ES2256849T3 - Proteasa catepsina o2. - Google Patents
Proteasa catepsina o2.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS DE CATEPSINA O 2 , ACIDOS NUCLEICOS Y ANTICUERPOS.
Description
Proteasa catepsina O2.
La invención se refiere a proteínas, ácidos
nucleicos y anticuerpos de catepsina O2.
Las catepsinas pertenecen a la superfamilia de la
papaína de las cisteína-proteasas. Las cisteína- o
tiol-proteasas contienen un residuo cisteína, así
como una histidina y una asparagina en el sitio activo responsable
de la proteolisis. Esta superfamilia tiene también una glutamina en
el hueco del oxianión.
Trabajos recientes han implicado a las
cisteína-proteasas en la unión del DNA con la
actividad putativa del factor de transcripción (Xu et al., J.
Biol. Chem. 269(33):21177-21183
(1994)), y como inmunosupresores a largo plazo (Hamajima et al.,
Parasite Immunology 16:261 (1994)).
Hasta la fecha, se han identificado y secuenciado
diversas catepsinas de distintos animales. Por ejemplo, la catepsina
S se ha clonado a partir de rata (Petanceska et al. J. Biol.
Chem. 267:26038-20643 (1992)), bovinos
(Wiederanders et al., FEBS Lett.
286:189-192 (1991)) y seres humanos
(Wideranders et al., J. Biol. Chem.
267:13708-1373 (1992); y Shi et al. J.
Biol. Chem. 267:7258-7262 (1992)). La
catepsina L se ha clonado a partir de seres humanos, rata, ratón y
pollo (Gal et al. Biochem. J.,
253:303-306 (1988); Ishidoh et al.,
FEBS Lett. 223:69-73 (1987); Joseph et
al., J. Clin. Invest. 81:1621-1629
(1988); Ritonja et al., FEBS Lett.
283:329-331 (1991)). La catepsina H se ha
clonado a partir de seres humanos y rata (Fuchs et al., Biol.
Chem. Hoppe-Seyler 369-375
(1988); Fuchs et al., Nucleic Acid Res. 17:9471
(1989); Whittier et al., Nucleic Acid Res.
15:2515-2535 (1987)). La catepsina B se ha
clonado a partir de seres humanos y ratones (Ferrara et al.,
FEBS Lett. 273:195-199 (1990); Chan et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:7721-7725 (1986)).
Recientemente, se clonó una
cisteína-proteasa a partir de osteoblastos de
conejo, y está relacionada estructuralmente con las catepsinas L y
S. Tezuka et al., J. Biol. Chem. 269(2):1106
(1994).
Las catepsinas se encuentran en la naturaleza en
una amplia variedad de tejidos. Por ejemplo, la catepsina L se
encuentra en tejidos que incluyen corazón, cerebro, placenta,
pulmón, músculo esquelético, riñón, hígado, testículos y páncreas.
La catepsina S se encuentra en pulmón, hígado, bazo y músculo
esquelético.
Las catepsinas se han implicado en diversas
enfermedades. Por ejemplo, las enzimas similares a las catepsinas B
y L se liberan desde tumores y pueden estar implicadas en la
metástasis tumoral. La catepsina L está presente en el fluido
sinovial y tejidos humanos transformados enfermos. De forma similar,
la liberación de catepsina B y otras proteasas lisosómicas de
granulocitos polimorfonucleares y macrófagos se observa en
traumatismos e inflamaciones. Las catepsinas se han implicado en la
artritis. Además, las catepsinas se encuentran en cantidades
anormalmente altas en varias líneas celulares tumorales.
Las cisteína-proteasas se han
implicado también en la remodelación ósea. La remodelación ósea es
un procedimiento de acoplamiento de la formación ósea y resorción
ósea, y forma parte del crecimiento óseo. La resorción ósea incluye
la desmineralización y degradación de proteínas de la matriz
extracelular (Delaisse et al., Biochem. J.
279:167-174 (1991)). El colágeno de tipo I
constituye el noventa y cinco por ciento de la matriz orgánica
(Krane et al., en Scientific American Medicine
(redactores Rubensttein, E. y Federman, D.D.) Vol. 3, 15
Rheumatism, XI Bone Formation and Resorption, págs.
1-26, Scientific American, Inc. Nueva York.
Además de la colagenasa intersticial, se piensa que las
cisteína-proteasas lisosómicas catepsina B y L están
implicadas en la resorción osteoclástica del hueso (Delaissé et
al., 1991, supra). Ambas enzimas están presentes en los
lisosomas, así como en la laguna de resorción extracelular ácida de
los osteoclastos (Goto et al., Histochemistry
99, 411-414 (1993)) y ambas proteasas
presentan la capacidad in vitro de degradar el colágeno de
tipo I a pH ácido (Maciewicz et al., Collagen Rel. Res.
7, 295-304 (1987, Delaissé et al.,
(1991), citado anteriormente). Los inhibidores de la
cisteína-proteasa, como E-64 y
leupeptina, se ha demostrado que evitan la resorción osteoclástica
del hueso (Delaissé et al., Bone 8,
305-313 (1987), Everts et al., Calcif. Tissue
Int. 43, 172-178 (1988)). La catepsina L
se considera que es una de las principales proteasas implicadas en
la degradación de colágeno en el hueso (Maciewiecz et al.,
Biochem. J. 256, 433-440 (1988); Kakegawa
et al., FEBS Lett. 321, 247-250
(1993)).
El estado sólido del material óseo se debe a la
baja solubilidad de la hdiroxiapatita y otras sales óseas de fosfato
cálcico a pH fisiológico, pero el hueso se puede romper a pH
ácido.
Los osteoclastos son células multinucleadas que
juegan papeles clave en la resorción ósea. Unidos a la superficie
ósea, los osteoclastos producen un microambiente ácido en una unión
estrechamente definida entre la membrana limitante del osteoclasto
especializado y la matriz ósea, permitiendo así la solubilización
localizada de la matriz ósea. Esto, a su vez, facilita la
proteolisis del colágeno óseo desmineralizado.
\newpage
Se piensa que la acción colagenolítica de las
cisteína-proteasas se ejerce preferencialmente en la
parte más ácida de la laguna de resorción ósea, próxima al límite
ondulado, a un pH alrededor de 3,5 o 4,5, mientras que las
colagenasas que contienen Zn son más activas en el medio neutro, en
la superficie de contacto entre la matriz desmineralizada y
mineralizada (Delaissé et al., citado anteriormente,
(1991)). Además de las catepsinas L y B, diversas actividades
similares a la catepsina L y B pueden participar en la degradación
colagenolítica del hueso. Page et al., Biochim. Biophys. Acta
1116, 57-66 (1992) aislaron múltiples formas
de catepsina B de osteoclastomas. Éstos tienen un pH ácido óptimo y
la capacidad de degradar colágeno de tipo I soluble e insoluble.
Delaissé et al., 1991, citado anteriormente, identificaron
una proteasa dependiente de tiol de 70 kDa en tejido óseo, que es
capaz también de degradar el
colágeno de tipo I.
colágeno de tipo I.
Los inhibidores de
cisteína-proteasa se ha demostrado que inhiben la
resorción osteoclástica del hueso, inhibiendo la degradación de las
fibras de colágeno. Las catepsinas B, L, N y S pueden degradar el
colágeno de tipo I a pH ácido. Se han aislado tres proteasas de tipo
catepsina de la bóveda craneal de ratón; las catepsinas putativas B
y L, y una proteasa de tipo catepsina L (Delaissé et al.,
Biochem. J. 279:167 (1991). Sin embargo, no está claro
todavía qué cisteína-proteasas son producidas
realmente por los osteoclastos.
Recientemente, se clonó un cDNA que codificaba
una nueva cisteína-proteasa humana,
independientemente por varios grupos (Shi et al., FEBS Lett.
357, 129-134 (1995), Inaoka et al,.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 89-96
(1995); Brömme y Okamoto, Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 376, 379-384
(1995)) y denominadas catepsina O, catepsina K y catepsina O2,
respectivamente.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar una nueva clase de catepsinas recombinantes, catepsina
O2, y producir cantidades útiles de estas proteínas de catepsina O2,
usando técnicas de DNA recombinante.
De acuerdo con los anteriores objetos, la
presente invención proporciona en un primer aspecto una proteína
catepsina recombinante que tiene una secuencia polipeptídica formada
por los aminoácidos 115-329 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura 1, en la que dicha proteína
catepsina recombinante tiene actividad
cisteína-proteasa.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
una proteína catepsina recombinante que tiene una secuencia
polipeptídica codificada por los nucleótidos 484 a 1128 de la
secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1, en la que dicha
proteína catepsina recombinante tiene actividad
cisteína-proteasa.
En un aspecto adicional, se proporciona una
proteína catepsina según el primer o segundo aspecto, fusionada con
un polipéptido heterólogo.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona una composición que comprende la proteína del primer o
segundo aspecto.
Las Figuras 1A y 1B representan la secuencia
nucleotídica (SEQ ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida
(SEQ ID Nº: 2) del DNAc de la catepsina O2. La secuencia de
aminoácidos (SEQ ID Nº: 2) se muestra en códigos de una letra debajo
de la secuencia nucleotídica (SEQ ID Nº: 1). Los residuos de los
sitios activos (C25, H159 y N175; numeración de la papaína) se
indican mediante escritura en negrita, y el sitio de
N-glicosilación potencial está subrayado una vez.
Puntas de flecha muestran los sitios putativos de escisión
postraducción entre la preseñal y la prorregión, así como entre la
prorregión y la enzima madura. La escisión entre la prorregión y la
proteína madura se confirmó mediante secuenciación de proteína
(subrayado doble).
Las Figuras 2A y 2B representan el alineamiento
múltiple de la secuencia de la catepsina humana O2 (SEQ ID Nº: 2)
con las catepsinas humanas S (SEQ ID Nº: 4) y L (SEQ ID Nº: 5) y la
catepsina de conejo OC2 (SEQ ID Nº: 3). * Residuos de los sitios
activos; en negrita, residuos conservados en todas las
cisteína-proteasas de la familia de la papaína. Los
aminoácidos idénticos en las seis proteasas se designan mediante
letras mayúsculas en la secuencia consenso, y los aminoácidos
idénticos en cinco de las seis se designan con letras minúsculas.
Los huecos se indican mediante guiones. Los números indican la
posición del último aminoácido en cada línea, y las puntas de flecha
muestran los sitios de escisión putativos postraducción.
La Figura 3 representa la maduración de
procatepsina O2 con pepsina. Se incubaron alícuotas del sobrenadante
de cultivo que contenían procatepsina O2 con pepsina (0,4 mg/ml) a
40ºC en tampón de acetato sódico 100 mM, pH 4,0. La incubación se
detuvo añadiendo tampón de muestra. Los tiempos de digestión son
según se indican. Los patrones de masa molecular (kDa) se indican en
el margen izquierdo.
La Figura 4 representa el
SDS-PAGE de catepsina O2 humana recombinante
purificada (tinción Coomassie Blue). Banda 1, fracción Sf9
bruta; Banda 2, tras el paso a través de flujo rápido de
n-butilo; Banda 3, tras el paso a través de Mono S.
Los patrones de masa molecular se indican en la banda derecha.
La Figura 5 representa el perfil de actividad de
pH para la catepsina O2 humana recombinante. Los valores
K_{cat}/K_{m} se obtuvieron midiendo las velocidades iniciales
de hidrólisis de Z-FR-MCA y
dividiendo por la concentración de enzima y sustrato.
La Figura 6 representa los valores
K_{cat}/K_{m} para la hidrólisis de
Z-X-R-MCA por las
catepsinas O2, S, L y B (normalizadas hasta el mejor sustrato = 1).
Catepsina O2 (Z-LR-MCA) 257.900
M^{-1}s^{-1}; catepsina S
(Z-LR-MCA) 243.000 M^{-1}s^{-1};
catepsina L (Z-FR-MCA) 5.111.000
M^{-1}s^{-1}); catepsina B
(Z-FR-MCA) 460.000 M^{-1}s^{-1}
(datos para catepsinas S, L y B de Brömme et al., 1994).
La Figura 7 representa la actividad
elastinolítica de la catepsina O2 humana recombinante y pH 4,5, 5,5
y 7,0, en comparación con las catepsinas S y L y la elastasa
pancreática. El sustrato es elastina insoluble marcada con
^{3}H.
La Figura 8 representa análisis de transferencia
Northern de las catepsinas humanas O2, L y S en preparaciones de
osteoclastoma. Banda 1, paciente 1 (tejido fibroso y celular); banda
2, paciente 2 (tejido celular); Banda 3, paciente 2 (tejido
fibroso). Las transferencias de nitrocelulosa se hibridaron con
sondas marcadas con ^{32}P de catepsinas humanas O2, L y S.
Las Figuras 9A y 9B representan el SDS PAGE de
colágeno de tipo I (colágeno de piel de ternera soluble) tras
digestión con catepsina O2 y L humanas recombinantes y tripsina
bovina. Figura 9A: Actividad colagenasa: Digestión de colágeno de
piel de ternera soluble a 28ºC y pH 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0
mediante catepsinas humanas O2, S y L, (cada una 50 nM) durante 12
horas. La reacción se detuvo mediante adición de
E-64 10 \muM. Se usó como patrón (S) colágeno
soluble sin tratar. Figura 9B: Actividad gelatinasa: Digestión de
colágeno de piel de ternera soluble desnaturalizado (calentado 10
min a 70ºC) a 28ºC y a pH 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, mediante
catepsina humana O2 (0,1 nM), catepsina L (0,2 nM) y catepsina
humana S (1 nM). Los patrones de masa molecular se indican en la
banda izquierda.
La Figura 10 representa un
SDS-PAGE de la purificación de la proparte de la
catepsina humana O2.
Las Figuras 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G,
11H, 11I, 11J, 11K y 11L representan la tinción inmunoquímica de la
catepsina humana O2 en tejidos humanos. (A) osteoclastoma, (B)
macrófagos pulmonares, (C) bronquiolo, (D) endometrio, (E) estómago,
(F) colon, (G) riñón, (H) placenta, (I) hígado, (J) ovario, (K)
adrenal, (L) testículos.
La presente invención proporciona nuevas
proteínas y ácidos nucleicos de catepsina O2.
Las proteínas de catepsina O2 de la presente
invención se pueden identificar de diversas formas. Los ácidos
nucleicos de catepsina O2 o las proteínas de catepsina O2 se
identifican inicialmente mediante homología sustancial de la
secuencia del ácido nucleico y/o de aminoácidos respecto a las
secuencias mostradas en la Figura 1. Tal homología puede basarse en
la secuencia del ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos
total.
Las proteínas de catepsina O2 de la presente
invención tienen una homología limitada respecto a otras catepsinas.
Por ejemplo, la catepsina O2 humana madura tiene aproximadamente 59%
de homología respecto a la catepsina L humana madura, 58% de
homología respecto a la catepsina S humana madura, 26% de homología
respecto a la catepsina B humana y 47% de homología respecto a la
catepsina H humana. Además, la proparte de la catepsina O2 humana
tiene un 38% de homología respecto a la proparte de la catepsina L
humana, un 51% de homología respecto a la proparte de la catepsina S
humana, un 13% de homología respecto a la proparte de la catepsina B
humana y un 23% de homología respecto a la proparte de la catepsina
H humana. Además, la proteína catepsina O2 humana tiene a groso modo
90% de homología respecto a una proteína de osteoclasto de
conejo.
Según se usa aquí, una proteína es una
"proteína catepsina O2" si la homología total de la secuencia
proteica respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 1 es preferiblemente superior a aproximadamente 90%, con
mayor preferencia superior al 95% y con la máxima preferencia
superior al 98%. Esta homología se determinará usando técnicas
estándar conocidas en la técnica anterior, como el programa de
secuencias Best Fit, descrito por Devereux et al., Nucl. Acid
Res. 12:387-395 (1984). El alineamiento
puede incluir la introducción de huecos en las secuencias a
alinear. Además, para secuencias que contengan más o menos
aminoácidos que la proteína mostrada en la Figura 1, se entiende que
el porcentaje de homología se determinará basándose en el número de
aminoácidos homólogos, en relación con el número total de
aminoácidos. Así, por ejemplo, la homología de secuencias más cortas
que las mostradas en la Figura 1, según se analiza debajo, se
determinará usando el número de aminoácidos en la secuencia más
corta.
En una realización preferida, las proteínas de
catepsina O2 de la presente invención son proteínas de catepsina O2
humana.
Las proteínas de catepsina O2 de la presente
invención son más cortas que la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Figura 1. Según se muestra en el Ejemplo 2, la proteína catepsina
O2 humana puede sufrir un tratamiento posterior a la traducción,
similar al observado para las catepsinas B y S, y papaína (Brömme
et al., J. Biol. Chem. 268:4832-4838
(1993); Vernat et al., J. Biol. Chem. 266:
21451-21457 (1991); y Rowan et al., J. Biol.
Chem. 267:15993-15999 (1992)). La
proteína catepsina O2 se fabrica como una preproteína, con una
presecuencia tradicional, una prosecuencia o "proparte ", y la
secuencia madura. Éstas se representan en la Figura 1, mostrándose
la secuencia de la catepsina O2 humana que incluye las secuencias
pre-, pro- y madura. La presecuencia comprende los primeros 15
aminoácidos de la secuencia mostrada en la Figura 1, la proparte se
extiende desde el aminoácido 16 hasta el aminoácido 114 (98
aminoácidos), y la proteína madura se extiende desde la posición 115
a la 329 (215 aminoácidos). Se establece la hipótesis de que la
prosecuencia, o proparte, sirve como inhibidor de la enzima hasta
que la enzima se activa, lo más probablemente como resultado de un
cambio en el pH. El tratamiento proteolítico de la proparte es
autoproteolítico para la papaína (Vernet et al., citado
anteriormente), catepsina S y catepsina L. La definición de
catepsina O2 incluye preprocatepsina O2, procatepsina O2, catepsina
O2 madura y la proparte, separada de la catepsina O2 madura.
Las proteínas de catepsina O2 de la presente
invención son preferiblemente recombinantes. Según se usa aquí,
"ácido nucleico" se puede referir a DNA o RNA, o moléculas que
contienen desoxi- y ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen
DNA genómico, DNAc y oligonucleótidos incluyendo ácidos nucleicos
sentido y antisentido. En la definición de ácido nucleico están
incluidos específicamente los ácidos nucleicos antisentido. Un ácido
nucleico antisentido hibridará con la hebra no codificadora
correspondiente de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la
Figura 1, pero puede contener ribonucleótidos así como
desoxirribonucleótidos. Generalmente, los ácidos nucleicos
antisentido funcionan para evitar la expresión de RNAm, de forma que
no se fabrica una proteína catepsina O2. El ácido nucleico puede
ser bicatenario, monocatenario, o contener porciones tanto de
secuencia bicatenaria como monocatenaria.
Por el término "ácido nucleico recombinante"
se designa aquí a un ácido nucleico, originalmente formado in
vitro mediante manipulación de un ácido nucleico por
endonucleasas, en una forma que normalmente no se encuentra en la
naturaleza. Por tanto, un gen de proteína catepsina O2 aislado, en
forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro
ligando moléculas de DNA que no están unidas normalmente, se
consideran ambos recombinantes, para los propósitos de esta
invención. Se entiende que una vez que se fabrica un ácido nucleico
recombinante y se vuelve a introducir en una célula hospedadora u
organismo, se replicará de forma no recombinante, es decir, usando
la maquinaria celular in vivo de la célula hospedadora, mejor
que usando manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos
nucleicos, una vez producidos por recombinación, aunque replicados
posteriormente de forma no recombinante, se consideran aún
recombinantes para los propósitos de la invención.
De forma similar, una "proteína
recombinante" es una proteína fabricada utilizando técnicas
recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico
recombinante como se representó anteriormente. Una proteína
recombinante se distingue de una proteína existente en la naturaleza
por al menos una o más características. Por ejemplo, la proteína
puede estar aislada de algunas o todas las proteínas y compuestos
con los que está asociada normalmente en su hospedador de tipo
silvestre. Así, por ejemplo, las proteínas de catepsina O2 que
están parcial o sustancialmente purificadas, o están presentes en
ausencia de células, se consideran recombinantes. La definición
incluye la producción de una proteína catepsina O2 de un organismo
en un organismo o célula hospedadora diferente. Alternativamente, la
proteína se puede fabricar a una concentración significativamente
superior a la que se observa normalmente, mediante el uso de un
promotor inducible o promotor de expresión elevada, de forma que la
proteína se fabrica a niveles de concentración incrementados.
Alternativamente, la proteína puede estar en una forma que no se
encuentra normalmente en la naturaleza, como por la adición de un
marcador de epítope o sustituciones, inserciones y deleciones de
aminoácidos.
También se incluyen en la definición de proteína
catepsina O2, proteínas de catepsina O2 de otros organismos, que se
clonan y expresan como se esboza debajo.
En el caso de ácidos nucleicos antisentido, un
ácido nucleico antisentido se define como aquel que hibridará con
toda o parte de la secuencia no codificadora correspondiente
mostrada en la Figura 1. Generalmente, las condiciones de
hibridación usadas para la determinación de la hibridación
antisentido serán condiciones muy estrictas, como SSC 0,1x a
65ºC.
Una vez identificado el ácido nucleico de la
proteína catepsina O2, se puede clonar y, si es necesario, sus
partes constituyentes se pueden recombinar para formar el ácido
nucleico completo de la proteína catepsina O2. Una vez aislado de su
fuente natural, p.ej., contenido en un plásmido u otro vector o
escindido de la misma como segmento de ácido nucleico lineal, el
ácido nucleico de la proteína catepsina O2 recombinante se puede
usar además como sonda para identificar y aislar otros ácidos
nucleicos de la proteína catepsina O2. También se puede usar como
un ácido nucleico "precursor" para fabricar ácidos nucleicos y
proteínas catepsina O2 modificadas o variantes.
Usando los ácidos nucleicos que codifican la
proteína catepsina O2, se fabrican diversos vectores de expresión.
Los vectores de expresión pueden ser, bien vectores de expresión
extracromosómicos autorreplicativos, o vectores que se integran en
un genoma hospedador. Generalmente, estos vectores de expresión
incluyen un ácido nucleico regulador transcripcional y de
traducción, conectado operativamente al ácido nucleico que codifica
la proteína catepsina O2. "Conectado operativamente" en este
contexto significa que el DNA regulador transcripcional y de
traducción se sitúa en relación con la secuencia codificadora de la
proteína catepsina O2 de tal manera que se inicie la transcripción.
Generalmente, esto significará que el promotor y las secuencias de
iniciación transcripcional o secuencias de inicio se sitúan en
posición 5' respecto a la región codificadora de la proteína
catepsina O2. El ácido nucleico regulador transcripcional y de
traducción será apropiado generalmente para la célula hospedadora
usada para expresar la proteína catepsina O2; por ejemplo, se usarán
secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y de la
traducción de Bacillus para expresar la proteína catepsina
O2 en Bacillus. Se conocen en la técnica numerosos tipos de
vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas,
para diversas células hospedadoras.
En general, las secuencias reguladoras
transcripcionales y de traducción pueden incluir, pero no están
limitadas a, secuencias promotoras, secuencias directoras o señal,
sitios de unión ribosómica, secuencias transcripcionales de inicio y
parada, secuencias de inicio y parada de traducción, y secuencias
incrementadoras o activadoras. En una realización preferida, las
secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias
transcripcionales de inicio y parada.
Las secuencias promotoras codifican promotores
constitutivos o inducibles. Los promotores pueden existir en la
naturaleza o ser promotores híbridos. Los promotores híbridos que
combinan elementos de más de un promotor, también son conocidos en
la técnica y son útiles en la presente invención.
Además, el vector de expresión puede comprender
elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede
tener dos sistemas de replicación, permitiendo por tanto que se
mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o
insecto para expresión y en un hospedador procariota para clonación
y amplificación. Asimismo, para vectores de expresión que se
integran, el vector de expresión contiene al menos una secuencia
homóloga al genoma de la célula hospedadora y, preferiblemente, dos
secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. El
vector de integración se puede dirigir a un locus específico
en la célula hospedadora, seleccionando la secuencia homóloga
apropiada para inclusión en el vector. Las construcciones para
vectores que se integran son bien conocidas en la técnica.
Además, en una realización preferida, el vector
de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la
selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de
selección son bien conocidos en la técnica, y variarán según la
célula hospedadora usada.
Las proteínas catepsina O2 de la presente
invención se producen cultivando una célula hospedadora transformada
con un vector de expresión que contiene ácido nucleico que codifica
una proteína catepsina O2, bajo las condiciones apropiadas para
inducir o causar la expresión de la proteína catepsina O2. Las
condiciones apropiadas para la expresión de la proteína O2 de
catepsina variarán con el tipo de vector de expresión y de célula
hospedadora, y se averiguarán fácilmente por un experto en la
técnica a través de experimentación de rutina. Por ejemplo, el uso
de promotores constitutivos en el vector de expresión requerirá
optimizar el crecimiento y proliferación de la célula hospedadora,
mientras que el uso de un promotor inducible requiere las
condiciones de crecimiento adecuadas para la inducción. Además, en
algunas realizaciones, la medición del tiempo de la recogida es
importante. Por ejemplo, los sistemas baculovíricos usados en la
expresión de células de insectos, son virus líticos y, por tanto, la
selección del tiempo de recogida puede ser crucial para el
rendimiento del producto.
Las células hospedadoras apropiadas incluyen
levaduras, bacterias, arqueobacterias, hongos y células de insectos
y animales, incluyendo células de mamíferos. Tienen especial interés
las células de Drosophila melanogaster, Saccharomyces
cerevisiae y otras levaduras, E. coli, Bacillus subtilis,
células SV9, C129, células 293, neurospora, BHK, CHO, COS, células
HeLa, y líneas celulares inmortalizadas linfoide y mieloide de
mamíferos.
En una realización preferida, las proteínas
catepsina O2 se expresan en sistemas bacterianos. Los sistemas de
expresión bacterianos se conocen bien en la técnica.
Un promotor bacteriano adecuado es cualquier
secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a
RNA-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción
aguas abajo (3') de la secuencia codificadora de la proteína
catepsina O2 en RNAm. Un promotor bacteriano tiene una región de
iniciación de la transcripción que se sitúa normalmente próxima al
extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación
de la transcripción incluye típicamente un sitio de unión de
RNA-polimerasa y un sitio de iniciación de la
transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de la vía
metabólica proporcionan particularmente secuencias promotoras
útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas
metabolizadoras de azúcares, como galactosa, lactosa y maltosa, y
secuencias derivadas de enzimas biosintéticas como el triptófano.
También se pueden usar promotores de bacteriófago y se conocen en la
técnica. Además, los promotores sintéticos e híbridos también son
útiles; por ejemplo, el promotor tac es un híbrido de las
secuencias promotoras trp y lac. Además, un promotor
bacteriano puede incluir promotores existentes en la naturaleza de
origen no bacteriano, que tienen la capacidad de unirse a
RNA-polimerasa e iniciar la transcripción.
Además de una secuencia promotora que funcione,
es deseable un sitio eficiente de unión a ribosoma. En E.
coli, el sitio de unión a ribosoma se denomina secuencia de
Shine-Delgarno (SD) e incluye un codón de iniciación
y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud,
localizada 3-11 nucleótidos aguas arriba del codón
de iniciación.
El vector de expresión puede incluir también una
secuencia de péptido señal que permite la secreción de la proteína
catepsina O2 en bacterias. La secuencia señal codifica típicamente
un péptido señal compuesto de aminoácidos hidrófobos que dirigen la
secreción de la proteína desde la célula, como se conoce bien en la
técnica. La proteína, bien es secretada al medio de cultivo
(bacterias gram-positivas) o al espacio
periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la
célula (bacterias gram-negativas).
El vector de expresión bacteriano puede incluir
también un gen marcador seleccionable para permitir la selección de
cepas bacterianas que se han transformado. Genes de selección
adecuados incluyen genes que hacen las bacterias resistentes a
fármacos como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina,
neomicina y tetraciclina. Marcadores seleccionables incluyen también
genes biosintéticos, como los de las vías biosintéticas de la
histidina, triptófano y leucina.
Estos componentes se agrupan en vectores de
expresión. Los vectores de expresión para bacterias se conocen bien
en la técnica, e incluyen vectores para Bacillus subtilis,
E. coli, Streptococcus cremoris y Streptococcus
lividans, entre otros.
Los vectores de expresión bacterianos se
transforman en células hospedadoras bacterianas, usando técnicas
bien conocidas en la técnica, como tratamiento con cloruro cálcico,
electroporación, y otras.
En una realización, se producen proteínas
catepsina O2 en células de insecto. Los vectores de expresión para
la transformación de células de insecto y, en particular, los
vectores de expresión basados en baculovirus, se conocen bien en la
técnica. De manera resumida, el baculovirus es un virus de DNA muy
grande que produce su proteína de la envuelta en concentraciones muy
elevadas. Debido al tamaño del genoma baculovírico, los genes
exógenos se tienen que colocar en el genoma vírico por
recombinación. Consecuentemente, los componentes del sistema de
expresión incluyen: un vector de transferencia, normalmente un
plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma del
baculovirus y un sitio de restricción conveniente para la inserción
de la proteína catepsina O2; un baculovirus de tipo silvestre con
una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el
vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del
gen heterólogo en el genoma de baculovirus); y células hospedadoras
de insecto y medio de cultivo apropiados.
Los sistemas de expresión de mamífero son también
conocidos en la técnica y se usan en una realización. Un promotor de
mamífero es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a la
RNA-polimerasa de mamífero e iniciar la
transcripción aguas abajo (3') de una secuencia que codifica la
proteína catepsina O2 en RNAm. Un promotor tendrá una región de
iniciación de la transcripción, que está colocada normalmente
próxima al extremo 5' de la secuencia codificadora, y una secuencia
TATA, que usa 25-30 pares de bases localizadas aguas
arriba respecto al sitio de iniciación de la transcripción. La
secuencia TATA se piensa que dirige la RNA polimerasa II para que
inicie la síntesis de RNA en el sitio correcto. Un promotor de
mamífero contendrá también un elemento promotor aguas arriba,
localizado típicamente entre 100 y 200 pares de bases aguas arriba
de la secuencia TATA. Un elemento promotor aguas arriba determina la
velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en
cualquier orientación. Se usan particularmente promotores de
mamífero de genes víricos de mamíferos, ya que los genes víricos se
expresan a menudo en concentraciones elevadas y tienen un intervalo
de hospedador amplio. Ejemplos incluyen el promotor temprano de
SV40, el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, el
promotor tardío principal de adenovirus y el promotor del virus del
Herpes simplex.
Típicamente, las secuencias de terminación de la
transcripción y de poliadenilación reconocidas por células de
mamífero son regiones reguladoras localizadas 3' respecto al codón
de parada de traducción y, por tanto, junto con los elementos
promotores, flanquean la secuencia codificadora. El extremo 3' del
RNAm maduro se forma mediante escisión y poliadenilación
postraducción en un sitio específico. Ejemplos de señales de
terminación de la transcripción y poliadenilación incluyen las
derivadas de SV40.
Los métodos para introducir ácido nucleico
exógeno en hospedadores de mamífero, así como en otros hospedadores,
se conocen bien en la técnica, y variarán según la célula
hospedadora usada. Las técnicas incluyen transfección en la que
interviene dextrano, precipitación de fosfato cálcico, transfección
en la que interviene polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos
en liposomas, y microinyección directa del DNA en los núcleos.
En una realización preferida, la proteína
catepsina O2 se produce en células de levadura. Los sistemas de
expresión de levadura son bien conocidos en la técnica, e incluyen
vectores de expresión para Saccharomyces cerevisiae,
Candida albicans y C. maltosa, Hansenula
polymorpha, Kluyveromyces fragilis y K. lactis,
Pichia guillerimondii y P. pastoris,
Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica.
Secuencias promotoras preferidas para expresión en levadura incluyen
el promotor GAL1.10 inducible, los promotores de
alcohol-deshidrogenasa, enolasa, glucoquinasa,
glucosa-6-fosfato-isomerasa,
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa,
hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
3-fosfoglicerato-mutasa,
piruvato-quinasa y el gen de la fosfatasa ácida.
Marcadores seleccionables de levadura incluyen ADE2, HIS4, LEU2,
TRP1 y ALG7, que confieren resistencia a tunicamicina; el gen de
resistencia G418, que confiere resistencia a G418; y el gen CUP1,
que permite a la levadura crecer en presencia de iones cobre.
Una proteína catepsina O2 recombinante se puede
expresar intracelularmente o secretarse. La proteína catepsina O2 se
puede fabricar también como proteína de fusión, usando técnicas bien
conocidas en el estado de la técnica. Así, por ejemplo, si el
epítope deseado es pequeño, la proteína catepsina O2 se puede
fusionar con una proteína vehículo para formar un inmunógeno.
Alternativamente, la proteína catepsina O2 se puede fabricar como
proteína de fusión para incrementar la expresión, o por otras
razones.
En una realización preferida, la proteína
catepsina O2 se purifica o aísla tras la expresión. Las proteínas
catepsina O2 se pueden aislar o purificar de diversas maneras
conocidas por los expertos en la técnica, dependiendo de qué otros
componentes estén presentes en la mezcla. Los métodos de
purificación estándar incluyen técnicas electroforéticas,
moleculares, inmunológicas y cromatográficas, incluyendo intercambio
de iones, cromatografía hidrófoba, de afinidad y HPLC de fase
inversa, y cromatoenfoque. Por ejemplo, la proteína catepsina O2 se
puede purificar usando una columna de anticuerpos
anti-catepsina O2 estándar. Las técnicas de
ultrafiltración y diafiltración, junto con la concentración de
proteína, también son útiles. Para una guía general en técnicas de
purificación adecuadas véase Scopes, R. Protein Purification,
Springer-Verlag, NY (1982). El grado de purificación
necesario variará dependiendo del uso de la proteína catepsina O2.
En algunos casos no será necesaria purificación.
En algunas realizaciones, la enzima catepsina O2
se expresa como proenzima. Según se representa en los ejemplos, la
proenzima se puede tratar con proteasa exógena para convertir la
enzima en la forma madura, activa, como se conoce en la técnica. Las
proteasas exógenas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, pepsina
y catepsina D.
Una vez expresadas y purificadas, si es
necesario, las proteínas de catepsina O2 son útiles en varias
aplicaciones.
Por ejemplo, según se muestra en el Ejemplo 5,
las proteínas catepsina O2 de la presente invención tienen actividad
colagenasa. Por tanto, las proteínas catepsina O2 se pueden usar
como colagenasa, tanto in vitro como in vivo. Por
ejemplo, la catepsina O2 se puede usar para tratar muestras
analíticas que contienen concentraciones de colágeno problemáticas o
perjudiciales.
De forma similar, las proteínas catepsina O2 se
pueden usar para degradar el exceso de colágeno en el cuerpo.
Existen diversas enfermedades asociadas con el exceso de colágeno.
Por ejemplo, un tratamiento de los problemas de disco espinal como
inflamación y hernia grave implica la inyección de colagenasa o
quimiopapaína para degradar el disco de colágeno (Leonardo et
al., Ann. Chirm Gynealcol. 82:141-148
(1993); Gogan et al., Spine 17:388-94
(1992); Stula, Nerochirurgia
33:169-172 (1990); y Boccanera et al.,
Chir. Organi. Mov. 75:25-32 (1990)).
Alternativamente, el tratamiento de adhesiones, como adhesiones
pélvicas, adhesiones posquirúrgicas, adhesiones pulmonares,
adhesiones abdominales y similares, se pueden tratar o disolver con
catepsina O2. De forma similar, las escaras y queloides se pueden
tratar con catepsina O2 para eliminar o reducir las cantidades
excesivas de colágeno presentes. Además, la endometriosis es otro
problema clínico significativo que implica el depósito de cantidades
en exceso de colágeno y otras sustancias en el útero y el tejido
circundante; ciertas formas de endometriosis se pueden tratar
también con la catepsina O2 de la presente invención.
En una realización alternativa, la catepsina O2
se puede usar para disolver las matrices alrededor de los tumores.
Generalmente, el pH del tumor es inferior al pH fisiológico y, según
se esboza en los Ejemplos, la catepsina O2 es activa a pH ácido. PO
tanto, la catepsina O2 es adecuada para disolver la matriz basada en
colágeno que rodea generalmente a un tumor.
En una realización, las proteínas catepsina O2 de
la presente invención se pueden administrar también para tratar la
picnodisostosis, un trastorno óseo de tipo osteoporosis. Este
trastorno parece producido por actividad insuficiente de las
cisteína-proteasas osteoclásticas. En algunas
realizaciones, se puede usar terapia génica para administrar la
catepsina O2.
Además, debido a que la catepsina O2 es funcional
a pH ácido, se puede administrar catepsina O2 junto con compuestos
de desmineralización ósea, como ácidos, para degradar el tejido
óseo. Así se pueden tratar crecimientos óseos aberrantes o en
exceso.
Las proteínas catepsina O2 de la presente
invención son útiles también para escrutar inhibidores de proteasa
de catepsina O2 e inhibidores de cisteína-proteasa.
Los inhibidores de cisteína-proteasa tienen
diversos usos, como se apreciará en la técnica, incluyendo la
purificación de cisteína-proteasas a través del
acoplamiento a columnas de cromatografía de afinidad, e inhibición
de cisteína-proteasas, similar a los inhibidores de
cisteína-proteasa conocidos. Además, los inhibidores
de cisteína-proteasa pueden tener usos terapéuticos,
ya que una gran variedad de trastornos fisiológicos están asociados
con concentraciones incrementadas de
cisteína-proteasas, incluyendo artritis,
inflamación, osteoporosis, distrofia muscular, invasión tumoral,
mieloma múltiple y glomerulonefritis, según se conoce en la
técnica.
Trabajo recientes han sugerido que las
cisteína-proteasas se pueden usar como factores de
transcripción que se unen a DNA (Xu et al., citado
anteriormente). En algunas realizaciones, las proteínas catepsina O2
de la presente invención se pueden usar como factores de
transcripción.
Recientemente se demostró que el parásito
Paragonimus westermani expresaba un inmunosupresor con
homología respecto a las cisteína-proteasas
(Hamajima et al., citado anteriormente). De hecho, la
homología respecto a las proteínas catepsina O2 de la presente
invención es aproximadamente 40%. Así, en una realización las
proteínas catepsina O2 pueden ser útiles como inmunosupresores.
En una realización preferida, cuando las
proteínas catepsina O2 se tienen que administrar a un ser humano,
las proteínas catepsina O2 son proteínas catepsina O2 humanas. Esto
es terapéuticamente deseable, a fin de asegurar que las reacciones
inmunológicas no deseables frente a la catepsina O2 administrada se
minimicen.
La administración de la proteína catepsina O2 de
la presente invención se puede realizar de diversas formas,
incluyendo, pero no limitadas a, oral, subcutánea, intravenosa,
intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular,
intrapulmonal, vaginal, rectal o intraocularmente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención comprenden una proteína catepsina O2 en una forma adecuada
para la administración a un paciente. Las composiciones
farmacéuticas pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas
portadoras, como albúmina sérica; tampones; rellenos como celulosa
microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; aglutinantes;
edulcorantes y otros saborizantes; colorantes; y polietilenglicol.
Los aditivos se conocen bien en la técnica, y se usan en diversas
formulaciones.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se administran generalmente en dosis terapéuticamente
efectivas, según se determinan rutinariamente por los expertos en la
técnica.
Se cree que la proteína catepsina O2 humana de la
invención tiene características que hacen a la proteína humana más
aceptable para fines terapéuticos que las proteínas catepsina O2 de
otras especies. En particular, la antigenicidad de las proteínas
catepsina O2 de otras especies en seres humanos, hacen estas
proteínas menos aceptables como composiciones terapéuticas; es
decir, las catepsinas de otras especies pueden provocar respuestas
inmunológicas indeseables en seres humanos.
Los siguientes ejemplos sirven para describir más
completamente la manera de usar la invención anteriormente descrita,
así como para exponer los modos preferidos contemplados para
realizar distintos aspectos de la invención. Se entiende que estos
ejemplos no sirven de ningún modo para limitar el verdadero alcance
de esta invención, sino que se presentan más bien para propósitos
ilustrativos.
A no ser que se especifique otra cosa, todas las
técnicas de DNA recombinante generales siguen los métodos descritos
en Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).
Se diseñaron dos cebadores de PCR degenerados,
basados en la secuencia publicada de un gen de osteoclastina de
conejo (Tezuko et al., 1994):
- 5'-GGA-TAC-GTT-ACN-CCN-GT-3' (SEQ ID Nº: 8)
- 5'-GC-CAT-GAG-GATA-NCC-3' (SEQ ID Nº: 9)
Estos cebadores se usaron para escrutar una
preparación de DNAc de bazo humano Quick Clone (Clontech). Se aisló
y purificó un fragmento amplificado de 450 pares de bases, y se usó
como sonda de DNAc para escrutar una biblioteca de DNAc de bazo
humano (gt10 de Clontech). Se escrutaron 600.000 clones sobre 20
filtros, usando una técnica en la que las placas se vuelven a formar
directamente sobre el filtro (Woo, Methods Enzymol.
68:389-395 (1979)). Esto permite la
amplificación de la señal de las placas positivas, permitiendo
tiempos de exposición más cortos, reduciendo por tanto el ruido de
fondo y la visualización de falsos positivos. Los filtros se lavaron
en condiciones moderadamente estrictas: una vez con SSC 2x, SDS al
0,1% a temperatura ambiente durante 10 min y una vez con SSC 2x, SDS
al 0,1% a 68ºC durante 20 min.
Los fagos de dos placas positivas se aislaron y
clonaron en el sitio EcoRI del vector pBluescript SK+
(Stratagene).
Un clon positivo se secuenció completamente en un
secuenciador ABI modelo 373A; la secuencia (SEQ ID Nº: 1) se muestra
en la Figura 1. Los alineamientos de secuencia de la proteína
catepsina O2 humana (SEQ ID Nº: 2), catepsina S humana (SEQ ID Nº:
4) y catepsina humana L (SEQ ID Nº: 5), se muestran en la Figura
2.
El DNAc de catepsina O2 humana se clonó en el gen
de polihedrina de los vectores de transferencia de baculovirus,
usando métodos estándar. El DNAc que codifica el marco de lectura
abierto completo de la preproenzima, se insertó en el sitio BgIII y
BamH1 del vector de transferencia pVL1392 (PharMingen). Se generaron
baculovirus recombinantes mediante recombinación homóloga después de
la cotransfección del vector de transferencia de baculovirus y el
DNA genómico AcNPV (PharMIngen) en células Sf9. A
continuación del punto final de dilución, la expresión de la
catepsina O2 humana se mide en un análisis de sustrato
fluorimétrico, esbozado a continuación.
Se obtuvo virus puro (AcNPVCO2) mediante
purificación en placa. Se cultivaron células Sf9 en medio
Sf900II (Gibco BRL, Grand Island, NY), hasta una densidad de
2 x 10^{6} células/ml, y se infectaron a un moi (multiplicidad de
infección) de 1. Se controló el número total de células, así como la
actividad celular y secretada de catepsina O2, cada 24 h. Después de
3,5 días se recogieron las células.
\newpage
La mayoría del material inmunorreactivo de
aproximadamente 43 kDa se encontró en las células infectadas. Como
contraste con el producto único de 43 kDa en el medio de cultivo, se
detectó una ligera banda adicional de 44 kDa en el extracto celular.
La banda de mayor peso molecular representa putativamente
preprocatepsina O2 sin tratar, mientras que la proteína de 43 kDa es
putativamente proenzima. No se observó ninguna actividad
inmediatamente tras la lisis de las células, ni durante las
condiciones de autoactivación a 40ºC entre pH 4,0 y 4,5, en
presencia de ditiotreitol, usando el sustrato sintético
Z-FR-MCA a pH 7,5. El incremento de
una actividad E-64 que se puede inhibir en
condiciones de autoactivación y medido a pH 5,5 se asignó a una
cisteína-proteasa Sf9 endógena (resultados no
publicados). No se observó tratamiento del precursor de catepsina
O2 con la catepsina B incubada a pH 4,0 y 5,5 durante 2 h a 37ºC
(datos no mostrados).
La catepsina O2 intracelular se produjo en las
células sf9 como precursor inactivo. La enzima se activó en
el lisado celular en condiciones ácidas y reductoras, como sigue.
Las células Sf9 se recogieron del medio de producción
mediante centrifugación a 2.000 x g y se lisaron en un
homogeneizador Dounce. El lisado celular que contenía el precursor
de catepsina O2 inactivo se completó hasta 100 ml con tampón de
acetato sódico 100 mM, a pH 3,75, que contenía triton
X-100 al 0,5%, ditioeritritol 5 mM y Na_{2}EDTA
2,5 Mm, y el pH se ajustó hasta 4,0. La conversión de la proforma en
la enzima activa se consiguió mediante tratamiento con pepsina.
Después de la adición de pepsina porcina (Sigma, St. Louis, MO) a
una concentración final de 0,4 mg/ml, la mezcla de activación se
incubó en un vibrador durante 90 min a 40º y 200 rpm. La activación
se controló usando Z-FR-MCA (10
\muM) como sustrato fluorogénico medido en tampón Tris/HCl 100 mM,
pH 7,5.
El precursor de catepsina O2 se transformó
eficientemente en enzima activa madura mediante tratamiento con
pepsina a pH 4,0. El digesto de extracto celular bruto o de
sobrenadante de medio de cultivo concentrado produjo una
desaparición del precursor dependiente del tiempo y la generación de
enzima madura (29 kD), a través de un intermediario de 36 kD (Fig.
3). En paralelo con este proceso, se observó un incremento de la
actividad E-64 susceptible de inhibición, medida a
pH 7,5.
No se observó activación del precursor mediante
adición de catepsina O2 activa purificada a pH 4,5 (datos no
mostrados), indicando que no es probable una autoactivación de
catepsina O2, ni cis ni trans, en los lisosomas. Esto contrasta con
las cisteína-proteasas relacionadas, como papaína y
catepsina S, que muestran una vía potencial de activación
autocatalítica (Vernet et al., J. Biol. Chem.,
265:1661-1666 (1990), Bröme et al., J.
Biol. Chem. 268:4832-4838 (1993)). Una
enzima activadora natural de catepsina O2 en el osteoclasto podría
ser la aspartil-proteasa catepsina D, que está
presente en los lisosomas osteoclásticos, pero se secreta en
concentraciones bajas en la laguna de resorción (Goto et al.,
1993).
El lisado activado se ajustó hasta pH 7,0 con
base Tris 2M, se aclaró por centrifugación a 10.000 x g y el
sobrenadante se ajustó hasta sulfato amónico 2,5 M a pH 5,5. Tras
centrifugación a 16.000 x g, el sobrenadante aclarado se concentró
hasta 50 ml por ultrafiltración (YM10 Amicon). Tras centrifugación
adicional a 10.000 x g, el sobrenadante aclarado se cargó en una
columna de bultil-sefarosa 4 Fast Flow (Pharmacia,
Suecia) y la columna se lavó con un gradiente de sulfato amónico
(2,5 M a 0 M en tampón acetato 25 mM, pH 5,5). La actividad se eluyó
a sulfato amónico 0 M. Las fracciones concentradas y agrupadas se
aplicaron luego a una columna FPLC Mono S (Pharmacia, Suecia) y se
eluyeron con un gradiente de NaCl lineal (0-2 M) en
acetato sódico 20 mM, pH 5,5. Se eluyó catepsina
electroforéticamente homogénea a NaCl 1,4 M.
El rendimiento promedio de un cultivo de células
Sf9 de 1 l (aprox. 2x10^{9} células) fue aproximadamente 1
mg de enzima purificada (Tabla 1).
| Análisis | Proteína total | Actividad total | Actividad específica | Factor de | Rendimiento |
| mg | \muMol/min | \muMol/mg/min | purificación | % | |
| Bruto^{b} | 800 | 1.753 | 2,2 | 1 | 100 |
| Fracción soluble de | 276 | 1.412 | 5.1 | 2.3 | 81 |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} 2,5 M | |||||
| Butil-sefarosa 4 | 2,9 | 1.143 | 394 | 179 | 65 |
| MonoS | 1,1 | 512 | 465 | 211 | 29 |
| ^{a} de 1 L del cultivo Sf9 | |||||
| ^{b} tras activación con pepsina |
La enzima purificada era una enzima de una sola
cadena y presentaba un peso molecular aparente de 29 kDa en un gel
SDS Tris/Glicina al 4-20% en condiciones reductoras.
El tratamiento con endoglicosidasas H y F, así como con
N-glicosidasa F no produjo ningún cambio en el peso
molecular, lo que implica que la proteasa no está glicosilada (datos
no mostrados). La catepsina humana O2 tiene dos sitios de
glicosilación potencial en su secuencia madura. Sin embargo, ambos
sitios tienen un residuo de prolina consecutivo a la asparagina, o
bien a la treonina, de forma que su uso es improbable. La catepsina
O2 contiene además un sitio de glicosilación putativo en la
proparte próxima al sitio de tratamiento entre la enzima madura y la
proparte. De nuevo, no se observó ningún cambio en el peso molecular
de la proenzima tras el tratamiento durante la noche con
endoglicosidasas H y F, así como con N-glicosidasa
F.
La secuenciación NH_{2}- terminal se realizó
mediante degradación automatizada de Edman. La secuenciación
N-terminal de la proteasa madura reveló el sitio de
tratamiento natural para las cisteína-proteasas de
la familia de papaína con una prolina adyacente a la alanina
N-terminal
(NH_{2}-APDSVDYRKKGYVTPVKN) (SEQ ID Nº: 10). Como
contraste, las cisteína-proteasas activadas
autocatalíticamente tienen frecuentemente en su sitio de tratamiento
una extensión N-terminal de 3 a 6 aminoácidos de la
proparte (Brömme et al. 1993). La masa molecular calculada de
catepsina O2 madura sería 23.495, que parece ser el peso real de la
enzima. La tripsina (24 kDa) presentaba el mismo peso molecular
aparente de 29 kDa cuando se analizaba en condiciones análogas.
La catepsina S humana recombinante se expresó
usando el sistema de expresión de baculovirus y se purificó según se
describe en otro lugar (Brömme y McGrath, resultados no publicados).
La catepsina L humana recombinante fue amablemente proporcionada por
el Dr. Mort, Shriner's Hospital for Crippled Children, Montreal,
Quebec). Todas las catepsinas usadas eran electroforéticamente
homogéneas y sus molaridades se determinaban mediante valoración del
sitio activo con E-64, según se describió por
Barrett y Kirschke (1981).
La catepsina O2 humana se ensayó con un sustrato
fluorogénico Z-FR-MCA (MCA,
metil-cumaril-amida) en tampón de
acetato sódico 100 mM, que contenía ditio-eritritol
2,5 mM y EDTA 2,5 mM. Las velocidades de hidrólisis iniciales del
sustrato-MCA se controlaban en cubetas de 1 cm a
25ºC a una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud
de onda de emisión a 450 nm. La concentración de
Z-FR-MCA es 5 \muM en condiciones
estándar.
Las constantes cinéticas V_{max} y K_{m} se
obtuvieron mediante análisis de regresión no lineal, usando el
programa Enzfitter (Leatherbarrow, Enzfitter, Elsevier Biosoft,
Cambridge, United Kingdom (1987).
La inhibición de catepsina O2 se analizó a
sustrato constante (Z-FR-MCA 5
\muM) y concentración de enzima constante (1 nM) en presencia de
diferentes concentraciones de inhibidor en el tampón de análisis de
sustrato. La catepsina O2 se preincubó con los inhibidores durante
10 min y la reacción se inició con sustrato. La actividad residual
se controló y el porcentaje de inhibición se calculó a partir de la
velocidad sin inhibir.
La proparte de la catepsina O2 humana se
amplificó mediante PCR usando técnicas estándar usando los
siguientes cebadores:
- 5'-CTG GAT CCC TGT ACC CTG AGG AGA TAC TG-3'(SEQ ID Nº: 11)
- 5'-CTA AGC TTC TAT CTA CCT TCC CAT TCT GGG ATA-3'(SEQ ID Nº: 12)
La proregión se expresó en el vector pTrcHis
(Invitrogen Corp., San Diego, CA), que contiene una serie de seis
residuos de histidina que funcionan como un dominio de unión a
metales en la proteína traducida. Este dominio de unión a metales se
usó para purificar la proparte de la catepsina O2 sobre resina
Probond de Invitrogen, incluida en su kit Xpress System Protein
Expression. En la Figura 10 se muestra un gel de la proparte
purificada.
La proparte purificada inhibía la enzima de
origen con un valor K_{i} 0,1 nM.
Se fabricaron anticuerpos policlonales en conejos
blancos de Nueva Zelanda frente a la proenzima catepsina O2 humana.
El DNAc que codificaba la proenzima se amplificó mediante PCR a
partir de una preparación de su secuencia de proenzima, usando
DNA-polimerasa Pfu (Promega). Los cebadores
usados se fabricaron frente al extremo 5' de la proenzima con un
sitio NheI y frente al extremo 3' con un sitio BamHI. La catepsina
O2 humana se clonó y expresó en E. coli (BL21 (DE3)) en el
vector pET11c de Novagen. La expresión se indujo con IPTG 0,4 mM a
DO600 = 0,6 y las células se recogieron 2 horas después de la
inducción. Después de la recogida, las proteínas expresadas se
hicieron correr en geles SDS de Tris-Glicina al 12%
de Novex que se tiñeron con Coomassie y se destiñeron. Se recortó
la banda de proenzima de catepsina O2, que se confirmó mediante
secuenciación N-terminal. La proteína se
electroeluyó desde las rodajas de gel y se concentró sobre
Centricon10, que se pretrató con tampón de elución 1x. El antígeno
se completó hasta 1 ml en PBS 1x y se usó para inmunización (El
Labs, Soquel, CA).
Los anticuerpos se purificaron del suero total
con polvo de acetona, formando un cultivo inducido de
BL21(DE3), y mediante unión de afinidad y elución desde el
antígeno sobre nitrocelulosa. Los anticuerpos purificados eran
específicos para procatepsina O2 humana, la proparte, y la enzima
madura, y no presentaban reactividad cruzada con catepsinas humanas
S, L y B en análisis de transferencia de Western a dilución
1:2000.
Se prepararon secciones de tejido humano fijadas
con formalina e incluidas en parafina (Biogenex, San Ramón, CA),
según se describió previamente (Cattoretti et al., 1992) y se
tiñeron con IgG de conejo testigo o anticuerpos anticatepsina O2
purificados por afinidad, usando el sistema de detección StrAviGen
(Biogenex). Las secciones se tiñeron por contraste con hematoxilina
de Mayer.
La inmunotinción de un osteoclastoma reveló una
tinción específica intensa de osteoclastos multinucleados, mientras
que las células estromales no presentaban ninguna reacción (Fig.
11). Se observó también la tinción inmunoquímica intensa de
osteoclastos en huesos humanos prenatales (datos no mostrados). En
pulmón, se detectó catepsina O2 en dos sitios; primero en los
macrófagos alveolares pulmonares (Fig. 11) y segundo, en células
epiteliales bronquiolares. La catepsina O2 se encontró también en
células epiteliales de las glándulas gástricas en el estómago, de
las glándulas intestinales en el colon, de los túbulos proximales y
distales en el riñón y en el epitelio de las glándulas uterinas en
el endometrio. Además, las células de Kupfer en el hígado, así como
las células espermáticas en desarrollo de los testículos muestran
una tinción intensa frente a catepsina O2. Se observó una tinción
más uniforme en el córtex de las glándulas adrenales, en ovarios y
placenta (Fig. 11).
De forma similar, se producen anticuerpos
policlonales frente a la proparte electroforéticamente homogénea de
la catepsina O2 humana, en conejos blancos de Nueva Zelanda, y
anticuerpos monoclonales para la proparte, procatepsina O2 y
catepsina O2 madura, mediante técnicas estándar.
Los siguientes experimentos se realizaron con la
catepsina humana purificada parcialmente del Ejemplo 2.
La estabilidad frente al pH de la catepsina O2 se
determinó mediante incubación de la proteasa activa a diferentes
valores de pH, en presencia de ditio-eritritol 5 mM
y EDTA 5 mM a 25ºC. La actividad residual se midió en intervalos de
tiempo, usando el análisis de sustrato fluorimétrico descrito
anteriormente.
Las velocidades iniciales de hidrólisis de
sustrato se controlaron según se describió anteriormente. El perfil
de actividad de pH de la catepsina O2 humana se obtuvo con una
concentración de sustrato 1 \muM
(Z-FR-MCA) ([S] << K_{m} en
la que la velocidad inicial V_{0} es directamente proporcional al
valor k_{cat}/K_{m}). Para el perfil de actividad se usaron los
siguientes tampones: citrato sódico 100 mM (pH
2,8-5,6) y fosfato sódico 100 mM (pH
5,8-8,0). Todos los tampones contenían EDTA 1 mM y
NaCl 0,4 M para minimizar la variación de la fuerza iónica. Se usó
un modelo de tres protonaciones (Khouri et al., Biochem.
30:8929-8936 (1991)) para el análisis de
regresión cuadrada mínima de los datos de actividad de pH. Los datos
se ajustaron a la siguiente ecuación:
(k_{cat}/K_{m})_{obs} =
(k_{cat}/K_{m})/([H^{+}]/K_{1} + 1 +
K_{2}/[H^{+}])
La estabilidad de pH de las catepsinas O2, S y L
se estudió a tres valores diferentes de pH. Se incubaron catepsinas
humanas recombinantes O2, S y L a 37ºC en tampón de acetato sódico
100 mM, pH 5,5 en tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,5 y en
Tris/HCl 100 mM, pH 7,5, que contenía ditio-treitol
5 mM y EDTA 2,5 mM. Incubando durante 0,5, 1, 2 y 4 horas, la
actividad restante se determinó usando
Z-FR-MCA 5 \muM para catepsina O2
(tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,5) y catepsina L (tampón de
acetato sódico 100 mM, pH 5,5) y
Z-VVR-MCA 5 \muM para catepsina S
(tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,5).
Los perfiles de actividad de pH son mediciones
sensibles de la integridad enzimática funcional y estructural. Una
comparación de los perfiles de pH de proteasas distintas pero
relacionadas revela diferencias en la actividad y estabilidad
intrínsecas de estas proteasas. La catepsina O2 humana presenta un
perfil acampanado con valores de pK flanqueantes 4,0 y 8,13 (Tabla
2; Fig. 5).
| Proteasa | pK_{1}' | pK_{1} | pK_{2} | pH óptimo^{a} |
| catepsina humana O2 | 3,43\pm0,05 | 4,00\pm0,02 | 8,13\pm0,01 | 6,1 |
| catepsina humana S^{b} | 4,49\pm0,03 | 7,82\pm0,03 | 6,1 | |
| Catepsina humana L^{b} | 3,33\pm0,14 | 4,22\pm0,28 | 6,95\pm0,09 | 5,6 |
| papaína^{c} | 3,58\pm0,29 | 4,54\pm0,29 | 8,45\pm0,02 | 6,5 |
| ^{a} calculado de (pK_{1} + pK_{2})/2 | ||||
| ^{b} de Brömme et al., 1993, citado anteriormente | ||||
| ^{c} de Khouri et al., 1991, citado anteriormente |
El pH óptimo de la catepsina O2 humana estaba
entre 6,0 y 6,5 y era comparable al observado para catepsina S
(Brömme et al. citado anteriormente, 1993). La amplitud del
perfil de pH, que refleja la estabilidad del par iónico (Menard
et al., Biochem. 30:531-5538 (1991)), es 4,15
para catepsina O2, pero sólo 3,35 para catepsina S (Brömme et
al., 1993, citado anteriormente). Este parámetro para catepsina
O2 humana es más similar al observado para la papaína, muy estable,
que presenta una amplitud de perfil de 3,91 (Khouri et al.,
citado anteriormente, 1991).
La catepsina humana O2 era más estable que la
catepsina L, a valores de pH de ligeramente ácidos a neutros, pero
menos estable que la catepsina S (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
| proteasa | tiempo de incubación h | actividad residual (%) | ||
| pH 5,5 | pH 6,5 | pH 7,5 | ||
| catepsina O2 | 0,5 | 91 | 85 | 11 |
| 1 | 88 | 49 | 0 | |
| 2 | 70 | 22 | 0 | |
| 4 | 52 | 15 | 0 | |
| catepsina S | 0,5 | 100 | 100 | 91 |
| 1 | 95 | 100 | 72 | |
| 2 | 92 | 94 | 61 | |
| 4 | 83 | 71 | 60 | |
| catepsina L | 0,5 | 87 | 12 | 0 |
| 1 | 78 | 3 | 0 | |
| 2 | 71 | 0 | 0 | |
| 4 | 51 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 50% de actividad de la catepsina
O2 se conservaba después de 1 hora a 37ºC y pH 6,5, mientras que no
se observaba esencialmente ninguna actividad de catepsina L en esas
condiciones.
Sin embargo, hay que considerar que la
estabilidad de pH se determinó sin protección de sustrato, que
normalmente incrementa la estabilidad de pH. En el análisis de
degradación de elastina ^{3}H con catepsina O2, se observaba un
aún un incremento de fragmentos ^{3}H solubilizados tras 2 horas a
pH 7,0.
La eficacia de los inhibidores específicos de
tipo proteasa para inhibir la catepsina O2 se determinó añadiendo el
inhibidor a la enzima purificada, en un análisis enzimático
fluorimétrico (descrito anteriormente).
La catepsina O2 humana presenta un perfil
inhibidor típico de una cisteína-proteasa. Es
inhibida por inhibidores de cisteína-proteasa y por
inhibidores de cisteína y serina-proteasas (Tabla
4). A concentraciones superiores a 0,1 \muM, aldehídos peptídicos,
diazometanos, E-64 y cistatina de pollo inhiben
completamente la actividad enzimática. Por otra parte, los
inhibidores específicos de serina y
aspártico-proteasa no afectaban a la actividad
enzimática. No se observó ningún efecto de EDTA sobre la actividad
de la catepsina O2, a una concentración de 4 mM. A mayores
concentraciones (> 5 mM), se observó una inhibición inespecífica
parcial.
| inhibidor | [inhibidor] | % de inhibición | |
| inhibidores de | |||
| serina-proteasa | PMSF | 1 mM | 0 |
| Befablock | 0,2 mM | 0 | |
| DC1 | 0,1 mM | 0 | |
| inhibidores de | |||
| serina/cisteína- | leupeptina | 0,05 \muM | 85 |
| proteasa | quimiostatina | 0,05 \muM | 64 |
| calpeptina | 0,1 \muM | 100 | |
| inhibidor de | pepstatina | 0,1 \muM | 0 |
| aspartato-proteasa | |||
| inhibidor de metalo- | |||
| proteasa | EDTA | 4 mM | 0 |
| inhibidor de | |||
| cisteína-proteasa | acetato de yodo | 50 \muM | 60 |
| Z-FF-CHN_{2} | 0,1 \muM | 90 | |
| Z-FA-CHN_{2} | 0,1 \muM | 100 | |
| E-64 | 0,1 \muM | 100 | |
| cisteína de pollo | 0,1 \muM | 100 |
La actividad de catepsina O2 sólo es inhibida por
inhibidores específicos de cisteína-proteasa.
La especificidad de sustrato hacia los sustratos
sintéticos se determinó usando el análisis de sustrato descrito
anteriormente.
La especificidad S_{2}P_{2} de la catepsina
O2 humana se caracterizó usando sustratos sintéticos de tipo
Z-X-R-MCA, siendo X
igual a F, L, V o R. El bolsillo del subsitio S_{2} de las
cisteína-proteasas está bien definido
estructuralmente y determina la especificidad primaria de esta clase
de proteasa. Por ejemplo, la catepsina B contiene un residuo
glutamato (E245) en el fondo del bolsillo del subsitio S_{2}, que
favorece la unión de residuos básicos, como arginina. Este residuo
glutamato es reemplazado por residuos neutros en todas las demás
catepsinas humanas conocidas, produciendo una velocidad de
hidrólisis muy baja del sustrato
Z-R-R-MCA. La
catepsina O2 contiene un residuo leucina en posición 205, el cual
hace Z-R-R-MCA un
sustrato muy pobre (Fig. 6). La especificidad de catepsina O2 hacia
los residuos P_{2} se asemeja a la de la catepsina S. Ambas
enzimas prefieren una leucina sobre una
fenil-alanina en esta posición, mientras que la
catepsina L se caracteriza por una especificidad inversa (Tabla 5,
Fig. 6). La valina en posición P_{2} se acepta relativamente bien
por la catepsina O_{2}, mientras que la presencia de un residuo
ramificado en posición beta en P_{2}, produce un sustrato pobre
para las catepsinas L, S y B.
| Sustrato | k_{cat}(s^{-1}) | K_{m}(\muM) | k_{cat} K_{m}(M^{-1}s^{1}) |
| Z-FR-MCA | 0,90\pm0,20 | 7,5\pm3,4 | 120.000 |
| Z-LR-MCA | 0,98\pm0,39 | 3,8\pm0,8 | 257.900 |
| Z-VR-MCA | 1,06\pm0,16 | 13,1\pm5,6 | 80.900 |
| Z-RR-MCA | 0,0005\pm0,0002 | 23\pm4 | 22 |
| Z-VVR-MCA | 0,01\pm0,004 | 18,5\pm1,5 | 540 |
| Z-LLR-MCA | 0,02\pm0,008 | 0,4\pm0,1 | 50.000 |
Para el cálculo de los parámetros cinéticos
k_{cat} y K_{m}, las velocidades iniciales se obtuvieron
típicamente a 9-11 concentraciones diferentes de
sustrato, y los resultados se ajustan a la ecuación (1). La
concentración de enzima se determina mediante valoración de sitio
activo con E-64 (Kinder et al., Biochem. J.
201:367-372 (1982)).
ecuación (1)v
= \frac{kcat \ x \ EO \ x \ [S]}{(Km +
[S])}
La eficiencia catalítica (k_{cat}/K_{m}) de
catepsina O2 frente a los sustratos dipeptídicos era comparable a la
de las catepsinas S y B, pero era aproximadamente un orden de
magnitud inferior a la de la catepsina L. Es interesante que los
valores de K_{m} para la catepsina O2 eran comparables a aquellos
determinados para la catepsina L. El valor K_{m} refleja en alguna
medida la afinidad de los sustratos para la proteasa. Esta tendencia
es incluso más obvia para el sustrato tripeptídico
Z-LLR-MCA, que presenta un valor
K_{m} tan bajo como 4 x 10^{-7}M (Tabla 5). Sin embargo, como
contraste con las catepsinas S y L, los valores k_{cat} son casi
dos órdenes de magnitud inferiores para la catepsina O2, lo que
puede reflejar una unión no productiva.
Se preparó [^{3}H] elastina según se describió
(Banda et al., Methods Enzymol. 144,
288-305 (1987)) y tenía una actividad específica de
113.000 cpm/mg de proteína. La elastina (2 mg) se incubó en 1 ml de
tampón que contenía ditio-treitol 2,5 mM, EDTA 2,5
mM y Triton X-100 al 0,05% para los análisis de
catepsina O2, S y L. Se extrajeron alícuotas después de 10, 20, 30,
50, 90, 120 y 180 min, se centrifugaron durante 1 min a 14.000 x g y
se contabilizaron en una placa de 24 pocillos que contenía fluido de
centelleo con un contador de centelleo líquido (1450 Microbeta Plus,
Wallac/Pharmacia). Las concentraciones de catepsina O2, S y L
humanas y elastasa bovina en el análisis de degradación de elastina
eran 65 nM, 28 nM, 80 nM y 80 nM, respectivamente. Para determinar
el efecto del pH sobre la actividad proteasa, los digeridos se
realizaron a pH 4,5 y 5,5 (acetato sódico 100 mM,
ditio-treitol y EDTA, cada uno 2,5 mM, Triton
X-100 al 0,05%), y a pH 7,0 (Tris/HCl 100 mM,
ditio-treitol y EDTA, cada uno 2,5 mM, Triton
x-100 al 0,05%). La elastasa pancreática bovina
(Boehringer, Mannheim, IN) se analizó en las mismas condiciones,
excepto porque no se añadieron ditio-eritritol ni
EDTA a la mezcla de incubación.
La actividad máxima se observó a pH 5,5. La
catepsina O2, entre pH 4,5 y 7,0, tiene una actividad elastinolítica
que es entre 1,7 y 3,5 veces superior a la de la catepsina S. Su
actividad elastinolítica al pH óptimo de la catepsina L (pH 5,5) y a
pH neutro era casi 9 veces y 2,4 veces superior, cuando se comparaba
con la catepsina L y elastasa pancreática, respectivamente (Fig.
7). Los valores determinados para catepsina L y S están totalmente
de acuerdo con los datos publicados (Kirsche et al., en:
Proteolysis and Protein Turnover (Bond, J.S. y Barrett,
A.J., editores) págs. 33-37, Portland Press, London
and Chapel Hill (1993), Kirsche y Wiederanders, Methods
Enzymol. 244, 500-511 (1994)).
Se diluyó colágeno soluble de tipo I de piel de
ternera hasta 0,4 mg/ml en tampón de acetato sódico 100 mM, pH 4,5,
5,0, 5,5 en tampón de fosfato potásico 100 mM, pH 6,0, 6,5 y
Tris/HCl 100 mM, pH 7,0 que contenía ditio-treitol 2
mM/EDTA 2 mM. Las catepsinas O2, S y L humanas y tripsina bovina
(Sigma) se incubaron a concentraciones de enzima 100 nM durante 10
horas a 28ºC. Para medir la actividad gelatinasa de las catepsinas
O2 y S, se calentó colágeno de tipo I durante 10 min a 70ºC, antes
de incubación con las proteasas. En presencia de proteasas 1 nM, la
mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 28ºC. Las muestras se
sometieron a electroforesis en SDS poliacrilamida, usando geles de
Tris-glicina al 4-20% (Novex, San
Diego, CA).
La catepsina O2 degradaba extensivamente el
colágeno de tipo I entre pH 5,0 y 6,0 a 28ºC, mientras que la
degradación a pH 4,5 y pH 7,0 es mucho menos pronunciada (Fig. 9A).
La escisión primaria parecía suceder en la región del telopéptido,
ya que los monómeros alfa liberados desde los componentes beta y
gamma eran ligeramente más pequeños. Adicionalmente, la escisión
puede ocurrir también en los monómeros alfa. Todavía no está claro
si la escisión ocurre en la región de la hélice intacta o en los
monómeros alfa que no forman hebra. Los fragmentos mayores de
colágeno de tipo I observados después de la acción de la catepsina
O2 tenían 70-80 kDa de tamaño. La catepsina L
también escindía en la región del telopéptido, pero prácticamente no
se detectaba ningún fragmento de peso molecular pequeño. El
intervalo de pH efectivo para la actividad colagenolítica de la
catepsina L es más ácido cuando se compara con el observado para
catepsina O2 (entre pH 4,0 y 5,5). La catepsina S parecía revelar
sólo una actividad colagenolítica muy débil. Como contraste, las
colagenasas tisulares escinden los monómeros alfa en fragmentos ¾ y
¼ (Gross y Nagai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54,
1197-1204 (1965)). No se observó ninguna degradación
de colágeno de tipo I con tripsina, a igual concentración de enzima,
comparada con la catepsina O2, mostrando que la integridad de la
triple hélice del colágeno usado no se dañaba (datos no
mostrados).
Además de su actividad colagenasa, la catepsina
O2 mostraba una potente actividad gelatinasa. A concentración 0,1 nM
de la enzima, el colágeno desnaturalizado se degradaba totalmente en
30 min en un intervalo de pH de 5,0 a 7,0. Como contraste, la
catepsina L mostraba su actividad gelatinasa sólo en el intervalo de
pH entre 4,5-5,5 (Fig. 6b). La catepsina S era
activa entre pH 4,0 y 7,0, pero mostraba una actividad
significativamente más débil que la de las catepsinas O2 y L.
Actividades elastinolíticas
relativas de catepsinas, comparadas con la elastasa pancreática
bovina
| Proteasa | pH 4,5 mg/min/\mumol | pH 5,5 mg/min/\mumol | pH 7,0 mg/min/\mumol |
| de enzima | de enzima | de enzima | |
| catepsina O2 | 245 | 286 | 170 |
| catepsina L | 18 | 32 | 0 |
| catepsina S | 146 | 102 | 55 |
| elastasa pancreática | 8 | 18 | 79 |
La distribución tisular del nivel de señal de las
catepsinas humanas O2, L y S se determinó mediante transferencia
Northern, usando sondas de DNAc de las enzimas humanas apropiadas.
Las sondas eran aproximadamente de 450 pares de bases de longitud y
se extendían sobre la región que codificaba los residuos entre los
residuos del sitio activo cisteína-25 (según la
numeración de la papaína) y la asparagina-175. La
Figura 8 muestra transferencias Northern para la catepsina O2
humana. Según se muestra en la Figura 8, las concentraciones de
señal en preparaciones de osteoclastoma humano presentan un nivel
muchas veces superior de expresión de catepsina O2, que de catepsina
L.
La distribución tisular del RNAm de catepsina O2
humana mostraba algunas similitudes con la catepsina L, sin embargo,
su concentración tisular parecía significativamente inferior en la
mayoría de los órganos (corazón, placenta, pulmón, páncreas e
hígado). Por otra parte, la catepsina O2 humana mostraba diferencias
notables en su distribución en tejidos humanos y líneas celulares
cuando se comparaba con las catepsinas L y S humanas. La catepsina
O2 mostraba niveles elevados de transcripción en ovario, intestino
delgado y colon, pero ninguna señal en hígado, que es rico en
catepsina L. También se encontraba en células HeLa.
Distribución tisular y en líneas
celulares (Transferencia de
Northern)
| Tejido | CATHO | CATHL | CATHS |
| corazón | xx | xxxx | - |
| cerebro | - | x | - |
| placenta | xx | xxxx | xx |
| pulmón | xx | xxx | xxx |
| hígado | - | xxxx | xx |
| músculo esquelético | xx | xx | - |
| riñón | x | xxxx | - |
(Continuación)
| Tejido | CATHO | CATHL | CATHS |
| páncreas | x | xx | - |
| bazo | x | - | x |
| timo | x | x | - |
| próstata | x | x | - |
| testículos | x | xx | - |
| ovario | xxx | x | - |
| intestino delgado | xx | - | - |
| colon | xxx | x | - |
| leucocitos | - | - | xxx |
| leucemia promielocítica HL-60 | - | - | x |
| HeLa S3 | xx | x | x |
| leucemia linfoblastoide MOLT-4 | - | xx | x |
| Linfoma de Burkitt Raji | - | - | x |
| adenocarcinoma colec. | - | x | - |
| carcinoma pulmonar A549 | - | xxxx | x |
| melanoma G361 | - | xxxxx | - |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Khepri Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEASA CATEPSINA O2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Four Embarcadero Center, Suite 3400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 94111-4187
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Publicación nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 26-octubre-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 02-octubre-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/330.121
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 27-octubre-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Silva, Robin M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38.304
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: FP-60261-1-PC/DJB/RMS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:(415) 781-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 398-3249
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 910 277299
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1482 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CATACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 142..1128
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 329 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 329 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 331 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 333 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 335 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 339 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATACGTTA CNCCNGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATGAGRT ANCC
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly
Tyr Val Thr Pro Val}
\sac{Lys Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGATCCCT GTACCCTGAG GAGATACTG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAAGCTTCT ATCTACCTTC CCATTCTGGG ATA
\hfill33
Claims (4)
1. Una proteína catepsina recombinante que tiene
una secuencia polipeptídica consistente en los aminoácidos
115-329 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Figura 1, en la que dicha proteína catepsina recombinante tiene
actividad cisteína-proteasa.
2. Una proteína catepsina recombinante que tiene
una secuencia polipeptídica codificada por los nucleótidos 484 a
1128 de la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1, en la que
dicha proteína catepsina recombinante tiene actividad
cisteína-proteasa.
3. La proteína catepsina recombinante de las
reivindicaciones 1 o 2, fusionada con un polipéptido heterólogo.
4. Una composición que comprende la proteína de
las reivindicaciones 1 o 2.
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