DE69733756T2

DE69733756T2 - Antiangiogenische peptiden, dafür kodierende polynukleotide und verfahren zur hemmung der angiogenesis

Info

Publication number: DE69733756T2
Application number: DE69733756T
Authority: DE
Inventors: J. Donald DAVIDSON; Jieyi Wang; J. Earl GUBBINS
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-05-05
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-05-06
Also published as: AU3060697A; CZ342698A3; EP1612272B1; DE69733756D1; EP0910571A2; US6251867B1; AU724077B2; WO1997041824A2; EP1612272A2; EP0910571B1; CN1152962C; EP1612272A3; HUP9903530A2; JP2002502235A; BR9708911A; JP4426650B2; ES2246513T3; ATE299888T1; US5972896A; HK1021191A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Peptidchemie. Genauer betrifft die Erfindung die Herstellung und die Verwendung von Peptiden, die Aminosäuresequenzen enthalten, die im wesentlichen ähnlich sind mit den entsprechenden Sequenzen der Kringle-5-Region von Säugetierplasminogen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Peptide enthalten, Antikörper, die spezifisch sind für den Angiostatinrezeptor, Mittel für die Angiostatindetektion und -messung, cytotoxische Wirkstoffe, die an Angiostatinproteine gebunden sind und die Behandlung von Krankheiten, die durch Angiogenese entstehen oder verschlechtert werden.
Hintergrund der Erfindung
Angiogenese, der Prozess, durch welchen neue Blutgefäße gebildet werden, ist essentiell für normale Körperaktivitäten einschließlich Reproduktion, Entwicklung und Wundheilung. Obwohl der Prozess nicht vollständig verstanden ist, wird geglaubt, dass er ein komplexes Wechselspiel von Molekülen einschließt, welche das Wachstum von Endothelialzellen regulieren (die primären Zellen von kapillaren Blutgefäßen). Unter normalen Bedingungen scheinen diese Moleküle die Mikrogefäßverteilung in einem ruhendem Stadium zu erhalten (d.h., einem Stadium ohne kapillares Wachstum) für verlängerte Zeiträume, welche für Wochen oder, in einigen Fällen, Dekaden andauern können. Wenn nötig, (wie zum Beispiel während der Wundheilung), können diese selben Zellen eine schnelle Proliferation und einen Umsatz innerhalb einer 5-Tages-Periode durchmachen (Folkman, J. und Shing, Y., The Journal of Biological Chemistry, 267(16), 10931–10934, und Folkman, J. Und Klagsbrun, Mischung., Science, 235, 442–447 (1987).
Obwohl die Angiogenese ein hoch regulierter Prozess unter normalen Bedingungen ist, werden viele Krankheiten (charakterisiert als angiogene Krankheiten) durch eine andauernde unregulierte Angiogenese vorangetrieben. Anders ausgedrückt, kann eine unregulierte Angiogenese entweder eine spezielle Krankheit direkt bewirken oder einen existierenden pathologischen Zustand verschlechtern. Zum Beispiel wurde die Neovaskularisation der Augen als mit die häufigste Ursache für Blindheit in Zusammenhang gebracht und sie dominiert ungefähr 20 Augenkrankheiten. In bestimmten existierenden Zuständen, wie zum Beispiel Arthritis, dringen neu gebildete kapillare Blutgefäße in die Gelenke ein und zerstören die Knorpel. Bei Diabetes dringen neue Kapillaren, die in der Netzhaut gebildet wurden, in den Glaskörper ein, bluten und erzeugen Blindheit. Wachstum und Metastasierung von festen Tumoren sind ebenfalls abhängig von Angiogenese (Folkman, J., Cancer Research, 46, 467473 (1986), Folkman, J., Journal of the National Cancer Institute, 82, 4–6 (1989). Es wurde zum Beispiel gezeigt, daß Tumoren, die auf größer als 2 mm anwachsen, ihre eigene Blutversorgung erhalten müssen und dies damit tun, in dem sie das Wachstum von neuen kapillaren Blutgefäßen anregen. Sobald diese neuen Blutgefäße in den Tumor eingebettet werden, stellen sie ein Mittel für die Tumorzellen bereit, um in den Kreislauf einzutreten und an entfernte Stellen, wie zum Beispiel Leber, Lunge oder Knochen zu metastasieren (Weidner, N., et al., The New England Journal of Medicin, 324(1): 1–8 (1991)).
Bis jetzt wurden verschiedene natürlich vorkommende angiogene Faktoren beschrieben und charakterisiert (Fidler, J. I. und Ellis, L. M., Cell, 79: 185–189 (1994)). In jüngster Zeit haben O'Reilly et al. ein 38 Kilodalton (kDa) Protein aus Serum und Urin von Tumor-tragenden Mäusen isoliert und gereinigt, das die Endothelialzellproliferation hemmt (O'Reilly, M. et al., Cell, 79: 315–328 (1994) und Interantionale Anmeldung WO 95/29242, veröffentlicht am 2. November 1995). Die Mikrosequenzanalyse dieses Endothelialinhibitors zeigte eine 98% Sequenzhomologie zu einem internen Fragment von Rattenplasminogen. Angiostatin, wie das inhibitorische Rattenfragment genannt wurde, war ein Peptid, welches die ersten vier Kringle-Regionen von Rattenplasminogen einschloss. Ein Peptidfragment aus derselben Region von menschlichem Plasminogen (d.h. Kringle 1–4 enthaltend) hemmte ebenfalls stark die Proliferation von kapillaren Endothelialzellen in vitro und in vivo. Das intakte Plasminogen, von welchem dieses Peptidfragment abgeleitet wurde, besaß keinen so starken inhibitorischen Effekt.
Verschiedene Angiogeneseinhibitoren sind derzeit in der Entwicklung zur Verwendung bei der Behandlung von angiogenen Krankheiten (Gasparini, G. und Harris, A. L., J. Clin. Oncol., 13(3): 765–782, (1995)), aber es gibt Nachteile in Verbindung mit diesen Verbindungen. Suramin ist beispielsweise ein potenter Angiogeneseinhibitor, aber er verursacht in Menschen schwerwiegende systemische Toxizität bei Dosen, die für die Antitumorwirksamkeit erforderlich sind. Verbindungen, wie zum Beispiel Retinoide, Interferone und Antiöstrogene sind für die menschliche Verwendung sicher, aber sie haben schwache antiangiogene Effekte. Wiederum andere Verbindungen können schwer oder kostspielig in der Herstellung sein.
Es besteht somit ein Bedürfnis nach Verbindungen, die in der Behandlung von angiogenen Krankheiten in Säugetieren nützlich sind. Genauer besteht ein Bedürfnis nach Angiogeneseinhibitoren, die sicher sind für die therapeutische Verwendung und welche eine selektive Toxizität in Bezug auf den pathologischen Zustand zeigen, wie zum Beispiel die selektive Hemmung der Proliferation von Endothelialzellen, während sie keine oder einen geringen Grad an Toxizität gegenüber normalen (d.h. nicht Krebs-) Zellen zeigen. Solche Verbindungen sollten auch leicht und kosteneffektiv herzustellen sein.
Zusammenfassung der Erfindung
In ihrer Hauptausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Kringle-5-Peptid-Verbindung bereit, dargestellt durch die Strukturformel A-B-C-X-Y (I) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz, Ester oder Prodrug davon, worin A, B, C, X und Y wie in Anspruch 1 definiert sind.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung einer Verbindung ein, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder ein Kringle-5-Fusionsprotein enthält für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der eine antiangiogene Therapie benötigt.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten ein, der eine antiangiogene Therapie benötigt, die eine Verbindung umfaßt, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Kringle-5-Fusionsprotein enthält, Kringle-5-Antiseren, Kringle-5-Rezeptoragonisten und Antagonisten und Kringle-5-Antagonisten verknüpft mit cytotoxischen Wirkstoffen entweder alleine oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel und/oder wahlweise Verbindungen mit verzögerter Freisetzung, um eine therapeutische Zusammensetzung zu bilden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine Zusammensetzung für die Behandlung einer Krankheit gewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Makula-Degeneration und diabetischer Retinopathie ein, die eine Verbindung umfasst, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Kringle-5-Fusionsprotein enthält.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine Zusammensetzung ein, die eine isolierte einzel- oder doppelsträngige Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Fusionsprotein kodiert. Ein solches Polynukleotid ist vorzugsweise ein DNA Molekül. Die vorliegende Erfindung schließt auch einen Vektor ein, der eine DNA Sequenz enthält, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Fusionsprotein kodiert, worin der Vektor in der Lage ist ein Kringle-5-Peptidfragment oder ein Kringle-5-Fusionsprotein zu exprimieren, wenn er in einer Zelle vorhanden ist, und eine Zusammensetzung, die eine Zelle umfaßt, welche einen Vektor enthält, worin der Vektor eine DNA Sequenz enthält, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Kringle-5-Fusionsprotein kodiert. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin eine Zelle gemäß Anspruch 14.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Kringle-5-Peptidfragments ein, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Aussetzen von Säugetierplasminogen gegenüber menschlicher oder Schweine-Elastase in einem Verhältnis von ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:300, um eine Mischung aus diesem Plasminogen und dieser Elastase zu bilden; (b) Inkubieren der Mischung und (c) Isolieren des Kringle-5-Peptidfragments aus der Mischung.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren ein zur Herstellung eines Kringle-5-Peptidfragments, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Aussetzen von Säugetierplasminogen gegenüber menschlicher oder Schweineelastase bei einem Elastase:Plasminogen-Verhältnis von ungefähr 1:100 bis ungefähr 1:300, um eine Mischung aus der Elastase und dem Plasminogen zu bilden, (b) Inkubieren der Mischung; und (c) Isolieren eines Proteinkonjugats eines Kringle-5-Peptidfragments aus der Mischung; (d) Aussetzen dieses Proteinkonjugats des Kringle-5-Peptidfragments gegenüber Pepsin, bei einem Verhältnis von ungefähr 1:0,2, um eine Mischung aus dem Pepsin und dem Plasminogen zu bilden, und (d) Isolieren des Kringle-5-Peptidfragments aus der Mischung. Alternativ kann ein Kringle-5-Peptidfragment oder Kringle-5-Fusionsprotein durch ein Verfahren hergestellt werden, das folgende Schritte umfasst: (a) Isolieren eines Polynukleotids, welches das Kringle-5-Peptidfragment oder Kringle-5-Fusionsprotein kodiert; (b) Klonieren des Polynukleotids in einen Expressionsvektor; (c) Transformieren des Vektors in eine geeignete Wirtszelle; und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die geeignet sind für die Expression des löslichen Kringle-5-Peptidfragments oder Kringle-5-Fusionsproteins.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aminosäuresequenz von menschlichem Plasminogen (Sequenzidentifikationsnr. 1).
2 zeigt die vergleichende Homologie in Aminosäuresequenzen von menschlichem (Sequenzidentifikationsnr. 34), Maus-(Sequenzidentifikationsnr. 35), Rhesusaffen-(Sequenzidentifikationsnr. 36), Rinder-(Sequenzidentifikationsnr. 37), und Schweine-(Sequenzidentifikationsnr. 38) Kringle-5.
3 zeigt die DNA Sequenz (Sequenzidentifikationsnr. 12) von menschlichem Plasminogen.
4 zeigt ein Diagramm der antiproliferativen Wirksamkeit einer einzelnen Dosis von verschiedenen Kringle-Fragmenten auf kapillare Rinderendothelial (bovine capillary endothelial, BCE)-Zellen, wenn in einem in vitro Zellproliferationsassay getestet.
5 zeigt eine Karte des Expressionsvektors pHil-D8, der eine leader-Sequenz für die rekombinante Proteinsekretion enthält.
6 zeigt eine Abtastung (scan) einer Fotographie eines Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE Gels von Kulturüberständen (10 μl/Spur) von Pichia pastoris, das ein Kringle-5-Peptidfragment oder Fusionsprotein exprimiert. Spuren 1, 6 und 10: negative Kontrollen; Spuren 2, 3 und 4: drei unterschiedliche Klone, die K5A exprimieren; Spur 5: ein Klon, der K5F exprimiert; Spuren 7 und 8: Klone, die K4-5A exprimieren; Spur 9: ein Klon, der K4-5F exprimiert. Pfeile zeigen Proteinbanden von K5A (ungefähr 11 kDa) und K4-5F (ungefähr 20 kDa) an. Molekulargewichtmarker sind gezeigt in den Spuren, die Spuren 1 und 10 vorausgehen.
7 zeigt ein abgetastetes Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE Gel von E. coli Stämmen, die ein Kringle-5-Peptidfragment oder Fusionsprotein exprimieren. So lange nicht anderweitig angegeben enthält jede Spur 10 μl von Kulturmaterial, äquivalent zu einer A₆₀₀ von 10. Spur 1: niedrigmolekulargewichtige Marker; Spur 2: K5A/pET32a, Gesamtkultur; Spur 3: K5A/pET32a, Gesamtkultur (1/10 Menge von Spur 2); Spur 4: K5A/pET32a, lösliche Fraktion; Spur 5: K5A/pET32a, unslösliche Fraktion; Spur 6: K4-5A/pET32a, Gesamtkultur; Spur 7: K4-5A/pET32a, Gesamtkultur (1/19 Menge von Spur 6); Spur 8: K4-5A/pET32a, lösliche Fraktion; Spur 9: K4-5A/pGEX-4T-2, unlösliche Fraktion; Spur 10: K4-5A/pGEX-4T-2, Gesamtkultur; Spur 11: K4-5A/pGEX-4T-2, lösliche Fraktion; Spur 12: K4-5A/pGEX-4T-2, unlösliche Fraktion; Spur 13: Kringle-5-Standard; Spur 14: hochmolekulargewichtige Marker.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Kringle-5" (K5, hiernach) auf die Region von Säugetierplasminogen, die drei Disulfidbindungen hat, welche zu der spezifischen dreidimensionalen Konformation beitragen, die durch die fünfte Kringle-Region des Säugetierplasminogenmoleküls definiert ist. Eine solche Disulfidbindung verknüpft die Cysteinreste, die an Aminosäurepositionen 462 und 541 angeordnet sind, eine zweite verknüpft die Cysteinreste, die bei Aminosäurepositionen 483 und 524 angeordnet sind, und eine dritte verknüpft die Cysteinreste, die bei Aminosäurepositionen 512 und 536 angeordnet sind. Die Aminosäuresequenz eines vollständigen Säugetierplasminogenmoleküls (das menschliche Plasminogenmolekül), einschließlich seiner Kringle-5-Region, ist in 1 (Sequenzidentifikationsnr. 1) gezeigt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Kringle-5 Peptidfragment" auf ein Peptid von zwischen 4 und 104 Aminosäuren (einschließlich) mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu dem entsprechenden Peptidfragment von Säugetierplasminogen, das einen α-N-Terminus bei ungefähr Aminosäureposition 443 von intaktem Säugetierplasminogen und einen α-C-Terminus bei ungefähr Position 546 hat. Die Gesamtlänge des Kringle-5-Peptidfragments kann variieren abhängig von der Art und Weise, in welcher das Kringle-5-Peptid erhalten wird, oder kann ein bißchen in der Sequenz variieren, abhängig von der Spezies, aus welcher es erhalten wird. Zum Beispiel können bestimmte Formen von Kringle-5-Peptidfragmenten hergestellt werden durch proteolytische Abspaltung von glu-Plasminogen, lys-Plasminogen oder Miniplasminogen, unter Verwendung der Enzyme menschliche oder Schweine-Elastase. Wenn in dieser Art und Weise hergestellt, befindet sich der α-C-Terminus der Peptidreste bei ungefähr Aminosäure 543 von Sequenzidentifikationsnr. 1, aber die α-N-terminale Aminosäure kann bei Aminosäureposition 443, 449 oder 454 beginnen. Somit kann ein Kringle-5-Peptidfragment, das aus menschlicher oder Schweineelastaseverdauung von glu-Plasminogen, lys-Plasminogen oder Miniplasminogen resultiert, eine Gesamtlänge von entweder 101, 95 oder 90 Aminosäuren haben. Eine Zusammenfassung dieser Kringle-5-Peptidfragmente ist in Tabelle 1 gezeigt. Wenn in der zuvor genannten Weise produziert, wird ein Pool aus diesen drei Fragmenten erhalten, worin ungefähr 60% der Fragmente eine Länge von 95 Aminosäuren haben, ungefähr 35% der Fragmente haben die Länge von 101 Aminosäuren, und ungefähr 5% der Fragmente haben eine Länge von 90 Aminosäuren. Wenn gewünscht, können diese verschiedenen Fragmente weiter gereinigt werden durch reverse Phase HPLC, eine Technik, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt ist. Trotz dieser Variation in der Länge schließt ein K5 Peptidfragment der vorliegenden Erfindung entweder die Sequenz Lys-Leu-Tyr-Asp (d.h., von Aminosäureposition 531 bis Aminosäureposition 534 von Sequenzidentifikationsnr. 1) oder Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp (d.h., von Aminosäureposition 514 bis Aminosäureposition 523 von Sequenzidentifikationsnr. 1) oder Analoge davon ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Kringle-5 Fusionsprotein" auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus zwei oder mehr individuellen Proteinen gezogen ist, wovon eines ein K5 Peptidfragment ist. Ein Fusionsprotein wird gebildet durch die Expression eines Polynukleotids, in welchen die kodierende Sequenz für ein Kringle-5-Fragment mit der kodierenden Sequenz von mindestens einem anderen Polypeptid verbunden wurde, so dass die zwei (oder mehr) Ableserahmen im Rahmen sind. Bevorzugte Kringle-5-Fusionsproteine sind diejenigen, worin Kringle-5-Peptidfragment an eine entsprechende Sequenz von menschlichem Plasminogen fusioniert ist, wie zum Beispiel Kringle-5 (K4), Kringles 3–4 (K3–4), Kringles 2–4 (K2–4) und Kringles 1–4 (K1–4). Ein bevorzugtes K5 Fusionsprotein ist Kringles 4–5 (K4–5). Andere Beispiele für Kringle 5 Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen ein K5 Peptidfragment oder K4–5, weiter an einen biologischen Anhänger gebunden, ein. Solche Fusionsproteine können oder können nicht in der Lage sein in die separaten Proteine aufgespalten zu werden, aus welchen sie abgeleitet sind.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Konjugat eines K5 Peptidfragments" ein Kringle 5 Peptidfragment, das chemisch an ein anderes Protein gebunden ist, um ein Konjugat zu bilden. Beispiele für Konjugate von Kringle 5 Peptidfragmenten schließen ein Kringle 5 Peptidfragment ein, das an Albumin gebunden ist, oder an ein Peptidfragment von einer anderen Kringleregion von Säugetierplasminogen. Molekulargewichte von Konjugaten von Kringle 5 Peptidfragmenten sind zwischen ungefähr 1,000 und ungefähr 25,000 kDa.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "wesentliche Sequenzhomologie" ungefähr 60% Aminosäureidentität, vorzugsweise mindestens ungefähr 70% Aminosäureidentität, noch bevorzugter ungefähr 80% Aminosäureidentität und am meisten bevorzugt ungefähr 95% Aminosäureidentität der entsprechenden Peptidsequenz von menschlichem Plasminogen. Sequenzen, die wesentliche Sequenzhomologie zu menschlichem Plasminogen haben, werden als "Homologe" bezeichnet. Zusätzlich dazu, daß sie eine wesentliche Sequenzhomologie haben, zeigen Homologe der vorliegenden Erfindung eine ähnliche biologische Wirksamkeit (d.h. Anti-Angiogenesewirksamkeit) wie K5 Peptidfragmente, die hierin beschrieben sind. Weil die Aminosäuresequenz oder die Zahl der Aminosäuren in einem Kringle 5 Peptidfragment von Spezies zu Spezies oder von dem Verfahren der Produktion variieren kann, kann die Gesamtzahl von Aminosäuren in einem Kringle 5 Peptidfragment in manchen Fällen nicht extakt definiert werden. Angenommen, dass diese Sequenzen in mindestens 73% ihrer Aminosäuren identisch sind, soll verstanden werden, daß die Aminosäuresequenz eines Kringle 5 Peptidfragments im wesentlichen ähnlich ist unter den Spezies, und dass Verfahren zur Produktion von Kringle 5 Peptidfragmenten Kringle 5 Peptidfragmente liefern mit wesentlicher Sequenzhomologie zu den entsprechenden Aminosäuresequenzen von menschlichem Plasminogen. 2 zeigt die Aminosäuresequenz von einem menschlichen Kringle 5 Peptidfragment, das 95 Aminosäuren hat (Sequenzidentifikationsnr. 34) im Vergleich mit den Sequenzen von Kringle 5 Fragmenten aus Ratten (Sequenzidentifikationsnr. 35), Rhesusaffen (Sequenzidentifikationsnr. 36), Rinder (Sequenzidentifikationsnr. 37) und Schweine (Sequenzidentifikationsnr. 38) Plasminogen.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Aminosäurerestsequenzen in Erwägung, die analog sind mit Sequenzen, die hierin bekannt gemacht werden, so daß diese Sequenzen (Analoge) ähnliche biologische Wirksamkeit zeigen zu den offenbarten Kringle 5 Peptidfragmenten und Fusionsproteinen davon. Es ist im Fachgebiet wohl bekannt, daß Modifikationen und Änderungen gemacht werden können ohne die biologische Funktion des Peptids im wesentlichen zu verändern. Wenn solche Änderungen gemacht werden, können Substitutionen von ähnlichen Aminosäureresten auf der Basis von relativer Ähnlichkeit von Seitenkettensubstituenten gemacht werden, zum Beispiel ihrer Größe, Ladung, Hydrophobizität, Hydrophilie und dergleichen. Abänderungen des beschriebenen Typs können gemacht werden, um die Potenz des Peptids oder die Stabilität gegenüber enzymatischer Zerstörung oder pharmakokinetische Parameter zu verbessern. Somit schließen Sequenzen, die innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen sollen, diejenigen analogen Sequenzen ein, die durch eine Änderung in der Aminosäurerestesequenz oder dem Typ gekennzeichnet sind, worin die Änderung nicht die grundsätzliche Natur und biologische Wirksamkeit der zuvor genannten K5 Peptidfragmente und/oder Fusionsproteine verändert.
Ein K5 Peptidfragment oder K5 Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kann auf der Basis der Wirksamkeit charakterisiert werden, wenn es auf seine Fähigkeit getestet wird, das Wachstum von Rinderkapillarzellen (BCE) in vitro zu inhibieren. Die Daten in Tabelle 1 und 4 veranschaulichen, daß das K5 Peptidfragment, das die Sequenz von Aminosäureposition 443 bis Aminosäureposition 543 von Sequenzidentifikationsnr. 1 hat, ungefähr einen 300-fachen Anstieg in der Aktivität zeigt (d.h. bei der Hemmung der BCE Zellproliferation) verglichen mit dem Kringle 5 Peptidfragment, das die Sequenz von Aminosäureposition 443 bis Aminosäureposition 546 von Sequenzidentifikationsnr. 1 hat, und einen ungefähr 800-fachen Anstieg in der Aktivität, wenn verglichen mit Kringle 1–4 Peptidfragmenten.
Der Ausdruck "isoliert", wie hierin verwendet, bedeutet daß das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (z.B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommend ist). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das selbe Polynukleotid oder die DNA oder das Polypeptid, welches von einigem oder allem co-existierenden Material in dem natürlichen System abgetrennt ist, ist isoliert. Ein solches Polynukleotid könnte ein Teil eines Vektors sein und/oder ein solches Polynukleotid oder Polypeptid könnte ein Teil einer Zusammensetzung sein, und immer noch isoliert sein, weil der Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung ist.
Der Ausdruck "Primer", bezeichnet eine spezifische Oligonukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Zielnukleotidsequenz und verwendet wird, um die Zielnukleotidsequenz zu hybridisieren, und als ein Anfangspunkt dient für die Nukleotidpolymerisation, die entweder durch DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder reverse Transkriptase katalysiert wird.
Der Ausdruck "Sonde", bezeichnet ein definiertes Nukleinsäuresegment (oder Nukleotidanalogsegment, d.h. PNA), das verwendet werden kann, um spezifische DNA zu identifizieren, die in Proben vorhanden ist, welche die komplementäre Sequenz tragen.
Ein "rekombinantes Polypeptid", wie hierin verwendet, bedeutet mindestens ein Polypeptid, welches aufgrund seiner Herkunft oder aufgrund von Manipulation nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polypeptids assoziiert ist, mit welchem es in Natur assoziiert ist und/oder an ein anderes Polypeptid gebunden ist als das, an welches es in Natur gebunden ist. Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid wird nicht notwendigerweise aus einer bezeichneten Nukleinsäuresequenz translatiert. Es kann auch in irgendeiner Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressionssystems.
Der Ausdruck "synthetisches Peptid", wie hierin verwendet, bedeutet eine polymere Form von Aminosäuren jeder Länge, welche chemisch synthetisiert werden kann durch Verfahren, die einem Fachmann mit durchschnittlichem Können wohl bekannt sind. Diese synthetischen Peptide sind in verschiedenen Anwendungen nützlich.
"Gereinigtes Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid von Interesse oder ein Fragment davon, welches im wesentlichen frei ist von Protein, d.h. weniger als ungefähr 50%, vorzugsweise weniger als ungefähr 70%, und noch bevorzugter weniger als ungefähr 90% des Proteins enthält, mit welchem das Polynukleotid natürlich assoziiert ist. Techniken zur Reinigung von Polynukleotiden von Interesse sind im Fachgebiet wohl bekannt und schließen zum Beispiel die Zerstörung der Zelle mit einem chaotropen Wirkstoff ein, die das Polynukleotid enthält, und die Abtrennung des Polynukleotids und der Proteine durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentation entsprechend der Dichte. Somit bedeutet "gereinigtes Polypeptid" ein Polypeptid von Interesse oder ein Fragment davon, welches im wesentlichen frei ist von zellulären Komponenten, d.h. weniger als ungefähr 50%, vorzugsweise weniger als ungefähr 70% und noch bevorzugter weniger als ungefähr 90% von zellulären Komponenten enthält, mit welchen das Polypeptid von Interesse natürlich assoziiert ist. Verfahren zur Reinigung sind im Fachgebiet bekannt.
"Polypeptid", wie hierin verwendet, zeigt eine molekulare Kette von Aminosäuren an, und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. Somit sind Peptide, Oligopeptide und Proteine innerhalb der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Ausdruck soll sich auch auf Modifikationen des Polypeptids nach der Expression beziehen, zum Beispiel auf Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zell-Linien", "Zellkulturen", und andere solche Ausdrücke, die Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zell-Linien bezeichnen, kultiviert als unizelluläre Einheiten, beziehen sich auf Zellen, welche als Empfänger für einen rekombinanten Vektor oder eine andere übertragene DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schließen die ursprünglichen Nachkommen der Orginalzelle ein, welche transfiziert wurde.
Wie hierin verwendet bedeutet "Replikon" irgendein genetisches Element, wie zum Beispiel ein Plasmid, ein Chromosom oder ein Virus, der sich als eine autonome Einheit der Polynukleotidreplikation innerhalb einer Zelle verhält.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, in welchem ein anderes Polynukleotidsegment angeheftet ist, wie zum Beispiel um die Replikation und/oder die Expression des angehefteten Segments voranzutreiben.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, welche notwendig sind, um die Expression von kodierenden Sequenzen, an welche sie ligiert sind, zu bewirken. Die Natur von solchen Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig von dem Wirtsorganismus. In Prokaryoten schließen solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promoter, ribosomale Bindungsstelle und Terminatoren ein; in Eukaryoten schließen solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promoter, Terminatoren und, in einigen Fällen, Verstärker ein. Der Ausdruck "Kontrollsequenz" soll somit zumindest alle Komponenten einschließen, deren Anwesenheit notwendig ist für die Expression und kann auch zusätzliche Komponenten einschließen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, zum Beispiel Leadersequenzen.
"Operativ verbunden" bezieht sich auf eine Situation, worin die beschriebenen Komponenten in einem Verhältnis stehen, das es ihnen erlaubt in ihrer beabsichtigten Art und Weise zu funktionieren. Somit ist zum Beispiel eine Kontrollsequenz, die "operativ verbunden" ist an eine kodierende Sequenz, in einer solchen Art und Weise ligiert, daß die Expression der kodierenden Sequenz erreicht wird unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Der Ausdruck "offener Ableserahmen" oder "ORF" bezieht sich auf eine Region einer Polynukleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert; diese Region kann einen Teil einer kodierenden Sequenz darstellen oder die gesamte kodierende Sequenz.
Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynukleotidsequenz, welche in mRNA transkribiert wird und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen angeordnet wird. Die Bindungen der kodierenden Sequenz werden bestimmt durch ein Translationsstartcodon an dem 5'-Terminus und ein Translationsstopcodon an dem 3'-Terminus. Eine kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynukleotidsequenzen einschließen.
Der Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf den Einschluß eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem Verfahren, das für die Insertion verwendet wurde. Zum Beispiel sind direkte Aufnahme, Transduktion oder fmating eingeschlossen. Das exogene Polynukleotid kann als ein nicht integrierter Vektor gehalten werden, zum Beispiel ein Plasmid, oder kann alternativ in das Wirtsgenom integiert werden.
"Gereinigtes Produkt" bezieht sich auf eine Herstellung des Produkts, welches von den zellulären Bestandteilen, mit welchen das Produkt normalerweise assoziiert ist, und von anderen Arten von Zellen, welche in der Probe von Interesse vorhanden sein können, isoliert wurde.
Alle Peptidsequenzen sind gemäß der allgemeinen anerkannten Convention geschrieben, wobei der α-N-terminale Aminosäurerest auf der linken und der α-C-terminale Rest auf der rechten Seite ist. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "α-N-terminal" auf die freie α-Aminogruppe auf einer Aminosäure in einem Peptid, und der Ausdruck "α-C-terminal" bezieht sich auf den freien α-Carbonsäureterminus einer Aminosäure in einem Peptid.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "N-Schutzgruppe" auf diejenigen Gruppen, die einen α-N-Terminus einer Aminosäure oder eines Peptids schützen sollen oder die Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptids anderweitig schützen, gegen unerwünschte Reaktionen während synthetischer Verfahren. Üblicherweise verwendete N-Schutzgruppen sind in Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, New York (1981)) offenbart.
Zusätzlich können Schutzgruppen als Prodrugs verwendet werden, welche in vivo leicht abgespalten werden, zum Beispiel durch enzymatische Hydrolyse, um die biologisch aktive Stammverbindung freizusetzen. N-Schutzgruppen umfassen Niederalkanoylgruppen, wie zum Beispiel Formyl, Acetyl ("Ac"), Propionyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl und dergleichen; andere Acylgruppen schließen 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, Trifluoracetyl, Trichloracetyl, Phthalyl, o-Nitrophenoxyacetyl, α-Chlorbutyryl, Benzoyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl ein; Sulfonylgruppen, wie zum Beispiel Benzensulfonyl, p-Toluensulfonyl und dergleichen; Carbamat bildende Gruppen, wie zum Beispiel Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, Phenoxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexylcarbonyl, Phenylthiocarbonyl; Arylalkylgruppen, wie zum Beispiel Benzyl, Triphenylmethyl, Benzyloxymethyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und Silylgruppen, wie zum Beispiel Trimethylsilyl und dergleichen. Bevorzugte N-Schutzgruppen sind Formyl, Acetyl, Benzoyl, Pivaloyl, t-butylacetyl, Phenylsulfony, Benzyl, t-Butyloxycarbonyl(Boc) und Benzyloxycarbonyl (Cbz). Zum Beispiel kann Lysin an dem α-N-Terminus geschützt werden durch eine Säure labile Gruppe (z.B. Boc) und an dem ε-N-Terminus durch eine Basen labile Gruppe (z.B. Fmoc) geschützt werden, dann selektiv während der Synthese entschützt werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Carboxyschutzgruppe" auf einen Carbonsäure-schützenden Ester oder eine Amidgruppe, verwendet um die Carbonsäurefunktionalität zu blockieren oder zu schützen, während die Reaktionen durchgeführt werden, die andere funktionelle Stellen auf der Verbindung involvieren. Carboxyschutzgruppen sind offenbart in Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" Seiten 152–186 (1981).
Zusätzlich kann eine Carboxyschutzgruppe verwendet werden als ein Prodrug, wobei die Carboxyschutzgruppe leicht in vivo abgespalten werden kann, zum Beispiel durch enzymatische Hydrolyse, um die biologisch aktive Stammverbindung freizusetzen. Solche Carboxyschutzgruppen sind demjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt, da sie extensiv verwendet wurden, beim Schutz von Carboxylgruppen in den Gebieten Penicillin und Cephalosphorin, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 3,840,556 und 3,719,667.
Repräsentative Carboxyschutzgruppen sind C₁-C₈ Niederalkyl (z.B., Methyl, Ethyl oder t-Butyl); Arylalkyl, wie zum Beispiel Phenethyl oder Benzyl und substituierte Derivate davon, wie zum Beispiel Alkoxybenzyl oder Nitrobenzylgruppen; Arylalkenyl, wie zum Beispiel Phenylethenyl; Aryl und substituierte Derivate davon, wie zum Beispiel 5-Indanyl; Dialkylaminoalkyl, wie zum Beispiel Dimethylaminoethyl; Rlkanolyoxyalkylgruppen, wie zum Beispiel Acetoxymethyl, Butyryloxymethyl, Valeryloxymethyl, Isobutyryloxymethyl, Isovaleryloxymethy,- 1-(Propionyloxy)-1-ethyl, 1-(Pivaloyloxyl)-1-ethyl, 1-Methyl-1-(propionyloxy)-1-ethyl, Pivaloyloxymethyl, Propionyloxymethyl; Cycloalkanoyloxyalkylgruppen, wie zum Beispiel Cyclopropylcarbonyloxymethyl, Cyclobutylcarbonyloxymethyl, Cyclopentylcarbonyloxymethyl, Cyclohexylcarbonyloxymethyl; Aroyloxyalkyl, wie zum Beispiel Benzoyloxymethyl, Benzoyloxyethyl; Arylalkylcarbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel Benzylcarbonyloxymethyl, 2-Benzylcarbonyloxyethyl; Alkoxycarbonylalkyl oder Cycloalkyloxycarbonylalkyl, wie zum Beispiel Methoxycarbonylmethyl, Cyclohexyloxycarbonylmethyl, 1-Methoxycarbonyl-1-ethyl; Alkoxycarbonyloxyalkyl oder Cycloalkyloxycarbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel methoxycarbonyloxymethyl, Titelverbindung-Butyloxycarbonyloxymethyl, 1-Ethoxycarbonyloxy-1-ethyl, 1-cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl; aryloxycarbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel 2-(Phenoxycarbonyloxy)ethyl, 2-(5-Indanyloxycarbonyloxy)ethyl; Alkoxyalkyl-carbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel 2-(1-Methoxy-2-methylpropan-2-oyloxy)ethyl; Arylalkyloxycarbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel 2-(benzyloxycarbonyloxy)ethyl; Arylalkenyloxycarbonyloxalkyl, wie zum Beispiel 2-(3-Phenylpropen-2-yloxycarbonyloxy)ethyl; Alkoxycarbonylaminoalkyl, wie zum Beispiel t-Butyloxycarbonylaminomethyl, Alkylaminocarbonylaminoalkyl, wie zum Beispiel Methylaminocarbonylaminomethyl; Alkanoylaminoalkyl, wie zum Beispiel Acetylaminomethyl; Heterocycliccarbonyloxyalkyl, wie zum Beispiel 4-Methylpiperazinylcarbonyloxymethyl; Dialkylaminocarbonylalkyl, wie zum Beispiel Dimethylaminocarbonylmethyl, Diethylaminocarbonylmethyl; (5-(Niederalkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie zum Beispiel (5-t-Butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl; und (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie zum Beispiel (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl.
Repräsentative Amidcarboxyschutzgruppen sind Aminocarbonyl und Niederalkylaminocarbonylgruppen.
Bevorzugte Carboxy-geschützte Verbindungen der Erfindung sind Verbindungen, worin die geschützte Carboxygruppe ein Niederalkyl, Cycloalkyl oder Arylalkylester ist, zum Beispiel Methylester, Ethylester, Propylester, Isopropylester, Butylester, sec-Butylester, Isobutylester, Amylester, Isoamylester, Octylester, Cyclohexylester, Phenylethylester und dergleichen oder ein Alkanolyoxyalkyl, Cycloalkanoyloxyalkyl, Aroyloxyalkyl oder ein Arylalkylcarbonyloxyalkylester. Bevorzugte Amidcarboxyschutzgruppen sind Niederalkylaminocarbonylgruppen. Zum Beispiel kann Asparaginsäure geschützt werden an dem α-C-Terminus durch eine Säure labile Gruppe zum Beispiel t-Butyl) und an dem β-C-Terminus geschützt werden durch eine hydrierungslabile Gruppe (z.B. Benzyl), dann selektiv während der Synthese entschützt werden.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "Niederalkylaminocarbonyl" eine -C(O)NHR¹⁰ Gruppe, welche den α-C-Terminus eines synthetischen Kringle 5 Peptidfragments bedeckt, worin R¹⁰ C₁-C₄ Alkyl ist.
Wie hierin verwendet zeigt der Ausdruck "Aminocarbonyl" eine -C(O)NH₂ Gruppe an, welche den -C-Terminus eines synthetischen Kringle 5 Peptidfragments bedeckt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Prodrug" auf Verbindungen, welche schnell in vivo umgewandelt werden, um die Stammverbindung zu ergeben, zum Beispiel durch enzymatische Hydrolyse in Blut. Eine eingehende Diskussion wird bereitgestellt in T. Higuchi und V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Band 14 der A. C. S. Symposium Series und in Edward B. Roche, Herausgeber Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Permagon Press, 1987.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliches Prodrug" auf (1) diejenigen Prodrugs der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche innerhalb des Umfangs von gesunder medizinischer Bewertung geeignet sind für die Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Antwort und dergleichen, übereinstimmend mit einem geeigneten Nutzen/Risikoverhältnis und wirksam für ihre beabsichtigte Verwendung und (2) auf zwitterionische Formen wo möglich, der Stammverbindung.
Der Ausdruck "aktiviertes Esterderivat", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Säurehalogenide, wie zum Beispiel Säurechloride und aktivierte Ester einschließlich Ameisen und Essigsäure abgeleiteten Anhydriden, Anhydriden, die von Alkoxycarbonylhalogeniden abgeleitet sind, wie zum Beispiel Isobutyloxycarbonylchlorid, N-Hydroxysuccinimid abgeleitete Ester, N-Hydroxyphthalimid abgeleitete Ester, N-Hydroxybenzotriazol abgeleitete Ester, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxamid abgeleitete Ester, 2,4,5-Trichlorphenol abgeleitete Ester.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Antiangiogeneseaktivität" auf die Fähigkeit eines Moleküls, das Wachstum von Blutgefäßen zu inhibieren.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "endothelialhemmende Aktivität" auf die Fähigkeit eines Moleküls, die Angiogenese im Allgemeinen zu inhibieren, und zum Beispiel das Wachstum oder die Migration von Rinder- kapillaren Endothelzellen in Kultur in der Anwesenheit von Fibroblastenwachstumsfaktor oder anderen bekannten Wachstumsfaktoren zu inhibieren.
Wie hierin verwendet ist der Ausdruck "ED₅₀" eine Abkürzung für die Dosis eines Kringle 5 Peptidfragments oder Fusionsproteins, welche wirksam ist, um das Wachstum von Blutgefäßen zu inhibieren oder das Wachstum von Rinderkapillarendothelzellen in Kultur in der Anwesenheit von Fibroblastenwachstumsfaktor oder anderen bekannten Wachstumsfaktoren zu inhibieren, oder die Migration von Endothelialzellen um eine Hälfte von dem was das Wachstum oder die Migration in Abwesenheit von dem Inhibitor wäre, zu inhibieren.
Wie hierin verwendet, folgen die Namen von natürlich vorkommenden Aminosäuren und Aminoacylresten, die hierin verwendet werden, größten Teils den Benennungskonventionen, die von der IUPAC Kommission über die Nomenklatur der organischen Chemie vorgeschlagen wurden, und der IUPAC-IUB Kommission der biochemischen Nomenklatur, wie dargelegt in Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974), Biochemistry, 14(2), (1975). Dementsprechend beziehen sich die Ausdrücke "Ala", "Arg", "Asn", "Asp", "Cys", "Gln", "Glu", "Gly", "His", "Ile", "Leu", "Lys", "Met", "Phe", "Pro", "Ser", "Thr", "Trp", "Tyr" und "Val" auf die Aminosäuren Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, und auf ihre entsprechenden Aminoacylreste in Peptiden in ihren L-, D- oder D, L-Formen. Wo keine spezifische Konfiguration angegeben ist, würde jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, verstehen, daß die Stereochemie des α-Kohlenstoffs der Aminosäuren und Aminoacylresten in Peptiden, welche in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen beschrieben sind, die natürlich vorkommende oder "L" Konfiguration, mit der Ausnahme des achiralen Moleküls Glycin und mit der weiteren Ausnahme von irgendwelchen Aminosäuren, welche achiral sind oder anderweitig als "D-" bezeichnet sind.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "3-I-Tyr" einen L-, D-, oder D, L-Tyrosylrest, worin ein Wasserstoffradikal ortho zu dem phenolischem Hydroxyl durch ein Jodidradikal ersetzt ist. Das Jodidradikal kann radioaktiv oder nicht radioaktiv sein.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Aminosäurereste in Erwägung mit nicht natürlich vorkommenden Nebenkettenresten, wie zum Beispiel Homophenylalanin, Phenylglycin, Norvalin, Norleucin, Ornithin, Thiazoylalanin (2-, 4- und 5-substituiert).
Somit soll verstanden werden, daß die vorliegende Erfindung irgendwelche Derivate von Kringle 5 Peptidfragmenten und Kringle 5 Fusionsproteinen umfaßt, welche antiangiogene Wirksamkeit haben, und die gesamte Klasse von Kringle 5 Peptidfragmenten und Fusionproteinen einschließt, die hierin beschrieben sind, und Homologe oder Analoge von solchen Fragmenten und Proteinen. Zusätzlich ist die Erfindung nicht abhängig von der Art und Weise, in welcher das Kringle 5 Peptidfragment oder Fusionprotein hergestellt wird, d.h. durch eine proteolytische Abspaltung eines isolierten Säugetierplasminogens, (2) durch Expression eines rekombinanten Moleküls, das ein Polynukleotid hat, welches die Aminosäuresequenz eines Kringle 5 Peptidfragments oder Fusionproteins kodiert, und (3) synthetische Festphasentechniken, die denjenigen von durchschnittlichem Können im Fachgebiet bekannt sind.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide mit der allgemeinen Struktur B-C-X bereit, worin B ein 88-mer Peptid ist, beginnend bei Val⁴⁴³ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 9-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Ala⁵⁴³ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 82-mer Peptid ist, beginnend bei Val⁴⁴⁹ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 9-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Ala⁵⁴³ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 77-mer Peptid ist beginnend bei Val⁴⁵⁴ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 9-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Ala⁵⁴³ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 88-mer Peptid ist beginnend bei Val⁴⁴³ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 12-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Phe⁵⁴⁶ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 82-mer Peptid ist, beginnend bei Val⁴⁴⁹ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 12-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Phe⁵⁴⁶ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 77-mer Peptid ist beginnend bei Val⁴⁵⁴ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 12-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Phe⁵⁴⁶ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 176-mer Peptid ist beginnend bei Val³⁵⁵ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 12-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Ala⁵⁴³ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur B-C-X, worin B ein 176-mer Peptid ist, beginnend bei Val³⁵⁵ und endend bei Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und X ist ein 12-mer Peptid beginnend bei Tyr⁵³⁵ und endend bei Phe⁵⁴⁶ von Sequenzidentifikationsnr. 1.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-C-Y, worin A Acetyl; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-C-X-Y, worin A Acetyl ist; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; X ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-Y, worin A Acetyl ist; B ist ein Dipeptid beginnend bei Aminosäureposition Pro⁵²⁹ und endend bei Aminosäureposition Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-Y, worin A Acetyl ist; B ist ein Dipeptid beginnend bei Aminosäureposition Pro⁵²⁹ und endend bei Aminosäureposition Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-X-Y, worin A Acetyl ist; B ist ein Hexapeptid beginnend bei Aminosäureposition Tyr⁵²⁵ und endend bei Aminosäureposition Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; X ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-X-Y, worin A Acetyl ist; B ist Arginyl; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; X ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-X-Y, worin A Acetyl ist; B ist ein Dipeptid beginnend bei Aminosäureposition Pro⁵²⁹ und endend bei Aminosäureposition Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; X ist 3-I-Tyrosyl und Y ist Aminocarbonyl.
In wiederum einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Peptide bereit mit der allgemeinen Struktur A-B-C-X-Y, worin A Acetyl ist; B ist ein Dipeptid beginnend bei Aminosäureposition Pro⁵²⁹ und endend bei Aminosäureposition Arg⁵³⁰ von Sequenzidentifikationsnr. 1; C ist ein 4-mer Peptid, worin R¹ und R⁴ wie zuvor definiert sind, R² ist Leucyl und R³ ist Tyrosyl; X ist Tyrosyl; und Y ist Aminocarbonyl.
Repräsentative Verbindungen der Erfindung schließen Verbindungen ein, worin A Acetyl ist und Y ist Aminocarbonyl und B-C-X ist

(a) die Sequenz von Aminosäurepositionen 355–543 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(b) die Sequenz von Aminosäurepositionen 355–546 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(c) die Sequenz von Aminosäurepositionen 443–543 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(d) die Sequenz von Aminosäurepositionen 449–543 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(e) die Sequenz von Aminosäurepositionen 454–543 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(f) die Sequenz von Aminosäurepositionen 443–546 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(g) die Sequenz von Aminosäurepositionen 449–546 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(h) die Sequenz von Aminosäurepositionen 454–546 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(i) die Sequenz von Aminosäurepositionen 525–535 von Sequenzidentifikationsnr. 1;
(j) die Sequenz von Aminosäurepositionen 529–535 von Sequenzidentifikationsnr. 1; und
(k) die Sequenz von Aminosäurepositionen 530–535 von Sequenzidentifikationsnr. 1.

K5 Fragmente oder K5 Fusionsproteine können erhalten werden durch Expression eines rekombinanten Moleküls, das ein Polynukleotid mit einer Sequenz umfaßt, welche ein Protein kodiert, das ein Kringle 5 Peptidfragment hat, und dann Reinigen des Peptidprodukts, welches exprimiert wird (siehe Menhart, N., et al., Biochemistry, 32: 8799–8806 (1993). Die DNA Sequenz von menschlichem Plasminogen wurde veröffentlicht (Browne, M. J. et al. Fibrinolysis, 5(4): 257–260 (1991) und ist in 3(a–b) (Sequenzidentifikationsnr. 12) gezeigt. Eine Polynukleotidsequenz, die Kringle 5 kodiert, beginnt bei ungefähr Nukleotidposition 1421 von Sequenzidentifikationsnr. 12 und endet bei ungefähr Nukleotidposition 1723.
Das Gen, das ein K5 Peptidfragment oder K5 Fusionprotein kodiert, kann aus Zellen oder Geweben, welche hohe Spiegel von menschlichem Plasminogen oder K5 Fusionproteinen exprimieren, isoliert werden durch (1) Isolieren von Messenger RNA aus dem Gewebe oder den Zellen, (2) durch Verwenden von reverser Transkriptase, um die entsprechende DNA Sequenz zu erzeugen und (3) durch Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den geeigneten Primern, um die DNA Sequenz zu amplifizieren, die für die aktive K5 Aminosäuresequenz oder das Fusionsprotein davon kodiert. Desweiteren kann ein Polynukleotid, welches ein K5 Peptidfragment oder K5 Fusionsprotein kodiert, in einen kommerziell erhältlichen Expressionsvektor kloniert werden (wie zum Beispiel pBR322, pUC Vektoren und dergleichen) oder Expressions-/Reinigungsvektoren (wie zum Beispiel ein GST Fusionvektor (Pharmacia^®, Piscataway, NJ)) und dann in einen geeigneten procaryotischen, viralen oder eukaryotischen Wirt exprimiert werden. Reinigung kann dann erzielt werden durch konventionelle Mittel oder, in dem Fall eines kommerziellen Expressions-/Reinigungssystems, in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers.
Ein K5 Peptidfragment oder K5 Fusionprotein kann auch synthetisiert werden durch Standardverfahren der Festphasenchemie, die denjenigen von durchschnittlichem Können im Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel können Kringle 5 Peptidfragmente synthetisiert werden durch Festphasenchemietechniken gemäß den Verfahren, die durch Steward and Young beschrieben sind (Steward, J. M. Und Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2te Ausgabe, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, (1984) unter Verwendung eines Applied Biosystem synthesizer. In ähnlicher Weise können multiple Fragmente synthetisiert werden, dann miteinander verbunden werden, um größere Fragmente zu bilden. Diese synthetischen Peptidfragmente können auch mit Aminosäuresubstitutionen an spezifischen Orten gemacht werden, um auf Antiangiogenesewirksamkeit in vitro und in vivo zu testen. Für die Festphasenpeptidsynthese kann eine Zusammenfassung der vielen Techniken gefunden werden in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 und J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Band 2, Seite 46, Academic Press (New York), 1973. Für die klassische Lösungssynthese siehe G. Schroder und K. Lupke, The Peptides, Band 1, Academic Press (New York). Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren die aufeinanderfolgende Zugabe von einer oder mehreren Aminosäuren oder geeignet geschützten Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure geschützt durch eine geeignete Schutzgruppe. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure wird dann entweder an einen inerten festen Träger angeheftet oder in Lösung verwendet durch Hinzugeben der nächsten Aminosäure in der Folge, welche die komplementäre (Amino oder Carboxyl) Gruppe geeignet geschützt hat und unter Bedingungen, die geeignet sind zur Bildung der Amidbindung. Die Schutzgruppe wird dann von diesem neu hinzugefügten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (geeignet geschützt) wird hinzugefügt, und so weiter. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der geeigneten Reihenfolge verknüpft wurden, werden jegliche restlichen Schutzgruppen (und jeglicher fester Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu liefern. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens ist es möglich, mehr als eine Aminosäure zu einem Zeitpunkt zu einer wachsenden Kette hinzuzufügen, zum Beispiel durch Koppeln (unter Bedingungen, welche chirale Zentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem geeignet geschützten Dipeptid, um nach dem Entschützen ein Pentapeptid zu bilden.
Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung involviert die Festphasenpeptidsynthese, worin die Aminosäure α-N-terminal durch eine Säure- oder Basen-empfindliche Gruppe geschützt wird. Solche Schutzgruppen sollten die Eigenschaften haben gegenüber Bedingungen der Peptidbindungsbildung stabil zu sein, wobei sie leicht entfernbar sind ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung von irgendwelchen der chiralen Zentren, die darin enthalten sind. Geeignete Schutzgruppen sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, Titelverbindung-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarobnyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl. Die 9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl (Fmoc) Schutzgruppe wird insbesondere bevorzugt für die Synthese von Kringle 5 Peptidfragmenten. Andere bevorzugte Nebenkettenschutzgruppen sind, für Nebenkettenaminogruppen wie Lysin und Arginin, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), Nitro, p-Toluensulfonyl, 4-Methoxybenzensulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl; für Tyrosin, Benzyl, o-Brombenzyloxy-carbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, t-Butyl (t-Bu), Cyclohexyl, Cyclopentyl und Acetyl (Ac); für Serin, t-Butyl, Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin, Trityl, Benzyl, Cbz, p-Toluensulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl; für Tryptophan, Formyl; für Asparaginsäure und Glutaminsäure, Benzyl und t-Butyl und für Cystein, Triphenylmethyl (Trityl). In dem Festphasenpeptidsyntheseverfahren wird die α-C-terminale Aminosäure an einen geeigneten festen Träger oder ein Harz angeheftet. Geeignete feste Träger, die für die obige Synthese nützlich sind, sind diejenigen Materialien, welche inert sind gegenüber den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der schrittweisen Kondensations-Entschützungsreaktionen, ebenso wie sie in den verwendeten Medien unlöslich sind. Der bevorzugte feste Träger für die Synthese von α-C-terminalen Carboxypeptiden ist 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-copoly(styren-1% Divinylbenzen). Der bevorzugte feste Träger für α-C-terminale Amidpeptide ist das 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethylharz, erhältlich von Applied Biosystems (Foster City, CA). Die α-C-terminale Aminosäure wird an das Harz gekoppelt durch N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), mit oder ohne 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) oder bis (2-oxo-3-Oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOPCl), vermittelte Kopplung für von ungefähr 1 bis ungefähr 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 10°C und 50°C in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dichlormethan oder DMF. Wenn der feste Träger 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxy-acetamidoethylharz ist, wird die Fmoc Gruppe abgespalten mit einem sekundären Amin, vorzugsweise Piperidin, vor der Kopplung mit der α-C-terminalen Aminosäure wie oben beschrieben. Das bevorzugte Verfahren für die Kopplung an das entschützte 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethylharz ist O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluor-phosphat (HBTU, 1 Äquivalent) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 Äquivalent) in DMF. Die Kopplung von nacheinander geschützten Aminosäuren kann in einem automatischen Polypeptid Synthesizer durchgeführt werden, wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die α-N-terminalen Enden in den Aminosäuren der wachsenden Peptidkette mit Fmoc geschützt. Die Entfernung der Fmoc Schutzgruppe von der α-N-terminalen Stelle des wachsenden Peptids wird erzielt durch Behandeln mit einem sekundären Amin, vorzugsweise Piperidin. Jede geschützte Aminosäure wird dann in ungefähr 3-fachem molaren Überschuß eingeführt und die Kopplung wird vorzugsweise in DMF ausgeführt. Das Kopplungsmittel ist normalerweise O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU, 1 Äquivalent) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT, 1 Äquivalent). Am Ende der Festphasensynthese wird das Polypeptid von dem Harz entfernt und entschützt, entweder nach und nach oder in einer einzelnen Operation. Das Entfernen des Polypeptids und das Entschützen können in einer einzelnen Operation erreicht werden durch Behandeln des Harz-gebundenen Polypeptids mit einem Abspaltungsreagenz, das Thianisol, Wasser, Ethandithiol und Trifluoressigsäure umfaßt. In Fällen, worin das α-C-terminale Ende des Polypeptids ein Alkylamid ist, wird das Harz durch Aminolyse mit einem Alkylamin abgespalten. Alternativ kann das Peptid entfernt werden durch Umesterung, z.B. mit Methanol, gefolgt von Aminolyse oder durch direkte Transamidierung. Das geschützte Peptid kann an diesem Punkt gereinigt werden oder direkt zum nächsten Schritt genommen werden. Die Entfernung der Nebenkettenschutzgruppen wird erzielt unter Verwendung des oben beschriebenen Abspaltungscocktails. Das vollständig entschützte Peptid wird durch eine Sequenz von chromatographischen Schritten gereinigt unter Verwendung von irgendeinem oder allen der folgenden Typen: Ionenaustausch auf einem schwach basischen Harz (Acetatform); hydrophobe Adsorptionschromatographie auf underivatisiertem Polystyren-Divinylbenzen (zum Beispiel Amberlite XAD); Silikageladsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie auf Carboxymethylzellulose; Verteilungschromatographie, z.B. auf Sephadex G-25, LH-20 oder Gegenstromverteilung; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere reverse Phase HPLC auf Octyl- oder Octadecylsilyl-Silika gebundender Phase Säulen-Packung. Molekulargewichte dieser Kringle 5 Peptidfragmente werden unter Verwendung von Bombardierung mit schnellen Atomen (Fast Atom Bombardment, FAB) Massenspektroskopie bestimmt. Festphasen Kringle 5 Peptidfragment-Synthese ist in Beispielen 1 bis 12 veranschaulicht.
Abhängig davon, wie sie hergestellt wurden, kann ein K5 Peptidfragment oder K5 Fusionsprotein mit oder ohne den zuvor genannten Disulfidbindungen der Kringle 5 Region von Säugetierplasminogen existieren oder, in dem Fall eines Fusionsproteins mit anderen Säugetier Kringle-Regionen mit oder ohne die Disulfidbindungen dieser entsprechenden Regionen, oder es kann mit Disulfidbindungen existieren, die eine Tertiärstruktur bilden, welche sich von der Tertiärstruktur unterscheidet, die in nativem Säugetierplasminogen gefunden wird. Kringle 5 Peptidfragmente, die durch enzymatische Abspaltung von Glu-, Lys- oder Miniplasminogen mit Elastase und/oder Pepsin hergestellt werden (Enzyme, welche an Stellen entfernt von den Cysteinbindungen abspalten) werden die native tertiäre Kringle 5 Proteinstruktur enthalten; Kringle 5 Peptidfragmente, die durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt wurden, können Cystylaminoacylreste enthalten oder nicht, und Kringle 5 Peptidfragmente, die durch Expression hergestellt wurden, können Disulfidbindungen an anderen Positionen enthalten als diejenigen, die in Kringle 5 Peptidfragmenten gefunden werden, die durch enzymatische Abspaltung hergestellt wurden.
Die Verbindungen der Erfindung einschließlich derjenigen, die in den Beispielen angegeben sind, besitzen anti-angiogene Wirksamkeit. Als Angiogeneseinhibitoren sind solche Verbindungen nützlich in der Behandlung von sowohl primären als auch metastatischen festen Tumoren und Karzinomen der Brust; des Colons; des Rektums; der Lunge; des Oropharynx; des Hypopharynx; des Oesophagus; des Magens; des Pankreas; der Leber; der Gallenblase; der Gallengänge; des Dünndarms; des Harnwegs einschließlich der Nieren, Blase und des Urothels; des weiblichen Genitaltrakts einschließlich Cervix, Uterus, Eierstöcken, Choriokarzinom und schwangerschaftstrophoblastische Erkrankung; des männlichen Genitaltrakts einschließlich der Prostata, der Samenbläschen, der Hoden- und Keimzelltumoren; der endokrinen Drüsen einschließlich der Schilddrüse, der Nebennieren und der Hirnanhangdrüse; der Haut einschließlich Hämangiomen, Melanomen, Sarkomen, die vom Knochen oder von den Weichteilen entstehen und Kaposi Sarkom; Tumoren des Gehirns, der Nerven, der Augen und Meninges einschließlich Astrozytomen, Gliomen, Glioblastomen, Retinoblastomen, Neuromen, Neuroblastomen, Schwannomen und Meningiomen; feste Tumoren, die von haematopoietischen Malignitäten entstehen, wie zum Beispiel Leukämien und einschließlich Chloromen, Plasmacytomen, Plaques und Tumoren von Mycosis Fungoides und kutanen T-Zell- Lymphomen/Leukämien; Lymphomen einschließlich sowohl Hodgkin's und non-Hodgkin's Lymphomen; Prophylaxe von Autoimmunkrankheiten einschließlich rheumatoider, immuner und degenerativer Arthritis; Augenkrankheiten einschließlich diabetischer Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, Hornhauttransplantatabstoßung, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Rubeosis, Netzhautneovaskularisierung aufgrund von Makuladegeneration und Hypoxie; abnormale Neovaskularisationszustände des Auges; Hautkrankheiten einschließlich Psoriasis; Blutgefäßerkrankungen einschließlich Hämangiomen und kapillare Proliferation innerhalb atherosklerotischer Plaques; Osler-Webber Syndrom; Myokard-Angiogenese; Plaqueneovaskularisation; Telangiektasien, haemophile Gelenke; Angiofibrome; Wundgranulation; Krankheiten gekennzeichnet durch übermäßige oder abnormale Stimulation von Endothelialzellen einschließlich intestinaler Adhaesionen, Morbus Crohn, Atherosklerose, Skleroderma und hypertrophe Narben (d.h. Keloide) und Krankheiten, die Angiogenese als eine pathologische Konsequenz haben, einschließlich Katzenkratzkrankheit (Rochele minalia quintosa) und Geschwüre (Helicobacter pylori). Eine andere Verwendung ist als ein Geburtenkontrollmittel, welches die Ovulation und die Errichtung der Plazenta hemmt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch nützlich sein für die Prävention von Metastasen aus den oben beschriebenen Tumoren, entweder alleine verwendet oder in Kombination mit Radiotherapie und/oder anderen chemotherapeutischen Behandlungen, die üblicherweise Patienten zur Behandlung von angiogenen Krankheiten verabreicht werden. Zum Beispiel können, wenn in der Behandlung von festen Tumoren verwendet, Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit chemotherapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden, wie zum Beispiel alpha Interferon, COMP (Cyclophosphamid, Vincristin, Methotrexat und Prednison), Etoposid, mBACOD (Methortrexat, Bleomycin, Doxorubicin, Cyclophosphamid, Vincristin und Dexamethason), PRO-MACE/MOPP (Prednison, Methotrexat (w/Leucovin rescue), Doxorubicin, Cyclophosphamid, Taxol, Etoposid/Mechlorethamin, Vincristin, Prednison und Procarbazin), Vincristin, Vinblastin, Angioinhibine, TNP-470, Pentosan Polysulfat, Plättchenfaktor 4, Angiostatin, Lösungsmittel-609, SU-101, CM-101, Techgalan, Thalidomid, SP-PG und dergleichen. Andere chemotherapeutische Wirkstoffe schließen Alkylierungsmittel wie zum Beispiel Stickstoffsenfgas einschließlich Mechloethamin, Melphan, Chlorambucil, Cyclophosphamid und Ifosfamid ein; Nitrosoharnstoffe einschließlich Carmustin, Lomustin, Semustin und Streptozocin; Alkylsulfonate, einschließlich Busulfan; Triazine einschließlich Dacarbazin; Ethylenimine einschließlich Thiotepa und Hexamethylmelamin; Folsäureanaloge einschließlich Methotrexat; Pyrimidinanaloge einschließlich 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid; Purinanaloge einschließlich 6-Mercaptopurin und 6-Thioguanin; Antitumorantibiotika einschließlich Actinomycin D; die Anthracycline einschließlich Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin C und Methramycin; Hormone und Hormonantagonisten einschließlich Tamoxifen und Cortiosteroide und gemischte Wirkstoffe einschließlich Cisplatin und Brequinar. Zum Beispiel kann ein Tumor konventionell durch Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie und Kringle 5 Verabreichung mit nachfolgender Kringle 5 Verabreichung, um den Schlafzustand von Mikrometastasen auszudehnen und zu stabilisieren und das Wachstum von irgendwelchen restlichen Primärtumoren zu hemmen, behandelt werden.
Cytotoxische Wirkstoffe, wie zum Beispiel Ricin können an Kringle 5 Peptidfragmente geknüpft werden und dadurch einen Tool zur Zerstörung von Zellen bereitstellen, welche Kringle 5 binden. Peptide, welche an cytotoxische Wirkstoffe gebunden sind, können in einer Art und Weise infundiert werden, die ausgestaltet ist, um die Zuführung an den gewünschten Ort zu maximieren. Zum Beispiel können Ricin-verknüpfte hochaffinitäts-Kringle 5 Fragmente über eine Kanüle direkt in das Ziel oder in Gefäße, welche die Zielstelle versorgen, zugeführt werden. Solche Wirkstoffe können auch in einer kontrollierten Art und Weise durch osmotische Pumpen, gekoppelt an Infusionkanülen, zugeführt werden. Eine Kombination aus Kringle 5 Antagonisten kann co-verabreicht werden mit Stimulatoren der Angiogenese, um die Gefäßbildung des Gewebes zu erhöhen. Therapeutische Regimes dieses Typs könnten ein wirksames Mittel zur Zerstörung von metastasierendem Krebs bereitstellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in der Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet sind. Mit "pharmazeutisch verträgliches Salz" sind diejenigen Salze gemeint, welche innerhalb des Umfangs von gesunder medizinischer Bewertung geeignet sind für die Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Antwort und dergleichen und die überstimmend sind mit einem vernünftigen Nutzen/Risikoverhältnis. Pharmazeutisch verträgliche Salz sind im Fachgebiet wohl bekannt. Zum Beispiel beschreiben S. M. Berge, et al. pharmazeutisch verträgliche Salze im Detail in J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1 und folgende.
Die Salze können in situ während der Endisolation und Reinigung der Verbindungen der Erfindung hergestellt werden oder separat durch Reagieren einer freien Basenfunktion mit einer geeigneten organischen Säure. Repräsentative Säureadditionssalze schließen folgende ein: Acetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzensulfonat, Bisulfat, Butyrat, Camphorat, Camphorsulfonat, Digluconat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat (Isethionat), Lactat, Maleat, Methansulfonat, Nicotinat, 2-Naphthalensulfonat, oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Phosphat, Glutamat, Bicarbonat, p-Toluensulfonat und Undecanoat. Auch die basischen Stickstoff-enthaltenden Gruppen können quaternisiert werden mit solchen Wirkstoffen, wie zum Beispiel niederen Alkylhalogeniden, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl und Butylchloriden, Bromiden und Jodiden; Dialkylsulfaten wie Dimethyl, Diethyl, Dibutyl und Diamylsulfaten; langkettigen Halogeniden, wie zum Beispiel Decyl, Lauryl, Myristyl und Stearylchloriden, Bromiden und Jodiden; Arylalkylhalogeniden, wie zum Beispiel Benzyl und Phenethylbromiden und anderen. Wasser oder Öl-lösliche oder dispergierbare Produkte werden dabei erhalten. Beispiele für Säuren, welche verwendet werden können, um pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze zu bilden, schließen solche anorganischen Säuren ein, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und solche organischen Säuren, wie zum Beispiel Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure und Citronensäure.
Basische Additionssalze können in situ während der Endisolation und Reinigung von Kringle 5 Peptidfragmenten hergestellt werden durch Reagieren eines Carbonsäure enthaltenden Anteils mit einer geeigneten Base, wie zum Beispiel dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations oder mit Ammoniak oder einem organischen primären, sekundären oder tertiären Amin. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen Kationen ein, basierend auf Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen, wie zum Beispiel Lithium, Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium und Aluminiumsalze und nicht toxischer quaternärer Ammoniak und Aminkationen einschließlich Ammonium, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Diethylamin, Ethylamin. Andere repräsentative organische Amine, die nützlich sind für die Bildung von Basenadditionssalzen schließen Ethylendiamin, Diethylamin, Ethylamin. Andere repräsentative organische Amine, die nützlich sind für die Bildung von Basenadditionssalzen schließen Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperidin, Piperazin ein. Bevorzugte Salze der Verbindungen der Erfindung schließen Phosphat, Tris und Acetat ein.
Kringle 5 Peptidfragmente, Kringle 5 Antiseren, Kringle 5 Rezeptoragonisten, Kringle 5 Rezeptorantagnoisten oder Kombinationen daraus können kombiniert werden mit pharmazeutisch verträglichen Matrizen mit anhaltender Freisetzung, wie zum Beispiel bioabbaubaren Polymeren, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden. Eine Matrix mit anhaltender Freisetzung, wie hierin verwendet, ist eine Matrix hergestellt aus Materialien, üblicherweise Polymeren, welche durch enzymatische oder Säure-Base-Hydrolyse oder durch Auflösung abbaubar sind. Einmal in den Körper eingeführt, wirken Enzyme und Körperflüssigkeiten auf die Matrix ein. Eine Matrix mit anhaltender Freisetzung wird wünschenswerterweise gewählt aus biokompatiblen Materialien, wie zum Beispiel Liposomen, Polylactiden (Polymilchsäure), Polyglcoliden (Polymer der Glycolsäure), Polylactid co-Glycolid (Copolymeren von Milchsäure und Glycolsäure)Polyanhydriden, Poly(ortho)estern, Polypeptiden, Hyaluronsäure, Kollagen, Chondroitinsulfat, Carbonsäuren, Fettsäuren, Phospholipiden, Polysacchariden, Nucleinsäure, Polyaminosäuren, Aminosäuren, wie zum Beispiel Phenylalanin, Tyrosin, Isoleucin, Polynucleotiden, Polyvinylpropylen, Polyvinylpyrolidon und Silikon. Eine bevorzugte bioabbaubare Matrix ist eine Matrix aus einem von entweder Polylactid, Polyglycolid oder Polylactid co-Glycolid (Copolymeren von Milchsäure und Glycolsäure).
Kringle 5 Peptidfragmente, Kringle 5 Fusionsproteine, Kringle 5 Rezeptoragonisten, Kringle 5 Rezeptorantagnoisten oder Kombinationen daraus können mit pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln oder Trägern kombiniert werden, um therapeutische Zusammensetzungen zu bilden. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger oder Bindemittel bezieht sich auf einen nicht toxischen festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder eine Formulierungshilfe jeden Typs. Die Zusammensetzungen können parenteral, sublingual, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, rektal, bukkal oder topisch verabreicht werden (wie durch Puder, Salben, Tropfen, transdermales Pflaster oder eine Iontophoresevorrichtung).
Der Ausdruck "parenteral", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Arten der Verabreichung, welche intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intraartikuläre Injektion und Infusion einschließen. Pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Injektion umfassen pharmazeutisch verträgliche sterile wässerige oder nicht wässerige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen ebenso wie sterile Pulver für die Rekonstitution in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor der Verwendung. Beispiele für geeignete wässerige und nicht wässerige Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Vehikel schließen Wasser, Ethanol, Polyole (wie zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen), Carboxymethylzellulose und geeignete Mischungen davon, pflanzliche Öle (wie zum Beispiel Olivenöl) und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat ein. Eine geeignete Fluidität kann aufrecht erhalten werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien, wie zum Beispiel Lecithin durch das Aufrecht erhalten der erforderlichen Partikelgröße in dem Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel Konservierungsmittel, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen kann sicher gestellt werden durch den Einschluß von verschiedenen antibakteriellen und antifungalen Wirkstoffen, wie zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Wirkstoffe, wie zum Beispiel Zucker, Natriumchlorid einzuschließen.
Eine verlängere Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann erreicht werden durch den Einschluß von Wirkstoffen, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine, welche die Absorption verzögern. Injizierbare Depotformen werden hergestellt durch Bilden von Mikroverkapselungsmatrizen des Arzneistoffs in bioabbaubaren Polymeren, wie zum Beispiel Polylactid-Polyglycolid, Poly(orhoester) und Poly(anhydriden). Abhängig von dem Verhältnis von Arzneistoff zu Polymer und der Natur des speziellen verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneistoff-Freisetung gesteuert werden. Injizierbare Depotformulierungen werden auch hergestellt durch Einschließen des Arzneistoffs in Liposome oder Mikroemulsionen, welche mit Körpergeweben kompatibel sind. Die injizierbaren Formulierungen können sterilisiert werden, zum Beispiel durch Filtration durch einen Bakterien-zurückhaltenden Filter oder durch Einschließen von sterilisierenden Mitteln in der Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser oder anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor der Verwendung aufgelöst oder dispergiert werden können.
Die topische Verabreichung schließt die Verabreichung an die Haut, die Mukosa oder Oberflächen der Lunge und des Auges ein. Zusammensetzungen für die topische Verabreichung einschließlich derjenigen für die Inhalation können als ein trockenes Pulver hergestellt werden, welches gepresst oder nicht gepresst werden kann. In nicht gepressten Pulverzusammensetzungen kann der aktive Inhaltsstoff in fein verteilter Form verwendet werden in Beimischung mit einem größeren pharmazeutisch verträglichen inerten Träger verwendet werden, der Partikel mit einer Größe von zum Beispiel bis zu 100 Mikrometern im Durchmesser umfaßt. Geeignete inerte Träger schließen Zucker, wie zum Beispiel Lactose ein. Vorzugsweise haben mindestens 95 Gewichtsprozent der Partikel des aktiven Inhaltsstoffs eine effektive Partikelgröße in dem Bereich von 0,01 bis 10 Mikrometer. Für die topische Verabreichung an das Auge wird eine Verbindung der Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen ophthalmologischen Vehikel zugeführt, so daß die Verbindung in Kontakt mit der Augenoberfläche gehalten wird, für einen ausreichenden Zeitraum, um es der Verbindung zu erlauben, die cornealen und internen Regionen des Auges zu penetrieren, wie zum Beispiel die fordere Kammer, die hintere Kammer, den Glaskörper, den Humor aquosus, den Humor vitreus, die Cornea, die Iris/Zilien, die Linse, das Choroid/Retina und die Sklera. Das pharmazeutisch verträgliche ophthalmologische Vehikel kann zum Beispiel eine Salbe, ein pflanzliches Öl oder ein Verkapselungsmaterial sein. Alternativ kann eine Verbindung der Erfindung direkt in den humor vitrious und aqueousus injiziert werden.
Die Zusammensetzung kann unter Druck gesetzt werden und ein komprimiertes Gas enthalten, wie zum Beispiel Stickstoff oder ein verflüssigtes Gastreibmittel. Das verflüssigte Treibmittelmedium und in der Tat die gesamte Zusammensetzung ist vorzugsweise so, daß sich der aktive Inhaltsstoff darin nicht wesentlich auflöst. Die unter Druck gesetzte Zusammensetzung kann auch einen oberflächenaktiven Wirkstoff, wie zum Beispiel einen flüssigen oder festen nicht ionischen oberflächenaktiven Wirkstoff enthalten, oder es kann ein fester anionischer oberflächenaktiver Wirkstoff sein. Es wird bevorzugt den festen anionischen oberflächenaktiven Wirkstoff in der Form eines Natriumsalzes zu verwenden.
Zusammensetzungen für die rektale oder vaginale Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, welche hergestellt werden können durch Mischen der Verbindungen dieser Erfindung mit geeigneten nicht reizenden Bindemitteln oder Trägern, wie zum Beispiel Kakaobutter, Polyethylenglycol oder einem Suppositorienwachs, welche bei Raumtemperatur Feststoffe sind aber bei Körpertemperatur Flüssigkeiten, und daher in dem Rektum oder der Vaginalhöhle schmelzen und die aktive Verbindung freisetzen.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in der Form von Liposomen verabreicht werden. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, sind Liposome im Allgemeinen abgeleitet von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen. Liposome werden gebildet durch mono- oder multi-lamellar hydrierte Flüssigkristalle, die in einem wässerigem Medium dispergiert werden. Jedes nicht toxische, physiologisch verträgliche und metabolisierbare Lipid, das in der Lage ist Liposome zu bilden, kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomform können, zusätzlich zu einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Bindemittel und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind die Phospholipide und die Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl natürlich als auch synthetisch. Verfahren zur Bildung von Liposomen sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Prescott, Herausgeber, Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), Seite 33 und folgende.
Wenn in den obigen oder anderen Behandlungen verwendet, kann eine therapeutisch wirksame Menge von einer der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in reiner Form oder, wo solche Formen existieren, in pharmazeutisch verträglicher Salzform verwendet werden, und mit oder ohne einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel. Eine "therapeutisch wirksame Menge" der Verbindung der Erfindung bedeutet eine ausreichende Menge der Verbindung, um eine angiogene Erkrankung zu behandeln (zum Beispiel, um das Tumorwachstum einzuschränken oder zu verlangsamen oder Tumormetastasen zu blockieren) bei einem vernünftigen Nutzen/Risikoverhältnis, das auf jede medizinische Behandlung anwendbar ist. Es wird jedoch verstanden werden, daß die gesamte tägliche Verwendung der Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch den behandelnden Arzt entschieden werden wird, innerhalb des Umfangs von gesunder medizinischer Bewertung. Der spezifische therapeutisch wirksame Dosisspiegel für irgendeinen speziellen Patienten wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich der zu behandelnden Krankheit und der Schwerde der Störung; der Wirksamkeit der spezifischen verwendeten Verbindung; der spezifischen verwendeten Zusammensetzung; dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, den Geschlecht und der Ernährung des Patienten; der Zeit der Verabreichung; dem Weg der Verabreichung; der Ausscheidungsrate, der spezifischen verwendeten Verbindung; der Dauer der Behandlung; den Arzneistoffen, welche in Kombination oder gleichzeitig mit der spezifischen verwendeten Verbindung verwendet werden, und ähnlichen Faktoren, die im medizinischen Fachgebiet wohl bekannt sind. Zum Beispiel liegt es wohl innerhalb des Könnens im Fachgebiet, die Dosierungen der Verbindung bei Spiegeln zu beginnen, die niedriger sind als diejenigen, die erforderlich sind, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, und die Dosierung nach und nach zu erhöhen, bis der gewünschte Effekt erreicht ist. Die gesamte tägliche Dosis von Kringle 5 Peptidfragmenten oder Fusionsproteinen, die lokal oder systemisch an einen menschlichen oder anderen Säugetierwirt in einzelnen oder geteilten Dosen verabreicht werden soll, kann in Mengen von zum Beispiel von 0,0001 bis 200 mg/kg Körpergewicht täglich, und üblicher 1 bis 300 mg/kg Körpergewicht sein. Wenn gewünscht, kann die wirksame tägliche Dosis unterteilt werden in vielfache Dosen für die Zwecke der Verabreichung. Folglich können Einzeldosiszusammensetzungen solche Mengen oder Untermengen davon enthalten, um die tägliche Dosis auszumachen.
Es wird verstanden werden, daß Wirkstoffe, welche mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können für die Hemmung, Behandlung oder Prophylaxe von angiogenen Erkrankungen nicht beschränkt sind auf diejenigen, die oben aufgelistet sind, sondern im Prinzip sämtliche Wirkstoffe einschließen, die nützlich sind für die Behandlung oder die Prophylaxe von angiogenen Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte Polynukleotide bereit, welche ein Säugetier-Kringle 5 Peptidfragment oder Fusionsprotein kodieren, welches Angiogenese-hemmende Wirksamkeit besitzt. Solche Polynukleotide können für die Expression von rekombinanten Kringle 5 Peptidfragmenten oder in der Gentherapie (wie unten beschrieben) verwendet werden.
Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann in der Form von mRNA oder DNA sein. Polynukleotide in der Form von DNA, cDNA, genomischer DNA und synthetischer DNA sind innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und kann, wenn einzelsträngig, der kodierende (sense) Strang oder der nicht kodierende (anti-sense) Strang sein. Ein Polynukleotid der Erfindung kann eine unmodifizierte Form sein, oder eine Modifikation, wie zum Beispiel Methylierung oder Bedeckung einschließen.
Die kodierende Sequenz, welche das Polypeptid kodiert, kann identisch sein mit der kodierenden Sequenz, die hierin bereitgestellt ist, oder kann eine unterschiedliche kodierende Sequenz sein, wobei die kodierende Sequenz, als ein Ergebnis der Überflüssigkeit oder Degeneration des genetischen Codes, das gleiche Polypeptid wie die hierin bereitgestellte DNA kodiert. Dieses Polynukleotid kann nur die kodierende Sequenz für das Polypeptid einschließen, oder die kodierende Sequenz für das Polypeptid und eine zusätzliche kodierende Sequenz, wie zum Beispiel eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz, oder die kodierende Sequenz für das Polypeptid (und wahlweise zusätzliche kodierende Sequenz) und eine nicht kodierende Sequenz, wie zum Beispiel eine nicht kodierende Sequenz 5' und/oder 3' von der kodierenden Sequenz für das Polypeptid.
Zusätzlich schließt die Erfindung abweichende Polynukleotide ein, die Modifikationen enthalten, wie zum Beispiel Polynukleotiddeletionen, Substitutionen oder Additionen; und jegliche Polypeptidmodifikation, die aus der abweichenden Polynukleotidsequenz resultiert. Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann auch eine kodierende Sequenz haben, welche eine natürlich vorkommende allele Variante der kodierenden Sequenz ist, die hierin bereitgestellt wird.
Zusätzlich kann die kodierende Sequenz für das Polypeptid in den selben Ableserahmen an eine Polynukleotidsequenz fusioniert werden, welche in der Expression und Sekretion eines Polypeptids von einer Wirtszelle hilft, zum Beispiel eine Leadersequenz, welche als eine sekretorische Sequenz für die Steuerung des Transports eines Polypeptids von der Zelle funktioniert. Das Polypeptid, das eine Leadersequenz hat, ist ein Präprotein und kann die Leadersequenz durch die Wirtszelle abgespalten haben, um das Polypeptid zu bilden. Die Polynukleotide können auch für ein Präprotein kodieren, welches das Protein plus zusätzliche 5'-Aminosäurereste ist. Ein Protein, das eine Prosequenz hat, ist ein Proprotein und kann in einigen Fällen eine inaktive Form des Proteins sein. Wenn die Prosequenz abgespalten wird, bleibt ein aktives Protein zurück. Somit kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung für ein Protein kodieren, oder für ein Protein, das eine Prosequenz hat, oder für ein Protein, das sowohl eine Präsequenz (Leadersequenz) als auch eine Prosequenz hat.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können auch die kodierende Sequenz fusioniert im Rahmen an eine Markersequenz haben, was die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erlaubt. Die Markersequenz kann eine GST-Marke sein, geliefert durch einen pGEX Vektor, um die Reinigung des Polypeptids zu erlauben, das an den Marker fusioniert ist, in dem Fall eines bakteriellen Wirts, oder zum Beispiel kann die Markersequenz ein Hemagglutinin (HA) Marker sein, wenn ein Säugetierwirt, z. B. COS-7 Zellen, verwendet wird. Der HA Marker entspricht einem Epitop, abgeleitet von dem Influenza Hemagglutinin Protein. Siehe zum Beispiel I. Wilson, et al., Cell 37: 767 (1984).
Das Polynukleotid kann in irgendeiner Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese, Replikation, reverser Transkription oder Transkription, welche auf der Information basiert, die durch die Sequenz von Basen in der Region (den Regionen) bereitgestellt wird, aus welchen das Polynukleotid abgeleitet ist; als solches kann es entweder eine sense oder eine anti-sense Orientierung des ursprünglichen Polynukleotids darstellen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Erzeugung eines Polynukleotids ist durch die Polymerasekettenreaktion beschrieben in U.S. Patenten 4,683,195 und 4,683,202.
Es wird in Erwägung gezogen, daß Polynukleotide erachtet werden, daß sie an die Sequenzen hybridisieren, die hierin bereitgestellt sind, wenn es mindestens 50% und vorzugsweise mindestens 70% Identität zwischen dem Polynukleotid und der Sequenz gibt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, welche Polynukleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, welche genetisch bearbeitet sind mit Vektoren der vorliegenden Erfindung, und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung durch rekombinante Techniken. Solche Verfahren umfassen das kultivieren der Wirtszellen und Bedingungen, die geeignet sind für die Expression des Kringle 5 abgeleiteten Polynukleotids, und das wiedergewinnen des Kringle 5 abgeleiteten Polypeptids aus der Zellkultur.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Herstellung eines Polypeptids durch rekombinante Techniken. Somit kann die Polynukleotidsequenz in irgendeines von einer Vielzahl von Expressionsvehikeln eingeschlossen werden, insbesondere Vektoren oder Plasmide für die Expression eines Polypeptids. Solche Vektoren schließen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA Sequenzen ein, zum Beispiel Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen DNA; Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden abgeleitet sind und Phagen DNA, virale DNA, wie zum Beispiel Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies. Jedoch kann irgendein anderes Plasmid oder Vektor verwendet werden so lange es replizierbar und überlebensfähig in dem Wirt ist.
Die geeignete DNA Sequenz kann in den Vektor eingesetzt werden durch eine Vielzahl von Verfahren. Im allgemeinen wird die DNA Sequenz in geeignete Restriktionsendonukleasestellen eingesetzt durch Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind. Solche Verfahren und andere sollen innerhalb des Umfangs von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, liegen. Die DNA Sequenz in dem Expressionsvektor ist operativ an eine geeignete Expressionskontrollsequenz (Promoter) geknüpft, um die mRNA Synthese zu steuern. Repräsentative Beispiele für solche Promoter schließen folgende ein:
LTR oder SV40 Promoter, das E. coli lac oder trp, der Phagen Lambda P sub L Promoter und andere Promoter, die dafür bekannt sind, die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder deren Viren zu steuern. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiierung und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen für die Amplifizierungsexpression einschließen. Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein Gen, um ein phenotypisches Merkmal für die Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie zum Beispiel Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für eukaryotische Zellkultur oder, wie zum Beispiel Tetracyclin oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, der die geeignete DNA Sequenz enthält, wie hierin oben beschrieben, ebenso wie ein geeigneter Promoter oder eine Kontrollsequenz, können verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um den Wirt zu erlauben, das Protein zu exprimieren. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können folgende genannt werden: bakterielle Zellen, wie zum Beispiel E. coli, Salmonella Typhimurium; Streptomyces spp.; Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe, Insektenzellen, wie zum Beispiel Drosophila und Sf9; und tierische Zellen, wie zum Beispiel CHO, COS oder Bowes, etc. Die Auswahl eines geeigneten Wirts soll innerhalb des Umfangs von denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, aus den hierin bereitgestellten Lehren liegen.
Genauer schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere der Sequenzen, wie oben breit beschrieben, umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie zum Beispiel ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in welchen eine Sequenz der Erfindung eingefügt wurde, in einer Vorwärts- oder reversen Orientierung. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt weiter regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel einen Promoter, operativ an die Sequenz geknüpft. Große Zahlen von geeigneten Vektoren und Promotern sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt und sind kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele bereit gestellt. Bakteriell: pSPORT1 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene^®, La Jolla, CA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia^®). Eukarytisch: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene^®) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia^®). Jedoch kann jedes andere Plasmid oder Vektor verwendet werden, solange es in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Promoterregionen können gewählt werden aus irgendeinem gewünschten Gen, unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase) Vektoren oder anderen Vektoren, mit wählbaren Markern. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Speziell benannte bakterielle Promoter schließen lacI, lacZ, T3, SP6, T7, gpt, lambda P sub R, P sub L und trp ein. Eukariotische Promoter schließen Cytomegalivirus (CMV) Immediate Early, Herpes-Simplex-Virus (HSV) Thymidin-Kinase, frühes und spätes SV40, LTPs von Retrovirus und Maus-Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promoters liegt wohl innerhalb des Könnens von jemandem, mit durchschnittlichem Können im Fachgebiet.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, die das oben beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotscihe Zelle sein, wie zum Beispiel eine Säugetier-Zelle oder eine niedrigere eukaryotische Zelle, wie zum Beispiel eine Hefe-Zelle oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein, wie zum Beispiel eine bakterielle Zelle. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann bewirkt werden, durch Kalziumphosphat-Transfizierung, DEAE-Dextran-vermittelte Transfizierung oder Elektroporation (L. Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", 2. Ausgabe, Appleton und Lang, Paramount Publishing, East Norwalk, CT (1994)).
Die Konstrukte in Wirtszellen können in einer üblichen Art und Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das durch die rekombinante Sequenz kodiert wird. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung synthetisch hergestellt werden, durch konventionelle Peptid-Synthesizer.
Proteine können in Säugetier-Zellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen, unter der Kontrolle von geeigneten Promotern exprimiert werden. Zell-freie Translations-Systeme können auch verwendet werden, um solche Proteine herzustellen, unter Verwendung von RNAs, abgeleitet von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung. Geeignete Klonierungs- und Expressions-Vektoren für die Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten sind beschrieben durch Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, (Gold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Die Transkription einer DNA, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch höhere Eukaryoten kodiert, wird durch Einfügen einer Verstärker-Sequenz in den Vektor erhöht. Verstärker sind cis-wirkende Elemente der DNA, üblicherweise ungefähr von 10 bis 300 bp, die auf einen Promoter wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40- Verstärker auf der späten Seite des Replikations-Ursprungs (pb 100 bis 270), einen Cytomegalivirus frühen Promoter-Verstärker, einen Polyoma-Verstärker auf der späten Seite des Replikations-Ursprungs und Adenovirus-Verstärker ein.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressions-Vektoren Replikations-Ursprünge und wählbare Marker, welche die Transformation der Wirtszelle erlauben, zum Beispiel das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und S. cerevisiae TRP1-Gen und einen Promoter, abgeleitet von einem hochexprimierten Gen, um die Transkrition einer stromabwärts Struktur-Sequenz zu steuern, einschließen. Solche Promoter können abgeleitet sein von Operons, die glykolytische Enzyme kodieren, wie zum Beispiel 3-Phosphorglycerat-Kinase (PGK), Alpha-Faktor, saure Phosphatase oder Hitze-Schock-Proteine, unter anderen. Die heterologe Struktur-Sequenz wird in der geeigneten Phase zusammengesetzt mit Translations-Initiations- und Terminations-Sequenzen und vorzugsweise einer Leader-Sequenz, die in der Lage ist, die Sequenzion von translatiertem Protein in dem periplasmatischen Raum oder das extra-zelluläre Medium zu steuern. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein kodieren, einschließlich einem N-terminalen Identifikations-Peptid, das gewünschte Charakteristika vermittelt, zum Beispiel Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinaten Produkts.
Nützliche Expressions-Vektoren für die bakterielle Verwendung werden durch Einfügen einer strukturellen DNA-Sequenz konstruiert, die ein gewünschtes Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und -terminationssignalen in betriebsfähiger Ablesephase mit einem funktionellen Promoter. Der Vektor wird einen oder mehrere phenotypische wählbare Marker und einen Replikations-Ursprung umfassen; um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und, wenn gewünscht, die Amplifikation innerhalb des Wirts bereitzustellen. Geeignete prokaryotische Wirte für die Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas; Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere auch als eine routinemäßige Auswahl verwendet werden können.
Nützliche Expressions-Vektoren für die bakterielle Verwendung umfassen einen auswählbaren Marker und einen bakteriellen Replikations-Ursprung, abgeleitet von Plasmiden, die genetische Elemente des wohl bekannten Klonierungs-Vektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Andere Vektoren schließen PKK223-3 (Pharmacia^® Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI) ein. Diese pBR322 "Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promoter und der zu exprimierenden Struktur-Sequenz kombiniert.
Nützliche Expressions-Vektoren können auch einen Fusionspartner umfassen, zur Erleichterung der Reinigung eines gewünschten Polypeptids der Erfindung oder zur Herstellung von löslichen Polypeptiden. Beispiele für kommerzielle Fusionsvektoren schließen pET32a (Novagen, Madison, WI), pGEX-4T-2 (Pharmacia^® und pCYB3 (New England Biolabs, Beverly, MA) ein.
Ein anderer nützlicher Fusionsvektor ist pHil-D8, dessen Struktur und Herstellung vollständig in Beispiel 19, Teil B offenbart ist. Expressions-Vektoren, die die Verwendung von Fusionspartnern vermeiden, können auch konstruiert werden, insbesondere für die Hoch-Level-Expression von Kringle-5-Peptid-Fragmenten oder Fusionsproteinen in bakteriellen Zellen. Zum Beispiel können Vektoren wie beschrieben durch Pilot-Matias, T. J., et al., in Gene, 128: 219–225 (1993) gemacht werden, um die translationale Kopplung zu optimieren.
Alternativ kann ein Polynukleotid der Erfindung co-exprimiert werden mit einem separaten akzessorischen Plasmid, welches selbst ein Protein oder Peptid kodiert, das bei der löslichmachung des ersten Peptids von Interesse hilfreich ist (siehe, zum Beispiel Makrides, S. C., Microbiolotical Reviews, 60: 512 (1996)). Zum Beispiel können bestimmte Kringle-5-Peptid-Fragmente (welche gezeigt haben, dass sie als lösliche Fusionsproteine mit Thioredoxin hergestellt werden (siehe Beispiel 20)) von einem nicht-Fusionsvektor gleichzeitig mit (d.h. in der selben Wirtszelle wie) einem Zweit-Vektor exprimiert werden, der Thioredoxin exprimiert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Wachstum des Wirtsstammes zu einer geeigneten Zelldichte wird der gewählte Promoter durch geeignete Mittel wieder verdrängt (zum Beispiel Temperatur-Shift oder chemische Induktion) und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert. Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel zerstört und der resultierende rohe Extrakt wird für die weitere Reinigung zurück gehalten. Mikrobielle Zellen, die in der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch irgendein geeignetes Verfahren zerstört werden, einschließlich Gefrier-Tau-Kreislauf-Führung, Ultraschall, mechanische Zerstörung oder die Verwendung von Zell-lysierenden Wirkstoffen; solche Verfahren sind dem durchschnittlichen Fachmann wohl bekannt.
Verschiedene Säugetier-Zellkultur-Systeme können auch verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele für Säugetier-Expressions-Systeme schließen die COS-7-Linien von Affen-Nieren-Fibroblasten ein, die von Gluzmann, Cell 23: 175 (1981) beschrieben wurden und andere Zell-Linien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, wie zum Beispiel die C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK-Zell-Linien. Säugetier-Expressions-Vektoren werden einen Replikations-Ursprung umfassen, einen geeigneten Promoter und Verstärker und auch jegliche notwendigen Ribosom-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor- und -Acceptorstellen, transkriptionelle Terminations-Sequenzen und 5'-flankierende, nicht transkribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von dem SV40 viralen Genom abgeleitet sind, zum Beispiel SV40-Ursprung, früher Promoter, Verstärker, Splice und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen. Repräsentative, nützliche Vektoren schließen pRc/CMV und pcDNA3 (erhältlich von Invitrogen, San Diego, CA) ein.
Die Verbindungen, Zusammensetzungen, Vektoren und Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung können in dem Kontext der Gentherapie verwendet werden, wobei das Gen, das Kringle-5-Peptid-Fragmente oder Kringle-5-Peptid-Fragment-Konjugate kodiert, in einem Patienten reguliert wird.
Verschiedene Verfahren zur Überführung oder Zuführung von DNA an Zellen zur Expression des Genprodukt-Proteins, anderweitig bezeichnet als Gentherapie, sind offenbart in Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335–356 (1992). Die Gentherapie umfasst den Einschluss von Polynukleotid-Sequenzen in somatische Zellen oder Keimlinien-Zellen für die Verwendung in entweder der ex vivo- oder der in vivo-Therapie. Gentherapie funktioniert, um Gene zu ersetzen, eine normale oder abnormale Genfunktion zu vergrößern und um infektiöse Krankheiten und andere Pathologien zu bekämpfen.
Strategien zur Behandlung von medizinischen Problemen mit Gentherapie schließen therapeutische Strategien ein, wie zum Beispiel die Identifizierung des defekten Gens und dann das Hinzufügen eines funktionalen Gens, um entweder die Funktion des defekten Gens zu ersetzen oder ein wenig funktionales Gen zu verstärken, oder prophylaktische Strategien, wie zum Beispiel Hinzufügen eines Gens, welches ein Proteinprodukt kodiert, das den Zustand behandeln wird oder das das Gewebe oder das Organ empfindlicher gegenüber einem Behandlungsregime machen wird. Als ein Beispiel einer prophylaktischen Strategie kann ein Gen, das ein Kringle-5-Peptid-Fragment oder ein Kringle-5-Peptid-Fragment-Konjugat kodiert, in einen Patienten eingesetzt werden und somit das Auftreten von Angiogenese verhindert, oder ein Gen, das Tumorzellen empfindlicher gegenüber Bestrahlung macht, könnte eingesetzt werden, sodass die Bestrahlung des Tumors eine erhöhte Abtötung der Tumorzellen bewirkt.
Viele Protokolle für den Transfer von DNA, welche ein Kringle-5-Peptid-Fragment oder ein Kringle-5-Fusionsprotein kodiert, oder für den Transfer der DNA für Kringle-5-Peptid-Fragment regulatorische Sequenzen (oder diejenigen des Fusionspartners) sind in dieser Erfindung vorstellbar. Die Transfektion von Promoter-Sequenzen, anders als die, die spezifisch mit einem Kringle-5-Peptid-Fragment assoziiert sind oder andre Sequenzen, welche die Produktion von Kringle-5-Peptid-Fragmenten erhöhen würden, sind auch als Verfahren der Gentherapie vorstellbar. Ein Beispiel dieser Technologie wird gefunden in Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Massachusetts, unter Verwendung von homologer Rekombination, um einen "genetischen Switch" einzuführen, welcher ein Erythropoietin-Gen in Zellen antreibt, wie offenbart in Genetic Engineering News, 15. April 1994.
Solche "genetischen Switches" könnten verwendet werden, um ein Kringle-5-Peptid-Fragment (oder einen Kringle-5-Rezeptor) in Zellen zu aktivieren, die diese Proteine nicht normal exprimieren.
Gentransfer-Verfahren für die Gentherapie fallen in drei breite Kategorien: (1) physikalisch (zum Beispiel Elektroporation, direkter Gentransfer und Partikelbeschuss), (2) chemisch (zum Beispiel Lipid-basierte Träger und andere nicht-virale Vektoren) und (3) biologisch (zum Beispiel Virusabgeleitete Vektoren). Zum Beispiel können nicht-virale Vektoren, wie zum Beispiel Liposome, beschichtet mit DNA, direkt intravenös in den Patienten injiziert werden. Es wird geglaubt, dass die Liposom/DNA-Komplexe in der Leber konzentriert werden, wo sie die DNA an Makrophagen und Kupferzellen überführen. Vektoren oder die "nackte" DNA des Gens kann auch direkt in das gewünschte Organ, Gewebe oder Tumor injiziert werden, für eine gezielte Zuführung der therapeutischen DNA.
Gentherapie-Methodiken können auch durch die Zuführungsstelle beschrieben werden. Fundamentale Wege, um Gene zuzuführen, schließen ex vivo-Gentransfer, in vivo-Gentransfer und in vitro-Gentransfer ein. Beim ex vivo-Gentrasfer werden Zellen von dem Patienten entnommen und in Zellkultur gezüchtet. Die DNA wird in die Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen werden zahlenmäßig expandiert und dann in den Patienten reimplantiert. Beim in vitro-Gentransfer sind die transformierten Zellen Zellen, die in Kultur wachsen, wie zum Beispiel Gewebekultur-Zellen und nicht spezielle Zellen von einem speziellen Patienten. Diese "Laborzellen" werden transfiziert und die transfizierten Zellen werden ausgewählt und entweder für die Implantation in einen Patienten oder für andere Verwendungen vermehrt. In vivo-Gentransfer involviert das Einführen der DNA in die Zellen des Patienten, wenn die Zellen innerhalb des Patienten sind. Alle drei der breit basierten Kategorien, die oben beschrieben sind, können verwendet werden, um den Gentransfer in vivo, ex vivo und in vitro zu erzielen.
Mechanische (d.h. physikalische) Verfahren der DNA-Zuführung können erreicht werden, durch Mikroinjektion von DNA in Keim- oder somatische Zellen, pneumatisch zugeführte DNA-beschichtete Partikel, wie zum Beispiel die Goldpartikel, die in einem "Gen-Gewehr" verwendet werden und anorganische chemische Ansätze, wie zum Beispiel Kalziumphosphat-Transfektion. Es wurde herausgefunden, dass die physikalische Injektion von Plasmid-DNA in Muskelzellen einen höheren Prozentsatz an Zellen liefert, welche transfiziert sind und das sie eine anhaltende Expression von Marker-Genen haben. Die Plasmid-DNA kann in das Genom der Zellen eindringen oder nicht. Die Nicht-Integration der transfizierten DNA würde die Transfektion und Expression von Genprodukt-Proteinen in letztlich unterschiedlichen, nichtproliferativen Geweben für einen verlängerten Zeitraum erlauben, ohne die Angst vor Mutations-Insertionen, Deletionen oder Veränderungen in dem zellulären oder mitochondrialen Genom. Einen Langzeit-, aber nicht notwendigerweise permanenten, Transfer von therapeutischen Genen in spezifische Zellen kann Behandlungen für genetische Krankheiten oder für die prophylaktische Verwendung bereitstellen. Die DNA könnte periodisch wieder injiziert werden, um den Genprodukt-Spiegel aufrecht zu erhalten, ohne Mutationen, die in den Genomen der Empfängerzellen auftreten. Eine Nicht-Integration von exogenen DNAs kann die Anwesenheit von verschiedenen, unterschiedlichen exogenen DNA-Konstrukten innerhalb einer Zelle erlauben, wobei alle Konstrukte verschiedene Genprodukte exprimieren.
Partikel-vermittelter Gentransfer kann auch verwendet werden für das Injizieren von DNA in Zellen, Gewebe und Organe. Mit einer speziellen Beschuss-Vorrichtung oder einem "Gen-Gewehr", wird eine treibende Kraft erzeugt, um DNA-beschichtete Partikel hoher Dichte (wie zum Beispiel Gold oder Wolfram) auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, die die Penetration der Ziel-Organe, Gewebe oder Zellen erlaubt. Die Elektroporation für den Gentransfer verwendet einen elektrischen Strom, um Zellen oder Gewebe für den Elektroporations-vermittelten Gentransfer empfänglich zu machen. Ein kurzer elektrischer Impuls mit einer gegebenen Feldstärke wird verwendet, um die Permeabilität einer Membran derart zu erhöhen, dass DNA-Moleküle in die Zellen penetrieren können. Die Techniken für Partikelvermittelten Gentransfer und Elektroporation sind denjenigen von durchschnittlichem Können im Fachgebiet wohl bekannt.
Chemische Verfahren der Gentherapie schließen Trägervermittelten Gentransfer durch die Verwendung von fusogenen Lipid-Vesikeln, wie zum Beispiel Liposome oder anderen Vesikeln für die Membranfusion ein. Ein Träger, der eine DNA von Interesse beherbergt, kann bequem in Körperflüssigkeiten oder den Blutstrom eingeführt werden und dann Orts-spezifisch an das Zielorgan oder das Gewebe in dem Körper gelenkt werden. Zell- oder Organ-spezifische DNA-tragende Liposome, können zum Beispiel entwickelt werden und die fremde DNA, die von dem Liposom getragen wird, kann durch solche spezifischen Zellen absorbiert werden. Injektion von Immuno-Liposomen, welche zu einem spezifischen Rezeptor auf bestimmten Zellen gelenkt werden, können als ein bequemes Verfahren zur Insertion der DNA in die Zellen, welche diesen Rezeptor tragen, verwendet werden. Ein anderes Träger-System, das verwendet wurde, ist das Asialoglycoprotein/Polylysin-Konjugat-System zum Tragen von DNA an Hepatocyten für den in vivo-Gentransfer.
Transfizierte DNA kann auch mit anderen Arten von Trägern komplexiert werden, sodass die DNA zu der Empfänger-Zelle getragen wird und dann in dem Cytoplasma oder in dem Nukleoplasma hinterlegt wird. DNA kann an nukleare Trägerproteine in spezifisch bearbeiteten Vesikel-Komplexen gekoppelt werden und direkt in den Nukleus getragen werden.
Träger-vermittelter Gentransfer kann auch die Verwendung von Lipid-basierten Verbindungen involvieren, welche nicht Liposome sind. Zum Beispiel sind Lipofektine und Cytofektine Lipid-basierte positive Ionen, welche an negativ geladene DNA binden und einen Komplex bilden, der die DNA durch eine Zell-Membran tragen kann. Eine anderes Verfahren des Träger vermittelten Gentransfers involviert Rezeptor-basierte Endocytose. In diesem Verfahren wird ein Ligand (spezifisch für einen Zell-Oberflächen-Rezeptor) hergestellt, um einen Komplex mit einem Gen von Interesse zu bilden und wird dann in den Blutstrom injiziert. Ziel-Zellen, die den Zell-Oberflächen-Rezeptor haben, werden den Liganden spezifisch binden und den Ligand-DNA-Komplex in die Zelle transportieren.
Biologische Gentherapie-Methodiken verwenden virale Vektoren oder nicht-virale Vektoren (wie zum Beispiel die Ligand-DNA-Konjugate, Liposome und die Lipid-DNA-Komplexe, die oben diskutiert wurden), um Gene in Zellen einzuführen. Die tranfizierten Zellen können Zellen sein, die abgeleitet sind von dem normalen Gewebe des Patienten, von dem erkrankten Gewebe des Patienten oder Nicht-Patienten-Zellen.
Es kann wünschenswert sein, dass ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Kringle-5-Peptid-Fragment-DNA-Sequenz oder eine Kringle-5-Fusionsprotein-DNA-Sequenz umfasst, operativ an eine Expressions-Kontroll-Sequenz geknüpft wird, um einen Expressionsvektor zu bilden, der in der Lage ist, ein Kringle-5-Peptid-Fragment bzw. ein Fusionsprotein zu exprimieren. Alternativ kann die Genregulation eines Kringle-5-Peptid-Fragments oder eines Kringle-5-Fusionsproteins erreicht werden, durch Verabreichen von Verbindungen, die an das Kringle-5-Gen, das Fusionspartnergen oder die Kontrollregionen, die mit dem Kringle-5-Gen assoziiert sind oder das Gen seines Fusionspartners oder an ein entsprechendes RNA-Transkript (von jedem) binden, um die Geschwindigkeit der Transkription oder Translation zu modifizieren.
Virale Vektoren, die für Gentherapie-Protokolle verwendet wurden, schließen Retroviren, andere RNA-Viren, wie zum Beispiel Poliovirus oder Sindbisvirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesviren, SV40, Vaccinia oder andere DNA-Viren ein. Replikationsdefekte retrovirale Ratten-Vektoren sind die am weitest verbreitet verwendeten Gentransfer-Vektoren. Ratten-Leukämie-Retroviren sind zusammen gesetzt aus einer Einzel-Strang-RNA, komplexiert mit einem nuklearen Kernprotein und Polimerase (pol) Enzymen, eingeschlossen durch einen Proteinkern (gag) und umgeben von einer Glycoproteinhülle (env), welche den Wirtsbereich bestimmt. Die genomische Struktur von Retroviren schließt gag-, pol- und env-Gene, eingeschlossen an den 5'- und 3'-langen terminalen Wiederholungen (LTRs) ein. Retrovirale Vektor-Systeme nutzen die Tatsache aus, dass ein minimaler Vektor, der die 5'- und 3'-LTRs und das Packsignal enthält, ausreichend ist, um dem Vektor das Einpacken und Infizieren und Integrieren in Zielzellen zu erlauben, was dazu führt, dass die viralen Strukturproteine in trans in die Pack-Zell-Linie eingeführt werden. Wesentliche Vorteile von retroviralen Vektoren für den Gentransfer schließen eine effiziente Infektion und Gen-Expression in den meisten Zelltypen, eine präzise Einzel-Kopie-Vektor-Integration in die chromosomale DNA der Ziel-Zelle und eine Erleichterung der Manipulation des retroviralen Genoms ein. Zum Beispiel wurden veränderte Retro-Virus-Vektoren in ex vivo-Verfahren verwendet, um Gene in periphere und Tumor-infiltrierende Lymphocyten, Hepatocyten, Epidermalzellen, Myocyten oder andere somatische Zellen einzuführen (welche dann in den Patienten eingeführt werden können, um das Genprodukt von der eingefügten DNA bereitzustellen).
Der Adenovirus ist zusammengesetzt aus linearer, doppelsträngiger DNA, komplexiert mit Kernproteinen und umgeben von Kapsid-Proteinen. Vorteile in der molekularen Virologie haben zu der Fähigkeit geführt, die Biologie dieser Organismen auszunutzen, um Vektoren hervor zu bringen, die in der Lage sind, neue genetische Sequenzen in Ziel-Zellen in vivo zu überführen. Adenoviral-basierte Vektoren werden Genprodukt-Peptide in hohen Spiegeln exprimieren. Adenovirale Vektoren haben eine hohe Effizient von Infektiosität, sogar bei niedrigen Virus-Titern. Zusätzlich ist der Virus vollständig infektiös, als ein Zell-freies Virion, sodass eine Injektion von Erzeuger-Zell-Linien nicht notwendig ist. Ein anderer potenzieller Vorteil von adenoviralen Vektoren ist die Fähigkeit, Langzeit-Expression von heterologen Genen in vivo zu erzielen.
Virale Vektoren wurden auch verwendet, um Gene in Zellen einzufügen, unter Verwendung von in vivo-Protokollen. Um die Gewebe-spezifische Expression von fremden Genen zu lenken, können cis-wirkende regulatorische Elemente oder Promoter verwendet werden, die dafür bekannt sind, dass sie Gewebe-spezifisch sind. Alternativ kann dies unter Verwendung von in situ-Zuführung von DNA oder viralen Vektoren an spezifische anatomische Stellen in vivo erreicht werden. Zum Beispiel wurde der Gentransfer in Blutgefäße in vivo durch Implantieren von in vitro-transduzierten Endothelialzellen in ausgewählte Stellen auf arteriellen Wänden erzielt. Die Virus-infizierten umgebenden Zellen exprimierten auch wiederum das Genprodukt. Ein viraler Vektor kann direkt an die in vivo-Stelle zugeführt werden (zum Beispiel durch einen Katheder), wodurch erlaubt wird, dass nur bestimmte Gebiete durch den Virus infiziert werden und eine Langzeit-, Orts-spezifische Gen-Expression bereitgestellt wird.
Der in vivo-Gentransfer unter Verwendung von Retrovirus-Vektoren wurde auch gezeigt in Mamma-Gewebe und Lebergewebe durch Injektion des veränderten Virus in Blutgefäße, welche zu den Organen führen.
Kringle-5-Peptid-Fragmente können auch hergestellt werden und in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Als Beispiele können verschiedene Peptid-Fragmente von Kringle-5 verwendet werden (1) als Argonisten und Antagonisten, die an Kringle-5-Bindungsstellen wirksam sind, (2) als Antigene für die Entwicklung von spezifischen Antiseren, (3) als Peptide für die Verwendung in diagnostischen Kits und (4) als Peptide, die verknüpft sind mit oder in Kombination verwendet werden mit cytotoxischen Wirkstoffen für die Ziel-gerichtete Abtötung von Zellen, die Kringle-5-Peptid-Fragmente binden. Die Aminosäure-Sequenzen, die diese Peptid-Fragmente umfassen, können auf der Basis ihrer Position auf den äußeren Regionen des Moleküls gewählt werden, welche zugänglich sind für die Bindung an Antiseren, oder auf Basis der inhibitorischen Potenz der Peptid-Fragmente gegenüber Prozessen, die aus Angiogenese entstehen oder dadurch verschlechtert werden. Desweiteren können diese Peptid-Sequenzen mit bekannten Sequenzen verglichen werden, unter Verwendung von Protein-Sequenz-Datenbanken, wie zum Beispiel GenBank, Brookhaven-Protein, SWISS-PROT und PIR, um potenzielle Sequenz-Homologien zu bestimmen. Diese Information erleichtert die Elimination von Sequenzen, welche einen hohen Grad an Sequenz-Homologie zu anderen Molekülen zeigen und dadurch das Potenzial für eine hohe Spezifität in der Entwicklung von Antiseren, Agonisten und Antagonisten gegen Kringle-5 zu verstärken.
Kringle-5-Peptid-Fragmente oder Fusionsproteine können auch verwendet werden als ein Mittel, um einen Kringle-5-Rezeptor zu isolieren, durch Immobilisierung des Kringle-5-Peptid-Fragments oder Fusionsproteins auf einem festen Träger in beispielsweise einer Affinitäts-Säule, durch welche kultivierte Endothelialzellen oder Membran-Extrakte hindurch geführt werden. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, kann nach der Isolation und Reinigung eines Kringle-5-Rezeptors eine Aminosäure-Sequenzierung folgen, um Polynukleotide zu identifizieren und zu isolieren, welche den Kringle-5-Rezeptor kodieren. Solche Polynukleotide können dann in einen geeigneten Expressions-Vektor kloniert werden und in Tumorzellen transfiziert werden. Die Expression des Rezeptors durch die transfizierten Tumorzellen würde das Ansprechen dieser Zellen auf Endogene oder Exogene Kringle-5-Peptid-Fragmente verstärken und dadurch die Geschwindigkeit von metastatischem Wachstum vermindern. Des weiteren würde die rekombinate Expression dieses Rezeptors erlauben, dass größere Mengen des Rezeptors produziert werden, zum Beispiel um eine ausreichende Menge zur Verwendung in Screening-Assays mit großem Durchsatz zu produzieren, um kleinere Antagonisten zu identifizieren, welche die Wirkung von Kringle-5 nachahmen.
Die systematische Substitution von Aminosäuren innerhalb dieser synthetisierten Peptide kann Peptid-Agonisten und Antagonisten hoher Affinität für den Kringle-5-Rezeptor ergeben, welche die Kringle-5-Peptid-Fragment-Bindung an seinen Rezeptor verstärken oder vermindern. Solche Agonisten können verwendet werden, um das Wachstum von Mikro-Metastasen zu unterdrücken und dadurch die Ausbreitung von Krebs einzuschränken. In Zellen von mangelhafter Vaskularisierung können Antagonisten für Kringle-5-Peptid-Fragmente angewendet werden, um die inhibitorischen Effekte von Kringle-5-Peptid-Fragmenten zu blockieren und die Angiogenese voranzutreiben. Zum Beispiel kann diese Art von Behandlung therapeutische Effekte haben, in der Förderung der Wundheilung in Diabetikern.
Kringle-5-Peptid-Fragmente oder Fusionsproteine oder Konjugate der vorliegenden Erfindung können auch als Antigene verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen, welche spezifisch sind für den Kringle-5-Inhibitor. Ein Weg, in welchem solche Antikörper verwendet werden könnten, ist in diagnostischen Verfahren und Kits, um Kringle-5-Peptid-Fragmente in einer Körperflüssigkeit oder -gewebe zu detektieren oder zu quantifizieren. Resultate dieser Tests könnten verwendet werden, um die prognostische Relevanz von Kringle-5-Peptid-Fragmenten zu diagnostizieren oder zu bestimmen.
Kringle-5-Peptid-Fragmente oder Kringle-5-Fusionsproteine können mit radioaktiven Isotopen (siehe Beispiel 13) markiert werden oder chemisch an Proteine gekoppelt werden, um Konjugate zu bilden. Konjugate schließen Enzyme, Trägerproteine, cytotoxische Wirkstoffe, fluoreszierende, chemilumineszierende und biolumineszierende Moleküle ein, welche verwendet werden, um das Testen auf die Fähigkeit der Verbindungen, die Kringle-5-Peptid-Fragmente enthalten, Kringle-5-Antiseren zu binden, Zelltypen zu detektieren, welche einen Kringle-5-Peptid-Fragment-Rezeptor besitzen oder bei der Reinigung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten zu helfen, zu erleichtern. Die Kopplungs-Technik wird im Allgemeinen gewählt auf der Basis der funktionallen Gruppen, die auf dem Aminosäuren der Kringle-5-Peptid-Fragment-Sequenz verfügbar sind, einschließlich Alkyl, Amino, Sulfhydryl, Carboxyl, Amid, Phenol, Indolyl und Imidazoyl. Verschiedene Reagenzien, die verwendet werden, um solche Kopplungen zu bewirken, schließen unter anderem Glutaraldehyd, diazotiertes Benzidin, Carbodiimide und p-Benzochinon ein. Die Effizient der Kopplungs-Reaktion wird bestimmt, unter Verwendung von verschiedenen Techniken, die für die spezifische Reaktion geeignet sind. Zum Beispiel kann die radio-Markierung eines Kringle-5-Peptids oder eines biologisch aktiven Fragments davon mit I¹²⁵ erzielt werden, unter Verwendung von Chloramin T und NaI¹²⁵ mit hoher spezifischer Wirksamkeit. Die Reaktion wird beendet mit Natriummetabisulfit und die Mischung wird auf Einweg-Säulen entsalzt. Das markierte Peptid wird aus der Säule eluiert und die Fraktionen werden gesammelt. Aliquote werden aus jeder Fraktion entfernt und die Radioaktivität wird in einem Gamma-Zähler gemessen. Dieses Verfahren liefert das radio-markierte Kringle-5-Peptid-Fragment frei von unreagiertem NaI¹²⁵. In einem anderen Beispiel können Blut- oder Gewebe-Extrakte, die ein Kringle-5-Peptid-Fragment enthalten, gekoppelt an Kringle-4, auf einer Polylysin-Harz-Affinitäts-Säule gereinigt werden, wobei das Kringle-4-Kringle-5-Peptid-Fragment an das Harz bindet, durch die Affinität des Kringle-4-Peptid-Fragments für Lysin. Elution des gebundenen Proteins würde ein gereinigtes Kringle-4-Kringle-5-Peptid-Fragment bereit stellen.
Eine andere Anwendung der Peptid-Konjugation ist die Produktion von polyklonalen Antiseren. Die Produktion von Antiserum gegen Kringle-5-Peptid-Fragmente, Kringle-5-Peptid-Fragment-Analoge und den Kringle-5-Rezeptor kann unter Verwendung von anerkannten Techniken durchgeführt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind. Zum Beispiel können Kringle-5-Peptid-Fragmente, die Lysin-Reste enthalten, an gereinigtes Rinder-Serum-Albumin (Bovine Serum Albumin, BSA), unter Verwendung von Glutaraldehyd geknüpft werden. Die Effizienz dieser Reaktion kann durch Messen des Einschlusses von radio-markiertem Peptid bestimmt werden. Unreagiertes Glutaraldehyd und Peptid kann durch Dialyse abgetrennt werden und das Konjugat kann verwendet werden, um polyklonale Antiseren in Hasen, Schafen, Ziegen oder anderen Tieren zu erzeugen. Kringle-5-Peptid-Fragmente, die an ein Träger-Molekül, wie zum Beispiel BSA, konjugiert sind, können mit einer Hilfsmischung kombiniert, emulgiert und subkutan injiziert werden, an vielen Stellen auf dem Rücken, Nacken, den Seiten und manchmal in die Fußsohlen eines geeigneten Wirts. Im Allgemeinen werden dann Booster-Injektionen in regelmäßigen Intervallen gegeben, wie zum Beispiel alle zwei bis vier Wochen. Ungefähr sieben bis zehn Tage nach jeder Injektion werden Blutproben erhalten, durch Venipunktur, unter Verwendung von zum Beispiel der Rand-Ohr-Venen-Nach-Dehnung. Die Blutproben werden über Nacht bei 4°C gerinnen gelassen und werden bei ungefähr 2400 × g bei 4°C für ungefähr 30 Minuten zentrifugiert. Das Serum wird entfernt, in Aliquote aufgeteilt und bei 4°C für die unmittelbare Verwendung oder bei –20°C bis –90°C für die nachfolgende Analyse gelagert.
Serum-Proben zur Erzeugung von polyklonalen Antiseren oder Medien-Proben aus der Produktion von monoklonalen Antiseren können für die Bestimmung des Antikörper-Titers und insbesondere für die Bestimmung von Antiseren mit hohem Titer analysiert werden. Danach können die Kringle-5-Peptid-Fragment-Antiseren mit dem höchsten Titer getestet werden, um folgendes festzustellen: a) die Antiserum-Verdünnung für die höchste spezifische Bindung des Antigens und die niedrigste nicht spezifische Bindung, b) die Fähigkeit, ansteigende Menge von Kringle-5-Peptid-Fragmenten zu binden, in einer Standard-Verdrängungs-Kurve, c) die potenzielle Kreuz-Reaktivität mit verwandten Peptiden und Proteinen, einschließlich Plasminogen und Kringle-5-Peptid-Fragmenten von verwandten Spezies, und d) die Fähigkeit, Kringle-5-Peptid-Fragmente in Zellkultur-Medien und in Extrakten von Plasma, Urin und Geweben zu detektieren. Titer können eingestellt werden, durch verschiedene Mittel, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel durch Dot Blot und Dichte-Analyse und auch durch Ausfällen von radiomarkierten Peptid-Antikörper-Komplexen, unter Verwendung von Protein A, sekundären Antiseren, kaltem Ethanol oder Kohle-Dextran, gefolgt von Wirksamkeitsmessung mit einem Gamma-Zähler. Wenn gewünscht, können die Antiseren mit dem höchsten Titer auf Affinitäts-Säulen gereinigt werden. Zum Beispiel können Kringle-5-Peptid-Fragmente an ein kommerziell erhältliches Harz gekoppelt werden und verwendet werden, um eine Affinitäts-Säule zu bilden. Antiserum-Proben können dann durch die Säule geführt werden, sodass Kringle-5-Antikörper (über Kringle-5-Peptid-Fragmente) an die Säule binden. Diese gebundenen Antikörper werden danach eluiert, gesammelt und bewertet für die Bestimmung des Titers und der Spezifität.
Kits zur Messung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten und des Kringle-5-Rezeptors werden auch als ein Teil der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. Antiseren, die den höchsten Titer und Spezifität besitzen und die Kringle-5-Peptid-Fragmente in Extrakten von Plasma, Urin, Geweben und Zellkultur-Medien detektieren können, können verwendet werden, um Assay-Kits zu bilden, für die schnelle verlässliche, sensitive und spezifische Messung und Lokalisierung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten. Diese Assay-Kits können die folgenden Techniken verwenden: kompetitive und nicht kompetitive Assays, Radio-Immuno-Assays, Biolumineszenz und Chemilumineszenz-Assays, Fluorometrische Assays, Sandwich-Assays, Immuno-radiometrische Assays, Dot-Blots, Enzym-verknüpfte Assays, einschließlich ELISAs, Mikrotiterplatten, Immunocytochemie und Antikörper-beschichtete Streifen oder Mess-Stäbe für die schnelle Überwachung von Urin oder Blut. Für jeden Kit werden der Bereich, die Sensitivität, die Genauigkeit, die Zuverlässigkeit, die Spezifität und die Wiederholbarkeit des Assays eingestellt, durch Mittel, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt sind.
Ein Beispiel eines Assay-Kits, der üblicherweise in der Forschung und in der Klinik verwendet wird, ist ein Radio-Immuno-Assay (RIA)-Kit. Ein Kringle-5-Peptid-Fragment RIA kann aufgestellt werden, in der folgenden Art und Weise: nach erfolgreicher Radio-Jodierung und Reinigung eines Kringle-5-Peptid-Fragments wird Antiserum, das den höchsten Titer an Anti-Kringle-5-Peptid-Fragment-Antikörpern besitzt, bei verschiedenen Verdünnungen zu Röhrchen hinzugefügt, die eine relativ konstante Menge an Radioaktivität enthalten, wie zum Beispiel 10.000 cpm, in einem geeigneten Puffer-System (Puffer oder Preimmun-Serum wird zur anderen Röhrchen hinzugefügt, um nicht spezifische Bindung zu bestimmen). Nach der Inkubation bei 4°C für 24 Stunden, wird Protein A zu allen Röhrchen hinzugefügt und die Röhrchen werden gevortext, bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert und bei ungefähr 2.000 bis 2.500 × g bei 4°C zentrifugiert, um die Komplexe von Antikörpern, die an markiertes Antigen gebunden sind, auszufällen. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt und die Radioaktivität in den Pellets wird in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Antiserum- Verdünnung, die ungefähr 10 bis 40% des markierten Peptids nach Abzug der nicht spezifischen Bindung bindet, wird für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Als nächstes wird ein Verdünnungs-Bereich (ungefähr 0,1 pg bis 10 ng) des Kringle-5-Peptid-Fragments, das für die Entwicklung des Antiserums verwendet wurde, bewertet, durch Hinzufügen von bekannten Mengen des Peptids zu Röhrchen, die radio-markiertes Peptid und Antiserum enthalten. Nach einem Inkubtionszeitraum (24 oder 48 Stunden zum Beispiel) wird Protein A hinzugefügt und die Röhrchen werden zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und die Radioaktivität in dem Pellet wird gezählt. Die Verdrängung der Bindung des radio-markierten Kringle-5-Peptid-Fragments durch das unmarkierte Kringle-5-Peptid-Fragment (Standard) liefert eine Standard-Kurve. Zusätzlich können verschiedene Konzentrationen von anderen Kringle-5-Peptid-Fragmenten, Plasminogenen, Kringle-5-Peptid-Fragrnenten von unterschiedlichen Gattungen und homologen Peptiden hinzugefügt werden, zu den Assay-Röhrchen, um die Spezifität des Kringle-5-Peptid-Fragment-Antiserums zu charakterisieren.
Danach werden Extrakte von verschiedenen Geweben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, primäre und sekundäre Tumoren, Levis-Lungen-Carcinomen, Kulturen von Kringle-5-Peptid-Fragment-produzierenden Zellen, Plazenta, Uterus und anderen Geweben, wie zum Beispiel Gehirn, Leber und Darm hergestellt, unter Verwendung von Extraktions-Techniken, die erfolgreich verwendet wurden, um Kringle-5-Peptid-Fragmente zu extrahieren. Nach Aufarbeiten der Gewebe-Extrakte wird Assay-Puffer hinzugefügt und verschiedene Aliquote werden in die RIA-Röhrchen platziert. Extrakte von bekannten Kringle-5-Peptid-Fragment-produzierenden Zellen erzeugen Verdrängungs-Kurven, die parallel sind, zu der Standard-Kurve, wohin gegen Extrakte von Geweben, die keine Kringle-5-Peptid-Fragmente produzieren, radiomarkierte Kringle-5-Peptid-Fragmente nicht von dem Kringle-5-Peptid-Fragment-Antiserum verdrängen. Solche Verdrängungs-Kurven zeigen die Nützlichkeit des Kringle-5-Peptid-Fragment-Assays an, Kringle-5-Peptid-Fragmente in Geweben und Körperflüssigkeiten zu messen.
Gewebe-Extrakte, die Kringle-5-Peptid-Fragmente enthalten, können auch charakterisiert werden, durch Unterwerfen von Aliquoten gegenüber reverse Phase HPLC. Eluat-Fraktionen werden gesammelt, in Speed Vac getrocknet, in RIA-Puffer rekonstituiert und in dem Kringle-5-RIA analysiert. In diesem Fall ist die maximale Menge an Kringle-5-Peptid-Fragment-Immuno-Reaktivität in den Fraktionen lokalisiert, die der Elutions-Position des Kringle-5-Peptid-Fragments entsprechen.
Der oben beschriebene Rssay-Kit würde Anweisungen bereit stellen, Antiserum, ein Kringle-5-Peptid-Fragment und möglicherweise ein radio-markiertes Kringle-5-Peptid-Fragment und/oder Reagenzien zur Ausfällung von gebundenen Kringle-5-Peptid-Fragment/Kringle-5-Antikörper-Komplexen. Ein solcher Kit würde nützlich sein für die Messung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten in biologischen Flüssigkeiten und Gewebe-Extrakten von Tieren und Menschen mit und ohne Tumoren.
Ein anderer Kit kann verwendet werden, um Kringle-5-Peptid-Fragmente in Geweben und Zellen zu visualisieren oder zu lokalisieren. Zum Beispiel sind Immuno-Histochemie-Techniken und Kits, welche solche Techniken verwenden, denjenigen von durchschnittlichem Können im Fachgebiet, wohl bekannt. Wie es im Fachgebiet bekannt ist, würde ein Immuno-Histochemie-Kit Kringle-5-Peptid-Fragment-Antiserum und möglicherweise blockierendes Serum und sekundäres Antiserum, gebunden an ein fluoreszierendes Molekül, wie zum Beispiel Fluorescein-Isothiocyanat oder ein anderes Reagenz, das verwendet wird, um das primäre Antiserum zu visualisieren, bereit stellen. Unter Verwendung dieser Methodik können biopsierte Tumoren untersucht werden, für Stellen einer Kringle-5-Peptid-Fragment-Produktion oder für Stellen des Kringle-5-Peptid-Fragment-Rezeptors. Alternativ kann ein Kit radio-markierte Nukleinsäuren bereit stellen, für die Verwendung in in vito-Hybridisierung an eine Sonde für Kringle-5-Peptid-Fragment-Messenger-RNA.
Die Verbindungen der Erfindung können unter Verwendung von Verfahren hergestellt werden, die denjenigen mit durchschnittlichem Können im Fachgebiet wohl bekannt sind (siehe zum Beispiel Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fibrinolysis und Thrombolysis, Band 3, Davidson, J. F., Rowan, R. M., Samama, M. M. und Desnoyers, P. C. Herausgeber, Raven Press, New York, 1978). Eine Weiße der Herstellung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten ist durch enzymatische Abspaltung des nativen Proteins (glu-Plasminogen) oder einer Variante davon (das heißt, eine abgestumpfte Form des Gesamtlängen-Proteins, welches einer Spaltung durch enzymatische Verdauung zugänglich ist und welches mindestens eine Kringle-5-Sequenz, wie oben definiert, umfasst, wie zum Beispiel lys-Plasminogen oder Miniplasminogen). Dieses Verfahren erfordert zuerst die Isolierung des Proteins aus menschlichem Plasma in der Abwesenheit von Plasmin-Inhibitoren und dadurch fördern der Umwandlung von glu-Plasminogen zu lys-Plasminogen (siehe Novokhatny, V und Kudinov, S. A., J. Mol. Biol. 179: 215–232 (1984)). Danach wird das abgestumpfte Molekül mit einem proteolytischen Enzym behandelt, bei einer Konzentration, die ausreichend ist, um Kringle-5-Peptid-Fragmente von dem Polypeptid ab zu spalten und es wird dann von den übrigen Fragmenten durch Mittel gereinigt, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind. Ein bevorzugtes proteolytisches Enzym ist menschliche oder Schweine-Elastase, welche Plasminogen und seine abgestumpften Varianten zwischen Kringle-Regionen 3 bis 4 und 4 bis 5 abspaltet (und dadurch in der Lage ist, Peptid-Fragmente zu bilden, die Kringle 1 bis 3 und 1 bis 4 oder Kringle 4 oder 5 alleine enthalten). Zum Beispiel kann lys-Plasminogen oder glu-Plasminogen mit Schweine- oder menschlicher neutrophiler Elastase bei einem Verhältnis von ungefähr 1:100 bis 1:300 lys-Plasminogen:Elastase (vorzugsweise bei einem Verhältnis von 1:150 bis 1:250 und am meisten bevorzugt bei einem Verhältnis von 1:150 in einer Puffer-Lösung (wie zum Beispiel Tris-HCL, NaCl, Natriumphosphat) behandelt werden. Alternativ kann die Elastase zuerst immobilisiert werden (wie zum Beispiel an ein Harz), um die Reinigung der Abspaltungsprodukte zu erleichtern. Das glu-Plasminogen oder lys-Plasminogen wird im Allgemeinen mit menschlicher oder Schweine-Elastase behandelt, bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 10°C bis ungefähr 40°C und für Zeiträume im Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 24 Stunden, abhängig von dem gewünschten Ausmaß der Abspaltung. Um eine vollständige Verdauung von glu-Plasminogen, lys-Plasminogen oder Miniplasminogen mit menschlicher oder Schweine-Elastase zu erreichen, ist ein Aussetzen dieser Polypeptide gegenüber dem Enzym für mindestens ungefähr 12 Stunden bei Raumtemperatur erforderlich. Eine Veränderung des pHs und der Aussetzungszeit gegenüber dem Enzym führt zu einer geringen oder teilweisen Abspaltung an einer oder mehreren der empfindlichen Abspaltungsstellen. Die Abspaltungsprodukte werden dann durch andere Mittel gereinigt, die im Fachgebiet wohl bekannt sind (wie zum Beispiel Säulenchromatographie). Eine bevorzugtes Reinigungsschema schließt das Aufbringen der Abspaltungsprodukte auf eine Lysin-Sepharose-Säule, wie in Beispiel 14 beschrieben, ein.
Fest-Phasen-Synthese von Kringle-5-Peptid-Fragmenten
Die folgenden Beispiele werden dazu dienen, die Herstellung der neuen Verbindungen der Erfindung zu veranschaulichen. Beispiele 1 bis 2 sind nicht in der Erfindung eingeschlossen, sind aber nützlich, um die Herstellung der Verbindungen der Erfindung vollständig zu verstehen.
Beispiel 1
N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH₂
Eine Amid-Peptid-Synthese-Säule (Applied Biosystems) wurde in die Peptid-Synthese-Säulenposition eines Perkin Elmer/Applied Biosynthesis "Synergy" Peptid-Synthesizer platziert und die folgenden Synthese-Sequenz wurde verwendet:

1. Solvatisieren des Harzes mit DMF für ungefähr 5 Minuten;
2. Entblocken der Fmoc-Gruppe von dem α-N-Terminus der Harzgebundenen Aminosäure, unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF für ungefähr 15 Minuten;
3. Waschen des Harzes mit DMF für ungefähr 5 Minuten;
4. Aktivieren des α-C-Terminus von Aminosäure Nr. 1 (Fmoc-Asp (β-OtBu), 25 μmol), unter Verwendung einer 0,2 M Lösung von HBTU (25 μmol) und HOBT (25 μmol) in DMSO-NMP (N-Methylpyrolidon) und einer 0,4 M Lösung von Diisopropylethylamin (25 mmol) in DMSO-NMP und Koppeln der aktivierten Aminosäure an das Harz;
5. Koppeln der aktivierten Fmoc-geschützten Aminosäure (hergestellt in Schritt 5) an die Harz-gebundene Aminosäure (hergestellt in Schritt 2) in DMF für ungefähr 30 Minuten;
6. Waschen mit DMF für 5 Minuten;
7. Wiederholen der Schritte 3. bis 6. mit den folgenden Aminosäuren:
8. Koppeln von Essigsäure an den α-N-Terminus des Harzgebundenen Peptids über die Bedingungen von Schritten 4. und 5.;
9. Waschen des Harzes mit THF für ungefähr 5 Minuten, um DMF zu entfernen und das Harz ein zu schrumpfen, dann Trocknen des Harzes mit Argon für 10 Minuten und Stickstoff für 10 Minuten mehr, um sauberes, Harz-gebundenes Peptid bereitzustellen;
10. Abspalten des Peptids aus dem Harz mit begleitendem Entschützen von Aminosäure-Nebenketten, durch Rühren mit Abspaltungs-Reagenz (frisch hergestelltes Thioanisol (100 ml), Wasser (50 μl), Ethandithiol (50 μl) und Trifluoressigsäure (1,8 ml), gemischt in der obigen Reihenfolge bei –5°C bis –10°C) bei 0°C für 10 bis 15 Minuten und dann bei Raumtemperatur für zusätzliche 1,75 Stunden (plus eine zusätzliche 0,5 Stunde für jedes Arg(Pmc), wenn vorhanden). Die Menge an verwendetem Abspaltungs-Reagenz wurde durch die folgende Formel bestimmt:
11. Filtern und Spülen des Produkts mit reiner Trifluoressigsäure, Hinzufügen des Filtrats in 0,5 ml Protionen zu einem Zentrifugen-Röhrchen, das ungefähr 8 ml kalten Diethylether enthält, Zentrifugieren und Dekantieren und Wiederholen des Verfahrens, bis alles Peptid ausgefällt war (wenn das Peptid nicht ausfiel nach der Zugabe von Ether, wurde die Mischung mit wässeriger 30%iger wässeriger Essigsäure (3 × 1 ml) extrahiert und die kombinierten wässerigen Extrakte wurden lyophilisiert, um das Produkt zu liefern).
12. Verwenden des Peptids roh, oder Reinigen des Peptids durch HPLC, unter Verwendung einer 7 μm Symmetrie-Prep C18-Säule (7,8 × 300 mm) mit Lösungsmittel-Mischungen, die in einem Gradienten von 5% bis 100% Acetonitril-(Wasser, 0,1% TFA) variierten, über einen Zeitraum von 50 Minuten, gefolgt von Lyophilisierung, um 35 mg von N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH₂ zu liefern.

Beispiel 2
N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist, und unter Verwendung von Fmoc-Pro als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden unter Verwendung der angegebenen Bedingungen hinzugefügt:
um 35 mg von N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH₂ bereitzustellen.
Beispiel 3
Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NN₂ (Sequenzidentifikationsnummer 40)
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist, und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu), als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden unter Verwendung der angegebenen Bedingungen hinzugefügt:
um 40 mg von N-Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NN₂ bereitzustellen.
Beispiel 4
N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Prp als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden unter Verwendung der angegebenen Bedingungen hinzugefügt:
um 20 mg von N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH₂ zu bereitzustellen.
Beispiel 5
N-Ac-Tyr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um 10 mg von N-Ac-Tyr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ bereitzustellen.
Beispiel 6
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (4 mg) bereitzustellen. MS(FAB) m/z 995 (M + H)⁺.
Beispiel 7
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂ (6 mg) bereitzustellen. MS (ESI) m/z 832 (M + H)⁺.
Beispiel 8
N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (Sequenzidentifikationsnummer 39)
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (6 mg) bereitzustellen. MS (FAB) m/z (1101) (M + H)⁺.
Beispiel 9
N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthes-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (8 mg) bereitzustellen. MS (ESI) m/z 898 (M + H)+.
Beispiel 10
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (Sequenzidentifikationsnummer 18)
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH₂ (2 mg) bereitzustellen. MS (ESI) m/z (1121) (M + H)⁺.
Beispiel 11
N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂ (Sequenzidentifikationsnummer 6)
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-3-I-Tyr(^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzufügen, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂ (2,5 mg) bereitzustellen. MS (ESI) m/z (1121) (M + H)⁺.
Beispiel 12
N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂
Die Titelverbindung wurde hergestellt unter Verwendung der Synthese-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben ist und unter Verwendung von Fmoc-Asp(β-O^tBu) als Aminosäure Nr. 1. Die folgenden Aminosäuren wurden hinzugefügt, unter Verwendung der angegebenen Bedingungen:
um 2 mg von N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH₂ (2 mg) bereitzustellen.
Beispiel 13
Herstellung und Trennung einer Mischung N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asr-3-I¹²⁵-Tyr⁵³⁵-NH₂ und N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I¹²⁵-Tyr⁵³⁵-Asp-Tyr-NH₂ (Sequenzidentifikationsnummer 18) beziehungsweise (Sequenzidentifikationsnummer 6).
Zu einer Lösung von 30 μg von N-Acetyl-propyl-arginyllysyl-leucyl-tyrosyl-aspartyltyrosylamid in 80 ml Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde ein Jod-Kügelchen hinzugefügt (Pierce, Rockfort, IL) und 100 μCi von NaI¹²⁵. Nach 10 Minuten wurde das überschüssige NaI¹²⁵-Reagenz entfernt, durch Aufbringen der Reaktionsmischung auf eine Waters C18-leichte SepPack-Säule und Eluieren mit Wasser, dann 0,1% TFA in 1:1 CH₃CN/Wasser und Sammeln von 3 × 200 μl Fraktionen, um eine Mischung aus Tyr₅₃₃ und Tyrsss-radio-markierten Peptiden bereitzustellen.
Die heiße Peptid-Mischung wurde auf eine C18 HPLC-Säule co-injiziert, mit einer äquimolaren Lösung von kalten Trägern, N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂ und N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-NH₂, deren Elutionszeiten vorbestimmt wurden als 36 bzw. 38 Minuten. Wiederholte Elutionen mit dem Lösungsmittel-System in Beispiel 1 und Lyophilisierung der kombinierten, relevanten Fraktionen lieferten die gewünschte Verbindung N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH₂ mit einer minimalen Verunreinigung an N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Rsp-Tyr-NH₂.
Allgemeine Methodiken
Beispiel 14
Isolation und Reinigung von Kringle-5-Peptid-Fragmenten
Die Kringle-5-Peptid-Fragmente wurden hergestellt aus der Verdauung von Lys-Plasminogen (Lys-HPg, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) mit Schweine-Elastase (SIGMA, St. Louis; MO), durch eine Modifikation des Verfahrens von Powell et al. (Arch Biochem. Biophys. 248(1): 390–400 (1986)). 1,5 mg Schweine-Elastase wurden inkubiert mit 200 mg Lys-HPg in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktion wurde beendet durch die Zugabe von DPF (Diisopropylfluorphosphat, SIGMA) auf eine Endkonzentration von 1 mM. Die Mischung wurde für zusätzliche 30 Minuten geschüttelt, gegen 50 mM Tris pH 8,0 über Nacht dialysiert und konzentriert. Das abgespaltene Plasminogen wurde über eine 2,5 cm × 15 cm Lysin-Sepharose-4B-Säule platziert (Brockway, W. J. und Castellino, F. J., Arch. Biochem. Biophys. 151: 194–199 (1972)) und ins Gleichgewicht gebracht mit 50 mM Tris pH 8,0, bis eine Absorption von 0,05 (bei 280 nm) erreicht war. (Dieser Schritt wurde durchgeführt, um irgendwelche Fragmente zu entfernen, die eine Kringle-1-Region und/oder eine Kringle-4-Region (welche beide Lysion binden), enthalten). Die nicht absorbierten Kringle-5-Peptid-Fragmente wurden gegen 50 mM Na₂PO₄-Puffer, pH 5,0 dialysiert, dann auf eine BioRad Mono-S-Säule aufgebracht, die mit den selben Puffer ins Gleichgewicht gebracht wurde. Der abgespaltene Kringle-5-Anteil, ungeschnittenes Mini-HPg und restliche Protease-Domain-Fraktion wurden eluiert mit einem 0 bis 20%, 20 bis 50% und 50 bis 70% Schritt-Gradienten von 20 mM Phosphat/1 M KCl pH 5,0. Die Kringle-5-Peptid-Fragmente eluierten beim 50%-Schritt, wie durch Gel-Elektrophorese bestimmt. Der gesammelte Peak wurde über Nacht gegen 20 mM Tris pH 8,0 dialysiert.
Die abgetrennten Kringle-5-Fragmente wurden als mindestens 95% rein bestimmt, durch FPLC-Chromatographie und Dod/SO4/PAGE mit Silberfärbung (Coomasie Blau). Sequenzanalyse des Aminoterminalen Abschnitts der gereinigten Fragmente enthüllte die Anwesenheit von 3 Polypeptiden, die α-N-Terminus-Sequenzen von VLLPDVETPS, VAPPPVVLL und VETPSEED hatten, welche den Aminosäure-Positionen Val⁴⁴⁹-Ser⁴⁵⁸, Va1⁴⁴³-Leu⁴⁵⁰ beziehungsweise und Val⁴⁵⁴-Asp⁴⁶¹ von Sequenzidentifikationsnummer entsprachen.
Beispiel 15
Endothelial-Proliferations-Assay
Die in vitro-Proliferation von Endothelialzellen wurde bestimmt wie beschrieben durch Lingen, et al., in Laboratory Investigation, 74: 476–483 (1996), unter Verwendung des Zell-Titer 96 wässerigen nicht radioaktiven Zell-Proliferations-Assay-Kits (Promega Corporation, Madison, WI). Kapilare (adrenale) Rinder-Endothelialzellen wurden bei einer Dichte von 1000 Zellen pro Auskerbung in eine 96-Auskerbungen-Platte gegeben, in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% Donor-Kälber-Serum und 1% BSA (Rinder-Serum-Albumin, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) enthielt. Nach 8 Stunden wurden die Zellen über Nacht in DMEM, das 0,1% BSA enthielt, ausgehungert, dann wieder mit Medien gefüttert, die bestimmte Konzentrationen an Inhibitor und 5 ng/ml pFGF (basischer Fibroblasten-Wachstums-Faktor) enthielten. Die Ergebnisse des Assays wurden korrigiert, sowohl für unstimulierte Zellen (d.h. kein bFGF hinzugefügt) als der Basislinie, als auch für Zellen, die mit bFGF stimuliert wurden, alleine (d.h. kein hinzugefügter Inhibitor) als die maximale Profileration. Wenn mehrere Experimente kombiniert wurden, wurden die Ergebnisse als die prozentuale Änderung in der Zell-Anzahl, verglichen mit bFGF alleine dargestellt.
Beispiel 16
Endothelialzell-Migrations-Assay
Der Endothelialzell-Migrations-Assay wurde im wesentlichen durchgeführt wie beschrieben durch Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol, 198: 440–450 (1991).
Kurz gesagt, wurden Rinder-Kapillar-(adrenale)-Endothelialzellen (BCE, bereitgestellt durch Judah Folkman, Harvard University, Medical School) über Nacht in DMEM, das 0,1 Rinder-Serum-Albumin (BSA) enthielt, ausgehungert. Zellen wurden dann mit Trypsin geerntet und in DMEM mit 0,1% BSA bei einer Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Zellen wurden zu dem Boden einer 48-Auskerbungen modifizierten Boyden-Kammer hinzugefügt (Nucleopore Corporation, Cabin John, MD). Die Kammer wurde zusammengesetzt und umgekehrt und den Zellen wurde erlaubt, für zwei Stunden bei 37°C an Polycarbonatchemotaxis-Membranen (5 μm Porengröße) anzuheften, die in 0,1% Gelatine über Nacht getränkt wurden und getrocknet wurden. Die Kammer wurde dann wieder umgekehrt und Test-Substanzen wurden zu den Auskerbungen der oberen Kammer hinzugefügt (bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl); der Apparat wurde dann für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Membranen wurden wiedergewonnen, fixiert und gefärbt (DiffQuick, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) und die Anzahl an Zellen, welche zu der oberen Kammer über 10 Hochstromfelder gewandert waren, wurden gezählt. Hintergrund-Wanderung zu DMEM + 0,1% PSA wurde abgezogen und die Daten wurden als die Anzahl von Zellen berichtet, die durch 10 Hochstromfelder (400 ×) gewandert waren, oder wenn Ergebnisse aus mehreren Experimenten kombiniert wurden, als die prozentuale Hemmung der Migration, verglichen mit einer positiven Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 17
Effekt von Kringle-5-Peptid-Fragmenten auf die Endothelialzell-Proliferation in vitro
Der Effekt von Kringle-5-Peptid-Fragmenten auf die Endothelialzell-Proliferation wurde in vitro bestimmt, unter Verwendung des oben beschriebenen Endothelialzell-Proliferations-Assays. Für diese Experimente wurden Kringle-5-Peptid-Fragmente hergestellt, wie in Beispielen 1 bis 14 veranschaulicht und bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von ungefähr 100 bis 1.000 pM mit bFGF, das als eine maximale Proliferations-Kontrolle verwendet wurde, getestet. Die Kringle-5-Peptid-Fragment Sequenzidentifikationsnummer 3 war wirksam beim Hemmen der BCE-Zell-Proliferation in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Die Konzentration von Kringle-5-Peptid-Fragment Sequenzidentifikationsnummer 3, die erforderlich war, um 50% Hemmung zu erreichen (ED₅₀) wurde bei ungefähr 300 pM bestimmt. Im Gegensatz dazu wurde von den Kringlen 1 bis 4 gezeigt, dass die ED₅₀ 135 nM ist.
Eine Zusammenfassung des Effekts von anderen Kringle-Peptid-Fragmenten auf die Hemmung der BCE-Zell-Proliferation ist in Tabelle 1 gezeigt. Das Kringle-3-Peptid-Fragment war am wenigsten wirksam bei der Hemmung der BCE-Zell-Proliferation (ED₅₀ = 460 nM), gefolgt von dem Kringle-1-Peptid-Fragment (ED₅₀ = 320 nM), Kringle 1 bis 4 Peptid-Fragmenten (ED₅₀ = 135 nM) und Kringle 1 bis 3 Peptid-Fragmenten (ED₅₀ = 75 nM). Das Kringle-5-Peptid-Fragment war das am meisten wirksame bei der Hemmung der BCE-Zell-Proliferation mit einer ED₅₀ von 0,3 nM.
Beispiel 18
Effekt von Kringle-5-Peptid-Fragmenten auf die Endothelialzell-Miaration in vitro
Der Effekt der Kringle-5-Peptid-Fragmente auf die Endothelialzell-Migration wurde auch in vitro bestimmt, unter Verwendung des oben beschriebenen Endothelialzell-Migrations-Assays. Kringle-5-Peptid-Fragmente inhibierten die BCE-Zell- Migration in einer Dosis-abhängigen Art und Weise mit einer ED₅₀ von ungefähr 300 pM. Bei der Konzentration von Kringle-5-Peptid-Fragmenten, die erforderlich war, für die maximale Hemmung von BCE-Zellen, wurden auch PC-3-Zellen und MDA 486-Zellen inhibiert. Dieses Ergebnis, zusammen mit dem Ergebnis in Beispiel 2, zeigt an, dass die Hemmung von stimulierter Proliferation und Migration von BCE-Zellen durch Kringle-5-Peptid-Fragmente sowohl wirksam, als auch spezifisch für Endothelialzellen und nicht für normale oder Tumorzellen ist.
Das vorhergehende ist lediglich veranschaulichend für die Erfindung und soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Verbindungen einschränken. Variationen und Änderungen, die für jemanden, der im Fachgebiet bewandert ist, offensichtlich sind, sollen innerhalb des Schutzumfangs und der Natur der Erfindung liegen, welche in den angehängten Ansprüchen definiert ist.
Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der ED₅₀-Werte, die von der Hemmung von verschiedenen Kringle-Fragmenten auf die BCE-Zell-Proliferation und Zell-Migration in vitro erhalten werden. In der Tabelle sind Kringle-Peptid-Fragmente markiert, entsprechend ihrer korrespondierenden Sequenz-Homologie zu Sequenzidentifikationsnummer 1. Das Symbol "*" zeigt Daten an, die von Marti, D., et al., Eur. J. Biochem., 219: 455–462 (1994) genommen wurden, und das Symbol "–" zeigt keine Daten an.
Tabelle 1
Beispiel 19
Rekombinante Expression von Kringle-5-Fragmenten in Pichia pastoris
A. Produktion von cDNAs, die Kringle-5-Fragmente kodieren, durch PCR:
PCR wurde verwendet, um cDNA-Fragmente zu erzeugen, welche Kringle-5-Peptid-Fragmente kodieren, die Aminosäure-Sequenzen haben, von (1) Aminosäure-Positionen 450–543 von Sequenzidentifikationsnummer 1 (hiernach K5A), (2) Aminosäure-Positionen 450–546 von Sequenzidentifikationsnummer 1 (hiernach K5F), (3) Aminosäure-Positionen 355–543 von Sequenzidentifikationsnummer 1 (hiernach K4-5A) und (4) Aminosäure-Positionen 355–546 von Sequenzidentifikationsnummer 1 (hiernach K4-5F) zur Klonierung und Expression sowohl in eukaryothischen als auch prokaryotischen Wirten. DNA-Fragmente wurden erzeugt, unter Verwendung eines cDNA-kodierenden menschlichen Plasminogens (erhalten von Dr. E. Reich, State University of New York, Stony Brook, NY) als Matrize und Sets von vorwärts und reversen Primern (erhalten von Operon Technologies, Inc. Alameda, CA), unten gezeigt:
PCR-Amplificationen wurden unter Verwendung der Primer-Sets, Sequenzidentifikationsnummer 2 und Sequenzidentifikationsnummer 4 (für K5A), Sequenzidentifikationsnummer 2 und Sequenzidentifikationsnummer 5 (für K5F), Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenzidentifikationsnummer 8 (für K4-5A) und Sequenzidentifikationsnummer 3 und Sequenz identifikations-Nr. 5 (für K4-5A) unter Standard-PCR-Bedingungen durchgeführt, das heißt, in einem Gesamt-Reaktions-Volumen von 100 μl, enthaltend 200 μM von jedem dNTP, worin N A, T, G und C war, 0,2 μM von jedem Primer, ungefähr 10 ng von Matrizen-DNA und 1 Einheit von Vent^® DNA Polymerase (New England Biolabs). Amplifikationen wurden durchgeführt für insgesamt 25 Zyklen (1 Zyklus = 94°C für 1 Minute, 48°C für 2 Minuten, 72°C für 1 Minute) auf einem DNA-Thermal-Cycler 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA). Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte Gel-gereinigt, mit BamHI und XhoI (New England Biolabs) verdaut, an einen modifizierten Pichia-Expressions-Vektor (pHil-D8, siehe unten) ligiert, mit den selben Enzymen geschnitten und in HB101-Zellen (BioRad), durch Elektroporation transformiert. DNA wurde hergestellt aus individuellen Klonen und einer Restriktions-Enzym-Verdauung und einer Sequenz-Analyse unterzogen, um Klone zu identifizieren, die Inserts mit der richtigen Sequenz und in der richtigen Orientierung enthielten. Plasmide von positiv identifizierten Klonen wurden dann in Pichia pastoris Stamm GS115 (Invitrogen, Carlsbad, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers transformiert. Um positive Klone in Pichia zu identifizieren, wurden Zellen im 5 ml BMGY-Medium (Invitrogen) bei 29°C über Nacht gezüchtet, durch Zentrifugation gesammelt und in 0,5 ml BMMY-Medium (Invitrogen) für die Expression resuspendiert. Nach Inkubation bei 29°C für 2 Tage wurden die Kultur-Überstände gesammelt und Aliquote wurden einer SDS-PAGE und einer Western-Blot-Analyse unterworfen, gemäß bekannten Techniken. Ein SDS-PAGE-Gel ist in 6 gezeigt.
B. Konstruktion des Expressions-Vektors pHil-D8:
Der Pichia-Expressions-Vektor, pHil-D8, wurde durch Modifikation des Vektors pHil-D2 (Invitrogen) konstruiert, um eine synthetische Leader-Sequenz für die Sekretion eines rekombinanten Proteins (siehe 5) einzuschließen. Die Leader-Sequenz, 5'-
(Sequenzidentifikationsnummer 9) kodiert ein PHO1-Sekretions- Signal (einzeln unterstrichen), operativ an eine Pro-Peptid-Sequenz (dickes Highlight) für die KEX2-Abspaltung gebunden. Um pHil-D8 zu konstruieren, wurde eine PCR unter Verwendung von pHil-S1 (Invitrogen) als Matrize durchgeführt, da dieser Vektor die Sequenz, die PHO1 kodiert, einen Vorwärts-Primer (Sequenzidentifikationsnummer 7) entsprechend den Nukleotiden 509–530 von pHil-S1 und einen Reverse-Primer (Sequenzidentifikationsnummer 8), der eine Nukleotid-Sequenz hat, welche den letzteren Abschnitt des PHO1-Sekretions-Signals (Nukleotide 45–66 von Sequenzidentifikationsnummer 9) kodiert und die Pro-Peptid-Sequenz (Nukleotide 67–108 von Sequenzidentifikationsnummer 9) enthält. Die Primer-Sequenzen (erhalten von Operon Technologies, Inc. Alameda, CA) waren wie folgt:
Amplifikation wurde durchgeführt für 25 Zyklen, wie in Beispiel 19 beschrieben. Das PCR-Produkt (ungefähr 500 bp) wurde Gel-gereinigt, mit BlpI und EcoRI geschnitten und an pHil-D2 ligiert, geschnitten mit denselben Enzymen. Die DNA wurde in E. coli HB101-Zelen transformiert und positive Klone wurden durch Restriktions-Enzym-Verdauung und Sequenz-Analyse identifiziert. Ein Klon, der die richtige Sequenz hatte, wurde als pHil-D8 bezeichnet.
Beispiel 20
Rekombinante Expression von Kringle-5-Peptid-Fragmenten in Bakterien
Restriktions- oder andere modifizierende Enzyme, ebenso wie andere verwendete Reagenzien, wurden von kommerziellen Quellen erhalten. Primer wurden bei Abbott Laboratories auf einem automatischen Synthesizer durch Standard-Verfahren synthetisiert, die im Fachgebiet bekannt sind.
DNAs von Kringle-5-Peptid-Fragmenten wurden auch durch PCR-Amplifikation erzeugt, für die Klonierung und Expression in bakteriellen Zellen (E. coli). Die allgemeine Vorgehensweise war PCR-Fragmente von gewünschten kodierenden Regionen zu erzeugen, mit und ohne Terminations-Kodons, die Enden mit Kinase zu behandeln und die Fragmente direkt in Vektoren der Wahl zu klonieren. Vektor-Konstrukte wurden dann in geeignete Wirtszellen transformiert und Kolonien wurden durch PCR mit Vektor-Primern gescreent, um die Anwesenheit eines Inserts zu bestätigen. Um die Orientierung eines Inserts zu bestimmen, wurden PCR-Reaktionen, die Insert-positive Klone zeigten, einer Richtungs-PCR unterworfen, unter Verwendung eines Vektor-Primers und eines Insert-Primers.
A Herstellung von End-abgestumpften, phosphatasierten Vektoren:
Eine Beschreibung von Expressions-Vektoren, die nützlich sind für die bakterielle Produktion von Kringle-5-Peptid-Fragmenten, ist in Tabelle 2 gezeigt.
Alle Vektoren wurden zuerst isoliert und gereinigt unter Verwendung von Qiagen-Säulen, gemäß den Angaben des Herstellers (QIRGEN, Inc. Santa Clarita, CA). Vektor-DNA (1 μg) wurde verdaut mit geeigneten Restriktions-Enzymen (siehe Tabelle 2) in 20 μl NEB4-Puffer (New England Biolabs), der 100 μg/ml Rinder-Serum-Albumin (BSA) enthielt. Die Reaktion wurde kurz zentrifugiert, 20 μl von doionisiertem H₂O, 0,4 μl von dNTP-Mischung (Pharmacia^®; 20 mM von jedem dNTP) und 0,25 μl von klonierter pfu DNA-Polymerase (Stratagene^®; 2,5 Einheiten/μl) wurden hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde bei 65°C für 20 Minuten inkubiert, um die Vektor-Enden aufzufüllen. Die Reaktionsmischung wurde wiederum kurz zentrifugiert und 4 μl von verdünnter Kälber-intestinaler Phosphatase (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD; 5 Einheiten insgesamt) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde dann bei 50°C für 1 Stunde inkubiert. Fünf 5 μl von 10% SDS, 2 μl von 5 M NaCl, 2 μl von 0,5 M EDTA und 45 μl von H₂O wurden hinzugefügt, die Reaktion wurde kurz zentrifugiert und dann bei 65°C für 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde dann dreimal mit Puffer-gesättigtem Phenol-Chloroform (GIBCO BRL) und einmal mit Chloroform extrahiert. Die wässerige Phase wurde durch eine CHROMA-SPIN^TM 1000 TE-Säule (CLONTECH, Palo Alto, CA) gereinigt.
B. Erzeugung von DNA-Fragmenten durch PCR:
PCR-Primer wurden entwickelt und bestellt, basierend auf der veröffentlichten Sequenz für menschliches Plasminogen (siehe Sequenzidentifikationsnummer 12) und sind unten gezeigt:
Solange nicht anderweitig angegeben, wurden alle PCRs mit pfu-DNA-Polymerase und Puffer (STRATAGENE^®) durchgeführt, unter Verwendung von 200 μM von jedem dNTP und 1 μM von jedem Primer. Die verwendeten Primer-Sets waren Sequenzidentifikationsnummer 11 und Sequenz-Identifikations-Nr. 13 (für K5A) und Sequenzidentifikationsnummer 10 und Sequenzidentifikationsnummer 13 (für K4-5A). Der Vektor pHil-D8, der das K4-K5A enthielt (beschrieben in Beispiel 19), wurde als Matrize verwendet. Vor der Verwendung als eine Matrize, wurde diese DNA mit DraI verdaut (welches viele Schnitte außerhalb der Kringle-Regionen macht), um Hintergrund zu elimineren, auf Grund des pHil-D8-Vektors in Transformationen. Ungefähr 10 ng Matrize wurden verwendet pro 50 μl PCR-Reaktion. PCR-Reaktionen wurden durchgeführt bei 94°C für 2 Minuten; dann für 15 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 49°C, 1 Minute; 72°C, 4 Minuten; und 72°C, 7 Minuten. Nach der PCR-Reaktion wurden 0,5 μl von 100 mM ATP und 5 Einheiten von T4-Kinase hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 37°C für 20 Minuten inkubiert, um die Enden mit Kinase zu behandeln. Reaktion wurde dann auf 68°C für 15 Minuten erhitzt und über 5400-HR-Spin-Säule (Pharmacia^®) zur Verwendung in Ligationen gereinigt.
C Ligation von PCR-Fragmenten in Expressions-Vektoren:
Sechs rekombinante Konstruktionen (insbesondere (i) K5A in UpET-PS3, (ii) K5A in pET32a, (iii) K4-5A in UpET-PS3, (iv) K4-5A in UpET-Ubi, (v) K4-5A in pET32a und (vi) K4-5A in pGEX-4T-2) wurden wie folgt hergestellt: End-abgestumpfter, phosphatasierter Vektor (1 μl aus Schritt A oben) und PCR-Fragment (1 μl aus Schritt B oben) wurden in einem Gesamt-Volumen von 5,5 ml ligiert, unter Verwendung eines schnellen Ligations-Kits, gemäß den Angaben des Herstellers (BOEHRINGER-MANNHEIM Corp., Indianapolis, IN). Ligations-Mischung (1 μl) wurde dann in 20 μl kompetente Zellen transformiert (XL-1-Blue superkompetente Zellen oder XL-2-Blue ultrakompetente Zellen (STRATAGENE^®)) gemäß den Angaben des Herstellers. Rekombinante Zellen wurden auf LB-Amp-Agar-Platten ausgewählt (MicroDiagnostic, Lombard, IL).
D. Expressionsstudien:
pGEX-Vektoren wurden in E. coli XL-1-Blue oder XL-2-Blue exprimiert. Alle anderen Vektoren wurden isoliert und in E. coli BL21 (DE3) (Novagen) gemäß den angaben des Herstellers retransformiert. Einzelne Kolonien wurden in 2,5 ml von LB/Amp inokuliert und bei 225 rpm, 37°C über Nacht geschüttelt. Die Über-Nacht-Kultur (0,5 ml) wurde dann in 50 ml von LB/Amp in einem 250 ml Kolben inokuliert und bei 225 rpm, 37°C auf einem OD600 von 0,5 bis 0,6 geschüttelt. Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosit (IPTG, 100 mM) wurde dann zu einer Entkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Die Kultur wurde bei 225 rpm, 30°C für 3 Stunden geschüttelt, bevor sie zentrifugiert wurde. Proben wurden hergestellt für SDS-PAGE, gemäß bekannten Techniken. Vorläufige Experimente zeigten, dass Zellen, die K5A/pET32a, K4-5A/pET32a und K4-5A/pGEX hatten, das meiste rekombinante Protein produzierten. Kulturen diese Klone wurden dann analysiert, für lösliche Versus unlösliche Expression durch SDS-PAGE. Wie 7 zeigt, produzierte K5A/pET32a rekominantes Protein, das beinahe vollständig löslich ist (vergleiche Spuren S und P von Trx-K5A), wohingegen K4-5A/pET32a und K4-5A/pGEX ungefähr 75% lösliches Protein produzierten.
E. Konstruktion von Abbott-modifizierten Vektoren
(i) VB1, VB2, VB3 und VB4-Kassetten-Herstellung:
VB1, VB2, VB3 und VB4 wurden als synthetische DNAs gemacht, unter Verwendung von Techniken, die denjenigen von durchschnittlichem Können im Fachgebiet wohl bekannt sind. Die Sequenzen von synVB1, synVB2, synVB3 und synVB4 sind unten gezeigt:
Jede synthetische Sequenz wurde doppelsträngig gemacht und in pCR-Script Cam^TM (Stratagene^®) kloniert, gemäß den Angaben des Herstellers; Klone mit der korrekten Sequenz wurden dann durch Standard-Verfahren isoliert. Fünf Mikrogramm gereinigter DNA wurden verdaut mit 8 Einheiten von BsmBI bei 55°C in 20 μl Reaktionen in 1 × NEB4-Puffer, der 100 μg/ml BSA enthielt. Die Reaktion wurde kurz zentrifugiert, 20 μl deionisiertes H₂O, 0,4 μl dNTP-Mischung (Pharmacia^®; 20 mM von jedem dNTP) und 0,25 μl geklonte pfu-DNA-Polymerase (Stratagene^®; 2,5 Einheiten pro μl) wurden hinzugefügt und die Reaktion wurde bei 65°C für 20 Minuten inkubiert, um die Enden aufzufüllen. Die DNA wurde dann auf einem 3% MetaPhor^TM Agarose-Gel (FMC, Rockland, Maine) in 0,5 × Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE) laufen gelassen. Die Kassetten-Bande wurde ausgeschnitten und die DNA wurde eluiert, durch Frieren des Gels Zentrifugieren des Puffers durch eine Ultrafree^TM-Probind-Patrone (MILLIPORE Corp., Bedford, MA), gefolgt von Isopropanol-Ausfällung, unter Verwendung von Pellet-Paint^TM (Novagen), als einen Träger. Die DNA (cfVB1, cfVB2, cfVB3 und cfVB4) wurde mit 70% Ethanol gespült, kurz. getrocknet und in 25 μl Tris-EDTA-(TE)-Puffer resuspendiert.
ii. Konstruktion von UpET:
VektorpET21d (Novagen) wurde mit SapI verdaut, zuerst mit T4 DNA-Polymerase + dGTP behandelt, dann Mung-Bean-Nuklease, dann DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment und wieder ligiert. Individuelle Kolonien wurden gescreent, um ein Plasmid auszuwählen, in welchem die existierende SapI-Stelle eliminiert wurde. Diese DNA wurde dann mit NcoI + BamHI verdaut und an 5'-CATGTGAAGAGC-3' (Sequenzidentifikationsnummer 19) + 5'-GATCGCTCTTCA-3' (Sequenzidentifikationsnummer 20) ligiert, um eine einzelne SapI-Stelle einzuführen. Gereinigte, verifizierte klonierte DNA wurde mit SapI + HindIII geschnitten, abgestumpft und wie oben beschrieben, phosphatasiert, mit der cfVB1-Kassette ligiert, im E. coli transformiert und auf LB-Amp-Platten platziert.
Kolonien wurden mit sterilen Pipetten-Spitzen aufgesammelt und auf LB-Amp-Agar-Platten gesetzt und in 20 μl von AmpliTaq^® PCR-Mischung (Perkin Elmer) in Costar-Thermowell-Platten, die 1 μM von jedem der Vektor-Primer 5'-AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (Vorwärts-Primer, Sequenzidentifikationsnummer 21) und 5'-ATCCGGATATAGTTCCTC-3' (Sequenzidentifikationsnummer 22) enthielten. Die Reaktionen wurden auf 94°C für 5 Minuten erhitzt, dann einem Kreislauf unterworfen, unter Verwendung eines GeneAmp 9600 Thermal-Cyclers für 30 Zyklen von 94°, 30 Sekunden; 40°, 1 Minute; 72°, 2 Minuten. 10 μl von jeder Reaktion wurden auf Agarose-Gelen laufen gelassen. Um die Orientierung der Kassette zu bestimmen, wurden 0,25 μl eines PCR-Schirms mit der korrekten Größe hinzugefügt zu einer frischen Reaktion, die den Reverse-Vektor-Primer und einen Kassetten-Primer 5'-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA-3' (Sequenzidentifikationsnummer 23) enthielt. Reaktionen wurden, wir oben, für zusätzliche 10 Zyklen einem Kreislauf unterworfen. Die endgültigen Vektoren wurden sequenziert, unter Verwendung von Standard-Verfahren und ein Klon wurde als UpET bezeichnet.
iii. Konstruktion von UpET-HTh:
UpET wurde verdaut mit SapI und für die abgestumpfte, phosphatasierte Klonierung präpariert. Es wurde zu der cfVB2-Kassette ligiert, transformiert, Kolonien wurden gescreent und sequenziert, wie für die cfVB1-Ligation oben.
iv. Konstruktion von UpET-H:
UpET wurde mit SapI verdaut und für die abgestumpfte, phosphatasierte Klonierung präpariert. Es wurde zu der cfVB3-Kassette ligiert, transformiert, Kolonien wurden gescreent und sequenziert, wie für die cfVB1-Ligation oben.
v. Konstruktion von UpET-Ubi:
Ein PCR-Fragment für S. cerevisiae ubiquitin wurde erzeugt, unter Verwendung von Ultma-DNA-Polymerase und Puffer (Perkin Elmer), 40 μM von jedem dNTP, 1 μM von jedem der Primer 5'-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3' (Ubi-5p, Sequenzidentifikationsnummer 24) und 5'-ACCACCTCTTAGCCTTAG-3' (Ubi-3p, Sequenzidentifikationsnummer 25) und 1,75 μg von Hefe-DNA bei 94°C, 2 Minuten, dann 25 Zyklen von 94°C, 1 Minute; 40° C, 1 Minute; 72°C, 2 Minuten; dann 72°C für 7 Minuten. Ein PCR-Fragment wurde erzeugt von 20 ng von pET15b (Novagen), unter Verwendung der Primer 5'-CATGGTATATCTCCTTCTT-3' (pET3p-ATG, Sequenzidentifikationsnummer 26) und 5'-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3' (T7RevTerm, Sequenzidentifikationsnummer 27) bei 94°C, 2 minuten, dann 10 Zyklen von 94°C, 45 Sekunden; 42°C, 1 Minute; 72°C, 15 Minuten; dann 72°C für 7 Minuten. Die Ubiquitin- und pET15b-abgeleiteten PCR-Fragmente wurden Gel-gereinigt und zusammen ligiert, unter Verwendung von BRL T4-Ligase und Ligase-Puffer. Ein T7-Promoter-Ubiquitin (T7-Ubiquitin)-PCR-Fragment wurde dann erzeugt, unter Verwendung der Ligation als Matrize und Ultma-DNA-Polymerase und den Primern 5'-AGATCTCGATCCCGCGAA-3' (pET5p, Sequenzidentifikationsnummer 28) und Sequenzidentifikationsnummer 25 bei 94°C, 2 Minuten, dann 25 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 42°C, 1 Minute; 72°C, 3 Minuten; dann 72°C, 7 Minuten. Das T7-Ubiquitin-PCR-Fragment wurde Gel-gereinigt.
Ein PCR-Fragment von reifem menschlichen Stromelysin wurde erzeugt, unter Verwendung von Ultma-DNA-Polymerase (wie oben) mit dem Primer 5'-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3' (Strom-3p, Sequenzidentifikationsnummer 29) und dem mit Kinase behandelten Primer 5'-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3' (Strom-5p, Sequenzidentifikationsnummer 30) und ungefähr 20 ng Matrize (d.h. Stromelysin kloniert in pET3b (Novagen)) bei 94°C, 2 Minuten, dann 15 Zyklen von 94°C, 1 Minute; 44°C, 1 Minute; 72° C, 2 Minuten, dann 72°C für 7 Minuten. Die Stromelysin-PCR-Reaktion (10 μl) wurde ligiert mit 100 pMol von "annealten" Oligos 5'-AGCGGCGACGACGACGRCAAG-3' (Ek-Cut-5p, Sequenzidentifikationsnummer 31) und 5'-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3' (Ek-Cut-3p, Sequenzidentifikationsnummer 32, kodierend für eine Enterokinase-Abspaltungs-Stelle) in 40 ml von BRL-Ligase und Ligase-Puffer. Ein Enterokinase-Stelle-reifes Stromelysin (Ek-Stromelysin)-PCR-Fragment wurde erzeugt, unter Verwendung von 1 μl dieser Ligation als eine Matrize, den Primern Sequenzidentifikationsnummer 29 und mit Kinase-behandelte Sequenzidentifikationsnummer 31, Ultma-DNA-Polymerase und Puffer bei 94°C, 2 Minuten; dann 10 Zyklen von 94°C, 1 Minte; 44°C, 1 Minute; 72°C, 2 Minuten, dann 72°C für 7 Minuten. Das Ek-Stromelysin-PCR-Fragment wurde Gel-gereinigt.
Die T7-Ubiquitin und Ek-Stromelysin-PCR-Fragmente wurden zusammen in BRL-Ligase und Ligase-Puffer ligiert. Ein T7-Ubiquitin-Ek-Stromelysin-PCR-Fragment wurde dann erzeugt, unter Verwendung der Ligation als Matrize und Ultma-DNA-Polymerase und der Primer-Sequenzidentifikationsnummer 28 und Sequenzidentifikationsnummer 29 bei 94°C, 2 Minuten, dann 25 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 42°C, 1 Minute; 72°C, 6 Minuten, dann 72°C für 7 Minuten.
Ein PCR-Fragment wurde erzeugt unter Verwendung der Stromelysin-pET3b-Plasmid-Metrize mit den Primern Sequenzidentifikatioons-Nr. 26 und Sequenzidentifikationsnummer 30 mit KlenTaq (AB Peptides St. Louis, MO) und pfu-DNA-Polymerasen bei 94°C, 2 Minuten, dann 15 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 42°C, 2 Minuten; 68°C, 20 Minuten. Dieses PCR-Fragment wurde mit dem T7-Ubiquitin-Ek-Stromelysin-PCR-Fragment gemischt und in BRL- DH5α-kompetente Zellen mit maximaler Effizient transformiert. Korrekte Klone wurden identifiziert, durch Isolation von Plasmid-DNA, Transfektion in BL21 (DE3) und die Expression wurde, wie oben beschrieben, untersucht.
Ein PCR-Fragment für Ubiquitin-Ek wurde erzeugt von einem korrekten T7-Ubiquitin-Ek-Stromelysin-Expressions-Plasmid mit den Primern Sequenzidentifikationsnummer 24 und Sequenzidentifikationsnummer 32 und pfu-DNA-Polymerase bei 94°C, 2 Minuten, dann 20 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 40°C, 1 Minute; 72°C, 3 Minuten; 72°C, 7 Minuten. Das Fragment wurde gereinigt, über einer Pharmacia 5–400 HR Spin-Säule und an die VBC1-Kassette ligiert, unter Verwendung des schnellen DNA-Ligations-Kits. Ein PCR-Fragment wurde erzeugt, unter Verwendung der Ligation als Matrize und der Primer Sequenzidentifikationsnummer 24 und 5'-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3' (Sequenzidentifikationsnummer 33) und pfu-DNA-Polymerase bei 94° C, 2 Minuten, dann 20 Zyklen von 94°C, 30 Sekunden; 40°C, 1 Minute; 72°C, 2 Minuten; 72°C, 7 Minuten. Das PCR-Fragment wurde mit Kinase behandelt und an Upet-H ligiert, hergestellt für die abgestumpfte, phosphatasierte Klonierung. Die Ligation wurde in kompetente Zellen transformiert und Kolonien wurden durch PCR, wie oben, gescreent. Plasmid-DNA wurde sequenziert, um korrekte Klone von UpET-Ubi zu identifizieren.

Claims

Eine Verbindung mit der Formel A-B-C-X-Y oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Ester davon, worin, A abwesend oder eine Stickstoffschutzgruppe ist; Y abwesend oder eine Carbonsäureschutzgruppe ist und B-C-X gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen, die durch die folgenden Aminosäurepositionen von SEQ-ID NR. 1 definiert sind: (a) die Sequenz von Aminosäureposition 355 bis 543; (b) die Sequenz von Aminosäureposition 355 bis 546; (c) die Sequenz von Aminosäureposition 443 bis 543; (d) die Sequenz von Aminosäureposition 449 bis 543; (e) die Sequenz von Aminosäureposition 454 bis 543; (f) die Sequenz von Aminosäureposition 443 bis 546; (g) die Sequenz von Aminosäureposition 449 bis 546; (h) die Sequenz von Aminosäureposition 454 bis 546; (i) die Sequenz von Aminosäureposition 525 bis 535; (j) die Sequenz von Aminosäureposition 529 bis 535; (k) die Sequenz von Aminosäureposition 530 bis 535; (l) die Sequenz von Aminosäureposition 529 bis 534; (m) die Sequenz von Aminosäureposition 531 bis 534; (n) die Sequenz von Aminosäureposition 450 bis 543.
Die Verbindung von Anspruch 2, worin A N-Ac und Y NH2 ist.
Die Verbindung von Anspruch 1 mit einer Endothelzell-Migrationsinhibition ED50 von 100 bis 500 pM.
Die Verbindung von Anspruch 1 mit einer Endothelzell-Proliferationsinhibition ED50 von 100 bis 500 pM.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit bei einem Patienten, der eine Antiangiogenese-Therapie benötigt.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin die Krankheit gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Arthritis, Makuladegeneration und diabetischer Retinopathie.
Verwendung gemäß Anspruch 6, worin die Krankheit Krebs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, worin der Krebs gewählt ist aus primären und metastatischen festen Tumoren, Karzinomen, Sarkomen, Lymphomen, Schuppenflechte und Hämangiomen.
Zusammensetzung, welche die Verbindung von Anspruch 1 und ein pharmazeutisch verträgliches Bindemittel umfasst.
Eine Zusammensetzung, die eine isolierte einzel- oder doppelsträngige Polynukleotidsequenz umfasst, welche eine Verbindung gemäß Anspruch 1 kodiert.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin die Polynukleotidsequenz eine DNA-Sequenz ist.
Die Zusammensetzung von Anspruch 11, worin die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) der Sequenz von Aminosäureposition 443 bis 543 von SEQ-ID NR. 1; (b) der Sequenz von Aminosäureposition 449 bis 543 von SEQ-ID NR. 1; (c) der Sequenz von Aminosäureposition 454 bis 543 von SEQ-ID NR. 1; (d) der Sequenz von Aminosäureposition 355 bis 543 von SEQ-ID NR. 1.
Die Zusammensetzung von Anspruch 12, worin die Polynukleotidsequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID NR. 34.
Eine Zelle, die geeignet ist, in ein menschliches oder nicht menschliches Tier implantiert zu werden, wobei die Zelle einen Vektor enthält, worin der Vektor eine DNA-Sequenz enthält, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 kodiert.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, das folgende Schritte umfasst: (a) Exponieren eines Säugetier-Plasminogens gegenüber Elastase bei einem Verhältnis von 1:100 bis 1:300, um eine Mischung des Plasminogens und der Elastase zu bilden; (b) Inkubieren der Mischung; und (c) Isolieren der Verbindung aus der Mischung.
Ein isoliertes einzel- oder doppelsträngiges Polynukleotid, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als ein Angiogeneseinhibitor kodiert.
Das Polynukleotid von Anspruch 16, das ein DNA-Molekül ist.
Das Polynukleotid von Anspruch 16, das ein RNA-Molekül ist.
Ein Vektor, der ein Polynukleotid umfasst, welches eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als Angiogeneseinhibitor kodiert.
Der Vektor von Anspruch 19, der ein Expressionsvektor ist.
Der Vektor von Anspruch 20, worin der Expressionsvektor hergestellt wird durch Einbau eines Polynukleotids, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 kodiert, in die Vektoren, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pHil-D8, pET32a, pGEX-4T-2, Up-ET-Ubi und pCYB3.
Der Vektor von Anspruch 20, der weiter eine mit dem Vektor umgewandelte Wirtszelle umfasst.
Der Vektor von Anspruch 22, worin die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
Der Vektor von Anspruch 23, worin die eukaryotische Zelle Pichia pastoris ist.
Der Vektor von Anspruch 22, worin die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist, die E. Coli ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer löslichen Verbindung gemäß Anspruch 1, das folgende Schritte umfasst: (a) Isolieren eines Polynukleotids, das die Verbindung kodiert, (b) Klonieren des Polynukleotids in einen Expressionsvektor, (c) Umwandeln des Vektors in eine geeignete Wirtszelle und (d) Züchten der Wirtszelle, um die Verbindung zu exprimieren.
Eine Verbindung, gewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-Y; (b) A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-Y; (c) A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y und (d) A-Gln-Rsp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y, worin A abwesend oder eine Stickstoffschutzgruppe ist und Y abwesend oder eine Carbonsäureschutzgruppe ist.