JP4426650B2 - 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 - Google Patents
新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4426650B2 JP4426650B2 JP54016297A JP54016297A JP4426650B2 JP 4426650 B2 JP4426650 B2 JP 4426650B2 JP 54016297 A JP54016297 A JP 54016297A JP 54016297 A JP54016297 A JP 54016297A JP 4426650 B2 JP4426650 B2 JP 4426650B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- amino acid
- kringle
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 71
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 71
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 148
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 86
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 10
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 title description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 96
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 189
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 178
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 138
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 93
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 83
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 55
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 51
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 31
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 17
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 17
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 125000006244 carboxylic acid protecting group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- -1 3-iodotyrosinyl Chemical group 0.000 abstract description 111
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 73
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 abstract description 9
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 abstract description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 125
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 112
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 26
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 23
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 125000002233 tyrosyl group Chemical group 0.000 description 21
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 16
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 15
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 15
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 15
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 14
- ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 12
- QTWZCODKTSUZJN-LJAQVGFWSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,5,7,8-pentamethyl-3,4-dihydrochromen-6-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C(C(C)=C1C)=C(C)C2=C1OC(C)(C)CC2 QTWZCODKTSUZJN-LJAQVGFWSA-N 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108010035389 K5 peptide Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 9
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100033640 Bromodomain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 7
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 6
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 108010087750 lysyl-plasminogen Proteins 0.000 description 5
- 108010049112 miniplasminogen Proteins 0.000 description 5
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 4
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 102000000422 Matrix Metalloproteinase 3 Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 108010018161 UlTma DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 108091007196 stromelysin Proteins 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 4
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 4
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 4
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical group CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N NMP Substances CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150023810 PHO1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100271429 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATP6 gene Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical group 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropan-1-one Chemical group CC(C)(C)[C]=O YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000004457 alkyl amino carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphanium Chemical compound C1=CC=C2N(O[P+](N(C)C)(N(C)C)N(C)C)N=NC2=C1 RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 2
- 210000000695 crystalline len Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 2
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 2
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 2
- LSPHULWDVZXLIL-UHFFFAOYSA-N (+/-)-Camphoric acid Chemical compound CC1(C)C(C(O)=O)CCC1(C)C(O)=O LSPHULWDVZXLIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N (2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 DVBUCBXGDWWXNY-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- NIVLKYFXNXCQPP-CXWHUAPYSA-N (3s)-3-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-acetylpyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-6-aminohexanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[[(2s)-1-amino-3-(4-hydroxyphenyl)-1- Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(C)=O NIVLKYFXNXCQPP-CXWHUAPYSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutane Chemical compound CCCCCl VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUQPJRPDRDVQMN-UHFFFAOYSA-N 1-chlorooctadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCl VUQPJRPDRDVQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTQNKKSJPHTPBS-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trichloroethanone Chemical group ClC(Cl)(Cl)[C]=O UTQNKKSJPHTPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1Cl HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKRMFCXDTFLKKT-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethanesulfonic acid Chemical compound OCCS(O)(=O)=O.OCCS(O)(=O)=O QKRMFCXDTFLKKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisoindole-1,3-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)C(=O)C2=C1 CFMZSMGAMPBRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080296 2-naphthalenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- 125000000094 2-phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WMPPDTMATNBGJN-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethylbromide Chemical compound BrCCC1=CC=CC=C1 WMPPDTMATNBGJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBVZCSKDTGDAQW-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl)phosphanyl]-1,3-oxazolidin-2-one;hydrochloride Chemical compound [Cl-].O=C1OCCN1[PH2+]N1C(=O)OCC1 LBVZCSKDTGDAQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFWBKUDRXMQSFD-FJXQXJEOSA-M 3-aminopropanoyl-[(1s)-1-carboxy-2-(1h-imidazol-5-yl)ethyl]azanide;zinc Chemical compound [Zn].NCCC(=O)[N-][C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 GFWBKUDRXMQSFD-FJXQXJEOSA-M 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGXQKGLWWDUOEY-UHFFFAOYSA-N 3-n-hydroxybicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxamide Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)N)C2C(=O)NO QGXQKGLWWDUOEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-M 3-phenylpropionate Chemical compound [O-]C(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002672 4-bromobenzoyl group Chemical group BrC1=CC=C(C(=O)*)C=C1 0.000 description 1
- 125000000242 4-chlorobenzoyl group Chemical group ClC1=CC=C(C(=O)*)C=C1 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000015404 Amino Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010025177 Amino Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 101100238293 Arabidopsis thaliana MOR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVLVBPDQNARYJU-XAHDHGMMSA-N C[C@H]1CCC(CC1)NC(=O)N(CCCl)N=O Chemical compound C[C@H]1CCC(CC1)NC(=O)N(CCCl)N=O FVLVBPDQNARYJU-XAHDHGMMSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000003732 Cat-scratch disease Diseases 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000021309 Germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101001056473 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000851058 Homo sapiens Neutrophil elastase Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 1
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010003266 Lys-Leu-Tyr-Asp Proteins 0.000 description 1
- 108700039736 M-BACOD protocol Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000605401 Mus musculus Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005890 Neuroma Diseases 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- MSHZHSPISPJWHW-UHFFFAOYSA-N O-(chloroacetylcarbamoyl)fumagillol Chemical compound O1C(CC=C(C)C)C1(C)C1C(OC)C(OC(=O)NC(=O)CCl)CCC21CO2 MSHZHSPISPJWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N Propyl levulinate Chemical compound CCCOC(=O)CCC(C)=O QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N Protium Chemical compound [1H] YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 101000855863 Viola biflora Cyclotide vibi-E Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 208000013058 Weber syndrome Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 125000005041 acyloxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L adipate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC([O-])=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000015234 adrenal cortex adenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000006307 alkoxy benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005078 alkoxycarbonylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000473 altretamine Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940045687 antimetabolites folic acid analogs Drugs 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005018 aryl alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940050390 benzoate Drugs 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N beta-phenylpropanoic acid Natural products OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000007293 brain stem infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- PHEZJEYUWHETKO-UHFFFAOYSA-N brequinar Chemical compound N1=C2C=CC(F)=CC2=C(C(O)=O)C(C)=C1C(C=C1)=CC=C1C1=CC=CC=C1F PHEZJEYUWHETKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010231 brequinar Drugs 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N camphorsulfonic acid Chemical compound C1CC2(CS(O)(=O)=O)C(=O)CC1C2(C)C MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005708 carbonyloxy group Chemical group [*:2]OC([*:1])=O 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical class ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004240 ciliary body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005170 cycloalkyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000004985 dialkyl amino alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008050 dialkyl sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L disulfite Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])(=O)=O WBZKQQHYRPRKNJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000004954 endothelial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010265 fast atom bombardment Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150056310 gem1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000003884 gestational trophoblastic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N hexamethylmelamine Chemical compound CN(C)C1=NC(N(C)C)=NC(N(C)C)=N1 UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 description 1
- 102000052502 human ELANE Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003026 hypopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 1
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012309 immunohistochemistry technique Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005928 isopropyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(OC(*)=O)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012332 laboratory investigation Methods 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000005001 male reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-M naphthalene-2-sulfonate Chemical compound C1=CC=CC2=CC(S(=O)(=O)[O-])=CC=C21 KVBGVZZKJNLNJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000007538 neurilemmoma Diseases 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 1
- OSTGTTZJOCZWJG-UHFFFAOYSA-N nitrosourea Chemical compound NC(=O)N=NO OSTGTTZJOCZWJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 125000003232 p-nitrobenzoyl group Chemical group [N+](=O)([O-])C1=CC=C(C(=O)*)C=C1 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L peroxydisulfate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000000405 phenylalanyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000286 phenylethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001557 phthalyl group Chemical group C(=O)(O)C1=C(C(=O)*)C=CC=C1 0.000 description 1
- 229940075930 picrate Drugs 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M picrate anion Chemical compound [O-]C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000021310 pituitary gland adenoma Diseases 0.000 description 1
- IUGYQRQAERSCNH-UHFFFAOYSA-N pivalic acid Chemical compound CC(C)(C)C(O)=O IUGYQRQAERSCNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010016700 plasminogen kringle 5 Proteins 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940056457 promace Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 206010039667 schwannoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 201000005829 seminal vesicle tumor Diseases 0.000 description 1
- 229960003440 semustine Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N tetraethylammonium Chemical compound CC[N+](CC)(CC)CC CBXCPBUEXACCNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical compound C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 206010043688 thyroid adenoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N undecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)=O ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000003741 urothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/18—Feminine contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
技術分野
本発明は、ペプチド化学の分野に関する。特に、本発明は、哺乳類プラスミノーゲンのクリングル5領域の対応する配列に非常に類似したアミノ酸配列を有するペプチドの調製および使用、該ペプチドを含有する医薬組成物、アンギオスタチン受容体に特異的な抗体、アンギオスタチン検出および測定の手段、アンギオスタチンタンパク質に結合した細胞毒性物質、および血管形成から生じるかまたはそれによって悪化する病気の治療に関する。
発明の背景
新しい血管が形成される工程である血管形成は、再生、発育、および傷の修復を含む通常の生体活動にとって不可欠である。この工程は完全には理解されていないが、内皮細胞(毛細血管の一次細胞)の成長を調節する分子の、複雑な相互作用にかかわっていると考えられる。通常の条件下において、これらの分子は、数週間または、ある場合には数十年間もの長い期間、微小血管系を休止状態(即ち、毛細血管の無成長状態の一つ)に維持すると考えられる。必要なときに(傷の修復中のような場合)、これらの同じ細胞が、5日以内に急速な増殖および代謝回転を受け得る(Folkman,J.およびShing,Y.,The Journal of Biological Chemistry,267(16),10931−10934,およびFolkman,J.およびKlagsbrun,M.,Science,235,442−447(1987)。
血管形成は、通常条件下においては非常に調節された工程であるが、多くの疾患(血管形成疾患を特徴とする)が、永続的な調節されていない血管形成によって誘発される。言い換えるならば、調節されていない血管形成は、特定の疾患を直接的に発生させるか、または既存の病的状態を悪化させる。例えば、視覚血管新生は、失明の最も一般的な原因とされており、約20種の眼の疾患を占めている。関節炎のようなある種の既存の条件下において、新たに形成される毛細血管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病においては、網膜中に形成される新たな毛細血管が硝子体に侵入し、出血させ、失明させる。固体腫瘍(solid tumors)の成長および転移も血管形成に依存している(Folkman,J.,Cancer Research,46,467−473(1986)、Folkman,J.,Journal of the National Cancer Institute,82,4−6(1989))。例えば、2mmより大きく増大した腫瘍は、それら自身の血液供給を得る必要があり、新毛細血管の成長を誘発することによってそれを行っている。一旦これらの新生血管が腫瘍中に埋め込まれると、それらは、腫瘍細胞が循環内に入り、肝臓、肺、または骨などの遠隔部位に転移するための手段を与える(Weidner,N.ら、The New England Journal of Medicine、324(1):1−8(1991))。
今日までに、いくつかの自然発生血管形成因子が記載され、特徴が示されてきた(Fidler,J.I.およびEllis,L.M.,Cell,79:185−189(1994))。最近、O’Reillyらは、内皮細胞増殖を阻害する、腫瘍保持マウスの血清および尿からの38キロダルトン(kDa)のタンパク質を、単離し精製した(O’Reilly,M.ら、Cell,79:315−328(1994)、および1995年11月2日公開の国際出願第WO 95/29242号)。この内皮阻害物質のミクロ配列分析は、マウスのプラスミノーゲンの内部フラグメントと98%配列相同であることを示した。マウスの阻害フラグメントに対して名付けられたアンギオスタチンは、マウスのプラスミノーゲンの最初の4つのクリングル領域を含むペプチドであった。ヒトプラスミノーゲンの同じ領域からのペプチドフラグメント(即ちクリングル1〜4を含む)も、生体外および生体内において毛細血管内皮細胞の増殖を強力に阻害する。このペプチドフラグメントの起源であるインタクトなプラスミノーゲンは、効力のある阻害効果を有していなかった。
現在、いくつかの血管形成阻害物質が、血管形成疾患の治療に使用するために開発中であるが(Gasparini,G.およびHarris,A.L.,J.Clin.Oncol.,13(3):765−782,(1995))、これら化合物は欠点を有する。例えば、スラミンは、強力な血管形成阻害物質であるが、抗腫瘍活性に必要とされる投与量において、ヒトにおいて強い全身毒性を生じる。レチノイド、インターフェロン、およびアンチエストロゲンのような化合物は、ヒトへの使用において安全であるが、弱い抗血管形成効果を有する。他の化合物も、製造が困難であるかまたは製造コストが高い。
従って、哺乳類における血管形成疾患の治療に有用な化合物が必要とされている。特に、治療的使用に安全であり、および、例えば、正常な(即ち、癌でない)細胞に対して毒性を全くまたはほとんど示さずに内皮細胞の増殖を選択的に阻害することによって、病理学的症状に対して選択的毒性を示す、抗血管形成阻害剤が必要とされている。そのような化合物は、容易に、および費用効率的に、製造されなければならない。
発明の要旨
主な実施態様において、本発明は、構造式A−B−C−X−Y(I)[式中、Aは、不存在または窒素保護基であり;Yは、不存在またはカルボン酸保護基であり;Bは、不存在、または配列番号1のアミノ酸位置約334〜アミノ酸位置530の配列に対応する1〜約197個の天然アミノ酸残基であり;Cは、R1−R2−R3−R4[式中、R1はリシルであり、R2はロイシルまたはアルギニルであり、R3はチロシル、3−I−チロシルまたはフェニルアラニルであり、R4はアスパルチルである]であり;およびXは、不存在、または配列番号1のアミノ酸位置535〜アミノ酸位置約546の配列に対応する1〜約12個の天然アミノ酸残基、ならびにそれらの相同体および類似体である]によって示されるクリングル5ペプチド化合物、またはその医薬的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式A−B1−C1−X1−Y(II)[式中、Aは、不存在または窒素保護基であり;Yは、不存在またはカルボン酸保護基であり;B1は、不存在、または配列番号1のアミノ酸位置約334〜アミノ酸位置513の配列に対応する1〜約176個の天然アミノ酸残基であり;C1は、配列番号1のアミノ酸位置514〜アミノ酸位置523の配列であり;およびX1は、不存在、または配列番号1のアミノ酸位置524〜アミノ酸位置533の配列に対応する1〜約10個の天然アミノ酸残基、ならびにそれらの相同体および類似体である]によって示されるクリングル5ペプチド化合物、またはその医薬的に許容される塩、エステル、またはプロドラッグをも包含する。
本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質を含有する化合物を患者に投与することを含んで成る、抗血管形成治療を必要とする患者の治療方法をも包含する。
本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質、クリングル5抗血清(antisera)、クリングル5受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに細胞毒性物質と結合したクリングル5アンタゴニストを、それらのみで、または治療組成物を形成するための医薬的に許容される賦形剤及び/又は任意の持続放出化合物と組み合わせて含有する化合物を含ん成る、抗血管形成治療を必要とする患者の治療のための組成物をも包含する。
本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質を含有する化合物を含んで成る、癌、関節炎、黄斑変性症、および糖尿病網膜症から成る群から選択される病気の治療のための組成物をも包含する。
本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質をコードする単離された一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド配列を含んで成る組成物をも包含する。そのようなポリヌクレオチドは、DNA分子であるのが好ましい。本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質をコードするDNA配列を含有するベクターであって、細胞中に存在する場合にクリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質を発現することができるベクター;および、ベクターを含有する細胞を含んで成る組成物であって、該ベクターがクリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質をコードするDNA配列を含有する組成物;をも包含する。本発明はさらに遺伝子治療法をも包含し、該遺伝子治療法によって、クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質またはクリングル5ペプチドフラグメント結合体をコードするDNA配列が、患者に導入されて、生体内クリングル5レベルを変化させる。
本発明は、(a)哺乳類プラスミノーゲンを、ヒトまたはブタエラスターゼに、約1:100〜約1:300の割合で曝露して、該プラスミノーゲンと該エラスターゼとの混合物を形成し;(b)該混合物を培養し;および、(c)該混合物からクリングル5ペプチドフラグメントを単離する;段階を含んで成る、クリングル5ペプチドフラグメントの製造方法をも包含する。
本発明は、(a)哺乳類プラスミノーゲンを、ヒトまたはブタエラスターゼに、約1:100〜約1:300のエラスターゼ:プラスミノーゲンの割合で曝露して、該エラスターゼと該プラスミノーゲンとの混合物を形成し;(b)該混合物を培養し;および、(c)該混合物からクリングル5ペプチドフラグメントのタンパク質結合体を単離し;(d)クリングル5ペプチドフラグメントの該タンパク質結合体を、ペプシンに、約1:0.2の割合で曝露して、該ペプシンと該プラスミノーゲンとの混合物を形成し;および(d)該クリングル5ペプチドフラグメントを該混合物から単離する;段階を含んで成る、クリングル5ペプチドフラグメントの製造方法をも包含する。または、クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質を、(a)該クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し;(b)ポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローニングし;(c)ベクターを適切な宿主細胞に形質転換し;および可溶性クリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質の発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させる;段階を含んで成る方法によって製造することもできる。
【図面の簡単な説明】
図1は、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す(配列番号1)。
図2は、ヒト(配列番号34)、マウス(配列番号35)、アカゲザル(配列番号36)、ウシ(配列番号37)、およびブタ(配列番号38)クリングル5の、アミノ酸配列における比較相同性を示す。
図3は、ヒトプラスミノーゲンのDNA配列(配列番号12)を示す。
図4は、生体内細胞増殖アッセイにおいて試験された、ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞における種々のクリングルフラグメントの単一投与の、抗増殖活性のグラフを示す。
図5は、組換えタンパク質分泌のためのリーダー配列を有する発現ベクターpHil−D8のマップを示す。
図6は、クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質を発現するPichia pastorisの培養上澄み(10μL/レーン)の、クーマシーブルー染色SDS−PAGEゲルの写真の走査を示す。レーン1、6および10:陰性対照;レーン、2、3および4:K5Aを発現する3つの明瞭なクローン;レーン5:K5Fを発現するクローン;レーン7および8:K4−5Aを発現するクローン;レーン9:K4−5Fを発現するクローン。矢印は、K5A(約11kDa)およびK4−5F(約20kDa)のタンパク質バンドを示す。分子量マーカーが、レーン1および10の前のレーンに示されている。
図7は、クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質を発現する大腸菌の走査されたクーマシーブルー染色SDS−PAGEゲルを示す。特に指示のない限り、各レーンは、10のA600に相当する10μLの培養物質を含有する。レーン1:低分子量マーカー;レーン2:K5A/pET32a、合計培養物;レーン3:K5A/pET32a、合計培養物(レーン2の1/10量);レーン4:K5A/pET32a、可溶性画分;レーン5:K5A/pET32a、不溶性画分;レーン6:K4−5A/pET32a、合計培養物;レーン7:K4−5A/pET32a、合計培養物(レーン6の1/10量);レーン8:K4−5A/pET32a、可溶性画分;レーン9:K4−5A/pET32a、不溶性画分;レーン10:K4−5A/pGEX−4T−2、合計培養物;レーン11:K4−5A/pGEX−4T−2、可溶性画分;レーン12:K4−5A/pGEX−4T−2、不溶性画分;レーン13:クリングル5標準;レーン14:高分子量マーカー。
発明の詳細な説明
本明細書において使用されている「クリングル5」(以後、K5)という用語は、哺乳類プラスミノーゲン分子の第五クリングル領域によって規定される特定の三次元確定に寄与する3つのジスルフィド結合を有する哺乳類プラスミノーゲンの領域を意味する。そのようなジスルフィド結合の1つは、アミノ酸位置462および541に位置するシステイン残基に結合し、第二番目は、アミノ酸位置483および524に位置するシステイン残基に結合し、第三番目は、アミノ酸位置512および536に位置するシステイン残基に結合している。クリングル5領域を含む完全哺乳類プラスミノーゲン分子(ヒトプラスミノーゲン分子)のアミノ酸配列が、図1に示されている(配列番号1)。
本明細書において使用されている「クリングル5ペプチドフラグメント」という用語は、インタクトな哺乳類ブラスミノーゲンのアミノ酸位置約443におけるα−N−末端、および位置約546におけるα−C−末端を有する、哺乳類プラスミノーゲンの対応するペプチドフラグメントに対して実質的に配列相同性の4〜104アミノ酸(両端のアミノ酸を含む)の間のペプチドを意味する。クリングル5ペプチドフラグメントの全長は、クリングル5ペプチドが得られる方法に依存して変化し、またはそれを得た種に依存して配列において幾分変化する。例えば、ある形態のクリングル5ペプチドフラグメントは、ヒトまたはブタエラステーゼ酵素を用いて、glu−プラスミノーゲン、lys−プラスミノーゲン、またはミニプラスミノーゲンのタンパク質分解開裂によって製造することができる。このようにして製造された場合、配列番号1のアミノ酸約543において、ペプチド残基のα−C−末端が存在するが、α−N−末端アミノ酸は、アミノ酸位置443、449、または454において開始する。従って、glu−プラスミノーゲン、lys−プラスミノーゲン、またはミニプラスミノーゲンの、ヒトまたはブタエラスターゼ消化から生じるクリングル5ペプチドフラグメントは、101、95または90のアミノ酸の全長を有する。これらのクリングル5ペプチドフラグメントの要約が、表1に示されている。前記のような方法で製造された場合、フラグメントの約60%が95アミノ酸の長さを有し、フラグメントの約35%が101アミノ酸の長さを有し、フラグメントの約5%が90アミノ酸の長さを有する、これらの3つのフラグメントのプールが得られる。所望であれば、これらの種々のフラグメントを、当業者に既知の技術である逆相HPLCによってさらに精製してもよい。長さにおける変化にもかかわらず、本発明のK5ペプチドフラグメントは、配列Lys−Leu−Tyr−Asp(即ち、配列番号1のアミノ酸位置531〜アミノ酸位置534)、またはAsn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp(即ち、配列番号1のアミノ酸位置514〜アミノ酸位置523)、またはそれらの類似体のいずれかを含む。
本明細書において使用される「クリングル5融合タンパク質」という用語は、それらのうちの1つがK5ペプチドフラグメントである2つまたはそれ以上の個々のタンパク質から引き出されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを意味する。クリングル5ペプチドフラグメントのコード配列が、2つ(またはそれ以上)の読み取り枠が枠内にあるような少なくとも1つの他のポリペプチドのコード配列と結合しているポリヌクレオチドの発現によって、融合タンパク質が形成される。好ましいクリングル5融合タンパク質は、クリングル5ペプチドフラグメントが、クリングル4(K4)、クリングル3−4(K3−4)、クリングル2−4(K2−4)、およびクリングル1−4(K1−4)のようなヒトプラスミノーゲンの対応する配列と融合している。好ましいK5融合タンパク質は、クリングル4−5(K4−5)である。本発明のクリングル5融合タンパク質の他の例は、生物学的標識(tag)にさらに結合しているK5ペプチドフラグメントまたはK4−5である。そのような融合タンパク質は、それらが由来する分離タンパク質に開裂されることもあり、されないこともある。
本明細書において使用される「K5ペプチドフラグメントの結合体」という用語は、結合体を形成するために他のタンパク質に化学的に結合しているクリング5ペプチドフラグメントを意味する。クリング5ペプチドフラグメントの結合体の例は、アルブミン、または哺乳類プラスミノーゲンの他のクリングル領域からのペプチドフラグメントに結合したクリングル5ペプチドフラグメントを包含する。クリングル5ペプチドフラグメントの結合体の分子量は、約1,000〜約25,000kDaである。
本明細書に使用されている「実質的配列相同」という用語は、ヒトプラスミノーゲンの対応するペプチド配列との、約60%、望ましくは少なくとも約70%、より望ましくは約80%、最も望ましくは約95%の、アミノ酸の同一性を意味する。ヒトプラスミノーゲンとの実質的配列相同を有する配列は、「相同体」と呼ばれる。実質的配列相同を有することに加えて、本発明の相同体は、本明細書に記載されるK5ペプチドフラグメントと同様の生物学的活性(即ち、抗血管形成活性)を示す。クリングル5ペプチドフラグメントのアミノ酸配列またはアミノ酸の数は、種によって、または製造方法によって変化するので、クリングル5ペプチドフラグメントのアミノ酸の総数は、正確に規定できない場合がある。これらの配列が、それらのアミノ酸の少なくとも73%において同一であるならば、クリングル5ペプチドフラグメントのアミノ酸配列が種間において実質的に同様であると理解すべきものとし、および、クリングル5ペプチドフラグメントのそれらの製造方法が、ヒトプラスミノーゲンの対応するアミノ酸配列に実質的に相同のクリングル5ペプチドフラグメントを製造すると理解すべきものとする。図2は、95アミノ酸を有するヒトクリングル5ペプチドフラグメントのアミノ酸配列(配列番号34)と、マウス(配列番号35)、アカゲザル(配列番号36)、ウシ(配列番号37)、およびブタ(配列番号38)プラスミノーゲンのクリングル5フラグメントの配列との比較を示す。
本発明は、それらの配列(類似体)が、開示されているクリングル5ペプチドフラグメントおよび融合タンパク質の生物学的活性と同様の生物学的活性を示すような、前記の配列に類似しているアミノ酸残基配列をも包含する。そのペプチドの生物学的機能を実質的に変化させずに、修正および変更を加えうることが当分野において既知である。その様な変更において、同様のアミノ酸残基の置換を、側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの大きさ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて、行うことができる。記載されている種類の代替物は、ペプチド活性または酵素崩壊への安定性または薬物動力を強化するために形成することができる。従って、本発明の範囲内と見なされる配列は、変更が、前記K5ペプチドフラグメント及び/又は融合タンパク質の本質的性質および生物学的活性を変化させないような、アミノ酸残基配列または種類における変更を特徴とする相似配列を包含する。
本発明のK5ペプチドフラグメントまたはK5融合タンパク質は、ウシ毛細血管(BCE)細胞の増殖を阻害する能力を生体内において試験したときの活性に基づいて、特性化できる。配列番号1のアミノ酸位置443〜アミノ酸位置543の配列を有するK5ペプチドフラグメントが、配列番号1のアミノ酸位置443〜アミノ酸位置546の配列を有するクリングル5ペプチドフラグメントと比較した場合に、活性(即ち、BCE細胞増殖阻害)において約300倍の増加を示し、およびクリングル1−4ペプチドフラグメントと比較した場合に、活性において約800倍の増加を示すことを、表1および図4のデータが示している。
本明細書において使用されている「単離された」という用語は、それの原環境(例えば、天然の場合は、自然環境)から取り出された物質を意味する。例えば、生体動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系中のいくつかのまたは全ての共存物質から分離されるいくつかのポリヌクレオチドまたはDNAまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部になることができ、及び/又はそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部になることができ、さらには、ベクターまたは組成物がそれの自然環境の一部でないという点において、単離することができる。
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的な特定のオリゴヌクレオチド配列を意味し、標的ヌクレオチド配列に交雑するのに使用され、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として機能する。
「プローブ」という用語は、相補配列を有する試料中の特定のDNAの存在を同定するために使用することができる、限定された核酸セグメント(またはヌクレオチド相似セグメント、即ちPNA)を意味する。
本明細書に使用される「組換えポリペプチド」は、それの起源または操作によって、それが自然において(in nature)会合しているポリペプチドの全てまたは一部と会合せず、及び/又はそれが自然において結合しているポリポプチド以外のポリペプチドに結合している、少なくともポリペプチドを意味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。組換え発現系の化学合成または発現を含むいずれかの方法によって得ることもできる。
本明細書において使用される「合成ペプチド」という用語は、当業者に既知の方法によって化学的に合成することができるある長さのアミノ酸のポリマー形態を意味する。これらの合成ペプチドは、種々の用途に有用である。
「精製ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが自然において会合しているタンパク質を、本質的に含まない、即ち、それの約50%未満、好ましくは約70%未満、より好ましくは約90%未満を含有する、関係するポリヌクレオチドまたはそれのフラグメントを意味する。意図するポリヌクレオチドの精製方法は、当分野において既知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞のカオトロピック剤での分裂、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および密度に従った沈降による、ポリヌクレオチドとタンパク質の分離を包含する。従って、「精製ポリペプチド」は、関係するポリペプチドが自然において会合している細胞成分を本質的に含まない、即ち、それの約50%未満、好ましくは約70%未満、より好ましくは約90%未満を含有する意図するポリペプチドまたはそれのフラグメントを意味する。精製方法は、当分野において既知である。
本明細書において使用される「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を意味し、生成物の特定の長さを意味しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などをも意味する。
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞物(unicellular entities)として培養される微生物または高等真核細胞系を意味する他のそのような用語は、組換えベクターまたは他の転移DNAの受容者として使用することができる、または使用されている細胞を意味し、感染された原細胞の原子孫を包含する。
本明細書に使用されている「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律性単位として機能するプラスミド、染色体、またはウイルスのような遺伝的要素を意味する。
「ベクター」は、結合セグメントの複製及び/又は発現を引き起こすように、他のポリヌクレオチドセグメントが結合されているレプリコンである。
「制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすために必要とされる、ポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主有機体に依存して異なる。原核生物において、そのような制御配列が一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含み;真核細胞においては、そのような制御配列が一般に、プロモーター、ターミネーター、およびある場合には、エンハンサーを含む。従って、「制御配列」は、その存在が発現に必要な最少限の全ての成分を含むものとし、および、その存在が有益である追加的成分、例えばリーダー配列を含んでもよい。
「操作可能に結合された」とは、記載されている成分が、意図されたように機能することが許されている関係にある状態を意味する。従って、例えば、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、コード配列に「操作可能に結合された」制御配列が連結される。
「開放読み取り枠」または「ORF」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を意味し;この領域は、コード配列の一部または全コード配列であってもよい。
「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、mRNAに転写され、およびポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、5’−末端における開始コドン、および3’−末端における翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、mRNA、cDNA、および組換えポリヌクレオチド配列を包含することができるが、それらに限定されるわけではない。
「形質転換」という用語は、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を意味する。例えば、直接取り込み、形質導入、またはf−交配を包含する。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして、維持することもでき、または宿主ゲノムに組み込むこともできる。
「精製された生成物」とは、生成物が通常会合している細胞成分から、および関心のある試料中に存在しうる他の種類の細胞から、単離された生成物の調製を意味する。
α−N−末端アミノ酸残基が左側にあり、α−C−末端が右側にある、一般に認められている協定に従って、全てのペプチド配列が記載されている。本明細書において使用されている「α−N−末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を意味し、「α−C−末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を意味する。
本明細書において使用されている「N−保護基」という用語は、合成中に、望ましくない反応から、アミノ酸またはペプチドのα−N−末端を保護する、またはそうでなければアミノ酸またはペプチドのアミノ基を保護することを目的とする基を意味する。一般に使用されるN−保護基が、Greene,「Protective Groups In Organic Synthesis」(John Wiley & Sons,New York(1981))に記載されており、そこに記載の内容は参照により本発明に組込まれる。さらに、保護基は、例えば酵素加水分解によって、生体内で容易に開裂されて、生物学的に活性な親を放出するプロドラッグとして使用することができる。N−保護基は、ホルミル、アセチル(Ac)、プロピオニル、ピバロイル、t−ブチルアセチル等の低級アルカノイル基:2−クロロアセチル、2−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、4−クロロベンゾイル、4−ブロモベンゾイル、4−ニトロベンゾイル等を包含する他のアシル基;ベンゼンスルホニル、p−トルエンスルホニル等のスルホニル基;ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1−(p−ビフェニリル)−1−メチルエトキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、フェニルオキシカルボニル、4−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−9−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基;ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)等のアリールアルキル基;および、トリメチルシリル等のシリル基を含む。好ましいN−保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、フェニルスルホニル、ベンジル、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。例えば、リシンは、α−N−末端において、酸不安定性基(例えば、Boc)によって保護され、ε−N−末端において、塩基不安定性基(例えば、Fmoc)によって保護され、次に、合成の間に選択的に脱保護される。
本明細において使用される「カルボキシ保護基」という用語は、化合物の他の官能部位にかかわる反応が行われている間に、カルボン酸官能価を封鎖または保護するために使用されるカルボン酸保護エステルまたはアミド基を意味する。カルボキシ保護基は、Greene,「Protective Groups in Organic Synthesis」、pp.152−186(1981)に記載されており、そこに記載の内容は参照により本発明に組込まれる。さらに、カルボキシ保護基は、例えば酵素加水分解によって、生体内で容易に開裂されて、生物学的に活性な親を放出するプロドラッグとして使用することができる。そのようなカルボキシ保護基は当業者に既知であり、それらに開示の内容が本発明の開示の一部を構成する米国特許第3,840,556号および第3,719,667号に開示されているように、ペニシリンおよびセファロスポリン分野においてカルボキシル基の保護に広範囲に使用されている。代表的なカルボキシ保護基は、C1−C8低級アルキル(例えば、メチル、エチル、またはt−ブチル等);フェネチルまたはベンジルのようなアリールアルキル、およびアルコキシベンジルまたはニトロベンジル基等のようなそれらの置換誘導体;フェニルエテニル等のようなアリールアルケニル;アリール、および5−インダニル等のようなその置換誘導体;ジメチルアミノエチル等のようなジアルキルアミノアルキル;アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、1−(プロピオニルオキシ)−1−エチル、1−(ピバロイルオキシ)−1−エチル、1−メチル−1−(プロピオニルオキシ)−1−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル等のようなアルカノイルオキシアルキル基;シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル等のようなシクロアルカノイルオキシアルキル基;ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル等のようなアロイルオキシアルキル;ベンジルカルボニルオキシメチル、2−ベンジルカルボニルオキシエチル等のようなアリールアルキルカルボニルオキシアルキル;メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、1−メトキシカルボニル−1−エチル等のようなアルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル;メトキシカルボニルオキシメチル、t−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、1−エトキシカルボニルオキシ−1−エチル、1−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ−1−エチル等のようなアルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル;2−(フェノキシカルボニルオキシ)エチル、2−(5−インダニルオキシカルボニルオキシ)エチル等のようなアリールオキシカルボニルオキシアルキル;2−(1−メトキシ−2−メチルプロパン−2−オイルオキシ)エチル等のようなアルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル;2−(ベンジルオキシカルボニルオキシ)エチル等のようなアリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル;2−(3−フェニルプロペン−2−イルオキシカルボニルオキシ)エチル等のようなアリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル;t−ブチルオキシカルボニルアミノメチル等のようなアルコキシカルボニルアミノアルキル;メチルアミノカルボニルアミノメチル等のようなアルキルアミノカルボニルアミノアルキル;アセチルアミノメチル等のようなアルカノイルアミノアルキル;4−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル等のような複素環式カルボニルオキシアルキル;ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル等のようなジアルキルアミノカルボニルアルキル;(5−t−ブチル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)メチル等のような(5−(低級アルキル)−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)アルキル;および、(5−フェニル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)メチル等のような(5−フェニル−2−オキソ−1,3−ジオキソレン−4−イル)アルキル;である。
代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニルおよび低級アルキルアミノカルボニル基である。
本発明の好ましいカルボキシ保護化合物は、保護カルボキシ基が、低級アルキル、シクロアルキル、またはアリールアルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、s−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステル等、またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキル、またはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルである化合物である。例えば、アスパラギン酸は、α−C−末端において、酸不安定性基(例えば、t−ブチル)によって保護され、β−C−末端において、水素化不安定性基(例えば、ベンジル)によって保護され、次に、合成の間に、選択的に脱保護される。
本明細書において使用されている「低級アルキルアミノカルボニル」という用語は、合成クリングル5ペプチドフラグメントのα−C−末端を封鎖する基−C(O)NHR10[式中、R10はC1−C4アルキルである]を意味する。
本明細書において使用されている「アミノカルボニル」という用語は、合成クリングル5ペプチドフラグメントのα−C−末端を封鎖する基−C(O)NH2を意味する。
本明細書において使用されている「プロドラッグ」という用語は、例えば、血液中の酵素加水分解によって、生体内で急速に変換されて親化合物を生成する化合物を意味する。充分な検討が、T.HiguchiおよびV.Stella,Prodrugs as Novel Delivery Systems,A.C.S.Symposium Series,Vol.14、およびEdward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Permagon Press,1987に記載されており、これらはどちらも参照により本発明に組込まれる。
本明細書において使用されている「医薬的に許容されるプロドラッグ」という用語は、(1)信頼できる医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を有さず、ヒトおよび下等動物の組織に接触して使用するのに適しており、それらの意図する使用に対して利益/危険性の適切な比を有する、本発明の化合物のプロドラッグ、および(2)可能な場合には親化合物の両性イオン形態、を意味する。
本明細書において使用されている「活性エステル誘導体」という用語は、酸塩化物のような酸ハロゲン化物、ならびに、蟻酸および酢酸誘導無水物、イソブチルオキシカルボニルクロライド等のようなアルコキシカルボニルハロゲン化物から誘導される無水物、N−ヒドロキシスクシンイミド誘導エステル、N−ヒドロキシフタルイミド誘導エステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導エステル、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシアミド誘導エステル、2,4,5−トリクロロフェノール誘導エステル等を包含するがそれらに限定されるわけではない活性エステルを意味する。
本明細書において使用されている「抗血管形成活性」という用語は、血管の成長を阻害する分子の能力を意味する。
本明細書において使用されている「内皮阻害活性」は、一般に、血管形成を阻害する分子の能力、例えば、線維芽細胞増殖因子または他の既知の増殖因子の存在下における培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖または移行を阻害する能力を意味する。
本明細書において使用されている「ED50」という用語は、血管増殖、または線維芽細胞増殖因子または他の既知の増殖因子の存在下における培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖、または内皮細胞の移行を、阻害物質の不存在下における増殖または移行の1/2で阻害するのに有効な、融合タンパク質のクリングル5ペプチドフラグメントの投与量の略語である。
本明細において使用されている天然アミノ酸およびアミノアシル残基の名称は、ほとんどの場合、IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic ChemistryおよびIUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによって、Nomenclature of α−Amino Acids(Recommendations,1974),Biochemistry,14(2),(1975)において提案されている命名協定に従っている。従って、「Ala」、「Arg」、「Asn」、「Asp」、「Cys」、「Gln」、「Glu」、「Gly」、「His」、「Ile」、「Leu」、「Lys」、「Met」、「Phe」、「Pro」、「Ser」、「Thr」、「Trp」、「Tyr」、および「Val」という用語は、アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、ならびにL−、D−、またはD,L−形態におけるペプチド中のそれらの対応するアミノアシル残基を意味する。特定の配置が示されていない場合は、本明細書および請求の範囲に記載されているアミノ酸およびペプチド中のアミノアシル残基のα−炭素の立体化学は、自然発生的または「L」配置であるが、但し、アキラル分子グリシンは除き、さらに、アキラルであるかまたはそうでなければ「D−」に指定されるアミノ酸は除くと、当業者に理解される。
本明細書において使用されている「3−I−Tyr」という用語は、フェノールヒドロキシルにオルト位の水素ラジカルがヨウ化物ラジカルによって置換されているL−、D−、またはD,L−チロシン残基を意味する。ヨウ化物ラジカルは、放射性または非放射性であってもよい。
本発明は、ホモフェニルアラニン、フェニルグリシン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、チアゾイルアラニン(2−、4−、および5−置換)等のような非自然発生側鎖残基を有するアミノ酸残基をも包含する。
従って、本発明は、抗血管形成活性を有するクリングル5ペプチドフラグメントおよびクリングル5融合タンパク質のどのような誘導体をも包含し、ならびに、本明細書に記載されているクリングル5ペプチドフラグメントおよび融合タンパク質の全種類ならびにそれらのフラグメントおよびタンパク質の相同体および類似体を包含することを意図するものであると理解すべきである。さらに、本発明は、クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質が生成される方法、即ち、(1)単離哺乳類プラスミノーゲンのタンパク質分解開裂、(2)クリングル5ペプチドフラグメントまたは融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する組換え分子の発現、(3)当業者に既知の固相合成法、に依存しない。
1つの実施態様において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal443で開始し、Arg530で終結する88−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Ala543で終結する9−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal449で開始し、Arg530で終結する82−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Ala543で終結する9−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal454で開始し、Arg530で終結する77−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Ala543で終結する9−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal443で開始し、Arg530で終結する88−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Phe546で終結する12−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal449で開始し、Arg530で終結する82−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Phe546で終結する12−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal454で開始し、Arg530で終結する77−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Phe546で終結する12−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal355で開始し、Arg530で終結する176−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Ala543で終結する12−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造B−C−X[式中、Bは、配列番号1のVal355で開始し、Arg530で終結する176−マーペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Xは、配列番号1のTyr535で開始し、Phe546で終結する12−マーペプチドである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−C−Y[式中、Aは、アセチルであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−C−X−Y[式中、Aは、アセチルであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;Xは、チロシルであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、配列番号1のアミノ酸位置Pro529で開始し、アミノ酸位置Arg530で終結するジペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、配列番号1のアミノ酸位置Pro529で開始し、アミノ酸位置Arg530で終結するジペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−X−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、配列番号1のアミノ酸位置Tyr525で開始し、アミノ酸位置Arg530で終結するヘキサペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;Xは、チロシルであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−X−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、アルギニルであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;Xは、チロシルであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−X−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、配列番号1のアミノ酸位置Pro529で開始し、アミノ酸位置Arg530で終結するジペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;Xは、3−I−チロシルであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B−C−X−Y[式中、Aは、アセチルであり;Bは、配列番号1のアミノ酸位置Pro529で開始し、アミノ酸位置Arg530で終結するジペプチドであり;Cは、R1およびR4が前記と同意義であり、R2がロイシルであり、R3がチロシルである4−マーペプチドであり;Xは、チロシルであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、一般構造A−B1−C1−X1−Y[式中、Aは、アセチルであり;B1およびX1は不存在であり;C1は、配列番号1のアミノ酸位置Arg514で開始し、アミノ酸位置Trp523で終結する10−マーペプチドであり;および、Yは、アミノカルボニルである]で示されるペプチドを提供する。
本発明の代表的化合物は、Aがアセチルであり、Yがアミノカルボニルであり、B−C−Xが、
(a)配列番号1のアミノ酸位置355〜543の配列;
(b)配列番号1のアミノ酸位置355〜546の配列;
(c)配列番号1のアミノ酸位置443〜543の配列;
(d)配列番号1のアミノ酸位置449−543の配列;
(e)配列番号1のアミノ酸位置454〜543の配列;
(f)配列番号1のアミノ酸位置443〜546の配列;
(g)配列番号1のアミノ酸位置449〜546の配列;
(h)配列番号1のアミノ酸位置454〜546の配列;
(i)配列番号1のアミノ酸位置525〜535の配列;
(j)配列番号1のアミノ酸位置529〜535の配列;
および
(k)配列番号1のアミノ酸位置530〜535の配列である。
他の代表的な化合物は、Aがアセチルであり、Yがアミノカルボニルであり、およびB1−C1−X1が配列番号1のアミノ酸位置514〜523の配列である化合物である。
K5フラグメントまたはK5融合タンパク質は、クリングル5ペプチドフラグメントを有するタンパク質をコードする配列を有するポリヌクレオチドを含んで成る組換え分子の発現、次に、発現されたペプチド生成物の精製によって得ることもできる(Menhart,N.ら、Biochemistry,32:8799−8806(1993)参照)。ヒトプラスミノーゲンのDNA配列は公表されており(Browne,M.J.ら、Fibrinolysis,5(4):257−260(1991))、図3(a〜b)(配列番号12)に示されている。クリングル5をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号12のヌクレオチド位置約1421で開始し、ヌクレオチド位置約1723で終結する。
K5ペプチドフラグメントまたはK5融合タンパク質をコードする遺伝子は、(1)組織または細胞からメッセンジャーRNAを単離し、(2)逆転写酵素を用いて対応するDNA配列を発生させ、および(3)適切なプライマーを用いた複製連鎖反応(PCR)を用いて、活性K5アミノ酸配列またはその融合タンパク質をコードするDNA配列を増幅することによって、ヒトプラスミノーゲンまたはK5融合タンパク質の高レベルを発現する細胞または組織から単離することができる。さらには、K5ペプチドフラグメントまたはK5融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、商業的に入手可能な発現ベクター(例えば、pBR322、pUCベクター等)または発現/精製ベクター(Pharmacia▲R▼、Piscataway,NJのGST融合ベクター等)中にクローニングし、次に、好適な原核、ウイルス、または真核宿主中に発現させることもできる。次に、通常の手段によって、または、商業的発現/精製系の場合には製造者の指示に従って、精製が行われる。
K5クリングルフラグメントまたはK5融合タンパク質は、当業者に既知の固相化学の標準法によって合成することもできる。例えば、StewardおよびYoung(Steward,J.M.およびYoung,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed.,Pierce Chemical Company,Rockford,IL,(1984))によって記載されている手順に従って、Applied Biosystem合成装置を用いて、クリングル5ペプチドフラグメントを、固相化学法によって合成することができる。同様に、多数のフラグメントを、合成し、結合して、より大きいフラグメントを形成することができる。これらの合成ペプチドフラグメントを、特定の位置におけるアミノ酸置換によって形成して、生体外および生体内における抗血管形成活性に関して試験することもできる。固相ペプチド合成に関して、多くの技術の要約が、J.M.StewartおよびJ.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.(San Francisco),1963、およびJ.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,vol.2,p.46,Academic Press(New York)、1973に見い出される。伝統的な溶液合成に関しては、G.SchroderおよびK.Lupke,The Peptides,Vol.1,Academic Press(New York)を参照。一般に、これらの方法は、1つまたはそれ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を、成長ペプチド鎖に逐次的に添加することを含んで成る。通常は、第一アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基が、適切な保護基によって保護される。次に、適切に保護され、アミド結合を形成するのに好適な条件下にある相補(アミノまたはカルボキシル)基を有する配列に、次のアミノ酸を加えることによって、保護されたまたは誘導体化されたアミノ酸が、不活性固体基剤に結合されるかまたは溶液中に使用される。次に、新たに付加されたアミノ酸残基から保護基が除去され、次のアミノ酸(適切に保護された)が加えられる、以後同様。最終的に、所望のアミノ酸が、適切な配列に結合され、残る保護基(および固体基剤)が逐次にまたは同時に除去されて、最終ポリペプチドが得られる。この一般法を簡単に変更して、例えば、保護トリペプチドと適切に保護されたジペプチドとをカップリング(キラル中心をラセミ化しない条件下において)して、脱保護後にペンタペプチドを形成することによって、1回につき1つ以上のアミノ酸を成長鎖に付加することができる。
本発明の化合物の特に好ましい調製方法は、アミノ酸α−N−末端が酸または塩基感受性基で保護される固相ペプチド合成を含む。そのような保護基は、ペプチド結合形成の条件に対して安定である一方、成長ペプチド鎖の破壊またはその中に含まれるキラル中心のラセミ化を伴わずに、容易に除去できるという特性を有していなければならない。好適な保護基は、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、t−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、o−ニトロフェニルスルフェニル、2−シアノ−t−ブチルオキシカルボニル等である。9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)保護基が、クリングル5ペプチドフラグメントの合成に特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リシンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に関しては、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル(pmc)、ニトロ、p−トルエンスルホニル、4−メトキシベンゼン−スルホニル、Cbz、Boc、およびアダマンチルオキシカルボニル;チロシンに関しては、ベンジル、o−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、2,6−ジクロロベンジル、イソプロピル、t−ブチル(t−Bu)、シクロヘキシル、シクロペンチル、およびアセチル(Ac);セリンに関しては、t−ブチル、ベンジル、およびテトラヒドロピラニル;ヒスチジンに関しては、トリチル、ベンジル、Cbz、p−トルエンスルホニル、および2,4−ジニトロフェニル;トリプトファンに関しては、ホルミル;アスパラギン酸およびグルタミン酸に関しては、ベンジル、およびt−ブチル;およびシステインに関しては、トリフェニルメチル(トリチル)である。固相ペプチド合成法においては、α−C−末端アミノ酸が、適切な固体基剤または樹脂に結合している。前記合成に好適な固体基剤は、段階的縮合−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性な、および使用される基剤(media)中において不溶性の物質である。α−C−末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体基剤は、4−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ(スチレン−1%ジビニルベンゼン)である。α−C−末端アミドペプチドに好ましい固体基剤は、Applied Biosystems(Foster City,CA)から入手可能な4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フェノキシアセタミドエチル樹脂である。α−C−末端アミノ酸は、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、またはO−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を用いて、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート(BOP)、またはビス(2−オキソ−3−オキサゾリジニル)ホスフィンクロライド(BOPCl)で媒介するかまたはせずに、約1〜約24時間、10〜50℃の温度で、ジクロロメタンまたはDMFのような溶媒中でのカップリングによって、樹脂に結合される。固体基剤が4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フェノキシ−アセタミドエチル樹脂である場合、前記のようなα−C−末端アミノ酸と結合する前に、Fmoc基が、第二級アミン、好ましくはピペリジンによって開裂される。脱保護された4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)フェノキシ−アセタミドエチル樹脂への結合に好ましい方法は、DMF中の、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート(HBTU、1当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT、1当量)である。連続的に保護されるアミノ酸の結合は、当分野で既知の自動ペプチド合成装置で行うことができる。好ましい実施態様においては、成長ペプチド鎖のアミノ酸のα−N−末端がFmocで保護される。成長ペプチドのα−N−末端側からのFmoc保護基の除去は、第二級アミン、好ましくはピペリジンでの処理によって行われる。次に、各保護アミノ酸が約3倍のモル過剰において導入され、カップリングが好ましくはDMF中で行われる。カップリング剤は通常、O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU、1当量)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT、1当量)である。固相合成の最後に、連続的に、または単一操作において、ポリペプチドが樹脂から除去され、脱保護される。ポリペプチドの除去および脱保護は、チアニソール、水、エタンジチオール、およびトリフルオロ酢酸を含んで成る開裂剤で樹脂結合ポリペプチドを処理することにって、単一操作で行うことができる。ポリペプチドのα−C−末端がアルキルアミドである場合、アルキルアミンを用いるアミノリシスによって樹脂が開裂される。あるいは、例えばメタノール用いるエステル交換、それに続くアミノリシスまたは直接的アミド交換によって、ペプチドを除去することもできる。保護ペプチドは、この時に精製されるか、または次の段階にそのまま使用される。側鎖保護基の除去は、前記の開裂カクテル(cleavage cocktail)を用いて行うことができる。完全に脱保護されたペプチドが、下記種類のいずれかまたは全てを用いる一連のクロマトグラフィー工程によって精製される:弱塩基性樹脂(アセテート形態)上のイオン交換;非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン上での疎水性吸着クロマトグラフィー(例えば、Amberlite XAD);シリカゲル吸着クロマトグラフィー;カルボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー;例えば、Sephadex G−25、LH−20、または向流分布(countercurrent distribution)上での分配クロマトグラフィー;高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、特にオクチル−またはオクタデシルシリル−シリカ結合相カラムパッキングでの逆相HPLC。これらのクリングル5ペプチドフラグメントの分子量は、Fast Atom Bombardment(FAB)質量分光分析法によって測定される。固相クリングル5ペプチドフラグメント合成が、実施例1〜12に例示されている。
それらがどのようにして製造されるかに依存して、K5ペプチドフラグメントまたはK5融合タンパク質は、哺乳類プラスミノーゲンのクリングル5領域の前記ジスルフィド結合を有してまたは有さずに存在し、または、他の哺乳類クリングル領域を有する融合タンパク質の場合は、それらの対応する領域のジスルフィド結合を有してまたは有さずに存在し、または原哺乳類プラスミノーゲンに見い出される三次構造と異なる三次構造を形成するジスルフィド結合を有して存在する。エラスターゼ及び/又はペプシン(システイン結合からはずされた部位で開裂する酵素)を用いるGlu−、Lys−、またはミニプラスミノーゲンの酵素開裂によって生じるクリングル5ペプチドフラグメントは、原三次クリングル5タンパク質構造を含み;固相ペプチド合成によって生成されるクリングル5ペプチドフラグメントは、シスチルアミノアシル残基を有するかまたは有さず;および、発現によって生じるクリングル5ペプチドフラグメントは、酵素開裂によって生じるクリングル5ペプチドフラグメントにおいて見い出されるのと異なる位置にジスルフィド結合を有する。
実施例に特定されているものを包含するがそれらに限定されるわけではない本発明の化合物は、抗血管形成活性を有する。血管形成阻害剤として、そのような化合物は、乳房;結腸;直腸;肺;口腔咽頭;下咽頭;食道;胃;膵臓;肝臓;胆嚢;胆管;小腸;腎臓、膀胱、およびウロテリウム(urothelium)を含む尿路;頸、子宮、卵巣、絨毛癌、および妊娠栄養膜疾患を含む女性生殖路;前立腺、精のう、精巣、および胚細胞腫瘍を含む男性生殖路;甲状腺、副腎、および下垂体を含む内分泌腺;血管腫、黒色腫、骨または軟組織から発生する肉腫、およびカポジ肉腫を含む皮膚の初期および転移固体腫瘍または癌;星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む、脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍;白血病のような造血悪性腫瘍から発生し、および緑色腫、形質細胞腫、菌状息肉腫の斑および腫瘍、および皮膚T−細胞リンパ腫/白血病を含む固体腫瘍;ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫;リュウマチ性、免疫性、および変性関節炎を含む自己免疫疾患の予防;糖尿病性網膜症、早熟網膜症、隔膜移植拒絶反応、水晶体後方線維増殖、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性および低酸素症による網膜血管新生を含む眼疾患;眼の異常血管新生条件;乾せん癬を含む皮膚疾患;血管腫およびアテローム動脈硬化斑中の毛細血管増殖を含む血管疾患;オスラーウエーバー症候群;心筋血管形成;斑血管新生;毛細血管拡張;血友病関節症;血管線維腫;創傷顆粒形成;腸管癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性はん痕(即ち、ケロイド)、ならびにキャトスクラッチ病(Rochele minalia quintosa)および潰瘍(Helicobacter pylori)を含む病理学的結果としての血管形成を有する疾患の、治療に有効である。他の用途は、排卵および胎盤定着を阻害する受胎調節剤としての使用である。
本発明の化合物は、単独で、または血管形成疾患を治療するために患者に通常行われている放射線治療及び/又は他の化学療法と組み合わせて、使用される場合に、前記の腫瘍からの転移の予防にも有効である。例えば、固体腫瘍の治療に使用する場合、本発明の化合物を、αインターフェロン、COMP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびブレドニソン)、エトポシド、mBACOD(メトトレキサイート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン)、PRO−MACE/MOPP(プレドニソン、メトトレキサート(w/ロイコビン レスキュー)、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド/メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニソン、およびプロカルバジン)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビンズ、TNP−470、ペントサンポリスルフェート、血小板因子4、アンギオスタチン、LM−609、SU−101、CM−101、テクガラン、サリドマイド、SP−PG等の化学療法剤と共に投与してもよい。他の化学療法剤は、メクロエタミン、メルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、およびイフォスファミドを含むナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤;カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシンを含むニトロソウレア;ブスルファンを含むアルキルスルホネート;ダカルバジンを含むトリアジン;チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含むエチエニミン;メトトレキサートを含む葉酸類似体;5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含むピリミジン類似体;6−メルカプトプリンおよび6−チオグアニンを含むプリン類似体;アクチノマイシンDを含む抗腫瘍抗生物質;ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、およびメトラマイシンを含むアントラサイクリン;タモキシフェンおよびコルチオステロイドを含むホルモンおよびホルモン拮抗薬、ならびにシスプラチンおよびブレキナールを含む種々の薬剤を包含する。例えば、手術、放射線または化学療法、およびクリングル5投与、続く二次クリングル5投与によって、従来通り腫瘍を治療して、ミクロ転移の休止を延長し、残留初期腫瘍の増殖を安定化し阻害することができる。
リシンのような細胞毒性剤を、クリングル5ペプチドフラグメントに結合させ、それによって、クリングル5に結合している細胞を崩壊する手段を得るこができる。細胞毒性剤に結合されたペプチドは、所望の位置への運搬を最大にするようにデザインされた方法で注入される。例えば、リシン結合高親和性クリングル5フラグメントは、カニューレによって目的部位に直接送達されるか、または目的部位に供給する容器(vessel)に送達される。そのような薬剤は、注入カニューレにつながれた浸透ポンプを介して、制御された方法で送達することもできる。クリングル5拮抗薬の組合せを、血管形成の刺激剤と共に投与して、組織の血管新生を増加させることもできる。この種の治療法は、転移癌を破壊する有効な手段を提供しうる。
本発明の化合物は、無機または有機酸から誘導される医薬的に許容される塩の形態で使用することもできる。「医薬的に許容される塩」とは、信頼できる医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を有さずにヒトおよび下等動物と接触して使用するのに適しており、利益/危険性の妥当な比を有している塩を意味する。医薬的に許容される塩は、当分野において既知である。例えば、S.M.Bergeらは、J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1以下参照において、医薬的に許容される塩について詳細に記載しており、そこに記載の内容は参照により本明細書に組込まれる。本発明の化合物の最終の単離および精製の間に系中において、または別個に遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることによって、塩を調製することができる。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロ燐酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩(イセチオネート)、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、蓚酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、燐酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、p−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩を包含するがそれらに限定されるわけではない。また、塩基性窒素含有基を、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物、およびヨウ化物のような低級アルキルハロゲン化物;硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルのような硫酸ジアルキル;デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリル塩化物、臭化物、およびヨウ化物のような長鎖ハロゲン化物;ベンジルおよびフェネチル臭化物等のようなアリールアルキルハロゲン化物;のような物質で、四級化することもできる。水または油溶解性または分散性製剤がそれによって得られる。医薬的に許容される酸付加塩を形成するために使用される酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、および燐酸のような無機酸、ならびに蓚酸、マレイン酸、琥珀酸、およびクエン酸のような有機酸を包含する。
塩基付加塩は、カルボン酸含有部分と、適切な塩基、例えば医薬的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、又は炭酸水素塩と、あるいはアンモニア、又は有機第一、第二、又は第三アミンとを反応させることによって、クリングル5ペプチドフラグメントの最終単離及び精製の間に、現場で調製することができる。医薬的に許容される塩には、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩等をベースとするカチオン、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン等を含む非毒性第四アンモニア、及びアミンカチオンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。塩基付加塩の形成に用いることができるその他の代表的な有機アミンには、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が含まれる。本発明の化合物の好ましい塩には、燐酸塩、トリス、及び酢酸塩が含まれる。
クリングル5ペプチドフラグメント、クリングル5抗血清、クリングル5受容体アゴニスト、クリングル5受容体アンタゴニスト、あるいはこれらの組合わせを、医薬的に許容される徐放性マトリックス、例えば生物分解性ポリマーと組合わせて、治療用組成物を形成することができる。ここで用いられている徐放性マトリックスは、酵素加水分解又は酸−塩基加水分解によって、あるいは溶解による分解可能な材料、通常はポリマーからできているマトリックスである。このマトリックスは一度体内に挿入されると、酵素及び体液による作用を受ける。徐放性マトリックスは、望ましくは生物学的適合性材料、例えばリポソーム、ポリラクチド(ポリ乳酸)、ポリグリコリド(グリコール酸のポリマー)、ポリラクチドコグリコリド(乳酸とグリコール酸のコポリマー)ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、及びシリコーンから選ばれる。好ましい生物分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、あるいはポリラクチドコグリコリド(乳酸とグリコール酸のコポリマー)のいずれかのうちの1つのマトリックスである。
クリングル5ペプチドフラグメント、クリングル5融合タンパク質、クリングル5受容体アゴニスト、クリングル5受容体アンタゴニスト、あるいはこれらの組合わせを、医薬的に許容される賦形剤又は担体と組合わせて、治療用組成物を形成することができる。医薬的に許容される担体又は賦形剤とは、非毒性固体、半固体、あるいは液体フィルター、希釈剤、カプセル化材料、あるいはあらゆる種類の調合補助薬のことを言う。これらの組成物は、非経口、舌下、槽内、膣内、腹膜組織内、直腸内、口内(Bucally)、あるいは局所的に(例えば粉末、軟膏、ドロップ、経皮パッチ、あるいはイオン泳動装置によって)投与することができる。
ここで用いられている「非経口的」という用語は、静脈内、筋肉内、腸膜組織内、胸骨内、皮下、及び関節内注射、及び注入を含む投与方法のことである。非経口注射用医薬組成物は、医薬的に許容される水性又は非水性滅菌溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンであり、同様に使用直前に、注射用滅菌溶液又は分散液に再構成するための滅菌粉末を含んでいる。適切な水性又は非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、カルボキシメチルセルロース、及びこれらの適切な混合物、植物油(例えばオリーブ油)、及び注射しうる有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。例えば被覆材料、例えばレシチンの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。これらの組成物はまた、補助剤、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含んでいてもよい。微生物の作用からの保護は、様々な抗菌剤、及び抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによって確保することができる。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含めるのも望ましいであろう。注射しうる医薬形態の長時間の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらすことができる。注射しうるデポー形態は、生物分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)、及びポリ(無水物)中に薬品のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。薬品のポリマーに対する比、及び使用される特定のポリマーの種類に従って、薬品放出の速度を制御することができる。注射しうるデポー剤調合物も、身体組織と適合するリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬品を捕捉することによって調製される。注射しうる調合物は、例えば細菌保持フィルターを通す濾過によって、あるいは使用直前に滅菌水又はその他の注射しうる滅菌媒質に溶解又は分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組込むことによって、滅菌することができる。
局所投与には、皮膚、粘膜、及び肺及び目の表面への投与が含まれる。吸入用組成物を含む局所投与用組成物は、加圧されていても加圧されていなくてもよい乾燥粉末として調製されてもよい。非加圧粉末組成物において、細かい分割形態の活性成分は、例えば直径100マイクロメートルまでの大きさの粒子を含む、これより大きいサイズの医薬的に許容される不活性担体と混合して用いることができる。適切な不活性担体には、糖、例えばラクトースが含まれる。望ましくは活性成分粒子の少なくとも95重量%は、0.01〜10マイクロメートルの有効な粒子サイズを有する。目への局所投与のためには、本発明の化合物は、医薬的に許容される眼科用ビヒクル中に入れられ、従ってこの化合物は、角膜及び目の内部、例えば前眼房、後眼房、ガラス体、眼房水、ガラス体液、角膜、虹彩/毛様体、レンズ、脈絡膜/網膜、及び強膜に化合物を浸透させるのに十分な時間の間、目の表面と接触したままに維持される。医薬的に許容される眼科用ビヒクルは、例えば軟膏、植物油、又はカプセル化材料であってもよい。あるいはまた本発明の化合物は、直接、ガラス体液及び眼房水に注入されてもよい。
この組成物は、加圧されていてもよく、圧縮ガス、例えば窒素又は液化ガス放射剤を含んでいてもよい。液化放射媒質及び実際には組成物全体は、活性成分が、実質的な程度までその中で溶解しないようなものが好ましい。加圧組成物はまた、界面活性剤、例えば液体又は固体非イオン性界面活性剤を含んでいてもよく、あるいは固体アニオン性界面活性剤であってもよい。ナトリウム塩形態の固体アニオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。
直腸又は膣投与用組成物は、好ましくは座薬である。これは、この発明の化合物と、適切な非刺激性賦形剤又は担体、例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、あるいは室温で固体であるが、体温では液体であり、従って直腸又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出する座薬ワックスとを混合することによって、調製することができる。
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することもできる。この技術において知られているように、リポソームは一般に、リン脂質又はその他の脂質物質に由来するものである。リポソームは、水性媒質中に分散された、一又は多ラメラ水和液体結晶によって形成されている。リポソームを形成しうるものなら、あらゆる非毒性の、生理学的に許容しうる代謝可能な脂質を用いることができる。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存料、賦形剤等を含んでいてもよい。好ましい脂質は、リン脂質、及びホスファチジルコリン(レシチン)であり、どちらも天然及び合成のものである。リポソームを形成する方法は、当分野において知られている。例えばPrescott,Ed、「細胞生物学における方法(Methods in Cell Biology)」、第XIV巻、アカデミック・プレス、ニューヨーク州ニューヨーク(1976年)、33頁以降参照。この文献は参照により本明細書に組込まれる。
前記治療又はその他の治療において用いられる場合、治療的有効量の本発明の化合物の1つは、純粋形態で、あるいはこのような形態が存在する場合は、医薬的に許容される塩形態で、医薬的に許容される賦形剤と共に、あるいはこれを伴なわずに用いることができる。本発明の化合物の「治療的有効量」とは、あらゆる医学的治療に適用しうる利益/危険性の適切な比において、脈管由来の疾患を治療する(例えば腫瘍の成長を制限するか、あるいは腫瘍の転移を遅らせるか、あるいは遮断する)のに十分な化合物の量を意味する。しかしながら本発明の化合物及び組成物の一日の総使用量は、担当医師によって、健全な医学的判断の範囲内で決定されると理解するものとする。ある特定の患者についての特定の治療的有効用量レベルは、次のような様々な要因に依る。すなわち、この要因には、治療される障害及びこの障害の程度;用いられる特定の化合物の活性;用いられる特定の組成物;年齢、体重、全体的な健康、性、及び患者の食餌療法;投与時間;投与経路;用いられる特定の化合物の排出速度;治療期間;用いられている特定の化合物と組合わされるか、あるいは同時に用いられている薬剤、及び医療技術の分野でよく知られている同様な要因が含まれる。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルから始めて、所望の効果が得られるまでこの用量を次第に増加することは、十分にこの技術の範囲内にある。単一又は分割した用量で、ヒト又はその他の哺乳類受容者(host)に局所的又は全身的に投与されるクリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の1日の総用量は、例えば体重1kgあたり0.0001〜200mgの量であり、より通常には体重1kgあたり1〜300mgである。所望であれば、効率的な一日の用量は、投与を目的として、多数の用量に分けてもよい。その結果、単一用量の組成物は、一日の用量を構成するために、このような量又はその約数を含んでいてもよい。
脈管由来の病気の阻害、治療、又は予防のために本発明の化合物と組合わせることができる薬剤は、前記リストに挙げたものに限定されず、原則として、脈管由来の病気の治療、又は予防に用いることができるあらゆる薬剤が含まれると理解されるものとする。
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチドをも提供するが、これは、脈管形成阻害活性を有する哺乳類クリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質をコードするものである。このようなポリヌクレオチドは、組換えクリングル5ペプチドフラグメントの発現に、あるいは遺伝子療法(以下に記載されるもの)に用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、mRNA又はDNAの形態にあってもよい。DNA、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAの形態にあるポリヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。DNAは二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖であるならば、コード(センス)鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、非修飾形態であってもよく、あるいは例えばメチル化又はキャッピングのような修飾を含んでいる。
ポリペプチドをコードするコード配列は、ここで与えられたコード配列と同一であってもよく、あるいは異なったコード配列であってもよい。この異なったコード配列は、遺伝子コードの重複又は縮退の結果として、ここで与えられたDNAと同じポリペプチドをコードするものである。このポリヌクレオチドは、ポリペプチドについてのコード配列のみを含んでいてもよく、あるいはポリペプチドについてのコード配列と追加のコード配列、例えばリーダー配列又は分泌(secretory)配列又はプロタンパク質配列、あるいはポリペプチドについてのコード配列(及び場合によっては追加のコード配列)と非コード配列、例えばポリペプチドについてのコード配列の非コード配列5’及び/又は3’を含んでいてもよい。
さらには本発明は、修飾を含む変異体ポリヌクレオチドも含んでいる。これらの修飾は例えば、ポリヌクレオチド欠失、置換、又は追加;及び変異体ポリヌクレオチド配列から生じるあらゆるポリペプチド修飾である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ここで提供されるコード配列の、自然界に発生する対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。
さらに、ポリペプチドについてのコード配列は、同じ読み枠において、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合されてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、これはポリペプチドを形成するために宿主細胞によって開裂リーダー配列を有していてもよい。ポリヌクレオチドはまた、タンパク質プラス追加の5’アミノ酸残留物であるプロタンパク質についてコードすることもできる。プロ配列を有するタンパク質は、プロタンパク質であり、いくつかの場合には、タンパク質の不活性形態であってもよい。プロ配列が一度開裂されたら、活性タンパク質が残る。従って本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質について、あるいはプロ配列を有するタンパク質について、あるいはプレ配列(リーダー配列)とプロ配列の両方を有するタンパク質についてコードすることができる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製に備えたマーカー配列に、枠組において融合されたコード配列を有していてもよい。マーカー配列は、細菌宿主の場合にマーカーに融合されたポリペプチドの精製に備えるための、pGEXベクターによって供給されたGSTタグであってもよい。あるいは例えばマーカー配列は、哺乳類宿主例えばCOS−7細胞が使用される場合、赤血球凝集素(HA)タグであってもよい。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。例えばI.Wilsonらの「細胞(Cell)」、第37巻:767頁(1984年)参照。
ポリヌクレオチドは、あらゆる方法で生成されることができる。この方法には、化学合成、複製、逆転写、又は転写が含まれるが、これに限定されるわけではなく、これはポリヌクレオチドが由来する部位における塩基配列によって与えられた情報に基づくものである。このようなものなので、これはもとのポリヌクレオチドのセンスか、あるいはアンチセンス配向のどちらかを表わすことができる。ポリヌクレオチドを生成させる好ましい方法は、米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載されたポリメラーゼ鎖反応による方法であり、これらの特許は参照により本明細書に組込まれる。
ポリヌクレオチドと配列との間に少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%の同一性がある場合、ポリヌクレオチドは、ここで与えられている配列に交雑していると考えられる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝学的に工夫された宿主細胞、及び組換え技術によって本発明のポリペプチドを産生する方法をも提供する。このような方法は、クリングル5由来のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること、及び細胞培養からクリングル5由来のポリペプチドを回収することを含んでいる。
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを産生するために用いることができる。従ってポリヌクレオチド配列は、多様な発現ビヒクルのいずれか1つに含まれていてもよい。特にポリペプチドを発現させるためのベクター又はプラスミドである。このようなベクターには、染色体配列、非染色体配列、及び合成DNA配列、例えばSV40の誘導体;細菌プラスミド;ファージDNA;イーストプラスミド;プラスミドとファージDNAの組合わせに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び偽狂犬病が含まれる。しかしながらその他のあらゆるプラスミド又はベクターも、再生可能かつ宿主中で生存しうる限りは、用いることができる。
適切なDNA配列を、多様な手順によってベクターに挿入してもよい。一般にDNA配列は、当分野で知られた手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順及びその他の手順は、当業者の範囲内にあると考えられる。発現ベクターにおけるDNA配列は、mRNA合成を管理するために、1つ又はそれ以上の適切な発現制御配列(プロモーター)に、操作的に結合されている。このようなプロモーターの代表例には、LTR又はSV40プロモーター、E.coli lac 又はtrp、ファージラムダPサブLプロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はこれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られているその他のプロモーターがあるが、これらに限定されるわけではない。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含んでいる。ベクターはまた、発現を増幅させるための適切な配列を含んでいてもよい。さらには発現ベクターは好ましくは、形質転換宿主細胞の選択のために表現型特性、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ、あるいは真核細胞培養のためのネオマイシン抵抗、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリンあるいはアンピシリン抵抗を生じるための遺伝子を含んでいる。
前記のような適切なDNA配列を含むベクター、及び適切なプロモーター又は制御配列を用いて、適切な宿主を形質転換し、宿主がタンパク質を発現するようにさせてもよい。適切な宿主の代表例として、次のものが挙げられよう。すなわち細菌細胞、例えばE.coli、Salmonella typhimurium;Streptomyces spp;真菌細胞、例えばイースト;昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ類及びSf9;及び動物細胞、例えばCHO、COS、又はBowes等である。適切な宿主の選定は、ここに示された教示に基づいて当業者の範囲内にあると考えられる。
特には、本発明はまた、上記において幅広く記載されている配列の1つ又はそれ以上を含む組換え構築をも含む。これらの構築には、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを含んでおり、この中へ本発明の配列が、前進あるいは逆配向に挿入されている。この実施態様の好ましい側面において、この構築はさらに調節配列を含んでいる。これは例えば、この配列に操作可能に結合されたプロモーターを含んでいる。非常に多数の適切なベクター及びプロモーターが当業者に知られており、商業的に入手可能である。次のベクターが例として挙げられる。細菌性のもの:pSPORT1(メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ社(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD))、pQE70、pQE60、pQE−9(Qiagen)pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene▲R▼、カリフォルニア州ラジョーラ(La Jolla,CA);pTrc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmacia▲R▼)。真核のもの:pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene▲R▼)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia▲R▼)。しかしながらその他のあらゆるプラスミド又はベクターは、複製可能かつ宿主中で生存しうる限り、用いることができる。
プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター又は選択しうるマーカーを有するその他のベクターを用いて、あらゆる所望の遺伝子から選択することができる。2つの適切なベクターは、pKK232−8及びpCM7である。特に挙げる細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、SP6、T7、gpt、ラムダPsub R、P sub L、及びtrpが含まれる。真核プロモーターには、ごく初期のサイトメガロウイルス(CMV)、単純疱疹ウイルス(HSV)チミジンキナーゼ、初期及び後期(late)SV40、レトロウイルスからのLTR、及びマウスメタロチオネイン−Iが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、通常の当業者のレベルの範囲内にある。
さらにもう1つの実施態様において、本発明は、前記構築を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば哺乳類細胞であってもよく、あるいは下等真核細胞、例えばイースト細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってもよい。宿主細胞へのこの構築の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、あるいはエレクトロポレーションよって実施することができる(L.Davisら、「分子生物学における基本的方法(Basic Method in Molecular Biology)」、第二版、Appleton及びLang、パラマウント・パブリッシング、コネチカット州イーストノーウオーク(East Norwalk,CT)(1994年))。
宿主細胞における構築は、組換え配列によってコードされた遺伝子産物を産生するための従来の方法で用いることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成器によって合成により産生することができる。
タンパク質は、哺乳類細胞、イースト、細菌、又はその他の細胞において、適切なプロモーターの制御下に発現させることができる。本発明のDNA構成に由来するRNAを用いて、このようなタンパク質を産生するために、細胞を含まない翻訳系も用いることができる。原核宿主及び真核宿主に用いるための適切なクローニング及び発現ベクターは、Sambrookらによって、「分子クローニング;研究所マニュアル(Molecular Cloning;A Laboratory Manual)」、第二版、(ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor,N.Y.)、1989年)に記載されている。これは参照により本明細書に組込まれる。
高級真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加される。エンハンサーは、DNAのシス作用成分であり、通常約10〜300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増強する。これの例には、複製起源の後期側上のSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起源、及び宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカーを含んでいる。例えばE.coliのアンピシリン抵抗遺伝子及びS.cerevisiae TRP1遺伝子、及び下流構造配列の転写を管理する高発現遺伝子に由来するプロモーターである。このようなプロモーターは、糖分解酵素、例えば3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、アルファ因子、酸ホスファターゼ、あるいはとりわけ熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来しうる。異質構造配列は、翻訳開始及び終了配列、及び好ましくは翻訳されたタンパク質の分泌を細胞周辺腔又は細胞外媒質の中に向けることができるリーダー配列とともに適切な段階で集められる。任意に、異質配列は、融合タンパク質をコードすることができる。このタンパク質には、所望の特性、例えば発現組換え産物の安定化又は簡略精製を与えることができるN−末端識別ペプチドが含まれる。
細菌使用に用いられる有用な発現ベクターは、適切な翻訳開始及び終了シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、機能プロモーターを有する操作可能な読取り段階に挿入することによって構成される。このベクターは、ベクターの維持を確保するため、及び所望であれば、増幅を宿主内に与えるために、1つ又はそれ以上の表現型の選択可能なマーカー及び複製起源を備えている。形質転換のために適した原核宿主には、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及びPseudomonas、Sreptomyces、及びStaphylococcus属内の様々な種が含まれる。ただし、通常選択される物質として、その他のものも用いることができる。
細菌使用のために用いることができる有用な発現ベクターは、選択しうるマーカー、及びよく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝子成分を含むプラスミドに由来する複製の細菌起源を含んでいる。その他のベクターには、PKK223−3(Pharmacia▲R▼、スウエーデン国ウプサラのファイン・ケミカル社(Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)及びGEM1(ウイスコンシン州マジソンのプロメガバイオテック社(Promega Biotec,Madison,WI))が含まれるがこれらに限定されるわけではない。これらのpBR322「バックボーン」部分は、適切なプロモーター及び発現される構造配列と組合わされる。
有用な発現ベクターはまた、本発明の所望のポリペプチドを精製しやすくするため、あるいは可溶性ポリペプチドを産生するための融合パートナーを含んでいてもよい。市販の融合ベクターの例には、pET32a(ウイスコンシン州マジソンのノヴァゲン社(Novagen,Madison,WI))、pGEX−4T−2(Pharmacia▲R▼)、及びpCYB3(マサチューセッツ州ビヴァリーのニューイングランド・バイオラブス社(New England Biolabs,Beverly,MA)があるが、これらに限定されるわけではない。融合パートナーの使用を避ける発現ベクターもまた、特にクリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の細菌細胞中の高レベルの発現のために構築されてもよい。例えば、pilot−Matias,T.J.らによって「遺伝子(Gene)」、第128巻、219〜225頁(1993年)に記載されているように、翻訳カップリングのためにベクターを最適なものにすることもできる。この文献は参照により本明細書に組込まれる。あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドは、別の付随プラスミドと共に共発現されてもよく、このプラスミド自体は、関連する第一ペプチドを可溶性化するのを助けるタンパク質又はペプチドをコードするものである(例えばMakrides,S.C.の「微生物評論誌(Microbiological Reviews)」、第60巻、512頁(1996年)参照)。例えばいくつかのクリングル5ペプチドフラグメント(これらは、チオレドキシンで可溶性融合タンパク質として産生されることが示されている(実施例20参照))は、チオレドキシンを発現する第二ベクターと同時に(すなわち同じ宿主細胞において)、非融合ベクターから発現されうる。
適切な宿主株の形質転換及び宿主株の適切な細胞密度までの成長の後で、選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば温度シフト又は化学誘導)によって閉塞状態から開放して活性化させられ、細胞は追加の時間の間培養される。細胞は典型的に、遠心分離によって採集され、物理的手段又は化学的手段によって粉砕され、得られる粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、あらゆる適切な方法によって粉砕され、この方法には、冷凍−解凍サイクル、超音波処理、機械的粉砕、あるいは細胞溶解剤の使用が含まれる。このような方法は、通常の技術者によく知られている。
様々な哺乳類細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために用いることができる。哺乳類発現系の例には、Gluzman、「細胞(Cell)」、第23巻、175頁(1981年)に記載されたサルの腎臓の線維芽細胞のCOS−7系統、及び適合性ベクターを発現しうるその他の細胞系統、例えばC127、3T3、CHO、HeLa、及びBHK細胞系統が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製起源、適切なプロモーター、及びエンハンサー、及びまたあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及び受容体部位、転写終了配列、及び5’側面側非転写配列を含んでいるものとする。例えばSV40ウイルスゲノム、SV40起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子成分を得てもよい。有用な代表的ベクターには、pRc/CMV及びpcDNA3(カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン社(Invitrogen)から入手しうるもの)が含まれる。
本発明はまた、クリングル5ペプチドフラグメント又はクリングル5ペプチドフラグメント結合体をコードする遺伝子が、患者において調節される遺伝子療法をも包含する。DNAを遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞へ転移させるか、あるいは送るための様々な方法は、あるいはまた遺伝子療法とも呼ばれるが、これらは、「生体内における哺乳類体細胞への遺伝子導入(Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo)」、N.Yang、Crit.Rev.Biotechn.第12巻(4):335〜356頁(1992年)に開示されている。これは参照により本明細書に組込まれる。遺伝子療法は、生体外あるいは生体内治療に用いるために、ポリヌクレオチド配列を体細胞又は細菌系統細胞内に組込むことをも包含する。遺伝子療法は、遺伝子を取替え、正常又は異常な遺伝子機能を増加させ、感染病及びその他の病気と戦う機能を果たす。
医学的な問題を遺伝子療法で処理するための戦略には、例えば欠陥遺伝子を識別し、ついで欠陥遺伝子の機能と取替えるか、あるいはわずかに機能的な遺伝子を増すかどちらかのために機能遺伝子を加えるような治療戦略、あるいはこの状態を処理するか、あるいは組織又は器官を、治療養生法を受けやすいものにするタンパク質産物をコードする遺伝子を加えるような予防戦略が含まれる。予防戦略の例として、クリングル5ペプチドフラグメント又はクリングル5ペプチドフラグメント結合体をコードする遺伝子が患者に入れられ、従って脈管形成の発生を妨げることができる。あるいは腫瘍細胞が照射を受けやすくなるような遺伝子を挿入して、腫瘍の照射によって腫瘍細胞がさらに多く殺されるようにしてもよい。
クリングル5ペプチドフラグメント又はクリングル5融合タンパク質をコードするDNA転移のための、あるいはクリングル5ペプチドフラグメント調節配列(あるいは融合パートナーの配列)についてのDNA転移のための多くのプロトコルが、この発明において考えられている。クリングル5ペプチドフラグメントと特異的に組合わされたものとは異なるプロモータ配列、あるいはクリングル5ペプチドフラグメントの産生を増すであろうその他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子療法の方法として考えられる。この技術の例は、マサチューセッツ州ケンブリッジのトランスカリヨティック・セラピーズ社(Traskaryotic Therapies,Inc.)に見られる。この場合、1994年4月15日のジェネティク・エンジニアリング・ニューズ(Genetic Engineering News)に開示されているような細胞中の赤血球生成促進因子遺伝子を作動させる(turn on)「遺伝子スイッチ」を挿入するために、相同組換えが用いられている。この文献は参照により本明細書に組込まれる。このような「遺伝子スイッチ」は、通常はこれらのタンパク質を発現しない細胞内において、クリングル5ペプチドフラグメント(あるいはクリングル5受容体)を活性化させるために用いることができよう。
遺伝子療法のための遺伝子導入方法は、3つの広いカテゴリーに分けられる:(1)物理的なもの(例えばエレクトロポレーション、直接遺伝子導入、及び粒子衝撃)、(2)化学的なもの(例えば脂質ベース担体、及びその他の非ウイルスベクター)、及び(3)生物学的なもの(例えばウイルス由来のベクター)である。例えば非ウイルスベクター、例えばDNA被覆されたリポソームは、直接患者の静脈内に注射されてもよい。リポソーム/DNA複合体は、肝臓に濃縮されると考えられている。ここは、これらがDNAを、マクロファージ及びクッパー細胞に運ぶ場所である。ベクター又は遺伝子の「裸の」DNAも、治療用DNAの標的となる送達のために、所望の器官、組織、又は腫瘍に直接注射してもよい。
遺伝子療法方法論はまた、送達部位によって説明することもできる。遺伝子を送達する基本的な方法には、生体外遺伝子導入、生体内遺伝子導入、及び試験管内遺伝子導入が含まれる。生体外遺伝子導入において、細胞は、患者から取られて、細胞培養で成長させられる。DNAは細胞中にトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされた細胞は、数値的に増殖させられ、ついで患者に再移植される。試験管内遺伝子導入において、形質転換細胞は、培養において成長する細胞、例えば組織培養細胞であり、特定の患者からの特定の細胞ではない。これらの「実験室細胞」がトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされた細胞が選択され、患者への移植のため、あるいはその他の用途のために膨張させられる。生体内遺伝子導入は、細胞が患者の内部にある場合、患者の細胞内にDNAを導入することに関わっている。前記のような広いベースのカテゴリーの3つすべてが、生体内、生体外、及び試験管内における遺伝子導入を行なうために用いられる。
DNA送達の機械的(すなわち物理的)方法は、DNAの胚又は体細胞への顕微注射、空気により送られたDNA被覆粒子、例えば「遺伝子ガン」に用いられる金粒子、及び無機化学方法、例えば燐酸カルシウムトランスフェクションによって実施することができる。プラスミドDNAの筋肉細胞への物理的注射は、トランスフェクションされ、かつマーカー遺伝子の持続した発現を有する細胞の高い割合を生じることが発見された。プラスミドDNAは、細胞のゲノム中に統合されてもよく、統合されなくてもよい。トランスフェクションされたDNAの非統合によって、長時間、細胞ゲノム又はミトコンドリアゲノムにおける突然変異挿入、欠失、あるいは変更の恐れも伴なわずに、末端分化、非増殖性組織における、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクション及び発現が可能になろう。治療用遺伝子の特定細胞への、長期的ではあるが必ずしも永久的ではない導入は、遺伝病の治療又は予防用に用いうる。DNAは、受入れ細胞のゲノムに生じる突然変異を伴なわずに、遺伝子産物レベルを維持するために、周期的に再注射することができよう。外生DNAの非組込みによって、1つの細胞内にいくつかの異なる外生DNA構成の存在に備えることができるであろう。これらの構築のすべては、様々な遺伝子産物を発現するものである。
DNAを細胞、組織、及び器官に注射するために、粒子仲介遺伝子導入も用いることができる。粒子衝撃装置、あるいは「遺伝子ガン」を用いて、標的器官、組織、あるいは細胞の浸透が可能になる高い速度まで、DNA被覆高密度粒子(例えば金又はタングステン)を加速するために、動力を発生させる。遺伝子導入のためのエレクトロポレーションでは、細胞又は組織がエレクトロポレーション仲介遺伝子導入を受けやすくなるように電流を用いる。DNA分子が細胞内に浸透することができるように、膜の透過性を増すため、ある一定の磁界の強さを有する短い電気インパルスが用いられる。粒子仲介遺伝子導入及びエレクトロポレーション技術は、通常の当業者にはよく知られている。
遺伝子療法の化学的方法は、紡錘細胞発生(fusogenic)脂質小胞、例えばリポソームあるいは膜融合のためのその他の小胞の使用による、担体仲介遺伝子導入に関わっている。関係のあるDNAを収容する担体は、体液又は血流中に便利な方法で導入され、ついで体内の標的器官又は組織に部位特異的に向けられる。例えば細胞又は器官特異的DNA含有リポソームが開発され、リポソームによって運ばれた異物DNAは、これらの特定の細胞によって吸収されうる。あるいくつかの細胞上の特異的受容体に標的が定められた免疫リポソームの注射は、DNAをこの受容体を運ぶ細胞中に挿入する便利な方法として用いることができる。これまで用いられていたもう1つの担体系は、生体内遺伝子導入のために、DNAを肝細胞に送るためのアシアロ糖タンパク質/ポリリジン結合体系である。
トランスフェクションされたDNAはまた、ほかの種類の担体と複合されてもよい。従ってDNAは受容細胞に送られ、ついで細胞質又は核質に貯蔵される。DNAは、特別に工夫された小胞複合体において担体核タンパク質と組み合わされ、核に直接送られる。
担体仲介遺伝子導入はまた、リポソームではない脂質ベース化合物の使用を含んでもよい。例えばリポフェクチン及びサイトフェクチンは、脂質ベースの陽イオンであり、これらのイオンは負電荷DNAと結合し、DNAを細胞膜を越えて送ることができる複合体を形成する。担体仲介遺伝子導入のもう1つの方法は、受容体ベースのエンドサイトーシスに関わっている。この方法では、リガンド(細胞表面受容体に特異的なもの)が、関係する遺伝子との複合体を形成するようにさせられ、ついで血流中に注射される。細胞表面受容体を有する標的細胞は、リガンドを特異的に結合し、リガンド−DNA複合体を細胞中に運ぶものである。
生物学的遺伝子療法の方法論では、遺伝子を細胞内に挿入するために、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター(例えばリガンド−DNA結合体、リポソーム、及び前記の脂質−DNA複合体)を用いている。トランスフェクションされた細胞は、患者の正常な組織、患者の患部組織、あるいは非患者細胞に由来する細胞であってもよい。
クリングル5ペプチドフラグメントDNA配列又はクリングル5融合タンパク質DNA配列を含む組換えDNA分子は、操作可能に発現制御配列と結合されて、各々、クリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質を発現しうる発現ベクターを形成するのが望ましいであろう。あるいはまた、クリングル5ペプチドフラグメント又はクリングル5融合タンパク質の遺伝子調節は、転写又は翻訳率を変えるために、クリングル5遺伝子、融合パートナー遺伝子、あるいはクリングル5遺伝子又はその融合パートナーの遺伝子と組合わされた制御部位に、あるいは(どちらかの)対応するRNA転写に結合する化合物を投与することによって実施されうる。
遺伝子療法プロトコルのために用いられていたウイルスベクターには、レトロウイルス、その他のRNAウイルス、例えばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、SV40、ワクシニア、及びその他のDNAウイルスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。複製欠損ネズミレトロウイルスベクターは、最も広く用いられている遺伝子導入ベクターである。ネズミの白血病レトロウイルスは、タンパク質コア(gag)によって覆われ、かつ宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ(env)によって取囲まれた核コアタンパク質及びポリメラーゼ(pol)と複合化された一本鎖RNAから構成されている。レトロウイルスのゲノム構造には、5’及び3’の長い末端リピート(LTR)において閉じ込められたgag、pol、及びenv遺伝子が含まれている。レトロウイルスベクター系は、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞系統においてトランスに供給されるならば、ベクターパッケージング、及び感染、及び標的細胞中への統合を可能にするには、5’及び3’LTR及びパッケージングシグナルを含む最小ベクターで十分であるという事実を利用している。遺伝子導入に対するレトロウイルスベクターの基本的利点には、大部分の細胞型における効率的感染及び遺伝子発現、標的細胞染色体DNAへの正確な単一コピーベクター統合、及びレトロウイルスゲノムの操作の容易性が含まれる。例えば、遺伝子を周辺及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、表皮細胞、筋細胞、及びその他の体細胞に導入するために、変更されたレトロウイルスベクターが、生体外方法に用いられてきた(これらはついで、遺伝子産物を、挿入されたDNAから供給するために、患者に導入されてもよい)。
アデノウイルスは、コアタンパク質と複合され、かつキャプシドタンパク質に取囲まれた線状二本鎖DNAから構成されている。分子ウイルス学における進歩によって、これらの生物の生物学を利用して、新規遺伝子配列を生体内で標的細胞中に形質導入しうるベクターを作ることができるようになった。アデノウイルスベースのベクターは、高いレベルにおいて遺伝子産物ペプチドを発現するものである。アデノウイルスベクターは、ウイルスの低い滴定量でさえ、高い効率の感染性を有する。さらにウイルスは、細胞を含まないビリオンとして十分に感染性があり、従って産生細胞系統の注射は必要ではない。アデノウイルスベクターに対するもう1つの潜在的な利点は、異質遺伝子の生体内での長期発現を行なうことができるということである。
生体内プロトコルを用いて遺伝子を細胞内に挿入するために、ウイルスベクターも用いられてきた。異物遺伝子の組織特異的発現を管理するために、組織特異的であるとして知られているシス作用調節成分又はプロモーターを用いることもできる。あるいはまた、これは、生体内での特異的解剖学的部位へのDNA又はウイルスベクターの現場での受渡しを用いて実施することもできる。例えば生体内での血管への遺伝子導入は、動脈壁上の選ばれた部位への形質導入された内皮細胞の試験管内移植によって実施された。ウイルス感染されたその周りの細胞も、遺伝子産物を発現した。ウイルスベクターは、生体内部位に直接(例えばカテーテルによって)送達することができ、従ってあるいくつかの部位のみがウイルスによって感染されることが可能にされ、長期的な部位特異的遺伝子発現が得られる。レトロウイルスベクターを用いる生体内遺伝子導入はまた、哺乳類の組織及び肝臓組織において、変換されたウイルスを器官に通じる血管内に注射することによって証明された。
クリングル5ペプチドフラグメントも産生することができ、多様な用途に用いることができる。例えば、クリングル5の様々なペプチドフラグメントは、次のように用いることができる。すなわち、(1)クリングル5結合部位において活性なアゴニスト及びアンタゴニストとして、(2)特異的抗血清の開発のための抗原として、(3)診断用キットに用いられるペプチドとして、及び(4)クリングル5ペプチドフラグメントを結合する細胞の標的キリングのための細胞毒性剤と結合されるか、あるいはこれと組合わされて使用されるペプチドとしてである。これらのペプチドフラグメントを含むアミノ酸配列は、結合のために抗血清に接近しうる分子の外部にあるその位置に基づいて、あるいは脈管形成から生じるか、あるいはこれによるプロセスに対するペプチドフラグメントの阻害能力に基づいて選択することができる。さらにはこれらのペプチド配列は、タンパク質配列データベース、例えばGenBank、Brookhaven Protein、SWISS−PROT、及びPIRを用いて既知の配列と比較され、可能性のある配列相同を決定することができる。この情報によって、ほかの分子との高い程度の配列相同を示す配列の除去が容易になり、これによって、クリングル5への抗血清、アゴニスト、及びアンタゴニストの開発において高い特異性の可能性を強化することができる。
クリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質はまた、例えば、培養内皮細胞又は膜抽出物が通過する親和性カラムにおいて、固体担体体上でのクリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の固定化によって、クリングル5受容体を単離する手段として用いることもできる。この技術で知られているように、クリングル5受容体の単離及び精製の後に、クリングル5受容体をコードするポリヌクレオチドを識別して単離するためにアミノ酸配列決定を行なってもよい。このようなポリヌクレオチドはついで、適切な発現ベクターにクローン化され、腫瘍細胞にトランスフェクションされてもよい。トランスフェクションされた腫瘍細胞による受容体の発現は、内生又は外生クリングル5ペプチドフラグメントへのこれらの細胞の反応性を強化し、これによって、転移成長率を減少させるであろう。さらには、この受容体の組換え発現によって、より多量な受容体が産生されることが可能になり、例えば、クリングル5の作用を模倣する、より小さいアンタゴニストを識別するために、高いスループットのスクリーニングアッセイに用いるのに十分な量を産生することができるようになるであろう。
これらの合成ペプチド内部でのアミノ酸の体系的置換によって、クリングル5受容体への高親和性ペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを生じることができる。これらは、その受容体へのクリングル5ペプチドフラグメントの結合を強化又は減少させるものである。このようなアゴニストは、微小転移の成長を抑え、これによって癌が広がるのを制限するために用いることができる。不適切な血管形成の場合、クリングル5ペプチドフラグメントへのアンタゴニストは、クリングル5ペプチドフラグメントの阻害効果を遮断し、脈管形成を促進するために用いられる。例えばこの種の治療は、糖尿病における患者の傷の治癒を促進することにおいて、治療効果を有しうる。
本発明のクリングル5ペプチドフラグメント又は融合タンパク質又は結合体はまた、クリングル5阻害剤に特異的なポリクローン又はモノクローン抗体を発生させるための抗原として用いることができる。このような抗体が用いられる1つの方法は、体液又は組織におけるクリングル5ペプチドフラグメントを検出又は定量するための診断方法及びキットにおける方法である。このようなテストから生じる結果は、クリングル5ペプチドフラグメントの予後の関連性を診断又は決定するために用いることができよう。
クリングル5ペプチドフラグメント又はクリングル5融合タンパク質は、放射性同位元素(実施例13参照)で標識されるか、あるいは結合体を形成するためにタンパク質と化学的に組合わされてもよい。結合体には、酵素、担体タンパク質、細胞毒性剤、蛍光、化学発光、及び生物発光分子が含まれ、これらはクリングル5ペプチドフラグメントを含む化合物がクリングル5抗血清を結合する能力のテストを容易にするため、クリングル5ペプチドフラグメント受容体を有する細胞型を検出するため、あるいはクリングル5ペプチドフラグメントの精製を助けるために用いられる。組合わせ技術は一般に、クリングル5ペプチドフラグメント配列のアミノ酸に対して有効な官能基をベースとして選ばれる。これには、アルキル、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、フェノール、インドリル、及びイミダゾイルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。このような組合わせを行なうために用いられる様々な試薬には、とりわけ、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、及びp−ベンゾキノンがある。組合わせ反応の効率は、特異反応に適した様々な技術を用いて測定される。例えばクリングル5ペプチド、又はその生物学的に活性なフラグメントのI125での放射性標識検出は、高い特異活性のクロラミンT及びNaI125を用いて実施することができる。反応は、メタ二亜硫酸塩で終了され、混合物は使い捨てカラムで脱塩される。標識ペプチドは、カラムから溶離され、画分が回収される。各画分からアリコートを除去し、ガンマカウンターで放射能を測定する。この手順によって、未反応NaI125を含まない、放射性標識されたクリングル5ペプチドフラグメントが生じる。もう1つの実施例において、クリングル4と組合わされたクリングル5ペプチドフラグメントを含む血液又は組織抽出物は、ポリリジン樹脂親和性カラムで精製されてもよく、これによって、クリングル4−クリングル5ペプチドフラグメントが、クリングル4ペプチドフラグメントのリジンへの親和性によって樹脂と結合する。結合タンパク質の溶離によって、精製されたクリングル4−クリングル5ペプチドフラグメントが生じるであろう。
ペプチド結合のもう1つの用途は、ポリクローン抗血清の産生である。クリングル5ペプチドフラグメント、クリングル5ペプチドフラグメントアナログ、及びクリングル5受容体に対する抗血清の産生は、当業者に知られた、確立されている技術を用いて実施することができる。例えばリジン残留物を含むクリングル5ペプチドフラグメントは、グルタルアルデヒドを用いて、精製ウシ血清アルブミン(BSA)に結合されてもよい。この反応の効率は、放射性標識されたペプチドの組込みを測定することによって、決定することができる。未反応グルタルアルデヒド及びペプチドは、透析によって分離することができ、結合体は、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、あるいはその他の動物にポリクローン抗血清を生じさせるために用いうる。担体分子、例えばBSAに結合されたクリングル5ペプチドフラグメントは、アジュバント混合物と組み合わされ、乳化され、背中、首、脇腹、時には適切な宿主のフットパッドの多数の部位に皮下注射されてもよい。ついで一般に、ブースター注射が、規則的な間隔で、例えば2〜4週間毎になされる。各注射の約7〜10日後に、例えば拡張作用後、辺縁耳静脈を用いる静脈穿刺によって、血液サンプルが得られる。血液サンプルは、4℃で一晩凝固させられ、4℃で約30分間約2400Xgで遠心分離される。血清を除去し、アリコートし、即時使用のためには4℃で貯蔵され、その後の分析のためには−20〜−90℃で貯蔵される。
ポリクローン抗血清の発生からの血清サンプル、あるいはモノクローン抗血清の産生からの培地サンプルを、抗体滴定量の測定、及び特に高い滴定量の抗血清の測定のために分析してもよい。その後、最高滴定量のクリングル5ペプチドフラグメント抗血清をテストして、次のものを確定することができる:a)抗原の最高特異的結合及び最低非特異的結合のために最適な抗血清希釈、b)標準的置換曲線における増加量のクリングル5ペプチドフラグメントを結合する能力、c)プラスミノゲン及び関連種のクリングル5ペプチドフラグメントを含む関連ペプチド及びタンパク質との潜在的交差反応性、及びd)細胞培養培地における、及び血漿、尿、及び組織の抽出物におけるクリングル5ペプチドフラグメントを検知する能力である。滴定量は、この技術で知られたいくつかの手段、例えばドットブロット及び密度分析によって、あるいはまた、タンパク質A、第二抗血清、冷エタノール又はチャコール−デキストランを用いる放射性標識ペプチド−抗体の沈殿、ついでガンマカウンターでの活性測定によって確定することができる。所望であれば、最高滴定量抗血清を親和性カラムで精製することができる。例えばクリングル5ペプチドフラグメントを、商品として入手しうる樹脂と組合わせ、これを用いて、親和性カラムを形成することもできる。ついでクリングル5抗体が(クリングル5ペプチドフラグメントを経て)カラムに結合するように、カラムに抗血清サンプルを通してもよい。これらの結合抗体はついで溶離され、回収され、滴定量及び特異性の測定のために評価される。
クリングル5ペプチドフラグメント及びクリングル5受容体の測定用キットも、本発明の一部として意図される。最高滴定量及び特異性を有し、かつ血漿、尿、組織、及び細胞培養培地の抽出物中においてクリングル5ペプチドフラグメントを検出することができる抗血清も、迅速で信頼性があり、感受性の高い特異性測定、及びクリングル5ペプチドフラグメントの位置測定用アッセイキットを確定するために用いることができる。これらのアッセイキットには、次の技術を用いることができるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、競争的及び非競争的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、生物発光及び化学発光アッセイ、蛍光アッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射アッセイ、ドットブロット、ELISAを含む酵素結合アッセイ、ミクロ滴定プレート、免疫細胞化学、及び抗体被覆ストリップ、あるいは尿又は血液の迅速監視用計量棒である。各キットの場合、アッセイの範囲、感受性、精度、信頼性、特異性、及び再生性が、当業者によく知られた手段によって確定される。
研究及び病院で通常用いられているアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)キットである。クリングル5ペプチドフラグメントRIAは、次の方法で確定することができる。クリングル5ペプチドフラグメントの放射ヨウ素化及び精製が成功した後、最高滴定量の抗クリングル5ペプチドフラグメント抗体を有する抗血清を、適切な緩衝系中で、比較的一定量の放射能、例えば10,000cpmを含む管へ、いくつかの希釈において加える。(非特異的結合を測定するために、緩衝又は予備免疫性(preimmune)血清を、他のいくつかの管に加える)。4℃で24時間の培養後、タンパク質Aをすべての管に加え、管を渦巻き運動に付し、室温で90分間培養し、約2000〜2500Xgで4℃において遠心分離させて、標識抗原に結合された抗体の複合体を沈殿させる。上澄み液を吸引によって除去し、ペレット内の放射能をガンマカウンターで計数する。非特異的結合を差引いた後、標識ペプチドの約10〜40%を結合する抗血清希釈を、さらなる特徴決定特性化のために選択する。
次に抗血清の開発のために用いられるクリングル5ペプチドフラグメントの希釈範囲(約0.1pg〜10ng)を、放射性標識されたペプチド及び抗血清の入っている管に、既知量のペプチドを加えて評価する。培養期間(例えば24〜48時間)後、タンパク質Aを添加し、管を遠心分離し、上澄み液を除去し、ペレット中の放射能を計数する。放射性標識されたクリングル5ペプチドフラグメントの結合を、非標識クリングル5ペプチドフラグメント(標準)で置換することによって、標準的曲線が生じる。さらにはいくつかの濃度の、その他のクリングル5ペプチドフラグメント、プラスミノーゲン、様々な種からのクリングル5ペプチドフラグメント、及び同族ペプチドを、アッセイ管に添加して、クリングル5ペプチドフラグメント抗血清の特異性を特性化もできる。
その後、一次及び二次腫瘍、ルイス肺癌、クリングル5ペプチドフラグメント−産生細胞の培養物、胎盤、子宮、及びその他の組織、例えば大脳、肝臓、及び腸を含む(これらに限定されるわけではない)様々な組織の抽出物が調製されるが、この場合、クリングル5ペプチドフラグメントを抽出するために用いて成功した抽出技術が用いられる。組織抽出物の精密検査後、アッセイ緩衝液を加え、様々なアリコートをRIA管に入れる。既知のクリングル5ペプチドフラグメント−産生細胞の抽出物は、標準曲線に平行な置換曲線を生じるのに対し、クリングル5ペプチドフラグメントを生じない組織の抽出物は、クリングル5ペプチドフラグメント抗血清から、放射性標識されたクリングル5ペプチドフラグメントを置換しない。このような置換曲線は、組織及び体液中のクリングル5ペプチドフラグメント測定するためには、クリングル5ペプチドフラグメントアッセイが有用であることを示している。
クリングル5ペプチドフラグメントを含む組織抽出物はまた、アリコートを逆相HPLCに付すことによって特徴決定されてもよい。溶離物画分を集め、Speed Vacで乾燥し、RIA緩衝液で再構成し、クリングル5RIAで分析する。この場合、最大量のクリングル5ペプチドフラグメント免疫反応性は、クリングル5ペプチドフラグメント溶離位置に対応する画分に位置している。
前記アッセイキットは、使用説明書、抗血清、クリングル5ペプチドフラグメント、及びおそらくは放射性標識されたクリングル5ペプチドフラグメント及び/又は結合されたクリングル5ペプチドフラグメントの沈殿用試薬/クリングル5抗体複合体を提供するであろう。このようなキットは、生物液、及び腫瘍のある、及び腫瘍のない動物及びヒトの組織の抽出物におけるクリングル5ペプチドフラグメントの測定に有用であろう。
組織及び細胞内のクリングル5ペプチドフラグメントを視覚化するか、あるいは位置決定するために、別のキットを用いることもできる。例えば免疫組織化学技術及びこのような技術を用いるキットは、通常の当業者によく知られている。当分野で知られているように、免疫組織化学キットは、クリングル5ペプチドフラグメント抗血清を提供し、おそらくは遮断血清も提供し、蛍光分子例えばフルオロセインイソチオシアネートに結合するか又は第一抗血清を視覚化するのに用いられるなんらかの他の試薬に結合した第二抗血清をも提供するであろう。この方法を用いることによって、生検された腫瘍を、クリングル5ペプチドフラグメント産生部位について、あるいはクリングル5ペプチドフラグメント受容体部位について検査することができる。あるいはまた、キットは、クリングル5ペプチドフラグメントメッセンジャーRNAを突き止めるために、in situハイブリダイゼーションに用いられる放射性標識された核酸を供給することができる。
本発明の化合物は、通常の当業者によく知られた方法を用いて調製することができる。(例えばSottrup−Jensenらの「化学的繊維素溶解及び血栓溶解における進歩(Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis)」、第3巻、Davidson,J.F.、Rowan,R.M.、Samama,M.M.、及びDesnoyers,P.C.出版社レイブン・プレス(Raven Press)、ニューヨーク、1978年参照)。クリングル5ペプチドフラグメントの調製方法の1つは、天然タンパク質(グルプラスミノーゲン)あるいはその変異体の酵素開裂による方法である(これは、完全な長さのタンパク質の端を切り取った形態を意味し、これは酵素消化によって分割を受けやすく、これは前記のような少なくとも1つのクリングル5配列、例えばリス−プラスミノーゲン(lys−plasminogen)又はミニプラスミノーゲンを含んでいる)。この方法ではまず、プラスミン阻害剤の不存在下に、ヒト血漿からタンパク質を単離し、これによってグル−プラスミノーゲン(glu−plasminogen)のリス−プラスミノーゲンへの転換を促進する必要がある(Novokhatny,V、及びKudinov,S.A.の「J.Mol.Biol.」第179巻、215〜232頁(1984年)参照)。ついで端を切り取った分子を、ポリペプチドからクリングル5ペプチドフラグメントを開裂するのに十分な濃度において、タンパク質分解酵素で処理し、ついで当業者に知られた手段によって残りのフラグメントから精製する。好ましいタンパク質分解酵素は、ヒト又はブタエラスターゼであり、これは、プラスミノーゲン及び端を切り取ったその変異体をクリングル部位3−4と4−5の間で開裂する(及びこれによって、クリングル1−3及び1−4、あるいはクリングル4又は5のみを含むペプチドフラグメントを形成することができる)。例えばリス−プラスミノーゲン又はグル−プラスミノーゲンは、緩衝溶液(例えばTris−HCl、NaCl、燐酸ナトリウム等)中において、リス−プラスミノーゲン:エラスターゼ比約1:100〜1:300で(好ましくは比1:150〜1:250、最も好ましくは比1:150で)ブタ又はヒト好中球エラスターゼで処理してもよい。あるいはまたエラスターゼは、開裂産物の精製を容易にするために、まず(例えば樹脂へ)不動態化されてもよい。グル−プラスミノーゲン又はリス−プラスミノーゲンは一般に、所望の開裂程度に従って、約10℃から約40℃の温度で、約4〜約24時間の間、ヒト又はブタエラスターゼで処理される。グル−プラスミノーゲン、リス−プラスミノーゲン、あるいはミニプラスミノーゲンのヒト又はブタエラスターゼでの完全な消化を行なうためには、室温において少なくとも約12時間、これらのポリペプチドの酵素への曝露が必要である。pH及び酵素への曝露時間を変えると、影響を受けやすい開裂部位の1つ又はそれ以上において、結果としてより少ない、あるいは部分的開裂を生じる。ついで開裂産物は、この技術でよく知られたあらゆる手段(例えばカラムクロマトグラフィー)によって精製される。好ましい精製図式は、開裂産物を、実施例14に記載されているリジンセファロースカラムに適用することである。
クリングル5ペプチドフラグメントの固相合成
本発明の新規な化合物の製造方法を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。
実施例1
N−Ac−Val−Leu−Leu−Pro−Asp−Val−Glu−Thr−Pro−Ser−Glu−Glu−Asp−NH2
Perkin Elmer/Applied Biosynthesisの“Synergy”ペプチドシンセサイザーのペプチド合成カラムの位置にアミドペプチド合成カラム(Applied Biosystems)を配置し、以下の合成手順を使用した。
1.樹脂をDMFで約5分間溶媒和する。
2.DMF中の20%ピペリジンで約15分間処理して樹脂結合アミノ酸のα−N−末端からFmoc基を脱ブロックする。
3.樹脂をDMFで約5分間洗浄する。
4.DMSO−NMP(N−メチルピロリドン)中のHBTU(25μモル)とHOBT(25μモル)との0.25M溶液と、DMSO−NMP中のジイソプロピルエチルアミン(25μモル)の0.4M溶液とを用いてアミノ酸No.1(Fmoc−Asp(β−OtBu)、25μモル)のα−C末端を活性化し、活性化アミノ酸を樹脂に結合させる。
5.活性化Fmoc保護アミノ酸(段階5で調製)をDMF中の樹脂結合アミノ酸(段階2で調製)に約30分間結合させる。
6.DMFで5分間洗浄する。
7.以下のアミノ酸を用いて段階3から6までを繰り返す。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
3. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
4. Fmoc−Ser(tBu)
5. Fmoc−Pro
6. Fmoc−Thr(tBu)
7. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
8. Fmoc−Val
9. Fmoc−Asp(β−OtBu)
10. Fmoc−Pro
11. Fmoc−Leu
12. Fmoc−Leu
13. Fmoc−Val
8.段階4及び5の条件で樹脂結合ペプチドのa−N−末端に酢酸を結合させる。
9.THFで樹脂を約5分間洗浄してDMFを除去し、樹脂を収縮させ、次いでアルゴンで10分間、更に窒素で10分間乾燥して清浄な樹脂結合ペプチドを得る。
10.開裂試薬(新しく調製したチオアニソール(100μl)、水(50μl)、エタンジチオール(50μl)及びトリフルオロ酢酸(1.8ml)をこの順序で−5℃〜−10℃で混合する)と共に0℃で10〜15分間、更に室温で1.75時間(Arg(Pmc)が存在する場合は各Arg(Pmc)毎に更に0.5時間)撹拌することによって、アミノ酸側鎖を脱保護しながら同時にペプチドを樹脂から開裂する。開裂試薬の使用量は以下の式によって決定した。
11.生成物を純粋なトリフルオロ酢酸で濾過及び洗浄し、約8mlの低温ジメチルエーテルを収容した遠心管に0.5mlの部分量の濾液を添加し、遠心し、傾瀉し、全部のペプチドが沈殿するまでこのプロセスを繰り返す(エーテルの添加によってペプチドが沈殿しなかったときは、混合物を30%酢酸水溶液で抽出し(3×1ml)、水性抽出物を集めて凍結乾燥させると生成物が得られた)。
12.粗ペプチドを用いるか、または、5%−100%アセトニトリル−(水、0.1%TFA)の勾配濃度の溶媒混合物と共に7μmのSymmetry Prep C18カラム(7.8×300mm)で50分間HPLC処理し次いで凍結乾燥することによってペプチドを精製し、35mgのN−Ac−Val−Leu−Leu−Pro−Asp−Val−Glu−Thr−Pro−Ser−Glu−Glu−Asp−NH2を得る。
実施例2
N−Ac−Met−Phe−Gly−Asn−Gly−Lys−Gly−Tyr−Arg−Gly−Lys−Arg−Ala−Thr−Thr−Val−Thr−Gly−Thr−Pro−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、アミノ酸No.1としてFmoc−Proを用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用いて以下のアミノ酸を添加し、35mgのN−Ac−Met−Phe−Gly−Asn−Gly−Lys−Gly−Tyr−Arg−Gly−Lys−Arg−Ala−Thr−Thr−Val−Thr−Gly−Thr−Pro−NH2を調製した。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Thr(tBu)
3. Fmoc−Gly
4. Fmoc−Thr(tBu)
5. Fmoc−Val
6. Fmoc−Thr(tBu)
7. Fmoc−Thr(tBu)
8. Fmoc−Ala
9. Fmoc−Arg(Pmc)
10. Fmoc−Lys(Boc)
11. Fmoc−Gly
12. Fmoc−Arg(Pmc)
13. Fmoc−Tyr(tBu)
14. Fmoc−Gly
15. Fmoc−Lys(Boc)
16. Fmoc−Gly
17. Fmoc−Asn(Trt)
18. Fmoc−Gly
19. Fmoc−Phe
20. Fmoc−Met
実施例3
Ac−Gln−Asp−Trp−Ala−Ala−Gln−Glu−Pro−His−Arg−His−Ser−Ile−Phe−Thr−Pro−Glu−Thr−Asn−Pro−Arg−Ala−Gly−Leu−Glu−Lys−Asn−Tyr−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、アミノ酸No.1としてFmoc−Tyr(tBu)を用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用いて以下のアミノ酸を添加し、40mgのN−Ac−Gln−Asp−Trp−Ala−Ala−Gln−Glu−Pro−His−Arg−His−Ser−Ile−Phe−Thr−Pro−Glu−Thr−Asn−Pro−Arg−Ala−Gly−Leu−Glu−Lys−Asn−Tyr−NH2を調製した。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asn(Trt)
3. Fmoc−Lys(Boc)
4. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
5. Fmoc−Leu
6. Fmoc−Gly
7. Fmoc−Ala
8. Fmoc−Arg(Pmc)
9. Fmoc−Pro
10. Fmoc−Asn(Trt)
11. Fmoc−Thr(tBu)
12. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
13. Fmoc−Pro
14. Fmoc−Thr(tBu)
15. Fmoc−Phe
16. Fmoc−Ile
17. Fmoc−Ser(tBu)
18. Fmoc−His(Trt)
19. Fmoc−Arg(Pmc)
20. Fmoc−His(Trt)
21. Fmoc−Pro
22. Fmoc−Glu(γ−OtBu)
23. Fmoc−Gln(Trt)
24. Fmoc−Ala
25. Fmoc−Ala
26. Fmoc−Trp
27. Fmoc−Asp(β−OtBu)
28. Fmoc−Gln(Trt)
実施例4
N−Ac−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Trpをアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、20mgのN−Ac−Arg−Asn−Pro−Asp−Gly−Asp−Val−Gly−Gly−Pro−Trp−NH2を調製した。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Pro
3. Fmoc−Gly
4. Fmoc−Gly
5. Fmoc−Val
6. Fmoc−Asp(β−Ot−Bu)
7. Fmoc−Gly
8. Fmoc−Asp(β−Ot−Bu)
9. Fmoc−Pro
10. Fmoc−Asn(Trt)
11. Fmoc−Arg(Pmt)
実施例5
N−Ac−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、10mgのN−Ac−Tyr−Thr−Thr−Asn−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2を調製した。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Leu
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Arg(Pmc)
7. Fmoc−Pro
8. Fmoc−Asn(Trt)
9. Fmoc−Thr(tBu)
10. Fmoc−Thr(tBu)
11. Fmoc−Tyr(tBu)
実施例6
N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2(4mg)を調製した。MS(FAB)m/z995(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Leu
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Arg(Pmc)
7. Fmoc−Pro
実施例7
N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2
実施例1に記載の合成手順を用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2(6mg)を調製した。MS(ESI)m/z832(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Tyr(tBu)
3. Fmoc−Leu
4. Fmoc−Lys(Boc)
5. Fmoc−Arg(Pmc)
6. Fmoc−Leu
実施例8
N−Ac−Pro−Glu−Lys−Arg−Tyr−Asp−Tyr−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Pro−Glu−Lys−Arg−Tyr−Asp−Tyr−NH2(6mg)を調製した。MS(FAB)m/z(1101)(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Arg(Pmc)
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Glu
7. Fmoc−Pro
実施例9
N−Ac−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−Tyr−NH2(8mg)を調製した。MS(ESI)m/z898(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Leu
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Arg(Pmc)
実施例10
N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I−Tyr−Asp−Tyr−NH2(配列番号13)
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I−Tyr−NH2(2mg)を調製した。MS(ESI)m/z(1121)(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−3−I−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Leu
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Arg(Pmc)
7. Fmoc−Pro
実施例11
N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I−Tyr−NH2(配列番号14)
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−3−I−Tyr(tBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I−Tyr−NH2(2.5mg)を調製した。MS(ESI)m/z1121(M+H)+。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Asp(β−OtBu)
3. Fmoc−Tyr(tBu)
4. Fmoc−Leu
5. Fmoc−Lys(Boc)
6. Fmoc−Arg(Pmc)
7. Fmoc−Pro
実施例12
N−Ac−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2
実施例1に記載の合成手順を用い、Fmoc−Asp(β−OtBu)をアミノ酸No.1として用いて標題化合物を調製した。指定された条件を用い以下のアミノ酸を添加して、2mgのN−Ac−Lys−Leu−Tyr−Asp−NH2(2mg)を調製した。
No. アミノ酸
2. Fmoc−Tyr(tBu)
3. Fmoc−Leu
4. Fmoc−Lys
実施例13
N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I125−Tyr535−NH2及びN−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I125−Tyr533−Asp−Tyr−NH2(配列番号13及び配列番号14)の混合物の調製及び分離
80mlのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)中の30μgのN−アセチル−プロリル−アルギニル−リシル−ロイシル−チロシル−アスパルチル−チロシルアミドの溶液に、1つのヨードビーズ(Pierce,Rockford,IL)と100μCiのNaI125とを添加した。10分後、反応混合物をWaters C18−Light SepPackカラムに導入し、水で溶出させ、次いでCH3CN/水の1:1混合物中の0.1%TFAで溶出させることによって余剰のNaI125試薬を除去し、3×200μlの画分を収集すると、Tyr533−及びTyr535−放射性標識ペプチド混合物が得られた。
ホットペプチド混合物を、等モル量の低温キャリア、N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I−Tyr−NH2及びN−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I−Tyr−Asp−Tyr−NH2の溶液と共に、C18 HPLCカラムに注入した。カラムの溶出時間を夫々36分及び38分に設定しておいた。実施例1の溶媒系による溶出を繰り返し、適当な画分を集めて凍結乾燥すると、所望の化合物N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I−Tyr−NH2が最少量の不純物N−Ac−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I−Tyr−Asp−Tyr−NH2と共に得られた。
汎用方法
実施例14
クリングル5ペプチドフラグメントの単離及び精製
Powellらの方法(Arch Biochem.Biophys.248(1):390−400(1986)、参照によって本発明に含まれるものとする)を修正した方法を用い、Lysプラスミノーゲン(Lys−HPg,Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)をブタエラスターゼ(SIGMA,St.Louis,MO)で消化することによってクリングル5ペプチドフラグメントを調製した。1.5mgのブタエラスターゼを、200mgのLys−HPgと共に、50mMのトリス−HCl,pH8.0中でインキュベートし、室温で一夜振盪した。DPF(ジイソプロピルフルオロホスフェート、SIGMA)を最終濃度1mMまで添加することによって反応を終了させた。混合物を更に30分間振盪し、50mMのトリス,pH8.0に一夜透析し、濃縮した。開裂されたプラスミノーゲンを、2.5cm×15cmのリシン−セファロース4Bカラム(Brockway,W.J.and Castellino,F.J.,Arch.Biochem.Biophys.151:194−199(1972)、参照によって本発明に含まれるものとする)に載せ、50mMのトリス,pH8.0によって吸光度0.05(280nm)に達するまで平衡させた。(この段階は、クリングル1領域及び/またはクリングル4領域(双方がリシンに結合する)を含むフラグメントを完全に除去するために行った)。吸収されないクリングル5ペプチドフラグメントを、50mMのNa2PO4バッファ,pH5.0に透析し、次いで、同じバッファで平衡させたBioRad Mono−Sカラムに導入した。開裂したクリングル5の部分、未切断のミニ−HPg及び残留プロテアーゼドメイン画分を、20mMの燐酸塩/1MのKCl,pH5.0の0−20%、20−50%及び50−70%の段階勾配によって溶出させた。50%の段階に溶出したクリングル5ペプチドフラグメントをゲル電気泳動によって測定した。収集したピークを20mMのトリス,pH8.0に一夜透析した。
分離したクリングル5フラグメントは銀染色(Coomasie Blue)を伴うFPLCクロマトグラフィー及びDodSO4/PAGEによって少なくとも95%純度であると測定された。精製フラグメントのアミノ末端部分の配列解析から、VLLPDVETPS、VAPPPVVLL及びVETPSEEDのα−N−末端配列を有する3つのポリペプチドの存在が判明した。夫々の配列は配列番号1のアミノ酸位置Val449−Ser458、Val443−Leu450及びVal454−Asp461に対応する。
実施例15
内皮増殖アッセイ
水性非放射性細胞増殖キットCell Titer 96(Promega Corporation,Madison,WI)を使用し、内皮細胞のin vitro増殖を、Lingenら,Laboratory Investigation,74:476−483(1996)に記載の手順で測定した。この文献に記載の方法は参照によって本発明に含まれるものとする。10%のドナー仔ウシ血清と1%のBSA(ウシ血清アルブミン、GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)とを含むダルベッコの改質イーグル培地(DMEM)中の96ウェルのプレートに、ウシ毛様(副腎)内皮細胞をウェルあたり1,000細胞の密度で平板培養した。8時間後、0.1%のBSAを含むDMEM中で細胞を一夜飢餓させ、次いで、特定濃度の阻害物質と5ng/mlのbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)とを含む培地を補給した。基準量として非刺激(即ちbFGF非添加)の細胞、及び、最大増殖としてbFGF単独刺激(即ち阻害物質非添加)の細胞を使用し、アッセイの結果を双方の細胞に対して補正した。多数の実験を総合し、結果をbFGF単独刺激細胞に比較した細胞数の変化のパーセントで表した。
実施例16
内皮細胞移動アッセイ
本質的にPolverini,P.J.ら,Methods Enzymol,198:440−450(1991)に記載の手順で内皮細胞移動アッセイを実施した。この文献に記載の方法は参照によって本発明に含まれるものとする。簡単に説明すると、ウシ毛様(副腎)内皮(BCE)細胞(Judah Folkman,Harvard University Medical Schoolから入手)を、0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するDMEM中で一夜飢餓させた。次に、トリプシンで細胞を収集し、0.1%のBSAを加えたDMEMに1.5×106細胞/mlの濃度で細胞を再浮遊させた。48ウェルの改質ボイデンチェンバー(Nucleopore Corporation,Cabin John,MD)の底部に細胞を加えた。チェンバーを組立てて倒立させ、0.1%のゼラチンに一夜浸漬させて乾燥させた走化性ポリカーボネート膜(ポアサイズ5μm)に37℃で2時間付着させた。次にチェンバーを再度倒立させ、上室のウェルに被験物質を(総量50μlまで)加えた。次に装置を37℃で4時間インキュベートした。膜を回収し、定着させ、染色し(DiffQuick、Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)、10個の高倍率視野あたりの上室に移動した細胞の数をカウントした。DMEM+0.1%BSAに対するバックグラウンド移動を減算し、データを10個の高倍率視野(400×)あたりの移動細胞数として記録するか、または、多数実験の結果を総合する場合には陽性対照に比較した移動阻害パーセントとして記録した。結果を表1に示す。
実施例17
内皮細胞のin vitro増殖に対するクリングル5ペプチドフラグメントの効果
内皮細胞増殖に対するクリングル5ペプチドフラグメントの効果を前述の内皮細胞増殖アッセイを用いてin vitroで測定した。これらの実験のためには、クリングル5ペプチドフラグメントを実施例1から14に記載の手順で調製し、bFGFを最大増殖対照として用い、約100〜1,000pMの範囲の種々の濃度で試験した。配列番号3のクリングル5ペプチドフラグメントは、BCE細胞増殖を用量依存的に阻害する効果を有していた。50%阻害(ED50)を達成するために必要な配列番号3のクリングル5ペプチドフラグメントの濃度は約300pMであった。対照的に、クリングル1−4のED50は135nMであった。
BCE細胞の増殖阻害に対する他のクリングルペプチドフラグメントの効果を表1にまとめる。クリングル3ペプチドフラグメントが最低のBCE細胞増殖阻害効果を示し(ED50=460nM)、次いでクリングル1ペプチドフラグメント(ED50=320nM)、クリングル1−4ペプチドフラグメント(ED50=135nM)、クリングル1−3ペプチドフラグメント(ED50=75nM)の順に有効であった。クリングル5ペプチドフラグメントは最大のBCE細胞増殖阻害効果を有しており、ED50=0.3nMを示した。
実施例18
内皮細胞のin vitro移動に対するクリングル5ペプチドフラグメントの効果
また、内皮細胞のin vitro移動に対するクリングル5ペプチドフラグメントの効果も前述の内皮細胞移動アッセイを用いて測定した。クリングル5ペプチドフラグメントはBCE細胞の移動を用量依存的に阻害し、ED50は約300pMであった。BCE細胞の最大阻害に必要なクリングル5ペプチドフラグメントの濃度で、PC−3細胞及びMDA486細胞も阻害された。この結果を実施例2の結果と総合すると、クリングル5ペプチドフラグメントは被刺激BCE細胞の増殖及び移動の双方を内皮細胞特異的に阻害する能力を有している。この阻害能能力は、正常細胞特異的または腫瘍細胞特異的でない。
上記の記載は本発明の単なる代表例であり、本発明は開示された化合物に限定されない。当業者に自明の変更及び変化は請求の範囲に定義された本発明の範囲及び要旨に包含される。
表1は、BCE細胞のin vitroの増殖及び移動に対して種々のクリングルフラグメントが示した阻害から得られたED50の値をまとめたものである。表中、各クリングルペプチドフラグメントの配列を、配列番号1に対する相同性に従って表す。記号“*”はMarti,D.ら,Eur.J.Biochem.,219:455−462(1994)から得られたデータを示す。この文献のデータは参照によって本発明に含まれるものとする。また、記号“−”はデータがないことを示す。
実施例19
Pichia pastoris中のクリングル5フラグメントの組換え発現
A.クリングル5フラグメントをコードするcDNAのPCRによる産生
真核細胞宿主及び原核細胞宿主の双方におけるクローニング及び発現に用いるために、(1)配列番号1のアミノ酸位置450−543(以後、K5Aと呼ぶ)、(2)配列番号1のアミノ酸位置450−546(以後、K5Fと呼ぶ)、(3)配列番号1のアミノ酸位置355−543(以後、K4−5Aと呼ぶ)、及び、(4)配列番号1のアミノ酸位置355−546(以後、K4−5Fと呼ぶ)、から成るグループから選択されたアミノ酸配列を有するクリングル5ペプチドフラグメントをコードするcDNAフラグメントをPCRによって作製した。ヒトプラスミノーゲンをコードするcDNA(Dr.E.Reich,State University of New York,Stony Brook,NYから入手)を鋳型として用い、以下の順方向プライマー及び逆方向プライマーのセット(Operon Technologies,Inc.Alameda,CA)を用いてDNAフラグメントを作製した。
配列番号2と配列番号4(K5A)、配列番号2と配列番号5(K5F)、配列番号3と配列番号8(K4−5A)、配列番号3と配列番号5(K4−5A)のプライマーセットを用い、標準PCR条件下、即ち、200μMの各dNTP(NはA、T、G及びC)と、0.2μMの各プライマーと、約10ngの鋳型DNAと1単位のVent(登録商標)DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)とを含む反応総量100μlでPCR増幅を実施した。DNAサーマルサイクラー480(Perkin Elmer,Foster City,CA)を使用し、合計25サイクル(1サイクル=94℃で1分、48℃で2分、72℃で1分)の処理によって増幅を実施した。増幅後、PCR産物をゲル精製し、BamHI及びXhoI(New England Biolabs)で消化し、同じ酵素で切断した修飾Pichia発現ベクター(pHil−D8、後記参照)に結合させ、電気穿孔によってHB101細胞(BioRad)を形質転換した。DNAを個々のクローンから調製し、制限酵素で消化し、配列解析して、正しい配列のインサートを適正方向で含んでいたクローンを同定した。Pichia pastoris菌GS115株(Invitrogen,Carlsbad,CA)を製造業者の指示通りに用い、陽性であると同定されたクローンに由来のプラスミドによって形質転換した。Pichia中の陽性クローンを同定するために、細胞を5mlのBMGY培地(Invitrogen)で29℃で一夜増殖させ、遠心によって収集し、発現のために0.5mlのBMMY培地(Invitrogen)に再浮遊させた。29℃で2日間インキュベーション後、培養上清を収集し、公知の技術に従ってアリコートをSDS−PAGE及びウェスタンブロット分析によって処理した。SDS−PAGEゲルを図6に示す。
B.発現ベクターpHil−D8の構築
組換えタンパク質を分泌させる合成リーダー配列を含むようにベクターpHil−D2(Invitrogen)を修飾することによってPichia発現ベクター,pHil−D8を構築した(図5参照)。
は、KEX2開裂を行うようにプロペプチド配列(太字部分)に作動可能に連結されたPHO1分泌シグナル(下線部分)をコードしている。pHil−D8を構築するために、pHil−S1(Invitrogen)を鋳型として用いてPCRを実施した。その理由はこのベクターが、PHO1をコードする配列と、pHil−S1のヌクレオチド509−530に対応する順方向プライマー(配列番号7)と、PHO1分泌シグナルの後半部分をコードするヌクレオチド配列(配列番号9のヌクレオチド45−66)及びプロペプチド配列(配列番号9のヌクレオチド67−108)を有する逆方向プライマー(配列番号8)とを含むからである。プライマー配列(Operon Technologies,Inc.Alameda,CA)を以下に示す。
実施例19と同様に25サイクルの処理によって増幅を実施した。PCR産物(約500bp)をゲル精製し、BlpI及びEcoRIで切断し、同じ酵素で切断したpHil−D2に結合させた。DNAで大腸菌HB101株を形質転換させ、制限酵素消化及び配列解析によって陽性クローンを同定した。適正配列を有する1つのクローンをpHil−D8と命名した。
実施例20
細菌中のクリングル5ペプチドフラグメントの組換え発現
使用した制限酵素または他の修飾酵素並びに他の試薬は市販製品から入手した。Abbott Laboratoriesにおいて全自動シンセサイザーを使用し、当業界で公知の標準方法によってプライマーを合成した。
細菌細胞(大腸菌)中のクローニング及び発現に用いるために、クリングル5ペプチドフラグメントのDNAを同じくPCR増幅によって作製した。汎用方法を用い、終止コドン含有または非含有の所望のコーディング領域のPCRフラグメントを作製し、末端をキナーゼ処理し、フラグメントを選択ベクターに直接クローニングした。次に、ベクター構築物によって適当な宿主細胞を形質転換させ、ベクタープライマーを用いたPCRによってコロニーをスクリーニングしてインサートの存在を確認した。インサートの方向を判定するために、1つのベクタープライマーと1つのインサートプライマーとを用い、インサート陽性クローンを示すPCR反応物を指向性PCRによって処理した。
A.平滑化しホスファターゼ処理したベクターの調製
クリングル5ペプチドフラグメントの細菌産生に有用な発現ベクターの種類を表2に示す。
最初に、Qiagenカラムを製造業者(QIAGEN,Inc.,Santa Clarita,CA)の指示通りに使用し、全部のベクターを単離及び精製した。100μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)を含有する20μlのNEB4バッファ(New England Biolabs)中で、ベクターDNA(1μg)を適当な制限酵素(表2参照)によって消化した。反応物を簡単に遠心し、20μlの脱イオンH2O、0.4μlのdNTPミックス(Pharmacia(登録商標);20mMの各dNTP)及び0.25μlのクローン化したpfu DNAポリメラーゼ(Stratagene(登録商標);2.5単位/μl)を添加し、反応混合物を65℃で20分間インキュベートしてベクターの末端を埋め戻した。反応混合物を再度簡単に遠心し、4μlの希釈した仔ウシ腸ホスファターゼ(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD;合計5単位)を添加した。次に、混合物を50℃で1時間インキュベートした。5μlの10%SDS、2μlの5MのNaCl、2μlの0.5MのEDTA及び45μlのH2Oを添加し、反応物を簡単に遠心し、次いで65℃で20分間インキュベートした。反応物を次に、バッファ飽和フェノール−クロロホルム(GIBCO BRL)で3回抽出し、クロロホルムで1回抽出した。水相をCHROMA SPIN(登録商標)100TEカラム(CLONTECH,Palo Alto,CA)で精製した。
B.PCRによるDNAフラグメントの作製
公表されているヒトプラスミノーゲンの配列(配列番号12参照)に基づいてPCRプライマーを設計及び注文した。得られたプライマーの配列を以下に示す。
特に注釈がない限り、全部のPCRは、200μMの各dNTPと1μMの各プライマーとを用い、pfu DNAポリメラーゼ及びバッファ(Stratagene(登録商標)によって実施した。使用したプライマーセットは、配列番号11と配列番号13(K5A)、配列番号10と配列番号13(K4−5A)であった。K4−K5Aを含有するベクターpHil−D8(実施例19に記載)を鋳型として使用した。形質転換物中のpHil−D8ベクターに起因するバックグラウンドを除去するために、このDNAを鋳型として使用する前にDraIによって消化した(クリングル領域の外部で多数の切断部を形成)。50μlのPCR反応物あたり約10ngの鋳型を使用した。PCR反応物を、94℃で2分間処理し、次いで94℃で30秒、49℃で1分、72℃で4分のサイクルを15回繰り返し、次いで72℃で7分間処理した。PCR反応後、0.5μlの100mMのATPと5単位のT4キナーゼとを添加し、反応物を37℃で20分間インキュベートし、末端をキナーゼ処理した。次いで、結合に使用するために、反応物を68℃で15分間加熱し、S400−HRスピンカラム(Pharmacia(登録商標))で精製した。
C.発現ベクター内へのPCRフラグメントの結合
6つの組換え構築物(詳細には、(i)UpET−PS3中のK5A、(ii)pET32a中のK5A、(iii)UpET−PS3中のK4−5A、(iv)UpET−Ubi中のK4−5A、(v)pET32a中のK4−5A及び(vi)pGEX−4T−2中のK4−5A)を以下のごとく作製した。高速結合キットを製造業者(BOEHRINGER−MANNHEIM Corp.Indianapolis,IN)の指示通りに用い、平滑化しホスファターゼ処理したベクター(前述の段階Aから1μl)とPCRフラグメント(前述の段階Bから1μl)とを、総量5.5μlに結合した。次に、製造業者の指示通りに用いた20μlのコンピテント細胞(XL1−Blue Supercompetent細胞またはXL2−Blue Ultracompetent細胞(StratageneR))を結合混合物(1μl)によって形質転換させた。組換え細胞をLB−Amp寒天プレート(MicroDiagnostics,Lombard,IL)で選択した。
D.発現研究
pGEXベクターは大腸菌のXL1−BlueまたはXL2−Blueで発現した。他の全部のベクターを単離し、製造業者の指示に従って大腸菌BL21(DE3)(Novagen)の形質転換に使用した。個々のコロニーを2.5mlのLB/Ampに接種し、225rpm、37℃で一夜振盪した。一夜培養物(0.5ml)を次に、250mlのフラスコに入れた50mlのLB/Ampに接種し、225rpm、37℃で、OD600が0.5−0.6になるまで振盪した。次に、イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG、100mM)を最終濃度1mMまで添加した。培養物を225rpm、30℃で3時間振盪してから遠心によって沈殿させた。SDS−PAGE用のサンプルを公知技術に従って調製した。予備実験は、K5A/pET32a、K4−5A/pET32a及びK4−5A/pGEXを有する細胞が組換えタンパク質を最も多く産生することを示した。次にこれらのクローンの培養物が可溶性発現であるか不溶性発現であるかをSDS−PAGEによって分析した。図7に示すように、K5A/pET32aはほぼ完全に可溶性の組換えタンパク質を産生したが(Trx−K5AのレーンS及びP比較)、K4−5A/pET32a及びK4−5A/pGEXは約75%可溶性のタンパク質を産生した。
E.Abbott修飾ベクターの構築
i.VB1、VB2、VB3及びVB4カセットの調製
平均的な当業者に公知の技術を用い、VB1、VB2、VB3及びVB4を合成DNAとして作製した。synVB1、synVB2、synVB3及びsynVB4の配列を以下に示す。
合成配列の各々を二重鎖にし、製造業者の指示に従ってpCR−Script Cam(登録商標)を用いることによってクローニングした。次に、正しい配列のクローンを標準手順によって単離した。5μgの精製DNAを、100μg/mlのBSAを含有する1×NEB4バッファ中の20μlの反応物中で8単位のBsmBIによって55℃で消化した。反応物を簡単に遠心し、20μlの脱イオンH2Oと0.04μlのdNTPミックス(Pharmacia(登録商標);20mMの各dNTP)と0.25μlのクローン化したpfu DNAポリメラーゼ(Stratagene(登録商標);2.5単位/μl)とを添加し、反応物を65℃で20分間インキュベートして末端を埋め戻した。次に、DNAを0.5×のトリス−酢酸塩−EDTAバッファ(TAE)中の3%MetaPhor(登録商標)アガロースゲル(FMC,Rockland,Maine)に流した。カセットバンドを切り出し、ゲルを凍結させ、バッファをUltrafree(登録商標)プロバインドカートリッジ(MILLIPORE Corp.,Bedford,MA)で遠心することによってDNAを溶出させ、次いでPellet Paint(登録商標)(Novagen)をキャリアとして用いたイソプロパノール沈殿によって処理した。DNA(cfVB1,cfVB2,cfVB3,cfVB4)を70%のエタノールで洗浄し、簡単に乾燥し、25μlのトリス−EDTA(TE)バッファに再懸濁させた。
ii.UpETの構築
ベクターpET21d(Novagen)をSapIで消化し、先ずT4 DNAポリメラーゼ+dGTP、次いでMung Beanヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼIクレノウフラグメントの順で処理し、再結合させた。個々のコロニーをスクリーニングして、既存のSapI部位が除去されたプラスミドを選択した。このDNAを次に、NcoI+BamHIで消化し、5′−CATGTGAAGAGC−3′(配列番号19)+5′−GATCGCTCTTCA−3′(配列番号20)に結合させ、単一のSapI部位を導入した。精製し確認したクローン化DNAをSapI+HindIIIで切断し、前述のように平滑化し、ホスファターゼ処理し、cfVB1カセットと結合させ、大腸菌を形質転換して、LB−Ampプレートで平板培養した。無菌ピペット先端でLB−Amp寒天プレートのコロニーを採取し、1μMの各ベクタープライマー、即ち、5′−AGATCTCGATCCCGCGAA−3′(順方向プライマー、配列番号21)と5′−ATCCGGATATAGTTCCTC−3′(配列番号22)とを含むCostar Thermowell中の20μlのAmpliTaq(登録商標)PCRミックス(Perkin Elmer)に導入した。反応物を94℃で5分間加熱し、次いでGeneAmp9600サーマルサイクラーを用いて94℃で30秒、40℃で1分、72℃で2分のサイクルを30回繰り返した。10μlの各反応物をアガロースゲルに流した。カセットの方向を判定するために、正しいサイズの0.25μlのPCRスクリーンを、逆方向ベクタープライマーとカセットプライマー5′−CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA−3′(配列番号23)とを含む新しい反応物に添加した。反応物を上記と同じサイクルで更に10回処理した。最終ベクターを標準手順を用いて配列決定し、1つのクローンをUpETと命名した。
iii.UpET−HThの構築
クローニングに使用するために、UpETをSapIで消化し、平滑化し、ホスファターゼ処理した。これをcfVB2カセットに結合し、形質転換し、コロニーをスクリーニングし、前述のcfVB1結合と同様に配列決定した。
iv.UpET−Hの構築
クローニングに使用するために、UpETをSapIで消化し、平滑化し、ホスファターゼ処理した。これをcfVB3カセットに結合し、形質転換し、コロニーをスクリーニングし、前述のcfVB1結合と同様に配列決定した。
v.UpET−Ubiの構築
Ultma DNAポリメラーゼ及びバッファ(Perkin Elmer)と、40μMの各dNTPと、1μMの各プライマー、5′−CAGATTTTCGTCAAGACTT−3′(Ubi−5p、配列番号24)及び5′−ACCACCTCTTAGCCTTAG−3′(Ubi−3p、配列番号25)と、1.75μgの酵母DNAとを用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で1分、40℃で1分、72℃で2分のサイクルを25回繰り返し、次いで72℃で7分間処理することによって、S.cerevisiaeユビキチンのPCR用フラグメントを作製した。プライマーとして5′−CATGGTATATCTCCTTCTT−3′(pET3p−ATG、配列番号26)及び5′−TGAGCAATAACTAGCATAAC−3′(T7RevTerm、配列番号27)を用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で45秒、42℃で1分、72℃で15分のサイクルを10回繰り返し、次いで72℃で7分間処理することによって、20ngのpET15b(Novagen)からPCRフラグメントを作製した。ユビキチン及びpET15b由来のPCRフラグメントをゲル精製し、BRLT4リガーゼ及びリガーゼバッファを用いて互いに結合させた。次に、結合物を鋳型とし、Ultma DNAポリメラーゼ及びプライマー、5′−AGATCTCGATCCCGCGAA−3′(pET5p、配列番号28)及び配列番号25を用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で30秒、42℃で1分、72℃で3分のサイクルを25回繰り返し、次いで72℃で7分処理することによって、T7プロモーター−ユビキチン(T7−ユビキチン)PCRフラグメントを作製した。T7−ユビキチンPCRフラグメントをゲル精製した。
Ultma DNAポリメラーゼ(前述)を、プライマー5′−TTAGGTCTCAGGGGAGT−3′(Strom−3p、配列番号29)、キナーゼ処理したプライマー5′−TTCAGAACCTTTCCTGGCA−3′(Strom−5p、配列番号30)、及び、約20ngの鋳型(即ち、pET3b(Novagen)にクローニングしたストロメリシン)と共に用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で1分、44℃で1分、72℃で2分のサイクルを15回繰り返し、次いで72℃で7分間処理することによって、成熟ヒトストロメリシンのPCRフラグメントを作製した。ストロメリシンPCR反応物(10μl)を、40μlのBRLリガーゼ及びリガーゼバッファ中の100pMolのアニールしたオリゴ5′−AGCGGCGACGACGACGACAAG−3′(Ek−Cut−5p、配列番号31)及び5′−CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT−3′(エンテロキナーゼ開裂部位をコードするEk−Cut−3p、配列番号32)に結合させた。1μlのこの結合物を鋳型とし、配列番号29とキナーゼ処理した配列番号31とをプライマーとし、Ultma DNAポリメラーゼ及びバッファを用いて、94℃で2分間処理し、次いで94℃で1分、44℃で1分、72℃で1分のサイクルを10回繰り返し、最後に72℃で7分間処理することによってエンテロキナーゼ部位−成熟ストロメリシン(Ek−ストロメリシン)PCRフラグメントを作製した。Ek−ストロメリシンPCRフラグメントをゲル精製した。
T7−ユビキチンフラグメントとEk−ストロメリシンPCRフラグメントをBRLリガーゼ及びリガーゼバッファ中で互いに結合させた。次に、この結合物を鋳型とし、Ultma DNAポリメラーゼと、プライマーとなる配列番号28及び配列番号29とを用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で30秒、42℃で1分、72℃で6分のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃で7分間処理することによって、T7−ユビキチン−Ek−ストロメリシンPCRフラグメントを作製した。
ストロメリシン−pET3bプラスミド鋳型を、プライマーとなる配列番号26及び配列番号30と、Klen Taq(AB Peptides,St.Louis,MO)及びpfu DNAポリメラーゼと共に用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で30秒、42℃で2分、68℃で20分のサイクルを15回繰り返す処理によってPCRフラグメントを作製した。このPCRフラグメントをT7−ユビキチン−Ek−ストロメリシンPCRフラグメントと混合し、最大効率のコンピテントBRL DH5α細胞を形質転換させた。前述と同様のプラスミドDNAの単離、BL21(DE3)のトランスフェクション及び発現を行う試験によって正しいクローンを同定した。
正しいT7−ユビキチン−Ek−ストロメリシン発現プラスミドを、プライマーとなる配列番号24及び配列番号32、pfu DNAポリメラーゼと共に用い、94℃で2分間処理し、次いで94℃で30秒、40℃で1分、72℃で3分のサイクルを20回繰り返し、最後に72℃で7分間処理することによって、ユビキチン−EkのPCRフラグメントを作製した。フラグメントを、Pharmacia S−400 HRスピンカラムで精製し、高速DNA結合キットを用いてVBC1カセットに結合させた。この結合物を鋳型とし、プライマー配列番号24及び5′−TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG−3′(配列番号33)をpfu DNAポリメラーゼと共に用い、94℃で2分処理し、次いで94℃で30秒、40℃で1分、72℃で2分のサイクルを20回繰り返し、最後に72℃で7分間処理することによってPCRフラグメントを作製した。PCRフラグメントをキナーゼ処理し、平滑化し、ホスファターゼ処理してクローニング準備したUpet−Hに結合させた。結合物でコンピテント細胞を形質転換させ、前述のようにPCRによってコロニーをスクリーニングした。プラスミドDNAを配列決定し、正しいUpET−Ubiクローンを同定した。
Claims (26)
- 式:
A−B−C−X−Y (I)
〔式中、
Aは存在しないかまたは窒素保護基を表し、
Yは存在しないかまたはカルボン酸保護基を表し、
B−C−Xが、
(a)配列番号1のアミノ酸位置355−543の配列、
(b)配列番号1のアミノ酸位置443−543の配列、
(c)配列番号1のアミノ酸位置449−543の配列、
(d)配列番号1のアミノ酸位置454−543の配列、
(e)配列番号1のアミノ酸位置443−546の配列、
(f)配列番号1のアミノ酸位置525−535の配列、
(g)配列番号1のアミノ酸位置529−535の配列、
(h)配列番号1のアミノ酸位置530−535の配列、及び
(i)配列番号1のアミノ酸位置529−534の配列、
から成るグループから選択される〕を有する化合物、または、医薬として許容されるその塩もしくはエステル。 - AがN−AcでありYが−NH2であることを特徴とする請求項1に記載の化合物。
- 内皮細胞移動阻害を示すED50が100〜500pMであることを特徴とする請求項1に記載の化合物。
- 内皮細胞増殖阻害を示すED50が100〜500pMであることを特徴とする請求項1に記載の化合物。
- 式:
A−B1−C1−X1−Y (II)
〔式中、
Aは存在しないかまたは窒素保護基を表し、
Yは存在しないかまたはカルボン酸保護基を表し、
B1は存在せず、
C1は配列番号1のアミノ酸位置513からアミノ酸位置523の配列であり、
X1は存在しない〕を有する化合物、または、医薬として許容されるその塩もしくはエステル。 - AがN−Acであり、Yが−NH2であることを特徴とする請求項5に記載の化合物。
- 請求項1または5のいずれかに記載の化合物をコードする単離された一本鎖または二重鎖のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列がDNA配列であることを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- 前記DNA配列が、
(a)配列番号1のアミノ酸位置443−543の配列、
(b)配列番号1のアミノ酸位置449−543の配列、
(c)配列番号1のアミノ酸位置454−543の配列、及び、
(d)配列番号1のアミノ酸位置355−543の配列、
から成るグループから選択されたアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項8に記載の組成物。 - 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号34、配列番号35、配列番号36及び配列番号37から成るグループから選択されたアミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項8に記載の組成物。
- 請求項1または5に記載の化合物と医薬として許容される賦形剤を含む組成物。
- 請求項1または5に記載の化合物の製造方法であって、
(a)哺乳類のプラスミノーゲンをエラスターゼに1:100〜1:300の割合で接触させて前記プラスミノーゲンと前記エラスターゼとの混合物を形成する段階と、
(b)前記混合物をインキュベートする段階と、
(c)前記化合物を前記混合物から単離する段階を含む前記製造方法。 - 血管形成阻害剤として使用するための請求項1または5のいずれかに記載の化合物をコードする単離された一本鎖または二重鎖のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドによってコードされた化合物が、ヒト、アカゲザル、ウシ、マウス及びブタのクリングル5のペプチドフラグメントまたは融合タンパク質から成るグループから選択されることを特徴とする請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 前記化合物が、ヒトのクリングル5ペプチドフラグメントまたはクリングル5融合タンパク質であることを特徴とする請求項14に記載のポリヌクレオチド。
- 前記化合物が、
(a)配列番号1のアミノ酸位置355−543の配列、
(b)配列番号1のアミノ酸位置355−546の配列、
(c)配列番号1のアミノ酸位置443−543の配列、
(d)配列番号1のアミノ酸位置449−543の配列、
(e)配列番号1のアミノ酸位置454−543の配列、
(f)配列番号1のアミノ酸位置443−546の配列、
(g)配列番号1のアミノ酸位置449−546の配列、及び、
(h)配列番号1のアミノ酸位置454−546の配列、
から成るグループから選択されることを特徴とする請求項13に記載のポリヌクレオチド。 - DNA分子であることを特徴とする請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- RNA分子であることを特徴とする請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 発現ベクターであることを特徴とする請求項19に記載のベクター。
- 更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する請求項20に記載のベクター。
- 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項21に記載のベクター。
- 前記真核細胞がPichia pastorisであることを特徴とする請求項22に記載のベクター。
- 前記宿主細胞が大腸菌である原核細胞であることを特徴とする請求項21に記載のベクター。
- 請求項1または5に記載の化合物の製造方法であって、
(a)当該化合物をコードするポリヌクレオチドを単離する段階と、
(b)前記ポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする段階と、
(c)前記ベクターで適当な宿主細胞を形質転換させる段階と、
(d)当該化合物の発現に適した条件下で前記宿主細胞を増殖させる段階とから成る方法。 - (a)A−Pro−Arg−Lys−Leu−Tyr−Asp−3−I−Tyr−Y、
(b)A−Pro−Arg−Lys−Leu−3−I−Tyr−Asp−Tyr−Y、
(c)A−Pro−Glu−Lys−Arg−Tyr−Asp−Tyr−Y、及び、
(d)A−Gln−Asp−Trp−Ala−Ala−Gln−Glu−Pro−His−Arg−His−Ser−Ile−Phe−Thr−Pro−Glu−Thr−Pro−Glu−Thr−Asn−Pro−Arg−Ala−Gly−Leu−Glu−Lys−Asn−Tyr−Yから成るグループ〔式中、Aは存在しないかまたは窒素保護基であり、Yは存在しないかまたはカルボン酸保護基である〕から選択された化合物。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/643,219 | 1996-05-03 | ||
US08/643,219 US5801146A (en) | 1996-05-03 | 1996-05-03 | Compound and method for inhibiting angiogenesis |
US08/832,087 | 1997-04-03 | ||
US08/832,087 US5981484A (en) | 1996-05-03 | 1997-04-03 | Antiangiogenic peptides and methods for inhibiting angiogenesis |
PCT/US1997/007700 WO1997041824A2 (en) | 1996-05-03 | 1997-05-05 | Antiangiogenic peptides derived from plasminogen |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008290560A Division JP4722989B2 (ja) | 1996-05-03 | 2008-11-13 | 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002502235A JP2002502235A (ja) | 2002-01-22 |
JP4426650B2 true JP4426650B2 (ja) | 2010-03-03 |
Family
ID=27094211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP54016297A Expired - Fee Related JP4426650B2 (ja) | 1996-05-03 | 1997-05-05 | 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6057122A (ja) |
EP (2) | EP0910571B1 (ja) |
JP (1) | JP4426650B2 (ja) |
CN (1) | CN1152962C (ja) |
AT (1) | ATE299888T1 (ja) |
AU (1) | AU724077B2 (ja) |
BR (1) | BR9708911A (ja) |
CZ (1) | CZ298260B6 (ja) |
DE (1) | DE69733756T2 (ja) |
DK (1) | DK0910571T3 (ja) |
ES (1) | ES2246513T3 (ja) |
HK (1) | HK1021191A1 (ja) |
HU (1) | HU224827B1 (ja) |
IL (1) | IL126626A0 (ja) |
NZ (1) | NZ332319A (ja) |
WO (1) | WO1997041824A2 (ja) |
Families Citing this family (63)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5837682A (en) * | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
US5945403A (en) * | 1997-05-30 | 1999-08-31 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
US6346510B1 (en) | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
US5801012A (en) | 1996-09-17 | 1998-09-01 | Northwestern University | Methods and compositions for generating angiostatin |
WO1999000420A1 (en) * | 1997-06-26 | 1999-01-07 | Karolinska Innovations Ab | Kringle domains 1-5 of plasminogen, capable of modulating angiogenesis in vivo |
AU1598599A (en) * | 1997-11-20 | 1999-06-15 | Genetix Pharmaceuticals, Inc. | Anti-angiogenic gene therapy vectors and their use in treating angiogenesis-related diseases |
US6797488B1 (en) * | 1997-12-08 | 2004-09-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Methods of producing anti-angiogenic proteins |
ATE238414T1 (de) * | 1998-01-12 | 2003-05-15 | Searle & Co | Verfahren zur angiostatinrückfaltung |
NZ507912A (en) * | 1998-05-22 | 2002-10-25 | Abbott Lab | Nonapeptide antiangiogenic drugs |
US6774211B1 (en) | 1998-05-22 | 2004-08-10 | Abbott Laboratories | Peptide antiangiogenic drugs |
WO1999061466A1 (en) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | Abbott Laboratories | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy |
US6632961B1 (en) | 1998-05-22 | 2003-10-14 | Abbott Laboratories | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy |
US6716963B1 (en) | 1998-05-22 | 2004-04-06 | Abbott Laboratories | Peptide antiangiogenic drugs |
US6770457B1 (en) | 1998-05-28 | 2004-08-03 | Korea Green Cross Corporation | Process of purifying angiogenesis inhibitors |
US6538103B1 (en) | 1998-07-14 | 2003-03-25 | Bristol--Myers Squibb Company | Lysine binding fragments of angiostatin |
US7317003B2 (en) | 1998-09-04 | 2008-01-08 | National University Of Singapore | Small peptides having anti-angiogenic and endothelial cell inhibition activity |
KR20000018933A (ko) * | 1998-09-07 | 2000-04-06 | 김승수 | 내피세포 성장억제 활성을 가지는 사람 프로트롬빈 크링글단백질 및 이를 암호하는 유전자 |
US6371904B1 (en) * | 1998-12-24 | 2002-04-16 | Vivant Medical, Inc. | Subcutaneous cavity marking device and method |
US6356782B1 (en) * | 1998-12-24 | 2002-03-12 | Vivant Medical, Inc. | Subcutaneous cavity marking device and method |
US9669113B1 (en) | 1998-12-24 | 2017-06-06 | Devicor Medical Products, Inc. | Device and method for safe location and marking of a biopsy cavity |
US6465424B1 (en) * | 1999-02-17 | 2002-10-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-angiogenic agent and method for inhibiting angiogenesis |
US7144854B1 (en) | 1999-09-10 | 2006-12-05 | Conjuchem, Inc. | Long lasting anti-angiogenic peptides |
DE60006100T2 (de) * | 1999-05-17 | 2004-07-01 | Conjuchem, Inc., Montreal | Lang wirkende insulinotrope peptide |
WO2000070665A2 (en) * | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Conjuchem, Inc. | Long lasting anti-angiogenic peptides |
SG87828A1 (en) * | 1999-09-03 | 2002-04-16 | Univ Singapore | Small peptides having potent anti-angiogenic activity |
US6576610B1 (en) * | 1999-10-04 | 2003-06-10 | Nuvas, Llc | Use of a context-dependent functional entity to enhance the efficacy of an agent |
CO5261544A1 (es) * | 1999-11-22 | 2003-03-31 | Abbott Lab | Peptidos n-alquilados que tienen actividad antiangiogenica |
US6753408B1 (en) | 1999-11-22 | 2004-06-22 | Fortuna Haviv | Peptides having antiangiogenic activity |
US6777535B1 (en) | 1999-11-22 | 2004-08-17 | Abbott Laboratories | N-alkylated peptides having antiangiogenic activity |
US6485740B1 (en) * | 2000-03-14 | 2002-11-26 | Yutoku Pharmaceutical Ind., Co., Ltd. | Transdermal methotrexate preparations |
EP1299727B1 (en) | 2000-07-12 | 2009-04-22 | Agensys, Inc. | Novel tumor antigen useful in diagnosis and therapy of bladder, ovary, lung and kidney cancers |
WO2002020813A2 (en) | 2000-09-05 | 2002-03-14 | Karolinska Innovations Ab | Recombinant endothelial cell growth inhibitors derived from a mammalian plasminogen |
US20020159992A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-10-31 | Jack Henkin | Antiangiogenic polypeptides and methods for inhibiting angiogenesis |
UY26929A1 (es) * | 2000-09-29 | 2002-04-26 | Abbott Lab | Polipéptidos antiangiogénicos y métodos para inhibir la angiogénesis |
CA2426543C (en) | 2000-11-28 | 2007-09-18 | David M. Waisman | Anti-angiogenic polypeptides |
CN101732731B (zh) * | 2000-12-19 | 2013-04-10 | 研究发展基金会 | 慢病毒载体介导的基因转移及其用途 |
AR038957A1 (es) * | 2001-08-15 | 2005-02-02 | Pharmacia Corp | Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer |
US20030050273A1 (en) * | 2001-08-29 | 2003-03-13 | Keiya Ozawa | Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases |
US20040132644A1 (en) * | 2001-10-16 | 2004-07-08 | The Procter & Gamble Company | Composition and method for treating diabetes |
EP1581164A4 (en) * | 2002-12-13 | 2008-03-12 | Mediomics Llc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TUMOR GROWTH AND METASTASES |
US20050053993A1 (en) * | 2002-12-18 | 2005-03-10 | Davidson Donald J. | Uses of an endothelial cell receptor |
BRPI0412259B1 (pt) | 2003-07-22 | 2019-08-20 | Astex Therapeutics Limited | Compostos de 1H-pirazol 3,4-dissubstituídos como moduladores de quinases dependentes de ciclina (CDK), seus usos, processo para a preparação dos mesmos e composição farmacêutica |
US20050250694A1 (en) * | 2003-10-10 | 2005-11-10 | Ma Jian-Xing | Compounds useful in inhibiting vascular leakage, inflammation and fibrosis and methods of making and using same |
MXPA04005080A (es) * | 2004-05-27 | 2005-11-30 | Aspid S A De C V | Una composicion moduladora de la inflamacion articular cronica a base de colagena-polivinilpirrolidona. |
TWI285647B (en) * | 2004-08-20 | 2007-08-21 | Univ Nat Chunghsing | Prevention, treatment and detection of porcine progressive atrophic rhinitis |
AR054425A1 (es) | 2005-01-21 | 2007-06-27 | Astex Therapeutics Ltd | Sales de adicion de piperidin 4-il- amida de acido 4-(2,6-dicloro-benzoilamino) 1h-pirazol-3-carboxilico. |
US8404718B2 (en) | 2005-01-21 | 2013-03-26 | Astex Therapeutics Limited | Combinations of pyrazole kinase inhibitors |
CA2594477C (en) * | 2005-01-21 | 2016-07-12 | Astex Therapeutics Limited | Pharmaceutical compounds |
JP5424887B2 (ja) | 2006-11-08 | 2014-02-26 | チョンシー ユー | ペプチド及び関連化合物の経皮送達システム |
US20080287341A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Danyang Chen | Treatment of vascular abnormalities using nanoparticles |
WO2009100617A1 (zh) * | 2008-02-04 | 2009-08-20 | Shanghai First People's Hospital | 抑制血管新生的多肽及其应用 |
PL2427475T3 (pl) | 2009-05-08 | 2021-07-19 | Techfields Biochem Co., Ltd. | Kompozycje proleku o wysokim przenikaniu peptydów i związków powiązanych z peptydami |
WO2010138631A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-02 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen |
WO2011004011A1 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Thrombogenics Nv | Variants of plasminogen and plasmin |
CA2823491A1 (en) | 2011-01-05 | 2012-07-12 | Thrombogenics Nv | Plasminogen and plasmin variants |
CA2844644A1 (en) | 2011-08-12 | 2013-02-21 | Thrombogenics N.V. | Plasminogen and plasmin variants |
KR101676690B1 (ko) | 2015-08-04 | 2016-11-16 | (주) 에빅스젠 | Vegf 유도-혈관신생 억제효과를 갖는 테트라펩티드 및 이의 용도 |
KR101644440B1 (ko) | 2015-12-10 | 2016-08-01 | (주) 에빅스젠 | 개선된 혈관신생 억제용 펩티드와 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
WO2017101873A1 (zh) * | 2015-12-18 | 2017-06-22 | 深圳瑞健生命科学研究院有限公司 | 一种预防或治疗放射性和化学性损伤的方法 |
CN108463235A (zh) | 2015-12-18 | 2018-08-28 | 泰伦基国际有限公司 | 一种用于预防和治疗宫颈糜烂的方法 |
CA3047174A1 (en) | 2016-12-15 | 2018-06-21 | Talengen International Limited | Method for preventing and treating liver fibrosis |
EP3643321A4 (en) | 2017-06-19 | 2021-05-05 | Talengen International Limited | PROCEDURES FOR THE REGULATION AND CONTROL OF GLP-1 / GLP-1R AND MEDICINAL PRODUCTS |
JP6651493B2 (ja) * | 2017-12-05 | 2020-02-19 | チョンシー ユー | ペプチド及び関連化合物の経皮送達システム |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3719667A (en) | 1970-08-24 | 1973-03-06 | Lilly Co Eli | Epimerization of 6-acylamido and 6-imido penicillin sulfoxide esters |
US3840556A (en) | 1971-05-28 | 1974-10-08 | Lilly Co Eli | Penicillin conversion by halogen electrophiles and anti-bacterials derived thereby |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
GB9019120D0 (en) * | 1990-09-01 | 1990-10-17 | Beecham Group Plc | Novel compounds |
US5288489A (en) * | 1991-08-28 | 1994-02-22 | Orion Therapeutic Systems, Inc. | Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment |
US5512591A (en) * | 1993-02-18 | 1996-04-30 | President And Fellows Of Harvard College | Treatments for diseases characterized by neovascularization |
JPH09512426A (ja) * | 1994-04-26 | 1997-12-16 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | 好中球の接着および移動の遮断に有用なMac−1 I−ドメイン蛋白質 |
JP3880064B2 (ja) * | 1994-04-26 | 2007-02-14 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション | アンジオスタチンおよび血管形成の抑制におけるその使用 |
EP0869970B1 (en) * | 1995-12-13 | 2004-03-24 | The Children's Medical Center Corporation | Endothelial cell proliferation inhibitor and its use |
US5854221A (en) * | 1996-12-12 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use |
-
1997
- 1997-05-05 AT AT97925478T patent/ATE299888T1/de active
- 1997-05-05 ES ES97925478T patent/ES2246513T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-05 DE DE69733756T patent/DE69733756T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-05 WO PCT/US1997/007700 patent/WO1997041824A2/en active IP Right Grant
- 1997-05-05 EP EP97925478A patent/EP0910571B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-05 EP EP05106596A patent/EP1612272B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-05 AU AU30606/97A patent/AU724077B2/en not_active Ceased
- 1997-05-05 DK DK97925478T patent/DK0910571T3/da active
- 1997-05-05 CZ CZ0342698A patent/CZ298260B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-05-05 US US08/851,350 patent/US6057122A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-05 HU HU9903530A patent/HU224827B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-05-05 NZ NZ332319A patent/NZ332319A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-05 JP JP54016297A patent/JP4426650B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-05 BR BR9708911A patent/BR9708911A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-05-05 IL IL12662697A patent/IL126626A0/xx unknown
- 1997-05-05 CN CNB971959897A patent/CN1152962C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-08-11 US US09/131,995 patent/US5972896A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-11 US US09/132,154 patent/US6251867B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-27 HK HK99104850A patent/HK1021191A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0910571B1 (en) | 2005-07-20 |
ATE299888T1 (de) | 2005-08-15 |
JP2002502235A (ja) | 2002-01-22 |
DE69733756T2 (de) | 2006-06-01 |
EP0910571A2 (en) | 1999-04-28 |
ES2246513T3 (es) | 2006-02-16 |
CN1223690A (zh) | 1999-07-21 |
US5972896A (en) | 1999-10-26 |
EP1612272B1 (en) | 2011-06-22 |
EP1612272A2 (en) | 2006-01-04 |
EP1612272A3 (en) | 2007-05-02 |
NZ332319A (en) | 2000-09-29 |
DK0910571T3 (da) | 2005-10-31 |
AU724077B2 (en) | 2000-09-14 |
CN1152962C (zh) | 2004-06-09 |
HK1021191A1 (en) | 2000-06-02 |
IL126626A0 (en) | 1999-08-17 |
US6057122A (en) | 2000-05-02 |
AU3060697A (en) | 1997-11-26 |
WO1997041824A2 (en) | 1997-11-13 |
DE69733756D1 (de) | 2005-08-25 |
US6251867B1 (en) | 2001-06-26 |
CZ298260B6 (cs) | 2007-08-08 |
HUP9903530A2 (hu) | 2000-02-28 |
HU224827B1 (hu) | 2006-02-28 |
BR9708911A (pt) | 1999-08-03 |
WO1997041824A3 (en) | 1998-01-08 |
HUP9903530A3 (en) | 2001-12-28 |
CZ342698A3 (cs) | 1999-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4426650B2 (ja) | 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 | |
JP4722989B2 (ja) | 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法 | |
ES2292174T3 (es) | Fragmentos de angiostatina y procedimientos de utilizacion. | |
EP0964869B1 (en) | Methods and compositions for the treatment of neoplastic diseases | |
JPH022372A (ja) | 活性化されたヒトプロテインcの直接発現のためのベクターおよび化合物 | |
US6617145B2 (en) | DNA molecules encoding fibrinolytically active polypeptide | |
US20020090373A1 (en) | ADAMTS polypeptides, nucleic acids encoding them, and uses thereof | |
US7495068B2 (en) | Antiangiogenic peptides, polypeptides encoding same and methods for inhibiting angiogenesis | |
CA2255661C (en) | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy | |
KR100506571B1 (ko) | 플라스미노겐으로부터유래된맥관형성억제펩타이드 | |
WO2000049871A1 (en) | An anti-angiogenic kringle protein and its mutants | |
JP4666767B2 (ja) | プラスミノーゲンの脱グリコシル化クリングル1〜5領域フラグメント及びこれらの使用方法 | |
CA2400497A1 (en) | Methods and compositions for generating angiostatin | |
BG60507B2 (bg) | Човешки тъканен плазминогенен активатор | |
MXPA98009612A (en) | Antiangiogenic drug to treat cancer, arthritis and retinopathy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040420 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20041221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070612 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070905 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071015 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071212 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080513 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080806 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080912 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081113 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090310 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090701 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090730 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091201 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091211 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121218 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131218 Year of fee payment: 4 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |