JP4426650B2 - 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 - Google Patents

Description

本出願は、１９９７年４月３日出願の同時係属中の米国出願第０８／８３２０８７号の部分継続出願であり、該米国出願は、現在係属中の１９９６年５月３日出願の米国出願第０８／６４３２１９号の部分継続出願である。
技術分野
本発明は、ペプチド化学の分野に関する。特に、本発明は、哺乳類プラスミノーゲンのクリングル５領域の対応する配列に非常に類似したアミノ酸配列を有するペプチドの調製および使用、該ペプチドを含有する医薬組成物、アンギオスタチン受容体に特異的な抗体、アンギオスタチン検出および測定の手段、アンギオスタチンタンパク質に結合した細胞毒性物質、および血管形成から生じるかまたはそれによって悪化する病気の治療に関する。
発明の背景
新しい血管が形成される工程である血管形成は、再生、発育、および傷の修復を含む通常の生体活動にとって不可欠である。この工程は完全には理解されていないが、内皮細胞（毛細血管の一次細胞）の成長を調節する分子の、複雑な相互作用にかかわっていると考えられる。通常の条件下において、これらの分子は、数週間または、ある場合には数十年間もの長い期間、微小血管系を休止状態（即ち、毛細血管の無成長状態の一つ）に維持すると考えられる。必要なときに（傷の修復中のような場合）、これらの同じ細胞が、５日以内に急速な増殖および代謝回転を受け得る（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＳｈｉｎｇ，Ｙ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７（１６），１０９３１−１０９３４，およびＦｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５，４４２−４４７（１９８７）。
血管形成は、通常条件下においては非常に調節された工程であるが、多くの疾患（血管形成疾患を特徴とする）が、永続的な調節されていない血管形成によって誘発される。言い換えるならば、調節されていない血管形成は、特定の疾患を直接的に発生させるか、または既存の病的状態を悪化させる。例えば、視覚血管新生は、失明の最も一般的な原因とされており、約２０種の眼の疾患を占めている。関節炎のようなある種の既存の条件下において、新たに形成される毛細血管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病においては、網膜中に形成される新たな毛細血管が硝子体に侵入し、出血させ、失明させる。固体腫瘍（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）の成長および転移も血管形成に依存している（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６，４６７−４７３（１９８６）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，８２，４−６（１９８９））。例えば、２ｍｍより大きく増大した腫瘍は、それら自身の血液供給を得る必要があり、新毛細血管の成長を誘発することによってそれを行っている。一旦これらの新生血管が腫瘍中に埋め込まれると、それらは、腫瘍細胞が循環内に入り、肝臓、肺、または骨などの遠隔部位に転移するための手段を与える（Ｗｅｉｄｎｅｒ，Ｎ．ら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２４（１）：１−８（１９９１））。
今日までに、いくつかの自然発生血管形成因子が記載され、特徴が示されてきた（Ｆｉｄｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．およびＥｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，７９：１８５−１８９（１９９４））。最近、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙらは、内皮細胞増殖を阻害する、腫瘍保持マウスの血清および尿からの３８キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質を、単離し精製した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ，７９：３１５−３２８（１９９４）、および１９９５年１１月２日公開の国際出願第ＷＯ ９５／２９２４２号）。この内皮阻害物質のミクロ配列分析は、マウスのプラスミノーゲンの内部フラグメントと９８％配列相同であることを示した。マウスの阻害フラグメントに対して名付けられたアンギオスタチンは、マウスのプラスミノーゲンの最初の４つのクリングル領域を含むペプチドであった。ヒトプラスミノーゲンの同じ領域からのペプチドフラグメント（即ちクリングル１〜４を含む）も、生体外および生体内において毛細血管内皮細胞の増殖を強力に阻害する。このペプチドフラグメントの起源であるインタクトなプラスミノーゲンは、効力のある阻害効果を有していなかった。
現在、いくつかの血管形成阻害物質が、血管形成疾患の治療に使用するために開発中であるが（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｇ．およびＨａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１３（３）：７６５−７８２，（１９９５））、これら化合物は欠点を有する。例えば、スラミンは、強力な血管形成阻害物質であるが、抗腫瘍活性に必要とされる投与量において、ヒトにおいて強い全身毒性を生じる。レチノイド、インターフェロン、およびアンチエストロゲンのような化合物は、ヒトへの使用において安全であるが、弱い抗血管形成効果を有する。他の化合物も、製造が困難であるかまたは製造コストが高い。
従って、哺乳類における血管形成疾患の治療に有用な化合物が必要とされている。特に、治療的使用に安全であり、および、例えば、正常な（即ち、癌でない）細胞に対して毒性を全くまたはほとんど示さずに内皮細胞の増殖を選択的に阻害することによって、病理学的症状に対して選択的毒性を示す、抗血管形成阻害剤が必要とされている。そのような化合物は、容易に、および費用効率的に、製造されなければならない。
発明の要旨
主な実施態様において、本発明は、構造式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ（Ｉ）［式中、Ａは、不存在または窒素保護基であり；Ｙは、不存在またはカルボン酸保護基であり；Ｂは、不存在、または配列番号１のアミノ酸位置約３３４〜アミノ酸位置５３０の配列に対応する１〜約１９７個の天然アミノ酸残基であり；Ｃは、Ｒ¹−Ｒ²−Ｒ³−Ｒ⁴［式中、Ｒ¹はリシルであり、Ｒ²はロイシルまたはアルギニルであり、Ｒ³はチロシル、３−Ｉ−チロシルまたはフェニルアラニルであり、Ｒ⁴はアスパルチルである］であり；およびＸは、不存在、または配列番号１のアミノ酸位置５３５〜アミノ酸位置約５４６の配列に対応する１〜約１２個の天然アミノ酸残基、ならびにそれらの相同体および類似体である］によって示されるクリングル５ペプチド化合物、またはその医薬的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式Ａ−Ｂ₁−Ｃ₁−Ｘ₁−Ｙ（ＩＩ）［式中、Ａは、不存在または窒素保護基であり；Ｙは、不存在またはカルボン酸保護基であり；Ｂ₁は、不存在、または配列番号１のアミノ酸位置約３３４〜アミノ酸位置５１３の配列に対応する１〜約１７６個の天然アミノ酸残基であり；Ｃ₁は、配列番号１のアミノ酸位置５１４〜アミノ酸位置５２３の配列であり；およびＸ１は、不存在、または配列番号１のアミノ酸位置５２４〜アミノ酸位置５３３の配列に対応する１〜約１０個の天然アミノ酸残基、ならびにそれらの相同体および類似体である］によって示されるクリングル５ペプチド化合物、またはその医薬的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグをも包含する。
本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質を含有する化合物を患者に投与することを含んで成る、抗血管形成治療を必要とする患者の治療方法をも包含する。
本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質、クリングル５抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）、クリングル５受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに細胞毒性物質と結合したクリングル５アンタゴニストを、それらのみで、または治療組成物を形成するための医薬的に許容される賦形剤及び／又は任意の持続放出化合物と組み合わせて含有する化合物を含ん成る、抗血管形成治療を必要とする患者の治療のための組成物をも包含する。
本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質を含有する化合物を含んで成る、癌、関節炎、黄斑変性症、および糖尿病網膜症から成る群から選択される病気の治療のための組成物をも包含する。
本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質をコードする単離された一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド配列を含んで成る組成物をも包含する。そのようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子であるのが好ましい。本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターであって、細胞中に存在する場合にクリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質を発現することができるベクター；および、ベクターを含有する細胞を含んで成る組成物であって、該ベクターがクリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する組成物；をも包含する。本発明はさらに遺伝子治療法をも包含し、該遺伝子治療法によって、クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質またはクリングル５ペプチドフラグメント結合体をコードするＤＮＡ配列が、患者に導入されて、生体内クリングル５レベルを変化させる。
本発明は、（ａ）哺乳類プラスミノーゲンを、ヒトまたはブタエラスターゼに、約１：１００〜約１：３００の割合で曝露して、該プラスミノーゲンと該エラスターゼとの混合物を形成し；（ｂ）該混合物を培養し；および、（ｃ）該混合物からクリングル５ペプチドフラグメントを単離する；段階を含んで成る、クリングル５ペプチドフラグメントの製造方法をも包含する。
本発明は、（ａ）哺乳類プラスミノーゲンを、ヒトまたはブタエラスターゼに、約１：１００〜約１：３００のエラスターゼ：プラスミノーゲンの割合で曝露して、該エラスターゼと該プラスミノーゲンとの混合物を形成し；（ｂ）該混合物を培養し；および、（ｃ）該混合物からクリングル５ペプチドフラグメントのタンパク質結合体を単離し；（ｄ）クリングル５ペプチドフラグメントの該タンパク質結合体を、ペプシンに、約１：０．２の割合で曝露して、該ペプシンと該プラスミノーゲンとの混合物を形成し；および（ｄ）該クリングル５ペプチドフラグメントを該混合物から単離する；段階を含んで成る、クリングル５ペプチドフラグメントの製造方法をも包含する。または、クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質を、（ａ）該クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し；（ｂ）ポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローニングし；（ｃ）ベクターを適切な宿主細胞に形質転換し；および可溶性クリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質の発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させる；段階を含んで成る方法によって製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
図２は、ヒト（配列番号３４）、マウス（配列番号３５）、アカゲザル（配列番号３６）、ウシ（配列番号３７）、およびブタ（配列番号３８）クリングル５の、アミノ酸配列における比較相同性を示す。
図３は、ヒトプラスミノーゲンのＤＮＡ配列（配列番号１２）を示す。
図４は、生体内細胞増殖アッセイにおいて試験された、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞における種々のクリングルフラグメントの単一投与の、抗増殖活性のグラフを示す。
図５は、組換えタンパク質分泌のためのリーダー配列を有する発現ベクターｐＨｉｌ−Ｄ８のマップを示す。
図６は、クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質を発現するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上澄み（１０μＬ／レーン）の、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真の走査を示す。レーン１、６および１０：陰性対照；レーン、２、３および４：Ｋ５Ａを発現する３つの明瞭なクローン；レーン５：Ｋ５Ｆを発現するクローン；レーン７および８：Ｋ４−５Ａを発現するクローン；レーン９：Ｋ４−５Ｆを発現するクローン。矢印は、Ｋ５Ａ（約１１ｋＤａ）およびＫ４−５Ｆ（約２０ｋＤａ）のタンパク質バンドを示す。分子量マーカーが、レーン１および１０の前のレーンに示されている。
図７は、クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質を発現する大腸菌の走査されたクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。特に指示のない限り、各レーンは、１０のＡ₆₀₀に相当する１０μＬの培養物質を含有する。レーン１：低分子量マーカー；レーン２：Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、合計培養物；レーン３：Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、合計培養物（レーン２の１／１０量）；レーン４：Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、可溶性画分；レーン５：Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、不溶性画分；レーン６：Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、合計培養物；レーン７：Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、合計培養物（レーン６の１／１０量）；レーン８：Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、可溶性画分；レーン９：Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、不溶性画分；レーン１０：Ｋ４−５Ａ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、合計培養物；レーン１１：Ｋ４−５Ａ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、可溶性画分；レーン１２：Ｋ４−５Ａ／ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、不溶性画分；レーン１３：クリングル５標準；レーン１４：高分子量マーカー。
発明の詳細な説明
本明細書において使用されている「クリングル５」（以後、Ｋ５）という用語は、哺乳類プラスミノーゲン分子の第五クリングル領域によって規定される特定の三次元確定に寄与する３つのジスルフィド結合を有する哺乳類プラスミノーゲンの領域を意味する。そのようなジスルフィド結合の１つは、アミノ酸位置４６２および５４１に位置するシステイン残基に結合し、第二番目は、アミノ酸位置４８３および５２４に位置するシステイン残基に結合し、第三番目は、アミノ酸位置５１２および５３６に位置するシステイン残基に結合している。クリングル５領域を含む完全哺乳類プラスミノーゲン分子（ヒトプラスミノーゲン分子）のアミノ酸配列が、図１に示されている（配列番号１）。
本明細書において使用されている「クリングル５ペプチドフラグメント」という用語は、インタクトな哺乳類ブラスミノーゲンのアミノ酸位置約４４３におけるα−Ｎ−末端、および位置約５４６におけるα−Ｃ−末端を有する、哺乳類プラスミノーゲンの対応するペプチドフラグメントに対して実質的に配列相同性の４〜１０４アミノ酸（両端のアミノ酸を含む）の間のペプチドを意味する。クリングル５ペプチドフラグメントの全長は、クリングル５ペプチドが得られる方法に依存して変化し、またはそれを得た種に依存して配列において幾分変化する。例えば、ある形態のクリングル５ペプチドフラグメントは、ヒトまたはブタエラステーゼ酵素を用いて、ｇｌｕ−プラスミノーゲン、ｌｙｓ−プラスミノーゲン、またはミニプラスミノーゲンのタンパク質分解開裂によって製造することができる。このようにして製造された場合、配列番号１のアミノ酸約５４３において、ペプチド残基のα−Ｃ−末端が存在するが、α−Ｎ−末端アミノ酸は、アミノ酸位置４４３、４４９、または４５４において開始する。従って、ｇｌｕ−プラスミノーゲン、ｌｙｓ−プラスミノーゲン、またはミニプラスミノーゲンの、ヒトまたはブタエラスターゼ消化から生じるクリングル５ペプチドフラグメントは、１０１、９５または９０のアミノ酸の全長を有する。これらのクリングル５ペプチドフラグメントの要約が、表１に示されている。前記のような方法で製造された場合、フラグメントの約６０％が９５アミノ酸の長さを有し、フラグメントの約３５％が１０１アミノ酸の長さを有し、フラグメントの約５％が９０アミノ酸の長さを有する、これらの３つのフラグメントのプールが得られる。所望であれば、これらの種々のフラグメントを、当業者に既知の技術である逆相ＨＰＬＣによってさらに精製してもよい。長さにおける変化にもかかわらず、本発明のＫ５ペプチドフラグメントは、配列Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ（即ち、配列番号１のアミノ酸位置５３１〜アミノ酸位置５３４）、またはＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（即ち、配列番号１のアミノ酸位置５１４〜アミノ酸位置５２３）、またはそれらの類似体のいずれかを含む。
本明細書において使用される「クリングル５融合タンパク質」という用語は、それらのうちの１つがＫ５ペプチドフラグメントである２つまたはそれ以上の個々のタンパク質から引き出されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを意味する。クリングル５ペプチドフラグメントのコード配列が、２つ（またはそれ以上）の読み取り枠が枠内にあるような少なくとも１つの他のポリペプチドのコード配列と結合しているポリヌクレオチドの発現によって、融合タンパク質が形成される。好ましいクリングル５融合タンパク質は、クリングル５ペプチドフラグメントが、クリングル４（Ｋ４）、クリングル３−４（Ｋ３−４）、クリングル２−４（Ｋ２−４）、およびクリングル１−４（Ｋ１−４）のようなヒトプラスミノーゲンの対応する配列と融合している。好ましいＫ５融合タンパク質は、クリングル４−５（Ｋ４−５）である。本発明のクリングル５融合タンパク質の他の例は、生物学的標識（ｔａｇ）にさらに結合しているＫ５ペプチドフラグメントまたはＫ４−５である。そのような融合タンパク質は、それらが由来する分離タンパク質に開裂されることもあり、されないこともある。
本明細書において使用される「Ｋ５ペプチドフラグメントの結合体」という用語は、結合体を形成するために他のタンパク質に化学的に結合しているクリング５ペプチドフラグメントを意味する。クリング５ペプチドフラグメントの結合体の例は、アルブミン、または哺乳類プラスミノーゲンの他のクリングル領域からのペプチドフラグメントに結合したクリングル５ペプチドフラグメントを包含する。クリングル５ペプチドフラグメントの結合体の分子量は、約１，０００〜約２５，０００ｋＤａである。
本明細書に使用されている「実質的配列相同」という用語は、ヒトプラスミノーゲンの対応するペプチド配列との、約６０％、望ましくは少なくとも約７０％、より望ましくは約８０％、最も望ましくは約９５％の、アミノ酸の同一性を意味する。ヒトプラスミノーゲンとの実質的配列相同を有する配列は、「相同体」と呼ばれる。実質的配列相同を有することに加えて、本発明の相同体は、本明細書に記載されるＫ５ペプチドフラグメントと同様の生物学的活性（即ち、抗血管形成活性）を示す。クリングル５ペプチドフラグメントのアミノ酸配列またはアミノ酸の数は、種によって、または製造方法によって変化するので、クリングル５ペプチドフラグメントのアミノ酸の総数は、正確に規定できない場合がある。これらの配列が、それらのアミノ酸の少なくとも７３％において同一であるならば、クリングル５ペプチドフラグメントのアミノ酸配列が種間において実質的に同様であると理解すべきものとし、および、クリングル５ペプチドフラグメントのそれらの製造方法が、ヒトプラスミノーゲンの対応するアミノ酸配列に実質的に相同のクリングル５ペプチドフラグメントを製造すると理解すべきものとする。図２は、９５アミノ酸を有するヒトクリングル５ペプチドフラグメントのアミノ酸配列（配列番号３４）と、マウス（配列番号３５）、アカゲザル（配列番号３６）、ウシ（配列番号３７）、およびブタ（配列番号３８）プラスミノーゲンのクリングル５フラグメントの配列との比較を示す。
本発明は、それらの配列（類似体）が、開示されているクリングル５ペプチドフラグメントおよび融合タンパク質の生物学的活性と同様の生物学的活性を示すような、前記の配列に類似しているアミノ酸残基配列をも包含する。そのペプチドの生物学的機能を実質的に変化させずに、修正および変更を加えうることが当分野において既知である。その様な変更において、同様のアミノ酸残基の置換を、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの大きさ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて、行うことができる。記載されている種類の代替物は、ペプチド活性または酵素崩壊への安定性または薬物動力を強化するために形成することができる。従って、本発明の範囲内と見なされる配列は、変更が、前記Ｋ５ペプチドフラグメント及び／又は融合タンパク質の本質的性質および生物学的活性を変化させないような、アミノ酸残基配列または種類における変更を特徴とする相似配列を包含する。
本発明のＫ５ペプチドフラグメントまたはＫ５融合タンパク質は、ウシ毛細血管（ＢＣＥ）細胞の増殖を阻害する能力を生体内において試験したときの活性に基づいて、特性化できる。配列番号１のアミノ酸位置４４３〜アミノ酸位置５４３の配列を有するＫ５ペプチドフラグメントが、配列番号１のアミノ酸位置４４３〜アミノ酸位置５４６の配列を有するクリングル５ペプチドフラグメントと比較した場合に、活性（即ち、ＢＣＥ細胞増殖阻害）において約３００倍の増加を示し、およびクリングル１−４ペプチドフラグメントと比較した場合に、活性において約８００倍の増加を示すことを、表１および図４のデータが示している。
本明細書において使用されている「単離された」という用語は、それの原環境（例えば、天然の場合は、自然環境）から取り出された物質を意味する。例えば、生体動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系中のいくつかのまたは全ての共存物質から分離されるいくつかのポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部になることができ、及び／又はそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部になることができ、さらには、ベクターまたは組成物がそれの自然環境の一部でないという点において、単離することができる。
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的な特定のオリゴヌクレオチド配列を意味し、標的ヌクレオチド配列に交雑するのに使用され、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として機能する。
「プローブ」という用語は、相補配列を有する試料中の特定のＤＮＡの存在を同定するために使用することができる、限定された核酸セグメント（またはヌクレオチド相似セグメント、即ちＰＮＡ）を意味する。
本明細書に使用される「組換えポリペプチド」は、それの起源または操作によって、それが自然において（ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）会合しているポリペプチドの全てまたは一部と会合せず、及び／又はそれが自然において結合しているポリポプチド以外のポリペプチドに結合している、少なくともポリペプチドを意味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。組換え発現系の化学合成または発現を含むいずれかの方法によって得ることもできる。
本明細書において使用される「合成ペプチド」という用語は、当業者に既知の方法によって化学的に合成することができるある長さのアミノ酸のポリマー形態を意味する。これらの合成ペプチドは、種々の用途に有用である。
「精製ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが自然において会合しているタンパク質を、本質的に含まない、即ち、それの約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含有する、関係するポリヌクレオチドまたはそれのフラグメントを意味する。意図するポリヌクレオチドの精製方法は、当分野において既知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞のカオトロピック剤での分裂、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および密度に従った沈降による、ポリヌクレオチドとタンパク質の分離を包含する。従って、「精製ポリペプチド」は、関係するポリペプチドが自然において会合している細胞成分を本質的に含まない、即ち、それの約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含有する意図するポリペプチドまたはそれのフラグメントを意味する。精製方法は、当分野において既知である。
本明細書において使用される「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を意味し、生成物の特定の長さを意味しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などをも意味する。
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞物（ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）として培養される微生物または高等真核細胞系を意味する他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容者として使用することができる、または使用されている細胞を意味し、感染された原細胞の原子孫を包含する。
本明細書に使用されている「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律性単位として機能するプラスミド、染色体、またはウイルスのような遺伝的要素を意味する。
「ベクター」は、結合セグメントの複製及び／又は発現を引き起こすように、他のポリヌクレオチドセグメントが結合されているレプリコンである。
「制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすために必要とされる、ポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主有機体に依存して異なる。原核生物において、そのような制御配列が一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含み；真核細胞においては、そのような制御配列が一般に、プロモーター、ターミネーター、およびある場合には、エンハンサーを含む。従って、「制御配列」は、その存在が発現に必要な最少限の全ての成分を含むものとし、および、その存在が有益である追加的成分、例えばリーダー配列を含んでもよい。
「操作可能に結合された」とは、記載されている成分が、意図されたように機能することが許されている関係にある状態を意味する。従って、例えば、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、コード配列に「操作可能に結合された」制御配列が連結される。
「開放読み取り枠」または「ＯＲＦ」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を意味し；この領域は、コード配列の一部または全コード配列であってもよい。
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、ｍＲＮＡに転写され、およびポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’−末端における開始コドン、および３’−末端における翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を包含することができるが、それらに限定されるわけではない。
「形質転換」という用語は、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を意味する。例えば、直接取り込み、形質導入、またはｆ−交配を包含する。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして、維持することもでき、または宿主ゲノムに組み込むこともできる。
「精製された生成物」とは、生成物が通常会合している細胞成分から、および関心のある試料中に存在しうる他の種類の細胞から、単離された生成物の調製を意味する。
α−Ｎ−末端アミノ酸残基が左側にあり、α−Ｃ−末端が右側にある、一般に認められている協定に従って、全てのペプチド配列が記載されている。本明細書において使用されている「α−Ｎ−末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を意味し、「α−Ｃ−末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を意味する。
本明細書において使用されている「Ｎ−保護基」という用語は、合成中に、望ましくない反応から、アミノ酸またはペプチドのα−Ｎ−末端を保護する、またはそうでなければアミノ酸またはペプチドのアミノ基を保護することを目的とする基を意味する。一般に使用されるＮ−保護基が、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１））に記載されており、そこに記載の内容は参照により本発明に組込まれる。さらに、保護基は、例えば酵素加水分解によって、生体内で容易に開裂されて、生物学的に活性な親を放出するプロドラッグとして使用することができる。Ｎ−保護基は、ホルミル、アセチル（Ａｃ）、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル等の低級アルカノイル基：２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル等を包含する他のアシル基；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル等のスルホニル基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェニルオキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基；ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等のアリールアルキル基；および、トリメチルシリル等のシリル基を含む。好ましいＮ−保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。例えば、リシンは、α−Ｎ−末端において、酸不安定性基（例えば、Ｂｏｃ）によって保護され、ε−Ｎ−末端において、塩基不安定性基（例えば、Ｆｍｏｃ）によって保護され、次に、合成の間に選択的に脱保護される。
本明細において使用される「カルボキシ保護基」という用語は、化合物の他の官能部位にかかわる反応が行われている間に、カルボン酸官能価を封鎖または保護するために使用されるカルボン酸保護エステルまたはアミド基を意味する。カルボキシ保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ｐｐ．１５２−１８６（１９８１）に記載されており、そこに記載の内容は参照により本発明に組込まれる。さらに、カルボキシ保護基は、例えば酵素加水分解によって、生体内で容易に開裂されて、生物学的に活性な親を放出するプロドラッグとして使用することができる。そのようなカルボキシ保護基は当業者に既知であり、それらに開示の内容が本発明の開示の一部を構成する米国特許第３，８４０，５５６号および第３，７１９，６６７号に開示されているように、ペニシリンおよびセファロスポリン分野においてカルボキシル基の保護に広範囲に使用されている。代表的なカルボキシ保護基は、Ｃ₁−Ｃ₈低級アルキル（例えば、メチル、エチル、またはｔ−ブチル等）；フェネチルまたはベンジルのようなアリールアルキル、およびアルコキシベンジルまたはニトロベンジル基等のようなそれらの置換誘導体；フェニルエテニル等のようなアリールアルケニル；アリール、および５−インダニル等のようなその置換誘導体；ジメチルアミノエチル等のようなジアルキルアミノアルキル；アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチル−１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル等のようなアルカノイルオキシアルキル基；シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル等のようなシクロアルカノイルオキシアルキル基；ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル等のようなアロイルオキシアルキル；ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチル等のようなアリールアルキルカルボニルオキシアルキル；メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチル等のようなアルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル；メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチル等のようなアルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル；２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）エチル等のようなアリールオキシカルボニルオキシアルキル；２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ）エチル等のようなアルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル；２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル等のようなアリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル；２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル等のようなアリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル；ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル等のようなアルコキシカルボニルアミノアルキル；メチルアミノカルボニルアミノメチル等のようなアルキルアミノカルボニルアミノアルキル；アセチルアミノメチル等のようなアルカノイルアミノアルキル；４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル等のような複素環式カルボニルオキシアルキル；ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル等のようなジアルキルアミノカルボニルアルキル；（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル等のような（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル；および、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル等のような（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル；である。
代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニルおよび低級アルキルアミノカルボニル基である。
本発明の好ましいカルボキシ保護化合物は、保護カルボキシ基が、低級アルキル、シクロアルキル、またはアリールアルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステル等、またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキル、またはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルである化合物である。例えば、アスパラギン酸は、α−Ｃ−末端において、酸不安定性基（例えば、ｔ−ブチル）によって保護され、β−Ｃ−末端において、水素化不安定性基（例えば、ベンジル）によって保護され、次に、合成の間に、選択的に脱保護される。
本明細書において使用されている「低級アルキルアミノカルボニル」という用語は、合成クリングル５ペプチドフラグメントのα−Ｃ−末端を封鎖する基−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ¹⁰［式中、Ｒ¹⁰はＣ₁−Ｃ₄アルキルである］を意味する。
本明細書において使用されている「アミノカルボニル」という用語は、合成クリングル５ペプチドフラグメントのα−Ｃ−末端を封鎖する基−Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂を意味する。
本明細書において使用されている「プロドラッグ」という用語は、例えば、血液中の酵素加水分解によって、生体内で急速に変換されて親化合物を生成する化合物を意味する。充分な検討が、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１４、およびＥｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍａｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に記載されており、これらはどちらも参照により本発明に組込まれる。
本明細書において使用されている「医薬的に許容されるプロドラッグ」という用語は、（１）信頼できる医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を有さず、ヒトおよび下等動物の組織に接触して使用するのに適しており、それらの意図する使用に対して利益／危険性の適切な比を有する、本発明の化合物のプロドラッグ、および（２）可能な場合には親化合物の両性イオン形態、を意味する。
本明細書において使用されている「活性エステル誘導体」という用語は、酸塩化物のような酸ハロゲン化物、ならびに、蟻酸および酢酸誘導無水物、イソブチルオキシカルボニルクロライド等のようなアルコキシカルボニルハロゲン化物から誘導される無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導エステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド誘導エステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導エステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシアミド誘導エステル、２，４，５−トリクロロフェノール誘導エステル等を包含するがそれらに限定されるわけではない活性エステルを意味する。
本明細書において使用されている「抗血管形成活性」という用語は、血管の成長を阻害する分子の能力を意味する。
本明細書において使用されている「内皮阻害活性」は、一般に、血管形成を阻害する分子の能力、例えば、線維芽細胞増殖因子または他の既知の増殖因子の存在下における培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖または移行を阻害する能力を意味する。
本明細書において使用されている「ＥＤ₅₀」という用語は、血管増殖、または線維芽細胞増殖因子または他の既知の増殖因子の存在下における培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖、または内皮細胞の移行を、阻害物質の不存在下における増殖または移行の１／２で阻害するのに有効な、融合タンパク質のクリングル５ペプチドフラグメントの投与量の略語である。
本明細において使用されている天然アミノ酸およびアミノアシル残基の名称は、ほとんどの場合、ＩＵＰＡＣ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによって、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ α−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，１９７４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４（２），（１９７５）において提案されている命名協定に従っている。従って、「Ａｌａ」、「Ａｒｇ」、「Ａｓｎ」、「Ａｓｐ」、「Ｃｙｓ」、「Ｇｌｎ」、「Ｇｌｕ」、「Ｇｌｙ」、「Ｈｉｓ」、「Ｉｌｅ」、「Ｌｅｕ」、「Ｌｙｓ」、「Ｍｅｔ」、「Ｐｈｅ」、「Ｐｒｏ」、「Ｓｅｒ」、「Ｔｈｒ」、「Ｔｒｐ」、「Ｔｙｒ」、および「Ｖａｌ」という用語は、アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、ならびにＬ−、Ｄ−、またはＤ，Ｌ−形態におけるペプチド中のそれらの対応するアミノアシル残基を意味する。特定の配置が示されていない場合は、本明細書および請求の範囲に記載されているアミノ酸およびペプチド中のアミノアシル残基のα−炭素の立体化学は、自然発生的または「Ｌ」配置であるが、但し、アキラル分子グリシンは除き、さらに、アキラルであるかまたはそうでなければ「Ｄ−」に指定されるアミノ酸は除くと、当業者に理解される。
本明細書において使用されている「３−Ｉ−Ｔｙｒ」という用語は、フェノールヒドロキシルにオルト位の水素ラジカルがヨウ化物ラジカルによって置換されているＬ−、Ｄ−、またはＤ，Ｌ−チロシン残基を意味する。ヨウ化物ラジカルは、放射性または非放射性であってもよい。
本発明は、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、チアゾイルアラニン（２−、４−、および５−置換）等のような非自然発生側鎖残基を有するアミノ酸残基をも包含する。
従って、本発明は、抗血管形成活性を有するクリングル５ペプチドフラグメントおよびクリングル５融合タンパク質のどのような誘導体をも包含し、ならびに、本明細書に記載されているクリングル５ペプチドフラグメントおよび融合タンパク質の全種類ならびにそれらのフラグメントおよびタンパク質の相同体および類似体を包含することを意図するものであると理解すべきである。さらに、本発明は、クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質が生成される方法、即ち、（１）単離哺乳類プラスミノーゲンのタンパク質分解開裂、（２）クリングル５ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する組換え分子の発現、（３）当業者に既知の固相合成法、に依存しない。
１つの実施態様において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁴³で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する８８−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ａｌａ⁵⁴³で終結する９−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁴⁹で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する８２−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ａｌａ⁵⁴³で終結する９−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁵⁴で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する７７−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ａｌａ⁵⁴³で終結する９−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁴³で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する８８−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ｐｈｅ⁵⁴⁶で終結する１２−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁴⁹で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する８２−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ｐｈｅ⁵⁴⁶で終結する１２−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ⁴⁵⁴で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する７７−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ｐｈｅ⁵⁴⁶で終結する１２−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ³⁵⁵で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する１７６−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ａｌａ⁵⁴³で終結する１２−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ｂ−Ｃ−Ｘ［式中、Ｂは、配列番号１のＶａｌ³⁵⁵で開始し、Ａｒｇ⁵³⁰で終結する１７６−マーペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｘは、配列番号１のＴｙｒ⁵³⁵で開始し、Ｐｈｅ⁵⁴⁶で終結する１２−マーペプチドである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｃ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；Ｘは、チロシルであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、配列番号１のアミノ酸位置Ｐｒｏ⁵²⁹で開始し、アミノ酸位置Ａｒｇ⁵³⁰で終結するジペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、配列番号１のアミノ酸位置Ｐｒｏ⁵²⁹で開始し、アミノ酸位置Ａｒｇ⁵³⁰で終結するジペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、配列番号１のアミノ酸位置Ｔｙｒ⁵²⁵で開始し、アミノ酸位置Ａｒｇ⁵³⁰で終結するヘキサペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；Ｘは、チロシルであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、アルギニルであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；Ｘは、チロシルであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、配列番号１のアミノ酸位置Ｐｒｏ⁵²⁹で開始し、アミノ酸位置Ａｒｇ⁵³⁰で終結するジペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；Ｘは、３−Ｉ−チロシルであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂは、配列番号１のアミノ酸位置Ｐｒｏ⁵²⁹で開始し、アミノ酸位置Ａｒｇ⁵³⁰で終結するジペプチドであり；Ｃは、Ｒ¹およびＲ⁴が前記と同意義であり、Ｒ²がロイシルであり、Ｒ³がチロシルである４−マーペプチドであり；Ｘは、チロシルであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造Ａ−Ｂ₁−Ｃ₁−Ｘ₁−Ｙ［式中、Ａは、アセチルであり；Ｂ₁およびＸ₁は不存在であり；Ｃ₁は、配列番号１のアミノ酸位置Ａｒｇ⁵¹⁴で開始し、アミノ酸位置Ｔｒｐ⁵²³で終結する１０−マーペプチドであり；および、Ｙは、アミノカルボニルである］で示されるペプチドを提供する。
本発明の代表的化合物は、Ａがアセチルであり、Ｙがアミノカルボニルであり、Ｂ−Ｃ−Ｘが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸位置３５５〜５４３の配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３５５〜５４６の配列；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸位置４４３〜５４３の配列；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸位置４４９−５４３の配列；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸位置４５４〜５４３の配列；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸位置４４３〜５４６の配列；
（ｇ）配列番号１のアミノ酸位置４４９〜５４６の配列；
（ｈ）配列番号１のアミノ酸位置４５４〜５４６の配列；
（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置５２５〜５３５の配列；
（ｊ）配列番号１のアミノ酸位置５２９〜５３５の配列；
および
（ｋ）配列番号１のアミノ酸位置５３０〜５３５の配列である。
他の代表的な化合物は、Ａがアセチルであり、Ｙがアミノカルボニルであり、およびＢ₁−Ｃ₁−Ｘ₁が配列番号１のアミノ酸位置５１４〜５２３の配列である化合物である。
Ｋ５フラグメントまたはＫ５融合タンパク質は、クリングル５ペプチドフラグメントを有するタンパク質をコードする配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換え分子の発現、次に、発現されたペプチド生成物の精製によって得ることもできる（Ｍｅｎｈａｒｔ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：８７９９−８８０６（１９９３）参照）。ヒトプラスミノーゲンのＤＮＡ配列は公表されており（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，５（４）：２５７−２６０（１９９１））、図３（ａ〜ｂ）（配列番号１２）に示されている。クリングル５をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド位置約１４２１で開始し、ヌクレオチド位置約１７２３で終結する。
Ｋ５ペプチドフラグメントまたはＫ５融合タンパク質をコードする遺伝子は、（１）組織または細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離し、（２）逆転写酵素を用いて対応するＤＮＡ配列を発生させ、および（３）適切なプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、活性Ｋ５アミノ酸配列またはその融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を増幅することによって、ヒトプラスミノーゲンまたはＫ５融合タンパク質の高レベルを発現する細胞または組織から単離することができる。さらには、Ｋ５ペプチドフラグメントまたはＫ５融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、商業的に入手可能な発現ベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣベクター等）または発現／精製ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ^▲Ｒ▼、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪのＧＳＴ融合ベクター等）中にクローニングし、次に、好適な原核、ウイルス、または真核宿主中に発現させることもできる。次に、通常の手段によって、または、商業的発現／精製系の場合には製造者の指示に従って、精製が行われる。
Ｋ５クリングルフラグメントまたはＫ５融合タンパク質は、当業者に既知の固相化学の標準法によって合成することもできる。例えば、ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，（１９８４））によって記載されている手順に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ合成装置を用いて、クリングル５ペプチドフラグメントを、固相化学法によって合成することができる。同様に、多数のフラグメントを、合成し、結合して、より大きいフラグメントを形成することができる。これらの合成ペプチドフラグメントを、特定の位置におけるアミノ酸置換によって形成して、生体外および生体内における抗血管形成活性に関して試験することもできる。固相ペプチド合成に関して、多くの技術の要約が、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３、およびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．２，ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７３に見い出される。伝統的な溶液合成に関しては、Ｇ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｐｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。一般に、これらの方法は、１つまたはそれ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を、成長ペプチド鎖に逐次的に添加することを含んで成る。通常は、第一アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基が、適切な保護基によって保護される。次に、適切に保護され、アミド結合を形成するのに好適な条件下にある相補（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列に、次のアミノ酸を加えることによって、保護されたまたは誘導体化されたアミノ酸が、不活性固体基剤に結合されるかまたは溶液中に使用される。次に、新たに付加されたアミノ酸残基から保護基が除去され、次のアミノ酸（適切に保護された）が加えられる、以後同様。最終的に、所望のアミノ酸が、適切な配列に結合され、残る保護基（および固体基剤）が逐次にまたは同時に除去されて、最終ポリペプチドが得られる。この一般法を簡単に変更して、例えば、保護トリペプチドと適切に保護されたジペプチドとをカップリング（キラル中心をラセミ化しない条件下において）して、脱保護後にペンタペプチドを形成することによって、１回につき１つ以上のアミノ酸を成長鎖に付加することができる。
本発明の化合物の特に好ましい調製方法は、アミノ酸α−Ｎ−末端が酸または塩基感受性基で保護される固相ペプチド合成を含む。そのような保護基は、ペプチド結合形成の条件に対して安定である一方、成長ペプチド鎖の破壊またはその中に含まれるキラル中心のラセミ化を伴わずに、容易に除去できるという特性を有していなければならない。好適な保護基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル等である。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基が、クリングル５ペプチドフラグメントの合成に特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リシンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に関しては、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼン−スルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、およびアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに関しては、ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペンチル、およびアセチル（Ａｃ）；セリンに関しては、ｔ−ブチル、ベンジル、およびテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに関しては、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニル；トリプトファンに関しては、ホルミル；アスパラギン酸およびグルタミン酸に関しては、ベンジル、およびｔ−ブチル；およびシステインに関しては、トリフェニルメチル（トリチル）である。固相ペプチド合成法においては、α−Ｃ−末端アミノ酸が、適切な固体基剤または樹脂に結合している。前記合成に好適な固体基剤は、段階的縮合−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性な、および使用される基剤（ｍｅｄｉａ）中において不溶性の物質である。α−Ｃ−末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体基剤は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）である。α−Ｃ−末端アミドペプチドに好ましい固体基剤は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能な４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセタミドエチル樹脂である。α−Ｃ−末端アミノ酸は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いて、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロライド（ＢＯＰＣｌ）で媒介するかまたはせずに、約１〜約２４時間、１０〜５０℃の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦのような溶媒中でのカップリングによって、樹脂に結合される。固体基剤が４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセタミドエチル樹脂である場合、前記のようなα−Ｃ−末端アミノ酸と結合する前に、Ｆｍｏｃ基が、第二級アミン、好ましくはピペリジンによって開裂される。脱保護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセタミドエチル樹脂への結合に好ましい方法は、ＤＭＦ中の、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続的に保護されるアミノ酸の結合は、当分野で既知の自動ペプチド合成装置で行うことができる。好ましい実施態様においては、成長ペプチド鎖のアミノ酸のα−Ｎ−末端がＦｍｏｃで保護される。成長ペプチドのα−Ｎ−末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、第二級アミン、好ましくはピペリジンでの処理によって行われる。次に、各保護アミノ酸が約３倍のモル過剰において導入され、カップリングが好ましくはＤＭＦ中で行われる。カップリング剤は通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。固相合成の最後に、連続的に、または単一操作において、ポリペプチドが樹脂から除去され、脱保護される。ポリペプチドの除去および脱保護は、チアニソール、水、エタンジチオール、およびトリフルオロ酢酸を含んで成る開裂剤で樹脂結合ポリペプチドを処理することにって、単一操作で行うことができる。ポリペプチドのα−Ｃ−末端がアルキルアミドである場合、アルキルアミンを用いるアミノリシスによって樹脂が開裂される。あるいは、例えばメタノール用いるエステル交換、それに続くアミノリシスまたは直接的アミド交換によって、ペプチドを除去することもできる。保護ペプチドは、この時に精製されるか、または次の段階にそのまま使用される。側鎖保護基の除去は、前記の開裂カクテル（ｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いて行うことができる。完全に脱保護されたペプチドが、下記種類のいずれかまたは全てを用いる一連のクロマトグラフィー工程によって精製される：弱塩基性樹脂（アセテート形態）上のイオン交換；非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン上での疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ）；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ＬＨ−２０、または向流分布（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）上での分配クロマトグラフィー；高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特にオクチル−またはオクタデシルシリル−シリカ結合相カラムパッキングでの逆相ＨＰＬＣ。これらのクリングル５ペプチドフラグメントの分子量は、Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ＦＡＢ）質量分光分析法によって測定される。固相クリングル５ペプチドフラグメント合成が、実施例１〜１２に例示されている。
それらがどのようにして製造されるかに依存して、Ｋ５ペプチドフラグメントまたはＫ５融合タンパク質は、哺乳類プラスミノーゲンのクリングル５領域の前記ジスルフィド結合を有してまたは有さずに存在し、または、他の哺乳類クリングル領域を有する融合タンパク質の場合は、それらの対応する領域のジスルフィド結合を有してまたは有さずに存在し、または原哺乳類プラスミノーゲンに見い出される三次構造と異なる三次構造を形成するジスルフィド結合を有して存在する。エラスターゼ及び／又はペプシン（システイン結合からはずされた部位で開裂する酵素）を用いるＧｌｕ−、Ｌｙｓ−、またはミニプラスミノーゲンの酵素開裂によって生じるクリングル５ペプチドフラグメントは、原三次クリングル５タンパク質構造を含み；固相ペプチド合成によって生成されるクリングル５ペプチドフラグメントは、シスチルアミノアシル残基を有するかまたは有さず；および、発現によって生じるクリングル５ペプチドフラグメントは、酵素開裂によって生じるクリングル５ペプチドフラグメントにおいて見い出されるのと異なる位置にジスルフィド結合を有する。
実施例に特定されているものを包含するがそれらに限定されるわけではない本発明の化合物は、抗血管形成活性を有する。血管形成阻害剤として、そのような化合物は、乳房；結腸；直腸；肺；口腔咽頭；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆嚢；胆管；小腸；腎臓、膀胱、およびウロテリウム（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）を含む尿路；頸、子宮、卵巣、絨毛癌、および妊娠栄養膜疾患を含む女性生殖路；前立腺、精のう、精巣、および胚細胞腫瘍を含む男性生殖路；甲状腺、副腎、および下垂体を含む内分泌腺；血管腫、黒色腫、骨または軟組織から発生する肉腫、およびカポジ肉腫を含む皮膚の初期および転移固体腫瘍または癌；星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む、脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍；白血病のような造血悪性腫瘍から発生し、および緑色腫、形質細胞腫、菌状息肉腫の斑および腫瘍、および皮膚Ｔ−細胞リンパ腫／白血病を含む固体腫瘍；ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；リュウマチ性、免疫性、および変性関節炎を含む自己免疫疾患の予防；糖尿病性網膜症、早熟網膜症、隔膜移植拒絶反応、水晶体後方線維増殖、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性および低酸素症による網膜血管新生を含む眼疾患；眼の異常血管新生条件；乾せん癬を含む皮膚疾患；血管腫およびアテローム動脈硬化斑中の毛細血管増殖を含む血管疾患；オスラーウエーバー症候群；心筋血管形成；斑血管新生；毛細血管拡張；血友病関節症；血管線維腫；創傷顆粒形成；腸管癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性はん痕（即ち、ケロイド）、ならびにキャトスクラッチ病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）および潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を含む病理学的結果としての血管形成を有する疾患の、治療に有効である。他の用途は、排卵および胎盤定着を阻害する受胎調節剤としての使用である。
本発明の化合物は、単独で、または血管形成疾患を治療するために患者に通常行われている放射線治療及び／又は他の化学療法と組み合わせて、使用される場合に、前記の腫瘍からの転移の予防にも有効である。例えば、固体腫瘍の治療に使用する場合、本発明の化合物を、αインターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびブレドニソン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサイート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニソン、メトトレキサート（ｗ／ロイコビン レスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニソン、およびプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビンズ、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリスルフェート、血小板因子４、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ等の化学療法剤と共に投与してもよい。他の化学療法剤は、メクロエタミン、メルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、およびイフォスファミドを含むナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシンを含むニトロソウレア；ブスルファンを含むアルキルスルホネート；ダカルバジンを含むトリアジン；チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含むエチエニミン；メトトレキサートを含む葉酸類似体；５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含むピリミジン類似体；６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンを含むプリン類似体；アクチノマイシンＤを含む抗腫瘍抗生物質；ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、およびメトラマイシンを含むアントラサイクリン；タモキシフェンおよびコルチオステロイドを含むホルモンおよびホルモン拮抗薬、ならびにシスプラチンおよびブレキナールを含む種々の薬剤を包含する。例えば、手術、放射線または化学療法、およびクリングル５投与、続く二次クリングル５投与によって、従来通り腫瘍を治療して、ミクロ転移の休止を延長し、残留初期腫瘍の増殖を安定化し阻害することができる。
リシンのような細胞毒性剤を、クリングル５ペプチドフラグメントに結合させ、それによって、クリングル５に結合している細胞を崩壊する手段を得るこができる。細胞毒性剤に結合されたペプチドは、所望の位置への運搬を最大にするようにデザインされた方法で注入される。例えば、リシン結合高親和性クリングル５フラグメントは、カニューレによって目的部位に直接送達されるか、または目的部位に供給する容器（ｖｅｓｓｅｌ）に送達される。そのような薬剤は、注入カニューレにつながれた浸透ポンプを介して、制御された方法で送達することもできる。クリングル５拮抗薬の組合せを、血管形成の刺激剤と共に投与して、組織の血管新生を増加させることもできる。この種の治療法は、転移癌を破壊する有効な手段を提供しうる。
本発明の化合物は、無機または有機酸から誘導される医薬的に許容される塩の形態で使用することもできる。「医薬的に許容される塩」とは、信頼できる医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を有さずにヒトおよび下等動物と接触して使用するのに適しており、利益／危険性の妥当な比を有している塩を意味する。医薬的に許容される塩は、当分野において既知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６：１以下参照において、医薬的に許容される塩について詳細に記載しており、そこに記載の内容は参照により本明細書に組込まれる。本発明の化合物の最終の単離および精製の間に系中において、または別個に遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることによって、塩を調製することができる。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロ燐酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオネート）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、蓚酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、燐酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩を包含するがそれらに限定されるわけではない。また、塩基性窒素含有基を、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物、およびヨウ化物のような低級アルキルハロゲン化物；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルのような硫酸ジアルキル；デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル塩化物、臭化物、およびヨウ化物のような長鎖ハロゲン化物；ベンジルおよびフェネチル臭化物等のようなアリールアルキルハロゲン化物；のような物質で、四級化することもできる。水または油溶解性または分散性製剤がそれによって得られる。医薬的に許容される酸付加塩を形成するために使用される酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、および燐酸のような無機酸、ならびに蓚酸、マレイン酸、琥珀酸、およびクエン酸のような有機酸を包含する。
塩基付加塩は、カルボン酸含有部分と、適切な塩基、例えば医薬的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、又は炭酸水素塩と、あるいはアンモニア、又は有機第一、第二、又は第三アミンとを反応させることによって、クリングル５ペプチドフラグメントの最終単離及び精製の間に、現場で調製することができる。医薬的に許容される塩には、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩等をベースとするカチオン、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン等を含む非毒性第四アンモニア、及びアミンカチオンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。塩基付加塩の形成に用いることができるその他の代表的な有機アミンには、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が含まれる。本発明の化合物の好ましい塩には、燐酸塩、トリス、及び酢酸塩が含まれる。
クリングル５ペプチドフラグメント、クリングル５抗血清、クリングル５受容体アゴニスト、クリングル５受容体アンタゴニスト、あるいはこれらの組合わせを、医薬的に許容される徐放性マトリックス、例えば生物分解性ポリマーと組合わせて、治療用組成物を形成することができる。ここで用いられている徐放性マトリックスは、酵素加水分解又は酸−塩基加水分解によって、あるいは溶解による分解可能な材料、通常はポリマーからできているマトリックスである。このマトリックスは一度体内に挿入されると、酵素及び体液による作用を受ける。徐放性マトリックスは、望ましくは生物学的適合性材料、例えばリポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンから選ばれる。好ましい生物分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、あるいはポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）のいずれかのうちの１つのマトリックスである。
クリングル５ペプチドフラグメント、クリングル５融合タンパク質、クリングル５受容体アゴニスト、クリングル５受容体アンタゴニスト、あるいはこれらの組合わせを、医薬的に許容される賦形剤又は担体と組合わせて、治療用組成物を形成することができる。医薬的に許容される担体又は賦形剤とは、非毒性固体、半固体、あるいは液体フィルター、希釈剤、カプセル化材料、あるいはあらゆる種類の調合補助薬のことを言う。これらの組成物は、非経口、舌下、槽内、膣内、腹膜組織内、直腸内、口内（Ｂｕｃａｌｌｙ）、あるいは局所的に（例えば粉末、軟膏、ドロップ、経皮パッチ、あるいはイオン泳動装置によって）投与することができる。
ここで用いられている「非経口的」という用語は、静脈内、筋肉内、腸膜組織内、胸骨内、皮下、及び関節内注射、及び注入を含む投与方法のことである。非経口注射用医薬組成物は、医薬的に許容される水性又は非水性滅菌溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンであり、同様に使用直前に、注射用滅菌溶液又は分散液に再構成するための滅菌粉末を含んでいる。適切な水性又は非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、カルボキシメチルセルロース、及びこれらの適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）、及び注射しうる有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。例えば被覆材料、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。これらの組成物はまた、補助剤、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含んでいてもよい。微生物の作用からの保護は、様々な抗菌剤、及び抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによって確保することができる。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含めるのも望ましいであろう。注射しうる医薬形態の長時間の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらすことができる。注射しうるデポー形態は、生物分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、及びポリ（無水物）中に薬品のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。薬品のポリマーに対する比、及び使用される特定のポリマーの種類に従って、薬品放出の速度を制御することができる。注射しうるデポー剤調合物も、身体組織と適合するリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬品を捕捉することによって調製される。注射しうる調合物は、例えば細菌保持フィルターを通す濾過によって、あるいは使用直前に滅菌水又はその他の注射しうる滅菌媒質に溶解又は分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組込むことによって、滅菌することができる。
局所投与には、皮膚、粘膜、及び肺及び目の表面への投与が含まれる。吸入用組成物を含む局所投与用組成物は、加圧されていても加圧されていなくてもよい乾燥粉末として調製されてもよい。非加圧粉末組成物において、細かい分割形態の活性成分は、例えば直径１００マイクロメートルまでの大きさの粒子を含む、これより大きいサイズの医薬的に許容される不活性担体と混合して用いることができる。適切な不活性担体には、糖、例えばラクトースが含まれる。望ましくは活性成分粒子の少なくとも９５重量％は、０．０１〜１０マイクロメートルの有効な粒子サイズを有する。目への局所投与のためには、本発明の化合物は、医薬的に許容される眼科用ビヒクル中に入れられ、従ってこの化合物は、角膜及び目の内部、例えば前眼房、後眼房、ガラス体、眼房水、ガラス体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜、及び強膜に化合物を浸透させるのに十分な時間の間、目の表面と接触したままに維持される。医薬的に許容される眼科用ビヒクルは、例えば軟膏、植物油、又はカプセル化材料であってもよい。あるいはまた本発明の化合物は、直接、ガラス体液及び眼房水に注入されてもよい。
この組成物は、加圧されていてもよく、圧縮ガス、例えば窒素又は液化ガス放射剤を含んでいてもよい。液化放射媒質及び実際には組成物全体は、活性成分が、実質的な程度までその中で溶解しないようなものが好ましい。加圧組成物はまた、界面活性剤、例えば液体又は固体非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、あるいは固体アニオン性界面活性剤であってもよい。ナトリウム塩形態の固体アニオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。
直腸又は膣投与用組成物は、好ましくは座薬である。これは、この発明の化合物と、適切な非刺激性賦形剤又は担体、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、あるいは室温で固体であるが、体温では液体であり、従って直腸又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出する座薬ワックスとを混合することによって、調製することができる。
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することもできる。この技術において知られているように、リポソームは一般に、リン脂質又はその他の脂質物質に由来するものである。リポソームは、水性媒質中に分散された、一又は多ラメラ水和液体結晶によって形成されている。リポソームを形成しうるものなら、あらゆる非毒性の、生理学的に許容しうる代謝可能な脂質を用いることができる。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存料、賦形剤等を含んでいてもよい。好ましい脂質は、リン脂質、及びホスファチジルコリン（レシチン）であり、どちらも天然及び合成のものである。リポソームを形成する方法は、当分野において知られている。例えばＰｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ、「細胞生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第ＸＩＶ巻、アカデミック・プレス、ニューヨーク州ニューヨーク（１９７６年）、３３頁以降参照。この文献は参照により本明細書に組込まれる。
前記治療又はその他の治療において用いられる場合、治療的有効量の本発明の化合物の１つは、純粋形態で、あるいはこのような形態が存在する場合は、医薬的に許容される塩形態で、医薬的に許容される賦形剤と共に、あるいはこれを伴なわずに用いることができる。本発明の化合物の「治療的有効量」とは、あらゆる医学的治療に適用しうる利益／危険性の適切な比において、脈管由来の疾患を治療する（例えば腫瘍の成長を制限するか、あるいは腫瘍の転移を遅らせるか、あるいは遮断する）のに十分な化合物の量を意味する。しかしながら本発明の化合物及び組成物の一日の総使用量は、担当医師によって、健全な医学的判断の範囲内で決定されると理解するものとする。ある特定の患者についての特定の治療的有効用量レベルは、次のような様々な要因に依る。すなわち、この要因には、治療される障害及びこの障害の程度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；年齢、体重、全体的な健康、性、及び患者の食餌療法；投与時間；投与経路；用いられる特定の化合物の排出速度；治療期間；用いられている特定の化合物と組合わされるか、あるいは同時に用いられている薬剤、及び医療技術の分野でよく知られている同様な要因が含まれる。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルから始めて、所望の効果が得られるまでこの用量を次第に増加することは、十分にこの技術の範囲内にある。単一又は分割した用量で、ヒト又はその他の哺乳類受容者（ｈｏｓｔ）に局所的又は全身的に投与されるクリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の１日の総用量は、例えば体重１ｋｇあたり０．０００１〜２００ｍｇの量であり、より通常には体重１ｋｇあたり１〜３００ｍｇである。所望であれば、効率的な一日の用量は、投与を目的として、多数の用量に分けてもよい。その結果、単一用量の組成物は、一日の用量を構成するために、このような量又はその約数を含んでいてもよい。
脈管由来の病気の阻害、治療、又は予防のために本発明の化合物と組合わせることができる薬剤は、前記リストに挙げたものに限定されず、原則として、脈管由来の病気の治療、又は予防に用いることができるあらゆる薬剤が含まれると理解されるものとする。
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチドをも提供するが、これは、脈管形成阻害活性を有する哺乳類クリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質をコードするものである。このようなポリヌクレオチドは、組換えクリングル５ペプチドフラグメントの発現に、あるいは遺伝子療法（以下に記載されるもの）に用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの形態にあってもよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡの形態にあるポリヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖であるならば、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、非修飾形態であってもよく、あるいは例えばメチル化又はキャッピングのような修飾を含んでいる。
ポリペプチドをコードするコード配列は、ここで与えられたコード配列と同一であってもよく、あるいは異なったコード配列であってもよい。この異なったコード配列は、遺伝子コードの重複又は縮退の結果として、ここで与えられたＤＮＡと同じポリペプチドをコードするものである。このポリヌクレオチドは、ポリペプチドについてのコード配列のみを含んでいてもよく、あるいはポリペプチドについてのコード配列と追加のコード配列、例えばリーダー配列又は分泌（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）配列又はプロタンパク質配列、あるいはポリペプチドについてのコード配列（及び場合によっては追加のコード配列）と非コード配列、例えばポリペプチドについてのコード配列の非コード配列５’及び／又は３’を含んでいてもよい。
さらには本発明は、修飾を含む変異体ポリヌクレオチドも含んでいる。これらの修飾は例えば、ポリヌクレオチド欠失、置換、又は追加；及び変異体ポリヌクレオチド配列から生じるあらゆるポリペプチド修飾である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ここで提供されるコード配列の、自然界に発生する対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。
さらに、ポリペプチドについてのコード配列は、同じ読み枠において、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合されてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、これはポリペプチドを形成するために宿主細胞によって開裂リーダー配列を有していてもよい。ポリヌクレオチドはまた、タンパク質プラス追加の５’アミノ酸残留物であるプロタンパク質についてコードすることもできる。プロ配列を有するタンパク質は、プロタンパク質であり、いくつかの場合には、タンパク質の不活性形態であってもよい。プロ配列が一度開裂されたら、活性タンパク質が残る。従って本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質について、あるいはプロ配列を有するタンパク質について、あるいはプレ配列（リーダー配列）とプロ配列の両方を有するタンパク質についてコードすることができる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製に備えたマーカー配列に、枠組において融合されたコード配列を有していてもよい。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合されたポリペプチドの精製に備えるための、ｐＧＥＸベクターによって供給されたＧＳＴタグであってもよい。あるいは例えばマーカー配列は、哺乳類宿主例えばＣＯＳ−７細胞が使用される場合、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってもよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。例えばＩ．Ｗｉｌｓｏｎらの「細胞（Ｃｅｌｌ）」、第３７巻：７６７頁（１９８４年）参照。
ポリヌクレオチドは、あらゆる方法で生成されることができる。この方法には、化学合成、複製、逆転写、又は転写が含まれるが、これに限定されるわけではなく、これはポリヌクレオチドが由来する部位における塩基配列によって与えられた情報に基づくものである。このようなものなので、これはもとのポリヌクレオチドのセンスか、あるいはアンチセンス配向のどちらかを表わすことができる。ポリヌクレオチドを生成させる好ましい方法は、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に記載されたポリメラーゼ鎖反応による方法であり、これらの特許は参照により本明細書に組込まれる。
ポリヌクレオチドと配列との間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の同一性がある場合、ポリヌクレオチドは、ここで与えられている配列に交雑していると考えられる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝学的に工夫された宿主細胞、及び組換え技術によって本発明のポリペプチドを産生する方法をも提供する。このような方法は、クリングル５由来のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること、及び細胞培養からクリングル５由来のポリペプチドを回収することを含んでいる。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを産生するために用いることができる。従ってポリヌクレオチド配列は、多様な発現ビヒクルのいずれか１つに含まれていてもよい。特にポリペプチドを発現させるためのベクター又はプラスミドである。このようなベクターには、染色体配列、非染色体配列、及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；イーストプラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び偽狂犬病が含まれる。しかしながらその他のあらゆるプラスミド又はベクターも、再生可能かつ宿主中で生存しうる限りは、用いることができる。
適切なＤＮＡ配列を、多様な手順によってベクターに挿入してもよい。一般にＤＮＡ配列は、当分野で知られた手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順及びその他の手順は、当業者の範囲内にあると考えられる。発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を管理するために、１つ又はそれ以上の適切な発現制御配列（プロモーター）に、操作的に結合されている。このようなプロモーターの代表例には、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ 又はｔｒｐ、ファージラムダＰサブＬプロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はこれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターがあるが、これらに限定されるわけではない。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含んでいる。ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含んでいてもよい。さらには発現ベクターは好ましくは、形質転換宿主細胞の選択のために表現型特性、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、あるいは真核細胞培養のためのネオマイシン抵抗、あるいは例えばＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンあるいはアンピシリン抵抗を生じるための遺伝子を含んでいる。
前記のような適切なＤＮＡ配列を含むベクター、及び適切なプロモーター又は制御配列を用いて、適切な宿主を形質転換し、宿主がタンパク質を発現するようにさせてもよい。適切な宿主の代表例として、次のものが挙げられよう。すなわち細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ；真菌細胞、例えばイースト；昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ類及びＳｆ９；及び動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、又はＢｏｗｅｓ等である。適切な宿主の選定は、ここに示された教示に基づいて当業者の範囲内にあると考えられる。
特には、本発明はまた、上記において幅広く記載されている配列の１つ又はそれ以上を含む組換え構築をも含む。これらの構築には、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを含んでおり、この中へ本発明の配列が、前進あるいは逆配向に挿入されている。この実施態様の好ましい側面において、この構築はさらに調節配列を含んでいる。これは例えば、この配列に操作可能に結合されたプロモーターを含んでいる。非常に多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に知られており、商業的に入手可能である。次のベクターが例として挙げられる。細菌性のもの：ｐＳＰＯＲＴ１（メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ社（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ^▲Ｒ▼、カリフォルニア州ラジョーラ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ^▲Ｒ▼）。真核のもの：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ^▲Ｒ▼）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ^▲Ｒ▼）。しかしながらその他のあらゆるプラスミド又はベクターは、複製可能かつ宿主中で生存しうる限り、用いることができる。
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択しうるマーカーを有するその他のベクターを用いて、あらゆる所望の遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。特に挙げる細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰｓｕｂ Ｒ、Ｐ ｓｕｂ Ｌ、及びｔｒｐが含まれる。真核プロモーターには、ごく初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期（ｌａｔｅ）ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、通常の当業者のレベルの範囲内にある。
さらにもう１つの実施態様において、本発明は、前記構築を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば哺乳類細胞であってもよく、あるいは下等真核細胞、例えばイースト細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。宿主細胞へのこの構築の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、あるいはエレクトロポレーションよって実施することができる（Ｌ．Ｄａｖｉｓら、「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第二版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ及びＬａｎｇ、パラマウント・パブリッシング、コネチカット州イーストノーウオーク（Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）（１９９４年））。
宿主細胞における構築は、組換え配列によってコードされた遺伝子産物を産生するための従来の方法で用いることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成器によって合成により産生することができる。
タンパク質は、哺乳類細胞、イースト、細菌、又はその他の細胞において、適切なプロモーターの制御下に発現させることができる。本発明のＤＮＡ構成に由来するＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を産生するために、細胞を含まない翻訳系も用いることができる。原核宿主及び真核宿主に用いるための適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって、「分子クローニング；研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、１９８９年）に記載されている。これは参照により本明細書に組込まれる。
高級真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加される。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用成分であり、通常約１０〜３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を増強する。これの例には、複製起源の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起源、及び宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカーを含んでいる。例えばＥ．ｃｏｌｉのアンピシリン抵抗遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子、及び下流構造配列の転写を管理する高発現遺伝子に由来するプロモーターである。このようなプロモーターは、糖分解酵素、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、アルファ因子、酸ホスファターゼ、あるいはとりわけ熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来しうる。異質構造配列は、翻訳開始及び終了配列、及び好ましくは翻訳されたタンパク質の分泌を細胞周辺腔又は細胞外媒質の中に向けることができるリーダー配列とともに適切な段階で集められる。任意に、異質配列は、融合タンパク質をコードすることができる。このタンパク質には、所望の特性、例えば発現組換え産物の安定化又は簡略精製を与えることができるＮ−末端識別ペプチドが含まれる。
細菌使用に用いられる有用な発現ベクターは、適切な翻訳開始及び終了シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能プロモーターを有する操作可能な読取り段階に挿入することによって構成される。このベクターは、ベクターの維持を確保するため、及び所望であれば、増幅を宿主内に与えるために、１つ又はそれ以上の表現型の選択可能なマーカー及び複製起源を備えている。形質転換のために適した原核宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の様々な種が含まれる。ただし、通常選択される物質として、その他のものも用いることができる。
細菌使用のために用いることができる有用な発現ベクターは、選択しうるマーカー、及びよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子成分を含むプラスミドに由来する複製の細菌起源を含んでいる。その他のベクターには、ＰＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ^▲Ｒ▼、スウエーデン国ウプサラのファイン・ケミカル社（Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＧＥＭ１（ウイスコンシン州マジソンのプロメガバイオテック社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））が含まれるがこれらに限定されるわけではない。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部分は、適切なプロモーター及び発現される構造配列と組合わされる。
有用な発現ベクターはまた、本発明の所望のポリペプチドを精製しやすくするため、あるいは可溶性ポリペプチドを産生するための融合パートナーを含んでいてもよい。市販の融合ベクターの例には、ｐＥＴ３２ａ（ウイスコンシン州マジソンのノヴァゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ^▲Ｒ▼）、及びｐＣＹＢ３（マサチューセッツ州ビヴァリーのニューイングランド・バイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）があるが、これらに限定されるわけではない。融合パートナーの使用を避ける発現ベクターもまた、特にクリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の細菌細胞中の高レベルの発現のために構築されてもよい。例えば、ｐｉｌｏｔ−Ｍａｔｉａｓ，Ｔ．Ｊ．らによって「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」、第１２８巻、２１９〜２２５頁（１９９３年）に記載されているように、翻訳カップリングのためにベクターを最適なものにすることもできる。この文献は参照により本明細書に組込まれる。あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドは、別の付随プラスミドと共に共発現されてもよく、このプラスミド自体は、関連する第一ペプチドを可溶性化するのを助けるタンパク質又はペプチドをコードするものである（例えばＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．の「微生物評論誌（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、第６０巻、５１２頁（１９９６年）参照）。例えばいくつかのクリングル５ペプチドフラグメント（これらは、チオレドキシンで可溶性融合タンパク質として産生されることが示されている（実施例２０参照））は、チオレドキシンを発現する第二ベクターと同時に（すなわち同じ宿主細胞において）、非融合ベクターから発現されうる。
適切な宿主株の形質転換及び宿主株の適切な細胞密度までの成長の後で、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば温度シフト又は化学誘導）によって閉塞状態から開放して活性化させられ、細胞は追加の時間の間培養される。細胞は典型的に、遠心分離によって採集され、物理的手段又は化学的手段によって粉砕され、得られる粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、あらゆる適切な方法によって粉砕され、この方法には、冷凍−解凍サイクル、超音波処理、機械的粉砕、あるいは細胞溶解剤の使用が含まれる。このような方法は、通常の技術者によく知られている。
様々な哺乳類細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために用いることができる。哺乳類発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ、「細胞（Ｃｅｌｌ）」、第２３巻、１７５頁（１９８１年）に記載されたサルの腎臓の線維芽細胞のＣＯＳ−７系統、及び適合性ベクターを発現しうるその他の細胞系統、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＢＨＫ細胞系統が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製起源、適切なプロモーター、及びエンハンサー、及びまたあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及び受容体部位、転写終了配列、及び５’側面側非転写配列を含んでいるものとする。例えばＳＶ４０ウイルスゲノム、ＳＶ４０起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写遺伝子成分を得てもよい。有用な代表的ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手しうるもの）が含まれる。
本発明はまた、クリングル５ペプチドフラグメント又はクリングル５ペプチドフラグメント結合体をコードする遺伝子が、患者において調節される遺伝子療法をも包含する。ＤＮＡを遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞へ転移させるか、あるいは送るための様々な方法は、あるいはまた遺伝子療法とも呼ばれるが、これらは、「生体内における哺乳類体細胞への遺伝子導入（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）」、Ｎ．Ｙａｎｇ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．第１２巻（４）：３３５〜３５６頁（１９９２年）に開示されている。これは参照により本明細書に組込まれる。遺伝子療法は、生体外あるいは生体内治療に用いるために、ポリヌクレオチド配列を体細胞又は細菌系統細胞内に組込むことをも包含する。遺伝子療法は、遺伝子を取替え、正常又は異常な遺伝子機能を増加させ、感染病及びその他の病気と戦う機能を果たす。
医学的な問題を遺伝子療法で処理するための戦略には、例えば欠陥遺伝子を識別し、ついで欠陥遺伝子の機能と取替えるか、あるいはわずかに機能的な遺伝子を増すかどちらかのために機能遺伝子を加えるような治療戦略、あるいはこの状態を処理するか、あるいは組織又は器官を、治療養生法を受けやすいものにするタンパク質産物をコードする遺伝子を加えるような予防戦略が含まれる。予防戦略の例として、クリングル５ペプチドフラグメント又はクリングル５ペプチドフラグメント結合体をコードする遺伝子が患者に入れられ、従って脈管形成の発生を妨げることができる。あるいは腫瘍細胞が照射を受けやすくなるような遺伝子を挿入して、腫瘍の照射によって腫瘍細胞がさらに多く殺されるようにしてもよい。
クリングル５ペプチドフラグメント又はクリングル５融合タンパク質をコードするＤＮＡ転移のための、あるいはクリングル５ペプチドフラグメント調節配列（あるいは融合パートナーの配列）についてのＤＮＡ転移のための多くのプロトコルが、この発明において考えられている。クリングル５ペプチドフラグメントと特異的に組合わされたものとは異なるプロモータ配列、あるいはクリングル５ペプチドフラグメントの産生を増すであろうその他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子療法の方法として考えられる。この技術の例は、マサチューセッツ州ケンブリッジのトランスカリヨティック・セラピーズ社（Ｔｒａｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に見られる。この場合、１９９４年４月１５日のジェネティク・エンジニアリング・ニューズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ）に開示されているような細胞中の赤血球生成促進因子遺伝子を作動させる（ｔｕｒｎ ｏｎ）「遺伝子スイッチ」を挿入するために、相同組換えが用いられている。この文献は参照により本明細書に組込まれる。このような「遺伝子スイッチ」は、通常はこれらのタンパク質を発現しない細胞内において、クリングル５ペプチドフラグメント（あるいはクリングル５受容体）を活性化させるために用いることができよう。
遺伝子療法のための遺伝子導入方法は、３つの広いカテゴリーに分けられる：（１）物理的なもの（例えばエレクトロポレーション、直接遺伝子導入、及び粒子衝撃）、（２）化学的なもの（例えば脂質ベース担体、及びその他の非ウイルスベクター）、及び（３）生物学的なもの（例えばウイルス由来のベクター）である。例えば非ウイルスベクター、例えばＤＮＡ被覆されたリポソームは、直接患者の静脈内に注射されてもよい。リポソーム／ＤＮＡ複合体は、肝臓に濃縮されると考えられている。ここは、これらがＤＮＡを、マクロファージ及びクッパー細胞に運ぶ場所である。ベクター又は遺伝子の「裸の」ＤＮＡも、治療用ＤＮＡの標的となる送達のために、所望の器官、組織、又は腫瘍に直接注射してもよい。
遺伝子療法方法論はまた、送達部位によって説明することもできる。遺伝子を送達する基本的な方法には、生体外遺伝子導入、生体内遺伝子導入、及び試験管内遺伝子導入が含まれる。生体外遺伝子導入において、細胞は、患者から取られて、細胞培養で成長させられる。ＤＮＡは細胞中にトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされた細胞は、数値的に増殖させられ、ついで患者に再移植される。試験管内遺伝子導入において、形質転換細胞は、培養において成長する細胞、例えば組織培養細胞であり、特定の患者からの特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」がトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされた細胞が選択され、患者への移植のため、あるいはその他の用途のために膨張させられる。生体内遺伝子導入は、細胞が患者の内部にある場合、患者の細胞内にＤＮＡを導入することに関わっている。前記のような広いベースのカテゴリーの３つすべてが、生体内、生体外、及び試験管内における遺伝子導入を行なうために用いられる。
ＤＮＡ送達の機械的（すなわち物理的）方法は、ＤＮＡの胚又は体細胞への顕微注射、空気により送られたＤＮＡ被覆粒子、例えば「遺伝子ガン」に用いられる金粒子、及び無機化学方法、例えば燐酸カルシウムトランスフェクションによって実施することができる。プラスミドＤＮＡの筋肉細胞への物理的注射は、トランスフェクションされ、かつマーカー遺伝子の持続した発現を有する細胞の高い割合を生じることが発見された。プラスミドＤＮＡは、細胞のゲノム中に統合されてもよく、統合されなくてもよい。トランスフェクションされたＤＮＡの非統合によって、長時間、細胞ゲノム又はミトコンドリアゲノムにおける突然変異挿入、欠失、あるいは変更の恐れも伴なわずに、末端分化、非増殖性組織における、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクション及び発現が可能になろう。治療用遺伝子の特定細胞への、長期的ではあるが必ずしも永久的ではない導入は、遺伝病の治療又は予防用に用いうる。ＤＮＡは、受入れ細胞のゲノムに生じる突然変異を伴なわずに、遺伝子産物レベルを維持するために、周期的に再注射することができよう。外生ＤＮＡの非組込みによって、１つの細胞内にいくつかの異なる外生ＤＮＡ構成の存在に備えることができるであろう。これらの構築のすべては、様々な遺伝子産物を発現するものである。
ＤＮＡを細胞、組織、及び器官に注射するために、粒子仲介遺伝子導入も用いることができる。粒子衝撃装置、あるいは「遺伝子ガン」を用いて、標的器官、組織、あるいは細胞の浸透が可能になる高い速度まで、ＤＮＡ被覆高密度粒子（例えば金又はタングステン）を加速するために、動力を発生させる。遺伝子導入のためのエレクトロポレーションでは、細胞又は組織がエレクトロポレーション仲介遺伝子導入を受けやすくなるように電流を用いる。ＤＮＡ分子が細胞内に浸透することができるように、膜の透過性を増すため、ある一定の磁界の強さを有する短い電気インパルスが用いられる。粒子仲介遺伝子導入及びエレクトロポレーション技術は、通常の当業者にはよく知られている。
遺伝子療法の化学的方法は、紡錘細胞発生（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）脂質小胞、例えばリポソームあるいは膜融合のためのその他の小胞の使用による、担体仲介遺伝子導入に関わっている。関係のあるＤＮＡを収容する担体は、体液又は血流中に便利な方法で導入され、ついで体内の標的器官又は組織に部位特異的に向けられる。例えば細胞又は器官特異的ＤＮＡ含有リポソームが開発され、リポソームによって運ばれた異物ＤＮＡは、これらの特定の細胞によって吸収されうる。あるいくつかの細胞上の特異的受容体に標的が定められた免疫リポソームの注射は、ＤＮＡをこの受容体を運ぶ細胞中に挿入する便利な方法として用いることができる。これまで用いられていたもう１つの担体系は、生体内遺伝子導入のために、ＤＮＡを肝細胞に送るためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジン結合体系である。
トランスフェクションされたＤＮＡはまた、ほかの種類の担体と複合されてもよい。従ってＤＮＡは受容細胞に送られ、ついで細胞質又は核質に貯蔵される。ＤＮＡは、特別に工夫された小胞複合体において担体核タンパク質と組み合わされ、核に直接送られる。
担体仲介遺伝子導入はまた、リポソームではない脂質ベース化合物の使用を含んでもよい。例えばリポフェクチン及びサイトフェクチンは、脂質ベースの陽イオンであり、これらのイオンは負電荷ＤＮＡと結合し、ＤＮＡを細胞膜を越えて送ることができる複合体を形成する。担体仲介遺伝子導入のもう１つの方法は、受容体ベースのエンドサイトーシスに関わっている。この方法では、リガンド（細胞表面受容体に特異的なもの）が、関係する遺伝子との複合体を形成するようにさせられ、ついで血流中に注射される。細胞表面受容体を有する標的細胞は、リガンドを特異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞中に運ぶものである。
生物学的遺伝子療法の方法論では、遺伝子を細胞内に挿入するために、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター（例えばリガンド−ＤＮＡ結合体、リポソーム、及び前記の脂質−ＤＮＡ複合体）を用いている。トランスフェクションされた細胞は、患者の正常な組織、患者の患部組織、あるいは非患者細胞に由来する細胞であってもよい。
クリングル５ペプチドフラグメントＤＮＡ配列又はクリングル５融合タンパク質ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子は、操作可能に発現制御配列と結合されて、各々、クリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質を発現しうる発現ベクターを形成するのが望ましいであろう。あるいはまた、クリングル５ペプチドフラグメント又はクリングル５融合タンパク質の遺伝子調節は、転写又は翻訳率を変えるために、クリングル５遺伝子、融合パートナー遺伝子、あるいはクリングル５遺伝子又はその融合パートナーの遺伝子と組合わされた制御部位に、あるいは（どちらかの）対応するＲＮＡ転写に結合する化合物を投与することによって実施されうる。
遺伝子療法プロトコルのために用いられていたウイルスベクターには、レトロウイルス、その他のＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、及びその他のＤＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。複製欠損ネズミレトロウイルスベクターは、最も広く用いられている遺伝子導入ベクターである。ネズミの白血病レトロウイルスは、タンパク質コア（ｇａｇ）によって覆われ、かつ宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）によって取囲まれた核コアタンパク質及びポリメラーゼ（ｐｏｌ）と複合化された一本鎖ＲＮＡから構成されている。レトロウイルスのゲノム構造には、５’及び３’の長い末端リピート（ＬＴＲ）において閉じ込められたｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子が含まれている。レトロウイルスベクター系は、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞系統においてトランスに供給されるならば、ベクターパッケージング、及び感染、及び標的細胞中への統合を可能にするには、５’及び３’ＬＴＲ及びパッケージングシグナルを含む最小ベクターで十分であるという事実を利用している。遺伝子導入に対するレトロウイルスベクターの基本的利点には、大部分の細胞型における効率的感染及び遺伝子発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの正確な単一コピーベクター統合、及びレトロウイルスゲノムの操作の容易性が含まれる。例えば、遺伝子を周辺及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、表皮細胞、筋細胞、及びその他の体細胞に導入するために、変更されたレトロウイルスベクターが、生体外方法に用いられてきた（これらはついで、遺伝子産物を、挿入されたＤＮＡから供給するために、患者に導入されてもよい）。
アデノウイルスは、コアタンパク質と複合され、かつキャプシドタンパク質に取囲まれた線状二本鎖ＤＮＡから構成されている。分子ウイルス学における進歩によって、これらの生物の生物学を利用して、新規遺伝子配列を生体内で標的細胞中に形質導入しうるベクターを作ることができるようになった。アデノウイルスベースのベクターは、高いレベルにおいて遺伝子産物ペプチドを発現するものである。アデノウイルスベクターは、ウイルスの低い滴定量でさえ、高い効率の感染性を有する。さらにウイルスは、細胞を含まないビリオンとして十分に感染性があり、従って産生細胞系統の注射は必要ではない。アデノウイルスベクターに対するもう１つの潜在的な利点は、異質遺伝子の生体内での長期発現を行なうことができるということである。
生体内プロトコルを用いて遺伝子を細胞内に挿入するために、ウイルスベクターも用いられてきた。異物遺伝子の組織特異的発現を管理するために、組織特異的であるとして知られているシス作用調節成分又はプロモーターを用いることもできる。あるいはまた、これは、生体内での特異的解剖学的部位へのＤＮＡ又はウイルスベクターの現場での受渡しを用いて実施することもできる。例えば生体内での血管への遺伝子導入は、動脈壁上の選ばれた部位への形質導入された内皮細胞の試験管内移植によって実施された。ウイルス感染されたその周りの細胞も、遺伝子産物を発現した。ウイルスベクターは、生体内部位に直接（例えばカテーテルによって）送達することができ、従ってあるいくつかの部位のみがウイルスによって感染されることが可能にされ、長期的な部位特異的遺伝子発現が得られる。レトロウイルスベクターを用いる生体内遺伝子導入はまた、哺乳類の組織及び肝臓組織において、変換されたウイルスを器官に通じる血管内に注射することによって証明された。
クリングル５ペプチドフラグメントも産生することができ、多様な用途に用いることができる。例えば、クリングル５の様々なペプチドフラグメントは、次のように用いることができる。すなわち、（１）クリングル５結合部位において活性なアゴニスト及びアンタゴニストとして、（２）特異的抗血清の開発のための抗原として、（３）診断用キットに用いられるペプチドとして、及び（４）クリングル５ペプチドフラグメントを結合する細胞の標的キリングのための細胞毒性剤と結合されるか、あるいはこれと組合わされて使用されるペプチドとしてである。これらのペプチドフラグメントを含むアミノ酸配列は、結合のために抗血清に接近しうる分子の外部にあるその位置に基づいて、あるいは脈管形成から生じるか、あるいはこれによるプロセスに対するペプチドフラグメントの阻害能力に基づいて選択することができる。さらにはこれらのペプチド配列は、タンパク質配列データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、及びＰＩＲを用いて既知の配列と比較され、可能性のある配列相同を決定することができる。この情報によって、ほかの分子との高い程度の配列相同を示す配列の除去が容易になり、これによって、クリングル５への抗血清、アゴニスト、及びアンタゴニストの開発において高い特異性の可能性を強化することができる。
クリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質はまた、例えば、培養内皮細胞又は膜抽出物が通過する親和性カラムにおいて、固体担体体上でのクリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の固定化によって、クリングル５受容体を単離する手段として用いることもできる。この技術で知られているように、クリングル５受容体の単離及び精製の後に、クリングル５受容体をコードするポリヌクレオチドを識別して単離するためにアミノ酸配列決定を行なってもよい。このようなポリヌクレオチドはついで、適切な発現ベクターにクローン化され、腫瘍細胞にトランスフェクションされてもよい。トランスフェクションされた腫瘍細胞による受容体の発現は、内生又は外生クリングル５ペプチドフラグメントへのこれらの細胞の反応性を強化し、これによって、転移成長率を減少させるであろう。さらには、この受容体の組換え発現によって、より多量な受容体が産生されることが可能になり、例えば、クリングル５の作用を模倣する、より小さいアンタゴニストを識別するために、高いスループットのスクリーニングアッセイに用いるのに十分な量を産生することができるようになるであろう。
これらの合成ペプチド内部でのアミノ酸の体系的置換によって、クリングル５受容体への高親和性ペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを生じることができる。これらは、その受容体へのクリングル５ペプチドフラグメントの結合を強化又は減少させるものである。このようなアゴニストは、微小転移の成長を抑え、これによって癌が広がるのを制限するために用いることができる。不適切な血管形成の場合、クリングル５ペプチドフラグメントへのアンタゴニストは、クリングル５ペプチドフラグメントの阻害効果を遮断し、脈管形成を促進するために用いられる。例えばこの種の治療は、糖尿病における患者の傷の治癒を促進することにおいて、治療効果を有しうる。
本発明のクリングル５ペプチドフラグメント又は融合タンパク質又は結合体はまた、クリングル５阻害剤に特異的なポリクローン又はモノクローン抗体を発生させるための抗原として用いることができる。このような抗体が用いられる１つの方法は、体液又は組織におけるクリングル５ペプチドフラグメントを検出又は定量するための診断方法及びキットにおける方法である。このようなテストから生じる結果は、クリングル５ペプチドフラグメントの予後の関連性を診断又は決定するために用いることができよう。
クリングル５ペプチドフラグメント又はクリングル５融合タンパク質は、放射性同位元素（実施例１３参照）で標識されるか、あるいは結合体を形成するためにタンパク質と化学的に組合わされてもよい。結合体には、酵素、担体タンパク質、細胞毒性剤、蛍光、化学発光、及び生物発光分子が含まれ、これらはクリングル５ペプチドフラグメントを含む化合物がクリングル５抗血清を結合する能力のテストを容易にするため、クリングル５ペプチドフラグメント受容体を有する細胞型を検出するため、あるいはクリングル５ペプチドフラグメントの精製を助けるために用いられる。組合わせ技術は一般に、クリングル５ペプチドフラグメント配列のアミノ酸に対して有効な官能基をベースとして選ばれる。これには、アルキル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、フェノール、インドリル、及びイミダゾイルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。このような組合わせを行なうために用いられる様々な試薬には、とりわけ、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、及びｐ−ベンゾキノンがある。組合わせ反応の効率は、特異反応に適した様々な技術を用いて測定される。例えばクリングル５ペプチド、又はその生物学的に活性なフラグメントのＩ¹²⁵での放射性標識検出は、高い特異活性のクロラミンＴ及びＮａＩ¹²⁵を用いて実施することができる。反応は、メタ二亜硫酸塩で終了され、混合物は使い捨てカラムで脱塩される。標識ペプチドは、カラムから溶離され、画分が回収される。各画分からアリコートを除去し、ガンマカウンターで放射能を測定する。この手順によって、未反応ＮａＩ¹²⁵を含まない、放射性標識されたクリングル５ペプチドフラグメントが生じる。もう１つの実施例において、クリングル４と組合わされたクリングル５ペプチドフラグメントを含む血液又は組織抽出物は、ポリリジン樹脂親和性カラムで精製されてもよく、これによって、クリングル４−クリングル５ペプチドフラグメントが、クリングル４ペプチドフラグメントのリジンへの親和性によって樹脂と結合する。結合タンパク質の溶離によって、精製されたクリングル４−クリングル５ペプチドフラグメントが生じるであろう。
ペプチド結合のもう１つの用途は、ポリクローン抗血清の産生である。クリングル５ペプチドフラグメント、クリングル５ペプチドフラグメントアナログ、及びクリングル５受容体に対する抗血清の産生は、当業者に知られた、確立されている技術を用いて実施することができる。例えばリジン残留物を含むクリングル５ペプチドフラグメントは、グルタルアルデヒドを用いて、精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合されてもよい。この反応の効率は、放射性標識されたペプチドの組込みを測定することによって、決定することができる。未反応グルタルアルデヒド及びペプチドは、透析によって分離することができ、結合体は、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、あるいはその他の動物にポリクローン抗血清を生じさせるために用いうる。担体分子、例えばＢＳＡに結合されたクリングル５ペプチドフラグメントは、アジュバント混合物と組み合わされ、乳化され、背中、首、脇腹、時には適切な宿主のフットパッドの多数の部位に皮下注射されてもよい。ついで一般に、ブースター注射が、規則的な間隔で、例えば２〜４週間毎になされる。各注射の約７〜１０日後に、例えば拡張作用後、辺縁耳静脈を用いる静脈穿刺によって、血液サンプルが得られる。血液サンプルは、４℃で一晩凝固させられ、４℃で約３０分間約２４００Ｘｇで遠心分離される。血清を除去し、アリコートし、即時使用のためには４℃で貯蔵され、その後の分析のためには−２０〜−９０℃で貯蔵される。
ポリクローン抗血清の発生からの血清サンプル、あるいはモノクローン抗血清の産生からの培地サンプルを、抗体滴定量の測定、及び特に高い滴定量の抗血清の測定のために分析してもよい。その後、最高滴定量のクリングル５ペプチドフラグメント抗血清をテストして、次のものを確定することができる：ａ）抗原の最高特異的結合及び最低非特異的結合のために最適な抗血清希釈、ｂ）標準的置換曲線における増加量のクリングル５ペプチドフラグメントを結合する能力、ｃ）プラスミノゲン及び関連種のクリングル５ペプチドフラグメントを含む関連ペプチド及びタンパク質との潜在的交差反応性、及びｄ）細胞培養培地における、及び血漿、尿、及び組織の抽出物におけるクリングル５ペプチドフラグメントを検知する能力である。滴定量は、この技術で知られたいくつかの手段、例えばドットブロット及び密度分析によって、あるいはまた、タンパク質Ａ、第二抗血清、冷エタノール又はチャコール−デキストランを用いる放射性標識ペプチド−抗体の沈殿、ついでガンマカウンターでの活性測定によって確定することができる。所望であれば、最高滴定量抗血清を親和性カラムで精製することができる。例えばクリングル５ペプチドフラグメントを、商品として入手しうる樹脂と組合わせ、これを用いて、親和性カラムを形成することもできる。ついでクリングル５抗体が（クリングル５ペプチドフラグメントを経て）カラムに結合するように、カラムに抗血清サンプルを通してもよい。これらの結合抗体はついで溶離され、回収され、滴定量及び特異性の測定のために評価される。
クリングル５ペプチドフラグメント及びクリングル５受容体の測定用キットも、本発明の一部として意図される。最高滴定量及び特異性を有し、かつ血漿、尿、組織、及び細胞培養培地の抽出物中においてクリングル５ペプチドフラグメントを検出することができる抗血清も、迅速で信頼性があり、感受性の高い特異性測定、及びクリングル５ペプチドフラグメントの位置測定用アッセイキットを確定するために用いることができる。これらのアッセイキットには、次の技術を用いることができるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、競争的及び非競争的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、生物発光及び化学発光アッセイ、蛍光アッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射アッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素結合アッセイ、ミクロ滴定プレート、免疫細胞化学、及び抗体被覆ストリップ、あるいは尿又は血液の迅速監視用計量棒である。各キットの場合、アッセイの範囲、感受性、精度、信頼性、特異性、及び再生性が、当業者によく知られた手段によって確定される。
研究及び病院で通常用いられているアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。クリングル５ペプチドフラグメントＲＩＡは、次の方法で確定することができる。クリングル５ペプチドフラグメントの放射ヨウ素化及び精製が成功した後、最高滴定量の抗クリングル５ペプチドフラグメント抗体を有する抗血清を、適切な緩衝系中で、比較的一定量の放射能、例えば１０，０００ｃｐｍを含む管へ、いくつかの希釈において加える。（非特異的結合を測定するために、緩衝又は予備免疫性（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清を、他のいくつかの管に加える）。４℃で２４時間の培養後、タンパク質Ａをすべての管に加え、管を渦巻き運動に付し、室温で９０分間培養し、約２０００〜２５００Ｘｇで４℃において遠心分離させて、標識抗原に結合された抗体の複合体を沈殿させる。上澄み液を吸引によって除去し、ペレット内の放射能をガンマカウンターで計数する。非特異的結合を差引いた後、標識ペプチドの約１０〜４０％を結合する抗血清希釈を、さらなる特徴決定特性化のために選択する。
次に抗血清の開発のために用いられるクリングル５ペプチドフラグメントの希釈範囲（約０．１ｐｇ〜１０ｎｇ）を、放射性標識されたペプチド及び抗血清の入っている管に、既知量のペプチドを加えて評価する。培養期間（例えば２４〜４８時間）後、タンパク質Ａを添加し、管を遠心分離し、上澄み液を除去し、ペレット中の放射能を計数する。放射性標識されたクリングル５ペプチドフラグメントの結合を、非標識クリングル５ペプチドフラグメント（標準）で置換することによって、標準的曲線が生じる。さらにはいくつかの濃度の、その他のクリングル５ペプチドフラグメント、プラスミノーゲン、様々な種からのクリングル５ペプチドフラグメント、及び同族ペプチドを、アッセイ管に添加して、クリングル５ペプチドフラグメント抗血清の特異性を特性化もできる。
その後、一次及び二次腫瘍、ルイス肺癌、クリングル５ペプチドフラグメント−産生細胞の培養物、胎盤、子宮、及びその他の組織、例えば大脳、肝臓、及び腸を含む（これらに限定されるわけではない）様々な組織の抽出物が調製されるが、この場合、クリングル５ペプチドフラグメントを抽出するために用いて成功した抽出技術が用いられる。組織抽出物の精密検査後、アッセイ緩衝液を加え、様々なアリコートをＲＩＡ管に入れる。既知のクリングル５ペプチドフラグメント−産生細胞の抽出物は、標準曲線に平行な置換曲線を生じるのに対し、クリングル５ペプチドフラグメントを生じない組織の抽出物は、クリングル５ペプチドフラグメント抗血清から、放射性標識されたクリングル５ペプチドフラグメントを置換しない。このような置換曲線は、組織及び体液中のクリングル５ペプチドフラグメント測定するためには、クリングル５ペプチドフラグメントアッセイが有用であることを示している。
クリングル５ペプチドフラグメントを含む組織抽出物はまた、アリコートを逆相ＨＰＬＣに付すことによって特徴決定されてもよい。溶離物画分を集め、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで乾燥し、ＲＩＡ緩衝液で再構成し、クリングル５ＲＩＡで分析する。この場合、最大量のクリングル５ペプチドフラグメント免疫反応性は、クリングル５ペプチドフラグメント溶離位置に対応する画分に位置している。
前記アッセイキットは、使用説明書、抗血清、クリングル５ペプチドフラグメント、及びおそらくは放射性標識されたクリングル５ペプチドフラグメント及び／又は結合されたクリングル５ペプチドフラグメントの沈殿用試薬／クリングル５抗体複合体を提供するであろう。このようなキットは、生物液、及び腫瘍のある、及び腫瘍のない動物及びヒトの組織の抽出物におけるクリングル５ペプチドフラグメントの測定に有用であろう。
組織及び細胞内のクリングル５ペプチドフラグメントを視覚化するか、あるいは位置決定するために、別のキットを用いることもできる。例えば免疫組織化学技術及びこのような技術を用いるキットは、通常の当業者によく知られている。当分野で知られているように、免疫組織化学キットは、クリングル５ペプチドフラグメント抗血清を提供し、おそらくは遮断血清も提供し、蛍光分子例えばフルオロセインイソチオシアネートに結合するか又は第一抗血清を視覚化するのに用いられるなんらかの他の試薬に結合した第二抗血清をも提供するであろう。この方法を用いることによって、生検された腫瘍を、クリングル５ペプチドフラグメント産生部位について、あるいはクリングル５ペプチドフラグメント受容体部位について検査することができる。あるいはまた、キットは、クリングル５ペプチドフラグメントメッセンジャーＲＮＡを突き止めるために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる放射性標識された核酸を供給することができる。
本発明の化合物は、通常の当業者によく知られた方法を用いて調製することができる。（例えばＳｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎらの「化学的繊維素溶解及び血栓溶解における進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）」、第３巻、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、Ｒｏｗａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｓａｍａｍａ，Ｍ．Ｍ．、及びＤｅｓｎｏｙｅｒｓ，Ｐ．Ｃ．出版社レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９７８年参照）。クリングル５ペプチドフラグメントの調製方法の１つは、天然タンパク質（グルプラスミノーゲン）あるいはその変異体の酵素開裂による方法である（これは、完全な長さのタンパク質の端を切り取った形態を意味し、これは酵素消化によって分割を受けやすく、これは前記のような少なくとも１つのクリングル５配列、例えばリス−プラスミノーゲン（ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）又はミニプラスミノーゲンを含んでいる）。この方法ではまず、プラスミン阻害剤の不存在下に、ヒト血漿からタンパク質を単離し、これによってグル−プラスミノーゲン（ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）のリス−プラスミノーゲンへの転換を促進する必要がある（Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ、及びＫｕｄｉｎｏｖ，Ｓ．Ａ．の「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第１７９巻、２１５〜２３２頁（１９８４年）参照）。ついで端を切り取った分子を、ポリペプチドからクリングル５ペプチドフラグメントを開裂するのに十分な濃度において、タンパク質分解酵素で処理し、ついで当業者に知られた手段によって残りのフラグメントから精製する。好ましいタンパク質分解酵素は、ヒト又はブタエラスターゼであり、これは、プラスミノーゲン及び端を切り取ったその変異体をクリングル部位３−４と４−５の間で開裂する（及びこれによって、クリングル１−３及び１−４、あるいはクリングル４又は５のみを含むペプチドフラグメントを形成することができる）。例えばリス−プラスミノーゲン又はグル−プラスミノーゲンは、緩衝溶液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、燐酸ナトリウム等）中において、リス−プラスミノーゲン：エラスターゼ比約１：１００〜１：３００で（好ましくは比１：１５０〜１：２５０、最も好ましくは比１：１５０で）ブタ又はヒト好中球エラスターゼで処理してもよい。あるいはまたエラスターゼは、開裂産物の精製を容易にするために、まず（例えば樹脂へ）不動態化されてもよい。グル−プラスミノーゲン又はリス−プラスミノーゲンは一般に、所望の開裂程度に従って、約１０℃から約４０℃の温度で、約４〜約２４時間の間、ヒト又はブタエラスターゼで処理される。グル−プラスミノーゲン、リス−プラスミノーゲン、あるいはミニプラスミノーゲンのヒト又はブタエラスターゼでの完全な消化を行なうためには、室温において少なくとも約１２時間、これらのポリペプチドの酵素への曝露が必要である。ｐＨ及び酵素への曝露時間を変えると、影響を受けやすい開裂部位の１つ又はそれ以上において、結果としてより少ない、あるいは部分的開裂を生じる。ついで開裂産物は、この技術でよく知られたあらゆる手段（例えばカラムクロマトグラフィー）によって精製される。好ましい精製図式は、開裂産物を、実施例１４に記載されているリジンセファロースカラムに適用することである。
クリングル５ペプチドフラグメントの固相合成
本発明の新規な化合物の製造方法を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。
実施例１
Ｎ−Ａｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＮＨ_２
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓの“Ｓｙｎｅｒｇｙ”ペプチドシンセサイザーのペプチド合成カラムの位置にアミドペプチド合成カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を配置し、以下の合成手順を使用した。
１．樹脂をＤＭＦで約５分間溶媒和する。
２．ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで約１５分間処理して樹脂結合アミノ酸のα−Ｎ−末端からＦｍｏｃ基を脱ブロックする。
３．樹脂をＤＭＦで約５分間洗浄する。
４．ＤＭＳＯ−ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中のＨＢＴＵ（２５μモル）とＨＯＢＴ（２５μモル）との０．２５Ｍ溶液と、ＤＭＳＯ−ＮＭＰ中のジイソプロピルエチルアミン（２５μモル）の０．４Ｍ溶液とを用いてアミノ酸Ｎｏ．１（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）、２５μモル）のα−Ｃ末端を活性化し、活性化アミノ酸を樹脂に結合させる。
５．活性化Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（段階５で調製）をＤＭＦ中の樹脂結合アミノ酸（段階２で調製）に約３０分間結合させる。
６．ＤＭＦで５分間洗浄する。
７．以下のアミノ酸を用いて段階３から６までを繰り返す。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）
５． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
６． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
８． Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
９． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
１０． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
１１． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
１２． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
１３． Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
８．段階４及び５の条件で樹脂結合ペプチドのａ−Ｎ−末端に酢酸を結合させる。
９．ＴＨＦで樹脂を約５分間洗浄してＤＭＦを除去し、樹脂を収縮させ、次いでアルゴンで１０分間、更に窒素で１０分間乾燥して清浄な樹脂結合ペプチドを得る。
１０．開裂試薬（新しく調製したチオアニソール（１００μｌ）、水（５０μｌ）、エタンジチオール（５０μｌ）及びトリフルオロ酢酸（１．８ｍｌ）をこの順序で−５℃〜−１０℃で混合する）と共に０℃で１０〜１５分間、更に室温で１．７５時間（Ａｒｇ（Ｐｍｃ）が存在する場合は各Ａｒｇ（Ｐｍｃ）毎に更に０．５時間）撹拌することによって、アミノ酸側鎖を脱保護しながら同時にペプチドを樹脂から開裂する。開裂試薬の使用量は以下の式によって決定した。

１１．生成物を純粋なトリフルオロ酢酸で濾過及び洗浄し、約８ｍｌの低温ジメチルエーテルを収容した遠心管に０．５ｍｌの部分量の濾液を添加し、遠心し、傾瀉し、全部のペプチドが沈殿するまでこのプロセスを繰り返す（エーテルの添加によってペプチドが沈殿しなかったときは、混合物を３０％酢酸水溶液で抽出し（３×１ｍｌ）、水性抽出物を集めて凍結乾燥させると生成物が得られた）。
１２．粗ペプチドを用いるか、または、５％−１００％アセトニトリル−（水、０．１％ＴＦＡ）の勾配濃度の溶媒混合物と共に７μｍのＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｐｒｅｐ Ｃ１８カラム（７．８×３００ｍｍ）で５０分間ＨＰＬＣ処理し次いで凍結乾燥することによってペプチドを精製し、３５ｍｇのＮ−Ａｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−ＮＨ_２を得る。
実施例２
Ｎ−Ａｃ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、アミノ酸Ｎｏ．１としてＦｍｏｃ−Ｐｒｏを用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用いて以下のアミノ酸を添加し、３５ｍｇのＮ−Ａｃ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ₂を調製した。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
４． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
５． Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
６． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
８． Ｆｍｏｃ−Ａｌａ
９． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
１０． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
１１． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
１２． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
１３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
１４． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
１５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
１６． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
１７． Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）
１８． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
１９． Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ
２０． Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ
実施例３
Ａｃ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、アミノ酸Ｎｏ．１としてＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）を用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用いて以下のアミノ酸を添加し、４０ｍｇのＮ−Ａｃ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２を調製した。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
６． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
７． Ｆｍｏｃ−Ａｌａ
８． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
９． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
１０． Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）
１１． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
１２． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
１３． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
１４． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
１５． Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ
１６． Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ
１７． Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）
１８． Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
１９． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
２０． Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
２１． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
２２． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（γ−ＯｔＢｕ）
２３． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）
２４． Ｆｍｏｃ−Ａｌａ
２５． Ｆｍｏｃ−Ａｌａ
２６． Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ
２７． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
２８． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）
実施例４
Ｎ−Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐをアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、２０ｍｇのＮ−Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−ＮＨ₂を調製した。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
３． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
４． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
５． Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
６． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−Ｏｔ−Ｂｕ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ
８． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−Ｏｔ−Ｂｕ）
９． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
１０． Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）
１１． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｔ）
実施例５
Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、１０ｍｇのＮ−Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂を調製した。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
８． Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）
９． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
１０． Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）
１１． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
実施例６
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（４ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ９９５（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
実施例７
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ₂（６ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ８３２（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
５． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
実施例８
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（６ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ（１１０１）（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ
７． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
実施例９
Ｎ−Ａｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（８ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ８９８（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
実施例１０
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（配列番号１３）
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（２ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（１１２１）（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−３−Ｉ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
実施例１１
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（配列番号１４）
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−３−Ｉ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（２．５ｍｇ）を調製した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１１２１（Ｍ＋Ｈ）⁺。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
５． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
６． Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）
７． Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
実施例１２
Ｎ−Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ₂
実施例１に記載の合成手順を用い、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（β−ＯｔＢｕ）をアミノ酸Ｎｏ．１として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、２ｍｇのＮ−Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＮＨ₂（２ｍｇ）を調製した。
Ｎｏ． アミノ酸
２． Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）
３． Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ
４． Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ
実施例１３
Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ¹²⁵−Ｔｙｒ⁵³⁵−ＮＨ₂及びＮ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ¹²⁵−Ｔｙｒ⁵³³−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂（配列番号１３及び配列番号１４）の混合物の調製及び分離
８０ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３０μｇのＮ−アセチル−プロリル−アルギニル−リシル−ロイシル−チロシル−アスパルチル−チロシルアミドの溶液に、１つのヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と１００μＣｉのＮａＩ¹²⁵とを添加した。１０分後、反応混合物をＷａｔｅｒｓ Ｃ１８−Ｌｉｇｈｔ ＳｅｐＰａｃｋカラムに導入し、水で溶出させ、次いでＣＨ₃ＣＮ／水の１：１混合物中の０．１％ＴＦＡで溶出させることによって余剰のＮａＩ¹²⁵試薬を除去し、３×２００μｌの画分を収集すると、Ｔｙｒ⁵³³−及びＴｙｒ⁵³⁵−放射性標識ペプチド混合物が得られた。
ホットペプチド混合物を、等モル量の低温キャリア、Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂及びＮ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂の溶液と共に、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムに注入した。カラムの溶出時間を夫々３６分及び３８分に設定しておいた。実施例１の溶媒系による溶出を繰り返し、適当な画分を集めて凍結乾燥すると、所望の化合物Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２が最少量の不純物Ｎ−Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ₂と共に得られた。
汎用方法
実施例１４
クリングル５ペプチドフラグメントの単離及び精製
Ｐｏｗｅｌｌらの方法（Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４８（１）：３９０−４００（１９８６）、参照によって本発明に含まれるものとする）を修正した方法を用い、Ｌｙｓプラスミノーゲン（Ｌｙｓ−ＨＰｇ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）をブタエラスターゼ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で消化することによってクリングル５ペプチドフラグメントを調製した。１．５ｍｇのブタエラスターゼを、２００ｍｇのＬｙｓ−ＨＰｇと共に、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０中でインキュベートし、室温で一夜振盪した。ＤＰＦ（ジイソプロピルフルオロホスフェート、ＳＩＧＭＡ）を最終濃度１ｍＭまで添加することによって反応を終了させた。混合物を更に３０分間振盪し、５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０に一夜透析し、濃縮した。開裂されたプラスミノーゲンを、２．５ｃｍ×１５ｃｍのリシン−セファロース４Ｂカラム（Ｂｒｏｃｋｗａｙ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．Ｊ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５１：１９４−１９９（１９７２）、参照によって本発明に含まれるものとする）に載せ、５０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０によって吸光度０．０５（２８０ｎｍ）に達するまで平衡させた。（この段階は、クリングル１領域及び／またはクリングル４領域（双方がリシンに結合する）を含むフラグメントを完全に除去するために行った）。吸収されないクリングル５ペプチドフラグメントを、５０ｍＭのＮａ₂ＰＯ₄バッファ，ｐＨ５．０に透析し、次いで、同じバッファで平衡させたＢｉｏＲａｄ Ｍｏｎｏ−Ｓカラムに導入した。開裂したクリングル５の部分、未切断のミニ−ＨＰｇ及び残留プロテアーゼドメイン画分を、２０ｍＭの燐酸塩／１ＭのＫＣｌ，ｐＨ５．０の０−２０％、２０−５０％及び５０−７０％の段階勾配によって溶出させた。５０％の段階に溶出したクリングル５ペプチドフラグメントをゲル電気泳動によって測定した。収集したピークを２０ｍＭのトリス，ｐＨ８．０に一夜透析した。
分離したクリングル５フラグメントは銀染色（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ）を伴うＦＰＬＣクロマトグラフィー及びＤｏｄＳＯ₄／ＰＡＧＥによって少なくとも９５％純度であると測定された。精製フラグメントのアミノ末端部分の配列解析から、ＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳ、ＶＡＰＰＰＶＶＬＬ及びＶＥＴＰＳＥＥＤのα−Ｎ−末端配列を有する３つのポリペプチドの存在が判明した。夫々の配列は配列番号１のアミノ酸位置Ｖａｌ⁴⁴⁹−Ｓｅｒ⁴⁵⁸、Ｖａｌ⁴⁴³−Ｌｅｕ⁴⁵⁰及びＶａｌ⁴⁵⁴−Ａｓｐ⁴⁶¹に対応する。
実施例１５
内皮増殖アッセイ
水性非放射性細胞増殖キットＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を、Ｌｉｎｇｅｎら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７４：４７６−４８３（１９９６）に記載の手順で測定した。この文献に記載の方法は参照によって本発明に含まれるものとする。１０％のドナー仔ウシ血清と１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とを含むダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の９６ウェルのプレートに、ウシ毛様（副腎）内皮細胞をウェルあたり１，０００細胞の密度で平板培養した。８時間後、０．１％のＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で細胞を一夜飢餓させ、次いで、特定濃度の阻害物質と５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）とを含む培地を補給した。基準量として非刺激（即ちｂＦＧＦ非添加）の細胞、及び、最大増殖としてｂＦＧＦ単独刺激（即ち阻害物質非添加）の細胞を使用し、アッセイの結果を双方の細胞に対して補正した。多数の実験を総合し、結果をｂＦＧＦ単独刺激細胞に比較した細胞数の変化のパーセントで表した。
実施例１６
内皮細胞移動アッセイ
本質的にＰｏｌｖｅｒｉｎｉ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８：４４０−４５０（１９９１）に記載の手順で内皮細胞移動アッセイを実施した。この文献に記載の方法は参照によって本発明に含まれるものとする。簡単に説明すると、ウシ毛様（副腎）内皮（ＢＣＥ）細胞（Ｊｕｄａｈ Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌから入手）を、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＤＭＥＭ中で一夜飢餓させた。次に、トリプシンで細胞を収集し、０．１％のＢＳＡを加えたＤＭＥＭに１．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で細胞を再浮遊させた。４８ウェルの改質ボイデンチェンバー（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ）の底部に細胞を加えた。チェンバーを組立てて倒立させ、０．１％のゼラチンに一夜浸漬させて乾燥させた走化性ポリカーボネート膜（ポアサイズ５μｍ）に３７℃で２時間付着させた。次にチェンバーを再度倒立させ、上室のウェルに被験物質を（総量５０μｌまで）加えた。次に装置を３７℃で４時間インキュベートした。膜を回収し、定着させ、染色し（ＤｉｆｆＱｕｉｃｋ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、１０個の高倍率視野あたりの上室に移動した細胞の数をカウントした。ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡに対するバックグラウンド移動を減算し、データを１０個の高倍率視野（４００×）あたりの移動細胞数として記録するか、または、多数実験の結果を総合する場合には陽性対照に比較した移動阻害パーセントとして記録した。結果を表１に示す。
実施例１７
内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に対するクリングル５ペプチドフラグメントの効果
内皮細胞増殖に対するクリングル５ペプチドフラグメントの効果を前述の内皮細胞増殖アッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。これらの実験のためには、クリングル５ペプチドフラグメントを実施例１から１４に記載の手順で調製し、ｂＦＧＦを最大増殖対照として用い、約１００〜１，０００ｐＭの範囲の種々の濃度で試験した。配列番号３のクリングル５ペプチドフラグメントは、ＢＣＥ細胞増殖を用量依存的に阻害する効果を有していた。５０％阻害（ＥＤ₅₀）を達成するために必要な配列番号３のクリングル５ペプチドフラグメントの濃度は約３００ｐＭであった。対照的に、クリングル１−４のＥＤ₅₀は１３５ｎＭであった。
ＢＣＥ細胞の増殖阻害に対する他のクリングルペプチドフラグメントの効果を表１にまとめる。クリングル３ペプチドフラグメントが最低のＢＣＥ細胞増殖阻害効果を示し（ＥＤ₅₀＝４６０ｎＭ）、次いでクリングル１ペプチドフラグメント（ＥＤ₅₀＝３２０ｎＭ）、クリングル１−４ペプチドフラグメント（ＥＤ₅₀＝１３５ｎＭ）、クリングル１−３ペプチドフラグメント（ＥＤ₅₀＝７５ｎＭ）の順に有効であった。クリングル５ペプチドフラグメントは最大のＢＣＥ細胞増殖阻害効果を有しており、ＥＤ₅₀＝０．３ｎＭを示した。
実施例１８
内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ移動に対するクリングル５ペプチドフラグメントの効果
また、内皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ移動に対するクリングル５ペプチドフラグメントの効果も前述の内皮細胞移動アッセイを用いて測定した。クリングル５ペプチドフラグメントはＢＣＥ細胞の移動を用量依存的に阻害し、ＥＤ₅₀は約３００ｐＭであった。ＢＣＥ細胞の最大阻害に必要なクリングル５ペプチドフラグメントの濃度で、ＰＣ−３細胞及びＭＤＡ４８６細胞も阻害された。この結果を実施例２の結果と総合すると、クリングル５ペプチドフラグメントは被刺激ＢＣＥ細胞の増殖及び移動の双方を内皮細胞特異的に阻害する能力を有している。この阻害能能力は、正常細胞特異的または腫瘍細胞特異的でない。
上記の記載は本発明の単なる代表例であり、本発明は開示された化合物に限定されない。当業者に自明の変更及び変化は請求の範囲に定義された本発明の範囲及び要旨に包含される。
表１は、ＢＣＥ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖及び移動に対して種々のクリングルフラグメントが示した阻害から得られたＥＤ₅₀の値をまとめたものである。表中、各クリングルペプチドフラグメントの配列を、配列番号１に対する相同性に従って表す。記号“＊”はＭａｒｔｉ，Ｄ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１９：４５５−４６２（１９９４）から得られたデータを示す。この文献のデータは参照によって本発明に含まれるものとする。また、記号“−”はデータがないことを示す。

実施例１９
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中のクリングル５フラグメントの組換え発現
Ａ．クリングル５フラグメントをコードするｃＤＮＡのＰＣＲによる産生
真核細胞宿主及び原核細胞宿主の双方におけるクローニング及び発現に用いるために、（１）配列番号１のアミノ酸位置４５０−５４３（以後、Ｋ５Ａと呼ぶ）、（２）配列番号１のアミノ酸位置４５０−５４６（以後、Ｋ５Ｆと呼ぶ）、（３）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４３（以後、Ｋ４−５Ａと呼ぶ）、及び、（４）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４６（以後、Ｋ４−５Ｆと呼ぶ）、から成るグループから選択されたアミノ酸配列を有するクリングル５ペプチドフラグメントをコードするｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって作製した。ヒトプラスミノーゲンをコードするｃＤＮＡ（Ｄｒ．Ｅ．Ｒｅｉｃｈ，Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ，ＮＹから入手）を鋳型として用い、以下の順方向プライマー及び逆方向プライマーのセット（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いてＤＮＡフラグメントを作製した。

配列番号２と配列番号４（Ｋ５Ａ）、配列番号２と配列番号５（Ｋ５Ｆ）、配列番号３と配列番号８（Ｋ４−５Ａ）、配列番号３と配列番号５（Ｋ４−５Ａ）のプライマーセットを用い、標準ＰＣＲ条件下、即ち、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣ）と、０．２μＭの各プライマーと、約１０ｎｇの鋳型ＤＮＡと１単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とを含む反応総量１００μｌでＰＣＲ増幅を実施した。ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し、合計２５サイクル（１サイクル＝９４℃で１分、４８℃で２分、７２℃で１分）の処理によって増幅を実施した。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、同じ酵素で切断した修飾Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（ｐＨｉｌ−Ｄ８、後記参照）に結合させ、電気穿孔によってＨＢ１０１細胞（ＢｉｏＲａｄ）を形質転換した。ＤＮＡを個々のクローンから調製し、制限酵素で消化し、配列解析して、正しい配列のインサートを適正方向で含んでいたクローンを同定した。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ菌ＧＳ１１５株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示通りに用い、陽性であると同定されたクローンに由来のプラスミドによって形質転換した。Ｐｉｃｈｉａ中の陽性クローンを同定するために、細胞を５ｍｌのＢＭＧＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２９℃で一夜増殖させ、遠心によって収集し、発現のために０．５ｍｌのＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再浮遊させた。２９℃で２日間インキュベーション後、培養上清を収集し、公知の技術に従ってアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図６に示す。
Ｂ．発現ベクターｐＨｉｌ−Ｄ８の構築
組換えタンパク質を分泌させる合成リーダー配列を含むようにベクターｐＨｉｌ−Ｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾することによってＰｉｃｈｉａ発現ベクター，ｐＨｉｌ−Ｄ８を構築した（図５参照）。

は、ＫＥＸ２開裂を行うようにプロペプチド配列（太字部分）に作動可能に連結されたＰＨＯ１分泌シグナル（下線部分）をコードしている。ｐＨｉｌ−Ｄ８を構築するために、ｐＨｉｌ−Ｓ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として用いてＰＣＲを実施した。その理由はこのベクターが、ＰＨＯ１をコードする配列と、ｐＨｉｌ−Ｓ１のヌクレオチド５０９−５３０に対応する順方向プライマー（配列番号７）と、ＰＨＯ１分泌シグナルの後半部分をコードするヌクレオチド配列（配列番号９のヌクレオチド４５−６６）及びプロペプチド配列（配列番号９のヌクレオチド６７−１０８）を有する逆方向プライマー（配列番号８）とを含むからである。プライマー配列（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を以下に示す。

実施例１９と同様に２５サイクルの処理によって増幅を実施した。ＰＣＲ産物（約５００ｂｐ）をゲル精製し、ＢｌｐＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＨｉｌ−Ｄ２に結合させた。ＤＮＡで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、制限酵素消化及び配列解析によって陽性クローンを同定した。適正配列を有する１つのクローンをｐＨｉｌ−Ｄ８と命名した。
実施例２０
細菌中のクリングル５ペプチドフラグメントの組換え発現
使用した制限酵素または他の修飾酵素並びに他の試薬は市販製品から入手した。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて全自動シンセサイザーを使用し、当業界で公知の標準方法によってプライマーを合成した。
細菌細胞（大腸菌）中のクローニング及び発現に用いるために、クリングル５ペプチドフラグメントのＤＮＡを同じくＰＣＲ増幅によって作製した。汎用方法を用い、終止コドン含有または非含有の所望のコーディング領域のＰＣＲフラグメントを作製し、末端をキナーゼ処理し、フラグメントを選択ベクターに直接クローニングした。次に、ベクター構築物によって適当な宿主細胞を形質転換させ、ベクタープライマーを用いたＰＣＲによってコロニーをスクリーニングしてインサートの存在を確認した。インサートの方向を判定するために、１つのベクタープライマーと１つのインサートプライマーとを用い、インサート陽性クローンを示すＰＣＲ反応物を指向性ＰＣＲによって処理した。
Ａ．平滑化しホスファターゼ処理したベクターの調製
クリングル５ペプチドフラグメントの細菌産生に有用な発現ベクターの種類を表２に示す。

最初に、Ｑｉａｇｅｎカラムを製造業者（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）の指示通りに使用し、全部のベクターを単離及び精製した。１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２０μｌのＮＥＢ４バッファ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、ベクターＤＮＡ（１μｇ）を適当な制限酵素（表２参照）によって消化した。反応物を簡単に遠心し、２０μｌの脱イオンＨ₂Ｏ、０．４μｌのｄＮＴＰミックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）；２０ｍＭの各ｄＮＴＰ）及び０．２５μｌのクローン化したｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）；２．５単位／μｌ）を添加し、反応混合物を６５℃で２０分間インキュベートしてベクターの末端を埋め戻した。反応混合物を再度簡単に遠心し、４μｌの希釈した仔ウシ腸ホスファターゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；合計５単位）を添加した。次に、混合物を５０℃で１時間インキュベートした。５μｌの１０％ＳＤＳ、２μｌの５ＭのＮａＣｌ、２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ及び４５μｌのＨ₂Ｏを添加し、反応物を簡単に遠心し、次いで６５℃で２０分間インキュベートした。反応物を次に、バッファ飽和フェノール−クロロホルム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で３回抽出し、クロロホルムで１回抽出した。水相をＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ（登録商標）１００ＴＥカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で精製した。
Ｂ．ＰＣＲによるＤＮＡフラグメントの作製
公表されているヒトプラスミノーゲンの配列（配列番号１２参照）に基づいてＰＣＲプライマーを設計及び注文した。得られたプライマーの配列を以下に示す。

特に注釈がない限り、全部のＰＣＲは、２００μＭの各ｄＮＴＰと１μＭの各プライマーとを用い、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）によって実施した。使用したプライマーセットは、配列番号１１と配列番号１３（Ｋ５Ａ）、配列番号１０と配列番号１３（Ｋ４−５Ａ）であった。Ｋ４−Ｋ５Ａを含有するベクターｐＨｉｌ−Ｄ８（実施例１９に記載）を鋳型として使用した。形質転換物中のｐＨｉｌ−Ｄ８ベクターに起因するバックグラウンドを除去するために、このＤＮＡを鋳型として使用する前にＤｒａＩによって消化した（クリングル領域の外部で多数の切断部を形成）。５０μｌのＰＣＲ反応物あたり約１０ｎｇの鋳型を使用した。ＰＣＲ反応物を、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で３０秒、４９℃で１分、７２℃で４分のサイクルを１５回繰り返し、次いで７２℃で７分間処理した。ＰＣＲ反応後、０．５μｌの１００ｍＭのＡＴＰと５単位のＴ４キナーゼとを添加し、反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、末端をキナーゼ処理した。次いで、結合に使用するために、反応物を６８℃で１５分間加熱し、Ｓ４００−ＨＲスピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標））で精製した。
Ｃ．発現ベクター内へのＰＣＲフラグメントの結合
６つの組換え構築物（詳細には、（ｉ）ＵｐＥＴ−ＰＳ３中のＫ５Ａ、（ｉｉ）ｐＥＴ３２ａ中のＫ５Ａ、（ｉｉｉ）ＵｐＥＴ−ＰＳ３中のＫ４−５Ａ、（ｉｖ）ＵｐＥＴ−Ｕｂｉ中のＫ４−５Ａ、（ｖ）ｐＥＴ３２ａ中のＫ４−５Ａ及び（ｖｉ）ｐＧＥＸ−４Ｔ−２中のＫ４−５Ａ）を以下のごとく作製した。高速結合キットを製造業者（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ−ＭＡＮＮＨＥＩＭ Ｃｏｒｐ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の指示通りに用い、平滑化しホスファターゼ処理したベクター（前述の段階Ａから１μｌ）とＰＣＲフラグメント（前述の段階Ｂから１μｌ）とを、総量５．５μｌに結合した。次に、製造業者の指示通りに用いた２０μｌのコンピテント細胞（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞またはＸＬ２−Ｂｌｕｅ Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＲ））を結合混合物（１μｌ）によって形質転換させた。組換え細胞をＬＢ−Ａｍｐ寒天プレート（ＭｉｃｒｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ）で選択した。
Ｄ．発現研究
ｐＧＥＸベクターは大腸菌のＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＸＬ２−Ｂｌｕｅで発現した。他の全部のベクターを単離し、製造業者の指示に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換に使用した。個々のコロニーを２．５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種し、２２５ｒｐｍ、３７℃で一夜振盪した。一夜培養物（０．５ｍｌ）を次に、２５０ｍｌのフラスコに入れた５０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに接種し、２２５ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．５−０．６になるまで振盪した。次に、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１００ｍＭ）を最終濃度１ｍＭまで添加した。培養物を２２５ｒｐｍ、３０℃で３時間振盪してから遠心によって沈殿させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを公知技術に従って調製した。予備実験は、Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａ、Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ及びＫ４−５Ａ／ｐＧＥＸを有する細胞が組換えタンパク質を最も多く産生することを示した。次にこれらのクローンの培養物が可溶性発現であるか不溶性発現であるかをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図７に示すように、Ｋ５Ａ／ｐＥＴ３２ａはほぼ完全に可溶性の組換えタンパク質を産生したが（Ｔｒｘ−Ｋ５ＡのレーンＳ及びＰ比較）、Ｋ４−５Ａ／ｐＥＴ３２ａ及びＫ４−５Ａ／ｐＧＥＸは約７５％可溶性のタンパク質を産生した。
Ｅ．Ａｂｂｏｔｔ修飾ベクターの構築
ｉ．ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ３及びＶＢ４カセットの調製
平均的な当業者に公知の技術を用い、ＶＢ１、ＶＢ２、ＶＢ３及びＶＢ４を合成ＤＮＡとして作製した。ｓｙｎＶＢ１、ｓｙｎＶＢ２、ｓｙｎＶＢ３及びｓｙｎＶＢ４の配列を以下に示す。

合成配列の各々を二重鎖にし、製造業者の指示に従ってｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ（登録商標）を用いることによってクローニングした。次に、正しい配列のクローンを標準手順によって単離した。５μｇの精製ＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する１×ＮＥＢ４バッファ中の２０μｌの反応物中で８単位のＢｓｍＢＩによって５５℃で消化した。反応物を簡単に遠心し、２０μｌの脱イオンＨ₂Ｏと０．０４μｌのｄＮＴＰミックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標）；２０ｍＭの各ｄＮＴＰ）と０．２５μｌのクローン化したｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）；２．５単位／μｌ）とを添加し、反応物を６５℃で２０分間インキュベートして末端を埋め戻した。次に、ＤＮＡを０．５×のトリス−酢酸塩−ＥＤＴＡバッファ（ＴＡＥ）中の３％ＭｅｔａＰｈｏｒ（登録商標）アガロースゲル（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）に流した。カセットバンドを切り出し、ゲルを凍結させ、バッファをＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）プロバインドカートリッジ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で遠心することによってＤＮＡを溶出させ、次いでＰｅｌｌｅｔ Ｐａｉｎｔ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をキャリアとして用いたイソプロパノール沈殿によって処理した。ＤＮＡ（ｃｆＶＢ１，ｃｆＶＢ２，ｃｆＶＢ３，ｃｆＶＢ４）を７０％のエタノールで洗浄し、簡単に乾燥し、２５μｌのトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファに再懸濁させた。
ｉｉ．ＵｐＥＴの構築
ベクターｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＳａｐＩで消化し、先ずＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＧＴＰ、次いでＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントの順で処理し、再結合させた。個々のコロニーをスクリーニングして、既存のＳａｐＩ部位が除去されたプラスミドを選択した。このＤＮＡを次に、ＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、５′−ＣＡＴＧＴＧＡＡＧＡＧＣ−３′（配列番号１９）＋５′−ＧＡＴＣＧＣＴＣＴＴＣＡ−３′（配列番号２０）に結合させ、単一のＳａｐＩ部位を導入した。精製し確認したクローン化ＤＮＡをＳａｐＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、前述のように平滑化し、ホスファターゼ処理し、ｃｆＶＢ１カセットと結合させ、大腸菌を形質転換して、ＬＢ−Ａｍｐプレートで平板培養した。無菌ピペット先端でＬＢ−Ａｍｐ寒天プレートのコロニーを採取し、１μＭの各ベクタープライマー、即ち、５′−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡ−３′（順方向プライマー、配列番号２１）と５′−ＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣ−３′（配列番号２２）とを含むＣｏｓｔａｒ Ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ中の２０μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＰＣＲミックス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に導入した。反応物を９４℃で５分間加熱し、次いでＧｅｎｅＡｍｐ９６００サーマルサイクラーを用いて９４℃で３０秒、４０℃で１分、７２℃で２分のサイクルを３０回繰り返した。１０μｌの各反応物をアガロースゲルに流した。カセットの方向を判定するために、正しいサイズの０．２５μｌのＰＣＲスクリーンを、逆方向ベクタープライマーとカセットプライマー５′−ＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＡ−３′（配列番号２３）とを含む新しい反応物に添加した。反応物を上記と同じサイクルで更に１０回処理した。最終ベクターを標準手順を用いて配列決定し、１つのクローンをＵｐＥＴと命名した。
ｉｉｉ．ＵｐＥＴ−ＨＴｈの構築
クローニングに使用するために、ＵｐＥＴをＳａｐＩで消化し、平滑化し、ホスファターゼ処理した。これをｃｆＶＢ２カセットに結合し、形質転換し、コロニーをスクリーニングし、前述のｃｆＶＢ１結合と同様に配列決定した。
ｉｖ．ＵｐＥＴ−Ｈの構築
クローニングに使用するために、ＵｐＥＴをＳａｐＩで消化し、平滑化し、ホスファターゼ処理した。これをｃｆＶＢ３カセットに結合し、形質転換し、コロニーをスクリーニングし、前述のｃｆＶＢ１結合と同様に配列決定した。
ｖ．ＵｐＥＴ−Ｕｂｉの構築
Ｕｌｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と、４０μＭの各ｄＮＴＰと、１μＭの各プライマー、５′−ＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＣＴＴ−３′（Ｕｂｉ−５ｐ、配列番号２４）及び５′−ＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡＧ−３′（Ｕｂｉ−３ｐ、配列番号２５）と、１．７５μｇの酵母ＤＮＡとを用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で１分、４０℃で１分、７２℃で２分のサイクルを２５回繰り返し、次いで７２℃で７分間処理することによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンのＰＣＲ用フラグメントを作製した。プライマーとして５′−ＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴ−３′（ｐＥＴ３ｐ−ＡＴＧ、配列番号２６）及び５′−ＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣ−３′（Ｔ７ＲｅｖＴｅｒｍ、配列番号２７）を用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で４５秒、４２℃で１分、７２℃で１５分のサイクルを１０回繰り返し、次いで７２℃で７分間処理することによって、２０ｎｇのｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）からＰＣＲフラグメントを作製した。ユビキチン及びｐＥＴ１５ｂ由来のＰＣＲフラグメントをゲル精製し、ＢＲＬＴ４リガーゼ及びリガーゼバッファを用いて互いに結合させた。次に、結合物を鋳型とし、Ｕｌｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー、５′−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡ−３′（ｐＥＴ５ｐ、配列番号２８）及び配列番号２５を用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で３０秒、４２℃で１分、７２℃で３分のサイクルを２５回繰り返し、次いで７２℃で７分処理することによって、Ｔ７プロモーター−ユビキチン（Ｔ７−ユビキチン）ＰＣＲフラグメントを作製した。Ｔ７−ユビキチンＰＣＲフラグメントをゲル精製した。
Ｕｌｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（前述）を、プライマー５′−ＴＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧＡＧＴ−３′（Ｓｔｒｏｍ−３ｐ、配列番号２９）、キナーゼ処理したプライマー５′−ＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡ−３′（Ｓｔｒｏｍ−５ｐ、配列番号３０）、及び、約２０ｎｇの鋳型（即ち、ｐＥＴ３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングしたストロメリシン）と共に用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で１分、４４℃で１分、７２℃で２分のサイクルを１５回繰り返し、次いで７２℃で７分間処理することによって、成熟ヒトストロメリシンのＰＣＲフラグメントを作製した。ストロメリシンＰＣＲ反応物（１０μｌ）を、４０μｌのＢＲＬリガーゼ及びリガーゼバッファ中の１００ｐＭｏｌのアニールしたオリゴ５′−ＡＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧ−３′（Ｅｋ−Ｃｕｔ−５ｐ、配列番号３１）及び５′−ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣＴ−３′（エンテロキナーゼ開裂部位をコードするＥｋ−Ｃｕｔ−３ｐ、配列番号３２）に結合させた。１μｌのこの結合物を鋳型とし、配列番号２９とキナーゼ処理した配列番号３１とをプライマーとし、Ｕｌｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファを用いて、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で１分、４４℃で１分、７２℃で１分のサイクルを１０回繰り返し、最後に７２℃で７分間処理することによってエンテロキナーゼ部位−成熟ストロメリシン（Ｅｋ−ストロメリシン）ＰＣＲフラグメントを作製した。Ｅｋ−ストロメリシンＰＣＲフラグメントをゲル精製した。
Ｔ７−ユビキチンフラグメントとＥｋ−ストロメリシンＰＣＲフラグメントをＢＲＬリガーゼ及びリガーゼバッファ中で互いに結合させた。次に、この結合物を鋳型とし、Ｕｌｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーとなる配列番号２８及び配列番号２９とを用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で３０秒、４２℃で１分、７２℃で６分のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で７分間処理することによって、Ｔ７−ユビキチン−Ｅｋ−ストロメリシンＰＣＲフラグメントを作製した。
ストロメリシン−ｐＥＴ３ｂプラスミド鋳型を、プライマーとなる配列番号２６及び配列番号３０と、Ｋｌｅｎ Ｔａｑ（ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼと共に用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で３０秒、４２℃で２分、６８℃で２０分のサイクルを１５回繰り返す処理によってＰＣＲフラグメントを作製した。このＰＣＲフラグメントをＴ７−ユビキチン−Ｅｋ−ストロメリシンＰＣＲフラグメントと混合し、最大効率のコンピテントＢＲＬ ＤＨ５α細胞を形質転換させた。前述と同様のプラスミドＤＮＡの単離、ＢＬ２１（ＤＥ３）のトランスフェクション及び発現を行う試験によって正しいクローンを同定した。
正しいＴ７−ユビキチン−Ｅｋ−ストロメリシン発現プラスミドを、プライマーとなる配列番号２４及び配列番号３２、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼと共に用い、９４℃で２分間処理し、次いで９４℃で３０秒、４０℃で１分、７２℃で３分のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で７分間処理することによって、ユビキチン−ＥｋのＰＣＲフラグメントを作製した。フラグメントを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓ−４００ ＨＲスピンカラムで精製し、高速ＤＮＡ結合キットを用いてＶＢＣ１カセットに結合させた。この結合物を鋳型とし、プライマー配列番号２４及び５′−ＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧ−３′（配列番号３３）をｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼと共に用い、９４℃で２分処理し、次いで９４℃で３０秒、４０℃で１分、７２℃で２分のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で７分間処理することによってＰＣＲフラグメントを作製した。ＰＣＲフラグメントをキナーゼ処理し、平滑化し、ホスファターゼ処理してクローニング準備したＵｐｅｔ−Ｈに結合させた。結合物でコンピテント細胞を形質転換させ、前述のようにＰＣＲによってコロニーをスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを配列決定し、正しいＵｐＥＴ−Ｕｂｉクローンを同定した。

Claims (26)

1. 式：
   Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｙ （Ｉ）
   〔式中、
   Ａは存在しないかまたは窒素保護基を表し、
   Ｙは存在しないかまたはカルボン酸保護基を表し、
   Ｂ−Ｃ−Ｘが、
   （ａ）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４３の配列、
   （ｂ）配列番号１のアミノ酸位置４４３−５４３の配列、
   （ｃ）配列番号１のアミノ酸位置４４９−５４３の配列、
   （ｄ）配列番号１のアミノ酸位置４５４−５４３の配列、
   （ｅ）配列番号１のアミノ酸位置４４３−５４６の配列、
   （ｆ）配列番号１のアミノ酸位置５２５−５３５の配列、
   （ｇ）配列番号１のアミノ酸位置５２９−５３５の配列、
   （ｈ）配列番号１のアミノ酸位置５３０−５３５の配列、及び
   （ｉ）配列番号１のアミノ酸位置５２９−５３４の配列、
   から成るグループから選択される〕を有する化合物、または、医薬として許容されるその塩もしくはエステル。
2. ＡがＮ−ＡｃでありＹが−ＮＨ₂であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
3. 内皮細胞移動阻害を示すＥＤ₅₀が１００〜５００ｐＭであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
4. 内皮細胞増殖阻害を示すＥＤ₅₀が１００〜５００ｐＭであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
5. 式：
   Ａ−Ｂ₁−Ｃ₁−Ｘ₁−Ｙ （ＩＩ）
   〔式中、
   Ａは存在しないかまたは窒素保護基を表し、
   Ｙは存在しないかまたはカルボン酸保護基を表し、
   Ｂ₁は存在せず、
   Ｃ₁は配列番号１のアミノ酸位置５１３からアミノ酸位置５２３の配列であり、
   Ｘ₁は存在しない〕を有する化合物、または、医薬として許容されるその塩もしくはエステル。
6. ＡがＮ−Ａｃであり、Ｙが−ＮＨ₂であることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
7. 請求項１または５のいずれかに記載の化合物をコードする単離された一本鎖または二重鎖のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
8. 前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
9. 前記ＤＮＡ配列が、
   （ａ）配列番号１のアミノ酸位置４４３−５４３の配列、
   （ｂ）配列番号１のアミノ酸位置４４９−５４３の配列、
   （ｃ）配列番号１のアミノ酸位置４５４−５４３の配列、及び、
   （ｄ）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４３の配列、
   から成るグループから選択されたアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
10. 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７から成るグループから選択されたアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
11. 請求項１または５に記載の化合物と医薬として許容される賦形剤を含む組成物。
12. 請求項１または５に記載の化合物の製造方法であって、
    （ａ）哺乳類のプラスミノーゲンをエラスターゼに１：１００〜１：３００の割合で接触させて前記プラスミノーゲンと前記エラスターゼとの混合物を形成する段階と、
    （ｂ）前記混合物をインキュベートする段階と、
    （ｃ）前記化合物を前記混合物から単離する段階を含む前記製造方法。
13. 血管形成阻害剤として使用するための請求項１または５のいずれかに記載の化合物をコードする単離された一本鎖または二重鎖のポリヌクレオチド。
14. 前記ポリヌクレオチドによってコードされた化合物が、ヒト、アカゲザル、ウシ、マウス及びブタのクリングル５のペプチドフラグメントまたは融合タンパク質から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
15. 前記化合物が、ヒトのクリングル５ペプチドフラグメントまたはクリングル５融合タンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
16. 前記化合物が、
    （ａ）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４３の配列、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸位置３５５−５４６の配列、
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸位置４４３−５４３の配列、
    （ｄ）配列番号１のアミノ酸位置４４９−５４３の配列、
    （ｅ）配列番号１のアミノ酸位置４５４−５４３の配列、
    （ｆ）配列番号１のアミノ酸位置４４３−５４６の配列、
    （ｇ）配列番号１のアミノ酸位置４４９−５４６の配列、及び、
    （ｈ）配列番号１のアミノ酸位置４５４−５４６の配列、
    から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
17. ＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
18. ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
19. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
20. 発現ベクターであることを特徴とする請求項１９に記載のベクター。
21. 更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する請求項２０に記載のベクター。
22. 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項２１に記載のベクター。
23. 前記真核細胞がＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする請求項２２に記載のベクター。
24. 前記宿主細胞が大腸菌である原核細胞であることを特徴とする請求項２１に記載のベクター。
25. 請求項１または５に記載の化合物の製造方法であって、
    （ａ）当該化合物をコードするポリヌクレオチドを単離する段階と、
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階と、
    （ｃ）前記ベクターで適当な宿主細胞を形質転換させる段階と、
    （ｄ）当該化合物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を増殖させる段階とから成る方法。
26. （ａ）Ａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−Ｙ、
    （ｂ）Ａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３−Ｉ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ、
    （ｃ）Ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｙ、及び、
    （ｄ）Ａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｙから成るグループ〔式中、Ａは存在しないかまたは窒素保護基であり、Ｙは存在しないかまたはカルボン酸保護基である〕から選択された化合物。

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