DE69534778T2

DE69534778T2 - Cathepsin-02-protease

Info

Publication number: DE69534778T2
Application number: DE69534778T
Authority: DE
Inventors: Dieter San Bruno BRÖMME; Kathleen Mountain View OKAMOTO
Original assignee: Arris Pharmaceutical Corp
Current assignee: Axys Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-10-27
Filing date: 1995-10-26
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-10-27
Also published as: KR100473219B1; HU220960B1; JPH10512740A; FI971777A0; DE69534778D1; NO971875L; JP3670666B2; CA2203765A1; EP0783527A4; NO971875D0; KR970707153A; AU711810B2; CN1170415A; US20030175937A1; AU3968895A; ATE317441T1; FI971777A; NZ296003A; EP0783527A1; CA2203765C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Cathepsin O2-Proteine, Nukleinsäuren und Antikörper.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Cathepsine gehören der Papain-Superfamilie der Cysteinproteasen an. Cystein- oder Thiolproteasen enthalten im katalytischen Zentrum, das für die Proteolyse verantwortlich ist, einen Cysteinrest sowie ein Histidin und ein Asparagin. Diese Superfamilie weist auch ein Glutamin in dem "oxy-anion hole" auf.
Neueste Arbeiten haben Cysteinproteasen mit der Bindung an DNA mit mutmaßlicher Transkriptionsfaktoraktivität (Xu et al., J. Biol. Chem. 269(33):21177–21183 (1994)) sowie als Langzeitimmunsuppressivum (Hamajima et al., Parasite Immunology 16:261 (1994)) in Zusammenhang gebracht.
Bisher ist eine Reihe von Cathepsinen identifiziert und aus einer Reihe von Tieren sequenziert worden. Zum Beispiel ist Cathepsin S aus der Ratte (Petanceska et al., J. Biol. Chem. 267:26038–20643 (1992)), Rind (Wiederanders et al., FEBS Lett. 286:189–192 (1991)) und Menschen kloniert worden (Wiederanders et al., J. Biol. Chem. 267:13708–13713(1992); und Shi et al., J. Biol. Chem. 267:7258–7262 (1992)). Cathepsin L ist aus Menschen, Ratte, Maus und Huhn kloniert worden (Gal et al., Biochem. J., 253:303–306 (1988); Ishidoh et al., FEBS Lett. 223:69–73 (1987); Joseph et al., J. Clin. Invest. 81:1621–1629 (1988); Ritonja et al., FEBS Lett. 283:329–331 (1991)). Cathepsin H ist aus Mensch und Ratte kloniert worden (Fuchs et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369–375 (1988); Fuchs et al., Nucleic Acid Res. 17:9471 (1989); Whittier et al., Nucleic Acid Res. 15:2515–2535 (1987)). Cathepsin B ist aus Mensch und Maus kloniert worden (Ferrara et al., FEBS Lett. 273:195–199 (1990); Chan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7721–7725 (1986)).
Eine Cysteinprotease ist kürzlich aus Kaninchenosteoklasten kloniert worden und ist strukturell mit den Cathepsinen L und S verwandt (Tezuka et al., J. Biol. Chem. 269(2):1106 (1994).
Cathepsine kommen in einer breiten Vielfalt von Geweben natürlich vor. Zum Beispiel kommt Cathepsin L in Geweben vor, die Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Skelettmuskel, Niere, Leber, Hoden und Pankreas umfassen. Cathepsin S kommt im Lungen-, Leber-, Milz- und Skelettmuskel vor.
Cathepsine sind mit einer Vielzahl von Krankheitszuständen in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel werden Enzyme, die den Cathepsinen B und L ähnlich sind, aus Tumoren freigesetzt und können an der Tumormetastase beteiligt sein. Cathepsin L liegt in erkrankter humaner Synovialflüssigkeit und in transformierten Geweben vor. In ähnlicher Weise wurde die Freisetzung von Cathepsin B und anderen lysosomalen Proteasen bei Trauma und Entzündung aus polymorphkernigen Granulozyten und Makrophagen beobachtet. Cathepsine sind mit Arthritis in Zusammenhang gebracht worden. Darüber hinaus kommen Cathepsine in ungewöhnlich hohen Mengen in verschiedenen Tumorzelllinien vor.
Cysteinproteasen sind auch mit Knochenumbau in Zusammenhang gebracht worden. Knochenumbau ist ein Verfahren, bei welchem Knochenaufbau und Knochenabbau miteinander verbunden sind und es stellt einen Bestandteil des Knochenwachstums dar. Knochenabbau umfasst die Demineralisation und den Abbau von extrazellulären Matrixproteinen (Delaissé et al., Biochem. J. 279:167–174 (1991)). Typ I-Kollagen macht fünfundneunzig Prozent der organischen Matrix aus (Krane et al., in Scientific American Medicine (Rubensttein, E. and Federman, D. D., Hrsg. Bd. 3, 15 Rheumatism, XI Bone Formation and Resorption, S. 1–26, Scientific American, Inc. New York). Zusätzlich zu der interstitiellen Kollagenase nimmt man an, dass die lysosomalen Cysteinprotease-Cathepsine B und L am osteoklastischen Knochenabbau beteiligt sind (Delaissé et al., 1991, oben). Beide Enzyme liegen sowohl in den Lysosomen als auch in der angesäuerten extrazellulären Resorptionslakune des Osteoklasten vor (Goto et al., Histochemistry 99, 411–414 (1993)) und beide Proteasen sind in vitro in der Lage, Kollagen Typ I bei saurem pH-Wert abzubauen (Maciewicz et al., Kollagen Rel. Res. 7, 295–304 (1987), Delaissé et al., (1991), oben). Cysteinprotease-Hemmstoffe wie zum Beispiel E-64 und Leupeptin haben gezeigt, dass sie osteoklastischen Knochenabbau verhindern (Delaissé et al., Bone 8, 305–313 (1987), Everts et al., Calcif. Tissue Int. 43, 172–178 (1988)). Cathepsin L wird als eine der wichtigsten Proteasen angesehen, die am Kollagenabbau im Knochen beteiligt sind (Maciewiecz et al., Biochem. J. 256, 433–440 (1988); Kakegawa et al., FEBS Lett. 321, 247–250 (1993)).
Der feste Zustand des Knochenmaterials beruht auf der geringen Löslichkeit von Hydroxyapatit und anderen Calciumphosphat-Knochensalzen bei physiologischem pH-Wert, Knochen kann jedoch bei saurem pH-Wert abgebaut werden.
Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, die beim Knochenabbau eine Schlüsselrolle einnehmen. An der Knochenoberfläche anhaftend erzeugen Osteoklasten in einer fest vorgegebenen Verbindung zwischen der spezialisierten „Border Membran" der Osteoklasten und der Knochenmatrix eine saure Mikroumgebung und dadurch wird die örtlich begrenzte Solubilisierung der Knochenmatrix ermöglicht. Dies wiederum erleichtert die Proteolyse von demineralisiertem Knochenkollagen.
Man nimmt an, dass die kollagenauflösende Wirkung von Cysteinproteasen bevorzugt in dem am stärksten sauren Abschnitt der Knochenresorptionslakune in der Nähe der „Ruffled Border" bei einem pH-Wert von ungefähr 3,5 oder 4,5 ausgeübt wird, wobei die Zn-enthaltenden Kollagenasen in der neutralen Umgebung an der Grenzfläche zwischen der demineralisierten und der mineralisierten Matrix aktiver sind (Delaissé et al., oben, (1991)). Neben den Cathepsinen L und B kann eine Vielfalt von Cathepsin L- und B-artigen Aktivitäten an dem kollagenauflösenden Knochenabbau teilnehmen. Page et al. Biochim. Biophys. Acta 1116, 57–66 (1992) isolierte vielfache Formen von Cathepsin B aus Osteoklastomen. Diese weisen ein saures pH-Optimum und die Fähigkeit auf, lösliches und unlösliches Typ I-Kollagen abzubauen. Delaissé et al., 1991, oben, identifizierte eine 70 kDa Thiol-abhängige Protease im Knochengewebe, welche ebenso in der Lage ist, Typ I-Kollagen abzubauen.
Es ist gezeigt worden, dass Cysteinprotease-Hemmstoffe osteoklastischen Knochenabbau durch Hemmung des Abbaus von Kollagenfasern hemmen. Die Cathepsine B, L, N und S können Typ I-Kollagen bei saurem pH-Wert abbauen. Drei Cathepsin-artige Proteasen, die mutmaßlichen Cathepsine B und L sowie eine Cathepsin L-artige Protease sind aus dem Schädeldach der Maus isoliert worden (Delaissé et al., Biochem. J. 279:167 (1991). Es ist jedoch immer noch unklar, welche Cysteinproteasen tatsächlich von Osteoklasten erzeugt werden.
Kürzlich wurde eine cDNA, die für eine neue humane Cysteinprotease kodiert, unabhängig durch verschiedenen Gruppen kloniert (Shi et al., FEBS Lett. 357, 129–134 (1995), Inaoka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 89–96 (1995); Brömme und Okamoto, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376, 379–384 (1995)) und jeweils als Cathepsin O, Cathepsin K und Cathepsin O2 bezeichnet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von rekombinanten Cathepsinen, Cathepsin O2, bereitzustellen und geeignete Mengen dieser Cathepsin O2-Proteine unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken herzustellen.
Gemäß der vorhergehenden Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein rekombinantes Cathepsinprotein mit einer Polypeptidsequenz bereit, die aus den Aminosäuren 115–329 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz besteht, wobei das rekombinante Cathepsinprotein Cysteinproteaseaktivität aufweist.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein rekombinantes Cathepsinprotein mit einer Polypeptidsequenz bereit, die durch die Nukleotide 484 bis 1128 der in 1 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert wird, wobei das rekombinante Cathepsinprotein Cysteinproteaseaktivität aufweist.
In einem zusätzlichen Aspekt wird ein Cathepsinprotein gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt bereitgestellt, das mit einem heterologen Polypeptid fusioniert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die das Protein des ersten oder zweiten Aspektes umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B veranschaulichen die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR:1) und davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:2) der humanen Cathepsin O2-cDNA. Die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:2) ist unterhalb der Nukleotidsequenz (SEQ ID NR:1) im 1-Buchstaben-Code gezeigt. Die Gruppen im katalytischen Zentrum (C25, H159 und N175; Papainnummerierung) sind durch fett gedruckte Schrift angegeben und die potenzielle N-Glycosylierungsstelle ist einmal unterstrichen. Pfeilspitzen zeigen die mutmaßlichen Posttranslations-Schnittstellen zwischen der Vorsignal- und der Proregion sowie zwischen der Proregion und dem reifen Enzym. Die Spaltung zwischen der Proregion und dem reifen Protein wurde durch Proteinsequenzierung bestätigt (doppelte Unterstreichung).
2A und 2B veranschaulichen das mehrfache Aminosäuresequenz-Alignment von humanem Cathepsin O2 (SEQ ID NR:2) mit den humanen Cathepsinen S (SEQ ID NR:4) und L (SEQ ID NR:5) und OC2 aus Kaninchen (SEQ ID NR:3), wobei * Gruppen im katalytischen Zentrum und fett gedruckte Schrift einen Rest, der in allen bekannten Cysteinproteasen der Papainfamilie konserviert ist, bezeichnet. Aminosäuren, die in allen sechs Proteasen identisch sind, sind in der Konsensussequenz als Großbuchstaben markiert, und Aminosäuren, die in fünf von sechs Aminosäuren identisch sind, sind als Kleinbuchstaben markiert. Lücken sind durch Trennstriche angegeben. Zahlen geben die Position der letzten Aminosäure in jeder Zeile an und Pfeilspitzen zeigen die mutmaßlichen Posttranslations-Schnittstellen.
3 veranschaulicht die Reifung von Procathepsin O2 mit Pepsin. Teilmengen des Kulturüberstandes, der Procathepsin O2 enthält, wurden mit Pepsin (0,4 mg/ml) bei 40 °C in 100 mM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,0, inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von Probenpuffer beendet. Die Zeiten des Verdaus sind wie angegeben. Molekülmassenstandards (kDa) sind am linken Seitenrand angegeben.
4 veranschaulicht die SDS-PAGE von gereinigtem humanen Cathepsin O2 (Coomassieblau-Färbung). Spur 1, Rohfraktion Sf9; Spur 2, nach Schnelldurchlauf über n-Butyl; 3, nach Durchlauf über Mono S. Molekülmassenstandards sind in der rechten Spur angegeben.
5 veranschaulicht das pH-Aktivitätsprofil für rekombinantes humanes Cathepsin O2. Die k_kat/K_m-Werte wurden durch Messung der anfänglichen Hydrolysegeschwindigkeiten von Z-FR-MCA und durch Teilen durch Enzym- und Substratkonzentration erhalten.
6 veranschaulicht k_kat/K_m-Werte für die Hydrolyse von Z-X-R-MCA durch die Cathepsine O2, S, L und B (wobei das beste Substrat = 1 normiert wurde). Cathepsin O2 (Z-LR-MCA) 257 900 M^–1s^–1; Cathepsin S (Z-LR-MCA) 243 000 M^–1s^–1; Cathepsin L (Z-FR-MCA) 5 111 000 M^–1s^–1); Cathepsin B (Z-FR-MCA) 460 000 M^–1s^–1 (Daten für Cathepsine S, L und M aus Brömme et al., 1994).
7 veranschaulicht die elastinolytische Aktivität von rekombinantem humanen Cathepsin O2 bei den pH-Werten 4,5, 5,5 und 7,0 im Vergleich zu den Cathepsinen S und L sowie der Pankreaselastase. Das Substrat ist ³H-markiertes unlösliches Elastin.
8 veranschaulicht Northern Blot-Analysen der humanen Cathepsine O2, L und S in Zubereitungen aus Osteoklastomen. Spur 1, Patient (fibröses Bindegewebe und Zellgewebe); Spur 2, Patient 2 (Zellgewebe); Spur 3, Patient 2 (fibröses Bindegewebe). Nitrocellulose-Blots wurden mit 32P-markierten Sonden aus den humanen Cathepsinen O2, L und S hybridisiert.
9A und 9B veranschaulichen SDS-PAGE von Typ I-Kollagen (lösliches Hautkollagen aus Kalb) nach Verdau mit den rekombinanten humanen Cathepsinen O2 und L und Rindertrypsin. 9A: Kollagenaseaktivität: Verdau von löslichem Hautkollagen aus Kalb bei 28 °C und bei den pH-Werten 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 durch die humanen Cathepsine O2, S und L (jeweils 50 nM) für 12 h. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μM E-64 beendet. Unbehandeltes lösliches Kollagen wurde als Standard (S) verwendet. 9B: Gelatinaseaktivität: Verdau von denaturiertem löslichen Hautkollagen aus Kalb (10 min bei 70 °C erwärmt) bei 28 °C und bei den pH-Werten 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 durch humanes Cathepsin O2 (0,1 nM), Cathepsin L (0,2 nM) und humanes Cathepsin S (1 nM). Molekülmassenstandards sind in der linken Spur angegeben.
10 veranschaulicht eine SDS-PAGE der Reinigung des Proabschnittes von humanem Cathepsin O2.
11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G, 11H, 11I, 11J, 11K und 11L veranschaulichen immunohistochemische Färbung von humanem Cathepsin O2 in humanen Geweben. (A) Osteoklastome, (B) Lungenmakrophagen, (C) Bronchiolen, (D) Endometrium, (E) Magen, (F) Dickdarm, (G) Niere, (H) Plazenta, (I) Leber, (J) Eierstock, (K) Nebenniere, (L) Hoden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue Cathepsin O2-Proteine und Nukleinsäuren bereit.
Die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung können über mehrere Wege identifiziert werden. Cathepsin O2-Nukleinsäuren oder Cathepsin O2-Proteine werden zunächst durch weitgehende Nukleinsäure- und/oder Aminosäurehomologie zu den in 1 gezeigten Sequenzen identifiziert. Eine solche Homologie kann auf der gesamten Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz beruhen.
Die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung weisen zu anderen Cathepsinen eine begrenzte Homologie auf. Zum Beispiel weist das reife humane Cathepsin O2 zu dem reifen humanen Cathepsin L annähernd 59% Homologie, zu dem reifen humanen Cathepsin S 59% Homologie, zu dem reifen humanen Cathepsin B 26% Homologie und zu dem reifen humanen Cathepsin H 47% Homologie auf. Darüber hinaus weist der Proabschnitt von humanem Cathepsin O2 zu dem Proabschnitt von humanem Cathepsin L 38% Homologie, zu dem Proabschnitt von humanem Cathepsin S 51 % Homologie, zu dem Proabschnitt von humanem Cathepsin B 13% Homologie und zu dem Proabschnitt von humanem Cathepsin H 23% Homologie auf. Darüber hinaus weist das humane Cathepsin O2-Protein zu einem Osteoklastenprotein aus Kaninchen annähernd 90% Homologie auf.
Wie hierin verwendet, ist ein Protein ein "Cathepsin O2-Protein", wenn die Gesamthomologie der Proteinsequenz zu der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz bevorzugt größer als etwa 90%, stärker bevorzugt größer als etwa 95% und am stärksten bevorzugt größer als 98% beträgt. Diese Homologie wird unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Standardtechniken bestimmt wie zum Beispiel das Best Fit-Sequenzprogramm, welches von Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387–395 (1984) beschrieben ist. Das Alignment kann das Einbringen von Lücken in die Sequenzen, die abgeglichen werden sollen, umfassen. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass für Sequenzen, welche entweder mehr oder weniger Aminosäuren als das in 1 gezeigte Protein enthalten, der prozentuale Anteil der Homologie auf Grundlage der Anzahl an homologen Aminosäuren im Verhältnis zu der Gesamtanzahl an Aminosäuren bestimmt wird. Daher wird, wie unten erörtert, zum Beispiel die Homologie von Sequenzen, die kürzer als die in 1 gezeigte sind, unter Verwendung der Anzahl an Aminosäuren in der kürzeren Sequenz bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung humane Cathepsin O2-Proteine.
Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung sind kürzer als die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz. Wie in Beispiel 2 gezeigt, kann das humane Cathepsin O2-Protein posttranslationaler Weiterverarbeitung unterzogen werden, die derjenigen ähnlich ist, die für die Cathepsine B und S sowie für Papain beobachtet wurde (Brömme et al., J. Biol. Chem. 268; 4832–4838 (1993); Vernat et al., J. Biol. Chem. 266: 21451–21457 (1991); und Rowan et al., J. Biol. Chem. 267: 15993–15999 (1992)). Das Cathepsin O2-Protein wird als ein Präproprotein mit einer herkömmlichen Präsequenz, einer Prosequenz oder einem "Proabschnitt" und der reifen Sequenz hergestellt. Diese sind in 1 mit der Sequenz von humanem Cathepsin O2 einschließlich der Prä-, Pro- und reifen kodierenden Sequenzen, die in 1 gezeigt sind, veranschaulicht. Die Präsequenz umfasst die ersten 15 Aminosäuren der in 1 gezeigten Sequenz, der Proabschnitt erstreckt sich von Aminosäure 16 zu Aminosäure 114 (98 Aminosäuren) und das reife Protein erstreckt sich von Position 115 bis 329 (215 Aminosäuren). Es wird angenommen, dass die Prosequenz oder der Proabschnitt solange als Hemmstoff des Enzyms dient, bis das Enzym aktiviert ist, höchstwahrscheinlich als Folge einer Änderung des pH-Wertes. Die proteolytische Weiterverarbeitung des Proabschnittes findet für Papain (Vernet et al., oben), Cathepsin S und Cathepsin L autoproteolytisch statt. Die Definition von Cathepsin O2 umfasst Präprocathepsin O2, Procathepsin O2, reifes Cathepsin O2 und den Proabschnitt, der von dem reifen Cathepsin O2 getrennt wird.
Die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt rekombinant. Wie hierin verwendet, kann sich "Nukleinsäure" entweder auf DNA oder auf RNA oder auf Moleküle, welche sowohl Deoxy- als auch Ribonukleotide enthalten, beziehen. Die Nukleinsäuren umfassen genomische DNA, cDNA und Oligonukleotide einschließlich Sense- und Antisense- Nukleinsäuren. Insbesondere sind von der Definition Nukleinsäure Antisense-Nukleinsäuren umfasst. Eine Antisense-Nukleinsäure hybridisiert mit dem entsprechenden nicht-kodierenden Strang der in 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, sie kann jedoch sowohl Ribonukleotide als auch Deoxyribonukleotide enthalten. Im Allgemeinen bewirken Antisense-Nukleinsäuren das Verhindern der mRNA-Expression, so dass ein Cathepsin O2-Protein entsteht. Die Nukleinsäure kann zweisträngig, einsträngig sein oder Abschnitte von sowohl einer zweisträngigen als auch einer einsträngigen Sequenz enthalten.
Die Bezeichnung "rekombinante Nukleinsäure" hierin bedeutet eine Nukleinsäure, die ursprünglich in vitro durch die Manipulation von Nukleinsäuren durch Endonucleasen in einer Form gebildet werden, die üblicherweise nicht natürlich vorkommt. Daher wird sowohl ein isoliertes Gen eines Cathepsin O2-Proteins in linearer Form als auch ein Expressionsvektor, der in vitro durch Ligation von DNA-Molekülen, die üblicherweise nicht miteinander verknüpft sind, gebildet ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als rekombinant angesehen. Es wird davon ausgegangen, dass sobald eine Nukleinsäure hergestellt und in eine Wirtszelle oder einen -organismus wieder eingebracht ist, sie nicht-rekombinant repliziert wird, d.h. vielmehr unter Verwendung der in vivo-Zellmaschinerie der Wirtszelle als unter Verwendung von in vitro-Manipulationen; solche Nukleinsäuren, die einmal rekombinant hergestellt sind, obwohl sie anschließend nicht-rekombinant repliziert werden, werden jedoch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung immer noch als rekombinant angesehen.
Auf ähnliche Weise wird ein "rekombinantes Protein" unter Verwendung rekombinanter Techniken, d.h. durch die Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, wie oben veranschaulicht, hergestellt. Ein rekombinantes Protein unterscheidet sich von einem natürlich vorkommenden Protein durch mindestens eine oder mehrere Eigenschaften. Zum Beispiel kann das Protein von einigen oder allen der Proteine und Verbindungen, mit welchen es üblicherweise in seinem Wildtyp-Wirt zusammenhängt, abgetrennt werden. Daher werden zum Beispiel Cathepsin O2-Proteine, welche im Wesentlichen oder teilweise gereinigt sind, oder außerhalb von Zellen vorliegen, als rekombinant angesehen. Die Definition umfasst die Herstellung eines Cathepsin O2-Proteins aus einem Organismus in einem unterschiedlichen Organismus oder einer Wirtszelle. Alternativ kann das Protein in einer wesentlich höheren Konzentration als es üblicherweise beobachtet wird, durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors oder eines Hochexpressionspromotors erzeugt werden, so dass das Protein in erhöhten Konzentrationsspiegeln erzeugt wird. Alternativ kann das Protein in einer Form vorliegen, die üblicherweise nicht natürlich vorkommt, wie bei dem Hinzufügen einer Epitopmarkierung oder Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und -deletionen.
Von der Definition von Cathepsin O2-Proteinen sind auch Cathepsin O2-Proteine aus anderen Organismen umfasst, welche wie unten kurz dargestellt kloniert und exprimiert sind.
Im Fall von Antisense-Nukleinsäuren ist eine Antisense-Nukleinsäure als eine solche definiert, welche mit allen oder einem Abschnitt der entsprechenden, in 1 gezeigten nicht kodierenden Sequenz hybridisiert. Im Allgemeinen sind die Hybridisierungsbedingungen, die für die Bestimmung der Antisense-Hybridisierung verwendet werden, hochstringente Bedingungen wie zum Beispiel 0,1XSSC bei 65 °C.
Sobald die Nukleinsäure des Cathepsin O2-Proteins identifiziert worden ist, kann sie kloniert werden und gegebenenfalls können ihre Bestandteile rekombiniert werden, um die Nukleinsäure des vollständigen Cathepsin O2-Proteins zu bilden. Sobald die Nukleinsäure des rekombinanten Cathepsin O2-Proteins aus ihrer natürlichen Quelle isoliert wird, z.B. innerhalb eines Plasmid oder eines anderen Vektors enthalten ist oder daraus als ein lineares Nukleinsäuresegment herausgeschnitten wird, kann sie weiterhin als Sonde verwendet werden, um weitere Nukleinsäuren des Cathepsin O2-Proteins zu identifizieren und zu isolieren. Sie kann ebenso als eine "Vorläufer"-Nukleinsäure verwendet werden, um modifizierte oder abweichende Nukleinsäuren und Proteine des Cathepsin O2-Proteins herzustellen.
Unter Verwendung der Nukleinsäuren, welche das Cathepsin O2-Protein kodieren, kann eine Vielfalt von Expressionsvektoren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren können entweder selbst replizierende extrachromosomale Vektoren sein oder Vektoren, welche in ein Wirtsgenom integriert werden. Im Allgemeinen umfassen diese Expressionvektoren eine transkriptionelle oder translationale regulatorische Nukleinsäure, die operativ mit der Nukleinsäure, die für das Cathepsin O2-Protein kodiert, verknüpft sind. "Operativ verknüpft" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die transkriptionelle und translationale regulatorische DNA auf eine solche Art und Weise bezüglich der kodierenden Sequenz des Cathepsin O2-Proteins positioniert ist, dass die Transkription gestartet wird. Im Allgemeinen bedeutet dies, dass der Promotor und die transkriptionellen Initiations- oder Startsequenzen 5' zu der Cathepsin O2-Protein kodierenden Region positioniert sind. Die transkriptionelle und translationale regulatorische Nukleinsäure ist im Allgemeinen für die Wirtszelle, die zur Expression des Cathepsin O2-Proteins verwendet wird, geeignet; zum Beispiel werden zur Expression des Cathepsin O2-Proteins in Bacillus transkriptionelle und translationale regulatorische Nukleinsäuresequenzen aus Bacillus verwendet. Zahlreiche Arten geeigneter Expressionvektoren und geeigneter regulatorischer Sequenzen sind im Fachbereich für eine Vielfalt von Wirtszellen bekannt.
Im Allgemeinen können die transkriptionellen und translationalen regulatorischen Sequenzen Promotorsequenzen, Leader- oder Signalsequenzen, ribosomale Bindungsstellen, Transkriptionsstart- und -stop-Sequenzen, Translationsstart- und -stopp-Sequenzen sowie Enhancer- oder Aktivatorsequenzen umfassen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die regulatorischen Sequenzen einen Promotor sowie Transkriptionsstart- und -stopp-Sequenzen.
Promotorsequenzen kodieren entweder für konstitutive oder für induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder natürlich vorkommende Promotoren oder Hybridpromotoren sein. Hybridpromotoren, welche Elemente von mehr als einem Promotor verbinden, sind ebenso im Fachbereich bekannt und in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Darüber hinaus kann der Expressionvektor zusätzliche Elemente umfassen. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch ermöglicht wird, dass er zur Expression in zwei Organismen, zum Beispiel in Säugetier- oder Insektenzellen sowie zur Klonierung und Amplifikation in einem prokaryotischen Wirt aufrechterhalten werden kann. Darüber hinaus enthält der Expressionsvektor zum Integrieren von Expressionsvektoren mindestens eine Sequenz, die zu dem Genom der Wirtszelle homolog ist und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionkonstrukt flankieren. Der Integrationsvektor kann durch Auswählen der geeigneten homologen Sequenz zum Einbringen in den Vektor auf einen spezifischen Locus in der Wirtszelle gerichtet sein. Konstrukte für Integrationsvektoren sind im Fachbereich bekannt.
Darüber hinaus enthält der Expressionvektor in einer bevorzugten Ausführungsform ein selektierbares Markergen, um die Selektion transformierter Wirtszellen zu ermöglichen. Selektionsgene sind im Fachbereich bekannt und variieren mit der vewendeten Wirtszelle.
Die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung werden durch Kultivieren einer Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine Nukleinsäure enthält, die für ein Cathepsin O2-Protein kodiert, unter geeigneten Bedingungen exprimiert, um die Expression des Cathepsin O2-Proteins zu induzieren oder zu bewirken. Die Bedingungen, die für die Expression des Cathepsin O2-Proteins geeignet sind, variieren mit der Auswahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle, und können leicht durch einen Fachmann durch Routineexperimentation bestimmt werden. Zum Beispiel erfordert die Verwendung von konstitutiven Promotoren in dem Expressionsvektor das Optimieren des Wachstums und der Proliferation der Wirtszelle, während die Verwendung eines induzierbaren Promotors geeignete Wachstumsbedingungen zur Induktion erfordert. Darüber hinaus ist in einigen Ausführungsformen die Wahl des richtigen Zeitpunktes der Ernte wichtig. Zum Beispiel sind Baculovirus-Systeme, die bei der Expression in Insektenzellen verwendet werden, lytische Viren. Daher kann die Auswahl des Zeitpunktes der Selektion für die Produktausbeute entscheidend sein.
Geeignete Wirtszellen umfassen Hefe-, Bakterien-, Archebakteria-, Pilz- und Insekten- sowie Tierzellen einschließlich Säugetierzellen. Von besonderem Interesse sind Drosophila melanaaster-Zellen, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora, BHK-, CHO-, COS-, HeLa-Zellen und immortalisierte Knochenmarks- und Lymphoid-Zelllinien aus Säugetieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Cathepsin O2-Proteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Bakterielle Expressionssysteme sind im Fachbereich bekannt.
Ein geeigneter bakterieller Promotor stellt eine beliebige Nukleinsäuresequenz dar, die in der Lage ist, an bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (3') der für das Cathepsin O2-Protein kodierenden Sequenz in mRNA zu starten. Ein bakterieller Promotor weist eine Transkriptionsstartregion auf, welche üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz positioniert ist. Die Transkriptionsstartregion umfasst üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle sowie eine Transkriptionsstartstelle. Sequenzen, die für Enzyme des Stoffwechselwegs kodieren, stellen besonders geeignete Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die sich von Enzymen, die Zucker wie zum Beispiel Galactose, Lactose und Maltose verstoffwechseln, ableiten sowie Sequenzen, die sich von biosynthetischen Enzymen wie zum Beispiel Tryptophan ableiten. Promotoren aus Bakteriophage können ebenso verwendet werden und sind im Fachbereich bekannt. Darüber hinaus sind synthetische Promotoren und Hybridpromotoren auch geeignet; zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid aus den trp- und lac-Promotorsequenzen. Außerdem kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren von nicht bakteriellem Ursprung umfassen, die die Fähigkeit haben, an bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu starten.
Darüber hinaus ist eine funktionsfähige Promotorsequenz sowie eine effiziente Ribosomenbindungsstelle wünschenswert. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle Shine-Dalgarno (SD-Sequenz) genannt und umfasst ein Startcodon und eine Sequenz, die 3–9 Nukleotide lang ist und 3–11 Nukleotide stromaufwärts des Startcodons gelegen ist.
Der Expressionvektor kann auch eine Signalpeptidsequenz umfassen, die die Sekretion des Cathepsin O2-Proteins in Bakterien bereitstellt. Die Signalsequenz kodiert üblicherweise für ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern, wie im Fachbereich bekannt ist. Das Protein wird entweder in das Nährmedium (grampositive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum sezerniert, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle gelegen ist (gramnegative Bakterien).
Der bakterielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Markergen umfassen, das die Selektion von Bakterienstämmen ermöglicht, die transformiert worden sind. Geeignete Selektionsgene umfassen Gene, welche die Bakterien gegenüber Arzneimitteln wie zum Beispiel Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin resistent machen. Selektierbare Marker umfassen auch biosynthetische Gene, wie zum Beispiel diejenigen aus den Histidin-, Tryptophan- und Leucinbiosynthesewegen.
Diese Bestandteile sind in Expressionvektoren eingebaut. Expressionsvektoren für Bakterien sind im Fachbereich bekannt und umfassen neben anderen Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans.
Die bakteriellen Expressionvektoren werden in bakterielle Wirtszellen unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Techniken wie zum Beispiel Calciumchlorid-Behandlung, Elektroporation und anderen Techniken transformiert.
In einer Ausführungsform werden Cathepsin O2-Proteine in Insektenzellen hergestellt. Die Expressionvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere Expressionvektoren auf Grundlage von Baculovirus sind im Fachbereich bekannt. Zusammengefasst, stellt Baculovirus einen sehr großen DNA-Virus dar, der sein Hüllprotein in sehr hohen Konzentrationen herstellt. Aufgrund der Größe des Baculovirusgenoms müssen exogene Gene durch Rekombination in das virale Genom positioniert werden. Entsprechend umfassen die Bestandteile des Expressionssystems: einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, welches sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine zweckmäßige Restriktionsstelle zur Insertion des Cathepsin O2-Proteins enthält; einen Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment in dem Transfervektor homolog ist (das ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom); sowie geeignete Insektenwirtszellen und Nährmedien.
Expressionssysteme von Säugetieren sind im Fachbereich bekannt und werden in einer Ausführungsform verwendet. Ein Säugetierpromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, an die Säugetier-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (3') einer für das Cathepsin O2-Protein kodierenden Sequenz in mRNA zu starten. Ein Promotor weist eine Transkriptionsstartregion auf, welche üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz positioniert ist sowie eine TATA-Box, die für 25–30 Basenpaare stromabwärts der Transkriptionsstartstelle gelegen ist. Es wird angenommen, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase II steuert, damit die RNA-Synthese an der richtigen Stelle beginnt. Ein Säugetierpromotor enthält auch ein stromaufwärts gelegenes Promotorelement, welches üblicherweise innerhalb 100–200 Basenpaare stromaufwärts der TATA-Box gelegen ist. Ein stromaufwärts gelegenes Promotorelement bestimmt die Geschwindigkeit, mit welcher die Transkription gestartet wird und kann in jede Richtung tätig werden. Als Säugetierpromotoren werden insbesondere die Promotoren aus viralen Genen aus Säugetieren verwendet, da die viralen Gene oftmals hoch exprimiert werden und eine große Auswahl an Wirten aufweisen. Beispiele umfassen den frühen SV40-Promotor, den Promotor des "mouse mammary tumor virus LTR", den starken späten Adenoviruspromotor und den Herpes simplex-Virus-Promotor.
Üblicherweise stellen die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, die von Säugetierzellen erkannt werden, regulatorische Regionen dar, die 3' zu dem Translationsstoppcodon liegen und daher zusammen mit den Promotorelementen die kodierende Sequenz flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung gebildet. Beispiele für Transkriptionsterminatoren und Polyadenylierungssignale umfassen diejenigen, die sich von SV40 ableiten.
Verfahren zum Einbringen einer exogenen Nukleinsäure in Säugetierwirte sowie in andere Wirte sind im Fachbereich bekannt und variieren mit der verwendeten Wirtszelle. Techniken umfassen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Ausfällung, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung des (der) Polynukleotids (Polynukleotide) in Liposomen sowie direkte Mikroinjektion der DNA in Zellkerne.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Cathepsin O2-Protein in Hefezellen hergestellt. Hefeexpressionssysteme sind im Fachbereich bekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluweromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Bevorzugte Promotorsequenzen für die Expression in Hefe umfassen den induzierbaren GAL1,10-Promotor, die Promotoren aus Alkoholdehydrogenase, Enolase, Glukokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, Glyeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase und das saure Phosphatasegen. Selektierbare Hefemarker umfassen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, welche Resistenz gegenüber Tunicamycin übertragen; das G418-Resistenzgen, welches Resistenz gegenüber G418 überträgt; sowie das CUP1-Gen, welches ermöglicht, dass Hefe in Gegenwart von Kupferionen wächst.
Ein rekombinantes Cathepsin O2-Protein kann intrazellulär exprimiert oder sezerniert werden. Das Cathepsin O2-Protein kann auch unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Techniken als Fusionsprotein hergestellt werden. Daher kann das Cathepsin O2-Protein mit einem Trägerprotein fusioniert werden, um ein Immunogen zu bilden, wenn das gewünschte Epitop zum Beispiel zu klein ist. Alternativ kann das Cathepsin O2-Protein zur Expressionserhöhung oder aus anderen Gründen als Fusionsprotein hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Cathepsin O2-Protein nach der Expression gereinigt oder isoliert. Cathepsin O2-Proteine können auf eine Vielfalt von Wegen, die dem Fachmann bekannt sind, in Abhängigkeit davon, welche weiteren Komponenten in der Probe vorliegen, isoliert oder gereinigt werden. Standardreinigungsverfahren umfassen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Techniken einschließlich Ionenaustausch-, hydrophober, Affinitäts- und Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie sowie Chromatofokussierung. Zum Beispiel kann das Cathepsin O2-Protein unter Verwendung einer Standardantikörpersäule, die gegen Cathepsin O2 gerichtet ist, gereinigt werden. Ultrafiltrations- und Diafiltrationstechniken sind in Verbindung mit Proteinanreicherung ebenso geeignet. Zur allgemeinen Anleitung für geeignete Reinigungstechniken siehe Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982). Der Reinigungsgrad, der notwendig ist, variiert in Abhängigkeit von der Verwendung des Cathepsin O2-Proteins. In einigen Fällen ist keine Reinigung notwendig.
In einigen Ausführungsformen wird das Cathepsin O2-Enzym als Proenzym exprimiert. Wie in den Beispielen veranschaulicht, kann das Proenzym mit exogener Protease behandelt werden, um das Enzym in die reife, aktive Form umzuwandeln, wie im Fachbereich bekannt ist. Geeignete exogene Proteasen umfassen Pepsin und Cathepsin D, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Sobald die Cathepsinproteine exprimiert und gegebenenfalls gereinigt sind, sind sie für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet.
Zum Beispiel weisen die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 5 gezeigt, Kollagenaseaktivität auf. Daher können die Cathepsin O2-Proteine sowohl in vitro als auch in vivo als Kollagenase verwendet werden. Zum Beispiel kann Cathepsin O2 verwendet werden, um Analyseproben zu behandeln, welche störende oder problematische Kollagenkonzentrationen enthalten.
Auf ähnliche Art und Weise können Cathepsin O2-Proteine verwendet werden, um überschüssiges Kollagen innerhalb des Körpers abzubauen. Es existiert eine Vielfalt an Zuständen, die mit überschüssigem Kollagen zusammenhängen. Zum Beispiel bringt eine Behandlung von Bandscheibenproblemen wie zum Beispiel schwere Scheibenentzündung und Bandscheibenvorfall die Injektion von Kollagenase oder Chymopapain zum Abbau von Bandscheibenkollagen mit sich (Leonardo et al., Ann. Chirm Gyneacol. 82:141–148 (1993); Gogan et al., Spine 17:388–94 (1992); Stula, Nerochirurgia 33:169–172 (1990); und Boccanera et al., Chir. Organi. Mov. 75:25–32 (1990)). Alternativ kann die Behandlung von Adhäsionen wie zum Beispiel Beckenadhäsionen, postchirurgische Adhäsionen, Lungenadhäsionen, Bauchadhäsionen und dergleichen mit Cathepsin O2 behandelt oder damit aufgelöst werden. Auf ähnliche Art und Weise können Narben und Wulstnarben mit Cathepsin O2 behandelt werden, um die vorliegenden überschüssigen Mengen an Kollagen zu entfernen oder zu vermindern. Darüber hinaus stellt Endometriose ein weiteres bedeutendes klinisches Problem dar, das die Ablagerung überschüssiger Kollagenmengen und weiterer Substanzen innerhalb der Gebärmutter und des umgebenden Gewebes mit sich bringt; bestimmte Endometrioseformen können auch mit dem Cathepsin O2 der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann Cathepsin O2 verwendet werden, um die Matrices um die Tumoren herum zu lösen. Im Allgemeinen ist der pH-Wert des Tumors niedriger als der physiologische pH-Wert und, wie in den Beispielen kurz dargestellt, ist Cathepsin O2 bei saurem pH-Wert aktiv. Daher ist Cathepsin O2 zur Auflösung der Matrix auf Grundlage von Kollagen, die im Allgemeinen einen Tumor umgibt, geeignet.
In einer Ausführungsform können die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung auch zur Behandlung von Pyknodysostose, einer Osteopetroseartigen Knochenkrankheit, verabreicht werden. Die Krankheit scheint durch unzureichende Aktivität osteoklastischer Cystein-Proteinasen verursacht zu sein. In einigen Ausführungsformen kann Cathepsin O2 mittels Gentherapie verabreicht werden.
Darüber hinaus kann Cathepsin O2 in Verbindung mit Verbindungen zur Knochendemineralisation wie zum Beispiel Säuren verabreicht werden, um das Knochengewebe abzubauen, da Cathepsin O2 bei saurem pH-Wert funktionsfähig ist. Daher kann atypisches oder übermäßiges Knochenwachstum behandelt werden.
Die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung sind zum Durchmustern von Cathepsin O2-Protease-Hemmstoffen und von Cystein-Protease-Hemmstoffen geeignt. Cysteinprotese-Hemmstoffe weisen eine Vielfalt an Verwendungen auf, wie im Fachbereich bekannt ist, einschließlich Reinigung von Cysteinproteasen über Bindung an Affinitätschromatographiesäulen und Hemmung von Cysteinproteasen, die bekannten Cysteinprotease-Hemmstoffen ähnlich sind. Darüber hinaus können Cysteinprotease-Hemmstoffe therapeutische Verwendungen aufweisen, da eine breite Vielfalt an physiologischen Krankheiten einschließlich Arthritis, Entzündung, Osteoporose, Muskeldystrophie, Tumorinvasion, multiples Myelom und Glomerulonephritis, mit erhöhten Spiegeln an Cysteinproteasespiegeln zusammenhängen, wie im Fachbereich bekannt ist.
Neueste Arbeiten legen nahe, dass Cysteinproteasen als Transkriptionsfaktoren verwendet werden können, die an DNA binden (Xu et al., oben). In einigen Ausführungsformen können die Cathepsin O2-Proteine der vorliegenden Erfindung als Transkriptionsfaktoren verwendet werden. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass der Parasit Paragonimus westermani ein Immunsuppressivum mit Homologie zu Cysteinproteasen exprimiert (Hamajima et al., oben). Tatsächlich beträgt die Homologie zu den Cathepsin O2-Proteinen der vorliegenden Erfindung annähernd 40%. Daher können die Cathepsin O2-Proteine in einer Ausführungsform als Immunsuppressiva geeignet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Cathepsin O2-Proteine humane Cathepsin O2-Proteine, wenn die Cathepsin O2-Proteine an einem Menschen zu verabreichen sind. Dies ist therapeutisch wünschenswert, um sicherzustellen, dass unerwünschte Immunreaktionen gegenüber dem verabreichten Cathepsin O2 minimiert werden.
Die Verabreichung des Cathepsin O2-Proteins der vorliegenden Erfindung kann über eine Vielfalt von Wegen durchgeführt werden, einschließlich oral, subkutan, intravenös, intranasal, transdermal, intraperitoneal, intramuskulär, intrapulmonal, vaginal, rektal oder intraokular, sie sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein Cathepsin O2-Protein in einer Form, die zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine oder mehrere der folgenden Bestandteilen umfassen: Trägerproteine wie zum Beispiel Serumalbumin; Puffer; Füllstoffe wie zum Beispiel mikrokristalline Cellulose, Lactose, Korn und andere Stärken; Bindemittel, Süßstoffe und andere Aromastoffe; Farbmittel; und Polyethylenglykol. Zusatzmittel sind im Fachbereich bekannt und werden in einer Vielfalt von Zubereitungen verwendet.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen in therapeutisch wirksamen Dosierungen, wie durch einen Fachmann routinemäßig bestimmt werden kann, verabreicht.
Es wird angenommen, dass das humane Cathepsin O2-Protein der Erfindung Eigenschaften aufweist, welche das humane Protein für therapeutische Zwecke annehmbarer als Cathepsin O2-Proteine aus anderen Spezies machen. Insbesondere macht die Antigenität von Cathepsin O2-Proteinen aus anderen Spezies in Menschen diese Proteine als therapeutische Zusammensetzungen weniger annehmbar; d.h. Cathepsine aus anderen Spezies können in Menschen unerwünschte Immunreaktionen auslösen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Art und Weise der Verwendung der oben beschriebenen Erfindung vollständiger zu beschreiben sowie die besten Ausführungsformen, die zum Ausführen verschiedener Aspekte der Erfindung vorgesehen sind, darzulegen. Es wird davon ausgegangen, dass diese Beispiele keineswegs dazu dienen, den tatsächlichen Umfang dieser Erfindung einzuschränken, sondern vielmehr für veranschaulichende Zwecke dargestellt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Klonieren von humanem Cathepsin O2
Soweit nicht anderweitig angegeben, sind alle allgemeinen rekombinanten DNA-Techniken gemäß den in Sambrook et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt worden (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).
Zwei degenerierte PCR-Primer wurden auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz eines Osteoclastingens aus Kaninchen entworfen (Tezuko et al. 1994):
Diese Primer wurden zum Durchmustern einer Quick Clone cDNA-Zubereitung (Clontech) aus humaner Milz verwendet. Ein amplifiziertes 450-Basenpaar-Fragment wurde isoliert und gereinigt und als cDNA-Sonde zum Durchmustern einer cDNA-Bibliothek aus humaner Milz (gt10 von Clontech) verwendet. 600 000 Klone wurden auf 20 Filtern unter Verwendung einer Technik, in welcher sich die Plaques direkt auf dem Filter wiederbilden, durchmustert (Woo, Methods Enzymol. 68:389–395 (1979)). Dies ermöglicht eine Amplifikation des Signals aus positiven Plaques, was kürzere Expositionszeiten ermöglicht, und wodurch das Hintergrundrauschen und das Sichtbarmachen falsch Positiver vermindert wird. Die Filter wurden unter mäßig stringenten Bedingungen gewaschen: einmal mit 2 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur für 10 min und einmal mit 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 68 °C für 20 min.
Phagen aus zwei positiven Plaques wurden isoliert und in die EcoRI-Stelle von pBluescript SK+-Vektor (Stratagene) kloniert.
Ein positiver Klon wurde vollständig auf einem ABI-Sequenziertyp 373A sequenziert; die Sequenz (SEQ ID NR:1) ist in 1 gezeigt. Sequenzalignments des Proteins von humanem Cathepsin O2 (SEQ ID NR:2), humanem Cathepsin S (SEQ ID NR:4) und humanem Cathepsin L (SEQ ID NR:5) sind in 2 gezeigt.
Beispiel 2
Expression von humanem Cathepsin O2
Die humane Cathepsin O2-cDNA wurde in das Polyhedringen der Baculovirus-Transfervektoren unter Verwendung von Standardverfahren kloniert. Die cDNA, die für das vollständige offene Leseraster des Präproenzyms kodiert, wurde in die BgIII- und BamH1-Stelle des pVL1392-Transfervektors (PharMingen) insertiert. Rekombinante Baculoviren wurden im Anschluss an die Cotransfektion des Baculovirus-Transfervektors erzeugt und linearisierter genomischer AcNPV DNA (PharMingen) in Sf9-Zellen durch homologe Rekombination erzeugt. Im Anschluss an die Endpunktverdünnung wurde die Expression des humanen Cathepsin O2 in einem fluorimetrischen Substratassay, der unten kurz dargestellt wird, gemessen.
Reiner Virus (AcNPVCO2) wurde durch Plaquereinigung erhalten. Sf9-Zellen wurden in Sf900II-Medien (Gibco BRL, Grand Island, NY) mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet und mit einer MOI (multiplicity of infection) von 1 infiziert. Die Gesamtzellzahl und die zelluläre sowie die sezernierte Aktivität von Cathepsin O2 wurde alle 24 h überwacht. Nach 3,5 Tagen wurden die Zellen geerntet.
Der Großteil des immunreaktiven Materials von etwa 43 kDa lag innerhalb der infizierten Zellen vor. Im Gegensatz zu dem Einzelprodukt von 43 kDa in dem Kulturmedium wurde in dem Zellextrakt eine zusätzliche schwache Bande von 44 kDa nachgewiesen. Die Bande mit dem höheren Molekulargewicht stellt vermutlich nicht prozessiertes Präprocathepsin O2 dar, während das 43 kDa-Protein vermutlich ein Proenzym ist. Weder unmittelbar nach der Lyse der Zellen noch während der Autoaktivierungsbedingungen bei 40 °C zwischen einem pH-Wert von 4,0 und 4,5 in Gegenwart von Dithiothreitol unter Verwendung des synthetischen Substrates Z-FR-MCA bei einem pH-Wert von 7,5 wurde Aktivität beobachtet. Der Anstieg an hemmbarer E-64-Aktivität unter autoaktivierenden Bedingungen, der bei einem pH-Wert von 5,5 gemessen wurde, wurde einer endogenen Sf9-Cysteinprotease (unveröffentlichte Ergebnisse) zugewiesen. Es wurde keine Prozessierung des Cathepsin O2- Vorläufers mit humanem Cathepsin B, welches bei den pH-Werten 4,0 und 5,5 für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert wurde, beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Aktivierung, Reinigung und N-terminale Sequenzierung von rekombinantem humanen Cathepsin O2:
Das intrazelluläre Cathepsin O2 wurde innerhalb der Sf9-Zellen als inaktiver Vorläufer hergestellt. Das Enzym wurde in dem Zelllysat unter reduzierenden und sauren Bedingungen wie folgt aktiviert. Die Sf9-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 2000 × g aus den Produktionsmedien geerntet und sie wurden in einem Dounce-Homogenisator lysiert. Das Zelllysat, das den inaktiven Cathepsin O2-Vorläufer enthält, wurde mit 100 mM Natriumacetatpuffer, der einen pH-Wert von 3,75 aufweist und 0,5% Triton X-100 enthält, 5 mM Dithiothreitol und 2,5 mM Na₂EDTA auf 100 ml aufgefüllt, und der pH-Wert wurde auf 4,0 eingestellt.
Die Umwandlung der Vorform in das aktive Enzym wurde durch Behandlung mit Pepsin ausgeführt. Nach Zugabe von Schweinepepsin (Sigma, St. Louis, MO) mit einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml wurde das Aktivierungsgemisch in einer Schüttelvorrichtung für 90 min bei 40 °C bei 200 rpm inkubiert. Die Aktivierung wurde unter Verwendung von Z-FR-MCA (10 μM) als fluorogenes Substrat in 100 mM Tris/HCl-Puffer, pH-Wert 7,5 gemessen.
Der Vorläufer von Cathepsin O2 wurde durch Behandlung mit Pepsin bei einem pH-Wert von 4,0 effizient in das reife aktive Enzym transformiert. Der Verdau von rohem Zellextrakt oder von konzentriertem Überstand von Kulturmedien führte zu einem zeitabhängigen Verschwinden des Vorläufers und über ein Zwischenprodukt von 36 kD (3) zur Erzeugung von reifem Enzym (29 kD). Gleichzeitig mit diesem Vorgang wurde eine Zunahme an hemmbarer E-64-Aktivität, die bei einem pH-Wert von 7,5 gemessen wurde, beobachtet.
Bei Zugabe von gereinigtem aktiven Cathepsin O2 bei einem pH-Wert von 4,5 (Daten nicht gezeigt) wurde keine Aktivierung des Vorläufers beobachtet, was darauf hinweist, dass weder eine Cis- noch eine Trans-Autoaktivierung von Cathepsin O2 innerhalb der Lysosomen wahrscheinlich ist. Dies steht im Widerspruch zu verwandten Cysteinproteasen wie zum Beispiel Papain und Cathepsin S, welche einen potenziellen autokatalytischen Aktivierungsweg aufweisen (Vernet et al., J. Biol. Chem., 265:1661–1666 (1990), Brömme et al., J. Biol. Chem. 268:4832–4838 (1993)). Ein natürliches aktivierendes Enzym von Cathepsin O2 innerhalb des Osteoklasten könnte die Aspartylprotease Cathepsin D sein, welche in osteoklastischen Lysosomen vorliegt, aber in niedrigen Konzentrationen in die Resorptionslakune sezerniert wird (Goto et al., 1993).
Das aktivierte Lysat wurde mit 2M Tris-Base auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, durch Zentrifugation bei 10 000 × g gereinigt, und der Überstand wurde auf 2,5 M Ammoniumsulfat bei einem pH-Wert von 5,5 eingestellt. Nach der Zentrifugation bei 16 000 × g wurde der gereinigte Überstand durch Ultrafiltration (YM10 Amicon) auf 50 ml konzentriert. Nach zusätzlicher Zentrifugation bei 10 000 × g wurde der geklärte Überstand auf Butylsepharose 4 Fast Flow (Pharmacia, Schweden) geladen und die Säule wurde mit einem Ammoniumsulfatgradienten (2,5 M bis 0 M in 25 mM Acetatpuffer, pH-Wert 5,5) gewaschen. Die Aktivität wurde bei 0 M Ammoniumsulfat eluiert. Die vereinigten und konzentrierten Fraktionen wurden anschließend auf eine FPLC Mono S-Säule (Pharmacia, Schweden) aufgebracht und mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 2 M) in 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,5 eluiert. Elektrophoretisch einheitliches Cathepsin O2 wurde bei 1,4M NaCl eluiert.
Die durchschnittliche Ausbeute einer 1L Sf9-Zellkultur (ca. 2 × 10⁹ Zellen) betrug ca. 1 mg gereinigtes Enzym (Tabelle 1).
Tabelle 1 Reinigung von rekombinantem humanen Cathepsin O2^a

^a aus 1 L Sf9-Kultur
^b nach Aktivierung mit Pepsin

Das gereinigte Enzym war ein einkettiges Enzym und wies in einem 4–20% Tris/Glycin-SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen ein offensichtliches Molekulargewicht von 29 kDa auf. Die Behandlung mit Endoglycosidasen H und F sowie mit der N-Glycosidase F führte nicht zu einer Veränderung des Molekulargewichts, was voraussetzt, dass die Protease nicht glycosyliert ist (Daten nicht gezeigt). Humanes Cathepsin O2 weist in seiner reifen Sequenz zwei potenzielle Glycosylierungsstellen auf. Beide Stellen weisen einen Prolinrest, der entweder auf das Asparagin oder auf das Threonin folgt, auf, so dass ihre Verwendung unwahrscheinlich ist. Cathepsin O2 enthält darüber hinaus in dem Proabschnitt, der in der Nähe der Prozessierungsstelle zwischen dem reifen Enzym und dem Proabschnitt liegt, eine mutmaßliche Glycosylierungsstelle. Wiederum wurde keine Veränderung des Molekulargewichts des Proenzyms nach der Behandlung mit den Endoglycosidasen H und F sowie der N-Glycosidase F über Nacht beobachtet.
Durch automatisierten Edman-Abbau wurde NH₂-terminales Sequenzieren durchgeführt. N-terminales Sequenzieren der reifen Protease zeigte die natürliche Prozessierungsstelle für Cysteinproteasen der Papainfamilie mit einem Prolin, welches neben dem N-terminalen Alanin liegt (NH₂-APDSVDYRKKGYVTPVKN) (SEQ ID NR:10). Im Gegensatz dazu weisen autokatalytisch aktivierte Cysteinproteasen häufig an ihrer Prozessierungsstelle eine N-terminale Verlängerung von 3–6 Aminosäuren von dem Proabschnitt auf (Brömme et al. 1993). Die berechnete Molekülmasse des reifen Cathepsin O2 beträgt 23,495, was das tatsächliche Gewicht des Enzyms zu sein scheint. Trypsin (24 kDa) wies bei Untersuchung unter analogen Bedingungen dasselbe offensichtliche Molekulargewicht von 29 kDa auf.
Rekombinantes humanes Cathepsin S wurde unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems exprimiert und wie anderswo beschrieben gereinigt (Brömme und McGrath, unveröffentlichte Ergebnisse). Rekombinantes humanes Cathepsin L wurde freundlicherweise von Dr. Mort (Shriner's Hospital for Crippled Children, Montreal, Quebec) bereitgestellt. Alle verwendeten Cathepsine waren elektrophoretisch einheitlich und ihre Molaritäten wurden durch Titration des katalytischen Zentrums mit E-64 wie von Barrett und Kirschke (1981) beschrieben bestimmt.
Fluorimetrischer Enzymassay
Humanes Cathepsin O2 wurde mit einem fluorogenen Substrat Z-FR-MCA (MCA, Methylcoumarylamid) in 100 mM Natriumacetatpuffer, der 2,5 mM Dithioerythreitol und 2,5 mM EDTA enthielt, untersucht. Anfängliche Hydrolysegeschwindigkeiten des MCA-Substrates werden in 1-cm-Küvetten bei 25 °C und einer Anregungswellenlänge bei 380 nm sowie einer Emissionswellenlänge bei 450 nm überwacht. Die Konzentration von Z-FR-MCA beträgt unter Standardbedingungen 5 μm.
Die Kinetikkonstanten V_max und K_m wurden durch nicht lineare Regressionsanalyse unter Verwendung des Programms Enzfitter (Leatherbarrow, Enzfitter, Elsevier Biosoft, Cambridge, United Kingdom (1987)) erhalten.
Die Hemmung von Cathepsin O2 wurde mit einer konstanten Substrat-(5 μM Z-FR-MCA) und Enzymkonzentration (1 mM) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Hemmstoffen in dem Substratassay-Puffer untersucht. Cathepsin O2 wurde mit den Hemmstoffen für 10 min vorinkubiert und die Reaktion wurde mit dem Substrat gestartet. Die Restaktivität wurde überwacht und die prozentuale Hemmung wurde aus der ungehemmten Geschwindigkeit berechnet.
Beispiel 3
Klonierung und Expression des Proabschnitts von Cathepsin O2
Der Proabschnitt von humanem Cathepsin O2 wurde durch PCR unter Verwendung von Standardtechniken unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
Der Probereich wurde in dem pTrcHis-Vektor (Invitrogen Corp., San Diego, CA) exprimiert, welcher eine Reihe von sechs Histidinresten enthält, die als Metallbindungsdomäne in dem translatierten Protein fungieren. Die Metallbindungsdomäne wurde zur Reinigung des Proabschnitts von Cathepsin O2 über Invitrogen's ProBond Resin, der in ihrem Xpress-Systemprotein-Expressionskit enthalten ist, verwendet. Ein Gel des gereinigten Proabschnitts ist in 10 gezeigt. Der gereinigte Proabschnitt hemmte das Stammenzym mit einem K_i-Wert von 0,1 nM.
Beispiel 4
Antikörper gegen humanes Cathepsin O2 und Immunhistochemie
Polyklonale Antikörper gegen das Proenzym von humanem Cathepsin O2 wurden in weißen Neuseeland-Kaninchen hergestellt. Die cDNA, die für das Proenzym kodiert, wurde durch PCR aus einer Zubereitung aus seiner Präproenzymsequenz unter Verwendung der Pfu-DNA-Polymerase (Promega) amplifziert. Die verwendeten Primer wurden an dem 5'-Ende des Proenzyms mit einer Nhel-Stelle und an dem 3'-Ende mit einer BamHI-Stelle hergestellt. Humanes Cathepsin O2 wurde in E. coli (BL21(DE3)) in dem pET11c-Vektor von Novagen kloniert und exprimiert. Die Expression wurde mit 0,4 mM IPTG bei OD600 = 0,6 induziert und die Zellen wurden 2 Stunden nach der Induktion geerntet. Nach der Sammlung ließ man die exprimierten Proteine auf Novex 12% Tris-Gycin-SDS-Gelen laufen, welche mit Coomassie gefärbt und entfärbt wurden. Die Proenzym-Bande von Cathepsin O2, welche durch N-terminates Sequenzieren bestätigt wurde, wurde herausgeschnitten. Das Protein wurde aus den Gelscheiben mittels Elektrophorese eluiert und auf einen Centricon10 angereichert, welcher mit 1 × Elutionspuffer vorbehandelt wurde. Das Antigen wurde in 1 × PBS auf 1 ml aufgefüllt und zur Immunisierung verwendet (EL Labs, Soquel, CA).
Die Antikörper wurden aus dem Gesamtserum mit Acetontrockenpulver, welche gegen eine induzierte Kultur von BL21(DE3) gerichtet sind, hergestellt, und durch Affinitätsbindung zu dem Antigen auf Nitrocellulose und zur Elution davon gereinigt. Die gereinigten Antikörper waren für humanes Procathepsin O2, den Proabschnitt und für das reife Enzym spezifisch und wiesen in einer Western Blot-Analyse bei einer Verdünnung von 1:2000 keine Kreuzreaktivität mit den humanen Cathepsinen S, L und B auf.
Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete humane Gewebeschnitte (Biogenex, San Ramon, CA) wurden wie kürzlich beschrieben hergestellt (Cattoretti et al., 1992) und mit Kontrollkaninchen-IgG oder Affinitäts-gereinigten Anticathepsin O2-Antikörpern unter Verwendung des StrAviGen-Nachweissystems (Biogenex) gefärbt. Die Schnitte wurden mit Mayer's Hämatoxylin gegengefärbt.
Immunofärbung eines Osteoklastoms zeigte eine intensive spezifische Färbung von mehrkernigen Osteoklasten, während Stromazellen keine Reaktion aufwiesen (11). Intensive immunohistochemische Färbung von Osteoklasten wurde auch in pränatalen humanen Knochen beobachtet (Daten nicht gezeigt). In der Lunge wurde Cathepsin O2 an zwei Stellen nachgewiesen; erstens in Makrophagen der Lungenalveolen und zweitens in Bronchiolarepithelzellen. Cathepsin O2 wurde auch in Epithelzellen von Magendrüsen im Magen, von Darmdrüsen im Dickdarm, von proximalen und distalen Tubuli in der Niere und in dem Epithel der Gebärmutterdrüsen in dem Endometrium nachgewiesen. Darüber hinaus weisen sowohl Kupferzellen in der Leber als auch sich entwickelnde Spermien im Hoden eine starke Färbung gegenüber Cathepsin O2 auf. Eine einheitlichere Färbung wurde in der Nebennierenrinde, im Eierstock und in der Plazenta beobachtet (11).
Auf ähnliche Art und Weise werden polyklonale Antikörper gegen den elektrophoretisch einheitlichen Proabschnitt von humanem Cathepsin O2 und monoklonale Antikörper gegen den Proabschnitt, gegen Procathepsin O2 und gegen reifes Cathepsin O2 durch Standardtechniken hergestellt.
Beispiel 5
Charakterisierung von humanem Cathepsin O2
Die folgenden Experimente wurden mit dem teilweise gereinigten humanen Cathepsin O2 aus Beispiel 2 durchgeführt.
pH Aktivitätsprofil und pH-Stabilität von rekombinantem humanen Cathepsin O2
Die pH-Stabilität von Cathepsin O2 wurde durch Inkubation der aktiven Protease bei verschiedenen pH-Werten in Gegenwart von 5 mM Dithioerythreitol und 5 mM EDTA bei 25 °C bestimmt. Die Restaktivität wurde in Zeitabschnitten unter Verwendung des oben beschriebenen fluorimetrischen Substratassays gemessen.
Anfängliche Hydrolysegeschwindigkeiten des Substrates wurden wie oben beschrieben überwacht. Das pH-Aktivitätsprofil von humanem Cathepsin O2 wurde bei 1 μM Substrat (Z-FR-MCA)-Konzentration erhalten ([S] <<K_m, wobei die anfängliche Geschwindigkeit v₀ zu dem k_kat/K_m-Wert direkt proportional ist). Die folgenden Puffer wurden für das pH-Aktivitätsprofil verwendet: 100 mM Natriumcitrat (pH-Wert 2,8–5,6) und 100 mM Natriumphosphat (pH-Wert 5,8–8,0). Alle Puffer enthielten zur Minimierung der Schwankung der Ionenstärke 1 mM EDTA und 0,4 M NaCl. Ein Dreiprotonierungs-Modell (Khouri et al., Biochem. 30:8929–8936 (1991)) wurde für die Regressionanalyse der pH-Aktivitätsdaten mit Hilfe der Fehlerquadratmethode verwendet. Diese Daten wurden auf die folgende Gleichung angepasst. (kkat/Km)obs = (kkat/Km)/([H+]/K1 + 1 + K2/[H+])
Die pH-Stabilität der Cathepsine O2, S und L wurde bei drei verschiedenen pH-Werten untersucht. Die rekombinanten humanen Cathepsine O2, S und L wurden bei 37 °C in 100 mM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,5, in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5 und in 100 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, enthaltend 5 mM Dithiothreitol und 2,5 mM EDTA, inkubiert. Bei Inkubation für 0,5, 1, 2 und 4 Stunden wurde die verbleibende Aktivität unter Verwendung von 5 μM Z-FR-MCA für Cathepsin O2 (100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5) und Cathepsin L (100 mM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,5) und 5 μM ZVVR-MCA für Cathepsin S (100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5) bestimmt.
pH-Aktivitätsprofile stellen empfindliche Maße für die enzymatische funktionelle und strukturelle Integrität dar. Ein Vergleich der pH-Profile aus unterschiedlichen, aber verwandten Proteasen zeigt Unterschiede in der intrinsischen Aktivität und Stabilität dieser Proteasen. Humanes Cathepsin O2 weist ein glockenförmiges pH-Wertprofil mit angrenzenden pK-Werten von 4,0 und 8,13 auf (Tabelle 2; 5).
Tabelle 2
pK-Werte des pH-Aktivitätsprofils von rekombinantem humanen Cathepsin O2 im Vergleich zu pK-Werten, die für die Cathepsine S und L und Papain beschrieben wurden

^a berechnet aus (pK₁ + pK₂)/2
^b aus Brömme et al., 1993, oben
^c aus Khouri et al., 1991, oben

Das pH-Optimum von humanem Cathepsin O2 lag zwischen 6,0 und 6,5 und ist mit demjenigen, welche für Cathepsin S beobachtet wurde, vergleichbar (Brömme et al., oben, 1993). Die Breite des pH-Profils, welche die Stabilität des Ionenpaars wiedergibt (Menard et al., Biochem. 30:5531–5538 1991)), beträgt für Cathepsin O2 4,15, für Cathepsin S jedoch nur 3,35 (Brömme et al., 1993, oben). Dieser Parameter für humanes Cathepsin O2 ist demjenigen ähnlicher, der für das sehr stabile Papain beobachtet wurde, welches eine Profilbreite von 3,91 aufweist (Khouri et al., oben, 1991).
Humanes Cathepsin O2 war bei schwach sauren bis neutralen pH-Werten stabiler als Cathepsin L, jedoch weniger stabil als Cathepsin S (Tabelle 3).
Tabelle 3 pH-Stabilität von rekombinantem humanen Cathepsin O2 bei 37 °C im Vergleich mit rekombinanten humanen Cathepsinen S und L
Nach ca. 1 Stunde blieb bei 37 °C und einem pH-Wert von 6,5 ca. 50% der Cathepsin O2-Aktivität übrig, während unter diesen Bedingungen im Wesentlichen keine Cathepsin L-Aktivität beobachtet werden konnte.
Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass die pH-Stabilität ohne Schutz des Substrates bestimmt wurde, welches üblicherweise die pH-Stabilität erhöht. In dem ³H-Elastinabbauassay mit Cathepsin O2 wurde ein Anstieg der solubilisierten ³H-Fragmente nach 2 Stunden bei einem pH-Wert von 7,0 noch immer beobachtet.
Hemmstoffprofil von rekombinantem humanen Cathepsin O2
Der Wirkungsgrad der spezifischen Inhibitoren der Klasse der Proteasen bei der Hemmung von Cathepsin O2 wurde durch Zugabe des Hemmstoffes zu dem gereinigten Enzym in einem fluorimetrischen Enzymassay (oben beschrieben) bestimmt.
Humanes Cathepsin O2 weist ein übliches Hemmstoffprofil einer Cysteinprotease auf. Es wird durch Cysteinproteasehemmstoffe und durch Hemmstoffe von sowohl Cystein- als auch Serinproteasen (Tabelle 4) gehemmt. Bei Konzentrationen über 0,1 μM hemmen Peptidaldehyde, Diazomethane, E-64 und Hühnercystatin die Enzymaktivität vollständig. Andererseits beeinträchtigten spezifische Serin- und Asparagin-Proteasehemmstoffe die Enzymaktivität nicht. Es wurde keine Wirkung von EDTA auf die Aktivität von Cathepsin O2 bei einer Konzentration von 4 mM beobachtet. Bei höheren Konzentrationen (> 5 mM) wurde eine teilweise unspezifische Hemmung beobachtet.
Tabelle 4 Hemmstoffprofil von rekombinantem humanen Cathepsin O2
Cathepsin O2-Aktivität wird nur durch spezifische Cysteinprotease-Hemmstoffe gehemmt.
Substratspezifität von rekombinantem humanen Cathepsin O2
Die Substratspezifität gegenüber synthetischen Substraten wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Substratassays bestimmt.
Die S₂P₂-Spezifität von humanem Cathepsin O2 wurde unter Verwendung synthetischer Substrate vom Typ Z-X-R-MCA mit X gleich F, L, V oder R charakterisiert. Die S₂-Bindungstasche der Cysteinproteasen ist strukturell gut definiert und bestimmt die primäre Spezifität dieser Proteaseklasse. Zum Beispiel enthält Cathepsin B einen Glutamat (E245)-Rest im unteren Teil der S₂-Bindungstasche, was die Bindung von basischen Resten wie Arginin begünstigt. Dieser Glutamatrest wird in allen anderen bekannten humanen Cathepsinen durch neutrale Reste ersetzt, was zu einer sehr niedrigen Hydrolysegeschwindigkeit des Z-R-R-MCA-Substrats führt. Cathepsin O2 enthält in Position 205 einen Leucinrest, was Z-R-R-MCA zu einem sehr schlechten Substrat macht (6). Die Spezifität von Cathepsin gegenüber P₂-Resten ähnelt derjenigen von Cathepsin S. Beide Enzyme bevorzugen in dieser Position ein Leucin gegenüber einem Phenylalanin, während Cathepsin L durch eine inverse Spezifität charakterisiert ist (Tabelle 5, 6). Valin in Position P₂ wird von Cathepsin O2 verhältnismäßig gut angenommen, während das Vorliegen dieses Beta-verzweigten Restes im P2 zu einem schlechten Substrat für die Cathepsine L, S und B führt.
Tabelle 5 Kinetische Parameter für die Z-X-R-MCA-katalysierte Hydrolyse durch rekombinantes humanes Cathepsin O2
Für die Berechnung der kinetischen Parameter k_kat und K_m wurden die anfänglichen Geschwindigkeiten üblicherweise bei 9 bis 11 verschiedenen Substratkonzentrationen erhalten und die Ergebnisse auf die Gleichung (1) angepasst. Die Enzymkonzentration wurde durch Titration des katalytischen Zentrums mit E-64 bestimmt (Kinder et al., Biochem. J. 201:367–372 (1982)).
Die katalytische Wirksamkeit (k_kat/K_m) von Cathepsin O2 gegenüber Dipeptidsubstraten war derjenigen der Cathepsine S und B vergleichbar, sie lag jedoch ca. eine Größenordnung niedriger als diejenige von Cathepsin L. Interessanterweise waren die K_m-Werte für Cathepsin O2 mit denjenigen, die für Cathepsin L bestimmt wurden, vergleichbar. Der K_m-Wert gibt die Affinität der Substrate zu der Protease teilweise wieder. Diese Tendenz ist für das Tripeptidsubstrat Z-LLR-MCA weitaus offensichtlicher, welches einen niedrigen K_m-Wert von 4 × 10^–7 M aufweist (Tabelle 5). Im Gegensatz zu den Cathepsinen S und L liegen die k_kat-Werte für Cathepsin O2 fast zwei Größenordnungen niedriger, was eine Bindung wiedergeben könnte, die nicht zum Produkt führt.
Aktivitäten von rekombinantem humanen Cathepsin O2 gegenüber extrazellulären Matrixproteinen
[³H]Elastin wurde wie beschrieben hergestellt (Banda et al., Methods Enzymol. 144, 288–305 (1987)) und wies eine spezifische Aktivität von 113 000 cpm/mg Protein auf. Elastin (2 mg) wurde für die Cathepsin O2-, S- und L-Assays in 1 ml Puffer, der 2,5 mM Dithiothreitol, 2,5 mM EDTA und 0,05% Triton X-100 enthielt, inkubiert. Teilmengen wurden nach 10, 20, 30, 50, 90, 120 und 180 min entnommen, für 1 min bei 14 000 × g zentrifugiert und in einer 24 Well-Platte, die Szintillationsfluid enthielt, mit dem Flüssigszintillationszähler gezählt (1450 Microbeta Plus, Wallac/Pharmacia). Konzentrationen der humanen Cathepsine O2, S und L sowie Rinderelastase betrugen in dem Elastinabbauassay jeweils 65 nM, 28 nM, 80 nM und 80 nM. Um die Wirkung des pH-Wertes auf die Proteaseaktivität zu bestimmen, wurde der Verdau bei den pH-Werten 4,5 und 5,5 (100 mM Natriumacetat, jeweils 2,5 mM Dithiothreitol und EDTA, 0,05% Triton X-100) und bei einem pH-Wert von 7,0 (100 mM Tris/HCl, jeweils 2,5 mM Dithiothreitol und EDTA, 0,05% Triton X-100) ausgeführt. Pankreaselastase aus Rind (Boehringer, Mannheim, IN) wurde unter denselben Bedingungen untersucht mit der Ausnahme, dass weder Dithiothreitol noch EDTA zu dem Inkubationsgemisch zugegeben wurde.
Die Höchstaktivität wurde bei einem pH-Wert von 5,5 beobachtet. Cathepsin O2 weist zwischen einem pH-Wert von 4,5 bis 7,0 eine elastinolytische Aktivität auf, die 1,7 bis 3,5 mal höher ist als diejenige von Cathepsin S. Seine elastinolytische Aktivität bei dem pH-Optimum von Cathepsin L (pH-Wert 5,5) und bei neutralem pH-Wert war im Vergleich zu Cathepsin L und zur Pankreaselastase fast 9 mal bzw. 2,4 mal höher (7). Die für Cathepsin L und S bestimmten Werte stehen in guter Übereinstimmung mit den veröffentlichten Daten (Kirschke et al., in: Proteolysis und Protein Turnover (Bond, J. S. und Barrett, A. J. Hrsg.) S. 33–37, Portland Press, London und Chapel Hill (1993), Kirschke und Wiederanders, Methods Enzymol. 244, 500–511 (1994)).
Lösliches Typ I-Hautkollagen vom Kalb wurde auf 0,4 mg/ml in 100 mM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,5, 5,0, 5,5, in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, 6,5 und 100 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,0, enthaltend 2 mM-Dithiothreitol/2 mM-EDTA verdünnt. Die humanen Cathepsine O2, S und L und Rindertrypsin (Sigma) wurden bei Konzentrationen von 100 nM Enzymkonzentration für 10 Stunden bei 28 °C inkubiert. Um die Gelatinaseaktivität der Cathepsine O2 und S zu messen, wurde Typ I-Kollagen vor der Inkubation mit der Protease für 10 min bei 70 °C erwärmt. In Gegenwart von 1 nM Proteasen wurde das Reaktionsgemisch für 30 min bei 28 °C inkubiert. Die Proben wurden SDS-Polyacrylamidelektrophorese unter Verwendung von 4–20% Tris-Glycingelen (Novex, San Diego, CA) unterzogen.
CathepsinO2baute Type I-Kollagen zwischen den pH-Werten 5,0 und 6,0 bei 28 °C weitgehend ab, während der Abbau bei dem pH-Wert 4,5 und dem pH-Wert 7,0 weitaus weniger ausgeprägt ist (9a). Die Primärspaltung schien in der Telopeptidregion aufzutreten, da die Alpha-Monomere, die aus den Beta- und Gamma-Bestandteile freigesetzt wurden, etwas kleiner waren. Zusätzliche Spaltung kann auch innerhalb der Alpha-Monomere auftreten. Es ist noch unklar, ob die Spaltung in der intakten helikalen Region oder in entwirrten Alpha-Monomeren auftritt. Hauptfragmente von Typ I-Kollagen, die nach der Einwirkung von Cathepsin O2 beobachtet wurden, wiesen die Größe von 70 bis 80 kDa auf. Cathepsin L spaltete auch in der Telopeptidregion, es wurden jedoch Fragmente mit keinem wesentlich kleineren Molekulargewicht nachgewiesen. Der effektive pH-Bereich für die kollagenolytische Aktivität von Cathepsin L ist im Vergleich zu demjenigen, der für Cathepsin O2 beobachtet wurde, saurer (zwischen einem pH-Wert von 4,0 und 5,5). Cathepsin S schien nur eine sehr schwache kollagenolytische Aktivität zu zeigen. Im Gegensatz dazu spalten Gewebekollagenasen die Alpha-Monomere in 3/4- und 1/4-Fragmente (Gross und Nagai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54, 1197–1204 (1965)). Mit Trypsin wurde bei gleicher Enzymkonzentration im Vergleich zu Cathepsin O2 kein Abbau von Typ I-Kollagen beobachtet, was zeigt, dass die Integrität der Tripel-Helix des verwendeten Kollagens nicht beeinträchtigt war (Daten nicht gezeigt).
Zusätzlich zu seiner Kollagenaseaktivität weist Cathepsin O2 eine starke Gelatinaseaktivität auf. Bei 0,1 nM Enzymkonzentration wurde denaturiertes Kollagen innerhalb von 30 min innerhalb eines pH-Bereichs von 5,0 bis 7,0 vollständig abgebaut. Im Gegensatz dazu wies Cathepsin L nur in dem pH-Bereich zwischen 4,5–5,5 eine Gelatinaseaktivität auf (6 b). Cathepsin S war zwischen den pH-Werten 4,0 und 7,0 aktiv, wies aber eine wesentlich schwächere Aktivität als die Cathepsine O2 und L auf.
Im Vergleich zu Rinderpankreaselastase relative elastinolytische Aktivitäten von Cathepsinen
Gewebeverteilung von humanem Cathepsin O2 auf mRNA-Ebene
Die Gewebeverteilung des mRNA-Spiegels der humanen Cathepsine O2, L und S wurde durch Nothern Blotting unter Verwendung von cDNA-Sonden der geeigneten humanen Enzyme bestimmt. Die Sonden waren ca. 450 Basenpaare lang und erstreckten sich über die Region, die für die Reste zwischen den Gruppen in dem katalytischen Zentrum Cystein-25 (gemäß der Papainnummerierung) und Asparagin-175 kodiert. 8 zeigt für humanes CathepsinO2Northern Blots. Wie in 8 gezeigt, weisen die mRNA-Spiegel in humanen Osteoklastomenzubereitungen einen vielfach höheren Expressionsspiegel von Cathepsin O2 als Cathepsin L auf.
Die Gewebeverteilung von humaner Cathepsin O2-mRNA zeigte einige Ähnlichkeiten zu Cathepsin L, ihre Gewebekonzentration schien jedoch in den meisten Organen wesentlich niedriger zu sein (Herz, Plazenta, Lunge, Pankreas und Niere). Andererseits wies humanes Cathepsin O2 bemerkenswerte Unterschiede in seiner Verteilung in humanen Geweben und Zelllinien im Vergleich zu den humanen Cathepsinen L und S auf. Cathepsin O2 zeigte im Eierstock, im Dünndarm und Dickdarm hohe Transkriptionsspiegel auf, aber keine mRNA in der Leber, welche reich an Cathepsin L ist. Es wurde auch in HeLa-Zellen gefunden.
Verteilung in Gewebe und Zelllinien (Northern Blotting)
Sequenzprotokoll

Claims

Rekombinantes Cathepsinprotein mit einer Polypeptidsequenz, die aus den Aminosäuren 115–329 der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz besteht, wobei das rekombinante Cathepsinprotein Cysteinproteaseaktivität aufweist.
Rekombinantes Cathepsinprotein mit einer Polypeptidsequenz, die von den Nukleotiden 484 bis 1128 der in 1 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert ist, wobei das rekombinante Cathepsinprotein Cysteinproteaseaktivität aufweist.
Rekombinantes Cathepsinprotein nach Anspruch 1 oder 2, das mit einem heterologen Polypeptid fusioniert ist.
Zusammensetzung umfassend das Protein von Anspruch 1 oder 2.