproteins
Desmoglein I (DG I) gemessen wurden. Dieses wurde durch Extraktion
in einem 8 M Harnstoff/2% SDS/β-Mercaptoethanol-Puffer
mit an-schließender
Reinigung des DG I-Glykoproteins
mittels Concanavalin A-Affinitätschromatographie
aus den Hautschuppen isoliert. Das Concanavalin A-Eluat wurde durch
SDS-PAGE fraktioniert und elektrophoretisch für das Immunblotting auf eine
PDVF-Membran übertragen.
DG I wurde mit einem spezifischen Antiserum bestimmt und mit verstärkter Chemolumineszenz
festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
-
-
Die
in Tabelle 4 vorgestellten Ergebnisse zeigen, daß rekombinantes SCCE in der
Lage ist, intrazelluläre
kohäsive
Strukturen im Stratum corneum in einem in vitro-Test zu degradieren.
-
BEISPIEL 12
-
Auswirkung
von Inhibitoren auf die Aktivität
von rekombinantem SCCE Es wurden die Auswirkungen der Inhibitoren
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat auf die S-2586-hydrolysierende
Aktivität
von rSCCE untersucht. Der Versuchsaufbau war wie in Bei-spiel 3.2
umrissen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
-
-
Wie
in der vorstehenden Tabelle 5 gezeigt, hemmten Aprotinin, Chymostatin
und Zinkionen die S-2586-hydrolysierendee Aktivität von rekombinantem
SCCE in ähnlicher
Weise, wie die des nativen Enzyms.
-
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- Form PCT/RO/134 (July 1992)
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