UA45314C2 - Фрагмент днк, що кодує поліпептид, який володіє активністю хімотрипсинового ензиму рогівкового шару (scce), поліпептид, що володіє активністю scce, фрагмент днк, експресуюча система (варіанти), вектор експресії, що експресується, плазміда, спосіб одержання поліпептиду, що володіє активністю scce - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується поліпептиду, що має активність хімотрипсинового ензиму рогівкового шару (SCCE), нуклеотидних послідовностей, що кодують такі поліпептиди, векторів експресії, плазмід, способів одержання названого поліпептиду.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному полипептиду и к нуклеотидной последовательности, 2 кодирующей полипептид, к системе зкспрессии, способной зкспрессировать зтот полипептид, а также к фармацевтическим и косметическим композициям, содержащим зтот полипептид, и Кк использованию полипептида для различньїх косметических или терапевтических целей.

Краткое описание изобретения

Кожа, как орган, представляет интерес с биологической, медицинской и косметической точек зрения. 70 Существуєт множество кожньіх заболеваний, которнє являются либо органо-специфическими, как например, псориаз и зкземьі, либо проявлениями таких общих заболеваний, как общие аллергические реакции. Тот факт, что существует коже-специфические заболевания, можно рассматривать, как доказательство существования молекулярньїх механизмов, которье уникальньії для кожи. Аналогично, исследования коже-специфических молекулярньїх процессов имеют важное значение для понимания и лечения кожньїх заболеваний. По-видимому, 712 разумно предположить, что некоторье из зтих процессов, так или иначе, связаньь с найболее специализированньми функциями кожи, то есть, с созданием физико-химического барьера между организмом и внешним окружением. Физико-химический кожньїй барьер локализован в самом верхнем слое кожи, роговичном слое (5ігаїт согпецт).

Роговичньій слой является найболее специализированной структурой кожи. Он является конечньім продуктом процессов дифференциации зпидермиса, то есть, расслоенной чешуйчатьм зпителием, которьй представляет самую верхнюю часть кожи. Большинство клеток зпидермиса состоит из кератиноцитов в различньїх стадиях дифференциации. Наиболее глубоко расположеннье кератиноцить!, базальнье клетки, находятся на базальной гембране в контакте с дермой /собственно кожей/, которая представляет соединительную ткань кожи, и являются единственньми кератиноцитами, обладающими способностью к с 22 делению. Часть базальньх клеток непрерьшвно покидаєт базальную мембрану и претерпеваєт процесс Го) дифференциации, в результате которого клетки становятся строительньми блоками роговичного слоя. В зтом процессе кератиноцить! претерпевают ряд адаптационньїх изменений. Происходит увеличение содержания цитоскелета, состоящего из зпидермис-специфических цитокератинов. Промежуточнье нити соприкасающихся клеток соединень! с функциональньмми фрагментами за счет возрастающего количества десмосом. Наиболее М 30 резкие изменения происходят при переходе от самого верхнего слоя живьїх клеток, зігайшт дгапиййвит, к «-- мертвому роговичному слою, зігаїшт согпецт, в процессе, которьіїй обьічно носит название кератинизация.

Ковалентне связаннье протеиньі расположеньі близко к внутренней части плазменной мембрань, образуя о очень устойчивую клеточную оболочку. Кроме того, богатое липидами вещество, образующееся в органеллах (|У кератиноцит-специфических клеток, секретируется во внеклеточное пространство, и, образуя липиднье 35 пластинки, которне окружают клетки роговичного слоя, составляет барьер, проницаемьй для гидрофильньсх М веществ. И наконец, все межклеточнье структурьі, за исключением плотно упакованньїх цитокератиновьіх нитей, исчезают.

Клетки вігайшт согпецт корнеоцитьі, являются, таким образом, мертвьмми клетками. Зто означаєт, что « регуляция различньїх процессов в роговичном слое должна бьіть результатом "программирования" на той З 70 стадии, когда кератиноцить! все еще являются живьми клетками. Превращения зпидермиса, которне обьічно с протекают в течение примерно четьірех недель, причем клетки являются частью роговичного слоя примерно в з» течение двух недель, завершаются отпадением клеток с поверхности кожи в процессе шелушения /десквамации/. Зтот процесс является примером "программирования" роговичного слоя. Необходимьм условием для функционирования роговичного слоя в качестве физико-химического барьера, является 45 требованиє того, чтобь! отдельнье его клетки удерживались вместе за счет механически устойчивьх структур, е то есть десмосом. Деградация десмосом, которая необходима для десквамации, должна регулироваться таким сл образом, чтобьї обеспечить такое шелушение с поверхности кожи, которое уравновешивалось бьі образованием нового роговичного слоя, без нарушения барьерньїх функций ткани. о Нарушения кератинизации -к 70 В основе большого числа патологических состояний кожи различной степени тяжести лежит нарушение процесса кератинизации. При псориазе наблюдается, помимо типичного хронического воспаления, избьіточное

Т» продуцирование незрельх клеток роговичного слоя, что приводит к типичному для зтого заболевания шелушению. Существует группа врожденньх заболеваний кожи, которье характеризуются утолщением роговичного слоя7 что приводит к обраованию "рьібьей чешуи так назьшваемого ихтиоза. У некоторьх индивидуумов, страдающих ихтиозом, наблюдаєтся пониженная скорость десквамации. Хотя и менеє серьезноє

ГФ) нежели ихтиоз, заболевание "сухая кожа" /ксеродерма/ также характеризуется роговичньмм слоем, с которого отшелушиваются корнеоцить, не так, как в обьічньїх условиях, в виде отдельньїх клеток или мелких агрегатов о клеток, но в виде крупньїх, макроскопических чешуек; зто заболевание весьма обьчно для старческого возраста, а также среди атонических индивидуумов с пониженной устойчивостью к кожньімм поражениям и 60 склонностью к развитию характерньхх форм зндогенной зкземь. В случае акне заболеваний наблюдается нарушенная кератинизация в протоках сальньїх желез, что приводит к образованию комедонов в закупорке желез. Образование комедонов прогрессирует и как считают, приводит к образованию воспалительньмх угревьсх язвочек. Протеолетические знзимь! участвуют в кератинизации

Существует несколько стадий в процессе кератинизации и во время превращений роговичного слоя, где бо протеолитическиє знзимь, по-видимому, играют важную роль. Естественно, исчезновениє всех внутриклеточньїх структур, за исключением цитокератиновьїх нитей, наблюдающееся в процессе перехода от живьіїх до ороговевших зпидермальньх слоев должно включать протеолиз. Превращение профилаггрина в филаггрин, протейин, которьй, как считают, функционирует в специальном типе аггрегаций нитей цитокератина в процессе кератинизации, может катализироваться специфической протеиназой. В роговичном слое филаггрин далее разлагается до низкомолекулярньх компонентов, которье, вероятно, важнь как "природнье увлажнители". Кроме того, существуют протеолитические модификации цитокератиновьїх полипептидов в процессе кератинизации. МИ наконец, протеолитические акть, по-видимому, играют решающую роль в деградации межклеточньїх когезивньїх структур в роговичном слое в процессах, которье обьічно приводят к /о десквамации.

Когезия и десквамация клеток роговичного слоя /вігашт согпейт/

Роль десмосом

Межклеточная когезия в роговичном слое, также как и в живьїх частях зпидермиса, в значительной степени осуществляется за счет десмосом. Десмосома состоит из двух симметричньїх половинок, каждая из которьїх 7/5 образована двумя соприкасающимися клетками. Каждая половинка десмосомь! имеет одну внутриклеточную часть, связанную с нитями цитокератина, и одну часть, состоящую из гликопротеинов, закрепленньх внутриклеточно и с трансмембранной и внеклеточной частями. Внеклеточнье части зтих протеинов, десмоглеиньі, представляют собой адгезионнье молекуль), и за счет их взаймодействия друг с другом во внеклеточном пространстве образуется когезивная структура. Деградация десмосом, по-видимому, протекает го несколько другими путями в роговичном слое ладоней и подойив /стоп/ по сравнению с роговичньім слоем не относящимся к ладоням-подошвам. В последних тканях около 8595 десмосом исчезаєт вскоре после того, как клетки становятся полностью ороговевшими. Оставшиеся десмосомь!, которье расположень, предпочтительно, на ворсинчатьїх краях чрезвьмчайно уплощенньїх клеток, по-видимому, остаются интактньми вплоть до того уровня, где происходит десквамация. В роговичном слое, которьій не относится к ладоням и подошвам, с Корнеоцить! гораздо менее уплощень), и не происходит деградации десмосом в более глубоких слоях ткани. В обоих типах тканей десквамация связана с деградацией десмосом. В случає ихтиозной кожи, также каки в і) случае "сухой кожи" число десмосом в поверхностньїх слоях роговичного слоя, как бьіло показано, повьішается.

Межклеточньсе липидь роговичного слоя.

Различия в деградации десмосом относящихся к ладоням и подошвам роговичньїх слоев и не относящихся к «Е зо ним, могут бьть связаньі с различньми количествами внеклеточньїх липидов в зтих двух типах тканей.

Содержание липидов значительно вьіше в роговичньїх слоях не относящихся к ладоням-подошвам. В - результате зффективность зтой ткани в качестве барьера, проницаемого для водьі и других гидрофильньх со веществ, гораздо вьіше проницаемости роговичного слоя ладоней и стоп. Так как десмосомь! занимают значительньій обьем, и так как йинтактнье десмосомь! предотвращают расширение межклеточного о з5 пространства, именно деградация десмосом может бьть тем механизмом, за счет которого большее «г внеклеточное пространство становится доступньмм для липидов. Внеклеточнье липидь роговичного слоя связаньії с десквамацией также и некоторьіми другими путями. Так как они составляют основную часть внеклеточного пространства, можно ожидать, что они оказьівают значительное влияние на активность знзимов, которье действуют в зтом месте, например, знзимов, ответственньїх за деградацию десмосомт Действительно, « 0 различнье нарушения метаболизма липидов, как бьіло показано, по-видимому, вьізьівают некоторье типь в с ихтиоза. По-видимому, также, сами липидь! в некоторой степени вносят вклад в клеточную когезию роговичного слоя. Более того, секреция липидов в межклеточное пространство роговичного слоя, по-видимому, связана с ;» секрецией также и ряда знзимов. Предшественники липидов хранятся в верхних живьїх кератиноцитах в специфических органеллах. Зти так назьваемье ламелларнье /пластинчатье/ тела, как бьло показано, содержат ряд гидролитических знзимов. Таким образом предполагаєтся, что знзим, ответственньй за ї5» деградацию десмосом в роговичном слое, синтезируется, возможно в неактивной про-форме, кератиноцитами, хранится в ламелларньїх телах, и секретируется в межклеточное пространство роговичного слоя в процессе о кератинизации, где он может бьіть активирован, и его активность далее регулируется, наряду с другими оо факторами, составом внеклеточньїх липидов.

Нарушений клеточной когезии в жизнеспособном зпидермисе - Существует ряд кожньх заболеваний, при которьїх нарушается когезия между кератиноцитами в ї» неороговевших жизнеспособньх зпидермальньх слоях. Зти заболевания характеризуются феноменом, именуемьм акантолизом, то есть разрушением десмосомньх контактов между кератиноцитами, которье в остальньїх проявлениях кажутся нормальньми. Зтот процесс, по-видимому, осуществляется за счет протеиназ, в Которне до сих пор не бьіли идентифицировань. Акантолиз, в своих острьїх формах, приводит к образованию волдьірей, и является характеристикой автоиммунньїх заболеваний ретрпідиз маЇдагіз и ретрпідиз оїіасецв

Ф) наследственного доброкачественного їатіїйаг ретрпідиз /болезнь НауїІеу-Науїеу5/ и наследственного /болезнь ка Оагієг в/.

Зпидермис принимает активное участие в иммунологических и воспалительньїх реакциях 60 В дополненийи к своим функциям в качестве создателя физико-химического барьера между внутренностями организма и внешней средой, зпидермис также функционирует в качестве активного иммунологического барьера. Кератиноцитьї обладают способностью продуцировать, а также реагировать на большое число цитокинов и других медиаторов воспалений, за счет которьїх они коммутируют и взаимодействуют с клетками иммунологической и воспалительной систем. Зто имеет огромное значение при защите хозяина от микробной 65 Мнфекции и в заживлений ран. Современнье исследования показали таюке, что кератиноцить, по-видимому, принимают активное участие во многих воспалительньїх кожньїх заболеваниях, таких, как псориаз и зкземь!.

Зпидермальньсе протеиназь! могут играть важную роль в воспалительньїх процессах

Одним из цитокинов, продуцируемьїх кератиноцитами , является интерлейкин 1 / ії -1/, їЇ -1 существует в двух формах, ії -1о; 6 ЇЇ -1/Д, оричем обе они присутствуют в зпидермисе. Если іЇ -1у, оосле синтеза является полностью активньм, ії -1/3 синтезируеєется в виде Неактивной З1кД п роформь!. Про- іЇ -1/3 превращаеєтся в активную 17кД форму за счет специфической протеиназьі, присутствующей например, в моноцитах, но до сих пор не обнаруженной в нормальном зпидермисе. Ряд сериновьїх протейназ со специфичностью к химотрипсин-подобному субстрату /химотрипсин поджелудочной железьі и катепсин С-нейтрофильньмх гранулоцитов/ может , однако, служить в качестве активаторов про- іЇ -1/Д.

Как предложил Норрис /Моїтіз, 1990/, протеолитические знзимьі, присутствующие в межклеточном пространстве роговичного слоя могут в определенньїх условиях оказаться способньіми превращать неактивнье формь! цитокинов в активньіе формь!. Особьйй интерес в зтом контексте представляет биологически неактивньй про-интерлейкин-1/Д , которьйй, как бьіло показано, продуцируется кератиноцитами /Мігцщапіева!), 1991/. До сих пор не бьло обнаружено знзимов осо способностью превращать про-интерлейкин-1/р в активньй 75 интерлейкиу-1/р . Однако, так как химотрипсин и катепсин 0- /химотрипсино-подобньій знзим/ облада/ст способностью катализировать превращение неактивного ЗікД рекомбинантного про-итерлейкина-1/д в полностью активную 17кД форму, возможно, что и зпидермальнье химотрипсин-подобнье знзимь! могут катализировать зто превращение.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к знзиму, которьій бьіл назван химотрипсиновьм знзимом вігаєт согпет/роговичного слоя//ЗССЕ/, которьій рассматриваєтся как знзим, ответственньій за деградацию десмосом в роговичном слое. Доказательство, представленное в примере!1, демонстрирует, что отшелушивание клеток с поверхности ороговевших поверхностньїх слоев кожи включает деградацию протеийнов десмосом, и что ответственньїм за зто знзимом, по-видимому, является химотрипсино-подобная сериновая протеиназа, которую с 29 можно ингибировать йонами цинка. г)

В примере2 описьівается открьтие химотрипсинового знзима вігайшт согпешт /5ССЕ/ протеиназь, которая удовлетворяет критериям ответственности за деградацию внутриклеточньїх когезивньїх структур в роговичном слое ин витро, и возможно также ин виво. ПримерЗ3 описьівает частичную характеризацию активности химотрипсинового знзима зігаїйит согпешт /5ССЕ/ с помощью хромогенньх субстратов. -

Полученнье результатьь демонстрируют, что ЗССЕ отличаєтся знзимологически от остальньх «- химотрипсиновьїх протеиназ. Характер ингибирования и способность разлагать два различньїх субстрата трипсиноподобньїх знзимов существенно отличается для ЗССЕ по сравнению с бьічьим химотрипсином и Ше катепсином ОС-человека. По-видимому, ЗССЕ также отличается от химазь! тучньїх клеток человека. Последний ю знзим катализирует деградацию Зис-АІа-АІа-Рго-Рпе-рпа зффективно /см. Зспулагіг еї аІ.,1987, и Зспеспіег еї

Зо а1., 1989/ - чего не делаєт ЗССЕ - и не ингибируется апротинином ЗВТ.) /Зспеснцег еї аї., 1983 и УМіпігоцрЬ еї « а!., 1986/, тогда как ЗССЕ ингибируется.

В примере4 описана частичная очистка ЗССЕ из КС! зестрактов корнеоцитов с помощью афинной хроматографии на несолюбилизированном ингибиторе трипсина сои /5ЗВТО)/ и определение п-терминальной « аминокислотной последовательности 5ССЕ. Для невосстановленньх образцов бьли получень! хорошие вьходь на стадиях 1-6, но снизились до 0 на стадиях 7 и 9, и вьїходьї на последующих стадиях бьіли заметно в с снижень!. Для восстаноленньїх образцов на стадиях 7 и 9 не детектировались производнье аминокислот, но на » последующих стадиях, на которьїх детектировались производнье, сильного падения вьїходов не наблюдалось.

Зти результатьї дают возможность предположить, что в положениях 7 и 9 существуют цистеиньі. Однако, не представилось возможности определить карбоксиметилированньюи цистейн на стадиях 7 и 9 после восстановительной обработки иодоуксусной кислотой /100мМ/. Полученная последовательность /рис. 13, т- послед. іЮ Мо3/ била идентична как для восстановленного так и для невосстановленного образцов. «сл Примеро оописьвает получение ЗССЕ-специфических моноклональньїх антител и поликлональньмх

ЗССЕ-специфических антител цьмпленка и кролика, а также иммуногистохимические исследования с о моноклональньми антителами. -к 70 Примерб описьівает клонирование и секвенирование КДНК, кодирующей ЗССЕ человека. Вначале, кДдНК библиотеку, полученную из мРНК, полученной из зпидермальньх кератиноцитов взрослого человека, ї» скринируют анти-ЗССЕ кроличьими поликлональньми антителами. Одно из зтих антител дает вьісокий фоновьй сигнал, и его исключают из интенсивньїх исследований за счет скринирования на ранней стадии.

Мспользуя другое поликлональное антитело /Д-5/, ряд иммунореактивньїх бляшек обогащают как 22 превосхищающие истинно положительнье бляшки. Не наблюдалось реакционноспособности с

ГФ) моноклональньми антителами моАо 4 и моАБ 9, ни для одной бляшки. Интенсивная характеристика рестрикционньїх знзимов и характеризация РСЯ одиннадцати вьіделенньїх бляшек не вьіявила никакого о сходства между различньмми бляшками. На оснований невозможноспр получить "отпечатки пальцев" вероятной

КДНК последовательности БССЕ стратегию пришлось модифицировать. 60 Несмотря на предпочтительное детектированиге ЗССЕ иммунореактивного материала в супрабазальньх кератиноцитах, для скринирования КДНК ЗССЕ использовали кДНК библиотеку, полученную из культивируемьсмх кератиноцитов человека. Можно ожидать, что такая библиотека должна содержать кКДНК только из базальньх кератиноцитов. Зта попьітка бьла основана на наблюдениийи слабого, но, вероятно, значительного иммуноокрашивания с использованием ЗССЕ моноклональньх антител также из базальньїх кератиноцитов. бо Бляшки бьіли скринированьій с использованием синтетического 17-мерного олигонуклеотидного зонда,

сконструированного на оснований найболее надежной части аминокислотной последовательности,

МПе-Пе-Арз-СІу-АІа-Рго /последовательность ІО Мої10 аа 1-аа 6/ зкспериментально определенной аминотерминальной последовательности нативного ЗССЕ ознзима, как описано в примере 4. з-за Неопределенности внутри зкспериментально определенной аминокислотной последовательности, зтот гексапептид, как считают, представляет одну из найболее надежньїх частей. Кроме того, возможнье кодонь, кодирующие зтот гексапептид, приводят к наименьшей из возможньїх дегенерации ДНК зонда. Более длинная зкспериментально определенная последовательность СіІп-МаІ-АІа- І ецш-І еи-Зег-Сіу-Авп-Сіп о /(-ї ец

Іпоследовательность іО Мо3З, аа 15-да 24/ бьла исключена из-за вьісокКой степени дегенерации 7/0 последовательности, кодирующей зту пептидную последовательность. Четьірнадцать позитивньїх бляшек бьіли идентифицированьі при первичном скринирований. Зти позитивнье бляшки бьіли снова скринировань! с использованием тех же зонда и метода, которье бьіли описаньій ранее. После процедурь! повторного скринирования бьіли идентифицировань! две позитивнье бляшки. Зти две отобраннье бляшки бьіли еще раз очищень, а размер вставок бьіл определен с помощью РСК с использованием ЗУМ1600 и 5УМ1601, которье /5 оказались комплементарнь двум плечам фага, в качестве праймеров, и вьіделенньїх фагов в качестве матриц:.

Зтот клонированньій фрагмент бьіл подвергнут частичному анализу последовательности.

Трансляция полученной ДНК последовательности привела к аминокислотной последовательности, которая бьла гомологична зкспериментально определенной протеийновой последовательности. ОДнако, в зтой последователоности не бьло трансляционного стартового кодона. Для вьіделения полной длиньі кДНК, го полученньй ДНК фрагмент вьделили на агарозном геле и использовали в качестве зонда, обеспечив гибридизацию в жестких условиях. Для получения полной длиньії кКДНК, библиотеку кКДНК рескринировали дваждь! с помощью зтого зонда, используя те же методь, которье бьіли описань! ранее, за исключением того, что гибридизацию вели в жестких условиях при 65"С. Зти зксперименть! привели к идентификации и вьіделению 45 отдельньїх позитивньїх бляшек, которье бьіли вначале скринированьй в РСК. анализе с использованием с ов З'М1600 или ЗУМ1601 в сочетаний с ЗУМ3208 в качестве РСК праймеров для идентификации бляшек, содержащих полную 5 открьїтую считьівающую рамку. і)

После дальнейшего скринирования и секвенирования полученнье РСК амплифицированнье фрагменть, полученнье из зтих фагов бьли клонировань), как бьіло подробно описано в примере б, и полученнье результать! указьівают, что один из фагов 205.2.1, содержит полной длинь! вставку. Бніла определена полная «г зо нуклеотидная последовательность КДНК фрагмента. Нуклеотидная последовательность /последовательность

ШО Мо1/ содержит открьтую считьшвающую рамку, достаточную для кодирования полной аминокислотной - последовательности протеина ЗССЕ предшественника, состоящего из 253 аминокислот, включая сигнальньй с пептид и преполипептид /последовательность іЮ Мо2/,.

Пример7 описьівает определение в зпидермисе человека двух ЗССЕ мРНК-видов, которье способнь о гибридизоваться с кКДНК Зондами, полученньіми на базе ЗССЕ кДНК последовательности. «Е

Пример8 описьівает зкспрессию рекомбинантного ЗССЕ в Е.соїї. Полученньій результат показьіваєт, что представляется возможность продуцировать рекомбинантньійй ЗССЕ в бактериях.

Примеро описьівает зкспрессию рекомбинантного ЗССЕ человека в клетки млекопитающих. Получают три протеина, которне демонстрируют реакцию со всеми жизнеспособньмми поликлональньмми антителами ЗССЕ « 70 Кролика и цьіпленка, также как и с депонированньіми моноклональньми антителами. Рекомбинантнье протеинь, 2-3) с которье реакционноспособньі по оотношению ок антителам, вьработанньм против нативного ЗССЕ, демонстрируют кажущийся молекулярньй вес, которьій примерно на ї1кД больше чем у нативного очищенного ;» ЗССЕ человека. Рекомбинантньй протеин не демонстрирует какой-либо протеолитической активности.

Вьіделениєе, активация и дальнейшая характеризация рекомбинантного 5ЗССЕ описаньії в примере10. Неактивную проформу рекомбинантного ЗССЕ можно активировать протеолитическим расщеплением ї5» трипсином или зндопептидазой І У5-С. Предполагается, что ряд других протеаз которне расщепляют пептид после основной аминокислотьі, таких как зндопротеиназа І! У5-С, папайн и плазмин, могут бьть способнь о активировать про-5ЗССЕ в активньій ЗССЕ. Бьіло обнаружено, что сигнальньй пептид состоит из 22 аминокислот оо и основан на п-терминальной аминокислотной последовательности нативного активного 5ССЕ, пропептида , Состоящего из семи аминокислот. Более того, бьіло показано, что полученньій рекомбинантньй ЗССЕ - существует в двух п-гликозилированньїх формах, и одной не-гликозилированной форме, что аналогично ї» результатам, полученньїм для активного нативного 5ССЕ.

Под термином "зігайшт согпешт" химотрипсиновьій знзим /ЗССЕ/" /химотрипсиновьій знзим роговичного слоя/ или "полипептид, обладающий 5ССЕ активностью" в широком смьісле подразумевают сериновую ов протеазу или ее проформу, которую можно активировать за счет протеолитического расщепления, причем указанньй знзим в его активной форме ингибируется теми же самьми ингибиторами, и точно таким же образом, (Ф, что и спонтанная клеточная диссоциация, которую можно вьізвать в модельной системе с образцами ка ороговевшего слоя кожи, инкубируемьми при нейтральньх или близких к нейтральньім рН при физиологических температурах. во Более конкретно, термин "полипептид, обладающий 5ССЕ активностью" определяет таким образом полипептид, которьій отличается от химотрипсина и катепсина С-, и которьій, в его активной форме способен разлагать МеО-5ис-Ага-Рго-Туг-грпА /5 - 2586/, причем зто разложение полипептидом ингибируется апротинином, химостатином и сульфатом цинка опрактически по способу примера З и 13, что проиллюстрировано на рис. 9 и в таблицеб. 65 Еще более конкретно термин "полипептид, обладающий 5ССЕ активностью" включаєт полипептид, которьй способен вьізвать протеолитическое расщепление протеина десмосом - десмоглеина 1 во время ин витро инкубирования роговичного слоя пяточной части.

Такой полипептид обьічно также реагирует с антителами, виіработанньми против нативного ЗССЕ, которьй бьлл вьіделен из зкстракта диссоциированньїх клеток роговичного слоя пяточной поверхности. Примерь! таких антител представляют поликлональнье антитела, полученнье как указано в 5.2, и моноклональнье антитела

ТЕ4Б и ТЕ9Б, полученньюе как указано в примере 5.1. Моноклональнье антитела получают за счет гибридом

ТЕ4Б и ТЕ9б, депонированньїх в Европейской коллекции клеточньїх культур животньїх, Рогіоп Юом/п, Заїївригу?

УМійвпіге БР4 000, Опіей Кіпддот, под регистрационньмми номерами ЕСАСС 93061817 и ЕС АСС 93061816, соответственно, в соответствии с требованиями Будапештского соглашения. 70 Клонирование и секвенирование КДНК, кодирующей, ЗССЕ человека, описано в примере 6. Нуклеотидная последовательность, содержащая открьтую считьвающую рамку, достаточную для кодирования полной аминокислотной последовательности протейина предшественника 5ССЕ, состоящая из 253 аминокислот, включая сигнальньй пептид и преполипептид, бьіла таким образом найдена. Нуклеотидная последовательност представлена как последовательность іО Мої, а полученная аминокислотная последовательность 7/5 "Химотрипсинового знзима роговичного слоя /ЗССЕ/" представлена как последовательность ІЮ Мо 2.

Под термином "про-«ЗССЕ или его аналог или вариант его" подразумевают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 0 Мо2 или его аналог или вариант указанной последовательности, которьій получают , когда нуклеотидная последовательность изобретения зкспрессируется в подходящую систему зкспрессии, и которьій после протеолитической активации приводит к образованию сериновой 2о протеиназь, которую можно ингибировать теми же самьми ингибиторами, что и спонтанную клеточную диссоциацию, которую можно вьзвать в модельньх системах с образцами ороговевшего слоя кожи, инкубируемьми при нейтральньх или почти нейтральньїх рН при физиологических температурах, то есть, около 37"С. Вообще, протеин будет реагировать с антителами, вьіработанньми против очищенного нативного или рекомбинатного 5ССЕ. сч

Под термином "ЗССЕ или его аналог или вариант его" подразумевают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность ІЮ Мо2 или аналог или вариант указанной последовательности, которьй і) продуцируется когда нуклеотидная последовательность настоящего изобретения зкспрессируется в подходящую систему зкспрессии, и которьій является сериновой протеиназой, которую можно ингибировать теми же самьми ингибиторами, что и спонтанную диссоциацию клеток, которую можно индуцировать в /«ф зо Модельньх системах с образцами ороговевших слоев кожи, инкубируемьх при нейтральньх или почти нейтральньїх значениях рН при физиологических температурах, те. около 377"С. Вообще, протеин должен -- реагировать с антителами, вьірабатьїваемьми против нативного или рекомбинантного ЗССЕ. со

Под термином "его аналог или вариант" подразумевают полипептид, последовательность которого в точности не соответствует аминокислотной последовательности Ю Мо2, но которая все еще сохраняет "ССЕ о з5 активность", как определено ранееє. Вообще, такие полипептидьі представляют полипептидь!, которье «г отличаются, например, до некоторой степени по составу аминокислот, или включают пост-трансляционнье модификации например, гликозилирование или фосфорилировниєе, по сравнению с ЗССЕ протеином, описанньїм в примерах.

Термин "аналог" или "вариант" используют в настоящем контексте для того, чтобьі обозначить протеин или « полипептид с аналогичньмм составом аминокислот, или последовательностью такой, как характеристическая в с последовательность аминокислот і Мо2, полученная из БССЕ протеина как указано в примере 6, позволяя небольшие вариации, которье изменяют аминокислотную последовательность, например, делеции, ;» сайт-направленньїй мутагенез, вставки дополнительньїх аминокислот, или их сочетания, для создания ЗССЕ протеиновьїх аналогов. Зти модификации могут привести к интересньім и полезньім новьім свойствам аналога.

Дналоговье полипептидьі или протейньі можно получить из животньїх или человека, или они могут бьть ї5» частично или полностью синтезировань. Аналоги можно также получить за счет использования методик рекомбинантньїх ДНК. о Таким образом, важньйй вариант настоящего изобретения относится к полипептиду, в котором, по крайней оо мере, один аминокислотньій остаток замещен другим аминокислотньм остатком и/или в котором , по крайней мере, один аминокислотньй остаток бьіл исключен или добавлен, так что в результате получен полипептид, - содержащий аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности, ї» представленной в последовательности і Мо2 или субпоследовательность указанной аминокислотной последовательности как определено далее, но практически обладающей ЗССЕ активностью, как указано ранее.

Мнтересньій вариант изобретения относится к полипептиду, которьій является аналогом или в Ссубпоследовательностью полипептида настоящего изобретения, содержащим от 50 до 250 аминокислот, например, по крайней мере, 70 аминокислот, по крайней мере, 100 аминокислот, по крайней мере, 150 (Ф) аминокислот или, по крайней мере, 200 аминокислот. ка Найболее важньм вариантом изобретения являются полипептид, содержащий аминокислотную последовательность -7-224 в последовательности іО Мо2 /про-ЗССЕ/ и полипептид, содержащий бо аминокислотную последовательность 1-224 в последовательности іЮ Мо2 /5ССЕ/,

Термин "знзиматически активное вещество" обозначает полипептидную последовательность, которая содержит только часть полипептидной последовательности, представленной в последовательности ЇЮ Мое2, и которая обладает знзиматической активностью. Сюда входят полипептиднье субпоследовательности, которье бьіли аналогизировань! за счет модификаций, как здесь указано. Специфический полипептид /или полипептидь!// 65 /Которьій обладает знзиматической активностью считается особенно интересньм.

Предсказанная аминокислотная последовательность і Мо2 бьла сравнена с аминокислотньми последовательностями знзимов химотрипсина человека /Тоцша еї аї, 1989/, катепсина С-человека /ЗаЇмезеп еї ам, 1987/ и химазь! тучньїх клеток человека /Сацдпеу еї аї, 1991/, Хотя предсказанная аминокислотная последовательность содержит консервативнье активнье участки сериновьіїх протеаз, степень гомологичности очень низка, около 33-3896. В зтом отношений кажется, что 5ССЕ имеет только умеренное сходство с известньми ранее сериновьіми протеиназами. С другой стороньї, ЗССЕ является типичной сериновой протеиназой в отношений гистидинового, аспарагинового и серинового остатков активньх сайтов и консервативньїх участков, расположенньіїх вблизи от зтих сайтов. Зто справедливо также для большинства цистеиновьїх остатков и других вьісоко консервативньїх участков сериновьїх протеиназ . В глубине "кармана" 70. "ргосп/ первичной специфичности /остаток 189 в химотрипсине/ расположен сериновьій остаток химотрипсина человека, химаза тучной клетки, и простато-специфический антиген и аланиновьй остаток катепсина о- человека. В ЗССЕ, с другой стороньі, зто положение занято аспарагиновьм остатом. Зто может обьяснить тот обнаруженньій факт, что хотя БССЕ несомненно обладает химотрипсиновой активностью, его относительная активность по отношению к различньм хромогенньім пептидньім субстратам отличается от химотрипсина и /5 Катепсина Об-, таюке, как и ингибирующая зффективность химостатина, низкомолекулярного ингибитора химотрипсин-подобньїх знзимов.

Сравнение последовательностей химотрипсина человека, катепсина С человека и химазь! тучньїх клеток человека с последовательностью ЗССЕ представлено в последующем сравнительном анализе первичньх структур зтих последовательностей: с щі 6) « «- (зе)

ІФ) « - . и? щ» 1 (95) - 70 с» іме) 60 б5

5ССЕ ІІХОСАРСАВСЗНКРИОУАБОВСМОГНН. - - СООУТУМЕВЧУСТААНСКММ

ЕОМСтТАР ІММСЕОАУРОБУРМИОУЗСОЮКТОЕНЕ...СбОоЗІ15ЕОМУУТААНСОСУВ ниМенто ІІТІОСКЕБВРЕЗЕРУМАУПОІТО5РАСОВ. ЕССОЗЕІУКЕВЕУТТААНСМО

НИМСНУМ ІІСОТЕСКРНОВРУМАУБУІУТ5МОРБКЕССОССКІІКЕМЕМ ТААНСАСЕ. . . 29 50

ЗССЕ ЕХТУу..НІОСБОТІСОККА. ОБІКАЗКВЕК. НРОТОТОТНУМОІМОУКІМ 75 НИМСтТЕР Т5ДМУУАСЕБРОСБОЕЕМІ ОУМЦКІАКМЕК. МРКЕЗІ ГП ТУММОЇ ТІ КГА ниМеНнто МІМУ..ТІСАНМІОККЕМТ.ООБІТАККАТКНРОТМОКТІОМОЇМІ ЦО нОМснУМ 5ІТУ..ТЬОАКМІТЕЕЕОТМОКОСЕМІКОВ.КНРКУМТЗТЬННОІМЬ КК . 8о

ЗссСЕ БОАКІБ5МУККУКЬРОКС.ОЕ. РРОТТСТУЗОМОТТТЗРОУТЕРБОГ МО дв НОМСТеР ТРАКЕ5ЗОТУБАМСТЬРБОБАПСОБЕ. -РАСТІЬСАТТОМОКТКУМАМКТРО КОЮ сч

НОМСНТо КЕУКЕНКМУМРУАСРКАО., ЕОГЕРОТІЬСТУАОЧИКУЗМЕВОТОТІЬКЕМО о

НИМСНУМ ЕКАБІТІАУСТ. -ПРЕРБОЕМЕУРРОКМСКУАСМОКТОУБКРОБОТТОВУ . . 110 140 З «- со

ЗССЕ МОМКІТ5РОВСТЕМХ КО ЕМО МІОСАСІРОЗКЕКМА. СМОО5СОРІУСВСТ ою

ЕОМСТК? ААОРЬБЗМАБСККОМОККІТОУМІСЬСА,. УББ. СМОВБОЗРЬУСОКО «

НОМСНТо ПЕМОКОКО..СОПЕТЕСЗУОРЕКОІСУСОВВЕККААЕК.сО5СОРІЬСММУ нОМеНУМ КОКІМОРОА.СЗНЕКРЕОНМІ,. ОБСУСМРЕКТКБАЕКО СПОСО САУ « а 4 лю 170 . 200 З с

І» , 18 БСсСЕ пОо....С1УБМСТЕРССО. РМОРСУУТОУСКЕТКМІМОТМККНВ, ї» НИМСТЕР САМТОУВІУБМОВОТС5Т.55. РОМТАКУТКБІРММОКІЇТААМ о нОМеНнто АН....СІУ5ІСКББОМР....РЕМЕТКУЗЗЕГРИТЕТІМЕЗ ЕК ООМЕТРІ, о й нОМСНІМ АО....БСІМБІСЕБОАКР....РАМЕТКІЗНУВРМНІМОТТ ОМ " т 230 ї» Сравнительньй анализ первичньїх структур осуществляют вручную.

Обозначения:

НОИМСТЕР - химотрипсин человека /Роційа е( аі, ВВАКС 158:569-575, 1989/ нНиМентТо - катепсин О-человека /З!цімезеп еї аї, Оіоспетівігу, 26:2289-2293, 1987/

ГФ) НиИМеНУМ - химаза тучньїх клеток человека /Сацонеу еї аї, у). Біоії. Спет., 226:12956-12963, 1991/

Ге Гомологичность:

НОМСТАР/ЗСОССЕ: 85/224-3890 во НиИМСНТО/5ССЕ: 74/224-3390

НИМСНУМ)/5ССЕ: 74/224-3390

НиИМеНтТО/НОМСНУМ: 109/226-4890

Нумерация относится к химотрипсиногену

Подчеркнуть!: ве Консервативньсе участки вблизи активного сайта Ліе 15, Ніз 57, Авр 102, Зег 195 химотрипсина/ и кармань первичной специфичности химотрипсина /Зег 189, бЗег 213-Тгр 215, С-Іу 226 химотрипсина)/.

Звездочки: возможньсе сайть! п-гликозилирования в 5ССЕ.

Таким образом, важньй вариант настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в которой последовательная нить из 20 аминокислот гомологична, по крайней мере, на 8095 нити оаминокислот той же осамой одлинь), вьбранной из аминокислотной последовательности іЮ Мо2.

Полипептиднье последовательности настоящего изобретения, гомологичнье, по крайней мере, на 80965, например, на 8595, или, по крайней мере, на 9095, полипептидам, представленньїм в последовательности (2) в' 7/0 2. составляют важньй вариант изобретения. Так как последовательность, представленная как последовательность Ю Мо2, по-видимому,совершенно уникальна, в обьем настоящего изобретения входят полипептидь, для которьїх степень гомологичности с аналогичной последовательной нитью из 20 аминокислот, вьібранньїх из аминокислотной последовательности іЮ Мо2, может бьіть не более 5595, хотя предпочтительно, не более 7095. Такие последовательности можно получить из аналогичньїх протеинов из других видов, например, /5 таких других млекопитающих, как мьіши, крьісьі, кролики, морские свинки, свиньи или коровь!. Так как небольшие части последовательности могут демонстрировать существенное сходство с другими сериновьіми протеазами, в обьем настоящего изобретения включень! также пептидь! со степенью гомологичности, по крайней мере, 95965, и найболее предпочтительно, по крайней мере, 9995 гомологичности с аналогичной последовательной нитью из аминокислот, вьібранньїх из аминокислотной последовательности, представленной в последовательности іЮ 20 МБ2.

Под термином "гомологичность последовательности" подразумевают идентичность в последовательности аминокислот в сегментах двух или более аминокислот в паре по отношению к идентичности и положению аминокислот полипептидов.

Таким образом, термин "гомологичньй" использован здесь для иллюстрации степени идентичности с оре аминокислотной последовательности данного полипептида и аминокислотной последовательности представленной в последовательности і Мо2. Аминокислотную последовательность, подлежащую сравнению с о аминокислотной последовательностью представленной в последовательности і Мо2, можно вьівести из нуклеотидной последовательности, такой, как ДНК или РНК последовательность, например, полученнье за счет гибридизации, как будет указано далее, или можно получить обьічньми методами аминокислотного «Е зо секвенирования. Степень гомологичности, предпочтительно определяют на аминокислотной последовательности зрелого полипетидда, то есть, без учета какой-либо лидерной последовательности. (87

Обьчно используют только кодирующие участки при сравнений нуклеотидньїх последовательностей для со определения их внутренней гомологичности.

В настоящем контексте термин "полипетид которьй распознаєтся, по крайней мере, одним из що) з5 депонированньх антител" должен включать аминокислотную последовательность, которая содержит «г аминокислотьі составляющие практически последовательную нить в линейной или пространственной конформации любой последовательности полипептида, представленного в последовательности ІЮ Мо 2, которая распознается по крайней мере, одинм из депонированньх антител. Как хоройо известно специалистам, интересньмми могут бьть также вторичнье или третичнье конформации; они могут обладать полезньми « свойствами и могут составлять зпитопьі. Депонированнье антитела ТЕ4Бб и ТЕ9Б, по-видимому, распознают з с конформационньсе зпитопь! ЗССЕ.

Бьіло показано, что поликлональнье кроличьи антитела, полученнье по способу примера 5.2.2 ;» обеспечивают гранулярное окрашивание зігайшт дгапицозит и скорее, диффузное окрашивание нижнего вігайт согпешт /роговичного слоя/, наблюдаемое с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии.

Антитела, виіработанньєе против очищенного нативного или рекомбинантного 4УУЕ обьчно связьіваются с «» верхними базальньмми клетками кератинизированного /ороговевшего/ чешуйчатого зпителия человека, но не с зпителиальньми клетками неороговевшего чушейчатого зпителия. Зти антитела связьшваются также с і-й межклеточньім пространством ороговевшего слоя кожи человека. оз Антитела, реакционноспособнье с полипептидами настоящего изобретения, пригодньії для использования с цу 5 различньїми целями, как перечислено далее:

Для вьіделения протейнов: Антитела можно использовать для вьіделения полипептида /полипептидов/ или

ГТ» его аналога из биологических образцов с использованием афинной хроматографии или иммуноосажденияо

Для диагностики и терапии: Моноклональнье антитела против полипептида /полипептидов/ или его аналогов можно использовать для диагностики и терапии болезненньх состояний у животньїх и человека. Диагностическим агентом может бьіть антитело со специфичностью для полипептида настоящего изобретения.

Зто антитело можно соединить с другим протеином или твердьіїм носителем и/или можно использовать в тестах іФ) агглютинации или в тестах проявления окраски. Такие антитела можно также использовать для количественного ко определения ЗССЕ полипептидов или их аналогов в биологических образцах с использованием стандартньх методик гистохимии и иммунохимии. во В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид изобретения, как определено ранее. В частности, изобретение относится Кк нуклеотидной последовательности, содержащей практически последовательность представленную в последовательности іЮ

Мо1. Другие важнье вариантьі относятся к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий субпоследовательность аминокислотной последовательности ОО Мо2, такой как нуклеотидная 65 последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность -7-224 последовательности 0 Мо2, или полипептид, которьій содержит аминокислотную последовательность 1-224 последовательности іЮ Мо2.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидной последовательности, которая гибридиз--тется с нуклеотидной последовательностью представленной в последовательности 0 Мої в жестких условиях как указано в примере 7 и в примере 9.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидную последовательность представленную в последовательности і Мої или ее аналог или ее субпоследовательность, которая 1/ гомологична последовательности у представленной в последовательности ЇО Мої, по крайней мере, на 76 9095, и/или 2/ кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого, по крайней мере, на 8095 гомологична аминокислотной последовательности, представленной в последовательности і Мо2, и/или

З/ кодирует полипептид, которой связан моноклональньм антителом, продуцированньм гибридомной клеточной линией ТЕ4Б, которая депонирована 18 июня 1993г в ЕСАСС под регистрационньім номером ЕСАСС 7/5 93061817 или моноклональньм антителом, продуцированньм гибридомной клеточной линией ТЕ9Б, которая депонирована 18 июня 1993г в ЕСАСС под регистрационньім номером 93061816, и/или 4/ кодирует полипептид, которьій связан поликлональной антисьівороткой, виіработанной против нативного

ЗССЕ, которьй бьл вьіделен из зкстракта диссоциированньх клеток роговичного слоя пяточной поверхности.

В обьем настоящего изобретения входит также модифицированная нуклеотидная последовательность, 2о которая отличается от указанной ранее нуклеотидной последовательности тем, что, по крайней мере, один нуклеотид исключен, замещен или модифицирован, или, по крайней мере один дополнительньй нуклеотид встроен, так что в результате получена нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, обладающий ЗССЕ активностью.

В настоящем описаний и формуле изобретения термин "субпоследовательность" обозначает сч г последовательность, предпочтительньй размер которой составляет, по крайней мере, 15 нуклеотидов, более предпочтительно, по крайней мере, 18 нуклеотидов, и найболее предпочтительно, по крайней мере 21 і) нуклеотид. В ряде вариантов настоящего изобретения субпоследовательность или аналог нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, содержит, по крайней мере, 48 нуклеотидов, например, по крайней мере, 75 нуклеотидов или, по крайней мере, 99 нуклеотидов. "Субпоследовательность" должна «г зо удовлетворять, по крайней мере, одному из критериев 1/-4/, приведенньх ранееє, или должна гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, представленной в последовательности ІЮ Мо1. -

Хорошо известно, что мелкие фрагментьї подходят для методик как описано здесь. Такие фрагменть! и со последовательности могут, наряду с другими применениями, бьїть использованьі в качестве зондов при идентификации мРНК фрагментов нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, как указано в о примере?7. «Е

Термин "аналог" по отношению к ДНК фрагментам изобретения должен обозначать нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, идентичньій или практически идентичньій полипептиду, кодируемому ДНК фрагментом изобретения. Хорошо известно, что одну и ту же аминокислоту можно кодировать различньми кодонами, причем использование кодона связано, наряду с остальньм, с « предпочтительностью рассматриваемого организма, зкспрессирующего нуклеотидную последовательность. (З) с Так, один или более из нуклеотидов или кодонов ДНК фрагмента настоящего изобретения может бьіть заменен

Й другими, которье будучи зкспрессированьі, приводят к получению полипептида идентичного или практически а идентичного полипептиду, кодирующему рассматриваемьй ДНК фрагмент.

Также, термин "аналог" используют в контексте настоящего изобретения для обозначения ДНК фрагмента

Мли ДНК последовательности аналогичного нуклеотидного состава или последовательности как характеристики їх ДНК последовательности

ІО Мо1, кюодирующей аминокислотную последовательность, составляющую ЗССЕ полипептидьі, обеспечивая о небольшие вариации, которье не оказьвают значительного вредного воздействия на знзиматическую оо активность аналога, по сравнению с активностью нативного ЗССЕ протеина, как указано в примере 3. Под 5р Термином "значительное вредное воздействие" подразумевают, что знзиматическая активность аналога должна - составлять, по крайней мере, 5095, более предпочтительно, по крайней мере 6095, еще более предпочтительно, ї» по крайней мере, 7095, например, по крайней мере, 7595 знзиматической активности нативного ЗССЕ, если зто определяют, например, по способу примера 3. Аналогичную ДНК последовательность или ДНК фрагмент можно получить из такого организма, как например, организм животного или человека, или получить частично или в Полностью синтетическим способом. Аналог можно таюке получить за счет использовния методик рекомбинантньїх ДНК. (Ф) Более того, термин "аналог и "последовательность" должнь включать такие вариации в ка последовательности, как замещения, вставки /включая интронь/, добавления и перестройку одного или более из нуклеотидов, причем зти вариации не должньі! оказьівать никакого вредного воздействия на полипептид, во кодируемьїй ДНК фрагментом или его субпоследовательностью.

Термин "замещение" подразумеваеєт замену одного или более из нуклеотидов в полной нуклеотидной последовательности одним или более из отличньїх нуклеотидов, "добавление" означает добавление одного или более из нуклеотидов с любого конца полной нуклеотидной последовательности; "включение" означает введение одного или более из нуклеотидов внутрь полной нуклеотидной последовательности; "делеция" б5 означает, что один или более из нуклеотидов удален из полной нуклеотидной последовательности либо с любого конца полной последовательности, либо из любой его подходящей точки, а "перегруппировка" означает,

что два или более нуклеотидньх остатка поменялись местами внутри ДНК или полипептидной последовательности, соответственно. ДНК фрагмент может, однако, также бьіть модифицирован в результате мутагенеза либо до, либо после введения его в организм.

Терминьі "фрагмент", "последовательность", "субпоследовательность" и "аналог, в том смьісле, как использованьі в настоящем описаний и формуле изобретения в отношений фрагментов, последовательностей, субпоследовательностей и аналогов в соответствии с настоящим изобретением, должнь,, естественно, рассматриваться как не содержащие зтих вещей в их природном окружении, но существующие скорее, например, в вьіделенной, очищенной, ин витро или рекомбинантной форме. 70 В одном варианте настоящего изобретения, детектирование и/или количественное определение ЗССЕ полипептидной мРНК можно получить за счет зкстрагирования РНК из клеток или тканей и превращения его в

КДНК для последующего использования в полимеразной цепной реакции /РСК/; РСК, праймер /праймерь/ можно синтезировать на оснований ДНК фрагментов настоящего изобретения, такого, как ДНК фрагмент, представленньй в последовательности і Мої. Зтот способ для определения и/или количественного /5 определения можно использовать в качестве диагностического метода для диагностики болезненньйх состояний, в которьїх ЗССЕ мРНК зкспрессируется в больших или меньших количествах нежели обьічно.

В обьем настоящего изобретения включен также диагностический агент, содержащий нуклеотидньй зонд, которьій способен детектировать нуклеотидную последовательность изобретения, а также способ диагностики заболеваний, в которьіїх ЗССЕ зкспрессия нарушена, и/или заболеваний при которьіх 5ССЕ ген мутирован; причем метод включает проведение РСК анализа образца, полученного от пациента, у которого подозревается заболевание, при котором присутствуют более вьісокие количества 5ССЕ, нежели обьічно, или присутствуют мутированнье формь! ЗССЕ, в котором образец подвергают контакту с диагностическим агентом как описано ранее, обеспечивая нуклеотидной последовательности возможность бьіть амплифицированной, и определяя наличие какой-либо идентичной или гомологичной нуклеотидньїх последовательностей в образце. с

Полипептидьї настоящего изобретения можно получить, используя рекомбинантную ДНК методику. Важньй вариант настоящего изобретения относится к зкспрессирующей системе, содержащей нуклеотидную і) последовательность настоящего изобретения.

Организм, которьій используют для получения полипептида настоящего изобретения, может бьіть вьІСШИМ организмом, например, животного, или низшим организмом, например, микроорганизмом, таким, как Е.соїї. «ф з0 Независимо от типа используемого организма, ДНК фрагмент настоящего изобретения вводят в организм либо непосредственно, либо с помощью подходящего вектора. В другом варианте, полипептидьі можно получить в 87 клеточньїх линиях млекопитающих, вводя ДНК фрагмент или его аналог ; или его субпоследовательность (є настоящего изобретения либо непосредственно либо с помощью вектора зкспрессии.

ДНК фрагмент или аналог, или его субпоследовательность можно также клонировать в подходящий о стабильньій вектор зкспрессии, а затем ввести в подходящую клеточную линию. Клетки, продуцирующие «г нужнье полипептидь, затем селектируют по уровням продуктивности в условиях, подходящих для используемого вектора или клеточной линии. Отобраннье клетки затем вьіращивают далее, и они образуют очень важньй и непрерьівньїй источник нужньїх полипептидов.

Примером специфического аналога ДНК последовательности настоящего изобретения является ДНК « последовательность, которая включает ДНК последовательность, представленную в ДНК последовательности 7) с ІЇО Мо1, или ее часть, и которая найболее адаптирована для зкспрессии в Е.соїї. Зта ДНК последовательность

Й является последовательностью, которая, будучи встроена в Е.соїї вместе с подходящей регуляторной а последовательностью, приводит Кк зкспрессиий полипептида содержащего практически аминокислотную последовательность, представленную в последовательности і Мо2, или ее часть. Так, ДНК последовательность содержит специфические кодонь, распознаваемье Е.сої. Пример такого варианта ї5» представлен в примеревд.

В настоящем контексте термин "ген" используют для обозначения ДНК последовательности, которая о включена в продуцирование полипептидной цепи, и которая включает участки, предшествующие и следующие оо за кодирующим участком /5'-прямом направлений и 3'обратном направлений последовательностей/ также как 5о прерьвающие последовательности, интронь, которье расположеньь между отдельньми кодирующими - сегментами, зкзоньії или в 5'-прямом направлений или 3-обратном направлений участки. Участок в 5'-прямом ї» направлений содержит регуляторную последовательность, которая контролирует зкспрессию гена, обьічно промотор. 3'-участок в обратном направлений содержит последовательности, которне участвуют в терминации транскрипции гена, и необязательно последовательности, ответственнье за полиаденилирование транскрипта дв М 3З-нетранслируемого участка.

Наряду с вьішеперечисленньім настоящее изобретение относится к зкспрессирующей системе, содержащей (Ф, нуклеотидную последовательность как описано ранее, кодирующую полипептид настоящего изобретения, ка систему, которая содержит 5і-фланкирующую последовательность , способную осуществлять зкспрессию указанной нуклеотидной последовательности . 60 В частности, настоящее изобретение относится к реплицируемому вектору зкспрессии, которьй обеспечиваєт зкспрессию нуклеотидной последовательности настоящего изобретения. Конкретньій вариант настоящего изобретения относится к реплицируемому вектору зкспрессии, обозначенному р 507, которьй бьл депонирован 11 мая 1993г в коллекции ЮОецізпе Заттішйпд моп Мікгоогдапізтіп спа 2ейКийигеп ОСтЬН (ОМ) под регистрационньім номером ОЗМ 8282 в соответствии с требованиями будапештского соглашения, и к векторам 65 Зкспрессии, которьіе зкспрессируют нуклеотиднье последовательности, которніе отличаются от нуклеотидной последовательности указанного депонированного вектора зкспрессии, но которьій кодируют тот же самьй полипептид или его аналог или его вариант, которне обладают 5ССЕ активностью.

Другими словами, обьем изобретения включает также реплицируемьй вектор зкспрессии, как бьіло указано ранее, в котором зкспрессируемая нуклеотидная последовательность является последовательностью, которая

Отличается от нуклеотидной последовательности депонированного вектора тем, что, по крайней мере, один нуклеотид бьл исключен, заменен или модифицирован, или, по крайней мере, один дополнительньій нуклеотид бьл встроен, таким образом, чтобьії нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, обладала би ЗССЕ активностью.

Более того, настоящее изобретение относится к плазмиде, обозначенной роОБО0, которая бьла 7/0 депонирована 11 мая 1993г в коллекции Оецізпе Заттінйпо моп Мікгоогдапізтіп па 2еїЇкКийигеп втЬН (ОМ) под регистрационньмм номером О5М 8281 в соответствии с требованиями Будапештского соглашения, и к плазмидам, содержащим нуклеотидную последовательность, которая оотличаєется от нуклеотидной последовательности, представленной в нуклеотидной последовательности і Мої, но которая кодирует полипептид, представленньій в последовательности ЇО Мо2, или ее аналог или ее вариант, которне обладают 7/5 ЗССЕ активностью, или которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, представленной в последовательности іІЮ Мо1, или ее частью в жестких условиях гибридизации.

В обьем настоящего изобретения входит также не человеческий организм, которьй содержит зкспрессионную систему настоящего изобретения. Организмь!, которье можно использовать в зтом аспекте изобретения, включают микроорганизмь, такие, как бактерии родов Васійи5, ЕзсПегіспіа или ЗаІтопеїйа, такие 2о дрожжи, как Заеспаготусез, Ріспіа, простейшие, или клетки, полученнье из многоклеточньїх организмов, таких, как грибьії, клетки насекомьїх, клетки растений, клетки млекопитающих или клеточнье линии. Если организм является бактерией, предпочтительно, чтобь! бактерия относилась к роду ЕзсПегіспіа, например, Е.соїї.

Кроме того, настоящее изобретение оотносится ок оплазмидному вектору, содержащему ДНК последовательность, которая кодирует полипептид настоящего изобретения или полипептид слияния, как здесь с ов определено. В одном из найболее важньх вариантов ДНК Фрагмент, или его аналог, или его субпоследовательность настоящего изобретения или фрагмент ДНК слияния настоящего изобретения может і) содержаться в реплицируемом векторе зкспрессии, которьій способен реплицироваться в организме хозяина или в клеточную линию.

Такой вектор может бьіть, в частности, плазмидой, фагом, космидой, мини-хромосомой или вирусом. В «Е зо интересном варианте изобретения зтот вектор может бьіть вектором, которьій при введений в клетку-хозяина оказьівается интегрированньїм в клеточньй геном. -

Если используют вьісший организм, для получения полипептидов можно использовать трансгенную со методику. Примерами подходящих животньїх являются овцьі, рогатьій скот, свиньи и т.д. ДНК фрагмент, которьій кодирует полипептид настоящего изобретения, зкспрессируется в нужную ткань под контролем о з5 ткане-специфических регуляторньїх злементов. Полученньій протеийин можно затем подвергнуть «г посттрансляционньім модификациям для получения полипептида настоящего изобретения.

Трансгеннье млекопитающие /зто не относится к человеку/ настоящего изобретения получают за счет введения "трансгена" в змбриональную мишеневую клетку вбібранного животного. В одном аспекте изобретения трансгеном является ДНК последовательность, которая способна продуцировать нужньій фенотип, когда она « содержится в геноме клеток трансгенного млекопитающего /не человека/. В специфических вариантах трансген 7-3) с содержит ДНК последовательность, кодирующую полипептид настоящего изобретения, причем зтот трансген

Й способен, будучи зкспрессирован, продуцировать полипептид. а Включение зкспрессирующей системьі в зародьшевую линию /дегт-Ііпе/ млекопитающего можно осуществить, используя любую подходящую методику, например, описанную Нодап еї аї, 1986, или в МО 9304172. ї5» В конкретном аспекте изобретения нуклеотидная последовательность изобретения может содержать другую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, отличающийся от или идентичньій полипептиду о настоящего изобретения, слитьій в рамке с нуклеотидной последовательностью последовательности, 2) представленной в последовательности 0 Мої или ее аналогом, кодирующим ЗССЕ полипептид, с целью получения слитого полипептида, причем зтот полипептид составляет еще один интересньй аспект настоящего - изобретения, см. пример8. Если используют технологию рекомбинантньїх ДНК, слитье ДНК ї» последовательности могут бьть встроеньі в подходящий вектор или геном. В другом варианте одну из нуклеотидньїх последовательностей встрайвают в вектор или геном, уже содержий другую нуклеотидную последовательность, Полипептид слияния можно также ополучить, встрайвая две нуклеотиднье в последовательности отдельно, и предоставляя возможность протекания зкспрессии. Организм хозяийна, которьій может бьіть как зукариотного, так и прокариотного происхождения, вьіращивают в условиях, которье (Ф, обеспечивают зкспрессию слитьїх последовательностей. Затем слитьій полипептид очищают, и полипептид ка настоящего изобретения, отделяют от его партнера слияния, используя подходящие методики.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения полипептида бор настоящего изобретения, которьій включает стадии: /а/ встаивания нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в вектор зкспрессии, /р/ трансформирования подходящего организма хозяина вектором, полученньїм на стадии /а/, /с/ культивирования организма хозяина, полученного на стадии, /Б/ в условиях, подходящих для зкспрессии полипептида, 65 /д/ сбора полипептида, и /е/ необязательной пост-трансляционной модификации полипептида.

В обьем настоящего изобретения входит также описанньїй ранее способ, в котором полученньій полипептид вьіделяют способом, включающим одну или более из стадий, подобньх афинной хроматографии, с использованием иммобилизованного нативного или рекомбинантного ЗССЕ ополипептида или антител, реакционноспособньх с указанньм полипептидом, и/или процедурам хроматографической обработки и злектрофореза.

Полипептид, полученньй как указано ранее, можно пост-трансляционно модифицировать, например, за счет термообработки, химической обработки /формальдегид, глутаральдегид и т.д./ или знзиматической обработки /пептидазьї, протеиназьь и протейин-модифицирующие знзимь/. Зтот полипептид при продуцирований в 7/0 организме может бьть процессирован другими способами, нежели те, которье происходят в его продуцирований в природном окуружении. Например, гликозилирование часто достигается, когда полипептид зкспрессируется такой клеткой вьісшего организма, как дрожжи, или предпочтительно, млекопитающие. Обьічно гликозилирование связано с аминокислотньіми остатками Авп; Зег, ТПг или гидроксилизином. Может оказаться вьггодньїм /а может и нет/ удалить или изменить характеристики процессинга, создаваемого рассматриваемьм /5 организмом хозяийна.

После зкспрессии в соответствии с настоящим изобретением полипептида в организм или клеточную линию, полипептид можно использовать как он есть, или его можно вначале вьіделить из организма или клеточной линии. Если полипептид зкспрессирован в виде секретированного продукта, его мокно очистить непосредственно. Если полипептид "зкспрессирован в виде ассоциированного продукта, может понадобиться 2о частичное или полное разрушение хозяина перед очисткой.

Примерь процедур, использованньїх для очистки полипептидов включают:

Л/ иммуноосаждение или афинную хроматографию с антителами,

Лі/ афинную -хроматографию с подходящим лигандом,

Лі/ другие- хроматографические процедурьї, такие, как гельфильтрация, ионообмен или вьісокозффективная сч Жидкостная хроматография, или модификации вьішеперечисленньх, /м/ злектрофоретические процедурьі, подобнье злектрофорезу в полиакриламидном геле, злектрофорезу в і) денатурированном полиакриламидном геле, злектрофорезу в агарозном огеле и изозлектрическому фокусированию,

М! любье другие специфические методики солюбилизации и/или очистки. «Е зо Настоящее изобретение относится также к практически чистому, ЗССЕ полипептиду. В данном контексте термин "практически чистьій" означаєт, что рассматриваємьй полипептид практически не содержит других (87 компонентов, то есть, других полипептидов или углеводов, которне могли образоваться в процессе получения со и/или вьіделения полипептида, или каким-либо другим образом оказаться вместе с полипептидом. Степень чистоть! протеина можно оценить с помощью злектрофореза на ЗД5 геле, как описано в примерез. о

Полипептид можно вьіделить по способу примераї4 с помощью ЗВТ) афинной хроматографии или с «Е помощью афинной хроматографии на иммобилизованньїх антителах, например, на антителах ТЕ4Б, способом известньім специалистам. Вьісокая степень чистоть! полипептида настоящего изобретения может бьть вьігодна, если полипептид собираются использовать в фармацевтических или косметических композициях. Кроме того, благодаря вьісокой степени чистоть, практически чистьй полипептид можно использовать в меньших « Количествах, нежели полипептид обьічной более низкой степени чистоть!, для большиства целей. в с В одном из аспектов настоящего изобретения чистьій полипептид можно получить из подходящей клеточной

Й линии, которая зкспрессирует полипептид настоящего изобретения как описано в примере9. Кроме того, а полипептид настоящего изобретения можно получить хорошо известньми способами жидкостного или твердофазного пептидного синтеза, используя последовательное сочетание отдельньїх аминокислот

Пполипептидной последовательности. В другом варианте полипептид можно синтезировать за счет соединения ї5» отдельньїх аминокислот, образующих фрагментьї полипептидной последовательности, которье затем соединяют для получения целевого полипептида. Зти способь), таким образом, составляют следующий о интересньйй аспект изобретения. оо Очень важньй аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, косметической композиции

Мли композиции для лечения кожи, которая содержит полипептид, обладающий ЗССЕ активностью, й - фармацевтически и/или косметически приемлемьй зксципиент. Композиция может содержать очищенньй ї» нативньій протеин или рекомбинантньій полипептид настоящего изобретения, или прознзим или протеин слияния-формь! полипептида настоящего изобретения, которне можно активировать за счет протеолитического расщепления. 5Б Прознзимную форму полипептидов настоящего изобретения можно классифицировать как "пролекарственную форму, то есть, соединие, которое после соответствующего протеолитического (Ф, расщепления превращается в активную форму. ка Особенно, но не исключительно, настоящее изобретение относится к композициям, пригодньім для поверхностного нанесения, например, нанесения на кожу. 60 Фармацевтическими композициями настоящего изобретения, подходящими для поверхностного нанесения могут бьіть креми, мази, лосьоньі, линименть, гели, растворьі, суспензии, пастьії, пластьіри, спрей, шампуни, мьіла, кондиционерь! для волос или порошки.

Поверхностное нанесение предусматриваєт нанесение на или вблизи с частями тела, на которьх наблюдаются рассматриваемье патологические изменения, например, на такие внешние части тела, как 65 участки кожной поверхности. Нанесение может бьіть просто распределением композиции по поверхности, или может включать любье приспособления, предназначеннье для усиления и закрепления контакта композиции и патологических повреждений, например, закроиівающие повязки, такие, как изолирующие пластьіри с нанесенной композицией настоящего изобретения. Зти композиции могут пропитьівать, или могут бьіть распределень! на тампонах, пластьірях, бинтах, марле, губчатьїх материалах, кусочках ватьі и т.д. В некоторьїх случаях можно Мспользовать композиции в форме иньекций непосредственно в пораженньй участок или вблизи него.

Композиции для поверхностного нанесения настоящего изобретения могут содержать 1-8095 активного соединения по весу в расчете на полньїй вес препаратов, например, 0,001-2595 вес/вес активного соединения, например, 0,1-1095, 0,5-595 или 2-595. В состав композиции может входить более одного активного соединения; так в обьем настоящего изобретения включень! композиции, содержащие ЗССЕ, про- ЗССЕ или ингибитор 7/0. ЗССЕ в сочетаний с другими фармацевтическими и/или косметическими соединениями.

Композицию настоящего изобретения обьічно наносят 1-10 раз в день, в зависимости от типа, степени и расположения пораженного участка.

Для поверхностного нанесения препарат может бьть оприготовлен в соответствии с обьічной фармацевтической практикой с фармацевтическими зксципиентами, которье обьчно используют для 7/5 поверхностньх нанесений. Природа носителя, котовірй используют для приготовления каждой конкретной композиции, зависит от предполагаемого способа нанесения композиции. Помимо водьі! можно использовать в композициях и другие носители, которне включают такие твердье вещества или жидкости, как мягчительнье средства, растворителе, увлажнители, загустители и порошки. Примерами такого типа носителей, которье можно использовать либо отдельно, либо в смесях, состоящих более чем из одного носителя, являются го следующие:

Умягчающие средства: стеариловьій спирт, монорицинолеат глицерина, моностеарат глицерина, пропан-1, 2-диол, бутан-1, З-диол, цетиловьій спирт, изопропилизостеарат, стеариновая кислота, изобутилпальмитат, изоцетилстеарат, олеиловьій спирт, изопропиллаурат, гексиллаурат, децилолеат, октадекан-2-ол, изоцетиловьій спирт, цетилпальмитат, диметилполисилоксан, ди-н-бутилсебакат, изопропилмиристат, с МЗзопропилпальмитат, изобутилстеарат, бутилстеарат, полизтиленгликоль, тризтиленгликоль, ланолин, касторовое масло, ацетилированнье ланолиновье спиртьії, петролеум, минеральное масло, бутилмиристат, о изостеариновая кислота, пальмитиновая кислота, изопропиллинолеат, лауриллактат, миристиллактат, децилолеат, миристилмиристат;

Растворители: вода, метиленхлорид, изопропанол, касторовое масло, монозтиловьій зфир зтиленгликоля, «Е зо монобутиловьй зфир дизтиленгликоля, монозтиловьій зфир дизтиленгликоля, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, растительнье и животнье масла, глицерин, зтанол, пропанол, пропиленгликоль и другие (87 гликоли или спиртьї, фиксированньсе масла; со

Такие увлажняющие агентьі как глицерин, сорбитол, натрий-2-пирролидон-5-карбоксилат, растворимьй коллаген , дибутилфталат, желатин; що)

Такие порошки, как мел, тальк, каолин, крахмал и его производнье смольі, коллоидная двуокись кремния, «г полиакрилат натрия, химически модифицированньй магний-алюминий-силикат, гидратированньй алюмосиликат, карбоксивиниловьій полимер, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, моностеарат зтиленгликоля;

Такие желирующие или способствующие набуханию агентьї, как пектин, желатин и их производнье, такие производнье целлюлозь, как метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза или окисленная целлюлоза, « целлюлозная смола, гуаргам, смоль! акации, карайи и трагаканта, бентонит, агар, альгинатьії, карбомерні, в с желатин, ріаддепитазкК, сегаїопіа, декстран и его производнье, смола дпайі гекторит, смола ксантам, щелуха іврадпшіа. з Такие полимерьї, как полиакриловая кислота или полимерь! полигликолевой кислотьІ, или их сополимерньі, парафин, полизтилен, полизтиленоксид, полизтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливинилпирролидон;

Такие поверхностно-активнье агентьї, как нейоннье поверхностно-активнье агентьі, например, гликоль и ї5» сложнье зфирь! глицерина, простьіе и сложнье зфирьї макроголя, простьіе и сложнье зфирь! сахара, такие, как сорбитановье зфирьї, такие ионнье поверхностно-активнье агенть,, как аминомьла, металлические мьїла, о сульфатированнье жирнье спиртьї, алкилафирсульфать, сульфатированнье масла и амфолитические оо поверхностно-активнье агенть! и лецитинь;

Такие буферирующие агентьї, как соли натрия, калия, алюминия /магния, или кальция/гакие как, хлоридь, - карбонату/, бикарбонать, цитрать, глюконать, лактать, ацетать, глюцептать или тартрать/, ї» Для поверхностного нанесения рН композиции, в принципе, может меняться в очень широком интервале значений, например, от З до 9. В предпочтительном варианте изобретения предпочтителен интервал рнН, которьій соответствует протеолитической активности полипептида, например, рН от около 4 до 8. Указаннье ов ранее буферирующие агенть! можно использовать для установления нужньх значений рн.

Препарать! настоящего изобретения могут также содержать такие другие добавки, как стабилизирующие

Ф) агентьї, консерванть!, агентьї, облегчающие растворениєе, окрашивающие агенть, хелатирующие агенть, ка геле-образующие агентьії, основания мазей, регуляторь! рН, антиоксиданть!ї, отдушки и агентьї, защдищающие кожу, и т.д. Если композиция приготовлена в форме мьла или шампуня, она может, кроме того, содержать бр Вспенивающие агенти, оттеночнье агенть и/или кондиционерні.

Типичнье консервантьь включают парабень, формальдегид, Катпоп Со, Вгопідох , ВгопороЇї , пара-хлор-мета-крезол, хлоргексидин, бензалконийхлорид и т.д.

Если композиции настоящего изобретения имеют форму шампуня или мьіла, можно использовать обьічнье ингредиентьї, а типичнье основь о мьіла и шампуня включают такие компоненть), как бетаийн, 65 натрийлаурилсульфат, нонилфенол, имидазол, сульфосукцинат, обезжиривающие агентьї, увлажнители и кондиционерні.

Более того, может оказаться вьігодньім создать препаратьї с модифицированньім вьіделением, в которьх активное соединение включено в полимерную матрицу, или в наночастиць, или в липосомь! или мицелль!, или адсорбировано на ионообменньх смолах, или носителем является полимер.

Композиции можно получить в соответствии с обьічной фармацевтической практикой, и они могут бьть:

Полутвердьми композициями: гелями, пастами, смесями. Жидкими композициями: растворами, суспензиями, змульсиями.

Как бьло указано, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать сам полипептид настоящего изобретения или его функциональное производное, или сочетание таких соединений с 7/0 Примерьі! подходящих функциональньїх производньїх включают фармацевтически приемлемьсе соли, особенно те соли, которне пригоднь! для использования на коже. Примерьї включают фармацевтически приегмлемье соли аминофункций, например, соли кислот, которье дают анионьі, которне фармацевтически приемлемь!, особенно для применения на коже. Примерьї включают фосфать!, сульфать!, нитрать!, ийодидьі, бромидь, хлоридьі, борать! а также анионьї, полученнье из карбоновьїх кислот, которье включают ацетать, бензоать, стеарать и 75. ТД.

Другие производнье аминофункций включают амидь, имидь, мочевинь! , карбамать! и т.д.

Другие подходящие производнье включают производнье кароксильной группьі полипептида настоящего изобретения, включая соли, сложньіе зфирьї и амидьі. Примерь! включают соли фармацевтически приемлемьх катионов, например, соли лития, натрия, калия, магния, кальция, цинка, алюминия, железа /2 и 3/, аммония и низшего /С1-Св/-алкиламмония. Сложнье зфирь! включают низшие алкилсложньсе зфирь!.

Примерьї композиций в примере 11 иллюстрируют примерьї фармацевтических косметических композиций и композиций для ухода за кожей в соответствии с настоящим изобретение/ч, но они ни коим образом не ограничивают обьем композиций настоящего изобретения.

Показано, что косметические композиции для ухода за кожей, содержащие нативнье или рекомбинантнье с ЗССЕ активнь против акне, ксеродермь! или других гиперкератозньхх состояний, таких, как мозоли и Кегайфовів ріїіагів. і)

Существуют различнье стадии акне вульгарне. Считают, что желательно вводить 5ССЕ на тех стадиях, когда наблюдается распространенная кератинизация в протоках сальньїх желез, что приводит к образованию комедонов и закупорке протк, позтому может бьіть вьігодно вводить вещество, которое ингибирует ЗССЕ на «Ж зо стадиях, когда воспалительнье акне поражения представляют преимущественную характеристику.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к использованию полипептида для - лечения или профилактики акне, ксеродермь! и других гиперкератинозньїх состояний, таких, как мозоли и со

Кегайовів ріїагів.

На оснований приведенньїх ранее научньїх наблюдений можно считать, что фармацевтические композиции, о з5 бСодержащие нативнье или рекомбинатнье ЗССЕ, пригодньі для лечения или профилактики различньх «г ихтиозов, акне, псориазов или других воспалительньїх кожньїх заболеваний, таких, как зкземь! с гиперкератозом, микробнье инфекции, и для залечивания ран, особенно при поверхностном нанесении.

Другой аспект изобретения относится к использоанию полипептида обладающего 5ССЕ активностью, для приготовления фармацевтических композиций для лечения или профилактики различньїх ихтиозов, акне, « псориазов или других воспалительньїх кожньїх заболеваний, сопровождающихся гиперкератозом, таких, как /-) с зкземь!.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения и/или предотвращения различньїхх ихтиозов, акне, ;» псориазов и других воспалительньїх кожньїх заболеваний, сопровождающихся гиперкератозом, таких как зкземьі, причем способ включает введение нуждающемуся в печений пациенту терапевтически или профилактически зффективного количества полипептида, обладающего ї5» ЗССЕ активностью. Обработка может бьіть профилактической, паллиативной или лечебной.

Предполагается, что "каскадная система" протеолитических знзимов существует в кожном окружении, о которая аналогична системе активации плазминогена. Предполагается, что ЗССЕ является одним из конечньїх 2) продуктов зтой системьі. Позтому предполагают, что активность ХССЕ можно ингибировать с помощью "ЗССЕ Мнгибитора". - В случае ряда кожньх заболеваний, таких, как автоиммуннье заболевания-пузьірчатки или ї» акантолитические заболевания, например, семейная пузьірчатка или болезнь Оагіегз существует когезия между кератиноцитами и ороговевшим жизненньім зпидермальньмм слоем /см. нарушения клеточной когезий в живом зпидермисе/. Считают что зтот процесс осуществляется за счет протеиназ, и позтому на него можно повлиять,

ВВоДдя соединение, которое способно ингибировать знзиматическую активность нативного ХЗССЕ. Может также оказаться вьгодньм вводить ЗССЕ ингибитор для лечения псориаза и других воспалительньїх кожньмх (Ф, заболеваний в состояниях, когда воспалительная компонента является преобладающей характеристикой. ка В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию ЗССЕ ингибитора, которьій оказьівает ингибирующее действие на знзиматическую активность нативного ЗССЕ, для приготовления фармацевтической бо Композиции для лечения или профилактики автоиммунньїх заболеваний-пузьірьчаток- или акантолитических заболеваний, таких, как семейная пузьірьчатка или болезнь Рагіег 5.

В настоящем контексте термин "ЗССЕ ингибитор" относится к существующему или новому соединению, которое может взаймодействовать с знзиматической активностью полипептидной последовательности или субпоследовательности изобретения или его аналога таким образом, что его ЗССЕ активность снижается. 65 Такое снижение можно определить, например, осуществляя зксперимент в соответствий со схемой примера 3.2, используя потенциальньй 5ССЕ ингибитор в качестве ингибитора. Указаннье соединения могут бьть органическими молекулами, небольшими пептидами или крупньмми полипептидами или производньіми любьїх указанньїх ранее. Такой подход может найти применение в программе скринирования лекарств для определения ЗССЕ ингибиторов.

Таким образом, следующий вариант настоящего изобретения относится к способу идентификации соединения, которое оказьваєт воздействие на знзиматическую активность нативного ЗССЕ, включающему использование рекомбинантного полипептида настоящего изобретения.

В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое обладаєт ингибирующим действием на знзиматическую активность нативного ЗССЕ. 70 В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое способно повьісить знзиматическую активность нативного или рекомбинантного ЗССЕ.

Важньм применением рекомбинантньїх полипептидов настоящего изобретения является скринирование лекарств. Полипептидьі настоящего изобретения можно использовать в скринирующей лекарства системе.

Настоящее изобретение относится также к способу идентификации соединения, которое способно превращать 7/5 прознзимную форму ЗССЕ в активньій ЗССЕ, содержащий полипептид настоящего изобретения.

В концепцию настоящего изобретения входит также использование аминокислотной последовательности, как указано ранее, для определения трехмерной структурь 5ССЕ полипептида для использования в созданий вещества, способного связьвать ЗССЕ полипептид, особенно для использования в созданиий лекарственного вещества, которое связьівает активньй сайт знзима.

И наконец, важньм аспектом настоящего изобретения являются различнье способь! регулирования активности, демонстрируемой 5ССЕ полипептидом. Зта активность может иметь важное значение для различньїх болезненньхх состояний, как бьіло указано ранее.

ДНК или РНК фрагмент, комплементарньй, по крайней мере, части мРНК, соответствующей полипептиду настоящего изобретения или его аналога, может бьіть зффективньїм в прекращений трансляции ЗССЕ мРНК в сч об Кклетках человека, и тем самьм, в ингибирований синтеза полипептида /полипептидов/. Зтот подход, которьй может оказаться интересньім при болезненньїх состояниях, в которьїх наблюдается более вьісокая нежели і) обьічно зкспрессия ЗССЕ, таких как автоиммуннье заболевания-пузьрьчатки или акантолитические заболевания, такие, как семейная пузьірьчатка и болезнь Оагіегз обьічно более известен как антисмьісловая олиготерапия и, позтому настоящее изобретение включаєт также и зтот подход. «Е зо Описание фигур Фиг.1

Однополярная клетка, отгтшелушившаяся с роговичного слоя пяточной поверхности ин витро. -

Поверхность ткани, которая ин виво смотрела вверх, на рисунке расположена зтой поверхностью вниз. со

Следует отметить, что наблюдается прогрессивная клеточная диссициация на зтой поверхности в процесе инкубирования, а на остальньїх поверхностях клеточной диссоциации не наблюдается. Фиг.2 о

Временная зависимость и действие апротинина на вьіделение клеток из роговичного слоя пяточной «г поверхности, инкубированного без /кружки/ и с /треугольники/ апротинином. Приведеньі средние значения /суммарньсе значения для четьірех образцов тканей/ и интервал достоверности. Фиг.З

Анти-десмоглеиновье /анти- ОС1/ реактивнье компонентьї в сплошном роговичном слое пяточной поверхности и в диссоциированньх Клетках. «

А. Окрашенньійй Соотизвіс БХОЗ-РАСЕ. з с В. Иммуноблот. 1-3: Связаннье ткани, неразбавленньєе /1/, разбавленньсе 1/3 /2/, разбавленньсе 1/9 /З3/. 4-5: диссоциированньсе клетки, неразбавленньє /4/, разбавленньсе 1/3 /5/. ;» Отмечаются только очевидно интактнье ЮС-1 с Мг 160кД в цельной ткани, и только продукть!ї разложения ро с Мг 95 и 80кКД в диссоциированньх клетках. Фиг.4

Временная зависимость и влияние апротинина на деградацию десмоглеина 1/00-1/ в роговичном слое ї5» пяточной поверхности, претерпевающей отшелушивание клеток ин витро. Денситометрическое сканирование иммуноблотов зкстрактов роговичного слоя пяточной поверхности, инкубированньій в отсутствии /А/ и в о присутствим /В/ апротинина /15мкМ/. Пик на 1бОкД соответствует интактньм 001. Пики на 95 и 80кКД 2) соответствуют продуктам деградации зтого протеина /см. фиг.3/. Отмечаєется зффективное ингибирование 5р апротинином деградации ОС1. Фиг.5. - Влияние ионов цинка /А/, химостатина и леупептина /В/ на деградацию десмоглеина 1/001/ в клетках ї» роговичного слоя пяточной поверхности, отшелушивающимся ин витро. Отмечается ингибирование трансформации анти- ЮОС1 позитивньїх компонентов из 160кД в 95 и 80кД за счет ионов цинка и химостатина, но не за счет леупептина. Фиг.б. 5Б Активность гидролиза пептидов, связанная с клетками роговичного слоя пяточной поверхности.

Загидролизом двух субстратов наблюдают, измеряя изменения в поглощении на 405нм. Среднее для трех

Ф) инкубирований. Квадрать! - 5-2586; кружки - 5-2288. Фиг.7 ка рН-зависимость корнеоцит-связанной 5-2586 гидролизующей активности. Среднее для трех инкубирований.

Квадрать - ацетат натрия, кружки - фосфат натрия, треугольники -Тгіз -НСЇІ. Фиг.8. 60 Зимография, демонстрирующая казейнолитическую активность в зкстрактах диссоциированньїх клеток роговичного слоя пяточной поверхности. См. также текст примера 2.2 для подробностей зксперимента.

А: Сравнение знзима из пяточньїх корнеоцитов, зкстрагированньїх образцов буфера Лазмли без восстанавливающего агента /Зс/5/ и КСІ/Зс/к/ с биічьим химотрипсином, 0,125нг/с/ и бьічьим трипсином, 0,5нг

Н/. Перед злектрофорезом КСІ-зкстракт диализуют против 5мММ Тгіз -НСІ, рН 6,8, и 5Д5 и глицерин добавляют б5 дО конечньх концентраций, как и в образцовом буфере; 1Омкл добавляют во все полось). Маркерь молекулярного веса приведень! слева.

В: Зависимость от рН инкубационного буфера. Источник знзима -5ЗД5-зкстрактьі диссоциированньмх пяточньїх корнеоцитов. Буферь! для предварительной обработки Тпйоп Х-100 и инкубирования: 0,1М ацетат натрия /РН Я би рН 5,5/, и 0,1М ТТтгіз -НС1 /рН 7,0 и рН 8,0/. Остальньсе условия как и для А.

С: Действие ингибиторов. Зе - 5Д5 - зкстракт пяточньїх корнеоцитов; с -бьічий химотрипсин; т -бьічий трипсин. Ингибиторьі присутствуют во время предварительной обработки Тпйоп Х-100 и последующего инкубирования. Конечная концентрация леупептина составляет 160мкМ апротинина 15мкМ, химостатина 40мкМ, и ионов цинка / в виде сульфата/ 100мкМ. Леупептин и химостатин добавляют в виде растворов в диметилсульфоксиде /ДМСО/. Буфер для предварительной обработки и инкубирования - 0,1М Тгіз -НСІ, рН 8 /р0 при конечной концентрации ДМСО 195 /обьем/обьем/. Остальньсе условия как и в А. Фиг.9.

Сравнение З5ССЕ, бьічьего химотрипсина и катепсина (з-ч-еловека в отношений де йствий ингибиторов /А; апротинин; В; химостатин, С; сульфат цинка/ и субстратной специфичности /Д/. Для д-С активность знзима без ингибиторов принимают за 10095. В Д активность знзима с МеоО- Зис-Агд-Рго-Туг-РМА принимают за 1. произвольную единицу. Фиг.10.

Афинная хроматография на ковалентне связанном ингибиторе трипсина сои /5ВТ/ . Пунктирная линия: поглощение на 280нм отражает концентрацию протеийна в злюате. Сплошная линия с незаполненньми квадратами: активность гидролиза пептида с 5-2586 в качестве субстрата, приведенная как изменение поглощения на 405нм. Сплошная линия с пустьмми кружками: Активность гидролиза пептида с 5-2288 в качестве субстрата, приведенная как изменение поглощения на 405нм, умноженная на 10. Фиг.11.

ЗДО -РАСЕ и Соотавіе-рІше -окрашивание /А/ и зимография после 5Д5 -РАСЕ с сополимеризованньім казеином /В/ фракций 2,6 и 10 из хроматограмм, представленньїх на фиг.10. Маркерь! молекулярного веса представлень! слева. В В: 1: группа казеинолитических компонентов, которне можно ингибировать леупептином /160мкМ/. С: группа казеинолитических компонентов, которне можно ингибировать химостатином /40мкмМ/.

Фиг.12. с

ЗД -РАСЕ 5ССЕ, очищенного с помощью афинной хроматографии на ЗВТ.-Атіде! 15. 12,590 гель. 1: невосстановленньй образец. о 2: Восстановленньй образец.

Маркерь! молекулярного веса представлень! слева. Фиг.13.

М-терминальная аминокислотная последовательность ЗССЕ. Звездочки означают неопределенности для «І зо предполагаемьх цистейнов в положениях 7 и 9. Знаки вопросов означают положения, в которьїх нельзя определить аминокислотнье производньсе, но на последующих стадиях нет снижения вьіхода. Фиг.14. --

Характеризация моноклональньїх антител ТЕ4Бб и ТЕ9Б за счет иммуноосаждения и иммуноблоттинга. со а: Соотазіе. -окрашенньй 12,596 ЗД5 -РАСЕ, невосстанавливающие условия.

Полоса1: Маркерь! молекулярного веса. о

Полосаг: КСІ-зкстракт, приготовленньй по способу примера 3.1, диссоциированньх пяточньїх корнеоцитов. «І

Полоса3: ЗССЕ, очищенньй по способу примера 4.1 с помощью афинной хроматографии на сделанном нерастворимьїм соевом трипсиновом ингибиторе. р: зимография иммуноосаждений в 12,5906 ЗДЗ-РАСЕ с 0,195 сополимеризованньмм термоденатурированньім казеином, Соотавіе - окрашенньй гель. «

Полоса1: Маркерь! молекулярного веса. шщ с Полоса?: КСІ-зкстракт, диализованньй по способу а. й Полосьї 3-6: Солюбилизованнье иммуноосадки с /слева направо/ моаб ТЕ4Бб /20мкг/, моаб ТЕЗ /Омкг/, «» моар Р /1Омкг/, и буферированньій фосфатом физиологический раствор. Моар Р/7 представляет собой мьішиное моноклональное антитело |/-51-карра типа к протеину зонь! беременности, и бьіл использован как неродственньй негативньй контроль. «» с: Иммуноблот из 12,596 ЗДЗ-РАСЕ /невосстанавливающие условия/.

Полоса!: биотинилированнье маркерьї молекулярного веса, детектируемье коньюгатами щелочная іні фосфатаза-авидин /Віогад/. Злектрофоретически обработанньй образец в полосах 2,4 и 6 тот же, что и в

Ге) полосе 2 в а, и в полосах 3,5 и 7 тот же, что в полосе З в а.

Полось 2 и 3: Первое антитело -моаб ТЕ4Б, 0,2мкг на мл. - Полось 4 и 5: Первое антитело - моар ТЕ9Б, 0, мкг/мл.

Та» Полось 6 и 7: Первое антитело - моар Р, 0,1мкг/мл.

Острия стрелок в а-с указьівают относительнье молекулярнье веса/сверху вниз/ 93, 66, 45, 31, 22 и 14кД, соответственно. Фиг.15.

Фиг.15 демонстрирует плазмиду р5 500. Зта плазмида содержит полной длиньі кКДНК ЗССЕ человека, клонированную в ресС19. Подробнее см. примерб. Фиг.16. іФ) Норзернблоттинг с МРНК, полученньіми из зпидермиса человека. Поли-Т-очищеннье РНК, соответсвующие ко примерно 100г полной РНК, нанесень в каждой полосе. 1: Гибридизацию осуществляют с зондом, полученньїм из 1070Бр Ніпс 2/Ніпс 2 фрагментом ЗССЕ-КДНК. во 2: гибридизацию ведут с зондом, полученньїм из 655 рр Ніпс 2/Вва! 2 фрагментом ЗССЕ-КДНК. Фиг.17. а. Соотазвіе - окрашенньй 5Д5-РАСЕ, 12,595 гель. 1 и 2: РВ5 -Тпйоп Х-100 нерастворимьїй осадок обработанньїх ультразвуком 0-2 клеток, трансформированньх р 510 и р 511 соответственно, и индуцированньх ІРТО-3: 5ССЕ, вьіделеннье из роговичного слоя пяточной поверхности человека.

БЮ. Иммуноблоть! с цьплячьей пре-иммунной сьівороткой /1-3/ и Ццьіплячьими анти-ЗССЕ /4-6/, 1 и 4: То-2 65 клетки, трансформированнье рз510 и индуцированнье ІРТО-2 и 5: ТО-2-клетки, трансформированнье рзоб11 и индуцированньсе ІРТО-3 и 6: ЗССЕ вьіделенньсе из роговичного слоя пяточной поверхности человека.

Образць подготовленьії кипячением в образцовом буфере с меркаптозтанолом. Фиг.18.

На фиг.18 представлена круговая карта вектора зкспрессии р5 507 сконструированного по способу примера 9. За счет вектора рЗ 507 осуществляєется зкспрессия рекомбинантного ЗССЕ человека в клетки млекопитающих. Фиг.19.

На фиг.19 представлен анализ зкспрессиий рекомбинантного человеческого ЗССЕ гена р5 507 в клетках млекопитающих.

Полоса!1: РНК клеток С127.

Полоса?: РНК из вьіделенного клона, 1:24, клеток С127, трансфецированньх р 507.

Полосаз: РНК из смеси популяций клонов С127, трансфецированньїх рЗ507.

Полось 4 и 5: РНК из С127 клеток, трансфецированньїх вектором зкспрессии, р51 47, которьій идентичен роОбО7, за исключением того, что в нем отсутствует 5ССЕ кДНК последовательность. Маркерьі размеров указаньї слева. Фиг.20.

ЗД5З-РАСЕ с последующим иммуноблоттингом ЗССЕ, зкспрессированньх в С127 клетки.

Полось 1 и 6: Предварительно окрашеннье маркерь! молекулярного веса /Віо-Бад, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 18,5кДа/

Полоса2: ре507/С127 , смесь , Т-склянки.

Полосаз: ре507/С127, смесь, роллер А

Полосад4: ре507/С127, смесь, роллер В.

Полосаб: Негативньй контроль ре522/С127.

Полоса7: Нативньйй ЗССЕ, полученньй из роговичного слоя.

Полосав: ре507/С127, клон 24, Т-склянки.

Полоса9: р5 507/С127, клон 24, роллер А

Полоса10: ре507/С127, клон 24, роллер В. Фиг.21. с

ЗД5З-РАСЕ /а/ и иммуноблоттинг /В/ рекомбинантного ЗССЕ, вьіделенного из клеточной С127 культуральной о средь за счет клеток, несущих плазмиду ро 507.

Полось 1 и 5: Предварительно окрашеннье маркерь! молекулярньїхх весов /Віо-Кадй, 106, 80, 49,5, 32,5,27,5и 18,5кДа/

Полоса2: Клеточная среда перед очисткой. «І

Полосаз: Несвязанньйй материал, собранньй с хроматограмм. «-

Полосайд: Связанньй материал, злюированньій буфером с низким рН. Фиг.22.

Нативньйй ЗССЕ и активньй рекомбинантньй 5ССЕ, анализированнье на их активность на казеиновом «ФО полиакриламидном геле. ю

Полось 1 и 10: Маркерь! молекулярньїх весов /Рпаптасіа 14-94кДа/.

Полоса?: Нативньй ЗССЕ. «

Полосаз: Нативньй ЗССЕ.

Полосьі 4-6: Рекомбинантньй ЗССЕ, расщепленньій в течение 1 часа, 3 часов и в течение ночи, соответственно /46Онг/ячейку/. «

Полоса7: Трипсин в том же количестве, что и в образцах в полосах 4-6, но без АРМ 5 Р.

Полосав8: Трипсин в том же количестве, что и в образцах в полосах 4-6, в присутствии того же количества т с АРМЄБР, что и в образцах. Фиг.23 "» Иммуноблот М-гликозидазьї РУ обработанньїх нативного и рекомбинантного ЗССЕ. Образцьі разделяют на " 8-1895 ЗДЗ-РАСЕ и иммуноблоттинг проведен как указано ранее.

Полоса!: Маркер молекулярного веса. Молекулярнье массьі, считая сверху: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5, и 18,БкДа. ве Полось 2 и 3: рекомбинантньій ЗССЕ, 0,3 иЗ мкг, соответственно. с Образць! в полосах З и 5 обработаньії М-гликозидазой

Примернь!: о Пример!1 -к 70 Доказательство того, что клетки, отгшелушивающиеся с поверхности ороговевшего поверхностного слоя кожи содержат разложившиеся десмосомальньсе протейнь, и что знзимом, которьй, по-видимому, ответственен ї» за зто, является химотрипсино-подобная протеиназа, которую могут ингибировать ионь! цинка. 1.1. Десквамация в роговичном слое

Целью исследования бьло вьяснить природу механизма, ответственного за клеточную когезию и 259 диссоциацию поверхностньїх клеток /десквамацию/ в ороговевшем слое кожи, зігайшт согпешт, Чешуйки

Ф! роговичного слоя толщиной 0,3-0.бмм, срезают параллельно поверхности кожи с пяточной поверхности добровольца с онормальной окожей. Зтот кусочек ткани опогружают в буферированньй фосфатом о физиологический раствор с 0,195 натрийазидом на три часа при комнатной температуре и слабо приклепленнье клетки с внешней поверхности /ин виво/ соскребают. Кусочки толщиной мм, нарезаннье перпендикулярно 60 поверхности ткани, помещают затем в среду, содержащую 0,1М Ттгіз-НСІ рН8, 5мМ ЕДТА, 0,195 азида натрия и 0,45956 агарозь, непосредственно перед гелеобразованием средьй за счет наличия агарозь. После инкубирования в течение 0,5 и 15 часов при 37"С, кусочки геля с тканью замораживают на сухом льду. 20мкм замороженньюе кусочки нарезают перпендикулярно поверхности кожи в криостате, укрепляют и исследуют в фазовом контрастном микроскопе. Наблюдается непрерьівное однополярное отшелушивание клеток с кусочков бо роговичного слоя пяточной поверхности, инкубируемьїх ин витро /фиг.1/. Клетки отшелушиваются только с той поверхности тканей, которье ин виво бьіли наружньми. Таким образом, наблюдаемьй процесс имитирует десквамацию.

Влияние температурь, рН и знзимньх ингибиторов

Затем бьіл разработан способ количественного определения отшелушивания клеток, которьій позволяет исследовать влияние различньїх параметров, таких, как температура, рН и знзимнье ингибиторьі. Цилиндрики роговичной оболочки пяточной поверхности с диаметром Змм получили с помощью устройства для биопсийи из чешуек ткани, взятой и замороженной из слабо прикрепленньїх поверхностньїх клеток, как бьіло указано ранее в 1.1. Зти цилиндрики /с определенной площадью поверхности, которая ин виво бьла обращена наружу/ 70 мнкубируют в О,5мл средьі), содержащей 0,1М Ттіз-НСІ рН8В , 5мМ ЕДТА, 0,195 азида натрия и апротинин /дх10бмоль/л/ или без него. /Воспгіпдег-Мапппеїт, Септапу/ в 1.5мл склянках Зппендорфа при 37"С в течение 5, 10 и 20 часов, а затем перемешивают в течение 10 секунд в смесителе для отделения диссоциированньїх поверхностньїх клеток.

Оставшуюся ткань удаляют и помещают в свежую среду для продолжения инкубирования . Ампуль! с 75 отделившимися клетками центрифугируют в течение 2 минут при 50009 для сбора клеток. Клеточнье осадки промьівают один раз О,5мл буферированного фосфатом физиологического раствора, а затем обрабатьівают при 60"С в течение 1,5 часа 0,бмл гидроксида натрия. Растворимьй в щелочи протеин определяют в соответствий с

Ї омгу еї аї., 1951, и берут за меру количества отделившихся клеток. Полученнье результать! представлень на фиг.2.

Аналогичньім образом исследуют влияние различньїх потенциальньїх ингибиторов /апротинина, ингибитора соевого трипсина , пепстатина /Воспгіпдег-Маппйеїп. Сегптапу/ и иодоацетамида /бідта, Її. Іоців, МО)/.

Отдельнье цилиндрики ткани в 2мм приготавливают и инкубируют со средой с различньми потенциальньми ингибиторами /или без них/ в концентрациях, указанньїх в таблицеї далее, в течение 16 часов при З38"С, и отделившиеся клетки подсчитьшают как бьло указано ранее. Следует отметить, что ЕДТА /которая Га представляет собой ингибитор металлопротеиназ / ббіла включена в инкубационную среду для достижения оптимальньх скоростей отторжения клеток. і)

Таблица!

Влияние ингибиторов протеазь! на отделение клеток с роговичного слоя пяточной поверхности ин витро.

Среднее и среднеквадратичное отклонение для пяти инкубированньх кусочков тканей. «Її -

С взяв 00000003 ов не ю зв з « й З с Бьіло обнаружено, что ингибиторь! серинпротеиназьії, апротинин и ингибитор соевого трипсина зффективно "з ингибируют отшелушивание клеток /фиг.2 и таблица! вьіше/. Так как зти два вещества бьіли ингибиторами, но ингибиторами металлопротейиназ /ЕДТА/ , тиолпротейиназ /иодоацетамид/, а аспарагиновльїх протеаз /пепстатин/ не бьіли, бьіл сделан вьівод, что серинпротеиназа принимаєет участие в наблюдаемом процессе. Пришли также к 395 вьіводу, что клеточная когезия в роговичном слое зависит от протеиновьїх структур, и что механизм, е аналогичньій наблюдаемому ин витро, должен также работать и в процессе десквамации ин виво /7ипавігот апа с Брадеїга 1988/.

В дальнейших исследованиях клеточного отшелушивания ин витро с роговичного слоя пяточной мні поверхности бьіло обнаружено, что зтот процесс можно разделить на две отдельнье стадии. Первая стадия - 20 имеет место независимо от того, присутствует ли ЕДТА в инкубационной среде, или нет. Вторая стадия

І» происходит только в присутствимй ЕДТА. Первую стадию можно ингибировать химостатином и ионами цинка, помимо апротинина. Вторую стадию можно ингибировать апротинином и химостатином. /7ипавігот апа радеїгиа 1990 а/. Химостатин является низкомолекулярньм ингибитором протеийназ с химотрипсино-подобной специфичностью к субстратам. Кроме того, біло обнаружено /7ипазігот апа Брдеїга 1990 а/ что леупептин, 59 низкомолекулярньій ингибитор протеиназ с трипсино-подобной специфичностью к субстрату, не оказьіваєт

ГФ) влияния на ин витро отшелушивания клеток. з Найболее вероятно, что протеиновье структурь!, которне отвственньі за клеточную когезию в роговичном слое, и таким образом являются возможньми кандидатами на деградацию в описанном ранее десквамационноподобном клеточном отшелушиваний, являются десмосомами. Десмосомь! состоят из двух бо симметричньїх половинок, которье расположень в непрерьвньх клетках. Две половинь! соединень! во внеклеточном пространстве трансмембранньіми протеинами, назьіваемьми десмоглеинами. 1.3. Судьба десмоглейна 1/00-1/ в процессе отшелушивания клеток ин витро

Исследуют судьбу десмоглейна 1/00-1/ в процессе отшелушивания клеток ин витро с роговичного слоя пяточной поверхности. Роговичньїй слой пяточной поверхности инкубируют, как бьіло указано ранее, в 1.1, и все бо еще когезивную ткань отделяют от диссоциированньїх клеток . Клетки и ткань зкстрагируют в буфере,

содержащем 0,1М ТТтівз-НСЇІ рН 9, 9М мочевинь,, 295 додецилсульфата, 195 меркаптозтанола, їмл буфера на 20мг ткани, в течение 15 часов при 377"С. Зкстракть! подготавливаются для злектрофореза на полиакриламидном геле в 7,595 гелях в присутствиий натрийдодецилсульфата /ЗД5З-РАСЕ/ в соовтетствии с указаниями І аеттії

Л аеттії,. 1970/, с последующим злектрофоретическим переносом /Том/ріп еї аі., 1979/ на нитроцеллюлозную мембрану /Віо-Кай, Кіспйтопа СА/, которая бьіла зондирована кроличьей поликлональной антисьівороткой, полученной против ЮО-1 вьіделенньїх с бьічьих морд /Согр»кКу еї аї., 1985/. Связаннье антитела детектируют с помощью щелочной фосфатазь, коньюгированной с козьими антикроличьими иммуноглобулинами /Віо-Кай,

КісптопасА/Віаке, еї а! 1984/. 70 Полученнье результатьі представленьії на фиг.3. Количества образца, добавляемого к иммуноблотам устанавливают таким, чтобьії установить примерно одинаковне концентрации протеинов/, что можно определить визуально по окрашенньм

Соотаззіе-рІше ЗД5З-РАСЕ гелям/для цельньїх тканей и диссоциированньїх клеток. Проводят несколько разбавлений зкстрактов для того, чтобьї обеспечить полу-количественное сравнение количеств различньх 7/5 анти-О6-1 реактивньїх компонентов в цельном роговичном слое и диссоциированньх клетках.

Если" все еще цельную ткань и диссоциированнье клетки зкстрагируют отдельно, обнаруживается, что тогда как все еще цельная ткань содержит только, по-видимому, интактнье 0-1, диссоциированнье поверхностнье клетки содержат только предполагаемьне продукть! разложения зтого протеина /фиг.3/.

На фиг.4 и 5 представленьь влияния апротинина, ийонов цинка, хи мое тати на /Воспгіпдег--Мапппеїт, Зептапу/ и леупептина /Воспгіпдег-Мапппеїт, бегтапу/ на деградацию 0-1 в процессе ин витро клеточного отшелушивания с роговичного слоя пяточной поверхности.

Во-первьїх, исследовали временную зависимость и влияние апротинина на деградацию десмоглеина 1/00-1/ в отшелушивании клеток роговичного слоя пяточной поверхности ин витро. Зкстракть! роговичного слоя пяточной поверхности инкубируют как указано в 1.2/ но без вбіделения цельной ткани от диссоциированньх с ов Кклеток перед зкстрагированием/ в присутствии апротинина /15мкл/ или без него, а затем зкстрагируют спустя 0, 6, 12 или 24 часа. БХД5З-РАСЕ и иммуноблоттинг проводят как указано ранее. Денситометрическое сканирование і) иммуноблотов проводят на Зпітадлу С5-900 сканирующем устройстве с летящим пятном /Зпітаадгу, Куойо,

Уарап/ в отраженном свете на 5б0нм в зигзагообразном режиме. Полученнье результать! приведень!ї на фиг.4.

Отмечается зффективное ингибирование апротинином деградации ЮО-1. «г зо Затем исследуют влияние ионов цинка, химостатина и леупептина на деградацию десмоглеина 1/05-1/ в процессе отшелушивания клеток роговичного слоя пяточной поверхности ин витро. Схема зксперимента - аналогична описанной ранее. Инкубирование ведут в течение 24 часов с сульфатом цинка в концентрациях 0, 1 со или 5ММ, и с химостатином или леупептином в концентрациях З30мкМ. Полученнье результать! демонстрируют ингибирование трансформации анти-00-1 позитивньїх компонентов из 1б0кД в 95мД за счет ийионов цинка и о

З5 Химостатина,но не за счет леупептина. «г

Из зтих результатов, очевидно, следует, что апротинин, ионьї цинка и химостатин оказались ингибиторами, а леупептин - нет. Так, характер ингибирования деградации 0О-1 оказался таким же, что и для отшелушивания клеток роговичного слоя пяточной поверхности ин витро /7ипавігот апа рдеїга 1990 бБ/.

Считалось важньм продемонстрировать, что механизмь, аналогичнье тем, которье ответственнь! за « отшелушивание клеток с роговичного слоя ладоней-подошв, проявляются также в роговичном слое кожи с в с других участков тела, нежели взятье с ладоней и подошв. /Такапавпі еї а/ї., /Такапазпі еї аї., 1987/ сообщил, . что смесь детергентов М,П-диметилдодециламиноксида /Зідта, 5, ||ців, МО/ и натрийдодецилсульфата и?» /Віо-Кай, Кісптопа, СА/ в молярном отношений 8:2 вьізьвает клеточную диссоциацию в роговичном слое, взятом не с поверхностей ладоней-подошв, подготовленном за счет трипсинизации целого зпидермиса. Чтобь иЗбежать загрязнений за счет зкзогенного трипсина, биопсин нормальной кожи человека с глутеальньхх участков їх инкубируют при рНВЗ с вьшеуказанной смесью детергентов и ЕДТА /Вдеїгидапа 7ипавзігот, 1990/, Бьіло обнаружено, что в таких условиях ороговевшие слой диссоциируют до отдельньх клеток, добавление о апротинина к инкубационной среде предотвращает такую клеточную диссоциацию. Бьіл сделан вьівод, что оо клеточная когезия и в роговичньїх слоях, взятьїх не с ладоней-подошв, зависит от структур тканей, то есть, десквамация в такой ткани зависит от протеолиза, и что зта ткань содержит протеиназу, которая может - катализировать такой протеолиз. Так как клеточная диссоциация включает лишь роговичньй слой, а не более ї» глубокие слой, не неороговевшие слой зпидермиса, бьіл сделан вьівод, что ответственная за зтот процесс протеиназа находится в более глубоких слоях в неактивном или ингибированном состоянии.

Пример2

Открьтие химотрипсинового знзима роговичного слоя /5ССЕ/: протеиназь), которая удовлетворяет критериям ответственности за деградацию внутриклеточньїх когезивньїх структур в роговичном слое ин витро, и (Ф, возможно также ин виво. ка Из зкспериментов примера! бьл сделан вьівод, что протеиназа, ответственная за диссоциацию однополярньїх поверхностньїх клеток в модели ин витро десквамации роговичного слоя пяточной поверхности бр должна обладать следующими свойствами: 1. Она должна присутствовать в роговичном слое. 2. Она должна бьїіть сериновой протеиназой. 3. Она должна обладать химотрипсино-подобной специфичностью к субстрату и характером ингибирования аналогичньмм тому, которьій наблюдают при отшелушивании клеток ин витро, и связанному с деградацией 65 десмоглеина 1. 4. Она должна бьїіть локализована внеклеточно в роговичном слое.

5. Она должна бьїть зависима от рН, что позволяло бьї ей бьіть активной в физиологических условиях, так как рН роговичного слоя составляет примерно 4, 5-6. 6. Так как отшелушивание клеток с роговичного слоя пяточной поверхности ин витро протекает непрерьівно

Во время пролонгированного времени инкубирования, даже если обьем инкубационной средь! очень велик по сравнению с обьемом инкубируемьїх кусочков ткани, или если инкубационная среда повторно меняется в процессе инкубирования, кажется разумньім предположить, что ответственньій знзим связан с тканью таким образом, что зто не позволяет зкстрагировать его в инкубационную среду в процессе инкубирования.

Нижеследующие два зксперимента привели к откритию ЗССЕ /рдеїгиа апа 2ипавігот, 19917; 70 2.1. Знзиматическая активность связана с диссоциированньіми корнеоцитами пяточной поверхности

Диссоциированньюе клетки роговичного слоя пяточной поверхности /корнеоцить/ получют за счет инкубирования роговичного слоя пяточной поверхности по способу примера 1. Клетки фильтруют через найлоновую сетку с размером отверстий 10мкМ, а затем триждьі! промьівают десятью обьемами 0,1М Тгівз -НСІ рН8, 5ММ ЕДТА и триждьі 0,1М Тгіз-НСІ рН8. Затем зти клетки инкубируют с двумя типами хромогенньх /5 протеиназньйх субстратов 5-2288 или 5-2586 /Кааї Оіадповзіїса, 5іоКпоЇт, Змедеп/ Пе-Рго-Агд-р-нитроанилид 7/5-2288/ расщепляется щироким кругом сериновьїх протеиназ с аргинино-специфичностью /например, трипсин/.

Агд-Рго-Туг-р-нитроанилид /5-2586/ является субстратом для химотрипсино-подобньх протеийназ.

В полном обьеме 120мкл каждая реакционная смесь содержит 0,07М Тгіз-НСЇІ рн, 0,195 азида натрия, 1,2,5, 5 или 1Омкл 2595 суспензии промьїтьїх корнеоцитов с пяточной поверхности и 1,04мМ /5 -2586/ или 1,25мММ 78-2288/ субстрата. После инкубирования в течение 5 часов при 37"С в микротитровальньїх пластинах реакцию останавливают, добавляя 125мкл 1095 уксусной кислоть. Клеткам дают осесть, и по 200мкг каждой надосадочной жидкости переносят в новье ячейки. За гидролизом двух субстратов следят, измеряя изменения в поглощении на 405нм, после того, как клетки переносят в Вепйгіпуд Еїїза Ргосезвог /Вспгіпдугегке, Магрига,

Обегтапу/. сч

Как показано на фиг.б, существует знзиматическая активность связанная с диссоциированньіми корнеоцитами пяточной поверхности, которая катализирует гидролиз 5-2586. При сравнении активность по і) отношению к 5-2288 оказьівается низкой. рН-зависимость гидролитической активности 5-2586 исследуют после зтого. Схема зксперимента соответствует представленной ранее, используют 1Омкл 2595 суспензии промьїтьїх корнеоцитов пяточной «г зо поверхности и буферь с различньми рН /ацетат натрия, фосфат натрия или Ттгіз-НС/. Конечная концентрация буфера составляет 0,07М. Полученнье результать! представлень на фиг.7, из которого следует, что активность 87 оптимальна при рН 7-8, но достаточно значительна и при рН5,5. с

В дальнейшем зксперименте исследуют влияния ЗДТА, ионов метллов и ингибиторов протеиназ на гидролиз 5-2586 при рНВ8 за счет протеиназьі, связанной с суспендированньми клетками роговичного слоя пяточной о з5 поверхности. Схема зксперимента представлена ранее и в таблице?. «Е

Таблица?

Влияние ЕДТА, ионов металлов и ингибиторов протеийназьій на гидролиз 5-2586 за счет протеиназь, связанной с клетками роговичного слоя пяточной поверхности /источник знзима: суспендированнье клетки/ «

Іппірйог о |Сопсепігайоп | Асіїміу (95) -о ингибитор концентрация (Активность (90) (50, п-3) - юю, г» з в» й о

ЩЕ г

Примечания к таблице: іФ) а/ Вещество присутствует в аналитической смеси ко в) 2595 суспензия клеток роговичного слоя пяточной поверхности приготовленная как указано в тексте, била предварительно инкубирована в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствий ТММ РМ5Р Зідта, 51, 6о Гоців, МО/ растворенного в 2-пропаноле /конечная концентрация 2-пропанола 496 обьем/обьем/. Контрольнье суспензии предварительно инкубируют только с 495 2-пропанолом. с/ Ингибитор, растворенньй в диметилсульфоксиде /ДМСО/. Все средьі включая контроли, содержат 595 /обьем/обьем/ ДМСО.

Как видно из таблицьі2, фенилметилсульфонилфторид /РМЗЕ; общий ингибитор сериновьїх протеиназ)/, б5 апротинин, ингибитор соевого трипсина, химостатин /ингибитор химотрипсина)/, и ионь! цинка, но не леупептин / ингибитор трипсина/ ингибируют 5-2586 гидролитическую активность. Характер ингибитора позтому весьма аналогичен характеру наблюдаемому при отшелушивании клеток ин витро и связанной деградацией десмоглейина 1. 2.2. Зимография диссоциированного роговичного слоя пяточной поверхности

Бьіло обнаружено, что знзим, ответственньій за гидролитическую активность 5-2586, раскрьттую в 2.1, может бьїть солюбилизирован, если корнеоцить! зкстрагируют 1М КСІ в 0,1М Ттів-НСІ рНв8. Позтому бьіли проведень зксперименть! с зимографией. По зтой причине КСІ зкстрактьї корнеоцитов приготовили для злектрофореза по способу Лазмли /Лаеттії, 1970/, но без восстанавливающего агента в образцовом буфере, и не нагревая образцьі. Приготовили также образцьі за счет зкстрагирования диссоциированньїх корнеоцитов пяточной 7/0 поверхности с образцовьім буфером Лазмли без восстанавливающего агента при комнатной температуре. Для зимографии адаптировали модифицированную процедуру Ногіе еї аі/ Ногіе еї аїІ., 1984/. Злектрофорез на полиакриламидном геле ведут в присутствиий натрийдодецилсульфата /ЗД5-РАСЕ/ по способу Лазмли в 12,595 гелях с 195 сополимеризованньмм термоденатурированньім казеином. После злектрофореза зти гели погружают в буфер, содержащий 295 Ттйоп х-100 на 1 час при комнатной температуре для удаления 5Д5, а затем инкубируют при 37"С в течение 15 часов. Затем гели окрашивают Отдельнье казеинолитические знзимь! проявились как прозрачнье полосьі на голубом фоне. См. также пояснения к фиг.8 для подробностей зксперимента.

Полученнье результать! представлень на фиг.8. Зкстрактьї корнеоцитов пяточной поверхности, содержат один основной казеинолитическии знзим с кажущимся молекулярньім весом около 25кД. Наблюдаются также го Меньшие казейнолитические знзимьі с молекулярньми весами около ЗОкД. /Зти меньшие компоненть! на рисунке видньі не отчетливо. Позднее бьіло обнаружено, что их можно ингибировать леупептином, а не химостатином/. 25кД знзим обладаєт значительной активностью при рН 5,5-8. Его можно ингибировать апротинином, ионами цинка и химостатином, но не леупептином. Таким образом, он имеет такой же характер ингибирования, что и указанная ранее гидролитическая активность 5-2586. В зкспериментах с сч гельхроматографией исключения /не показань/ 25кД казеинолитическии знзим, как бьло обнаружено, проявляется вместе с 5-2586 гидролитической активностью. і)

В последующим зкспериментах /не представлень/ с описанной ранее методикой в 2.2; било обнаружено, что роговичньій слой не с ладоней и подошв содержит знзим со свойствами, практически идентичньмми свойствам 25кКД протейиназьі, связанной с корнеоцитами пяточной поверхности, которье с зтого момента будем назьвать «Е

Зо Химотрипсиновьм знзимом роговичного слоя /ЗССЕ/ гим/авігот апа Едеїгна. 19917.

Оказалось возможньм также получить доказательства того, что ЗССЕ связан с корнеоцитами пяточной - поверхности таким образом, что зто позволяет ему бьіть активньім во внеклеточном пространстве роговичного (є слоя. Зто бьіло сделано первой демонстрацией того, что диссоциированнье корнеоцить! проницаемь! для пероксидазь! хрена /Мг 44кД/. Бьіло показано затем, что фибриноген человека /Мг 340кД/ может деградировать о з5 под действием суспензии корнеоцитов, и что зту деградацию можно ингибировать теми же ингибиторами, что й «г

ЗССЕ, Отсюда можно сделать вьівод, что деградация фибриногена связана с солюбилизированньм знзимом /Едеїга 1992/,

Примерз

Частичная очистка химотрипсинового знзима роговичной оболочки /5ССЕ/ и анализ протеиназь с « Хромогенньми субстратами в с 3.1. Получение КСІ зкстрактов корнеоцитов пяточной поверхности

Получение диссоциированньїх корнеоцитов пяточной поверхности по способу примера! бьло проведено в ;» большем масштабе, и бьли полученьй КСі-зкстрактьь промьїтьх корнеоцитов пяточной поверхности, содержащие ЗССЕ, как описано в примерег,

Получение КС! зкстрактов корнеоцитов пяточной поверхности схематически представлено в таблицез ї5» далее. Гиперпластичньй роговичньій слой пяточной поверхности собирают с помощью общества Змжмедівзп

Реадісугівів. о Использовали только материал, полученньій с помощью ножниц или ш, игщов. Материал не брали с ног, оо пораженньїх заболеваниями связанньми с отшелушиванием. Перед посьілкой роговичньій слой сушили на аю воздухе и упаковьівали в пластиковье пакетьі. В лаборатории материал хранился при -207С до использования. с»

Ф) іме) 60 б5

Таблица 3

Схаметическое представленне получения ФССЕ-содержащих

КС1 зкстрактов диссоцнированньх корнеоцитов пяточной поверхности роговичньй слой пяточной поверхности 50 г прі ниці ННЯ під НО Ніни Нр іо ЛЬ ііі ль іній

Инкубируют при 379С в течение 24 часов 1 720 в 1000 мл 0,1 М Тг;-нНсС1і рн 8 5 ММ ЕДТА, 0,15 На-азида с 25 надосадочная Центрифугируют при 740 х 9 5 минут о жЖжидкоОость

Промьівают осадок 5 х 600 мл « 30 « «- промьіВвКки о,1 М тго -НС1 рн, со

Центрифугируют как указано ранее ів) 35 « "ин дн нн ль нн. пу чобоні печі тет т неначе

Зкстракт осадка с 1 обьемом « у - 2 М КС1 в 0,1 М Тгое -НС1 рн 8 с в)

Із» 30 минут при 4-С Зкстракт 1

Центрифугируют как указано ранее /около 250 мл/ щ» 1 о Промьівают осадок 1 обьемом шу . ге 1М кКсСІ в 0,1 М Ттгй -нс1і рн Зкстракт 2

Центрифугируют как указано ранее /около 150 мл/

Ф) о Осадок 60 Для каждой последующей стадии афинной хроматографии собирают зкстракть! 1 и 2 (из двух получений по 50г каждоє) роговичного слоя пяточной поверхности 3.2 Анализь! протеиназ хромогенньіми субстратами

Проводят сравнение ЗССЕ, бьчьего химотрипсина и катепсина С человека в отношений влияния ингибиторов апротинина, химостатина, сульфата цинка и специфичности субстрата.

Исходньій раствор МеО-5ис-Аго-Рго-Туг-РМА /5-2586/ приготавливают в дистиллированной воде, раствор бо Вис-АІіа-АіІа-Рго-Рпе-рМА /Военйгіпдег, Мапппеїйт, Сегптапу/ в 1-метил-2-пирролидоне /конечная концентрация растворителя в инкубационньїх смесях 495/ и химостатина в диметилсульфоксиде /конечная концентрация растворителя в инкубационньіїх смесях 195/. Катепсин З из гнойной мокроть! человека получают от Е. 72 оці,

Сепема, Зм/йгепапа. Источником 5ССЕ служит КСІ-зкстракт диссоциированньїх корнеоцитов рого-вичного слоя пяточной поверхности, полученньїх как описано ранее. Источники ингибирования апротинина, химостатина и сульфата цинка описань! ранее.

Инкубирование ведут при 37"С в микротитровальньїх пластинах. Полньій обьем инкубирования составляет 135мкл. Каждая инкубационная смесь содержит Тгіз-НСІ рНа8,О /конечная концентрация 0,08М/, КСІ /конечная концентрация 0,2М/, 1О0Омкл раствора субстрата, 25мкл источника знзима/ соответствующим образом 70 разбавленного в 0,1М Тгіз-НСІ рНа,О, 1,0М КСІ/ и 10мкл раствора ингибитора.

На фиг.9 А-С , МеО-5ис-Ага-Рго-Тур-рРМА/ 5-2586, начальналбная концентрация 1,2мММ/ использован в качестве субстрата. В Д начальная концентрация обоих субстратов составляет 1,2мММ.

К концу инкубирования /1,5 часа/ добавляют по 125мкл 1095 уксусной кислотьі в каждую ячейку, и поглощение считьявают на 405нм, используя в качестве сравнения инкубационнье смеси без добавления 7/5 знзимов. Количество добавляємьїх знзимов устанавливают таким, чтобьї изменения поглощения на 405нм к концу инкубации составляло бьї 0,3-0,7.

Полученнье результатьї суммированьі на фиг.9, А - Д. Для того, чтобьі изучить влияние ингибиторов, в качестве субстрата используют 5-2586. Зфофективность апротинина в качестве ингибитора ЗССЕ и химотрипсина оказалась вьісокой и примерно одинаковой для зтих двух знзимов. С другой стороньі, влияние на го Ккатепсин (- гораздо меньше /фиг.9А/. Химостатин приводит к ингибированию всех трех знзимов, но концентрация ингибитора, которая обеспечиваєт 5095 ингибиторование более чем на три порядка величинь! вьіше для 5ССЕ, нежели для химотрипсина и катепсина СП/фиг.98/. Сульфат цинка оказьівается зффективньм ингибитором, ЗССЕ, но не химотрипсина и катепсина О- /фиг.9С/,. Активность трех знзимов против субстратов мМео-зЗис-Аго-Ргуд-Туг-ріМА /5-2586/ и Зйис-АІа-Аіа-Рго-Рпе-рМА сравнивают /см. фиг.9 Д/. Так какцель состоялав су определений сходства или различий между исследованньми знзимами, зти зксперименть! проводили только с одной исходной концентрацией для каждого субстрата. Тогда как Зис-АІа-АІа-Рг о-Рне-Л МА являются, і) по-видимому, гораздо лучшим субстратом, нежели 5-2586 для химотрипсина и катепсина сО-, для 5ССЕ справедливо обратное.

Примері «І

Очистка М-терминальной аминокислотной последовательности, определяющей химотрипсиновьй знзим роговичного слоя - 4.1. Вьіделение 5ССЕ из КСі-зкстрактов корнеоцитов с помощью оафинной хроматографии на со несолюбилизированном ингибиторе соевого трипсина /5ВТ1/.

На фиг.10 представлень результатьь афинной хроматографии на ЗВТІ. Афинньій гель приготавливают, юю связьівая 50мг ЗВТ /Воепгіпдег, Маппйеїт, Септапу/ с 12мл осажденного Айіде! 15 /Віо-Кад, Кісптопа, СА/, в «І соответствии с рекомендациями изготовителя. Остальнье активнье группьі на геле бьли блокировань зтаноламином. Обьединеннье КСі-зкстрактьь из 100г /сухой вес/ роговичного слоя пяточной поверхности /полньій обьем 70О0мл/ пропустили через 0,8х2см слой ЗВТІ - Айіде! 15 набитьій в стеклянную колонку, при « скорости 42мл/час с непрерьвной записью поглощения злюата на 28Онм. Колонку промьвают 01М

Тгів-НСТ рН8, 1М КСІ, до тех пор, пока поглощениє злюата не становится менее 0,01, а затем 1їОмл 01М - с Тгів-НСІ рН8. Позтапное злюирование связанного материала осуществляют НОСІ при 1, 10 и 100мММ. Злюент а заменяют, когда поглощение злюата снижаєтся ниже 0,01. Фракция по Змл собирают в тестовье ампуль,, "» которье содержат Ттіз-НСІ рН8, полньій обьем 0,4мл, в количестве; расчитанном таким образом, чтобь! зтого бьіло достаточно для установления рН злюата вьіше 7. рН каждой фракции немедленно проверяют и, при необходимости, устанавливают около 7 за счет небольших обьемов 1М Ттгіз-НС1, рН8. Анализь! пептидной т» гидролизующей активности с 5-2586 /субстрат для ЗССЕ/ и 5-2288 /субстрат для трипсино-подобньїх знзимов/ сл проводят по способу примера 2.1. Начальная концентрация обоих субстратов в аналитических смесях составляет 1,1ММ. Примерно 9095 5-2586 гидролизующей активности связана с гелем. После позтапного (95) злюирования промьїтого геля с 10-100мМ НС, примерно 6095 от полной 5-2586 гидролизующей активности в шу 50 нанесенном КСІ-зкстракте можно вьіделить. Из полной 5-2288 гидролизующей активности около 2090 оказьівается связанной с афинностью геля и 1095 можно вьіделить в злюате.

Я» Фиг.11 демонстрирует анализ злюата из ЗВТ! -афинной хроматографии с озлектрофорезом на полиакриламидном геле в присутствимй ЗДО /5Д5-РАСЕ/ и с зимографией. Обработали на 12,595 гелях невосстановленнье образцьі. См. также Едеїга апа 7ипавігот 1991 и пример 2, 2.2 для подробностей зксперимента. Перед подготовкой для злектрофореза образцьі концентрируют примерно в 20 раз в А с о помощью центрифужной фильтрации на Шпгаїее -МС-фильтрах /срезают10 кД'Міййроге, Вега, МА/ и разбавляют в 10 раз в В. де Фиг.12 представляет сравнение с помощью ЗД5З-РАСЕ невосстановленного и восстановленного образцов из

ЗВТІ афинной хроматографии. 60 Как следует из фиг.10 и 11, З5ВТІ -афинная хроматография дает протеин, которьій имеет степень чистоть более 9095 /о чем можно судить по Соотавззіе-бІце -окрашенньм ЗД5-РАСЕ гелям/ с кажущимся молекулярньм весом около 25кд в невосстановленной форме и около 28кД в восстановленной форме. Кроме того, существует небольшая Соотаззіе-ріше -позитивная компонента с кажущимся молекулярньм весом примерно на їкД больше, нежели основная компонента. При зимографии гелей наблюдается одна основная и одна небольшая б5 полоса с теми же самьми злектрофоретическими подвижностями, что и у двух полос детектируемьх на

Соотазвзіе-рбІче -окрашенньїх гелях с невосстановленньми образцами. Обе зти казеинолитические компоненть!

можно ингибировать химостатином. В дополнение, зимография показьвает небольшие компоненть! с кажущимися молекулярньіми весами около ЗОкД, которне можно ингибировать леупептином. Бьіл сделан вьівод, что основнь!м вьіделенньім протеином является 5ССЕ. 4.2. Анализ К-терминальной аминокислотной последовательности ЗССЕ 20Омкл фракции из хромограммь с ЗВТ! - АйЙідеІ 15, Аовонм 0,2, приготавливают из ЗДЗ-РАСЕ с восстановлением или без него, и обрабатьвают на 12,595 полиакриламидном геле /лолщина їмм, ширина щели 7Змм/. После злектрофореза вьіделеннье протеинь! переносят злектрофоретически на Іттобіп фильтр /МіШіроге/ и окрашивают Соотазвззіе-рІце по способу Маїзцааїга, 1987. Основную протеиновую полосу вьірезают и 7/0 обрабатьвают в Арріїед.

Віозувіет 477А импульсном жидкофазном анализаторе аминокислотньхх последовательностей с подключенньм РТН 120А анализатором /Арріїедй Ішс., Ровіеєг СПУ, СА, ОБА/. Секвенирование осуществляют в соответствии с установленньми циклическими программами и химикалиями от изготовителей. Начальньй и повторньсе вьіходьі, рассчитанньсе с учетом стандартньїх протеинов составляют 2595 и 9790 соответственно.

Вьїходьії производньїх аминокислот соответствуют только одному секвенированному пептиду. Для невосстановленньїх бразцов вьїходь! бьіли хорошими на стадиях 1-6, но падали до О на стадиях 7 и 9. Вьіходь на последующим стадиях бьіли заметно снижень. Хотя для восстановленньх образцов на стадиях 7 и 9 не бьіли обнаруженьї производнье аминокислот, но для последующих стадий, где можно бьло детектировать производнье, падения вьїходов не наблюдалось. Зти результатьь дают возможность предположить, что в го положениях 7 и 9 имеются цистеиньі. ОДнако, оказалось невозможньм обнаружить карбоксиметилированньй цистеин на стадиях 7 и 9 после восстановления и обработки иодоуксусной кислотой /Л00мМ/. Полученная последовательность /фиг.13 оследовательность 1Д Мо3/ бьла идентична для восстановленньїх и невосстановленньїх образцов.

Примербо сч 5.1. Получение БССЕ-специфических моноклональньх антител

Мьішам ВАГ В /с/Вотпоїюаага, Септигк/ вводят примерно ЗОмкг нативного ЗССЕ, очищенного по способу і) примера 4.1, в полном адьюванте Фрайнда /Оіїсо І арімагієв, Ойгоїї, МІ/ в виде подкожньїх иньекций. Иньекции с тем же количеством ЗССЕ в неполном адьюванте Фрейнда/Оіїсо І арімайгіев, Ойгоїї, МІ/ повторяют через месяц. Спустя 4 месяца после первой иньекциий одной мьіши внутривенно вводят бустернье иньекции в З «Е зо последующих дня, по ЗОмкг антигена за иньекцию. Гибридомь! получают по способу описанному Сагіззоп еї аї|., 1985, с клетками 5Р2/0 миеломной клеточной линии /"АТСС СВІ. 1581/, Идентификацию антител реагирующих с. ї7 очищенньіми препаратами ведут с помощью Е ТА. Надосадочнье культуральнье жидкости позитивньх клонов (се анализируют далее с помощью иммуноблоттинга после ЗДЗ-РАСЕ. Клоньі, которне продуцируют антитела, реагирующие с 5ССЕ в зтом тесте, размножают в мьішиной асцитной жидкости, и антитела вьіделяют с о з5 помощью Протеин А афинной хроматографии и классифицируют по способу, описанному в Сагізвоп 1985. («ф

Получают два подходящих антитела, моар ТЕ4Б и моао ТЕ9Б, причем оба они классифицировань! как

ІдО 4 О-каппа.

Характеризация моаб ТЕ4Б и моар ТЕ9Ь с помощью иммуноосаждения и иммуноблоттинга представлена на фиг.14. «

Фиг.14а /полоса 2/ представляет Соомаззіе Біше -крашенньй ЗД5-РАСЕ гель с концентрированньм шщ с КСІ-зкстрактом диссоциированньїх корнеоцитов пяточной поверхности, полученньй по способу примера 3.1. й Образец диализуют в течение 4 часов против 0,1М ацетата натрия, рН4, и концентрируют приблизительно в 100 «» раз за счет ультрафильтрации перед проведением злектрофореза. Фиг.14а /полоса 3/ представляет получение

ЗССЕ, очищенного по способу примера 4.1.

Фиг.146 представляет результать! зксперимента иммуноосаждения, в котором антитела бьіли инкубировань! ї» с КСіІ-зкстрактом корнеоцитов, а затем вьіделеньй за счет инсолюбилизированного протеина А. Повторно солюбилизированнье и диссоциированнье комплексь! антитело-антитело бьіли проанализированьі с помощью іні зимографии пс способу примера?г.

Ге) 25О0мкл КСіІ-зкстракта диссоциированньїх корнеоцитої пяточной поверхности, которье бьли в 5 раз з ю сконцентрировань з; счет ультрафильтрации, диализуют против буферированного фосфатом физиологического раствора, к которому бьл добавлен альбумин бьічьей сьіворотки /Зідта, Зі, айв, МО/ до конечной

Та» концентрации 1Омг/мл, смешивают с 7Омкл раствора оантител или буферированного фосфатом физиологического раствора, и инкубируют в течение 15 часов при 4"С. 25мкл осажденной Протеин А Сефарозь / Рпаптасіа, Оррзаїа, Змедеп/ добавляют затем в ампульі, и инкубирование продолжают при осторожном Встряхиваний при комнатной температуре в течение 2 чсов. Гель вьіделяют центрифугированием и пять раз промьівают Тмл 0,0595 Тмееп 20 /Зідта, 51, І оців, МО/ в 0,05М Ттгіз-НСІ, рН7,5, О0,5М Пасі. После окончательной іФ) промьівки гель зкстрагируют 100мкл бразцового буфера Лазмли без восстанавливающего агента в течение 1 ко часа при комнатной температуре. Зти зкстрактьї очищают центрифугированием и наносят на гель.

Мого ТЕ4Б и ТЕ9Б, оба осаждают казеинолитический знзим, с тем же самьїм Мг, что и очищенньйй ЗССЕ, и бо соответствующий основной казеийнолитический знзим в КСіІ-зкстракте Антитела не осаждают меньшие казеинолитические знзимь в зкстракте с Мг около ЗОкДа, которье, как бьло показано, ингибируются леупептином, ингибитором трипсино-подобньїх сериновьїх опротеиназ. В дополнение к 25кКДа казеинолитическому знзиму антитела, по-видимому, связьівают небольшой протеинолитический компонент с Мг около 8окДа. Зтот компонент обьчно присутствует в КСіІ-зкстрактах корнеоцитов пяточной поверхности, б5 полученньїх из ткани, которая бьіла вьісушена перед приготовлением, но не бьіл обнаружен в препаратах из свежей ткани /Т. ЕдеїІгид, неопубликованнье наблюдения/.

Он не присутствует в ЗССЕ-препаратах, вьіделенньїх с помощью афинной хроматографии, и может присутствовать в продуктах агрегации. Не удалось обнаружить соответствующую компоненту, реагирующую с антителами на иммуноблотах.

На иммуноблотах ЗДЗ-РАСЕ гелей проведенньїх в невосстанавливающих условиях, /фиг.14с/ моар ТЕ4Бб и

ТЕЗ9Ь реагируют с компонентой, присутствующей в КС1-зкстрактах корнеоцитов пяточной поверхности /фиг.14с полось 2 и 4/ и в очищенньїх ЗССЕ-препаратах /фиг.14с, полось З и 5/, причем оба они имеют то же МГ, что и

Основной вьіделенньій протеийн, и основная казейнолитическая компонента на зимограммах. Зти антитела оказались нереакционноспособньіми с образцами, которье бьіли восстановленьй в присутствий ЗД5, что 7/0 предполагает, что они направлень! против конформационно-зависимьх зпитопов.

Помимо основного протеина с Мг около 25кД в невосстановленной форме, очищенньй 5ССЕ-препарат содержит небольшую Соотаззіе Біце компоненту с Мг около 26бкД /невосстановленньій; см. пример 3/. На зимограммах соответствующая казеийнолитическая компонента присутствует, и может бьіть ингибирована химостатином способом, аналогичньм способу для основной 25кд казейнолитической компоненть! /см. /5 примерз/. При более вьісоких концентрациях моао ТЕ4Б5 и ТЕ9БЬ /результать! не представлень/ также можно видеть зту небольшую компоненту, реагирующую с антителами на иммуноблотах. Аналогичнье результать /не представлень/ бьіли полученьі с поликлональньми кроличьими антителами, вьіработанньми против Соомазвзіе

Біше -позитивной компонентьії, вбіделенной с помощью препаративного злектрофореза. Точное соотношение между двумя протеинами с ЗССЕ-подобной активностью и кажущейся иммунологической перекрестной го реакцией неизвестно. 5.2. Антитела, специфические для поликлональньїх 5ССЕ. 5.2.1. Цьіплячьи анти- БССЕ 45 мкг

ЗССЕ, вьіделенньїх с помощью ЗВТ -афинной хроматографии по способу примера 4.1/ в О0,2мл 0,1М Ттів-НСЇІ термоденатурируют в течение 6О минут при 6б0"С и гомогенизируют в равном обьеме полного адьюванта с

Фрейнда /Оіїсо І арогафгіев/.

Полученную змульсию вводят подкожно в Оегсо цьіплят, приблизительно 20 недельного возраста, у которьсх і) отбирали образцьї крови для приготовления пре-иммунной сьіворотки. Цьіплятам ввели дополнительнье подкожнье иньекции змульсий, полученньїх как описано ранее, но с неполньм адьювантом Фрейнда и с ЗОмкг очищенного, термоденатурированного ЗССЕ /полньій обьем каждой змульсиий 25О0мкл/ после 3, 5 и 7 недель. У «г зо Чьіплят собрали кровь через 2 недели после последней иньекции. Зту кровь немедленно смешивают с 2 обьемами раствора АІземегз /на 100мл: 1,87г глюкозь, 0,8г цитрата натрия, 0,62г хлорида натрия, лимонная - кислота до рНб,1/ и центрифугируют. Цьшплячьи анти-ЗССЕ, вьібраннье для дальнейших исследований, с используют в разбавлениях 1/2000 в зкспериментах с иммуноблоттингом. См. фиг.17, пример8 для иллюстрации специфичности антисьіворотки. о 5.2.2. Кроличий анти-ЗССЕ «г

ЗССЕ, вьіделенньій с помощью ЗВТ -афинной хроматографии подвергают ЗД5-РАСЕ без восстановления, как описано в примере 4.1, на гелях с толщиной 15мм в соответствий с данньми

Лазмли 1970. Основная протеиновая полоса, которая как ранее бьіло показано, является ЗССЕ, бьіла визуализирована с помощью метода окрашивания хлоридом меди, в соответствий с работой «

Ї ее еї аїЇ, 1987/, и ее вьірезают. После удаления хлорида меди с ЕДТА по способу І ее еї аї., срезь! геля з с гомогенизируют в буферированном фосфатом физиологическом растворе. Образць! гомогенизированньх кусочков геля суспендируют в равньїх обьемах адьюванта Фрейнда. Приблизительно ЗОмкг чистого 5ССЕ, ;» полученного таким образом в полном адьюванте, вводят подкожно кролику. Через 3, 5 и 7 недель иньекцию повторяют с тем же количеством ЗССЕ, но с неполньім адьювантом. Кровь у кролика отбирают через две недели после последней иньекции. їх Полученньй кроличий анти-ЗССЕ /Д-5/ используют в разбавлений 1/500-14/1000 в зкспериментах с иммуноблотами со щелочной фосфатазой, коньюгированной с анти-кроличьими иммуноглобулинами в качестве о второго антитела. оо Во всех зкспериментах иммуноблоттинга связаннье вторье антитела определяют по способу Віаке еї а), 0/0 1984 (относится к примерам 5, 8 и 9). - Кроличьи анти-ЗССЕ Во-1 получают таким же образом, но с ЗССЕ, которье бьіли восстановленьі перед ї» ЗДЗ-РАСЕ, в качестве антигена, 5.3. Иммуногистохимические исследования с моноклональньми антителами

В иммуногистохимических исследованиях с 5ССЕ-специфическими моноклональньми антителами, ЗССЕ боб Можно детектировать в вьісоких супрабазальньїх клетках кератинизирующего чешуйчатого зпителия человека /зпидермис, внутренняя оболочка корней волосяньїх фолликул, твердая опластина/ но не в (Ф, некератинизированном чешуйчатом зпителии / внутренняя корневая оболочка волосяньіїх фолликул,слизь губ и ка с внутренней поверхности щек/. ЗССЕ можно специфически зкспрессировать в кератинизирующий чешуйчатьйй зпителий. Кроме того, биілорбнаружено, что ЗССЕ зкспрессируется в вьісокие 60 супербазальнье клетки зпидермиса человека, реконструированнье ин витро и вьіращеннье на границе раздела воздух-вода. Если к среде добавить ретинольную кислоту в концентрации, которая стимулирует пролиферацию кератиноцитов , но ингибирует образование роговичного слоя, ЗССЕ больше не зкспрессируется. Зто предполагает, что 5ССЕ зкспрессия может бьіть частью программь! диференциации зпидермиса. 65 Результатьї иммунозлектромикроскопических зкспериментов с ЗССЕ-специфическими моноклональньм антителами соотвтствуют роли ЗССЕ в десмосомальной деградации, и, следовательно, в десквамации.

Антитела, специфически меченье ламелларньіми телами, претерпевают секрецию в межклеточное протранство между самьмми верхними гранулярньмми клетками и самьіми нижними клетками роговичного слоя, тогда как в роговичном слое антитела распознают зпитопь!ї втесной связи с десмосомами во внеклеточном пространстве.

Примерб

Клонирование и секвенирование кКДНК, кодирующей 5ССЕ человека

Рестрикционнье знзимь! получают от Рготеда, Майдізоп, МІ и ТАО-полимеразу от Регкіп-ЕІтетг-Сейфв8,

МогмаїкК,СсТ. Библиотеку кКДНК кератиноцитов дії ІІ человека получают из мРНК, полученньїх из кератиноцитов зпидермального происхождения взрослого человека, полученньїх от Сіопіесі І арогагіев, Роїо А, СА (Мо в 7/0 каталоге НІ, 1045в). Вначале библиотеку скринируют анти-зССЕ кроличьей поликлональной сьівороткой Д-5 и

Во-1 (см. примерб5б.2.2.). Так как Во-1 поликлональная анти-5ССЕ сьіворотка дает вьісокие фоновне сигналь,, ее исключают из интересньх скринирований на ранней стадии. Мспользуя Д-5 антисьворотку, ряд иммунореактивньїх бляшек бьіли обогащеньї как предполагаемье для истинно положительньїх бляшек. Никакой реакционной способности не наблюдаєется с моноклональньмми антителами моар4 и моарО ни для одной из 7/5 бляшек. Интенсивная характеризация с помощью рестрикционньїх знзимов и РСК характеризация одиннадцати вьіделенньїх бляшек показали, что нет сходства между различньми бляшками. Наличие такого частичного сходства указьваєт, что бляшки содержат гомологичнье ДНК вставки из одной и той же кДНК последовательности. Так как не удалось определить "отпечаток пальцев" возможной ЗССЕ кДднкК последовательности, стратегию пришлось модифицировать.

Бляшки бьіли скринировань в Е. Соїї у 1090 (Сіопіесп) за счет гибридизации бляшек с использованием в качестве зонда дегенеративного синтетического олигонуклеотида. Олигонуклеотидньй зонд о/бьл сконструирован на оснований зкспериментально определенной аминотерминальной последовательности нативного ЗССЕ ознзима, как указано в примере4.2. Наиболее надежная часть аминокислотной последовательности, Пе-Пе-Авзр-С1у-АІа-Рго (последовательность ІЮ МоЗ аа1 - ааб) бьіла вьібрана для с -92- о конструирования синтетического 17-мерного олигонуклеотидного зонда 5-АТНАТНОАУООМОСМСО-3 /НІА или С или Т; У - С или Т; КУА или С или С или Т/, обозначенного, ЗУМ3067, последовательность ІЮ 4М0о,

Олигонуклеотидньи зонд синтезируют, используя Вескмао 200А ДНК синтезатор, используя фосфорамидитную методику в соответствии с инструкциями. «І

Е. соїї у 1090 бактерии вьіращивают в течение ночи в ІВ среде /Зутрбгоок еї а! 1989/, содержащей 0,290 мальтозьь и 10мММ Мао5зоО). О4мл культурь смешивают затем с разбавленньм библиотечньм фаговьм - источником и адсорбируют в течение 20 минут при 377"С. Инфицированную культуру смешивают с бмл мягкой со агарозь! /0,759о агарозьі в В и 1ї10мММ Мазо,4/. Мягкую агарозную смесь вьіливают на 10 150мм І А пластин.

Пластиньі инкубируют в течение 5 часов, и помещают на ночь при 4"С. В целом, все пластиньі содержат юю приблизительно 4х10? бляшек. «І

Для иммобилизации бляшек каждую пластину покрьівают МЕМ би Роті СоІопу/Ріадое Зегееп мембранами /Ои Ропі, УМітіпдіоп, ОЕ/ на две минутьі. Полученнье мембрань!ї погружают дваждь на 2 минуть! в 0,5мМ Ммаон, дваждь опо 2 минуть в Тгіз-НСІ ріНУ7,Х и оставляют сохнуть. Затем зти мембраньй используют для « гибридизационньїх зкспериментов как будет указано далее. Зти мембрань! предварительно гибридизуют в 1095 сульфате декстрана, 1М Масі, 195 ЗД5 растворе, содержащем 100мг/мл денатурированной ДНК спермь! сельди - с /Зідта, 5, Гоців, МО/, в течение 5 часов при 657"С. В качестве зонда используют 5УМ 3067, ІА Р) адтк, "» меченьй с использованием Т4 полинуклеотидной киназьй / Рготеда, Майдізоп, МУ1/ и его добавляют к " прегибридизационной смеси. Гибридизацию ведут в течение 12-18 часов при 4276.

После гибридизации мембрань! промьівают четьіре раза по 5 минут в 2х55С при комнатной температуре, два раза по ЗО минут в 2х555 195 5Д5 при 42"С, и, наконец, в 0,1 552 при комнатной температуре в течение 30 ве минут. Зти мембраньї авторадиографируют на рентгеновской пленке /Нурегіїт-МР, Атегзпат, ОК/.В первичном с скринирований идентифицируют 14 позитивньїх бляшек. Зти позитивнье бляшки повторно скринируют, используя тот же зонд и методику, что и описаннье ранее. После процедурь! повторного скринирования о идентифицируют две положительнье бляшки. Две отобраннье бляшки еще раз очищают, и размерь! вставок -лЩ 20 определяют за счет РСК, используя в качестве праймеров ЗУМ 1600 и ЗУМ 1601, и вьіделенньюе бляшки в качестве матриц. Зти два праймера комплементарньії левому и правому плечам Х9І11 фага, соответственно.

Т» Амплифицированньій ДНК фгармент примерно 0,9КЬ, полученньй из фага А 6.2.2, переваривают затем ЕсоК1 и клонируют в ЕсоК1 переваренньійй русС19 /Рпагтасіа, Оррзаїа Зм'едеп/, ре 496. Зтот клонированньій фрагмент подвергают затем частичному анализу последовательности, используя праймерь! последовательностей, 22 Ккомплементарньхх руС19,. Нуклеотидную последовательность определяют, используя Т7 секвенирующие

Ф! наборь / Рпагтасіа, Оррзаїа Зуу"едеп, или ОВ, Сіеміапа, ОПіо/.

Трансляция полученной ДНК последовательности приводит к аминокислотной последовательности, которая де гомологична зкспериментально определенной протеийновой последовательности.

Однако, зта последовательность не содержит трансляционного стартового кодона. Для вьіделения полной 60 длиньі КДНК, полученньй ДНК фрагмент вьделяют на агарозном геле и используют в качестве зонда, обеспечивающего гибридизацию в жестких условиях Зтот зонд метят З2р за счет мультипраймерном ДНК метящей системь! /"Атегзпат, ОК/ следующим способом. Воду добавляют в количестве Змл на грамм геля, и помещают в баню с кипящей водой на 7 минут для того, чтобь! расплавить гель и денатурировать ДНК. Затем ампулу переносят в водяную баню при 37"С, по крайней мере, на 10 минут. В реакционную смесь для введения бо метки добавляют обьем ДНК/агарозного раствора, содержащий примерно 25нг ДНК. /Все зто в соответствий с инструкциями поставщика/.

Для получения полной длиньії кКДНК, библиотеку кКДНК повторно скринируют дваждьі, используя те же способь, что и описаннье ранее, за исключением того, что гибридизацию ведут в жестких условиях при 657С" В результате зтих зкспериментов идентифицируют и вьіделяют 45 индивидуальньїхх позитивньїх бляшек, которьіе вначале скринируют с помощью РСК, используя 5УМ 1600 /5-5ТОПОСО АСО АСТ ССТ ОбА ОСО-3; последовательность ІЮ Моб5/, или БУМ 1601 /У-АСА ССА БАС САА СТО ОТА АТО-3' /последовательность ІЮ Моб/ в сочетаний с УМ 3208 в качестве РСК, праймеров для идентификации бляшек, содержащей полную 5' открьїтую считьвающую рамку. БУМ 3208, 5-ТОСОТООСАСССТСТТОСАСА-3, последовательность ІЮ Мо7, по крайней мере, частично комплементарна 5 части ЗССЕ кДНК, бьла сконструирована на оснований 7/0 Мнформации о ДНК последовательности, полученной из р5 496. После зтого скринирования, бьіли отобрань 4 фага для дальнейшего анализа. Для анализа последовательности, полученнье РСК. амплифицированнье фрагментьі, полученнье из зтих фагов, біли клонированьь в рОС19 как бьіло указано ранее. Полученнье результать! показьівают, что один из зтих фагов, 205.2.1 содержит полной длинь! вставку.

ДНК из фагового изолята 205.2.1 получают по способу Затьгоок еї а/ї., 1989, и ДНК препарат переваривают 7/5 ЕсокК1 переваренную ДНК вьіделяют злектрофорезом на агарозом геле, и фрагмент около 1кр вьіделяют и клонируют в ЕсоКт! переваренную ру С19. Полученную плазмиду обозначают р 500 /фиг.15/. Полную нуклеотидную последовательность КДНК фрагмента определяют как указано ранее. В качестве праймера для реакций секвенирования используют специфические олигонуклеотидьі, комплементарнье рОС19 или ЗСССЕ последовательностям. Нуклеотидная последовательность /последовательность ЛЮ Мо1/ содержит открьїтую 2о бчитьвающую рамку, достаточную для кодирования полной аминокислотной последовательности ССЕ протеим"предшественника, состоящего из 253 аминокислот, включая сигнальньій пептид и преполипептид /Іпоследовательность ЛО Мо2/,

Как бьіло обнаружено, другой фаг, названньй 106.1.2, содержит ЗССЕ кДНК последовательность, в которой отсутствует 5-нетранслируемая последовательность и первье три кодона. Зту вставку вбіделяют как 954 орр сч ов ЕсоК1 фрагмент и клонируют в Есок1 линеаризованную рОСт19 , что приводит к получению плазмидь рз 498.

Зту плазмиду частично секвенируют. і)

Третий фаг, обозначенньій 108.1.2, как біло обнаружено, содержит 5ССЕ кДНК последовательность, в которой также отсутствует 5'--нсетранслируемая последовательность и семь нуклеотидов транслируемого участка. Зта кКДНК вставка имеет более длинньій вариант 3'-нетранслируемого участка, простирающийся от «Е зо 057 Брв обратном направлений от стоп кодона. Зтот 1884 рр ЕсокК1 фрагмент вьіделяют и клонируют в Есок1 линеризованную рОС19. Полученную плазмиду полностью секвенируют и обозначают р 501. --

Пример7 со

Определение ЗССЕ мРНК в зпидермисе человека Получение полной РНК из зпидермиса человека

Зто осуществляют в соответствии с методикой СПпотсгупеКкі апа бЗасспі, 1987. Абдоминальную кожу о Здорового человека получают при пластической хирургии. Немедленно после удаления ее охлаждают на льду. «Кф

В течение менее 15 минут зпидермис вьіделяют, соскребая скальпелем, погружают в раствор Д /Спотсгупекі апа Засспі, 1987/ и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе. Затем все делают по схеме Спотсгупзвкі.

Осажденную полную РНК хранят при -207С в 7095 зтаноле до дальнейшего анализа.

Получение информационной РНК « 5б0Омкг полной РНК зпидермиса обрабатьшают с помощью набора Роїу А Тгасі /Ргомеда/ в соответствими сопе) с инструкциями поставщиков. й РНК-злектрофорез и блоттинг "» Агарознье гели /1,496/ приготавливают с 0,6М формальдегидом в І1хХМОРЗ буфере и 0,бг/мл зтидиумбромида /Зідта, Зі, ІГоців МО/. мРНК, соответствующую 100мкг полной РНК, растворяют в РНК-образцовом буфере /5095 формамида, 2,2М формальдегида, 395 РісоїЇ! ІХМОРБ/ и нагревают при 60"С в т» течение 5 минут перед нанесением. РНК-маркерь /ВКІ., Сеїйетгвзриго, МО/ обрабатьвают аналогичньім образом. сл После злектрофореза гели погружают в дистиллированную воду на 5 минут , а затем в 5Х0ОММ Маосон на 30 минут, и в 01М Ттіз-НС1 рнН7,5 на 30 минут. Осуществляют блоттинг на мембраньі Сепе-Зегееп Різ /МЕМ Ви Ропі, (95) ММтіпдіоп, ОЕ/ с Маси-Сепе оборудованием /Рпагтасіа, Оррзаїа, Зу/"едеп/ в течение 1 часа в 10х5С02С. Затем -л 20 мембраньї промьшают Зх5СС, сушат в течение ночи и прогревают в течение 2 часов при 80"С. РНК визуализируют на мембранах в УФ-свете. їз» КДНК зондь

Плазмиду ро 501, полученную как указано в примереб, переваривают Міпе. Ніпс11 и ВоІ11Ота кКДдНнКкК содержит один Ніпс11-сайт у Бр Мо1060 и один Ва111-сайт у Бр Мо1715. 1070 рр фрагмент /Ніпс11-сайт в руС19 множественного клонирования сайт-зндогенньй Ніпс11-сайт/ о содержит 5ССЕ кодирующий участок кроме 7 Бр с 5 конца, и нетранслируемьй участок, включая сайт полиаденилирования у Бр 944-951, которьій является общим для всех ЗССЕ-кДНК, которье бьли вьіделень. іме) Фрагмент 655 рр Ніпс11-ВаІ11, которьій не содержит поли-А-хвоста, является уникальньм для ЗССЕ кКДНК 108-1-2. Зти фрагменть! бьіли вьіделеньї с помощью злектрофореза на агарозе и бьіли использовань! для 60 получения зондов с помощью набора Міргіте для введения метод в ДНК /Атіїзпат, ВисКкіпдатвзпіге, ОК/.

Гибридизация

Мембрадь! кипятят в течение 30 минут в 195 ЗД5 в 1ХхТЕ, и предварительно гибридизуют при 60"С в 195 ЗД5, 1М Масі, 1095 декстрансульфате, ДНК спермь! сельди 0,1мг/мл в течение З часов. Гибридизацию ведут в том же растворе при 60"С в течение ночи. Промьівки осуществляют 2Хх30 минут при 60О"С в 196 5Д5 в 2х50С, и в 65 течение З часов в 01х5СС при комнатной температуре. Затем зти мембраньі подвергают авторадиографии.

Результатиь!:

Можно продемонстрировать наличие в зпидермисе человека двух видов мРНК с размерами около 1,2кКБ5 и 2,0Кк0, соответственно /фиг.16/. Зто находится в хорошем соответствии с доказательствами, полученньми в зкспериментах по клонированию, где бьіли обнаружень два типа кКДНК.

Примерв8

Зкспрессия рекомбинантного ЗССЕ в Е. сої

Конструирование плазмид рРОЕХ-2Т/5ССЕ 1. Смьісловне РСК праймерь 1.4. ССТОСБАТССАТСОСААООТСОТАТТАТТОАТООСОССССАТОТ /5УМ 3367; послед. ІЮ Мо8, подчеркнута 7/0 З-часть, кодирующая М-терминальнье аминокислоть/ ІЮСАРС активного нативного ЗССЕ, 5-часть с Ват

НІ1-сайтом, и дополнительная последовательность, кодирующая сайт Фактора Ха, ІЕОК. 1,65. СОТОб АТССАТСОААООТСОТТТОвАААСТОСАСОСАСААСАА /5УМ 3368, последовательность ІЮ Ме9, подчеркнуть! 3-часть, соответствующая парам оснований 76-96 в полной ЗССЕ-кДНК последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность І ЕТАСЕЕ, 5-часть каки в 1а. 2. Антисмьісловніе РСК праймерь!

ТОАТССТСТОАОСТСТОСТО- /5УМ 3371; комплементарен парам оснований 285-304 в полной ЗССЕ-КДНК последовательности, последовательность ІЮ Мо1, с Засі-сайтом у Бр 294/.

Последовательность р 498 /примерб/ РСОК-амплифицируют праймерами 1а/2 и 1Б5/2. Полученнье продукть очищают зкстракцией фенолом и осаждают зтанолом, переваривают ВамНі/ Засі и очищают с помощью злектрофореза в агарозе. Затем их клонируют в ТС2-клетки в рОЕХ-2Т /Рпагтасіа/ переваривают ВамНт/Есок 1 вместе с 3 673 парами оснований ЗССЕ 106-1-2, полученньіми при перевариваниий ро 498 басі и ЕсокК1. Из бактериальньїх клонов, которье бьіли использованьї для исследования зкспрессии плазмид ро 510 кодирующая нативньій М-терминал следующий за сайтом фактора Ха, и р5 511, кодирующая пропептид, следующий за сайтом фактора Ха/ бьли вьделеньй и нуклеотиднье последовательности, соответствующие вставкам, су полученньім из РСК-продуктов, бьіли провереньії способом дидеокси-цепной терминации с использованием набора Т7 для секвенирования /Ріагтасіа, Оррзаїа, Змедеп/. о исследования зкспрессий

Культурь! (ведущиеся в течение ночи) ТС клеток с р5 510 и р 511 в ІВ среде, содержащей 5Омкг/мл

Сагрепісіййп /Зідта, 5, Гоціз, МО/ разбавляют в 10 раз свежей средой и вьиіращивают в течение З часов при «І зо З7"С, ІРТО- /Зідта, ЗІ, Гоців, МО/ добавляют до конечной концентрации 0,1мМ, и культурь! виращивают при 37"С еще в течение З часов. Бактериальнье осадки обрабатьвают ультразвуком в РВ5 195 Тпйоп Х-100 /Зідта, (7

ЗІ, Гоців, МО/. После центрифугирования при 10 000ху в течение 15 минут, надосадочную жидкость и осадки со анализируют с помощью ЗДЗ-РАСЕ и иммуноблоттинга с поликлональной ЗССЕ-специфической цьіплячьей анти-сьівороткой. о

Большие количества ІРТО-индуцируемьх протеийнов с Мг примерно 5ОКД /рз 510/ и 52кД /рз 511/ с «КЕ

ЗССЕ-подобной иммунореактивностью бьіли обнаружень! в осадках, нерастворимьїх в РВІ-Тпйоп Х-100 /см. фиг.177/.

Надосадочнье жидкости после обработки ультразвуком в РВО-Тийоп Х-100 содержат О51Т/5ССЕ протеийнь! слияния того же размера, что и в нерастворимьїх осадках, но их количество мало по сравнению с количеством в « нерастворимьїх осадках. 8 с Зти результатьії показьвают, что можно зкспрессировать ЗССЕ как протеийн слияния с О51, а й последовательности, соответствующие специфическим протеазньм сайтам расщепления в пре-про-ХССЕ "» аминокислотной последовательности сделают возможньм повторить зтот зксперимент с целью получить рекомбинантньй ЗССЕ в бактериях. Полученньій протейн можно солюбилизировать в мочевине или гуанидиниигидрохлориде, а затем очистить с помощью ионообменной хроматографии благодаря вьсокой ї» изозлектрической точке ЗССЕ. Очищенньй протеин можно ренатурировать , диализуя против буферов с низкой концентрацией денатурирующего агента, а затем расщепить Фактором Ха для вьісвобождения 57 іні полипептида из БХССЕ или про-ЗССЕ. Протеиньі слияния СЗТ/5ССЕ можно также использовать в качестве г) иммуногенов для получения ЗССЕ-специфических антител, и в качестве иммуносорбентов для очистки антител.

Примеро - Зкспрессия рекомбинантного ССЕ человека в клетки млекопитающих

Та» Для создания вектора зкспрессии для получения рекомбинантного ЗССЕ человека, кДНК последовательно вьіделяют из плазмидьі ро 500 в виде 897 ор ЕсокК1/ОгаІ! фрагмента. Зтот Фрагмент субклонируют в ЕсоК1 и зЗтаї! переваренную рисСт19, получая р5 502. Затем плазмиду р5 502 переваривают ЕсокК1 и 5а11 для вьіделения

КДНК последовательностей ЗССЕ в виде 0,9кЬ фрагмента, которьій снова субклонируют в рОС19 вариант, в котором отсутствует Ніпа111 сайт, получая плазмиду р5 503. Зтот рОС19 вариант получают при перевариваний о рист19 с помощью Ніпа111, заполняя, используя знзим Кленова, и снова лигируя. Для облегчения клонирования іме) в вектор зкспрессии, Ніпа111 сайт вводят в 5і-конец КДНК ЗССЕ. Зтого добиваются, переваривая р5 503 Есок1 и встраивая линкер, которьій превращает сайт в Ніпа1!11, ЗХУМЗ6ОЗ 6о0 5-ААТТОТОСААдОСТТССАС-3, последовательность ІЮ Мо10. Полученную плазмиду, которая несет кодирующую протеин часть КДНК ЗССЕ с Ніпа111 сайтом у 5' конца и За/1 сайтом у 3' конца, соответственно, обозначают р 505.

Окончательньій вектор зкспрессии получают, лигируя три различньх ДНК фрагмента. Вначале, р Ф 505 переваривают Ніпа111 и За/1 вьіделяют фрагмент 0,9кр. бо Затем, для получения дистальной части регуляторного злемента, расположенного в обратном направлений, мМмьішиного металлотионеина, последовательности вируса бьчьей папилломь), кроличий бета-глобиновьй геномньій фрагмент, обеспечивающий сигналь! процессинга МмДНК, и плазмиднье последовательности, рМі 2а, для обеспечения селекции и репликации в Е.соїї Л/УаїЇдегвігот еї аї., 1992/, вектор р5 147 переваривают ас! и за, и вьіделяют фрагмент около 12кб. В третьих, для вьіделения проксимальной части промотора мьішиного металлотионеина, плазмиду р З 42, в которой нативньйй ВаІ11 расположен в лидерной последовательности, бьіл превращен в Ніпа111 сайт, переваривают бас! и Ніпа111,, и вьіделяют фрагмент приблизительно 220бБр.

Лигирование зтих трех фрагментов приводит к получению вектора зкспрессиий ЗССЕ р 507 /см. фиг.18/.

Вектор зкспрессии р3 507 совместно трансфецируют с вектором, содержащим ген устойчивости к неомицину, управляемьій 5' длинньім концевьім повтором вируса саркомь! Нагієу, и с сигналами полиаденилирования 540 70 Ллизку апа Воїспап, 1984/, в мьішинье С127 клетки /"АТСС СТІ 1616/. Зкспериментьї по трансфекции осуществляют в соответствии со способом кальций-фосфатного осаждения /Згапйат апа Мап дег р, 1973/. клетки культивируют в Нам'з Р12/ Оцрессоз модифицированной среде Еадіє /ОМЕМ; Сірсо ВКА, Сайпегерига,

МД! /1:1/ дополненной 1095 сьівороткой плода теленка /Нусіопе, Годап, ОТ/ Клоньі клеток, устойчивьх к неомицину отбирают с помощью 1,5мг/мл (3418/ Сбірсо-ВК2/, и через 10-15 дней после селекции устойчивье 75 клоньі клеток идентифицируют и вьіделяют из основньїх пластин, и отправляют для дальнейшего анализа.

Для анализа зкспрессиий рекомбинантньх ЗССЕ генов, приготавливают полную РНК из вьіделенньйх клеточньїх линий. Полную РНК получают из С127 клеток, и вбіделяют на 195 формальдегид-агарозном геле, переносят на нитроцеллюлозную мембрану, и гибридизуют с ЗССЕ зондом, меченьм 32 р. Зтот зонд представляєт собой 1070 рр Нітс11 фрагмент ЗССЕ кДНК, вьіделенной Ніпс11 перевариванием р 500, и агарозньм злектрофорезом. Зкспериментальная процедура соответствует указаниям А!Їзибеї еї аї., 1992.

Зкспериментьі по Норзернблоттингу и гибридизации с З2р-меченой ЗССЕ кДНК, показьвают, что рекомбинантную ЗССЕ мРНК можно детектировать в нескольких клеточньїх линиях, содержащих ЗССЕ вектор, раз 507. Гибридизация не обнаружена в контрольньїх образцах, полученньїх из С127 клеточной линии, содержащей идентичньй вектор, за исключением ЗССЕ кДНК /фигю19/, Размер 1, ко соответствует С ожидаемому размеру. о

Образцьї кондиционной клеточной культуральной средьій собирают и анализируют в иммуноблоттинге.

ЗД5З-РАСЕ осуществляют по способу Лазмли /1970/ и для иммуноблоттинга в качестве детектирующего антитела используют цьіплячий анти-нативн ЗССЕ. Меченьій щелочной фосфатазой анти-цьіплячий дос /5ідта,

ЗІ, Гоців, МО/ используют для знзимной метки. Полученнье результать! представлень на фиг.20. Для анализа « зкспрессиий рекомбинантного ЗССЕ, получают полную РНК из С127 клеток, тран фектированньїх вектором «- зкспрессии ро 507. В качестве контрольньїх образцов получают полную РНК как из нетрансфектированньїх С127 клеток, так и из С127 клеток, транфектированньїх вектором зкспрессии рЗ 147. Вектор р3 147 аналогичен (ФО вектору р3 507 за исключением того, что он содержит кКДНК для желчньми солями стимулированной липазь ю человека /Міївзоп еї аІЇ., 1990/ вместо ЗССЕ кКДНК человека. РНК получают по способу А!йзибеї еї а! /1992/,

Зо Зксперименть! Норзернблоттинга и гибридизации З2р-меченой КДНК ЗССЕ показьівают, что рекомбинантная «

МРНК ЗССЕ примерно 1,4 кодетектируется в С127 клетках содержащих 5ССЕ вектор, р 507 /фиг.19/.

Гибридизация не обнаружена в контрольньїх образцах, полученньїх из С127 клеточньїх линий, содержащий р 147 или нетрансфектированнье С127 клетки. Длина рекомбинантной мРНК 5ССЕ соответствует ожидаемой « величине.

Образцьї кондиционной клеточной культуральной средьсобирают и анализируют за счет 5ЗД5З-РАОЕ и не) с иммуноблоттинга. Блотьі проявляют по способу Віаке еї аї.,1984.Полученнье результать! /см. фиг.20/ з» показьввают, что С127 клетки, содержащие р5 507, продуцируют три протеина, которне демонстрируют реакцию со всеми доступньіми полилональньми кроличьими и цьіплячьими, ЗССЕ актителами, а также с анти-ЗССЕ моноклональньми, полученньми по способу примераб5. Рекомбинантнье ЗССЕ реактивнье протеийинь 42 демонстрируют кажущийся молекулярньй вес, которьій примерно на їкДа больше, чем у очищенного нативного ть ЗССЕ человека. Рекомбинантньй протеин не демострирует какой-либо протеолитической активности. При с сравнений предполагаемой З5ССЕ аминокислотной последовательности с зкспериментально полученньм МН-2 концом нативного ЗССЕ человека, и с последовательностями других химотрипсино-подобньїх протеаз, можно о сделать вьівод, что рекомбинантньй ЗССЕ, полученньій в С127 клетках, является его про-знзимной формой. -щш 20 Даннье последовательности показьшвают, что зтот хтро-знзим можно активировать протеолитическим

Їх расщеплением со стороньї С-конца лизина в последовательности ..АСОСДКІИОСАР..., где подчеркнутая последовательность является МН-2 последовательностью активного нативного ЗССЕ человека /последовательность ІЮ Мо2, аа 5 - аа 6/.

Пример10 25 Вьіделение и характеризация рекомбинантного ЗССЕ

ГФ) Вьіделение юю 1,3мг моноклонального антитела ТЕ4Б, направленного против нативного ЗССЕ, соединяют с 1,5мМл

СМВг-активированной сефарозьі /РНагтасіа-7КВ Віоїесп., Оррзаїа, Зуледеп/, используя способ, рекомендованньй изготовителем. 40мл средьі, содержащей ЗССЕ, фильтруют через 0,45мкм фильтр, а затем 60 вводят в колонку. Колонку промьівают несколько раз 10ММ фосфата натрия, 150мМ Масі, рнН7,2, а затем злюйруют 0,1М глицин-НСЇІ, рН2,5, Злюированньій протеин немедленно нейтрализуют, добавляя 0,1 обьем 1М

Тгів-НСІ, рН8.О.

Активация

Рекомбинантньй 5ССЕ /4,бмкг в 200мл/, очищенньій на геле, соединенном с моноклональньм антителом 69 /см. ранее/, переваривают 4,бмкл 0,1мг/мл трипсина /массовое отношение 10:1/ при 377"С. Образцьї /5Омкл отбирают Через 20 минут, 1 час, З часа и 20 часов, и 5мкл 10мкМ /4-амидинофенил/метансульфонил/"АРМ5Р;

Воепгіпдег Мапппеїт, Септапу/ добавляют для окончания реакции.

Активность расщепленного 5ССЕ оанализируют с помощью невосстанавливающего 5Д5-РАСЕ на Казейновьх гелях по способу примера 2.2. МИдентичность полученньх отщепленньїх форм ЗССЕ бьіла проанализирована с помощью восстанавливающего 5Д5-РАСЕ с последующим иммуноблоттингом, с использованием Ццьіплячьего анти-нативного ЗССЕ с последующим введением метки щелочной фосфатазь в анти-цьплячий ІдС и нитроблютетразолия и 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатазь! в качестве субстрата для щелочной фосфатазь. 70 М-терминальное секвенирование

Афинно очищенньй /как указано ранеє/ 5ССЕ, примерно ЗБмкг, бьл подвергнут слот-блоттингу с использованием установки Віо-Юої ЗЕ /Віо-Кай, Кісптопа, СА/ на мембране Ітторбііоп/Міїїроге, Сіагога, МА/,

Затем мембрану промьївают несколько раз дистиллиованной водой для удаления всего Тгіз и глицина. Часть мембрань, на которой бьіл связан протейн, внірезают и секвенируют, используя Арріїед Віозузіетв/Розвіег СПУ, 75 СА, АТТА импульсньій жидкофазньй секвенатор с подключенньм РТН 120А анализатором. Секвенирование осуществляют используя установленнье циклические программь и химикалии поставщиков.

Последовательность, полученная в первьїх шести положениях представляет собой діи-діи-аіа-діп-діу-азр, что соответствует аминокислотам -7/- -2 последовательности ІЮ Мо2. Как можно сделать заключение из зтого результата, сигнальньій пептид состоит из 22 аминокислот и основан на М-терминальной аминокислотной 2о последовательности нативного активного ЗССЕ, а пропептид состоит из семи аминокислот.

Дегликозилирование

Очищенньй рекомбинантньій ЗССЕ /5мкг/ и нативньій ЗССЕ /20мкг/ кипятят в течение З минут в 20мкл 0,595

ЗД и 0,1М Д-меркаптозтанола. Образцьі разбавляют натрийфосфатньм буфером, рН8,б и Мопідеї Р-40 до конечньїх концентраций 0,2 М и 1,2595, соответственно. Добавляют М-гликозидазу Е У/Воейгіпдег Маппеїіт/ сі рекомбинантного протеина 0,6 единиц, а для нативного протеина 1,2 единиц знзима/, и реакционную смесь о инкубируют в течение ночи при 37"С. Конечная концентрация 5Д5 в анализируемом образце составила 0,17965.

Обработаннье М-гликозидазой Е? ЗССЕ анализируют на 8-1896 ЗДЗ-РАСЕ с последующим иммуноблоттингом, как указано ранее. Полученнье результать! демонстрируют восстановление кажущегося молекулярного веса двух верхних полос, тогда как кажущийся молекулярньй вес самой нижней полось! не изменяется, /фиг.23/. Зто «І показьшваєт, что рекомбинантньй ЗССЕ, опродуцированньй в С127 клетках, существует в двух «-

Н-гликозилированньїх формах и одной не-гликозилированной форме. Зтот результат аналогичен с тем, которьй наблюдается для активного нативного зХССЕ /фиг.23/. со

Пример11 ою

Композиции, содержащие 5ССЕ

Такие композиции можно получить в соответствие с обьічньми фармацевтическими методиками, включая «І тщательное смешивание активньїх соединений с другими ингредиентами. Все проценть дань по весу.

Композиции, которье содержат более одного активного соединения, также входят в обьем изобретения.

Нижеследующиепримерь! следует рассматривать как включающие также более одного активного соединения. «

Аналогично, термин "ЗССЕ" можно заменить на "про-ЗССЕ". Таким образом, в обьем настоящего изобретения входят композиции, которне содержат как ЗССЕ, так и про-ЗССЕ. - с ЗССЕ - нативньій или рекомбинантньй химотрипсиновьій знзим роговичного слоя, необязательно в "з сочетаниий с другими активньіми ссединениями п суз-дчапишт ваїв (сколько нужно)

Крем масло/вода о с» ЗССЕ 0,01-20 сл Полисорбат во 0,5

Змульгируемьй воск Б (95) Минеральное масло А - 50 Диметикон 1

Глицерилстеарат 6 чз» Антиоксидант ч.5

ЕДТА 0

Консервант ч.5

Глицерин 8595 4 (ФІ Пропиленгликоль 7

Агент, регулирующий рН 0,01-10 о Вода 65-76 60 Примерь изменяемьх факторов: Антиоксидантьі, хелатирующие агентьі, консервантьії, змульгирующие системь! /соотношение между масляной фазой и водной фазой и содержание змульгирующего агента и других относящихся к зтому зксципиентов/.

Крем вода/масло до 65 ЗСЕ 0,01-20

Цетиловьй спирт 0,5

Ланолин Б

Бельїй петролатум 10

Минеральное масло 45

Антиоксидант ч.5

ЕДТА 1

Агент, регулирующий рН 0,01-10

Консервант СУ

Вода 15-25

Примерь! изменяемьх факторов: антиоксидантьі, хелатирующие агентьі, консервантьі, змульгирующие системь! /соотношение между масляной фазой и водной фазой и содержание змульгирующего агента и других относящихся Кк зтому зксципиентов/

Мазь до

ЗССЕ 0,01-20

Ланолин 15

Петролатум 58-68

Минеральное масло 15

Диметикон 2

Антиоксидант 4.5.

Примерь! изменяемьІх факторов: антиоксиданть!.

Линимент до с 29 ЗССЕ 0,01-20 Ге)

Змульгирующий воск А

Глицерилстеарат 3

Минеральное масло 15 «

Полисорбат 80 0,6

Глицерин 8595 З ч- пропиленгликоль 5 со

Антиоксидант 4.5.

ЕДТА 0 Іо)

Консервант -8. ? З -

Вода 59-69

Примерь! изменяемьх факторов: антиоксидантьі, хелатирующие агентьі, консервантьі, змульгирующие системь!ї / сосотношение между масляной фазой и водной фазой и содержание змульгирующих агентов и других « относящихся Кк зтому зксципиентов/ - с Гель до и - ; з» ЗССЕ 0,01-20

Тризтаноламин 1-5

Зтиловьій спирт 10 -

Цетиловьй спирт 10

ЧК»

Целлюлозная смола 5 1 ЕДТА 0

Консервант 4.5. (95)

Вода 59-74 -й 20

ГТ» Примерь! изменяемьІх факторов: гелеобразующие агентьї, антиоксидантьї, хелатирующие агенть консерванть!.

Водньй раствор до

ЗССЕ 0,01-20

ГФ) Агент, регулирующий рН 0,01-10

Цетиловьй спирт А іме) п ропиленгликоль 5

Консервант 4.5. бо

Антиоксидант 4.5/

ЕДТА 01

Вода 37-89

Примерь! изменяемьІх факторов: антиоксидантьі, хелатирующие агенть!ї, консерванть, обезжиривающие бо агентьі, увлажнители.

Раствор в зтиловом спирте до

ЗССЕ 0,01-20

Агент, регулирующий рН 0,01-10

Пропиле нгликоль Б

Цетиловьй спирт 3

Антиоксидант

ЕДТА 01

Зтиловьй спирт 50-95

Примерь! изменяемьІх факторов: антиоксидантьї, хелатирующие агентьї, увлажнители.

Суспензия до

ЗССЕ 0,01-20

Карбомер 0,5

Целлюлозная смола 0,5

Полисорбат 80 0,1

Пропиленгликоль Б

Аскорбиновая кислота 0,05

Цетиловьй спирт А

Полисорбат 4.5.

ЕДТА 01

Агент, регулирующий рН 0,01-10

Вода 72-80 Ге

Примерь! изменяемьх факторов: антиоксидантьі, хелатирующие агентьї, консервантьі, суспендирующие о) агенть!

Паста о

ЗССЕ 0,01-20 ч

Петролатум 45-55 ч-

Оксид цинка до со

Минеральное масло 5

Антиоксидант 4.5. І в)

Примерь! изменяемьІх факторов: антиоксидантьї, основания паст. т

Пластьрь до

ЗОСЕ 0,01-20 «

Сшіпа 2М 70-80 50 Миристиловьй спирт Б З с Касторовое масло 2 :з» Бельй пчелиньй воск 10

Бельїй петролатум 3 антиоксидант 4.5. т- Примерь! изменяемьІх факторов: антиоксидантьі, хелатирующие агенть!ї, консерванть, обезжиривающие 1 агентьі, увлажнители. о Раствор для азрозольного спрея до -оУу 70 ЗССЕ 0,01-20

Агент, регулирующий рН 0,01-10 їз» Изопропилмиристат 3

Пропиленгликоль Б

Зтиловьій спирт 48-92

Пропеллант 4.5. о Примерьї изменяемьїх факторов: обезжиривающие агентьї, увлажнители. ко

Спрей - пенньїй азрозоль до 60 ЗССЕ 0,1-20

Воск З

Зтиловьій спирт 50-55

Антиоксидант 4.5.

ЕДТА 01 65 Вода 20-35

Пропеллант а.5.

Примерьї изменяемьїх факторов: пропелланть,, антиоксидантьї, хелатирующие агенть.

Спрей - азрозольная змульсия до 2 ЗССЕ 0,01-20

Производнье целлюлозь 1-3

Твин? 60 1,0

Глицерилстеарат 2,5

Сорбат калия 0,2

Антиоксидант 4.5.

ЕДТА 01

Консервант 4.5/

Агент, регулирующий рН 0,01-10

Вода 50-95

Пропеллант 4.5.

Примерь! изменяемьх факторов: антиоксиданти, хелатирующие агентьії, консервантьії, змульгирующие системь! /соотношение между масляной фазой и водной фазой, и содержание змульгирующих агентов и других, относящихся к зтому зксципиентов/.

Шампунь до

ЗССЕ 0,01-20

Натрийлаурилсульфат 40 - с

Цетиловьй спирт 3 т

Вспенивающий агент или кондиционер Го)

З

Хлорид натрия 2

Антиоксидант 4.5.

ЕДТА 01 З

Консервант 4.5. че

Вода 43-53 со

Примерьї изменяемьх факторов: основания шампуней, антиоксидантьї, хелатирующие агентьї, консерванть, ю увлажнители, кондиционерь!. -

Шампунь для тела до

ЗССЕ 0,01-20

Натрийлаурилсульфат 40 «

Цетиловьй спирт А

Вспенивающий агент или кондиционер о, с З ч » Перламутровьїй агент 10 щі Консервант 4.5.

Антиоксидант 4.5.

ЕДТА 01 ї Вода /40-5О 1 | я

Примерьї изменяемьїх факторов: основания шампуней, антиоксидантьї, хелатирующие агенть, консерванть,

Ге) добавки, кондиционерьі. - Медицинское мьіло до

Чл» ЗССЕ 0,01-20 1-гидроксизтан-1, 1-дифосфорная кислота 02

Глицерин 0,8

Чер

Натриевое мьіло кокосового масла и таллового масла 88-98 (Ф) Добавки 0,7 ко

Примерьї изменяемьїх факторов: увлажнители, основания для мьіла. 60 Порошок до

ЗССЕ 0,01-20 Тальк

Тальк 65-70

Каолин 6

Диоксид титана 2 б5

Карбонат кальция 8

Стеарат магния 3

Кукурузньй или пшеничньй крахмал 2 Пример изменяемьїх факторов: основания порошков, консервантьї, массовье соотношения.

Кондиционер для волос до

ЗССЕ 0,01-20

Цетиловьй спирт 2,2

Алкилтриметиламмонийхлорид 1,25

Октилдодеканол 1

Лимонная кислота 1

ЕДТА 0

Консервант 4.5.

Антиоксидант 4.5.

Вода до100

Примерьї изменяемьїх факторов: кондиционерьї, консервантьї, хелатирующие агенть, антиоксиданти.

Аналогичньмм способом можно приготовить композиции для поверхностного нанесения, содержащие соединение, которое способно ингибировать или повьішать активность ЗССЕ.

Пример12

Активность по перевариванию десмосом рекомбинантньм ЗССЕ

Корнеоцитьі, содержащие интактнье десмосомьі, удаляют с кожи срезая полоски до более глубоких слоев роговичного слоя, и Ччешуйки отделяют гексаном и сушат в аликвотах. Аликовоть! корнеоцитов /Змг/ с 29 зкстрагируют 1М хлоридом натрия при 4С для солюбилизации характеристических протеаз, а затем г) интенсивно промьівают с инкубационньм буфером /0,1М Тгіз/нсСІ рн 8,0/ для удаления зндгенной протеолитической активности из препаратов. Инкубирование ведут в. 0,1 М Тг рН8,О с 10мкг рекомбинантного

ЗССЕ /или без него/в течение 24 часов при 37"С. Доказательством десмосомального переваривания за счет знзима является определение уровней десмосомного маркерного протеина десмоглеина 1/00-1/. Его вьіделяют - из чешуек, зкстрагируя 8М мочевина /295 5Д5В/Я -меркаптозтанольньім буфером с последующей очисткой ЮО-1 - использованием конканвалин А-афинной хроматографии. Злюат конканвалина А фракционируют за счет

ЗД5З-РАСЕ и злектрофоретически переносят на РОМЕ мембрану для иммуноблоттинга, 0-1 идентифицируют, ме) используя специфическую антисьмшворотку и определяют, используя возрастание хемилюминесценции. ю

Полученньсе результать! приведень в таблице 4.

Зо Таблицай « контрольнг 5ССЕ, 10мкг ОС-1/произвольнье единицьі/мг 7950-4992 4059-2360 чешуек

Результатьі, представленнье в таблице4, показьшвают, что рекомбинантньй ЗССЕ способен разлагать межклеточньсе когезивнье структурь! в роговичном слое в анализе ин витро. «

Пример1З

Влияние ингибиторов на активность рекомбинантного ЗХССЕ З с Исследуют влияние ингибиторов апротинина, химостатина и сульфата цинка на 5-2586 гидролизующую "» активность г ЗССЕ. Схема зксперимента представлена в примере3.2. Результать! представлень в таблицеб. " Таблица5 4 т о ть зв о ще

Как представлено ранее в таблицеб5, апротинин, химостатин и ионьї цинка ингибируют 5-2586 60 гидролизующую активность рекомбинантного ЗССЕ таким же образом, как и нативного знзима. - Тошна ег а!. (1989). ВВКС 158:569-575

Томуріп еї аї. (1979). Ргос Маї!| Асад Зсі ОБА 76:4350-4354 - МаїІдепвігот еї аї. (1992) Сепе 120:175-181 - М/іпігоць еї аї. (1986). У Сіїп Іпмеві 77:196-201 бо МО 93/04172 (Шейа ру бБутбрісот АКіероїад оп 19 Айцдиві 1992) А!йзибреї! ес аї. (1992). Сицтепі ргофосоїв іп

Моїіесшіаг Віоіоду. допп УМіПеу 5 опа

- ВіаКе еї а!. (1984). Апа! Віоспет 136:175-179 - Сагівзвоп еї а!. (1985). Моїес |Іттип 22:1073-1080 - Сацопеу еї аї. (1991). У Віої Спет 266:12956-12963 - Спотсгупекі апа Засепі (1987). Апа! Віоспет 162:156-159 - деїігоа апа І опавігот (1990). У Іпмеві Оегтаїйо! 95:456-459 - деїгой апа І ипавігот (1991). Агспй Оегт Кез 283:108-112 - деїгоа (1992). Ешиг У ЮОегтаїйо! 2:50-55 - огреКу еї аї. (1985). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 82:810-814 70 - Сгапйат апа Мап дег Ер (1973). Мігоїоду 52:456-467 Нодап, В., Сопвіапііпі, Р. апа Іасу, Е. (1986).

Мапіршіайпд (Ше Моизе Етбргуо. А І арогаїогу Мапиаі). Соїд бргіпд Нагрог Ргезз Ногіе еї а). (1984). Сотр

Віоспет РпНузіо! 773:349-354 - Гаеттії (1970). Майте 227:680-685 - | ее еї а. (1987). Апа! Віоспет 166:308-312 - Гомгу еї аї. (1951). У Віої Спет 193:265-275

Ї опазігот апа Едеїгиа (1988). У Іпмеві Оегптаїйо! 91:340-343

Ї ипазігот апа Едеїгиа (1990 а). Агсп Оегт Кез 282:234-237

Ї ипазігот апа Едеїгиа 71990 б). У Іпмеві Оегтацо! 94:216-220

Ї опавігот апа Едеїгиа (1991). Асіа ЮОегт Мепегео! (5іоскКА) 71:471-474 - ГизКу апа Воїснап (1984). СеїІ 36:391-401 - Маївидаїга Р (1987). У Віої Спет 262:10035-10038 - Міг2щапі еї а)ї. (1991). У Сіїп Іпмеві 87:1066-1071 сч - Міївзоп еї аї. (1990) Єшиг У Віоснет 192:543-550 - Моїтіз (1990). У Іпмеві Оегтаїйо! 95:371 і) - Заїмезеп еї а)!. (1987). Віоспетівігу 26:2289-2293 - Загоргоок еї а). (1989). МоїІесшаг Сіопіпо, А І арогаїюгу Мапиаї). 2па ед. Соїа 5ргіпд Нагрог - Бспеспіег еї аї. (1983). У Віої Спет 258:2973-2978 І - Зспеснег еї аї. (1989). У Віої Спет 264:21308-21315 «Е зо - Зспмагіз еї аї. (1987). У Іттипої 138:2611-2615 - ТаКаназвпі еї а! (1987). У ос Совзтеї Спет 38:21-28 -- со

Claims (1)

1. Формула винаходу ю

   35 . - в

   1. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, обладающий активностью химотрипсинового знзима роговичного слоя (ЗССЕ), и характеризующийся последовательностью: « ші с ;» щ» 1 (95) - 50 с» Ф) іме) 60 б5

   СААТТССОСО САТТТССооС Стос АТО СА дсА тТоС Сстт сто сто Ссос со 5і Мес Аза Асад бег цей Печ Пцеч Рго їец -29 -25 САБО АТС СТА Сто СТА ТОСОТТА оС о ТтТб САЛА АСТ ССА ССА БАД АХА сс 39 біп Ізїе цецшц Геч Пец 5еї цеш Аїа цеч Сі Тг діа біу 01 бі Аза -20 -15 -10 -5 САб ОСТ САС ДАС АТТ АТТ САТ СОС ОСС ССА ТСТ ССА АСА СОС ТОС САС 147 біп біу А5р цуз І1е ІЗе Ар біу А1їа Рго Су5 Аї1а Аку біу 5ег Нів й 1 5 10 ССА ТОб САС СТО ССС СТО СТО АСТ СОС ААТ САС СТО САС ТОС ОСА бос 195 70 Ро Тгр сіп Маї А1а пес цеш беїг біу Ап біп цеш Ніє СуБ б1у біу СТО Сто Сто ААТ САС СосС тоб сто СТО АСТ ОСС ОСС САС ТОС ААб АТО 243 Ммаї реч Уаї Аб5п біц Агу Ттр Маї Пец ТБх Аза Аза Нів Суб був Мес й 35 40 75 ААТ САС ТАС АСС СТО САС СТО СОС ОАСТ САТ АСО СТО ОС САС Або АБА 291 Ап біс Тук Тк Маї нНіБ цеч біу Бек Абр Тпг Печ б1іу АБр Ахд Аг 45 50 55 60 ОСТ САС Або АТС АЛ ССС ТСо ААб ТСА ТС СОС САС ССС бос ТАС ТоС 339 Аіа б1)іп Аху І1е цЦув Аїа бех Цув бет Рне Агу Нів Рго Сбіу Тух 5ег 65 70 75 20 АСА САб АСС САТ СТІ ААТ САС СТО АТО СІС СТО ААС СТО ААТ АОС СА 387 Тпт біп о тТвІ Ніє Уаї Азп Ар цем Мес тем Уаї Цубє Тем А5п 5ех біп во 85 80 ССС о АСО СТО ТСА ТСС АТО СТО ААб ААА сто дос сто сосотос сос тос 435 Аза Ах цем беї бех Мес УМаї Цуз Гуз Маїі Аху цец Рко бех Ак Суб 95 100 105 Ге 25 слАА ССС ССТ ОА АССОАСС ТОТ АСТ СТ ТОС СОС тоб СОС АСТ АС АСО 483 о біч Рго Рго біу Тих ТІ Суб Тіг Уа1ї бех біу Тер біу Тіг Тпг Тег 150 115 120 АОС ССА АТ СТО АСС о ТТТ ССС ТСТ ОАС СТО АТО ТОС СТО САТ СТО АКОо 531 бек Рго АБр Маї ТпПк Рпе Рхо бег АБр Геч Мес Сув Ма1ї1 Авр Ма1ї Цув 125 130 135 140 « 30 СТО АТС ТСС ССС САб САС ТОС АСО ААб ОСТІ ТАС АЛО САС ОТТА СТО САА 579 ч: Теч І1їе бех Рго біп А5р Суз Тптх ПЦув Уаї Тук Цув Азр Теч їеч бій 115 150 155 со ААТ ТСС АТО СТО ТС обСТ СОС АТС ССС САС ТОС АЛ АЛА АС бос ТоС 627 Авп Бех Мес Пец Су А1а біу І1е Рко Авр 5ег Тїув ув АБп Аза СувБ І в) 160 165 170 Зо Акт оост бАС ТСА 000 боА ССО ТТО СТО ТОС АСА СТ АСС СТО САЛА ОТ 6175 З МБа біу Авр Бех біу біу Рго цец Уаї Су Акгу б1у Тйх цем біп б1у 175 180 185 Сто сто ТСС о Тоо бОА АСТ ТТС ССТ ТОС бос САА ССС ОААТ САС ССА бсА 723 « цем Уаї бек ТтІр біу тТпх Рпе Рго Сув біу біп Рхо Авп Авр Рго біу 190 195 200 - с СТ ТАС АСТ САА СТО ТОС ААС ТТС АСС АЛ ТОб АТА ААТ САС СС АТО 771 Маї Тукх ТптІ біп Уа) Сув ПЦув Рпе ТІ Цубв Ттр І1е Авп АБр Тпх Мес в! з» 205 210 215 220 п ААА ААП САТ СОС ТААСССОСАСА СТОАСТТААТ ТААСТСТОТо СТТССАДСАВ 823 цув цув Нів Ах 225 ї- ААААТОСАСА ССАСТОАССА СОСССАТСАС СТАТСААСТС АААТТТСАСТ ТТАССТТТСС 883 1 ТСАДАСАТАТ АТТТАААССТ САТОСОСТОТ ТОАТААЛАССА АТСАДАТТОС ТАААСАССТА 943 с АААССААЛАС АААТАААСАА АСАСАДААСС СТСААСОСАА ТТ 986 ша 20 его аналог или вариант, гоМмОолОгичнНьЬІій по меньшей мере на 909 указанной последовательности.

   2. Фрагмент ДНК по п. 71, отличающийся тем, что содержит в основном последовательность, Т» представленную в пункте 1.

   З. Полипептид, обладающий активностью ЗССЕ, содержащий полную последовательность или субпоследовательность представленной ниже аминокислотной последовательности: іме) бо б5

   Мес Азїа Ахд бех цЦез цей цец Ро Пец біп І16є цешй цех Тем бег цей -23 -25 -20 -15 Аїа цез біш Тих Аза біу біс ба Аза бій біу Ар Був І16 І16 АБр -10 -5 1 Ф1у Аза Рхо Суб Аза Атху біу бек НіБ Рхо ТтІр біп Уаї Аїа Тез їец 5- 10 15 бех б1іу АБп біп Пец Ніє СуБ йіу біу Уаї Цеч Уаї Авп бі Аг Тхтр 20 25 30 35 маї цеч ТНх Аза Аїа Нів Сув Пув Меб Азп Січ Тух Тих Уаї Нів Гей 40 45 50 біу бек АБр ТІ Пец біу АБр Ах Ах Аїа біп Агу ІЗе Був Аїа 5ех 55 бо 65 цув бег Рпе Агу Ніє Рго біу Тух бек Тпг біп Тпх Нів Маї Авп АБр 70 75 80 їец Мес Іїеч Уаї цу Тез Авп о бет біп Аза Аку Пе бек бек Мес Уаї 85 90 25 цув цув Маї Агу Тез Рго Бех Ату Сув бій Рко Рко біу Тих Тпх Сув 100 Й 105 110 115 ТІ Ма! Бек біу Тгр біу Тпх Тпу ТБг бетг Рго АБр Маї Тпт Ре рхго 120 125 130 Бех АБр Пец Мес Су Уаї Авр Уаї Цуб5 еп І1е Бег Рго біп АБр Су с 135 140 145 о Так цув Уаї Тут Цув АБр цей це бій АБп бет Мес цем Суб А1а біу 150 155 1650 І1е Рго Ар 5ех цу ЦуБ АБп о Аїа Сув Азп Сіу АБр бек біу біу Рго «І 165 170 175 «- Те Уаї Сув Аг біу Тбх Пеу біп Сіу їеч Уаї бег Ттр біу Тнх рРпе 180 185 190 195 со Рхо Сув біу Сіп Рго Авп Авр Рго біу УМа1 Тут ТБІ біп Уа1ї Суб цу ю 200 205 210 Зо вве Тнх цу Ттр І1є АБп Авр Тит Мес цу цує Нів Аха З 215 220 его аналог или вариант, на 8095 гомологичньІй приведенной аминокислотной последовательности.

   4. Полипептид по п. 3, отличающийся тем, что содержит одну из следующих аминокислотньх « последовательностей: З ді бі Аза біп Ф1у Азрорув 11 ї116 Ар с з з "з біу діа ро Сув діа Ах біу 5ег Ніб Ро Ттр біп маі діа Пец їси " 5 10 15 Бет д1іу Авп сіп Шез Ні Сус біу біу Маї 195 Маії Авп сім Ат9 Тер 20 25 зо 35 ї : Уаї Ти Тпх Аїа Аза Нів Сув цув Меб Азп б)и Тут ТАх Уаії Ніз Тви 1 40 45 50 ОО О3у Зет Авр Тпх їжи О1у Ар Агу Аху Аза біп лта ї16 Був Ада бек бо 65 - 50 . шШув Векх Рпе Аху Нів Рто б1у Тут ех ТП» б15 ТБх Кій Уві Ава Акр Т» - 70 75 І ва їєч Меб їв Маї Цує їжи АБп бат О1п Ліа Агу 123 Зет бе Меб Ма) 85 30 85 25 Шув цув Уві Агя Іжшу Рго Бех Аг Суб б1ч Рго Рхо сіу Тит Тпх Суб Ф! 100 105 Р) 115 ко 60 б5 -ДО-

   ТнІ Уаї бехт Сіу Тгр б1іу Тпх ТБг Типг о бег Рхо Аб5р Ма) ТПх Рпе Рго 120 125 130 бех Авр ем Мес Суз Уаї Авр Маї Гуз їеч І1е Бек Ро тів АБр Су 135 140 ТвІ цу маї Тут Цув Авр їеч Тез бБи Ап бетх Мес Тем Сув діа С1у 150 155 160 Іїе Рго-Авр ех ПЦує цу двп А1їа Суб АБп б1іу Авр 5ех О1у б1у Рго 165 170 115 тез уаі Сув Агу б1у Тпгоцец біп біу Іеш Маї Бек ТтІр С1у ТБЕ рве 180 185 130 135 Рго Суб біу біп Рхо АвпоАБр о Рго біу Уаї Тук Тах біп Ммаї Сув ЦуБ 200 205 210 75 вне Ту ув Тхр І16 Авп Авр Твг Мес Цув ув Нів АхЯ 215 220 или І1їе І1е Авр 1 с1у Аза Рго СуБ А1а Агу біу бех Ні Рто ТІр біп Маї Аза Гей Теп 5 10 15 бЗех с1у Азп біп Пец НіБ СуБ бі1у б1іу Маії Пец Маї Авп біз Аку Ттр 20 25 зо 35 Уаї цем Тпх Аза Аза Нів Сув цув Мес Азп біц Тухк ТпПх Маї Нів їеч сч 40 45 50 о біу бег АБр Тих Печ біу Ар Аху Агу Аза біп Аку Ізїе цуБ Аїа 5ег «8 60 65 Ту бет Рпе Акгуд Нів Рго біу Тух Зек Тах біп Тпк Ні Уа1ї Ап АБр то 75 8о « Тез Мес це Угі цув реп АБп бек біп А1а Ахд цец бех бег Мес Уаї - 85 зо 95 Ге) цує цув Маї Ах Тез Рко Бех Аху Сув бій Рго Ркго Сіу Тпх Тпг Суб 100 й 105 110 й 115 Іо) Тпг о Маї бет біу Тер біу ТНІ ТПг ТНІ бег Рго А5р Маї Тпк РНе рго - 120 125 130 Бех Авр Меч Мег Сув Маї Ар МУа1ї Цуб Печ І1е бек Рко біп Авр Сув 135 140 145 « Тпг цуб Маї Тут Цув АБр Теч Тїеш бі Абп бек Мес Пец Суб дія сіу шщ 150 155 160 с І1е Рко. Ар бех Був ув АБп А1їа Сує Азп біу Авр ех сіу с1у Рго ч 165 170 175 а ес Уаї Сує Агуд сС1у Тпк Пец біп б1у Те Маї бег Тер біу Тк Рре 180 185 190 195

   45 . т» Рто Сує Сіу біп Рхо Авп Авр Рго біу Маії Тух ТІ біп Уаї Сув пуб 200 205 210 1 Рпе ТП Був Ттр І1е Азп Аєр Тих Мес Гуз Цув Нів Агд ОО 215 220 ши 20 5. Полипептид по п. З, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, которая на 8095 гомологична приведенной аминокислотной последовательности, или ее субпоследовательности. їз» 6. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что представляет собой рекомбинантньїй полипептид.

   7. Фрагмент ДНК, способньй к гибридизации с фрагментом ДНК по п. 1, или его частью в жестких условиях гибридизации.

   8. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что гомологичен по меньшей мере на 8095 последовательности, о представленной в п. 71, которьій кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 8095 гомологична аминокислотной последовательности, представленной в п. 3. іме) 9. Фрагмент ДНК по п. 1, которьій кодирует полипептид, обладающий активностью ЗССЕ, и которьй способен связьшваться с моноклональньм антителом, продуцируемьім гибридомной клеточной линией ТЕ4Б, бо которая имеет депозитньій номер Мо 93061817 в ЕСАСО.

   10. Фрагмент ДНК по п. 1, которьій кодирует полипептид, обладающий активностью 5ССЕ, и которьй способен связьшваться с моноклональньм антителом, продуцируемьім гибридомной клеточной линией ТЕО9Б, которая имеет депозитньій номер Мо 93061816 в ЕСАСС.

   11. Фрагмент ДНК по п. 1, которьій кодирует полипептид, обладающий активностью 5ССЕ, и которьй 65 способен связьіваться с поликлональной антисьівороткой, полученной против нативного ЗССЕ, которьй бьл ввіделен из зкстракта диссоциированньх клеток рогового слоя пяточной поверхности (зігайит сотеийт)і). -д41-

   12. Зкспрессирующая система, содержащая нуклеотидную последовательность по любому из пунктов 1-2 и 8-11.

   13. Зкспрессирующая система, содержащая нуклеотидную последовательность по п. 7.

   14. Реплицируемьй вектор зкспрессии, зкспрессирующий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп. 3-6.

   15. Реплицируемьй вектор зкспрессиий по п. 14, отличающийся тем, что представляет собой плазмиду.

   16. Реплицируемьій вектор зкспрессии по п. 15, отличающийся тем, что представляет собой рзе507, депонированную под регистрационньм номером ОМ 8282 в ЮОецівспе бЗаттішпуд моп Місгоогдапізтеп па 7/0 ейкикигеп бтЬН (ОМ).

   17. Реплицируемьій вектор зкспрессии по п. 15, отличающийся тем, что представляет собой рзе500, депонированную под регистрационньм номером ОМ 8281 в ЮОецізспе бЗаттішпуд моп Місгоогдапізтеп па 7ейїкийигеп ОотЬН (О5М).

   18. Плазмида, содержащая фрагмент ДНК по п. 7.

   19. Способ получения полипептида, обладающего активностью ЗССЕ, предусматривающий встраивание фрагмента ДНК по любому из пунктов 1-2 и 8-11 в вектор зкспрессии, трансформирование подходящего организма-хозяина указанньм вектором, полученньм на предьдущей стадии, культивирование организма-хозяина в условиях, подходящих для зкспрессии полипептида.

   20. Способ по п. 19, предусматривающий осуществление посттрансляционной модификации пептида. с (8) « «- со ІС) « -

   с . и? щ» 1 (95) - 50 с» Ф) іме) 60 б5