FI119027B - Rekombinantti sarveiskerroksen kymotryptinen entsyymi (SCCE) - Google Patents

Description

119027

Rekombinantti sarveiskerroksen kymotryptinen entsyymi (SCCE) - Rekombinant stratum comeum kymotryptisk enzym (SCCE) 5 Esillä oleva keksintö koskee rekombinantti-polypeptidiä ja polypeptidiä koodaavaa nukleotidisekvenssiä, ekspressiosysteemiä, joka pystyy ilmentämään polypeptidiä, sekä polypeptidin sisältäviä farmaseuttisia ja kosmeettisia koostumuksia ja polypep-tidin käyttöä erilaisiin kosmeettisiin tai terapeuttisiin tarkoituksiin.

10 Lyhyt keksinnön kuvaus

Iho on elimenä mielenkiintoinen biologiselta, lääketieteelliseltä ja kosmeettiselta kannalta. On paljon ihosairauksia, jotka ovat joko elinspesifisiä, esimerkiksi psori-aasi ja ekseemat, tai jonkin yleissairauden ilmentymiä, kuten yleiset allergiset reaktiot. Sitä seikkaa, että on olemassa ihospesifisiä sairauksia, voidaan pitää osoituk-15 sena siitä, että on olemassa molekyylimekanismeja, jotka ovat uniikkeja iholle.

Niinpä tutkimukset, jotka kohdistuvat ihospesifisiin molekyyliprosesseihin, ovat tärkeitä ihon sairauksien ymmärtämiseksi ja hoitamiseksi. Näyttää järkevältä olettaa, että useat näistä prosesseista tavalla tai toisella liittyvät ihon kaikkein spesialisoitu-neimpaan toimintaan, toisin sanoen fysikaalis-kemiallisen raja-aidan muodostami-20 seen kehon ulkopuolen ja sisäpuolen välille. Fysikaalis-kemiallinen ihoraja-aita sijaitsee ihon uloimmassa kerroksessa, sarveiskerroksessa.

Sarveiskerros (Stratum comeum) on ihon spesialisoitunein rakenne. Se on epider- , ·. miksen erilaistumisprosessin lopputuote, toisin sanoen kerrostunut levyepiteeli, joka • · 25 muodostaa ihon uloimman osan. Suurin osa epidermiksen soluista muodostuu eri •.. 7 erilaistumistiloissa olevista keratino-syyteistä. Alimmat keratinosyytit, tyvisolut, t • · ’ ovat tyvikalvossa kosketuksessa dermikseen eli ihon sidekudokseen ja ne ovat ainoat * ·: · * keratinosyytit, jotka pystyvät jakautumaan. Osa tyvisoluista lähtee jatkuvasti tyvi- :.: : kalvosta ja käy läpi erilaistumisprosessin, joka mahdollisesti tekee soluista sarveis- « · · !: : 30 kerroksen rakennusosia. Tässä prosessissa keratinosyytit käyvät läpi muutamia adaptiivisia muutoksia. Epidermisspesifisistä sytokeratiineista muodostuvan solun : tukirangan pitoisuus lisääntyy. Vierekkäisten solujen väliset filamentit liittyvät toi- • · · . *: *; siinsa funktionaaliseksi yksiköksi lukumäärältään lisääntyneiden desmosomien , · , avulla. Dramaattisimmat muutokset tapahtuvat siirryttäessä ylimmästä elävien solu- * · · 35 jenkerroksesta, sarveiskerroksesta, elinkelvottomaan sarveiskerrokseenprosessissa, : · · ·* jotka tavallisesti kutsutaan keratinisaatioksi. Kovalenttisesti silloittuneita proteiineja : kerrostuu lähelle solukalvon sisintä muodostaen erittäin kestävän solunkuoren. Li- • · · ....: saksi solunulkoiseen tilaan erittyy runsaasti lipidejä sisältävää ainetta, joka on peräi- 2 119027 sin eräästä keratinosyyttispesifisestä soluelimestä, ja muodostamalla lipidikalvoja, jotka ympäröivät sarveiskerroksen soluja, se muodostaa läpäisevyysraja-aidan hyd-rofiilisille aineille. Lopuksi kaikki solunsisäiset rakenteet lukuunottamatta tiheästi pakkautuneita sytokeratiinisäikeitä, katoavat.

5

Sarveiskerroksen solut, komeosyytit, ovat siis elinkelvottomia. Tämä tarkoittaa, että eri prosessien säätelyn sarveiskerroksissa täytyy olla tulosta "ohjelmoinnista" sellaisessa vaiheessa, jossa keratinosyytit ovat edelleen elinkelpoisia. Epidermiksen vaihtuminen, joka normaalisti tapahtuu noin neljässä viikossa, joiden aikana solut ovat 10 osa sarveiskerroksia noin kahden viikon ajan, päättyy solujen irtoamiseen ihon pinnalta kesimisprosessissa. Tämä prosessi on eräs esimerkki sarveiskerroksen "ohjelmoinnista". Eräs edellytys sarveiskerroksen toiminnalle fysikaalis-kemiallisena raja-aitana on, että yksittäiset solut pysyvät yhdessä mekaanisesti kestävien rakenteiden, toisin sanoen desmosomien, avulla. Desmosomien hajoamisen, mikä on edellytykse-15 nä kesimiselle, tulee olla säädelty niin, että se aikaansaa solujen irtoamisen ihon pinnalta, mikä tasapainottaa sarveiskerroksen de novo -tuotantoa haittaamatta kudoksen raja-aitatoimintoja.

Keratinisaatiohäiriöt 20 Monien ihossa esiintyvien vakavuudeltaan vaihtelevien patologisten tilojen joukkoon kuuluvat häiriöt keratinisaatioprosessissa. Psoriaasissa esiintyy tyypillisen kroonisen tulehduksen lisäksi epäkypsän sarveiskerroksen ylituotantoa, minkä seurauksena on tälle taudille tyypillinen hilseily. On olemassa ryhmä perinnöllisiä iho-. ·. sairauksia, joille on tunnusomaista paksuuntunut sarveiskerros, mikä johtaa "kalan- !" 25 suomu-jen" muodostumiseen, niin kutsutut iktyoosit. Useissa iktyooseissa kesimi- • · 1 *... nen on hidastunut. Vaikkakin vähemmän vakavana kuin iktyooseissa myös "kuivalle •f iholle" (kseroderma) on tunnusomaista sarveiskerros, josta komeosyytit irtoavat, ei • « · kuten normaaleissa tiloissa yksittäisinä soluina tai pieninä solukasaantumina, vaan :.: : laajoina makroskooppisesti havaittavina suomuina. Tämä häiriö on erittäin yleinen ··· 1.: : 30 vanhuksilla ja atoopikoilla eli henkilöillä, joiden ihoa ärsyttävien tekijöiden sietoky ky on alentunut ja joissa on alttius kehittyä jokin endogeenisen ekseeman tunnus-: omainen muoto. Aknetaudeissa on kysymys häiriintyneestä keratinisaatiosta talirau- hastiehyeissä, mikä johtaa komedonien ja ihohuokosten tukkeutumisten muodostu- .1 . miseen. Komedonien muodostuminen edeltää ja sen uskotaan synnyttävän inflam- • · · *· 1: 35 matorisia aknevaurioita.

• · · • · • 1 * · φ • · · • · · • · · • · 3 119027

Proteolyyttiset entsyymit ovat mukana keratinisaatiossa

Keratinisaatioprosessissa ja sarveiskerroksen vaihtumisessa on useita vaiheita, joissa proteolyyttisillä entsyymeillä näyttää olevan tärkeitä tehtäviä. Vannaa on, että kaikkien solunsisäisten rakenteiden, sytokeratiinifilamentteja lukuunottamatta, joita 5 esiintyy transitiossa elinkykyisten ja sarveistuneiden epidermikerrosten välillä, katoamisessa täytyy olla mukana proteolyysi. Profilaggriinin muuttumista filaggriiniksi, proteiiniksi, jonka uskotaan toimivan sytokeratiinifilamenttien erityistyyppisessä ag-gregaatiossa keratinisaation aikana, saattaa katalysoida jokin spesifinen proteinaasi. Sarveiskerroksissa filaggriini hajoaa edelleen pienimoolimassaisiksi komponenteik-10 si, jotka luultavasti ovat tärkeitä "luonnon kostutusaineina". Lisäksi keratinisaatio- prosessin aikana tapahtuu sytokeratiinin polypeptidien proteolyyttisiä muutoksia. Lopuksi vielä proteolyyttisillä tapahtumilla on todennäköisesti ratkaiseva merkitys solunsisäisten kohesiivisten rakenteiden hajoamisessa sarveiskerroksissa prosesseissa, jotka mahdollisesti johtavat kesimiseen.

15

Sarveiskerroksen solujen koheesio ja kesiminen. Desmosomien tehtävä Intrasellulaarinen kiinnevoima sarveiskerroksissa samoin kuin epidermiksen elinkykyisissä osissa on merkittävässä määrin desmosomivälitteistä. Desmosomi muodostuu kahdesta symmetrisestä puolikkaasta, joista kumpikin muodostuu kahdesta vie-20 rekkäisestä solusta. Kussakin desmosomin puolikkaassa on yksi solunsisäinen osa, joka on liittynyt sytokeratiinifilamentteihin, ja yksi osa, jonka muodostavat glyko-proteiinit, jotka ovat ankkuroituneet solunsisäisesti ja transmembraanisiin ja solu-nulkoisiin osiin. Näiden proteiinien solunulkoiset osat, desmogleiinit, ovat adheesiomolekyylejä ja niiden yhteistoiminnan kautta solunulkoisessa tilassa muodostuu * 1 '.V 1 25 kohesiivinen rakenne. Desmosomien hajoaminen näyttää noudattavan jossakin mää- ;. 7 rin erilaisia teitä kämmenten ja jalkapohjien sarveiskerroksissa verrattuna ei-palmo- * ··1 plantaariseen sarveiskerrokseen. Viimeksi mainitussa kudoksessa noin 85 % desmo- : 1 someista häviää pian sen jälkeen, kun solut ovat täysin sarveistuneet. Loput desmo- • 1 i.i : somit, jotka sijaitsevat ensisijaisesti äärimmäisen litistyneiden solujen villusten päis- • · 1 V · 30 sä, jäävät selvästikin koskemattomiksi siihen saakka, kunnes kesiminen tapahtuu.

Palmo-plantaarisessa sarveiskerroksissa komeosyytit ovat paljon vähemmän litisty- : neitä eikä kudoksen syvemmissä kerroksissa tapahdu ekstensiivistä desmosomien • · · . 1:1. hajoamista. Molemmissa kudoksissa kesiminen liittyy desmosomien hajoamiseen.

.· . Iktyoottisessa ihossa samoin kuin "kuivassa ihossa" desmosomien lukumäärän on • 1 » 35 osoitettu lisääntyneen sarveiskerroksen pintakerroksissa.

• · • · • · · • · · 1 • · · • · · 4 119027

Sarveiskerroksen solujenväliset lipidit

Ero desmosomien hajoamisessa palmo-plantaarisen ja ei-palmo-plantaarisen sarveiskerroksen välillä saattaa liittyä erilaisuuteen solunulkoisten lipidien määrissä näissä kahdessa kudostyypissä. Lipidipitoisuus on huomattavasti suurempi ei-palmo-plan-5 taarisessa sarveiskerroksessa. Tämän seurauksena tämän kudoksen tehokkuus veden ja muiden hydrofiilisten aineiden permeabiliteettisulkuna on suurempi kuin kämmenten ja jalkapohjien sarveiskerroksen. Koska desmosomit vievät merkittävästi tilaaja koska ehjät desmosomit estävät solunulkoisen tilan laajenemisen, desmosomien hajoaminen saattaa olla mekanismi, jonka avulla lipideille muodostuu lisää so-10 lunulkoista tilaa. Sarveiskerroksen solunulkoiset lipidit liittyvät kesimiseen myös usealla muulla tavalla. Koska ne ovat ekstrasellulaarisen tilan pääaineosia, niillä voidaan odottaa olevan huomattava vaikutus tässä paikassa toimivien entsyymien aktiivisuuteen, esimerkiksi entsyymien, jotka aikaansaavat desmosomien hajoamisen. Erilaisten lipidien metaboliassa esiintyvien häiriöiden on nimittäin osoitettu 15 olevan todennäköisiä syitä useaan iktyoosityyppiin. On myös todennäköistä, että lipidit ovat itse jossakin määrin osallisina sarveiskerroksen solujen koheesioon. Lisäksi lipidien erittyminen sarveiskerroksen solunulkoiseen tilaan liittyy todennäköisesti myös joidenkin entsyymien erittymiseen. Lipidien prekursoreita varastoituu ylempiin elinkykyisiin keratinosyytteihin spesifisiin organelleihin. Näiden niin kut-20 suttujen lamellikappaleiden on osoitettu sisältävän muutamia hydrolyyttisiä entsyymejä. Niinpä olettaankin, että jokin entsyymi, joka aikaansaa desmosomien hajoamisen sarveiskerroksessa, syntetisoituu, mahdollisesti inaktiivisessa pro-muodossa, keratinosyyttien vaikutuksesta, varastoituu lamellikappaleisiin, ja erittyy sarveisker- .·, roksen solunulkoiseen tilaan keratinisaation aikana, jolloin se saattaa aktivoitua ja • · * 25 sen aktiivisuutta säätelee edelleen, muiden tekijöiden lisäksi, solunulkoisten lipidien koostumus.

9 • · * ·:.' Solujen kiinnevoiman häiriöt elinkykyisessä epidermiksessä « · Ϊ.: : On olemassa muutamia ihosairauksia, joissa keratinosyyttien välinen kiinnevoima * ** V · 30 on heikentynyt sarveistumattomissa, elinkykyisissä epidermikerroksissa. Näille sai rauksille on tunnusomaista akantolyysiksi kutsuttu ilmiö, toisin sanoen desmosomi- : : ’: kosketusten katkeaminen muuten näennäisesti normaalien keratinosyyttien välillä.

··· . 1: 1. Prosessia välittävät todennäköisesti proteinaasit, joita ei ole tähän mennessä täysin . · . identifioitu. Akantolyysi, joka pitkälle kehittyneenä johtaa rakkuloiden muodostumi- • 1 f *;" 35 seen, on eräs autoimmuunisairauksien, pemphigus vulgariksen ja pemphigus folia- *... 1 ceuksen, perinnöllisen hyvänlaatuisen familiaarisen pemfiguksen (Hailey-Haileyn ; tauti) ja perinnöllisen dyskeratosis folliculariksen (Darierin tauti) tunnusmerkki.

»M

· 5 119027

Epidermis osallistuu aktiivisesti immunologisiin ja inflammatorisiin reaktioihin Sen lisäksi, että epidermis toimii fysikaalis-kemiallisen raja-aidan tuottajana kehon ulkopuolen ja sisäpuolen välille, se toimii myös aktiivisena immunologisena raja-aitana. Keratinosyyteillä on kyky tuottaa samoin kuin reagoida suuren joukon kanssa 5 sytokiineja ja muita inflammatorisia mediaattoreita, joiden kautta ne ovat yhteydessä ja vuorovaikutuksessa immunologisten ja inflammatoristen systeemeiden solujen kanssa. Tämä on erittäin tärkeää isännän puolustuskyvyn kannalta mikrobiperäisiä infektioita vastaan ja haavojen paranemisprosessissa. Nykyaikainen tutkimus on myös osoittanut, että keratinosyytit ovat todennäköisesti mukana monissa inflamma-10 torisissa ihotaudeissa, kuten psoriaasissa ja ekseemoissa.

Epidermiksen proteinaasit saattavat olla tärkeitä tulehduksessa Eräs sytokiineista, joita keratinosyytit tuottavat, on interleukiini 1 (11-1). 11-1 esiintyy kahdessa muodossa, Π-laina ja fl-lB:na, joita molempia on epidermiksessä. Kun 15 lila on täysin aktiivinen sellaisena kuin se syntetisoituu, Il-ΐβ puolestaan syntetisoituu inaktiivisena 31 kD pro-muotona. Pro-Π-lB:n muuttaa aktiiviseksi 17 kD muodoksi eräs spesifinen proteinaasi, jota on esimerkiksi monosyyteissä, mutta jota ei toistaiseksi ole detektoitu normaalissa epidermiksessä. Muutamat seriiniproteinaa-20 sit, joilla on kymotrypsiinin kaltainen substraattispesifisyys (haiman kymotrypsiini ja neutrofiilisten granulosyyttien katepsiini G), voivat kuitenkin toimia pro-fl-lB:n aktivoijina.

,·. Kuten Norris on ehdottanut (1990), proteolyyttiset entsyymit, joita on läsnä sarveis- V,' ‘ 25 kerroksen intrasellullaaritilassa, saattavat joissakin olosuhteissa kyetä muuttamaan ',., sytokiinien inaktiivisia muotoja aktiivisiksi muodoiksi. Erityisen mielenkiintoinen *;’ tässä yhteydessä on biologisesti inaktiivi pro-interleukiini- IB, jota keratinosyyttien !1··1 on osoitettu tuottavan (Mizutani et ai., 1991). Tähän mennessä ei ole löydetty epi- Ϊ.: : dermiksen entsyymejä, jotka kykenisivät muuttamaan pro-interleukiini-lB:n aktiivi- * / ! 30 seksi interleukiini- lBiksi. Koska kuitenkin kymotrypsiini ja katepsiini G (eräs ky- motrypsiininkaltainen entsyymi) kykenevät katalysoimaan inaktiivisen 31 kD re- : kombinantti-pro-interleukiini-lB:n konversion täysin aktiiviseksi 17 kD muodoksi, • · · . 1 j'; on mahdollista, että myös epidermiksen kymotrypsiininkaltaiset entsyymit voivat .· . katalysoida tätä muutosta.

• · · ’· 1; 35 • · t * 1 • 1 1 1 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ; Esillä oleva keksintö koskee entsyymiä, joka on nimetty sarveiskerroksen kymo- »· · · 6 119027 tryptiseksi entsyymiksi (SCCE), jonka ajatellaan aikaansaavan desmosomien hajoamisen sarveiskerroksessa. Näyttö tästä esitetään esimerkissä 1, joka osoittaa, että solujen varisemisessa ihon sarveistuneen pintakerroksen pinnalta on mukana desmo-somiproteiinien hajoaminen ja että tämän aikaansaava entsyymi on kymotrypsiinin-5 kaltainen seriiniproteinaasi, joka voidaan inhiboida sinkki-ioneilla.

Esimerkissä 2 kuvataan sarveiskerroksen kymotryptisen entsyymin (SCCE) löytämistä, proteinaasin, joka täyttää kriteerit, että se aikaansaa solunsisäisten kohesiivis-ten rakenteiden hajoamisen sarveiskerroksessa in vitro ja mahdollisesti myös in vi-10 vo. Esimerkissä 3 kuvataan sarveiskerroksen kymotryptisen entsyymin (SCCE) aktiivisuuden osittaista karakterisointia käyttämällä kromogeenisia substraatteja.

Tulokset osoittavat, että SCCE eroaa entsymologisesti muista kymotryptisistä pro-teinaaseista. SCCE;n inhibiittoriprofiili ja kyky hajoittaa kahta kymotrypsiinin kal-15 täisten entsyymien eri substraattia on merkittävästi erilainen verrattuna naudan ky-mo-trypsiiniin ja ihmisen katepsiini G:hen. SCCE näyttää eroavan myös ihmisen syöttösolun kymaasista. Viimeksi mainittu entsyymi katalysoi tehokkaasti Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA:n hajoamista (katso Schwartz et ai., 1987 ja Schechter et ai., 1989) - mitä SCCE ei tee - eikä aprotiniini tai SBTI inhiboi sitä (Schechter et ai., 20 1983 ja Wintroub et ai., 1986), minkä ne tekevät SCCE:n suhteen.

Esimerkki 4 kuvaa SCCE:n osittaista puhdistamista komeosyyttien KCl-ekstrak-teista affiniteettikromatografian avulla liukenemattomalla soijapaputrypsiini-inhibiittorilla (SBTI) ja SCCE:n N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittä- • 1 j** 1 25 niistä. Pelkistämättömillä näytteillä saannot olivat hyviä vaiheissa 1-6, mutta puto- sivat nollaan vaiheissa 7 ja 9 ja saannot seuraavissa vaiheissa olivat korostuneen ·;' huonot. Myöskään pelkistetyillä näytteillä aminohappojohdoksia ei pystytty detek- \ϊ·: toimaan vaiheissa 7 ja 9, mutta seuraavissa vaiheissa, joissa johdoksia pystyttiin • · : detektoimaan, ei saannoissa esiintynyt mitään syviä laskuja. Nämä tulokset antavat V : 30 aiheen olettaa, että asemissa 7 ja 9 on kysteiinejä. Vaiheissa 7 ja 9 ei kuitenkaan pystytty detektoimaan karboksimetyloitua kysteiiniä pelkistyksen ja jodietikkaha- i ;’· polla (100 mM) käsittelyn jälkeen. Saatu sekvenssi (kuvio 13, SEQ ID NO:3) oli ··1 samanlainen pelkistetyillä ja pelkistämättömillä näytteillä.

» « 9 9 • « · · " 35 Esimerkki 5 kuvaa SCCE-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden ja polyklo- s..»1 naalisten SCCE-spesifisten kananpoika- ja kaniini-vasta-aineiden valmistusta sekä 9 « monoklonaalisilla vasta-aineilla tehtyjä immunohistokemiallisia tutkimuksia.

·· 1

V

7 119027

Esimerkki 6 kuvaa humaani-SCCEitä koodaavan cDNA:n kloonausta ja sekvensointia. Aluksi cDNA-kirjasto, joka valmistettiin aikuisen ihmisen epidermiksen kerati-nosyyteistä johdetusta mRNAista, seulottiin polyklonaalisilla anti-SCCE-kaniini-vasta-aineilla. Yksi vasta-aineista antoi voimakkaan taustasignaalin ja se suljettiin 5 pois laajasta seulontatutkimuksesta varhaisessa vaiheessa. Käyttämällä erästä toista polyklonaalista vasta-ainetta (D-5) rikastettiin joukko immunoreaktiivisia plakkeja, kuten oli odotettavissa todella positiivisten plakkien osalta. Minkään plakin kohdalla ei kuitenkaan todettu reaktiivisuutta monoklonaalisia vasta-aineita moAb 4 ja moAb 9 kohtaan. Yhdentoista eristetyn plakin laaja restriktioentsyymikarakterisointi ja 10 PCR-karakterisointi paljasti, että eri plakkien välillä ei voitu havaita minkäänlaista samankaltaisuutta. Koska tässä oletettavan SCCE:n cDNA-sekvenssin "sormenjäljen" määrittämisessä epäonnistuttiin, strategiaa oli muutettava.

Huolimatta SCCE-immunoreaktiivisen materiaalin ensisijaisesta havaitsemisesta 15 suprabasaalisissa keratinosyyteissä viljellyistä ihmisen keratinosyyteistä valmistet tua cDNA-kirjastoa käytettiin SCCE-cDNA:n seulomiseen. Sellaisen kirjaston voidaan odottaa sisältävän vain basaalikeratinosyyteistä peräisin olevaa cDNAita.

Tämä yritys perustui heikon, mutta oletettavasti merkittävän immunovärjäytymisen havaitsemiseen käytettäessä myös basaalikeratinosyyttien SCCE:n monoklonaalisia 20 vasta-aineita.

Plakit seulottiin käyttämällä synteettistä 17-meeristä oligonukleotidikoetinta, joka . rakennettiin aminohapposekvenssin luotettavimman osan, natiivi-SCCE-entsyymin : kokeellisesti määritetyn aminoterminaalisen sekvenssin Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro • · • *' 25 (SEQ ID NO: 10, aa 1 - aa 6), perusteella, kuten esimerkissä 4 kuvataan. Kokeelli- • sesti määritettyyn aminohapposekvenssiin sisältyvän epävarmuuden vuoksi tämän :. j.: heksapeptidin pääteltiin edustavan yhtä luotettavimmista osista. Lisäksi tätä heksa- j :’| peptidiä koodaavien mahdollisten kodonien seurauksena oli DNA-koettimen vähin : ’:': mahdollinen degeneroituminen. Pitempi kokeellisesti määritetty sekvenssi Gln-Val- 30 Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID NO:3, aa 15 - aa 24) suljettiin pois tätä . .·. peptidisekvenssiä koodaavan sekvenssin erittäin voimakkaan degeneroitumisen . · · ·. vuoksi. Ensiseulonnassa identifioitiin neljätoista positiivista plakkia. Nämä positiivi- • · » set plakit seulottiin uudelleen käyttäen samaa koetinta ja edellä kuvattuja menetel- • · *·.'·:* miä. Uudelleenseulontamenettelyn jälkeen identifioitiin kaksi positiivista plakkia.

• · · 35 Nämä kaksi valikoitua plakkia puhdistettiin vielä kerran ja inserttien koko määritet- . ’ ·. tiin PCRillä käyttäen SYM 1600:a ja SYM 1601 :tä, jotka olivat komplementaarisia * · · . 2 ]: molemmille faagihaaroille, alukkeina ja eristettyjä faageja templaatteina. Tälle kloo- • * natulle fragmentille suoritettiin osittain sekvenssianalyysi.

8 119027

Saatu DNA-sekvenssi translatoitui aminohapposekvenssiksi, joka oli homologinen kokeellisesti määritellyn proteiinisekvenssin kanssa. Sekvenssistä puuttui kuitenkin translaation aloituskodoni. Täyspitkän cDNA:n eristämiseksi saatu DNA-fragmentti erotettiin agaroosigeelillä ja sitä käytettiin koettimena, jolla voitiin suorittaa hybridi-5 saatio ankarissa olosuhteissa. Täyspitkän cDNA:n saamiseksi cDNA-kirjasto seulottiin uudelleen kahdesti tällä koettimella käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä, paitsi että hybridisaatio tapahtui ankarissa olosuhteissa, 65 °C:ssa. Näiden kokeiden tuloksena identifioitiin ja eristettiin 45 yksittäistä positiivista plakkia, jotka aluksi seulottiin PCR-analyysillä käyttäen SYM 1600:a tai SYM 1601:tä yhdessä SYM 10 3208:n kanssa PCR-alukkeina plakin, joka sisälsi koko 5-osan avoimen lukukehyk sen, identifioimiseen.

Edelleenseulonan ja sekvenssianalyysin jälkeen saadut näistä faageista johdetut PCRillä monistetut fragmentit kloonattiin, kuten esimerkissä 6 yksityiskohtaisesti 15 kuvataan, ja tulokset osoittivat, että yksi faageista, 205.2.1, sisälsi täyspitkän inser-tin. cDNA-fragmentin täydellinen nukleotidisekvenssi määritettiin. Nukleotidisek-venssi (SEQ ID NO: 1) sisälsi avoimen lukukehyksen, joka oli riittävä koodaamaan SCEE:n prekursoriproteiinin, joka muodostui 253 aminohaposta, signaalipeptidija prepolypeptidi mukaanluettuina (SEQ ID NO:2), koko aminohapposekvenssiä.

20

Esimerkki 7 kuvaa kahden SCCE-mRNA-lajin, jotka kykenivät hybridisoitumaan SCCE-cDNA-sekvenssin perusteella valmistetun cDNA-koettimen kanssa, detek-. toimista ihmisen epidermiksessä.

• t • · • · · • · : ** 25 Esimerkki 8 kuvaa yhdistelmä-SCCE:n ekspressiota E. colissa. Tulokset osoittavat, • · · .. ** että yhdistelmä-SCCE:tä on mahdollista tuottaa bakteereissa.

• · · * * * • · · : :*: Esimerkki 9 kuvaa rekombinantti-humaani -SCCE:n ilmentämistä nisäkässoluissa.

»·» · :T: Tuotetaan kolme proteiinia, jotka osoittautuvat reagoivan kaikkien saatavissa ole- 30 vien polyklonaalisten kaniini- ja kananpoika-SCCE-vasta-aineiden sekä talletettujen . monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Yhdistelmäproteiineilla, jotka reagoivat natiivi-SCCE:tä vastaan nostatettujen vasta-aineiden kanssa, on näennäismoolimas- • φ · *. sa, joka on noin 1 kD suurempi kuin puhdistetun natiivi-humaani-SCCE:n mooli- • · :: massa. Yhdistelmäproteiinilla ei ole proteolyyttistä aktiivisuutta.

• · · : : 35 ·«· . *·. Yhdistelmä-SCCE:n puhdistamista, aktivointia ja edelleen karakterisointia kuvataan • · · esimerkissä 10. Yhdistelmä-SCCE:n inaktiivinenpro-muoto voidaan aktivoida pilk- • # komalla proteolyyttisesti trypsiinillä tai endopeptidaasi Lys-C:llä. Ajatellaan, että 9 119027 muutamat muut proteaasit, jotka pilkkovat peptidin emäksisen aminohapon jälkeen, kuten endoproteinaasi Lys-C, papaiini ja plasmiini, kykenisivät aktivoimaan pro-SCCE:n aktiiviseksi SCCE:ksi. On todettu, että signaalipeptidi muodostuu 22 aminohaposta ja perustuu natiivin aktiivisen SCCE:n N-terminaaliseen aminohapposek-5 venssiin, propeptidi muodostuu seitsemästä aminohaposta. Lisäksi on osoitettu, että tuotettu rekombinantti-SCCE esiintyy kahdessa N-glykosyloidussa muodossa ja yhdessä ei-glykosyloidussa muodossa, mikä on analogista aktiivisella natiivi-SCCE:llä saatujen tulosten kanssa.

10 Termillä "sarveiskerroksen kymotryptinen entsyymi (SCCE)" tai "polypeptidi, jolla on SCCE-aktiivisuus" tarkoitetaan, sen laajimmassa aspektissa, seriiniproteaasia tai sen pro-muotoa, kuten proentsyymiä (pro-SCCE) tai fuusioproteiinia, joka voidaan aktivoida proteolyyttisesti pilkkomalla, jonka entsyymin sen aktiivisessa muodossa inhiboivat samat inhibiittorit ja samalla tavalla kuin spontaanissa solujen dissosiaati-15 ossa tapahtuu, joka voidaan indusoida mallisysteemeissä ihon sarveiskerroksen näytteillä, joita on inkuboitu neutraalissa tai lähes neutraalissa pH:ssa fysiologisissa lämpötiloissa.

Tarkemmin sanottuna termi "polypeptidi, jolla on SCCE-aktiivisuus" määrittelee siis 20 polypeptidin, joka on erilainen kuin kymotrypsiini ja katepsiini G ja joka aktiivi sessa muodossaan pystyy hajoittamaan substraatin MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-: .·. 2586), ja jonka polypeptidin aikaansaamaa hajoamista inhiboi aprotiniini, * kymostatiini ja sinkkisulfaatti, perimmiltään kuten esimerkeissä 3 ja 13 esitetään ja

• M

kuviossa 13 ja taulukossa 5 kuvataan.

• ί Ä **: 25 • · « * Vielä tarkemmin sanottuna termi "polypeptidi, jolla on SCCE-aktiivisuus" käsittää ϊ·ί ' polypeptidin, joka kykenee aiheuttamaan desmosomiproteiinin desmogleiim I:n pro- : teolyyttisen hajoamisen inkuboitaessa plantaarista sarveiskerroksia in vitro.

30 Sellainen polypeptidi reagoi yleensä myös natiivi-SCCE:tä vastaan nostatettujen :*’*.· vasta-aineiden kanssa, jotka on puhdistettu dissosioituneiden plantaarisen sarveis- • ·· kerroksen solujen ekstraktista. Esimerkkejä sellaisista vasta-aineista ovat polyklo-naaliset vasta-aineet, jotka on tuotettu kuten kappaleessa 5.2 kuvataan, ja monoklo-*·«* naaliset vasta-aineet TE4b ja TE9b, jotka on tuotettu kuten esimerkissä 5.1 kuva- 35 taan. Monoklonaaliset vasta-aineet tuotetaan hybridoomilla TE4b ja TE4b, jotka on ·· :*·*: talletettu laitokseen European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down,

Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Yhdistynyt Kuningaskunta, talletusnumeroilla 119027 ίο ECACC 93061817 ja ECACC 93061816, vastaavassa järjestyksessä, Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

Humaani-SCCE:tä koodaavan cDNA:n kloonausta ja sekvensointia kuvataan esi-5 merkissä 6. On löydetty nukleotidisekvenssi, joka sisältää avoimen lukukehyksen, joka on riittävä koodaamaan SCCE-prekursoriproteiinin, joka muodostuu 253 aminohaposta mukaanlukien signaalipeptidin ja prepolypeptidin, koko aminohapposekvenssiä. Nukleotidisekvenssi on esitetty SEQ ID NO: l:ssä ja "sarveiskerroksen kymotryptisen entsyymin (SCCE:n)" dedusoitu aminohapposekvenssi on esitetty 10 SEQ ID NO:2:ssa.

Termillä "pro-SCCE tai jokin sen analogi tai variantti" tarkoitetaan polypeptidiä, jolla on aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai jokin mainitun sekvenssin analogi tai variantti, joka saadaan, kun keksinnön mukainen nukleotidisekvenssi ilmenne-15 tään jossakin sopivassa ekspressiosysteemissä ja joka proteolyyttisesti aktivoitaessa synnyttää seriiniproteinaasin, joka voidaan inhiboida samoilla inhibiittoreilla kuin spontaani solujen dissosiaatio, joka voidaan indusoida mallisysteemeissä ihon sar-veiskerroksen näytteillä, joita on inkuboitu neutraalissa tai lähes neutraalissa pHrssa fysiologisissa lämpötiloissa, so. noin 37 °C:ssa. Yleensä proteiini reagoi puhdistet-20 tua natiivi- tai rekombinantti-SCCE:tä vastaan nostatettujen vasta-aineiden kanssa.

Termillä "SCCE tai jokin sen analogi tai variantti" tarkoitetaan polypeptidiä, jolla , on aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2 tai jokin mainitun sekvenssin analogi tai · · ·· : variantti ja joka syntyy, kun keksinnön mukainen nukleotidisekvenssi ilmennetään I ** 25 jossakin sopivassa ekspressiosysteemissä, ja joka on seriiniproteaasi, joka voidaan ·♦· .. *’ inhiboida samoilla inhibiittoreilla kuin spontaani solujen dissosiaatio, joka voidaan ί, ·,: indusoida mallisysteemeissä ihon sarveiskerroksen näytteillä neutraalissa tai lähes j :*: neutraalissa pH:ssa fysiologisissa lämpötiloissa, esimerkiksi noin 37 °C:ssa. Yleensä i': ’: proteiini reagoi puhdistettua natiivia tai yhdistelmä-SCCE:tä vastaan nostatettujen 30 vasta-aineiden kanssa.

• · · • · ·

Termillä "jokin sen analogi tai variantti" tarkoitetaan siis polypeptidiä, jolla ei ole • · · _ *. tarkalleen SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi, mutta jolla silti on • · ·.*·: "SCCE-aktiivisuus", kuten edellä määriteltiin. Yleensä sellaisia polypeptidejä ovat O 35 polypeptidit, jotka vaihtelevat jossakin määrin aminohappokompositioltaan tai niissä . X on post-translaationaalisia muutoksia, esimerkiksi glykosylaatio tai fosforylaatio, • · · verrattuna esimerkeissä kuvattuun SCCE-proteiiniin.

• · 11 119027

Termiä "analogi" tai "variantti" käytetään siis tässä yhteydessä tarkoittamaan proteiinia tai polypeptidiä, jolla on samankaltainen aminohappokoostumus tai -sekvenssi kuin karakteristinen aminohapposekvenssi SEQ ID NO:2, joka on johdettu SCCE-proteiinista, kuten esimerkissä 6 kuvataan, sallien pienehköjä variaatioita, jotka 5 muuttavat aminohapposekvenssiä, esimerkiksi deleetioita, suunnattuja mutaatioita, ylimääräisten aminohappojen insertioita tai näiden yhdistelmiä, SCCE-proteiinin analogien synnyttämiseksi. Nämä muutokset voivat antaa mielenkiintoisia ja hyödyllisiä ominaisuuksia analogille. Analoginen polypeptidi tai proteiini voidaan johtaa eläimestä tai ihmisestä tai se voi olla osaksi tai kokonaan synteettistä alkuperää. 10 Analogi voidaan myös johtaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-menetelmiä.

Esillä olevan keksinnön eräs tärkeä toteutusmuoto koskee siis polypeptidiä, jossa ainakin yksi aminohappotähde on korvattu jollakin eri aminohappotähteellä ja/tai jossa ainakin yksi aminohappotähde on poistettu tai lisätty, jolloin syntyy polypeptidi, 15 jolla on aminohapposekvenssi, joka on erilainen kuin SEQ ID NO:2:ssa esitetty aminohapposekvenssi tai mainitun aminohapposekvenssi alasekvenssi, kuten tuonnempana määritellään, mutta jolla on olennaisesti edellä määritelty SCCE-aktiivisuus.

Esillä olevan keksinnön eräs mielenkiintoinen toteutusmuoto koskee polypeptidiä, 20 joka on keksinnön mukaisen polypeptidin analogi tai alasekvenssi, joka käsittää 50 -250 aminohappoa, esimerkiksi vähintään 70 aminohappoa, vähintään 100 aminohappoa, vähintään 150 aminohappoa tai vähintään 200 aminohappoa.

• * : Keksinnön erityisen tärkeitä toteutusmuotoja on polypeptidi, jolla on aminohappo- " 25 sekvenssi -7-224 SEQ ID NO:2:ssa (pro-SCCE), ja polypeptidi, jolla on aminohap- posekvenssi 1-224 SEQ ID NO:2:ssa (SCCE).

• * t • · · ···

Termi "entsymaattisesti aktiivinen alasekvenssi" tarkoittaa polypeptidisekvenssiä, : *:*: joka käsittää ainoastaan osan SEQ ID NO:2:ssä esitetystä polypeptidisekvenssistä ja 30 joka on entsymaattisesti aktiivinen. Tähän sisältyvät myös polypeptidialasekvenssit, , .·. jotka on tehty analogisiksi tässä selitetyillä muokkauksilla. Spesifistä polypeptidiä ,···, (tai polypeptidejä), jossa on entsymaattisesti aktiivinen kohta, pidetään erityisen • · · mielenkiintoisena.

• · « · * • · * • · 1...! 35 Ennakoitua aminohapposekvenssiä SEQ ID NO:2 on verrattu entsyymien ihmisen . kymotiypsiini (Toulta et ai., 1989), ihmisen katepsiini G (Salvesen et ai., 1987) ja ihmisen syöttösolukymaasi (Caughey et ai., 1991) aminohapposekvensseihin. Vaik- • · ka dedusoitu aminohapposekvenssi sisältää seriiniproteinaasien säilyneet aktiiviset 12 119027 alueet, homologia-aste on melko alhainen, noin 33 - 38 %. Tässä suhteessa näyttää siis, että SCCE on vain kohtalaisen samankaltainen aikaisemmin tunnettujen seriini-proteinaasien kanssa. Toisaalta SCCE on tyypillinen seriiniproteinaasi koskien aktiivisen kohdan histidiini-, aspartaatti-ja seriinitähteit ja näiden kohtien lähellä ole-5 via säilyneitä alueita. Tämä pätee myös suurimpaan osaan kysteiinitähteistä ja muihin seriiniproteaasin erittäin hyvin säilyneisiin alueisiin. Ensimmäisen spesifisyys-taskun (tähde 189 kymotrypsiinissä) pohjalla on seriinitähde ihmisen kymotrypsii-nissä, syöttösolukymaasissa ja prostaattispesifmen antigeeni ja alaniinitähde ihmisen katepsiini G:ssä. Toisaalta taas SCCE:ssä tässä asemassa on asparagiinitähde. Tämä 10 saattaisi selittää havainnon, että vaikka SCCE:llä epäilemättä onkin kymotryptistä aktiivisuutta, sen suhteellinen aktiivisuus erilaisia kromogeenisia peptidisubstraatte-ja kohtaan eroaa kymotrypsiinistä ja katepsiini G:stä, kuten myös kymostatiinin, erään kymotrypsiinin kaltaisten entsyymien pienimoolimassaisen inhibiittorin, inhi-bitioteho.

15

Ihmisen kymotrypsiinin, ihmisen katepsiini G:n ja ihmisen syöttösolukymaasin ja SCCE:n sekvenssien vertailu on esitetty seuraavassa sekvenssien kohdistuksessa.

* 1 2 3 * · ·1· · ·· r 1 • · · • · · 4 9 • · • • 4 1 t · · * 1 1 9 9 f 1 1

• · I

··» · • 1 · t 1 r f 1 · m 9 9 4 9 • · · ··♦ «·· • · · • Il 9 4 9 4 9 4 99 2 4 4 3 t : *·« 4 9 *49 •99 44· 9 9 4 13 119027

SCCE IIDGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHH. - .CGGVLVNERWVLTAAHCKMN

HUMCTRP IVNGEDAVPGSWPWQVSLQDKTGFHF...CGGS LIS EDWWTAAHCGVR

HUMCHTG IIGGRESRPHSRPYMAYLQIQSPAGQS.RCGGFLVREDFVLTAAHCWGS

HUMCHYM IIGGTECKPHSRPYMAYLEIVTSNGPSKFCGGFLIRRNFVLTAAHCAGR

5 20 50

SCCE EYTV..HLGSDTLGDRRA..QRIKASKSFR.HPGYSTQTHVNDLMLVKLN

HUMCTRP TSDVWAGEFDQGSDEENI. QVLKIAJCVFK. NPKFSILTVNNDITLLKLA

HUMCHTG NINV. . TLGAHNIQRRENT. QQHITARRAIRHPQYNQRTIQNDIMLLQLS

10 HUMCHYM SITV. . TLGAHNITEEEDTWQKLEVIKQF. RHPKYNTSTLHHDIMLLKLK

80

SCCE SQARLSSMVKKVRLPSRC..E..PPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMC

HUMCTRP TPARFSQTVSAVCLPSADDDF..PAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQ

15 HUMCHTG RRVRRNRNVNPVALPRAQ. . EGLRPGTLCTVAGWGRVSMRRGTDTLREVQ

HUMCHYM EKASLTLAVGT. . LPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEV

110 140

SCCE VDVKLISPQDCTEVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNA. CNGDSGGPLVCRGT

20 HUMCTRP AALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGA. . . GV£S. CMGDSGGPLVCOKD

HUMCHTG LRVQRDRQ. . CLRIFGSYDPRRQICVGDRRERK&AFK. GDSGGPLLCNNV

HUMCHYM KLRLMDPQA. CSHFRDFDHNL. QLCVGNPRKTK£AFK. GDSGGPLLCAGV

. 170 t 200 ♦ · « · ·«« ·

• V

ft · :-25 * • ♦t

·;*' SCCE LQ____GLVSWGTFPCGO. PNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHR

5 HUMCTRP GAWTLVGIVSWGSDTCST, SS . P£VYARVTKLIPWVQKILAAN

• t

: HUMCHTG AH____GIVSYGKSSGVP PgVFTRVSSFLPWIRTTMRSFKLLDQMETPL

V*! HUMCHYM AQ____GIVSYGRSDAKP P&VFTRISHYRPWINQILQAN

30 23*0 • It #··· * .»j*, Kohdistus suoritettu manuaalisesti.

• « · f * HUMCTRP = ihmisen kymotrypsiini (Touita et ai., BBRC 158:569-575, 1989) *.,.i 35 HUMCHTG = ihmisen katepsiini G (Salvesen et ai., Biochemistry 26:2289-2293, : 1987) HUMCHYM = ihmisen syöttösolukymaasi (Caughey et ai., J. Biol. Chem. 266: 12956-12963, 1991) 119027 14

Homologiat: HUMCTRP/SCCE; 85/224 = 38 % HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33 % HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33 % 5 HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48 %.

Numerointi koskee kymotiypsinogeenia.

Alleviivaukset: 10 Säilyneet alueet lähellä aktiivista kohtaa (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 kymo-trypsiinissä) ja kymotiypsiinin primaarinen spesifisyystasku (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 kymotrypsiinissä).

Asteriski: Mahdollinen N-glykosylaatiokohta SCCE:ssä.

15

Esillä olevan keksinnön eräs tärkeä toteutusmuoto koskee siis polypeptidiä, jolla on aminohapposekvenssi, josta 20 aminohappoa käsittävä yhtenäinen pätkä on homologinen vähintään 80-prosenttisesti samanpituisen aminohappopätkän kanssa, joka on valittu SEQ ID NO:2:ssa esitetystä aminohapposekvenssistä.

20

Keksinnön mukaiset polypeptidisekvenssit, jotka ovat vähintään 80-prosenttisesti, kuten vähintään 85-prosenttisesti, esimerkiksi 90-prosenttisesti homologisia SEQ ID NO:2;ssa esitetyn polypeptidin kanssa, ovat tärkeitä toteutusmuotoja. Koska SEQ

• a ··· * ID NO:2:ssa esitetty sekvenssi näyttää olevan melko ainutlaatuinen, keksinnön suo- ! *'* 25 ja-ala koskee polypeptidejä, joiden homologisuusaste samankaltaisen konsekutiivi- * a t sen 20 aminohapon pätkän, joka on valittu SEQ ID NO:2:ssa esitetystä aminohappo-:,:): sekvenssistä, kohdalla ei ehkä ole enempää kuin 55 %, vaikkakin suositeltavimmin j ei enempää kuin 70 %. Sellaisia sekvenssejä voidaan johtaa samankaltaisista proteiini'. neista, jotka ovat peräisin eri lajeista, esimerkiksi muista nisäkkäistä, kuten hiirestä, 30 rotasta, kaniinista, marsusta, siasta tai lehmästä. Koska pienemmät osat sekvenssistä . .·, saattavat olla huomattavan samankaltaisia muiden seriiniproteaasien kanssa, keksin- » · » nön suoja-ala sisältää myös peptidit, joiden homologisuusaste on vähintään 95 % ja *, suositeltavimmin vähintään 99 % samankaltaisen yhtenäisen 20 aminohapon pätkän, » · •V»! joka on valikoitu SEQ ID NO:2:ssa esitetystä aminohapposekvenssistä, kohdalla.

t#· _ _ t : 35 , )·, Termillä "sekvenssihomologia" tarkoitetaan samanlaisuutta aminohapposekvenssissä • · · **\ kahden tai useamman aminohapon pätkissä, jotka täsmäävät polypeptidien amino happojen identtisyyden ja aseman osalta.

15 119027

Termiä "homologinen" käytetään tässä kuvaamaan identtisyysastetta annetun poly-peptidin aminohapposekvenssin ja SEQ ID NO:2:ssa esitetyn aminohapposekvenssin välillä. SEQ ID NO:2:ssa esitettyyn aminohapposekvenssiin verrattava aminohapposekvenssi voi olla dedusoitu jostakin nukleotidisekvenssistä, kuten DNA- tai 5 RNA-sekvenssistä, joka on esimerkiksi saatu hybridisaation avulla, kuten tuonnempana määritellään, tai joka on voitu saada konventionaalisilla aminohapposekven-sointimenetelmillä. Homologisuusaste määritetään suositeltavimmin kypsän poly-peptidin aminohapposekvenssistä, toisin sanoen ottamatta huomioon mitään johto-sekvenssiä. Yleensä käytetään ainoastaan koodaavia alueita, kun nukleotidisekvens-10 sejä vertaillaan niiden sisäisen homologian määrittämiseksi.

Tässä yhteydessä termi "polypeptidi, jonka vähintään yksi talletetuista vasta-aineista tunnistaa" on tarkoitettu sisältämään aminohapposekvenssin, joka käsittää aminohappoja, jotka muodostavat olennaisesti peräkkäisen pätkän koskien SEQ ID 15 NO:2:ssa esitetyn polypeptidin minkä tahansa alasekvenssin lineaarista tai avaruudellista konformaatiota, jonka vähintään yksi talletetuista vasta-aineista tunnistaa. Kuten alalla hyvin tiedetään, myös sekundaarisilla ja tertiaarisilla konformaatioilla saattaa olla mielenkiintoisia ja hyödyllisiä ominaisuuksia ja ne voivat muodostaa epitooppeja. Talletetut vasta-aineet TE4b ja TE9b näyttävät tunnistavan SCCE:n 20 konformationaalisia epitooppeja.

On osoitettu, että eräs polyklonaalinen kaniini-vasta-aine, joka oli valmistettu esimerkissä 5.2.2 kuvatulla tavalla, tuotti stratum granulosumin granulaarisen värjäy-: tymisen ja alemman sarveiskerroksen aika diffuusin väqäytymisen immunofluore- 25 senssimikroskopiassa.

·»· • * • * . . Puhdistettua natiivi- tai yhdistelmä-SCCE.tä vastaan nostatetut vasta-aineet yleensä «·· ; .·. sitoutuvat suprabasaalisiin soluihin keratinisoituneessa (sarveistuneessa) ihmisen le- ] · | · | vyepiteelissä, mutta ei epiteelisoluihin sarveistumattomassa levyepiteelissä. Nämä » · · 30 vasta-aineet sitoutuvat myös ihmisen ihon sarveiskerroksen solujen väliseen tilaan.

♦ · ♦ '”·* Vasta-aineet, jotka reagoivat keksinnön mukaisten polypeptidien kanssa, sopivat *·: * muutamiin seuraavassa lueteltuihin tarkoituksiin: • · • t · • · * • · . · ··. 35 Proteiinien puhdistamiseen: vasta-aineita voidaan käyttää polypeptidi(e)n tai sen tai niiden analogien puhdistamiseen biologisista näytteistä käyttämällä affiniteettikro- • · * * · · · ] matografia- tai immunosaostusmenetelmiä.

• » n 9027 16

Diagnoosiin ja hoitoon: monoklonaalisia vasta-aineita polypeptidiä/polypeptidejä tai sen analogeja vastaan voidaan käyttää tautitilojen diagnosoimiseen ja hoitoon eläimillä ja ihmisillä. Diagnostinen aine voi olla jokin vasta-aine, joka on spesifinen keksinnön mukaisen polypeptidin suhteen. Vasta-aine voidaan kytkeä johonkin toi-5 seen proteiiniin tai johonkin kiinteään kantajaan ja/tai sitä voidaan käyttää aggluti- naatiokokeissa tai väijäytymiskokeissa. Sellaisia vasta-aineita voidaan myös käyttää SCCE-polypeptidien tai niiden analogien kvantitoimiseen biologisissa näytteissä käyttämällä histokemian ja immunokemian standardimenetelmiä.

10 Erään aspektinsa mukaan keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, joka koodittaa edellä määriteltyä keksinnön muraita polypeptidiä. Erityisesti keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, joka käsittää olennaisesti SEQ ID NO:l:ssä esitetyn sekvenssin. Eräät muut tärkeät toteutusmuodot koskevat nukleotidisekvenssiä, joka koodaa polypeptidiä, jolla on jokin aminohapposekvenssin SEQ ID NO:2 alasekvenssi, kuten 15 nukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, joka sisältää SEQ ID NO:2:n amino happosekvenssin -7-224, tai polypeptidiä, joka sisältää SEQ ID NO:2:n aminohapposekvenssin 1-224.

Esillä oleva keksintö koskee myös nukleotidisekvenssiä, joka hybridisoituu SEQ ID 20 NO: 1 :ssä esitetyn nukleotidisekvenssin kanssa erittäin ankarissa olosuhteissa, kuten esimerkissä 7 ja esimerkissä 9 kuvataan.

Erään toisen aspektinsa mukaan keksintö koskee nukleotidisekvenssiä, jolla on SEQ ..· · ID NO: 1 :ssä esitetty nukleotidisekvenssi tai jokin sen analogi tai alasekvenssi, joka 25 • **': 1) on homologinen SEQ ID NO: l:ssä esitetyn sekvenssin kanssa vähintään 90-pro- • · ; senttisesti, ja/tai * · · : .·. 2) koodaa polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi on vähintään 80-prosenttisesti *·.··* homologinen SEQ ID NO:2:ssa esitetyn aminohapposekvenssin kanssa, ja/tai • · · 30 3) koodaa polypeptidiä, jonka sitoo monoklonaalinen vasta-aine, joka on tuotettu . hybridomasolulinjalla TE4b, joka on talletettu 18. kesäkuuta 1993 ECACC:hen ja • · · * ·:· ‘ saanut väliaikaisen talletusnumeron ECACC 93061817, tai monoklonaalinen vasta- • · · * '·’ * aine, joka on tuotettu hybridomasolulinjalla TE9b, joka on talletettu 18. kesäkuuta 1993 ECACC:hen ja saanut väliaikaisen talletusnumeron 93061816, ja/tai • * 35 4) koodaa polypeptidiä, jonka sitoo polyklonaalinen antiseerumi, joka on nostatettu • · · •. natiivi-SCCE:tä vastaan, joka on puhdistettu dissosioituneen plantaarisen sarveisker- • · · *·*··* roksen soluekstraktista.

• · 17 119027

Esillä olevan keksinnön suoja-alaan sisältyy myös muunnettu nukleotidisekvenssi, joka eroaa edellä määritellystä nukleotidisekvenssistä siinä, että vähintään yksi nukleotidi on poistettu, korvattu toisella tai muunnettu tai vähintään yksi lisänukleotidi on insertoitu, jolloin tuloksena on nukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, 5 jolla on SCCE-aktiivisuus.

Esillä olevassa selityksessä ja patenttivaatimuksissa termi "alasekvenssi" tarkoittaa sekvenssiä, jonka koko on mielellään vähintään 15 nukleotidiä, mieluummin vähintään 18 nukleotidiä ja kaikkein mieluiten vähintään 21 nukleotidiä. Muutamissa 10 keksinnön suoritusmuodoissa keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin alasekvens si tai analogi käsittää vähintään 48 nukleotidiä, kuten vähintään 75 nukleotidiä tai vähintään 99 nukleotidiä. "Alasekvenssin" tulisi täyttää vähintään yksi edellä mainituista kriteereistä 1) - 4) tai sen tulisi hybridisoitua SEQ ID NO; l:ssä esitetyn nukleotidisekvenssin kanssa.

15

Tiedetään, että PCR-menetelmissä voidaan käyttää pieniä fragmentteja, kuten tässä kuvataan. Sellaisia fragmentteja ja alasekvenssejä voidaan muiden käyttöjen lisäksi käyttää koettimina keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin mRNA-fragmenttien identifioinnissa, kuten esimerkissä 7 kuvataan.

20

Termillä "analogi" koskien keksinnön mukaisia DNA-palasia on tarkoitus viitata nukleotidisekvenssiin, joka koodaa polypeptidiä, joka on samanlainen tai olennaisesti samanlainen kuin polypeptidi, jota keksinnön mukainen DNA-fragmentti koo-"!*: dittaa. Tiedetään, että samaa aminohappoa voivat koodata eri kodonit, kodonin käy- • * ·.. 25 tön liittyessä, inter alia, siihen, mitkä kysymyksessä olevista organismeista ensisijai- * * *. sesti ekspressoivat nukleotidi sekvenssin. Niinpä yksi tai useampi keksinnön mukai- . ! ·. sen DNA-fragmentin nukleotideistä tai kodoneista voidaan vaihtaa toisiin, jotka eks- • · · pressoituina tuottavat tulokseksi polypeptidin, joka on samanlainen tai olennaisesti v · · samanlainen kuin kysymyksessä olevan DNA-fragmentin koodittama polypeptidi.

• · · 30

Termiä "analogi" käytetään tässä yhteydessä myös tarkoittamaan DNA-fragmenttia :: tai DNA-sekvenssiä, jolla on samankaltainen nukleotidikoostumus tai sekvenssi kuin • · · v : karakteristinen DNA-sekvenssi SEQ ID NO: 1, joka koodaa aminohapposekvenssiä, ♦ . ·. : joka muodostaa SCCE-polypeptidit, sallien vähäiset variaatiot, joilla ei ole merkittä- ,···] 35 vää vastakraita vaikutusta analogin entsyymiaktiivisuuteen verrattuna esimerkissä 3 • ♦ * * * kuvattuun natiivi-SCCE-proteiinin aktiivisuuteen. Termillä "merkittävä vastakkainen :: vaikutus" tarkoitetaan, että analogin entsymaattisen aktiivisuuden tulisi olla vähin- tään 50 %, mieluummin vähintään 60 %, vielä mieluummin vähintään 70 %, kuten 1 1 9027 18 * 7 vähintään 75 % natiivi-SCCE:n entsymaattisesta aktiivisuudesta, kun se määritetään esimerkiksi esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Analoginen DNA-fragmentti tai DNA-sekvenssi voidaan johtaa jostakin organismista, kuten jostakin eläimestä tai ihmisestä, tai se voi olla osittain ja kokonaan synteettistä alkuperää. Analogi voidaan 5 myös johtaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-menetelmiä.

Lisäksi termit "analogi" ja "alasekvenssi" ovat tarkoitetut sallimaan sellaisia variaatioita sekvenssissä kuten yhden tai useamman nukleotidin substituution, insertion (intronit mukaanlukien), lisäyksen ja uudelleenjärjestelyn, joilla variaatioilla ei ole 10 olennaista vastakraita vaikutusta DNA-fragmentin tai jonkin sen alasekvenssin koodittamaan polypeptidiin.

Termillä "substituutio" tarkoitetaan yhden tai useamman nukleotidin korvaamista täydessä nukleotidisekvenssissä yhdellä tai useammalla erilaisella nukleotidillä, 15 "lisäyksellä" tarkoitetaan yhden tai useamman nukleotidin lisäämistä täyden nukleo-tidisekvenssin kumpaan tahansa päähän, "insertiolla" tarkoitetaan yhden tai useamman nukleotidin viemistä täyden nukleotidisekvenssin sisään, "deleetiolla" tahdotaan sanoa, että yksi tai useampi nukleotidi on poistettu täydestä nukleotidisekvens-sistä, joko sekvenssin kummasta tahansa päästä tai jostakin sopivasta kohdasta sen 20 sisältä, ja "uudelleenjärjestelyllä" tarkoitetaan, että kaksi tai useampia nukleotiditäh-teitä on vaihdettu DNA- tai polypeptidisekvenssin sisällä, vastaavasti. DNA-frag-menttia voidaan kuitenkin muuttaa myös mutageneesin avulla joko ennen sen inser-toimista organismiin tai sen jälkeen.

• « • · * 1 · · : 1 ·.. 25 Termit "fragmentti", "sekvenssi", "alasekvenssi" ja "analogi", kun niitä käytetään • ···. tässä selityksessä ja patenttivaatimuksissa viittaamassa keksinnön mukaisiin frag- . ", mentteihin, sekvensseihin, alasekvensseihin ja analogeihin, tulee tietysti ymmärtää • · t niin, että ne eivät kata näitä ilmiöitä niiden luonnollisessa ympäristössä, vaan pi-*”.1 kemminkin esimerkiksi eristettyinä, puhdistettuina, in vitro tai yhdistelmä-muodos- : 30 sa.

:: Keksinnön eräässä toteutusmuodossa SCCE-polypeptidi-mRNA:n detektoiminen v · ja/tai kvantifioiminen voidaan suorittaa erottamalla RNA soluista tai kudoksista ja .·1. : muuttamalla se cDNA:ksi myöhempää käyttöä varten polymeraasiketjureaktiossa , · · · [ 35 (PCR). PCR-aluke/PCR-alukkeet voidaan syntetisoida jonkin keksinnön mukaisen 4 · · 1 DNA-fragmentin, kuten SEQ ID NO: 1 :ssä esitetyn DNA-fragmentin perusteella.

* :: Tätä detektoimiseen ja/tai kvantitoimiseen tarkoitettua menetelmää voidaan käyttää • · 19 119027 diagnostisena menetelmänä diagnosoitaessa tautitilaa, jossa SCCE-mRNA ilmentyy normaalia suurempina tai pienempinä määrinä.

Esillä olevan keksinnön suoja-alaan kuuluu myös diagnostinen aine, joka käsittää 5 nukleotidikoettimen, joka pystyy detektoimaan keksinnön mukaisen nukleotidisek-venssin, sekä tautien, joissa SCCE-ekspressio on epäsäännönmuraita, ja/tai tautien, joissa SCCE-geeni on mutatoitunut, diagnosointimenetelmä, jossa potilaasta, jolla epäillään olevan sairaus, jossa esiintyy normaalia liian suuri määrä SCCE:tä tai jokin SCCE:n mutatoitunut muoto, otetulle näytteelle suoritetaan PCR-analyysi, 10 jossa näyte saatetaan kosketukseen edellä kuvatun diagnostisen aineen kanssa, jolloin mikä tahansa nukleotidisekvenssi pääsee monistumaan ja minkä tahansa identtisten tai homologisten nukleotidisekvenssien läsnäolo voidaan määrittää.

Keksinnön mukaiset polypeptidit voidaan tuottaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-tek-15 nilkkaa. Eräs esillä olevan keksinnön tärkeä toteutusmuoto koskee ekspressiosys-teemiä, joka käsittää keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin.

Organismi, jota käytetään keksinnön mukaisen polypeptidin tuottamiseen, voi olla jokin korkeampi organismi, esimerkiksi jokin eläin, tai alempi organismi, esimer-20 kiksi jokin mikro-organismi, kuten E. coli. Käytetyn organismin tyypistä riippumatta keksinnön mukainen DNA-fragmentti viedään organismiin joko suoraan tai jonkin vektorin avulla. Vaihtoehtoisesti polypeptidit voidaan tuottaa jossakin nisäkässolu-linjassa viemällä keksinnön mukainen DNA-fragmentti tai jokin sen analogi tai ala-sekvenssi siihen joko suoraan tai jonkin ekspressiovektorin avulla.

• · · · 25 • · · • · ·. DNA-fragmentti tai jokin sen analogi tai alasekvenssi voidaan myös kloonata jos- sakin sopivassa stabiilissa ekspressiovektorissa ja sitten sijoittaa se johonkin sopi- • t · .*" vaan solulinjaan. Solut, jotka tuottavat haluttuja polypeptidejä, valikoidaan sitten • tuottavuustason perusteella vektorin ja käytetyn solulinjan suhteen sopivissa olosuh- j · · ‘ 30 teissä. Valikoituja soluja kasvatetaan edelleen ja ne muodostavat haluttujen poly- peptidien erittäin tärkeän ja jatkuvan lähteen.

« · • · • · · ϊ* *! · Eräs esimerkki keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin eräästä spesifisestä analogista . % : on DNA-sekvenssi, joka käsittää SEQ ID NO: 1 :ssä esitetyn DNA-sekvenssin tai • * · 35 osan siitä ja joka soveltuu erityisesti ilmentämiseen E. colissa. Tämä DNA- • · sekvenssi on sellainen, joka E. coliin yhdessä sopivien säätelysekvenssien kanssa insertoituna ekspressoi polypeptidiä, jolla on olennaisesti SEQ ID NO:2:ssa esitetty * :**: aminohapposekvenssi tai osa siitä. Tämä DNA-sekvenssi käsittää siis spesifisiä ko- 20 119027 doneja, jotka E. coli tunnistaa. Erästä esimerkkiä tästä toteutusmuodosta kuvataan esimerkissä 8.

Tässä yhteydessä termiä "geeni" käytetään tarkoittamaan DNA-sekvenssiä, joka on 5 mukana tuotettaessa polypeptidiketjua ja joka sisältää koodaavaa aluetta (5'-ylävirran ja 3'-alavirran sekvenssit) edeltäviä ja seuraavia alueita sekä välisekvenssejä, int-roneja, jotka sijaitsevat yksittäisten koodaavien segmenttien, eksoneiden, välissä tai 5'-ylävirran ja 3'-alavirran alueilla. 5'-ylävirran alue käsittää säätelysekvenssin, joka ohjaa geenin ekspressiota, tyypillisesti jonkin promoottorin. 3'-alavirrassa on 10 sekvenssejä, jotka ovat mukana geenin transskription lopettamisessa ja mahdollisesti sekvenssejä, jotka aikaansaavat transskriptin ja 3'-transloitumattoman alueen polya-denylaation.

Edellä olevan mukaisesti keksintö koskee ekspressiosysteemiä, joka käsittää edellä 15 kuvatun nukleotidisekvenssin, joka koodaa keksinnön muraita polypeptidiä, systeemin käsittäen 5'-pään sekvenssin, joka kykenee välittämään mainitun nukleotidi-sekvenssin ilmentymisen.

Erityisesti keksintö koskee replikoituvaa ekspressiovektoria, joka kantaa ja pystyy 20 välittämään keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin ilmentymisen. Eräs esillä olevan keksinnön erityistoteutusmuoto koskee replikoituvaa ekspressiovektoria, joka on nimetty pS507:ksi ja joka on talletettu 11. toukokuuta 1993 laitoksen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturcn GmbH (DSM) kokoelmiin talle-.,· · tusnumerolla DSM 8282 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti, ja ekspressio- : * *.. 25 vektoreita, jotka ekspressoivat nukleotidisekvenssejä, jotka eroavat mainitun tallete- * * *: tun ekspressiovektorin nukleotidisekvenssistä, mutta jotka koodaavat samaa poly- t· ; peptidiä tai sen analogia tai varianttia, jolla on SCCE-aktiivisuus.

fM

• ·

Li : **j·* Toisin sanoen keksinnön suoja-alaan kuuluu myös edellä kuvatun kaltainen replikoi- • · * 30 tuva ekspressiovektori, jossa ekspressoitunut nukleotidisekvenssi on sellainen, joka , eroaa talletetun vektorin nukleotidisekvenssistä siinä, että vähintään yksi nukleotidi • · ψ *“;* on poistettu, korvattu tai muutettu tai vähintään yksi lisänukleotidi on insertoitu, L: : jolloin saadaan nukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on SCCE-aktii- :*·.· visuus.

35 • * *, Lisäksi keksintö koskee plasmidia, joka on nimetty pS500:ksi ja joka on talletettu • · * *·'··[ 11. toukokuuta 1993 laitoksen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ':"' * Zellkulturen GmbH (DSM) kokoelmiin talletusnumerolla DSM 8281 Budapestin 2i 1 19027 sopimuksen ehtojen mukaisesti, ja plasmideja, joilla on nukleotidisekvenssi, joka eroaa SEQ ID NO:l:ssä esitetystä nukleotidisekvenssistä, mutta joka koodaa SEQ ID NO:2:ssa esitettyä polypeptidiä tai jotakin sen analogia tai varianttia, jolla on SCCE-aktiivisuus, tai joka hybridisoituu SEQ ID NO:l:ssä esitetyn nukleotidi-5 sekvenssin tai osan siitä kanssa ankarissa hybridisaatio-olosuhteissa.

Esillä olevan keksinnön suoja-alaan sisältyy myös ei-humaani organismi, joka kantaa keksinnön muraita ekspressiosysteemiä. Organismit, joita voidaan käyttää keksinnön tässä aspektissa, käsittävät jonkin mikro-organismin, kuten jonkin Bacillus-, 10 Escherichia- tai Salmonella-sukuun kuuluvan bakteerin, jonkin hiivan, kuten

Saccha-romyces- tai Pichia-hiivan, jonkin alkueläimen tai solun, joka on johdettu jostakin monisoluisesta organismista, kuten jostakin sienestä, hyönteissolun, kasvi-solun, nisäkässolun tai solulinjan. Jos organismi on jokin bakteeri, on suositeltavaa, että tämä bakteeri on Escherichia-sukua, esimerkiksi E. coli.

15

Keksintö koskee lisäksi plasmidivektoria, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koo-dittaa keksinnön muraita polypeptidiä tai tässä kuvattua fuusiopolypeptidiä. Eräässä erityisen tärkeässä toteutusmuodossa keksinnön mukainen DNA-fragmentti tai jokin sen analogi tai alasekvenssi tai tässä määritelty fuusio-DNA-fragmentti voi olla rep-20 likoituvassa ekspressiovektorissa, joka kykenee replikoituinaan jossakin isäntäorga-nismissa tai solulinjassa.

Vektori voi erityisesti olla plasmidi, faagi, kosmidi, minikromosomi tai virus.

: Keksinnön eräässä mielenkiintoisessa toteutusmuodossa vektori voi olla vektori, jo- 25 ka johonkin isäntäsoluun vietynä integroituu isäntäsolun genomiin.

• · · • · j j · j Jos käytetään jotakin korkeampaa organismia, voidaan polypeptidien tuottamiseen käyttää geeninsiirtotekniikkaa. Esimerkkejä sopivista eläimistä ovat lampaat, nauta-karja, siat, jne. Keksinnön muraita polypeptidiä koodaava DNA-fragmentti ekspres- * 30 soituu halutussa solukossa solukkospesifisten säätelyosien ohjaamana. Saatuun pro teiiniin voidaan sitten tehdä translaationjälkeisiä muutoksia keksinnön mukaisen polypeptidin aikaansaamiseksi.

• · · • · ♦ * * \ s Keksinnön mukaiset siirtogeeniset ei-humaaninisäkkäät tuotetaan viemällä "siirto- • » .··♦, 35 geeni" valitun eläimen embryogeeniseen kohdesoluun. Keksinnön eräässä aspektissa * · * siirtogeeni on DNA-sekvenssi, joka kykenee tuottamaan halutun fenotyypin, kun se * : on sisällytetty transgeenisen ei-humaaninisäkkään solujen genomiin.

* » 22 1 1 9027

Erityistoteutusmuodoissa siirtogeeni käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa keksinnön muraita polypeptidiä, siirtogeenin pystyessä ekspressoitumaan polypeptidin tuottamiseksi.

5 Ekspressiosysteemin sisällyttäminen nisäkkään itulinjaan voidaan suorittaa käyttämällä mitä tahansa sopivaa menetelmää, esimerkiksi sellaista, jota Hogan et ai. ovat kuvanneet 1986 tai jota on kuvattu julkaisussa WO 93/04172.

Keksinnön eräässä erityisaspektissa keksinnön mukainen nukleotidisekvenssi voi 10 käsittää jonkin toisen nukleotidisekvenssin, joka koodittaa jotakin polypeptidiä, joka on erilainen tai samanlainen kuin keksinnön mukainen polypeptidi, fuusioituneena kehyksessä SEQ ID NO. l.ssä esitetyn sekvenssin nukleotidisekvenssiin tai johonkin sen analogiin, joka koodaa SCCE-polypeptidiä, tarkoituksena tuottaa fuusioitunut polypeptidi, tämän polypeptidin muodostaessa vielä erään keksinnön mielenkiintoi-15 sen aspektin, katso esimerkiksi esimerkki 8. Kun käytetään yhdistelmä-DNA-tek-niikkaa, fuusioituneet DNA-sekvenssit voidaan insertoida johonkin sopivaan vektoriin tai genomiin. Vaihtoehtoisesti yksi nukleotidisekvensseistä insertoidaan vektoriin tai genomiin, joka jo sisältää toisen nukleotidisekvenssin. Jokin fuusiopolypep-tidi voidaan myös valmistaa insertoimalla mainitut kaksi polypeptidisekvenssiä erik-20 seen ja antamalla ilmentymisen tapahtua. Isäntäorganismi, joka voi olla eukaryoot- tista tai prokaryoottista alkuperää, kasvatetaan olosuhteissa, jotka takaavat fuusioituneiden sekvenssien ilmentymisen. Fuusioitunut polypeptidi puhdistetaan sitten ja keksinnön mukainen polypeptidi erotetaan sen fuusiopartnerista käyttäen jotakin so-,,· : pivaamenetelmää.

M A- : ·.. 25 ***: Eräs keksinnön aspekti koskee siis keksinnön mukaisen polypeptidin tuottamisme- • + ; netelmää, joka käsittää seuraavat vaiheet: • M « * i.i: *·“· * (a) keksinnön mukainen nukleotidisekvenssi insertoidaan johonkin ekspressiovek- 30 toriin, , (b) jokin sopiva isäntäorganismi transformoidaan vaiheessa (a) valmistetulla vek- r*:·’ torilla, 'V : (c) vaiheessa(b)tuotettuaisäntäorganismiaviljelläänsopivissaolosuhteissapoly- :' ·. · peptidin ilmentämiseksi, 35 (d) polypeptidi korjataan, ja • \ (e) polypeptidiin tehdään valinnaisesti translaationjälkeisiä muutoksia.

• · * W * 4 4* ψ • • f 119G?7 23

Esillä olevan keksinnön alaan kuuluu myös edellä kuvattu menetelmä, jossa tuotettu polypeptidi eristetään menetelmällä, joka käsittää yhden tai useampia vaiheita kuten affiniteettikromatografiaa käyttäen immobilisoitua natiivi- tai yhdistelmä-SCCE-po-lypeptidiä tai vasta-aineita, jotka reagoivat mainitun polypeptidin kanssa, ja/tai 5 muita kromatografia-tai elektroforeesimenetelmiä.

Edellä kuvatulla tavalla valmistettua polypeptidi voidaan muokata translaation jälkeen lämpökäsittelyn, kemiallisen käsittelyn (formaldehydi, glutaraldehydi, jne.) tai entsyymikäsittelyn (peptidaasit, proteinaasit ja proteiinin modifiointientsyymit) 10 avulla. Polypeptidiä voidaan käsitellä eri tavalla, kun se tuotetaan jossakin organismissa kuin silloin, kun se on luonnollisessa tuotantoympäristössään. Esimerkkinä mainittakoon, että glykosylaatioon päästään usein kun polypeptidi ekspressoidaan jonkin korkeamman organismin, kuten hiivan tai mieluummin nisäkkään, solussa. Glykosylaatio havaitaan tavallisesti aminohappotähteiden Asn, Ser, Thr tai hyd-15 roksilysiini yhteydessä. Saattaa olla tai ei olla eduksi poistaa tai muuttaa kysymyksessä olevan isäntäorganismin aiheuttamia prosessointiominaisuuksia.

Sen jälkeen kun polypeptidi on ekspressoitu keksinnön mukaisesti jossakin organismissa tai solulinjassa, polypeptidiä voidaan joko käyttää sellaisenaan tai se voi-20 daan ensiksi puhdistaa organismista tai solulinjasta. Jos polypeptidi ekspressoituu eritystuotteena, se voidaan puhdistaa suoraan. Jos polypeptidi ekspressoituu assosioituneena tuotteena, se saattaa tarvita osittaisen tai täydellisen lohkaisun isännästä ennen puhdistamisesta. Esimerkkejä polypeptidien puhdistamiseen käytetyistä me-,,· j netelmistä ovat: (i) immunosaostus tai affiniteettikromatografia vasta-aineita käyt- Γ’.. 25 täen, (ii) affiniteettikromatografia sopivaa ligandia käyttäen, (iii) muut kromatogra- fiamenetelmät, kuten geelisuodatus-, ioninvaihto- tai suuren erotuskyvynnestekro- « ψ . matografia tai minkä tahansa edellä mainitun johdannaiset, (iv) elektroforeesimene- j .·, telmät kuten polyakryyliamidigeelielektroforeesi, denaturoiva polyakryyliamidigee- *«/ lielektroforeesi, agaroosigeelielektroforeesi ja isoelektrinen fokusointi, (v) mikä ta- t · t * 30 hansa muu spesifinen solubilisointi- ja/tai puhdistusmenetelmä.

• · · *«·* Esillä oleva keksintö koskee myös olennaisesti puhdasta SCCE-polypeptidiä. Esillä 1.: : olevassa yhteydessä termin "olennaisesti puhdas" ymmärretään tarkoittavan, että ky- v symyksessä oleva polypeptidi on olennaisesti vapaa muista komponenteista, esimer- • » ,*·% 35 kiksi muista polypeptideistä tai hiilihydraateista, jotka saattavat olla tuloksena poly- ’** peptidin tuotannosta ja/tai talteenotosta tai jotka muulla tavoin todetaan yhdessä po- * *t* ’ lypeptidin kanssa. Proteiinin puhtaus voidaan määrittää SDS-geelielektroforeesilla, ***** joka suoritetaan esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

24 1 1 9 0 2 7

Polypeptidi voidaan puhdistaa kuten esimerkissä 4 kuvataan SBTI-affmiteetti-kroma-tografialla tai affiniteettikromatografialla jollakin immobilisoidulla vasta-aineella, kuten vasta-aineella TE4b, alaan perehtyneiden tuntemilla menetelmillä. Keksinnön mukaisen polypeptidin erittäin korkea puhtausaste saattaa olla eduksi, 5 kun polypeptidiä on määrä käyttää jossakin farmaseuttisessa tai kosmeettisessa koostumuksessa. Samoin tämän korkean puhtausasteen ansiosta olennaisesti puhdasta polypeptidiä voidaan käyttää useimpiin tarkoituksiin pienempänä määränä kuin konventionaalista vähemmän puhdasta polypeptidiä.

10 Keksinnön eräässä aspektissa puhdas polypeptidi voidaan saada jostakin sopivasta solulinjasta, joka ilmentää keksinnön muraita polypeptidiä, kuten esimerkissä 9 kuvataan. Keksinnön mukainen polypeptidi voidaan myös valmistaa hyvin tunnetuilla neste- tai kiinteäfaasipeptidisynteeseillä käyttämällä polypeptidisekvenssin yksittäisten aminohappojen peräkkäistä kytkentää. Vaihtoehtoisesti polypeptidi voidaan syn-15 tetisoida kytkemällä toisiinsa yksittäisiä aminohappoja, jotka muodostavat polypeptidisekvenssin fragmentteja, jotka myöhemmin kytketään niin, että saadaan haluttu polypeptidi. Nämä menetelmät muodostavat siis keksinnön vielä erään mielenkiintoisen aspektin.

20 Keksinnön eräs erittäin tärkeä aspekti on farmaseuttinen koostumus, kosmeettinen koostumus tai ihonhoitokoostumus, joka käsittää polypeptidin, jolla on SCCE-aktii-vi-suus, ja jonkin farmaseuttisesti ja/tai kosmeettisesti hyväksyttävän täyteaineen. Koostumus voi sisältää puhdistetun natiivin proteiinin tai keksinnön mukaisen yh-distelmä-polypeptidin tai keksinnön mukaisen polypeptidin proentsyymi- tai fuusio-: 25 proteiinimuodon, joka voidaan aktivoida proteolyyttisesti pilkkomalla. Keksinnön • * • *·· mukaisten polypeptidien proentsyymimuodot voidaan katsoa "prodrugiksi", toisin sanoen yhdisteeksi, joka asianmukaisesti proteolyyttisesti pilkottaessa muuttuu ak- : tiiviseksi muodoksi.

·«· • * • · · • * · • · · * 30 Erityisesti, mutta ei eksklusiivisesti esillä oleva keksintö koskee koostumuksia, jotka soveltuvat paikalliseen käyttöön, esimerkiksi iholle levitettäviksi.

• · · *: |;'’ Keksinnön mukaisia farmaseuttisia koostumuksia voivat olla emulsiovoiteet, voiteet, • « · *·* ’ lotionit, linimentit, geelit, liuokset, suspensiot, pastat, puikot, sprayt, shampoot, :\i 35 saippuat, hiustenhoitoaineet tai puuterit.

• *· • · • · • · · *. Paikallinen anto voi olla levittämistä kehon niille osille tai niiden osien lähelle, jois- • · · sa kysymyksessä olevia patologisia muutoksia esiintyy, esimerkiksi kehon ulkopuo- • · 25 119027 liseen osaan, kuten hion pintaan. Käyttö voi olla yksinkertaisesti koostumuksen voitelua iholle tai siihen voidaan käyttää mitä tahansa apukeinoa, joka edistää koostumuksen ja patologisten vaurioiden välistä kosketusta, kuten peittositeiden käyttöä, esimerkiksi peittolaastareiden, joissa on keksinnön muraita koostumusta.

5 Koostumuksia voidaan impregnoida tai levittää vanutukkoihin, laastareihin, side-liuskoihin, sidetaitoksiin, sienimateriaaleihin, puuvillasiteisiin, jne. Valinnaisesti koostumuksesta voidaan käyttää injektiomuotoa annettavaksi leesioon tai sen lähelle.

10 Esillä olevan keksinnön mukaiset paikallisesti käytettävät koostumukset voivat sisältää 1-80 paino-% aktiivista yhdistettä laskettuna valmisteiden kokonaispainosta, kuten 0,001 - 25 paino-% aktiivista yhdistettä, esimerkiksi 0,1 -10 %, 0,5 - 5 % tai 2 - 5 %. Koostumukseen voidaan sisällyttää useampaa kuin yhtä aktiivista yhdistettä; toisin sanoen koostumukset, jotka käsittävät SCCE:tä, pro-SCCE;tä ja jotakin 15 SCCE-inhibiittoria yhdessä muiden farmaseuttisten ja/tai kosmeettisten yhdisteiden kanssa, sisältyvät myös keksinnön alaan. Koostumusta levitetään sopivasti 1-10 kertaa päivässä, leesioiden tyypistä, vaikeudesta ja sijainnista riippuen.

Paikallista käyttöä varten valmiste voidaan formuloida konventionaalisen farmaseut-20 tisen käytännön mukaisesti käyttäen farmaseuttisia täyteaineita, joita konventionaa-lisesti käytetään paikallisiin sovelluksiin. Kantajan, jota käytetään millaisen tahansa erityiskoostumuksen valmistamiseen, laatu riippuu menetelmästä, jolla kysymyksessä olevaa koostumusta on tarkoitus käyttää. Muita kantajia kuin vettä, joita koostumuksissa voidaan käyttää, voivat olla kiinteät tai nestemäiset aineet, kuten peh-: 25 mennysaineet, liuotteet, kostutusaineet, sakeutusaineet ja jauheet. Esimerkkejä kus- • · : ’ · takin näistä kantajatyypeistä, joita voidaan käyttää yksinään tai yhden tai useamman ··· kantajan seoksina, ovat seuraavat: • · · • * · ··· • :*: pehmentimet, kuten stearyylialkoholi, glyseryylimonorisinoleaatti, glyseryylimonos- f·· · 30 tearaatti, propaani- 1,2-dioli, butaani-l,2-dioli, setyylialkoholi, isorpropyyli-isostea-raatti, steariinihappo, isobutyylipalmitaatti, isosetyylistearaatti, oleyylialkoholi, .·. isopropyylilauraatti, heksyylilauraatti, dekyylioleaatti, oktadenan-2-oli, isosetyylial- • · · koholi, setyylipalmitaatti, dimetyylipolysiloksaani, di-n-butyylisebasaatti, isopro- *’· * pyylimyristaatti, isopropyylipalmitaatti, isopropyylistearaatti, butyylistearaatti, po- * · *·.**: 35 lyeteeniglykoli, trieteeniglykoh, butyylistearaatti, polyeteeniglykoli, trieteeniglykoli, :‘"i lanoliini, risiiniöljy, asetyloidut lanoliinialkoholit, vaseliini, mineraaliöljy, butyyli- # myristaatti, isosteariinihappo, palmitiinihappo, isopropyylilinoleaatti, lauryylilak- • · · taatti, myristyylilaktaatti, dekyylioleaatti, myristyylimyristaatti; • · 26 119027 liuotteet, kuten vesi, metyleenikloridi, isopropanoli, risiiniöljy, eteeniglykolin mo-noetyylieetteri, dieteeniglykolin monobutyylieetteri, dieteeniglykolin monoetyylieet-teri, dimetyylisulfoksidi, tetrahydrofuraani, kasvi- ja eläinöljyt, glyseroli, etanoli, propanoli, propeeniglykoli ja muut glykolit tai alkoholit, rasvaöljyt; 5 humektantit eli kostutusaineet, kuten glyseriini, sorbitoli, natrium-2-pyrrolidoni-5-karboksylaatti, liukoinen kollageeni, dibutyyliftalaatti, gelatiini; jauheet, kuten liitu, talkki, kaoliini, tärkkelys ja sen johdokset, kumit, kolloidinen 10 piidioksidi, natriumpolyakrylaatti, kemiallisesti muunnettu magnesiumaluminiumsi-likaatti, hydratoitu aluminiumsilikaatti, karboksivinyylipolymeeri, natriumkarboksi-metyyliselluloosa, eteeniglykolimonostearaatti; geeliyttämis- tai paisutusaineet, kuten pektiini, gelatiini ja niiden johdokset, sellu-15 loosajohdokset, kuten metyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa tai hapetettu selluloosa, selluloosakumi, guarkumi, akaasiakumi, karaijakumi, traganttikumi, bentoniitti, agar, alginaatit, karbomeeri, gelatiini, kuivattu rakkolevä, sarveisaine, dekstraani ja sen johdokset, intiankumi, hektoriitti, ispaghulan kuori, ksantaanikumi; 20 polymeerit, kuten polymaitohappo- tai polyglykolihappopolymeerit tai kopolymee-rit; parafiini, polyeteeni, polyeteenioksidi, polyeteeniglykoli, polypropeeniglykoli, polyvinyylipyrrolidoni; . pinta-aktiiviset aineet, kuten ionittomat pinta-aktiiviset aineet, esimerkiksi glykoli- » · : 25 ja glyseroliesterit, makrogolieetterit ja -esterit, sokerieetterit ja -esterit, kuten sorbi- : *** taaniesterit, ioniset pinta-aktiiviset aineet, kuten amiinisaippuat, metallisaippuat,

M

..: sulfatoidut rasva-alkoholit, alkyylieetterisulfaatit, sulfatoidut öljyt ja amfolyyttiset : pinta-aktiiviset aineet ja lesitiinit; • · * 1 · · « • · 1 · 30 puskurointiaineet, kuten natrium-, kalium-, aluminium-, magnesium tai kalsiumsuo-lat (kuten kloridi, karbonaatti, bikarbonaatti, sitraatti, glukonaatti, laktaatti, asetaatti, . gluseptaatti tai tartraatti).

· e • · · · · * 1 · • · ·

Paikallista käyttöä varten koostumuksen pH voi periaatteessa olla hyvin laajalta alu- • 1 *·.1·: 35 eelta, kuten 3-9. Keksinnön eräässä suositeltavassa toteutusmuodossa suositellaan pH:ta, jossa polypeptidille saadaan sopiva proteolyyttinen aktiivisuus, esimerkiksi , 1 . noin pH 4 - 8. Halutun pH:n aikaansaamiseksi voidaan käyttää edellä mainittuja

# I

m\\ konventionaalisia puskureita.

• 1 27 119027

Keksinnön mukaisessa valmisteessa voi myös olla muita lisäaineita, kuten stabilaat-toreita, säilytysaineita, liukoisuutta lisääviä aineita, väriaineita, kelatointiaineita, geelinmuodostusaineita, voidepohjia, pH:n säätelyaineita, antioksidantteja, hajusteita ja ihonsuoja-aineita, jne. Jos koostumus on shampoon tai saippuan muodossa, 5 se voi lisäksi sisältää vaahdotusaineita, helmiäisaineita ja/tai hoitoaineita.

Tyypillisiä säilytysaineita ovat parabeenit, formaldehydi, Kaihon CG, Bronidox, Bronopol, p-kloori-m-kresoli, klooriheksidiini, bentsalkoniumkloridi, jne.

10 Konventionaalisia aineosia voidaan käyttää silloin, kun keksinnön mukaiset koostumukset ovat shampoon tai saippuan muodossa, ja tyypilliset saippua- ja shampoo-pohjat sisältävät sellaisia komponentteja kuin betaiinia, natriumlauryylisulfaattia, nonyylifenolia, imidatsolia, sulfosukkinaattia, rasvanpalautusaineita, kostutusaineita ja hoitoaineita.

15

Lisäksi saattaa olla edullista valmistaa muunnetusti vapautuvia valmisteita, joissa aktiivinen yhdiste on sisällytetty polymeerimatriksiin tai nanopartikkeleihin tai lipo-someihin tai miselleihin tai adsorboitu ioninvaihtohartseille tai sen kantajana on polymeeri.

20

Koostumukset voidaan formuloida konventionaalisen farmasian käytännön mukaisesti ja ne voivat olla: . puolikiinteitä valmisteita: geelejä, pastoja, seoksia.

• · Λ - 25 • · • ** Nestemäisiä valmisteita: liuoksia, suspensioita, liotusaineita, emulsioita.

• ♦ :: Kuten mainittiin, keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus voi sisältää kek- !.·'j sinnön mukaisen polypeptidin itsensä tai jonkin sen funktionaalisen johdoksen tai :T: 30 sellaisten yhdisteiden yhdistelmän. Esimerkkejä sopivista funktionaalisista johdok sista ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat, erityisesti sellaiset, jotka sopivat . käytettäviksi ihoympäristössä. Esimerkkejä ovat funktionaalisen aminoryhmän far- . * · ·. maseuttisesti hyväksyttävät suolat, esimerkiksi happojen kanssa muodostetut suolat, • · · joista syntyy anioneja, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä, erityisesti ihoym- ·.*·: 35 päristössä. Esimerkkejä näistä ovat fosfaatit, sulfaatit, nitraatti, jodidi, bromidi, klo- • · · \: ridi, boraatti sekä karboksyylihapoista johdetut anionit, mukaanlukien asetaatti, . bentsoaatti, stearaatti, jne.

• * · • · 28 119027

Muita funktionaalisia aminojohdoksia ovat amidit, imidit, ureat, karbamaatit, jne.

Muita sopivia johdoksia ovat keksinnön mukaisen polypeptidin karboksyylihappo-johdokset, mukaanlukien suolat, esterit ja amidit. Esimerkkeihin kuuluvat suolat, 5 joiden kationit ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä, esimerkiksi litium-, natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, sinkki-, aluminium-, ferri-, ferro-, ammonium-ja alemmat (Ci^)-alkyyliammoniumsuolat. Estereihin kuuluvat alemmat alkyyliesterit.

Esimerkissä 11 esitetyt koostumusesimerkit ovat esimerkkejä keksinnön mukaisista 10 farmaseuttisista, kosmeettisista ja ihonhoitovalmisteista, mutta ne eivät ole tarkoite tut millään tavalla rajoittamaan keksinnön mukaisten koostumusten alaa.

Kosmeettisten koostumusten tai ihonhoitokoostumusten, jotka sisältävät natiivi- tai yhdistelmä-SCCEitä, ajatellaan olevan aktiivisia aknea, kserodermaa tai muita hy-15 perkeratoositiloja, kuten kallositeetteja ja keratosis pilarista vastaan. Acne vulgarik- sessa on erilaisia vaiheita. Ajatellaan olevan hyödyllistä antaa SCCE:tä vaiheissa, joissa esiintyy talirauhastiehyeiden sarveistumishäiriöitä, jotka johtavat komedonien ja tukkeutumien muodostumiseen, kun sen sijaan saattaa olla edullista antaa jotakin ainetta, joka estää SCCE:tä, vaiheissa, joissa inflammatorinen aknevaurio on hallit-20 seva piirre.

Keksinnön eräs aspekti koskee siis polypeptidin käyttöä aknen, kseroderman tai muiden hyperkeratoositilojen, kuten kallositeettien ja keratoris pilariksen, ehkäi-.·. syyn.

: 25 • ·

Edellä kuvattujen tieteellisten havaintojen perusteella ajatellaan, että farmaseuttisia ..* koostumuksia, jotka sisältävät natiivin tai yhdistelmä-SCCE:n, voitaisiin käyttää eri- laisten iktyoosien, aknen, psoriaasin tai muiden inflammatoristen ihosairauksien, •. j: kuten ekseemojen, joihin liittyy hyperkeratoosia, mikrobiperäisien infektioita ja haa- :T: 30 vojen parantumishäiriöitä, hoitoon tai ehkäisyyn, erityisesti paikallisesti käytettynä.

.*. Keksinnön eräs toinen aspekti liittyy polypeptidin, jolla on SCCE-aktiivisuus, käyt- . ·: ·, töön farmaseuttisten koostumusten, jotka ovat tarkoitetut erilaisten iktyoosien, ak- *· ^ nen, psoriaasin tai muiden inflammatoristen ihotautien, joihin liittyy hyperkeratoo- 35 siä, kuten ekseemien, hoitoon tai ehkäisyyn, valmistuksessa.

«·· ♦ · • · « φ · , Keksinnön vielä eräs aspekti koskee erilaisten iktyoosien, aknen, psoriaasin ja mui- den inflammatoristen ihotautien, joihin liittyy hyperkeratoosia, kuten ekseemien, • · 29 119027 hoito- ja/tai ehkäisymenetelmää, jossa potilaalle, joka tarvitsee sellaista, annetaan terapeuttisesti tai profylaktisesti tehokas määrä polypeptidiä, jolla on SCCE-aktiivi-suus. Hoito voi olla profylaktista, palliatiivista tai kuratiivista.

5 Ajatellaan, että ihoympäristössä on olemassa proteolyyttisten entsyymien "kaskadi-systeemi", joka on samanlainen kuin plasminogeenin aktivointisysteemi. SCCE:n oletetaan olevan eräs tämän systeemin lopputuote. SCCE-aktiivisuutta ajatellaan voitavan inhiboida jonkin "SCCE-inhibiittorin" avulla.

10 Monissa ihotaudeissa, kuten autoimmuuneissa pemfigustaudeissa tai akantolyytti-sissä taudeissa, esimerkiksi familiaarisessa pemfiguksessa ja Darierin taudissa kera-tinosyyttien välinen koheesio on heikentynyt sarveistumattomassa elinkykyisessä epidermikerroksessa (katso kappale Solujen kiinnevoiman häiriöt elinkykyisessä epidermiksessä). Tämän prosessin ajatellaan olevan proteinaasivälitteinen ja sen 15 vuoksi sitä ajatellaan voitavan hoitaa antamalla yhdistettä, joka kykenee estämään natiivin SCCE.n entsymaattisen aktiivisuuden. Saattaisi myös olla eduksi antaa jotakin SCCE-inhibiittoria psoriaasin ja muiden inflammatoristen ihotautien hoitamiseksi tiloissa, joissa inflammatorinen komponentti on hallitsevana piirteenä.

20 Erään toisen aspektinsa mukaan esillä oleva keksintö koskee jonkin SCCE:n inhibiittorin, jolla on inhiboiva vaikutus natiivi-SCCE:n entsymaattiseen aktiivisuuteen, käyttöä farmaseuttisen koostumuksen, joka on tarkoitettu autoimmuunien pemfigus-tautien tai akantolyyttisten tautien, kuten familiaarisen pemfiguksen ja Darierin tau-, din, hoitoon tai ehkäisyyn, valmistuksessa.

··· · 25 ·· : *·* Tässä yhteydessä termi "SCCE-inbihiittori" viittaa johonkin olemassa olevaan tai ·»· ..: uuteen yhdisteeseen, joka kykenee olemaan vuorovaikutuksessa jonkin keksinnön i, j#: mukaisen entsymaattisesti aktiivisen polypeptidisekvenssin tai jonkin sen ala- j:': sekvenssin tai analogin kanssa siten, että SCCE-aktiivisuus vähenee. Väheneminen *' ·': 30 voidaan mitata esimerkiksi suorittamalla esimerkissä 3.2 hahmoteltu koe käyttämällä potentiaalista SCCE-inhibiittoria inhibiittorina. Mainitut yhdisteet voivat olla or- . .·. gaanisia molekyylejä, pieniä peptidejä tai suuria peptidejä tai minkä tahansa edellä • · · l j* t mainituun johdoksia. Tällaista lähestymistapaa voidaan käyttää lääkkeen seulonta- • · · ohjelmassa SCCE-inhibiittoreiden tunnistamiseksi.

\*·: 35

Esillä olevan keksinnön vielä eräs toteutusmuoto koskee siis menetelmää sellaisen . * ·, yhdisteen identifioimiseksi, jolla on vaikutus natiivi-SCCE:n entsymaattiseen aktii- • · ·

Ml • · 30 119027 visuuteen, ja tässä menetelmässä käytetään keksinnön muraita yhdistelmä-polypepti-diä.

Erityisesti esillä oleva keksintö koskee menetelmää sellaisen yhdisteen identifioimi-5 seksi, jolla on inhibitorinen vaikutus natiivi-SCCE:n entsymaattiseen aktiivisuuteen.

Erään toisen aspektinsa mukaan tämä keksintö koskee menetelmää sellaisen yhdisteen identifioimiseksi, joka kykenee vahvistamaan natiivi- tai yhdistelmä-SCCE:n entsymaattista aktiivisuutta.

10

Eräs esillä olevan keksinnön mukaisten yhdistelmä-polypeptidien tärkeä käyttösovellus on lääkkeenseulonta-analyysi. Keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan käyttää lääkkeenseulontasysteemissä. Keksintö koskee siten myös menetelmää sellaisen yhdisteen identifioimiseksi, joka pystyy muuttamaan SCCE.n proentsyymi-15 muodon aktiiviseksi SCCE:ksi, joka käsittää keksinnön mukaisen polypeptidin.

Tähän keksintöön sisältyy myös jonkin edellä kuvatun aminohapposekvenssin käyttö jonkin SCCE-polypeptidin kolmiulotteisen rakenteen dedusoimiseksi käytettäväksi sellaisen aineen rakenteluun, joka kykenee sitoutumaan SCCE-polypeptidiin, 20 erityisesti käytettäväksi lääkeaineen, joka sitoutuu entsyymin aktiiviseen kohtaan, suunnittelemiseksi.

Keksinnön tärkeitä aspekteja ovat lopuksi erilaiset menetelmät SCCE-polypeptidin . aktiivisuuden säätelemiseksi. Tämä aktiivisuus saattaa vaikuttaa merkittävästi edellä • · **· : 25 kuvattuihin eri tautitiloihin.

·« • * » · * • · · DNA- tai RNA-fragmentti, joka on komplementaarinen ainakin osalle keksinnön muraita polypeptidiä tai jotakin sen analogia vastaavaa mRNA:ta, saattaa tehoksi*: kaasti pysäyttää SCCE-mRNA:iden translaation ihmissoluissa ja siten estää poly- :T: 30 peptidi(e)n synteesin. Tämä lähestymistapa, joka saattaa olla mielenkiintoinen tau- ritilöissä, joissa todetaan normaalia suurempi SCCE:n ilmentyminen, kuten autoim- . muunisissa pemfigustaudeissa tai akantolyyttisissä taudeissa, kuten familiaarisessa m·"·, pemfiguksessa ja Darierin taudissa, tunnetaan yleisemmin antisense-oligoterapiana • · « ja siten esillä olevan keksintö käsittää sellaiset lähestymistavat.

V·: 35 ·*» • » » · • · · 9 9 • * * « · 9 ··· • · 31 119027

Kuvioiden selitykset Kuvio 1

Unipolaarinen solujen variseminen plantaarisesta sarveiskerroksesta in vitro. Kudospinta, joka oli ollut ulospäin in vivo, on kuviossa ylöspäin. Huomattakoon, 5 että tällä pinnalla esiintyi inkuboinnin aikana progressiivista solujen hajoamista, mutta muilla pinnoilla ei esiintynyt solujen hajoamista.

Kuvio 2

Ajan ja aprotiniinin vaikutus solujen irtoamiseen plantaarisesta sarveiskerroksesta, 10 jota inkuboitiin ilman (ympyrät) aprotiniinia ja aprotiniinin kanssa (kolmiot).

Kuviossa on esitetty keskiarvot (kumulatiiviset arvot neljästä kudoskappaleesta) ja alueet.

Kuvio 3 15 Anti-desmogleiini(anti-DG I)-reaktiiviset komponentit koherentissa plantaarisessa sarveiskerroksessa ja dissosioituneissa soluissa. A. Coomassie-sini-väijätty SDS-PAGE. B. Immunoblotit 1-3: Koherentti kudos, laimentamaton (1), laimennettu 1/3 (2), laimennettu 1/9 (3). 4-5: Dissosioituneet solut, laimentamaton (4), laimennettu 1/3 (5). Huomaa ainoastaan näennäisesti koskematon DG I, jonka Mr 160 kD kohe-20 rentissa kudoksessa, ja ainoastaan DG I:n hajoamistuotteita, joiden Mr 95 ja 80 kD dissosioituneissa soluissa.

Kuvio 4 , Ajan ja aprotiniinin vaikutus desmogleiini I:n (DG I) hajoamiseen plantaarisessa • · ··· : 25 sarveiskerroksessa, jossa on tapahtumassa solujen irtoamista in vitro. Densitomet- : risiä skannauksia ilman (A) aprotiniinia ja aprotiniinin kanssa (15 μΜ) inkuboidun 9» ¥ .'** plantaarisen sarveiskerroksen ekstrakteista valmistetuista immunobloteista. Piikki *#·]1 160 kD:n kohdalla vastaa ehjää DG I:tä. Piikit 95 ja 80 kD:n kohdalla vastaavat ! tämän proteiinin hajoamistuotteita (vrt. kuvio 3). Huomaa aprotiniinin tehokas 30 inhibitiovaikutus DG I:n hajoamiseen.

* , ,·, Kuvio 5 • · ·

t'.\\t Sinkki-ionin (A), kymostatiinin ja leupeptiinin (B) vaikutus desmogleiinin I:n (DG

\ I) hajoamiseen plantaarisessa sarveiskerroksessa solujen irtoamisen aikana in vitro.

9 9 :: 35 Huomaa anti-DG I -positiivisten komponenttien transformaation esto 160 kD: sta 95 :** : ja 80 kD:iin sinkki-ionien ja kymostatiinin vaikutuksesta, mutta ei leupeptiinin vai kutuksesta.

• 1 1 9 9 9 • 99 * « · · • · 32 119027

Kuvio 6

Peptidin hydrolysoiva aktiivisuus plantaarisen sarveiskerroksen solujen yhteydessä. Näiden kahden substraatin hydrolyysiä seurattiin mittaamalla absorbanssin muutos 405 nm:ssä. Kolmen inkuboinnin keskiarvo. Neliöt = S-2586; ympyrät = S-2288.

5

Kuviot 7

Korneosyytteihin liittettyä S-2586:ta hydrolysoivan aktiivisuuden pH-riippuvuus. Kolmen inkuboinnin keskiarvo. Neliöt = natriumasetaatti, ympyrät = natriumfosfaat-ti, kolmiot = Tris-HCl.

10

Kuvio 8

Zymografia, joka kuvaa kaseinolyyttistä aktiivisuutta ekstrakteissa, jotka on valmistettu dissosioituneista plantaarisen sarveiskerroksen soluista. Katso myös teksti esimerkissä 2.2 koskien kokeen yksityiskohtia.

15 A. Entsyymin, joka saatiin plantaarisista komeosyyteistä uutettuina käyttäen Laemm-lin näytepuskuria ilman pelkistysainetta (sc/s) ja KCl:a (sc/k), ja naudan kymotrypsiinin, 0,125 ng, (c) ja naudan trypsiinin, 0,5 ng, (t) vertailu. Ennen elektroforeesia KCl-ekstrakti dialysoitiin 5 mM Tris-HCl.a vastaan, pH 6,8, ja SDS ja 20 glyseroli lisättiin, jotta loppukonsentraatiot saatiin kuten näytepuskurissa; 10 μΐ lisättiin kaikkiin juoviin. Moolimassamarkkerit vasemmalla.

B: Riippuvuus pH:sta inkubointipuskurissa. Entsyyminlähde = dissosioituneiden , plantaaristen komeosyyttien SDS-ekstraktit. Puskurit esikäsittelyyn Triton X-100:11a

1 25 ja inkubointiin: 0,1 M natriumasetaatti (pH 4,0 ja pH 5,5) ja 0,1 M Tris-HCl (pH

? **' 7,0 ja pH 8,0). Muut olosuhteet kuten kohdassa A.

··* t ♦ • « ί,ί,ί C: Inhibiittoreiden vaikutus, se = plantaaristen komeosyyttien SDS-ekstrakti; c = I ;'s naudan kymotrypsiini; t = naudan trypsiini. Inhibiittorit olivat läsnä Triton X-100:11a iTj 30 suoritetun esikäsittelyn ja sitä seuraavan inkuboinnin aikana. Leupeptiinin loppu- t konsentraatio oli 160 μΜ, aprotiniinin 15 μΜ, kymostatiinin 40 μΜ ja sinkki-ionien , ,·. (sulfaattina) 100 μΜ. Leupeptiini ja kymostatiini lisättiin liuotettuina dimetyylisul- '*Y't foksidiin (DMSO). Puskuri esikäsittelyyn ja inkubointiin: 0,1 M Tris-HCl pH 8 ja • · · \ DMSO:n loppukonsentraatio 1 % (v/v). Muut olosuhteet kuten kohdassa A.

• · • · · off \ *: 35 *’"i Kuvio 9 , ’·, SCCE:n, naudan kymotrypsiinin ja ihmisen katepsiini G:n vertailu koskien inhibiit- • m · torien (A; aprotiniini, B; kymostatiini, C; sinkkisulfaatti) vaikutuksia ja substraatti- * f 33 119027 spesifisyyttä (D). Kuvioissa A-C entsyymiaktiivisuus ilman mitään inhibiittoria standardisoitiin 100 %:ksi. Kuviossa D entsyymiaktiivisuus MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA:n läsnäollessa standardisoitiin 1 mielivaltaiseksi yksiköksi.

5 Kuvio 10

Affiniteettikromatografia kovalenttisesti sitoutuneella soijapaprutrypsiini-inhi-biit-torilla (SBTI). Pisteviiva: absorbanssi 280 nm:ssä, heijastaen eluaatin proteiinikon-sentraatiota. Yhtenäinen viiva, jossa avoimia neliöitä: peptidin hydrolysoiva aktiivisuus S-2586:n ollessa substraattina, ilmoitetaan absorbanssin muutoksena 10 405 nm:ssä. Yhtenäinen viiva, jossa avoimia ympyröitä: peptidin hydrolysoiva ak tiivisuus S-2288:n ollessa substraattina, ilmoitetaan absorbanssin muutoksena 405 nm:ssä, kymmenkertaisena.

Kuvio 11 15 SDS-PAGE ja Coomassie-sini-värjäys (A) ja zymografia SDS-PAGE:n jälkeen ko- polymeroidun kaseiinin kanssa (B) kuvion 10 kromatogrammin fraktioista 2, 6 ja 10. Moolimassamarkkerit vasemmalla. B:ssä: 1: ryhmä kaseinolyyttisiä komponentteja, jotka voitiin inhiboida leupeptiinillä (160 μΜ); c: ryhmä kaseinolyyttisiä komponentteja, jotka voitiin inhiboida kymostatiinilla (40 μΜ).

20

Kuvio 12 SDS-PAGE SCCE:stä, joka puhdistettiin affiniteettikromatografialla SBTI-Affigel 15:llä, 12,5 % geeliä. 1: pelkistämätön näyte. 2: pelkistetty näyte. Moolimassamarkkerit vasemmalla.

: 25

Kuvio 13 * · · ’ SCCE:n N-terminaalinen aminohapposekvenssi. Asteriskit tarkoittavat epävarmuuk- :.i.: siä koskien oletettuja kystiinejä asemissa 7 ja 9. Kysymysmerkit tarkoittavat asemia, ♦ · :: joissa ei voitu detektoida mitään aminohappojohdoksia, mutta ilman mitään laskuja v : 30 saannoissa seuraavissa vaiheissa.

: Kuvio 14 ··· . ·: *. Monoklonaalisten vasta-aineiden TE4b ja TE9b karakterisointi immunosaostuksen .· . ja immunoblottauksen avulla.

• · · 1 • · ” 35 • · * A: Coomassie-sini-värjätty 12,5 % SDS-PAGE, ei-pelkistävät olosuhteet.

• ;*; Raita 1: Moolimassamarkkerit • · · 34 119027

Raita 2: KCl-ekstrakti, joka valmistettiin esimerkissä 3.1 kuvatulla tavalla disso- sioituneista plantaarisista komeosyyteistä.

Raita 3: SCCE, joka puhdistettiin kuten esimerkissä 4.1 kuvataan affiniteettik- romatografialla ei-liukoisella soijapaputiypsiini-inhibiittorilla.

5 B: Zymografia immunopresipitaateista 12,5 % SDS-PAGE:ssa käyttäen 0,1% kopo-lymeroitua kuumassa denaturoitua kaseiinia, Coomassie-väijätty geeli.

Raita 1: Moolimassamarkkerit.

Raita 2: KCl-ekstrakti, dialysoitu kuten kohdassa A.

10 Raidat 3-6: Solubilisoidutimmunopresipitaatitja (vasemmalta oikealle) moabTe4b (20 pg), moab TE9b (10 pg), moab PZ (10 pg) ja fosfaattipuskuroitu keittosuola-liuos. Moab PZ on eräs IgGl-kappa-tyyppinen hiiren monoklonaalinen vasta-aine raskausalueen proteiinille ja sitä käytettiin ei-läheisenä negatiivisena verrokkina.

15 C: Immunoblotti 12,5 % SDS-PAGE:stä (ei-pelkistävät olosuhteet).

Raita 1: biotinyloituja moolimassamarkkereita detektoituina alkaalisella fosfa- taasilla konjugoidulla avidiinilla (BioRad). Elektroforesoitu näyte raidoilla 2,4 ja 6 sama kuin raidalla 2 A:ssa ja raidoilla 3, 5 ja 7 sama kuin raidalla 3 A:ssa.

Raidat 2 ja 3: ensimmäinen vasta-aine = moab TE4b, 0,2 pg/ml.

20 Raidat 4 ja 5: ensimmäinen vasta-aine = moab TE9b, 0,1 pg/ml.

Raidat 6 ja 7: ensimmäinen vasta-aine = moab PZ, 0,1 pg/ml.

Nuolenpäät A-C:ssä tarkoittavat suhteellisia moolimassoja (ylhäältä alas) 93, 66, 45, . ·. 31, 22 ja 14 kD, vastaavassa järjestyksessä.

• · * · 25 • » 1

Kuvio 15 **.' Kuvio 15 esittää plasmidia pS500. Tämä plasmidi sisältää täyspitkän humaani- « · · [·"' SCCE-cDNA:n kloonattuna pUC19:ään. Katso yksityiskohdat esimerkistä 6.

• · · • · · • * * · v : 30 Kuvio 16

Northem-blotteja, joissa on ihmisen epidermiksestä valmistettu mRNA. Kussakin : raidassa käytettiin poly-T-puhdistettua RNA:ta, joka vastasi suunnilleen 100 g koko- :*:*: nais-RNA:ta. 1: Hybridisaatio suoritettiin koettimella, joka oli valmistettu SCCE- .* . cDNA:n 1070 emäsparin Hinc 2/Hinc 2 -fragmentista. 2: Hybridisaatio suoritettiin 35 koettimella, joka oli valmistettu SCCE-cDNA:n 655 emäsparin Hinc 2/Bgl 2 -frag- • · *···* mentista.

« * · » • · » * · · • · 35 119027

Kuvio 17 A: Coomassie-väijätty SDS-PAGE, 12,5% geeli. 1 ja 2: PBS-Triton X-100:aan liukenemattomia pellettejä sonikoiduista TG 2 soluista, jotka on transformoitu pS510;lläjapS511:llä, vastaavassa järjestyksessä, ja indusoitu IPTG:llä. 3: SCCE, 5 joka oli puhdistettu ihmisen plantaarisesta sarveiskerroksesta.

B: Immunoblotteja, joissa kananpojan pre-immunoseerumia (1-3) ja kananpojan-anti-SCCE:tä (4-6). 1 ja 4: TG 2 -soluja, jotka on transformoitu pS510:llä ja indusoitu IPTG:llä. 2 ja 5: TG 2 -soluja, jotka on transformoitu pS511 :llä ja indusoitu 10 IPTG:llä. 3 ja 6: SCCE, joka on puhdistettu ihmisen plantaarisesta sarveiskerroksesta.

Näytteet valmistettiin kiehuttamalla näytepuskurissa merkaptoetanolin kanssa.

15 Kuvio 18

Kuvio 18 esittää ekspressiovektorin pS507:n, joka on konstruoitu esimerkissä 9 kuvatulla tavalla, ympyräkarttaa. Vektori pS507 välittää yhdistelmä-humaani-SCCE:n ekspressiota nisäkässoluissa.

20 Kuvio 19

Kuvio 19 esittää analyysiä pS507:n yhdistelmä-humaani-SCCE-geenin ekspressiosta nisäkässoluissa.

Raita 1: RNA C127-soluista.

, *. Raita 2: RNA eristetystä kloonista, 1:24, C127-soluista, jotka on transfektoitu : 25 Ps507:iiä.

:,,7 Raita 3: RNApS507:llätransfektoitujen C127-kloonienpopulaatioseoksesta.

Raidat 4 ja 5; RNA C 127-soluista, jotka on transfektoitu ekspressiovektorilla ;.i· * pS 147, joka on identtinen pS507:n kanssa paitsi että siitä puuttuu SCCE-cDNA- • · : sekvenssi. Koon markkerit on osoitettu vasemmalla.

30

Kuvio 20 • SDS-PAGE ja immunoblottaus C127-soluissa ekspressoidusta SCCE:stä.

a a · • · f a · · aa· ’· , Raidat 1 ja 6: Esivärjätyt moolimassamarkkerit (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5,27,5 35 ja 18,5 kDa).

Raita 2: pS507/C127, seos, T-pullo.

a ; Raita 3: pS507/C127, seos, rolleri A.

Raita 4: pS507/C 127, seos, rolleri B.

36 1 1 9 0 2 7

Raita 5: negatiivinen verrokki pS544/C 127.

Raita 7: natiivi-SCCE, valmistettu sarveiskerroksesta.

Raita 8: pS507/C127, klooni 24, T-pullo.

Raita 9: pS507/C127, klooni 24, rolled A.

5 Raita 10: pS507/C127, klooni 24, rolled B.

Kuvio 21 SDS-PAGE (A) ja immunoblottaus (B) yhdistelmä-SCCE:stä, joka on puhdistettu C127-soluviljelyaineesta, jossa on soluja, jotka kantavat plasmidia pS507.

10 Raidat 1 ja 5: Esivärjätyt moolimassamarkkerit (Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 ja 18,5 kDa).

Raita 2: Soluviljelyaine ennen puhdistamista.

Raita 3: Sitoutumaton materiaali, joka koottiin kromatografiasta.

Raita 4: Sitoutunut materiaali, joka eluoitiin matala-pH-puskurilla.

15

Kuvio 22

Natiivi-SCCE ja aktivoitu yhdistelmä-SCCE, joka analysoitiin aktiivisuuden kannalta kaseiini-polyakryyliamidigeelillä.

20 Raidat 1 ja 10: Moolimassamarkkerit (Pharmacia 14-94 kDa).

Raita 2: Natiivi-SCCE.

Raita 3: Natiivi-SCCE.

Raidat 4-6: Yhdistelmä-SCCE, jota on pilkottu 1 tunti, 3 tuntia ja yön yli, vastaa- . ·. vassa järjestyksessä (460 ng/kuoppa).

• · * 25 Raita 7: Trypsiini samana määränä kuin kaistojen 4-6 näytteissä, mutta ilman APMSF:ä.

·;’ Raita 8: Trypsiini samana määränä kuin kaistojen 4-6 näytteissä, kun läsnä on sa- *»·’ ma määrä APMSF:ä kuin näytteissä.

: Raita 9: Sama kuin raita 3.

0*: 30

Kuvio 23 : : Immunoblotti N-Glycosidase F® :llä käsitellystä natiivi- ja yhdistelmä-SCCE:stä.

• · · Näytteet eristettiin 8-18 % SDS-PAGE:lla ja immunoblotattiin edellä kuvatulla ta- .· . valla.

• · * 35 Raita 1: Moolimassamarkkeri. Moolimassat ylhäältä lähtien: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 ja 18,5 kDa.

• :*: Raidat 2 ja 3: Yhdistelmä-SCCE, 0,3 ja 3 pg, vastaavassa järjestyksessä.

»«· • · 37 119027

Raidat 4 ja 5 : Natiivi-SCCE, 1,5 ja 1,8 μ§, vastaavassa järjestyksessä. Raitojen 3 ja 5 näytteet käsiteltiin N-Glycosidase F® :llä.

Esimerkit 5 Esimerkki 1

Osoitus siitä, että solujen varisemiseen ihon sarveistuneen pintakerroksen pinnalta liittyy desmosomiproteiinien hajoamista ja että sen aikaansaava entsyymi näyttää olevan eräs kymotiypsiininkaltainen seriiniproteinaasi, joka voidaan inhiboida sinkki-ioneilla.

10 1.1 Kesiminen sarveiskerroksessa

Tutkimuksen tavoitteena oli valaista niiden mekanismien laatua, jotka aikaansaavat solujen kiinnevoiman ja pintasolujen dissosioitumisen (kesimisen) ihon sarveistu-neessa kerroksessa, sarveiskerroksessa. Sarveiskerroksen hiutale, 0,3 - 0,6 mm:n 15 paksuinen, leikattiin ihon pinnan suuntaisesti vapaaehtoisen, jolla oh normaali iho, kantapään alta. Kudospalasta liotettiin fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa, jossa oli 0,1% natriumatsidia, 3 tuntia huoneenlämpötilassa ja pinnasta, joka oh ollut ulospäin in vivo, raaputettiin löyhästi kiinnittyneitä soluja. Yhden mm:n paksuisia suikaleita, jotka oh leikattu kohtisuoraan kudoksen pintaan nähden, pantiin sitten 20 nesteeseen, joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% natriumatsidia ja 0,45% agaroosia, juuri ennen väliaineen geehytymistä agaroosin läsnäolon vaikutuksesta. Kun kudoskappaleita oh inkuboitu 0, 5 ja 15 tuntia 37 °C:isessa geehssä, ne jäädytettiin kuivajään päällä. 20 pm:n kryostaattileikkeitä leikattiin ihon pintaan . ·. nähden kohtisuoraan kryostaatissa, preparoitiin ja tutkittiin faasikontrastimikro- * 25 skoopissa. Todettiin solujen jatkuvaa unipolaarista irtoamista in vitro inkuboiduista

• M

*... # plantaarisen sarveiskerroksen kappaleista (kuvio 1). Soluja irtosi ainoastaan kudos- pinnasta, joka oli in vivo ollut ulospäin. Havaittu prosessi mimitoi siis kesimistä.

• ♦ t • · • · · • · ί.ί : 1.2. Lämpötilan, pH:n ja entsyymi-inhibiittorien vaikutukset »i· v : 30 Sitten kehitettiin solujen irtoamisen kvantitointimenetelmä, jonka avulla voitiin tut kia eri parametrien, kuten lämpötilan, pH:n ja entsyymi-inhibiittorien, vaikutuksia. Plantaarisesta sarveiskerroksesta valmistettiin sylinterin muotoisia kappaleita, joiden : * · *: läpimitta oli 3 mm, biopsian avulla kudoshiutaleista, jotka oh otettu ja jäädytetty / . löyhästi kiinnittyneistä soluista, kuten edellä kappaleessa 1.1. kuvattiin. Sylintereitä 35 (joissa oh määrätty pinnan alue, joka oh ollut ulospäin in vivo), inkuboitiin 0,5 *·;·’ ml:ssa nestettä, joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,1 % natrium atsi- : dia, ja aprotiniinin kanssa tai ilman sitä (4 x 10'6 mol/1) (Boehringer Mannheim, ··*·: Saksa), 1,5 ml:n Eppendorf-koeputkissa 37 °C:ssa 5, 10 ja 20 tuntia, ja sekoitettiin 38 119027 sitten 10 sekuntia Vortex-sekoittimella dissosioituneiden pintasolujen irrottamiseksi. Jäljellejäänyt kudos poistettiin ja pantiin tuoreeseen nesteeseen jatkoinkubointia varten. Koeputket, joissa irronneet solut olivat, sentrifugoitiin 2 minuuttia nopeudella 5 000 g solujen keräämiseksi. Solupelletit pestiin kertaalleen 0,5 ml:lla fosfaat-5 tipuskuroitua keittosuolaliuosta ja sitten niitä käsiteltiin 60 °C:ssa 1,5 tuntia 0,6 ml:n kanssa 1 M natriumhydroksidia. Alkaliin liukeneva proteiini kvantitoitiin Lowiyn et ai., 1951, mukaisesti ja otettiin irronneiden solujen määrän mitaksi. Tulokset on esitetty kuviossa 2.

10 Samalla tavoin tutkittiin eri potentiaalisten inhibiittoreiden [aprotmiinin, soijapapu-trypsiini-inhibiittorin, pepstatiinin (Boehringer Mannheim, Saksa) ja jodiasetamidin (Sigma, St. Louis, MO)] vaikutusta. Yksittäisiä 2 mm:n kudossylintereitä preparoitiin ja inkuboitiin nesteen kanssa, jossa joko oli tai ei ollut erilaisia potentiaalisia in-hibiittoreita tuonnempana taulukossa 1 esitettyinä konsentraatioina, 16 tuntia 37 15 °C:ssa ja irronneet solut kvantitoitiin edellä kuvatulla tavalla. Huomaa, että EDTA

(joka on eräs metalloproteinaasien estäjä) sisällytettiin inkubointiaineeseen, jotta saatiin optimaaliset solunirtautumisnopeudet.

Taulukko 1 20

Proteaasi-inhibiittorien vaikutus solujen irtoamiseen plantaarisesta sarveiskerroksesta in vitro

Keskiarvoja standardipoikkeama viidestä inkuboidusta kudoskappaleesta « • · - __ ..

• · '.!1 ' 25 Inhibiittori Konsentraatio Inhibitio K\\ (moi/i) (%) • · • —m. --- ---...

Ilman - 0±8 : Aprotiniini (Trasylol®) 1,5 xl O"7 18 ±8 : 30 Aprotiniini (Trasylol®) 4xl0'7 53 ± 13

Aprotiniini (Trasylol®) 1,5 x1ο-6 90 + 5 : Aprotiniini (Trasylol®) 4xl0'6 98 ±2

Soijapaputrypsiim-mhibiittori 5x10" 81 ±9 ,· . Pepstatiini lx 10"4 8±4 *· 1: 35 Jodiasetamidi 1 x 10’3 6 ±13 · · : : • t · • “ --— ---— • · · · • · 1 • · · 39 119027

Todettiin, että seriiniproteinaasi-inhibiittorit aprotiniini ja soijapaputrypsiini-inhi-biittori estivät tehokkaasti solujen irtoamista (kuvio 2 ja edellä oleva taulukko 1). Koska nämä kaksi ainetta olivat inhibitorisia, mutta metalloproteinaasien estäjät (EDTA), tioliproteinaasien estäjät (jodiasetamidi) ja asparagiiniproteaasien estäjät 5 (pepstatiini) eivät olleet, pääteltiin, että jokin seriiniproteaasi osallistuu todettuun prosessiin. Pääteltiin myös, että solujen koheesio sarveiskerroksessa on riippuvainen proteiinien rakenteesta ja että jokin in vitro todetun mekanismin kanssa samankaltaisen mekanismin täytyy toimia myös in vivo kesimisen aikana (Lundström ja Egelrud 1988).

10

Lisätutkimuksissa, jotka koskivat solujen irtoamista in vitro plantaarisesta sarveis-kerroksesta todettiin, että prosessi voitiin jakaa kahteen erilliseen vaiheeseen. Ensimmäinen vaihe toteutuu riippumatta siitä, onko EDTA:a läsnä inkubointiainees-sa. Toinen vaihe tapahtuu ainoastaan EDTA:n läsnäollessa. Ensimmäinen vaihe 15 voitiin estää kymostatiinilla ja sinkki-ioneilla, aprotiniinin lisäksi. Toinen vaihe voitiin estää aprotiniinilla ja kymostatiinilla. (Lundström ja Egelrud 1990 a). Kymostatiini on pienimoolimassainen proteinaasien inhibiittori, jolla on kymostatii-nin kaltainen substraattispesifisyys. Lisäksi on todettu (Lundström ja Egelrud 1990 a), että leupeptiinillä, eräällä pienimoolimassaisella proteinaasien inhibiittorilla, 20 jolla on trypsiinin kaltainen substraattispesifisyys, ei ollut vaikutusta in vitro solujen irtoamiseen.

Proteiinirakenteet, jotka todennäköisimmin aikaansaavat solujen koheesion sarveis-kerroksessa ja ovat siten mahdollisia hajoajia edellä kuvatussa kesimisen kaltaisessa • « "* * 25 solujen irtoamisessa, ovat desmosomit. Desmosomi muodostuu kahdesta symmetri- t · :, .7 sestä puolikkaasta, jotka sijaitsevat vierekkäisissä soluissa. Mainitut kaksi puolikasta • · ‘ ovat yhteydessä solunulkoiseen tilaan transmembraanisella proteiineilla, j oita kutsu- :: taan desmogleiineiksi.

• · • · · • · · ··· · iT: 30 1.3. Desmogleiini I:n (DG I) kohtalo solujen irtoamisen aikana in vitro

Tutkittiin desmogleiinin I:n (DG I) kohtaloa solujen irtoamisen aikana plantaarisesta : sarveiskerroksesta in vitro. Plantaarista sarveiskerrosta inkuboitiin, kuten edellä kap- . *: ·. paleessa 1.1 kuvataan, ja vielä kohesiivinen kudos erotettiin dissosioituneista soluis-

[· ta. Soluja ja kudosta uutettiin puskurissa, joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl pH 9, 9 M

* · · ** 35 ureaa, 2% natriumdodekyylisulfaattia, 1% merkaptoetanolia, 1 ml puskuria/20 mg <·« kudosta, 15 tuntia 37 °C:ssa. Ekstraktit preparoitiin polyakryyliamidigeelielektrofo-. reesia varten 7,5% geeleissä natriumdodekyylisulfaatin läsnäollessa (SDS-PAGE) „..: Laemmlin mukaan (Laemmli, 1970), ja siirrettiin sen jälkeen elektroforeettisesti 40 119027 (Towbin et ai., 1979) nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad, Richmond, CA), johon käytettiin koettimena kaniinin polyklonaalista antiseerumia, joka oli valmistettu naudan lihaksista puhdistettua DG I:tä vastaan (Gorbsky et ai., 1985). Sitoutuneet vasta-aineet detektoitiin alkaalisella fosfataasilla konjugoiduilla vuohen anti-kaniini-immu-5 noglobuliineilla (Bio-Rad, Richmond, CA) (Blake et ai., 1984).

Tulokset on esitetty kuviossa 3. Näytemäärät, jotka lisättiin immunoblottiin, säädeltiin siten, että saatiin suunnilleen samat proteiinikonsentraatiot (arvioituina tarkastelemalla Coomassie-sinellä värjättyjä SDS-PAGE-geelejä) koherentille kudokselle ja 10 dissosioituneille soluille. Ekstrakteista ajettiin useita laimennoksia, jotta pystyttiin vertailemaan semi-kvantitatiivisesti eri anti-DG I -reaktiivisten komponenttien määriä koherentissa sarveiskerroksessa ja dissosioituneissa soluissa.

Kun vielä kohesiivista kudosta ja dissosioituneita soluja uutettiin erikseen, todettiin, 15 että kun vielä kohesiivinen kudos sisälsi ainoastaan näennäisesti ehjää DG I:tä, dis-sosioituneet pintasolut sisälsivät ainoastaan tämän proteiinin putatiivisia hajoamistuotteita (kuvio 3).

Kuvioissa 4 ja 5 esitetään aprotiniinin, sinkki-ionien, kymostatiinin (Boehringer 20 Mannheim, Saksa) ja leupeptiinin (Boehringer Mannheim, Saksa) vaikutuksia DG I:n hajoamiseen in vitro solujen irtoamisen aikana plantaarisesta sarveiskerroksesta.

Ensiksi tutkittiin ajan kulumisen ja aprotiniinin vaikutusta desmogleiinin I:n (DG I) hajoamiseen plantaarisessa sarveiskerroksessa, jossa oli käynnissä solujen iitoami- ··, * 25 nen in vitro. Plantaarisen sarveiskerroksen ekstraktia inkuboitiin kuten edellä kappa- • ·· *... a leessa 1.2 kuvataan (mutta erottamatta koherenttia kudosta dissosioituneista soluista # " ennen uuttamista) ilman aprotiniinia ja sen läsnäollessa (15 μΜ) ja uutettiin 0, 6, 12 t ♦ * ]**;' tai 24 tunnin kuluttua. SDS-PAGE ja immunoblottaus suoritettiin edellä kuvatulla y · · ·« : tavalla. Immunoblotit skannattiin densitometrisesti Shimadzu CS-9000 valopistes- : 30 kannelissa (Shimadzu, Kioto, Japani) valon heijastuessa 560 nm.ssä sekaheijastuk- sella. Tulokset on esitetty kuviossa 4. Huomaa aprotiniinin tehokas inhiboiva vaiku-; tus DG I:n hajoamiseen.

* m ft f · · a · · « , Sitten tutkittiin sinkki-ionin, kymostatiinin ja leupeptiinin vaikutusta desmogleiini 35 I:n (DG I) hajoamiseen plantaarisessa sarveiskerroksessa solujen irtoamisen aikana • · *·;·* in vitro. Koemenettely oli kuten edellä hahmoteltiin. Inkuboinnit suoritettiin 24 : tunnin pituisina sinkkisulfaatin konsentraatiolla 0,1 tai 5 mM ja kymostatiinin tai ·:··: leupeptiinin konsentraatiolla 330 μΜ. Tulokset osoittivat, että sinkki-ionit ja kymos- 41 119027 tätiini estivät anti-DG I positiivisten komponenttien transformaation 160 kD:sta 95 ja 80 kD:iin, mutta leupeptiini ei estänyt.

Näistä tuloksista näkyy selvästi, että aprotiniini, sinkki-ionit ja kymostatiini olivat 5 inhibitorisia, kun taas leupeptiini ei ollut. DG I:n degradaatioprofiili oli siis sama kuin solujen irtoamisessa plantaarisesta sarveiskerroksesta in vitro (Lundström ja Egelrud 1990 b).

Katsottiin tärkeäksi osoittaa, että samantapaiset mekanismit kuin ne, jotka saavat ai-10 kaan solujen irtoamisen palmo-plantaarisesta sarveiskerroksesta, ovat läsnä myös ihon sarveiskerroksessa, joka on peräisin kehon muista kohdista kuin kämmenistä ja jalkapohjista. Takashi et ai. (Takashi et ai. 1987) ovat raportoineet, että detergent-tien Ν,Ν-dimetyylidodekyyliamiinioksidi (Sigma, St. Louis, MO) ja natriumdode-kyylisulfaatti (Bio-Rad, Richmond, USA) moolisuhteessa 8:2 aiheuttivat solujen 15 hajoamisen ei-palmo-plantaarisessa sarveiskerroksessa, joka oli preparoitu trypsini-soimalla kokoepidermiksestä. Eksogeenisen trypsiinin aiheuttaman kontaminaation välttämiseksi normaalista ihmisen ihosta gluteaaliselta alueelta otettuja biopsioita inkuboitiin pH 8:ssa edellä mainitun detergenttiseoksen ja EDTA:n kanssa (Egelrud ja Lundström 1990). Todettiin, että näissä olosuhteissa sarveistunut kerros dissosioi-20 tui yksittäisiksi soluiksi. Aprotiniinin lisääminen inkubointinesteeseen esti tämän solujen dissosioitumisen. Pääteltiin, että myös ei-pahno-plantaarisessa sarveiskerroksessa solujen koheesio on riippuvainen proteiinirakenteista, että kesiminen tässä kudoksessa on riippuvainen proteolyysistä ja että tämä kudos sisältää jotakin protei-naasia, joka pystyy katalysoimaan tämän proteolyysin. Koska solujen dissosioitumi-·" * 25 nen koski ainoastaan sarveiskerroksia eikä syvempiä sarveistumattomia epidermiker- *...4 roksia, pääteltiin, että dissosiaation aiheuttava proteinaasi on syvemmissä kerrok- " sissa epäaktiivisessa tai inhiboidussa tilassa.

I · · ·** : Esimerkki 2 * 30 Sarveiskerroksen kymotryptisen entsyymin (SCCE): proteinaasin, joka täyttää kri teerit, että se aikaansaa intrasellulaaristen kohesiivisten rakenteiden hajoamisen sar-:j,5 veiskerroksessa in vitro ja mahdollisesti myös in vivo, keksiminen :T: Esimerkissä 1 esitetyistä kokeista pääteltiin, että proteinaasilla, joka aikaansaa uni- . polaarista pintasolujen dissosiaatiota kesimismallissa in vitro plantaarisessa sarveis- **./.* 35 kerroksessa, tulisi olla seuraavat ominaisuudet: t : *·» m i: : 1. Sen on oltava läsnä sarveiskerroksessa.

·!·*: 2. Sen on oltava seriiniproteinaasi.

42 119027 3. Sillä tulisi olla kymotrypsiininkaltainen substraattispesifisyys ja inhibiittoripro-fiili, joka olisi samanlainen kuin mikä todettiin in vitro solujen irtoamisessa ja siihen liittyvässä desmogleiini I:n hajoamisessa.

4. Sen tulisi sijaita ekstrasellulaarisesti sarveiskerroksessa.

5 5. Sillä tulisi olla pH-riippuvuus, joka sallisi sen olla aktiivinen fysiologisissa olo suhteissa, sarveiskerroksen pH:n ollessa noin 4,5 - 6.

6. Koska solujen irtoaminen plantaarisesta sarveiskerroksesta in vitro etenee jatkuvasti pidennettyjen inkubointijaksojen aikana silloinkin, kun inkubointinesteen tilavuus on hyvin suuri inkuboitujen kudoskappaleiden tilavuuteen verrattuna tai kun 10 inkubointineste vaihdetaan toistuvasti inkuboinnin aikana, näytti olevan järkevää olettaa, että dissosiaation aiheuttava entsyymi sitoutuu kudokseen sillä tavoin, että se ei se ei pääse ekstraktoitumaan inkubointinesteeseen inkuboinnin aikana.

Seuraavat kaksi koetta johtivat SCCE:n keksimiseen (Egelrud ja Lundström 1991): 15 2.1. Dissosioituneisiin plantaarisiin komeosyytteihin liittyvä entsyymiaktiivisuus Dissosioituneita plantaarisia sarveiskerros -soluja (komeosyyttejä) valmistettiin in-kuboimalla plantaarista sarveiskerrosta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Solut suodatettiin nylonverkon, jonka meshkoko oli 100 pm, läpi ja pestiin sitten kolme kertaa 20 kymmenellä tilavuudella 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA ja kolme kertaa 0,1 M Tris-HCl:ssa pH 8. Sitten soluja inkuboitiin kahdentyyppisen kromogeenisen protei-naasisubstraatin S-2288 tai S-2586 (Kabi Diagnostica, Tukholma, Ruotsi) kanssa: ne-Pro-Arg-p-nitroanilidi (S-2288) pilkkoutuu monilla seriiniproteinaaseilla, joilla Λ on arginiinispesifisyys (esim. trypsiinillä). Arg-Pro-Tyr-p-nitroanilidi (S-2586) on **, 25 substraatti kymotrypsiinin kaltaisille proteinaaseille.

* 9

Kukin reaktioseos sisälsi 120 pl:n kokonaistilavuudessa 0,07 M Tris-HCl pH 8, /;’ 0,1% natriumatsidia, 1, 2,5, 5 tai 10 pl 25% pestyjen plantaaristen komeosyyttien suspensiota ja 1,04 mM (S-2586)- tai 1,25 mM (S-2288)-substraattia. 5 tunnin : 30 37 °C:ssamikrotiitterilevyillä inkuboinnin jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 125 pl 10% etikkahappoa. Solujen annettiin sakkautua ja 200 pl kutakin supema- « ϊ,ϊ,ϊ tanttia siirrettiin uusiin kuoppiin. Mainitun kahden substraatin hydrolyysiä seurattiin ιΎι mittaamalla absorbanssin muutos 405 nm:ssä, kun solut oli siirretty Behring Elisa e/ . Processoriin (Behringwerke, Marburg, Saksa).

9 9· * r 35 <· ^ ^ g * *;·* Kuten kuviossa 6 on esitetty, dissosioituneisiin plantaarisiin komeosyytteihin liittyi entsyymiaktiivisuus, joka katalysoi S-2586:n hydrolyysiä. Sitä vastoin aktiivisuus S-*:»*: 2288:a kohtaan oli vähäinen.

43 119027

Sitten tutkittiin S-2586-hydrolysointiaktiivisuuden riippuvuutta pH:sta. Koemalli oli kuten edellä hahmoteltiin ja siinä käytettiin 10 μΐ 25% pestyjen plantaaristen kome-osyyttien suspensiota puskureissa, joiden pH:t vaihtelivat (natriumasetaatti, natrium-5 fosfaatti tai Tris-HCl). Lopulliset puskurikonsentraatiot olivat 0,07 M. Tulokset on esitetty kuviossa 7, josta näkyy, että aktiivisuus oli optimaalinen pH:ssa 7-8, mutta merkittävä myös pH 5,5:ssä.

Lisäkokeessa tutkittiin EDTA:n, metalli-ionien ja proteinaasi-inhibiittorien vaiku-10 tuksia S-2586:n hydrolyysiin, joka suoritettiin pH 8:ssa proteinaasilla, joka liittyi suspendoituihin plantaarisiin sarveiskerros -soluihin. Koemalli oli kuten edellä ja taulukossa 2 on hahmoteltu.

Taulukko 2 15 EDTA:n, metalli-ionien ja proteinaasi-inhibiittorien vaikutukset S-2586:n hydrolyysiin, joka suoritettiin plantaarisiin sarveiskerros -soluihin liittyvällä proteinaasilla (entsyyminlähde: suspendoidut solut)

Inhibiittori Konsentraatio Aktiivisuus (%) 20 (±SD, n=3)

Ilman -100 EDTAa 4,2 mM 109+1 : PMSFb 1 mM 8 ± 3 •ti]' 25 Aprotiniinia 3 μΜ 10 ±1 * ··1 SoijapaputrypsiinMnhibiittoria 0,16 μΜ 6±1 *

Kymostatiinia’6 11 μΜ 66 ±9 I.:’· 55 μΜ 32 ±0 :T: 275 μΜ 15 ±3 30 Leupeptiini8,0 325 μΜ 93 ± 3 . ZnS04a 100 μΜ 10 + 3 .y. HgCl2a 100 μΜ 84 + 2 *’· 1 CuS04a 100 μΜ 85 + 2 • » · • · · • 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 44 1 19027 aKoeseoksessa läsnä oleva substanssi.

25% plantaaristen sarveiskerros -solujen suspensiota, joka valmistettiin tekstissä kuvatulla tavalla, inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa niin, että läsnä oli 1 mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO) liuotettuna 2-propanoliin (2-propanolin loppukon-5 sentraatio 4% v/v). Verrokkeja esi-inkuboitiin vain 4% 2-propanolilla.

cInhibiittori liuotettuna dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Kaikki nesteet, verrokit mukaanlukien, sisälsivät 5% (v/v) DMSO:ta.

Kuten edellä taulukossa 2 on osoitettu, fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF; 10 yleinen seriiniproteinaasien inhibiittori), aprotiniini, soijapaputrypsiini-inhibiittori, kymostatiini (eräs kymotrypsiini-inhibiittori) ja sinkki-ionit, mutta ei leupeptiini (eräs trypsiini-inhibiittori) inhiboivat S-2586 hydrolysointiaktiivisuuden. Inhibiittoriprofiili oli siis hyvin samankaltainen kuin mikä todettiin in vitro solujen irtoamisessa ja siihen liittyvässä desmogleiini I:n hajoamisessa.

15 2.2. Dissosioituneen plantaarisen sarveiskerroksen zymografia Todettiin, että entsyymi, joka on vastuussa S-2586:ta hydrolysoivasta aktiivisuudesta kappaleessa 2.1., voitiin tehdä liukoiseksi, kun komeosyytit uutettiin 1 M KCl:lla 0,1 M Tiis-HCl:ssa pH 8. Sen vuoksi suoritettiin kokeita zymografialla. Tätä tarkoi-20 tusta varten valmistettiin komeosyyttien ekstrakteja elektroforeesia varten Laemmlin (Laemmli 1970) mukaan, mutta ilman pelkistysainetta näytepuskurissa ja ilman näytteiden kuumennusta. Näytteitä valmistettiin myös uuttamalla dissosioituneita plantaarisia komeosyyttejä Laemmlin näytepuskurilla ilman pelkistysainetta huo- • · ·“ : neenlämpötilassa, Zymografiaa varten tehtiin Horien et ai. (Horie et ai 1984) menet- : ’·* 25 telytapaan muutos. Suoritettiin polyakryyliamidigeehelektroforeesi (SDS-PAGE) • » · ..: Laemmlin mukaan 12,5% geeleissä, joissa oli 1% kopolymeroitua lämmöllä denatu- : roitua kaseiinia. Elektroforeesin jälkeen geelejä liotettiin puskurissa, joka sisälsi 2% : Triton X-100, 1 tunti huoneenlämpötilassa SDS:n poistamiseksi ja sitten inkuboitiin . * · *: 3 7 °C: ssa 15 tuntia. Sitten geelit värjättiin Coomassie-sinellä. Erotetut kaseinolyytti- 30 set entsyymit ilmestyivät kirkkaina raitoina sinistä taustaa vasten. Katso myös kuvi- . on 8 kuvateksti kokeen yksityiskohtien osalta.

• · · ··· « · · • · · •I * Tulokset on esitetty kuviossa 8. Plantaaristen komeosyyttien ekstraktit sisälsivät yh- * · *·.*·: den pääasiallisen kaseinolyyttisen entsyymin, jonka näennäinen moolimassa oli noin 35 25 kD. Mukana oli myös vähäisempiä kaseinolyyttisiä entsyymejä, joiden mooli massat olivat noin 30 kD. (Nämä vähäisemmät komponentit eivät ole selvästi näky- • · · vissä kuviossa. Myöhemmin havaittiin, että ne voitiin inhiboida leupeptiinillä, mutta ei kymostatiinilla). 25 kD:n entsyymillä oli merkittävä aktiivisuus pH 5,5:ssä - 8:ssa.

45 119027

Sitä inhiboivat aprotmiini, sinkki-ionit ja kymostatiini, mutta ei leupeptiini. Sillä oli siis sama inhibiittoriprofiili kuin edellä kuvatulla S-2586:ta hydrolysoivalla aktiivisuudella. Kokeissa, jotka suoritettiin geeliekskluusiokromatografialla (ei esitetty), 25 kD:n kaseinolyyttisen entsyymin havaittiin kerakromatografoituvan S-2586-hyd-5 rolysointiaktiivisuuden kanssa.

Lisäkokeissa (ei esitetty), jotka suoritettiin samalla menetelmällä kuin edellä kohdassa 2.2., havaittiin, että ei-palmo-plantaarinen sarveiskerros sisältää entsyymin, jolla on näennäisesti samankaltaisia ominaisuuksia kuin plantaarisiin komeosyyt-10 teihin liittyvällä 25 kD :n proteinaasilla ja jota tästedes kutsutaan sarveiskerroksen kymotryptiseksi entsyymiksi (SCCE) (Lundström ja Egelrud 1991).

On myös ollut mahdollista saada todisteita siitä, että SCCE liittyy plantaarisiin kor-neosyytteihin sillä tavoin, että se voi olla aktiivinen sarveiskerroksen ekstrasellulaa-15 ritilässä. Tämä toteutettiin osoittamalla ensiksi, että pipaijuuriperoksidaasi (Mr 44 kD) ei läpäise dissosioituneita komeosyyttejä. Sitten osoitettiin, että komeosyyt-tisuspensio pystyi hajoittamaan ihmisen fibrinogeenia (Mr 340 kD) ja että tämä hajoaminen voitiin estää samoilla inhibiittoreilla kuin SCCE. Voitiin hylätä se ajatus, että fibrinogeenin hajoaminen johtui solubilisoituneesta entsyymistä (Egelrud 1992).

20

Esimerkki 3

Sarveiskerroksen kymotryptisen entsyymin (SCCE) osittainen puhdistaminen ja . proteinaasikokeet kromogeenisilla substraateilla t · ··· 1 • · • · ! 1' 25 3.1. Plantaaristen korneosyyttien KCl-ekstraktien valmistus ..·1 Dissosioituneiden plantaaristen korneosyyttien esimerkissä 1 kuvattua tuotantoa li- :; sättiin ja pestyjen plantaaristen korneosyyttien SCCE:tä sisältäviä KCl-ekstrakteja i valmistettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.

• 1 · · ··1 • 1 · • « · 30 Plantaaristen korneosyyttien KCl-ekstraktien valmistus on luonnosteltu kaavamai-, sesti alla olevassa taulukossa 3. Hyperplastista ihmisen plantaarista sarveiskerrosta # ·; ♦. koottiin yhteistyössä Ruotsin pedikyristiliiton kanssa. Käytettiin ainoastaan materi- • · · aalia, joka oli saatu nipistämällä tai leikkaamalla. Materiaalia ei koottu jaloista, jois- ·.2: sa esiintyi hilseilyhäiriöitä. Ennen lähettämistä sarveiskerros ilmakuivattiin ja pa- ·«· 10 J...: 35 kattiin muovipusseihin. Laboratoriossa sitä säilytettiin -20 C:ssa käyttöön saakka.

· · 2 » · « • · 1 * • ·

Taulukko 3 46 1 1 9027

Kaavioluonnos dissosioituneiden plantaaristen komeosyyttien SCCE:tä sisältävien KCl-ekstraktien valmistuksesta 5

Plantaarinen sarveiskerros 50 g

Inkuboidaan 37 °C:ssa 24 tuntia 10 1000 ml:ssa 0,1 M Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,1 % Na-atsidia

Supematantti Sentrifiigoidaan 750 x g; 5 min 15 Pestään pelletti 5 x 600 mlilla

Pesut 0,1 M Tris-HCl pH 8.

Sentrifiigoidaan kuten edellä.

Uutetaan pelletti 1 tilavuudella 20 2 M KCl:a 0,1 M Tris-HCl:ssä pH 8 30 min 4 °C:ssa Ekstrakti 1

Sentrifiigoidaan kuten edellä (noin 250 ml) • • t : Pestään pelletti 1 tilavuudella : 25 IM KCl:a 0,1 M Tris-HCl:ssä pH 8 Ekstrakti 2

Sentrifiigoidaan kuten edellä (noin 150 ml) M.5 Pelletti • · t :; ··· · • ·· f · ♦ • · · 30 Kutakin seuraavaa affmiteettikromatografiavaihetta varten ekstraktit 1 ja 2, jotka . saatiin kahdessa valmistuskerrassa kukin 50 g:sta plantaarista sarveiskerrosta, koot- tiin yhteen.

• · * • · V*i 3.2. Proteinaasimääritykset kromogeenisilla substraateilla ··· 35 Verrattiin SCCE:tä, naudan kymotrypsiiniä ja ihmisen katepsiini G:tä keskenään . . ·. koskien inhibiittorien aprotiniini, kymostatiini ja sinkkisulfaatti vaikutuksia ja subst- .!!!: raattispesifisyyttä.

• · 47 119027

Valmistettiin varastoliuoksia MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA:sta (S-2586) tislatussa vedessä, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA:sta (Boehringer, Mannheim, Saksa) l-metyyli-2-pyrrolidonissa (liuotteen loppukonsentraatio inkubointiseoksissa 4%) ja kymostatii-nista dimetyylisulfoksidissa (liuotteen loppukonsentraatio inkubointiseoksissa 1%).

5 Katepsiini G, joka oli peräisin purulentista ihmisen ysköksestä, saatiin E. Lottilta, Geneve, Sveitsi. SCCE:n lähde oli dissosioituneiden plantaaristen komeosyyttien KCl-ekstrakti, joka oli valmistettu edellä kuvatulla tavalla. Inhibiittorien aprotiniini, kymostatiini ja sinkkisulfaatti lähteet olivat kuten edellä kuvattiin.

10 Inkuboinnit suoritettiin 37 °C:ssa mikrotiitterilevyillä. Kokonaisinkubointitilavuus oli 135 μΐ. Kukin inkubointiseos sisälsi Tris-HCl:a pH 8,0 (loppukonsentraatio 0,08 M), KCl.a (loppukonsentraatio 0,2 M), 100 μΐ substraattiliuosta, 25 μΐ entsyy-minlähdettä (sopivasti laimennettuna 0,1 M Tris-HCl:iin pH 8,0, 1,0 M KCltiin) ja 10 μΐ inhibiittoriliuosta.

15

Kuviossa 9 , A-C, substraattina käytettiin MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA:ta (S-2586, lähtökonsentraatio 1,2 mM). D:ssä molempien substraattien lähtökonsentraatio oli 1,2 mM.

20 Inkubointien lopussa (1,5 tuntia) lisättiin 125 μΐ 10% etikkahappoa jokaiseen kuoppaan ja absorbanssi luettiin 405 nm:ssä käyttäen verrokkeina inkubointiseoksia ilman lisättyä entsyymiä. Lisättyjen entsyymien määrät säädeltiin sellaisiksi, että ab-sorbanssin muutokseksi 405 nm:ssä saatiin inkubointien lopussa 0,3 - 0,7.

» · • · · · • · • · : 25 Tulokset on koottu kuvioon 9, A-D. Inhibiittorien vaikutuksien tutkimiseen subst- raattina käytettiin S-2586:ta. Aprotiniinin teho SCCE:n ja kymotrypsiinin inhibiitto-rina oli suuri ja suunnilleen sama kuin molempien entsyymien kohdalla. Vaikutus · katepsiini G:hen oli toisaalta paljon vähäisempi (kuvio 9 A). Kymostatiini aikaansai :T: kaikkien kolmen entsyymin inhibition, mutta inhibiittorikonsentraatio, joka aikaan- 30 sai 50 % inhibition, oli yli kolme kertaluokkaa suurempi SCCE:n kohdalla kuin ky-. .·, motrypsiinin ja katepsiini G:n kohdalla (kuvio 9 B). Sinkkisulfaatti oli tehokas SCCE:n inhibiittori, mutta ei kymotrypsiinin eikä katepsiini G:n (kuvio 9 C).

• · *

Näiden kolmen entsyymin aktiivisuutta substraatteja MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA

\*·: (S-2586) ja Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA kohtaan verrataan kuviossa 9 D. Koska ta- L j 35 voitteena oli löytää yhtäläisyyksiä tai eroja tutkittujen entsyymien välillä, nämä ko- . * ·, keet suoritettiin ainoastaan yhdellä kunkin substraatin lähtökonsentraatiolla. Vaikka • · ·

Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA osoittautui olevan merkittävästi parempi substraatti kuin S-2586 kymotrypsiinille ja katepsiini G:lle, asia oli päinvastoin SCCE:n kohdalla.

4g 1 1 9027

Esimerkki 4

Sarveiskerroksen kymotiyptisen entsyymin puhdistaminen ja N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen 5 4.1. SCCE.npuhdistaminen komeosyyttien KCl-ekstrakteista affiniteettikromato- graflalla solubilisoimattomalla soijapaputrypsiini-inhibiittorilla (SBTI)

Kuviossa 10 esitetään tulokset SBTLllä suoritetusta affiniteettikromatografiasta. Affiniteettigeeli valmistettiin kytkemällä 50 mg SBTI:tä (Boehringer, Mannheim, Saksa) 12 ml:aan sedimentoitua Affigel 15:tä (Bio-Rad, Richmond, CA) valmistajan 10 suositusten mukaisesti. Geelillä jäljellä olevat aktiiviset ryhmät blokeerattiin etano-liamiinilla. Yhdistetyt KCl-ekstraktit 100 g:sta (kuivapaino) plantaarista sarveisker-rosta (kokonaistilavuus 700 ml) ajettiin lasipylvääseen pakatun 0,8 x 2 cm:n SBTI-Affigel 15 -petin läpi, virtausnopeus 42 ml/h, rekisteröiden jatkuvasti eluaatin absor-banssia 280 nm:ssä. Pylvästä pestiin 0,1 M Tris-HCl:llä pH 8,1 M KClilla, kunnes 15 eluaatin absorbanssi oli alle 0,01, ja sitten 10 ml:lla 0,1 M Tris-HCl:a pH 8.

Sitoutunut materiaali eluoitiin vaiheittain HClilla konsentraatioilla 1, 10 ja 100 mM. Eluentti vaihdettiin, kun eluaatin absorbanssi oli laskenut alle 0,01. 3 ml:an fraktioita koottiin koeputkiin, jotka sisälsivät Tris-HCl:a pH 8, kokonaistilavuutena 0,4 ml, määränä, jonka laskettiin olevan riittävä säätämään eluaatin pH:n yli 7:ään.

20 Kunkin fraktion pH tarkistettiin heti ja tarpeen vaatiessa säädettiin noin 7:ään pienillä tilavuusmäärillä 1 M Tris-HCl:a, pH 8. Peptidin hydrolysointiaktiivisuus määritykset S-2586:lla (substraatti SCCE:lle) ja S-2288:lla (substraatti trypsiininkaltaisille entsyymeille) suoritettiin esimerkissä 2.1 kuvatulla tavalla. Kummankin substraatin "1 1 lähtökonsentraatio määritysseoksissa oli 1,1 mM. Noin 90% S-2586-hydrolysoin- ♦ 1 25 tiaktiivisuudesta sitoutui geeliin. Eluoitaessa vaiheittain pestyä geeliä 10-100 mM ··1 HCl:lla suunnilleen 60 % kokonais-S-2586-hydrolysointiaktiivisuudesta käytetyssä KCl-ekstraktissa voitiin saada talteen. Kokonais-S-2288-hydrolysointiaktiivisuudes- :,· 1 ta noin 20% sitoutui affiniteettigeeliin ja 10% voitiin saada talteen eluaattiin.

• · 1 • · 30 Kuvio 11 esittää eluaatin analyysejä SBTI-affmiteettikromatografiasta, johon liittyi ! polyakryyliamidigeelielektroforeesi SDS.n läsnäollessa (SDS-PAGE) ja zymografia.

Ajettiin pelkistettyjä näytteitä 12,5% geelillä. Katso myös Egelrud ja Lundström ’· ^ 1991 ja esimerkki 2, 2.2 kokeen yksityiskohtien osalta. Ennen valmistelua elektrofo- */’: reesia varten näytteet oli konsentroitu noin 20-kertaisiksi A:ssa sentrifugointisuoda-

Mf 35 tuksen avulla käyttäen Ultrafree-MC-filttereitä (raja-arvo 10 kD; Millipore, , .·. Bedford, MA) ja laimennettu 10-kertaisesti B:ssä.

» · · 49 119027

Kuvio 12 esittää SDS-PAGE:lla tehtyä SBTI-affiniteettikromatografiasta tulleen pelkistämättömän ja pelkistetyn näytteen vertailua. Kuten kuvioista 10 ja 11 näkyy, SBTI-affiniteettikromatografiasta saatiin proteiini, joka oli yli 90-prosenttisen puhdas (Coomassie-sinellä värjätyistä SDS-PAGE-geeleistä määritettynä) ja jonka nä-5 ennäismoolimassa oli noin 25 kD pelkistämättömässä muodossa ja noin 28 kD pelkistetyssä muodossa. Lisäksi läsnä oli pienempi Coomassie-sini-positiivinen komponentti, jonka näennäismoolimassa oli noin 1 kD suurempi kuin pääkomponentin. Zymografiageeleillä oli yksi suurempi ja yksi pienempi juova, joiden elektroforeetti-nen liikkuvuus oli samanlainen kuin kahden juovan, jotka havaittiin Coomassie-si-10 neliä värjätyillä geeleillä pelkistämättömillä näytteillä. Molemmat nämä kasei-nolyyttiset komponentit voitiin estää kymostatiinilla. Lisäksi zymografiassa havaittiin pienempiä komponentteja, joiden näennäismoolimassat olivat noin 30 kD ja jotka voitiin inhiboida leupeptiinillä. Pääteltiin, että suurempi puhdistettu proteiini oli SCCE.

15 4.2. SCCE.n N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen SDS-PAGE:a varten pelkistäen tai ilman pelkistystä valmistettiin 200 mikrolitraa fraktiota kromatogrammista, joka saatiin SBTI-Affigel 15:llä, A280nm 0,2, ja ajettiin 12,5% polyakryyliamidigeelillä (paksuus 1 mm, raon leveys 73 mm).

20 Elektroforeesin jälkeen erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilon-suodattimelle (Millipore) ja värjättiin Coomassie-sinellä Matsuidairan, 1987, mukaan. Suurempi proteiini leikattiin ja käsiteltiin Applied Biosystemsin 477A pulssi-nestefaasi-amino-happo-sekvenssianalysaattorissa, johon oli liitetty on line PTH : 120A analysaattori (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Sekvensointi * * 1 " 25 suoritettiin käyttäen normaalijakso-ohjelmia ja valmistajan kemikaaleja. Lähtö- ja toistuvat saannot, jotka laskettiin standardiproteiineista, olivat 25% ja 97%, vastaa-vassa järjestyksessä.

• · f * · • · · · * T: Aminohappojohdoksien saannot olivat yhteensopivia tulosten kanssa, jotka saatiin 30 kun vain yksi peptidi sekvensoitiin. Pelkistämättömillä näytteillä saannot olivat hy-j .·, viä vaiheissa 1-6, mutta putosivat nollaan vaiheissa 7 ja 9. Seuraavissa vaiheissa saannot laskivat tuntuvasti. Myöskään pelkistetyillä näytteillä aminohappojohdoksia • · t ei voitu havaita vaiheissa 7 ja 9, mutta seuraavissa vaiheissa, joissa johdoksia voitiin \**i havaita, ei saannoissa tapahtunut mitään jyrkkiä laskuja. Nämä tulokset antavat ai- ι«· 35 heen ajatella, että asemissa 7 ja 9 on kystiinejä. Ei kuitenkaan ollut mahdollista ha-. väitä karboksimetyloitua kystiiniä vaiheissa 7 ja 9 pelkistyksen ja jodietikkahapolla 2 ,’: (100 mM) käsittelyn jälkeen. Saatu sekvenssi (kuvio 13, SEQ ID NO:3) oli sama » · pelkistetyillä ja pelkistämättömillä näytteillä.

Esimerkki 5 50 119027 5.1. SCCE-spesiflsten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus BALB/c-hiirille (Bomholtgaard, Tanska) annettiin noin 30 pg natiivi-SCCE:tä, joka oli puhdistettu esimerkissä 4.1 kuvatulla tavalla, Freundin täydellisessä adjuvantissa 5 (Difco Laboratories, Detroit, MI) ihonalaisina injektioina. Injektiot toistettiin kuukauden kuluttua samoilla määrillä SCCE:tä Freundin epätäydellisessä adjuvantissa (Difco Laboratories, Detroit, MI). Neljä kuukautta ensimmäisen injektion jälkeen yhdelle hiirelle annettiin suonen sisään tehosteruiskeet 3 peräkkäisenä päivänä, 30 μ g antigeeniä per injektio. Hybridoomia tuotettiin menetelmällä, jota Carlsson et ai.

10 kuvasivat 1985, SP2/0 myeloomasolulinjan soluilla (ATCC CRL 1581). Vasta-aineiden, jotka reagoivat puhdistetun SCCE-valmisteen kanssa, identifioiminen suoritettiin ELISA-menetelmällä. Viljelysupematantteja positiivisista klooneista analysoitiin edelleen immunoblottaus-menetelmällä SDS-PAGE:n jälkeen. Klooneja, jotka tuottivat SCCE:n kanssa tässä kokeessa reagoivia vasta-aineita, monistettiin 15 hiiren askitesnesteessä ja vasta-aineita puhdistettiin proteiini A-affiniteettikromato-grafialla ja luokiteltiin menetelmällä, jota Carlsson et ai. kuvasivat 1985. Saatiin kaksi käyttökelpoista vasta-ainetta, moab TE4b ja moab TE9b, jotka kumpikin luokiteltiin IgGj-kappa-vasta-aineiksi.

20 Moab TE4b:n ja moab TE9b:n karakterisoiminen immunosaostuksen ja immuno-blottauksen avulla on esitetty kuviossa 14. Kuvio 14 a (raita 2) esittää Coomassie-sinellä värjättyä SDS-PAGE-geeliä, jossa on konsentroitu dissosioituneiden plantaa-risten komeosyyttien KCl-ekstrakti, joka valmistettiin esimerkissä 3.1 kuvatulla : tavalla. Näytettä dialysoitiin 4 tuntia 0,1 M natriumasetaattia, pH 4, vastaan ja * · * * 25 konsentroitiin noin 100-kertaiseksi ultrasuodattamalla ennen kuin se valmisteltiin *·· ./ elektroforeesia varten. Kuvio 14 a (raita 3) kuvaa erästä SCCE-valmistetta, joka on » puhdistettu esimerkissä 4.1. kuvatulla tavalla.

• · {· · • f 9«· 9 t T: Kuvio 14 b esittää tulokset immunosaostuskokeesta, jossa vasta-aineita inkuboitiin 30 komeosyyttien KCl-ekstraktin kanssa ja sitten otettiin talteen insolubilisoidun prote-, iini A:n kanssa. Uudelleen solubilisoituja ja dissosioituja antigeeni-vasta-aine- ·♦·, komplekseja analysoitiin zymografian avulla kuten esimerkissä 2 kuvataan.

f · ♦ 9 9 • 9 V·: 250 μΐ dissosioituneiden plantaarikomeosyyttien KCl-ekstraktia, joka oli konsent- 35 roitu 5-kertaiseksi ultrasuodatuksella, dialysoitu fosfaattipuskuroitua keittosuola-, X liuosta vastaan ja johon oli lisätty naudan seerumialbumiinia (Sigma, St. Louis, 9 · · •X: MO) lopulliseen konsentraatioon 10 mg/ml, sekoitettiin 10 μ1:η kanssa vasta-aine- liuosta tai fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta ja inkuboitiin 15 tuntia 4 C:ssa.

51 119027

Sitten putkiin lisättiin 25 μΐ sedimentoitua Protein A Sepharosea (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) ja inkubointia jatkettiin varovasti ravistellen huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Geeli otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin viisi kertaa 1 ml:11a 0,05% Tween 20:tä (Sigma, St. Louis, MO) 0,05 M Tris-HCl:ssä, pH 7,5, 0,5M NaChssa.

5 Viimeisen pesun jälkeen geeliä uutettiin 100 pl:lla Laemmlin näytepuskuria ilman pelkistysainetta 1 tunti huoneenlämpötilassa. Ekstraktit kirkastettiin sentrifugoimalla ja levitettiin geelille.

Moabit TE4b ja TE9b saostivat kumpikin kaseinolyyttisen entsyymin, jolla oli sama 10 Mr kuin puhdistetulla SCCE:llä ja vastaavalla suuremmalla kaseinolyyttisellä ent syymillä KCl-ekstraktissa. Vasta-aineet eivät saostaneet ekstraktissa olevia pienempiä kaseinolyyttisiä entsyymejä, joiden Mr oli noin 30 kDa, joiden oli osoitettu inhi-boituvan leupeptiinin, erään trypsiininkaltaisen seriiniproteinaasien estäjän, vaikutuksesta. 25 kDa:n kaseinolyyttisen entsyymin lisäksi vasta-aineet näyttivät sitoutu-15 van erääseen pienempään proteolyyttiseen komponenttiin, jonka Mr oli noin 80 kDa. Tämä komponentti on tavallisesti läsnä plantaaristen komeosyyttien, jotka ovat peräisin ennen valmistusta kuivatusta kudoksesta, KCl-ekstrakteissa, mutta sitä ei löydy tuoreesta kudoksesta tehdyissä valmisteissa (T. Egelrud, julkaisematon havainto). Sitä ei ole SCCE-valmisteissa, jotka on puhdistettu affiniteettikromatogra-20 fialla, ja se saattaa olla jokin aggregaatiotuote. Vastaavaa komponenttia, joka reagoisi vasta-aineiden kanssa, ei ole voitu havaita immunobloteissa.

Ei-pelkistävissä olosuhteissa ajettujen SDS-PAGE-geelien immunobloteissa (kuvio ; . 14 c) moabit TE4b ja TE9b reagoivat erään komponentin kanssa, joka oli läsnä pla- • · « · : ·. 25 ntaaristen komeosyyttien KCl-ekstrakteissa (kuvio 14 c raidat 2 ja 4) ja puhdiste- * · · ·. tussa SCCE-valmisteessa (kuvio 14 c raidat 3 ja 5), joilla kummallakin oli sama Mr • · " kuin suuremmalla puhdistetulla proteiinilla ja suuremmalla kaseinolyyttisellä kom- /:’ ponentilla zymogrammeissa. Vasta-aineet eivät reagoineet näytteiden kanssa, jotka • · * oli pelkistetty SDS:n läsnäollessa, mikä antaa aiheen ajatella, että suuntautuvat kon-*.* · 30 formaatiostariippuvaisia epitooppejavastaan.

: Suuremman proteiinin, jonka Mr on noin 25 kD pelkistetyssä muodossa, lisäksi puh- : T; distettu SCCE-valmiste sisältää pienemmän Coomassie-positiivisen komponentin, .* . jonka Mr on noin 26 kD (pelkistämätön; katso esimerkki 3). Zymogrammeissa vas- * * * L. * 35 taava kaseinolyyttinen komponentti on läsnä ja se voidaan inhiboida kymostatiinilla • · *·;·* samalla tavoin kuin suurempi 25 kD:n kaseinolyyttinen komponentti (katso esimerkki 3). Suuremmilla moabien TE4b ja TE9b konsentraatioilla (tuloksia ei ole esitetty) •: · ·: myös tämän pienemmän komponentin voitiin nähdä reagoivan vasta-ainei-den kanssa 52 1 1 9 0 2 7 immunobloteissa. Samanlaisia tuloksia (ei esitetty) on saatu eräällä polyklonaalisella kaniini-vasta-aineella, joka on synnytetty suurempaa Coomassie-positiivista komponenttia vastaan, joka on puhdistettu preparatiivisella elektroforeesilla. Tarkkaa kysymyksessä olevan kahden proteiinin, joilla on SCCE:n kaltainen aktiivisuus ja jotka 5 ilmeisesti ristireagoivat immunologisesti, välistä suhdetta ei tunneta.

5.2. Polyklonaaliset SCCE-spesifiset vasta-aineet

5.2.1. Kananpojan anti-SCCE

45 pg SCCE:tä, joka oli puhdistettu SBTI-affmiteettikromatografialla, kuten esimer-10 kissä 4.1 kuvataan, 0,2 ml:ssa 0,1 M Tris-HCl:a, denaturoitiin kuumentamalla 60 minuuttia 60 °C:ssa ja homogenisoitiin vastaavassa tilavuudessa Freundin täydellistä adjuvanttia (Difco Laboratories). Saatu emulsio ruiskutettiin subkutaanisti Derco-kananpoikiin, jotka olivat noin 20 viikon ikäisiä ja joista oli otettu verinäyte pre-immuuniseerumin valmistusta varten. Kananpojille annettiin vielä ihonalaisia 15 injektioita emulsioilla, jotka oli valmistettu edellä kuvatulla tavalla, mutta käyttäen . Freundin epätäydellistä adjuvanttia ja 30 pg puhdistettua, kuumentamalla denaturoitua SCCE:tä (kunkin emulsion kokonaistilavuus oli 250 pl), 3, 5 ja 7 viikon kuluttua. Kananpojista laskettiin veri 2 viikkoa viimeisen injektion jälkeen. Veri sekoitettiin heti 2 tilavuuteen Alseverin liuosta (per 100 ml: 100 ml 1,87 g glukoosia, 0,8 20 g natriumsitraattia, 0,62 g natriumkloridia, sitruunahappoa pH 6,1 :teen) ja sentrifu-goitiin. Lisätutkimuksiin valittu kaniinin anti-SCCE käytettiin laimennoksena 1/2000 kokeissa, jotka suoritettiin immunoblottaus-menetelmällä. Katso kuvio 17, esimerkki 8 antiseerumin spesifisyyden kuvauksen osalta.

« • · • ·

:·. 25 5.2.2. Kaniinin anti-SCCE

’ ·.. f SBTI-affiniteettikromatografialla puhdistetulle SCCE:lle suoritettiin SDS-PAGE il- man pelkistystä, kuten esimerkissä 4.1. kuvataan, geeleillä, joiden paksuus oli /·;* 15 mm, Laemmlin 1970 mukaisesti. Suurempi proteiininauha, joka aikaisemmin oli · · : osoittautunut SCCEiksi, visualisoitiin kuparikloridiväijäysmenetelmällä Leen et ai.

V * 30 (1987) mukaan ja leikattiin irti. Kun kuparikloridi oli poistettu EDTA:lla Leen et ai.

mukaan, geelisuikaleet homogenisoitiin fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuokses- :, j j sa. Näytteitä homogenisoiduista geelisuikaleista suspendoitiin yhtä suuriin tilavuuk- :T: siin Freundin adjuvanttia. Noin 30 pg tällä tavalla valmistettua puhdasta SCCE:tä . täydellisessä adjuvantissa annettiin subkutaanisti kaniinille. 3, 5 ja 7 viikon kuluttua • · · 35 injektio toistettiin samalla määrällä SCCE;tä, mutta ilman täydellistä adjuvanttia.

* *; * * Kaniinista laskettiin veri kahden viikon kuluttua viimeisestä injektiosta.

* * · • · · * * · * • · 53 119027

Saatua kaniinin anti-SCCE:tä (D-5) käytettiin laimennettuna 1/500 - 1/1000 immu-noblottauskokeissa käyttäen alkalisella fosfataasilla konjugoituja anti-kaniini-immu-noglobuliineja toisena vasta-aineena.

5 Kaikissa immunoblottauskokeissa sitoutuneita toisia vasta-aineita detektoitiin Blaken et ai., 1984, mukaan (viitataan esimerkkeihin 5, 8 ja 9).

Kaniinin anti-SCCE Bo-1 valmistettiin samalla tavalla, mutta käyttäen SCCE:tä, joka oli pelkistetty ennen SDS-PAGE:a, antigeeninä.

10 5.3. Immunohistokemialliset tutkimukset monoklonaalisilla vasta-aineilla Immunohistokemiallisissa tutkimuksissa SCCE-spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla SCCE voitiin havaita ihmisen keratinisoituvien levyepiteelien korkealla tyvikalvon yläpuolella sijaitsevissa soluissa (epidermis, karvan juurituppien sisempi 15 juurikerros, kova suulaki), mutta ei ei-keratinisoituvissa levyepiteeleissä (karvan juuritupen sisempi juurikerros, huulien ja suun limakalvot). SCCE saattaa siis ilmentyä erityisesti keratinisoituvissa suomuisissa epiteeleissä. Lisäksi SCCE:n todettiin ilmentyvän ihmisen epidermiksen korkealla tyvikalvon yläpuolella olevissa soluissa, jotka oli rekonstruoitu in vitro ja kasvatettu ilma-vesirajapinnalla. Kun 20 kasvatusnesteeseen lisättiin retinolihappoa konsentraationa, joka stimuloi keratino-syyttien proliferaatiota, mutta esti sarveiskerroksen muodostumista, SCCE ei enää ilmentynyt. Tämä antaa aiheen ajatella, että SCCErn ilmentyminen saattaa olla osa epidermiksen erilaistumisprosessia.

• * • · •\ * 25 Immunoelektronimikroskooppitutkimuksista, jotka suoritettiin SCCE-spesifisillä · · monoklonaalisilla vasta-aineilla, saadut tulokset sopivat yhteen SCCE:n roolin kans- '1 sa desmosomien hajoamisessa ja siten hilseilyssä. Vasta-aineet leimasivat erityisesti / · · ’ lamellaarisia kappaleita, joissa tapahtui sekreetiota ylimpien granulaaristen solujen • · · :· j4: ja alimpien sarveiskerroksen solujen väliseen tilaan, kun taas sarveiskerroksessa : 30 vasta-aineet tunnistivat epitooppeja, jotka liittyivät läheisesti desmosomeihin solu- nulkoisessa tilassa.

• · · • · ···

Esimerkki 6 e. * . Ihmisen SCCE:tä koodittavan cDNA:n kloonaus ja sekvensointi • · · 35 Restriktioentsyymejä saatiin Promegalta, Madison, MI, ja TAQ-polymeraasia **:** Perkin-Elmer-Cetukselta, Norwalk, CT. λgtll humaani-keratinosyytti-cDNA-kirjas- :. ϊ!1 t°, joka oli valmistettu epidenniksestä peräisin olevasta aikuisen ihmisen kerati-

•: * ·: nosyyteistä johdetusta mRNA: sta, saatiin Clontech Laboratoriesilta, Palo Alto, CA

54 119027 (Catalog # HL 1045 b). Aluksi kiijasto seulottiin anti-SCCE-kaniinin polyklonaali-silla seerumeilla D-5 ja Bo-1 (katso esimerkki 5.2.2). Koska Bo-1 polyklonaalinen anti-SCCE-seerami antoi voimakkaita taustasignaaleja, se suljettiin pois laajasta seulontatutkimuksesta varhaisessa vaiheessa. Käyttämällä D-5-antiseerumia rikas·’ 5 tettiin joukko immunoreaktiivisia plakkeja kuten oli odotettua todella positiivisista plakeista. Minkään plakin kohdalla ei todettu reaktiivisuutta monoklonaalisten vasta-aineiden moab 4 ja moab 9 kanssa. Laaja restriktioentsyymeillä suoritettu karakterisointi ja yhdentoista eristetyn plakin PCR-karakterisointi paljasti, että eri plakkien välillä ei voitu havaita samankaltaisuuksia. Sellaisten osittaisten samankaltai-10 suuksien läsnäolo osoittaa, että plakit sisältävät homologisen DNA-insertin samasta cDNA-sekvenssis-tä. Koska oletettavan SCCE-cDNA-sekvenssin "sormenjäljen" määrittämisessä epäonnistuttiin, strategiaa muutettiin.

Plakit seulottiin E- coli Y 1090:ssä (Clontech) plakkihybridisaatiomenetelmällä 15 käyttäen degeneroitua synteettistä oligonukleotidiä koettimena. Oligonukleotidikoe-tin rakennettiin natiivi-SCCE-entsyymin kokeellisesti määritetyn aminoterminaali-sen sekvenssin perusteella, kuten esimerkissä 4.2 kuvataan. Luotettavin osa aminohapposekvenssiä, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO:3, aa 1 - aa 6), valittiin synteettisen 17-meeriseb oligonukleotidikoettimen 5-ATHATHGAYGGNGCNCC-20 3' (H=A tai C tai T; Y = C tai T; N = A tai C tai G tai T) rakentamiseksi, joka koetin nimettiin SYM3067:ksi, SEQ ID NO:4. Oligonukleotidikoetin syntetisoitiin Beckman 200A DNA -syntetisaattorilla käyttäen fosforamidiittimenetelmää myyjän ohjeiden mukaisesti.

• ♦ • ♦ ··· · . .

25 E. coli Y 1090 -bakteereja kasvatettiin yön yli LB-nesteessä (Sambrook et ai. 1989), joka sisälsi 0,2% maltoosia ja 10 mM MgS04, 0,4 ml viljelmää sekoitettiin sitten ^ laimennettuun kirjastofaagivarastoon ja adsorboitiin 20 minuuttia 37 °C:ssa. Infek- toitu viljelmä sekoitettiin 6 ml:aan pehmeätä agaroosia (0,75% agaroosi LB:ssä ja • * * 10 mM MgS04). Pehmeä agaroosiseos kaadettiin kymmenelle 150 mm:n LA-levyl- * ·* : 30 le. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 5 tuntia ja pantiin 4 °C:seen yön yli. Kaikkiaan levyt sisälsivät noin 4 x 105 plakkia.

• · · *99 99· : T: Plakkien immobilisoimiseksi kutakin levyä päällystettiin NEN DuPont Colony/Pla-

Sm : que Screen -kalvoilla (DuPont, Wilmington, DE) kaksi minuuttia. Kalvoja liotettiin !..* 35 2 kertaa 2 minuuttia 0,5 M NaOHissa, 2 kertaa 2 minuuttia Tris-HCl:ssa pH 7,5 ja •: *' annettiin sitten kuivua ilmassa. Näitä kalvoja käytettiin sitten hybridisaatiokokeessa :. t ]: tuonnempana selitetyllä tavalla. Kalvoja esihybridisoitiin 10% dekstraanisulfaatti-, ·:··: 1 M NaCl-, 1% SDS-liuoksessa, joka sisälsi 100 mg/ml denaturoitua sillinmaiti- 55 119027 DNA:ta (Sigma, St. Louis, MO), 5 tuntia 65 °C:ssa. Koetin SYM 3067 leimattiin [λ-P] dATPillä käyttäen T4 polynukleotidikinaasia (Promega, Madison, WI) ja lisättiin esihybridisaatioseokseen. Hybridisaatio toteutettiin 42 °C:ssa 12-18 tuntia.

5 Hybridisaation jälkeen kalvoja pestiin neljä kertaa 5 minuuttia 2 x SCC: ssä huoneenlämpötilassa, kaksi kertaa 30 minuuttia 2 x SCC:ssä, 1% SDSissä 42 °C:ssa ja lopuksi 0,1 SCC:ssä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Kalvot autoradiografoitiin röntgenfilmille (Hyperfilm-MP, Amersham, UK). Ensimmäisessä seulonnassa identifioitiin 14 positiivista plakkia. Nämä positiiviset plakit seulottiin uudelleen käyttä-10 en samaa koetinta ja menetelmää kuin edellä kuvattiin. Uudelleenseulonnan jälkeen identifioitiin kaksi positiivista plakkia. Nämä kaksi valikoitua plakkia puhdistettiin toiseen kertaan ja inserttien koko määritettiin PCR:llä käyttäen SYM 1600:a ja SYM 1601 alukkeina ja eristettyjä faageja templaatteina. Nämä kaksi aluketta ovat komplementaarisia λgt 11 faagin vasemmalle ja oikealle haaralle, vastaavassa järjestyk-15 sessä. Faagista A 6.2.2 kehitetty monistettu DNA-fragmentti, jonka pituus oh noin 0,9 kb, digeroitiin sitten EcoRLUä ja kloonattiin EcoRI-digeroituun pUC19:ään (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi), pS496. Tälle kloonatulle fragmentille suoritettiin osittainen sekvenssianalyysi käyttäen pUC19:lle komplementaarisia sekvenssialukkeita. Nukleotidisekvenssi määritettiin käyttäen T7 sekvensointikittejä (Pharmacia, Upp-20 sala, Ruotsi, tai USB, Cleveland, Ohio).

Saadun DNA-sekvenssin translaation tuloksena oli aminohapposekvenssi, joka oli homologinen kokeellisesti määritetyn proteiinisekvenssin kanssa. Sekvenssistä puut- .·. tui kuitenkin translaation aloituskodoni. Täyspitkän cDNA:n eristämiseksi saatu :·. 25 DNA-fragmentti erotettiin agaroosigeelillä ja sitä käytettiin koettimena, joka mah- ’... φ dollisti hybridisaation ankarissa olosuhteissa. Tämä koetin 32P-leimattiin käyttäen " Multiprime DNA -leimaussysteemiä (Amersham, UK) menetellen seuraavasti. Vettä [1"/ lisättiin 3 ml/g geeliä ja se pantiin kiehuvaan vesihauteeseen seitsemäksi minuutiksi • · · : ·| : geelin sulattamiseksi ja DNA.n denaturoimiseksi. Sitten putki siirrettiin vesihautee- V 1 30 seen, jonka lämpötila oli 37 °C, vähintään 10 minuutiksi. Noin 25 ng DNA:ta sisäl tävä tilavuusmäärä DNA/agaroosiliuosta hsättiin leimausreaktioon, toimittajan oh-: : : jeiden mukaisesti.

i1· · 1 • · · • 1 · m.\ . Täyspitkän cDNA:n saamiseksi cDNA-kiqasto seulottiin uudelleen kaksi kertaa tällä 35 koettimella käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä, paitsi että hybridisaatio suoritettiin ·;·1 rajuissa olosuhteissa, 65 °C:ssa. Näiden kokeiden tuloksena identifioitiin ja eristettiin : 45 yksittäistä positiivista plakkia, jotka aluksi seulottiin PCR-analyysillä käyttäen

*:··: SYM 1600:a (5'-GTG GCG ACG CCT GGA GCC-3’; SEQ ID NO:5) tai SYM

56 119027 1601:tä(5-ACA CCAGAC CAACTGGTA ATG-3'; SEQ IDNO:6)yhdistelmänä S YM 3208:n kanssa PCR-alukkeina sellaisen plakin identifioimiseksi, joka sisältäisi koko 5' avoimen lukukehyksen. SYM 3208, 5-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3', SEQ ID NO:7, joka oli ainakin osaksi komplementaarinen SCCE-cDNA:n 5'-osal-le, 5 rakennettiin pS496: sta saadun DNA-sekvenssi-informaation perusteella. Tämän seulonnan jälkeen valittiin neljä faagia lisäanalyysiä varten. Sekvenssianalyysiä varten saadut näistä faageista johdetut PCR-monistetut fragmentit kloonattiin pUC19:ään, kuten edellä kuvattiin. Saadut tulokset osoittivat, että yksi faageista, 205.2.1, sisälsi täyspitkän insertin.

10

Faagi-isolaatista 205.2.1 DNA valmistettiin Sambrookin et ai., 1989, mukaan ja DNA-valmistetta digeroitiin EcoRI.llä. Digeroitu DNA erotettiin agaroosi-elektro-foreesilla ja noin 1 kb:n fragmentti eristettiin ja kloonattiin EcoRI:llä digeroituun pUC19:ään. Saatu plasmidi nimettiin pS500:ksi (kuvio 15). cDNA-fragmentin täy-15 dellinen nukleotidisekvenssi määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Sekvensointireak-tioissa käytettiin alukkeina spesifisiä, pUC19:lle tai SCCE.lle komplementaarisia oligonukleotidejä. Nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO: 1) sisälsi avoimen lukukehyksen, joka oli riittävä koodittamaan SCCE-prekursoriproteiinin, joka muodostui 253 aminohaposta, signaalipeptidi ja prepolypeptidi mukaanluettuina (SEQ ID NO:2), 20 koko aminohapposekvenssiä.

Erään toisen faagin, joka nimettiin 106.1.2:ksi, todettiin sisältävän SCCE-cDNA- sekvenssin, josta puuttui 5'-transloitumaton sekvenssi ja kolme ensimmäistä kodo- . nia. Tämä insertti eristettiin 954 emäsparin EcoRI-fragmenttina ja kloonattiin • · · · 25 EcoREllä linearisoituun pUC19:ään, jolloin saatiin plasmidi pS498. Tämä plasmidi • » 57 119027

Kokonais-RNA:n valmistus ihmisen epidermiksestä Tämä suoritettiin Chomczynskin ja Sacchin, 1987, mukaan. Tervettä ihmisen vatsan ihoa saatiin plastiikkakirurgiasta. Heti irrotuksen jälkeen se jäähdytettiin jäällä. Alle 15 minuutissa epidermis otettiin talteen kaapimalla voimakkaasti skalpellilla, upotet-5 tiin liuokseen D (Chomczynski ja Sacchi, 1987) ja homogenisoitiin lasihomogenisaat-torilla. Sitten noudatettiin Chomczynskin ja Sacchin kuvaamaa protokollaa. Pelletoitu kokonais-RNA varastoitiin -20 °C:seen 70% etanoliin lisäanalyysiin saakka.

Lähetti-RNA:n valmistus 10 Viisisataa mikrogrammaa kokonais-epidermis-RNA:ta käsiteltiin käyttäen Poly A Tract-kittiä (Promega) toimittajan ohjeiden mukaisesti.

RNA-elektroforeesi ja blottaus

Agaroosigeelejä (1,4%) valmisteltiin 0,66 M formaldehydillä 1 x MOPS-puskurissa 15 ja 0,6 g/ml etidiumbromidissa (Sigma, St. Louis, MO). mRNA:ta, joka vastasi 100 μ g kokonais-RNA:ta, liuotettiin RNA-näytepuskuriin (50% formamidia, 2,2 M formaldehydiä. 3% Ficollia, 1 x MOPS) ja kuumennettiin 60 °C:ssa 5 minuuttia ennen käyttöä. RNA-markkerit (BRL, Gaithersburg, MD) käsiteltiin samalla tavalla. Elektroforeesin jälkeen geelejä liotettiin tislatussa vedessä 5 minuuttia ja sen jälkeen 20 50 mM NaOH:ssa 30 minuuttia ja 0,1 M Tris-HCl:ssa, pH 7,5, 30 minuuttia. Blot taus GeneScreen Plus -kalvoille (NEN DuPont, Wilmington, DE) suoritettiin Vacu-Gene-laitteella (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) 1 tunti 10 x SCC:ssä. Kalvot pestiin sitten 3 x SCC:ssä, kuivattiin yön yli ja lämpökäsiteltiin 2 tuntia 80 °C:ssa. RNA , ·, visualisoitiin kalvoilla UV-valolla.

::!: 25 • · • ·· cDNA-koettimet » ·;' Plasmidi pS501, joka valmistettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, digeroitiin * * · *·"* HincILUa ja BglII:lla. Tämä cDNA sisältää yhden HincII-kohdan emäsparissa Ϊ.: i n:ol060 ja yhden Bglll-kohdan emäsparissa n:o 1715. 1070 emäsparin fragmentti *·· : 30 (HincII-kohta pUC19-multippelikloonauskohdassa - endogeeninen HincII-kohta) si sältää SCCE:tä koodittavan alueen lukuunottamatta 7 emäsparia 5'-päässä ja fcrans-: loitumattoman alueen, jossa on polyadenylaatiokohta emäspareissa 944-951, joka yhteinen kaikille SCCE-cDNA:ille, jotka eristettiin. 655 emäsparin Hindi - Bglll-.* . fragmentti, joka ei sisällä poly-A-häntää, on uniikki SCCE-cDNA 108-l-2:lle.

35 Fragmentit puhdistettiin agaroosielektroforeesilla ja käytettiin 32PdCTP-leimattujen • i • · · * koettimien valmistukseen Multiprime DNA -leimauskitillä (Amersham,

Buckinghamshire, UK).

• · t19027 58

Hybridisaatio

Kalvoja keitettiin 30 minuuttia 1% SDS:ssä 1 x TE:ssä ja esihybridisoitiin 60 °C:ssa liuoksessa, jossa oli 1% SDS, IM NaCl, 10% dekstraanisulfaattia, sillinmaiti-DNA:ta 0,1 mg/ml, 3 tuntia. Hybridisaatio suoritettiin samassa liuoksessa 60 °C:ssa 5 yön yli. Pesut suoritettiin 2 x 30 minuuttia 60 °C:ssa 1% SDS:ssä ja 2 x SCC:ssä ja 3 tuntia 0,1 x SCC:ssä huoneenlämpötilassa. Sitten kalvoille suoritettiin autoradio-grafia.

Tulokset: 10 Ihmisen epidermiksessä voitiin osoittaa kahden mRNA-lajin, joiden koot olivat noin 1,2 kb ja 2,0 kb, vastaavassa järjestyksessä, läsnäolo (kuvio 16). Tämä sopii hyvin yhteen todisteiden kanssa, jotka saatiin kloonauskokeista, joissa todettiin kaksi cDNA-tyyppiä.

15 Esimerkki 8

Yhdistelmä-SCCE.n ilmentäminen E. colissa pGEX-2T/SCCE-plasmidien rakentaminen li Sense-PCR-alukkeet 20 l.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT (SYM 3367; SEQ ID NO;8, alleviitattu 3'-osa koodittaa aktiivisen natiivi-SCCE:n N-termi-naalisia aminohappoja IIDGAPC, 5'-pää BamHI-kohtineen ja lisäsekvensseineen koodittaa faktori Xa kohtaa IEGR.

• ♦ • «

yl'm 25 l.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM

, 3368; SEQ ID NO:9, alleviivattu 3'-osa vastaa emäspareja 76-96 täydellisessä SCCE-cDNA-sekvenssissä, joka koodittaa aminohapposekvenssiä LETAGEE, 5'-osa on kuten kohdassa l.a.

* ; : «»· ·

«•I

*·' 1 30 Z Anti-sense-PCR-alukkeet TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3371; komplementaarinen emäspareille 285-304 täydellisessä SCCE-cDNA-sekvenssissä, SEQ ID NO: 1, jossa on Sacl- :T; kohta emäsparissa 294).

* • · ♦ i · ♦ # Φ t./ 35 Eräs pS498:n sekvenssi (esimerkki 6) PCR-monistettiin alukkeilla la/2 ja lb/2.

·;·* Saadut tuotteet puhdistettiin fenoliuutolla ja etanolisaostuksella, digeroitiin BamHI/- j*J SacEllä ja puhdistettiin agaroosielektroforeesilla. Ne kloonattiin sitten TG2-soluissa

*:··: pGEX-2T:hen (Pharmacia), joka oli digeroitu BamHI/EcoRIllä, yhdessä SCCE

59 119027 106-l-2:n, joka saatiin digeroimalla pS498 SacLllä ja EcoRI:llä, 3'-pään 673 emäs-parin kanssa. Bakteeriklooneista eristettiin ekspressiotutkimuksia varten plasmideja (pS510, joka koodittaa natiivia N-terminaalia faktori Xa kohdan vieressä, ja pS511, joka koodittaa propeptidiä faktori Xa kohdan vieressä) ja nukleotidisekvenssit, jotka 5 vastaavat PCR-tuotteista johdettuja inserttejä, tarkistettiin dideoksi-ketjunpäättämis-menetelmällä käyttäen T7 sekvensointikittiä (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi).

Ekspressiotutkimukset pS510:n ja pS511 :n kanssa LB-nesteessä, joka sisälsi 50 pg/ml Carbenicilliniä 10 (Sigma, St. Louis, MO), yön yli viljellyt TG 2 -solut laimennettiin kymmenkertaisesti tuoreeseen elatusnesteeseen ja kasvatettiin 3 tuntia 37 °C:ssa. IPTG:tä (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin lopulliseksi konsentraatioksi 0,1 M ja viljelmiä kasvatettiin 37 °C:ssa vielä 3 tuntia. Bakteeripelletit sonikoitiin PBS 1% Triton X-100 -liuoksessa (Sigma, St. Louis, MO). Kun niitä oli sentrifugoitu 10 000 x g voimalla 15 mi-15 nuuttia, supematantit ja pelletit analysoitiin SDS-PAGE:lla ja immunoblottaus-me-netelmällä käyttäen polyklonaalista SCCE-spesifistä kananpojan antiseerumia.

Suuria määriä IPTG:llä indusoitavia proteiineja, joiden Mr oli noin 50 kD (pS510) ja 52 kD (pS511) ja joilla oli SCCE:n kaltainen immunoreaktiivisuus, todettiin pel-20 leteissä, jotka eivät liuenneet PBS-Triton X-100 -liuokseen (katso kuvio 17).

Supematantit sisälsivät PBS-Triton X-100:ssa sonikoinnin jälkeen GST/SCCE-fuu-sioproteiineja, joiden koko oli sama kuin liukenemattomissa pelleteissä, mutta nii-den määrät olivat pieniä liukenemattomiin pelletteihin verrattuna.

f«* » «* 25 * Φ f ·· Nämä tulokset osoittavat, että on mahdollista ilmentää SCCE:tä fuusioproteiinina * I GST:n kanssa ja sekvenssit, jotka vastaavat spesifisen proteaasin pilkkomiskohtaa pre-pro-SCCE-aminohapposekvenssissä, tekevät mahdolliseksi toistaa tämä koe tar- ei* koituksena tuottaa yhdistelmä-SCCE:tä bakteereissa. Tuotettu proteiini voidaan ! 30 liuottaa ureaan tai guanidiniumhydrokloridiin ja sitten puhdistaa kationisella ionin- vaihtokromatografialla, koska SCCE:llä on korkea isoelektrinen piste. Puhdistettu iti]i proteiini voidaan renaturoida dialysoimalla puskureita vastaan pienemmällä denatu- ϊΤϊ rointiainekonsentraatiolla ja sitten pilkkoa faktori Xa:lla GST-polypeptidin irrotta- f / . miseksi SCCEistä tai pro-SCCE:stä. GST/SCCE-fuusioproteiineja käytetään myös 35 immunogeeneina SCCE-spesifisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja immunosorbent- ; · ‘ teinä vasta-aineiden puhdistuksessa.

* · · t · I

• » 60 119027

Esimerkki 9

Yhdistelmä-humaani-SCCE:n ilmentäminen nisäkässoluissa Ekspressiovektorin kehittämiseksi yhdistelmä-SCCE:n tuottamista varten humaani-cDNA-sekvenssejä eristettiin plasmidista pS500 897 emäsparin EcoRI/Dral-frag-5 menttina. Tämä fragmentti alakloonattiin EcoRI- ja Smal-digeroituun pUC 19:ään, jolloin saatiin pS502. Plasmidi pS502 digeroitiin sitten EcoRIillä ja Sällillä SCCE-cDNA-sekvenssien eristämiseksi 0,9 kb:n fragmenttina, joka taas alakloonattiin pUC19-varianttiin, josta puuttui Hindlll-kohta, jolloin saatiin plasmidi pS503. Tämä pUC19-variantti kehitettiin digeroimalla pUC19:ää Hindlllilla, insertoimalla käyttä-10 en Klenowin entsyymiä ja religointia. Ekspressiovektoriin kloonauksen helpottami seksi SCCE-cDNA:n 5'-päähän vietiin Hindlll-kohta. Tämä tehtiin digeroimalla pS503:a EcoRIillä ja insertoimalla kytkijä, joka muuttaa kohdan HindIHiksi, SYM3603 5-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQIDNOilO. Saatu plasmidi, joka kantaa proteiinia, joka koodittaa osaa SCCE-cDNAista, jossa on Hindlll-kohta 5'-15 päässä ja Sali-kohta 3'-päässä, vastaavasti, nimettiin pS505:ksi.

Lopullinen ekspressiovektori saatiin ligatoimalla kolme erilaista DNA-fragmenttia. Ensiksi pS505 digeroitiin Hindlllilla ja Sällillä ja 0,9 kb fragmentti eristettiin.

20 Töiseksi ylävirran muriinimetaUotioneiinisäätelyosan distaaliosan, naudanpapilloo- mavirussekvenssien, kaniinin beta-globiini-genomifragmentin, joka tuo mRNAin käsittelysignaaleja, ja plasmidisekvenssien pML2d saamiseksi, seulonnan ja repli-kaation E. colissa mahdollistamiseksi (Waldenstrom et ai. 1992), vektori pS147 di-. ·. geroitiin Saclillä ja Sällillä ja noin 12 kbin fragmentti eristettiin.

: 25 * · t · · '... a Kolmanneksi, muriinimetallotioneiinipromoottorin proksimaaliosan eristämiseksi * ·; * plasmidi pS42, jossa johtosekvenssissä sijaitseva natiivi-Bglll on muutettu Hindin- • · * kohdaksi, digeroitiin Saclillä ja Hindlllilla ja suunnilleen 220 emäsparin fragmentti : eristettiin.

• · · ; 30 Näiden kolmen fragmentin ligoinnin tuloksena saatiin SCCE ekspressiovektori : pS507 (katso kuvio 18).

• · · • * · • · · . * . Ekspressiovektori pS507 keratransfektoitiin vektorin kanssa, joka sisälsi neomysiini- ./ 35 resistenssigeenin, jota ohjaa Harveys sarkoomaviruksen 5'-pään pitkä terminaalinen • · ’”·* toistuva sekvenssi ja jossa on SC40 polyadenylaatiosignaaleja (Lusky ja Botchan, : 1984) muriini-C127-soluihin (ATCC CRL 1616). Transfektiokokeet suoritettiin kal- •: ··I siumfosfaattisaostusmenetelmällä (Graham ja Van der Eb, 1973). Soluja viljeltiin 119027

Ham's F12/Dulbecco's modified Eagle's mediumissa (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) (1:1), johon oli lisätty 10% fetaalivasikanseerumia (HyClone, Logan, UT). Neomysiinille resistenttien solujen klooneja valikoitiin käyttäen 1,5 mg/ml G418:a (Gibco-BRL), ja 10-15 päivän seulonnan jälkeen resistentit so-5 lukloonit identifioitiin ja eristettiin emolevyiltä ja siirrettiin seuraaviin analyyseihin.

Yhdistelmä-SCCE-geenien ekspression analysoimiseksi valmistettiin kokonais-RNA eristetyistä solulinjoista. Kokonais-RNA valmistettiin C127-soluista ja erotettiin 1% formaldehydi-agaroosigeelille, siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja hybridisoitiin 10 32P-leimattuun SCCE-koettimeen. Koetin oli SCCE-cDNA:n 1070 emäsparin

HincII-fragmentti, joka oli eristetty digeroimalla pS500:a HincIIilla ja agaroosielekt-roforeesilla. Koemenetelmät olivat Ausubelin et ai. mukaiset. Northern blot -kokeet ja hybridisointi 32P-leimatulla SCCE-cDNA:lla osoittivat, että yhdistelmä-SCCE-mRNA voitiin detektoida useissa solulinjoissa, joissa oli SCCE-vektori, pS507.

15 Hyb-ridisaatiota ei todettu vertailunäytteissä, jotka oli johdettu C127-solulinjoista, jotka sisälsivät saman vektorin, mutta ilman SCCE-cDNA:ta (kuvio 19). Koko 1,4 kD vastaa odotettua kokoa.

Koottiin näytteitä käytetystä solunviljelynesteestä ja ne analysoitiin immunoblotta-20 us-menetelmällä. SDS-PAGE suoritettiin Laemmlin (1970) mukaan ja immunoblot-taukseen käytettiin kananpojan anti-natiivi-SCCE:tä detektointivasta-aineena. Entyymileimaukseen käytettiin erästä alkaalisella fosfataasilla leimattua anti-kanan-poika-IgG:tä (Sigma, St. Louis, MO). Tulokset on esitetty kuviossa 20.

• · • · *·* · 25 Yhdistelmä-SCCE:n ekspression analysoimiseksi valmistettiin kokonais-RNA ’ · · ·. Cl 127-soluista, jotka oli transfektoitu ekspressiovektorilla pS507. Vertailunäytteiksi * * valmistettiin kokonais-RNA sekä transfektoimattomista C127-soluista että C127-so- • · · • · · luista, jotka oli transfektoitu ekspressiovektorilla pS147. Vektori pS147 on saman- ::: lainen kuin pS507 paitsi että se sisältää cDNA:n ihmisen sappihappojen suoloilla • · · ‘ 30 stimuloitua lipaasia varten (Nilsson et ai, 1990) ihmisen SCCE-cDNA:n sijasta.

RNA valmistettiin Ausubelin et ai. (1992) mukaan. Northern blot -kokeet ja hybridi-saatio P-leimatulla SCCE-cDNA:lla osoittivat, että noin 1,4 kb:n yhdistelmäni : SCCE-mRNA oli detektoitavissa C 127-soluissa, jotka sisälsivät SCCE-vektorin ; pS507 (kuvio 19). Hybridisaatiota ei todettu vertailunäytteissä, jotka oli johdettu • · · *.·" 35 C 127-solulinjoista, jotka sisälsivät pS 147, tai transfektoimattomista C 127-soluista.

* * ’ .*' Yhdistelmä-SCCE-mRNA:n pituus oli odotetun mukainen.

• · * • · « • * · • · 62 119027 Käytetystä soluviljelynesteestä koottiin näytteitä ja analysoitiin SDS-PAGE:lla ja immunoblottaus-menetelmällä. Blotti kehitettiin kuten Blake et ai. (1984) kuvaavat. Saadut tulokset (katso kuvio 20) osoittavat, että C127-solut, jotka sisältävät pS507, tuottavat kolmea proteiinia, jotka reagoivat kaikkien käytettävissä olevien polyklo-5 naalisten kaniinin ja kananpojan-SCCE-vasta-aineiden kanssa samoin kuin anti-SCCE-monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka valmistettiin kuten esimerkissä 5 kuvataan. Reaktiivisilla yhdistelmä-SCCE-proteiineilla on näennäismoolimassa, joka noin 1 kD suurempi kuin puhdistetun natiivin humaani-SCCE:n moolimassa. Yhdistelmä-proteiinilla ei ole mitään proteolyyttistä aktiivisuutta. Verrattaessa 10 dedusoitua SCCE-aminohapposekvenssiä natiivin humaani-SCCE:n kokeellisesti määritettyyn NH-2 päähän ja muiden kymotrypsiinirikaltaisten proteaasien sekvens-seihin voidaan päätellä, että yhdistelmä-SCCE, joka on tuotettu C127-soluissa, on pro-entsyymimuodossa. Sekvenssitiedot osoittavat, että tämä pro-entsyymi voidaan aktivoida pilkkomalla proteolyyttisesti lysiini C-terminaalisella puolella sekvenssis- 15 sä ...AOGDKIIDGAP.....jossa alleviivattu sekvenssi on aktiivisen natiivin humaa- ni-SCCE:n NH-2 sekvenssi (SEQ ID NO:2, aa 5 - aa 6).

Esimerkki 10

Yhdistelmä-SCCE:n puhdistaminen ja karakterisointi 20

Puhdistaminen 1,3 mg natiivi-SCCE:tä vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta TE4b kytkettiin 1,5 ml:aan CNBr-aktivoitua Sepharosea (Pharmacia-LKB Biotech., Uppsala, : 1 2 3: Ruotsi) käyttäen valmistajan kuvaamaa menetelmää. 40 ml väliainetta, joka sisälsi ««· φ 25 SCCEitä, suodatettiin 0,45 pmin suodattimen läpi ja pantiin siten kolonniin. Kolon-·1·. ni pestiin useita kertoja 10 mM natriumfosfaatilla, 150 mM NaClilla, pH 7,2,ja _ s, eluoitiin sitten 0,1 M glysiini-HClilla, pH 2,5. Eluoitunut proteiini neutraloitiin heti .1" lisäämällä 0,1 tilavuutta 1 M Tris-HClia, pH 8,0.

• · 1 • 1 ♦ · 1 · 2 * · · 3 30 Aktivoiminen

Yhdistelmä-SCCE (4,6 pg 200 piissä), joka puhdistettiin käyttäen geeliä, johon oli kytketty monoklonaalinen vasta-aine (katso edellä), digeroitiin 4,6 piillä 0,1 mg/ml v1: trypsiiniä (painosuhde 10:1) 37 °C:ssa. Näytteitä (50 pl) otettiin 20 minuutin, 1 tun- : nin, 3 tunnin ja 20 tunnin kuluttua ja 5 pl 10 mM (4-amidiinofenyyli)metaani-sulfo- • 14 35 nyyliä (APMSF; Boehringer Mannheim, Saksa) lisättiin reaktion päättämiseksi. Pil-‘: 1 kotun SCCEin aktiivisuutta tutkittiin ei-pelkistävällä SDS-PAGE:llä kaseiinigeeleil- :.i,: lä, kuten esimerkissä 2.2 kuvataan. Saatujen SCCEin pilkottujen muotojen identi- •:": teetti tutkittiin pelkistävällä SDS-PAGE:llä ja sitten immunoblottauksella käyttäen 63 119027 kananpojan anti-natiivi-SCCE:tä ja sitten alkaalisella fosfataasilla merkittyä anti-ka-nanpoika-IgG:tä ja nitrosinitetratsoliumia ja 5-bromi-4-kloori~3-indolyylifosfaattia substraattina alkaaliselle fosfataasille.

5 N-terminaalinen sekvensointi

Affiniteetti-puhdistettu (edellä kuvatulla tavalla) SCCE, noin 35 pg, rakoblotattiin käyttäen Bio-Dot SF -yksikköä (Bio-Rad, Richmond, CA) Immobilon-kalvolle (Millipore, Bedford, MA). Kalvo pestiin sitten useita kertoja tislatulla vedellä kaiken Trisin ja glysiinin poistamiseksi. Se osa kalvoa, johon proteiini oli sitoutunut, 10 leikattiin irti ja sekvensoitiin käyttäen Applied Biosystemsin (Foster City, CA) 477A Pulsed Liquid Phase -sekvenaattoria, johon oli liitetty PTH 120A on-line analysaattori. Sekvensointi suoritettiin käyttäen normaalijakso-ohjelmia ja valmistajan kemikaaleja. Sekvenssi, joka saatiin kuudessa ensimmäisessä asemassa, oli glu-glu-ala-gln-gly-asp vastaten SEQ ID NO:2:n aminohappoja -7--2. Kuten tästä tulok-15 sesta voidaan päätellä, signaalipeptidi muodostuu 22 aminohaposta ja perustuu nadivin aktiivisen SCCE:n N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin, propeptidi muodostuu seitsemästä aminohaposta.

Deglykosylaatio 20 Puhdistettua yhdistelmä-SCCE:tä (5 pg) ja natiivi-SCCE:tä (20 pg) keitettiin 3 minuuttia 20 pl:ssa 0,5% SDS:ä ja 0,1 M β-merkaptoetanolissa. Näytteet laimennettiin natriumfosfataasipuskurilla, pH 8,6, ja Nodinet P-40:llä lopullisiin konsentraatioihin 0,2 M ja 1,25%, vastaavassa järjestyksessä. N-Glycosidase F® (Boehringer :': Mannheim) lisättiin (rekombinantti-proteiiniin 0,6 yksikköä ja natiiviin proteiiniin :1... 25 1,2 yksikköä entsyymiä) ja reaktioseosta inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. SDS:n loppu- •1\ konsentraatio näytekokeessa oli 0,17%. N-Glycosidase F®:llä käsitelty SCCE ana- lysoitiin 8-18% SDS-PAGE:llä ja sen jälkeen immunoblottauksella, kuten edellä ku- • · · . 1" # vattiin. Saadut tulokset osoittivat kahden ylemmän raidan näennäismoolimassan pie- nenemistä, kun taas alimman raidan näennäismoolimassa pysyi muuttumattomana • · · *·1 1 30 (kuvio 23). Tämä osoittaa, että C127-soluissa tuotettu yhdistelmä-SCCE esiintyy kahdessa N-glykosyloidussa muodossa ja yhdessä glykosyloitumattomassa muodos- sa. Tämä tulos on analoginen sen kanssa, mikä voidaan nähdä aktiivisen natiivi- ·1 SCCE:n yhteydessä (kuvio 23).

« · • · · t · · • « • · · • · • · * · · • « · • ·

• M

64 1 1 9027

Esimerkki 11 SCCEitä sisältäviä koostumuksia

Koostumukset voidaan valmistaa konventionaalisilla farmaseuttisilla menetelmillä, joihin sisältyy aktiivikomponentin perusteellinen sekoittaminen muiden aineosien 5 kanssa. Kaikki prosenttimäärät ovat painoprosentteja.

Koostumukset, jotka sisältävät useamman kuin yhden aktiivisen yhdisteen, kuuluvat nekin keksinnön alaan. Seuraavat esimerkit voidaan siis toteuttaa niin, että ne sisältävät useamman kuin yhden aktiivisen aineen. Samalla tavoin termi "SCCE" voidaan 10 korvata "pro-SCCE:llä". Koostumukset, jotka sisältävät SCCErtä samoin kuin pro-SCCE:tä, sisältyvät siis keksinnön alaan.

SCCE = natiivi tai rekombinantti sarveiskerroksen kymotryptinen entsyymi, valinnaisesti yhdistettynä muihin aktiivisiin yhdisteisiin 15 q.s. = quantum satis Ö/v-emulsiovoide % SCCE 0,01-20

Polysorbaatti 80 0,5 20 Emulgoiva vaha 5

Mineraaliöljy 4

Dimetikoni 1

Glyseryylistearaatti 6

Antioksidantti q.s.

j\ ’ 25 EDTA 0,1 • · ... Säilytysaine q.s.

" Glyseriini 85% 4

Propeeniglykoli 7 :l:m: pH:n säätelyaine 0,01-10 0 : 30 Vesi 65-76

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, : V: emulgointisysteemit (öljyfaasin ja vesifaasin suhde ja emulgointiaineiden ja muiden t/ . relevanttien täyteaineiden pitoisuus).

• · · • · · · • i • · • · · • · · • · · • · · 1 • · 65 1 1 9027 V/ö-emulsiovoide % SCCE 0,01-20

Setyylialkoholi 0,5

Lanoliini 5 5 Valkoinen vaseliini 10

Mineraaliöljy 45

Antioksidantti q.s.

EDTA 1 pH:n säätelyaine 0,01 -10 10 Säilytysaine q.s.

Vesi 15-25

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, emulgointisysteemit (öljyfaasin ja vesifaasin suhde ja emulgointiaineiden ja muiden 15 relevanttien täyteaineiden pitoisuus).

Voide % SCCE 0,01-20

Lanoliini 15 20 Vaseliini 58-68

Mineraaliöljy 15

Dimetikoni 2

Antioksidantti q.s.

• » :\ 25 Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit.

* " Linimentti % SCCE 0,01-20 « · · '···'' Emulgointivaha 4 !.: * 30 Glyseryylistearaatti 3

Mineraaliöljy 15 ·\Λ Polysorbaatti 80 0,6

Glyseriini 85% 3 / . Propeeniglykoli 5 *;,/ 35 Antioksidantti q.s.

!·;·5 EDTA 0,1 Säilytysaine q.s.

·:··: Vesi 59-69 66 119027

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, emulgointisysteemit (öljyfaasin ja vesifaasin suhde ja emulgointiaineiden ja muiden relevanttien täyteaineiden pitoisuus).

5 Geeli % SCCE 0,01-20

Trietanoliamiini 1-5

Etyylialkoholi 10

Setyylialkoholi 10 10 Selluloosakumi 5 EDTA 0,1 Säilytysaine q.s.

Vesi 59-74 15 Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: geelejä muodostavat aineet, antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet.

Liuos, vesi % SCCE 0,01-20 20 pH;n säätelyaine 0,01-10

Setyylialkoholi 4

Propeeniglykoli 5 Säilytysaine q.s.

Antioksidantti q.s.

* 25 EDTA 0,1 ···, Vesi 37-89 • · • ♦ f • * ·

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, *;;,! rasvanpalautusaineet, kostutusaineet.

f * * 30

Liuos, etyylialkoholi % KV SCCE 0,01-20 v : pH:n säätelyaine 0,01-10 X : Propeeniglykoli 5 *·/ 35 Setyylialkoholi 3 * · *!* Antioksidantti q.s.

*.:!* EDTA 0,1 *ϊ**ί Etyylialkoholi 50-95 67 119027

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, kostutusaineet.

Suspensio % 5 SCCE 0,01-20

Karbomeeri 0,5

Selluloosakumi 0,5

Polysorbaatti 80 0,1

Propeeniglykoli 5 10 Askorbiinihappo 0,05

Setyylialkoholi 4

Polysorbaatti q.s.

EDTA 0,1 pH:n säätelyaine 0,01-10 15 Vesi 72-80

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, suspendointiaineet.

20 Pasta % SCCE 0,01-20

Vaseliini 45-55

Sinkkioksidi 40 , Mineraaliöljy 5 « t ···’ : 25 Antioksidantti q.s.

i* 1 « · • ·· ··> ..·* Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, pastapohjat.

• · · t t · ··*

Puikko % t:V: 30 SCCE 0,01-20

Cutina LM 70-80 , Myristyylialkoholi 5 * · ·

Risiiniöljy 2 • « · \ Mehiläisvaha, valkoinen 10 • * 35 Vaseliini, valkoinen 3

Antioksidantti q.s.

+ * · • ♦ ·

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, puikkopohjat.

*♦ · 68 1 19027

Spray - manuaalinen % SCCE 0,01-20 pH:n säätelyaine 0,01-10

Etyylialkoholi 30 5 Glyseriini 85% 5

Propeeniglykoli 5

Setyylialkoholi 3

Antioksidantti q.s.

EDTA 0,1 10 Säilytysaine q.s.

Vesi 22-57

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, rasvanpalautusaineet, kostutusaineet.

15

Spray - aerosoliliuos % SCCE 0,01-20 pH:n säätelyaine 0,01-10

Isopropyylimyristaatti 3 20 Propeeniglykoli 5

Etyylialkoholi 48-92

Ponneaine q.s.

·’· Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: rasvanpalautusaineet, kostutusaineet.

* « « · 25 j «1 ·» , Spray - aerosolivaahto % , SCCE 0,01-20

Vaha 3

Etyylialkoholi 50-55 : 30 EDTA 0,1

Vesi 20-35 *

Ponneaine q.s.

• a a * » · ; Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: ponneaineet, antioksidantit, kelatointiaineet.

* 1 · 35 t : ··» • w m • 1 · • •f 69 1 1 9027

Spray - aerosoliemulsio % SCCE 0,01-20

Selluloosajohdokset 1-3

Tween® 60 1,0 5 Glyseryylistearaatti 2,5

Kaliumsorbaatti 0,2

Antioksidantti q.s.

EDTA 0,1 Säilytysaine q.s.

10 pH:n säätelyaine 0,01-10

Vesi 50-95

Ponneaine q.s.

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, 15 emulgointisysteemit (öljyfaasin ja vesifaasin suhde ja emulgointiaineiden ja muiden relevanttien täyteaineiden pitoisuus).

Shampoo % SCCE 0,01-20 20 Natriumlauryylisulfaatti 40

Setyylialkoholi 3

Vaahdotusaine tai hoitoaine 3

Natriumkloridi 2 ·*· Antioksidantti q.s.

* 25 EDTA 0,1 *···. Säilytysaine q.s.

Vesi 43-53 • · i • · v «·* • ψ I · ·

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: shampoopohjat, antioksidantit, kelatointiaineet, ·* ’ 30 säilytysaineet, kostutusaineet, hoitoaineet.

*,·.* Body Shampoo % sT: SCCE 0,01-20 . Natriumlauryylisulfaatti 40 t..* 35 Setyylialkoholi 4 7 Vaahdotusaine tai hoitoaine 3 *.·,’·* Helmiäisaine 10 •i·*: Säilytysaine q.s.

70 119027

Antioksidantti q.s.

EDTA 0,1

Vesi 40-50 5 Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: shampoopohjat, antioksidantit, kelatointiaineet, säilytysaineet, lisäaineet, hoitoaineet.

Lääkesaippua % SCCE 0,01-20 10 l-Hydroksietaani-l,l-difosforihappo 0,2

Glyseriini 0,8

Kookosöljyn ja talin natriumsaippua 88-98

Lisäaineet 0,7 15 Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: kostutusaineet, saippuapohjat.

Puuteri % SCCE 0,01-20

Talkki 65-70 20 Kaoliini 6

Titaniumoksidi 2

Kalsiumkarbonaatti 8

Magnesiumstearaatti 3 . Maissi- tai kauratärkkelys 5-10 . 25 • · : Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: puuteripohjat, säilytysaineet, painosuhteet.

* • · • ·

Hiustenhoitoaine % : SCCE 0,01-20 30 Setyylialkoholi 2,2

Alkyylitrimetyyliammoniumkloridi 1,25 . .·. Oktyylidekanoli 1 .···. Sitruunahappo 1 ’ EDTA 0,1 • · 35 Säilytysaine q.s.

Antioksidantti q.s.

. .·. Vesi ad 100.

* · f • · · • · 7i 1 19027

Esimerkkejä vaihtuvista tekijöistä: hoitoaineet, säilytysaineet, kelatointiaineet, anti-oksidantit.

Samalla tavoin voidaan valmistaa paikallisesti käytettäviä koostumuksia, jotka sisäl-5 tävät yhdisteen, joka kykenee inhiboimaan tai tehostamaan SCCE:n aktiivisuutta.

Esimerkki 12

Yhdistelmä-SCCE:n desmosomindigerointiaktiivisuus

Komeosyyttejä, jotka sisälsivät ehjiä desmosomeja, poistettiin ihosta teipillä sarveis-10 kerroksen syvemmistä kerroksista, ja levyt irrotettiin heksaanilla ja kuivattiin erissä. Komeosyyttieriä (3 mg) uutettiin 1 M natriumkloridilla 4 °C:ssa luontaisten prote-aasien liuottamiseksi ja sitten ne pestiin perusteellisesti inkubointipuskurilla (01 M Tris/HCl pH 8,0) endogeenisen proteolyyttisen aktiivisuuden poistamiseksi valmisteista. Inkuboinnit suoritettiin 0,1 M Trisissä pH 8,0 siten, että läsnä oli 10 μg yhdis-15 telmä-SCCE:tä tai ilman sitä, 24 tuntia 37 °C:ssa. Näyttö desmosomien hajoamisesta entsyymin vaikutuksesta osoitettiin mittaamalla desmosomien markkeriproteiinin desmogleiini I:n (DG I) tasot. Se eristettiin levyistä uuttamalla 8 M urea/2% SDS/β-merkaptoetanoli-puskurissa ja sitten puhdistamalla DG I glykoproteiini käyttämällä konkanavaliini A -affiniteettikromatografiaa. Konkanavaliini A -eluaatti fraktioitiin 20 SDS-PAGE:llä ja siirrettiin elektroforeesilla PDVF-kalvolle immunoblottausta varten.

DG I identifioitiin käyttäen jotakin spesifistä antiseerumia ja detektoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssiä. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4 ··: :· 25 • 1 • 1 • · 1 • _______ • Verrokki + rSCCE, 10pg * 1 · • · · *#· — ——- ' -—----- : DG I (mielivaltaista yksikköä/mg levyjä) 7950 + 4992 4059 + 2360 ."1· 30 • · · -----------—--

Taulukossa 4 esitetyt tulokset osoittavat, että yhdistelmä-SCCE kykenee hajoitta- * 1 1 !!’. maan solunsisäisiä kohesiivisia rakenteita sarveiskerroksessa in vitro -kokeessa.

* · 1 » · · * • · • · · • · 1 • · • t 1 • · • 1 • 1 1 • · · • · 1 • · 1

Esimerkki 13 72 119027

Inhibiittorien vaikutukset yhdistelmä-SCCE:n aktiivisuuteen Tutkittiin inhibiittorien aprotiniini, kymostatiini ja sinkkisulfaatti vaikutusta rSCCE:n S-2596:ta hydrolysoivaan aktiivisuuteen. Koemenetelmä on luonnosteltu 5 esimerkissä 3.2. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

Taulukko 5

Inhibiittori Konsentraatio (μΜ) Aktiivisuus (%) 10 _

Aprotiniini 0 100 0,35 51,6 1,4 21,2 5,7 7,4 15

Kymostatiini 0 100 0,64 74,9 2,56 33 41 1,9 20

ZnSO40 100 15,6 50,7 62,5 19,4 250 5,1 :::: 25 _ • « • · · • 1 1 * .·1 Kuten edellä olevassa taulukossa 5 on osoitettu, aprotiniini, kymostatiini ja sinkki- ionit inhiboivat yhdistelmä-SCCE:n S-2586:ta hydrolysoivaa aktiivisuutta samalla ·,j · tavoin kuin natiivi entsyymi.

• 1 · I · · » · · • · · • · 1 • · ·

Ml • · 1 • · · * * t • · 1 * · · • · • · · • · • · * · 1 • · • · · • · 1 * 1 73 1 1 9027

Viitejulkaisut - Ausubel et al. (1992). Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.

- Blake et al. (1984). Anal. Biochem 136:175-179 - Carlsson et al. (1985). Molec. Inunun. 22:1073-1080 5 - Caughey et al. (1991). J. Biol. Chem. 266:12956-12963 - Chomczynski ja Sacchi (1987). Anal. Biochem. 162:156-159 - Egelrud ja Lundström (1990). J. Invest. Dermatol. 95:456-459 - Egelrud ja Lundström (1991). Arch. Derm. Res. 283:108-112 - Egelrud (1992). Eur. J. Dermatol. 2:50-55 10 - Gorbsky et al. (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:810-814 - Graham ja Van der Eb (1973). Virology 52:456-467 - Hogan, B., Constantini, F. ja Lacy, E. (1986). Manipulating the Mouse Embryo.

A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press.

- Horre et al. (1984). Comp. Biochem. Physiol. 77B :349-354 15 - Laemmli (1970). Nature 227:680-685 - Lee at al. (1987). Anal. Biochem. 166:308-312 - Lowry et al. (1951). J. Biol. Chem. 193:265-275 - Lundström ja Egelrud (1988). J. Invest. Dermatol. 91:340-343 - Lundström ja Egelrud (1990 a). Arch. Derm. Res. 282:234-237 20 - Lundström ja Egelrud (1990 b), J. Invest. Dermatol. 94:216-220 - Lundström ja Egelrud (1991). Acta Derm. Venereol. (Stockholm) 71:471-474 - Lusky ja Botchan (1984). Cell 36:391-401 - Matsudaira, P. (1987). J. Biol. Chem. 262:10035-10038 - Mizutani et al. (1991). J. Clin. Invest. 87:1066-1071 .··* : 25 - Nilsson et al. (1990). Eur. J. Biochem. 192:543-550 : *·* - Norris (1990). J. Invest. Dermatol. 95:371 - Salvesen et al. (1987). Biochemistry 26:2289-2293 : - Sambrook et al. (1989). Molecular Clonin, A Laboratory Manual. 2. painos. Cold : Spring Harbor ,*:* : 30 - Schechter et al (1983). J. Biol. Chem. 258:2973-2978 - Schechter et al. (1989). J. Biol. Chem. 264:21308-21315 - Schwartz et al. (1987). J. Immunol. 138:2611-2615 - Takahashi et al. (1987). J. Soc. Cosmet, Chem. 38:21-28 !\ * - Toulta et al. (1989). BBRC 158:569-575 V·; 35 - Towbin et al (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:4350-4354 - Waldenstrom et al (1992). Gene 120:175-181 - Wintroub et al. (1986). J. Clin. Invest. 77:196-201 - WO 93/04172 (Symbicom Aktiebolag jättänyt 19. elokuuta 1992) • · 74 119027

Sekvenssiluettelo (1) YLEISINFORMAATIO: 5 (i) Hakija:

(A) Nimi: SYMBICOM AB

(B) Katuosoite: PO BOX 1451

(C) Kaupunki: UMEÄ (E) Maa: RUOTSI

10 (F) Postinumero (ZIP): S-901 24 (ii) Keksinnön nimitys: Rekombinantti sarveiskerroksen kymotryptinen entsyymi (SCCE) 15 (iii) Sekvenssien lukumäärä: 10 (iv) Tietokoneella luettava muoto: (A) Tietoväline: levyke (B) Tietokone: IBM PC yhteensopiva

20 (C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS

(D) Ohjelmisto: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) SEQ ID NO: l:tä KOSKEVAT TIEDOT: « ··: ! 25 (i) SEKVENSSITUNNUSMERKIT: *i '* (A) Pituus: 986 emäsparia • · · ..·* (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksisäikeinen i :‘: (D) Topologia: lineaarinen ;:i·; 3o

(ii) Molekyylityyppi: cDNA

* • · i • · ·

tIj·. (iii) Hypoteettinen: EI

* * ·

35 (vi) Anti-sense: EI

· : : · · . (vi) Alkuperäinen lähde: • tt (A) Organismi: Homo sapiens • · 75 119027 (ix) Ominaisuus:

(A) Nimi/Avain: CDS

(B) Sijainti: 25...786 5 (ix) Ominaisuus: (A) Nimi/Avain: sig-peptidi (B) Sijainti: 25...90 10 (ίχ) Ominaisuus: (A) Nimi/Avain: mat-peptidi (B) Sijainti: 112...783 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEO ID NO: 1: GAATTCCGCG GATTTCCGGG CTCC ATG GCA AGA TCC OTT CTC CTG CCC CTG 51

Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu -29 -25 CAG ATC CTA CTG CTA TCC TTA GCC TTG GAA ACT GCA GGA GAA GAA GCC 99

Gin lie Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala -20 -15 -10 -5 CAG GGT GAC AAG ATT ATT GAT GGC GCC CCA TGT GCA AGA GGC TCC CAC 147

Gin Gly Asp Lys lie lie Asp Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His 15 10 CCA TGG CAG GTG GCC CTG CTC AGT -GGC AAT CAG CTC CAC TGC GGA GGC 195

Pro Trp Gin Val Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gin Leu His Cys Gly Gly *·* * IS 20 25 *· • e

I M

*...t GTC CTG GTC AAT GAG CGC TGG GTG CTC ACT GCC GCC CAC TGC AAG ATG 243 ..* Val Leu Val Asn Glu Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Mec . .*. 30 35 40 • · » *·* j.:'; AAT GAG TAC ACC GTG CAC CTG GGC AGT GAT ACG CTG GGC GAC AGG AGA 291 ···, Asn Glu Tyr Thr Val His Leu Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg • * 45 50 55 60 . GCT CAG AGG ATC AAG GCC TCG AAG TCA TTC CGC CAC CCC GGC TAC TCC 339 ·,·.* Ala Gin Arg lie Lys Ala Ser Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser 65 70 75 • · · • ,·* : ACA CAG ACC CAT GTT AAT GAC CTC ATG CTC GTG AAG CTC AAT AGC CAG 387 *· *ί Thr Gin Thr His Val Asn Asp Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gin t***; 80 85 90 Φ · · . GCC AGG CTG TCA TCC ATG GTG AAG AAA GTC AGG CTG CCC TCC CGC TGC 435 ’***, Ala Arg Leu Ser Ser Met Val Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys *:··: 95 loo 105 76 119027 GAA CCC CCT GGA ACC ACC TGT ACT GTC TCC GGC TGG GGC ACT ACC ACG 4 83

Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys Thr Vai Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr 110 HS 120 AGC CCA GAT GTG ACC TTT CCC TCT GAC CTC ATG TGC GTG GAT GTC AAG 531

Ser Pro Asp Vai Thr Phe Pro Ser Asp Leu Met Cys Vai Asp vai Lys 125 130 135 140 . CTC ATC TCC CCC CAG GAC TGC ACG AAG GTT TAC AAG GAC TTA CTG GAA 579 “* Leu Ile Ser Pro Gin Asp Cys Thr Lys Vai Tyr Lys Asp Leu Leu Glu 145 150 155 AAT TCC ATG CTG TGC G CT GGC ATC CCC GAC TCC AAG AAA AAC GCC TGC 627

Asn Ser Met Leu Cys Ala Gly Ile Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys 160 165 170 AAT GGT GAC TCA GGG GGA CCG TTG GTG TGC AGA GGT ACC CTG CAA GGT 675

Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Arg Gly Thr Leu Gin Gly 175 180 185 CTG GTG TCC TGG GGA ACT TTC CCT TGC GGC CAA CCC AAT GAC CCA GGA 723 10 Leu Vai Ser Trp Gly Thr Phe Pro Cys Gly Gin Pro Asn Asp Pro Gly 190 195 200 GTC TAC ACT CAA GTG TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATA AAT GAC ACC ATG 771

Vai Tyr Thr Gin Vai Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met 205 210 215 220 AAA AAG CAT CGC TAACGCCACA CTGAGTTAAT TAACTGTGTG CTTCCAACAG 823

Ly e Lys. Hi s Arg 225 AAAATGCACA GGAGTGAGGA CGCCGATGAC CTATGAAGTC AAATTTGACT TTACCTTTCC 883 ! TCAAAGATAT ATTTAAACCT CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGG TAAAGACCTA 943 • e e e AAACCAAAAC AAATAAAGAA ACACAAAACC CTCAACGGAA TTC 986 • e • e e «et • · · e·· e · ··}} (2) SEQ ID NO: 2:TA KOSKEVAT TIEDOT: | 4 · I ♦ * (i) SEKVENSSITUNNUSMERKIT: e 20 (A) Pituus: 253 aminohappoa (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen • «· « · (ii) Molekyyiityyppi: proteiini e (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 2: » e 77 119027 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 2:

Met Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu Gin lie Leu Leu Leu Ser Leu *29 -25 -20 -15

Ala Leu Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala Gin Gly Asp Lys lie lie Asp -io -5 i

Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His Pro Trp Gin Val Ala Leu lieu 5 10 15

Ser Gly Asn Gin Leu His Cys Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Arg Txp 20 25 30 35

Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Het Asn Glu Tyr Thr Val His Leu 40 45 50

Gly Ser Asp Thr lieu Gly Asp Arg Arg Ala Gin Arg He Lys Ala Ser 55 60 65

Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser Thr Gin Thr His Val Asn Asp 70 75 80

Leu Met lieu Val Lys Leu Asn Ser Gin Ala Arg Leu Ser Ser Met Val 85 90 95

Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys Glu Pro Pro Gly Thr Thr Cys 100 105 110 115 >t|1: Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp Val Thr Phe Pro *.t1 1 120 125 130 e ·

• M

• ***· Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys Leu lie Ser Pro Gin Asp Cys *·1 135 140 145 * 1 1 • · · *·» • m·' Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Asn Ser Met Leu Cys Ala Gly ί.Ι I 150 155 160 • · f 1 1 is· * lie Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro 165 170 175 *·!1 Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gin Gly Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe jT: 180 185 190 195 e ·1·,1 Pro Cys Gly Gin Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gin Val Cys Lys *;,1,1 200 205 210 : : II» • Phe Thr Lys Trp lie Asn Asp Thr Met Lys Lys His Arg : 215 220 • a · · (2) SEQ ID NO: 3:a koskevat tiedot: 78 119027 (i) Sekvenssitunnusmerkit; (A) Pituus: 24 aminohappoa 5 (B) Tyyppi: aminohappo (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi; peptidi 10 (iii) Hypoteettinen: ei (v) Fragmentin tyyppi: N-terminaalinen (vi) Alkuperäinen lähde: Homo sapiens 15 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 3:

Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Cys Gly Ser Xaa Pro Xaa Gin Vai 15 10 15

Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gin Leu 20 20 (2) SEQ ID NO: 4:ä koskevat tiedot: (i) Sekvenssitunnusmerkit: m « · • · I’.* ’ (A) Pituus: 17 emäsparia 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen * * 1.::

j”*; (ii) Molekyylityyppi: DNA

30 ·, (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 4: e · « #·· #»* * * * • · * 4.’ · athathgayg gngcncc ♦ f* • « *·· t : • · · » * * • * · ··· » · (2) SEQ ID NO: 5:tä koskevat tiedot: 79 1 1 9027 (1) Sekvenssitunnusmerkit: (A) Pituus: 21 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

10 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 5: GTGGCGACGA CTCCTGGAGC C 21 (2) SEQ ID NO: 6:ta koskevat tiedot: 15 (i) Sekvenssitunnusmerkit: (A) Pituus: 21 emäsparia . (B) Tyyppi: nukleiinihappo S * (C) Säikeisyys: yksinkertainen «*« ψ " 20 (D) Topologia: lineaarinen S S · «·· • · i · ·

(ii) Molekyylityyppi: DNA

(xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 6: • · * • · · • · * acaccagacc aactggtaat g 21 * » • t • · · * »· * · • · · 1 : «·· * * • * * I f « ·· • · 1 1 9027 (2) SEQ ID NO: 7:ä koskevat tiedot: 80 (1) Sekvenssitunnusmerkit: (A) Pituus: 21 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (ii) Molekyylityyppi: DNA 10 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 7: _ 21

TGGGTGGGAG CCTCTTGCAC A

(2) SEQ ID NO: 8:a koskevat tiedot: 15 (i) Sekvenssitunnusmerkit: .*, (A) Pituus: 42 emäsparia *« • '·· (B) Tyyppi: nukleiinihappo 1 *a * ^ *1 (C) Säikeisyys: yksinkertainen • · t 41* i (D) Topologia: lineaarinen * *· « * · V * 20

(ii) Molekyylityyppi: DNA

i * t ♦ # * * · · •M • » « · * (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 8: ψ · · ♦ M * CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TATTATTGAT GGCGCCCCAT GT 42 44* i ·*· 25 ·· * a e · ·« * • · (2) SEQ ID NO: 9:ä koskevat tiedot: 81 119027 (1) Sekvenssitunnusmerkit: (A) Pituus: 42 emäsparia 5 (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Säikeisyys: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen

(ii) Molekyylityyppi: DNA

10 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 9: CGTGGATCCA TCGAAGGTCG TTTGGAAACT GCAGGAGAAG AA 42 (2) SEQ ID NO: 10:tä koskevat tiedot: 15 (i) Sekvenssitunnusmerkit: « i · ”* ' (A) Pituus: 18 emäsparia t *·· * "*» (B) Tyyppi: nukleiinihappo f »

V

’»·’ (C) Säikeisyys: yksinkertainen i ifl · ·:*. 20 (D) Topologia: lineaarinen *

t :’: (ii) Molekyylityyppi: DNA

··* • * > ψ ψ * a f V*: (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO: 10:

Mf *” AATTGTGGAA GCTTCCAC 18 C · * 9 9 ♦ ·· * • ,·»* I • 9 119027

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

82 (PCT Rule A. The indications made below relate to Uic microorganism referred to in the description on page 12 , line 2 4 , D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet { ]

Name of depositary insumiion

European Collection of Animal Cell Cultures

Address of depositary institution (iteltJitg positt cede end tauury)

Porton Down

Salisbury, Wiltshire SP4 OJG United Kingdom

Date of deposit Accession Number 18 June 1993 ECACC 93061817 C. ADDITIONAL INDICATIONS (lotto Uamk if tot tppBahty This information is continued on tn additional ibeet | 1

As regards the respective Patent Offices of the respective designated states, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Rfthc indicauom <rc not for til impMidSuie) • __ _ • · e · · · «· • · e · e • · · • · e · • · ♦ • e · “I — ......... ..........

: e. separate furnishing of indications (λ».^**;/** w&«ur> ··· 1 _____ _

. 1 ; 1 , The indiationi listed below will be submitted io the International Bureau la ter {specify the fotot l tottrt cfthritAtctuons e.g^ VtenaiM

·.· · Member of Depota·) e • 1 · • · 1 e e · · · * · · * • " For receiving Office use only ......... " '»"i ~ For International Bureau use only -- ~ [~X I This sheet was received with the international application | | This sheet was received by the International Bureau on: «·· • · • 1 * · e ettmm^1,1 1 '1 1 1 . Authorized offiur Authorized officer **·\ Χ^ΙογΊτ'1'^ * 1 Fomi PCT/R0/134 (July ty92) 119027

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

83 (PCT Rule Obis) A. The indicaiion* made below relate to the microorganism referred to in the description on page ^ , line ^3 .

D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are Identified on an additional sheet f^|

Name of depoiitary insiinuion

European Collection of Animal Cell Cultures

Address of depositary institution (including postal tadc and country)

Porton Down

Salisbury, Wiltshire SP4 OJG United Kingdom

Date of deposit Accession Number 18 June 199 3_ ECACC 93061816 C. ADD! t lONAL INDICATIONS (WUmi if net applicable) This information is continued on an additional sheet | *[

As regards the respective Patent Offices of the respective designated statds, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (iftheindleotions art not for alldea/nasodStales) • · • · ··· · ··

• * I

• »· I

• I

• *· I

• I m * * · • * · ______________________ E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if net applicable) * · * ... .--— , — __ *** * Tbetndiauonslistedbe)owwi||bcsubmiucdioUieimcnuiionalQureaulaierfMeoAiA«|CMnfnMu'e«riA«MdicauanacL· 'Accession . · I * . Humber a[ Deposit') • · · * • · · • · · ··· • e ·

* · · 1 " ....... ' 1 - him n n I I

• · • r^——— For receiving Office use only - - ---—i ........— For International Bureau use only ' — · I X I This sheet was received with the international application | | This sheet was received by the International Bureau on: *· * • ♦· • · · Authorized officer , j Autboriud officer

..· A.' Loris J

Form PCT/RO/134 (July 1992)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

84 119027 (PCT Rule 13bis) A. The indications made below relate to the microorganism referred to in the description on page ^3 . line __________ · D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet □

Name of depositary institution

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)

Address of depositary institution (inclyd'tng pastel code end country)

Maschroder Weg lb D-38124 Braunschweig Federal Republic of Germany-

Date of deposit Accession Number 11 May 1993 DSM 8282 C. ADDITIONAL INDICATIONS (In1·2hUniif ner tppliubUt) This informstion is continued on an additional sheet ( |

As regards the respective Patent Offices of the respective designated states, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if the indiuLenf arc not lor alt ioifnatd Sloia) • ♦ » · *«« 1 ♦ · • · • 2· ··· ·· * · · . _ _ _ ♦ 1 · ir......2 r· => -p·..» i "tfi^BaBagseaa^sg^sagsgs^ • E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if net apptieeble) e · · r - . . - , - - j-r - , * 1 2 1 The indication2 listed below will be submitted to the international Bureau later (rpeei/y Oufount nature of Ute inJiaiionj e./, ‘Acuta»i .3. Number of DepetW) fee • · · 2 • 1 · «·· • · 1 3 • # · 1 · T"1· 1 1 -......1. TI-J-- -1- [· II INM·· JLJ ΙΙΙΙΓ I T I..............

• I-m — - — For receiving Office uae only —i.i — For International Bureau use only ...........

, 1, 1 Qj] This sheet was received with the international application Q This sheet was received by the International Bureau on: *♦ · ·»· { · — ------- ·»· Authorized office! ' / Authorized officer A. Lons * I 1 1 I Form PCT/RO/134 (July 1992)

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

85 1 1 9027 (PCT Rule 13ύύ) Λ. The indication! made below relate to the micrnorganiim referred to in the deaeripiion on page . line .

D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional aheel )' ]

Name of deposiury institution

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)

Address of deposiury institution (ine/iidinj postal cede and camrryj

Maschroder Weg lb D-38124 Braunschweig Federal Republic of Germany·

Date of deposit Accession Number 11 May 1993 DSM 8281 C. ADDITIONAL INDICATIONS {leave ttani if not applicable) This information is continued on an additional sheet □

As regards the respective Patent Offices of the respective designated states, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been ~ refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (tfAcinUcaioaftteaetforall itäpiauiSiaia) e · • ·· · • e • · • · · ··· * • · • a · • · · ; E, SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave bleak if not applicable) • · · * .

* , The indication! lilted belowwill betubmiued to the International Bureau later (specify the four» I Marc ofthein£catiaas t j, ‘Actaaen ·.· · Somber of Deposit') • · · • · » ··· • · · • · *

• . . JJ

• _ - For receiving Office uie only ........ 1 1 1 For International Bureau me only —— ·,*·* Ξ Thu sheet wu received wilt the international application | | Thu sheet wm received by the International Bureau on: ♦ · · i : * Authorized officer / · Authorized officer

v.’.: 4- <ln> S

....: A. Loris_ _

Fono PCT7R 0/134 (July 1992)

Claims (22)

86 119027

1. Nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa polypeptidiä, joka aktiivisessa muodossaan kykenee hajottamaan substraatin MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), jota polypeptidin aikaansaamaa hajottamista inhiboi aprotiniini, kymostatiini ja 5 sinkkisulfaatti, ja joka polypeptidi: a) sisältää aminohapposekvenssin, joka on vähintään 80-%:isesti homologinen SEQ ID NO:2:n aminohapposekvenssin 1-224 kanssa; b) sisältää aminohapposekvenssin, jonka olennainen 20 aminohapon ketju on vähintään 95-%:isesti homologinen saman pituisen aminohappoketjun kanssa, joka on valittu SEQ ID

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että sillä on 15 vähintään 90 %:n homologia SEQ ID NO: 1 :ssä esitetyn sekvenssin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se on a):n tai b):n mukaisen sekvenssin alasekvenssi, jonka koko on vähintään 15 nukleotidia . • · • · · • · · ΙΓ

* 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, • · · että se hybridisoituu SEQ ID NO: 1 :ssä esitetyn sekvenssin kanssa erittäin ankarissa • · 20 olosuhteissa ja että sen koko on vähintään 15 nukleotidia. • · · • · · ·«* • 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että • · · · sillä on SEQ ID NO:ssa 1 esitetty sekvenssi tai sen alasekvenssi, jonka koko on vähintään 15 nukleotidia. • *

5 Escherichia coli, jokin hiiva, alkueläin tai solu, joka on johdettu jostakin monisoluisesta organismista, kuten jostakin sienestä, hyönteissolu, kasvisolu, nisäkässolu tai solulinja, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 6 mukaisen ekspressiovektorin.

6. Replikoituva ekspressiovektori, tunnettu siitä että se sisältää ja kykenee * * * 25 välittämään minkä tahansa patenttivaatimuksissa 1 - 5 määritellyn mukaisen ,\ · nukleotidisekvenssin ekspressoitumisen. * · · • · • * ·

7. Replikoituva ekspressiovektori, joka on nimetty pS507:ksi ja talletettu 11. toukokuuta 1993 laitoksen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) .·, : kokoelmiin saantinumerolla DSM 8282 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti. • · · • * 87 119027

8. Plasmidi, joka on nimetty pS500:ksi ja talletettu 11. toukokuuta 1993 laitoksen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) kokoelmiin saantinumerolla DSM 8281 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti.

9. Ei-humaani -organismi, kuten jokin mikro-organismi, kuten jokin bakteeri, esimerkiksi

10. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 10 (a) insertoidaan missä tahansa patenttivaatimuksista 1 - 5 määritelty nukleotidisekvenssi johonkin ekspressiovektoriin, (b) transformoidaan jokin sopiva ei-humaani-isäntäorganismi vaiheessa (a) valmistetulla vektorilla, (c) viljellään vaiheessa (b) tuotettua isäntäorganismia sopivissa olosuhteissa polypeptidin 15 ilmentämiseksi, (d) kootaan polypeptidi, ja (e) valinnaisesti polypeptidiä muokataan translaation jälkeen. • · • t t

• · · "* * 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotettu • · polypeptidi eristetään menetelmällä, joka käsittää yhden tai useampia vaiheita, kuten • · ’···* 20 affiniteettikromatografialla käyttäen immobilisoitua natiivi- tai yhdistelmä-SCCE- polypeptidiä tai vasta-aineita, jotka reagoivat mainitun polypeptidin kanssa, ja/tai muita • · : kromatografia-ja elektroforeesimenetelmiä. • · • · · • * ·

10 NO:2:ssa esitetystä aminohapposekvenssistä; tai c) on a):n mukaisen polypeptidin alasekvenssi, joka sisältää 50-250 aminohappoa, esimerkiksi vähintään 70 aminohappoa, vähintään 100 aminohappoa, vähintään 150 aminohappoa tai vähintään 200 aminohappoa.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määritetyn polypeptidin käyttö kosmeettisena . . tuotteena. • * · • · · • ·

13. Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määritellyn polypeptidin käyttö farmaseuttisen ; koostumuksen, joka on tarkoitettu aknen, kseroderman tai jonkin muun hyperkeratoottisen * *·! I,.’ tilan, kuten kallositiittien ja keratosis pilariksen hoitoon tai ehkäisyyn, valmistukseen. • · • · ·

14, Patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määritellyn polypeptidin käyttö farmaseuttisen : koostumuksen, joka on tarkoitettu erilaisten iktyoosien, psoriaasin tai muiden • · · 30 inflammatoristen ihotautien, kuten ekseemien, hoitoon tai ehkäisyyn, valmistukseen 88 119027

15. Menetelmä yhdisteen tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste vaikuttaa SEQ ID NO:2:n aminohapposekvenssin 1-224 sisältävän natiivi-SCCE:n entsymaattiseen aktiivisuuteen ja että menetelmässä käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määritettyä polypeptidiä.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä yhdisteen tunnistamiseksi, t u n n e 11 u siitä, että yhdisteellä on inhibitorinen vaikutus SEQ ID NO:2:n aminohapposekvenssin 1-224 sisältävän natiivi-SCCE:n entsymaattiseen aktiivisuuteen.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä yhdisteen tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste kykenee tehostamaan SEQ ID NO:2:n aminohappo- 10 sekvenssin 1-224 sisältävän natiivi- tai yhdistelmä-SCCE:n entsymaattista aktiivisuutta.

18. Menetelmä yhdisteen tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste kykenee muuttamaan SEQ ID NO:2:n aminohapposekvenssin -7-224 sisältävän SCCE.n proentsyymimuodon SEQ ID NO:2;n aminohapposekvenssin 1-224 sisältäväksi aktiiviseksi SCCE:ksi ja että menetelmässä käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaisesti 15 määriteltyä polypeptidiä.

19. Diagnostinen aine, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määritetylle polypeptidille spesifinen vasta-aine.

20. Diagnostinen aine, tunnettu siitä, että se kykenee havaitsemaan patentti- j #.φ vaatimuksen 1 mukaisen nukleotidisekvenssin ja että se • · · ··· · • : ’·· 20 a) on patenttivaatimuksen 1 mukaisen sekvenssin alasekvenssi ja jonka koko on vähintään • · · ί : 15 nukleotidia; tai *·* • · · • · · b) hybridisoituu SEQ ID NO:l :ssä esitetyn sekvenssin kanssa erittäin ankarissa » i · *’*,* olosuhteissa ja jonka koko on vähintään 15 nukleotidia. • · · • · ·

21. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 25 mukaisesti määriteltyä polypeptidiä ja on muodossa, joka soveltuu paikalliseen • · .·*·. annosteluun ja on valittu joukosta, johon kuuluvat emulsiovoide, voide, lotion, linimentti, • · · ,· φ geeli, pasta, puikko, spray, shampoo, saippua, hiustenhoitoaine ja puuteri.

• · * • ·· • · :***· 22. Kosmeettinen tai ihonhoitokoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää ··· * . patenttivaatimuksen 1 mukaisesti määriteltyä polypeptidiä ja on muodossa, joka soveltuu . [ 30 paikalliseen annosteluun ja on valittu joukosta, johon kuuluvat emulsio-voide, voide, * · · ** '· lotion, linimentti, geeli, pasta, puikko, spray, shampoo, saippua, hiustenhoitoaine ja puuteri. 89 119027