KR101314899B1 - 콜라겐 또는 히알루론산 생성을 증가시키는 펩티드 - Google Patents

콜라겐 또는 히알루론산 생성을 증가시키는 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상술되는 아미노산 서열을 갖는 신규한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 신규한 펩티드 등을 함유한 조성물, 상기 신규한 펩티드 등을 이용하는 방법, 상기 신규한 펩티드 등의 용도, 상기 신규한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 등에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는데 이용될 수 있다.
펩티드, 콜라겐, 히알루론산

Description

콜라겐 또는 히알루론산 생성을 증가시키는 펩티드 {PEPTIDES THAT INCREASE COLLAGEN OR HYALURONIC ACID PRODUCTION}
본 발명은 상술되는 아미노산 서열을 갖는 신규한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 신규한 펩티드 등을 함유하는 조성물, 상기 신규한 펩티드 등을 이용하는 방법, 상기 신규한 펩티드 등의 용도, 상기 신규한 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 등에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는데 이용될 수 있다.
종래부터, 동물의 결합 조직에는, 그 주요 성분으로서 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 콘드로이틴 황산, 헤파란 황산, 데르마탄 황산, 라미닌 등이 포함되어 있는 것이 알려져 왔다. 이들 중에서도, 콜라겐 및 히알루론산은 후술되는 바와 같이 결합 조직에 있어서 중요한 역할을 한다.
즉, 콜라겐은 동물의 결합 조직을 구성하는 주요 단백질이며, 특히 콜라겐은 인체의 총 단백질의 거의 30% 를 차지한다. 콜라겐의 주된 기능이 생체 조직의 골격 구조의 형성에 있으므로, 콜라겐은 동물의 조직 형태의 골격 구조를 구성하는 주된 성분으로서 피부, 연골 조직, 각막, 심장, 간 등에 널리 분포한다. 콜라겐은 각종 세포의 접착 및 세포의 분화 또는 증식에 대해서 특이적으로 작용하고, 세포 기능에 대한 조절 인자로서의 역할도 갖고 있기 때문에, 콜라겐의 감소는, 일부 경우 각막 궤양 등의 각막 장애, 류마티스, 관절염, 퇴행성 관절염 및 골관절염 등의 관절 장애, 및 염증성 질환 등의 각종 질병을 유발할 수 있다.
피부 진피 세포외 매트릭스에서는, 콜라겐 섬유가 그물 모양의 다발을 형성 하여 조직 형태를 유지한다. 콜라겐 섬유가 성숙 및 증식하여 가교 형성이 진행되면, 굵고 직선적인 콜라겐 섬유 다발이 되는데, 이는 젊은 피부에서의 적절한 팽팽함을 제공한다. 그러나, 노화한 피부에서는 섬유아세포의 활성 (예컨대, 콜라겐 생성 활성 등) 이 저하함에 따라, 진피 세포외 매트릭스에서의 콜라겐 섬유가 현저히 감소하여 비정상인 노화 가교가 형성되기 때문에, 피부가 경직되고, 바람직하지 않게도 본래의 탄력성이 풍부한 피부의 팽팽함이 사라진다. 그 결과, 피부에는 주름 및 처짐이 형성된다. 광노화에 의한 털없는 마우스의 콜라겐 섬유 다발 구조의 변화가 상세하게 연구되었다 (Fragrance Journal, 4, 36-37, 1998 참조). 상기 연구 결과, UVB 가 조사된 털없는 마우스에서는, 주름이 형성되어, 상기 주름 형성과 일치하게 콜라겐 섬유다발 구조가 붕괴하여 피부 탄력성이 저하되는 것으로 나타나 있다. 또한, 콜라겐은 수분 유지 기능이 뛰어난 것으로도 알려져 있다.
콜라겐 감소에 의한 상태를 개선하기 위해서, 각종의 콜라겐 합성 강화 물 질이 발견되어 왔다. 예를 들어, 레틴산 (예를 들어, R. Marks 등, British Journal of Dermatology, 122, 91-98, 1990 참조), 글리신, 프롤린 및 알라닌으로 이루어진 3 종의 아미노산을 함유한 제제 (예를 들어, 일본 특허 공개공보 평 7-194375 호 참조), 감초, 뽕나무 껍질, 알로에, 쇠뜨기 (Equisetum arvense), 금은화 (Lonicerae flos), 코르크나무 껍질, 쑥 (Artemisia princeps) 잎, 용담 등으로부터의 식물 추출물 (예를 들어, 일본 특허 공개공보 제 2001-206835 호 참조), TGF-β, 아스코르브산 등이 알려져 있다. 덧붙여, 또 다른 콜라겐 합성 강화 물질로서 I형 프로콜라겐의 182 ~ 241 번째 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드(예를 들어, K. Katayama 등, Biochemistry, 30, 7097-7104, 1991 참조), 및 상기 언급한 I형 프로콜라겐의 182 ~ 241 번째 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에서 선택된 Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 펩티드 (예를 들어, K. Katayama 등, J. Biol . Chem ., 268(14), 9941-9944, 1990 참조)가 알려져 있다.
한편, 히알루론산은 피부, 연골, 관절액, 탯줄, 안구 유리체, 또는 기타 결합 조직에 존재하는 산성 점액다당류의 일종이다. 특히, 피부 표피에서는, 히알루론산이 기저층으로부터 과립층까지 넓게 분포하고 있으며, 표피 세포외 공간의 구조를 지지하여 표피 기저층으로부터 각질 세포층으로의 영양분 또는 노폐물 등의 물질 수송에 관여하고, 표피 세포의 턴오버를 강화하는 유발자 (trigger) 로서 기능하는 것이 알려져 있다. 또한, 히알루론산은 불과 1 g 으로 약 6 L 의 물을 보유할 수 있는 강력한 보수 작용을 가져, 이 작용에 의해, 세포간 공간에 수분을 유지하는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다. 히알루론산은, 노화에 의해 서서히 감소하는 것으로 알려져 있는데, 이 감소는 또한 콜라겐의 경우와 마찬가지로 피부의 주름 및 처짐 형성, 피부의 탄력성 및 팽팽함의 저하, 피부 건조 또는 피부 거칠기 등의 피부의 노화를 초래하는 한 요인이다. 그러나, 히알루론산은 중합체 화합물이기 때문에, 피부의 외측으로부터 표피에 이를 공급하는 것이 용이하지 않고, 표피 세포들 사이 등의 부분에 히알루론산을 공급하기 위해서는, 생체 내에서의 히알루론산의 생합성을 강화시키는 것이 중요하다.
히알루론산의 감소에 의해 야기되는 상태를 개선하기 위해서, 각종의 히알루론산 합성 강화 물질이 발견되었다. 예를 들어, 알로에 추출물, 오크라 추출물, 수용성 β-1,3-글루칸 유도체, 효모 추출물 (일본 특허 공개공보 제 2004-051533 호), 칼리메니아 (Kallymeniaceae) 과(科) 칼로필리스 (Callophyllis) 속(屬) 에 속하는 해조의 추출물 (일본 특허 공개공보 제 2000-136147 호), 라벤더 추출물 (일본 특허 공개공보 평 10-182402 호) 및 두르빌레아 (Durvilleaceae) 과두르빌레아 (Durvillea) 속에 속하는 해조의 추출물 (일본 특허 공개공보 평 09-176036 호) 이 알려져 있다.
발명의 간단한 설명
그러나, 종래의 물질이 안전성 및 효과의 면에서 충분히 만족스럽지 않았기 때문에, 안전하고 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 현저히 강화하는 능력을 가진 신규한 물질의 개발이 요망되어 왔다. 종래의 문제점의 관점에서, 본 발명의 목적은 안전하고 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 현저히 강화하는 능력을 가진 신규한 물질을 제공하는 것이다.
상기 언급한 문제를 해결하는 점에서 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 상술되는 아미노산 서열을 갖는 신규한 펩티드가 안전하고 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 현저히 강화하는 능력을 가진 신규한 물질로서 이용될 수 있음을 발견하였다. 이로써 본 발명이 완성되었다.
구체적으로, 본 발명의 요지는 하기에 관한 것이다:
[1] 하기 식 (I) 로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
Leu-Glu-His (I);
[2] 상기 [1] 에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환 및/또는 부가되고, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 능력을 가진 펩티드로서, 단, Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 을 포함하지 않는 펩티드, 또는 이의 유도체, 또는 이의 염;
[3] 하기 식 (II) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
Leu-Glu-His-Ala (서열번호: 1) (II);
[4] 하기 식 (III) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
Leu-Glu-Lys-Ala (서열번호: 18) (III);
[5] 하기 식 (IV) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
Leu-Asp-His-Ala (서열번호: 19) (IV);
[6] 하기 식 (V) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
Leu-Glu-His-Ala-Phe (서열번호: 20) (V);
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 함유하는 조성물;
[8] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염 또는 상기 [7] 에 정의된 바와 같은 조성물을 사용함에 의한, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 방법;
[9] 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 조성물의 제조에 있어서의 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의 용도;
[10] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
[11] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 (antisense) 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드;
[12] 상기 [10] 또는 [11] 에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한 플라스미드;
[13] 상기 [10] 또는 [11] 에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터; 및
[14] 상기 [10] 또는 [11] 에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한 형질전환체.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 강화시키는 능력을 가진 신규한 물질이 제공된다. 또한, 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은 이를 세포에 작용시킬 때 세포수를 현저하게 감소시키지 않는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명에 따르면, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 강화시키는 능력을 갖고 있으며 세포독성을 나타내지 않으면서 안전하게 사용될 수 있는 신규한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염이 제공된다.
본 발명은 하기 식 (I) 로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염이다:
Leu-Glu-His.
본 발명은 또한 식 (I): Leu-Glu-His 로 표시되는 아미노산 서열 중에 하나 이상의 아미노산이 치환 및/또는 부가되어 있으며, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 능력을 가진 것을 특징으로 하는 펩티드 (이 때, 상기 펩티드는 Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 를 포함하지 않음), 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 제공한다.
본 명세서에서, "펩티드의 유도체"는, 예를 들어, 펩티드의 아세틸화, 팔미토일화, 미리스틸화, 아미드화, 아크릴화, 단실화, 비오티닐화, 인산화, 숙시닐화, 아닐리드 형성, 벤질옥시카르보닐화, 포르밀화, 니트로화, 술폰화, 알데히드 형성, 고리화, 글리코실화, 모노메틸화, 디메틸화, 트리메틸화, 구아니딜화, 아미딘화 (amidination), 말레일화 (maleylation), 트리플루오로아세틸화, 카르바밀화, 트리니트로페닐화, 니트로트로포닐화, 또는 아세토아세틸화로 수득되는 유도체 등을 지칭한다. 이들 중에서, 팔미토일화가 세포 내로의 투과성을 증가시킬 것으로 예상되므로 바람직하고, N-말단의 아세틸화, C-말단의 아미드화 및 C-말단의 메틸화도, 이들이 펩티드를 말단에서부터 분해하는 엑소펩티다아제에 대항한 저항성을 부여하여 생체내 안정성을 증가시킬 것으로 예상되기 때문에 또한 바람직하다.
본 명세서에서, "염"은 펩티드 또는 이의 유도체의 임의의 약물학상으로 허용가능한 염 (무기 염 및 유기 염 포함) 을 지칭하며, 이에는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염, 염산염, 황산염, 질산염, 유기 염 (아세트산염, 시트르산염, 말레인산염, 말산염, 옥살산염, 락트산염, 숙신산염, 푸마르산염, 프로피온산염, 포름산염, 벤조산염, 피크르산염, 벤젠술폰산염 등) 등이 포함되고, 바람직한 것은, 펩티드 또는 이의 유도체의 암모늄염, 염산염, 황산염 및 아세트산염이고, 더욱 바람직하게는 암모늄염 및 아세트산염이다.
아미노산의 치환은 바람직하게는, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니나, 보존적 아미노산 치환, 즉, 아미노산의 보존적 치환이다.
본 명세서에서, 용어 "아미노산의 보존적 치환"은 하기 표 1 에 나타난 각 군의 아미노산들 간의 치환을 지칭한다.
산성 아미노산 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E)
염기성 아미노산 아르기닌 (R), 리신 (K), 히스티딘 (H)
친수성 아미노산 세린 (S), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q)
소수성 아미노산 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 메티오닌 (M), 프롤린 (P), 알라닌 (A)
방향족 아미노산 티로신 (Y), 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F)
히드록시아미노산 세린 (S), 트레오닌 (T)
황-함유 아미노산 시스테인 (C), 시스틴, 메티오닌 (M)
소형 아미노산 글리신 (G), 알라닌 (A), 세린 (S), 메티오닌 (M), 트레오닌 (T)
이들 중에서, 바람직한 아미노산의 보존적 치환으로는, 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E) 간의 치환, 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 사이의 치환, 트립토판 (W) 및 페닐알라닌 (F) 간의 치환, 페닐알라닌 (F) 및 발린 (V) 간의 치환, 류신 (L), 이소류신 (I) 및 알라닌 (A) 사이의 치환, 글리신 (G) 및 알라닌 (A) 간의 치환 등을 들 수 있다.
하나 이상의 아미노산의 (보존적) 치환은, 바람직하게는 하나 또는 여러 아미노산의 (보존적) 치환, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 개의 아미노산의 (보존적) 치환, 한층 더 바람직하게는 1 내지 2 개의 아미노산의 (보존적) 치환, 더욱 더 바람직하게는 하나의 아미노산의 (보존적) 치환을 지칭한다.
하나 이상의 아미노산의 부가는, 바람직하게는 1 내지 22 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 12 개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 5 개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 3 개의 아미노산, 더 더욱 바람직하게는 1 내지 2 아미노산의 부가를 지칭한다.
Leu-Glu-His (이하, 일부 경우에 1-문자 코드의 아미노산으로 나타내어 LEH 로 지칭함) 에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환 및/또는 부가된 펩티드로서는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환을 포함한 것들 (예를 들어, IEH, LDH, LDK, LEK 등), 및 LEH 서열에 하나 이상의 아미노산이 부가된 것들 (예를 들어, LEHA, LEHW, LEHF, LEHV, LEHL, LEHI, LEHM, LEHG, LEHS, LEHT, ALEH, GLEH, SLEH, MLEH, TLEH, LEHAW, LEHAF, LEHAV, LEHAL, LEHAI, LEHAM, LEHAG, LEHAS, LEHAT, ALEHA, GLEHA, SLEHA, MLEHA, TLEHA, FLEHA, SLEHHT, GLEHAL, DLEHAL, QLEHAK, SLEHAD, QLEHAR, EFLEHA, LEHAVV, DPELEHA, HLEHAAS, LEHASVD 등) 등이 있다. 이들 중에서, 바람직한 펩티드로서는, IEH, LDH, LDK, LEK, LEHA, LEHF, LEHG, LEHAF, FLEHA, SLEHHT, GLEHAL, DLEHAL, QLEHAK, SLEHAD, QLEHAR, EFLEHA, LEHAVV, DPELEHA, HLEHAAS, LEHASVD 등이 있고, 더욱 바람직하게는, 상기 펩티드는 LEHA 및 LEHAF 이다.
또한, LEH 펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환 및 부가된 펩티드는, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니나, 바람직한 예로서, 예를 들어, IEHA, LDHA, LDKA, LEKA 등을 들 수 있다. 이러한 펩티드의 더욱 바람직한 예로서는, LEHA 펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환 및/또는 부가된 펩티드, 더욱 바람직하게는 LEHA 펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환 및/또는 부가된 펩티드를 들 수 있다. 여기서, 하나 이상의 아미노산의 (보존적) 치환 및/또는 부가는 상기 기재된 의미와 동일하다.
나아가, LEH 펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환 및/또는 부가된 펩티드로부터 하나 또는 여러 아미노산이 결실된 펩티드도, 콜라겐 또는 히알루론산의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 능력을 가진 것인 한 또한 본 발명의 펩티드에 포함된다. 이러한 펩티드로서는, 예를 들어, EHA, LHA, LEA 등이 있으며, 이는 LEHA 펩티드로부터 하나의 아미노산이 결실된 펩티드이다.
본 명세서에서, "콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 능력을 가짐"이라는 용어는 관심 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 세포에 대해 작용시킬 때, 세포 내의 콜라겐, 히알루론산 또는 이들 둘 다의 생성량이 상기 관심 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 세포에 작용시키지 않은 경우에 비해 증가하는 것을 의미한다. 상기 용어는, 예를 들어, 인간 세포의 배양 시스템에 대한 시험에서 관심 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 10 ㎍/ml 의 농도로 작용시킬 때, 세포 내 콜라겐의 생성량이 상기 관심 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 작용시키지 않은 경우와 비교하여, 예를 들어, 약 110% 이상, 더욱 바람직하게는 약 120% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 130% 이상에 도달하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 관심 펩티드 등을 100 ㎍/ml 의 농도로 작용시킬 때, 세포 내 히알루론산의 생성량이 관심 펩티드 등을 작용시키지 않은 경우와 비교하여, 예를 들어, 약 110% 이상, 더욱 바람직하게는 약 120% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 130% 이상에 도달하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 상기 언급한 용어에 관한 세포는 섬유아세포 또는 각질형성세포 (keratinocyte) 를 의미하며, 더욱 구체적인 구현예에서, 이는 피부 섬유아세포 또는 표피 각질형성세포를 의미한다.
본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 제조가능하다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 화학합성 방법 (예를 들어, 고체상 방법 (예를 들어, Fmoc 방법), 액체상 방법 등) 으로 합성될 수 있고, 또는 재조합 발현 등의 방법으로 제조될 수도 있다. 본 발명의 펩티드를 구성하는 아미노산은 L- 또는 D-형일 수 있으며, 바람직하게는 L-형이다.
나아가, 본 발명의 펩티드는 또한 프로테아제 처리 등의 공지의 방법에 의해 관심 아미노산 서열을 포함한 단백질의 아미노산 서열로부터 관심 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 절단함으로써 제조가능하다. 예를 들어, LEH 서열 및 LEHA 서열을 포함한 단백질로서는 하기 표 2 에 나타낸 단백질들이 포함된다.
공급 유기체 단백질명 LEHA 서열을 포함한 부분 서열
다우쿠스 카로타
(Daucus carota)		 β-프룩토푸라노시다제 (EC3.2.1.26) 동종효소 (isozyme) I 클래스 3 전구체, 가용적임 잔기: 12-15 LPSRDLEHASSYTP
(서열번호: 6)
리코페르시콘 에스쿨렌텀
(Lycopersicon esculentum)		 3β-히드록실라제 잔기: 134-137 IFGSPLEHARQLWP
(서열번호: 7)
솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum) 샤퍼로닌(Chaperonin)-60 베타 서브유닛 전구체 잔기: 560-563 VVRCCLEHAASVAK(서열번호: 8)
오리자 사티바 (Oryza sativa) 추정상의 샤퍼로닌 60 베타 잔기: 562-565 VVRCCLEHAASVAK(서열번호: 9)
글리신 맥스 (Glycine max) 글리시닌 (Glycinin) G3 전구체 잔기: 228-231 FAPEFLEHAFVVDR(서열번호: 10)
파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris) 세린 트레오닌 키나아제 동족체 (homolog) COK-4 잔기: 334-337 EVEVQLEHALSMQE(서열번호: 11)
마니호트 에스쿨렌타 (Manihot esculenta) 플라보놀 3-O-글루코실트랜스페라제 7 (EC 2.4.1.91) (UDP-글루코오스 플라보노이드 3-O-글루코실트랜스페라제 7) (단편) 잔기: 168-171 PQVEILEHAALGVF(서열번호: 12)
프루누스 페르시카 (Prunus persica) MADS6 잔기: 93-96 TGSWTLEHAKLKAR(서열번호: 13)
프라가리아 × 아나나사 (Fragaria × ananassa) UDP-글루코오스 글루코실트랜스페라제 잔기: 304-307 EIANALEHAGHRFL(서열번호: 14)
스트롱길로켄트로투스 푸르푸라투스 (Strongylocentrotus purpuratus) 과분극-활성화 (Ih) 채널 잔기: 406-409 VAINGLEHAHWWEQ(서열번호: 15)
레텐테론 자포니쿰 (Lethenteron japonicum) 호메오단백질 (Homeoprotein) LjEMX 잔기: 193-196 SQLLRLEHAFEKNH(서열번호: 16)
미틸러스 갈로프로빈시알 리스 (Mytilus galloprovincialis) 파라미오신 (Paramyosin) 잔기: 618-621 DARSLLEHAERARK(서열번호: 17)
당업자는 프로테아제의 서열 특이성 등을 고려하여, 관심 아미노산 서열을 포함한 단백질의 아미노산 서열로부터 관심 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 절단하기에 적합한 프로테아제를 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 다우쿠스 카로타에서 유래한 서열 (서열번호: 6) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위하여, 서모리신 (thermolysin) (바실러스 테르모프로테올리티쿠스 (Bacillus thermoproteolyticus) 에서 유래) 및 키모트립신 (소 췌장에서 유래) 등을 동시에 사용하는 것에 의한 절단 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 솔라눔 투베로숨에서 유래한 서열 (서열번호: 8) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 프로테아제 M "Amano" G (아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) 에서 유래함: Amano Enzyme, Inc. 제조) 및 상기 언급한 서모리신 등을 동시에 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 오리자 사티바에서 유래한 서열 (서열번호: 9) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 상기 언급한 프로테아제 M "Amano" G 및 상기 언급한 서모리신 등을 동시에 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 글리신 맥스에서 유래한 서열 (서열번호: 10) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 상기 언급한 서모리신 등을 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 파세올루스 불가리스에서 유래한 서열 (서열번호: 11) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 상기 언급한 키모트립신 및 상기 언급한 서모리신 등을 동시에 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 마니호트 에스쿨렌타에서 유래한 서열 (서열번호: 12) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 상기 언급한 키모트립신 및 상기 언급한 서모리신 등을 동시에 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 언급한 레텐테론 자포니쿰에서 유래한 서열 (서열번호: 16) 로부터 LEH 서열 및/또는 LEHA 서열을 절단하기 위해서, 트립신 (돼지 췌장에서 유래한 것) 및 상기 언급한 서모리신 등을 동시에 사용하는 것에 의한 방법을 예로 들 수 있다. 관심 아미노산 서열을 포함한 단백질 및 프로테아제의 조합은 상기 언급한 조합들에 한정되지 않으며, 바람직한 조합으로서는 콩 단백질 (글리신 맥스에서 유래한 단백질) 및 서모리신의 조합을 들 수 있다.
단백질을 프로테아제로 가수분해할 때 사용되는 반응 조건은 특별히 한정되지 않으며, 당업자가 통상의 일반적인 기술적 지식에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 시판되는 프로테아제를 사용할 때는, 그의 지시사항에 따라 반응 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 30° 내지 80℃, 바람직하게는 40° 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 50° 내지 60℃ 의 반응 온도가 사용될 수 있다. 또한, 일반적으로, 2 내지 30 시간, 바람직하게는 3 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 시간, 특히 바람직하게는 12 내지 18 시간의 반응 시간이 사용될 수 있다. 반응 pH 로서는, 사용되는 프로테아제의 최적 pH 부근인 것이 바람직하다. 반응 종료 수단도 역시 특별한 제한은 없고, 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 수단으로서는, 예를 들어, 85℃ 에서 15 분간 가열 또는 100 ℃ 에서 5 분간 가열과 같은 가열 처리 등을 들 수 있다.
프로테아제를 이용한 가수분해 처리 후, 당업계에 공지된 수단에 따라 정제함으로써 관심 펩티드를 수득할 수 있다. 이러한 공지의 수단으로서, 예를 들어, 강산 이온교환수지, 옥타데실실리카 (ODS) 수지 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제로 처리한 펩티드의 수용액을 ODS 수지에 흡착시키고 상기 펩티드를 임의 농도의 유기 용매 (예를 들어, 아세토니트릴 등) 로 용출함으로써 관심 펩티드를 정제할 수 있다. 대안적으로는, 예를 들어, 프로테아제로 처리한 펩티드의 수용액을 강산 이온교환수지에 흡착시키고, 상기 펩티드를 염 농도가 0.18 M 내지 0.25 M, 더욱 바람직하게는 0.20 M 내지 0.23 M 인 용리액 (예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨 등의 용액) 으로 용출시켜 관심 펩티드를 정제할 수 있다.
따라서, 천연 단백질을 프로테아제로 가수분해하여 수득된 펩티드가 화학합성 방법으로 제조한 경우와 비교할 때, 비용 측면에서 유리하다. 나아가, 천연 단백질을 프로테아제로 가수분해하여 수득된 펩티드는 생체에 대하여 더 안전할 것으로 추측된다. 따라서, 이렇게 수득된 펩티드는 생체에의 적용시 더욱 높은 안전성이 요구되는 내용 약제, 식품, 민감성 피부용 화장품, 사료 등에 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 유도체는 당업계에 공지된 방법으로 제조가능하다. 예를 들어, LEH 펩티드의 N-말단을 아세틸화하는 하기 방법을 예로 들 수 있다(Fmoc 방법에 의한 고체상 합성 방법에 따름; L.A. Carpino, G. Y. Han, J. Am . Chem. Soc ., 92, 5748 (1970)). 먼저, Fmoc-His(1-Trt)-OH 의 C-말단을 고체상 합성용 수지에 결합시키고, 그 후 피페리딘 처리에 의해 보호기 (Fmoc) 를 제거한다. 이어서 수득된 수지를 중화하고, 세정한 후, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 His 의 N-말단에 도입한다. 다음으로, 피페리딘 처리하여 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하고, 수득된 수지를 다시 중화 및 세정한다. 그 후, N-아세틸-류신을 Glu 의 N-말단에 도입한다. 상기 수득된 수지로부터 펩티드 사슬을 절단하고, His 의 Trt 기 및 Glu 의 tBu 기를 TFA (트리플루오로아세트산) 으로 절단하여 탈보호화를 수행한다. 마지막으로, 제조용 HPLC 로 미반응 물질을 제거하여 정제를 수행하여, N-말단이 아세틸화된 LEH 를 수득한다. 당업자에게는, 상기 언급한 방법을 적절히 변형하여 임의의 유도체를 제조할 수 있고, 예를 들어, N 말단-팔미토일화 LEH 를 제조하는 경우, 상기 언급한 N-아세틸-류신을 N-팔미토일-류신으로 변경할 수 있는 것이 자명하다.
본 발명의 펩티드의 염 또한 당업자가 당업계에 공지된 임의 방법으로 용이하게 제조가능하다.
이렇게 수득된 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는데 사용될 수 있다.
하기 실시예에서 나타난 바와 같이, 피부 섬유아세포를 상기와 같은 펩티드 또는 이의 유도체 또는 이의 염이 첨가된 배양 용액 중에서 배양하면 상기 세포 내 I형 콜라겐의 생성량이 증가되고, 표피 각질형성세포를 상기 배양 용액 중에서 배양하면 상기 세포 내 히알루론산의 생성량이 증가된다는 것이 확인된다.
본 발명은 또한 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 이러한 특징들에 기인하여, 상기 조성물은, 예를 들어, 약학 조성물, 식품, 화장품 또는 사료로서, 나아가, 콜라겐 또는 히알루론산과 관련된 생리적 조건들을 규명하는 연구 시약으로서 적절히 사용될 수 있다.
약학 조성물로서는, 예를 들어, 인간으로 대표되는 포유동물에서 콜라겐 및/또는 히알루론산의 양의 감소로 인한 질병에 대한 치료제 또는 예방제를 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 또는 골관절염과 같은 관절 질환에 대한 치료제 및/또는 예방제로서, 또는 자외선에의 노출, 노화 등에 기인한 피부의 주름 또는 처짐에 대한 예방제 및/또는 치료제로서, 나아가, 피부의 탄력성 또는 팽팽함의 저하에 대한 예방제 및/또는 치료제로서 적절히 사용될 수 있다.
식품으로서는, 예를 들어, 인간으로 대표되는 포유동물에서 콜라겐 및/또는 히알루론산의 양의 감소로 인한 병태의 개선 또는 예방을 위한 식품을 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 관절통과 같은 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품으로서, 또는 자외선에의 노출, 노화 등에 기인한 피부의 주름 또는 처짐의 개선 또는 예방을 위한 식품으로서, 나아가, 피부의 탄력성 또는 팽팽함 저하의 개선 또는 예방을 위한 식품으로서 적절히 사용될 수 있다.
화장품으로서는, 예를 들어, 자외선에의 노출, 노화 등에 기인한 피부의 주름 또는 처짐의 예방 및/또는 개선을 위한 화장품, 및 피부의 탄력성 또는 팽팽함 저하의 예방 및/또는 개선을 위한 화장품을 들 수 있다.
사료로서는, 예를 들어, 소, 돼지, 가금류, 양 및 말과 같은 가축 또는 개 및 고양이와 같은 애완 동물에서 콜라겐 및/또는 히알루론산의 양의 감소로 인해 유발된 병태를 개선 또는 예방하기 위한 사료를 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 또한 각막 궤양과 같은 각막 장애, 류마티스, 관절염, 퇴행성 관절염 및 골관절염과 같은 관절 장애, 및 염증성 질환 등의 콜라겐 및/또는 히알루론산의 양의 감소로 인해 유발되는 각종 질병을 개선 또는 예방하기 위한 사료로서 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 중 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의 함량은 펩티드 등의 종류, 상기 조성물의 투여 형태 등에 따라 다르다. 일반적으로는, 콜라겐 및/또는 히알루론산 생성 강화에 대한 커다란 효과를 얻는 관점에서, 상기 함량은 바람직하게는 0.0001 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 50 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.001 내지 20 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.05 내지 10 중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.12 내지 10 중량% 이다.
본 발명의 조성물은, 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염에 더하여, 제형, 식품 등의 분야에서 통상 사용되는 담체, 기제 및/또는 첨가제 등을 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 적절히 배합함으로써 제조될 수 있다.
한 가지 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 농도가 예를 들어, 0.05 중량% 이상, 바람직하게는 0.08 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 이상, 더욱 더 바람직하게는 0.12 중량% 이상이 되도록 한 번 정제하여 수득된 것들을 상기 언급한 함량을 갖도록 배합함으로써 제조될 수 있다.
담체로서는, 예를 들어, 당류 (예를 들어, 만니톨, 락토오스, 덱스트란 등), 셀룰로오스류 (예를 들어, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스 등), 수난용성 검류 (예를 들어, 검 아라빅, 트라가칸트 검 등), 가교 비닐 중합체, 지질 등을 1 종 이상 조합하여 이용할 수 있다.
기제로서는, 예를 들어, 물, 유지류, 광물유, 왁스, 지방산, 실리콘 유, 스테롤, 에스테르, 금속 비누, 알콜 등을 1 종 이상 조합하여 이용할 수 있다.
첨가제로서는, 예를 들어, 계면활성제, 가용화 성분, 유화제, 유성 성분, 안정화제, 증점제, 보존제, 결합제, 활택제, 분산제, pH 조절제, 보습제, 자외선 흡수제, 킬레이트제, 경피흡수 촉진제, 산화방지제, 붕괴제, 가소제, 완충제, 비타민류, 아미노산류, 착색제, 향료 등을 1 종 이상 조합하여 이용할 수 있다.
나아가, 필요에 따라 다른 유용한 작용을 부가하기 위해서, 본 발명의 조성물에, 미백 성분, 항염증 성분, 항균 성분, 세포 활성화 성분 , 수렴 성분, 항산화 성분, 여드름 개선 성분, 콜라겐 등의 생물학적 성분의 합성을 강화시키는 성분, 혈행 강화 성분, 보습 성분 및 노화 방지 성분 등의 각종 성분을 1종 이상 조합하여 배합시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은, 외용제 (화장품 포함), 내용제 (식품 및 사료 포함) 등의 임의의 투여 형태를 취할 수 있고, 바람직하게는 외용제로 사용될 수 있다.
외용제로서는, 예를 들어, 액체, 에멀젼, 크림, 로션, 페이스트, 무스, 겔, 시트 (기판에 의해 지지됨), 에어로졸 및 스프레이 등의 임의의 형태로 사용될 수 있다.
화장품으로서는, 예를 들어, 로션, 에멀젼, 크림, 오일 및 마스크 등의 기초 화장품류, 및 파운데이션, 블러셔 및 립스틱 등의 메이크업류, 나아가 페이스 워시 (face wash), 클렌징 조제물 및 바디-클렌징 조제물 등의 클렌징 조제물, 및 입욕제 등의 임의의 형태로 사용될 수 있다.
내용제 (식품 및 사료 포함) 로서는, 예를 들어, 정제, 환약, 과립, 세립, 분말, 경질 캡슐, 연질 캡슐, 건조 시럽, 용액 (드링크제, 현탁제 및 시럽 포함), 겔제, 리포솜 제제, 엑기스 제제, 팅크제, 레모네이드제 및 젤리제 등의 임의의 형태로 사용될 수 있다.
또한, 식품의 경우, 상기 조성물은 빵, 면, 즉석-제조 식품, 식육 가공 식품 (예를 들어, 햄, 소세지 등), 수산 가공 식품, 조미료 (예를 들어, 드레싱 등), 유제품, 과자류 (예를 들어, 비스킷, 캔디, 젤리, 아이스크림 등), 스프 및 쥬스 등의 임의의 일반적인 식품 형태로 제공될 수 있다. 이러한 형태로 제조하는 경우, 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은, 관심 식품의 성질 등에 따라, 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절히 배합될 수 있다.
사료는, 임의의 형태로 사용될 수 있기 때문에 특별히 한정되지 않는다.
상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의, 콜라겐 및/또는 히알루론산의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 능력을 이용하여, 본 발명의 조성물을 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는데 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염, 또는 상기 언급한 조성물이 사용되는 것을 특징으로 하는, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염, 또는 상기 언급한 조성물은 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 생성을 강화시키는 효과를 수득하기에 유효한 양 이상으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 방법에서 사용되는 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의 양은 보통, 외용제의 경우, 바람직하게는 체중이 약 50 kg 인 성인 1 명당 약 0.1 ㎍ 내지 2 g/일이다. 내용제의 경우 사용되는 양은 보통, 바람직하게는 체중이 약 50 kg 인 성인 1 명당 약 0.001 mg 내지 10,000 mg/일, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 1,000 mg/일, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 100 mg/일이다.
본 발명의 방법은 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염, 또는 상기 언급한 조성물을 피부에 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 피부에 적용되는 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의 양은 바람직하게는 약 1 ng 내지 500 ㎍/cm2, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 50 ㎍/cm2, 더욱 더 바람직하게는 약 0.1 내지 10 ㎍/cm2 이다.
본 발명은 또한 상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염의, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는 조성물, 바람직하게는 외용제로 사용될 수 있는 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
상기 언급한 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염은 조성물 내에서 상기 언급한 함량을 갖도록 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급한 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급한 펩티드를 인코딩하는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, LEHA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 유전암호표에 따라 LEHA 를 인코딩하는 것이 명백한 임의의 서열을 코돈 사용 방법 등에 따라 적절히 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드로서 하기 서열을 예로 들 수 있다:
TTG GAA CAT GCG (서열번호: 2)
TTG GAA CAT GCA (서열번호: 3)
CTT GAA CAC GCG (서열번호: 4)
CTG GAG CAC GCA (서열번호: 5)
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법으로 제조가능하다. 예를 들어, 시판되는 DNA 합성기 (예를 들어, Applied Biosystems 3400 DNA 합성기; Applied Biosystems 제조) 를 사용하여 상기 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 수득한 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 후술되는 플라스미드 또는 발현 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 언급한 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이러한 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 상기 언급한 펩티드를 유전공학에 의해 발현하는데에, 또는 유전자 치료법 등에서, 또는 콜라겐 또는 히알루론산과 관련된 생리적 조건을 규명하는 시약으로서 이용될 수 있다.
나아가, 이러한 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 후술되는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 플라스미드는, 분자생물학적 실험을 위한 일반 기술을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, pBR 플라스미드, pUC 플라스미드 등을 비롯한 공지의 플라스미드에 편입시킴으로써 제조가능하다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터는, 분자생물학적 실험을 위한 일반 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록, 상기 폴리뉴클레오티드를, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, pcDNA3, pSD64, λ 파아지 벡터 등을 비롯한 공지의 벡터에 편입시킴으로써 제조가능하다.
상기 기재된 바와 같이 수득한 플라스미드 또는 발현 벡터를 사용하여, 후술되는 형질전환체를 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 상기 언급한 플라스미드 또는 발현 벡터를 원하는 숙주에 도입하거나, 상기 언급한 폴리뉴클레오티드를 숙주의 염색체에 직접 편입시키는 것 등에 의해 수득가능하다. 상기 숙주는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 대장균 (E. coli), 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등을 숙주로 사용할 수 있디. 상기 발현 벡터를 숙주에 도입하는 방법으로서는, 예를 들어, 칼슘 처리 방법, 원형질체 방법, 전기천공 (electroporation) 방법, 또는 DEAE 덱스트란 방법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다.
상기 언급한 펩티드는 또한 상기 기재된 바와 같이 수득한 형질전환체를 적절한 조건 하에서 배양하여 상기 언급한 펩티드를 발현시키고 상기 펩티드를 정제함으로써 수득될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 참고예에 기초하여 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예 등에 전혀 한정되지 않는다.
실시예 1 LEH 의 제조
1) 펩티드의 합성
자동 펩티드 합성기 (SHIMADZU CORPORATION 제조: PSSM8) 를 사용하여 Fmoc 방법으로 고체상 합성 방법에 의해 펩티드를 합성하였다. 구체적인 절차는 하기와 같다: 먼저, Fmoc-His(1-Trt)-OH 의 C-말단을 고체상 합성용 수지에 결합시키고, 그 후 피페리딘 처리에 의해 보호기 (Fmoc) 를 제거하였다. 이어서, 상기 수지를 중화 및 세정하고, His 의 N-말단에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 도입하였다. 다음으로, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하고, 상기 수지를 다시 중화 및 세정하였다. 그 후, Glu 의 N-말단에 Fmoc-Leu-OH 를 도입하였다. 그 후, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하고, 상기 수지로부터 펩티드 사슬을 절단하였다. His 의 Trt 기 및 Glu 의 tBu 기를 TFA (트리플루오로아세트산) 로 절단하여 탈보호화를 수행하였다. 마지막으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, LEH 를 수득하였다.
2) 합성 펩티드에 대한 순도 검정
생성된 정제 생성물을 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 적용하였다[컬럼: μBondasphere 5 μ C18-100Å (내부 직경: 3.9 mm, 길이: 150 mm), Waters Corporation 제조; 이동상: 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한 용매 A 및 0.1% 트리플루오로아세트산 및 90% 아세토니트릴을 함유한 용매 B 의 구배로서, 0 분 (용매 B = 7%) 에서 20 분 (용매 B = 12%) 임; 유속: 1 ml/분; 검출 방법: 220 nm 의 파장에서의 흡광도]. 13.1 분째에 단일한 가파른 피크가 나타났으며, 순도는 99% 이었다.
실시예 2 LEHA 의 제조
실시예 1 에 기재된 방법과 동일한 방식으로 펩티드 LEHA 를 합성 및 정제하 였다. 생성된 정제 생성물을 분석용 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 적용하였다[컬럼: μBondasphere 5 μ C18-100Å (내부 직경: 3.9 mm, 길이: 150 mm), Waters Corporation 제조; 이동상: 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유한 용매 A 및 0.1% 트리플루오로아세트산 및 90% 아세토니트릴을 함유한 용매 B 의 구배로서, 0 분 (용매 B = 12%) 에서 20 분 (용매 B = 17%) 임; 유속: 1 ml/분; 검출 방법: 220 nm 의 파장에서의 흡광도]. 12.8 분째에 단일한 가파른 피크가 나타났으며, 순도는 99% 이었다.
실시예 3 LEH 및 LEHA 를 이용한 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생성 검정
인간 정상 피부 (CRL-1836; ATCC) 에서 유래한 섬유아세포를 48-웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 더 구체적으로, 상기 세포를 12,500 개 세포/cm2 의 밀도로 플레이트 상에 도말하고, 5% 이산화탄소 기체 및 95% 공기의 대기 하에서 37℃에서 약 72 시간 동안 배양하였다. 배양 용액으로서는, 소 태아 혈청 (FBS) 이 10 중량% 농도로 함유된 둘베코 변형 이글 배지 (D-MEM) 를 웰당 500 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 세포가 포화 상태에 도달했을 때, 배양 용액을 제거하고, 거기에, 실시예 1 또는 2 에서 합성된 LEH 또는 LEHA 를 10 ㎍/ml 의 농도로 D-MEM 에 첨가하여 제조한 배지를 웰당 500 ㎕ 의 양으로 첨가하였다. 이 때, 펩티드를 첨가하지 않은 배지를 웰당 500 ㎕ 의 양으로 첨가한 세포를 대조군으로 사용하였다. 배양 72 시간 후, 배양 용액을 수집하고, 수집된 배양 용액 중의 I형 콜라겐의 농도를 효소-결합 면역흡착 측정법 (항-인간 프로콜라겐 I형 C-펩티드 EIA 키트; TAKARA BIO INC. 제조) 으로 정량하였다. 상기 정량의 결과를 기초로, 펩티드를 첨가한 배양 용액 중의 I형 콜라겐의 양을 산출하였는데, 이 때 대조군 배양 용액 중의 I형 콜라겐의 양을 100% 로 한다. 결과는 표 3 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
LEH 10 132.2
LEHA 10 137.5
표 3 에 나타난 바와 같이, 인간 정상 피부에서 유래한 섬유아세포 중의 콜라겐의 생성량은 상기 세포를 펩티드가 첨가된 각 배양 용액 중에서 배양함에 의해 현저히 증가된 것으로 나타났다.
실시예 4 LEH 및 LEHA 를 사용한 독성 시험
실시예 3 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에, 250 ㎕ 의 D-MEM 를 첨가하고, 이어서 생존 세포수를 Cell Counting Kit-8 (DOJINDO LABORATORIES 제조) 로 계수하였다. 결과는 표 4 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 2.8×104
LEH 10 2.8×104
LEHA 10 2.9×104
표 4 에 나타난 바와 같이, 상기 세포를 펩티드가 첨가된 각 배양 용액에서 배양함에 의한 생존 세포수의 현저한 감소는 나타나지 않았다.
실시예 5 콩 단백질로부터의 LEH 및 LEHA 펩티드의 제조
1) 콩 단백질의 프로테아제 분해
1 g 의 탈피 대두 분말을 증류수 40 ml 에 분산시키고, 상기 분산액의 pH 를 0.1 N NaOH 를 이용하여 8.5 로 조정하였다. 거기에 50 ㎎ 의 서모리신 (바실러스 테르모프로테올리티쿠스로부터의 것, 상표명: THERMOASE PC10F, DAIWA KASEI K.K. 제조) 을 첨가하고, 60℃ 에서 15 시간 동안 분해를 실시하였다. 상기 반응 후, 상기 분산액을 100℃ 에서 10 분간 끓여 서모리신을 불활성화하였다. 분산액을 냉각시킨 후, 거기에 1 g 의 여과 조제 (상표명: Radiolight 500, SHOWA CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD 제조) 를 첨가하고, 혼합물을 교반하였다. 그 후, 여과를 수행하였다.
2) 조 펩티드의 수집
상기 기재된 바와 같이 수득한 여과액을 강산 이온교환수지가 충전된 150-ml 컬럼 (상표명: "Dowex 50W × 2, H+ 형태, 50-100 메쉬", The Dow Chemical Company 제조) 에 통과시키고, 상기 컬럼을 컬럼 부피의 5 배의 탈이온수로 세정하여, 비(非)-펩티드 성분을 제거하였다. 2 M 암모니아 용액을 상기 컬럼에 통과시켜 상기 컬럼에 흡착된 성분을 용출시키고, 펩티드 분획을 수집하였다. 암모니아를 증발기로 증류 제거하고, 상기 분획을 추가로 농축하고, 건조시켜 고화시켰다. 거기에 물 5 ml 를 첨가하여 상기 건조된 생성물을 용해시키고, 원심분리 (10,000 rpm, 30 분) 를 수행하여 용해되지 않은 물질을 제거하였다. 용액 중의 펩티드를 분석 키트 (상표명: QuantiPro BCA 분석 키트, SIGMA) 로 정량하였다. 그 결과, 140 mg 의 조 펩티드가 수집된 것이 확인되었다.
3) 분자량 분획
Sephadex G-25 (Medium 타입, Amersham Biosciences 제조) 가 충전된 겔 여과 컬럼 (φ 2.6×100 cm) 을 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.0) 으로 평형화하고, 여기에, 상기 기재한 바와 같이 수득한 조 펩티드 140 mg 을 적용하였다. 유속 1.0 ml/분으로 용출을 실시하고, 280 nm 에서 검출하여, 분자량이 1,000 이하인 분획을 수집하였다. 수집하여 수득한 분획을 탈염 처리한 후, 부피가 2 ml 이하가 되도록 농축하였다.
4) 강산 이온교환수지에 의한 분리
강산 이온교환수지 (상표명 "SP Sephadex C-25, H+ 형태", Amersham Biosciences 제조) 가 충전된 20-ml 컬럼을 탈이온수로 평형화하고, 여기에 상기 기재한 바와 같이 수득한 분자량 1,000 이하의 농축 분획 2.0 ml 를 적용하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피의 5 배의 탈이온수로 세정하고, 성분을 0 에서 0.256 M 의 염화나트륨 수용액의 선형 구배로 용출하였다. 상기 용리액을 분획 수집기로 각 분획당 2.0 ml 의 양으로 수집하였다. 생성된 크로마토그램에서, 6 개의 주요한 피크가 검출되었다. 이들 6 개의 주요한 피크, 구체적으로, 0.026 내지 0.062 M 의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [1]) 14 ml, 0.062 내지 0.092 M 의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [2]) 12 ml, 0.092 내지 0.113 M 의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [3]) 8 ml, 0.113 내지 0.168 M 의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [4]) 22 ml, 0.20 내지 0.23 M 의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [5]) 14 ml, 및 0.256 M 이상의 농도의 염화나트륨으로 용출된 분획 (이하, SP [6]) 16 ml 가 각각 수집되었다.
5) HPLC 분석
탈염 처리 후, 상기 기재된 바와 같이 수득한 SP [1] 내지 SP [6] 을 하기 조건 하에서 HPLC 분석에 적용하였다:
(컬럼) Inertsil ODS-2, φ 4.6×250 mm, 5 ㎛ (GL Science Inc.)
(검출) 214 nm
(유속) 1.0 mL/분
(분리 조건)
용매 (a): 0.05% 트리플루오로아세트산이 함유된 용액
용매 (b): 0.05% 트리플루오로아세트산 및 20% 아세토니트릴이 함유된 용액
100% 용매 (a) 로 컬럼을 평형화한 후, 60 분까지 용매 (b) 가 100% 가 되는 선형 구배로 용출을 실시하였다.
(주입 부피) 20 ㎕
(컬럼 온도) 실온
화학적 합성으로 제조한 Leu-Glu-His 및 Leu-Glu-His-Ala 를 표준으로 사용하여, 분획의 용출 시간을 상기 표준의 용출 시간과 비교하였다. 그 결과, 피크가 상기 표준과 동일한 용출 시간에서 검출된 분획은 SP [5] 뿐이었고, SP [5] 이외의 분획들에서는 상기 표준과 동일한 용출 시간에서 유의미한 피크가 나타나지 않았다.
6) N-말단 아미노산 서열 분석
상기 표준과 동일한 용출 시간에서 검출된 SP [5] 의 2 개의 피크를 뽑아내고, N-말단 아미노산 서열 분석기 (Procise 494 HT Protein Sequencing Systems, Applied Biosystems) 로 분석을 수행하였다. 그 결과, 이들 2 개 피크는 Leu-Glu-His 및 Leu-Glu-His-Ala 에 해당하는 것으로 확인되었다.
7) 정량
HPLC 분석 결과로부터 산출한 결과, 탈피 대두 분말 1 g 을 서모리신으로 처리한 경우, 30.1 ㎍ 의 Leu-Glu-His 및 20.1 ㎍ 의 Leu-Glu-His-Ala 이 생성된 것으로 나타났다.
실시예 6 콩 단백질에서 유래한 LEH 및 LEHA 를 사용한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 검정
실시예 5 에서 수득한 SP [5] 분획에 함유된 펩티드를 농도가 10 ㎍/ml 이 되도록 조절하고 이를 합성된 LEH 및 LEHA 대신 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3 에서와 동일한 방식으로 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 강화 효과를 조사하였다. 결과는 표 5 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
SP [5] 10 177
표 5 에 나타난 바와 같이, 인간 정상 피부에서 유래한 섬유아세포를 SP [5] 가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의해 상기 세포에서의 콜라겐 생성량이 현저히 증가한 것으로 나타났다.
실시예 7 콩 단백질에서 유래한 LEH 및 LEHA 를 사용한 독성 시험
실시예 6 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에 대하여, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 생존 세포수를 계수하였다. 결과는 표 6 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 2.2×104
SP [5] 10 2.2×104
표 6 에 나타난 바와 같이, 세포를 SP [5] 가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의한 생존 세포수의 유의미한 감소는 나타나지 않았다.
합성된 LEH 및 LEHA 펩티드에 의해 나타난 것과 유사한 콜라겐 생성 강화 효과는 또한, 실시예 5 에 기재된 바와 같은 콩 단백질로부터 제조된 LEH 및 LEHA 펩티드를 사용하여 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 콜라겐 생성 검정을 수행한 경우에서도 발견되었다. 부가적으로, 콩 단백질로부터 제조한 LEH 및 LEHA 펩티드를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 독성 시험을 수행한 경우 생존 세포수에 있어서 유의미한 감소는 나타나지 않았다.
실시예 8 N-말단- 아세틸화 LEHA 의 제조
Fmoc 방법에 의한 고체상 합성 방법을 따라 LEHA 펩티드의 N-말단-아세틸화 유도체를 제조하였다(L.A. Carpino, G.Y. Han, J. Am . Chem . Soc ., 92, 5748 (1970)). 먼저, Fmoc-Ala-OH 의 C-말단을 고체상 합성용 수지에 결합시키고, 그 후 상기 보호기 (Fmoc) 를 피페리딘 처리에 의해 제거하였다. 이어서, 상기 수지를 중화 및 세정하고, Fmoc-His(1-Trt)-OH 를 Ala 의 N-말단에 도입하였다. 다음으로, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하고, 상기 수지를 다시 중화 및 세정하였다. 그 후, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 His 의 N-말단에 도입하였다. 다음으로, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하였다. 이어서, 상기 수지를 중화 및 세정하고, N-아세틸-류신을 Glu 의 N-말단에 도입하였다. 상기 수지로부터 펩티드 사슬을 절단하고, His 의 Trt 기 및 Glu 의 tBu 기를 TFA (트리플루오로아세트산) 로 절단하여 탈보호화를 수행하였다. 마지막으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, N-말단이 아세틸화된 LEHA 를 수득하였다. 생성된 정제 생성물의 순도는 96.8% 이었다.
실시예 9 C-말단- 아미드화 LEHA 의 제조
Fmoc 방법에 의한 고체상 합성 방법에 따라 LEHA 펩티드의 C-말단-아미드화 유도체를 제조하였다(L.A. Carpino, G.Y. Han, J. Am . Chem . Soc ., 92, 5748 (1970)). 먼저, Fmoc-Ala-OH 의 C-말단을 4-메틸벤즈히드릴아민 수지에 결합시키고, 그 후 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하였다. 이어서, 상기 수지를 중화 및 세정하고, Fmoc-His(1-Trt)-OH 를 Ala 의 N-말단에 도입하였다. 다음으로, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하고, 상기 수지를 다시 중화 및 세정하였다. 그 후, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 His 의 N-말단에 도입하였다. 다음으로, 피페리딘 처리에 의해 상기 보호기 (Fmoc) 를 제거하였다. 이어서, 상기 수지를 중화 및 세정하고, Fmoc-Leu-OH 를 Glu 의 N-말단에 도입하였다. 상기 수지로부터 펩티드 사슬을 절단하고, His 의 Trt 기 및 Glu 의 tBu 기를 TFA (트리플루오로아세트산) 로 절단하여 탈보호화를 수행하였다. 마지막으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, C-말단이 아미드화된 LEHA 를 수득하였다. 생성된 정제 생성물의 순도는 94.0% 이었다.
실시예 10 펩티드 유도체를 이용한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 검정
실시예 8 및 9 에서 제조한 N-말단-아세틸화 LEHA 및 C-말단-아미드화 LEHA 를 실시예 1 및 2 에서 합성한 LEH 및 LEHA 대신 사용한 것을 제외하고는 실시예 3 에서와 동일한 방식으로 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 강화 효과를 조사하였다. 결과는 표 7 에 나타나 있다.
펩티드 유도체 펩티드 유도체의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
N-말단-아세틸화-LEHA 10 124
C-말단-아미드화 LEHA 10 121
표 7 에 나타난 바와 같이, 인간 정상 피부에서 유래한 섬유아세포를 펩티드 유도체가 첨가된 각 배양 용액에서 배양함에 의해 상기 세포에서 콜라겐의 생성량이 현저히 증가한 것으로 나타났다.
실시예 11 펩티드 유도체를 이용한 독성 시험
실시예 10 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에 대하여, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 생존 세포수를 계수하였다. 결과는 표 8 에 나타나 있다.
펩티드 유도체 펩티드 유도체의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 2.6×104
N-말단-아세틸화-LEHA 10 2.8×104
C-말단-아미드화 LEHA 10 2.6×104
표 8 에 나타난 바와 같이, 세포를 펩티드 유도체가 첨가된 각 배양 용액에서 배양함에 의한 생존 세포수에 있어서의 유의미한 감소는 나타나지 않았다.
실시예 12 피부 표피 각질형성세포에서 히알루론산 생성 검정
정상 인간 표피 각질형성세포 (NHEK, KURABO INDUSTRIES LTD. 제조) 를 48-웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 더 구체적으로, 세포를 플레이트 상에 25,000 개 세포/cm2 의 밀도로 도말하고, 5% 이산화탄소 기체 및 95% 공기의 대기하에서 37℃에서 약 72 시간 동안 배양하였다. 배양 용액으로서는, HuMedia KG-2 (KURABO INDUSTRIES LTD. 제조) 를 웰당 400 ㎕ 의 양으로 사용하였다. 배양 72 시간 후 상기 배양 용액을 제거하고, 실시예 2 에서 기재된 바와 같이 합성한 LEHA 가 100 또는 300 ㎍/ml 의 농도로 첨가된 HuMedia KG-2 배지를 웰당 400 ㎕ 의 양으로 첨가하였다. 여기서, LEHA 를 첨가하지 않은 HuMedia KG-2 가 400 ㎕ 의 양으로 첨가된 세포를 대조군으로 사용하였다. 추가로 72 시간 배양 후, 배양 용액을 수집하고, 수집된 배양 용액 중의 히알루론산의 농도를 효소 결합 면역흡착 분석법 (히알루론산 측정 키트; Seikagaku Corporation 제조) 으로 정량하였다. 상기 정량 결과를 기초로, LEHA 가 첨가된 배양 용액 중의 히알루론산의 양을 산출하였는데, 이 때 대조군 배양 용액 중의 히알루론산의 양을 100% 로 하였다. 결과는 표 9 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 히알루론산 생성량 (%)
대조군 0 100
LEHA 100 154
300 193.3
표 9 에 나타난 바와 같이, 정상 인간 표피 각질형성세포를 LEHA 가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의해 상기 세포에서의 히알루론산의 생성량이 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 놀랍게도, LEHA 를 300 ㎍/ml 의 농도로 사용한 경우, 히알루론산이 대조군에서와 비교하여 약 200% 인 양으로 생성되는 현저히 큰 히알루론산 생성 강화 효과가 발견되었다.
실시예 13 LEKA 의 제조
실시예 1 에서 기재된 방법과 동일한 방식으로 펩티드 LEKA 를 제조하였다. 다음으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, LEKA 를 수득하였다.
실시예 14 LEKA 를 이용한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 검정
실시예 1 및 2 에서 합성한 LEH 및 LEHA 대신에 상기 기재된 바와 같이 합성한 LEKA 펩티드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3 에서와 동일한 방식으로 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 강화 효과를 조사하였다. 결과는 표 10 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
LEKA 10 112.2
표 10 에 나타난 바와 같이, 정상 인간 피부에서 유래한 섬유아세포를 LEKA 펩티드가 첨가된 배양 용액 중에서 배양함에 의해 상기 세포에서의 콜라겐의 생성량이 증가한 것으로 나타났다.
실시예 15 LEKA 를 이용한 독성 시험
실시예 14 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에 대하여, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 생존 세포수를 계수하였다. 결과는 표 11 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 2.9×104
LEKA 10 3.6×104
표 11 에 나타난 바와 같이, LEKA 가 첨가된 배양 용액 중에서 세포를 배양함에 의한 생존 세포수의 감소는 나타나지 않았다
실시예 16 LDHA 의 제조
실시예 1 에 기재된 방법과 동일한 방식으로 펩티드 LDHA 를 합성하였다. 다음으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, LDHA 를 수득하였다.
실시예 17 LDHA 를 이용한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 검정
실시예 1 및 2 에서 합성한 LEH 및 LEHA 를 10 ㎍/ml 의 양으로 사용하는 것 대신에 상기 기재된 바와 같이 합성한 LDHA 펩티드를 1 ㎍/ml 의 양으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 3 에서와 동일한 방식으로 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 강화 효과를 조사하였다. 결과는 표 12 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
LDHA 1 130.5
표 12 에 나타난 바와 같이, 정상 인간 피부에서 유래한 섬유아세포를 LDHA 펩티드가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의해 상기 세포에서의 콜라겐 생성량이 증가한 것으로 나타났다.
실시예 18 LDHA 를 이용한 독성 시험
실시예 17 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에 대하여, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 생존 세포수를 계수하였다. 결과는 표 13 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 3.1×104
LDHA 1 3.3×104
표 13 에 나타난 바와 같이, LDHA 펩티드가 첨가된 배양 용액에서 세포를 배양함에 의한 생존 세포수의 감소는 나타나지 않았다.
실시예 19 LEHAF 의 제조
실시예 1 에 기재된 방법과 동일한 방식으로 펩티드 LEHAF 를 합성하였다. 다음으로, 미반응 물질을 제조용 HPLC 로 제거함으로써 정제를 수행하여, LEHAF 를 수득하였다.
실시예 20 LEHAF 를 이용한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 검정
실시예 1 및 2 에서 합성한 LEH 및 LEHA 를 10 ㎍/ml 의 농도로 사용하는 것 대신에 상기 기재된 바와 같이 합성한 LEHAF 를 1 또는 3 ㎍/ml 의 농도로 사용한 것을 제외하고는 실시예 3 에서와 동일한 방식으로 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성 강화 효과를 조사하였다. 결과는 표 14 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 콜라겐 생성량 (%)
대조군 0 100
LEHAF 1 119.2
LEHAF 3 121.0
표 14 에 나타난 바와 같이, 정상 인간 피부에서 유래한 섬유아세포를 LEHAF 펩티드가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의해 상기 세포에서의 콜라겐의 생성량이 증가한 것으로 나타났다.
실시예 21 LEHAF 를 이용한 독성 시험
실시예 20 에서의 배양 용액을 수집한 후의 세포에 대하여, 실시예 4 에서와 동일한 방식으로 생존 세포수를 계수하였다. 결과는 표 15 에 나타나 있다.
펩티드 펩티드의 농도 (㎍/ml) 생존 세포수 (세포수)
대조군 0 3.0×104
LEHAF 1 3.0×104
LEHAF 3 3.0×104
표 15 에 나타난 바와 같이, 세포를 LEHAF 펩티드가 첨가된 배양 용액에서 배양함에 의한 생존 세포수의 유의미한 감소는 나타나지 않았다.
실시예 22 털없는 마우스를 이용한 항-주름 효과 검정
상기 펩티드를 이용한 도포 시험에 의해 털없는 마우스를 이용한 자외선에 의한 주름 생성에 대한 예방 효과를 검정한다. 즉, 5 주령의 수컷 털없는 마우스를 3 군으로 나누고 (8 마리/1 군), 3 주간에 걸쳐 UVB 자외선을 주 3 회 조사한다(제 1 주째에는 90 mJ/cm2 의 밀도로, 제 2 주째에는 120 mJ/cm2 의 밀도로, 제 3 주째에는 150 mJ/cm2 의 밀도로 함). 상기 3 주 동안, 각 군의 털없는 마우스의 등에, 각 시험 펩티드 등이 함유된 시험 용액 50 ㎕ 를 1 일 3 회 도포한다. 첫번째 자외선 조사로부터 24 일 후에, 육안으로 주름을 7 등급으로 점수를 매겨(표 16), 주름 생성에 대한 예방 효과를 평가한다. 상기 항-주름 효과 검정을 기초로 하여, 본 발명의 펩티드가 함유된 시험 용액이 도포된 군에서 우수한 주름 생성 예방 효과가 발견된다.
문헌 [Photodermatol . Photoimmunol . Photomed 7, 153-158, 1990] 의 주름 점수를 참고로 한, 주름의 육안 관찰에 있어서의 점수
0.0 등 피부 상에 뚜렷한 피부 고랑 (skin groove) 이 발견되지 않음
0.5 등 피부 상에 뚜렷한 피부 고랑이 부분적으로 발견됨
1.0 등 피부 전체에 걸쳐 뚜렷한 피부 고랑이 발견됨
1.5 등 피부 전체에 걸쳐 발견되는 피부 고랑에 있어서, 횡방향의 피부 고랑이 세로 방향의 피부 고랑보다 더 깊음
2.0 등 피부 전체에 걸쳐 발견되는 피부 고랑에 있어서, 횡방향의 피부 고랑이 세로 방향의 피부 고랑보다 훨씬 더 깊음
2.5 등 피부 전체에 걸쳐 주름이 발견됨
3.0 등 피부 전체에 걸쳐 깊은 주름이 발견됨
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Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 식 (II) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염으로서, 상기 유도체는 상기 펩티드의 아세틸화 또는 아미드화로 수득될 수 있는 유도체인, 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
    Leu-Glu-His-Ala (서열번호: 1) (II).
  5. 삭제
  6. 하기 식 (IV) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염으로서, 상기 유도체는 상기 펩티드의 아세틸화 또는 아미드화로 수득될 수 있는 유도체인, 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
    Leu-Asp-His-Ala (서열번호: 19) (IV).
  7. 하기 식 (V) 으로 표시되는 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염으로서, 상기 유도체는 상기 펩티드의 아세틸화 또는 아미드화로 수득될 수 있는 유도체인, 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염:
    Leu-Glu-His-Ala-Phe (서열번호: 20) (V).
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 4 항, 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드 또는 이의 유도체, 또는 이의 염을 함유하는 화장품 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 10 항에 있어서, 콜라겐 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 구성원의 세포 내에서의 생성을 강화시키는데 사용가능한 화장품 조성물.
  15. 제 10 항에 있어서, 외용제로 사용가능한 화장품 조성물.
  16. 삭제
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