PL178589B1

PL178589B1 - Izolowany kwas nukleinowy, zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, plazmid, komórka ssaka, polipeptyd i kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób skóry

Info

Publication number: PL178589B1
Application number: PL94312189A
Authority: PL
Inventors: Torbjörn Egelrud; Lennart Hansson
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-20
Publication date: 2000-05-31
Also published as: CN100457908C; HU220339B; EP1398326B1; NO322728B1; FI956075A; ES2208656T3; CA2165197C; DK72593D0; NO955110D0; US5981256A; ATE315584T1; DE69434612D1; DE69433280D1; FI119027B; CN1128047A; PL312189A1; DE69433280T2; CZ333595A3; DE69434612T2; BR9407015A

Abstract

1. Izolowany kwas nukleinowy, zawierajacy sekwencje nukleotydowa kodujaca polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID Nr 2 albo analog lub wariant tej sekwencji wykazujacy aktywnosc enzymu chymotryptynowego warstwy rogowej skóry (SCCE) 6. Zdolny do replikacji wektor ekspresyjny oznaczony symbolem pS507, zdeponowany w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8282, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztanskiego. 7. Plazmid oznaczony symbolem pS500, zdeponowany w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Samm- lung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8281, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztanskiego 8. Komórka ssaka transformowana zdolnym do replikacji wektorem ekspresyjnym oznaczonym symbo- lem pS507, zdeponowanym w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8282, zgodnie z warunkami Traktatu Budape- sztanskiego 9. Zasadniczo czysty polipeptyd posiadajacy sekwencje am i nokwasowa SEQ ID NR 2 albo jej analog lub wariant, wykazujacy aktywnosc SCCE 12. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób skóry zawierajaca czynnik aktywny oraz farmaceuty- cznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd posiadajacy aktyw- nosc enzymu chymotryptynowego warstwy rogowej skóry (SCCE) o sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr 2 albo jej analog lub wariant wykazujacy aktywnosc SCCE, w ilosci od 0,001 do 25% wagowych (%w) calej kom- pozycji. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowany kwas nukleinowy, zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, plazmid, komórka ssaka, polipeptyd i kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób skóry.

Skóra jest narządem interesującym z punktu widzenia biologicznego, medycznego i kosmetycznego. Istnieje wiele chorób skóry. Choroby te mogą być specyficzne w stosunku do tego organu (np. łuszczyca i egzemy) lub są objawem choroby ogólnej, np. są to uogólnione reakcje alergiczne. Fakt istnienia chorób specyficznych dla skóry można traktować jako dowód na istnienie mechanizmów molekularnych charakterystycznych tylko dla skóry. Analogicznie, badania procesów molekularnych specyficznych dla skóry mająpodstawowe znaczenie dla zrozumienia i leczenia chorób skóry. Wydaje się uzasadnione przyjęcie założenia, że wiele z tych procesów w taki lub inny sposób wiąże się z najbardziej podstawową rolą skóry, a mianowicie, ze stanowieniem fizyko-chemicznej bariery między wnętrzem organizmu a otoczeniem. Ta bariera fizykochemiczna jest zlokalizowana w najbardziej powierzchownej warstwie skóry, czyli w warstwie rogowej.

Warstwa rogowa jest najbardziej wyspecjalizowaną strukturą skóry. Jest ona produktem końcowym procesu różnicowania naskórka czyli nabłonka wielowarstwowego płaskiego, który jest odpowiedzialny za tę najbardziej powierzchowną część skóry. Większość komórek naskórka składa się z keratynocytów w różnych stadiach różnicowania. Najniższe keratynocyty, komórki warstwy podstawowej, znajdują się na błonie podstawnej w kontakcie ze skórą właściwą, to znaczy, z tkanką łączną skóry i są to jedyne keratynocyty wykazujące zdolność dzielenia się. Pewna frakcja komórek podstawnych w sposób ciągły opuszcza błonę podstawną i wchodzi w proces różnicowania, który ostatecznie sprawia, że komórki te stają się blokami budulcowymi warstwy rogowej. W procesie tym, keratynocyty przechodzą przez wiele zmian adaptacyjnych. Istnieje zwiększona zawartość zrębu komórkowego składającego się z naskórkowo-swoistych cytokeratyn. Pośrednie włókna przyległych komórek łączą się w jednostkę funkcjonalną poprzez zwiększonailość desmosomów Najbardziej istotne zmiany zachodzą podczas przejścia od najwyższej, szczytowej warstwy komórek żywych, warstwy ziarnistej, do martwej warstwy rogowej w procesie zazwyczaj zwanym rogowaceniem. Usieciowane wiązaniami kowalencyjnymi proteiny odkładają się w bezpośrednim sąsiedztwie wewnętrznej strony błony plazmatycznej tworząc bardzo odporną otoczkę komórkową. Ponadto, mająca swe źródło w organellach komórek keratynocyto - swoistych substancja bogata w lipidy jest wydzielana do przestrzeni pozakomórkowej i poprzez tworzenie płytek lipidowych otaczających komórki warstwy rogowej stanowi barierę nie przepuszczającą substancji hydrofilowych. W końcu zanikają wszystkie struktury wewnątrzkomórkowe za wyjątkiem ściśle upakowanych włókien cytokeratynowych.

Komórki warstwy rogowej, korneocyty, nie są więc żywotne. Oznacza to, że regulacja różnych procesów przebiegających w warstwie rogowej musi być wynikiem „programowania” na etapie, kiedy keratynocyty są wciąż żywe. Przemiana naskórka, zachodząca normalnie w ciągu około 4 tygodni, podczas których komórki pozostają częścią warstwy rogowej w czasie około 2 tygodni kończy się odpadaniem tych komórek z powierzchni skóry w procesie złusz4

178 589 czania. Ten proces jest przykładem „programowania” warstwy rogowej. Warunkiem wstępnym funkcjonowania warstwy rogowej jako bariery fizyko-chemicznej jest to, aby jej poszczególne komórki były utrzymywane razem przez odporne mechanicznie struktury, desmosomy. Rozkład desmosomów niezbędny do złuszczania, musi być tak regulowany aby zachodziło odpadanie komórek z powierzchni skóry, będące równowagą dla odbudowy warstwy rogowej bez zakłócania funkcji tkanki skórnej jako bariery.

Zaburzenia rogowacenia

Wśród wielu stanów patologicznych w skórze, występujących z różnym nasileniem występują zaburzenia w keratynizacji (rogowaceniu). W łuszczycy, poza typowym przewlekłym zapaleniem występuje nadmierne wytwarzanie niedojrzałej warstwy rogowej z następczym typowym złuszczaniem. Istnieje grupa chorób dziedzicznych, zwanych istiozami, charakteryzujących się zgrubiałą warstwą rogową i w następstwie powstawaniem „rybiej łuski”. W niektórych ichtiozach występuje zmniejszona szybkość złuszczania. Chociaż mniej poważna niż ichtiozy, „sucha skóra” (skóra pergaminowa, kseroderma) również charakteryzuje się warstwą rogową, z której spadająkorneocyty, nie tak, jak z normalnej skóry, w postaci pojedynczych komórek albo małych agregatów komórek lecz w postaci dużych łusek, widocznych makroskopowo. To zaburzenie bardzo często występuje u ludzi starszych i wśród pacjentów z atopowymi zaburzeniami skóry, to znaczy, u osobników z obniżoną odpornością na środki drażniące skórę i ze skłonnością do rozwoju charakterystycznej formy egzemy endogennej. W trądziku natomiast występuje zaburzenie keratynizacji w przewodach gruczołów łojowych prowadzące do powstawania zaskómików i zaczopowania. Tworzenie się zaskómików poprzedza i jak się przypuszcza, pobudza proces zapalny w trądziku.

Enzymy proteolityczne związane z rogowaceniem

W procesie rogowacenia i przemiany warstwy rogowej wyróżnia się kilka etapów, w których ważną rolę zdająsię odgrywać enzymy proteolityczne. Z pewnością, zanikanie wszystkich struktur wewnątrzkomórkowych za wyjątkiem włókien cytokeratynowych pojawiających się podczas przejścia od żywotnych do zrogowaciałych warstw naskórka musi być związane z proteolizą. Przypuszcza się, że transformacja profilagryny do filagryny, białka, któremu przypisuje się rolę w specjalnym typie agregacji włókien cytokeratynowych podczas rogowacenia, jest katalizowana przez swoistąproteinazę. W warstwie rogowej filagryna jest dalej rozkładana do składników o niskich masach cząsteczkowych, pełniących prawdopodobnie rolę „naturalnych środków zwilżających”. Ponadto, w procesie rogowacenia występują modyfikacje proteolityczne polipeptydów cytokeratynowych. Procesy proteolityczne zdająsię odgrywać kluczowąrolę w rozkładzie międzykomórkowych struktur kohezyjnych w warstwie rogowej w procesach prowadzących do złuszczania.

Spójność i złuszczanie się komórek warstwy rogowej. Rola desmosomów

Na spójność międzykomórkową w warstwie rogowej, jak również w żywotnych częściach naskórka wpływają w znacznej mierze desmosomy. Desmosom składa się z dwu symetrycznych połówek, z których każda jest uformowana przez dwie komórki sąsiadujące. Każda połówka desmosomu posiada jedną część wewnątrzkomórkową połączoną z włóknami cytokeratyny i jedną część zbudowaną z glikoprotein zakotwiczonych wewnątrz komórki ale z częściami transbłonowymi i pozakomórkowymi. Pozakomórkowe części tych białek, desmogleiny, są cząsteczkami adhezyjnymi. Wzajemna interakcja tych desmoglein w przestrzeni pozakomórkowej powoduje powstanie spójnej struktury. Wydaje się, że degradacja desmosomów przebiega nieco innymi drogami w warstwie rogowej dłoni i stóp w porównaniu do warstwy rogowej innych części skóry. W tej ostatniej tkance, 85% desmosomów zanika wkrótce po pełnym zrogowacemu komórek. Pozostałe desmosomy, które są preferencyjnie zlokalizowane w kosmkowych brzegach ekstremalnie spłaszczonych komórek pozostają nienaruszone aż do czasu zrogowacenia. W warstwie rogowej dłoni i stóp korneocyty są znacznie mniej spłaszczone i nie występuje rozległy rozkład desmosomów w głębszych warstwach tej tkanki. W obydwu tkankach złuszczanie jest związane z degradacją desmosomów Wykazano, ze w „rybiej łusce” oraz w „suchej skórze” ilość desmosomów w warstwach powierzchniowych warstwy rogowej jest zwiększona.

178 589

Lipidy międzykomórkowe warstwy rogowej

Różnice w degradacji desmosomów w warstwie rogowej dłoni i stóp w porównaniu z warstwą rogową innych części ciała mogą być związane z różnicami w ilościach pozakomórkowych lipidów w tych dwóch typach tkanki. Zawartość lipidów jest znacznie wyższa w warstwie rogowej części skóry poza dłońmi i stopami. W wyniku tego, skuteczność tej tkanki jako bariery nie przepuszczającej wody i innych substancji hydrofitowych jest większa niż warstwy rogowej dłoni i stóp. Ponieważ desmosomy zajmująznacznąobjęlość i ponieważ nienaruszone desmosomy zapobiegają powiększaniu się przestrzeni pozakomórkowej, degradacja desmosomów może być mechanizmem, dzięki któremu dla lipidów staje się dostępna większa przestrzeń międzykomórkowa. Te pozakomórkowe lipidy warstwy rogowej są związane ze złuszczaniem również na kilka innych sposobów. Ponieważ są one głównymi składnikami przestrzeni pozakomórkowej, można oczekiwać, że posiadają one znaczny wpływ na aktywność enzymów zlokalizowanych w tym miejscu, np. enzymów odpowiedzialnych za degradację desmosomów. Rzeczywiście, wykazano, że różne zaburzenia w metabolizmie lipidów mogą stanowić przyczynę kilku typów ichtioz. Jest również prawdopodobne, że same lipidy przyczyniają się w pewnej mierze do spójności komórek w warstwie rogowej. Poza tym, wydzielanie lipidów do przestrzeni pozakomórkowej warstwy rogowej jest prawdopodobnie również związane z wydzielaniem wielu enzymów. Prekursory tych lipidów sąmagazynowane w górnych, żywych keratynocytach w szczególnych organellach. Okazało się, że te tak zwane ciałka blaszkowate zawierają wiele enzymów hydrolitycznych. Tak więc, sądzi się, że enzym odpowiedzialny za degradację desmosomów w warstwie rogowej jest syntetyzowany, prawdopodobnie w nieaktywnej formie proenzymu, przez keratynocyty, przechowywany w ciałkach blaszkowatych i wydzielany do przestrzeni pozakomórkowej warstwy rogowej podczas procesu rogowacenia, gdzie może być aktywowany a jego aktywność dalej regulowana przez wiele czynników, między innymi, przez kompozycję lipidów pozakomorkowych.

Zaburzenia w spoistości komórek żywotnej części naskórka

Istnieje wiele chorób skóry, w których występują zaburzenia spójności pomiędzy keratynocytami w niezrogowaciałych, żywotnych warstwach naskórka Choroby te charakteryzują się występowaniem zjawiska zwanego akantolizą, polegającego na rozpadzie kontaktów desmosomalnych pomiędzy pozornie normalnymi keratynocytami. Przypuszcza się, że w procesie tym uczestniczą proteinazy, jak dotąd nie w pełni zidentyfikowane. Akantoliza, która jeśli się rozprzestrzenia, jestprzyczynąpowstawania pęcherzy, jest cechą charakterystyczną chorób autoimmunologicznych, pęcherzycy zwykłej i pęcherzycy liściastej, dziedzicznej łagodnej pęcherzycy rodzinnej (choroby Hayley'a-Hayley'a) i dziedzicznego wadliwego rogowacenia liściastego (choroby Darriera).

Naskórek bierze czynny udział w reakcjach immunologicznych i zapalnych

Poza funkcją stanowienia bariery fizyko-chemicznej między wnętrzem organizmu a otoczeniem zewnętrznym, naskórek pełni również rolę aktywnej bariery immunologicznej. Keratynocyty mają zdolność wytwarzania i reagowania na wiele cytokin i innych mediatorów procesów zapalnych, poprzez które to mediatory komunikują się one i reagują z komórkami układów immunologicznego i zapalnego. Ma to ogromne znaczenie dla obrony gospodarza przed zakażeniami mikroorganizmami i dla gojenia się ran. Ostatnie badania wskazują również na fakt, że keratynocyty prawdopodobnie biorą czynny udział w wielu chorobach zapalnych skóry, takich jak łuszczyca i egzemy.

Proteinazy naskórka mogą mieć duże znaczenie w procesie zapalnym

Jednąz cytokin wytwarzaną przez keratynocyty jest interleukina-1 (I1-1). I1-1 występuje w dwu formach, w formie I1- 1a i I1-1 β. Obydwie te formy występują w naskórku Forma I1- 1α jest w pełni aktywna bezpośrednio po jej syntezie, natomiast I11 β jest syntetyzowana w postaci nieaktywnej pro-formy o wielkości 31 kD. Pro-I1- 1-β jest przekształcana do aktywnej forrnyo wielkości 17 kD przez specyficzną proteinazę obecną między innymi w monocytach, jednak nie wykrytą dotychczas w normalnym naskórku. Jednakże, aktywatorami tej formy pro-l1-1- może

178 589 być również wiele proteinaz serynowych ze specyficznością dla substratu podobną do chymotrypsyny (np. chymotrypsyna trzustkowa i katepsyna G z granulocytów obojętnochłonnych).

Jak przypuszczał Norris (1990), enzymy proteolityczne występujące w przestrzeni międzykomórkowej warstwy rogowej mogą w pewnych warunkach przekształcać nieaktywne formy cytokin w formy aktywne. W tym kontekście, przedmiotem zainteresowania jest nieaktywna biologicznie pro-interleukma-1 β, która, j ak wykazano jest wytwarzana w keratynocytach (Mizutani i wsp., 1991). Dotychczas nie wykryto enzymów naskórkowych o zdolności przekształcania pro-interleukiny-1 β do aktywnej interleukiny-1 β. Biorąc jednak pod uwagę, że chymotrypsyna i katepsyna G (enzym chymotrypsyno - podobny) wykazują zdolność katalizowania konwersji nieaktywnej rekombinantowej pro-interleukiny-1 β o wielkości 31 kD do w pełni aktywnej formy o wielkości 17 kD, jest możliwe, że również naskórkowe enzymy chymotrypsyno - podobne mogą katalizować tę konwersję.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Przedmiotem wynalazkujest enzym, który został nazwany enzymem chymotrypsynowym warstwy rogowej (SCCE) i o którym sądzi się, że jest odpowiedzialny za degradację desmosomów w warstwie rogowej. Dowód jest przedstawiony w przykładzie I. W przykładzie tym wykazano, że odpadanie komórek z powierzchni zrogowaciałej warstwy powierzchniowej skóry wymaga degradacji białek desmosomalnych i że odpowiedzialnym za to enzymem wydaje się być proteinaza serynowa chymotrypsyno - podobna, hamowana przez jony cynku.

W przykładzie II jest opisane odkrycie enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej (SCCE); proteinaza ta spełnia kryteria odpowiedzialności za degradację wewnątrzkomórkowych struktur kohezyjnych w warstwie rogowej in vitro i prawdopodobnie również in vivo. W przykładzie III opisana jest częściowa charakteryzacja aktywności enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej (SCCE) z użyciem substratów chromogennych.

Wyniki badań wykazują, że SCCE różni się pod względem enzymologicznym od innych proteinaz typu chymotrypsyny. Profil inhibitorów i zdolność rozkładania dwu różnych substratów dla enzymów chymotrypsyno - podobnych jest znacząco różny dla SCCE w porównaniu do chymotrypsyny wołowej i ludzkiej katepsyny G SCCE wydaje się również różnić od chimazy ludzkich komórek tucznych. Ten ostatni enzym wydajnie katalizuje degradację Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Schwartz i wsp., 19871 Schechter i wsp., 1989), podczas gdy SCCE nie ma takiej cechy, nie jest hamowany przez aprotyninę ani SBTI (Schechter i wsp., 1983 i Wintroub i wsp., 1986), natomiast SCCE - jest hamowany.

W przykładzie IVjest opisane częściowe oczyszczanie SCCE z ekstraktów komeocytów w chlorku potasu metodą chromatografii powinowactwa na insolubihzowanym inhibitorze trypsyny z soi (SBTI) i oznaczanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej SCCE. W próbkach nieredukowanych wydajności były dobre w etapach 1-6 ale spadały do zera w etapach 7 i 9 a wydajności w następnych etapach były znacząco obniżone. Również w próbkach zredukowanych nie można było wykryć pochodnych aminokwasowych w etapach 7 i 9 ale w następnych etapach, w których pochodne były wykrywalne, nie było ostrych spadków wydajności. Wyniki te wskazująna występowanie reszt cysteiny w pozycjach 7 19. Nie było jednak możliwe wykrycie karboksymetylowanej cysteiny w etapach 7 i 9 po redukcji i działaniu kwasem jodooctowym (100 mM). Otrzymana sekwencja (fig. 13; SEQ ID Nr: 3) była identyczna dla próbek redukowanych i nieredukowanych.

W przykładzie V jest opisane preparowanie przeciwciał monoklonalnych SCCE-swoistych oraz przeciwciał poliklonalnych kurcząt i króliczych SCCE-swoistych a także są opisane badania immunohistochemiczne z udziałem tych przeciwciał monoklonalnych.

W przykładzie V jest opisane klonowanie i sekwencjonowame cDNA kodującego ludzki SCCE. Na początku, bank cDNA przygotowany z mRNA pochodzącego z ludzkich keratynocytów naskórka pobranych od osób dorosłych poddawano sknningowi z przeciwciałami poliklonalnymi królika przeciw SCCE. Jedno z tych przeciwciał dawało wysoki sygnał tła i zostało wyłączone z badań przesiewowych we wczesnym etapie. Przy użyciu innego przeciwciała poliklonalnego (D-5) uzyskano wiele immunoreaktywnych łysinek, uznanych za łysinki rzeczywi178 589 ście pozytywne. Jednak nie zaobserwowano reaktywności żadnej z tych łysinek z przeciwciałami monoklonalnymi moAb4 i moAb 9 . Wyczerpująca charaktcryzajja enzymami restyykcyjnymi i charakteryzacja w reakcji PCRjedenastu wyizolowanych łysinek ujawniła, że nie można wykryć żadnego podobieństwa między tymi różnymi łysinkami. Ze względu na niepowodzenie w określeniu „odcisków palców” prawdopodobnej sekwencji cDNA SCCE, zmodyfikowano strategię.

Pomimo preferencyjnego wykrywania materiału immunoreaktywnego wobec SCCE w keratynocytach nadpodstawnych, do skriningu cDNA SCCE użyto banku cDNA przygotowanego z hodowli ludzkich keratynocytów. Można oczekiwać, że taki bank będzie zawierał jedynie cDNA z keratynocytów podstawnych. Takie podejście oparto na obserwacji słabej ale prawdopodobnie ważnej barwnej reakcji immunologicznej przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciw SCCE również z keratynocytów podstawnych.

Skrining łysinek prowadzono stosując 17-merowa sondę oligonukleotydową zaprojektowaną na podstawie najbardziej wiarygodnej części sekwencji aminokwasowej, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID Nr: 10, aa 1 - aa 6) oznaczonej eksperymentalnie amino-terminalnej sekwencji natywnego enzymu SCCE opisanej w przykładzie IV. Ze względu na niepewność, co do oznaczonej eksperymentalnie sekwencji aminokwasowej, uznano ten heksapeptyd za reprezentujący jedną z najbardziej wiarygodnych części. Ponadto, możliwe kodony kodujące ten heksapeptyd dawały możliwie najmniejszą degenerację sondy DNA. Wykluczono dłuższą, oznaczoną eksperymentalnie sekwencję:

Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID Nr: 3, aa 15 - aa 24) z powodu wysokiego stopnia degeneracji sekwencji kodującej tę sekwencję peptydową. W pierwszym skriningu zidentyfikowano 14 łysinek pozytywnych. Te pozytywne łysinki powtórnie przesiewano stosując tę samą sondę i opisane powyżej sposoby. Po etapie powtórnego skriningu zidentyfikowano dwie łysinki pozytywne. Te dwie wyselekcjonowane łysinki oczyszczono jeszcze raz i oznaczono wielkości insertów w reakcjach PCR stosując jako primery SYM 16001 SYM 1601, które były komplementarne do dwu ramion faga oraz wyizolowane fagi jako matryce Ten sklonowany fragment poddano częściowej analizie sekwencji.

Translacja otrzymanej sekwencji DNA dała w wyniku sekwencję aminokwasową homologiczną do oznaczonej eksperymentalnie sekwencji proteiny. W sekwencji tej jednak nie było kodonu początku translacji. W celu wyizolowania cDNA o pełnej długości, otrzymany fragment DNA rozdzielono na żelu agarozowym i użyto jako sondę w hybrydyzacji prowadzonej w warunkach ścisłych. Dla uzyskania cDNA o pełnej długości, ten bank cDNA poddano powtórnemu dwukrotnemu skriningowi z tą sondą, stosując metody opisane powyżej za wyjątkiem hybrydyzacji prowadzonej w warunkach ścisłych w temperaturze 65°C. W tych próbach zidentyfikowano i wyizolowano 45 indywidualnych łysinek pozytywnych, które początkowo poddano skriningowi w reakcjach PCR, stosując jako primery SYM 1600 i SYM 1601 w kombinacji z SYM 3208 do identyfikacji łysinki zawierającej całą 5' otwartą ramkę odczytu.

Po dalszym skriningu i analizie sekwencji klonowano otrzymane amplifikowane fragmenty PCR pochodzące z tych fagów, co zostało szczegółowo opisane w przykładzie VI. Wyniki wskazują, że jeden z tych fagów, 205.2.1, zawierał insert o pełnej długości. Oznaczono całkowitą sekwencję nukleotydowątego fragmentu cDNA. Ta sekwencja nukleotydowa (SEQ ID Nr: 1) zawierała otwartą ramę odczytu wystarczającą do zakodowania całej sekwencji aminokwasowej prekursora białka SCCE składającego się z 253 aminokwasów łącznie z peptydem sygnałowym i pre-polipeptydem (SEQ ID Nr: 2).

W przykładzie VII jest opisana detekcja w ludzkim naskórku dwu rodzajów mRNA dla SCCE, które miały zdolność hybrydyzacji z sondami cDNA przygotowanymi na podstawie sekwencji cDNA dla SCCE.

W przykładzie VIII jest opisana ekspresja rekombinantowego enzymu SCCE w E. coli

Wyniki wskazują, ze istnieje możliwość wytwarzania rekombinantowego SCCE w bakteriach.

W przykładzie IX jest opisana ekspresja rekombinantowego ludzkiego SCCE w komórkach ssaczych. Wytwarzane sątrzy białka, które dająreakcję ze wszystkimi dostępnymi przeciwciałami poliklonalnymi królika i kurczaka przeciw SCCE i ze zdeponowanymi przeciwciałami

178 589 monoklonalnymi. Te rekombinantowe białka wykazujące reaktywność z przeciwciałami przeciw natywnemu SCCE mają pozorną masę cząsteczkową o około 1 kD wyższą od oczyszczonego, natywnego, ludzkiego SCCE. To rekombinantowe białko nie wykazuje jakiejkolwiek aktywności proteolitycznej.

Oczyszczanie, aktywacja i dalsza charakteryzacja rekombinantowego SCCE jest opisana w przykładzie X. Nieaktywną pro-formę rekombinantowego SCCE można aktywować przez rozszczepienie proteolityczne trypsynaalbo endopeptydaząLys-C. Zakłada się, że wiele innych proteaz, które rozszczepiająpeptyd po reszcie zasadowego aminokwasu, takie jak endoproteinaza Lys-C, papaina i plazmina będą miały zdolność aktywowania pro-SCCE do aktywnego enzymu SCCE. Okazało się, że peptyd sygnalny składa się z 22 aminokwasów i opiera się na N-terminalnej sekwencji aminokwasowej natywnego aktywnego SCCE, propeptyd składa się z 7 aminokwasów. Ponadto wykazano, że wytworzony rekombinantowy SCCE występuje w dwu formach N-zglikozylowanych i jednej niezglikozylowanej, co jest analogiczne do wyników uzyskanych dla aktywnego natywnego enzymu SCCE.

Termin „enzym chymotrypsynowy warstwy rogowej (SCCE)” albo „polipeptyd wykazujący aktywność SCCE” oznacza w najszerszym aspekcie proteazę serynową albo jej pro-formę, taką jak proenzym (pro-SCCE) lub białko fuzyjne, które może być aktywowane przez rozszczepienie proteolityczne, który to enzym w swej formie aktywnej jest hamowany przez te same inhibitory i w sposób podobny do tego jaki przebiega podczas samoistnej dysocjacji komórek, którą można indukować w układach modelowych z użyciem próbek warstwy zrogowaciałej skóry inkubowanych w środowisku o pH obojętnym lub bliskim obojętnego, w temperaturze fizjologicznej.

Bardziej szczegółowo, termin: „polipeptyd wykazujący aktywność SCCE” oznacza polipeptyd inny niż chymotrypsyna i katepsyna G, który to polipeptyd w swej formie aktywnej ma zdolność rozkładania substratu MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), a rozkład katalizowany tym polipeptydem jest hamowany przede wszystkim aprotyniną, chymostatyną i siarczanem cynku, co jest opisane w przykładach III i XIII i zilustrowane na fig. 9 i w tabeli 5.

Jeszcze bardziej szczegółowo, termin: „polipeptyd wykazujący aktywność SCCE” oznacza polipeptyd wykazujący zdolność degradacji proteolitycznej białka desmosomowego, desmogleiny I, podczas inkubacji in vitro warstwy rogowej podeszwowej.

Taki polipeptyd będzie na ogół również reagował z przeciwciałami przeciw natywnemu SCCE, oczyszczonemu z ekstraktu zdysocjowanych komórek warstwy rogowej podeszwy. Przykładami takich przeciwciał są przeciwciała poliklonalne przygotowane w przykładzie 5.2 i przeciwciała monoklonalne TE4b i TE9b przygotowane w sposób opisany w przykładzie 5.1. Te przeciwciała monoklonalne są wytwarzane przez hybrydoma TE4b i TE9b zdeponowane w Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórek Zwierzęcych, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Wielka Brytania, pod numerami akcesyjnymi odpowiednio: ECACC 930618171 ECACC 93061816, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego.

Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA kodującego ludzki SCCE jest opisane w przykładzie VI. Znaleziono sekwencję nukleotydową zawierającą otwartą ramę odczytu wystarczającą do zakodowania całej sekwencji aminokwasowej białka prekursora SCCE zawierającego 253 aminokwasy, w tym peptyd sygnalny i prepolipeptyd. Ta sekwencja nukleotydową jest przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr: 1 a wyprowadzona z niej sekwencja aminokwasowa „enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej (SCCE)” jest podana na sEq ID Nr: 2.

Termin „pro-SCCE albo jego analog lub wariant” oznacza polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasowąSEQ ID Nr. 2 albo analog lub wariant tej sekwencji, który to „Pro-SCCE” jest wytwarzany w wyniku ekspresji sekwencji nukleotydowej według wynalazku w odpowiednim układzie ekspresyjnym, i który w wyniku aktywacji proteolitycznej daje proteinazę serynową, może być hamowany przez te same inhibitory, które hamują samoistnądysocjację komórek indukowaną w układach modelowych zawierających próbki zrogowaciałej warstwy skóry, inkubowanych w środowisku o pH obojętnym lub bliskim obojętnego, w temperaturze fizjologicznej,

178 589 to znaczy, około 37°C. W zasadzie, białko to będzie reagować z przeciwciałami przeciw oczyszczonemu natywnemu albo rekombinantowemu SCCE.

Termin „SCCE albo jego analog lub wariant”oznacza polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 albo będącą analogiem lub wariantem tej sekwencji, który to „SCCE” jest wytwarzany w wyniku ekspresji sekwencji nukleotydowej według wynalazku w odpowiednim układzie ekspresyjnym, który jest proteinaząserynowąi który może być hamowany przez te same inhibitory, jakie hamująsamoistnądysocjację komórek indukowanąw układach modelowych zawierających próbki zrogowaciałej warstwy skóry, inkubowane w środowisku o pH obojętnym lub bliskim obojętnego, w temperaturze fizjologicznej, to znaczy, około 37°C. W zasadzie, białko to będzie reagować z przeciwciałami przeciw oczyszczonemu natywnemu albo rekombinantowemu SCCE.

Termin „analog albo wariant” oznacza polipeptyd nie posiadający sekwencji aminokwasowej dokładnie takiej samej jak przedstawiona na sEq ID Nr: 2, wykazujący jednak „aktywność SCCE” zdefiniowaną powyżej. Na ogół, takimi polipeptydami będąpolipeptydy różniące się do pewnego stopnia w składzie aminokwasowym albo w modyfikacjach post-translacyjnych, np. gliko/ylacjąalbo resztami fosforanowymi od białka SCCE opisanego w przykładach.

Termin „analog” lub „wariant” stosuje się zatem w mniejszym opisie do białka lub polipeptydu o składzie aminokwasowym albo sekwencji podobnej do charakterystycznej sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr: 2 pochodzącej z białka SCCE opisanego w przykładzie VI, z niewielkimi różnicami, zmieniającymi tę sekwencję aminokwasową, np. delecjami, mutacjami sterowanymi miejscem, insercjami dodatkowych aminokwasów albo ich kombinacjami z wytworzeniem analogów białka SCCE. Te modyfikacje mogą dawać interesujące i użyteczne nowe właściwości takiego analogu. Taki analogiczny polipeptyd albo białko może pochodzić od zwierzęcia lub od człowieka albo może mieć źródło częściowo lub całkowicie syntetyczne. Analog ten można również wytworzyć z zastosowaniem technik rekombinacji DNA.

Przedmiotem ważnego rozwiązania mniejszego wynalazku jest zatem polipeptyd, w którym co najmniej jedna reszta aminokwasowa została zastąpiona inną resztą aminokwasową i/lub w którym co najmniej jedna reszta aminokwasowa została wycięta lub dodana, w wyniku czego powstał polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową inną niż sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr: 2 lub subsekwencję tej sekwencji aminokwasowej zdefiniowaną poniżej ale zasadniczo wykazującą aktywność SCCE zdefiniowaną powyżej.

Interesujące rozwiązanie wynalazku odnosi się do polipeptydu będącego analogiem albo subsekwencjąpolipeptydu według wynalazku, zawierającym od 50 do 250 aminokwasów, np. co najmniej 70 aminokwasów, co najmniej 100 aminokwasów, co najmniej 150 aminokwasów albo co najmniej 200 aminokwasów.

Szczególnie ważny przedmiot wynalazku stanowi polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową odpowiadającą pozycjom -7-224 w SEQ ID Nr: 2 (pro-SCCE) oraz polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową odpowiadającą pozycjom 1 -224 w SEQ ID Nr: 2 (sCĆE).

Termin „sekwencja aktywna enzymatycznie” oznacza sekwencję polipeptydową zawierającąjedynie część sekwencji polipeptydowej przedstawionej na SEQ ID Nr: 2, wykazującą aktywność enzymatyczną. Przedmiotem wynalazku są również subsekwencje polipeptydowe, które zostały zanalogizowane na drodze modyfikacji podanych w opisie. Za szczególnie interesujący uważa się specyficzny polipeptyd (lub polipeptydy), zawierający miejsce aktywne enzymatycznie.

Wyprowadzoną sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 porównano z sekwencjami aminokwasowymi enzymów ludzkiej chymotrypsyny (Toulta i wsp. 1989), ludzkiej katepsyny G (Salvesen i wsp., 1987) i ludzkiej chimazy komórek tucznych (ćaughey i wsp., 1991). Jakkolwiek ta wyprowadzona sekwencja aminokwasowa zawiera aktywne regiony konserwatywne proteaz serynowych, jednak stopieńhomologii jest całkiem niski, około 33-38%. Wynika stąd, że SCćE wykazuje niewielkie podobieństwo do znanych proteinaz serynowych. Z drugiej strony, SCćE jest typową proteinazą serynową w odniesieniu do aktywnych miejsc reszt histydyny, asparginianu i seryny i regionów konserwatywnych sąsiadujących z tymi miejscami. Odnosi się to również do większości reszt cysternowych i innych wysoce konserwatywnych regionów pro10

178 589 teinaz serynowych. W głębi kieszeni pierwszorzędowej swoistości (reszta 189 w chymotrypsynie) znajduje się reszta serynowa w ludzkiej chymotrypsynie, chimazie komórek tucznych i w swoistym antygenie stercza i reszta alaninowa w ludzkiej katepsynie G. W SCCE pozycja tajest natomiast zajęta przez resztę asparaginy. Tym można tłumaczyć zjawisko, że jakkolwiek SCCE wykazuje niewątpliwie aktywność chymotrypsyny, jej względna aktywność w stosunku do różnych chromogennych substratów peptydowych różni się od aktywności chymotrypsyny i katepsyny G. Różni się również cechą hamowania przez chymostatynę, będącą inhibitorem enzymów chymotrypsyno-podobnych o niskiej masie cząsteczkowej.

Porównanie sekwencji ludzkiej chymotrypsyny, ludzkiej katepsyny G i ludzkiej chimazy komórek tucznych z sekwencją SCCE jest przedstawione w następującym wyhniowamu sekwencji.

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

SCCE

HUMCTRP

HUMCHTG

HUMCHYM

IIDGAPCARGSHPWQVALLSGNQLHH. . . CGGVLVNERWVLTAAHCKMN TVNGEDAVPGSWPWQVSLQDKTGFHF. . . CGGSLISEDWWTAAHCGVR IIGGRESRPHSRPYMAYLQIQSPAGQS. RCGGFLVREDFVLTAAHCWGS IIGGTECKPHSRPYMAYLEIVTSNGPSKFCGGFLIRRNFVLTAAHCAGR

SO

EYTV. .HLGSDTLGDRRA. . QRIKASKSFR. HPGYSTQTHVNDLMLVKLN TSDWVAGEFDQGSDEENI. QVLKIAKVFK. NPKFSILTVNNDITLLKLA NINV. . TLGAKNIQRRENT. QQHITARRAIRHPQYNQRTIQNDIMLLQLS SITV. . TLGAHNITEEEDTWQKLEVIKQF. RHPKYNTSTLHHDIMLLKLK

SQARLSSMVKKVRLPSRC. . E. .PPGTTCTVSGWGTTTSPDVTFPSDLMC TPARFSQTVSAVCLPSADDDF. . PAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQ RRVRRNRNVNPVALPRAQ. . EGLRPGTLCTVAGWGRVSMRRGTDTLREVQ EKASLTLAVGT. . LPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEV 110 140

VDVKLISPQDCTEVYKDLLENSMLCAGIPDSKKNA. CNGDSGGPLVCRGT AALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGA. . .GVSS . CMGDSGGPLVCOKD LRVQRDRQ. . CLRIFGS YDPRRQICVGDRRERKAAFK. GDSGGPLLCNNV KLRLMDPQA. CSHFRDFDHNL. QLCVGNPRKTKSAFK. GDSGGPLLCAGV

170 ί 200

LQ. . . .GLVSWGTFPCGQ.PNDPGVYTQVCKFTKWINDTMKKHR

GAWTLVGIVSWGSDTCST. SS . PGVYARVTKLIPWVQKILAAN

AH. . . .GrV5YGKSSGVP. . . . PĘVFTRVSSFLPWIRTTMRSFKLLDQMETPL AQ. . . ,GIVSYGRSDAKP .... PĄVFTRISHYRPWINQILQAN

230

178 589

Wyliniowanie (wyrównanie) przeprowadzono ręcznie.

HUMCTRP = ludzka chymotrypsyna (Touita i wsp., BBRC 158:

569-575, 1989)

HUMCHTG=ludzka katepsyna G (Salvesen i wsp., Biochemistry 26 · 2289-2293, 1987)

HUMCHYM = ludzka chimaza komórek tucznych (Caughey i wsp., J. Biol. Chem. 266:12956-12963, 1991)

Homologie:

HUMCTRP/SCCE: = 38%

HUMCHTG/SCCE_: 74/224 = 33%

HUM.CHYM/SCCE: 742224 = 33%

HUMCHYG/HUMCHYM_: 109226 = 48%

Numeracja odnosi się do chymotrypsynogenu.

Podkreślenia:

Regiony konserwatywne w pobliżu miejsca aktywnego (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 w chymotrypsynie) i w kieszeni aktywności pierwszorzędowej chymotrypsyny (Ser 189, S9r 213-Trp 215, Gly 226 w ehymo trypsynie).

Gwiazdka: Możliwe miejsce glikozylacji w SCCE.

Ważne rozwiązanie wynalazku dotyczy zatem polipeptydu posiadającego sekwencje ami_nokwasową, w której nieprzerwany łańcuch 20 aminokwasów jest homologiczny przynajmniej w 80% z łańcuchem aminokwasów o tej samej długości wybranym z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID Nr: 2.

Ważny aspekt stanowią sekwencje aminokwasowe według wynalazku, wykazujące homologię co najmniej 80%, przykładowo co najmniej 85%, np. 90% z polipeptydem przedstawionym na SEQ ID Nr: 2. Ponieważ sekwencja przedstawiona na SEQ ID Nr: 2 wydaje się być unikalna, zakresem wynalazku objęte sąpolipeptydy, dla których stopień homologii w stosunku do podobnego nieprzerwanego łańcucha 20 aminokwasów wybranego z sekwencji SEQ ID Nr. 2 nie musi być wyższy niż 55%, chociaż korzystnie nie musi być wyższy niż 70%. Takie sekwencje mogąpochodzić z podobnych białek z innych gatunków, np. z innych ssaków, takich jak myszy, szczury, króliki, świnki morskie, świnie lub krowy. Jako, że mniejsze części takiej sekwe_ncji mogą wykazywać znaczące podobieństwa do innych proteaz serynowych, zakresem wynalazku objęte są również peptydy o stopniu homologii wynoszącym co najmniej 95%, najkorzystniej co najmniej 99% w stosunku do podobnego nieprzerwanego łańcucha 20 aminokwasów wybranego z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID Nr 2.

Pod terminem „homologia sekwencji” rozumie się identyczność w sekwencji amrnokwasów w segmentach dwóch lub większej ilości aminokwasów w porównywanej parze w odniesieniu do identyczności i pozycji aminokwasów w tych polipeptydach.

Termin „homologiczny” stosuje się w niniejszym opisie w celu ilustracji stopnia identy_czności sekwencji aminokwasowej danego polipeptydu i sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID Nr: 2. Sekwencja aminokwasowa porównywana z sekwencją aminokwaso_wą przedstawioną na SEQ ID Nr: 2 może być wyprowadzona z sekwencji nukleotydowej, takiej jak sekwencja DNA lub RNA, np. uzyskanej przez hybrydyzację zdefiniowaną poniżej albo może być otrzymana na drodze konwencjonalnego sekwencjonowania aminokwasów··. Stopień homologii korzystnie określa się biorąc za podstawę sekwencję aminokwasową dojrzałego polipeptydu, to znaczy, bez brania pod uwagę jakiejkolwiek sekwencji liderowej. W zasadzie, porównując sekwencje nukleotydowe w celu oznaczenia ich wewnętrznej homologii bierze się pod uwagę tylko regiony kodujące.

W kontekście niniejszego wynalazku, termin „polipeptyd, który jest rozpoznawany przez co najmniej jedno ze zdeponowanych przeciwciał” obejmuje sekwencję aminokwasową zaw_ie_rającą aminokwasy stanowiące nieprzerwany ciąg w rozumieniu konformacji liniowej albo pr_zestrzennej subsekwencji polipeptydu przedstawionego na SEQ ID Nr: 2, który to ciąg jest rozpoznawany przez co najmniej jedno ze zdeponowanych przeciwciał. Jak ogólnie wiadomo, również konformacja drugorzędowa lub trzeciorzędowa może mieć właściwości interesujące i

178 589 użyteczne i może stanowić epitopy. Zdeponowane przeciwciała TE4b i TE9b prawdopodobnie rozpoznają epitopy konformacyjne w enzymie SCCE

Okazało się, że poliklonalne przeciwciało królika otrzymane według przykładu 5 2.2 daje zabarwienie ziarnistości w warstwie ziarnistej i raczej rozproszone zabarwienie w dolnej warstwie rogowej w badaniu techniką mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Przeciwciała wyhodowane przeciw oczyszczonemu, natywnemu lub rekombinantowemu SCCE będą się w zasadzie wiązać z komórkami warstwy nadpodstawnej w zrogowaciałym ludzkim nabłonku płaskim ale nie z komórkami nabłonkowymi w nabłonku płaskim niezrogowaciałym. Te przeciwciała będą się również wiązać z przestrzenią międzykomórkową zrogowaciałej warstwy skóry ludzkiej.

Przeciwciała reagujące z polipeptydami według wynalazku są przeznaczone do wielu podanych poniżej następujących zastosowań.

Oczyszczanie białek: Przeciwciała te mogą być stosowane do oczyszczania polipeptydu (polipeptydów) lub jego analogów z próbek biologicznych z użyciem technik chromatografii powinowactwa lub immunoprecypitacji.

Diagnostyka i terapia: Przeciwciała monoklonalne przeciw polipeptydowi (polipeptydom) albo jego analogowi można stosować do diagnostyki i leczenia stanów chorobowych u zwierząt i u ludzi. Środkiem diagnostycznym może być przeciwciało swoiste wobec polipeptydu według wynalazku. Przeciwciało to może być sprzężone z innym białkiem albo ze stałym nośnikiem i/lub może być użyte w testach aglutynacji albo w testach barwnych. Takie przeciwciała można również stosować do ilościowego oznaczania polipeptydów SCCE lub ich analogów w próbkach biologicznych z zastosowaniem standardowych technik histochemicznych lub immunochemicznych

W jedlnym z aspektów, przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd według wynalazku zdefiniowany powyżej. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa zawierająca zasadniczo sekwencję przedstawioną na SEQ ID Nr: 1. Inne ważne rozwiązania wynalazku odnoszą się do sekwencji nukleotydowej kodującej polipeptyd zawierający subsekwencję aminokwasów podanąna SEQ ID Nr 2, takiej jak sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową -7-224 z sekwencji SEQ ID Nr: 2 albo polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową 1-224 z SEQ ID Nr: 2.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa hybrydyzująca z sekwencjąnukleotydowąprzedstawioną na SEQ ID Nr: 1 podczas hybrydyzacji prowadzonej w warunkach ścisłych, co jest opisane w przykładzie VII i w przykładzie IX.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydowąprzedstawionąna SEQ ID Nr: 1 albo jej analog lub subsekwencję, która:

1) wykazuje homologię z sekwencją przedstawioną na SEQ ID Nr: 1 w stopniu co najmniej 90% i/lub

2) koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa wykazuje co najmniej 80% homologii z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID Nr: 2, i/lub

3) koduje polipeptyd, który wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez linię komórkową hybrydoma TE4b, zdeponowaną w dniu 18 czerwca 1993 roku w Kolekcji ECACC pod tymczasowym numerem depozycyjnym ECACC 93061817 albo z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez linię komórkową hybrydoma TE9b, zdeponowaną w dniu 18 czerwca 1993 roku w Kolekcji ECACC pod tymczasowym numerem depozycyjnym ECACC 93061816, i/lub

4) koduje polipeptyd, wiążący się z poliklonalną antysurowicą otrzymaną przeciw natywnemu SCCE, który został oczyszczony z ekstraktu zdysocjowanych komórek podeszwowej warstwy rogowej.

Przedmiotem wynalazku jest również modyfikowana sekwencja nukleotydowa różniąca się od sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej powyżej tym, ze został z niej usunięty, lub został w niej podstawiony lub zmodyfikowany co najmniej jeden nukleotyd albo został do niej wbudo178 589 wany co najmniej jeden dodatkowy nukłeotyd, w wyniku czego powstała sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd wykazujący aktywność SCCE.

W niniejszym opisie i w zastrzeżeniach termin „subsekwencja” oznacza sekwencję, która korzystnie ma rozmiary co najmniej 15 nukleotydów, bardziej korzystnie, co najmniej 18 nukłeotydów a najkorzystniej, co najmniej 21 nukleotydów. W wielu rozwiązaniach według wynalazku taka subsekwencja lub analog sekwencji nukleotydowej według wynalazku będzie zawierać co najmniej 48 nukleotydów, np. co najmniej 75 nukleotydów albo co najmniej 99 nukleotydów. Ta „subsekwencja” powinna spełniać co najmniej jedno z kryteriów od 1) do 4) podanych powyżej lub powinna hybrydyzować z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID Nr 1.

Dobrze wiadomo, że małe fragmenty są użyteczne w technikach reakcji PCR, opisanych poniżej. Takie fragmenty i subsekwencje mogą poza innymi zastosowaniami być używane jako sondy do identyfikacji fragmentów mRNA sekwencji nukleotydowej według wynalazku, co zostało opisane w przykładzie VII.

Termin „analog” w odniesieniu do fragmentów DNA według wynalazku określa sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd identyczny lub w zasadzie identyczny z polipeptydem kodowanym przez fragment DNA według wynalazku. Wiadomo, że ten sam aminokwas może być kodowany przez różne kodony a użycie danego kodonu jest zależne między innymi od preferencji danego organizmu, w którym zachodzi ekspresja tej sekwencji nukleotydowej. Tak więc, można wymienić jeden lub większą ilość nukleotydów albo kodonów fragmentu DNA według wynalazku na inne i po ekspresji otrzymać polipeptyd identyczny albo zasadniczo identyczny z polipeptydem kodowanym przez ten fragment DNA.

Termin „analog” obejmuje również w mniejszym kontekście fragment DNA albo sekwencję DNA o składzie nukleotydowym albo sekwencji nukleotydowej podobnej do charakterystycznej sekwencji DNA, SEQ ID Nr: 1, kodującej sekwencję aminokwasową, z której zbudowane są polipeptydy SCCE, z dopuszczalnymi niewielkimi odchyleniami, nie mającymi znaczącego niepożądanego wpływu na aktywność enzymatyczną tego analogu w porównaniu do aktywności natywnego białka SCCE, co jest opisane w przykładzie III. Pod określeniem „znaczący niepożądany wpływ” rozumie się, że aktywność enzymatyczna tego analogu powinna wynosić co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 60% ajeszcze korzystniej, co najmniej 70%, np. co najmniej 75% aktywności enzymatycznej natywnego SCCE, oznaczanej np. w sposób podany w przykładzie III. Taki analogiczny fragment lub sekwencję DNA można otrzymać z organizmu takiego jak zwierzę lub człowiek albo mogą one mieć pochodzenie częściowo lub całkowicie syntetyczne. Analog ten można również wytworzyć technikami rekombinacji DNA.

Ponadto, określenia „analog” i „subsekwencja” pozwalają na zmiany w sekwencji, takie jak podstawienie, insercja (łącznie z mtronami), addycja i przegrupowanie jednego lub większej ilości nukleotydów, które to zmiany nie mają znaczącego niekorzystnego wpływu na polipeptyd kodowany przez ten fragment DNA lubjego subsekwencję.

Określenie „podstawienie” oznacza zastąpienie jednego łub większej ilości nukleotydów w pełnej sekwencji nukleotydowej jednym lub większą ilością innych nukleotydów, „addycja” oznacza dodanie jednego lub większej ilości nukleotydów na dowolnym końcu pełnej sekwencji nukleotydowej, „insercja” oznacza wprowadzenie jednego lub większej ilości nukleotydów w obrębie całej sekwencji nukleotydowej, „delecja” oznacza, że z pełnej sekwencji nukleotydowej usunięto jeden lub większą ilość nukleotydów, albo z jednego z końców tej sekwencji albo z dowolnego punktu w obrębie tej sekwencji a „przegrupowanie” oznacza, ze dwa albo większą ilość reszt nukleotydowych wymieniono w obrębie tej sekwencji, odpowiednio DNA albo polipeptydowej. Fragment DNA można jednakże modyfikować na drodze mutagenezy, albo przed albo po jego insercji do organizmu

Terminy: „fragment”, „sekwencja”, „subsekwencja” i „analog” stosowane w mniejszym opisie i w zastrzeżeniach w odniesieniu do fragmentów, sekwencji, subsekwencji i analogów według wynalazku, powinny być oczywiście rozumiane w taki sposób, że nie obejmujątych zjawisk zachodzących w ich naturalnym środowisku lecz np. w formie izolowanej, oczyszczonej, in vitro albo rekombinantowej.

178 589

Wjednym z rozwiązań wynalazku, można wykrywać i/lub oznaczać ilościowo mRNA dla polipeptydu SCCE przez ekstrakcję RNA z komórek albo tkanek i przetworzenie go cDNA do następnego użycia w reakcji amplifikacji z udziałem polimerazy (PCR). Pnmery do reakcji PCR można syntetyzować w oparciu o fragment DNA według wynalazku, taki jak fragment DNA przedstawiony na SEQ ID Nr: 1. Ten sposób wykrywania i/lub ilościowego oznaczania można stosowaćjako metodę diagnostyczną do wykrywania stanu chorobowego, w którym mRNA dla SCCE jest wytwarzany w ilościach wyższych lub niższych niż normalnie.

Zakresem wynalazku objęty jest również środek diagnostyczny zawierający sondę nukleotydową zdolną do wykrycia sekwencji nukleotydowej według wynalazku oraz sposób diagnozowania chorób, w których ekspresja SCCE jest rozregulowana i/lub chorób, w których gen dla SCCE jest zmutowany, który to sposób polega na poddaniu próbki pochodzącej od pacjenta podejrzanego o chorobę spowodowaną wyższą ilością SCCE od normalnie występującej albo występowaniem zmutowanej formy SCCE, analizie metodą PCR, w której próbkę kontaktuje się ze środowiskiem diagnostycznym opisanym powyżej, pozwalając na amplifikację dowolnej sekwencji nukleotydowej i oznaczając obecność każdej identycznej albo homologicznej sekwencji nukleotydowej w próbce.

Polipeptydy według wynalazku można wytwarzać stosując technologie rekombinacji DNA Ważnym przedmiotem wynalazkujest układ ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową według wynalazku.

Organizmem stosowanym do wytwarzania polipeptydu według wynalazku może być organizm wyższy, np. zwierzę albo organizm niższy, np. mikroorganizm, takijak E coli. Niezależnie od typu użytego organizmu, fragment DNA według wynalazku wprowadza się do organizmu albo bezpośrednio albo za pomocą odpowiedniego wektora. Alternatywnie, polipeptydy te można wytwarzać w liniach komórkowych ssaków przez wprowadzenie fragmentu DNA albo jego analogu lub subsekwencji według wynalazku albo bezpośrednio albo za pośrednictwem wektora ekspresyjnego.

Taki fragment DNA lubjego analog lub subsekwencję można również klonować do odpowiedniego stabilnego wektora ekspresyjnego i następnie wprowadzać do odpowiedniej linii komórkowej. Następnie, komórki wytwarzające żądane polipeptydy poddaje się selekcji w oparciu o poziomy wydajności w warunkach odpowiednich dla wektora i użytej linii komórkowej Dalej, prowadzi się wzrost wyselekcjonowanych komórek tworząc bardzo ważne, ciągłe źródło żądanych polipeptydów.

Przykładem specyficznego analogu sekwencji DNA według wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję DNA przedstawioną na SEQ ID Nr: 1 albo część tej sekwencji, szczególnie przystosowaną do ekspresji w E. coli. Ta sekwencja DNA charakteryzuje się tym, że po insercji w E. coli razem z odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi daje w wyniku ekspresji polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową zasadniczo odpowiadającą sekwencji przedstawionej na SEQ ID Nr: 2 lubjego części. Tak więc, ta sekwencja DNA zawiera specyficzne kodony rozpoznawane przez E coli Przykład tego rozwiązania jest podany w przykładzie VIII.

W niniejszym kontekście, termin „gen” obejmuje sekwencję DNA, którajest zaangażowana w wytwarzanie łańcucha polipeptydowego, która to sekwencja DNA zawiera regiony poprzedzające i następujące po regionie kodującym (sekwencje 5' - w górę i 3' - w dół) oraz sekwencje wtrącone, mtrony, umieszczone pomiędzy indywidualnymi segmentami kodonów, egzonami, albo w regionach 5' - w górę albo 3' - w dół. Region 5' - w górę zawiera sekwencję regulatorową, kontrolującąekspresję genu, na ogół promotor. Region 3' - w dół zawiera sekwencje zaangażowane w zakańczanie transkrypcji genu i ewentualnie sekwencje odpowiedzialne za poliadenylację transkryptu oraz region 3' nie podlegający translacji.

Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazkujest układ ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową opisaną powyżej, koduj ącąpolipeptyd według wynalazku, który to układ zawiera sekwencję flankującą 5' zdolną do pośredniczenia w ekspresji tej sekwencji nukleotydowej.

Przedmiotem wynalazkujest zwłaszcza wektor ekspresyjny mający zdolność replikacji, zawierający i pośredniczący w ekspresji sekwencji nukleotydowej według wynalazku. Szczegół178 589 ne rozwiązanie wynalazku dotyczy zdolnego do replikacji wektora ekspresyjnego oznaczonego symbolem pS507, zdeponowanego w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8282, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego i wektorów ekspresyjnych do ekspresji sekwencji nukleotydowych, które różnią się od sekwencji nukleotydowej tego zdeponowanego wektora ekspresyjnego ale kodują ten sam polipeptyd albo jego analog lub wariant wykazujący aktywność SCCE.

Innymi słowy, zakres wynalazku obejmuje również zdolny do replikacji wektor ekspresyjny opisany powyżej, w którym sekwencja nukleotydowa podlegająca ekspresji różni się od sekwencji nukleotydowej zawartej w zdeponowanym wektorze tym, że został z niej usunięty albo został w niej podstawiony albo modyfikowany co najmniej jeden nukleotyd albo został wprowadzony co najmniej jeden dodatkowy nukleotyd, w wyniku czego powstała sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd wykazujący aktywność SCCE.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest plazmid oznaczony symbolem pS500, zdeponowany 11 maja 1993 roku w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8281, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego oraz plazmidy posiadające sekwencję nukleotydową różniącą się od sekwencji nukleotydowej przedstawionej na SEQ ID Nr: 1 ale kodującą polipeptyd przedstawiony na sEQ ID Nr: 2 albo analog lub wariant tej sekwencji wykazujący aktywność SCCE lub hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową SEQ ID Nr: 1 lub jej częścią podczas hybrydyzacji w warunkach ścisłych.

W zakres wynalazku wchodzi również organizm nie-człowieka zawierający układ ekspresyjny według wynalazku. Do organizmów, które mogą być użyte w tym aspekcie wynalazku należąmikroorganizmy takiejak bakterie z rodzaju Bacillus, Escherichia albo Salmonella, drożdże, takie jak Saccharomyces, Pichia, pierwotniaki albo komórki pochodzące z organizmu wielokomórkowego, takiego jak grzyb, komórka owadzia, komórka roślinna, komórka ssaka albo linia komórkowa. Jeśli tym organizmem jest bakteria, korzystne jest, aby bakteria ta należała do gatunku Escherichia, np. E. coli.

Przedmiotem wynalazku jest poza tym wektor plazmidowy zawierający sekwencję DNA kodującą polipeptyd według wynalazku albo zdefiniowany w opisie polipeptyd fuzyjny W jednym, szczególnie ważnym rozwiązaniu wynalazku fragment DNA albo jego analog lub subsekwencja według wynalazku albo zdefiniowany w opisie fragment fuzyjny DNA według wynalazku może być zawarty w zdolnym do replikacji wektorze ekspresyjnym, który jest zdolny do replikacji w organizmie gospodarza albo w linii komórkowej.

Wektorem może być zwłaszcza plazmid, fag, kosmid, mini-chromosom albo wirus W interesującym rozwiązaniu według wynalazku wektorem może być wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza integruje się z genomem tej komórki.

Jeśli stosuje się organizm wyższy, wówczas do wytwarzania tych polipeptydów można stosować techniki transgeniczne. Przykładami odpowiednich zwierząt są owce, bydło, świnie i podobne. Dokonuje się ekspresji fragmentu DNA kodującego polipeptyd według wynalazku w żądanej tkance pod kontrolą specyficznych dla tkanki elementów regulatorowych. Następnie, otrzymane białko można poddać modyfikacjom post-translacyjnym, otrzymując polipeptyd według wynalazku.

Transgeniczne zwierzęta nie-ssaki według wynalazku otrzymuje się przez wprowadzenie „transgenu” do docelowej komórki embrionalnej docelowego ssaka. W jednym aspekcie wynalazku transgenem jest sekwencja DNA zdolna do wytwarzania żądanego fenotypu jeśli znajduje się w genomie komórek transgenicznego ssaka, nie-człowieka, W szczególnych rozwiązaniach, taki transgen zawiera sekwencję DNA kodującąpolipeptyd według wynalazku, przy czym transgen ten ma możliwość ekspresji z wytworzeniem tego polipeptydu.

Układ ekspresyjny wprowadza się do linii rozrodczej ssaka stosując odpowiednie techniki, np. opisaną przez Hogan'a i wsp., 1986 albo w opisie patentu światowego Wo 93/04172.

178 589

W szczególnym aspekcie wynalazku, sekwencja nukleotydowa według wynalazku może zawierać inną sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd różniący się albo identyczny, połączony przez fuzję w zgodnej fazie odczytu z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID Nr: 1 albo z jej analogiem kodującym polipeptyd SćCE, w celu wytworzenia polipeptydu fuzyjnego, stanowiącego jeszcze inny ciekawy aspekt wynalazku, opisany np. w przykładzie VIII. Przy użyciu technologii rekombinacji DNA, te fuzyjne sekwencje DNA można wbudowywać do odpowiedniego wektora albo genomu Alternatywnie, jedną z sekwencji nukleotydowych wbudowuje się do wektora albo genomu już zawierającego inną sekwencję nukleotydową. Polipeptyd fuzyjny można również otrzymać przez oddzielnąinsercję tych dwóch sekwencji nukleotydowych i wywołanie ich ekspresji. Prowadzi się wzrost organizmu gospodarza eukariotycznego lub prokariotycznego w warunkach zapewniających ekspresję połączonych sekwencji Polipeptyd fuzyjny oczyszcza się następnie i oddziela się polipeptyd według wynalazku od jego partnera fuzyjnego w odpowiedni sposób.

W jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu według wynalazku polegający na wykonaniu następujących etapów:

(a) insercji sekwencji nukleotydowej według wynalazku do wektora ekspresyjnego, (b) transformowaniu odpowiedniego organizmu gospodarza wektorem uzyskanym w etapie (a), (c) hodowli organizmu gospodarza powstałego w etapie (b) w warunkach odpowiednich do ekspresji tego polipeptydu, (d) odzyskaniu tego polipeptydu i (e) ewentualnego poddania tego polipeptydu modyfikacji post-translacyjnej.

Zakresem wynalazkujest również objęty sposób przedstawiony powyżej, w którym to sposobie, wytworzony polipeptyd izoluje się sposobem zawierającym jeden lub większą ilość etapów takich jak chromatografia powinowactwa z użyciem immobilizowanego, natywnego lub rekombinantowego polipeptydu SćCE lub przeciwciał reagujących z tym polipeptydem i/lub innych procedur chromatograficznych i elektroforetycznych.

Polipeptyd wytworzony w sposób opisany powyżej można poddawać modyfikacjom post-translacyjnym polegającym na obróbce cieplnej, chemicznej (formaldehydem, aldehydem glutarowym i odczynnikami podobnymi) albo obróbce enzymatycznej (działaniu peptydazami, proteinazami i enzymami modyfikującymi białka). Jeśli polipeptyd ten jest wytwarzany w organizmie, może on być przetwarzany innymi drogami niż te, jakie mają miejsce przy jego wytwarzaniu w środowisku naturalnym. Przykładowo, często uzyskuje się glikozylację jeśli polipeptyd jest wytwarzany w komórce wyższego organizmu, takiego jak drożdże albo korzystnie ssaka Glikozylacja normalnie występuje w powiązaniu z resztami aminokwasowymi Asn, Ser, Thr albo hydroksylizyny. Może być korzystne lub niekorzystne usunięcie albo zmienienie charakterystyki przetwarzania związanej z danym organizmem gospodarza.

Po ekspresji według wynalazku polipeptydu w organizmie albo w linii komórkowej, polipeptyd ten można stosować jako taki albo uprzednio go oczyszczać z tego organizmu lub z linii komórkowej. Jeśli polipeptydjest wytwarzany w postaci produktu wydzielanego, wówczas można go oczyszczać bezpośrednio. Jeśli polipeptyd ten jest wytwarzany w postaci produktu zasocjowanego, wówczas może być potrzebne częściowe lub całkowite zniszczenie gospodarza przed oczyszczaniem. Przykładami procedur stosowanych do oczyszczania polipeptydów są: (i) immunoprecypitacja albo chromatografia powinowactwa z użyciem przeciwciał, (ii) chromatografia powinowactwa z odpowiednim ligandem, (iii) inne procedury chromatograficzne, takie jak filtracja żelowa, jono-wymienna albo wysokosprawna chromatografia cieczowa lub pochodne tych metod, (iv) procedury elektroforetyczne, takie jak elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, denaturacyjna elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, elektroforeza w żelu agarozowym i ogniskowanie w polu izoelektrycznym, (v) inne specyficzne techniki solubilizacji i/lub oczyszczania.

Przedmiotem wynalazku jest również zasadniczo czysty polipeptyd SćCE. W tym konteście, termin „zasadniczo czysty” oznacza, że polipeptyd ten jest zasadniczo wolny od

178 589 innych składników, np. innych polipeptydów albo węglowodanów, które mogą powstawać w czasie produkcji i/albo odzysku tego polipeptydu albo z innych przyczyn występująłącznie z tym polipeptydem. Czystość tego białka można oznaczać metodą elektroforezy żelowej SDS prowadzonej w sposób podany w przykładzie III.

Polipeptyd ten można oczyszczać w sposób opisany w przykładzie IV metodą chromatografii powinowactwa na SBTI albo metodą chromatografii powinowactwa na immobilizowanym przeciwciele, takim jak przeciwciało TE4b, stosując znane procedury. Wysoka czystość polipeptydu według wynalazku może być korzystna wówczas, gdy polipeptyd ten stosuje się do celów farmaceutycznych albo kosmetycznych. Dzięki wysokiej czystości, zasadniczo czysty polipeptyd może być do większości zastosowań używany w mniejszej ilości niż polipeptyd o niższej, konwencjonalnej czystości.

W jednym z aspektów wynalazku, czysty polipeptyd można otrzymać z odpowiedniej linii komórkowej, która wytwarza polipeptyd według wynalazku, według przykładu IX Polipeptyd według wynalazku można również wytwarzać znanymi metodami syntezy peptydów w fazie ciekłej lub stałej z zastosowaniem następnego sprzęgania poszczególnych aminokwasów tej sekwencji polipeptydowej. Alternatywnie, polipeptyd ten można syntetyzować przez sprzęganie odpowiednich aminokwasów; formując fragmenty sekwencji polipeptydowej, które następnie sprzęga się uzyskując żądany polipeptyd. Metody te stanowią inny interesuj ący aspekt wynalazku.

W bardzo ważnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, kompozycja kosmetyczna albo kompozycja do pielęgnacji skóry, zawierająca polipeptyd posiadający aktywność SCCE i środek pomocniczy dopuszczony do celów farmaceutycznych i/lub kosmetycznych. Kompozycja ta może zawierać oczyszczone białko natywne albo rekombinantowy polipeptyd według wynalazku albo proenzym bądź formę białka fuzyjnego polipeptydu według wynalazku, które mogą być aktywowane przez rozszczepienie proteolityczne. Proenzymowa forma polipeptydów według wynalazku może być uznana jako „prolek”, to znaczy związek, który przechodzi w postać aktywnąpo odpowiednim rozszczepieniu proteolitycznym.

Szczególnie ale nie wyłącznie, przedmiotem wynalazku są kompozycje odpowiednie do stosowania miejscowego, np. na skórę.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do stosowania miejscowego mogą występować w postaci kremów, maści, płynów, mazideł, żeli, roztworów, zawiesin, past, szminek, sprejów, szamponów, mydeł, środków wzmacniających włosy lub pudrów

Stosowaniem miejscowym może być stosowanie albo na albo w pobliżu części ciała, na której występują zmiany patologiczne, np. na zewnętrzne części ciała, takie jak powierzchnia skóry. Stosować można przez zwykłe smarowanie kompozycji lub można stosować materiały odpowiednie do wzmocnienia i utrwalenia kontaktu tej kompozycji ze zmianami patologicznymi, takie jak opatrunki okluzyjne (zamykające), np. plastry okluzyjne, dostarczające kompozycję według wynalazku. Tego typu kompozycje mogą być impregnowane albo nałożone na podkładki, plastry, paski, gazę, materiały z gąbki, kawałki bawełny i tym podobne. Ewentualnie można stosować iniekcyjną formę kompozycji na lub w pobliże miejsc chorych.

Kompozycje do stosowania miejscowego według wynalazku mogą zawierać 1 -80% wagowych związku aktywnego w przeliczeniu na całkowitą masę preparatu, np. 0,001 -25% wagowych związku aktywnego, np. 0,1 -10%, 0,5-5% albo 2 -5% związku aktywnego. Do kompozycji można wprowadzić więcej niż jeden związek aktywny, co oznacza, że przedmiotem wynalazku są kompozycje zawierające SCCE, pro-SCCE albo inhibitor SCCE w połączeniu z innymi związkami farmaceutycznymi i/lub kosmetycznymi. Kompozycję taką stosuje się 1-10 razy dziennie, zależnie od typu, ciężkości i lokalizacji zmian chorobowych

Do celów stosowania miejscowego preparat można przygotowywać zgodnie ze znanąpraktyką farmaceutyczną z dodatkiem farmaceutycznych środków pomocniczych powszechnie stosowanych do form miejscowych. Rodzaj nośnika użytego do przygotowania konkretnej kompozycji będzie zależał od zamierzonego sposobu podawania tej kompozycji. Do nośników innych niż woda, które mogąbyć użyte w tych kompozycjach zaliczająsię ciała stałe i ciekłe, takiejak środki zmiękczające, rozpuszczalniki, środki zwilżające, zagęszczacze i proszki. Przykłady każdego

178 589 z tych typów nośników, stosowanych pojedynczo albo w mieszaninach jednego lub większej ilości nośników są następujące:

Do środków zmiękczających należą alkohol stearylowy, monoester glicerolu z kwasem rycynowym, monostearynian glicerolu, propano-1,2-diol, butano-1,3-diol, alkohol cetylowy, izo stearynian izopropylowy, kwas stearynowy, palmitynian izobutylowy stearynian izocetylowy. alkohol oleilowy, laurynian izopropylowy, laurynian heksylowy, oleinian decylowy, oktadekan2-ol, alkohol izocetylowy palmitynian cetylowy, dimetylopolisiloksan, sebacyman di-n-butylowy, mirystynian izopropylowy, palmitynian izopropylowy, stearynian izopropylowy, stearynian butylowy, glikol polietylenowy, glikol trój etylenowy, lanolina, olej rycynowy, acetylowane alkohole lanolinowe, benzyna, olej skalny, mirystynian butylu, kwas ^stearynowy kwas palmitynowy, linolenian izopropylowy, mleczan laurylowy, mleczan mirystylowy, oleinian decylowy, mirystynian mirystylowy;

jako rozpuszczalniki stosuje się wodę, chlorek metylenowy, izopropanol, olej rycynowy, eter monoetylowy glikolu etylenowego, eter monobutylowy glikolu dietylenowego, eter monoetylowy glikolu dietylenowego, dimetylosulfotlenek, tetrahydrofuran, oleje roślinne i zwierzęce, glicerol, etanol, propanol, glikol propylenowy i inne glikole lub alkohole, oleje utwardzane;

jako środki zwilżające stosuje się glicerynę, sorbitol, sól sodową kwasu 2-pirolidono-5karboksylowego, rozpuszczalny kolagen, ftalan dibutylowy, żelatynę;

jako proszki stosuje się kredę, talk, kaolin, skrobię i jej pochodne, żywice, koloidalny dwutlenek krzemu, poliakrylan sodowy, chemicznie modyfikowany glinokrzemian magnezowy, uwodniony krzemian glinu, polimer karboksywinylowy, karboksymetylocelulozę sodową, monostearynian glikolu etylenowego;

środki żelujące lub spęczniające, takie jak pektyna, żelatyna i jej pochodne, pochodne celulozy, takie jak metyloceluloza, karboksymetyloceluloza albo celuloza utleniona, guma celulozowa, guma guaranowa, guma akacjowa, guma karaja, tragakanta, bentonit, agar, alginiany. karbomer, żelatyna, plecha morszczynu pęcherzykowatego, woskowiec, dekstran i jego pochodne, guma ghatti. hektorit, łupina ispanhula, guma ksantanowa;

jako polimery stosuje się kwas polimlekowy albo jego polimery lub kopolimery z kwasem poliglikolowym, parafinę, polietylen, tlenek polietylenu, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy, poliwinτlopirolidon;

jako środki powierzchniowo czynne stosuje się środki niejonowe, np. glikol i estry glicerolu, etery i estry makrogolu, etery i estry cukrów, takie jak estry sorbitanu, jonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak mydła aminowe, mydła metaliczne, sulfonowane alkohole tłuszczowe, eterosiarczany alkilowe, oleje sulfonowane i amfolityczne środki powierzchniowo czynne oraz lecytyny;

jako środki buforujące stosuje się sole sodowe, potasowe, glinowe, magnezowe lub wapniowe (takie jak chlorki, węglany, dwuwęglany, cytryniany, glukoniany mleczany, glukoheptomany lub szczawiany).

Do stosowania miejscowego, pH kompozycji może w zasadzie wahać się w szerokich granicach, od 3 do 9 W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, stosuje się pH, przy którym uzyskuje się odpowiednią aktywność proteolityczną polipeptydu, np. korzystne jest pH w zakresie około 4-8. Dla uzyskania odpowiedniej wartości pH stosuje się konwencjonalne środki buforujące opisane powyżej.

Preparat według wynalazku może również zawierać inne dodatki, takie jak środki stabilizujące, konserwujące, solubilizujące, barwniki, środki chelatujące, tworzące żele, podstawy maściowe, regulatory pH, antyutleniacze, środki zapachowe, środki chroniące skórę i podobne. Jeśli kompozycja występuje w postaci szamponu albo mydła, wówczas może również zawierać środki spieniające, perlące i/lub kondycjonujące.

Do typowych środków konserwujących należąparabeny, formaldehyd, Kathon CG, Bronidox, Bronopol, p-chloro-m-krezol, chloroheksydyna, chlorek benzalkonium i podobne. Jeśli kompozycja według wynalazku występuje w postaci szamponu lub mydła, wówczas można

178 589 stosować dodatki na ogół używane do szamponów i mydeł, np. betainę, laurylosiarczan sodowy, nonylofenoł, imidazol, sulfobursztynian, środki natłuszczające, nawilżające i kondycjonujące

Może być poza tym korzystne przygotowanie preparatów o zmodyfikowanym uwalnianiu, których związek aktywny jest wprowadzony do matrycy polimerycznej albo preparatów w postaci nanocząsteczek lub liposomów lub micelli bądź preparatów, w których związek jest zaadsorbowany na żywicach jono-wymiennych lub zawarty w polimerze.

Kompozycje te można przygotowywać zgodnie ze znaną praktyką farmaceutyczną i mogą występować w postaciach::

Form półstałych: żeli, past, mieszanin;

Form ciekłych, roztworów, zawiesin, form dla zwierząt, emulsji

Jak wskazano, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać polipeptyd według wynalazku jako taki albo jego funkcyjną pochodną bądź kombinację tych związków·'. Przykładami odpowiednich pochodnych funkcyjnych są dopuszczalne farmaceutycznie sole, zwłaszcza te, które stosuje się do kontaktu ze skórą. Przykłady obejmują dopuszczalne farmaceutycznie sole funkcji aminowej, np. sole z kwasami dające aniony dopuszczalne farmaceutycznie zwłaszcza do kontaktu ze skórą. Przykładami takich soli są fosforany, siarczany, azotany, jodki, bromki, chlorki, borany oraz aniony pochodzące od kwasów karboksylowych, np. octany, benzoesany, stearynian i podobne.

Do innych pochodnych funkcji aminowej należą amidy, imidy, moczniki, karbaminiany i podobne.

Do innych odpowiednich pochodnych należą pochodne grupy karboksylowej polipeptydu według wynalazku, w tym sole, estry i amidy. Przykłady obejmują sole z kationami dopuszczonymi farmaceutycznie, np. sole litowe, sodowe, potasowe, magnezowe, wapniowe, cynkowe, glinowe, żelazowe, żelazawe, amoniowe i niższe sole alkilo-(C_r-C₆)-amoniowe. Estrami mogą być niższe estry alkilowe

Przykłady kompozycji podane w przykładzie XI ilustrują formy farmaceutyczne, kosmetyczne i do pielęgnacji skóry według wynalazku ale w żaden sposób nie mogą być rozumiane jako ograniczające zakres kompozycji według wynalazku.

Uznaje się, że kompozycje kosmetyczne lub kompozycje do pielęgnacji skóry zawierające natywny łub rekombinantowy SCCE działają przeciw trądzikowi, kserodermie i innym stanom nadmiernego złuszczania, takim jak modzele i liszaj mieszkowy. W trądziku pospolitym występują różne stadia choroby. Uważa się, że SCCE powinno się podawać w etapach, w których występuje zaburzenie keratynizacji w przewodach i w gruczołach łojowych, co prowadzi do powstawania zaskórmków i zaczopowama, natomiast byłoby korzystne zastosowanie substancji hamującej enzym SCCE w etapach, w których w trądziku przeważa stan zapalny.

Jeden z aspektów wynalazku polega więc na zastosowaniu polipeptydu do leczenia lub zapobiegania rozwojowi trądzika, kserodermii lub innych stanów nadmiernego rogowacenia, takich jak modzele i liszaj mieszkowy.

Opierając się na opisanych powyżej badaniach naukowych uznano, że kompozycje farmaceutyczne zawierające natywny lub rekombinantowy enzym SCCE są użyteczne do leczenia lub zapobiegania różnym ichtiozom, trądzikowi, łuszczycy i innym zapalnym chorobom skóry, takimjak egzemy z nadmiernym złuszczaniem, zakażenia bakteryjne i do gojenia ran, zwłaszcza, jeśli stosuje się je miejscowo.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazkujest użycie polipeptydu wykazującego aktywność enzymu SCCE do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania różnym ichtiozom, trądzikowi, łuszczycy i innym zapalnym chorobom skóry przebiegającym z nadmiernym złuszczaniem, np. egzemom

W następnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób leczenia i/lub zapobiegania różnym ichtiozom, trądzikowi, łuszczycy i innym zapalnym chorobom skóry przebiegającym z nadmiernym złuszczaniem, np. egzemom, który to sposób polega na podaniu pacjentowi potrzebującemu leczenia terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości polipeptydu wyka20

178 589 zującego aktywność enzymu SCCE. Leczenie może być profilaktyczne, paliatywne lub leczące źródło choroby.

Uważa się, że w środowisku skóry istnieje „układ kaskady” enzymów proteolitycznych, podobny do tego jaki funkcjonuje w układzie aktywacji plazminogenu. Przypuszcza się, ze SCCE jest jednym z końcowych produktów tego układu. Uznaje się, że aktywność SCCE może być hamowana za pomocą „inhibitora SCCE”.

W wielu chorobach skóry, takich jak autoimmunologiczne choroby pęcherzycowe albo choroby akantolityczne, np. pęcherzyca rodzinna i choroba Darriera, występuje zaburzenie spójności między keratynocytami w nie-zrogowaciałej, żywej warstwie naskórkowej (patrz: zaburzenia w spójności komórek w żywym naskórku) Zakłada się, że w procesie tym biorą udział proteinazy, a zatem, stan ten może być leczony przez podanie związku zdolnego do hamowania aktywności enzymatycznej natywnego SCCE. Może być również korzystne podanie inhibitora SCCE do leczenia łuszczycy i innych zapalnych chorób skóry w stanach, w których komponenta zapalna jest cechą dominującą.

W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest użycie inhibitora SCCE, wykazującego hamujący wpływ na aktywność enzymatycznąnatywnego SCCE do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do leczenia lub zapobiegania autoimmunologicznym chorobom pęcherzycowym albo chorobom akantolitycznym, np. pęcherzycy rodzinnej i chorobie Darriera.

W tym kontekście, termin „inhibitor SCCE” oznacza istniejący lub nowy związek zdolny do reagowania z aktywną enzymatycznie sekwencjąpolipeptydowąalbo subsekwencją według wynalazku lub jej analogiem w taki sposób, że zmniejsza się aktywność SCCE. Spadek aktywności można mierzyć np. prowadząc doświadczenie opisane w przykładzie 3 2, stosując jako inhibitor potencjalny inhibitor SCCE Takimi związkami mogą być cząsteczki organiczne, małe peptydy, bądź duże polipeptydy lub pochodne tych związków. Takie podejście może znaleźć zastosowanie w programie skriningu leków do identyfikacji inhibitorów SCCE.

W dalszym rozwiązaniu przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji związku posiadającego wpływ na aktywność enzymatyczną natywnego SCCE polegający na użyciu rekombinantowego polipeptydu według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zwłaszcza sposób identyfikacji związku posiadającego hamujący wpływ na aktywność enzymatyczną natywnego SCCE.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji związku zdolnego do zwiększania aktywności enzymatycznej natywnego lub rekombinantowego SCCE.

Ważnym zastosowaniem rekombinantowych polipeptydów według wynalazku jest ich użycie do skriningu leków. Polipeptydy według wynalazku mogąbyć stosowane w układzie skriningu leków. Wynalazek również dotyczy sposobu identyfikacji związku zdolnego do przekształcania proenzymu SCCE do aktywnej formy SCCE polegającego na użyciu polipeptydu według wynalazku.

Zakres wynalazku obejmuje również użycie sekwencji aminokwasowej zdefiniowanej powyżej do określania trójwymiarowej struktury polipeptydu SCCE użytecznej do projektowania substancji zdolnej do wiązania polipeptydu SCCE, zwłaszcza do projektowania substancji leczniczej wiążącej się z miejscem aktywnym enzymu.

W ważnym aspekcie, przedmiotem wynalazku są różne sposoby regulowania aktywności wykazywanej przez polipeptyd SCCE. Aktywność ta może mieć ważne implikacje w różnych stanach chorobowych opisanych powyżej.

Fragment DNA lub RNA komplementarny do co najmniej części mRNA odpowiadającej polipeptydowi według wynalazku lub jego analogowi może skutecznie blokować translację mRNA SCCE w komórkach ludzkich i przez to hamować syntezę tego polipeptydu (polipeptydów). Takie podejście, które może być interesujące w stanach chorobowych, w których występuje wyższa niż normalnie ekspresja SCCE, takich jak autoimmunologiczne choroby pęcherzycowe albo choroby akantolityczne, np. pęcherzyca rodzinna i choroba Darriera jest powszechniej znane pod

178 589 nazwą terapii oligonukleotydami antysensownymi, a zatem, przedmiot wynalazku obejmuje również to podejście.

ZNA czenie: figur

Figura 1 przedstawia jednobiegunowe złuszczanie z warstwy rogowej podeszwy in vitro. Powierzchnia tkanki wystawiona na zewnątrz in vivo jest na figurze skierowana ku górze. Należy zauważyć postępujące oddzielanie się komórek na tej powierzchni podczas inkubacji ale brak dysocjacji komórek na innych powierzchniach.

Figura 2 przedstawia czas trwania i wpływ aprotyniny na uwalnianie się komórek z podeszwowej warstwy rogowej inkubowanej bez (kółka) albo z aprotyniną(trójkąty). Podane sąśrednie (wartości kumulacyjne z czterech skrawków tkanki) i odchylenia.

Figura 3 przedstawia reaktywne komponenty anty-desmogleiny (anty-DG I) w spójnej warstwie rogowej podeszwy i w komórkach oddzielonych. A. Barwione błękitem ćoomassie pasma z elektroforezy SDS-PAGE. B. Immunobloting. 1-3: tkanka spójna, nierozcieńczona (1), rozcieńczona 1/3 (2), rozcieńczona 1/9 (3). 4-5: komórki zdysocjowane, nierozcieńczone (4), rozcieńczone 1/3 (5). Widoczna jest tylko nienaruszona DG I o masie cząsteczkowej 160 kD w tkance spójnej i jedynie produkty rozkładu DG I o masie cząsteczkowej 95 i 80 kD w komórkach zdysocjowanych.

Figura 4 przedstawia czas trwania i wpływ aprotyniny na degradację desmogleiny I (DG I) w warstwie rogowej podeszwy przechodzącej złuszczanie komórek in vitro. Widoczne są wykresy z densytometru skaningowej plam z prób immunologicznych ekstraktów z warstwy rogowej podeszwy inkubowanej bez (A) i z dodatkiem (B) aprotyniny (15 μΜ). Pik przy masie 160 kD odpowiada całej DG I. Piki przy 95 i 80 kD odpowiadają produktom degradacji tego białka (patrz fig. 3). Należy zauważyć wydajne hamowanie przez aprotyninę rozkładu DG I.

Figura 5 przedstawia wpływ jonów cynku (A), chymostatyny i leupeptyny (B) na rozkład desmogleiny I (DG I) w warstwie rogowej podeszwy podczas złuszczania komórek in vitro Widoczna jest transformacja komponentów anty-DG I dodatnich od masy 160 kD do masy 95 i 80 kD wywołana przez jony cynku i chymostatynę ale nie przez leupeptynę.

Figura 6 przedstawia aktywność hydrolityczną peptydu związaną z komórkami warstwy rogowej podeszwy. Hydrolizę dwóch substratów śledzono przez pomiar zmian absorbancji przy długości fali 405 nm. Podane są średnie z trzech inkubacji. Kwadraty: substrat S-2586; kółk_a:substrat S-2288.

Figura 7 przedstawia zależność od wartości pH aktywności hydrolizowania substratu

S-2586 związanej z korneocytami. Podane są średnie z trzech inkubacji. Kwadraty: octan sodu; kółka: fosforan sodowy; trójkąty: Tris HC1.

Figura 8 przedstawia enzymografię ilustrującą aktywność kazeinolityczną w ekstraktach zdysocjowanych komórek warstwy rogowej podeszwy. Przeczytaj również tekst pod przykł_ad_em2.2 dla szczegółów eksperymentalnych.

A: Porównanie enzymu z korneocytów podeszwy ekstrahowanych buforem Laemmli'ego do próbek bez środka redukującego (sc/s) i KC1 (sc/k) z chymotrypsyną wołową w ilości 0,125 ng (c) i trypsyną wołową w ilości 0,5 ng (t). Przed elektroforezą ekstrakt KC1 dializowano wobec 5 mM Tris HC1 (pH = 6.8) i dodano SDS i glicerol do końcowych stężeń takich samychjak w b_uforze do próbek; do wszystkich pasm dodano po 10 pl. Markery mas cząsteczkowych podane są po lewej stronie.

B: Zależność od wartości pH w buforze inkubacyjnym. Źródło enzymu: ekstrakty w SDS zdysocjowanych korneocytów podeszwy. Do wstępnego traktowania odczynnikiem Triton X-100 i do inkubacji użyto bufory: 0,1 M oc tan s odowy (pH = 4.0tpH = 5.5)i0,l M Tris HC1 (pH = 7.0 i 8.0). Inne warunki jak w punkcie A

C: Wpływ inhibitorów: sc = ekstrakt w SDS korneocytów podeszwy; c = chymotrypsyna wołowa; t = trypsyna wołowa. Inhibitory były obecne podczas wstępnej obróbki Tritonem X-100 i następnej inkubacji. Końcowe stężenie leupeptyny wynosiło 160 pM, aprotyniny - 15 (M, chymostatyny - 40 pM i jonów cynku (w postaci siarczanu) - 100 pM. Leupeptynę i chymostatynę dodawano w postaci roztworów w dimetylosulfotlenku (DMSO). Do wstępnej obróbki i inkuba22

178 589 cji stosowano bufor, 0,1 M Tris HC1 o pH = 8. Końcowe stężenie DMSO wynosiło 1% (objętościowo). Inne warunki były takie same jak w punkcie A.

Figura 9 przedstawia porównanie SCCE, chymotrypsyny wołowej i ludzkiej katepsyny G pod względem wrażliwości na inhibitory (A: aprotyninę, B: chymostatynę, C: siarczan cynku) ipod względem swoistości dla substratu (D). Na wykresach A-C, aktywność enzymu bez inhibitora standaryzowano na 100%. Na wykresie D, aktywność hydrolizowania MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA standaryzowano przyjmując jednostkę arbitralnie.

Figura 10 przedstawia chromatografię powinowactwa na związanym kowalencyjnie inhibitorze trypsyny z soi (SBTI). Lima kropkowana: absorbancja przy 280 nm, odzwierciedlająca stężenie białka w eluacie. Linia ciągła z pustymi kwadratami: aktywność hydrolizowania peptydu oznaczana na S-2586 jako substracie, wyrażona jako zmiana absorbancji przy 405 nm Linia ciągła z pustymi kółkami: aktywność hydrolizowania peptydu oznaczana na S-2288 jako substracie, wyrażona jako zmiana absorbancji przy 405 nm, dziesięciokrotnie zwielokrotniona.

Figura 11 przedstawia elektroforezę SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomasie (A) i enzymografię po elektroforezie SDS-PAGE ze skopolimeryzowaną kazeiną (B) frakcji 2, 6 i 10 z chromatogramu przedstawionego na fig. 10. Markery masy cząsteczkowej podane są po lewej stronie. W części B, pasmo 1 oznacza grupę komponentów kazeinolitycznych, które mogły być hamowane przez leupeptynę (160 pM), c: grupa komponentów kazeinolitycznych, które mogły być hamowane przez chymostatynę (40 pM).

Figura 12 przedstawia elektroforezę SDS PAGE SCCE oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa na żywicy SBTI-Affigel 15. Żel był 12,5%. 1: próbka nieredukowana. 2' próbka redukowana. Markery masy cząsteczkowej podane są po lewej stronie.

Figura 13 przedstawia N-terminalną sekwencję aminokwasową SCCE. Gwiazdki oznaczają niepewności, co do przypuszczalnych pozycji cysteiny w pozycjach 7 i 9. Znaki zapytania oznaczają pozycje, w których nie można było wykryć pochodnych aminokwasów ale nie było spadków wydajności w następnych etapach.

Figura 14 przedstawia charakteryzację przeciwciał monoklonalnych TE4b i TE9b za pomocą immunoprecypitacji i immunoblottingu.

a: Żel SDS PAGE 12,5%o, barwiony błękitem Coomassie, warunki nieredukujące.

Pasmo 1: Markery masy cząsteczkowej

Pasmo 2:Ekstrakt w KC1 dysocjujących korneocytów podeszwy przygotowany w przykładzie 3.1

Pasmo 3: SCCE oczyszczony w sposób opisany w przykładzie 4.1 metodą chromatografii powinowactwa na insolubilizowanym inhibitorze trypsyny z soi.

b: Enzymografia immunostrątów w żelach SDS PAGE ze skopoliimerj^i^to^wuną denaturowaną ciepłem kazeiną. Żel barwiony błękitem Coomassie.

Pasmo 1: Markery masy cząsteczkowej

Pasmo 2: Ekstrakt w KC1, dializowany jak w a.

Pasma 3-6: Solubilizowane immunostrąty (od lewej do prawej) z przeciwciałem monoklonalnym TE4b (20 pg), przeciwciałem monoklonalnym TE9b (10 pg), przeciwciałem monoklonalnym PZ (10 pg) i z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem PZ jest moimklonalnym przeciwciałem mysim typu IgG1-kappa wobec białka strefy ciążowej i i jst użyte JłO^o mezwiązaon kontrola negatywna.

c: Immuno^od^g z 12.5% żeli SDS PAGE (warunki meredżkuJące).

Pasmo 1: Biotnoylowaoe markery masy cząsteczkowej wykrywane awidyną skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą (BioRad). Próbka z elektroforezy w pasmach 2, 4 i 6 jest taka sama jak w paśmie 2 w punkcie a, a w pasmach 3, 5 i 7 taka sama jak w paśmie 3 w punkcie a.

Pasma 2 i 3: Pierwsze przeciwciało = moab TE4b, 0,2 pg/ml.

Pasma 4 i 5: Pierwsze przeciwciało = moab TE9b, 0,1 pg/ml.

Pasma 6 i 7: Pierwsze przeciwciało = moab PZ, 0,1 pg/ml.

Strzałki w pasmach a-c oznaczają względne masy cząsteczkowe (od góry do dołu) 93, 66,

45, 31, 22 i 14 kD.

178 589

Figura 15 przedstawia plazmid pS500. Ten plazmid zawiera cDNA dla ludzkiego SCCE o pełnej długości sklonowany w plazmidzie pUC19. Szczegóły są podane w przykładzie VI.

Figura 16 przedstawia plamy hybrydyzacyjne według Northerna mRNA otrzymanego z naskórka ludzkiego. Do każdego pasma użyto poli-T-oczyszczony RNA odpowiadający ilości około 100 g całkowitego RNA. 1: Hybrydyzację prowadzono z sondą otrzymaną z fragmentu Hinc 2/Hinc 2 cDNA dla SCCE o długości 1070 par zasad. 2. Hybrydyzację prowadzono z sondą otrzymaną z fragmentu Hinc 2/Bgl 2 cDNA dla SCCE o długości 655 par zasad.

Figura 17 przedstawia:

a. 12,5% żel SDS PAGE barwiony błękitem Coomassie. 11 2: Traktowane PBS-Tritonem Χ-100 nierozpuszczalne peletki sonifikowanych komórek TG 2 transformowanych odpowiednio plazmidami pS51O i pS5111 indukowanych IPTG. 3: SCCE oczyszczony z warstwy rogowej podeszwy ludzkiej.

b. Plamy z immunoblottingu prowadzonego z pre-immunosurowicąkurczaka (1 -3) i anty-SCCE kurczaka (4-6). 1 i 4: komórki TG2 transformowane plazmidem pS510 i indukowane przez IPTG. 2 i 5: komórki TG2 transformowane przez pS511 i indukowane przez IPTG. 3 i 6: SCCE oczyszczony z warstwy rogowej podeszwy ludzkiej.

Próbki przygotowano przez gotowanie w buforze do próbek z merkaptoetanolem.

Figura 18 przedstawia mapę kołową wektora ekspresyjnego pS507, skonstruowanego w sposób opisany w przykładzie IX.

Wektor pS507 pośredniczy w ekspresji rekombinantowego ludzkiego SCCE w komórkach ssaczych.

Figura 19 przedstawia analizę ekspresji rekombinantowego genu dla ludzkiego SCCE w plazmidzie pS507 w komórkach ssączych.

Pasmo 1: RNA z komórek C127.

Pasmo 2: RNA z izolowanego klonu, 1 · 24, z komórek C127 transfekowanych plazmidem pS507.

Pasmo 3: RNA z mieszaniny populacji klonów C127 transfekowanych plazmidem pS 127.

Pasma 4 i 5: RNA z komórek C127 transfekowanych wektorem ekspresyjnym pS147, identycznym z pS507, z tym, że nie zawiera sekwencji cDNA dla SCCE. Markery masy cząsteczkowej są podane po lewej stronie.

Figura 20 przedstawia żele SDS PAGE po immunoblottingu SCCE wytwarzanego w komórkach C127.

Pasma 1 i 6: Wstępnie barwiony marker masy cząsteczkowej (BioRad, 106, 80,49,5,32,5,

27.5 i 18,5 kDa)

Pasmk 2: pS507/C127, mieszanie, kolba T

Pasmo 3: pS507/C127, mieszanie, walec A

Pasmo 4: pS507/C127, mieszanie, walec B

Pasmo 5: kontrola negatywna pS507/C127

Pasmo 7: Natywny SCCE otrzymany z warstwy rogowej

Pasmo 8: pS507/C1^S7, klon 24, kolba T ^Pasmo 9: ^pS5⁰⁷/C¹2⁷, kk>n ²⁴, walec A ^Pasmo 10: jsSStnCCIin, klon ⁴4, walec B

Figura 21 przedstawia żele SDS PAGE (A) i wyniki immunoblottingu (B) rekombinantowego SCCE oczyszczonego z hodowli komórek C127 z komórkami zawierającymi plazmid _piS5o7.

Pasma 1 i 5: Wstępnie barwiony marker masy cząsteczkowej (BioRad, 106, 80, 49,5 32,5,

27.5 _i 18,5 kDa)

P_asmo 2: Pożywka komórkowa przed oczyszczaniem

Pasmo 3: Niezwiązany materiał zebrany z chromatografii

Pasmo 4: Związany materiał eluowany buforem o niskiej wartości pH

Figura 22 przedstawia natywny SCCE i aktywowany rekombinantowy SCCE oznaczany na aktywność na żelu poliakryloamidowym z kazeiną

178 589

Pasma 1 i 10: markery masy cząsteczkowej (Pharmacia 14-94 kDa)

Pasmo 2: Natywny SCCE

Pasmo 3: Natywny SCCE

Pasma 4-6: Rekombinantowy SCCE rozszczepiany odpowiednio przez godzinę, 3 godziny i dobę (460 ng/dołek).

Pasmo 7: Trypsyna w tej samej ilości jak w próbkach z pasm 4-6 ale bez APMSF.

Pasmo 8: Trypsyna w tej samej ilości jak w próbkach z pasm 4-6 z dodatkiem tej samej ilości APMSF w tych próbkach.

Pasmo 9: Takie samo jak pasmo 3.

Figura 23 przedstawia plamy z immunoblottingu N-Glukozydazy F^R traktowanej natywnym i rekombinantowym SCCE. Próbki rozdzielano elektroforetycznie na 8-18% SDS PAGe i prowadzono immunoblotting w sposób opisany powyżej.

Pasmo 1: Markery masy cząsteczkowej. Od góry masy cząsteczkowe 106, 80,49,5, 32,5,

27,5 i 18,5 kDa.

Pasma 2 i 3: Rekombinantowy SCCE, odpowiednio 0,3 i 3 pg.

Pasma 4 i 5: Natywny SCCE, odpowiednio 1,5 i 1,8 pg.

Próbki w pasmach 3 i 5 traktowano N-Glukozydazą F^r.

PRZYKŁADY

Przykład I. Dowód, ze schodzenie komórek z powierzchni zrogowaciałej warstwy powierzchniowej skóry wymaga rozkładu białek desmosomalnych i że enzymem za to odpow_iedzialnym wydaje się proteinaza serynowa chymotrypsyno-podobna, hamowana przez jony cynku.

1.1 Złuszczanie snę warstwy rogowej.

Celem badania było wyjaśnienie rodzaju mechanizmów odpowiedzialnych za spójn_ość komórek i oddzielanie się komórek powierzchownych (złuszczanie) w zrogowaciałej wa_rstw_ieskóry, warstwie rogowej. Ścinek warstwy rogowej o grubości 0,3-0,6 mm cięto rów_nol_egl_e do powierzchni skóry ze stopy ochotnika ze zdrową skórą. Ten skrawek tkanki moczono w płyn_ie f_izjologicznym buforowanym fosforanem z dodatkiem 0,1% azydku sodu przez 3 godzmy _w temperaturze pokojowej i zdrapano komórki luźno związane z zewnętrznej powierzchni skóry, m vivo. Skrawki o grubości 1 mm cięte prostopadle do powierzchni tkanki umieszcza_no n_astęp_nie w pożywce zawi erające⁾ 0,1 M Tris; HC1 (pH = 8!), 5 mM EDTA, 0,1 % azydku sodu i 0,45% agarozy, tuż przed początkiem żelowania pożywki dzięki dodatkowi agarozy. Po inkub_acji prow_adzonej w czasach 0,51 15 godzin w temperaturze 37° zamrażano kawałki żelu z tŁa4kąw _suchy_mlodzie. Kriostatowane przekroje o grubości 20 pm cięto prostopadle do powierzchm _skó_ry w kriostacie, montowano i badano w mikroskopie z kontrastem fazowym. Obserwo_{wano ci}ągł_e, jednopolarne złuszczanie komórek z warstwy rogowej podeszwy inkubowanej in _vit_ro (fig. 1) Komórki schodziły tylko z powierzchni tkanki zwróconej m vivo na zewnątrz. Ofoerwmwuiy proces przypominał złuszczanie.

1.2. Wpływ temperatury', wartości pH i inhibitorów enzymu

Opracowano ilościowy sposób oznaczania odpadania komórek, co umożliwiło b_ad_aniawpływu różnych parametrów, takich jak temperatura, wartość pH i inhibitory enzymów. Przygo towano cylindry warstwy rogowej podeszwy o średnicy 3 mm wykonane dziurkaczem do bi_opsji ze skrawków pobranych z tkanki pobranej i uwolnionej z luźno utrzymujących się komórek z p_owierzch4i skóry w sposób opisany w p. 1.1. Cylmdry (o określonym polu powierzchni zwróconej m vivo na zewnątrz) mkubowano w 0,5 ml pożywki zawierającej 0,1 M Tris HC1 (pH = 8), 5 mM EDTA, 0,1 % azydku sodowwgo, z dodatkiem lub be z dodatku apro^^in}' (4 x 10 '⁶ mol/litr) B_oehringer Mannheim, Niemcy) w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml w temperaturze 37° _{w czas}i_e 5, 10 i 20 godzin, po czym wirowano w czasie 10 sekund w wirówce Vortex w _cel_{u u}w_olm_ema zdysocjowanych komórek powierzchniowych. Pozostałą tkankę usunięto i ukieszczo_4o w świeżej pożywce do ciągłej mkubiicji. Probówki z uwolnionymi komórkami wirowano w _czasie 2 minut przy 5000 g w celu zebrania komórek. Peletki komórek przemyto raz ilością 0,5 _ml b_uf_or_ow_anego fosforanem płynu fizjologicznego i następnie traktowano w temperaturze

178 589

60°C w czasie 1,5 godziny ilością0,6 ml 1 M wodorotlenku sodu. Białko rozpuszczalne w środowisku alkalicznym oznaczano ilościowo metodą Lowry'ego i wsp., (1951) i traktowano jako miarę ilości uwolnionych komórek. Wyniki są przedstawione na fig. 2.

W podobny sposób badano wpływ różnych potencjalnych inhibitorów (aprotyniny, inhibitora trypsyny z soi, pepstatyny (Boehringer Mannheim, Niemcy) i jodoacetamidu (Sigma, St. Louis, MO). Przygotowano pojedyncze cylindry tkanki o średnicy 2 mm i inkubowano je w pożywce z dodatkiem lub bez dodatku różnych potencjalnych inhibitorów w stężeniach wskazanych w tabeli 1 poniżej, w czasie 16 godzin w temperaturze 37°C i uwolnione komórki oznaczano ilościowo w sposób podany powyżej. Należy zauważyć, że EDTA (będący inhibitorem metaloproteinaz) został włączony do pożywki inkubacyjnej co dało optymalne szybkości uwalniania komórek.

Tabela 1

Wpływ inhibitorów proteazy na uwalnianie komórek z warstwy rogowej podeszwy in vitro Średnie i odchylenia standardowe SD dla 5 inkubowanych skrawków tkanki

Inhibitor	Stężenie (mol/litr)	Hamowanie (%)
Żaden	-	0 ± 8
Aprotynina (TrasylolR	1,5 x W⁷	18 ± 8
Aprotynina (Trasylol^R)	4x K)7	53 ± 13
Aprotynina (TrasylolR)	1,5 x 10-6	90 ±5
Aprotynina (TrasylolR)	4 x rn⁶	98 ±2
Inhibitor trypsyny z soi	5 x 10-	81 ±9
Pepstatyna	1 x 10‘⁴	8 ± 4
Jodoacetamid	1 x rn³	6 ±13

Okazało się, że inhibitory proteinazy serynowej: aprotynina i inhibitor trypsyny z soi, skutecznie hamowały złuszczanie się komórek (fig. 2, tabela 1 powyżej). Ponieważ te dwie substancje wywierały wpływ hamujący a inhibitory metaloproteinaz (EDTA), tioproteinaz (jodoacetamid) i proteaz kwasu asparaginowego (pepstatyna) nie wywierały takiego wpływu, uznano, że w obserwowanym procesie bierze udział proteaza serynowa. Uznano również, że spójność komórek w warstwie rogowej jest zależna od struktur białkowych i że w procesie złuszczania in vivo musi uczestniczyć mechanizm podobny do obserwowanego in vitro (Lundstrom i Egelrud, 1988).

W dalszych badaniach złuszczania komórek in vitro z warstwy rogowej podeszwy okazało się, że proces ten można podzielić na dwa oddzielne etapy. Pierwszy etap przebiega niezależnie od obecności EDTA w pożywce inkubacyjnej. Drugi etap przebiega tylko w obecności EDTA Pierwszy etap może być hamowany chymostatyną i jonami cynku oraz aprotyniną. Drugi etap można hamować aprotyninąi chymostatyną (Lundstrom i Egelrud, 1990 a). Chymostatynajest nisko-cząsteczkowym inhibitorem proteinaz ze specyficznością wobec substratu chymotrypsyno-podobną. Okazało się następnie (Lundstrom i Egelrud, 1990 a), że leupeptyna, inhibitor proteinaz o niskiej masie cząsteczkowej, ze specyficznością wobec substratu trypsyno-podobną, nie ma wpływu na złuszczanie komórek in vitro.

Strukturami białkowymi najprawdopodobniej odpowiedzialnymi za spójność komórek w warstwie rogowej a zatem, możliwymi kandydatami do podlegania rozkładowi w opisanym powyżej złuszczaniu się komórek są desmosomy. Desmosom składa się z dwu symetrycznych połówek zlokalizowanych w przylegających komórkach. Te dwie połówki są związane z przestrzenią pozakomórkową poprzez białka transbłonowe, zwane desmogleinami.

1.3. Tłuszcz desmogleiny I (DG I) podczas złuszczania komórek in vitro.

Badano tłuszcz desmogleiny I (DG I) podczas złuszczania komórek in vitro z warstwy rogowej podeszwy. Warstwę rogową inkubowano jak opisano powyżej w p.1.1 i ciągle spójną

178 589 tkankę oddzielono od komórek zdysocjowanych. Komórki i tkankę ekstrahowano w buforze zawierającym 0,1 M Tris HC1 (pH = 9), 9M mocznik, 2% dodecylosiarczanu sodu, 1% metkaptoetanolu, stosując 1 ml buforu na 20 mg tkanki, w czasie 15 godzin w temperaturze 37°C. Ekstrakty przygotowywano do elektroforezy w 7,5% żelach poliakryloamidowych, z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS PAGE) według Laemmli'ego (Laemmli, 1970), następnie próbki z elektroforezy (Towbin i wsp., 1979) przenoszono na filtry nitrocelulozowe (BioRad, Richmond, CA) i hybrydyzowano z sondąpoliklonalnej antysurowicy królika przeciw DG I oczyszczoną od pozostałości bydlęcych (Gorbsky i wsp, 1985). Związane przeciwciała wykrywano za pomocą immunoglobulin kozła anty-króliczych skomugowanych z alkaliczną fosfatazą (BioRad, Richmond, CA), (Blake i wsp., 1984).

Wyniki są przedstawione na fig. 3. Ilości próbki dodawane do prób immunoblottingu dopasowywano tak, aby otrzymać podobne stężenia białka (szacowane wizulanie na żelach SDS-PAGE barwionych błękitem Coomassie) dla spójnej tkanki zdysocjowanych komórek. Badano kilka rozcieńczeń ekstraktów aby umożliwić pół-ilościowe porównanie ilości różnych reagujących przeciw DG I komponentów spójnej warstwy rogowej i zdysocjowanych komórek.

Po oddzielnej ekstrakcji ciągle spójnej tkanki i zdysocjowanych komórek okazało się, że ta spójna tkanka zawierała tylko widocznie nienaruszone białko DG I, natomiast zdysocjowane komórki powierzchniowe zawierały jedynie przypuszczalne produkty rozkładu tego białka (fig 3).

Na figurach 41 5 są przedstawione wpływy aprotyniny, jonów cynku, chymostatyny (Boehringer, Mannheim, Niemcy) i leupeptyny (Boehringer, Mannheim, Niemcy) na rozkład DG 1 podczas złuszczania komórek z warstwy rogowej podeszwy in vitro.

Na początku badano czas i siłę działania aprotyniny na rozkład desmogleiny I (DG I) w warstwie rogowej podeszwy poddawanej złuszczaniu komórek in vitro. Ekstrakty warstwy rogowej podeszwy inkubowano w sposób podany w punkcie 1.2 (ale bez oddzielania spójnej tkanki od zdysocjowanych komórek przed ekstrakcją) wobec dodatku (15 pM) i bez dodatku aprotyniny i po 0, 6,12 lub 24 godzinach poddano je ekstrakcji Elektroforezę i immunoblotting prowadzono w sposób podany powyżej. Analizę metodą densytometru skaningowej plam z immunoblottingu prowadzono w skanerze z ruchomąplamką świetlną typu Shimadzu CS-9000 (Shimadzu, Kyoto, Japonia) w świetle odbitym o długości fali 560 nm w sposób zygzakowy. Wyniki sąprzedstawione na fig. 4. Należy zauważyć wydajne hamowanie przez aprotyninę rozkładu DG I.

Następnie badano wpływ jonów cynku, chymostatyny i leupeptyny na rozkład desmogleiny I (DG I) w warstwie rogowej podeszwy podczas złuszczania komórek in vitro. Schemat doświadczenia opisano powyżej. Inkubacje prowadzono przez 24 godziny z siarczanem cynku w stężeniach 0,1 albo 5 mM a z chymostatyną i leupeptyną w stężeniu 330 pM. Wyniki przedstawiają hamowanie transformacji komponentów anty-DG I-dodatnich od masy cząsteczkowej 160 kD do 95 i 80 kD przez jony cynku i chymostatynę ale nie przez leupeptynę.

Powyższe wyniki są dowodem na to, że aprotynina, jony cynku i chymostatyna mają działanie inhibitorów podczas gdy leupeptyną nie wywiera takiego działania. Tak więc, profil hamowania dla degradacji DG I był taki sam jak dla złuszczania się komórek z warstwy rogowej podeszwy in vitro (Lundstrom i Egelrud 1990b).

Uznano za istotne wykazać, że mechanizmy podobne do tych jakie są odpowiedzialne za złuszczanie się komórek z warstwy rogowej dłoni i stóp istnieją również w warstwie rogowej skóry z innych części ciała. Takahashi i wsp. (Takahashi i wsp., 1987) opublikował wyniki doświadczeń, w których mieszanina detergentów tlenku N,N-dimetylododecyloaminy (Sigma, St. Louis, MO) i dodecylosiarczanu sodu (BioRad, Richmond, CA) w stosunku 8:2 powodowała oddzielanie się komórek z warstwy rogowej nie dłoni i nie stóp uprzednio preparowanej przez działanie trypsynąna cały naskórek. Dla uniknięcia zanieczyszczenia egzogenną trypsyną, próbki biopsji normalnej ludzkiej skóry z okolicy pośladka inkubowano przy wartości pH = 8 z podaną powyżej mieszaniną detergentów i EDTA (Egelrud i Lundstrom, 1990) Okazało się, że w

178 589 tych warunkach zrogowaciała warstwa dysocjowała do pojedynczych komórek. Dodatek aprotyniny do pożywki inkubacyjnej zapobiegał tej dysocjacji komórek. Wynika stąd, że również w warstwie rogowej nie dłoni i nie stóp spójność komórek zależy od struktur białkowych, ze złuszczanie w tej tkance zależy od proteolizy i że ta tkanka zawiera proteinazę, która może katalizować proteolizę. Ponieważ procesowi dysocjacji podlegająjedynie komórki warstwy rogowej i nie dotyczy to głębszych, nie-zrogowaciałych warstw naskórkowych, można wnioskować, ze odpowiedzialna za ten proces proteinaza jest zlokalizowana w głębszych warstwach, w stanie nieaktywnym albo hamowanym.

Przykładl I. Wykrycie enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej (SCCE), proteinazy spełniającej kryteria odpowiedzialności za rozkładanie wewnątrzkomórkowych struktur kohezyjnych w warstwie rogowej in vitro i prawdopodobnie również in vivo.

Na podstawie doświadczeń przeprowadzonych w przykładzie I wywnioskowano, że proteinaza odpowiedzialna zajednopolarnądysocjację komórek powierzchniowych w modelu in vitro złuszczania się warstwy rogowej podeszwy powinna mieć następujące właściwości:

1. Powinna być obecna w warstwie rogowej

2. Powinna być proteinazą serynową

3. Powinna się charakteryzować chymotrypsyno-podobną swoistością w stosunku do substratu i profilem inhibitorów podobnym do tego, jaki obserwuje się podczas złuszczania komórek in vitro i podczas towarzyszącej degradacji desmogleiny I.

4. Powinna mieć pozakomórkowąlokalizację w warstwie rogowej.

5. Powinna wykazywać zalezność od wartości pH w zakresie pozwalającym na wywieranie aktywności w warunkach fizjologicznych, czyli pH warstwy rogowej, które ma zakres 4.5 -6.

6. Złuszczanie komórek z warstwy rogowej podeszwy in vitro przebiega w sposób ciągły podczas przedłużonych czasów inkubacji, nawet, jeśli objętość pożywki inkubacyjnej jest bardzo duża w porównaniu do objętości inkubowanych skrawków tkanki lub nawet jeśli pożywkę inkubacyjną wielokrotnie się zmienia podczas inkubacji. Dlatego przypuszcza się, że enzym odpowiedzialny za ten proces jest związany z tkanką w taki sposób, który nie pozwala na jego ekstrakcję do pożywki inkubacyjnej podczas inkubacji.

Następne dwa doświadczenia doprowadziły do odkrycia SCCE (Egelrud i Lundstrom, 1991).

2.1 Aktywność enzymu związana ze zdysocjowanymi korneocytami podeszwy.

Zdysocjowane komórki warstwy rogowej podeszwy (korneocyty) preparowano przez inkubację warstwy rogowej podeszwy jak opisano w przykładzie I. Komórki filtrowano przez siatkę nylonową o średnicy otworów 100 pm, po czym przemywano trzy razy w 10 objętościach roztworu o składzie: 0,1 M Tris HC1 (pH = 8), 5 mM EDTA i trzy razy w 0,1 M roztworze Tris HC1 (pH = 8). Następnie komórki inkubowano z dwoma typami chromogennych substratów dla protemazy: S-2288 albo S-2586 (Kabi Diagnostica, Stockholm, Szwecja)

Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288) jest rozszczepiany przez szeroki zakres proteinaz serynowych ze swoistością argininy (np. przez trypsynę) Arg-Pro-Tyr-p-nitroanilid (S-2586) jest substratem dla proteinaz chymotrypsyno-podobnych.

W całkowitej objętości 120 pl każda mieszanina reakcyjna zawierała 0,07 M Tris HCd (pH = 8), 0,1% azydku sodu, 1, 2,5, 5 lub 10 pl 25% zawiesiny przemytych korneocytów podeszwy i 1,04 mM S-2586 albo 1,25 mM S-2288 jako substratu. Po inkubacji prowadzonej 5 godzin w temperaturze 37°C w płytkach do -mikromianowania zatrzymywano reakcję przez dodanie 125 pl 10% kwasu octowego. Komórki pozostawiano do sedymentacji i 200 pl każdego supernatantu przenoszono do nowych dołków. Hydrolizę tych dwóch substratów śledzono po usunięciu komórek przez pomiar zmiany absorbancji przy długości fali 405 nm w aparacie Behring Elisa Processor (Behringwerke, Marburg, Niemcy).

178 589

Na fig. 6 wykazano, że istnieje aktywność enzymu związana ze zdysocjowanymi korneocytami podeszwy, która to aktywność katalizuje hydrolizę substratu S-2586. Aktywność wobec S-2288 jest niska.

Następnie badano zależność od wartości pH aktywności hydrolizowama S-2586. Procedura doświadczenia była taka jak opisano powyżej. Stosowano 10 pl 25% zawiesiny przemytych korneocytów podeszwy i bufory o różnych wartościach pH (octan sodu, fosforan sodu albo Tris HC1). Końcowe stężenia buforu wynosiły 0,07 M. Wyniki są przedstawione na fig. 7. Wynika z nich, że optymalna aktywność występuje przy pH o wartości 7-8 ale jest również znacząca przy pH 5.5.

W dalszym doświadczeniu badano wpływ EDTA, jonów metali i inhibitorów proteinazy na hydrolizę S-2586 przy wartości pH 8 katalizowaną proteinazą związaną z obecnymi w zawiesinie komórkami warstwy rogowej podeszwy. Doświadczenie prowadzono w sposób podany powyżej i w tabeli 2.

Tabela 2

Wpływ EDTA, jonów metali i inhibitorów proteinazy na hydrolizę S-2586 przez proteinazę związaną z komórkami warstwy rogowej podeszwy (źródło enzymu: zawiesina komórek)

Inhibitor	Stężenie	Aktywność (%) (±SD, n=3)
Żaden	-	100
EDTA^a	4.2 mM	109 ± 1
PMSF³	1 mM	8 ± 3
Aprotyninaa	3 pM	10 ± 1
Inhibitor trypsyny z soj^	0.16 μΜ	6± 1
Ćhymostutynua ^c	11 pM	66 ±9
	55 pM	32 ±0
	275 pM	15 ± 3
Leupeptyna c	325 pM	93 ±3
ZnSO4a	100 pM	10 ± 3
Hgćl₂	100 pM	84 ±2
ĆuSO4.	100 pM	85 ±2

a- substancja obecna w badanej mieszaninie b - 25% zawiesina komórek warstwy rogowej podeszwy przygotowana w sposób opisany w tekście i preinkubowana przez godzinę w temperaturze pokojowej wobec 1mM PMSF (Sigma, St. Louis, MO), rozpuszczona w 2-propanolu (końcowe stężenie 2-propanolu 4%, objętościowo) Próbki kontrolne preinkubowano tylko w 4% 2-propanolu c - inhibitor rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wszystkie pożywki, również kontrolne, zawierały 5% objętościowych DMSO.

Jak wynika z tabeli 2, fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF, ogólny inhibitor proteinaz serynowych), aprotynina, inhibitor trypsyny z soi, chymostatyna (inhibitor chymotrypsyny) i jony cynku, ale nie leupeptyna (inhibitor trypsyny) hamowały aktywność hydrolizowania S-2586. Profil inhibitorów jest więc podobny do obserwowanego w doświadczeniu złuszczania komórek in vitro i związaną z tym degradacją desmogleiny I.

2.2. Enzymografia zdysocjonowanej warstwy rogowej podeszwy.

Okazało się, że enzym odpowiedzialny za hydrolizę S-2586 wykryty w p. 2.1 może być solubilizowany, jeśli korneocyty podda się ekstrakcji 1 M roztworem KC1 w 0,1 M Tris HC1 (pH=8). Przeprowadzono więc doświadczenia enzymograficzne. W tym celu przygotowano

178 589 ekstrakty korneocytów w KC1 do elektroforezy w sposób podany przez Laemmli'ego (Laemmli 1970), ale bez dodatku środka redukującego do buforu do próbek i bez ogrzewania próbek. Próbki również przygotowano drogą ekstrakcji zdysocjowaonch korneocytów podeszwy buforem do próbek Laemmli'ego bez środka redukującego, w temperaturze pokojowej. Do enzymografii zastosowano modyfikację procedury Hone'ego i wsp. (Horie i wsp., 1984). Elektroforezę w żelu poliakryloamidowym wobec dodecylosiarczaou sodu (SDS-PAGE) prowadzono według Laemmli'ego w 12,5% żelach z dodatkiem 1% kopolimeryzowanej i denaturowanej ciepłem kazeiny. Po elektroforezie żele moczono w buforze zawierającym 2% Triton Χ-100 w czasie godziny, w temperaturze pokojowe dla usunięcia SDS, po czym inkubowano je w temperaturze 37°C w czasie 15 godzin. Następnie żele barwiono błękitem Coomassie. Oddzielone enzymy kazeinolityczne były widoczne jako klarowne pasma na niebieskim tle. Szczegóły doświadczalne są podane w opisie rysunku na fig. 8.

Wyniki są przedstawione na fig. 8. Ekstrakty kotoeocntów podeszwy zawierały jeden dominujący enzym kazemohtyczon o oznaczonej masie cząsteczkowej około 25 kD. Były też występujące w mniejszej ilości enzymy kazeioolitnczoe o masach cząsteczkowych około 30 kD. (Te komponenty występujące w mniejszej ilości, nie są wyraźnie widoczne na figurze. W dalszych próbach okazało się, że mogą one być hamowane przez leupeptynę, ale nie przez chymostatynę) Enzym o wielkości 25 kD wywiera silne działanie przy zakresie pH wynoszącym od 5.5 do 8. Jest on hamowany przez aprotymnę, jony cynku i chymostatynę, ale nie przez leupeptynę. Ma on więc ten sam profil inhibitorów jak opisana powyżej aktywność hydrolizy S-2586 W doświadczeniach metodą ekskluzyjnej chromatografii żelowej (nie opisanych) ten kazeioolitnczoy enzym o masie cząsteczkowej 25 kD był ko-chromatografowaon z aktywnościąhydrolizującą S-2586.

W następnych badaniach (nie opisanych) wykonanych tą samątechnikąjak opisana w punkcie 2.2 okazało się, że warstwa rogowa nie dłoni i nie pięt zawiera enzym o oznaczonych właściwościach identycznych z właściwościami proteioazn o masie cząsteczkowej 25 kD związanej z koroeocntami podeszwy. Od tego czasu enzym ten nazwano enzymem chnmotrypsnoownm warstwy rogowej, SCCE (Lundstrom i Egelrud, 1991).

Możliwe było również uzyskanie dowodu, że SCCE jest związany z korneocytami podeszwy w sposób pozwalający na wywieranie aktywności w przestrzeni pozakomórkowej warstwy rogowej Dokonano tego przez wykazanie, że zdysocjowane komeocyty są nieprzepuszczalne dla peroksydazy chrzanu (o oznaczonej masie cząsteczkowej 44 kD). Następnie, wykryto, ze ludzki fibrynogen (o oznaczonej masie cząsteczkowej 340 kD) może być rozkładany przez zawiesinę korneocytów i że ten rozkład może być hamowany przez te same rnhibitoryjakie hamująSCCE. W ten sposób można było wykluczyć, że degradację fibryoogeou wywołuje enzym rozpuszczony (Egelrud, 1992)

Przykład III. Częściowe oczyszczanie enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej (SCCE) i oznaczenia tej protemazy z udziałem substratów chromogennych.

3.1. Przygotowanie ekstraktów koroeocntów podeszwy w KC1.

Powiększono skalę wytwarzania zdysocjowanych korneocytów podeszwy opisanego w przykładzie I i przygotowano ekstrakty w KC1 przemytych koroeocntów podeszwy zawierających SCCE postępując w sposób opisany w przykładzie II.

Przygotowanie ekstraktów w KC1 korneocytów podeszwy jest schematycznie przedstawione w poniższej tabeli 3. Hlperplastnczln^ ludzką warstwę rogową podeszwy zebrano przy współpracy Towarzystwa Pedikiurzystów Szweckich. Użytojedyole materiał uzyskany przez obcinanie lub skrawanie. Nie zbierano materiału z zaburzeniami złuszczania. Przed wysyłką. warstwę rogową suszono na powietrzu i pakowano do plastikowych torebek. W laboratorium przechowywano jąw temperaturze -20°C aż do użycia.

178 589

Tabela 3

Schemat przygotowania ekstraktów w KC1 zawierających SCCE ze zdysocjowanych korneocytów podeszwy

Warstwa rogowa podeszwy _50 g_

Inkubacja w temperaturze 37°C przez 24 godziny w 1000 ml roztworu o składzie 0,1 M TRIS HC1 (pH=8), 5 mM EDTA, 0,1% azydku sodu supematant — wirowanie przy 740 g, 5 minut przemywanie — Przemywanie peletki 5 razy po 600 ml 0,1 M TRIS HC1 (pH=8) wirowanie jak poprzednio

Ekstrakcja peletki jedną objętością

M KC1 w 0,1 M TRIS HC1 (pH=8), — ekstrakt 1 minut w temperaturze 4°C. (około 250 ml)

Wirowanie jak poprzednio

Przemywanie peletki jedną objętością 1M KC1 w 0,1 M Tris HC1 (pH=8) Wirowanie jak poprzednio — ekstrakt 2 (około 150 ml)

Peletka

Do każdego następnego etapu chromatografii pulowano ekstrakt 1 i ekstrakt 2 z tych dwu przygotowań, w ilości po 50 g warstwy rogowej podeszwy.

3.2. Oznaczenie aktywności proteinazy na chromogennych substratach.

Porównane SCCE, chymotrypsynę wołową i ludzką katepsynę G pod względem wpływu na ich aktywność inhibitorów: aprotyniny, chymostatyny, siarczanu cynku i pod względem swoistości wobec substratu.

Przygotowano roztwory podstawowe MaO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) w wodzie destylowanej, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Boehringer Mannheim, Niemcy) w 1-metylo-2pirolidonie (końcowe stężenie rozpuszczalnika w mieszaninach inkubacyjnych wynosiło 4%) i chymostatyny w dimetylosulfotlenku (końcowe stężenie rozpuszczalnika w mieszaninach inkubacyjnych wynosiło 1%o). Katepsynę G z ropnej plwociny ludzkiej otrzymano od E. Lotti, Genewa, Szwajcaria. Jako źródło SCCE służył ekstrakt w KC1 zdysocjowanych korneocytów podeszwy przygotowanych powyżej. Źródła inhibitorów: aprotyniny, chymostatyny i siarczanu cynku podano powyżej.

inkubacje prowadzono w temperaturze 37°C w płytkach do mikromianowania. Całkowita objętość próbki inkubacyjnej wynosiła 136 pl. Każda mieszanina inkubacyjna zawierała roztwór o składzie: Tris HC1 c pH=8 (końcowe stężenie równe 0,08 M), KC1 (końcowe stężenie równe 0,2 M) z dodatkiem 100 pl roztworu substratu, 25 pl źródła enzymu (odpowiednio rozcieńczonego w 0,1 M Tris HC1 o pH 8,0, w 1.0 M KC1) i 10 pl roztworu inhibitora.

Na figurach 9 A-C, jako substrat użyto MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) w początkowym stężeniu 1,2 mM. Na fig. 9D początkowe stężenie obydwu substratów wynosiło 1,2 mM. Pod koniec inkubacji (1,5 godziny) do każdego dołka dodano po 125 pi 10% kwasu octowego i odczytywano absorbancję przy długości fali 405 nm, porównując wyniki z odczytami dla mieszanin inkubacyjnych, do których nie dodano enzymów, traktując je jako ślepe próby. ilości dodawanych enzymów tak dobierano, aby zmiany absorbancji przy 405 nm na końcu inkubacji wynosiły 0,3 do 0,7

Wyniki są przedstawione sumarycznie na fig 9 A-D. Do badań wpływu inhibitorów użyto

S-2586. Wydajność aprotyniny jako inhibitora SCCE i chymotrypsyny była wysoka i mniej więcej taka sama dla tych dwóch enzymów. Z drugiej strony, wpływ katepsyny G był znacznie mniejszy (fig. 9A). Chymostatyna hamowała wszystkie trzy enzymy, ale stężenie inhibitora powodujące 50% hamowanie było o ponad trzy rzędy wielkości wyższe dla SCCE niż dla chy178 589 motrypsyny i katepsyny G (fig. 9B). Siarczan cynku był wydajnym inhibitorem SCCE, ałe nie chymotrypsyny i katepsyny G (fig. 9C). Aktywność tych trzech enzymów wobec substratów: MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) i Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA jest porównana na fig. 9D. Ponieważ celem doświadczenia było znalezienie podobieństw i różnic między badanymi enzymami, próby prowadzono tylko z jednym, początkowym stężeniem każdego substratu. Podczas, gdy Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA okazał się znacznie lepszym substratem niż S-2586 dla chymotrypsyny i katepsyny G, odwrotne zjawisko obserwuje się dla SCCE

Przykład IV. Oczyszczanie i oznaczanie N-terminalnej sekwencji aminokwasowej enzymu chymotrypsynowego warstwy rogowej.

4.1. Oczyszczanie SCCE z ekstraktów korneocytów w KC1 za pomocą chromatografii powinowactwa na insołubilizowanym inhibitorze trypsyny z soi (SBTI).

Figura 10 przedstawia wyniki chromatografii powino SBTI (Boehringer, Mannheim, Niemcy) z ilością 12 ml osiadłego żelu Affigel 15 (BioRad, Richmond, CA) postępując według instrukcji producenta. Pozostające aktywne grupy na żelu blokowano etanoloaminą. Połączone ekstrakty w KC1 ze 100 g (suchej masy) warstwy rogowej podeszwy (całkowita objętość 700 ml) przepuszczano przez kolumnę szklaną o wymiarach 0.8 cm x 2 cm upakowaną złożem SBTI-Affigel 15 z prędkością przepływu 42 ml/godzinę, z ciągłym zapisem absorbancji eluatu przy 280 nm. Kolumnę przemywano roztworem o składzie: 0,1 M Tris HC1 (pH=8), 1 M KC1, aż do spadku absorbancji eluantu poniżej wartości 0,01, a następnie ilością 10 ml roztworu zawierającego 0,1 M Tris HC1 (pH=8). Następnie eluowano związany materiał 110 i 100 mM roztworem HC1. Eluant zmieniano, jeśli absorbancja eluatu spadała do wartości poniżej 0,01. Zbierano frakcje po 3 ml do probówek zawierających Tris HC1 (pH=8), w całkowitej objętości 0.4 ml, w ilości wyliczonej tak, aby doprowadzić pH eluatu do wartości powyżej 7 Wartość pH każdej frakcji natychmiast sprawdzano i w miarę potrzeby doprowadzano do około 7 dodając małe objętości 1 M Tns HC1 (pH=8). Analizy aktywności hydrolizowania peptydu, z użyciem S-2586 (substrat dla SCCE) i S-2288 (substrat dla enzymów trypsyno-podobnych) prowadzono w sposób opisany w przykładzie 2.1 Początkowe stężenie obydwu substratów w oznaczonych mieszaninach wynosiło 1 1 mM. Z żelem wiązało się około 90% aktywności hydrolizowania peptydu S-2586. Po etapowym eluowaniu przemytego żelu 10-100 mM roztworem HC1 można było odzyskać około 60% całkowitej aktywności hydrolizowania S-2586 w zastosowanym ekstrakcie w KC1. Z całkowitej aktywności hydrolizowania peptydu S-2288, około 20% wiązało się z żelem do chromatografii powinowactwa, a 10%o można było odzyskać w eluacie.

Figura 11 przedstawia analizę eluatu z chromatografii powinowactwa na SBTI za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wobec SDS (SDS-PAGE) i enzymografii. Analizowano próbki nieredukowane na żelach 12.5 procentowych. Patrz również Egelrud i Lundstrom (1991) i przykład 2, 2 2 w części eksperymentalnej. Przed przygotowaniem do elektroforezy, próbki zatężano około 20-krotnie (fig. 11A) za pomocą filtracji z wirowaniem na filtrach Ultrafree-MC (odcinających masy cząsteczkowe 10 kD firmy Millipore, Bedford, MA) i rozcieńczano 10-krotnie (fig. 11B).

Na figurze 12 jest przedstawione porównanie metodą SDS-PAGE próbki nieredukowanej i redukowanej uzyskanej z chromatografii powinowactwa SBTI. Jak to jest uwidocznione na fig. 10 i 11, białko otrzymane z chromatografii powinowactwa SBTI ma czystość ponad 90 procentową (analizowaną przez barwienie żeli SDS-PAGE błękitem Coomassie), masę cząsteczkową około 25 kD w formie niezredukowanej i około 28 kD w formie zredukowanej. Ponadto występuje w niewielkiej ilości składnik barwiący się błękitem Coomassie o oznaczonej masie cząsteczkowej o około 1 kD wyższej od głównego składnika. Na żelach enzymograficznych występuje jedno główne pasmo i jedno małe pasmo o tej samej ruchliwości elektroforetycznej jaką wykazują dwa pasma wykryte w żelach barwionych błękitem Coomassie z próbek nieredukowanych. Obydwa te kazeinolityczne składniki są hamowane przez chymostatynę. Poza tym, enzymografia wykazała występujące w mniejszej ilości składniki o oznaczonych masach cząsteczkowych około 30kD, które mogą być hamowane przez leupeptynę. Wykazano, że tym głównym oczyszczonym białkiem był SCCE.

178 589

4.2. Analiza N-terminalnej sekwencji aminokwasowej SCCE.

Ilości 200 μΐ frakcji z chromatogramu z żelem SBTI-Affigel 15o absorba4cji A^ = 0,2 przygotowano do elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących i analizowano na 12,5% żelach poliakrτloamidowτch (grubość 1 mm, szerokość szczeliny 73 mm) Po elektroforezie, rozdzielone białka przenoszono elektroforetycznie na filtry Immobilon (Millipore) i barwiono błękitem Coomassie według Matsuidaira, (1987). Wycinano główne pasmo białka i poddano je analizie w pulsacyjnym analizatorze sekwencji ammokwasowych w fazie ciekłej, Applied Biosystems 477a z analizatorem 04-li4e PTH 120A (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Sekwencjonowanie prowadzono w programach regularnych cykli, stosując odczynniki dostarczone przez producenta. Początkowe i powtarzalne wydajności, wyliczane w odniesieniu do białek standardowych wynosiły odpowiednio 25% i 97%.

Wydajności pochodnych ammokwasowych były porównywalne tylko z jednym sekwencjonowanym peptydem. W próbkach nieredukowa4τch wydajności były dobre w etapach 1-6, ale spadały do zera w etapach 7 i 9. Wydajności w następnych etapach były znacznie obniżone. Również w próbkach redukowanych, nie można było wykryć pochodnych ammokwasowych w etapach 7 i 9, ale w następnych etapach, gdzie można było wykryć te pochodne, nie było gwałtownych spadków wydajności. Wyniki wskazują, że w pozycjach 71 9 znajdują się reszty cysteiny. Nie było jednak możliwe wykrycie karboksτmetylowanej cysteiny w etapach 71 9 po redukcji i działaniu kwasem jodooctowym (100 mM). Otrzymana sekwencja (fig. 13, SEQ ID Nr: 3) była identyczna dla próbek redukowanych i 4ieredukowanτch.

Przykład V.

5.1. Przygotowanie przeciwciał monoklonalnych, SCCE-swoistych.

Myszom BALB/c (Bomholtgaard, Dania) podawano drogą iniekcji podskórnych około 30 μg natywnego SCCE, oczyszczonego jak w przykładzie 4.1 w kompletnym adiuwancie Freunda (Difco Laboratories, Detroit, MI). Po miesiącu powtarzano iniekcje, podając tę samą ilość SCCE w niekompletnym adiuwancie Freunda (Difco Laboratories, Detroit, MI) Po czterech miesiącach od pierwszej iniekcji jednej myszy podano dożylnie wspomagające iniekcje 30 μg antyge4u/wstrzτk4ięcie w ciągu 3 kolejnych dni. Hybrydoma wytwarzano metodąopisanąprzez Carlssona i wsp (1985) stosując komórki linii komórkowej szpiczaka SP2/0 (ATCC CRL 1581). Identyfikację przeciwciał reagujących z oczyszczonym preparatem SCCE prowadzono techniką ELISA. Supernatanty hodowli z klonów pozytywnych analizowano dalej metodą elektroforezy SDS-PAGE i następnego immu4oblottingu. Klony wytwarzające przeciwciała reagujące z SCCE w tej próbie namnażano w mysim płynie puchlinowym, a przeciwciała oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa na białku A i klasyfikowano metodą opisaną przez Carlsson'a i wsp. (1985). Otrzymano dwa użyteczne przeciwciała, moab TE4b i moab TE9b; sklasyfikowano je jako IgG,-kappa.

Charakteryzacja przeciwciał moab TE4b i moab TE9b metodami immu4oprecτpitacji i immu4oblotti4gu jest przedstawiona na fig 14.

Figura 14A (pasmo 2) przedstawia żel SDS-PAGE barwiony błękitem Coomassie ze stężonym ekstraktem w KC1 zdysocjowanτch komeocytów podeszwy, przygotowany według przykładu 3.1. Przed badaniem eleklroforetycz4τm, próbkę dializowano 4 godziny wobec 0,1 M octanu sodowego (pH 4) i zatężano około 100-krotnie przez ultrafiltrację Fig. 14A (pasmo 3) przedstawia preparat SCCE oczyszczony według przykładu 4.1.

Figura 14B przedstawia wyniki immu4oprecτpatacJa, w której przeciwciała inkubowano z ekstraktem korneocytów w KC1 i następnie odzyskiwano na insolubilizowanτm białku A. Resolubilizowane i dysocjowane kompleksy antygen-przeciwciało analizowano metodą enzymograAczną według przykładu 2.

Ilość 250 μΐ ekstraktu w KC1 zdysocjowanych korneocytów podeszwy, zatężonych 5-krotnie metodą ultrafiltracji, dializowanych wobec buforowanego fosforanem roztworu fizjologicznego i do których dodano albuminę surowicy bydlęcej (Sigma, St. Louis, MO) w ilości zapewniającej końcowe stężenie 10 mg/ml, mieszano z 10 μl roztworu przeciwciała albo buforowanego fosforanem roztworu fizjologicznego i inkubowano 15 godzin w temperaturze 4°C. Na178 589 stępnie, do probówek dodano 25 pl osiadłej żywicy Sepharose z białkiem A (Pharmacia, Upsala, Szwecja) i kontynuowano inkubacje, lekko wstrząsając, w temperaturze pokojowej, w czasie 2 godzin. Żel odzyskiwano przez wirowanie i przemywano 5 razy ilością 1 ml 0,05% roztworu Tween'u 20 (Sigma, St. Louis, MO) w roztworze o składzie: 0,05 M Tris HC1 (^=7.5), 0,5 M NaCl. Po końcowym przemywaniu, żel ekstrahowano w czasie godziny, w temperaturze pokojowej ilością 100 pI buforu Laemmli'ego do próbek bez środka redukującego. Ekstrakty klarowano przez wirowanie i podawano na żel.

Obydwa przeciwciała TE4b i TE9b wytrącały enzym kazeinolityczny o tej samej oznaczonej masie cząsteczkowej jak oczyszczony SCCE i odpowiadający mu główny enzym kazeinolityczny w ekstrakcie w KC1. Przeciwciała te nie wytrącały występujących w mniejszości w tym ekstrakcie enzymów kazemolitycznych o oznaczonej masie cząsteczkowej około 30 kDa, które były hamowane przez leupeptynę, inhibitor seryno-proteinaz trypsyno-podobnych. Poza wiązaniem się z enzymem kazeinolitycznym o masie cząsteczkowej 25 kDa przeciwciała te wydawały się wiązać z występującym w małej ilości składnikiem proteolitycznym o oznaczonej masie cząsteczkowej około 80 kDa. Komponent ten zazwyczaj występuje w ekstraktach KC1 korneocytów podeszwy przygotowanych z tkanki uprzednio suszonej, ale nie wykrywa się go w preparatach ze świeżej tkanki (T. Egelrud, obserwacja niepublikowana). Nie występuje on w preparatach SCCE oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa i może reprezentować produkt zagregowany. Nie można było wykryć odpowiedniego składnika reagującego z przeciwciałami w próbach immunoblottingu.

Na filtrach z immunoblottingu żeli SDS-PAGE wykonanych w warunkach nieredukujących (fig. 14 c) przeciwciała TE4b i TE9b reagowały z komponentem obecnym w ekstraktach KC1 korneocytów podeszwy (fig. 14 c, pasma 2 i 4) i w oczyszczonym preparacie SCCE (fig. 14 c, pasma 3 i 5). Obydwa te białka miały takąsamąmasę cząsteczkowąjak główne oczyszczone białko i główny składnik kazeinolityczny na enzymogramach. Przeciwciała nie reagowały z próbkami, które redukowano w obecności SDS, co świadczy o tym, że są one skierowane przeciw epitopom zależnym od konformacji.

Poza głównym białkiem o oznaczonej masie cząsteczkowej 25 kDa w formie niezredukowanej, oczyszczony preparat SCCE zawiera występujący w niewielkiej ilości składnik barwiący się w próbie z błękitem Coomassie o masie cząsteczkowej około 26 kDa (nieredukowany, przykład 3). Na enzymogramach występuje odpowiedni komponent kazeinolityczny. Może on być hamowany przez chymostatynę w sposób podobny do głównego składnika kazeinolitycznego o masie cząsteczkowej 25 kD (przykład 3. Przy wyższych stężeniach przeciwciał TE4b i TE9b (wyniki nie sąprzytoczone) jest widoczne, że również ten mniejszy składnik reaguje z przeciwciałami na filtrach z immunoblottingu. Podobne wyniki (nie cytowane) uzyskano stosując poliklonalne przeciwciało królika przeciw głównemu składnikowi barwionemu błękitem Coomassie, oczyszczonemu metodiąpreparatywncj elektroforezy. Nie jest znana dokładna zależność między tymi dwoma białkami o aktywności SCCE-podobnej, a oznaczoną krzyżową reakcją immunologiczną.

5.2 Przeciwciała poliklonalne swoiste wobec SCCE.

5.2.1. Przeciwciała anty-SCCE kurcząt.

Próbkę 45 pg SCCE oczyszczoną metodą chromatografii powinowactwa z użyciem SBTI według przykładu 4.1 w 0,2 ml roztworu 0,1 M Tris HC1 denaturowano ciepłem przez ogrzewanie w temperaturze 60°C w czasie 60 minut i homogenizowano w tej samej objętości kompletnego adiuwanta Freunda (Difco Laboratories). Otrzymaną emulsję wstrzykiwano podskórnie kurczakom Derco w wieku około 20 tygodni, od których pobrano próbki krwi do przygotowania surowicy pre-immunizowanej. Po 3, 51 7 tygodniach, kurczakom podawano dodatkowe iniekcje podskórne emulsji przygotowanych w powyższy sposób, ale z niekompletnym adiuwantem Freunda i z dodatkiem 30 pg oczyszczonego, denaturowanego ciepłem SCCE (całkowita objętość każdej emulsji wynosiła 250 pl). Po dwu tygodniach od ostatniej iniekcji kurczęta wykrwawiano, krew natychmiast mieszano z dwiema objętościami roztworu Alsevefa (zawierającego w 100 ml: 100 ml 1.87 g glukozy, 0.8 g cytrynianu sodu, 0.62 g chlorku sodu i kwas cytrynowy do ustawienia pH na wartość 6.1) i wirowano. Antysurowicę kurcząt, anty-SCCE stosowano do dalszych badań

178 589 w rozcieńczeniu 1/2000 w próbach immunoblottingu (fig. 17). Swoistość tej antysurowicy ilustruje przykład 8.

5.2.2. Surowica anty-SCCE królika

SCCE oczyszczony metodą chromatografii powinowactwa SBTI poddano elektroforezie SDS-PAGE bez redukcji, sposób podany w przykładzie 4.1 na żelach o grubości 15 mm, według Laemmli'ego (1970). Główne pasmo białka, poprzednio określone jako SCCE, wizualizowano przez barwienie metodą z chlorkiem miedzi według Lee i wsp. (1987) i wycinano. Po usunięciu chlorku miedzi za pomocąEDTA, według Lee i wsp., skrawki żelu homogenizowano w buforowanym fosforanem płynie fizjologicznym. Próbki homogenizowanych skrawków żeli zawieszano w równych objętościach adiuwanta Freunda. Ilość około 30 pg czystego SCCE przygotowanego w ten sposób w kompletnym adiuwancie Freunda wstrzykiwano podskórnie królikowi. Po 3, 5 i 7 tygodniach powtarzano iniekcje z tą samą ilością SCCE, ale w niekompletnym adiuwancie Freunda. Królika wykrwawiano po 2 tygodniach od ostatniej iniekcji.

Uzyskanąantysurowicę przeciw SCCE (D-5) użyto w rozcieńczeniajh 1/500 do 1/1000 do prób immunoblottingu ze skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą immunoglobulinami anty-króliczymi jako drugim przeciwciałem.

We wszystkich doświadczeniach immunoblottingu, związane drugie przeciwciało wykrywano według Bleke'go i wsp (1984; stosuje się do przykładów 5, 8 i 9).

Królicze anty-SCCE Bo-1 przygotowano w ten sam sposób, ale z udziałem SCCE redukowanego przed elektroforezą SDS-PAGE jako antygenem

5.3. Badania immunohistochemiczne z udziałem przeciwciał monoklonalnych.

W badaniach immunohistochemicznych z udziałem SCCE-swoistych przeciwciał monoklonalnych, SCCE był wykrywalny w wysokich nadpodstawnych komórkach ludzkiego rogowaciejącego nabłonka (naskórek, podkład wewnętrznego korzenia mieszka włosowego, podniebienie twarde), ale nie w nierogowaciejących nabłonkach płaskich (podkład wewnętrznego korzenia mieszka włosowego, śluzówka warg i policzków). Tak więc, SCCE może być swoiście wytwarzany w rogowaciejących nabłonkach płaskich. Ponadto, okazało się, ze ekspresja SCCE zachodzi w ludzkich wysokich nadpodstawnych komórkach naskórka rekonstytuowanych in vitro i rosnących na granicy powietrze-woda. SCCE nie był wytwarzany po dodaniu kwasu retynowego do pożywki w stężeniu, które stymulowało proliferencję keratynocytów, ale hamowało powstawanie warstwy rogowej. Wskazuje to na fakt, ze ekspresja SCCE może być częściąprogramu różnicowania się naskórka.

Wyniki doświadczeń immunoelektromikroskopowych z SCCE-swoistnymi przeciwciałami monoklonalnymi są zgodne z rolą SCCE w degradacji desmosomów, a zatem i w procesie złuszczania. Przeciwciała swoiście znaczyły ciałka blaszkowate,wydzielane do przestrzeni międzykomórkowej między najwyższymi komórkami ziarnistymi, a najbardziej powierzchownymi komórkami warstwy rogowej, natomiast w warstwie rogowej, przeciwciała te rozpoznawały epitopy w ścisłym powiązaniu z desmosomami w przestrzeni pozakomórkowej.

Przykład VI. Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA kodującego ludzki SCCE.

Enzymy restrykcyjne uzyskano z firmy Promega, Madison, MI, a TAQ-polimerazę z firmy Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT. BankcDNA dla ludzkich keratynocytów ludzi dorosłych pochodzenia naskórkowego otrzymano z Clontech Laboratories, Palo Alto, CA (Katalog # HL 1045 b). Początkowo, prowadzono skrining banku z udziałem anty-SCCE poliklonalnych surowic królika, D-5 i Bo-1 (przykład 5.2.2). Poliklonalna surowica anty-SCCE, Bo-1 dawała wysokie sygnały tła, została więc wykluczona z dokładnych badań skriningowych już we wczesnym etapie. Stosując antysurowicę D-5, wzbogacono wiele łysinek immunoreaktywnych, ponieważ z góry oznaczono łysinki rzeczywiście pozytywne. Nie obserwowano reaktywności żadnej z łysinek z przeciwciałami monoklonalnymi moAb 41 moAb 9. Wyczerpująca charakteryzacja enzymami restrykcyjnymi i charakteryzacja w reakcji amplifikacji z udziałem polimerazy, PCR, jedenastu wyizolowanych łysinek wykazały, że pomiędzy poszczególnymi łysinkami nie można wykryć żadnych podobieństw. Istnienie takich częściowych podobieństw świadczy o tym, że łysinki zawierają insert homologicznego DNA z tej samej sekwencji cDNA. Strategię zmodyfi178 589 kowano, gdyż nie można było określić „odcisków palców” prawdopodobnej sekwencji cDNA dla SććE.

Łysinki przesiewano w E. coli Y 1090 (ćlontech) metodą hybrydyzacji łysinek, stosując jako sondę zdegenerowany oligonukleotyd syntetyczny. Tę sondę oligonukleotydowąskonstruowano w oparciu o oznaczoną doświadczalnie sekwencję amino-terminalnąnatywnego enzymu SCCE, co jest opisane w przykładzie 4.2. Najbardziej wiarygodną część tej sekwencji aminokwasowej, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID Nr: 3; aa 1- aa 6) wybrano do konstruowania syntetycznej, 17-merowej sondy oligonukleotydowej:

5'-ArHAniGAYGGNGCNCC-3' (H=A albo ć albo T; Y=ć albo T, N=A albo ć albo G albo T), oznaczonej symbolem SYM 3067, (SEQ ID Nr. 4). Tę sondę oligonukleotydową syntetyzowano stosując syntetyzer DNA Becki-naria 200A i technikę imidofosforynową, postępując według instrukcji dostawcy.

Prowadzono wzrost E. coliY 1090 przez dobę na pożywce LB (Sambrooki wsp , 1989) zawierającej 0,2% maltozy i 10 mM MgSO4. Następnie 0,4 ml hodowli zmieszano z rozcieńczonym podstawowym bankiem faga i absorbowano przez 20 minut w temperaturze 37°ć Zakażoną hodowlę zmieszano z 6 ml miękkiej agarozy (0,75% agarozy w pożywce LB z dodatkiem 10 mM MgSO4). Tę mieszaninę z miękką agarozą wylano do dziesięciu płytek LA o średnicy 150 mm. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 godzin, po czym przez dobę utrzymywano w temperaturze 4°C. Ostatecznie, płytki zawierały około 4x10⁵ łysinek.

Do immobilizacji łysinek, każdą płytkę pokrywano na dwie minuty filtrami do skriningu łysinę w koloniach, NEN DuPont Colony/Plaque Screen (DuPont, Wilmington, DE). Filtry płukano 2 razy po 2 minuty w 0,5 M roztworze NaOH, 2 razy po 2 minuty w Tris HC1 (pH=7.5) i pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu. Filtry te stosowano w następnych doświadczeniach hybrydyzacji. Filtry wstępnie hybrydyzowano w roztworze o składzie 10% siarczan dekstranu, 1 M NaCl, 1% roztwór SDS zawierający 100 mg/ml denaturowanej spermy śledzia (Sigma, St. Louis, MO) w czasie 5 godzin w temperaturze 65°ć Sondę, SYM 3067, znakowano [Ż-³²P] dATP stosując T4 kinazę {iolinukleotydową(Promega. Madison, WI) i dodawano do mieszaniny prehybrydyzacyjnej. Hybrydyzację prowadzono w czasie 12-18 godzin w temperaturze 42°ć

Po hybrydyzacji filtry przemywano cztery razy po 5 minut w 2xSSC w temperaturze pokojowej, 2 razy po 30 w 2xSSC, 1 % SDS w temperaturze 42°C i w końcu w 0,1 SSć w temperatu_rze pokojowej w czasie 30 minut. Następnie filtry poddawano αutorudiografii na filmach d_o pro_mieni X (Hyperfilm-MP, Amersham, W. Brytania). W pierwszym skriningu zidentyfikowano 14 łysinek pozytywnych. Te pozytywne łysinki powtórnie przesiewano stosując tę samą s_ondę i oprsane powyżej sposoby. Po procedurze powtórnego skriningu zidentyfikowano dwie pozytyw_ne łysinki. Te dwie pozytywne łysinki oczyszczono jeszcze raz i oznaczono rozmiary insertów _{w re}akcji PCR, stosując SYM 1600 i SYM 1601 jako primery i izolowane fagi jak matryc_e. Użyte dwa primery były komplementarne odpowiednio do lewego i prawego ramienia faga λ gt 11. Amplifikowany fragment DNA o wielkości 0,9 kb, generowany z faga A 6.2 2 trawi_{ono e}nzymem EcoRI i klonowano do trawionego EcoRI plazmidu pUć19 (Pharmacia, Ups_ala, S_zwecj_a), pS496. Ten sklonowany fragment poddano analizie sekwencji stosując primery sekwencji ko_mplementarne do pUć19. Sekwencję nukleotydowąoznaozano w zestawie T7 do sekwenoJonow_Unia (Pharmacia, Upsala, Szwecja albo USB, CleY-ekand. Ohio).

Po translacji otrzymanej sekwencji DNA uzyskano sekwencję aminokwasową hom_ol_ogiczną do oznaczonej doświadczalnie sekwencji białka. Jednak sekwencja ta nie zawierała kod_onu początku translacji. W celu wyizolowania cDNA o pełnej długości, otrzymany fragment DNA rozdzielono na żelu agarozowym i użyto jako sondę, prowadząc hybrydyzację w warunkach ścisłych. Sondę tę znakowano ₃ ²P w wieloprimerowym układzie znakowania DNA (Amersham, W. Brytania) w następującej procedurze. Dodano wodę w stosunku 3 ml na gram żelu i umieszczono we wrzącej łaźni wodnej na 7 minut dla upłynnienia żelu i /.denaturowania DNA. Następnie probówkę przeniesiono do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na co najmniej 10 minut. Objętość roztworu DNA/agaroza zawierającą około 25 ng DNA dodano do reakcji znakowania, zgodnie z instrukcjami dostawcy.

178 589

Dla otrzymania cDNA o pełnej długości, powtarzano dwa razy skrining banku cDNA z tą sondą, stosując te same metody, jakie opisano opisano powyżej, z tym, że hybrydyzację prowadzono w warunkach ścisłych, w temperaturze 65°C. W wyniku doświadczeń zidentyfikowano i wyizolowano 45 indywidualnych pozytywnych łysinek, które początkowo przesiewano metodą reakcji PCR, stosując SYM 1600.

(5'-GTG GCG ACG ACT CCT GGA GCC-3'; SEQ ID Nr: 5) albo SYM 1601 (5'-ACA CCA Gac CAA CTG GTA ATG-3') (SEQ ID Nr: 6) w kombinacji z SYM 3208 jako primery PCR do identyfikacji łysinek zawierających całą 5' -otwartą ramę odczytu. Zaprojektowano SYM 3208, 5' TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3', (SEQ ID Nr: 7), która jest przynajmniej częściowo komplementarna do części 5' cDNA SCCE, opierając się na informacji o sekwencji DNA uzyskanej z pS496. Po tym skriningu wyselekcjonowano 4 fagi do dalszej analizy Do analizy sekwencji klonowano do pUC19 otrzymane amplifikowane fragmenty PCR pochodzące z tych fagów w sposób opisany powyżej. Otrzymane wyniki wskazują, że jeden z tych fagów,

205.2.1, zawierał insert o pełnej długości.

Wypreparowano DNA z izolatu 205.2.1 postępując w sposób podany przez Sambrook'a i wsp. (1989) i ten preparat DNA trawiono EcoRI. Trawiony DNA rozdzielano metodą elektroforezy na żelu agarozowym, po czym wyizolowano fragment o wielkości około 1 kilozasady i klonowano go do pUC19 uprzednio trawionego przez EcoRI. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pS500 (fig. 15). Całkowitą sekwencję nukleotydową tego fragmentu cDNA oznaczono w sposób podany powyżej. Jako primery do reakcji sekwencjonowania użyto specyficzne oligonukleotydy komplementarne do pUC19 albo sekwencje SCCE. Ta sekwencja nukleotydową (SEQ ID Nr: 1) zawierała otwartą ramę odczytu wystarczającą do zakodowania całej sekwencji aminokwasowej prekursorowego białka SCCE, składającego się z 253 aminokwsów łącznie z peptydem sygnałowym i prepolipeptydem (SEQ ID Nr: 2).

Okazało się, że inny fag, oznaczony symbolem 106.1.2. zawiera sekwencję cDNA SCCE, w której brakuje 5'- nie podlegającej translacji sekwencji i pierwszych trzech kodonów. Ten insert wyizolowano jako fragment EcoRI o długości 954 pary zasad i sklonowano go do linearyzowanego restryktazą EcoRI plazmidu pUC19, otrzymując plazmid pS498. Ten plazmid częściowo sekwencjonowano

Trzeci fag, oznaczony symbolem 108.1.2., zawiera sekwencję cDNA SCCE, w której również brakuje 5'- nie podlegającej translacji sekwencji i siedmiu nukleotydów z regionu podlegającego translacji. Ten insert cDNA posiadał dłuższy wariant nie podlegającego translacji regionu 3', rozciągający się od 1057 pary zasad w dół od kodonu stopu. Ten fragment EcoRI o długości 1884 par zasad izolowano i klonowano do lineatyzowanego EcoRI plazmidu pUCl 9. Otrzymany plazmid całkowicie sekwencjcncwano. Oznaczono go symbolem pS501.

Przykład VII. Detekcja mRNA SCCE w ludzkim naskórku.

Preparowanie całkowitego RNA z ludzkiego naskórka.

Proces prowadzono według Chomczyńskiego i Sacchi (1987). Zdrową ludzka skórę brzucha otrzymano z chirurgii plastycznej. Bezpośrednio po usunięciu, schłodzono ją na lodzie W czasie poniżej 15 minut odzyskiwano naskórek przez zeskrobanie skalpelem, zanurzenie w roztworze D (Chomczyński i Sacchi, 1987) i homogenizacje w homogenizatorze szklanym. Następnie postępowano według przepisu podanego przez Chomczyńskiego i Sacchi. Całkowity RNA w formie peletki przechowywano w temperaturze -20°C w 70% etanolu do dalszej analizy.

Preparowanie informacyjnego RNA

Próbkę 500 pg całkowitego RNA naskórka poddano obróbce w zestawie Poly A Tract-kit (Promega) postępując według instrukcji dostawcy.

Elektroforeza i hybrydyzacja RNA

Ż_el_e agarozowe (1,4%) preparowano 0,66 M formaldehydem w buforze 1xMOPS i bromku etidium w stężeniu 0,6 g/ml (Sigma, St. Louis, MO). Próbkę mRNA odpowiadającą 100 pg cułtowPego RNA rozpuszczono w buforze do próbek RNA (50% formamid, 2.2 M formaldehyd,

3% Fic^l, 1xMOPS) i przed stosowaniem utrzymywano w temperaturze 60°C przez 5 minut. Podob_nie traktowano markery RNA (BRL, Gaithersburg, MD). Po elektroforezie, żele moczono w

178 589 wodzie destylowanej przez 5 minut, następnie w 50 mM NaOH przez 30 minut i w 0,1M Tris HC1 (pH=7.5) przez 30 minut. Przenoszenie na filtry GeoeScreeo Plus (NEN, DuPont, Wilmiogtoo, DE) prowadzono w aparaturze Vacu-Gene (Pharmacia, Upsala, Szwecja) w czasie godziny w 10xSSC. Następnie filtry płukano w 3xSCC, suszono przez dobę i utrzymywano w piecu o temperaturze 80°C przez 2 godzmy. RNA na filtrach wizualizowano w świetle UV.

Sondy cDNA.

Plazmid pS501 otrzymany w przykładzie VI trawiono enzymami HiocII i Bg1II. Ten cDNA zawiera jedno miejsce HincII przy 1060 parze zasad i jedno miejsce Bg1ll przy 1715 parze zasad. Ten fragment o długości 1070 par zasad (miejsce HincII w wielokrotnym miejscu klonowania pUC19 - endogenne miejsce HiocII) zawiera region kodujący SCCE za wyjątkiem 7 par zasad na końcu 5' i region nie podlegający translacji łącznie z miejscem poIiadeoylacji przy 944-951 parze zasad, co jest wspólne dla wszystkich wyizolowanych cDNA SCCE. Fragment HincII - Bg1ll o długości 655 par zasad, nie zawierający ogona poli-A jest unikalny dla cDNA

108.1.2 SCCA. Fragmenty te oczyszczono metodą elektroforezy w żelu agarozowym i użyto do przygotowania sond znakowanych ³²P dCTP w zestawie do znakowania DNA, Multiprime (Amersham, Buckmghamshire, W. Brytania).

Hybrydyzacja.

Filtry gotowano przez 30 minut w 1% SDS w buforze 1xTe i wstępnie hybrydyzowano w czasie 3 godzin w temperaturze 60°C w roztworze o składzie: 1%SDS, 1MNaCl, 10% siarczanu dekstranu, DNA spermy śledzia w ilości 0,1 mg/ml. Hybrydyzację prowadzono w tym samym roztworze, w temperaturze 60°C przez dobę. Przemywania prowadzono 2x30 minut w temperaturze 60°C w 1% SDS w 2xSCC i 3 godziny w 0,lxSCC w temperaturze pokojowej. Następnie filtry poddawano autoradiografii.

Wyniki:

Udało się wykazać (fig. 16) obecność w ludzkim naskórku dwóch rodzajów mRNA o wielkości odpowiednio około 1.2 kilozasad i 2.0 kilozasad Jest to zgodne z dowodami uzyskanymi z doświadczeń z klonowaniem, w których wykryto dwa typy cDNA.

Przykład VIII. Ekspresja rekombioaotowego SCCE w E. coli.

Konstruowanie plazmidów pGEX-2T/SCCE.

1. Sensowne primern PCR.

1.a.. CGTGGATCCATCGAAGGTCGTArDATTGATGGCGGCCęATGT (SYM 3367; SEQ ID Nr: 8). Podkreślona jest część 3' kodująca N-terminalne aminokwasy IIDGAPC aktywnego natywnego SCCE, część 5' z miejscem BamHI i dodatkowa sekwencja kodująca miejsce czynnika Xa, IEGR.

1. b. CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; SEQ ID Nr: 9). Podkreślona jest część 3' odpowiadająca parom zasad 76-96 w całkowitej sekwencji cDNA SCCE, kodująca sekwencję aminokwasowąLETAGEE, część 5'jak w sekwencji la

2. Anjynenjowne pnnmfy PCR.

TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3371); komplementarny do par zasad 285-304 w całkowitej sekwencji cDNA SCCE, SEQ ID NR: 1, z miejscem SacI przy 294 parze zasad.

Sekwencję pS498 (przykład VI) amplifikowano w reakcji PCR, stosując primem 1a/2 i 1b/2. Otrzymane produkty oczyszczono przez ekstrakcję fenolem i precypitacje etanolem, trawiono enzymami BamHI/SacI i oczyszczano metodą elektroforezy w żelu agarozowym Następnie klonowano je w komórkach TG2 do pGEX-2T (Pharmacia) trawionego enzymami BamHI/EcoRI razem z fragmentem 3' 673 par zasad SCCE 106.1.2 otrzymanym przez trawienie pS498 enzymem SacI i EcoRI. Z bakteryjnych klonów użytych do badań ekspresji wyizolowano plazmidy (pS510 kodujący natywny N-koniec za miejscem dla czynnika Xa i pS511, kodujący proponowany propeptyd za miejscem dla czynnika Xa), po czym sekwencje nukleotydowe odpowiadające insertom pochodzącym z produktów PCR sprawdzano metodą zakańczania łańcucha didezoksy, stosując zestaw T7 do sekweocjooowaoia (Pharmacia, Upsala, Szwecja).

178 589

Badania ekspresji.

Dobowe hodowle komórek TG 2 z plazmidami pS510 i pS511w pożywce LB zawierającej 50 pg/ml karbenicyliny (Sigma, St. Louis, MO) rozcieńczono dziesięciokrotnie w. świeżej pożywce i prowadzono wzrost przez 3 godziny w temperaturze 37°C Dodano IPTG (Sigma, St. Louis, MO) do końcowego stężenia 0,1 mM i prowadzono wzrost hodowli w temperaturze 37°C przez dodatkowe 3 godziny. Peletki bakterii sonifikowano w PBS z dodatkiem 1% odczynnika Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Po wirowaniu z prędkością 10.000xg w czasie 15 minut, supernatanty i peletki analizowano metodą SDS-PAGE i następnie prowadzono immunoblotting z poliklonalną antysurowicą kurczaka SCCE-swoistą.

Duże ilości białek indukowanych IPTG o oznaczonej masie cząsteczkowej około 50 kD (pS510) i 52 kD (pS511) z SCCE-podobną immunoreaktywnością oznaczono w peletkach nierozpuszczalnych w roztworze PBS-Tnton X-100 (fig. 17).

Supernatanty po sonifikacji w PBS-Triton X-100 zawierały białka fuzyjne GST/SCCE o tej samej wielkości jak w nierozpuszczalnych peletkach, ale ilości były małe w porównaniu do nierozpuszczalnych peletek.

Powyższe wyniki wskazują, że jest możliwa ekspresja SCCE w postaci białka fuzyjnego z GST, a sekwencje odpowiadające miejscu rozszczepiania specyficznąproteaząw sekwencji aminokwasowej pre-pro-SCCE umożliwi powtórzenie doświadczenia w celu wytwarzania rekombinantowego SCCE w bakteriach. Wytworzone białko można solubilizować w moczniku albo w chlorowodorku guanidyny i następnie je oczyszczać metodąkationo-wymiennej chromatografii, wykorzystując wysoki punkt izoelektryczny SCCE. Oczyszczone białko można renaturować metodą dializy wobec buforów z niskim stężeniem środka denaturującego i następnie rozszczepiać czynnikiem Xa uwalniając polipeptyd GST z SCCE albo pro-SCCE. Białka fuzyjne GST/SCCE mogą być również użyte jako immunogeny do produkcji przeciwciał SCCE-swoistych oraz jako immunosorbenty do oczyszczania przeciwciał.

Przykład IX. Ekspresja rekombinantowego ludzkiego SCCE w komórkach ssaczych.

W celu przygotowania wektora ekspresyjnego do wytworzenia rekombinantowego SCCE, wyizolowano ludzkie sekwencje cDNA z plazmidu pS500 w postaci fragmentu EcoRi/Dral o długości 897 pas zasad. Ten fragment subklonowano do uprzednio trawionego EcoRI i Smal plazmidu pUC19, otrzymując pS502. Plazmid pS502 trawiono następnie enzymami EcoRI i Sall izolując sekwencje cDNA SCCE jako fragment o wielkości 0.9 kilozasad, który znów sybkłonowano do wariantu plazmidu pUC19, który nie zawiera miejsca HindIII, otrzymując plazmid pS503. Ten wanant pUC19 otrzymano przez trawienie pUC 19 przez HindIII; uzupełnienie fragmentem Klenowa i powtórną ligację. Dla ułatwienia klonowania do wektora¹ ekspresyjnego, do końca 5' cDNA SCCE wprowadzono miejsce HindIII. Dokonano tego przez trawienie pS503 enzymem EcoRi i insercję linkera, który przekształca to miejsce na HindIII, czyli SYM 3603:

S'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3' (SEQ ID Nr 10). Otrzymany plazmid, zawierający część kodującą białko z cDNA dla SCCE z miejscem HmdIII na końcu 5' i miejsce Sali na końcu 3' oznaczono symbolem pS505.

Końcowy wektor ekspresyjny otrzymano przez ligację trzech różnych fragmentów DNA Po pierwsze, pS505 trawiono enzymami HindIII i Sa1I i wyizolowano fragment o wielkości 0.9 kilozasad.

Po drugie, dla uzyskania elementu regulacyjnego górnej, dystalnej części mysiej metalotioneiny, sekwencji bydlęcego papillomawirusa, fragmentu genomowego beta-globiny królika dostarczającego sygnały przetwarzania mRNA i sekwencje plazmidowe, pML2d, dla umożliwienia selekcji i replikacji w E. coli (Waldenstrom i wsp., 1992), trawiono wektor pS147 enzymami SacI ,i Sal1 i izolowano fragment o długości około 12 kilozasad.

Po trzecie, w celu wyizolowania bliższej części promotora mysiej metalotioneiny trawiono plazmid pS42, w którym natywne miejsce BgllI usytuowane w sekwencji liderowej przekształcono na miejsce HindIII, enzymami SacI i HindIII i izolowano fragment o wielkości około

220 par zasad.

178 589

Ligacja tych trzech fragmentów dała w wyniku wektor do ekspresji SCCE, pS507 (fig. 18). Ten wektor ekspresyjny pS507 wprowadzano ketodąko-lraksfekcji z wektorem zawierającym gen oporności na neomycynę przenoszonym przez 5' długie końcowe powtórzenie wirusa mięsaka i z sygnałami poliadenylacji z SV40 (Lusky i Botchan, 1984) do mysich komórek C127 (ATCC CRL 1616). Próby transfekcji prowadzono metodąpreeypitacji fosforanem wapnia (Graham i Vander Eb, 1973). Komórki hodowano w pożywce Eagle'go modyfikowanej przez Ham'a, F12/Dulbecco (DMEM; Gibco BRL, Gaitersburg, MD) (1:1) wzbogaconej 10% płodową surowicą bydlęcą (HyClone, Logan, UT). Klony komórek neomycyno-oporne selekcjonowano na pożywce z dodatkiem 1.5 mg/ml G418 (Gibco BRL) i po 10-15 dniach selekcji, na płytkach macierzystych identyfikowano i izolowano oporne klony komórek i pasażowano je do następnej analizy.

W celu zanalizowania ekspresji rekombmα4towτch genów SCCE, wypreparowano całkowity RNA z izolowanych linii komórkowych. Ten całkowity RNA otrzymano z komórek C1271 rozdzielono go na żelu agarozowym z dodatkiem 1% formaldehydu, przeniesiono go na filtry nitrocelulozowe i hybrydyzowano z sondą “P znaczonego SCCE Sondę stanowił fragment HincII cDNA dla SCCE o długości 1070 par zasad izolowany przez trawienie pS500 enzymem HincII i elektroforezę w żelu agarozowym. Doświadczenia prowadzono w sposób opisany przez Ausbel'a i wsp. (1992). Próby hybrydyzacji według Northema i hybrydyzacja ze znakowanym ³²P cDNA dla SCCE wykazały, że mRNA dla rekombrnantowego SCCE był wykrywalny w kilku liniach komórkowych posiadających wektor SCCE, pS507. Nie stwierdzano hybrydyzacji w próbkach kontrolnych pochodzących z lirni komórkowych C127 zawierających identyczny wektor za wyjątkiem cDNA dla SCCE (fig. 19). Wielkość 1 4 kilozasady odpowiada spodziewanej wielkości.

Próbki ko4dycJO4owanej pożywki hodowli komórkowej zbierano i analizowano metodą immu4oblottingu. Elektroforezę SDS-PAGE prowadzono metodą Laemlli'ego (1970). Do immunoblottmgu użyto antysurowieę kurczęcia przeciw natywnemu SCCE jako przeciwciało wykrywające. Do znakowania enzymu użyto znakowanej alkaliczną fosfatazą IgG anty-kurczcciej (St Louis, MO). Wyniki są przedstawione na fig. 20.

W celu analizy ekspresji rekombinantowego SCCE, z komórek C127 transfekowanych wektorem ekspresyjnym pS507 wypreparowano całkowity RNA. Do przygotowania próbek kontrolnych wypreoparowano całkowity RNA z 4ietra4sfekowa4τch komórek C127 i z komórek C127 transfekowanych wektorem ekspresyjnym pS 147 Wektor pS 147 jest podobny do wektora pS507 z tą różnicą, że zamiast cDNA dla ludzkiego SCCE zawiera cDNA dla ludzkiej lipazy stymulowanej solami żółciowymi (Nilsson i wsp., 1990). RNA preparowano sposobem podanym przez Ausubel'a i wsp., (1992). Próby hybrydyzacji techini^iąNorthern a i hybrydyzacja ze znaczonym 32P-cDNA dla SCCE wykazały, że w komórkach C127 zawężających wektor pS507 z sekweiKyąda SCCE jest wykrywalny rekombi4a4towτ mRNA SCCE o wielkości około 1.4 kilozasady (fig. 19). Nie wykryto hybrydyzacji w próbkach kontrolnych pochodzących z lmii komórkowych C127 zawierających pS147 ani z lmii melrα4sfekowa4τeh komórek C127. Długość rekombinantowego mRNA SCCE była zgodna z oczekiwaniem

Próbki ko4dτcjonowa4ej pożywki hodowli komórkowej zbierano i analizowano metodą elektroforezy SDS-PAGE i immu4oblottingu. Plamy hybrydyzacyjne rozwijano w sposób opisany przez Blake'go i wsp. (1984). Uzyskane wyniki wskazują (fig. 20), że komórki C127 zawierające pS507 .wytwarzają trzy białka wykazujące reakcję ze wszystkimi dostępnymi przeciwciałami poliklo4al4τma królika i kurczaka przeciw SCCE oraz z przeciwciałami monoklonal4τmi anty-SCCE otrzymanymi w przykładzie V. Te rekombi4a4towe, reaktywne jako SCCE białka wykazują oznaczoną masę cząsteczkową o około 1 kDa wyższąod masy oczyszczonego natywnego ludzkiego SCCE. To rekokbma4lowe białko nie wykazuje jakiejkolwiek aktywności proteolitycznej. Przez porównanie wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej SCCE z eksperymentalnie oznaczonym końcem aminowym natywnego ludzkiego SCCE i z sekwencjami innych proteaz chymotrypsτ4o-podobnτeh można wnioskować, ze ten rekombina4Iowt SCCE wytwarzany w komórkach C127 występuje w formie proenzymu. Dane z analizy sekwencji wskazują, że ten proenzym może być aktywowany przez proteolityczne rozszczepie40

178 589 nie w miejscu C-terminalnej lizyny w sekwencji· ...AOGDKIIDGAP. . Część podkreślona oznacza sekwencję końca aminowego aktywnego, natywnego ludzkiego enzymu SCCE (SEQ ID Nr: 2, aa 5 - aa 6).

Przykład X. Oczyszczanie i charakteryzacja rekombinantowego SCCE

Oczyszczanie.

Ilość 1.3 mg monoklonalnego przeciwciała TE4b przeciw natywnemu SCCE sprzęgano z

1.5 ml aktywowanej przez CNBr żywicy Sepharose (Pharmacia-LKB Biotech., Upsala, Szwecja) postępując według instrukcji producenta. Próbkę 40 ml pożywki zawierającej SCCE filtrowano przez filtr 0.45 pm i podawano na kolumnę. Kolumnę przemywano kilka razy roztworem o składzie: 10 mM fosforan sodu, 150 mMNaCl (pH=7.2) i następnie eluowano roztworem 0,1 M chlorowodorku glicyny (pH=2.5). Eluowane białko natychmiast zobojętniano przez dodanie 0,1 objętości 1M Tris HC1 (pH=8).

Aktywowanie

Rekombinantowy SCCE (46 pg w 200 pl) oczyszczony z użyciem żelu ze sprzęgniętym przeciwciałem monoklonalnym (opisanym powyżej) trawiono ilością4 6 pl roztworu trypsyny ostężeniu0.1 mg/ml (stosunek mas: 10:1) w temperaturze 37°C. W czasach 20 minut, 1 godzina, 3 godziny i 20 godzin pobierano próbki po 50 pl i w celu zakończenia reakcji dodawano (4-amidynofenylo)metanosulfonyl (APMSF; Boehringer Mannheim, Niemcy) w ilości 5 pl 10 mM roztworu. Aktywność rozszczepionego SCCE analizowano metodą nieredukcyjnej elektroforezy SDS-PAGE na żelach kazeinowych, w sposób opisany w przykładzie 2.2. Identyczność otrzymanych rozszczepionych form SCCE oznaczano metodą elektroforezy SDS-PAGE prowadzonej w warunkach redukujących i następnego immunoblottingu stosując antysurowicę kurczaka przeciw natywnemu SCCE i następnie IgG przeciw kurczęcią znakowaną alkaliczną fosfatazą oraz błękit nitro-tetrazobowy i fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilowy jako substrat dla alkalicznej fosfatazy.

Sekwencjonowanie N-terminalne.

Oczyszczony metodą chromatografii powinowactwa (w sposób opisany powyżej) SCCE w ilości 35 pg plamowano rowkowo w zestawie Bio-Dot SF (Bio-Rad, Richmond, CA) na filtrze Immobilon (Millipore, Bedford, MA). Następnie filtr przemywano kilka razy wodą destylowaną w celu usunięcia całego Tris i glicyny. Wycinano część filtru, gdzie było związane białko i sekwencjonowano je w aparacie do sekwencjonowania pulsacyjnego w fazie ciekłej, Applied Biosystems 477A (Foster City, CA) z analizatorem on-line PTH 120A. Sekwencjonowanie prowadzono w programach cykli regularnych i stosując odczynniki dostarczone przez producenta. Jako pierwsze sześć pozycji otrzymano sekwencję glu-glu-ala-gln-gly-asp odpowiadającą aminokwasom -7 - -2 w sekwencji SEQ ID Nr: 2. Na podstawie powyższych wyników można wnioskować, że peptyd sygnalny składa się z 22 aminokwasów i opiera się na N-terminalnej sekwencji aminokwasowej natywnego aktywnego SCCE, pro-peptyd składa się z siedmiu aminokwasów.

Degl ikozylacja.

Oczyszczony rekombinantowy SCCE (5 pg) i natywny SCCE (20 pg) gotowano przez 3 minuty w 20 pl roztworu 0,5% SDS i 0.1M β-merkaptoetanolu. Próbki rozcieńczono buforem fosforanu sodu (pH=8.6) i odczynnikiem Nonidet P-40 do uzyskania końcowych stężeń odpowiednio 0.2 Mi 1.25%. Dodano N-glukozydazę (N-Glycosidase FR; Boehringer Mannheim) w ilości 0.6 jednostki dla białka rekombinantowego i 1.2 jednostki dla białka natywnego enzymu, po czym inkubowano mieszaninę reakcyjną przez dobę w temperaturze 37°C. Końcowe stężenie SDS w badanej próbce wynosiło 0.17%. SCCE traktowany N-glukozydaząanalizowano metodą elektroforezy SDS-PAGE w żelach 8-18% i następnie opisaną powyżej metodą immunoblottingu. Otrzymane wyniki wykazują zmniejszenie oznaczonej masy cząsteczkowej dwu górnych pasm, podczas gdy oznaczona masa cząsteczkowa najniższego pasmaj est niezmieniona (fig. 23) Świadczy to o tym, że rekombinantowy SCCE wytwarzany w komórkach C127 występuje w dwu formach N-zglikozylowanych i w jednej formie niezglikozylowanej. Ten wyniki jest analogiczny z tym, jaki się obserwuje dla aktywnej formy natywnego SCCE (fig. 23).

178 589

Przykład XI. Kompozycje zawierające SCCE.

Kompozycje te można wytwarzać zgodnie ze znanymi technikami farmaceutycznymi obejmującymi dokładne mieszanie związków aktywnych z substancjami pomocniczymi. Wartości podane w procentach oznaczają procenty wagowe.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje zawierające więcej niż jeden związek aktywny. Następujące przykłady kompozycji są tak zaprojektowane, że mogą również zawierać więcej niż jedną substancję aktywną. Podobnie, termin „SCCE” można zastąpić terminem „pro-SCCE”. Kompozycje zawierające SCCE orazpro-SCCE sąrównież objęte zakresem wynalazku.

SCCE = natywny lub rekombinantowy enzym chymotrypsynowy warstwy rogowej, ewentualnie w kombinacji z innymi związkami aktywnymi

q.s. = quantum satis (do określonej ilości)

Krem olej w wodzie %

SCCE 0.01-20

Polisorbate 80 0 5

Wosk emulgujący 5

Olej mineralny 4

Dimeticon 1

Stearynian gliceryny 6

Środek antyutlemający q.s.

EDTA 0.1

Środek konserwujący q.s.

Gliceryna 85% 4

Glikol propylenowy 7

Środek regulujący wartość pH 0.01-10

Woda 65-76

Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, układy emulgujące (proporcja między fazą olejową a fazą wodną i zawartość środków emulgujących i innych stosowanych dodatków).

Krem woda w oleju SCCE

Alkohol cetylowy Lanolina Wazelina biała Olej mineralny Środek antyutleniający EDTA 1

Środek regulujący wartość pH Środek konserwuący Woda %

0.01-20

0.5

q.^s.

0.01-10

q.s.

15-25

Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, układy emulgujące (proporcja między faząolejowąa fazą wodną i zawartość środków emulgujących i mnych stosownych dodatków).

Maść %

SCCE 0.01-20

Lanolina 15

Wazelina 58-68

Olej mineralny 15

Dimeticon 2

Środek antyutleniający q.s.

Przykłady czynników zmiennych: antyntleniacze.

Mazidło %

SCCE 0.01-20

Wosk emulgujący 4

178 589

Stearynian gliceryny 3

Olej mineralny	15
Polysorbate 80	0.6
Gliceryna 85%	3
Glikol propylenowy	5
Środek antyutleniający	q.s.
EDTA	0.1
Środek konserwujący	q.s.
Woda	59-69
Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, układy
emulgujące (proporcja między fazą olejową a	fazą wodną i zawartość środków emulgujących i in-
nych stosownych dodatków).
Żel	%
SCCE	0.01-20
Trójetanolcamina	1-5
Alkohol etylowy	10
Alkohol cetylowy	10
Guma celulozowa	5
EDTA	0.1
Środek konserwujący	q.^s.
Woda	59-74
Przykłady czynników zmiennych: środki żelujące, antyutleniacze, środki chelatujące, kon-
serwujące.
Roztwór wodny	%
SCCE	0.01-20
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Alkohol cetylowy	4
Glikol propylenowy	5
Środek konserwujący	q.s.
Środek antyutleniający	q.s.
EDTA	0 1
Woda	37-98
Przykłady czynników zmiennych, antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, środ-
ki natłuszczające, środki zwilżające.
Roztwór w alkoholu etylowym	%
SCCE	0.01-20
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Glikol propylenowy	5
Alkohol cetylowy	3
Środek antyutleniający	q.s.
EDTA	0 1
Alkohol etylowy	50-95
Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, środki chelatujące, środki zwilżające.
Zawiesina	%
SCCE	0.01-20
Karbomer	05
Guma celulozowa	0.5
Polysorbate 80	0.1
Glikol propylenowy	5
Kwas askorbinowy	0.05
Alkohol cetylowy	4

178 589

Polysorbate	q.s.
EDTA	0.1
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Woda	72-80
Przykłady czynników zmiennych: antyutleniaoze, środki chelatujące, środki konserwujące,
środki zawieszające.
Pasta	%
SCćE	0.01-20
Wazelina	45-55
Tlenek cynku	40
Olej mineralny	5
Środek antyutleniający	q.^s.
Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, podstawy pastowe.
Laseczka	%
SCćE	0.01-20
„Cutina LM”	70-80
Alkohol mirystylowy	5
Olej rycynowy	2
Wosk pszczeli biały	10
Wazelina biała	3
Środek antyntleniający	q.s.
Przykłady czynników zmiennych: untyutleniaoze, podstawy laseczkowe.
Spray rozpylany ręcznie	%
SCćE	0.01-20
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Alkohol etylowy	30
Gliceryna 85%	5
Glikol propylenowy	5
Alkohol cetylowy	3
Środek ant/utleniający	q.^s.
EDTA	0.1
Środek konserwujący	q.s.
Woda	22-57
Przykłady czynników zmiennych: artyutleniacze. środki chelatujące, konserwujące, natłusz-
czające, nawilżające.
Roztwór sprafu w aerozolu	%
SCCE	0.01-20
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Mirystyniun izopropylowy	30
Glikol propylenowy	5
Alkohol etylowy	48-92
Środek rozpylający	q.s.
Przykłady czynników zmiennych: środki natłuszczające, nawilżające.
Spray - forma aerozolowa	%
SććE	0.01-20
Wosk	3
Alkohol etylowy	50-55
Środek antyutleniający	q.s.
EDTA	0.1
Woda	20-35
Środek rozpylający	qs.

Przykłady czynników zmiennych: środki rozpylające, antyutleniacze, środki chelatujące.

178 589

Spray - emulsja aerozolowa	%
SCCE	0.01-20
Pochodne celulozy	1-3
Tween^R 60	1.0
Stearynian glicerolu	2.5
Sorbinian potasu	0.2
Środek antyutleniający	q.s.
EDTA	0.1
Środek konserwujący	q.s.
Środek regulujący wartość pH	0.01-10
Woda	50-95
Środek rozpylający	q.s.

Przykłady czynników zmiennych: antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, układy emulgujące (proporcja między faząoleiowaa faząwodnąi zawartość środków emulgujących i innych stosownych dodatków).

Szampon %

SCCE 0.01-20

Laurylosiarczan sodowy 40

Alkohol cetylowy 3

Środek spieniający lub kondycjonujący 3

Chlorek sodu 2

Środek antyutleniający q.s.

EDTA 0.1

Środek konserwujący q.s

Woda 43-53

Przykłady czynników zmiennych: podstawy szamponów, antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, zwilżające, kondycjonujące.

Szampon do kąpeli %

SCCE 0.01-20

Laurylosiarczan sodowy 40

Alkohol cetylowy 4

Środek spieniający lub kondycjonujący 3

Środek perlący 10

Środek konserwujący q.s.

Środek antyutleniający q s.

EDTA 0.1

Woda 40-50

Przykłady czynników zmiennych: podstawy szamponów, antyutleniacze, środki chelatujące, konserwujące, dodatki, środki kondycjonujące.

Mydło lecznicze %

SCCE 0.01-20 kwas 11 -hydroksyetylo-1,1 -difosforowy 0.2

Gliceryna 0.8

Mydło sodowe z oleju kokosowego i sadła 88-98

Dodatki 0.7

Przykłady czynników zmiennych: środki zwilżające, podstawy mydeł. Puder %

SCCE 0.01-20

Talk 65-70

Kaolin 6

Dwutlenek tytanu 2

Węglan wapnia 8

178 589

Stearynian magnezowy 3

Skrobia kukurydziana albo owsiana 5-10

Przykłady czynników zmiennych: podsatwy pudrów, środki konserwujące, wzajemne proporcje składników.

Środek kondycjonujący do włosów %

SCCE	0.01-20
Alkohol cetylowy	2.2
Chlorek alkilotrójmetyloamoniowy	1.25
Oktylododekanol	1
Kwas cytrynowy	1
EDTA	0 1
Środek konserwujący	q.s.
Środek antyutleniający	q.^s.
Woda	do 100

Przykłady czynników zmiennych: środki kondycjonujące, środki konserwujące, chelatujące, antyutleniacze.

W podobny sposób można wytwarzać kompozycje do stosowania miejscowego, zawierającego związek zdolny do hamowania lub wzmacniania aktywności SCCE.

Przykład XII. Aktywność rekombinantowego SCCE w kierunku trawienia desmosomów.

Korneocyty, zawierające nienaruszone desmosomy usunięto ze skóry przez taśmowe ścieranie w kierunku głębszych warstw warstwy rogowej i odłączano łuski działaniem heksanem i suszono w oddzielnych próbkach. Ilości korneocytów po 3 mg ekstrahowano 1 M roztworem chlorku sodu w temperaturze 4°C w celu rozpuszczenia znajdujących się w nich proteaz, a następnie wyczerpująco przemywano buforem inkubacyjnym 0,1 M Tris HC1 (pH=8) w celu usunięcia endogennej aktywności proteolitycznej występującej w tych preparatach. Inkubacje prowadzono w 0,1 M Tris HC1 (pH-8) z dodatkiem lub bez dodatku 10 pg rekombinantowego SCCE w czasie 24 godzin w temperaturze 37°C. Dowód na trawienie desmosomów przez enzym uzyskano przez pomiar poziomów białka będącego markerem desmosomu, desmogleiny I (DG I). Izolowano jąz łusek przez ekstrakcję w buforze 8 M mocznika, 2% SDS i β-merkaptoetanolu i następne oczyszczanie glikoproteiny DG I metodą chromatografii powinowactwa z użyciem konkanawaliny A. Eluat konkanawaliny A frakcjonowano metodą SDS-PAGE i przenoszono elektroforetycznie na filtr PDVF do immunoblottingu. DG I identyfikowano z użyciem swoistej antysurowicy i wykrywano stosując wzmocnioną chemiluminescencję. Wyniki są przedstawione w tabeli 4.

Tabela 4

	Kontrola	+rSCCE 10 pg
DG I (jednostki przyjęte dowolnie/mg łusek)	7950 ±4992	4059 ±2360

Wyniki prezentowane w tabeli 4 wskazują, że rekombinantowy SCCE ma zdolność rozkładania wewnątrzkomórkowych struktur kohezyjnych w warstwie rogowej w próbie in vitro.

Przykład XIII. Wpływ inhibitorów na aktywność rekombinantowego SCCE.

Badano wpływ inhibitorów: aprotyniny, chymostatyny i siarczanu cynku na aktywność hydrolizowania S-2586 przez rekombinantowy SCCE (rSCCE). Doświadczenie prowadzono w sposó opisany w przykładzie 3.2. Wyniki są przedstawione w tabeli 5.

178 589

Tabela 5

Inhibitor	Stężenie (pM)	Aktywność (%)
Aprotynina	0	100
	0 35	51 6
	1 4	21.2
	5 7	74
Chymostatyna	0	100
	0.64	74.9
	2 56	33
	41	1 9
ZnSO₄	0	100
	15 6	50.7
	62 5	19.4
	250	5 1

Jak to jest wykazane w tabeli 5, aprotynina, chymostatyna i jony cynku hamują aktywność hydrclizowama substratu S-2586 przez rekombinantowy enzym SCCE w podobny sposób jak enzymu natywnego.

PIŚMIENNICTWO

- Ausubel et al. (1992) Current protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons

- Blake et al. (1984). Anal Biochem 136:175-179

- Carlsson et al. (1985). Molec Immun 22:1073-1080

- Caughey et al. (1991). J Biol Chem 26642956-12963

- Chomczyński and Sacchi (1987). Anal Biochem 162456-159

- Egelrud and Lundstrom (1990). J Invest Dermatol 95:456-459

- Egelrud and Lundstrom (1991) Arch Derm Res 283:108-112

- Egelrud (1992). Eur J Dermatol 2:50-55

- Gorbsky et al. (1985). Proc Natl Acad Sci USA 82 810-814

- Graham and Van der Eb (1973). Virology 52.456-467

- Hogan, B. Constantini, F and Lacy, E (1986) Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manuał. Cold Spring Harbor Press

- Horie et al. (1984). Comp Biochem Physiol 77B:349-354

- Laemmli (1970). Nature 227:680-685

- Lee et al. (1987). Anal Biochem 166:308-312

- Lowry et al. (1951). J Biol Chem 193·265-275

- Lundstrom and Egelrud (1988) J Invest Dermatol 91.340-343

- Lundstrom and Egelrud (1990 a). Arch Derm Res 282:243-237

- Lundstrom and Egelrud (1990 b). J Invest Dermatol 94:216-220

- Lundstrom and Egelrud (1991). Acta Derm Venereol (Stockh) 71 471-474

- Lusky and Botchan (1984). Cell 36:391-401

- Matsudaira P (1987). J Biol Chem 262:10035-10038

- Mizutani et al. (1991). J Clin Invest 874066-1071

- Nilsson et al. (1990). Eur J Biochem 192:543-550

- Norris (1990) J Invest Dermatol 95:371

- Salvesen et al. (1987). Biochemistry 26.2289-2293

- Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning, A Laborahiry Manual.

2nd ed. Cold Spring Harbor

- Schechter et al. (1983). J Biol Chem 258:2973-2978

178 589

- Schechter et al. (1989). J Biol Chem 264:21308-21315

- Schwartz et al. (1987). J Immunol 138:2611-2615

- Takahashi et al. (1987). J Soc Cosmet Chem 38:21-28

- Toulta et al. (1989). BBRC 158:569-575

- Towbin et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354

- Waldenstrom et al. (1992). Gene 120:175-181

- Wintroub et al. (1986). J Clin Invest 77:196-201

- WO 93/04172 (filed by Sτmbicok Aktiebolag on 19 August 1992)

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGiŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: SYMBICOM AB (B) ULICA: PO BOX 1451 (C) MIASTO: UMEA (E) KRAJ: SZWECJA (f) KOD POCZTOWY (ZIP): S-901 24 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Rekombma4towτ enzym chomotryptynowy warstwy rogowej (SCCE) (ni ILOŚĆ SEKWENCJI· 10 (v) FORMA KOMPUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Releasa # 1.0, wersja # 1.25 (EPO) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr. 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 986 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ORYGINALNE ŻRÓDO.

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ. cDNA (B) LOKALIZACJA: 25 .... 786 (ix) CECHY SEKWENCJI:

(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd signalny (B) LOKAIZACJA: 25 .... 90 (ix) CECHY SEKWENCJI.

(A) NAZWA/KLUCZ: peptyd skojarzony (B) LOKAIZACJA: 112 ... 783 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 1

178 589

GAATTCCGCG GATTTCCGGG CTCC ATG GCA AGA TCC CTT CTC CTG CCC Cro 51

Mec Ala Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu -29 -25

CAG ATC CTA CTG CTA	TCC TTA GCC TTG GAA ACT GCA GGA GAA GAA GCC	99
Gln -20	Ile Leu	Leu	Leu	Ser -15	Leu Ala Leu	Glu Thr Ala Gly Glu Glu Ala
-10	-5
CAG	GGT GAC	AAG	ATT	ATT	GAT GGC GCC	CCA TGT	GCA AGA GGC TCC CAC	117
Gln	Gly Asp	Lys	Ile 1	Ile	Asp Gly Ala 5	Pro Cys	Ala Arg Gly Ser His 10
CCA	TGG CAG	GTG	GCC	CTG	CTC AGT GGC	AAT CAG	CTC CAC TGC GGA GCG	195
Pro	Trp Gln 15	Val	Ala	Leu	Leu Ser Gly 0 0	Asn Gln	Leu His Cys Gly Gly 25
GTC	CTG GTC	AAT	GAG	CGC	TGG GTG CTC	ACT GCC	GCC CAC TGC AAG ATG	297
Val	Leu Val 30	Asn	Glu	Arg	Trp Val Leu 33	Thr Ala	Ala His Cys Lys Met 40
AAT	GAG TAC	ACC	GTG	CAC	CTG GGC AGT	GAT ACG	CTG GGC GAC AGG AGA	295
Asn 45	Glu Tyr	Thr	Val	His 55	Leu Gly Ser	Asp Thr 55	Leu Gly Asp Arg Arg 60
GCT	CAG AGG	ATC	AAG	GCC	TCG AAG TCA	TTC CGC	CAC CCC GGC TAC TCC	339
Ala	Gln Arg	Ile	Lys 65	Ala	Ser Lys Ser	Phe Arg 70	His Pro Gly Tyr Ser 77
ACA	CAG ACC	CAT	GTT	AAT	GAC CTC ATG	CTC GTG	AAG CTC AAT AGC CAG	387
Thr	Gln Thr	His 80	Val	Asn	Asp Leu Met 88	Leu Val	Lys Leu Asn Ser Gln 90
GCC	AGG CTG	TCA	TCC	ATG	GTG AAG AAA	GTC AGG	CTG CCC TCC CGC TGC	435
Ala	Arg Leu 95	Ser	Ser	Met	Val Lys Lys 100	Val Arg	Leu Pro Ser Arg Cys 110
GAA	CCC CCT	GGA	ACC	ACC	TGT ACT GTC	TCC GGC	TGG GGC ACT ACC ACG	483
Glu	Pro Pro 110	Gly	Thr	Thr	Cys Thr Val 115	Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr 120
AGC	CCA GAT	GTG	ACC	TTT	CCC TCT GAC	CTC ATG	TGC GTG GAT GTC AAG	531
Ser 125	Pro Asp	Val	Thr	Phe 130	Pro Ser Asp	Leu Met US	Cys Val Asp Val Lys 140
CTC	ATC TCC	CCC	CAG	GAC	TGC ACG AAG	GTT TAC	AAG GAC TTA CTG GAA	579
Leu	Ile Ser	Pro	Gln 145	Asp	Cys Thr Lys	Val Tyr 150	Lys Asp Leu Leu Glu 1S5
AAT	TCC ATG	CTG	TGC	GCT	GGC ATC CCC	GAC TCC	AAG AAA AAC GCC TGC	627
Asn	Ser Met	Leu 160	Cys	Ala	Gly Ile Pro 165	Asp Ser	Lys Lys Asn Ala Cys 170
AAT	GGT GAC	TCA	GGG	GGA	CCG TTG GTG	TGC AGA	GGT ACC CTG CAA GGT	675
Asn	Gly Asp 175	Ser	Gly	Gly	Pro Leu Val 88 0	Cys Arg	Gly Thr Leu Gin Gly 115

178 589

CTG GTG TCC TGG GGA ACT TTC CCT TGC GGC CAA CCC AAT GAC CCA GGA 723

Leu Val Ser Trp Gly Thr Phe Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly

190 195 200

GTC TAC ACT CAA GTG TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATA AAT GAC ACC ATG 771

Val Tyr Thr Gln Val Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met

205 210 215 220

AAA AAG CAT CGC TAACGCCACA CTGAGTTAAT TAACTGTGTG CTTCCAACAG 823

Lys Lys His Arg

225

AAAATGCACA GGAGTGAGGA CGCCGATGAC CTATGAAGTC AAATTTGACT TTACCTTTCC 883

TCAAAGATAT ATTTAAACCT CATGCCCTGT TGATAAACCA ATCAAATTGG TAAAGACCTA 943

AAACCAAAAC AAATAAAGAA ACACAAAACC CTCAACGGAA TTC 986 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI SEQ ID Nr: 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DLUGOSC: 253 aminokwasów (B) TYP: aminokwas

	(D) TOPOLOGIA: liniowa	Nr:	2
(ii) TYP	CZĄSTECZK1 : 1 : SEKWENCJ 1 :' .	b i alko
(x	i ) OPIS	SEQ	ID
Met -29	Ala	Arg Ser	Leu Leu Leu Pro -25	Leu	Gln -20	Ile	Leu Leu Leu Ser Leu -15
Ala	Leu	Glu Thr -10	Ala Gly Glu Glu	Ala -5	Gln	Gly Asp Lys Ile Ile Asp 1
Gly	Ala 5	Pro Cys	Ala Arg Gly Ser 10	His	Pro	Trp	Gln Val Ala Leu Leu 15
Ser 20	Gly	Asn Gln	Leu His Cys Gly Gly 25	Val	Leu 30	Val Asn Glu Arg Trp 35
Val	Leu	Thr Ala	Ala His Cys Lys 40	Met	Asn 45	Glu	Tyr Thr Val His Leu 50
Gly	Ser	Asp Thr 55	Leu Gly Asp Arg	Arg 60	Ala	Gln	Arg Ile Lys Ala Ser 65
Lys	Ser	Phe Arg 70	His Pro Gly Tyr 75	Ser	Thr	Gln	Thr His Val Asn Asp 80
Leu	Met 85	Leu Val	Lys Leu Asn Ser 90	Gln	Ala	Arg	Leu Ser Ser Met Val 95
Lys 100	Lys	Val Arg	Leu Pro Ser Arg 105	Cys	Glu	Pro 110	Pro Gly Thr Thr Cys 115

178 589

Thr

Val

Ser

Gly

Trp 120

Gly

Thr

Ser 125

Pro

Asp

val

Thr

Phe 130

Pro

Ser

Asp

Leu

Mec 135

Cys

Val

Asp

Val

Lys 140

Leu

Ile

Ser

Pro

Gln 145

Asp

Cys

Thr

Lys

Val 150

Tyr

Lys

Asp

Leu

Leu 155

Glu

Asn

Ser

Met

Leu 160

Cys

Ala

Gly

Ile

Pro 165

Asp

Ser

Lys

Asn 170

Ala

Cys

Asn

Gly

Asp 175

Ser

Gly

Pro

Leu 180

Val

Cys

Arg

Gly

Thr 185

Leu

Gln

Gly

Leu

Val 190

Ser

Trp

Gly

Thr

Phe 195

Pro

Cys

Gly

Gln

Pro 200

Asn

Asp

Pro

Gly

Val 205

Tyr

Thr

Gln

Val

Cys 210

Lys

Phe

Thr

Lys

Trp

Ile

Asn

Asp

Thr

Met

Lys

His

Arg

215 220 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-terminalny (vi) ORYGINALNE ZRODLO:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 3

Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Cys Gly Ser Xaa Pro Xaa Gln Val 15 10 15

Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DLUGOSC: 1T par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA

178 589 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 4 ATHATHGAYG GNGćNCC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 5 GTGGćGACGA ćTććTGGAGC C (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NIćI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 6 AćAććAGACC AAćTGGTAAT G (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (ć) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 7 TGGGTGGGAG CCTćTTGćAC A (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (ć) ILOŚĆ NICI· jedna (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: seq id Ni 8

CGTGGATćCA TCGAAGGTćG TATTATTGAT GGCGććCCAT GT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 9 ćGTGGATCCA TćGAAGGTćG TTTGGAAAćT GCAGGAGAAG AA

178 589 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID Nr: 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI^- (A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGlA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10

178 589

CN

Uwolnione komórki (pg białka/mm

godziny

178 589

Gęstość względna

178 589

Gęstość względna

kOa

178 589

Fig. 8C

Fig. 8A

Fig. 8B

178 589 ktywność (%) ’ Aktywność (%)

Fig. 9C

178 589

1000

Numer frakcji l MCI J (C*3) li IS i Igoi

Fig. 11A Fig. 11B

178 589

D

Λ ύ

I DGAPCACGS

P? QVA L L S GNQL

Fig. 13

Fig. 14A Fig. 14B Fig. 14C

178 589

Fig. 15

178 589

Fig. 17Α

. .5 - 19(¾ χί??

178 589

Xhoł

178 589

2 3 4 5

178 589

Fig. 21A

Fig. 21B

178 589

Fig. 22

Fig. 23

178 589

0.5'mrn /

Oh

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd o sekwencj i aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID Nr: 2 albo analog lub wariant tej sekwencji wykazujący aktywność enzymu chymotryptynowego warstwy rogowej skóry (SCCE).

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID Nr: 1.

3. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, zawierający sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd posiadający fragment sekwencji aminokwasowej przedstawioną na SEQ ID Nr: 2.

4. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, zawierający sekwencję nukleotydowąkodującąpolipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową od pozycji 7 do pozycji 224 albo od pozycji 1 do pozycji 224 sekwencji SEQ ID Nr: 2.

5. Izolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID Nr: 1 lub jej analog bądź jej fragment, która to sekwencja nukleotydową:

1) posiada homologię z sekwencją przedstawioną na SEQ ID Nr: 1 w stosunku co najmniej 90% i/lub
2) koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa wykazuje co najmniej 80% homologię z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NR· 2, i/lub
3) koduje polipeptyd, który wiąże się z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez linię komórkową hybrydoma TE4b, zdeponowaną zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego w dniu 18 czerwca 1993 roku w Kolekcji ECACC pod tymczasowym numerem depozytowym ECACC 93061817 albo z przeciwciałem monoklonalnym wytwarzanym przez linię komórkową hybrydoma TE9b, zdeponowali ąw dniu 18 czerwca 1993 roku w Kolekcji ECACC pod tymczasowym numerem depozytowym ECACC 93061816, i/lub
4) koduje polipeptyd, wiążący się z poliklonalnąantysurowicąotrzymanąprzeciw natywnemu SCCE, który został oczyszczony z ekstraktu zdysocjowanych komórek warstwy rogowej podeszwy.

6. Zdolny do replikacji wektor ekspresyjny oznaczony symbolem pS507, zdeponowany w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8282, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego.

7. Plazmid oznaczony symbolem pS500, zdeponowany w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8281, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego

8. Komórka ssaka transformowana zdolnym do replikacji wektorem ekspresyjnym oznaczonym symbolem pS507, zdeponowanym w dniu 11 maja 1993 w Kolekcji „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DSM) pod numerem akcesyjnym DSM 8282, zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego.

9. Zasadniczo czysty polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID NR: 2 albo jej analog lub wariant, wykazujący aktywność SCCE

10. Zasadniczo czysty polipeptyd według zastrz. 9, posiadający sekwencję aminokwasową od pozycji 7 do pozycji 224 albo od pozycji 1 do pozycji 224 w sekwencji SEQ ID Nr· 2!.

11. Zasadniczo czysty polipeptyd według zastrz. 9, posiadający sekwencję aminokwasową, w której nieprzerwany łańcuch 20 aminokwasów jest homologiczny przynajmniej w 80% z łańcuchem aminokwasów o tej samej długości wybranym z sekwencji aminokwasowej na SEQ ID Nr: 2.

178 589

12. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób skóry zawierająca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd posiadający aktywność enzymu chymotryptynowego warstwy rogowej skóry (SCCE) o sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr: 2 albo jej analog lub wariant wykazujący aktywność SCCE, w ilości od 0,001 do 25% wagowych (%w) całej kompozycji.

13. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chorób skóry zawierająca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik według zastrz. 12, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera zasadniczo czysty polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasowąod pozycji 7 do pozycji 224 albo od pozycji 1 do pozycji 224 w sekwencji SEQIDNr: 2, w ilości od 0,001 do 25% wagowych (%w) całej kompozycji.

* * *