HU220960B1 - Enzimatikusan aktív rekombináns katepszin-fehérjék - Google Patents

Description

A találmány tárgyát enzimatikusan aktív rekombináns katepszin-fehérjék képezik.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható különböző csontrendellenességek kezelésére.

A katepszinek a ciszteinproteázok papaincsaládjához tartoznak. A cisztein- vagy tiolproteázok cisztein-, hisztidin- és aszparagincsoportokat tartalmaznak a proteolízisért felelős aktív centrumban. Ez a proteázcsalád egy glutamincsoportot is tartalmaz az oxi-anionos zsebben.

Nemrégiben a ciszteinproteázokról kimutatták, hogy DNS-hez kötődnek feltételezhetően transzkripciós faktoraktivitással [Xu és munkatársai, J. Bioi. Chem. 269(33), 21 177-21 183 (1994)], és mint tartós immunszupresszorok [Hamajima és munkatársai, Parasite Immunology 16, 261 (1994)].

Számos állati eredetű katepszint azonosítottak és szekvenáltak már. Például a katepszin-S-t klónozták patkányból [Petanceska és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267, 26 038-26 043 (1992)], és emberből [Wideranders és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267, 13 708-13 713 (1992); Shi és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267, 7258-7262 (1992)]. A katepszin-L-t emberből, patkányból, egérből és csirkéből klónozták [Gál és munkatársai, Biochem. J. 253, 303-306 (1988); Ishidoh és munkatársai, FEBS Lett. 223, 69-73 (1987); Joseph és munkatársai, J. Clin. Invest. 81, 1621-1629 (1988); Ritonja és munkatársai, FEBS Lett. 283, 329-331 (1991)]. A katepszin-H-t emberből és patkányból klónozták [Fuchs és munkatársai, Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 369-375 (1988); Fuchs és munkatársai, Nucleic Acid Rés. 17, 9471 (1989); Whittier és munkatársai, Nucleic Acid Rés. 75, 2515-2535 (1987)]. A katepszin-B-t emberből és egérből klónozták [Ferrara és munkatársai, FEBS Lett. 273, 195-199 (1990); Chan és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7721-7725 (1986)].

Nemrégiben nyúleredetű oszteoklasztokból klónoztak egy ciszteinproteázt, amely a katepszin-L- és S-sel rokon szerkezetű [Tezuka és munkatársai, J. Bioi. Chem. 269(2), 1106 (1994)].

A katepszinek a természetben nagyon sokféle szövetben megtalálhatók. Például a katepszin-L megtalálható szívben, agyban, placentában, tüdőben, vázizomban, vesében, májban, herében és hasnyálmirigyben. A katepszin-S megtalálható tüdőben, májban, lépben és vázizomban.

A katepszinek számos megbetegedésben játszanak szerepet. Például a katepszin-B- és L-hez hasonló enzimek szabadulnak fel tumorokból és a tumor metasztázisában lehet szerepük. A katepszin-L beteg emberi ízületi nedvben és transzformált szövetekben van jelen. Ehhez hasonlóan, a katepszin-B és más lizoszomális proteázok felszabadulása figyelhető meg polimorfonukleáris granulocitákból és makrofágokból trauma és gyulladás esetén. A katepszineknek az ízületi gyulladásban is szerepük van. Ezenkívül a katepszinek abnormálisán magas szinten fordulnak elő tumorsejtvonalakban.

A ciszteinproteázoknak a csont-újjáalakításban is van szerepük. A csont-újjáalakítás a csontképződést és a csontlebomlást (reszorpciót) összekapcsoló folyamat, a csontnövekedés része. Csontlebomláson a demineralizációt és az extracelluláris mátrixfehéijék degradációját értjük [Delaisse és munkatársai, Biochem. J. 279, 167-174 (1991)]. Az I. típusú kollagén alkotja az organikus mátrix 99 százalékát [Krane és munkatársai, „Scientific American Medicine”-ben (szerk. Rubensttein, E. és Federman, D. D.), 3, „15 Rheumatism, XI Boné Formádon and Resorption”, 1-26, Scientific American, Inc., New York]. A kötőszöveti kollagenáz mellett a katepszin-B és -L nevű lizoszomális ciszteinproteázokról feltételezzük, hogy szerepet játszanak a csontlebomlásban [Delaissé és munkatársai, lásd fent (1991)]. Mindkét enzim jelen van a lizoszómákban, és az oszteoklaszt savas extracelluláris reszorpciós hézagaiban is [Goto és munkatársai, Histochemistry 99, 411-414 (1993)], és mindkét proteáz képes in vitro degradálni az I. típusú kollagént savas pH-n [Maciewicz és munkatársai, Collagen Rel. Rés. 7, 295-304 (1987), Delaissé és munkatársai, lásd fent (1991)]. A ciszteinproteáz-inhibitorok, mint például az E-64 és a leupeptin, meggátolják az oszteoklasztikus csontlebontást [Delaisse és munkatársai, Boné 8, 305-313 (1987); Everts és munkatársai, Calcif. Tissue Int. 43, 172-178 (1988)]. A katepszin-L az egyik olyan proteáz, amely a csontban szerepet játszik a kollagén degradációjában [Maciewiecz és munkatársai, Biochem. J. 256, 433-440 (1988); Kakegawa és munkatársai, FEBS Lett. 321, 247-250 (1993)].

A csont anyagának szilárd állapota a hidroxiapatit és más csontban található kalcium-foszfát-sók rossz oldhatóságának köszönhető fiziológiás pH-η, de a csont savas pH-η lebomolhat.

Az oszteoklasztok multinukleáris sejtek, amelyek kulcsszerepet játszanak a csontlebomlásban. A csont felszínéhez kapcsolódva az oszteoklasztok savas mikrokömyezetet alakítanak ki egy szigorúan meghatározott kapcsolódáson („tightly defined junction”) keresztül, amely a specializálódott oszteoklaszt-határmembrán és a csontmátrix között alakul ki, így lehetővé téve a csontmátrix lokális szolubilizálását. Ez viszont elősegíti a demineralizált csonteredetű kollagén proteolízisét.

Feltételezik, hogy a ciszteinproteázok kollagenolitikus hatása elsősorban a csontreszorpciós hézag legsavasabb részében érvényesül, közel a recés határhoz („ruffled bordér”), körülbelül 3,5 vagy 4,5 pH-η, minthogy a Zn-tartalmú kollagenázok aktívabbak semleges környezetben a demineralizált és mineralizált mátrix határfelületénél [Delaisse és munkatársai, lásd fent, (1991)]. A katepszin-L és -B mellett sokféle katepszinL- és -B-szerű aktivitás vehet részt a kollagenolitikus csontdegradációban. Page és munkatársai [Biochim. Biophys. Acta 1116, 57-66 (1992)] a katepszin-B többféle formáit izolálták oszteoklasztómákból. Ezeknek savas pH-optimuma van, és képesek degradálni a szolubilis és a nem szolubilis I. típusú kollagént. Delaisse és munkatársai [lásd fent (1991)] azonosítottak egy csontszövetből származó 70 kD méretű tiolfüggő proteázt, amely szintén képes volt degradálni az I. típusú kollagént.

A ciszteinproteáz-inhibitorokról kimutatták, hogy gátolják az oszteoklasztikus csontlebomlást a kollagén rostok degradációjának gátlásával. A katepszin-B, -L,

HU 220 960 Β1

-N és -S képes degradálni az I. típusú kollagént savas pH-η. Három katepszinszerű proteázt izoláltak egérkoponyából, feltételezhetően katepszin-B-t és -L-t, és egy katepszin-L-szerű proteázt [Delaisse és munkatársai, Biochem. J. 279, 167 (1991)]. Mégsem világos, hogy tulajdonképpen milyen ciszteinproteázt termelnek az oszteoklasztok.

Nemrégiben egy új emberi ciszteinproteázt kódoló cDNS-t klónozott függetlenül néhány kutatócsoport [Shi és munkatársai, FEBS Lett. 357, 129-134 (1995); Inaoka és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 206, 89-96 (1995); Brömme és Okamoto, Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 376, 379-384 (1995)] és katepszin-O- katepszin-K- és katepszin-O2-vel jelölték azokat, sorrendben.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki egy új rekombináns katepszin, a katepszin02 előállítását, ennek változatait, és a katepszin-O2 termelését hasznosítható mennyiségben rekombináns DNS-technika alkalmazásával.

Az előbb említett célokkal összhangban, a találmány tárgyát enzimatikusan aktív rekombináns katepszin-fehérjék képezik.

Az 1A. és IB. ábra a humán katepszin-O2-cDNS nukleotidszekvenciáját (1. az. számú szék.) és az ebből származó aminosavszekvenciát (2. az. számú szék.) ábrázolja. Az aminosavszekvencia (2. az. számú szék.) egybetűs kóddal került a nukleotidszekvencia (1. az. számú szék.) alá. Az aktív centrum csoportjai (C25, H159 és N159; papainszámozás szerint) vastagon vannak szedve, és a potenciális N-glikozilálási helyek egyszer alá vannak húzva. A nyilak a feltételezett poszttranszlációs hasítóhelyeket mutatják a preszignál és a prorégió között, valamint a prorégió és az érett enzim között. A hasítást a prorégió és az érett enzim között fehéijeszekvenálással igazoltuk (kettős aláhúzás).

A 2A. és 2B. ábrák, többek között, a humán katepszin-O2 (2. az. számú szék.), humán katepszin-S (4. az. számú szék.), -L (5. az. számú szék.) és a nyúleredetű C2 (3. az. számú szék.) aminosavszekvenciájának egymás alá rendezését mutatják; a * jelzi az aktív centrum csoportjait; a vastag betűk mutatják a papaincsalád minden ismert ciszteinproteázának konzervatív csoportjait. Mind a hat proteázban az azonos aminosavakat nagybetűvel írtuk a konszenzus szekvenciában, és a hat közül öt proteázban azonos aminosavakat kisbetűvel irtuk. A hiányokat kötőjellel jelöltük. A számok mindegyik vonalban az utolsó aminosav helyzetét mutatják, és a nyilak a feltételezett poszttranszlációs hasítási helyet.

A 3. ábra prokatepszin-02 pepszinnel végzett érési folyamatát mutatja. A prokatepszin-02-t tartalmazó tenyészet felülúszójából vett aliquotokat pepszinnel (0,4 mg/ml) inkubáltuk 40 °C-on 100 mM nátriumacetát-pufferben, pH 4,0-en. Az inkubációt mintapuffer hozzáadásával állítottuk le. Az emésztési idők a jelölésnek megfelelőek voltak. A molekulasúly-standardokat a bal margón jelöltük.

A 4. ábra a tisztított rekombináns humán katepszin02 SDS-PAGE képét mutatja (Coomassie Blue festés). 1. sáv: nyers Sf9-frakció; 2. sáv: n-Butyl fást

Flow után; 3. sáv: Mono S után. A molekulasúlystandardok a jobb oldali sávban láthatók.

Az 5. ábra a rekombináns humán katepszin-O2 aktivitásának pH-fuggését ábrázolja. A k^/K™ értékeket a Z-FR-MCA hidrolízisének mért kezdeti sebességeiből kaptuk, és azt elosztottuk az enzim- és szubsztrátkoncentrációval.

A 6. ábra k^/K™ értékeket ábrázolja a Z-X-R-MCA hidrolízisére a katepszin-O2-, -S-, -L- és -B-enzimekkel (a legjobb szubsztrátra normalizálva, ennek értéke 1). A katepszin-O2-re (Z-LR-MCA) 257 900 M^_1s^_1: katepszin-S-re (Z-LR-MCA) 243 000 M^s-b katepszinL-re (Z-FR-MCA) 5 111 000 M^s-L katepszin-B-re (Z-FR-MCA) 460 000 M-'s^-1 (a katepszin-S-re, -L-re és -B-re vonatkozó adatok Brömme és munkatársaitól származnak, 1994).

A 7. ábra a rekombináns humán katepszin-02 elasztinolitikus aktivitását mutatja pH 4,5-n, 5,5-n és 7,0-n, a katepszin-S-sel, -L-lel és pankreászeredetű elasztázzal összehasonlítva. A szubsztrát ³H-jelölt inszolubilis elasztin volt.

A 8. ábra a humán katepszin-O2, -L és -S Northemblot-analízisét mutatja oszteoklasztóma-mintákban. 1. csík: páciens mintája (szálas és sejtes szövet); 2. csík:

2. páciens (sejtes szövet); 3. csík: 2. páciens (szálas szövet). A nitrocellulóz biotokat 32P-jelölt katepszin-O2-, -L- és -S-próbákhoz hibridizáltuk.

A 9A. és 9B. ábra az I. típusú kollagén (boíjúbőrből izolált oldható kollagén) SDS-PAGE-t ábrázolja humán rekombináns katepszin-O2, -L és marhaeredetű tripszin emésztése után. A 9A. ábrán a kollagenáz aktivitást ábrázoljuk: az oldható borjúbőrből izolált kollagén emésztése humán katepszin-O2-vel, -S-sel és -Llel (mindegyik 50 nM koncentrációban) 12 óráig, 28 °C-on és a következő pH-kon: 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0. A reakciót 10 μΜ Ε-64-gyel állítottuk le. A kezeletlen oldható kollagént vettük standardnek (S). A 9B. ábrán a zselatináz aktivitást ábrázoljuk: denaturált oldható boíjúbőrből izolált kollagén (10 perc előmelegítés 70 °C-on) emésztése humán katepszin-O2-vel (0,1 nM), katepszin-L-lel (0,2 nM) és humán katepszin-S-sel (1 nM) 28 °C-on a következő pH-kon: 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 és 7,0. A molekulasúly-standardok a bal csíkban találhatók.

A 10. ábra a humán katepszin-O2 előtagjának („propart”) tisztítását követő SDS-PAGE-t mutatja be.

A 11A., 11B., 11C., 11D., 11E., 11F„ 11G., 11H., 11L, 11J., 11K.. és 11L. ábra a humán katepszin02 immunohisztokémiai festését ábrázolja humánszövetekben. (A) oszteoklasztóma, (B) tüdómakrofágok, (C) bronchiólusz, (D) endometrium, (E) gyomor, (F) vastagbél, (G) vese, (H) placenta, (I) máj, (J) petefészek, (K) mellékvese, (L) here.

A találmány tárgyát újfajta katepszin-02-fehérjék és nukleinsavak képezik.

A találmány szerinti katepszin-02-fehéijéket sokféleképpen lehet azonosítani. A katepszin-O2-nukleinsavakat vagy a katepszin-O2-fehérjéket eredetileg az 1. ábrán bemutatott szekvenciákkal lényegében homológ nukleinsav- és/vagy aminosavszekvenciákkal azonosítot3

HU 220 960 Bl ták. Ilyen homológia a nukleinsav- vagy aminosavszekvencia egészére alapulhat.

A találmány szerinti katepszin-02-fehérjék a többi katepszinnel korlátozott homológiát mutatnak. Például az érett emberi katepszin-O2 durván 59%-os homológját mutat az érett emberi katepszin-L-lel, 58%-os homológiát az érett emberi katepszin-S-sel, 26%-os homológiát az érett emberi katepszin-B-vel és 47%-os homológiát az érett emberi katepszin-H-val. Ezenfelül a humán katepszin-O2 előtagja („propart”) 38%-os homológiát mutat a humán katepszin-L előtagjával, 51%-os homológiát a humán katepszin-S előtagjával, 13%-os homológiát a humán katepszin-B előtagjával és 23%-os homológiát a humán katepszin-H előtagjával. Ezenkívül a humán katepszin-02-fehérje durván 90%-os homológiát mutat a nyúleredetű oszteoklaszt-fehérjével.

A leírás vonatkozásában egy fehérjét akkor tekintünk „katepszin-O2-fehérjének”, ha a fehéijeszekvencia teljes egésze homológ az 1. ábrán bemutatott szekvenciával, előnyösen legalább 90%-osan, még előnyösebben legalább 95%-osan és a legelőnyösebben legalább 98%osan. A homológiát a technika állásának megfelelően határozzuk meg, például a „Best Fit sequence” nevű program alkalmazásával, Devereux és munkatársai szerint [Nucl. Acid. Rés. 12, 387-395 (1984)]. A szekvenciák egymás alá rendezésénél nem egyező szakaszok fordulhatnak elő. Ezenkívül az olyan szekvenciák esetén, amelyek vagy több vagy kevesebb aminosavat tartalmaznak, mint az 1. ábrán bemutatott fehérje, a százalékos homológiát a homológ aminosavaknak az összes aminosavra vonatkoztatott aránya alapján határozzuk meg. így például az 1. ábrán bemutatott szekvenciánál rövidebb szekvenciák homológiáját, ahogyan később tárgyaljuk, a rövidebb szekvenciában található aminosavak száma alapján határozzuk meg.

A találmány szerinti katepszin-02-fehéijék előnyösen humán katepszin-02-fehérjék.

A találmány szerinti katepszin-02-fehéijék lehetnek rövidebbek is, mint az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvencia. Ahogyan a 2. példában láthatjuk, a humán katepszin-O2-fehéqén történhet poszttranszlációs módosítás, amely a katepszin-Β-, -S-hez és a papainhoz hasonló [Brömme és munkatársai, J. Bioi. Chem. 268, 4832-4838 (1993); Vemat és munkatársai, J. Bioi. Chem. 266, 21 451-21 457 (1991); Rowan és munkatársai, J. Bioi. Chem. 267,15 993-15 999 (1992)]. Akatepszin-02-fehéije pre-profehérje formájában keletkezik, egy hagyományos „preszekvenciával”, egy „proszekvenciával” vagy előtaggal és az érett szekvenciával. Ezeket az 1. ábrán mutatjuk be, a humán katepszin-O2 szekvenciájával, amelyen látható a pre-, pro- és az érett kódolószekvencia. A „preszekvencia” az 1. ábrán látható szekvencia első 15 aminosavjának felel meg, az előtag („proszekvencia”) a 16-114. (98 db) aminosavaknak felel meg, és az érett fehéije a 115-329. (215 db) aminosavaknak felel meg. A „proszekvencia” vagy az előtag feltételezhetően az enzim inhibitoraként működik, ameddig az enzim nem aktiválódik, amelynek legvalószínűbb oka a pH változása. Az előtag proteolitikus hatása autoproteolízis a papain [Vemet és munkatársai, lásd fent], katepszin-S és katepszin-L esetében. A katepszin-O2 meghatározásába beleértjük a pre-prokatepszin-O2-t, prokatepszin-O2-t, az érett katepszin-O2-t és az előtagot, elkülönítve az érett katepszin-O2-től.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin-02-fehéijék meghatározása tartalmazza az 1. ábrán látható szekvencia részleteit vagy fragmenseit. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint körülbelül 40-200. aminosavak közötti tartomány fragmensei. A fragmensek nem azonosak Tezuka és munkatársai (lásd fent) által ismertetett nyúleredetű oszteoklaszt-fehérjével, és legalább 95-98%-os homológiát mutatnak az emberi katepszin02-fehéijével. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, ha a katepszin-02-fehéijével immunizálunk, amelynek során kapott ellenanyagokat például diagnosztikai célokra alkalmazzuk, a katepszin-02fehéijének legalább egy közös epitópja vagy antigéndeterminánsa van vagy az előtaggal, vagy az 1. ábrán bemutatott érett fehéijével. Az „epitóp” vagy az „antigéndetermináns” kifejezésen a fehéije egy részletét értjük, amely egy ellenanyag képződését és kötődését váltja ki. így a legtöbb esetben a kisebb katepszin-O2-fehéije ellen kifejlesztett ellenanyagok a teljes hosszúságú fehéréhez is képesek kötődni. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az ellenanyagok egyetlen epitóp ellen termelődnek; így az ellenanyagok kicsi vagy semmilyen keresztreakciót sem mutatnak más fehérjékkel, például más katepszin-fehéqékkel, vagy más szervezetekből származó katepszinekkel.

A nukleinsavak esetében, a nukleinsavszekvencia egészére vonatkoztatott homológia együtt változik az aminosavszekvencia homológiájával, de figyelembe kell venni a genetikai kód degeneráltságát és a különböző szervezetek kodonhasználatát. Ennek megfelelően, a nukleinsavszekvencia homológiája kisebb vagy nagyobb lehet a fehérjeszekvencia homológiájánál. így a nukleinsavszekvencia homológiája az 1. ábra szerinti nukleinsavszekvenciához hasonlítva előnyösen nagyobb mint 65%, még előnyösebben nagyobb mint körülbelül 75% és legelőnyösebben nagyobb mint 85%. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint a homológia 95-98% vagy 99%.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsavhomológiát hibridizációs kísérletekkel határozzuk meg. így például azokat a nukleinsavakat, amelyek erősen sztringens körülmények között hibridizálódnak az 1. ábrán bemutatott nukleinsavszekvenciákhoz, katepszin-O2-géneknek tekintjük. Az erősen sztringens körülmény általában 0,1 xSSC-t, 37-65 °Cot jelent.

A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint kevésbé sztringens körülményeket alkalmazunk; a csökkentett sztringencia általában 2 χ SSC-t és 0,1% SDS-t jelent.

A találmány szerinti katepszin-O2-fehérjék és nukleinsavak előnyösen rekombinánsok. A „nukleinsav” kifejezés jelenthet vagy DNS-t, vagy RNS-t, vagy dezoxi- és ribonukleinsavakat egyaránt tartalmazó molekulákat. A nukleinsavak lehetnek genomi eredetű DNS-ek,

HU 220 960 Bl cDNS-ek, szensz és antiszensz nukleinsavakat tartalmazó oligonukleotidok. A nukleinsav meghatározásba kifejezetten beleértjük az antiszensz nukleinsavakat is. Egy antiszensz nukleinsav hibridizálódik az 1. ábrán bemutatott megfelelő nukleinsavszekvencia nem kódoló láncához, de tartalmazhat ribonukleinsavakat és dezoxiribonukleinsavakat is. Általában az antiszensz nukleinsavak úgy működnek, hogy megakadályozzák az mRNS expresszióját, így a katepszin-02-fehérje keletkezését. A nukleinsav lehet dupla szálú, egyszálú, vagy tartalmazhat egyaránt dupla szálú és egyszálú szakaszokból álló szekvenciát.

A „rekombináns nukleinsav” kifejezésen olyan nukleinsavat értünk, amelyet eredetileg in vitro alakítottunk ki, endonukleázokkal manipulálva olyanra, amely természetesen nem fordul elő. Tehát egy izolált katepszinO2-gén, lineáris formában vagy expressziós vektor formájában, amelyet természetes módon nem kapcsolódó DNS-molekulák in vitro ligálásával állítottunk elő, rekombinánsnak tekinthető a találmány célja szempontjából. Nyilvánvaló, ha egyszer egy rekombináns nukleinsavat előállítunk, és visszajuttatunk egy gazdasejtbe vagy szervezetbe, az nem rekombináns módon fog replikálódni, azaz inkább a gazdasejt in vivő celluláris apparátusát használja fel, mint az in vitro manipulációkat; azonban ha az ilyen nukleinsavakat egyszer rekombináns módon állítottunk elő, bár ezt követően nem rekombináns módon replikálódnak, azért még a találmány célja szempontjából rekombinánsnak tekintjük.

Ehhez hasonlóan, egy „rekombináns fehéije” olyan fehéije, amelyet rekombináns technikákkal állítottunk elő, azaz a fent ismertetett rekombináns nukleinsav expressziójával. A rekombináns fehéije legalább egy vagy több tulajdonságban eltér a természetesen előforduló fehérjétől. Például a rekombináns fehéije megtisztítható néhány vagy az összes fehérjétől és szennyező vegyülettől, amelyekkel természetes módon a vad típusú gazdaszervezetben együtt fordul elő. így például azok a katepszin-02-fehéqék, amelyek lényegében teljesen vagy részlegesen tisztítva vannak, vagy sejtektől elkülönítve vannak, rekombinánsnak tekinthetők. A definíció magában foglalja egy bizonyos szervezetből eredő katepszin-O2 előállítását egy másik szervezetben vagy gazdasejtben. Egy másik lehetőség, hogy a fehéije szignifikánsan magasabb koncentrációban állítható elő, mint ahogy természetesen megfigyelhető, indukálható promoter vagy magas expressziós szintre képes promoter alkalmazásával, így a fehérje megnövekedett koncentrációja érhető el. Egy újabb lehetőség, hogy a fehérjét olyan formában állítjuk elő, amelyben természetesen nem fordul elő, például egy epitóp szakasz hozzákapcsolásával vagy aminosav szubsztitúciójával, inszerciójával és deléciójával.

A katepszin-02-fehéije meghatározásán értünk más szervezetből származó katepszin-02-fehérjéket is, amelyek klónozását és expresszióját a későbbiekben ismertetjük.

Antiszensz nukleinsavak esetében, egy antiszensz nukleinsav úgy határozható meg, hogy az hibridizálódik az 1. ábrán bemutatott, megfelelő nem kódoló szekvencia egészéhez vagy részéhez. Általában az antiszensz hibridizációnál alkalmazott hibridizációs körülmények erősen sztringens körülmények, úgymint

0,lxSSC 65 °C-on.

Ha egyszer a katepszin-O2-nukleinsavat azonosítottuk, akkor az klónozható, és ha szükséges, alkotórészei rekombinálhatók az egész katepszin-O2-nukleinsav kialakításához. Ha egyszer természetes forrásából izoláltuk úgy, hogy például plazmid vagy más vektor tartalmazza, vagy ezekből kihasított lineáris nukleinsavszegmensként, ez a katepszin-O2-nukleinsav a továbbiakban próbaként alkalmazható más katepszin-O2-nukleinsavak azonosítására és izolálására. Ez „prekurzor” nukleinsavként is alkalmazható, módosított vagy variáns katepszin-O2-nukleinsavak és fehérjék előállításához.

A találmány szerinti katepszin-02-fehéqét kódoló nukleinsavak alkalmazásával sokféle expressziós vektor állítható elő. Az expressziós vektorok lehetnek egyrészt önreplikálódó extrakromoszomális vektorok, másrészt egy gazdagenomba integrálódó vektorok. Általában ezek az expressziós vektorok transzkripciós és transzlációs szabályzónukleinsavakat tartalmaznak, amelyek működőképesen kapcsolódnak a katepszin02-fehéijét kódoló nukleinsavhoz. A találmány szerinti szövegösszefüggésben a „működőképesen kapcsolt” kifejezés azt jelenti, hogy a transzkripciós és transzlációs szabályzó-DNS úgy van pozícionálva a katepszin-02-fehérjét kódoló szekvenciához, hogy a transzkripció iniciálva legyen. Általában ez azt jelenti, hogy a promoter és a transzkripciós iniciációs vagy startszekvenciák a katepszin-O2-fehérjét kódoló szakasztól 5’-végi irányban vannak pozícionálva. A transzkripciós és transzlációs szabályzónukleinsav általában a megfelelő gazdasejtnek megfelelő, amelyet a katepszin-02-fehérje expresszálására alkalmazunk; például Bacillusból származó transzkripciós és transzlációs szabályzószekvenciákat alkalmazunk katepszin02-fehéqe Bacillusban történő expresszálásához. Sokféle gazdasejtben alkalmazható, megfelelő expressziós vektorok számos típusa és szabályzószekvenciák ismertek a technika állása szerint.

Általában a transzkripciós és transzlációs szabályzószekvenciák tartalmazhatnak anélkül, hogy ezekre korlátozódnának, promoterszekvenciákat, vezető- és szignálszekvenciákat, riboszóma-kötőhelyeket, transzkripciós start- és stopszekvenciákat, transzlációs start- és stopszekvenciákat, és enhanszer vagy aktivátor szekvenciákat. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a szabályzószekvenciák tartalmaznak promotert és transzkripciós start- és stopszekvenciákat.

A promoterszekvenciák vagy konstitutív vagy indukálható promotereket kódolnak. A promoterek lehetnek természetesen előforduló promoterek vagy hibrid promoterek. A technika állásának megfelelő hibrid promoterek, amelyek több mint egy promoter elemeiből állnak, szintén ismertek és a találmány számára hasznosak.

Ezenkívül az expressziós vektorok további elemeket tartalmazhatnak. Például az expressziós vektornak két replikációs rendszere lehet, így lehetővé téve azt, hogy kétféle szervezetben is működjön, például emlős5

HU 220 960 Bl vagy rovarsejtekben expresszió céljára, és prokarióta gazdaszervezetben klónozás és amplifikáció céljára. Továbbá az integrálódó expressziós vektor esetében, az expressziós vektor legalább egy, a gazdasejt genomjával homológ szekvenciát tartalmaz, előnyösen két homológ szekvenciát, amelyek az expressziós konstrukciót szegélyezik. Az integrálódó vektor a gazdasejt egy specifikus helyére irányulhat, a beépülést elősegítő megfelelő homológ szekvencia által. Az integrálódó vektorkonstrukciók a technika állása szerint ismertek.

Ezenkívül a találmány szerinti előnyös megvalósítási módon az expressziós vektor szelektálható markergént tartalmaz, lehetővé téve a transzformált gazdasejt szelekcióját. Szelekciós gének ismertek a technika állása alapján, és az alkalmazott gazdasejt szerint különbözhetnek.

A találmány szerinti katepszin-02-fehérjék olyan expressziós vektorral transzformált gazdasejt tenyésztésével állíthatók elő, amely a katepszin-02-fehéqét kódoló nukleinsavat tartalmazza, megfelelő körülmények között, amely alkalmas a katepszin-02-fehérje expressziójának indukálására vagy kiváltására. A katepszin-02-fehérje expressziójára alkalmas körülmények változhatnak az expressziós vektor és a gazdasejt megválasztásával, és azt szakember könnyen meg tudja állapítani rutinkísérletek segítségével. Például konstitutív promoterek alkalmazásához az expressziós vektorban a gazdasejt növekedésének és proliferációjának optimalizálása szükséges, míg egy indukálható promoter alkalmazásához az indukcióhoz szükséges megfelelő növekedési körülmények szükségesek. Ezenkívül a találmány szerinti néhány megvalósítási módon fontos a vágás időzítése. Például baculovírus-rendszerek rovarsejtben való expressziós alkalmazása esetén, mivel lírikus vírusról van szó, a vágási idő megválasztása döntő lehet a termelés hatásfokára.

Megfelelő gazdasejtek lehetnek az élesztő-, baktérium-, achebaktérium-, gomba-, rovar- és állati sejtek, beleértve az emlőssejteket Különösen érdekesek a Drosphila melanogaster-sejtek, Saccharomyces cerevisiae- és más élesztősejtek, E. coli, Bacillus subtilis, SF9, C129, 293, Neurospora, BHK-, CHO-, COS-, HeLa-sejtek és immortalizált emlős myeloid és limfoid sejtvonalak.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin-02-fehéqéket bakteriális rendszerben expresszáljuk. A bakteriális expressziós rendszerek a szakember köteles tudásához tartoznak.

Alkalmas bakteriális promoter lehet bármilyen nukleinsavszekvencia, amely képes kötni bakteriális RNSpolimerázt és képes iniciálni a katepszin-O2-fehéije kódolószekvenciájának szintésirányú (3’) transzkripcióját mRNS-é. Egy bakteriális promotemek van transzkripciós iniciációs régiója, amely rendszerint a kódolószekvencia 5’-végével szomszédos. Ez a transzkripciós iniciációs régió tipikusan tartalmaz egy RNS-polimeráz kötőhelyet és egy transzkripciós iniciációs helyet. A metabolikus enzimeket kódoló szekvenciák különösen hasznos promoterszekvenciaként szolgálhatnak. Ilyen promoterszekvenciák származhatnak például cukormetabolizáló enzimekből, például galaktóz, laktóz és maltóz esetén, és származhatnak bioszintetikus enzimekből, például a triptofánszintézis enzimjeiből. Bakteriofágokból származó promoterek is alkalmazhatók a technika állása szerint. Ezenkívül szintetikus promoterek és hibrid promoterek is hasznosak, például a tacpromoter a trp- és a lac-promoterszekvenciák hibridje. Továbbá egy bakteriális promoter tartalmazhat nem bakteriális eredetű természetesen előforduló promotereket, amelyek képesek kötni a bakteriális RNS-polimerázt és iniciálni a transzkripciót.

Egy funkcionális promoterszekvencia mellett hatásos riboszómakötő hely is kívánatos. Az E. coliban, a riboszómakötő helyet Shine-Delgamo-féle (SD) szekvenciának hívjuk, és ez tartalmaz egy iniciációs kodont és egy 3-9 nukleotid hosszúságú szekvenciát 3-11 nukleotidra 5’-irányban (upstream) az iniciációs kodontól.

Az expressziós vektor tartalmazhat egy szignálpeptid-szekvenciát is, amely lehetővé teszi a katepszin-O2fehérje szekrécióját baktériumban. A szignálszekvencia tipikusan egy hidrofób aminosavakat tartalmazó szignálpeptidet kódol, amely a fehéije sejtből való szekrécióját irányítja, a technika állása szerint ismert módon. A fehérje vagy a tápközegbe szekretálódik (Grampozitív baktériumok), vagy a periplazmába, amely a belső és a külső sejtmembrán között helyezkedik el (Gram-negatív baktériumok).

A bakteriális expressziós vektor szelektálható markergént is tartalmazhat, amely lehetővé teszi transzformáit baktériumtörzsek szelekcióját. Alkalmas szelekciós gének lehetnek azok a gének, amelyek a baktérium drogrezisztenciáját kiváltják, például ampicillinre, klór-amfenikolra, eritromycinre, kanamycinre, neomycinre vagy tetracyklinre. A szelektálható markerek között bioszintetikus gének is vannak, például a hisztidin, triptofán vagy leucin bioszintézisútban.

Ezek az alkotórészek expressziós vektorokban állíthatók össze. A technika állásának megfelelő, baktériumokban alkalmazott expressziós vektorok jól ismertek, például vektorok többek között Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris és Streptococcus lividans törzsekben való alkalmazásra.

A bakteriális expressziós vektorokat bakteriális gazdasejtbe transzformáljuk a technika állása szerinti eljárások alkalmazásával, például kalcium-kloridos kezeléssel, elektroporációval vagy mással.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin-O2-fehéijéket rovarsejtekben termeltetjük. A technika állásának megfelelő, rovarsejtek transzformációjára alkalmas expressziós vektorok, és különösen baculovírus-alapú expressziós vektorok jól ismertek. Röviden, a baculovírus egy nagyon nagy DNSvírus, amely nagyon magas szinten termeli burokfehérjéjét. A baculovírus-genom mérete miatt exogén géneket kell helyezni a vírusgenomba rekombinációval. Ennek megfelelően az expressziós rendszer alkotórészei: egy transzfervektor, rendszerint egy bakteriális plazmid, amely a baculovírus-genom fragmensét és a katepszin-02-fehérje inszerciójára alkalmas megfelelő restrikciós hasítóhelyet egyaránt tartalmazza; egy vad típusú baculovírus, a transzfervektorban található baculo6

HU 220 960 BI vírus-specifikus fragmenssel homológ szekvenciával (ez teszi lehetővé a heterológ gén homológ rekombinációját a baculovírus-genomba); megfelelő rovar gazdasejteket és tápközeget.

Emlős expressziós rendszerek is ismertek a technika állása szerint, és alkalmazzuk azokat a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint. Emlőspromoter bármilyen olyan DNS-szekvencia, amely képes kötni az emlős-RNS-polimerázt és képes iniciálni a katepszin02-fehéijét kódoló szekvencia szintézisirányú (3’-végi irányba) transzkripcióját mRNS-re. A promoter rendelkezik transzkripciós iniciációs régióval, amely rendszerint a kódolószekvencia 5’-végéhez közel helyezkedik el, valamint tartalmaz egy - a transzkripciós iniciációs helytől 25-30 bázispámyira 5’-irányban található TATA-szakaszt. A TATA-szakaszról feltételezzük, hogy az RNS-polimeráz-II-t irányítja úgy, hogy az RNS-szintézis a megfelelő helyen kezdődjék. Az emlőspromoterek tartalmaznak még egy 5’-végi promoterelemet is, amely tipikusan a 100-200. bázispár között található a TATA-szakasztól 5’-végi irányban. Az 5’-végi promoterelem határozza meg a transzkripció iniciálásának sebességét és mindkét orientációban képes működni. Különösen olyan emlőspromotereket alkalmazunk, amelyek emlősvírusgénekből származnak, mivel a vírusgének gyakran nagyon magas szinten expresszálódnak és sokféle gazdaszervezetben tenyésznek. Alkalmazhatjuk például az SV40 korai promoterét, egéreredetű tumorvírus LTR-promoterét, az adenovírus fő késői promoterét és a herpes simplex vírus promoterét.

Tipikusan az emlőssejtek által felismert transzkripciós terminációs és poliadenilálási szekvenciák a transzlációs stopkodontól 3’-végi irányban elhelyezkedő szabályzórégiók, a promoterelemekkel együtt szegélyezik a kódolószekvenciát. Az érett mRNS 3’-végi terminálisa helyspecifikus poszttranszlációs hasítással és poliadenilálással alakul ki. A transzkripciós terminációs és poliadenilálási szignálok példái között szerepelnek az SV40-ből származók is.

Exogén nukleinsavak emlős és más gazdaszervezetekbe juttatására alkalmas, a technika állásának megfelelő eljárások jól ismertek, és különbözhetnek az alkalmazott gazdaszervezetek szerint. Ilyen technika lehet például dextránközvetített transzfekció, protoplasztfúzió, elektroporáció, polinukleotid(ok) liposzómába kapszulázása és DNS közvetlen mikroinjekciója a sejtmagba.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint katepszin-02-fehérjét élesztősejtekben termeltetjük. A technika állásának megfelelő élesztőeredetű expressziós rendszerek jól ismertek, például Saccharomyces cerevisae, Candida albicans és C. maltosa, Hansenula polymopha, Kluyveromyces fragilis és K. lactis, Pichia guillerimondii és P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe és Yarrowia lipolytica esetében. Előnyös promoterszekvenciák élesztőben történő expresszióra például az indukálható GALl,10-promoter, alkohol-dehidrogenáz, enoláz, glükokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, foszforfruktokináz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvátkináz és savas foszfatázgének promoterei. Szelektálható markerek élesztőben például ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 és ALG7, amely tunicamycin-rezisztenciát vált ki, a G418rezisztencia-gén, amely G418-rezisztenciát vált ki; és a CUPl-gén, amely lehetővé teszi az élesztő növesztését rézionok jelenlétében.

A rekombináns katepszin-02-fehérje expresszálható intracellulárisan vagy szekretálva. A katepszin02-fehéije fúziós fehéije formájában is előállítható, a technika állásának megfelelő, jól ismert módszerekkel, így például, ha a kívánt epitóp kicsi, a katepszin-02fehérje egy hordozófehéijéhez fuzionálható, hogy immunogén legyen. Vagy a katepszin-02-fehéije fúziós fehéqeként is előállítható azért, hogy megnöveljük az expressziót, vagy más okból.

A találmány szerinti katepszin-02-fehérjék meghatározásában szerepelnek az aminosavszekvencia variánsai is. Ezek a variánsok a szubsztitúciós, inszerciós vagy deléciós variáns egy vagy több esete lehet. Ezeket a variánsokat rendszerint a katepszin-O2-fehéijét kódoló DNS-ben lévő nukleotidok helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő, kazettamutagenezissel, vagy a technika állása szerinti, más jól ismert eljárás alkalmazásával úgy, hogy a variánst kódoló DNS-t állítjuk elő, és azután a DNS-t expresszáljuk a fent leírt rekombináns sejttenyészetben. A körülbelül 100-150 aminosavat is tartalmazható katepszin-02-fehéijéből származó fragmensek variánsait in vitro szintézissel is előállíthatjuk, szokásos technikák alkalmazásával. Az aminosavszekvencia variánsait a variáció előre meghatározott természetével jellemezzük, ami egy olyan tulajdonság, amely megkülönbözteti azokat a természetesen előforduló katepszin-O2-aminosavszekvencia alléi vagy fajközi variációitól. A variánsok tipikusan ugyanolyan minőségű biológiai aktivitással rendelkeznek, mint a természetesen előforduló analógok, bár a módosított tulajdonságokkal rendelkező variánsok szelektálhatok is, ahogyan később részletesen ismertetjük.

Amíg az aminosavszekvencia variációjának helye vagy a beépítés régiója előre meghatározható, addig a mutáció helye mint olyan, nem határozható meg. Például egy adott helyen lévő mutáció hatékonyságának optimalizálása céljából random mutagenezist végezhetünk a célkodonon vagy célrégión, és az expresszált katepszin-02-fehérje variánsait szkríneljük a kívánt aktivitás optimális kombinációjára. Ismert szekvenciájú DNS előre meghatározott helyén létrehozott szubsztitúciós mutációk végrehajtására alkalmas technika például az M13-láncindító oligonukleotidmutáció. A mutánsok szkrínelését a katepszin-02-fehéijék aktivitásának mérésére szolgáló eljárásokkal végeztük; például tisztított vagy részlegesen tisztított katepszin-O2 használható a kinetikus mérési eljárásokban, ahogyan azt a példákban bemutatjuk, az aminosavszubsztitúciók, -inszerciók vagy -deléciók hatásának meghatározására. Alternatív megoldás, hogy a mutáns katepszin-O2-géneket építjük katepszin-O2 deléciós törzsekbe és teszteljük katepszin-O2-aktivitásra, ahogyan azt itt ismertetjük. Ismert génszekvenciák esetén a megfelelő deléciós törzsek előállítása a szakember köteles tudásához tartozik.

HU 220 960 Bl

Az aminosavszubsztitúción tipikusan egy aminosav szubsztitúcióját értjük; az inszerciók rendszerint körülbelül 1-20 aminosav hosszúságúak, bár lényegesen nagyobb inszerciók is elfogadhatók lehetnek. A deléciók nagysága körülbelül 1-30 aminosavtól kezdődhet, bár néhány esetben a deléciók sokkal nagyobbak is lehetnek, például ha a katepszin-O2-fehéqe proszekvenciáját vagy érett szakaszát deletáljuk. Ráadásul, ahogyan azt már említettük, a katepszin-02-fehéije sokkal kisebb fragmenseit is alkalmazhatjuk ellenanyagok előállítására.

Szubsztitúciók, deléciók, inszerciók vagy ezek bármilyen kombinációja alkalmazható a végső származék előállítására. Általában ezek a cserék csak néhány aminosavcsoportot érintenek, hogy minimalizáljuk a molekulát érintő változtatásokat. Mégis, bizonyos körülmények között nagyobb cserék is elfogadhatók.

Ha a katepszin-02-fehérje tulajdonságaiban csak kis változtatást kívántunk elérni, a szubsztitúciók általában a következő táblázattal összhangban történtek:

I. táblázat

Eredeti csoport	Szubsztitúciók (pl.)
Alá	Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

A funkcióban vagy az immunológiai tulajdonságokban történő lényegi változtatásokhoz olyan szubsztitúciókat választottunk ki, amelyek kevésbé konzervatívak, ahogyan azt az 1. táblázatban bemutattuk. Például még szignifikánsabb hatású szubsztitúciókat végezhetünk: amely a módosított szakaszra eső polipeptidlánc szerkezetére, például az alfa-hélixre vagy a bétaszerkezetre hat; a molekula töltésére vagy hidrofobicitására a célhelynél; vagy az oldallánc teijedelmére. Általában a következő szubsztitúciók esetében várhatjuk, hogy a legnagyobb változásokat okozzák a polipeptid tulajdonságaiban: (a) hidrofil csoportok, például szerilvagy treonilcsoport szubsztitúciója hidrofób csoportra (csoporttal), például leucil-, izoleucil-, fenil-alanil-, valil- vagy alanilcsoportra; (b) cisztein vagy prolin szubsztitúciója bármilyen más csoportra (csoporttal);

(c) elektropozitív oldallánccal rendelkező csoport, például lizil-, arginil- vagy hisztidilcsoport szubsztitúciója elektronegatív csoportra (csoporttal), például glutamilvagy aszpartilcsoportra; vagy (d) nagyméretű oldallánccal rendelkező csoport, például fenil-alanil-csoport szubsztitúciója oldallánccal nem rendelkező csoportra (csoporttal), például glicilcsoportra.

A variánsok tipikusan ugyanolyan minőségű biológiai aktivitással rendelkeznek, és ugyanazt az immunválaszt váltják ki, mint a természetesen előforduló analógok, habár a variánsokat a polipeptid tulajdonságainak szükség szerinti módosítására is szelektálhatjuk. Alternatív módon a variánsok úgy is tervezhetők, hogy a katepszin-O2-fehéije biológiai aktivitása megváltozzon. Például a katepszin-O2-fehérje proteolitikus aktivitása megváltoztatható a katalitikus triád aminosavjainak szubsztitúciójával. A katalitikus triád, amelynek alkotórészei cisztein a 25. pozícióban, hisztidin a 162. pozícióban és aszparagin a 182. pozícióban, egyenként vagy szimultán megváltoztatható, így a proteolitikus aktivitás csökkenhet vagy eliminálódhat. Ezt a beadott katepszin-O2 toxicitásának csökkentése érdekében lehet elvégezni. Ehhez hasonlóan a proszekvencia és az érett szekvencia közötti hasítóhely is átalakítható, például a proteolitikus folyamat eliminálása érdekében.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin-O2-fehéijét tisztítottuk vagy izoláltuk az expresszió után. A katepszin-02-fehérjék szakember számára ismert számos eljárással izolálhatok és tisztíthatok, attól függően, milyen egyéb szennyező komponenseket tartalmaz a minta. A hagyományos tisztítási eljárásokon értjük az elektroforetikus, molekuláris, immunológiai és kromatográfiás technikákat, ez utóbbin pedig az ioncserés, hidrofób, affinitás és fordított fázisú HPLC kromatográfiát, és a kromatofokuszálást. Például a katepszin-02-fehéqe a hagyományos anti-katepszinO2-ellenanyagot tartalmazó oszlopon tisztítható. Az ultraszűrés és a diafiltráció is hasznos, összekapcsolva a fehérje koncentrálásával. A megfelelő tisztítási technikák általános útmutatóját lásd „Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)”. A szükséges tisztítási fok különbözhet a katepszin-O2-fehérje alkalmazása szerint. Néhány esetben nem szükséges a tisztítás.

A találmány néhány megvalósítási módja szerint a katepszin-O2-enzimet proenzim formájában expresszáltuk. Ahogyan a példákban bemutatjuk, a proenzimet exogén proteázzal kezeltük, így átalakítva azt az érett, aktív formába, a technika állásának megfelelően. A megfelelő exogén proteáz lehet anélkül, hogy csak ezekre korlátozódna, pepszin és katepszin-D.

Az expresszált, és ha szükséges, a tisztított katepszin-02-fehéijék számos alkalmazási területen hasznosak.

Például, ahogyan azt az 5. példában bemutatjuk, a találmány szerinti katepszin-02-fehérjéknek kollagenázaktivitásuk van. így a katepszin-O2-fehérjék kollagenázként alkalmazhatók, in vitro és in vivő egyaránt. Például katepszin-O2-vel kezelhetünk olyan analitikai mintákat, amelyek zavaró vagy problematikus szinten tartalmaznak kollagént.

HU 220 960 Bl

Ehhez hasonlóan a katepszin-O2-fehérjék a szervezetben feleslegben lévő kollagén degradálására alkalmazhatók. A feleslegben lévő kollagén sokféle állapothoz asszociálódhat. Például a gerinckorong-problémák egyik kezelési módja, mint például súlyos gerinckorong(„spinal disc”) gyulladás és sérv esetén, kollagenáz vagy kimopapain injektálása, a korong kollagéntartalmának degradálása céljából [Leonardo és munkatársai, Ann. Chirm Gyneacol. 82, 141-148 (1993); Gogan és munkatársai, Spiné 17, 388-94 (1992); Stula, Nerochirurgia 33, 169-172 (1990); és Boccanera és munkatársai, Chir. Organi. Mov. 75, 25-32 (1990)]. Ehhez hasonlóan, az adhéziók kezelése, például medencében fellépő adhézió, műtét utáni adhézió, tüdőadhézió, hasi vagy ehhez hasonló adhézió katepszin-O2-vel kezelhető vagy szüntethető meg. Ehhez hasonlóan, forradások és keloidok kezelhetők katepszin-02-vel, a feleslegben lévő kollagén eltávolítása vagy csökkentése érdekében. Ráadásul, az endometriózis a másik jelentős klinikai probléma, amely feleslegben lévő kollagén és más anyag felhalmozódásával jár a méhben és a környező szövetekben; az endometriózis bizonyos formái szintén kezelhetők a találmány szerinti katepszin-O2-vel.

A találmány egyik alternatív megvalósítási módja szerint a katepszin-O2 a tumorok körül található mátrixok megszüntetésére alkalmazható. Általában a tumor pH-ja alacsonyabb, mint a fiziológiás pH, és ahogyan azt a példákban bemutatjuk, a katepszin-O2 savas pH-n aktív. Tehát a katepszin-O2 alkalmas a kollagénalapú mátrixok megszüntetésére, amelyek általában körülveszik a tumort.

A találmány egy megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti katepszin-02-fehéqék beadhatók pycnodysostosis és osteopterosisszerű csontrendellenességek kezelésére. Úgy tűnik, hogy ezen rendellenességek oka az oszteoklasztikus ciszteinproteázok elégtelen aktivitása. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint génterápia is alkalmazható a katepszin-O2 bejuttatására.

Ezenkívül, mivel a katepszin-O2 savas pH-η működik, a katepszin-O2 csontdemineralizációs anyagokkal együtt is beadható, például savakkal, a csontszövet degradálása céljából. így kezelhető a rendellenes vagy túlzott csontnövekedés.

A találmány szerinti katepszin-02-fehéijék a katepszin-O2-proteáz inhibitorainak és a ciszteinproteázok inhibitorainak szkrínelésére is alkalmazhatók. A ciszteinproteáz-inhibitorok sokféle célra alkalmazhatók a technika állásának megfelelően, például affinitáskromatográfiás oszlopban ciszteinproteázok tisztítására, ciszteinproteázok gátlására, más ismert ciszteinproteáz-inhibitorokhoz hasonlóan. Ráadásul a ciszteinproteáz-inhibitorok terápiás alkalmazása is lehetséges, mivel sokféle fiziológiai rendellenességhez asszociálódik az emelkedett ciszteinproteáz-szint, például arthritis, gyulladás, osteoporózis, muszkuláris disztrófia, tumorburjánzás, többszörös myelóma és glomerulonephritis esetén, ahogyan ez a technika állása szerint ismert.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a katepszin-O2 előtagját alkalmazhatjuk a katepszin-O2 specifikus inhibitoraként. így például az előtag külön expresszálható, az érett szekvencia nélkül, és alkalmazható nagymértékben specifikus, erősen kötődő katepszin-02-inhibitorként, ahogyan azt a 3. példában bemutatjuk. így az előtag terápiásán adagolható olyan mintákhoz vagy szövetekhez, amelyek túlzott mennyiségben tartalmaznak katepszin-O2-t; például csontrendellenességek vagy tumorok kezelése során, ahogyan ezt az alábbiakban bemutatjuk.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin-O2 előtagját megjelöltük, és a katepszin-O2 diagnózisára, mennyiségi és minőségi azonosításra alkalmaztuk mintákban vagy szövetekben.

Ezenkívül a katepszin-02-fehéqék poliklonális és monoklonális, katepszin-02-fehéijék elleni ellenanyagok termeltetésére alkalmazhatók, amelyek a későbbiekben leírtak szerint alkalmazhatók. Ehhez hasonlóan, a katepszin-02-fehérjék affinitáskromatográfiás oszlophoz kapcsolhatók, szokásos technológia alkalmazásával. Ezek az oszlopok katepszin-O2-ellenanyagok tisztítására alkalmazhatók.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint monoklonális ellenanyagokat állítottunk elő katepszin-O2-fehéqe ellen, a technika állásának megfelelő eljárásokkal. Ahogyan azt később ismertetjük, a teljes katepszin-02-fehérje, vagy annak egy szakasza ellen ellenanyag termeltethető.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a termeltetett ellenanyagok kizárólag a humán katepszin-02-fehéijén található epitópok ellen termelődtek; ezért az ellenanyagok kicsi vagy semmilyen keresztreakciót sem mutatnak más szervezetekből származó katepszin-O2-fehéqék ellen termeltetett ellenanyagokkal, például nyúl- vagy patkányeredetű katepszinekkel.

Ezek az ellenanyagok sokféleképpen alkalmazhatók. A találmány egy eíőnyös megvalósítási módja szerint, az ellenanyagokat katepszin-O2 jelenlétének diagnózisára alkalmaztuk mintában vagy páciensben. Például túlzott mennyiségű katepszin-02-fehéqe jelenléte esetében, amely például előfordulhat oszteoklaszttal kapcsolatos rendellenességek és csontbetegségek, valamint tumorok esetén, alkalmazhatjuk ezeket az ellenanyagokat diagnosztikai célokra.

Ehhez hasonlóan a katepszin-O2 magas szintje asszociálódhat bizonyos petefészek- vagy nyaki karcinómákhoz, amelyet a HeLa-sejtekben található magas katepszin-O2-szint igazolt. így ezek a tumorok detektálhatok vagy diagnosztizálhatok a találmány szerinti ellenanyagokkal.

A katepszin-O2 detekciója elvégezhető a technika állásának megfelelő eljárásokkal; például egy pácienstől vér- vagy szövetminták vétele és reaktivitásának tesztelése jelölt katepszin-O2 ellenanyagokkal, például szokásos eljárások alkalmazásával, úgymint RIA és ELISA.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az ellenanyagokat közvetlenül vagy közvetve jelölhetjük. A ,jelölt” kifejezésen egy olyan vegyületet értünk, amelynek legalább egy olyan hozzákapcsolt eleme (izotóp vagy kémiai anyag) van, ami lehetővé teszi a vegyület detektálását. A jelölések általában három

HU 220 960 Bl csoportba tartozhatnak: a) izotópjelölések, amelyek lehetnek radioaktív vagy nehézizotópok; b) immunojelölések, amelyek lehetnek ellenanyagok vagy antigének; és c) színes vagy fluoreszcens festékek. A jelölések bármilyen pozícióban beépülhetnek a vegyületbe. így például a katepszin-O2-fehérje ellen termeltetett ellenanyagot jelölhetünk meg a detekció céljából, vagy egy második katepszin-O2-ellen termeltetett ellenanyagot termeltethetünk és jelölhetünk meg.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti katepszin-02-fehérjék ellen termeltetett ellenanyagokat alkalmazzuk katepszin02-fehéijék tisztítására vagy szeparálására mintákból, így például katepszin-02-fehérjék ellen termeltetett ellenanyagokat affinitáskromatográfiás oszlophoz kapcsolhatjuk, szokásos eljárások alkalmazásával. Ezek az oszlopok alkalmazhatók a katepszin-02-fehérje kikötésére szövetmintákból.

Egy közelmúltban megjelent publikáció javaslata szerint a ciszteinproteázok DNS-kötő transzkripciós faktorként alkalmazhatók [Xu és munkatársai, lásd fent]. A találmány néhány megvalósítási módja szerint a találmány szerinti katepszin-O2-fehéijéket transzkripciós faktorként alkalmazhatjuk.

A Paragonimus wastermani nevű parazitáról nemrégiben mutatták ki, hogy a ciszteinproteázokkal homológ immunszupresszort expresszál [Hamajima és munkatársai, lásd fent]. Valójában a találmány szerinti katepszin02-fehérjékkel való homológia 40%. így a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a katepszin02-fehérjék immunszupresszorokként alkalmazhatók.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, ha a katepszin-02-fehérjéket embereknek adjuk be, a katepszin-02-fehérjék humán katepszin-O2fehéijék. Ez terápiásán kívánatos azért, hogy biztosítsa a beadott katepszin-O2-vel szemben fellépő nemkívánatos immunreakciók minimalizálását.

A találmány szerinti katepszin-O2-fehérje beadása sokféle módon történhet, például - anélkül, hogy az ismertetettekre korlátozódna - orálisan, szubkután, intravénásán, intranazálisan, transzdermálisan, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, intrapulmonárisan, vaginálisan, rektálisan vagy intraokulárisan.

A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmények a katepszin-02-fehérjét páciensnek beadható formában tartalmazzák. A gyógyszerészeti készítmények egy vagy több dolgot tartalmazhatnak a következők közül: hordozófehérjéket, például szérumalbumint; puffereket; töltőanyagokat, például mikrokristályos cellulózt, laktózt, kukorica- vagy másféle keményítőt; kötőágenseket; édesítőszereket és más ízanyagokat; színezőanyagokat és polietilénglikolt. Az adalék anyagok a technika állásának megfelelően jól ismertek, és sokféle kiszerelésben alkalmazhatók.

A találmány szerinti gyógyszerészeti készítményeket általában terápiásán hatásos dózisban adjuk be, amit a technika állásának megfelelően rutinszerűen meg lehet határozni.

Úgy gondoljuk, hogy a találmány szerinti humán katepszin-02-fehérje olyan tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek a humánfehéijét még elfogadhatóbbá teszik terápiás célokra, mint a más fajokból származó katepszin-O2-fehéijéket. Különösen a más fajokból származó katepszin-O2-fehérjék antigén sajátsága teszi azokat emberben kevésbé elfogadhatóvá mint terápiás szer; például a más fajokból származó katepszinek nemkívánatos immunválaszt váltanak ki emberben.

Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást és annak legelőnyösebb megvalósítási módjait kívánjuk még részletesebben ismertetni anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Az idézett publikációk a teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik.

1. példa

Humán katepszin-02 klónozása

Hacsak másképp nem specifikáljuk, minden általános rekombináns DNS-technika Sambrook és munkatársai által leírt eljárásokat követi („Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).

Két degenerált PCR láncindító oligonukleotidot terveztünk, a nyúleredetű oszteokalcingén közölt szekvenciája alapján [Tezuko és munkatársai (1994)]:

5’-GGA-TAC-GTT-CAN-CCN-GT-3’ (8. szék. az. számú)

5’-GC-CAT-GAG-G/ATA-NCC-3’ (9. szék. az. számú) szék. az. számú=szekvenciaazonosító szám

Ezeket a láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk humánlép „Quick Clone”-cDNS preparálásához (Clontech cégtől szereztük be). Egy amplifikált, 450 bázispár méretű fragmenst izoláltunk és tisztítottunk, és használtunk cDNS-próbaként a humánlép-cDNS-könyvtár szkrinelésére (gtlO a Clontech cégtől). 600 000 kiónt szkríneltünk 20 szűrőn egy olyan technikát alkalmazva, amelyben a plakkok közvetlenül a szűrőn újra kialakulnak [Woo, Methods Enzymol. 68, 389-395 (1979)]. Ez lehetővé tett egy szignálamplifikációt a pozitív plakkokról, így rövidebb expozíciós időt alkalmazva csökkentettük a hátteret és a fals pozitívok megjelenését. A szűrőket mérsékelt sztringens körülmények között mostuk: egyszer 2 χ SSC, 0,1% SDS-el, szobahőmérsékleten 10 percig, és egyszer 2 x SSC, 0,1% SDS-el 68 °C-on 20 percig.

A két pozitív plakkról izoláltuk a fágokat és „pBluescript-SK⁺” vektor (Stratagene cégtől szereztük be) EcoRI-hasítóhelyébe klónoztuk.

Egy pozitív kiónt teljesen szekvenáltunk egy ABIszekvenátoron, modell 373A; a szekvenciát az 1. ábrán mutatjuk be (1. szék. az. számú). A humán katepszin02 (2. szék. az. számú), humán katepszin-S (4. szék. az. számú) és a humán katepszin-L (5. szék. az. számú) fehérjék szekvenciáinak egymás alá rendezését mutatjuk be a 2. ábrán.

2. példa

Humán katepszin-02 expressziója

A humán katepszin-O2 cDNS-ét baculovirus transzfervektorok polihedringénjébe klónoztuk szokásos eljárásokkal. A pre-proenzim teljes nyitott leolvasási fázisát kódoló cDNS-t pVL1392-transzfervektor (PharMin10

HU 220 960 Bl gén cégtől szereztük be) BglII/BamHl hasítóhelyébe inszertáltuk. Rekombináns baculovírusokat állítottunk elő homológ rekombinációval, a baculovirus transzfervektor és linearizált AcNPV-jelű genomi eredetű DNS (PharMingen cégtől szereztük be) kotranszfekciójával 5 Sf9-sejtekbe. Végponthígítás után a humán katepszin02 expresszióját fluorimetriás mérési eljárással mértük, lásd a további leírást.

Tiszta vírust (AcNPVCO2) kaptunk plakktisztítással.

Az Sf9-sejteket Sf900II-tápközegben (Gibco BRL, 10 Grand Island, NY) növesztettük 2 x1ο⁶ sejt/ml sűrűségig, és 1 „moi”-értéknél fertőztük meg azokat. A teljes sejtszámot, és a celluláris és a szekretált katepszin-02-aktivitást minden 24 órában mértük. 3,5 nap után vágtuk a sejteket.

A körülbelül 43 kD méretű, immunreaktív anyag többségét a fertőzött sejtekben találtuk. A táptalajban található egyetlen 43 kD méretű termékkel szemben, a celluláris extraktumban egy további, alig látható, 44 kD méretű csíkot detektáltunk. A nagyobb molekulatömegű csík feltételezhetően a még nem hasított pre-prokatep- 20 szin-O2-nek felel meg, míg a 43 kD méretű fehéije feltételezhetően a proenzim. Rögtön a sejtek lízise után sem, és az autoaktiválás körülményei között (40 °C, pH 4,0 és

4,5 között, ditiotreitol jelenlétében) sem volt megfigyelhető aktivitás, Z-FR-MCA szintetikus szubsztrátot alkalmazva, pH 7,5-en. Egy Ε-64-gyel gátolható aktivitás növekedése az autoaktiválás körülményei között, melyet pH 5,5-n mértünk, egy endogén Sf9-eredetű ciszteinproteáz jelenlétére utal (nem publikált eredmények). A humán katepszin-B-nek nem volt megfigyelhető hatása a 30 katepszin-O2 prekurzorra, pH 4,0-en és 5,5-en, 2 óráig, °C-on inkubálva (az adatokat nem mutatjuk be).

A rekombináns humán katepszin-O2 aktiválása, tisztítása és N-terminális-szekvenálása

Intracelluláris katepszin-O2-t termeltünk Sf9-sejtek- 35 ben, inaktív prekurzor formájában. Az enzimet a sejtlizátumban aktiváltuk redukáló és savas körülmények között a következők szerint. Az Sf9-sejteket a tápközegből centrifugálással távolítottuk el, 2000 xg-n, és Dounce-típusú homogenizátorban lizáltuk azokat. Az inaktív katepszin-O2-prekurzort tartalmazó sejtlizátum térfogatát 250 ml-re egészítettük ki 100 mM-os nátrium-acetát-pufferrel, pH-ja 3,75, és amely 0,5% Triton Χ-100-at, 5 mM ditiotreitolt és 2,5 mM Na₂EDTA-t tartalmazott, majd a pH-ját 4,0-re állítottuk. A profor- 45 ma átalakítását aktív enzimmé pepszines kezeléssel hajtottuk végre. Disznópepszin 0,4 mg/ml-es végkoncentrációban való adagolása után (Sigma, St. Louis, MO) az aktivációs keveréket rázógépben inkubáltuk 90 percig, 40 °C-on, 200 rpm-en. Az aktiválást Z-FR-MCA (10 μΜ) fluorogén szubsztrát alkalmazásával követtük,

100 mM TRIS/HC1 pufferben, pH 7,5-en.

A katepszin-O2-prekurzor lényegében átalakult érett, aktív enzimmé a pepszines kezeléssel, pH 4,0-en. A nyers sejtextraktum és a koncentrált tápközegfelülúszó emésztése a prekurzor időfüggő eltűnését eredményezte, és az érett enzim (29 kD) keletkezését egy átmeneti állapoton (36 kD) keresztül (3. ábra). Ezzel a folyamattal párhuzamosan egy Ε-64-gyel gátolható aktivitás növekedése volt megfigyelhető pH 7,5-en mérve. A prekurzor aktiválódása nem volt megfigyelhető, 15 ha tisztított, aktív katepszin-02-t adtunk hozzá pH 4,5en (az adatokat nem mutatjuk be), amely azt jelzi, hogy a katepszin-O2 cisz-, és transz-autoaktivációja valószínűleg nem megy végbe a lizoszómákban. Ez különbözik a rokon szerkezetű ciszteinproteázoktól, például a papaintól és a katepszin-S-től, amelyek potenciálisan autokatalitikusan aktiválódnak [Vemet és munkatársai, J. Bioi. Chem. 265, 1661-1666 (1990); Brömme és munkatársai, J. Bioi. Chem. 268, 4832-4838 (1993)]. A katepszin-O2 természetes aktiválóenzime az oszteo25 klasztban az aszpartilproteázokhoz tartozó katepszinD, amely az oszteoklasztikus lizoszómákban található, de alacsony szinten szekretálódik a reszorpciós hézagokba (Goto és munkatársai, 1993).

Az aktivált lizátum pH-ját 7,0-re állítottuk 2 M TRIS-bázissal, centrifugálással tisztítottuk 10 000xg-n, és a felülúszóhoz 2,5 M ammónium-szulfátot adagoltunk, pH 5,5-en. 16 000xg-n való centrifugálás után a tiszta felülúszót 50 ml-re töményítettük ultraszűréssel (YM10 Amicon). További centrifugálás után 10 000 gn, a tiszta felülúszót butil-Sepharose 4 Fást Flow (Pharmacia, Sweden) oszlopra vittük fel, és az oszlopot ammónium-szulfát-gradienssel mostuk (2,5 M-tól 0 M-ig, 25 mM acetátpufferben, pH 5,5). Az aktivitás 0 M ammónium-szulfátnál eluálódott. Az összeöntött és kon40 centrált frakciókat ezután FPLC Mono S oszlopra (Pharmacia, Sweden) vittük fel, és lineáris NaCl-gradienssel eluáltuk (0-2 M) 20 mM nátrium-acetátpufferben, pH 5,5. Elektroforetikusan homogén katepszin-O2-t eluáltunk 1,4 M NaCl-nál.

Az átlagos kitermelés 1 L Sf9-sejtkultúrából (körülbelül 2xl0⁹ sejt) körülbelül 1 mg tisztított enzim (1. táblázat).

1. táblázat

Rekombináns humán katepszin-O2 tisztítása

Mérési eljárás	Összfehéije (mg)	Összes aktivitás (pmol/perc)	Specifikus aktivitás (pmol/mg/perc)	Tisztítási faktor	Kitermelés (%)
Nyers6	800	1,753	2,2	1	100
2,5 M (NH4)2SO4 oldható rész	276	1,412	5,1	2,3	81
„Butyl Sepharose 4”	2,9	1,143	394	179	65
| „MonoS”	14	512	465	211	29

^a 1 L Sff-tenyészetből ⁶ pepszinnel való aktiválás után

HU 220 960 BI

A tisztított enzim egyláncú enzim, és látszólagos molekulatömege 29 kD, 4-20% Tris/glicin SDS-gélben, redukáló körülmények között. Endoglikozidáz-H- és -Ffel és N-glikozidáz-F-fel való kezelés nem változtatja meg a molekulatömeget, ami azt jelenti, hogy a proteáz nem glikozilált (az adatokat nem mutatjuk be). A humán katepszin-O2 két potenciális glikozilálási hellyel rendelkezik az érett szekvenciában. Mégis, mindkét helyen egy prolincsoport van az aszparagin- vagy a treonincsoport után, így a glikozilálás nem valószínű. A katepszin02 tartalmaz még egy feltételezhető glikozilálási helyet az előtagban, közel az érett enzim és az előtag közötti hasítási helyhez. Nem tapasztaltunk változást a proenzim molekulatömegében sem, amikor egy éjszakán át kezeltük endoglikozidáz-H-val, -F-fel és N-glikozidáz-F-fel.

Az NH₂-terminális szekvenálást automatikus Edman-degradációval hajtottuk végre. Az érett proteáz N-terminális-szekvenálása kiderítette a papaincsalád ciszteinproteázainak természetes hasítóhelyét, amelyben az N-terminális alaninnal szomszédos prolin található (NH₂-APDSVDYRKKGYVTPVKN) (10. az. számú szék.). Ezzel ellentétben, az autokatalitikusan aktivált ciszteinproteázok hasítóhelyénél gyakran 3-6 aminosavból álló, N-terminális-toldás található az előtagon (Brömme és munkatársai, 1993). Az érett katepszin02 számított molekulatömege 23 495, ami az enzim aktuálisan mért molekulatömege is. A tripszin (24 kD) rendelkezik ugyanekkora látszólagos molekulatömeggel, ha azonos körülmények között teszteljük (29 kD).

A rekombináns humán katepszin-S-t baculovírus expressziós rendszer alkalmazásával expresszáltuk és tisztítottuk, ahogyan azt már máshol leírták (Brömme és McGrath, nem közölt eredmények). A rekombináns humán katepszin-L Dr. Mórt (Shriner’s Hospital fór Crippled Children, Montreal, Quebec) nagylelkű adománya. Az összes felhasznált katepszin elektroforetikusan homogén volt, és molaritásukat Ε-64-gyel végzett aktívhely-titrálással határoztuk meg, Barrett és Kirschke (1981) szerint.

Fluorimetrikus mérési eljárás az enzim aktivitásának meghatározására

A humán katepszin-O2-t fluorogén szubsztrát, ZFR-MCA (MCA=metil-kumaril-amid) alkalmazásával mértük, 100 mM nátrium-acetát-pufferben, amely

2,5 mM ditiotreitolt és 2,5 mM EDTA-t tartalmazott. Az MCA-szubsztrát kezdeti hidrolízissebességét 1 cmes küvettában követtük, 25 °C-on, a gerjesztési hullámhossz 380 nm, az emissziós hullámhossz 450 nm volt. A Z-FR-MCA koncentrációja 5 μΜ volt a szokásos körülmények között.

A V_max és K™ kinetikai állandókat nemlineáris regressziós analízissel kaptuk, „Enzfitter” (Leatherbarrow, Enzfitter, Elsevier Biosoft, Cambridge, United Kingdom, 1987) program alkalmazásával.

A katepszin-02 gátlását állandó szubsztrát- (5 μΜ Z-FR-MCA) és enzimkoncentrációnál (1 nM) mértük különböző inhibitorkoncentrációk jelenlétében a szubsztrátmérő pufferben. A katepszin-02-t előinkubáltuk az inhibitorokkal 10 percig, és a reakciót a szubsztrát hozzáadásával indítottuk. A maradék aktivitást mértük, és a százalékos inhibíciót a gátlás nélküli sebességből számítottuk.

3. példa

A katepszin-O2 előtagjának klónozása és expressziója

A humán katepszin-O2 előtagját PCR-rel amplifikáltuk, a szokásos technikával, a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

5’-CTG GAT CCC TGT ACC CTG AGG AGA

TAC TG-3’ (11. az. számú)

5’-CTA AGC TTC TAT CTA CCT TCC CAT TCT

GGG ATA-3’ (12. az. számú)

Az előrégiót pTrcHis-vektorban expresszáltuk (Invitrogen Corp., San Diego, CA), amely több hatos hisztidincsoportot tartalmaz, amelynek fémkötő szerepe van a lefordított fehérjében. Ezt a fémkötő domént alkalmaztuk a katepszin-02 előtagjának tisztításához, az Invitrogen cégtől vásárolt „ProBond” gyantán, amelyet az „Xpress system” nevű fehéqeexpressziós kit tartalmazott. A tisztított előtagról készült gélt a 10. ábrán mutatjuk be.

A tisztított előtag gátolta az eredeti enzimet, K_r értéke 0,1 nM volt.

4. példa

Humán katepszin-02 ellen termeltetett ellenanyagok és immunohisztokémia

Poliklonális ellenanyagokat termeltettünk a humán katepszin-02 proenzimje ellen „New Zealand” típusú fehér nyulakban. A proenzimet kódoló cDNS-t PCRrel amplifíkáltuk a pre-proenzim szekvenciájából, PfuDNS-polimeráz (Promega cégtől szereztük be) alkalmazásával. Az alkalmazott láncindító oligonukleotidok a proenzim 5’-végénél egy Nhel-hasítóhelyet, és a 3’végénél egy BamHI-hasítóhelyet tartalmaztak. A humán katepszin-O2-t E. coliban [BL21 (DE3)] klónoztuk és expresszáltuk, a pETl lc-vektorban, amelyet a Novagen cégtől szereztünk be. Az expressziót 0,4 mM IPTG-vel indukáltuk OD600=0,6-nál, és a sejteket 2 órával az indukció után választottuk el. Ezután az expresszált fehérjéket Novex 12%-os Tris-glicin SDSgélben futtattuk, amit Coomassie-val festettünk meg és festéktelenítettünk. A katepszin-02 proenzimcsíkját kivágtuk, aminek minőségét előzőleg N-terminális szekvenálással igazoltuk. A fehérjét elektromosan eluáltuk ki a gélszeletből, és Centricon 10-ben töményítettünk, amely 1 xelúciós pufferrel volt előkezelve. Az antigént 1 ml 1 χ PBS-ben vettük fel, és használtunk az immunizáláshoz (EL Labs, Soquel, CA).

Az ellenanyagokat a teljes szérumból tisztítottuk acetonos por segítségével, amit az indukált BL21(DE3)tenyészetből nyertünk ki. A tisztítást nitrocellulózhoz kapcsolt antigénhez történő affinitáskötéssel és elúcióval végeztük. A tisztított ellenanyagok specifikusak voltak a humán katepszin-O2-re, az előtagra és az érett enzimre, és nem volt keresztreakciójuk a humán katepszin-S-sel, -L-lel és -B-vel „Western Blot”-analízisben 1:2000 hígításban.

Formaiinnal fixált és paraffinba ágyazott humánszövetmetszeteket (Biogenex, San Ramon, CA) készítettünk, korábbi leírások alapján (Cattoretti és munkatársai,

HU 220 960 Bl

1992) és megfestettük azokat kontrollnyúl-eredetű IgGvel vagy affinitástisztított anti-katepszin-O2 ellenanyagokkal, „StrAviGen” detekciós rendszert (Biogenex cégtől szereztük be) alkalmazva. A metszetek kontrasztfestését Mayer-féle hematoxilinnel végeztük. 5

Az oszteoklasztómák immunofestése a több sejtmagvú oszteoklasztok intenzív, specifikus festődését eredményezte, míg a támasztószövet nem adott reakciót (11. ábra). A prenatális humáncsontokból származó oszteoklasztok intenzív immunohisztokémiai festődését is megfigyelhettük (az eredményeket nem mutatjuk be). A tüdőben a katepszin-O2 két helyen is detektálható volt; egyrészt a tüdő alveoláris makrofágjaiban (11. ábra), másrészt a bronchioláris epitélsejtekben.

A katepszin-O2 a gyomor emésztőmirigyeinek, a vastagbél belső elválasztású mirigyeinek, a vese proximális és disztális tubulusainak epiteliális sejtjeiben és a méhben található mirigyek epitéliumában, az endometriumban. Ezenkívül a májban található Kupfer-sejtek és a herében fejlődő spermasejtek mutatnak erős festő- 20 dést a katepszin-O2-re. Egységesebb festődést figyelhettünk meg a mellékvesekéregben, a petefészekben és a placentában (11. ábra).

Ehhez hasonlóan, poliklonális ellenanyagokat termeltettünk elektroforetikusan homogén humán katep- 25 szin-02 előtagja ellen „New Zealand” típusú fehér nyulakban, és monoklonális ellenanyagokat az előtag, a prokatepszin-02 és az érett katepszin-02 ellen a hagyományos technikák alkalmazásával.

5. példa

A humán katepszin-02 jellemzése

A következő kísérleteket a 2. példa szerinti részlegesen tisztított humán katepszin-02-vei végeztük.

A rekombináns humán katepszin-02 aktivitásának és stabilitásának pH-fiiggése

A katepszin-02 pH-stabilitását úgy határoztuk meg, hogy az aktív proteázt inkubáltuk különböző pH-kon mM ditiotreitol és 5 mM EDTA jelenlétében 25 °Con. A maradék aktivitást mértük bizonyos időközönként a fent ismertetett fluorimetriás szubsztrátot alkalmazó mérési eljárással.

A szubsztráthidrolízis kezdeti sebességét a korábban leírtak szerint mértük. A humán katepszin-02 aktivitásának pH-függését 1 μΜ szubsztrátkoncentrációnál (Z-FRMCA) kaptuk meg ([S])<<K^ ahol a kezdeti sebesség, v₀ egyenesen arányos a k^j/Kn, értékkel). A következő 10 puffereket alkalmaztuk az aktivitás pH-függésének meghatározásához: 100 mM nátrium-citrát (pH 2,8-5,6) és 100 mM nátrium-foszfát (pH 5,8-8,0). Mindegyik puffer tartalmazott 1 mM EDTA-t és 0,4 M NaCl-ot az ionerősség változásainak minimalizálására. A hármas proto15 nálás modelljét [Khouri és munkatársai, Biochem. 30, 8929-8936 (1991)] alkalmaztuk a legkisebb négyzetek módszerével elvégzett regressziós analízishez. Az adatokat a következő egyenletbe helyettesítettük be: (kA)obs=(lqca/K_in)/([HU/K_{1 +} l₊K₂/[HU)

A katepszin-02, -S és -L pH-stabilitását három különböző pH-értéken vizsgáltuk. A rekombináns humán katepszin-O2-t, -S-t és -L-t 37 °C-on inkubáltuk 100 mM nátrium-acetát-pufferben, pH 5,5-n, 100 mM kálium-foszfát-pufferben, pH 6,5-n és 100 mM Tris/HCl-ban, pH 7,5-en, 5 mM ditiotreitol és 2,5 mM EDTA jelenlétében. Az inkubációs idő 0,5,1,2 és 4 óra volt, a maradék aktivitást 5 μΜ Z-FR-MCA-val mértük a katepszin-02 (100 mM kálium-foszfát-puffer, pH 6,5) és a katepszin-L (100 mM nátrium-acetát-puffer, pH 30 5,5) esetében, és 5 μΜ Z-WR-MCA-val a katepszin-S (100 mM kálium-foszfát-puffer, pH 6,5) esetében.

Az aktivitás pH-függései érzékenyen követik az enzim funkcionális és strukturális integritását. A különböző, de rokon szerkezetű proteázok pH-profiljainak 35 összehasonlításából kiderülnek a proteázok belső aktivitásában és stabilitásában lévő különbségek. A humán katepszin-02 harang alakú pH-profilt mutat, melynek szélső pK-értékei 4,0 és 8,13 (2. táblázat; 5. ábra).

2. táblázat

A rekombináns humán katepszin-O2-aktivitás pH-függésének pK-értékei, a katepszin-S, -L és a papain pK-értékeivel összehasonlítva

Proteáz	pK,	pK,	PK2	pH optimum”
„humán cathepsin 02”	3,43+0,05	4,00+0,02	8,13+0,01	6,1
„humán cathepsin Sb”		4,49+0,3	7,82+0,03	6,1
| „humán cathepsin Lb”	3,33+0,014	4,22+0,28	6,95+0,09	5,6
1 „papainc”	3,58+0,29	4,54+0,29	8,45+0,02	6,5

^a (pKj +pKj)/2-ből számolt ^b Brömme és munkatársai szerint, 1993, lásd fent ^c Khouri és munkatársai szerint, 1991, lásd fent

A humán katepszin-02 pH-optimuma 6,0 és 6,5 között volt, és ez összehasonlítható a katepszin-S-re meg- 55 figyelt értékkel (Brömme és munkatársai, lásd fent, 1993). A pH-profil szélessége, amely az ionpár stabilitását tükrözi [Menard és munkatársai, Biochem. 30, 5531-5538 (1991)], 4,15 a katepszin-02 esetén, de csak 3,35 a katepszin-S esetében (Brömme és munkatár- 60 sai, 1993, lásd fent). Ez a katepszin-O2-re mért adat közelebbi hasonlóságban van a stabil papainra megfigyelt, 3,91 profilszélességgel (Khouri és munkatársai, lásd fent, 1991).

A humán katepszin-02 stabilabb, mint a katepszinL enyhe savastól semleges pH-értékeknél, de kevésbé stabil, mint a katepszin-S (3. táblázat).

HU 220 960 Β1

3. táblázat

A rekombináns humán katepszin-02 pH-stabilitása 37 °C-on, a rekombináns humán katepszin-S-sel és -L-lel összehasonlítva

I Proteáz	Inkubációs idő (óra)	Maradék aktivitás (%)
pH=5,5	pH=7,5	pH=6,5
katepszin-02	0,5	91	85	11
	1	88	49	0
	2	70	22	0
	4	52	15	0
katepszin-S	0,5	100	100	91
	1	95	100	72
	2	92	94	61
	4	83	71	60
katepszin-L	0,5	87	11	0
	1	78	3	0
	2	71	0	0
	4	51	0	0

A katepszin-02 aktivitásának körülbelül 50%-a marad meg 1 óra után, 37 °C-on és 6,5 pH-η, míg lényegében semmilyen katepszin-L-aktivitást sem tudtunk megfigyelni ugyanilyen körülmények között.

Mégis, figyelembe kell vennünk, hogy a stabilitás pH-fiiggését a szubsztrát védelme nélkül határoztuk meg, amely rendszerint megnöveli a pH-stabilitást. A katepszin-O2-vel végzett ³H-elasztin degradációs mérési eljárásban szolubilizált ³H-ftagmensek növekedése figyelhető meg 2 óra után pH 7,0-en.

A rekombináns humán katepszin-02 inhibitorprofilja

A proteázosztály-specifikus inhibitorok hatékonyságát határoztuk meg katepszin-O2-re úgy, hogy tisztított enzimhez adtunk inhibitort a fluorimetriás enzimmérési eljárásban (leírását lásd fent). A humán katepszin-02 a ciszteinproteázok tipikus inhibitorprofilját mutatja. Gátolható ciszteinproteáz-inhibitorokkal, és a ciszteinproteázokat és a szerinproteázokat egyaránt gátló inhibitorokkal (4. táblázat). 0,1 μΜ koncentráció fölött, a peptidaldehidek, diazometánok, E-64 és a csirkeeredetű cisztatin teljesen gátolja az enzimaktivitást. Másrészt, specifikus szerin- és aszpartátproteáz-inhibitorok nincsenek hatással az enzimaktivitásra. Az EDTA-nak 4 mM-os koncentrációban nem volt megfigyelhető hatása a katepszin02 aktivitására. Magasabb koncentrációban (>5 mM) egy részleges, nem specifikus gátlást figyeltünk meg.

4. táblázat

A rekombináns humán katepszin-02 inhibítorprofilja

	Inhibitor	[Inhibitor]	%-os inhibició
Szerinproteáz-inhibítorok	PMSF	1 mmol/1	0
	Befablock	0,2 mmol/1	0
	DC1	0,1 mmol/1	0
Szerin-S és ciszteinproteáz-inhibítorok	leupeptin	0,05 pmol	85
	kimosztatin	0,05 pmol	64
	kalpeptin	0,1 pmol	100
Aszpartát proteáz-inhibítorok	pepsztain	0,1 pmol	0
Metalloproteáz-inhibítorok	EDTA	4 mmol/1	0
Ciszteinproteáz-inhibítorok	jód-acetát	50 pmol	60
	Z-FF-CHN2	0,1 pmol	90
	z-fa-chn2	0,1 pmol	100
	E-64	0,1 pmol	100
1	csirkeeredetű cisztein	0,1 pmol	100

A katepszin-02 aktivitása csak a ciszteinproteázokra specifikus inhibitorokkal gátolható.

HU 220 960 Bl

A rekombináns humán katepszin-O2 szubsztrátspecifitása

A szintetikus szubsztrátok irányában mutatott szubsztrátspecifitást a fent leírt mérési eljárással határoztuk meg.

A humán katepszin-O2 S₂P₂-specifitását Z-X-RMCA típusú szintetikus szubsztrátok alkalmazásával jellemeztük, ahol az X lehet F, L, V vagy R. A ciszteinproteázok S₂-kötőzsebe szerkezetileg jól körülírható, és meghatározza a proteázosztály elsődleges specifi- 10 tását. Például, a katepszin-B egy glutamátcsoportot (E245) tartalmaz az S₂-oldallánc-zseb alján, amely bázikus csoportok, mint például arginin, megkötésének kedvez. Ezt a glutamátcsoportot cseréltük ki semleges csoportokkal minden ismert humán katepszinben, amely a Z-R-R-MCA szubsztrát nagyon alacsony hidrolízissebességét eredményezte. A katepszin-O2 egy leucincsoportot tartalmaz a 205. helyen, amely a Z-R5 R-MCA szubsztrátot nagyon gyenge szubsztráttá teszi (6. ábra). A katepszin-O2 specifitása a P₂-csoportok felé emlékeztet a katepszin-S-ére. Mindkét enzimben előnyösebb, ha leucin van ebben a pozícióban, nem fenil-alanin, míg a katepszin-L-t fordított specifitás jellemzi (5. táblázat, 6. ábra). A katepszin-O2 esetében a valin viszonylag jól elfogadható a P₂-pozícióban, míg ennek a béta-helyzetben elágazó csoportnak a jelenléte a katepszin-L, -S és -B esetében gyenge szubsztrátot eredményez.

5. táblázat

A Z-X-R-MCA szubsztrát rekombináns humán katepszin-O2 által katalizált hidrolízisének kinetikai paraméterei

1 Szubsztrát	kca, (S '>	Km (pmol)	kcatKmíM-'S-')
Z-FR-MCA	0,90±0,20	7,5±3,4	120,000
1 Z-LR-MCA	0,98±0,39	3,8±0,8	257,900
j Z-VR-MCA	l,06±0,16	13,1±5,6	80,900
| Z-RR-MCA	0,0005±0,0002	23±4	22
Z-WR-MCA	0,01 ±0,04	18,5±1,5	540
| Z-LLR-MCA	0,02±0,008	0,4±0,l	50,000

A k_kat és K„, kinetikai paraméterek számításához a kezdeti sebességet tipikusan 9-11 különböző szubsztrátkoncentrációnál mértük meg, és az eredményeket az (1) egyenletbe helyettesítettük be. Az enzimkoncentrációt aktívcsoport-titrálással határoztuk meg, Ε-64-gyet alkalmazva [Kinder és munkatársai, Biochem. J. 201, 367-372 (1982)].

k^xEoxfS] v=(l)-egyenlet (Km+[S])

A katepszin-O2 katalitikus hatékonysága (k^/K^,) a dipeptidszubsztrátok felé összehasonlítható volt a katepszin-S és -B hatékonyságával, de körülbelül egy nagyságrenddel volt kisebb a katepszin-L hatékonyságánál. Érdekes, hogy a katepszin-O2-re vonatkozó K_m-értékek összehasonlíthatók voltak a katepszin-L ennek megfelelő értékeivel. A Kiérték bizonyos mértékben a szubsztrátok affinitását tükrözik a proteáz irányában. Ez a tendencia még nyilvánvalóbb a Z-LLR-MCA tripeptidszubsztrát esetében, amelynek Κ,,,-értéke 4χ10⁷ M (5. táblázat). Azonban a katepszin-S és -L-lel ellentétben, a kfcat-értékek majdnem két nagyságrenddel alacsonyabbak a katepszin-O2 esetében, amely nem produktív kötődésre utalhat.

A rekombináns humán katepszin-O2 aktivitása extracelluláris mátrixfehérjék irányában [³H]-elasztint preparáltunk korábbi leírás alapján [Banda és munkatársai, Methods Enzymol. 144, 288-305 (1987)], amelynek specifikus aktivitása 113 000 cpm/mg fehérje volt. Elasztint (2 mg) inkubáltunk 1 ml pufferben, amely 2,5 mM ditiotreitolt, 2,5 mM

EDTA-t és 0,05% Triton Χ-100-at tartalmazott a katepszin-02-, -S- és -L-aktivitás mérési eljárásaihoz. Aliquotokat vettünk ki 10, 20, 30, 50, 90,120 és 180 perc után, 1 percig centrifugáltuk 14 OOOxg-n és egy szcintillációs folyadékot tartalmazó 24 lyukú mikrotitertálcában olvastuk le folyadékszcintillációs számlálóban („1450 Microbeta Plus” típusú készülék a Pharmacia cégtől szereztük be, Wallac). A humán katepszin-O2, -S és -L, és a marhaeredetű elasztáz koncentrációja az elasztindegradációs mérési eljárásban 65 nM, 28 nM, 80 nM és 80 nM volt, sorrendben. A pH hatását a proteázaktivitásra úgy határoztuk meg, hogy az emésztéseket pH 4,5-n és 5,5-n (100 mM nátrium-acetát, 2,5 mM ditiotreitol és EDTA, 0,05% Triton X-100), és pH 7,0-n (100 mM Tris/HCl,

2,5 mM ditiotreitol és EDTA, 0,05% Triton X-100) végeztük. A marhapankreászból származó elasztázt (Boehringer, Mannheim, IN) ugyanilyen körülmények között mértük, kivéve, hogy sem ditiotreitolt, sem EDTA-t nem adtunk a reakciókeverékhez.

A maximális aktivitást pH 5,5-en figyeltük meg. A katepszin-O2-nek pH 4,5-7,0 között van elasztinolitikus aktivitása, amely 1,7-3,5-szer nagyobb, mint a katepszin-S ugyanilyen aktivitása. A katepszin-O2 elasztinolitikus aktivitása a katepszin-L pH-optimumán (pH 5,5) és semleges pH-η majdnem 9-szer és 2,4-szer volt magasabb, ha a katepszin-L-hez és a pankreászeredetű elasztázhoz hasonlítottuk, sorrendben (7. ábra). A katepszin-L-re és -S-re meghatározott értékek jó egyezésben vannak a publikált adatokkal [Kirschke és munkatársai, „Proteolysis and Protein Tumover” (szerk. Bond, J. S. és Barrett, A. J.) 33-37, Portland Press,

HU 220 960 Bl

London and Chapel Hill (1993); Kirschke és Wiederanders, Methods Enzymol. 244, 500-511 (1994)].

Oldható, boíjúbőr-eredetű, I. típusú kollagént hígítottunk 0,4 mg/ml-re 100 mM nátrium-acetát-pufferben, pH 4,5, 5,0, 5,5, 100 mM kálium-foszfát-pufferben, pH 6,0,

6,5 és 100 mM Tris/HCl pufferben, pH 7,0, amelyek 2 mM ditiotreitolt és 2 mM EDTA-t tartalmaztak. Humán katepszin-O2-t, -S-t és -L-t és marhaeredetű tripszint (Sigma cégtől szereztük be) inkubáltunk 100 nM-os enzimkoncentrációban 10 óráig, 28 °C-on. A katepszin02 és -S zselatinázaktivitásának mérésére, I. típusú kollagént melegítettünk föl 10 percig 70 °C-ra a proteázzal való inkubálás előtt. 1 nM proteáz jelenlétében a reakciókeveréket 30 percig inkubáltuk 28 °C-on. A mintákat SDS-poliakrilamid-elektroforézissel analizáltuk, 4-20%os Tris-glicin-gélekben (Novex, San Diego, CA).

A katepszin-O2 alaposan degradálta az I. típusú kollagént pH 5,0 és 6,0 között, 28 °C-on, míg a degradáció-pH

4.5- en és 7,0-en sokkal kevesebb volt (9a. ábra). Úgy tűnik, hogy az elsődleges hasítás a telopeptidrégióban történik meg, mivel az alfa-monomerek felszabadulása a bétaés a gamma-komponensekről valamivel kisebb volt. További hasítás következhet be az alfa-monomeren belül. Még nem világos, vajon a hasítás az intakt helikális régióban vagy a komformációját vesztett, kigöngyölített alfamonomerekben megy-e végbe. Az I. típusú kollagén fő fragmense figyelhető meg a katepszin-O2 hatása után, amelynek mérete 70-80 kD. A katepszin-L szintén a telopeptidrégióban hasított, de lényegében nem voltak detektálhatok kis molekulatömegű fragmensek. A katepszin-L kollagenolitikus aktivitásának effektiv pH-tartománya savasabb, ha a katepszin-O2 esetében megfigyelt értékhez (pH 4,0-5,5 között) hasonlítjuk. A katepszin-S csak nagyon gyenge kollagenolitikus aktivitást mutatott. Ezzel ellentétben, a szövetkollagenázok hasítják az alfamonomert háromnegyed és egynegyed fragmensekre [Gross és Nagai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54, 1197-1204 (1965)]. Nem volt megfigyelhető az I. típusú kollagén degradációja a katepszin-O2-vel azonos koncentrációban alkalmazott tripszin hatására, ami azt mutatja, hogy az alkalmazott kollagén hármashélix-integritása nem károsodott (az adatokat nem mutatjuk be).

A kollagenáz aktivitásán kívül a katepszin-O2 hatásos zselatinázaktivitással rendelkezik. Az enzim 0,1 nMos koncentrációjában a denaturált kollagén teljesen degradálódott 30 perc alatt, 5,0-7,0 pH-tartományban. Ezzel ellentétben, a katepszin-L zselatinázaktivitását csak

4.5- 5,5 pH-tartományban fejti ki (6b. ábra). A katepszin-S pH 4,0-7,0 között aktív, de szignifikánsan gyengébb aktivitást mutatott, mint a katepszin-O2 és -L.

A katepszinek relatív elasztinolitikus aktivitása, a marhapankreász-eredetű elasztázhoz hasonlítva

Proteáz	pH 4,5 mg/perc/ /pmol enzim	PH 5,5 mg/perc/ /pmol enzim	PH 7,0 mg/perc/ /pmol enzim
Katepszin-02	245	286	170
Katepszin-L	18	32	0

Proteáz	pH 4,5 mg/perc/ /pmol enzim	PH 5,5 mg/perc/ /pmol enzim	PH 7,0 mg/perc/ /pmol enzim
Katepszin-S	146	102	55
Pankreászeredetű elasztáz	8	18	79

A humán katepszin-O2-mKNS megoszlása szövetekben

A humán katepszin-02, -L és -S mRNS-szinten való szöveteloszlását határoztuk meg Northem-blotolással, a megfelelő humánenzimek cDNS-próbáinak alkalmazásával. A próbák körülbelül 450 bázispár hosszúságúak voltak és fedésben voltak a kódolórégiónak azzal a szakaszával, amely az aktív centrumban lévő cisztein-25- (a papainszámozás szerint) és aszparagin-175-csoportok között található. Ahogyan a 8. ábrán bemutatjuk, mRNSszinten a humánoszteoklasztóma-minták többszörösen magasabb szinten expresszálják a katepszin-02-t, mint a katepszin-L-t.

A humán katepszin-O2-mRNS eloszlása a szövetekben mutat némi hasonlóságot a katepszin-L-hez, de szövetbeli koncentrációja szignifikánsan alacsonyabb a szervek többségében (szív, placenta, tüdő, pankreász és vese). Másrészt a humán katepszin-02 figyelemre méltó különbségeket mutat humán szövetekben és sejtvonalakban való megoszlásában, ha azt a humán katepszin-L-hez és -Shez hasonlítjuk. A katepszin-02 magas szintű transzkripciót mutat a petefészekben, vékonybélben és vastagbélben, de nincsen jelen a májban, amely gazdag katepszinL-ben. Ugyanezt találtuk HeLa-sejtek esetében is.

Megoszlás szövetekben és sejtvonalakban (Northem-blot)

Szövet	HCATO	HCATL	HCATS
SZÍV	XX	XXXX	-
agy	-	X	-
placenta	XX	XXXX	XX
| tüdő	XX	XXX	XXX
máj	-	XXXX	XX
vázizom	XX	XX	-
vese	X	XXXX	-
pankreász	X	XX	-
lép	X	-	X
timusz	X	X	-
prosztata	X	X	-
here	X	XX	-
petefészek	XXX	X	-
vékonybél	XX	-	-
vastagbél	XXX	X	-
leukocita	-	-	XXX
promielocit. leukémia HL-60	-	-	X

HU 220 960 Bl

Táblázat (folytatás)

I Szövet	HCATO	HCATL	HCATS
limfoblaszt. leukémia MOLT -4		XX	X
Burkit-féle lim| fúrna. Raji-sejtek		-	X

Szövet	HCATO	HCATL	HCATS
colect. adenokarcinóma		X
tüdőkarcinóma A549		xxxx	X
| melanóma G361	-	xxxxx	-

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1482 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 142... 1128

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGCACTCAC AGTCGCAACC TTTCCCCTTC CTGACTTCCC GCTGACTTCC GCAATCCCGA 60

TGGAATAAAT CTAGCACCCC TGATGGTGTG CCCACACTTT GCTGCCGAAA CGAAGCCAGA 120

CAACAGATTT CCATCAGCAG C ATG TGG	GGG Gly	CTC Leu	AAG Ly s 5	GTT Val	CTG Leu	CTG CTA CCT	171
	Me t 1	Trp	Leu	Leu	Pro 10
GTG	GTG AGC TTT GCT CTG TAC	CCT	GAG	GAG	ATA	CTG	GAC	ACC	CAC	TGG	219
Va 1	Val Ser Phe Alá Leu Tyr 15	Pro	Glu	Glu 20	lle	Leu	Asp	Thr	Hi s 25	Trp
GAG	CTA TGG AAG AAG ACC CAC	AGG	AAG	CAA	TAT	AAC	AAC	AAG	GTG	GAT	267
Glu	Leu Trp Lys Lys Thr His 30	Arg	Lys 35	Gin	Tyr	Asn	Asn	Ly s 40	Val	Asp
GAA	ATC TCT CGG CGT TTA ATT	TGG	GAA	AAA	AAC	CTG	AAG	TAT	ATT	TCC	315
Glu	lle Ser Arg Arg Leu lle 45	Trp 50	Glu	Ly s	Asn	Leu	Lys 55	Tyr	lle	Ser
ATC	CAT AAC CTT GAG GCT TCT	CTT	GGT	GTC	CAT	ACA	TAT	GAA	CTG	GCT	363
lle	His Asn Leu Glu Alá Ser 60 65	Leu	Gly	Val	Hi s	Thr 70	Tyr	G1 u	Leu	Al a
ATG	AAC CAC CTG GGG GAC ATG	ACC	AGT	GAA	GAG	GTG	GTT	CAG	AAG	ATG	411
Me t 75	Asn His Leu Gly Asp Met 80	Thr	Ser	Glu	Glu 85	Val	Val	Gin	Ly s	Me t 90
ACT	GGA CTC AAA GTA CCC CTG	TCT	CAT	TCC	CGC	AGT	AAT	GAC	ACC	CTT	459
Thr	Gly Leu Lys Val Pro Leu 95	Se r	Hi s	Ser 100	Arg	Ser	Asn	Asp	Thr 105	Leu
TAT	ATC CCA GAA TGG GAA GGT	AGA	GCC	CCA	GAC	TCT	GTC	GAC	TAT	CGA	507
Tyr	lle Pro Glu Trp Glu Gly 110	Arg	Al a 115	Pro	As p	Ser	Val	As p 120	Tyr	Arg

HU 220 960 Bl

AAG Lys

AAA Lys

GGA TAT GTT ACT

CCT GTC

AAA AAT CAG GGT CAG TGT GGT TCC

555

Gly 125

Tyr

Val

Thr

Pro

Val 130

Ly s

Asn

Gin

Gly

Gin 135

Cys

Gly

Ser

TGT

TGG

GCT

TTT

AGC

TCT

GTG

GGT

GCC

CTG

GAG

GGC

CAA

CTC

AAG

AAG

603

Cys

Trp 140

Al a

Phe

Ser

Ser

Val 145

Gly

Al a

Leu

Glu

Gly 150

Gin

Leu

Lys

Lys

AAA

ACT

GGC

AAA

CTC

TTA

AAT

CTG

AGT

CCC

CAG

AAC

CTA

GTG

GAT

TGT

651

Lys 155

Thr

Gly

Ly s

Leu

Leu 160

Asn

Le u

Ser

Pro

Gin 165

Asn

Leu

Val

Asp

Cys 170

GTG

TCT

GAG

AAT

GAT

GGC

TGT

GGA

GGG

GGC

TAC

ATG

ACC

AAT

GCC

TTC

699

Val

Ser

Glu

Asn

As p 175

Gly

Cys

Gly

Gly

Gly 180

Tyr

Me t

Thr

Asn

Al a 185

Phe

CAA

TAT

GTG

CAG

AAG

AAC

CGG

GGT

ATT

GAC

TCT

GAA

GAT

GCC

TAC

CCA

747

Gin

Tyr

Val

Gin 190

Ly s

Asn

Arg

Gly

Ile 195

Asp

Ser

Glu

Asp

Al a 200

Tyr

Pro

TAT

GTG

GGA

CAG

GAA

GAG

AGT

TGT

ATG

TAC

AAC

CCA

ACA

GGC

AAG

GCA

795

Tyr

Val

Gly 205

Gin

Glu

Glu

Ser

Cy s 210

Me t

Tyr

Asn

Pro

Thr 215

Gly

Lys

Al a

GCT

AAA

TGC

AGA

GGG

TAC

AGA

GAG

ATC

CCC

GAG

GGG

AAT

GAG

AAA

GCC

843

Al a

Lys 220

Cys

Arg

Gly

Tyr

Arg 225

Glu

Ile

Pro

Glu

Gly 230

Asn

Glu

Ly s

Al a

CTG

AAG

AGG

GCA

GTG

GCC

CGA

GTG

GGA

CCT

GTC

TCT

GTG

GCC

ATT

GAT

891

Leu 235

Lys

Arg

Al a

Val

Al a 240

Arg

Val

Gly

Pro

Val 245

Ser

Val

Al a

Ile

Asp 250

GCA

AGC

CTG

ACC

TCC

TTC

CAG

TTT

TAC

AGC

AAA

GGT

GTG

TAT

TAT

GAT

939

Al a

Ser

Leu

Thr

Ser 255

Phe

Gin

Phe

Tyr

Ser 260

Ly s

Gly

Val

Tyr

Tyr 265

Asp

GAA

AGC

TGC

AAT

AGC

GAT

AAT

CTG

AAC

CAT

GCG

GTT

TTG

GCA

GTG

GGA

987

Glu

Ser

Cys

Asn 270

Ser

Asp

Asn

Leu

Asn 275

Hi s

Ala

Val

Leu

Al a 280

Val

Gly

TAT

GGA

ATC

CAG

AAG

GGA

AAC

AAG

CAC

TGG

ATA

ATT

AAA

AAC

AGC

TGG

1035

Tyr

Gly

Ile 285

Gin

Ly s

Gly

Asn

Ly s 290

Hi s

Trp

Ile

Ile

Lys 295

Asn

Ser

TrP

GGA

GAA

AAC

TGG

GGA

AAC

AAA

GGA

TAT

ATC

CTC

ATG

GCT

CGA

AAT

AAG

1083

Gly

Glu 300

Asn

Trp

Gly

Asn

Ly s 305

Gly

Tyr

Ile

Leu

Me t 310

Al a

Arg

Asn

Lys

AAC Asn

AAC Asn

GCC Ala

TGT Cys

GGC Gly

ATT Ile

GCC Al a

AAC Asn

CTG Leu

GCC Al a

AGC Ser

TTC Phe

CCC Pr o

AAG Ly s

ATG Me t

1128

315 320 325

TGACTCCAGC CAGCCAAATC CATCCTGCTC TTCCATTTCT TCCACGATGG TGCAGTGTAA 1188 CGATGCACTT TGGAAGGGAG TTGGTGTGCT ATTTTTGAAG CAGATGTGGT GATACTGAGA 1248 TTGTCTGTTC AGTTTCCCCA TTTGTTTGTG CTTCAAATGA TCCTTCCTAC TTTGCTTCTC 1308 TCCACCCATG ACCTTTTTCA CTGTGGCCAT CAGGACTTTC CCTGACAGCT GTGTACTCTT 1368 AGGCTAAGAG ATGTGACTAC AGCCTGCCCC TGACTGTGTT GTCCCAGGGC TGATGCTGTA 1428 CAGGTACAGG CTGGAGATTT TCACATAGGT TAGATTCTCA TTCACGGGAC CCGG 1482

HU 220 960 Bl

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 329 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Trp

Gly

Leu

Ly s 5

Val

Leu

Leu

Leu

Pro 10

Va 1

Val

Ser

Phe

Al a 15

Leu

Tyr

Pro

Glu

Glu 20

Ile

Leu

Asp

Thr

His 25

Trp

Glu

Leu

Trp

Ly s 30

Lys

Thr

Hi s

Arg

Lys 35

Gin

Tyr

Asn

Asn

Ly s 40

Val

Asp

Glu

Ile

Ser 45

Arg

Arg

Leu

Ile

Trp 50

Glu

Ly s

Asn

Leu

Lys 55

Tyr

Ile

Ser

Ile

Hi s 60

Asn

Leu

Glu

Al a

Ser 65

Leu

Gly

Val

Hi s

Thr 70

Tyr

Glu

Leu

Al a

Me t 75

Asn

Hi s

Leu

Gly

Asp 80

Me t

Thr

Ser

Glu

Glu 85

Val

Va 1

Gin

Ly s

Me t 90

Thr

Gly

Leu

Ly s

Va 1 95

Pro

Leu

Ser

Hi s

Ser 100

Arg

Ser

Asn

As p

Thr 105

Leu

Tyr

Ile

Pro

Glu 110

Trp

Glu

G1 y

Arg

Al a 115

Pro

As p

Ser

Va 1

As p 120

Tyr

Arg

Ly s

Lys

Gly 125

Tyr

Va 1

Thr

Pro

Val 130

Lys

Asn

Gin

Gly

Gin 135

Cy s

Gly

Ser

Cy s

Trp 140

Al a

Phe

Ser

Ser

Val 145

Gly

Al a

Leu

Glu

Gly 150

Gin

Leu

Lys

Ly s

Lys 155

Thr

Gly

Ly s

Leu

Leu 160

Asn

Leu

Ser

Pro

Gin 165

Asn

Leu

Va 1

Asp

Cys 170

Val

Ser

Glu

Asn

Asp 175

Gly

Cys

Gly

Gly

Gly 180

Tyr

Me t

Thr

Asn

Al a 185

Phe

Gin

Tyr

Val

Gin 190

Ly s

Asn

Arg

G1 y

Ile 195

As p

Ser

Glu

Asp

Al a 200

Tyr

Pro

Tyr

Va 1

Gly 205

Gin

Glu

Glu

Ser

Cys 210

Me t

Tyr

Asn

Pro

Thr 215

Gly

Ly s

Alá

Al a

Ly s 220

Cys

Arg

Gly

Tyr

Arg 225

G1 u

Ile

Pro

Glu

Gly 230

Asn

Glu

Lys

Al a

Leu 235

Lys

Arg

Al a

Va 1

Al a 240

Arg

Va 1

Gly

Pro

Val 245

Ser

Val

Alá

Ile

Asp 250

Al a

Ser

Leu

Thr

Ser 255

Phe

Gin

Phe

Tyr

Ser 260

Ly s

Gly

Val

Tyr

Tyr 265

Asp

Glu

Ser

Cys

Asn 270

Ser

As p

HU 220 960 Bl

Asn

Leu

Asn His Ala 275

Va 1

Leu Ala Val 280

Gly

Tyr

Gly

Ile 285

Gin

Ly s

Gly

Asn

Ly s

Hi s

Trp

Ile

Ile

Ly s

As n

Ser

Trp

Gly

Glu

Asn

Trp

Gly

Asn

290

295

300

Lys

Gly

Tyr

Ile

Leu

Me t

Al a

Arg

Asn

Lys

Asn

Asn

Al a

Cy s

Gly

Ile

305

310

315

320

Al a

Asn

Leu

Al a

Ser

Phe

Pro

Ly s

Me t

325

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 329 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Trp

Gly

Leu

Lys 5

Val

Leu

Leu

Leu

Pro 10

Val

Va 1

Ser

Phe

Ala 15

Leu

His

Pro

Glu

Glu 20

Ile

Leu

Asp

Thr

Gin 25

Trp

Glu

Leu

Trp

Ly s 30

Lys

Thr

Tyr

Ser

Lys 35

Gin

Tyr

Asn

Ser

Ly s 40

Val

Asp

Glu

Ile

Ser 45

Arg

Arg

Leu

Ile

Trp 50

Glu

Lys

Asn

Leu

Lys 55

H i s

Ile

Ser

Ile

Hi s 60

Asn

Leu

Glu

Al a

Ser 65

Leu

Gly

Val

Hi s

Thr 70

Tyr

Gl u

Leu

Al a

Me t 75

Asn

Hi s

Leu

Gly

Asp 80

Me t

Thr

Ser

Glu

Glu 85

Val

Val

Gin

Lys

Me t 90

Thr

Gly

Leu

Ly s

Val 95

Pro

Pro

Ser

Arg

Ser 100

Hi s

Ser

Asn

As p

Thr 105

Leu

Tyr

Ile

Pro

As p 110

Trp

Glu

Gly

Arg

Thr 115

Pro

As p

Ser

Ile

As p 120

Tyr

Arg

Ly s

Lys

Gly 125

Tyr

Val

Thr

Pro

Val 130

Ly s

Asn

Gin

Gly

Gin 135

Cy s

Gly

Ser

Cy s

Trp 140

Al a

Phe

Ser

Ser

Val 145

Gly

Al a

Leu

Glu

Gly 150

Gin

Leu

Lys

Lys

Ly s 155

Thr

Gly

Ly s

Leu

Leu 160

Asn

Leu

Ser

Pro

Gin 165

Asn

Leu

Val

Asp

Cy s 170

Val

Ser

Glu

Asn

Tyr 175

Gly

Cys

Gly

Gly

Gly 180

Tyr

Me t

Thr

Asn

Al a 185

Phe

Gin

Tyr

Va 1

Gin 190

Arg

Asn

Arg

Gly

Ile 195

Asp

Ser

Glu

As p

Al a 200

Tyr

Pro

Tyr

Val

Gly 205

Gin

Asp

Glu

HU 220 960 Bl

Ser

Cys 210

Me t

Tyr

Asn

Pro Thr 215

Gly

Ly s

Al a

Al a

Lys 220

Cys

Arg

Gly

Tyr

Arg

Glu

Ile

Pro

GI u

Gly

Asn

Glu

Lys

Al a

Leu

Lys

Arg

Al a

Val

Al a

225

230

235

240

Arg

Val

Gly

Pro

Val

Ser

Val

Al a

Ile

Asp

Al a

Ser

Leu

Thr

Ser

Phe

245

250

255

Gin

Phe

Tyr

Ser

Lys

Gly

Va 1

Tyr

Tyr

Asp

Glu

Asn

Cys

Se r

Ser

As p

260

265

270

Asn

Val

Asn

His

Al a

Val

Leu

Al a

Val

Gly

Tyr

Gly

Ile

Gin

Lys

Gly

275

280

285

Asn

Ly s

His

Trp

Ile

Ile

Lys

Asn

Ser

Trp

Gly

Glu

Ser

Trp

Gly

Asn

290

295

300

Lys

Gly

Tyr

Ile

Leu

Me t

Al a

Arg

Asn

Lys

Asn

Asn

Al a

Cy s

Gly

Ile

305

310

315

320

Al a

Asn

Leu

Al a

Ser

Phe

Pro

Lys

Me t

325

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 331 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Lys Arg Leu

Va 1

Cy s

Va 1

Leu

Leu

Va 1

Cy s

Ser

Ser

Al a

Val

Al a

1

5

10

15

Gin Leu His Lys

As p

Pro

Thr

Leu

Asp

Hi s

Hi s

Trp

Hi s

Leu

Trp

Lys

20

25

30

Lys Thr Tyr Gly

Ly s

Gin

Tyr

Ly s

Glu

Ly s

Asn

Glu

Glu

Al a

Va 1

Arg

35

40

45

Arg Leu Ile Trp

Glu

Ly s

Asn

Leu

Lys

Phe

Val

Me t

Leu

Hi s

Asn

Leu

50

55

60

Glu His Ser Met

Gly

Me t

Hi s

Ser

Tyr

As p

Leu

Gly

Me t

Asn

Hi s

Leu

65

70

75

80

Gly Asp Me t Thr

Ser

Glu

Glu

Va 1

Me t

Ser

Leu

Me t

Ser

Ser

Leu

Arg

85

90

95

Val Pro Ser Gin

Trp

Gin

Arg

Asn

Ile

Thr

Tyr

Lys

Ser

Asn

Pro

Asn

100

105

110

Arg Ile Leu Pro

Asp

Ser

Val

Asp

Trp

Arg

Glu

Ly s

Gly

Cy s

Val

Thr

115

120

125

Glu Val Lys Tyr

Gin

Gly

Ser

Cys

Gly

Al a

Cy s

Trp

Al a

Phe

Ser

Al a

130

135

140

HU 220 960 Bl

Val 145

Gly

Al a

Leu

Glu Alá 150

Gin

Leu

Lys

Leu

Ly s 155

Thr

Gly

Lys

Leu

Val 160

Ser

Leu

Ser

Al a

Gin

Asn

Leu

Val

Asp

Cys

Ser

Thr

Glu

Lys

Tyr

Gly

165

170

175

Asn

Lys

Gly

Cys

Asn

Gly

Gly

Phe

Me t

Thr

Thr

Alá

Phe

Gin

Tyr

Ile

180

185

190

Ile

As p

Asn

Lys

Gly

Ile

As p

Ser

Asp

Alá

Ser

Tyr

Pro

Tyr

Lys

Alá

195

200

205

Me t

As p

Gin

Lys

Cys

Gin

Tyr

As p

Ser

Lys

Tyr

Arg

Al a

Al a

Thr

Cys

210

215

220

Ser

Ly s

Tyr

Thr

Glu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Arg

Glu

Val

Asp

Leu

Ly s

Glu

225

230

235

240

Al a

Val

Al a

Asn

Lys

Gly

Pro

Val

Ser

Val

Gly

Val

Asp

Alá

Arg

Hi s

245

250

255

Pro

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Arg

Ser

Gly

Val

Tyr

Tyr

Glu

Pro

Ser

Cys

260

265

270

Thr

Gin

Asn

Val

Asn

Hi s

Gly

Val

Leu

Val

Va 1

Gly

Tyr

Gly

Asp

Leu

275

280

285

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Trp

Leu

Val

Lys

Asn

Ser

Trp

Gly

Hi s

Asn

Phe

290

295

300

Gly

Glu

Glu

Gly

Tyr

Ile

Arg

Me t

Al a

Arg

Asn

Lys

Gly

Asn

Hi s

Cy s

305

310

315

320

Gly

Ile

Al a

Ser

Phe

Pro

Ser

Tyr

Pro

Glu

Ile

325 330

Az 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 333 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen MOLEKULATÍPUS: fehérje

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Asn

Pro

Thr

Leu 5

Ile

Leu

Al a

Al a

Phe 10

Cy s

Leu

Gly

Ile

Al a 15

Ser

Al a

Thr

Leu

Thr 20

Phe

Asp

Hi s

Ser

Leu 25

Glu

Al a

Gin

Trp

Thr 30

Lys

Trp

Lys

Al a

Me t 35

Hi s

Asn

Arg

Leu

Tyr 40

Gly

Me t

Asn

Glu

Glu 45

Gly

Trp

Arg

Arg

Al a 50

Val

Trp

Glu

Ly s

Asn 55

Me t

Ly s

Me t

Ile

Glu 60

Leu

Hi s

Asn

Gin

Glu 65

Tyr

Arg

Glu

Gly

Lys 70

Hi s

Ser

Phe

Thr

Me t 75

Al a

Me t

Asn

Al a

Phe 80

HU 220 960 Bl

Gly

Asp

Me t

Thr

Ser Glu 85

Glu

Phe

Arg Gin Val 90

Me t

Asn

Gly

Phe 95

Gin

Asn

Arg

Lys

Pro

Arg

Lys

Gly

Ly s

Val

Phe

Gin

Glu

Pro

Leu

Phe

Tyr

100

105

110

Glu

Al a

Pro

Arg

Ser

Val

Asp

Trp

Arg

Glu

Lys

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

115

120

125

Val

Ly s

Asn

Gin

Gly

Gin

Cys

Gly

Ser

Cys

Trp

Al a

Phe

Ser

Al a

Thr

130

135

140

Gly

Al a

Leu

Glu

Gly

Gin

Me t

Phe

Arg

Lys

Thr

Gly

Arg

Leu

Ile

Ser

145

150

155

160

Leu

Ser

Glu

Gin

Asn

Leu

Val

Asp

Cy s

Ser

Gly

Pro

Gin

Gly

Asn

Glu

165

170

175

Gly

Cy s

Asn

Gly

Gly

Leu

Me t

As p

Tyr

Al a

Phe

Gin

Tyr

Val

Gin

Asp

180

185

190

Asn

Gly

Gly

Leu

Asp

Ser

Glu

Glu

Ser

Tyr

Pro

Tyr

Glu

Al a

Thr

Glu

195

200

205

G1 u

Ser

Cys

Lys

Tyr

Asn

Pro

Ly s

Tyr

Ser

Val

Al a

Asn

As p

Thr

Gly

210

215

220

Phe

Val

Asp

Ile

Pro

Lys

Gin

Glu

Lys

Al a

Leu

Me t

Lys

Al a

Val

Al a

225

230

235

240

Thr

Val

Gly

Pro

Ile

Ser

Val

Al a

Ile

Asp

Alá

Gly

Hi s

Glu

Ser

Phe

245

250

255

Leu

Phe

Tyr

Lys

Glu

Gly

Ile

Tyr

Phe

Glu

Pro

Asp

Cys

Ser

Ser

Glu

260

265

270

Asp

Me t

Asp

Hi s

Gly

Val

Leu

Va 1

Val

Gly

Tyr

Gly

Phe

Glu

Ser

Thr

275

280

285

Glu

Ser

Asp

Asn

Asn

Ly s

Tyr

Trp

Leu

Val

Lys

Asn

Ser

Trp

Gly

Glu

290

295

300

Glu

Trp

Gly

Me t

Gly

Gly

Tyr

Val

Lys

Me t

Al a

Lys

Asp

Arg

Arg

Asn

305

310

315

320

Hi s

Cy s

Gly

Ile

Al a

Ser

Al a

Al a

Ser

Tyr

Pro

Thr

Val

325

330

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 335 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Trp Alá Thr Leu Pro Leu Leu Cys Alá Gly Alá Trp Leu Leu Cys 15 10 15

HU 220 960 Bl

Va 1

Pro Val

Cy s 20

Gly

Alá

Al a

Glu

Leu 25

Cy s

Val

Asn

Ser

Leu 30

G1 u

Lys

Phe

Hi s

Phe

Lys

Ser

Trp

Me t

Ser

Ly s

Hi s

Arg

Lys

Thr

Tyr

Ser

Thr

35

40

45

Glu

Glu

Tyr

Hi s

Hi s

Arg

Leu

Gin

Thr

Phe

Al a

Ser

Asn

Trp

Arg

Lys

50

55

60

lle

Asn

Al a

Hi s

Asn

Asn

Gly

Asn

Hi s

Thr

Phe

Lys

Me t

Al a

Leu

Asn

65

70

75

80

Gin

Phe

Ser

Asp

Me t

Ser

Phe

Al a

Glu

lle

Ly s

Hi s

Lys

Tyr

Leu

Trp

85

90

95

Ser

Glu

Pro

Gin

Asn

Cys

Ser

Al a

Thr

Lys

Ser

Asn

Tyr

Le u

Arg

Gly

100

105

110

Thr

Gly

Pro

Tyr

Pro

Pro

Ser

Val

Asp

Trp

Arg

Lys

Ly s

Gly

Asn

Phe

115

120

125

Val

Ser

Pro

Val

Lys

Asn

Gin

Gly

Al a

Cys

Gly

Ser

Cy s

Trp

Thr

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Thr

Gly

Al a

Leu

Glu

Ser

Al a

lle

Al a

lle

Al a

Thr

Gly

Lys

145

150

155

160

Me t

Leu

Ser

Leu

Al a

Glu

Gin

Gin

Leu

Val

Asp

Cys

Al a

Gin

Asp

Phe

165

170

175

Asn

Asn

Tyr

Gly

Cys

Gin

Gly

Gly

Leu

Pro

Ser

Gin

Al a

Phe

Glu

Tyr

180

185

190

lle

Leu

Tyr

Asn

Ly s

Gly

lle

Me t

Gly

Glu

As p

Thr

Tyr

Pro

Tyr

Gin

195

200

205

Gly

Ly s

Asp

Gly

Tyr

Cy s

Ly s

Phe

Gin

Pro

Gly

Lys

Al a

lle

Gly

Phe

210

215

220

Val

Ly s

Asp

Val

Al a

Asn

lle

Thr

lle

Tyr

As p

Glu

Glu

Al a

Me t

Val

225

230

235

240

Glu

Alá

Val

Al a

Leu

Tyr

Asn

Pro

Val

Ser

Phe

Al a

Phe

Glu

Val

Thr

245

250

255

Gin

Asp

Phe

Me t

Me t

Tyr

Arg

Thr

Gly

lle

Tyr

Ser

Ser

Thr

Ser

Cys

260

265

270

Hi s

Ly s

Thr

Pro

As p

Ly s

Val

Asn

Hi s

Al a

Val

Leu

Al a

Va 1

Gly

Tyr

275

280

285

Gly

Glu

Lys

Asn

Gly

lle

Pro

Tyr

Trp

lle

Val

Lys

Asn

Ser

Trp

Gly

290

295

300

Pro

Gin

Trp

Gly

Me t

Asn

Gly

Tyr

Phe

Leu

lle

Glu

Arg

Gly

Lys

Asn

305

310

315

320

Me t

Cy s

Gly

Leu

Al a

Al a

Cys

Al a

Ser

Tyr

Pro

lle

Pro

Leu

Val

325 330 335

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 339 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Trp

Gin

Leu

Trp 5

Al a

Ser

Leu

Cys

Cys 10

Leu

Leu

Val

Leu

Al a 15

Asn

Al a

Arg

Ser

Arg

Pro

Ser

Phe

Hi s

Pro

Val

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

Asn

20

25

30

Tyr

Va 1

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

Thr

Trp

Gin

Al a

Gly

Hi s

Asn

Phe

Tyr

40 45

HU 220 960 Bl

Asn

Val 50

As p Me t

Ser

Tyr

Leu 55

Ly s

Arg

Leu

Cy s

Gly 60

Thr

Phe

Leu

Gly

Gly

Pro

Ly s

Pro

Pro

Gin

Arg

Val

Me t

Phe

Thr

Glu

Asp

Leu

Lys

Leu

65

70

75

80

Pro

Al a

Ser

Phe

As p

Al a

Arg

Glu

Gin

Trp

Pro

Gin

Cy s

Pro

Thr

Ile

85

90

95

Lys

G1 u

Ile

Arg

As p

Gin

Gly

Ser

Cys

Gly

Ser

Cys

Trp

Al a

Phe

Gly

100

105

110

Al a

Val

Glu

Al a

Ile

Ser

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Hi s

Thr

Asn

Al a

Hi s

115

120

125

Val

Ser

Val

Glu

Val

Ser

Al a

Glu

As p

Leu

Leu

Thr

Cys

Cy s

Gly

Ser

130

135

140

Me t

Cy s

Gly

Asp

Gly

Cy s

Asn

Gly

Gly

Tyr

Pro

Al a

Glu

Al a

Trp

Asn

145

150

155

160

Phe

Trp

Thr

Arg

Ly s

Gly

Leu

Val

Ser

Gly

Gly

Leu

Tyr

Glu

Ser

Hi s

165

170

175

Val

Gly

Cys

Arg

Pro

Tyr

Ser

Ile

Pro

Pro

Cy s

Glu

Hi s

Hi s

Val

Asn

180

185

190

Gly

Ser

Arg

Pro

Pro

Cys

Thr

Gly

Glu

G1 y

Asp

Thr

Pro

Lys

Cys

Ser

195

200

205

Ly s

Ile

Cys

Glu

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Thr

Tyr

Ly s

Gin

Asp

Ly s

Hi s

210

215

220

Tyr

Gly

Tyr

Asn

Ser

Tyr

Ser

Val

Ser

Asn

Ser

Glu

Lys

Asp

Ile

Me t

225

230

235

240

Al a

Glu

Ile

Tyr

Ly s

Asn

Gly

Pro

Val

Glu

Gly

Al a

Phe

Ser

Val

Tyr

245

250

255

Ser

As p

Phe

Leu

Le u

Tyr

Lys

Ser

Gly

Va 1

Tyr

Gin

Hi s

Val

Thr

Gly

260

265

270

Glu

Me t

Me t

Gly

Gly

Hi s

Al a

Ile

Arg

Ile

Leu

Gly

Trp

Gly

Va 1

Glu

275

280

285

Asn

Gly

Thr

Pro

Tyr

Trp

Leu

Val

Al a

Asn

Ser

Trp

Asn

Thr

Asp

Trp

290

295

300

Gly

Asp

Asn

Gly

Phe

Phe

Lys

Ile

Leu

Gly

Gly

Gin

Asp

Hi s

Cy s

Gly

305

310

315

320

Ile

Glu

Ser

Glu

Val

Val

Al a

Gly

Ile

Pro

Arg

Thr

Asp

Gin

Tyr

Trp

325

330

335

Glu

Lys

Ile

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav

HU 220 960 Β1

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGATACGTTA CNCCNGT 17

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCATGAGRT ANCC 14

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Alá Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lay Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val 15 10 15

Lys Asn

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 29 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGGATCCCT GTACCCTGAG GAGATACTG 29

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: ismeretlen

TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAAGCTTCT ATCTACCTTC CCATTCTGGG ATA 33

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Rekombináns, enzimatikusan aktív katepszinfehérje, melynek aminosavszekvenciája tartalmazza az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvencia 115-329. sorszámú aminosavainak szekvenciáját.
2. 2. Rekombináns, enzimatikusan aktív katepszinfehérje, melynek aminosavszekvenciája megegyezik az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvencia 115-329. sorszámú aminosavainak szekvenciájával.
3. 3. Rekombináns, enzimatikusan aktív katepszinfehéije, melyet az 1. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia 484-1128. sorszámú nukleotidjai kódolnak.
4. 4. Rekombináns fehéije, melynek aminosavszekvenciája azonos az 1. ábrán bemutatott aminosavszekvencia 16-114. sorszámú aminosavainak szekvenciájával.
5. 5. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns, enzimatikusan aktív katepszinfehérje, melynek enzimatikus aktivitása a Z-FR-MCA hidrolízise.

   5
6. 6. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns, enzimatikusan aktív katepszin fehéije, melynek enzimatikus aktivitása a Z-LR-MCA hidrolízise.
7. 7. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike sze10 rinti rekombináns, enzimatikusan aktív katepszinfehérje, melynek enzimatikus aktivitása a Z-VR MCA hidrolízise.
8. 8. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns, enzimatikusan aktív katepszin

   15 fehérje, melynek enzimatikus aktivitása a Z-LLR MCA hidrolízise.