WO2005093421A1 - Enzymimmunoassay zur bestimmung von cathepsin k - Google Patents

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WO2005093421A1
WO2005093421A1 PCT/EP2004/004732 EP2004004732W WO2005093421A1 WO 2005093421 A1 WO2005093421 A1 WO 2005093421A1 EP 2004004732 W EP2004004732 W EP 2004004732W WO 2005093421 A1 WO2005093421 A1 WO 2005093421A1
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cathepsin
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buffer
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Viktor Ruzicka
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Biovendor Laboratory Medicine, Inc.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the invention relates to an ELISA for determining cathepsin K in the blood and other body fluids for the diagnosis of osteoresorptive processes and the osteolytic activity of tumor metastases. Areas of application are medicine and especially medical diagnostics.
  • the enzyme-linksä immunosorb ⁇ assay (ELISA) technique is the current technology standard in clinical laboratories. With this technology i.a. Marker proteins for certain diseases can be determined in patient body fluids.
  • Cathepsin K has been identified as the osteoclast protease, which, released into the pericellular space (known as lacunae), cleaves and dissolves the bone collagen. The bone is resorbed in cooperation with the phosphatases, the low pH and probably other factors that break down inorganic bone components. Osteoresorptive processes are based on a large number of important and frequently occurring diseases. These include e.g. Osteoporosis, osteomalacia, osteodystrophy, Paget's disease and so-called osteolytic metastases from malignant tumors such as Prostate, breast or lung cancer.
  • Bone degradation can be roughly estimated biochemically by calcium and phosphate balance determinations in the blood and urine or degradation products of bone collagen in the urine or in the blood are determined. These include e.g. so-called crosslinks (NTx, CTx, deoxypridinolin, pyridinolin) or hydroxyproline.
  • crosslinks NTx, CTx, deoxypridinolin, pyridinolin
  • hydroxyproline e.g. so-called crosslinks (NTx, CTx, deoxypridinolin, pyridinolin) or hydroxyproline.
  • the determination of bone-specific acid phosphatase in the blood is considered by some to be a method for the detection of osteoresorptive activity.
  • there are doubts about the identity and specificity of the bone-specific phosphatase and the results obtained appear largely dubious and ambiguous.
  • the invention was therefore based on the object of developing a method with which the concentration of Cathepsin K, Procathepsin K and Cathepsin-K frames can be determined and that can be used for the diagnosis of osteoreso ⁇ tive processes.
  • the invention relates to a test kit for the determination of cathepsin K in the blood and other body fluids for the diagnosis of osteoreso ⁇ tive processes and the osteolytic activity of tumor metastases, comprising at least in a separate repackaging: a) a solid support with bound antibodies, which are sensitive and specific to cathepsin Tie K; b) human recombinant cathepsin K as a standard for the quantitative determination of this enzyme in body fluids; c) a buffer for making a standard series of recombinant cathepsin K; d) a buffer for diluting the sample to be examined; e) a wash buffer; f) a detectably labeled conjugate that binds to cathepsin K; g) and a substrate that allows the detection of the detectably labeled conjugate.
  • the antibodies which are bound to the solid support are preferably monoclonal antibodies which are produced by the hybridoma cell lines with the deposit numbers CCM 7185 and CCM 7186.
  • Mainly microtitre plates are used as solid supports and a conjugated antibody, preferably a polyclonal antibody, which binds to cathepsin K as the detectably labeled conjugate.
  • a conjugated antibody preferably a polyclonal antibody, which binds to cathepsin K as the detectably labeled conjugate.
  • the human recombinant cathepsin K used as standard is expressed in eukaryotic cells and is in solution or lyophilized.
  • DNA DNA sequence: Genbank Accession No. NM_000396 position 170 ... 1111
  • Protein Number of amino acids: A total of 326 - of which 314 are ProcathepsinK and 12 are vector-encoded
  • Cathepsin K has 215 amino acids (23.48 kDa).
  • Monoclonal and polyclonal antibodies which had a high titer, were conjugated with horseradish peroxidase (HRP) using the periodate method. Various combinations of antibodies were then tested. Both the antibodies that were bound to the microtiter plate and the conjugated antibodies were varied. It was shown that the combination of monoclonal antibodies, which are produced by the hybridoma cell lines with the accession numbers CCM 7185 and CCM 7186, provides the best results for the plate coating with the HRP-conjugated polyclonal antibody RAHuCATD. Furthermore, the concentration of the coating antibodies, the conjugate dilution, the buffer components, the incubation times and temperatures, as well as the stability of the reagents and components of the test kit were optimized according to known methods.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the coating solution is suctioned off and the wells are washed 1x with 350 ⁇ l washing buffer.
  • the MTP is incubated for 1 hour at room temperature (approx. 25 ° C.) and shaken at about 300 ⁇ m using an orbital MTP shaker.
  • the MTP is incubated for 1 hour at room temperature (approx. 25 ° C) and shaken at about 300 ⁇ m using an orbital MTP shaker. 9. The wells are washed 3 times with 350 ⁇ l washing buffer each.
  • the MTP is incubated for 10 min at room temperature (approx. 25 ° C).
  • the color development is stopped by adding 100 ⁇ l stop solution.
  • the optical density is measured with a photometer at a wavelength of 450 nm.
  • Microtite plates Corning Costar, high binding coating buffer: 0.1 mol / 1 carbonate buffer, pH 8.5
  • Wash buffer 0.1 mol / 1 TBS, pH 7.2 with 0.1% Tween-20
  • Blocking solution TBS, pH 7.2 with 0.5% BSA and 2% sucrose
  • Sample buffer 0.1 mol / 1 TBS, pH 7.2 with 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA
  • Cathepsin K concentrations of 0.1 - 10 ng / ml were used to create the curve.
  • the lower detection limit is determined on the basis of the absorption, which is three standard deviations above the blank value, and corresponds to a Cathepsin K concentration of 0.02 ng / ml.
  • Serum samples with different concentrations were diluted and measured.
  • the sample recovery rate ranged from 88.5% to 110% (Table 4).
  • the ELISA shows no cross-reactivity with other human cysteine proteinases (cathepsin B, H, L or S) or with the aspartic proteinase cathepsin D. Likewise, no interference from hemoglobin (5 mg / ml), bilirubin 0.2 mg / ml) and total Lipids (10 mg / ml) observed.
  • the cathepsin K concentrations in the serum remained largely unchanged even after 7 days of storage at -20 ° C
  • Cathepsin K concentrations in the serum of normal people, patients with proven osteoporosis and patients with prostate and breast cancer metastases embodiment
  • microorganism identified under I. above was accompanied by: (X) a scientific description () a proposed taxonomic designation
  • the International Depositary Authority accepts the microorganism identified under above, which was received by it on 03/22/2004 (date of original deposit) 1 .
  • CCM - CZECH COLLECTION OF Signature (s) of pcrson (s) having the power to MICROORGANISMS represent the International Depositary Authority or of Masaryk University authorized official (s):, Faculty of Science X, / Address: Tvrdeho 14 MVDr Hanl ⁇ tegnepova 602 00 Brno Czech Republic Czech Collection of Microorganlsms tel. 420-543 247 231 Masaryk University fax.
  • microorganism identified under I. above was accompanied by: (X) a scientific dcscription () a proposed taxonomic designation
  • the International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above. wliich was received by it on 03/22/2004 (date of original deposit) 1 .
  • Treaty was received by it on (date of reeeipt of request for conversion)
  • CCM - CZECH COLLECTION OF Signature (s) of person (s) having the power to MICROORGANISMS represent the International Depositary Authority or of Masaryk University authorized off ⁇ cial (s): Faculty of Science Address: Tvrdeho 14 MVDr. HanTSt nwXa 602 00 Brno Czech Republic CZ ⁇ Ch Coll ⁇ ctiort ⁇ ; ! tf icroorganisms tel. 420-543 247 231 Masaryk university fax. 420-543 247 339 Date: 03/22/2004 60200 BRNO »Tvrdeho 14 email.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Bestimmung von Cathepsin K im Blut und anderen Körperflüssigkeiten für die Diagnose von osteoresorptiven Prozessen und der osteolytischen Aktivität von Tumormetastasen, umfassend in separater Verpackung wenigstens: o) einen festen Träger mit daran gebundenen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch Cathepsin K binden; p) humanes rekombinantes Cathepsin K als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Körperflüssigkeiten; q) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe des rekombinanten Cathepsin K; r) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; s) einen Waschpuffer; t) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Cathepsin K bindet; u) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

Description

Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Cathepsin K
Die Erfindung betrifft einen ELISA zur Bestimmung von Cathepsin K im Blut und anderen Körperflüssigkeiten für die Diagnostik von osteoresorptiven Prozessen und der osteolytischen Aktivität von Tumormetastasen. Anwendungsgebiete sind die Medizin und hier besonders die medizinische Diagnostik.
Die enzyme-linkeä immunosorbenά assay (ELISA)-Technik ist gegenwärtiger Technologiestandard in klinischen Labors. Mit dieser Technologie können u.a. Markerproteine für bestimmte Krankheiten in Körperflüssigkeiten von Patienten bestimmt werden.
Cathepsin K wurde als die Osteoklasten-Protease identifiziert, die, freigesetzt in den perizellulären Raum (sog. Lakunen), das Knochenkollagen spaltet und auflöst. In Zusammenarbeit mit den Phosphatasen, dem niedrigen pH und wohl anderen Faktoren, die anorganische Knochenkomponenten abbauen, wird der Knochen resorbiert. Osteoresorptive Prozesse liegen einer Vielzahl von wichtigen und häufig auftretenden Krankheiten zugrunde. Zu solchen zählen z.B. Osteoporose, Osteomalazie, Osteodystrophie, Morbus Paget sowie sog. osteolytische Metastasen von bösartigen Tumoren wie z.B. Prostata-, Mamma- oder Lungenkarzinomen.
Biochemisch läßt sich der Knochenabbau durch Kalzium- und Phosphat-Bilanz- bestimmungen im Blut und Urin grob abschätzen oder es werden Abbauprodukte von Knochenkollagen im Urin oder im Blut bestimmt. Zu solchen zählen z.B. sogenannte Crosslinks (NTx, CTx, Deoxypridinolin, Pyridinolin) oder Hydroxyprolin. Die Bestimmung von knochenspezifischer saurer Phosphatase im Blut wird von einigen als Methode zum Nachweis der osteoresorptiven Aktivität angesehen. An der Identität und Spezifität der knochenspezifischen Phosphatase bestehen jedoch Zweifel, und die erzielten Ergebnisse erscheinen zum großen Teil dubios und zwiespältig.
Der Erfindung lag demzufolge die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem die Konzentration von Cathepsin K, Procathepsin K und Cathepsin-K Framenten bestimmt werden kann und das für die Diagnose von osteoresoφtiven Prozessen verwendet werden kann.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Bestimmung von Cathepsin K im Blut und anderen Köφerflüssigkeiten für die Diagnose von osteoresoφtiven Prozessen und der osteolytischen Aktivität von Tumormetastasen, umfassend in separater Neφackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen Antiköφern, die sensitiv und spezifisch Cathepsin K binden; b) humanes rekombinantes Cathepsin K als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Köφerflüssigkeiten; c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe des rekombinanten Cathepsin K; d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; e) einen Waschpuffer; f) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Cathepsin K bindet; g) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt.
Bei den Antiköφern, die an den festen Träger gebunden sind, handelt es sich bevorzugt um monoklonale Antiköφer, die von den Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186 produziert werden.
Als feste Träger werden vorwiegend Mikrotiteφlatten eingesetzt und als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antiköφer, vorzugsweise ein polyklonaler Antiköφer, der an Cathepsin K bindet.
Das als Standard eingesetzte humane rekombinante Cathepsin K wird in eukaryontischen Zellen exprimiert und liegt in Lösung oder lyophilisiert vor.
Im Folgenden wird die Entwicklung des ELISAs näher beschrieben. Herstellung des humanen rekombinanten Cathepsin K
DNA: DNA-Sequenz: Genbank Accession No. NM_000396 Position 170...1111
Synthetisches Gen: Ohne Signalsequenz, mit der N-terminalen Aktivationssequenz Vektor: pQE30
Protein: Anzahl der Aminosäuren: Insgesamt 326 - davon 314 ProcathepsinK und 12 Vektorkodiert
Molekulargewicht: 36,69 kDa Aminosäurensequenz: Unterstrichene Aminosäuren werden durch den Vektor kodiert: 1 MRGSHHHHHH GSLYPEEILD THWELWKKTH RKQYNNKVDE
ISRRLIWEKN LKYISIHNLE 61 ASLGVHTYEL AMNHLGDMTS EEWQKMTGL KVPLSHSRSN DTLYIPEWEG RAPDSVDYRK 121 KGYVTPVKNQ GQCGSCWAFS SVGALEGQLK KKTGKLLNLS PQNLVDCVSE NDGCGGGYMT 181 NAFQYVQKNR GIDSEDAYPY VGQEESCMYN PTGKAAKCRG YREIPEGNEK ALKRAVARVG 241 PVSVAIDASL TSFQFYSKGV YYDESCNSDN LNHAVLAVGY GIQKGNKHWI IKNSWGENWG 301 NKGYILMARN KNNACGIANL ASFPKM
Anmerkung: Ohne das Aktivationspeptid hat Cathepsin K 215 Aminosäuren (23,48 kDa).
Expression von Cathepsin K: Die Expression erfolgt im E.coli-Stamm: JM109.
Kultivierung: Auf dem Schüttler wächst die Kultur für 3h 30min bis zu einer OD (550 nm) von 0,6. Es folgt die Zugabe vom Induktor IPTG. Die Expression wird nach 2 Stunden gestoppt. Die Kultur erreicht eine OD (550 nm) von 1,8. Kontrollexpression in 50ml: Die Beschreibung gilt für Gel und Blot:
Die Ergebnisse (Abb. 1) verdeutlichen, dass das Protein nicht in einer löslichen Form exprimiert wird. Die Bande auf dem Blot des Überstandes ist durch das Überlaufen von Inhalt aus der benachbarten Vertiefung zu erklären.
Im Hinblick auf das Vorkommen von Degradationsprodukten wurden ganze Zellen im Guanidium aufgelöst und auf eine Nickel-Kolonne aufgetragen.
Isolierung und Aufreinigung des exprimierten Cathepsin K
Vorgehen:
- Solubilisierung der E.coli Zellen in 6M Gnd-HCl, 0, IM Tris-HCl pH 8,6 - Zentrifugation zur Beseitigung von unlöslichem Material
- Purifizieren auf der NiNTA-Kolonne, Equilibrierung mit 6M Gnd-HCl, 0, 1 M Tris-HCl pH 8,6 , Elution mit 0,5M Imidazol in 6M Gnd-HCl, 0.1M Tris-HCl pH 8,6
- Reinheitskontrolle mit SDS-PAGE nach Fällung mit TCA, Reduktion mit MeOH 0,015M und Nachreinigung mit der Gelchromatographie Reinheitskontrolle mit SDS-PAGE nach TCA-Fällung
I. Direktes Verdünnen des Materials
- Procathepsin K in 6M Gnd-HCl, 0,1M Tris-HCl pH 8,6 schlagartig verdünnt in 0,1M Tris-HCl , 0,5% CHAPS , ImM GSSG, pH 8,6 auf eine Endkonzentration von lOug/ml und Gnd-HCl-Konzentration von 0,1M und anschließend bei 4C über Nacht inkubiert
- 3x Dialyse gegen 0,1M Tris-HCl pH 8,6 Einengen in einer Amicon Rührzelle, cut-off 3kDa - Zentrifugation bei 12000 g / 20min Reinheitskontrolle mit SDS-PAGE und Proteinbestimmung nach Bradford II. Schrittweise Beseitigung von Gnd-HCl durch Dialyse
- Procathepsin K in 6M Gnd-HCl, 0,1M Tris-HCl pH 8,6 verdünnt in 6M Gnd-HCl , 0,1M Acetat-Puffer , 0,015M MeOH , pH 4,0 auf eine Endkonzentration von lOμg/ml und das pH der Lösung wurde auf pH 4,0 mit konzentrierter HC1 gebracht
- Dialyse gegen IM Gnd-HCl , 0, IM Acetat pH 4,0
- Dialyse gegen 0,5M Gnd-HCl , 0,1M Acetat pH 4,0
- Dialyse gegen 0,25M Gnd-HCl , 0,1 M Acetat pH 4,0 - Dialyse gegen 0, IM Gnd-HCl , 0, IM Acetat pH 4,0
- Dialyse gegen 0,05M Gnd-HCl , 0, IM Acetat pH 4,0 3x Dialye gegen 0, IM Acetat pH 4,0 Einengung in einer Amicon-Rührzelle, cut-off 3kDa Zentrifugation bei 12000 g / 20min - Reinheitskontrolle mit SDS-PAGE, Proteinbestimmung nach Bradford
Herstellung von spezifischen Antiköφern
Sowohl das durch direktes Verdünnen (I.) als auch das durch die schrittweise Beseitigung von Gnd-HCl durch Dialyse (II:) enthaltene Material wurden für die Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet.
Die Immunisierung und Gewinnung von polyklonalen und monoklonalen Antiköφern erfolgte nach bekannten Verfahren.
Bereitstellung von spezifischen Antikörpern:
Zunächst erfolgte eine Immobilisierung von 5mg Procathepsin K, gewonnen durch die schrittweise Dialyse, bei pH 4,0 an 0,5g PORÖS AL (Applied Biosystems). Die gewonnenen Antiköφer wurden anschließend mit Hilfe dieser Säule immunaffinitätsgereinigt und für die Entwicklung von ELISA verwendet. (Abb 2) Entwicklung und Validierung des ELISAs
Optimierung der Komponenten und Bedingungen
Monoklonale und polyklonale Antiköφer, die einen hohen Titer aufwiesen, wurden mit Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) unter Anwendung der Periodat- Methode konjugiert. Anschließend wurden verschiedene Kombinationen von Antiköφern getestet. Sowohl die Antiköφer, die an die Mikrotiteφlatte gebunden wurden als auch die konjugierten Antiköφer, wurden variiert. Es zeigte sich, dass die Kombination von monoklonalen Antiköφers, die von den Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186 produziert werden, für die Plattenbeschichtung mit dem HRP-conjugierten polyklonalen Antiköφer RAHuCATD die besten Ergebnisse liefert. Des weiteren erfolgte die Optimierung der Konzentration der Beschichtungsantiköφer, der Konjugatverdünnung, der Pufferbestandteile, der Inkubationszeiten und -temperaturen, sowie der Stabilität der Reagenzien und Bestandteile des Testkits nach bekannten Methoden.
Testdurchführung:
1. 100 μl des Beschichtungslösung [Antiköφer in Beschichtungspuffer (2 μg/ml)] werden in die Vertiefungen der MTP gegeben und bei 4°C 16 h inkubiert
2. Die Beschichtungslösung wird abgesaugt und die Vertiefungen werden lx mit 350 μl Waschpuffer gewaschen.
3. Es folgt die Hinzugabe von 200 μl Blockierlösung pro Vertiefung, die Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min, das Absaugen der Blockierlösung und das Trocknen der Platten.
4. 100 μl der Standardlösungen und der Proben, die 1 :3 mit Probenpuffer verdünnt wurden, werden in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert.
5. Die MTP wird lh bei Raumtemperatur (ca. 25°C) inkubiert und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 φm geschüttelt.
6. Die Vertiefungen werden 3x mit je 350 μl Waschpuffer gewaschen. 7. Es erfolgt die Hinzugabe von 100 μl Konjugatlösung, die 1 :3000 in einem Stabilisator verdünnt wurde.
8. Die MTP wird lh bei Raumtemperatur (ca. 25°C) inkubiert und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 φm geschüttelt. 9. Die Vertiefungen werden 3x mit je 350 μl Waschpuffer gewaschen.
10. 100 μl der Substratlösung wird in jede Vertiefung pipettiert.
11. Die MTP wird 10 min bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) inkubiert.
12. Die Farbentwicklung wird durch Hinzugabe von 100 μl Stoplösung gestoppt.
13. Die optische Dichte wird mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
verwendete Materialien:
Mikrotiteφlatten (MTP): Corning Costar, High Binding Beschichtungspuffer: 0.1 mol/1 Carbonat Puffer, pH 8.5
Waschpuffer: 0.1 mol/1 TBS, pH 7.2 mit 0.1 %Tween-20
Blockierlösung: TBS, pH 7.2 mit 0.5 % BSA und 2 % Sucrose
Probenpuffer: 0.1 mol/1 TBS, pH 7.2 mit 0.1 %Tween-20 und 0.1 % BSA
Konjugat-Stabilisator: kommerziell erhältlich Substrat-Lösung: kommerziell erhältliche TMB-Lösung
Stoplösung: 0.2 mol/1 Schwefelsäure
Standardkurve und Nachweisgrenze:
Eine repräsentative Standardkurve, die mit Hilfe des rekombinanten humanen Cathepsin K erstellt wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt.
Zur Erstellung der Kurve wurden Cathepsin K-Konzentrationen von 0.1 - 10 ng/ml eingesetzt. Die untere Nachweisgrenzen wird ermittelt anhand der Absoφtion, die drei Standardabweichungen über dem Leerwert liegt, und entspricht einer Cathepsin K- Konzentrationen von 0,02 ng/ml. Intratestvarianz
Vier Serumproben mit unterschiedlichen Cathepsin K-Konzentrationen wurden mit einer Untersuchung (8-fach-Bestimmung) gemessen. Die Varianz der 8 Ergebnisse je derselben Probe lag bei allen Konzentrationen unter 4,5% (Tabelle 1).
Figure imgf000009_0001
Tabelle 1: Intratestvarianz
Intertestvarianz
Vier Serumproben mit unterschiedlichen Cathepsin K-Konzentrationen wurden mit 6 Untersuchung gemessen. Die Varianz der 6 Ergebnisse je derselben Probe lag bei allen Konzentrationen unter 6 % (Tabelle 2)
Figure imgf000009_0002
Tabelle 2: Intertestvarianz Wiederfindungsrate
Rekombinantes Cathepsin K in den Konzentrationen 0.5, 1 und 2 ng/ml wurde zu vier Seren mit bekannten Cathepsin K-Konzentrationen gegeben und untersucht. Die Wiederfindungsrate des hinzugegebenen Cathepsin K in den Serum Proben lag zwischen 82.8 % und 97.6% (Tabelle 3)
Figure imgf000010_0001
Tabelle 3: Wiederfindungsrate
Linearität
Serumproben mit verschiedenen Konzentrationen wurden verdünnt und gemessen. Die Wiederfindungsrate der Proben lag zwischen 88.5 % und 110 % (Tabelle 4).
Figure imgf000011_0001
Tabelle 4: Linearität
Spezifität des ELISAs
Der ELISA zeigt keine Kreuzreaktivität mit anderen humanen Cystein Proteinasen (cathepsin B, H, L or S) oder mit der aspartischen Proteinase Cathepsin D. Ebenso wurde keine Störung durch Hämoglobin (5 mg/ml), Bilirubin 0.2 mg/ml) und Total-Lipide (10 mg/ml) beobachtet.
Stabilität
Die Cathepsin K Konzentrationen im Serum blieb größtenteils auch nach 7 Tagen Lagerung bei -20 °C unverändert
Cathepsin K Konzentrationen im Serum von Normalpersonen, Patienten mit nachgewiesener Ostoeporose und Patienten mit Prostata- und Brustkrebs-Metastasen Ausführungsbeispiel
Es wurden jeweils 20 Normalpersonen, 20 Patienten mit Osteoporose und 20 Patienten mit metastasierendem Prostata- und Brustkrebs auf Cathepsin K untersucht. Die gemessenen Werte lassen alle drei Populationen klar und scharf unterscheiden können (Tabelle 5).
Figure imgf000012_0001
Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 4 bis 9 grafisch dargestellt.
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGAN1SMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE INTERNATIONAL FORM MUDr.Viktor Rύzicka BIOVENDOR Inc. RECEIPT IN THE CASE Palackeho 56 OF AN ORIGINAL DEPOSIT 612 00 Brno issued pursuant to Ruie 7.1 by the Czech Republic INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page
I. IDENTIFICATION OF THE MIKROORGANISM
Identification reference given by the depositor: Accesion number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Clone 15D3 B6 D12 CCM 7185
II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR TAXONOMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I. above was accompanied by: ( X ) a scientific description ( ) a proposed taxonomic designation
III. RECEIPT AND ACCEPTANCE
The International Depositary Authority accepts the microorganism identified under above, which was received by it on 22.03.2004 (date of original deposit)1.
IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorganism identified under I. above, which was received by this International Depositary Authorily on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under Budapest
Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion)
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: CCM - CZECH COLLECTION OF Signature(s) of pcrson(s) having the power to MICROORGANISMS represent the International Depositary Authority or of Masaryk University authorized official(s): , Faculty of Science X, / Address: Tvrdeho 14 MVDr HanlΕtegnepova 602 00 Brno Czech Republic Czech Collection of Microorganlsms tel. 420-543 247 231 Masaryk University fax.420-543 247 339 Date: 22.03.2004 602 00 8RNO, Tvrdόho 14 e-mail, ccm@sci.muni.cz CZECH REPUBLIC Where Ruie 6 4 (d) applies, such date is the date on which the Status of international depositary authorily was acquired. BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURß- INTERNATIONAL FORM MUDr.Viktor Rύzicka BIOVENDOR Inc. RECEIPT IN THE CASE Palackeho 56 OF AN ORIGINAL DEPOSIT 612 00 Brno issued pursuant to Ruie 7.1 by the Czech Republic INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page
I. IDENTIFICATION OF THE MI ROORGANISM
Identification reference given by the depositor: Accesion number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Clone 4B9 F12 CCM 7186
II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR TAXONOMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I. above was accompanied by: ( X ) a scientific dcscription ( ) a proposed taxonomic designation
III. RECEIPT AND ACCEPTANCE
The International Depositary Authority accepts the microorganism identified under I. above. wliich was received by it on 22.03.2004 (date of original deposit)1.
IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorganism identified under I. above, which was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under Budapest
Treaty was received by it on (date of reeeipt of request for conversion)
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: CCM - CZECH COLLECTION OF Signature(s) of person(s) having the power to MICROORGANISMS represent the International Depositary Authority or of Masaryk University authorized offιcial(s): Faculty of Science Address: Tvrdeho 14 MVDr. HanTSt nwXa 602 00 Brno Czech Republic CZΘCh Collθctiort α; !tf icroorganisms tel. 420-543 247 231 Masaryk university fax.420-543 247 339 Date: 22.03.2004 60200 BRNO» Tvrdeho 14 e-mail. ccm(Λ)sci. muni.cz CZECH flEPUBUC Where Ruie 6 4 (d) applies, such date is the date on which the Status of international deposilary authority was acquired.

Claims

Patentansprüche
1. Testkit zur Bestimmung von Cathepsin K im Blut und anderen Köφerflüssigkeiten für die Diagnose von osteoresoφtiven Prozessen und der osteolytischen Aktivität von Tumormetastasen, umfassend in separater Veφackung wenigstens: h) einen festen Träger mit daran gebundenen Antiköφern, die sensitiv und spezifisch Cathepsin K binden; i) humanes rekombinantes Cathepsin K als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Köφerflüssigkeiten; j) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe des rekombinanten Cathepsin K; k) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; 1) einen Waschpuffer; m) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Cathepsin K bindet; n) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt.
2. Testkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Antiköφern, die an den festen Träger gebunden sind, um monoklonale Antiköφer handelt, die von den Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186 produziert werden.
3. Testkit nach Anspruch 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Träger vorwiegend Mikrotiteφlatten eingesetzt werden.
4. Testkit nach Anspruch 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antiköφer eingesetzt wird, der an Cathepsin K bindet.
5. Testkit nach Anspruch 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass als konjugierter Antiköφer ein polyklonaler Antiköφer eingesetzt wird.
6. Testkit nach Anspruch 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass die als Konjugate eingesetzten Substanzen mit allen üblichen Substanzen konjugiert werden können, vorzugsweise mit: Meerrettichperoxidase, oder alkalischer Phosphatase.
7. Testkit nach Anspruch 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass dadurch gekennzeichnet, dass das als Standard eingesetzte humane rekombinante Cathepsin K in eukaryontischen Zellen exprimiert wurde und in Lösung oder lyophilisiert vorliegt.
8. Monoklonale Antiköφer, die Cathepsin K spezifisch erkennen und binden, wobei diese monoklonalen Antiköφer Eigenschaften wie die monoklonalen Antiköφer aus den Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186 aufweisen.
9. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 8, wobei die monoklonalen Antiköφer biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei den Antiköφern ggf. Teile, die für die Erkennung von Cathepsin K nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
10. Monoklonale Antiköφer nach Anspruch 8-9, die von den Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186 produziert werden.
11. Hybridomzelllinien mit den Hinterlegungsnummern CCM 7185 und CCM 7186
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