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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, ein Expressionssystem,
das in der Lage ist, das Polypeptid zu exprimieren, sowie pharmazeutische
und kosmetische Zusammensetzungen, die das Polypeptid umfassen,
und die Verwendung des Polypeptids für verschiedene kosmetische
oder therapeutische Zwecke.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die Haut als Organ ist unter biologischen,
medizinischen und kosmetologischen Gesichtspunkten von Interesse.
Es gibt eine große
Anzahl von Hautkrankheiten, die entweder organspezifisch sind, z.
B. Psoriasis und Ekzeme, oder die Äußerungen eines allgemeinen
Krankheitszustands sind, wie allgemeine allergische Reaktionen.
Die Tatsache, daß es
hautspezifische Krankheiten gibt, kann als Beweis für die Existenz
molekularer Mechanismen angesehen werden, die nur bei der Haut vorkommen.
Analogerweise sind Studien von hautspezifischen molekularen Vorgängen bedeutsam
für das
Verständnis
und die Behandlung von Hautkrankheiten. Es erscheint naheliegend
anzunehmen, daß einige
dieser Vorgänge
in der einen oder anderen Weise mit der am meisten spezialisierten
Funktion der Haut zusammenhängen,
nämlich
der Bildung einer physikalisch-chemischen Barriere zwischen dem
Körperäußeren und
dem Körperinneren.
Die physikalisch-chemische Hautbarriere befindet sich in der äußersten
Schicht der Haut, dem Stratum corneum.
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Das Stratum corneum ist die am stärksten spezialisierte
Struktur der Haut. Es ist das Endprodukt des Differenzierungsprozesses
der Epidermis, das heißt
des geschichteten schuppigen Epithels, das den äußersten Teil der Haut bildet.
Die Mehrzahl der Zellen der Epidermis besteht aus Keratinocyten
in verschiedenen Differenzierungsstadien. Die untersten Keratinocyten,
die Basalzellen, sitzen auf einer Basalmembran in Kontakt mit der
Dermis, das heißt
dem Verbindungsgewebe der Haut, und sind die einzigen zur Teilung
befähigten Keratinocyten.
Ständig
verläßt ein Teil
der Basalzellen die Basalmembran und durchläuft einen Differenzierungsprozeß, der die
Zellen schließlich
zu Baublöcken
des Stratum corneum werden läßt. In diesem
Prozeß durchlaufen
die Keratinocyten eine Anzahl von adaptiven Veränderungen. Der Gehalt an Cytoskelett,
das aus epidermisspezifischen Cytokeratinen besteht, steigt. Die
intermediären
Filamente der benachbarten Zellen werden durch eine erhöhte Anzahl
von Desmosomen zu einer funktionellen Einheit zusammengefaßt. Die
dramatischsten Veränderungen
finden während
des Übergangs
von der obersten lebenden Zellschicht, dem Stratum granulosum, zum
nicht lebensfähigen
Stratum corneum statt, in einem Prozeß, der gewöhnlich Keratinisierung genannt
wird. Kovalent kreuzgebundene Proteine werden in der Nähe der inneren
Seite der Plasmamembran abgelagert und bilden eine sehr widerstandsfähige Zellhülle. Darüberhinaus
wird eine lipidreiche Substanz, die aus einem keratinocytenspezifischen
Zellorganell stammt, in den extrazellulären Raum sekretiert und bildet,
durch die Ausbildung von Lipidlamellen, die die Zellen des Stratum
corneum umgeben, die Permeabilitätsbarriere
gegen hydrophile Substanzen. Schließlich verschwinden alle intrazellulären Strukturen
außer
den dicht gepackten Cytokeratinfilamenten.
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Die Zellen des Stratum corneum, die
Corneocyten, sind somit nicht lebensfähig. Das bedeutet, daß die Regulation
der verschiedenen Prozesse im Stratum corneum das Ergebnis einer „Programmierung" in einem Stadium
sein muß,
in dem die Keratinocyten noch lebensfähig sind. Die Umschichtung
der Epidermis, die sich normalerweise in etwa vier Wochen vollzieht,
während
derer die Zellen ungefähr
zwei Wochen lang Teile des Stratum corneum sind, wird durch das
Abschuppen der Zellen von der Hautoberfläche im Vorgang der Desquamation
beendet. Dieser Vorgang ist ein Beispiel der „Programmierung" des Stratum corneum.
Eine Vorbedingung für
die Funktion des Stratum corneum als physikalisch-chemische Barriere
ist, daß seine
einzelnen Zellen durch mechanisch widerstandsfähige Strukturen, nämlich Desmosomen,
zusammengehalten werden. Die Degradation von Desmosomen, die eine
Vorbedingung für
die Desquamation ist, muß so
reguliert werden, daß sich
ein Zellabschuppen von der Hautoberfläche ergibt, das die Neuproduktion
des Stratum corneum ausgleicht, ohne die Barrierefunktion des Gewebes
zu beeinträchtigen.
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Störungen der
Keratinisierung
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Unter einer großen Zahl von pathologischen
Zuständen
der Haut von unterschiedlichem Schweregrad finden sich auch Störungen des
Keratinisierungsvorgangs. Bei der Psoriasis handelt es sich, zusätzlich zu
einer typischen chronischen Entzündung,
um Überproduktion
eines unreifen Stratum corneum, was zur typischen Schuppenbildung
dieser Krankheit führt.
Es gibt eine Gruppe ererbter Hautkrankheiten, die durch ein verdicktes
Stratum corneum gekennzeichnet sind, das zur Bildung von „Fischschuppen" führt, die
sogenannten Ichthyosen. Bei einigen Ichthyosen ist die Rate der
Desquamation geringer. Obwohl weniger schwer als die Ichthyosen,
ist die „trockene
Haut" (Xeroderma)
ebenfalls durch ein Stratum corneum gekennzeichnet, von dem Corneocyten
abgeschuppt werden; und zwar nicht wie unter normalen Bedingungen
als einzelne Zellen oder als kleine Zellaggregate, sondern als große, makroskopisch
sichtbare Schuppen. Diese Störung
ist unter älteren
Menschen und Atopikern, das heißt
Individuen mit einer verringerten Widerstandsfähigkeit gegen Hautirritationen
und einer Veranlagung zur Entwicklung einer charakteristischen Form
von endogenen Ekzemen, weit verbreitet. Bei den Aknekrankheiten
ist die Keratinisierung in den Gängen
der Talgdrüsen
gestört,
was zur Bildung von Mitessern und Verstopfungen führt. Der
Bildung von Mitessern folgt die entzündliche Akne, von der man annimmt,
daß sie
durch jene hervorgerufen wird.
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Proteolytische
Enzyme sind an der Keratinisierung beteiligt
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Es gibt mehrere Stadien im Keratinisierungsvorgang
und während
der Umschichtung des Stratum corneum, in denen proteolytische Enzyme
wichtige Rollen zu spielen scheinen. Mit Sicherheit muß das Verschwinden
aller intrazellulären
Strukturen außer
den Cytokeratinfilamenten, das sich während des Übergangs von den lebensfähigen zu
den verhornten Epidermisschichten vollzieht, Proteolyse beinhalten.
Die Transformation von Profilaggrin in Filaggrin, ein Protein, von
dem man annimmt, daß es
bei dem speziellen Typ der Aggregation von Cytokeratinfilamenten
während
der Keratinisierung wirkt, könnte
durch eine spezifische Proteinase katalysiert werden. Im Stratum
corneum wird Filaggrin weiter zu Bestandteilen von niederem Molekulargewicht
abgebaut, die möglicherweise
als „natürliche Feuchtigkeits spender" von Bedeutung sind.
Weiterhin gibt es proteolytische Veränderungen von Cytokeratinpolypeptiden
während
des Keratinisierungsvorgangs. Schließlich ist es noch wahrscheinlich,
daß proteolytische
Vorgänge
entscheidende Rollen beim Abbau intrazellulärer kohäsiver Strukturen im Stratum
corneum bei Vorgängen
spielen, die schließlich
zur Desquamation führen.
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Zellkohäsion im
Stratum corneum und Desquamation. Die Rolle der Desmosomen
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Die interzelluläre Kohäsion im Stratum corneum sowie
in den lebensfähigen
Teilen der Epidermis wird zu einem bedeutenden Teil durch Desmosomen
bewirkt. Ein Desmosom besteht aus zwei symmetrischen Hälften, von
denen jede aus zwei benachbarten Zellen gebildet wird. Jede desmosomale
Hälfte
hat einen interzellulären
Teil, der an die Cytokeratinfilamente gebunden ist, und einen Teil,
der aus intrazellulär
und mit transmembranalen und extrazellulären Teilen verankerten Glykoproteinen
aufgebaut ist. Die extrazellulären
Teile dieser Proteine, die Desmogleine, sind Adhäsionsmoleküle, und durch ihre gegenseitige
Wechselwirkung im extrazellulären
Raum wird eine kohäsive
Struktur gebildet. Der Abbau von Desmosomen scheint im Stratum corneum
der Handflächen
und Fußsohlen
im Vergleich zum nicht-palmo-plantaren Stratum corneum auf etwas unterschiedlichem
Weg zu erfolgen. In letzterem Gewebe verschwinden etwa 85% der Desmosomen
kurz nachdem die Zellen vollständig
verhornt sind. Die verbleibenden Desmosomen, die vorzugsweise an
den villibesetzten Rändern
der extrem abgeflachten Zellen gelegen sind, bleiben scheinbar bis
zu dem Niveau intakt, auf dem die Desquamation stattfindet. In palmo-plantarem
Stratum corneum sind die Corneocyten viel weniger abgeflacht, und
es kommt nicht zu einer extensiven Degradation von Desmosomen in
den tieferen Schichten des Gewebes. In beiden Geweben geht die Desquamation
mit desmosomaler Degradation einher. Es wurde gezeigt, daß sowohl
in ichthyolytischer Haut als auch in „trockener Haut" die Zahl der Desmosomen
in den oberflächennahen
Schichten des Stratum corneum erhöht ist.
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Interzelluläre Lipide
des Stratum corneum
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Der Unterschied zwischen der desmosomalen
Degradation in palmo-plantarem und nichtpalmo-plantarem Stratum
corneum könnte
mit dem Unterschied in den Mengen extrazellulärer Lipide in den beiden Gewebetypen
zusammenhängen.
Der Lipidgehalt ist in nicht palmo-plantarem Stratum corneum bedeutend
höher. Demzufolge
ist die Wirksamkeit dieses Gewebes als Permeabilitätsbarriere
gegen Wasser und andere hydrophile Substanzen höher als die des Stratum corneum
der Handflächen
und Fußsohlen.
Da Desmosomen ein beträchtliches
Volumen einnehmen, und da intakte Desmosomen eine Ausweitung des
extrazellulären
Raumes verhindern, könnte
die desmosomale Degradation ein Mechanismus sein, durch den mehr
extrazellulärer Raum
für Lipide
verfügbar
gemacht wird. Die extrazellulären
Lipide des Stratum corneum hängen
auch in mehrfacher anderer Weise mit der Desquamation zusammen.
Da sie Hauptbestandteile des extrazellulären Raumes sind, steht zu erwarten,
daß sie
bedeutende Einflüsse
auf die Aktivitäten
von Enzymen haben, die an diesem Ort wirksam sind, z. B. Enzyme,
die für
die desmosomale Degradation verantwortlich sind. Tatsächlich wurde
gezeigt, daß verschiedene
Störungen
des Fettstoffwechsels die wahrscheinliche Ursache für mehrere Typen
von Ichthyosen sind. Es ist auch wahrscheinlich, daß Lipide
selbst bis zu einem gewissen Grad zur Kohäsion der Zellen des Stratum
corneum beitragen. Mehr noch, die Sekretion von Lipide in den extrazellulären Raum
des Stratum corneum ist wahrscheinlich auch mit der Sekretion einer
Anzahl von Enzymen verbunden. Vorläufer der Lipide sind in den
oberen lebensfähigen
Keratinocyten in spezifischen Organellen eingelagert. Es wurde gezeigt,
daß diese
sogenannten Lamellarkörperchen
eine Anzahl hydrolytischer Enzyme enthalten. Man nimmt deshalb an,
daß ein
Enzym, das für
die desmosomale Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist,
möglicherweise
in einer inaktiven Vorform von den Keratinocyten synthetisiert wird,
in Lamellarkörperchen
gelagert und während
der Keratinisierung in den extrazellulären Raum des Stratum corneum
sekretiert wird, wo es aktiviert werden kann, und daß seine
Aktivität
neben anderen Faktoren durch die Zusammensetzung der extrazellulären Lipide
weiter gesteuert wird.
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Störungen der Zellkohäsion in
lebensfähiger
Epidermis
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Es gibt eine Anzahl von Hautkrankheiten,
bei denen die Kohäsion
zwischen Keratinocyten und den nichtverhornten lebensfähigen Epidermisschichten
beeinträchtigt
ist. Diese Krankheiten sind durch ein Acantholyse genanntes Phänomen gekennzeichnet,
nämlich
ein Zusammenbruch der desmosomalen Kontakte zwischen ansonsten scheinbaren
normaleren Keratinocyten. Wahrscheinlich wird dieser Vorgang von
Proteinasen verursacht, die bisher noch nicht genau bestimmt wurden.
Die Acantholyse, die, wenn sie große Bereiche erfaßt, zur
Blasen bildung führen
kann, ist ein Charakteristikum der Autoimmunkrankheiten Pemphigus
vulgaris und Pemphigus foliaceus, des ererbten milden familiären Pemphigus
(Hayley-Hayley'sche
Krankheit) und der ererbten Dyskeratosis follicularis (Darier'sche Krankheit).
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Die Epidermis spielt eine
aktive Rolle bei immunologischen und entzündlichen Reaktionen
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Zusätzlich zu ihrer Funktion als
Erbauer der physikalisch-chemischen Barriere zwischen Körperinnerem
und -äußerem fungiert
die Epidermis auch als aktive immunologische Barriere. Die Keratinocyten
haben die Fähigkeit,
eine große
Anzahl von Cytokinen und anderen Entzündungsbewirkern herzustellen
sowie auf diese zu antworten, wodurch sie mit Zellen des immunologischen
und inflammatorischen Systems kommunizieren und wechselwirken. Dies
ist von großer
Bedeutung bei der Verteidigung des Wirtes gegen mikrobielle Infektionen
und bei der Wundheilung. Die moderne Forschung hat auch gezeigt,
daß die
Keratinocyten wahrscheinlich eine aktive Rolle bei vielen Entzündungskrankheiten
der Haut, wie Psoriasis und Ekzeme spielen.
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Epidermale
Proteinasen können
bei Entzündungen
wichtig sein
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Eines der Cytokine, das von Keratinocyten
produziert wird, ist Interleukin 1 (Il-1). Es gibt zwei Formen von
Il-1, Il-1α und
Il-1β, die
beide in der Epidermis vorkommen. Während Il-1α schon in der synthetisierten Form
voll aktiv ist, wird Il-1β als
inaktive 31 kD-Vorform synthetisiert. Pro-Il1β wird durch eine spezifische
Proteinase, die z. B. in Monocyten vorkommt, die aber bisher in
normaler Epidermis nicht festgestellt wurde, in die aktive 17 kD-Form
konvertiert. Eine Anzahl von Serinproteinasen mit chymotrypsinartiger
Substratspezifität (pankreatisches
Chymotrypsin und Cathepsin G aus neutrophilen Granulocyten) können jedoch
auch als Pro-Il1β-Aktivatoren
dienen.
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Wie von Norris (1990) vorgeschlagen,
könnten
die im intrazellulären
Raum des Stratum corneum vorhandenen proteolytischen Enzyme unter
bestimmten Bedingungen in der Lage sein, inaktive Cytokinformen
in aktive Formen zu konvertieren. Von besonderem Interesse ist in
diesem Zusammenhang das biologisch inaktive Pro-Interleukin-1β, von dem
gezeigt wurde, daß es
von Keratinocyten produziert wird (Mizutani et al., 1991). Bisher
wurden keine epidermalen Enzyme mit der Fähigkeit gefunden, Pro-Interleukin-1β in aktives
Interleukin-1β zu konvertieren.
Da jedoch Chymotrypsin und Cathepsin G (ein chymotrypsinähnliches
Enzym) die Fähigkeit
haben, die Umwandlung von inaktivem rekombinantem 31 kD-Pro-Interleukin-1β in eine voll aktive 17 kD-Form
zu katalysieren, ist es möglich,
daß auch
epidermale chymotrypsinähnliche
Enzyme diese Umwandlung katalysieren könnten.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das in seiner
aktiven Form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
(S-2586) abzubauen, wobei das Abbauen durch das Polypeptid durch
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und das Polypeptid:
- (a) eine Aminosäuresequenz hat, die eine Homologie
von mindestens 80% mit der Aminosäuresequenz 1-224 in SEQ ID
NR: 2 hat;
- (b) eine Aminosäuresequenz
hat, aus der eine konstitutive Abfolge von 20 Aminosäuren bis
zu einem Grad von mindestens 95% homolog ist mit einer Abfolge von
Aminosäuren
der selben Länge,
ausgewählt
aus der Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NR: 2 gezeigt ist; oder
- (c) eine Untersequenz des Polypeptids in (a) ist, umfassend
50 bis 250 Aminosäuren.
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D. h. ein Enzym, das als Stratum
corneum chymotryptisches Enzym (SCCE) bezeichnet wurde, und von
dem man annimmt, daß es
für die
desmosomale Degradation im Stratum corneum verantwortlich ist. In Beispiel
1 werden Hinweise darauf vorgestellt, die zeigen, daß die Zellabschuppung
von der Oberfläche
der verhornten Oberflächenschicht
der Haut mit der Degradation desmosomaler Proteine einhergeht, und
daß das dafür verantwortliche
Enzym eine chymotrypsinähnliche
Serinproteinase zu sein scheint, die durch sind Zinkionen gehemmt
werden kann.
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Beispiel 2 beschreibt die Entdeckung
des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE); eine Proteinase,
die die Kriterien dafür
erfüllt,
die Verantwortliche für
die Degradation der intrazellulären
kohäsiven Strukturen
im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo zu
sein. Beispiel 3 beschreibt die teilweise Charakterisierung der
Aktivität
des Stratum corneum chymotryptischen Enzyms (SCCE) mittels chromogener
Substrate.
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Die Ergebnisse zeigen, daß SCCE sich
von anderen chymotryptischen Proteinasen enzymologisch unterscheidet.
Das Inhibitorprofil und die Fähigkeit,
zwei verschiedene Substrate von chymotrypsinartigen Enzymen zu degradieren,
ist bei SCCE im Vergleich zu Rinder-Chymotrypsin und menschlichem
Cathepsin G signifikant verschieden. SCCE scheint auch von menschlicher
Mastzellen-Chymase signifikant verschieden zu sein. Das letztere
Enzym katalysiert wirkungsvoll die Degradation von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
(vgl. Schwartz et al., 1987 und Schechter et al., 1989) – was SCCE
nicht tut – und
wird nicht durch Aprotinin oder SBTI gehemmt (Schechter et al.,
1983 und Wintroub et al, 1986), was bei SCCE der Fall ist.
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Beispiel 4 beschreibt die teilweise
Reinigung von SCCE aus KCl-Extrakten von Corneocyten mittels der
Affinitätschromatographie
auf unlöslich
gemachtem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI und die Bestimmung der
N-terminalen Aminosäuresequenz
von SCCE. Mit nichtreduzierten Proben waren die Erträge in den Stufen
1–6 gut,
fielen aber in den Stufen 7 und 9 auf Null, und die Erträge in den
nachfolgenden Schritten waren bedeutend verringert. Auch mit reduzierten
Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate festgestellt
werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen Derivate
festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen Abfälle der
Erträge.
Das Ergebnis legt nahe, daß in
den Positionen 7 und 9 Cysteine vorhanden sind. Es war jedoch nicht
möglich,
in den Schritten 7 und 9 nach einer Reduktion und Behandlung mit
Jodessigsäure
(100 mM) carboxymethyliertes Cystein festzustellen. Die erhaltene
Sequenz (13, SEQ ID
NR: 3) war bei reduzierten und nichtreduzierten Proben identisch.
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Beispiel 5 beschreibt die Herstellung
SCCE-spezifischer monoclonaler Antikörper und polyclonaler SCCE-spezifischer
Hühner-
und Kaninchenantikörper
sowie immunhistochemische Studien mit den monoclonalen Antikörpern.
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Beispiel 6 beschreibt das Clonieren
und die Sequenzierung einer cDNA, die menschliches SCCE codiert.
Zunächst
wurde eine cDNA-Bank, die aus von adulten menschlichen Keratinocyten
epidermalen Ursprungs abgeleiteter mRNA hergestellt worden war,
mit polyclonalen Anti-SCCE-Antikörpern
von Kaninchen abgesucht. Einer der Antikörper gab ein starkes Hintergrundsignal
und wurde zu einem frühen
Zeitpunkt aus der ausgedehnten Absuchungsstudie ausgeschieden. Unter
Verwendung eines anderen polyclonalen Antikörpers (D-5) wurde eine Anzahl
immunreaktiver Plaques in der für
echte positive Plaques erwarteten Weise angerei chert. Es wurde jedoch
bei keinem der Plaques eine Reaktivität mit den monoclonalen Antikörpern moAb4 und
moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzym-Charakterisierung
und PCR-Charakterisierung von elf ausgewählten Plaques ergab, daß keine Ähnlichkeiten
zwischen den verschiedenen Plaques festgestellt werden konnten.
Da dieser Versuch, einen „Fingerabdruck" einer möglichen
SCCE-cDNA-Sequenz zu definieren, gescheitert war, mußte die
Strategie modifiziert werden.
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Trotz der bevorzugten Feststellung
immunreaktiven SCCE-Materials in den suprabasalen Keratinocyten,
wurde eine cDNA-Bank, die aus gezüchteten menschlichen Keratinocyten
hergestellt worden war, zum Absuchen von SCCE-cDNA verwendet. Es
kann erwartet werden, daß eine
solche Bank nur cDNA aus basalen Keratinocyten enthält. Dieser
Versuch basierte auf der Beobachtung einer schwachen aber möglicherweise signifikanten
Immunfärbung
bei Verwendung von monoclonalen SCCE-Antikörpern, ebenfalls aus basalen
Keratinocyten.
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Die Plaques wurden mit einer synthetischen
17-mer-Oligonucleotidsonde abgesucht, die auf der Basis des zuverlässigsten
Teils der Aminosäuresequenz,
Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NR: 10, As 1–As 6) der experimentell bestimmten
aminoterminalen Sequenz des nativen SCCE-Enzyms wie in Beispiel
4 beschrieben entwickelt worden war. Aufgrund der Unsicherheit innerhalb
der experimentell bestimmten Aminosäuresequenz, wurde dieses Hexapeptid
als einer der zuverlässigsten
Teile erachtet. Auch führten
die möglichen
Codons, die dieses Hexapeptid codieren, zur geringstmöglichen
Degeneration der DNA-Sonde. Die längere, experimentell bestimmte
Sequenz Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu (SEQ ID NR: 3, As
15–As
24) wurde aufgrund des hohen Grades von Degeneration einer Sequenz,
die diese Peptidsequenzen codiert, ausgeschlossen. Vierzehn positive
Plaques wurden im ersten Suchvorgang festgestellt. Diese positiven
Plaques wurden erneut abgesucht, wobei die gleiche Sonde und die
gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben verwendet wurden.
Nach diesem erneuten Suchvorgang wurden zwei positive Plaques festgestellt.
Die beiden ausgewählten
Plaques wurden ein weiteres Mal gereinigt, und die Größe der Inserts
durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601, die zu den zwei
Phagenarmen komplementär
waren, als Primer und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden.
Dieses clonierte Fragment wurde einer partiellen Sequenzanalyse
unterworfen.
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Die Übersetzung der erhaltenen DNA-Sequenz
ergab eine Aminosäuresequenz,
die zu der experimentell bestimmten Proteinsequenz homolog war.
Jedoch fehlte der Sequenz ein Translationsstartcodon. Um eine cDNA
von voller Länge
zu isolieren, wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel separiert und als
Sonde verwendet, die eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen
erlaubte. Um eine DNA von voller Länge zu erhalten, wurde die
cDNA-Bank mit dieser Sonde zweimal erneut abgesucht, wobei die gleichen
Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt wurden, außer daß die Hybridisierung
unter stringenten Bedingungen bei 65°C geschah. Diese Versuche führten zur
Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques, die
anfangs mit PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 oder SYM
1601 in Verbindung mit SYM 3208 als PCR-Primer für die Bestimmung einer Plaque,
die den ganzen 5' offenen
Leserahmen enthielt, verwendet wurde.
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Nach weiterem Absuchen und weiterer
Sequenzanalyse wurden die erhaltenen, aus diesen Phagen abgeleiteten
amplifizierten PCR-Fragmente wie detailliert im Beispiel 6 beschrieben
cloniert, und die Ergebnisse zeigten, daß einer der Phagen, 205.2.1,
ein Insert von voller Länge
enthielt. Die komplette Nucleotidsequenz des cDNA-Fragments wurde
bestimmt. Die Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) enthielt einen offenen
Leserahmen, der ausreichte, um die ganze Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren
einschließlich
eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids
(SEQ ID NR: 2) zu codieren.
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Beispiel 7 beschreibt die Entdeckung
von zwei SCCE-mRNA-Spezies in menschlicher Epidermis, die in der
Lage waren, mit cDNA-Sonden zu hybridisieren, die auf der Grundlage
einer SCCE-cDNA-Sequenz hergestellt worden waren.
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Beispiel 8 beschreibt die Expression
rekombinanten SCCE in E. coli. Die Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist,
rekombinantes SCCE in Bakterien herzustellen.
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Beispiel 9 beschreibt die Expression
rekombinanten menschlichen SCCE in Säugerzellen. Es werden drei
Proteine hergestellt, die eine Reaktion mit allen verfügbaren polyclonalen
Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern sowie
mit den hinterlegten polyclonalen Antikörpern zeigen. Die rekombinanten
Proteine, die mit den gegen natives SCCE hervorgerufenen Antikörpern reaktiv
sind, weisen ein etwa 1 kDa größeres scheinbares
Molekulargewicht auf als gereinigtes, natives menschliches SCCE.
Das rekombinante Protein zeigt keinerlei proteolytische Aktivität.
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Die Reinigung, Aktivierung und weitere
Charakterisierung von rekombinantem SCCE wird im Beispiel 10 beschrieben.
Die inaktive Vorform von rekombinantem SCCE kann durch proteolytische
Spaltung mit Trypsin oder Endopeptidase Lys-C aktiviert werden.
Man nimmt an, daß eine
Anzahl anderer Proteasen, die ein Peptid nach einer basischen Aminosäure spalten,
wie etwa Endoproteinase Lys-C, Papain und Plasmin, in der Lage sein
werden, Pro-SCCE zu aktivem SCCE zu aktivieren. Es wurde gefunden,
daß das
Signalpeptid aus 22 Aminosäuren
besteht, und beruhend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz
von nativem, aktivem SCCE besteht das Propeptid aus sieben Aminosäuren. Weiterhin
wird gezeigt, daß das
erzeugte rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten Formen und in
einer nichtglykosylierten Form vorkommt, was analog zu den mit aktiver
nativer SCCE erhaltenen Ergebnissen ist.
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Unter dem Begriff „Stratum
corneum chymotryptisches Enzym (SCCE)" oder „ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität" wird in seinem weitesten
Sinn eine Serinproteinase oder eine Vorform einer solchen, wie ein
Proenzym (Pro-SCCE) oder ein Fusionsprotein, das durch proteolytische
Spaltung aktiviert werden kann, verstanden, wobei dieses Enzym in
seiner aktiven Form von den gleichen Inhibitoren und in ähnlicher
Weise gehemmt wird, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen
mit Proben verhornter Haut hervorgerufen werden kann, die bei neutralem
oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur inkubiert
werden.
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Spezifischer gesehen, definiert der
Begriff „ein
Polypeptid mit SCCE-Aktivität" somit ein Polypeptid, das
von Chymotrypsin und Cathepsin G verschieden ist, und das in seiner
aktiven Form in der Lage ist, das Substrat MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA
(S-2586) abzubauen, wobei der Abbau durch das Polypeptid von Aprotinin,
Chymostatin und Zinksulfat gehemmt wird, und zwar im wesentlichen
wie in den Beispielen 3 und 13 beschrieben und in 9 und Tabelle 5 veranschaulicht.
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Noch spezifischer umfaßt der Begriff „ein Polypeptid
mit SCCE-Aktivität" ein Polypeptid,
das in der Lage ist, die proteolytische Degradation des desmosomalen
Proteins Desmoglein I während
der in vitro-Inkubation von plantarem Stratum corneum zu verursachen.
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Ein solches Polypeptid wird im allgemeinen
auch mit Antikörpern
reagieren, die gegen natives SCCE, das aus einem Extrakt von dissoziierten
plantaren Stratum corneum-Zellen gereinigt wurde, hervorgerufen wurden.
Beispiele solcher Antikörper
sind die polyclonalen Antikörper,
die wie in 5.2 beschrieben hergestellt werden, und die monoclonalen
Antikörper
TE4b und TE9b, die wie in Beispiel 5.1 beschrieben hergestellt werden.
Die monoclonalen Antikörper
werden von den Hybridomen TE4b und TE9b produziert, die gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags unter den Zugangsnummern ECACC 93061817
bzw. ECACC 93061816 bei der European Collection of Animal Cell Cultures,
Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Vereinigtes Königreich,
hinterlegt wurden.
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Das Clonieren und die Sequenzierung
einer cDNA, die menschliches SCCE codiert, wird im Beispiel 6 beschrieben.
Es wurde eine Nucleotidsequenz gefunden, die einen offenen Leserahmen
enthält,
der ausreicht, um die ganze Aminosäuresequenz eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren
einschließlich eines
Signalpeptids und eines Präpolypeptids
zu codieren. Die Nucleotidsequenz wird in SEQ ID NR: 1 und die daraus
abgeleitete Aminosäuresequenz
von „Stratum
corneum chymotryptischem Enzym (SCCE)" in SEQ ID NR: 2 gezeigt.
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Mit dem Begriff „Pro-SCCE oder ein Analogon
oder eine Variante davon" ist
ein Polypeptid gemeint, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 oder
ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz hat, die produziert
wird, wenn eine Nucleotidsequenz der Erfindung in einem geeigneten
Expressionssystem exprimiert wird, und die nach proteolytischer
Aktivierung eine Serinproteinase ergibt, die von den gleichen Inhibitoren
gehemmt werden kann, wie die spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen
mit Proben verhornter Hautschichten induziert werden kann, die bei
neutralem oder fast neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur,
d. h. etwa 37°C
inkubiert werden. Im allgemeinen wird das Protein mit Antikörpern reagieren,
die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen
wurden.
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Mit dem Begriff „ein SCCE oder ein Analogon
oder eine Variante davon" ist
ein Polypeptid gemeint, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 oder
ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz hat, die produziert
wird, wenn eine Nucleotidsequenz der Erfindung in einem geeigneten
Expressionssystem exprimiert wird, und die eine Serinproteinase
ist, die von den gleichen Inhibitoren gehemmt werden kann, wie die
spontane Zelldissoziation, die in Modellsystemen mit Proben verhornter
Hautschichten induziert werden kann, die bei neutralem oder fast
neutralem pH-Wert bei physiologischer Temperatur, d. h. etwa 37°C inkubiert
werden. Im allgemeinen wird das Protein mit Antikörpern reagieren,
die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen
wurden.
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Mit dem Begriff „ein Analogon oder eine Variante
davon" ist somit
ein Polypeptid gemeint, das nicht genau die gleiche Aminosäuresequenz
hat, wie in SEQ ID NR: 2 gezeigt, aber noch „SCCE-Aktivität" wie vorstehend definiert
hat. Im allgemeinen werden solche Polypeptide Polypeptide sein,
die im Vergleich zu dem in den Beispielen beschriebenen SCCE-Protein
bis zu einem gewissen Grad variieren, z. B. hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung
oder in den posttranslationalen Modifikationen, z. B. Glykosylierung
oder Phosphorylierung.
-
Der Begriff „Analogon" oder „Variante" wird also im vorliegenden Zusammenhang
gebraucht, um ein Protein oder Polypeptid von einer ähnlichen
Aminosäurezusammensetzung
oder -Sequenz wie die charakteristische Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 zu
bezeichnen, das vom SCCE-Protein wie in Beispiel 6 beschrieben abgeleitet
ist, wobei kleinere Abweichungen möglich sind, die die Aminosäuresequenz
verändern,
z. B. Deletionen, stellengerichtete Mutationen, Insertionen zusätzlicher
Aminosäuren
oder Kombinationen davon, um so SCCE-Proteinanaloga zu erzeugen.
Diese Modifikationen können
interessante und nützliche
neuartige Eigenschaften des Analogons ergeben. Das analoge Polypeptid
oder Protein kann von einem Tier oder einen Menschen abgeleitet
oder teilweise oder komplett synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon
kann auch durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken abgeleitet
sein.
-
Ein wichtiges Polypeptid ist ein
Polypeptid, in dem mindestens ein Aminosäurerest durch einen anderen
Aminosäurerest
ersetzt wurde, und/oder bei dem mindestens ein Aminosäurerest
deletiert oder hinzugefügt
wurde, so daß sich
ein Polypeptid ergibt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die
von der Aminosäuresequenz
aus SEQ ID NR: 2 oder einer Untersequenz dieser Aminosäuresequenz,
wie nachstehend definiert, verschieden ist, doch im wesentlichen
die vorstehend definierte SCCE-Aktivität hat.
-
Ein interessantes Polypeptid ist
ein Polypeptid, das ein Analogon oder eine Untersequenz des Polypeptids
der Erfindung ist, und das 50 bis 250 Aminosäuren umfaßt, z. B. mindestens 70 Aminosäuren, mindestens
100 Aminosäuren,
mindestens 150 Aminosäuren
oder mindestens 200 Aminosäuren.
-
Besonders wichtig ist das Polypeptid,
das die Aminosäuresequenz
1-224 in SEQ ID NR: 2 (SCCE) hat.
-
Der Begriff „enzymatisch aktive Untersequenz" bezeichnet eine
Polypeptidsequenz, die nur einen Teil der in SEQ ID NR: 2 gezeigten
Polypeptidsequenz umfaßt,
und die enzymatische Aktivität
aufweist. Dazu zählen
auch Polypeptidsequenzen, die durch Modifikationen wie hier erklärt analogisiert
wurden. Das spezifische Polypeptid (oder die Polypeptide), das die
enzymatisch aktive Stelle umfaßt,
wird als besonders interessant erachtet.
-
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 wurde mit den Aminosäuresequenzen der Enzyme menschliches
Chymotrypsin (Toulta et al., 1989), menschliches Cathepsin G (Salvesen
et al., 1987) und menschliche Mastzellen-Chymase (Caughey et al.,
1991) verglichen. Obwohl die abgeleitete Aminosäuresequenz die konservierten
aktiven Regionen von Serinproteinasen enthält, ist der Grad der Homologie
ziemlich niedrig, ungefähr
33–38%.
In dieser Hinsicht erscheint es somit, daß SCCE nur eine mäßige Ähnlichkeit
mit bisher bekannten Serinproteinasen hat. Andererseits ist SCCE
eine typische Serinproteinase, was die Histidin-, Aspartat- und
Serinreste des aktiven Zentrums und die konservierten Regionen in
der Nähe
dieser Stellen betrifft. Dies gilt auch für die meisten der Cysteinreste
und der anderen hochgradig konservierten Regionen von Serinproteinasen.
Am Boden der primären
Spezifitätstasche
(Rest 189 bei Chymotrypsin) befindet sich ein Serinrest in menschlichem
Chymotrypsin, in Mastzellen-Chymase und in prostataspezifischem
Antigen, und ein Alaninrest in menschlichem Cathepsin G. Beim SCCE
hingegen wird diese Position von einem Asparaginrest eingenommen.
Dies könnte
den Befund erklären,
daß SCCE,
obwohl es zweifellos chymotryptische Aktivität hat, sich in seiner relativen
Aktivität
verschiedenen chromogenen Peptidsubstraten gegenüber von Chymotrypsin und Cathepsin
G unterscheidet, so, wie dies auch die Inhibitionswirkung von Chymostatin,
einem Inhibitor chymotrypsinartiger Enzyme von geringer Molekularmasse
tut.
-
Einen Vergleich zwischen den Sequenzen
von menschlichem Chymotrypsin, menschlichem Cathepsin G und menschlicher
Mastzellen-Chymase und der von SCCE ist in der folgenden Aufstellung
der Sequenzen gezeigt.
-
-
Die Ausrichtung geschah manuell.
- HUMCTRP = menschliches Chymotrypsin (Touita et al., BBRC 158:
569–575,
1989)
- HUMCHTG = menschliches Cathepsin G (Salvesen et al., Biochemistry
26: 2289–2293,
1987)
- HUMCHYM = menschliche Mastzellen-Chymase (Caughey et al., J.
Biol. Chem. 266: 12956–12963,
1991)
-
Homologien:
-
- HUMCTRP/SCCE: 85/224 = 38%
- HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33%
- HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33%
- HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48%
-
Die Numerierung bezieht sich auf
Chymotrypsinogen.
-
Unterstreichungen:
-
Konservierte Regionen in der Nähe des aktiven
Zentrums (Ile 15, His 57, Asp 102, Ser 195 bei Chymotrypsin und
der primären
Spezifitätstasche
von Chymotrypsin (Ser 189, Ser 213-Trp 215, Gly 226 bei Chymotrypsin).
-
Sternchen: Mögliche Glykosylierungsstellen
bei SCCE.
-
Ein wichtiges Polypeptid ist ein
Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz,
von der eine fortlaufende Abfolge von 20 Aminosäuren zu mindestens 80% zu einer
ebenso langen Abfolge von Aminosäuren
aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz homolog ist.
-
Polypeptidsequenzen, die eine Homologie
von mindestens 80%, wie mindestens 85%, z. B. 90% mit dem in SEQ
ID NR: 2 gezeigten Polypeptid haben, sind wichtig. Da die in SEQ
ID NR: 2 gezeigte Sequenz ziemlich einzigartig zu sein scheint,
sind Polypeptide wichtig, für
die der Homologiegrad zu einer ähnlichen
fortlaufenden Abfolge von 20 Aminosäuren, die aus der in SEQ ID
NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
ausgewählt
werden, nicht über
55%, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 70% beträgt. Solche Sequenzen können von ähnlichen
Proteinen von anderen Arten, z. B. anderen Säugern, wie Maus, Ratte, Kaninchen,
Meerschweinchen, Schwein oder Rind sein. Da kleinere Teile der Sequenz
beträchtliche Ähnlichkeiten
zu anderen Serinproteinasen aufweisen können, beinhalten die interessanten
Polypeptide auch Peptide mit einem Homologiegrad von mindestens
95% und, am meisten vorzuziehen, mindestens 99% Homologie zu einer ähnlichen fortlaufenden
Abfolge von 20 Aminosäuren,
die aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ausgewählt werden.
-
Mit dem Begriff „Sequenzhomologie" ist die Identität der Aminosäuresequenzen
in Abschnitten von zwei oder mehr Aminosäuren des Gegenstückes hinsichtlich
Identität
und Position der Aminosäuren
der Polypeptide gemeint.
-
Der Begriff „homolog" wird somit hier dazu verwendet, den
Grad der Identität
zwischen der Aminosäuresequenz
eines gegebenen Polypeptids und der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
zu veranschaulichen. Die Aminosäuresequenz,
die mit der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz verglichen werden
soll, kann aus einer Nucleotidsequenz, wie einer DNA- oder RNA-Sequenz
abgeleitet werden; z. B. durch Hybridisierung, wie nachstehend definiert
erhalten sein, oder sie kann durch konventionelle Aminosäuresequenzierungsverfahren
erhalten werden. Der Homologiegrad wird vorzugsweise anhand der
Aminosäuresequenz
eines reifen Polypeptids bestimmt, das heißt, ohne irgendwelche Leader-Sequenzen
in Betracht zu ziehen. Im allgemeinen werden nur codierende Regionen
verwendet, wenn Nucleotidsequenzen untereinander verglichen werden,
um ihre interne Homologie zu bestimmen.
-
Im vorliegenden Zusammenhang soll
der Begriff „Polypeptid,
das von mindestens einem der hinterlegten Antikörper erkannt wird" auch eine Aminosäuresequenz
einschließen,
die Aminosäuren
umfaßt,
die einen hinsichtlich linearer oder räumlicher Anordnung im wesentlichen
zusammenhängenden
Bereich einer beliebigen Untersequenz des in SEQ ID NR: 2 gezeigten
Polypeptids darstellen, der von mindestens einem der hinterlegten
Antikörper
erkannt wird. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt, können auch
die sekundäre oder
tertiäre
Anordnung interessante und nützliche
Eigenschaften haben und Epitope darstellen. Die hinterlegten Antikörper TE4b
und TE9b scheinen Konformationsepitope des SCCE zu erkennen.
-
Es wurde gezeigt, daß ein wie
in Beispiel 5.2.2 hergestellter polyclonaler Antikörper von
Kaninchen in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine körnige Färbung des
Stratum granulosum und eine ziemlich diffuse Färbung des unteren Stratum corneum
hervorrief. Antikörper,
die gegen gereinigtes natives oder rekombinantes SCCE hervorgerufen
wurden, werden im allgemeinen an suprabasale Zellen in keratinisiertem
(verhorntem) menschlichem schuppigen Epithel binden, nicht aber
an Epithelzellen in nichtverhorntem schuppigem Epithel. Diese Antikörper werden
auch an den interzellulären
Raum der verhornten Schicht der menschlichen Haut binden.
-
Antikörper, die mit Polypeptiden
wie vorstehend definiert reagieren, sind für eine Reihe von Zwecken geeignet,
wie nachfolgend aufgeführt:
Zur
Reinigung von Proteinen: Die Antikörper können zur Reinigung des Proteins/der
Proteine oder seiner/ihrer Analoga aus biologischen Proben verwendet
werden, wozu die Verfahren der Affinitätschromatographie oder Immunfällung verwendet
werden.
-
Für
die Diagnose und Therapie: Die monoclonalen Antikörper gegen
das Polypeptid/die Polypeptide oder seiner/ihrer Analoga kann bei
der Diagnose und Therapie von Krankheitszuständen bei Tieren und Menschen
verwendet werden. Das Diagnosemittel kann ein Antikörper mit
der Spezifität
für das
Polypeptid wie vorstehend definiert sein. Der Antikörper kann
an ein anderes Protein oder an einen festen Träger gekoppelt sein, und/oder
er kann in den Agglutinationstests oder den Farbentwicklungstests
verwendet werden. Solche Antikörper
können
auch dazu verwendet werden, SCCE-Polypeptide oder Analoga davon
in biologischen Proben mittels der standardmäßigen histochemischen oder
immunchemischen Verfahren zu quantifizieren. Somit betrifft die
Erfindung ein Diagnosemittel, das ein Antikörper mit der Spezifität für ein Polypeptid
wie vorstehend definiert ist.
-
Unter einem ihrer Gesichtspunkte
betrifft die Erfindung eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid
wie vorstehend definiert codiert. Im Einzelnen betrifft die Erfindung
eine Nucleotidsequenz, die im wesentlichen die in SEQ ID NR: 1 gezeigte
Sequenz umfaßt.
Andere wichtige Ausführungsformen
betreffen eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Untersequenz
der Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2 codiert, wie eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid
codiert, das die Aminosäuresequenz
1-224 von SEQ ID NR: 2 umfaßt.
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
auch eine Nucleotidsequenz, die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nucleotidsequenz
unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert, wie in Beispiel
7 und Beispiel 9 beschrieben.
-
In der vorliegenden Beschreibung
und den vorliegenden Ansprüchen
bezeichnet der Begriff „Untersequenz" eine Sequenz, die
vorzugsweise eine Größe von mindestens
15 Nucleotiden hat, stärker
vorzuziehen mindestens 18 Nucleotide, am stärksten vorzuziehen mindestens
21 Nucleotide. In einer Anzahl von Ausführungsformen dieser Erfindung
umfaßt
die Untersequenz oder das Analogon der Untersequenz der Erfindung mindestens
48 Nucleotide, wie mindestens 75 Nucleotide oder mindestens 99 Nucleotide.
Die „Untersequenz" sollte mindestens
einem der vorstehenden Kriterien genügen oder sollte mit der in
SEQ ID NR: 1 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren.
-
Es ist allgemein bekannt, daß kleine
Fragmente in PCR-Verfahren wie hier beschrieben nützlich sind. Solche
Fragmente und Untersequenzen können
neben anderen Hilfsmitteln als Sonden bei der Bestimmung von mRNA-Fragmenten
der Nucleotidsequenz der Erfindung verwendet werden, wie in Beispiel
7 beschrieben.
-
Der Begriff „Analogon" hinsichtlich der DNA-Fragmente der
Erfindung soll eine Nucleotidsequenz bezeichnen, die ein Polypeptid
codiert, das identisch oder im wesentlichen identisch mit dem Polypeptid
ist, das von einem DNA-Fragment der Erfindung codiert wird. Es ist
allgemein bekannt, daß die
gleiche Aminosäure von
verschiedenen Codons codiert werden kann, wobei die Codonverwendung
unter anderem mit der Präferenz
des betreffenden, Nucleotidsequenz-exprimierenden Organismus zusammenhängt. So
können
ein oder mehrere Nucleotide oder Codons des DNA-Fragment der Erfindung
gegen andere ausgetauscht werden, die, wenn sie exprimiert werden,
zu einem Polypeptid führen,
das mit dem vom betreffenden DNA-Fragment codierten Polypeptid identisch
oder im wesentlichen identisch ist.
-
Der Begriff „Analogon" wird im vorliegenden Zusammenhang auch
dazu verwendet, ein DNA-Fragment oder eine DNA-Sequenz von einer ähnlichen
Nucleotidzusammensetzung oder -sequenz wie die charakteristische
DNA-Sequenz SEQ ID NR: 1, welche die das SCCE-Polypeptid bildende Aminosäuresequenz
codiert, zu bezeichnen; hierbei sind geringfügige Variationen zulässig, die
keine wesentliche widrige Auswirkung auf die Enzymaktivität des Analogons
im Vergleich zur Aktivität
von nativem SCCE-Protein haben, wie in Beispiel 3 beschrieben. Mit
dem Begriff „wesentliche
widrige Auswirkung" ist
gemeint, daß die
Enzymaktivität
des Analogons mindestens 50%, stärker
vorzuziehen mindestens 60%, noch stärker vorzuziehen mindestens 70%,
wie mindestens 75% der Enzymaktivität des nativen SCCE, wenn z.
B. wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt, betragen sollte. Das
analoge DNA-Fragment
oder die DNA-Sequenz kann von einem Organismus, wie einem Tier oder
einem Menschen abgeleitet sein, oder kann teilweise oder komplett
synthetischen Ursprungs sein. Das Analogon kann auch durch die Verwendung
rekombinanter DNA-Verfahren abgeleitet sein.
-
Darüberhinaus sollen die Begriffe „Analogon" und „Untersequenz" Abweichungen in
der Sequenz, wie Substitution, Insertion (einschließlich Introns),
Addition und Neuanordnung eines oder mehrerer Nucleotide zulassen,
die keine wesentliche widrige Auswirkung auf das von dem DNA-Fragment
codierten Polypeptid oder eine Untersequenz davon haben.
-
Der Begriff „Substitution" soll die Ersetzung
eines oder mehrere Nucleotide in der vollen Nucleotidsequenz mit
einem oder mehreren verschiedenen Nucleotiden bedeuten, unter „Addition" wird die Hinzufügung eines
oder mehrerer Nucleotide an jedem beliebigen Ende der vollen Nucleotidsequenz
verstanden, „Insertion" soll die Einführung von
einem oder mehreren Nucleotiden in die volle Nucleotidsequenz bedeuten, „Deletion" soll anzeigen, daß ein oder
mehrere Nucleotide aus der vollen Nucleotidsequenz entfernt wurden,
ob an einem beliebigen Ende der Sequenz oder an jedem geeigneten
Punkt innerhalb derselben, und „Neuanordnung" soll bedeuten, daß zwei oder
mehr Nucleotidreste innerhalb der DNA bzw. der Polypeptidsequenz
ausgetauscht wurden. Das DNA-Fragment kann jedoch auch durch Mutagenese
entweder vor oder nach seiner Einführung in den Organismus verändert werden.
-
Im Sprachgebrauch der vorliegenden
Erfindung und der Ansprüche
sollen die Begriffe „Fragment", „Sequenz", „Untersequenz" und „Analogon" hinsichtlich Fragmenten,
Sequenzen, Untersequenzen und Analoga gemäß der Erfindung selbstverständlich so
verstanden werden, daß sie
nicht diese Phänomene
in ihrer natürlichen
Umgebung umfassen, sondern vielmehr z. B. in isolierter, gereinigter,
in vitro- oder rekombinanter Form.
-
Die Feststellung und/oder Quantifizierung
von SCCE-Polypeptid-mRNA kann durch Extraktion von RNA aus den Zellen
oder Geweben und deren Umwandlung in cDNA für eine anschließende Verwendung
in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geschehen. Der/die PCR-Primer kann/können auf
der Basis eines DNA-Fragments der Erfindung, wie das in SEQ ID NR:
1 gezeigte DNA-Fragment synthetisiert werden. Dieses Verfahren zur
Feststellung und/oder Quantifizierung kann als Diagnoseverfahren
zur Diagnose eines Krankheitszustands verwendet werden, bei dem
eine SCCE-mRNA in höheren
oder geringeren Mengen als normal exprimiert wird.
-
Ebenfalls innerhalb des Schutzbereiches
der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosemittel, das in der Lage
ist, eine Nucleotidsequenz der Erfindung nachzuweisen, und das
- a) eine Untersequenz einer Nucleotidsequenz
gemäß der Erfindung
ist, die eine Größe von mindestens
15 Nucleotiden hat; oder
- b) mit SEQ ID NR: 1 unter hochstringenten Bedingungen hybridisiert
und eine Größe von mindestens
15 Nucleotiden hat. Das Diagnosemittel ist ebenfalls verwendbar
in einem Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, bei denen die SCCE-Expression
gestört
ist, und/oder Krankheiten, bei denen das SCCE-Gen mutiert ist, das
das Unterwerfen einer Probe von einem Patienten, der einer Krankheit
verdächtig
ist, bei der ein höherer
SCCE-Gehalt als normal oder eine mutierte SCCE-Form vorliegt, einer
PCR-Analyse umfaßt, bei
der die Probe mit einem Diagnosemittel wie vorstehend beschrieben
in Kontakt gebracht wird, das die Amplifikation jeder beliebigen
Nucleotidsequenz erlaubt, und Feststellung der Gegenwart einer beliebigen identischen
oder homologen Nucleotidsequenz in der Probe.
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Die Polypeptide können unter Verwendung von rekombinanter
DNA-Technologie hergestellt werden. Eine wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Expressionssystem, das eine
Nucleotidsequenz der Erfindung umfaßt.
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Der Organismus, der für die Herstellung
des Polypeptids der Erfindung benützt wird, kann ein höherer Organismus,
z. B. ein Tier oder ein niederer Organismus, z. B. ein Mikroorganismus
wie E. coli sein. Ungeachtet des verwendeten Organismentyps wird
das DNA-Fragment der Erfindung in den Organismus entweder direkt
oder mittels eines geeigneten Vektors eingeführt. Alternativ können die
Polypeptide durch Einführen
des DNA-Fragments der Erfindung oder eines Analogons oder einer
Untersequenz desselben entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors
in Säuger-Zellinien
hergestellt werden.
-
Das DNA-Fragment oder ein Analogon
oder eine Untersequenz davon kann in einen geeigneten stabilen Expressionsvektor
cloniert werden und dann in eine geeignete Zellinie gesetzt werden.
Die Zellen, die die gewünschten
Polypeptide herstellen, werden dann auf der Grundlage des Produktivitätsniveaus
unter Bedingungen, die für
den Vektor und die verwendete Zellinie geeignet sind, selektiert.
Die selektierten Zellen werden weitergezüchtet und bilden eine sehr
wichtige und kontinuierliche Quelle der gewünschten Polypeptide.
-
Ein Beispiel eines spezifischen Analogon
der DNA-Sequenz der Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte
DNA-Sequenz oder einen Teil davon umfaßt, und die besonders an eine
Expression in E. coli angepaßt
ist. Diese DNA-Sequenz ist eine, die, wenn sie zusammen mit geeigneten
regulatorischen Sequenzen in E. coli insertiert wird, zur Expression
eines Polypeptids führt,
das im wesentlichen die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz
oder einen Teil davon hat. Somit umfaßt diese DNA-Sequenz spezifische
Codons, die von E. coli erkannt werden. Ein Beispiel dieser Ausführungsform
ist in Beispiel 8 beschrieben.
-
Im vorliegenden Zusammenhang wird
der Begriff „Gen" verwendet, um eine
DNA-Sequenz zu bezeichnen, die an der Herstellung einer Polypeptidkette
beteiligt ist, und die Regionen beinhaltet, die der codierenden
Region (5'-Stromaufwärts- und
3'-Stromabwärts-Sequenzen)
vorausgehen oder ihr nachfolgen, sowie intervenierende Sequenzen,
Introns, die zwischen einzelnen codierenden Segmenten, Exons, oder
in der 5'-Stromaufwärts- oder
3'-Stromabwärts-Region gelegen sind.
Die 5'-Stromaufwärts-Region
umfaßt
eine regulatorische Sequenz, die die Expression des Gens steuert,
typischerweise einen Promotor. Die 3'-Stromabwärts-Region umfaßt Sequenzen,
die an der Termination der Transkription des Gens beteiligt sind,
und wahlweise Sequenzen, die für
die Polyadenylierung des Transkripts und der 3'-nichtübersetzten Region verantwortlich
sind.
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In Übereinstimmung mit dem vorstehend
Gesagten betrifft die Erfindung ein Expressionssystem, das eine
Nucleotidsequenz wie die vorstehend beschriebene umfaßt, die
ein Polypeptid der Erfindung codiert, wobei das System eine 5'-flankierende Sequenz
umfaßt,
die in der Lage ist, die Expression jener Nucleotidsequenz zu vermitteln.
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Im Einzelnen betrifft die Erfindung
einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung
enthält
und in der Lage ist, deren Expression zu vermitteln. Eine spezifische
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen als pS507 bezeichneten
replizierbaren Expressionsvektor, der gemäß den Bestimmungen des Budapester
Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer DSM 8282 bei der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)
hinterlegt wurde, und Expressionsvektoren, die Nucleotidsequenzen
exprimieren, welche von der Nucleotidsequenz dieses hinterlegten
Vektors abweichen, welche aber das gleiche Polypeptid oder ein Analogon
oder eine Variante davon mit SCCE-Aktivität codieren.
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Mit anderen Worten umfaßt der Schutzbereich
der Erfindung auch einen replizierbaren Expressionsvektor wie vorstehend
beschrieben, wobei die exprimierte Nucleotidsequenz sich von der
Nucleotidsequenz des hinterlegten Vektors darin unterscheidet, daß mindestens
ein Nucleotid deletiert, substituiert oder modifiziert oder mindestens
ein zusätzliches
Nucleotid insertiert wurde, so daß sich eine Nucleotidsequenz
ergibt, die ein Polypeptid mit SCCE-Aktivität codiert.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
ein als pS500 bezeichnetes Plasmid, das gemäß den Bestimmungen des Budapester
Vertrags am 11. Mai 1993 unter der Zugangsnummer DSM 8281 bei der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)
hinterlegt wurde, und Plasmide, die eine Nucleotidsequenz haben,
welche von der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nucleotidsequenz abweicht,
die aber das in SEQ ID NR: 2 gezeigte Polypeptid oder ein Analogon
oder eine Variante davon, die SCCE-Aktivität aufweisen, codiert, oder
die mit der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einem
Teil davon unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
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Innerhalb des Schutzbereiches der
vorliegenden Erfindung liegt auch ein nichtmenschlicher Organismus,
der einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung
enthält.
Organismen, die in dieser Hinsicht der Erfindung verwendet werden
können,
umfassen Mikroorganismen, wie ein Bakterium der Gattung Bacillus,
Escherichia oder Salmonella, eine Hefe, wie Saccharomyces, Pichia,
eine Protozoen- oder eine aus einem mehrzelligen Organismus abgeleitete
Zelle, wie ein Pilz, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine
Säugerzelle
oder eine Zellinie. Wenn der Organismus ein Bakterium ist, ist ein
Bakterium der Gattung Escherichia vorzuziehen, z. B. E. coli.
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Die Erfindung betrifft ferner einen
Plasmidvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid der
Erfindung oder ein Fusionspolypeptid wie hierin definiert codiert.
In einer besonders wichtigen Ausführungsform kann das DNA-Fragment
der Erfindung oder ein Analogon oder eine Untersequenz davon in
einem replizierbaren Expressionsvektor enthalten sein, der in der
Lage ist, sich in einem Wirtsorganismus oder eine Zellinie zu replizieren.
-
Im Einzelnen kann der Vektor ein
Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom oder Virus sein. In einer interessanten
Ausführungsform
der Erfindung kann der Vektor ein Vektor sein, der, in eine Wirtszelle
eingeschleust, in das Wirtszellengenom eingebaut wird.
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Wenn ein höherer Organismus verwendet
wird, können
transgene Techniken für
die Produktion der Polypeptide angewandt werden. Beispiele geeignete
Tiere sind Schafe, Rinder, Schweine usw. Ein DNA-Fragment, das ein
Polypeptid wie vorstehend definiert codiert, wird im gewünschten
Gewebe unter der Steuerung gewebespezifischer regulatorischer Elemente
exprimiert. Das so erhaltene Protein kann dann posttranslationalen
Modifikationen unterworfen werden, um damit ein Polypeptid wie das
vorstehend definierte zu erhalten.
-
Die transgenen nicht-menschlichen
Organismen der Erfindung werden erzeugt, indem ein „Transgen" in eine embryonale
Zielzelle des Tieres der Wahl eingeschleust wird. Unter einem Gesichtspunkt
der Erfindung ist ein Transgen eine DNA-Sequenz, die in der Lage
ist, einen gewünschten
Phänotypen
hervorzubringen, wenn sie im Genom von Zellen eines transgenen nicht-menschlichen
Säugers
enthalten ist. In spezifischen Ausführungsformen umfaßt das Transgen
eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, wobei das
Transgen in der Lage ist, exprimiert zu werden, wodurch das Polypeptid
hergestellt wird.
-
Der Einbau des Expressionssystems
in die Keimbahn des Säugers
kann mit jedem beliebigen geeigneten Verfahren geschehen, z. B.
wie bei Hogan et al., 1986 oder in WO 93/04172 beschrieben.
-
Unter einem bestimmten Gesichtspunkt
der Erfindung kann die Nucleotidsequenz der Erfindung eine weitere
Nucleotidsequenz umfassen, die ein Polypeptid codiert, das von dem
vorstehend definierten Polypeptid verschieden oder mit diesem identisch
ist, und das zwecks Herstellung eines Fusionspolypeptids im selben Leserahmen
an eine Nucleotidsequenz der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Sequenz oder
an ein Analogon davon, das ein SCCE-Polypeptid codiert, gebunden
ist; dieses Fusionspolypeptid stellt einen weiteren interessanten Aspekt
dar; vgl. z. B. Beispiel 8. Bei Verwendung rekombinanter DNA-Technologie
können
die fusionierten DNA-Sequenzen in einen geeigneten Vektor oder ein
Genom insertiert werden. Alternativ wird eine der Nucleotidsequenzen
in den Vektor oder das Genom insertiert, wenn es schon die andere
Nucleotidsequenz enthält.
Ein Fusionspolypeptid kann auch durch die separate Insertion der
zwei Nucleotidsequenzen und Geschehenlassen der Expression hergestellt
werden. Der Wirtsorganismus, der eukaryontischen oder prokaryontischen
Ursprungs sein kann, wird unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression
fusionierter Sequenzen garantieren. Das fusio nierte Polypeptid wird
dann gereinigt und das Polypeptid wie vorstehend definiert mit Hilfe
eines geeigneten Verfahrens von seinem Verbindungspartner getrennt.
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Ein Aspekt der Erfindung betrifft
somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids wie vorstehend definiert,
das die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) Insertion einer Nucleotidsequenz der Erfindung
in einen Expressionsvektor,
- (b) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem
in Schritt (a) hergestellten Vektor,
- (c) Kultivieren des in Schritt (b) hergestellten Wirtsorganismus
unter Bedingungen, die für
die Expression des Polypeptids geeignet sind,
- (d) Gewinnung des Polypeptids, und
- (e) wahlweise posttranslationale Modifikation des Polypeptids.
-
Innerhalb des Schutzbereiches der
vorliegenden Erfindung liegt auch ein Verfahren wie vorstehend beschrieben,
bei dem das erzeugte Polypeptid durch ein Verfahren isoliert wird,
das einen oder mehrere Schritte umfaßt, wie Affinitätschromatographie
mit immobilisiertem nativem oder rekombinantem SCCE-Polypeptid oder
mit Antikörpern,
die mit diesem Polypeptid reagieren und/oder anderen chromatographischen
und elektrophoretischen Verfahren.
-
Das wie vorstehend beschrieben hergestellte
Polypeptid kann posttranslationalen Modifikationen als Ergebnis
von Wärmebehandlung,
chemischer Behandlung (Formaldehyd, Glutaraldehyd usw.) oder Enzymbehandlung
(Peptidasen, Proteinasen und Proteinmodifikationsenzyme) unterworfen
werden. Wenn das Polypeptid in einem Organismus hergestellt wurde,
kann es in anderer Weise als in seiner natürlichen Herstellungsumgebung
behandelt werden. Z. B. wird Glykosylierung oft erreicht, wenn das
Polypeptid durch eine Zelle eines höheren Organismus, wie Hefe
oder vorzugsweise ein Säuger
exprimiert wird. Die Glykosylierung findet sich normalerweise in
Verbindung mit den Aminosäureresten
Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin. Es kann vorteilhaft sein oder auch
nicht, die durch den betreffenden Wirtsorganismus bedingten Verarbeitungsmerkmale
zu entfernen oder abzuändern.
-
Im Anschluß an die Expression gemäß der Erfindung
des Polypeptids in einem Organismus oder einer Zellinie, kann das
Polypeptid entweder als solches verwendet werden, oder es kann zuerst
aus dem Organismus oder der Zellinie gereinigt werden. Wenn das
Polypeptid als sekretiertes Produkt exprimiert wird, kann es direkt
gereinigt werden. Wenn das Polypeptid als assoziiertes Produkt exprimiert
wird, kann eine teilweise oder vollständige Zerstörung des Wirts vor der Reinigung
erforderlich sein. Beispiele für
Verfahren, die für
die Reinigung von Polypeptiden angewandt werden sind: (i) Immunfällung oder
Affinitätschromatographie
mit Antikörpern,
(ii) Affinitätschromatographie
mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere chromatographische Verfahren,
wie Gelfiltration, Ionenaustausch oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
oder aus den obigen abgeleitete Verfahren, (iv) elektrophoretische
Verfahren, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese, denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
Agarose-Gelelektrophorese und Isoelektrische Fokussierung, (v) jedes andere
spezifische Solubilisierungs- und/oder Reinigungsverfahren.
-
Das SCCE-Polypeptid kann im wesentlichen
rein sein. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „im wesentlichen
rein", daß das betreffende
Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Bestandteilen, z. B.
anderen Polypeptiden oder Kohlenhydraten ist, die von der Herstellung
und/oder Gewinnung des Polypeptids herrühren oder sonstwie zusammen
mit dem Polypeptid vorkommen könnten.
Die Reinheit eines Proteins kann durch SDS-Gelelektrophorese, die
wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt wird, abgeschätzt werden.
-
Das Polypeptid kann wie in Beispiel
4 beschrieben durch SBTI-Affinitätschromatographie
auf einem immobilisierten Antikörper,
wie dem Antikörper
TE4b, nach Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, gereinigt
werden. Ein hoher Reinheitsgrad des Polypeptids kann vorteilhaft
sein, wenn das Polypeptid in einer pharmazeutischen oder kosmetischen
Zusammensetzung verwendet werden soll. Das im wesentlichen reine
Polypeptid kann eben wegen seiner hohen Reinheit für die meisten
Zwecke in einer geringeren Menge verwendet werden, als ein Polypeptid
von konventioneller, geringerer Reinheit.
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Unter einem Gesichtspunkt der Erfindung
kann das reine Polypeptid aus einer geeigneten Zellinie, die ein
Polypeptid wie vorstehend definiert exprimiert, wie in Beispiel
9 erhalten werden. Auch kann ein Polypeptid wie vorstehend beschrieben
nach den allgemein bekannten Verfahren der Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese
durch Aneinanderkoppeln der einzel nen Aminosäuren der Polypeptidsequenz
hergestellt werden. Alternativ kann das Polypeptid durch Aneinanderkoppeln
einzelner Aminosäuren
synthetisiert werden, die Fragmente der Polypeptidsequenz bilden,
und die später
ihrerseits aneinandergekoppelt werden und so das gewünschte Polypeptid
ergeben.
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Ein sehr wichtiger Gesichtspunkt
der Erfindung betrifft eine Arzneimittelzusammensetzung, eine kosmetische
Zusammensetzung oder eine Hautpflegemittelzusammensetzung, die ein
Polypeptid wie vorstehend definiert umfaßt und in einer für topische
Verabreichung geeigneten Form ist, die ausgewählt wird aus Cremes, Salben,
Lotionen, Linimenten, Gelen, Pasten, Stiften, Sprays, Shampoos,
Seifen, Haarfestigern oder Pulvern. Die Zusammensetzung kann gereinigtes
natives Protein oder ein rekombinantes Polypeptid wie vorstehend definiert
oder eine Proenzym- oder Fusionsproteinform des Polypeptids wie
vorstehend definiert, die durch proteolytische Spaltung aktiviert
werden kann, umfassen. Die Proenzymform des Polypeptids kann als „Vor-Medikament" betrachtet werden,
das heißt
als Verbindung, die nach geeigneter proteolytischer Spaltung in
ihre aktive Form konvertiert wird.
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Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, betrifft
die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die für topische
Verabreichung, z. B. Verabreichung auf die Haut geeignet ist.
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Die topische Verabreichung kann eine
Verabreichung auf oder in die Nähe
jener Körperteile
sein, die die betreffenden pathologischen Veränderungen aufweisen, z. B.
auf einen äußeren Teil
des Körpers,
wie eine Hautfläche.
Das Auftragen kann ein einfaches Aufschmieren der Zusammensetzung
sein, oder es kann die Verwendung einer beliebigen Vorrichtung beinhalten,
die geeignet ist, den Kontakt zwischen der Zusammensetzung und den
pathologischen Läsionen
zu verstärkten,
wie die Verwendung von Okklusionsverbänden, z. B. Okklusionspflastern,
die mit der Zusammensetzung der Erfindung geliefert werden. Die
Zusammensetzungen können
auf Pflaster, Streifen, Gaze, Schwammaterialien, Baumwollstückchen usw.
getropft oder verteilt werden. Wahlweise kann eine Injektionsform
der Zusammensetzung in die Läsionen
selbst oder in deren Nähe verwendet
werden.
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Die Zusammensetzungen zur topischen
Anwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung können 1–80% des
Wirkstoffes nach dem Gewichtsanteil enthalten, basierend auf dem
Gesamtgewicht der Zubereitungen, wie etwa 0,001–25% w/w des Wirkstoffes, z.
B. 0,1–10%,
0,5–5%
oder 2–5%.
Es kann mehr als ein Wirkstoff in der Zusammensetzung enthalten
sein; d. h. Zu sammensetzungen, die SCCE, Pro-SCCE oder einen SCCE-Inhibitor
in Kombination mit anderen pharmazeutischen und/oder kosmetischen
Bestandteilen umfassen, sind ebenfalls innerhalb des Schutzbereiches
der Erfindung. Die Zusammensetzung wird bequemerweise 1–10 mal
am Tag aufgetragen, je nach Art, Schwere und Stelle der Läsionen.
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Für
topische Verabreichung kann das Präparat gemäß der konventionellen pharmazeutischen
Vorgehensweise mit den üblicherweise
für eine
topische Anwendung benützten
Excipientien zubereitet werden. Die Art des zur Herstellung einer
bestimmten Zusammensetzung verwendeten Vehikels hängt vom
beabsichtigten Verabreichungsverfahren dieser Zusammensetzung ab.
Von Wasser verschiedene Vehikel, die in Zusammensetzungen verwendet
werden können,
können
Feststoffe oder Flüssigkeiten
beinhalten, wie weichmachende Mittel, Lösungsmittel, Feuchtigkeitsspender,
Verdickungsmittel und Pulver. Beispiele für jeden von diesen Typen von
Vehikeln, die einzeln oder als Gemische aus einem oder mehreren
Vehikeln verwendet werden können,
sind folgende:
Weichmachende Mittel, wie Stearylalkohol, Glycerinmonoricinoleat,
Glycerinmonostearat, Propan-1,2-diol, Butan-1,3-diol, Cetylalkohol,
Isopropylisostearat, Stearinsäure,
Isobutylpalmitat, Isocetylstearat, Oleylalkohol, Isopropyllaurat,
Hexyllaurat, Decyloleat, Octadecan-2-ol, Isocetylalkohol, Cetylpalmitat,
Dimethylpolysiloxan, Di-n-butylsebacat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat,
Isopropylstearat, Butylstearat, Polyethylenglykol, Triethylenglykol,
Lanolin, Rizinusöl,
acetylierte Lanolinalkohole, Petroleum, Mineralöl, Butylmyristat, Isostearinsäure, Palmitinsäure, Isopropyllinoleat,
Lauryllactat, Myristyllactat, Decyloleat, Myristylmyristat;
Lösungsmittel,
wie Wasser, Methylenchlorid, Isopropanol, Rizinusöl, Ethylenglykolmonoethylether,
Diethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykolmonoethylether, Dimethylsulfoxid,
Tetrahydrofuran, pflanzliche und tierische Öle, Glycerin, Ethanol, Propanol,
Propylenglykol und andere Glykole oder Alkohole, fixierte Öle;
Feuchtigkeitsspendende
Mittel, wie Glycerin, Sorbitol, Natrium-2-pyrrolidon-5-carboxylat,
lösliches
Kollagen, Dibutylphthalat, Gelatine;
Pulver, wie Kalk, Talkum,
Kaolin, Stärke
und Stärkederivate,
Harze, kolloides Silikondioxid, Natriumpolyacrylat, chemisch modifiziertes
Magnesium-Aluminium-Silikat, hydratiertes Aluminiumsilikat, Carboxyvinylpolymer, Natriumcarboxymethylcellulose,
Ethylenglykolmonostearat;
gelierende oder Verdickungsmittel,
wie Pectin, Gelatine und Derivate davon, Cellulosederivate wie Methylcellulose,
Carboxymethylcellulose oder oxidierte Cellulose, Natriumcarboxymethylcellulose,
Guarkernmehl, Gummi arabicum, Karaya, Tragacanth, Bentonit, Agar,
Alginate, Carbomer, Gelatine, Blasentang, Ceratonia, Dextran und
Derivate davon, Ghatti-Harz,
Hektorit, Ispaghula-Schoten, Xanthan;
Polymere, wie Polymilchsäure oder
Polyglykolsäure
Polymere oder Copolymere davon, Paraffin, Polyethylen, Polyethylenoxid,
Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyvinylpyrrolidon;
Tenside,
wie nichtionische Tenside, z. B. Glykol und Glycerinester, Macrogolether
und -ester, Zuckerether und -ester, wie Sorbitester, ionische Tenside,
wie Aminseifen, Metallseifen, sulfatierte fettige Alkohole, Alkylethersulfate,
sulfatierte Öle,
und ampholytische Tenside und Lecitine;
Puffer, wie Natrium-,
Kalium-, Aluminium-, Magnesium- oder Calciumsalze (wie das Chlorid,
Carbonat, Bicarbonat, Citrat, Gluconat, Lactat, Acetat, Gluceptat
oder Tartrat).
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Für
topische Verabreichung kann der pH-Wert der Zusammensetzung im Prinzip
in einem sehr breiten Bereich variierten, wie 3–9. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist ein pH-Wert vorzuziehen, bei dem man eine geeignete
proteolytische Aktivität
des Polypeptids erhält,
z. B. ein pH-Wert von ungefähr
4 bis 8. Es können
konventionelle Puffer wie die vorstehend beschriebenen verwendet
werden, um den gewünschten
pH-Wert zu erhalten.
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Die Präparate der Erfindung können auch
andere Zusätze
enthalten, wie Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Solubilisierer,
Farbstoffe, chelierende Mittel, gelbildende Mittel, Salbengrundlagen,
pH-Regulatoren, Antioxidantien, Geruchsstoffe und Hautschutzmittel
usw. Wenn die Zusammensetzung in Form eines Shampoos oder einer
Seife ist, kann die Zusammensetzung weiterhin Schaummittel, Perlmittel
und/oder Regulierer enthalten.
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Typische Konservierungsstoffe sind
unter anderen die Parabene, Formaldehyde, Kathon CG, Bronidox, Bronopol,
p-Chloro-m-cresol, Chlorhexidin, Benzalkonchlorid, usw.
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Wo die Zusammensetzungen der Erfindung
in der Form eines Shampoos oder einer Seife sind, können konventionelle
Zutaten verwendet werden, und typische Shampoo- und Seifenbasen
sind unter anderen Betain, Natriumlaurylsulfat, Nonylphenol, Imidazol,
Sulfosuccinat, rückfettende
Mittel, Feuchtigkeitsspender und Regulierer.
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Weiterhin kann es vorteilhaft sein,
Präparate
mit modifiziertem Abgabe Verhalten herzustellen, bei denen der Wirkstoff
in eine Polymermatrix oder in Nanopartikeln oder Liposomen oder
Micellen eingebaut oder an ein Ionenaustauscherharz adsorbiert ist,
oder sich auf einem Polymer befindet.
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Die Zusammensetzungen können nach
konventioneller pharmazeutischer Vorgehensweise zubereitet werden
und können
folgende sein:
Halbfeste Präparate:
Gele, Pasten, Gemische.
Flüssige
Präparate:
Tränke,
Emulsionen.
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Wie gesagt, kann eine Arzneimittelzusammensetzung
der Erfindung ein Polypeptid wie vorstehend definiert oder ein funktionelles
Derivat davon oder eine Kombination solcher Bestandteile umfassen.
Beispiele für geeignete
funktionelle Derivate sind unter anderen pharmazeutisch verträgliche Salze,
besonders jene, die zur Anwendung in einer cutanen Umgebung geeignet
sind. Beispiele sind unter anderen pharmazeutisch verträgliche Salze
der Aminofunktion, z. B. Salze, die Anionen liefern, die pharmazeutisch
verträglich
sind, insbesondere in einer cutanen Umgebung. Zu den Beispielen
zählen
Phosphate, Sulfate, Nitrat, Iodid, Bromid, Chlorid, Borat, sowie
Anionen, die aus Carboxylsäuren
abgeleitet sind, darunter Acetat, Benzoat, Stearat usw.
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Andere Derivate der Aminofunktion
sind unter anderen Amide, Imide, Harnstoffe, Carbamate usw.
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Zu den anderen geeigneten Derivaten
zählen
Derivate der Carboxylgruppe eines Polypeptids wie vorstehend definiert,
darunter Salze, Ester und Amide. Beispiele dafür sind Salze mit pharmazeutisch
verträglichen
Kationen, z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink,
Aluminium, Eisen(III), Eisen(II), Ammonium und niedere (C1-6) Alkylammoniumsalze. Zu den Estern zählen auch
die niederen Alkylester.
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Die Beispiele für Zusammensetzungen in Beispiel
11 veranschaulichen Beispiele für
pharmazeutische Kosmetika und Hautpflegepräparate gemäß der vorliegenden Erfindung,
sollen jedoch den Schutzbereich der Zusammensetzungen der Erfindung
in keiner Weise einschränken.
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Es wird angenommen, daß kosmetische
oder Hautpflegezusammensetzungen, die natives oder rekombinantes
SCCE umfassen, wirkungsvoll gegen Akne, Xerodermie oder andere hyperkeratotische
Zustände
wie Callositas und Keratosis pilaris sind. Bei Acne vulgaris gibt
es verschiedene Stadien. Es wird angenommen, daß es hilfreich ist, SCCE in
jenen Stadien zu verabreichen, in denen die Keratinisierung in den
Gängen der
Talgdrüsen
gestört
ist, was zur Entstehung von Mitessern und Verstopfungen führt, wogegen
es vorteilhaft sein könnte,
eine Substanz zu verabreichen, die SCCE in den Stadien inhibiert,
in denen eine entzündliche Akneläsion die
vorherrschende Erscheinung ist.
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Ein Gesichtspunkt der Erfindung betrifft
somit die Verwendung eines Polypeptids wie vorstehend definiert
zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung
oder Prophylaxe von Akne, Xerodermie oder anderen hyperkeratotischen
Zuständen,
wie Callositas und Keratosis pilaris.
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Gestützt auf die vorstehend beschriebenen
wissenschaftlichen Befunde wird angenommen, daß Arzneimittelzusammensetzungen,
die natives oder rekombinantes SCCE umfassen, nützlich für die Behandlung oder die Prophylaxe
der verschiedenen Ichthyosen, Akne, Psoriasis und anderer entzündlicher
Hautkrankheiten, wie Ekzeme mit Hyperkeratosis, mikrobielle Infektionen
und Wundheilung sind, und zwar besonders, wenn sie topisch angewandt
werden.
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Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung
betrifft die Verwendung eines Polypeptids wie vorstehend definiert
zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung
oder Prophylaxe der verschiedenen Ichthyosen, Akne, Psoriasis und
anderer entzündlicher
Hautkrankheiten mit Hyperkeratosis, wie Ekzeme.
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Die Polypeptide sind in einem Verfahren
zur Behandlung und/oder Vorbeugung der verschiedenen Ichthyosen,
Akne, Psoriasis und anderer entzündlicher
Hautkrankheiten mit Hyperkeratosis, wie Ekzeme verwendbar, wobei
das Verfahren die Verabreichung an einen einschlägi gen Patienten einer therapeutisch
oder prophylaktisch wirksamen Menge eines Polypeptids mit SCCE-Aktivität umfaßt. Die
Behandlung kann prophylaktisch, palliativ oder heilend sein.
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Es wird angenommen, daß in der
cutanen Umgebung ein „Kaskadensystem" proteolytischer
Enzyme existiert, das dem Plasminogen-Aktivierungssystem ähnelt. Man
nimmt an, daß SCCE
eines der Endprodukte dieses Systems ist. Es wird angenommen, daß die Aktivität von SCCE
mit Hilfe eines „SCCE-Inhibitors" gehemmt werden kann.
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Bei einer Anzahl von Hautkrankheiten,
wie Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder acantholytische Krankheiten,
z. B. Familien-Pemphigus und Darier'scher Krankheit ist die Kohäsion zwischen
Keratinocyten und der nichtverhornten, lebensfähigen Epidermisschicht beeinträchtigt (vgl.
Störungen
der Zellkohäsion
in lebensfähiger
Epidermis). Es wird angenommen, daß dieser Vorgang von Proteinasen
bewirkt wird, und daß er somit
durch Verabreichung einer Zusammensetzung behandelt werden kann,
die in der Lage ist, die Enzymaktivität von nativem SCCE zu hemmen.
Es könnte
auch vorteilhaft sein, bei Zuständen,
bei denen eine entzündliche
Komponente die vorherrschende Erscheinung ist, einen SCCE-Inhibitor
zur Behandlung von Psoriasis und anderen entzündlichen Hautkrankheiten zu
verabreichen.
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Es wird somit angenommen, daß ein SCCE-Inhibitor,
der eine hemmende Auswirkung auf die Enzymaktivität von nativem
SCCE hat, zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur
Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder
acantholytischen Krankheiten, z. B. Familien-Pemphigus und Darier'sche Krankheit verwendbar
ist.
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Im vorliegenden Zusammenhang betrifft
der Begriff „SCCE-Inhibitor" einen schon existierenden
oder neuartigen Wirkstoff, der in der Lage ist, mit einer enzymatisch
aktiven Polypeptidsequenz oder -untersequenz der Erfindung oder
einem Analogon davon in einer solchen Weise zu interagieren, daß die SCCE-Aktivität vermindert
ist. Eine Verminderung kann z. B. durch Ausführen eines Versuchs wie in
Beispiel 3.2 umrissen gemessen werden, wobei der potentielle SCCE-Inhibitor
als Inhibitor verwendet wird. Diese Wirkstoffe können organische Moleküle, kleine
Peptide oder große
Polypeptide oder Derivate der vorstehend Genannten sein. Eine solche
Vorgehensweise kann Anwendung in einem Durchmusterungsprogramm zur
Bestimmung von SCCE-Inhibitoren finden.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bestimmung eines Wirkstoffes,
der eine Auswirkung hat auf die Enzymaktivität von nativem SCCE (welches
die Aminosäuresequenz
1-224 aus SEQ ID NR: 2 hat), und der die Verwendung eines rekombinanten
Polypeptids wie vorstehend definiert umfaßt.
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Im einzelnen betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Wirkstoffes, der eine
hemmende Wirkung hat auf die Enzymaktivität von nativem SCCE (welches
die Aminosäuresequenz 1-224
aus SEQ ID NR: 2 hat).
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Unter einem anderen Aspekt betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Wirkstoffes,
der in der Lage ist die Enzymaktivität von nativem oder rekombinantem
SCCE (welches die Aminosäuresequenz
1-224 aus SEQ ID NR: 2 hat) zu erhöhen.
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Eine wichtige Anwendung der rekombinanten
Polypeptide der vorgesehenen Erfindung ist ein Durchmusterungstest
für Wirkstoffe.
Die vorstehend definierten Polypeptide können in einem Wirkstoffdurchmusterungssystem
verwendet werden. Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren
zur Bestimmung einer Verbindung, die imstande ist, die Proenzymform
von SCCE, die die Aminosäuresequenz – 7–224 aus
SEQ ID NR: 2 hat, in aktives SCCE, das die Aminosäuresequenz
1m224 aus SEQ ID NR: 2 hat, umzuwandeln, und das die Anwendung eines
Polypeptids wie vorstehend definiert umfaßt.
-
Die Aminosäuresequenz wie vorstehend definiert
kann zur Ableitung der dreidimensionalen Struktur eines SCCE-Polypeptids
verwendet werden, die ihrerseits zur Entwicklung einer Substanz
verwendet werden kann, die zum Binden an das SCCE-Polypeptid in
der Lage ist; insbesondere zur Entwicklung eines Arzneiwirkstoffes,
der an das aktive Zentrum des Enzyms bindet.
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Wichtige Gesichtspunkte sind schließlich noch
verschiedene Verfahren zur Steuerung der Aktivität eines SCCE-Polypeptids. Diese
Aktivität
kann wichtige Folgen für
verschiedene Krankheitszustände
wie vorstehend beschrieben haben.
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Ein DNA- oder RNA-Fragment, das mindestens
zu einem Teil der dem vorstehend definierten Polypeptid entsprechenden
mRNA oder einem Analogon von ihr komplementär ist, kann ein Unterbrechen
der Übersetzung
der SCCE-mRNAs in menschlichen Zellen bewirken und dadurch die Synthese
des Polypeptids/der Polypeptide hemmen. Diese Vorgehensweise, die
bei Krankheitszuständen
von Interesse sein kann, bei denen sich eine höhere SCCE-Expression als normal
findet, wie bei Autoimmun-Pemphigus-Krankheiten oder acantholytischen
Krankheiten, wie Familien-Pemphigus und Darier'sche Krankheit, ist besser unter der Bezeichnung
Gegensinn-Oligotherapie bekannt, und somit umfaßt die vorliegende Erfindung
auch solche Vorgehensweisen.
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LEGENDEN ZU
DEN FIGUREN
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1.
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Unipolare Zellabschuppung von plantarem
Stratum corneum in vitro. Die Gewebeoberfläche, die in vivo nach außen zeigte,
zeigt in der Figur nach oben. Beachte, daß während der Inkubation an dieser
Oberfläche
eine fortschreitende Zelldissoziation stattfand, an den anderen
Oberflächen
jedoch keine Dissoziation stattfand.
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2.
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Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin
auf die Zellabgabe von plantarem Stratum corneum, das ohne (Kreise)
und mit (Dreiecke) Aprotinin inkubiert wurde. Der Mittelwert (kumulative
Werte für
vier Gewebestücke) und
der Schwankungsbereich sind angegeben.
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3.
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Anti-Desmoglein-(anti-DG I)-reaktive
Bestandteile in kohärentem
plantarem Stratum corneum und in dissoziierten Zellen. A. Coomassieblau
gefärbte
SDS-PAGE. B. Immunblot. 1–3:
Zusammenhängendes
Gewebe, unverdünnt
(1), verdünnt
1/3 (2), verdünnt
1/9 (3). 4–5:
Dissoziierte Zellen, unverdünnt
(4), verdünnt
1/3 (5).
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Beachte das nur scheinbar intakte
DG I mit Mr 160 kD in zusammenhängendem
Gewebe, und nur Degradationsprodukte von DG I mit Mr 95 und 80 kD
in dissoziierten Zellen.
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4.
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Zeitverlauf und Wirkung von Aprotinin
auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in plantarem Stratum
corneum, das in vitro-Zellabschuppung mitmacht. Densitometrische
Scans von Immunblots von Extrakten aus plantarem Stratum corneum,
das in Abwesenheit (A) und in Gegenwart (B) von Aprotinin (15 μM) inkubiert wurde.
Die Spitzen bei 95 und 80 kD entsprechen den Degradationsprodukten
dieses Proteins (vgl. 3). Beachte
die wirksame Hemmung der Degradation von DG I durch Aprotinin.
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5.
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Die Wirkung von Zinkionen (A), Chymostatin
und Leupeptin (B) auf die Degradation von Desmoglein I (DG I) in
plantarem Stratum corneum während
der in vitro-Zellabschuppung. Beachte die Inhibition der Transformation
der anti-DG I-positiven Bestandteile von 160 kD bis 95 und 80 kD
durch Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin.
-
6.
-
Mit den plantaren Stratum corneum-Zellen
zusammenhängende
peptidhydrolysierende Aktivität.
Die Hydrolyse der zwei Substrate wurde mittels Messung der Veränderung
der Absorption bei 405 nm verfolgt. Mittelwerte aus Inkubationen
in dreifachem Ansatz. Quadrate = S-2586; Kreise = S-2288.
-
7.
-
pH-Abhängigkeit der mit den Corneocyten
zusammenhängenden
Hydrolyseaktivität
von S-2586. Mittelwerte aus Inkubationen in dreifachem Ansatz. Quadrate
= Natriumacetat, Kreise = Natriumphosphat, Dreiecke = Tris-HCl.
-
8.
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Zymographie, die die caseinolytische
Aktivität
in Extrakten aus dissoziierten plantaren Stratum corneum-Zellen
zeigt. Vgl. auch den Text von Beispiel 2.2 zu Versuchsdetails.
- A: Vergleich des Enzyms aus plantaren Corneocyten,
das mit Laemmli'schem
Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (sc/s) und KCl (sc/k) mit Rinder-Chymotrypsin,
0,125 ng (c) und Rinder-Trypsin 0,5 ng (t) extrahiert wurden. Vor
der Elektrophorese wurde der KCl-Extrakt gegen 5 mM Tris-HCl, pH
6.8, und bis zu einer Endkonzentration wie beim Probenpuffer hinzugefügtem SDS
und Glcerin dialysiert; 10 μl
wurden zu allen Reihen hinzugefügt.
Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite.
- B: pH-Abhängigkeit
des Inkubationspuffers. Enzymquelle = SDS-Extrakte dissoziierter
plantarer Corneocyten. Puffer zur Vorbehandlung mit Triton X-100
und Inkubation: 0,1 M Natriumacetat (pH 4.0 und pH 5.5), und 0,1
M Tris-HCl (pH 7.0 und pH 8.0). Die anderen Bedingungen wie in A.
- C: die Auswirkung von Inhibitoren. sc = SDS-Extrakt von plantaren
Corneocyten; c = Rinder-Chymotrypsin; t
= Rinder-Trypsin. Die Inhibitoren waren während der Vorbehandlung mit
Triton X-100 und der anschließenden
Inkubation vorhanden. Die Endkonzentration von Leupeptin war 160 μM, die von
Aprotinin 15 μM, die
von Chymostatin 40 μM
und die von Zinkionen (als Sulfat) 100 μM. Leupeptin und Chymostatin
wurden als Lösungen
in Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt. Puffer für die Vorbehandlung
und Inkubation = 0,1 M Tris-HCl, pH 8 mit einer DMSO-Endkonzentration
von 1% (v/v). Die anderen Bedingungen wie in A.
-
9.
-
Vergleich von SCCE, Rinder-Chymotrypsin
und menschlichem Cathepsin G hinsichtlich der Wirkung von Inhibitoren
(A; Aprotinin, B; Chymostatin, C; Zinksulfat) und Substratspezifität (D). In
A-C wurde die Enzymaktivität
ohne Vorhandensein eines Inhibitors auf 100% standardisiert. In
D wurde die Enzymaktivität
mit MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA auf 1 willkürliche Einheit standardisiert.
-
10.
-
Affinitätschromatographie auf kovalent
gebundenem Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI. Punktierte Linie:
Absorption bei 280 nm, die die Proteinkonzentration des Eluats widerspiegelt.
Durchgezogene Linie mit offenen Quadraten: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2586
als Substrat, die als Veränderung
der Absorption bei 405 nm angegeben wird. Durchgezogene Linie mit
offenen Kreisen: Peptidhydrolyseaktivität mit S-2288 als Substrat,
die als zehnmal multiplizierte Veränderung der Absorption bei
405 nm angegeben wird.
-
11.
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SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung (A)
und Zymograpie nach SDS-PAGE mit co-polymerisiertem Casein (B) der
Fraktionen 2, 6 und 10 aus dem in 10 gezeigten
Chromatogramm. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite. In
B: 1: Gruppe caseinolytischer Bestandteile, die durch Leupeptin
(160 μM)
gehemmt werden konnten. c: Gruppe caseinolytischer Bestandteile,
die durch Chymostatin (40 μM)
gehemmt werden konnten.
-
12.
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SDS-PAGE von SCCE, gereinigt durch
Affinitätschromatographie
auf SBTI-Affigel 15. 12,5% Gel. 1: Nichtreduzierte Probe. 2: Reduzierte
Probe. Molekulargewichtsmarker auf der linken Seite.
-
13.
-
N-terminale Aminosäuresequenz
von SCCE. Sternchen bezeichnen Unsicherheiten bei den angenommenen
Cysteinen in den Positionen 7 und 9. Fragezeichen geben die Positionen
an, in denen keine Aminosäurederivate
festgestellt werden konnten, wo aber bei den nachfolgenden Schritten
keine Ertragsabfälle auftraten.
-
14.
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Charakterisierung der monoclonalen
Antikörper
TE4b und TE9b mittels Immunfällung
und Immunblotting. a:
Coomassie-gefärbte
12,5%-SDS-PAGE, nichtreduzierende Bedingungen.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker |
Reihe
2: | KCl-Extrakt,
aus dissoziierten plantaren Corneocyten wie in Beispiel 3.1 beschrieben
hergestellt |
Reihe
3: | SCCE,
durch Affinitätschromatographie
auf unlöslich gemachtem
Sojabohnen-Trypsininhibitor
wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt. |
b:
Zymographie von Immunpräzipitaten
in 12,5% SDS-PAGE mit 0,1% co-polymerisiertem, hitzedenaturiertem Casein,
Coomassie-gefärbtem
Gel.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker |
Reihe
2: | KCl-Extrakt,
wie in a dialysiert |
Reihe
3: | Solubilisierte
Immunpräzipitate
mit (von links nach rechts) moab TE4b (20 μg), moab TE9b (10 μg), moab
PZ (10 μg),
und phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Moab PZ ist ein monoclonaler
Mäuse-Antikörper vom
IgG 1-Kappa-Typ
gegen α2-PAG (pregnancy zone protein) und wurde
als nicht verwandte Kontrolle verwendet. |
c:
Immunblot von 12,5% der SDS-PAGE (nichtreduzierende Bedingungen).
Reihe
1: | Biotinylierte,
mit Alkaliphosphatase-konjugiertem Avidin (BioRad) festgestellte
Molekulargewichtsmarker. Die elektrophoresierten Proben in den Reihen
2, 4, und 6 sind die gleichen wie in Reihe 2 in a, und in den Reihen
3, 5 und 7 die gleichen wie in Reihe 3 in a. |
Reihen
2 u. 3: | Erster
Antikörper
= moab TE4b, 0,2 μg
pro ml. |
Reihen
4 u. 5: | Erster
Antikörper
= moab TE9b, 0,1 μg
pro ml. |
Reihen
6 u. 7: | Erster
Antikörper
= moab PZ, 0,1 μg
pro ml. Die Pfeilspitzen in a–c
bezeichnen die relativen Molekulargewichte (von oben nach unten
93, 66, 45, 31, 22 bzw. 14 kD. |
-
15.
-
15 zeigt
das Plasmid pS500. Dieses Plasmid enthält die in pUC19 clonierte cDNA
des menschlichen SCCE in voller Länge. Zu Details siehe Beispiel
6.
-
16.
-
Northern Blots mit aus menschlicher
Epidermis hergestellter mRNA. Poly-T-gereinigte RNA, entsprechend
etwa 100 g Gesamt-RNA wurde in jeder Reihe aufgebracht. 1: Hybridisierung
mit einer Sonde aus einem 1070 bp-Hinc 2/Hinc 2-Fragment SCCE-cDNA.
2: Hybridisierung mit einer Sonde aus einem 655 bp-Hinc 2/Bgl 2-Fragment
SCCE-cDNA.
-
17.
-
- a: Coomassie-gefärbte SDS-PAGE, 12,5%-Gel. 1
und 2: PBS-Triton X-100-unlösliche
Präzipitate
ultraschallzertrümmerter
TG 2-Zellen, die mit pS510 bzw. pS511 transformiert und mit IPTG
induziert wurden. 3: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum
gereinigtes SCCE.
- b: Immunblots mit Hühner-Präimmunserum
(1–3)
und Hühner-anti-SCCE
(4–6).
1 und 4: Mit pS510 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen.
2 und 5: Mit pS511 transformierte und mit IPTG induzierte TG 2-Zellen.
3 und 6: Aus menschlichem plantarem Stratum corneum gereinigtes
SCCE.
-
Die Proben wurden durch Kochen in
Probenpuffer mit Mercaptoethanol hergestellt.
-
18.
-
18 zeigt
eine zirkuläre
Karte des Expressionsvektors pS507, der wie im Beispiel 9 beschrieben konstruiert
wurde. Der Vektor pS507 vermittelt die Expression von rekombinantem
menschlichem SCCE in Säugerzellen.
-
19.
-
19 zeigt
die Analyse der Expression des rekombinanten menschlichen SCCE-Gens
von pS507 in Säugerzellen.
Reihe
1: | RNA
aus C127-Zellen. |
Reihe
2: | RNA
aus einem isolierten Clon, 1 : 24, von mit pS507 transfizierten
C127-Zellen. |
Reihe
3: | RNA
aus einem Populationsgemisch von mit pS507 transfizierten C127-Clones. |
Reihen
4 u. 5: | RNA
aus C127-Zellen, die mit einem Expressionsvektor, pS147, transfiziert
wurden, der außer
dem Fehlen der SCCE-cDNA-Sequenz mit p507 identisch ist. Die Größenmarker
sind links angegeben. |
-
20.
-
SDS-PAGE mit anschließendem Immunblotting
von in C127-Zellen-exprimiertem SCCE.
Reihen
1 u. 6: | Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker
(Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa) |
Reihe
2: | pS507/C127,
Gemisch, T-Kolben |
Reihe
3: | pS507/C127,
Gemisch, Roller A |
Reihe
4: | pS507/C127,
Gemisch, Roller B |
Reihe
5: | Negative
Kontrolle pS522/C127 |
Reihe
7: | Aus
Stratum corneum hergestelltes natives SCCE |
Reihe
8: | pS507/C127,
Clon 24, T-Kolben |
Reihe
9: | pS507/C127,
Clon 24, Roller A |
Reihe
10: | pS507/C127,
Clon 24, Roller B |
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21.
-
SDS-PAGE (A) und Immunblotting (B)
von rekombinantem SCCE, gereinigt aus C127-Zellkulturmedium mit Zellen, die das
Plasmid pS507 enthalten.
Reihen
1 u. 5: | Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker
(Bio-Rad, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 und 18,5 kDa) |
Reihe
2: | Zellmedium
vor der Reinigung |
Reihe
3: | Ungebundenes,
aus der Chromatographie gewonnenes Material |
Reihe
4: | Mit
dem Niedrig-pH-Puffer eluiertes gebundenes Material |
-
22.
-
Aktivitätstest von nativem SCCE und
aktiviertem rekombinantem SCCE auf einem Casein-Polyacrylamidgel.
Reihen
1 u. 10: | Molekulargewichtsmarker
(Pharmacia 14–94
kDa) |
Reihe
2: | Natives
SCCE. |
Reihe
3: | Natives
SCCE. |
Reihen
4–6: | Rekombinantes
SCCE, 1 Stunde lang, 3 Stunden lang bzw. über Nacht gespaltet (460 ng/Vertiefung). |
Reihe
7: | Trypsin
in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch
in Abwesenheit von APMSF. |
Reihe
8: | Trypsin
in gleicher Menge wie bei den Proben in den Reihen 4–6, doch
in Anwesenheit der gleichen Menge APMSF wie in den Proben. |
Reihe
9: | Wie
Reihe 3. |
-
23.
-
Immunblot von N-Glycosidase F
®-behandeltem
nativem und rekombinantem SCCE. Die Proben wurden auf 8–18% SDS-PAGE
getrennt und wie vorstehend beschrieben immungeblottet.
Reihe
1: | Molekulargewichtsmarker
(Molekularmassen von oben nach unten: 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5
und 18,5 kDa. |
Reihen
2 u. 3: | Rekombinantes
SCCE, 0,3 bzw. 3 μg. |
Reihen
4 u. 5: | Rekombinantes
SCCE, 1,5 bzw. 1,8 μg.
Die Proben in den Reihen 3 und 5 wurden mit N-Glycosidase F® behandelt. |
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Hinweise auf die Tatsache, daß die Zellabschuppung
von der Oberfläche
der verhornten Oberflächenschicht
der Haut mit der Degradation der desmosomalen Proteine einhergeht,
und daß das
dafür verantwortliche
Enzym eine Chymotrypsin-ähnliche
Serinproteinase zu sein scheint, die durch Zinkionen gehemmt werden
kann
-
1.1 Desquamation im Stratum
corneum
-
Ziel der Studie war es, die Natur
der für
die Zellkohäsion
und Oberflächenzelldissoziation
(Desquamation) verantwortlichen Mechanismen in der verhornten Schicht
der Haut, dem Stratum corneum, zu erhellen. Ein Stück Stratum
corneum von 0,3–0,6
mm Dicke wurde parallel zur Hautoberfläche von unter der Ferse eines Probanden
mit normaler Haut herausgeschnitten. Das Gewebestück wurde
3 Stunden lang bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit
0,1% Natriumazid eingeweicht, und die an der in vivo nach außen gerichteten
Seite lose anhaftenden Zellen wurden abgeschabt. Ein mm dicke, senkrecht
zur Gewebeoberfläche
geschnittene Scheiben wurden dann in ein Medium gelegt, das 0,1
M Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und 0,45% Agarose
enthielt; dies geschah unmittelbar vor dem Gelieren des Mediums
aufgrund des Agarosegehalts. Nach Inkubationszeiten von 0, 5 und
15 Stunden bei 37°C
wurden Gelstücke
mit Gewebe auf Trockeneis eingefroren. Auf einem Kryostaten wurden
20 μm-Kryostatschnitte
senkrecht zur Hautoberfläche
geschnitten, aufgezogen und in einem Phasenkontrastmikroskop untersucht.
Es wurde ein kontinuierliches, unipolares Abschuppen der Zellen
von Stücken
von plantarem Stratum corneum, die in vitro inkubiert worden waren,
beobachtet (1). Die
Zellen schuppten nur von der Seite ab, die in vivo nach außen gezeigt
hatte. Der beobachtete Vorgang glich somit der Desquamation.
-
1.2. Auswirkungen von
Temperatur, pH-Wert und Enzyminhibitoren
-
Dann wurde ein Verfahren zum Quantifizieren
der Zellabschuppung entwickelt, das Studien zu den Auswirkungen
verschiedener Parameter, wie Temperatur, pH-Wert und Enzyminhibi toren
erlaubte. Mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug wurden aus dem Gewebestück, das
wie vorstehend in 1.1 beschrieben entnommen und von lose anhaftenden
Oberflächenzellen
befreit worden war, Zylinder von 3 mm Durchmesser von plantarem
Stratum corneum ausgestochen. Die Zylinder (mit einer definierten
Fläche,
die in vivo nach außen
gezeigt hatte) wurden in 0,5 ml Medium mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,
5 mM EDTA, 0,1% Natriumazid und mit oder ohne Aprotinin (4 × 10–6 mol/l)
(Boehringer Mannheim, Deutschland) in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen 5, 10 und 20 Stunden
lang bei 37°C
inkubiert und dann 10 Sek. auf einem Vortex-Mixer geschüttelt, um dissoziierte Oberflächenzellen
freizusetzen. Das verbleibende Gewebe wurde entfernt und zur weiteren
Inkubation in frisches Medium gegeben. Die Röhrchen mit den freigesetzten
Zellen wurden 2 Minuten lang bei 5000 g zentrifugiert, um die Zellen
zu gewinnen. Die Zellpräzipitate
wurden einmal mit 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen
und dann 1,5 Stunden lang bei 60°C
mit 0,6 ml 1 M Natriumhydroxyd behandelt. Das alkalilösliche Protein
wurde gemäß Lowry
et al., 1951 quantifiziert und als Maß für die Menge der freigesetzten
Zellen genommen. Die Ergebnisse werden in 2. gezeigt.
-
In ähnlicher Weise wurden die Auswirkungen
verschiedener potentieller Inhibitoren (Aprotinin, Sojabohnen-Trypsininhibitor,
Pepstatin (Boehringer Mannheim, Deutschland) und Jodacetamid (Sigma,
St. Louis, MO) untersucht. Es wurden einzelne 2 mm-Gewebezylinder
hergestellt und mit Medium mit oder ohne verschiedenen potentiellen
Inhibitoren in den in der Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen
16 Stunden lang bei 37°C
inkubiert, und die freigesetzten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben
quantifiziert. Beachte, daß dem
Inkubationsmedium EDTA (das ein Inhibitor von Metallproteinasen
ist) hinzugefügt
wurde, um optimale Zellfreisetzungsraten zu erhalten.
-
TABELLE
1
Auswirkung von Proteaseinhibitoren auf die Zellfreisetzung
von plantarem Stratum corneum in vitro.
Mittelwert und Standardabweichung
aus 5 inkubierten Gewebestücken.
-
-
Es zeigte sich, daß die Serinproteinaseninhibitoren
Aprotinin und Sojabohnen-Trypsininhibitor die Zellabschuppung wirksam
hemmten (2 und Tabelle
1 vorstehend). Da diese zwei Substanzen hemmend wirkten, aber die
Inhibitoren von Metallproteinasen (EDTA), Thiolproteinasen (Jodacetamid)
und Aspartoproteasen (Pepstatin) nicht, wurde daraus geschlossen,
daß an
dem beobachteten Vorgang eine Serinprotease teilnimmt. Es wurde
auch geschlossen, daß die
Zellkohäsion
im Stratum corneum von Proteinstrukturen abhängt, und daß ein dem in vitro beobachteten ähnlicher
Mechanismus auch bei der in vivo-Abschuppung wirken maß (Lundström und Egelrud,
1988).
-
In weiteren Studien zur Zellabschuppung
von plantarem Stratum corneum in vitro wurde herausgefunden, daß der Vorgang
in zwei separate Schritte aufgeteilt werden konnte. Der erste Schritt
findet unabhängig davon
statt, ob EDTA im Inkubationsmedium vorhanden ist oder nicht. Der
zweite Schritt geschieht nur in Gegenwart von EDTA. Der erste Schritt
konnte außer
durch Aprotinin durch Chymostatin und Zinkionen gehemmt werden.
Der zweite Schritt konnte durch Aprotinin und Chymostatin gehemmt
werden (Lundström
und Egelrud, 1990 a). Chymostatin ist ein Proteinaseninhibitor von
niederem Molekulargewicht mit chymotrypsinartiger Substratspezifität. Es ist
weiterhin festgestellt worden (Lundström und Egelrud, 1990 a), daß Leupeptin,
ein Proteinaseninhibitor von niederem Molekulargewicht mit trypsinartiger
Substratspezifität,
keinen Einfluß auf
die in vitro-Zellabschuppung hatte.
-
Die Proteinstrukturen, die am wahrscheinlichsten
für die
Zellkohäsion
im Stratum corneum verantwortlich sind, und die somit mögliche Kandidaten
für eine
Degradation im Zug der vorstehend beschriebenen desquamationsartigen
Zellabschuppung darstellen, sind die Desmosomen. Ein Desmosom besteht
aus zwei symmetrischen Hälften,
die sich in benachbarten Zel len befinden. Die beiden Hälften sind
im extrazellulären
Raum durch Desmogleine genannte Transmembranproteine verbunden.
-
1.3. Das Schicksal von
Desmoglein I (DG I) während
der Zellabschuppung in vitro
-
Es wurde das Schicksal von Desmoglein
I (DG I) während
der Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro untersucht.
Plantares Stratum corneum wurde wie vorstehend in 1.1 beschrieben
inkubiert, und noch zusammenhängendes
Gewebe wurde von dissoziierten Zellen getrennt. Zellen und Gewebe wurden
in einem Puffer von 0,1 M Tris-HCI, pH 9, 9 M Harnstoff, 2% Natriumdodecylsulfat,
1% Mercaptoethanol, 1 ml Puffer auf 20 mg Gewebe 15 Stunden lang
bei 37°C
extrahiert. Die Extrakte wurden für Polyacrylamid-Gelelektrophorese
in 7,5%-Gelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) nach
Laemmli (Laemmli, 1970) vorbereitet, gefolgt von elektrophoretischem
Transfer (Towbin et al., 1979) auf eine Nitrocellulosemembran (Bio-Rad,
Richmond, CA), die mit einem polyclonalem Kaninchen-Antiserum, das
gegen aus Rindermäulern
gereinigtes DG I hergestellt worden war, (Gorbsky et al., 1985),
sondiert wurde. Gebundene Antikörper
wurden mit Alkaliphosphatasekonjugierten anti-Kaninchen Immunglobulinen
von Ziegen (BioRad, Richmond, CA) festgestellt (Blake et al., 1984).
-
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Die Probenmengen,
die zum Immunblot hinzugefügt
wurden, wurden so eingestellt, daß sich für zusammenhängendes Gewebe und dissoziierte
Zellen ungefähr
die gleichen Proteinkonzentrationen (durch visuelle Inspektion der
mit Coomassieblau gefärbten
SDS-PAGE-Gele abgeschätzt)
ergaben. Es wurden Durchgänge
mit mehreren Verdünnungen
vorgenommen, um einen semiquantitativen Vergleich der verschiedenen
anti-DG I-reaktiven Bestandteile in zusammenhängendem Stratum corneum und
dissoziierten Zellen zu ermöglichen.
-
Wenn noch zusammenhängendes
Gewebe und dissoziierte Zellen getrennt extrahiert wurden, zeigte es
sich, daß,
während
das noch zusammenhängende
Gewebe nur scheinbar intaktes DG I enthielt, die dissoziierten Oberflächenzellen
nur mutmaßliche
Degradationsprodukte dieses Proteins enthielten (3).
-
In 4 und 5 werden die Auswirkungen
von Aprotinin, Zinkionen, Chymostatin (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
und Leupeptin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) auf die Degradation
von DG I während
der Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro gezeigt.
-
Zuerst wurde der zeitliche Verlauf
und die Auswirkung von Aprotinin auf die Degradation von Desmoglein
I (DG I) in plantarem Stratum corneum im Zug der Zellabschuppung
in vitro untersucht. Es wurden Extrakte aus plantaren Stratum corneum
wie vorstehend in 1.2 beschrieben (aber ohne Abtrennung des zusammenhängenden
Gewebes von dissoziierten Zellen vor der Extraktion) in Abwesenheit
oder Gegenwart von Aprotinin (15 μM)
inkubiert und nach 0, 6, 12 oder 24 Stunden extrahiert. SDS-PAGE
und Immunblotting wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Das
densitometische Scannen der Immunblots wurde auf einem Shimadzu
CS-9000 Lichtpunktscanner (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit reflektiertem
Licht bei 560 nm im Zickzackmodus ausgeführt. Die Ergebnisse werden
in 4 gezeigt. Beachte
die wirksame Inhibition der Degradation von DG I durch Aprotinin.
-
Dann wurde die Auswirkung von Zinkionen,
Chymostatin und Leupeptin auf die Degradation von Desmoglein I (DG
I) im plantarem Stratum corneum während der Zellabschuppung in
vitro untersucht. Der Versuch war wie vorstehend umrissen aufgebaut.
Die Inkubationen wurden 24 Stunden lang mit Zinksulfat bei Konzentrationen
von 0, 1 oder 5 mM und mit Chymostatin oder Leupeptin bei Konzentrationen
von 330 μM
ausgeführt. Die
Ergebnisse zeigten eine Inhibition der Transformation von anti-DG
I-positiven Bestandteilen von 160 kD bis 95 und 80 kD durch Zinkionen
und Chymostatin, aber nicht durch Leupeptin.
-
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig,
daß Aprotinin,
Zinkionen und Chymostatin hemmend wirkten, Leupeptin hingegen nicht.
Somit war das inhibitorische Profil für die Degradation von DG I
das gleiche wie für
die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro (Lundström und Egelrud,
1990 b).
-
Es wurde als wichtig erachtet, zu
demonstrieren, daß Mechanismen,
die jenen der Zellabschuppung von palmo-plantarem Stratum corneum ähneln, auch
im Stratum corneum der Haut von anderen Körperstellen als den Handflächen und
Fußsohlen
wirken. Takahashi et al. (Takahashi et al., 1987) hatte berichtet,
daß ein Gemisch
der der Detergentien N,N-Dimethyldodecylaminoxid (Sigma, St. Louis,
MO) und Natriumdodecylsulfat (Bio-Rad, Richmond, CA) in einer molaren
Verhältnis
von 8 : 2 in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum, das durch Trypsinisierung
von ganzer Epidermis präpariert
worden war, Zelldissoziation hervor rief. Um eine Kontamination durch
exogenes Trypsin zu vermeiden, wurden die Stanzbiopsien von normaler
menschlicher Haut aus der glutealen Region bei pH 8 mit dem vorgenannten
Detergentiengemisch und EDTA (Egelrud und Lundström, 1990)
inkubiert. Es stellte sich heraus, daß die verhornte Schicht unter
diesen Bedingungen zu einzelnen Zellen dissoziierte. Die Hinzufügung von
Aprotinin zum Inkubationsmedium verhinderte diese Zelldissoziation.
Daraus wurde geschlossen, daß auch
in nicht-palmo-plantarem Stratum corneum die Zellkohäsion von
Proteinstrukturen abhängt,
daß die
Desquamation in diesem Gewebe von Proteolyse abhängt, und daß das Gewebe eine Proteinase
enthält,
die diese Proteolyse katalysieren kann. Da die Zelldissoziation
nur das Stratum corneum und nicht die tieferen, nichtverhornten
Epidermisschichten betraf, wurde gefolgert, daß die verantwortliche Proteinase
in den tieferen Schichten in einem inaktiven oder inhibierten Zustand
vorhanden ist.
-
BEISPIEL 2
-
Die Entdeckung des Stratum corneum
chymotryptischen Enzyms (SCCE): eine Proteinase, die die Kriterien
erfüllt,
um für
die Degradation intrazellulärer
kohäsiver
Strukturen im Stratum corneum in vitro und möglicherweise auch in vivo verantwortlich
zu sein Aus den in Beispiel 1 dargestellten Versuchen wurde gefolgert, daß die für die unipolare
Oberflächen-Zelldissoziation
im in vitro-Modell der Desquamation in plantarem Stratum corneum
verantwortliche Proteinase folgende Eigenschaften haben müßte:
- 1. Sie muß im
Stratum corneum anwesend sein.
- 2. Sie muß eine
Serinproteinase sein.
- 3. Sie müßte eine
chymotrypsinartige Substratspezifität und ein Inhibitorprofil aufweisen,
das jenem ähnlich ist,
das bei der in vitro-Zellabschuppung und bei der damit einhergehenden
Degradation von Desmoglein I beobachtet wurde.
- 4. Sie müßte eine
extrazelluläre
Lokalisierung im Stratum corneum haben.
- 5. Sie müßte eine
pH-Abhängigkeit
haben, die es ihr erlaubt, unter physiologischen Bedingungen aktiv
zu sein, wobei der pH-Wert des Stratum corneum um die 4.5–6 beträgt.
- 6. Da die Zellabschuppung von plantarem Stratum corneum in vitro über lange
Inkubationszeiten hinweg kontinuierlich fortschreitet, selbst wenn
das Volumen des Inkubationsmediums im Vergleich zum Volumen der
inkubierten Gewebestücke
sehr groß ist,
oder wenn das Inkubationsmedium während des Inkubationsverlaufs
zu wiederholten Malen gewechselt wird, scheint Grund zur Annahme
zu bestehen, daß das
verantwortliche Enzym in einer Weise an das Gewebe gebunden ist,
die seine Extraktion ins Inkubationsmedium während des Inkubationsverlaufs
nicht erlaubt.
-
Die folgenden beiden Versuche führten zur
Entdeckung von SCCE (Egelrud und Lundström, 1991):
-
2.1. Mit der Dissoziation
plantarer Corneocyten verbundene Enzymaktivität
-
Dissoziierte plantare Stratum corneum-Zellen
(Corneocyten) wurden durch Inkubation von plantarem Stratum corneum
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Zellen wurden durch
ein Nylonnetz mit 100 μm Durchlaßgröße filtriert
und dann dreimal in 10 Volumina von 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA
und dreimal in 0,1 M Tris-HCI, pH 8 gewaschen. Dann wurden die Zellen
mit zwei Typen chromogener Proteinasesubstrate, S-2288 oder S-2586
(Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden) inkubiert: Ile-Pro-Arg-p-Nitroanilid
(S-2288) wird von einem breiten Spektrum von Serinproteinasen mit
Argininspezifität
(z. B. Trypsin) gespaltet. Arg-Pro-Tyr-p-Nitroanilid (S-2586) ist
ein Substrat für
chymotrypsinartige Proteinasen.
-
In einem Gesamtvolumen von 120 μl enthielt
jedes Reaktionsgemisch 0,07 M Tris-HCl, pH 8, 0,1% Natriumazid,
1, 2,5, 5 oder 10 μl
einer 25%igen Suspension von gewaschenen plantaren Corneocyten und 1,04
mM (S-2586) oder 1,25 mM (S-2288) Substrat. Nach 5stündiger Inkubation
bei 37°C
in Mikrotiterplatten wurde die Reaktion durch Hinzufügen von
125 μl 10%iger
Essigsäure
gestoppt. Die Zellen wurden sedimentieren gelassen und 200 μl von jedem Überstand
in neue Vertiefungen transferiert. Die Hydrolyse der beiden Substrate
wurde durch Messen der Veränderung
des Absorptionsverhaltens bei 405 nm verfolgt, nachdem die Zellen
in einem Behring-Elisaverarbeitungsgerät (Behringwerke, Marburg, Deutschland)
entfernt worden waren.
-
Wie in 6 gezeigt, existierte eine mit der Dissoziation
plantarer Corneocyten einhergehende Enzymaktivität, die die Hydrolyse von S-2586
katalysierte. Im Vergleich dazu war die Aktivität gegenüber S-2288 niedrig.
-
Dann wurde die pH-Abhängigkeit
der S-2586-hydrolysierenden Aktivität untersucht. Der Versuchsaufbau
war wie vorstehend umrissen, wobei 10 μl einer 25%igen Suspension gewaschener
plantarer Corneocyten und Puffer mit verschiedenen pH-Werten (Natriumacetat,
Natriumphosphat oder Tris-HCl) verwendet wurden. Die Endkonzentrationen
der Puffer waren 0,07 M. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt, aus welcher hervorgeht, daß die Aktivität bei pH
7–8 optimal,
aber auch bei pH 5.5 signifikant war.
-
In einem weiteren Versuch wurden
die Auswirkungen von EDTA, Metallionen und Proteinaseninhibitor auf
die Hydrolyse von S-2586 bei pH 8 durch die mit suspendierten plantaren
Stratum corneum-Zellen assoziierte Proteinase untersucht. Der Versuchsaufbau
war wie vorstehend und in Tabelle 2 umrissen.
-
TABELLE
2
Auswirkungen von EDTA, Metallionen und Proteinaseinhibitoren
auf die Hydrolyse von S-2586 durch die mit den plantaren Stratum
corneum-Zellen assoziierte Proteinase (Enzymquelle: suspendierte
Zellen)
-
-
Wie in der vorstehenden Tabelle 2
gezeigt, inhibierten Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF; ein genereller
Inhibitor von Serinproteinasen), Aprotinin, Sojabohnen-Trypsininhibitor,
Chymostatin (ein Chymotrypsininhibitor) und Zinkionen, nicht aber
Leupeptin (ein Trypsininhibitor) die Hydrolyseaktivität des S-2586.
Das Inhibitorprofil war somit jenem sehr ähnlich, das bei der in vitro-Zellabschuppung
und der damit einhergehenden Degradation von Desmoglein I beobachtet
wurde.
-
2.2. Zymographie von dissoziiertem
plantarem Stratum corneum
-
Es wurde festgestellt, daß das in
2.1 entdeckte, für
die S-2586-hydrolysierende Aktivität verantwortliche Enzym solubilisiert
werden konnte, wenn die Corneocyten mit 1 M KCl in 0,1 M Tris-HCL,
pH 8 extrahiert wurden. Deshalb wurden Versuche mit Zymographie
ausgeführt.
Zu diesem Zweck wurden KCl-Extrakte aus Corneocyten gemäß Laemmli
(Laemmli, 1970) für
die Elektrophorese hergestellt, aber ohne Reduktionsmittel im Probenpuffer
und ohne Erhitzen der Proben. Es wurden auch Proben mittels Extraktion
von dissoziierten plantaren Corneocyten mit Laemmli'schem Probenpuffer
ohne Reduktionsmittel bei Raumtemperatur hergestellt. Für die Zymographie
wurde eine Modifikation des Verfahrens von Horie et al. (Horie et
al., 1984) angewandt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart
von Natriumdo decylsulfat (SDS-PAGE) wurde gemäß Laemmli in 12,5%-Gelen mit
1% co-polymerisiertem, hitzedenaturiertem Casein ausgeführt. Nach
der Elektrophorese wurden die Gele 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
in einem Puffer von 2% Triton X-100 getränkt, um das SDS zu entfernen
und dann 15 Stunden lang bei 37°C
inkubiert. Die Gele wurden dann mit Coomassieblau gefärbt. Die
separierten caseinolytischen Enzyme traten als helle Banden gegen
einen blauen Hintergrund auf. Vgl. auch die Legende zu 8 zu Versuchsdetails.
-
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Die Extrakte
aus plantaren Corneocyten enthielten ein caseinolytisches Hauptenzym
mit einem scheinbaren Molekulargewicht von um die 25 kD. Es gab
auch kleinere caseinolytische Enzyme mit Molekulargewichten um die
30 kD. (Diese kleineren Bestandteile sind in der Figur nicht klar
zu sehen. Später
wurde herausgefunden, daß sie
durch Leupeptin, nicht aber durch Chymostatin gehemmt werden konnten.)
Das 25 kD-Enzym hatte eine signifikante Aktivität bei pH 5.5 bis 8. Es wurde
durch Aprotinin, Zinkionen und Chymostatin, nicht aber durch Leupeptin
gehemmt. Somit hatte es das gleiche Inhibitorprofil wie die vorstehend
beschriebene S-2586-hydrolysierende Aktivität. Bei Versuchen mit Gelausschlußchromatographie
(nicht gezeigt) zeigte es sich, daß das caseinolytische 25 kD-Enzym
mit der S-2586-hydrolysierenden Aktivität co-chromatographierte.
-
In weiteren Versuchen (nicht gezeigt)
mit der gleichen Technik, wie vorstehend für 2.2 beschrieben, ergab sich,
daß nicht-palmo-plantares
Stratum corneum ein Enzym mit Eigenschaften enthält, die mit jenen der 25 kD-Proteinase,
die mit plantaren Corneocyten assoziiert ist, identisch ist, und
das von jetzt an Stratum corneum chymotryptisches Enzym (SCCE) (Lundström und Egelrud,
1991) genannt wird.
-
Es war auch möglich, Hinweise darauf zu gewinnen,
daß SCCE
mit plantaren Corneocyten in einer Weise assoziiert ist, die es
ihm erlaubt, im extrazellulären
Raum des Stratum corneum aktiv zu sein. Dies geschah, indem zuerst
gezeigt wurde, daß die
dissoziierten Corneocyten für
Meerrettichperoxidase (Mr 44 kD) impermeabel sind. Dann wurde gezeigt,
daß menschliches
Fibrinogen (Mr 340 kD) von einer Corneocytensuspension degradiert
werden konnte, und daß diese
Degradation von den gleichen Inhibitoren wie SCCE gehemmt werden
konnte. Es konnte ausgeschlossen werden, daß die Degradation von Fibrinogen
aufgrund von solubilisiertem Enzym geschah (Egelrud, 1992).
-
BEISPIEL 3
-
Teilweise Reinigung von
Stratum corneum chymotryptischem Enzym (SCCE) und Proteinasetests
mit chromogenen Substraten
-
3.1 Herstellung von KCl-Extrakten
aus plantaren Corneocyten
-
Die Herstellung dissoziierter plantarer
Corneocyten, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in größerem Maßstab durchgeführt, und
es wurden wie in Beispiel 2 beschrieben KCl-Extrakte aus gewaschenen
plantaren Corneocyten, die SCCE enthielten, hergestellt.
-
Die Herstellung von KCl-Extrakten
aus plantaren Corneocyten wird nachstehend in Tabelle 3 schematisch
dargestellt. Hyperplastisches menschliches plantares Stratum corneum
wurde durch Zusammenarbeit mit der Gesellschaft der schwedischen
Pediküristen
gewonnen. Es wurde nur Material verwendet, das durch Abzwicken oder
Abschneiden gewonnen worden war. Von Füßen mit gestörter Abschuppung
wurde kein Material gewonnen. Vor dem Versand wurde das Stratum
corneum luftgetrocknet und in Plastiksäckchen verpackt. Im Labor wurde
es bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
-
TABELLE
3
Schematische Darstellung der Herstellung von SCCE-haltigen
KCl-Extrakten aus dissoziierten plantaren Corneocyten.
-
Für
jeden nachfolgenden Affinitätschromatographieschritt
wurden die Extrakte 1 und 2 aus zwei Präparaten von jeweils 50 g plantarem
Stratum corneum vereinigt.
-
3.2. Proteinasetests mit
chromogenen Substraten
-
Es wurde ein Vergleich von SCCE,
Rinder-Chymotrypsin und menschlichem Cathepsin G hinsichtlich der
Auswirkungen der Inhibitoren Aprotinin, Chymostatin, Zinksulfat
und der Substratspezifität
gemacht.
-
Es wurde eine Vorratslösung von
MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) in destilliertem Wasser, eine von
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Boehringer, Mannheim, Deutschland) in 1-Methyl-2-Pyrrolidon (Endkonzentration
des Lösungsmittels
in den Inkubationsgemischen 4%) und von Chymostatin in Dimethylsulfoxid
(Endkonzentration des Lösungsmittels
in den Inkubati onsgemischen 1%) hergestellt. Cathepsin G aus eitrigem menschlichem
Auswurf wurde von E. Lotti, Genf, Schweiz bezogen. Die SCCE-Quelle
war KCl-Extrakt aus dissoziierten plantaren Corneocyten, der wie
vorstehend beschrieben hergestellt wurde. Die Quellen der Inhibitoren
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat waren wie vorstehend beschrieben.
-
Die Inkubationen wurden bei 37°C in Mikrotiterplatten
vorgenommen. Das gesamte Inkubationsvolumen betrug 135 μl. Jedes
Inkubationsgemisch enthielt Tris-HCI, pH 8.0 (Endkonzentration 0,08
M), KCl (Endkonzentration 0,2 M), 100 μl Substratösung, 25 μl Enzymquelle (angemessen verdünnt in 0,1
M Tris-HCI, pH 8.0, 1,0 M KCl) und 10 μl Inhibitorlösung.
-
In 9,
A–C, wurde
MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586, Anfangskonzentration 1,2 mM) als
Substrat verwendet. In D betrug die Anfangskonzentration beider
Substrate 1,2 mM.
-
Am Ende der Inkubationen (1,5 Stunden)
wurden zu jeder Vertiefung 125 μl
10%iger Essigsäure
hinzugefügt
und die Absorption bei 405 nm abgelesen, wobei die Inkubationsgemische
ohne hinzugefügte
Enzyme als Nullproben dienten. Die Menge der hinzugefügten Enzyme
wurde so eingestellt, daß sich
am Ende der Inkubationen eine Veränderung der Absorption bei
405 nm von 0,3–0,7
ergab.
-
Die Ergebnisse sind in 9, A–D zusammengefaßt. Für die Untersuchungen
zur Auswirkung von Inhibitoren wurde S-2586 als Substrat verwendet.
Die Wirksamkeit von Aprotinin als Inhibitor von SCCE und Chymotrypsin
war hoch und für
die beiden Enzyme ungefähr
gleich. Die Auswirkung auf Cathepsin G hingegen war viel geringer
(9A). Chymostatin bewirkte
eine Hemmung aller drei Enzyme, doch die Inhibitorkonzentration,
die 50% Hemmung bewirkte, war für
SCCE mehr als drei Größenordnungen
höher als
für Chymotrypsin und
Cathepsin G (9B). Zinksulfat
war ein wirksamer Inhibitor von SCCE, nicht aber von Chymotrypsin
und Cathepsin G (9C).
Die Aktivität
der drei Enzyme gegen die Substrate MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586) und
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA werden in 9D verglichen.
Da es darum ging, Ähnlichkeiten
oder Unterschiede zwischen den untersuchten Enzymen herauszufinden,
wurden diese Versuche nur bei einer Anfangskonzentration für jedes
Substrat vorgenommen. Während
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA für
Chymotrypsin und Cathepsin G ein wesentlich besseres Substrat als
S-2586 zu sein schienen, ergab sich für SCCE das Gegenteil.
-
BEISPIEL 4
-
Reinigung und Bestimmung
der N-terminalen Aminosäuresequenz
von Stratum corneum chymotryptischem Enzym
-
4.1. Reinigung von SCCE
aus KCl-Extrakten von Corneocyten mittels Affinitätschromatographie
auf unlöslich gemachtem
Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI
-
10 zeigt
die Ergebnisse der Affinitätschromatographie
auf SBTI. Das Affinitätsgel
wurde durch Verbinden von 50 mg SBTI (Boehringer, Mannheim, Deutschland)
mit 12 ml sedimentiertem Affigel 15 (BioRad, Richmond, CA) nach
den Empfehlungen des Herstellers hergestellt. Verbleibende aktive
Gruppen auf dem Gel wurden mit Ethanolamin blockiert. Kombinierte
KCl-Extrakte aus 100 g (Trockengewicht) plantarem Stratum corneum
(Gesamtvolumen 700 ml) wurden durch ein in eine Glassäule gepacktes
0,8 × 2
cm-Bett von SBTI-Affigel
15 laufen gelassen, Durchflußrate
42 ml/Stunde, wobei die Absorption des Eluats bei 280 nm kontinuierlich
aufgezeichnet wurde. Die Säule
wurde mit 0,1 M Tris-HCI, pH 8, 1 M KCl gewaschen, bis die Absorption des
Eluats unter 0,01 lag, und dann mit 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8. Die schrittweise
Elution des gebundenen Materials wurde mit HCl bei 1, 10 und 100
mM ausgeführt.
Das Eluant wurde gewechselt, wenn die Absorption des Eluats auf
unter 0,01 gesunken war. In Teströhrchen, die Tris-HCl, pH 8,
Gesamtvolumen 0,4 ml, enthielten, wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt,
wobei die Menge so berechnet wurde, daß sie genügte, den pH-Wert des Eluats
auf über
7 einzustellen. Der pH-Wert jeder einzelnen Fraktion wurde sofort überprüft und wenn
nötig mit
kleinen Volumina 1 M Tris-HCl, pH 8, auf etwa pH 7 eingestellt.
Die Analysen der peptidhydrolysierenden Aktivität mit S-2586 (Substrat für SCCE)
und S-2288 (Substrat für
trypsinartige Enzyme) wurden wie in Beispiel 2.1. beschrieben ausgeführt. Die
Anfangskonzentration beider Substrate in den Testgemischen betrug
1,1 mM. Etwa 90% der S-2586-hydrolysierenden Aktivität wurde
an das Gel gebunden. Durch schrittweise Elution des gewaschenen
Gels mit 10–100
mM HCl konnten ungefähr
60% der gesamten S-2586-hydrolysierenden Aktivität im verwendeten KCl-Extrakt
wiedergewonnen werden. Von der gesamten S-2288-hydrolysierenden
Aktivität
wurden um die 20% an das Affinitätsgel
gebunden, und 10% konnten im Eluat wiedergewonnen werden.
-
11 zeigt
Analysen des Eluats aus der SBTI-Affinitätschromatographie mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese
in Gegenwart von SDS (SDS-PAGE) und mit Zymographie. Es wurden nichtreduzierte
Proben auf 12,5%-Gelen durchlaufen gelassen. Vgl. auch Egelrud und
Lundström,
1991 und Beispiel 2, 2.2 zu Versuchsdetails. Bevor sie für die Elektrophorese
vorbereitet wurden, waren die Proben in A mittels Zentrifugenfiltration mit
Ultrafree-MC-Filter (Abtrennung bei 10 kD; Millipore, Bedford, MA)
ungefähr
20fach konzentriert und in B 10fach verdünnt worden.
-
In 12 wird
ein Vergleich mittels SDS-PAGE zwischen einer nichtreduzierten und
einer reduzierten Probe der SBTI-Affinitätschromatographie gezeigt.
Wie in den 10 und 11 gezeigt, ergab die SBTI-Affinitätschromatographie
ein Protein, das zu mehr als 90% rein war (wie nach den Coomassieblau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen
beurteilt wurde), mit scheinbarem Molekulargewicht um die 25 kD
in nichtreduzierter Form und um die 28 kD in reduzierter Form. Darüberhinaus
gab es eine kleine Coomassieblau-positive Komponente mit einem scheinbaren
Molekulargewicht, das etwa 1 kD größer war, als das der Hauptkomponente.
Auf den Zymographiegelen war eine größere und eine kleinere Bande
mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität wie die beiden auf den Coomassieblau-gefärbten Gelen
bei nichtreduzierten Proben festgestellten Banden. Diese caseinolytischen
Komponenten konnten beide durch Chymostatin gehemmt werden. Weiterhin
zeigte die Zymographie kleinere Komponenten mit scheinbaren Molekulargewichten
um die 30 kD, die durch Leupeptin gehemmt werden konnten. Es wurde
gefolgert, daß der
Hauptanteil des gereinigten Proteins SCCE war.
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4.2 Analyse der N-terminalen
Aminosäuresequenz
von SCCE
-
Zweihundert Mikroliter einer Fraktion
aus einem Chromatogramm mit SBTI-Affigel 15, A280nm 0,2,
wurden für
SDS-PAGE mit und ohne Reduktion vorbereitet und auf einem 12,5%-Polyacrylamidgel
(Dicke 1 mm, Schlitzbereite 73 mm) durchlaufen gelassen. Nach der
Elektrophorese wurden die getrennten Proteine elektrophoretisch
auf einen Immobilon-Filter (Millipore) transferiert und mit Coomassieblau
gemäß Matsuidaira, 1987
gefärbt.
Die Hauptproteinbande wurde ausgeschnitten und in einem Applied
Biosystems 477A Puls-Flüssigphasen-Aminosäuresequenzanalysator
mit einem PTH 120A Online-Analysator (Applied Biosystems Inc., Foster
City, CA, USA) verarbeitet. Die Sequenzierung geschah mit regulären Zyklusprogrammen
und Chemikalien vom Hersteller. Die Anfangs- und die Wiederholungserträge betrugen
25% bzw. 97%, von den Standardproteinen her gerechnet.
-
Die Erträge von Aminosäurederivaten
waren mit nur einem der sequenzierten Peptide kompatibel. Bei nichtreduzierten
Proben waren die Erträge
in den Schritten 1–6
gut, fielen aber in den Schritten 7 und 9 auf Null. Die Erträge in den
nachfolgenden Schritten waren deutlich verringert. Auch bei reduzierten
Proben konnten in den Schritten 7 und 9 keine Aminosäurederivate
festgestellt werden, doch bei den nachfolgenden Schritten, in denen
Derivate festgestellt werden konnten, ergaben sich keine steilen
Abfälle
der Erträge.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß sich
in den Positionen 7 und 9 Cysteine befinden. Es war jedoch nicht
möglich,
in den Schritten 7 und 9 nach der Reduktion und Behandlung mit Jodessigsäure (100
mM) carboxymethylierte Cysteine zu entdecken. Die erhaltene Sequenz
(13, SEQ ID NR: 3)
war für
reduzierte und nichtreduzierte Proben identisch.
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BEISPIEL 5
-
5.1. Die Herstellung SCCE-spezifischer
monoclonaler Antikörper
-
BALB/c-Mäuse (Bomholtgaard, Dänemark)
erhielten ungefähr
30 μg natives
SCCE, das wie in Beispiel 4.1 beschrieben in Freund'schem vollständigem Adjuvans
(Difco Laboratories, Detroit, MI gereinigt worden war, als subcutane
Injektionen. Die Injektionen mit der gleichen Menge SCCE in Freund'schem unvollständigem Adjuvans
(Difco Laboratories, Detroit, MI) wurden nach einem Monat wiederholt.
Vier Monate nach der ersten Injektion erhielt eine Maus an drei
aufeinanderfolgenden Tagen intravenöse Auffrischungsimpfungen; 30 μg Antigen
pro Injektion. Die Hybridome wurden mit dem bei Carlsson et al.,
1985 beschriebenen Verfahren mit Zellen der SP2/0-Myelomzellinie
(ATCC CRL 1581) hergestellt. Die Bestimmung der mit dem gereinigten SCCE-Präparat reagierenden
Antikörper
wurde mit einer ELISA-Technik ausgeführt. Die Kulturüberstände von positiven
Clones wurden mittels Immunblotting nach SDS-PAGE weiter analysiert.
Clone, die Antikörper
produzierten, die in diesem Test mit SCCE reagierten, wurden in
Mäuse-Ascitesfluid
propagiert, und die Antikörper wurden
durch Protein A-Affinitätschromatographie
gereinigt und mit dem in Carlsson et al., 1985 beschriebenen Verfahren
klassifiziert. Es wurden 2 nutzbare Antikörper erhalten, moab TE4b moab
TE9b, die beide als IgG1-Kappa klassifiziert
wurden.
-
Die Charakterisierung der moabs TE4b
und TE9b mittels Immunfällung
und Inimunblotting wird in 14 gezeigt.
-
14a (Reihe
2) zeigt ein Coomassie-gefärbtes
SDS-PAGE-Gel mit einem konzentrierten KCl-Extrakt aus dissoziierten
plantaren Corneocyten, der wie in Beispiel 3.1. beschrieben hergestellt
wurde. Die Probe wurde 4 Stunden lang gegen 0,1 M Natriumacetat,
pH 4, dialysiert und durch Ultrafiltration etwa 100fach konzentriert,
bevor sie für
die Elektrophorese vorbereitet wurde. 14a (Reihe 3) zeigt ein SCCE-Präparat, das
wie in Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt wurde.
-
14b zeigt
die Ergebnisse eines Immunfällungsversuchs,
bei dem Antikörper
mit einem KCl-Extrakt von Corneocyten inkubiert worden waren und
dann mit unlöslich
gemachtem Protein A zurückgewonnen
wurden. Die resolubilisierten und dissoziierten Antigen-Antikörper-Komplexe
wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durch Zymographie analysiert.
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250 μl eines KCl-Extraktes aus dissoziierten
plantaren Corneocyten, der durch Ultrafiltration 5fach konzentriert
und gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert worden war,
und zu dem Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) bis zu einer
Endkonzentration von 10 mg pro ml hinzugefügt worden war, wurde mit 10 μl Antikörperlösung oder
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
vermischt und 15 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Dann wurde zu den
Röhrchen
25 μl sedimentierte
Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) hinzugefügt, und
die Inkubation ging mit leichtem Schütteln über 2 Stunden bei Raumtemperatur weiter.
Das Gel wurde durch Zentrifugierung wiedergewonnen und fünfmal mit
1 ml 0,05% Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) in 0,05 M Tris-HCl, pH
7.5, 0,5 M NaCl gewaschen. Nach den letzten Waschen wurde das Gel mit
100 μl Laemmli'schem Probenpuffer
mit Reduktionsmittel 1 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. Die
Extrakte wurden durch Zentrifugieren gereinigt und auf das Gel aufgetragen.
-
Die moabs TE4b und TE9b fällten beide
ein caseinolytisches Enzym mit dem gleichen Mr wie gereinigtes SCCE
und das entsprechende caseinolytische Hauptenzym im KCl-Extrakt.
Die Antikörper
fällten
keine kleineren caseinolytischen Enzyme mit Mr um die 30 kDa, von
denen gezeigt wurde, daß sie
durch Leupeptin, einem Inhibitor trypsinartiger Serinproteinasen
gehemmt werden. Zusätzlich
zu den caseinolytischen 25 kDa-Enzymen schienen die Antikörper noch
eine kleinere proteolytische Komponente mit Mr um die 80 kDa zu
binden. Diese Kom ponente findet sich gewöhnlich in KCl-Extrakten von
plantaren Corneocyten, die aus Gewebe hergestellt wurden, das vor
der Präparation
getrocknet worden war; sie findet sich jedoch nicht in Präparaten
aus frischem Gewebe (T. Egelrud, unveröffentlichte Beobachtung). Sie
findet sich nicht in SCCE-Präparaten,
die durch Affinitätschromatographie
gereinigt wurden, und sie könnte
ein Aggregationsprodukt darstellen. Es war nicht möglich, eine
entsprechende Komponente festzustellen, die mit den Antikörpern auf
Immunblots reagierte.
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Auf Immunblots von SDS-PAGE-Gelen,
die unter nichtreduzierenden Bedingungen gefahren wurden (14c), reagierten die moabs
TE4b und TE9b mit einer in KCl-Extrakten von plantaren Corneocyten (14c, Reihen 2 und 4) und
im gereinigten SCCE-Präparat
(14c, Reihen 3 und
5) vorhandenen Komponente, die beide das gleiche Mr wie das gereinigte
Haupt-Protein und die caseinolytische Hauptkomponente in Zymogrammen
hatten. Die Antikörper
reagierten nicht mit Proben, die in Gegenwart von SDS reduziert
worden waren, was die Annahme nahelegt, daß sie gegen konformationsabhängige Epitope
gerichtet sind.
-
Zusätzlich zum Hauptprotein mit
Mr um die 25 kD in nichtreduzierter Form, enthält das gereinigte SCCE-Präparat eine
kleinere, Coomassie-positive Komponente mit Mr um die 26 kD (nicht
reduziert; vgl. Beispiel 3). Auf Zymogrammen findet sich eine entsprechende
caseinolytische Komponente, die mit Chymostatin in einer Weise gehemmt
werden kann, die der der caseinolytischen 25 kD-Hauptkomponente ähnelt (vgl.
Beispiel 3). Bei höherer
Konzentration der moabs TE4b und TE9b (Ergebnisse nicht gezeigt)
konnte man sehen, daß auch
diese kleinere Komponente auf Immunblots mit den Antikörpern reagierte. Ähnliche
Ergebnisse (nicht gezeigt) wurden mit einem polyclonalen, gegen
die Coomassie-positive Hauptkomponente hervorgerufenen Kaninchenantikörper erhalten,
der durch vorbereitende Elektrophorese gereinigt worden war. Die
genaue Verwandtschaft zwischen den zwei Proteinen mit SCCE-artiger
Aktivität
und anscheinender immunologischer Kreuzreaktion ist nicht bekannt.
-
5.2. SCCE-spezifische
polyclonale Antikörper
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5.2.1. Hühner-anti-SCCE
-
45 μg SCCE, die durch SBTI-Affinitätschromatographie
wie im Beispiel 4.1 beschrieben gereinigt worden waren, in 0,2 ml
0,1 M Tris-HCl, wurden 60 Minuten lang bei 60°C hitze denaturiert und in einem
gleichen Volumen Freund'schem
vollständigem
Adjuvans (Difco Laboratories) homogenisiert. Die erhaltene Emulsion wurde
Derco-Hühnchen,
etwa 20 Wochen alt, subcutan injiziert, von denen eine Blutprobe
zur Herstellung von Präimmunserum
genommen worden war. Nach 3, 5 und 7 Wochen erhielten die Hühner weitere
subcutane Injektionen von Emulsionen, die wie vorstehend beschrieben,
jedoch mit Freund'schem
unvollständigem
Adjuvans und 30 μg
gereinigtem, hitzedenaturiertem SCCE (Gesamtvolumen jeder Emulsion
250 μl)
hergestellt waren. 2 Wochen nach der letzten Injektion wurde den
Hühnern
Blut abgenommen. Das Blut wurde sofort mit 2 Volumina Alsever'scher Lösung (auf
100 ml: 1,87 g Glucose, 0,8 g Natriumcitrat, 0,62 g Natriumchlorid,
Zitronensäure
bis pH 6.1) vermischt und zentrifugiert. Das Hühner-anti-SCCE, das für weitere
Untersuchungen gewählt
wurde, wurde in der Verdünnung
1/2000 bei Versuchen mit Immunblotting verwendet. Vgl. 17, Beispiel 8 zu einer
Illustration der Spezifität
des Antiserums.
-
5.2.2. Kaninchen-anti-SCCE
-
Durch SBTI-Affinitätschromatographie
gereinigtes SCCE wurde wie in Beispiel 4.1 beschrieben auf 15 mm
dicken Gelen gemäß Laemmli,
1970, SDS-PAGE ohne Reduktion unterworfen. Die Hauptproteinbande, von
der vorhin gezeigt wurde, daß sie
SCCE war, wurde mit dem Kupferchlorid-Färbungsverfahren nach Lee et
al., 1987 sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Nach Entfernung des
Kupferchlorids mit EDTA gemäß Lee et
al. wurden die Gelscheiben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert.
Proben homogenisierter Gelscheiben wurden in gleichen Volumina von
Freund'schem Adjuvans
suspendiert. Etwa 30 μg
reines SCCE, die auf diese Weise in vollständigem Adjuvans hergestellt
wurden, wurden einem Kaninchen subcutan verabreicht. Nach 3, 5 und
7 Wochen wurde die Injektion mit der gleichen Menge SCCE aber mit
unvollständigem Adjuvans
wiederholt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde dem Kaninchen
Blut abgenommen.
-
Das so erhaltene Kaninchen-anti-SCCE
(D-5) wurde in der Verdünnung
1/500–1/1000
in Immunblot-Versuchen mit Alkaliphosphatase-konjugierten anti-Kaninchen-Immunglobulinen
als zweiter Antikörper benützt.
-
Bei allen Immunblotting-Versuchen
wurden gebundene zweite Antikörper
gemäß Blake
et al., 1984 festgestellt (bezieht sich auf Beispiele 5, 8 und 9).
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Der Kaninchen-anti-SCCE Bo-1 wurde
in der gleichen Weise, aber mit SCCE, das vor der SDS-PAGE als Antigen
reduziert worden war, hergestellt.
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5.3. Immunhistochemische
Studien mit den monoclonalen Antikörpern
-
In immunhistochemischen Studien mit
SCCE-spezifischen monoclonalen Antikörpern, konnte SCCE in hohen
suprabasalen Zellen der menschlichen keratinisierenden schuppigen
Epithelien (Epidermis, innere Wurzelschicht der Haarfollikel, harter
Gaumen) festgestellt werden, nicht jedoch in den nichtkeratinisierenden schuppigen
Epithelien (innere Wurzelschicht der Haarfollikel, Lippen- und Mundschleimhäute). Somit
könnte SCCE
spezifisch in keratinisierenden schuppigen Epithelien exprimiert
werden. SCCE-Expression wurde weiterhin in hohen suprabasalen Zellen
der menschlichen Epidermis gefunden, die in vitro rekonstruiert
worden waren und an der Luft-Wasser-Grenzfläche gezüchtet wurden. Wenn dem Medium
Retinolsäure
in einer Konzentration hinzugefügt
wurde, die die Keratinocytenvermehrung stimulierte aber die Bildung
eines Stratum corneum hemmte, wurde SCCE nicht mehr exprimiert.
Dies legt die Annahme nahe, daß die
SCCE-Expression Teil des epidermalen Differenzierungsprogramms sein
könnte.
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Die Ergebnisse der immunelektromikroskopischen
Versuche mit SCCE-spezifischen monoclonalen Antikörpern sind
mit einer Rolle von SCCE bei der desmosomalen Degradation und somit
bei der Desquamation kompatibel. Die Antikörper markierten spezifisch
die Lamellarkörperchen,
die die Sekretion in den interzellulären Raum zwischen den obersten
granulären
Zellen und den untersten Stratum corneum-Zellen durchmachten, wogegen
die Antikörper
im Stratum corneum Epitope erkannten, die eng mit den Desmosomen
im extrazellulären
Raum assoziiert waren.
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BEISPIEL 6
-
Clonierung und Sequenzierung
der menschliches SCCE codierenden cDNA
-
Restriktionsenzyme wurden von Promega,
Madison, MI, und TAQ-Polymerase von Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT bezogen. Eine
menschliche λgt11-Keratinocyten-cDNA-Bank,
die aus von adulten menschlichen Keratinocyten epidermalen Ursprungs
abgeleiteter mRNA her gestellt war, wurde von Clontech, Laboratories
Palo Alto, CA bezogen (Katalog-Nr. HL 1045 b). Zuerst wurde die
Bank mit den polyclonalen anti-SCCE-Seren von Kaninchen D-5 und
Bo-1 (vgl. Beispiel 5.2.2) abgesucht. Da das polyclonale anti-SCCE-Serum Bo-1
hohe Hintergrundsignale ergab, wurde es zu einem frühen Zeitpunkt
von der ausgedehnten Durchsuchungsstudie ausgeschlossen. Mit dem
D-S-Antiserum wurde eine Anzahl immunreaktiver Plaques angereichert,
wie dies für
tatsächlich
positive Plaques erwartet worden war. Bei keiner der Plaques wurde
eine Reaktivität
mit den monoclonalen Antikörpern
moAb4 und moAb9 beobachtet. Eine ausgedehnte Restriktionsenzymcharakterisierung
und PCR-Charakterisierung von elf isolierten Plaques ergab, daß zwischen
den verschiedenen Plaques keine Ähnlichkeiten
festgestellt werden konnten. Das Vorhandensein solcher teilweiser Ähnlichkeiten
zeigt an, daß die
Plaques homologe DNA-Inserts von der selben cDNA-Sequenz enthalten.
Aufgrund des gescheiterten Versuchs, einen „Fingerabdruck" einer wahrscheinlichen
SCCEcDNA-Sequenz zu definieren, wurde die Strategie abgeändert.
-
Die Plaques wurden in E. coli Y 1090
(Clontech) durch Plaquehybridisierung abgesucht, wobei ein degeneriertes
synthetisches Oligonucleotid als Sonde benützt wurde. Die Oligonucleotidsonde
war auf der Basis der experimentell bestimmten aminoterminalen Sequenz
des nativen SCCE-Enzyms wie in Beispiel 4.2. beschrieben entwickelt.
Der verläßlichste
Teil der Aminosäuresequenz,
Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro (SEQ ID NR: 3, As 1–As 6) wurde zur Konstruktion
einer synthetischen 17-mer Oligonucleotidsonde 5'-ATHATHGAYGGNGCNCC-3' (H = A oder C oder T; Y = C oder T;
N = A oder C oder G oder T) ausgewählt, die SYM3067 benannt wurde,
SEQ ID NR: 4. Die Oligonucleotidsonde wurde mit Hilfe eines Beckman
200A-DNA-Synthetisierers mit dem Phosphoramiditverfahren nach den
Anleitungen des Verkäufers
synthetisiert.
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E. coli Y 1090-Bakterien wurden über Nacht
in LB-Medium (Sambrook et al., 1989) mit 0,2% Maltose und 10 mM
MgSO4 gezüchtet. 0,4 ml der Kultur wurden
dann mit verdünntem
Vorrat von Phagenbank vermischt und 20 Minuten lang bei 37°C adsorbiert.
Die infizierte Kultur wurde mit 6 ml Weichagarose (0,75% Agarose
in LB und 10 mM MgSO4) vermischt. Das Weichagarosegemisch
wurde in zehn 150 mm-LA-Schalen gegossen. Die Schalen wurden 5 Stunden
lang bei 37°C
inkubiert und bei 4°C über Nacht
gelagert. Insgesamt enthielten die Schalen etwa 4 × 105 Plaques.
-
Zur Immobilisierung der Plaques wurde
jede Schale zwei Minuten lang mit NEN DuPont ColonylPlaque Screen
Membranen (DuPont, Wilmington, DE) abgedeckt. Die Membranen wurden
2 mal 2 Minuten mit 0,5 M NaOH, 2 mal zwei Minuten mit Tris-HCl,
pH 7.5 durchtränkt
und an der Luft trocknen gelassen. Diese Membranen wurden dann für einen
Hybridisierungsversuch wie nachstehend beschrieben verwendet. Die
Membranen wurden in 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS-Lösung mit
100 mg/ml denaturierter Heringsperma-DNA (Sigma, St. Louis, MO)
5 Stunden lang bei 65°C
vorhybridisiert. Die Sonde, SYM-3067, wurde unter Verwendung von
T4-Polynucleotidkinase (Promega, Madison, WI) [λ-32P]
dATP-markiert und zum Vorhybridisierungsgemisch hinzugefügt. Die
Hybridisierung wurde 12–18
Stunden bei 42°C
ausgeführt.
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Nach der Hybridisierung wurden die
Membranen viermal 5 Minuten in 2 × SSC bei Raumtemperatur, 1%
SDS bei 42°C
und schließlich
in 0,1 SSC 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gewaschen. Die Membranen
wurden auf Röntgenfilm
(Hyperfilm-MP, Amersham, UK) autoradiographiert. Im ersten Suchdurchgang wurden
vierzehn positive Plaques festgestellt. Diese positiven Plaques
wurden mit der gleichen Sonde und mit den gleichen Verfahren wie
vorstehend beschrieben erneut abgesucht. Nach dem erneuten Absuchen
wurden zwei positive Plaques festgestellt. Die zwei ausgewählten Plaques
wurden eine weitere Zeitlang gereinigt, und die Größe der Inserts
wurde durch PCR bestimmt, wobei SYM 1600 und SYM 1601 als Primer
und isolierte Phagen als Matrizen verwendet wurden. Diese beiden
Primer sind komplementär
zu dem linken beziehungsweise rechten Arm des Phagen λgt 11. Das
aus dem Phagen A 6.2.2 generierte amplifizierte DNA-Fragment von
etwa 0,9 kb wurde dann mit EcoRI verdaut und in EcoRI-verdauten
pUC19 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pS496, cloniert. Dieses clonierte
Fragment wurde einer teilweisen Sequenzanalyse unter Verwendung von
zu pUC19 komplementären
Primern unterworfen. Die Nucleotidsequenz wurde mit Hilfe des T7-Sequenzierungskits
(Pharmacia, Uppsala, Schweden, oder USB, Cleveland, Ohio) bestimmt.
-
Die Übersetzung der erhaltenen DNA-Sequenz
ergab eine Aminosäuresequenz,
die zu der der experimentell bestimmten Proteinsequenz homolog war.
Jedoch fehlte der Sequenz ein Übersetzungs-Startcodon. Um
eine cDNA von voller Länge
zu isolieren, wurde das erhaltene DNA-Fragment auf Agarosegel getrennt
und als Sonde benützt,
die die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen erlaubte. Diese
Sonde wurde mit Hilfe des multiprime DNA-Markierungssystems (Amersham, UK) durch
folgendes Verfahren 32P-markiert: Es wurde Wasser
im Verhältnis
von 3 ml pro Gramm Gel hinzugefügt
und das Ganze sieben Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gestellt,
um das Gel zu schmelzen und die DNA zu denaturieren. Das Röhrchen kam dann
für mindestens
10 Minuten in ein Wasserbad von 37°C. Ein Volumen DNA/Agarose-Lösung, das
ungefähr
25 ng DNA enthielt, wurde gemäß den Anleitungen
des Lieferanten zur Markierungsreaktion hinzugefügt.
-
Um eine cDNA von voller Länge zu erhalten,
wurde die cDNA-Bank mit dieser Sonde zweimal erneut abgesucht, wobei
die gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben angewandt wurden,
außer
daß die
Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bei 65°C stattfand.
Diese Versuche führten
zur Bestimmung und Isolierung von 45 einzelnen positiven Plaques,
die anfänglich
durch PCR-Analyse abgesucht wurden, wobei SYM 1600 (5'-GTG GCG ACG ACT
CCT GGA GCC-3';
SEQ ID NR: 5) oder SYM 1601 (5'-ACA
CCA GAC CAA CTG GTA ATG-3';
SEQ ID NR: 6) in Kombination mit SYM 3208 als PCR-Primer zur Bestimmung
einer Plaque eingesetzt wurden, die den ganzen 5' offenen Leserahmen enthält. SYM
3208, 5'-TGGGTGGGAGCCTCTTGCACA-3'; SEQ ID NR: 7; der
dem 5'-Teil der
SCCE-cDNA zumindest teilweise komplementär ist, wurde auf der Basis
der von pS496 gewonnenen DNA-Sequenzinformation entworfen. Nach
diesem Absuchen wurden vier Phagen zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Für die Sequenzanalyse
wurden die so erhaltenen amplifizierten PCR-Fragmente, die von diesen
Phagen abgeleitet waren, wie vorstehend beschrieben in pUC19 cloniert.
Die Ergebnisse zeigten, daß einer
der Phagen, 205.2.1, ein Insert von voller Länge enthielt.
-
DNA aus dem Phagenisolat 205.2.1
wurde gemäß Sambrook
et al., 1989 präpariert,
und das DNA-Präparat
wurde mit EcoRI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Agarose-Elektrophorese getrennt, und
ein Fragment von etwa 1 kb wurde isoliert und in EcoRIverdauten
pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pS500 bezeichnet
(15). Die komplette
Nucleotidsequenz des cDNA-Fragments wurde wie vorstehend beschrieben
bestimmt. Als Primer für
die Sequenzierungsreaktionen wurden spezifische, zu den pUC19- oder SCCE-Sequenzen
komplementäre
Oligonucleotide verwendet. Die Nucleotidsequenzen (SEQ ID NR: 1)
enthielten einen offenen Leserahmen, der zur Codierung der gesamten
Aminosäuresequenz
eines SCCE-Vorläuferproteins
von 253 Aminosäuren,
einschließlich
eines Signalpeptids und eines Präpolypeptids
ausreicht (SEQ ID NR: 2).
-
Ein anderer Phage, der als 106.1.2.
bezeichnet wurde, enthielt eine SCCE-cDNA-Sequenz, der die 5'-nichtübersetzte
Sequenz und die ersten drei Codons fehlten. Dieses Insert wurde
als 954 bp-EcoRI-Fragment isoliert und in EcoRI-linearisierten pUC19
cloniert, wodurch man das Plasmid pS498 erhielt. Dieses Plasmid
wurde teilweise sequenziert.
-
Ein dritter, als 108.1.2 bezeichneter
Phage enthielt eine SCCE-cDNA-Sequenz, der ebenfalls die 5'-nichtübersetzte
Sequenz und sieben Nucleotide der übersetzten Region fehlten.
Dieses cDNA-Insert hat eine?? längere
Variante der 3'-nichtübersetzten
Region, die sich 1057 bp stromabwärts des Stoppcodons erstreckt.
Dieses 1884 bp-EcoRI-Fragment wurde isoliert und in EcoRI-linearisierten
pUC19 cloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde komplett sequenziert
und als pS501 bezeichnet.
-
BEISPIEL 7
-
Feststellung von SCCE-mRNA
in menschlicher Epidermis
-
Präparation der Gesamt-RNA aus
menschlicher Epidermis
-
Diese wurde gemäß Chomczynski und Sacchi, 1987
ausgeführt.
Durch plastische Chirurgie wurde krankheitsfreie menschliche Abdominalhaut
gewonnen. Sie wurde sofort nach dem Abnehmen auf Eis gekühlt. Innerhalb
von weniger als 15 Minuten wurde die Epidermis durch kräftiges Abschaben
mit einem Skalpell gewonnen, in Lösung D (Chomczynski und Sacchi,
1987) getaucht und mit einem Glas-Homogenisierer homogenisiert.
Dann wurde das von Chomczynski und Sacchi beschriebene Verfahren
befolgt. Die präzipitierte
Gesamt-RNA wurde bis zur weiteren Analyse bei – 20°C in 70% Ethanol gelagert.
-
Präparation
der Messenger-RNA
-
Fünfhundert
Mikrogramm der gesamten Epidermis-RNA wurden mit dem Poly A Tract-Kit
(Promega) gemäß den Anleitungen
des Lieferanten verarbeitet.
-
RNA-Elektrophorese
und Blotting
-
Die Agarosegele (1,4%) wurden mit
0,66 M Formaldehyd in 1 × MOPS-Puffer
und 0,6 g/ml Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO) präpariert.
Es wurde mRNA entsprechend 100 μg
Gesamt-RNA in RNA-Probenpuffer (50% Formamid, 2,2 M Formaldehyd,
3% Ficoll, 1 × MOPS)
aufgelöst
und vor dem Auftragen 5 Minuten lang bei 60°C erhitzt. Die RNA-Marker (BRL, Gaithersburg,
MD) wurden ähnlich
behandelt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele 5 Minuten lang
in destilliertem Wasser getränkt;
es folgten 30 Minuten in 50 mM NaOH und 30 Minuten in 0,1 M Tris-HCl,
pH 7.5. Das Blotting auf GeneScreen Plus-Membranen (NEN DuPont,
Wilmington, DE) wurde mit der Vacu-Gene-Ausrüstung (Pharmacia, Uppsala,
Schweden) 1 Stunde lang in 10 × SCC
ausgeführt.
Dann wurden die Membranen in 3 × SCC
gewaschen, über
Nacht getrocknet und 2 Stunden bei 80°C gebacken. Die RNA auf den
Membranen wurde unter UV-Licht sichtbar gemacht.
-
cDNA-Sonden
-
Das wie in Beispiel 6 beschrieben
hergestellte Plasmid pS501 wurde mit HincII und BglII verdaut. Diese
cDNA enthält
eine HincII-Stelle bei bp Nr. 1060 und eine BglII-Stelle bei bp
Nr. 1715. Das 1070-bp-Fragment (HincII-Stelle in Mehrfachclonierungsstelle
von pUC19 – endogene
HincII-Stelle) enthält
die SCCE-codierende Region mit der Ausnahme von 7 bp am 5'-Ende und einer nichtübersetzten
Region einschließlich
der Polyadenylierungsstelle bei bp 944 bis 951, die allen SCCE-cDNAs,
die isoliert wurden, gemeinsam ist. Das 655 bp-HincII-BglII-Fragment, das den Poly
A-Schwanz nicht enthält,
kommt einzig bei der SCCEcDNA 108-1-2 vor. Die Fragmente wurden
durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und zur Herstellung von 32PdCTP-markierten Sonden mit dem Multiprime
DNA-Markierungskit (Amersham, Buckinghamshire, UK) verwendet.
-
Hybridisierung
-
Die Membranen wurden 30 Minuten lang
in 1% SDS in 1 × TE
gekocht und bei 60°C
in 1% SDS, 1 M NaCl, 10% Dextransulfat, Heringsperma-DNS 0,1 mg/ml
3 Stunden lang vorhybridisiert. Die Hybridisierung geschah in der
gleichen Lösung
bei 60°C über Nacht.
Gewaschen wurden 2 × 30
Minuten bei 60°C
in 1% SDS in 2 × SCC
und 3 Stunden in 0,1 × SCC
bei Raumtemperatur. Dann wurden die Membranen der Autoradiographie
unterworfen.
-
Ergebnisse: Es konnte das Vorhandensein
von zwei mRNA-Spezies mit Größen um die
1,2 kb bzw. 2,0 kb in menschlicher Epidermis demonstriert werden
(16). Dies ist in guter Übereinstimmung
mit den aus den Clonierungsversuchen erhaltenen Hinweisen, bei denen
zwei Typen von cDNAs gefunden wurden.
-
BEISPIEL 8
-
Expression rekombinanten
SCCE in E. coli
-
Konstruktion des Plasmids
pGEX-2T/SCCE-Plasmide
-
1. Sinn-PCR-Primer
-
- 1.a CGTGGATCCATCGAAGGTCGTATTATTGATGGCGCCCCATGT
(SYM 3367; SEQ ID NR: 8), unterstrichener 3'-Teil codiert die N-terminalen Aminosäuren IIDGAPC
von aktivem nativem SCCE, 5'-Teil
mit BamHI-Stelle und einer zusätzlichen
Sequenz codiert die Faktor Xa-Stelle IEGR.
- 1.b CGTGGATCCATCGAAGGTCGTTTGGAAACTGCAGGAGAAGAA (SYM 3368; SEQ
ID NR: 9), unterstrichener 3'-Teil
entspricht dem Basenpaaren 76–96
in der vollständigen
SCCE-cDNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz LETAGEE codiert,
5'-Teil wie in 1a.
-
2. Gegensinn-PCR-Primer
-
TGATCCTCTGAGCTCTCCTG (SYM 3371; komplementär zu den
Basenpaaren 285–304
in der vollständigen
SCCE-cDNA-Sequenz, SEQ ID NR: 1, mit der SacI-Stelle bei bp 294.
-
Eine Sequenz von pS498 (Beispiel
6) wurde mit den Primern 1a/2 und 1b/2 PCR-amplifiziert. Die erhaltenen
Produkte wurden durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt,
mit BamHI/SacI verdaut und durch Agarose-Elektrophorese gereinigt.
Sie wurden dann zusammen mit den 3' 673 Basenpaaren von SCCE 106-1-2, die
durch Verdauung von pS489 mit SacI und EcoRI erhalten worden waren,
in TG2-Zellen in pGEX-2T (Pharmacia) cloniert, der mit BamHI/EcoRI
verdaut worden war. Aus den für
Expressionsversuche verwendeten bakteriellen Clones wurden Plasmide
isoliert (pS510, das den nativen N-terminus neben der Faktor Xa-Stelle
codiert, und pS511, das das vorgeschlagene Propeptid neben der Faktor
Xa-Stelle codiert),
und die den aus PCR-Produkten abgeleiteten Inserts entsprechenden
Nucleotidsequenzen wurden mit dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren
unter Verwendung eines T7-Sequenzierungskits (Pharmacia, Uppsala, Schweden) überprüft.
-
Expressionsstudien
-
Übernacht-Kulturen
von TG2-Zellen mit pS510 und pS511 in LB-Medium mit 50 μg/ml Carbenicillin (Sigma,
St. Louis, MO) wurden in frischem Medium zehnfach verdünnt und
3 Stunden lang bei 37°C
gezüchtet. Es
wurde IPTG (Sigma, St. Louis, MO) bis zu einer Endkonzentration
von 0,1 mM hinzugefügt
und die Kulturen wurden weitere 3 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Bakterielle
Präzipitate
wurden in PBS 1% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) ultraschallzertrümmert. Nach
15-minütiger
Zentrifugierung bei 10000 × g
wurden die Überstände und
Niederschläge
mit SDS-PAGE und Immunblotting mit einem polyclonalen SCCE-spezifischen Antiserum
von Hühnern
untersucht.
-
In den in PBS-Triton X-100 unlöslichen
Niederschlägen
wurden große
Mengen von IPTGinduzierbaren Proteinen mit Mr von etwa 50 kD (pS510)
und 52 kD (pS511) mit SCCEartiger Immunreaktivität gefunden (vgl. 17).
-
Die Überstände nach Ultraschallzertrümmerung
in PBS-Triton X-100 enthielten GST/SCCE-Fusionsproteine von der gleichen Größe wie die
unlöslichen
Niederschläge,
doch die Mengen waren im Vergleich zu jenen der unlöslichen
Niederschläge
gering.
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist,
SCCE als ein Fusionsprotein mit GST herzustellen, und daß Sequenzen,
die den spezifischen Protease-Spaltungsstellen in der Prä-pro-SCCE-Aminosäuresequenz entsprechen,
es ermöglichen
werden, diesen Versuch mit dem Ziel zu wiederholen, rekombinantes
SCCE in Bakterien zu erzeugen. Das erzeugte Protein kann in Harnstoff
oder Guanidinhydrochlorid solubilisiert und dann wegen des hohen
isoelektrischen Punkts von SCCE durch Kationenaustauschchromatographie
gereinigt werden. Das gereinigte Protein kann durch Dialyse gegen
Puffer mit niedrigerer Konzentration von denaturierenden Mitteln
renaturiert und dann mit Faktor Xa gespaltet werden, um das GST-Polypeptid
aus SCCE oder Pro-SCCE freizusetzen. Die GST/SCCE-Fusionsproteine
werden auch als Immunogene zur Herstellung von SCCE-spezifischen
Antikörpern
und als Immunsorbentien bei der Antikörperreinigung verwendet werden.
-
BEISPIEL 9
-
Expression
von rekombinantem menschlichem SCCE in Säugerzellen
-
Um einen Expressionsvektor für die Herstellung
von rekombinantem SCCE zu generieren, wurden menschliche cDNA-Sequenzen
aus dem Plasmid pS500 als 897 bp-EcoRI/DraI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde
in EcoRI- und SmaI-verdautes pUC19 subcloniert, wodurch man pS502
erhielt. Das Plasmid pS502 wurde dann mit EcoRI und SalI verdaut,
um die SCCE-cDNA-Sequenzen als ein 0,9 kb-Fragment zu isolieren,
das seinerseits in eine pUC19-Variante, der die HindIII-Stelle fehlt,
subcloniert wurde, wodurch man das Plasmid pS503 erhielt. Diese
pUC 19-Variante wurde durch Verdauung von pUC 19 mit HindIII, Auffüllen mittels
Klenow-Enzym und Religierung generiert. Um das Clonieren in einen
Expressionsvektor zu erleichtern, wurde eine HindIII-Stelle in das
5'-Ende der SCCE-cDNA
eingebaut. Dies geschah durch Verdauung von pS503 mit EcoRI und
Insertion eines Linkers, der die Stelle in HindIII, SYM3603, 5'-AATTGTGGAAGCTTCCAC-3', SEQ ID NR: 10 konvertiert.
Das so erhaltene Plasmid, das den proteincodierenden Teil der SCCE-cDNA
mit einer HindIII-Stelle am 5'-Ende
bzw. einer SalI-Stelle am 3'-Ende
enthält,
wurde als pS505 bezeichnet.
-
Der endgültige Expressionsvektor wurde
durch Ligierung von drei verschiedenen DNA-Fragmenten erhalten.
Erstens wurde pS505 mit HindIII und SalI verdaut und ein 0,9 kb-Fragment
isoliert.
-
Zweitens wurde, um den distalen Teil
des stromaufwärts
gelegenen regulatorischen Elements des murinen Metallthioneins zur
Verfügung
zu stellen, die Rinderpapillomvirussequenzen, die genomischen Betaglobinfragmente
des Kaninchens, die mRNA-verarbeitende Signale liefern, und die
Plasmidsequenzen pML2d, die Selektion und Replikation in E. coli
erlauben (Waldenström
et al., 1992), der Vektor pS 147 mit SacI und SalI verdaut und ein
Fragment von etwa 12 kb isoliert.
-
Drittens wurde, um den proximalen
Teil des murinen Metallthioneinpromotors zu isolieren, das Plasmid pS42,
bei dem die in der Leadersequenz gelegene native BglII- in eine
HindIII-Stelle umgewandelt
worden ist, mit SacI und HindIII verdaut und ein Fragment von ungefähr 220 bp
isoliert.
-
Die Ligierung dieser drei Fragmente
ergab den SCCE-Expressionsvektor pS507 (vgl. 18).
-
Der Expressionsvektor pS507 wurde
mit einem Vektor, der ein vom 5'-Long
Terminal Repeat des Harvey-Sarkomvirus gesteueres Neomycin-Resistenzgen
und SV40-Polyadelylierungssignale (Lusky und Botchan, 1984) enthielt,
in murine C127-Zellen co-transfiziert (ATCC CRL 1616). Die Transfektionsversuche wurden
nach dem Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren
(Graham und Van der Eb, 1973) ausgeführt. Die Zellen wurden in Ham's F12/Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) (1 : 1), das mit 10% fötalem Kälberserum (HyClone, Logan,
UT) angereichert war, gezüchtet.
Die neomycinresistenten Zellclone wurden mit 1,5 mg/ml G418 (Gibco
BRL) selektiert, und nach 10–15
Tagen der Selektion wurden die resistenten Clone bestimmt und von
den Ursprungsschalen isoliert und weiterer Analyse zugeführt.
-
Um die Expression der rekombinanten
SCCE-Gene zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus den isolierten
Zellinien präpariert.
Die Gesamt-RNA wurde aus C127-Zellen präpariert und auf 1% Formaldehyd-Agarosegel
separiert, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einer 32P-markierten SCCE-Sonde hybridisiert. Die
Sonde war das 1070 bp-HincII-Fragment
der SCCE-DNA, das durch HincII-Verdauung von pS500 und Agaroseelektrophorese
erhalten wurde. Bei den Versuchen wurde nach Ausubel et al., 1992
vorgegangen. Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit 32P-markierter SCCE-cDNA zeigten, daß rekombinante
SCCE-inRNA in mehreren Zellinien, die den SCCE-Vektor pS507 enthielten,
feststellbar war. Bei den Kontrollproben, die aus C127-Zellinien
abgeleitet waren, die einen außer
hinsichtlich der SCCE-cDNA identischen Vektor enthielten, wurde
keine Hybridisierung gefunden (19).
Die Größe 1,4 kB
entspricht der erwarteten Größe.
-
Es wurden Proben von konditioniertem
Zellkulturmedium genommen und durch Immunblotting analysiert. Die
SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli
(1970) ausgeführt,
und für
das Immiunblotting wurde anti-natives SCCE von Hühnern als feststellender Antikörper benützt.
-
Ein Alkaliphosphatase-markiertes
anti-Hühner-IgG
(Sigma, St. Louis, MO) wurde zur Enzymmarkierung benützt. Die
Ergebnisse werden in 20 gezeigt.
-
Um die Expression des rekombinanten
SCCE zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus C127-Zellen, die mit
dem Expressionsvektor pS507 transfiziert waren, präpariert.
Als Kontrollproben wurde die Gesamt-RNA sowohl aus transfizierten
C127-Zellen als auch aus mit dem Expressionsvektor pS147 transfizierten C127-Zellen
präpariert.
Der Vektor pS147 ähnelt
pS507, außer
daß er
die cDNA für
menschliche gallensalzstimulierte Lipase (Nilsson et al., 1990)
anstatt der menschlichen SCCE-cDNA enthält. Die RNA wurde nach Ausubel
et al. (1992) präpariert.
Northern Blot-Versuche und die Hybridisierung mit 32P-markierter
SCCEcDNA zeigten, daß in
den C127-Zellen, die den SCCE-Vektor, pS507 enthielten, rekombinante
SCCE-mRNA von etwa 1,4 kb feststellbar war (19). Bei den Kontrollproben, die aus
C127-Zellinien abgeleitet waren, die pS147 enthielten, oder in nichttransfizierten
C127-Zellen wurde keine Hybridisierung gefunden. Die Länge der rekombinanten
SCCE-mRNA war wie erwartet.
-
Es wurden Proben von konditioniertem
Zellkulturmedium genommen und durch SDS-PAGE und Immunblotting analysiert.
Der Blot wurde wie bei Blake et al., 1984 beschrieben entwikkelt.
Die erhaltenen Resultate (vgl. 20)
zeigen, daß C127-Zellen,
die pS507 enthalten, drei Proteine erzeugen, die eine Reaktion mit
allen verfügbaren
polyclonalen Kaninchen- und Hühner-SCCE-Antikörpern, sowie
mit den wie in Beispiel 5 hergestellten monoclonalen anti-SCCE zeigen. Die
rekombinanten SCCE-reaktiven Proteine zeigen ein scheinbares Molekulargewicht,
das etwa 1 kDa größer als
gereinigtes, natives menschliches SCCE ist. Das rekombinante Protein
zeigt keinerlei proteolytische Aktivität. Durch Vergleich der abgeleiteten
SCCE-Aminosäuresequenz
mit dem experimentell bestimmten NH-2-Ende von nativem menschlichem
SCCE und mit Sequenzen andere chymotrypsinartiger Proteasen kann
geschlossen werden, daß das
in C127-Zellen hergestellte rekombinante SCCE in seiner Proenzymform
ist. Die Sequenzdaten deuten darauf hin, daß dieses Proenzym durch proteolytische
Spaltung an der C-terminalen Seite des Lysins in der Sequenz ...AQGDKIIGAP...
aktiviert werden kann; die unterstrichene Sequenz ist die NH-2-Sequenz
von nativem menschlichem SCCE (SEQ ID NR: 2, As 5–As 6).
-
BEISPIEL 10
-
Reinigung und Charakterisierung
von rekombinantem SCCE
-
Reinigung
-
1,3 mg des gegen natives SCCE gerichteten
monoclonalen Antikörpers
TE4b wurde an 1,5 ml von CNBr-aktivierter Sepharose (Pharmacia-LKB
Biotech, Uppsala, Schweden) gekoppelt, wobei das vom Hersteller beschriebene
Verfahren angewandt wurde. 40 ml SCCE-haltiges Medium wurden durch
ein 0,45 μm-Filter
filtriert und dann auf die Säule
aufgebracht. Die Säule
wurde mehrere Male mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7.2
gewaschen und dann mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 2.5 eluiert. Das eluierte
Protein wurde sofort durch Hinzufügen von 0,1 Volumen 1 M Tris-HCl,
pH 8.0 neutralisiert.
-
Aktivierung
-
Das rekombinante SCCE (4,6 μg in 200 μl), das mit
dem Gel mit dem gekoppelten monoclonalen Antikörper (vgl. vorstehend) gereinigt
worden war, wurde mit 4,6 μl
0,1 mg/ml Trypsin (Massenverhältnis
10 : 1) bei 37°C
verdaut. Die Proben (50 μl)
wurden nach 20 Minuten, 1 Stunde, 3 Stunden und 20 Stunden herausgenommen,
und es wurden 5 μl
10 μM (4-Amidinophenyl)methan-sulfonyl
(APMSF; Boehringer Mannheim, Deutschland) hinzugefügt, um die
Reaktion zu beenden. Die Aktivität
des gespalteten SCCE wurde durch nichtreduzierende SDS-PAGE auf
Caseingelen wie in Beispiel 2.2 beschrieben getestet. Die Identität der gespalteten
Formen von SCCE wurde durch reduzierende SDS-PAGE und anschließendem Immunblotting
mit anti-nativem SCCE von Hühnern
und anschließend
alkaliphosphatasemarkiertem anti-Hühner IgG und Nitroblau-Tetrazol
und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
als Substrat für
Alkaliphosphatase getestet.
-
N-terminale
Sequenzierung
-
Affinitätsgereinigtes (wie vorstehend
beschrieben) SCCE, ungefähr
35 μg, wurde
mit einer Bio-Dot SP-Einheit (Bio-Rad, Richmond, CA) auf eine Immobilon
-Membran (Millipore, Bedford, MA) slot-geblottet; dann wurde die
Membran mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um alles Tris
und Glycin zu entfernen. Der Teil der Membran, wo das Protein gebunden
war, wurde ausgeschnitten und mit einem Applied Biosystems (Foster
City, CA) 477A Puls-Flüssigphasensequenzierer
mit einem PTH 120 A Online-Analysator sequenziert. Die Sequenzierung
wurde mit regulären
Zyklusprogrammen und Chemikalien des Herstellers ausgeführt. Die
in den ersten sechs Positionen erhaltene Sequenz war glu-glu-ala-gln-gly-asp,
entsprechend den Aminosäuren – 7 bis – 2 aus
SEQ ID NR: 2. Wie aus diesem Ergebnis geschlossen werden kann, besteht
das Signalpeptid aus 22 Aminosäuren,
und basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz von nativem aktivem
SCCE, besteht das Propeptid aus sieben Aminosäuren.
-
Deglykosylierung
-
Gereinigtes rekombinantes SCCE (5 μg) und natives
SCCE (20 μg)
wurden 3 Minuten lang in 20 μl 0,5%
SDS und 0,1 M β-Mercaptoethanol
gekocht. Die Proben wurden mit Natriumphosphatpuffer, pH 8.6 und Nonidet
P-40 bis zu Endkonzentrationen von 0,2 M bzw. 1,25% verdünnt. Es
wurde N-Glycosidase F® (Boehringer Mannheim)
hinzugefügt
(für rekombinantes
Protein 0,6 Einheiten und für
natives Protein 1,2 Enzymeinheiten), und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Die Endkonzentration von SDS im Probentest war 0,17%.
N-Glycosidase F®-behandeltes
SCCE wurde auf 8–18%
SDS-PAGE und anschließendem
Immunblotting wie vorstehend beschrieben analysiert. Die erhaltenen
Ergebnisse zeigten eine Verringerung des scheinbaren Molekulargewicht
der beiden oberen Banden, während
das scheinbare Molekulargewicht der untersten Bande unverändert war
(23). Dies zeigt, daß das in
C127-Zellen hergestellte rekombinante SCCE in zwei N-glykosylierten
Formen und in einer nichtglykosylierten Form existiert. Das Resultat
ist zu dem analog, was bei aktivem nativem SCCE beobachtet werden
kann (23).
-
BEISPIEL 11
-
Zusammensetzungen, die
SCCE umfassen
-
Die Zusammensetzungen können gemäß üblicher
pharmazeutischer Verfahren, einschließlich der gründlichen
Vermischung des Wirkstoffes mit anderen Zutaten hergestellt werden.
Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozente.
-
Zusammensetzungen, die mehr als einen
Wirkstoff enthalten, sind auch innerhalb des Schutzbereiches der
Erfindung. Die folgenden Beispiele sind demnach so aufzufassen,
daß sie
auch mehr als einen Wirkstoff enthalten. In ähnlicher Weise kann der Begriff „SCCE" durch „Pro-SCCE" ersetzt werden.
Zusammensetzungen, die SCCE sowie Pro-SCCE enthalten, sind somit
ebenfalls innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung.
-
SCCE = natives oder rekombinantes
Stratum corneum chymotryptisches Enzym, wahlweise in Verbindung
mit anderen Wirkstoffen
q. s. = quantum satis
Creme Öl/Wasser | % |
SCCE | 0,01–20 |
Polysorbat
80 | 0,5 |
Emulgierendes
Wachs | 5 |
Mineralöl | 4 |
Dimethicon | 1 |
Glycerinstearat | 6 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Glycerin
85% | 4 |
Propylenglykol | 7 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Wasser | 65–76 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, emulgierende Systeme (das
Verhältnis
zwischen der öligen
Phase und der wässrigen
Phase und dem Gehalt an emulgierenden Agentien und anderen relevanten
Excipientien).
Creme
Wasser/Öl | % |
SCCE | 0,01–20 |
Cetylalkohol | 0,5 |
Lanolin | 5 |
Weißes Paraffin | 10 |
Mineralöl | 45 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 1 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Wasser | 15–25 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, emulgierende Systeme (das
Verhältnis
zwischen der öligen
Phase und der wässrigen
Phase und dem Gehalt an emulgierenden Agentien und anderen relevanten
Excipientien).
Salbe | % |
SCCE | 0,01–20 |
Lanolin | 15 |
Paraffin | 58–68 |
Mineralöl | 15 |
Dimeticon | 2 |
Antioxidans | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien.
Liniment | % |
SCCE | 0,01–20 |
Emulgierendes
Wachs | 4 |
Glycerinstearat | 3 |
Mineralöl | 15 |
Polysorbat
80 | 0,6 |
Glycerin
85% | 3 |
Propylenglykol | 5 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Wasser | 59–69 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, emul gierende Systeme (das
Verhältnis
zwischen der öligen
Phase und der wässrigen
Phase und dem Gehalt an emulgierenden Agentien und anderen relevanten
Excipientien).
Gel | % |
SCCE | 0,01–20 |
Triethanolamin | 1–5 |
Ethylalkohol | 10 |
Cetylalkohol | 10 |
Natriumcarboxymethylcellulose | 5 |
EDTA | 0,1. |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Wasser | 59–74 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Gelbildende
Mittel, Antioxidantien, chelierende Mittel, Konservierungsmittel.
Lösung, Wasser | % |
SCCE | 0,01–20 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Cetylalkohol | 4 |
Propylenglykol | 5 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Wasser | 37–89 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, rückfettende Mittel, Feuchtigkeitsspender.
Lösung, Ethylalkohol | % |
SCCE | 0,01–20 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Propylenglykol | 5 |
Cetylalkohol | 3 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Ethylalkohol | 50–95 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Feuchtigkeitsspender.
Suspension | % |
SCCE | 0,01–20 |
Carbomer | 0,5 |
Natriumcarboxymethylcellulose | 0,5 |
Polysorbat
80 | 0,1 |
Propylenglykol | 5 |
Ascorbinsäure | 0,05 |
Cetylalkohol | 4 |
Polysorbat | q.
s. |
EDTA | 0,1. |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Wasser | 72–80 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, suspendierende Mittel.
Paste | % |
SCCE | 0,01–20 |
Paraffin | 45–55 |
Zinkoxid | 40 |
Mineralöl | 5 |
Antioxidans | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
Pastengrundlagen.
Stift | % |
SCCE | 0,01–20 |
Cutina
LM | 70–80 |
Myristylalkohol | 5 |
Rizinusöl | 2 |
Bienenwachs,
weiß | 10 |
Paraffin,
weiß | 3 |
Antioxidans | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
Stiftgrundlagen.
Pumpspray | % |
SCCE | 0,01–20 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Ethylalkohol | 30 |
Glycerin
85% | 5 |
Propylenglykol | 5 |
Cetylalkohol | 3 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Wasser | 22–57 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, rückfettende Mittel, Feuchtigkeitsspender.
Aerosolspray,
Lösung | % |
SCCE | 0,01–20 |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Isopropylmyristat | 3 |
Propylenglykol | 5 |
Ethylalkohol | 48–92 |
Treibmittel | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Rückfettende
Mittel, Feuchtigkeitsspender.
Aerosolspray,
Schaum | % |
SCCE | 0,01–20 |
Wachs | 3 |
Ethylalkohol | 50–55 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Wasser | 20–35 |
Treibmittel | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Treibmittel,
Antioxidantien, chelierende Mittel
Aerosolspray,
Emulsion | % |
SCCE | 0,01–20, |
Cellulosederivate | 1–3 |
Tween® 60 | 1,0 |
Glycerinstearat | 2,5 |
Kaliumsorbat | 0,2 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
pH-regulierendes
Mittel | 0,01–10 |
Wasser | 50–95 |
Treibmittel | q.
s. |
-
Beispiele variabler Faktoren: Antioxidantien,
chelierende Mittel, Konservierungsmittel, emulgierende Systeme (das
Verhältnis
zwischen der öligen
Phase und der wässrigen
Phase und dem Gehalt an emulgierenden Agentien und anderen relevanten
Excipientien).
Shampoo | % |
SCCE | 0,01–20 |
Natriumlaurylsulfat | 40 |
Cetylalkohol | 3 |
Schaummittel
oder Regulierer | 3 |
Natriumchlorid | 2 |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Wasser | 43–53 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Shampoogrundlagen,
Antioxidantien, chelierende Mittel, Konservierungsmittel, Feuchtigkeitsspender,
Regulierer.
Körpershampoo | % |
SCCE | 0,01–20 |
Natriumlaurylsulfat | 40 |
Cetylalkohol | 4 |
Schaummittel
oder Regulierer | 3 |
Perlmittel | 10 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Antioxidans | q.
s. |
EDTA | 0,1 |
Wasser | 40–50 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Shampoogrundlagen,
Antioxidantien, chelierende Mittel, Konservierungsmittel, Zusätze, Regulierer.
Arzneiseife | % |
SCCE | 0,01–20 |
1-Hydroxyethan-1,
1-diphosphorsäure | 0,2 |
Glycerin | 0,8 |
Natriumseife
aus Kokosnußöl und Talg | 88–98 |
Zusätze | 0,7 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Feuchtigkeitsspender,
Seifengrundlagen.
Puder | % |
SCCE | 0,01–20 |
Talkum | 65–70 |
Kaolin | 6 |
Titandioxid | 2 |
Calciumcarbonat | 8 |
Magnesiumstearat | 3 |
Mais-
oder Haferstärke | 5–10 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Pudergrundlagen,
Konservierungsmittel, Massenverhältnisse.
Haarfestiger | % |
SCCE | 0,01–20 |
Cetylalkohol | 2,2 |
Alkyltrimethylammoniumchlorid | 1,25 |
Octyldodecanol | 1 |
Zitronensäure | 1 |
EDTA | 0,1 |
Konservierungsmittel | q.
s. |
Antioxidans | q.
s. |
Wasser | ad
100 |
-
Beispiele variabler Faktoren: Regulierer,
Konservierungsmittel, chelierende Mittel, Antioxidantien.
-
In ähnlicher Weise können topische
Zusammensetzungen zubereitet werden, die einen Wirkstoff umfassen,
der in der Lage ist, die Aktivität
von SCCE zu hemmen oder zu steigern.
-
BEISPIEL 12
-
Desmosomenverdauende
Aktivität
von rekombinantem SCCE
-
Corneocyten, die intakte Desmosomen
enthielten, wurden durch „tape
stripping" bis zu
den tieferen Schichten des Stratum corneum von der Haut abgezogen,
und die Schuppen wurden mit Hexan abgelöst und portionsweise eingetrocknet.
Die Corneocytenportionen (3 mg) wurden mit 1 M Natriumchlorid bei
4°C extrahiert,
um die darin befindlichen Proteasen zu solubilisieren, und dann
ausgiebig mit Inkubationspuffer (0,1 M Tris/HCl, pH 8.0) gewaschen,
um die endogene proteolytische Aktivität aus den Präparaten
zu entfernen. Die Inkubationen wurden in 0,1 M Tris, pH 8.0 mit
oder ohne 10 μg
rekombinantem SCCE 24 Stunden lang bei 37°C ausgeführt. Die desmosomale Verdauung
durch das Enzym wurde nachgewiesen, indem die Spiegel des Desmosomen-Markerproteins
Desmoglein I (DG I) gemessen wurden. Dieses wurde durch Extraktion
in einem 8 M Harnstoff/2% SDS/β-Mercaptoethanol-Puffer
mit anschließender
Reinigung des DG I-Glykoproteins mittels Concanavalin A-Affinitätschromatographie
aus den Hautschuppen isoliert. Das Concanavalin A-Eluat wurde durch
SDS-PAGE fraktioniert und elektrophoretisch für das Immunblotting auf eine
PDVF-Membran übertragen.
DG I wurde mit einem spezifischen Antiserum bestimmt und mit verstärkter Chemolumineszenz
festgestellt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
-
-
Die in Tabelle 4 vorgestellten Ergebnisse
zeigen, daß rekombinantes
SCCE in der Lage ist, intrazelluläre kohäsive Strukturen im Stratum
corneum in einem in vitro-Test zu degradieren.
-
BEISPIEL 13
-
Auswirkung von Inhibitoren
auf die Aktivität
von rekombinantem SCCE
-
Es wurden die Auswirkungen der Inhibitoren
Aprotinin, Chymostatin und Zinksulfat auf die S-2586-hydrolysierende
Aktivität
von rSCCE untersucht. Der Versuchsaufbau war wie in Beispiel 3.2
umrissen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
-
-
Wie in der vorstehenden Tabelle 5
gezeigt, hemmten Aprotinin, Chymostatin und Zinkionen die S-2586-hydrolysierendee
Aktivität
von rekombinantem SCCE in ähnlicher
Weise, wie die des nativen Enzyms.
-
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